(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における末梢免疫反応を調節するための免疫抑制細胞を含む組成物であって；ここで前記免疫抑制細胞が以下：
（ａ）間葉系幹細胞の培養物を用意し；
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド（前記ポリヌクレオチドが、Ｎｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない）とを接触させ；
（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し；及び
（ｄ）ステップ（ｃ）の選択された細胞を、選択なしでさらに培養すること
により得られ；ここで前記末梢免疫反応の調節が以下：
（ｉ）末梢Ｔ細胞活性化の抑制、
（ｉｉ）末梢ヘルパーＴ細胞機能の抑制、
（ｉｉｉ）末梢調節性Ｔ細胞（ＴｒｅｇＳ）の集団の拡大、
（ｉｖ）炎症性サイトカインの末梢産生の減少、
（ｖ）抗炎症性サイトカインの末梢産生の刺激、
（ｖｉ）末梢単球の樹状細胞への分化の阻害、及び
（ｖｉｉ）樹状細胞の成熟の阻害
の１つ以上から選択される、組成物。
【請求項２】
前記末梢免疫反応が、末梢炎症性反応であり、同種異系移植、虚血又は壊死に起因する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記末梢免疫反応の調節が、末梢Ｔ細胞活性化の抑制及び／又は末梢ヘルパーＴ細胞機能の抑制である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記末梢Ｔ細胞活性化が、Ｔ細胞によるＣＤ６９の発現、ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖、及び／又はＨＬＡ‐ＤＲの発現を含み；そして前記末梢ヘルパーＴ細胞機能が、サイトカイン分泌及び／又は関節リウマチの病状に関係する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記末梢免疫反応の調節が、末梢調節性Ｔ細胞（Ｔregｓ）の集団の拡大である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記末梢免疫反応の調節が、炎症性サイトカインの末梢産生の減少である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記サイトカインが、インターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）であり、及びＴ細胞によって産生される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記サイトカインが、腫瘍壊死因子‐アルファ（ＴＮＦ‐α）であり、及び単球によって産生される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記末梢免疫反応の調節が、抗炎症性サイトカインの末梢産生の刺激である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記サイトカインが、インターロイキン‐１０（ＩＬ‐１０）であり、及びヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、又は単球によって産生される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記末梢免疫反応の調節が、末梢単球の樹状細胞への分化の阻害及び／又は樹状細胞の成熟の阻害である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記成熟が、前記樹状細胞によるＣＤ８６の発現の増加を伴う、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
移植片対宿主病を減少するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
移植による拒絶反応を阻害するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
末梢自己免疫疾患を処置するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記末梢自己免疫疾患が、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、狼瘡及び１型糖尿病からなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
対象における末梢免疫反応を調節するためのＮｏｔｃｈ細胞内ドメインを発現している間葉系幹細胞を含む組成物であって、ここで前記末梢免疫反応の調節が、以下：
（ｉ）末梢Ｔ細胞活性化の抑制、
（ｉｉ）末梢ヘルパーＴ細胞機能の抑制、
（ｉｉｉ）末梢調節性Ｔ細胞（ＴｒｅｇＳ）の集団の拡大、
（ｉｖ）炎症性サイトカインの末梢産生の減少、
（ｖ）抗炎症性サイトカインの末梢産生の刺激、
（ｖｉ）末梢単球の樹状細胞への分化の阻害、及び
（ｖｉｉ）樹状細胞の成熟の阻害
の１つ以上から選択される、組成物。
【請求項１８】
前記末梢免疫反応が、末梢炎症性反応であり、同種異系移植、虚血又は壊死に起因する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記末梢免疫反応の調節が、末梢Ｔ細胞活性化の抑制及び／又は末梢ヘルパーＴ細胞機能の抑制である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記末梢Ｔ細胞活性化が、Ｔ細胞によるＣＤ６９の発現、ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖、及び／又はＨＬＡ‐ＤＲの発現を含み；そして前記末梢ヘルパーＴ細胞機能が、サイトカイン分泌及び／又は関節リウマチの病状に関係する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記末梢免疫反応の調節が、末梢調節性Ｔ細胞（Ｔregｓ）の集団の拡大である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２２】
前記末梢免疫反応の調節が、炎症性サイトカインの末梢産生の減少である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２３】
前記サイトカインが、インターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）であり、及びＴ細胞によって産生される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記サイトカインが、腫瘍壊死因子‐アルファ（ＴＮＦ‐α）であり、及び単球によって産生される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記末梢免疫反応の調節が、抗炎症性サイトカインの末梢産生の刺激である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２６】
前記サイトカインが、インターロイキン‐１０（ＩＬ‐１０）であり、及びヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、又は単球によって産生される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記末梢免疫反応の調節が、末梢単球の樹状細胞への分化の阻害及び／又は樹状細胞の成熟の阻害である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２８】
前記成熟が、前記樹状細胞によるＣＤ８６の発現の増加を伴う、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
移植片対宿主病を減少するための、請求項１７に記載の組成物。
【請求項３０】
移植による拒絶反応を阻害するための、請求項１７に記載の組成物。
【請求項３１】
末梢自己免疫疾患を処置するための、請求項１７に記載の組成物。
【請求項３２】
前記末梢自己免疫疾患が、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、狼瘡及び１型糖尿病からなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、２０１１年４月６日に出願された米国仮特許出願第６１／５１６，６３７号及び２０１１年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／５４１，２４８号に基づく優先権を主張し、その開示は、すべての目的のために、本明細書全体において参照として組み込まれる。
【０００２】
政府支援に関する陳述
適用なし。
【０００３】
本開示は、免疫調節（例えば、免疫抑制）の分野である。
【背景技術】
【０００４】
脊椎動物における末梢（すなわち、非ＣＮＳ）免疫は、２つの系：自然免疫系及び適応免疫系によって媒介される。自然免疫系は、損傷及び／又は感染に対して、早期、非特異的反応を提供する。一方、適応免疫系は、損傷又は感染の過程の後半に活用され、そして侵入抗原体に特異的である。適応免疫系が、脊椎動物においてのみ活動性である一方で、より進化的に古い自然免疫系は、植物、無脊椎動物及び脊椎動物において活動性である。
【０００５】
上記のように、自然免疫系は、感染直後に感染部位で活動性になり、そして感染性病原体に対する事前暴露に依存しない。従って、それは、任意の特定の病原体に特異的でない一連の一般的な防御機構を提供する。自然免疫系の細胞要素は、マクロファージ、樹状細胞、好中球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。自然免疫系高分子成分デフェンシンペプチド及び補体系が挙げられる。自然免疫のさらなる要素は、感染に対する物的障壁（例えば、皮膚の角質化、上皮細胞、胃酸及び多くの上皮組織から分泌される粘液の間の密着結合）及び細胞固有の反応、例えば、貪食（場合により、貪食された物質のリソソーム融合と一緒に）及び２本鎖ＲＮＡの分解が挙げられる。
【０００６】
自然免疫系の活性化は、一部分において、病原体関連分子、例えば、Ｎ‐ホルミルメチオニン含有ポリペプチド、細胞壁ペプチドグリカン、細菌の鞭毛、リポ多糖、テイコ酸、及び真菌特異的分子、例えば、マンナン、グルカン及びキチンの認識によって媒介される。また、微生物に共通する特定の核酸配列（例えば、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド）は、自然免疫反応を引き起こすことができる。そのような病原体関連免疫刺激物質の認識は、マクロファージ、好中球及び／樹状細胞による病原体の炎症反応及び貪食の増加をもたらす。
【０００７】
上記の特定の病原体関連免疫刺激物質は、自然免疫系細胞の表面上のパターン認識受容体によって認識することができる病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）と呼ばれる繰り返しパターンで生じる。これらの受容体は、補体系の可溶性メンバー及び膜結合受容体、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体ファミリー（ＴＬＲｓ）及びいわゆるＮＯＤタンパク質のメンバーが挙げられる。膜結合受容体は、貪食を刺激し、そしてさまざまな自然及び適応免疫反応に関与している遺伝子発現プログラムを活性化することができる。
【０００８】
最終的に、自然免疫系は、一部分において、適応免疫系の細胞の増殖及び分化を刺激する細胞外シグナル伝達分子を分泌することによって、及び適応免疫系の細胞に抗原を加工しそして提示することによって適応免疫を活性化することに関与する。
【０００９】
適応免疫系は、自然免疫系と対照的に、感染直後に活性化せず、そして病原体に対して特異的な、長期反応をもたらす。適応免疫系の活性化は、損傷部位ではなく、リンパ系器官で起こり、そして自然免疫系の成分による抗原の提示に依存して適応免疫系の細胞を活性化する。適応免疫系の主要な細胞は、抗体を合成し分泌する、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）及びＴリンパ球（Ｔ細胞）である。
【００１０】
Ｔ細胞の３つの主要なクラス：細胞傷害性、ヘルパー及び制御（調節）性Ｔ細胞がある。細胞傷害性Ｔ細胞は、感染した宿主細胞を破壊することができる。ヘルパーＴ細胞は、サイトカインを分泌することにより及び／又は多数の異なる共刺激（ｃｏ‐ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）分子の１つの表面発現により、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の活性化に関与する。２つの種類のヘルパーＴ細胞があり：ＴH１細胞は、マクロファージ、傷害性Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化に関与して、細胞内病原体に対する免疫を提供し、そしてマクロファージ‐活性化サイトカインインターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）及び腫瘍壊死因子‐アルファ（ＴＮＦ‐α）を分泌する。ＴH１細胞はまた、炎症反応を刺激することができる。ＴH２細胞は、主に細胞外病原体に反応して、Ｂ細胞の活性化を促進して抗体を産生し、そしてサイトカインインターロイキン‐４（ＩＬ‐４）及びインターロイキン‐１０（ＩＬ‐１０）を分泌する。未感作ヘルパーＴ細胞のＴH１細胞への成長は、インターロイキン‐１２（ＩＬ‐１２）によって刺激され；一方、樹状細胞によるジャグド（Ｊａｇｇｅｄ）タンパク質の病原体誘導発現は、未感作ヘルパーＴ細胞を誘導して、ＩＬ‐４を産生するＴH２細胞を生じ、そしてそれは、Ｂ細胞による抗体産生を刺激する。調節性Ｔ細胞（Ｔregｓ）は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及び樹状細胞の機能を阻害し、そしてＦｏｘｐ３転写因子の発現が独特である。従って、ヘルパーＴ細胞及び調節性Ｔ細胞の間の相互作用が、宿主に過度の損傷を与えることなく、侵入する病原体を除去するために十分な活性を伴って、免疫反応を適度なバランスに保つために役立つ。
