(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリコン薄膜に数μｍ単位の幅のスリットを形成することによって作製された、気体と溶液の気液界面に配置されたカンチレバーと、励起用レーザーを用いて駆動した前記カンチレバーの共振周波数を検出用レーザーを用いて、前記励起用レーザーおよび検出用レーザーの伝播を妨害する液体やガラスカバーの妨害層を介さずに測定するようにした、前記気体側に配置した監視装置とを具備し、前記カンチレバーの気体に面する面における親水性負荷を取り除き高い信号雑音比（ＳＮＲ）が得られるようにしたことを特徴とする気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサ。
【請求項２】
請求項１記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記スリットの幅が２μｍ〜１０μｍであり、メニスカス力によって前記溶液が前記気体側に漏れるのを防ぐことを特徴とする気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサ。
【請求項３】
請求項１又は２記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記監視装置は、前記カンチレバーの前記気体に面する面から反射されるドップラーレーザーを用いてリアルタイムに前記カンチレバーの共振周波数を監視することを特徴とする気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサ。
【請求項４】
請求項１、２又は３記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記カンチレバーの溶液側に溶液を供給するマイクロ流路を配置し、プッシュプル型シリンジポンプを用いて前記溶液の液圧を前記マイクロ流路の両端でそれぞれ制御するとともに、前記プッシュプル型シリンジポンプと前記マイクロ流路を接続するチューブの長さを調整することにより、前記カンチレバーにおける液圧の摂動を補償するようにしたことを特徴とする気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサ。
【請求項５】
請求項４記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記プッシュプル型シリンジポンプと前記マイクロ流路の流入口との間に、前記マイクロ流路内に化学物質を注入するための注入装置を配置することを特徴とする気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサ。
【請求項６】
請求項４記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記カンチレバーの表面を検出分子に特異的に結合する分子で予め修飾して、分子識別能を付加しておき、前記カンチレバーの表面に前記検出分子が吸着した時に発生する共振周波数の変化を検出することを特徴とする気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサ。
【請求項７】
請求項４記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記マイクロ流路内の液圧を直接測定することを特徴とする気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサ。
【請求項８】
請求項１、２又は３記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記カンチレバーの溶液に面する面に原子間力顕微鏡の探針を具備することを特徴とする気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサ。
【請求項９】
請求項８記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記溶液中の生体分子を生理的条件下で観察することを特徴とする気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＭＥＭＳ（微小電子機械システム）により作製したマイクロカンチレバーは、高感度であるという利点により、様々な研究分野で用いられている。例えば、バイオセンサなどのバイオ応用向けに液中環境での調査に適用することが試みられてきた。
【０００３】
図１３は従来の継続的監視のための閉ループフィードバック実験システムの模式図である。
【０００４】
