(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号１５に記載されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼ。
【請求項２】
Ｄｉｐｌｏｃｌａｄｏｎ属に属する星虫に由来する請求項１に記載のルシフェラーゼ。
【請求項３】
ｐＨ５．５〜８．０の範囲のいずれのｐＨにおいても最大発光波長が５５７〜５６２ｎｍの範囲内にある発光を誘導する請求項１に記載のルシフェラーゼ。
【請求項４】
Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のホタルルシフェラーゼによって誘導される発光の１．５倍の発光強度を有する発光を誘導する請求項１に記載のルシフェラーゼ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項６】
前記ルシフェラーゼの遺伝子のコドンが哺乳類における発現に最適化された請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
配列番号２、配列番号３または配列番号１３に記載される塩基配列を含む請求項５に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、節足動物門昆虫綱甲虫目に属す発光昆虫である星虫由来のルシフェラーゼに関する。より具体的には、本発明は、節足動物門昆虫綱甲虫目の星虫よりクローニングされたルシフェラーゼおよびその変異体、ならびに当該ルシフェラーゼの遺伝子を細胞内で発現させて、その発光をイメージングにより検出して細胞の機能を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内のシグナル伝達および遺伝子発現といった細胞の機能を測定するためには、蛍光色素および蛍光タンパク質といった蛍光プローブ並びにルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用する発光プローブが用いられている。特に遺伝子の発現調節の解析には、励起光による細胞のダメージが生じず且つ自家発光の問題が生じない、定量性に優れた発光計測が用いられる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞を観察する場合、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光を測定することで、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さ（具体的には発現量）を調べることができる。発光の測定は、最初に細胞を溶解して細胞溶解液を作製し、その後この細胞溶解液にルシフェリンおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等を添加し、光電子増倍管を用いたルミノメーターで定量するという手順で行われる。すなわち、発光の測定は細胞を溶解した後に行われる。このため、ある時点でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、細胞全体の平均値として測定される。ルシフェラーゼ遺伝子等の発光遺伝子をレポーター遺伝子として導入する方法として、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等を使用でき、各方法は目的および細胞の種類の違いに応じて使い分けられている。細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の上流または下流に目的のＤＮＡ断片を繋ぎ、ルシフェラーゼの発現量を分析することで、当該ＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることが可能となる。また、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子と目的の遺伝子とを共発現させることで、当該遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることが可能となる。
【０００３】
時間経過に沿って発光遺伝子の発現量を分析するには、生きた細胞からの発光を経時的に測定する必要がある。このような測定は、ルミノメーターを備えたインキュベーターにて細胞を培養し、全細胞集団からの発光を一定時間ごとに定量することで行われる。これにより、一定の周期性をもった発現リズム等を分析することができ、細胞全体における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることができる。
【０００４】
近年、生物学および医学の研究において、生きた試料を対象とした画像による動的変化の経時的観察の必要性が高まってきている。蛍光観察を利用する研究分野では、試料内のタンパク質分子機能を動的に捉えるために、タイムラプスまたは動画撮像が行われている。従来技術では、蛍光試料を用いた経時的観察（例えば、蛍光分子を付したタンパク質１分子の動画観察）が行われている。
【０００５】
一方、経時的観察のために発光試料を用いる場合、発光試料の発光強度は極めて小さいため、イメージ・インテンシファイアを装着したＣＣＤカメラを用いて観察する必要がある。また最近では、発光試料を観察するための光学系を有した顕微鏡も開発されている（特許文献１および特許文献２）。
【０００６】
発光強度が小さい発光試料を顕微鏡により撮像する場合、鮮明な画像を撮影するために必要な露出時間は長くなる。このような発光試料は、使用できる研究用途が制限される。例えば、発光強度の小ささのために３０分間の露出時間が必要となる場合、３０分間隔での経時的撮影は可能であっても、より短い間隔での撮影、さらにはリアルタイムでの撮影は不可能である。また、画像の取得に当って、発光する細胞に焦点を合わせるために複数枚の画像を取得し比較する必要があるが、発光強度の小ささのために長い露出時間を必要とする場合、１枚の画像を取得するだけでも手間と時間を要することになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−３０１５９９号公報
【特許文献２】国際公開公報第２００６／０８８１０９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、従来のルシフェラーゼと比較してより簡便な測定または観察を可能にするルシフェラーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の側面によると、Ｄｉｐｌｏｃｌａｄｏｎ属に属する星虫に由来するルシフェラーゼが提供される。
【００１０】
本発明の第２の側面によると、ｐＨ５．５〜８．０の範囲のいずれのｐＨにおいても最大発光波長が５５７〜５６２ｎｍの範囲にある発光を誘導するルシフェラーゼが提供される。
【００１１】
本発明の第３の側面によると、哺乳細胞内で、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来の既知のルシフェラーゼによって誘導される発光の１．５倍の発光強度を有する発光を誘導するルシフェラーゼが提供される。
【００１２】
本発明の第４の側面によると、ｐＨの変化に対して最大発光波長の変化が小さいルシフェラーゼが提供され、これにより、環境中のｐＨの影響を抑制して測定または観察することができる。また、本発明の更なる側面によると、既知のホタルルシフェラーゼによって誘導される発光の１．５倍の発光強度を有する発光を誘導するルシフェラーゼが提供され、これにより、発光像を撮像するために必要な露出時間を短縮することができ、且つ従来よりも時間分解能が高い経時的観察が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、星虫ルシフェラーゼの各ｐＨにおける発光スペクトルを示す。
【図２】図２は、各ルシフェラーゼのＫｍ値を示す。
【図３】図３は、哺乳細胞にて発現させた、星虫ルシフェラーゼおよびＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのホタルルシフェラーゼの発光強度を比較する。
【図４】図４は、哺乳細胞にて発現させた、星虫野生型ルシフェラーゼおよび星虫変異型ルシフェラーゼの発光強度を比較する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一実施形態は、Ｄｉｐｌｏｃｌａｄｏｎ属に属する星虫に由来するルシフェラーゼに関する。
【００１５】
「ルシフェラーゼ」とは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。当該酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光する。現在、ルシフェラーゼは、ホタルに由来するものおよびバクテリアに由来するものが取得されている。実施形態に係るルシフェラーゼも、上述の通り定義されるルシフェラーゼと同義であるが、後述する星虫から初めて取得された新規のルシフェラーゼである。なお、ここにいう「由来する」とは、星虫が有する野生型のルシフェラーゼに加えて、その変異体をも含むことを意味する。
【００１６】
