(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
in vitroでヒトＥＰＯ受容体を検出するための方法であって、
サンプルと、ヒトＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に特異的に結合するＥＰＯ受容体抗体をインキュベートすることによって、該サンプル中のヒトＥＰＯ受容体の存在をin vitroで決定し、それによって、in vitroでヒトＥＰＯ受容体を検出する工程を含み、
ここで、ＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に特異的に結合するＥＰＯ受容体抗体は、ＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に交差吸着することにより精製され、かつ、ヒト内皮細胞から得ることができる６６ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しない、方法。
【請求項２】
ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体であって、
該抗体は、ヒトＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に結合するが、ヒト内皮細胞から得ることができる６６ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合せず、
前記抗体は、ヒトＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に結合しない抗体を含まないことを特徴とする、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の方法で使用するための、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体を含む、医薬品組成物であって、
該抗体は、ヒトＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に結合するが、ヒト内皮細胞から得ることができる６６ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合せず、
前記抗体は、ヒトＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に結合しない抗体を含まない、医薬組成物。
【請求項４】
ヒトＥＰＯ受容体を検出するための、ＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に結合し、ＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に交差吸着することにより精製され、かつ、ヒト内皮細胞から得ることができる６６ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しないことを特徴とする、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体の使用。
【請求項５】
赤血球の数を増加させるための医薬に対する患者の反応性を予測又は決定するための方法であって、
−  患者のサンプルと、請求項２に記載のＥＰＯ受容体抗体又は請求項３に記載の医薬組成物をin vitroでインキュベートすること、及び、請求項２に記載の抗体又は請求項３に記載の医薬組成物に含まれる抗体の該サンプルへの結合をin vitroで決定することにより、患者の癌細胞上のヒトＥＰＯ受容体の存在をin vitroで決定すること、及び
−  患者の癌細胞上のヒトＥＰＯ受容体の存在と赤血球の数を増加させるための医薬に対する患者の反応性を関連付けることを含む、方法。
【請求項６】
ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体を産生するための方法であって、
−  ＥＰＯ受容体フラグメントＬＤＫＷＬＬＰＲＮＰＰＳＥＤＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０２）を含むポリペプチドで動物を免疫する工程、
−  ＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に特異的に結合する抗体を選択する工程、及び、
−  ＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に交差吸着することにより精製し、それによって、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体を産生する工程を含む、方法。
【請求項７】
抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができる５８ｋＤ〜７０ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しないことを特徴とする、請求項１もしくは５もしくは６に記載の方法。
【請求項８】
抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができるタンパク質に１０−３Ｍ以上の親和性で結合することを特徴とする、請求項１及び５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができる５８ｋＤ〜７０ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しないことを特徴とする、請求項２に記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができるタンパク質に１０−３Ｍ以上の親和性で結合することを特徴とする、請求項２又は９に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができる５８ｋＤ〜７０ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しないことを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項１２】
抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができるタンパク質に１０−３Ｍ以上の親和性で結合することを特徴とする、請求項４又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
抗体が、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項２、９及び１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
抗体が、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体である、請求項２、９、１０及び１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
抗体が、ヒトＥＰＯ受容体に結合する抗体フラグメントである、請求項２、９、１０、１３及び１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項２に記載の抗体と薬学的に許容しうる担体を含む、医薬製剤。
【請求項１７】
請求項２に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１９】
請求項２に記載の抗体又は請求項３に記載の医薬組成物を含む、診断キット。
【請求項２０】
ヒトの組織又は細胞サンプル中のＥＰＯ受容体を分析するための、請求項２に記載の抗体又は請求項３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２１】
サンプルが、ヒトの組織もしくは細胞の溶解物、又はヒトの組織の切片、又は新鮮なヒトの組織の切片、又はヒトの凍結組織、又はヒトの凍結組織の切片、又はヒトのホルマリン固定パラフィン包埋組織、又はヒトのホルマリン固定パラフィン包埋組織の切片であることを特徴とする、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
分析が、免疫化学、免疫蛍光又は免疫組織化学により実施されることを特徴とする、請求項２０又は２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
分析が、ウエスタンブロットにより実施される、請求項２１又は２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトＥＰＯ受容体抗体及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、赤血球前駆細胞の増殖及び分化に関与する１６６−ａａの糖タンパク質である。これらの細胞応答は、５０８−ａａの糖タンパク質であるヒトＥＰＯ受容体（ＥＰＯ受容体、ＥＰＯＲ）により媒介される。ＥＰＯ受容体は、単一の膜貫通ドメインを含有する５０８アミノ酸長のタンパク質であり（Swiss Prot P19235）、クラスＩサイトカイン受容体の成長ホルモンサブファミリーのメンバーとして分類されている。ＥＰＯ受容体は、例えば、Winkelmann, J.C., et al., Blood 76 (1990) 24-30、及びJones, S.S., et al., Blood 76 (1990) 31-35 に記載されている。
【０００３】
ＥＰＯ受容体に対する抗体は、例えば、D'Andrea, A.D., Blood 82 (1993) 46-52; Elliott, S., Blood 107 (2006) 1892-1895; Kirkeby, A., J. Neurosci. Methods 164 (2007) 50-58; Miura, O., Arch. Biochem. 306 (1993) 200-208; Mayeux, P., et al., J. Biol. Chem. 266 (1991) 23380-23385; Westphal. G., et al., Clin. Exp. Med. 2 (2002) 45-52; Elliott, S., et al., J. Immunol. Meth. 352 (2010) 126-139、ならびに EP 1 146 056、EP 1 327 681、EP 0 773 962、EP 0 776 370、US 2002/0031806、US 2003/0215444、US 2004/0058393、US 2004/0071694、US 2004/0175379、US 2005/0227289、US 2005/0244409、US 2006/0018902、US 6,153,190、US 6,998,124、US 7,053,184、US 7,081,523、WO 1995/005469、WO 1996/003438、WO 2000/061637、WO 2004/035603、WO 2005/100403、及び WO2010/022924から公知である。しかし、組織サンプル中のＥＰＯ受容体の発現及び局在を調べる研究は、ＥＰＯ受容体に対する公知の抗体の特異性が低いために、一致しない、しばしば人為的な結果をもたらし（Jelkmann, W., et al., Crit. Rev. Onc. Hematol. 67 (2008) 39-61; Elliott, S., et al., Blood 107 (2006) 1892-1895; Jelkmann, W. and Laugsch, M., J. Clin. Oncol. 25 (2007) 1627-1628; Kirkeby, A., et al., J. Neurosci. Methods 164 (2007) 50-58; Laugsch, M. et al., Int. J. Cancer 122 (2008) 1005-1011 を参照）、又は研究が疑わしい特異性を有する抗体を用いていること及び観測の有意性に議論の余地があることが報告された（上記 Elliott, S.）。
【０００４】
発明の概要
本明細書において報告される抗体が、内皮細胞上／内皮細胞内に存在する類似のサイズのタンパク質に交差反応することなく、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合することによって、明確な検出結果を可能にすることが見い出された。
【０００５】
本明細書において報告される一局面は、in vitroでヒトＥＰＯ受容体を検出するための方法であって、サンプルと、ヒトＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に特異的に結合するＥＰＯ受容体抗体をインキュベートすることにより、該サンプル中のヒトＥＰＯ受容体の存在をin vitroで決定し、それによって、in vitroでヒトＥＰＯ受容体を検出する工程を含み、ここで、ＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に特異的に結合するＥＰＯ受容体抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができる約５８ｋＤ〜約７０ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しない、方法である。
【０００６】
一態様において、該方法は、抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができる約６６ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しないことを特徴とする。
【０００７】
一態様において、該方法は、抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができるタンパク質に１０−３Ｍ以上の親和性で結合することを特徴とする。
【０００８】
一態様において、該方法は、抗体が、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であることを特徴とする。
【０００９】
一態様において、該方法は、抗体が、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体であることを特徴とする。
【００１０】
一態様において、該方法は、抗体が、ヒトＥＰＯ受容体に結合する抗体フラグメントであることを特徴とする。
【００１１】
本明細書において報告される１つの局面は、ヒトＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に結合し、かつ、ヒト内皮細胞から得ることができる約５８ｋＤ〜約７０ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しないことを特徴とする、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体である。
【００１２】
一態様において、該抗体は、ヒト内皮細胞から得ることができる約６６ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しないことを特徴とする。
【００１３】
一態様において、該抗体は、ヒト内皮細胞から得ることができるタンパク質に１０−３Ｍ以上の親和性で結合することを特徴とする。
【００１４】
一態様において、該抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であることを特徴とする。
【００１５】
一態様において、該抗体は、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体であることを特徴とする。
【００１６】
一態様において、該抗体は、ヒトＥＰＯ受容体に結合する抗体フラグメントであることを特徴とする。
【００１７】
本明細書において報告される１つの局面は、本明細書において報告される方法で使用することができる、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体である。
【００１８】
本明細書において報告される１つの局面は、本明細書において報告される方法で使用するための、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体である。
