(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジペプチジルペプチダーゼIV（DPPIV）阻害活性を有するペプチド化合物を含むことを特徴とする魚介類の白子由来のタンパク源の加水分解物。
【請求項２】
前記魚介類が、サケ類、カラフトマス、ニシン、マダラ、カツオ、ブリ（ハマチ）、イカの一種以上からなる請求項１に記載の加水分解物。
【請求項３】
前記ペプチド化合物が、DPPIV阻害活性による血糖値上昇抑制効果を有する請求項１または２に記載の加水分解物。
【請求項４】
前記魚介類の白子由来のタンパク源が、魚介類の白子からのプロタミン及び／またはDNAの抽出工程で得られる副産物としての抽出残留物中に含まれるタンパク源である請求項１から３のいずれか１項に記載の加水分解物。
【請求項５】
前記ペプチド化合物として、Phe-Pro-Val-Gly及びその塩、Ile-Pro-Leu及びその塩、Leu-Pro-Val-Leu及びその塩、並びにVal-Pro-Phe-Pro及びその塩から選択される少なくとも１種を含む請求項１から４のいずれか１項に記載の加水分解物。
【請求項６】
Phe-Pro-Val-Gly及びその塩、Ile-Pro-Leu及びその塩、Leu-Pro-Val-Leu及びその塩、並びにVal-Pro-Phe-Pro及びその塩から選択される少なくとも１種をジペプチジルペプチダーゼIV（DPPIV）阻害活性成分として含むことを特徴とするDPPIV阻害用の組成物。
【請求項７】
前記DPPIV阻害活性による血糖値上昇抑制効果を有する請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
医薬用である請求項１から５のいずれか１項に記載の加水分解物。
【請求項９】
医薬用である請求項６または７に記載の組成物。
【請求項１０】
DPPIV阻害用の添加物を含む飲食品の製造方法における、請求項１から５のいずれか１項に記載の加水分解物または請求項６または７に記載の組成物の前記DPPIV阻害用の添加物としての使用方法。
【請求項１１】
DPPIV阻害用の添加物を含むペットフードの製造方法における、請求項１から５のいずれか１項に記載の加水分解物または請求項６または７に記載の組成物の前記DPPIV阻害用の添加物としての使用方法。
【請求項１２】
Phe-Pro-Val-Gly及びその塩、Ile-Pro-Leu及びその塩、並びにLeu-Pro-Val-Leu及びその塩から選択される少なくとも１種のペプチド化合物。
【請求項１３】
ジペプチジルペプチダーゼIV（DPPIV）阻害活性を有する加水分解物の製造方法であって、
魚介類の白子由来のタンパク源を加水分解してDPPIV阻害活性を有する加水分解物を得る工程
を有することを特徴とするDPPIV阻害活性を有する加水分解物の製造方法。
【請求項１４】
前記魚介類が、サケ類、カラフトマス、ニシン、マダラ、カツオ、ブリ（ハマチ）、イカの一種以上からなる請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記加水分解物が、DPPIV阻害活性による血糖値上昇抑制効果を有する請求項１３または１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記魚介類の白子由来のタンパク源が、魚介類の白子からのプロタミン及び／またはDNAの抽出工程で得られる副産物としての抽出残留物中に含まれるタンパク源である請求項１３から１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記加水分解を、タンパク源を加水分解する酵素の存在下により行う請求項１３から１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記タンパク源を加水分解する酵素が、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、金属プロテアーゼ及びシステインプロテアーゼの少なくとも１種である請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記加水分解を、Phe-Pro-Val-Gly及びその塩、Ile-Pro-Leu及びその塩、Leu-Pro-Val-Leu及びその塩、並びにVal-Pro-Phe-Pro及びその塩から選択される少なくとも１種が前記加水分解物に含まれる条件で行う請求項１３から１８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２０】
ジペプチジルペプチダーゼIV（DPPIV）阻害活性を有するペプチド化合物の製造方法であって、
請求項１３から１９のいずれか１項に記載の製造方法により加水分解物を得る工程と、
前記加水分解物から、DPPIV阻害活性を有するペプチド化合物を単離する工程と、
を有することを特徴とするDPPIV阻害活性を有するペプチド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼIV（DPPIV）阻害活性を有するペプチド及びその塩（ペプチド化合物）、それを含む組成物に関するものであって、これらには、魚介類の白子由来のタンパク源の加水分解物から見出されたDPPIV阻害活性を有するペプチド化合物の１種以上が有効成分として含まれていることを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病はインスリン作用の不足に基づく慢性の高血糖を主徴とする代謝疾患群であり、その治療における血糖コントロールは、糖尿病の発症だけでなく、網膜症、腎症、神経障害、心筋梗塞、脳梗塞といった合併症の発症進展を抑制し、患者のクオリティ・オブ・ライフ（QOL）や余命を改善する手段として非常に重要である。日本においては、糖尿病患者のうち95％以上が２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）患者であるとされる。近年、新たな２型糖尿病治療薬としてジペプチジルペプチダーゼIV［Dipeptidyl peptidase-IV（DPPIV）］阻害薬が認可され、低血糖などの副作用が少なく優れたメカニズムで血糖コントロールできる方法であることから注目されている。DPPIVは、膵β細胞に作用してインスリン分泌を促す消化管ホルモンであるインクレチン（gastric inhibitory polypeptide: GIP、glucagon-like peptide-1: GLP-1）を不活性型に変換するため、DPPIVを阻害することでインクレチンの作用を持続させ、インスリン分泌を促進することができる。DPPIVはセリンプロテアーゼの1つであり、ペプチドのN末端から２番目のプロリン（Pro）又はアラニン（Ala）を認識して切断する酵素である。DPPIVはN末端の第２残基にプロリン及びアラニンを有し、さらにN末端残基としてリジン（Lys）及びアルギニン（Arg）を有しているペプチドへの作用が強いとの報告がある（非特許文献１）。【０００３】
