(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物の多形体であって、
【化１】
0005972986.tif 000018
前記多形体は、（ａ）１０．３°、１４．１°及び１４．６°に回折角２θの特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶形Ｉ、並びに（ｂ）１０．４°、１２．１°及び１３．４°に回折角２θの特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶形ＩＩから選択される、多形体。
【請求項２】
多形体は、結晶面の距離が８．６Å、６．３Å及び６．１Åに特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶形Ｉである、請求項１記載の多形体。
【請求項３】
多形体は、１０．３°、１４．１°、１４．６°、１５．８°、１６．６°及び１９．６°に回折角２θの特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶形Iである、請求項１記載の多形体。
【請求項４】
多形体は、結晶面の距離が８．６Å、６．３Å、６．１Å、５．６Å、５．３Å及び４．５Åに特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶形Ｉである、請求項３記載の多形体。
【請求項５】
多形体は、１０．３°、１４．１°、１４．６°、１５．７°及び１６．６°に回折角２θの特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶形Ｉである、請求項１記載の多形体。
【請求項６】
９．３°及び１９．６°に回折角２θの特徴的なピークがさらに現れる粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項５に記載の多形体。
【請求項７】
多形体の融点が１７４〜１７７℃である、請求項１〜６のいずれかに記載の多形体。
【請求項８】
多形体が純度≧８５％である、請求項１〜６のいずれかに記載の多形体。
【請求項９】
多形体が純度≧９５％である、請求項８記載の多形体。
【請求項１０】
多形体が純度≧９９％である、請求項９記載の多形体。
【請求項１１】
多形体は、１５．４°、１７．８°及び１８．８°に回折角２θの特徴的なピークがさらに現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶形ＩＩである、請求項１記載の多形体。
【請求項１２】
多形体は、結晶面の距離が８．５Å、７．３Å及び６．６Åに特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶形ＩＩである、請求項１記載の多形体。
【請求項１３】
多形体は、結晶面の距離が５．７Å、５．０Å及び４．７Åに特徴的なピークがさらに現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶形ＩＩである、請求項１２記載の多形体。
【請求項１４】
結晶形ＩＩの融点が２０９〜２１２℃である、請求項１、１１〜１３のいずれかに記載の多形体。
【請求項１５】
結晶形ＩＩが純度≧８５％である、請求項１、１１〜１４のいずれかに記載の多形体。
【請求項１６】
結晶形ＩＩが純度≧９５％である、請求項１５記載の多形体。
【請求項１７】
結晶形ＩＩが純度≧９９％である、請求項１６記載の多形体。
【請求項１８】
治療有効量の請求項１〜１７のいずれかに記載の多形体、及び医薬的に許容される賦形剤、佐剤又は担体を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
他の活性成分を更に含む、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
多形体は式Ｉの化合物の結晶形Ｉ又は結晶形ＩＩである、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２１】
経口的に投与される、請求項１８〜２０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２２】
錠剤又はカプセル剤である、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２３】
１〜９９質量％の前記多形体を含む、請求項１８〜２２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２４】
１〜７０質量％の前記多形体を含む、請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
１０〜３０質量％の前記多形体を含む、請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２６】
マクロファージにおけるＩＦＮ−γ誘導性一酸化窒素の生成を阻害する薬物を製造するための、請求項１〜１７のいずれかに記載の多形体の使用。
【請求項２７】