【００１１】
記憶細胞として公知の適応免疫系におけるリンパ球の種類は、感染及び除去の後、病原体に対する受容体を保持し、同じ病原体のその後の暴露に対してより迅速な適応免疫反応を備えることを可能にし、そして多くの感染症に対して天然又はワクチン接種誘導免疫の基礎を提供する。対照的に、自然免疫系は、そのような免疫記憶を保有しない。
【００１２】
Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）を発現するプラスミドでトランスフェクトされた、間葉系幹細胞（ＭＳＣ、また「骨髄幹細胞」又は「骨髄接着性幹細胞（marrow adherent stem cell）」として公知である）は、中枢及び末梢神経系の多数の疾患及び障害の処置のために有用である。例えば、米国特許第７，６８２，８２５号（２０１０年３月２３日）；米国特許出願公開第２００６／０２１６２７６号（２００６年９月２８日）；米国特許出願公開第２０１０／００３４７９０号（２０１０年２月１１日）；米国特許出願公開第２０１０／０３１０５２３号（２０１０年１２月９日）；国際公開第０８／１０２４６０号（２００８年８月２８日）；Yasuharaら、(2009) Stem Cells and Development 18: 1501-1513及びGlavaski-Joksimovicら、(2009) Cell Transplantation 18: 801-814を参照。
【００１３】
これらの細胞（ＳＢ６２３細胞として公知）の損傷神経組織を助ける能力は、一部分では、様々な栄養因子のそれらの分泌及び様々な細胞外マトリックス成分のそれらの同化と関連する。例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２６６５５４号（２０１０年１０月２１日）及び米国特許出願公開第２０１０／０３１０５２９号（２０１０年１２月９日）を参照。
【００１４】
現在の細胞移植治療は、例えば、移植細胞に対する宿主末梢免疫反応を含む重大な不利益を有する。また、炎症は、多くの神経変性疾患、例えば、パーキンソン病及び多発性硬化症の特徴である。Villosladaら、(2008) Clin. Immunol. 128: 294-305を参照。ＭＳＣは、抗原提示細胞の産生を阻害すること及びヘルパーＴ細胞のサイトカインプロファイルを変化させることを含む機構を通じて、末梢免疫活性を低減することが報告されている。Kongら、(2009) J. Neuroimmunol. 207: 83-91を参照。しかしながら、ＭＳＣは、再生能を制限され、エクスビボ操作の後に、老化現象を示す。Wagnerら、(2008) PLoS One 3: e2213; Jinら、(2010) Biochem Biophys Res Commun. 391: 1471-1476を参照。老化細胞が、組織再生のために有益であろう多数のサイトカインを分泌するが、一般的な老化細胞分泌プロファイルは、炎症誘発性である。Rodierら、(2009) Nature Cell Biol. 11: 973-979; Coppeら、(2008) PLoS Biol. 6: 2853-2868; Freundら、(2010) Trends Mol. Med. 16(5): 238-246を参照。
【００１５】
これら及び他の理由のために、宿主末梢免疫反応を誘発せず、及び／又は炎症、及び他の免疫反応を低減する細胞移植のための方法及び組成物の必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者等は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列でトランスフェクトしたＭＳＣ及びそれらの子孫（すなわち、ＳＢ６２３細胞）の培養物内に、老化細胞の集団を同定した。ＳＢ６２３細胞が、多数の中枢神経系障害を処置することができることが示されているが、本出願は、多数の末梢免疫機能を調節するＳＢ６２３の驚くべき能力を開示する。例えば、ＳＢ６２３細胞は、同種異系及び異種の両方の混合リンパ球反応におけるヒトＴ細胞の増殖を阻害し、Ｔ細胞によるＩＬ‐１０産生を刺激し、そして樹状細胞への単球の分化を阻止することができる。ＳＢ６２３細胞はまた、親ＭＳＣと比較して、樹状細胞の成熟を阻害し、そしてＳＢ６２３細胞は、共刺激分子、ＣＤ８６の表面発現のより大きな減少からも明らかなように、樹状細胞成熟に対してより大きな阻害を与える。ＳＢ６２３細胞はまた、Ｔ細胞集団のサイトカインプロファイルを、炎症誘発性のものから抗炎症性のものに変更することができる。ＳＢ６２３細胞のこれらの特性は、老化細胞が炎症誘発性サイトカインを分泌することを報告する研究を考慮すると、さらに驚くべきことでありそして予測しないことである。Orjaloら、(2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 17031-17036を参照。
【００１７】
従って、ＳＢ６２３細胞、及び／又はそれらの老化細胞の亜集団は、以下の実施態様において例示されるように、多数の治療方法において有用である。
【００１８】
１．対象における末梢免疫抑制のための方法であって、前記方法がＳＢ６２３細胞の有効量を前記対象に投与することを含み；ここで前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を用意し；（ｂ）前記ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触し；（ｃ）前記ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し；及び（ｄ）前記ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００１９】
２．対象における末梢炎症反応を阻害するための方法であって、前記方法がＳＢ６２３細胞の有効量を前記対象に投与することを含み；ここで前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を用意し；（ｂ）前記ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触し；（ｃ）前記ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し；及び（ｄ）前記ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００２０】
３．前記末梢炎症反応が、同種異系の移植、虚血又は壊死に起因する、実施態様２に記載の方法。
【００２１】
４．対象における末梢Ｔ細胞活性化を抑制するための方法であって；前記方法がＳＢ６２３細胞の有効量を前記対象に投与することを含み；ここで前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を用意し；（ｂ）前記ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触し；（ｃ）前記ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し；及び（ｄ）前記ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００２２】
５．前記末梢Ｔ細胞活性化が、前記Ｔ細胞によるＣＤ６９及び／又はＨＬＡ‐ＤＲの発現を含む、実施態様４に記載の方法。
【００２３】
６．前記末梢Ｔ細胞活性化が、前記Ｔ細胞のＣＤ４+の増殖を含む、実施態様４に記載の方法。
【００２４】
７．対象における末梢ヘルパーＴ細胞の機能を抑制するための方法であって；前記方法がＳＢ６２３細胞の有効量を前記対象に投与することを含み；ここで前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を用意し；（ｂ）前記ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触し；（ｃ）前記ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し；及び（ｄ）前記ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００２５】
８．前記末梢ヘルパーＴ細胞機能がサイトカイン分泌である、実施態様７に記載の方法。
【００２６】
９．前記末梢ヘルパーＴ細胞機能が関節リウマチの病状と関連する、実施態様７に記載の方法。
【００２７】
１０．対象における末梢調節性Ｔ細胞（Ｔregｓ）の集団を拡大するための方法であって；前記方法がＳＢ６２３細胞の有効量を前記対象に投与することを含み；ここで前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を用意し；（ｂ）前記ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触し；（ｃ）前記ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し；及び（ｄ）前記ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００２８】
１１．対象におけるサイトカインの末梢産生を調節するための方法であって；前記方法がＳＢ６２３細胞の有効量を前記対象に投与することを含み；ここで前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を用意し；（ｂ）前記ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触し；（ｃ）前記ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し；及び（ｄ）前記ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００２９】
１２．前記サイトカインが炎症誘発性サイトカインであり、及び前記サイトカインの産生が減少する、実施態様１１に記載の方法。
【００３０】
１３．前記サイトカインがＴ細胞により産生される、実施態様１２に記載の方法。
【００３１】
１４．前記サイトカインがインターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）である、実施態様１３に記載の方法。
【００３２】
１５．前記サイトカインが単球により産生される、実施態様１２に記載の方法。
【００３３】
１６．前記サイトカインが腫瘍壊死因子‐アルファ（ＴＮＦ‐α）である。実施態様１５に記載の方法。
【００３４】
１７．前記サイトカインが抗炎症性サイトカインであり、及び前記サイトカインの産生が刺激される、実施態様１１に記載の方法。
【００３５】
１８．前記サイトカインがインターロイキン‐１０（ＩＬ‐１０）である、実施態様１７に記載の方法。
【００３６】
１９．前記サイトカインがＴ細胞又は単球により産生される、実施態様１８に記載の方法。
【００３７】
２０．前記Ｔ細胞がヘルパーＴ細胞である、実施態様１９に記載の方法。
【００３８】
２１．前記ヘルパーＴ細胞がＴH１細胞である、実施態様２０に記載の方法。
【００３９】
２２．前記サイトカインが調節性Ｔ細胞により産生される、実施態様１９に記載の方法。
【００４０】
２３．前記調節性Ｔ細胞がＴR１細胞である、実施態様２２に記載の方法。
【００４１】
２４．対象における末梢単球の樹状細胞への分化を阻害するための方法であって；前記方法がＳＢ６２３細胞の有効量を対象に投与することを含み；ここで前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を用意し；（ｂ）前記ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触し；（ｃ）前記ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し；及び（ｄ）前記ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００４２】
２５．対象における末梢樹状細胞の成熟を阻害するための方法であって；前記方法がＳＢ６２３細胞の有効量を対象に投与することを含み；ここで前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を用意し；（ｂ）前記ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触し；（ｃ）前記ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し；及び（ｄ）前記ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００４３】
２６．前記成熟が樹状細胞によるＣＤ８６の発現の増加を含む、実施態様２５に記載の方法。
【００４４】
２７．対象におけるＧＶＨＤ（ｇｒａｆｔ ｖｅｒｓｕｓ ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）を処置するための方法であって；前記方法がＳＢ６２３細胞の有効量を対象に投与することを含み；ここで前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を用意し；（ｂ）前記ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触し；（ｃ）前記ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し；及び（ｄ）前記ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００４５】
