(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［１］［ａ］の対応するケトンおよび適切なアミノドナーからの一般式［１］［ｃ］の鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミンの酵素的合成のための方法であって、
【化１】
0005999565.tif 000018
【化２】
0005999565.tif 000019
（式中、Ｒ１およびＲ２は異なっており、かつ独立して直鎖または分岐鎖脂肪族、芳香族、ヘテロ芳香族であるか、または環式構造を形成する）
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質からなる群から選択されるトランスアミナーゼを使用することによる方法。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が異なっており、かつＲ１およびＲ２が独立して１〜３０の炭素原子を含有し、Ｒ１およびＲ２が、独立して、置換または非置換脂肪族；置換または非置換分岐鎖脂肪族；置換または非置換環状脂肪族；少なくとも１つの酸素、イオウ、または窒素原子を含有する置換または非置換ヘテロ環式脂肪族；置換または非置換芳香族；少なくとも１つのイオウ、または窒素原子を含有する置換または非置換ヘテロ芳香族であるか；あるいは一緒になって、置換もしくは非置換環式構造または少なくとも１つの酸素、イオウ、もしくは窒素原子を含有するヘテロ環式構造を形成し；前記置換基が、これらに限定されないが、ハロゲン原子、炭素原子数１〜６のアルキル基、ヒドロキシル基、メトキシ基、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、およびトリフルオロメチル基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミン生成物の最終濃度が、反応混合物の１〜５０重量％の間にあることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アミノドナーが、α−メチルベンジルアミンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記アミノドナーが、ｓｅｃ−ブチルアミンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミン生成物の最終濃度が、反応混合物の５〜３５重量％の間にあることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記反応混合物が、水相および第２の有機相を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記反応混合物が、水相および第２の有機相を含み、水相：有機相の容積比が１００〜０．０１の間にある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記反応混合物が、水相および第２の有機相を含み、水相：有機相の容積比が２０〜０．１の間にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応混合物が、水相および第２の有機相を含み、水相：有機相の容積比が２０〜１の間にある、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ケトンの（Ｒ）−選択的アミノ化のための方法およびこの方法で使用するための酵素に関する。
【０００２】
相当数の医薬として活性な化合物（既存および開発中）が、天然アミノ酸から合成的に直接誘導することができないキラルアミン官能性を含有している。医薬製造業者によれば、ケトンからのアミンの不斉合成は、今後最も所望される反応の１つである（Ｃｏｎｓｔａｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍ．２００７，９，４１１）。さらに、それらの医薬として活性な化合物の合成において、「グリーン」経路に可能な限り依存することが医薬製造業者の目標である。したがって、生体触媒による変換が好ましい。
【０００３】
キラルアミンの生体触媒による生成のための魅力的な経路は、式［１］に示す、ケトンおよびアミンドナーを出発とする立体選択的アミノ基転移である。
【化１】
0005999565.tif 000002
【０００４】
必要とされる立体選択的酵素（互換的にトランスアミナーゼ、アミノトランスフェラーゼ、またはアミノフェラーゼと呼ばれる）として、例えば、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）由来の（Ｓ）−選択的ω−トランスアミナーゼ（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，６１，４６３）が報告されている。ただし、（Ｓ）−選択的酵素は、（Ｒ）−選択的酵素よりもはるかに豊富である。
【０００５】
例えば、立体選択的トランスアミナーゼは、欧州特許刊行物の欧州特許第１０３８９５３号明細書および欧州特許第９８７３３２号明細書に記載されている。
【０００６】
欧州特許第１０３８９５３号明細書は、ｓｅｃ‐ブチルアミンの存在下で光学活性な（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンを合成することができるトランスアミナーゼをコードするＤＮＡに関する。
【０００７】
欧州特許第９８７３３２号明細書は、具体的には、鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンおよび２−ブタノンへのアセトフェノンおよびｓｅｃ‐ブチルアミンの立体選択的アミノ基転移を触媒することができるマイコバクテリウム・オーラム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒｕｍ）種由来のトランスアミナーゼに関する。同じトランスアミナーゼはまた、鏡像異性的に濃縮された（Ｓ）−α−メチルベンジルアミンを得るための（ＲＳ）−α−メチルベンジルアミンまたはラセミ分割ならびに鏡像異性的に濃縮されたＤ−アラニンおよびＤ−セリンの合成に使用される。
【０００８】
米国特許第７１６９５９２号明細書は、組換えトランスアミナーゼをコードするアルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）種由来のＤＮＡに関し、このトランスアミナーゼは、アミノドナーの存在下でいくつかのケトンの（Ｒ）−立体特異的アミノ基転移を触媒し、鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミンを生成することができる。
【０００９】
より広範囲の化合物に立体選択的アミノ基転移反応を適用することができるように、さらなる立体選択的トランスアミナーゼに対する必要性がある。
【００１０】
本発明は、新規トランスアミナーゼの使用により、一般式［１］「ａ］の対応するケトンから一般式［１］［ｃ］の鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミンを酵素的に合成するための方法に関する。
【００１１】
これらの新規トランスアミラーゼは、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｂ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｄ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｅ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｆ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｇ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｈ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｊ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｋ）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｌ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｍ）配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｎ）配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｏ）配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｐ）配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｑ）配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｒ）配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｓ）配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；
ｔ）配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質；および
ｕ）トランスアミナーゼ活性を有し、かつラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、オクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）、オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、シノリゾビウム・モレレンス（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｏｒｅｌｅｎｓｅ）、クルトバクテリウム・プシルム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｓｉｌｌｌｕｍ）、ペキロマイセス・リアシヌス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ）、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、エルシニア・クリステンセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ）、アクロモバクター・スパニウス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｎｉｕｓ）、アクロモバクター・インソリタス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｓｏｌｉｔｕｓ）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム・フレデリクスバーゲンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム・サクルム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｒｕｍ）、マイコバクテリウム・フルオランセニボランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌｕｏｒａｎｔｈｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、バークホルデリア・トロピカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）、コスモスポラ・エピスファエリア（Ｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｅｐｉｓｐｈａｅｒｉａ）、およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からなる生物の群から選択される微生物から単離されるタンパク質、
からなる群から選択される。
【００１２】
本発明によれば、デフォルト設定のＣｌｕｓｔａｌＷ２多重配列アラインメント（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２，Ｌａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００７，２３，２９４７）を使用した配列アラインメント研究により、本発明の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、および２５のトランスアミナーゼでは、トランスアミナーゼの野生型アミノ酸配列である配列番号１との同一性パーセントが広範囲にわたって変動することが見出された。配列番号１との同一性パーセントが約３０％であっても、極めて適切なトランスアミナーゼが本発明により見出されている。
【００１３】
しかしながら、本発明者らは、本発明で使用することができるトランスアミナーゼ（およびそれから誘導される変異体）はすべて、共通して、配列番号１の野生型アミノ酸配列と比較すると、配列番号１のアミノ酸配列の下記位置に対応する位置に、少なくとも３７の保存アミノ酸、すなわちＡ３２、Ａ４４、Ｄ５０、Ｇ５２、Ｄ５７、Ｙ６０、Ｖ６５、Ｇ６８、Ｆ７１、Ｌ７３、Ｒ７９、Ｖ１０６、Ｖ１１６、Ｒ１２２、Ｇ１２３、Ｐ１４５、Ｐ１７７、Ｋ１８０、Ｎ１８１、Ｗ１８３、Ｄ１８５、Ｅ２１３、Ｇ２１６、Ｎ２１８、Ｐ２３０、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｒ２４０、Ｖ２４３、Ｅ２６９、Ａ２７６、Ｇ２７７、Ｇ２７８、Ｐ２８１、Ｇ２９６、Ｗ３０７、およびＹ３２１を有することを見出した。
【００１４】
配列番号１のトランスアミナーゼの野生型アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置に対応する野生型または変異型タンパク質配列のアミノ酸残基は、デフォルト設定のＣｌｕｓｔａｌＷ２多重配列アラインメントを実施することにより同定することができる。このようなアライメントにおいて、配列番号１で示されるトランスアミナーゼ配列のアミノ酸残基と同じ列に配置されるアミノ酸残基は、配列番号１のトランスアミナーゼ配列のこの各アミノ酸残基に対応する位置にあると定義される。
【００１５】
微生物ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、オクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）、オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、シノリゾビウム・モレレンス（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｏｒｅｌｅｎｓｅ）、クルトバクテリウム・プシルム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｓｉｌｌｌｕｍ）、ペキロマイセス・リアシヌス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ）、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、エルシニア・クリステンセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ）、アクロモバクター・スパニウス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｎｉｕｓ）、アクロモバクター・インソリタス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｓｏｌｉｔｕｓ）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム・フレデリクスバーゲンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム・サクルム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｒｕｍ）、マイコバクテリウム・フルオランセニボランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌｕｏｒａｎｔｈｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、バークホルデリア・トロピカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）、コスモスポラ・エピスファエリア（Ｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｅｐｉｓｐｈａｅｒｉａ）、およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の各試料は、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ）  ａｔ  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに２０１０年７月１３日に寄託された。
