(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ型インフルエンザウイルス感染の処置のために、その処置を必要とする対象者へ使用するための、オバトクラックスメシレートを含む医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物であって、
前記Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２及びＨ５Ｎ１からなる群より選択される医薬組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の医薬組成物であって、
前記対象者は、ヒトである医薬組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の医薬組成物であって、
前記対象者は、ヒトの乳幼児、ヒトの子供又はヒトの高齢者である医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記オバトクラックスメシレートは、ノイラミニダーゼ阻害剤、Ｍ２阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、インターフェロン、インフルエンザワクチン、インフルエンザ抗原ポリペプチド、及びインフルエンザ抗原ポリペプチドに対する中和抗体からなる群より選択される追加の治療薬と組み合わせられる医薬組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記オバトクラックスメシレートは、ゲムシタビン、ドセタキセル、ＨＡ−１４、アルステルパウロン、ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩＩＩ、ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＶ、インジルビン−３’−モノオキシム、還元型Ｌ−グルタチオン、フルオシノロンアセトニド、チロフィバン、塩酸トポテカン、クロファラビン、ビンブラスチン、及びメナジオン結晶からなる群より選択される化合物の有効量と組み合わせられる医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
気道に投与するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルス複製を阻害するための方法および医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、世界中に最も広く存在するウイルスのうちの1つであり、人間および家畜の両方に影響する。結果的に、インフルエンザは、経済的負担、病態、ひいては死亡率に影響を与える。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、直径約１２５ｎｍの粒径の、ＲＮＡエンベロープウイルスである。これは基本的に、脂質二重層構造および外部糖タンパク質を持つウイルスエンベロープに覆われた、内部ヌクレオカプシドまたは核タンパク質と結びついたリボ核酸（ＲＮＡ）のコアからなる。ウイルスのエンベロープの内層は、主に、マトリックスタンパク質からなり、外層は大部分が宿主由来の脂質性物質からなる。インフルエンザウイルスは、その粒子の表面に、長さ１０ｎｍ〜１２ｎｍの先の尖ったスパイクのような糖タンパク質のノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）の２つの表面抗原を含む。これらの表面タンパク質、特にヘマグルチニンは、インフルエンザサブタイプの抗原特異性を決定する。ウイルス型は、宿主種の由来、地理的位置、および分離の年度、通し番号より分類され、Ａ型では、ＨＡおよびＮＡのサブタイプの血清学的特性によって分類される。Ａ型インフルエンザウイルスとして、１６種のＨＡサブタイプ（Ｈ１−Ｈ１６）および、９種のＮＡサブタイプ（Ｎ１−Ｎ９）が見つかっている。すべてのＨＡおよびＮＡサブタイプのウイルスは、水鳥から回収されているが、３種のＨＡサブタイプ（ＨＩ、Ｈ２、およびＨ３）並びに２種のＮＡサブタイプ（ＮｌおよびＮ２）のみが、１９１８年以来、ヒト集団において、定常的な系統になっている。ＨＡサブタイプのうち１種およびＮＡのうち１種のみが、Ｂ型インフルエンザウイルスとして認識されている。
【０００４】
Ａ型インフルエンザウイルスは、継続的に、進化および抗原変異を行っている。ウイルスＲＮＡポリメラーゼによる有効な校正機構の欠如は、糖タンパク質の表面で、アミノ酸置換を生じ得る高率の転写エラーを引き起こす。これは「抗原ドリフト」と呼ばれる。断片化したウイルスゲノムは、第２の抗原変異型の出現を可能にさせる。また、２つのインフルエンザウイルスが、同時に宿主細胞に感染する場合、「抗原シフト」と呼ばれる遺伝子再配分で、新しい表面または内部タンパク質を持つ新規ウイルスを生じ得る。これらの抗原変化である、「ドリフト」および「シフト」は予測不可能であり、免疫学的観点から強い衝撃を与え得る。なぜなら、これらの「ドリフト」および「シフト」が、新しいインフルエンザ型の出現を最終的に引き起こし、ウイルスが免疫系を避けることを可能にすることにより、ほぼ毎年恒例の既知の流行になるからである。これらの両遺伝子修飾は、人間における世界的大流行を招く新しいウイルス変種の原因になっている。