この図において、１００はバイオセンサデバイスであり、このバイオセンサデバイス１００は、ステージ１０１、スライドガラス１０２、ウェハ上に作製したカンチレバー１０３、液体セル１０４、液体１０５からなる。１１０は光学系であり、この光学系１１０は対物レンズ（マイクロスコープ）１１１、反射ミラー１１２，１１３，１１４、カンチレバー１０３を観察するためのＣＣＤカメラ１１５からなる。１２０はカンチレバー１０３を励振するためのレーザーダイオード（波長４０５ｎｍ）、１３０はカンチレバー１０３の振動を計測するためのレーザードップラー干渉計、１４０はカンチレバー１０３をその共振周波数で振動させるための位相同期ループ（ＰＬＬ）回路であり、このＰＬＬ回路１４０は、信号発生器１４１、ロックイン増幅器１４２、第１の並列インターフェース１４３、第２の並列インターフェース１４４からなる。１５０は共振周波数の変調信号を記録するデータロガーである。
【０００５】
ここで、継続的監視のための閉ループフィードバック実験システムは、（１）バイオセンサデバイス１００におけるレーザーダイオード１２０からの４０５ｎｍ波長のレーザー光（Ａ）によりカンチレバー１０３を励振し、（２）レーザードップラー干渉計１２０におけるヘリウムネオンレーザーからの６３３ｎｍの波長のレーザー光（Ｂ）によりカンチレバー１０３の振動を計測し、（３）ＰＬＬ回路１４０におけるロックイン増幅器１４２からの位相信号を共振周波数追跡すべき閉ループにフィードバックし、（４）光学系１１０の対物レンズ１１１をＸ軸及びＹ軸方向に調節できるバイオセンサデバイス１００のためのテーブルを有する。
【０００６】
すなわち、レーザードップラー干渉計１３０からの速度信号（Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｓｉｇｎａｌ）は、レーザードップラー干渉計１３０及びレーザーダイオード１２０間の２つの信号を比較するロックイン増幅器１４２へフィードバックされ、ロックイン増幅器１４２からの位相信号は第１の並列インターフェース１４３へ、ロックイン増幅器１４２からの増幅信号は第２の並列インターフェース１４４へとそれぞれ送られ、第１の並列インターフェース１４３からのＦＭ信号は信号発生器１４１へフィードバックされるとともに、データロガー１５０へ記録され、第２の並列インターフェース１４４からのＡＭ信号は信号発生器１４１へフィードバックされる。
【０００７】
バイオセンサデバイス１００は、観察テーブル上に配置され、そのカンチレバー１０３は、観察テーブルの裏面から対物レンズ１１１を通じてレーザー光を照射することによって観察される。２つのレーザーは、測定及び振動により駆動するように、対物レンズ１１１を通じて照射される。
【０００８】
図１４は従来の液体中における原子間力顕微鏡用カンチレバーの模式図である。
【０００９】
この図において、２０１は液体、２０２は液体２０１中に配置された探針２０２Ａを有するカンチレバー、２０３はサンプル、Ａは励振用レーザー、Ｂは検出用レーザーである。
【００１０】
このように構成することにより、液体中に配置されたカンチレバー２０２によって、サンプル２０３の微小凹凸面を計測するようにしている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊｕｒｇｅｎ  Ｆｒｉｔｚ，“Ｃａｎｔｉｌｅｖｅｒ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ”，Ａｎａｌｙｓｔ，Ｖｏｌ．１３３，２００８，ｐｐ．８５５−８６３
【非特許文献２】Ｔｈｏｍａｓ  Ｐ．Ｂｕｒｇ，Ｍｉｃｈｅｌ  Ｇｏｄｉｎ，Ｓｃｏｔｔ  Ｍ．Ｋｎｕｄｓｅｎ，Ｗｅｎｊｉａｎｇ  Ｓｈｅｎ，Ｇｒｅｇ  Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｓ．Ｆｏｓｔｅｒ，Ｋｅｎ  Ｂａｂｃｏｃｋ，Ｓｃｏｔｔ  Ｒ．Ｍａｎａｌｉｓ，“Ｗｅｉｇｈｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｆｌｕｉｄ”，ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４４６，２００７，ｐｐ．１０６６−１０６９
【非特許文献３】Ｊ．Ｗ．Ｐａｒｋ，Ｏ．Ｄｕｃｌｏｕｘ，Ｓ．Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｈ．Ｆｕｊｉｔａ，“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｎ  Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌｌｙ  Ａｃｔｕａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｃａｎｔｉｌｅｖｅｒ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ”，Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ２００９，Ｄｅｎｖｅｒ，ＵＳＡ，Ｊｕｎｅ  ２００９，ｐｐ．９７９−９８２