【００１９】
一態様において、該抗体は、ＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に結合し、かつ、ヒト内皮細胞から得ることができる約５８ｋＤ〜約７０ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しないことを特徴とする。
【００２０】
一態様において、該抗体は、ヒト内皮細胞から得ることができる約６６ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しないことを特徴とする。
【００２１】
一態様において、該抗体は、ヒト内皮細胞から得ることができるタンパク質に１０−３Ｍ以上の親和性で結合することを特徴とする。
【００２２】
一態様において、該抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であることを特徴とする。
【００２３】
一態様において、該抗体は、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体であることを特徴とする。
【００２４】
一態様において、該抗体は、ヒトＥＰＯ受容体に結合する抗体フラグメントであることを特徴とする。
【００２５】
本明細書において報告される１つの局面は、ヒトＥＰＯ受容体を検出するための、ＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に結合し、かつ、ヒト内皮細胞から得ることができる約５８ｋＤ〜約７０ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しないことを特徴とする、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体の使用である。
【００２６】
一態様において、該使用は、抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができる約６６ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しないことを特徴とする。
【００２７】
一態様において、該使用は、抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができるタンパク質に１０−３Ｍ以上の親和性で結合することを特徴とする。
【００２８】
一態様において、該使用は、抗体が、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であることを特徴とする。
【００２９】
一態様において、該使用は、抗体が、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体であることを特徴とする。
【００３０】
一態様において、該使用は、抗体が、ヒトＥＰＯ受容体に結合する抗体フラグメントであることを特徴とする。
【００３１】
本明細書において報告される１つの局面は、赤血球の数を増加させるための医薬に対する患者の反応性を予測又は決定するための方法であって、
−  患者のサンプルと本明細書において報告されるＥＰＯ受容体抗体をin vitroでインキュベートすること、及び該抗体の該サンプルへの結合をin vitroで決定することにより、患者の癌細胞上のヒトＥＰＯ受容体の存在をin vitroで決定することを含み、
それによって、患者の癌細胞上のヒトＥＰＯ受容体の存在が、赤血球の数を増加させるための医薬に対する患者の反応性の指標となる、方法である。
【００３２】
一態様において、該方法は、抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができる約５８ｋＤ〜約７０ｋＤ、一態様においては、約６６ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しないことを特徴とする。
【００３３】
一態様において、該方法は、抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができるタンパク質に１０−３Ｍ以上の親和性で結合することを特徴とする。
【００３４】
一態様において、該方法は、抗体が、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であることを特徴とする。
【００３５】
一態様において、該方法は、抗体が、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体であることを特徴とする。
【００３６】
一態様において、該方法は、抗体が、ヒトＥＰＯ受容体に結合する抗体フラグメントであることを特徴とする。
【００３７】
本明細書において、アミノ酸配列ＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）を有するヒトＥＰＯ受容体フラグメントに特異的に結合し、かつ、ヒト内皮細胞に結合しない抗体を報告する。そのような抗体は、アミノ酸配列ＬＤＫＷＬＬＰＲＮＰＰＳＥＤＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０２）を有するＥＰＯ受容体フラグメントで実験動物を免疫し、その後、交差吸着、すなわち、実験動物から得られる、アミノ酸配列ＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）を有するＥＰＯ受容体フラグメントに対する抗体を選択することにより得ることができることが見い出された。
【００３８】
本明細書において報告される１つの局面は、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体を産生するための方法であって、
−  ＥＰＯ受容体フラグメントＬＤＫＷＬＬＰＲＮＰＰＳＥＤＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０２）を含むポリペプチドで動物を免疫する工程、及び
−  ＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に結合する抗体を選択し、それによって、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体を産生する工程を含む、方法である。
【００３９】
一態様において、該選択は、免疫した動物から得られる、固定化した配列番号０１のＥＰＯ受容体フラグメントに対する抗体を交差吸着することによる選択である。
【００４０】
一態様において、該方法は、抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができる約５８ｋＤ〜約７０ｋＤ、一態様においては、約６６ｋＤの分子量を有するタンパク質に特異的に結合しないことを特徴とする。
【００４１】
一態様において、該方法は、抗体が、ヒト内皮細胞から得ることができるタンパク質に１０−３Ｍ以上の親和性で結合することを特徴とする。
【００４２】
一態様において、該方法は、抗体が、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であることを特徴とする。
【００４３】
一態様において、該方法は、抗体が、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体であることを特徴とする。
【００４４】
一態様において、該方法は、抗体が、ヒトＥＰＯ受容体に結合する抗体フラグメントであることを特徴とする。
【００４５】
本明細書において報告される１つの局面は、ＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に結合する、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体である。
【００４６】
一態様において、該抗体は、ヒトＥＰＯ受容体に対して、１０−７Ｍ以下の親和性を有する。一態様において、該抗体は、ヒトＥＰＯ受容体に対して、１０−８Ｍ以下の親和性を有する。一態様において、該抗体は、ヒトＥＰＯ受容体に対して、５×１０−９Ｍ以下の親和性を有する。一態様において、該抗体は、ヒトＥＰＯ受容体に対して、２×１０−９Ｍ以下の親和性を有する。一態様において、該抗体は、ヒトＥＰＯ受容体に対して、約１．８×１０−９Ｍの親和性を有する。一態様において、該抗体は、ヒトＥＰＯ受容体に対して、少なくとも５×１０−１０Ｍの親和性を有する。一態様において、該抗体は、ヒトＥＰＯ受容体に対して、少なくとも約６．３×１０−１０Ｍの親和性を有する。
【００４７】
全ての局面の一態様において、該抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。
【００４８】
全ての局面の一態様において、該抗体は、マウス、又はラット、又はウサギ、又はハムスター、又はヒツジ、又はヤギ、又はニワトリ、又はサル、又はブタ、又はヒト、又はヒト化抗体である。一態様において、該抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。
【００４９】
一態様において、該抗体は、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する、抗体フラグメントである。
【００５０】
本明細書において報告される１つの局面は、本明細書において報告される抗体をコードする、単離された核酸である。
【００５１】
本明細書において報告される１つの局面は、本明細書において報告される抗体をコードする核酸を含む、宿主細胞である。
【００５２】
本明細書において報告される１つの局面は、本明細書において報告される抗体を産生する方法であって、該抗体が産生されるように、本明細書において報告される宿主細胞を培養することを含む、方法ある。
【００５３】
一態様において、該方法は、宿主細胞又は培養培地から抗体を回収する工程を含む。
【００５４】
一態様において、該宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞である。一態様において、該細胞は、ＣＨＯ細胞、又はＨＥＫ細胞、又はＢＨＫ細胞、又はＳｐ２／０細胞、又はＮＳ０細胞である。
【００５５】
一態様において、該細胞は、E.coli細胞又はBacillus細胞である。
【００５６】
本明細書において報告される１つの局面は、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体を産生するための方法であって、
−  ＥＰＯ受容体フラグメントＬＤＫＷＬＬＰＲＮＰＰＳＥＤＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０２）を含むポリペプチドで動物を免疫する工程、及び
−  ＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号１）に結合する抗体を選択する工程、及び
それによって、ヒトＥＰＯ受容体に特異的に結合する抗体を産生する工程を含む、方法である。
【００５７】
一態様において、該方法は、下記の追加の工程の１つ又は複数を含む：
−  選択された抗体をコードする核酸を含む細胞を培養する工程、及び／又は
−  該細胞又は培養培地から該抗体を回収する工程。
【００５８】
本明細書において報告される１つの局面は、本明細書において報告される抗体と検出可能な標識又は細胞毒性薬を含む、免疫コンジュゲートである。
【００５９】
本明細書において報告される１つの局面は、本明細書において報告される抗体と場合により薬学的に許容しうる担体を含む、医薬製剤である。
【００６０】
本明細書において報告される１つの局面は、検出可能な標識にコンジュゲートした本明細書において報告される抗体を含む、診断製剤である。
【００６１】
本明細書において報告される１つの局面は、医薬として使用するための、本明細書において報告される抗体である。
【００６２】
本明細書において報告される１つの局面は、貧血を処置するのに使用するための、本明細書において報告される抗体である。
【００６３】
本明細書において報告される１つの局面は、患者の赤血球の数を変化させるのに使用するための、本明細書において報告される抗体である。
【００６４】
本明細書において報告される１つの局面は、医薬の製造における、本明細書において報告される抗体の使用である。
【００６５】
一態様において、該医薬は、貧血を処置するための医薬である。
【００６６】
一態様において、該医薬は、患者の赤血球の数を変化させるための医薬である。
【００６７】
本明細書において報告される１つの局面は、貧血を有する個体を処置する方法であって、該個体の赤血球の数を変化／増加させるために、本明細書において報告される抗体の有効量を該個体に投与することを含む、方法である。
【００６８】
本明細書において報告される１つの局面は、個体の赤血球の数を変化させる方法であって、該個体の赤血球の数を変化させるために、本明細書において報告される抗体の有効量を該個体に投与することを含む、方法である。
【００６９】
本明細書において報告される１つの局面は、本明細書において報告される抗体を含む、診断キットである。
【００７０】
本明細書において報告される１つの局面は、本明細書において報告される抗体を含む診断キットを製造するための方法である。
【００７１】
本明細書において報告される１つの局面は、ヒトの組織サンプル中のヒトＥＰＯ受容体を決定又は分析するための、本明細書において報告される抗体の使用である。
【００７２】
全ての局面の一態様において、該サンプルは、ヒトの組織又はヒトの細胞の溶解物である。
【００７３】
全ての局面の一態様において、該サンプルは、組織の切片、又は新鮮な組織の切片、又は凍結組織、又は凍結組織の切片、又はホルマリン固定パラフィン包埋組織、又はホルマリン固定パラフィン包埋組織の切片である。
【００７４】
全ての局面の一態様において、該分析は、免疫化学、免疫蛍光又は免疫組織化学により実施される。一態様において、該分析は、ウエスタンブロットにより、又はＦＡＣＳにより、又はＮＩＲＦもしくはＰＥＴを使用するin-vivoイメージングにより実施される。
【００７５】
全ての局面の一態様において、該決定は、組織サンプルと本明細書において報告される抗体をインキュベートすること、及び該抗体の該組織サンプルへの結合を検出することによる決定である。
【００７６】
本明細書において報告される１つの局面は、赤血球の数を増加させるための医薬に対する患者の反応性を予測又は決定するための方法であって、
−  患者の癌細胞上のヒトＥＰＯ受容体の存在をin vitroで決定すること、及び
−  患者の癌細胞上のヒトＥＰＯ受容体の存在と赤血球の数を増加させるための医薬に対する患者の反応性を関連付けることを含む、方法である。
【００７７】
本明細書において報告される１つの局面は、癌患者を処置するための、赤血球の数を増加させるための医薬の用量を決定するための方法であって、
−  患者の癌細胞上のヒトＥＰＯ受容体の存在をin vitroで決定すること、ならびに
−  ヒトＥＰＯ受容体が存在することが決定された場合、赤血球の数を増加させる医薬を投与しないか、又はより少ない用量で投与することを決めること、及び
−  ヒトＥＰＯ受容体が存在しないことが決定された場合、赤血球の数を増加させる医薬を一用量投与することを決めることを含む、方法である。
【００７８】
本明細書において報告される１つの局面は、赤血球の数を増加させるための医薬に対する患者の反応性を予測又は決定するための方法であって、
−  患者の癌細胞上のヒトＥＰＯ受容体の密度をin vitroで決定すること、
−  患者の癌細胞上のヒトＥＰＯ受容体の密度と赤血球の数を増加させるための医薬に対する患者の反応性を関連付けることを含む、方法である。
【００７９】
本明細書において報告される１つの局面は、癌患者を処置するための、赤血球の数を増加させるための医薬の用量を決定するための方法であって、
−  患者の癌細胞上のヒトＥＰＯ受容体の存在をin vitroで決定すること、ならびに
−  ヒトＥＰＯ受容体が存在する場合、赤血球の数を増加させる医薬を投与しないか、又はより少ない用量で投与することを決めること、及び
−  ヒトＥＰＯ受容体が存在しない場合、赤血球の数を増加させる医薬の通常の一用量を投与することを決めることを含む、方法である。
【００８０】
全ての局面の一態様において、癌細胞上のヒトＥＰＯ受容体の存在を決定すること、又は癌細胞上のヒトＥＰＯ受容体の密度を決定することは、患者の組織サンプルと本明細書において報告されるＥＰＯ受容体抗体をin vitroでインキュベートすること、及び該抗体の該サンプルへの結合をin vitroで決定することによる。
