(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＧＥ分子の検出または定量方法であって、
（Ａ）検出または定量の対象となるサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥ分子の存在下で標識したＡＧＥ分子に接触させる工程であって、該ＲＡＧＥ分子は、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６またはその改変体である、工程、
および
（Ｂ）該ＡＧＥ分子に対する該ＲＡＧＥ分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該サンプルにおけるＡＧＥ分子の存在もしくは存在レベルを示す、工程を包含する、方法。
【請求項２】
糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法であって、
（Ａ）糖尿病性腎症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥ分子の存在下で標識したＡＧＥ分子に接触させる工程であって、該ＲＡＧＥ分子は、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６またはその改変体である、工程、
および
（Ｂ）該固定されたＲＡＧＥ分子に対する該標識したＡＧＥ分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害のレベルが正常個体と比べて高いことは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、工程を包含する、方法。
【請求項３】
前記ＲＡＧＥ分子は、ＲＡＧＥ１４３である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記標識したＡＧＥ分子は、標識したＬｙｓ−ＡＧＥ（グルタルアルデヒド修飾リジン修飾ＡＧＥ）、標識したグルコース修飾ＡＧＥ（Ｇ−ＡＧＥ）、標識したリボース修飾ＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ）、標識したフルクトース修飾ＡＧＥ（Ｆ−ＡＧＥ）またはそれらの改変体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＡＧＥ分子の検出または定量のためのキットであって、
（Ａ）固定されたＲＡＧＥ分子を有する固相および標識したＡＧＥ分子；および
（Ｂ）固定されたＲＡＧＥ分子に結合した該標識したＡＧＥ分子の標識を検出する手段であって、該標識の強度から、ＡＧＥ分子に対する該ＲＡＧＥ分子の結合が検出される、手段
を備え、該ＲＡＧＥ分子は、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６またはその改変体であり、該結合の阻害の存否またはレベルは、ＡＧＥ分子の存在もしくは存在レベルを示す、キット。
【請求項６】
糖尿病または糖尿病性腎症の診断のためのキットであって、
（Ａ）固定されたＲＡＧＥ分子を有する固相および標識したＡＧＥ分子；および
（Ｂ）固定されたＲＡＧＥ分子に結合した該標識したＡＧＥ分子の標識を検出する手段であって、該標識の強度から、ＡＧＥ分子に対する該ＲＡＧＥ分子の結合が検出される、手段
を備え、該ＲＡＧＥ分子は、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６またはその改変体であり、該結合の阻害のレベルが正常個体と比べて高いことは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、キット。
【請求項７】
前記ＲＡＧＥ分子は、ＲＡＧＥ１４３である、請求項５〜６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８】
前記標識したＡＧＥ分子は、標識したＬｙｓ−ＡＧＥ（グルタルアルデヒド修飾リジン修飾ＡＧＥ）、標識したグルコース修飾ＡＧＥ（Ｇ−ＡＧＥ）、標識したリボース修飾ＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ）、標識したフルクトース修飾ＡＧＥ（Ｆ−ＡＧＥ）またはそれらの改変体である、請求項５〜７のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＧＥｓまたはＯｘＬＤＬ等のリガンド様活性の新規検出技術および生活習慣病危険因子などの検出技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
レクチン様酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体１（Ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：本明細書中以降、ＬＯＸ−１ともいう）は、アテローム発生の原因となる酸化ＬＤＬ（本明細書中以降、ＯｘＬＤＬともいう）のような変性ＬＤＬに対する特有のスカベンジャー受容体であり、１９９７年に、培養ウシ大動脈内皮細胞において初めて同定された。ＬＯＸ−１は、他のスカベンジャー受容体と機能的には類似しているにもかかわらず、構造的には異なる独特の構造を有している。
【０００３】
ウシＬＯＸ−１（ｂＬＯＸ−１）は、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる分子量約５０ｋＤａの糖タンパク質であり、Ｎ末端が細胞質内にあり、Ｃ末端が細胞外に出ている細胞膜１回貫通型のＩＩ型膜タンパク質である。ヒトＬＯＸ−１（ｈＬＯＸ−１）はまた、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる約３０ｋＤａ（１３９位および１８３位の糖鎖付加により、分子量約４０ｋＤａ）のＩＩ型膜タンパク質である。この受容体は、構造的には、以下の４つのドメイン：Ｎ末端側の細胞質ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、ネックドメイン、およびＣ型レクチン様ドメイン（本明細書中以降、ＣＴＬＤという）からなる。このＣＴＬＤは、種間で、特に、６個のシステイン残基の位置で高度に保存されており、ＬＯＸ−１のリガンドを認識するための機能的ドメインである。このＣＴＬＤ中の６個のシステイン残基は、ｈＬＯＸ−１の分子内ジスルフィド結合に関与している。この保存されたＣＴＬＤに加えて、ｈＬＯＸ−１および他の既知の種におけるネックドメインは、高い配列同一性を有している。また、Ｘｉｅら（非特許文献１：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３２：６８−７４（２００３））によれば、ＣＴＬＤが変性ＬＤＬを結合するのに十分な最小ドメインであり、たとえＣＴＬＤがグリコシル化されていなくても、変性ＬＤＬを認識および結合できることが明らかにされた。
【０００４】
これまでの研究により、ＬＯＸ−１は、血管内皮細胞のみならず、マクロファージおよび活性化血管平滑筋細胞において発現されており、構造的に関連性のない種々の高分子（変性ＬＤＬ、細菌、老化赤血球、アポトーシスを受けた細胞、および血小板があげられる）を認識し、生体防御機構や炎症性機転などの種々の生命現象において重要な役割を果たしていること、そしてその発現は種々の条件下で、高脂血症、糖尿病、高血糖、高血圧症、高血圧性腎硬化症、動脈硬化、虚血再灌流傷害、血管バルーン傷害後のような病態；ならびに酸化ＬＤＬ、アンジオテンシンＩＩ、エンドセリン、ＴＮＦ−α、後期糖化反応生成物（ＡＧＥ）、ＴＧＦ−β、８−イソ−プロスタグランジンＦ２α、ズリ応力のような刺激によって、調節されていることが分かっている（非特許文献２：Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．  １２７，１０３−１０７（２００６））。
【０００５】
変性ＬＤＬ測定に関しては、疾病の早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野での活用が期待されている。これまで、ヒト血漿中の動脈硬化危険因子である変性ＬＤＬの測定には、モノクローナル抗体が用いられてきたが、特に変性ＬＤＬは分子の修飾構造は一定ではなく、意味のある分子種が明確でないなどの理由で、モノクローナル抗体による検出にも問題が多い。
【０００６】
後期糖化反応生成物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：本明細書中以降、ＡＧＥという）は、糖尿病患者の生活の質を損ねる元凶である血管合併症として知られる糖尿病性血管障害の発症・進展に関与している。血管合併症による眼、神経、腎臓の障害は、それぞれ糖尿病網膜症、神経症、腎症（あわせて三大合併症）とよばれており、糖尿病患者に特徴的な病態である。
【０００７】
ＡＧＥを認識する受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥ：本明細書中以降、ＲＡＧＥという）は、１９９２年に、ウシ肺から同定され、ＡＧＥと結合するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する、分子量約３５ｋＤａのＩ型膜タンパク質（糖鎖修飾を受けた完全なＲＡＧＥは、分子量５５ｋＤａ）である。ＲＡＧＥの細胞外ドメインは、１つのＶ型イムノグロブリンドメイン、続いて、２つのＣ型イムノグロブリンドメイン（Ｃ１領域およびＣ２領域）の３つのイムノグロブリンフォールド構造を取るドメインが結合した構造を取っている。ＲＡＧＥはまた、細胞膜１回貫通型のドメインおよび４３アミノ酸の細胞内ドメインを含む。ＲＡＧＥは、多様なクラスのリガンド（ＡＧＥ、Ｓ１００／カルグラニュリン（ｃａｌｇｒａｎμｌｉｎｅ）、アンホテリンおよびアミロイド−βペプチド（およびβ−シート原線維のクラス））と相互作用する。Ｖドメインは、リガンド結合に必須の部位であり、細胞内ドメインは、ＲＡＧＥ媒介性細胞内シグナル伝達に必須であることが示された（非特許文献３：Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００３；９３：１１５９−１１６９）。
【０００８】
ＲＡＧＥは、正常組織および血管系においては低レベルでしか発現されない。しかし、この受容体は、そのリガンドが蓄積した場所においてアップレギュレートされる。例えば、糖尿病患者の血管では、ＲＡＧＥの代表的リガンドとしては、以下のＡＧＥ構造体が挙げられる：（カルボキシメチル）リジン−タンパク質付加物（インビボで存在する主なＡＧＥ）、カルボキシエチル−リジン（ＣＥＬ）タンパク質付加物、ペントシジン−付加物（コラーゲンおよび基底膜の不安定化に関連した糖尿病組織において見いだされる主要なＡＧＥ架橋物質）、ピラリン、イミダゾロン、メチルグリオキサール（他の範囲のＡＧＥの形成の前駆体）、クロスリン、フルオロリンク、プロピリジン、アルグピリミジン、ベスパーリジン、グリオキサール誘導リジンダイマー、デオキシグルコサミン誘導リジンダイマーなど。ＲＡＧＥの発現は、糖尿病血管系において内皮細胞、平滑筋細胞、および浸潤性単核食細胞で増加している。ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用は、血管系ホメオスタシスにおいて重要な細胞の特性を変化させる。例えば、ＲＡＧＥがＡＧＥと結合した後、内皮細胞は、ＶＣＡＭ−１、組織因子、およびＩＬ−６の発現、ならびに高分子へのそれらの透過性を増加させる。単核食細胞において、ＲＡＧＥは、サイトカインおよび増殖因子の発現を活性化し、可溶性ＡＧＥに応じて細胞移動を誘導するのに対して、走触性は、固定リガンドで起こる（非特許文献４：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：９４９−９５５（２００１））。
【０００９】
本発明者らは、これまでに、ＬＯＸ−１変異体−界面活性剤複合体およびＲＡＧＥ変異体−界面活性剤複合体、ならびにこれらを用いて生活習慣病危険因子などを検出する方法を出願した（特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００２−３２０４８９号公報
【特許文献２】特開２００２−１８１８２０号公報
【特許文献３】特開２００３−３６４９９号公報
【特許文献４】特開２００３−２３８４０４号公報
【特許文献５】特開２００３−１２５７８６号公報
【特許文献６】特開２００２−１７３５３号公報
【特許文献７】特開２００９−１０８０３７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３２：６８−７４（２００３）
【非特許文献２】Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．  １２７，１０３−１０７（２００６）
【非特許文献３】Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００３；９３：１１５９−１１６９
【非特許文献４】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：９４９−９５５（２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らが提出した特許文献７では、特異的分子を用いていることから、その反応特異性に依拠せざるを得ず、ＯｘＬＤＬ様分子およびＲＡＧＥ分子について網羅的な検出ができないという点があり、これを克服することが困難であった。したがって、病変の検出においても、偽陰性の可能性を極小化できないと考えられることから、これを克服することを１つの課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そこで、本発明では、本発明者らは、ＯｘＬＤＬ様活性を示す分子の検出または定量方法またはＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量方法として、固相に固定されたＲＡＧＥ１４３またはその改変体あるいは固相に固定されたＣＴＬＤ１４またはその改変体の存在下で、サンプルに標識したＡＧＥまたは標識したＯｘＬＤＬを接触させる工程を利用することによって、網羅的検出または定量を可能にした。
【００１４】
したがって、本発明は、以下を提供する。
（１）ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量方法であって、
（Ａ）検出または定量の対象となるサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥ分子の存在下で標識したＡＧＥ分子に接触させるか、または固相に固定されたＡＧＥ分子の存在下で、標識したＲＡＧＥ分子に接触させる工程、
および
（Ｂ）該ＡＧＥ分子に対する該ＲＡＧＥ分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該サンプルにおけるＡＧＥｓ様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す、工程を包含する、方法。
（２）糖尿病性腎症の予備的な検出方法であって、
（Ａ）糖尿病性腎症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥ分子の存在下で標識したＡＧＥ分子に接触させるか、または固相に固定されたＡＧＥ分子の存在下で、標識したＲＡＧＥ分子に接触させる工程、
および
（Ｂ）該ＡＧＥ分子に対する該ＲＡＧＥ分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、工程を包含する、方法。
（３）糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な検出方法であって、
（Ａ）糖尿病性腎症の検出の対象となる糖尿病に罹患した被験体からのサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥ分子の存在下で標識したＡＧＥ分子に接触させるか、または固相に固定されたＡＧＥ分子の存在下で、標識したＲＡＧＥ分子に接触させる工程、
および
（Ｂ）該ＡＧＥ分子に対する該ＲＡＧＥ分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、工程を包含する、方法。
（４）糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法であって、
（Ａ）糖尿病性腎症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥ分子の存在下で標識したＡＧＥ分子に接触させるか、または固相に固定されたＡＧＥ分子の存在下で、標識したＲＡＧＥ分子に接触させる工程、
および
（Ｂ）該固定化されたＡＧＥもしくはその改変体に対する該ＲＡＧＥ分子または該ＡＧＥもしくはその改変体のリガンドの結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、工程を包含する、方法。
（５）前記ＲＡＧＥ分子は、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６またはその改変体である、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（６）前記ＡＧＥ分子は、Ｌｙｓ−ＡＧＥ（グルタルアルデヒド修飾リジン修飾ＡＧＥ）、グルコース修飾ＡＧＥ（Ｇ−ＡＧＥ）、リボース修飾ＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ）、フルクトース修飾ＡＧＥ（Ｆ−ＡＧＥ）またはそれらの改変体である、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（７）ＯｘＬＤＬ様活性を示す分子の検出または定量方法であって、
（Ａ）検出または定量の対象となるサンプルを、固相に固定されたＣＴＬＤ分子の存在下で標識した変性ＬＤＬに接触させるか、または固相に固定された変性ＬＤＬの存在下で、標識したＣＴＬＤ分子に接触させる工程、
および
（Ｂ）該変性ＬＤＬに対する該ＣＴＬＤ分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、ＯｘＬＤＬ様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す、工程を包含する、方法。
（８）前記ＣＴＬＤ分子は、ＣＴＬＤ１４、ＬＯＸ−１全長、ＬＯＸ−１細胞外領域全長、ＣＴＬＤまたはそれらの改変体である、項目７に記載の方法。
（９）前記変性ＬＤＬは、酸化ＬＤＬ（ＯｘＬＤＬ）、マロンジアルデヒド化ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）、アクロレイン修飾ＬＤＬ、ノネナール修飾ＬＤＬ、クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）修飾ＬＤＬ、４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）修飾ＬＤＬ、ヘキサノイル（ＨＥＬ）修飾ＬＤＬ、小粒子ＬＤＬ、糖化ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬまたはその改変体である、項目７または８に記載の方法。
（１０）ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量のためのキットであって、
（Ａ）固定されたＲＡＧＥ分子を有する固相および標識したＡＧＥ分子、または固定されたＡＧＥ分子を有する固相および標識したＲＡＧＥ分子；および
（Ｂ）該ＡＧＥ分子に対する該ＲＡＧＥ分子の結合を検出する手段
を備え、該結合の阻害の存否またはレベルは、ＡＧＥｓ様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す、キット。
（１１）糖尿病性腎症の予備的な診断のためのキットであって、
（Ａ）固定されたＲＡＧＥ分子を有する固相および標識したＡＧＥ分子、または固定されたＡＧＥ分子を有する固相および標識したＲＡＧＥ分子；および
（Ｂ）該ＡＧＥに対する該ＲＡＧＥ分子の結合を検出する手段
を備え
該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、キット。
（１２）糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な診断のためのキットであって、
（Ａ）固定されたＲＡＧＥ分子を有する固相および標識したＡＧＥ分子、または固定されたＡＧＥ分子を有する固相および標識したＲＡＧＥ分子；および
（Ｂ）該ＡＧＥに対する該分子の結合を検出する手段
を備え、
該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、キット。
（１３）糖尿病または糖尿病性腎症の診断のためのキットであって、
（Ａ）固定されたＲＡＧＥ分子を有する固相および標識したＡＧＥ分子、または固定されたＡＧＥ分子を有する固相および標識したＲＡＧＥ分子；および
（Ｂ）該ＡＧＥに対する該分子の結合を検出する手段
を備え、
該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、キット。
（１４）前記ＲＡＧＥ分子は、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６またはその改変体である、項目１０〜１３のいずれか１項に記載のキット。
（１５）前記ＡＧＥ分子は、Ｌｙｓ−ＡＧＥ（グルタルアルデヒド修飾リジン修飾ＡＧＥ）、グルコース修飾ＡＧＥ（Ｇ−ＡＧＥ）、リボース修飾ＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ）、フルクトース修飾ＡＧＥ（Ｆ−ＡＧＥ）またはそれらの改変体である、項目１０〜１４のいずれか１項に記載のキット。
（１６）ＯｘＬＤＬ様活性を示す分子の検出または定量のためのキットであって、
（Ａ）固定されたＣＴＬＤ分子を有する固相および標識した変性ＬＤＬ、または固定された変性ＬＤＬを有する固相および標識したＣＴＬＤ分子；および
（Ｂ）該変性ＬＤＬに対する該ＣＴＬＤ分子の結合を検出する手段
を備え、該結合の阻害の存否またはレベルは、ＯｘＬＤＬ様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す、キット。
（１７）前記ＣＴＬＤ分子は、ＣＴＬＤ１４、ＬＯＸ−１全長、ＬＯＸ−１細胞外領域全長、ＣＴＬＤまたはその改変体である、項目１６に記載のキット。
（１８）前記変性ＬＤＬは、酸化ＬＤＬ（ＯｘＬＤＬ）、マロンジアルデヒド化ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）、アクロレイン修飾ＬＤＬ、ノネナール修飾ＬＤＬ、クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）修飾ＬＤＬ、４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）修飾ＬＤＬ、ヘキサノイル（ＨＥＬ）修飾ＬＤＬ、小粒子ＬＤＬ、糖化ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬまたはその改変体である、項目１６または１７に記載のキット。
（１９）ＡＧＥｓ様活性を示す分子を含む、糖尿病性腎症の予備的な診断マーカー。
（２０）ＡＧＥｓ様活性を示す分子を含む、糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な診断マーカー。