タンパク質加水分解物による血糖値上昇抑制効果はこれまでにも報告があり、その作用機序はインスリン分泌促進作用（特許文献１）やグルコース吸収阻害活性（特許文献２）、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）分泌促進（特許文献３）によるものが報告されている。また、海苔の酵素分解物（特許文献４）やローヤルゼリーを分解して得られるペプチド（特許文献５）に血糖値上昇抑制効果を認めたものの、その作用機序を明らかにしていない報告もある。魚介類の白子を原料としたものでは、白子より抽出されるプロタミンにアミラーゼ阻害活性（非特許文献２）やGLP-1分泌の促進作用（非特許文献３）が知られている。【０００４】
DPPIV阻害活性に着目したものとしては、化学合成によって得られる化合物が多数報告（特許文献６）されているが、これらの化学合成品は安全性の問題や副作用に注意しなくてはならない。天然物由来のDPPIV阻害剤としては、チーズ水溶性画分由来のペプチド（特許文献７）、乳タンパク質由来のペプチド（特許文献８）、小豆またはインゲン豆の酵素分解物（特許文献９）、ゼラチン由来のペプチド（特許文献10）、サケ皮から抽出したゼラチンの酵素分解物由来ペプチド（非特許文献４）などが知られている。【０００５】
一方、魚介類の白子は卵と比べて利用価値は低く、肥料飼料への利用にとどまり、有効に活用されていない。比較的利用されているサケ由来の白子であってもプロタミンや核酸の原料として利用されているが、年間10,000t以上が産業廃棄物となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第4864064号公報
【特許文献２】特開2009-235064号公報
【特許文献３】特許第4180645号公報
【特許文献４】特許第3585778号公報
【特許文献５】特許第3691685号公報
【特許文献６】特許第4357293号
【特許文献７】特許第4915833号公報
【特許文献８】特許第5068174号公報
【特許文献９】国際公開第2011/016220号
【特許文献１０】特許第5176964号公報
【特許文献１１】米国特許出願公開第2005/0053606号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Plant Physiol. , Vol.122, 425-432
【非特許文献２】Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.109, 556-558
【非特許文献３】第64回日本栄養食糧学会講演要旨集 p188
【非特許文献４】J. Agric. Food Chem., Vol.60, 973-978
【非特許文献５】Protein Expression and Purification, Vol.1, 127-133
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、糖尿病患者およびその予備軍における、病態の発症や進行の予防に寄与できるDPPIV阻害活性を有するペプチド化合物又はそれを含有する組成物を、古くから食経験があり、安全性の高い魚介類の白子を原料として簡便な方法で提供することである。また、血糖値上昇の抑制効果のある機能性食品、保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント等の飲食品のDPPIV阻害活性成分を古くから食経験があり、安全性の高い魚介類の白子を原料として簡便な方法で提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、DPPIV阻害活性を有する天然由来の素材に関して鋭意研究を行った結果、魚介類の白子および白子処理物のタンパク源の加水分解物にDPPIV阻害活性を見出した。更に、その加水分解物に含有される構造及び／又は活性新規のDPPIV阻害活性ペプチドを決定し、本発明を完成するに至った。【００１０】
本発明にかかるDPPIV阻害用の組成物の第一の態様は、魚介類の白子由来のタンパク源の加水分解により得られるDPPIV阻害活性を有するペプチド化合物を含むことを特徴とする。【００１１】
本発明にかかるDPPIV阻害用の組成物の第二の態様は、Phe-Pro-Val-Glyまたはその塩、Ile-Pro-Leuまたはその塩、Leu-Pro-Val-Leuまたはその塩、並びにVal-Pro-Phe-Proまたはその塩から選択される少なくとも１種をDPPIV阻害活性成分として含むことを特徴とする。【００１２】
これらのDPPIV阻害用の組成物またはペプチド化合物を用いて、DPPIV阻害のための医薬品、飲食品（機能性食品、保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント等）、ペットフード等を調製することができる。【００１３】
本発明にかかるペプチド化合物は、Phe-Pro-Val-Gly及びその塩、Ile-Pro-Leu及びその塩、並びにLeu-Pro-Val-Leu及びその塩から選択される少なくとも１種である。これらのペプチド化合物は単独で、あるいは２種以上の混合物として、所望とする用途に利用することができる。【００１４】
本発明にかかるDPPIV阻害活性を有する加水分解物の製造方法は、
魚介類の白子由来のタンパク源を加水分解してDPPIV阻害活性を有する加水分解物を得る工程
を有することを特徴とする。【００１５】