【０００５】
インフルエンザウイルスは、Ａ型またはＢ型ウイルスで、ほぼ毎年冬に、４０％の高い感染率で６週間以上の流行の原因になる。インフルエンザ感染は、無症状感染から、軽度の上気道感染、重度のウイルス性肺炎まで、様々な病態を生じる。典型的なインフルエンザ流行は、入院率または死亡率の増加が証明するように、肺炎および下気道疾患の発症増加を引き起こす。疾患の重症度は、主として、宿主の年齢、その免疫状態、および感染場所により決定される。
【０００６】
６５歳以上の高齢者は特に影響を受けやすく、先進国における、あらゆるインフルエンザ関連の死亡の８０％〜９０％を占める。また、慢性疾患をもつ人々も、合併症などに最も罹りやすい。乳幼児も重度の疾患に罹る可能性がある。したがって、特にこれらのグループは保護を必要とする。保健機関は、これらの「リスクのある」グループを除き、高齢者と接触する健康な成人には、ワクチンの接種を薦めている。
【０００７】
現在、インフルエンザの処置の選択肢は、ワクチンの接種および抗ウイルス薬を用いた化学療法または化学的予防を含む。インフルエンザワクチンを用いたインフルエンザに対するワクチンの接種は、子供および高齢者、または喘息、糖尿病もしくは心臓疾患を持つ人々などの危険性の高いグループに度々勧められる。しかしながら、ワクチンの接種をしても、なおインフルエンザにかかる可能性はある。ワクチンは、各時期に、数種の特定のインフルエンザ型のために再製剤化されるが、その時期に世界で人々に対し活発に感染するすべての型を含むことはできない。季節的流行に対処するために必要な数百万の用量の調製および製造には、製造業者にとっては約６ヵ月間を要する。時折、新しい、または、見落とされた型が、ある時期に顕著に現れ、ワクチンの接種をした人々にも感染する（例えば、２００３〜２００４年のインフルエンザ流行期のＨ３Ｎ２  福建インフルエンザ（Ｆｕｊｉａｎ  ｆｌｕ））。また、ワクチン接種の直前に感染し、病気を防ぐはずのワクチンとそのまったく同じ型で発病する可能性もある。なぜなら、ワクチンが有効になるのに約２週間かかるからである。さらに、これらのインフルエンザワクチンの有効性は変化する。ウイルスの高変異率のため、特定のインフルエンザワクチンは、通常、数年を超えての防護効果を持たない。インフルエンザウイルスは時間とともに急速に変化し、異なる型が優勢になるので、１年間で製剤にしたワクチンは、次の年には効果がなくなる可能性がある。
【０００８】
また、抗ウイルス剤（例えば、ノイラミニダーゼ阻害剤、またはＭ２阻害剤）は、インフルエンザ処置に用いられうる。しかしながら、ウイルスは、標準的な抗ウイルス剤に抵抗性を持つことが可能である。したがって、ウイルス力価への感度を低減した薬剤などの、インフルエンザ感染処置のための薬剤が、いまも必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、インフルエンザウイルス複製を阻害するための方法および医薬組成物に関する。
【００１０】
より具体的には、本発明は、感染細胞においてインフルエンザウイルスの複製能を阻害するための方法に関し、ゲムシタビン、オバトクラックスメシレート（Ｏｂａｔｏｃｌａｘ  Ｍｅｓｙｌａｔｅ）、ドセタキセル、ＨＡ−１４、アルステルパウロン（Ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩＩＩ、ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＶ、インジルビン−３’−モノオキシム（Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｍｏｎｏｘｉｍｅ）、還元型Ｌ−グルタチオン、フルオシノロンアセトニド、チロフィバン、塩酸トポテカン（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、クロファラビン、ビンブラスチン、メナジオン結晶（Ｍｅｎａｄｉｏｎｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）、およびそれらの誘導体、または類似体からなる群より選択した少なくともひとつの化合物と該感染細胞とを接触させることからなるステップを含む。
【００１１】
また、本発明は、インフルエンザ感染の処置において、その処置を必要とする対象者に使用するための、ゲムシタビン、オバトクラックスメシレート、ドセタキセル、ＨＡ−１４、アルステルパウロン、ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩＩＩ、ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＶ、インジルビン−３’−モノオキシム、還元型Ｌ−グルタチオン、フルオシノロンアセトニド、チロフィバン、塩酸トポテカン、クロファラビン、ビンブラスチン、メナジオン結晶、およびそれらの誘導体、または類似体からなる群より選択した化合物に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者は、これまでに、インフルエンザウイルス複製を阻害し、インフルエンザ感染の処置のための薬剤として用いることのできる様々な化合物を発見した。前記化合物は表１に示されており、また当業者とってこの化合物自体は周知である。