癌又は炎症関連疾患を治療する薬物を製造するための、請求項１〜１７のいずれかに記載の多形体の使用。
【請求項２８】
炎症関連疾患が狼瘡、リウマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、心血管疾患、糖尿病又は糖尿病関連症状である、請求項２７記載の多形体の使用。
【請求項２９】
糖尿病関連症状が肥満、高血圧、アテローム性動脈硬化、冠動脈心疾患、脳卒中、末梢血管疾患、腎障害、神経障害、筋壊死、網膜症若しくは代謝異常症候群（Ｘ症候群）、又はこれらの組合せである、請求項２８記載の多形体の使用。
【請求項３０】
請求項１〜１７のいずれかに記載の多形体を含む、マクロファージにおける一酸化窒素の生成を調節するための医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１〜１７のいずれかに記載の多形体を含む、癌又は炎症関連疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項３２】
炎症関連疾患が狼瘡、リウマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、心血管疾患、糖尿病、又は糖尿病関連症状である、請求項３１記載の医薬組成物。
【請求項３３】
糖尿病関連症状が肥満、高血圧、アテローム性動脈硬化、冠動脈心疾患、脳卒中、末梢血管疾患、腎障害、神経障害、筋壊死、網膜症若しくは代謝異常症候群（Ｘ症候群）、又はこれらの組合せである、請求項３２記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年９月２８日に出願した国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１２／０８２２７８のＰＣＴ国際出願の優先権を主張するものである、参照によりその全体を本明細書へ組み入れるものとする。
【０００２】
本出願はトリテルペノイド化合物であるエチル  ２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９（１１）ジエン−２８−オエート（ＣＤＤＯエチルエステル）の多形体、及び少なくとも一つの当該多形体を利用して、様々な疾患、一般には炎症関連疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
トリテルペノイド化合物は、スクアレンの環化によって植物で生合成されている。これらの天然分子は、医薬用途のための候補物質であるが、比較的弱い生物活性を示す。従って、化学者たちは、高い効力を有する類似体を合成しようとしている（Ｈｏｎｄａら，１９９７＆１９９８）。
【０００４】
いくつかの合成類似体は、ＩＦＮ−γ又はＬＰＳによって刺激されたマクロファージにおけるサイトカイン誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及びシクロオキシゲナーゼ?２（ＣＯＸ−２）のｄｅ  ｎｏｖｏ合成を抑制することが報告されている（Ｓｕｈら，１９９８；Ｈｏｎｄａら，２００２）。その中で、２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９（１１）−ジエン−２８−オエート（ＣＤＤＯ）は、抗炎症活性及び抗増殖活性を示す（Ｈｏｎｄａら，１９９８＆２０００）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈｏｎｄａら，１９９７
【非特許文献２】Ｈｏｎｄａら，１９９８
【非特許文献３】Ｓｕｈら，１９９８
【非特許文献４】Ｈｏｎｄａら，２００２
【非特許文献５】Ｈｏｎｄａら，１９９８
【非特許文献５】Ｈｏｎｄａら，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記のように、ｉＮＯＳ活性の抑制剤としての、特にＮＯ生成の阻害における、トリテルペノイドの研究は、ＣＤＤＯ及びＣＤＤＯメチルエステルの高い有効性を示している（ＩＣ５０＜１ｎＭレベル）。Ｈｏｎｄａら（２０００）参照のこと。しかし、上記の分子、特にＣＤＤＯエステルの治療における潜在能力を利用することは不完全であると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
式ＩのＣＤＤＯエチルエステルの治療における潜在能力を解明するために、本発明者らは、該化合物の多形体を検討した。その結果、本発明者らは、ＣＤＤＯエチルエステルの３つの多形体形態を発見した。この３つの多形体は有益な特性を有する（例えば、好適な薬物動態及びより高い全身暴露）、従ってそれ自体で薬剤開発の理想的な候補物質となった。
【０００８】
発明の概要
一方では、本発明は、式Ｉの化合物の多形体、及び／或いは該多形体の水和物或いは溶媒和物に関する。
【０００９】
【化１】
0005972986.tif 000002
【００１０】
その中でも、多形体は式Ｉの化合物の少なくとも二つの実質的に純粋な結晶形、及び一つの実質的に純粋なガラス質の固形物形態を含む。ここで便宜のために、これらの二つの結晶形は結晶形Ｉと結晶形ＩＩを示している。