（２１）ＡＧＥｓ様活性を示す分子を含む、糖尿病または糖尿病性腎症の診断マーカー。
（２２）糖尿病性腎症の予備的な診断の指標とするための、被験体中のＡＧＥｓ様活性の使用であって、該ＡＧＥｓ様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、使用。
（２３）糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な診断の指標とするための、被験体中のＡＧＥｓ様活性の使用であって、該ＡＧＥｓ様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、使用。
（２４）糖尿病または糖尿病性腎症の診断の指標とするための、被験体中のＡＧＥｓ様活性の使用であって、該ＡＧＥｓ様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、使用。
【００１５】
本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のＣＴＬＤ分子を用いたアッセイによって、簡便性は顕著に上がっているといえる。従来の手法が、試料添加後に３段階も別の反応を行う必要があったのが、反応は試料添加の１段階のみであって、従来の手法のように強酸などの劇薬は一切使用しないという点で安全なアッセイが提供されたとも言える。
【００１７】
また、ＣＴＬＤ分子を用いたアッセイによって、網羅性に関しても顕著な効果が発揮された。すなわち、変性ＬＤＬとは構造が異なる分子でＣＴＬＤ１４に認識されることが示されている分子（機能は明確ではないがＨｓｐ：分子シャペロンであるｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ等）にまで拡張された。また従来の手法では捕捉できなかった分子も検出可能になり、網羅性は改善された。加えて、結合は弱いものの、  ＡＧＥｓもＣＴＬＤ１４のリガンドとして認識することができる。従来の手法では、全く別の抗体（しかも特異性が低い）を準備して別個に反応を行う必要があった、本発明の手法では変性ＬＤＬと同時にリガンド様活性を示す分子として検出可能でとなった。
【００１８】
本発明のＲＡＧＥ分子を用いたアッセイでも顕著な効果を奏することがわかった。変性ＬＤＬおよび血糖値の管理に使われているヘモグロビン・エー・ワン・シー（ＨｂＡ１ｃ）についても、ＲＡＧＥは認識するものの、Ｒ−ＡＧＥなどのＡＧＥｓ（後期糖化反応生成物）と構造が異なることから、従来の手法では同時検出は困難であった。本発明の手法では、リガンド様活性を示す分子として同時に検出が可能となった。また、Ｌｙｓ−ＡＧＥのような低分子リガンドも同時に検出可能となったことから、網羅性についても、本発明のＲＡＧＥ分子を用いたアッセイでは改善されているといえる。
【００１９】
血糖値上昇の後にＡＧＥ様分子が上がり、その後飲水量が増加することから、飲水量が増加することが一つの糖尿病性腎症の指標であることから、「予測診断」が可能といえる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＲＡＧＥを固定化した９６穴プレートを用いて、クエルセチンを０μｇ／アッセイ（１００％のコントロール）、０．０５μｇ／アッセイ、０．５μｇ／アッセイおよび５μｇ／アッセイの用量で添加したときの、相対結合活性（％、クエルセチン無添加を１００％とする。）を示す。
【図２】図２は、ＲＡＧＥを固定化した９６穴プレートを用いて、ＬＯＸ−１阻害剤のモデルとしてＯｘＬＤＬを０μｇ／アッセイ（１００％のコントロール）、０．０５μｇ／アッセイ、０．５μｇ／アッセイおよび５μｇ／アッセイの用量で添加したときの、相対結合活性（％、クエルセチン無添加を１００％とする。）を示す。
【図３】図３は、ＲＡＧＥを固定化した９６穴プレートを用いて、ＬＯＸ−１阻害剤のモデルとしてＧ−ＡＧＥを０μｇ／アッセイ（１００％のコントロール）、０．０５μｇ／アッセイ、０．５μｇ／アッセイおよび５μｇ／アッセイの用量で添加したときの、相対結合活性（％、クエルセチン無添加を１００％とする。）を示す。
【図４】図４は、ＲＡＧＥを固定化した９６穴プレートを用いて、ＬＯＸ−１阻害剤のモデルとしてＲ−ＡＧＥを０μｇ／アッセイ（１００％のコントロール）、０．０５μｇ／アッセイ、０．５μｇ／アッセイおよび５μｇ／アッセイの用量で添加したときの、相対結合活性（％、クエルセチン無添加を１００％とする。）を示す。
【図５】図５に蛍光標識モデルリガンドとして水溶性色素Ａｌｅｘａ５４６でラベルしたＲ−ＡＧＥを使用して行ったコントロール実験を示す。図５左に使用した細胞の位相差像を示し、図５中央にＲＡＧＥ（蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現）発現細胞の蛍光を示し、図５右にリガンドを結合した細胞像を示す。図５右にある白い点が結合したリガンドである。
【図６】図６に図５と同様の順で行った実験の、クエルセチンの添加の場合の写真を示す。図６左に使用した細胞の位相差像を示し、図６中央にＲＡＧＥ（蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現）発現細胞の蛍光を示し、図６右にリガンドに加えクエルセチンを加えた細胞像を示す。図６右に示すように、クエルセチン添加によりリガンドの結合が阻害されることが細胞における高感度観察で確認された。
【図７】図７は、図５と同様の順で、Ｒ−ＡＧＥの添加の場合の写真を示す。図７左に使用した細胞の位相差像を示し、図７中央にＲＡＧＥ（蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現）発現細胞の蛍光を示し、図７右にリガンドに加えＲ−ＡＧＥを加えた細胞像を示す。図７右に示されるように、Ｒ−ＡＧＥ添加によるリガンド結合の阻害を示す蛍光像が示される。
【図８】図８は、ＬＯＸ−１を固定化した９６穴プレートを用いて、クエルセチンを０μｇ／アッセイ（１００％のコントロール）、０．０５μｇ／アッセイ、０．５μｇ／アッセイおよび５μｇ／アッセイの用量で添加したときの、相対結合活性（％、クエルセチン無添加を１００％とする。）を示す。
【図９】図９は、ＬＯＸ−１を固定化した９６穴プレートを用いて、ＯｘＬＤＬを０μｇ／アッセイ（１００％のコントロール）、０．０５μｇ／アッセイ、０．５μｇ／アッセイおよび５μｇ／アッセイの用量で添加したときの、相対結合活性（％、クエルセチン無添加を１００％とする。）を示す。
【図１０】図１０は、ＬＯＸ−１を固定化した９６穴プレートを用いて、ＡｃＬＤＬを０μｇ／アッセイ（１００％のコントロール）、０．０５μｇ／アッセイ、０．５μｇ／アッセイおよび５μｇ／アッセイの用量で添加したときの、相対結合活性（％、クエルセチン無添加を１００％とする。）を示す。
【図１１】図１１は、ＯｘＬＤＬを固定化した９６穴プレートを用いて、ＯｘＬＤＬを０μｇ／アッセイ（１００％のコントロール）、０．０５μｇ／アッセイ、０．５μｇ／アッセイおよび５μｇ／アッセイの用量で添加したときの、相対結合活性（％、クエルセチン無添加を１００％とする。）を示す。
【図１２】図１２は、ＯｘＬＤＬを固定化した９６穴プレートを用いて、クエルセチンを０μｇ／アッセイ（１００％のコントロール）、０．０５μｇ／アッセイ、０．５μｇ／アッセイおよび５μｇ／アッセイの用量で添加したときの、相対結合活性（％、クエルセチン無添加を１００％とする。）を示す。
【図１３】図１３は、ＣＴＬＤ分子としてＣＴＬＤ１４を固定した９６穴プレートを用いて、変性ＬＤＬの例としてＯｘＬＤＬを標識した例を用いてクエルセチンを０μｇ／アッセイ（１００％のコントロール）、０．５μｇ／アッセイ、２．５μｇ／アッセイおよび５μｇ／アッセイの用量で添加したときの、相対結合活性（％、クエルセチン無添加を１００％とする。）を示す。
【図１４】図１４は、ＬＯＸ−１を蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現させた細胞を用い、ＯｘＬＤＬをコントロールリガンドとして用いたコントロール実験を示す。図１４左に使用した細胞の位相差像を示し、図１４中央にＬＯＸ−１（蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現）発現細胞の蛍光を示し、図１４右にリガンドを結合した細胞像を示す。図１４右にある白い点が結合したリガンドである。
【図１５】図１５は、図１４と同様の順で、クエルセチンを添加した場合の写真を示す。図１５左に使用した細胞の位相差像を示し、図１５中央にＬＯＸ−１（蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現）発現細胞の蛍光を示し、図１５右にリガンドに加えクエルセチンを加えた細胞像を示す。図１５右に示すように、クエルセチン添加によりリガンドの結合が阻害されることが細胞における高感度観察で確認された。
【図１６】図１６は、実施例７において、高コレステロール・クリントン−シブルスキー齧歯類飼料、もしくは、正常食を与えたマウスの血清脂質濃度の測定結果を示す。総コレステロール量、ＨＤＬコレステロール量、ＬＤＬコレステロール量を比色定量法（和光純薬、大阪、日本）により測定した結果を示す。高コレステロール食群では、総コレステロール値がコントロール群に比べて有意に高く（図１６−Ａ）、さらに、コレステロールの中でもＨＤＬコレステロール値には大きな差がない（図１６−Ｂ，コントロール群  （６９．７±３．４  ｍｇ／ｄｌ）ｖｓ．  高コレステロール食群（６５．４±２．４  ｍｇ／ｄｌ））が、ＬＤＬコレステロール値では、コントロール群（４７．５±４．０  ｍｇ／ｄｌ）  ｖｓ．高コレステロール食群（１１２．９±４．９  ｍｇ／ｄｌ）と有意に高いことが確認され（図１６−Ｃ）、高コレステロール食群では、高脂血症を発症していることが確認された。このことから、本実施例に用いた抗コレステロール食マウスは、高脂血症モデルマウスとして活用可能なことが示された。＊は、正常食（コントロール食）に対する統計学的有意を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図１７】図１７は、高脂血症モデルマウス（高コレステロール食群）と健常群マウス（コントロール）由来の血清のＤｉＩ標識ＡｃＬＤＬのＬＯＸ−１固定化プレートへの結合阻害活性を測定した結果である。高脂血症モデルマウス由来の血清は、３０％の阻害活性を示したが、健常群由来の血清では、１２％阻害に過ぎず、有意水準（Ｐ＜０．０５）で統計学的に有意な阻害活性が認められた（リガンド様活性を示す分子が存在することが示された）。ＬＤＬに関しても、高脂血症モデルマウス由来のＬＤＬは、１３％の阻害活性を示したが、健常群由来のＬＤＬでは、３％阻害に過ぎず、有意水準（Ｐ＜０．０５）で統計学的に有意な阻害活性が認められた。＊は、正常食（コントロール食）に対する統計学的有意を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図１８】図１８は、高脂血症モデルマウス、ならびに、健常マウス由来のＬＤＬ中に、ＬＤＬの酸化に伴い生じる酸化ＬＤＬ（リガンド活性を示す分子）に特徴的な構造である４−ヒドロキシ−２−ノネナール（ＨＮＥ）が生成していることを抗ＨＮＥモノクローナル抗体との反応性により比色定量した結果である。健常マウス由来のＬＤＬは、ほとんど反応しないが（ＯＤ≒０）、高脂血症モデルマウス由来のＬＤＬは顕著な反応性を示し（ＯＤ＝０．３）、有意水準（Ｐ＜０．０５）で統計学的に有意な差が認められた。このことから、高脂血症モデルマウス由来のＬＤＬには、ＬＯＸ−１のリガンド様活性を示す分子が統計学的に有意に存在していることが示され、図１７において、示された阻害活性の結果と合わせて、本出願の手法により、リガンド様活性を示す分子が効率的に検出し得ることが示された。＊は、正常食（コントロール食）に対する統計学的有意を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図１９】図１９は、血糖値計による血糖値とグルコース測定キットによる血清中のグルコース濃度の相関を示すグラフである。
【図２０】図２０は、健常マウスとストレプトゾトシン投与により糖尿病を誘導させた糖尿病モデルマウスの血清中のグルコース濃度を測定した結果である。
【図２１】図２１は、血清中のグルコース濃度とクレアチン濃度の個体毎の相関を示す図である。
【図２２】図２２は、健常マウスとストレプトゾトシン投与により糖尿病を誘導させた糖尿病モデルマウスの血中クレアチン濃度を示す図である。本発明のＲＡＧＥのリガンド様活性を示す分子が検出された群において、後日、腎症発症の指標となる血中クレアチニン濃度が上昇することが確認された。
【図２３】図２３は、コントロールマウスとストレプトゾトシン（Ｓｔｚ）投与により糖尿病を誘導したマウス由来の血清の「Ａｌｅｘａ５４６標識Ｒ−ＡＧＥのＲＡＧＥ固定化プレートへの結合阻害活性」、ならびに、「血糖値または血中グルコース濃度」を経時的に測定し、個体毎の相関を示したグラフのうち０日目のグラフである。
【図２４】図２４は、コントロールマウスとストレプトゾトシン（Ｓｔｚ）投与により糖尿病を誘導したマウス由来の血清の「Ａｌｅｘａ５４６標識Ｒ−ＡＧＥのＲＡＧＥ固定化プレートへの結合阻害活性」、ならびに、「血糖値または血中グルコース濃度」を経時的に測定し、個体毎の相関を示したグラフのうち１６日目のグラフである。
【図２５】図２５は、コントロールマウスとストレプトゾトシン（Ｓｔｚ）投与により糖尿病を誘導したマウス由来の血清の「Ａｌｅｘａ５４６標識Ｒ−ＡＧＥのＲＡＧＥ固定化プレートへの結合阻害活性」、ならびに、「血糖値または血中グルコース濃度」を経時的に測定し、個体毎の相関を示したグラフのうち２２日目のグラフである。
【図２６】図２６は、コントロールマウスとストレプトゾトシン（Ｓｔｚ）投与により糖尿病を誘導したマウス由来の血清の「Ａｌｅｘａ５４６標識Ｒ−ＡＧＥのＲＡＧＥ固定化プレートへの結合阻害活性」、ならびに、「血糖値または血中グルコース濃度」を経時的に測定し、個体毎の相関を示したグラフのうち５７日目のグラフである。
【図２７】図２７は、コントロールマウスとストレプトゾトシン（Ｓｔｚ）投与により糖尿病を誘導したマウス由来の血清の「Ａｌｅｘａ５４６標識Ｒ−ＡＧＥのＲＡＧＥ固定化プレートへの結合阻害活性」、ならびに、「血糖値または血中グルコース濃度」を経時的に測定し、個体毎の相関を示したグラフのうち７１日目のグラフである。
【図２８】図２８は、コントロールマウスとストレプトゾトシン（Ｓｔｚ）投与により糖尿病を誘導したマウス由来の血清の「Ａｌｅｘａ５４６標識Ｒ−ＡＧＥのＲＡＧＥ固定化プレートへの結合阻害活性」、ならびに、「血清中のクレアチニン量」を経時的に測定し、個体毎の相関を示した７１日目のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００２２】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２３】
本明細書において使用される場合、用語「受容体」とは、１個以上のリガンドと可逆的、かつ特異的に複合体化する１個以上の結合ドメインを備える生物学的な構造であって、ここで、この複合体化は生物学的な構造を有する。受容体は、完全に細胞の外部（細胞外の受容体）、細胞膜の中（しかし、受容体の部分を細胞外部の環境および細胞質ゾルに向けている）、または完全に細胞の中（細胞内の受容体）に存在し得る。これらはまた、細胞と独立的に機能し得る。細胞膜中の受容体は、細胞を、その境界の外部の空間と連絡（例えば、シグナル伝達）させ、そして細胞の内側および外側への分子およびイオンの輸送において機能させることを可能とする。本明細書において使用する場合、受容体は、受容体全長であっても、受容体のフラグメントであってもよい。
【００２４】
本明細書において使用される場合、用語「レクチン様酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体１（Ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」とは、ＬＯＸ−１ともいわれ、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号４に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（３）上記配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（５）配列番号３に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）上記配列番号３に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（７）上記配列番号３に示される核酸配列において１または数個のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（８）上記配列番号３に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；および（９）上記配列番号３に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド、のうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。また、ＬＯＸ−１としては、ヒトＬＯＸ−１（ｈＬＯＸ−１ともいう）、ウシＬＯＸ−１（ｂ−ＬＯＸ１ともいう）、ブタＬＯＸ−１、マウスＬＯＸ−１、ウサギＬＯＸ−１のような哺乳動物のＬＯＸ−１が挙げられるが、これらに限定されない。ｂＬＯＸ−１は、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる分子量約５０ｋＤａの糖タンパク質であり、Ｎ末端が細胞質内にあり、Ｃ末端が細胞外に出ている細胞膜１回貫通型のＩＩ型膜タンパク質である。ｈＬＯＸ−１はまた、Ｃ型レクチンファミリーに属する２７３アミノ酸残基からなる約３０ｋＤａのＩＩ型膜タンパク質である。ＬＯＸ−１は、構造的には、以下の４つのドメイン：Ｎ末端側の細胞質ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、ネックドメイン、およびＣ型レクチン様ドメインからなる。
【００２５】
本明細書において使用される場合、用語「Ｃ型レクチン様ドメイン」とは、「ＣＴＬＤ」ともいい、Ｃ型レクチンファミリーに属するメンバーの糖鎖認識部位と相同性を有する。ＣＴＬＤは、このメンバー間で、種間で非常によく保存されており、６個のシステイン残基の位置は、完全に保存されている。また、ＣＴＬＤは、ＬＯＸ−１のリガンドを認識するための機能的ドメインであり、この中の６個のシステイン残基は、ｈＬＯＸ−１の３カ所の分子内ジスルフィド結合に関与している。従って、本発明の変異ＬＯＸ−１−界面活性剤複合体は、配列番号４のアミノ酸配列において、１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位におけるシステインが保持されていることが好ましい。同様に、本発明のＣＴＬＤ−界面活性剤複合体においても、配列番号４のアミノ酸配列における１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位におけるシステインに対応するアミノ酸が保持されていることが好ましい。この保存されたＣＴＬＤに加えて、ｈＬＯＸ−１および他の既知の種におけるネックドメインは、高い配列同一性を有している。また、ｈＬＯＸ−１における１４０位のシステインは、分子間ジスルフィド結合に関与し、ｈＬＯＸ−１の二量体を形成する。しかし、この１４０位のシステインは、変性ＬＤＬの認識に必須ではないので、発現された場合に、必ずしもこの１４０位のシステインが保持されている必要はなく、変異されていてもよい。さらに、ｈＬＯＸ−１では、１８３位のＮと１３９位のＮにおいて糖鎖が付加されている。糖鎖が付加されたｈＬＯＸ−１の分子量は、５０ｋＤａである。通常ｈＬＯＸ−１はグリコシル化されているが、たとえグリコシル化されていなくても、グリコシル化された通常のｈＬＯＸ−１と同様に、変性ＬＤＬを認識および結合できる。上記ＣＴＬＤは、変性ＬＤＬを結合するのに必要十分な最小ドメインである。このＬＯＸ−１のＣ末端の４残基（ＬＲＡＱ）は、リガンドの認識と取り込みに必須であり、Ｃ末端の７残基（ＫＡＮＬＲＡＱ）がｈＬＯＸ−１のフォールディングと輸送に必須である。ｈＬＯＸ−１のＷ１５０、Ｒ２０８、Ｒ２２９、Ｒ２３１、Ｒ２４８等がリガンド認識と取り込みに必須のアミノ酸である。ＬＯＸ−１はまた、細胞膜から切断され、可溶性形態として放出され、健常者の血中にも存在することが報告されている。
【００２６】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＴＬＤ様ポリペプチド」とは、「ＣＴＬＤ」、「ＰＲ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ（プロテアーゼ耐性））−ＣＴＬＤ」、「ＣＴＬＤ１４」（ＣＴＬＤ＋ネックドメインのＣ末端側の１４アミノ酸を有するポリペプチド）、「ＰＲ−ＣＴＬＤ１４」、「ＣＴＬＤ＋ネック」（ＣＴＬＤ＋ネックドメインを有するポリペプチド）、または「ＰＲ−ＣＴＬＤ＋ネック」に包含される全てのポリペプチドまたはその変異体を包含する。
【００２７】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＴＬＤ分子」とは、ＣＴＬＤ様ポリペプチドの他、それらの任意の複合体を含むことが理解される。したがって、ＣＴＬＤ分子には、ＬＯＸ−１全長、ＬＯＸ−１細胞外領域全長（Ｓ６１〜Ｑ２７３）、ＣＴＬＤ１４（１２９−１４３）、ＣＴＬＤ（１４３−２７３）等も包含されることが理解される。
【００２８】
本明細書において使用される場合、「複合体」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。２以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。したがって、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。そのような複合体としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、配列番号２のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントであって、ＬＯＸ−１に関する生物学的な活性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合体も使用することができる。
