(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性の細胞表現型およびＴｕＪ１陽性の細胞表現型が減少した哺乳動物のグリア制限前駆細胞（ＧＲＰ）を生産する方法であって、該方法が
（ａ）Ａ２Ｂ５陽性細胞を選別することによってのみ、Ａ２Ｂ５陽性細胞を産生する能力がある哺乳動物組織源からＡ２Ｂ５反応性細胞を単離すること；
（ｂ）該Ａ２Ｂ５陽性細胞を基質上で少なくとも１０in vitro培養日数（ＤＩＶ）培養すること；および
（ｃ）該培養細胞を回収すること
を含み、
ＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性の細胞表現型およびＴｕＪ１陽性の細胞表現型が、（ａ）〜（ｃ）を含むが（ｂ）においてＡ２Ｂ５陽性細胞を６ＤＩＶ培養する方法によって生産されるＧＲＰ細胞より減少している、前記方法。
【請求項２】
ＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性の細胞表現型およびＴｕＪ１陽性の細胞表現型が減少した哺乳動物のグリア制限前駆細胞（ＧＲＰ）を生産する方法であって、該方法が
（ａ）哺乳動物の神経組織を細胞懸濁液に解離すること；
（ｂ）Ａ２Ｂ５陽性細胞を選別することによってのみ、Ａ２Ｂ５反応性細胞を単離すること；
（ｃ）該Ａ２Ｂ５陽性細胞を基質上で少なくとも１０in vitro培養日数（ＤＩＶ）培養すること；および
（ｄ）該培養細胞を回収すること
を含み、
ＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性の細胞表現型およびＴｕＪ１陽性の細胞表現型が、（ａ）〜（ｄ）を含むが（ｃ）においてＡ２Ｂ５陽性細胞を６ＤＩＶ培養する方法によって生産されるＧＲＰ細胞より減少している、前記方法。
【請求項３】
哺乳動物の神経組織が、神経管閉鎖後の哺乳動物から得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物の神経組織が、胎児死体の前脳組織、胎児死体の脊髄組織、哺乳動物の脳生検組織または脊髄生検組織である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物がヒトであり、神経組織が妊娠１４〜２４週の胎児死体の前脳組織である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
神経組織を解離することが酵素的および／または機械的に行われる、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞が１０〜２０ＤＩＶ、１５〜２０ＤＩＶ、少なくとも２０ＤＩＶ、または、１００ＤＩＶもしくはそれを超えて培養される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
回収した細胞を凍結および解凍することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
Ａ２Ｂ５反応性細胞が、磁気活性化細胞分離、蛍光活性化細胞分離またはイムノパニングを用いて単離される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が、Ａ２Ｂ５反応性細胞を単離するために、磁気ビーズを含むカラム、蛍光活性化細胞分離またはイムノパニングディッシュに２回または３回以上通される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞および／またはオリゴデンドロサイトへの分化を促進する条件下で、請求項１〜７および９のいずれか一項に記載の方法に従って生産されたＧＲＰ細胞を培養することを含む、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞および／またはオリゴデンドロサイトを産生する方法。
【請求項１２】
ＧＲＰ細胞が、アストロサイト前駆細胞および／またはアストロサイトへの分化を促進する条件下、オリゴデンドロサイト前駆細胞および／またはオリゴデンドロサイトへの分化を促進する条件下、または、アストロサイトおよび／またはアストロサイト前駆細胞ならびにオリゴデンドロサイト前駆細胞および／またはオリゴデンドロサイトへの分化を促進する条件下で培養される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２０１０年４月２２日に出願された米国仮出願番号61/326,799および２００９年１１月１２日に出願された米国仮出願番号61/260,441の優先権の利益を主張し、それぞれの教示は、参照によって完全に本明細書に取り込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、哺乳動物由来のグリア制限前駆細胞（ＧＲＰ）集団であって、可能性のある意図しない細胞表現型が減少した、および／または該集団の細胞における標準偏差が減少した集団の生産方法ならびにこれら細胞の使用方法を提供する。また、本発明では、ＧＲＰを特徴付けるための抗体パネルおよびＧＲＰ細胞の特徴付けにおけるその使用方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
