(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血由来間葉幹細胞（ＵＣＢ−ＭＳＣ）を培地中で培養する段階と、
前記培養する段階から得られた培養物におけるトロンボスポンジン−２（ＴＳＰ−２）の濃度を測定する段階と、
前記測定された濃度に基づいて、培養された細胞の軟骨細胞への分化能を確認する段階と、
を含み、
前記確認する段階は、維持培地で１日間単層培養した場合の前記ＵＣＢ−ＭＳＣのＴＳＰ−２発現量が、７２ｐｇ／ｍｌ／１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓより高い場合に、前記ＵＣＢ−ＭＳＣは軟骨細胞に分化する能力が高いと判定すること、あるいは
維持培地で７日間ペレット培養した場合の前記ＵＣＢ−ＭＳＣのＴＳＰ−２発現量が、５５０ｐｇ／ｍｌ／１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓより高い場合に、前記ＵＣＢ−ＭＳＣは軟骨細胞に分化する能力が高いと判定すること
を含む、ＵＣＢ−ＭＳＣの軟骨細胞への分化能を確認する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の一つ以上の具体例は、幹細胞、例えば、ＭＳＣ（間葉系幹細胞）の細胞活性と関連したＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦ並びにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨は、高密度の結合組織の一タイプである。軟骨は丈夫であるが柔軟な（stiff yet flexible）ゲル類似マトリックスに分散された軟骨細胞（chondrocyte）から構成される。軟骨は、血管を含んでおらず、栄養分は、前記マトリックスを介して拡散される。軟骨は、三種の主要タイプがある：ヒアリン（hyaline）軟骨（例：鼻，気管，細気管支の軟骨及び関節軟骨）、弾性（elastic）軟骨（例：外耳、ユースタキオ管の一部、喉頭軟骨の一部）、及び線維軟骨（fibrocartilage）（例：半月板（meniscus），椎間板の軟骨）。軟骨の主目的のうち一つは、骨沈積を始めさせることである。他の一つは、骨の関節運動のための軟らかい表面を提供することである。さらに他の目的は、強いが柔軟な支持を提供するためのものである。
【０００３】
軟骨損傷または不全（failure）を治療するためのさまざまな方策がある。退行性関節炎（osteoarthritis）は、一般的に相対的に弱く（relatively mild）始まり、時間及び摩耗（wear）によって悪化する退行性疾患である。薬物治療には、抗炎症剤（例：ジクロフェナック、イブプロフェン及びナプロクセン）、ＣＯＸ−２選択的阻害剤、ヒドロコルチソン、グルコサミン及び硫酸コンドロイチンのような薬物が軟骨欠損による痛みを弱化させると知られている。
【０００４】
トロンボスポンジン−２（ＴＳＰ−２：thrombospondin−２）は、強力な抗血管新生活性（anti-angiogenic activity）を有した分泌された、細胞外マトリックス糖蛋白質である（非特許文献１）。
【０００５】
トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１：thrombospondin−１）は、同じモノマーから構成されたマルチマー糖蛋白質である。前記モノマーは、還元条件のＳＤＳ−PAGEで、約１８５ＫＤａの分子量を有する。主マルチマーは、非還元ゲルで、約４５０ＫＤａの分子量を有するトリマーであり、沈降平衡によって分子量は、モノマーに対して１３５ＫＤａ、トリマーに対して４２０ＫＤａである。モノマーのアミノ酸残基から予測された分子量は、１２７，５２４Ｄａであり、糖化及びβ−ヒドロキシル化を反映していない。ＴＳＰ−１は、細胞の吸着、増殖及び走化性に関与すると知られている。ＴＳＰ−１はまた、悪性腫瘍の進行に関与すると知られている。
【０００６】
ＩＬ−１７ＢＲ（interleukin−１７Ｂ receptor）は、人間の場合、ＩＬ１７ＲＢ遺伝子によってコーディングされる蛋白質である。ＩＬ−１７ＢＲは、ＩＬ１７ＢとＩＬ１７Ｅとに特異的に結合し、ＩＬ１７及びＩＬ１７Ｃには結合しないサイトカイン受容体である。
【０００７】
ＨＢ−ＥＧＦは、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）のｅｒｂクラスに結合することによって、生物学的活性を発揮する。ＨＢ−ＥＧＦは、ヘパリンと高い親和性をもって結合する。ＨＢ−ＥＧＦは、ＥＧＦＲに結合し、標的細胞で、細胞移動及び増殖を含んだ成長因子の生物学的効果を調節すると見られる。ＨＢ−ＥＧＦは、線維芽細胞、平滑筋細胞及び上皮細胞に対して、細胞分裂促進（mitogenic）活性を有する。ＨＢ−ＥＧＦは、熱に弱い陽イオン性蛋白質であり、分子量約２２，０００Ｄａを有する。ＨＢ−ＥＧＦは、内蔵虚血と関連した症状、例えば、内蔵細胞懐死（intestinal cell necrosis）及び小腸結腸炎（enterocolitis）を治療すると知られている。ＨＢ−ＥＧＦはまた、哺乳動物で、肝疾患及び肝細胞死滅（liver cell death）を抑制し、肝再生を促進すると知られている。
【０００８】
このような先行技術にもかかわらず、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦと、幹細胞の軟骨細胞への分化との関連性については、依然として明らかにされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bornstein et al．，2000，Matrix Biology 19: 557-568
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の一具体例は、幹細胞活性と関連したＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦ、またはそれを発現する幹細胞を提供することである。
【００１１】
本発明の他の具体例は、幹細胞細胞活性と関連したＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦ、またはそれを発現する幹細胞を利用する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一具体例は、ＴＳＰ−２及びＴＳＰ−２を発現する細胞から構成される群から選択された一つ以上を含む、細胞の軟骨細胞への分化を促進する組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の一具体例による、ＴＳＰ−２を含む組成物は、細胞、例えば、ＭＳＣが軟骨細胞に分化されることを促進させるものであってもよい。
【００１４】
本発明の一つ以上の具体例による、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２またはＩＬ−１７ＢＲを利用する、細胞、例えば、ＭＳＣが軟骨細胞に分化する能力を確認する方法によれば、効率的にＭＳＣが軟骨細胞に分化する能力を確認することができる。
【００１５】
本発明の一つ以上の具体例による、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、またはＩＬ−１７ＢＲを利用する、細胞、例えば、ＭＳＣを軟骨細胞に分化させる方法によれば、効率的に細胞、例えば、ＭＳＣを軟骨細胞に分化させるものであってもよい。
【００１６】
本発明の一具体例による、細胞、例えば、ＭＳＣを病変組織細胞に分化させる方法によれば、効率的に細胞、例えば、ＭＳＣを病変組織細胞に分化させるものであってもよい。
【００１７】
本発明の一具体例による、細胞、例えば、ＭＳＣの活性を調節する物質を探索する方法によれば、細胞、例えば、ＭＳＣの活性を調節する物質を効率的に探索することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】７個のＵＣＢ−ＭＳＣ細胞タイプ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６及びＣ７をそれぞれ分化培地で４週間分化させた結果を示す図面である。
【図２】軟骨分化培地で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣのＴＳＰ−２ｍＲＮＡ発現量を示す図面である。
【図３】ＥＬＩＳＡ分析を介した培養上澄み液中のＴＳＰ−２の量を示す図面である。
【図４】ＥＬＩＳＡ分析を介した培養上澄み液中のＴＳＰ−２の量を示す図面である。
【図５】ＴＳＰ−２存在下または不存在下で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣのペレット・サイズを示す図面である。
【図６】軟骨分化培地で培養された６個のＵＣＢ−ＭＳＣタイプの培養上澄み液中に発現されたＴＳＰ−２を示す図面である。
【図７】in vitroでＵＣＢ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとの軟骨分化を示す図面である。
【図８】ＵＣＢ−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣの軟骨生成細胞系（chondrogenic lineage）への分化能を示す図面である。
【図９】６週で本実施例で分析されたそれぞれ１０個のＢＭ−ＭＳＣ細胞タイプ及びＵＣＢ−ＭＳＣ細胞タイプの軟骨分化を示すイメージである。
【図１０】６週でＵＣＢ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとの軟骨生成能の差を示す図面である。
【図１１】成長因子組み合わせの存在の下で、単層培養とペレット培養とを行った場合、ＴＳＰ−２の発現を示す図面である。
【図１２】ＵＣＢ−ＭＳＣ細胞タイプによるＴＳＰ−２発現程度を示す図面である。
【図１３】Ｃ３ ＵＣＢ−ＭＳＣ及びＣ５ ＵＣＢ−ＭＳＣを３日間ペレット培養し、ＴＳＰ−２発現量を測定した結果である。
【図１４】分化及び脱分化の条件で、ＵＣＢ−ＭＳＣによるＴＳＰ−２発現量を示すグラフである。
【図１５】ＴＳＰ−２の存在下で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣのマーカー蛋白質発現量を示す図面である。
【図１６】ＴＳＰ−２の存在下で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣのマーカー蛋白質発現量を示す図面である。
【図１７】ＴＳＰ−２の存在下で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣのマーカー蛋白質発現量を示す図面である。
【図１８】ＴＳＰ−２発現抑制条件で、軟骨生成培地で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣの軟骨分化程度を示すグラフである。
【図１９】正常人と骨関節炎患者の血漿でのＴＳＰ−２レベルを示す図面である。
【図２０】関節炎患者の関節液存在下で、ＵＣＢ−ＭＳＣのＴＳＰ−１発現量を示すグラフである。
【図２１】関節炎患者の関節液存在下で、ＵＣＢ−ＭＳＣのＴＳＰ−１発現量を示すグラフである。
【図２２】軟骨に分化されたＵＣＢ−ＭＳＣを溶解させ、ＩＬ−１７ＢＲ ｍＲＮＡの量を、ＲＴ−ＰＣＲを介して分析する結果を示す図面である。
【図２３】関節炎患者の関節液の存在下で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣで、ＨＢ−ＥＧＦｍＲＮＡを測定した結果を示す図面である。
【図２４】軟骨細胞死滅条件で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣで、ＨＢ−ＥＧＦ発現量を示す図面である。
【図２５】ＨＢ−ＥＧＦ存在下で培養されたウサギ由来軟骨細胞を観察した結果を示す図面である。
【図２６】ＵＣＢ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとのペレット培養結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の一具体例は、ＴＳＰ−２及びＴＳＰ−２を発現する細胞から構成される群から選択された一つ以上を含む、細胞の軟骨細胞への分化を促進する組成物を提供する。
【００２０】
トロンボスポンジン−２（ＴＳＰ−２：thrombospondin−２）は、強力な抗血管新生活性（anti-angiogenic activity）を有した分泌された、細胞外マトリックス糖蛋白質である（Bornstein et al．，2000，Matrix Biology 19：557-568）。ＴＳＰ−２は、ジスルフィド連結されたホモトリマー糖蛋白質であり、人間では、ＴＨＢＳ２遺伝子によってコーディングされる。ＴＳＰ−２は、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００３２３８（ヒト）（配列番号１）、またはＮＰ＿０３５７１１（マウス）（配列番号２）に開示されたアミノ酸配列、またはそれから誘導される配列を有するものであってもよい。
