(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲ−１４５の阻害剤を含む、肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の治療または予防を必要とする対象においてＰＡＨを治療または予防するための医薬組成物であって、
前記ｍｉＲ−１４５の阻害剤が、成熟ｍｉＲ−１４５配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ロックド核酸である二環式糖ヌクレオシド修飾を少なくとも１つ含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’−ＧＵＣＣＡＧＵＵＵＵＣＣＣＡＧＧＡＡＵＣＣＣＵ−３’または５’−ＧＧＡＵＵＣＣＵＧＧＡＡＡＵＡＣＵＧＵＵＣＵ−３’の配列に相補的な配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つのさらなる糖修飾または骨格修飾を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つのさらなる糖修飾または骨格修飾が２’−Ｏ−アルキル修飾またはホスホロチオエートリンケージである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが約８〜約１８ヌクレオチド長または約１２〜約１６ヌクレオチド長である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記阻害剤が吸入投与経路のために製剤化される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記阻害剤が乾燥粉末剤または液体エアロゾル剤として製剤化される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記対象がヒトである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ヒトが、骨形成タンパク質２型レセプターをコードする遺伝子に変異を有する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記阻害剤がインヘラーのために製剤化される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の活性または発現を調節する作用剤を投与することによる肺動脈高血圧の治療および予防に関する。特定的には、本発明は、肺動脈高血圧の治療または予防を必要とする対象の細胞内のｍｉＲ−１４５の発現または活性を阻害することにより肺動脈高血圧を治療または予防する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
肺動脈高血圧（ＰＡＨ）は、肺血管抵抗の漸進的増加をもたらすＰＡ圧増加および血管リモデリングにより特徴付けられる肺小動脈（ＰＡ）の疾患である（Rich et al., 1987）。血管閉塞の結果、右心不全および高い死亡率になる（Jeffery et al., 2002、Voelkel et al., 1997）。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）２型レセプター（ＢＭＰＲ２）（トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βスーパーファミリーに対するレセプター）をコードする遺伝子の生殖系列変異は、遺伝型ＰＡＨ（ｈＰＡＨ）の患者の約７０％で同定されている（Morrell et al., 2001）。さらに、ＢＭＰＲ２発現はまた、この遺伝子の変異が不在であるＰＡＨ症例（特発性ＰＡＨ、ｉＰＡＨ）では著しく低減されることから、ＰＡＨの発症におけるこのレセプター経路のより広い役割が示唆される。肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）では、ＢＭＰＲ２の変異は、ＢＭＰおよびＴＧＦ−βに対する異常増殖反応に関連する。内皮細胞では、この変異は、アポトーシスに対する細胞（ＰＡＥＣ）の感受性を増大させる（Morrell et al., 2001）。いくつかのファミリーおよび大多数のｉＰＡＨ症例ではＢＭＰＲ２変異が不在であることから、依然としてさらなる病理学的機序（おそらくＴＧＦ−βスーパーファミリーに関連する）を同定する必要があることが示唆される。
【０００３】
すべての型のＰＡＨに共通する主要な病理組織学的特徴の１つは、平滑筋特異的α−アクチン（ＳＭＡ）を発現する細胞が末梢肺動脈に蓄積することである。これは、新生内膜中のＳＭＡ陽性細胞の出現および通常は平滑筋を欠失している前毛細血管肺細動脈中へのＳＭＡ陽性細胞の伸長を含む（Mandegar et al., 2004）。ＰＡのこの遠位部の筋肉化に関与する細胞過程は明らかでないが、これらの観測からＰＡＨの発症におけるＰＡＳＭＣの中心的役割が示唆される。
【０００４】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、特異的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的としてその分解または翻訳抑制を誘発することにより遺伝子発現を負に制御することが可能な一群の小型内因性非コードＲＮＡである（Ambros, 2004、Bartel, 2009）。最近の研究では、ｍｉＲＮＡ：ｍＲＮＡ標的の主な機序的効果としてｍＲＮＡ分解が規定された（Guo et al., 2010）。いくつかの最近の研究では、血管炎症および血管病変発症におけるｍｉＲＮＡの直接的役割が評価された（Kartha and Subramanian, 2010、Urbich et al., 2008）。最近の研究では、血管壁中でｍｉＲ−１４５が豊富に発現されることが示された（Cheng et al., 2009）。ｍｉＲ−１４５は、保存ＳＲＦ結合部位により制御されてヒト５番染色体上（Lio et al., 2010）およびマウス１８番染色体上（Xin et al., 2009）でｍｉＲ−１４３および、ｍｉＲ−１４５の両方をコードする長いｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして転写される。血管壁へのｍｉＲ−１４５の局在化により、外膜線維芽細胞および内皮細胞と比較して平滑筋層での高い発現が実証された（Cheng et al., 2009）。このため、ｍｉＲ−１４５は、その標的遺伝子ＫＬＦ−５およびその下流シグナリング分子ミオカルジンを介して平滑筋細胞（ＳＭＣ）の成熟および増殖ならびに血管新生内膜病変の形成を制御可能な平滑筋細胞表現型マーカーおよびモジュレーターと考えられる（Cheng et al., 2009、Elia et al., 2009）。ＴＧＦ−βスーパーファミリー内では、Ｓｍａｄ依存性経路を介して活性ｍｉＲ１４３／１４５クラスターに対するアゴニストが示された（Davis-Dusenbery et al., 2011、Long et al., 2011）。さらに、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４３、およびｍｉＲ１４３／１４５ノックアウト（ｋｏ、−／−）マウスの分析では、アクチンフィラメントの破壊により誘導されるＳＭＣサイズの低減に起因して、大動脈および他の末梢動脈の著しくより薄い平滑筋層が示された（Elia et al., 2009）。これにより、ｍｉＲ−１４５−／−マウスでは、中等度の全身性低血圧がもたらされ、
傷害に対する反応による新生内膜形成が不在になる（Xin et al., 2009）。さらに、単一および二重ｋｏ動物から単離された血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）は、過増殖活性および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（ＶＳＭＣに対する既知の化学誘引物質）へのより高い遊走能を示した（Elia et al., 2009、Xin et al., 2009）。さらにまた、ｍｉＲ−１４３（１４５）ｋｏマウスの血管系の薬理学的分析から、血圧上昇刺激に対する反応が弱められることが明らかにされた（Elia et al., 2009、Xin et al., 2009）。まとめると、これらの知見からｍｉＲ−１４５ｋｏマウスおよびｍｉＲ１４３／１４５二重ｋｏマウスではＶＳＭＣの表現型の脱分化が示される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
根底にある遺伝学の理解が向上したにもかかわらず、ＰＡＨは、依然として、重篤で死に至ることも多い疾患である。肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）の増殖を含めて、肺小動脈の広範なリモデリングは、病変を特徴付ける。ＰＡＨの現在の治療では、ＰＡＨ病変の根底をなす平滑筋増殖に適切に対処できない。したがって、ＰＡＨの新規な治療を開発する必要性が当技術分野に存在する。血管リモデリングの役割を果たすと報告されているｍｉｃｒｏＲＮＡは、ＰＡＨの効果的治療を開発するための新規な治療標的になる可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、部分的には、ｍｉＲ−１４５がＰＡＨのマウスモデルにおいて特発型（idiopathic）および遺伝型のＰＡＨのいずれに罹患するヒトの肺組織でも異常制御されてアップレギュレートされるという発見に基づく。開発されたノックアウト動物におけるｍｉＲ−１４５発現の排除は、ＰＡＨの発症を防ぐ。したがって、本発明は、ｍｉＲ−１４５の発現または機能の阻害剤を対象に投与することにより、必要とされる対象においてＰＡＨを治療または予防する方法を提供する。
【０００７】
一実施形態において、本方法は、ｍｉＲ−１４５配列（たとえば、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１４５、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１４５、または成熟ｍｉＲ−１４５）に少なくとも部分的に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む。特定の実施形態において、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト成熟ｍｉＲ−１４５配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む。本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートリンケージ、２’−Ｏ−アルキル修飾、二環式糖ヌクレオシド修飾（たとえば、ロックド核酸（ＬＮＡ））などの１つ以上の骨格修飾または糖修飾を含有可能である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−１４５を標的とする本アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、約８〜約１８ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｍｉＲ−１４５を標的とする本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１２〜約１６ヌクレオチド長または約１０〜約１４ヌクレオチド長の範囲内である。
【０００８】
一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａｎｔｉｍｉＲである。ａｎｔｉｍｉＲは、ｍｉＲ−１４５を標的として阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ａｎｔｉｍｉＲは、ＬＮＡ  ａｎｔｉｍｉＲであり得る。一実施形態において、ａｎｔｉｍｉＲは、成熟ｍｉＲ−１４５の塩基２〜１７を標的とする。他の実施形態において、ａｎｔｉｍｉＲは、１６ヌクレオチド長である。さらに他の実施形態において、ａｎｔｉｍｉＲは、完全にホスホロチオレート化される。ａｎｔｉｍｉＲは、完全にホスホロチオレート化されてｍｉＲ−１４５の５’領域に完全に相補的であり得る。ａｎｔｉｍｉＲはまた、ＬＮＡとＤＮＡとの混合体として合成することも可能である。
【０００９】
本発明の他の実施形態において、本ｍｉＲ−１４５阻害剤は、肺高血圧もしくは肺動脈高血圧（ＰＡＨ）と診断された対象またはそれらを発症するリスクのある対象に投与される。対象が診断され得るまたは発症するリスクがあり得る肺高血圧の型としては、特発性ＰＡＨ、遺伝性または家族性ＰＡＨ、および二次性肺高血圧（たとえば、肺塞栓、肺気腫、肺線維症、および先天性心疾患から生じる高血圧）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、対象は、特発性ＰＡＨまたは遺伝性ＰＡＨと診断される。いくつかの実施形態において、ＰＡＨを発症するリスクのある対象は、骨形成タンパク質２型レセプターをコードする遺伝子に変異を有する。特定の実施形態において、対象はヒトである。
【００１０】
本ｍｉＲ−１４５阻害剤は、静脈内、動脈内、経鼻、経口、または経肺（たとえば、鼻または口を介する吸入により）をはじめとする種々の経路により対象に投与可能である。特定の実施形態において、本ｍｉＲ−１４５阻害剤は、肺送達デバイスを介した吸入経路により投与される。そのような実施形態において、本ｍｉＲ−１４５阻害剤は、乾燥粉末剤または液体エアロゾル剤として製剤化さ得る。
【００１１】
本発明はまた、肺動脈高血圧を治療または予防するためのキットを包含する。一実施形態において、本キットは、本明細書に記載のｍｉＲ−１４５の阻害剤と投与デバイスとを含む。投与デバイスは、インヘラー、ネブライザー、インサフレーター、点滴器、エアロゾル発生器などのように肺送達に供すべく設計可能である。他の実施形態において、投与デバイスは、カテーテルなどのように静脈内送達または動脈内送達に供すべく設計可能である。本ｍｉＲ−１４５阻害剤は、投与デバイス内に貯蔵すべく任意選択で製剤化可能である。本キットは、ＰＡＨを治療または予防するために本ｍｉＲ−１４５阻害剤を対象（たとえばヒト）に投与するための説明書をさらに含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＳＭＣへのｍｉＲ１４５プローブの共局在化。実施例に詳述されるようにｍｉＲ１４５およびＳＭＡの染色のために正常ヒト肺切片を処理した。（Ａ）ｍｉＲ１４５プローブおよびＳＭアクチン、（Ｂ）対照プローブおよびＳＭアクチン。倍率×１０。（Ｃ）正常ヒト肺ならびにｉＰＡＨおよびｆＰＡＨ患者の肺の分析。
【図２】マウス肺切片におけるｍｉＲ−１４５の局在化および低酸素マウスに対する正常酸素マウスにおける発現。（Ａ）マウス肺におけるｍｉＲ−１４５の局在化を示すｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。パラフィン切片を再水和してａｎｔｉ−ｍｉＲ−１４５または陰性対照としてのスクランブルプローブと共にインキュベートした。共局在化では、陰性対照としての非免疫アイソタイプＩｇＧ抗体と共に免疫組織化学アッセイを用いて同一サンプルでα−アクチンを検出した。画像倍率×１００または×４００倍率 ＝５０μｍ。正常酸素および１４日間低酸素の野生型マウスのｑ−ＰＣＲ分析。正常酸素（白色棒）または低酸素（黒色棒）の１０週齢マウスの（Ｂ）全肺または（Ｃ）右室から全ＲＮＡを抽出した。６匹のマウス／グループを分析した。すべてのサンプルを三重試験方式で試験した。結果をＵ６の値に規格化し、そして対照グループに任意の値１を割り当てて相対変化倍率として表した。対応のないｔ検定を用いてデータを解析した（＊＊＊ｐ＜０．００１  ｖｓ対照サンプル）。
【図３】低酸素マウスに対する正常酸素マウスにおけるｍｉＲ−１４３。正常酸素および１４日間低酸素のｗｔマウスのｑ−ＰＣＲ分析。正常酸素（白色棒）または低酸素（黒色棒）の１０週齢マウスの（Ａ）全肺または（Ｂ）右室から全ＲＮＡを抽出した。６匹のマウス／グループを分析した。各サンプルを三重試験方式で試験した。結果をＵ６の値に規格化し、そして対照グループに任意の値１を割り当てて相対変化倍率として表した。対応のないｔ検定を用いてデータを解析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１  ｖｓ正常酸素サンプル）。
