(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
男性被験体の精子における、正常なGALNTL5タンパク質が発現されなくなるか、又は発現量が正常男性の精子における発現量よりも少なくなるGalntl5遺伝子の発現異常を指標に精子無力症を検出する、精子無力症の検出方法。
【請求項２】
男性被験体の精子におけるGALNTL5タンパク質を定量し、GALNTL5タンパク質の発現量を指標に精子無力症を検出する方法であって、GALNTL5タンパク質が存在しないか、又は正常男性の精子に含まれるGALNTL5タンパク質に比較して少ない場合に精子無力症であると判断する、請求項１に記載の精子無力症の検出方法。
【請求項３】
抗GALNTL5抗体を用いてGALNTL5タンパク質を測定する、請求項２記載の精子無力症の検出方法。
【請求項４】
精子のGalntl5遺伝子の発現の正常男性の精子における発現と比較した際の減少を生じさせる変異の有無を検出することを含む請求項１又は２に記載の精子無力症の検出方法。
【請求項５】
精子のGALNTL5タンパク質の発現の正常男性の精子における発現と比較した際の減少を生じさせる変異がヘテロである、請求項４に記載の精子無力症の検出方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項の精子無力症の検出方法において用いる、抗GALNTL5タンパク質抗体を含む精子無力症検出キット。
【請求項７】
ヒト又はマウスGALNTL5タンパク質の断片ペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトGALNTL5タンパク質の54番目〜72番目のアミノ酸配列QQIIYGSEQIPKPHVIVKR（配列番号８）、配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトGALNTL5タンパク質の282番目〜297番目のアミノ酸配列FKWDNVFSYEMDGPEG（配列番号９）、配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトGALNTL5タンパク質の362番目〜377番目のアミノ酸配列SKKQTGKPSTIISAMT（配列番号１０）、配列番号４のアミノ酸配列からなるマウスGALNTL5タンパク質の42番目〜58番目のアミノ酸配列LLKKRSLGKNAHQQTRH（配列番号５）、配列番号４のアミノ酸配列からなるマウスGALNTL5タンパク質の263番目〜278番目のアミノ酸配列LRWDNVFAYELDGPEG（配列番号６）又は配列番号４のアミノ酸配列からなるマウスGALNTL5タンパク質の342番目〜358番目のアミノ酸配列SKALSQHRRANQSALS（配列番号７)からなる断片ペプチドに対する抗GALNTL5タンパク質抗体を含む、請求項６記載の精子無力症検出キット。
【請求項８】
精子のGalntl5遺伝子の全部又は一部が欠損し、GALNTL5タンパク質発現が喪失しているか、又は低下している、精子無力症非ヒトモデル動物。
【請求項９】
Galntl5遺伝子の欠損が、ヘテロ欠損である請求項８記載の精子無力症非ヒトモデル動物。
【請求項１０】
マウスである、請求項８又は９に記載の精子無力症非ヒトモデル動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は男性不妊症の原因因子検出及びヒト男性不妊症モデル非ヒト動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
男性不妊の原因は１）精巣での精子形成障害、２）精子輸送路の閉塞、３）前立腺炎及び４）勃起・射精障害に分けられるが、このうち２）〜４）に関しては診断が可能でそれぞれ治療法が確立されている。これに対し、男性不妊症の９０％を占める精子形成障害は、遺伝子異常により引き起こされると考えられているが、その原因因子を特定する手法は全く確立されていない。正確な原因因子検査手法の確立は、今後の生殖医療の発展といったライフイノベーションに繋がると共に、少子化の阻止という意味でも社会に大いに還元できる可能性を有している。
生物の精子形成研究の歴史は長く、これまで様々なアプローチで研究が進められてきた。近年、哺乳類では遺伝子改変マウスの作成によって、多くの遺伝子が精子形成に寄与していることが明らかになってきたが、ヒト精子形成障害を引き起こす遺伝子変異を同定した例はほとんど報告されていない。
本発明者らは、ヒトゲノムからタンパク質に糖を付加する糖転移酵素遺伝子の同定を試みてきた。その中で、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型Ｏ−結合型糖鎖の合成をスタートさせる糖転移酵素であるポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子（ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ）は、ヒトのゲノム中に２０個存在することが報告されている。この遺伝子ファミリーに分類されるが、他のｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ遺伝子に共通して存在するＣ末レクチン構造を欠失した特徴を持ち、ヒト精巣特異的に発現する糖転移酵素様の新規遺伝子ＧＡＬＮＴＬ５を同定することに本発明者らは成功した。その発現様式からＧＡＬＮＴＬ５が精子形成あるいは精子と卵子との受精機構に寄与する遺伝子と推測されることから、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質、遺伝子を特許申請している（特許文献１を参照）。一方、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の糖転移酵素活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現できないことから、これまでに本遺伝子の精子形成における機能を推測するには至っていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−１４８５９４号公報
【発明の概要】
【０００４】
本発明はＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の変異又はＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現異常を指標に男性不妊症を検出する方法の提供、及びＧＡＬＮＴＬ５遺伝子に変異が導入されたヒト男性不妊症モデル動物の提供を目的とする。
これまでの精子形成障害による男性不妊症診断は、顕微鏡観察下での精液検査で、精子濃度、精子運動性、精子正常形態率のみで診断される。そのため的確な臨床的治療法の開発を行うこと無く、顕微授精による不妊治療のみが治療手段として選択されるのが現状であった。
本発明者らは精子形成過程特異的に発現するＧＡＬＮＴＬ５遺伝子が変異し、正常なＧＡＬＮＴＬ５タンパク質が形成されなくなることにより、精子の運動性が低下し、男性不妊となることを見出した。その結果、ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の変異を検出し、あるいはＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現量を測定することにより、男性不妊症の原因を診断することができることを見出した。
さらに、本発明は非ヒト動物において、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子を欠損させることにより、精子の運動性が低下し、ヒト男性不妊症のモデル動物を作出することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  男性被験体の精子におけるＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の発現異常を指標に男性不妊症を検出する、男性不妊症の検出方法。
［２］  男性被験体の精子におけるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質を定量し、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現量を指標に男性不妊症を検出する、［１］の男性不妊症の検出方法。
［３］  抗ＧＡＬＮＴＬ５抗体を用いてＧＡＬＮＴＬ５タンパク質を測定する、［２］の男性不妊症の検出方法。
［４］  精子のＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の発現の減少を生じさせる変異の有無を検出することを含む［１］又は［２］の男性不妊症の検出方法。
［５］  変異がＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の第３イントロンと第４エクソンの間のスプライシングアクセプター部位ＡＧのＧＧへの変異である、［４］の男性不妊症の検出方法。
［６］  変異がＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の第６エクソンの第１０６番目のＴの欠失である、［４］の男性不妊症の検出方法。
［７］  精子のＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現の減少を生じさせる変異がヘテロである、［１］〜［６］のいずれかの男性不妊症の検出方法。
［８］  男性不妊症が、精子無力症である［１］〜［７］のいずれかの男性不妊症の検出方法。
［９］  ［１］〜［８］のいずれかの男性不妊症の検出方法において用いる、男性不妊症検出用抗ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体。
［１０］  ［９］の抗ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体であって、ヒト又はマウスＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の断片ペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の５４番目〜７２番目のアミノ酸配列ＱＱＩＩＹＧＳＥＱＩＰＫＰＨＶＩＶＫＲ（配列番号８）、配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の２８２番目〜２９７番目のアミノ酸配列ＦＫＷＤＮＶＦＳＹＥＭＤＧＰＥＧ（配列番号９）、配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の３６２番目〜３７７番目のアミノ酸配列ＳＫＫＱＴＧＫＰＳＴＩＩＳＡＭＴ（配列番号１０）、配列番号４のアミノ酸配列からなるマウスＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の４２番目〜５８番目のアミノ酸配列ＬＬＫＫＲＳＬＧＫＮＡＨＱＱＴＲＨ（配列番号５）、配列番号４のアミノ酸配列からなるマウスＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の２６３番目〜２７８番目のアミノ酸配列ＬＲＷＤＮＶＦＡＹＥＬＤＧＰＥＧ（配列番号６）又は配列番号４のアミノ酸配列からなるマウスＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の３４２番目〜３５８番目のアミノ酸配列ＳＫＡＬＳＱＨＲＲＡＮＱＳＡＬＳ（配列番号７）で表される部分が有するエピトープを含む配列からなる断片ペプチドを動物に免疫することにより得られる、該断片ペプチドが有するエピトープを特異的に認識する抗ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体。
［１１］  ＱＱＩＩＹＧＳＥＱＩＰＫＰＨＶＩＶＫＲ（配列番号８）、ＦＫＷＤＮＶＦＳＹＥＭＤＧＰＥＧ（配列番号９）及びＳＫＫＱＴＧＫＰＳＴＩＩＳＡＭＴ（配列番号１０）、ＬＬＫＫＲＳＬＧＫＮＡＨＱＱＴＲＨ（配列番号５）、ＬＲＷＤＮＶＦＡＹＥＬＤＧＰＥＧ（配列番号６）又はＳＫＡＬＳＱＨＲＲＡＮＱＳＡＬＳ（配列番号７）で表わされるアミノ酸配列からなる断片ペプチド。
［１２］  ［１］〜［８］のいずれかの男性不妊症の検出のための、ヒトＧＡＬＮＴＬ５遺伝子のＤＮＡ断片ポリヌクレオチド。
［１３］  ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いられるプライマーである［１２］のポリヌクレオチド。
［１４］  ［１］〜［８］のいずれかの男性不妊症の検出のための、［９］又は［１０］の抗ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体を含む検出キット。
［１５］  ［１］〜［８］のいずれかの男性不妊症の検出のための、［１２］又は［１３］のポリヌクレオチドを含む検出キット。
［１６］  精子のＧａｌｎｔｌ５遺伝子の全部又は一部が欠損し、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質発現が喪失しているか、又は低下している、男性不妊症非ヒトモデル動物。