本発明にかかるDPPIV阻害活性を有するペプチド化合物の製造方法は、
魚介類の白子由来のタンパク源を加水分解して、DPPIV阻害活性を有するペプチド化合物を含む加水分解物を得る工程と、
前記加水分解物から、DPPIV阻害活性を有するペプチド化合物を単離する工程と、
を有することを特徴とする。【００１６】
魚介類の白子を原料とした加工物にDPPIV阻害を認めたという報告はなく、本発明で決定したペプチドのうち、Phe-Pro-Val-Gly、Ile-Pro-Leu、Leu-Pro-Val-Leuは構造、活性ともに報告がない。また、Val-Pro-Phe-Proは癌細胞増殖に関わる汎上皮性膜結合ムチン（MUC1）の作用を阻害するという報告があるものの（特許文献11）、DPPIV阻害活性については知られていない。【００１７】
白子由来の素材による血糖値上昇抑制効果としては、白子より抽出されるプロタミンによるアミラーゼ阻害活性が知られている（非特許文献２）が、本発明にかかるPhe-Pro-Val-Gly、Ile-Pro-Leu、Leu-Pro-Val-Leu、またはVal-Pro-Phe-Proで示されるアミノ酸配列からなるDPPIV阻害ペプチドとプロタミンのアミノ酸配列を比較すると、本発明のDPPIV阻害ペプチドがプロタミン由来でないことは明白である（非特許文献５）。【００１８】
一方、魚介類由来のタンパク質加水分解物を原料としたものとして、サケ皮から抽出したゼラチンの酵素分解物由来ペプチドにDPPIV阻害活性を認めたという報告（非特許文献４）があるが、白子と皮コラーゲンのアミノ酸組成は大きく異なっており、これらを加水分解して得られた組成物のDPPIV阻害活性は、それぞれ異なるペプチド群が活性の中心であることは明らかである。また、皮コラーゲン加水分解物を得るためには、皮からのコラーゲン抽出工程と、皮に含有される脂質や他組織などから混入した不純物を除去する煩雑な工程が必要となる。皮と白子は明確に異なる部位であるため、白子中に皮コラーゲンが含まれることはない。さらに、白子は明らかに他部位と形態が異なっているため、原料選別も容易であると考えられ、また、脂質含量が低く原料としても適していると言える。白子は加水分解処理等により、核酸等が遊離することにより優れた呈味性を示し、食品分野における応用性が広いと考えられる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明にかかるDPPIV阻害活性を有するペプチド化合物及びそれを含む組成物は、古くから食経験のある魚介類の白子を原料としており、安全性が高いため、医薬品、飲食品（機能性食品、保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント等）、ペットフード等に広く活用することができる。【００２０】
また、本発明にかかるDPPIV阻害活性を有するペプチド化合物及びそれを含む組成物を得るための原料は、魚介類の白子であれば良い。なかでも、食用とされることが少なく、プロタミン又は／及びDNAなど機能性食品の原料とされる以外に主たる用途が少なく、年間10,000t以上が産業廃棄物となっているサケ類の白子が好ましい。さらに、本発明ではプロタミンやDNA製造にも使われない熟度の低いサケ類白子も原料とすることができる。またその他の原料として、サケ白子から機能性素材として利用されるプロタミン及び／又はDNAを抽出した後に生じる製造副産物を利用することもできる。このように、原料を安価、かつ、安定的に入手することができ、未利用資源の有効活用、及び、産業廃棄物の低減にも貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例１で得られた加水分解物のDPPIV阻害活性の測定結果を示す図である。
【図２】実施例１で得られた加水分解物のSDラットに対するデンプン負荷試験の測定結果を示す図である。
【図３】白子の加水分解物からのペプチドの精製方法を示す図である。
【図４】実施例９で得られた加水分解物のDPPIV阻害活性の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明にかかるDPPIV阻害活性を有する組成物は、DPPIV阻害活性を有する成分として、魚介類の白子（すなわち魚介類精巣）に含まれるタンパク源の加水分解物中から得られるペプチド化合物を含む。この加水分解物は、魚介類の白子由来のタンパク源を、DPPIV阻害活性を有するペプチド化合物が生じる条件で加水分解することにより得ることができる。
【００２３】
DPPIV阻害活性を有するペプチド化合物を含む組成物は、以下の各形態のものとすることができる。
（１）魚介類の白子由来のタンパク源を加水分解して得られる、DPPIV阻害活性を有するペプチド化合物を含む加水分解物。
（２）魚介類の白子由来のタンパク源の加水分解物からのDPPIV阻害活性を有するペプチド化合物の１種または２種以上を含むDPPIV阻害活性を有する画分、粗精製品あるいは精製品。
（３）上記の加水分解物、DPPIV阻害活性を有する画分、粗精製物あるいは精製物に対して、担体、賦形剤、希釈剤及び各種添加剤から選択された少なくとも１種を添加して得られる組成物。
（４）魚介類の白子由来のタンパク源の加水分解物から単離されたペプチド化合物の１種以上を含む組成物。
（５）上記の単離されたペプチド化合物のアミノ酸配列に基づいて合成により得られたDPPIV阻害活性を有するペプチド化合物の１種以上を含む組成物。
（６）DPPIV阻害活性を有するペプチド化合物の２種以上の混合物としての組成物。
（７）上記（４）〜（６）のいずれかの組成物に対して、担体、賦形剤、希釈剤及び各種添加剤から選択された少なくとも１種を添加して得られる組成物。
【００２４】
上記の（２）におけるDPPIV阻害活性を有する画分、粗精製品あるいは精製品は、魚介類の白子由来のタンパク源の加水分解処理後に限外ろ過や膜処理、分液操作または樹脂等による分画処理等を行い、DPPIV阻害活性を有するペプチド化合物を含む画分を取得する方法、更には、かかる画分を種々の分離・精製方法を用いて精製処理する方法等により得ることができる。例えば、白子由来のタンパク源の加水分解から高分子化合物を除去した残りのDPPIV阻害活性を有するペプチド化合物を含む画分に対して、必要に応じて精製処理を行ってから、凍結乾燥法等を利用して乾燥処理を行うことにより、粉末状のDPPIV阻害活性を有するペプチド化合物を含む組成物を得ることができる。この高分子化合物の除去は、少なくとも分子量5000以上の高分子化合物が除去されるように行うとよい。