グリア制限前駆細胞（ＧＲＰ）は、Ｃ−シリーズガングリオシドのサブセットを認識する、Ａ２Ｂ５抗体とそれらの反応性によって定義される(Dietrich et al., Glia 2002 40:65-77; Rao and Mayer-Proschel, Dev. Biol. 1997 188:48-63; Saito et al., J. Neurochem. 2001 78:64-74; Windrem et al., Nat. Med. 2004 10:93-97)。ＧＲＰの他の抗原性の特徴は、アストロサイトマーカーのグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の中程度の発現およびＥ−ＣＡＭ（ポリシアル化Ｎ−ＣＡＭまたはＰＳＡ−ＮＣＡＭ）およびβ−ＩＩＩチューブリン（ＴｕＪ１）の神経細胞マーカーの低い発現を包含する(Dietrich et al., Glia 2002 40:65-77; Rao and Mayer-Proschel, Dev. Biol. 1997 188:48-63)。
【０００４】
ＧＲＰが単離されたときには、それらは神経幹細胞を過ぎて、コミットした系列制限細胞に内因的にすでに分化している。ＧＲＰが、奇形腫を誘導または形成することは観察されたことがない。
脳および脊髄におけるニューロンの非常に重要なカテゴリーには、軸索がミエリンで覆われているニューロンが含まれる。このミエリン鞘が損傷した場合、その生きた突起がニューロンの軸索周辺の絶縁するミエリン層を構成するオリゴデンドロサイトが破壊される。脱髄した（demyelinated）ニューロンは、適切にシグナルを伝導することができず、最終的には死滅する。
【０００５】
損傷が不完全である場合、内因性の修復メカニズムが活性化され、再ミエリン化および部分的または完全な機能の回復をもたらす(Lassmann et al., Mult. Scler. 1997 3:133-136; Prineas and Connell, Ann. Neurol. 1979 5:22-31)。これは、再ミエリン化が、実際に機能の復元を導くことができるという重要な点を実証する。しかしながら、多様な疾患や外傷が原因で脱髄を経験する患者の多数は、十分な内因性の再ミエリン化を経験しない(Prineas et al., Ann. Neurol. 1993 33:137-151)。そして、多くのニーズおよび努力にも拘らず、失われた機能の復元を助けることのできる製品の開発において、ほとんど進展がなされていない。これは、損傷したミエリン産生オリゴデンドロサイトのin vivoでの再生をもたらすために生じるはずの複数のシグナルおよび複雑な細胞間相互作用が、部分的な原因となり得る。再ミエリン化をもたらす細胞治療が、脱髄の動物モデルで有益であることが実証されたことは重要である。
【０００６】
Totoiu et al. (Exp. Neurol. 2004 187:254-265)は、ウイルス誘導性のマウスＭＳモデルにおける脊髄損傷の治療において、マウスＧＲＰの局所移植の有効性を報告した。ＧＲＰは遊走してオリゴデンドロサイトへ分化し、軸索回避（axonal sparing）に関連すると思われる再ミエリン化をもたらした。彼らはまた、改善された運動を観察した。その後の研究(Hardison et al. Exp. Neurol. 2006 197:420-429)は、マウスＧＲＰが炎症性Ｔ細胞およびマクロファージの両方の存在下で、生存および再ミエリン化が可能であることを実証した。
【０００７】
ミエリン塩基性タンパク質をコードする遺伝子の変異により、正常なミエリンの産生に欠損を示すシバラーマウス（shiverer mouse）は、ミエリン産生における外来細胞移植の効果を研究するためのモデルである。シバラーへの細胞移植によるミエリン産生の実証は、ＴＭおよびＭＳを包含する多くの脱髄疾患ならびに髄鞘形成不全疾患に当てはまる。ヒトＧＲＰは、周産期異種移植後のシバラーマウス脳の広範かつ高効率のミエリン化を可能にすることが示された(Windrem et al., Nat. Med. 2004 10:93-97)。部位的に（regionally）適切な細胞型（アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト）への分化が、腫瘍のエビデンスなしに実証された。これら研究は、脳および脊髄の両方の再ミエリン化を示すことに広がり、それは、移植した動物のサブセットにおける実質的な表現型の回復を伴った(Windrem et al., Cell Stem Cell 2008 2:553-565)。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の一側面は、哺乳動物のグリア制限前駆細胞（ＧＲＰ）の生産方法に関する。
本発明の別の側面は、ＧＲＰ細胞集団における意図しない細胞の表現型を減少させる、および／またはＧＲＰ細胞集団の細胞における標準偏差を減少させる方法に関する。
本発明の別の側面は、（Ａ２Ｂ５抗体を用いる）Ｃ−シリーズガングリオシドに対する抗体、ＧＦＡＰに対する抗体、ならびにＯｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、Ｏ１、ＰＤＧＦＲ−α、ネスチン、ＮＧ２、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＴｕＪ１、Ｋｉ−６７およびＮｅｕＮからなる群から選択される１または２以上の抗体を含む、ＧＲＰ細胞の特徴付けのための抗体パネル、およびこの抗体パネルで細胞をＧＲＰ細胞として特徴付ける方法に関する。
【０００９】
本発明の別の側面は、ＧＲＰ細胞の特徴付けに有用な遺伝子発現プロファイルに関する。
本発明の別の側面は、Ａ２Ｂ５陽性細胞のない哺乳動物神経細胞の生産方法に関する。