「星虫」とは、節足動物門昆虫綱甲虫目フェンゴデス（Ｐｈｅｎｇｏｄｉｄａｅ）科ディプロクラドン（Ｄｉｐｌｏｃｌａｄｏｎ）属に属する昆虫である。星虫は、主に南アジア、東南アジアおよび東アジアにかけて生息することが確認されている。なお、ディプロクラドン属に近縁であるフェンゴデス科フィリキソシリキス属（Ｐｈｒｉｘｏｔｈｒｉｘ）に属す鉄道虫（Ｒａｉｌｒｏａｄ−ｗｏｒｍ）は中南米に生息している。
【００１７】
本発明の一実施形態に係るルシフェラーゼは、例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼである。当該ルシフェラーゼは、星虫から得られたものである。明細書および特許請求の範囲においては、当該ルシフェラーゼを星虫ルシフェラーゼまたは星虫由来ルシフェラーゼと称する。
【００１８】
本発明の一実施形態に係るルシフェラーゼは、ｐＨの変化に対して最大発光波長の変化が小さいという特徴を有する。ここで「最大発光波長」とは、ルシフェラーゼが関与する発光反応において、測定波長範囲内において発光強度が最大となる波長を意味する。前記ルシフェラーゼを用いることで、環境中のｐＨの影響を抑制して測定または観察することができる。例えば、顕微鏡によるイメージングにおいて、異なるｐＨ領域に存在する前記ルシフェラーゼについて、単一の測定波長を用いて同時に発光強度を測定することができる。また、本発明の一実施形態に係るルシフェラーゼによれば、光電変換効率が測定波長によって異なる装置（例えばＣＣＤ）を用いて定量的な測定を行うことが容易となる。このような装置によって従来のルシフェラーゼを測定する場合、ｐＨごとに測定波長を変更する必要があるが、測定波長が変わると定量的な比較が困難となる。これに対し、本発明の一実施形態に係るルシフェラーゼを用いれば、ｐＨが異なっても単一の測定波長を用いることができ、定量的な比較が容易となる。
【００１９】
本発明の一実施形態に係るルシフェラーゼは、一定のｐＨ範囲内のいずれのｐＨにおいても最大発光波長が一定の波長範囲内にあることを特徴とする。例えば、本発明の一実施形態に係るルシフェラーゼはｐＨ６．５〜７．０、ｐＨ６．０〜７．５、ｐＨ５．５〜８．０、ｐＨ５．０〜８．５、またはｐＨ４．５〜９．０の範囲のいずれのｐＨにおいても最大発光波長が５２０〜６００ｎｍ、５３０〜５９０ｎｍ、５４０〜５８０ｎｍ、５４５〜５７５ｎｍ、５５０〜５７０ｎｍ、５５５〜５６５ｎｍまたは５５７〜５６２ｎｍの範囲内にある。
【００２０】
本発明の一実施形態に係るルシフェラーゼは、一定のｐＨ範囲内にわたってｐＨを変化させた場合、最大発光波長の変化量が一定値以下であることを特徴とする。例えば、本発明の一実施形態に係るルシフェラーゼはｐＨ６．５〜７．０、ｐＨ６．０〜７．５、ｐＨ５．５〜８．０、ｐＨ５．０〜８．５またはｐＨ４．５〜９．０の範囲でｐＨを変化させた場合、最大発光波長の変化量が８０ｎｍ、６０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍまたは５ｎｍ以下である。
【００２１】
図１には、一実施形態に係るルシフェラーゼの発光スペクトルが示される。この図から示されるとおり、当該ルシフェラーゼはｐＨ５．５〜８．０の範囲のいずれのｐＨにおいても最大発光波長が５５７〜５６２ｎｍの範囲内にある。また、ｐＨ５．５〜８．０の範囲で、最大発光波長の変化量は５ｎｍである。
【００２２】
一実施形態に係るルシフェラーゼは、既知のルシフェラーゼと比較して発光強度が高い。従って、一実施形態に係るルシフェラーゼは、タンパク質のイメージングのためのレポーターとして利用する場合に特に有利な効果を奏する。すなわち、一実施形態に係るルシフェラーゼは、少量でも高い発光強度を提供できるため、発現量が低いタンパク質の良好な検出を可能とする。また、一実施形態に係るルシフェラーゼは、発光強度が高いことにより検出に必要な露出時間を短縮できる。このため、一実施形態に係るルシフェラーゼを経時的観察のためのレポーターとして利用すれば、撮影間隔を短くすることが可能となり、よりリアルタイムに近い観察が可能となる。
【００２３】
図３には、一実施形態に係る星虫ルシフェラーゼとホタル（Ｐ．  ｐｙｒａｌｉｓ）由来ルシフェラーゼとの間の発光強度の比較が示される。この図から、当該星虫ルシフェラーゼは、Ｐ．  ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼによる発光強度の１．５倍以上の発光強度を示すことがわかる。
【００２４】
一実施形態に係るルシフェラーゼには、星虫から取得された野生型のルシフェラーゼだけでなく、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の一部に変異が生じた変異型ルシフェラーゼを含む。そのような変異は、ルシフェラーゼの酵素活性を向上させる変異であってよい。また、そのような変異は、当該ルシフェラーゼの実験的な操作性を向上させる変異であってよい。たとえば、野生型ルシフェラーゼが哺乳細胞内において低い可溶性を示す場合、実施形態に係る変異型ルシフェラーゼは、その可溶性を高める変異が導入されたルシフェラーゼであってよい。ここにおいて、変異型ルシフェラーゼとは、実施形態に係るルシフェラーゼの特徴、すなわち従来のルシフェラーゼと比較して高い発光強度を示す限りにおいて、ルシフェラーゼのアミノ酸配列に変異、例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または付加等が生じたルシフェラーゼであってよい。この変異とは、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の１以上のアミノ酸の変異であり、好ましくは、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の１から２０のアミノ酸の変異、１から１５のアミノ酸の変異、１から１０のアミノ酸の変異または１から５のアミノ酸の変異である。好ましくは、当該変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列との間で７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有する。
【００２５】
そのような変異型星虫ルシフェラーゼの例は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。当該変異型ルシフェラーゼは、配列番号１にアミノ酸配列が示される野生型ルシフェラーゼの３４４番目のシステインがセリンに置換されたものである。当該変異型ルシフェラーゼは、野生型星虫ルシフェラーゼと比較して高い発光強度を示す。図４には、変異型星虫ルシフェラーゼおよび野生型星虫ルシフェラーゼの発光強度の比較が示される。図４によれば、変異型星虫ルシフェラーゼは、野生型星虫ルシフェラーゼの４．９倍の発光強度を示す。
【００２６】
本発明は、実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸に関する。すなわち、当該核酸は、星虫に由来するルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸である。核酸とは、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを指す。また、ルシフェラーゼの「遺伝子」とは、主として、ｍＲＮＡに転写される領域、すなわち構造遺伝子を意味する。
【００２７】
実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸は、例えば配列番号２に示される塩基配列を含む核酸である。この配列を有する遺伝子は、星虫からクローニングされており、野生型星虫ルシフェラーゼをコードする。
【００２８】
実施形態に係る核酸は、野生型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸であっても、そこにおいて変異が生じた変異型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸であってもよい。ここにおいて、変異型ルシフェラーゼ遺伝子とは、コードされたルシフェラーゼが、実施形態に係るルシフェラーゼの特徴を示す限りにおいて、塩基配列中の特定の塩基、たとえば数個の塩基の置換、欠失および／または付加等を受けた遺伝子であってよい。また、塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異が含まれる。すなわち、実施形態に係る核酸には、野生型ルシフェラーゼをコードする変異型ルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸が含まれる。
【００２９】
そのようなコードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の一例は、遺伝子中に存在する特定の制限酵素の認識配列を無効にする変異である。この変異によって、遺伝子を含む核酸は当該制限酵素によって切断されなくなるものの、当該遺伝子は変異前と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードできる。このような変異は、制限酵素の認識配列を構成するコドンを、異なる塩基配列の同義コドンに変換することで達成できる。このような変異は、遺伝子組み換えに使用する制限酵素の認識配列が当該遺伝子中に存在する場合に有用である。この場合、予め遺伝子中の認識配列を無効にしておくことで、制限酵素で処理した場合に遺伝子を含む核酸が断片化することを防ぐことができ、結果として組み換えが容易になる。