【００８１】
一態様において、赤血球の数を増加させる医薬は、エリスロポエチンである。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、ｗｔ−ＨＥＬＡ、ＨＥＬＡ−ＥＰＯＲ及びＵＴ−７細胞からの溶解物のウエスタンブロット分析を示す。
【図２】図２は、ｗｔ−ＨＥＬＡ及びＨＥＬＡ−ＥＰＯＲ細胞の免疫細胞化学分析：Ａ：ＥＰＯ受容体−ＧＦＰ融合タンパク質；Ｂ：本明細書において報告される例示的抗体を示す。
【図３】図３は、ｗｔ−ＨＥＬＡ及びＨＥＬＡ−ＥＰＯＲ細胞の免疫組織化学的分析：Ａ：野生型ＨＥＬＡ細胞；Ｂ：ＥＰＯＲ−ＨＥＬＡを示す。
【図４】図４は、ＵＴ−７、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）及びＨＭＶＥＣ細胞（ヒト微小血管内皮細胞）からの溶解物のウエスタンブロット分析を示す。
【００８３】
配列の簡単な説明
配列番号０１は、アミノ酸配列ＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶを有するヒトＥＰＯ受容体のフラグメントを示す。
配列番号０２は、アミノ酸配列ＬＤＫＷＬＬＰＲＮＰＰＳＥＤＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶを有するヒトＥＰＯ受容体のフラグメントを示す。
配列番号０３は、ヒトＥＰＯ受容体前駆体のアミノ酸配列を示す。
【００８４】
発明の態様の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書の目的に関して、「アクセプターヒトフレームワーク」は、下記に定義するような、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含む、フレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それらの同じアミノ酸配列を含むか、又はアミノ酸配列変化を含有しうる。いくつかの態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一の配列である。
【００８５】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）間の非共有相互作用の強さの合計を指す。特に断りのない限り、本明細書において使用されるように、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（同様に、Ｋｄ又はＫＤ又は平衡定数）により表すことができる。親和性は、本明細書に記載する方法を含む、当技術分野において公知の一般的な方法により測定することができる。ポリクローナル抗体の親和性が決定された場合、親和性は、また、「見掛けの親和性」として示される。結合親和性を測定するための具体的説明及び例示的態様は以下に記載される。
【００８６】
用語「抗ヒトＥＰＯ受容体抗体」及び「ヒトＥＰＯ受容体に結合する抗体」は、抗体がヒトＥＰＯ受容体を標的とする診断薬及び／又は治療薬として有用であるように十分な親和性で、配列番号０３のヒトＥＰＯ受容体に結合することができる抗体を指す。特定の態様において、ヒトＥＰＯ受容体に結合する抗体は、≦１０nM、≦１nM、≦０．１nM、≦０．０１nM、又は≦０．００１nM（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の態様において、抗ヒトＥＰＯ受容体抗体は、異なる種のヒトＥＰＯ受容体の中で保存されているヒトＥＰＯ受容体のエピトープに結合する。
【００８７】
用語「抗体」は、本明細書において最も広範な意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、非限定的に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体フラグメントを含む、様々な抗体構造を包含する。
【００８８】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体フラグメントから生成される多特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の起源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる起源又は種に由来する、抗体を指す。
【００９０】
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
【００９１】
用語「細胞毒性薬」は、本明細書において使用されるように、細胞の機能を阻害もしくは抑制し、かつ／又は細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性薬としては、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又はその他のインターカレート剤）；増殖阻害剤；酵素及びそれらのフラグメント、例えば、核酸分解酵素；抗生物質；毒素、例えば、細菌、真菌、植物又は動物起源の小分子毒素又は酵素的に活性な毒素（それらのフラグメント及び／又は変異体を含む）；ならびに下記に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
【００９３】
薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な用量及び期間における有効な量を指す。
【００９４】
用語「Ｆｃ領域」は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語には、天然配列のＦｃ領域及び変異体のＦｃ領域が含まれる。一態様において、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長している。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は存在しても、存在しなくてもよい。本明細書において、特に指定されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242 に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
【００９５】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４で表示される。
【００９６】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書において互換的に使用され、天然の抗体の構造と実質的に類似する構造を有する抗体、又は本明細書に定義されるようなＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
【００９７】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性核酸が導入されている細胞（そのような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞としては、初代形質転換細胞及びその細胞に由来する子孫（継代数に関わらない）を含む、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含有してもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異子孫が本明細書に含まれる。
【００９８】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生される抗体のアミノ酸配列、又はヒト抗体レパートリーもしくはその他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト起源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【００９９】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからの選択である。一般的に、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3 に記載されるようなサブグループである。一態様において、ＶＬの場合、サブグループは、前記のKabatらに記載されるようなサブグループカッパＩである。一態様において、ＶＨの場合、サブグループは、前記のKabatらに記載されるようなサブグループＩＩＩである。
【０１００】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基とヒトＦＲからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体を指す。特定の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には、２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、その中で、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、そして、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【０１０１】
用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であり、かつ／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然の４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、ＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に、超可変ループからのアミノ酸残基及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は、配列変動性が最も高く、かつ／又は抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）に存在する（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に存在する（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242）。ＶＨのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは、一般的に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、また、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、略称（abbreviated）ＣＤＲ又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含有される。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に存在する（Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 を参照）。特に断りのない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及びその他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、前記のKabatらに従ってナンバリングされる。
【０１０２】
「免疫コンジュゲート」は、非限定的に細胞毒性薬を含む、１つ又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【０１０３】
「個体」又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。特定の態様において、個体又は被験体は、ヒトである。
【０１０４】
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から分離された抗体である。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定して、９５％以上又は９９％の純度に精製される。抗体純度を評価する方法については、例えば、Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87 を参照されたい。
【０１０５】
「単離された」核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸としては、核酸分子を通常含有する細胞に含有される核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外又はその天然の染色体位置と異なる染色体位置に存在する。
【０１０６】
「抗ヒトＥＰＯ受容体抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はそのフラグメント）をコードする１つ又は複数の核酸分子を指し、単一のベクター又は別々のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞内の１つ又は複数の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【０１０７】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において使用されるように、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、該集団を含む個々の抗体は、例えば、天然の突然変異を含有するか、又はモノクローナル抗体調製物の生産の過程で生じる可能性のある変異体抗体（そのような変異体は、一般的に、少量で存在する）を除いて、同一であり、かつ／又は同じエピトープと結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の性質を表し、任意の特定の方法で抗体を産生する必要があるものとして解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、非限定的に、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む、種々の技術によって製造してもよく、モノクローナル抗体を製造するためのそのような方法及びその他の例示的な方法は、本明細書に記載される。
【０１０８】
「天然の抗体」は、様々な構造を有する天然の免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変領域（ＶＨ）（また、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインと呼ばれる）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（また、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインと呼ばれる）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【０１０９】
用語「ヒト内皮細胞から得ることができる」は、全細胞の場合、パラホルムアルデヒド固定のプロセスを示し、組織切片の場合、脱パラフィン化、続く、クエン酸緩衝液中、９７℃で４５分間のエピトープ回復のプロセスを示す。
【０１１０】
用語「パッケージ挿入物」は、治療薬品の商用パッケージ内に慣習的に含まれる指示書を指すために使用され、その指示書には、適応、用法、用量、投与法、併用療法、禁忌及び／又は該治療薬品の使用に関する注意についての情報が記載されている。
【０１１１】