［１７］  Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子の欠損が、ヘテロ欠損である［１６］記載の男性不妊症非ヒトモデル動物。
［１８］  マウスである、［１６］又は［１７］の男性不妊症非ヒトモデル動物。
［１９］  細胞に相同組換えを行い、相同組換えが起こった組換え細胞をネガティブ選択により選択する方法であって、相同組換えの際に相同組換え領域の外側にＧａｌｎｔｌ５遺伝子をネガティブ選択マーカー遺伝子として導入し、相同組換え後に生存した細胞を選択することを含む方法。
［２０］  Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子からなる、相同組換えが起こった細胞を選択するためのネガティブ選択マーカー。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１２−０３３２７３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１−１は、ヒトＧＡＬＮＴＬ５タンパク質（４４３アミノ酸）の構造を示す図である。
図１−２は、ヒト組織及びヒト細胞株におけるＧＡＬＮＴＬ５遺伝子転写物のリアルタイムＰＣＲによる定量的解析の結果を示す図である。
図１−３は、マウスＧａｌｎｔｌ５オーソログ遺伝子のアンチセンスＲＮＡを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す図である。図１−３ａがセンス鎖を用いた結果、図１−３ｂがアンチセンス鎖を用いた結果を示す。図１−３ｃはアンチセンス鎖を用いた像の拡大図を示す。
図２は、成体マウス生殖細胞のＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の局在を示す図である。図２ａ、２ｂ、２ｃは精子形成過程のそれぞれステージＩＩＩ、ＶＩ及びＶＩＩの結果を示す。図２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇは精巣上体精子におけるそれぞれ、抗ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体染色、ＰＮＡ染色及びＤＡＰＩ染色の拡大図を示し、図２ｇはマージした像を示す。
図３−１は、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子改変マウスの作成に用いたベクターの構造を示す図である。
図３−２は、相同組換えにより樹立したＧａｌｎｔｌ５遺伝子欠損ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡの遺伝子型をサザンブロットにより調べた結果を示す図である。
図３−３は、相同組換えにより樹立したＧａｌｎｔｌ５遺伝子欠損ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡの遺伝子型をＰＣＲにより調べた結果を示す図である。
図３−４は、Ｗｔマウス及びＨｔマウスのゲノムＤＮＡの遺伝子型をＰＣＲにより調べた結果を示す図である。
図３−５は、Ｗｔマウス及びＨｔマウスの精巣上体精子のＧＡＬＮＴＬ５タンパク質量を示す図である。
図４−１は、Ｇａｌｎｔｌ５＋／＋Ｗｔマウス、Ｇａｌｎｔｌ５＋／−Ｈｔオスマウス、及びＧａｌｎｔｌ５＋／−Ｈｔメスマウスの妊性を示す図である。
図４−２は、Ｗｔマウス（ａ）又はＨｔマウス（ｂ）の精巣上体精子の形態を示す図である。
図４−３は、Ｗｔマウス精子及びＨｔマウス精子の精子数（ａ）、異常率（ｂ）、運動性（ｃ）、経路速度（ｄ）及び進行速度（ｅ）を示す図である。
図５は、抗ＧＡＬＮＴＬ５抗体を用いて精巣上体精子におけるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現を検出した結果を示す図である。図５ａはＷｔマウス精子の結果を、図５ｂ，ｃはＨｔマウス精子の結果を示す。
図６−１は、Ｗｔマウス及びＨｔマウスの精巣上体精子に存在する解糖系酵素群（ヘキソキナーゼ（ＨＸＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ２（ＰＧＫ２）及びフルクトース二リン酸アルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ））の存在を示す図である。
図６−２は、Ｗｔオスマウス（図６−２ａ）及びＨｔオスマウス（図６−２ｂ）の精子におけるＨＸＫの局在を示す図である。
図７は、ＷｔオスマウスとＨｔオスマウスの精巣上体精子が有するタンパク質の比較の結果を示す図である。
図８は、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質を強制発現させたＣＯＳ１培養細胞中のＣａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ、ＧＭ１３０、Ｇｏｌｇｌｉｎ−９７、ユビキチンの細胞内局在を示す図である。ａはＣａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎを、ｂはＧＭ１３０を、ｃはＧｏｌｇｌｉｎ−９７を、ｄはユビキチンの染色の結果を示す。
図９−１は、Ｗｔマウス精子とＨｔマウス精子におけるユビキチンの局在を示す図である。図９−１ａがＷｔマウス精子の結果を、図９−１ｂがＨｔマウス精子の結果を示す。
図９−２は、精巣上体精子溶解物をαチューブリン、ユビキチン、アクロシン、ＮＳＦ及びｔＡＣＥに対する抗体を用いて行ったウエスタンブロッティングで検出したマウス精巣上体精子中の先体タンパク質の発現を示す図である。
図１０は、Ｗｔマウス精子とＨｔマウス精子におけるアクロシンの局在を示す図である。図１０ａ及びｂはＷｔマウス精子の結果を、図１０ｃ及びｄはＨｔマウス精子の結果を示す。
図１１は、Ｗｔマウス精子とＨｔマウス精子におけるＮＳＦの局在を示す図である。図１１ａ及びｂはＷｔマウス精子の結果を、図１１ｃ及びｄはＨｔマウス精子の結果を示す。
図１２は、Ｗｔマウス精子とＨｔマウス精子におけるｔＡＣＥの局在を示す図である。図１２ａ及びｂはＷｔマウス精子の結果を、図１２ｃ及びｄはＨｔマウス精子の結果を示す。
図１３は、Ｗｔマウス精子とＨｔマウス精子におけるユビキチン及びＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の二重染色並びにユビキチン及びＵＢＣ３Ｂの二重染色の結果を示す図である。図１３ａはＷｔマウス精子のユビキチン及びＵＢＣ３Ｂの二重染色の結果であり、図１３ｂはＨｔマウス精子のユビキチン及びＵＢＣ３Ｂの二重染色の結果であり、図１３ｃはＷｔマウス精子のユビキチン及びＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の二重染色の結果であり、図１３ｄはＷｔマウス精子のＵＢＣ３Ｂ及びＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の二重染色の結果である。
図１４は、Ｗｔマウス精子におけるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質並びにＲａｂ２７ａ若しくはＭｙｏｓｉｎ  Ｖａの共局在を示す図である。図１４ａはＷｔマウス精子におけるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質及びＲａｂ２７ａの局在を示し、図１４ｂはＷｔマウス精子におけるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質及びＭｙｏｓｉｎ  Ｖａの局在を示し、図１４ｃはＷｔマウスの精巣内精子におけるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質及びＲａｂ２７ａの局在を示す。
図１５−１は、精子無力症と診断された患者を含む１０個体から採取した精子の構成タンパク質の検出の結果を示す図である。
図１５−２は、精子無力症と診断された患者の精子のＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の配列を示す図である。図中星印の部位は変異部位を示す。
図１５−３は、９個のエクソンを有するＧＡＬＮＴＬ５遺伝子中の変異の位置を示す図である。
図１５−４は、精子無力症と診断された患者を含む６人の精子（図１５−４ａ）及び血液細胞（図１５−４ｂ）のＧＡＬＮＴＬ５遺伝子のＰｓｔＩ制限酵素による消化を行った場合と行わなかった場合のＤＮＡフラグメントを示す図である。
図１６−１は、精子無力症と診断された患者を含む５個体から採取した精子についての構成タンパク質の検出の結果を示す図である。
図１６−２は、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の減少が観察された患者の精子、血液細胞のＧＡＬＮＴＬ５遺伝子をＰＣＲによって各エクソンを増幅させ塩基配列決定した結果を示し、第６エクソンの一部配列を示すものある。Ａは、正常な第６エクソンの遺伝子配列を示し、Ｂは欠失がある第６エクソンの遺伝子配列を示す。
図１６−３は、９個のエクソンを有するＧＡＬＮＴＬ５遺伝子中の変異の位置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
ヒトＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の塩基配列及びヒトＧＡＬＮＴＬ５タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１及び２に表わす。また、マウスＧａｌｎｔｌ５遺伝子の塩基配列及びマウスＧＡＬＮＴＬ５タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３及び４に表わす。
ヒト男性不妊症の検出
本発明のヒト男性不妊症の検出において対象とする男性不妊症は精子のＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の変異により、ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の発現異常が生じ、正常なＧＡＬＮＴＬ５タンパク質が発現されなくなること、又は発現量が少なくなることを原因とする男性不妊症であり、このような男性不妊症として精子無力症が挙げられる。すなわち、本発明の方法はヒト男性不妊症の原因因子を検出する方法でもある。本発明において、男性不妊症の検出は男性不妊症の原因因子を特定することも含む。
ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の変異はＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の塩基配列の変化をいい、該変化によりＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現が低下するか、又は発現したとしてもＧＡＬＮＴＬ５タンパク質が本来有する正常な機能が低下した若しくは正常な機能を喪失したＧＡＬＮＴＬ５タンパク質が発現されるようになる変異をいう。このようなＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の変異として、ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の総てまたは一部の欠失が挙げられる。ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子は９個のエクソンを有し、例えば、いずれかの１以上のエクソンにおける変異、すなわち、一塩基の欠失によりフレームシフトが起こり、正常なＧＡＬＮＴＬ５タンパク質が発現できなくなるような変異等が挙げられる。また、イントロンとエクソンの境目のスプライシングアクセプター部位又はスプライシングドナー部位における変異が挙げられる。スプライシングドナー部位は、イントロンの上流の末端（５’末端）にあり、通常ＧＴ配列からなる。スプライシングアクセプター部位は、イントロンの下流の端（３’末端）にあり、通常ＡＧ配列からなる。スプライシングドナー部位又はスプライシングアクセプター部位に変異が生じると、正常なスプライシングが起こらなくなり、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質が発現しなくなるか、あるいは正常なＧＡＬＮＴＬ５タンパク質が発現しなくなる。例えば、スプライシングアクセプター部位の配列に変異が生じるとエクソンスキップが生じる。一例として、第３イントロンと第４エクソンの境目のスプライシングアクセプター部位のＡＧ配列がＧＧ配列に変異した場合、第４エクソンがスキップされ、フレームシフトにより第５エクソン中に新たなストップコドンが出現し、正常なＧＡＬＮＴＬ５タンパク質が発現されることなく、発現が停止する。具体的には、ＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴ（配列番号２１）で表される第３イントロンと第４エクソンの境目のスプライシングアクセプター部位のＡＧ配列がＧＧ配列に変異し、ＴＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＧＴＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴ（配列番号２２）になった場合である。