【００１６】
上記化学構造［１］［ａ］および［１］［ｃ］では、Ｒ１およびＲ２は異なっており、かつ独立して直鎖もしくは分岐鎖脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、ヘテロ芳香族でありうるか、または環式構造を形成することができる。
【００１７】
より具体的には、Ｒ１およびＲ２は異なっており、かつＲ１およびＲ２は、独立して１〜３０の炭素原子を含有し、Ｒ１およびＲ２は、独立して、置換または非置換脂肪族；置換または非置換分岐鎖脂肪族；置換または非置換環状脂肪族；少なくとも１つの酸素、イオウ、または窒素原子を含有する置換または非置換ヘテロ環式脂肪族；置換または非置換芳香族；少なくとも１つのイオウ、酸素、または窒素原子を含有する置換または非置換ヘテロ環式芳香族であるか；あるいは一緒になって、置換もしくは非置換環式構造または少なくとも１つの酸素、イオウ、もしくは窒素原子を含有するヘテロ環式構造を形成し；これらの置換基は、これらに限定されないが、ハロゲン原子、炭素原子数１〜６のアルキル基、ヒドロキシル基、メトキシ基、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、およびトリフルオロメチル基からなる群から選択される。
【００１８】
好ましくは、鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミン生成物の最終濃度は、反応混合物の１〜５０重量％の間にある。最も好ましくは、鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミン生成物の最終濃度は、反応混合物の５〜３５重量％の間にある。
【００１９】
本発明の方法は、すべての反応物が溶解している水性反応混合物、または反応物の一部が少なくとも部分的に溶解し、反応物の一部が少なくとも部分的に固形物になっているスラリー状の水性反応混合物において実施することができる。
【００２０】
トランスアミナーゼを含有する緩衝化された水相に隣接して第２の液層を形成する有機溶媒などの非水混和性溶媒の使用は、有機溶媒が難水溶性のケトンおよびアミノドナーのリザーバーとして機能することができるため、純粋な水性反応または水性スラリー反応よりもトランスアミナーゼ反応において有利となりうる。これにより、スラリー反応（固体−水）と比較して、難水溶性のケトンまたはアミノドナーがトランスアミナーゼを含有する水相に溶出するための物質移動速度を増加させることができる。さらに、これにより、潜在的な基質または生成物阻害を、これらの潜在的阻害物質の抽出除去により、減少させることができる。さらに、トランスアミナーゼ反応生成物の少なくとも１つのそのような抽出除去により、水相におけるトランスアミナーゼ反応の平衡が生成物側に傾くため、トランスアミナーゼ触媒反応の収率および／または効率を改善することができる。
【００２１】
本発明の工程は、水相および第２の有機相を含む反応混合物中で実施することができる。水相および第２の有機相を含む反応混合物を使用する場合は、反応混合物は、好ましくは、水相および第２の有機相を含み、水相：有機相の容積比は１００〜０．０１の間である。より好ましくは、反応混合物は、水相および第２の有機相を含み、水相：有機相の容積比は２０〜０．１の間である。より好ましくは、反応混合物は、水相および第２の有機相を含み、水相：有機相の容積比は２０〜１の間である。
【００２２】
適切な有機溶媒は、例えば、これらに限定されないが、シクロヘキサノン、ジクロロメタン、ペンタン、ヘプタン、ＭＴＢＥ（メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル）、トルエン、２−メチル−テトラヒドロフラン、酢酸ブチル、および酢酸エチルの群から選択することができる。
【００２３】
本発明の上記トランスアミナーゼａ）〜ｍ）は、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（２０１０年６月１５日に公開）、ＲｅｆＳｅｑ、またはＥＭＢＬ−ＥＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ）もしくはＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）サーバー経由の非重複データのような公開ヌクレオチドおよびポリペプチドデータベースのデータベース検索で、分岐鎖Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼまたはピリドキサル５’−リン酸依存性酵素クラスＩＶ（ＰＬＰＤＥ＿ＩＶ）スーパーファミリーに帰属する４−アミノ−４−デオキシコリスマートリアーゼ（ＥＣ４．１．３．３８）に高度な類似性を有する「仮想タンパク質」と注釈を付けられたものが同定されている。この注釈を支持する機能的発現および活性は、これまで報告されていない。
【００２４】
驚くべきことに、トランスアミナーゼａ）〜ｍ）は、実際、以下に記載されるように、（Ｓ）−選択的アミノ酸アミノトランスフェラーゼではなく（Ｒ）−選択的ω−トランスアミナーゼであることが見出された。さらに、トランスアミナーゼａ）〜ｍ）は、欧州特許第１０３８９５３号明細書、欧州特許第９８７３３２号明細書、および米国特許第７１６９５９２号明細書に記載の（Ｒ）−トランスアミナーゼとは基質スペクトルが異なっている。
【００２５】
本発明の上記トランスアミナーゼａ）〜ｔ）は、以下のω−トランスアミナーゼ変換の１つまたは複数におけるそれらの活性および鏡像異性選択性によって特徴づけられた。
【００２６】
[（ｉ）（ＲＳ）−α−メチルベンジルアミンのラセミ分割］
【化２】
0005999565.tif 000003
酵素一般、具体的にはトランスアミナーゼの鏡像異性選択性は、キラル中心を含む基質のラセミ混合物のラセミ分割で決定することができる。本発明によれば、（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼは、ピルビン酸などのケトン基質の存在下で、（Ｒ）−α−メチルベンジルアミン（ＭＢＡ）をラセミＭＢＡから優先的にアミノ基転移させる酵素である。本発明の（Ｒ）−トランスアミナーゼは、ピルビン酸の存在下で、α−メチルベンジルアミンの（Ｓ）−鏡像異性体よりも（Ｒ）−鏡像異性体を優先的に変換する酵素であり、それによって、少なくとも１０％の鏡像異性過剰（ｅ．ｅ．）となる、残存（Ｓ）−鏡像異性体の濃縮が生じる。好ましくは、（Ｓ）−ＭＢＡの得られるｅ．ｅ．は、少なくとも５０％である。より好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも６０％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも７０％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも８０％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９０％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９５％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９６％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９７％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９８％である。最も好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９９％である。
【００２７】
典型的には、８０ｍＭラセミα−メチルベンジルアミン（ＭＢＡ）を、０．１ｍＭピリドキサル５′−リン酸（ＰＬＰ）を含有する１００ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）緩衝液ｐＨ７．０中で、トランスアミナーゼの存在下、２８℃で２０時間、４０ｍＭピルビン酸ナトリウムと反応させる。（Ｒ）−および／または（Ｓ）−ＭＢＡの濃度および鏡像異性過剰は、例えば、適切なキラルカラム材料を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により決定することができる。（Ｒ）−トランスアミナーゼの調製形態は、重要ではない；（Ｒ）−トランスアミナーゼは、（部分的に）精製された酵素、無細胞抽出物（ＣＦＥ）、もしくは粗細胞抽出物；液体、粉末、もしくは固定形態；透過性細胞、細胞全体、もしくはトランスアミナーゼを含む細胞を含有する培養液、または任意の他の形態として加えることができる。
【００２８】
[（ｉｉ）α−メチルベンジルアミンの純粋な鏡像異性体に対する活性および選択性］
酵素の鏡像異性選択性はまた、特異的基質の個々の鏡像異性体へのその比活性によって特徴づけられる。これらは、高光学純度形態の個々の基質について、個別に活性測定して決定することができる。本発明によれば、α−メチルベンジルアミン（ＭＢＡ）の２つの鏡像異性体に対するトランスアミナーゼ比活性は、トランスアミナーゼの（Ｒ）−選択性の尺度となる。本発明の文脈では、（Ｓ）−ＭＢＡに関する比活性に対する（Ｒ）−ＭＢＡに関する比活性比が、トランスアミナーゼ鏡像異性選択性値（ＴＥＶ）として定義される。（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼとは、ＴＥＶ値が１を超えるトランスアミナーゼとして定義される。トランスアミナーゼの良好な（Ｒ）−選択性とは、（Ｓ）−ＭＢＡに対する（Ｒ）−ＭＢＡの比活性比であるＴＥＶが１０以上であるとして定義される。トランスアミナーゼの高度な（Ｒ）−選択性とは、（Ｓ）−ＭＢＡに対する（Ｒ）−ＭＢＡの比活性比であるＴＥＶが１００以上であるとして定義される。
【化３】
0005999565.tif 000004
【００２９】
（Ｒ）−および（Ｓ）−ＭＢＡに対するトランスアミナーゼ比活性は、分光光度法を使用して個別に測定される。最終反応容量を１ｍｌとして、適切に希釈された液体形態のトランスアミナーゼ５０μｌを、０．１ｍＭ  ＰＬＰ含有５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液ｐＨ７．５の存在下で、１２．５ｍＭ  （Ｒ）−または（Ｓ）−ＭＢＡおよび５ｍＭピルビン酸ナトリウムとキュベット中で混合する。３０℃で５分間プレインキュベートした後、０．５Ｍピルピン酸ナトリウム（５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＰＬＰ中）１０μｌを他のアッセイ成分に添加して反応を開始する。ピルピン酸ナトリウムの添加後、３００ｎｍの吸収を記録し、３００ｎｍでのアセトフェノンのモル吸光係数ε＝０．２８ｃｍ２／μｍｏｌを使用して、ランバート−ベールの法則に従って試料中のトランスアミナーゼ活性を計算する。トランスアミナーゼ活性の１単位（Ｕ）は、０．１ｍＭ  ＰＬＰ含有５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液ｐＨ７．５中で、１２．５ｍＭ（Ｒ）−ＭＢＡまたは（Ｓ）−ＭＢＡおよび５ｍＭピルピン酸ナトリウムから、３０℃で１分間にアセトフェノン１μｍｏｌを形成するものとして定義される。ＣＦＥのトランスアミナーゼ比活性（Ｕ／ｍｇ総ＣＦＥタンパク質）は、容積活性値（Ｕ／ｍｌ  ＣＦＥ）をトランスアミナーゼ液体試料中の総タンパク質濃度で割ることにより計算される。トランスアミナーゼ鏡像異性選択性値（ＴＥＶ）は、（Ｒ）−ＭＢＡに対する容積活性または比活性をそれぞれ、（Ｓ）−ＭＢＡに対する容積活性または比活性で割ることにより計算される。
【００３０】
好ましくは、（Ｒ）−トランスアミナーゼのＴＥＶは少なくとも１であり、より好ましくは、（Ｒ）−トランスアミナーゼのＴＥＶは少なくとも１０であり、より一層好ましくは、（Ｒ）−トランスアミナーゼのＴＥＶは少なくとも１００である。
【００３１】
[（ｉｉｉ）対応するケトンおよびベンジルアミンまたはα−メチルベンジルアミンなどの適切なアミノドナーからの鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミンの合成］
（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼにより触媒される反応の所望される典型的な結果は、アミノドナーおよびケトン基質からの、式１［ｃ］に記載の鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミンの形成である。（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼ反応にとって適切なアミノドナーは、例えば、ラセミＭＢＡもしくは（Ｒ）−ＭＢＡ、ラセミ１−アミノインダンもしくは（Ｒ）−１−アミノインダン、ラセミ１−アミノテトラリンもしくは（Ｒ）−１−アミノテトラリン、ラセミアラニンもしくはＤ−アラニン、イソプロピルアミン、ベンジルアミン、ラセミｓｅｃ−ブチルアミン（２−アミノブタン）もしくは（Ｒ）−ｓｅｃ−ブチルアミン（２−アミノブタン）、β−アラニン、またはラセミ３−アミノ酪酸もしくはＤ−３−アミノ酪酸を含む。
【００３２】
一般に、特定のトランスアミナーゼに対しては、特定のアミノドナーが好ましい。驚くべきことに、我々は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２３、および配列番号４３のトランスアミナーゼについて、好ましいアミノドナーは、ラセミＭＢＡもしくは（Ｒ）−ＭＢＡ、またはラセミｓｅｃ−ブチルアミンもしくは（Ｒ）−ｓｅｃ−ブチルアミンであることを見出した。
【００３３】
典型的には、７０ｍＭアミノドナーを、１００ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）でｐＨ７．５に緩衝化された水性反応混合物中で、（Ｒ）−トランスアミナーゼ存在下、２８℃で７０ｍＭケトン基質と反応させる。場合によっては、水混和性または水非混和性溶媒を使用して、アミノドナーまたはケトン基質を可溶化することができる。本発明の（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼは、等モル量のアミノドナーおよびケトン基質から出発して、２８℃で一晩にわたる反応の後に、少なくとも５０％の鏡像異性過剰を有する鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミンを有する所望の鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミンへの少なくとも最低０．５％の変換を示すことになる。（Ｒ）−トランスアミナーゼの形態は、重要ではない；（Ｒ）−トランスアミナーゼは、（部分的に）精製された酵素、無細胞抽出物、もしくは粗細胞抽出物；液体、粉末、もしくは固定形態；透過性細胞、細胞全体、もしくはトランスアミナーゼを含む細胞を含有する培養液、または任意の他の形態として加えることができる。