「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、参照ポリペプチド配列に対して、配列をアラインし、必要であれば、最大の配列同一性パーセントを達成するために、ギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しないとした場合の、該参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当技術分野の範囲内の様々な方法、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者であれば、配列をアラインするための適切なパラメーター（比較される配列の全長にわたって最大アライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む）を決定することができる。しかし、本明細書の目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成する。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムは、Genentech, Inc. により作成され、そのソースコードは、U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559 に使用者文書でファイルされており、U.S. Copyright Registration No. TXU510087 で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, California から公的に入手可能であるが、あるいはそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム（デジタルUNIX V4.0D を含む）で使用するためにコンパイルされるべきである。配列比較パラメーターは全て、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変更されない。
【０１１２】
アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの又はそれに対する、アミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと又はそれに対して、特定のアミノ酸配列同一性％を有する又はそれを含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は下記のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアライメントにおいて、完全な一致として採点されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と異なると理解されるであろう。特に断りのない限り、本明細書において使用される全てのアミノ酸配列同一性％の値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを使用して、直前の段落に記載するように得られる。
【０１１３】
用語「医薬製剤」は、そこに含まれる活性成分の生物学的活性が有効となるような形態であり、かつ、該製剤を投与する被験体に対して許容できない毒性を示す追加の成分を含有しない、調製物を指す。
【０１１４】
「薬学的に許容しうる担体」は、被験体に対して非毒性である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容しうる担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤又は保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
用語「ＥＰＯ受容体」は、特に断りのない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む、任意の脊椎動物起源からの任意の天然のＥＰＯ受容体を指す。この用語は、「完全長」の未処理ヒトＥＰＯ受容体、ならびに細胞内のプロセシングから生じる任意の形態のヒトＥＰＯ受容体を包含する。この用語は、また、ヒトＥＰＯ受容体の天然の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。例示的なヒトＥＰＯ受容体のアミノ酸配列は、配列番号０３に示される。
【０１１６】
用語「処置（treatment）」（及びその文法上の変形、例えば、「処置する（treat）」又は「処置する（treating）」）は、処置される個体の自然経過を変えようとする臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理の過程のいずれかで実施することができる。処置の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行を遅延させること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１１７】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般的に、類似の構造を有し、その各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む（例えば、Kindt, T.J. et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91 を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインであっても、抗原結合特異性を十分に付与しうる。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、該抗原に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離し、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることもできる（例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628 を参照）。
【０１１８】
用語「ベクター」は、連結している別の核酸を伝搬することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造体としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、動作可能なように連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。
【０１１９】
ＩＩ．組成物及び方法
一局面において、本発明は、ヒトＥＰＯ受容体、特に、配列番号０１のヒトＥＰＯ受容体フラグメントに特異的に結合する抗体が、ヒトの上皮細胞又は内皮細胞に交差反応性又は交差結合を示さないという知見に一部基づいている。特定の態様において、ヒトＥＰＯ受容体に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、貧血又は癌の診断又は処置に有用である。本発明の抗体は、また、赤血球の数を増加させる医薬を投与する前、特に、エリスロポエチンを投与する前の患者の層別化に有用である。
【０１２０】
Ａ．例示的な抗ヒトＥＰＯ受容体抗体
一局面において、本発明は、ヒトＥＰＯ受容体に結合する単離された抗体を提供する。特定の態様において、抗ヒトＥＰＯ受容体抗体は、ヒトＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（ＥｐｏＲ（３６１−３７１）；配列番号０１）に結合する。
【０１２１】
【表１】
0005984919.tif 000002
【０１２２】
一態様において、ここで提供されるヒトＥＰＯ受容体に結合する抗体は、ＥＰＯ受容体フラグメント３４７−３７１と同等の親和性（同じ大きさの同等のＫｄ値）で、ヒトＥＰＯ受容体フラグメント３６１−３７１に結合する。
【０１２３】
一態様において、ここで提供されるヒトＥＰＯ受容体に結合する抗体は、ヒトＥＰＯ受容体フラグメント３６１−３７１への結合とヒトＥＰＯ受容体フラグメント３４７−３７１への結合の親和性比（Ｋｄ値比）が１０未満、又は５未満、又は約３である。
【０１２４】
１．抗体親和性
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、≦１０nM、≦１nM、≦０．１nM、≦０．０１nM、又は≦０．００１nM（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、又は例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【０１２５】
一態様において、Ｋｄは、放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって決定され、対象の抗体のＦａｂ型及びその抗原を用いて、下記のアッセイにより記載するように実施される。抗原に対するＦＡＢの溶液結合親和性は、未標識抗原の力価測定系列の存在下で、Ｆａｂを最少濃度の（１２５Ｉ）標識抗原で平衡化し、次に、抗Ｆａｂ抗体でコートしたプレートと結合している抗原を捕捉することによって測定する（例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881 を参照）。アッセイ条件を確立するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート（Thermo Scientific）を、５μg/mlの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Cappel Labs）の５０mM炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ９．６）で一晩コートし、その後、２％（w/v）ウシ血清アルブミンのＰＢＳ溶液で、室温（およそ２３℃）にて２〜５時間ブロッキングする。非吸着プレート（Nunc #269620）中、１００pM又は２６pMの［１２５Ｉ］抗原を、段階希釈した対象のＦａｂと混合する（例えば、Presta, L.G. et al., Cancer  Res. 57 (1997) 4593-4599 の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。次に、対象のＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベートは、確実に平衡に達するようにより長い期間（例えば、約６５時間）続けてもよい。その後、混合物を捕捉プレートに移し、室温でインキュベートする（例えば、１時間）。次に、溶液を除去し、０．１％ポリソルベート２０（TWEEN-20（登録商標））のＰＢＳ溶液でプレートを８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μl／ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）；Packard）を加え、プレートをTOPCOUNT（商標）ガンマカウンター（Packard）で１０分間カウントする。最大結合の２０％以下を示す濃度の各Ｆａｂを選択し、競合結合アッセイに使用する。
【０１２６】
別の態様によれば、Ｋｄ値は、BIACORE（登録商標)2000又はBIACORE（登録商標）3000（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、２５℃にて、約１０反応単位（ＲＵ）の固定化した抗原ＣＭ５チップを用いて決定される。簡潔に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5, BIACORE, Inc.）を、販売業者の説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化する。抗原を１０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μg/ml（〜０．２μM）に希釈した後、結合したタンパク質がおよそ１０反応単位（ＲＵ）になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原を注入した後、１Ｍエタノールアミンを注入し、未反応基をブロッキングする。反応速度の測定のために、２倍段階希釈したＦａｂ（０．７８nM〜５００nM）を、２５℃にて、およそ２５μl／分の流速で、０．０５％ポリソルベート２０（TWEEN-20（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳに注入する。会合速度（ｋon）及び解離速度（ｋoff）は、単一１対１Langmuir結合モデル（BIACORE（登録商標）Evaluation Software version 3.2）使用して、会合と解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることによって計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する（例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881 を参照）。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる会合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、会合速度は、漸増濃度の抗原の存在下、２５℃で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０nMの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度（励起＝２９５nm；発光＝３４０nm、帯域通過１６nm）の増減を測定する蛍光消光技術を用いて決定することができ、これは、分光計、例えば、ストップフローを搭載した分光光度計（Aviv Instruments）又は撹拌キュベットを備えた８０００系SLM-AMINCO（商標）分光光度計（ThermoSpectronic）で測定される。
【０１２７】
２．抗体フラグメント
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖフラグメント、ならびに後述するその他のフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。特定の抗体フラグメントに関しては、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134 を参照されたい。ｓｃＦｖフラグメントに関しては、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg 及び Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315 を参照されたい；また、WO 93/16185；ならびに米国特許第5,571,894号及び第5,587,458号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつ、in vivo半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの考察については、米国特許第5,869,046号を参照されたい。
【０１２８】
ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 及び Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 を参照されたい。また、トリアボディ及びテトラボディが、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134 に記載されている。
【０１２９】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む、抗体フラグメントである。特定の態様において、単一ドメイン抗体は、ヒトの単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第6,248,516 B1号を参照）。
【０１３０】
抗体フラグメントは、非限定的に、本明細書に記載するような、インタクトな抗体のタンパク質分解、ならびに組み換え宿主細胞（例えば、E. coli又はファージ）による産生を含む、様々な技術によって製造することができる。
【０１３１】
３．キメラ及びヒト化抗体