【００１３】
【表１】
0006006292.tif 000002
0006006292.tif 000003
【００１４】
従って、本発明は、感染細胞におけるインフルエンザウイルス複製能の阻害方法に関し、ゲムシタビン、オバトクラックスメシレート、ドセタキセル、ＨＡ−１４、アルステルパウロン、ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩＩＩ、ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＶ、インジルビン−３’−モノオキシム、還元型Ｌ−グルタチオン、フルオシノロンアセトニド、チロフィバン、塩酸トポテカン、クロファラビン、ビンブラスチン、メナジオン結晶、およびそれらの誘導体、または類似体からなる群より選択した少なくともひとつの化合物と前記感染細胞とを接触させることからなるステップを含む。
【００１５】
ウイルス表現型に関連して、ここで用いられる「複製能の阻害」という用語は、前記化合物のない場合のウイルスの成長と比較して、ウイルスが、前記化合物によって、より低い力価になることを意味する。ある実施形態では、前記化合物なしで成長したインフルエンザウイルスと比較した場合、前記化合物は、ヒト細胞において、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％、または少なくとも約２００％、または少なくとも約３００％、または少なくとも約４００％、または少なくとも約５００％、複製に対するインフルエンザウイルスの能力を阻害する。
【００１６】
本発明によると、前記の感染細胞は、鳥類および哺乳類細胞を含む真核性感染細胞である。好ましくは、前記感染細胞は哺乳類細胞である。典型的に、前記哺乳類細胞は、ヒト、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウサギの細胞を含むが、これに限定されない。
【００１７】
また、本発明は、インフルエンザ感染の処置において、その処置を必要とする対象者に使用するための、ゲムシタビン、オバトクラックスメシレート、ドセタキセル、ＨＡ−１４、アルステルパウロン、ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩＩＩ、ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＶ、インジルビン−３’−モノオキシム、還元型Ｌ−グルタチオン、フルオシノロンアセトニド、チロフィバン、塩酸トポテカン、クロファラビン、ビンブラスチン、メナジオン結晶、およびそれらの誘導体、または類似体からなる群より選択した化合物に関する。
【００１８】
ここで用いられる「インフルエンザ感染」という用語は、該技術において一般的な意味を持ち、インフルエンザウイルスの感染によって引き起こされる疾患を指す。本発明のいくつかの実施形態においてインフルエンザ感染は、Ａ型またはＢ型インフルエンザウイルスに関連する。本発明のいくつかの実施形態においてインフルエンザ感染は、Ａ型インフルエンザウイルスに関連する。本発明のいくつかの特定の実施形態では、インフルエンザ感染は、ＨｌＮｌ、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１であるＡ型インフルエンザウイルスにより引き起こされる。
【００１９】
対象者は、インフルエンザに感染しやすいヒトまたは他の任意の動物（例えば、鳥類および哺乳類）であり得る（例えば、ネコおよびイヌなどの飼育動物、ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなどの家畜及び畜産用動物など）。主として、前記対象者は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット及びマウス）および霊長類（例えば、サル、チンパンジー、およびヒト）を含む哺乳類である。特定の実施形態において対象者はヒト以外の動物である。いくつかの実施形態において対象者は家畜またはペットである。別の実施形態において対象者はヒトである。また別の実施形態において対象者はヒトの乳幼児である。別の実施形態において対象者はヒトの子供である。別の実施形態において対象者はヒトの成人である。別の実施形態において対象者はヒトの高齢者である。別の実施形態において対象者はヒトの未熟児である。
【００２０】