【００２５】
DPPIV阻害活性を有するペプチド化合物としては、後述する実施例７及び実施例９においてDPPIV阻害活性が確認されている各ペプチド及びその塩を挙げることができ、これらの少なくとも１種を活性成分として用いて本発明にかかるDPPIV阻害のための組成物を提供することができる。本発明にかかる組成物に含有させる好ましいペプチド化合物としては、以下の４種のペプチドまたはその塩を挙げることができる。
（Ａ）FPVG（Phe-Pro-Val-Gly）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩。
（Ｂ）IPL（Ile-Pro-Leu）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩。
（Ｃ）LPVL（Leu-Pro-Val-Leu）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩。
（Ｄ）VPFP（Val-Pro-Phe-Pro）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩。
【００２６】
加水分解用の原料としての魚介類の白子由来のタンパク源としては、魚介類の白子そのもの、魚介類の白子から抽出したタンパク源等を用いることができる。魚介類の白子から抽出されるタンパク源としては、魚介類の白子からのプロタミン及び／又はDNA製造における副産物を用いることができる。プロタミン及び／又はDNAの製造方法は特に限定されないが、プロタミンであれば魚介類の白子を磨砕し、鉱酸水溶液中にこれらの成分を抽出することができる。DNAであれば魚介類の白子を必要に応じて磨砕し、プロテアーゼまたはヌクレアーゼを用いた加水分解処理もしくは食塩水溶液、アルカリ水溶液、有機溶媒、あるいは界面活性剤等を用いた抽出処理によりDNAを得ることができる。副産物とは、魚介類の白子からプロタミン及び／又はDNAを抽出あるいは分離した後の残留物（残渣）であり、この残留物そのものや、この残留物から活性成分を抽出あるいは濃縮したもの、さらに分離したタンパク源を加水分解用の原料として用いることができる。
【００２７】
魚介類とは、脊索動物、軟体動物、棘皮動物、節足動物または刺胞動物に分類される水産動物の総称であり、白子の供給元である魚介類としては、例えば、サケ、マス等のサケ目サケ科、マグロ、カツオ等のスズキ目サバ科、ブリ（ハマチ）、カンパチ等のスズキ目アジ科、その他、ニシン等のニシン目ニシン科、マダラ等のタラ目タラ科といった魚類、また、イカ、タコ等の頭足類が含まれ、とくに「サケ」としてはシロザケ、ギンザケ、ベニザケ、タイセイヨウサケ（アトランティックサーモン）、キングサーモン、カラフトマス、トラウト等が挙げられる。
【００２８】
白子そのものとしては、魚介類から取り出した白子を必要に応じて洗浄したもの、あるいは白子を必要に応じて洗浄して裁断あるいはすり潰し処理したものを、加水分解用として用いることができる。更には、種々の抽出法によって白子からタンパク源を抽出して加水分解用途として利用することができる。例えば、白子からプロタミン及び／またはDNAを抽出した残りの製造副産物中に含まれるタンパク源を加水分解用として用いることもできる。
【００２９】
また、白子としては、プロタミン及びDNAを多く含み水分含量の少ない性成熟度の高い白子に加えて、プロタミン及びDNA含有割合が少なく水分含量が多いため、プロタミンやDNA製造に適さない性成熟度の低い白子も加水分解用の原料とすることができる。一般的なサケ類白子の水分含量は70-85％程度であり、目的に応じて白子の性成熟度を白子水分含量によって定義することができる。例えば、本発明では水分75％未満の性成熟度の高い白子から、75％以上の性成熟度の低い白子まで広く原料とすることができる。
【００３０】
異なる魚介類の白子の１種以上を混合して用いることもできる。更に、白子以外のタンパク源を白子のタンパク源に混合して加水分解用の原料としてもよい。この白子以外のタンパク源としては、例えば、本発明の目的に応じて、微生物、植物、動物、及びこれらの発酵物、並びに、これらから抽出されたタンパク源等の少なくとも１種を用いることができる。
【００３１】
魚介類の白子由来のタンパク源の加水分解は、当技術分野で既知の手段によって実施することができ、例えば、酸、酵素等を用いることができるが、方法に限定されるものではない。タンパク源を加水分解する酵素としては、エンドペプチダーゼあるいはエキソペプチダーゼが挙げられ、それらを単独又は組み合わせて用いても良い。好ましくはエンドペプチダーゼを主とした酵素を用いるのが良い。エンドペプチダーゼとしては、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、金属プロテアーゼ、システインプロテアーゼ等が挙げられ、好ましくはセリンプロテアーゼを主とした酵素を用いるのが良い。これらのタンパク源を加水分解する酵素を２種以上組み合わせて使用することもできる。タンパク源を加水分解する酵素はその加水分解活性に適した温度、ｐＨ条件下で、白子タンパク源原料に0.001〜5%（w/w）添加し、1〜48時間反応させることが好ましい。また、精製した酵素製剤及び粗酵素製剤を使用でき、白子原料由来の酵素活性を利用しても良い。
【００３２】
加水分解反応は、得られる加水分解物にDPPIV阻害活性を有する水溶性のペプチド化合物が得られる反応条件下において行われる。この反応条件は、例えば次の方法により得ることができる。まず、原料タンパク源の分解反応を行い、反応の進行に応じて所定の時間的な間隔で反応生成物をサンプリングする。得られた各反応生成物のDPPIV阻害活性を測定し、目的とするDPPIV阻害活性を示す反応生成物が得られた反応条件を特定し、この反応条件を加水分解物の製造における反応条件として利用する。この反応条件としては、IP（Ile-Pro）及びVPL（Val-Pro-Leu）の両方が加水分解物中に含まれる反応条件を選択することが好ましい。更に、これらの２種に加えて先に挙げた（Ａ）〜（Ｄ）のペプチド化合物の少なくとも１種が加水分解物中に得られる反応条件を選択することがより好ましい。