【００３４】
トランスアミナーゼ反応が可逆反応であり、その変換率が特異的な基質および生成物の平衡により影響を受けることは当業者には公知である。さらに、等モルのアミノドナーおよびケトン基質濃度における基質変換率を、例えば、反応生成物の１つを蒸発させることによりその場で生成物を除去すること、または樹脂を使用すること、またはピルビン酸デカルボキシラーゼまたは乳酸デヒドロゲナーゼなど、反応生成物の１つをさらに変換する酵素を添加することによって、増加させることができることは当業者には公知である。さらに、ケトン基質１［ａ］のアミン生成物１［ｃ］への変換率は、過剰量のアミノドナー１［ｂ］によって増加させることができる。
【００３５】
好ましくは、生成された鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミンは、少なくとも５０％のｅ．ｅ．を有する。より好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも６０％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも７０％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも８０％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９０％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９５％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９６％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９７％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９８％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９９％である。最も好ましくは、生成された鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）アミンは、９９％を超えるｅ．ｅを有する。
【００３６】
本出願では、「（参照配列）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質」とは、そのようなタンパク質が、ＢＬＡＳＴＰ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２）、またはＡｌｉｇｎ  Ｐｌｕｓ  ５（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＆  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）などの配列アラインメントツールを用いて実施される配列アラインメントで決定された場合に、参照配列のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、それぞれの参照配列のホモログであることを意味する。
【００３７】
用語「ホモログ」は、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、より具体的には少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、具体的に本明細書で使用される。用語ホモログはまた、遺伝暗号の縮重により他の核酸配列とは異なるが、同じポリペプチド配列をコードする核酸配列（ポリヌクレオチド配列）も含むことを意味する。
【００３８】
本明細書においては、配列同一性または配列類似性は、配列の比較により決定される、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上の核酸配列間の関係として定義される。通常、配列同一性または配列類似性は配列の全長にわたって比較するが、互いにアライメントした配列の一部に対してのみ比較する場合もある。当技術分野では、「同一性」または「類似性」はまた、場合によってはそのような配列間の一致によって決定される、ポリペプチド配列間または核酸配列間の配列関連性度を意味する。同一性または類似性を決定する好ましい方法は、検査される配列間に最大の一致を与えるように設計されている。本発明の文脈では、２つの配列間の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法としては、ＮＣＢＩならびに他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）から公的に入手できるＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，２１５，４０３−４１０）が挙げられる。ＢＬＡＳＴＰを使用するポリペプチド配列比較用の好ましいパラメーターは、ギャップ開始１０．０、ギャップ伸長０．５、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスである。ＢＬＡＳＴＮを使用する核酸配列比較用の好ましいパラメーターは、ギャップ開始１０．０、ギャップ伸長０．５、ＤＮＡ完全マトリックス（ＤＮＡ同一性マトリックス）である。
【００３９】
本発明のトランスアミナーゼは、任意の形態で使用することができる。例えば、トランスアミナーゼは、例えば分散液、溶液、または固定化形態で、粗酵素として、市販酵素として、市販調製物からさらに精製された酵素として、公知精製法を組み合わせてその供給源から得られた酵素として、天然にまたは遺伝子改変によって必要とされるトランスアミナーゼ活性を有する全（場合によっては透過化および／または固定化）細胞で、またはそのような活性を有する細胞の溶解物で、使用することができる。
【００４０】
本発明の方法におけるトランスアミナーゼを含む細胞は、当技術分野でそれ自体公知である分子生物学的手法を使用して構築することができる。例えば、トランスアミナーゼを異種の系で生成させることにする場合、トランスアミナーゼをコードする遺伝子を含むベクターを準備するためにそのような手法を使用することができる。
【００４１】
トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ポリペプチドの発現レベルを改善するために、ポリペプチドの生成に使用される宿主細胞の好ましいコドン使用に適合させることができる。このような適合を達成するための適切な方法は、例えば、国際公開第０８０００６３２号パンフレットに記載のコドン対最適化（Ｃｏｄｏｎ−Ｐａｉｒ−Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）である。
【００４２】
このような遺伝子を含むベクターは、トランスアミナーゼをコードする遺伝子に機能的に連結することができる１つまたは複数の調節エレメント、例えば１つまたは複数のプロモーターを含むことができる。このようなベクターの例は、ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣ、ｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ４９、ｐＥＴ−ＤＥＳＴ４２（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のようなプラスミド、ｐＥＴ系列のプラスミド、例えばｐＥＴ−２６ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）またはｐＭＳ４７０Δ８（Ｂａｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，２０（８）：１８５１−１８５８）を含む。
【００４３】
本明細書で使用する用語「実施可能に連結された」とは、機能的な関係にあるポリヌクレオチドエレメント（またはコード配列もしくは核酸配列）の連結を指す。核酸配列は、それが別の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合、「実施可能に連結されて」いる。例えばプロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、それはコード配列と実施可能に連結している。
【００４４】
本明細書で使用する用語「プロモーター」とは、遺伝子の転写開始部位の転写方向に関して上流に位置して、１つまたは複数の遺伝子の転写を制御するために機能し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのための結合部位、転写開始部位、ならびにこれらに限定されないが、転写因子結合部位、リプレッサー、および活性化タンパク質結合部位を含む、他の任意のＤＮＡ配列の存在、ならびに直接的または間接的に作用してプロモーターからの転写量を調節する、当業者には公知の他の任意のヌクレオチド配列によって構造的に同定される核酸断片を指す。「構成的」プロモーターとは、大部分の環境および発生の条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、環境および発生の調節下で活性なプロモーターである。所与の（組換え）核酸またはポリペプチド分子と所与の宿主生物または宿主細胞との間の関係を示すために使用する場合、用語「同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」とは、自然界ではその核酸またはポリペプチド分子が、同じ種の、好ましくは同じ品種または株の宿主細胞または生物によって産生されることを意味するものと理解される。
【００４５】
本明細書で上記に記載されたものなど、本発明の方法で使用するための酵素、具体的にはトランスアミナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現を達成するために使用することができるプロモーターは、その発現される酵素をコードするヌクレオチド配列にとって天然のものであってもよく、またそれが実施可能に連結しているヌクレオチド配列（コード配列）にとって異種であってもよい。プロモーターはその宿主細胞と同種、すなわち内因性であることが好ましい。
【００４６】
異種プロモーター（目的の酵素をコードするヌクレオチド配列にとって）を使用する場合、この異種プロモーターは、そのコード配列にとって天然のものであるプロモーターより、高い定常状態レベルでそのコード配列を含む転写産物を生成することができる（または、単位時間当たり、より多くの転写分子すなわちｍＲＮＡ分子を生成することができる）ことが好ましい。この文脈で適切なプロモーターとしては、構成的および誘導性の両方の天然プロモーターならびに人工プロモーターが挙げられ、これらは当業者には周知である。
【００４７】
「強力な構成的プロモーター」とは、天然の宿主細胞に比べて、ｍＲＮＡを高頻度で発生させるプロモーターである。
【００４８】
グラム陽性微生物におけるこのような強力な構成的プロモーターの例としては、ＳＰ０１−２６、ＳＰ０１−１５、ｖｅｇ、ｐｙｃ（ピルベートカルボキシラーゼプロモーター）、およびａｍｙＥが挙げられる。
【００４９】
グラム陽性微生物における誘導プロモーターの例としては、ＩＰＴＧ誘導性Ｐｓｐａｃプロモーター、キシロース誘導性ＰｘｙｌＡプロモーターが挙げられる。
【００５０】
グラム陰性微生物における構成的および誘導性プロモーターの例としては、これらに限定されないが、ｔａｃ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃｌｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ（ＰＢＡＤ）、ＳＰ６、λ−ＰＲ、およびλ−ＰＬが挙げられる。
【００５１】
酵母および真菌類などの真核微生物における構成的および誘導性プロモーターの例としては、これらに限定されないが、ＡＯＸ−、ＧＡＰ−、およびＴＥＦ−プロモーターが挙げられる。
【００５２】
用語「異種」とは、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはタンパク質に関して使用される場合、それが存在する生物、細胞、ゲノム、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の一部としては天然に存在しない核酸またはタンパク質を指すか、あるいはそれが自然界に見出されるものとは異なる細胞の中に、またはゲノムまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の中の一部位または複数部位の中に見出される核酸またはタンパク質を指す。これら異種の核酸またはタンパク質は、それが導入される細胞にとって内因性のものではないが、別の細胞から得られたものか、または合成もしくは組換えにより生成されたものである。必ずしもそうとは限らないが、一般にそのような核酸は、そのＤＮＡが転写または発現される細胞によって通常は産生されないタンパク質をコードする。同様に外因性ＲＮＡは、その外因性ＲＮＡが存在する細胞中で通常は発現されないタンパク質をコードする。これら異種の核酸およびタンパク質はまた、外来の核酸およびタンパク質と呼ぶこともできる。それを発現する細胞にとって異種または外来であると当業者が認識する任意の核酸またはタンパク質は、本明細書においては異種の核酸およびタンパク質という用語によって包含される。
【００５３】
宿主細胞または微生物は、具体的には、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、およびピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる属の群から選択することができる。具体的には、トランスミナーゼ（ｔｒａｎｓｍｉｎａｓｅ）の生成に適した宿主株、つまり宿主細胞は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・クリゾゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞の群から選択することができる。
【００５４】
上記のｎ）で言及のトランスアミナーゼ活性を有するタンパク質は、オランダおよびドイツで収集された土壌試料に存在する微生物により生成される。これらの微生物は、増殖するための微生物の唯一の窒素源として（Ｒ）−アミンを使用する培地中で、これらの土壌試料から増菌された。この目的のために、以下の６つの構造的に多様な（Ｒ）−アミンが唯一の窒素源として使用された：（Ｒ）−２−アミノブタン、（Ｒ）−３，３−ジメチル−２−アミノブタン、（Ｒ）−α−メチルベンジルアミン、（Ｒ）−α−エチルベンジルアミン、（Ｒ）−１−アミノインダン、および（Ｒ）−１−アミノテトラリン）。
【００５５】
液体培地中での増菌に続いて、微生物を、唯一の窒素源としてそれぞれの（Ｒ）−アミンを含有する寒天プレート上で単離し、純粋培養物を再度それぞれの液体増菌培地中で増殖させ、全細胞系におけるトランスアミナーゼ反応のために使用した。得られる生成（Ｒ）−アミンの変換および鏡像異性過剰は、ＨＰＬＣまたはＧＣ分析によりモニターされた。
【００５６】
（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼにより触媒される反応の所望される典型的な結果は、アミノドナーおよびケトン基質からの、式１［ｃ］に記載の鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミンの形成である。（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼ反応にとって適切なアミノドナーは、例えば、ラセミＭＢＡもしくは（Ｒ）−ＭＢＡ、ラセミ１−アミノインダンもしくは（Ｒ）−１−アミノインダン、ラセミ１−アミノテトラリンもしくは（Ｒ）−１−アミノテトラリン、ラセミアラニンもしくはＤ−アラニン、イソプロピルアミン、ベンジルアミン、ラセミｓｅｃ−ブチルアミン（２−アミノブタン）もしくは（Ｒ）−ｓｅｃ−ブチルアミン（２−アミノブタン）、β−アラニン、またはラセミ３−アミノ酪酸もしくはＤ−３−アミノ酪酸を含む。
