(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）造血前駆細胞を含むヒト末梢血細胞の細胞集団を提供し、
ｂ）その造血前駆細胞の増殖を促進するための増殖条件下でその集団を培養し、
ｃ）ｉＰＳ再プログラミング因子を発現する１以上の発現カセットを含む１以上の染色体外で複製するエピソーム性ベクターをその増殖造血前駆細胞に導入し、
ｄ）フィーダー非依存性培養においてその増殖造血前駆細胞を培養し、それによりその造血前駆細胞からヒトｉＰＳ細胞を作製させ、
ｅ）ｉＰＳ細胞について選択する、
段階を含む、造血前駆細胞からヒトｉＰＳ細胞を作製するためのインビトロの方法であって、前記１以上の発現カセットが、１以上のポリシストロニックなカセットを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞集団が、外部から加えられた顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で細胞が動員されていない１以上の対象由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞集団が、体積約１０ｍＬ以下の血液試料中に含まれる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記増殖条件が、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）又はインターロイキン６（ＩＬ−６）を含む１以上のサイトカインを含む増殖培地を含む、請求項１から請求項３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記増殖条件がＮｏｔｃｈ−１リガンドを含まない、請求項１から請求項４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
段階ｂ）の前記増殖条件が、既知組成の細胞外マトリクスを含む、請求項１から請求項５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
段階ｂ）の前記増殖条件がマトリクスを含まない、請求項１から請求項５の何れかに記載の方法。
【請求項８】
段階ｂ）における条件の又は段階ｄ）の培養の酸素分圧が７％以下である、請求項１から請求項７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
前記再プログラミング因子が、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、Ｋｌｆ４、Ｃ−ｍｙｃ（又はＬ−ｍｙｃ）、ＳＶ４０ラージＴ抗原又はそれらの組み合わせである、請求項１から請求項８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
前記段階ｃ）が、前記増殖段階ｂ）の第３、４、５又は６日前後に行われる、請求項１から請求項９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
前記段階ｃ）の増殖造血前駆細胞の出発数が、約１０４個から約１０５個である、請求項１から請求項１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
前記段階ｄ）の培養が、既知組成の細胞外マトリクスを含む、請求項１から請求項１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
前記既知組成の細胞外マトリクスが、単一タイプの細胞外マトリクスペプチドを有する、請求項１から請求項１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
前記既知組成の細胞外マトリクスがヒトフィブロネクチン断片である、請求項１から請求項１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
前記段階の１以上における培地が化学的に既知組成である、請求項１から請求項１４の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
ａ）体積が１０ｍＬ以下である、造血前駆細胞を含む末梢血試料を提供し；
ｂ）ｉＰＳ再プログラミング因子を発現する１以上の発現カセットを含む１以上の染色体外で複製するエピソーム性ベクターをその造血前駆細胞に導入し；
ｃ）フィーダー非依存性培養においてその造血前駆細胞を培養し、それによってその末梢血試料からヒトｉＰＳ細胞を生成させる、
段階を含む、末梢血試料からヒトｉＰＳ細胞を作製するためのインビトロでの方法であって、前記１以上の発現カセットが、１以上のポリシストロニックなカセットを含む、方法。
【請求項１７】
前記段階ｂ）の前に前記造血前駆細胞の増殖を促進するための増殖条件下でその造血前駆細胞を培養することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
造血前駆細胞を含むヒト末梢血細胞の細胞集団及びその子孫細胞と、フィーダー非依存性細胞外マトリクスと、フィーダー非依存性培地と、を含み、その造血前駆細胞が、再プログラミング因子を発現する１以上の発現カセットを含む１以上の染色体外で複製する１以上のエピソーム性ベクターを含む、インビトロ細胞培養組成物であって、前記１以上の発現カセットが、１以上のポリシストロニックなカセットを含む、インビトロ細胞培養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１０年６月１５日出願の米国出願第６１／３５５，０４６号及び２０１０年１０月１日出願の米国出願第６１／３８８，９４９号（これらの開示全体が、権利放棄なく、それらの全体において参照により本明細書中に具体的に組み込まれる。）の優先権を主張する。本願はまた、２００９年６月５日出願の米国出願第６１／１８４，５４６号、２００９年９月４日出願の米国出願第６１／２４０，１１６号及び２０１０年６月４日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／３７３７６号にも関する（これらの開示全体が、権利放棄なく、それらの全体において参照により本明細書中に具体的に組み込まれる。）。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、全般的には分子生物学及び幹細胞の分野に関する。より具体的には、本発明は、体細胞、特に造血前駆細胞の再プログラミングに関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
一般に、幹細胞は、一連の成熟した機能的細胞を生じさせ得る未分化細胞である。例えば、造血幹細胞は、最終分化したあらゆる様々なタイプの血液細胞を生じさせ得る。胚性幹（ＥＳ）細胞は胚由来で多能性であり、従って何れかの臓器もしくは組織型へ又は少なくとも潜在的には完全な胚へと発生する能力を保持している。
【０００４】
一般にｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣと略記される人工多能性幹細胞は、非多能性細胞、一般には成体体細胞から、人工的に導かれる多能性幹細胞の一種である。人工多能性幹細胞は、ある種の幹細胞遺伝子及びタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラの形成及び潜在能及び分化能の点など、多くの点で胚性幹細胞などの天然の多能性幹細胞と同一であると考えられているが、天然の多能性幹細胞とそれらの関係は未だ評価の途上にある。
【０００５】
ＩＰＳ細胞は、２００６年に最初にマウス細胞から作製され（非特許文献１）、２００７年にヒト細胞から作製された（非特許文献２；非特許文献３）。これは、論争の的となっている胚を使用することなく、研究において重要であり、治療において使用できる可能性がある多能性幹細胞を研究者が得ることを可能にし得るため、幹細胞研究における重要な進歩として挙げられている。
【０００６】
ヒトにおいて、ｉＰＳ細胞は一般には真皮繊維芽細胞から作製される。しかし、皮膚生検を必要とし、インビトロで繊維芽細胞を数回継代して増殖させる必要があることから、皮膚は患者特異的な幹細胞を作製するには煩雑な供給源である。さらに、ヒト体細胞の再プログラミングのための先行方法は、体細胞をヒト対象から直接得るか又は大きな労力を要する細胞培養系で細胞を維持する必要があるため、不利である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ，２００６．１２６（４）：６６３−６７６
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ，２００７．１３１：８６１
【非特許文献３】Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７．３１８：１９１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、単純で使い易く、容易に利用可能な代替供給源から多能性幹細胞を誘導するための方法を開発する必要がある。本発明の開発において、血液は、患者又は健常者から回収し、保管するか又は、例えば中央流通ユニットから１以上の遠隔地へ移送することができるので、発明者らは血液細胞がこのような供給源になり得ると考えた。しかし、血液細胞、特に末梢血細胞を再プログラミングするためのより効率的な方法を開発することが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の態様は、末梢血細胞を再プログラミングする全体的なプロセス効率（ｉＰＳ系統の産生数に対する血液細胞投入数の変換効率）を向上させ、例えば標準的な血液試料（約８から１０ｍＬの体積中）から妥当な数のｉＰＳコロニー（例えば少なくとも５個）を得るために必要とされる投入血液体積を減少させることである。本発明のある実施態様は、非動員末梢血から得ることができるＣＤ３４＋出発細胞数が少ないという欠点を克服するために、末梢血からのＣＤ３４＋出発細胞数を増加させることができることを活用するという点で新規である。ＣＤ３４＋細胞を増殖させることにより、本質的にそれらの分化も引き起こすので、当業者は細胞が再プログラミングされにくくなり得ると考えるかもしれない。本発明の実施例は、増殖させた細胞から再プログラミングに十分な数が得られ、増殖させずに基本的に同一の条件で行った場合よりもかなり高い、予想外に良好な全体的プロセス効率を達成することを示す。この進歩により、本発明のある態様は、少量の末梢血から、特に動員処置していない対象からｉＰＳ細胞を作製することが可能となる。
【００１０】
一方、本発明のある態様は、組成が不明確なフィーダー細胞により生じる問題及び異種由来物混入の可能性を回避するために、既知組成の細胞外マトリクス上で末梢血細胞からｉＰＳ細胞を作製するという利点を有する。さらなる態様において、本発明はまた、再プログラミングのためにベクター組み込みを使用することに関する問題も克服する。
【００１１】
従って、第一の実施態様において、ａ）造血前駆細胞を含むヒト末梢血細胞の細胞集団を提供し；ｂ）造血前駆細胞の増殖を促進するための条件下でその集団を培養し；ｃ）ｉＰＳ再プログラミング因子を発現する外来性エピソーム性遺伝因子又は外来性ＲＮＡ遺伝因子を、増殖させた造血前駆細胞に導入し；ｄ）基本的にフィーダー細胞不含の培養又はフィーダー細胞−馴化培地において又はゼノフリー培養において、増殖させたエピソーム含有造血前駆細胞を培養し、それにより造血前駆細胞からヒトｉＰＳ細胞を生成させる段階、の１以上を含む、造血前駆細胞からヒトｉＰＳ細胞を作製するための方法が提供される。特定の態様において、少量の血液試料、例えば１０ｍＬ以下から、上記の１以上の段階を用いてｉＰＳ細胞が作製され得る。増殖段階は必ずしも必要でないことがあるが、特に血液体積が小さい場合、予想外に再プログラミング効率を大きく向上させる。
【００１２】
ある態様において、細胞集団の供給源は、外部から加えた顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）によって細胞が動員されていない１以上の対象由来である。細胞集団の供給源は、血液試料又は血液成分であり得る。適切な血液試料体積は、約１から約５ｍＬ、約１から１０ｍＬ、約１から１５ｍＬ又はより具体的には約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０ｍＬ又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲であり得る。この細胞集団は、凍結保存血液試料から得ることができるか又は、細胞集団の供給源又は細胞集団は凍結保存されているものであり得る。
【００１３】
例えば、本細胞集団は、少なくとも、約又は最大で１ｘ１０３、２ｘ１０３、３ｘ１０３、４ｘ１０３、５ｘ１０３、６ｘ１０３、７ｘ１０３、８ｘ１０３、９ｘ１０３、１ｘ１０４、２ｘ１０４、３ｘ１０４、４ｘ１０３、５ｘ１０４、６ｘ１０４、７ｘ１０４、８ｘ１０４、９ｘ１０４、１ｘ１０５、２ｘ１０５、３ｘ１０５、４ｘ１０５、５ｘ１０５、６ｘ１０５、７ｘ１０５、８ｘ１０５、９ｘ１０５、１ｘ１０６、２ｘ１０６個の造血前駆細胞又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲を含み得る。ある態様において、増殖又は再プログラミング前の出発細胞は、少なくとも又は約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３個の細胞又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲を含み得る。この出発細胞集団の播種密度は、少なくとも又は約１０、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８個／ｍＬ又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲であり得る。８から１０ｍＬの標準的な血液試料には６から１２，０００個のＣＤ３４＋細胞が含まれ得、通常これはｉＰＳ細胞コロニーを得るための再プログラミングに十分ではない。しかし、本発明のあるいくつかの態様は、十分な数まで前駆細胞を増殖させ、ｉＰＳ細胞作製を成功させるために増殖細胞を再プログラミングするための方法を提供する。特定の態様において、本細胞集団は、基本的にＴ細胞又はＢ細胞のような最終分化した血液細胞の何れも含み得ず、従ってこれら由来のｉＰＳ細胞は、遺伝子再配列なく完全なゲノムを有し得る。
【００１４】
本方法の段階ａ）において、造血前駆細胞を単離するために有用なあらゆる方法を使用し得る。例えば、このような単離は、表面マーカー発現に基づき得、これにはＣＤ３４発現の陽性選択及び／又は系統特異的マーカー発現の陰性選択が含まれ得る。選択方法には、磁気活性化細胞分類（Ｍａｇｎｅｔｉｃ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、ＭＡＣＳ（登録商標））又は蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ（商標）、即ちフローサイトメトリー）が含まれ得る。
【００１５】
造血前駆細胞の増殖又は最初の回復段階における再プログラム化造血前駆細胞の培養に対して、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）又はインターロイキン６（ＩＬ−６）を含む１以上のサイトカインを含む増殖培地を含む条件下で細胞を培養し得る。増殖条件には、固定化した改変ＮｏｔｃｈリガンドなどのＮｏｔｃｈ−１リガンドをさらに含んでもよいし（Ｄｅｌｔａ  １  ｅｘｔ−ＩｇＧ；Ｄｅｌａｎｅｙら、２０１０）又は、目的に対して末梢性であることが明示される場合はこのようなＮｏｔｃｈ−１リガンドを含まなくてもよい。再プログラミング段階前に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５日間又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲にわたり細胞を増殖させ得る。例えば、増殖相の第３、４、５又は６日前後に再プログラミング因子を細胞に導入し得る。
【００１６】
造血前駆細胞に対する増殖条件は、マトリクス成分を基本的に何ら含まなくてもよいし、又は、あるいはレトロネクチン（登録商標）のようなヒトフィブロネクチン断片などの、既知組成であるか又はゼノフリーの細胞外マトリクスを含んでもよい。
【００１７】
造血前駆細胞のインビボでの微小環境を模倣することによって造血前駆細胞のインビトロ増殖を促進するために、造血前駆細胞の増殖又は最初の回復段階における再プログラム化造血前駆細胞の培養のための条件は、低酸素条件、例えば約１から７％酸素分圧、特に約２から５％酸素であり得る。
【００１８】
本発明のまたさらなる態様において、エレクトロポレーション又は脂質介在性遺伝子送達など、外来性遺伝因子を細胞に導入するために何らかの方法を使用することができる。
【００１９】
ある態様において、エピソーム性遺伝因子は、再プログラミング因子の発現のための複製開始点及び１以上の発現カセットを含み得る。このような１以上の発現カセットは、染色体外鋳型を複製するための複製開始点に結合するトランス作用因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。あるいは、末梢血細胞がこのようなトランス作用因子を発現し得る。
【００２０】
代表的な実施態様において、複製開始点は、リンパ球向性ヘルペスウイルス又はガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス又は酵母の複製開始点、例えば、ＥＢＶのｏｒｉＰに対応する、リンパ球向性ヘルペスウイルス又はガンマヘルペスウイルスの複製開始点などであり得る。さらなる態様において、リンパ球向性ヘルペスウイルスは、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、リスザルヘルペスウイルス（ＨＳ）又はマレック病ウイルス（ＭＤＶ）であり得る。
【００２１】
外来性エピソーム性遺伝因子の複製及び一過性の維持のために、トランス作用因子は、好ましくはＥＢＶのＯｒｉＰに対応する複製開始点の存在下で、ＥＢＶのＥＢＮＡ−１（ＥＢＶ核抗原１）の野生型タンパク質に対応するポリペプチド又はその誘導体であり得る。誘導体は、野生型ＥＢＮＡ−１と比較した場合に、組み込まれた鋳型からの転写に対する活性化能が低下しており、従って染色体遺伝子を異所性に活性化して癌化を引き起こす確率が低下しているものであり得る。その一方、誘導体は、その誘導体が複製開始点に結合した後、対応する野生型タンパク質の少なくとも５％、染色体外鋳型からの転写を活性化し得る。
【００２２】
造血前駆細胞の再プログラミングに対して、本発明の方法のある態様は、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、Ｋｌｆ４及びＣ−ｍｙｃもしくはＬ−ｍｙｃの何れか又はそれらの組み合わせからなる群から選択される１以上、例えばＳｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ及び場合によってはＬｉｎ−２８のセット、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｋｌｆ４及び場合によってはＣ−ｍｙｃもしくはＬ−ｍｙｃのセット又はこれらの６因子の組み合わせを含み得る再プログラミング因子を使用することを含み得る。ある態様において、Ｃ−ｍｙｃ発現の毒性作用の可能性を低下させるために、ＳＶ４０ラージＴ遺伝子（ＳＶ４０ＬＴ）がＣ−ｍｙｃとともに含まれ得る。特定の態様において、外来性エレメントはＤＮＡ又はＲＮＡの何れでも、同じ転写制御エレメント下で、２以上の再プログラミング因子遺伝子など、１以上のポリシストロニックなカセットを含み得る。
【００２３】
いくつかのさらなる態様において、外来性再プログラミング因子が導入されている造血前駆細胞をゼノフリー細胞外マトリクスの存在下で培養し得る。ヒト細胞の場合、ゼノフリーマトリクスは、ヒトではない動物の成分を基本的に含まない細胞外マトリクスとして定義される。特定の態様において、このマトリクスは、例えば、ヒトフィブロネクチン断片、例えばレトロネクチン（登録商標）など、単一タイプの細胞外マトリクスペプチドを有するものとされ得る。
【００２４】
さらに、再プログラミングのための外来性遺伝因子導入後の段階ｄ）において、複数の異なる条件下で細胞を培養し得る。再プログラミング因子導入直後の第一のサブ段階において、上述のような造血前駆細胞増殖培地又は再プログラミング培地、それらの組み合わせ又はそれらの同等物中で細胞を培養し得る。例えば、造血前駆細胞の回復のために、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）又はインターロイキン６（ＩＬ−６）を含む１以上のサイトカインを含む培地を含む条件下で細胞を培養し得る。このサブ段階は、約、短くても又は長くても２、４、８、１２、１６、２４、３２、４８、９６時間又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲にわたり続き得る。このサブ段階において、マトリクス成分は任意であり得る。このサブ段階後、マトリクス上にない場合は細胞をマトリクスに移し得る。
【００２５】
増殖培地；再プログラミング培地、例えば再プログラミングを効率的に促進するためにＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ミオシンＩＩ  ＡＴＰａｓｅ阻害剤及び／又はＲｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達阻害剤を含む培地など；それらの組み合わせ又はそれらの同等物を含む条件下で細胞をさらに培養し、続いて１００％再プログラミング培地に移し得る。例えばＧＳＫ−３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり得；ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり得；ＴＧＦ−β受容体阻害剤はＡ−８３−０１であり得；ミオシンＩＩ  ＡＴＰａｓｅ阻害剤はブレビスタチンであり得；ＲＯＣＫ阻害剤はＨＡ−１００又はＨ１１５２であり得る。このサブ段階は、約、短くても又は長くても、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲にわたり続き得る。いくつかの態様において、この再プログラミング培地は、化学的に既知組成でもよいし、ＴｅＳＲ培地、ヒト胚細胞培養液又はＮ２Ｂ２７培地に基づいていてもよい。さらなる態様において、好ましくは徐々に、基本的にＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ミオシンＩＩ  ＡＴＰａｓｅ阻害剤及びＴＧＦ−β受容体阻害剤などの外部から加えられたシグナル伝達阻害剤を含まない培地に細胞を移し得る。このような培地は、ＴｅＳＲ２又はその他の幹細胞培地であり得、好ましくは化学的に既知組成であり得る。
【００２６】
何れかの段階もしくはサブ段階に対するか又はプロセス全体にわたる何れの培地、培養物又はマトリクスも、ゼノフリー又は既知組成のものであり得る。培地は、ＴｅＳＲ（商標）培地など、化学的に既知組成であり得る。
【００２７】
ある態様において、本方法は、例えば、ＥＳ細胞様の形態など、１以上の胚細胞の特徴に基づきｉＰＳ細胞を選択することをさらに含み得る。さらなる態様において、本方法は、ＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ミオシンＩＩ  ＡＴＰａｓｅ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達阻害剤、場合によっては白血病抑制因子（ＬＩＦ）又はそれらの組み合わせからなる群から選択される１以上のものを含むｉＰＳ細胞増殖培地中で、選択したｉＰＳ細胞を培養することを含み得る。
【００２８】
上記方法に従い作製されるｉＰＳ細胞の集団も提供し得る。
【００２９】
造血前駆細胞を含むヒト末梢血細胞の細胞集団及びその子孫細胞、ゼノフリー細胞外マトリクス及び培地を含む細胞培養組成物も提供され得、この造血前駆細胞には、再プログラミング因子を発現する１以上の外来性エピソーム性又はＲＮＡ遺伝因子が含まれる。特に、マトリクスは既知組成のものであり得る。例えば、本マトリクスは、組み換えフィブロネクチン断片など、単一タイプの細胞外マトリクスペプチドを有し得る。組み換えフィブロネクチン断片はレトロネクチン（登録商標）であり得る。さらなる態様において、本細胞培養組成物はゼノフリー又は既知組成であり得る。本培養組成物に含まれる培地はゼノフリー又は化学的に既知組成であり得る。このような培地は、再プログラム化造血前駆細胞の初期段階のための、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）又はインターロイキン６（ＩＬ−６）を含む１以上のサイトカインを含み得る。この培養組成物はまた、固定化改変Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ  １  ｅｘｔ−ＩｇＧ；Ｄｅｌａｎｅｙら、２０１０）などのＮｏｔｃｈ−１リガンドも含み得る。再プログラミング効率を向上させるために、培地には、ＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ミオシンＩＩ  ＡＴＰａｓｅ阻害剤及び／又はＲｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達阻害剤が含まれ得る。
【００３０】
細胞培養組成物中で、ヒト末梢血細胞の細胞集団は、外部から加えられる顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で細胞が動員されていない１以上の対象由来であり得る。造血前駆細胞は、インビトロで、例えば幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）又はインターロイキン６（ＩＬ−６）を含む１以上のサイトカインの存在下で増殖させたものであり得る。増殖培養は浮遊細胞培養であり得、上述のような何れの基質又はマトリクスも使用する必要がない場合がある。本細胞集団の供給源は、血液試料又は血液成分であり得る。血液試料の適切な体積は、約１から約５ｍＬ、約１から１０ｍＬ、約１から１５ｍＬ又はより具体的には約３，４，５，６，７，８、９、１０ｍＬ又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲であり得る。本細胞集団は凍結保存血液試料から得られ得るか又は、細胞集団の供給源もしくは本細胞集団は凍結保存されたものであり得る。
【００３１】
本発明の方法及び／又は組成物に関して論じる実施態様は、本明細書中に記載の何らかのその他の方法又は組成物に対して使用され得る。従って、ある方法又は組成物に関する実施態様は、本発明の他の方法及び組成物にも同様に適用され得る。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、核酸に関して「コードする（「ｅｎｃｏｄｅ」又は「ｅｎｃｏｄｉｎｇ」）」という用語は、本発明を当業者により容易に理解可能とするために使用するが、これらの用語は、それぞれ「を含む（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）」とともに交換可能に使用され得る。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」という指定は１以上を意味し得る。特許請求の範囲において本明細書中で使用される場合、「を含む」という語と組み合わせて使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は、１であるか又は１より大きいことを意味し得る。
【００３４】
特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみに言及することが明確に示されない限り又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」という意味のために使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。本明細書中で使用される場合、「別の」は、少なくとも２番目又はそれ以降を意味し得る。
【００３５】
本願を通じて、「約」という用語は、値が、値を測定するために使用される装置、方法に対する固有の誤差変動又は研究対象物の間に存在する変動を含むことを指すために使用される。
【００３６】
本発明のその他の目的、特性及び長所は、続く詳細な説明から明らかになろう。しかし、詳細な説明及び具体例は本発明の好ましい実施態様を示してはいるが、この詳細な説明から本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び改変が当業者にとって明らかとなろうから、単なる例示に過ぎないことを理解されたい。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ａ）造血前駆細胞を含むヒト末梢血細胞の細胞集団を提供し、
ｂ）その造血前駆細胞の増殖を促進するための増殖条件下でその集団を培養し、
ｃ）ｉＰＳ再プログラミング因子を発現する外来性エピソーム性遺伝因子又は外来性ＲＮＡ遺伝因子をその増殖造血前駆細胞に導入し、
ｄ）ゼノフリー培養においてその増殖造血前駆細胞を培養し、それによりその造血前駆細胞からヒトｉＰＳ細胞を作製させる、
段階を含む、造血前駆細胞からヒトｉＰＳ細胞を作製するためのインビトロの方法。
（項目２）
前記細胞集団が、外部から加えられた顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で細胞が動員されていない１以上の対象由来である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞集団が、体積約１０ｍＬ以下の血液試料中に含まれる、項目１から項目２の何れかに記載の方法。
（項目４）
前記増殖条件が、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）又はインターロイキン６（ＩＬ−６）を含む１以上のサイトカインを含む増殖培地を含む、項目１から項目３の何れかに記載の方法。
（項目５）
前記増殖条件がＮｏｔｃｈ−１リガンドを含まない、項目１から項目４の何れかに記載の方法。
（項目６）
段階ｂ）の前記増殖条件が、既知組成の細胞外マトリクスを含む、項目１から項目５の何れかに記載の方法。
（項目７）
段階ｂ）の前記増殖条件がマトリクスを含まない、項目１から項目５の何れかに記載の方法。
（項目８）
段階ｂ）における条件の又は段階ｄ）の培養の酸素分圧が７％以下である、項目１から項目７の何れかに記載の方法。
（項目９）
前記再プログラミング因子が、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、Ｋｌｆ４、Ｃ−ｍｙｃ（又はＬ−ｍｙｃ）、ＳＶ４０ラージＴ抗原又はそれらの組み合わせである、項目１から項目８の何れかに記載の方法。
（項目１０）
前記外来性エピソーム性遺伝因子又は外来性ＲＮＡ遺伝因子が、１以上のポリシストロニックなカセットを有する、項目１から項目９の何れかに記載の方法。
（項目１１）
前記段階ｃ）が、前記増殖段階ｂ）の第３、４、５又は６日前後に行われる、項目１から項目１０の何れかに記載の方法。
（項目１２）
前記段階ｃ）の増殖造血前駆細胞の出発数が、約１０４個から約１０５個である、項目１から項目１１の何れかに記載の方法。
（項目１３）
前記段階ｄ）の培養が、既知組成の細胞外マトリクスを含む、項目１から項目１２の何れかに記載の方法。
（項目１４）
前記既知組成の細胞外マトリクスが、単一タイプの細胞外マトリクスペプチドを有する、項目１から項目１３の何れかに記載の方法。
（項目１５）
前記既知組成の細胞外マトリクスがヒトフィブロネクチン断片である、項目１から項目１４の何れかに記載の方法。
（項目１６）
前記段階の１以上における培地が化学的に既知組成である、項目１から項目１５の何れかに記載の方法。
（項目１７）
ｅ）ｉＰＳ細胞について選択することをさらに含む、項目１から項目１６の何れかに記載の方法。
（項目１８）
ａ）体積が１０ｍＬ以下である、造血前駆細胞を含む末梢血試料を提供し；
ｂ）ｉＰＳ再プログラミング因子を発現する外来性エピソーム性遺伝因子又は外来性ＲＮＡ遺伝因子をその造血前駆細胞に導入し；
ｃ）ゼノフリー培養においてその造血前駆細胞を培養し、それによってその末梢血試料からヒトｉＰＳ細胞を生成させる、
段階を含む、末梢血試料からヒトｉＰＳ細胞を作製するためのインビトロでの方法。
（項目１９）
前記段階ｂ）の前に前記造血前駆細胞の増殖を促進するための増殖条件下でその造血前駆細胞を培養することをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
造血前駆細胞を含むヒト末梢血細胞の細胞集団及びその子孫細胞と、ゼノフリー細胞外マトリクスと、ゼノフリー培地と、を含み、その造血前駆細胞が、再プログラミング因子を発現する１以上の外来性エピソーム性遺伝因子又は外来性ＲＮＡ遺伝因子を含む、インビトロ細胞培養組成物。
【００３７】
