(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２および配列番号３によって表されるヌクレオチド配列を含む、遺伝子ＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅの共発現のための配列番号７によって表される発現構築物であり、配列番号１はＡｓｐＡＴ遺伝子を表し、配列番号２はＧＳ遺伝子を表し、配列番号３はＰＥＰＣａｓｅ遺伝子を表し、少なくとも１つの制御配列および転写ターミネーター配列に結合し、野生型または非形質転換植物と比べて、植物の炭素、窒素、バイオマスおよび産出量を増強するのに有効である、発現構築物。
【請求項２】
前記制御配列が配列番号４によって表され、および前記転写ターミネーター配列が配列番号５によって表される、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項３】
前記制御配列が、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ルビスコプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項４】
用いられる前記ターミネーターが、ＮｏｓターミネーターおよびＣａＭＶ  ３’ＵＴＲからなる群から選択される、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項５】
配列番号７を有するポリヌクレオチドが植物中で過剰発現される、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項６】
ｉ）配列番号１０および配列番号１１によって表されるプライマーを用いて配列番号１によって表されるｃＤＮＡ配列をコードする遺伝子を増幅する工程、配列番号８および配列番号９によって表されるプライマーを用いて配列番号２によって表されるｃＤＮＡ配列をコードする遺伝子を増幅する工程ならびに配列番号１２および配列番号１３によって表されるプライマーを用いて配列番号３によって表されるｃＤＮＡ配列をコードする遺伝子を増幅する工程；
ｉｉ）工程（ｉ）で得られる配列番号１、２および３の増幅された生成物をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクターに独立にクローニングする工程；
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた陽性クローンからプラスミドを独立にｐＣＡＭ  ＢＩＡ  １３０２と一緒に消化し、さらに消化された遺伝子生成物およびｐＣＡＭ  ＢＩＡ  １３０２をライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換する工程；
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた陽性コロニーからプラスミドの配列を決定して、ＡｓｐＡＴ：：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２；ＧＳ：：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２およびＰＥＰＣａｓｅ：：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２のインフレームクローニングを確認する工程；
ｖ）配列番号１０および配列番号１６；配列番号１４および配列番号１５ならびに配列番号１７および配列番号１８によって表されるプライマーを用いて工程（ｉｖ）で得られた生成物を増幅する工程；
ｖｉ）クローニングする工程、消化する工程、ライゲーションする工程および配列決定する工程を増幅されたＧＳコード配列に対して独立に再度行い、さらに消化されたＧＳ＋ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２を形成し、増幅されたＡｓｐＡＴコード配列の陽性クローンのプラスミドをライゲーションしてＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２発現カセットを形成する工程；
ｖｉｉ）遺伝子ＡｓｐＡ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅが独立したＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＮｏｓ転写ターミネーターによって制御されるように、工程（ｖｉ）で得られるＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋発現カセットで前もってクローニングされた目的ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２と、増幅されたＰＥＰＣａｓｅコード配列の陽性クローンの消化されたプラスミドとをライゲーションして、配列番号７によって表される、単一植物の発現構築物ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅを形成する工程、
を含む、請求項１に記載の発現構築物の調製方法。
【請求項７】
ａ）請求項１に記載の発現構築物でアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌種を形質転換する工程；
ｂ）工程（ａ）で得られた組み換えアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌種で外植体を形質転換する工程；
ｃ）工程（ｂ）の形質転換された外植体を選択して、野生型植物と比べて植物の炭素、窒素、バイオマスおよび産出量を増強された所望の形質転換植物を得る工程：
を含む、請求項１に記載の発現構築物を用いて、植物の炭素、窒素、バイオマスおよび産出量を増強する方法。
【請求項８】
前記形質転換植物が、シロイヌナズナ、トマト、ポテト、タバコ、トウモロコシ、小麦、イネ、コットン、マスタード、キマメ、ササゲ、エンドウ、サトウキビ、ダイズおよびソルガムを含む群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
野生型と比べて、前記形質転換植物がＰＥＰＣａｓｅ活性において４５〜５０％、ＧＳ活性において少なくとも５５％、およびＡｓｐＡＴ活性において５５〜６０％の増加を示し、結果的に植物の炭素および窒素レベルを増加する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
野生型と比べて、前記形質転換植物は、増加した種子の産出量および／または鞘の産出量によって示される増加した産出量および／またはバイオマスを示す、請求項７に記載の方法
【請求項１１】
形質転換植物が、野生型または非形質転換植物と比べて、増加した新芽の新鮮重量、新芽の乾燥重量、根の新鮮重量および根の乾燥重量によって特徴づけられる増強された生長特性を示す、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
以下に、本発明および実施方法を具体的に記載する。
【０００２】
本発明は、植物の炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）、バイオマスおよび産出量を増強する発現構築物に関する。
【０００３】
さらに、本発明は、酵素ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（本願明細書において、「ＰＥＰＣａｓｅ」と称す。）、グルタミンシンテターゼ（本願明細書において、「ＧＳ」と称す。）およびアスパラギン酸アミノ基転移酵素（本願明細書において、「ＡｓｐＡＴ」と称す。）由来の遺伝子の過剰共発現を利用する上記発現構築物を用いることにより植物のＣレベルおよびＮレベルの増強プロセスならびに続く植物のバイオマスおよび産出量における改善プロセスを提供する。特に、本発明は、上記タンパク質をコードしている核酸配列が植物細胞内で発現される遺伝子組み換え植物に関する。
【０００４】
より具体的には、本発明は、３つの遺伝子の過剰共発現に関する遺伝子構造を有する植物の形質転換に関し、ここで、１つの遺伝子ＰＥＰＣａｓｅはＣＯ２を補足することを担当する酵素をコードし、他の２つの酵素（ＡｓｐＡＴおよびＧＳ）をコードすることは、Ｎの吸収に関し、ここでＮの吸収はＰＥＰＣａｓｅによるＣ骨格を必要とし、ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子で形質転換された植物のアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ：シロイヌナズナ）を含む構成的プロモーターおよびこの植物のＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子の発現を制御し、これにより植物のＣおよびＮ、バイオマスおよび産出量の状況を増強する。
【背景技術】
【０００５】
（背景技術および先行技術）
すなわち、本発明は、３つの遺伝子の過剰共発現を伴って形質転換された植物に関する。
【０００６】
ＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅは増強されたＣ含有量、Ｎ含有量、バイオマス構成要素および産出量構成要素をもたらす。
【０００７】
ＰＥＰＣａｓｅ（ＥＣ．４．１．１．３１）は、ＨＣＯ３−およびＭｇ２＋の存在下で、ホスホエノールピルビン酸のβカルボキシル化を触媒する、植物の至る所にある酵素であり、オキサロ酢酸（本願明細書において、「ＯＡＡ」と称す。）および無機リン酸塩（本願明細書において、「Ｐｉ」と称す。）を産出し、主に、中間体を伴うトリカルボン酸回路を補充するアナプレロティック作用を有する。より高等植物において、異なる器官特異性のＰＥＰＣａｓｅのいくつかのアイソフォームがあり、そして、アイソフォームは、開いた気孔、果実成熟および種子成熟を包含している様々な機能に関している。Ｃ４植物およびＣＡＭ植物の葉は、光合成の初期ＣＯ２の固定を触媒するＰＥＰＣａｓｅを高レベルで含有する。Ｃ３植物の葉にみられるはるかに低レベルのＰＥＰＣａｓｅは、細胞のｐＨの調整において、アナプレロティック作用に貢献し、役割を果たす。
【０００８】
ＧＳ（ＥＣ６．３．１．２）は、アンモニア（本願明細書において、「ＮＨ３」と称す。）とグルタミン酸エステル（塩）（本願明細書において、「Ｇｌｕ」と称す。）とのＡＴＰ依存型の縮合を触媒し、グルタミン（本願明細書において、「Ｇｌｎ」と称す。）を製造する。その後、グルタミン酸シンターゼ（ＧＯＧＡＴ）は、Ｇｌｎのアミド基をα−ケトグルタル酸に転換して２分子のＧｌｕを製造する。ＧｌｎおよびＧｌｕの両方は、タンパク質、核酸および葉緑素の主な有機窒素源である。
【０００９】
ＡｓｐＡＴ（ＥＣ２．６．１．１）は、アスパラギン酸（本願明細書において、「Ａｓｐ」と称す。）のアミノ基のα−ケトグルタル酸への可逆的な転換を触媒し、ＯＡＡおよびＧｌｕを形成する。植物において、ＡｓｐＡＴは、以下の様々な代謝の役割を果たすといわれている：根でＮＨ３＋を吸収する間にＣ骨格を再利用して、アスパラギン（本願明細書において、「Ａｓｎ」と称す。）およびウレイドなどの主な窒素輸送分子を生合成するためのアミド前駆体を提供し、シード充填する間、Ａｓｎの窒素を集め、アミノ酸のＡｓｐ族の生合成のための前駆体を与えるＣ４植物中を行き来する細胞内のＣに加わる。