【図４】低酸素ｗｔマウスの脳、腎臓、および脾臓におけるｍｉＲ−１４５発現。正常酸素（白色棒）または低酸素（黒色棒）のマウスの（それぞれＡ、Ｂ、Ｃ）。各器官から四重試験方式で全ＲＮＡを抽出してｑ−ＰＣＲにより分析した。ｔ検定を用いてデータを解析したが、有意性は同定されなかった。
【図５】インビトロで５％低酸素に暴露されたＳＭＣにおけるｍｉＲ−１４５発現。一次遠位肺動脈平滑筋細胞をインビトロで５％低酸素に（Ａ）２４時間または（Ｂ）７２時間暴露し、そして阻害剤ＳＢ２０３５８０（ｐ３８阻害剤−５μＭ）、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ−β阻害剤−１μＭ）、Ｕ０１２６（ＥＲＫ阻害剤−１μＭ）の存在下または不在下でｍｉＲ１４５のレベルを評価した。
【図６】ｗｔマウスと比較したｍｉＲ−１４５−／−マウスにおけるｍｉＲ−１４５発現の分析。（Ａ）ｑ−ＰＣＲおよび（Ｂ）ｉｎ  ｓｉｔｕ分析によりｋｏマウスにおけるｍｉＲ−１４５破壊を確認した。画像はすべて×１００の倍率、スケールバー＝１００μｍ。
【図７】低酸素に対する反応における野生型マウスおよびｍｉＲ−１４５−／−マウスでのｍｉＲ−１４３発現。正常酸素および１４日間低酸素の野生型（ＷＴ）マウスおよびノックアウト（ＫＯ）マウスのｑ−ＰＣＲ分析。正常酸素（黒色棒）または低酸素（ストライプ棒）の１０週齢マウスから全ＲＮＡを抽出した。６匹のマウス／グループを分析した。結果をＵ６の値に規格化し、そして対照グループに任意の値１を割り当てて相対変化倍率として表した。二元配置ＡＮＯＶＡおよびそれに続いてボンフェローニの事後検定を用いてデータを解析した（＊＊＊ｐ＜０．００１  ｖｓ対照サンプル）。
【図８】マウスにおけるＰＡＨ発症および血管リモデリングに対するｍｉＲ−１４５破壊の効果。（Ａ）収縮期右室圧（ｓＲＶＰ、ｎ＝９〜１０）および（Ｂ）右室肥大（ＲＶＨ、ｎ＝９〜１０）の評価。（Ｃ）弾性線維ワンギーソン法を用いて染色された代表的肺動脈。画像はすべて４００×の倍率、スケールバー＝５０μｍ。（Ｄ）正常酸素および低酸素の野生型（ＷＴ）マウスおよびｍｉＲ−１４５−／−マウス（ｎ＝５）の両方からの肺動脈リモデリング。マウスを低酸素に１４日間暴露した。ｎはマウスの数である。二元配置ＡＮＯＶＡおよびそれに続いてボンフェローニの事後検定を用いてデータを解析した（＊ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＷＴ正常酸素マウス）。
【図９】正常酸素条件および低酸素条件に付された野生型マウスおよびｍｉＲ−１４５−／−マウスにおける（Ａ）全身動脈圧（ＳＡＰ、ｎ＝６〜９）および（Ｂ）心拍数（ＨＲ、ｎ＝６〜１０）の評価。マウスを低酸素に１４日間暴露した。ｎはマウスの数である。二元配置ＡＮＯＶＡおよびそれに続いてボンフェローニの事後検定を用いてデータを解析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１  ｖｓ野生型正常酸素マウス）。
【図１０】ｍｉＲ−１４５選択標的の分析。正常酸素および低酸素のｗｔマウスおよびｍｉＲ−１４５−／−マウスの全肺において、（Ａ）ＳＭＡＤ５、（Ｂ）ＳＭＡＤ４、（Ｃ）ＫＬＦ４、および（Ｄ）ＫＬＦ５の発現レベルをｑ−ＰＣＲにより評価した。一元配置ＡＮＯＶＡおよびそれに続いてボンフェローニの事後検定を用いてデータを解析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１１】ＷＴ低酸素雌マウスおよびｍｉＲ−１４５−／−低酸素雌マウスにおけるＫＬＦ４およびＫＬＦ５タンパク質発現レベルの分析。（Ａ、Ｄ）慢性低酸素に１４日間暴露されたＷＴマウスおよびｍｉＲ−１４５−／−マウスの全肺においてＫＬＦ４およびＫＬＦ５の発現レベルをウェスタンブロットにより評価した。４匹のマウス／グループを分析し、特定のソフトウェア（Scion Imageソフトウェア）を用いてウェスタンブロットバンドの強度を測定した。得られた定量値を（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、および（Ｆ）に棒グラフで示す。結果をＧＡＰＤＨの値に規格化し、そしてＷＴグループに任意の値１を割り当てて増加倍率として表した。対応のないｔ検定を用いてデータを解析した。＊＊ｐ＜０．００５  ｗｔマウスと比較して。
【図１２】マイクロアレイデータの確認。正常酸素および低酸素のｗｔマウスおよびｍｉＲ−１４５−／−マウスの肺動脈において、（Ａ）ＷＩＦ１、（Ｂ）ＴＧＦＢ２、（Ｃ）ＦＲＺＢ、（Ｄ）ＤＡＢ２、（Ｅ）ＡＣＥ、（Ｆ）ＦＳＣＮ１、（Ｇ）ＣＴＧＦ、（Ｈ）Ａｎｇｐｔｌ４、（Ｉ）ＡＰ２Ｂ１、および（Ｊ）ＩＴＧＢＬ１Ｉの発現レベルをｑ−ＰＣＲにより評価した。一元配置ＡＮＯＶＡおよびそれに続いてボンフェローニの事後検定を用いてデータを解析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１３】ｍｉＲＮＡ特異的ａｎｔｉｍｉＲの注射後に得られたｍｉＲ−１４５またはｍｉＲ−１４３の選択的ノックダウン。成熟ｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５配列のいずれかの５’領域に完全に相補的なａｎｔｉｍｉＲを８週齢の雌マウスに皮下注射して、慢性低酸素に１４日間付した。それらは、低酸素の８日後、２回目の注射を受けた。１４日後、マウスを屠殺して、肺から全ＲＮＡを抽出した。正常酸素媒体処置動物、低酸素媒体処置動物、およびスクランブル、ｍｉＲ−１４５、またはｍｉＲ−１４３のａｎｔｉｍｉＲが注射された低酸素動物における（Ａ）ｍｉＲ−１４５および（Ｂ）ｍｉＲ−１４３の発現。（Ｃ）〜（Ｄ）ｍｉＲ−１４５または（Ｅ）〜（Ｆ）ｍｉＲ−１４３の発現レベルを示す、ｑ−ＰＣＲにより評価された同一のＲＮＡの（Ｃ）〜（Ｆ）ノーザンブロット分析。一元配置ＡＮＯＶＡおよびそれに続いてボンフェローニの事後検定を用いてデータを解析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−１４３のダウンレギュレーションは、他のすべてのグループと対比して統計的に有意である。）。
【図１４】マウスにおけるＰＡＨ発症および血管リモデリングに対するｍｉＲ−１４５またはｍｉＲ−１４３ノックダウンの効果。ｍｉＲ−１４５もしくはｍｉＲ−１４３に特異的なａｎｔｉｍｉＲ、スクランブルａｎｔｉｍｉＲ、または媒体で処置されて慢性低酸素に１４日間暴露されたＣ５７Ｂ１６マウスにおける（Ａ）収縮期右室圧（ｓＲＶＰ、ｎ＝６〜１０）、（Ｂ）右室肥大（ＲＶＨ  ｎ＝７〜１３）の評価。（Ｃ）同一のグループ（ｎ＝４）で測定された肺動脈リモデリング。ｎ＝マウスの数。一元配置ＡＮＯＶＡおよびそれに続いてボンフェローニの事後検定を用いてデータを解析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｄ）弾性線維ワンギーソン法を用いて染色された代表的肺動脈。画像はすべて×４０の倍率、スケールバー＝２０μｍ。
【図１５】媒体処置された正常酸素マウスおよび媒体、スクランブルａｎｔｉＭｉｒ、ｍｉＲ−１４５  ａｎｔｉＭｉｒ、またはｍｉＲ−１４３  ａｎｔｉＭｉｒが注射された低酸素マウスにおける（Ａ）全身動脈圧（ＳＡＰ、ｎ＝６〜８）および（Ｂ）心拍数（ＨＲ、ｎ＝７〜１３）の評価。一元配置ＡＮＯＶＡおよびそれに続いてボンフェローニの事後検定を用いてデータを解析した。
【図１６】ｉＰＡＨおよびｈＰＡＨのヒト肺におけるｍｉＲ−１４５発現レベルの評価。（Ａ）ｍｉＲ−１４５の発現レベルを示す、ｉＰＡＨ（ｎ＝６）、ｈＰＡＨ（ｎ＝５）、および対照患者（ｎ＝６）のパラフィン包埋ヒト肺から抽出されたＲＮＡのｑ−ＰＣＲ分析。すべてのサンプルをＲｎｕ−４８の値に規格化し、そして対照グループに任意の値１を割り当てて相対変化倍率として表した。二元配置ＡＮＯＶＡおよびそれに続いてボンフェローニの事後検定を用いてデータを解析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）。（Ｂ）ｑ−ＰＣＲ分析に使用したのと同一のサンプルから取得したパラフィン切片におけるｍｉＲ−１４５発現のｉｎ  ｓｉｔｕ分析。スクランブルプローブを陰性対照として使用した。共局在化では、陰性対照としての非免疫アイソタイプＩｇＧ抗体と共に免疫組織化学を用いて同一サンプルで連続切片に対してα−アクチンを検出した。典型的な複合病変および新たに筋肉化された細動脈におけるα−アクチンおよびｍｉＲ−１４５の発現の増大が、画像から実証される。画像はすべて４００×の倍率、スケールバー＝５０μｍ。（Ｃ）ｈＰＡＨ患者の新生内膜病変におけるｍｉＲ−１４５ダウンレギュレーション。共局在化では、α−アクチン発現を免疫組織化学により検出した。
【図１７】ヒトＢＭＰＲ２変異ＰＡＳＭＣの分析。（Ａ）ＰＡＳＭＣにおけるｍｉＲ−１４５発現のｑＰＣＲ分析。ＢＭＰＲ２遺伝子に変異を有するｈＰＡＨ患者のＰＡＳＭＣから全ＲＮＡを抽出した。第４継代一次細胞を使用した。非罹患対照と比較してｐｒｅ−ｍｉＲ−１４５および成熟ｍｉＲ−１４５の発現に関してｃＤＮＡを分析した。結果を（Ａ）ｐｒｅ−ｍｉＲ−１４５に対してはＧＡＰＤＨおよび（Ｂ）成熟ｍｉＲ−１４５に対してはＲｎｕ−４８に規格化し、そして対照グループに任意の値１を割り当てて相対変化倍率として表した。対応のないｔ検定を用いてデータを解析した（＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１  ｖｓ対照サンプル）。（Ｃ）ｑ−ＰＣＲの結果を確認するために、野生型細胞およびＢＭＰＲ２変異細胞から抽出された同一の全ＲＮＡをノーザンブロット分析にも使用した。Scion Imageソフトウェアを用いてブロットの定量を行い、関心対象のｍｉＲＮＡのバンド強度を確定して、相対Ｕ６シグナルに規格化した（Ｄ）。対応のないｔ検定を用いてデータを解析した（＊＊＊ｐ＜０．００１  ｖｓ対照サンプル）。
【図１８】ｓｉＲＮＡを介してＢＭＰＲ２発現がダウンレギュレートされたヒトＰＡＳＭＣにおけるｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５のアップレギュレーション。ＢＭＰＲ２発現を標的として特異的に抑制可能なｓｉＲＮＡまたは陰性対照としてのｓｉスクランブルを一次ヒトＰＡＳＭＣにトランスフェクトした。これらのサンプルおよび比較のための未処理細胞から全ＲＮＡを７２時間後に抽出した。ＢＭＰＲ２ダウンレギュレーションの効率を（Ａ）ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲにより評価した。また、（Ｂ）ｍｉＲ−１４３および（Ｃ）ｍｉＲ−１４５の発現を同一サンプルで評価した。結果をＢＭＰＲ２に対してはＧＡＰＤＨならびにｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５に対してはＲｎｕ−４８に規格化し、そして対照グループに任意の値１を割り当てて相対変化倍率として表した。一元配置ＡＮＯＶＡおよびそれに続いてボンフェローニの事後検定を用いてデータを解析した。＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１  記載の対照またはｓｉスクランブルグループと比較して。
【図１９】ｗｔマウスおよびＢＭＰＲ２  ＢＭＰＲ２  Ｒ８９９ＸマウスにおけるｍｉＲ−１４５発現。４匹のｗｔマウスまたはＢＭＰＲ２変異マウスの全肺からＲＮＡを抽出し、そして（Ａ）ｑ−ＰＣＲ（すべてのサンプルを三重試験方式で分析し、結果をＵ６に規格化し、そして対照グループに任意の値１を割り当てて相対変化倍率として表した）（＊＊＊ｐ＜０．００１  ｖｓ対照サンプル）および（Ｂ）〜（Ｃ）ノーザンブロットによりｍｉＲ−１４５発現に関して評価した。（Ｄ）同一のマウスの肺におけるｍｉＲ−１４５の局在化を示すｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。パラフィン切片を再水和してａｎｔｉ−ｍｉＲ−１４５または陰性対照としてのスクランブルプローブと共にインキュベートした。共局在化では、陰性対照としての非免疫アイソタイプＩｇＧ抗体と共に免疫組織化学アッセイを用いて同一サンプルでα−アクチンを検出した。画像は×２００の倍率、スケールバー＝５０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、部分的には、ｍｉＲ−１４５の発現および機能が肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の発症に決定的な役割を果たすという驚くべき発見に基づく。本発明者らは、ｍｉＲ−１４５が慢性低酸素に対する反応によりマウスにおいて有意にアップレギュレートされることおよびｍｉＲ−１４５の遺伝子的または薬理学的な阻害がマウスにおいてＰＡＨの発症を防ぐことを示した。ヒト組織において、本発明者らは、対照と比較してＢＭＰＲ２遺伝子に変異を有するＰＡＨ患者から取得した肺組織および単離肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）におけるｐｒｅ−ｍｉＲ−１４５および成熟型ｍｉＲ−１４５の増加を報告する。したがって、本発明は、ＰＡＨの治療的介入のための新しい標的としてｍｉＲ−１４５を提供する。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ−１４５の発現および／または活性の阻害剤を対象に投与することを含む、肺高血圧とくにＰＡＨの治療または予防を必要とする対象において肺高血圧とくにＰＡＨを治療または予防する方法を提供する。肺高血圧は、肺内の肺動脈が狭窄、遮断、または損傷して動脈圧の増加を引き起こしたときに生じる。右室に高い負荷がかかると、心筋に歪みを生じて心不全になる可能性がある。ＰＡＨの症状としては、初期運動時および最終的休息時の息切れ、疲労、眩暈、または失神の発作、胸部圧迫感または疼痛、下肢（足首および脚）および腹の腫脹、皮膚および口唇に青み、ならびに脈拍亢進または心臓動悸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、治療を受けていない対象と比較して、ＰＡＨに罹患している対象において、ｍｉＲ−１４５阻害剤の投与後、前述の症状の１つ以上が改善もしくは解消されるか、またはＰＡＨの発症が遅延される。いくつかの実施形態において、対象における右室収縮期圧は、ｍｉＲ−１４５阻害剤の投与後、低減される。
【００１５】
本発明に係る方法により治療可能な肺高血圧の型としては、特発性ＰＡＨ、遺伝性または家族性ＰＡＨ、および二次性肺高血圧（たとえば、肺塞栓、肺気腫、肺線維症、および先天性心疾患から生じる高血圧）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。家族性または遺伝性のＰＡＨの型は、特定の遺伝子の変異に関連付けられてきた。たとえば、遺伝性のＰＡＨの型を有する患者の７０％は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）２型レセプター（ＢＭＰＲ２）をコードする遺伝子に変異を有する（Morrell et al., 2001）。したがって、いくつかの実施形態において、本発明に係る方法により治療される対象は、ＰＡＨを発症するリスクがある。一実施形態において、リスクのある対象（たとえばヒト）は、ＢＭＰＲ２をコードする遺伝子に変異を有する。
【００１６】
本明細書で用いられる場合、「対象」または「患者」という用語は、ヒトおよび他の霊長動物（たとえば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル類）、家畜（たとえば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）、家畜哺乳動物（たとえば、イヌおよびネコ）、実験動物（たとえば、マウス、ラット、モルモットなどの齧歯動物）、ならびにトリ（たとえば、家禽、野鳥、および猟鳥、たとえば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他のジュンケイ類のトリ、アヒル、ガチョウなど）を含めて（ただし、これらに限定されるものではない）、任意の脊椎動物を意味する。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。他の実施形態において、対象はヒトである。
【００１７】