例として、治療処置は、本発明の少なくとも１つの化合物の投与により生じる、インフルエンザ感染の進行、重症度および／または継続の抑制または改善、またはインフルエンザ感染の１つ以上の症状の改善（特に、１つ以上の識別可能な症状）を含む。特定の実施形態では、治療処置は、インフルエンザ感染の少なくとも１つの測定可能な身体的パラメータの改善を含む。他の実施形態では、治療処置は、身体的な例えば識別可能な症状の安定化などよって、もしくは生理的な例えば身体的パラメータの安定化などによって、またはその両方によって、インフルエンザ感染の進行を阻害することを含む。他の実施形態において治療処置は、インフルエンザ感染の減少または安定化を含む。地域社会において抗ウイルス剤は、症状の重さの軽減および病気である日数の減少のために、すでにインフルエンザに感染している人々の処置に用いられうる。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明の化合物は予防処置に用いてもよい。本明細書において、用語「予防」または「予防的使用」および「予防処置」とは、任意の医療的または公衆衛生上の行為を指し、その目的は、病気への処置または処置というよりも、阻止にある。本明細書において、用語「阻止する」、「阻止」および「阻止すること」は、病気ではないが、疾患を持つ患者と接近した、もしくは接近した可能性のある対象者において、特定の状態を得るもしくは発展させるリスクの低減、または、再発もしくは前記状態の低減もしくは抑制を指す。
【００２２】
本明細書において、予防的使用は、深刻なインフルエンザ合併症の高いリスクを持つ多くの人々が、互いに密に接しながら暮らす場所において伝染または蔓延を阻止するため、発生が感知される状況における使用を含む（例えば、病院棟、デイケアセンター、刑務所、介護施設など）。また、予防的使用では、インフルエンザからの防護が必要だがワクチン接種後の防護効果がない（例えば、免疫系の脆弱性のため）人々における、またはワクチンを利用できない場合における、または副作用のためワクチンの接種ができない場合における使用を含む。予防的使用では、また、ワクチン接種に続く２週間でワクチンがまだ無効である時期の使用を含む。予防的使用はまた、インフルエンザに感染して、密な接触によって合併症の高いリスクを持つ人へ感染させる機会を減少させるため、インフルエンザの病気ではない、または合併症の高いリスクがあるとは考えられない人への処置を含む（例えば、医療従事者、介護施設職員など）。
【００２３】
本発明の化合物は、典型として、有効量で対象者に投与する。本明細書では、「有効量」は望ましい生物学的反応を引き出すのに十分な量を指す。本発明において、望ましい生物学的反応とは、インフルエンザウイルスの複製の阻害であり、インフルエンザウイルス量の低減であり、またはインフルエンザウイルス感染の重症度、期間、進行、もしくは発病の低減もしくは改善であり、インフルエンザウイルス感染進行の阻止であり、インフルエンザウイルス感染関連症状の再発、発生、発病もしくは進行の阻止であり、またはインフルエンザ感染に対して用いられる別の治療の予防的もしくは処置効果の促進もしくは改善である。対象者に投与する化合物の的確な量は、投与形態、感染型および重症度、並びに一般的健康状態、年齢、性別、体重、および薬剤に対する耐性などの対象者の特徴に依存するであろう。当業者は、これらおよび他の要因により、適切な用量を決定することができる。他の抗ウイルス剤と併用投与する場合、例えば、抗インフルエンザ薬剤と併用投与する場合、２番目の薬剤の「有効量」は使用する薬剤の種類によって決まってもよい。適切な用量は、承認された薬剤では周知であり、対象者の状態、処置する状態の種類、および使用される本明細書の化合物量により、当業者によって調節されうる。分量が明確に示されない場合は、有効量は推測されるべきである。例えば、本明細書の化合物は、処置または予防処置のために、１日に、体重に対して、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、対象者に対して投与可能である。
【００２４】
一般に、投薬計画は様々な要因によって選択されうる。その要因は、処置する疾患、および疾患の重症度、使用する特定の化合物の活性度、使用する特定の組成物、対象者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食習慣、投与時間、投与経路、並びに使用する特定の化合物の排出率、対象者の腎機能および肝機能、並びに使用する特定の化合物またはその塩、治療期間、使用する特定の化合物とともに組合せでもしくは偶発的に用いられる薬剤、並びに、医療技術において周知の要因などを含む。当業者は、疾患の進行の処置、阻止、阻害（全体的にもしくは部分的に）または防止に必要である本明細書の化合物の有効量を容易に決定し、処方することができる。
【００２５】
本明細書の化合物の用量は、１日に体重に対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、１日に体重に対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、１日に体重に対して約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または１日に体重に対して約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、の範囲でありうる。１日の薬用量は、１回の投与になりうり、または、１日２回（例えば、１２時間毎）、１日３回（例えば、8時間毎）、もしくは１日４回（例えば、６時間毎）などの複数回の投与になりうることが理解される。