【００３０】
そのようなコードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の別の例は、遺伝子のコドンを特定の生物種における発現に最適化させる変異である。ここにいう「最適化」とは、核酸に含まれる遺伝子のコドンを、特定の生物種においてコドン出現頻度が高いコドンに代えることを意味する。最適化を行った場合、特定の生物種における遺伝子の発現は、最適化をしない場合に比べて高まる。実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子は星虫から取得されたものであるため、当該遺伝子を導入しようとする生物種が分類学的に星虫から遠い程、最適化の効果はより高いと考えられる。特定の生物種とは、例えば細菌細胞、酵母細胞および哺乳細胞である。更に哺乳細胞は、例えばマウスの細胞、サルの細胞およびヒトの細胞である。
【００３１】
実施形態に係るコドンが最適化されたルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸は、例えば配列番号３に示される塩基配列を含む核酸である。当該核酸は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識配列が無効にされており、且つ哺乳細胞における発現にコドンが最適化されている。
【００３２】
本発明の一実施形態に係る核酸は、Ｋｏｚａｋ配列が付与されたルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸を含む。Ｋｏｚａｋ配列とは、開始コドンとその前後の複数の塩基配列から成る配列であり、Ｋｏｚａｋ配列が存在することで、その遺伝子の発現量が増大することがわかっている。Ｋｏｚａｋ配列は、生物種または生物群ごとに共通配列が見出されている。一実施形態に係るＫｏｚａｋ配列を含む核酸は、それを導入する生物種に対応したＫｏｚａｋ配列を有する。例えば哺乳細胞に導入される場合、核酸は、Ｋｏｚａｋ配列として配列番号４（ｒはグアニンまたはアデニンを意味する）の配列を含む。Ｋｏｚａｋ配列の付与によって開始コドン直後のアミノ酸配列が変化してもよい。Ｋｏｚａｋ配列を付与するルシフェラーゼ遺伝子は、野生型遺伝子であってもよいが、上述のようなコドンの最適化を行った変異型遺伝子であってもよい。
【００３３】
本発明はこれらの核酸を含むベクターを含む。当該ベクターには、ルシフェラーゼをコードする核酸以外に、発現を調節するための配列またはマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。
【００３４】
本発明は、実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内の機能を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼを細胞内に導入する工程、および前記ルシフェラーゼの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。例えば、ＤＮＡ中の特定の発現調節領域の下流に実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子を導入し、それによる発光の有無によってルシフェラーゼの発現を検出することで、発現調節領域の機能を調べることが可能である。
【００３５】
本発明は、実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内タンパク質を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼと解析の対象とするタンパク質とから成る融合タンパク質を細胞内に導入する工程；および、前記ルシフェラーゼの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。
【００３６】
当該方法は、解析の対象とするタンパク質の細胞内の局在の観察、および、その局在の時間変化の観察（タイムラプス）を含む。また、当該方法は、タンパク質の局在だけでなく、そのタンパク質が単に発現したか否かの確認をも含む。使用される細胞に特別な限定はなく、細胞のイメージングの分野において通常使用できる細胞であってよい。また、解析の対象とするタンパク質も特別に限定はなく、研究の目的に応じたタンパク質を選択することができる。当該タンパク質は、使用する細胞内に本来存在するタンパクであってよく、または細胞内に本来存在しない異種性のまたは改変したタンパク質であってよい。
【００３７】
融合タンパク質を細胞内に導入する場合、既知の導入方法を使用することができる。１つの方法は、細胞外で精製した融合タンパク質を細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によって融合タンパク質を細胞内に直接注入することができる。または、融合タンパク質を含む培養液にて細胞をインキュベートさせて、エンドサイトーシスによって融合タンパク質を細胞に取り込ませることができる。また別の方法は、まず融合タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を導入し、その後細胞内で融合タンパク質を発現させる方法である。例えば、当該核酸を含む発現ベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等によって細胞内に導入し、発現ベクターから融合タンパク質を発現させることができる。ここにおいて、融合タンパク質の遺伝子は、実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子と解析の対象とするタンパク質の遺伝子とを含む遺伝子であり、ここにおいて、ルシフェラーゼ遺伝子とタンパク質遺伝子とは、それぞれ正常に翻訳されるよう連結されている。
【００３８】
ルシフェラーゼの発光をイメージング装置により検出する工程は、既知の検出方法を使用することができる。例えば、ルシフェラーゼを含む融合タンパク質を発現する細胞に、ルシフェリン、ＡＴＰおよびＭｇ２＋イオン等を適宜与えてルシフェラーゼによる発光反応を生じさせ、発生した発光をイメージング装置により検出することができる。イメージング装置とは、例えば発光を捉えるためのフィルターを備えた顕微鏡である。顕微鏡を使用することで、細胞内における発光の位置を特定して、この情報をもとにタンパク質の局在を特定することが可能となる。また、イメージング装置として、経時的に撮像できる機能を備えた顕微鏡を使用することができ、この顕微鏡によって経時的観察も可能となる。
【００３９】
［実施例１：ルシフェラーゼ遺伝子のクローニング］
１．材料
材料としてマレーシア・ペラ州のブルム森林にて採集した星虫のメス成虫を用いた。この星虫は、Ｄｉｐｌｏｃｌａｄｏｎ属に属することは判明しているものの、学名が決定されていない種であった。本願では、この種をＤｉｐｌｏｃｌａｄｏｎ  ｓｐ．１と称する。
【００４０】
２．Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡの抽出
Ｄｉｐｌｏｃｌａｄｏｎ  ｓｐ．１の成虫（メス）の腹付近からハサミを用いて組織肉片を切り取った。この組織肉片からＴｏｔａｌ  ＤＮＡの抽出はＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてマニュアルに従って実施した。得られたＴｏｔａｌ  ＤＮＡをＤｉｐｌｏｃｌａｄｏｎ  ｓｐ．１由来のＴｏｔａｌ  ＤＮＡとしてルシフェラーゼ遺伝子増幅の実験に用いた。
【００４１】
３．星虫ルシフェラーゼ遺伝子の同定
３−１．Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡを鋳型としてイントロンを含む星虫ルシフェラーゼ遺伝子を増幅するＰＣＲに用いる特異的プライマーを設計した。このプライマーの名称および配列は以下の通りである：Ｈｏｍｅ−Ｄｉｐｌｏ（Ｉ）−ＢａｍＨＩ−Ｆ（配列番号５）およびＨｏｍｅ−Ｄｉｐｌｏ（Ｉ）−ｓｔｏｐ−ＥｃｏＲＩ−Ｒ（配列番号６）。これらのプライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託して行った。
【００４２】
最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度が０．３μＭの配列番号５および配列番号６のプライマーを含む１９μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ星虫ＴｏｔａｌＤＮＡ溶液を１．０μｌ加えた。なお、星虫Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ溶液の濃度は未定量であった。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を３５サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。
【００４３】
３−２．Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
【００４４】
ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００４５】