【００２１】
前記組成物は、担体をさらに含むものであってもよい。前記担体は、薬剤学的に許容可能なものであってもよい。例えば、前記担体は、培地、バッファ及び生体適合性重合体からなる群から選択されるものであってもよい。前記生体適合性重合体は、二次元的構造内または三次元的構造内で、細胞を支持及び／または細胞活性を維持することができる一般的に知られた重合体のうちから選択されるものであってもよい。前記生体適合性重合体の例は、ヒアルロン酸、ヒドロキシアパタイト、キトサン、コラーゲン及びフィブリンからなる群から選択される一つ以上が含まれる。
【００２２】
前記組成物は、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥を治療または予防するためのものであってもよい。軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥は、関節炎または関節変形を含んでもよい。前記関節炎は、リューマチ関節炎及び退行性関節炎であってもよい。軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥は、例えば、老化現象による退行性関節炎；肥満を含んだ関節の過負荷による早期退行性関節炎；スポーツや転落（falling）、事故などによる外傷；外傷による軟骨損傷を放置し、さらに発生した退行性関節炎；靭帯の損傷、関節周囲の筋肉弱化、関節が外れる脱臼、関節内ガラス体発生、骨の成長障害による関節変形；のうち一つ以上から由来するものであってもよい。また、前記接触される細胞は、例えば、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥によって露出される組織、例えば、滑液（synovial fluid）、骨膜、骨及び骨髄のうち一つ以上から由来する細胞であってもよい。
【００２３】
前記組成物は、３０ｐｇないし３００ｍｇのＴＳＰ−２を含んでもよい。例えば、１０ｎｇないし３００ｍｇ、１００ｎｇないし３００ｍｇ、１μgないし３００ｍｇ、１０μgないし３００ｍｇ、または１０μgないし３００ｍｇのＴＳＰ−２を含んでもよい。
【００２４】
また、前記組成物は、１ｘ１０４cells／ｍｌないし１ｘ１０６cells／ｍｌ、５ｘ１０４cells／ｍｌないし１ｘ１０６cells／ｍｌ、２．５ｘ１０５cells／ｍｌないし１ｘ１０６cells／ｍｌ、または５ｘ１０５cells／ｍｌないし１ｘ１０６cells／ｍｌのＴＳＰ−２を生産する細胞を含んでもよい。
【００２５】
前記組成物は、in vitroまたはin vivoで、前記分化を促進するものであってもよい。in vivo分化促進の場合、分化が起きる個体は、哺乳動物であってもよい。
【００２６】
前記細胞は、幹細胞であってもよい。前記幹細胞は、誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳ cell：induced pluripotent stem cell）、胚芽由来幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択されるものであってもよい。前記成体幹細胞は、間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、内皮幹細胞及び造血幹細胞からなる群から選択されるものであってもよい。前記間葉幹細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト由来のものであってもよい。前記間葉幹細胞は、例えば、骨髄由来間葉幹細胞、臍帯血由来間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、胚嚢（embryonic yolk sac）由来間葉幹細胞、胎盤由来間葉幹細胞、皮膚由来間葉幹細胞、末梢血液由来間葉幹細胞、筋肉由来間葉幹細胞、肝由来間葉幹細胞、神経組織由来間葉幹細胞、骨膜（periosteum）由来間葉幹細胞、臍帯（umbilical cord）由来間葉幹細胞、胎児膜（fetal membrane）由来間葉幹細胞、滑液膜（synovium）由来間葉幹細胞、羊膜（amniotic membrane）由来間葉幹細胞、半月状軟骨（meniscus）由来間葉幹細胞、前十字靭帯（anterior cruciate ligament）由来間葉幹細胞、関節軟骨細胞（articular chondrocytes）由来間葉幹細胞、及び間葉幹細胞が存在するその他の組織から分離及び／または培養された間葉幹細胞から構成された群から選択される一つ以上の間葉幹細胞であってもよい。
【００２７】
前記細胞は、前記ＴＳＰ−２を生産し、細胞外部に分泌する細胞であってもよい。すなわち、前記細胞は、自体がＴＳＰ−２を分泌し、自体が前記ＴＳＰ−２と相互作用し、軟骨細胞に分化されるものであってもよい。また前記細胞は、他の細胞によって生産されて分泌されたり、または外部から投与されたＴＳＰ−２に接触される細胞であってもよい。前記接触される細胞は、例えば、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥がある組織に存在する細胞であってもよい。本明細書において、「軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥がある組織に存在する細胞」とは、前記組織自体だけではなく、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥によって露出される組織に存在する細胞であってもよい。軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥の程度によって、前記露出される組織は異なりうる。前記組織は、例えば、滑液、骨膜、骨及び骨髄からなる群から選択されるものであってもよい。前記組織は、関節炎または関節変形がある組織であってもよい。前記関節炎は、リューマチ関節炎及び退行性関節炎であってもよい。前記接触される細胞は、例えば、老化現象による退行性関節炎；肥満を含んだ関節の過負荷による早期退行性関節炎；スポーツや転落、事故などによる外傷；外傷による軟骨損傷を放置し、さらに発生した退行性関節炎；靭帯の損傷、関節周囲の筋肉弱化、関節が外れる脱臼、関節内ガラス体発生、骨の成長障害による関節変形組織；のうち一つ以上から由来する細胞であってもよい。
【００２８】
前記「ＴＳＰ−２を生産する細胞」とは、天然的にＴＳＰ−２を生産したり、ＴＳＰ−２を生産するように誘導された細胞であってもよい。前記組成物は、細胞がＴＳＰ−２を生産するように誘導する誘導物質をさらに含んでもよい。
【００２９】
前記「ＴＳＰ−２を生産する細胞」は、幹細胞であってもよい。前記幹細胞は、誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳ cells）、胚芽由来幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択されるものであってもよい。前記成体幹細胞は、間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、内皮幹細胞及び造血幹細胞からなる群から選択されるものであってもよい。前記間葉幹細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト由来のものであってもよい。前記間葉幹細胞は、例えば、骨髄由来間葉幹細胞、臍帯血由来間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、胚嚢由来間葉幹細胞、胎盤由来間葉幹細胞、皮膚由来間葉幹細胞、末梢血液由来間葉幹細胞、筋肉由来間葉幹細胞、肝由来間葉幹細胞、神経組織由来間葉幹細胞、骨膜由来間葉幹細胞、臍帯由来間葉幹細胞、胎児膜由来間葉幹細胞、滑液膜由来間葉幹細胞、羊膜由来間葉幹細胞、半月状軟骨由来間葉幹細胞、前十字靭帯由来間葉幹細胞、関節軟骨細胞由来間葉幹細胞、及び間葉幹細胞が存在するその他の組織から分離及び／または培養された間葉幹細胞から構成された群から選択される一つ以上の間葉幹細胞であってもよい。
【００３０】
前記「ＴＳＰ−２を生産する細胞」と前記「分化される細胞」は、同一でもあるし、異なることもある。すなわち、ＴＳＰ−２を生産する細胞は、パラクリン（paracrine）またはオートクリン（autocrine）によって作用するものであってもよい。前記「分化される細胞」は、前記ＴＳＰ−２を生産し、細胞外部に分泌する細胞であってもよい。すなわち、前記細胞は、自体がＴＳＰ−２を分泌し、自体が前記ＴＳＰ−２と相互作用し、軟骨細胞に分化されるものであってもよい。また前記細胞は、他の細胞によって生産されて分泌されたり、または外部から投与されたＴＳＰ−２に接触される細胞であってもよい。前記接触される細胞は、例えば、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥がある組織に存在する細胞であってもよい。本明細書において、「軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥がある組織に存在する細胞」とは、前記組織自体だけではなく、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥によって露出される組織に存在する細胞であってもよい。軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥の程度によって、前記露出される組織は、異なってもよい。前記組織は、例えば、滑液、骨膜、骨及び骨髄からなる群から選択されるものであってもよい。前記組織は、関節炎または関節変形がある組織であってもよい。前記関節炎は、リューマチ関節炎及び退行性関節炎であってもよい。前記接触される細胞は、例えば、老化現象による退行性関節炎；肥満を含んだ関節の過負荷による早期退行性関節炎；スポーツや転落、事故などによる外傷；外傷による軟骨損傷を放置し、さらに発生した退行性関節炎；靭帯の損傷、関節周囲の筋肉弱化、関節が外れる脱臼、関節内ガラス体発生、骨の成長障害による関節変形組織；のうち一つ以上から由来する細胞であってもよい。
【００３１】
前記「ＴＳＰ−２を生産する細胞」は、ＴＳＰ−２を設定された値より高い量で発現する細胞であってもよい。前記「設定された値」は、標準細胞（reference cell）が発現する量であってもよい。前記標準細胞は、軟骨細胞に分化する能力が認知されているものであってもよい。かような分化能は、in vitroで分化培地で培養し、分化を誘導することによって知られたものであってもよい。また、前記標準細胞を個体に投与し、in vivoで分化する能力が確認されたものであってもよい。前記標準細胞は、ＢＭ−ＭＳＣ、線維芽細胞及びＵＣＢ−ＭＳＣから構成された群から選択されるものであってもよい。前記ＵＣＢ−ＭＳＣは、Ｃ５、Ｃ６及びＣ７から構成された群から選択されるものであってもよい。
【００３２】
前記設定された値は、維持培地または誘導培地で、軟骨細胞に分化する活性が低い幹細胞から発現される値以上であってもよい。前記軟骨細胞に分化する活性が低いＭＳＣは、Ｃ５，Ｃ６またはＣ７ ＵＣＢ−ＭＳＣであってもよい。
【００３３】
前記設定された値は、ＴＳＰ−２を生産する細胞が、１日間維持培地で培養される場合、７２ｐｇ／１０５cells／ｍｌ以上であってもよい。前記設定された値は、ＴＳＰ−２を生産する細胞が７日間誘導培地でペレット培養される場合、５５０ｐｇ／１０５cells／ｍｌ以上であってもよい。
【００３４】
前記設定された値は、ＭＥＭ−α、ＭＳＣ維持培地（例：１０％ＦＢＳ、及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン含有のＭＥＭ−α培地）、及びＭＳＣの軟骨細胞への分化培地（例：高いグルコース濃度のＤＭＥＭ（４，５００ｍｇ／Ｌグルコース含有）、５０μｇ／ｍｌアスコルベート、０．１μＭデキサメタゾン、４０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリン、１００μｇ／ｍｌピルベート、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−β３、５００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−６、５０ｍｇ／ｍｌ ＩＴＳ＋及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン含有の培地）からなる群から選択された培地で発現されたＴＳＰ−２の値であってもよい。
【００３５】
前記ＴＳＰ−２は、細胞破砕物及び／または培養上層（supernatant）で発現されたものであってもよい。前記ＴＳＰ−２は、ｍＲＮＡレベルまたは蛋白質レベルで測定された濃度であってもよい。