【非特許文献４】Ｏ．Ｄｕｃｌｏｕｘ，Ｊ．Ｗ．Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｔｉｅｒｃｅｌｉｎ，Ｐ．Ｐｅｒｎｏｄ，Ｖ．Ｐｒｅｏｂｒａｚｈｅｎｓｋｙ，Ｍ．Ｈａｍｏｎ，Ｙ．Ｓａｋａｉ  ａｎｄ  Ｈ．Ｆｕｊｉｔａ，“ＭＥＭＳ  Ｒｅｓｏｎａｔｏｒｓ  Ａｃｔｕａｔｅｄ  ｂｙ  ＴｂＣｏ／ＦｅＣｏ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｏｓｔｒｉｃｔｉｖｅ  Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒｓ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ”，Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ２００９，Ｄｅｎｖｅｒ，ＵＳＡ，Ｊｕｎｅ  ２００９，ｐｐ．１０１９−１０２２
【非特許文献５】Ｄ．Ｒａｍｏｓ，Ｊ．Ｔａｍａｙｏ，Ｊ．Ｍｅｒｔｅｎｓ，ａｎｄ  Ｍ．Ｃａｌｌｅｊａ，“Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｃａｎｔｉｌｖｅｒｓ  ｉｎ  ｌｉｑｕｉｄｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，ｖｏｌ．９９，２００６，Ａｔｎ．１２４９０４
【非特許文献６】Ｓ．Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｄ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，ａｎｄ  Ｈ．Ｋａｗａｋａｔｓｕ，“Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｓｉｌｉｃｏｎ  ｃａｎｔｉｌｅｖｅｒ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｅｒ  ｖｉｂｒａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｓ  ｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂ，Ｖｏｌ．２７，２００９，ｐｐ．９６４−９６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、図１４に示すようなカンチレバー２０２を液体２０１中に配置する構成では、カンチレバー２０２周囲の液体２０１分子のブラウン運動に起因する熱雑音が生じ、また、検出用レーザーＢが液体２０１を通して散乱したり、図１４に矢印で示すようにガラスとの界面で屈折したりすることにより、測定ノイズ増加する。さらに、液体２０１の粘性が高いとカンチレバー２０２を振動させる際の障害となる。これらの理由から、カンチレバー２０２の振動を正確に測定し、ナノ／マイクロスケールで現象を理解するための主要素である共振周波数を精密に識別することが困難であった。
【００１３】
流体力学的効果を低減させるため、これまでに多数の技術がダイナミックカンチレバーセンサに利用されてきた。上記非特許文献２では、１０-4ｇ／ｍＬの分解能で質量密度を計測することができる、懸濁マイクロチャネル共振器（ＳＭＲ）について研究している。この懸濁マイクロチャネル共振器は、高感度であるものの、マイクロ流路の作製が複雑であり、また、その容積に制限があることは、バイオセンサにとっての欠点と考えられてきた。上記非特許文献３では、カンチレバーを液中で効率的に共振させるため、位置調整可能な光熱励振用レーザーを導入している。さらに、上記非特許文献４では、片面が液体に面しているカンチレバーは他方の自由表面上では親水性負荷（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｌｏａｄｉｎｇ）によって生じる減衰効果が少ないという理由で、細胞数測定用バイオセンサの気液界面にカンチレバーを配置している。この研究では、光熱励振技術によって遠隔で作動させ、レーザードップラー振動計（ＬＤＶ：Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｖｉｂｒｏｍｅｔｅｒ）によって計測した、気液界面で共振するＭＥＭＳカンチレバーに基づくバイオセンサについて研究している。
【００１４】
図１５は従来（非特許文献４に示される本発明の発明者らによる先行発明）のカンチレバーセンサの断面図である。
【００１５】
この図において、３０１はマイクロ流路、３０２はカンチレバー、３０３はスリット、３０４はＰＤＭＳからなるカバー、３０５は空気部、３０６はガラス基板、３０７は磁気ひずみ膜である。