【００３３】
本発明において「ペプチド」とはペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチドに含まれるアミノ酸残基数は２以上であれば限定されず、タンパク質まで含むものである。後述する実施例等においては、２種以上のペプチドを含む組成物を「ペプチド組成物」と記載している。また、「タンパク源」とはタンパク質そのものや、タンパク質と脂質及び／または糖質等と形成されたタンパク質複合体も含む。
【００３４】
魚介類の白子由来のタンパク源の加水分解物中には、タンパク源の種類や加水分解反応の条件に応じて種々の長さ（分子量）及びアミノ酸配列のペプチド化合物が混合状態で得ることができる。一方、魚介類の白子を加水分解処理することにより、加水分解物中に核酸等が遊離し、加水分解物は優れた呈味性を示し、食品分野において広く用いることが可能となる。
【００３５】
加水分解物からのDPPIV阻害活性を有するペプチド化合物の単離は、公知の分離方法により行うことができ、例えば後述する実施例５に記載される分離カラムを用いた方法を好適に利用することができる。
【００３６】
本発明にかかるDPPIV阻害活性を有する加水分解物を含む組成物、並びに加水分解物から抽出されたペプチド化合物から選択された１種以上を活性成分として、そのまま、あるいは、必要に応じて、担体、賦形剤、希釈剤などと共に用いて、DPPIV阻害剤を調製することができる。あるいは、本発明にかかるDPPIV阻害活性を有する加水分解物を含む組成物、並びに加水分解物から抽出されたペプチド化合物から選択された１種以上をDPPIV阻害活性を付与する目的で、医薬品、飲食品（機能性食品、保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント等）、ペットフード等に含有させることができる。
【００３７】
魚介類の白子由来のタンパク源の加水分解物としては、少なくともIP（Ile-Pro）及びVPL（Val-Pro-Leu）を含む加水分解物を挙げることができ、更に、これらの２種のペプチドに加えて、FPVG（Phe-Pro-Val-Gly）、IPL（Ile-Pro-Leu）、LPVL（Leu-Pro-Val-Leu）及びVPFP（Val-Pro-Phe-Pro）から選択された少なくとも１種を含む加水分解物であることが好ましい。これらの各ペプチドは、塩の形態を採るものでもよい。
【００３８】
また、その塩を構成する酸としては、特に制限されないが、医薬品、飲食品、ペットフードなどへの用途を考慮すると、以下に挙げる薬学的に許容される塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、メタンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、リン酸塩、更にはクエン酸等のトリカルボン酸との塩、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、またはフマル酸等のジカルボン酸との塩、酢酸、プロピオン酸、酪酸、または乳酸等のモノカルボン酸との塩等を挙げることができる。次に、塩を構成する塩基としては、特に制限されないが、食品、医薬品、ペットフードなどへの用途を考慮すると、以下に挙げる薬学的に許容される塩を構成する塩基が好ましい。例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、リチウム塩、アルミニウム塩、ストロンチウム塩等の無機塩や、メチルアミン塩、ジメチルアミン塩、トリエチルアミン塩のようなモノ−、ジ−及びトリ−アルキルアミン塩、モノ−、ジ−及びトリ−ヒドロキシアルキルアミン塩、グアニジン塩、N−メチルグルコサミン塩などの有機塩を挙げることができる。
【００３９】
加水分解物（固形分）中に含まれるIP、VPL、IPL及びLPVLの割合は以下の範囲にあることが好ましい。
Ile-Pro (IP)：０．００１〜１０重量％
Val-Pro-Leu (VPL)：０．００１〜５重量％
Ile-Pro-Leu (IPL)：０．００１〜１重量％
Leu-Pro-Val-Leu (LPVL)：０．００１〜１重量％
これらのペプチドまたはその塩が加水分解物中に上記範囲に示す割合で含まれるように、魚介類の白子由来のタンパク源の加水分解の条件を設定することによって、上述したペプチドの２種以上を含む加水分解物を得ることができる。イカ白子を用いた場合のIPの含有割合は、０．００５〜５重量％となるようにすることが好ましい。
【００４０】
この加水分解物の好ましい例としては、サケ白子を用いた実施例１におけるペプチド組成物としての加水分解物と同様の処理によって得られる以下の表１で示される組成のものを挙げることができる。
【００４１】
【表１】
0005952967.tif 000002
【００４２】
本発明において目的とするDPPIV阻害効果を得るためには、ペプチド組成物をそのまま医薬品または飲食品（機能性食品、保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント等）、ペットフード等に添加しても良いが、限外ろ過や膜処理、分液操作または樹脂等による分画処理に供して、精製度を上げても良い。さらに、合成して得られたペプチド化合物についても利用可能である。活性ペプチドの精製度を上げた後、凍結乾燥や噴霧乾燥等によって粉末化しても良い。本発明のDPPIV阻害活性を有するペプチド化合物及び組成物は、経口的に投与し、生体内のDPPIVを阻害することで血糖値を低下させることができる。
【００４３】
本発明にかかるDPPIV阻害のための組成物の製剤化は、DPPIV阻害活性を有するペプチド及びその塩がそのまま製剤化可能であれば、DPPIV阻害活性を有するペプチド及びその塩の少なくも１種をそのまま用いて製剤化できる。一方、担体、賦形剤及び希釈剤の少なくとも１種を用いて製剤化を行う場合は、DPPIV阻害活性を有するペプチド及びその塩の少なくも１種と、あるいはDPPIV阻害活性を有するペプチド及びその塩の少なくも１種を含む組成物と、薬学的に、あるいは食品への添加物として許容されている各種の担体、賦形剤及び希釈剤の少なくとも１種と、必要に応じて添加されるビタミン、著色剤、調味剤、甘味剤、酸化防止剤等の各種添加剤とを用いて製剤化を行うことができる。これらの製剤中へのDPPIV阻害活性を有するペプチド及びその塩の少なくも１種の配合割合は、0.0001〜100重量％の範囲から選択することができる。