本発明の別の側面は、これら生産された哺乳動物ＧＲＰ細胞の、アストロサイトおよび／またはオリゴデンドロサイトの産生のための使用方法に関する。
【００１０】
本発明の別の側面は、これら生産された哺乳動物ＧＲＰ細胞の、ニューロンの脱髄に関連する疾患、障害、傷害または損傷を患う哺乳動物におけるニューロンの再ミエリン化を増加させるための使用方法に関する。
本発明の別の側面は、これら生産された哺乳動物ＧＲＰ細胞の、グリア性瘢痕の形成を減少させるための、これら生産される哺乳動物ＧＲＰ細胞の使用方法に関する。
さらに本発明の別の側面は、これら生産された哺乳動物ＧＲＰ細胞の、哺乳動物における神経変性疾患もしくは障害または神経系もしくはその一部への損傷もしくは傷害の処置における使用方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明に従って生産された３つの独立した細胞調製物（cell preparations）のパイロット規模の成長曲線を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明に従って生産された３つの独立した細胞調製物のパイロット規模の成長曲線を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明に従って生産された３つの独立した細胞調製物のパイロット規模の成長曲線を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明に従って生産された細胞の生産規模（production scale）の成長曲線を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明に従って生産された細胞の生産規模の成長曲線を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、各継代時および最終的な回収時の生存率を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、懸濁液対ポリ−Ｌ−オルニチン処理面の細胞生存率の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物グリア前駆細胞（ＧＲＰ）の生産方法を提供する。ＧＲＰは、文献においてはグリア制限前駆細胞またはグリア前駆細胞とも呼ばれる。
本発明の哺乳動物ＧＲＰ細胞は、Ａ２Ｂ５陽性細胞を産生する能力があるあらゆる哺乳動物組織源に由来し得る。かかる哺乳動物組織源の例は、限定することなく、胚性／胎性、および（生後すべての年齢を包含する）成体の給源を含み、いずれも、限定することなく、神経組織、脳組織、脊髄組織、視神経組織、嗅上皮組織、内分泌組織、皮膚組織、筋肉組織、脂肪組織、結合組織、胎盤組織、臍帯血、血液、骨髄組織、骨組織、胚性幹細胞、および誘導多能性細胞（induced pluripotent cells）を包含する組織由来である。Ａ２Ｂ５陽性細胞の産生能によって、Ａ２Ｂ５陽性細胞に分化した哺乳動物組織源、Ａ２Ｂ５陽性細胞に脱分化した哺乳動物組織源、および脱分化した後にＡ２Ｂ５陽性細胞に分化した哺乳動物組織源を包含することを意味する。
【００１３】
哺乳動物のグリア制限前駆細胞（ＧＲＰ）は、本発明に従って、Ａ２Ｂ５陽性細胞を産生する能力がある哺乳動物の組織源から、Ａ２Ｂ５抗体反応性細胞を単離することによって生産される。その後Ａ２Ｂ５陽性細胞は、基質上で６日を超えるin vitro培養日数（ＤＩＶ）培養される。培養された細胞は、その後回収される。
【００１４】
本発明の一態様において、本方法は、例えば、限定されることなく、胎児死体の前脳組織、胎児死体の脊髄組織、哺乳動物の脳生検組織または脊髄生検組織などの哺乳動物の神経組織を細胞懸濁液に解離することを含む。一態様において、哺乳動物の神経組織は、神経管閉鎖後に得られる。ヒトＧＲＰについては、例えば、妊娠約１４〜２４週の組織の神経管閉鎖後に得られた神経組織が、一貫した産物を産生することが実証された。分離は、既知の方法に従って、酵素的に、機械的に、または酵素的および機械的の両方で行われる。
【００１５】
Ａ２Ｂ５抗体反応性細胞は、当業者に知られる様々な手段によって単離することができる。例えば、一態様において、Ａ２Ｂ５抗体反応性細胞は、磁気活性化細胞分離（magnetic activated cell sorting）を用いて単離される。例えば、細胞は、単一のＡ２Ｂ５抗体で標識後、Miltenyiの磁気ビーズ技術またはDynalの磁気ビーズ技術または既知の適切な抗体分離技術を用いて、カラムに通すことができる。代替的に、抗体陽性細胞は、標準的な方法を用いる蛍光活性化細胞分離またはイムノパニング（immunopanning）を用いて捕獲することができる。カラム（またはＦＡＣＳまたはイムノパニングディッシュ）は、Ａ２Ｂ５（＋）細胞を濃縮し、Ａ２Ｂ５（−）細胞を減少させる。追加の１または２以上のカラム（または追加のＦＡＣＳまたは１または２以上のイムノパニングディッシュ）は、効果的に中程度に陽性な細胞を減少させ、高度に陽性な細胞を濃縮する。
【００１６】
Ａ２Ｂ５陽性集団は、その後６日を超えるin vitro培養日数（ＤＩＶ）、例えば、約１０〜２０ＤＩＶ、１５〜２０ＤＩＶ、少なくとも２０ＤＩＶおよび／または１００ＤＩＶまで、またはそれを超えて、または少なくとも２回の継代で培養され、培養細胞は回収および凍結される。
【００１７】
この生産工程は、単一の抗体で所望の細胞を選別する方法が使用され、成育が継代なしの６ＤＩＶから、２回の継代までの、または６ＤＩＶを超える、例えば、約１０〜２０ＤＩＶ、１５〜２０ＤＩＶ、少なくとも２０ＤＩＶまたは１００ＤＩＶまで、またはそれを超える成育に拡張される点で、以前に記載された生産工程と異なる。さらに、細胞は懸濁液ではなく、細胞の接着のための基質上で成育される。