【００１６】
このバイオセンサにおいては、図１５に示すように、カンチレバー３０２の片面は空気部３０５に接しているが、その空気部３０５は下方に配置されたガラス基板３０６によって密閉されているため、レーザードップラー振動計測時にガラス基板３０６による乱反射を生じるといった問題があった。
【００１７】
本発明は、上記状況に鑑みて、気液界面でも安定した高い信号雑音比（ＳＮＲ）を得ることができる、気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、シリコン薄膜に数μｍ単位の幅のスリットを形成することによって作製された、気体と溶液の気液界面に配置されたカンチレバーと、励起用レーザーを用いて駆動した前記カンチレバーの共振周波数を検出用レーザーを用いて、前記励起用レーザーおよび検出用レーザーの伝播を妨害する液体やガラスカバーの妨害層を介さずに測定するようにした、前記気体側に配置した監視装置とを具備し、前記カンチレバーの気体に面する面における親水性負荷を取り除き高い信号雑音比（ＳＮＲ）が得られるようにしたことを特徴とする。
【００１９】
〔２〕上記〔１〕記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記スリットの幅が２μｍ〜１０μｍであり、メニスカス力によって前記溶液が前記気体側に漏れるのを防ぐことを特徴とする。
【００２０】
〔３〕上記〔１〕又は〔２〕記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記監視装置は、前記カンチレバーの前記気体に面する面から反射されるドップラーレーザーを用いてリアルタイムに前記カンチレバーの共振周波数を監視することを特徴とする。
【００２１】
〔４〕上記〔１〕、〔２〕又は〔３〕記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記カンチレバーの溶液側に溶液を供給するマイクロ流路を配置し、プッシュプル型シリンジポンプを用いて前記溶液の液圧を前記マイクロ流路の両端でそれぞれ制御するとともに、前記プッシュプル型シリンジポンプと前記マイクロ流路を接続するチューブの長さを調整することにより、前記カンチレバーにおける液圧の摂動を補償するようにしたことを特徴とする。
【００２２】
〔５〕上記〔４〕記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記プッシュプル型シリンジポンプと前記マイクロ流路の流入口との間に、前記マイクロ流路内に化学物質を注入するための注入装置を配置することを特徴とする。
【００２３】
〔６〕上記〔４〕記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記カンチレバーの表面を検出分子に特異的に結合する分子で予め修飾して、分子識別能を付加しておき、前記カンチレバーの表面に前記検出分子が吸着した時に発生する共振周波数の変化を検出することを特徴とする。
【００２４】
〔７〕上記〔４〕記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記マイクロ流路内の液圧を直接測定することを特徴とする。
【００２５】
〔８〕上記〔１〕、〔２〕又は〔３〕記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記カンチレバーの溶液に面する面に原子間力顕微鏡の探針を具備することを特徴とする。
【００２６】
〔９〕上記〔８〕記載の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、前記溶液中の生体分子を生理的条件下で観察することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。
【００２８】
マイクロ流路に構築された気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサにおいて、カンチレバーの気体に面する面の親水性負荷を取り除きカンチレバーの変位計測における信号雑音比を向上させることができる。
【００２９】
また、カンチレバーの周波数特性が向上するので、液中原子間力顕微鏡の撮像においてより微小な凹凸情報の検出ができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の実施例を示す気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサの全体構成図である。
【図２】図１のマイクロカンチレバーセンサのカンチレバーの裏面図である。
【図３】図１のＡ部拡大図である。
【図４】本発明に係るカンチレバー周囲の異なる環境における周波数特性図である。