【００１０】
バイオマス生産、産出量または収穫（高）指数の点における植物の性能は内的要因および環境要因の数に依存する。これらすべての要因の間で、植物のＣレベルおよびＮレベルは植物生産性に影響を与える重要な要因の１つである。ＣおよびＮの吸収の新たな詳細は、調節系が代謝要因および環境要因の両方に応じてこれらの栄養素の摂取および配給を調整するということを示唆する。植物の感覚はＣおよびＮの状況において変化し、この情報を、遺伝子発現における変化がもたらされる核へ伝達する。植物の生長および穀物の産出量は吸収されたＣおよびＮにより大きく影響を受けるので、効率的なＣおよびＮの吸収を設計する多くの試みが過去になされている。しかしながら、植物のＣ、Ｎ、バイオマスおよび産出量の状況における大きな改善を示す報告は未だなされていない。
【００１１】
表１は、異なる植物におけるＣおよび／またはＮならびにバイオマスを改善するための種々方法において利用されうる情報の状況を示す。
【００１２】
【表１】
0005856283.tif 000002
【表２】
0005856283.tif 000003
【表３】
0005856283.tif 000004
【表４】
0005856283.tif 000005
【００１３】
ＰＥＰＣａｓｅの高度の活性は、ＣＯ２捕獲を促進し、そして炭素骨格をＡｓｐＡＴおよびＧＳの統合活動を通して有機形態に窒素の経路に用いられるようにする。結果として、本発明者らは本発明の目的が、ＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅをコードする遺伝子の発現に付随して増加することにより得られ、本発明を構成する。
【００１４】
以下に、本発明の技術分野の状況および植物中の炭素および／または窒素レベルのどちらかを増強するために以前なされた試みを説明する。
【００１５】
非特許文献１では、トウモロコシのＰＥＰＣａｓｅが、タバコ中のタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーターの下で発現された。滴定酸度およびリンゴ酸のレベルが高い非形質転換体と比べて、最大２倍高いＰＥＰＣａｓｅの活性が、遺伝子組み換え葉において観察された。
【００１６】
非特許文献２では、ソルガムのＰＥＰＣａｓｅが、シロイヌナズナ中のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下で発現された。主な葉の形質転換体は、ＰＥＰＣａｓｅ活性において最大１０倍の増加および、種子の乾燥重量および全タンパク質含有量において最大３０％の増加を示した。しかしながら、当該形質転換体（初代および後代）は、植物毎に、種子生産において、いかなる改善された生長表現型または変性を示さなかった。しかしながら、これらの生化学的な差異は光合成速度またはＣＯ２補償点の点で大きな生理的な変化を起こさなかった。
【００１７】
また別の非特許文献３では、フィードバック阻害への感度を縮小するシアノバクテリアのシネココッカス ウルカヌス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｕｌｃａｎｕｓ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＳｖＰＥＰＣａｓｅ）がシロイヌナズナにおけるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で過剰発現した。Ｔ１形質転換体の１／３はブリーチされた葉として厳しい表現型を示し、土壌で生育したときに生殖力がなかった。しかしながら、フィードバック阻害剤（Ｌ−リンゴ酸塩）にふつう敏感なＣ４光合成のためにトウモロコシＰＥＰＣａｓｅ（ＺｍＰＥＰＣ）を形質転換したシロイヌナズナを有する表現型には見られなかった。ＳｖＰＥＰＣの形質転換されたＴ２植物の増殖阻害は、主にホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）（芳香族アミノ酸およびフェニルプロパノイドの合成のためのシキミ酸経路の前駆体の１つ）の減少した利用可能性に起因すると推測された。
【００１８】
また別の非特許文献４では、手つかずのトウモロコシＰＥＰＣａｓｅ遺伝子がイネの葉において過剰発現した。遺伝子組み換えのイネの葉に導入されたＰＥＰＣａｓｅは内因性のイネのＰＥＰＣａｓｅと似て、タンパク質リン酸化を通して活性調節を行うが、トウモロコシ葉に発生するのとは対照的であり、光に下方制御され、暗所で上方制御される。形質転換されていないイネと比較して、ＰＥＰのレベルはわずかに低く、そして生産量（ＯＡＡ）は遺伝子組み換えのイネにおいてわずかに高く、このことはトウモロコシＰＥＰＣａｓｅが、脱リン酸化し、光への活性が低いが機能していることを示していた。１４ＣＯ２ラベルした実験は、トウモロコシＰＥＰＣａｓｅは遺伝子組み換えのイネの光合成によるＣＯ２固定にあまり寄与していないことを示した。むしろ、そのことは、ＣＯ２の吸収速度をわずかに小さくした。この効果は光の当たるところでの呼吸の刺激に起因し、より低酸素濃度でより際立っていた。ＰＥＰＣａｓｅの過剰生成は直接はあまり光合成に影響を及ぼさないが、光の当たるところでの呼吸を刺激して間接的に光合成を抑制する。
【００１９】
また別の非特許文献５では、ダイズサイトソルのＧＳ遺伝子ＧＳ１５をＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと融合してセイヨウミヤコグサ（ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ  Ｌ．）内の恒常的発現を達成した。異なるＮレジメの下で生長する遺伝子組み換え植物において、遊離型アミノ酸およびアンモニアの増加が、１２ｍＭのＮＨ４＋で培養された野生型の生育した植物と比較して、同じ条件下で遺伝子組み換え植物内の溶解性炭化水素の減少によって達成されるのが観察された。ラベル実験は、根に取り込むアンモニアとその後のアミノ酸の新芽への移動は、過剰発現したＧＳ植物より低かった。しかしながら、形質転換植物における早い香りの発生は、植物がアンモニウムリッチな培地において生長したとき、早期に花が咲き、老化の速さにおけるＧＳの役割を示した。炭素骨格の限界およびＮＨ４＋吸収を増強するエネルギーは予測された。
【００２０】
また別の非特許文献６では、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの構築が行われているα−ＧＳがタバコに導入された。遺伝子組み換え植物中の葉のＧＳ活性は、転換されていない植物の最大６倍に増加した。Ｎ欠乏の下、ＧＳ遺伝子組み換え体は、多くのＮの下の植物と区別できない速度で光合成の維持によってよりよく生長するのに対し、対照植物の光合成は、Ｎを欠乏することで４０〜５０％に抑制されている。しかしながら、最適なＮ受精条件下、光合成におけるＧＳ過剰発現および生長の効果は見られなかった。
【００２１】
また別の非特許文献７では、エンドウの細胞性ＧＳの過剰発現は、窒素、光および光呼吸に関して、研究された。葉において、異所的に細胞性ＧＳ１を過剰発現するタバコは、葉の新鮮重量、乾燥重量、および溶解性タンパク質における増加によって明らかに、Ｎの限定条件およびＮの非限定的条件のもと、光に依存しない改善された生長性の表現型を示す。細胞性ＧＳ１遺伝子組み換え植物もＣＯ２の光呼吸の突発の増加および光呼吸中間体のレベルの増加を示し、光呼吸における変化を示す。しかしながら、植物生産性におけるＧＳの過剰発現による光呼吸の刺激の効果は考察されてなかった。
【００２２】
また別の非特許文献８では、大腸菌ＧＳ遺伝子（ｇｌｎＡ）を伴う全長のｃＤＮＡをコードしたイネ（Ｏｒｙｚａ  Ｓａｔｉｖａ）の細胞性ＧＳ遺伝子（ＯｓＧＳ１；１およびＯｓＧＳ１；２）は、構成的ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下、イネ中で過剰発現された。ＧＳの過剰発現した植物における増加した代謝レベルが得られ、葉におけるより高いＧＳ活性および溶解性タンパク質濃度ならびにより多いアミノ酸および全植物中の全Ｎ含有量を示した。しかしながら、両方の穀物の産出生産性および全アミノ酸の減少は野生型植物と比べてＧＳ過剰発現植物の種において観察された。
【００２３】
また別の非特許文献９では、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でのパニクム（Ｐａｎｉｃｕｍ）ミトコンドリアの過剰発現および細胞性ＡｓｐＡＴ（ｍＡｓｐＡＴおよびｃＡｓｐＡＴのそれぞれ）の効果が遺伝子組み換えタバコにおいて評価されている。ｍＡｓｐＡＴまたはｃＡｓｐＡＴ形質転換植物は、それぞれ、非形質転換植物の約３倍または３．５倍高い葉におけるＡｓｐＡＴ活性を有した。興味深いことに、両方の形質転換された植物の葉はＰＥＰＣａｓｅのレベルを増加し、ｃＡｓｐＡＴを伴う形質転換植物はその葉中のｍＡｓｐＡＴのレベルも増加していた。これらの結果は、遺伝子組み換えタバコ内のパニクムｃＡｓｐＡＴの増加した発現が、遺伝子組み換えタバコの内因性のｍＡｓｐＡＴおよびＰＥＰＣａｓｅの発現を増強し、パニクムｍＡｓｐＡＴの増加した発現が内因性のＰＥＰＣａｓｅの発現を増強することを示唆する。しかしながら、植物の生長および生産性におけるＡｓｐＡＴ過剰発現の効果の説明はない。
【００２４】
また別の非特許文献１０では、葉緑体、細胞性およびミトコンドリアのＡｓｐＡＴアイソザイム、それぞれをコードしているイネ由来の３つのＡｓｐＡＴ遺伝子（ＯｓＡＡＴ１−３）および大腸菌（ＥｃＡＡＴ）由来の１つのＡｓｐＡＴ遺伝子が、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御の下、イネにおいて過剰発現されている。当該ＯｓＡＡＴ１、ＯｓＡＡＴ２、およびＥｃＡＡＴの形質転換体は、主に葉のＡｓｐＡＴ活性およびより多い種のアミノ酸ならびにタンパク質含有量の増加を示した。しかしながら、ＯｓＡＡＴ３の過剰発現した植物中の葉のＡｓｐＡＴ活性、種のアミノ酸含有量またはタンパク質含有量において優位な変化は見られなかった。
【００２５】
また別の非特許文献１１では、ＡｓｐＡＴ５をコードしたダイズ由来の葉緑体ＡｓｐＡＴが、シロイヌナズナにおいて過剰発現を達成するためＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに結合された。形質転換体におけるＡｓｐＡＴ５の発現は、Ｔ３種における、遊離型グリシン、アラニン、アスパラギン、およびＧｌｕのそれぞれの含有量において、３倍、４倍、２３倍、および５０倍の増加をもたらす。しかしながら、バリン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、およびフェニルアラニンの含有量において数倍の現象も観測された。さらに、植物の生長および生産性において、ＡｓｐＡｔの過剰発現の効果に関する報告はない。
【００２６】