【００１８】
基質の例は、限定されることなく、ポリ−L−オルニチン、ポリ−L−リジンおよび組み換えまたは天然の細胞外基質分子またはそれらの断片、例えば、限定されることなく、ラミニン、フィブロネクチンおよびCELLstartTM（ヒト胚性幹細胞、間葉系幹細胞および神経幹細胞の接着および増殖のための異種成分不含（xeno-free）基質、Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）を含む。
【００１９】
本発明の方法に従って生産される細胞の成長曲線、生産量、および免疫学的に定義された表現型は、それらの治療上の能力を変化させることなく、狭いばらつき（tightened variability）および意図しない細胞表現型の減少を示す。
位相差顕微鏡観察は、最初の継代（６ＤＩＶ）の前、２回目の継代（２０ＤＩＶ、回収）の終わり、および１００日までのin vitro培養日数で、安定した形態学的表現型を明らかにした。この双極性から多極性の形態は、３つの独立した細胞調製物において調製物間で一定である。
【００２０】
本発明に従って生産される細胞のパイロット規模の成長曲線を、図１Ａ〜図１Ｃに示す。３つの独立した細胞調製物は、未処理のプラスチック上の成育（「懸濁」）とポリ−Ｌ−オルニチン処理した組織培養プラスチック上の成育との比較として、図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃにそれぞれ示す。基質でコートしたフラスコ上で成育した細胞の調製物は、増加した傾きおよび増加したプレーティング効率を示した。
【００２１】
生産規模の成長曲線を、図２Ａおよび図２Ｂに示す。これら曲線は、パイロット規模と同様であり、２０ＤＩＶで回収された細胞は、老化に近くないことを実証する。
細胞生存率は、トリパンブルー色素排除試験法（trypan blue exclusion method）によって評価された。懸濁液対ポリ−Ｌ−オルニチン処理表面の生存率の比較を図３Ｂに示し、各継代および最終的な回収における生存率を図３Ａに示す。すべての場合において、平均生存率の値は９０％を超える。
【００２２】
本発明に従って生産される細胞は、所望の表現型（グリア制限前駆細胞およびそれらの子孫）および混入する可能性のある意図しない表現型（神経前駆細胞、神経細胞、ミクログリア細胞および内皮細胞）を認識する抗体のパネルを用いて、免疫表現型分類された（immunophenotyped）。このパネル中の抗体は、Ａ２Ｂ５、ＧＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ−α、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、Ｏ１、ネスチン、ＮＧ２、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＴｕＪ１、Ｋｉ−６７および／またはＮｅｕＮから選択される。この独特な抗体のパネルでの免疫表現型分類は、６ＤＩＶ超対６ＤＩＶにおいて、可能性のある意図しない（potentially unintended）細胞表現型（ＰＳＡ−ＮＣＡＭおよびＴｕＪ１）の減少、および本発明の方法に従って生産される細胞における標準偏差の減少を示した。
【００２３】
したがって、本発明の別の側面は、６ＤＩＶを超えた細胞を回収することを含む、ＧＲＰ細胞集団において、可能性のある意図しない細胞表現型を減少させる、および／またはＧＲＰ細胞集団の細胞における標準偏差を減少させる方法に関する。可能性のある意図しない細胞表現型の減少および／または細胞における標準偏差の減少は、６ＤＩＶで回収される細胞との比較によって決定される。
【００２４】
ＧＲＰ細胞集団の凍結および解凍が、意図しない表現型をさらに減少させることもわかった。所望のＡ２Ｂ５、ＧＦＡＰおよびＫｉ−６７陽性表現型は、凍結／解凍で維持されるが、意図しない細胞表現型のマーカー（ＰＳＡ−ＮＣＡＭおよびＴｕＪ１）は、＞５０％減少する。
したがって、本発明の別の側面は、ＧＲＰ細胞集団の凍結および解凍を含む、ＧＲＰ細胞集団における可能性のある意図しない細胞表現型を減少させる方法に関する。
【００２５】
一態様において、ＧＲＰ細胞集団は本発明に従って生産され、回収後さらに凍結および解凍される。
しかしながら、本開示を読んだ当業者が理解するように、凍結前のＧＲＰ細胞を生産する代替方法が使用できる。例えば、一態様において、Ａ２Ｂ５陽性細胞が６ＤＩＶまたはそれ未満で培養される方法によって、ＧＲＰ細胞集団が生産される。培養細胞は、その後回収および凍結される。解凍後、細胞数を増加させるために、細胞は３日または４日以上の追加のin vitro培養日数（ＤＩＶ）培養することができる。
【００２６】
さらに、本発明の選択された抗体パネルによる免疫表現型分類は、本発明の細胞治療を特徴付ける、有用で信頼できる手段を提供する。したがって、本発明の別の側面は、Ａ２Ｂ５、ＧＦＡＰ、およびＯｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、Ｏ１、ＰＤＧＦＲ−α、ネスチン、ＮＧ２、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＴｕＪ１、Ｋｉ−６７およびＮｅｕＮからなる群から選択される１または２以上の抗体を含む、ＧＲＰ細胞を特徴付けるための本発明の抗体パネル、および本発明の抗体パネルを用いて、細胞をＧＲＰ細胞として特徴付ける方法および／または細胞集団の純度を実証する（documenting）方法に関する。一態様において、最初にカバースリップ上またはマルチチャンバースライド（multichamber slides）中に標準的なプロトコルに従って細胞をプレートし、標準的な組織培養条件下においてオーバーナイトで成育させ、その後標準的な手順に従って固定および染色することにより、細胞は抗体パネルを用いて特徴付けられる。