【図５】本発明の実施例を示すカンチレバーの製造工程図である。
【図６】本発明に係るカンチレバーの共振周波数を１時間計測した計測値を示す図である。
【図７】プッシュプル型シリンジポンプを使用し、マイクロ流路の両側に向かうチューブの長さを調整して、逆方向の同じ圧力であるべき液圧Ｐ１およびＰ２を平衡させるための実験のセットアップ状態を示す図である。
【図８】本発明に係るカンチレバーの３種類の微小球濃度に対する共振周波数の過渡応答を示す図である。
【図９】本発明に係るカンチレバーの３種類の異なる濃度における微小球の反応動態を示す図である。
【図１０】本発明に係るカンチレバーのマイクロ流路内の流速による周波数の変化を示す図である。
【図１１】本発明に係る原子間力顕微鏡用カンチレバーの模式図である。
【図１２】本発明の実施例を示す原子間力顕微鏡用カンチレバーの製造工程図である。
【図１３】従来の液体中で共振するマイクロカンチレバーセンサの模式図である。
【図１４】従来の液体中における原子間力顕微鏡用カンチレバーの模式図である。
【図１５】従来のカンチレバーセンサの断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサは、シリコン薄膜に数μｍ単位の幅のスリットを形成することによって作製された、気体と溶液の気液界面に配置されたカンチレバーと、励起用レーザーを用いて駆動した前記カンチレバーの共振周波数を検出用レーザーを用いて、前記励起用レーザーおよび検出用レーザーの伝播を妨害する液体やガラスカバーの妨害層を介さずに測定するようにした、前記気体側に配置した監視装置とを具備し、前記カンチレバーの気体に面する面における親水性負荷を取り除き高い信号雑音比（ＳＮＲ）が得られるようにした。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００３３】
図１は本発明の実施例を示す気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサの全体構成図、図２は図１のマイクロカンチレバーセンサのカンチレバーの裏面図、図３は図１のＡ部拡大図である。
【００３４】
ここでは、バイオセンサ構造について説明する。
【００３５】
これらの図において、１はＰＤＭＳからなるカバー、２はＳＯＩウェハからなり、カンチレバー構造を有するデバイス、３はマイクロ流路、４は気体部、５はカンチレバーの共振周波数の監視装置であり、図１３に示したものと同様であるので、その説明は割愛する。
【００３６】
マイクロ流路３に組み込んだカンチレバー２Ａを、ＤＲＩＥ（Ｄｅｅｐ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｉｏｎ  Ｅｔｃｈｉｎｇ）プロセスを用いてシリコン・オン・インシュレーター（ＳＯＩ、Ｓｉ／ＳｉＯ2 ／Ｓｉ：５／２／４００μｍ）ウェハ上に作製した。カンチレバー２Ａは、図２に示すように、メニスカス力によって液体を維持する数μｍ幅のスリット２Ｂを形成することによって、マイクロ流路３の底面に形成した。流体溶液の流入と流出を可能にするため、マイクロ流路３の上に厚さ２ｍｍのＰＤＭＳカバー１を加工した。カンチレバー２Ａの共振周波数を検出しながら、溶液をマイクロ流路３に流入させ、カンチレバー２Ａの上面と接触させるようにした。なお、２ＣはＳｉＯ2 膜である。
【００３７】
カンチレバー２Ａの固定端部の周辺で加熱強度を変化させることによって、光熱励振用レーザーでカンチレバー２Ａを作動させた。最大振幅を有する自由端に位置付けたＬＤＶのビームによって、共振周波数におけるその位相を計測した。位相の偏差は位相同期回路を用いて信号発生器に対して補償した。
【００３８】
なお、図２に示されるカンチレバーは、長さ８０μｍ、幅２０μｍ、厚さ５μｍである。スリット２Ｂの幅は、図３に示されるように、マイクロ流路３中の液体が漏れることなく維持される限り、適宜設定することができる。
【００３９】
次に、カンチレバー周囲の環境が異なる場合の周波数特性の比較について説明する。
【００４０】
図４は本発明に係るカンチレバー周囲の環境が異なる場合の周波数特性図であり、大気中〔図４（ａ）〕、大気と純水との界面〔図４（ｂ）〕、および純水中〔図４（ｃ）〕という３種類の異なる条件でカンチレバーを共振させ、その共振周波数を測定した結果を示す。環境の影響を正確に把握するため、同じカンチレバーを異なる条件で共振させた。
【００４１】
大気中では、図４（ａ）に示すように、カンチレバーはその共振周波数において最も高いＱ値を示し、１，１９１ｋＨｚで３９７であった。
【００４２】
一方、カンチレバーを純水に浸漬させた状態では、図４（ｃ）に示すようにカンチレバー周辺の流体力学負荷（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｌｏａｄｉｎｇ）の影響によって、共振周波数およびＱ値は７８８．５ｋＨｚおよび１１まで大幅に低下した。さらに、片面が大気に晒されているカンチレバーの場合は、図４（ｂ）に示すように、他の条件の場合の中間である９１９．５ｋＨｚの共振周波数と少なくとも１５のＱ値を有していた。