【００２９】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＴＬＤ」および「ＰＲ−ＣＴＬＤ」とは、代表的には、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列において９０位および１０７位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（４）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）上記配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）配列番号１に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号１に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）配列番号１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９０位および１０７位のアミノ酸は、配列番号２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（１０）上記配列番号１に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（１１）上記配列番号１に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００３０】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＴＬＤ１４」および「ＰＲ−ＣＴＬＤ１４」とは、（１）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号６に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号６に示されるアミノ酸配列において１０４位および１２１位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（４）上記配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）上記配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）配列番号５に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号５に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）配列番号５に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１０４位および１２１位のアミノ酸は、配列番号６における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（１０）上記配列番号５に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（１１）上記配列番号５に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００３１】
本明細書において使用される場合、用語「ＣＴＬＤ＋ネック」および「ＰＲ−ＣＴＬＤ＋ネック」とは、（１）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号８に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号８に示されるアミノ酸配列において１７２位および１８９位以外のアミノ酸位置で１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（４）上記配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（５）上記配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）配列番号７に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号７に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）配列番号７に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において１７２位および１８９位位のアミノ酸は、配列番号６における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＬＯＸ−１の活性を示すポリペプチド；（１０）上記配列番号７に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（１１）上記配列番号７に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００３２】
なお、上記ＣＴＬＤ様ポリペプチドは、天然型ＬＯＸ−１の活性が保持されている限り、非天然アミノ酸を含んでいてもよいし、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体などを含んでいてもよい。
【００３３】
上記に示されるＣＴＬＤ様ポリペプチド−界面活性剤複合体においても、システイン残基は、分子内ジスルフィド結合に関与しているので、本発明のＣＴＬＤ様ポリペプチドにおいて、配列番号４のアミノ酸配列の１４４位、１５５位、１７２位、２４３位、２５６位、２６４位に対応するシステインが保持されていることが好ましい。
【００３４】
本明細書において使用される場合、用語「リガンド」とは、特異的な受容体または受容体のファミリーに対する結合パートナーである。リガンドは、受容体に対する内因性のリガンドであるか、またはその代わりに、薬剤、薬剤候補、もしくは薬理学的手段のような受容体に対する合成リガンドであり得る。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「変性ＬＤＬ」とは、ＬＤＬが体内で活性酸素、酸化的酵素、Ｆｅ３＋などと接触すること、あるいは、血管内皮細胞やマクロファージなどによる細胞依存性化学変化によって発生する種々の分子修飾を有する任意のＬＤＬ改変体である。生体内に存在する変性ＬＤＬとしては、代表的には、酸化ＬＤＬ（本明細書中、ＯｘＬＤＬといい、例としては完全酸化ＬＤＬ（本明細書中Ｆ−ＯｘＬＤＬともいう）および部分酸化ＬＤＬ（本明細書中Ｍ−ＯｘＬＤＬともいう）が挙げられる）、マロンジアルデヒド化ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）、アクロレイン修飾ＬＤＬ、ノネナール修飾ＬＤＬ、クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）修飾ＬＤＬ、４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）修飾ＬＤＬ、ヘキサノイル（ＨＥＬ）修飾ＬＤＬ、小粒子ＬＤＬ（直径２５５ｎｍ以下のＬＤＬ）、糖化ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬなどが挙げられるが、これらに限定されない。酸化ＬＤＬが異常値を示す場合、動脈硬化症、虚血性心疾患（心筋梗塞、狭心症など）、脳血管障害（脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、一過性脳虚血発作など）、大動脈瘤、腎梗塞、高脂血症などのような疾患が予想されるがこれらに限定されない（「今日の臨床検査  ２００７−２００８」発行所  株式会社  南江堂、参照）。一般に使用される検査方法では、基準物質としては、ＭＤＡ−ＬＤＬ（正常範囲：１０〜８０ΜＬ）および酸化ホスファチジルコリン（正常範囲：８．４Ｕ／ｍＬ〜１７．６Ｕ／ｍＬ）が使用されている。本明細書において「ＯｘＬＤＬ様活性を示す分子」とは、少なくとも上述のＯｘＬＤＬの活性（本明細書において「ＯｘＬＤＬ様活性」という。）の一つを有する分子をいう。そのようなＯｘＬＤＬ様活性としては、ＬＯＸ−１に対する結合活性（リガンド活性）を挙げることができるが、それに限定されない。
【００３６】
本明細書において使用される場合、用語「後期糖化反応生成物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」とは、ＡＧＥともいわれ、糖尿病患者の生活の質を損ねる元凶である血管合併症として知られる糖尿病性血管障害の発症・進展に関与している。グルコースに代表される還元糖は、タンパク質、アミノ酸のアミノ基と非酵素的に反応して、シッフ塩基またはアマドリ転位化合物などの糖化生成物を形成する。ここまでの反応は可逆的であり、前期反応とよばれている。その後、さらに縮合、開裂、架橋形成などの複雑かつ不可逆的な反応を経て、後期糖化反応生成物を形成する。このような一連の反応は、グリケーションと称される。ＡＧＥはまた、このような過程を経て生成された構造物の総称である。生体中に存在するＡＧＥ構造としては、カルボキシメチルリジン(ＣＭＬ)、カルボキエチルリジン(ＣＥＬ)、ペントシジン、ピラリン、イミダゾリン、メチルグリオキサール、クロスリンなどが挙げられるが、これに限定されない。血漿中に存在するアルブミン、イムノグロブリン、オボアルブミンなどが上記の糖化を受けた産物もＡＧＥであり、ＡＧＥとして実験系に汎用されている。さらに、インビトロ実験系では、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に糖化処理を施したもの、例えば、Ｒ−ＡＧＥ（リボースにより糖化処理をしたＢＳＡ）、Ｆ−ＡＧＥ（フルクトースにより処理をしたＢＳＡ）；Ｇ−ＡＧＥ（グルコースにより糖化処理をしたＢＳＡ）なども汎用されている。血糖コントロールの指標として用いられているヘモグロビンＡ１ｃはアマドリ転移化合物であるが、ＡＧＥに包含される。また、任意のタンパク質も、ＡＧＥに変換可能である。例えば、ＡＧＥに包含されるＣＭＬアルブミンおよびＣＥＬアルブミンは、いずれもアルブミンが糖化を受けたＡＧＥである。このようなＡＧＥ生成反応は、生体内において循環血液中、細胞外マトリクス、細胞内のいずれでも起こり得る。例えば、糖尿病患者の血管に存在するＡＧＥとしては、：蛍光性で架橋構造を有するもの（ペントシジン、クロスリンなど）および蛍光も架橋もないもの（カルボキシメチルリジン、ピラリン、メチルグリオキサール（ＭＧ）−イミダゾロンなど）の２つに大別できる。ＡＧＥが異常値を示す場合、細小血管症（腎症、網膜症、神経症など）、大血管障害（虚血性心疾患、脳血管疾患、閉塞性動脈硬化症のような疾患が予想される。一般に使用される検査方法では、基準物質としては、ピラリン（正常範囲：血漿中２３ｐｍｏｌ／ｍＬ未満）、ペントシジン（正常範囲：血漿中０．００９１５〜０．０４３１μｇ／ｍＬ（ＥＬＩＳＡで測定した場合））などが使用される（「今日の臨床検査  ２００７−２００８」発行所  株式会社  南江堂、参照）。
【００３７】
本明細書において「ＡＧＥ分子」とは、上記ＡＧＥに含まれる任意の分子をいう。例えば、ＡＧＥとしては、Ｌｙｓ−ＡＧＥ（グルタルアルデヒド修飾リジン修飾ＡＧＥ）、グルコース修飾ＡＧＥ（Ｇ−ＡＧＥ）、リボース修飾ＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ）、フルクトース修飾ＡＧＥ（Ｆ−ＡＧＥ）またはそれらの改変体あるいはそれらの複合体を挙げることができるがそれらに限定されない。
【００３８】
本明細書において「ＡＧＥｓ様活性を示す分子」とは、少なくとも上述のＡＧＥの活性（本明細書において「ＡＧＥｓ様活性」という。）の一つを有する分子をいう。そのようなＡＧＥｓ様活性としては、ＲＡＧＥに対する結合活性（リガンド活性）を挙げることができるが、それに限定されない。
【００３９】
本明細書において使用される場合、用語「ＡＧＥ受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥ）」とは、ＲＡＧＥともいわれ、（１）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（３）上記配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（５）配列番号９に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（６）上記配列番号９に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（７）上記配列番号９に示される核酸配列において１または数個のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（８）上記配列番号９に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；および（９）上記配列番号９に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド、のうちの１つである。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。ＲＡＧＥはまた、１９９２年に、ウシ肺から同定され、ＡＧＥと結合するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する、分子量約３５ｋＤａのＩ型膜タンパク質（糖鎖修飾を受けた完全なＲＡＧＥは、分子量５５ｋＤａ）である。ＲＡＧＥの細胞外ドメインは、１つのＶ型イムノグロブリンドメイン、続いて、２つのＣ型イムノグロブリンドメイン（Ｃ１領域およびＣ２領域）の、３つのイムノグロブリンフォールド構造を取るドメインが結合した構造を取っている。ＲＡＧＥはまた、細胞膜１回貫通型のドメインおよび４３アミノ酸の細胞質ドメインを含む。ＲＡＧＥは、多様なクラスのリガンド（ＡＧＥ、Ｓ１００／カルグラニュリン、アンフォテリンおよびアミロイド−βペプチド）と相互作用する。Ｖドメインは、リガンド結合に必須の部位であり、細胞質ドメインは、ＲＡＧＥ媒介性細胞内シグナル伝達に必須である。ＲＡＧＥはまた、各ドメイン内でジスルフィド結合を有するので、本発明の変異ＲＡＧＥ−界面活性剤複合体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位に対応するシステイン残基を保持��ていることが好ましい。ＲＡＧＥは、正常組織および血管系においては低レベルでしか発現されない。しかし、この受容体は、そのリガンドが蓄積した場所においてアップレギュレートされる。ＲＡＧＥの発現は、糖尿病血管系において内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、腎メサンギウム細胞および浸潤性単核食細胞で増加している。また、ＡＧＥが蓄積している動脈硬化巣のような病的部位においても、ＲＡＧＥの発現が増加している。ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用は、血管系ホメオスタシスにおいて重要な細胞の特性を変化させる。例えば、ＲＡＧＥがＡＧＥと結合した後、血管内皮細胞は、ＶＣＡＭ−１、組織因子、およびＩＬ−６の発現、ならびに高分子へのそれらの透過性を増加させる。単核食細胞において、ＲＡＧＥは、サイトカインおよび増殖因子の発現を活性化し、可溶性ＡＧＥに応じて細胞移動を誘導するのに対して、走触性は、固定リガンドで起こる。
【００４０】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ様ポリペプチド」とは、「ＲＡＧＥ８」、「ｍＲＡＧＥ８」、「ＲＡＧＥ１」、「ｍＲＡＧＥ１」、「ＲＡＧＥ２」、「ｍＲＡＧＥ２」、「ＲＡＧＥ３」、「ｍＲＡＧＥ３」、「ＲＡＧＥ４」、「ｍＲＡＧＥ４」、「ＲＡＧＥ７」、「ｍＲＡＧＥ７」、「ＲＡＧＥ１４３」、「ｍＲＡＧＥ１４３」、「ＲＡＧＥ２２３」、「ｍＲＡＧＥ２２３」、「ＲＡＧＥ２２６」および「ｍＲＡＧＥ２２６」と称されるポリペプチドまたはこれらの変異体を包含する。
【００４１】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ分子」とは、ＲＡＧＥ様ポリペプチドの他、それらの任意の複合体を含むことが理解される。したがって、ＲＡＧＥ分子には、ＲＡＧＥ様ポリペプチド等、例えば、ＲＡＧＥ（全長）、ＲＡＧＥ細胞外領域（配列番号１０の２２−３３２位）、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６等が包含されることが理解される。
【００４２】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ８」および「ｍＲＡＧＥ８」とは、（１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号１１に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号１１に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号１１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号１２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号１１に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号１１に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドのうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００４３】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ１」および「ｍＲＡＧＥ１」とは、（１）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位、２０６位および２５０位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号１３に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号１３に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号１３に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１３に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列であって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位、２０６位および２５０位のアミノ酸配列は、配列番号１４における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号１３に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号１３に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００４４】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ２」および「ｍＲＡＧＥ２」とは、（１）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号１６に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号１５に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号１５に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号１５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１５に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸配列は、配列番号１６における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号１５に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号１５に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００４５】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ３」および「ｍＲＡＧＥ３」とは、（１）配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号１８に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号１８に示されるアミノ酸配列において、９２位、９５位および２０６位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（３７４）上記配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号１７に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号１７に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号１７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１７に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位、９５位および２０６位のアミノ酸配列は、配列番号１８における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号１７に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号１７に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００４６】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ４」および「ｍＲＡＧＥ４」とは、（１）配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号２０に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号２０に示されるアミノ酸配列において、１４位、１７位、１２８位および１７２位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号１９に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号１９に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号１９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号１９に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において１４位、１７位、１２８位および１７２位のアミノ酸配列は、配列番号２０における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号１９に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号１９に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００４７】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ７」および「ｍＲＡＧＥ７」とは、（１）配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号２２に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号２２に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号２１に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号２１に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号２１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号２１に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号２２における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号２１に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号２１に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００４８】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ１４３」および「ｍＲＡＧＥ１４３」とは、（１）配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号２４に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号２４に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号２４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号２４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号２３に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号２３に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号２３に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号２３に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号２４における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号２３に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号２３に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００４９】