【００１１】
本発明の１つの実施形態において、多形体は式Ｉの化合物のガラス質の固形物形態であり、該ガラス質の固形物形態のＴｇが約５２℃±１０℃である。
【００１２】
他の実施形態において、多形体は、約１４．３°に回折角２θの特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する式Ｉの化合物のガラス質の固形物形態である。
【００１３】
他の実施形態において、式Ｉの化合物はガラス質の固形物形態が純度≧８５％（すなわち、少なくとも８５％）であることを特徴とする。他の実施形態において、純度が少なくとも９５％或いは９９％である。
【００１４】
他の実施形態において、該多形体は、約１０．３°、１４．１°及び１４．６°に回折角２θの特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する、式Ｉの化合物の結晶形Ｉである。
【００１５】
他の実施形態において、該多形体は、約１０．３°、１４．１°、１４．６°、１５．８°、１６．６°及び１９．６°に回折角２θの特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する、式Ｉで示される化合物の結晶形Ｉである。
【００１６】
他の実施形態において、該多形体は、結晶面の距離が８．６Å、６．３Å及び６．１Åに特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する式Ｉで示される化合物の結晶形Iである。
【００１７】
他の実施形態において、該多形体は、結晶面の距離が８．６Å、６．３Å、６．１Å、５．６Å、５．３Å及び４．５Åに特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する式Ｉの化合物の結晶形Ｉである。
【００１８】
本発明の多形体の実施形態のもう一つのサブセットは結晶形Ｉである。
【００１９】
そのような実施形態において、式Ｉの化合物の結晶形Ｉは、約１０．３°、１４．１°、１４．６°、１５．７°及び１６．６°に回折角２θの特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有することを特徴とする。
【００２０】
他の実施形態において、式Ｉの化合物の結晶形Ｉは、約９．３°及び１９．６°に回折角２θの特徴的なピークがさらに現れる粉末Ｘ線回折パターンを有する。
【００２１】
他の実施形態において、式Ｉの化合物の結晶形Ｉの融点が１７４−１７７℃であることを特徴とする。
【００２２】
他の実施形態において、式Ｉの化合物の結晶形Ｉは純度≧８５％である（すなわち、少なくとも８５％）。他の実施形態において、その純度が少なくとも９５％或いは９９％である。
【００２３】
本発明の多形体の実施形態のもう一つのサブセットは結晶形ＩＩである。
【００２４】
そのような実施形態において、式Ｉの化合物の結晶形ＩＩは、約１０．４°、１２．１°及び１３．４°に回折角２θの特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有することを特徴とする。
【００２５】
他の実施形態において、式Ｉの化合物の結晶形ＩＩは約１５．４°、１７．８°及び１８．８°に回折角２θの特徴的なピークがさらに現れる粉末Ｘ線回折パターンを有することを特徴とする。
【００２６】
他の実施形態において、式Ｉの化合物の結晶形ＩＩは、結晶面の距離が８．５Å、７．３Å及び６．６Åに特徴的なピークが現れる粉末Ｘ線回折パターンを有することを特徴とする。
【００２７】
他の実施形態において、式Ｉの化合物の結晶形ＩＩは、結晶面の距離が５．７Å、５．０Å及び４．７Åに特徴的なピークがさらに現れる粉末Ｘ線回折パターンを有することを特徴とする。
【００２８】
他の実施形態において、式Ｉの化合物の結晶形ＩＩの融点が２０９−２１２℃であることを特徴とする。
【００２９】
他の実施形態において、式Ｉの化合物の結晶形ＩＩは純度が８５％以上である（例えば、純度が少なくとも９５％或いは少なくとも９９％である）。
【００３０】
一方では，本発明は式Ｉの化合物の結晶形多形体を調製する方法にも関する。
【００３１】
そのような方法の一つの実施形態は、過量の化合物をＣＨ２Ｃｌ２、酢酸エチル、アセトニトリル、エタノール、メタノール、ヘプタン、またはこれらの混合物の中から選択される溶媒に添加して少なくとも２４時間かけてスラリー化し、得られた結晶形の多形体或いはガラス質の固形物形態を回収する工程を含む。
【００３２】
ある実施形態において、生成した結晶形は結晶形Ｉであってもよいが、または結晶形ＩＩであってもよい。
【００３３】
他の実施形態において、室温或いは５０℃において、式Ｉの化合物が混合溶媒中でスラリー化されている。
【００３４】
他の実施形態において、式Ｉの化合物が溶媒に少なくとも４８時間スラリー化される。
【００３５】
溶媒が酢酸エチル／ヘプタンの混合物、エタノール／ヘプタンの混合物でもよい。例えば、酢酸エチル／ヘプタンの混合物において、酢酸エチルとヘプタンの比が１：１０（重量比或いは容量比）の割合でもよい。