【００５７】
典型的には、８０ｍＭアミノドナーを、１００ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）でｐＨ７．５に緩衝化された水性反応混合物中で、（Ｒ）−トランスアミナーゼ存在下、２８℃で４０ｍＭケトン基質と反応させる。好ましくは、１００ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）でｐＨ７．５に緩衝化された水性反応混合物中で、（Ｒ）−トランスアミナーゼ存在下、２８℃で少なくとも１００ｍＭのケトン基質を使用する。場合によっては、水混和性または水非混和性溶媒を使用して、アミノドナーまたはケトン基質を可溶化することができる。本発明の（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼは、等モル量のアミノドナーおよびケトン基質から出発して、２８℃で一晩にわたる反応の後に、少なくとも５０％の鏡像異性過剰を有する鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミンを有する所望の鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミンへの少なくとも０．５％の低変換を示すことになる。
【００５８】
（Ｒ）−トランスアミナーゼの形態は、重要ではない；（Ｒ）−トランスアミナーゼは、（部分的に）精製された酵素、無細胞抽出物、もしくは粗細胞抽出物；液体、粉末、もしくは固定形態；透過性細胞、細胞全体、もしくはトランスアミナーゼを含む細胞を含有する培養液、または任意の他の形態として加えることができる。
【００５９】
トランスアミナーゼ反応が可逆反応であり、その変換率が特異的な基質および生成物の平衡により影響を受けることは当業者には公知である。さらに、等モルのアミノドナーおよびケトン基質濃度における基質変換率を、例えば、反応生成物の１つを蒸発させることによりその場で生成物を除去すること、または樹脂を使用すること、またはピルビン酸デカルボキシラーゼもしくは乳酸デヒドロゲナーゼなど、反応生成物の１つをさらに変換する酵素を添加することによって、増加させることができることは当業者には公知である。
【００６０】
好ましくは、生成された鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミンは、少なくとも５０％のｅ．ｅ．を有する。より好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも６０％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも７０％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも８０％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９０％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９５％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９６％である。より一層好ましくは、ｅ．ｅ．は少なくとも９７％である。最も好ましくは、生成された鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミンは、少なくとも９９％のｅ．ｅ．を有する。
【００６１】
最終結果は、３１種の微生物の収集であり、それらの特徴は表１に示すとおりである。
【００６２】
【表１】
0005999565.tif 000005
【００６３】
テトラロンから鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミノテトラリンを合成するために、好ましくは、微生物シノリゾビウム・モレレンス（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｏｒｅｌｅｎｓｅ）、ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、もしくはオクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）、またはこれらの種のいずれかから得られるトランスアミナーゼが使用される。より好ましくは、微生物ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）もしくはオクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）、またはこれらの種のいずれかから得られるトランスアミナーゼ。最も好ましくは、微生物オクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）またはこの種から得られるトランスアミナーゼが使用される。
【００６４】
インダノンから鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）アミノインダンを合成するために、好ましくは、微生物ペキロマイセス・リアシヌス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ）もしくはクルトバクテリウム・プシルム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｓｉｌｌｕｍ）、またはこれらの種のいずれかから得られるトランスアミナーゼが使用される。最も好ましくは、微生物クルトバクテリウム・プシルム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｓｉｌｌｕｍ）またはこの種から得られるトランスアミナーゼが使用される。
【００６５】
プロピオフェノンから鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−α−エチルベンジルアミンを合成するために、好ましくは、微生物ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、エルシニア・クリステンセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、もしくはオクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）、またはこれらの種のいずれかから得られるトランスアミナーゼが使用される。より好ましくは、微生物エルシニア・クリステンセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、またはオクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）、またはこれらの種のいずれかから得られるトランスアミナーゼが使用される。より一層好ましくは、微生物シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）もしくはオクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）、またはこれらの種のいずれかから得られるトランスアミナーゼが使用される。最も好ましくは、微生物オクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）またはこの種から得られるトランスアミナーゼが使用される。
【００６６】
アセトフェノンから鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンを合成するために、好ましくは、微生物マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、もしくはアクロモバクター・スパニウス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｎｉｕｓ）、またはこれらの種のいずれかから得られるトランスアミナーゼが使用される。より好ましくは、微生物オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）もしくはアクロモバクター・スパニウス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｎｉｕｓ）、またはこれらの種のいずれかから得られるトランスアミナーゼが使用される。最も好ましくは、微生物アクロモバクター・スパニウス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｎｉｕｓ）またはこの種から得られるトランスアミナーゼが使用される。
【００６７】
３，３−ジメチル−２−ブタノンから鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−３，３−ジメチル−２−アミノブタンを合成するために、好ましくは、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物またはこの属から得られるトランスアミナーゼが使用される。より好ましくは、マイコバクテリウム・フレデリクスバーゲンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム・サクルム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｒｕｍ）、もしくはマイコバクテリウム・フルオランセニボランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌｕｏｒａｎｔｈｅｎｉｖｏｒａｎｓ）の群からの微生物、またはこれらの種の１つから得られるトランスアミナーゼが、それぞれ使用される。より一層好ましくは、微生物ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）もしくはアクロモバクター・インソリタス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｓｏｌｉｔｕｓ）、またはこれらの種のいずれかから得られるトランスアミナーゼが使用される。最も好ましくは、微生物アクロモバクター・インソリタス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｓｏｌｉｔｕｓ）またはこの種から得られるトランスアミナーゼが使用される。
【００６８】
２−ブタノンから鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−２−アミノブタンを合成するために、好ましくは、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の微生物またはこの属から得られるトランスアミナーゼが使用される。より好ましくは、コスモスポラ・エピスファエリア（Ｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｅｐｉｓｐｈａｅｒｉａ）もしくはフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の群からの微生物、またはこれらの種のいずれかから得られるトランスアミナーゼが、それぞれ使用される。より一層好ましくは、微生物ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）またはこの種から得られるトランスアミナーゼが使用される。最も好ましくは、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、バークホルデリア・トロピカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）もしくはラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）の群からの微生物、またはこれらの種のいずれかから得られるトランスアミナーゼが、それぞれ使用される。
【００６９】
寄託されたプールからの個々の微生物の再単離は、プールされた微生物を適切に希釈して播種し、それらが初めに増菌された、それぞれの（Ｒ）−アミンを含有する選択増菌培地上に再画線することにより達成することができる。均一形態のコロニーのみが得られるまで、それぞれの（Ｒ）−アミンを含有する選択的増菌培地上への再画線を反復して実施する。続いて、１６ＳリボソームＲＮＡまたはＤ２−ＬＳＵリボソームＲＮＡの配列決定を、例えば検証済みのＭｉｃｒｏＳＥＱ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）システムを使用して実施し、個々の微生物を再同定する。
【００７０】
表１の株から得ることができるトランスアミナーゼには、表１の株のトランスアミナーゼ遺伝子配列に由来した酵素が含まれる。これらの遺伝子配列は、ゲノム配列決定および公知トランスアミナーゼとの配列比較、ＤＮＡ単離および公知トランスアミナーゼ遺伝子と高度の同一性（少なくとも８０％）を有するＤＮＡ配列のプローブの使用、酵素精製および酵素配列決定、他の宿主生物へのこれらの株に由来するＤＮＡの形質転換および（Ｒ）−アミン上での増殖による選別、その後のＤＮＡ配列決定、またはこれらの手法の組合せ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７）など、当業者に公知の種々の方法により同定および単離することができる。
【００７１】
したがって、本発明はまた、ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）（ＤＳＭ  ２３７９７として寄託された）、オクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）（ＤＳＭ  ２３７９３として寄託された）、オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）（ＤＳＭ  ２３７８６として寄託された）、シノリゾビウム・モレレンス（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｏｒｅｌｅｎｓｅ）（ＤＳＭ  ２３７９４として寄託された）、クルトバクテリウム・プシルム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｓｉｌｌｌｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８７として寄託された）、ペキロマイセス・リアシヌス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ）（ＤＳＭ  ２３７７１として寄託された）、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８８として寄託された）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）（ＤＳＭ  ２３７９５として寄託された）、エルシニア・クリステンセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ）（ＤＳＭ  ２３７９２として寄託された）、アクロモバクター・スパニウス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｎｉｕｓ）（ＤＳＭ  ２３７９１として寄託された）、アクロモバクター・インソリタス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｓｏｌｉｔｕｓ）（ＤＳＭ  ２３７９０として寄託された）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８９として寄託された）、マイコバクテリウム・フレデリクスバーゲンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｅ）（ＤＳＭ  ２３７９８として寄託された）、マイコバクテリウム・サクルム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｒｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８５として寄託された）、マイコバクテリウム・フルオランセニボランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌｕｏｒａｎｔｈｅｎｉｖｏｒａｎｓ）（ＤＳＭ  ２３７９６として寄託された）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、バークホルデリア・トロピカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）（ＤＳＭ  ２３７９９として寄託された）、コスモスポラ・エピスファエリア（Ｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｅｐｉｓｐｈａｅｒｉａ）（ＤＳＭ  ２３７７２として寄託された）およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７７０として寄託された）からなる生物の群に由来する（Ｒ）−トランスアミナーゼ活性を有する酵素を含む微生物に関する。