本発明において、ＲＡＧＥ１４３を使用することが好ましくありうる。理論に束縛されることは望まないが、ＲＡＧＥ１４３は、ＲＡＧＥ１同様の認識活性を有し、かつ、分子としての安定性が優れているからである。ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２２３，ＲＡＧＥ２２６なども使用することができるが、保存中に分解が生じやすく、実験期間中に反応性が変化する可能性があることから、分解を進行させない任意の方法を用いて使用することが好ましく、あるいは長時間のアッセイにおいてはＲＡＧＥ１４３が好ましくありうる。ＲＡＧＥ１４３に限らず、ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２２３，ＲＡＧＥ２２６などでも同様の結果は得られることが理解される。
【００５０】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ２２３」および「ｍＲＡＧＥ２２３」とは、（１）配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号２６に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号２６に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号２５に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号２５に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号２５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号２５に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号２６における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号２５に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号２５に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「ＲＡＧＥ２２６」および「ｍＲＡＧＥ２２６」とは、（１）配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（２）上記配列番号２８に示されるアミノ酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；（３）上記配列番号２８に示されるアミノ酸配列において、９２位および９５位以外のアミノ酸位置で１または数個のアミノ酸の置換、付加および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示すポリペプチド；（４）上記配列番号２８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含むポリペプチド；（５）上記配列番号２８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体を含むポリペプチド；（６）配列番号２７に示される核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（７）上記配列番号２７に示される核酸配列に対して相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（８）上記配列番号２７に示される核酸配列において１または数個の置換、付加および／または欠失を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（９）上記配列番号２７に示される核酸配列と相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該コードされるアミノ酸配列において９２位および９５位のアミノ酸配列は、配列番号２８における対応するアミノ酸を保持し、かつ天然型ＲＡＧＥの活性を示す、ポリペプチド；（１０）上記配列番号２７に示される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および（１１）上記配列番号２７に示される核酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、のうちの１つによって示される。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行））を用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。
【００５２】
なお、上記ＲＡＧＥ様ポリペプチドは、天然型ＲＡＧＥの活性が保持されている限り、非天然アミノ酸を含んでいてもよいし、アミノ酸アナログ、アミノ酸誘導体などを含んでいてもよい。
【００５３】
上記のＲＡＧＥ様ポリペプチドにおいても、分子内ジスルフィド結合を形成することは重要であるので、配列番号１０のアミノ酸配列の３８位、９９位、１４４位、２０８位、２５９位および３０１位に対応するシステインは保持されていることが好ましい。
【００５４】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【００５５】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００５６】
本明細書において「アミノ酸誘導体」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのようなアミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。本明細書では、アミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、アミノ酸と同じ生物学的機能を提供し得る限り代替として使用され得ることが理解される。
【００５７】
本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
【００５８】
本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。
【００５９】
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【００６０】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００６１】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００６２】
本明細書において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいう。例えば、ＬＯＸ−１においては、２３２位および２４９位におけるアミノ酸であり、ＲＡＧＥにおいては、１１４位、１１７位、２２８位、２７２位におけるアミノ酸である。
【００６３】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、ＬＯＸ−１）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００６４】
本明細書中で使用される「異種」とは、異なる配列または対応しない配列、あるいは異なる種由来の配列である、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をいう。例えば、ヒトのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、マウスのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種であり、そしてヒトＬＯＸ−１の核酸配列またはアミノ酸配列は、ヒトアルブミンのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して異種である。
【００６５】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【００６６】
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、例えば、ＬＯＸ−１が変性ＬＤＬを認識する機能、ＲＡＧＥがＡＧＥを認識する機能などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【００６７】
したがって、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。
【００６８】
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
【００６９】
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
【００７０】
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
【００７１】
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。
【００７２】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、オルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００７３】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ  Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。
【００７４】
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、リガンド分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【００７５】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【００７６】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【００７７】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、リガンド結合能において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００７８】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７９】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００８０】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、目的とする機能（例えば、ＡＧＥの認識能など）が保持される限り、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ＡＧＥの認識能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００８１】
本明細書において使用される場合、用語「タグ配列」とは、受容体−リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質、より具体的には、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンのような関係を有する）をいう。よって、例えば、タグ配列が結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。このようなタグ配列は、当該分野で周知である。代表的なタグ配列としては、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡ、Ａｖｉタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
本明細書において使用される場合、用語「検出剤」とは、広義には、目的の物質（例えば、変性ＬＤＬ、ＡＧＥなど）を検出できるあらゆる因子をいう。
【００８３】
本明細書において使用される場合、用語「固相」とは、本明細書中において「基板」および「基材」と互換的に使用され、本発明のデバイスが構築される材料をいう。抗体のような分子が固定され得る平面状の支持体をいう。本発明において表面プラズモン共鳴の原理を用いて検出する場合、固相は、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面に持つガラス基板の基材であることが好ましい。本発明において水晶発振子マイクロバランスの原理を用いて検出する場合は、周波数変換素子（例えば水晶発振子、表面弾性波素子）を固相として用い、直接受容体を結合させる。水晶板の片面はシリコーンで被覆し、もう一方の面は金電極を施したものを固相として用いる。本発明において酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）のような機構を使用する場合、一般に、固相（基材）としては、マイクロタイタープレートが使用される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。適切な基材としては、ビーズ、金粒子、プレート（例えば、マイクロタイタープレート）、試験管、チップ、磁性粒子、膜、繊維、スライドガラス、金属薄膜、フィルター、チューブ、ボール、ダイアモンド様炭素被膜ステンレスなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
固相および基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコーン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、アミロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料として使用することが好ましい。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のパラメータによって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。
【００８５】
本明細書において「チップ」は、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、受容体を固定化した固相を、受容体チップおよび／または受容体マイクロチップと呼ぶ。
【００８６】
本明細書において使用される場合、用語「乾燥形態」とは、本発明で使用される成分を含む検出剤、デバイス、診断剤などにおいて、実質的に水分含量が低下している状態であることをいう。一般的には、「乾燥状態」は、風乾、減圧乾燥などの当該分野で周知の技術を用いて容易に達成することができる。
【００８７】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００８８】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００８９】
本発明において用いられる配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
【００９０】
本明細書において使用される場合、用語「標識」とは、特定の物質を検出するために、この物質に結合することが既知の物質に付加される分子をいう。標識としては、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
本明細書において使用される場合、用語「リフォールディング」とは、異常な折り畳みを有するためにその本来有する機能を失っているポリペプチドの異常な構造を解きほぐし、界面活性剤により再凝集を防ぎつつ、サイクロアミロースの包接能を活用してそのポリペプチドの本来の正しい構造に再折りたたみすることをいう。
【００９２】
本明細書において使用される場合、用語「界面活性剤」とは、液体に溶解すると、溶液の表面張力を著しく減少させる物質をいう。界面活性剤は、溶液の中で臨海ミセル濃度を超えると、ミセルコロイドを形成する。界面活性剤は、親水性基と親油性基とを有するために、両親媒性化合物であり、二相界面で方向配位をして安定な層をなす。界面活性剤は、長鎖脂肪酸塩やドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような陰イオン性界面活性剤、臭化セチルトリメチルアンモニウムのような陽イオン界面活性剤、さらに両性界面活性剤、ＴｒｉｔｏｎＴＭシリーズおよびＴｗｅｅｎＴＭシリーズのような非イオン性界面活性剤に分けられる。適切な界面活性剤としては、ポリオキシエチレン系界面活性剤、イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【００９４】
（ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量方法）
１つの局面において、本発明は、ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量方法であって、（Ａ）検出または定量の対象となるサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥ分子の存在下で標識したＡＧＥ分子に接触させるか、または固相に固定されたＡＧＥ分子の存在下で、標識したＲＡＧＥ分子に接触させる工程、および（Ｂ）該ＡＧＥ分子に対する該ＲＡＧＥ分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該サンプルにおけるＡＧＥｓ様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す、工程を包含する、方法を提供する。
【００９５】
この方法において、受容体分子であるＲＡＧＥ分子またはそのリガンドであるＡＧＥ分子のいずれかを固相に固定し、他方の存在の元で、検出または定量の対象となるサンプルをアッセイしたところ、従来得られなかった感度の上昇、ＡＧＥｓ様活性を示す分子のスクリーニングの網羅性の上昇という効果が得られた。
【００９６】
本発明の実施形態では、使用される固相としては、固定される分子、例えば、ＲＡＧＥ分子、ＡＧＥ分子が固定されうる限り任意のものを利用することができる。１つの実施形態では、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）のような機構を使用する場合、一般に、固相（基材）としては、マイクロタイタープレートが使用される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。その材料としては、例えば、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。固相への固定方法は、当該分野において任意の公知の方法で実施することができる。例えば、好ましくは、固相表面上のシラノール基（ＳｉＯＨ）を介した結合反応、素材のマトリックスによる疎水性結合および修飾官能基によるイオン結合、マトリックスに含まれている芳香族環を介した結合反応を用いることができる。固相への固定後は、その固相は、乾燥させてもよく、湿潤状態で利用しても良い。乾燥させることによって保存がしやすくなる。
【００９７】
本発明において、本発明のサンプルをＡＧＥ分子またはＲＡＧＥ分子に接触させる手法としては、当該分野において公知の任意の手法を用いることができ、例えば、両者を溶液中で混合すること、あるいはその後インキュベートすることなど手法を用いることができるがこれらに限定されない。
【００９８】
本発明において、ＡＧＥ分子に対する該ＲＡＧＥ分子の結合を検出する手法としては、当該分野において公知の任意の手法を用いることができ、例えば、いずれかの分子を標識（例えば、蛍光標識）した場合に、その標識を検出する任意の手法を利用することができることが理解される。ここで、上記結合の阻害の存否またはレベルは、該サンプルにおけるＡＧＥｓ様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示すものである。
【００９９】
本発明において、ＡＧＥ分子に対する該ＲＡＧＥ分子の結合の定量は、上記検出において、数値化する任意の手法によって、実現することができる。このような定量は相対的（レベル）でもよく、絶対量で表示してもよい。例えば、そのような手法としては、既知量のＡＧＥ分子およびＲＡＧＥ分子について、検出対象となる標識の強度をプロットし、検量線を作成し、サンプルの検出データから外挿する手法が挙げられるがそれに限定されない。
【０１００】
１つの実施形態では、本発明において用いられるＲＡＧＥ分子は、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２２３、ＲＡＧＥ２２６またはその改変体でありうる。１つの好ましい実施形態では、ＲＡＧＥ１４３が用いられる。長期保存に対して安定性が高いからであるが、これに限定されない。
【０１０１】