【００４４】
DPPIV阻害活性測定には、市販のキット等を用いれば良いが、例えば、DPPIV Drug Discovery Assay Kit（Enzo life sciences Inc.製）を用いることができる。
【００４５】
以下に実施例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
（実施例１）
（サケ白子からのDPPIV阻害ペプチド組成物の製造）
シロサケ（Oncorhynchus keta）の白子を粉砕処理し、8g（水分含量77.0％）に加水し、それぞれの酵素の指摘pHになるよう調整した。タンパク源を加水分解する酵素は、セリンプロテアーゼとして、プロテアーゼP「アマノ」3SD（Aspergillus melleus由来、天野エンザイム社製）、ビオプラーゼOP（Bacillus clausii由来、ナガセケムテック社製）、アスパラギン酸プロテアーゼとして、プロテアーゼM「アマノ」SD（Aspergillus oryzae由来、天野エンザイム社製）、オリエンターゼA20（Aspergillus niger由来、エイチビィアイ社製）、金属プロテアーゼとして、アロアーゼAP-10（Bacillus subtilis由来、ヤクルト薬品工業社製）、ウマミザイムG（Aspergillus oryzae由来、天野エンザイム社製）、システインプロテアーゼとして、パパインDFをそれぞれ用いた。それぞれの酵素の至適温度に加温した後、各酵素0.02gを添加して4時間攪拌し酵素分解反応を行った。反応液を90℃に加温し、酵素失活させた。冷却後、セライトを用いて濾過した。濾液を限外濾過膜に透過させて、分子量5,000以上の画分を除いた後、凍結乾燥してDPPIV阻害ペプチド組成物の粉末を得た。白子に含まれるDNAの分子量は数万以上であるため、これらの処理により高分子のDNAは抽出、除去されていると考えられる。【００４７】
（実施例２）
（DPPIVの活性測定）
実施例１で得られた各DPPIV阻害ペプチド組成物について、DPPIV阻害活性の測定を行った。測定はDPPIV Drug Discovery Assay Kit（Enzo life sciences Inc.製）を一部改変して行った。DPPIV酵素の基質としてAMC基質（H-Gly-Pro-アミノ-4-メチルクマリン、BML-P189-9090；Biomol社製）を用い、酵素としてDPPIV（Human、recombinant；Biomol社製）、対照阻害剤として、ディプロチンＡ（DiprotinA、株式会社ペプチド研究所製）を使用した。すなわち、96穴プレートに25μLの50mM Tris緩衝液（pH 7.5）及び実施例１で得られた高分子化合物を分画除去した後の加水分解物水溶液（3mg/mL）10μL、DPPIV（0.002 mU/μL）溶液 15μLを添加、混和し、37℃でプレインキュベーションした。この溶液に対して、37℃でプレインキュベーションしたAMC基質溶液（0.01mM）を50μL添加し、マイクロプレートリーダー（GENio Pro、TECAN社製）にて励起波長340nm、測定波長460nmにおける蛍光強度を5分間おきに30分間測定した。サンプル無添加のものの活性を100％として、各サンプルの相対的な活性を算出した。各サンプルは３反復で測定し、平均値を求めた。【００４８】
結果を図１に示す。パパインDFのサケ白子分解物は粘度が高く、回収が困難であったため、阻害活性を測定しなかった。セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、金属プロテアーゼを用いた場合、いずれもDPPIV阻害活性を示したが、特にセリンプロテアーゼで分解した場合に高い阻害活性を示した。【００４９】
（実施例３）
（SDラットに対するデンプン負荷試験）
試験には明暗周期12時間（午前7時〜午後7時点灯）、室温20〜24℃、湿度43〜61％、飼料（CRF-1、オリエンタル酵母工業株式会社製）及び飲水（水道水）自由摂取の環境下で1週間馴化飼育したSDラット（Slc:SD、7週齢）を用いた。馴化最終日の夕方から一晩16時間以上の絶食を行った後、体重別層化無作為抽出法にて各群5匹に群分けした。【００５０】
実施例１で得られたサケ白子由来のペプチド組成物（粉末）を蒸留水で溶解し、100mg/mL溶液を調製した。これをSDラット体重1kgあたり100mgの用量で強制経口投与した。あるいは、蒸留水を同容量投与した（コントロール群）。被験物質投与後、デンプン（和光純薬製）を蒸留水に溶解し、20％水溶液とし、SDラット体重1kgあたり2g負荷した。採血はデンプン負荷前、負荷後30、60、120分の4点について無麻酔下にて行った。なお、血糖値測定は血糖自己測定器(ニプロフリースタイルフリーダム、ニプロ社製)を使用し、全血中の血糖濃度(mg/dL)を測定した。【００５１】
測定結果を図２に示す。その結果、コントロール群に比べて、白子由来のペプチド組成物投与群では血糖値上昇が有意に抑制された。よって、白子由来のペプチド組成物はDPPIV阻害を起因として血糖値上昇抑制効果を示すことが明らかとなった。【００５２】
（実施例４）
（ペプチド組成物の活性測定）
原料調査を目的として、シロサケの白子（サケ白子）、プロタミン、サケ皮由来のコラーゲン（サケ皮コラーゲン）、アメリカオオアカイカの白子（イカ白子）それぞれにHClを添加して加水分解し、アミノ酸分析装置JLC-500/V2（JEOL社製）を用いてアミノ酸組成（mol%）を測定した。測定結果を表２に示す。【００５３】
【表２】
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【００５４】
シロサケの白子、イカの白子、サケ皮由来のコラーゲンペプチドを加水分解用素材としてそれぞれ個々に用い、以下に示す加水分解酵素と組み合わせて、実施例１と同様にして各素材由来のペプチド組成物（粉末）を得た。