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号；及び Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA81 (1984) 6851-6855 に記載されている。一例として、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）とヒト定常領域を含む。さらなる例として、キメラ抗体は、そのクラス又はサブクラスが親抗体のものから変更されている、「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合フラグメントが含まれる。
【０１３２】
特定の態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性は保持したままで、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化されている。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその部分）が非ヒト抗体に由来し、かつ、ＦＲ（又はその部分）がヒト抗体配列に由来する、１つ又は複数の可変ドメインを含む。また、ヒト化抗体は、場合により、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換されている。
【０１３３】
ヒト化抗体及びそれらを製造する方法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 に概説されており、さらに、例えば、Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；米国特許第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号及び第7,087,409号；Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記載）；Padlan, E.A., Mol. Immunol.28 (1991) 489-498（「リサーフェシング」を記載）；Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60（「ＦＲシャッフリング」を記載）；ならびに Osbourn, J. et al., Methods36 (2005) 61-68 及び Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（ＦＲシャッフリングのための「誘導選択」アプローチを記載）に記載されている。
【０１３４】
ヒト化に使用されうるヒトフレームワーク領域としては、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308 を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 及び Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632 を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 を参照）；ならびにスクリーニングＦＲライブラリーに由来するフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 及び Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618 を参照）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３５】
４．ヒト抗体
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において公知の様々な技術を使用して生産することができる。ヒト抗体は、一般的に、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 及び Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459 に記載されている。
【０１３６】
ヒト抗体は、抗原接種に応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製してもよい。そのような動物は、典型的には、内因性の免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒトの免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有する。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性の免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法に関しては、Lonberg, N., Nat. Biotech.23 (2005) 1117-1125 を参照されたい。また、例えば、XENOMOUSE（商標）技術を記載する、US 6,075,181及び6,150,584；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載する米国特許第5,770,429号；K-M MOUSE（登録商標）技術を記載する米国特許第7,041,870号、ならびにVELOCIMOUSE（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第US 2007/0061900号も参照されたい。そのような動物から産生されるインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに改変してもよい。
【０１３７】
ヒト抗体は、また、ハイブリドーマベースの方法により製造することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されている（例えば、Kozbor, D., J. Immunol.133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63; 及び Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95 を参照）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体が、Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562 に記載されている。追加の方法としては、例えば、米国特許第7,189,826号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）及びNi, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載する）に記載される方法が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、また、Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 及び Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191 に記載されている。
【０１３８】
ヒト抗体は、また、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより生成してもよい。そのような可変ドメイン配列は、次に、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技術を後述する。
【０１３９】
５．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、所望の活性（１つ又は複数）を有する抗体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離してもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、そして、所望の結合特性を有する抗体のライブラリーをスクリーニングするための種々の方法が、当該技術分野において公知である。そのような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 に概説されており、さらに、例えば、McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; 及び Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132 に記載されている。
【０１４０】
特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングして、ファージライブラリーにランダムに組み換えて、次に、Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455 に記載されるように、抗原結合ファージをスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、抗体フラグメントを単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント又はＦａｂフラグメントのいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対して高い親和性の抗体を提供する。あるいは、Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734 に記載されるように、任意の免疫化なしで、ナイーブなライブラリーをクローニングし（例えば、ヒトから）、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対する単一起源の抗体を提供することができる。最後に、ナイーブなライブラリーは、また、Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 に記載されるように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度な可変ＣＤＲ３領域をコードし、かつ、in vitroで再配列を達成することによって合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公報としては、例えば、米国特許第5,750,373号、ならびに米国特許出願公開第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号及び第2009/0002360号が挙げられる。
【０１４１】
ヒト抗体ライブラリーから単離される抗体又は抗体フラグメントは、本明細書において、ヒト抗体又はヒト抗体フラグメントと考えられる。
【０１４２】
６．多特異性抗体
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、多特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様において、結合特異性の一方はヒトＥＰＯ受容体に対してであり、もう一方は任意のその他の抗原に対してである。特定の態様において、二重特異性抗体は、ヒトＥＰＯ受容体の２つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異性抗体は、また、ヒトＥＰＯ受容体を発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるために使用されうる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる。
【０１４３】
多特異性抗体を製造するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え共発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983)537-540, WO 93/08829, 及びTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659 を参照）、及び「knob-in-hole」エンジニアリング（例えば、米国特許第5,731,168号を参照）が含まれるが、これらに限定されない。多特異性抗体は、また、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を製造するために静電ステアリング効果を操作すること（WO 2009/089004）；２つ以上の抗体又はフラグメントを架橋すること（例えば、米国特許第4,676,980号、及びBrennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83 を参照）；二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553 を参照）；二重特異性抗体フラグメントを製造するために「ダイヤボディ」技術を使用すること（例えば、Holliger, P. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 を参照）；及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374 を参照）；ならびに、例えば、Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69) に記載されるような三重特異性抗体を調製することにより製造してもよい。
【０１４４】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の官能性抗原結合部位を有する改変抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、US 2006/0025576を参照）。
【０１４５】
本明細書の抗体又はフラグメントは、また、ヒトＥＰＯ受容体ならびに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む、「二重作用性ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む（例えば、US 2008/0069820を参照）。
【０１４６】
本明細書の抗体又はフラグメントは、また、WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792及びWO 2010/145793に記載される多特異性抗体を含む。
【０１４７】
７．抗体変異体
ａ）グリコシル化変異体
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、該抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作製又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することにより簡便に達成することができる。
【０１４８】
抗体がＦｃ領域を含む場合、その領域に連結している糖が改変されうる。哺乳動物細胞によって産生される天然の抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合により一般的に連結している、分岐した二分岐オリゴ糖を含む（例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32 を参照）。オリゴ糖は、様々な糖、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「ｓｔｅｍ」中のＧｌｃＮＡｃに連結しているフコースを含みうる。いくつかの態様において、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾は、特定の特性が改善された抗体変異体を作製するために行われうる。
【０１４９】