【００７２】
さらなる実施形態によれば、本発明は、Ｃｐｕ−ＴＡ１［配列番号３０］、Ｃｐｕ−ＴＡ２［配列番号３３］、Ｃｐｕ−ＴＡ３［配列番号３５］、Ｒａｑ−ＴＡ２［配列番号３８］、Ｒａｑ−ＴＡ３［配列番号４０］、Ａｓｐ−ＴＡ１［配列番号４３］、およびＭｇｉ−ＴＡ１［配列番号４６］からなる群から選択される（Ｒ）−トランスアミナーゼ活性を有する酵素、またはこれらのアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質を含む微生物に関する。
【００７３】
さらなる実施形態によれば、本発明は、（Ｒ）−トランスアミナーゼ活性を有し、かつラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）（ＤＳＭ  ２３７９７として寄託された）、オクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）（ＤＳＭ  ２３７９３として寄託された）、オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）（ＤＳＭ  ２３７８６として寄託された）、シノリゾビウム・モレレンス（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｏｒｅｌｅｎｓｅ）（ＤＳＭ  ２３７９４として寄託された）、クルトバクテリウム・プシルム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｓｉｌｌｌｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８７として寄託された）、ペキロマイセス・リアシヌス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ）（ＤＳＭ  ２３７７１として寄託された）、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８８として寄託された）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）（ＤＳＭ  ２３７９５として寄託された）、エルシニア・クリステンセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ）（ＤＳＭ  ２３７９２として寄託された）、アクロモバクター・スパニウス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｎｉｕｓ）（ＤＳＭ  ２３７９１として寄託された）、アクロモバクター・インソリタス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｓｏｌｉｔｕｓ）（ＤＳＭ  ２３７９０として寄託された）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８９として寄託された）、マイコバクテリウム・フレデリクスバーゲンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｅ）（ＤＳＭ  ２３７９８として寄託された）、マイコバクテリウム・サクルム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｒｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８５として寄託された）、マイコバクテリウム・フルオランセニボランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌｕｏｒａｎｔｈｅｎｉｖｏｒａｎｓ）（ＤＳＭ  ２３７９６として寄託された）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、バークホルデリア・トロピカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）（ＤＳＭ  ２３７９９として寄託された）、コスモスポラ・エピスファエリア（Ｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｅｐｉｓｐｈａｅｒｉａ）（ＤＳＭ  ２３７７２として寄託された）およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７７０として寄託された）からなる生物の群から選択される生物から得ることができるポリペプチドに関する。
【００７４】
さらなる実施形態によれば、本発明は、（Ｒ）−トランスアミナーゼ活性および（Ｒ）−トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、かつラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）（ＤＳＭ  ２３７９７として寄託された）、オクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）（ＤＳＭ  ２３７９３として寄託された）、オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）（ＤＳＭ  ２３７８６として寄託された）、シノリゾビウム・モレレンス（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｏｒｅｌｅｎｓｅ）（ＤＳＭ  ２３７９４として寄託された）、クルトバクテリウム・プシルム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｓｉｌｌｌｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８７として寄託された）、ペキロマイセス・リアシヌス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ）（ＤＳＭ  ２３７７１として寄託された）、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８８として寄託された）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）（ＤＳＭ  ２３７９５として寄託された）、エルシニア・クリステンセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ）（ＤＳＭ  ２３７９２として寄託された）、アクロモバクター・スパニウス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｎｉｕｓ）（ＤＳＭ  ２３７９１として寄託された）、アクロモバクター・インソリタス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｓｏｌｉｔｕｓ）（ＤＳＭ  ２３７９０として寄託された）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８９として寄託された）、マイコバクテリウム・フレデリクスバーゲンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｅ）（ＤＳＭ  ２３７９８として寄託された）、マイコバクテリウム・サクルム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｒｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８５として寄託された）、マイコバクテリウム・フルオランセニボランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌｕｏｒａｎｔｈｅｎｉｖｏｒａｎｓ）（ＤＳＭ  ２３７９６として寄託された）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、バークホルデリア・トロピカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）（ＤＳＭ  ２３７９９として寄託された）、コスモスポラ・エピスファエリア（Ｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｅｐｉｓｐｈａｅｒｉａ）（ＤＳＭ  ２３７７２として寄託された）およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７７０として寄託された）からなる生物���群から選択される生物から得ることができるポリペプチドに関する。
【００７５】
さらなる実施形態によれば、本発明は、Ｃｐｕ−ＴＡ１［配列番号３０］、Ｃｐｕ−ＴＡ２［配列番号３３］、Ｃｐｕ−ＴＡ３［配列番号３５］、Ｒａｑ−ＴＡ２［配列番号３８］、Ｒａｑ−ＴＡ３［配列番号４０］、Ａｓｐ−ＴＡ１［配列番号４３］、およびＭｇｉ−ＴＡ１［配列番号４６］からなる群から選択される（Ｒ）−トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド、またはこれらのポリペプチド配列のいずれかと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質に関する。
【００７６】
さらなる実施形態によれば、本発明は、（Ｒ）−トランスアミナーゼ活性および（Ｒ）−トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、かつラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）（ＤＳＭ  ２３７９７として寄託された）、オクロバクテリウム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）（ＤＳＭ  ２３７９３として寄託された）、オクロバクテリウム・トリティシ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｔｒｉｔｉｃｉ）（ＤＳＭ  ２３７８６として寄託された）、シノリゾビウム・モレレンス（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｏｒｅｌｅｎｓｅ）（ＤＳＭ  ２３７９４として寄託された）、クルトバクテリウム・プシルム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｓｉｌｌｌｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８７として寄託された）、ペキロマイセス・リアシヌス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ）（ＤＳＭ  ２３７７１として寄託された）、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、ミクロバクテリウム・トリコテセノリティクム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８８として寄託された）、シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）（ＤＳＭ  ２３７９５として寄託された）、エルシニア・クリステンセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎｉｉ）（ＤＳＭ  ２３７９２として寄託された）、アクロモバクター・スパニウス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｎｉｕｓ）（ＤＳＭ  ２３７９１として寄託された）、アクロモバクター・インソリタス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｓｏｌｉｔｕｓ）（ＤＳＭ  ２３７９０として寄託された）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８９として寄託された）、マイコバクテリウム・フレデリクスバーゲンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｅ）（ＤＳＭ  ２３７９８として寄託された）、マイコバクテリウム・サクルム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｒｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７８５として寄託された）、マイコバクテリウム・フルオランセニボランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌｕｏｒａｎｔｈｅｎｉｖｏｒａｎｓ）（ＤＳＭ  ２３７９６として寄託された）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）種、バークホルデリア・トロピカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）（ＤＳＭ  ２３７９９として寄託された）、コスモスポラ・エピスファエリア（Ｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｅｐｉｓｐｈａｅｒｉａ）（ＤＳＭ  ２３７７２として寄託された）およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（ＤＳＭ  ２３７７０として寄託された）からなる生物���群から選択される生物から得ることができるポリペプチドをコードする配列を含む核酸に関する。
【００７７】
さらなる実施形態によれば、本発明は、Ｃｐｕ−ＴＡ１［配列番号３０］、Ｃｐｕ−ＴＡ２［配列番号３３］、Ｃｐｕ−ＴＡ３［配列番号３５］、Ｒａｑ−ＴＡ２［配列番号３８］、Ｒａｑ−ＴＡ３［配列番号４０］、Ａｓｐ−ＴＡ１［配列番号４３］、およびＭｇｉ−ＴＡ１［配列番号４６］からなる群から選択される（Ｒ）−トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド、またはこれらのポリペプチド配列のいずれかと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質をコードする配列を含む核酸に関する。
【００７８】