・加水分解酵素Ａ
アロアーゼAP-10（金属プロテアーゼ）：シロサケ白子、イカ白子
・加水分解酵素Ｂ
アルカラーゼ 2.4L FG（セリンプロテアーゼ）：シロサケ白子、イカ白子
・加水分解酵素Ｃ
プロテアーゼＰ「アマノ」3SD（セリンプロテアーゼ）：シロサケ白子
・加水分解酵素Ｄ
パパイン（システインプロテアーゼ）：サケ皮
得られた各ペプチド組成物を蒸留水に3mg/mLの濃度で溶解し、0.45μmのメンブレンフィルター処理を行った後、DPPIV阻害活性試験を実施例２と同様にして行った。結果を表
３に示す。【００５５】
【表３】
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【００５６】
（実施例５）
（活性ペプチドの濃縮法）
実施例４で得られた各素材由来のペプチド組成物サンプル100mgをそれぞれ個々に用いて蒸留水に溶解し、蒸留水で平衡化したSep-Pak（登録商標） カラム（C18 6cc： Waters社製）に供し、蒸留水で洗浄後、吸着画分を含水エタノールにて溶出した。得られた溶出液をエバポレーターで乾固し、ペプチド組成物濃縮画分を得た。このようにして得られた溶出画分はそのままDPPIV阻害活性ペプチド組成物として利用可能である。【００５７】
（実施例６）
（活性ペプチドの探索）
実施例５で得られたサケ白子由来のペプチド組成物濃縮画分中に含有している強力なDPPIV阻害ペプチドのそれぞれを分離処理することとした。【００５８】
まず、実施例１に記載のサケ白子由来の加水分解物としてのペプチド組成物から、図３に記載の方法に従って各ペプチド画分を分離した。分離した各ペプチド分画物はLC-MS（LCMS-IT-TOF、Shimadzu社製）を用いて下記条件で分析し、マススペクトル（MS）による解析を行った。MS解析によって推定された構造を有する候補ペプチドをペプチド合成装置（SyroI、Biotage社製）にて合成した。これらをLC-MSで比較することで各ペプチド構造を決定した。【００５９】
（LCMS-IT-TOFによる構造決定）
＜HPLC分析条件＞
・HPLCシステム：（株）島津製作所製 Prominenceシリーズ（システムコントローラー：CBM-20A、オートサンプラー：SIL-20A、送液ポンプ：LC-20AB Binary pump、カラムオーブン：CTO-20A、PDA検出器：SPD-M20A（測定波長 190-700nm））
・カラム：Xterra MS C18 3.5μm、2.1×100 mm（Waters社製）
・カラム温度：40℃
・移動相A：H2O（0.1容量％TFA含有、関東化学製、LC-MS用）
・移動相B：メタノール（関東化学製、LC-MS用）
・グラジエント：0〜15分にかけてB液3容量％保持し、15〜45分にかけてB液3容量%からB液60容量％へのリニアグラジエント、45-50分にかけてB液60容量％保持。
・分析時間：50分
・流量：0.1mL/min
・注入量：1μL
＜IT-TOFMS検出条件＞
・システム：（株）島津製作所製  LCMS-IT-TOF（イオン化モード：ESI+、霧化ガス流量：1.5L/min、印加電圧：1.7kV、CDL温度：200℃、BH温度：200℃、測定範囲MS：m/z 100-1500、MS/MS：50-1000）
（実施例７）
（同定ペプチドの活性測定）
実施例６におけるLC-MS解析で同定されたペプチドを合成し、蒸留水に溶解してそのDPPIV阻害活性を実施例２と同様にして求めた。まず、各ペプチド溶液を段階希釈して各々の阻害活性を求め、阻害活性（％）とサンプル濃度の対数（Log10）の関係式から逆算して、各サンプルの50%阻害濃度（IC50値）を求めた。合成ペプチドのDPPIV阻害活性を比較した結果を表４に示す。同定された18種類のペプチドのうち、10種類はIC50値が100μM以下であり、非常に高いDPPIV阻害活性を示した。【００６０】
【表４】
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【００６１】
（実施例８）
（活性ペプチド含量測定）
実施例４で得られた各素材からのペプチド組成物濃縮画分を蒸留水にて2mg/mLの濃度で溶解し、0.45μmのメンブレンフィルター処理を行い、活性ペプチド含量測定に用いた。また、シロサケ白子を原料としたDNA製造におけるDNA抽出分離後の残留物としての副産物を元に、同様のペプチド組成物を調製し、活性ペプチド含量を測定した。JMS LCmate（JEOL社製）を用いて、上記で同定されたペプチドのうちIP、VPI、VPL、IPI、LPL、LPI、IPLを下記条件Ａで定量した。また、上記で同定されたペプチドのうち、FPVG、LPVL、VPFP、LPFを下記条件Ｂで定量した。定量結果及び上記実施例における同定ペプチドのDPPIV阻害活性IC50値（μM）を用いて、以下の式にて活性寄与率を算出した。【００６２】
寄与率＝(ペプチド組成物1g中の同定ペプチド含量／（同定ペプチドのIC50値（μM)×同定ペプチドの分子量／1000））／（1000／ペプチド組成物のIC50値（μg/mL））×100
（同定ペプチド定量条件Ａ）
＜HPLC分析条件＞
・HPLCシステム：Alliance Waters 2695（Waters社製）
・カラム：Discovery（登録商標） HS F5、5μm、2.1×250mm(SUPELCO社製)
・移動相A：H2O（0.1容量％ギ酸および0.01容量％TFA含有、関東化学製、LC-MS用）
・移動相B：メタノール（関東化学製、LC-MS用）
・グラジエント：0〜30分にかけてB液40容量%からB液80容量％へのリニアグラジエント、30-35分にかけてB液80容量％保持。
・分析時間：35分
・流量：0.2mL/min
・注入量：5μL
＜MS検出条件＞
・システム：JMS-LCmate（JEOL社製）
・イオン化モード：ESI+、SIM測定イオン：m/z：229.2、328.2、342.2
（同定ペプチド定量条件Ｂ）
＜HPLC分析条件＞
・HPLCシステム：Alliance Waters 2695（Waters社製）
・カラム：XTerra（登録商標） Phenyl 3.5μm、4.6 × 100mm Column (Waters社製)
・移動相A：H2O（0.1容量％ギ酸および0.01容量％TFA含有、関東化学製、LC-MS用）