１つの実施形態では、本発明において用いられるＡＧＥ分子は、Ｌｙｓ−ＡＧＥ（グルタルアルデヒド修飾リジン修飾ＡＧＥ）、グルコース修飾ＡＧＥ（Ｇ−ＡＧＥ）、リボース修飾ＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ）、フルクトース修飾ＡＧＥ（Ｆ−ＡＧＥ）またはそれらの改変体でありうる。
【０１０２】
（糖尿病性腎症の予備的な検出方法）
別の局面において、本発明は、糖尿病性腎症の予備的な検出方法（または、予測方法もしくは予備的診断方法）であって、（Ａ）糖尿病性腎症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥ分子の存在下で標識したＡＧＥ分子に接触させるか、または固相に固定されたＡＧＥ分子の存在下で、標識したＲＡＧＥ分子に接触させる工程、および（Ｂ）該ＡＧＥ分子に対する該ＲＡＧＥ分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、工程を包含する、方法を提供する。このように、ＲＡＧＥ分子またはＡＧＥ分子を用いて被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示すことが示されたのは過去に例がなく、診断分野において顕著な進歩を示すものであるといえる。
【０１０３】
ここで、本発明の糖尿病性腎症の予備的な検出方法（または、予測方法もしくは予備的診断方法）において、ＡＧＥ分子およびＲＡＧＥ分子、接触、結合の検出、結合のレベルの算出等は、（ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量方法）において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
【０１０４】
本明細書において「被験体」とは、本発明の診断または検出の方法の対象となる生物（例えば、ヒトをいう。
【０１０５】
本明細書において「サンプル」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、体液（血液、唾液、尿、涙液等）が含まれる。好ましくは血液、尿、涙液を使用する。
【０１０６】
結合の阻害の存否またはレベルから、被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を判定する手法は以下のとおりである。被験体の病状にかかわらず、これからサンプルを調製する。ＲＡＧＥの存在下で標識したＡＧＥ分子サンプルを３７℃で１時間反応させた際に、標識下ＡＧＥ分子の結合を阻害する活性を定量する。サンプルの代わりに緩衝液を添加した際の標識ＡＧＥ結合量（標識が蛍光標識の場合は、蛍光光度計により測定される蛍光強度）を１００％とし、結合を阻害する程度が大きい程、ＡＧＥ様活性を示す分子の存在量が多く、罹患する可能性が高いと判定される。
【０１０７】
（糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な検出方法）
別の局面において、本発明は、糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な検出方法（または、予測方法もしくは予備的診断方法）であって、（Ａ）糖尿病性腎症の検出の対象となる糖尿病に罹患した被験体からのサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥ分子の存在下で標識したＡＧＥ分子に接触させるか、または固相に固定されたＡＧＥ分子の存在下で、標識したＲＡＧＥ分子に接触させる工程、および（Ｂ）該ＡＧＥ分子に対する該ＲＡＧＥ分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、工程を包含する、方法を提供する。このように、ＲＡＧＥ分子またはＡＧＥ分子を用いて糖尿病に罹患した被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示すことが示されたのは過去に例がなく、診断分野において顕著な進歩を示すものであるといえる。
【０１０８】
ここで、本発明の糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な検出方法（または、予測方法もしくは予備的診断方法）において、ＡＧＥ分子およびＲＡＧＥ分子、接触、結合の検出、結合のレベルの算出等は、（ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量方法）において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
【０１０９】
結合の阻害の存否またはレベルから、糖尿病に罹患した被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を判定する手法は以下のとおりである。糖尿病に罹患した被験体からサンプルを調製する。ＲＡＧＥの存在下で標識したＡＧＥ分子サンプルを３７℃で１時間反応させた際に、標識下ＡＧＥ分子の結合を阻害する活性を定量する。サンプルの代わりに緩衝液を添加した際の標識ＡＧＥ結合量（標識が蛍光標識の場合は、蛍光光度計により測定される蛍光強度）を１００％とし、結合を阻害する程度が大きい程、ＡＧＥ様活性を示す分子の存在量が多く、罹患する可能性が高いと判定される。
【０１１０】
（糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法）
別の局面において、本発明は、糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法（または、診断方法）であって、（Ａ）糖尿病性腎症の検出の対象となる被験体からのサンプルを、固相に固定されたＲＡＧＥ分子の存在下で標識したＡＧＥ分子に接触させるか、または固相に固定されたＡＧＥ分子の存在下で、標識したＲＡＧＥ分子に接触させる工程、および（Ｂ）該固定化されたＡＧＥもしくはその改変体に対する該ＲＡＧＥ分子または該ＡＧＥもしくはその改変体のリガンドの結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、工程を包含する、方法を提供する。このように、ＲＡＧＥ分子またはＡＧＥ分子を用いて糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを診断することができることが示されたのは過去に例がなく、診断分野において顕著な進歩を示すものであるといえる。
【０１１１】
ここで、本発明の糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法において、ＡＧＥ分子およびＲＡＧＥ分子、接触、結合の検出、結合のレベルの算出等は、（ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量方法）において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
【０１１２】
結合の阻害の存否またはレベルから、被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを判定する手法は以下のとおりである。糖尿病または糖尿病性腎症に罹患している疑いのあるあるいは検査の対象となる被験体からサンプルを調製する。ＲＡＧＥの存在下で標識したＡＧＥ分子サンプルを３７℃で１時間反応させた際に、標識下ＡＧＥ分子の結合を阻害する活性を定量する。サンプルの代わりに緩衝液を添加した際の標識ＡＧＥ結合量（標識が蛍光標識の場合は、蛍光光度計により測定される蛍光強度）を１００％とし、結合を阻害する程度が大きい程、ＡＧＥ様活性を示す分子の存在量が多く、罹患する可能性が高いと判定される。
【０１１３】
（ＯｘＬＤＬ様活性を示す分子の検出または定量方法）
１つの局面において、本発明は、ＯｘＬＤＬ様活性を示す分子の検出または定量方法であって、（Ａ）検出または定量の対象となるサンプルを、固相に固定されたＣＴＬＤ分子の存在下で標識した変性ＬＤＬに接触させるか、または固相に固定された変性ＬＤＬの存在下で、標識したＣＴＬＤ分子に接触させる工程、および（Ｂ）該変性ＬＤＬに対する該ＣＴＬＤ分子の結合を検出する工程であって、該結合の阻害の存否またはレベルは、ＯｘＬＤＬ様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す、工程を包含する、方法を提供する。
【０１１４】
この方法において、受容体分子であるＣＴＬＤ分子またはそのリガンドである変性ＬＤＬのいずれかを固相に固定し、他方の存在の元で、検出または定量の対象となるサンプルをアッセイしたところ、従来得られなかった感度の上昇、ＯｘＬＤＬ様活性を示す分子のスクリーニングの網羅性の上昇という効果が得られた。
【０１１５】
本発明の実施形態では、使用される固相としては、固定される分子、例えば、ＣＴＬＤ分子、変性ＬＤＬが固定されうる限り任意のものを利用することができる。１つの実施形態では、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）のような機構を使用する場合、一般に、固相（基材）としては、マイクロタイタープレートが使用される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。その材料としては、例えば、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。
【０１１６】
固相への固定方法は、当該分野において任意の公知の方法で実施することができる。例えば、好ましくは、固相表面上のシラノール基（ＳｉＯＨ）による結合、素材のマトリックスによる疎水性結合および修飾官能基によるイオン結合、マトリックスに含まれている芳香族環を介した結合を用いることができる。固相への固定後は、その固相は、乾燥させてもよく、湿潤状態で利用しても良い。乾燥させることによって保存がしやすくなる。
【０１１７】
本発明において、本発明のサンプルをＣＴＬＤ分子または変性ＬＤＬに接触させる手法としては、当該分野において公知の任意の手法を用いることができ、例えば、両者を溶液中で混合すること、あるいはその後インキュベートすることなど手法を用いることができるがこれらに限定されない。
【０１１８】
本発明において、ＣＴＬＤ分子に対する変性ＬＤＬの結合を検出する手法としては、当該分野において公知の任意の手法を用いることができ、例えば、いずれかの分子を標識（例えば、蛍光標識）した場合に、その標識を検出する任意の手法を利用することができることが理解される。ここで、上記結合の阻害の存否またはレベルは、該サンプルにおけるＯｘＬＤＬ様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示すものである。
【０１１９】
本発明において、ＣＴＬＤ分子に対する変性ＬＤＬの結合の定量は、上記検出において、数値化する任意の手法によって、実現することができる。このような定量は相対的（レベル）でもよく、絶対量で表示してもよい。例えば、そのような手法としては、既知量のＣＴＬＤ分子および変性ＬＤＬについて、検出対象となる標識の強度をプロットし、検量線を作成し、サンプルの検出データから外挿する手法が挙げられるがそれに限定されない。
【０１２０】
１つの実施形態において、本発明において用いられるＣＴＬＤ分子は、ＣＴＬＤ１４、ＬＯＸ−１全長、ＬＯＸ−１細胞外領域全長またはそれらの改変体でありうる。好ましくは、ＣＴＬＤ１４を用いることができる。長期保存に対して安定性が高いからであるが、これに限定されない。
【０１２１】
１つの実施形態では、本発明において用いられる変性ＬＤＬは、酸化ＬＤＬ（ＯｘＬＤＬ）、マロンジアルデヒド化ＬＤＬ（ＭＤＡ−ＬＤＬ）、アクロレイン修飾ＬＤＬ、ノネナール修飾ＬＤＬ、クロトンアルデヒド（ＣＲＡ）修飾ＬＤＬ、４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）修飾ＬＤＬ、ヘキサノイル（ＨＥＬ）修飾ＬＤＬ、小粒子ＬＤＬ、糖化ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬまたはその改変体でありうる。
【０１２２】
（ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量のためのキット）
１つの局面において、本発明は、ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量のためのキットを提供する。このキットは、（Ａ）固定されたＲＡＧＥ分子を有する固相および標識したＡＧＥ分子、または固定されたＡＧＥ分子を有する固相および標識したＲＡＧＥ分子；および（Ｂ）該ＡＧＥ分子に対する該ＲＡＧＥ分子の結合を検出する手段を備える。このキットにおいて、該結合の阻害の存否またはレベルは、ＡＧＥｓ様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す。本発明のキットにおいて使用されうるＲＡＧＥ分子、固相、ＡＧＥ分子、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、（ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量方法）において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
【０１２３】
（糖尿病または糖尿病性腎症の検出または診断のためのキットまたはマーカー）
別の局面において、本発明は、糖尿病性腎症の予備的な検出または診断（または、予測）のためのキットを提供する。ここで、このキットは（Ａ）固定されたＲＡＧＥ分子を有する固相および標識したＡＧＥ分子、または固定されたＡＧＥ分子を有する固相および標識したＲＡＧＥ分子；および（Ｂ）該ＡＧＥに対する該ＲＡＧＥ分子の結合を検出する手段を備え、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す。本発明のキットにおいて使用されうるＲＡＧＥ分子、固相、ＡＧＥ分子、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、（ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量方法）、（糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法）において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
【０１２４】
別の局面において、本発明は、ＡＧＥｓ様活性を示す分子を含む、糖尿病性腎症の予備的な診断マーカーを提供する。あるいは、本発明は、糖尿病性腎症の予備的な診断の指標とするための、被験体中のＡＧＥｓ様活性の使用であって、該ＡＧＥｓ様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、使用を提供する。ここで、本発明の診断マーカーを測定した場合に、ＡＧＥｓ様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す。ＡＧＥｓ様活性またはＡＧＥｓ様活性を示す分子は、本発明のＡＧＥ分子またはＲＡＧＥ分子を利用した技術を用いて測定することができる。本発明の診断マーカーまたは使用において使用されうるＡＧＥｓ様活性、ＡＧＥｓ様活性を示す分子、ならびにそれらに関連するＲＡＧＥ分子、固相、ＡＧＥ分子、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、（ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量方法）、（糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法）ならびに他の欄において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
【０１２５】
別の局面において、本発明は、糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な検出または診断（または、予測）のためのキットを提供する。このキットは、（Ａ）固定されたＲＡＧＥ分子を有する固相および標識したＡＧＥ分子、または固定されたＡＧＥ分子を有する固相および標識したＲＡＧＥ分子；および（Ｂ）該ＡＧＥに対する該分子の結合を検出する手段を備える。ここで、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す。本発明のこのキットにおいて使用されうるＲＡＧＥ分子、固相、ＡＧＥ分子、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、（ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量方法）、（糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法）において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
【０１２６】
別の局面において、本発明は、ＡＧＥｓ様活性を示す分子を含む、糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な診断マーカーを提供する。あるいは、本発明は、糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な診断の指標とするための、被験体中のＡＧＥｓ様活性の使用であって、該ＡＧＥｓ様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す、使用を提供する。ここで、本発明の診断マーカーを測定した場合に、ＡＧＥｓ様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が将来糖尿病性腎症に罹患することまたはその可能性を示す。ＡＧＥｓ様活性またはＡＧＥｓ様活性を示す分子は、本発明のＡＧＥ分子またはＲＡＧＥ分子を利用した技術を用いて測定することができる。本発明の診断マーカーまたは使用において使用されうるＡＧＥｓ様活性、ＡＧＥｓ様活性を示す分子、ならびにそれらに関連するＲＡＧＥ分子、固相、ＡＧＥ分子、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、（ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量方法）、（糖尿病における糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法）ならびに他の欄において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
【０１２７】
別の局面において、本発明は、糖尿病または糖尿病性腎症の検出または診断のためのキットを提供する。ここでこのキットは、（Ａ）固定されたＲＡＧＥ分子を有する固相および標識したＡＧＥ分子、または固定されたＡＧＥ分子を有する固相および標識したＲＡＧＥ分子；および（Ｂ）該ＡＧＥに対する該分子の結合を検出する手段を備える。ここで、該結合の阻害の存在またはレベルは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す。本発明のこのキットにおいて使用されうるＲＡＧＥ分子、固相、ＡＧＥ分子、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、（ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量方法）、（糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法）において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
【０１２８】
別の局面において、本発明は、ＡＧＥｓ様活性を示す分子を含む、糖尿病または糖尿病性腎症の診断マーカーを提供する。あるいは、本発明は、糖尿病または糖尿病性腎症の診断の指標とするための、被験体中のＡＧＥｓ様活性の使用であって、該ＡＧＥｓ様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す、使用を提供する。ここで、本発明の診断マーカーを測定した場合に、ＡＧＥｓ様活性が標準値に比べて高いことは、該被験体が糖尿病または糖尿病性腎症に罹患していることを示す。ＡＧＥｓ様活性またはＡＧＥｓ様活性を示す分子は、本発明のＡＧＥ分子またはＲＡＧＥ分子を利用した技術を用いて測定することができる。本発明の診断マーカーまたは使用において使用されうるＡＧＥｓ様活性、ＡＧＥｓ様活性を示す分子、ならびにそれらに関連するＲＡＧＥ分子、固相、ＡＧＥ分子、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、（ＡＧＥｓ様活性を示す分子の検出または定量方法）、（糖尿病または糖尿病性腎症の検出方法）ならびに他の欄において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
【０１２９】
（ＯｘＬＤＬ様活性を示す分子の検出または定量のためのキット）
別の局面において、本発明は、ＯｘＬＤＬ様活性を示す分子の検出または定量のためのキットを提供する。このキットは、（Ａ）固定されたＣＴＬＤ分子を有する固相および標識した変性ＬＤＬ、または固定された変性ＬＤＬを有する固相および標識したＣＴＬＤ分子；および（Ｂ）該変性ＬＤＬに対する該ＣＴＬＤ分子の結合を検出する手段を備える。ここで、該結合の阻害の存否またはレベルは、ＯｘＬＤＬ様活性を示す分子の存在もしくは存在レベルを示す。本発明のこのキットにおいて使用されうる変性ＬＤＬ，ＣＴＬＤ分子、固相、標識、接触、結合の検出技術または手段等は、結合のレベルの算出等は、（ＯｘＬＤＬ様活性を示す分子の検出または定量方法）において説明される任意の実施形態が利用されうることが理解される。
【０１３０】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１３１】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１３２】
以下の実施例で用いた動物の取り扱いは、食品総合研究所において規定される基準を遵守した。なお、以下に製造例を記載するが、詳細な情報は、さらに非特許文献７を参酌することができることが理解される。
【０１３３】
（製造例１：ＣＴＬＤ様ポリペプチドの生成）
切断部位２箇所に変異を導入したＣＴＬＤ様ポリペプチド（Ｇ２３２Ａ／Ｇ２４９Ａ；本例中、ＰＲ−ＣＴＬＤともいう）をコードする核酸を、定法に従って生成した。定法に従って、この核酸を、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を融合させた哺乳動物用発現ベクターｐＥＣＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）に導入することによって、Ｎ末端にＣＦＰが融合したＰＲ−ＣＴＬＤコード核酸を含むプラスミドを構築した。ＣＨＯ細胞を１０％  ＦＣＳを補充したＦ１２培地中、３７℃において５％ＣＯ２加湿雰囲気下で培養した。１×１０４細胞／ｍｌの密度で懸濁したＣＨＯ細胞４００μｌを、トランスフェクションを行う２４時間前に、カバーガラス上に播種した。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬を用いて製造業者のプロトコルに従って、細胞をトランスフェクトし、４８時間インキュベートし、ＣＨＯ細胞に一過性発現させた。その後、この細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、ＣＦＰの蛍光によりＣＴＬＤ様ポリペプチド発現細胞が確認できた。また、リガンドである変性ＬＤＬを蛍光色素である過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン（ＤｉＤ；Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により標識し、この変性ＬＤＬをＣＴＬＤ様ポリペプチド発現細胞に添加したところ、リガンドの認識能および取り込み能が確認できた。