２８．対象における移植による拒絶反応を阻害するための方法であって；前記方法がＳＢ６２３細胞の有効量を対象に投与することを含み；ここで前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を用意し；（ｂ）前記ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触し；（ｃ）前記ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し；及び（ｄ）前記ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００４６】
２９．対象における末梢自己免疫疾患を処置するための方法であって；前記方法がＳＢ６２３細胞の有効量を対象に投与することを含み；ここで前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を用意し；（ｂ）前記ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触し；（ｃ）前記ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し；及び（ｄ）前記ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００４７】
３０．前記末梢自己免疫疾患が、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、狼瘡及び１型糖尿病からなる群から選択される、実施態様２９に記載の方法。
【００４８】
３１．前記対象が実験動物である、実施態様１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【００４９】
３２．前記対象がヒトである、実施態様１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、フローサイトメトリーによる、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞におけるＣＦＳＥ希釈の測定を示す。
【図２】図２は、培養３日後のトリパンブルー排除により決定される、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の培養物における細胞数の変化を示す。
【図３】図３は、ＭＳＣ及びＳ６２３細胞の培養物のヨウ化プロピジウム染色の結果を示す（図３Ａ及び３Ｂ）。図３Ａは、代表的なＦＡＣＳデータを示す。「Ｍ１」標識ピークは、休止期（Ｇ０／Ｇ１）細胞を示す。図３Ｂは、図３ＡにおけるＭ１ピークの面積を測定することにより決定される、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞に関する、細胞周期の休止期における細胞の割合を示す。
【図４】図４は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞における、ｐ１６Ｉｎｋ４Ａレベルの測定を示す。
【図５】図５は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞における、特定の表面マーカーのレベルを示す。
【図６】図６は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞における、ＣＤ５４発現の測定を示す。
【図７】図７は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞における、特定のサイトカインのレベルを示す。
【図８】図８は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞における、形質変換成長因子ベータ‐１（ＴＧＦ‐β‐１）及び血管内皮増殖因子‐Ａ（ＶＥＧＦ‐Ａ）のレベルを示す。
【図９】図９は，同種異系ＭＬＲ（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）における、ＳＢ６２３細胞及びＭＳＣのＴ細胞活性化に対する影響を示す（図９Ａ及び９Ｂ）。図９Ａは、ＣＦＳＥ及びフィコエリトリン標識抗ＣＤ６９でゲーティングした、代表的なＦＡＣＳトレースを示し、非刺激のヒトＴ細胞（対照）（左上パネル、「‐」で示す）；同種異系ＰＢＭＣにより刺激したヒトＴ細胞（右上パネル、「ＭＬＲ」で示す）；１０4ＭＳＣを伴う以前に述べたようなＭＬＲ（左下パネル、「ＭＬＲ＋ＭＳＣ」で示す）及び１０4ＳＢ６２３細胞を伴う以前に述べたようなＭＬＲ（右下パネル、「ＭＬＲ＋ＳＢ６２３」で示す）である。図９Ｂは、ＭＬＲ培養物におけるＣＤ６９発現の定量を示す。非刺激のＴ細胞培養物（対照）を、「血清」で示し；混合リンパ球反応におけるＰＢＭＣ刺激Ｔ細胞を、「ＭＬＲ」で示し；間葉系幹細胞の存在下での以前に述べたような混合リンパ球反応を、「ＭＳＣ」で示し；及びＳＢ６２３細胞の存在下での以前に述べたような混合リンパ球反応を、「ＳＢ６２３」で示す。「ＭＳＣ」及び「ＳＢ６２３」の値は、異なるドナー由来のＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞をそれぞれ含む、３つの培養物の平均である。
【図１０】図１０は、ＣＦＳＥ希釈を測定することにより定量した、同種異系ＭＬＲにおけるＴ細胞の増殖率の比較を示す（図１０Ａ及び１０Ｂ）。図１０Ａは、代表的なＦＡＣＳトレースを示し、非刺激ヒトＴ細胞（対照）（左上パネル、「Ｔ細胞単独」で示す）；同種異系ＰＢＭＣにより刺激したヒトＴ細胞（右上パネル、「ＭＬＲ」で示す）；１０4ＭＳＣ伴う以前に述べたようなＭＬＲ（左下パネル、「ＭＬＲ＋ＭＳＣ」で示す）及び１０4ＳＢ６２３細胞を伴う以前に述べたようなＭＬＲ（右下パネル、「ＭＬＲ＋ＳＢ６２３」で示す）である。図１０Ｂは、ＭＬＲ培養物におけるＣＳＦＥ希釈の定量を示す。培養物の組成は、図１０Ａに示されている通りである。
【図１１】図１１は、異なる培養条件下でのＨＬＡ‐ＤＲ発現の比較を示す。非刺激Ｔ細胞培養物（対照）を「血清」で表し；混合リンパ球反応におけるＰＢＭＣ刺激Ｔ細胞を「ＭＬＲ」で表し；間葉系幹細胞の存在下での混合リンパ球反応を「ＭＳＣ」で表し；及びＳＢ６２３細胞の存在下での混合リンパ球反応を「ＳＢ６２３」で表す。「ＭＳＣ」及び「ＳＢ６２３」の値は、異なるドナーに由来するＭＳＣ又はＳＢ６２３をそれぞれ含む、３つの培養物の平均である。
【図１２】図１２は、異種リンパ球刺激反応における、ＳＢ６２３細胞及びＭＳＣのＴ細胞増殖に対する影響を示す。増殖をＰＫＨ２６（細胞透過性色素）の希釈により測定した。ＰＫＨ２６を含有するＣＤ３２+Ｔ細胞のパーセンテージを、非刺激Ｔ細胞（「Ｔ細胞単独」）；グリア混合細胞と共培養したＴ細胞（「異種ＭＬＲ」）；グリア混合細胞及び間葉系幹細胞と共培養したＴ細胞（「異種ＭＬＲ＋ＭＳＣ」）並びにグリア混合細胞及びＳＢ６２３細胞と共培養したＴ細胞（異種ＭＬＲ＋ＳＢ６２３」）について測定した。図で示したように、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の調合物を、３つの異なるドナーから得た。
【図１３】図１３は、調節性Ｔ細胞（Ｔregｓ）のマーカーとしてＣＤ４及びＣＤ２５の共発現を使用する、インビトロＴ細胞培養物におけるＴregｓに関するアッセイを示す（図１３Ａ及び１３Ｂ）。図１３Ａは、ＩＬ‐２刺激Ｔ細胞（「Ｔ細胞」）、間葉系幹細胞で７日間共培養したＩＬ‐２刺激Ｔ細胞（「Ｔ細胞＋ＭＳＣ」）及びＳＢ６２３細胞で７日間共培養したＩＬ‐２刺激Ｔ細胞について、ＣＤ４及びＣＤ２５を測定する代表的なＦＡＣＳトレースを示す。図１３Ｂは、５つの異なる対応するＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞のロットの平均ＣＤ４／ＣＤ２５発現レベルを示す。「ドナー１ＰＢＬ」について、ＣＤ４+ＣＤ２５+細胞の有意な増加が、ＭＳＣとの共培養と比較して、ＳＢ６２３細胞との共培養において観察された（ｐ＜０．０５）。
【図１４】図１４は、ＰＥ‐コンジュゲート抗ＦｏｘＰ３抗体で細胞内ＦｏｘＰ３について染色し、続いてフローサイトメトリー分析により分析した、ＩＬ‐２の存在下で培養したＴ細胞におけるＦｏｘＰ３転写因子のレベルを示す（図１４Ａ及び１４Ｂ）。図１４Ａは、ＩＬ‐２の非存在下で培養したＴ細胞（「ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ」で示す）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐２において培養したＴ細胞（「＋ＩＬ‐２」で示す）、上記ＩＬ‐２において培養し及びＭＳＣで共培養したＴ細胞（「＋ＭＳＣ」で示す）、並びに上記ＩＬ‐２において培養し及びＳＢ６２３細胞で共培養したＴ細胞（「＋ＳＢ６２３」で示す）について、代表的なＦＡＣＳトレースを示す。図１４Ｂは、ＩＬ‐２の存在下での培養後（「Ｔ細胞単独」）、ＩＬ‐２の存在下でのＭＳＣでの共培養後（「Ｔ細胞＋ＭＳＣ」）又はＩＬ‐２の存在下でのＳＢ６２３細胞での共培養後（「Ｔ細胞＋ＳＢ６２３」）の、ＦｏｘＰ３発現Ｔ細胞の平均パーセンテージを示す。共培養を、３つの異なる対応するＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞のロットで行った。
【図１５】図１５は、ＩＬ‐２の存在下で培養したＣＤ４+Ｔ細胞における細胞内ＩＬ‐１０レベルの測定結果を示す（図１５Ａ及び１５Ｂ）。図１５Ａは、ＩＬ‐２の存在下で培養したＴ細胞（「Ｔ細胞単独」）、上記のようにＩＬ‐２において培養し及びＭＳＣで共培養したＴ細胞（「Ｔ細胞＋ＭＳＣ」で示す）、並びに上記のようにＩＬ‐２において培養し及びＳＢ６２３細胞で共培養したＴ細胞（「Ｔ細胞＋ＳＢ６２３」で示す）について、代表的なＦＡＣＳトレースを示す。ＩＬ‐１０レベルを示すＡｌｅｘａ ４８８蛍光を、横座標に示す。図１５Ｂは、共培養しないＴ細胞（「Ｔ細胞単独」）と比較した、Ｔ細胞と３つの異なる対応するＭＳＣ（「Ｔ細胞＋ＭＳＣ」）及びＳＢ６２３細胞（「Ｔ細胞＋ＳＢ６２３」）のロットとの共培養におけるＩＬ‐１０陽性細胞の平均パーセンテージを示す。
【図１６】図１６は、ＩＬ‐２の非存在下並びにＰＭＡ及びイオノマイシン非最大限誘導レベルの存在下で培養したＴ細胞におけるサイトカインのレベルを示す（図１６Ａ及び１６Ｂ）。図１６Ａにおいて、インターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）のレベルを、培養前に新たに分離したＴ細胞（「新鮮な細胞」）；他の細胞の非存在下で７日間培養したＴ細胞（「培養対照」）；７日間ＳＢ６２３細胞と共培養したＴ細胞（「ＳＢ６２３」）；及び７日間ＭＳＣと共培養したＴ細胞（「ＭＳＣ」）について示す。図１６Ｂにおいて、インターロイキン‐１０（ＩＬ‐１０）のレベルを、培養前に新たに分離したＴ細胞（「新鮮な細胞」）；他の細胞の非存在下で７日間培養したＴ細胞（「培養対照」）；７日間ＳＢ６２３細胞と共培養したＴ細胞（「ＳＢ６２３」）；及び７日間ＭＳＣと共培養したＴ細胞（「ＭＳＣ」）について示す。「ＭＳＣ」及び「ＳＢ６２３」についての値は、異なるドナー由来のＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞をそれぞれ含む、３つの培養物の平均である。
【図１７】図１７は、ＩＬ‐２３刺激Ｔ細胞におけるＩＬ‐１７のレベルを示す。発現割合を、蛍光抗体でＩＬ‐１７について細胞を染色した後、フローサイトメトリーにより決定した。Ｔ細胞を、示したようにＩＬ‐２３あり又はなしで、及び示したように単独又はＭＳＣ若しくはＳＢ６２３細胞と共培養において培養した。
【図１８】図１８は、７日間の培養又は共培養後の単球培養物におけるＣＤ１ａ及びＣＤ１４のレベルを示す（図１８Ａ及び１８Ｂ）。図１８Ａは、ＣＤ１Ａ及びＣＤ１４について染色した細胞の代表的なＦＡＣＳトレースを示す。単球は、ＣＤ１Ａ+ＣＤ１４+樹状細胞前駆体の集団を含む（左端のパネル）。単球をＩＬ‐４及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下で７日間培養した場合、この樹状細胞前駆体集団は減少し、そしてＣＤ１Ａ+ＣＤ１４-樹状細胞の集団と置き換わる（左から２番目のパネル）。単球を、ＩＬ‐４及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下、ＭＳＣで（左から３番目のパネル）又はＳＢ６２３細胞で（右端のパネル）共培養した場合、ＣＤ１Ａ+ＣＤ１４-樹状細胞集団は減少し、そしてＣＤ１Ａ+ＣＤ１４+前駆体細胞集団が増加する。図１８Ｂは、単球（左端の一対のバー）、ＩＬ‐４及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下で７日間培養した単球（左から2番目の一対のバー）、ＩＬ‐４及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下で７日間、ＭＳＣと共培養した単球（左から３番目の一対のバー）又はＩＬ‐４及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下で７日間、ＳＢ６２３細胞と共培養した単球（右端の一対のバー）について、平均発現データを示す。共培養実験の結果を、３つの異なる対応するＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞のロットから得た。
【図１９】図１９は、ＴＮＦ‐α刺激単球培養物における平均蛍光強度として表されるＣＤ８６のレベルを示す。「対照」で示される培養物は、ＩＬ‐４及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下で５日間、その後ＴＮＦ‐αにおいてさらに４８時間培養したＰＢＭＣを含む。「ＣｓＡあり」で示される培養物は、ＩＬ‐４及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下で５日間、その後ＴＮＦ‐α＋１μｇ／ｍｌのシクロスポリンＡにおいてさらに４８時間培養したＰＢＭＣを含む。「ＭＳＣ」で示される培養物は、ＩＬ‐４及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下で５日間、その後ＴＮＦ‐α＋１０4ＭＳＣにおいてさらに４８時間培養したＰＢＭＣを含む。「ＳＢ６２３」で示される培養物は、ＩＬ‐４及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下で５日間、その後ＴＮＦ‐α＋１０4ＳＢ６２３細胞においてさらに４８時間培養したＰＢＭＣを含む。ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の結果は、異なるドナー由来のサンプルをそれぞれ使用する、３つの実験の平均である。単球ドナーは、すべての場合において同じであった。すべての培養物は、１０5ＰＢＭＣで開始した。
【図２０】図２０は、単球におけるサイトカイン発現の測定を示す（図２０Ａ及び２０Ｂ）。図２０Ａは、炎症性サイトカインＴＮＦ‐αを発現する培養物における単球のパーセンテージを示す。図２０Ｂは、抗炎症性サイトカインＩＬ‐１０を発現する培養物における単球のパーセンテージを示す。ＣＤ１４の表面発現に基づいて選択される単球を、補充なし（「陰性」）、マクロファージコロニー刺激因子補充（「ＭＣＳＦ」）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子補充（「ＧＭＣＳＦ」）、ＭＳＣ補充又はＳＢ６２３細胞補充で培養した。ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞を、図においてＤ５２、Ｄ５５及びＤ６５として示す３つの異なるドナーから得た。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本開示の実行は、特に断らない限り、細胞生物学、毒物学、分子生物学、生化学、細胞培養、免疫学、腫瘍学、組換えＤＮＡの分野及び当該技術分野の手法の範囲内である関連分野における標準的な方法及び従来の技術を利用する。そのような技術は、文献に記載されており、それによって当業者に利用可能である。例えば、Alberts, B.ら、"Molecular Biology of the Cell," 5th edition, Garland Science, New York, NY, 2008; Voet, D.ら、"Fundamentals of Biochemistry: Life at the Molecular Level," 3rd edition, John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, 2008; Sambrook, J.ら、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; Ausubel, F.ら、"Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, New York, 1987 及び定期的更新; Freshney, R.I., "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique," Fifth Edition, Wiley, New York, 2005; 及び"Methods in Enzymology"シリーズ、Academic Press, San Diego, CAを参照。免疫学の標準的な技術は、例えば、"Current Protocols in Immunology," (R. Coico, series editor), Wiley, updated August 2010に記載されている。
【００５２】
本開示の目的のために、用語「末梢（peripheral）」は、中枢神経系の外側の体の部位を意味するために使用される。これらは、例えば、骨髄、末梢循環及びリンパ器官が挙げられる。
【００５３】
ＳＢ６２３細胞の調製
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄から接着細胞を選択することにより得ることができ、そして接着細胞においてＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）の発現によりＳＢ６２３細胞を形成するように誘導することができる。１つの実施態様において、ＭＳＣの培養物は、ＮＩＣＤをコードする配列を含むポリヌクレオチドと接触し（例えば、トランスフェクションにより）、続いて薬剤選択により、トランスフェクトした細胞を濃縮しそしてさらに培養する。例えば、米国特許第７，６８２，８２５号（２０１０年３月２３日）；米国特許出願公開第２０１０／０２６６５５４号（２０１０年１０月２１日）；及び国際公開第２００９／０２３２５１号（２００９年２月１９日）を参照し；それらすべての開示は、間葉系幹細胞の分離及び間葉系幹細胞のＳＢ６２３細胞（それらの文書において「神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）」及び「神経再生細胞（ｎｅｕｒａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）」を意味する）への転換を記載する目的のために、それらの全体について、参照により組み込まれる。また以下の実施例１も参照。
【００５４】
これらの方法において、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする任意のポリヌクレオチド（例えば、ベクター）を使用することができ、そしてトランスフェクトされた細胞の選択及び濃縮のための任意の方法を使用することができる。例えば、特定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むベクターはまた、薬剤耐性マーカー（例えば、Ｇ４１８に対する耐性）をコードする配列を含む。これらの実施態様において、選択は、ベクターでの細胞培養物のトランスフェクション後、細胞培養物に、ベクターを含まない細胞ではなくベクターを含む不十分な細胞を殺すために十分な量の選択薬剤（例えば、Ｇ４１８）を添加することにより、達成される。選択の非存在は、前記選択薬剤の除去又はベクターを含まない細胞を殺さないレベルへのその濃縮の減少を必要とする。
【００５５】
ＳＢ６２３細胞における老化
上記のように、ＳＢ６２３細胞は、培養ＭＳＣにおいてＮＩＣＤの発現によりＭＳＣに由来する。培養において操作を受けているＭＳＣは、しばしば老化するので；そこから由来するＳＢ６２３細胞を、老化について試験した。
【００５６】
ＳＢ６２３細胞は、軟寒天（ｓｏｆｔ ａｇａｒ）においてコロニーを形成せず、それらが形質転換細胞でないことを示す。また、ＳＢ６２３細胞を、細胞分裂により希釈される細胞透過性色素である、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で前標識した場合、細胞の亜集団は、培養５日後、ＣＦＳＥの高い濃度を保持した（図１）。このゆっくりとした増殖（又は非増殖）亜集団は、ＭＳＣ培養物において観察しなかった。ＳＢ６２３細胞集団における特定の細胞がまた、β‐ガラクトシダーゼ（細胞老化のマーカー）に関して強度に染色することを観察し、そしてそのような細胞は、ＭＳＣ培養物よりもＳＢ６２３培養物においてより豊富であった。これらの結果は、ＳＢ６２３細胞集団における非増殖、老化細胞のプールの存在と一致している。
【００５７】
細胞増殖を、１００万のＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞を播種し、培養３日後、トリパンブルー排除によって生細胞を測定することにより測定した。図２は、より多くの生細胞をＭＳＣ培養物において観察し、ＳＢ６２３細胞に関してより低い増殖指数を示したことを示す。細胞周期状態をヨウ化プロピジウム染色により評価し、そしてそれは、ＳＢ６２３培養物において、休止期（Ｇ０／Ｇ１）における細胞のより大きい集団を示し（図３）、ＳＢ６２３細胞における増殖率の低下に関するさらなる支持を提供する。
【００５８】
老化の追加の評価を、ｐ１６Ｉｎｋ４Ａタンパク質の発現に関して、ＳＢ６２３細胞集団を染色することにより行った。ｐ１６Ｉｎｋ４Ａは、細胞周期のＧ１からＳ期への進行を阻害し、そして老化細胞において発現する。図４は、より高いパーセンテージのｐ１６Ｉｎｋ４Ａ発現細胞を、ＭＳＣと比較して、ＳＢ６２３細胞の培養物において検出したことを示す。さらに、培養の５日後、高いＣＦＳＥレベルを保持するＳＢ６２３培養物における細胞を、ｐ１６Ｉｎｋ４Ａ発現に関して試験した場合、ｐ１６Ｉｎｋ４Ａを発現するＳＢ６２３細胞の亜集団は、高いＣＦＳＥレベルを含む分画と一致した。これらの結果は、総合すれば、ＳＢ６２３培養物内に、老化細胞の亜集団の存在を示す。
【００５９】
表面マーカー及びサイトカイン発現
ＳＢ６２３細胞は、ＭＳＣと共通する多くの表面マーカーを発現する。これらは、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及び血管内皮細胞接着分子‐１（ＶＣＡＭ‐１又はＣＤ１０６）が挙げられる。ＭＳＣと比較して、ＳＢ６２３細胞においてＣＤ４４及びＣＤ７３のレベルが高く、そしてＶＣＡＭ‐１レベルが低かった。ＳＢ６２３細胞はまた、細胞間接着分子‐１（ＩＣＡＭ‐１又はＣＤ５４）を発現し、そしてそれは、通常、ＭＳＣで発現していない。図５及び６を参照。ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞は、表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４及びＣＤ４５を発現しない。
【００６０】
ＳＢ６２３細胞はまた、多くのサイトカイン及び栄養因子を分泌する。これらの因子の特定の同一性を、ブレフェルジンＡでタンパク質分泌を遮断し、そして抗体染色及びフローサイトメトリーにより細胞内サイトカインに関して試験することにより決定した。これらの試験は、ＳＢ６２３細胞が、いくつかある因子の中で特に、インターロイキン１α（ＩＬ‐１α）、インターロイキン‐６（ＩＬ‐６）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、血管内皮増殖因子‐Ａ（ＶＥＧＦ‐Ａ）及び形質変換成長因子ベータ‐１（ＴＧＦβ‐１）を産生することを示した。図７及び８を参照。ＳＢ６２３細胞により産生されるＩＬ‐６及びＧＭ‐ＣＳＦの量は、一般的に、ＭＳＣにより産生されるものよりも多い。
【００６１】
老化細胞は、特定の成長刺激サイトカイン及び栄養因子を合成しそして分泌することが報告されているので（Orjaloら、(2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 17031-17036）、ＳＢ６２３培養物内の老化細胞の集団の存在は、様々な種類の組織再生を支持するためのＳＢ６２３細胞移植の有用性を示唆した。しかしながら、老化細胞の分泌プロファイルは、炎症誘発性であることが報告され、仮にＳＢ６２３細胞に関する場合であれば、細胞移植治療のためのＳＢ６２３細胞の有用性を減少するかもしれない。
【００６２】
驚くべきことに、そしてＳＢ６２３細胞培養物における老化細胞の集団の存在にもかかわらず、ＳＢ６２３細胞は、本明細書において開示したように、多くの免疫抑制特性を有する。例えば、ＳＢ６２３は、Ｔ細胞の増殖及び活性化を抑制し、Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを変化させ、単球の樹状細胞への分化を阻止し、そして樹状細胞の成熟の低下において、それらの親ＭＳＣよりも優れている。
【００６３】
ＳＢ６２３細胞によるＴ細胞の活性化及びＴ細胞の増殖の抑制
ＳＢ６２３細胞を、非血縁ドナー由来の１０5ＣＦＳＥ標識末梢血Ｔ細胞及び１０5末梢血単核細胞を含む混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に添加した。Ｔ細胞活性化の初期マーカー、ＣＤ６９のレベルを測定して、Ｔ細胞活性化を調節するＳＢ６２３細胞の能力を調べた。対照混合リンパ球反応において、ＣＤ６９の表面発現を強力に誘導した。しかしながら、１０4ＳＢ６２３細胞の存在下で１日後、表面ＣＤ６９を発現する、ＭＬＲにおけるＣＤ４+Ｔ細胞（すなわち、ヘルパーＴ細胞）の分画が、有意に減少した。実施例４を参照。
【００６４】
ＳＢ６２３細胞の存在下で５日後、前標識ＣＤ４+Ｔ細胞におけるＣＦＳＥの希釈（細胞増殖の指標）は、ＭＬＲにおけるＣＤ４+Ｔ細胞の増殖が、ＳＢ６２３細胞の存在下で減少することが示された。実施例４を参照。従って、ＳＢ６２３細胞は、Ｔ細胞増殖及びＴ細胞活性化の両方を抑制することができる。
【００６５】
ＳＢ６２３細胞のＴ細胞機能に対するさらなる影響は、表面ＨＬＡ‐ＤＲ発現の低下（本明細書の実施例４）、未感作のＴ細胞のインビトロ培養物における調節性Ｔ細胞の増加した産生（本明細書の実施例６）、及びサイトカイン分泌の変化（本明細書の実施例７及び８）が挙げられる。ＳＢ６２３細胞はまた、異種リンパ球活性化系におけるＴ細胞増殖の減少について有効であった。本明細書の実施例５を参照。
【００６６】
ＳＢ６２３細胞による樹状細胞発生の阻害