ｍｉＲ−１４５は、ｍｉＲ−１４３とクラスターをなしてネズミ１８番染色体上およびヒト５番染色体上の遺伝子間領域に位置する。互いに相同性を有していないｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−１４３は、単一の転写物として共転写される。ｍｉＲ−１４５のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、成熟配列およびスター（すなわちマイナー）配列にプロセシングされる。スター配列は、ステムループ構造の他のアームからプロセシングされる。マウスおよびヒトのｍｉＲ−１４５のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列（たとえば、ステムループ配列）、成熟配列、およびスター配列を以下に与える。
【化１】
0006049700.tif 000002
【００１８】
以上の配列は、リボ核酸配列またはデオキシリボ核酸配列または両者の組合せ（すなわちリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含む核酸）のいずれかであり得る。本明細書に記載の配列のいずれか１つを含む核酸は、ＤＮＡ配列に対してはウリジン塩基の代わりにチミジン塩基を、およびＲＮＡ配列に対してはチミジン塩基の代わりにウリジン塩基を有するものとみなされる。
【００１９】
本発明に係る方法で使用するのに好適なｍｉＲ−１４５の発現または活性の阻害剤としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、合成リボザイム、またはアプタマーが挙げられる。特定の実施形態において、ｍｉＲ−１４５の阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはそれらの組合せを含み得る。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾（たとえば、糖または骨格修飾）を有する。たとえば、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＳＮを含有するオリゴヌクレオチドとその相補的マイクロＲＮＡ標的鎖との間で形成される複合体に増強された熱安定性を付与する１つ以上の「コンフォメーション拘束型」または二環式の糖ヌクレオシド修飾（ＢＳＮ）を含み得る。たとえば、一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの「ロックド核酸」を含有する。ロックド核酸（ＬＮＡ）は、リボース糖部分が「ロックド」コンフォメーションをとる２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボヌクレオシド（構造Ａ）を含有する。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’，４’−Ｃ−架橋２’デオキシリボヌクレオシド（ｃＤＮＡ、構造Ｂ）を含有する。たとえば、米国特許第６，４０３，５６６号およびWang et al. (1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 9: 1147-1150（その両方ともその全体を参照により本明細書に援用する）を参照されたい。さらに他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、構造Ｃで示される構造を有する少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含有する。ｍｉＲ−１４５を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＳＮ（ＬＮＡ、ｃＤＮＡなど）または他の修飾ヌクレオチド、リボヌクレオチド、もしくはデオキシリボヌクレオチドの組合せを含有することが可能である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−１４５を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオチドの組合せを含む。
【化２】
0006049700.tif 000003
【００２０】
他の選択肢として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖−リン酸骨格ではなくペプチド系骨格を含有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドへの他の修飾糖またはホスホジエステル修飾も利用可能であると考えられる。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが含有し得る他の化学修飾としては、糖修飾、たとえば、２’−Ｏ−アルキル（たとえば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ、および４’チオ修飾、ならびに骨格修飾、たとえば、１つ以上のホスホロチオエートリンケージ、モルホリノカルボキシレートリンケージ、またはホスホノカルボキシレートリンケージ（たとえば、米国特許第６，６９３，１８７号および同第７，０６７，６４１号（それらの全体を参照により本明細書に援用する）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、完全なホスホロチオエートリンケージ骨格を含む。一実施形態において、ｍｉ−１４５を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各塩基上に２’Ｏ−メチル糖修飾を含有し、ホスホロチオエートリンケージにより結合される。アンチセンスオリゴヌクレオチド、特定的には、より短い長さ（たとえば１５ヌクレオチド未満）のものは、１つ以上の親和性促進修飾、たとえば、ＬＮＡ、二環式ヌクレオシド、ホスホノホルメート、２’Ｏ−アルキル修飾などを含み得るが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’末端および３’末端の両方に２’−Ｏ−メトキシエチル修飾リボヌクレオチドを含有し、その中心に少なくとも１０デオキシリボヌクレオチドを有する２’−Ｏ−メトキシエチル「ギャップマー」である。この「ギャップマー」は、ＲＮＡ標的のＲＮａｓｅ  Ｈ依存的分解機序を開始可能である。安定性を向上させかつ有効性を改善するアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾、たとえば、米国特許第６，８３８，２８３号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載のものは、当技術分野で公知であり、本発明の方法で使用するのに好適である。たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達および安定性を向上させるために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、コレステロール部分などのステロイド、ビタミン、脂肪酸、炭水化物もしくはグリコシド、ペプチド、または他の小分子リガンドに、その３’末端でリンケージさせることが可能である。
【００２１】
ｍｉＲＮＡの活性の抑制に有用な好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５〜約２５ヌクレオチド長、約１０〜約３０ヌクレオチド長、または約２０〜約２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｍｉＲ−１４５を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約８〜１８約ヌクレオチド長、約１２〜約１６ヌクレオチド長、約１０〜約１４ヌクレオチド長、または約１１〜約１５ヌクレオチド長である。ｍｉＲ−１４５に相補的な８ｍｅｒ以上のものを使用することが可能である。
【００２２】
たとえば、一実施形態において、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＡＧＧＧＡＵＵＣＣＵＧＧＧＡＡＡＡＣＵＧＧＡＣ−３’（配列番号７）の配列を有する。他の実施形態において、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＣＣＵＧＧＧＡＡＡＡＣＵＧＧＡＣ−３’（配列番号８）の配列を有する。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＵＧＧＧＡＡＡＡＣＵＧＧＡＣ−３’（配列番号９）の配列を有する。他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＧＧＡＡＡＡＣＵＧＧＡＣ−３’（配列番号１０）の配列を有する。さらに他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＡＡＡＡＣＵＧＧＡＣ−３’（配列番号１１）の配列を有する。さらに他の実施形態において、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＡＡＣＵＧＧＡＣ−３’（配列番号１２）の配列を有する。本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟またはマイナー（すなわちスター）ｍｉＲ−１４５配列に少なくとも部分的に相補的な配列、たとえば、成熟またはマイナー（すなわちスター）ｍｉＲ−１４５配列（たとえば、配列番号１または配列番号２）に少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的な配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟またはマイナーｍｉＲ−１４５配列に実質的に相補的でありうる。すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的でありうる。一実施形態において、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟またはマイナーｍｉＲ−１４５配列に１００％相補的な配列を含む。特定の実施形態において、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１に少なくとも部分的に相補的である。他の実施形態において、本アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２に少なくとも部分的に相補的である。
【００２３】
アンチセンスは、ｍｉＲに部分的にまたは完全に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドａｎｔｉｍｉＲであり得る。ａｎｔｉｍｉＲは、配列番号７〜１２の配列を含むかまたは有するものなどのように、ｍｉＲＮＡの５’末端に相補的であり得るし、ｍｉＲＮＡの完全相補的配列にわたりプロセシングされたものであり得る。ａｎｔｉｍｉＲは、成熟またはマイナー（すなわちスター）ｍｉＲ−１４５配列に少なくとも部分的に相補的な配列、たとえば、成熟またはマイナー（すなわちスター）ｍｉＲ−１４５配列（たとえば、配列番号１または配列番号２）に少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的な配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ａｎｔｉｍｉＲは、成熟またはマイナーｍｉＲ−１４５配列に実質的に相補的であり得る。すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的であり得る。一実施形態において、ａｎｔｉｍｉＲは、成熟またはマイナーｍｉＲ−１４５配列に１００％相補的な配列を含む。特定の実施形態において、ａｎｔｉｍｉＲは、配列番号１に少なくとも部分的に相補的である。他の実施形態において、ａｎｔｉｍｉＲは、配列番号２に少なくとも部分的に相補的である。
【００２４】
ａｎｔｉｍｉＲは、約５〜約２５ヌクレオチド長、約１０〜約３０ヌクレオチド長、または約２０〜約２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｍｉＲ−１４５を標的とするａｎｔｉｍｉＲは、約８〜１８約ヌクレオチド長、約１２〜約１６ヌクレオチド長、約１０〜約１４ヌクレオチド長、または約１１〜約１５ヌクレオチド長である。一実施形態において、ａｎｔｉｍｉＲは、約１６ヌクレオチド長である。ａｎｔｉｍｉＲは、完全にもしくは部分的にホスホロチオレート化され得るか、またはホスホロチオレート化され得ない。一実施形態において、ａｎｔｉｍｉＲは、ＬＮＡ  ａｎｔｉｍｉＲである。一実施形態において、ａｎｔｉｍｉＲは、成熟ｍｉＲ−１４５の塩基２〜１７を標的とする。たとえば、ａｎｔｉｍｉＲは、５’−ＵＣＣＵＧＧＧＡＡＡＡＣＵＧＧＡ−３’（配列番号１３）の配列を有し得る。一実施形態において、ａｎｔｉｍｉＲは、配列番号１３で示される配列を有し、かつ完全にホスホロチオレート化される。さらに他の実施形態において、配列番号１３で示される配列を有するａｎｔｉｍｉＲは、ＬＮＡ  ａｎｔｉｍｉＲである。配列番号１３で示される配列を有するａｎｔｉｍｉＲは、ＬＮＡとＤＮＡとの混合物であり得る。さらに他の実施形態において、配列番号１３で示される配列を有するａｎｔｉｍｉＲは、完全にホスホロチオレート化されたＬＮＡ  ａｎｔｉｍｉＲである。
【００２５】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンタゴｍｉｒである。「アンタゴｍｉｒ」とは、ｍｉＲ−１４５配列に少なくとも部分的に相補的な一本鎖化学修飾リボヌクレオチドのことである。アンタゴｍｉｒは、２’−Ｏ−メチル糖修飾などの１つ以上修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、アンタゴｍｉｒは、修飾ヌクレオチドのみを含む。アンタゴｍｉｒはまた、部分的または完全なホスホロチオエート骨格を生じる１つ以上のホスホロチオエートリンケージを含み得る。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達および安定性を向上させるために、アンタゴｍｉｒをその３’末端でコレステロールまたは他の部分にリンケージ可能である。ｍｉＲ−１４５を阻害するのに好適なアンタゴｍｉｒは、約１５〜５０約ヌクレオチド長、約１８〜約３０ヌクレオチド長、約２０〜約２５ヌクレオチド長、または約１０〜約１４ヌクレオチド長で得る。アンタゴｍｉｒは、成熟またはマイナーｍｉＲ−１４５配列に少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的であり得る。いくつかの実施形態では、アンタゴｍｉｒは、成熟またはマイナーｍｉＲ−１４５配列に実質的に相補的、すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的であり得る。他の実施形態では、アンタゴｍｉｒは、成熟またはマイナーｍｉＲ−１４５配列に１００％相補的である。
【００２６】
本明細書に記載の阻害ヌクレオチド分子は、好ましくは、ｍｉＲ−１４５（配列番号１）の成熟配列を標的とする。一実施形態において、本明細書に記載の阻害ヌクレオチド分子は、ｍｉＲ−１４５のマイナー（すなわちスター）配列（配列番号２）を標的とする。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−１４５の阻害剤は、成熟またはマイナーｍｉＲ−１４５配列に完全に相補的な配列を含むアンタゴｍｉｒである。一実施形態において、ｍｉＲ−１４５の阻害剤は、配列番号１に部分的にまたは完全に相補的な配列を有するアンタゴｍｉｒである。他の実施形態において、ｍｉＲ−１４５の阻害剤は、配列番号２に部分的にまたは完全に相補的な配列を有するアンタゴｍｉｒである。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−１４５の阻害剤は、化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一実施形態において、ｍｉＲ−１４５の阻害剤は、配列番号１に実質的に相補的な配列を含む化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の実施形態において、ｍｉＲ−１４５の阻害剤は、配列番号２に実質的に相補的な配列を含む化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書で用いられる場合、「実質的に相補的」とは、標的ポリヌクレオチド配列（たとえば、成熟、マイナー、または前駆体ｍｉＲＮＡ配列）に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的な配列を意味する。