次の図面は本明細書の一部をなすものであり、本発明のある態様をさらに明らかにするために含まれる。本明細書中で与えられる具体的な実施態様の詳細な説明と合わせてこれらの図面の１以上を参照することによって、本発明がより詳細に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】典型的な再プログラミングプロセスの概略図。標準的な方式において、８ｍＬバイアルの全血を処理してＰＢＭＣを得て、これを凍結するか又はＣＤ３４発現細胞を濃縮するために新鮮血を精製する。次に、形質移入のための最適数の細胞を得るため、増殖期用にこれらの細胞を播種する。次いで、１００％新鮮増殖培地中で又は低分子物と混合した再プログラミング培地と組み合わせて、形質移入細胞を再懸濁する。少なくとも４８時間内に、細胞を既知組成のフィーダーフリーマトリクスに移し、低分子物と混合した１００％再プログラミング培地を１日おきに供給する。形質移入からおよそ９から１４日後（ｄｐｔ）、培養物に低分子不含の既知組成の多能性幹細胞培地（即ちＴｅＳＲ２）を供給する。次に、ｉＰＳコロニーを同定するために、Ｔｒａ１−８１で１８から２５ｄｐｔまでにコロニーを染色する。
【図２Ａ】造血前駆細胞（ＨＰ）は、非動員血液ドナーから増殖可能である。図２Ａは、３種類の試験条件を用いた、単一の非動員血液ドナーからのＨＰの増殖を示す。各条件は、サイトカイン富化培地に依存する一方、マトリクスは、マトリクス−不含、フィブロネクチン被覆（Ｎｏｔｃｈ−）及びフィブロネクチン／ＤＬＬ−１被覆（Ｎｏｔｃｈ＋）と様々であった。図２Ｂは、前駆細胞がより分化した細胞型へと変化していく際に起こるＣＤ３４発現の自然減少を示す。ＣＤ４５発現は一般に造血系細胞の指標である。増殖中に１０日目に採取した同じドナーからの細胞は、Ｂ、Ｔ及びＮＫマーカーの発現がごく僅かであるか又はない（データを示さず。）という、本質的に主に骨髄である発現プロファイルを示した（図２Ｃ）。さらに、本明細書中で、増殖が複数のドナーにわたり一致するが、その増殖の度合いは、患者試料間で変動があることが分かった（図２Ｄ）。複数の再プログラミング実験を行うためにより多数の細胞を確立するために、５名のドナーのプールを作った。このプールに対して増殖能を２回調べた（複製物１及び２、Ｒ１及びＲ２）（図２Ｅ）。
【図２Ｂ】造血前駆細胞（ＨＰ）は、非動員血液ドナーから増殖可能である。図２Ａは、３種類の試験条件を用いた、単一の非動員血液ドナーからのＨＰの増殖を示す。各条件は、サイトカイン富化培地に依存する一方、マトリクスは、マトリクス−不含、フィブロネクチン被覆（Ｎｏｔｃｈ−）及びフィブロネクチン／ＤＬＬ−１被覆（Ｎｏｔｃｈ＋）と様々であった。図２Ｂは、前駆細胞がより分化した細胞型へと変化していく際に起こるＣＤ３４発現の自然減少を示す。ＣＤ４５発現は一般に造血系細胞の指標である。増殖中に１０日目に採取した同じドナーからの細胞は、Ｂ、Ｔ及びＮＫマーカーの発現がごく僅かであるか又はない（データを示さず。）という、本質的に主に骨髄である発現プロファイルを示した（図２Ｃ）。さらに、本明細書中で、増殖が複数のドナーにわたり一致するが、その増殖の度合いは、患者試料間で変動があることが分かった（図２Ｄ）。複数の再プログラミング実験を行うためにより多数の細胞を確立するために、５名のドナーのプールを作った。このプールに対して増殖能を２回調べた（複製物１及び２、Ｒ１及びＲ２）（図２Ｅ）。
【図２Ｃ】造血前駆細胞（ＨＰ）は、非動員血液ドナーから増殖可能である。図２Ａは、３種類の試験条件を用いた、単一の非動員血液ドナーからのＨＰの増殖を示す。各条件は、サイトカイン富化培地に依存する一方、マトリクスは、マトリクス−不含、フィブロネクチン被覆（Ｎｏｔｃｈ−）及びフィブロネクチン／ＤＬＬ−１被覆（Ｎｏｔｃｈ＋）と様々であった。図２Ｂは、前駆細胞がより分化した細胞型へと変化していく際に起こるＣＤ３４発現の自然減少を示す。ＣＤ４５発現は一般に造血系細胞の指標である。増殖中に１０日目に採取した同じドナーからの細胞は、Ｂ、Ｔ及びＮＫマーカーの発現がごく僅かであるか又はない（データを示さず。）という、本質的に主に骨髄である発現プロファイルを示した（図２Ｃ）。さらに、本明細書中で、増殖が複数のドナーにわたり一致するが、その増殖の度合いは、患者試料間で変動があることが分かった（図２Ｄ）。複数の再プログラミング実験を行うためにより多数の細胞を確立するために、５名のドナーのプールを作った。このプールに対して増殖能を２回調べた（複製物１及び２、Ｒ１及びＲ２）（図２Ｅ）。
【図２Ｄ】造血前駆細胞（ＨＰ）は、非動員血液ドナーから増殖可能である。図２Ａは、３種類の試験条件を用いた、単一の非動員血液ドナーからのＨＰの増殖を示す。各条件は、サイトカイン富化培地に依存する一方、マトリクスは、マトリクス−不含、フィブロネクチン被覆（Ｎｏｔｃｈ−）及びフィブロネクチン／ＤＬＬ−１被覆（Ｎｏｔｃｈ＋）と様々であった。図２Ｂは、前駆細胞がより分化した細胞型へと変化していく際に起こるＣＤ３４発現の自然減少を示す。ＣＤ４５発現は一般に造血系細胞の指標である。増殖中に１０日目に採取した同じドナーからの細胞は、Ｂ、Ｔ及びＮＫマーカーの発現がごく僅かであるか又はない（データを示さず。）という、本質的に主に骨髄である発現プロファイルを示した（図２Ｃ）。さらに、本明細書中で、増殖が複数のドナーにわたり一致するが、その増殖の度合いは、患者試料間で変動があることが分かった（図２Ｄ）。複数の再プログラミング実験を行うためにより多数の細胞を確立するために、５名のドナーのプールを作った。このプールに対して増殖能を２回調べた（複製物１及び２、Ｒ１及びＲ２）（図２Ｅ）。
【図２Ｅ】造血前駆細胞（ＨＰ）は、非動員血液ドナーから増殖可能である。図２Ａは、３種類の試験条件を用いた、単一の非動員血液ドナーからのＨＰの増殖を示す。各条件は、サイトカイン富化培地に依存する一方、マトリクスは、マトリクス−不含、フィブロネクチン被覆（Ｎｏｔｃｈ−）及びフィブロネクチン／ＤＬＬ−１被覆（Ｎｏｔｃｈ＋）と様々であった。図２Ｂは、前駆細胞がより分化した細胞型へと変化していく際に起こるＣＤ３４発現の自然減少を示す。ＣＤ４５発現は一般に造血系細胞の指標である。増殖中に１０日目に採取した同じドナーからの細胞は、Ｂ、Ｔ及びＮＫマーカーの発現がごく僅かであるか又はない（データを示さず。）という、本質的に主に骨髄である発現プロファイルを示した（図２Ｃ）。さらに、本明細書中で、増殖が複数のドナーにわたり一致するが、その増殖の度合いは、患者試料間で変動があることが分かった（図２Ｄ）。複数の再プログラミング実験を行うためにより多数の細胞を確立するために、５名のドナーのプールを作った。このプールに対して増殖能を２回調べた（複製物１及び２、Ｒ１及びＲ２）（図２Ｅ）。
【図３】造血前駆細胞（ＨＰ）の形質移入のためのベクター。細胞の再プログラミングを成功させるために、ＧＦＰ発現対照プラスミド又は再プログラミングのための因子を発現するプラスミドの組み合わせの何れかを用いてＨＰに対してエレクトロポレーションにより形質移入を行う。首尾よく使用されてきた再プログラミング因子の様々な組み合わせを発現させるために使用することができるプラスミドの組み合わせは複数あり、このようなプラスミドの例を本明細書中で示す。各プラスミドは、ｏｒｉＰ及び、形質移入細胞内にプラスミドが確実に保持されるようにするためにＥＢＮＡ１を発現するカセットを有する。
【図４】ポリシストロニックなベクターに対するベクターマップ−セット１及びセット２。
【図５Ａ】再プログラミングのための投入細胞数及び形質移入効率の最適化。図５Ａ．ドナーＧＧ（ロイコパックソース）由来のＰＢＭＣからの精製細胞を６日間増殖させた。ＧＦＰを発現する、対照のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１−ベースのプラスミドを用いて、一連の細胞数に対して形質移入を行った。フローサイトメトリーにより検出されるＧＦＰを発現する生存細胞の％を計算することによって、形質移入効率を求めた。図５Ｂ．ＰＢＭＣ（ドナーＡ２３８９）からの精製細胞を３日又は６日間増殖させ、対照のＧＦＰ−発現プラスミドを用いて６ｘ１０４から１ｘ１０５個の細胞に対して形質移入を行った。このグラフは、ＧＦＰ−陽性である集団全体の％及び総細胞の絶対数を示す。図５Ｃ．このグラフは、増殖３日又は６日で形質移入した場合のＧＦＰ及びＣＤ３４も共発現するｂの細胞分画を表す。図５Ｄ．形質移入のために組み合わせプラスミドセット２を用いた新鮮採血血液（ドナー３００２）からの代表的な再プログラミング試験。アルカリホスファターゼ活性（ｉ）に対する陽性染色コロニーを含有する６ウェルプレートから、１つのウェルを示す。白矢印は、パネルｉｉで拡大したコロニーを示すが、これはまたパネルｉｉｉでＴｒａ１−８１発現について陽性染色されている。図５Ｅ．６日間にわたり増殖させた一連の投入細胞数に対して、プラスミドセット２を用いて再プログラミング試験を行った（ドナーＧＧ）。図５Ｆ．４名の異なるドナーから精製したＣＤ３４発現細胞を６日間にわたり増殖させ、比較するためにＣ−ｍｙｃ（セット１）又はＬ−ｍｙｃ（セット２）を発現するプラスミドの組み合わせを用いて形質移入を行い、ｉＰＳＣの総数を比較した。
【図５Ｂ】再プログラミングのための投入細胞数及び形質移入効率の最適化。図５Ａ．ドナーＧＧ（ロイコパックソース）由来のＰＢＭＣからの精製細胞を６日間増殖させた。ＧＦＰを発現する、対照のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１−ベースのプラスミドを用いて、一連の細胞数に対して形質移入を行った。フローサイトメトリーにより検出されるＧＦＰを発現する生存細胞の％を計算することによって、形質移入効率を求めた。図５Ｂ．ＰＢＭＣ（ドナーＡ２３８９）からの精製細胞を３日又は６日間増殖させ、対照のＧＦＰ−発現プラスミドを用いて６ｘ１０４から１ｘ１０５個の細胞に対して形質移入を行った。このグラフは、ＧＦＰ−陽性である集団全体の％及び総細胞の絶対数を示す。図５Ｃ．このグラフは、増殖３日又は６日で形質移入した場合のＧＦＰ及びＣＤ３４も共発現するｂの細胞分画を表す。図５Ｄ．形質移入のために組み合わせプラスミドセット２を用いた新鮮採血血液（ドナー３００２）からの代表的な再プログラミング試験。アルカリホスファターゼ活性（ｉ）に対する陽性染色コロニーを含有する６ウェルプレートから、１つのウェルを示す。白矢印は、パネルｉｉで拡大したコロニーを示すが、これはまたパネルｉｉｉでＴｒａ１−８１発現について陽性染色されている。図５Ｅ．６日間にわたり増殖させた一連の投入細胞数に対して、プラスミドセット２を用いて再プログラミング試験を行った（ドナーＧＧ）。図５Ｆ．４名の異なるドナーから精製したＣＤ３４発現細胞を６日間にわたり増殖させ、比較するためにＣ−ｍｙｃ（セット１）又はＬ−ｍｙｃ（セット２）を発現するプラスミドの組み合わせを用いて形質移入を行い、ｉＰＳＣの総数を比較した。
【図５Ｃ】再プログラミングのための投入細胞数及び形質移入効率の最適化。図５Ａ．ドナーＧＧ（ロイコパックソース）由来のＰＢＭＣからの精製細胞を６日間増殖させた。ＧＦＰを発現する、対照のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１−ベースのプラスミドを用いて、一連の細胞数に対して形質移入を行った。フローサイトメトリーにより検出されるＧＦＰを発現する生存細胞の％を計算することによって、形質移入効率を求めた。図５Ｂ．ＰＢＭＣ（ドナーＡ２３８９）からの精製細胞を３日又は６日間増殖させ、対照のＧＦＰ−発現プラスミドを用いて６ｘ１０４から１ｘ１０５個の細胞に対して形質移入を行った。このグラフは、ＧＦＰ−陽性である集団全体の％及び総細胞の絶対数を示す。図５Ｃ．このグラフは、増殖３日又は６日で形質移入した場合のＧＦＰ及びＣＤ３４も共発現するｂの細胞分画を表す。図５Ｄ．形質移入のために組み合わせプラスミドセット２を用いた新鮮採血血液（ドナー３００２）からの代表的な再プログラミング試験。アルカリホスファターゼ活性（ｉ）に対する陽性染色コロニーを含有する６ウェルプレートから、１つのウェルを示す。白矢印は、パネルｉｉで拡大したコロニーを示すが、これはまたパネルｉｉｉでＴｒａ１−８１発現について陽性染色されている。図５Ｅ．６日間にわたり増殖させた一連の投入細胞数に対して、プラスミドセット２を用いて再プログラミング試験を行った（ドナーＧＧ）。図５Ｆ．４名の異なるドナーから精製したＣＤ３４発現細胞を６日間にわたり増殖させ、比較するためにＣ−ｍｙｃ（セット１）又はＬ−ｍｙｃ（セット２）を発現するプラスミドの組み合わせを用いて形質移入を行い、ｉＰＳＣの総数を比較した。
【図５Ｄ】再プログラミングのための投入細胞数及び形質移入効率の最適化。図５Ａ．ドナーＧＧ（ロイコパックソース）由来のＰＢＭＣからの精製細胞を６日間増殖させた。ＧＦＰを発現する、対照のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１−ベースのプラスミドを用いて、一連の細胞数に対して形質移入を行った。フローサイトメトリーにより検出されるＧＦＰを発現する生存細胞の％を計算することによって、形質移入効率を求めた。図５Ｂ．ＰＢＭＣ（ドナーＡ２３８９）からの精製細胞を３日又は６日間増殖させ、対照のＧＦＰ−発現プラスミドを用いて６ｘ１０４から１ｘ１０５個の細胞に対して形質移入を行った。このグラフは、ＧＦＰ−陽性である集団全体の％及び総細胞の絶対数を示す。図５Ｃ．このグラフは、増殖３日又は６日で形質移入した場合のＧＦＰ及びＣＤ３４も共発現するｂの細胞分画を表す。図５Ｄ．形質移入のために組み合わせプラスミドセット２を用いた新鮮採血血液（ドナー３００２）からの代表的な再プログラミング試験。アルカリホスファターゼ活性（ｉ）に対する陽性染色コロニーを含有する６ウェルプレートから、１つのウェルを示す。白矢印は、パネルｉｉで拡大したコロニーを示すが、これはまたパネルｉｉｉでＴｒａ１−８１発現について陽性染色されている。図５Ｅ．６日間にわたり増殖させた一連の投入細胞数に対して、プラスミドセット２を用いて再プログラミング試験を行った（ドナーＧＧ）。図５Ｆ．４名の異なるドナーから精製したＣＤ３４発現細胞を６日間にわたり増殖させ、比較するためにＣ−ｍｙｃ（セット１）又はＬ−ｍｙｃ（セット２）を発現するプラスミドの組み合わせを用いて形質移入を行い、ｉＰＳＣの総数を比較した。
【図５Ｅ】再プログラミングのための投入細胞数及び形質移入効率の最適化。図５Ａ．ドナーＧＧ（ロイコパックソース）由来のＰＢＭＣからの精製細胞を６日間増殖させた。ＧＦＰを発現する、対照のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１−ベースのプラスミドを用いて、一連の細胞数に対して形質移入を行った。フローサイトメトリーにより検出されるＧＦＰを発現する生存細胞の％を計算することによって、形質移入効率を求めた。図５Ｂ．ＰＢＭＣ（ドナーＡ２３８９）からの精製細胞を３日又は６日間増殖させ、対照のＧＦＰ−発現プラスミドを用いて６ｘ１０４から１ｘ１０５個の細胞に対して形質移入を行った。このグラフは、ＧＦＰ−陽性である集団全体の％及び総細胞の絶対数を示す。図５Ｃ．このグラフは、増殖３日又は６日で形質移入した場合のＧＦＰ及びＣＤ３４も共発現するｂの細胞分画を表す。図５Ｄ．形質移入のために組み合わせプラスミドセット２を用いた新鮮採血血液（ドナー３００２）からの代表的な再プログラミング試験。アルカリホスファターゼ活性（ｉ）に対する陽性染色コロニーを含有する６ウェルプレートから、１つのウェルを示す。白矢印は、パネルｉｉで拡大したコロニーを示すが、これはまたパネルｉｉｉでＴｒａ１−８１発現について陽性染色されている。図５Ｅ．６日間にわたり増殖させた一連の投入細胞数に対して、プラスミドセット２を用いて再プログラミング試験を行った（ドナーＧＧ）。図５Ｆ．４名の異なるドナーから精製したＣＤ３４発現細胞を６日間にわたり増殖させ、比較するためにＣ−ｍｙｃ（セット１）又はＬ−ｍｙｃ（セット２）を発現するプラスミドの組み合わせを用いて形質移入を行い、ｉＰＳＣの総数を比較した。
【図５Ｆ】再プログラミングのための投入細胞数及び形質移入効率の最適化。図５Ａ．ドナーＧＧ（ロイコパックソース）由来のＰＢＭＣからの精製細胞を６日間増殖させた。ＧＦＰを発現する、対照のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１−ベースのプラスミドを用いて、一連の細胞数に対して形質移入を行った。フローサイトメトリーにより検出されるＧＦＰを発現する生存細胞の％を計算することによって、形質移入効率を求めた。図５Ｂ．ＰＢＭＣ（ドナーＡ２３８９）からの精製細胞を３日又は６日間増殖させ、対照のＧＦＰ−発現プラスミドを用いて６ｘ１０４から１ｘ１０５個の細胞に対して形質移入を行った。このグラフは、ＧＦＰ−陽性である集団全体の％及び総細胞の絶対数を示す。図５Ｃ．このグラフは、増殖３日又は６日で形質移入した場合のＧＦＰ及びＣＤ３４も共発現するｂの細胞分画を表す。図５Ｄ．形質移入のために組み合わせプラスミドセット２を用いた新鮮採血血液（ドナー３００２）からの代表的な再プログラミング試験。アルカリホスファターゼ活性（ｉ）に対する陽性染色コロニーを含有する６ウェルプレートから、１つのウェルを示す。白矢印は、パネルｉｉで拡大したコロニーを示すが、これはまたパネルｉｉｉでＴｒａ１−８１発現について陽性染色されている。図５Ｅ．６日間にわたり増殖させた一連の投入細胞数に対して、プラスミドセット２を用いて再プログラミング試験を行った（ドナーＧＧ）。図５Ｆ．４名の異なるドナーから精製したＣＤ３４発現細胞を６日間にわたり増殖させ、比較するためにＣ−ｍｙｃ（セット１）又はＬ−ｍｙｃ（セット２）を発現するプラスミドの組み合わせを用いて形質移入を行い、ｉＰＳＣの総数を比較した。
【図６】ＢＳＡ−含有サプリメントＢ２７の非存在下でｉＰＳＣの生成が起こる。
【図７Ａ】ＣＤ３４発現量は再プログラミング効率と相関する。図７Ａ．代表的な再プログラミング試験であり、再プログラミングのために精製後のＣＤ３４陽性（ｉ）及び陰性（ｉｉ）分画の両方を使用した。パネル（ｉ）は、コロニーがアルカリホスファターゼ（ＡＰ染色、青色）を発現する能力に基づく、ドナー２９３９からの再プログラム化コロニーを首尾よく含有する６ウェルプレートの１つのウェルを示す。ドナー２９３９からのＣＤ３４枯渇分画は、精製集団パネルｉｉと並行して行った際にＡＰ染色されないことにより示されるようにコロニーを形成することができなかった。パネルｉｉｉ及びｉｖは白矢印により目印を付けたパネル（ｉ）のコロニーの拡大写真であり、Ｔｒａ１−８１（緑色）の発現を示す。図７Ｂ．４名の異なる血液ドナーから精製した細胞を３、６、９又は１３日間にわたり増殖させた。フィーダーフリーの再プログラミングプロトコールにおいて、Ｌ−ｍｙｃ発現プラスミドＤＮＡの組み合わせセット２を用いて、全時間点又は時間点の一部からの細胞集団を試験した。ＥＳ細胞の特徴である形態特性及びＴｒａ１−８１に対する陽性染色能を示すｉＰＳＣの総数を形質移入に使用される細胞総数により除したものとして、再プログラミング効率を計算した。黒四角は、指示された時間点でのＣＤ３４発現集団の％を示す。
【図７Ｂ】ＣＤ３４発現量は再プログラミング効率と相関する。図７Ａ．代表的な再プログラミング試験であり、再プログラミングのために精製後のＣＤ３４陽性（ｉ）及び陰性（ｉｉ）分画の両方を使用した。パネル（ｉ）は、コロニーがアルカリホスファターゼ（ＡＰ染色、青色）を発現する能力に基づく、ドナー２９３９からの再プログラム化コロニーを首尾よく含有する６ウェルプレートの１つのウェルを示す。ドナー２９３９からのＣＤ３４枯渇分画は、精製集団パネルｉｉと並行して行った際にＡＰ染色されないことにより示されるようにコロニーを形成することができなかった。パネルｉｉｉ及びｉｖは白矢印により目印を付けたパネル（ｉ）のコロニーの拡大写真であり、Ｔｒａ１−８１（緑色）の発現を示す。図７Ｂ．４名の異なる血液ドナーから精製した細胞を３、６、９又は１３日間にわたり増殖させた。フィーダーフリーの再プログラミングプロトコールにおいて、Ｌ−ｍｙｃ発現プラスミドＤＮＡの組み合わせセット２を用いて、全時間点又は時間点の一部からの細胞集団を試験した。ＥＳ細胞の特徴である形態特性及びＴｒａ１−８１に対する陽性染色能を示すｉＰＳＣの総数を形質移入に使用される細胞総数により除したものとして、再プログラミング効率を計算した。黒四角は、指示された時間点でのＣＤ３４発現集団の％を示す。
【図８】完全既知組成の試薬（動物由来物質不含）を用いた血液細胞由来ｉＰＳＣ。図８Ａ．増殖６日後の、標準的な（ｎ＝１３）及び完全既知組成の動物由来物質不含培地（ｎ＝２）中での、複数のドナーから集めたＣＤ３４発現細胞の倍単位の増殖。第６日の細胞総数を精製翌日の細胞数で除して、倍単位の増殖を計算した。％は、集団全体中のＣＤ３４発現細胞の分画を示す。図８Ｂ．この画像は、完全既知組成の動物由来物質不含試薬を用いてＣＤ３４発現について濃縮させた増殖細胞を再プログラミングした後の、アルカリホスファターゼに対して陽性染色されたコロニーを含有する６ウェルプレートのうち１つのウェルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
Ｉ．導入
本発明は、末梢血細胞の再プログラミングの全体的プロセス効率を改善するための方法及び組成物に関する。このような再プログラミングは、ゼノフリー又は既知組成条件下であり得、基本的に外来性レトロウイルス遺伝因子不含であり得、従ってより臨床的に意義のあるｉＰＳ細胞が作製される。
【００４０】
ｉＰＳ細胞は、不明確な系及び染色体組み込みに依存するウイルスを利用した方法を含む方法を用いて誘導されることにより、その完全な臨床的関連の評価が阻まれている。例えば、マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）は、ＭＥＦの存在下で馴化された再プログラミング培地とともにｉＰＳ発生を促進するための支持層として頻繁に使用されてきた。発明者らは、使用ＭＥＦの品質がバッチ間で変動し得ることにより再プログラミング効率が幾分影響を受けることを見出した。従って、ＭＥＦの再プログラミングに対する寄与は不明確であるため、その変動性を調節し、定量することは困難である。従って、結果がより予測可能となるように、組成がより明確でＭＥＦに依存しない、操作に適した系を確立することが好ましい。複数の研究室が、マトリゲル（商標）（マウス起源）又はその誘導体（Ａａｓｅｎ及びＢｅｌｍｏｎｔｅ、２０１０；Ｓｕｎら、２００９）などのフィーダーフリー基質を用いたｉＰＳ細胞の作製に成功しているが、末梢血細胞又はゼノフリーマトリクスを用いた研究グループはない。
【００４１】
さらに、ウイルスを利用した再プログラミング法は、今まで、非組み込み法よりも効率的であることが証明されており、従ってｉＰＳ細胞を作製するためにより一貫して使用されている。残念ながら、Ｃ−ｍｙｃ及びＴ−抗原などの既知の癌遺伝子をコードする組み込みＤＮＡ保有発現カセットが存在することは、少なくとも２つの理由のために許容できない。それらが存在すると必ず、それらの遺伝子の再活性化及び発現の脅威を引き起こすが、これは臨床応用の制限のある基準内で認めることはできない。ウイルスを利用した方法により発生する組み込みが複数の、多くの場合は予測できない位置で起こり得るが、これらは、増殖又は重大な細胞プロセスを調節するために非常に重要であり得る宿主ＤＮＡ内に存在する内在遺伝子の発現を混乱させ、下流分析においてこれらの細胞性能を変動させる可能性がある。従って、既知組成の条件を用いたｉＰＳ細胞作製のための非組み込みストラテジーによって、この潜在的な変動性が軽減される。
【００４２】
臨床応用に対する厳しい基準に合致させるために患者特異的な細胞を提供するため、ｉＰＳクローンは、標的細胞の高い分画を含有するか又は少なくとも増殖に適している扱い易い供給源から作製され、フィーダーフリー条件又は化学的に既知組成の条件から生成され、何百もの試料にわたりスケーラブルなプロセスを介して再プログラミング可能でなければならない。血液は、世界中で日常的に患者から採取される、非常に入手し易い組織供給源であり、ウイルス性ベクターを組み込むことにより、動員及び非動員血液ドナー由来の細胞を再プログラミングすることに成功している（Ｌｏｈら、２００９；Ｙｅら、２００９）（ＰｌｏＳ、印刷中）。ＣＤ３４発現に対して濃縮された細胞は特に、繊維芽細胞よりも効率的に再プログラミングすることが示されている。
【００４３】
しかし、ＣＤ３４＋細胞を再プログラミングするための最新の方法は、臨床応用に必要な厳密なゼノフリー基準を満たすものではない。第一に、ＣＤ３４＋細胞が占めるのは、非動員化末梢血の小規模な分画（０．１％）（血液１ｍＬあたり僅か１０００個の細胞）に過ぎない。第二に、研究者らは、染色体ＤＮＡへの組み込みを必要とするウイルスベースの方法に依存してきた。第三に、公開されている方法はＭＥＦ及び馴化培地を含み、従って組成不明確であり、異種性混入物を含有する。
【００４４】
本発明は、末梢血からｉＰＳ細胞を作製するための完全既知組成プロセスの発見に一部基づく。実施例で示されるように、１０ｍＬ未満の血液からＣＤ３４発現細胞の集団を増殖させるための及び、組み込まれて最終的に染色体外となるＤＮＡを含まないフィーダーフリー条件下でｉＰＳ細胞を作製するための方法が提供される。
【００４５】
本発明のさらなる実施態様及び長所を下記で説明する。
ＩＩ．定義
【００４６】
「再プログラミング」は、培養又はインビボの何れかにおいて、再プログラミングなしで同じ条件下にある場合よりも、測定可能な程度に少なくとも１つの新しい細胞型の子孫を細胞が形成する能力を向上させるプロセスである。より具体的には、再プログラミングは、体細胞に対して多能性を与えるプロセスである。これは、基本的にこのような子孫が再プログラミング前に形成され得ない場合、十分な増殖後に、測定可能な割合の、新しい細胞型の表現型の特徴を有する子孫が形成され得、新しい細胞型の特長を有するものの割合が、再プログラミング前よりも、測定可能な程度に多くなることを意味する。ある一定の条件下で、新しい細胞型の特徴がある子孫の割合は、少なくとも約１％、５％、２５％以上（後出のものほど好ましい。）であり得る。
【００４７】
「ゼノフリー（ＸＦ）」又は「動物由来成分不含（ＡＣＦ）」又は「動物由来物質不含」という用語は、培地に関連して使用される場合、細胞外マトリクス又は培養条件が、基本的に異種の動物由来成分不含である、培地、細胞外マトリクス又は培養条件を指す。ヒト細胞を培養する場合、マウスなどの非ヒト動物のあらゆるタンパク質が異種性成分である。ある態様において、ゼノフリーマトリクスは、基本的にあらゆる非ヒト動物由来成分不含であり得、従ってマウスフィーダー細胞又はマトリゲル（商標）は除外される。マトリゲル（商標）は、ラミニン（主要成分）、コラーゲンＩＶ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチン／ナイドジェンを含むようにエンゲルブレス−ホルム−スワム（ＥＨＳ）マウス肉腫という細胞外マトリクスタンパク質が豊富な腫瘍から抽出された可溶化基底膜標品である。
【００４８】
「既知組成の」という用語は、培地、細胞外マトリクス又は培養条件に関して使用される場合、ほぼ全ての構成成分の性質及び量が既知である、培地、細胞外マトリクス又は培養条件を指す。
【００４９】
「化学的に既知組成の培地」は、ほぼ全ての成分の化学的性質及びそれらの量が既知である培地を指す。これらの培地は合成培地とも呼ばれる。化学的に既知組成の培地の例としてはＴｅＳＲ（商標）が挙げられる。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、細胞は、それらが有する外来性遺伝因子又はベクターエレメントが１０％未満であるときは外来性遺伝因子又はベクターエレメントについて「実質的に不含」であり、それらが有する外来性遺伝因子又はベクターエレメントが１％未満であるときは外来性遺伝因子又はベクターエレメントについて「基本的に不含」である。しかし、外来性遺伝因子又はベクターエレメントを含むものが総細胞集団の０．５％未満又は０．１％未満である細胞集団がさらにより望ましい。
【００５１】
培養物、マトリクス又は培地は、シグナル伝達阻害剤、動物成分又はフィーダー細胞などのある一定の物質について、その培養物、マトリクス又は培地が有するこれらの物質のレベルがそれぞれ、当業者にとって公知の従来の検出方法を用いて検出可能なレベルよりも低いレベルであるか、又はこれらの物質がその培養物、マトリクス又は培地に外来的に添加されていない場合、「基本的に不含」である。
【００５２】
「末梢血細胞」は、赤血球細胞、白血球細胞及び血小板を含み、血液の循環プール内で見出される、血液の細胞成分を指す。
【００５３】
「造血前駆細胞」又は「造血系前駆細胞」は、造血系に拘束されているが、さらなる造血系分化が可能である細胞を指し、造血幹細胞、多能性造血幹細胞（血球母細胞）、骨髄前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞及びリンパ球前駆細胞を含む。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）及びリンパ球系統（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての血液細胞型を生じさせる多能性幹細胞である。造血前駆細胞はＣＤ３４を発現してもよいし又はしなくてもよい。造血前駆細胞は、ＣＤ１３３を同時発現し得、ＣＤ３８発現について陰性であり得る。ある実施態様において、ある一定のヒト造血前駆細胞は、ＣＤ３４を発現しなくてもよいが、これらの細胞は、それでもなお、本明細書中で開示される方法を介してｉＰＳ細胞に変換され得る。造血系前駆細胞としては、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋造血前駆細胞及びＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋／ＣＤ４３＋造血系前駆細胞が挙げられる。このＣＤ３４＋／ＣＤ４３＋／ＣＤ４５＋造血系前駆細胞は、骨髄前駆細胞が非常に豊富であり得る。ＣＤ３４＋／ＣＤ４３＋／ＣＤ４５＋造血前駆細胞などの造血前駆細胞の様々な系統は、本明細書中で開示される方法を介してｉＰＳ細胞へと変換され得る。造血前駆細胞はまた、ＣＤ３４−／ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−（原始造血前駆細胞）、ＣＤ４３（＋）ＣＤ２３５ａ（＋）ＣＤ４１ａ（＋／−）（赤血球−巨核球形成性）、ｌｉｎ（−）ＣＤ３４（＋）ＣＤ４３（＋）ＣＤ４５（−）（多能性）及びｌｉｎ（−）ＣＤ３４（＋）ＣＤ４３（＋）ＣＤ４５（＋）（骨髄偏向（ｍｙｅｌｏｉｄ−ｓｋｅｗｅｄ））細胞、ＣＤ１３３＋／ＡＬＤＨ＋（アルデヒドデヒドロゲナーゼ）をはじめとした様々な原始造血細胞のサブセットも含む（例えば、Ｈｅｓｓら．２００４；Ｃｈｒｉｓｔら、２００７）。これらの原始造血系細胞型又は造血前駆細胞の何れも、本明細書中で記載のようにｉＰＳ細胞に変換され得ることが予測される。
【００５４】
「ベクター」又は「コンストラクト」（遺伝子送達又は遺伝子移入「ビヒクル」と呼ばれることがある。）は、インビトロ又はインビボの何れかで宿主細胞に送達させようとするポリヌクレオチドを含む巨大分子又は分子複合体を指す。ベクターは線状でもよいし又は環状分子でもよい。
【００５５】
「プラスミド」は、一般的なタイプのベクターであり、染色体ＤＮＡとは独立に複製可能である、染色体ＤＮＡから離れた染色体外ＤＮＡ分子である。ある場合において、これは環状及び２本鎖である。
【００５６】
「発現コンストラクト」又は「発現カセット」とは、転写を指示することが可能な核酸分子を意味する。発現コンストラクトには、少なくとも、プロモーター又はプロモーターと機能的に同等な構造が含まれる。エンハンサー及び／又は、転写終結シグナルなどのさらなるエレメントも含まれ得る。
【００５７】
「外来性」という用語は、細胞又は生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸又はポリヌクレオチドに関して使用される場合、人工的な手段によって細胞又は生物に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸又はポリヌクレオチドを指すか、又は細胞に関する場合、単離され、続いて他の細胞又は生物に人工的な手段によって導入された細胞を指す。外来性核酸は、異なる生物もしくは細胞由来であり得るか又は生物又は細胞内で天然に生じる核酸の１以上のさらなるコピーであり得る。外来性細胞は、異なる生物由来であり得るか又は同じ生物由来であり得る。非限定例として、外来性核酸は、天然細胞での位置とは異なる染色体位置にあるか又はそうでなければ天然で見られるものとは異なる核酸配列に隣接される。
【００５８】
「に対応する」という用語は、本明細書中では、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全て又は一部と相同である（即ち同一であるが、厳密には進化的に関連はない。）か又はポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するために使用される。対照的に、「に相補的」という用語は、本明細書中では、相補的配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全て又は一部と相同であることを意味するために使用される。例示としては、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」と相補的である。
【００５９】