その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＴＯＰ１０株またはＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３−Ｆ（−２９）  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  Ｃ−３’：配列番号７）とＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＧＧ−３’：配列番号８）とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー対を含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃１分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃２分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、２μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００４６】
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上精を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上精を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃で２分間熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。
【００４７】
シークエンシングによって得られた遺伝子配列を、配列情報解析ソフトウェア  ＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏの「シークエンス連結」機能を用いて解析した。この配列をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （以下ＮＣＢＩと略す）が提供するｂｌａｓｔｘサーチを利用して相同性検索を実施し、既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。得られた塩基配列（配列番号９）には５箇所のイントロンが含まれるため、これらを除いた塩基配列（配列番号２）が、アミノ酸配列に翻訳される。翻訳されたアミノ酸配列を、新規星虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）として使用した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規星虫ルシフェラーゼ遺伝子であると決定した。
【００４８】
配列番号１、２および９に示される配列は以下の通りである。
【００４９】
配列番号１
MPNEIVLHGAKPRDPLDLGTAGSQLFRSLTQFSYLREALVDAHTEQVVSYADILENSCRLAICFEKYGLRQNSVIAVCSENSAIFFYPVIAALYMGIITATVNDNYTERELFDTLNISKPELVFCSKKAIKNLTQLKNHIDFIKKLVVLDSDEDIGEVESLANFMKRYSESVIDVRNFKPRDFDAKEQVALIMSSSGTTGLPKGVVLTHRNLSVRFVHCKDPLFGTRTVPSTSILSIVPFHHAFGMFTTLSYFIVGLRVILLKRFEEEFFLSTIEKYRIPTIVLAPPVMVFLAKSPLVDQYDVSSIREVATGGAPVGIEVAEAVAKRLKINGILQGYGLTETCCAVLITPHDHVKTGSTGKVAPYVQAKVVDLSTGKSLGPNKRGELCFKSEIIMKGYFNNIKATEEAIDKEGWLHSGDVGYYDEDGHFYVVDRLKELIKYKGYQVAPAELEWLLLQHPAIKDAGVTGVPDEAAGELPGACIVLEEGHSLTEQEVIEYVAERVSPTKRIRGGVVFVDDIPKGATGKLVRSELRRMLSQKKSKL
【００５０】
配列番号２
atgccgaatgaaatcgttttacatggagccaaaccgcgagatccattagacctgggaactgcaggaagtcaattatttaggtctttgacgcaattttcttatttaagagaagctctggtcgacgctcatactgagcaagtggtatcttacgcggatatcttagaaaacagttgccgtctagctatatgctttgagaaatatggattacgccaaaatagtgtcatagcagtatgcagcgaaaatagcgcgatctttttctaccccgtaatcgccgctttatatatgggtatcataacagcaacagtaaatgataactacaccgaaagggaattattcgacactttaaatatttcgaaacctgaactggtattctgttcgaagaaggcgattaaaaacttgacgcaattgaagaatcacatcgattttattaaaaagctcgtagttttggatagtgatgaagacataggtgaagtcgaatctcttgccaactttatgaaacgctattcagaatctgttattgatgtgagaaactttaagcctcgcgattttgatgctaaagaacaagttgccttaatcatgtcgtcatcaggaacaactggattacctaaaggagtcgttctaacccatagaaatttgagcgttcgctttgtacattgcaaggacccgttattcggcacaaggactgtcccttcaacttcaattttatctatcgttcctttccatcatgcgtttggaatgtttacgacgttgtcctattttatagtaggactcagagtcatactactaaaaagattcgaagaagaatttttcttaagcactattgaaaagtacagaattccaactatcgttcttgcaccacccgtaatggtattcctagccaagagtccgttagtcgatcagtacgatgtgtccagtattagagaagttgctaccggtggtgcacctgtcggcattgaagtggcagaagctgttgcgaaacggctaaaaattaatggaatacttcaaggatacggtctaacagagacatgttgcgccgtattaatcaccccacacgaccatgttaaaacaggttctactgggaaagtcgccccgtacgtgcaagcgaaagttgtagatcttagcaccggaaaatctctagggccaaataaaagaggagaactttgctttaaaagcgagataattatgaaaggttatttcaacaatataaaggctacggaagaggctatcgataaagaaggatggttacattctggagatgtcgggtattatgatgaagatggtcatttctacgtagtagatcgtttaaaagaacttatcaagtacaagggatatcaagttgcaccggctgaattggaatggttgcttttgcaacatccagctatcaaagacgccggtgttactggcgttcctgacgaagctgccggagaacttccgggtgcttgcatagtccttgaagaaggacatagtcttaccgaacaagaagttattgaatatgtagccgaacgtgtttctccaactaaacgtatacgtggtggagtagttttcgttgatgatatacccaaaggagcgactggaaaactcgtcagaagtgaattacggagaatgctttctcagaagaaatcgaaactataa
【００５１】
配列番号９
atgccgaatgaaatcgttttacatggagccaaaccgcgagatccattagacctgggaactgcaggaagtcaattatttaggtctttgacgcaattttcttatttaagagaagctctggtaagtgtttaacgaaaatagacaatgtacacatcatttgaaaatattgttgaaaaatgggtgtttttttataattttgtctaaagaaacttatatgcagtttcttaataatgataaagtgcaactctttggattacagtcttaaagcatataattattctgagttaattttaacatattttactgtaactataaaaaatcactagcatttgactggttactatatttgaagatacaatgctaaagttaggcaacccaaataacactttttctagtttggttcgacacaatattatttaaaagatcacctatatataccgatgatagaagagaaactatgatgtatgtattattacatgcaaaaataatgttcctcgttcgaattggaatttttataaaattaattaaaattccaattgatcatcatatccatcatatttgcaaaaatatcaacattaaaacattttaggtcgacgctcatactgagcaagtggtatcttacgcggatatcttagaaaacagttgccgtctagctatatgctttgagaaatatggattacgccaaaatagtgtcatagcagtatgcagcgaaaatagcgcgatctttttctaccccgtaatcgccgctttatatatgggtatcataacagcaacagtaaatgataactacaccgaaagtaagtggaaaacttacaaacattttttaatcctccatcatatcgatataatcttccaggggaattattcgacactttaaatatttcgaaacctgaactggtattctgttcgaagaaggcgattaaaaacttgacgcaattgaagaatcacatcgattttattaaaaagctcgtagttttggatagtgatgaagacataggtgaagtcgaatctcttgccaactttatgaaacgctattcagaatctgttattgatgtgagaaactttaagcctcgcgattttgatgctaaagaacaagttgccttaatcatgtcgtcatcaggaacaactggattacctaaaggagtcgttctaacccatagaaatttgagcgttcgctttgtacattgcaagtaggtaacaggaaaaaatttgttttgaaactatacctaagattgattgtacgttattaatcaaaaatccatgcgcctatattacatggtaaagtaggatgtgacacaactgtgtgaaacgtcatcatctactagctttttattgatgacgtacatgttgaaataaaatttgaatggcttataccttaccttagcccaccacattttacctccatttctttgcccctagctgacagatccacttccacatcgtttaatcctcttttcagccgatcctgaattcgaattcaaattcgaattctcttcttctagaagagaatttttctctctttccctcttttttctatcttctctagaaaagaattctagaattctaatcctcttttcagccgataggatgccctatcggctgccctatctgagtccatcatttcaacgatccctagtcatcttagagtgatgaagaatttctacgatttattgttctagtattgttcatttactacaaacaaacaatacaataataaagaatttgaactgtgaattagaaataattcgttcaattttgcacttagtcttaccagtcagtggagttaggttcttagccgtgtatttttaacctcctttaacaggtctgggtttttatatacattttctaacccaatccagacgtatattcgtgctcgttattcattattatcctgaccaagccaaatattatccacagttatggacaggacaggagtcctctcctcataaacttagtgtagtttaatttttcttagggccggtctcgccaccttttaataaatttatctgacaaataacgtacacaaccggcttctattgtaaaaaatatttaccaaataagtttgtcgctggaataactggtttttccggaagatttcaataattagattaatcttttagggacccgttattcggcacaaggactgtcccttcaacttcaattttatctatcgttcctttccatcatgcgtttggaatgtttacgacgttgtcctattttatagtaggactcagagtcatactactaaaaagattcgaagaagaatttttcttaagcactattgaaaagtacagaattccaactatcgttcttgcaccacccgtaatggtattcctagccaagagtccgttagtcgatcagtacgatgtgtccagtattagagaagttgctaccggtggtgcacctgtcggcattgaagtggcagaagctgttgcgaaacggtatttgttttttttttaattgttgaagtgttgttttataacagttaatgtacaggctaaaaattaatggaatacttcaaggatacggtctaacagagacatgttgcgccgtattaatcaccccacacgaccatgttaaaacaggttctactgggaaagtcgccccgtacgtgcaagcgaaagttgtagatcttagcaccggaaaatctctagggccaaataaaagaggagaactttgctttaaaagcgagataattatgaaaggttatttcaacaatataaaggctacggaagaggctatcgataaagaaggatggttacattctggagatgtcgggtattatgatgaagatggtcatttctacgtagtagatcgtttaaaagaacttatcaagtacaagggatatcaagtatgtcgatttttatttaagtgaacgtgtatgaatttaagaccctttatgtattttaggttgcaccggctgaattggaatggttgcttttgcaacatccagctatcaaagacgccggtgttactggcgttcctgacgaagctgccggagaacttccgggtgcttgcatagtccttgaagaaggacatagtcttaccgaacaagaagttattgaatatgtagccggtgagttttagtagcatttttagtttttaatcaattgcgcatttttttcgtagaacgtgtttctccaactaaacgtatacgtggtggagtagttttcgttgatgatatacccaaaggagcgactggaaaactcgtcagaagtgaattacggagaatgctttctcagaagaaatcgaaactataa
【００５２】
配列番号１のアミノ酸配列をヒトコドン最適化した塩基配列を配列番号３に示す。遺伝子合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託して行った。配列番号３に示される配列は以下の通りである。
【００５３】
配列番号３
atgcccaacgagattgtgctgcacggcgccaagcccagggaccctctggatctgggcacagccggcagccagctgttcagaagcctgacccagttcagctacctgcgcgaggccctggtggacgcccacaccgaacaggtggtgtcctacgccgacatcctggaaaacagctgcagactggccatctgcttcgagaagtacggcctgcggcagaacagcgtgatcgccgtgtgcagcgagaacagcgccatcttcttctaccctgtgatcgccgccctgtacatgggcatcatcaccgccaccgtgaacgacaactacaccgagagagagctgttcgacaccctgaacatcagcaagcccgagctggtgttctgcagcaagaaggccatcaagaatctgacccagctgaagaaccacatcgacttcatcaagaaactggtggtgctggacagcgacgaggacatcggcgaggtggaaagcctggccaacttcatgaagcggtacagcgagtccgtgatcgacgtgcggaacttcaagccccgggacttcgacgccaaagaacaggtggccctgatcatgagcagcagcggcaccaccggcctgcctaagggcgtggtgctgacccaccggaacctgagcgtgcgcttcgtgcactgcaaggaccctctgttcggcaccagaaccgtgcccagcaccagcatcctgagcatcgtgcccttccaccacgccttcggcatgttcaccaccctgagctacttcatcgtgggcctgagagtgatcctgctgaagagattcgaggaagagttcttcctgagcaccatcgagaagtatcgcatccccaccatcgtgctggcccctcccgtgatggtgttcctggccaagagccccctggtggatcagtacgacgtgtccagcatcagagaggtggccaccggcggagcccctgtgggaattgaagtggccgaggccgtggccaagcggctgaagatcaacggcatcctgcagggctacggcctgaccgagacatgctgcgccgtgctgatcaccccccacgaccacgtgaaaaccggcagcaccggcaaggtggccccctatgtgcaggccaaggtggtggacctgtccaccggcaagagcctgggccccaacaagcggggcgagctgtgcttcaagagcgagatcatcatgaagggctacttcaacaacatcaaggccaccgaggaagccatcgacaaagagggctggctgcacagcggcgacgtgggctactacgacgaggacggccacttctacgtggtggaccggctgaaagagctgatcaagtacaagggctaccaggtggcacctgccgagctggaatggctgctgctgcagcaccccgccatcaaggatgccggcgtgaccggcgtgccagatgaagctgctggcgagctgcctggcgcctgtatcgtgctggaagagggccactccctgaccgagcaggaagtgatcgagtacgtcgccgagcgggtgtcccccaccaagagaatcagaggcggcgtggtgttcgtggacgacatccctaagggcgccacaggcaagctggtgcgcagcgagctgcggcggatgctgagccagaaaaagtccaagctgtga