【００２６】
治療処置にあたり、本明細書の化合物は症状（例として、鼻詰まり、咽頭痛、咳、痛み、倦怠感、頭痛、および悪寒、発汗）の発生から、例えば、４８時間以内（または４０時間以内、または２日未満、または１．５日未満、または２４時間以内）に、対象に投与することができる。治療処置は任意の適切な期間、例えば、５日間、７日間、１０日間、１４日間など、続けることができる。
【００２７】
地域発生での予防処置において、本明細書の化合物は、指針症例により、症状の発生から、例えば、２日以内に対象に投与することができ、そして、任意の適切な期間、例えば、７日間、１０日間、１４日間、２０日間、２８日間、３５日間、４２日間など、続けることができる。
【００２８】
本発明では、投与方法の様々な種類を用いることができ、以下に詳細を記述する。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、添加の適切な治療剤、例えば、抗ウイルス剤またはワクチンとの組合せで用いられる。「組合せ治療」が用いられるとき、有効量は、本発明の化合物の第１分量および添加の適切な治療剤の第２分量（例えば、抗ウイルス剤またはワクチン）を用いて得られる。
【００３０】
本明細書で用いられる用語「組合せで」または「併用投与」は、2つ以上の治療（例えば、１つまたは複数の予防剤、および／または治療剤）を用いることを指し、置き換えて用いることができる。これらの用語の使用は、処置（例えば、予防剤、および／または治療剤）が対象者に行われる順序を制限しない。
【００３１】
併用投与は、原則的に同時に、併用投与化合物の第１および第２分量を投与することを含み、それは、例えば、第１および第２分量を一定の比率で有する単一の医薬組成物か、または各々が個別である複数のカプセル剤もしくは錠剤などである。加えてまた、このような併用投与は、順序に関わらず連続での各化合物の使用を含む。
【００３２】
本発明の化合物と併用投与が可能である具体的な例として、ノイラミニダーゼ阻害剤を含む。ノイラミニダーゼ阻害剤の例として、オセルタミビル、オセルタミビルカルボン酸（ＧＳ４０７１、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９９７）４１：１９４９−５２など参照）、ザナミビル、ペラミビル（ＲＷＪ−２７０２１、ＢＸＣ−１８１２、ＢｉｏＣｒｙｓｔ社）、２，３−ジデヒドロ−２−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＤＡＮＡ）、２−デオキシ−２，３−デヒドロ−Ｎ−トリフルオロアセチルノイラミン酸（ＦＡＮＡ）、Ａ−３２２２７８、およびＡ−３１５６７５（（Ｍａｒｉｎｇ他、米国特許第６４５５５７１号、およびＫａｔｉ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（２００２）４６：１０１４−２１参照）を含む。
【００３３】
本発明の化合物と併用投与が可能である具体的な例として、Ｍ２阻害剤を含む。Ｍ２阻害剤の例として、アマンタジン（１−アミノ−アダマンタン）、リマンタジン［１−（１−アミノエチル）アダマンタン］、スピロ［シクロプロパン−１，２’−アダマンタン］−２−アミン、スピロ［ピロリジン−２，２’−アダマンタン］、スピロ［ピペリジン−２，２’−アダマンタン］、２−（２−アダマンチル）ピペリジン、３−（２−アダマンチル）ピロリジン、２−（１−アダマンチル）ピペリジン、２−（１−アダマンチル）ピロリジン、および２−（１−アダマンチル）−２−メチル−ピロリジンなどのアミノアダマンタン化合物、並びに、Ｍ２特異的モノクローナル抗体（米国特許出願公開第２００５０１７０３３４号、およびＺｅｂｅｄｅｅ  ａｎｄ  Ｌａｍｂ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６２：２７６２−７２など参照）を含む。
【００３４】
本発明の化合物と併用投与が可能である具体的な例として、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤を含む。本明細書では、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤という用語は、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体またはそのサブユニットのうちの１つ（すなわち、ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡ）のポリメラーゼ、プロテアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ活性を阻害する抗ウイルス剤を指す。