【００３６】
前記組成物は、細胞を軟骨細胞に分化させる活性を促進するものであってもよい。前記細胞は、前記「ＴＳＰ−２を発現する細胞」と同一であるか異なってもよい。
【００３７】
前記「細胞」は、前記ＴＳＰ−２を生産し、細胞外部に分泌する細胞であってもよい。すなわち、前記細胞は、自体がＴＳＰ−２を分泌し、自体が前記ＴＳＰ−２と相互作用し、軟骨細胞に分化されるものであってもよい。また前記細胞は、他の細胞によって生産されて分泌されたり、または外部から投与されたＴＳＰ−２に接触される細胞であってもよい。前記接触される細胞は、例えば、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥がある組織に存在する細胞であってもよい。本明細書において、「軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥がある組織に存在する細胞」とは、前記組織自体だけではなく、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥によって露出される組織に存在する細胞であってもよい。軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥の程度によって、前記露出される組織は、異なってもよい。前記組織は、例えば、滑液、骨膜、骨及び骨髄からなる群から選択されるものであってもよい。前記組織は、関節炎または関節変形がある組織であってもよい。前記関節炎は、リューマチ関節炎及び退行性関節炎であってもよい。前記接触される細胞は、例えば、老化現象による退行性関節炎；肥満を含んだ関節の過負荷による早期退行性関節炎；スポーツや転落、事故などによる外傷；外傷による軟骨損傷を放置し、さらに発生した退行性関節炎；靭帯の損傷、関節周囲の筋肉弱化、関節が外れる脱臼、関節内ガラス体発生、骨の成長障害による関節変形組織；のうち一つ以上から由来する細胞であってもよい。例えば、前記ＴＳＰ−２を発現する細胞の周辺に位置する細胞であってもよい。
【００３８】
他の様相は、細胞を軟骨細胞に分化させるのに有効な量のＴＳＰ−２を発現する細胞からなる群から選択された一つ以上を含む組成物を個体に投与する段階を含む、個体で細胞を軟骨細胞に分化させる方法を提供する。
【００３９】
前記「細胞を軟骨細胞に分化させるのに有効な量」は、一定の比率の細胞を軟骨細胞に分化させるのに十分な量であってもよい。前記量は、選択される細胞及びＴＳＰ−２を発現する細胞によって、当業者が容易に選択することができる。例えば、前記量は、１日ないし７日内に、総幹細胞の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上を軟骨細胞に分化させるものであってもよい。前記「ＴＳＰ−２を発現する細胞」は、前記の通りである。前記「分化される細胞」については、前記の通りである。前記個体は、哺乳動物、例えば、人間、マウス及びウサギからなる群から選択されるものであってもよい。
【００４０】
他の様相は、幹細胞を培地中で培養する段階と、前記培養物から、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦからなる群から選択された一つ以上の濃度を測定する段階と、前記測定された濃度に基づいて、培養された細胞の軟骨細胞への分化能を確認する段階と、を含む、幹細胞の軟骨細胞への分化能を確認する方法を提供する。
【００４１】
前記方法は、幹細胞を培地中で培養する段階を含む。幹細胞を培地中で培養することは知られている。当業者であるならば、選択される幹細胞によって、適切な培地及び条件を選択することができる。
【００４２】
前記幹細胞は、誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳ cells）、胚芽由来幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択されるものであってもよい。前記成体幹細胞は、間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、内皮幹細胞及び造血幹細胞からなる群から選択されるものであってもよい。前記間葉幹細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト由来のものであってもよい。前記間葉幹細胞は、例えば、骨髄由来間葉幹細胞、臍帯血由来間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、胚嚢由来間葉幹細胞、胎盤由来間葉幹細胞、皮膚由来間葉幹細胞、末梢血液由来間葉幹細胞、筋肉由来間葉幹細胞、肝由来間葉幹細胞、神経組織由来間葉幹細胞、骨膜由来間葉幹細胞、臍帯由来間葉幹細胞、胎児膜由来間葉幹細胞、滑液膜由来間葉幹細胞、羊膜由来間葉幹細胞、半月状軟骨由来間葉幹細胞、前十字靭帯由来間葉幹細胞、関節軟骨細胞由来間葉幹細胞、及び間葉幹細胞が存在するその他の組織から分離及び／または培養された間葉幹細胞から構成された群から選択される一つ以上の間葉幹細胞であってもよい。
【００４３】
例えば、前記幹細胞は、ＭＳＣであってもよい、前記培地は、ＭＳＣ維持の培地、または軟骨細胞に分化させる分化の培地であってもよい。前記培地は、ＭＥＭ−α、ＭＳＣ維持培地（例：１０％ＦＢＳ、及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン含有のＭＥＭ−α培地）、及びＭＳＣの軟骨細胞への分化培地（例：高いグルコース濃度のＤＭＥＭ、５０μｇ／ｍｌアスコルベート、０．１μＭデキサメタゾン、４０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリン、１００μｇ／ｍｌピルベート、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−β３、５００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−６、５０ｍｇ／ｍｌ ＩＴＳ＋及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン含有の培地）から構成される群から選択される培地であってもよい。その他前記培養は、ＭＳＣ培養で一般的に知られた方法で培養されるものであってもよい。
【００４４】
前記「幹細胞を培地中で培養する段階」は、他の細胞を含まずに、幹細胞だけを培養するものであるか、あるいは幹細胞以外に、他の細胞を含んでもよい。前記「他の細胞」は、ＴＳＰ−２を生産し、細胞外部に分泌する細胞であってもよい。すなわち、前記細胞は、自体がＴＳＰ−２を分泌し、自体が前記ＴＳＰ−２と相互作用し、軟骨細胞に分化されるものであってもよい。また前記細胞は、他の細胞によって生産されて分泌されたり、または外部から投与されたＴＳＰ−２に接触される細胞であってもよい。前記接触される細胞は、例えば、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥がある組織に存在する細胞であってもよい。本明細書において、「軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥がある組織に存在する細胞」とは、前記組織自体だけではなく、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥によって露出される組織に存在する細胞であってもよい。軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥の程度によって、前記露出される組織は、異なってもよい。前記組織は、例えば、滑液、骨膜、骨及び骨髄からなる群から選択されるものであってもよい。前記組織は、関節炎または関節変形がある組織であってもよい。前記関節炎は、リューマチ関節炎及び退行性関節炎であってもよい。前記接触される細胞は、例えば、老化現象による退行性関節炎；肥満を含んだ関節の過負荷による早期退行性関節炎；スポーツや転落、事故などによる外傷；外傷による軟骨損傷を放置し、さらに発生した退行性関節炎；靭帯の損傷、関節周囲の筋肉弱化、関節が外れる脱臼、関節内ガラス体発生、骨の成長障害による関節変形組織；のうち一つ以上から由来する細胞であってもよい。例えば、前記ＴＳＰ−２を発現する細胞の周辺に位置する細胞であってもよい。
【００４５】
前記方法は、前記培養物から、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦからなる群から選択された一つ以上の濃度を測定する段階を含む。前記ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦからなる群から選択された一つ以上の濃度は、細胞破砕物または培養上層液から測定されるものであってもよい。前記ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦからなる群から選択された一つ以上の濃度は、ｍＲＮＡレベルまたは蛋白質レベルで測定されるものであってもよい。ｍＲＮＡまたは蛋白質のレベルを測定する方法は、知られている。例えば、定量的ＰＣＲまたはＥＬＩＳＡが使われてもよい。
【００４６】
トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）は、同じモノマーから構成されたマルチマー糖蛋白質である。前記モノマーは、還元条件のＳＤＳ−PAGEで、約１８５ＫＤａの分子量を有する。主マルチマーは、非還元ゲルで、約４５０ＫＤａの分子量を有するトリマーであり、沈降平衡によって分子量は、モノマーに対して１３５ＫＤａ、トリマーに対して４２０ＫＤａである。モノマーのアミノ酸残基から予測された分子量は、１２７，５２４Ｄａであり、糖化及びβ−ヒドロキシル化を反映していない。ＴＳＰ−１は、細胞の吸着、増殖及び走化性に関与すると知られている。ＴＳＰ−１はまた、悪性腫瘍の進行に関与すると知られている。ＴＳＰ−１は、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００３２３７（ヒト）（配列番号３）、及びＮＰ＿０３５７１０（マウス）（配列番号４）のアミノ酸配列、及びそれらから由来したものであってもよい。
【００４７】
ＩＬ−１７ＢＲは、人間の場合、ＩＬ１７ＲＢ遺伝子によってコーディングされる蛋白質である。ＩＬ−１７ＢＲは、ＩＬ１７ＢとＩＬ１７Ｅとに特異的に結合し、ＩＬ１７及びＩＬ１７Ｃには結合しないサイトカイン受容体である。ＩＬ−１７ＢＲは、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿７５８４３４（ヒト）（配列番号５）、及びＮＰ＿０６２５２９（マウス）（配列番号６）のアミノ酸配列、及びそれらから由来したものであってもよい。
【００４８】
ＨＢ−ＥＧＦは、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）のｅｒｂクラスに結合することによって、生物学的活性を発揮する。ＨＢ−ＥＧＦは、ヘパリンと高い親和性をもって結合する。ＨＢ−ＥＧＦは、ＥＧＦＲに結合し、標的細胞で細胞移動及び増殖を含んだ成長因子の生物学的効果を調節すると見られる。ＨＢ−ＥＧＦは、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１９３６（ヒト）（配列番号７）、及びＮＰ＿０３４５４５（マウス）（配列番号８）のアミノ酸配列、及びそれらから由来したものであってもよい。
【００４９】
前記方法は、前記測定された濃度に基づいて、培養された細胞の軟骨細胞への分化能を確認する段階を含んでもよい。
【００５０】
前記確認する段階は、前記測定されたＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦからなる群から選択された一つ以上の濃度を軟骨細胞に分化する能力が確認された標準細胞を対照群として得られた濃度と比較する段階を含んでもよい。
【００５１】
前記確認する段階は、前記測定された濃度が、前記標準細胞から得られた濃度より高い場合は、前記幹細胞の軟骨細胞への分化能が高いと判定し、前記測定された濃度が、前記標準細胞から得られた濃度より低いか、あるいは同じである場合は、前記幹細胞の軟骨細胞への分化能が低いと判定することを含んでもよい。
【００５２】