【００２７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンタゴｍｉｒは、ｍｉＲ−１４５に対する前駆体ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）または初期ｍｉＲＮＡ配列（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）に実質的に相補的な配列を含み得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１４５配列のステムループ領域の外側に位置する配列に実質的に相補的な配列を含む。一実施形態において、ｍｉＲ−１４５機能の阻害剤は、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１４５配列（配列番号３）に実質的に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２８】
本明細書に記載のｍｉＲ−１４５の阻害剤はいずれも、ｍｉＲ−１４５阻害剤をコードする発現ベクターを細胞に配達することにより、標的細胞（たとえば平滑筋細胞）に配達可能である。「ベクター」は、細胞の内部に関心対象の核酸を送達するために使用可能な物質組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含めて（ただし、これらに限定されるものではない）、多くのベクターが当技術分野で公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。発現コンストラクトは、生存細胞中で複製可能であるか、または、それは合成で作製可能である。本出願の目的では、「発現コンストラクト」、「発現ベクター」、および「ベクター」という用語は、一般的な例示的な意味で本発明の用途を示すべく同義的に用いられ、本発明を限定しようとするものではない。
【００２９】
一実施形態では、ｍｉＲ−１４５の阻害剤を発現するための発現ベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み、発現されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、ｍｉＲ−１４５の成熟またはマイナー配列（たとえば、配列番号１または配列番号２）に部分的にまたは完全に相補的である。本明細書で用いられる「機能可能に連結された」または「転写制御下で」という表現は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御すべく、ポリヌクレオチドに対して適正な位置および向きであることを意味する。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、「プロモーター」とは、細胞の合成系または導入された合成系により認識され、遺伝子の特定の転写を開始するのに必要とされるＤＮＡ配列を意味する。好適なプロモーターとしては、ＲＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ、およびウイルスプロモーター（たとえば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス長末端反復）が含まれるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。とくに興味深いのは、血管特異的プロモーター、より特定的にはα平滑筋アクチンプロモーターなどの平滑筋特異的プロモーターである。他の好適なプロモーターとしては、ミオシン軽鎖−２プロモーター（Franz et al. (1994) Cardioscience, Vol. 5(4):235-43、Kelly et al. (1995) J. Cell Biol, Vol. 129(2):383-396）、αアクチンプロモーター（Moss et al. (1996) Biol. Chem., Vol. 271(49):31688-31694）、トロポニン１プロモーター（Bhavsar et al. (1996) Genomics, Vol. 35(1): 11-23）、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体プロモーター（Barnes et al. (1997) J. Biol. Chem., Vol. 272(17): 11510- 11517）、ジストロフィンプロモーター（Kimura et al. (1997) Dev. Growth Differ., Vol. 39(3):257-265）、α７インテグリンプロモーター（Ziober and Kramer (1996) J. Bio. Chem., Vol. 271(37):22915-22）、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーター（LaPointe et al. (1996) Hypertension, Vol. 27(3 Pt 2):715-22）、およびαＢ−クリスタリン／低分子熱ショックタンパク質プロモーター（Gopal-Srivastava (1995) J. Mol. Cell. Biol., Vol. 15(12):7081-7090）、αミオシン重鎖プロモーター（Yamauchi-Takihara et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86(10):3504-3508）、ならびにＡＮＦプロモーター（LaPointe et al. (1988) J. Biol. Chem., Vol. 263(19):9075-9078）が挙げられる。
【００３１】
特定の実施形態において、ｍｉＲ−１４５阻害剤をコードするポリヌクレオチドに機能可能にリンケージされたプロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは当技術分野で公知であり、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーター、および誘導マウス乳腺腫瘍ウィルスＬＴＲが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
細胞に発現コンストラクトおよび核酸を送達する方法は、当技術分野で公知であり、たとえば、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、ポリアミントランスフェクション試薬を利用するトランスフェクション、細胞超音波処理、高速度マイクロプロジェクタイルを使用する遺伝子衝撃およびレセプター媒介トランスフェクションを含み得る。
【００３３】
本発明はまた、治療後、ｍｉＲ−１４５阻害剤を捕捉または除去する方法を包含する。本方法は、肺組織においてｍｉＲ−１４５阻害剤に対する結合部位を過剰発現することを含み得る。結合部位領域は、好ましくは、ｍｉＲ−１４５のシード領域の配列を含有する。シード領域は、標的認識に重要な塩基２〜８にわたるｍｉＲＮＡの５’部分である。いくつかの実施形態において、結合部位は、ｍｉＲ−１４５の１つ以上の標的の３’ＵＴＲからの配列、たとえば、ＫＬＦ４、ＫＬＦ−５、Ｓｒｇａｐ１、およびＳｒｇａｐ２を含有し得る。
【００３４】
本発明はまた、ｍｉＲ−１４５の阻害剤を含む医薬組成物を包含する。臨床用途を想定する場合、医薬組成物は、目的の用途に適合する形態で調製されるであろう。一般に、これは、発熱原およびヒトまたは動物に有害となり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを包含する。
【００３５】
一実施形態において、医薬組成物は、有効用量のｍｉＲ−１４５阻害剤と薬学的に許容可能な担体とを含む。たとえば、医薬組成物は、本明細書に記載のｍｉＲ−１４５を標的とする有効用量の修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択された配列を有する修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態において、医薬組成物は、有効用量の合成アンチセンスオリゴヌクレオチド、たとえば、配列番号１３で示される配列を有するａｎｔｉｍｉＲを含む。一実施形態において、医薬組成物は、完全にホスホロチオレート化された配列番号１３を有する有効用量のａｎｔｉｍｉＲを含む。さらに他の実施形態において、医薬組成物は、配列番号１３を有する有効用量のＬＮＡ  ａｎｔｉｍｉＲを含み、ａｎｔｉｍｉＲは、完全にホスホロチオレート化される。
【００３６】
「有効用量」とは、有利または所望の臨床結果を得るのに十分な量のことである。本発明に係るｍｉＲＮＡ阻害剤の有効用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇであり得る。何が有効用量とみなされるのかの正確な決定は、背格好、年齢、肺動脈高血圧のタイプおよび重症度、ならびに阻害剤の性質（たとえば、アンタゴｍｉｒ、発現コンストラクト、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）を含めて、各患者それぞれの因子に基づき得る。したがって、投与量は、本開示および当技術分野の知識から、当業者であれば容易に確認可能である。
【００３７】
ｍｉＲ−１４５機能のオリゴヌクレオチド阻害剤のためのまたは特定のｍｉＲＮＡ阻害剤を発現するコンストラクトのための送達媒体として、コロイド分散系、たとえば、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質ベース系、たとえば、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソームなどを使用してもよい。特定の実施形態において、ｍｉＲ−１４５阻害剤は、肺送達に供すべく製剤化される。本明細書で用いられる場合、「肺送達」または「呼吸送達」とは、口または鼻を介した肺内への吸入による対象へのｍｉＲ−１４５阻害剤の送達を意味する。たとえば、ｍｉＲ−１４５阻害剤は、ネブライザー用に嗅剤、エアロゾル剤、溶液剤として、または吹送用にマイクロ微粉末剤として、製剤化可能である。ｍｉＲ−１４５阻害剤が乾燥粉末剤として製剤化されるいくつかの実施態様において、活性化合物の粒子は、好適には５０ミクロン未満、好ましくは１０ミクロン未満、たとえば、１〜５ミクロンまたは２〜５ミクロンの直径を有する。
【００３８】
送達媒体を安定状態にして標的細胞による取込みを可能にすべく、一般的には、適切な塩および緩衝液を利用することが望まれるであろう。本発明に係る水性組成物は、薬学的に許容可能な担体または水性媒体中に溶解または分散された阻害剤ポリヌクレオチドを含む有効量の送達媒体（たとえば、リポソームまたは他の複合体または発現ベクター）を含む。「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」という表現は、動物またはヒトに投与したときに、有害反応、アレルギー反応、または他の不利な反応を引き起こさない分子体および組成物を意味する。本明細書で用いられる場合、「製薬上許容される担体」には、医薬、たとえばヒトへの投与に好適な医薬の製剤化での使用が許容される溶媒、緩衝剤、溶液剤、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗菌類剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。医薬活性物質用のそのような媒体および作用剤の使用は、当業界で周知である。いかなるの従来の媒体または作用剤の場合にもそれが本発明に係る活性成分と不適合でないかぎり、治療組成物でのその使用が可能であると考えられる。組成物のベクターやポリヌクレオチドを不活性化しないかぎり、補助的活性成分もまた、組成物中に組込み可能である。
【００３９】
本発明に係る活性組成物は、伝統的な医薬製剤を含み得る。本発明に係るこれらの組成物の投与は、標的組織を利用可能な経路であるかぎり、任意の通常経路を介して行い得る。これは、経口、経鼻、または頬腔内を含む。他の選択肢として、投与は、真皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、または静脈内への注射により行い得る。特定の実施形態において、ｍｉＲ−１４５阻害物を含む医薬組成物は、吸入により投与される。ｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡ阻害剤を含む発現コンストラクトを含む医薬組成物はまた、カテーテルシステムまたは心臓および肺に治療剤を送達するために冠循環／肺循環を分離するシステムにより投与可能である。心臓および冠血管系に治療剤を送達するための種々のカテーテルシステムは、当業界で公知である。本発明で使用するのに好適なカテーテルに基づく送達法または冠脈分離法のいくつかの例（これらに限定されるものではない）は、米国特許第６，４１６，５１０号、米国特許第６，７１６，１９６号、米国特許第６，９５３，４６６号、国際公開第２００５／０８２４４０号、国際公開第２００６／０８９３４０号、米国特許出願公開第２００７／０２０３４４５号、米国特許出願公開第２００６／０１４８７４２号および米国特許出願公開第２００７／００６０９０７号（それらはすべて、それらの全体を参照により本明細書に援用する）に開示されている。そのような組成物は、本明細書で説明した製薬上許容される組成物として通常投与されるであろう。
【００４０】
活性化合物はまた、非経口投与または腹腔内投与が可能である。例として、遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水中に調製可能である。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、ならびに油に導入して、ディスパージョン剤を調製することもできる。通常の貯蔵条件下および使用条件下では、こうした調製物は、微生物の増殖を防止するために一般的には保存剤を含有する。
【００４１】
注入使用、カテーテル送達、または吸入送達に好適な医薬製剤としては、たとえば、無菌の水性の溶液剤またはディスパージョン剤および無菌の注入用の溶液または分散液を即時調製するための無菌の粉末剤が挙げられる（たとえば、エアロゾル剤、ネブライザー溶液剤）。一般的には、これらの製剤は、無菌であり、容易な注入またはエアロゾル化ネブライゼーションが行える程度に流動性である。製剤は、製造条件下および貯蔵条件下で安定でなければならず、かつ細菌や菌類などの微生物の汚染作用を受けないように貯蔵されなければならない。適切な溶媒または分散媒体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、ならびに植物油を含有することができる。適正な流動性は、たとえば、レシチンなどのようなコーティング剤を用いることにより、ディスパージョン剤の場合には所要の粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤を用いることにより、維持することができる。微生物の活動の防止は、種々の抗細菌剤および抗菌類剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより行うことが可能である。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖または塩化ナトリウムを組み込むことが好ましいであろう。吸収を遅らせる作用剤、たとえば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを組成物で使用することにより、注入用組成物を長期間にわたり吸収させるようにすることが可能である。
【００４２】