【００２７】
免疫陽性（immunopositive）細胞は、標準的な顕微鏡観察方法を用いて同定され、各抗体について陽性の細胞の百分率は、（pan nuclei stain：ＤＡＰＩなどによって定義される）細胞の全数に対して相対的に定義される。以下の本発明の抗体パネルを用いる免疫表現型は、ＧＲＰである哺乳動物細胞の集団を示す：大部分の細胞は、Ａ２Ｂ５と、ＧＦＡＰ、ネスチン、ＮＧ２、ＰＤＧＦＲ−α、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２およびＯ１の１または２以上とに陽性であり、大部分の細胞は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＴＵＪ１、ＰＥＣＡＭ、ＣＤ６８およびＮｅｕＮの１または２以上に陰性である。本明細書で用いられる「大部分」は、５０％を超える細胞が、選択される抗体について陽性または陰性であることを意味する。
【００２８】
細胞生産物の免疫細胞化学的な特徴付けに加えて、細胞単離物に見出され得る、異なる型の細胞と発現が相関する遺伝子標的を同定した。遺伝子発現データは、未精製細胞、１５の脳組織に由来する６ＤＩＶで回収されたＧＲＰ細胞および本発明の方法に従って生産されたＧＲＰ細胞から収集した。約３７５遺伝子が、６ＤＩＶで回収されたＧＲＰ細胞と未精製細胞との間で、≦０．０１のＰ値とともに発現レベル（増加および減少レベル）において、少なくとも５倍（5-fold）の変化を示した。これらデータを用いて、細胞集団を同定する手段として、チップ／アレイ解析、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲおよびｑＰＣＲなどの技法を介して、遺伝子発現プロファイルが生成および評価されてもよい。
【００２９】
本発明においては、Ａ２Ｂ５陽性細胞を欠損した哺乳動物の神経細胞を生産する方法もまた提供される。この方法においては、Ａ２Ｂ５抗体反応性細胞は、Ａ２Ｂ５陽性細胞を産生する能力がある哺乳動物組織源から単離される。Ａ２Ｂ５抗体反応性細胞を除去した後に残る細胞が、その後収集される。本方法の一態様において、細胞は基質上で１日または２日以上のin vitro培養日数（ＤＩＶ）培養される。本方法において、収集された細胞は、細胞集団を凍結および解凍することによって、任意に一部の細胞型をさらに欠損させられてもよい。
【００３０】
本発明の別の側面は、本発明の方法に従って生産されたＧＲＰから、アストロサイトおよび／またはオリゴデンドロサイトを産生する方法に関する。この方法において、本発明に従って生産されたＧＲＰ細胞は、アストロサイトおよび／またはオリゴデンドロサイトへの分化を促進する条件下で培養される。
【００３１】
一態様において、ＧＲＰ細胞は、アストロサイトへの分化を促進する条件下で培養される。アストロサイト分化を促進する培地配合の２つの非限定的な例は、１）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ１またはＮ２サプリメント、塩基性ＦＧＦ、ＢＭＰ４におけるＧＲＰの成育（ここで、これら成長因子はｎｇ／ｍＬの範囲または１０〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲で存在する）；および２）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ１またはＮ２サプリメント、１〜１０％ＦＢＳ、およびｎｇ／ｍＬの範囲または１０〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲での塩基性ＦＧＦを包含する。
【００３２】
別の態様において、ＧＲＰ細胞はオリゴデンドロサイトへの分化を促進する条件下で培養される。オリゴデンドロサイトへの分化を促進する培地配合および条件の２つの非限定的な例は、１）成長因子を欠くＤＭＥＭ／Ｆ１２培地における２日間のＧＲＰの成育、およびＮ２、ｎｇ／ｍＬの範囲または１０〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲で存在するＰＤＧＦ−ＡＡ、および１〜１００ｎＭの範囲のＴ３が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地への細胞の移動；および２）Ｎ２、１００台のｎＭの範囲のＴ３、数十μｇ／ｍＬの範囲のＮアセチルシステイン、およびｎｇ／ｍＬの範囲または１０〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲のＰＤＧＦ−ＡＡおよびＣＮＴＦが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地におけるＧＲＰの成育を包含する。
【００３３】