【０１３４】
これらの結果から、ＰＲ−ＣＴＬＤ発現細胞は、明瞭なリガンド取り込み能を示し、プロテアーゼ耐性を付与するために行ったアミノ酸置換は、変性ＬＤＬ認識能には何ら影響を与えていないことが示された。
【０１３５】
さらに、このＰＲ−ＣＴＬＤのプロテアーゼ感受性を検討したところ、２ｕ（１ｕは、１ｍｇの対象タンパク質を分解可能な濃度）のトロンビンで、０．０２ｍｇのＰＲ−ＣＴＬＤを１８時間処理しても分解が起こらないことが確認され、プロテアーゼ耐性ＣＴＬＤ様ポリペプチド（ＰＲ−ＣＴＬＤ）を生成することに成功した。
【０１３６】
（製造例２：タグ配列付加ＣＴＬＤ様ポリペプチドの生成）
製造例１において生成したＣＴＬＤ様ポリペプチド（ＰＲ−ＣＴＬＤ）に加えて、さらに、ＣＴＬＤ様ポリペプチドと同様のプロテアーゼ耐性変異を導入した長さの異なるタンパク質ＰＲ−ＣＴＬＤ１４（ネック領域の１４アミノ酸を含む、ＬＯＸ−１のアミノ酸１２９位〜２７３位）を作成した。ＰＲ−ＣＴＬＤ１４のアミノ酸配列には分子間Ｓ−Ｓ結合に関与するＣｙｓが含まれる。分子間Ｓ−Ｓ結合を形成しなくても認識能はあるが、細胞上で機能を発現する際には、一定以上の分子密度をとる必要がある（Ｘｉｅら、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３（２）：１１１−１１７（２００４）およびＭａｔｓｕｎａｇａら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１３：１２０３−１２１４（２００７））。そこで、高密度集積に寄与し得る構造として分子間Ｓ−Ｓ結合形成が可能なＰＲ−ＣＴＬＤ１４もまた、変性ＬＤＬを検出するアッセイ系を構築するのに使用することができる。
【０１３７】
発現させたプロテアーゼ耐性のＣＴＬＤ様ポリペプチド（ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４）を検出／評価系において活用する際には、有効な修飾が施されていることが望ましい。そこでこれらの分子のＮ末側に２種類のタグ（一つは大腸菌内でビオチン化を受ける配列ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号２９））、他方はストレプトアビジンに直接認識される配列であるＳｔｒｅｐｔａｇ（ＡＷＲＨＰＱＦＧＧ（配列番号３０））またはＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号３１））を付加した。ビオチンとストレプトアビジンの結合は非共有結合で最も強く（ＫＤ＝１０−１５Ｍ）、ストレプトアビジンを介した固定化などへの発展に際しても有効である。しかし、ビオチン化のためには、培地中へのビオチンの添加、ビオチンリガーゼを共発現させる必要があるなどの手間が掛かる。そこで、結合の強さでは劣るが（ＫＤ＝１０−７Ｍ）、遺伝子配列上でタグを付加し大腸菌で発現させればストレプトアビジンへの結合が可能なＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号３１））付加タンパク質も生成した。いずれもｐＥＴ系ベクターの５’側に、タグ配列をコードする核酸配列を導入して発現用プラスミドとした（ｐＥＴ  Ｎ−Ａｖｉ、ｐＥＴ  Ｎ−ＳｔＩＩ）。定法に従って、これらの発現ベクターそれぞれにＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４を導入して、発現構築物を生成した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質のビオチン化のために、ｐＥＴ系ベクターと同一菌体内で保持可能なｐＡＣ系ベクターにビオチンリガーゼをコードしているＢｉｒＡ遺伝子を導入し、発現用プラスミドを作製した（ＢｉｒＡ／ｐＡＣ）。
【０１３８】
ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４はともに、分子内Ｓ−Ｓ結合の形成が構造の安定化と機能に必須である。そこで発現宿主としてＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のＳ−Ｓ結合形成を促進する性質がある。プロテアーゼ耐性ＣＴＬＤ様ポリペプチドにＡｖｉＴａｇを付加する場合、ＡｖｉＴａｇおよび目的タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターと、ＢｉｒＡ遺伝子を含む発現ベクターとで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）ＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩコード核酸を含む発現ベクターで形質転換した場合は、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４の発現を、ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。
【０１３９】
予備実験として、ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４を可溶性ポリペプチドとして発現するための温度条件および誘導時間を調べた。温度条件は、（１）３７℃、（２）２５℃および（３）２０℃に設定した。誘導時間は、（Ａ）２時間、（Ｂ）４時間、（Ｃ）８時間、（Ｄ）１８時間、（Ｅ）２４時間に設定した。まず、これらの宿主細胞を３７℃で誘導し、誘導されたタンパク質の分子量を測定したところ、予想される分子量のタンパク質の誘導が確認されたが、１００％が不溶性画分に回収された。この結果に鑑みて、誘導時間を変動させずに、誘導時の温度を２５℃に下げたところ、わずかながら可溶性ポリペプチドとしての発現が確認された。さらに誘導時の温度を２０℃にまで下げて、誘導時間の検討を行ったところ、可溶性ポリペプチドとして回収するためには、温度条件（３）および誘導時間（Ｄ）１８時間〜（Ｅ）２４時間、特に２０〜２４時間の誘導が適切であると結論付けられた。
【０１４０】
上記の形質転換細胞を３７℃で１２時間前培養した。本培養は、この前培養液を、２０倍希釈になるように上記の各ＬＢ培地に添加し、２５℃で旋回培養した。上記で得られた条件に基づいて、培養液の光学密度（Ａ６００）が約０．５に達したときに、培養温度を２０℃に下げると同時に、１ｍＭ（最終濃度）ＩＰＴＧを添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質を生成する場合は、誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現される目的タンパク質のビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後２０〜２４時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離により菌体をペレット化して上清を廃棄し、適量のＴＢＳで洗浄した。
【０１４１】
ＴＢＳに懸濁した菌体を、超音波破砕機にて破砕後、１５，０００ｒｐｍ×３０分の遠心分離により回収される上清を可溶性画分とした。発現された目的タンパク質の９０％以上が不溶性画分に残った。目的タンパク質は、精製のためのＨｉｓタグがＣ末側に付加されているので、Ｎｉ−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させ精製した。検出用として付加したＡｖｉＴａｇも精製に利用可能であり、この場合は、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍｕｔｅｉｎ  ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）に吸着後、ビオチンにより溶出させた。ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩの場合、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＩＢＡ，ＵＳ）に吸着後、ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎにより溶出させた。ＰＲ−ＣＴＬＤおよびＰＲ−ＣＴＬＤ１４とも、１Ｌ当たりの収量は、以下の表１に示すように、０．５ｍｇ未満であった。
【０１４２】
【表１】
0005999542.tif 000002
【０１４３】
（製造例３：ＲＡＧＥ様分子）
切断部位４箇所に変異を導入したｓＲＡＧＥ１様ポリペプチド（Ｒ１１４Ｑ／Ｖ１１７Ａ／Ｒ２２８Ｎ／Ｍ２７２Ｉ；本例中、ｍＲＡＧＥ１ともいう）を定法に従って生成した。この核酸を、定法に従って、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）を融合させた哺乳動物用発現ベクターｐＥＣＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）またはｐＴａｒｇｅｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に導入することによって、Ｎ末端にＣＦＰが融合したｍＲＡＧＥ１コード核酸を含むプラスミドを構築した。ＣＨＯ細胞を１０％  ＦＣＳを補充したＦ１２培地中、３７℃において５％ＣＯ２加湿雰囲気下で培養した。１×１０４細胞／ｍｌの密度で懸濁したＣＨＯ細胞４００μｌを、トランスフェクションを行う２４時間前に、カバースリップ上に播種した。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬を用いて製造業者のプロトコルに従って、細胞をトランスフェクトし、４８時間インキュベートし、ＣＨＯ細胞に一過性発現させた。その後、この細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、ＣＦＰの蛍光によりｍＲＡＧＥ１発現細胞が確認できた。また、リガンドであるリボースにより糖化処理したＢＳＡ（Ｒ−ＡＧＥ，製造法は製造例８を参照。）を蛍光色素であるＡｌｅｘａ６３３（Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）により標識し、この標識糖化ＢＳＡ（ＡＧＥ分子）をｍＲＡＧＥ１発現細胞に添加したところ、リガンドの認識能および取り込み能が確認できた。
【０１４４】
ｍＲＡＧＥ１発現細胞は、明瞭なリガンド取り込み能を示し、プロテアーゼ耐性の増大を狙ったアミノ酸置換は、リガンド認識能には影響を与えていないことが示された。
【０１４５】
さらに、そのプロテアーゼ感受性を検討したところ、天然型に比べ耐性が上昇していることが示され、プロテアーゼ耐性の上がったＲＡＧＥ分子の作出に成功した。
【０１４６】
（製造例４：ＲＡＧＥのリガンド認識能に必須の最小領域の決定）
本実施例では、ｍｉｎｉＲＡＧＥを作製した。
【０１４７】
ｍｉｎｉＲＡＧＥとして、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３６４３２に示される配列に基づいて、以下のプライマー：
順方向プライマー（ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ９、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６に共通）
５’−ＣＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡＡＡＣＡＴＣＡＣＡＧＣ−３’（配列番号３２）
逆方向プライマー
・ＲＡＧＥ１については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号３３）
・ＲＡＧＥ２については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＧＧＣＴＧ−３’（配列番号３４）
・ＲＡＧＥ３については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣ−３’（配列番号３５）
・ＲＡＧＥ７については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＡＧＴ−３’（配列番号３６）・ＲＡＧＥ８については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＡＧＡＣＡＣＧＧ−３’（配列番号３７）・ＲＡＧＥ９については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号３８）
・ＲＡＧＥ１４３については
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＡＴＴＧＧＧ−３’（配列番号４１）、・ＲＡＧＥ２２３については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＡＡＧＧＣＣＣＧ−３’（配列番号４２）
・ＲＡＧＥ２２６については、
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号４３）
を設計し、ＲＡＧＥ４については、順方向プライマー
５’−ＴＣＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＣＡＧＧＡＡＴＧＧ−３’（配列番号３９）逆方向プライマー
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号４０）
を設計し、ＲＡＧＥ２（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜２５０位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ３（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜２３０位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ４（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列１０１〜３３２位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ７（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１３７位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ８（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１２０位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ９（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１１２位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ１４３（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１４３位）をコードするＤＮＡ、ＲＡＧＥ２２３（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜２２３位）をコードするＤＮＡ、およびＲＡＧＥ２２６（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜２２６位）をコードするＤＮＡを得た。
【０１４８】
これらｍｉｎｉＲＡＧＥをコードするＤＮＡを、制限酵素の認識配列を付加した特異的プライマーによりＰＣＲにより増幅した後、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をクローニング用ベクターとしてＴＡクローニングを行い、塩基配列を確認した。
【０１４９】
（２）タグ配列付加ＲＡＧＥ様ポリペプチドの生成
上記製造例において生成したＲＡＧＥ様ポリペプチド（ｓＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２〜ＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６）を検出／評価系において活用する際には、有効な修飾が施されていることが望ましい。そこでこれらの分子のＮ末側に２種類のタグ（一つは大腸菌内でビオチン化を受ける配列ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号２９））、他方はストレプトアビジンに直接認識される配列であるＳｔｒｅｐｔａｇ（ＡＷＲＨＰＱＦＧＧ（配列番号３０）またはＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号３１））を付加した。ビオチンとストレプトアビジンの結合は非共有結合で最も強く（ＫＤ＝１０−１５Ｍ）、ストレプトアビジンを介した固定化などへの発展に際しても有効である。しかし、ビオチン化のためには、培地中へのビオチンの添加、ビオチンリガーゼを共発現させる必要があるなどの手間が掛かる。そこで、結合の強さでは劣るが（ＫＤ＝１０−７Ｍ）、遺伝子配列上でタグを付加し大腸菌で発現させればストレプトアビジンへの結合が可能なＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号３１））付加タンパク質も生成した。いずれもｐＥＴ系ベクターの３’側にタグ配列をコードする核酸配列を導入して、発現用プラスミドとした（ｐＥＴ  Ｃ−Ａｖｉ、ｐＥＴ  Ｃ−ＳｔＩＩ）。定法に従って、これらの発現ベクターに、ｍＲＡＧＥおよびｍｉｎｉＲＡＧＥを導入して、発現構築物を生成した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質のビオチン化のために、ｐＥＴ系ベクターと同一菌体内で保持可能なｐＡＣ系ベクターにビオチンリガーゼをコードしているＢｉｒＡ遺伝子を導入したＢｉｒＡ／ｐＡＣを作製した。
【０１５０】
ＲＡＧＥは、ＣＴＬＤと同様に、Ｓ−Ｓ結合の形成が構造の安定化と機能に必須である。そこで発現宿主としてＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）を用いた。Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）は、チオレドキシンレダクターゼおよびグルタチオンレダクターゼ変異株であり、細胞質内に発現させたタンパク質のＳ−Ｓ結合形成を促進する性質がある。ＲＡＧＥ様ポリペプチド（ｓＲＡＧＥ１、ｍＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２〜ＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６をまとめて「ＲＡＧＥ様ポリペプチド」と称する）にＡｖｉＴａｇを付加する場合、ＡｖｉＴａｇおよびこのポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターと、ＢｉｒＡ遺伝子を含む発現ベクターとで同時に形質転換させた。得られた形質転換宿主細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加した（いずれも最終濃度）ＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩコード核酸を含む発現ベクターで形質転換した場合は、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地中で３７℃で培養した。ＲＡＧＥ様ポリペプチドの発現を、ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。
【０１５１】
予備実験として、ＲＡＧＥ様ポリペプチドを可溶性ポリペプチドとして発現するための温度条件および誘導時間を調べた。温度条件は、（１）３７℃、（２）２５℃および（３）２０℃に設定した。誘導時間は、（Ａ）１８時間、（Ｂ）２０時間、および（Ｃ）２４時間に設定した。まず、これらの宿主細胞を３７℃で誘導し、誘導されたタンパク質の分子量を測定したところ、大部分が不溶性画分に回収された。培養温度を２５℃に下げるとｓＲＡＧＥの場合、９０％以上が可溶性ポリペプチドとして発現されたが、ｍＲＡＧＥ１の場合は、２０％程度しか可溶性ポリペプチドとして発現されなかった。各ｍｉｎｉＲＡＧＥに関しては、欠損部分が長くなるほど可溶化率が下がる傾向が観察された。ＲＡＧＥ８およびＲＡＧＥ９に関しては培養温度を下げても殆どが不溶性となり、可溶性ポリペプチドとして発現させるのは困難であった。上記の結果に鑑みて、培養温度を２５℃に維持して、誘導時間の検討を行ったところ、誘導時間（Ａ）１８時間が適切であることが分かった。
【０１５２】
上記の形質転換細胞を３７℃で１２時間前培養した。本培養は、この前培養液を、２０倍希釈になるように上記の各ＬＢ培地に添加し、２５℃で旋回培養した。上記で得られた条件に基づいて、培養液の光学密度（Ａ６００）が約０．５に達したときに、１ｍＭ（最終濃度）ＩＰＴＧを添加し、目的タンパク質の発現を誘導した。ＡｖｉＴａｇ付加タンパク質を生成する場合は、誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、発現される目的タンパク質のビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後１８時間後に１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離により菌体をペレット化して上清を廃棄し、適量のＴＢＳで洗浄した。
【０１５３】
ＴＢＳに懸濁した菌体を、超音波破砕機にて破砕後、１５，０００ｒｐｍ×３０分の遠心分離により回収される上清を可溶性画分とした。目的タンパク質は、精製のためのＨｉｓタグがＣ末側に付加されているので、Ｎｉ−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させ精製した。検出用として付加したＡｖｉＴａｇも精製に利用可能であり、この場合は、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍｕｔｅｉｎ  ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）に吸着後、ビオチンにより溶出させた。ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩの場合、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＩＢＡ，ＵＳ）に吸着後、ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎにより溶出させた。
【０１５４】
（３）ＲＡＧＥのリガンド認識能に必須の最小領域の決定
上記のようにして溶出させた各ＭｉｎｉＲＡＧＥの発現効率、可溶性ポリペプチドとして発現する比率、収率などは以下の表２に示すとおりである。