特定のタンパク質を「コードする」、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」又は「導入遺伝子」は、適切な制御配列の調節下に置かれた場合、インビトロ又はインビボで、転写され、場合によってはまた遺伝子産物、例えばポリペプチドに翻訳もされる核酸分子である。コード領域はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ形態の何れかで存在し得る。ＤＮＡ形態で存在する場合、この核酸分子は、１本鎖（即ちセンス鎖）又は２本鎖であり得る。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンにより定められる。遺伝子としては、原核又は真核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核又は真核ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列を挙げることができるが、これらに限定されない。転写終結配列は通常、遺伝子配列に対して３’に位置する。
【００６０】
「細胞」という用語は、本明細書中で当技術分野においてその最も広い意味で使用され、多細胞生物の組織の構造単位である生体を指し、外側から細胞を隔離する膜構造により囲まれ、自己複製能を有し、遺伝情報を有し、それを発現するための機構を持つ。本明細書中で使用される細胞は、天然の細胞又は人工的に改変された細胞（例えば融合細胞、遺伝子改変細胞など）であり得る。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「幹細胞」という用語は、自己複製可能であり、多能性を有する細胞を指す。一般に、幹細胞は損傷組織を再生することができる。本明細書中での幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞又は組織幹細胞（組織特異的幹細胞又は体性幹細胞とも呼ばれる。）であり得るが、これらに限定されない。上述の能力を有し得る人工的に作製された何れの細胞（例えば、本明細書中で使用される、融合細胞、再プログラム化細胞など）も幹細胞であり得る。
【００６２】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期胚由来の多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年からノックアウトマウスの作製にも適用されてきた。１９９８年にヒトＥＳ細胞が樹立され、これは現在、再生医療に対して利用可能になりつつある。
【００６３】
ＥＳ細胞とは異なり、組織幹細胞の分化能は限定的である。組織幹細胞は、組織の特定の位置に存在し、未分化の細胞内構造を有する。従って組織幹細胞の多能性は一般に低い。組織幹細胞では核／細胞質比がより高く、細胞内小器官が少ししかない。殆どの組織幹細胞は多能性が低く、細胞周期が長く、個体の寿命を超える増殖能を有する。組織幹細胞は、真皮系、消化器系、骨髄系，神経系の組織幹細胞など、その細胞が由来する部位に基づいてカテゴリーに分類される。真皮系における組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛包幹細胞などが挙げられる。消化器系における組織幹細胞としては、膵臓（共通）幹細胞、肝臓幹細胞などが挙げられる。骨髄系における組織幹細胞としては、造血幹細胞、間充織幹細胞などが挙げられる。神経系における組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
【００６４】
一般にｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣと略称される「人工多能性幹細胞」は、再プログラミング因子と呼ばれるある一定の因子を導入することにより、非多能性細胞、一般に成体の体細胞又は最終分化細胞、例えば繊維芽細胞、造血細胞、筋細胞、神経細胞、表皮細胞などから人工的に調製された、あるタイプの多能性幹細胞を指す。
【００６５】
「多能性」とは、１以上の組織又は器官又は特に、３種類の胚葉：内胚葉（胃の内壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）又は外胚葉（表皮組織及び神経系）の何れかを構成する全ての細胞に分化する潜在能力を有する幹細胞を指す。本明細書中で使用される「多能性幹細胞」は、３種類の胚葉の何れか由来の細胞に分化することができる細胞、例えば全能性細胞又は人工多能性細胞の直接の子孫を指す。
【００６６】
核酸分子に関して「操作可能に連結される」とは、２以上の核酸分子（例えば転写しようとする核酸分子、プロモーター及びエンハンサーエレメント）がその核酸分子の転写を可能にするように連結されることを意味する。ペプチド及び／又はポリペプチド分子に関して「操作可能に連結される」とは、２以上のペプチド及び／又ポリペプチド分子が、１本のポリペプチド鎖、即ち、融合体の各ペプチド及び／又はポリペプチド成分の少なくとも１つの特性を有する融合ポリペプチドが得られるように連結されることを意味する。この融合ポリペプチドは特にキメラ、即ち異種分子から構成される。
ＩＩＩ．血液細胞の再プログラミング
【００６７】
現在、当技術分野で一般に使用される真皮繊維芽細胞に加えて、代替的な供給源からｉＰＳ細胞を提供するために、末梢血細胞を含む細胞集団を再プログラミングするための方法が提供され得る。利用し易く、環境変異原への曝露がより少ない血液細胞を再プログラミングすることも非常に望まれている。例えば、血液バンクで回収され保管される末梢血細胞は、自己又は同種異系であるが組織適合性のｉＰＳ細胞株の供給源として使用することができる。より重要なことに、後天性血液疾患の発症機序を調べるために、血液細胞に限定され、その後天性血液疾患においてのみ見られる体細胞変異を含有するｉＰＳ細胞を作製したい場合、血液細胞を再プログラミングできることが不可欠である。ある実施態様において、再プログラミング用に大量の出発細胞を提供するために、末梢血細胞集団中の造血前駆細胞を増殖させる。従って、本発明におけるヒト血液細胞からの再プログラミングは、培養での操作にあまり時間を要しないドナー細胞からｉＰＳ細胞を樹立する新規方法に相当する。ヒト血液から細胞を再プログラミングできれば、患者特異的幹細胞を作製するための、信頼性の高い方法の開発が促進されよう。
Ａ．造血前駆細胞
【００６８】
造血幹細胞及び前駆細胞の医療上の潜在能力は非常に高いので、胚性幹細胞から造血前駆細胞を分化させるための方法を改善しようと相当な努力が積み重ねられてきた。成人において、骨髄に主に存在する造血幹細胞は、血液系の全細胞に分化する、活発に分裂する造血（ＣＤ３４＋）前駆細胞の異種集団を生成させる。ＣＤ３４＋内皮細胞がｉＰＳ細胞に変換され得ると予測される一方で、ある実施態様において、内皮細胞ではない造血細胞を使用することが望まれ得、例えば、一部の例においてＣＤ３１又はＶＥ−カドヘリンを発現しない造血前駆細胞又は造血系前駆細胞を使用することが望まれ得る。造血前駆細胞を同定し易くするためにＣＤ４３及び／又はＣＤ４５マーカーなどの他のマーカーも使用され得る（例えばＫａｄａｊａ−Ｓａａｒｅｐｕｕら、２００８；Ｖｏｄｙａｎｉｋら、２００６）。造血前駆細胞には、ＣＤ４３（＋）ＣＤ２３５ａ（＋）ＣＤ４１ａ（＋／−）（赤血球−巨核球形成性）、ｌｉｎ（−）ＣＤ３４（＋）ＣＤ４３（＋）ＣＤ４５（−）（多能性）及びｌｉｎ（−）ＣＤ３４（＋）ＣＤ４３（＋）ＣＤ４５（＋）（骨髄偏向（ｍｙｅｌｏｉｄ−ｓｋｅｗｅｄ））細胞を含む原始造血細胞の様々なサブセットが含まれる。成人において、血球系前駆細胞は増殖し、分化し、その結果、１日に数千億の成熟血液細胞が生成する。造血前駆細胞はまた臍帯血中にも存在する。インビトロで、ヒト胚性幹細胞を造血前駆細胞に分化させ得る。造血前駆細胞はまた、下記のように末梢血の試料から増殖又は濃縮させることもできる。造血細胞は、ヒト由来、マウス由来又は何らかの他の哺乳動物種由来のものであり得る。
【００６９】
造血前駆細胞の単離としては、細胞選別機、抗体被覆磁気ビーズを用いた磁気分離、充填カラム；アフィニティークロマトグラフィー；モノクローナル抗体と連結されるか又はモノクローナル抗体と一緒に使用される細胞毒性薬（以下に限定されないが補体及び細胞毒を含む。）；及び固体マトリクス、例えばプレートに連結される抗体を用いた「パニング」又は何らかの他の従来技術を含む何らかの選択方法が挙げられる。
【００７０】
分離又は単離技術の使用には、物理的な相違に基づくもの（密度勾配遠心及び対向流遠心溶出法）、細胞表面（レクチン及び抗体アフィニティー）及び生体染色特性（ミトコンドリア−結合色素ｒｈｏ１２３及びＤＮＡ−結合色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）が含まれるがこれらに限定されない。的確に分離する技術としては、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）又はＭＡＣＳ（磁気活性化細胞選別）（これらは、例えば複数のカラーチャネル、低角度及び鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなど、様々な程度の改善があり得る。）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
先行技術又は細胞型純度を評価するために使用される技術（フローサイトメトリーなど）で使用される抗体は、酵素、磁気ビーズ、コロイド磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物、薬物又はハプテンを含むが限定されない、同定可能な物質に結合され得る。抗体に結合され得る酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ及びβ−ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。抗体に結合され得る蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、フィコエリスリン、アロフィコシアニン及びテキサスレッドが挙げられるが、これらに限定されない。抗体に結合され得るさらなる蛍光色素については、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９２−１９９４）を参照のこと。抗体に結合され得る金属化合物としては、フェリチン、金コロイド及び特にコロイド超常磁性ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。抗体に結合され得るハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニン、オキサザロン及びニトロフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。抗体に結合され得るか又は組み込まれ得る放射性化合物は当技術分野にとって公知であり、テクネチウム９９ｍ（９９ＴＣ）、１２５Ｉ及び、１４Ｃ、３Ｈ及び３５Ｓを含むが限定されない何らかの放射性核種を含むアミノ酸が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７２】
アフィニティーカラムなど、的確な選択を可能にする、正の選択のためのその他の技術を用いることができる。この方法により、非標的細胞集団の残存量が約２０％未満、好ましくは約５％未満になるように除去できるはずである。
【００７３】
光散乱特性ならびに様々な細胞表面抗原のそれらの発現に基づいて細胞を選択し得る。精製した幹細胞は、ＦＡＣＳ分析によると、側方散乱が低く、前方散乱が低から中のプロファイルを有する。サイトスピン標本から、濃縮された幹細胞が、成熟リンパ球細胞と成熟顆粒球との間のサイズを有することが示される。
【００７４】
例えばＳｕｔｈｅｒｌａｎｄら（１９９２）の方法及び米国特許第４，７１４，６８０号に記載の方法を用いて、培養前にＣＤ３４＋細胞に対して播種集団を濃縮することも可能である。例えば、この細胞は、系統特異的マーカーを発現する細胞を除去するための負の選択に対する対象である。例示的な実施態様において、非ＣＤ３４＋造血細胞及び／又は特定の造血細胞サブセットの枯渇のために細胞集団を負の選択に供し得る。Ｔ細胞マーカー、例えばＣＤ２、ＣＤ４及びＣＤ８など；Ｂ細胞マーカー、例えばＣＤ１０、ＣＤ１９及びＣＤ２０など；単球マーカーＣＤ１４；ＮＫ細胞マーカーＣＤ２、ＣＤ１６及びＣＤ５６又は何らかの系統特異的マーカーを含む、様々な分子の細胞表面発現に基づいて負の選択が行われ得る。例えばＭＡＣＳ又はカラム分離を介して、他の細胞型の分離のために使用され得る抗体のカクテル（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３及びＣＤ２３５ａ）などの様々な分子の細胞表面発現に基づいて負の選択を行い得る。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、系統マーカー陰性（ＬＩＮ−）は、系統コミット細胞に付随する少なくとも１つのマーカー、例えばＴ細胞（ＣＤ２、３、４及び８など）、Ｂ細胞（ＣＤ１０、１９及び２０など）、骨髄性細胞（ＣＤ１４、１５、１６及び３３など）、ナチュラルキラー（”ＮＫ”）細胞（ＣＤ２、１６及び５６など）、ＲＢＣ（グリコホリンＡなど）、巨核球細胞（ＣＤ４１）、肥満細胞、好酸球もしくは好塩基球に付随するマーカー又は、ＣＤ３８、ＣＤ７１及びＨＬＡ−ＤＲなどの他のマーカーを欠く細胞を指す。好ましくは、系統特異的マーカーとしては、ＣＤ２、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ７１のうち少なくとも１つが挙げられるが、これらに限定されない。より好ましくは、ＬＩＮ−には、少なくともＣＤ１４及びＣＤ１５が含まれよう。例えばｃ−ｋｉｔ＋又はＴｈｙ−１＋に対する正の選択によって、さらなる精製を遂行することができる。当技術分野で公知の方法により、ミトコンドリア結合色素ローダミン１２３を使用し、ローダミン＋細胞について選択することによって、さらなる濃縮を行うことができる。ＣＤ３４＋、好ましくはＣＤ３４＋ＬＩＮ−及び最も好ましくはＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋ＬＩＮ−である細胞の選択的単離によって、高度に濃縮された組成物を得ることができる。幹細胞が高度に濃縮された集団及びそれらを得るための方法は当業者にとって周知であり、例えばＰＣＴ／ＵＳ９４／０９７６０；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８５７４及びＰＣＴ／ＵＳ９４／１０５０１に記載の方法を参照のこと。
【００７６】
特定の系統の細胞を最初に除去することによって細胞を分離するために、様々な技術を使用することができる。モノクローナル抗体は、特定の細胞系統及び／又は分化段階に付随するマーカーを同定するために特に有用である。粗分離を可能にするために、固体支持体に抗体を連結し得る。使用される分離技術により、回収しようとする分画の生存能が最大限に保持されるはずである。「比較的粗精の」分離を行うために、様々な効率の様々な技術を使用し得る。このような分離では、維持しようとする細胞集団とともに残存する不要な細胞は、存在する全細胞の１０％以下、通常は、最大で約５％、好ましくは最大で約１％である。使用する特定の技術は、分離効率、関連する細胞毒性、実行し易さ及び実行のスピードならびに高機能装置の必要性及び／又は技術的熟練に依存する。
【００７７】
造血前駆細胞の選択は、細胞に特異的なマーカーのみで達成する必要はない。負の選択及び正の選択の併用によって濃縮細胞集団を得ることができる。
【００７８】
Ｂ．血液細胞の供給源
造血幹細胞（ＨＳＣ）は通常骨髄に存在するが、血液へと送り込まれ得、これは、末梢血中の多くのＨＳＣを採取するために臨床的に使用される動員と呼ばれるプロセスである。最適な動員物質の１つは顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。
【００７９】
非かく乱状態又はＧ−ＣＳＦのような造血成長因子の外部からの投与を受けて動員化した後の何れかでのアフェレーシス技術によって、末梢血中を循環するＣＤ３４＋造血幹細胞又は前駆細胞を回収することができる。動員後に回収される幹細胞又は前駆細胞の数は、非かく乱状態でのアフェレーシス後に得られるものよりも多い。本発明の特定の態様において、細胞集団の供給源は、インビボで造血幹細胞又は前駆細胞を濃縮する必要がないので、細胞が外部から加えられた因子により動員化されていない対象である。
【００８０】
本明細書中に記載の方法での使用のための細胞の集団は、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、げっ歯類細胞（例えばマウス又はラット）、ウシ細胞、ヒツジ（Ｏｖｉｎｅ）細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）細胞、イヌ細胞及びネコ細胞又はそれらの混合物など、哺乳動物細胞であり得る。非ヒト霊長類細胞としてはアカゲザル細胞が挙げられる。動物、例えばヒト患者から細胞を得てもよいし、又は細胞株由来であってもよい。動物から細胞を得る場合、それらの細胞は、例えば未分離細胞（即ち混合集団）などとして使用し得るか；例えば形質転換により、最初に培養において樹立されているものであり得るか；又は予備精製法に供されたものであり得る。例えば、細胞表面マーカーの発現に基づき正又は負の選択によって細胞集団を操作し得るか、インビトロもしくはインビボで１以上の抗原で刺激得るか、インビトロもしくはインビボで１以上の生物学的修飾物質で処理し得るか又はこれらの何れかもしくは全ての組み合わせを行い得る。
【００８１】
細胞集団には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、全血又は混合集団を含有するその分画、脾臓細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤リンパ球、白血球除去輸血により得られる細胞、生検組織、リンパ節、例えば腫瘍から排出するリンパ節が含まれる。適切なドナーとしては、免疫付与ドナー、非免疫付与（ナイーブ）ドナー、処置又は未処置ドナーが挙げられる。「処置を受ける」ドナーは、１以上の生物学的修飾物質に曝露されたことがあるドナーである。「未処置」ドナーは１以上の生物学的修飾物質に曝露されたことがない。
【００８２】
例えば、当技術分野で公知の方法に従い、記載のように末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ることができる。このような方法の例は、Ｋｉｍら（１９９２）；Ｂｉｓｗａｓら（１９９０）；Ｂｉｓｗａｓら（１９９１）により論じられている。
【００８３】
細胞集団から造血前駆細胞を得る方法も当技術分野で周知である。ｈＳＣＦ、ｈＦＬＴ３及び／又はＩＬ−３（Ａｋｋｉｎａら、１９９６）などの様々なサイトカインを用いて造血前駆細胞を増殖させることができるか、又はＭＡＣＳ又はＦＡＣＳを用いてＣＤ３４＋細胞を濃縮することができる。上述のように、ＣＤ３４＋細胞を濃縮するために負の選択技術も使用することができる。
【００８４】
対象から細胞試料を得て、次いで望ましい細胞型について濃縮することもできる。例えば、ＰＢＭＣ及び／又はＣＤ３４＋造血細胞を本明細書中で記載のように血液から単離することができる。望ましい細胞型の細胞表面上のエピトープへの抗体結合を用いた単離及び／又は活性化など、様々な技術を用いて、細胞を他の細胞から単離することもできる。使用することができる別の方法には、受容体結合により細胞を活性化することなく特異的な細胞型について選択的に濃縮するための、細胞表面マーカーに対する抗体を用いた負の選択が含まれる。
【００８５】
腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨又はその他の髄腔から骨髄細胞を得ることができる。患者から骨髄を採取し、様々な分離及び洗浄手順を通じて単離し得る。骨髄細胞の単離のための典型的な手順には、次の段階：ａ）３分画における骨髄懸濁液の遠心分離及び中間分画又はバフィーコートの回収；ｂ）段階（ａ）のバフィーコート分画を分離液、一般的にはＦｉｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＡＢの商標）中でもう１回遠心し、骨髄細胞を含有する中間分画を回収し；ｃ）再輸血可能な骨髄細胞の回収のために段階（ｂ）の回収分画を洗浄することが含まれる。
【００８６】
ＩＶ．培養条件
ヒト多能性幹細胞研究は、現代の生物学において最もダイナミックな分野の１つである。ヒトＥＳ細胞のようなヒトｉＰＳ細胞は殆どが、マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダー層下で得られ、培養されてきた。例えば、ヒト多能性幹細胞の治療可能性は、１種類の細胞型の喪失もしくは機能不全から生じる、パーキンソン病及び糖尿病などの疾病に対する分化細胞型の移植にある。しかし、これらの臨床応用は現在のところ、インビトロ誘導及び増殖相中の異種由来物質混入により限定的である。従来使用されてきたようなマウスフィーダー又は馴化培地は、非ヒト病原体を導入するリスクを有し、将来的な移植が不可能となる。従って、研究モデルと臨床応用との間のギャップを埋めるためには、ゼノフリープロセスの計画及び実施が必要である。従ってゼノフリー培地及びゼノフリー細胞外マトリクスなどのゼノフリー（ＸＦ；又は動物成分不含、ＡＣＦ；又は動物由来物質不含）培養条件は、ヒトでの移植が望まれる再生幹細胞療法の開発において必須要素である。さらに、再プログラミング効率は、使用するＭＥＦフィーダー細胞の違い又は何らかの動物由来製品により影響を受け得る。
【００８７】
末梢血中の造血前駆細胞からの全体的再プログラミング効率を向上させ、変動性を減少させるために、様々なフィーダーフリー、ゼノフリー又は既知組成の培養条件、造血前駆細胞増殖用のマトリクス又は培地ならびにこのような細胞の再プログラム化が提供され得る。
Ａ．造血前駆細胞増殖条件
【００８８】
本発明の増殖方法は、細胞密度が少なくとも約５，０００、好ましくは７，０００から約２００，０００個／ｍＬ（培地）及びより好ましくは約１０，０００から約１５０，０００個／ｍＬ（培地）であり、初期酸素濃度が約１から２０％及び好ましくは８％未満となるように、造血前駆細胞が実質的に濃縮され、実質的に間質細胞不含である細胞集団を適切な培地体積中で増殖容器に接種することを含み得る。ある１つの実施態様において、初期酸素濃度は、約１、２、３、４、５、６、７％からの範囲又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲であり得る。
【００８９】
ある１つの態様において、接種細胞集団は成体骨髄由来であり、細胞約７，０００個／ｍＬから約２０，０００個／ｍＬ、好ましくは約２０，０００個／ｍＬである。別個の態様において、接種細胞集団は動員化した末梢血由来であり、細胞約２０，０００個／ｍＬから約５０，０００個／ｍＬ、好ましくは５０，０００個／ｍＬである。別の態様において、接種細胞集団は非動員化末梢血液由来であり、細胞約７，０００個／ｍＬから約５０，０００個／ｍＬ、好ましくは約２０，０００個／ｍＬである。
【００９０】
本発明の方法において、２４ウェルプレート、１２．５ｃｍ２のＴフラスコ又はガス透過性バッグなどの何れかの適切な増殖容器、フラスコ又は適切なチューブを使用することができる。このような培養容器はＦａｌｃｏｎ、Ｃｏｒｎｉｎｇ又はＣｏｓｔａｒから市販されている。本明細書中で使用される場合、「増殖容器」はまた、自立型であるにしろ自立型でないにしろ、又は本明細書中に記載のバイオリアクターなどの増殖装置に組み込まれているにしろそうではないにしろ、細胞を増殖させるための何らかのチャンバー又は容器を含むものとする。ある１つの実施態様において、増殖容器は、陥凹面と残りの細胞支持面が正しい位置に置かれる平面により形成される体積空間が小さいチャンバーである。
【００９１】
造血前駆細胞の増殖のために様々な培地を使用することができる。例示的な培地としては、様々な異なる栄養素、成長因子、サイトカインなどが補給され得る、ダルベッコＭＥＭ、ＩＭＤＭ及びＲＰＭＩ−１６４０が挙げられる。培地は、血清不含であってもよいし、又はウシ胎仔血清又は自己血清など、適切な量の血清が補給されてもよい。好ましくは、ヒトの治療で使用するためには、培地は血清不含であるか又は自己血清が培地に補給される。ある適切な培地は、ＩＭＤＭ、ペプトン、プロテアーゼ阻害剤及び下垂体抽出物のうち少なくとも１つの有効量及びヒト血清アルブミン又は血漿タンパク質分画、ヘパリン、還元剤、インスリン、トランスフェリン及びエタノールアミンのうち少なくとも１つの有効量を含有するものである。さらなる実施態様において、適切な増殖培地は、少なくともＩＭＤＭ及び１から１５％ウシ胎仔血清を含有する。その他の適切な培地処方物は当業者にとって周知であり、例えば、米国特許第５，７２８，５８１号を参照のこと。
【００９２】
何れかの所定の造血前駆細胞増殖で使用されている具体的な培地にかかわらず、使用培地には、好ましくは、約０．１ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬ、より一般的には１０ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬの濃度の少なくとも１つのサイトカインが補給される。適切なサイトカインとしては、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＫＬ）（スティール因子（ＳｔＩ）、肥満細胞増殖因子（ＭＧＦ）及び幹細胞因子（ＳＣＦ）とも呼ばれる。）、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１１、ＭＩＰ−１α、ＬＩＦ、ｃ−ｍｐｌリガンド／ＴＰＯ及びｆｌｋ２／ｆｌｋ３リガンド（Ｆｌｔ２Ｌ又はＦｌｔ３Ｌ）が挙げられるがこれらに限定されない（Ｎｉｃｏｌａら、１９７９；Ｇｏｌｄｅら、１９８０；Ｌｕｓｉｓ、１９８１；Ａｂｂｏｕｄら、１９８１；Ｏｋａｂｅ、１９８２；Ｆａｕｓｅｒら、１９８１）。特に、培養には、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及びＴＰＯのうち少なくとも１つが含まれる。より具体的には、培養にはＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及びＴＰＯが含まれる。
【００９３】
ある実施態様において、サイトカインが培地に含有され、培地かん流により補充される。あるいは、バイオリアクター系を使用する場合、個別の入口を通る濃縮溶液として、培地かん流なしでサイトカインを個別に添加し得る。かん流なしでサイトカインを添加する場合、これらは一般に、新鮮サイトカインがおよそ２から４日ごとに添加されているバイオリアクターの体積の１／１０から１／１００と等しい量で、１０ｘから１００ｘ溶液として添加される。さらに、かん流培地中のサイトカインに新鮮濃縮サイトカインをさらに個別に添加することもできる。
【００９４】
次に、細胞が培地を馴化するように、適切な条件下で細胞を培養し得る。培養液を交換しない場合、例えば培養の最初の数日間はかん流を行わない場合、精製造血前駆細胞の増殖が向上し得る。
【００９５】
ある態様において、適切な条件は、造血前駆細胞増殖を実質的に阻害するのに十分な老廃物を放出することなく、自己分泌因子が細胞から放出されるようになるように、３３から３９及び好ましくは３７℃前後で（初期酸素濃度は好ましくは４から８％及び最も好ましくは約５％）、少なくとも６日間、好ましくは約７から約１０日間、培養することを含む。その後、全部で１０日から２８日となり得る残りの培養期間にわたり、段階的に又は徐々に酸素濃度を約２０％に上昇させ得る。骨髄幹細胞、動員化末梢血細胞又は非動員化末梢血細胞を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５日前後又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲にわたり増殖させ得る。
【００９６】
培地交換を行わない初期培養期間後、造血前駆細胞の増殖を可能とする速度で培養液を交換し得る。体積を変化させない系において、第７日（動員化末梢血液幹細胞の場合）又は第１０日（骨髄細胞の場合）に培地を交換し得る。かん流系における新鮮培地の交換は例えば層流であり得る。この一様な乱れのない流れにより、細胞が所々で培地に曝露されない「デッドスペース」の形成を防ぐ。約０．１０／日から０．５０／日又は１日あたり１／１０から１／２体積を交換する速度で培地を交換し得る。例えば、かん流速度は約０．２５／日から０．４０／日であり得る。最も好ましくは、骨髄幹細胞の場合、かん流は、第１４日前後から開始して０．２７／日の速度であり、動員化又は非動員化末梢血細胞の場合、かん流は、第１０日前後に０．２５／日で開始し、第１２日前後に０．４０／日に向上させる。
【００９７】
特に、増殖の間中、細胞濃度を最適に維持し得る。例えば、前駆細胞は、〜１０から２０倍しか増殖しない単核細胞（ＭＮＣ）集団に対して、〜１５００倍まで増殖し得る。前駆細胞は高い増殖能を有し、そのため、この場合培養は閉鎖系で行われ、このような系は、全体的な細胞増殖に十分な体積を提供しなければならない。しかし、前駆細胞はまた、比較的高い接種密度を有し得る。最適接種密度及び増殖条件は、米国特許第５，７２８，５８１号に記載のものなどのバイオリアクター中で細胞を増加させることにより達成することができる。凹部で適切な細胞密度で細胞を播種し得、適切な細胞密度が得られたら、さらなる培地を添加する。この器具の形態により、細胞に対する酸素移動効率を顕著に低下させずに培地体積を最大で３倍大きくすることが可能になり得る。
【００９８】
Ｂ．再プログラミング中及び再プログラミング後の培養条件
出発細胞（つまり、再プログラミングしようとする増殖造血前駆細胞）及び最終的な再プログラム化細胞は、一般に、培養液及び条件について異なる要件を有する。細胞の再プログラミングが起こるようにしながら同時にこれを可能にするために、１以上の過渡的な培養条件が必要とされ得る。再プログラミングプロセスを開始させるために、播種から少なくとも、約又は最長０、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９日後、とりわけ播種から３、４、５又は６日後、典型的な実施態様においては播種から６日後、増殖させた造血前駆細胞に対して形質移入を行い得る。代替的な実施態様において、増殖段階は必ずしも必要でないことがある。例えば、非動員化末梢血からの精製から十分な造血前駆細胞が直接得られる場合、増殖段階なしで再プログラミングを開始することができる。しかし、例えば体積１０ｍＬ以下の、体積が小さい末梢血を扱う場合、造血前駆細胞数を増加させ、従って再プログラミング効率を向上させるために増殖段階を使用し得る。
【００９９】
形質移入直後及び形質移入後に細胞を安定化させる手段として、上述のような造血前駆細胞増殖培地又は再プログラム化細胞の培養に有利に働く１以上のサイトカイン及びシグナル伝達阻害剤を含む培地中又はこれら２種類の条件を合わせて（等しく又はその他）（これらは全て最適にはゼノフリーである。）、細胞を培養し得る。使用培地にかかわらず、この条件は、基本的にマトリクス成分不含であってもよいし、又は好ましくはフィブロネクチン断片などのゼノフリーマトリクスタンパク質であるマトリクスを含んでもよい。このような培養条件は、少なくとも、約又は最長で形質移入後の最初の０、１、２、４、６、８、１０、１２、２４時間又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲にわたり得る。次に、細胞がマトリクス上に置かれていない場合は細胞をマトリクスに移し、上述のような造血前駆細胞増殖培地中又は細胞の再プログラミングに有利に働く培地中で又はこれら２種類の条件を合わせて（等しく又はその他）（これらは全て最適にはゼノフリーである。）培養し得る。使用培地にかかわらず、各培地を新たにして１００パーセントの再プログラミング培地へと１又は２日にわたり細胞を徐々に移し、形質移入安定化インキュベーション後、このような再プログラミング条件を少なくとも、約又は最長１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間継続し得る。
【０１００】
開示される方法を用いて再プログラミング因子を細胞に導入し、上述のように培養した後、得られた細胞を、ＴｅＳＲ２など、細胞の多能性を維持するのに十分な培地に移し得る。このような条件は、好ましくは、培地を除去せずに再プログラミング培地にＴｅＳＲ２（又は類似の多能性細胞培養液）を添加し、その後細胞が１００％多能性細胞培養液中で培養されるように完全に置き換えることにより、再プログラミング条件の後半の間に徐々に得られ得る。漸進的な移行期間を含む多能性細胞培養液中での細胞の培養は、１００％再プログラミング条件後、少なくとも、約又は最長１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日間継続し得る。多能性幹細胞は接着細胞なので、この多能性細胞培養条件には細胞外マトリクスが含まれ得る。
【０１０１】
従来、ＭＥＦフィーダー上で血清含有培地が使用されてきた。ある態様において、本発明は、血清又はＭＥＦフィーダー細胞を不要にし、細胞の再プログラミングのための既知組成のプロセス及び条件を提供する。
【０１０２】
本発明において作製された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養は、米国特許出願第２００７０２３８１７０号及び米国特許出願第２００３０２１１６０３号に記載のような霊長類多能性幹細胞、より具体的には胚性幹細胞を培養するために開発された様々な培地及び技術を使用することができる。当然のことながら、当業者にとって公知であるような、ヒト多能性幹細胞の培養及び維持のためのさらなる方法を本発明とともに使用し得る。