前記確認する段階は、前記幹細胞が、１日間維持培地で、単層培養した場合、ＴＳＰ−２発現量が、７２ｐｇ／ｍｌ／１．０ｘ１０５cellsより高いか、あるいはペレット培養した場合、５５０ｐｇ／ｍｌ／１．０ｘ１０５cellsより高いＴＳＰ−２を発現する場合、前記幹細胞を軟骨細胞に分化する能力が高いと判定することを含んでもよい。前記幹細胞の維持培地は、ＭＥＭ−α、１０％ＦＢＳ及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン含有の培地であり、前記幹細胞の軟骨細胞誘導培地は、高いグルコース濃度のＤＭＥＭ、５０μｇ／ｍｌアスコルベート、０．１μＭデキサメタゾン、４０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリン、１００μｇ／ｍｌピルベート、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−β３、５００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−６、５０ｍｇ／ｍｌ ＩＴＳ＋及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン含有の培地であってもよい。
【００５３】
前記方法は、前記測定されたＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦからなる群から選択された一つ以上の量を軟骨細胞に分化する能力が低いと確認された標準細胞を対照群として得られたＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦからなる群から選択された一つ以上の量と比較する段階をさらに含んでもよい。
【００５４】
また前記方法は、前記標準細胞から得られたＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦからなる群から選択された一つ以上の濃度より１０％以上、２０％以上または３０％以上高い場合は、前記幹細胞の軟骨細胞への分化能が高いと判定するものであってもよい。前記標準細胞は、ＢＭ−ＭＳＣ、線維芽細胞及びＵＣＢ−ＭＳＣからなる群から選択されたものであってもよい。前記ＵＣＢ−ＭＳＣは、Ｃ５、Ｃ６またはＣ７であってもよい。
【００５５】
他の様相は、前記の方法によって得られた軟骨細胞に分化する能力が高いと判定された細胞を軟骨細胞に分化させる段階を含む、細胞を軟骨細胞に分化させる方法を提供する。
【００５６】
前記分化は、in vitroまたはin vivoで行われてもよい。前記方法は、軟骨細胞に分化する能力が高いと判定された細胞、例えば、ＭＳＣを軟骨細胞分化培地中で培養し、in vitroで前記細胞、例えば、ＭＳＣを軟骨細胞に分化させる段階を含んでもよい。前記培養は、生体適合性重合体と共に培養されるものであってもよい。
【００５７】
前記生体適合性重合体は、二次元的構造内または三次元的構造内で、細胞を支持及び／または細胞活性を維持することができる一般的に知られた重合体のうちから選択されるものであってもよい。前記生体適合性重合体は、ヒアルロン酸、ヒドロキシアパタイト、キトサン、フィブリン及びコラーゲンからなる群から選択される一つ以上の重合体であってもよい。
【００５８】
前記方法は、前記細胞、例えば、ＭＳＣを軟骨細胞分化を必要とする個体に投与する段階をさらに含んでもよい。前記個体は、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥を有した個体であってもよい。例えば、前記個体は、関節炎または関節変形を有した個体であってもよい。前記関節炎は、リューマチ関節炎及び退行性関節炎であってもよい。前記個体は、例えば、老化現象による退行性関節炎；肥満を含んだ関節の過負荷による早期退行性関節炎；スポーツや転落、事故などによる外傷；外傷による軟骨損傷を放置し、さらに発生した退行性関節炎；靭帯の損傷、関節周囲の筋肉弱化、関節が外れる脱臼、関節内ガラス体発生、骨の成長障害による関節変形組織；のうち一つ以上を有するものであってもよい。前記外傷は、骨折を含む。前記投与は、静脈、筋肉内または病変部位に局所的に行われてもよい。前記細胞、例えば、ＭＳＣは、担体と共に投与されるものであってもよい。前記担体は、培地、バッファまたは生体適合性重合体であってもよい。前記生体適合性重合体は、二次元的構造内または三次元的構造内で、細胞を支持及び／または細胞活性を維持することができる一般的に知られた重合体のうちから選択されるものであってもよい。前記生体適合性重合体は、ヒアルロン酸、ヒドロキシアパタイト、キトサン、フィブリン及びコラーゲンからなる群から選択される一つ以上の重合体であってもよい。前記細胞は、幹細胞であってもよい。前記幹細胞は、ｉＰＳ細胞、胚芽幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択される一つ以上であってもよい。前記成体幹細胞は、間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、内皮幹細胞及び造血幹細胞からなる群から選択されるものであってもよい。前記間葉幹細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト由来のものであってもよい。前記間葉幹細胞は、例えば、骨髄由来間葉幹細胞、臍帯血由来間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、胚嚢由来間葉幹細胞、胎盤由来間葉幹細胞、皮膚由来間葉幹細胞、末梢血液由来間葉幹細胞、筋肉由来間葉幹細胞、肝由来間葉幹細胞、神経組織由来間葉幹細胞、骨膜由来間葉幹細胞、臍帯由来間葉幹細胞、胎児膜由来間葉幹細胞、滑液膜由来間葉幹細胞、羊膜由来間葉幹細胞、半月状軟骨由来間葉幹細胞、前十字靭帯由来間葉幹細胞、関節軟骨細胞由来間葉幹細胞、及び間葉幹細胞が存在するその他の組織から分離及び／または培養された間葉幹細胞から構成された群から選択される一つ以上の間葉幹細胞であってもよい。
【００５９】
他の様相は、細胞を含む試料を培地で培養する段階と、前記培養物から、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦからなる群から選択された一つ以上の濃度を測定する段階と、を含む、軟骨細胞に分化する能力を有した細胞を含む試料を確認する方法を提供する。
【００６０】
前記培養する段階において、前記細胞は、幹細胞であってもよい。前記幹細胞は、例えば、ＵＣＢ−ＭＳＣであってもよい。前記「軟骨細胞に分化する能力を有した細胞」は、幹細胞、例えば、ＵＣＢ−ＭＳＣであってもよい。また、前記「軟骨細胞に分化する能力を有した細胞」は、幹細胞、例えば、ＵＣＢ−ＭＳＣと、それと共に培養された他の細胞とであってもよい。前記他の細胞は、他のタイプの幹細胞であってもよい。前記「他の細胞」は、ＴＳＰ−２を生産し、細胞外部に分泌する細胞であってもよい。すなわち、前記細胞は、自体がＴＳＰ−２を分泌し、自体の前記ＴＳＰ−２と相互作用し、軟骨細胞に分化されるものであってもよい。また前記細胞は、他の細胞によって生産されて分泌されたり、または外部から投与されたＴＳＰ−２に接触される細胞であってもよい。前記接触される細胞は、例えば、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥がある組織に存在する細胞であってもよい。本明細書において、「軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥がある組織に存在する細胞」とは、前記組織自体だけではなく、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥によって露出される組織に存在する細胞であってもよい。軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥の程度によって、前記露出される組織は、異なってもよい。前記組織は、例えば、滑液、骨膜、骨及び骨髄からなる群から選択されるものであってもよい。前記組織は、関節炎または関節変形がある組織であってもよい。前記関節炎は、リューマチ関節炎及び退行性関節炎であってもよい。前記接触される細胞は、例えば、老化現象による退行性関節炎；肥満を含んだ関節の過負荷による早期退行性関節炎；スポーツや転落、事故などによる外傷；外傷による軟骨損傷を放置し、さらに発生した退行性関節炎；靭帯の損傷、関節周囲の筋肉弱化、関節が外れる脱臼、関節内ガラス体発生、骨の成長障害による関節変形組織；のうち一つ以上から由来する細胞であってもよい。例えば、前記ＴＳＰ−２を発現する細胞の周辺に位置する細胞であってもよい。前記培地は、細胞の維持または軟骨細胞への誘導培地であってもよい。
【００６１】
他の様相は、ヘパリン結合ＥＧＦ類似成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ:heparin binding ＥＧＦ-like growth factor）及びＨＢ−ＥＧＦを発現する幹細胞を含む、軟骨細胞の死滅を減少させるための組成物を提供する。
【００６２】
前記ＨＢ−ＥＧＦは、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）のｅｒｂクラスに結合することによって、生物学的活性を発揮することができる。ＨＢ−ＥＧＦは、ヘパリンと高い親和性をもって結合する。ＨＢ−ＥＧＦは、ＥＧＦＲに結合し、標的細胞で、細胞移動及び増殖を含んだ成長因子の生物学的効果を調節すると見られる。ＨＢ−ＥＧＦは、ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００１９３６（ヒト）（配列番号７）、及びＮＰ＿０３４５４５（マウス）（配列番号８）のアミノ酸配列、及びそれらから由来したものであってもよい。
【００６３】
前記組成物は、ＨＢ−ＥＧＦを発現する幹細胞を含んでもよい。前記幹細胞は、ＵＣＢ−ＭＳＣであってもよい。前記組成物は、担体を含んでもよい。前記担体は、前記の通りである。
【００６４】
他の様相の他の具体例は、軟骨細胞の死滅を減少させるのに十分な量のＨＢ−ＥＧＦ及びＨＢ−ＥＧＦを発現する幹細胞を含む、軟骨細胞の死滅を減少させるための組成物を個体に投与する段階を含む、個体の軟骨細胞の死滅を減少させる方法を提供する。
【００６５】
「軟骨細胞の死滅を減少させるのに十分な量」は、軟骨細胞の死滅を対照群に比べて、減少させるのに十分な量をいう。例えば、軟骨細胞の死滅を対照群に比べて、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上減少させるのに十分な量をいう。前記組成物については、前記の通りである。前記個体は、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥を含む個体であってもよい。軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥は、関節炎、骨多孔症、骨折または関節変形を含んでもよい。前記関節炎は、リューマチ関節炎及び退行性関節炎であってもよい。軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥は、例えば、老化現象による退行性関節炎；肥満を含んだ関節の過負荷による早期退行性関節炎；スポーツや転落、事故などによる外傷；外傷による軟骨損傷を放置し、さらに発生した退行性関節炎；靭帯の損傷、関節周囲の筋肉弱化、関節が外れる脱臼、関節内ガラス体発生、骨の成長障害による関節変形；のうち一つ以上から由来するものであってもよい。また、前記接触される細胞は、例えば、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥によって露出される組織、例えば、滑液、骨膜、骨及び骨髄のうち一つ以上から由来する細胞であってもよい。前記投与は、静脈、筋肉内または病変部位に局所的に行われてもよい。前記個体は、哺乳動物でもある。前記哺乳動物は、ヒト、牛、豚、犬及びマウスを含んでもよい。
【００６６】
前記組成物は、担体をさらに含んでもよい。前記担体は、培地、バッファまたは生体適合性重合体であってもよい。前記生体適合性重合体は、二次元的構造内または三次元的構造内で、細胞を支持及び／または細胞活性を維持することができる一般的に知られた重合体のうちから選択されるものであってもよい。前記生体適合性重合体は、ヒアルロン酸、ヒドロキシアパタイト、キトサン、フィブリン及びコラーゲンからなる群から選択される一つ以上の重合体であってもよい。前記方法は、in vitroまたはin vivoで行われてもよい。
【００６７】
他の様相は、軟骨損傷、変性、喪失、欠陥及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の状態を有する患者の関節液の存在下で、幹細胞を培養する段階を含む、幹細胞からＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦからなる群から選択された一つ以上の蛋白質の発現を増大させる方法を提供する。
【００６８】
前記幹細胞は、ＢＭ−ＭＳＣまたはＵＣＢ−ＭＳＣであってもよい。前記発現は、蛋白質レベルまたはｍＲＮＡレベルで測定されたものであってもよい。前記幹細胞は、前記関節液に対して、同種他家（allogeneic）由来または自家（autologous）由来のものであってもよい。
【００６９】