また、第６エクソンに１塩基の欠失が生じ、ストップコドンが出現した場合も、正常なＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現が困難になる。具体的には、ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子をコードするＤＮＡの７３５番目から７９７番目のＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＣＣＣＴＧＡＴＡＧＡＴＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＡＴＡＧＡＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＡ（配列番号２３）で表される配列の７６４番目のＴ（第６エクソンの第１０６番目のＴ、配列番号２３の配列の２３番目のＴ）が欠失し、ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＡＴＡＧＡＴＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＡＴＡＧＡＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＡ（配列番号２４）となり、第６エクソン中にストップコドンが出現し、正常なＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現が不可能となる。
上記のＧＡＬＮＴＬ５遺伝子変異をヘテロで保持しているヒトが精子無力症を発症する。
ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子は精子形成過程特異的に発現する遺伝子であり、本発明の男性不妊症の検出方法においては、精子におけるＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の変異を検出し、あるいは精子におけるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現異常を検出すればよい。
男性不妊症の検出に利用する変異は、配列番号１に示すＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の塩基配列と男性不妊症患者の精子のＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の塩基配列を比較し、該変異によりＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現が異常になる変異を探索することにより、見出すことができる。
ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の変異の検出は、被験体より採取した精子よりＤＮＡ又はＲＮＡを抽出し、変異を検出すればよい。ＤＮＡ又はＲＮＡの検出は公知の方法により行うことができる。得られたＤＮＡ又はＲＮＡの変異の検出は、公知の方法で行うことができる。そのような方法としては、遺伝子変異部位に特異的なプライマーを用いる方法、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）を用いる方法、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法、直接配列決定法、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、ミスマッチ部位の化学的切断を利用した方法（ＣＣＭ）、プライマー伸長法（ＴａｑＭａｎ（登録商標）法）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＭＡＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法などを用いることができる。例えば、得られた被験体の精子ＤＮＡを鋳型として、変異が存在する部位を含む断片をＰＣＲで増幅し、その後配列を決定し、変異の有無を測定することができる。また、例えば、変異部位に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより変異の検出を行うことができる。この際、プローブの一端を基板に固定してＤＮＡチップ（マイクロアレイ）として使用できる。ＰＣＲ等には変異部位の３’側および５’側に存在する２種類の配列をプライマー対として用いることができる。また、変異部位に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行う方法においては、変異部位を含む連続した塩基配列からなるプローブを用いればよい。変異の検出に用いるプライマーやプローブ等のポリヌクレオチドを構成する塩基の数は５〜５０、好ましくは１０〜３３、さらに好ましくは１０〜３０、特に好ましくは１５〜２５である。また、上記遺伝子の塩基配列の変異部位を含む連続した塩基配列において、数個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１個又は２個、特に好ましくは１個のミスマッチを有するポリヌクレオチドも用いることができる。ポリヌクレオチドは、蛍光物質、酵素、放射性同位体、化学発光物質等で標識されていても良い。標識に用いる標識物質は、公知のものを用い、公知の方法で標識することができる。蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン、フルオレセイン等が挙げられる。本発明は、男性不妊症検出用のプライマーやプローブ等のポリヌクレオチドも包含する。
被験体の精子のＧＡＬＮＴＬ５遺伝子にＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現異常をもたらす変異が存在する場合に、該被験体はＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現異常による男性不妊症、すなわち、精子の運動性の低下又は喪失を原因とする男性不妊症である精子無力症であると判定することができる。
ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子に変異を有する精子におけるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現異常には、正常のＧＡＬＮＴＬ５遺伝子を有する精子と比較した場合の発現量の低下、発現の喪失が含まれる。発現の異常は被験体より採取した精子中のＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現量を測定すればよい。すなわち、被験体の精子からタンパク質を抽出しＧＡＬＮＴＬ５タンパク質を測定すればよい。ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現量の測定はＧＡＬＮＴＬ５タンパク質に対する抗体を用いて行うことができ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、イムノブロット法、イムノクロマトグラフィー、ラテックス凝集法等の抗原抗体反応を利用した測定法により測定すればよい。
ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の測定に用い得る抗体として、例えば後述の抗ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体が挙げられる。
また、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現異常によるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質量の減少に伴い、他の精子タンパク質の減少が認められる。すなわち、正常個体の精子において、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質は成熟精子形成に必須であるタンパク質の精子細胞内の分布を制御する機能を有しており、正常精子において精子アクロゾーム（先体）に共局在すべきタンパク質がＧＡＬＮＴＬ５が存在しないと精子先体へ輸送されなくなる。このため、精子先体タンパク質の量も減少する。ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質量の減少に伴い精子タンパク質の減少が現在明らかにされているタンパク質としては、解糖系酵素群（ヘキソキナーゼ（ＨＸＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ２（ＰＧＫ２）及びフルクトース二リン酸アルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ））、ユビキチン、アクロシン、ＵＢＣ３Ｂ、ＮＳＦ、ｔＡＣＥが挙げられる。精子におけるＧＡＬＮＬＴ５タンパク質の検出に加え、これらのタンパク質を同時に検出し、定量することにより、精子の運動性の低下の原因がＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の欠損によるものであるとより正確に判定することができる。これらの他のタンパク質はそれぞれのタンパク質に対する抗体を用いて検出することができる。本発明は、精子におけるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質及び解糖系酵素群（ヘキソキナーゼ（ＨＸＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ２（ＰＧＫ２）、フルクトース二リン酸アルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ））、ユビキチン、アクロシン、ＵＢＣ３Ｂ、ＮＳＦ及びｔＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１種、すなわち１、２、３、４、５、６、７又は８種を用いて男性不妊症を検出する方法をも包含する。また、抗ＧＡＬＮＴＬ５抗体と解糖系酵素群（ヘキソキナーゼ（ＨＸＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ２（ＰＧＫ２）、フルクトース二リン酸アルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ））、ユビキチン、アクロシン、ＵＢＣ３Ｂ、ＮＳＦ及びｔＡＣＥからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質に対する抗体を組み合わせて含む、男性不妊症検出のためのキットも包含する。
被験体から採取した精子に正常ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質が存在しないか、又は存在しても正常男性の精子に含まれる正常ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質に比較して少ない場合に、該被験体はＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現異常による男性不妊症、すなわち、精子の運動性の低下又は喪失を原因とする男性不妊症である精子無力症であると判定することができる。この際、正常男性の精子に含まれるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質量を測定し、該測定値に基づいてカットオフ値を設定し、被験体の精子のＧＡＬＮＴＬ５タンパク質量がカットオフ値より低い場合に、男性不妊症であると判定することができる。
本発明は、ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の欠損あるいはＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現異常を測定し、男性不妊症を検出するためのキットも包含する。該キットは遺伝子を検出する場合は、遺伝子の変異を検出するためのプライマーやプローブを含み、タンパク質を検出する場合は、抗ＧＡＬＮＴＬ５抗体を含む。また、精子からのＧＡＬＮＴＬ５遺伝子又はＧＡＬＮＴＬ５タンパク質を抽出するための試薬を含んでいてもよい。
本発明の男性不妊症の検出方法は、男性不妊症の診断のための検査方法ということもできる。また、本発明の方法により、精子のＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の変異又はＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現異常を検出することにより、精子の運動性等の精子の能力を予測することができる。
本発明の方法でＧＡＬＮＴＬ５遺伝子に異常があると判定された男性不妊症患者の精子は運動性が低下しており、該患者は精子無力症であると判断することができる。また、ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子に異常がある精子において卵子との試験管内での自然受精の効率を低下させる可能性が考えられるので、顕微授精法の中でも、特に卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）が有効である（表１マウスの実験から）。
ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の断片ポリペプチド及び抗ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体
本発明は抗ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体を含む。該抗体はＧＡＬＮＴＬ５タンパク質のエピトープを含む断片ペプチドを用いて作製することができる。該断片ペプチドをマウス、ウサギ、モルモット、ラット、ヤギ、ブタ、ウマ等の動物に免疫することにより作製できる。ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質のエピトープを含む断片ペプチドはポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子（ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ）ファミリーに属するＧａｌｎｔｌ５遺伝子以外の遺伝子がコードするタンパク質の構造に基づいて予測することができる。すなわち、例えばＧＡＬＮＴＬ１０タンパク質の立体構造を解析し、立体構造上分子の外側に位置しておりエピトープと認識される可能性の高い部位を含む断片を選択すればよい。選択した部位を含む断片とアミノ酸配列相同性の高いＧＡＬＮＴＬ５タンパク質のアミノ酸配列を含む断片をＧＡＬＮＴＬ５タンパク質のエピトープを含む断片ペプチドとして用いることができる。マウスＧＡＬＮＴＬ５タンパク質のエピトープを含む断片ペプチドとして、配列番号４のアミノ酸配列からなるマウスＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の４２番目〜５８番目のアミノ酸配列ＬＬＫＫＲＳＬＧＫＮＡＨＱＱＴＲＨ（配列番号５）、配列番号４のアミノ酸配列からなるマウスＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の２６３番目〜２７８番目のアミノ酸配列ＬＲＷＤＮＶＦＡＹＥＬＤＧＰＥＧ（配列番号６）又は配列番号４のアミノ酸配列からなるマウスＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の３４２番目〜３５８番目のアミノ酸配列ＳＫＡＬＳＱＨＲＲＡＮＱＳＡＬＳ（配列番号７）で表わされるアミノ酸配列からなる断片を挙げることができる。また、ヒトＧＡＬＮＴＬ５タンパク質のエピトープを含む断片ペプチドとして、配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の５４番目〜７２番目のアミノ酸配列ＱＱＩＩＹＧＳＥＱＩＰＫＰＨＶＩＶＫＲ（配列番号８）、配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の２８２番目〜２９７番目のアミノ酸配列ＦＫＷＤＮＶＦＳＹＥＭＤＧＰＥＧ（配列番号９）及び配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の３６２番目〜３７７番目のアミノ酸配列ＳＫＫＱＴＧＫＰＳＴＩＩＳＡＭＴ（配列番号１０）で表わされるアミノ酸配列からなる断片を挙げることができる。抗体はポリクローナル抗体もモノクローナル抗体も含む。ポリクローナル抗体は、例えば、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む断片ペプチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む断片ペプチド及び配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む断片ペプチドを同時に免疫して得た３種類の断片ペプチドに対する抗体が混合した抗体組成物、及び配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む断片ペプチド、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む断片ペプチド及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む断片ペプチドを同時に免疫して得た３種類の断片ペプチドに対する抗体が混合した抗体組成物も含む。
本発明は、（ｉ）配列番号５、６、７、８、９又は１０で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｉｉ）配列番号５、６、７、８、９又は１０で表わされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸残基１６〜３０個、好ましくは１７〜３０個、さらに好ましくは１９〜３０個からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号５、６、７、８、９又は１０で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するエピトープを含むＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の断片ポリペプチドを含む。
また、配列番号５、６、７、８、９又は１０で表わされるアミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加された配列でありエピトープを有しているアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含する。
上記ペプチドを用いて抗ＧＡＬＮＴＬ５抗体であって、上記ペプチドを特異的に認識し、結合する抗体を作製することができる。該抗体はＧＡＬＮＴＬ５の検出に用いることができる。本発明はＧＡＬＮＴＬ５の上記エピトープに対する特異的抗体をも包含する。
本発明の抗体には、望ましい活性（例えば、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質を認識して結合する活性）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。本発明の抗体のアミノ酸配列変異体は、本発明の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、本発明の抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域およびＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である。
改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。
また、本発明の抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数、位置、種類を変化させるなどの抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ−結合又はＯ−結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入又は欠失などの公知の方法で行うことができる。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子が欠損した、ヒト男性不妊症非ヒトモデル動物
さらに本発明はＧａｌｎｔｌ５遺伝子が欠損した、ヒト男性不妊症非ヒトモデル動物を包含する。本発明のヒト男性不妊症非ヒトモデル動物はＧａｌｎｔｌ５遺伝子のノックアウト動物である。非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、サル等を含み、好ましくは個体発生までの時間が短く繁殖が容易なマウス又はラット等のげっ歯類動物である。
本発明のヒト男性不妊症非ヒトモデル動物において、精子に特異的に存在するＧａｌｎｔｌ５遺伝子に人為的に変異が導入され、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現が異常になる。ここで、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現が異常になるとは、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質が発現しないか、又は発現しても正常なＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の機能を保持していないことをいう。その結果、精子の運動性が低下し、精子の卵への到達が困難になることにより、受精ができなくなり、不妊症となる。Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子の欠損とはＧａｌｎｔｌ５遺伝子が、正常なＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現が抑制されるように変異していることをいう。Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子の変異は、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子の全部又は一部を欠失させ、あるいはＧａｌｎｔｌ５遺伝子の任意の部位に他の遺伝子が挿入若しくは置換し、あるいはＧａｌｎｔｌ５遺伝子の全部が他の遺伝子で置換することにより導入することができる。変異は、公知の遺伝子工学の手法により、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子の塩基配列の全部を欠失させることにより導入することができる。また、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子の塩基配列の一部を欠失させたり、あるいはＧａｌｎｔｌ５遺伝子の塩基配列内に他の遺伝子を挿入したり、あるいはＧａｌｎｔｌ５遺伝子の塩基配列を部分的に他の遺伝子で置換したり、あるいはＧａｌｎｔｌ５遺伝子の全部を他の遺伝子で置換したりすることにより導入することができる。Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子の一部の欠失やＧａｌｎｔｌ５遺伝子の塩基配列内に他の遺伝子の挿入、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子を部分的に他の遺伝子で置換することにより、プロモーターやエクソンが破壊され、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現が異常になる。変異の導入は、例えば、部位特異的変異導入法や相同組換えにより行うことができる。例えば、エクソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子やｌａｃＺ（βガラクトシダーゼ遺伝子）、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子を挿入することによりエクソンを破壊することができる。また、イントロン部分にｐｏｌｙＡ付加配列等の遺伝子の転写を終結させるエレメントを挿入してもよい。例えば、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子の第２エクソンをネオマイシン耐性遺伝子で置換すればよい。相同組換えは、上記の他の遺伝子を相同組換えによりＧａｌｎｔｌ５遺伝子の一部又は全部と置換できるように設計されたターゲティングベクターを用いて公知の方法で行うことができる。
本発明のＧａｌｎｔｌ５遺伝子に変異を有する、ヒト男性不妊症非ヒト動物モデルを作出するためには、上記ターゲティングベクターを用いて非ヒト動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）のＧａｌｎｔｌ５遺伝子の少なくとも一方の対立遺伝子を破壊したＧａｌｎｔｌ５遺伝子欠損ＥＳ細胞を樹立する。ターゲティングベクターはエレクトロポレーション、マイクロインジェクション等の公知の方法でＥＳ細胞に導入することができる。ＥＳ細胞内のＧａｌｎｔｌ５遺伝子が欠損しているかは相同組換えに用いた薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子をマーカーとして選択することができる。樹立したＥＳ細胞を非ヒト動物の胚に移植する。この際、胚としては胚盤胞が用いられる。移植は例えば胚盤胞マイクロインジェクション法により行うことができる。次いで、胚盤法を非ヒト動物の仮親である偽妊娠メス動物に移植し、キメラ動物を得る。生殖系列キメラ動物と正常動物との交配によりＧａｌｎｔｌ５遺伝子のヘテロ（Ｈｔ）欠損動物を得ることができる。ヘテロ欠損オス動物はＧＡＬＮＴＬ５タンパク質発現に異常を有するため不妊である。一方、ヘテロ欠損メス動物は妊性を有している。そこで、ヘテロ欠損メス動物と野性型（正常）オス動物を交配することにより、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子ヘテロ欠損動物を得ることができる。得られた動物がＧａｌｎｔｌ５遺伝子のヘテロ欠損動物であるかどうかは、尾を含む体細胞組織及び生殖細胞である精子あるいは卵子からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲやサザンハイブリット法によって遺伝子型を同定し、判別する。また、得られた動物の精子からＲＮＡを単離して、ＲＴ−ＰＣＲやウエスタンブロッティング法で、動物の精子のＧａｌｎｔｌ５遺伝子とＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現量を調べる方法等により確認することができる。なお、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子ヘテロ欠損マウスは精子の運動性が低下しているために不妊であり、更に精子の自然受精能が保持されていない可能性があるため、体外授精法のうち顕微授精（卵細胞質内精子注入法）（ＩＣＳＩ）によりＧａｌｎｔｌ５遺伝子ヘテロ欠損オスの精子とＧａｌｎｔｌ５遺伝子ヘテロ欠損メスの卵を授精させることにより、両方の対立遺伝子のＧａｌｎｔｌ５遺伝子が欠損したホモ欠損動物を得ることができる。