【００３６】
本発明の多形体を提供するために、少なくとも一つの溶媒を含む適当な溶媒系で、自然沈殿（蒸発）、冷却または貧溶媒の添加（貧溶媒において、本発明の化合物の溶解度はより低い）によって溶媒系の過飽和を達成することにより、式Ｉの化合物が結晶化される。本発明の化合物を結晶化のために、適当な種晶を使用することができ、また、使用しないこともできる。
【００３７】
他の実施形態において、本発明の式Ｉの化合物を、室温で溶媒であるヘプタンに溶解し、次いで、自然沈殿によって所望の結晶形Ｉが得られる。該結晶形Ｉの融点は１７４−１７７℃である。
【００３８】
他の実施形態において、室温或いは５０℃で、過量の本発明の式Ｉの化合物を酢酸エチル／ヘプタン（重量比或いは容量比で１：１０）の混合溶媒に添加し、少なくとも４８時間の撹拌を行い、結晶形ＩＩが得られる。該結晶形ＩＩは融点が２０９−２１２℃である。
【００３９】
他の実施形態において、室温或いは５０℃で、過量の本発明の式Ｉの化合物をジクロロメタン溶媒に溶解し、次いで、溶媒を蒸発させることにより、式Ｉの化合物のガラス質の固形物形態が得られる。該ガラス質の固形物形態はＴｇが５２℃±１０℃の範囲である。
【００４０】
本発明は更に、障害又は適応症、特に、炎症に関係した障害又は適応症を治療するための、式Ｉの化合物の多形体（結晶形Ｉ又はＩＩ又はガラス質の固形物形態）の用途、又は本発明は障害或いは適応症、例えば、急性又は慢性の酸化性ストレス及び炎症に関係した障害或いは適応症、特に、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）若しくは誘導性シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）の部分的な過剰発現を特徴とする障害或いは適応症を治療する薬剤を製造するための、上記の多形体の用途を提供する。
【００４１】
従って、本発明は、少なくとも治療有効量の本発明の結晶形Ｉ或いは結晶形ＩＩ或いはガラス質の固形物形態、及び医薬的に許容される賦形剤、佐剤或いは担体を含む医薬組成物或いは薬剤に関する。該組成物或いは薬剤は、任意的に、少なくとももう一つの他の活性成分をさらに含んでもよい。
【００４２】
本発明の医薬組成物或いは薬剤は、治療を必要とする適応症或いは疾患に応じて適当な形態或いは剤型（例えば、錠剤或いはカプセル剤）とすることができ、また、当技術分野で周知の方法（例えば、経口投与）により投与することができる。
【００４３】
本発明の医薬組成物或いは薬剤は、１−９９ｗｔ％（例えば、１−７０ｗｔ％、１０−３０ｗｔ％）の式Ｉの化合物の多形体（例えば、結晶形Ｉ、結晶形ＩＩ或いはガラス質の固形物形態）を含んでもよい。
【００４４】
本発明の全ての多形体（結晶形又はガラス質の固形物形態を含む）は実質的に純粋、又はほぼ純粋である。本明細書において使用される用語「実質的に純粋な」或いは「ほぼ純粋な」とは、本発明の多形体、特に、結晶形Ｉ或いは結晶形ＩＩ中での式Ｉの化合物の含量が、少なくとも８５ｗｔ％（例えば、少なくとも９５ｗｔ％、或いは少なくとも９９ｗｔ％）であることをいう。
【００４５】
上記の結晶形とガラス質の固形物形態の多形体の主ピークは、誤差限界の範囲内で（所定値±０．２）再現できる。
【００４６】
本発明において、「図１のような粉末Ｘ線回折パターン」とは、図１の主ピークを示す粉末Ｘ線回折パターンであることを意図し、該主ピークとは、図１の最高ピークと比べて（最高ピークの相対強度は１００％を表す）、相対強度が１０％以上、好ましい３０％以上のピークであることを意図する。本発明において、図２のような粉末Ｘ線回折パターンとは、同様に図２の主ピークを示す粉末Ｘ線回折パターンであることを意図し、該主ピークとは、図２の最高ピークと比べて（最高ピークの相対強度は１００％を表す）、相対強度が１０％以上、好ましい３０％以上のピークであることを意図する。
【００４７】
下記の図のような工程を含む式Ｉの化合物を製造する方法が、本発明の範囲内に属する
【００４８】
【化２】
0005972986.tif 000003
【００４９】
本発明はまた、式Ｉの化合物、またはその多形体若しくは結晶形Ｉ、結晶形ＩＩ、ガラス質の固形物形態からなる群より選択される形態の用途であって、マクロファージにおいてＩＦＮ−γにより誘導されるＮＯの生成を阻害する、癌を治療する、又は炎症関連疾患、障害若しくは適応症、例えば、狼瘡、リウマチ性関節炎、クローン病或いは潰瘍性大腸炎、心血管疾患、糖尿病、糖尿病の一種以上の関連症状、その中、関連症状は肥満、高血圧、アテロム性動脈硬化、冠動脈心疾患、脳卒中、外周血管疾患、腎障害、神経障害、筋壊死、網膜症、代謝異常症候群（Ｘ症候群）或いはこれらの２種以上の組み合わせから選択される疾患を治療するための薬物を製造する用途も提供する。
【００５０】