表１の株の遺伝子配列に由来する酵素には、表１の株に由来する遺伝子の突然変異誘発により得られる、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する酵素も含まれる。突然変異誘発法は当業者には公知であり、遺伝子合成および突然変異誘発プライマー（Ｂｌｏｏｍ  ＆  Ａｒｎｏｌｄ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００９，１０６，９９９５）を使用する突然変異誘発法を含む。
【００７９】
［実施例］
［全般］
［微生物増殖培地］
ＬＢ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）培地
１０ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ（ＢＤ，Ｌｅ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）
５ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＤ，Ｌｅ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）
５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
１５ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ（固体培地用、ＢＤ，Ｌｅ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）
成分を脱イオン水に溶解し、必要に応じてｐＨを７．０に調整した。培地は、１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌した。固体培地のために、高圧蒸気滅菌前に寒天を加えた。高圧蒸気滅菌した培地を６０℃まで放冷した後、抗生物質を加えた。
【００８０】
［選択増菌培地（ＳＥＭ）］
１０ｇ／ｌ  Ｄｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｂａｓｅ（ＹＣＢ，ＢＤ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）
５５ｍＭグリセロール（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
１０ｍＭピルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
５ｍＭ（Ｒ）−アミン基質
１５ｇ／ｌ  Ｄｉｆｃｏ  Ａｇａｒ  Ｎｏｂｌｅ（ＢＤ，Ｌｅ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）
【００８１】
ＹＣＢ培地（１００ｇ／ｌ）、５５０ｍＭグリセロール、および１００ｍＭピルビン酸の原液は、ＭｉｌｌｉＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）で調製し、０．２２μｍ滅菌フィルターを通す濾過により滅菌した。液体増菌培地は、（Ｒ）−２−アミノブタン、（Ｒ）−３，３−ジメチル−２−アミノブタン、（Ｒ）−α−メチルベンジルアミン、（Ｒ）−α−エチルベンジルアミン、（Ｒ）−１−アミノインダン、および（Ｒ）−１−アミノテトラリンの群から選択される（Ｒ）−アミン基質を、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水で希釈した増菌培地の原液に１：１０の割合で加えることにより調製した。固体増菌培地は、最終濃度１５ｇ／ｌになるように、Ａｇａｒ  Ｎｏｂｌｅを含有する高圧蒸気滅菌したＭｉｌｌｉＱ水を用いて適宜調製した。
【００８２】
［抗生物質］
カルベニシリンまたはネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎｅ）を１００μｇ／ｍｌの最終濃度で含有するＬＢ培地を、［配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６］を含む発現ベクターを含有する組換えエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株を選択し培養するために使用し、これらのプラスミドを維持した。カルベニシリンおよびネオマイシンの原液（５０ｍｇ／ｍｌ）は、０．２２μｍ滅菌フィルターを通す濾過により滅菌した。
【００８３】
［分子および遺伝子の手法］
標準的な遺伝子および分子生物学の手法については、当技術分野で一般に知られており、以前に記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８２  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｍｉｌｌｅｒ  １９７２  ”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ２００１  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７）。
【００８４】
［プラスミドおよび株］
Ｅ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）株ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、すべてのクローニング手順に使用した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）はまた、タンパク質発現のためにも使用した。遺伝子発現の誘導のために、Ｌ−アラビノースを最終濃度０．０２％（ｗ／ｖ）で使用した。
【００８５】
［標的遺伝子のクローニング］
［配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６］の標的遺伝子を、国際公開第０８０００６３２号パンフレットに記載の手順に従って、コドン対最適化を行った。Ｇａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用するクローニングを容易にするために、すべての遺伝子に対して、リボソーム結合部位および開始コドンの上流、ならびに停止コドンの下流にａｔｔＢ部位を付加した。合成遺伝子は、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。これらの遺伝子構築物を、Ｇａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、導入したａｔｔＢ部位および製造業者のプロトコール（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）に記載のエントリーベクターとしてのｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を介してｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）由来の発現ベクターにクローニングした。このようにして、ｐＢＡＤ発現ベクターをそれぞれ得た。化学的にコンピテントなＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を、それぞれのｐＢＡＤ−発現ベクターにより形質転換して、対応する発現株を得た。
【００８６】
［プラスミドの同定］
相異なる遺伝子を保持するプラスミドを、形質転換細胞の抗生物質に対する抵抗性、形質転換細胞のＰＣＲ診断分析またはプラスミドＤＮＡの精製、精製プラスミドＤＮＡの制限酵素分析またはＤＮＡ配列分析などの当技術分野で一般に公知の遺伝的、生化学的、および／または表現型手段によって同定した。
【００８７】
［溶液中のタンパク質濃度の測定］
無細胞抽出物（ＣＦＥ）など、溶液中のタンパク質濃度は、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４（１９７６）でＢｒａｄｆｏｒｄが記載するような改変タンパク質色素結合法を使用して測定した。適切に希釈した各試料５０μｌを、試薬（エタノール４６ｍｌに溶解した１００ｍｇのブリリアントブルーＧ２５０および８５％オルトリン酸１００ｍｌをｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１，０００ｍｌにした）９５０μｌと共に、室温で少なくとも５分間インキュベートした。各試料の波長５９５ｎｍにおける吸収を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ２０またはＬａｍｂｄａ３５  ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で測定した。既知濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、０．０１２５ｍｇ／ｍｌ〜０．２０ｍｇ／ｍｌの範囲）を含有する溶液を用いて決定した検量線を使用して、試料中のタンパク質濃度を計算した。
【００８８】
［分析］
［高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析］
芳香族基を含有するケトンおよびアミンは、Ｐｒｅｖａｉｌ  Ｃ１８の１５ｃｍカラム上で分析した。α−メチルベンジルアミン、α−エチルベンジルアミン、２−アミノテトラリンの鏡像異性体の分離および定量については、Ｃｒｏｗｎｐａｋ  Ｃｒ（＋）カラム（Ｄａｉｃｅｌ）に加えて、ｏ−フタルアルデヒドおよびメルカプトエタノールを使用するアミンのポストカラム誘導体化ならびに蛍光検出を使用した。１−アミノテトラリンおよび１−アミノインダンの鏡像異性体の分離および定量ついては、Ｐｒｅｖａｉｌ  Ｃ１８  １５ｃｍおよびＣｒｏｗｎｐａｋ  Ｃｒ（＋）カラムに加えて、ｏ−フタルアルデヒドおよびメルカプトエタノールを使用するアミンのポストカラム誘導体化を使用し、蛍光検出を使用した。
【００８９】
［ガスクロマトグラフィー］
２−ブタノン、２−アミノブタン、３，３−ジメチル−ブタノン、および３，３−ジメチル−２−アミノブタンなどのアルキルケトンおよびアルキルアミンは、アミンカラム用のＣＰ−Ｓｉｌ  ８  ＣＢカラム（Ｖａｒｉａｎ）上で、市販の参照物質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して分析した。（Ｒ）−および（Ｓ）−アルキルアミンの分離および定量については、Ｃｈｉｒａｌｓｉｌ−ＣＢカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用した。
【００９０】
［実施例１−唯一の窒素源としての（Ｒ）−アミン上での微生物の増菌］
オランダおよびドイツの様々な場所からの土壌試料を１００ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）緩衝液ｐＨ７．０に懸濁し、１８０の毎分回転数（ｒｐｍ）で振盪させながら、２８℃で１時間インキュベートした。この懸濁液をワットマン濾紙に通して濾過した。濾液１００μｌをそれぞれ使用して、（Ｒ）−２−アミノブタン、（Ｒ）−３，３−ジメチル−２−アミノブタン、（Ｒ）−α−メチルベンジルアミン、（Ｒ）−α−エチルベンジルアミン、（Ｒ）−１−アミノインダン、および（Ｒ）−１−アミノテトラリンの群から選択される６種の（Ｒ）−アミンの１つを含有するＳＥＭ１０ｍｌが入っている１００ｍｌの三角フラスコに接種した。このフラスコを、オービタリーシェーカー（ｏｒｂｉｔａｒｙ  ｓｈａｋｅｒ）上にて１８０ｒｐｍで振盪させながら、２８℃でインキュベートした。微生物増殖が顕著な培地濁度または「細胞凝集物」の形態で得られた場合に、この培地１００μｌを使用して、同じ（Ｒ）−アミン（５ｍＭ）を含有するＳＥＭに接種した。このような継代接種を２回した後に、１：１００希釈した最後の培地１００μｌを、対応する（Ｒ）−アミン（５ｍＭ）を含有するＳＥＭ寒天プレート上に播種した。さらに、無希釈培養物約１０μｌを、対応する（Ｒ）−アミン（５ｍＭ）を含有するＳＥＭ寒天プレート上に画線した。接種した寒天プレートを、増殖が観察されるまで、２８℃でインキュベートした。種々の形態のコロニーを、新たなＳＥＭプレート上に再画線し、異なる微生物種を分離した。均一形態を有する純粋培養物が２８℃のインキュベーションおよび４℃での保存の後に得られるまで、再画線接種を継続した。
【００９１】
選択された微生物は、ＭｉｃｒｏＳＥＱ（商標登録）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎのために、ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に送った。細菌または真菌の１６ＳまたはＤ２−ＬＳＵリボソームＲＮＡの得られた配列を、検証済みＭｉｃｒｏＳＥＱ（登録商標）配列データベース（ＢａｓｅＣｌｅａｒ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにおける）と比較し、９９％を超える同一性が得られない場合は、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）上のＢｌａｓｔＮアルゴリズムを使用して、非重複性（ｎｒ）ヌクレオチドデータベースと比較した。これらの配列分析結果の概要を表２に示す。
【００９２】
【表２】
0005999565.tif 000006
【００９３】
［実施例２−増菌単離物における（Ｒ）−トランスアミナーゼ活性の検出］
ＳＥＭ寒天プレート上の増菌単離物の純粋培養物を、微生物が増菌した、５ｍＭのそれぞれの（Ｒ）−アミンを含有するＳＥＭ培養液２５ｍｌに接種し、培養物が濁るまで、オービタリーシェーカー上で１８０の毎分回転数（ｒｐｍ）、２８℃で培養した。次いで、培養物を５０ｍｌの遠心管に移し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−２０  ＸＰＩ遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｗｏｅｒｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にてＪＡ−２５．５０ローター中、５０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、０．１ｍＭピリドキサル５’−リン酸（ＰＬＰ）を含有する、２ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）緩衝液ｐＨ７．０に再懸濁した。この細胞懸濁液を使用し、４０ｍＭのアミノドナーおよびケトン基質を用いて、（Ｒ）−トランスアミナーゼ活性を測定した。増菌単離物３Ｋｂ、３Ｎａ、３Ｂａ、３Ｄｂ、および３Ｈ１の細胞懸濁液について、アミンドナーとして４０ｍＭ（Ｒ）−α−メチルベンジルアミン、ケトン基質として１−テトラロンを用い、生成物としてアセトフェノンおよび１−アミノテトラリンを生成させる試験を実施した。増菌単離物５ＢａＢおよび５ＢａＳの細胞懸濁液について、アミンドナーとして４０ｍＭ（Ｒ）−α−メチルベンジルアミン、ケトン基質として１−アミノインダンを用い、生成物としてアセトフェノンおよび１−アミノインダンを生成させる試験を実施した。増菌単離物２Ａ２、２Ｃａ、２Ｃｂ、２Ｍ１、２Ｄａ、および２Ｋ１の細胞懸濁液について、アミンドナーとして４０ｍＭ（Ｒ）−α−メチルベンジルアミン、ケトン基質としてプロピオフェノンを用い、生成物としてアセトフェノンおよびα−エチルベンジルアミンを生成させる試験を実施した。増菌単離物５ＢａＢおよび５ＢａＳの細胞懸濁液について、アミンドナーとして４０ｍＭ（Ｒ）−α−メチルベンジルアミン、ケトン基質として１−アミノインダンを用い、生成物としてアセトフェノンおよび１−アミノインダンを生成させる試験を実施した。増菌単離物６Ａｂ、６Ｂｂ、６Ｉ、および６Ｆの細胞懸濁液について、アミンドナーとして４０ｍＭベンジルアミン、ケトン基質としてアセトフェノンを用い、生成物としてベンズアルデヒドおよびα−メチルベンジルアミンを生成させる試験を実施した。形成されたアミン生成物の濃度および鏡像異性過剰（ｅ．ｅ．）を、全般の部で記載のようにＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ分析の結果を表３に要約する。
【００９４】