【０１０３】
好ましくは、既知組成ではない条件は使用してはならず、例えば、繊維芽フィーダー細胞又は、繊維芽フィーダー細胞、特にマウスフィーダー細胞に曝露した培地において再プログラム化細胞を培養してはならない。例えば、ＴｅＳＲ培地など、既知組成のフィーダー非依存性の培養系を用いて基本的に未分化の状態で多能性細胞を培養し、維持し得る（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６；Ｌｕｄｗｉｇら、２００６）。再プログラム化細胞を培養するために、フィーダー非依存性の培養系及び培地を使用し得る。これらのアプローチによって、マウス繊維芽「フィーダー層」を必要とせずに、基本的に未分化の状態で再プログラム化細胞を増殖させることが可能になる。本明細書中で記載のように、必要に応じて費用を削減するためにこれらの方法に対して様々な変更を行い得る。
【０１０４】
ＴｅＳＲ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ１０６６、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９、イーグルＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ１６４０及びフィッシャー培地の何れかならびにそれらの何らかの組み合わせなど、その基礎培地として動物細胞を培養するために使用される培地を用いて、本発明のある態様に従う培地を調製することができるが、培地は、動物細胞を培養するために使用できる限り、それらに特に限定されない。特に培地はゼノフリー又は化学的に既知組成であり得る。
【０１０５】
本発明による培地は、血清含有又は血清不含培地であり得る。血清不含培地とは未処理又は未精製血清を含まない培地を指し、従って精製した血液由来成分又は動物組織由来成分（増殖因子など）を含む培地が含まれ得る。異種動物由来成分の混入を防ぐ態様から、血清は幹細胞と同じ動物由来であり得る。
【０１０６】
本発明による培地は、血清に対する何らかの代替物を含有してもよいし、又はしなくてもよい。血清に対する代替物としては、アルブミン（脂質に富むアルブミン、アルブミン代替物、例えば組み換えアルブミン、植物性デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物）、トランスフェリン（又はその他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオグリセロール又はそれらの同等物を適切に含有する材料が挙げられ得る。例えば国際公開第９８／３０６７９号に開示の方法により血清に対する代替物を調製することができる。あるいは、さらに好都合にするために、何らかの市販の材料を使用することができる。市販の材料としては、ノックアウト血清リプレースメント（ＫＳＲ）、化学的に既知組成の脂質濃縮液（Ｇｉｂｃｏ）及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。
【０１０７】
本発明の培地はまた、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸など）、ビタミン、成長因子、サイトカイン、抗酸化物質、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤及び無機塩も含有し得る。２−メルカプトエタノールの濃度は例えば約０．０５から１．０ｍＭ、特に約０．１から０．５ｍＭであり得るが、この濃度は、幹細胞を培養するのに適切である限り、これらに特に限定されない。
【０１０８】
細胞を培養するために使用する培養容器としては、フラスコ、組織培養用フラスコ、皿、ペトリ皿、組織培養皿、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレー、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグ及びローラーボトルを挙げることができるが、それらの中で幹細胞を培養することができる限り、特にこれらに限定されない。培養物の必要性に応じて、少なくとも又は約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＬ、１００ｍＬ、１５０ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、３００ｍＬ、３５０ｍＬ、４００ｍＬ、４５０ｍＬ、５００ｍＬ、５５０ｍＬ、６００ｍＬ、８００ｍＬ、１０００ｍＬ、１５００ｍＬ又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲の体積で細胞を培養し得る。ある実施態様において、培養容器は、バイオリアクターであり得、これは、生物学的に活性のある環境を補助する何らかの装置又は系を指し得る。バイオリアクターの体積は、少なくとも又は約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲であり得る。
【０１０９】
培養容器は細胞接着性又は非接着性であり得、目的に応じて選択され得る。細胞への容器表面の接着性を向上させるために、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）など、細胞接着のための何らかの基質で細胞接着性培養容器を被覆することができる。細胞接着のための基質は、細胞を付着させることを目的とする何らかの材料であり得る。細胞接着のための基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリＬ−リジン、ポリＤ−リジン、ラミニン及びフィブロネクチン、それらの断片又は混合物が挙げられる。
【０１１０】
その他の培養条件を適切に定めることができる。例えば、培養温度は、約３０から４０℃例えば、少なくとも又は約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃であり得るが、特にそれらに限定されない。ＣＯ２濃度は、約１から１０％、例えば、約２から５％又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲であり得る。酸素分圧は、少なくとも、最大又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０％又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲であり得る。
【０１１１】
本発明の方法は、担体上での懸濁培養（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、２００４）又はゲル／生体ポリマーカプセル化（米国公開第２００７／０１１６６８０号）を含め、再プログラム化細胞又は幹細胞などの細胞の懸濁培養物に対しても使用することができる。細胞の懸濁培養という用語は、培地中で培養容器又はフィーダー細胞（使用する場合）に対して非接着条件下で細胞を培養することを意味する。細胞の懸濁培養には、細胞の解離培養及び細胞の凝集懸濁培養が含まれる。細胞の解離培養という用語は、懸濁した幹細胞を培養することを意味し、幹細胞の解離培養には、１個の細胞の培養又は複数の細胞（例えば細胞約２から４００個）からなる小さな細胞凝集物の培養が含まれる。上述の解離培養を継続する場合、培養し、解離した幹細胞は、より大きな細胞凝集物を形成し得、その後、凝集懸濁培養を行うことができる。凝集懸濁培養には、胚様体培養法（Ｋｅｌｌｅｒら、１９９５参照）及びＳＦＥＢ法（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００５；国際公開第２００５／１２３９０２号）が含まれる。
【０１１２】
Ｃ．マトリクス成分
末梢血細胞の再プログラミングにおいて、接着細胞培養に対する基質とするために様々な既知組成のマトリクス成分を使用し得る。例えば、多能性細胞増殖に対する固体支持体を提供する手段として、培養表面を被覆するために、Ｌｕｄｗｉｇら（２００６ａ；２００６ｂ）（その全体において参照により組み込まれる。）に記載されるように、組み換えコラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン及びビトロネクチンを組み合わせて使用し得る。
【０１１３】
細胞に対する支持を与えるために、マトリクス組成物を表面に固定化し得る。マトリクス組成物には、１以上の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質及び水性溶媒が含まれ得る。「細胞外マトリクス」という用語は当技術分野で認識されている。その構成成分には、次のタンパク質：フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン、メロシン、アンコリン、コンドロネクチン、リンクタンパク質、骨シアロタンパク質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、アンジュリン（ｕｎｄｕｌｉｎ）、エピリグリン及びカリニンのうち１以上が含まれる。その他の細胞外マトリクスタンパク質は、参照により本明細書中に組み込まれるＫｌｅｉｎｍａｎら（１９９３）に記載されている。「細胞外マトリクス」という用語は、細胞外マトリクスとしてのその特徴が当業者により容易に調べられるので、将来的に発見され得る現在のところ未知の細胞外マトリクスを包含するものとする。
【０１１４】
いくつかの態様において、マトリクス組成物中の総タンパク質濃度は約１ｎｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬであり得る。いくつかの好ましい実施態様において、マトリクス組成物中の総タンパク質濃度は約１μｇ／ｍＬから約３００μｇ／ｍＬである。より好ましい実施態様において、マトリクス組成物中の総タンパク質濃度は約５μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬである。
【０１１５】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質は、天然起源のものであり、ヒト又は動物組織から精製され得る。あるいは、ＥＣＭタンパク質は、遺伝子操作した組み換えタンパク質又は事実上合成物であり得る。ＥＣＭタンパク質は、タンパク質全体又はペプチド断片、ネイティブ又は改変体の形態であり得る。細胞培養のためのマトリクスにおいて有用であり得るＥＣＭタンパク質の例としては、ラミニン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン及びビトロネクチンが挙げられる。いくつかの実施態様において、マトリクス組成物には、合成により作製されるフィブロネクチンペプチド断片又は組み換えフィブロネクチンが含まれる。
【０１１６】
またさらなる実施態様において、マトリクス組成物には、少なくともフィブロネクチン及びビトロネクチンの混合物が含まれる。
【０１１７】
いくつかの他の実施態様において、マトリクス組成物には、好ましくはラミニンが含まれる。
【０１１８】
マトリクス組成物には、好ましくは単一型の細胞外マトリクスタンパク質が含まれる。いくつかの好ましい実施態様において、マトリクス組成物には、特に再プログラム化細胞又は造血前駆細胞の培養とともに使用するためのフィブロネクチンが含まれる。例えば、５μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬのタンパク質濃度になるようにダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中で、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ（ＢＤ）から販売されるヒトフィブロネクチン（カタログ番号３５４００８）などのヒトフィブロネクチンを希釈することによって、適切なマトリクス組成物を調製し得る。特定の例において、マトリクス組成物にはレトロネクチン（登録商標）などのフィブロネクチン断片が含まれる。レトロネクチン（登録商標）は、中央の細胞−結合ドメイン（タイプＩＩＩリピート、８、９、１０）、高親和性ヘパリン−結合ドメインＩＩ（タイプＩＩＩリピート、１２、１３、１４）及びヒトフィブロネクチンのオルタナティブスプライシングＩＩＩＣＳ領域内のＣＳ１部位を含有する（５７４アミノ酸の）〜６３ｋＤａタンパク質である。
【０１１９】
いくつかの他の実施態様において、マトリクス組成物には、好ましくはラミニンが含まれる。例えば、５μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬのタンパク質濃度になるようにダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中でラミニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）；カタログ番号Ｌ６２７４及びＬ２０２０）を希釈することによって、適切なマトリクス組成物を調製し得る。
【０１２０】
いくつかの実施態様において、マトリクス組成物はゼノフリーであり、即ちマトリクス又はその成分タンパク質はヒト起源のもののみである。これは、ある一定の研究用途に対して望ましいものであり得る。例えばヒト細胞を培養するためのゼノフリーマトリクスにおいて、ヒト起源のマトリクス成分を使用し得、何らかの非ヒト動物成分が排除され得る。ある態様において、マトリゲル（商標）は、ヒトｉＰＳ細胞への再プログラミングのための基質として排除され得る。マトリゲル（商標）は、マウス腫瘍細胞により分泌されるゼラチン状タンパク質混合物であり、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）から市販されている。この混合物は、多くの組織で見られる複雑な細胞外環境に類似しており、細胞培養のための基質として細胞生物学者により使用されることが多いが、望ましくないゼノ抗原又は混入物を導入し得る。
【０１２１】
Ｄ．再プログラミングのためのシグナル伝達阻害剤
本発明のある態様において、再プログラミングプロセスの少なくとも一部の間、シグナル伝達カスケードに関与するシグナルトランスデューサーを阻害する１以上のシグナル伝達阻害剤の存在下又は非存在下で、例えばＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤及び／又はミオシンＩＩ  ＡＴＰａｓｅ阻害剤又はこれらの同じ経路内のその他のシグナルトランスデューサーの阻害剤の存在下で、細胞を維持し得る。ある態様において、再プログラム化細胞及び得られるｉＰＳ細胞のクローン増殖を促進するために、ＨＡ−１００又はＨ１１５２などのＲＯＣＫ阻害剤を使用し得る。再プログラミング効率を向上させるために、馴化ヒトＥＳ細胞培養液又は血清不含Ｎ２Ｂ２７培地などの特異的再プログラミング培地と組み合わせて高濃度のＦＧＦを使用することもできる。好ましい態様において、培地は既知組成又はゼノフリーである。
【０１２２】
ある実施態様において、外来性エピソーム性遺伝因子により再プログラミング因子（例えば本明細書中で記載のように２、３以上）を細胞に導入することに加えて、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ミオシンＩＩ  ＡＴＰａｓｅ阻害剤及び／又はＬＩＦを含む再プログラミング培地で細胞を処理するが、これは再プログラミング効率及び反応速度を向上させ、初代再プログラミング培養におけるｉＰＳ細胞の同定を促進し、従ってｉＰＳ細胞のクローン性を保持するなどの長所がある。
【０１２３】
当然のことながら、これらの態様及び実施態様において、望ましい場合、ＭＥＫ阻害剤の代わりに、同じシグナル伝達経路（例えばＥＲＫ１又はＥＲＫ２カスケード）のシグナル伝達成分を阻害する他のシグナル伝達阻害剤で置き換え得る。これには、特にＦＧＦ受容体を通じたＭＡＰＫ経路の上流刺激の阻害が含まれ得る（Ｙｉｎｇ、２００８）。同様に、望ましい場合は、ＧＳＫ３阻害剤をインスリン合成及びＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達などのＧＳＫ３関連シグナル伝達経路の他の阻害剤に置き換えることができ；ＬＩＦは、望ましい場合は、Ｓｔａｔ３又はｇｐ１３０シグナル伝達の他の活性化因子に置き換えることができる。
【０１２４】
このようなシグナル伝達阻害剤、例えばＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ−β受容体阻害剤は、少なくとも又は約０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、５００から約１０００μＭ又はそれらにおいて導き出せる何らかの範囲の有効濃度で使用し得る。
【０１２５】
阻害剤は、従来の手段によって当業者により、又は従来の供給源から、提供され得るか又は得られ得る（ＷＯ２００７１１３５０５も参照）。
【０１２６】
１．グリコーゲンシンターゼキナーゼ３阻害剤
グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）は、ある種のセリン及びスレオニンアミノ酸上での、特に細胞基質における、リン酸分子の付加を媒介するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼである。ＧＳＫ−３によるこれらの他のタンパク質のリン酸化は通常、標的タンパク質（「基質」とも呼ばれる。）を阻害する。述べられているように、ＧＳＫ−３は、グリコーゲンシンターゼをリン酸化し、従って不活性化することについて知られている。これは、損傷を受けたＤＮＡ及びＷｎｔシグナル伝達に対する細胞応答の調節にも関連付けられている。ＧＳＫ−３は、Ｃｉをタンパク質分解して不活性化型にすることを標的としたヘッジホッグ（Ｈｈ）経路においてＣｉもリン酸化する。グリコーゲンシンターゼに加えて、ＧＳＫ−３は他に多くの基質を有する。しかし、ＧＳＫ−３は、基質を最初にリン酸化するための「プライミングキナーゼ」を通常必要とするという点でキナーゼの中では稀なものである。
【０１２７】
ＧＳＫ−３リン酸化の結果、通常、基質の阻害が起こる。例えば、ＧＳＫ−３がその基質のうち別のもの、転写因子のＮＦＡＴファミリー、をリン酸化する場合、これらの転写因子は核に移行することができず、従って阻害される。発現中の組織パターン形成を確立するために必要とされるＷｎｔシグナル伝達経路でのその重要な役割に加えて、ＧＳＫ−３は、骨格筋肥大などの状況下で誘導されるタンパク質合成に対しても非常に重要である。ＮＦＡＴキナーゼとしてのその役割から、ＧＳＫ−３は分化及び細胞増殖両方のキーとなる制御因子としても位置付けられる。
【０１２８】
ＧＳＫ３阻害は、１以上のＧＳＫ３酵素の阻害を指し得る。ＧＳＫ３酵素ファミリーは周知であり、多くの変異型が記載されている（例えばＳｃｈａｆｆｅｒら、２００３参照）。具体的な実施態様において、ＧＳＫ３−βが阻害される。ＧＳＫ３−α阻害剤も適切であり、ある態様において、本発明での使用のための阻害剤は、ＧＳＫ３−α及びＧＳＫ３−βの両方を阻害する。
【０１２９】
ＧＳＫ３の阻害剤としては、ＧＳＫ３に結合する抗体、ＧＳＫ３のドミナントネガティブ変異型及びＧＳＫ３を標的とするｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸を挙げることができる。ＧＳＫ３阻害剤の例はＢｅｎｎｅｔｔら（２００２）及びＲｉｎｇら（２００３）に記載されている。
【０１３０】
ＧＳＫ３阻害剤の具体例としては、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、１−Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ−Ａ０１４４１８（例えばＧｏｕｌｄら、２００４参照）、ＣＴ９９０２１（例えばＷａｇｍａｎ、２００４参照）、ＣＴ２００２６（Ｗａｇｍａｎ、前出参照）、ＳＢ４１５２８６、ＳＢ２１６７６３（例えばＭａｒｔｉｎら、２００５参照）、ＡＲ−Ａ０１４４１８（例えばＮｏｂｌｅら、２００５参照）、リチウム（例えばＧｏｕｌｄら、２００３参照）、ＳＢ４１５２８６（例えばＦｒａｍｅら、２００１参照）及びＴＤＺＤ−８（例えばＣｈｉｎら、２００５参照）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手可能なさらなる代表的なＧＳＫ３阻害剤（例えば参照により本明細書中に組み込まれるＤａｌｔｏｎら、ＷＯ２００８／０９４５９７参照）としては、ＢＩＯ（２’Ｚ，３’£）−６−ブロモムジルブム（ｂｒｏｍｏｍｄｉｒｕｂｍ）−３’−オキシム（ＧＳＫ３阻害剤ＩＸ）；ＢＩＯ−アセトキシム（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム（ＧＳＫ３阻害剤Ｘ）；（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン（ＧＳＫ３−阻害剤ＸＩＩＩ）；ピリドカルバゾール−シクロペナジエニルルテニウム（ｃｙｃｌｏｐｅｎａｄｉｅｎｙｌｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）錯体（ＧＳＫ３阻害剤ＸＶ）；ＴＤＺＤ−８  ４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン（ＧＳＫ３β阻害剤Ｉ）；２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール（ＧＳＫ３β阻害剤ＩＩ）；ＯＴＤＺＴ２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン（ＧＳＫ３β阻害剤ＩＩＩ）；α−４−ジブロモアセトフェノン（ＧＳＫ３β阻害剤ＶＩＩ）；ＡＲ−ＡＯ１４４１８Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）尿素（ＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩＩＩ）；３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン（ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩ）；ＴＷＳｌ  １９ピロロピリミジン化合物（ＧＳＫ３β阻害剤ＸＩＩ）；Ｌ８０３Ｈ−ＫＥＡＰＰ  ＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２又はそのミリストイル化型（ＧＳＫ３β阻害剤ＸＩＩＩ）；２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン（ＧＳＫ３β阻害剤ＶＩ）；ＡＲ−ＡＯ１４４−１８；ＳＢ２１６７６３；及びＳＢ４１５２８６が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
ＧＳＫ３阻害剤は、例えばＷｎｔ／β−カテニン経路を活性化し得る。β−カテニン下流遺伝子の多くは、多能性遺伝子ネットワークを同時制御する。例えば、ＧＳＫ阻害剤はｃＭｙｃ発現を活性化し、同時にそのタンパク質安定性及び転写活性を促進する。従って、いくつかの実施態様において、細胞において内在性Ｍｙｃポリペプチド発現を刺激するためにＧＳＫ３阻害剤を使用することができ、それにより多能性を誘導するためにＭｙｃを発現させる必要がなくなる。
【０１３２】
さらに、ＧＳＫ３−βの活性部位の構造の特徴が調べられており、特異的及び非特異的阻害剤と相互作用するキーとなる残基が同定されている（Ｂｅｒｔｒａｎｄら、２００３）。この構造特性により、さらなるＧＳＫ阻害剤を容易に同定することが可能となっている。
【０１３３】
本明細書中で使用される阻害剤は、好ましくは、標的とすべきキナーゼに特異的である。ある実施態様の阻害剤は、ＧＳＫ３−β及びＧＳＫ３−αに特異的であり、実質的にｅｒｋ２を阻害せず、実質的にｃｄｃ２を阻害しない。好ましくは、阻害剤は、ＩＣ５０値の比率として測定した場合に、マウスｅｒｋ２及び／又はヒトｃｄｃ２よりもヒトＧＳＫ３に対して、少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも２００倍、非常に好ましくは少なくとも４００倍選択的であり；ここで、ＧＳＫ３  ＩＣ５０値に対する言及は、ヒトＧＳＫ３−β及びＧＳＫ３−αに対する平均値を指す。ＧＳＫ３に特異的であるＣＨＩＲ９９０２１を用いて良好な結果が得られている。ＣＨＩＲ９９０２１の使用に適切な濃度は、０．０１から１００、好ましくは０．１から２０、より好ましくは０．３から１０μＭの範囲である。
【０１３４】
２．ＭＥＫ阻害剤
マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ又はＭＥＫ）又はＭＡＰＫカスケードのようなその関連シグナル伝達経路の阻害剤を含むＭＥＫ阻害剤を本発明のある態様で使用し得る。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ｓｉｃ）は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼをリン酸化するキナーゼ酵素である。これはＭＡＰ２Ｋとしても知られている。細胞外刺激により、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫＫ又はＭＡＰ２Ｋ）及びＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＫＫＫ又はＭＡＰ３Ｋ）から構成されるシグナル伝達カスケード（「ＭＡＰＫカスケード」）を介してＭＡＰキナーゼの活性化が導かれる。
【０１３５】
本明細書中のＭＥＫ阻害剤は一般にＭＥＫ阻害剤を指す。従って、ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２及びＭＥＫ５を含む、タンパク質キナーゼのＭＥＫファミリーのメンバーの何らかの阻害剤を指す。ＭＥＫ１、ＭＥＫ２及びＭＥＫ５阻害剤についても述べる。当技術分野で既に公知の適切なＭＥＫ阻害剤の例としては、ＭＥＫ１阻害剤ＰＤ１８４３５２及びＰＤ９８０５９、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２の阻害剤、Ｕ０１２６及びＳＬ３２７及びＤａｖｉｅｓら（２０００）により論じられているものが挙げられる。
【０１３６】
特に、他の既知のＭＥＫ阻害剤と比較した場合、ＰＤ１８４３５２及びＰＤ０３２５９０１は特異性及び効力が高いことが分かっている（Ｂａｉｎら、２００７）。他のＭＥＫ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤のクラスはＺｈａｎｇら（２０００）において記載されている。
【０１３７】
ＭＥＫの阻害剤としては、ＭＥＫに対する抗体、ＭＥＫのドミナントネガティブ変異型及びＭＥＫの発現を抑制するｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸を挙げることができる。ＭＥＫ阻害剤の具体例としては、ＰＤ０３２５９０１（例えばＲｉｎｅｈａｒｔら、２００４参照）、ＰＤ９８０５９（例えばＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｙから入手可能）、Ｕ０１２６（例えばＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｙから入手可能）、ＳＬ３２７（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ＡＲＲＹ−１６２（例えばＡｒｒａｙ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａから入手可能）、ＰＤ１８４１６１（例えばＫｌｅｉｎら、２００６参照）、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ−１０４０）（例えばＭａｔｔｉｎｇｌｙら、２００６参照）、スニチニブ（例えば、参照により本明細書中に組み込まれる、Ｖｏｓｓ、ら、ＵＳ２００８００４２８７参照）、ソラフェニブ（Ｖｏｓｓ上出参照）、バンデタニブ（Ｖｏｓｓ上出参照）、パゾパニブ（例えばＶｏｓｓ上出参照）、アキシチニブ（Ｖｏｓｓ上出参照）及びＰＴＫ７８７（Ｖｏｓｓ上出参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
現在のところ、いくつかのＭＥＫ阻害剤の臨床試験評価が行われている。ＣＩ−１０４０は、癌に対して第Ｉ相の及び第ＩＩ相臨床試験において評価を受けている（例えばＲｉｎｅｈａｒｔら、２００４参照）。臨床試験で評価中の他のＭＥＫ阻害剤としては、ＰＤ１８４３５２（例えばＥｎｇｌｉｓｈら、２００２参照）、ＢＡＹ４３−９００６（例えばＣｈｏｗら、２００１参照）、ＰＤ−３２５９０１（またＰＤ０３２５９０１とも）、ＧＳＫ１１２０２１２、ＡＲＲＹ−４３８１６２、ＲＤＥＡｌ  １９、ＡＺＤ６２４４（またＡＲＲＹ−１４２８８６又はＡＲＲＹ−８８６も）、ＲＯ５１２６７６６、ＸＬ５１８及びＡＺＤ８３３０（またＡＲＲＹ−７０４も）が挙げられる。
【０１３９】
ＭＥＫの阻害は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて都合よく達成することもできる。一般に、ＭＥＫ遺伝子の全て又は一部に相補的な２本鎖ＲＮＡ分子を多能性細胞に導入し、こうしてＭＥＫをコードするｍＲＮＡ分子の特異的分解が促進される。この転写後機構の結果、標的となるＭＥＫ遺伝子の発現が低下するか又は消失する。ＲＮＡｉを用いてＭＥＫ阻害を達成するための適切な技術及びプロトコールは既知である。
【０１４０】
ＧＳＫ３阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含むキナーゼ阻害剤を同定するための多くのアッセイが知られている。例えば、Ｄａｖｉｅｓら（２０００）は、ペプチド基質及び放射性標識ＡＴＰの存在下でキナーゼをインキュベートするキナーゼアッセイを記載している。キナーゼによる基質のリン酸化の結果、基質に標識が取り込まれる。各反応液の分注液をホスホセルロース紙上に固定し、遊離ＡＴＰを除去するためにリン酸中で洗浄する。次に、インキュベート後の基質の活性を測定し、キナーゼ活性の指標を得る。このようなアッセイを用いて、候補キナーゼ阻害剤の存在下又は非存在下での相対的なキナーゼ活性を容易に決定することができる。Ｄｏｗｎｅｙら（１９９６）も、キナーゼ阻害剤を同定するために使用することができるキナーゼ活性に対するアッセイを記載している。
【０１４１】
３．ＴＧＦ−β受容体阻害剤
ＴＧＦ−β受容体阻害剤としては、一般にＴＧＦシグナル伝達の何らかの阻害剤又はＴＧＦ−β受容体（例えばＡＬＫ５）阻害剤に特異的な阻害剤を挙げることができ、これには、ＴＧＦβ受容体（例えばＡＬＫ５）に対する抗体、ＴＧＦβ受容体（例えばＡＬＫ５）のドミナントネガティブ変異型及びＴＧＦβ受容体（例えばＡＬＫ５）の発現を抑制するｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸を挙げることができる。典型的なＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤としては、ＳＢ４３１５４２（例えばＩｎｍａｎら、２００２参照）、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミドとしても知られるＡ−８３−０１（例えば、Ｔｏｊｏら、２００５参照、例えばＴｏｉｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから市販されている。）；２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ（例えば、参照により本明細書中に組み込まれる、Ｄａｌｔｏｎら、ＷＯ２００８／０９４５９７参照）、ＢＭＰ４（Ｄａｌｔｏｎ、上出参照）、ＧＷ７８８３８８（−（４−［３−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリドム（ｐｙｒｉｄｍ）−２−イル｝−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）ベンズアミド）（例えば、Ｇｅｌｌｉｂｅｒｔら、２００６参照）、ＳＭ１６（例えば、Ｓｕｚｕｋｉら、２００７参照）、ＩＮ−１１３０（３−（（５−（６−メチルピリジン−２−イル）−４−（キノキサリン−６−イル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）ベンズアミド）（例えば、Ｋｉｍら、２００８参照）、ＧＷ６６０４（２−フェニル−４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン）（例えば、ｄｅ  Ｇｏｕｖｉｌｌｅら、２００６参照）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［ｌ，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩）（例えばＤａＣｏｓｔａら、２００４参照）及びピリミジン誘導体（例えば、参照により本明細書中に組み込まれるＳｔｉｅｆｌら、ＷＯ２００８／００６５８３で列挙されるもの参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