本明細書において使用される用語「治療有効量」とは、疾患、又は疾患若しくは障害の少なくとも一つの臨床症状を治療するために、対象に投与した場合において、その疾患、障害或いは体調を治療する効果に影響を与える化合物の量を意図する。「治療有效量」は化合物、疾患、障害、及び／又は疾患若しくは障害の症状，疾患、障害及び／又は疾患若しくは障害の症状の重症度、治療対象の年齢、及び／又は治療対象の体重などによって変更することがてきる。具体的な例における適切な量は、当該技術分野における当業者にとって明らかであるか、或いは従来の試験によって決定することができる。併用療法の場合において（即ち、本発明の多形体の他に、少なくとももう一つの活性成分がある）、用語「治療有効量」とは、疾患、障害或いは体調を有効に治療する組成物の総量を意図する。
【００５１】
本発明の化合物を含む医薬組成物は、治療を必要とする対象に、経口、吸入、経直腸、注射或いは局部的に投与することができる。経口投与のために、医薬組成物は錠剤、粉末、細粒、カプセル剤のような普通な固形物剤型；水或いは油懸濁液のような液体剤型；シロップ、溶液、懸濁液のような他の液体剤型であってもよい；注射投与のために、医薬組成物は溶液、水溶液、油懸濁液濃縮物、凍結乾燥粉末などであってもよい。好ましくは、医薬組成物は錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、坐剤、鼻噴霧剤或いは注射剤からなる群より選択されるいずれかの剤型である、より好ましくは錠剤或いはカプセル剤である。医薬組成物は正確な投薬量を有する単位投与剤量である。その上、医薬組成物は他の活性成分をさらに含んでもよい。
【００５２】
本発明の医薬組成物の全ての剤型は、製薬分野の慣用方法で生産できる。例えば、活性成分と一種以上の賦形剤と混合し、所望の剤型を生産することができる。「医薬的に許容される担体」とは、所望の薬物剤型に適した慣用な薬物担体を指す。例えば、希釈剤、例えば水、さまざまな有機溶剤のような媒介物；でんぶん、ショ糖のような充填剤；セルロース誘導体、アルジネート、ゼラチン及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような結合剤；グリセリンのような湿潤剤；寒天、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウムのような崩壊剤；四級アンモニウム化合物のような吸収促進薬；へクサデカノールのような界面活性剤；カオリン、ベントナイトのような吸収担体；滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコールのような潤滑剤。その上、医薬組成物は他の医薬的に許容される賦形剤、例えば、分散剤、安定剤、増粘剤、錯化剤、緩衝液、浸透促進剤、ポリマー、芳香剤、甘味料及び染料を更に含む、賦形剤は、所望の剤型及び投与種類に適したものであることが好ましい。
【００５３】
本明細書において使用される用語「溶媒和物」とは、溶媒と化合物との相互作用によって形成した化学成分を意図する。適当な溶媒和物は医薬的に許容される溶媒和物、例えば水和物、一水和物と半水和物を含む。
【００５４】
本明細書において使用される用語「活性成分」とは、生物活性を有する化学物質を意図する。ある実施形態において、「活性剤」とは、製薬的な用途を有する化合物を意図する。例えば、活性剤は抗癌治療剤でもよい。
【００５５】
用語「疾患」或いは「障害」或いは「適応症」とは、如何なる疾患、不快、病気、症状或いは兆候を含むことを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】式Ｉの化合物の結晶形Ｉの粉末Ｘ線回折パターンを示す。
【図２】式Ｉの化合物の結晶形ＩＩの粉末Ｘ線回折パターンを示す。
【図３】式Ｉの化合物のガラス質の固形物形態の粉末Ｘ線回折パターンを示す。
【図４】ガラス質の固形物形態の熱流量（ｗ／ｇ）図を示す。
【図５】式Ｉの化合物（ＣＤＤＯエチルエステル）の結晶形ＩＩが、マウスマクロファージ１７においてＩＦＮ−γにより誘導される一酸化窒素の生成を阻害する効果を示す。
【実施例】
【００５７】
図１、図２及び図３で示される粉末Ｘ線回折パターン（ＸＲＰＤ）は、Ｅｍｐｙｒｅａｎ  ｃｏｎｓｏｌｅを有するＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ  Ｘ線回折システムを用いて生成した。２θの値が２８．４４３度である単結晶シリコンを標準物質として使用して、回折ピークの位置を較正した。Ｅｍｐｙｒｅａｎ  Ｃｕ  ＬＥＦＸ線管のＫα放射線を、Ｘ線の光源として用いた。
【００５８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書の実施例において使用される技術或いは方法は、特に言及しない限り、当業者に一般的に知られている慣用技術或いは方法である。
【００５９】
実施例１  式Ｉの化合物の合成方法
【化３】
0005972986.tif 000004
【００６０】
段階１  ＡＰＳＮ１３Ｂ−１の合成
0005972986.tif 000005
【００６１】
オレアノール酸（１０００ｇ、２．２ｍｏｌ）と炭酸カリウム（６０４ｇ、４．４ｍｏｌ）のＤＭＦ（１２Ｌ）溶液に、ヨウ化エチル（３７６ｇ、２．４ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を４５℃で一晩撹拌した。オレアノール酸がＨＰＬＣで検出できなかった後、この混合物を室温へ冷却して、水（１２０Ｌ）に注いだ。得られた懸濁液を３０分撹拌した。固形物を遠心分離により集め、水（１Ｌ）で洗浄し、５０℃で真空乾燥して、後の段階で使用するＡＰＳＮ１３Ｂ−１を９７６ｇ得た。収率９２％。