【表３】
0005999565.tif 000007
【００９５】
これらの結果は、増菌された微生物における、良好から優秀な（Ｒ）−選択性を有するトランスアミナーゼの存在を示す。
【００９６】
［実施例３−公的データベースからの（Ｒ）−トランスアミナーゼの発現］
表４にまとめられている推定上のトランスアミナーゼのポリペプチドをコードするコドン対最適化遺伝子を、全般の部に記載のように、製造業者のプロトコール（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）に従い、Ｇａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣ由来発現ベクターにクローニングした（欧州特許第１５１３９４６号明細書に記載のように）。
【００９７】
【表４】
0005999565.tif 000008
【００９８】
さらに、ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｌｍｉｔｉｌｉｓ）由来のＬ−スレオニンアルドラーゼ（ＬＴＡ＿ＳＡＶ、受託番号Ｑ８２Ｎ１５）（陰性対照として）、ならびに（Ｒ）−トランスアミナーゼＡＢＮ３５８７１（米国特許第７１６９５９２号明細書の配列２）およびＡＡＮ２１２６１（米国特許第６４１３７５２号明細書の配列１）のポリペプチドをコードするコドン対最適化合成遺伝子を注文し、上記のようにクローニングした。コンピテントＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞を形質転換し、１００μｇ／ｍｌの抗生物質を含有する選択的ＬＢ寒天プレート上に播種した後、表４に示す、組換えＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＢＡＤ株をそれぞれ得た。５ｍｌのＬＢ前培養物および５０μｇ／ｍｌ抗生物質の前培養物に、それぞれの寒天プレートから接種し、オービタリーシェーカー上で１８０ｒｐｍ、２８℃で一晩培養した。このような前培養物から、発現培養物を、５０〜１００ｍｌのＬＢおよび５０μｇ／ｍｌ抗生物質を含有する三角フラスコに、ＯＤ６２０＝０．０５の開始細胞密度で接種した。これらの培養物を、オービタリーシェーカー上で１８０ｒｐｍ、２８℃でインキュベートした。指数増殖期（約０．６のＯＤ６２０）の途中で、培養フラスコに０．０２％（ｗ／ｖ）のＬ−アラビノースを添加して、標的遺伝子の発現を誘導した。誘導後、オービタリーシェーカー上で１８０ｒｐｍ、２８℃で一晩（約２０時間）培養を継続した。続いて、細胞を４℃で１０分間、５，０００×ｇで遠心分離して集めた。上清を廃棄し、細胞を再懸濁して秤量した。細胞ペレットは、含水重量の２倍容量となる、０．１ｍＭ  ＰＬＰ含有氷冷５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液ｐＨ７．５に再懸濁した。無細胞抽出物（ＣＦＥ）は、氷／アセトン槽で冷却しながら、Ｓｏｎｉｃｓ（Ｍｅｙｒｉｎ／Ｓａｔｉｇｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）Ｖｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ  ＶＣＸ１３０  ｓｏｎｉｆｉｅｒ（出力１００％、１０秒オン／１０秒オフ、１０分間）を使用して、細胞懸濁液を超音波処理し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）５４１５Ｒ遠心分離機で４℃、３０分間、１３，０００×ｇで遠心分離することにより得た。上清（＝ＣＦＥ）を新たなチューブに移し、直ぐに使用する場合には氷上に保存し、そうでなければ−２０℃に保存した。ＣＦＥのタンパク質濃度は、全般の部に記載のようにＢｒａｄｆｏｒｄに準拠した改変方法を使用して測定した。
【００９９】
［実施例４−（ＲＳ）−α−メチルベンジルアミンのラセミ分割］
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で異種性に発現されたトランスアミナーゼＸＰ＿００１２０９３２５およびＥＤＨ２５８８５を含む無細胞抽出物（ＣＦＥ）を、（Ｒ）−トランスアミナーゼ活性について試験し、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で異種性に発現された、ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｌｍｉｔｉｌｉｓ）由来のＬ−スレオニンアルドラーゼ（ＬＴＡ＿ＳＡＶ、受託番号Ｑ８２Ｎ１５）（陰性対照として）ならびに（Ｒ）−トランスアミナーゼＡＢＮ３５８７１（米国特許第７１６９５９２号明細書の配列２）およびＡＡＮ２１２６１（欧州特許第９８７３３２号明細書の配列１）を含有するＣＦＥと、（ＲＳ）−α−メチルベンジルアミンのラセミ分割に関して比較した。全反応容量０．２５ｍｌにおいて、ＣＦＥ０．１ｍｌを、０．１ｍＭ  ＰＬＰ含有１００ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液中の８０ｍＭ（ＲＳ）−α−メチルベンジルアミン（ＭＢＡ）、４０ｍＭピルピン酸ナトリウムと混合し、２８℃で２０時間インキュベートした。停止試薬（０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含有するＨ２０中の５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル）０．９ｍｌを反応容量０．１ｍｌに添加して反応を停止し、全般の部に記載のように、キラル相上でＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ分析の結果を表５に示す。
【０１００】
【表５】
0005999565.tif 000009
【０１０１】
これらの結果は、ＸＰ＿００１２０９３２５が、（Ｓ）−α−ΜΒΑではなく、（Ｒ）−α−ＭＢＡをすべて選択的に変換したので、極めて効率的かつ選択的な（Ｒ）−トランスアミナーゼであることを示す。ＡＢＮ３５８７１またはＡＡＮ２１２６１のような他の（Ｒ）−トランスアミナーゼもまた選択的であったが、その生成効率は明確に低く、（ＲＳ）−α−ＭＢＡのラセミ分割において低いｅ．ｅ．が得られた。ＥＤＨ２５８８５も（ＲＳ）−α−ＭＢＡに対する（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼ活性が低いことを示した。
【０１０２】
［実施例５−鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−アミンの合成］
１００ｍＭリン酸カリウム（ＫＰ）ｐＨ７．５で緩衝化された最終容量０．２５μｌにおいて、等モル量の７０ｍＭアミノドナーおよび７０ｍＭケトン基質を、ＣＦＥ０．１ｍｌのトランスアミナーゼの存在下、２８℃で２４時間反応させた。トランスアミナーゼＸＰ＿００１２０９３２５、ＡＡＮ２１２６１、およびＡＢＮ３５８７１をそれぞれ含むＣＦＥを、４−フェニル−２−ブチルアミンおよびアセトフェノンを生成するベンジルアセトンおよびα−メチルベンジルアミン；α−エチルベンジルアミンおよびアセトフェノンを生成するプロピオフェノンおよびα−メチルベンジルアミン；１−アミノインダンおよびアセトフェノンを生成する１−インダノンおよびα−メチルベンジルアミン；１−アミノテトラリンおよびアセトフェノンを生成する１−テトラロンおよびα−メチルベンジルアミン；２−アミノテトラリンおよびアセトフェノンを生成する２−テトラロンおよびα−メチルベンジルアミン；２−アミノブタンおよびアセトフェノンを生成するブタノンおよびα−メチルベンジルアミン；３，３−ジメチル−２−アミノブタンおよびアセトフェノンを生成する３，３−ジメチル−２−ブタノンおよびα−メチルベンジルアミンのそれぞれと共にインキュベートした。停止試薬（０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含有するＨ２Ｏ中の５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル）０．７５ｍｌを反応容量０．２５ｍｌに添加して反応を停止した。生成物濃度および鏡像異性過剰を、全般の部に記載のように、ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ分析の結果を表６に示す。
【０１０３】
【表６】
0005999565.tif 000010
【０１０４】
さらに、トランスアミナーゼＹＰ＿９５５２９７を含むＣＦＥを、α−エチルベンジルアミンおよびアセトフェノンを生成するプロピオフェノンおよびα−メチルベンジルアミンと共にインキュベートした。停止試薬（０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含有するＨ２Ｏ中の５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル）０．７５ｍｌを反応容量０．２５ｍｌに添加して反応を停止した。生成物濃度および鏡像異性過剰を、全般の部に記載のように、ＨＰＬＣにより分析した。２８℃で２４時間のインキュベーション後、０．８７ｍｍｏｌ／ｌの（Ｒ）−α−エチルベンジルアミンが、９９％のｅ．ｅを伴って得られた。
【０１０５】
上記の結果は、トランスアミナーゼＸＰ＿００１２０９３２５およびＹＰ＿９５５２９７が高度に選択的な（Ｒ）−トランスアミナーゼであることを示す。さらに、ＸＰ＿００１２０９３２５は、トランスアミナーゼＡＡＮ２１２６１およびＡＢＮ３５８７１とは異なる基質スペクトルを有することが明確になる。すなわち、４−フェニル−２−ブチルアミンは、ＸＰ＿００１２０９３２５により顕著な濃度で形成されたが、トランスアミナーゼＡＡＮ２１２６１およびＡＢＮ３５８７１によっては形成されなかった（表６）。さらに、ＸＰ＿００１２０９３２５は、２−ブタノンから鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−２−アミノブタンを生成したが、ＡＢＮ３５８７１は、鏡像異性的に濃縮された（Ｓ）−２−アミノブタンを導いた（表６）。
【０１０６】
［実施例６−キラルα−メチルベンジルアミンに対する（Ｒ）−トランスアミナーゼの選択性］
（Ｒ）−トランスアミナーゼの鏡像異性選択性を検討するために、α−メチルベンジルアミン（ＭＢＡ）の純粋な鏡像異性体形態の変換に関し試験した。実施例３で調製されたトランスアミナーゼを含有する無細胞抽出物について、（Ｒ）−ＭＢＡおよび（Ｓ）−ＭＢＡそれぞれに対する活性を、ケトン基質としてピルベートを用い、サーモスタット付きＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ３５  ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計において、波長３００ｎｍ、３０℃で分光光度法にて個別に試験した。
【０１０７】
最終反応容量を１ｍｌとして、適切に希釈された、トランスアミナーゼを含有するＣＦＥ５０μｌを、０．１ｍＭ  ＰＬＰ含有５０ｍＭ  ＫＰ緩衝液ｐＨ７．５の存在下で、１２．５ｍＭ（Ｒ）−または（Ｓ）−ＭＢＡおよび５ｍＭピルビン酸ナトリウムと、使い捨てプラスチックＵＶまたは石英キュベット中で混合した。光度計中で３０℃、５分間プレインキュベートされた他のアッセイ成分に、０．５Ｍピルピン酸ナトリウム（５０ｍＭ  ＫＰ緩衝液ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＰＬＰ中）１０μｌを添加して反応を開始した。ピルピン酸ナトリウムの添加後、３００ｎｍの吸収を記録し、アセトフェノンのモル吸光係数ε＝０．２８ｃｍ２／μｍｏｌを使用して、ランバート−ベールの法則に従って試料（ＣＦＥ）中のトランスアミナーゼ活性を計算した。トランスアミナーゼ活性の１単位（Ｕ）は、０．１ｍＭ  ＰＬＰ含有５０ｍＭ  ＫＰ緩衝液ｐＨ７．５中で、１２．５ｍＭ（Ｒ）−ＭＢＡまたは（Ｓ）−ＭＢＡおよび５ｍＭピルピン酸ナトリウムから、３０℃で１分間にアセトフェノン１μｍｏｌを形成するものとして定義される。一般手順に従って、ＣＦＥのトランスアミナーゼ比活性（Ｕ／ｍｇ総ＣＦＥタンパク質）は、容積活性値（Ｕ／ｍｌ  ＣＦＥ）を測定された総タンパク質濃度で割ることにより計算した。（Ｓ）−ＭＢＡ対する（Ｒ）−ＭＢＡのトランスアミナーゼ比活性比が、トランスアミナーゼ鏡像異性選択性値（ＴＥＶ）として定義される。（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼとは、ＴＥＶ値が１を超えるトランスアミナーゼとして定義される。良好な（Ｒ）−選択性とは、（Ｓ）−ＭＢＡに対する（Ｒ）−ＭＢＡの比活性比であるＴＥＶが５以上であるとして定義される。高度な（Ｒ）−選択性とは、（Ｓ）−ＭＢＡに対する（Ｒ）−ＭＢＡの比活性比であるＴＥＶが１０以上であるとして定義される。これらの実験で測定された、（Ｒ）−および（Ｓ）−ＭＢＡに対する、ＣＦＥ中のトランスアミナーゼの比活性およびＴＥＶを表７に示す。
【０１０８】
【表７】
0005999565.tif 000011
【０１０９】
この実験から明らかになるように、トランスアミナーゼＡＢＮ３５８７１およびＡＡＮ２１２６１と同様に、トランスアミナーゼＸＰ＿００１２０９３２５、ＸＰ＿００２５６４０６４、ＹＰ＿７６１２０１、ＹＰ＿９５５２９７、ＮＰ＿０８５７５０、ＥＢＰ６４５９１、およびＥＤＩ７３９６６は、（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼである。トランスアミナーゼＹＰ＿９５５２９７およびＮＰ＿０８５７５０は、ＴＥＶが５を超える良好な（Ｒ）−選択性を示し、一方、ＸＰ＿００１２０９３２５およびＸＰ＿００２５６４０６４は、ＴＥＶが１０を超える高度な（Ｒ）−選択性さえも示した。
【０１１０】
［実施例７−プールされた寄託物からの微生物の再単離］
全般の部および実施例１に記載のように、プールされた寄託物からの個々の微生物の再単離は、６種の（Ｒ）−アミンの１つを唯一の窒素源として含有する選択増菌培地（ＳＥＭ）寒天プレート上に、１：１０００、１：１０，０００、およびさらなる希釈のプールされた寄託物を播種することにより達成される。初めにその上で培養物が増菌された、それぞれの（Ｒ）−アミンを含有するＳＥＭ寒天プレート上に再画線を反復することにより、純粋な培養物が得られる。均一形態のコロニーのみが得られるまで、それぞれの（Ｒ）−アミンを含有する選択的増菌培地上への再画線を反復して実施する。続いて、１６ＳリボソームＲＮＡまたはＤ２−ＬＳＵリボソームＲＮＡの配列決定を、検証済みのＭｉｃｒｏＳＥＱ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）システムを使用して実施し、個々の微生物を再同定する。
【０１１１】
［実施例８−フェノキシアセトンの酵素的アミノ基転移］
実施例３および実施例６のように生成およびアッセイされた、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で異種性に発現された（Ｒ）−トランスアミナーゼＸＰ＿００１２０９３２５［配列番号１］（２Ｕ／ｍｌ）を含む無細胞抽出物を、０．１Ｍのケトン基質であるフェノシキアセトンならびに０．５Ｍのアミノドナーであるイソプロピルアミン、（ＲＳ）−２−ブチルアミン（事実上、０．２５Ｍ（Ｒ）−２−ブチルアミン）、および（ＲＳ）−α−メチルベンジルアミン（事実上、０．２５Ｍ（Ｒ）−ＭＢＡ）のそれぞれと、０．１ｍＭ  ＰＬＰ含有５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液ｐＨ７．５中で、３０℃、２４時間インキュベートした。形成された１−フェノキシ−２−プロピルアミンの量をＨＰＬＣ分析により測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
【０１１２】
反応混合物５０μｌを、アセトニトリル／水と０．０１％（ｖ／ｖ）ギ酸との５０：５０混合物９５０μｌに加え、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