さらに、「ＡＬＫ５阻害剤」は、非特異的キナーゼ阻害剤を包含するものではないが、「ＡＬＫ５阻害剤」は、例えば、ＳＢ−４３１５４２など、ＡＬＫ５に加えてＡＬＫ４及び／又はＡＬＫ７を阻害する阻害剤を包含すると理解されたい（例えばＩｎｍａｎら、２００２参照）。本発明の範囲を限定するものではないが、ＡＬＫ５阻害剤は、間充織−上皮転換／移行（ＭＥＴ）プロセスに影響を与えると考えられる。ＴＧＦβ／アクチビン経路は、上皮−間充織移行（ＥＭＴ）に対するドライバーである。発明者らは、ＴＧＦβ／アクチビン経路の阻害によりＭＥＴ（即ち再プログラミング）プロセスを促進することができることを企図する。
【０１４３】
ＴＧＦβ／アクチビン経路の阻害は同様の効果を有すると考えられている。従って、本明細書中で記載のようなＴＧＦ−β／ＡＬＫ５阻害剤と組み合わせて又はこれの代わりに、ＴＧＦβ／アクチビン経路の何らかの阻害剤（例えば上流又は下流）を使用することができる。典型的なＴＧＦβ／アクチビン経路阻害剤としては、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＳＭＡＤ２／３リン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ２／３及びＳＭＡＤ４の相互作用の阻害剤及びＳＭＡＤ６及びＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本明細書中に記載の分類は、単に組織化することを目的とするものであり、当業者は、化合物が経路内の１以上の点に影響を与え得、従って化合物が規定のカテゴリーの複数において機能し得ることを知っている。
【０１４４】
ＴＧＦβ受容体阻害剤は、ＴＧＦβ受容体に対する抗体、ＴＧＦβ受容体のドミナントネガティブ変異型及びＴＧＦβ受容体を標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸を含み得る。阻害剤の具体例としては、ＳＵ５４１６；２−（５−ベンゾ［ｌ，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩（ＳＢ−５０５１２４）；レルデリムムブ（ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍｂ）（ＣＡＴ−１５２）；メテリムマブ（ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）（ＣＡＴ−１９２）；ＧＣ−１００８；ＩＤｌｌ；ＡＰ−１２００９；ＡＰ−１１０１４；ＬＹ５５０４１０；ＬＹ５８０２７６；ＬＹ３６４９４７；ＬＹ２１０９７６１；ＳＢ−５０５１２４；ＳＢ−４３１５４２；ＳＤ−２０８；ＳＭ１６；ＮＰＣ−３０３４５；Ｋｉ２６８９４；ＳＢ−２０３５８０；ＳＤ−０９３；グリベック；３，５，７，２’，４’−ペンタヒドロキシフィアボン（ｆｉａｖｏｎｅ）（Ｍｏｒｉｎ）；アクチビン−Ｍ１０８Ａ；Ｐ１４４；可溶性ＴＢＲ２−Ｆｃ；及びＴＧＦβ受容体を標的とするアンチセンス形質移入腫瘍細胞（例えば、Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉら、２００７；Ｋａｍｉｎｓｋａら、２００５；及びＣｈａｎｇら、２００７参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
４．ＲＯＣＫ阻害剤
多能性幹細胞、特にヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞は、細胞剥離及び解離時にアポトーシスの影響を受け易く、これはクローン単離又は増殖及び分化誘導に重要である。最近、ＲＯＣＫ−関連シグナル伝達経路に対する阻害剤であるＲｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、例えばＲｈｏ特異的阻害剤、ＲＯＣＫ特異的阻害剤又はミオシンＩＩ特異的阻害剤など、小さなクラスの分子が、解離した多能性幹細胞のクローン効率及び生存性を向上させることが分かった。本発明のある態様において、多能性幹細胞の培養及び継代及び／又は幹細胞の分化に対してＲＯＣＫ阻害剤を使用し得る。従って、接着培養又は懸濁培養など、多能性幹細胞が増殖し、解離し、凝集物を形成するか又は分化を引き起こす何らかの細胞培養液中にＲＯＣＫ阻害剤が存在し得る。
【０１４６】
ＲＯＣＫシグナル伝達経路としては、ＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅ；ＲＯＣＫ、Ｒｈｏの主要な下流エフェクターキナーゼ；ミオシンＩＩ、ＲＯＣＫの下流のプレドミナントエフェクター（Ｈａｒｂら、２００８）；及び何らかの中間、上流又は下流シグナルプロセッサーを挙げることができる。ＲＯＣＫは、ミオシン調節軽鎖（ＭＲＬＣ）の脱リン酸化を通じてミオシン機能を負の方向に制御するＲＯＣＫの主要な下流の標的の１つである、ミオシンホスファターゼ標的サブユニット１（ＭＹＰＴ１）をリン酸化し、不活性化し得る。
【０１４７】
ＲＯＣＫは、（３種類のアイソフォーム−ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ及びＲｈｏＣが存在する）Ｒｈｏに対する標的タンパク質となるセリン／スレオニンキナーゼである。これらのキナーゼは、最初にＲｈｏＡ−誘導性ストレスファイバー及び接着斑の形成に介在するものと位置付けられた。２種類のＲＯＣＫアイソフォーム、ＲＯＣＫ１（ｐ１６０ＲＯＣＫ、ＲＯＫβとも呼ばれる。）及びＲＯＣＫ２（ＲＯＫα）は、Ｎ−末端キナーゼドメインと、それに続くＲｈｏ−結合ドメイン及びプレクストリン相同ドメイン（ＰＨ）を含有するコイルドコイルドメインから構成される。両方のＲＯＣＫとも、細胞骨格制御因子であり、ストレスファイバー形成、平滑筋収縮、細胞接着、膜ラフリング及び細胞運動性においてＲｈｏＡの影響に介在する。ＲＯＣＫは、ミオシンＩＩ、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）、ＭＬＣホスファターゼ（ＭＬＣＰ）及びホスファターゼ・テンシンホモローグ（ＰＴＥＮ）などの下流分子を標的とすることによって、その生物学的活性を発揮し得る。
【０１４８】
ＲＯＣＫ阻害剤の非限定例としては、ＨＡ−１００、Ｙ−２７６３２、Ｈ−１１５２、ファスジル（ＨＡ１０７７とも呼ばれる。）、Ｙ−３０１４１（米国特許第５，４７８，８３８号に記載）、Ｗｆ−５３６、ＨＡ−１０７７、ヒドロキシル−ＨＡ−１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、ＳＢ−７７２０７７−Ｂ及びその誘導体及びＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導核酸（例えばｓｉＲＮＡ）、競合ペプチド、アンタゴニストペプチド、阻害抗体、抗体−ＳｃＦＶ断片、それらのドミナントネガティブ変異型及び発現ベクターが挙げられる。さらに、他の低分子化合物がＲＯＣＫ阻害剤として知られているので、このような化合物又はその誘導体も実施態様において使用することができる（例えば、参照により本明細書によって組み込まれる米国特許公開第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号及び同第２００３００８７９１９号及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号及び同第２００４／０３９７９６号参照）。本発明のある態様において、ＲＯＣＫ阻害剤の１又は２以上の組み合わせを使用することもできる。
【０１４９】
クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ｃ３細胞外酵素及び／又はミオシンＩＩ特異的阻害剤などのＲｈｏ特異的阻害剤も本発明のある態様においてＲＯＣＫ阻害剤として使用し得る。
【０１５０】
Ｅ．低酸素条件
前駆細胞様状態の維持に有利に働くように再プログラミングする前に増殖段階中全体及びおそらくは再プログラミング段階の少なくとも一部において、低酸素を使用し得る。最初に、細胞が増殖する際、細胞はより前駆細胞様の状態からより分化した状態に移行する傾向がある（即ちＣＤ３４発現レベルが時間とともに低下する。）。低酸素条件は、造血前駆細胞（ＨＰ）の典型的な微小環境を模倣しており、前駆細胞の分化を遅延させると思われる（Ｅｌｉａｓｓｏｎ及びＪｏｎｓｓｏｎ、２０１０）。本明細書中で使用される低酸素は、約２％のレベルであり得るか又は約１から７％の範囲内であり得る。さらなる態様において、低Ｏ２は、ｉＰＳ形成を促進するために再プログラミング段階中にも使用し得る（Ｙｏｓｈｉｄａら、２００９）。
【０１５１】
Ｖ．エピソーム性遺伝因子
本発明のある態様において、再プログラミング因子は、１以上の外来性エピソーム遺伝因子に含まれる発現カセットから発現される（参照により本明細書中に組み込まれる米国特許公開第２０１０／０００３７５７号及び米国出願第６１／２５８，１２０号参照）。
【０１５２】
再プログラミング遺伝子の異所性発現のために、レトロウイルス又はレンチウイルスベクターを用いて、ヒト体細胞から多能性幹細胞への誘導が達成されている。モロニーマウス白血病ウイルスなどの組み換えレトロウイルスは、宿主ゲノムへの安定的な組み込み能を有する。これらは宿主ゲノムへの組み込みを可能にする逆転写酵素を含有する。レンチウイルスはレトロウイルスのサブクラスである。これらは、非分裂細胞ならびに分裂細胞のゲノムに組み込む能力があるので、ベクターとして広く適用されている。ＲＮＡ型のウイルス性ゲノムは、ウイルスが細胞に侵入したときに逆転写されてＤＮＡを生成し、次いでこれがウイルスインテグラーゼ酵素によりランダムな位置でゲノムに挿入される。従って、再プログラミングを成功させる現在の技術は、組み込みに基づくウイルスによるアプローチに依存している。
【０１５３】
しかし、現在の技術では、組み込みを標的化すること未だ日常的なものではなく（Ｂｏｄｅら、２０００）、従来の選択肢である無作為組み込みは人工多能性幹細胞において挿入変異を引き起こし、結果が予測不能となり得る。同じ理由で、導入遺伝子の発現は、組み込み部位のクロマチン構造に依存するので調節することができない（Ｂａｅｒら、２０００）。高レベル発現は、都合のよいゲノム遺伝子座でのみ達成可能であるが、高発現部位への組み込みは人工多能性幹細胞の重要な細胞機能を妨害するという危険がある。
【０１５４】
さらに、ＤＮＡメチル化が付随するプロセスで導入遺伝子を下方制御することにより機能する、外来ＤＮＡに対する細胞防御機構の存在に関する証拠が増えつつある（Ｂｉｎｇｈａｍ、１９９７、Ｇａｒｒｉｃｋら、１９９８）。さらに、ウイルス成分は、細胞を形質転換するために他の因子とともに作用し得る。多くのウイルス遺伝子からの連続的発現を伴うので、細胞内でウイルスゲノムの少なくとも一部が存続することにより細胞形質転換が起こり得る。これらの遺伝子は細胞のシグナル伝達経路を妨害し得、それにより、細胞の表現型の変化が観察され、形質転換された細胞の細胞分裂が増加するが、これはウイルスにとって好都合である。
【０１５５】
従って、ある実施態様において、本発明は、基本的に、例えば先行する方法で使用されるレトロウイルス又はレンチウイルスベクターエレメント由来のものなどの外来性遺伝因子不含である人工多能性幹細胞を作製するための新規方法を開発する。本発明におけるこれらの方法は、最適な再プログラミング効率及び反応速度を得るために、細胞シグナル伝達阻害剤の存在下で再プログラム化細胞を培養することと組み合わせて、染色体外で複製するベクター又はエピソームとして複製可能なベクターを使用する（参照により本明細書中に組み込まれる米国出願第１２／４７８，１５４号参照）。
【０１５６】
アデノウイルス、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）などの多くのＤＮＡウイルス又は出芽酵母ＡＲＳ（自律複製配列）含有プラスミドは、哺乳動物細胞において染色体外で複製する。これらのエピソーム性プラスミドは本質的に、ベクターの組み込みに付随するこれらの欠点が全くない（Ｂｏｄｅら、２００１）。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を含むリンパ球向性ヘルペスウイルスに基づく系も染色体外で複製し、体細胞への再プログラミング遺伝子の送達に役立ち得る。
【０１５７】
例えば、本発明で使用されるエピソーム性ベクターに基づくアプローチは、下記で詳細に記載するような臨床背景においてこの系の実行可能性を損なうことなく、ＥＢＶエレメントに基づく系の良好な複製及び維持に必要なロバストなエレメントを取り上げる。有用なＥＢＶエレメントは、ＯｒｉＰ及びＥＢＮＡ−１又はそれらの変異型又は機能的同等物である。この系のさらなる長所は、これらの外来性エレメントが、細胞への導入後、時間とともに失われることであり、これらのエレメントを基本的に含まない自立したｉＰＳ細胞が得られるようになる。
【０１５８】
Ａ．エピソーム性ベクター
これらの再プログラミング法は、基本的に外来性ベクター又はウイルス性エレメント不含のｉＰＳ細胞を作製するために、エピソームとして複製可能なベクターである、染色体外で複製するベクター（即ちエピソーム性ベクター）を使用し得る（参照により本明細書中に組み込まれる米国出願第６１／０５８，８５８号；Ｙｕら、２００９参照）。アデノウイルス、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）もしくはウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）などの多くのＤＮＡウイルス（ＢＰＶ）又は出芽酵母ＡＲＳ（自律複製配列）含有プラスミドは、哺乳動物細胞において染色体外で又はエピソームとして複製する。これらのエピソーム性プラスミドは本質的に、ベクターの組み込みに付随するこれらの欠点が全くない（Ｂｏｄｅら、２００１）。例えば、上記で定義されるようなエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を含むリンパ球向性ヘルペスウイルスに基づく系又は上記で定義されるようなエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）は染色体外で複製し、体細胞への再プログラミング遺伝子の送達に役立ち得る。
【０１５９】
例えば、本発明で使用されるプラスミドに基づくアプローチは、下記で詳細に記載するような臨床背景においてこの系の実行可能性を損なうことなく、ＥＢＶエレメントに基づく系の良好な複製及び維持に必要なロバストなエレメントを取り上げ得る。基本的なＥＢＶエレメントはＯｒｉＰ及びＥＢＮＡ−１又はそれらの変異型又は機能的同等物である。この系のさらなる長所は、これらの外来性エレメントが、細胞への導入後、時間とともに失われることであり、外来性エレメントを基本的に含まない自立したｉＰＳ細胞が得られる。
【０１６０】
プラスミド又はリポソームに基づく染色体外ベクター、例えばｏｒｉＰに基づくベクター及び／又はＥＢＮＡ−１誘導体をコードするベクターを使用することにより、ＤＮＡの大きな断片を細胞に導入し、染色体外で維持し、細胞周期ごとに１回複製させ、娘細胞に対して効果的に分割し、実質的に免疫応答の誘発をなくすことができるようになる。特に、ｏｒｉＰに基づく発現ベクターの複製に必要とされる唯一のウイルス性タンパク質であるＥＢＮＡ−１は、ＭＨＣクラスＩ分子におけるその抗原の提示に必要なプロセシングを迂回する効果的な機構を発達させてきたので、細胞性免疫応答を誘導しない（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａら、１９９７）。さらに、ＥＢＮＡ−１は、クローン化遺伝子の発現を促進するためにトランスで作用し得、一部の細胞系統では最大で１００倍、クローン化遺伝子の発現を誘導する。（Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔら、１９９８；Ｅｖａｎｓら、１９９７）。最後に、このようなｏｒｉＰに基づく発現ベクターの作製は安価である。
【０１６１】
他の染色体外ベクターとしては、他のリンパ球向性ヘルペスウイルスに基づくベクターが挙げられる。リンパ球向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えばヒトＢリンパ芽球）において複製し、その自然の生活環の一部のためにプラスミドになるヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、「リンパ球向性」ヘルペスウイルスではない。典型的なリンパ球向性ヘルペスウイルスとしては、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；リスザルヘルペスウイルス（ＨＳ）及びマレック病ウイルス（ＭＤＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０又はＢＰＶなど、エピソームに基づくベクターの他のソースも企図される。
【０１６２】
Ｂ．エプスタインバーウイルス
ヒトヘルペスウイルス４（ＨＨＶ−４）とも呼ばれるエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）は、（単純ヘルペスウイルス及びサイトメガロウイルスを含む）ヘルペスファミリーのウイルスであり、ヒトにおいて最も一般的なウイルスの１つである。ＥＢＶは、細胞分裂中の細胞内でのその複製及びその保持のための２つの基本的特性にのみ依存して（Ｙａｔｅｓら、１９８５；Ｙａｔｅｓら、１９８４）、そのゲノムを染色体外で維持し、効率的な複製及び維持のために宿主細胞の機構とともに働く（Ｌｉｎｄｎｅｒ及びＳｕｇｄｅｎ、２００７）。一方のエレメントは、一般にｏｒｉＰと呼ばれ、シスに存在し、複製開始点となる。他方の因子、ＥＢＮＡ−１は、ｏｒｉＰ内の配列に結合することによって、トランスで機能してプラスミドＤＮＡの複製及び維持を促進する。非限定例として、本発明のある態様は、これらの２つの特性を取り上げ、従来のプラスミドを上回りこれらの遺伝子の複製及び持続的発現を促進するために、体細胞の再プログラミングに必要な遺伝子を往復させるベクターとの関連で、それらを使用する。
Ｃ．複製開始点
【０１６３】
ある態様において、ＥＢＶの複製開始点であるＯｒｉＰを使用し得る。ＯｒｉＰはＤＮＡ複製が開始される部位又はその付近の部位であり、リピートファミリー（ＦＲ）及び二重対称（ｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ、ＤＳ）として知られるおよそ１キロ塩基対離れた２つのシス作用性配列から構成される。
【０１６４】
ＦＲは、３０ｂｐリピートの２１個の不完全コピーから構成され、２０個の高親和性ＥＢＮＡ−１結合部位を含有する。ＦＲにＥＢＮＡ−１が結合すると、これは、プロモーターの転写エンハンサーとして最大で１０ｋｂ離れてシスで作用し（Ｒｅｉｓｍａｎ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｙａｔｅｓ、１９８８；Ｓｕｇｄｅｎ及びＷａｒｒｅｎ、１９８９；Ｗｙｓｏｋｅｎｓｋｉ及びＹａｔｅｓ、１９８９；Ｇａｈｎ及びＳｕｇｄｅｎ、１９９５；Ｋｅｎｎｅｄｙ及びＳｕｇｄｅｎ、２００３；Ａｌｔｍａｎｎら、２００６）、ＦＲ含有プラスミドの核内繋留及び正確な維持に寄与する（Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔら、１９９８；Ｋｉｒｃｈｍａｉｅｒ及びＳｕｇｄｅｎ、１９９５；Ｗａｎｇら、２００６；Ｎａｎｂｏ及びＳｕｇｄｅｎ、２００７）。ｏｒｉＰプラスミドの効率的な分割もＦＲに起因すると思われる。このウイルスはＦＲにおいて２０個のＥＢＮＡ−１−結合部位を維持するように進化してきたが、一方で、効率的なプラスミド維持に必要なのはこれらの部位のうち僅か７個であり、全部で１２個のＥＢＮＡ−１結合部位を有する、３コピーのＤＳのポリマーにより再構成することができる（Ｗｙｓｏｋｅｎｓｋｉ及びＹａｔｅｓ、１９８９）。
【０１６５】
二重対称（ｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）エレメント（ＤＳ）は、ＥＢＮＡ−１の存在下でＤＮＡ合成の開始に十分であり（Ａｉｙａｒら、１９９８；Ｙａｔｅｓら、２０００）、ＤＳで又はその付近の何れかで開始が起こる（Ｇａｈｎ及びＳｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ、１９８９；Ｎｉｌｌｅｒら、１９９５）。ウイルス性ＤＮＡ合成の終結はＦＲで起こると考えら得るが、これは、２Ｄゲル電気泳動により観察されるように、ＦＲにＥＢＮＡ−１が結合した際にそれが複製フォーク障壁として機能するからである（Ｇａｈｎ及びＳｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ、１９８９；Ｅｒｍａｋｏｖａら、１９９６；Ｗａｎｇら、２００６）。ＤＳからのＤＮＡ合成の開始は、細胞周期あたり１回可能であり（Ａｄａｍｓ、１９８７；Ｙａｔｅｓ及びＧｕａｎ、１９９１）、細胞複製系の構成成分により制御される（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉら、２００１；Ｒｉｔｚｉら、２００３；Ｄｈａｒら、２００１；Ｓｃｈｅｐｅｒｓら、２００１；Ｚｈｏｕら、２００５；Ｊｕｌｉｅｎら、２００４）。ＤＳは、ＦＲで見られるものよりも親和性が低いものではあるが、４個のＥＢＮＡ−１−結合部位を含有する（Ｒｅｉｓｍａｎら、１９８５）。ＤＳのトポロジーは、４個の結合部位が２つの部位ペアとして編成され、各ペア間では中心から中心への間隔が２１ｂｐであり、ペアではない２個の内部結合部位間の中心から中心への間隔が３３ｂｐであるというものである（Ｂａｅｒら、１９８４；Ｒａｗｌｉｎｓら、１９８５）。
【０１６６】
ＤＳ内のエレメントの機能的役割は、非効率的にＤＳを置換し得るエレメントとして同定された、Ｒｅｐ＊と呼ばれるＥＢＶのゲノムの別の領域の研究により確認されている（Ｋｉｒｃｈｍａｉｅｒ及びＳｕｇｄｅｎ、１９９８）。Ｒｅｐ＊を８回重合させることにより、その複製の支援においてＤＳと同程度に有効なエレメントが得られた（Ｗａｎｇら、２００６）。Ｒｅｐ＊の生化学的精査から、その複製機能に非常に重要な２１ｂｐの中心−中心間隔を有するＥＢＮＡ−１結合部位のペアが同定された（同書）。Ｒｅｐ＊のポリマーの全フランキング配列をラムダファージ由来の配列で置換した後でも複製機能が維持されたので、Ｒｅｐ＊の最小レプリケーターがＥＢＮＡ−１結合部位のペアであることが分かった。ＤＳ及びＲｅｐ＊の比較から、これらのレプリケーターが、ＥＢＮＡ−１により曲げられ、結合される、適切な間隔が空いた部位ペアを介して細胞複製機構を動員することによりＤＮＡ合成の開始を支援するという、共通メカニズムが明らかになった。
【０１６７】
ＥＢＶと関連がない哺乳動物細胞において複製し、いくつかの点でＥＢＶのＲａｊｉ株内の開始ゾーンと同様と思われる、他の染色体外認可プラスミドがある。Ｈａｎｓ  Ｌｉｐｐｓ及び共同研究者らは、「核骨格／マトリクス結合領域」（Ｓ／ＭＡＲ）及びロバストな転写単位を含有するプラスミドを開発し、研究した（Ｐｉｅｃｈａｃｚｅｋら、１９９９；Ｊｅｎｋｅら、２００４）。それらのＳ／ＭＡＲは、ヒトインターフェロン−β遺伝子由来であり、Ａ／Ｔリッチであり、核マトリクスとのその結合及び、低イオン強度で又はスーパーコイルＤＮＡへ埋め込まれた際に優先的に巻き戻されるということにより、機能面で定義される（Ｂｏｄｅら、１９９２）。これらのプラスミドは、半保存的に複製し、ＯＲＣタンパク質に結合し、それらのＤＮＡ全体にわたり効率的で無作為にＤＮＡ合成の開始を支援する（Ｓｃｈａａｒｓｃｈｍｉｄｔら、２００４）。これらは、薬物選択なしで、増殖中のハムスター及びヒト細胞中で効率的に維持され、ブタ胚に導入された場合、胎仔動物の殆どの組織においてＧＦＰの発現を支え得る（Ｍａｎｚｉｎｉら、２００６）。
Ｄ．トランス作用因子
【０１６８】
トランス作用因子の特定の例は、各細胞分裂中の細胞染色体とは独立であるが呼応してｏｒｉＰのＦＲ及びＤＳ又はＲｅｐ＊に結合して複製及びＥＢＶに基づくベクターと娘細胞との正確な分割を促進する、ＤＮＡ結合タンパク質であるエプスタインバー核抗原１（ＥＢＮＡ−１）であり得る。
【０１６９】
ＥＢＮＡ−１の６４１アミノ酸（ＡＡ）は、突然変異誘発及び欠失分析によってその様々な機能と関連付けられたドメインに分類されている。ＡＡ４０−８９とＡＡ３２９−３７８との間の２つの領域は、ＥＢＮＡ−１が結合した際に、２個のＤＮＡエレメントにシス又はトランスで連結可能であり、従って連結領域（Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）１及び２（ＬＲ１、ＬＲ２）と呼ばれている（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ及びＳｕｇｄｅｎ、１９９２；Ｆｒａｐｐｉｅｒ及びＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、１９９１；Ｓｕら、１９９１；Ｍａｃｋｅｙら、１９９５）。ＥＢＮＡ−１のこれらのドメインをＧＦＰに融合させると、ＧＦＰが有糸分裂染色体に誘導される（Ｍａｒｅｃｈａｌら、１９９９；Ｋａｎｄａら、２００１）。ＬＲ１及びＬＲ２は複製に対して機能面で重複しており、何れか一方を欠失させた場合、ＤＮＡ複製を補助することが可能なＥＢＮＡ−１誘導体が得られる（Ｍａｃｋｅｙ及びＳｕｇｄｅｎ、１９９９；Ｓｅａｒｓら、２００４）。ＬＲ１及びＬＲ２はアルギニン及びグリシン残基に富み、Ａ／ＴリッチＤＮＡに結合するＡＴ−フックモチーフと似ている（Ａｒａｖｉｎｄ及びＬａｎｄｓｍａｎ、１９９８）、（Ｓｅａｒｓら、２００４）。ＥＢＮＡ−１のＬＲ１及びＬＲ２のインビトロ分析から、それらのＡ／ＴリッチＤＮＡへの結合能が明らかになった（Ｓｅａｒｓら、２００４）。このようなＡＴ−フックを１個含有するＬＲ１をＥＢＮＡ−１のＤＮＡ結合及び二量体化ドメインと融合させた場合、野生型ＥＢＮＡ−１よりも効率が低いが、ｏｒｉＰプラスミドのＤＮＡ複製に十分であることが分かった（同書）。
【０１７０】
しかしＬＲ１及びＬＲ２は異なる。ＬＲ１のＣ−末端側半分は、Ｎ−末端側半分のＡｒｇ−Ｇｌｙの繰り返し以外のアミノ酸から構成され、ユニーク領域（ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｇｉｏｎ）１（ＵＲ１）と呼ばれる。ＵＲ１は、ＦＲを含有する形質移入及び組み込まれたレポーターＤＮＡから転写を効率的に活性化するためにＥＢＮＡ−１にとって必要である（Ｗｕら、２００２；Ｋｅｎｎｅｄｙ及びＳｕｇｄｅｎ、２００３；Ａｌｔｍａｎｎら、２００６）。ＵＲ１は、ＥＢＶが感染したＢ細胞の効率的な形質転換にも必須である。ウイルス全体に関して、このドメインを欠くＥＢＮＡ−１の誘導体で野生型タンパク質を置換した場合、これらの誘導体ウイルスの形質転換能は野生型ウイルスの形質転換能の０．１％となる（Ａｌｔｍａｎｎら、２００６）。
【０１７１】
ＬＲ２は、ＥＢＮＡ−１のｏｒｉＰ複製の支持に必要ではない（Ｓｈｉｒｅら、１９９９；Ｍａｃｋｅｙ及びＳｕｇｄｅｎ、１９９９；Ｓｅａｒｓら、２００４）。さらに、ＥＢＮＡ−１のＮ−末端側半分をＨＭＧＡ１ａなどのＡＴ−フックモチーフを含有する細胞性タンパク質で置換することができ、これは依然として複製機能を保持している（Ｈｕｎｇら、２００１；Ｓｅａｒｓら、２００３；Ａｌｔｍａｎｎら、２００６）。これらの知見から、ヒト細胞におけるｏｒｉＰの維持に必要なのはＬＲ１及びＬＲ２のＡＴ−フックの活性であると思われることが示唆される
【０１７２】
ＥＢＮＡ−１の残基の３分の１（ＡＡ９１−３２８）は、プロテオソーム分解及び提示を阻害することによるＥＢＮＡ−１の宿主免疫応答回避能に関与する、グリシン−グリシン−アラニン（ＧＧＡ）リピートからなる（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａら、１９９５；Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａら、１９９７）。これらのリピートは、インビトロ及びインビボでのＥＢＮＡ−１の翻訳を阻害することも分かっている（Ｙｉｎら、２００３）。しかし、このドメインの大部分を欠失させても、細胞培養においてＥＢＮＡ−１の機能に明らかな影響がなく、このため、このドメインが果たす役割の解明は困難なものとなっている。
【０１７３】
核移行シグナル（ＮＬＳ）は、細胞核輸入機構とも関連するＡＡ３７９−３８６によりコードされる（Ｋｉｍら、１９９７；Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９７）。ＬＲ１及びＬＲ２のＡｒｇ−Ｇｌｙリッチ領域内の配列は、塩基含量が高いゆえにＮＬＳとしても機能し得る。
【０１７４】
最後に、Ｃ−末端（ＡＡ４５８−６０７）は、ＥＢＮＡ−１の重複するＤＮＡ結合及び二量体化ドメインをコードする。ＤＮＡに結合するこれらのドメインの構造は、Ｘ線結晶学により解析され、パピローマウイルスのＥ２タンパク質のＤＮＡ結合ドメインと同様であることが分かった（Ｈｅｇｄｅら、１９９２；Ｋｉｍら、２０００；Ｂｏｃｈｋａｒｅｖら、１９９６）。
【０１７５】
本発明の具体的な実施態様において、再プログラミングベクターは、ｏｒｉＰ及び、細胞分裂中のプラスミド複製及びその的確な維持を補助する能力があるタイプのＥＢＮＡ−１をコードする短縮配列の両方を含有する。野生型ＥＢＮＡ−１のアミノ末端側の３分の１内の高反復配列及び、様々な細胞で毒性を示している２５アミノ酸領域の除去は、ｏｒｉＰに付随するＥＢＮＡ−１のトランス作用の機能に重要ではない（Ｙａｔｅｓら、１９８５；Ｋｅｎｎｅｄｙら、２００３）。従って、ΔＵＲ１として知られるＥＢＮＡ−１の短縮型は、ある実施態様においてエピソーム性ベクターに基づく系内でｏｒｉＰと一緒に使用され得る。
【０１７６】
ある態様において、本発明において使用され得るＥＢＮＡ−１の誘導体は、対応する野生型ポリペプチドに対してアミノ酸配列が修飾されているポリペプチドである。この修飾には、ＥＢＮＡ−１中のＬＲ１（残基約４０から約８９）のユニーク領域（残基約６５から約８９）に対応する領域中の少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換が含まれ、得られる誘導体が望ましい特性、例えば、二量体化し、ｏｒｉＰに対応するｏｒｉを含有するＤＮＡに結合し、核に移行し、細胞毒性がなく、染色体外から転写を活性化するが組み込まれた鋳型からの転写を実質的に活性化しないこと、を有する限り、ＥＢＮＡ−１の他の残基に対応する領域の１以上のアミノ酸残基、例えば約残基１から約残基４０、残基約９０から約３２８（「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ」リピート領域）、残基約３２９から約３７７（ＬＲ２）、残基約３７９から約３８６（ＮＬＳ）、残基約４５１から約６０８（ＤＮＡ結合及び二量体化）又は残基約６０９から約６４１、の欠失、挿入及び／又は置換が含まれ得る。
【０１７７】
Ｅ．非残留特性
重要なこととして、ｏｒｉＰに基づくエピソーム性ベクターの複製及び維持は不完全であり、細胞へそれが導入されてから最初の２週間内に細胞から急激に失われるが（細胞分裂１回あたり２５％）；しかし、プラスミドを保持する細胞ではその喪失はそれほど多くない（細胞分裂１回あたり３％）（Ｌｅｉｇｈｔ及びＳｕｇｄｅｎ、２００１；Ｎａｎｂｏ及びＳｕｇｄｅｎ、２００７）。プラスミドを有する細胞に対する選択が排除されると、得られる娘細胞内にプラスミドが以前に存在したという痕跡を残すことなく、時間経過とともに各細胞分裂中にプラスミドが失われ、プラスミド全てが排除される。本発明のある態様は、ｉＰＳ細胞を作製するために遺伝子を送達するための現在のウイルスによるアプローチに代わるものとして、ｏｒｉＰに基づく系の、この痕跡を残存さないという特性を利用する。他の染色体外ベクターもまた宿主細胞の複製及び増殖中に失われ、これも本発明において使用し得る。ある態様において、外来性エピソーム性ベクターエレメントの除去又は基本的に外来性遺伝因子不含であるｉＰＳ細胞の選択のための方法が使用され得る。
【０１７８】
ＶＩ．ベクター構築及び送達
ある実施態様において、細胞において上述のような再プログラミング因子をコードする核酸配列に加えてさらなるエレメントを含むように再プログラミングベクターを構築し得る。これらのベクターの構成成分及び送達方法の詳細は下記で開示する。
【０１７９】
Ａ．ベクター
当業者は、標準的な組み換え技術を通じてベクターを構築するために十分な知識を有しているであろう（例えば、両者とも参照により本明細書中に組み込まれるＭａｎｉａｔｉｓら、１９８８及びＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４参照）。
【０１８０】
ベクターは、遺伝子送達及び／又は遺伝子発現をさらに調整するか又はそれ以外では標的とする細胞に有利な特性を与える他の成分又は機能性も含み得る。このような他の成分としては、例えば、細胞への結合又は標的化に影響を与える成分（細胞型又は組織特異的結合を媒介する成分を含む。）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を与える成分；取り込み後に細胞内でのポリヌクレオチドの移行に影響を与える成分（薬剤介在性の核移行など）；及びポリヌクレオチドの発現に影響を与える成分が挙げられる。
【０１８１】