例示的なＲＮＡポリメラーゼ阻害剤としては、リバビリン、ビラミジン、６−フルオロ−３−ヒドロキシ−２−ピラジンカルボキサミド（Ｔ−７０５）、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシン、ピラゾフリン、３−デアザグアニン、カルボジン（例えば、Ｓｈａｎｎｏｎ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９８１）２０：７６９−７６参照）、およびシクロペンテニルシトシン（ｃｙｃｌｏｐｅｎｅｎｙｌ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）（例えば、Ｓｈｉｇｅｔａ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９８８）３２：９０６−１１参照）などの抗ウイルスヌクレオシド類似体、並びにエンドヌクレアーゼ阻害フルチミド（例えば、Ｔｏｍａｓｓｉｎｉ他、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９９６）４０：１１８９−９３参照）が挙げられる。
【００３５】
本発明の化合物と併用投与が可能である具体的な例えとして、インフルエンザ特異的妨害オリゴヌクレオチドを含む。インフルエンザ特異的妨害オリゴヌクレオチドの例えば、ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｚｈｏｕ他、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．（２００７）７６：１８６−９３参照）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチド、リボザイム（例えば、Ｄｒａｐｅｒ、米国特許第６２５８５８５号参照）、モルホリノオリゴマー及びペプチド核酸（例えば、Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｋｕｒｒｅｃｋ、Ｈａｎｄｂ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００６）１７３：２６１−８７参照）を含む。
【００３６】
本発明の化合物と併用投与が可能である具体的な例として、インターフェロンを含む。本明細書の「インターフェロン」または「ＩＦＮ」は、文字通りに定義される任意の分子を含むことを意図し、それは、例えば、あらゆる種類のＩＦＮ（Ｉ型およびＩＩ型）、特にＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＮＦ−オメガおよびＩＦＮ−ガンマを含む。また、本明細書で用いられるインターフェロンという用語は、それらの、塩、官能性誘導体、変異体、突然変異タンパク質、融合タンパク質、類似体、および活性断片を含むことをも意図する。好ましい実施形態においては、インターフェロンはインターフェロン−アルファであるとよい。インターフェロン−アルファは、組み換えインターフェロン−α２ａ（例えば、ＲＯＦＥＲＯＮ  登録商標（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ社、米国））、インターフェロン−α２ｂ（例えば、Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ  登録商標（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．社、米国））、コンセンサスインターフェロン、および精製インターフェロン−α生成物を含むが、これに限定されない。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本明細書の化合物は、インフルエンザワクチンと併用投与が可能である。あらゆる種類のインフルエンザワクチンは、通常、三価ワクチンである。これらは、一般的に、２つのインフルエンザウイルスＡ型および１つのインフルエンザウイルスＢ型由来の抗原を含む。多くの場合、標準的な０．５ｍｌの注射用量は、各型からの１５ｕｇのヘマグルチニン抗原成分を含み、一元放射免疫拡散法（ＳＲＤ）により評価される。各時期に、インフルエンザワクチンに組み込まれるインフルエンザウイルス型は、各国の保健機関およびワクチン製造業者と共同で世界保健機関により取り決められる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、併用療法は、インフルエンザ抗原ポリペプチド（例えば、インフルエンザヘマグルチニンおよびマトリックス２細胞外ドメインポリペプチド）による能動免疫化、またはインフルエンザ抗原ポリペプチドを指向する１つ以上の中和抗体（例えば、インフルエンザヘマグルチニンおよびマトリックス２細胞外ドメインポリペプチドに対する抗体）での受動免疫化を含む。
【００３９】