【００６２】
段階２  ＡＰＳＮ１３Ｂ−２の合成
0005972986.tif 000006
【００６３】
４５℃で、ＡＰＳＮ１３Ｂ−１（９７５ｇ、２ｍｏｌ）、ピリジン（４７４ｇ）、ＤＭＡＰ（２４．４ｇ、０．２ｍｏｌ）とＴＨＦ（６Ｌ）の混合物に、無水酢酸（６１２ｇ、６ｍｏｌ）を加えた。この溶液を一晩撹拌した。反応終了後、この溶液を水（６０Ｌ）に注いだ。固形物を遠心分離により集め、４５℃で真空乾燥して、後の段階で使用するＡＰＳＮ１３Ｂ−２を８４７ｇ得た。収率８０％。
【００６４】
段階３  ＡＰＳＮ１３Ｂ−３の合成
0005972986.tif 000007
【００６５】
室温で、ＡＰＳＮ１３Ｂ−２（８４６ｇ、１．６ｍｏｌ）とギ酸（１Ｌ）のＤＣＭ（５Ｌ）溶液に、過酸化水素（３０％水溶液）（４５３ｇ、４ｍｏｌ）をゆっくり添加して、一晩撹拌した。得られた溶液に水（２Ｌ）を加え、ＤＣＭで抽出した。水相が中性になるまで、飽和したＮａＨＣＯ３水溶液で有機相を洗浄した後、更に塩水で洗浄し、無水ＮａＳＯ４で乾燥した。有機相を濾過し，濾液を真空中で蒸発させて、ＡＰＳＮ１３Ｂ−３を８７１ｇ得た。収率１００％。この材料を更に精製せず、次の反応に使用した。
【００６６】
段階４  ＡＰＳＮ１３Ｂ−４の合成
0005972986.tif 000008
【００６７】
４５℃で、ＡＰＳＮ１３Ｂ−３（８７１ｇ、１．６ｍｏｌ）の酢酸（５Ｌ）溶液に、臭化水素酸（３０ｍｌ）の酢酸（４０％）溶液を加えた後、臭素（２５６ｇ）の酢酸（７００ｍｌ）溶液をゆっくり添加した。得られた混合物を４５℃で３０分撹拌した。室温で、臭素（５１２ｇ）の酢酸（１．３Ｌ）溶液をゆっくり添加して、一晩撹拌し続けた。反応終了後、得られた混合物を冷水（３５Ｌ）に注いだ。得られた固形物を回収して、飽和亜硫酸ナトリウム溶液で洗浄し、真空乾燥することにより、黄色の固形物であるＡＰＳＮ１３Ｂ−４を８４１ｇ得た。収率９７％。
ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：５４１［Ｍ＋Ｈ］＋
【００６８】
段階５  ＡＰＳＮ１３Ｂ−５の合成
0005972986.tif 000009
【００６９】
ＡＰＳＮ１３Ｂ−４（８４０ｇ、１．５６ｍｏｌ）及びＫＯＨ（２６３ｇ、４．７ｍｏｌ）のＥｔＯＨ（４．５Ｌ）溶液を３０分還流加熱した。真空中でＥｔＯＨを除いた後、得られた混合物を６Ｎ  ＨＣｌ水溶液により酸性化した。水相を酢酸エチル（３Ｌ）で抽出した。得られた有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液及び塩水で洗浄し、無水ＮａＳＯ４で乾燥した。有機相を濾過し、濾液を真空中で蒸発させて、ＡＰＳＮ１３Ｂ−５を９２８ｇ得た。収率１００％。
ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：４９９［Ｍ＋Ｈ］＋
【００７０】
段階６  ＡＰＳＮ１３Ｂ−６
0005972986.tif 000010
【００７１】
氷浴したＡＰＳＮ１３Ｂ−５（９２７ｇ、１．８ｍｏｌ）のアセトン（５Ｌ）溶液にジョーンズ試薬（４００ｍｌ）を少しずつ滴下した。ＴＬＣでＡＰＳＮ１３Ｂ−５を検出できなくなるまで、得られた混合物を室温で撹拌した。アセトンを除いた後、得られた混合物に水を添加した。得られた水混合物をＤＣＭで抽出した。得られた有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液及び塩水で洗浄し、無水ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過した。濾液を真空中で蒸発させて、粗製のＡＰＳＮ１３Ｂ−６を得た。ペトロールと酢酸エチル中で再結晶することによって、純粋なＡＰＳＮ１３Ｂ−６を４９８ｇ得た。収率５４％。
ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：４９７［Ｍ＋Ｈ］＋
【００７２】
段階７  ＡＰＳＮ１３Ｂ−７の合成
0005972986.tif 000011
【００７３】
ＡＰＳＮ１３Ｂ−６（４９６ｇ、１ｍｏｌ）の無水トルエン（２Ｌ）溶液にギ酸エチル（１８５ｇ、２．５ｍｏｌ）とＣＨ３ＯＮａ（２１６ｇ、４ｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。次に、得られた混合物を酢酸エチル（１Ｌ）で希釈し、５％  ＨＣｌ水溶液で洗浄した（３回）。水相を酢酸エチルで再抽出し、合併した有機相を塩水で洗浄し、無水ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過した。濾液を真空中で蒸発させて、ＡＰＳＮ１３Ｂ−７を４９７ｇ得た。収率９５％。
ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：５２５［Ｍ＋Ｈ］＋