本明細書において、「軟骨損傷、変性、喪失、欠陥及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の状態」は、関節炎または関節変形を含んでもよい。前記関節炎は、リューマチ関節炎及び退行性関節炎であってもよい。前記状態は、例えば、老化現象による退行性関節炎；肥満を含んだ関節の過負荷による早期退行性関節炎；スポーツや転落、事故などによる外傷；外傷による軟骨損傷を放置し、さらに発生した退行性関節炎；靭帯の損傷、関節周囲の筋肉弱化、関節が外れる脱臼、関節内ガラス体発生、骨の成長障害による関節変形；のうち一つ以上の状態であってもよい。前記方法は、in vitroまたはin vivoで行われてもよい。前記関節液は、前記状態が存在する組織自体だけではなく、軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥によって露出される組織に存在する細胞であってもよい。軟骨の損傷、変性、喪失または欠陥の程度によって、前記露出される組織は、異なってもよい。前記組織は、例えば、滑液、骨膜、骨及び骨髄からなる群から選択されるものであってもよい。また、前記関節液は、前記状態が存在する個体内の任意の位置の関節液であってもよい。
【００７０】
他の様相は、病変組織の存在下で、幹細胞を培養する段階を含む、幹細胞を病変組織細胞に分化させる方法を提供する。
【００７１】
前記病変組織は、関節炎患者の関節液；関節炎患者の関節腔（joint cavity）由来の滑液；急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ：acute respiratory distress syndrome）、気管支喘息、肺ガン、てんかん性肺疾患（interstitial lung disease）または慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ：chronic obstructive pulmonary disease）の患者の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ：bronchoalveolar lavage fluid）；患者から採取された脳脊髓液（spinal fluid）、肋膜液（pleural fluid）、腹水（ascites fluid）、胃液（gastric fluid）；であってもよい。前記培養は、幹細胞の培養と関連した当業界に公知の方法によってなされてもよい。
【００７２】
前記方法は、培養によって得られた病変組織細胞に分化された幹細胞、例えば、ＭＳＣを、病変組織を有した個体に投与し、病変組織を治療する段階をさらに含んでもよい。前記病変組織及び前記幹細胞、例えば、ＭＳＣは、互いに対して、同種他家由来または自家由来のものであってもよい。
【００７３】
前記方法において、前記幹細胞は、ｉＰＳ細胞、胚芽幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択される一つ以上であってもよい。前記成体幹細胞は、間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、内皮幹細胞及び造血幹細胞からなる群から選択されるものであってもよい。前記間葉幹細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト由来のものであってもよい。前記間葉幹細胞は、例えば、骨髄由来間葉幹細胞、臍帯血由来間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、胚嚢由来間葉幹細胞、胎盤由来間葉幹細胞、皮膚由来間葉幹細胞、末梢血液由来間葉幹細胞、筋肉由来間葉幹細胞、肝由来間葉幹細胞、神経組織由来間葉幹細胞、骨膜由来間葉幹細胞、臍帯由来間葉幹細胞、胎児膜由来間葉幹細胞、滑液膜由来間葉幹細胞、羊膜由来間葉幹細胞、半月状軟骨由来間葉幹細胞、前十字靭帯由来間葉幹細胞、関節軟骨細胞由来間葉幹細胞、及び間葉幹細胞が存在するその他の組織から分離及び／または培養された間葉幹細胞から構成された群から選択される一つ以上の間葉幹細胞であってもよい。前記方法は、in vitroまたはin vivoで行われてもよい。
【００７４】
他の様相は、病変組織の存在下で、幹細胞を培養する段階と、前記培養物から発現される産物を測定する段階と、を含む、幹細胞の活性を調節する物質を探索する方法を提供する。
【００７５】
前記方法は、病変組織の存在下で、幹細胞、例えば、ＭＳＣを培養する段階を含む。前記病変組織は、関節炎患者の関節液；関節炎患者の関節腔由来の滑液；急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、気管支喘息、肺ガン、てんかん性肺疾患または慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）の患者の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）；患者から採取された脳脊髓液、肋膜液、腹水、または胃液；であってもよい。前記培養は、前記幹細胞、例えば、ＭＳＣの維持培地（maintenance medium）、または病変組織に該当する組織に分化させる分化培地の存在下で行われてもよい。前記病変組織は、細胞浮遊液体積または細胞濃度または細胞数を基準に５ないし３０％、例えば、１０％ないし２０％の量で培養物中に含まれるものであってもよい。前記培養は、幹細胞の培養と関連した分野の当業者に公知の方法によってなされてもよい。
【００７６】
前記方法において、前記幹細胞は、ｉＰＳ細胞、胚芽幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択された一つ以上であってもよい。前記成体幹細胞は、間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、内皮幹細胞及び造血幹細胞からなる群から選択されるものであってもよい。前記間葉幹細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト由来のものであってもよい。前記間葉幹細胞は、例えば、骨髄由来間葉幹細胞、臍帯血由来間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、胚嚢由来間葉幹細胞、胎盤由来間葉幹細胞、皮膚由来間葉幹細胞、末梢血液由来間葉幹細胞、筋肉由来間葉幹細胞、肝由来間葉幹細胞、神経組織由来間葉幹細胞、骨膜由来間葉幹細胞、臍帯由来間葉幹細胞、胎児膜由来間葉幹細胞、滑液膜由来間葉幹細胞、羊膜由来間葉幹細胞、半月状軟骨由来間葉幹細胞、前十字靭帯由来間葉幹細胞、関節軟骨細胞由来間葉幹細胞、及び間葉幹細胞が存在するその他の組織から分離及び／または培養された間葉幹細胞から構成された群から選択される一つ以上の間葉幹細胞であってもよい。
【００７７】
前記方法は、前記培養物から発現される産物を測定する段階を含む。前記測定は、公知の方法によって行われてもよい。例えば、ＲＮＡである場合、定量的ＰＣＲ、蛋白質である場合、ＥＬＩＳＡによって行われてもよい。前記産物は、ＲＮＡまたは蛋白質であってもよい。
【００７８】
前記方法は、前記測定された産物から、幹細胞、例えば、ＭＳＣの活性を調節する物質を確認する段階を含んでもよい。前記幹細胞、例えば、ＭＳＣの活性は、分化活性であってもよい。例えば、前記方法は、前記測定された産物の量を、対照群実験から得られた産物の量と比較する段階をさらに含んでもよい。前記対照群実験は、陰性対照群実験または陽性対照群実験であってもよい。前記対照群実験は、病変組織を除外したり、あるいは病変組織の代わりに、正常組織の存在下で、幹細胞、例えば、ＭＳＣを培養する段階によって得られる培養物から発現産物を測定するものであってもよい。
【００７９】
前記方法は、前記産物の量が対照群に比べて高い場合、幹細胞、例えば、ＭＳＣの活性を陽性的に調節すると判断する段階を含んでもよい。前記方法は、前記産物の量が対照群に比べて低い場合、幹細胞、例えば、ＭＳＣの活性を陰性的に調節すると判断する段階を含んでもよい。前記分化は、病変組織に該当する組織への分化であってもよい。例えば、病変組織が関節液（joint fluid）である場合、軟骨細胞（chondrocyte）に分化されるものであってもよい。
【００８０】
他の様相は、幹細胞をペレット培養方式で培養する段階を含む、幹細胞から、ＴＳＰ−２及びＨＢ−ＥＧＦからなる群から選択された一つ以上の発現を増大させる方法を提供する。
【００８１】
幹細胞をペレット培養方式で培養する段階は、幹細胞を三次元的に凝集された状態で培養するものであってもよい。ペレット培養は、例えば、細胞を含む懸濁液を遠心分離し、沈殿した細胞ペレットを形成させ、このペレットをそのまま培養するものであってもよい。このとき、培養に使われる初期細胞濃度は、５ｘ１０５cells／ｍｌないし５ｘ１０７cellsであってもよい。前記遠心分離は、３５０ｇないし１，５００ｇで、５分ないし３０分間なされてもよい。前記幹細胞は、誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳ cells）、胚芽由来幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択されるものであってもよい。前記成体幹細胞は、間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、内皮幹細胞及び造血幹細胞からなる群から選択されるものであってもよい。前記間葉幹細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト由来のものであってもよい。前記間葉幹細胞は、例えば、骨髄由来間葉幹細胞、臍帯血由来間葉幹細胞、脂肪由来幹細胞、胚嚢由来間葉幹細胞、胎盤由来間葉幹細胞、皮膚由来間葉幹細胞、末梢血液由来間葉幹細胞、筋肉由来間葉幹細胞、肝由来間葉幹細胞、神経組織由来間葉幹細胞、骨膜由来間葉幹細胞、臍帯由来間葉幹細胞、胎児膜由来間葉幹細胞、滑液膜由来間葉幹細胞、羊膜由来間葉幹細胞、半月状軟骨由来間葉幹細胞、前十字靭帯由来間葉幹細胞、関節軟骨細胞由来間葉幹細胞、及び間葉幹細胞が存在するその他の組織から分離及び／または培養された間葉幹細胞から構成された群から選択される一つ以上の間葉幹細胞であってもよい。
【実施例】
【００８２】
以下、本発明を実施例を介して、さらに詳細に説明する。しかし、該実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【００８３】
実施例１．関節炎患者の関節液によって、ＵＣＢ−ＭＳＣで特異的に誘導される分泌蛋白質の同定
ＵＣＢ−ＭＳＣの軟骨再生及び炎症調節物質の同定のために、関節炎患者の関節液を、ＵＣＢ−ＭＳＣが培養されている培地に、２０（ｖ／ｖ）％濃度になるように添加した後、３時間さらに培養した。得られた培養上澄み液を分析試料として使用した。また、前記関節液を添加していない状態で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣ培養液と、培養されていない培地に前記関節液を２０（ｖ／ｖ）％濃度になるように添加した培地とを、対照群として分析した。前記関節液は、退行性関節炎患者から得た。
【００８４】
それぞれ得られた培養液または対照群試料中に含まれていると予想される蛋白質に、検出可能な標識を付けた。前記標識は、ビオチンであり、前記ビオチンは、蛍光標識されたストレプトアビジンとの特異的な結合によって形成された複合体を、蛍光検出を介して検出した。次に、各試料を５０７個の分泌蛋白質にそれぞれ結合する抗体が固定されている蛋白質チップ（RayBiotech，Inc．，RayBioTM Biotin Label-based Human Antibody Array I；Ｃａｔ＃ＡＡＨ−ＢＬＧ−１−２）に添加し、生産者の指針書によって反応させた。反応後、レーザスキャナー（Axon Genepix Scanner ４０００Ｂ）を使用し、前記蛋白質チップに５３２ｎｍの励起光を照射し、６３５ｎｍで放射光を検出した。このように得られた検出信号を、対照群から得られた標準検出信号と比較し、試料中の各蛋白質の濃度を決定した。
【００８５】
分析結果、関節炎患者の関節液の存在下で、ＵＣＢ−ＭＳＣを培養する場合、そうではない場合に比べ、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＩＬ−１７ＢＲ及びＨＢ−ＥＧＦが顕著に増加した。
【００８６】
実施例２．ＴＳＰ−２とＵＣＢ−ＭＳＣの軟骨分化との関連性
本実施例では、ＴＳＰ−２がＵＣＢ−ＭＳＣの軟骨分化と関連があるか否かを調べた。また、ＴＳＰ−２がＵＣＢ−ＭＳＣの軟骨分化を誘導するか否かを調べた。
【００８７】
（１）ＵＣＢ−ＭＳＣ細胞タイプの軟骨分化能