本発明の化合物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルをさらに含む医薬組成物に製剤化してもよい。ある実施形態では、本発明は、上記の本発明の化合物を含む医薬組成物、および薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントまたはビヒクルに関する。ある実施形態では、本発明は、有効量の本発明の化合物または薬学的に許容されるそれらの塩、および薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントもしくはビヒクルを含む医薬組成物である。薬学的に許容される担体は、例えば、目的の投与形態に関して適切に選択され、そして従来の薬務に合う、医薬的希釈剤、賦形剤または担体を含む。
【００４０】
薬学的に許容される担体は、本化合物の生物活性を過度に抑止しない不活性成分を含んでもよい。薬学的に許容される担体は、対象者への投与において、例えば、非毒性、非炎症性、非免疫原性、または、他の望ましくない反応もしくは副作用を持たない、などの生体適合性を持つべきである。また、標準的な医薬製剤方法を用いることができる。
【００４１】
本明細書の、薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルは、望ましい特定の投与剤形に適するように、任意のおよびあらゆる溶剤、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存料、固形バインダー、潤滑剤などを含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ編（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．社、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ州、１９８０年）は、薬学的に許容される組成物の製剤に用いられる様々な担体、およびそれらを調製するための既知の方法を開示している。任意の従来の担送媒介物の、望ましくない生物学的作用を引き起こすこと、または、薬学的に許容される組成物の他の任意の成分での有害作用などにより、本明細書の化合物と不適合である場合を除き、その使用は本発明の範囲内にあると考えられる。
【００４２】
薬学的に許容される担体になりうる物質のいくつかの例として、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（ツイン８０、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、もしくはソルビン酸カリウムなど）、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または電解質（硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウムもしくは亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、羊毛脂、ラクトースおよびグルコースおよびスクロースなどの糖、コーンスターチおよびポテトスターチなどのデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウムや、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロース並びにその誘導体、粉末トラガカント、モルト、ゼラチン、タルク、ココアバターおよび座薬ワックスなどの賦形剤、ラッカセイ油や、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、寒天、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、アルギン酸、発熱物質非含有水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、並びにリン酸緩衝液、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性の混合可能な潤滑剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、調味料および香料、保存料、酸化防止剤を含むが、これに限定されない。また、これらは、調製者の判断により、組成物に含まれる。
【００４３】
本明細書の組成物は、処置をする感染の重症度により、経口、非経口、吸入スプレー、経局所、経直腸、経鼻、経口腔、経膣、または埋め込み型リザーバー経由により投与することができる。本明細書の「非経口」という用語は、皮下、静脈、筋肉、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内への注射または注入法を含むが、これに限定されない。具体的には、本組成物は、経口、腹腔内または静脈内に投与する。
【００４４】