実験が行われ、本発明の方法に従って調製されたＧＲＰが、定義された、再現可能な選択された抗原の発現パラメータを示し、in vivo設定においてもニューロンではなく、一貫してアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトへ分化する能力があることを確認した。さらに実験は、これらＧＲＰが、動物モデルにおいて、細胞生存、遊走およびミエリン生産オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトへの分化の特徴を示すことを示した。合わせて、これら研究は、本発明の方法に従って生産されるＧＲＰが、うまく均質化し（integrate）、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトへ分化し、脳および脊髄の脱髄した神経組織における軸索を再ミエリン化することを実証する。
【００３４】
したがって、本発明はまた、哺乳動物においてin vivoでアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを生産するための、およびニューロンの脱髄と関連する疾患、障害、傷害または損傷を患う哺乳動物におけるニューロンの再ミエリン化を増加するための、本発明に従って生産されたＧＲＰ細胞を使用する方法に関する。０．０１〜１億個の細胞を、１または２以上の注射を伴う、当該技術分野の神経外科医によく知られるカテーテルまたはニードルを用いる直接の実質移植（parenchymal transplantation）によって投与することができる。これら移植は、穿頭孔または椎弓切除によって、神経組織に直接アクセスした後に行うことができる。
【００３５】
代替的に、移植は当該技術分野の介入放射線医（interventional radiologist）によって、神経標的組織の直接の視覚的アクセスを必要とせずに、ＣＴガイド経皮送達（CT-guided percutaneous delivery）によって、脊髄内に行うことができる。さらに、細胞は、実質内に直接ではなく、腰椎穿刺または他の適した方法などを通じて、脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与することができる。細胞は、一部の病気については静脈投与によって投与することもできる。最後に、いくつかの臨床試験が、これら疾患のために他の神経細胞型で現在行われている。他の神経細胞によるこれら臨床試験において使用される同様のプロトコルおよび手順が、本発明に従って生産されるＧＲＰで使用するために、当業者によって日常的に適応され得る。
【００３６】
in vivoにおけるグリアの挙動のためのモデルであるシバラーマウス(Nave, J. Neurosci, Res. 1994 38:607-612)の脳に異種移植したときの、本発明に従って生産されたヒトＧＲＰの生存、遊走、増殖および分化が実証された。シバラーマウスは、これらマウスが、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を形成できなくなる常染色体の劣性変異を有する。シバラーマウスのＣＮＳで形成された内在性のオリゴデンドロサイトは、コンパクトなミエリンのアセンブルに失敗する(Privat et al., Neurosci. Lett. 1979 12:107-112)。
【００３７】
移植片生着を最大にするために、成熟のＢおよびＴリンパ細胞を産生するために必須のタンパク質をコードするＲａｇ２遺伝子における常染色体の劣性変異も保有し、それ故に細胞性免疫不全症を示すシバラーマウス系統が開発された（Shinkai et al. Cell 1992 68:855-867）。新生の二重ホモ接合体ｓｈｉｖｅｒｅｒ／ｒａｇ２免疫不全マウスは、脳室下帯を標的とする単一部位に、１００，０００個のヒトＧＲＰを移植された。移植から８または１２週後、動物は屠殺され、ヒトＧＲＰおよびそれらの子孫の生存および分布が、免疫細胞化学的に評価された。
【００３８】
この遺伝学的免疫不全（genetically immune compromised）モデルにおけるヒト細胞の広範な分布は、ヒトＧＲＰの生存および遊走の能力を実証する。ｓｈｉｖｅｒｅｒ／ｒａｇ２におけるin vivoでの生存、遊走および分化と同様の結果が、６ＤＩＶおよび２０ＤＩＶの両方のＧＲＰで観察された。
【００３９】
in vivoにおけるヒトＧＲＰの分化能力が、これらマウスからの脳切片において、免疫細胞化学的に評価された。１つの群のマウスは移植後８週で屠殺された一方で、別の群は、神経学的悪化が、著しく損なわれた歩行運動および（典型的に生後１２〜１８週の）持続的発作の頻繁な発症をもたらしたときに、人道的な理由のために屠殺した。脳切片は、抗ミエリン塩基性タンパク質抗体（ＭＢＰ；この抗体によって認識されるインタクトなＭＢＰの発現は、シバラーマウスでは観察されず、したがって、ＭＢＰの発現は、移植したヒトＧＲＰのみに由来する）および（マウスＧＦＡＰを認識しない）抗ヒトＧＦＡＰ抗体で染色した。
【００４０】
アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトの数の定量は実行可能ではなかったが、屠殺後のin vivoでのＭＢＰおよびＧＦＡＰの免疫反応性の領域を測定することによって、２つの細胞型がin vivoでヒトＧＲＰから産生されたことが確認された。これらデータは、本発明のヒトＧＲＰの適切な細胞表現型へ分化する能力を詳述する。
【００４１】