【００５４】
以下、この新規のルシフェラーゼを星虫ルシフェラーゼと称する。
【００５５】
［実施例２：新規ルシフェラーゼの酵素学的なパラメータの測定］
１．新規星虫ルシフェラーゼ遺伝子のタンパク質発現
星虫ルシフェラーゼ遺伝子を大腸菌でタンパク質発現させるため、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクター（インビトロジェン）に導入した。遺伝子発現ベクターの構築は標準的な方法に従い以下のように実験を実施した。
【００５６】
１−１．新規星虫ルシフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現ベクターへの導入
配列番号１に示すアミノ酸をコードするルシフェラーゼ遺伝子を、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクターの制限酵素サイトＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ間に導入するため、開始コドンおよびその前に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列ＧＧＡＴＣＣを含むプライマー、並びに終始コドンおよびその後ろに制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列ＧＡＡＴＴＣを含むプライマーを作製した。このプライマー対を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の両端に上述の制限酵素認識部位を含んだ断片の増幅を行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡績株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００５７】
最終濃度が等倍の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が１．０ｍＭのＭｇＳＯ４、最終濃度が０．０２Ｕ／μｌのＴＯＹＯＢＯ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（１Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマー対を含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型としてＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ認識配列を持たないルシフェラーゼ遺伝子の溶液を０．４μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５５℃３０秒および６８℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に６８℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を通常のエタノール沈殿法により沈殿濃縮し、制限酵素処理用１０×Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒを４μｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡績株式会社）および制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡績株式会社）を各２μｌならびに滅菌脱イオン水３２μｌを加えて溶解し、３７℃で２時間保温して制限酵素処理した。その後、この反応溶液をエタノール沈殿法により沈殿濃縮した後、滅菌脱イオン水に溶解した。この溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行った。紫外線照射下において確認されるＤＮＡバンドを含むゲルを、ナイフを用いて切り出した。この切り出したゲルからＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてＤＮＡを抽出した。これらの操作はマニュアルに従って実施した。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｐａｃｋ（ニッポンジーン）をマニュアルに従って用いて、あらかじめ同様の方法で制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素ＥｃｏＲＩで処理したｐＲＳＥＴ−Ｂベクターに抽出したＤＮＡを導入した。このベクターＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換し、コロニーを形成させた。
【００５８】
得られたコロニーを鋳型としてダイレクトコロニーＰＣＲを実施し、ｐＲＳＥＴ−Ｂに導入したルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。ダイレクトコロニーＰＣＲは、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３’：配列番号１０）およびＴ７  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＴＧＧ−３’：配列番号１１）のプライマー対を用いて行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマーを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００５９】
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴを用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスには、ベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上精を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上精を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザを用いて塩基配列を読み取り、正常に遺伝子発現ベクターｐＲＳＥＴ−Ｂに導入されていることを確認した。
【００６０】
２．発光タンパク質の精製
ＪＭ１０９（ＤＥ３）を含む大腸菌溶液５０μｌにルシフェラーゼ発現ベクター０．５μｌを添加し、氷上で１０分、その後４２℃で１分、最後に氷上で２分インキュベートした。その後、大腸菌溶液５０μｌをＳＯＣ培地２００μｌに加えた。その大腸菌／ＳＯＣ培地混合溶液を３７℃で２０分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル１００μｌをＬＢ培地プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）にストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、５００ｍｌスケールのＬＢ培地で培養した。培養は３７℃で２４時間、１８℃で２４時間行った。合計４８時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）し、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム２ｍｌのカラムにＮｉ−Ａｇａｒ懸濁液５００μｌと０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ｍｌを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て４℃の条件で行った。２５ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液２ｍｌでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに５００ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を２ｍｌ加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア）でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをＶｉｖａｓｐｉｎ６（ザルトリウス）で限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、５０％グリセリン溶液とした。保存は−２０℃で行った。
【００６１】
３．発光スペクトルの測定
測定のための装置としてＬｕｍｉＦｌＳｐｅｃｔｒｏＣａｐｔｕｒｅ（ＡＴＴＯ）を用い、０．１Ｍクエン酸／０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５−８．０）に１ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、２ｍＭ  ＡＴＰおよび４ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む溶液に、精製酵素を１μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、酵素添加後１５秒経過時点で発光スペクトルを測定した。測定結果を図１に示す。