・移動相B：メタノール（関東化学製、LC-MS用）
・グラジエント：0〜4分にかけてB液40容量％保持し、4〜24分にかけてB液40容量%からB液60容量％へのリニアグラジエント、24-29分にかけてB液60容量％保持。
・分析時間：29分
・流量：0.2mL/min
・注入量：5μL
＜MS検出条件＞
・システム：JMS-LCmate（JEOL社製）
・イオン化モード：ESI+、SIM測定イオン：m/z：376.2、419.2、441.3、459.3
定量試験の結果［各ペプチド組成物（１ｇ）中の活性ペプチドの含有量（ｍｇ／ｇ）］を表５に示す。DPPIV阻害活性の低いサケ皮由来のコラーゲンペプチドでは今回同定されたペプチドは検出されなかった。一方、DPPIV阻害活性の確認されたイカ白子由来のペプチド組成物には、上記活性ペプチドが検出され、本活性ペプチドがこれらペプチド組成物のDPPIV阻害活性に寄与していることが明らかとなった。また、これらの活性ペプチドのうち、複数のペプチドを含むペプチド組成物がDPPIV阻害活性を示すことを見出した。【００６３】
サケ白子ペプチド組成物中の活性ペプチドの活性寄与率においては、表６で示される範囲のものを挙げることもできる。【００６４】
【表５】
0005952967.tif 000006
【００６５】
表中の「−」はＮ．Ｄ．（not detected：検出されず）を示す。【００６６】
【表６】
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【００６７】
表５に示すとおり、各ペプチド組成物中には使用した加水分解酵素すべてに共通して、ジペプチドとしてのIle-Pro (IP)とトリペプチドとしてのVal-Pro-Leu (VPL)が含まれていた。セリンプロテアーゼを用いて得られたペプチド組成物では、Ile-Pro (IP)及びVal-Pro-Leu (VPL)に加えて、Ile-Pro-Leu (IPL)及びLeu-Pro-Val-Leu (LPVL)が共通して含まれていた。また、サケ白子由来のペプチド組成物では、加水分解酵素の種類を変えた場合においても、Ile-Pro (IP)及びVal-Pro-Leu (VPL)に加えて、Ile-Pro-Leu (IPL)が共通して含まれていた。【００６８】
（実施例９）
（各魚介類白子由来ペプチド組成物のDPPIV阻害活性およびペプチド含量）
各魚介類（シロサケ、カラフトマス、ニシン、マダラ、カツオ、ブリ（ハマチ）、イカ）白子を原料とし、実施例１の方法に倣い、ペプチド組成物を得た。すなわち、各魚種白子粉砕処理物10gに対して加水し、溶液をpH8.0に調整した後、酵素（プロテアーゼP「アマノ」3SD）0.016gを添加し、50℃5時間の酵素分解反応を行った。反応後、反応液を90℃に加温して酵素失活させ、冷却した後、セライトを用いて濾過した。濾液を凍結乾燥し、DPPIV阻害ペプチド組成物の粉末を得た。【００６９】
上記ペプチド組成物は蒸留水にて溶解し、0.45μmのメンブレンフィルター処理を行い、DPPIV阻害活性測定および活性ペプチド含量の測定に用いた。【００７０】
DPPIV阻害活性の測定はDPPIV Drug Discovery Assay Kit （Enzo life sciences Inc.製）を一部改変して行った。DPPIV酵素の基質としてAMC基質（H-Gly-Pro-アミノ-4-メチルクマリン、BML-P189-9090；Biomol社製）を用い、酵素としてDPPIV（Human、recombinant；Biomol社製）、対照阻害剤として、ディプロチンＡ（DiprotinA、株式会社ペプチド研究所製）を使用した。すなわち、96穴プレートに25μLの50mM Tris緩衝液（pH 7.5）及び上記ペプチド組成物（3、10または20mg/mL）10μL、AMC基質溶液（0.01mM）50μLを添加、混和し、37℃でプレインキュベーションした。この溶液にDPPIV（0.002mU/μL）溶液 15μLを添加して反応を開始し、マイクロプレートリーダー（GENio Pro、TECAN社製）によって励起波長340nm、測定波長460nmにおける蛍光強度を5分間おきに30分間測定した。サンプル無添加のものの活性を100％として算出した各サンプルの相対活性値からDPPIV阻害活性IC50値（μM）を算出した。【００７１】
結果を図４に示す。魚種による差があるものの、今回サンプルとして用いたいずれの魚種からも高いDPPIV阻害活性が認められた。【００７２】
次に、ペプチド組成物中の活性ペプチドの定量を行った。Xevo-TQD（Waters社製）を用いて、下記条件Cで定量した。
（活性ペプチド定量条件C）
＜UPLC分析条件＞
・UPLCシステム：ACQUITY（Waters社製）
・カラム：ACQUITY HSS PFP、1.8μm、2.1×150mm (Waters社製)
・移動相A：H2O（0.1容量％ギ酸含有、関東化学製、LC-MS用）
・移動相B：メタノール（関東化学製、LC-MS用）
・グラジエント：0〜15分にかけてB液20容量%からB液72容量％へのリニアグラジエント、15-20分にかけてB液80容量％保持。
・分析時間：20分
・流量：0.2mL/min
＜MS検出条件＞
・システム：Xevo-TQD（Waters社製）
・イオン化モード：ESI+、MS MRM測定 precursor/product ions (Q1/Q3)：IP=229.1/86.0, VPI=328.2/229.1, VPL=328.2/229.1, IPI=342.1/229.1, LPL=342.1/229.1, IPL=342.2/229.1, LPF=376.1/263.2, FPVG=419.2/120.0, LPVL=441.3/169.1, VPFP=459.2/197.1
定量した結果［各ペプチド組成物中の活性ペプチドの含有量（mg/100g）］を表7に示す。今回サンプルとして用いたいずれの魚種からもDPPIV阻害活性ペプチドが検出された
。【００７３】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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