【００４３】
特に、本発明に係る気液界面におけるカンチレバーのＳＮＲは液中環境のカンチレバーの８倍であるが、これは、カンチレバーが、レーザー検出器とカンチレバー表面との間の界面に、雑音を増加させる液体やガラスカバーなどの妨害層を有さないためである。そのため、その雑音レベルから、理論計算上では８．４×１０-12 ｇ程度の低い付加質量を測定することができた。
【００４４】
以下、本発明の実験例について説明する。
【００４５】
（Ａ）カンチレバーの作製
図５は本発明の実施例を示すカンチレバーの製造工程図である。
【００４６】
寸法８０μｍ×２０μｍ×５μｍのカンチレバーをＤＲＩＥプロセスによってＳＯＩウェハ上に作製し、その親水性表面をＳｉＯ2 層で覆った。カンチレバーは、厚さ４００μｍのシリコン最下層上に作製したマイクロ流路に組み込んだ厚さ５μｍのシリコン層上に形成した。そのプロセスは次の通りである。
【００４７】
（１）図５（ａ）に示すように、ＳＯＩウェハ１１を準備する。
【００４８】
（２）図５（ｂ）に示すように、熱蒸着プロセスを用いて厚さ１００ｎｍのＡｌ層１２をＳＯＩウェハ１１の底面に堆積させる。
【００４９】
（３）図５（ｃ）に示すように、Ａｌ層１２上にフォトレジスタＳ１８１８を４０００ｒｐｍで３０秒間スピン塗布し、９０℃の熱板上で１０分間焼成する。Ａｌ層１２は、マイクロ流路のＤＲＩＥプロセス中のエッチングマスクとしての役割を果たす。
【００５０】
（４）図５（ｄ）に示すように、フォトレジスタＳ１８０５を用いて厚さ５μｍのシリコン層でカンチレバー１３をパターニングし、薄いシリコン層上にパターニングしたカンチレバー１３を、ＳＴＳ−ＩＣＰの「ＳＯＩプロセス」を用いて３３サイクルで形成する。
【００５１】
（５）図５（ｅ）に示すように、マイクロ流路が予定される領域１５を、ＳｉＯ2 膜１４膜まで、ＳＴＳ−ＩＣＰの「Ｔｏｋｙｏプロセス」を用いて５００サイクルで作製し、ピラニア溶液を用いてデバイスを１２０℃の熱板で１５分間洗浄し、次いで純水で数回すすぎを行う。
【００５２】
（６）図５（ｆ）に示すように、厚さ２μｍの埋め込みＳｉＯ2 膜１４を、デバイスから７ｃｍ離したフィラメント光下で５分間、気相フッ酸（ＨＦ）によって除去し、最終的なマイクロ流路が予定される領域１５′を形成する。
【００５３】
さらに、カンチレバーの表面を官能基化するため、マイクロ流路側のカンチレバー表面にスパッタリングを施して厚さ１３０ｎｍのＳｉＯ2 を堆積させた。
【００５４】
（Ｂ）共振周波数の安定化
カンチレバー周囲の様々なスリット幅に関して、静的および動的流動条件における漏れが研究されてきた。マイクロ流路からの溶液の漏れを検証するため、幅２μｍ〜１０μｍのスリットを使用した。静的条件では、スリット幅が１０μｍであっても、スリットはメニスカス力によって漏れを生じることなく溶液を維持した。さらに、動的条件では、純水をマイクロ流路に流したところ、流動速度が生体反応に対する流動速度としてはかなり高速である１１，２５０ｍｍ／秒未満のとき、スリットからの漏れはなかった。
【００５５】
しかしながら、流入口と流出口の圧送構造が非対称的であるため、マイクロ流路内で生体反応が十分に起こり得る１時間にわたって共振周波数を継続的にモニタしたところ、いくつかの問題が生じた。
【００５６】
図６は本発明に係るカンチレバーの共振周波数を１時間計測した計測値を示す図であり、図６（ａ）はプル型シリンジポンプを使用した場合、図６（ｂ）のａはプッシュプル型シリンジポンプを使用した場合であり、ピークは規則的に出現した。図６（ｂ）のｂはマイクロ流路の流入口／流出口に向かうチューブの長さを調整した後にプッシュプル型シリンジポンプを使用した場合を示している。
【００５７】
１つのシリンジポンプのみを適用して液体を注入すると、流体速度が高速になってマイクロ流路内の液圧が減少するため、カンチレバーが液圧の影響を受けやすくなった。共振周波数は１時間計測する間に約１５ｋＨｚ増加し、数時間後に初期レベルに戻った〔図６（ａ）〕。これを最小限に抑え、マイクロ流路内のカンチレバーの共振周波数を安定させるため、反対の圧力を両方向に同時に印加することができるプッシュプル型シリンジポンプ（ｐｕｓｈ／ｐｕｌｌ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｐｕｍｐ）を利用することによって、マイクロ流路の両側で液圧を制御した〔図６（ｂ）のａ〕。それに加えて、ポンプと流入口／流出口とを接続するチューブの長さを調整して、流体抵抗を平均化した。その結果、１時間以上にわたって共振周波数を安定させることに成功した〔図６（ｂ）のｂ〕。