【０１５５】
【表２−１】
0005999542.tif 000003
【０１５６】
【表２−２】
0005999542.tif 000004
【０１５７】
上記の結果から、ＲＡＧＥのリガンド認識能に必須の最小領域は、ＲＡＧＥ８（天然型ＲＡＧＥのアミノ酸配列２３〜１２０位）であることが分かった。
【０１５８】
（製造例５：ＬＯＸ−１細胞外領域の調製法）
本製造例では、ＬＯＸ−１細胞外領域の調製例を示す。なお、ＣＴＬＤ１４、ＣＴＬＤも同様に製造した。
【０１５９】
発現宿主をＢＬ２１（ＤＥ３）とし、１００％近くを封入体として発現させた後、以下の２つの方法で調製した。
【０１６０】
１) サイクロアミロースによるリフォールディング（非特許文献７を参照。）
発現構築物とＢｉｒＡ遺伝子を含むベクターとで同時に形質転換させたＢＬ２１（ＤＥ３）、若しくは発現構築物で形質転換させたＢＬ２１（ＤＥ３）をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ、発現構築物のみの場合は添加せず）を含む（いずれも最終濃度）ＬＢ培地で３７℃で培養した。培養液の濁度（Ａ６００）が約０．５に達した時に１ｍＭ（最終濃度）ＩＰＴＧを添加し目的蛋白質の発現を誘導した。目的タンパク質をビオチン化させる場合は、誘導開始と同時に５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、ビオチン化も同時に行わせた。誘導開始後４時間後に、１２，０００ｒｐｍ  ｘ  ５分の遠心分離で菌体を回収し、ＴＢＳにて洗浄した。
【０１６１】
ついでＴＢＳに懸濁した菌体を超音波破砕機にて破砕後、細胞破砕液の沈殿画分をＴＢＳで洗浄し封入体とした。封入体を最終濃度４０ｍＭのＤＴＴを含む６Ｍグアニジン塩酸塩溶液で室温にて１時間処理し、続いて７０倍容量の０．１％ＣＴＡＢ（２ｍＭ  ＤＬ−シスチンを含む）／ＴＢＳ溶液を添加し、室温で１時間反応させた後、最終濃度で０．６％になるように、３％ＣＡ溶液を添加し、さらに室温で１時間反応させた。その反応溶液を１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られたた上清をリフォールディング溶液とした。精製はＨｉｓタグを使用したＮｉ−アガロース精製によった。
【０１６２】
２）希釈透析法によるリフォールディングおよび精製（Ｖｏｈｒａ  ＲＳ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ５２：  ４１５−４２１を参照）
１）同様に得られた菌体を溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ  ７．８を含む１ｍｇ／ｍｌリゾチーム，プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁し、４℃で３０分間反応させた後、１０，０００ｇで１５分間遠心した。得られた沈殿（封入体）をＶｏｈｒａらの手法に準じてリフォールドした。
【０１６３】
１００ｍｇの封入体を２．２．ｍｌの緩衝液Ａ（Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８，６Ｍグアニジン塩酸塩、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４）に懸濁し、４℃で２時間反応させた。１００，０００×ｇで３０分遠心した上清を可溶化封入体溶液とし、Ｈｉｓ  ｔａｇを利用してＣＯＳＭＯＧＥｌ  Ｈｉｓ−Ａｃｃｅｐｔ（ナカライ）に結合させ、ＦＰＬＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による１０−１００ｍＭのイミダゾール濃度勾配により溶出させた。タンパク質のピークフラクションを６Ｍグアニジン塩酸塩を含む５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）にて透析した。透析溶液に最終濃度で１００ｍＭのＤＴＴを添加した後、タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌに調製した。続いて、グアニジン塩酸塩濃度を段階的に低下させた緩衝液にて１４時間ずつの透析を繰り返し、リフォールド精製タンパク質を得た。
【０１６４】
（製造例６：ＲＡＧＥ調製法）
全てのＲＡＧＥ分子に該当するＲＡＧＥ様ポリペプチド（ＲＡＧＥ関連タンパク質）は本製造例に記載のとおりの以下の２つの手法で調製した。
【０１６５】
１）封入体として調製し、リフォールディングする手法
製造例５と同様の手法を用いた。なお、製造例５とは発現構築物が異なるため、培養時に添加する抗生物質の記載のみアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）に変更して用いた。
【０１６６】
2）可溶性タンパク質として発現させる手法（非特許文献７を参照）
製造例４に記載の情報に基づいて、発現構築物とＢｉｒＡ遺伝子を含むベクターとで同時に形質転換させたＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）、を含む（いずれも最終濃度）ＬＢ培地で２５℃で培養した。培養液の濁度（Ａ６００）が約０．５に達した時に１ｍＭ（最終濃度）ＩＰＴＧと５０μＭ（最終濃度）のビオチンを添加し、目的タンパク質の誘導と同時にビオチン化を行った。誘導開始後１８時間後に、１２，０００ｒｐｍ×５分の遠心分離で菌体を回収し、ＴＢＳにて洗浄した。菌体をＴＢＳに懸濁し、超音波破砕機にて破砕後、１５，０００ｒｐｍ×３０分の遠心分離し、回収される上清を可溶性画分とした。目的タンパク質をＣ末側のＨｉｓタグによりＮｉ−アガロースに結合させた後、イミダゾールにより溶出させた。目的タンパク質を含むピークフラクションをＴＢＳにて透析後、Ｎ末に付加されたビオチンによりストレプトアビジンムテインマトリクス（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍｕｔｅｉｎ  ｍａｔｒｉｘ）（Ｒｏｃｈｅ）に結合させた後、ビオチンにより溶出させ得られた目的タンパク質を精製ＲＡＧＥとした。
【０１６７】
（製造例７：酸化ＬＤＬ調製法）
本製造例では、酸化ＬＤＬを調製した（非特許文献７を参照）。
【０１６８】
調製に際して、可能なものは全て滅菌し、可能な限り無菌的に操作した。ヒト血漿より調製したＬＤＬ（透析によりＥＤＴＡを除去）をＰＢＳ（−）により１ｍｇ／ｍｌ  に調製し、最終濃度が５μＭになるようにＣｕＳＯ４を添加した。次いでこの溶液を、３７℃で２０時間反応させ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（最終濃度）を添加して酸化反応を停止した。この溶液をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％ＥＤＴＡ）に対して透析し、さらに無菌濾過後に０．０２％ＮａＮ３（最終濃度）を添加し、酸化ＬＤＬ溶液とした。
【０１６９】
（製造例８：ＡＧＥ分子である糖化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）調製方法）
本製造例では、ＡＧＥ分子として種々の糖化ＢＳＡを調製した（非特許文献７を参照）。
【０１７０】
糖化ＢＳＡは以下のように調製した。調製に際して可能なものは全て滅菌し、可能な限り無菌的に操作した。
【０１７１】
エタノールで洗浄したスパチュラを使用して、各糖（グルクトース４．５１ｇ、フルクトース４．５１ｇ、およびリボース３．７５ｇ）を秤量し、γ線滅菌済みのキャップ付きプラスチックチューブに入れた。各チューブに２０ｍｌの滅菌１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を無菌的に添加し、穏やかに転倒混和し溶液を混合した。最後に２１ｍｌのエンドトキシンフリーの蒸留水を添加し、０．２２μｍフィルタにより無菌濾過した後、１２週間、遮光して３７℃で反応させた。１週間に１回、無菌条件下で糖−ＢＳＡ調製物８０μｌを取り出し、ｐＨを確認し、さらに、反応液のｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨ溶液（エンドトキシンフリー）でｐＨ７．４に調製した。１２週後に、滅菌ＰＢＳにて透析し、糖を完全に除去し、得られた反応液を糖化ＢＳＡ（反応させた糖によって、リボース−ＢＳＡ、グルコース−ＢＳＡ、フルクトース−ＢＳＡ）（本明細書では、それぞれ、リボース修飾ＡＧＥ（リボースＡＧＥまたはＲ−ＡＧＥとも称する。）、グルコース修飾ＡＧＥ（グルコースＡＧＥまたはＧ−ＡＧＥとも称する。）、フルクトース修飾ＡＧＥ（フルクトース−ＡＧＥまたはＦ−ＡＧＥとも称する。）と称する。）とし、４℃で無菌的に保存した。
【０１７２】
（実施例１）
本実施例では、受容体であるＲＡＧＥを固定化した９６穴プレートを用いて、リボース修飾ＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ）をリガンドとして標識して用いて本発明のアッセイが機能するか確認した。
【０１７３】
（１）蛍光プレートリーダー測定
受容体（製造例６において製造したＲＡＧＥ）を固定化した９６穴プレート（ヌンク製）を調製した。
【０１７４】
この９６穴プレートをプロテインフリーブロッティング緩衝液（Ｔｈｅｒｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて４℃で一晩ブロッキングした。
【０１７５】
活性測定対象分子（Ｓｉｇｍａ製のクエルセチン、上記製造例のように製造したＯｘＬＤＬ，Ｇ−ＡＧＥ（製造例８のように調製した。），Ｒ−ＡＧＥ（製造例８のように調製した。））を５０μｌ/ウェルで、０μｇ／アッセイ（１００％のコントロール）、０．０５μｇ／アッセイ、０．５μｇ／アッセイおよび５μｇ／アッセイの用量で添加した。蛍光標識リガンド（水溶性色素Ａｌｅｘａ５４６（Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）標識Ｒ−ＡＧＥ（製造例８のように調製した。））を５０μｌ／ウェルの容量で添加し、その後３７℃、６０分でインキュベートさせることによって反応を進行させた。次いで、緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０  ｍＭ；ＮａＣｌ  １５０ｍＭ）による洗浄を５分×２回、１０分×３回行った。１００μｌの緩衝液（ＴＢＳ）を添加し蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  ＡＲＶＯ  ＳＸ，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製）で測定した。
【０１７６】
コントロールとして、蛍光標識モデルリガンドとして水溶性色素Ａｌｅｘａ５４６（Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）でラベルしたリボース修飾ＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ）（製造例８にて調製）を使用して同様の実験を行った。なお、クエルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ；Ｓｉｇｍａ製）は、糖尿病発症予防効果が報告されているフラボノイドであり、ＲＡＧＥ阻害剤のモデルとして使用した。
【０１７７】
（結果）
結果を以下の表３に示し、そのプロットを図１〜４（それぞれ、クエルセチン、ＯｘＬＤＬ，Ｇ−ＡＧＥ，Ｒ−ＡＧＥ）に示す。
【０１７８】
【表３】
0005999542.tif 000005
【０１７９】
図５に蛍光標識モデルリガンドとして水溶性色素Ａｌｅｘａ５４６でラベルしたリボース修飾ＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ）を使用して行ったコントロール実験を示す。図５左に使用した細胞の位相差像を示し、図５中央にＲＡＧＥ（蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現）発現細胞の蛍光を示し、図５右にリガンドを結合した細胞像を示す。図５右にある白い点が結合したリガンドである。
【０１８０】
図６に図５と同様の順で、クエルセチンの添加の場合の写真を示す。図６左に使用した細胞の位相差像を示し、図６中央にＲＡＧＥ（蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現）発現細胞の蛍光を示し、図６右にリガンドに加えクエルセチンを加えた細胞像を示す。図６右に示すように、クエルセチン添加によりリガンドの結合が阻害されることが細胞における高感度観察で確認された。
【０１８１】
図７には、図５と同様の順で、Ｒ−ＡＧＥの添加の場合の写真を示す。図７左に使用した細胞の位相差像を示し、図７中央にＲＡＧＥ（蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現）発現細胞の蛍光を示し、図７右にリガンドに加えＲ−ＡＧＥを加えた細胞像を示す。図７右に示されるように、Ｒ−ＡＧＥ添加によるリガンド結合の阻害を示す蛍光像が示される。
【０１８２】
（定量アッセイ）
次に、グルコース修飾ＡＧＥ（Ｇ−ＡＧＥ）（製造例８に記載のように製造したもの。）固定化プレートを使用して、Ｌｙｓ−ＡＧＥ(グリセルアルデヒド修飾リジン：低分子ＡＧＥモデル）（０．０９ｇのリジンを０．４５ｇのＤＬグリセルアルデヒドを５０ｍｌの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、遮光条件下、３７℃で１週間反応させて調製した。）、およびリボース修飾ＡＧＥ(Ｒ−ＡＧＥ)（製造例８に記載のように製造したもの。）をそれぞれについて、０、０．２５μｇ/アッセイおよび２．５μｇ/アッセイの量で用いて定量的アッセイを行った。
【０１８３】
その結果を表４に示す。
【０１８４】
【表４】
0005999542.tif 000006
【０１８５】
（実施例２）
本実施例では、ＡＧＥ分子としてＲ−ＡＧＥまたはＧ−ＡＧＥ固定化９６穴プレートを用いて本発明のアッセイが機能するか確認した。
【０１８６】
ＡＧＥ分子として、グルコース修飾ＡＧＥ（Ｇ−ＡＧＥ）（製造例８に記載のように製造したもの。）、またはリボース修飾ＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ）（製造例８に記載のように製造したもの。）を固定化した９６穴プレート（ヌンク製）を調製した。
【０１８７】
この９６穴プレートをプロテインフリーブロッティング緩衝液（Ｔｈｅｒｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて４℃で一晩ブロッキングした。
【０１８８】
活性測定対象分子（Ｌｙｓ−ＡＧＥ（グルタルアルデヒド修飾リジン修飾ＡＧＥ：低分子ＡＧＥモデル）（０．０９ｇのリジンを０．４５ｇのＤＬグリセルアルデヒドを５０ｍｌの０．２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、遮光条件下、３７℃で１週間反応させて調製した。）、グルコース修飾ＡＧＥ（Ｇ−ＡＧＥ）、またはリボース修飾ＡＧＥ（Ｒ−ＡＧＥ）、を５０μｌ/ウェルで、０μｇ／アッセイ（１００％のコントロール）、０．２５μｇ／アッセイおよび２．５μｇ／アッセイの用量で添加した。
【０１８９】
ビオチン標識ＲＡＧＥ１４３（製造例６で調製）を５０μｌ／ウェルの容量で添加し、その後３７℃、６０分でインキュベートさせることによって反応を進行させた。次いで、緩衝液（ＴＢＳ）による洗浄を５分×２回、１０分×３回行った。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を上記ウェル（１００μｌ／ウェル）に添加し、室温で６０分間反応させた。その後、緩衝液（ＴＢＳ）で洗浄した。その後、発色基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を１００μｌ／ウェル添加した。これを、室温でおよそ１０分間おいて反応させ、１Ｎ  塩酸（ＨＣｌ）を１００μｌ／ウェル添加して反応を停止させた。その後４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１９０】
その結果を以下の表５に示す。いずれも、定量的に結合が阻害されることが理解される。
【０１９１】
【表５】
0005999542.tif 000007
【０１９２】
（実施例３）
本実施例では、ＬＯＸ−１受容体を固定させたプレートにおいて、そのリガンドと競合させたモデルを用い、蛍光標識モデルリガンドとして脂溶性色素ＤｉＩでラベルしたアセチル化ＬＤＬを使用して、本アッセイが機能するか確認した。
【０１９３】
ＬＯＸ−１受容体（製造例５と同様に調製した。）を固定化した９６穴プレート（ヌンク製）を調製した。
【０１９４】
この９６穴プレートを、ブロッキング試薬Ｎ１０２（日本油脂製）を用いて４℃で一晩ブロッキングした。
【０１９５】
活性測定対象分子（Ｓｉｇｍａ製のクエルセチン、上記製造例のように製造したＯｘＬＤＬおよびＡｃＬＤＬ）を５０μｌ/ウェルの容量（最終的に、使用量は、０、０．０５μｇ／アッセイ、０．５μｇ／アッセイ、５μｇ／アッセイとした。）で添加した。クエルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ；Ｓｉｇｍａ製）は、ＯｘＬＤＬによる細胞障害を抑制する効果が報告されているフラボノイドであり、ＬＯＸ−１阻害剤のモデルとして使用した。
【０１９６】
蛍光標識リガンドである脂溶性色素ＤｉＩでラベルしたアセチル化ＬＤＬ（アセチル化ＬＤＬ（Ｍｏｌｅｃμｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ製）をＰＢＳ（−）にて透析し、無菌濾過後１ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）当たり１０μｌのＤｉＩ／ＤＭＳＯ溶液（３００ｍｇ／ｍｌ）を無菌的に添加し、遮光条件下で３７℃、１８時間反応させた。反応溶液１ｍｌ当たりに０．０８３４ｇのＫＢｒを添加し溶解させた後、１２℃で、１０５，０００ｇ×２０時間の超遠心分離に供し、最上層画分を回収し、ＤｉＩ標識ＡｃＬＤＬとした。）を５０μｌ／ウェルの容量で添加し、その後３７℃、６０分でインキュベートさせることによって反応を進行させた。次いで、緩衝液（ＴＢＳ）による洗浄を５分×２回、１０分×３回行った。１００μｌの緩衝液（ＴＢＳ）を添加し蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  ＡＲＶＯ  ＳＸ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製）で測定した。
【０１９７】
その結果を表６に示す。そのプロットを図８〜１０（それぞれ、クエルセチン、ＯｘＬＤＬ、ＡｃＬＤＬ）に示す。図８〜１０では、各図において、縦軸には、相対結合活性（％、添加量０のときの吸光度の数値を１００％とする。）を示す。左からそれぞれ、０、０．０５μｇ／アッセイ、０．５μｇ／アッセイ、５μｇ／アッセイを用いたときの相対結合活性が示される。
【０１９８】
【表６】
0005999542.tif 000008
【０１９９】
（実施例４）
本実施例では、変性ＬＤＬの例としてＯｘＬＤＬを固定させ、ＣＴＬＤ分子としてＣＴＬＤ１４を標識した例を用いて本発明が機能するか確認した。
【０２００】
ＯｘＬＤＬを固定化した９６穴プレート（ヌンク）を調製した。
【０２０１】
この９６穴プレートをブロッキング試薬Ｎ１０２（日本油脂製）を用いて４℃で一晩ブロッキングした。
【０２０２】
活性測定対象分子（製造例５で製造したＯｘＬＤＬ、Ｓｉｇｍａ製のクエルセチン）を５０μｌ/ウェルの容量（最終的に、使用量は、０、０．０５μｇ／アッセイ、０．５μ
ｇ／アッセイ、５μｇ／アッセイとした。）で添加した。
【０２０３】
ビオチン標識ＣＴＬＤ１４（製造例６で調製）を５０μｌ／ウェルの容量で添加し、その後３７℃、６０分でインキュベートさせることによって反応を進行させた。
【０２０４】
次いで、緩衝液（ＴＢＳ）による洗浄を５分×２回、１０分×３回行った。
【０２０５】
セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識したストレプトアビジンを上記ウェル（１００μｌ／ウェル）に添加し、室温で６０分間反応させた。その後、緩衝液（ＴＢＳ）で洗浄した。その後、発色基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を１００μｌ／ウェル添加した。これを、室温でおよそ１０分間おいて反応させ、１Ｎ  塩酸（ＨＣｌ）を１００μｌ／ウェル添加して反応を停止させた。その後４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０２０６】
その結果を以下の表７に示し、そのプロットを図１１〜１２（それぞれＯｘＬＤＬ、クエルセチン）に示す。いずれも、定量的に結合が阻害されることが理解される。
【０２０７】
【表７】
0005999542.tif 000009
【０２０８】
（実施例５）
本実施例では、ＣＴＬＤ分子としてＣＴＬＤ１４を固定させ、変性ＬＤＬの例としてＯｘＬＤＬを標識した例を用いて本発明が機能するか確認した。
【０２０９】
製造例５のように調製したＣＴＬＤ１４を固定化した９６穴プレート（１５μｇ／ｍｌ，  ５０μｌ／ウェル）（ヌンク製）を調製した。
【０２１０】
この９６穴プレートをブロッキング試薬Ｎ１０２（日本油脂製）を用いて４℃で一晩ブロッキングした。
【０２１１】
活性測定対象分子であるクエルセチン、クエルセチンの配糖体であるルチン（Ｓｉｇｍａ製）を５０μｌ／ウェルの用量で添加した。
【０２１２】
次に、ＯｘＬＤＬを５０μｌ／ウェルの用量で添加し、その後３７℃、６０分でインキュベートさせることによって反応を進行させた。次いで、緩衝液（ＴＢＳ）による洗浄を５分×２回、１０分×３回行った。
【０２１３】
セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗ＡｐｏＢを上記ウェルに１００μｌ／ウェルで添加し、３７℃で６０分間反応させた。その後、緩衝液（ＴＢＳ）で洗浄した（５分間×２、１０分間×３）。再度緩衝液による洗浄を行って、発色基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を１００μｌ／ウェル添加した。これを、室温でおよそ１０分間おいて反応させ、１Ｎ  塩酸（ＨＣｌ）を１００μｌ／ウェル添加して反応を停止させた。その後４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０２１４】
その結果を以下の表８に示し、クエルセチンについてはそのプロットを図１３に示す。クエルセチンは定量的に結合が阻害されるのに対してその配糖体であるルチンは阻害されないことが理解される。
【０２１５】
【表８】
0005999542.tif 000010
【０２１６】
図１４にＬＯＸ−１を蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現させた細胞を用い、ＯｘＬＤＬをコントロールリガンドとして用いたコントロール実験を示す。図１４左に使用した細胞の位相差像を示し、図１４中央にＬＯＸ−１（蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現）発現細胞の蛍光を示し、図１４右にリガンドを結合した細胞像を示す。図１４右にある白い点が結合したリガンドである。