このような成分はまた、ベクターにより送達される核酸を取り込み、発現している細胞を検出するか又は選択するために使用することができる検出可能なマーカー及び／又は選択マーカーなどのマーカーも含み得る。このような成分は、ベクターの天然の特性として提供され得るか（結合及び取り込みに介在する成分又は機能性を有するある種のウイルス性ベクターの使用など）又はベクターはこのような機能性をもたらすために改変され得る。当技術分野において多岐にわたるこのようなベクターが公知であり、一般に入手可能である。ベクターが宿主細胞中に維持される場合、このベクターは自律的構造として有糸分裂中に細胞により安定的に複製され得るか、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得るか又は宿主細胞の核もしくは細胞質中に維持され得る。
【０１８２】
Ｂ．制御エレメント
ベクターに含まれる真核発現カセットは、特に、（５’から３’方向で）タンパク質コード配列に操作可能に連結される真核転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル及び転写終結／ポリアデニル化配列を含有する。
【０１８３】
ｉ．プロモーター／エンハンサー
「プロモーター」は、開始及び転写速度が調節される核酸配列領域である調節配列である。これは、制御タンパク質及び分子がＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などに結合して核酸配列の特異的転写を開始させ得る遺伝因子を含有し得る。「操作可能に配置される」、「操作可能に連結される」、「制御下」及び「転写制御下」という句は、プロモーターが、転写開始及び／又はその配列の発現を調節するために核酸配列に対して正しい機能的位置及び／又は向きにあることを意味する。
【０１８４】
ＥＢＮＡ１−をコードする本発明のベクターでの使用に適切なプロモーターは、ＥＢＮＡ１タンパク質をコードする発現カセットの発現を支配し、その結果、ＥＢＶ  ｏｒｉＰ含有ベクターを安定的に維持するのに十分な定常状態レベルのＥＢＮＡ１タンパク質が得られるものである。プロモーターはまた、再プログラミング因子をコードする発現カセットの効率的な発現のためにも使用される。
【０１８５】
プロモーターは一般に、ＲＮＡ合成に対して開始部位の位置を決定するために機能する配列を含む。この例のうち最もよく知られているものはＴＡＴＡボックスであるが、例えば哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子に対するプロモーター及びＳＶ４０後期遺伝子に対するプロモーターなど、一部のプロモーターにはＴＡＴＡボックスがなく、開始部位それ自身を覆う別のエレメントが、開始位置の固定に役立つ。さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を制御する。一般的には、これらは、開始部位上流の領域３０から１１０ｂｐに位置するが、多くのプロモーターが、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが示されている。コード配列をプロモーターの「調節下」に持っていくために、１つは、選択したプロモーターの「下流」（即ち３’側）の転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端に位置する。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされるＲＮＡの発現を促進する。
【０１８６】
プロモーターエレメント間の間隔は柔軟であることが多く、そのためエレメントが互いに対して逆転するか又は移動した場合、プロモーター機能が保持される。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活性を低下させることなく５０ｂｐまで広げられ得る。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するために、協力的に又は独立して機能し得ると思われる。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用制御配列を指す「エンハンサー」と一緒に使用してもよいし又は使用しなくてもよい。
【０１８７】
プロモーターは、コードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することにより得られ得るような、核酸配列と天然に結合するものであり得る。このようなプロモーターは「内在性」と呼ばれ得る。同様に、エンハンサーは、核酸配列と天然に結合するものであり得、その配列の下流又は上流に位置し得る。あるいは、その天然の環境で核酸配列と通常は結合しないプロモーターを指す、組み換え又は異種プロモーターの調節下にコード核酸セグメントを配置することにより、一定の長所が得られる。組み換え又は異種エンハンサーは、その天然の環境において核酸配列と通常は結合しないエンハンサーも指す。このようなプロモーター又はエンハンサーとしては、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー及び何らかの他のウイルスもしくは原核細胞もしくは真核細胞から単離されるプロモーター又はエンハンサー及び「天然」ではない、即ち異なる転写制御領域の異なるエレメント及び／又は発現を変化させる突然変異を含有するプロモーター又はエンハンサーを挙げることができる。例えば、組み換えＤＮＡ構築で最もよく使用されるプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成により作製することに加えて、本明細書中で開示される組成物と組み合わせて、ＰＣＲ（商標）を含む組み換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を用いて配列を作製し得る（それぞれ参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第４，６８３，２０２号及び同第５，９２８，９０６号参照）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核小器官内の配列の転写及び／又は発現を支配する調節配列も使用できることが企図される。
【０１８８】
当然、発現に対して選択される、細胞小器官、細胞型、組織、器官又は生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効率的に支配するプロモーター及び／又はエンハンサーを使用することは重要であろう。分子生物学分野の熟練者は、一般に、タンパク質発現に対するプロモーター、エンハンサー及び細胞型の組み合わせの使用を知っている（例えば、参照により本明細書中に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９参照）。使用されるプロモーターは、組み換えタンパク質及び／又はペプチドの大規模生成に有益であるなど、導入されたＤＮＡセグメントの高発現レベルを支配するために適切な条件下で、構成的であり、組織特異的であり、誘導性であり及び／又は有用であり得る。プロモーターは異種性又は内在性であり得る。
【０１８９】
発現を駆動させるために、さらに何らかのプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢ、ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ、ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／のとおり）も使用し得る。Ｔ３、Ｔ７又はＳＰ６細胞質発現系の使用は、別の可能な実施態様である。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが送達複合体の一部として又はさらなる遺伝子発現コンストラクトとしての何れかで提供される場合、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持し得る。
【０１９０】
プロモーターの非限定例としては、初期又は後期ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０初期又は後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーターなど；真核細胞プロモーター、例えばβアクチンプロモーター（Ｎｇ、１９８９；Ｑｕｉｔｓｃｈｅら、１９８９）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８８、Ｅｒｃｏｌａｎｉら、１９８８）、メタロチオネインプロモーター（Ｋａｒｉｎら、１９８９；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、１９８４）；及び連鎖状応答エレメントプロモーター（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、例えば環状ＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）及びミニマルＴＡＴＡボックス付近の応答エレメントプロモーター（ｔｒｅ）が挙げられる。ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えばＧｅｎｂａｎｋ、受入番号Ｘ０５２４４に記載のヒト成長ホルモンミニマルプロモーター、ヌクレオチド２８３−３４１）又はマウス乳房腫瘍プロモーター（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＡＴＣＣ４５００７より入手可能）を使用することも可能である。具体例はホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターであり得る。
【０１９１】
ｉｉ．プロテアーゼ切断部位／自己切断ペプチド及び配列内リボソーム結合部位
ある態様において、本発明に従い、プロテアーゼ切断部位（即ちプロテアーゼの認識部位を含む配列）又は少なくとも１つの自己切断ペプチドをコードする配列（複数であり得る。）によって、マーカー又は再プログラミングタンパク質をコードする遺伝子が互いに対して連結され得る。例えば、本発明のある態様において、少なくとも２つの再プログラミング因子遺伝子を含むポリシストロニックなメッセージを使用し得る（参照により本明細書中に組み込まれる米国仮出願第１２／５３９，３６６号参照）。
【０１９２】
本発明のある実施態様に従い、ポリシストロニックなメッセージを構成する遺伝子を連結する配列によりコードされる切断部位を切断可能なプロテアーゼが本発明ポリヌクレオチドによりコードされる。とりわけ、プロテアーゼをコードする遺伝子は、ポリシストロニックなメッセージの少なくとも１つの一部である。
【０１９３】
適切なプロテアーゼは部位を切断し、自己切断ペプチドは当業者にとって公知である（例えばＲｙａｎら、１９９７；Ｓｃｙｍｃｚａｋら、２００４参照）。プロテアーゼ切断部位の好ましい例は、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えばタバコエッチウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２−コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、リノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球形ウイルス、ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｖｉｒｕｓ）３Ｃ−様プロテアーゼ、ＰＹ／ＩＦ（パースニップ黄色斑点ウイルス）３Ｃ−様プロテアーゼ、トロンビン、第Ｘａ因子及びエンテロキナーゼの切断部位である。切断厳密性が高いので、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ切断部位を使用し得る。
【０１９４】
典型的な自己切断ペプチド（「ｃｉｓ−作用性加水分解エレメント」とも呼ばれる。ＣＨＹＳＥＬ；ｄｅＦｅｌｉｐｅ（２００２）参照）は、ポティウイルス及びカルジオウイルス２Ａペプチド由来である。ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）、ウマ鼻炎Ａウイルス、ゾーシー・アシグナウイルス（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ）及びブタテッショウイルス由来の２Ａペプチドから、特定の自己切断ペプチドが選択され得る。
【０１９５】
ポリシストロニックなメッセージにおけるコード配列の効率的な翻訳のために、特異的開始シグナルも使用し得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン又は隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む外来性翻訳調節シグナルが提供される必要があり得る。当業者は、これを容易に決定して必要なシグナルを与えることが可能である。挿入全体の翻訳を確実にするために、開始コドンが、所望のコード配列の読み枠で「インフレーム」でなければならないことは周知である。外来性翻訳調節シグナル及び開始コドンは、天然又は合成の何れかであり得る。適切な転写エンハンサーエレメントを含むことによって発現効率を向上させ得る。
【０１９６】
本発明のある実施態様において、多重遺伝子又はポリシストロニックなメッセージを生成させるために配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントが使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部の部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２種類のメンバー（ポリオ及び脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）ならびに哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳ（Ｍａｃｅｊａｋ及びＳａｒｎｏｗ、１９９１）が記載されている。ＩＲＥＳエレメントは異種オープンリーディングフレームに連結され得る。複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写し、それぞれをＩＲＥＳにより分離し、ポリシストロニックなメッセージを生成させ得る。ＩＲＥＳエレメントにより、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。１個のメッセージを転写するために１個のプロモーター／エンハンサーを用いて、複数の遺伝子を効率的に発現させ得る（それぞれ参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５，９２５，５６５号及び同第５，９３５，８１９号参照）。
【０１９７】
ｉｉｉ．マルチクローニング部位
ベクターは、多重制限酵素部位を含有する核酸領域であるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含み得、ベクターを消化するためにこれらのうち何れかを標準的な組み換え技術と組み合わせて使用することができる（例えば、参照により本明細書中に組み込まれるＣａｒｂｏｎｅｌｌｉら、１９９９、Ｌｅｖｅｎｓｏｎら、１９９８及びＣｏｃｅａ、１９９７参照）。「制限酵素消化」とは、核酸分子の特異的位置でのみ機能する酵素による核酸分子の触媒的開裂を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は当業者により広く理解されている。外来性配列をベクターに連結できるようにするためにＭＣＳ内で切断する制限酵素を用いてベクターを直線化するか断片化することが多い。「ライゲーション」とは、互いに近接していてもよいし又は近接していなくてもよい２つの核酸断片の間でホスホジエステル結合を形成するプロセスを指す。制限酵素及びライゲーション反応を含む技術は組み換え技術の分野の熟練者にとって周知である。
【０１９８】
ｉｖ．スプライシング部位
転写された真核ＲＮＡ分子の殆どはＲＮＡスプライシングを受け、一次転写産物からイントロンが除去される。ゲノム真核配列を含有するベクターは、タンパク質発現に対する転写産物の的確なプロセシングを確実にするために、ドナー及び／又はアクセプタースプライシング部位を必要とし得る（例えば参照により本明細書中に組み込まれるＣｈａｎｄｌｅｒら、１９９７参照）。
【０１９９】
ｖ．終結シグナル
本発明のベクター又はコンストラクトは一般に少なくとも１つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」又は「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の特異的終結に関与するＤＮＡ配列からなる。従って、ある実施態様において、ＲＮＡ転写産物の生成を終了させる終結シグナルが企図される。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを達成するためにインビボで必要であり得る。
【０２００】
真核系において、ターミネーター領域は、ポリアデニル化部位を露出するように、新しい転写産物の部位特異的切断を可能にする特異的ＤＮＡ配列も含み得る。これは、特殊化した内在性ポリメラーゼにシグナルを送り、約２００Ａ残基（ポリＡ）のストレッチを転写産物の３’末端に付加する。このポリＡテールで修飾されたＲＮＡ分子は、より安定であると思われ、より効率的に翻訳される。従って、真核生物を含むその他の実施態様において、ターミネーターがＲＮＡの切断のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターシグナルがメッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。ターミネーター及び／又はポリアデニル化部位エレメントは、メッセージレベルを向上させ、カセットから他の配列への通読を最小限に抑えるために作用し得る。
【０２０１】
本発明での使用に対して企図されるターミネーターには、本明細書中に記載されているか又は当業者にとって公知の何らかの公知の転写ターミネーターが含まれ、例えば、遺伝子の終結配列、例えばウシ成長ホルモンターミネーターなど、又はウイルス性終結配列、例えばＳＶ４０ターミネーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施態様において、終結シグナルは、配列短縮化などによる、転写可能な又は翻訳可能な配列の欠如であり得る。
【０２０２】
ｖｉ．ポリアデニル化シグナル
発現、特に真核発現において、一般に転写産物の的確なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明を首尾よく実施するためにそれほど重要ではないと考えられるが、何らかのこのような配列が使用され得る。好ましい実施態様には、都合がよく、様々な標的細胞でよく機能することが知られている、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル又はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化は、転写産物の安定性を向上させ得るか又は細胞質輸送を促進し得る。
【０２０３】
ｖｉｉ．複製開始点
宿主細胞中でベクターを増殖させるために、ベクターは、複製が開始される特異的核酸配列である、１以上の複製開始部位（「ｏｒｉ」と呼ばれることが多い。）、例えば上述のようなＥＢＶのｏｒｉＰに対応する核酸配列又は分化プログラム化における機能が同等であるか又は向上している遺伝子改変ｏｒｉＰを含有し得る。あるいは、上述のような他の染色体外複製ウイルスの複製開始点又は自律複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
【０２０４】
ｖｉｉｉ．選択及びスクリーニング可能マーカー
本発明のある実施態様において、発現ベクター中にマーカーを含むことによって、本発明の核酸コンストラクトを含有する細胞をインビトロ又はインビボで同定し得る。このようなマーカーは同定可能な変化を細胞に与え、これにより発現ベクターを含有する細胞を容易に同定できるようになる。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を与えるものである。正の選択マーカーは、マーカーが存在する場合に選択するものとするマーカーであり、一方で負の選択マーカーは、マーカーが存在する場合は選択しないものとするマーカーである。正の選択マーカーの例は薬剤耐性マーカーである。
【０２０５】
通常、薬剤選択マーカーを含めることは、形質転換体のクローニング及び同定に役立ち、例えばネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン及びヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。条件の実行に基づき形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、比色分析に基づくＧＦＰなどのスクリーニング可能マーカーを含む他のタイプのマーカーも企図される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの負の選択マーカーとしてのスクリーニング可能酵素も使用され得る。ＦＡＣＳ分析と組み合わせる可能性がある、免疫学的マーカーの使用方法も当業者にとって公知である。遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現可能である限り、使用するマーカーは重要ではないと思われる。選択及びスクリーニング可能マーカーのさらなる例は当業者にとって周知である。本発明のある特性には、分化プログラム因子が細胞において分化状態の望ましい変化をもたらした後に、ベクター不含細胞を選択するために選択及びスクリーニング可能マーカーを使用することが含まれる。
【０２０６】
Ｃ．ベクター送達
本発明での体細胞への再プログラミングベクターの導入は、本明細書中で記載のように又は当業者にとって公知のように、細胞の形質転換のための核酸送達に対して何らかの適切な方法を使用し得る。このような方法としては、エクスビボ形質移入（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８９、Ｎａｂｅｌら、１９８９）による、マイクロインジェクション（参照により本明細書中に組み込まれる、Ｈａｒｌａｎｄ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号）を含むインジェクション（それぞれ参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許第５，９９４，６２４号、同第５，９８１，２７４号、同第５，９４５，１００号、同第５，７８０，４４８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，７０２，９３２号、同第５，６５６，６１０号、同第５，５８９，４６６号及び同第５，５８０，８５９号）による；エレクトロポレーション（参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５，３８４，２５３号；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）による；リン酸カルシウム沈殿法（Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３；Ｃｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）による；ＤＥＡＥ−デキストランと続いてポリエチレングリコールを使用すること（Ｇｏｐａｌ、１９８５）による；直接音波負荷（ｄｉｒｅｃｔ  ｓｏｎｉｃ  ｌｏａｄｉｎｇ）（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）による；リポソーム介在性形質移入（Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７；Ｗｏｎｇら、１９８０；Ｋａｎｅｄａら、１９８９；Ｋａｔｏら、１９９１）及び受容体介在性形質移入（Ｗｕ及びＷｕ、１９８７；Ｗｕ及びＷｕ、１９８８）による；微粒子銃（ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０９６９９号及び同第９５／０６１２８号；米国特許第５，６１０，０４２号、同第５，３２２，７８３号、同第５，５６３，０５５号、同第５，５５０，３１８号、同第５，５３８，８７７号及び同第５，５３８，８８０号及びそれぞれ参照により本明細書中に組み込まれる。）による；炭化ケイ素繊維との撹拌（それぞれ参照により本明細書中に組み込まれる、Ｋａｅｐｐｌｅｒら、１９９０；米国特許第５，３０２，５２３号及び同第５，４６４，７６５号）による；アグロバクテリウム介在性形質転換（それぞれ参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許第５，５９１，６１６号及び同第５，５６３，０５５号）による；プロトプラストのＰＥＧ介在性形質転換（それぞれ参照により本明細書中に組み込まれる、Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら、１９９３；米国特許第４，６８４，６１１号及び同第４，９５２，５００号）による；乾燥／抑制介在性ＤＮＡ取り込み法（ｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ／ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｕｐｔａｋｅ）（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５）及びこのような方法の何れかの組み合わせなどによる、ＤＮＡの直接送達が挙げられるが、これらに限定されない。これらなどの技術の適用を通じて、細胞小器官、細胞、組織又は生物を安定的に又は一過性に形質転換し得る。
【０２０７】
ｉ．リポソーム介在性形質移入
本発明のある実施態様において、例えばリポソームなどの脂質複合体中に核酸を封入し得る。リポソームは、リン脂質二重膜及び内部の水媒体を特徴とする小胞構造物である。多重膜リポソームは、水媒体により分離される複数の脂質層を有する。これらは、過剰な水溶液中でリン脂質を懸濁した際に自然に形成される。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再編成が起こり、脂質二重層の間に水及び溶解した溶質を捕捉する（Ｇｈｏｓｈ及びＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）又はＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化した核酸も企図される。リポソームの使用量は、リポソームの性質ならびに使用する細胞により変動し得、例えば細胞１，０００，０００個から１０，０００，０００個あたり約５から約２０μｇのベクターＤＮＡが企図され得る。
【０２０８】
インビトロでの外来ＤＮＡのリポソーム介在性核酸送達及び発現は非常に首尾よく行われてきた（Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７）。培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ及び肝細胞腫細胞における外来ＤＮＡのリポソーム介在性送達及び発現の実行可能性も明らかになっている（Ｗｏｎｇら、１９８０）。
【０２０９】
本発明のある実施態様において、リポソームを血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ）と複合体化させ得る。これは、細胞膜との融合を促進し、リポソーム封入ＤＮＡの細胞への侵入を容易にすることが示されている（Ｋａｎｅｄａら、１９８９）。他の実施態様において、リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体化させるか又はこれと一緒に使用することができる（Ｋａｔｏら、１９９１）。またさらなる実施態様において、リポソームは、ＨＶＪ及びＨＭＧ−１の両方と複合体化させるか又はこれと一緒に使用することができる。他の実施態様において、送達ビヒクルは、リガンド及びリポソームを含み得る。
【０２１０】
ｉｉ．エレクトロポレーション
本発明のある実施態様において、エレクトロポレーションを介して細胞に核酸を導入する。エレクトロポレーションは、細胞及びＤＮＡ懸濁液の高電圧放電への曝露を含む。受容側の細胞は、機械的損傷によってより形質転換し易くなり得る。またベクターの使用量は、使用する細胞の性質により変動し得、例えば細胞１，０００，０００個から１０，０００，０００個あたり約５から約２０μｇのベクターが企図され得る。
【０２１１】
エレクトロポレーションを用いた真核細胞の形質移入は非常に首尾よく行われてきた。この方式で、マウスプレＢリンパ球にヒトκ−免疫グロブリン遺伝子が形質移入され（Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）、ラット肝細胞にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が形質移入された（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６）。
【０２１２】
ｉｉｉ．リン酸カルシウム
本発明の他の実施態様において、リン酸カルシウム沈殿法を用いて細胞に核酸を導入する。この技術を用いてヒトＫＢ細胞にアデノウイルス５ＤＮＡが形質移入された（Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３）。またこの方式で、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３及びＨｅＬａ細胞にネオマイシンマーカー遺伝子が形質移入され（Ｃｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａ、１９８７）、ラット肝細胞に様々なマーカー遺伝子が形質移入された（Ｒｉｐｐｅら、１９９０）。
【０２１３】
ｉｖ．ＤＥＡＥ−デキストラン
別の実施態様において、ＤＥＡＥ−デキストランと、次いでポリエチレングリコールを用いて細胞に核酸を送達する。この方式において、レポータープラスミドがマウス骨髄腫及び赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ、１９８５）。
【０２１４】
ＶＩＩ．再プログラミング因子
ｉＰＳ細胞の作製は、誘導のために使用される再プログラミング因子にとって非常に重要である。本発明で開示される方法において、次の因子又はそれらの組み合わせが使用され得る。ある態様において、再プログラミングベクターにＳｏｘ及びＯｃｔ（特にＯｃｔ３／４）をコードする核酸が含まれる。例えば、１以上の再プログラミングベクターが、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ及び場合によってはＬｉｎ２８をコードする発現カセット又はＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４及び場合によってはＣ−ｍｙｃもしくはＬ−ｍｙｃをコードする発現カセット又はＳｏｘ２、Ｏｃｔ４及び場合によってはＥｓｒｒｂをコードする発現カセット又はＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４と、Ｃ−ｍｙｃ又はＬ−ｍｙｃの何れか及び場合によってはＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする発現カセットを含み得る。同じ発現カセット、異なる発現カセット、同じ再プログラミングベクター又は異なる再プログラミングベクター中に、これらの再プログラミング因子をコードする核酸が含まれ得る。
【０２１５】
Ｏｃｔ４及びＳｏｘ遺伝子ファミリーのある種のメンバー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３及びＳｏｘ１５）は、不在であると誘導が不可能になる誘導プロセスに関与する非常に重要な転写制御因子として同定されている。しかし、Ｋｌｆファミリー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４及びＫｌｆ５）のある種のメンバー、Ｍｙｃファミリー（Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ及びＮ−ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８を含むさらなる遺伝子が誘導効率を向上させることが確認されている。
【０２１６】
Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）は８量体（「Ｏｃｔ」）転写因子ファミリーの１つであり、多能性を維持することにおいて極めて重要な役割を果たす。卵割球及び胚性幹細胞など、Ｏｃｔ４＋細胞にＯｃｔ４がないと自然発生的なトロホブラスト分化が起こり、従ってＯｃｔ４が存在すると胚性幹細胞の多能性及び分化能が生じる。Ｏｃｔ４の類縁、Ｏｃｔ１及びＯｃｔ６を含む「Ｏｃｔ」ファミリーの様々な他の遺伝子は誘導を引き起こすことができず、従って誘導プロセスに対するＯｃｔ−４の排他性が明らかになる。