【００５８】
このように構成することにより、本発明のカンチレバーは、連続計測中の気液間の環境が非対称的であっても、スリットからの液体の漏れはなく、かつ共振周波数が安定していることが実証された。
【００５９】
図７はプッシュプル型シリンジポンプを使用し、マイクロ流路の両側に向かうチューブの長さを調整して、逆方向の同じ圧力であるべき液圧Ｐ１およびＰ２を平衡させるための実験のセットアップ状態を示す図である。
【００６０】
この図において、２１はポンプ、２２はポンプ２１から送り出される第１の流れ、２３は注入装置、２４は注入装置２３の出口に接続される第１のチューブ、２５はマイクロ流路、２６はマイクロ流路２５への流入口、２７はマイクロ流路２５からの流出口、２８は流出口２７へ接続される第２のチューブ、２９は第２のチューブ２８を経てポンプ２１に戻される第２の流れである。つまり、化学物質をマイクロ流路２５に注入するため、ポンプ２１と流入口２６との間に注入装置２３を採用した。溶液は注入装置２３の閉回路に導入し、次いで第１のチューブ２４に注入した。
【００６１】
（Ｃ）異なる濃度の微小球に対する反応動態
直径４５０ｎｍのカルボキシル化微小球を、アミノ基で官能基化したカンチレバーに連続的に暴露して、異なる濃度に対応する反応動態を確認した。アミノ官能基を表面上に均一に分布させるため、ＡＰＴＥＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン）溶液、すなわち、ＡＰＴＥＳ５％、純水５％、およびエタノール９０％、をカンチレバー上のＳｉＯ2 層に３０分間適用し、エタノールおよび純水を用いて慎重にすすぎを行った。デバイスは、６０℃のオーブン内で一晩完全に乾燥させた。微小球上でアミノ基とカルボキシル基を結び付けるため、ＥＤＣ〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド：水溶性カルボジイミド〕を２ｍｇ／ｍＬ添加してペプチド結合させた。
【００６２】
３種類の異なる微小球懸濁濃度は、３×１０7 個／ｍＬ、３×１０6 個／ｍＬ、３×１０5 個／ｍＬとし（順に濃度を１０分の１ずつにした）、異なるマイクロ流路内の各カンチレバーにそれぞれ適用した。実験は、マイクロ流路内の平均流体速度を２ｍｍ／秒として１時間行った。この速度は、プッシュプル型シリンジポンプの体積速度に換算すると５μＬ／分であった。
【００６３】
幅２μｍのスリットを有する３つのカンチレバーを３つの異なるマイクロ流路内で用いた。ＥＤＣ結合緩衝液中でのそれらの共振周波数はそれぞれ、５５９ｋＨｚ、５８７．５ｋＨｚ、および５９６．８ｋＨｚ、Ｑ値は１８であった。各カンチレバーは、ロックインアンプを備えた位相同期回路を使用して共振条件で振動させた。共振周波数シフトは、位相のフィードバック電圧に感度３０ｋＨｚ／Ｖを乗算して計算した。
【００６４】
図８は本発明に係るカンチレバーの３種類の微小球濃度に対する共振周波数の過渡応答を示す図であり、図８（ａ）は微小球濃度が３×１０7 個／ｍＬ、図８（ｂ）は微小球濃度が３×１０6 個／ｍＬ、図８（ｃ）は微小球濃度が３×１０5 個／ｍＬである（スケールバーは１０分を示している）。
【００６５】
この図に示すように、濃度が高いほど反応時間は短くなる。特に、図８（ａ）に示すように、最も高い濃度では、共振周波数は最初の５分間で大幅に減少し、その後わずかだけ徐々に増加した。対照的に、図８（ｂ），図８（ｃ）に示すように、他の２つの低濃度では、共振周波数はそれぞれ減少し飽和した。
【００６６】
図９は本発明に係るカンチレバーの３種類の異なる濃度における微小球の反応動態を示す図であり、図９（ａ）は３つの条件における共振周波数シフトの正規化プロット図であり、この図において、Ａは図８（ａ）に示した共振周波数の過渡応答、Ｂは図８（ｂ）に示した共振周波数の過渡応答、Ｃは図８（ｃ）に示した共振周波数の過渡応答を示している。図９（ｂ）は微小球の濃度に応じて変わる時定数、および結果から導き出された方程式を示す図である。
【００６７】
反応動態の方程式［ｆr ］＝［ｆr0］ｅｘｐ（−ｋｔ），ｆr （式中、ｆr は共振周波数、ｆr0は初期共振周波数、ｔは時間、ｋは速度定数）によって、ｋはそれぞれ、濃度の高い順に０．８２、０．３１、および０．１１と算出された。結果として、微小球濃度が１０倍になるとｋは約２．６２倍となる。これは、図９（ｂ）および図中に挿入した方程式で説明されている。
【００６８】
上記したように、本発明によれば、バイオ応用向けのカンチレバーを用いて、それを気液界面に配置しその界面で共振させることで、カンチレバー表面の気体側における親水性負荷を取り除き、液中環境の場合の８倍のＳＮＲが得られた。
【００６９】