まず、さまざまなＵＣＢ−ＭＳＣ細胞タイプの軟骨分化能を確認した。各細胞タイプは、軟骨分化培地（chondrogenic culture medium）中で、ペレット培養方法で培養した。前記軟骨分化培地は、５０μｇ／ｍｌアスコルベート、０．１μＭデキサメタゾン、４０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリン、１００μｇ／ｍｌピルベート、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−β３、５００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−６、５０ｍｇ／ｍｌ ＩＴＳ＋及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン含有の高グルコース濃度のＤＭＥＭであり、初期細胞濃度は、５ｘ１０５cells／ｍｌとし、培養は、１５ｍｌポリプロピレン・チューブで４週間培養した。培地は、１週で２回交換し、２８日目にペレットを、パラフィン中に内包された４％パラホルムアルデヒドで固定し、５μｍ切片を作った。前記切片を、サフラニン−Ｏで染色し、陰イオン性プロテオグリカンを検出した。
【００８８】
図１は、７個のＵＣＢ−ＭＳＣ細胞タイプ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６及びＣ７を、それぞれ分化培地で４週間分化させた結果を示す図面である。図１に図示されているように、軟骨分化能が良好であると分類されたＣ１及びＣ２の場合、軟骨標識のラクナ（lacunae）が、明らかな境界線を有した円形に、切断面全体的に良好に形成された。軟骨分化能が中間程度であると分類されたＣ３及びＣ４は、大きさは小さいが、明らかな境界線を有したラクナが、全体面または一部切断面で形成された。軟骨分化能が低いと分類されたＣ５、Ｃ６及びＣ７は、ラクナ構造がほとんど生成されていない。これは、ＵＣＢ−ＭＳＣが、個人間の遺伝的、及び臍帯血採取過程での差によって、異なる分化能を有しているということを示している。
【００８９】
（２）ＴＳＰ−２の軟骨分化能との関連性
軟骨分化能が異なるＵＣＢ−ＭＳＣ細胞タイプを、軟骨分化培地で１週間培養した後、細胞から全体ＲＮＡをテンプレートとして、ＴＳＰ−２特異的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ（real time−ＰＣＲ）によって、ＴＳＰ−２ ｍＲＮＡ量を測定した。
【００９０】
図２は、軟骨分化培地で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣのＴＳＰ−２ ｍＲＮＡ発現量を示す図面である。図２に図示されているように、ＴＳＰ−２は、軟骨分化能の大きいＣ１（またはＣ２）ＵＣＢ−ＭＳＣ細胞タイプで、最も多く発現される一方、軟骨分化能の弱いＣ５（Ｃ６またはＣ７）では、発現が弱かった。
【００９１】
また、軟骨分化能が異なるＵＣＢ−ＭＳＣ細胞タイプを軟骨分化培地で培養し、培養上澄み液中のＴＳＰ−２の濃度を、経時的にＥＬＩＳＡを介して分析した。
【００９２】
図３及び図４は、ＥＬＩＳＡ分析を介した培養上澄み液中のＴＳＰ−２の量を示す図面である。図３及び図４に図示されているように、軟骨分化能の大きい細胞タイプであるＣ１またはＣ２で、ＴＳＰ−２が高レベルに発現されるが（図３）、Ｃ５、Ｃ６またはＣ７では、非常に低レベルに発現された（図４）。
【００９３】
（３）ＴＳＰ−２の軟骨分化誘導活性
分離精製されたヒトＴＳＰ−２蛋白質（Ｒ＆Ｄ System、Minneapolis、ＭＮ、ＵＳＡ）１０ｎｇ／ｍｌを含む軟骨分化培地で、ＵＣＢ−ＭＳＣをマイクロマス培養方法で培養し、ペレット・サイズを測定した。ＵＣＢ−ＭＳＣが軟骨細胞に分化されるにつれて、細胞外媒質（ＥＣＭ）合成が増大するので、ペレット・サイズは、軟骨分化程度を示す尺度である。
【００９４】
図５は、ＴＳＰ−２存在下または不存在下で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣのペレット・サイズを示す図面である。図５で、対照群は、２５８，５２６．０７０μｍ２であり、ＴＳＰ−２（１０ｎｇ）の場合、９０１，９１９．４３１μｍ２（対照群の３．４９倍）であった。図５に図示されているように、ＴＳＰ−２によって、ＵＣＢ−ＭＳＣのペレット・サイズが増大し、これは、ＴＳＰ−２が軟骨分化を誘導するということを示している。
【００９５】
実施例３．軟骨分化能によるＴＳＰ−２発現レベル
本実施例では、軟骨分化能によるＵＣＢ−ＭＳＣのＴＳＰ−２発現レベルを測定した。まず、ＵＣＢ−ＭＳＣ Ｃ３，Ｃ４及びＣ５を、軟骨分化培地で同じ条件で７日間培養し、軟骨分化を誘導した。ＵＣＢ−ＭＳＣ Ｃ３，Ｃ４及びＣ５の相対的な軟骨分化能は、あらかじめ実験を介して確認し、Ｃ３＞Ｃ４＞Ｃ５の順序であった。次に、培養上澄み液中のＴＳＰ−２をＥＬＩＳＡを利用して測定した。
【００９６】
図６は、軟骨分化培地で培養された３個のＵＣＢ−ＭＳＣタイプの培養上澄み液中に発現されたＴＳＰ−２を示す図面である。図６に図示されているように、軟骨分化能が最も弱いと分類された、Ｃ５ ＵＣＢ−ＭＳＣは、軟骨分化誘導前（naive）には、７２ｐｇ／ｍｌ／１ｘ１０５cells、軟骨分化誘導３日目１．２ｎｇ／ｍｌ／１ｘ１０５cells、７日目０．５５０ｎｇ／ｍｌ／１ｘ１０５cellsを分泌した。軟骨分化のために使用するのに適したＵＣＢ−ＭＳＣは、Ｃ５に比べて、ＴＳＰ−２を多く発現する細胞に決定する。
【００９７】
実施例４：ＵＣＢ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとの軟骨生成能
本実施例では、約１０個の異なる人間供与者から由来したＵＣＢ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとのin vitroでの軟骨生成能（chondrogenesis）を測定した。
【００９８】
（１）ＵＣＢ−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣの準備
臍帯血（ＵＣＢ：umbilical cord blood）標本は、通知された母親同意（informed maternal consent）を得て分娩された放出物（deliveries）の臍帯静脈から得た。骨髄吸引物（bone marrow aspirate）は、各供与者の同意の下、供与者の腸骨稜（iliac crest）から得た。付着性及び防錘状の間葉幹細胞類似の単核細胞（adherent and spindle-shaped mesenchymal stem cell（ＭＳＣ）−like mononuclear cell）は、同じ過程を経て、ヒトＢＭ及びＵＣＢから分離した。２つの起源から得られた前記ＭＳＣ類似単核細胞に対して、次の特性を確認した：（１）幹性（stemness）（増殖性）、（２）付着性、（３）防錘状、（４）フローサイトメトリー（flow cytometry）を使用した細胞表面抗原、並びに骨及び軟骨のような間葉組織への分化能。
【００９９】
前記（１）ないし（３）の基準を充足させると確認された、２つの起源から得られたＭＳＣ類似細胞で確認された細胞の表面抗原表現型は、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５（造血マーカー：hemapoietic marker）、及びＨＬＡ−ＤＲ（クラスＩＩマーカー）に対して陰性であり、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０（間葉幹細胞マーカー）、及びＨＬＡ−ＡＢＣ（クラスＩマーカー）に対して陽性であった。線維芽細胞も、前記のところと同じセットの表面抗原を発現し、付着性防錘状の良好に増殖する細胞であるために、骨及び軟骨のような間葉組織へのＭＳＣの適切な分化潜在力（differentiation potential）を確認するために、ＭＳＣ類似単核細胞に対してさらに特性を確認した。
【０１００】
（２）各タイプのＭＳＣの軟骨分化能及び特性確認
ＢＭ−ＭＳＣまたはＵＣＢ−ＭＳＣを、６週間軟骨分化培地にペレット培養法によって培養し、軟骨生成を誘導した。軟骨分化培地は、５００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−６（Ｒ＆Ｄ System、Minneapolis、ＭＮ、ＵＳＡ）、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−β３（Sigma）、ＩＴＳ＋Premix（６．２５μｇ／ｍｌインシュリン、６．２５μｇ／ｍｌトランスフェリン、６．２５ｎｇ／ｍｌセレン酸（selenious acid）、１．２５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び５．３５ｍｇ／ｍｌリノール酸（linoleic acid）、１：１００ dilution、Becton Dickinson）、１００ｎＭデキサメタゾン（Sigma）、５０μｇ／ｍｌアスコルベート−２−ホスフェート、４０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリン（Sigma）及び１００μｇ／ｍｌピルベート（Sigma）で補充された高グルコースＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle medium）を使用した。前記軟骨分化培地は、軟骨生成分野の当業者に一般的に使われているものである（“Pellet Culture”in Materials and Methods of PNAS，Vol．99，No．7，pp．4397-4402(2002)；“Chondrogenesis”in MATERIALS AND METHODS of Stem cells，20(2002)：530-41参照）。前記軟骨分化培地で、ＵＣＢ−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣは、軟骨細胞（chondrocyte）に容易に分化すると知られている。
【０１０１】
培養は、４ないし６継代にあるＭＳＣをトリプシンで除去した後、前記軟骨分化培地に懸濁し、５ｘ１０５／ｍｌにした。次に、この懸濁液を、１５−ｍｌポリプロピレン・チューブに添加し、５００ｇで５分間遠心分離し、得られたペレットを培養した。培地は、１週で２回交換し、経時的にペレットをパラフィン中に内包された４％パラホルムアルデヒドで固定し、５μｍ切片を作った。前記切片を、サフラニン−Ｏで染色し、陰イオン性プロテオグリカンを検出した。また、前記切片を、タイプＩＩコラーゲンに対して免疫染色した。軟骨分化は、ペレット培養物中に球が形成されているか否か、サフラニン−Ｏまたはヘマトキシリンによるカウンター染色で、軟骨特異的プロテオグリカンに存在するか否か、及びタイプＩＩコラーゲンに対する免疫染色で、タイプＩＩコラーゲンが存在するか否かによって決定した。
【０１０２】
図７は、in vitroで、ＵＣＢ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとの軟骨分化を示す図面である。図７において、ａ、ｃ及びｅ；ｂ、ｄ及びｆは、ＵＣＢ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとに係わる１週、３週、及び６週でのサフラニン−Ｏ染色結果を示している。ｇ及びｈは、ＵＣＢ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとに係わる６週でのタイプＩＩコラーゲン免疫染色の結果を示している。
【０１０３】
６週で、サフラニン−Ｏ特異的オレンジ−レッド染色は、ＢＭ−ＭＳＣに比べ、ＵＣＢ−ＭＳＣでさらに明確であった（ｅ及びｆ参照）。また、６週でのコラーゲンＩＩ免疫染色（矢印で表示された部分）は、ＢＭ−ＭＳＣに比べ、ＵＣＢ−ＭＳＣでさらに明確であった（ｇ及びｈ参照）。
【０１０４】
１週でのサフラニン−Ｏ特異的オレンジ−レッド染色は、両細胞で明確な差を示していておらず、３週でのＢＭ−ＭＳＣは、軟骨形態を全く示さない一方、ＵＣＢ−ＭＳＣは、軟骨細胞の形態を示し始めている。ＵＣＢ−ＭＳＣに対して、３週でのペレット外部は、軟骨膜類似細胞（perichondrium-like cells）が観察され、内部は、サフラニン−Ｏに弱く染色され始め、細胞外マトリックス（extra-cellular matrix）が分泌されているということを示している。６週でＢＭ−ＭＳＣは、あたかも３週目のＵＣＢ−ＭＳＣの軟骨形成レベル程度を示す一方、ＵＣＢ−ＭＳＣは、典型的な軟骨組織の様子を示した。
【０１０５】
機能を行う正常な軟骨細胞の形成有無を確認するために、コラーゲンＩＩ免疫染色を実施したとき、矢印が指すように褐色を呈する陽性所見を観察することができた。これは、ＵＣＢ−ＭＳＣがＢＭ−ＭＳＣと比較し、優秀な陽性を示したために、軟骨形成能にすぐれているといえる。
【０１０６】
結論として、図６に図示されているように、ＵＣＢ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣより軟骨生成能に顕著にすぐれている。
【０１０７】