【０２１７】
図１５に図１４と同様の順で、クエルセチンを添加した場合の写真を示す。図１５左に使用した細胞の位相差像を示し、図１５中央にＬＯＸ−１（蛍光タンパク質との融合タンパク質として強制発現）発現細胞の蛍光を示し、図１５右にリガンドに加えクエルセチンを加えた細胞像を示す。図１５右に示すように、クエルセチン添加によりリガンドの結合が阻害されることが細胞における高感度観察で確認された。
【０２１８】
なお、ルチンの場合、細胞上での結合阻害が検出されず、マイクロプレート上での結果と一致した。
【０２１９】
（実施例６：糖尿病または糖尿病性腎症の診断または予測診断）
本実施例では、本発明のアッセイを用いて糖尿病または糖尿病性腎症の診断または予測診断を行なうことができるか確認した。
【０２２０】
本実施例では、糖尿病または糖尿病性腎症のモデル動物を作製し、このモデル動物から採血し、血糖値等の糖尿病および糖尿病性腎症のパラメータとなる値（例えば、腎症の症状の一つである飲水量の増加）、ならびに本発明で開発したＡＧＥｓ様活性の測定を行い、これらを相関付けを行い糖尿病または糖尿病性腎症の診断または予測診断を行なうことができるかを判断した。詳細は以下のとおりである。
【０２２１】
まず、糖尿病または糖尿病性腎症のモデル動物として、ストレプトゾトシン（STZ)を投与したモデルを作製した（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  （２００６）  ２９０，Ｆ２１４−Ｆ２２２，  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ    （１９９９）  １６２，  １８９−１９５）。投与日をゼロ日とし、１週間程度の間隔で採血し、血糖値、腎症の症状の一つである飲水量の増加、ＡＧＥｓ様活性の測定を行った。
【０２２２】
ＡＧＥｓ活性は実施例２と同様の手法で測定した。
【０２２３】
（結果）
以下の表９〜１１に血糖値およびＡＧＥｓ活性の測定結果を示す。測定値（％）は、ＡＧＥｓ活性を示す分子がゼロの時の測定値を１００％として表示した。したがって表示されるＡＧＥｓ様活性は、阻害率（測定値％の低下）で評価することになる。
【０２２４】
【表９】
0005999542.tif 000011
【０２２５】
【表１０】
0005999542.tif 000012
【０２２６】
【表１１】
0005999542.tif 000013
【０２２７】
以上の結果をまとめたものを以下の表１２に示す。
【０２２８】
【表１２】
0005999542.tif 000014
【０２２９】
したがって、糖尿病の指標の一つである血糖値は、１６日目には上昇が観察された。この時点で、ＡＧＥｓ様活性の上昇（すなわち、阻害率（測定値%）の低下）も腎症の症状（飲水量の増加を含む）も観察されなかった。糖尿病の指標の一つである血糖値の上昇が観察された２２日目には、ＡＧＥｓ様活性の上昇が観察され始めた。２２日目の時点で腎症の症状（飲水量の増加を含む）は観察されなかった。
【０２３０】
２６日目当たりから腎症の症状の一つである飲水量の増加が観察され始めた。
【０２３１】
したがって、ＡＧＥｓ様活性の上昇は、糖尿病の診断に使用しうるとともに、糖尿病性腎症の予備診断および診断に使用しうることが理解される。
【０２３２】
（実施例７：ＬＤＬを用いたＬＯＸ−１（ＣＴＬＤ１４）へのリガンドの結合阻害）
本実施例では、上述の実施例において用いたＡｃＬＤＬについて、ＬＯＸ−１（ＣＴＬＤ１４）へのリガンドの結合阻害が、確認できることを実証する。また、血清ではなくＬＤＬに関しても確認が取れることを実証する。
【０２３３】
（方法）
マウス：Ｃ５７ＢＬ／６  雄マウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリー・ジャパン（横浜、日本）から４週齢で購入し、（独）農研機構・食品総合研究所内のＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｒｅｅ）動物施設にて維持し、５週齢に達したものを用いた。６匹のマウスにＡＩＮ−９３Ｍ（オリエンタル酵母）に与えコントロール群とし、１６匹のマウスに高コレステロール食として高コレステロール・クリントン−シブルスキー齧歯類飼料（１５．８％  脂肪、１．２５％コレステロール、および、０．５％  コール酸ナトリウム  （Ｄ１２１０９Ｃ，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｋｃ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）を１６週間与えた。この動物実験は、「動物の愛護および管理に関する法律」、「実験動物の使用および保管ならびに苦痛の軽減に関する基準」等に基づいて作成された、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構の動物実験等の指針、ならびに独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構  食品総合研究所（以下、食品総合研究所）の動物実験委員会における審査を受け承認されたものである。
【０２３４】
（血清脂質測定）
マウスは、イソフルラン軽麻酔のもと、全採血により屠殺した。各マウスの総コレステロール量（図１６Ａ）、ＨＤＬコレステロール量（図１６Ｂ）、および、ＬＤＬコレステロール量（図１６Ｃ）は、比色定量法（和光純薬、大阪、日本）により測定した。ＬＤＬは、高コレステロール食、および、正常食マウスの血清から、連続超遠心分離により分離した後、０．０３ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで透析した。
【０２３５】
（マイクロプレートを用いた競合結合アッセイ）
５０μｌのリフォールドしたＣＴＬＤ１４  溶液（１５μｇ／ｍｌ  のＣＴＬＤ１４を含む）を９６穴ウェルプレートの各ウェルに加え、１４時間４℃で反応させた。タンパク質溶液を除いた後、２００μｌのＴＢＳで洗浄し、続いてブロッキング溶液ＬＮ１０２  （ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）２００μｌを加え、４℃で１４時間反応しブロッキングを完了した。５０μｌのサンプル（ＴＢＳで希釈した血清、もしくはＬＤＬ）を各ウェルに添加し、続いて、５０μｌのＤｉＩ標識ＤｉＤ−ＡｃＬＤＬを添加し、３７℃で２時間反応させた。反応液を除去し、各ウェルを２００μｌのＴＢＳで５回洗浄した後、１００μｌのＴＢＳを添加し、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  Ａｒｖｏ  ＳＸ，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ，  ＵＳＡ）により蛍光強度（励起波長：５２０ｎｍ，蛍光波長：５５０ｎｍ）を測定した。結果は、３回の独立した測定から得られた値を、サンプル無しのウェルから得られる蛍光強度を１００％とした相対値（％）で表した（図１７、Ａ：血清、Ｂ：ＬＤＬ）。
【０２３６】
（酵素結合イムノソルベントアッセイ）
正常食、もしくは、高コレステロール食群から調製したＬＤＬ  １００μｌ（タンパク量で１〜１００μｇ／ｍｌ）を９６ウェルプレートの各ウェルに加え、４℃で１４時間反応させた。ＬＤＬ溶液を除いた後、各ウェルを２００μｌのＴＢＳで洗浄し、続いてブロッキング溶液ＬＮ１０２  （ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）２００μｌを加え、３７℃で２時間反応しブロッキングした。抗ＨＮＥ−ヒスチジンモノクローナル抗体（日本油脂，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）１００μｌ（０．５μｇ／ｍｌ  の抗体を含む）を各ウェルに添加し、３７℃で２時間反応させた。抗体溶液を除いた後、ＴＢＳで５回洗浄し、１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウス抗体（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を添加し、３７℃で１時間反応させた後、ＴＢＳで５回洗浄した。各ウェルに基質であるＴＭＢ溶液を１００μｌ添加し、室温で発色させ、１００μｌの１Ｎ  ＨＣｌの添加により反応を停止した後、マイクロプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  Ａｒｖｏ  ＳＸ，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果は、３回の独立した実験の平均で示した（図１８，Ｂ−２）。
【０２３７】
（実施例８：糖尿病の進行状態の指標としての血清（血漿）中グルコース量）
実施例６で示したように、糖尿病発症の指標と成る血糖値は既に１６日目で上昇が観察され、２２日目に、ＡＧＥｓ様活性の上昇が観察された。しかし、腎症の症状（飲水量の増大など）は観察されなかったため、腎症の症状が出る前に、ＡＧＥｓ様活性が上昇することが示された。その後、経過を観察し（２６日目頃から飲水量が多少は増えた）７１日目に全採血を行い、腎症マーカーであるクレアチニン濃度を測定し、腎症が発症していることを確認した。同時に血清中のグルコース濃度も精密な測定法により測定した。ここで、７１日目の採血の主眼は、クレアチニン量の測定であり、糖尿病発症の指標である血中のグルコース濃度は、以前から有意に高かったことが、実施例６に記載されている。
【０２３８】
本実施例では、実施例６までは、グルコース濃度を直接定量せずに血糖値計で簡便に測定していたのを、最終確認としてグルコース測定キットにより厳密に測定し、従来の簡便な測定法との相関を確認し、本発明の方法の厳密性を確認した。
【０２３９】
より詳細には、本実施例では、７１日目に全採血を行い、その血清中のグルコース濃度を正確に測定するために、グルコースＣＩＩ−テストワコーを用い、検量線は、製造業者の指示書に基づき作成して測定を行った。
【０２４０】
（使用したマウス）
実施例６までに使用していたマウス（Ｓｔｚ処理ＢＡＬＢ／ｃマウス）を使用した。
【０２４１】
（測定方法および結果）
発色試薬は、発色剤１瓶（１５０ｍｌ用）を緩衝液（１５０ｍｌ）に溶解し調製した。血清、および標準液（ブランクは蒸留水）各２μｌを９６穴マイクロプレートに入れ（同一試料に関して３ウェルで測定）、続いて発色試薬３００μｌをそれぞれのウェルに加えよく混合した。３７℃で５分間置いた後に、５０５ｎｍと６００ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差を測定値とした。標準液から検量線を作成し、検量線から試料中のグルコース濃度を求めた。図１９において、これらの測定結果を横軸に、従来の血糖値計による測定値を縦軸としてプロットした結果を示す。この図では、血糖値と上記グルコース測定キットとの相関が示される。また、血清中のグルコース濃度を正確に測定した場合もコントロール群およびストレプトゾトシン投与群での結果を図２０に示す。
【０２４２】
これらの結果から、標準血清による検量線を作成から、各マウスの血清中のグルコース濃度を測定したところ、グルコースキットによる測定値と血糖値計による測定値間には相関があり（図１９）、血清中のグルコース濃度を正確に測定した場合もコントロール群とストレプトゾトシン投与群での顕著な差は当然認められたが（図２０）、経時的な変化を定量していた血糖値計による簡便な測定でも問題がないことが確認された。
【０２４３】
（実施例９：腎症の進行状態の指標としての血清（血漿）中クレアチニン量）
本実施例では、２２日目に既にＡＧＥｓ様活性が検出されていたが、その後、腎症に至ったのかを明らかにする目的で、全採血時に血清中のクレアチニン濃度の測定を行った。測定は、ラボアッセイクレアチニンＴＭ（Ｊａｆｆｅ法；和光純薬）を用いた。測定に際し、製造業者の指示書に基づき標準血清による検量線を作成し、サンプルのクレアチニン濃度を求めた。
【０２４４】
（使用したマウス）
実施例６までに使用していたマウス（Ｓｔｚ処理ＢＡＬＢ／ｃマウス）を使用した。
【０２４５】
（測定方法および結果）
５０μｌの試料に除タンパク試薬３００μｌを加え混合し、室温で１０分間放置した後、２，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。除タンパクした試料、ならびに、検量線作成用標準液１００μｌを９６ウェルマイクロプレートに添加した（同一試料に関して３ウェルずつ）。ブランク（標準液ゼロ）として、蒸留水１００μｌをウェルに添加した。続いて、ピクリン酸  ５０μｌを入れ、さらに、０．７５  ｍｏｌ／ｌ  水酸化ナトリウム溶液を５０μｌ添加し、よく混合し、２５〜３０℃で２０分間放置した。その後、３０分以内に、５２０ｎｍの吸光度を測定した。血清中のグルコース濃度とクレアチン濃度の個体毎の相関を示したのが図２１である。コントロール群は、グルコース濃度は２００ｍｇ／ｄｌ以下、クレアチン濃度は、０．４〜０．７ｍｇ／ｄｌの範囲にあるのに対して、Ｓｔｚ群は、グルコース濃度が４００ｍｇ／ｄｌを越え、さらに、グルコース濃度の高い個体においては、クレアチニン量も０．７ｍｇ／ｄｌ以上の値を示す個体が多かった（図２１）。さらに、コントロール群とＳｔｚ群のクレアチン濃度の平均値は、Ｓｔｚ群の方が有意に高かった（図２２）。このことから、Ｓｔｚ群では、糖尿病発症に引き続き、腎症も発症したと考えられる。しかし、ＡＧＥｓ様活性が検出された２２日目では、飲水量の増加を腎症発症の最も簡便な指標として測定したところ、腎症の発症を明確に捉えることはできなかった。
【０２４６】
したがって、２２日目に既にＡＧＥｓ様活性が検出されていたが、その後、腎症に至ったことが実証された。
【０２４７】
（実施例１０：時系列のデータのまとめ）
これまでの実施例に加え、血糖値または血中グルコース濃度について、これまでのデータ（０日目、１６日目、２２日目）に加え、同様の実験を５７日目および７１日目のサンプルについても行い、データも採取し、時系列に沿って纏めたものを図２３〜図２７に示す（したがって、本実施例において提示するデータは、実施例１〜９に記載のものと一部重複する。）。
【０２４８】
詳細には、図２３〜図２７は、コントロールマウスとストレプトゾトシン（Ｓｔｚ）投与により糖尿病を誘導したマウス由来の血清の「Ａｌｅｘａ５４６標識Ｒ−ＡＧＥのＲＡＧＥ固定化プレートへの結合阻害活性」、ならびに、「血糖値または血中グルコース濃度」を経時的に測定し、個体毎の相関を示したグラフであって、それぞれ０日目（図２３）、１６日目（図２４）、２２日目（図２５）、５７日目（図２６）、７１日目（図２７）のものである。図中のＡＧＥｓ様活性とは、Ａｌｅｘａ５４６標識Ｒ−ＡＧＥの結合を１００％阻害する濃度を１００，全く阻害しない時の濃度を０として現した値であり、この値が高いほど、ＡＧＥｓ様活性を示す分子の含量が高いことを示す。０日目（図２３参照）がＳｔｚ投与開始日である。１６日目（図２４）には、Ｓｔｚ投与群の大半の個体で、血糖値の上昇が観察され、コントロール群に比べて有意に高い血糖値を示し始めており、糖尿病が既に誘導されていると考えられる。一方、ＡＧＥｓ様活性は、数個体で上昇が検出されたが、血糖値の顕著な上昇を示した個体とＡＧＥｓ様活性の上昇を示した個体の相関は明瞭ではなかった。２２日目（図２５）になると、Ｓｔｚ群とコントロール群で血糖値の差が顕著になり、ＡＧＥｓ様活性の値も２０以上を示す個体が増え、血糖値が高い個体ではＡＧＥｓ様活性も高い傾向があるなど、発症群においてＡＧＥｓ様活性が検出されている。糖尿病の発症に伴い、ＡＧＥｓ様活性を示す分子が生成されて来ていると考えられる。またこの段階では、飲水量の増大などの糖尿病腎症の発症を示す兆候は観察されず、腎症の兆候が現れる前に、ＡＧＥｓ様活性を示す分子が捉えられていると考えられる。
【０２４９】
５７日目の採血の血清においては（（図２６）、Ｓｔｚ群で高い血清中のグルコース濃度が検出され、ＡＧＥｓ様活性も全般に高くなっていたが、グルコース濃度との相関は高くなかった。さらに、コントロール群のＡＧＥｓ様活性も上昇しており、この回の採血結果からは糖尿病の進行に伴い、ＡＧＥｓ様活性を示す分子が顕著に蓄積されることが明瞭には示されなかった。
【０２５０】
７１日目に当たる１１月２５日のＳｔｚ群では、高グルコース濃度を示し、コントロール群とは有意な差を示した。さらに、ＡＧＥｓ様活性もコントロール群よりも高く、グルコース濃度、ＡＧＥｓ様活性共に高い個体も多かった。図２８は、７１日目の血清中のクレアチニン量を測定し、ＡＧＥｓ様活性との相関をみたものであるが、コントロール群に対し、Ｓｔｚ群では、クレアチニン濃度、ＡＧＥｓ様活性共に高い個体が多く観察された。クレアチニンは腎症のマーカーであるから、Ｓｔｚ群では糖尿病の進行に伴い腎症が発症していることが確認されたといえる。また、ＡＧＥｓ様活性は、既に２２日目から検出されており、５７日目の結果はコントロール値が異常値を示しているため、誤操作の可能性と判断されることから、腎症発症よりも早い段階で検出可能であり、ＡＧＥｓ様活性の測定は、腎症発症を早い時期に捉えるマーカーになり得ると言える。
【０２５１】
このようにコントロールマウスおよびＳｔｚマウスの血清中グルコース濃度、ＡＧＥｓ様活性の変化を経時的に追跡した結果、個体毎に両者の相関が示されたといえる。また、０日目から２２日目までは、Ｓｔｚ群で血糖値、ＡＧＥｓ様活性が共に上昇する個体数が多いことが観察され、７１日目でもその傾向は観察された。２２日目の段階では、腎症発症の簡便な目安である飲水量の増大などは認められていなかったが、この時点で既にＡＧＥｓ様活性の上昇がみられた。さらに、７１日目では、腎症発症の指標となる血中クレアチニン量も測定したが、Ｓｔｚ群において、ＡＧＥｓ活性とクレアチニン濃度が共に高い個体が多いことも確認された。
【０２５２】
以上からＡＧＥｓ様活性は糖尿病または糖尿病性腎症の診断のために使用することができ、また、糖尿病性腎症の予備的な診断（予測）、糖尿病における糖尿病性腎症の予備的な診断（予測）も可能であることが実証され、診断マーカーとして有用であることが実証された。
【０２５３】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２５４】
ＣＴＬＤ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体およびＲＡＧＥ様ポリペプチド−界面活性剤結合複合体は、糖尿病、動脈硬化、糖尿病性血管障害、糖尿病性腎症などの早期診断、機能性食品の予防効果評価、生活改善や投薬による治療効果の評価など様々な分野で活用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０２５５】
配列番号１：ＰＲ−ＣＴＬＤまたはＣＴＬＤをコードする核酸配列
配列番号２：ＰＲ−ＣＴＬＤまたはＣＴＬＤのアミノ酸配列
配列番号３：ＰＲ−Ｌｏｘ−１またはＬｏｘ−１をコードする核酸配列
配列番号４：ＰＲ−Ｌｏｘ−１またはＬｏｘ−１のアミノ酸配列
配列番号５：ＰＲ−ＣＴＬＤ１４またはＣＴＬＤ１４をコードする核酸配列
配列番号６：ＰＲ−ＣＴＬＤ１４またはＣＴＬＤ１４のアミノ酸配列
配列番号７：Ｌｏｘ−１のＣＴＬＤ＋ネックまたはＰＲ−ＣＴＬＤ＋ネックをコードする核酸配列
配列番号８：Ｌｏｘ−１のＣＴＬＤ＋ネックまたはＰＲ−ＣＴＬＤ＋ネックのアミノ酸配列
配列番号９：ＲＡＧＥまたはｍＲＡＧＥをコードする核酸配列
配列番号１０：ＲＡＧＥまたはｍＲＡＧＥのアミノ酸配列
配列番号１１：ＲＡＧＥ８またはｍＲＡＧＥ８をコードする核酸配列
配列番号１２：ＲＡＧＥ８またはｍＲＡＧＥ８のアミノ酸配列
配列番号１３：ＲＡＧＥ１またはｍＲＡＧＥ１をコードする核酸配列
配列番号１４：ＲＡＧＥ１またはｍＲＡＧＥ１のアミノ酸配列
配列番号１５：ＲＡＧＥ２またはｍＲＡＧＥ２をコードする核酸配列
配列番号１６：ＲＡＧＥ２またはｍＲＡＧＥ２のアミノ酸配列
配列番号１７：ＲＡＧＥ３またはｍＲＡＧＥ３をコードする核酸配列
配列番号１８：ＲＡＧＥ３またはｍＲＡＧＥ３のアミノ酸配列
配列番号１９：ＲＡＧＥ４またはｍＲＡＧＥ４をコードする核酸配列
配列番号２０：ＲＡＧＥ４またはｍＲＡＧＥ４のアミノ酸配列
配列番号２１：ＲＡＧＥ７またはｍＲＡＧＥ７をコードする核酸配列
配列番号２２：ＲＡＧＥ７またはｍＲＡＧＥ７のアミノ酸配列
配列番号２３：ＲＡＧＥ１４３またはｍＲＡＧＥ１４３をコードする核酸配列
配列番号２４：ＲＡＧＥ１４３またはｍＲＡＧＥ１４３のアミノ酸配列
配列番号２５：ＲＡＧＥ２２３またはｍＲＡＧＥ２２３をコードする核酸配列
配列番号２６：ＲＡＧＥ２２３またはｍＲＡＧＥ２２３のアミノ酸配列
配列番号２７：ＲＡＧＥ２２６またはｍＲＡＧＥ２２６をコードする核酸配列
配列番号２８：ＲＡＧＥ２２６またはｍＲＡＧＥ２２６のアミノ酸配列
配列番号２９：ＡｖｉＴａｇ配列  ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ
配列番号３０：Ｓｔｒｅｐｔａｇ配列  ＡＷＲＨＰＱＦＧＧ
配列番号３１：ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ配列  ＷＳＨＰＱＦＥＫ
配列番号３２：順方向プライマー（ＲＡＧＥ１、ＲＡＧＥ２、ＲＡＧＥ３、ＲＡＧＥ７、ＲＡＧＥ８、ＲＡＧＥ９、ＲＡＧＥ１４３、ＲＡＧＥ２２３およびＲＡＧＥ２２６に共通）５’−ＣＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡＡＡＣＡＴＣＡＣＡＧＣ−３’
配列番号３３：ＲＡＧＥ１逆方向プライマー
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＣ−３’
配列番号３４：ＲＡＧＥ２逆方向プライマー
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＧＧＣＴＧ−３’
配列番号３５：ＲＡＧＥ３逆方向プライマー
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣ−３’
配列番号３６：ＲＡＧＥ７逆方向プライマー
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＡＧＴ−３’
配列番号３７：ＲＡＧＥ８逆方向プライマー
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＡＧＡＣＡＣＧＧ−３’
配列番号３８：ＲＡＧＥ９逆方向プライマー
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣ−３’
配列番号３９：ＲＡＧＥ４順方向プライマー
５’−ＴＣＧＣＡＴＡＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＣＡＧＧＡＡＴＧＧ−３’
配列番号４０：ＲＡＧＥ４逆方向プライマー
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＧＧＣＣＣ−３’
配列番号４１：ＲＡＧＥ１４３逆方向プライマー
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＡＴＴＧＧＧ−３’
配列番号４２：ＡＧＥ２２３逆方向プライマー
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＡＡＧＧＣＣＣＧ−３’
配列番号４３：ＲＡＧＥ２２６逆方向プライマー
５’−ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＧＣ−３’
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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