滅菌注射用溶液剤は、適切な量の活性化合物を、所望により任意の他の成分（たとえば、以上に列挙したもの）と共に、溶媒中に組み込んでから、濾過滅菌を行うことにより、調製可能である。一般的には、ディスパージョン剤は、基剤としての分散媒と所望の他の成分（たとえば、以上に列挙したもの）とを含有する滅菌媒体中に種々の無菌の活性成分を導入することにより調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望の成分とよりなる粉末を事前に滅菌濾過されたその溶液から生成する真空乾燥技術および凍結乾燥技術を含む。いくつかの実施形態において、滅菌粉末剤は、たとえば、インサフレーターまたは吸入装置を介して、対象に直接投与可能である（すなわち、希釈剤による再構成を行わない）。
【００４３】
本発明に係る組成物は、中性形または塩形で製剤化可能である。薬学的に許容可能な塩としては、たとえば、無機酸（たとえば塩酸もしくはリン酸）から、または有機酸（たとえば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）から誘導される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が含まれる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩もまた、無機塩基（たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは第二鉄の水酸化物）、または有機塩基（たとえば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン）から、誘導可能である。
【００４４】
製剤化後、溶液剤は、好ましくは、投与処方に適合し得る形でかつ治療上有効な量で投与される。製剤は、注入用溶液剤、薬剤放出カプセル剤、吸入剤などのようなさまざまな剤形で容易に投与することができる。たとえば水溶液の状態で非経口投与に供する場合、一般的には、溶液を適切に緩衝化し、かつたとえば十分な生理食塩水またはグルコースを用いて最初に液体希釈液を等張化する。そのような水性溶液は、たとえば、静脈内、筋肉内、皮下、動脈内、および腹腔内への投与に使用することができる。好ましくは、当業者に公知のように、特定的には本開示に照らして、無菌の水性媒体が利用される。例として、１回の投与量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解させて、１０００ｍｌの皮下注入液に添加するかまたは提案された注入部位に注入することが可能である（たとえば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照されたい）。治療される対象の病状に依存して投与量のいくらかの変更を生じることは避けられないであろう。いずれにせよ、投与の責任者が個々の対象に対して適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、FDA Office of Biologics基準に規定された、無菌性、発熱原性、ならびに一般的安全性および純度の基準を満たさなければならない。
【００４５】
本発明の他の実施形態において、ｍｉＲ−１４５の阻害剤は、他の治療剤、たとえば、ＰＡＨを阻害する他の作用剤と組み合わせて使用される。併用治療の例としては、以上のものがいずれも含まれる。組合せは、両方の作用剤を含む単一の組成物もしくは薬理学的製剤を用いて、または一方の組成物がｍｉＲ−１４５阻害剤および他の作用剤を含む２つの個別の組成物もしくは製剤を同時に用いて、達成され得る。他の選択肢として、ｍｉＲ−１４５阻害剤を用いた治療は、他の作用剤の投与前または投与後、数分間〜数週間の範囲内の間隔で行い得る。他の作用剤およびｍｉＲ−１４５阻害剤が細胞に別々に適用されるいくつかの実施態様において、一般的には、作用剤およびｍｉＲ−１４５阻害剤が細胞に対して依然として有利な組合せ効果を及ぼし得るように、各送達の時間の間で有意な期間が経たないことが保証されるであろう。そのような場合、典型的には、互いに約１２〜２４時間以内で、互いに約６〜１２時間以内で、または約１２時間だけ遅延時間をもたせて、細胞と両方の治療剤とを接触させるであろうと考えられる。いくつかの状況で、治療期間を有意に延長することが望ましいこともあるが、その場合、それぞれの投与間で数日間（２、３、４、５、６、または７）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）の経過期間をとる。
【００４６】
一実施形態において、ｍｉＲ−１４５阻害剤または他の作用剤の１回超の投与が望まれるであろう。これに関連して、種々の組合せを利用し得る。例としてｍｉＲ−１４５阻害剤が「Ａ」でありかつ他の作用剤が「Ｂ」である場合、合計３回および４回の投与に基づく次の入替え、すなわち、Ａ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ａ、Ａ／Ｂ  Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ、Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ、Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ、Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ、Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂが例として提供される。他の組合せも同様に考えられる。他の作用剤および治療剤の特定例を以下に提供する。
【００４７】
本発明の一実施形態において、必要とされる対象においてＰＡＨを抑制、予防、または治療する方法は、ｍｉＲ−１４５阻害剤、たとえば、本明細書に記載のａｎｔｉｍｉＲ−１４５と、ＰＡＨを抑制、予防、または治療するする第２の作用剤と、１種以上の追加の作用剤とを、対象に投与することを含む。一実施形態において、異なるｍｉＲ−１４５阻害剤の組合せ、たとえば、本明細書に記載のａｎｔｉｍｉＲ−１４５とｍｉＲ−１４５の小分子阻害剤との組合せが投与される。
【００４８】
一実施形態において、追加のまたは他の作用剤は、ｍｉＲ−２０４のアゴニストである。ヒトｍｉＲ−２０４−５ｐ配列は、５’−ＵＵＣＣＣＵＵＵＧＵＣＡＵＣＣＵＡＵＧＣＣＵ−３’（配列番号１５）である。ヒトｍｉＲ−２０４−３ｐ配列は、５’−ＧＣＵＧＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧＡＣＧＵ−３’（配列番号１６）である。ｍｉＲ−２０４のアゴニストは、成熟ｍｉＲ−２０４配列を含むポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−２０４に対するｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列の配列を含む。成熟ｍｉＲ−２０４、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０４、またはｐｒｉ−ｍｉＲ−２０４配列を含むポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。一実施形態において、ｍｉＲ−２０４アゴニストは、約１５〜約５０ヌクレオチド長、約１８〜約３０ヌクレオチド長、約２０〜約２５ヌクレオチド長、または約１０〜約１４ヌクレオチド長であり得る。ｍｉＲ−２０４アゴニストは、ｍｉＲ−２０４の成熟、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列に少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。一実施形態において、ｍｉＲ−２０４アゴニストは、配列番号１５または１６で示される配列を有する。ポリヌクレオチドであるｍｉＲ２０４アゴニストは、１つ以上の化学修飾、たとえば、ロックド核酸、ペプチド核酸、糖修飾、たとえば、２’−Ｏ−アルキル（たとえば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）修飾、２’−フルオロ修飾、および４’チオ修飾、ならびに１つ以上の骨格修飾、たとえば、ホスホロチオエートリンケージ、モルホリノカルボキシレートリンケージ、またはホスホノカルボキシレートリンケージを含有する。一実施形態において、ｍｉＲ−２０４配列を含むポリヌクレオチドは、コレステロールにコンジュゲートされる。ｍｉＲ−２０４配列を含むポリヌクレオチドは、以上に記載したように、ベクターからｖｉｖｏで発現可能あり、かつ／またはプロモーターに機能可能にリンケージ可能である。
【００４９】
他の実施形態において、ｍｉＲ−２０４のアゴニストは、ｍｉＲ−２０４の機能を増大、追加、または置き換えるように作用するｍｉＲ−２０４とは異なる作用剤であり得る。たとえば、ＰＤＧＦ、エンドセリン−１、アンギオテンシンＩＩ、およびＳＴＡＴ３の発現または活性を阻害する作用剤は、ＰＡＨを治療、予防、または予防するために、ｍｉＲ−１４５阻害剤と組み合わせて使用可能である。作用剤は、ポリペプチド、ペプチド、小有機分子、関心対象のポリペプチドをコードする核酸などの形態で送達され得る。ポリペプチドは、サイズおよびグリコシル化にかかわらず、核酸の任意の翻訳産物であり得る。作用剤はまた、単純な薬剤、ペプチド、ペプチド断片、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、核酸とペプチドもしくはペプチド断片との工学操作されたハイブリッド、またはそれぞれの誘導体の形態をとり得る。
【００５０】
ＰＡＨを治療、予防、または予防するための組合せはまた、ｍｉＲ−１４５阻害剤とエポプロステノール（これらに限定されるものではない）などの血管拡張剤とを含み得る。ｍｉＲ−１４５阻害剤と共に使用可能な他の作用剤としては、エンドセリンレセプターアンタゴニスト、たとえば、ボセンタン、シタキセンタン、およびアンブリセンタン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、たとえば、５型ホスホジエステラーゼ阻害剤、シルデナフィル、およびタダラフィル、カルシウムチャネルブロッカー、たとえば、アムロジピン、ジルチアゼム、およびニフェジピン、プロスタグランジン、たとえば、トレプロスチニル、イロプロスト、およびベラプロスト、二硝酸イソソルビド、ならびにグアニル酸シクラーゼアクチベーター、たとえば、シナシグアトおよびリオシグアトが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
抗凝固剤またはトロンビンをブロックもしくは阻害する化合物、たとえば、ワルファリンおよびトリペプチドモチーフＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇに基づく化合物、たとえば、ＬＹ２８７０４５などもまた、使用可能である。イノガトランやメラガトランなどの多くの化合物は、当技術分野で公知であり、これらもまた使用可能である。例として、とくに、米国特許第６，３２６，３８６号、同第６，２３２，３１５号、同第６，２０１，００６号、同第６，１７４，８５５号、同第６，０６０，４５１号、および同第５，９８５，８３３号を参照されたい。ただし、これらに限定されるものではない。
【００５２】
ｍｉＲ−１４５阻害剤と共に使用可能な追加の作用剤としては、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、ニコチンレセプターアゴニスト、一酸化窒素の濃度を増大させる作用剤、抗血管新生剤、ＴＧＦ−βレセプターのアゴニスト、およびデスドメインレセプターリガンドが挙げられる。
【００５３】
ＰＡＨを治療、予防、または予防するために同様にｍｉＲ−１４５阻害剤と組み合わせて使用可能なアンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ−Ｉ）としては、カプトプリル、ベナゼプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、キナプリル、ラミプリル、イミダプリル、ペリンドプリル、エルブミン、およびトランドラプリルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、ＡＣＥ阻害剤の代わりにまたはそれに加えて、ＡＣＥレセプターブロッカーを使用してもよく、こうしたものとしては、ロサルタン、イルベサルタン、カンデサルタン、シレキセチル、およびバルサルタンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
ニコチンレセプターアゴニスト、たとえば、ニコチン（Ｓ−３−（１−メチル−２−ピロリジニル）ピリジン）およびニコチンレセプターに実質的に特異的に結合して薬理学的効果を提供する他の化合物もまた、ＰＡＨを治療、予防、または予防するために、ｍｉＲ−１４５阻害剤と組み合わせて使用可能である。ニコチンレセプターアゴニストは、天然に存在する化合物（限定されるものではないが、小分子、ポリペプチド、ペプチド、たとえば、天然に存在する植物アルカロイドが挙げられる）、内因性リガンド（たとえば、天然源から精製されるか、組換え産生されるか、または合成されるものであり、さらにはそのような内因性リガンドの誘導体および変異体が含まれる）、および合成により生成される化合物（たとえば、小分子、ペプチドなど）を包含する。「ニコチン」という用語は、ニコチンに類似した薬剤治療性を呈する、ニコチンの薬理学的に許容可能な任意の誘導体または代謝物をさらに含む。そのような誘導体、代謝物、および代謝物の誘導体は、当技術分野で公知であり、コチニン、ノルコチニン、ノルニコチン、ニコチンＮ−オキシド、コチニンＮ−オキシド、３−ヒドロキシコチニン、および５−ヒドロキシコチニン、またはそれらの薬学的に許容可能な塩を含むが、必ずしもそれらに限定されるものではない。
【００５５】
ＰＡＨを治療、予防、または予防するために、一酸化窒素を増加させる１種以上の作用剤と共に、ｍｉＲ−１４５阻害剤を使用することも可能である。一酸化窒素増加剤の例としては、Ｓ−ニトロソペニシラミン、ニトロプルシドナトリウム、Ｎ−エチル−２−（１−エチル２−ヒドロキシ−２−ニトロソヒドラジノ）エタンアミン（ＮＯＣ１２）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一酸化窒素の生成はまた、サイトカイン、たとえば、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびエンドトキシンにより、一酸化窒素シンターゼ酵素に対するそれらの効果に基づいて、調節され得る。誘導型のＮＯシンターゼは、サイトカインにより増加され、構成性型のものは、サイトカインにより低減されるように思われる。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、Liaoらの米国特許第６，１４７，１０９号に記載されるように、内皮細胞ＮＯＳ活性をアップレギュレートすることが見いだされた。一酸化窒素シンターゼはいずれの型のものでも、タンパク質もしくはそれから得られる活性断片としてまたは発現用のＤＮＡコンストラクトとして、利用可能である。
【００５６】
ＰＡＨを治療、予防、または予防するために、抗血管新生効果を有する作用剤をｍｉＲ−１４５阻害剤と組み合わせて使用することも可能である。こうしたものとしては、抗血管新生ポリペプチド、すなわち、アンギオスタチン、エンドスタチン、および抗血管新生反トロンビンＩＩＩなどが挙げられ、さらには機能活性なそれらの変異体および誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の抗血管新生剤としては、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤、たとえば、アミホスチン、ＷＲ−１０６５、マリマスタット、プリモマスタット（primomastat）、ａ−１−抗トリプシン、スフィンゴシンなどが挙げられる。
【００５７】
ＴＧＦ−βレセプターのアゴニストもまた、関心対象となる。ＴＧＦ−βレセプターＩ型およびＩＩ型は、ＴＧＦ−βのほとんどの活性を媒介する。リガンドは、ＴＧＦ−βならびにそのミメティクスおよび生物学的活性誘導体を含む。
【００５８】