【００７４】
段階８  ＡＰＳＮ１３Ｂ−８の合成
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【００７５】
ＡＰＳＮ１３Ｂ−７（４９６ｇ、０．９４ｍｏｌ）のＥｔＯＨ（２．５Ｌ）及び水（２００ｍｌ）溶液に、ヒドロキシルアミン塩酸塩（９８ｇ、１．４ｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を２時間還流加熱した。得られた混合物を真空中で濃縮し、水（２Ｌ）を添加した。得られた混合物をＥＡで抽出した（３回）。合併した有機相を水及び塩水で洗浄し、無水ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過した。濾液を真空中で蒸発させて、ＡＰＳＮ１３Ｂ−８を４５３ｇ得た。収率９２％。
ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：５２２［Ｍ＋Ｈ］＋
【００７６】
段階９  ＡＰＳＮ１３Ｂ−９の合成
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【００７７】
氷浴したＡＰＳＮ１３Ｂ−８（４５２ｇ、０．８６ｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１．５Ｌ）溶液にＣＨ３ＯＮａ（５６ｇ、１．０４ｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。次に、得られた混合物を真空中で濃縮し、酢酸エチル（２Ｌ）を加えた。得られた混合物を５％  ＨＣｌ水溶液で洗浄した（３回）。水相をＥＡで再抽出し、合併した有機相を塩水で洗浄し、無水ＮａＳＯ４で乾燥し、濾過した。濾液を真空中で蒸発させて、ＡＰＳＮ１３Ｂ−９を４２９ｇ得た。収率９５％。
ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：５２２［Ｍ＋Ｈ］＋
【００７８】
段階１０  ＡＰＳＮ１３Ｂ−１０（式Ｉに示される化合物１）の合成
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【００７９】
トルエンに溶解させたＡＰＳＮ１３Ｂ−９（４２８ｇ、０．８２ｍｏｌ）及びＤＤＱ（２０５ｇ、０．９０ｍｏｌ）の混合物を一晩還流加熱した。濾過によって不溶性成分を除いた後、濾液を真空中で蒸発させて、粗製の固形物を得た。得られた固形物からフラッシュカラムクロマトグラフィーによってＡＰＳＮ１３Ｂ−１０を３４１ｇ得た、収率８０％。生成物を酢酸エチル及び石油エーテル中で再結晶によりさらに純化し、化学的に純粋な生成物を得た。最終生成物における不純物は最大限０．１％以下である。
ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：５２０［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８．０４（１Ｈ，Ｓ），５．９６（１Ｈ，Ｓ），４．１７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ），２．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ），２．０４−０．０７（２１Ｈ，ｍ）．
【００８０】
実施例２  式Ｉの化合物の結晶形Ｉの製造
実施例１で製造した式Ｉの化合物を室温でヘプタン溶媒に溶解させ、自然沈殿によって所望の結晶形Ｉを得た。該結晶形Ｉは融点が１７４−１７７℃であった。
【００８１】
表１は図１で示される粉末Ｘ線回折パターンを要約したものである。
【表１】
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【００８２】
実施例３  式Ｉの化合物の結晶形ＩＩの製造
実施例１の方法で製造した過量の式Ｉの化合物のスラリー懸濁液を、室温又は５０℃で、酢酸エチル／ヘプタンの混合溶媒（重量比或いは容量比は１：１０の割合である）中で少なくとも４８時間撹拌し、結晶形ＩＩを得た。該結晶形ＩＩの融点は２０９−２１２℃であった。
【００８３】
表２は図２で示される粉末Ｘ線回折パターンを要約したものである。
【表２】
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【００８４】
実施例４  式Ｉの化合物のガラス質の固形物形態の製造
実施例１の方法で製造した過量の式Ｉの化合物のスラリー懸濁液を、室温又は５０℃で、ジクロロメタン溶媒に溶解させ、次いで溶媒を蒸発させて、式Ｉの化合物的ガラス質の固形物形態を得た。該ガラス質の固形物形態のＴｇは約５２℃±１０℃であった。
【００８５】
図３は式Ｉの化合物のガラス質の固形物形態の粉末Ｘ線回折パターンを示す。図４はガラス質の固形物形態の熱流量（ｗ／ｇ）図を示す。
【００８６】
実施例５  式Ｉの化合物の多形体の予備薬物動態学