図８は、ＵＣＢ−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣの軟骨生成細胞系（chondrogenic lineage）への分化能を示す図面である。ＵＣＢ−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣの軟骨生成細胞系への分化能を決定するための実験は、４ないし６継代にあるＭＳＣをトリプシン処理して除去した後、前記軟骨分化培地で懸濁し、５ｘ１０５cells／ｍｌにした。次に、この懸濁液を１５ｍｌポリプロピレン・チューブに添加し、５００ｇで５分間遠心分離し、得られたペレットを培養した。培地は、１週に２回交換しつつ培養した。
【０１０８】
図８に図示されているように、総１０個のＵＣＢ−ＭＳＣ試料中の７個（すなわち、７０％）が分化能を示した一方、総１０個のＢＭ−ＭＳＣ試料中の５個（すなわち、５０％）が分化能を示した。６週でのペレット領域サイズは、ＢＭ−ＭＳＣのペレット領域（ｎ＝５，３４６５３１．３±８７３９６．６μｍ２）に比べ、ＵＣＢ−ＭＳＣのペレット領域（ｎ＝７，１４５０１２３．７±２４２５６．９μｍ２）（ｐ＜０．０２）がはるかに大きかった。ペレット及びサフラニン−Ｏ陽性領域は、ｉ−solution software（ＩＭ Technology、Doosan、Daejeon）で測定した。
【０１０９】
図９は、６週で本実施例で分析されたそれぞれ１０個のＢＭ−ＭＳＣ細胞タイプ及びＵＣＢ−ＭＳＣ細胞タイプの軟骨分化を示すものである。図９に図示されているように、サフラニン−Ｏによる軟骨プロテオグリカン特異的オレンジ−レッド染色は、ＵＣＢ−ＭＳＣの場合、７個細胞タイプ（Ａの上段で７個及び下段で２個）で明確であったが、ＢＭ−ＭＳＣの場合、５個細胞タイプ（Ｂの上段５個）で明確であった。すなわち、ＵＣＢ−ＭＳＣは、総細胞タイプのうち７０％が軟骨生成細胞系に分化されたが、ＢＭ−ＭＳＣは、５０％だけ軟骨生成細胞系に分化した。
【０１１０】
図１０は、６週でのＵＣＢ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとの軟骨生成能の違いを示す図面である。図１０は、同じ数のＭＳＣを使用し、同じ軟骨生成条件（chondrogenic conditions）下で６週間培養された後、ＵＣＢ−ＭＳＣから生成された軟骨ペレットと、ＢＭ−ＭＳＣから生成された軟骨ペレットとの差をさらに明確に示している。図９に図示されているように、ＢＭ−ＭＳＣに比べ、ＵＣＢ−ＭＳＣ由来の軟骨ペレットが明確にさらに大きい。また、ＢＭ−ＭＳＣに比べ、ラクナを取り囲む軟骨細胞類似細胞を有したＵＣＢ−ＭＳＣ由来の軟骨ペレットで、軟骨特異的プロテオグリカン・マトリックスは、さらに豊富であって明確であった。これは、同じin vivo軟骨生成条件で、ＢＭ−ＭＳＣに比べてＵＣＢ−ＭＳＣが、顕著に優秀な軟骨分化能を有するということを示している。
【０１１１】
前記のように、ＢＭ−ＭＳＣに比べてＵＣＢ−ＭＳＣは、統計的に有意に（significantly）高い軟骨分化能を有している。これは、同一にＭＳＣであると命名されたとしても、互いに顕著に異なる分化的細胞特性（differential cellular feature）を有するいうことを示している。すなわち、同じＭＳＣであっても、互いに異なる細胞タイプで分類されるということを示している。本実施例は、（１）分化が、末端分化された線維芽細胞（fibroblast）とは異なるＭＳＣの自己同一性（identity）だけではなく、（２）特に、各タイプのＭＳＣが分離された源泉組織（source tissue）の起源（origin）と年齢とに依存する、細胞タイプの差を検査するために使われるということを示している。
【０１１２】
前記軟骨生成培地は、ＵＣＢ−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣに係わって、同じものを使用した。また、前記培地に含まれた成長因子の組み合わせは、ＢＭ−ＭＳＣの軟骨生成のために導入されたものであって、当業界に周知である（Biochemical and Biophysical Research Communications 320(2004)：914-919の要約書、Materials and Methodsの“Cell culture”and“Pellet culture”参照）。従って、本実施例に使われた特定の培地条件は、ＵＣＢ−ＭＳＣの軟骨生成能に有利に影響を及ぼすものではない。
【０１１３】
結論として、ＵＣＢ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣに比べて顕著にすぐれたin vitroでの軟骨生成活性を有している。
【０１１４】
実施例５：ＵＣＢ−ＭＳＣでのＴＳＰ２発現誘導因子の確認
本実施例では、培養条件を異ならせ、ＵＣＢ−ＭＳＣでのＴＳＰ２発現誘導因子を確認した。
【０１１５】
まず、単層培養中の細胞をトリプシンを処理して除去し、ＵＣＢ−ＭＳＣを無血清ＤＭＥＭ中で、５ｘ１０５cells／ｍｌの濃度に懸濁させて２４時間培養した。使われた培地は、ＤＭＥＭ（１００ｎＭデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌアスコルベート−２−ホスフェート、４０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリン及び１００μｇ／ｍｌピルベート含有）、及びＤＭＥＭに１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−β３（Sigma）、５００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ−６（Ｒ＆Ｄ System、Minneapolis、ＭＮ、ＵＳＡ）及びＩＴＳ＋（６．２５μｇ／ｍｌインシュリン、６．２５μｇ／ｍｌトランスフェリン、６．２５μｇ／ｍｌセレン酸、１．２５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び５．３５ｍｇ／ｍｌリノール酸、１：１００ dilution、Becton Dickinson）から選択される成長因子を添加したものを使用した。培養は、単層培養またはペレット培養を行い、ペレット培養の場合、前記懸濁液を５００ｇで５分間遠心分離し、細胞をペレット化させて培養した。
【０１１６】
培養上澄み液を回数した後、細胞破砕物を得て、この細胞破砕物から抽出された総ＲＮＡをテンプレートとして、ＲＴ（リアルタイム）−ＰＣＲを行い、ＴＳＰ２のｍＲＮＡレベルを測定した。
【０１１７】
図１１は、成長因子組み合わせの存在の下で、単層培養とペレット培養とを行った場合、ＴＳＰ−２の発現を示す図面である。図１１に図示されているように、ペレット培養でＴＳＰ−２発現が顕著に増加した。また、図１１によれば、成長因子は、ＴＳＰ２発現に影響を及ぼしていない。
【０１１８】
実施例６：軟骨生成に適した細胞タイプの選択
本実施例では、ＵＣＢ−ＭＳＣを、軟骨生成を誘導しない培地で培養した後、ＴＳＰ−２発現量が、ＵＣＢ−ＭＳＣの軟骨分化能と関連性があるか否かを確認した。具体的には、Ｃ３ ＵＣＢ−ＭＳＣ及びＣ５ ＵＣＢ−ＭＳＣの細胞タイプを、無血清ＤＭＥＭ（１００ｎＭデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌアスコルベート−２−ホスフェート、４０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリン及び１００μｇ／ｍｌピルベートを含有）培地で、５ｘ１０５cells／ｍｌの濃度で単層培養及びペレット培養を行った。培養条件は、実施例５に示されているところと同一であった。上澄み液中のＴＳＰ−２発現量は、ＥＬＩＳＡを介して測定した。また、ＢＭ−ＭＳＣも同じ条件で培養した。
【０１１９】
図１２は、ＵＣＢ−ＭＳＣ細胞タイプによるＴＳＰ−２発現程度を示す図面である。図１２で、Ｃ３及びＣ５は、ＵＣＢ−ＭＳＣ細胞タイプであり、naive及びpelletは、それぞれ単層培養及びペレット培養で２４時間培養したものである。培養過程及び培養後の光学顕微鏡観察の結果は、図１のＣ３及びＣ５と同一である。図１２に図示されているように、Ｃ５について、naive培養した場合、ＴＳＰ−２発現量は、３３ないし７２ｐｇ／ｍｌ／１．０ｘ１０５cellsであり、pellet培養した場合、１６３ないし５５０ｐｇ／ｍｌ／１．０ｘ１０５cellsであった。Ｃ３ ＵＣＢ−ＭＳＣ細胞及びＣ５ ＵＣＢ−ＭＳＣ細胞の軟骨生成能は、Ｃ３がＣ５に比べてすぐれているとあらかじめ確認された。従って、未知の細胞が、軟骨生成能にすぐれているか否かということは、基準細胞、例えば、Ｃ５ ＵＣＢ−ＭＳＣ細胞のＴＳＰ−２発現量と比較することによって決定されてもよい。例えば、標的細胞が１日naive培養された場合、ＴＳＰ−２発現量が、３３ないし７２ｐｇ／ｍｌ／１．０ｘ１０５cellsより高いか、あるいはpellet培養した場合、１６３ないし５５０ｐｇ／ｍｌ／１．０ｘ１０５cellsよりも高ければ、軟骨生成能が、Ｃ５よりすぐれていると決定することができる。かような方法で、軟骨生成に適した細胞を選抜することができる。
【０１２０】
軟骨生成に適した細胞を選抜する基準によって、標準細胞は、当業者によって適切に選択されうる。
【０１２１】
図１２に図示されているように、幹細胞をペレット培養することによって、ＴＳＰ−２の発現が顕著に増加した。
【０１２２】
図１３は、Ｃ３ ＵＣＢ−ＭＳＣ及びＣ５ ＵＣＢ−ＭＳＣを３日間ペレット培養し、ＴＳＰ−２発現量を測定した結果である。図１３に図示されているように、軟骨分化能が良好であるＣ３に比べて、軟骨分化能が良好ではないＣ５では、培養時間が経過しても、ＴＳＰ−２の発現量がＣ３に比べて大きくなかった。
【０１２３】
従って、ＴＳＰ−２発現量は、ＵＣＢ−ＭＳＣの軟骨分化能と関連性を有しており、ＴＳＰ−２発現量を測定することによって、ＭＳＣの軟骨分化能を予測することができる。
【０１２４】
図２６は、ＵＣＢ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとのペレット培養後のＴＳＰ−２発現レベルを測定した結果を示す図面である。図２６に図示されているように、ＢＭ−ＭＳＣに比べてＵＣＢ−ＭＳＣが、ＴＳＰ−２を顕著に高い割合で発現した。これは、実際にＵＣＢ−ＭＳＣとＢＭ−ＭＳＣとの軟骨分化度が、ＵＣＢ−ＭＳＣがすぐれているということと関連性があることを提示している。
【０１２５】
図２６の結果は、単層培養中の細胞をトリプシンを処理して除去し、ＵＣＢ−ＭＳＣ及びＢＭ−ＭＳＣを無血清ＤＭＥＭ中で、５ｘ１０５cells／ｍｌの濃度に懸濁させて２４時間培養した。使われた培地は、ＤＭＥＭ（１００ｎＭデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌアスコルベート−２−ホスフェート、４０μｇ／ｍｌ Ｌ−プロリン及び１００μｇ／ｍｌピルベート含有）を使用した。培養は、ペレット培養を行い、５００ｇで５分間遠心分離して細胞をペレット化させて２４時間培養した。培養上澄み液を回数した後、ＴＳＰ−２ＥＬＩＳＡを実施した。
【０１２６】
実施例７：軟骨分化及び軟骨脱分化の条件で、ＵＣＢ−ＭＳＣによるＴＳＰ−２発現
本実施例では、軟骨分化及び軟骨脱分化の条件で、ＵＣＢ−ＭＳＣによるＴＳＰ−２発現量を測定し、ＴＳＰ−２発現量と軟骨分化との関連性を確認した。
【０１２７】
（１）軟骨分化条件での軟骨前駆細胞によるＴＳＰ−２発現
胎児マウスの肢芽（limb bud）から軟骨細胞の前駆細胞を分離した。分離された前駆細胞の４ｘ１０７cells／ｍｌを、培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（２：３）、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ユニット／ｍｌペニシリンを含有）に再浮遊（resuspension）させ、１５μｌ液滴ずつ培養皿に落とし、独立した点（spot）状で付着させた後で６日間培養し、点別にそれぞれ軟骨分化を誘導した。ＴＳＰ−２の発現量を、細胞から分離された総ＲＮＡをテンプレートにしたＲＴ−ＰＣＲを介して測定した。
【０１２８】
図１４は、分化及び脱分化の条件で、軟骨前駆細胞または軟骨細胞によるＴＳＰ−２発現量を示している。図１４のＡに図示されているように、分化条件でのＴＳＰ−２発現量は、培養時間が経過するにつれて増加した。
【０１２９】
（２）軟骨脱分化条件で軟骨細胞によるＴＳＰ−２発現
２週齢ウサギの膝関節から軟骨細胞を分離した。分離された軟骨細胞を、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１βの存在下で、培地（ＤＭＥＭ、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有）中で培養して脱分化を誘導した。ＩＬ−１βは、炎症性サイトカインであって、軟骨細胞を脱分化させて軟骨細胞の性質を失わせる性質を有している。ＴＳＰ−２の発現量を、細胞から分離された総ＲＮＡをテンプレートにしたＲＴ−ＰＣＲを介して測定した。
【０１３０】
図１４のＢに図示されているように、脱分化条件でのＴＳＰ−２発現量は、培養時間が経過するにつれて減少した。