単球の樹状細胞（抗原提示細胞の１種）への分化及びさらに樹状細胞の成熟は、単球の、サイトカイン、インターロイキン‐４（ＩＬ‐４）及び顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）への暴露によりインビトロにおいて刺激することができる。この分化は、インターロイキン‐６（ＩＬ‐６）又は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）により阻止することができ、そしてそれら両方は、ＳＢ６２３細胞により分泌されることが知られるサイトカインの中の１つである。例えば、Tateら、(2010) Cell Transplant. 19: 973-984及び国際公開第２００９／０２３２５１号を参照。
【００６７】
本発明者等は、単球とＳＢ６２３細胞との共培養が、単球のＣＤ１ａ+樹状細胞への分化及びＣＤ８６+状態への樹状細胞の成熟の両方を減少することを本明細書において示す。以下の実施例９及び１０を参照。新たな樹状細胞の産生を低減し及び既存の樹状細胞の機能を阻害するそれらの能力のため、ＳＢ６２３細胞は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞による、ペプチドの提示によるＴ細胞の活性化に起因する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置及び／又は改善するために使用することができる。
【００６８】
本明細書に記載されたようなそれらの様々な免疫抑制特性のため、ＳＢ６２３細胞は、他の生物学的及び化学的免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、インターフェロン。ミコフェノール酸、フィンゴリモド、ミリオシン、アザチオプリン、メルカプトプリン、ダクチノマイシン、ミトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラサイクリン、メトトレキサート、ＦＫ５０６、シクロホスファミド、ニトロソウレア、白金化合物及びグルココルチコイド）の代わりに使用することができる。さらに、免疫抑制剤の使用は、例えば、神経系障害の神経再生及び処置のために、細胞治療においてＳＢ６２３同種移植に伴って必要ではない。
【００６９】
前駆細胞
ＳＢ６２３細胞に転換することができる前記細胞は、任意の種類の非最終分化細胞であってもよい。例えば、米国特許第５，８４３，７８０号；６，２００，８０６号及び７，０２９，９１３号において開示されたような全能性幹細胞などが、前駆細胞として使用することができる。全能性幹細胞は、培養し（例えば、米国特許第６，６０２，７１１号及び７，００５，２５２号）そして様々な種類の多能性細胞に分化することができ（例えば、米国特許第６，２８０，７１８号；６，６１３，５６８号及び６，８８７，７０６号）、それはまた、開示された方法の実施において前駆細胞として使用することができる。
【００７０】
他の典型的な前駆細胞の種類は、骨髄接着間質細胞（ＭＡＳＣ）、また骨髄接着幹細胞として知られ、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。ＭＡＳＣの典型的な開示は、米国特許出願公開第２００３／０００３０９０号；Prockop (1997) Science 276: 71-74及びJiang (2002) Nature 418: 41-49において提供される。ＭＡＳＣの分離及び精製方法は、例えば、米国特許第５，４８６，３５９号；Pittenger ら、(1999) Science 284: 143-147及びDezawaら、(2001) Eur. J. Neurosci. 14: 1771-1776において見出すことができる。ヒトＭＡＳＣは、市販されており（例えば、Bio Whittaker, Walkersville, MD）又は例えば、骨髄吸引、続いて接着骨髄細胞の選択によりドナーから得ることができる。例えば、国際公開第２００５／１００５５２号を参照。
【００７１】
ＭＡＳＣは、また、臍帯血から分離することができる。例えば、Campagnoliら、(2001) Blood 98: 2396-2402; Ericesら、(2000) Br. J. Haematol. 109: 235-242及びHouら、(2003) Int. J. Hematol. 78: 256-261を参照。
【００７２】
ＭＳＣのＳＢ６２３細胞への転換は、例えば、米国特許第７，６８２，８２５号（２０１０年３月２３日）及び国際公開第２００９／０２３２５１号（２００９年２月１９日）において記載され、それら両方の開示は、間葉系幹細胞の分離及び間葉系幹細胞のＳＢ６２３細胞への転換（これらの文書において、「神経前駆細胞（neural precursor cell）」及び「神経再生細胞（neural regenerating cell）」）を記載する目的のために、それら全体について、参照により組み込まれる。
【００７３】
Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン
Ｎｏｔｃｈタンパク質は、すべての後生動物で見られる、細胞内シグナル伝達を通じて細胞分化に影響を及ぼす膜貫通受容体である。Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインのＮｏｔｃｈリガンド（例えば、デルタ（Ｄｅｌｔａ）、セレート（Ｓｅｒｒａｔｅ）、ジャグド（Ｊａｇｇｅｄ））との接触は、Ｎｏｔｃｈタンパク質の２つのタンパク質分解切断をもたらし、その２番目は、γ‐セクレターゼにより触媒され、そして細胞質中にＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）を放出する。マウスＮｏｔｃｈタンパク質において、この切断は、アミノ酸ｇｌｙ １７４３及びｖａｌ １７４４の間で起こる。ＮＩＣＤは、核に移行し、そこで転写因子として働き、さらなる転写調節タンパク質（例えば、ＭＡＭ、ヒストンアセチラーゼ）を漸加して、様々な標的遺伝子（例えば、Ｈｅｓ１）の転写抑制を緩和する。
【００７４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に関してさらなる詳細及び情報が、例えば、Artavanis-Tsakonasら、(1995) Science 268: 225-232; Mumm及びKopan (2000) Develop. Biol. 228: 151-165並びにEhebauerら、(2006) Sci. STKE 2006 (364), cm7. [DOI: 10.1126/stke.3642006cm7]において見出される。
【００７５】
細胞培養及びトランスフェクション
細胞培養のための標準的な方法は、当該技術分野において公知である。例えば、R. I. Freshney "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique," Fifth Edition, Wiley, New York, 2005を参照。
【００７６】
外来性ＤＮＡの細胞への導入方法（すなわち、トランスフェクション）はまた、当該技術分野において周知である。例えば、Sambrookら、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; Ausubelら、"Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, New York, 1987及び定期更新を参照。
【００７７】
自己免疫疾患及びアレルギー反応
自己免疫疾患は、正常の健全な組織を攻撃する免疫反応に起因する。典型的な自己免疫疾患は、限定されないが、筋委縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、血小板減少性紫斑病、橋本甲状腺炎、ギラン・バレー症候群、悪性貧血、皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｓｙｏｓｉｔｉｓ）、アジソン病、１型糖尿病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（「狼瘡」）、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、多発性筋炎、胆汁性肝硬変、乾癬、反応性関節炎、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、血管炎、クローン病、及びセリアック病‐スプルー（グルテン過敏性腸疾患）が挙げられる。
【００７８】
アレルギーは、免疫反応を通常は刺激しない外部物質に対する免疫過敏症に起因する。一般的なアレルギーは、花粉、カビ、ペットの鱗屑及び埃が挙げられる。特定の食品及び薬はまた、アレルギー反応を引き起こす可能性がある。
【００７９】
本明細書に開示されるように、ＳＢ６２３細胞の免疫抑制特性は、免疫疾患及びアレルギーの処置のために有用である。
【００８０】
製剤、キット及び投与経路
本明細書に開示されるように、ＳＢ６２３細胞を含む治療用組成物をまた提供する。そのような組成物は、典型的に細胞及び医薬的に許容される担体を含む。
【００８１】
本明細書に開示された治療用組成物は、とりわけ、免疫調節（例えば、免疫活性化の低減）及び様々な免疫疾患の進行の逆転のために有用である。従って、ＳＢ６２３細胞を含む組成物の「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、免疫活性化を防ぎ又は逆転する量であってもよい。例えば、体重、投与経路、疾患の重症度などに依存して、例えば、投与量は、約１００；５００；１，０００；２，５００；５，０００；１０，０００；２０，０００；５０，０００；１００，０００；５００，０００；１，０００，０００；５，０００，０００；〜１０，０００，０００細胞以上で変化してもよく；例えば、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、１月に２回、１月に１回の投与頻度でもよい。
【００８２】
補助的な活性化合物をまた、組成物中に組み込むことができる。例えば、ＳＢ６２３細胞は、他の免疫調節剤、例えば、自己免疫疾患の処置、又は移植による拒絶反応及び／又はＧＶＨＤを阻止するために、例えばシクロスポリンとの組み合わせが有用である。従って、本明細書に開示された治療用組成物は、ＳＢ６２３細胞及びシクロスポリン（又は任意の他の免疫抑制剤）の両方を含むことができる。ＳＢ６２３細胞の組成物が、他の治療薬と組み合わせて使用される場合、組み合わせの治療有効量に言及することができ、それは、免疫調節をもたらすＳＢ６２３細胞及び他の薬剤の合わせた量であり、連続的に又は同時に、組み合わせて投与される。濃度の２つ以上の組み合わせが、治療に有効であるかもしれない。
【００８３】
様々な医薬組成物並びにそれらの調製及び使用のための技術は、本開示に照らして、当業者に公知である。適切な薬理的な組成物の詳細なリスト及びそれらの投与のための技術に関して、テキスト、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985; Bruntonら、"Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics," McGraw-Hill, 2005; University of the Sciences in Philadelphia (eds.), "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," Lippincott Williams & Wilkins, 2005;及びUniversity of the Sciences in Philadelphia (eds.), "Remington: The Principles of Pharmacy Practice," Lippincott Williams & Wilkins, 2008を参照してもよい。
【００８４】
本明細書に記載された細胞は、移植のための生理学的に適合性の担体中に懸濁してもよい。本明細書で使用される場合、用語「生理学的に適合性の担体（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」は、製剤の他の成分と適合し、そしてそのレシピエントに有害でない担体を意味する。当業者は、生理学的に適合性の担体に精通している。適切な担体の例は、細胞培地（例えば、イーグル最小必須培地）、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液＋／−グルコース（ＨＢＳＳ）、及び複数の電解質溶液、例えば、Ｐｌａｓｍａ‐Ｌｙｔｅ（商標）Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）が挙げられる。
【００８５】
患者に投与するＳＢ６２３細胞懸濁液の用量は、移植部位、治療目標及び溶液中の細胞数に依存して変化する。典型的には、患者に投与する細胞の量は、治療有効量である。本明細書で使用される場合、「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」又は「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、特定の疾患の処置を達成するために、すなわち疾患に関連する症状の量及び重症度の減少を生み出すために、必要とされる移植された細胞数を意味する。治療有効量は、関連のある医学的状態の症状の完全な又は部分的な改善、又はそのような状態の処置、治療、予防又は改善率の増加をもたらすのに十分な組成物の量をさらに意味する。例えば、移植片対宿主病に関する処置の場合、ＳＢ６２３細胞の治療有効量の移植は、典型的に、移植した細胞の免疫抑制をもたらす。仮に、疾患が移植による拒絶反応であるなら、例えば、治療有効量は、移植した場合、移植片が許容されるように宿主において十分な免疫抑制をもたらすＳＢ６２３の数である。治療有効量は、疾患又は障害の種類、疾患又は障害の広範さ、及び疾患又は障害を患う器官の大きさで変化する。