また別の非特許文献１２では、トウモロコシ由来のＤｏｆ１転写因子の過剰発現は遺伝子組み換えシロイヌナズナにおけるＮの吸収を改善する。Ｄｏｆ１を発現する植物はＣ骨格生産量、アミノ酸含有量の著しい増加、およびグルコースレベルの減少のため遺伝子をコードしている酵素の上方修正を示した。当該結果は、Ｃ代謝およびＮ代謝の密接な関係に基づく、Ｃ代謝およびＮ代謝の相対的な変更を示唆する。元素分析は、Ｎ含有量がＤｏｆ１遺伝子組み換え植物において増加し、正味のＮの吸収の促進を示唆することを明らかにした。しかしながら、植物バイオマスまたは産出量におけるＣＮの代替の効果は考察されなかった。
【００２７】
また別の非特許文献１３では、ＮＡＤＫ２変異体と共に、ＮＡＤキナーゼ２の過剰発現をした遺伝子組み換えシロイヌナズナは、植物の代謝におけるＮＡＤＰレベルを変更することの影響の調査が挙げられた。代謝産物のプロファイルは、ＮＡＤＰ（Ｈ）濃度が、ＮＡＤＫ２の過剰発現およびＮＡＤＫ２変異体においてＮＡＤＫ活性に比例していた。カルビン回路と関連するいくつかの代謝産物も、過剰発現体においてより高く、全ルビスコ活性における増加によりなされた。さらに、ＮＡＤＫ２の過剰発現に起因する増強したＮＡＤＰ（Ｈ）の生成物は、Ｎの吸収を増加した。ＧｌｎおよびＧｌｕ濃度は、いくつかの他のアミノ酸と同様、過剰発現体において高かった。しかしながら、Ｃ代謝およびＮ代謝に影響するＮＡＤＫ２の役割において明らか証拠はない。
【００２８】
植物のＣおよびＮの状況における改善は生産性を改善することに大きく関係する。しかしながら、植物のＣレベルおよびＮレベルの増強ならびに続くバイオマスおよび産出量における改善を示す報告はまだされていない。
【００２９】
さらに、３つ遺伝子（すなわち、ＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅ）を過剰共発現して、ＣおよびＮ、バイオマスならびに産出量の状態を増強する試みはなされていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
本発明の主な目的は、上記に詳述した先行技術で知られている欠点を未然に防ぐ、植物の炭素、窒素、バイオマスおよび産出量を増強する発現構築物を提供することである。
【００３１】
本発明の別の目的は、ＡｓｐＡＴ（配列番号１）、ＧＳ（配列番号２）、およびＰＥＰｃａｓｅ（配列番号３）の過剰共発現のための発現構築物を提供することであり、ここでＰＥＰＣａｓｅはＣＯ２を効率よく補足し、他の２つの遺伝子をＮの吸収における役割を有する酵素（ＡｓｐＡＴおよびＧＳ）にコードし、ＰＥＰＣａｓｅの媒介した反応によって提供された炭素骨格を用いることで、結果的に、改善された植物のバイオマスおよび産出量を伴うＣの状況およびＮの状況を増強する。
【００３２】
また、本発明の別の目的は、遺伝子（ＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅ）の過剰共発現を示す遺伝子組み換え植物を生育することである。
【００３３】
また、本発明の別の目的は、遺伝子組み換え植物のＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅ遺伝子の発現を評価することである。
【００３４】
また、本発明の別の目的は、遺伝子組み換え植物を、Ｃ、Ｎ、バイオマスおよび産出量の状況について、野生植物と比較して評価することである。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
したがって、本発明は、配列番号１、配列番号２および配列番号３によって表されるヌクレオチド配列を含む遺伝子ＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅの共発現のため、配列番号７によって表される発現構築物を提供し、ここで、配列番号１はＡｓｐＡＴ遺伝子を表し、配列番号２はＧＳ遺伝子を表し、配列番号３はＰＥＰＣａｓｅ遺伝子を表し、少なくとも１つの制御配列および転写ターミネーター配列に結合し、野生型または非形質転換植物と比べて、植物の炭素、窒素、バイオマスおよび産出量を増強するのに有効である。
【００３６】
本発明の実施形態において、制御配列は配列番号４によって表されるのが好ましい。
【００３７】
本発明の別の実施形態において、転写ターミネーター配列は配列番号５によって表される。
【００３８】
一実施形態において、本発明は、ダイズ由来の細胞質ＡｓｐＡＴ遺伝子、タバコ由来の細胞質ＧＳ遺伝子およびトウモロコシ由来の細胞質ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子から調製される発現構築物を提供する。
【００３９】
本発明の別の実施形態において、配列番号７を有するポリヌクレオチドは、植物中で過剰発現される。
【００４０】
本発明のさらに別の実施形態において、用いられる制御配列は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ルビスコ（ｒｕｂｉｓｃｏ）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。
【００４１】
本発明のさらに別の実施形態において、用いられるターミネーターは、ＮｏｓターミネーターおよびＣａＭＶ３’ＵＴＲからなる群から選択されるのが好ましい。
【００４２】
本発明のさらに別の実施形態において、発現構築物の調整プロセスは、
ｉ）配列番号１０および配列番号１１によって表されるプライマーを用いて配列番号１によって表されるｃＤＮＡ配列をコードしている遺伝子を増幅する工程、配列番号８および配列番号９によって表されるプライマーを用いて配列番号２によって表されるｃＤＮＡ配列をコードしている遺伝子を増幅する工程ならびに配列番号１２および配列番号１３によって表されるプライマーを用いて配列番号３によって表されるｃＤＮＡ配列をコードしている遺伝子を増幅する工程；
ｉｉ）工程（ｉ）で得られる配列番号１、２および３の増幅された生成物をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクターに独立にクローニングする工程；
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた陽性クローンからプラスミドを独立にｐＣＡＭＢＩＡ１３０２と一緒に消化し、さらに消化された遺伝子生成物およびｐＣＡＭＢＩＡ１３０２をライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換する工程；
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた陽性コロニーからプラスミドの配列を決定して、ＡｓｐＡＴ：：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２；ＧＳ：：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２およびＰＥＰＣａｓｅ：：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２のインフレームクローニングを確認する工程；
ｖ）配列番号１０および配列番号１６；配列番号１４および配列番号１５ならびに配列番号１７および配列番号１８によって表されるプライマーを用いて工程（ｉｖ）で得られた生成物を増幅する工程；
ｖｉ）クローニングする工程、消化する工程、ライゲーションする工程および配列決定する工程を増幅されたＧＳコード配列に対して独立に再度行い、さらに消化されたＧＳ＋ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２を形成し、ならびに増幅されたＡｓｐＡＴコード配列の陽性クローンのプラスミドをライゲーションしてＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２発現カセットを形成する工程；
ｖｉｉ）遺伝子ＡｓｐＡ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅが独立したＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＮｏｓ転写ターミネーターによって制御されるように、工程（ｖｉ）で得られるＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋発現カセットで前もってクローニングされた目的ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２と、増幅されたＰＥＰＣａｓｅコード配列の陽性クローンの消化されたプラスミドとをライゲーションして、配列番号７によって表される、単一植物の発現構築物ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅを形成する工程、
を含むプロセスである。
【００４３】
本発明のさらに別の実施形態において、増強する工程が、
ａ）請求項１に記載の発現構築物でアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌種を形質転換する工程；
ｂ）工程（ａ）で得られた組み換えアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌種で外植体を形質転換する工程；
ｃ）工程（ｂ）の形質転換された外植体を選択して、野生型植物と比べて植物の炭素、窒素、バイオマスおよび産出量を増強された所望の形質転換植物を得る工程：
を含む、発現構築物を用いて、植物の炭素、窒素、バイオマスおよび産出量を増強するプロセスである。
【００４４】
本発明のさらに別の実施形態において、野生型と比べて、形質転換植物がＰＥＰＣａｓｅ活性において約４５〜５０％、ＧＳ活性において少なくとも５５％、およびＡｓｐＡＴ活性において５５〜６０％の増加を示し、結果的に植物の炭素および窒素レベルを増加する、プロセスである。
【００４５】
本発明の別の実施形態において、得られるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌種は、ＡＴＣＣナンバーアグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０ＲＫ）（Ｃ５８誘導体）ＡＴＣＣ（登録商標番号：３３９７０）（参照：Ｈａｙａｓｈｉ  Ｈ，Ｃｚａｊａ  Ｉ，Ｌｕｂｅｎｏｗ  Ｈ，Ｓｃｈｅｌｌ  Ｊ，Ｗａｌｄｅｎ  Ｒ．１９９２年）を伴うＧＶ３１０１からなる群から選択される。
【００４６】
本発明のまた別の実施形態において、形質転換植物は、穀類作物、豆類、野菜作物、油糧種子作物および観賞植物からなる群から選択される。
【００４７】
また別の実施形態において、形質転換植物は、シロイヌナズナ、トマト、ポテト、タバコ、トウモロコシ、小麦、イネ、コットン、マスタード、キマメ、ササゲ、エンドウ、サトウキビ、ダイズおよびソルガムからなる群から選択される。
【００４８】
さらに別の実施形態において、野生型と比べて、上記形質転換植物は、増加した種子の産出量および／または鞘の産出量によって示される増加した産出量および／またはバイオマスを示す。