大抵のニューロンで発現するタンパク質であるＮｅｕＮ、およびヒト核抗原（ＨｕＮＡ）に対する抗体を用いて、脳切片の二重染色も実行した。これらデータは、ＭＢＰおよびＧＦＡＰ発現の決定に使用された同一の動物から収集した。８週で屠殺された動物におけるヒトＧＲＰは、脳梁の近くに集中しており、ＨｕＮＡ／ＮｅｕＮ二重陽性の細胞が０．３％未満観察された。ニューロンではなく、グリアに分化するこれら細胞の能力は、神経変性疾患における使用と関係し、ここで、（ニューロンおよびグリアの両方を生み出す）神経幹細胞が細胞治療として使用された場合に、アロディニア様過敏症と関連する異常な軸索新芽形成が報告されている(Hofstetter et al. Nat. Neurosci. 2005 8:346-353; Macias et al., Exp. Neurol. 2006 201:335-348)。
【００４２】
ラットにおいて、脊髄内投与後のヒトＧＲＰの細胞生存および分布も評価した。１μＬの容量での６万（６０，０００）個のヒトＧＲＰが、１２頭の胸腺欠損ラットの脊髄内にＣ−４の位置で移植された。４頭の動物が、３つの時点（移植後１、４および１２週）のそれぞれで屠殺された。動物は、屠殺時にパラホルムアルデヒドで灌流し、それらの脊髄は回収され、１ｃｍの頸髄が、ヒトＧＲＰの存在について、横断切片のＨｕＮＡ抗体染色を用いて分析された。
【００４３】
移植の１、４および１２週後、ヒト細胞を移植した胸腺欠損ラットの脊髄中には、増殖塊（proliferating masses）は検出されなかった。移植したヒト細胞の生存は、４および１２週の時点で観察された。ヒトＧＲＰは脊髄の断面全体にわたって存在し、最大の細胞密度が、注射が行われた脊髄後柱で観察された。移植後１週において４頭の動物のうちの１頭が、移植後４および１２週において４頭の動物のうちの４頭が、剖検にてヒトＧＲＰが存在していた。４週においては、分析した切片の約２／３がヒトＧＲＰを有しており（０．６３ｃｍの体軸方向の拡散）、１２週においては、分析した切片のすべてが、ヒトＧＲＰを有していた（１ｃｍの体軸方向の拡散）。
【００４４】
２つの異なる細胞投与量での脊髄内投与後の、本発明の工程に従って調製されたヒトＧＲＰの細胞の生存および分布が決定された。移植後２８日では、肉眼的な剖検によっては脊髄の異常は検出されなかった。ＨｕＮＡおよびＫｉ−６７抗体を用いた免疫細胞化学的分析は、胸腺欠損ラットの脊髄内に、合計８００，０００個または１，２００，０００個のヒトＧＲＰ／動物の投与量のいずれにおいても、増殖塊がないことを明らかにした。
【００４５】
ヒトＧＲＰは脊髄の断面全体にわたって存在し、最大の細胞密度が、注射が行われた脊髄後柱で観察された。ＨｕＮＡ／Ｋｉ−６７の共局在は、合計８００，０００個の細胞を注射した動物においては非常に低く、ヒトＧＲＰは分析された１ｃｍの脊髄セグメント全体にわたる、ＨｕＮＡ抗体で染色したすべての切片において検出された。合計１，２００，０００個の細胞を注射したラットの脊髄におけるヒトＧＲＰ細胞密度は、手作業で数えるには高すぎたが、ＨｕＮＡ／Ｋｉ−６７共局在の視覚的評価は、低投与量の動物において観察されたものと同様であった。
【００４６】
ルイスラットの脊髄上において、局所的な炎症性脱髄病変を誘導するための条件が確立された。この動物モデルは、ヒトにおける横断性脊髄炎の病理を模倣し、本発明に従って生産され、移植されたヒトＧＲＰについて、誘導された局所的な脱髄病変の近傍で生存する能力を明らかにするために使用された。ラットモデルは、公表されたモデル（Kerschensteiner et al., Am. J. Pathol. 2004 164:1455-1469）に基づいており、これを局所的な炎症性脱髄の臨床学的なおよび組織学的な証拠をより確かに誘導するように改変した。
【００４７】
成体ルイスラットは、フロイント不完全アジュバントに懸濁されたミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）で免疫され、その１０日後、Ｔ９椎弓切除、および腫瘍壊死因子α、インターロイキン６、インターフェロンαおよびエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）のカクテルの注射を行った。ルイスラットの脊髄後柱における局所的な炎症は、カクテルの注射の４日後に観察された。活発な炎症は、サイトカインおよびＥｔＢｒの注射後１０〜１４日で大部分が回復した。しかしながら、当該領域の広範な脱髄は持続した。この領域に移植されたヒトＧＲＰは、１３ｍｍまでの体軸方向の拡散を伴って、移植後３、８および１４週で検出され、それらは脱髄病変において生存できることが実証された。
【００４８】
本発明に従って生産されるヒトＧＲＰの、多発性硬化症の環境を模倣する炎症性の環境における生存も評価された。雌性ダークアグーチ（Dark Agouti）ラット（体重１５０〜１７５グラム）は、フロイント不完全アジュバント中１０ｍｇのＭＯＧを尾の基部に注射された。ラットは免疫後１０〜１２日で、臨床学的疾患を発症した（２．５〜３．０のＥＡＥスコア；後肢の不全麻痺）。ヒトＧＲＰ細胞の移植２日前に始め、その後毎日、ラットはシクロスポリンＡを１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ＩＰ）注射された。椎弓切除は胸椎の位置（Ｔ８〜Ｔ９）で行われ、それぞれの動物は、２μＬの生理食塩水中の約１５０，０００個のヒトＧＲＰの単回投与を脊髄後柱に受けた。
【００４９】
疾患の症状が現れた２日または７日後に、ヒトＧＲＰが動物に移植された。動物は、移植後１週、２週および４週で屠殺した。移植したヒトＧＲＰ細胞は、移植部位近くの脊髄の４０μｍの横断切片において、ＨｕＮＡ抗体を用いて検出した。炎症性応答の間存在する宿主活性化（host activate）ミクログリア表面のＣＤ１１ｂを検出するために、ＯＸ４２抗体を使用した。マクロファージおよびミクログリアの浸潤を決定するために、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用した。移植後１週間に、ＨｕＮＡ染色は、ＯＸ４２による免疫染色部位の近くに局在した