ｍｉＲ−１４５阻害剤と共に使用するための関心対象となる他の作用剤は、デスドメインまたはそのホモログもしくはオルソログを含む哺乳動物細胞表面レセプターに結合し、かつそのように結合することによりアポトーシスのシグナルを細胞に配達する化合物、通常はポリペプチド化合物であるデスドメインレセプターリガンドを含む。これらのレセプターにより引き起こされる細胞内タンパク質相互作用は、ＴＮＦ−Ｒ１のＣ末端近傍の約８０アミノ酸ドメインに相同的でありかつ細胞傷害性のシグナル伝達に関与するデスドメインの結合相互作用に帰属可能である。ＴＮＦレセプターデスドメインファミリーは、ＴＮＦ−Ｒ１、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＴＲＡＭＰ（ｗｓＩ／Ａｐｏ−３／ＤＲ−３）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ−４）、およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ−５、ＴＲＩＣＫ２、ＫＩＬＬＥＲ）を含む。デスドメインリガンドは、特異的デスドメインレセプターに結合することにより細胞の増殖および分化を制御するタンパク質を含む。これらのリガンドは、ＴＮＦファミリー、たとえば、ＴＮＦ、リンホトキシン、ＣＤ３０リガンド、４−１  ＢＢリガンド、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ２７リガンド、およびＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）、ならびにそれらのホモログおよびアナログを含む。
【００５９】
通常、免疫抑制剤として使用されるが、最近、血管平滑筋細胞の増殖を阻害することが見いだされた、ラパマイシンのアナログ、たとえば、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス、およびエベロリムスもまた、ｍｉＲ−１４５阻害剤と組み合わせて使用され得る。細胞複製の進行にきわめて重要なタンパク質ｃ−ｍｙｃのアンチセンスノックダウンは、動脈壁において細胞増殖を阻害する他の方法であり、ｍｉＲ−１４５阻害剤と組み合わせて使用可能である。
【００６０】
一実施形態において、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤（たとえばRheoPro）を含む、抗血小板剤の共有結合または非共有結合もまた、ｍｉＲ−１４５阻害剤と組み合わせて使用可能であり、関心対象となる。治療剤または酸素治療などの治療もまた、ｍｉＲ−１４５阻害剤の投与と組み合わせて使用可能である。
【００６１】
本発明はまた、肺動脈高血圧を治療または予防するためのキットを包含する。一実施形態において、本キットは、本明細書に記載の少なくとも１種のｍｉＲ−１４５阻害剤と投与デバイスとを含む。特定の実施形態において、投与デバイスは、鼻または口を介してｍｉＲ−１４５阻害剤を肺に配達すべく設計されたデバイスである。たとえば、肺送達に好適な投与デバイスとしては、点滴器、スワブ、エアロゾル発生器、インサフレーター、ネブライザー、インヘラー（たとえば、エアロゾル系定量噴霧式吸入器）、乾燥粉末散布デバイス、および他の肺送達デバイス、たとえば、手動式、ガス推進式、音波駆動式のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−１４５阻害剤は、投与デバイス内に含有される粉末として製剤化される。他の実施形態において、ｍｉＲ−１４５阻害剤は、投与デバイス内に含有される液体エアロゾルとして製剤化される。特定の実施形態において、投与デバイスはインヘラーである。ｍｉＲ−１４５阻害剤が静脈内にまたは動脈内に送達される実施形態では、本キットは、カテーテルまたは他の類似の適切な投与デバイスを含み得る。本キットは、肺高血圧を治療するために有効用量のｍｉＲ−１４５阻害剤を対象に投与のための説明書をさらに含み得る。ある実施形態において、本キットは、以上に記載されるような１種以上の追加の作用剤または治療剤を含む。
【００６２】
以下の追加の実施例により本発明をさらに説明するが、それらに限定されるものとみなしてはならない。当業者であれば、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を加え得ることかつそれにより本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同一もしくは類似の結果が得られることはわかるはずである。
【実施例】
【００６３】
実施例
実施例１。ヒト肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）の初代培養。
既報のように、ＰＡＳＭＣを末梢動脈から外植した（Yang et al., 2005）。ＢＭＰＲ２に変異を有することがわかっている４名のＰＡＨ患者から平滑筋細胞系を取得した。これらには、位置３４７でシステインがアルギニンと置き換わってＢＭＰＲ２のキナーゼドメインに変異を有する１名の患者（Ｃ３４７Ｒ）、ＢＭＰＲ２の細胞質テールにミスセンス変異を有して９０３位でアスパラギンの代わりにセリンが入った１名の患者（Ｎ９０３Ｓ）、アミノ酸位置９に短縮（truncating）変異を有する１名の患者（Ｗ９Ｘ）、およびアミノ酸位置８９９に短縮変異を有する１名の患者（Ｒ８９９Ｘ）が含まれる。さらに３つのＰＡＳＭＣ調製物を非罹患対象から取得した。既報のように細胞を培養した（Yang et al., 2005）。
【００６４】
実施例２。凍結肺ＰＡＳＭＣからのＲＮＡ抽出および逆転写
製造業者の説明書に従ってmiRNeasyキット（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて組織および細胞からの全ＲＮＡを取得し、ゲノムＤＮＡ汚染を排除するためにＤＮＡｓｅ１（増幅グレード、Sigma, St. Louis, MO, USA）で処理し、そしてNanoDrop ND-1000 Spectrophotometer（Nano-Drop Technologies, Wilmington, DE, USA）を用いて定量した。ＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡアッセイプロトコル（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）に従ってステムループ逆転写プライマーを用いて、ｍｉＲＮＡ分析のためのｃＤＮＡを全ＲＮＡから合成した。各反応系には、５０ｎｇの抽出全ＲＮＡ、５０ｎＭのステムループＲＴプライマー、１×ＲＴ緩衝液、各０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、３．３３Ｕ／ｍｌのMultiscribe逆転写酵素、および０．２５Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼ阻害剤が含まれていた。９６ウェルプレート中で、１５ｍｌの反応系を１６℃で３０分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間インキュベートし、次いで、４℃に保持した。Superscript II逆転写酵素（Invitrogen, Paisley, UK）を用いて、全ＲＮＡからｐｒｅｍｉＲＮＡ分析用の全ｃＤＮＡを取得した。各反応系には、１ｍｇの全ＲＮＡ、１×Superscript II緩衝液、１０Ｕ／ｍｌのSuperscript II RT、０．１５ｍｇ／ｍｌのランダムヘキサマープライマー（Invitrogen, Paisley, UK）、１Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅ阻害剤（Promega, Madison, WI, USA）、および各０．２５ｍＭのｄＮＴＰが含まれていた。サイクル条件は、次のとおり、すなわち、２５℃で１０分間、４８℃で３０分間、９５℃で５分間であった。−２０℃でｃＤＮＡを貯蔵した。すべてのｉｎ  ｖｉｖｏグループにわたり安定であるので、ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として選択した。
【００６５】
実施例３。パラフィン包埋ヒト肺からのｍｉＲＮＡ抽出。
ＬＲＥＣおよびＨＴＡのガイドラインに準拠して、Papworth NHS Foundation Trust Hospital Tissue Bankからホルマリン固定パラフィンワックス包埋組織ブロックを取得した。末期肺高血圧のためにPapworth Hospitalで移植を受けたインフォームドコンセントが得られた患者からの肺サンプルを使用した。変異ＢＭＰＲ２を伴うｈＰＡＨ（ｎ＝５）、ｉＰＡＨ（ｎ＝６）、および対照（ｎ＝６）を含む一連の病状の組織を取得した。対照は、肺癌のために肺切除を受けた患者からの腫瘍のない肺葉から採取され、かつ病理学者により腫瘍がないと報告された組織で構成された。RecoverAll全ＲＮＡ単離キット（Ambion, Streetsville, Canada）を用いて、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルから全ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡを含む）を抽出した。３つの１０ｍｍスライスをキシレンにより５０℃で３分間脱蝋し、エタノールで２回洗浄し、そしてプロテアーゼにより５０℃で１５分間、次いで、８０℃で１５分間消化させた。溶解物をフィルターカートリッジに通し、そしてＤＮＡｓｅにより消化させ、次いで、ＲＮＡｓｅを含まない３０ｍｌの水中にＲＮＡを溶出させ、そしてNanoDrop ND-1000分光光度計を用いて定量した。
【００６６】
実施例４。成熟ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡのＴａｑＭａｎ  ｑ−ＰＣＲ分析
定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）では、１０ｍｌの反応系を３８６ウェル光学プレート中、９５℃で１０分間インキュベートし、続いて、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を４０サイクル行った。結果をマウスおよびヒトのｍｉＲＮＡではそれぞれＵ６またはＲｎｕ−４８の値に、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１４５発現ではＧＡＰＤＨに規格化した。2D D Ct法（１、２）を用いて、すべてのｍｉＲＮＡ発現に関して変化倍率を得た。各ｍｉＲＮＡに対するｑ−ＰＣＲを三重試験方式で行い、結果をサンプルの平均±標準誤差として提示する。
【００６７】
すべてのｑ−ＰＣＲ実験に対して、値を変化倍率または平均±標準偏差として表す。図面の説明に記載されるように、二元配置ＡＮＯＶＡおよびそれに続いてボンフェローニの事後検定、一元配置ＡＮＯＶＡおよびそれに続いてボンフェローニの事後検定または必要に応じて対応のないｔ検定を用いて、すべてのデータを解析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００６８】
実施例５。野生型（ｗｔ）およびｍｉＲ−１４５−／−の肺動脈のマイクロアレイ分析。
各グループから１０週齢の６匹のマウスの主分岐肺動脈を切除し、ＲＮＡ単離前、−８０℃で凍結保存した。ＲＮＡの量および質をNanoDrop（登録商標）分光光度計（Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA）により評価した。RNA 6000 Nanoキット（Santa Clara, CA）を用いて、Agilent 2100バイオアナライザーにより、ＲＮＡ完全性を評価した。Illuminaアレイ（Applied biosystems Carlsbad, California）を用いたハイブリダイゼーションのために、Illumina TotalPrep RNA増幅キット（Ambion）を用いて、５００ｎｇの供給ＲＮＡからビオチン化増幅ＲＮＡを作製した。製造業者のプロトコルに従ってIllumina mouseWG-6 v2.0発現ビーズチップをハイブリダイズし、Illumina BeadArrayリーダーにより走査し、Illumina GenomeStudio（登録商標）ソフトウェア（バージョン１．１．１）に読み込んだ。マイクロアレイデータの解析および確認では、データ処理およびＲ解析（ランクプロダクト統計解析が行われる）のために、分位点規格化バックグラウンド除去強度値をGenomeStudio（登録商標）ソフトウェアからエクスポートした。４グループ間で隣接比較を行った。０．０５未満の偽陽性率のプローブを有意であるとみなした。マイクロアレイで使用された２４サンプルから誘導されたｃＤＮＡに関する標的確認のために、Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を使用した（ｎ＝１８／グループ）。
【００６９】
実施例６。ノーザンブロット分析
全ＲＮＡを１５％ＴＢＥ−尿素ゲル（Invitrogen, Paisley, UK）上で分離し、トランスブロットセミドライシステム（Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK）を用いて非荷電ナイロン膜Hybond-NX（Amersham Bioscience UK Ltd, Buckingham, UK）に移し、そしてＵＶ架橋した。ハイブリダイゼーション緩衝液（５０％脱イオン化ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳ、および２μｇ熱変性ニシン精子ＤＮＡ）を用いて５５℃でプレハイブリダイゼーションを３０分間行った。次いで、２５ｐｍｏｌのｍｉＲ−１４５検出プローブまたはU6 miRCURY LNA（商標）検出プローブ５’−ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識（Exiqon, Denmark）を同一プレハイブリダイゼーション温度で一晩添加した。ハイブリダイゼーション後、膜を低ストリンジェンシー洗浄溶液（invitrogen, Paisley, UK）により５０℃で３０分間洗浄し、続いて、高ストリンジェンシー洗浄溶液（invitrogen, Paisley, UK）により３０分間洗浄した。その後、膜をブロッキング溶液（マレイン酸中の１％ブロッキング試薬）中でブロックし、そして室温で抗ＤＩＧ抗体（Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA）と共に１：５０００で３０分間インキュベートした。CDP Star化学発光基質（Sigma-Aldrich, Poole, UK）を用いて膜上で関心対象のｍｉＲＮＡの存在を検出した。Scion Imageソフトウェアを用いてｍｉＲＮＡ定量を行い、関心対象のｍｉＲＮＡのバンド強度を確定して相対Ｕ６シグナルに規格化した。
【００７０】
実施例７。免疫組織化学
ヒトおよびマウスの肺を４％パラホルムアルデヒド溶液により４０℃で１８時間固定し、そしてパラフィン中に包埋した。段階的濃度のキシレンおよびエタノールで脱パラフィン化した後、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、スライドを３％Ｈ２Ｏ２入りのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に室温で３０分間浸漬した。次いで、非特異的バックグラウンド染色を低減するために、２０％正常ヤギ血清と共に３０分間インキュベートした。次いで、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）入りのＰＢＳ中で、切片をα−平滑筋アクチンに対するマウスモノクローナル抗体（Dako, Clone 1A4, High Wycombe, UK）またはアイソタイプが一致したマウスＩｇＧ非免疫対照（Dako, High Wycombe, UK）と共にインキュベートした。次いで、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ入りのＰＢＳ中に１：２００を希釈された切片を適切なビオチン化二次抗体（Dako, High Wycombe, UK）と共にインキュベートし、次いで、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ入りのＰＢＳ中に１：４００を希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ標識Extravidin（商標）（Sigma, St. Louis, MO, USA）と共にインキュベートした。３．３ジアミノベンジジンを用いて染色を可視化し、そして核をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色した。