【０１３１】
以上の結果から、ＴＳＰ−２の発現は、軟骨細胞の分化及び脱分化と関連があるということが分かる。
【０１３２】
実施例８：ＴＳＰ−２によるＵＣＢ−ＭＳＣの軟骨分化誘導
本実施例では、ＴＳＰ−２の存在下で、ＵＣＢ−ＭＳＣを培養して軟骨分化を誘導した。培地は、前記の軟骨生成培地を使用した。組み換えＴＳＰ−２（Ｒ＆Ｄ System、Minneapolis、ＭＮ、ＵＳＡ）は、１０ｎｇ／ｍｌないし５００ｎｇ／ｍｌの量で培地中に添加し、ペレット培養した。初期濃度は、５ｘ１０５cells／ｍｌであった。培養した後、細胞から分離された総ＲＮＡをテンプレートとして、軟骨細胞マーカーのコラーゲンタイプＩＩ（Ｃｏｌ ＩＩＡ１）、アゲレカン（Ａｃａｎ）、Ｓｏｘ−９及びＴＳＰ−２、並びに肥大軟骨細胞（hypertrophic chondrocyte）と骨とのマーカーであるＣｏｌ １Ａ１及びＣｏｌ ＸＡ１に特異的なプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを行い、それらマーカーのｍＲＮＡ発現量を測定した。
【０１３３】
図１５、図１６及び図１７は、ＴＳＰ−２の存在下で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣのマーカー蛋白質発現量を示す図面である。図１５、図１６及び図１７に図示されているように、軟骨細胞マーカーであるコラーゲンタイプＩＩ（Ｃｏｌ ＩＩＡ１）、アゲレカン（Ａｃａｎ）及びＳｏｘ−９の発現は、１週で濃度依存的に増加した。一方、肥大軟骨細胞と骨とのマーカーであるＣｏｌ １Ａ１及びＣｏｌ ＸＡ１は、経時的に減少したり、あるいは発現していない。
【０１３４】
従って、外来から添加されたＴＳＰ−２は、ＵＣＢ−ＭＳＣに対して、軟骨細胞への分化を促進するということが分かる。
【０１３５】
実施例９：ＴＳＰ−２発現抑制条件でのＵＣＢ−ＭＳＣの軟骨分化誘導
本実施例では、ＴＳＰ−２発現抑制条件で、ＵＣＢ−ＭＳＣを軟骨生成培地で培養して軟骨細胞分化を誘導した。
【０１３６】
ＴＳＰ−２のｍＲＮＡに対して相補的である配列を有するｓｉＲＮＡ（Bioneer、Daejeon、韓国、センス配列：配列番号９、アンチセンス配列：配列番号１０）を、培地中に３３ｎＭの濃度で添加してＴＳＰ−２発現を抑制した。培地は、前記の軟骨生成培地を使用し、ペレット培養した。初期濃度は、５ｘ１０５cells／ｍｌであり、７日間培養した。ＴＳＰ−２の発現量は、ＵＣＢ−ＭＳＣから抽出された総ＲＮＡをテンプレートとして、ＴＳＰ−２に特異的なプライマーをプライマーとして使用したＲＴ−ＰＣＲによって測定するか、あるいは培養上澄み液に係わるＥＬＩＳＡを介して測定した。軟骨細胞マーカーであるＣｏｌ ＩＩＡ１とアゲレカンは、ＲＴ（リアルタイム）−ＰＣＲを介して測定した。
【０１３７】
図１８は、ＴＳＰ−２発現抑制条件で、軟骨生成培地で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣの軟骨分化程度を示している。図１８に図示されているように、ＴＳＰ−２発現抑制条件、すなわち、ＴＳＰ−２ ｓｉＲＮＡの存在下で、ＵＣＢ−ＭＳＣは、軟骨細胞マーカーであるＣｏｌ ＩＩＡ１及びアグレカンの発現が、対照群に比べて顕著に減少した。これは、ＴＳＰ−２が、ＵＣＢ−ＭＳＣの軟骨分化を誘導したり促進するということを示している。図１８で、Ａ及びＢは、ＴＳＰ−２の濃度をそれぞれＲＴ−ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡを介して測定したものであり、Ｃ及びＤは、Ｃｏｌ ＩＩＡ１及びアグレカンを、ＲＴ−ＰＣＴを介して測定したものである。
【０１３８】
実施例１０：骨関節炎患者の血漿でのＴＳＰ−２レベル
本実施例では、正常人（１５人）と骨関節炎患者（２８人）との血液を採取した後、血漿中のＴＳＰ−２のレベルをＥＬＩＳＡを利用して測定した。
【０１３９】
図１９は、正常人と関節炎患者との血漿でのＴＳＰ−２レベルを示す図面である。図１９に図示されているように、正常人の血漿に比べ、関節炎患者で、ＴＳＰ−２レベルが高かった。これは、血液中のＴＳＰ−２レベルが、関節炎を診断できるマーカーとして作用しうるということを示している。また、関節炎だけではなく、軟骨分化と関連した疾患の診断のためのマーカーとして作用しうるということを示している。
【０１４０】
実施例１１：関節炎患者の関節液によるＵＣＢ−ＭＳＣでのＴＳＰ−１発現
本実施例では、関節炎患者の関節液が、ＵＣＢ−ＭＳＣでＴＳＰ−１発現に及ぼす影響を確認した。
【０１４１】
関節炎患者の関節液の存在下で、ＵＣＢ−ＭＳＣを培養した。ＵＣＢ−ＭＳＣは、ＭＥＭ−α、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン含有の培地で、５−６日間培養した。関節液を添加するときにＵＣＢ−ＭＳＣは、培養容器面積の７０−８０％レベルで培養中であった。関節炎患者の関節液は、ＵＣＢ−ＭＳＣが培養されている培地を、ＭＥＭ−α及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン含有培地に交換した後、２０（ｖ／ｖ）％濃度に添加した後、３時間さらに培養した。その後、得られた培養液を分析試料として使用した。また、前記関節液を添加していない状態で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣ培養液と、培養されていない培地に前記関節液を２０（ｖ／ｖ）％濃度になるように添加した培地とを対照群として分析した。前記関節液は、退行性関節炎患者から得た。
【０１４２】
図２０及び２１は、関節炎患者の関節液存在下で、ＵＣＢ−ＭＳＣのＴＳＰ−１発現量を示している。図２０でＭＳＣ onlyは、ＵＣＢ−ＭＳＣを関節液なしに培養したものであり、ＪＦ＃１、ＪＦ＃２及びＪＦ＃３は、それぞれ異なる患者の関節液であり、triplicateで実験した結果である。図２１でＴＳＰ−１発現量は、ＵＣＢ−ＭＳＣから抽出された総ＲＮＡをテンプレートとして、ＴＳＰ−１に特異的なプライマーをプライマーとしたＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
【０１４３】
図２１でＪＦは、患者の関節液を示す。図２１でＴＳＰ−１発現量は、ＵＣＢ−ＭＳＣの培養上澄み液に対してＥＬＩＳＡを介して測定した。図２１に図示されているように、関節炎患者の関節液存在下で培養されるＵＣＢ−ＭＳＣは、関節炎患者の関節液が存在しない培地で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣ、または２０％関節炎患者の関節液のみ添加された培地で培養された培養物中のＴＳＰ−１発現量に比べ、相乗的に増加したＴＳＰ−１を発現した。
【０１４４】
実施例１２：ＩＬ−１７ＢＲの軟骨分化能との関連性
軟骨分化能の差を示すＵＣＢ−ＭＳＣ細胞タイプを、軟骨分化培地で１週間ペレット培養して軟骨分化を誘導する。細胞を溶解させて得た全体ＲＮＡをテンプレートとして、ＲＴ−ＰＣＲ（real time−ＰＣＲ）を行い、ＩＬ−１７ＢＲ ｍＲＮＡ量を測定した。
【０１４５】
図２２は、軟骨に分化されたＵＣＢ−ＭＳＣを溶解させ、ＩＬ−１７ＢＲ ｍＲＮＡの量を、ＲＴ−ＰＣＲを介して分析する結果を示す図面である。
【０１４６】
図２２に図示されているように、細胞の軟骨分化能によって、ＩＬ−１７ＢＲ ｍＲＮＡ発現レベルが変わった。すなわち、Ｃ２とＣ３との細胞は、ＩＬ−１７ＢＲ ｍＲＮＡを発現し、その程度は分化能の高いＣ２が、Ｃ３に比べて８．９倍高かった。一方、軟骨分化能の弱いＣ５は、ＩＬ−１７ＢＲ ｍＲＮＡを発現していない。
【０１４７】
実施例１３．関節炎患者の関節液が細胞のＨＢ−ＥＧＦ発現に及ぼす影響
実施例１に記載された方法と類似の方法で、関節炎患者の関節液を１０（ｖ／ｖ）％濃度になるように添加された培地で、ＵＣＢ−ＭＳＣを６時間培養した後、細胞から全体ＲＮＡを得た後、ＲＴ−ＰＣＲによって、ＨＢ−ＥＧＦ ｍＲＮＡ量を測定した。対照群として、関節液を添加していない培地を使用したことを除いては、同じ条件でＵＣＢ−ＭＳＣを培養した。
【０１４８】
図２３は、関節炎患者の関節液の存在下で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣで、ＨＢ−ＥＧＦ ｍＲＮＡを測定した結果を示す図面である。図２３で、Ｃ３及びＣ５は、ＵＣＢ−ＭＳＣであり、ＢＭ−ＭＳＣは、骨髄由来間葉幹細胞であり、ＢＥＡＳ−２Ｂは、肺由来気管支上皮細胞であり、ＪＦは、関節液（joint fluid）である。図２３に図示されているように、ＵＣＢ−ＭＳＣでのＨＢ−ＥＧＦ発現は、関節炎患者の関節液によって顕著に増加した一方、ＢＭ−ＭＳＣ及びＢＥＡＳ−２Ｂでは、大きく増加していない。関節炎患者の関節液によって、ＵＣＢ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣに比べて２倍（Ｃ５ ＵＣＢ−ＭＳＣ）ないし８．４倍（Ｃ３ＵＣＢ−ＭＳＣ）多くＨＢ−ＥＧＦを発現した。
【０１４９】
これは、関節炎患者の関節液によって、特異的にＵＣＢ−ＭＳＣでＨＢ−ＥＧＦ発現が誘導されるということを示している。これはまた、関節炎病変部位で、ＢＭ−ＭＳＣに比べてＵＣＢ−ＭＳＣが、ＨＢ−ＥＧＦを顕著に多く発現させるということを示している。
【０１５０】
また、ＵＣＢ−ＭＳＣ及び患者によるＵＣＢ−ＭＳＣで、関節液によるＨＢ−ＥＧＦ発現の程度を測定した。ＵＣＢ−ＭＳＣは、Ｃ３及びＣ５を使用し、３人の患者から採取された関節液（それぞれＪＦ１、ＪＦ５及びＪＦ１１と表記）を使用した。培養条件及びＨＢ−ＥＧＦ測定条件は、図２０に示されている通りである。表１は、ＵＣＢ−ＭＳＣ及び患者によるＵＣＢ−ＭＳＣで、関節液によるＨＢ−ＥＧＦ発現量をＲＴ（real time）−ＰＣＲによって分析した結果を示している。
【０１５１】
【表１】
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【０１５２】
表１に図示されているように、ＵＣＢ−ＭＳＣは、関節炎患者の関節液と培養する場合、ＵＣＢ−ＭＳＣは、ＨＢ−ＥＧＦを対照群に比べて９．２ないし４６．９倍多く発現した。
【０１５３】
実施例１４：軟骨細胞死滅条件でのＵＣＢ−ＭＳＣによるＨＢ−ＥＧＦの発現
本実施例では、軟骨細胞死滅条件で、ＵＣＢ−ＭＳＣによるＨＢ−ＥＧＦ発現程度を分析した。まず、２週齢ウサギの関節から軟骨細胞を分離した。分離された軟骨細胞を、ＤＭＥＭ及び１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有培地中で５日間６ウェルプレートで培養し、この培養中である軟骨細胞を実験に使用した。ＵＣＢ−ＭＳＣ培養は、ＳＮＰ（sodium nitroprusside）、または前記ウサギ由来軟骨細胞存在下でなされた。培養は、前記条件で２４時間なされた。ＳＮＰは、５００μＭで添加した。ＳＮＰは、一酸化窒素を生成する化合物であり、軟骨細胞の死滅を誘導すると知られている。ＳＮＰ添加は、関節炎患者で起こる環境を、in vitroで摸倣したものである。また、前記ウサギ由来軟骨細胞は、トランスウェル・チャンバ（transwell chamber）（ＢＤ Falcon、San Jose、California、ＵＳＡ、Cell Culture inserts for ６−well plates、０．４μｍ、translucent ＰＥＴ membrane）の下段で培養し、前記ＵＣＢ−ＭＳＣは、チャンバの上段で共同培養した。
【０１５４】
ＨＢ−ＥＧＦの発現いかんは、培養物から細胞を分離して破砕した後、同じ濃度の破砕物に対して、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体及び抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体に特異的に結合する抗体に、蛍光標識を付着させて使用した免疫ブロッティングによって測定した。
【０１５５】
図２４は、軟骨細胞死滅条件で培養されたＵＣＢ−ＭＳＣでのＨＢ−ＥＧＦ発現量を示している。図２４に図示されているように、軟骨細胞死滅条件でＵＣＢ−ＭＳＣは、ＨＢ−ＥＧＦを発現していないが、ウサギ由来軟骨細胞と共同培養する場合、ＨＢ−ＥＧＦを発現した。
【０１５６】
また、ＨＢ−ＥＧＦ存在下で、前記ウサギ由来軟骨細胞を培養して軟骨細胞が保護されるか否かを確認した。図２５は、ＨＢ−ＥＧＦ存在下で培養されたウサギ由来軟骨細胞を、光学顕微鏡で観察した結果を示す図面である。図２５に図示されているように、対照群（上段）では、ＳＮＰ濃度依存的に軟骨細胞が死滅したが、５０ｎｇ／ｍｌ ＨＢ−ＥＧＦを含む培地では、軟骨細胞の死滅が濃度依存的に抑制されている。これは、ＨＢ−ＥＧＦによって、軟骨細胞のＳＮＰによる死滅が抑制されるということを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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