【００５０】
注射部位周辺の明白なＨ＆Ｅ染色はまた、マクロファージおよびミクログリアの宿主浸潤を示す。移植後２週間までに、ＨｕＮＡのＯＸ４２免疫染色との共局在は観察されなくなった一方で、Ｈ＆Ｅ染色はまだ観察されたが、前より明白ではなくなった。移植したヒトＧＲＰは、疾患発症後２日および７日のいずれの注射の後においても、評価した最も長い時点である１２週まで、ＤＡ／ＥＡＥラット脊髄において生存可能であった。したがって、ヒトＧＲＰは、ヒト多発性硬化症の炎症病変において見出される条件を模倣する条件において、生存可能である。
【００５１】
本明細書において実証される、グリア細胞に関連する神経変性疾患または障害の複数の動物モデルにおける、本発明に従って生産されたＧＲＰ細胞の有効性は、これら神経変性疾患または障害の処置または緩和におけるそれらの有用性を示す。グリア細胞は、神経変性疾患である筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の発症において、重要な役割を担うことが示されている(Howland et al. PNAS 99, 1105, 1995; Clement et al. Science 302, 113, 2003; Rothstein et al. Ann. Neurol. 38, 73, 1995)。
【００５２】
アストロサイトは、ＣＮＳにおいて、脳血管制御、シナプス伝達の調節（例えば、グルタミン酸輸送）および他の効果を包含する多くの重要な機能を担い、他の効果は成長因子の放出ならびにニューロンおよびグリアのための栄養支援（trophic support）の供給を包含する。グリア細胞はまた、多くの神経変性疾患において、有害な効果を起こす反応性アストロサイトの形成を低減または予防することができる。そして、グリア細胞は、脊髄損傷およびいくつかの神経変性疾患で起こるようなグリア性瘢痕のレベルを低減することができる。
【００５３】
さらに、ＡＬＳのラットモデルへの正常グリア細胞（これは、その後アストロサイトに分化する）の移植は、このモデルにおいて神経を保護することが実証された（Lepore et al. Nature Med. 11, 1294, 2008）。これらデータは、モデルとなる神経変性疾患におけるグリア前駆細胞の治療上の有効性を示し、さらなる研究は、グリア前駆細胞治療が、限定することなく、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病およびアレキサンダー病(Maragakis and Rothstein Nature Clinical Practice Neurology 2, 679, 2006)、多発性硬化症(Windrem et.al. Cell Stem Cell. 2008 Jun 5;2(6):553-65, Hardison et.al Exp Neurol. 2006 Feb;197(2):420-9)、他の脱髄疾患(Duncan, J Inherit Metab Dis. 2005;28(3):357-68)および脊髄損傷(Keirstead et.al. J Neurosci. 2005 May 11;25(19):4694-705, Mitsui et.al. J Neurosci. 2005 Oct 19;25(42):9624-36.)を包含する、他の神経変性疾患または障害において有効であることを示す。
【００５４】
したがって、本発明の別の側面は、哺乳動物におけるグリア細胞に関連する神経変性疾患または障害の治療および神経系またはその一部への傷害または損傷の処置における、本発明に従って生産される哺乳動物のＧＲＰ細胞の使用方法に関する。傷害または損傷は、限定されることなく、外傷、薬物、放射線、および免疫介在性の損傷または傷害を包含する原因によって誘導される損傷または傷害を包含することを意味する。
【００５５】
加えて、関連する成長因子などを産生する健康なグリア細胞を供給することによって、本発明の細胞は、明確にはグリア細胞に関係しない、哺乳動物における神経変性疾患または障害および神経系の傷害の処置に有用であることが予期される。これら処置方法においては、１個〜１億個の本発明に従って生産される細胞を、当該技術分野の神経外科医によく知られるカテーテルまたはニードルを用いる直接の実質移植によって投与することができる。これら移植は、穿頭孔または椎弓切除によって、神経組織に直接アクセスした後に行うことができる。
【００５６】
代替的に、移植は当該技術分野の介入放射線医によって、神経標的組織の直接の視覚的アクセスを必要とせずに、ＣＴガイド経皮送達によって、脊髄内に行うことができる。さらに、細胞は実質内に直接ではなく、腰椎穿刺または他の適した方法などを通じて、脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与することができる。最後に、いくつかの臨床試験が、これら疾患のために他の神経細胞型で現在行われている。他の神経細胞によるこれら臨床試験において使用される同様のプロトコルおよび手順が、本発明に従って生産されるＧＲＰで使用するために、当業者によって日常的に適応され得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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