【００７１】
実施例８。検出されたｍｉＲＮＡ局在化に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。
マウスおよびヒトの肺においてｍｉＲ−１４５を検出するために、histoclearおよび段階的濃度のエタノールを用いて切片を再水和した。次いで、スライドを１０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．０中で１０分間煮沸し、室温（ＲＴ）に冷却し、１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫと共に３７℃で１５分間インキュベートし、最後に抗原回復させるために４％ＰＦＡ中、室温で１０分間固定した。抗原回復後、スライドをハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、２．５×デンハルト溶液、２．５ｍｇ／ｍｌサケＤＮＡ、０．６ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、０．０２５％ＳＤＳ、および０．１％ブロッキング試薬）と共に６０℃で１時間インキュベートし、続いて、同一の緩衝液中で４０ｎＭ  ｍｉＲ−１４５またはスクランブルmercury LNA（商標）検出プローブ（５’−ＤＩＧ標識）（Exiqon, Denmark）と共に６０℃で一晩インキュベートした。融解温度は、それぞれ、７９℃および７８℃であった。１％ブロッキング試薬入りのＰＢＳおよび１０％ＦＣＳ中、室温で切片を１時間ブロックし、続いて、１：１０００希釈された抗ＤＩＧ抗体（Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA）と共に４℃で一晩インキュベートすることにより、免疫検出を行った。次いで、スライドを０．１ＭトリスｐＨ９．０と共に５分間インキュベートした。ｍｉＲ−１４５を染色するために、ＢＭ紫色溶液（Roche Applied Science, Mannheim, Germany）またはＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液（Roche Applied Science, Mannheim, Germany）をそれぞれヒトまたはマウスの切片に添加し、そして室温で３日間放置した。
【００７２】
実施例９。ＳＭＡおよびｍｉＲ１４５の共局在化。
上述したように、慣例に従って固定されたパラフィン包埋６μｍヒト肺切片上でｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。スライドをｈｉｓｔｏｃｌｅａｒにより脱パラフィン化し、そして１０μｇ／ｍｌプロテイナーゼ（Ｓｉｇｍａ）により３７℃で２０分間処理し、次いで、４％パラホルムアルデヒドにより１０分間固定した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、スライドをハイブリダイゼーション緩衝液と共に６０度で１時間インキュベートした。次いで、スライドを６０℃で４０ｎＭ  ＤＩＧ標識ｍｉＲ１４５またはスクランブルプローブ（Ｅｘｉｑｏｎ）により一晩ハイブリダイズした。洗浄およびブロッキングの後、スライドをブロッキング緩衝液中で抗ＤＩＧ＿ＡＰ  Ｆａｂフラグメント（Ｒｏｃｈｅ）と共に４度で一晩インキュベートし、そしてＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）および０．１ＭトリスＨＣＬ（ｐＨ９．５）で洗浄した。染色が顕微鏡下で見えるようになるまで、ＢＭ紫色溶液（Ｒｏｃｈｅ）によりｍｉＲ−１４５を室温で１〜２日間可視化した。ＰＢＳで洗浄した後、スライドを０．３％Ｈ２Ｏ２入りのＰＢＳで１０分間クエンチした。非特異的バックグラウンドをブロックするために、１０％ウサギ正常血清をスライド上に１時間適用し、次いでスライドを、１０％正常血清中、４℃でモノクローナル抗ヒトα平滑筋アクチン（ＤＡＫＯ）と共に一晩インキュベートした。色素原として３，３’−ジアミノベンジジンを用いてスライドを５分間可視化した。可視化を図１に示す。
【００７３】
実施例１０。ｍｉＲ−１４５発現の排除は、マウスにおいて肺動脈高血圧の発症を防ぐ。
ｍｉＲ−１４５が肺組織中で発現されたかを評価するために、以上に記載したように、野生型（ｗｔ）マウスの肺組織切片上でｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。マウスの肺の血管および気管支の平滑筋層内にｍｉＲ−１４５の陽性染色が観察された（図２Ａ）。ｍｉＲ−１４５発現が傷害に対する反応時に変化されたかを評価するために、１４日間低酸素暴露されたｗｔマウスからの全肺および右室においてｍｉＲ−１４５の発現を定量的ＰＣＲにより評価し、この発現を正常酸素条件に暴露されたマウスと比較した。分析の結果、低酸素に対する反応により肺および右室の両方でｍｉＲ−１４５の有意なアップレギュレーションが明らかにされた（それぞれ図２Ｂ、Ｃ）。ｍｉＲ−１４３レベルもまたアップレギュレートされた（図３）。同一動物の脳、腎臓、および脾臓におけるｍｉＲ−１４５発現の分析の結果、いかなる異常制御も明らかにされなかった（図４）。したがって、ｍｉＲ−１４５は、マウスの肺の平滑筋細胞内で発現され、低酸素に対する反応により肺において選択的にアップレギュレートされる。単離されたヒト遠位肺動脈ＳＭＣにおいて、２４時間および７２時間の低酸素暴露時にｍｉＲ−１４５の変化が検出されなかったことから、複数の細胞の血管区画（図５）におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの複雑な制御が示唆される。
【００７４】
次いで、ＰＡＨの発症に対するｍｉＲ−１４５の遺伝子破壊の効果を評価した。ｍｉＲ−１４５ノックアウトマウスは、既報である（Xin et al. (2009) Genes Dev., Vol. 23: 2166-2178）。ホモ接合ｍｉＲ−１４５−／−雌マウスまたは年齢の一致する野生型対照（８週齢のＣ５７ＢＬ６Ｊ／１２９ＳＶＥＶ系統）を慢性低酸素に４日間暴露または正常酸素条件に維持し、そして１０週齢で評価した。
【００７５】
８週齢のｍｉＲ−１４５ノックアウト（ｍｉＲ−１４５−／−）マウスおよび年齢の一致する対照の同腹仔を慢性低酸素に１４日間暴露または正常酸素条件で維持し、１０週齢でＰＡＨの発症に関して評価した。すべての実験で、イソフルラン（Ｏ２中１．５％）麻酔下のマウスにおいて、経横隔膜的に針を右室中に前進させて収縮期右室圧（ｓＲＶＰ）を測定した。既報のように、カニューレを頸動脈中に配置して全身動脈圧（ＳＡＰ）を記録した（Keegan et al., 2001）。右室壁（ＲＶ）重量と左室＋中隔（ＬＶ＋Ｓ）重量との比として右室肥大（ＲＶＨ）を判定した。既報のように、弾性線維ワンギーソン（ＥＶＧ）染色法により肺切片を染色し、そして盲検方式でリモデリングされた血管のパーセントを決定した（Keegan et al., 2001）。血管断面の直径の少なくとも半分で観測可能な個別の二重弾性膜を有する場合、動脈は、筋肉化されたとみなした。５匹のマウス／グループをリモデリングに関して分析した。各肺切片から約１５０の動脈を評価した。
【００７６】
研究に使用したノックアウト動物におけるｍｉＲ−１４５発現の不在を定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより確認した（図６）。ｍｉＲ−１４５は、ｍｉＲ−１４３とクラスターを形成してそのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ型で転写されるので、正常酸素および低酸素の両方の条件下の野生型動物およびノックアウト動物においてｍｉＲ−１４３の発現をも分析し、ｍｉＲ−１４３レベルが、ｍｉＲ−１４５の遺伝子破壊の後および低酸素傷害に対する反応により、肺において実質的に変化しないことを確認した。野生型マウスおよびｍｉＲ−１４５−／−マウスの全肺から抽出されたＲＮＡでｍｉＲ−１４３発現のｑ−ＰＣＲ分析を行ったが、野生型動物とｍｉＲ−１４５−／−動物との間で低酸素に対する反応により差を示していなかった（図７）。したがって、ｍｉＲ−１４５−／−における低酸素に対する反応によるＰＡＨの発症の変化はいずれも、ｍｉＲ−１４５の選択的損失に特異的であった。
【００７７】
次いで、野生型マウスおよびｍｉＲ−１４５−／−マウスにおけるＰＡＨの発症を定量化した。野生型マウスでは、収縮期ＲＶＰおよびＲＶＨの顕著な予想された増加が観察された（図８Ａ、Ｂ）。これとは対照的に、ｍｉＲ−１４５−／−動物は、収縮期ＲＶＰまたはＲＶＨの増加を示さなかった。興味深いことに、野生型とｍｉＲ−１４５−／−マウスとの間にベースラインの収縮期ＲＶＰまたはＲＶＨの差は存在しなかった（図８Ａ、Ｂ）。測定値を表１および２に示す。
【００７８】
【表１】
0006049700.tif 000004
【００７９】
【表２】
0006049700.tif 000005
【００８０】
組織学的分析では、低酸素暴露後、野生型動物の肺小動脈（ＰＡ）における肺血管リモデリングの存在が示されたが、そのようなリモデリングは、ｍｉＲ−１４５−／−動物から採取された肺において低減され、この知見は、定量的スコアにより確認された（図８Ｃ、Ｄ）。したがって、ｍｉＲ−１４５の遺伝子破壊は、低酸素に対する反応によるＰＡＨの発症からマウスを保護する。
【００８１】
平均ＳＡＰは、予想どおり、対照と比較してｍｉＲ−１４５−／−マウスでは低減され、これまでに発表された研究と合致する（Elia et al., 2009; Xin et al., 2009）。野生型マウスおよびｍｉＲ−１４５−／−マウスのＳＡＰはいずれも、低酸素暴露により変化せず（図９Ａ）、低酸素暴露されたｗｔマウスでもｍｉＲ−１４５−／−マウスでも、心拍数（ＨＲ）の変化は、観測されなかった（図９Ｂ）。
【００８２】
この一連の実験の結果から、ｍｉＲ−１４５は、正常酸素条件（図８Ａ、Ｂ）または低酸素条件に付されたマウスから採取された肺において平滑筋細胞区画で排他的に発現されることが示される。低酸素マウスモデルでは、ｍｉＲ−１４５レベルは、対照と比較して上昇し、ｍｉＲ−１４５の遺伝子破壊は、ＰＡＨの発症を予防する。ｍｉＲ−１４５−／−マウスの血管系の機能分析では、低酸素に対する反応の低減が明らかにされ、これらのマウスを低酸素に２週間暴露した場合、収縮期圧は、野生型マウスのように著しい上昇を示さなかった。右室肥大に関しても類似の結果が得られた。それに加えて、リモデリングされた血管のパーセントは、ノックアウト動物において有意に低減されたことから、ＰＡＨ発症におけるｍｉＲ−１４５破壊の保護的役割が強く示唆される。この効果は、ｍｉＲ−１４３の調節がまったく存在しなくても起こるので、ＰＡＨの発症におけるｍｉＲ−１４５の重要性が確認される。したがって、これらの知見から、ｍｉＲ−１４５は、ＰＡＨの治療を設計するための実用性のある治療標的であり得ることが示唆される。
【００８３】
実施例１１。対照と比較した、ｍｉＲ−１４５−／−マウスの肺におけるｍｉＲ−１４５予測標的の分析。
遺伝子およびタンパク質の発現に対するｍｉＲ−１４５破壊の効果を確認するために、文献ですでに確認されたまたはTargetScanおよびPicTarの予測アルゴリズムを用いて同定されたかつＰＡＨに関与する可能があるとして選択されたいくつかのｍｉＲ−１４５遺伝子標的を、ｗｔ動物およびｍｉＲ−１４５  ｋｏ動物の肺組織において、ｑ−ＰＣＲにより分析した。それらは、ＫＬＦ４およびＫＬＦ５（クルッペル様因子４および５）（両方ともＳＭＣの増殖および分化に関与する）ならびにＳＭＡＤ４およびＳＭＡＤ５（ＴＧＦ−βスーパーファミリーのシグナリング媒介物）を含んでいた。ＲＮＡ分析の結果、ｍｉＲ−１４５−／−正常酸素マウスでは、ｗｔ正常酸素マウスと比較して、ＳＭＡＤ４およびのＳＭＡＤ５の両方の有意なアップレギュレーションが明らかにされた（図１０Ａ、Ｂ）。ＫＬＦ４は、正常酸素および低酸素の両方のｍｉＲ−１４５−／−マウスで増加し、ＫＬＦ５発現は、ｍｉＲ−１４５−／−低酸素マウスと対比してｗｔ低酸素マウスで有意にアップレギュレートされた（図１０Ｃ、Ｄ）。低酸素条件でのＷＴ動物およびＫＯ動物におけるＫＬＦ４タンパク質発現のウェスタンブロット分析の結果、この標的の有意なアップレギュレーションが確認されたが、正常酸素では有意な変化が観測されなかった（図１１）。これとは対照的に、ＫＬＦ５タンパク質レベルは、正常酸素条件および低酸素条件のいずれでも同一サンプルで有意にアップレギュレートされなかった（図１１）。
【００８４】
実施例１２。ＷＴ動物と比較したｍｉＲ−１４５−／−マウスのＰＡにおける遺伝子発現プロフィールのマイクロアレイ分析。
ｍｉＲ−１４５−／−低酸素グループ、ＷＴ低酸素グループ、ｍｉＲ−１４５−／−正常酸素グループ、およびＷＴ正常酸素グループのそれぞれから６つのサンプルを用いて、グローバルトランスクリプトーム分析を行った。ｍｉＲＷａｌｋ中のデータベースの少なくとも３つで予想された３’ＵＴＲ  ｍｉＲＮＡ結合領域を有し、かつｍｉＲ−１４５−／−低酸素とＷＴ低酸素との比較で有意な偽陽性率を有する潜在的ｍｉＲ−１４５標的をさらなる分析に供すべく選択した。Ingenuity経路分析ソフトウェアおよびDatabase for Annotation, Visualization and Integrated Discovery（DAVID）を用いて、肺高血圧に関連する経路中に存在する標的を選択した。これらの選択基準を用いてリアルタイムＰＣＲにより確認すべく、合計１３の標的を選択した（表３）。
【００８５】
【表３】
0006049700.tif 000006
【００８６】
確認された(validated)ｍｉＲ−１４５標的のＦＳＣＮ１、ＤＡＢ２、およびＡＣＥをさらなる分析に供すべく選択した（Cheng et al., 2009、Boettger et al., 2009、Kano et al., 2010、Xu et al., 2009）。マイクロアレイから選択された標的のうち１０種をリアルタイムＰＣＲにより確認した（図１２）。標的ＴＧＦＢ２、ＦＲＺＢ、ＡＣＥ、ＣＴＧＦ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＰ２Ｂ１、およびＩＴＧＢＬ１の７種では、すべての他のグループと対比して、ＷＴ低酸素グループが有意に発現増加を示した（図１２）。さらに、リアルタイムＰＣＲデータは、ＷＩＦ１、ＣＡＭＫ２Ａ、ＴＴＮ、ＡＣＥ、ＤＡＢ２、およびＦＳＣＮ１に対してマイクロアレイで観測されたグループ間変化を反映し（表３）、これらの変化が有意であることを示した（図１２）。マイクロアレイで観測された変化は、ＴＭＯＤ１およびＡＰＨ１Ａでは確認されなかった（図示せず）。確認された標的を５つのグループ、すなわち、ｗｎｔシグナリングの阻害剤（ＷＩＦ１、ＦＲＺＢ、ＤＡＢ２）、アクチン細胞骨格の制御（ＦＳＣＮ、ＴＴＮ）、転写制御（ＣＡＭＫ２Ａ）、細胞接着（ＩＴＧＢＬ１、ＣＴＧＦ）、および内皮機能（ＡＣＥ、ＡＮＧＰＴＬ４）に分類した。アレイデータのさらなる分析により、ＷＮＴシグナリング経路の多くの成分で顕著な変化が明らかにされた（表４）。
【００８７】
【表４】
0006049700.tif 000007
【００８８】
このように、単離肺動脈に関する全トランスクリプトームマイクロアレイ研究を用いて、低酸素に対する転写反応を定量化した。ＫＬＦ４および５の発現は、ｍｉＲ−１４５制御と相関し、低酸素ｍｉＲ−１４５ノックアウトマウスにおいてこれらの両方の標的の有意なアップレギュレーションを生じる。ＷＴ低酸素とｍｉＲ１４５−／−低酸素との比較から確認された３種の標的は、カノニカルｗｎｔ／β−カテニンシグナリングを阻害する。ＷＩＦ１およびＦＲＺＢは、細胞外空間でＷｎｔタンパク質に結合し、リガンド−レセプター相互作用を抑制し（Leyns et al , 1997、Hsieh et al., 1999、Jiang et al , 2009、Baldin et al., 1993、Baranwai et al., 2009）、一方、ＤＡＢ２は、リン酸化アキシンを安定化し、β−カテニンのプロテアソーム分解を増大させることによりＷｎｔ／β−カテニンシグナリングを減少させる（Jiang et al., 2009）。これらの因子は、ｗｎｔシグナリングを阻害してサイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）やＥカドヘリン（ＣＤＨ）などのｗｎｔ標的遺伝子の発現の減少をもたらし、これらはまた、ｍｉＲ１４５−／−低酸素グループでダウンレギュレートされることが見いだされた（表２）。ＣＤＨおよびＣＣＮＤ１のダウンレギュレーションは、それぞれ、細胞骨格再組織化および増殖低減を引き起こし得る（Baldin el al. , 1993; Baranwai et al., 2009）。したがって、ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングの阻害は、ｍｉＲ１４５−／−マウスにおいて低酸素で観測された表現型に寄与し得る。