【００８６】
開示した治療用組成物は、医薬的に許容される材料、組成物又はビヒクル、例えば、液体又は固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又は封入材料、すなわち、担体をさらに含む。これらの担体は、例えば、体内で、ＳＢ６２３細胞を安定させ及び／又はＳＢ６２３細胞の生存を容易にすることができる。それぞれの担体は、製剤の他の成分に適合しそして対象に有害でない意味において「許容される（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」べきである。医薬的に許容される担体として役に立つことができる材料のいくつかの例は、糖、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；トラガカント粉末；モルト；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバター及び坐薬ワックス；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱性物質除去水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；並びに医薬製剤に使用される他の無毒性適合物質が挙げられる。湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤がまた、組成物中に存在してもよい。
【００８７】
本開示の他の態様は、対象に、ＳＢ６２３細胞、任意により、他の治療剤と組み合わせた投与を実施するためのキットに関する。１つの実施態様において、キットは、任意により例えば、適切な、１つ以上の別々になった医薬品として処方されるシクロスポリン又は他の免疫抑制剤を含む、医薬担体において処方されるＳＢ６２３細胞の組成物を含む。
【００８８】
典型的な製剤は、限定されないが、非経口投与、例えば、肺内、静脈内、動脈内、眼内、頭蓋内、硬膜下（ｓｕｂ‐ｍｅｎｉｎｇｉａｌ）又は皮下投与に適切なもの、ミセル、リポソーム又は薬物放出カプセル（徐放のために設計された生体適合性コーティング中に組み込まれた活性薬剤）中に封入された製剤；摂取可能な製剤；局所使用のための製剤、例えば、点眼薬、クリーム、軟膏及びゲル；並びに他の製剤、例えば、吸入、エアロゾル及びスプレーが挙げられる。開示の組成物の投与量は、処置の必要性の程度及び重症度、投与された組成物の活性、対象の全体的な健康状態、及び当業者に周知の他の考慮に従って変化する。
【００８９】
さらなる実施態様において、本明細書に記載される組成物は、局所的に送達される。局所送達は、非全身的に組成物を送達することを可能にし、それによって、全身送達と比較して、体に対する組成物の負担を軽減する。そのような局所送達は、例えば、様々な医療的な埋め込み装置、限定されないが、ステント及びカテーテルの使用を通じて達成でき、又は吸入、静脈切開術、注射若しくは手術によって達成できる。コーティング、移植、包埋方法、並びに医療装置、例えばステント及びカテーテルに所望する薬剤を取り付ける他の方法は、当該技術分野において確立され、そして本明細書において熟慮される。
【実施例】
【００９０】
実施例１：ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の調製
成人ドナー由来の骨髄穿刺液を、Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、そして１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、２ｍＭのＬ‐グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したα‐ＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）に播種した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ2で３日間培養し、接着細胞の単層を得た。非接着細胞の除去後、培養を同じ条件で２週間継続した。この間に、細胞を０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡを使用して、２回継代した。２代継代由来の細胞の一部をＭＳＣとして凍結した。
【００９１】
２代継代由来の残りの細胞を播種し、そしてサイトメガロウィルスプロモーター（ｐＣＭＶ‐ｈＮＩＣＤ１‐ＳＶ４０‐ＮｅｏR）と作動可能に連結されたＮｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むプラスミドで、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用してトランスフェクトした。このプラスミドはまた、ＳＶ４０プロモーターの転写調節下、ネオマイシン及びＧ４１８に対する耐性をコードする配列を含む。トランスフェクトした細胞を、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充した前の段落で記載した生育培地中で、３７℃、５％ＣＯ2で培養した。７日後、Ｇ４１８耐性クローンを増やし、そして培養物を２回継代した。２代継代後、細胞を採取しそしてＳＢ６２３細胞として凍結した。
【００９２】
本明細書に記載されたように調製したＭＳＣ及びＳＢ６２３を、必要に応じて解かし、そしてさらなる試験で使用した。
【００９３】
実施例２：ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の増殖能力
細胞増殖を定量するために、１００万のＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞を播種し、そして３日間培養した。３日目に、生細胞をトリパンブルー排除によりカウントした。図２は、より少ない生細胞が、ＭＳＣ培養物と比較して、ＳＢ６２３培養物に存在したことを示す。
【００９４】
ＭＳＣ及びＳＢ６２３培養物の細胞周期プロファイルを、ヨウ化プロピジウム染色により評価した。ヨウ化プロピジウムは、細胞周期の休止期における細胞を増殖期の細胞よりもより強力に染色するＤＮＡ挿入色素である。培養３日後、１００万のＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞を、４℃で、７０％エタノール中で一晩固定した。ＰＢＳ／２％ＦＢＳで２回洗浄後、細胞を、暗所で、ＰＢＳ／２％ＦＢＳにおける１ｍｌの染色緩衝液（５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム、５０μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で、３０分間インキュベートした。収集及び分析を、ＦＬ‐２リニアチャンネルで、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏ（商標）プログラム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で行った。図３は、ＭＳＣと比較して、ＳＢ６２３細胞のより大きいヨウ化プロピジウム染色を示し、ＳＢ６２３細胞培養物において細胞周期のＧ０／Ｇ１休止期における細胞のより高い分画を示す。
【００９５】
細胞自律的な染色、５‐（‐６‐）カルボキシフルオレセインジアセテート（ＣＦＳＥ）の希釈を、増殖動態の追加測定として使用した。この分析において、同じ数のＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞を、５μＭの５‐（‐６‐）カルボキシフルオレセインジアセテート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で、室温で２分間標識し、次に、５日間培養した。フローサイトメトリー収集及び分析（ＣＦＳＥに関する）を、ＦＬ‐１ ｌｏｇチャンネルを使用して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で行った。結果（図１）は、ＳＢ６２３細胞培養物が、ＭＳＣと比較して、高いＣＦＳＥ含量を有する細胞集団を含むことを示し、ＳＢ６２３細胞培養物において、非分裂又はゆっくりと分裂する細胞の集団の存在を示す。
【００９６】
ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞における細胞内ｐ１６Ｉｎｋ４Ａタンパク質のレベルを以下のように評価した。細胞を３日間培養し、次に４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を含むＰＢＳで透過処理した。２％のウシ胎児血清を含むＰＢＳ（ＰＢＳ／２％ＦＢＳ）で２回洗浄した後、細胞ペレットを、０．２ｍｌのＰＢＳ／２％ＦＢＳに再懸濁し、そして２つのサンプルに分けた。１つの細胞サンプルを、フィコエリトリン（ＰＥ）‐コンジュゲート抗ｐ１６Ｉｎｋ４Ａ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で染色し、そして他のサンプルを、アイソタイプ対照として、ＰＥ‐コンジュゲートマウスＩｇＧでインキュベートした。サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でフローサイトメトリーにより分析し、そしてデータをｐ１６Ｉｎｋ４Ａ陽性及びＩｇＧ陰性染色した細胞に関してゲーティングによりｐ１６Ｉｎｋ４Ａを発現する培養物における細胞のパーセンテージに変換した。図４は、ＳＢ６２３細胞培養物が、ｐ１６Ｉｎｋ４Ａを発現する細胞の有意に高い分画を含むことを示す。
【００９７】
実施例３：ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞による表面マーカー及びサイトカイン発現
表面マーカーを測定するために、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞を、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して培地から採取し、ＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄し及び１ｍｌのＰＢＳ／２％ＦＢＳに再懸濁した。細胞を、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０への蛍光色素コンジュゲート抗体（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、又はＣＤ１０５への蛍光色素コンジュゲート抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で、氷上で１５分間インキュベートした。細胞を、その後、ＰＢＳ／２％ＦＢＳで１回洗浄し、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を行った。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、データ分析のために使用した。結果を、対照としてＩｇＧを使用して、ｄＭＦＩ（「デルタ平均蛍光強度（ｄｅｌｔａ ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）」として表し；すなわち、ＩｇＧに関するＭＦＩを、所定の表面マーカーに関して取得したＭＦＩから差し引き、ｄＭＦＩを得た。
【００９８】
結果を、図５及び６に示す。図５は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の両方が、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ１０５を発現するが、ＳＢ６２３細胞は、これらの表面マーカーをより高いレベルで常に発現することを示す。図６は、ＳＢ６２３細胞がまた、ＭＳＣよりも、ＣＤ５４のより高いレベルを常に発現することを示す。
【００９９】
細胞内サイトカインの検出のために、細胞を３日間培養し、そして採取前に６時間、ブレフェルジンＡの１：１，０００希釈（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，最終濃度３μｇ／ｍｌ）で処理した。細胞を固定し、細胞内ｐＩｎｋ４Ａの測定のために上記のように透過処理し、そして蛍光色素コンジュゲート抗体（ヒトＧＭ‐ＣＳＦ（ＢＤ）、ＩＬ‐１α（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＩＬ‐６（ＢＤ）又はＴＧＦβ‐１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））で、１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ／２％ＦＢＳで２回洗浄した。データ収集及び分析を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏ（商標）ソフトウェアを使用して、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）装置上で行った。
【０１００】
図７に示すこれらの分析結果は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞によるＩＬ‐１α、ＩＬ‐６及びＧＭ‐ＣＳＦの発現の概ね同じレベルを示し；一方で、図８は、同程度のレベルのＴＧＦ‐β‐１及びＶＥＧＦ‐Ａが、ＭＳＣ及びＳＢ６２３によって産生されることを示す。
【０１０１】
実施例４：同種異系混合リンパ球反応（ａｌｌｏ‐ＭＬＲ）