【０２１７】
Ｓｏｘファミリー遺伝子はＯｃｔ４と同様に多能性維持に関与するが、多能性幹細胞で排他的に発現されるＯｃｔ４とは異なり、多能性及び単能性幹細胞に関与する。Ｓｏｘ２は再プログラミング誘導のために使用された最初の遺伝子であり、一方で、Ｓｏｘファミリーにおける他の遺伝子が誘導プロセスで同様に作用することが分かっている。Ｓｏｘ１は、Ｓｏｘ２と同様の効率でｉＰＳ細胞を生じさせ、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５及びＳｏｘ１８遺伝子も効率は低いがｉＰＳ細胞を生じさせる。
【０２１８】
胚性幹細胞において、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２とともにＮａｎｏｇは、多能性を推進するために必要である。従って、Ｔｈｏｍｓｏｎらが因子の１つとしてＮａｎｏｇを用いてｉＰＳ細胞を作製することができることを報告したにもかかわらず、Ｙａｍａｎａｋａらが、Ｎａｎｏｇが誘導に不必要であることを報告した際は驚きが起こった。
【０２１９】
Ｌｉｎ２８は、分化及び増殖と関連する、胚性幹細胞及び胚性癌腫細胞で発現されるｍＲＮＡ結合タンパク質である。Ｔｈｏｍｓｏｎらは、これがｉＰＳ作製における因子であるが、不必要であることを明らかにした。
【０２２０】
Ｋｌｆファミリー遺伝子のＫｌｆ４は最初にＹａｍａｎａｋａらによって同定され、マウスｉＰＳ細胞作製のための因子としてＪａｅｎｉｓｃｈらによって確認され、ヒトｉＰＳ細胞作製のための因子であることがＹａｍａｎａｋａらによって明らかにされた。しかし、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらは、Ｋｌｆ４がヒトｉＰＳ細胞作製に不要であり、実際にヒトｉＰＳ細胞を生成させることができなかったことを報告した。Ｋｌｆ２及びＫｌｆ４は、ｉＰＳ細胞を生成させることが可能な因子であり、効率は低いが関連遺伝子Ｋｌｆｌ及びＫｌｆ５も同様であることが分かった。
【０２２１】
遺伝子のＭｙｃファミリーは、癌に関与する癌原遺伝子である。Ｙａｍａｎａｋａら及びＪａｅｎｉｓｃｈらは、Ｃ−ｍｙｃが、マウスｉＰＳ細胞作製に関与する因子であることを明らかにし、Ｙａｍａｎａｋａらは、それが、ヒトｉＰＳ細胞作製に関与する因子であることを明らかにした。しかし、Ｔｈｏｍｓｏｎら及びＹａｍａｎａｋａらは、Ｃ−ｍｙｃがヒトｉＰＳ細胞作製に不必要であることを報告した。ｉＰＳ細胞誘導における「Ｍｙｃ」ファミリー遺伝子の使用は、Ｃ−ｍｙｃで誘導したｉＰＳ細胞を移植したマウスの２５％で致死性の奇形腫が発生したというように、臨床治療時にｉＰＳ細胞が引き起こす不測の事態について問題を抱えている。Ｎ−ｍｙｃ及びＬ−ｍｙｃは、同様の効率でＣ−ｍｙｃの代わりに誘導することが確認されている。
【０２２２】
Ｃ−ｍｙｃが発現される際に起こり得る細胞毒性を低下させるか又は防ぐために、ＳＶ４０ラージ抗原を使用し得る。
【０２２３】
本発明で使用される再プログラミングタンパク質は、ほぼ同じ再プログラミング機能を有するタンパク質ホモローグにより置き換えることができる。それらのホモローグをコードする核酸も再プログラミングのために使用し得る。保存的アミノ酸置換が好ましく、即ち、例えば極性酸性アミノ酸としてのアスパラギン酸−グルタミン酸；極性塩基性アミノ酸としてのリジン／アルギニン／ヒスチジン；非極性又は疎水性アミノ酸としてのロイシン／イソロイシン／メチオニン／バリン／アラニン／グリシン／プロリン；極性又は非電荷親水性アミノ酸としてのセリン／スレオニン置換である。保存的アミノ酸置換はまた、側鎖に基づく分類も含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群はセリン及びスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群はアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群はフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群はリジン、アルギニン及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群はシステイン及びメチオニンである。例えば、イソロイシン又はバリンでのロイシンの置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置換、セリンでのスレオニンの置換又は構造的に関連のあるアミノ酸でのアミノ酸の同様な置換が、結果として得られるポリペプチドの特性に大きな影響を与えないと予想することは理に適っている。アミノ酸の変化の結果、機能的ポリペプチドを得られるか否かは、ポリペプチドの特異的活性をアッセイすることによって容易に決定できる。
【０２２４】
ＶＩＩＩ．ｉＰＳ細胞の選択及び分化
本発明のある態様において、再プログラミング因子を造血前駆細胞に導入した後、上述のように細胞を培養する（場合によっては、形質移入細胞を濃縮するために、正の選択又はスクリーニング可能マーカーのようなベクターエレメントの存在に対して選択）。再プログラミングベクターは、これらの細胞において再プログラミング因子を発現させ、細胞分裂とともに複製し、分割し得る。あるいは、再プログラミングタンパク質を含有する培地を補充することにより、再プログラミングタンパク質がこれらの細胞及びそれらの子孫に入る。これらの再プログラミング因子は、自律的多能性状態を確立するために体細胞ゲノムを再プログラム化し、ベクターの存在に対する正の選択の解除後、外来性遺伝因子は、追加の再プログラミングタンパク質を添加する必要なく、時間とともに徐々に失われる。
【０２２５】
これらの人工多能性幹細胞は、多能性胚性幹細胞と実質的に同一であると予想されるので、胚性幹細胞の特徴に基づいてこれらの末梢血細胞由来の子孫から選択され得る。再プログラミングベクターＤＮＡが存在しないことを調べることによって又はレポーターなどの選択マーカーを使用することによって、基本的に外来性遺伝因子不含のｉＰＳ細胞の選択を加速するか又は促進するために、さらなる負の選択段階も使用し得る。
【０２２６】
Ａ．胚性幹細胞の特徴に対する選択
先行研究で作製に成功したｉＰＳＣは、次の点において天然に単離された多能性幹細胞（マウス及びヒト胚性幹細胞、それぞれｍＥＳＣ及びｈＥＳＣなど）と際立って類似しており、従って、天然に単離された多能性幹細胞に対するｉＰＳＣの同一性、確実性及び多能性が確認された。従って、本発明で開示される方法から作製される人工多能性幹細胞は、次の胚性幹細胞の特徴の１以上に基づき選択され得る。
【０２２７】
ｉ．細胞生物学的特性
形態：ｉＰＳＣは、形態学的にＥＳＣと同様である。各細胞は、円形であり、核小体が２個あるか又は核小体が大きく、細胞質が僅かであり得る。ｉＰＳＣのコロニーもまたＥＳＣのコロニーと同様であり得る。ヒトｉＰＳＣは、ｈＥＳＣと同様に、縁部が鋭角で、平らで密なコロニーを形成し、マウスｉＰＳＣは、ｍＥＳＣと同様のコロニーを形成し、ｈＥＳＣのコロニーよりも隆起し、凝集したコロニーを形成する。
【０２２８】
増殖特性：幹細胞はその定義の一部として自己複製しなければならないので、倍加時間及び有糸分裂活性はＥＳＣで肝要なものである。ｉＰＳＣは有糸分裂的に活性であり、活発に自己複製し、増殖し、ＥＳＣと同等の速度で分裂し得る。
【０２２９】
幹細胞マーカー：ｉＰＳＣは、ＥＳＣ上で発現される細胞表面抗原性マーカーを発現し得る。ヒトｉＰＳＣは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ及びＮａｎｏｇを含むが、これらに限定されない、ｈＥＳＣに特異的なマーカーを発現した。マウスｉＰＳＣはｍＥＳＣと同様に、ＳＳＥＡ−１を発現したが、ＳＳＥＡ−３もＳＳＥＡ−４も発現しなかった。
【０２３０】
幹細胞遺伝子：ｉＰＳＣは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４及びｈＴＥＲＴをはじめとする、未分化ＥＳＣで発現される遺伝子を発現し得る。
【０２３１】
テロメラーゼ活性：テロメラーゼは、〜５０回の細胞分裂というヘイフリックの限界により制限されずに細胞分裂を持続するために必要である。ｈＥＳＣは自己複製及び増殖を持続させるために高テロメラーゼ活性を発現し、ｉＰＳＣも高テロメラーゼ活性を示し、テロメラーゼタンパク質複合体における必要な要素であるｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）を発現する。
【０２３２】
多能性：ｉＰＳＣは、ＥＳＣと同様の方式で完全に分化した組織に分化可能である。
【０２３３】
神経への分化：ｉＰＳＣをニューロンに分化させ、βＩＩＩ−チューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＣｈＡＴ、ＬＭＸ１Ｂ及びＭＡＰ２を発現させ得る。カテコールアミン関連酵素が存在することから、ｈＥＳＣのように、ｉＰＳＣがドーパミン作動性ニューロンに分化可能であり得ることが示され得る。幹細胞関連遺伝子は分化後に下方制御される。
【０２３４】
心臓への分化：自然に心拍を開始する心筋細胞にｉＰＳＣを分化させ得る。心筋細胞は、ｃＴｎＴ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＬ２Ａ、ＭＹＨＣβ及びＮＫＸ２．５を発現する。幹細胞関連遺伝子は分化後に下方制御される。
【０２３５】
奇形腫形成：免疫不全マウスに注入されたｉＰＳＣは、９週間など、ある一定の時間後、奇形腫を自然に形成し得る。奇形腫は、３胚葉、内胚葉、中胚葉及び外胚葉由来の組織を含有する多系統の腫瘍であり、これは、一般的に１種類の細胞型のみである他の腫瘍とは異なる。奇形腫形成は多能性に対する指標となる基準である。
【０２３６】
胚様体：培養中のｈＥＳＣは、有糸分裂的に活性があり、ｈＥＳＣを分化させるコアと、全三胚葉から完全に分化した細胞の辺縁部とからなる「胚様体」と呼ばれる球状胚様構造を自然に形成する。ｉＰＳＣも胚様体を形成し得、辺縁部には分化した細胞がある。
【０２３７】
胚盤胞注入：ｈＥＳＣは、天然には胚盤胞の内部細胞塊（胚結節）内及び胚結節中に存在し、胚に分化し、一方で胚盤胞の殻（トロホブラスト）は胚外組織に分化する。中空状のトロホブラストは、生きている胚を形成できず、従って、胚結節内の胚性幹細胞が分化し、胚を形成する必要がある。受容側の雌に移す胚盤胞を生成させるためにマイクロピペットによりトロホブラストにｉＰＳＣを注入することにより、その結果、生きているキメラ仔マウスを得ることができるが、マウスは、それらの全身にわたり１０％−９０でｉＰＳＣ誘導体が組み込まれ、キメラ化している。
【０２３８】
ｉｉ．エピジェネティックな再プログラム化
プロモーター脱メチル化：メチル化は、ＤＮＡ塩基へのメチル基の移行、一般にはＣｐＧ部位（隣接するシトシン／グアニン配列）におけるシトシン分子へのメチル基の移行である。遺伝子の幅広いメチル化は、発現タンパク質の活性を妨げるか又は発現を妨害する酵素を動員することによって、発現を妨害する。従って、遺伝子のメチル化は、転写を妨げることによって効果的に発現を抑制する。Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１及びＮａｎｏｇを含む多能性関連遺伝子のプロモーターはｉＰＳＣにおいて脱メチル化され得、それによりｉＰＳＣにおいてそれらのプロモーター活性及び多能性関連遺伝子の積極的な促進及び発現を示す。
【０２３９】
ヒストン脱メチル化：ヒストンは、様々なクロマチン関連修飾を通じてそれらの活性を発揮させ得るＤＮＡ配列に構造的に局在する小型のタンパク質である。Ｏｃｔ／４、Ｓｏｘ２及びＮａｎｏｇと会合するＨ３ヒストンは、脱メチル化されてＯｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＮａｎｏｇの発現を活性化し得る。
【０２４０】
Ｂ．非残留特性に対する選択
本発明におけるｏｒｉＰに基づくベクターなどの再プログラミングベクターは、染色体外で複製し得、何世代か後に宿主細胞から失われる。しかし、基本的に外来性ベクターエレメント不含である子孫細胞に対するさらなる選択段階により、このプロセスが容易になり得る。例えば、当技術分野で公知のように外来性ベクターエレメントの有無を調べるために、子孫細胞試料を抽出し得る（Ｌｅｉｇｈｔ及びＳｕｇｄｅｎ、２００１）。
【０２４１】
再プログラミングベクターは、選択マーカー、より具体的には、チミジンキナーゼをコードする遺伝子などの、このような選択マーカーを基本的に含まない子孫細胞について選択するための負の選択マーカーをさらに含み得る。ヒト単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ１型遺伝子（ＨＳＶｔｋ）は、哺乳動物細胞において条件致死マーカーとして働き得る。ＨＳＶｔｋによりコードされる酵素はある種のヌクレオシド類似体（例えばガンシクロビル、抗ヘルペス剤）をリン酸化することができ、従ってそれらを毒性のあるＤＮＡ複製阻害剤に変換する。代替的又は補足的なアプローチは、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ（蛍光インシトゥハイブリッド形成）、遺伝子アレイ又はハイブリッド形成（例えばサザンブロット）などの従来の方法を用いて、子孫細胞において外来性遺伝因子がないことを調べることである。
【０２４２】
Ｃ．ｉＰＳ細胞の分化
造血細胞、筋細胞（例えば心筋細胞）、ニューロン、繊維芽細胞及び表皮細胞及びそれら由来の組織又は器官を含むがこれらに限定されない細胞系統にｉＰＳ細胞を分化させるために、本発明とともに様々なアプローチを使用し得る。ｉＰＳ細胞の造血系分化の典型的な方法には、例えば、両者ともそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる米国出願第６１／０８８，０５４号及び同第６１／１５６，３０４号により開示される方法又は胚様体（ＥＢ）に基づく方法（Ｃｈａｄｗｉｃｋら、２００３；Ｎｇら、２００５）が含まれ得る。Ｗａｎｇら、２００７で例示されるように、血液系統分化のためにフィブロネクチン分化方法も使用し得る。ｉＰＳ細胞の心臓分化の典型的な方法には、胚様体（ＥＢ）法（Ｚｈａｎｇら、２００９）、ＯＰ９間質細胞法（Ｎａｒａｚａｋｉら、２００８）又は増殖因子／化学的手法（全てそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許公開第２００８００３８８２０号、同第２００８０２２６５５８号、同第２００８０２５４００３号及び同第２００９００４７７３９号参照）が含まれ得る。
【実施例】
【０２４３】
ＩＸ．実施例
次の実施例は、本発明の好ましい実施態様を明らかにするために含まれる。当業者にとって当然のことながら、続く実施例で開示される技術は、発明者らにより本発明の実施の際に良好に作用することが分かった技術を表し、従って、その実施に対して好ましい方式を構成すると考えられ得る。しかし、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示される具体的な実施態様において多くの変更をなし得、それでも同様の結果を得ることができることを認識されたい。
【０２４４】
実施例１
造血前駆細胞からのｉＰＳ細胞の作製
図１で示されるように、患者からの正常な非動員化末梢血を処理してＰＢＭＣを回収し、ＣＤ３４を発現する細胞について濃縮するために精製した。次に、これらの細胞を増殖させるために播種し、播種からおよそ１週間以内に形質移入した。次いでこれらを形質移入後１日、インキュベート期間をおき、次いでおよそ１から２日の回復期をおいて、１００％再プログラミング培地に移した。細胞が接着し、散開したコロニーが明らかになった時点で、ｉＰＳ細胞の形成を支援するために培地をＴＥＳＲ２に徐々に移した。
【０２４５】
ヒト全血をバキュテナー中で回収した（ここで含まれるべき体積の範囲は１から５０ｍＬ）。
【０２４６】
ヒト全血からＰＢＭＣを分離し、凍結するか又はＣＤ３４細胞を単離するためにすぐに処理した。
【０２４７】
末梢血から処理したＰＢＭＣに、ＣＤ３４に対する抗体を添加し、手作業で又は機械的に分離した。
【０２４８】
ＣＤ３４及び、造血前駆細胞全てを検出するためのより一般的なマーカーであるＣＤ４５を発現する細胞の％を検出するためにフローサイトメトリーにより純度を測定した（Ａｃｃｕｒｉ；Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ  ＵＳＡ）。分離した分画の純度は、ＣＤ３４発現陽性２０から９６％の範囲であった。
【０２４９】
ＣＤ３４発現について濃縮された細胞を凍結するか又はＤＮＡｓｅＩ（２０Ｕ／ｍＬ）とともに３７℃で１０分間すぐにインキュベートした。この段階によって、解凍、精製などにより高まるストレスから細胞溶解した際に放出されるＤＮＡが確実に除去され、細胞凝集が制限される。細胞を遠心し、ＤＮＡｓｅを含有する上清を除去した。次に細胞を一晩回復させた。
【０２５０】
ＣＤ３４発現細胞は、サイトカイン富化培地を用いて増殖可能である。この実施例において、少なくとも３回の独立ケースにおいて、総細胞数を増殖させるためにはサイトカイン富化培地のみで十分であることが分かった。
【０２５１】
サイトカイン富化培地：各３００ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３及び幹細胞因子（ＳＣＦ）。１００ｎｇ／ｍＬのインターロイキン６（ＩＬ６）及び１０ｎｇ／ｍＬインターロイキン３（ＩＬ３）。基本培地は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、組み換えヒトインスリン、鉄飽和ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ及びさらなるサプリメント（図２Ａ−２Ｃでマトリクス不含とされる。）。好ましい実施態様において、ＢＳＡを完全に省略し得る。さらにこの培地中で完全に既知組成の成分が使用される。あるいは、上記で詳述した濃度の動物由来物質不含ＴＰＯ、Ｆｌｔ３、ＳＣＦ、ＩＬ６及びＩＬ３を補給したＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｈ３０００（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号９８５０）を使用することができる。
【０２５２】
ＣＤ３４発現細胞は、フィブロネクチン断片と組み合わせたサイトカイン富化培地を用いて増殖可能である。この実施例において、フィブロネクチンの組み換えヒト断片存在下でＣＤ３４＋細胞をさらに増殖させることができることが観察された。この断片は５７４アミノ酸（６３ｋＤａ）であり、中央の細胞結合ドメイン（タイプＩＩＩリピート、８、９、１０）、高親和性ヘパリン−結合ドメインＩＩ（タイプＩＩＩリピート１２、１３、１４）及び、ヒトフィブロネクチンのオルタナティブスプライシングを受けるＩＩＩＣＳ領域内のＣＳ１部位を含有する（レトロネクチン（登録商標）、Ｔａｋａｒａより入手可能）。このフィブロネクチン断片を５μｇ／ｍＬでＰＢＳと混合し、非処理組織培養プレート上に沈着させた（図２Ａ−２ＣでＮｏｔｃｈ−とされる。）。
【０２５３】
ＣＤ３４発現細胞は、フィブロネクチン断片及び固定化改変Ｎｏｔｃｈ−１リガンド（Ｄｅｌｔａ１ｅｘｔ−ＩｇＧ、ＤＬＬ１）と組み合わせたサイトカイン富化培地を用いて増殖可能である。Ｄｅｌａｎｅｙらは、Ｎｏｔｃｈ−１リガンドを用いて、臍帯血から１００倍を超えてＣＤ３４＋細胞を増殖させたことを明らかにしている（Ｄｅｌａｎｅｙら、２０１０）。この実施例において、同様のアプローチを用いてＮｏｔｃｈ−１リガンド存在下で末梢血由来のＣＤ３４＋細胞を増殖させることもできることが分かった（図２Ａ−２ＣでＮｏｔｃｈ＋とされる。）。このリガンドは、免疫グロブリンＧのＦｃ部分にＣ−末端で融合している、組み換えデルタ様タンパク質１（ＤＬＬ１；ａａ１−５４５）の細胞外ドメインに相当するヒトペプチドである。
【０２５４】
マトリクス又はＮｏｔｃｈ−１リガンド非存在下でのＣＤ３４＋細胞の増殖。基本的に、ウェルあたり６ｘｌ０３個（２４ウェルプレート）又はウェルあたり１ｘ１０５個（６ウェルプレート）になるように細胞を播種し、４日後に補給を行い、増殖から６日後に形質移入を行った。図２Ａ−２Ｃは、時間経過に伴う倍単位の増殖、集団全体の増殖速度及びその時間枠中のＣＤ３４発現の自然減少を示す。
【０２５５】
増殖後第６日に、マトリクス不含状態から細胞を回収し、ｏｒｉＰ−レプリコンを含有するプラスミドの組み合わせを用いて形質移入する。これらのプラスミドから発現される再プログラミング因子には、次のものの何らかの組み合わせが含まれ得る：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｃ−ｍｙｃ又はＬ−ｍｙｃ、ｋｌｆ４及びＳＶ４０ラージＴ抗原（図３）。単一キュベット形質移入用のＬｏｎｚａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置又は９６ウェルシャトル型を使用して、２．５ｘｌ０４から１．５ｘｌ０６個の細胞に対して形質移入を行った。下記の表１は、ＣＤ３４＋細胞を含む血液由来造血前駆細胞における、ｅＧＦＰをコードするＯｒｉＰに基づくプラスミドを用いた形質移入後の代表的な結果を示す。この表は、末梢血から増殖させた投入ＨＰ数を漸増させて行ったサンプル形質移入から得られた結果を反映する。再プログラミング因子に対する発現カセットを欠く対照プラスミドを用いて、細胞に対して形質移入を行った。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に対して陽性に染色されない集団の％を計算することによって形質移入効率（％ＧＦＰ＋）を調べた。
【表１】
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【０２５６】
増殖に使用したものと同じサイトカイン富化培地中で次の形質移入細胞を再懸濁し、回復のために一晩インキュベートした。翌日、細胞を遠心して沈降させ、培地をサイトカイン富化培地で更新し、レシピエントプレートを準備した。
【０２５７】
レシピエント再プログラミングプレート調製。形質移入から２４時間後、非処理６ウェルプレートをレトロネクチン（登録商標）（１０μｇ／ウェル）で被覆した。
【０２５８】
形質移入から４８時間後、ＰＢＳでプレートを洗浄し、２％ＢＳＡでブロッキング処理し、再び洗浄した。場合によっては、動物由来物質不含培養条件のために、２％ＢＳＡブロッキング段階を省略し得る。ウェルあたり３ｘ１０４から３ｘ１０５個の細胞の範囲の密度で調製受容プレート上に２ｍＬの細胞が播種されるように、再プログラミング培地（表２）で形質移入細胞の体積を合わせた。
【表２】
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【０２５９】
再プログラミング培養物への補給。細胞に１日おきに補給する。最初の補給では、２ｍＬの培地を各ウェルに添加し、培地は除去しない。続く補給では、各ウェルから２ｍＬを穏やかに除去し、新鮮培地で置き換える。播種から２４時間後に細胞が接着し始め、１週間までに、散開するコロニーが形成され始める。およそ７から１０日で低分子物不含のＴＥＳＲ２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に培養物を移す。前の培地が２ｍＬ残存するので、これは緩やかな移行である。十分な若いコロニーが形成されたら、存在する培地の殆どが新鮮なものになるように、ウェルからより多くの培地を除去し得る。再プログラム化されていない分化細胞に取り囲まれた円形のｉＰＳＣコロニーが形質移入からおよそ２０日後に現れた。ｉＰＳＣコロニーを囲む細胞は、マトリクスに接着している血液細胞又は、分化し始めた部分的に再プログラム化された細胞に相当する。低分子シグナル伝達阻害剤を使用した場合、実際のｉＰＳＣコロニー（Ｔｒａ１−８１陽性）は、より散開した非ｉＰＳＣ領域内か又はより分化した細胞の下で入れ子状になることが多かった。
【０２６０】
実施例２
ポリシストロニックな再プログラミングベクターを用いた造血前駆細胞からのｉＰＳ細胞作製の最適化
ポリシストロニックなメッセージを含有するＯｒｉＰに基づく再プログラミングプラスミドの概略マップを図４で示す（セット１及びセット２の組み合わせ）。ＰＢＭＣからの精製細胞を３日間又は６日間増殖させた。一連の投入細胞数に対して、ＧＦＰを発現する対照、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡｌベースのプラスミドを用いて形質移入を行った。３日間及び６日間増殖させたドナーＧＧ由来のＰＢＭＣに対して、上述のような再プログラミングプラスミドを用いて形質移入を行った。
【０２６１】
フローサイトメトリーにより検出されるＧＦＰ発現生存細胞の％を計算することによって、白血球分離により回収したＰＢＭＣ由来のＣＤ３４に富むより少数の細胞の形質移入効率を評価した。形質移入翌日のトリパンブルー陰性細胞を投入細胞の総数で除した比を確認することによって生存能も調べたところ、投入細胞１ｘ１０４から１ｘ１０５個の範囲内で３０％であった（データを示さず。）。形質移入効率は、投入細胞数が１ｘ１０４から３ｘ１０４個の範囲である場合におよそ３０％であり、細胞が６ｘ１０４から１ｘ１０５個の範囲である場合、概ね４０％であった（図５Ａ）。ＰＢＭＣ由来の精製細胞を３日間又は６日間増殖させ、６ｘｌ０４から１ｘｌ０５個の細胞に対して対照ＧＦＰ−発現プラスミドを用いて形質移入を行った。ＣＤ３４の発現がより高い場合、６日ではなく３日間増殖させた細胞に対して形質移入を行ったとき、形質移入効率が２倍に高くなった（図５Ｂ）。さらに、９０％を上回る第３日形質移入細胞がＧＦＰ及びＣＤ３４を同時発現し、一方で両マーカーを同時発現したのは第６日形質移入集団の僅か１８％であった（図５Ｃ）。しかし、６日間の増殖によって、形質移入のための細胞数全体は増加した。これらの結果から、このプロトコールに対して選択される条件が、本集団中の他の細胞型よりも、ＣＤ３４発現細胞の形質移入に有利に働くという考え方が支持される。
【０２６２】
ヒトフィブロネクチン（レトロネクチン）又はビトロネクチンの活性ドメインを含有する組み換えタンパク質断片は、試験した他のものよりも一貫して良好にｉＰＳＣ形成を支えた。ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ培地、Ｎ２、Ｂ２７ならびにＰＤ０３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、Ａ−８３−０１及びＨＡ−１００を含んだ低分子物カクテルと組み合わせて使用した場合、レトロネクチン被覆プレート上でのコロニー形成効率が顕著に向上した（図５Ｄ）。アルカリホスファターゼ活性に対して陽性に染色されるコロニーを含有する６ウェルプレートから、１つのウェルを示す（図５Ｄ、パネルｉ）。白矢印は、パネルｉｉで拡大したコロニーを指し、これはまたパネルｉｉｉでＴｒａ１−８１発現について陽性に染色されている。
【０２６３】
投入細胞数を最適化するために、６日間にわたり増殖させた投入細胞数の範囲でプラスミドセット２を用いて再プログラミング試験を行った（ドナーＧＧ）（図５Ｅ）。
【０２６４】
再プログラミング効率がより高い可能性があるＣ−ｍｙｃの代わりにＬ−ｍｙｃを使用し得る。図５Ｆで示されるように、４名の異なるドナーから精製したＣＤ３４発現細胞を６日間増殖させ、比較としてＣ−ｍｙｃ（セット１）又はＬ−ｍｙｃ（セット２）を発現するプラスミドの組み合わせを用いて形質移入を行い、それぞれから得られたｉＰＳＣの総数を比較した。
【０２６５】
Ｂ−２７サプリメント中に動物由来成分を必要とせずにゼノフリー培養を達成するために、図６のとおり、再プログラミング培地中でＢ−２７サプリメントを完全に省略し得ることが分かった。
【０２６６】
ＣＤ３４発現量は、再プログラミング効率と相関することが示された（図７Ａ−７Ｂ）。ＰＢＭＣ由来のＣＤ３４発現細胞を単離する場合は本プロセスにおいてさらなる段階が生じるので、本明細書中で詳述する方法を用いて、実際にＣＤ３４発現と再プログラミング効率との間に相関があるか否かを判定することは重要であった。次のセットの実験によりこの相関が確認された。第一に、宿主細胞集団は、ＣＤ３、ＣＤ１９及びＣＤ５６を標的とする抗体を用いたフローサイトメトリーによって増殖の第３日及び第６日に検出可能なレベルのＴ、Ｂ及びＮＫ細胞がないとみなされた（ｎ＝９、データを示さず。）。第二に、４５％ＣＤ３、１０％ＣＤ１９、２０％ＣＤ５６から構成されるＣＤ３４−枯渇細胞集団は、本明細書中のフィーダーフリープロトコールを用いてｉＰＳＣを生成させることができなかったが（図７Ａ、ｉｉ）、同時にＣＤ３４発現について精製したものはｉＰＳＣを生成させる（ｎ＝３、図７Ａ、ｉ）。第三に、さらなるドナーからＣＤ３４発現細胞を精製し、ＣＤ３４発現及び再プログラム化のレベル低下と同期する様々な増殖日数で形質移入を行った。全４名のドナーに対して、ＣＤ３４発現％が低下するにつれて、再プログラミング効率が低下した（図７Ｂ）。例えば、ドナー３０９６は、ＣＤ３４発現レベルが３分の１を超えて低下したとき、さらに１０日間増殖させた場合は１ｘ１０５個あたり１個のｉＰＳＣであったのに対して、増殖３日後に形質移入した場合は１ｘ１０５個の投入細胞あたり９０個を上回るｉＰＳＣを示した。この結果は、ＣＤ３４の割合が高い場合、６日間の増殖と比べて３日間の増殖で形質移入効率がより高いことを示す本明細書中の先行する観察を裏付ける。要するに、これらのデータは、造血細胞の集団内のＣＤ３４発現量が、本明細書中で詳述するフィーダーフリー法を用いて再プログラミングするそれらの能力と相関するという概念を裏付ける。
【０２６７】
標準的条件又は完全既知組成条件の何れかの下で培養したＣＤ３４発現細胞の倍単位の増殖を図８Ａで詳述する。完全既知組成の再プログラミング法を用いたｉＰＳＣ生成能によって、変動がさらに小さくなり、臨床グレードのｉＰＳＣの生成が促進される。ＣＤ３４発現細胞の大規模プールを精製し、複数のドナーから混合して複数の試験に必要とされる細胞数を確保した。６日間の増殖後、標準的な条件下の細胞の場合は８３＋／−３２倍であるのに対して、完全既知組成培地中では１１３＋／−１１倍の規模で精製細胞を増殖させることに成功した。この２種類の集団間で３０倍の差があるものの、ＣＤ３４発現細胞の絶対数は、フローサイトメトリーによるＣＤ３４発現集団の％を乗じた場合、２つの集団間で同様である。例えば、標準的な条件下で増殖させた集団の４２＋／−１３％がＣＤ３４を発現し、完全既知組成条件を用いた場合は２６＋／−１６％がＣＤ３４を発現した。図８Ｂの画像は、完全既知組成の、動物由来物質不含試薬を用いてＣＤ３４発現に富む増殖細胞の再プログラミングを行った後の、アルカリホスファターゼに対して陽性に染色されるコロニーを含有する６ウェルプレートのうち１ウェルを示す。
【０２６８】
本明細書中で詳述した方法を用いて複数のｉＰＳクローンを２６名のドナーから増殖させ、さらなる特性評価のためにクローンの一部を選択した。これらのクローンは正常の核型を示し、長期にわたるそれらの遺伝的完全性を確認するために一部を複数回継代して評価した。これらのクローンは、一般的な細胞表面マーカーＴｒａ１−８１及びＳＳＥＡ−４（フローサイトメトリーにより調べた場合）ならびにＤＮＴ３Ｂ、ＲＥＸ１、ＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４及びＣ−ｍｙｃを含む多能性の指標となる内在性遺伝子も発現した。クローンは、組み込まれる及び染色体外プラスミドＤＮＡがないことも確認した。ｉＰＳＣを様々な継代数で回収することによってｏｒｉＰ−形質移入プラスミドが徐々に失われることを確認し、細胞あたり１コピーの検出限界でＰＣＲによりスクリーニングして、平均７回から１０回の範囲の継代内で喪失が検出可能であった。興味深いことに、ｉＰＳＣをディスパーゼではなくＥＤＴＡで分割した場合、ｏｒｉＰの喪失が明らかとなったのは継代が１０回を超えた後であった。さらに、試験されるｉＰＳＣのサンプルセットにおけるＰＣＲによる分析後、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子又はＴ細胞受容体再配列の指標となる遺伝子セグメントの増幅もなかった。このような再配列がないことから、宿主細胞が造血前駆細胞に由来し、本プロトコールが、より分化したＢ又はＴ細胞型ではなく造血前駆細胞からのｉＰＳＣの生成に選択的に有利に働くという主張が裏付けられる。ニューロンを形成するための適格性について、１ドナー由来のｉＰＳＣクローンをいくつか試験した。さらに、３種類の異なるドナー由来の５種類のｉＰＳクローンも免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに注入後に奇形腫を形成した。興味深いことに、２名のドナーからのクローンが、奇形腫研究のためにマウスに注入した後、それぞれ１５及び１８回の継代までプラスミドＤＮＡを喪失しなかったので、残存する形質移入ＤＮＡの存在により、奇形腫形成能が妨げられないと思われた。
【０２６９】
本明細書中で開示され、主張される方法は全て、本開示に照らして、過度の実験なく為すことができ、実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施態様の観点から記載してきたが、当業者にとって当然のことながら、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本方法に対して及び本明細書中に記載の方法の段階又は一連の段階において、変更を適用し得る。より具体的には、化学的かつ生理学的に関連のある、ある種の物質を本明細書中に記載の物質の代わりとし得ると同時に、同じ又は類似の結果が達成されることは明らかである。当業者にとって明らかな全てのかかる類似の置き換え及び改変は、添付の特許請求の範囲により定められるとおりの本発明の精神、範囲及び概念内にあるとみなされる。