一態様において、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）連結されたフコースを欠く糖構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、又は２０％〜４０％でありうる。フコースの量は、例えば、WO 2008/077546 に記載されているように、Ａｓｎ２９７に連結している全て糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対して、Ａｓｎ２９７における糖鎖中のフコースの平均量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定して計算することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位に位置しているアスパラギン残基を指すが（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）、Ａｓｎ２９７は、また、抗体の小さな配列変異に起因して、２９７位の約±３アミノ酸上流又は下流に、すなわち、２９４位〜３００位に位置しうる。そのようなフコース化変異体は、ＡＤＣＣ機能が改善しうる（例えば、US 2003/0157108; US 2004/0093621 を参照）。「脱フコース化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関する出版物の例としては、US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2005/031140; Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622 が挙げられる。脱フコース化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコース化を欠損するＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; 及び WO 2004/056312、特に実施例１１）及びノックアウト細胞株、例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＴ８）ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; 及び WO 2003/085107 を参照）が挙げられる。
【０１５０】
さらに、分割オリゴ糖（例えば、抗体のＦｃ領域に連結している二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって分割されている）を有する抗体変異体が提供される。そのような抗体変異体は、フコース化が減少し、かつ／又はＡＤＣＣ機能が改善しうる。そのような抗体変異体の例は、例えば、WO 2003/011878；米国特許第6,602,684号；及びUS 2005/0123546に記載されている。また、Ｆｃ領域に連結しているオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、ＣＤＣ機能が改善しうる。そのような抗体変異体は、例えば、WO 1997/30087；WO 1998/58964；及び WO 1999/22764に記載されている。
【０１５１】
ｂ）Ｆｃ領域変異体
特定の態様において、１つ又は複数のアミノ酸修飾を本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入して、それによって、Ｆｃ領域変異体を生成してもよい。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含みうる。
【０１５２】
特定の態様において、本発明は、抗体のin vivoでの半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣ）が不要又は有害である用途において望ましい候補となるエフェクター機能の全てではないがいくつかを有する、抗体変異体を意図する。in vitro及び／又はin vivoの細胞毒性アッセイは、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために実施することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠いているが（従って、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確認するために実施することができる。ＡＤＣＣに介在する初代細胞のＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492 の４６４ページの表３にまとめられている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのin vitroアッセイの非限定例は、米国特許第5,500,362号（例えば、Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; 及び Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502 を参照）；米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 を参照）に記載されている。あるいは、非放射能アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射能細胞毒性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）；及びCytoTox 96（登録商標）非放射能細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、又は追加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656 に開示されているように、in vivo、例えば、動物モデルで評価してもよい。また、抗体が、Ｃ１ｑに結合することができず、そのために、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するためにＣ１ｑ結合アッセイを行ってもよい。例えば、WO 2006/029879及びWO 2005/100402のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; 及び Cragg, and M.S. M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743 を参照）。ＦｃＲｎ結合及びin vivoクリアランス／半減期の決定は、当技術分野において公知の方法を使用して実施することもできる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769 を参照）。
【０１５３】
エフェクター機能が低下した抗体には、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ又は複数の置換を有する抗体が含まれる（米国特許第6,737,056号）。そのようなＦｃ突然変異体には、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７位の２つ以上に置換を有するＦｃ突然変異体（残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む）（米国特許第7,332,581号）が含まれる。
【０１５４】
ＦｃＲへの結合が改善又は低下した特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第6,737,056号；WO 2004/056312 及び Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 を参照）。
【０１５５】
特定の態様において、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する、１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３及び／又は３３４位（残基のＥＵナンバリング）に置換を有するＦｃ領域を含む。
【０１５６】
いくつかの態様において、例えば、米国特許第6,194,551号、WO 99/51642 及び Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184 に記載されるように、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が改変（すなわち、改善又は低下）するようにＦｃ領域が改変される。
【０１５７】
半減期が増加し、かつ、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（母体ＩｇＧの胎児への移動に関与する）への結合が改善した抗体（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, 及び Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）が、US 2005/0014934 に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する、１つ又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体には、Ｆｃ領域の残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の１つ又は複数の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換を有するＦｃ変異体が含まれる（米国特許第7,371,826号）。
【０１５８】
また、その他のＦｃ領域変異体の例に関しては、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；及びWO 94/29351 を参照されたい。
【０１５９】
ｃ）抗体誘導体
特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、当該技術分野において公知の容易に得ることができる追加の非タンパク性部分を含有するようにさらに改変されうる。抗体の誘導体化に適するその部分としては、水溶性ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモ重合体又はランダム共重合体のいずれか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモ重合体、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコールならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中安定性のために製造に有利でありうる。ポリマーはどんな分子量のポリマーであってもよく、また、分岐であっても非分岐であってもよい。抗体に連結するポリマーの数は変更可能であり、二つ以上のポリマーが連結しているならば、これらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、非限定的に、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が規定の条件下で治療に使用されるかどうかなどの検討事項に基づいて決定することができる。
【０１６０】
別の態様において、放射線で曝露することにより選択的に加熱されうる、抗体と非タンパク性部分のコンジュゲートが提供される。一態様において、非タンパク性部分は、カーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、いずれの波長の放射線であってもよく、その波長としては、非限定的に、一般的な細胞に有害ではないが、抗体−非タンパク性部分に近接する細胞が死滅する温度まで非タンパク性部分を加熱する波長が挙げられる。
【０１６１】
実質的に（又はほとんど）非免疫原性である結合がもたらされるコンジュゲーション法が特に好適である。従って、ペプチド−（すなわち、アミド−）、スルフィド−（立体的に込み合った）、ジスルフィド−、ヒドラゾン−又はエーテル結合が特に好適である。これらの結合は、ほとんど非免疫原性であり、血清中で適度な安定性を示す（例えば、Senter, P.D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; WO 2009/059278; WO 95/17886 を参照）。
【０１６２】
該部分及び抗体の生化学的性質に応じて、異なるコンジュゲーション戦略がすぐに利用できる。該部分が５０〜５００アミノ酸の天然又は組み換え部分である場合、当業者であれば、タンパク質コンジュゲートを合成する化学を記載している教科書の標準的な手順を容易に遂行することができる（例えば、Hackenberger, C.P.R., and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074 を参照）。一態様において、抗体又は部分内でのマレインイミド部分とシステイン残基の反応が使用される。これは、例えば、抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントが使用される場合に、特に好適なカップリング化学である。あるいは、一態様において、抗体又は部分のＣ末端へのカップリングが実施される。タンパク質、例えば、ＦａｂフラグメントのＣ末端の修飾を、例えば、記載されるように実施することができる（Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371）。
【０１６３】
一般的に、部位特異的反応及び共有カップリングは、天然アミノ酸を、存在するその他の官能基の反応性に直交する反応性を有するアミノ酸に変換することに基づいている。例えば、珍しい配列関係内の特定のシステインをアルデヒドに酵素変換することができる（Frese, M.A., and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427 を参照）。また、特定の酵素の特異的な酵素反応性と所与の配列関係の天然アミノ酸を利用することにより所望のアミノ酸修飾を得ることが可能である（例えば、Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136；及び Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403 によって使用される、プロテアーゼ触媒によるＣ−Ｎ結合形成を参照）。
【０１６４】
部位特異的反応及び共有カップリングは、また、末端アミノ酸と適切な修飾試薬の選択的反応により達成することができる。
【０１６５】
部位特異的共有カップリングを達成するために、Ｎ末端システインとベンゾニトリルの反応性を使用することができる（Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662 を参照）。
【０１６６】
天然の化学ライゲーションは、また、Ｃ末端のシステイン残基に依存しうる（Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96）。
【０１６７】
EP 1 074 563は、一連の負の電荷を帯びたアミノ酸内のシステインと一連の正の電荷を帯びたアミノ酸に位置しているシステインがより速く反応することに基づくコンジュゲーション法を記載している。
【０１６８】
該部分は、また、合成ペプチドであってもペプチド模倣体であってもよい。ポリペプチドが化学合成される場合、直交化学反応性を有するアミノ酸をそのような合成の間に組み込むことができる（例えば、de Graaf, A.J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295 を参照）。多様な直交官能基が議論されており、合成ペプチドに導入することができることから、そのようなペプチドのリンカーへのコンジュゲーションは標準的な化学である。
【０１６９】
単標識ポリペプチドを得るために、１：１の化学量論コンジュゲートを、クロマトグラフィーによってその他のコンジュゲーション副生成物と分離してもよい。この手順は、色素標識結合対メンバーと荷電リンカーを使用して促進することができる。この種類の標識された及び高度に負の電荷を帯びた結合対メンバーを使用することによって、電荷と分子量の違いを分離に使用することができるので、単コンジュゲートしたポリペプチドは、未標識ポリペプチド及び二つ以上のリンカーを有するポリペプチドから容易に分離される。蛍光色素は、標識された一価の結合剤のような複合体を非結合成分から精製するために有用でありうる。
【０１７０】
一態様において、エフェクター部分は、結合部分、標識部分及び生物活性部分からなる群より選択される。
【０１７１】