ＤＭＳＯ−クリンパー（Ｃｒｅｍｐｈｏｒ）−ＰＢＳ（重量比或いは容量比が１：１：８である）に溶解させた式Ｉの化合物（ＣＤＤＯエチルエステル）の三つの多形体とメチル２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアナ−１，９（１１）ジエン−２８−オエート（ＣＤＤＯメチルエステル）の溶液を、１０ｍｇ／ｋｇで雌性ＣＤ−１マウスに注射した。投与から０．０８３、０．２５、０．５、１、２、４、８及び２４時間後の血液試料を採取した。コントロール血液に加えた化合物を標準品として、ＨＰＬＣ／ＭＳで血液試料中のレベルを定量化した。
【００８７】
ＰＫの結果を表３に示す。式Ｉの化合物（ＣＤＤＯエチルエステル）の三つの多形体の全身暴露は、ＣＤＤＯメチルエステルより高かった。順序は下記である：ＣＤＤＯエチルエステルのガラス質固形物形態＞ＣＤＤＯエチルエステルの結晶形ＩＩ＞ＣＤＤＯエチルエステルの結晶形Ｉ＞ＣＤＤＯメチルエステル。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
実施例６  結晶形の安定性測定
実施例３で製造した式Ｉの化合物の結晶形ＩＩを、２５℃／６０％Ｒ．Ｈ．及び４０℃／７５％Ｒ．Ｈ．でテストした。ＸＲＤ図は全ての試料の間に著しい変化がなかた。本発明の他の多形体は同様に使用した。該実施例において、本発明の他の多形体と比べて、式Ｉの化合物の結晶形ＩＩは最も熱力学的な安定であることを示した。
【００９０】
実施例７  ガラス質の固形物形態の安定性測定
実施例４で製造した式Ｉの化合物のガラス質の固形物形態を、２５℃／６０％Ｒ．Ｈ．及び４０℃／７５％Ｒ．Ｈ．で１週間テストした。ＸＲＤ図は全ての試料の間に著しい変化がなかた。
【００９１】
実施例８  式Ｉの化合物の結晶形ＩＩで処理したＲＡＷ２６４．７細胞におけるＮＯの検出
検出の要約
ＲＡＷ２６４．７細胞の培養
１．１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を使用して、３７℃、５％ＣＯ２下で、ＲＡＷ２６４．７細胞を培養した。
２．顕微鏡の下で培養物を観察して、コンフルエンスと評価し、細菌と真菌の汚染物がないことを確認した。
３．使用した培地を除いた。
４．予熱したＤ−ＰＢＳで単細胞層を洗浄した。
５．ピペットにより、３ｍｌトリプシン／ＥＤＴＡを洗浄した単細胞層へ移し、フラスコを回転させて、単細胞層をトリプシンで覆った。
６．顕微鏡で細胞を検査し、全ての細胞が離れ、浮遊していることを確認した。
７．新鮮な血清を含んだ少量の培地で細胞を再懸濁し、トリプシンを失活させた。
８．室温で１０００ｒｐｍ、５分間遠心分離をすることによって、細胞を回収した。
９．３７℃、５％ＣＯ２で細胞をインキュベートした。
【００９２】
ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＮＯの誘導
１．細胞を９６穴細胞培養プレートに１穴あたり１×１０５個で播種した。
２．３７℃、５％ＣＯ２で細胞を２時間インキュベートした後、吸引により非接着性細胞を除き、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮ−γ及び希釈した化合物を含む新鮮な完全培地を添加した。
３．３７℃、５％ＣＯ２で細胞を更に４８時間インキュベートした。
【００９３】
ＲＡＷ細胞におけるＮＯを測定する
１．１０００ｒｐｍ、５分間遠心分離することにより、上清を回収した。
２．試料に使われたマトリックス或いはバッファーを使用して、０．１Ｍ亜硝酸塩標準品を１：１，０００の割合で希釈した、濃度が１００μＭである亜硝酸塩溶液を１ｍｌ調製した。
３．濃度が１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６及び０μＭである亜硝酸塩標準溶液を、１穴あたり５０μｌ調製した。
４．室温で、スルファニルアミド溶液とＮＥＤ溶液を平衡させた（１５−３０分）。
５．１穴あたり５０μｌ試料を加え、２連で試験を行った。
６．多重チャンネルのピペットで、５０μｌスルファニルアミド溶液を全ての試料と希釈系列の亜硝酸塩標準溶液を含んだ穴に分配した。
７．光を避けて、室温で５−１０分間インキュベートした。
８．多重チャンネルのピペットで、５０μｌＮＥＤ溶液を全ての穴に分配した。
９．光を避けて、室温で５−１０分間インキュベートした。すぐに紫色／マゼンタになった。
１０．３０分以内に、フィルターが５２０ｎｍから５５０ｎｍまでのマイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。
【００９４】
図５は、式Ｉの化合物（ＣＤＤＯエチルエステル）の結晶形ＩＩの、マウスマクロファージ１７におけるＩＦＮ−γにより誘導される一酸化窒素の生成の阻害活性（ＩＣ５０（ｎＭ））を示す。式Ｉの化合物（ＣＤＤＯエチルエステル）の結晶形ＩＩのＩＣ５０は３４ｎＭであった。式Ｉの化合物（ＣＤＤＯエチルエステル）のガラス質の固形物形態のＩＣ５０は３２ｎＭであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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