【０２７０】
参考文献
次の参考文献は、これらが、本明細書中で記載されるものを補足する、代表的な手順又はその他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書中に具体的に組み込まれる。
米国特許第４，７１４，６８０号
米国特許第５，４７８，８３８号
米国特許第５，７２８，５８１号
米国特許第４，６８３，２０２号
米国特許第４，６８４，６１１号
米国特許第４，９５２，５００号
米国特許第５，３０２，５２３号
米国特許第５，３２２，７８３号
米国特許第５，３８４，２５３号
米国特許第５，４６４，７６５号
米国特許第５，５３８，８７７号
米国特許第５，５３８，８８０号
米国特許第５，５５０，３１８号
米国特許第５，５６３，０５５号
米国特許第５，５６３，０５５号
米国特許第５，５８０，８５９号
米国特許第５，５８９，４６６号
米国特許第５，５９１，６１６号
米国特許第５，６１０，０４２号
米国特許第５，６５６，６１０号
米国特許第５，７０２，９３２号
米国特許第５，７３６，５２４号
米国特許第５，７８０，４４８号
米国特許第５，７８９，２１５号
米国特許第５，９２５，５６５号
米国特許第５，９２８，９０６号
米国特許第５，９３５，８１９号
米国特許第５，９４５，１００号
米国特許第５，９８１，２７４号
米国特許第５，９９４，６２４号
米国特許出願第１２／４７８，１５４号
米国特許出願第６１／０５８，８５８号
米国特許出願第６１／０８８，０５４号
米国特許出願第６１／１５６，３０４号
米国特許出願第６１／２５８，１２０号
米国特許出願公開第２００３０２１１６０３号
米国特許出願公開第２００７０２３８１７０号
米国特許出願公開第２００８００３８８２０号
米国特許出願公開第２００８０２２６５５８号
米国特許出願公開第２００８０２５４００３号
米国特許出願公開第２００９００４７７３９号
米国特許出願公開第２００２／００７６９７６号
米国特許出願公開第２００３／００５９９１３号
米国特許出願公開第２００３／００８７９１９号
米国特許出願公開第２００４／０００２５０７号
米国特許出願公開第２００４／０００２５０８号
米国特許出願公開第２００４／００１４７５５号
米国特許出願公開第２００４／００３９７９６号
米国特許出願公開第２００５／０１９２３０４号
米国特許出願公開第２００５／０２０９２６１号
米国特許出願公開第２００８／００４２８７号
米国特許出願公開第２００７／０１１６６８０号
Ａａｓｅｎ及びＢｅｌｍｏｎｔｅ、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ，５（２）：３７１−３８２，２０１０
Ａｂｂｏｕｄら、Ｂｌｏｏｄ，５８：１１４８−１１５４，１９８１．
Ａｄａｍｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１（５）：１７４３−１７４６，１９８７．
Ａｉｙａｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ，１７（２１）：６３９４−６４０３，１９９８．
Ａｋｋｉｎａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０（４）：２５８１−２５８５，１９９６．
Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５０９２−５０９６，１９８８．
Ａｌｔｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３（３８）：１４１８８−１４１９３，２００６．
Ａｎｄｒｅｗｓら、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（Ｅｄ．），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，２０７−２４６，１９８７．
Ａｒａｖｉｎｄ及びＬａｎｄｓｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６（１９）：４４１３−４４２１，１９９８．
Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９９４．
Ｂａｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９：７０４１−７０４９，２０００．
Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１０（５９７４）：２０７−２１１，１９８４．
Ｂａｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，４０８（３）：２９７−３１５，２００７．
Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：３４，２００２．
Ｂｅｒｔｒａｎｄら、Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，３３３（２）：３９３−４０７，２００３．
Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｃｅｌｌ，９０（３）：３８５−３８７，１９９７．
Ｂｉｓｗａｓら、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５９０：５８２−５８３，１９９０．
Ｂｉｓｗａｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．ＭｉｃｒｏＢｉｏｌ．，２９：２２２８−２２３３，１９９１．
Ｂｏｃｈｋａｒｅｖら、Ｃｅｌｌ，８４（５）：７９１−８００，１９９６．
Ｂｏｄｅら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３８１：８０１−８１３，２０００．
Ｂｏｄｅら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６：３３−４６，２００１．
Ｂｏｄｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５（５０４１）：１９５−１９７，１９９２．
Ｃａｒｂｏｎｅｌｌｉら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７７（ｌ）：７５−８２，１９９９．
Ｃｈａｄｗｉｃｋら、Ｂｌｏｏｄ，１０２（３）：９０６−１５，２００３．
Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（８）：３５９６−６０１，１９９７．
Ｃｈａｎｇら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，１２：４３９３−４４０１，２００７．
Ｃｈａｕｄｈｕｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１８）：１００８５−１００８９，２００１．
Ｃｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５−２７５２，１９８７．
Ｃｈｉｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，１３７（１−２）：１９３−２０１，２００５．
Ｃｈｏｗら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，４６：７２−７８，２００１．
Ｃｈｒｉｓｔら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，９２（９）：１１６５−７２，２００７．
Ｃｏｃｅａ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３（５）：８１４−８１６，１９９７．
ＤａＣｏｓｔａら、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６５（３）：７４４−７５２，２００４．
Ｄａｖｉｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３５１：９５−１０５，２０００．
ｄｅ  Ｇｏｕｖｉｌｌｅら、Ｄｒｕｇ  Ｎｅｗｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，１９（２）：８５−９０，２００６．
ｄｅＦｅｌｉｐｅ、Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，１３６：２１５−３８，２００２．
Ｄｅｌａｎｅｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１６（２）：２３２−２３６，２０１０．
Ｄｈａｒら、Ｃｅｌｌ，１０６（３）：２８７−２９６，２００１．
Ｄｏｗｎｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（３５）：２１００５−２１０１１，１９９６．
Ｅｌｉａｓｓｏｎ及びＪｏｎｓｓｏｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２２２（１）：１７−２２，２０１０．
Ｅｎｇｌｉｓｈら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃ．Ｓｃｉ．，２３（１）：４０−４５，２００２．
Ｅｒｃｏｌａｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１５３３５−１５３４１，１９８８．
Ｅｒｍａｋｏｖａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（５１）：３３００９−３３０１７，１９９６．
Ｅｖａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｄｅｖｉｔａら（Ｅｄｓ．），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ−Ｒａｖｅｎ，ＮＹ，１０５４−１０８７，１９９７．
Ｆａｕｓｅｒら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，１：７３−８０，１９８１
Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：８４６３−８４６７，１９８７．
Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６：１０８２−１０９３，２００４．
Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１４８−５１４６，１９９７．
Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８−３３５２，１９７９．
Ｆｒａｍｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ  ．，３５９：１−１６，２００１．
Ｆｒａｐｐｉｅｒ及びＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８（２３）：１０８７５−１０８７９，１９９１．
Ｇａｈｎ及びＳｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ、Ｃｅｌｌ，５８（３）：５２７−５３５，１９８９．
Ｇａｈｎ及びＳｕｇｄｅｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９（４）：２６３３−２６３６，１９９５．
Ｇａｒｒｉｃｋら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１８：５６−５９，１９９８．
Ｇｅｌｌｉｂｅｒｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４９（７）：２２１０−２２２１，２００６．
Ｇｈｏｓｈ及びＢａｃｈｈａｗａｔ、Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ，Ｗｕら（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ，８７−１０４，１９９１．
Ｇｏｌｄｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５９３−５９６，１９８０．
Ｇｏｐａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０，１９８５．
Ｇｏｕｌｄら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，７：３８７−３９０，２００４．
Ｇｏｕｌｄら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓ．，４８：４９−５３，２００３．
Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７，１９７３．
Ｈａｒｂら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，３（８）：ｅ３００１，２００８．
Ｈａｒｌａｎｄ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０１（３）：１０９４−１０９９，１９８５．
Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，１９９２−１９９４．
Ｈｅｇｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３５９（６３９５）：５０５−５１２，１９９２．
Ｈｅｓｓら、Ｂｌｏｏｄ，１０４（６）：１６４８−５５，２００４．
Ｈｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（４）：１８６５−１８７０，２００１．
Ｉｎｍａｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６２（１）：６５−７４，２００２．
Ｊｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（３１），１１３２２−１１３２７，２００４．
Ｊｕｌｉｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３２６（２）：３１７−３２８，２００４．
Ｋａｄａｊａ−Ｓａａｒｅｐｕｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２７（１２）：１７０５−１７１５，２００８．
Ｋａｅｐｐｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８，１９９０．
Ｋａｍｉｎｓｋａら、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｐｏｌｏｎｉｃａ，５２（２）：３２９−３３７，２００５．
Ｋａｎｄａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２１（１０）：３５７６−３５８８，２００１．
Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５−３７８，１９８９．
Ｋａｒｉｎら、Ｃｅｌｌ，３６：３７１−３７９，１９８９．
Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３３６１−３３６４，１９９１．
Ｋｅｌｌｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（６）：８６２−９，１９９５．
Ｋｅｎｎｅｄｙ及びＳｕｇｄｅｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２３（１９）：６９０１−６９０８，２００３．
Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１４２６９−１４２７４，２００３．
Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５（４０）：３１２４５−３１２５４，２０００．
Ｋｉｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：３８７９−３８８２，１９９２．
Ｋｉｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２３９（２）：３４０−３５１，１９９７．
Ｋｉｍら、Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ、３８（３）：３２５−３３９，２００８．
Ｋｉｒｃｈｍａｉｅｒ及びＳｕｇｄｅｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９（２）：１２８０−１２８３，１９９５．
Ｋｉｒｃｈｍａｉｅｒ及びＳｕｇｄｅｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（６）：４６５７−４６６６，１９９８．
Ｋｌｅｉｎら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，８：１−８，２００６．
Ｋｌｅｉｎｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．，５：１−１１，１９９３．
Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（７）：６１８１−６１８５，１９９８．
Ｌｅｉｇｈｔ及びＳｕｇｄｅｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２１：４１４９−６１，２００１．
Ｌｅｖｅｎｓｏｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，９（８）．１２３３−１２３６，１９９８．
Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａら、Ｎａｔｕｒｅ，３７５（６５３３）：６８５−６８８，１９９５．
Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（２３）：１２６１６−１２６２１，１９９７．
Ｌｉｎｄｎｅｒ及びＳｕｇｄｅｎ、Ｐｌａｓｍｉｄ，５８：１−１２，２００７．
Ｌｏｈら、Ｂｌｏｏｄ，１１３（２２）：５４７６−５４７９，２００９．
Ｌｕｄｗｉｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４（２）：１８５−１８７，２００６ｂ．
Ｌｕｄｗｉｇら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３（８）：６３７−４６，２００６ａ．
Ｌｕｓｉｓ、Ｂｌｏｏｄ，５７：１３−２１，１９８１．
Ｍａｃｅｊａｋ及びＳａｒｎｏｗ、Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４，１９９１．
Ｍａｃｋｅｙ及びＳｕｇｄｅｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９（５）：３３４９−３３５９，１９９９．
Ｍａｃｋｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９（１０）：６１９９−６２０８，１９９５．
Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８．
Ｍａｎｚｉｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３（４７）：１７６７２−１７６７７，２００６．
Ｍａｒｅｃｈａｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（５）：４３８５−４３９２，１９９９．
Ｍａｒｔｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：１１１−１８４，２００５．
Ｍａｔｔｉｎｇｌｙら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ．Ｔｈｅｒａｐ．，３１６：４５６−４６５，２００６．
Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ及びＳｕｇｄｅｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６（１）：４８９−４９５，１９９２．
Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（４９１０）：１３４２−１３４４，１９８９．
Ｎａｎｂｏ及びＳｕｇｄｅｎ、ＥＭＢＯ  Ｊ．，２６：４２５２−６２，２００７．
Ｎａｒａｚａｋｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１８（５）：４９８−５０６，２００８．
Ｎｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３２（５）：８７３−８４，２００５．
Ｎｇ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１７：６０１−６１５，１９８９．
Ｎｉｃｏｌａら、Ｂｌｏｏｄ，５４：６１４−６２７，１９７９．
Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０，１９８２．
Ｎｉｃｏｌａｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１４９：１５７−１７６，１９８７．
Ｎｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７０（２１）：１２８６４−１２８６８，１９９５．
Ｎｏｂｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，１０２：６９９０−６９９５，２００５．
Ｏｋａｂｅ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．，１１０：４３−４９，１９８２．
Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１（３）：４１５−４２８，１９９３．
ＰＣＴ出願第２００５／１２３９０２号
ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８５７４号
ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９７６０号
ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／１０５０１号
ＰＣＴ出願第ＷＯ２００３／０６２２２７号
ＰＣＴ出願第ＷＯ２００７１１３５０５号
ＰＣＴ出願第ＷＯ２００８／００６５８３号
ＰＣＴ出願第ＷＯ２００８／０９４５９７号
ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１０／０００３７５７号
ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０９６９９号
ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／０６１２８号
ＰＣＴ出願第ＷＯ９８／３０６７９号
ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／２０７４１号
Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ，３３４（６１８０）：３２０−３２５，１９８８．
Ｐｉｅｃｈａｃｚｅｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７（２）：４２６−４２８，１９９９．
Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９（２）：１６９−１７７，１９８５．
Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１−７１６５，１９８４．
Ｑｕｉｔｓｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：９５３９−９５４５，１９８９．
Ｒａｗｌｉｎｓら、Ｃｅｌｌ，４２（（３）：８５９−８６８，１９８５．
Ｒｅｉｓｍａｎ及びＳｕｇｄｅｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６（１１）：３８３８−３８４６，１９８６．
Ｒｅｉｓｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５（８）：１８２２−１８３２，１９８５．
Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｃｅｌｌ，３７：２６３−２７２，１９８４．
Ｒｉｎｅｈａｒｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌ．，２２：４４５６−４４６２，２００４．
Ｒｉｎｇら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２：５８８−５９５，２００３．
Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０．
Ｒｉｔｚｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１６（Ｐｔ１９）：３９７１−３９８４，２００３．
Ｒｙａｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：（Ｐｔ  ４）：６９９−７２３，１９９７．
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９．
Ｓｃｈａａｒｓｃｈｍｉｄｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，２３（１）：１９１−２０１，２００４．
Ｓｃｈａｆｆｅｒら、Ｇｅｎｅ，３０２（１−２）：７３−８１，２００３．
Ｓｃｈｅｐｅｒｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０（１６）：４５８８−４６０２，２００１．
Ｓｃｙｍｃｚａｋら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２（５）：５８９−９４  ２００４．
Ｓｅａｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７（２１）：１１７６７−１１７８０，２００３．
Ｓｅａｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（２１）：１１４８７−１１５０５，２００４．
Ｓｈｉｒｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（４）：２５８７−２５９５，１９９９．
Ｓｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８（２３）：１０８７０−１９８７４，１９９１．
Ｓｕｇｄｅｎ及びＷａｒｒｅｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３（６）：２６４４−２６４９，１９８９．
Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０６（３７）：１５７２０−１５７２５，２００９．
Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ，２０：５９０，１９９２．
Ｓｕｚｕｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６７（５）：２３５１−２３５９，２００７．
Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６６３−６７６，２００６．
Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ，１３１：８６１，２００７．
Ｔｏｊｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，９６（１１）：７９１−８００，２００５，
Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８，１９８６．
Ｖｏｄｙａｎｉｋら、Ｂｌｏｏｄ，１０８（６）：２０９５−１０５，２００６．
Ｗａｇｍａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，１０：１１０５−１１３７，２００４．
Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２６（３）：１１２４−１１３４，２００６．
Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２５（３）：３１７−８，２００７．
Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｎａｔ．ＮｅｕｒｏＳｃｉ．，８（３）：２８８−９６，２００５．
Ｗｉｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４−１３４６，１９８９．
Ｗｏｎｇら、Ｇｅｎｅ，１０：８７−９４，１９８０．
Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３（１８）：５２６２−５２７０，２００７．
Ｗｕ及びＷｕ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：８８７−８９２，１９８８．
Ｗｕ及びＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２，１９８７．
Ｗｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６（５）：２４８０−２４９０，２００２．
Ｗｙｓｏｋｅｎｓｋｉ及びＹａｔｅｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３（６）：２６５７−２６６６，１９８９．
Ｙａｔｅｓ及びＧｕａｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５（１）：４８３−４８８，１９９１．
Ｙａｔｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４（１０）：４５１２−４５２２，２０００．
Ｙａｔｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１２−８１５，１９８５．
Ｙａｔｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３８０６−３８１０，１９８４．
Ｙａｔｅｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，（６）１９７−２０５，１９８８．
Ｙｅら、Ｂｌｏｏｄ，１１４（２７）：５４７３−５４８０，２００９．
Ｙｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１（５６３８）：１３７１−１３７４，２００３．
Ｙｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ，４５３：５１９−２３，２００８．
Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，５（３）：２３７−４１，２００９．
Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７，２００７．
Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４：７９７，２００９．
Ｚｈａｎｇら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４８：２５４２−２５４５，２００９．
Ｚｈａｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ；１０：２８２５−２８２８，２０００．
Ｚｈｏｕら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，２４（７）：１４０６−１４１７，２００５
【図５Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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