Ｂ．組み換え法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号に記載されているように、組み換え法及び組成物を使用して産生してもよい。一態様において、本明細書に記載される抗ヒトＥＰＯ受容体抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードしうる。さらなる態様において、そのような核酸を含む１つ又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一つのそのような態様において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、そのベクターで形質転換されている）。一態様において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０細胞）である。一態様において、抗ヒトＥＰＯ受容体抗体を製造する方法であって、上記に提供される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を該抗体の発現に適する条件下で培養すること、及び場合により該宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から該抗体を回収することを含む、方法が提供される。
【０１７２】
抗ヒトＥＰＯ受容体抗体の組み換え産生のために、例えば、上記に記載される抗体をコードする核酸を単離して、１つ又は複数のベクターに挿入し、さらに宿主細胞でクローニング及び／又は発現させる。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離され、配列決定することができる。
【０１７３】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適する宿主細胞には、本明細書に記載される原核又は真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合、細菌で産生してもよい。細菌で抗体フラグメント及びポリペプチドを発現するために、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号及び第5,840,523号を参照されたい（また、E. coliでの抗体フラグメントの発現を記載する、Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 を参照）。発現後、抗体を可溶性画分の細菌細胞ペーストから単離して、さらに精製することもできる。
【０１７４】
原核生物の他に、糸状菌（filamentous fungi）又は酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクター用の適切なクローニング又は発現宿主であり、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、グリコシル化経路が「ヒト化」されている真菌及び酵母株が含まれる（Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 及び Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 を参照）。
【０１７５】
グリコシル化抗体を発現するための適切な宿主細胞は、また、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは、特に、ポドプテラフルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０１７６】
植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号及び第6,417,429号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのPLANTIBODIES（商標）技術を記載する）を参照されたい。
【０１７７】
脊椎動物細胞を宿主として使用してもよい。例えば、懸濁液中で成長するように適合させた哺乳動物細胞株が有用でありうる。その他の有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 に記載されるような２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されるようなＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（MMT 060562）；例えば、Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 に記載されるようなＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。その他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含む）；ならびにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などのミエローマ細胞株が含まれる。抗体産生に適する特定の哺乳動物宿主細胞株に関しては、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268 を参照されたい。
【０１７８】
Ｃ．アッセイ
本明細書において提供される抗ヒトＥＰＯ受容体抗体は、当該技術分野において公知の様々なアッセイによって、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性を同定、スクリーニング又は特徴付けしてもよい。
【０１７９】
１．免疫組織化学染色アッセイ
一局面において、組織切片を、脱パラフィン化、すなわち、パラフィンを除去し、続いて、例えば、クエン酸緩衝液（Vector  Laboratoriesから入手可能である）を使用して、高温で処理、例えば、９７℃で４５分間処理するエピトープ回復を行う。ブロッキング（例えば、Protein Block Serum-Free（カタログ番号X0909、DAKO Deutschland GmbHから入手可能）を用いて）した後、組織切片を、一次抗体と、例えば、本明細書において報告される抗体の場合、１２７．５ng/mlの濃度で６０分間インキュベートする。その後、結合した抗体を、例えば、Envisionポリクローナルウサギ検出キット（DAKO Deutschland GmbH）で決定する。最後に、標本を対比染色、脱水及びマウントする。
【０１８０】
２．癌細胞のＥＰＯ受容体の状態を決定することによる患者の層別化
患者からのサンプル材料は、例えば、癌疾患を処置するために実施される腫瘍摘出からの組織材料から又は腫瘍生検によるかのいずれかで採取する。採取した腫瘍組織は、ホルマリンで固定し、標準的な組織学的手順に従ってパラフィンに包埋する。本明細書において報告される抗ＥＰＯ受容体抗体を使用する免疫組織化学は、この腫瘍材料の切片で実施する（上記及び実施例を参照）。染色した組織切片の組織病理学的評価から、その腫瘍組織が、ＥＰＯ受容体に陽性であるか又は陰性であるかを決定することができる。この評価は、規定した断面積における腫瘍細胞の染色強度及び染色した腫瘍細胞の数を考慮する採点システムに基づくことができる。
【０１８１】
患者の腫瘍組織のＥＰＯ受容体の状態を評価することは、癌患者の最適な処置を決定するための基準となりうる。これには、腫瘍進行の予後、放射線療法、化学療法、特異的な抗腫瘍剤による療法のような抗腫瘍療法の強さ、腫瘍性疾患関連貧血の化学療法の処置、患者の貧血症状を治すために使用される赤血球生成促進剤（ＥＳＡ）の用量又は投与計画の変更、ＥＳＡを用いた抗貧血処置の中断、ある特定の種類のＥＳＡから別の種類のＥＳＡへの変更、ＥＳＡを用いた抗貧血処置から血液又は分離もしくは濃縮した赤血球（濃厚赤血球）の輸血への切り替え、あるいは、ＥＳＡを用いた今後の処置の延期又は中止の決定が含まれる。
【０１８２】
ＥＳＡは、例えば、エリスロポエチン受容体の刺激によって赤血球生成を刺激する薬剤、例えば、組み換えヒトエリスロポエチン又はエポエチン、改変エリスロポエチン、連続エリスロポエチン受容体刺激薬、小分子もしくはペプチド性エリスロポエチン受容体アゴニスト、低酸素誘導因子の安定剤などである。
【０１８３】
Ｄ．診断及び検出のための方法及び組成物
特定の態様において、本明細書において提供される任意の抗ヒトＥＰＯ受容体抗体は、生体サンプル中のヒトＥＰＯ受容体の存在を検出するために有用である。用語「検出する」は、本明細書において使用されるように、定量的又は定性的検出を包含する。特定の態様において、生体サンプルは、細胞又は組織、例えば、ＰＢＭＣ（末梢血単球細胞）、正常もしくは疾患組織、新鮮な組織、凍結組織、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織からの組織切片又はサンプルを含む。
【０１８４】
一態様において、診断又は検出方法で使用するための抗ヒトＥＰＯ受容体抗体が提供される。さらなる局面において、生体サンプル中のヒトＥＰＯ受容体の存在を検出する方法が提供される。特定の態様において、該方法は、生体サンプルと本明細書に記載される抗ヒトＥＰＯ受容体抗体を、抗ヒトＥＰＯ受容体抗体のヒトＥＰＯ受容体への結合を許容する条件下で接触させること、及び抗ヒトＥＰＯ受容体抗体とヒトＥＰＯ受容体間で複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。そのような方法は、in vitroでの方法であっても、in vivoでの方法であってもよい。一態様において、抗ヒトＥＰＯ受容体抗体は、例えば、ヒトＥＰＯ受容体が、患者の選択及び／もしくは層別化のための、又は治療で使用される用量を調整するためバイオマーカーである場合、組み換えヒトＥＰＯ（エポエチン）、高グリコシル化ヒトエリスロポエチン、エリスロポエチン受容体アゴニスト、エリスロポエチン模倣ペプチド、化学エリスロポエチン受容体活性化化合物又はその他の赤血球生成促進剤（ＥＳＡ）を用いる治療に適する被験体を選択するために使用される。
【０１８５】
本発明の抗体を使用して診断されうる例示的な障害としては、例えば、癌、又は組織再生のための幹細胞のＥＰＯ受容体状態が含まれる。
【０１８６】
特定の態様において、標識した抗ヒトＥＰＯ受容体抗体が提供される。標識としては、直接的に検出される標識又は部分（蛍光、色素体、高電子密度、化学発光及び放射性標識など）、ならびに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分が含まれるが、これらに限定されない。例示的な標識としては、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば、希土類元素キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、蛍ルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第4,737,456号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、単糖類オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ（色素前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ又はミクロペルオキシダーゼに結合したもの）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８７】
Ｅ．医薬製剤
本明細書に記載される抗ヒトＥＰＯ受容体抗体の医薬製剤は、所望の純度を有するそのような抗体と１つ又は複数の任意の薬学的に許容しうる担体（Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）を混合することにより凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製される。薬学的に許容しうる担体は、一般的に、用いられる用量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、該担体としては、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸及びその他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン；グルコール、マンノース又はデキストリンを含む、単糖類、二糖類及びその他の糖；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書の例示的な薬学的に許容しうる担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Baxter International, Inc.）などの介在性薬物分散剤をさらに含む。ｒｈｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第2005/0260186号及び第2006/0104968号に記載されている。一局面において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
【０１８８】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第6,171,586号及びWO 2006/044908に記載される製剤が含まれ、後者の製剤には、ヒスチジン−酢酸緩衝液が含まれる。
【０１８９】
本明細書の製剤は、また、処置される特定の適応のために必要に応じて、二つ以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を与えない補体活性を有する二つ以上の活性成分を含有してもよい。そのような活性成分は、意図される目的に有効な量で組み合させて適切に存在する。
【０１９０】
活性成分は、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）、又はマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション技術により又は界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に封入してもよい。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980) に開示されている。
【０１９１】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、造形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。
【０１９２】
in vivo投与に使用される製剤は、一般的に、滅菌されている。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜に通す濾過により容易に達成されうる。
【０１９３】
Ｆ．治療法及び組成物
本明細書において提供される任意の抗ヒトＥＰＯ受容体抗体は、治療法において使用してもよい。
【０１９４】
さらなる局面において、本発明は、医薬の製造又は調製における、抗ヒトＥＰＯ受容体抗体の使用を提供する。
【０１９５】
さらなる局面において、本発明は、本明細書において提供される任意の抗ヒトＥＰＯ受容体抗体を含む医薬製剤を提供する。一態様において、医薬製剤は、本明細書において提供される任意の抗ヒトＥＰＯ受容体抗体と薬学的に許容しうる担体を含む。別の態様において、医薬製剤は、本明細書において提供される任意の抗ヒトＥＰＯ受容体抗体と、例えば、後述される少なくとも１つの追加の治療薬剤を含む。
【０１９６】
本発明の抗体は、治療において、単独で又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療薬剤と同時に投与してもよい。
【０１９７】
上記のそのような併用療法は、併用投与（２つ以上治療薬剤が同じ又は別々の製剤中に含まれる場合）及び個別投与を包含し、個別投与の場合、本発明の抗体の投与は、追加の治療薬剤及び／又は補助剤を投与する前、同時及び／又は後に行うことができる。本発明の抗体は、また、放射線療法と組み合わせて使用することができる。