得られた男性不妊症モデル動物はヒト精子無力症のモデル動物として、治療薬の開発等に用いることができる。
Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子のネガティブ選択マーカーとしての利用
現在ＥＳ細胞などに相同組換えによって遺伝子を組み込む際に、ポジティブ選択マーカーとしてネオマイシン遺伝子を、ネガティブ選択マーカーとして相同組換え領域の外側にチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子配列を挿入して、薬剤添加によって目的とした遺伝子相同組換え体を得る手法がとられている。Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子が発現するとゴルジ体の構造、機能に障害が生じ、発現した細胞が細胞死を起こす。従って、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子をネガティブ選択マーカーとして利用することができる。例えば、相同組換えの際に、相同組み換え領域の外側に発現誘導型のＧａｌｎｔｌ５遺伝子を導入することで、目的の遺伝子相同組み換えが起きなかった組み換え体の細胞は残されたＧａｌｎｔｌ５遺伝子の発現によって死滅する。Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子を相同組換えの際に用いるターゲティングベクターに組み込めばよい。本発明は、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子をネガティブ選択マーカーとして利用する方法、及びＧａｌｎｔｌ５遺伝子からなるネガティブ選択マーカーを包含する。Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子としては、ヒトＧＡＬＮＴＬ５遺伝子、マウスＧａｌｎｔｌ５遺伝子の他、他種動物由来のＧａｌｎｔｌ５遺伝子を用いることができる。マウスＧａｌｎｔｌ５遺伝子としては配列番号３に表す塩基配列からなる遺伝子を用いることができ、ヒトＧＡＬＮＴＬ５遺伝子としては配列番号１に表す塩基配列からなる遺伝子を用いることができる。また、配列番号３に表す塩基配列において１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列であって、該塩基配列がコードするタンパク質がＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の機能を有する遺伝子、並びに配列番号１に表す塩基配列において１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列であって、該塩基配列がコードするタンパク質がＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の機能を有する遺伝子もネガティブ選択マーカー遺伝子として用いることができる。
癌治療
培養細胞内でのＧＡＬＮＴＬ５タンパク質強制発現の結果から、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質は精子形成過程の細胞以外では、ゴルジ体を消失させ、細胞を死滅させる細胞性毒素となり得る物質であることが示された。実際に様々な癌由来を含む培養細胞で、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子の発現は全く観察されていない。従って、ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子を癌細胞特異的に死滅させるための治療遺伝子として用いることができる。ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子を癌治療に用いるためには、元来ヒトゲノムにコードされているＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の発現をがん細胞のみに選択的に発現させればよい。例えば、ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の発現を活性化する薬剤として、ヒストン脱メチル化剤などの使用が有効と考えられる。また、ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子をベクターに導入し、該ベクターを用いてＧＡＬＮＴＬ５遺伝子を癌細胞特異的にデリバリーし癌細胞中で特異的に発現させてもよい。遺伝子を被験体へ導入する方法として、ウイルスベクターを用いる方法及び非ウイルスベクターを用いる方法があり、種々の方法が公知である（別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、１９９６；別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社、１９９７；日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。
遺伝子導入のためのウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が挙げられる。癌細胞へのＧＡＬＮＴＬ５遺伝子デリバリーは、例えば癌細胞特異的な細胞表面タンパク質に特異的に結合し得る化合物をベクターに結合させることにより達成することができる。本発明はＧＡＬＮＴＬ５遺伝子を含む癌治療剤を包含する。該癌治療剤は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用しても良い。その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、数日又は数週間又は数ヶ月おきに１回あたり、０．００１ｍｇ〜１００ｍｇを皮下注射、筋肉注射、又は静脈注射によって投与すればよい。
実施例において、各材料の調製及び分析は以下の方法で行った。
１．ＧＡＬＮＴＬ５  ｃＤＮＡの同定
ヒトＧＡＬＮＴＬ５  ｃＤＮＡ（Ｒｅｆｓｅｑアクセッション番号：ＮＰ＿６６０３３５）を本発明者がクローニングしたヒトｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔｓをクエリーとして用い、ヒトｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇのＢＬＡＳＴサーチにより同定した。全長マウスＧａｌｎｔｌ５  ｃＤＮＡクローンは、マウス精巣ＱＵＩＣＫ−ＣｌｏｎｅＴＭ  ｃＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型に、５’−ＡＴＧＡＡＡＧＴＧＴＣＡＴＡＡＴＴＣＡＧＧＧ−３’（配列番号１１）及び５’−ＣＴＡＧＡＡＡＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＧＴＧＴＴＡＡＡＴＧＧ−３’（配列番号１２）のＰＣＲプライマーを用いて増幅させ、作成した。
２．ヒトＧＡＬＮＴＬ５転写産物の定量的分析
定量的リアルタイムＰＣＲはＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ  Ｌｔｄ．）を用いて行った（Ｉｗａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，１２８０２−９（２００２）；Ｔｏｇａｙａｃｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，２２０３２−４０（２００１）；Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３００，７３８−４４（２００３））。用いたＰＣＲプライマーの配列は、５’−ＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＴＣＧＡＡＡ−３’（配列番号１３）及び５’−ＧＣＧＧＧＣＴＧＧＧＴＡＡＴＧＴＴ−３’（配列番号１４）であった。
３．Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析
センス及びアンチセンスＲＮＡプローブを直鎖状マウス全長Ｇａｌｎｔｌ５  ｃＤＮＡから作製し、ジゴキシゲニン−ＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローニングした。成体マウス精巣の切片のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは藤原らの方法（Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１，１２２５８−６２（１９９４））に従って行った。
４．変異マウスの作出
マウスＧａｌｎｔｌ５遺伝子ゲノムＢＡＣクローンＲＰ２３−２２９Ｎ３はＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．より入手した。ターゲティングベクターを構築しＧａｌｎｔｌ５遺伝子の第２エクソンをネオマイシン抵抗性遺伝子で置換した。２０μｇのプラスミドをネオマイシン抵抗性線維芽細胞中で培養したＥ１４胚性幹細胞中にエレクトロポレーションにより導入した。Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ）及びガンシクロビル（ＷＡＫＯ）を用いた二重薬剤選択後、それぞれのコロニーをサザンブロッティング及びＰＣＲにより分析し相同組換えが生じたことを確認した。ＳｐｅＩによる消化の後、５’プローブによりノーマルアレルから１９．８ｋｂｐフラグメントを検出し、標的アレルから１９．８ｋｂｐフラグメント及び１４．６ｋｂｐフラグメントを検出した。胚性幹細胞及びマウスの尾について、ＰＣＲ及びＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により抽出したゲノムＤＮＡを用いて遺伝子型を決定した。野性型アレルはマウスＧａｌｎｔｌ５の第２エクソンに隣接する配列からなるプライマー６６０５Ａ（５’−ＧＡＧＡＣＣＴＴＡＧＣＴＴＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＣＡＣ−３’（配列番号１５）及びプライマー５９７０Ｓ（５’−ＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＴＣＣＧ−３’（配列番号１６））を用いて検出した。変異体アレルはｎｅｏ遺伝子の配列からなるプライマーＮｅｏＬｅｆｔ２５（５’−ＴＧＣＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＧ−３’（配列番号１７））及び３．４ｋｂｐの相同領域の３’末端の外側の第３イントロン中の配列からなるプライマーＡｖｒＨｉｎｄ２−２（５’−ＴＡＴＡＣＣＡＣＡＡＴＴＧＡＡＴＧＧＡＴＡＴＡＧＡ−３’（配列番号１８）を用いて同定した。
本発明において、得られたＧａｌｎｔｌ５遺伝子ヘテロ（Ｈｔ）欠損マウスをＨｔマウスと呼び、野性型マウスをＷｔマウスと呼ぶ。また、Ｈｔマウスの精子をＨｔマウス精子と呼び、Ｗｔマウスの精子をＷｔマウス精子と呼ぶ。
５．円形精子細胞の注入
精子形成細胞をＷｔオスマウス及びＨｔオスマウスの精巣から集めた（Ｏｇｕｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ４８，２１９−２５（１９９３））。伸長精子細胞をＨｔ成熟卵母細胞の卵細胞質中に圧電駆動マイクロマニピュレータを用いて直接注入した。培養４８時間後の４〜８細胞の大きさの胚を０．５日目に偽妊娠メスの卵管に移した。
６．精子運動性アッセイ
精子の運動性を評価するために、精子サンプルをマイクロスライド（０．１×２．０ｍｍ）に載せた。精子運動性パラメータを３００以上の精子を含むサンプル中でＩＶＯＳ  ＴＯＸ自動化システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｔｈｒｏｎｅ）を用いて測定した。
７．抗体
免疫染色等に以下の抗ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体を用いた。