【００４９】
さらに別の実施形態において、形質転換植物は、野生型または非形質転換植物と比べて、増加した新芽の新鮮重量、新芽の乾燥重量、根の新鮮重量および根の乾燥重量によって特徴づけられる増強された生長特性を示す。
【００５０】
本発明のまた別の実施形態において、形質転換された植物は、野生植物と比べて増強した炭素、窒素、バイオマスおよび産出量のレベルを示す。
【００５１】
本発明のさらに別の実施形態において、遺伝子組み換え植物中の過剰発現酵素の発現および機能が評価される。
【００５２】
本発明のまた別の実施形態において、用いられる選択可能なマーカーは、複製ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって制御され、ＣａＭＶ３’ＵＴＲ（ポリＡシグナル）によって停止されるハイグロマイシン耐性のための配列番号６によって表されるｈｐｔ遺伝子（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）である。
【００５３】
本発明の別の実施形態において、生化学的評価およびＲＴ−ＰＣＲは、導入された遺伝子の発現を評価し、遺伝子組み換え植物中の過剰発現酵素の機能を評価するために行われた。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態において、遺伝子組み換え植物は、同じ条件で栽培された野生植物と比較して異なる生長および産出量パラメーターを示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００５５】
【非特許文献１】Ｈｕｄｓｐｅｔｈ，Ｒ．Ｌ．、Ｇｒｕｌａ，Ｊ．Ｗ．、Ｄａｉ，Ｚ．、Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｇ．Ｅ．およびＫｕ，Ｍ．Ｓ．Ｂ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉａｚｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｏｏ（遺伝子組み換えタバコにおいてのトウモロコシ（Ｍｉａｚｅ）のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現）」、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１９９２年、第９８巻、ｐ．４５８〜４６４
【非特許文献２】Ｌｅｂｏｕｔｅｉｌｌｅｒ，Ｂ．、Ｄｕｐｏｎｔ，Ａ．Ｇ．、Ｐｉｅｒｒｅ，Ｊ．Ｎ．、Ｂｌｅｔｏｎ，Ｊ．、Ｔｃｈａｐｌａ，Ａ．、Ｍａｕｃｏｕｒｔ，Ｍ．および  Ｍｏｉｎｇ，Ａ．、Ｒｏｌｉｎ，Ｄ．、およびＶｉｄａｌ，Ｊ．、「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ  ｌ  ｉｍｐａｃｔｓ  ｏｆ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｌｅａｖｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｅｄｓ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナの葉および種におけるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼレベルの調節の生理学的影響）」、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年、第１７２巻、ｐ．：２５６〜２７２
【非特許文献３】Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｍ．、Ｌｉ，Ｋ．Ｚ．Ｍｉｗａ，Ｔ．およびＩｚｕｉ，Ｋ．、「Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（シロイヌナズナ中のアミノ酸代謝を変化するフィードバック抑制に対する減少した感度を有するシアノバクテリアのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの過剰発現）」、Ｐｌａｎｔａ、２００４年、第２１９巻、ｐ．４４０〜４１９
【非特許文献４】Ｆｕｋａｙａｍａ，Ｈ．、Ｈａｔｃｈ，Ｍ．Ｄ．、Ｔａｍａｉ，Ｔ．、Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｈ．、Ｓｕｄｏｈ，Ｓ．、Ｆｕｒｂａｎｋ，Ｒ．Ｔ．およびＭｉｙａｏ，Ｍ．、「Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｍｐａｃｔｓ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  Ｃ（４）−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｉｃｅ  ｐｌａｎｔｓ（遺伝子組み換えイネにおいて過剰生産されたトウモロコシＣ４）の具体的なホスホエノールピルビン酸  カルボキシラーゼの活性調節および生理学的影響）」Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  、２００３年、第７７巻、ｐ．２２７〜２３９
【非特許文献５】Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｒ．、Ｆｒａｉｓｉｅｒ，Ｖ．、Ｃｈａｉｌｌｏｕ，Ｓ．、Ｌｉｍａｍｉ，Ｍ．Ａ．、Ｄｅｌｅｅｎｓ，Ｅ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｏｎ，Ｂ．、Ｄｏｕａｔ，Ｃ，Ｂｏｕｔｉｎ，Ｊ．Ｐ．およびＨｉｒｅｌ，Ｂ．、「Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｉｎ  ｓｈｏｏｔｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ  Ｌ．ｐｌａｎｔｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｌａｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（アンモニウム吸収および植物発育における変化をもたらす遺伝子組み換えのセイヨウミヤコグサの新芽におけるダイズ遺伝子をコードしている細胞性グルタミンシンテターゼをコードしているダイズ遺伝子の過剰発現）」、Ｐｌａｎｔａ、１９９７年、第２０１巻、ｐ．４２４〜４３３
【非特許文献６】Ｆｕｅｎｔｅｓ，Ｓ．Ｉ．、Ａｌｌｅｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｏｒｔｉｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ａ．およびＨｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｇ．、「Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｔ  ｌｏｗ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（低窒素条件で光合成および生長を増加する細胞性グルタミンシンテターゼの過剰発現）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ  、２００１年、第５２巻、ｐ．１０７１〜１０８１
【非特許文献７】Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｉ．．、Ｂｒｅａｒｓ，Ｔ．、Ｋｎｉｇｈｔ，Ｔ．、Ｃｌａｒｋ，Ａ．およびＣｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．、「Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ．Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ，ｌｉｇｈｔ，ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ（細胞性グルタミンシンテターゼの過剰発現、窒素、光および光呼吸との関連性）」Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００２年、第１２９巻、ｐ．１１７０〜１１８０
【非特許文献８】Ｃａｉ，Ｈ．、Ｚｈｏｕ，Ｙ．、Ｘｉａｏ，Ｊ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｚｈａｎｇ，Ｑ．およびＬｉａｎ，Ｘ．、「Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｓ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ａｂｉｏｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｒｉｃｅ（イネにおける窒素代謝および非生理的なストレス応答を変性する過剰発現したグルタミンシンテターゼ遺伝子）」、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、２００９年、第２８巻、ｐ．５２７〜５３７
【非特許文献９】Ｓｅｎｔｏｋｕ，Ｎ．、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．、Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｔ．、Ｉｓｈｉｍａｒｕ，Ｋ．、Ｏｈｓｕｇｉ，Ｒ．、Ｔａｋａｉｗａ，Ｆ．およびＴｏｋｉ，Ｓ．、「Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｓ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ａｂｉｏｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｒｉｃｅ（キビのアスパラギン酸アミノ基転移酵素遺伝子を発現する遺伝子組み換えタバコの分析）」、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０００年、第１９巻、ｐ．５９８〜６０３
【非特許文献１０】Ｚｈｏｕ，Ｙ．、Ｃａｉ，Ｈ．、Ｘｉａｏ，Ｊ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｚｈａｎｇ，Ｑ．．およびＬｉａｎ，Ｘ．、「Ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｒｅｓｕｌｔｅｄ  ｉｎ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  ｓｅｅｄｓ（変更した窒素代謝および増加した種中のアミノ酸含有量を招くアスパラギン酸アミノ基転移酵素遺伝子の過剰発現）」、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００９年、第１１８巻、ｐ．１３８１〜１３９０