【０１９８】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療薬剤）は、非経口、肺内及び鼻腔内、局所処置が望まれる場合の病巣内投与を含む、任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が挙げられる。投薬は、任意の適切な経路、例えば、注射、例えば、投与が短期であるか長期であるかに一部依存して、静脈内又は皮下注射によって行うことができる。非限定的に、単回投与又は様々な時点における複数回投与、ボーラス投与及びパルス注入を含む、様々な投薬計画が本明細書において意図される。
【０１９９】
本発明の抗体は、医療実施基準（good medical practice）に合致するように製剤化、調薬及び投与されうる。この状況において考慮される要因としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画及び医師に公知の他の要因が挙げられる。抗体は、必ずしも必要でないが、場合により、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ又は複数の薬剤と共に製剤化される。そのようなその他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置の種類、及び上記で考察されるその他の要因に依存する。これらは、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載される用量の約１〜９９％で、又は適切であると実験的に／臨床的に決定された任意の用量及び任意の経路で使用される。
【０２００】
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の適切な用量（単独で又は１つもしくは複数のその他の追加の治療薬剤と組み合わせて使用する場合）は、処理される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答、ならびに担当医の判断に依存するであろう。抗体は、一回又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。患者に投与する初期候補用量は、例えば、１回又は複数回の個別投与によるか、連続注入によるかに関わらず、疾患の種類及び重症度に依存して、抗体約１μg/kg〜１５mg/kg（例えば、０．１mg/kg〜１０mg/kg）でありうる。１つの典型的な一日用量は、前述の要因に応じて、約１μg/kg〜１００mg/kg以上の範囲でありうる。数日以上にわたって繰り返し投与する場合、状態に応じて、処置は、一般的に、疾患症状の所望の抑制が現れるまで持続されうる。抗体の一つの例示的な用量は、約０．０５mg/kg〜約１０mg/kgの範囲でありうる。従って、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg又は１０mg/kgの１つ又は複数の用量（又はそれらの任意の組み合わせ）を患者に投与してもよい。そのような用量は、断続的、例えば、毎週又は三週毎に投与してもよい（例えば、患者が、約２〜約２０用量、又は例えば、約６用量の抗体を摂取するように）。初期のより高い負荷用量に続いて、１つ又は複数のより低い用量が投与されうる。しかし、その他の用量レジメンも有用でありうる。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
【０２０１】
任意の上記製剤又は治療法は、抗ヒトＥＰＯ受容体抗体の代わりに又は追加して、本発明の免疫コンジュゲートを使用して行ってもよいことが理解される。
【０２０２】
ＩＩＩ．製造品
本発明の別の局面において、上述される障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と容器上又は容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を含んでもよい。適切な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、様々な材料、例えば、ガラス又はプラスチック製であってもよい。容器は、組成物を単独で、又は状態を治療、予防及び／もしくは診断するために効果的な別の組成物と組み合わせて保持し、また、無菌接続ポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針で穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用輸液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤が本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択された状態を処置するために使用されることを表示する。さらに、製造品は、（ａ）組成物を含有する第一の容器（該組成物は、本発明の抗体を含む）；及び（ｂ）組成物を含有する第二の容器（該組成物は、さらなる細胞毒性薬又はその他の治療薬剤を含む）を含んでもよい。本発明のこの態様の製造品は、組成物が特定の状態を処置するために使用することができることを表示するパッケージ挿入物をさらに含んでもよい。あるいは、又は追加的に、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容しうる緩衝液を含む、第二（又は第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業上及び使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含んでもよい。
【０２０３】
任意の上記の製造品は、抗ヒトＥＰＯ受容体抗体の代わりに又は追加して、本発明の免疫コンジュゲートを含んでもよいことが理解される。
【０２０４】
ＩＶ．実施例
下記は、本発明の方法及び組成物の実施例である。様々なその他の態様が、上記に提供される一般的な説明を考慮して実施されうることが理解される。
【０２０５】
実施例１
ヒトＥＰＯＲの細胞内ドメインに対する抗体の生成
成熟ヒトエリスロポエチン受容体の残基３４７−３７１に対応する２５アミノ酸合成ペプチド（ＬＤＫＷＬＬＰＲＮＰＰＳＥＤＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ、配列番号０２）を、免疫原（ＥＰＯ受容体前駆体のアミノ酸残基３７１−３９５に対応する、配列番号０３）として使用した。
【０２０６】
免疫化のために、Ｃ末端のシステイン残基を介して、ペプチドをＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）に結合した。ウサギを該タンパク質で４週毎に３〜５回免疫した。特異的抗体の一次レベルスクリーニングを、確立された手順に従って、タンパク質又はビオチン化ペプチドのいずれかでコートしたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートで試験することにより行った。
【０２０７】
ポリクローナル血清を硫酸アンモニウムで沈殿させた。ＩｇＧをＤＥＡＥクロマトグラフィーにより分離し、成熟ｈＥＰＯ受容体のアミノ酸残基３６１−３７１（配列番号０１）を含有するペプチド提示カラム（peptide presenting column）で免疫親和性吸着することによりさらに精製した。プロピオン酸（ｐＨ２．６）を使用してＩｇＧをカラムから回収した。ＴＲＩＳ緩衝液（２．５Ｍ、ｐＨ８．５）を使用して、得られた溶液をｐＨ７．３に調整した。次に、精製したＩｇＧを５０mMリン酸カリウム／１５０mM ＫＣｌ緩衝液で透析し、続いて、同じ緩衝液を使用してSuperdex 200カラム（GE Healthcare）でゲル濾過し、最後に、０．２μmのメンブランフィルターを使用して滅菌濾過した。
【０２０８】
実施例２
ＥＰＯ受容体を発現するＨＥＬＡ細胞の生成
組み換えヒトＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）を発現する安定にトランスフェクトされたＨＥＬＡ細胞を生成するために、ＥＰＯ受容体又はＥＰＯ受容体−ｅＧＦＰをコードするレトロウイルス発現ベクター（細胞内Ｃ末端への融合タンパク質として、Invitrogen）及びｐＶＳＶ−Ｇ（ラブドウイルス科水疱性口内炎ウイルスのＧ糖タンパク質をコードする発現ベクター）で一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの上清を用いて、細胞を形質導入した。形質導入の２日後、培地を、０．２mg/mlゼオシンを含有する新しい補填ＲＰＭＩに交換した。
【０２０９】
一過性のトランスフェクション実験のために、ＦｕＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Roche Molecular Biochemicals Cat. No. 1815075）を使用して、１２ウェルプレート中のカバースリップ上に、１ml培地中、８×１０４のＨＥＬＡ細胞をプレーティングした。詳しく述べると、９７μlのＦＣＳ不含ＲＰＭＩ１６４０に３μlのＦｕＧＥＮＥ６を加え、室温で５分間インキュベートした。その後、１μgのＤＮＡミックスを加え、室温で１５分間インキュベートした。最後に、カバースリップ上の細胞を含有する１mlの細胞培養培地に５０μlのＤＮＡ／ＦｕＧＥＮＥ６溶液を加えた。
【０２１０】
実施例３
ＥＰＯ受容体を発現するＵＴ７細胞の生成
ＵＴ−７細胞株は、長期の増殖にＥＰＯを必要とするヒト因子依存性赤白血病細胞株（ヒト骨髄急性骨髄性白血病細胞株ＤＳＭＺ：ＡＣＣ１３７）である。ＵＴ７細胞を、Ｌ−グルタミン（２mM）、非必須アミノ酸（１×）、ピルビン酸ナトリウム（１mM）、１０％ウシ胎仔血清及び１０U/ml ＧＭ−ＣＳＦを補填したＲＰＭＩ培地中に維持した。形質導入細胞（ＵＴ７／ＥＰＯＲ）を、０．４mg/mlゼオシンを添加した非形質導入細胞と同じ培地（１０U/mlの代わりに２５U/ml ＧＭ−ＣＳＦ）中で維持した。各刺激の前に、Ｌ−グルタミン（２mM）、非必須アミノ酸（１×）、ピルビン酸ナトリウム（１mM）及び０．１％ウシ胎仔血清を補填したＲＰＭＩ培地中で一晩インキュベートすることにより細胞を餓死させた。
【０２１１】
ＥＰＯ受容体をコードするレトロウイルス発現ベクター及びｐＶＳＶ−Ｇで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの上清を用いてＵＴ−７細胞を形質導入した。形質導入の２日後、培地を、０．４mg/mlゼオシン及び２５U/ml ＧＭ−ＣＳＦを含有する新しい補填ＲＰＭＩに交換した。選択後、表面にＥＰＯ受容体を安定に発現するＵＴ−７細胞の細胞株を得た。
【０２１２】
実施例４
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング
標準的な手順及びInvitrogenのＮｕＰＡＧＥゲルシステムに従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを実施した。異なる細胞数に対応する抽出物を、NuPAGE Novex 4-12% Bis-Trisゲルの各ラインにロードした。ゲル電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦメンブランに転写し、実施例１で得られた抗ＥＰＯ受容体抗体と４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、メンブランをコンジュゲート抗マウス又は抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰとインキュベートし、ＥＣＬ試薬（LUMI-Light（登録商標）PLUSウエスタンブロッティング基質、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を使用して現像した。結果を図１に示す。
【０２１３】
実施例５
ＢＩＡＣＯＲＥ分析
【０２１４】
【表２】
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【０２１５】
ＥＰＯ受容体フラグメントに結合する抗ＥＰＯ受容体抗体ＧＢｂの動力学を２５℃で決定した。
【０２１６】
抗体ＧＢｂは、ＥＰＯ受容体フラグメント３６１−３７１に対してナノモルの親和性を示し、ＥＰＯ受容体フラグメント３４７−３７１に対してナノモルの親和性を示す。該抗体は、高い解離定数（ｔ／２解離）を示す。
【０２１７】
ヤギ抗ウサギＦｃγ抗体を使用して、抗体ＧＢｂをセンサーチップのフローセルに捕捉し、続いて、ＥＰＯ受容体フラグメント３４７−３７１又は３６１−３７１でそれぞれ灌流した。
【０２１８】
測定は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００装置により、ＨＢＳ−ＥＰ−緩衝液（ｐＨ７．４）（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、３．４mM ＥＤＴＡ、０．００５％ポリソルベート２０（w/v））中、２５℃で行った。非特異的結合を減少させるために１．０mg/ml ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン）を加えた。ＧＢｂ抗体は、対応する配列番号０１のＥＰＯ受容体フラグメントに対してナノモルの結合親和性を示す。
【０２１９】
実施例６
免疫細胞化学Ｉ
一過性にトランスフェクトしたＨＥＬＡ  ＥＰＯＲ細胞上のＥＰＯ受容体に対する、親和性精製したポリクローナル抗体の免疫細胞化学分析を下記のように実施した。ガラスカバースリップ上で培養したＨＥＬＡ細胞を、ＥＰＯ受容体−ＧＦＰ融合タンパク質を一過性に発現するようにトランスフェクトし、ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で固定して、ＥＰＯ受容体に結合したポリクローナル抗体の１．０〜１０μg/mlの精製ＩｇＧで染色した。ＣＹ３ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体によって結合した抗体を検出した。ＬＥＩＣＡ走査型共焦点レーザー顕微鏡ＳＰ２により、Alexa Fluor 488及びＣＹ３で、それぞれ、４８８nm及び５４３nm励起を使用して標本を画像解析した。抗ＥＰＯ受容体抗体の免疫反応性が、ＥＰＯ受容体−ＧＦＰ融合タンパク質の緑色蛍光と近接して共局在化することが見い出された。該抗体は、また、ＥＲ／ゴルジ領域に限定される新しく合成したＥＰＯ受容体を認識する。また、非トランスフェクト細胞においては、いずれの検出可能な標識も欠乏していることから、本明細書において報告される抗ＥＰＯ受容体ポリクローナル抗体の高い特異性が確認される。
【０２２０】
結果を図２に示す。
【０２２１】
実施例７
免疫組織化学ＩＩ
ＨＥＬＡ  ＥＰＯＲ又はｗｔ−ＨＥＬＡ細胞（ＥＰＯＲ発現について陰性）のいずれかからの異種移植組織の組織切片を脱パラフィン化し、続いて、クエン酸緩衝液（Vector Laboratories）中、９７℃で４５分間エピトープ回復した。Labvision装置で自動染色を実施した。抗ＥＰＯ受容体抗体を１２７．５ng/mlの最終濃度で使用した。Envisionポリクローナルウサギ検出キット（DAKO Deutschland GmbH）を使用して一次抗体を検出した。Zeiss Axiovision Rel 4.8, Microscopeで撮像した（図３を参照）。
【０２２２】
実施例８
ＵＴ−７細胞、ヒト臍帯静脈（ＨＵＶＥＣ）及びヒト微小血管内皮（ＨＭＶＥＣ）細胞のウエスタンブロット分析
実施例４に記載する方法を使用した。
【０２２３】
図４のパネルＡは、ＥＰＯ受容体フラグメントＬＤＫＷＬＬＰＲＮＰＰＳＥＤＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０２）に結合する抗体の免疫反応性を示す。
【０２２４】
図４のパネルＢは、ＥＰＯ受容体フラグメントＬＰＧＰＧＧＳＶＤＩＶ（配列番号０１）に交差吸着した抗体の免疫反応性を示す。
【０２２５】
前述の発明は、理解の明確化を目的として、例示及び実施例によっていくらか詳しく記載したが、その説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み入れられる。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図１】
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【配列表】
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