マウスＧａｌｎｔｌ５  ｍＲＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列に基づいて３種類のポリペプチド（ＬＬＫＫＲＳＬＧＫＮＡＨＱＱＴＲＨ（配列番号５）、ＬＲＷＤＮＶＦＡＹＥＬＤＧＰＥＧ（配列番号６）、ＳＫＡＬＳＱＨＲＲＡＮＱＳＡＬＳ（配列番号７））を合成した。また、ヒトＧＡＬＮＴＬ５タンパク質のアミノ酸領域に対応した３種類のポリペプチド（ＱＱＩＩＹＧＳＥＱＩＰＫＰＨＶＩＶＫＲ（配列番号８）、ＦＫＷＤＮＶＦＳＹＥＭＤＧＰＥＧ（配列番号９）及びＳＫＫＱＴＧＫＰＳＴＩＩＳＡＭＴ（配列番号１０））を合成した。各ポリペプチドのＮ末端にシステインを付加し、キャリアーとコンジュゲートした。抗マウスＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体はモルモットを用いて、抗ヒトＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体はラビットを免疫して作製した。得られた抗血清をアフィニティーカラムを用いて精製した。抗ヒトＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体は最終的にＰｒｏｔｅｉｎ  Ａセファロースカラムを用いて精製した。α−チューブリン、ヘキソキナーゼＩ（ＨＸＫ  Ｉ）、フォスフォグリセレートキナーゼ１／２（ＰＧＫ１／２）、アルドラーゼＡ、ＮＳＦ、ＡＣＥ、ユビキチン、アクロシン、Ｒａｂ２７ａ、ＵＢＣ３Ｂ及びｍｙｏｓｉｎ  Ｖａに対する抗体は市販の抗体を用いた。
８．ウエスタンブロッティング
マウス精子を精巣上体尾部（ｃａｕｄａ  ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ）から集め、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁しＭａｋｌｅｒ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｓｅｆｉ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ．）を用いて計数した。ヒト精子は数回ＰＢＳで洗浄した精液から集めた。５×１０６個の精子からＲＩＰＡ溶解バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１％  ＮＰ−４０；１％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ；０．１％  ＳＤＳ）を用いてボルテックスによりタンパク質溶解物を得た。精巣は溶解バッファー中でホモジナイズし粗溶解物を得た。得られた溶解物を用いてウエスタンブロッティングを行った。
９．質量分析
５×１０５個の精子を１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ変性ゲル上で電気泳動した。タンパク質バンドは銀染色した。ゲルからタンパク質を溶出しトリプシン処理し、質量分析（Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋｓ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりペプチドの配列を分析し、ＭＳ−Ｆｉｔサーチプログラムを用いて分析した（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）。
１０．免疫蛍光顕微鏡観察
ｐＡｃＧＦＰ−Ｃ１  ＧＦＰレポーターベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＧＦＰ−ｍＧａｌｎｔｌ５構築物を作出した。カバースリップ上で増殖させたＣＯＳ１細胞を、リポフェクタミン２０００を用いてＧＦＰ−ｍＧａｌｎｔｌ５プラスミドＤＮＡにより一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトの４８時間後に細胞をメタノール中で２分間固定し、次いで室温で０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理を１分間行った。最終的に細胞を５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳでブロックした。一次抗体としてカルレティキュリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）、ＧＭ１３０及びＧｏｌｇｉｎ−９７に対する抗体を用い、Ａｌｅｘａ５９４で標識した２次抗体を用いた。上記カバースリップをスライドガラス上に載せＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤを用いてＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）染色し、核を対比染色した。蛍光顕微鏡及びデジタルカメラにより撮像した。
１１．免疫細胞化学
Ｍｉｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２４８，３３１−４２（２００２）に記載の方法で、精巣上体尾から集めた精子をカバースリップ上に載せ、ＰＢＳで洗浄後、精子をＡｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８又はＡｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４とコンジュゲートした二次抗体並びにフルオレセインイソチオシアネートとコンジュゲートしたＰＮＡと室温で３０分間インキュベートした。蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いて免疫染色を観察した。
１２．ヒト個体の組織のＰＣＲ及びＤＮＡ配列分析
ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出し、得られたゲノムＤＮＡ  ２０ｎｇを第４エクソンのプライマー（５’−ＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＡＡＡＧＡＧＣ−３’（配列番号１９及び５’−ＡＴＡＣＴＣＡＡＧＴＧＣＣＡＴＣＧＧＧＧ−３’（配列番号２０）及びＴａｋａｒａ  Ｔａｑ（登録商標）（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．）を混合しＰＣＲ増幅した。３０サイクル（９４℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分）の増幅を行い、アガロースゲルから産物を精製し、配列決定し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にサブクローニングした。
【実施例１】
【０００７】
Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子改変マウスの作成
Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニング（Ｎａｒｉｍａｔｓｕ，Ｈ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ  ２１，１７−２４（２００４）．）により、複数のヒトＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ遺伝子のクローニングを行い、ＧＡＮＮＴＬ５タンパク質をコードする新規のｐｐ−ＧａｌＮａｃ−Ｔ遺伝子を同定した。図１−１にヒトＧＡＬＮＴＬ５タンパク質（４４３アミノ酸）の構造を示す。比較のためにファミリータンパク質であるＧＡＬＮＴ１２（５８１アミノ酸）の構造も示す。ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質はＧａｌＮＡｃ−Ｔ遺伝子ファミリーのタンパク質に特有のＣ末端のレクチンドメインを欠失しているが、ｐｐ−ＧａｌＮＡ−Ｔ遺伝子ファミリーのタンパク質が有している典型的な他のモチーフ、すなわち膜貫通ドメイン（ＴＭ）、ステム領域（Ｓｔｅｍ）及びＧＴ１モチーフ及びＧａｌ／ＧａｌＮＡＣ−Ｔモチーフからなる触媒ユニットを有している。
図１−２に、２３種類のヒト組織及び２種類のヒト細胞株におけるＧＡＬＮＴＬ５遺伝子転写物の定量的解析の結果を示す。ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子転写物の量はＧＡＰＤＨでノーマライズし、１μｇのトータルＲＮＡ中のＧＡＰＤＨに対するコピー数で示す。図１−２に示すようにＧＡＬＮＴＬ５  ｍＲＮＡの発現はヒト精巣に限られていた。
次いで、精子形成等におけるＧａｌｎｔｌ５遺伝子の機能を明らかにすることを目的に、マウスゲノムに存在するＧａｌｎｔｌ５相同遺伝子に着目し、上記の「７．抗体」に記載の方法で、マウスＧＡＬＮＴＬ５タンパク質を特異的に認識する抗体を作成し、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の局在をマウス精巣切片および精巣上体精子を使って明らかにした。
成体マウスの精巣を材料にし、マウスＧａｌｎｔｌ５オーソログ遺伝子のアンチセンスＲＮＡを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。図１−３ａがセンス鎖を用いた結果、図１−３ｂがアンチセンス鎖を用いた結果を示す。図１−３ｃはアンチセンス鎖を用いた像の拡大図を示す。図１−３に示すように、Ｇａｌｎｔｌ５  ｍＲＮＡは主に円形精子細胞及び伸長精子細胞で発現しており、精細管の内被細胞では発現していなかった。
精細管の内被細胞は、精原細胞及び体細胞であるセルトリ細胞を含んでいる。マウス精巣切片の免疫組織化学によりＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の局在を調べた。すなわち、マウス成体の精巣の切片を抗ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体で免疫染色し、ヘキスト染色により対比染色した。結果を図２に示す。図２ａ、２ｂ、２ｃはそれぞれ精子形成過程のステージＩＩＩ、ＶＩ及びＶＩＩの結果を示す。図２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇはそれぞれ、抗ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体染色、ＰＮＡ染色及びＤＡＰＩ染色の拡大図を示し、図２ｇはマージした像を示す。ＰＮＡ染色により先体（アクロソーム）が染色され、ＤＡＰＩ染色により核が染色される。図２に示すように、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質は、主に細胞質及び分化精子細胞の先体（アクロソーム）の周囲に局在していた（図２ａ−ｃ）。ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質はまた精巣上体へ放出直前のｓｔｅｐ−１６精子細胞の残査小体中にも観察された（図２ｃ）。精巣上体精子中において、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質は尾部中片部（ｍｉｄｄｌｅ−ｐｉｅｃｅ）では微量に存在するか、頭部−尾部結合部位（ｈｅａｄ−ｔａｉｌ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）周囲の精子頚部に集積していた（図２ｄ）。これらの図により、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質は減数分裂後の精子形成過程の精子細胞質内に局在し、精巣上体成熟精子においては、精子尾部中間部に弱く点在する一方で、精子頚部に強く蓄積されることが示された（図２）。以上のＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の精子形成過程の精子細胞内局在等から、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子が精子形成に寄与している可能性が強く示された。
そこで、９個のエクソンから構成されるマウスＧａｌｎｔｌ５遺伝子の中で、翻訳開始部位がコードされている第２エクソンをネオマイシン耐性遺伝子に変換するベクターを構築した。図３−１にベクターの構造を示す。図３−１上はマウスＧａｌｎｔｌ５遺伝子を含む９個のエクソンの最初の３個を有する正常アレルを示す。図３−１中央は選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子（ＮＥＯ）及びチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）を含むターゲティングベクターの構造を示す。相同組換えは第１及び第３エクソンをそれぞれ含む６．０ｋｂｐの領域及び３．４ｋｂｐの領域で行った。図３−１下は翻訳開始領域を含む第２エクソンをＮｅｏカセットで置換した標的アレルを示す。図３−１において番号を付したボックスはエクソンを、点線は相同ＤＮＡ領域を、バー及び矢印は、それぞれ５’プローブ及びＰＣＲプライマー（６６０５Ａ、５９７０Ｓ、ＮｅｏＬｅｆｔ２５及びＡｖｒＨｉｎｄ２−２）の位置を示す。制限酵素部位はＡ（Ａｖｒ  ＩＩ）、Ｈ（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）、Ｐ（Ｐｍｌ  Ｉ）及びＳ（Ｓｐｅ  Ｉ）で表される。