【００６２】
図１に示されるように、取得されたルシフェラーゼは、ｐＨ５．５〜８．０の環境における最大発光波長が５５７〜５６２ｎｍであった。より詳細には、ｐＨ８．０の環境において、５６２ｎｍ付近に最大発光波長を示した。また、ｐＨ７．５において５５９ｎｍ付近、ｐＨ７．０において５５７ｎｍ付近、ｐＨ６．５において５５７ｎｍ付近、ｐＨ６．０において５５７ｎｍ付近およびｐＨ５．５において５５７ｎｍ付近となった。
【００６３】
４．速度論的解析
４−１．Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰの濃度の決定
Ｄ−ルシフェリン溶液中のＤ−ルシフェリン濃度およびＡＴＰ溶液中のＡＴＰ濃度を以下の通りに決定した。
【００６４】
ＵＶ−Ｖｉｓｉｂｌｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて、Ｄ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液の紫外可視吸収スペクトルを測定し、この測定結果と以下のε値とから濃度を算出した。  
Ｄ−ルシフェリン：λｍａｘ  ３２８ｎｍ、ε１８２００、ｐＨ５．０
ＡＴＰ：λｍａｘ  ２５９ｎｍ、ε１５４００、ｐＨ７．０。
【００６５】
測定はそれぞれ１０回ずつ行い、吸光度の平均値を濃度算出に用いた。このように濃度を決定したＤ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液を用いて、以下のＫｍ値算出を行った。
【００６６】
４−２．Ｄ−ルシフェリンに対するＫｍ値の測定
様々なＤ−ルシフェリン濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、Ｄ−ルシフェリンに対するＫｍ値を決定した。
【００６７】
Ｄ−ルシフェリンを０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加して、異なる濃度の８種類のＤ−ルシフェリン溶液を作製した。これらの溶液は、Ｄ−ルシフェリンの終濃度がそれぞれ０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０、４０および８０μＭとなるようにＤ−ルシフェリンを含む。これらのＤ−ルシフェリン溶液を９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、４ｍＭ  ＡＴＰおよび８ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時に測定を行った。測定にはＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を使用した。測定は各ルシフェリン濃度について３回ずつ行った。
【００６８】
得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Ｖとして、ルシフェリン濃度Ｓに対してプロットした。このプロットにミカエリス・メンテン型のカーブフィッティングを行い、Ｋｍ値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。
【００６９】
４−３．ＡＴＰに対するＫｍ値の測定
様々なＡＴＰ濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、ＡＴＰに対するＫｍ値を決定した。
【００７０】
ＡＴＰを０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加して、異なる濃度の８種類のＡＴＰ溶液を作製した。これらの溶液は、ＡＴＰの終濃度がそれぞれ１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、４８０および６４０μＭとなるようにＡＴＰを含む。これらのＡＴＰ溶液をそれぞれ９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、１ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時に測定を行った。測定は各ＡＴＰ濃度について３回ずつ行った。
【００７１】
得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Ｖとして、ＡＴＰ濃度Ｓに対してプロットした。このプロットにミカエリス・メンテン型のカーブフィッティングを行い、Ｋｍ値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。
【００７２】
上記のようにして決定されたＤ−ルシフェリンに対するＫｍ値およびＡＴＰに対するＫｍ値を表１に示す。表１には、同様に測定した既知のルシフェラーゼの各Ｋｍ値も示される。ＧＬ３とはＰ．  ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼである。また、ＥＬｕｃ、ＣＢＧおよびＣＢＲとは既知のコメツキムシ由来のルシフェラーゼである。これらの既知のルシフェラーゼは市販のものを使用した。
【００７３】
【表１】
0005995372.tif 000002
【００７４】
さらに、これらの結果について、縦軸をＡＴＰに対するＫｍ値とし、横軸をＤ−ルシフェリンに対するＫｍ値としてプロットした図を、図２として示す。
【００７５】
［実施例３：発光強度の測定］
星虫ルシフェラーゼをＨｅＬａ細胞で発現させた場合の発光強度をＰ．  ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼの発光強度と比較した。
【００７６】
星虫ルシフェラーゼにおいて、哺乳細胞での発現に最適化した遺伝子を含む核酸にＫｏｚａｋ配列を付与し、ｐＦ９Ａ  ＣＭＶ  ｈＲＬｕｃ  ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイトのＳｇｆＩおよびＰｍｅＩのサイト間に挿入した。Ｋｏｚａｋ配列付与後は開始コドン直後のアミノ酸配列がプロリンからアラニンになる。ｐＦ９Ａベクターは内部コントロールとしてウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子をベクター配列に含んでおり、マルチクローニングサイトに挿入された発光遺伝子の発光強度をウミシイタケ由来ルシフェラーゼの発光強度との比として算出することが可能である。また、比較のために、既知であるＰ．  ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼの遺伝子において哺乳細胞における発現に最適化させた遺伝子を含む核酸にＫｏｚａｋ配列を付与し、同様にｐＦ９Ａ  ＣＭＶ  ｈＲＬｕｃ  ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉベクターに挿入した。
【００７７】
このようにして得られた２種のプラスミドを、２４穴のプレートに播種したＨｅＬａ細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、２４時間後ＰＢＳで細胞を洗浄した。２４穴プレートの各ウェルに２ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン／ＣＯ２  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５００μｌずつ添加し、２５℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を用いて９０分間発光強度を測定した。９０分経過時点の発光強度を星虫またはＰ．  ｐｙｒａｒｉｓ由来ルシフェラーゼの発光強度とした。各ウェル内の培養液を除去した後、ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄した。次に各ウェルに１０μＭセレンテラジン／ＣＯ２  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍを５００μｌずつ添加し、２５℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒを用いて３０分間発光強度を測定した。セレンテラジン添加後、５分経過時点の発光強度を内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼの発光強度とする。星虫またはＰ．  ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼの発光強度をウミシイタケルシフェラーゼの発光強度で除算した値を計算し、算出されたその値を各ルシフェラーゼの発光強度としてグラフ化した。その結果を図３に示す。星虫由来ルシフェラーゼはＨｅＬａ細胞内でＰ．  ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼの１．５倍の発光強度であることが示された。
【００７８】
［実施例４：星虫ルシフェラーゼの安定化］