【００８９】
実施例１３。対照マウスおよびｍｉＲ−１４３  ａｎｔｉｍｉＲで処置されたｗｔマウスと比較したｍｉＲ−１４５  ａｎｔｉｍｉＲで処置されたｗｔマウスにおけるＰＡＨの発症の定量化。
慢性低酸素に対する反応でｍｉＲ−１４５破壊マウスにおいて観測されたＰＡＨの発症に対する保護効果が、ｍｉＲ−１４５の薬理学的操作により再現可能であることを決定するために、ＬＮＡ  ａｎｔｉｍｉＲを使用した。
【００９０】
ＬＮＡ  ａｎｔｉｍｉＲは、１６ヌクレオチド長であり、成熟ｍｉＲ−１４５（配列番号１３）または成熟ｍｉＲ−１４３（５’−ＴＡＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣ−３’、配列番号１４）の塩基２〜１７を標的とし、ｍｉＲ−１４３またはｍｉＲ−１４５のいずれかの５’領域に完全に相補的な完全にホスホロチオレート化されたオリゴヌクレオチドとして存在し、ＬＮＡとＤＮＡとの混合体として合成された。ＬＮＡ対照オリゴヌクレオチド（スクランブル）は、同程度のＬＮＡ／ＤＮＡ含有量を有するＣ．エレガンス（C. elegans）特異的ｍｉＲＮＡを指向する配列で構成された。ａｎｔｉｍｉＲおよび対照オリゴヌクレオチドは、皮下注射（０．２ｍｌ生理食塩水中２５ｍｇ／ｋｇ）を介して雌Ｃ５７Ｂ１６マウス（８〜１０週齢）に投与された。マウスは、１４日間低酸素暴露の１および８日目にオリゴヌクレオチドまたは媒体を注射された。
【００９１】
８週齢の雌Ｃ５７Ｂ１６マウスにｍｉＲ−１４５またはｍｉＲ−１４３に特異的なａｎｔｉｍｉＲを皮下注射し、次いで、慢性低酸素に２週間暴露し、媒体およびスクランブルで処置されたマウスと比較した。低酸素暴露の８日目に第２の用量を注射した。処置動物においてｍｉＲ−１４５またはｍｉＲ−１４３の選択的かつ実質的なダウンレギュレーションがｑ−ＰＣＲにより肺で確認された（図１３Ａ、Ｂ）。スクランブル処置されたマウスは、ｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５のいずれでも発現に変化を示さなかった（図１３Ａ、Ｂ）。ノーザンブロットにより選択的ダウンレギュレーションを確認した（図１３Ｃ〜Ｆ）。次いで、対照と比較して処置マウスにおけるＰＡＨの発症を評価し、媒体処置正常酸素マウスと比較して、媒体処置低酸素マウスにおいて、収縮期ＲＶＰおよびＲＶＨの有意な上昇を観測した（図１４）。スクランブル処置動物およびａｎｔｉｍｉＲ−１４３動物では同一の効果が観測されたが、ｍｉＲ−１４５に対するａｎｔｉｍｉＲで処置されたマウスは、収縮期ＲＶＰ（図１４Ａ）の有意な減少を示した。ａｎｔｉｍｉＲ−１４５またはａｎｔｉｍｉＲ−１４３で処置されたマウスでは、ＲＶＨおよびＳＡＰの変化は、観測されなかった（図１４Ｂ）。組織学的分析では、低酸素に暴露された媒体処置マウスまたはスクランブル処置マウスにおいて観測されたリモデリングのパーセントと比較して、慢性低酸素に暴露されたａｎｔｉｍｉＲ−１４５処置マウスの小ＰＡの肺血管リモデリングの有意な減少を示した（図１４Ｃ、Ｄ）。これらのデータから、ｍｉＲ−１４３ではなくｍｉＲ−１４５の選択的薬理学的操作により、低酸素に暴露されたマウスにおいてＰＡＨの発症が予防されることが示される。平均ＳＡＰの変化は観測されなかった（図Ｉ５Ａ）。グループにわたる変化は、ＨＲでは観測されなかった（図１５Ｂ）。
【００９２】
実施例１４。ｍｉＲ−１４５発現は、特発性または遺伝性のＰＡＨのヒト患者の肺組織において増大される。
ＰＡＨの発症におけるｍｉＲ−１４５の役割をさらに解明するために、特発性ＰＡＨ（ｉＰＡＨ）または遺伝性ＰＡＨ（ｈＰＡＨ）の患者から採取された肺組織におけるｍｉＲ−１４５発現を対照肺組織と比較した。末期肺高血圧のために移植を受けた患者から肺サンプルを取得した。変異ＢＭＰＲ２（ｎ＝５）に関連するｈＰＡＨまたはｉＰＡＨ（ｎ＝６）と診断された患者から肺組織を取得した。対照（ｎ＝６）は、肺癌のために肺切除を受けた患者からの腫瘍のない肺葉から採取されたかつ病理学者により腫瘍がないと報告された組織で構成された。
【００９３】
上述のように、パラフィン包埋肺組織からｍｉＲＮＡを抽出して、定量的ＰＣＲにより発現レベルを評価した。対照と比較して、ｍｉＲ−１４５は、ｈＰＡＨおよびｉＰＡＨのサンプルの両方で有意に増加した（図１６Ａ）。次いで、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて、以上の患者グループから選択されたヒト肺におけるｍｉＲ−１４５の発現の位置を特定した（図１６Ｂ）。マウス肺の分析と一致して、対照肺切片におけるｍｉＲ−１４５の発現は、血管および細気管支の両方の系列を含む、肺の平滑筋細胞に限定された(confined)（図１６Ｂ）。ＰＡＨは、前腺房および腺房内の肺動脈を含む同心状および叢状の両方の動脈病変の発症により特徴付けられる。ｉＰＡＨおよびｈＰＡＨの患者では、ｍｉＲ−１４５は、動脈の平滑筋細胞により発現され、どこに存在するかにかかわらず、同心状病変および叢状血管病変の筋肉成分中に観測された（図１６Ｂ）。ｍｉＲ−１４５陽性細胞はまた、血管が筋肉化された前腺房および腺房内の動脈で観測された（図１６Ｂ）。それに加えて、肺胞管のレベルで新たに筋肉化された細動脈は、豊富なｍｉＲ−１４５  ｍＲＮＡを発現した（図１６Ｂ）。ｉｎ  ｓｉｔｕ局在化は定量的でないが、ｍｉＲ−１４５発現は、中膜層（medial layer）内に存在するより分化したＳＭＣと比較して、新生内膜筋線維芽細胞中ではとくに低減された（たとえば図１６Ｃ参照）。まとめると、ヒト肺では、ｍｉＲ−１４５は、平滑筋細胞区画中で発現される。ｍｉＲ−１４５発現はまた、ｈＰＡＨおよびｉＰＡＨの患者で複合病変のリモデリングされた血管内で観測される。いくつかの血管では、ｍｉＲ−１４５のレベルは、新生内膜細胞において低減されるように思われる。
【００９４】
ＢＭＰＲ２変異を有する患者から単離されたＰＡＳＭＣの増殖および特徴は、生殖系列変異を伴わない患者から単離されたものとは基本的には異なるので、培養下でヒト一次細胞を用いて、ｍｉＲ−１４５制御に対するＢＭＰＲ２変異の効果を評価した。ＰＡＨ患者から取得した一次ヒトＰＡＳＭＣを培養して、培養細胞中のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡレベルおよび成熟ｍｉＲＮＡレベルを定量した。ｐｒｅ−ｍｉＲ−１４５および成熟ｍｉＲ−１４５は両方とも、非罹患対照と比較して既知のＢＭＰＲ２変異を有する患者に由来する細胞において有意に増加する（図１７Ａ、Ｂ）。ノーザンブロット分析を行って、同一サンプルで成熟ｍｉＲ−１４５のレベル差を確認および定量した。ＰＣＲ分析と一致して、ｍｉＲ−１４５は、非変異対照ＰＡＳＭＣと比較してＢＭＰＲ２に変異を有する患者から抽出されたＲＮＡにおいて有意に増加した（図１７Ｃ、Ｄ）。したがって、ｍｉＲ１４５の基礎レベルは、生殖系列ＢＭＰＲ２変異を有する患者では増加する。
【００９５】
実施例１５。ヒトＰＡＳＭＣにおけるｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５の発現に対するＢＭＰＲ２ダウンレギュレーションの効果
ヒトＷＴ  ＰＡＳＭＣにおいてｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５の発現レベルに対するＢＭＰＲ２のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンの効果をインビトロで評価するために、ＢＭＰＲ２を標的として特異的にダウンレギュレート可能な低分子干渉（ｓｉ）配列または陰性対照としてのｓｉスクランブルを細胞にトランスフェクトした。
【００９６】
ＰＡＳＭＣを６ウェルプレートに接種して（１．５×１０５細胞／ウェル）、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で２日間増殖させた。トランスフェクション前、ＰＡＳＭＣをＯｐｔｉｍｅｍ  Ｉ中で３時間インキュベートした。０日目、ＯｐｔｉｍｅｍＩ中に希釈されたDharmaFECT1（商標）（４ｍｌ／ウェル）との複合状態のｓｉＲＮＡ［ＢＭＰＲ−ＩＩもしくはＳｍａｄ４に対するDharmacon（商標）  On-TARGETplus siRNAまたはｓｉ対照非標的化プール（ｓｉＣＰ）（Perbio Science UK Ltd）］を最終濃度１０ｎＭでＰＡＳＭＣにトランスフェクトした。最終体積の半分の体積（１ウェルに対して２００ｍｌ）のＯｐｔｉｍｅｍＩ中でDharmafectを５分間インキュベートし、続いて、１０×最終濃度で関連ｓｉＲＮＡを含有するＯｐｔｉｍｅｍＩ（１ウェルに対して２００ｍｌ）を添加し、ｓｉＲＮＡを５×最終濃度にした。ミックスを室温で２０分間インキュベートしてリポプレックスを形成させた。トランスフェクションミックス（４００ｍｌ／ウェル）を新鮮なＯｐｔｉｍｅｍＩ（１．６ｍｌ／ウェル）中の細胞上に滴下してウェルの十分な被覆を確保した。細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートし、続いて、１日目にＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳと２４時間交換した。
【００９７】
４日後、これらのサンプルからおよび未処置細胞からＲＮＡを抽出した。ＢＭＰＲ２のダウンレギュレーションは、ｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５の両方の有意なアップレギュレーションを誘発したが、未処置細胞またはｓｉスクランブル処置細胞では変化は観測されなかった（図１８）。
【００９８】
この一連の実験の結果から、ｍｉＲ−１４５レベルは、ｈＰＡＨおよびｉＰＡＨの患者からのヒトサンプルにおいて増加し、かつｍｉＲ−１４５発現は、複合病変の中膜および新生内膜のＳＭＣに局在化されることが示される。また、この結果から、肺平滑筋細胞におけるＢＭＰＲ２変異とｍｉＲ−１４５レベルの増加との間の特異的関係が実証される。興味深いことに、分析されたＰＡＨ患者の全肺におけるｍｉＲ−１４５のアップレギュレーションにもかかわらず、ｉＰＡＨおよびｈＰＡＨの患者の血管におけるこのｍｉＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕ局在化は、肥大した動脈、肺血管病変、および新たに筋肉化された細動脈において豊富なｍｉＲ−１４５  ｍＲＮＡ発現を示した。ｍｉＲ−１４５発現の操作は、ＰＡＨの発症に対して実質的な影響を及ぼすように思われるので、ｍｉＲ−１４５のダウンレギュレーションは、ＰＡＨに対する新規な治療手段である。
【００９９】
実施例１６。ＢＭＰＲ２  Ｒ８９９ＸマウスにおけるｍｉＲ−１４５発現。
ＰＡＨのマウスモデルにおけるおよびＢＭＰＲ２遺伝子に変異を有するＰＡＨ患者から抽出されたＰＡＳＭＣにおけるｍｉＲ−１４５制御の重要性を考慮して、ヘテロ接合Ｒ８９９＋／−マウスにおけるｍｉＲ−１４５発現に対する短縮ＢＭＰＲ２変異の効果を評価した。このマウスは、既報のＲ８９９Ｘトランスジェニックマウス（West et al., 2008）に類似して、自然肺高血圧を発症する。
【０１００】
６ヶ月齢のマウスの全肺からＲＮＡを抽出して、ｍｉＲ−１４５に対するｑ−ＰＣＲおよびノーザンブロットにより分析した。これにより、対照と比較して変異マウスのｍｉＲ−１４５の有意なアップレギュレーションが明らかにされた（図１９Ａ〜Ｃ）。パラフィン肺切片におけるｍｉＲ−１４５のｉｎ  ｓｉｔｕ局在化では、ｗｔマウスおよびＢＭＰＲ２変異マウスの両方の肺血管および気管支の平滑筋層中で陽性染色が確認され、変異動物では強い染色が観測された（図１９Ｄ）。
【０１０１】
実施例では、マウス肺のｍｉＲ−１４５が平滑筋に局在化することが実証される。定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）を用いて、低酸素に暴露される野生型（ｗｔ）マウスにおけるｍｉＲ−１４５の発現の増加が実証された。ｍｉＲ−１４５は、慢性低酸素に対する反応によりマウスにおいて有意にアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１４５の遺伝子破壊またはａｎｔｉｍｉＲ駆動薬理学的低減は、マウスにおいてＰＡＨの発症を防ぐ。
【０１０２】
ｍｉＲ−１４５−／−マウスの血管系の機能分析では、慢性低酸素への肺血管反応の低減および右室肥大の低減が明らかにされた。ｍｉＲ−１４５ノックアウトマウスおよびａｎｔｉｍｉＲで処置されたマウスにおいて、収縮期右室圧（ｓＲＶＰ）、右室肥大（ＲＶＨ）、およびリモデリングされた肺動脈のパーセントの測定を介して、ＰＡＨを評価した。それに加えて、リモデリングされた血管のパーセントは、ノックアウト動物において有意に低減されたことから、ＰＡＨ発症におけるｍｉＲ−１４５破壊の保護的役割が強く示唆される。ｍｉＲ−１４５発現を実質的に低減可能なａｎｔｉｍｉＲで処置されたｗｔマウスにおいて、類似の保護効果が観測された。したがって、ｍｉＲ−１４５欠損およびａｎｔｉｍｉＲ媒介低減は、ＰＡＨの発症からの有意な保護をもたらした。これとは対照的に、ｍｉＲ−１４３  ａｎｔｉｍｉＲは、効果がなかった。
【０１０３】
さらに、非罹患対照と比較して特発性および遺伝性のＰＡＨ（ｉＰＡＨ、ｈＰＡＨ）の患者の肺組織においてｍｉＲ−１４５のアップレギュレーションが観測され、リモデリングされた血管のＳＭＣにおいてｍｉＲ−１４５の発現が実証された。ヒト組織では、対照と比較して、ｍｉＲ−１４５の前駆型および成熟型は、ＢＭＰＲ２遺伝子に変異を有するＰＡＨ患者から取得した組織内においておよび単離ＰＡＳＭＣにおいて、増加する。ＢＭＰＲ２変異を有する患者から培養された一次ＰＡＳＭＣにおいて、さらにはｂｍｐｒ２欠損マウスの肺において、ｍｉＲ−１４５発現レベルの増加が見られた。この保存された異常制御から、ｍｉＲ−１４５の制御とＴＧＦ−βスーパーファミリーとの間の関連性の存在が示唆される。
【０１０４】
ｍｉＲ−１４５は、ＰＡＨのマウスモデルにおいて異常制御され、ｍｉＲ−１４５のダウンレギュレーションは、ＰＡＨの発症を防ぐ。ｈＰＡＨおよびｉＰＡＨの患者サンプルでは、ｍｉＲ−１４５は、リモデリングされた血管において発現され、ＢＭＰＲ２中の変異は、マウスおよびＰＡＨ患者においてｍｉＲ−１４５のアップレギュレーションをもたらす。これらの観測に基づいて、ＰＡＨの発症には、ｍｉＲ−１４５の決定的な役割が存在し、ｍｉＲ−１４５の操作は、ＰＡＨ治療で新規な戦略になる。
【０１０５】
本明細書で考察および引用された出版物、特許、および特許出願はすべて、それらの全体を参照により本明細書に援用する。開示された本発明は、記載の特定の方法、プロトコル、および材料に限定されるものではない。なぜなら、これらは、変更可能であるからである。同様に、本明細書中で用いられる用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的としたものにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０１０６】
当業者であれば、通常の実験の域を出ることなく、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価形態がわかるであろう。またはそれらを確認することができるであろう。そのような等価形態は、以下の特許請求の範囲内に包含されるものとする。
【０１０７】
参照文献
【化３】
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【化４】
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【化５】
0006049700.tif 000010
【化６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【配列表】
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