上記のターゲティングベクターを用いて相同組換えによりＧａｌｎｔｌ５遺伝子欠損ＥＳ細胞を樹立し、ゲノムＤＮＡの遺伝子型をサザンブロットにより決定した。ＳｐｅＩで消化し、正常アレル及び標的アレルとして１９．８ｋｂ及び１４．５ｋｂのフラグメントを検出した（図３−２）。方法の欄の「４．変異マウスの作出」に記載した４つのプライマーを用いたＰＣＲによっても上記ＥＳ細胞の遺伝子型を決定した。正常アレルから０．７ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅され、標的アレルから４．４ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅された（図３−３）。また、マウスの尾からＤＮＡを精製しＰＣＲにより遺伝子型を決定した（図３−４）。さらに、Ｗｔマウス及びＨｔマウスの精巣上体精子のＧＡＬＮＴＬ５タンパク質量をウエスタンブロッティングにより測定した。図３−５に示すように、Ｈｔマウス精子のＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の量はＷｔマウス精子の半分以下であった。
方法の欄の「４．変異マウスの作出」に記載した方法で樹立した遺伝子組み換えＥＳ細胞をマウス胚に導入する手法で、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子欠損マウスの作成を試み、導入した遺伝子組み換えＥＳ細胞が生殖細胞に分化したと推測される７匹のキメラオスマウス個体を獲ることに成功した。しかし、すべてのキメラオスマウスが妊性を示さないことから、遺伝子組み換えマウス系統を確立することは困難を極めた。そこで遺伝子組み換えＥＳ細胞が導入されたキメラメスマウスを正常オスマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）と交配しＧａｌｎｔｌ５遺伝子ヘテロ（Ｈｔ）欠損マウスの仔を産出することに成功した。Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子Ｈｔメスマウスは妊性に異常が観察されないことから、以後Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子Ｈｔメスマウスと正常オスマウスとの交配でＧａｌｎｔｌ５遺伝子欠損Ｈｔマウスの系統を維持することとした。図４−１にオスマウスの妊性を検討した結果を示す。図４−１はＧａｌｎｔｌ５＋／＋Ｗｔマウス、Ｇａｌｎｔｌ５＋／−Ｈｔオスマウス、及びＧａｌｎｔｌ５＋／−Ｈｔメスマウスの妊性を示す。図に示すように、系統が確立されたＧａｌｎｔｌ５遺伝子Ｈｔ欠損オスマウスはキメラオスマウス同様、妊性を示さなかった。Ｈｔマウスが雄性不妊である原因を調べるために、精子観察を試みた結果、頭部形状の異常頻度が高いことがわかった。図４−２ａ及び４−２ｂはＷｔマウス又はＨｔマウスの精巣上体の精子の形態を示す。図４−２ｂ中の矢はＨｔオスマウスの変形した精子を示す。また、図４−３ａ〜図４−３ｅにＷｔマウス精子及びＨｔマウス精子の精子数、異常率、運動性、経路速度（ｐａｔｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ）及び進行速度（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ）を示す。図に示すように、精子が尾を振ることによる運動能に障害があることが示された（図４−３ｃ、ｄ及びｅ）。表１にＷｔオスマウス又はＨｔオスマウスの伸長精子細胞を注入することにより得られた胚の数等を示す。表１に示すようにＨｔオスマウス精子を使った顕微授精法（ＩＣＳＩ：卵細胞質内精子注入法）を行ったところ、Ｈｔオスマウス精子でも正常オスマウス精子と仔の産出数に差がないことから、Ｈｔオスマウスが雄性不妊を示す原因は精子運動能の障害であることが明らかになった。
【表１】
0005954800.tif 000002
また、抗ＧＡＬＮＴＬ５抗体を用いて精巣上体精子におけるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現を検出した。結果を図５に示す。図５ａはＷｔマウス精子の結果を、図５ｂ，ｃはＨｔマウス精子の結果を示す。図に示すようにＷｔマウス精子においては、尾部中片部で弱い発現が認められ、頭部−尾部結合部位において強い発現が認められた。Ｈｔマウス精子においては、Ｗｔマウス精子よりも発現は弱かった。
更に生化学的な実験によって、Ｈｔマウス精子の運動能低下は精子運動能に必須なエネルギー産生解糖系酵素の所有量低下に起因していることを突き止めた。図６−１及び６−２はＷｔマウス及びＨｔマウスの精巣上体の精子に存在する解糖系酵素群（ヘキソキナーゼ（ＨＸＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ２（ＰＧＫ２）及びフルクトース二リン酸アルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ））の検討の結果を示す。図６−１は、それぞれの遺伝子型のオスマウスからの精子溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し抗ＨＸＫ抗体、抗ＰＧＫ２抗体及び抗ＡＬＤＯＡ抗体を用いて検出した結果を示す。αチューブリンをコントロールとした。図６−２ａ及び６−２ｂは、Ｗｔオスマウス（図６−２ａ）及びＨｔオスマウス（図６−２ｂ）の精子におけるＨＸＫの局在を示す。ＨＸＫの局在は抗ラビットＩｇＧ免疫蛍光二次抗体を用いて可視化して検出した。先体はＰＮＡで染色し、核はＤＡＰＩで染色した。図に示すように、ＨｔオスマウスにおいてＨＸＫは少なかった。図７にＷｔオスマウスとＨｔオスマウスの精巣上体の精子が有するタンパク質の比較の結果を示す。ＭＳ／ＭＳ分析によりタンパク質を同定した。各タンパク質量の比較は精子タンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色することにより行った。（図６−１、６−２及び７）。これらの結果は、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子のハプロ欠損は正常精子が有している解糖系の酵素レベルを低下することにより精子の運動性が抑制されることを示している。
このＨｔマウス精子の運動能障害の表現型は、ヒト男性不妊症で見られる精子無力症と非常に良く似ていることから、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子Ｈｔ欠損オスマウスは、精子幹細胞異常を起因とする男性不妊症の治療薬開発等を目的として、精子無力症疾患モデルマウスとして有効利用が可能である。
【実施例２】
【０００８】
ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の機能検定
ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔタンパク質は細胞内のゴルジ体に局在し、糖転移酵素として機能する。ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質は他のｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ遺伝子ファミリーのタンパク質と同様にＧＴ１モチーフ及びトランスメンブレン（ＴＭ）ドメインを有しているが、Ｃ末端のレクチンドメインを欠失している（図１−１）。ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質のトランスメンブレンドメインはＧＡＬＮＴＬ５タンパク質がゴルジ体に存在していることを少なくとも示している。このようにＣ末レクチン構造の欠失を除いては、他のｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔと高い相同性を示すＧＡＬＮＴＬ５タンパク質も他のｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔタンパク質と同様にゴルジ体に局在すると予想されたが、実際に抗マウスＧＡＬＮＴＬ５タンパク質抗体によるマウス精巣切片を用いた免疫染色では、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質が形態形成過程の精子細胞内ゴルジ体に局在する像は観察されなかった。そこで、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の細胞内局在を確認するために、ＧＦＰタンパク質タグを付加したＧＡＬＮＴＬ５タンパク質をＣＯＳ１細胞に強制発現することを試みた。一過性の発現用のプラスミドは以下の方法で作製した。一般に市販されているｐＡｃＧＦＰ−Ｃ１  ＧＦＰレポーターベクター（クローンテック社）にマウスＧａｌｎｔｌ５のｃＤＮＡを導入してＧＦＰ−Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子発現ベクターを構築した。細胞への導入法は方法の欄の「１０．免疫蛍光顕微鏡観察」に記載した通りであった。ＧＦＰ−ｍＧａｌｎｔｌ５プラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞を小胞体マーカーであるカルレティキュリン（Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）、ｃｉｓゴルジ体マーカーであるＧＭ１３０、ｔｒａｎｓゴルジ体マーカーであるＧｏｌｇｌｉｎ−９７及びユビキチンに対する抗体を用いて蛍光免疫染色した。図８にＧＡＬＮＴＬ５タンパク質を強制発現させたＣＯＳ１培養細胞中のＣａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ、ＧＭ１３０、Ｇｏｌｇｌｉｎ−９７、ユビキチンの細胞内局在を示す。図８ａ、８ｂ、８ｃ及び８ｄは、それぞれＣａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ、ＧＭ１３０、Ｇｏｌｇｌｉｎ−９７、ユビキチンの染色の結果を示す。
酵素活性が確認され、ゴルジ体での局在が報告されているｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ遺伝子ファミリーに属するＧＡＬＮＴ３タンパク質がゴルジ体に局在することが確認できた。その一方で、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質は小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体に局在せず、核周辺部の細胞内に留まることが示された（図８）。興味深いことに、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質を強制発現した細胞は、Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ（ＥＲマーカー）は正常であるにもかかわらず、ゴルジ体マーカーの消失が観察された（図８ａ）。これまで安定したＧＡＬＮＴＬ５タンパク質発現細胞株の樹立を試みてきたが、成功に至っておらず、本実施例によってＧＡＬＮＴＬ５タンパク質発現はゴルジ体の構造、機能維持に障害を生じさせ、細胞を死滅させる効果を持つ、細胞にとって毒性を示す物質であることが明らかになった。一方、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の発現が観察される精子細胞は、精子形成過程でゴルジ体は収縮し、ゴルジ体は最終的に精子細胞から残査小体によって取り除かれる細胞内器官であることから、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質が精子形成過程の精子細胞内でのゴルジ体収縮、あるいはゴルジ体から精子細胞特有の膜構造体、先体へのタンパク質輸送切り替えを担っている可能性が推測された。実際に、ＧＦＰタグ付きＧＡＬＮＴＬ５タンパク質のシグナルが細胞内小胞あるいは顆粒状の形態で観察され（図８）、興味深いことに、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質によって形成される小胞にユビキチンシグナルが梱包されている像が観察された（図８ｄ）。
以上の培養細胞での結果は、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質が精子形成過程における精子細胞特有の膜構造体である先体へのタンパク質輸送に寄与していることを示唆している。
Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子のノックダウンはユビキチン化したタンパク質を含む先体の構成タンパク質を損傷することが予測された。そこで、ゴルジ体から精子細胞特有の膜構造体である先体に輸送されるアクロシン（Ａｃｒｏｓｉｎ）を代表とする先体タンパク質の局在量をＷｔマウス精子とＨｔマウス精子間で比較した。
図９〜１４に結果を示す。
図９−１にはユビキチンの局在を示す。図９−１ａ及びｂは、抗ユビキチン抗体を用いて検出した精巣上体精子のユビキチンの局在を示し、図９−１ａがＷｔマウス精子の結果を、図９−１ｂがＨｔマウス精子の結果を示す。図９−２は、精巣上体精子溶解物をαチューブリン、ユビキチン、アクロシン、ＮＳＦ及びｔＡＣＥに対する抗体を用いて行ったウエスタンブロッティングで検出したマウス精巣上体精子中の先体タンパク質の発現を示す。予測されたとおり、ユビキチンのシグナルはＨｔマウスの精子の先体では欠失していた。