同種異系混合リンパ球反応のための細胞を、健康な、非血縁者由来の末梢血のサンプル１０ｍｌから得た。レスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）Ｔ細胞を得るために、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｔ‐ｃｅｌｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）をメーカーの説明に従って使用した。濃縮したＴ細胞（レスポンダー細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ ｃｅｌｌ））を５μＭの５‐（‐６‐）カルボキシフルオレセインジアセテート（ＣＦＳＥ）で、室温で２分間標識した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。血清クエンチング及びＰＢＳで３回洗浄後、標識したレスポンダー細胞を、９６穴Ｕ底プレートのウェル中に、１０5細胞を含んで、０．１ｍｌの完全リンパ球培地（ＲＰＭＩ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））＋１０％ＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ）中に播種した。
【０１０２】
刺激細胞を調製するために、末梢血軟膜単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）密度勾配遠心分離後、回収した。赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、３７℃で１０分間添加し；次に、細胞をＰＢＳ／２％熱不活性化ＦＢＳで２回洗浄した。単核刺激細胞を、レスポンダー細胞を含むウェル（０．１ｍｌ中に１０5細胞）に添加するか、又は１０5の刺激細胞を、１０4のＳＢ６２３細胞若しくは１０4のＭＳＣと混合し、遠心しそしてペレット細胞を、その後、上記のように調製したＣＦＳＥ標識レスポンダー細胞のウェルに添加した０．１ｍｌの完全リンパ球培地（上記の通り）に再懸濁した。
【０１０３】
反応開始２日後、培養物におけるＣＤ４+Ｔ細胞の表面上のＣＤ６９（初期Ｔ細胞活性化マーカー）の提示を、Ｔ細胞活性化のアッセイとして使用した。ＣＤ６９発現の分析のために、細胞を、２日後、ピペットにより採取し、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）‐コンジュゲート抗ＣＤ６９抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色し、そして、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、ＣＤ４+リンパ球でゲーティングして分析した。
【０１０４】
Ｔ細胞増殖の測定のために、培養７日後、細胞を採取し、そしてフィコエリトリン（ＰＥ）‐コンジュゲート抗ＣＤ4抗体（ＢＤ）で染色した。データ収集のために、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用した。
【０１０５】
ａｌｌｏ‐ＭＬＲの対照について、ＣＤ４+集団内のＴ細胞分画が、そしてそれは、表面ＣＤ６９の発現が誘導されていたが、２日後に有意に増加した（図９Ａ及び９Ｂ）。
【０１０６】
ＭＬＲにおける、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞との共培養のＴ細胞活性化に対する影響を、また評価した。これらの実験において、１０，０００のＭＳＣ又は１０，０００のＳＢ６２３細胞を、ＭＬＲの開始時に培養物に添加した。これらの条件下、２日後、対照培養物において観察した表面ＣＤ６９発現細胞の増加が、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞との共培養で有意に減少した（ｐ＜０．０５；図９Ａ及び９Ｂ）。
【０１０７】
Ｔ細胞活性化の他の測定として、ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖速度を、ＭＬＲ開始７日後、アッセイした。これらの実験のために、細胞をピペットでＭＬＲから採取し、そしてＰＥ‐標識抗ＣＤ４抗体で染色した。フローサイトメトリーを、Ｂｅｃｔｏｎ‐Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）装置を使用して、ＣＤ４+細胞でゲーティングして行った；そしてＣＳＦＥの希釈を、ＣＤ４+レスポンダーＴ細胞の増殖速度の指標として評価した。対照ａｌｌｏ‐ＭＬＲにおいて、ＣＤ４+レスポンダーＴ細胞の８０％以上が、７日後増殖した。ＳＢ６２３細胞又はＭＳＣの存在下で、Ｔ細胞増殖が、有意に減少した（すなわち、より高いレベルのＣＦＳＥ染色を観察した（図１０））。
【０１０８】
表面ＨＬＡ‐ＤＲ発現の誘導はまた、Ｔ細胞活性化の測定である。ＳＢ６２３細胞及びＭＳＣの両方が、ａｌｌｏ‐ＭＬＲにおいて、ＨＬＡ‐ＤＲ発現Ｔ細胞のパーセンテージを減少した（図１１）。
【０１０９】
従って、多くの異なる独立した基準により、ＳＢ６２３細胞は、Ｔ細胞活性化を抑制する。Ｔ細胞活性化阻害能力は、免疫抑制のためのＳＢ６２３細胞の有用性を示す。
【０１１０】
実施例５：異種リンパ球活性化反応
ＳＢ６２３細胞の免疫抑制特性を、また、異種移植モデル系において示した。異種リンパ球反応を、刺激細胞として、Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラットグリア混合細胞（星状膠細胞及び小グリア細胞を含む）、並びにレスポンダー細胞として、メーカーの説明に従ってＰＫＨ２６で標識した、ヒト末梢血Ｔ細胞を使用して確立した。グリア混合細胞を得るために、生後９日目のラットの脳を採取し、そして０．２５％トリプシンで処理する前に、３０分間粉砕した。細胞懸濁物を、７０μＭのセルストレーナーを通じて濾過し、そして遠心分離前にＦｉｃｏｌｌ（商標）で覆った。グリア混合細胞を、アッセイにおいて使用する前に、ＤＭＥＭ／Ｆ１２／１０％ＦＢＳ／ｐｅｎ‐ｓｔｒｅｐ中で１４日間培養した。異種反応を、５日間にわたって、同種異系ＭＬＲ（１００，０００グリア混合細胞：１００，０００ＣＦＳＥ標識ヒトＴ細胞；及び任意により、１０，０００ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞）において使用したものと同じ細胞比率を使用して行った。ヒトＣＤ３ゲートＴ細胞（ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞の両方を含む）におけるＰＫＨ２６希釈を、フローサイトメトリーにより評価した。
【０１１１】
同種異系ＭＬＲのように、異種系へのＳＢ６２３細胞又はＭＳＣの添加は、別な方法ではグリア混合細胞による刺激後に観察したが、レスポンダーＴ細胞の増殖度を低減した（図１２）。従って、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の免疫抑制特性は、自己又は同種異系環境に限定されるものではない。
【０１１２】
実施例６：ＳＢ６２３細胞の調節性Ｔ細胞の成長に対する影響
調節性Ｔ細胞（Ｔregｓ）は、免疫反応を弱め又は抑制することができる。従って、Ｔregｓの発生を支持するためのＳＢ６２３細胞の能力を調べた。この目的を達成するために、実施例２で記載したように精製した、末梢血由来の濃縮Ｔ細胞をインターロイキン‐２（ＩＬ‐２）の存在下で培養し、そしてそれは、未感作Ｔ細胞のＴregｓへの分化を刺激することを示し、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞との共培養のこのプロセスに対する影響を評価した。共培養物は、Ｔ細胞とＳＢ６２３細胞の比率１０：１又はＴ細胞とＭＳＣの比率１０：１（１０5Ｔ細胞：１０4ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞）を含む。表面マーカーＣＤ４及びＣＤ２５の共発現、サイトカインインターロイキン‐１０（ＩＬ‐１０）の分泌、及び転写因子ＦｏｘＰ３の分子内産生を、Ｔregｓのためのマーカーとして使用した。
【０１１３】
これらの実験のために、ヒトＴ細胞を、Ｔ細胞分離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を、メーカーの説明に従って使用して末梢血から濃縮した。濃縮Ｔ細胞を、使用前にＲＰＭＩ‐１６４０／１０％熱不活性ＦＢＳ／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐにおいて一晩培養した。一日前に、１０，０００のＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞を、９６穴Ｕ底プレートにウェルごとに播種した。共培養アッセイの当日、１００，０００の濃縮Ｔ細胞を、事前準備した１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐２をまた含む、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞単層のそれぞれのウェルに移した。内部標準として、Ｔ細胞培養物をまた、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞の非存在下で保持した。７日目に、細胞を表面ＣＤ４（ヘルパーＴ細胞マーカー）及びＣＤ２５（ＩＬ‐２受容体アルファ鎖）、及び細胞内ＦｏｘＰ３に関して染色した。
【０１１４】
表面マーカーＣＤ４及びＣＤ２５に関するアッセイの結果を、図１３に示す。ＳＢ６２３細胞とＩＬ‐２刺激Ｔ細胞との共培養は、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔreg細胞の数を有意に増加し（図１３Ａの左端と右端パネルを比較）、そしてこのＴreg成長の刺激は、Ｔ細胞をＭＳＣと共培養した場合よりも、Ｔ細胞をＳＢ６２３細胞で共培養した場合の方が大きい（図１３Ａの中央と右パネルを比較）。
【０１１５】
フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）タンパク質に関するアッセイは、これらの結果を裏付ける。ＦｏｘＰ３は、ＴregＳの成長及び機能を調節する転写因子である。細胞内ＦｏｘＰ３を、Ｔ細胞を７日間培養又は共培養し（上記の通り）、次に固定しそしてＣｙｔｏＦｉｘ／Ｐｅｒｍ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で細胞を透過処理することにより検出した。ＰＥ‐コンジュゲート抗ＦｏｘＰ３抗体（クローンＰＣＨ１０１，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１：５希釈）を、細胞を染色するために３０分間染色し、そして染色細胞を細胞の大きさに基づくリンパ球でゲーティングするフローサイトメトリーにより分析した。図１４に示す結果は、ＩＬ‐２の存在下、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞との共培養物が、Ｔ細胞によるＦｏｘＰ３発現を、共培養しなかったＴ細胞におけるその発現と比較して、増加したことを示す。
【０１１６】
Ｔregｓによる免疫抑制の１つの機構は、抗炎症性サイトカイン、例えば、インターロイキン‐１０（ＩＬ‐１０）の分泌によるものである。従って、ＩＬ‐２を含むＴ細胞培養物又はＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞との共培養物におけるＩＬ‐１０産生Ｔ細胞のパーセンテージを、培養又は共培養の７日後、細胞内ＩＬ‐１０を蛍光色素コンジュゲート抗ＩＬ‐１０抗体で染色することにより測定した。
【０１１７】
従って、培養又は共培養の７日後、細胞をブレフェルジンＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の１：１，０００希釈で、６時間処理し（細胞内タンパク質の分泌を防止するために）、２％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、その後、ＰＢＳ／２％ＦＢＳにおける０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘ‐１００で、氷上で１５分間透過処理した。Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗ヒトＩＬ‐１０抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を、その後添加し、そして培養物を、氷上で３０分間インキュベートした。ウェルを、２％ウシ胎児血清／０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で、２回洗浄し；細胞をピペットで得て、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して分析した。データ分析を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏ（商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して行った。
【０１１８】
この分析の結果は、ＩＬ‐２の存在下で培養したＴ細胞が、細胞内ＩＬ‐１０を発現せず；一方で、それらをＳＢ６２３細胞又はＭＳＣのいずれかとＩＬ‐２の存在下で共培養した場合、低いレベルのＩＬ‐１０を、ＣＤ４+Ｔ細胞により産生し、若干多いＩＬ‐１０を、ＳＢ６２３細胞で共培養したＴ細胞によって産生したことを示す（図１５）。
【０１１９】
実施例７：ＳＢ６２３細胞による炎症性の抗炎症性サイトカインプロファイルへの転換
ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の共培養の、Ｔ細胞により産生される炎症性及び抗炎症性サイトカインの相対量に対する影響を、ホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシンでの処理により準最適に活性化したＴ細胞におけるＩＬ‐１０（抗炎症性サイトカイン）及びインターフェロン‐ガンマ（ＩＮＦ‐γ、炎症性サイトカイン）を測定することにより評価した。これらの実験のために、Ｔ細胞を末梢血から濃縮して、ＩＬ‐２の非存在下で培養を行った以外は、上記のように（実施例６）ＭＳＣ又はＳＢ６２３と培養し、又は共培養した。７日目に、２５ｎｇ／ｍｌの非活性化用量のホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）／０．５μＭイオノマイシン（Ｉｏ）（両方ともＳｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、３μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下、添加し、そして６時間後、細胞を採取し、ＩＬ‐１０及びＩＦＮ‐γの細胞内発現に関して分析した。これらの実験で使用したＰＭＡの非活性化用量及びイオノマイシンは、Ｔ細胞増殖を誘導しなかったが、Ｔ細胞によるサイトカイン合成を誘導するためには十分であった。ＩＬ‐１０レベルを、実施例６に記載したように、Ａｌｅｘａ４８８‐コンジュゲート抗ヒトＩＬ‐１０抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して測定した。ＩＦＮ‐γレベルを、ＰＥ‐標識抗ヒトＩＦＮ‐γ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、ＦＡＣＳにより測定した。
【０１２０】
この分析の結果を、図１６に示す。ＰＡＭ／イオノマイシンで準最適刺激後、新しく分離したＴ細胞の２０％超が、ＩＦＮ‐γを発現した一方で、１％未満がＩＬ‐１０を発現した（すなわち、ＩＦＮ‐γ又はＩＬ‐１０のいずれかを発現した細胞の、９５％超がＩＦＮ‐γを発現し、そして５％未満がＩＬ‐１０を発現した）。しかしながら、ＳＢ６２３細胞又はＭＳＣのいずれかで７日間培養後、ＩＮＦ‐γ又はＩＬ‐１０のいずれかを発現する細胞の、９５％超がＩＬ‐１０を発現した一方で、５％未満がＩＦＮ‐γを発現した。従って、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞のいずれかとの共培養は、炎症性のものから抗炎症性のものに、Ｔ細胞セクレトームを転換した。
【０１２１】
炎症性サイトカインＩＦＮ‐γの分泌は、ヘルパーＴ細胞のＴH１サブセットの特徴を示し；一方で、ＩＬ‐１０分泌は、ＴH２細胞及びＴreg細胞の特徴を示す。従って、未感作Ｔ細胞とＳＢ６２３細胞又はＭＳＣの共培養に際して観察した、ＩＦＮ‐γ分泌からＩＬ‐１０分泌への変更は、ＴH１の豊富な集団の、大量のＴH２細胞、Ｔreg細胞、又は両方を含む集団への転換と一致する。この結果はまた、ＳＢ６２３細胞、又はＭＳＣとの共培養が、一部分において、Ｔ細胞によるサイトカイン産生の変更を通じて、炎症性集団（ＴH１細胞によって特徴付けられる）からより抗炎症性集団（ＴH２細胞及び／又はＴreg細胞によって特徴付けられる）にＴ細胞の分化を向けることを示す。
【０１２２】
実施例８：ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞共培養のＴ細胞によるＩＬ‐１７の産生に対する影響
ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞により分泌される公知の２つのサイトカイン、ＴＧＦβ‐１及びＩＬ‐６（上記実施例３を参照）は、また、Ｔｈ１７ヘルパーＴ細胞（すなわち、ＩＬ‐１７を分泌するヘルパーＴ細胞）の成長に役割を果たす。従って、Ｔ細胞を、Ｔｈ１７ヘルパーＴ細胞の成長を刺激することが知られている、ＩＬ‐２３の存在下培養し、そしてＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞との共培養のＴｈ１７細胞数に対する影響を測定した。
【０１２３】
これらの実験のために、実施例７に記載のように、ヒトＴ細胞を分離し、そして１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐２３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を添加して培養した。ブレフェルジンＡで、６時間処理後、細胞を採取し、固定し実施例７に記載のように透過処理し、ＰＥ‐コンジュゲート抗ＩＬ‐１７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。結果は、ＩＬ‐２３の存在下でのＴ細胞の培養が、ＩＬ‐１７発現細胞の数を増加したことを示した。また、Ｔ細胞とＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞との共培養は、ＩＬ‐２３の非存在下及び存在下の両方において、ＩＬ‐１７発現細胞の数の小さな増加をもたらした。
【０１２４】
実施例９：ＳＢ６２３細胞との共培養による単球の樹状細胞への分化の阻害
単球（ＣＤ１４を発現）の樹状細胞（ＣＤ１ａを発現）への成長の通常の進行は、インターロイキン‐４（ＩＬ‐４）及び顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）の存在下、単球を培養することにより、インビトロにおいて再現することができる。インビトロにおける単球との共培養の場合、ＭＳＣは、単球の樹状細胞への分化を阻止することができ、一部分では、効果は、ＭＳＣによるインターロイキン‐６（ＩＬ‐６）の分泌により媒介される。Chomaratら、（２０００）Nature Immunology 1:510-514; Djouadら、(2007) Stem Cells 25: 2025-2032。米国特許出願公開第２０１０／０２６６５５４号（２０１０年１０月２１日）を参照。ＭＳＣ及びＳＢ６２３によってまた分泌される、ＶＥＧＦは、また、樹状細胞分化に関係する。従って、ＳＢ６２３細胞の単球分化に対する影響を調べた。
【０１２５】
単球を、１０％ウシ胎児血清（Ｌｏｎｚａ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ）、２ｍＭのＬ‐グルタミン、２ｍＭのＬ‐ピルビン酸ナトリウム、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、４０ｎｇ／ｍｌのＧＭ‐ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を含むＲＰＭＩ‐１６４０（Ｍｅｉｄａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）において培養した。ＳＢ６２３細胞との共培養（又は対照として、ＭＳＣ）を、単球とＳＢ６２３細胞（又はＭＳＣ）の比率１０：１；すなわち、１００，０００の単球対１０，０００のＳＢ６２３細胞又はＭＳＣで行った。培養（共培養）７日後、トリプシン／ＥＤＴＡ（上記のように）使用して細胞の一部を採取し、ＰＥ‐コンジュゲート抗ＣＤ‐１４抗体及びＦＩＴＣ‐標識抗ＣＤ１ａ抗体（両方ともｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と一緒にインキュベートした。収集及び分析を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏ（商標）ソフトフェアを使用して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）セルソーターを使用して（両方とも、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）行った。培養物の他の部分を、位相差顕微鏡によって観察した。
【０１２６】
セルソーティング分析の結果（図１８）は、ＳＢ６２３細胞又はＭＳＣとの共培養の後に、ＣＤ１４+細胞（すなわち、単球のより高い分画）のより高いパーセンテージを示した。さらに、効果は、単球をＳＢ６２３と培養した場合、ＭＳＣとの共培養と比較して、大きかった。また、より少ないＣＤ１ａ+樹状細胞を、共培養において観察した。これらの結果は、ＳＢ６２３細胞（及びより少ない程度にＭＳＣ）が単球の樹状細胞への分化を阻害することができることを示す。
【０１２７】
顕微鏡分析は、これらの観察結果を裏付けた。単球培養物において、樹状細胞の集団を、顕微鏡により容易に観察したが；ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞との共培養物において、そのような集団をほとんど観察しなかった。
【０１２８】
実施例１０：ＳＢ６２３細胞との共培養による樹状細胞の成熟阻害
単球から分化後、樹状細胞は、ＣＤ８６表面マーカーを発現する細胞へと成熟する。この成熟を、腫瘍壊死因子‐アルファ（ＴＮＦ‐α）の存在下、樹状細胞を培養することによりインビトロで再現することができる。ＩＬ‐６及びＶＥＧＦが、樹状細胞の成熟を阻止することを示す。Parkら、(2004) J. Immunol. 173: 3844-3854; Takahashiら、(2004) Cancer Immunol. Immunother 53: 543-550。ＳＢ６２３細胞がこれらのサイトカインの両方を分泌するので、ＳＢ６２３共培養の樹状細胞分化に対する影響を調べた。
【０１２９】
ＳＢ６２３細胞の共培養の樹状細胞の成熟に対する影響を評価するために、単球を末梢血から取得し、実施例９に記載のように樹状細胞にインビトロで分化した。培養５日後、ヒトＴＮＦ‐α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を、１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で培養物に添加した。いくつかの培養物において、ＳＢ６２３細胞又はＭＳＣをまた、この時点で添加した。すべてのサンプルは、１０5単球及び、共培養物において１０4ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞を含んだ。対照として、樹状細胞のＣＤ８６+状態への成熟を阻害する、シクロスポリンＡを、１μｇ／ｍｌの最終濃度でＴＮＦ‐α刺激培養物に添加した。２日後、細胞をＰＥ‐コンジュゲート抗ＣＤ８６抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒセルソーターで行いそしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏ（商標）ソフトウェアを使用して（両方とも、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）分析した。
【０１３０】
図１９に示す結果は、ＴＮＦ‐α成熟樹状細胞の有意な分画が、ＣＤ８６を発現し、そしてこの分画が、予想した通り、シクロスポリンでの処理により低下することを示す。ＳＢ６２３細胞及びＭＳＣでの共培養がまた、ＣＤ８６+細胞の分画を低下する。特に、ＣＤ８６発現により測定したように、ＳＢ６２３細胞は、ＭＳＣよりも樹状細胞成熟に対するより強い阻害効果を有する。
【０１３１】
実施例１１：ＳＢ６２３細胞との共培養による単球／マクロファージの分泌プロファイルの変化
ＣＤ１４細胞表面マーカーを発現するヒト末梢血単球（すなわち、マクロファージ前駆体）を、抗ＣＤ１４コート磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、磁気選択により軟膜の細胞から得た。ＣＤ１４+単球の分離培養物を、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）に暴露して、それらをＭ１（炎症性）マクロファージに転換し；又はマクロファージコロニー刺激因子に暴露して、それらをＭ２（抗炎症性）マクロファージに転換し；又はＳＢ６２３細胞又はＭＳＣのいずれかと共培養した。
【０１３２】
腫瘍壊死因子‐アルファ（ＴＮＦ‐α、Ｍ１マクロファージを特徴付ける炎症性サイトカイン）及びインターロイキン１０（ＩＬ‐１０、Ｍ２マクロファージを特徴付ける抗炎症性サイトカイン）を発現する細胞のパーセンテージを、これらの培養物において、以下のように決定測定した。培養物を、１００ｎｇ／ｍｌの細菌性リポ多糖（ＬＰＳ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に２４時間暴露した。ＬＰＳに対する暴露の最後の６時間、ブレフェルジンＡ及びモネンシン（両方とも、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；及び両方とも、１：１，０００希釈で使用した）を培養物に添加した。細胞を、次に、ＰＥ‐コンジュゲート抗ＴＮＦα又はＦＩＴＣ‐コンジュゲート抗ＩＬ‐１０のいずれかで染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。
【０１３３】
図２０に示すこれらの研究結果は、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞との共培養が、培養物において、抗炎症性サイトカインを産生した単球の分画を増加したことを示した。ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞との共培養は、ＧＭ‐ＣＳＦに対する暴露のように、ＴＮＦ‐αを産生した細胞のパーセンテージを増加しなかった（図２０Ａ）。特に、抗炎症性サイトカインＩＬ‐１０を発現する細胞のパーセンテージを、単球をＭＳＣと共培養した場合、増加し、そしてＳＢ６２３細胞と共培養した場合、さらにもっと増加した（図２０Ｂ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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