変異型星虫ルシフェラーゼをＨｅＬａ細胞で発現させた場合の発光強度を、配列番号１に示す野生型星虫ルシフェラーゼの発光強度と比較した。
【００７９】
まず、変異型星虫ルシフェラーゼを作製した。実施例３にて作製した、コドンを最適化し且つＫｏｚａｋ配列を付与した野生型星虫ルシフェラーゼの遺伝子を含むベクターに、変異導入用のプライマー（配列番号１２）を用いて変異を導入した。これによって得られる変異型星虫ルシフェラーゼ遺伝子は、３４４番目のシステインがセリンに置換されたルシフェラーゼをコードする。変異導入の方法は、Ａｓａｋｏ  Ｓａｗａｎｏ  ａｎｄ  Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｍｉｙａｗａｋｉ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，  Ｖｏｌ．２８，  Ｎｏ．１６，  Ｅ７８に記載の方法に沿って行った。変異導入後、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇにより配列を確認し、目的の変異が導入されたことを確認した。得られた変異体の塩基配列を配列番号１３に、アミノ酸配列を配列番号１４に示す。なお、配列番号１４に記載されるアミノ酸配列は、Ｋｏｚａｋ配列を付与したことにより、２番目のアミノ酸がアラニンになっている。Ｋｏｚａｋ配列を付与せず、Ｃ３４４Ｓ変異のみを導入した後のアミノ酸配列は配列番号１５に示す。配列番号１３および１５に示される配列は以下の通りである。
【００８０】
配列番号１３
atggccaacgagattgtgctgcacggcgccaagcccagggaccctctggatctgggcacagccggcagccagctgttcagaagcctgacccagttcagctacctgcgcgaggccctggtggacgcccacaccgaacaggtggtgtcctacgccgacatcctggaaaacagctgcagactggccatctgcttcgagaagtacggcctgcggcagaacagcgtgatcgccgtgtgcagcgagaacagcgccatcttcttctaccctgtgatcgccgccctgtacatgggcatcatcaccgccaccgtgaacgacaactacaccgagagagagctgttcgacaccctgaacatcagcaagcccgagctggtgttctgcagcaagaaggccatcaagaatctgacccagctgaagaaccacatcgacttcatcaagaaactggtggtgctggacagcgacgaggacatcggcgaggtggaaagcctggccaacttcatgaagcggtacagcgagtccgtgatcgacgtgcggaacttcaagccccgggacttcgacgccaaagaacaggtggccctgatcatgagcagcagcggcaccaccggcctgcctaagggcgtggtgctgacccaccggaacctgagcgtgcgcttcgtgcactgcaaggaccctctgttcggcaccagaaccgtgcccagcaccagcatcctgagcatcgtgcccttccaccacgccttcggcatgttcaccaccctgagctacttcatcgtgggcctgagagtgatcctgctgaagagattcgaggaagagttcttcctgagcaccatcgagaagtatcgcatccccaccatcgtgctggcccctcccgtgatggtgttcctggccaagagccccctggtggatcagtacgacgtgtccagcatcagagaggtggccaccggcggagcccctgtgggaattgaagtggccgaggccgtggccaagcggctgaagatcaacggcatcctgcagggctacggcctgaccgagacatgcagcgccgtgctgatcaccccccacgaccacgtgaaaaccggcagcaccggcaaggtggccccctatgtgcaggccaaggtggtggacctgtccaccggcaagagcctgggccccaacaagcggggcgagctgtgcttcaagagcgagatcatcatgaagggctacttcaacaacatcaaggccaccgaggaagccatcgacaaagagggctggctgcacagcggcgacgtgggctactacgacgaggacggccacttctacgtggtggaccggctgaaagagctgatcaagtacaagggctaccaggtggcacctgccgagctggaatggctgctgctgcagcaccccgccatcaaggatgccggcgtgaccggcgtgccagatgaagctgctggcgagctgcctggcgcctgtatcgtgctggaagagggccactccctgaccgagcaggaagtgatcgagtacgtcgccgagcgggtgtcccccaccaagagaatcagaggcggcgtggtgttcgtggacgacatccctaagggcgccacaggcaagctggtgcgcagcgagctgcggcggatgctgagccagaaaaagtccaagctgtga
【００８１】
配列番号１５
MPNEIVLHGAKPRDPLDLGTAGSQLFRSLTQFSYLREALVDAHTEQVVSYADILENSCRLAICFEKYGLRQNSVIAVCSENSAIFFYPVIAALYMGIITATVNDNYTERELFDTLNISKPELVFCSKKAIKNLTQLKNHIDFIKKLVVLDSDEDIGEVESLANFMKRYSESVIDVRNFKPRDFDAKEQVALIMSSSGTTGLPKGVVLTHRNLSVRFVHCKDPLFGTRTVPSTSILSIVPFHHAFGMFTTLSYFIVGLRVILLKRFEEEFFLSTIEKYRIPTIVLAPPVMVFLAKSPLVDQYDVSSIREVATGGAPVGIEVAEAVAKRLKINGILQGYGLTETCSAVLITPHDHVKTGSTGKVAPYVQAKVVDLSTGKSLGPNKRGELCFKSEIIMKGYFNNIKATEEAIDKEGWLHSGDVGYYDEDGHFYVVDRLKELIKYKGYQVAPAELEWLLLQHPAIKDAGVTGVPDEAAGELPGACIVLEEGHSLTEQEVIEYVAERVSPTKRIRGGVVFVDDIPKGATGKLVRSELRRMLSQKKSKL
【００８２】
ここで使用したｐＦ９Ａベクターは内部コントロールとしてウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子をベクター配列に含んでおり、マルチクローニングサイトに挿入された発光遺伝子の発光強度をウミシイタケ由来ルシフェラーゼの発光強度との比として算出することが可能である。
【００８３】
このようにして得られた変異型星虫ルシフェラーゼのプラスミドと実施例３にて作製したコドン最適化しＫｏｚａｋ配列を付与した野生型星虫ルシフェラーゼのプラスミドとを、４８穴のプレートに播種したＨｅＬａ細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、２４時間後ＰＢＳで細胞を洗浄した。４８穴プレートの各ウェルに２ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン／ＣＯ２  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５００μｌずつ添加し、３７℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を用いて９０分間発光強度を測定した。９０分経過時点の発光強度を各由来ルシフェラーゼの発光強度とする。各ウェル内の培養液を除去した後、ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄した。次に各ウェルに１０μＭセレンテラジン／ＣＯ２  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍを５００μｌずつ添加し、３７℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒを用いて３０分間発光強度を測定した。セレンテラジン添加後、５分経過時点の発光強度を内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼの発光強度とした。野生型または変異型ルシフェラーゼの発光強度をウミシイタケルシフェラーゼの発光強度で除算した値を計算し、算出されたその値を各ルシフェラーゼの発光強度としてグラフ化した。その結果を図４に示す。変異型星虫ルシフェラーゼはＨｅＬａ細胞内で野生型星虫ルシフェラーゼの４．９倍の発光強度であることが示された。
【００８４】
当業者は、付加的な利点および改変を容易に導入するであろう。したがって、本発明は、その広い側面において、ここに示されおよび記載された、詳細な説明および代表的な実施形態に限定されない。したがって、特許請求の範囲およびその均等物によって定義される一般的な発明概念の意図および範囲を逸脱することなく、様々な改変を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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