ＨＰＬＣの条件：
カラム：Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ  Ｓｔａｒ  ＲＰ  Ｃ１８（２５０×４．０，５μｍ）
溶出液Ａ：０．０１％ギ酸水溶液
溶出液Ｂ：アセトニトリル
流速：０．８ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
注入容量：４μｌ
検出：ＵＶ２１０ｎｍ（または２５４ｎｍ）
【０１１３】
これらの実験結果を表８に示す。
【０１１４】
【表８】
0005999565.tif 000012
【０１１５】
アキラル性のアミノドナーであるイソプロピルアミンの０．５Ｍに対して、（Ｒ）−２−ブチルアミンおよび（Ｒ）−ＭＢＡの有効濃度が０．２５Ｍであるので、２−ブチルアミンおよびＭＢＡは、（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼＸＰ＿００１２０９３２５［配列番号１］にとって、イソプロピルアミンよりも事実上良好なアミノドナーである。したがって、アミノドナーのイソプロピルアミンに比較して低いアミノドナー濃度で、同等または良好でさえある変換が、アミノドナーの２−ブチルアミンおよびＭＢＡそれぞれについて得られる。１．０重量％の高い生成物濃度も得られた（アミノドナーとして２−ブチルアミンを用いて）。
【０１１６】
［実施例９−第２の有機溶媒相の存在下でのベンジルアセトンのアミノ基転移］
実施例３および実施例６のように生成およびアッセイされた、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で異種性に発現された（Ｒ）−トランスアミナーゼＸＰ＿００１２０９３２５［配列番号１］（２Ｕ／ｍｌ）を含む無細胞抽出物を、０．１Ｍのケトン基質であるベンジルアセトンおよび０．２５Ｍのアミノドナーである（ＲＳ）−α−メチルベンジルアミンと、０．５ｍＭ  ＰＬＰ含有５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液ｐＨ７．５中で、３０℃、２４時間インキュベートした。反応は、１５％（ｖ／ｖ）の非水混和性有機溶媒シクロヘキサンの存在下および非存在下で実施した。形成された４−フェニル−２−プロピルアミンの量および反応の鏡像異性過剰（ｅ．ｅ．）は、実施例８に記載のように、ＨＰＬＣ分析により測定した。鏡像異性過剰の測定は、キラル固定相上でＨＰＬＣ分析により以下のように実施した。
【０１１７】
反応混合物２０μｌを、Ｍａｒｆｅｙ試薬溶液（アセトン中の１％ｗ／ｖ  Ｎ−α−［２，４−ジニトロフェニル５−フルオロフェニル］−Ｌ−アラニンアミド）５０μｌおよびＮａＨＣＯ３の飽和溶液１０μｌと混合した。この混合物を４０℃で１時間インキュベートした後、２Ｎ  ＨＣｌを１０μｌおよびアセトニトリルを９２０μｌ加え、その試料を５分間遠心分離した後注入した。
ＨＰＬＣの条件：
カラム：Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ  Ｓｔａｒ  ＲＰ  Ｃ１８（２５０×４．０，５μｍ）
溶出液Ａ：０．０１％ギ酸水溶液
溶出液Ｂ：アセトニトリル
流速：１ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
注入容量：２μｌ
検出：ＵＶ３３８．１ｎｍ
均一濃度５０／５０  溶出液Ａ／溶出液Ｂ
【０１１８】
これらの実験結果を表９に示す。
【０１１９】
【表９】
0005999565.tif 000013
【０１２０】
これらの結果は、（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼＸＰ＿００１２０９３２５［配列番号１］が、非水混和性有機溶媒シクロヘキサンの存在に十分耐性であること、およびその存在が、酵素反応の鏡像異性選択性に影響を与えないことを示す。
【０１２１】
[実施例１０−増菌された微生物のゲノムに由来する組換え（Ｒ）−トランスアミナーゼ］
（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼ活性に対する選択培地上で増菌された６株（実施例１および２）、すなわち、ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）３Ｋｂ、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）１Ａ１  ＤＳＭ  ２３７８４、シノリゾビウム・モレレンス（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｏｒｅｌｅｎｓｅ）３Ｈ１  ＤＳＭ  ２３７９４、クルトバクテリウム・プシルム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｓｉｌｌｕｍ）５ＢａＢ  ＤＳＭ  ２３７８７、マイコバクテリウム・フレデリクスバーゲンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｅ）１ｌａ  ＤＳＭ  ２３７９８、およびアクロモバクター・スパニウス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｎｉｕｓ）６ｌ  ＤＳＭ  ２３７９１から、ゲノムＤＮＡを、製造業者のマニュアルに従い、Ｅａｓｙ−ＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離し、最終的にＴＥ緩衝液で溶出した。ＤＮＡの品質は、測光法ならびにＢｓｐ１４３ｌまたはＢａｍＨＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ）による消化とその後のアガロースゲル電気泳動により確認した。ラーネラ・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓ）３Ｋｂ、ミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）１Ａ１  ＤＳＭ  ２３７８４、クルトバクテリウム・プシルム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｓｉｌｌｕｍ）５ＢａＢ  ＤＳＭ  ２３７８７、アクロモバクター・スパニウス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｎｉｕｓ）６Ｉ  ＤＳＭ  ２３７９１およびミクロバクテリウム・ゲンセンギソリ（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）１Ａ１  ＤＳＭ  ２３７８４から、このようにして単離されたゲノムＤＮＡ試料を使用してゲノムの配列決定を行った。
【０１２２】
これらのゲノム配列をサーバーにアップロードし、公知の（Ｒ）−トランスアミナーゼ配列である配列番号１に対して、またゲノムの１つで見出されたヒットに対してＢＬＡＳＴ検索を実施した。種々の類似度を有するいくつかのヒットが同定され、その後のｐＭＳ４７０Δ８（Ｂａｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，２０（８）：１８５１−１８５８）へのＮｄｅｌ／ＨｉｎｄｌｌｌクローニングおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現のために選択された。遺伝子のうちの３つはＰＣＲにより増幅することができず、１つは天然配列中にＮｄｅｌおよびＨｉｎｄｌｌｌを含有していたため、Ａｓｐ−ＴＡ１、Ｃｐｕ−ＴＡ１、Ｃｐｕ−ＴＡ３、Ｒａｑ−ＴＡ２、およびＭｇｉ−ＴＡ１について、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために最適化されたコドンをＧｅｎｅａｒｔ／ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に注文した。
【０１２３】
【表１０】
0005999565.tif 000014
【０１２４】
６つの標的遺伝子を、２５℃ｏ／ｎにて０．５ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）添加のＬＢ培地中のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’で発現させた。対照として、トランスアミナーゼ遺伝子を挿入していないｐＭＳ４７０ベクターを含有するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’培養物を使用した。細胞を採取し、０．１ｍＭ  ＰＬＰ含有５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液ｐＨ７．５中で超音波処理により溶解し、遠心分離した。溶解物をＶｉｖａＳｐｉｎ濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して濃縮した。溶解物のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイにより測定した。
【０１２５】
すべての溶解物について、ドナー微生物がその上で増菌した対応するかさ高いアミンをドナーとしてかつピルベートをアクセプターとして使用して、転移反応を試験した。ピルビン酸（１０ｍＭ）より５倍過剰量のラセミまたは高光学純度のアミン（５０ｍＭ）を、０．１ｍＭ  ＰＬＰ含有５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液ｐＨ７．５中で３０℃、２４時間反応させた。Ｍｇｉ−ＴＡ１についての反応では、１０ｍＭピルビン酸および１０ｍＭアミノドナーＭＢＡまたは１−アミノテトラリンをそれぞれ、０．１ｍＭ  ＰＬＰ含有５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液ｐＨ７．５中で３０℃、１９時間反応させた。対応するケトンの形成は、実施例８および９に記載のように、ＨＰＬＣで検出した。新しいトランスアミナーゼの選択性は、Ｌ−またはＤ−アラニンの形成およびそれぞれのアミンの異なる鏡像異性体の反応性により決定される。新しいトランスアミナーゼＣｐｕ−ＴＡ１［配列番号３０］、Ｃｐｕ−ＴＡ２［配列番号３３］、Ｃｐｕ−ＴＡ３［配列番号３５］、Ｒａｑ−ＴＡ２［配列番号３８］、Ｒａｑ−ＴＡ３［配列番号４０］、Ａｓｐ−ＴＡ１［配列番号４３］、およびＭｇｉ−ＴＡ１［配列番号４６］は、（Ｒ）−選択性を示した（表１１）。Ｃｐｕ−ＴＡ２はまた、アミノドナーとしてＭＢＡおよびアラニン、アクセプターケトンとしてフェノキシアセトンおよびアセトフェノンをそれぞれ用いて試験した。これらの２つの反応のアミン生成物はそれぞれ、鏡像異性的に濃縮された（Ｒ）−１−フェノキシ−２−プロピルアミンおよび（Ｒ）−ＭＢＡであった（表１１）。
【０１２６】
これらの結果は、新しいトランスアミナーゼＣｐｕ−ＴＡ１［配列番号３０］、Ｃｐｕ−ＴＡ２［配列番号３３］、Ｃｐｕ−ＴＡ３［配列番号３５］、Ｒａｑ−ＴＡ２［配列番号３８］、Ｒａｑ−ＴＡ３［配列番号４０］、Ａｓｐ−ＴＡ１［配列番号４３］、およびＭｇｉ−ＴＡ１［配列番号４６］は、実際、（Ｒ）−選択性であることを示す。
【０１２７】
【表１１】
0005999565.tif 000015
【０１２８】
［実施例１１−非水混和性有機溶媒の存在下における、ベンジルアセトンおよび（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンからの４−フェニル−２−プロピルアミンの合成］
実施例３および実施例６のように生成およびアッセイされた、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で異種性に発現された（Ｒ）−トランスアミナーゼＸＰ＿００１２０９３２５［配列番号１］を含む無細胞抽出物を、０．０８Ｍのアミノドナー（Ｒ）−α−メチルベンジルアミン（ＭＢＡ）および１．５倍過剰量のケトン基質ベンジルアセトン（０．１２Ｍ）と、０．１ｍＭ  ＰＬＰ含有５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液ｐＨ７．５中で、２８℃、２０時間インキュベートした。反応は、１０％（ｖ／ｖ）の非水混和性有機溶媒シクロヘキサンの存在下および非存在下で実施した。形成された４−フェノキシ−２−プロピルアミンの量を、全般の部で記載のように、ＨＰＬＣ分析により測定した。
【０１２９】
シクロヘキサノンが無添加の場合、アミノドナーとして（Ｒ）−ＭＢＡを用いて、ベンジルアセトンから４２．８ｍＭの４−フェニル−２−プロピルアミンが形成されたが、１０％（ｖ／ｖ）シクロヘキサノンの場合は、さらに高い濃度である４４．３ｍＭの４−フェニル−２−プロピルアミンが形成された。
【０１３０】
［実施例１２−（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンからの（Ｒ）−ｓｅｃ−ブチルアミンの酵素的合成］
トランスアミナーゼＸＰ＿００１２０９３２５［配列番号１］、ＸＰ＿００２５６４０６４［配列番号３］、ＥＥＵ４４０１９［配列番号５］、ＸＰ＿００１４０２２２１［配列番号７］、ＹＰ＿７６１２０１［配列番号９］、ＹＰ＿８３８９４０［配列番号１１］、ＹＰ＿９５５２９７［配列番号１３］、ＥＤＩ７３９６６［配列番号１５］、ＮＰ＿０８５７５０［配列番号１７］、ＥＤＨ２５８８５［配列番号１９］、ＥＢＰ６４５９１［配列番号２１］、およびＥＣＵ９３０１４［配列番号２３］、ならびにＡＢＮ３５８７１およびＡＡＮ２１２６１を、実施例３に記載のように生成した。異種性に発現されたトランスアミナーゼを含有する無細胞抽出物を、２５ｍＭブタノンおよび５０ｍＭ（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンと、全量１ｍｌの０．１ｍＭ  ＰＬＰ含有１００ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液ｐＨ７．５中で２８℃、２４時間、４００ｒｐｍで振盪させながら反応させた。２０時間後、各反応の試料１００μｌを２−ヘキサノン溶液５０μｌおよびアセトニトリル８５０μｌに添加して反応を停止し、３０００×ｇで１０分間遠心分離した。参照物質として市販のＭＢＡ、アセトフェノン、ブタノンおよびｓｅｃ−ブチルアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、アミン用ＣｐＳｉｌ  ８カラム（３０ｍ  ｘ  ０．２５  ｘ  ０．５）上でＧＣ−ＦＩＤ検出により、試料を分析した。結果を表１２にまとめてある。
【０１３１】
【表１２】
0005999565.tif 000016
【０１３２】
［実施例１３−（Ｒ）−ＭＢＡおよび３，３−ジメチル−ブタノンからの（Ｒ）−３，３−ジメチル−２−ブチルアミンの酵素的合成］
実施例３に記載のように生成された、異種性に発現されたトランスアミナーゼＸＰ＿００１２０９３２５［配列番号１］、ＹＰ＿９５５２９７［配列番号１３］、ＡＢＮ３５８７１、およびＡＡＮ２１２６１を含有する無細胞抽出物を、２５ｍＭ  ３，３−ジメチル−ブタノンおよび５０ｍＭ（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンと、全量１ｍｌの０．１ｍＭ  ＰＬＰ含有１００ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液ｐＨ７．５中で２８℃、２４時間、４００ｒｐｍで振盪させながら反応させた。２０時間後、各反応の試料１００μｌを２−ヘキサノン溶液５０μｌおよびアセトニトリル８５０μｌに添加して反応を停止し、３０００×ｇで１０分間遠心分離した。参照物質として市販のＭＢＡ、アセトフェノン、ブタノンおよびｓｅｃ−ブチルアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、アミン用ＣｐＳｉｌ  ８カラム（３０ｍ  ｘ  ０．２５  ｘ  ０．５）上でＧＣ−ＦＩＤ検出により、試料を分析した。結果を表１３にまとめてある。
【０１３３】
【表１３】
0005999565.tif 000017
【配列表】
0005999565000001.app