図１０はＷｔマウス精子とＨｔマウス精子の抗アクロシン抗体を用いて測定したアクロシンの局在を示す。図１０ａ及びｂはＷｔマウス精子の結果を、図１０ｃ及びｄはＨｔマウス精子の結果を示す。アクロシンの発現はＨｔマウス精子で少なかった。図１１はＷｔマウス精子とＨｔマウス精子の抗ＮＳＦ抗体を用いて測定したＮＳＦの局在を示す。図１１ａ及びｂはＷｔマウス精子の結果を、図１１ｃ及びｄはＨｔマウス精子の結果を示す。ＮＳＦはＷｔマウス精子の頭部で検出されたが、Ｈｔマウス精子の頭部では少なかった。図１２はＷｔマウス精子とＨｔマウス精子の抗ｔＡＣＥ抗体を用いて測定したｔＡＣＥの局在を示す。図１２ａ及びｂはＷｔマウス精子の結果を、図１２ｃ及びｄはＨｔマウス精子の結果を示す。Ｗｔマウス精子ではアクロゾームの外膜に局在が認められ、尾部の中央部では少なかった。Ｈｔマウス精子では頭部及び尾部の細胞膜に多く局在していた。
図１３はＷｔマウス精子及びＨｔマウス精子の精巣上体の精子のユビキチン及びＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の二重染色並びにユビキチン及びＵＢＣ３Ｂ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｅ２）の二重染色の結果を示す。図１３ａはＷｔマウス精子のユビキチン及びＵＢＣ３Ｂの二重染色の結果であり、ＵＢＣ３Ｂが精子頚部のみに局在していた。ユビキチンは先体のみでなく頭部−尾部結合部位領域に局在していた。図１３ｂはＨｔマウス精子のユビキチン及びＵＢＣ３Ｂの二重染色の結果であり、尾部でＵＢＣ３Ｂの異常な局在が認められた。ユビキチンは頭部−尾部結合部位領域においても先体においても局在していなかった。図１３ｃはＷｔマウス精子のユビキチン及びＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の二重染色の結果であり、ユビキチンは先体と頭部−尾部結合部位領域の両方で発現しており、ユビキチンとＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の強い共局在は頭部−尾部結合装置のみで強く認められた。図１３ｄはＷｔマウス精子のユＵＢＣ３Ｂ及びＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の二重染色の結果であり、ＵＢＣ３Ｂは精子頚部のみに局在していた。この結果はＧＡＬＮＴＬ５タンパクが精子の頭部−尾部結合部位領域中でユビキチン及びＵＢＣ３Ｂと共に局在していることを示し、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質が頭部−尾部結合部位領域のユビキチン−プロテアソーム（ｕｂｉｑｕｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）タンパク質の蓄積に関与していることを示唆する。
図１４はＷｔマウス精子におけるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質並びにＲａｂ２７ａ若しくはＭｙｏｓｉｎ  Ｖａの共局在を示す。図１４ａはＷｔマウス精子におけるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質及びＲａｂ２７ａの局在を示す。核はＤＡＰＩで染色した。図に示すようにＧＡＬＮＴＬ５タンパク質及びＲａｂ２７ａは頭部−尾部結合部位領域及びｍｉｄｄｌｅ−ｐｉｅｃｅの細胞質で共局在していた。図１４ｂはＷｔマウス精子におけるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質及びＭｙｏｓｉｎ  Ｖａの局在を示す。図に示すようにＧＡＬＮＴＬ５タンパク質及びＭｙｏｓｉｎ  Ｖａは頭部−尾部結合部位領域に共局在していた。図１４ｃはＷｔマウスの精巣精子におけるＧＡＬＮＴＬ５タンパク質及びＲａｂ２７ａの局在を示す。図に示すようにＧＡＬＮＴＬ５タンパク質及びＲａｂ２７ａは伸長精子細胞の細胞質で共局在していた。アクチン系ｖｅｓｉｃｌｅ−ｍｏｔｏｒタンパク質複合体はＭｙｏｓｉｎ  Ｖａ及びＲａｂ２７ａ／ｂを含む。図１４に示すように、Ｒａｂ２７ａ及びＭｙｏｓｉｎ  ＶａとＧＡＬＮＴＬ５タンパク質は主に精子の頭部−尾部結合部位領域に共局在していた。また、精巣においてＲａｂ２７ａとＧＡＬＮＴＬ５タンパク質は伸長精子細胞の細胞質に共局在していた。
上記のようにＨｔマウス精子ではアクロゾーム（先体）タンパク質の局在量が顕著に減少していることが明らかになった（図９−１〜図１２）。更に、機能が未だ明らかになっていない精子細胞特異的な細胞内構造体Ｃｈｒｏｍａｔｏｉｄ  ｂｏｄｙ（ＣＢ）も膜輸送機構によって、成熟精子頚部に輸送され、ＣＢに梱包されるｕｂｉｑｕｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅタンパク質が成熟精子頚部に蓄積されることがラット精子の研究で明らかになっている。マウス精子でも同様にｕｂｉｑｕｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅタンパク質が精子頚部に蓄積されることが確認されたが、Ｈｔマウス精子ではｕｂｉｑｕｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅタンパク質のシグナルが消失あるいは異所的に局在していることが観察された（図１３ａ−ｂ）。
ゴルジ体から先体へのタンパク質輸送、ＣＢの精子頚部への輸送は、Ｍｙｏｓｉｎ  Ｖａ及びＲａｂ２７ａ／ｂを含むアクチン系ｖｅｓｉｃｌｅ−ｍｏｔｏｒタンパク質複合体が寄与していることが報告されている。精巣内精子形成過程、更には成熟精子頚部において内在性ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質がＭｙｏｓｉｎ  Ｖａ及びＲａｂ２７ａ／ｂを含むアクチン系ｖｅｓｉｃｌｅ−ｍｏｔｏｒタンパク質複合体と共局在することが観察されたことから（図１４）、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質は糖転移酵素として機能するのではなく、ｖｅｓｉｃｌｅ−ｍｏｔｏｒタンパク質複合体の一部として、成熟精子形成に必須であるタンパク質の精子細胞内分布を制御する新規の機能を有していることが強く示唆された。
【実施例３】
【０００９】
ヒト男性不妊症の検査
Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子Ｈｔ欠損マウス精子細胞で、局在量に異常が検出されたＧＡＬＮＴＬ５タンパク質を含む５つの精子タンパク質の抗体を用い、ヒト精子形成障害と診断されたヒト精子でのタンパク質量の変動を検出した。検出はＧＡＬＮＴＬ５、ｔＡＣＥ、ＮＳＦ及びＨＸＫに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングにより行った。α−ｔｕｂｕｌｉｎ量をコントロールとした。
図１５−１に結果を示す。図１５−１は精子無力症と診断された患者を含む１０個体から採取した精子の構成タンパク質の検出の結果を示す。また、表２に精液の臨床分析の結果を示す。
【表２】
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表２に示すように、精子無力症と診断された患者精子の中に、ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子Ｈｔ欠損マウス精子における減少パターンと酷似した患者を見出すことができた。図１５−１は１０個体（レーン１〜４：コントロールの正常精子、レーン５〜１０：不妊症患者精子）の精子の構成タンパク質を示し、レーン５の患者においてＧＡＬＮＴＬ５タンパク質および関連タンパク質の減少が観察された。更に、「１２．ヒト個体の組織のＰＣＲ及びＤＮＡ配列分析」に記載の方法により、ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の減少が見られた患者精子（図１５−１のレーン５の患者）のゲノムＤＮＡ解析を行った。すなわち、異常精子に対するヒトＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の変異の影響を評価するために、９個のエクソンに対するフランキングプライマーを設計し異常精子からＤＮＡフラグメントを増幅し、ＰＣＲ産物について直接配列決定を行った。図１５−２に結果を示す。図１５−２は第３イントロンと第４エクソンの間の部位のＤＮＡ配列クロマトグラムを示す。正常ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の第３イントロンと第４エクソンの間に制限酵素部位ＰｓｔＩが存在し、レーン５の患者の精子からＰＣＲで得られた５６クローン中４９クローンはＰｓｔＩを有していたが、５６クローン中７クローンにおいてはスプライシングアクセプター部位に点変異が認められた。図１５−３は９個のエクソンを有するＧＡＬＮＴＬ５遺伝子中の変異の位置を示す。図１５−２及び図１５−３の星印は変異の位置を示す。図１５−２及び図１５−３に示すように、ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の第３イントロンと第４エクソンのスプライシングアクセプター部位に変異が同定された。該変異により第４エクソンがスキップされフレームシフトにより第５エクソン中に新たなストップコドンが出現する。興味深いことに、同定されたＤＮＡ変異は、体細胞由来である血液細胞には存在せず、精子細胞のみに存在していた。図１５−４ａは精子無力症と診断された患者を含む６人の精子のゲノムＤＮＡの第４エクソン周辺から増幅した７９０ｂｐ領域のＤＮＡのブロットの結果を示す。左図は制限酵素で消化しない場合の結果であり、右図はＰｓｔＩ制限酵素で消化した場合の結果である。図１５−４ａに示すように上記のレーン５の患者にのみおいてＰｓｔＩ制限部位の変異が認められた。図１５−４ｂは図１５−４ａで用いた６人の患者の血液細胞の結果を示す。血液細胞では上記のレーン５の患者においても変異は認められなかった。この結果は、変異が精子幹細胞内で生じたことを示唆する。この結果は、ヒトＧＡＬＮＴＬ５遺伝子における変異がＧＡＬＮＴＬ５タンパク質発現量低下による精子無力症の原因であることを示す。
【実施例４】
【００１０】
ヒト男性不妊症の検査（その２）
精子無力症と診断された患者５個体から採取した精子について、実施例３と同様に構成タンパク質の検出を行った。
結果を図１６−１に示す。図１６−１に示すように、レーン５の患者においてＧＡＬＮＴＬ５タンパク質および関連タンパク質の減少が観察された。
ＧＡＬＮＴＬ５タンパク質の減少が観察された患者（図１のレーン５の患者）の精子、及び血液細胞を用いて、実施例３と同様の方法で、ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子をＰＣＲによって各エクソンを増幅させ、塩基配列を決定した。図１６−２に結果を示す。図１６−２は第６エクソンの部位のＤＮＡ配列クロマトグラムを示す。図１６−２に示すように、第６エクソンにおいて、精子においても血液細胞においてもゲノム中に一塩基の欠失を観察することができた。
図１６−３は９個のエクソンを有するＧＡＬＮＴＬ５遺伝子中の変異の位置を示す。図１６−３の星印は変異の位置を示す。図１６−３に示すように、ＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の第６エクソンの変異により第６エクソン中に新たなストップコドンが出現する。
これらの結果から、ヒトＧＡＬＮＴＬ５遺伝子変異をヘテロで保持する患者が精子無力症を発症することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
精子形成障害による不妊症と診断された患者精子からタンパク質を抽出し、成熟精子形成に必須である様々なタンパク質量を特異的抗体によるウエスタンブロット法で定量することは、精子形成障害の原因因子を同定する上で、極めて有効な手段であり、特に直接精子の運動性に関与するＧＡＬＮＴＬ５遺伝子の発現を定量することにより精子無力症を検出することができる。本手法は精子形成障害による男性不妊症の原因因子を的確に同定する、これまでに確立されていない画期的なものであり、男性不妊症治療薬の開発などにおいて有効なバイオマーカーとして利用価値は非常に高いものである。さらに、Ｇａｌｎｔｌ５遺伝子を欠損させた非ヒト動物の精子の運動性が喪失あるいは低下しており、該非ヒト動物をヒト精子無力症のモデル動物として利用することができ、該モデル動物を用いて精子無力症の治療薬等を検索することができる。
本発明の男性不妊症の検出方法は精子形成障害による男性不妊症の原因因子を的確に同定する、これまでに確立されていない画期的なものであり、男性不妊症治療薬の開発などにおいて有効なバイオマーカーとして利用価値は非常に高いものである。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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