【非特許文献１１】Ｍｕｒｏｏｋａ，Ｙ．、Ｍｏｒｉ，Ｙ．およびＨａｙａｓｈｉ，Ｍ．、「Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｓｅｅｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｏｙａｂｅａｎ  ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ（ダイズのアスパラギン酸アミノ基転移酵素遺伝子を発現してシロイヌナズナの種のアミノ酸含有量の変動）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００９年、第９４巻、ｐ．２２５〜２３０
【非特許文献１２】Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｓ．、Ａｋｉｙａｍａ，Ａ．、Ｋａｗａｋａ，Ｈ．、Ｕｃｈｉｍｉｙａ，Ｈ．およびＭｉｗａ，Ｔ．、「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｄｏｆｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｕｎｄｅｒ  ｌｏｗ−ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（植物におけるＤｏｆ１転写因子を伴った代謝工学：改善した窒素の吸収および低窒素条件下での生長）」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｅｉｎｃｅｓ（ＵＳＡ）、２００４年、第１０１巻、ｐ．７８３３〜７８３８
【非特許文献１３】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．、Ｔａｋａｈａｒａ，Ｋ．、Ｈａｓｈｉｄａ，Ｓ．、Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．、Ｆｕｊｉｍｏｒｉ，Ｔ．、Ｋａｗａｉ−Ｙａｍａｄａ，Ｍ．、Ｙａｍａｙａ，Ｔ．、Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｓ．およびＨｉｒｏｆｕｍｉ  Ｕｃｈｉｍｉｙａ，Ｈ．、「Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ａｎｄ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｐｌａｎｔｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＮＡＤ  ｋｉｎａｓｅ２  ｇｅｎｅ（ＮＡＤ  キナーゼ２遺伝子を過剰発現するシロイヌナズナにおける炭素代謝および窒素代謝の多面的な調節）」、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００９年、第１５１巻、ｐ．１００〜１１３
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、実施例１〜４に示すように、（ａ）ＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅの植物形質転換ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３０２のＴ−ＤＮＡ領域の概略図、ならびに（ｂ）個々の植物源由来のＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅのコード配列の増幅の概略図を表す。
【図２】図２は、ＷＴ、Ｌ１およびＬ２のＤＮＡ分析（ａ）およびＲＮＡ分析（ｂ）（ここで、ＷＴは野生；Ｌ１およびＬ２は２つの異なる遺伝子組み換えラインの過剰共発現したＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅである）を表す。
【図３】図３は、播種６０日での、ＷＴおよびＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子組み換え植物の新芽の新鮮重量（ＦＷ）（ａ）、新芽の乾燥重量（ＤＷ）（ｂ）、根の新鮮重量（ｃ）および根の乾燥重量（ｄ）を表す。データは、各バーに記された標準偏差を有する５つの分離した生理的複製物の平均である。
【図４】図４は、播種４２日でのＷＴ、Ｌ１およびＬ２の（ａ）ＡｓｐＡＴ活性、（ｂ）ＧＳ活性および（ｄ）ＰＥＰＣａｓｅ活性を表す。
【図５】図５は、播種６５日での異なる植物の部分のＷＴ、ＬＩおよびＬ２の（ａ）Ｎ含有量および（ｂ）Ｃ含有量の分析を表す。データは３つの生理的複製物の平均を各バーで記した標準偏差を用いたものである。
【図６】図６は、播種７５日での代表的なＷＴおよびＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ    遺伝子組み換え植物を表す。
【図７】図７は、播種７５日でのＷＴ、Ｌ１およびＬ２における、鞘の数（ａ）および種の産出量を表す。データは、各バーで記した５つの分離した生理的複製物の平均である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明は、植物におけるＣの代謝およびＮの代謝の遺伝子工学に関する。特に、本発明は、増加したＣおよびＮのレベルを有し、これにより良好な生長およびバイオマス生産および増強された産出量を促進するためのＣおよびＮの吸収もしくはＣおよびＮの利用ならびに／またはＣおよびＮの発現に関する、酵素に付随する変更をしたＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅの過剰共発現のための発現構築物に関する。
【００５８】
用語「ベクター」は、必要なときに、外来の資源からの遺伝子がライゲーションされかつ単離される核酸から作成される構成のことである。その構成は通常、プラスミド（すなわち、核酸を置換する染色体自体）であり、例えば大腸菌のバクテリア細胞で繁殖される。本発明におけるベクターは別の１つの資源から遺伝子を転換するために用いられた。
【００５９】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を製造しうる核酸配列のことである。
【００６０】
用語「遺伝子発現」は、ＤＮＡ（すなわち、デオキシリボ核酸の配列）によって選択して転写されたＲＮＡ（すなわち、リボ核酸配列）（すなわち、ＤＮＡによるＲＮＡの合成プロセス）のレベルおよび量を意味する。遺伝子は、対照と比べてより多く転写されたとき、そのことは遺伝子の「過剰発現」といわれた。
【００６１】
用語「プロモーター」は具体的なＤＮＡ配列を意味し、通常、転写に関するＤＮＡ配列の上流（５’）に位置し、酵素ＲＮＡポリメラーゼが転写プロセスのため結合している。「構成的プロモーター」は全組織において、周囲環境に関しない全期間中の遺伝子の発現ならびに生物の発育段階に関する。
【００６２】
用語「発現カセット」は、（ａ）構成的プロモーター；（ｂ）構成的プロモーターに３’位でクローニングした全３つの遺伝子、（ｃ）コード配列に３’位に位置するポリアデニル化シグナル、を含むベクターを意味する。
【００６３】
用語「選択可能なマーカー」は、それ以外は有毒な抗生物質の存在下で細胞の生存を可能とする遺伝子を意味する。
【００６４】
用語「遺伝子組み換え植物」は、ゲノムに導入された遺伝子の安定な融合をした遺伝子工学的に形質転換された植物を意味し、後代に遺伝情報を伝えることができる。
【００６５】
「野生型」植物は、非形質転換植物である。
【００６６】
用語「Ｔ０」は、同定され、対応する耐性遺伝子を含有する遺伝子組み換え植物のための選択試薬抗生物質の存在下での生長が選択される遺伝的な形質転換植物の第一セットを意味する。用語「Ｔ１」は、前もって遺伝子組み換えに選択された、Ｔ０世代植物の花の自己受精後に得られる世代の植物を意味する。「Ｔ２」植物は、Ｔ１植物から生産される、などである。
【００６７】
本発明は、以下の実施例により、より詳細に説明されるだろう。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例は、本発明の説明を目的として示され、それゆえ本発明の範囲を限定するために解釈されるべきではない。
【００６９】
本発明で用いられたプライマーの配列を以下に示す。
【表５】
0005856283.tif 000006
【表６】
0005856283.tif 000007
【表７】
0005856283.tif 000008
【表８】
0005856283.tif 000009
【表９】
0005856283.tif 000010
【表１０】
0005856283.tif 000011
【表１１】
0005856283.tif 000012
【表１２】
0005856283.tif 000013
【表１３】
0005856283.tif 000014
【表１４】
0005856283.tif 000015
【表１５】
0005856283.tif 000016
【表１６】
0005856283.tif 000017
【表１７】
0005856283.tif 000018
【表１８】
0005856283.tif 000019
【００７０】
（実施例１）
（ＡｓｐＡＴ遺伝子の増幅およびクローニング）
ヌクレオチド配列をコードしたダイズのサイトソルＡｓｐＡＴ遺伝子（配列番号１）を、ヌクレオチド配列のＮＣＢＩデーターベース（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０３４２１０．１；（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｐｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＡＦ０３４２１０．１）から得た。ダイズからのＲＮＡを、ｉＲＩＳ  Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡキットを用いて単離した（Ｇｈａｗａｎａら、米国特許第０３４４ＮＦ２００４／ＩＮ号明細書）。ｃＤＮＡを、製造業者の取扱い説明に従って、２  Ｕ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（増幅等級、米国インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製）で消化した後、１μｇのオリゴ（ｄＴ）１２−１８および逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（インビトロジェン）の４００Ｕの存在下で、全ＲＮＡ調剤（２μｇ）を用いて合成した。その後、ＡｓｐＡＴの全コード領域を、制限酵素部位ＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）のようなプライマーＡｓｐＡＴＢｇｌＩＩＦ（配列番号１０）およびＡｓｐＡＴＰｍｌＩＲ（配列番号１１）を用いてダイズｃＤＮＡから増幅し、ＰｍｌＩ（ＣＡＣＧＴＧ）をＡｓｐＡＴのコード配列に組み込んだ。Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑポリメラーゼ酵素を以下の条件を用いてＰＣＲのために用いた：３分間、９４℃での初期変性、３０秒間９４℃を３０回、３０秒間５９℃でアニーリング、１分２０秒間７２℃でエクステンション、７分間７２℃で最終エクステンション。増幅した生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（米国プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）にクローニングした。陽性クローン由来のプラスミドとｐＣＡＭＢＩＡ１３０２プラスミドを、ＢｇｌＩＩおよびＰｍｌＩで消化し、アガロースゲル電気泳動から単離した消化生成物をライゲーションし、タカラバイオ社（日本）から入手した大腸菌ＤＨ５α細胞（カタログ番号第９０５７）に形質転換した。当該陽性コロニー由来のプラスミドを配列し、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２のＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（配列番号４）およびＮｏｓターミネーター（配列番号５）の間に位置するＡｓｐＡＴコード配列のフレームクローニング中で確認し、得られたベクターをＡｓｐＡＴ：：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２として設計した。