しかしながら、カンチレバー周囲の環境が非対称的であるため、液圧変化の影響を受けやすくなった。プッシュプル型シリンジポンプを利用し、ポンプとマイクロ流路を接続するチューブの長さを調整して、カンチレバーにおける液圧の摂動を補償した。カンチレバーの共振周波数は、大気に晒された表面から反射されるドップラーレーザーを用いてリアルタイムでモニタした。共振周波数は、表面上のアミノ基と微小球のカルボキシル基との間のペプチド結合による負荷質量によって変化した。３種類の異なる濃度は、周波数変化に対して対数関数的に比例することが示された。
【００７０】
図１０は本発明に係るカンチレバーのマイクロ流路内の流速による共振周波数の変化を示す図である。
【００７１】
スリット付きカンチレバーを用いて、マイクロ流路内の送液圧力を測定するセンサに応用することができる。液体の送液により生じた流路内圧力をカンチレバーの共振周波数変化として図１０のように測定することができる。流速の増加に伴い、共振周波数はほぼ線形的に上昇した。これにより、共振周波数変化からカンチレバーに加わる圧力を計算すれば、マイクロ流路内の送液圧力を直接測定することができる。
【００７２】
図１１は本発明に係る原子間力顕微鏡用カンチレバーの模式図である。
【００７３】
この図において、３１はマイクロ流路、３２はマイクロ流路への流入口、３３はマイクロ流路からの流出口、３４は液体中に配置された探針３４Ａを有するスリット３４Ｂ付きのカンチレバー、３５はサンプル、３６は気体部、Ａは励振用レーザー、Ｂは検出用レーザーである。
【００７４】
このように構成したので、図１４に比べて、励起用レーザーＡと検出用レーザーＢの乱反射を生じることがなくなるので、高い信号雑音比の振動信号が得られ、またカンチレバーの気体に面する面の親水性負荷が除去され、カンチレバーの周波数特性が向上するので、マイクロ流路３１中においても、カンチレバー３４により、サンプル３５の微小な凹凸情報を高精度に計測する原子間力顕微鏡としての応用が可能となる。
【００７５】
図１２は本発明の実施例を示す原子間力顕微鏡用カンチレバーの製造工程図である。
【００７６】
（１）図１２（ａ）に示すように、ＳＯＩウェハ４１の裏面にＡｌ層４２を蒸着する。
【００７７】
（２）図１２（ｂ）に示すように、裏面のＡｌ層４２をパターニングする。
【００７８】
（３）図１２（ｃ）に示すように、ＳＯＩウェハ４１の表面に探針４３Ａ付きのＡＦＭカンチレバー４３のプローブをパターニングし、異方性エッチングを行う。
【００７９】
（４）図１２（ｄ）に示すように、表面にスリット４３Ｂ付きのカンチレバー４３の形をパターニングし、ＤＲＩＥを行う。
【００８０】
（５）図１２（ｅ）に示すように、ＳＯＩウェハ４１のＳｉＯ2 膜４４まで、裏面のＤＲＩＥを行い、マイクロ流路となる領域４５を形成する。
【００８１】
（６）図１２（ｆ）に示すように、フッ酸でＳｉＯ2 膜４４をエッチングし、最終的なマイクロ流路となる領域４５′を形成する。
【００８２】
このようにして、原子間力顕微鏡用カンチレバーを作製することができる。
【００８３】
また、カンチレバーセンサはカンチレバー表面に検出分子を吸着させた時に発生する、共振周波数や静的変位の変化を検出する装置であり、検出分子に特異的に結合するような分子（例えば抗体）であらかじめカンチレバーの表面を修飾しておくことで、分子識別能を付加させることができる。
【００８４】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサは、マイクロ流路に構築された気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサのカンチレバー表面の気体側における親水性負荷を取り除きカンチレバーの変位計測における信号雑音比を向上させる気液界面で共振するマイクロカンチレバーセンサとして利用することができる。
【符号の説明】
【００８６】
１    ＰＤＭＳからなるカバー
２    カンチレバーデバイス
２Ａ，１３，３４    カンチレバー
２Ｂ，３４Ｂ，４３Ｂ    スリット
２Ｃ，１４，４４    ＳｉＯ2 膜
３，２５，３１    マイクロ流路
４，３６    気体部
５    カンチレバーの共振周波数の監視装置
１１，４１    ＳＯＩウェハ
１２，４２    Ａｌ層
１５，４５    マイクロ流路となる領域
１５′，４５′    最終的なマイクロ流路となる領域
２１    ポンプ
２２    第１の流れ
２３    注入装置
２４    第１のチューブ
２６，３２    マイクロ流路への流入口
２７，３３    マイクロ流路からの流出口
２８    第２のチューブ
２９    第２の流れ
３４Ａ，４３Ａ    探針
３５    サンプル
４３    ＡＦＭカンチレバー
Ａ    励振用レーザー
Ｂ    検出用レーザー
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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