【００７１】
（実施例２）
（ＧＳ遺伝子の増幅およびクローニング）
タバコのサイトソルＧＳ遺伝子（配列番号２）をヌクレオチド配列のＮＣＢＩデーターベース（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ９５９３２．１；（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／Ｘ９５９３２．１））から得た。タバコ由来のＲＮＡを、ｉＲＩＳ  Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡキットを用いて単離した（Ｇｈａｗａｎａら、米国特許第０３４４ＮＦ２００４／ＩＮ号明細書）。ｃＤＮＡを、製造業者の取扱い説明に従って、２  Ｕ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（米国インビトロジェン製、増幅等級）で消化した後、１μｇオリゴ（ｄＴ）１２−１８および逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（インビトロジェン）の４００Ｕの存在下で、全ＲＮＡ調剤（２μｇ）を用いて合成した。ＧＳの全コード領域を、制限酵素部位ＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）（配列番号８）を伴ったプライマーＧＳＮｃｏＩＦおよび制限酵素部位ＢｓｔＥＩＩ（ＧＧＴＧＡＣＣ）（配列番号９）を伴ったＧＳＢｓｔＥＩＩＲを用いてタバコのｃＤＮＡから増幅した。ＧＳＮｃｏＩＦプライマーを、ＢｇｌＩＩサイトを除去するために、位置１５の「Ａ」ヌクレオチドを「Ｇ」で置換して変性した。
【００７２】
Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑポリメラーゼ酵素を以下の条件を用いてＰＣＲのために用いた：３分間、９４℃での初期変性、３０秒間９４℃を３０回、３０秒間５９℃でアニーリング、１分１０秒間７２℃でエクステンション、７分間７２℃で最終エクステンション。増幅した生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（米国プロメガ社）にクローニングした。当該陽性コロニー由来のプラスミドとバイナリ―ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３０２をＮｃｏＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化し、アガロースゲル    電気泳動から単離した消化生成物を、ＧＳをｐＣＡＭＢＩＡベクターのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流に位置させるようにライゲーションした。ライゲーションした生成物を大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換し、形質転換体を配列して、ＧＳコード配列のフレームクローニング中で確認し、得られたベクターをＧＳ：：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２として設計した。
【００７３】
（実施例３）
（トウモロコシＰＥＰＣａｓｅ遺伝子の増幅およびクローニング）
ヌクレオチド配列をコードしたトウモロコシＰＥＰＣａｓｅ遺伝子（配列番号３）をＮＣＢＩデーターベース（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１１１９４８．１；（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ  ００１１１１９４８））から得た。トウモロコシからのＲＮＡを、ｉＲＩＳ  Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡキットを用いて単離した（Ｇｈａｗａｎａら、米国特許第０３４４ＮＦ２００４／ＩＮ号明細書）。ｃＤＮＡを、製造業者の取扱い説明に従って、２  Ｕ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（米国インビトロジェン製、増幅等級）で消化した後、１μｇオリゴ（ｄＴ）１２−１８および逆転写酵素  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（インビトロジェン）の４００Ｕの存在下で、全ＲＮＡ    調剤（２μｇ）を用いて合成した。
【００７４】
ＰＥＰＣａｓｅの全コード領域を、制限酵素部位ＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）（配列番号１２）を伴ったプライマーＰＥＰＣａｓｅ  ＢｇｌＩＩ  Ｆ（配列番号１２）および制限酵素部位ＳｐｅＩ（ＡＣＴＡＧＴ）（配列番号１３）を伴ったＰＥＰＣａｓｅＳｐｅＩＲ（配列番号１３）を用いてトウモロコシｃＤＮＡから増幅した。Ｑ溶液（ＧＣリッチテンプレートの増幅を促進する）を補なった、Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑポリメラーゼ酵素を以下の条件を用いてＰＣＲのために用いた：３分間、９４℃での初期変性、３０秒間９４℃を３２回、３０秒間５８℃でアニーリング、３分間７２℃でエクステンション、７分間７２℃で最終エクステンション。増幅した生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（米国プロメガ社）にクローニングした。陽性クローン由来のプラスミドとｐＣＡＭＢＩＡ１３０２プラスミドを、ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩで消化し、アガロースゲル電気泳動から単離した消化生成物をライゲーションし、次いで、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。形質転換体を配列して、ＰＥＰＣａｓｅコード配列のフレームクローニング中で確認し、得られたベクターをＰＥＰＣａｓｅ：：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２として設計した。
【００７５】
（実施例４）
（シングルｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ベクター中、ＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅのための発現カセットのアセンブリ）（オーストラリアの「Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＣＡＭＢＩＡ）」製）
単一の植物の形質転換ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３０２へのＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅのそれぞれの発現カセットの増幅および融合の段階的方法は以下に説明する通りである：ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、下流のクローンＧＳおよびノパリンシンターゼ（本願明細書において、「Ｎｏｓ」と称す。）、ターミネーターを含むＧＳ発現カセットを、プライマー３５ＳＳｐｅＩＦ（配列番号１４）およびＮｏｓＴＡｓｃＩ，ＢｂｖＣＩ，ＰｍｌＩＲ（配列番号１５）を用いて、ＧＳ：：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ベクターから増幅した（実施例２）。プライマーを順方向プライマー中のＳｐｅＩ（ＡＣＴＡＧＴ）、および逆方向プライマー中のＡｓｃＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）、ＢｂｖＣＩ（ＣＣＴＣＡＧＣ）およびＰｍｌＩ（ＣＡＣＧＴＧ）に組み込み、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ベクターのＳｐｅＩおよびＰｍｌＩ部位にＧＳ発現カセットのサブクローニングを促進し、同様にベクター骨格中の３’末端に追加の制限酵素部位（ＡｓｃＩ、ＢｂｖＣＩ）を作成するように設計した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑポリメラーゼ酵素を以下の条件を用いてＰＣＲのために用いた：３分間、９４℃での初期変性、３０秒間９４℃を３０回、３０秒間５９℃でアニーリング、２分間７２℃でエクステンション、７分間７２℃で最終エクステンション。増幅した生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（米国プロメガ社）にクローニングした。陽性クローン由来のプラスミドをＳｐｅＩおよびＰｍｌＩで消化し、消化した生成物を、アガロースゲル電気泳動から単離し、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ベクターのＳｐｅＩおよびＰｍｌＩ部位にライゲーションした。ライゲーションした生成物を大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換し、形質転換体をプラスミドの配列決定によって確認した。
【００７６】
３’Ｎｏｓターミネーター配列と共にＡｓｐＡＴコード配列を、ＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）およびＳｐｅＩ（ＡＣＴＡＧＴ）のそれぞれの制限酵素部位を有するプライマーＡｓｐＡＴＢｇｌＩＩＦ（配列番号１０）およびＮｏｓＴＳｐｅＩ（配列番号１６）を用いて、ＡｓｐＡＴ：：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ベクターから増幅した（実施例１）
【００７７】
Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑポリメラーゼ酵素を以下の条件を用いてＰＣＲのために用いた：３分間、９４℃での初期変性、３０秒間９４℃を３０回、３０秒間５９℃でアニーリング、２分間７２℃でエクステンション、７分間７２℃で最終エクステンション。増幅した生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（米国プロメガ社）にクローニングした。陽性クローン由来のプラスミドをＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩと共に消化において、消化ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２のＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（前もってＧＳ発現カセットでクローニングしている）の下流にクローニングした。ライゲーションした生成物をその後、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換し、形質転換体を配列して、ＡｓｐＡＴコード配列のフレームクローニング中で確認した。
【００７８】
ＰＥＰＣａｓｅ：：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ベクター（実施例３）由来の下流のクローニングしたＰＥＰＣａｓｅ遺伝子と共にＣａＭＶ３５ＳプロモーターをＡｓｃＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）のための制限部位を有するプライマー３５ＳＡｓｃＩＦ（配列番号１７）およびＢｂＶＣＩ（ＣＣＴＣＡＧＣ）のための制限部位を有するＰＥＰＣａｓｅＢｂＶＣＩＲ（配列番号１８）とを増幅した。
【００７９】
Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑポリメラーゼ酵素を以下の条件を用いてＰＣＲのために用いた：３分間、９４℃での初期変性、３０秒間９４℃を３０回、３０秒間６０℃でアニーリング、４分間７２℃でエクステンション、７分間７２℃で最終エクステンション。増幅した生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（米国プロメガ社）にクローニングし、陽性クローン由来のプラスミドをＡｓｃＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）およびＢｂＶＣＩ（ＣＣＴＣＡＧＣ）で消化し、アガロースゲル電気泳動から単離した消化生成物を前もってＧＳおよびＡｓｐＡＴ発現カセットでクローニングした消化ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２のＮｏｓターミネーター配列の上流にライゲーションした。当該ライゲーションした生成物を大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換し、そして形質転換体を配列して、ＰＥＰＣａｓｅコード配列のフレームクローニング中で確認した。得られた植物の発現ベクターをＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅの過剰共発現のＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅとして設計した。ハイグロマイシ耐性遺伝子（配列番号：．６）が遺伝子組み換え植物をスクリーニングするための選択可能なマーカーとして包含された。
【００８０】
発現構築物の概略図を図１に示され、遺伝子組み換え植物が、配列番号２９、３０、および３１によって表されるタンパク質をより多く製造するような植物の形質転換のために、配列番号７によって表される。
【００８１】
（実施例５）
（遺伝子ＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅを過剰共発現する遺伝子組み換えの    シロイヌナズナの生育）
（植物発現ベクター（ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ）の生産）
簡単に植物発現ベクターを以下の通り構築した：ｃＤＮＡ配列をコードしたダイズのＡｓｐＡＴ遺伝子（配列番号１）、タバコのサイトソルＧＳ遺伝子（配列番号２）およびトウモロコシのＰＥＰＣａｓｅ遺伝子（配列番号３）を、最初に独立にｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ベクターにクローニングした。ＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅのための発現カセット用元素を、その後増幅し、そして遺伝子ＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅがＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＮｏｓ転写ターミネーターのそれぞれに制御されるようにデスティネーションｐＣＡＭＢＩＡ１３０２に集めた。
【００８２】
（アグロバクテリウム媒介植物形質転換：）
ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅをＡＴＣＣ番号アグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０ＲＫ）（Ｃ５８誘導体）ＡＴＣＣ（登録商標番号：３３９７０  参照：Ｈａｙａｓｈｉ  Ｈ，Ｃｚａｊａ  Ｉ，Ｌｕｂｅｎｏｗ  Ｈ，Ｓｃｈｅｌｌ  Ｊ，Ｗａｌｄｅｎ  Ｒ，、１９９２年）と一緒にアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌種ＧＶ３１０１に、標準の三親性（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ）交配方法を用いて形質転換した。
【００８３】
手短に言うと、組み換え構築ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅを含む大腸菌ＤＨ５α細胞およびそれらの含むヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を一晩３７℃で培養した。アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を４８時間２８℃で生育した。全部で３つの培養物を、その後ペレット化し、洗浄し、混合し、続いて抗生物質カナマイシン（５０ｕｇ／ｍＬ）およびリファンピシン（５０ｕｇ／ｍＬ）を補充したＹＥＭ（酵母エキスマンニトール）プレートにプレートした。抗生物質耐性コロニーをコロニーＰＣＲで確認し、組み換え構築ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅでアグロバクテリウムの形質転換を確実に行った。
【００８４】
コロンビア生態型のシロイヌナズナの種は、英国ハーペンデン、ＩＡＣＲ−ＲｏｔｈａｍｓｔｅｄのＣｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｈ  Ｆｏｙｅｒ博士によって立派に得られた。
【００８５】
シロイヌナズナは、真空浸潤方法を用いてＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅを含むアグロバクテリアで形質転換された。手短に言うと、液体５ｍＬの培地を単一の形質転換されたアグロバクテリウムコロニーから作製し、繁殖期後期まで、２８℃でカナマイシン（５０ｕｇ／ｍＬ）およびリファンピシン（５０ｕｇ／ｍＬ）を補充したＹＥＭ中で生育した。次に、１ｍＬの菌液を、同じ構成物質で補充した１００ｍＬのＹＥＢ培地で希釈した。当該培養物を、６００ｎｍで高額密度が１．〜１．８に達するまで一晩生長した。当該細菌２０００ｇを室温で２０分間撹拌し、２％のショ糖、０．０５％のＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ）および０．０１％のＳｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７（米国、Ｌｅｈｌｅ  Ｓｅｅｄｓ）を有する半分の強度のＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ）培地を含有する、浸透用の溶液に懸濁させた。シロイヌナズナの花を菌液に浸し、１０分間真空下で浸透した。その後植物を生長チャンバーに移動し、長期間制御して種のセットを生育させた（１６時間、２２〜２３℃で光を当ておよび８時間２０℃で暗くした）。
【００８６】
（第１の形質転換体Ｔ０の遺伝子組み換えシロイヌナズナの選択性）
形質転換植物由来の種の表面を２分間７０％（ｖ／ｖ）のエタノール中に浸漬し、続いて１０％（ｖ／ｖ）の次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸漬して殺菌した。その後、種を殺菌した蒸留水で４回洗浄し、ハイグロマイシンＢを２０μｇｍｌ−１（Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．Ｈ３２７４）の濃度で補完されたＭＳ培地を含有する１％の寒天に植え付けた。その後、種を４℃の暗所で２時間層状にした。層状化の後、プレートを、発芽の間１６時間の光および８時間の暗闇のサイクルで栽培箱に移した。１４日後、ハイグロマイシン耐性苗を推定上の第１の形質転換体（Ｔ０）として選択して、バーミキュライト、パーライトおよびココピートの混合物（１：１：１）を含有する鞘に移植し、生長および結実のための光、温度および湿度の条件を制御して成熟まで育てた。
【００８７】
（ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子組み換え植物のＴ１およびＴ２の生産性の向上）
Ｔ０の遺伝子組み換え植物から得られた種はＭＳ＋ハイグロマイシンＢ（２０μｇｍＬ−１濃度）プレート上で発芽し、分離比３：１（ハイグロマイシンＢに対する感度をスコアして）を示す遺伝子組み換えラインは遺伝子組み換え植物のＴ１の生産性を上げるために選択された。ホモ接合の遺伝子組み換え植物はＴ２の生産で得られ、異なる生理学および生化学的パラメーターを野生の対照植物と比較して評価される。
【００８８】
（実施例６）
（ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅで形質転換されたアラビドプシス・タリアナのゲノムＤＮＡの分析）
ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅで形質転換された２つの独特の遺伝子組み換えライン由来のシロイヌナズナを植物ゲノムに導入遺伝子の挿入を検証するために選択した。ゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ植物のミニキット（キノゲン社（ＱＩＡＧＥＮ  Ｃｏ．））を用いて単離した。ＰＣＲをハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子（配列番号６）（ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ベクター由来の植物選択マーカー）にプライマーｈｐｔ  Ｆ（配列番号１９）およびｈｐｔ  Ｒ（配列番号２０）のアニーリングを鋳型として単離したＤＮＡを用いて実施し、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子（配列番号６）とした（ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ベクター由来の植物選択マーカー）。
【００８９】
ＰＣＲサイクリング条件を３分間９４℃で初期変性、３０秒間９４℃を２８回、３０秒間５８℃でアニーリング、１分間７２℃でエクステンション、７分間７２℃で最終エクステンションによって定義した。
【００９０】
図２Ａにおいて、ＷＴが野生を表し、Ｌ１およびＬ２が２つの異なる遺伝子組み換えラインを表すという結果が示されている。ｈｐｔ遺伝子の増幅はＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅのシロイヌナズナへの挿入を確かめる遺伝子組み換えと共にのみ見られた。
【００９１】
（実施例７）
（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応によるＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子組み換えの評価）
形質転換体のＲＮＡ分析を、ＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅの発現を確かめるために行った。全ＲＮＡをｉＲＩＳプラントＲＮＡキットを用いて、遺伝子組み換え植物の葉および根から単離した（Ｇｈａｗａｎａら、米国特許第０３４４ＮＦ２００４／ＩＮ号明細書）。ｃＤＮＡを製造業者の取扱い説明に従って、２  Ｕ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（米国インビトロジェン、増幅等級）で消化した後、１μｇのオリゴ（ｄＴ）１２−１８および逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（インビトロジェン）の４００Ｕの存在下で、全ＲＮＡ調剤（２μｇ）を用いて合成した。導入遺伝子の発現をＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅのための遺伝子の具体的なプライマーを用いて評価し、ＰＥＰＣａｓｅ  Ｅｘｐ  Ｆ（配列番号２１）、ＰＥＰＣａｓｅ  Ｅｘｐ  Ｒ（配列番号２２）、ＧＳ  Ｅｘｐ  Ｆ（配列番号２３）、ＧＳ  Ｅｘｐ  Ｒ（配列番号２４）、ＡｓｐＡＴ  Ｅｘｐ  Ｆ（配列番号２５）およびＡｓｐＡＴ  ＥｘｐＲ（配列番号２６）を設定した。ＲＴ−ＰＣＲ用の陽性対照として、２６Ｓ  ｒＲＮＡをプライマー  ２６Ｓ  Ｆ（配列番号２７）および２６Ｓ  Ｒ（配列番号２８）を用いて増幅した。その分析結果を図２Ｂに示し、ここで、ＷＴは野生を表し、Ｌ１およびＬ２は２つの遺伝子組み換えラインを表す。ＲＴ−ＰＣＲ生成物の増幅を導入された遺伝子の発現を確定する遺伝子組み換えにおいてのみ観察した。
【００９２】
（実施例８）
（野生型およびＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子組み換えシロイヌナズナからの酵素アッセイ）
ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子組み換え植物および野生植物の酵素アッセイを、以下の通り行った：
【００９３】
ＰＥＰＣａｓｅ活性測定：
氷結した葉の試料（２００ｍｇ）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、５．０ｍＭのＤＴＴ、１．０ｍＭのＰＭＳＦ、２％（ｗ／ｖ）のＰＶＰＰ、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールおよび０．１％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１０を含油する抽出緩衝液（１ｍＬ）中、乳鉢および乳棒ですりつぶした。抽出物を４℃で、１０分間、１２，０００ｇで遠心分離し、その上清を酵素の活性の決定に用いた。ＰＥＰＣａｓｅを、過剰のＭＤＨおよび乳酸脱水素酵素（Ａｓｈｔｏｎら、１９９０年）の存在下、３４０ｎｍでの分光光度法で分析した。当該反応混合物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＮａＨＣＯ３、５ｍＭのグルコース−６−リン酸塩、０．２ｍＭのＮＡＤＨ、２単位のＭＤＨ、０．１単位の乳酸脱水素酵素および粗製抽出物を含有していた。
【００９４】
ＡｓｐＡＴ活性測定：
２００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、２．０ｍＭのＥＤＴＡおよび２０％のグリセロールからなるＡｓｐＡＴ用抽出緩衝液
【００９５】
酵素を、ＩｒｅｌａｎｄおよびＪｏｙ（１９９０）によって開示されているように、実質的にＭＤＨ−カップル反応において分析した。簡単に言うと、当該反応混合物は、１０  ｍＭ２−オキソグルタル酸、２ｍＭのアスパラギン酸、０．２ｍＭのＮＡＤＨ、および５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を含有していた。当該反応は２−オキソグルタル酸の添加によって開始された。アッセイの制御を反応混合物から２−オキソグルタル酸を排除して行った。
【００９６】
ＧＳ活性測定：
ＧＳ（グルタミンシンテターゼ）を５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５ｍＭのグルタミン酸ナトリウム、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールおよび不溶性ＰＶＰＰ（２％ｗ／ｖ）を含有する粉砕媒体中で抽出した。酵素アッセイを以前Ｌｅａら（１９９０）により開示されているように行い、その活性を、α−グルタミルヒドロキサメートで調製した標準曲線から計算した。
【００９７】
分析結果を図５Ａ〜５Ｃに示す。ＰＥＰＣａｓｅ活性において約４５〜５０％、ＧＳ活性において５５％およびＡｓｐＡＴ活性において５５〜６０％の増加を、２つの独立したＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子組み換え植物を野生植物と比較して観察した。
【００９８】
（実施例９）
野生型およびＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子組み換えシロイヌナズナ
におけるＣおよびＮの分析
ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅを形質転換されたシロイヌナズナおよび野生型対照植物の種を２０ｇ／Ｌショ糖で補完された半分の濃度のＭＳ培地において生長させた。１４日たった種を、バーミキュライト、パーライトおよびココヤシの混合物（１：１：１）を含有する鞘に移植し、シロイヌナズナ生長チャンバー中、２２℃で１６時間光を当ておよび２０℃で８時間暗闇に維持して長日性の条件で生長させた。ロゼット葉、幹、茎生葉、緑鞘を包含している異なる植物の部分を、６５日経過した植物から採取し、８０℃で４８時間乾燥した。ＣおよびＮ元素の定量的な決定を標準物質としてスルファニルアミドを用いて、Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ  ＣＨＮＳ  ａｎａｌｙｚｅｒで行った。その結果を図６に示す。当該元素分析は、ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子組み換え植物の葉の全炭素含有量およびＮ含有量が、野生植物と比べてＡｓｐＡＴ、ＧＳおよびＰＥＰＣａｓｅの過剰共発現によりかなり増加していることを示した。
【００９９】
（実施例１０）
野生型およびＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子組み換え植物における生長および産出量の調査
野生型およびＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子組み換え植物を異なる生育特性に対して分析した。新芽の新鮮重量および乾燥重量、根の新鮮重量および乾燥重量を６０日たった植物のため記録した。評価した異なるパラメーターを通して、ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ植物は増強した生育特性を示した。特に、遺伝子組み換え植物は、より大きな面積を有するロゼットにつきより多くの葉を有する。遺伝子組み換え植物は、新芽の乾燥重量において６０％の増加し、新芽の新鮮重量において約７０％の増加を示し、根の新鮮重量および根の乾燥重量のそれぞれにおいて約４０％および３０％の増加が見られた（図３参照）。
【０１００】
７２日経過したＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子組み換え植物の鞘の総数を計算し、非形質転換野生植物と比較した（図７ａ参照）。さらに全種の産出量（全種の重量／植物）も、遺伝子組み換え植物および対照植物について測定した。両方のパラメータを通して、ＡｓｐＡＴ＋ＧＳ＋ＰＥＰＣａｓｅ遺伝子組み換えシロイヌナズナは、図７ｂに示すように野生植物と比較して増加した産出量を示した。
【０１０１】
本発明の利点
１．植物の炭素および窒素の状態を増強する努力がなされ、食事の安全への一歩である。
２．本発明は、ＰＥＰＣａｓｅの過剰発現が炭素骨格にＡｓｐＡＴおよびＧＳの過剰発現を通して吸収された窒素を捕捉させる革新的なアプローチを提供する。
３．改善された炭素および窒素の捕獲に関する植物の能力は、植物の種および植物のバイオマス生産の両方の点で改善された植物の生産性にも反映された。
【図１】
0005856283.tif 000020
【図２】
0005856283.tif 000021
【図３】
0005856283.tif 000022
【図４】
0005856283.tif 000023
【図５】
0005856283.tif 000024
【図７】
0005856283.tif 000025
【図６】
0005856283.tif 000026
【配列表】
0005856283000001.app