本明細書の組成物の無菌注射剤形は、水性または油性懸濁剤でありうる。これらの懸濁剤は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用い、公知の技術により製剤化される。また、無菌注射調整剤は、非毒性の局所に使用可能な希釈剤または溶媒、例えば１，３−ブタンジオール内の溶剤などの、無菌注射液剤または懸濁剤でありうる。用いられうる許容されるビヒクルおよび溶媒は共通して水、リンゲル液、および生理食塩水である。さらに、無菌、不揮発性の油は、溶媒または懸濁化剤として慣例的に用いられる。この目的のため、合成モノグリセリド、または合成ジグリセリドを含む、任意の無刺激性不揮発性油が用いられうる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、オリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化形などの天然の薬学的に許容される油と同様に、注射剤の調製に有用である。また、これらの油剤または油懸濁剤は、乳剤および懸濁剤を含む薬学的に許容される投与剤形の製剤に一般的に使用されるカルボキシメチルセルロースまたは同様の分散化剤などの、長鎖アルコール希釈剤または分散化剤を含むとよい。薬学的に許容される固体、液体、または他の投与剤形の製造で一般的に使用されるトウィーン、スパン、および他の乳化剤、または生物学的利用能増強剤などの、一般的に使用される界面活性剤は、製剤の目的に使用してもよい。
【００４５】
本明細書の医薬組成物は、これに限定されないが、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または液剤を含む任意の経口的に許容される剤形で経口投与してもよい。経口使用のための錠剤の場合には、一般的に使用される担体としてラクトースおよびコーンスターチが挙げられるが、これに限定されない。また、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も通例添加される。カプセル形の経口投与では、有用な希釈剤として、ラクトースおよび無水コーンスターチを含む。経口使用のために水性懸濁剤が必要なときは、活性成分を乳化剤および懸濁剤と組合せる。所望ならば、特定の甘味料、調味料または着色剤を添加してもよい。
【００４６】
あるいは、本明細書の医薬組成物は、直腸投与のために座薬の剤形で投与してもよい。これらは、薬剤と、室温では固体であるが、直腸温度では液体であり、それゆえ直腸内で溶融して薬剤を放出する適切な非刺激性賦形剤とを混合することによって調製可能である。このような物質として、ココアバター、ミツロウおよびポリエチレングリコールを含むが、これに限定されない。
【００４７】
また、本明細書の医薬組成物は、特に、処置ターゲットが、眼、皮膚、または下部消化管の疾患を含む、容易に局所適用が可能である範囲または臓器を含むときに、局所的に投与してもよい。適切な局所製剤は、これらの各範囲または各臓器に対して容易に調製される。
【００４８】
下部消化管のための局所的適用は、直腸座薬剤（上記参照）または適切な浣腸剤により有効に使用できる。また、局所経皮パッチを使用してもよい。
【００４９】
局所適用では、本医薬組成物は、１種以上の担体に懸濁または溶解した活性成分を含有する適切な軟膏剤に剤形化してもよい。本発明の化合物の局所投与のための担体は、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水を含むが、これに限定されない。あるいは、本医薬組成物は、１種以上の薬学的に許容される担体に懸濁もしくは溶解した活性成分を含有する適切なローション剤またはクリーム剤に剤形化することが可能である。適切な担体は、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水を含むが、これに限定されない。
【００５０】
眼科用途では、本医薬組成物は、塩化ベンジルアルコニウムなどの保存料を含むかまたは含まないかのどちらかで、等張性、ｐＨ調整滅菌食塩水による微粉化懸濁剤として、または特に、等張性、ｐＨ調整滅菌食塩水による液剤として剤形化してもよい。あるいは、眼科用途では、本医薬組成物はワセリンなどの軟膏剤に剤形化してもよい。
【００５１】
また、本医薬組成物は、気道に投与することも可能である。気道とは、中咽頭および喉頭を含む上気道、それに続き、気管のあとの気管支および細気管支への分岐を含む下気道を内包する。肺送達用組成物は、患者の分散剤吸入により送達することができ、そうすることで、分散剤内の活性成分は、例えば、肺胞領域を通って、直接かつ迅速に血液循環内へ吸収することができる肺に送り届けられる。肺送達は、ネブライザ、エアロゾル、ミセル、および乾燥粉末から作られる製剤の使用を含む様々な方法で行うことが可能である。吸入による投与は経口および／または経鼻で可能である。送達は、液体ネブライザ、エアロゾルによる吸入、および乾燥粉末分散装置で行うことが可能である。好ましくは、定量投与装置がよい。噴霧器または吸入器使用の有用性のうちの１つは、装置が自給式であるので、汚染の可能性を最小限にすることである。乾燥粉末分散装置は、例えば、容易に乾燥粉末に製剤化できる薬剤を送達する。本発明の医薬組成物は、凍結乾燥もしくは噴霧用乾燥粉末として、単独または適切な粉末担体との組合せにより、安定的に保存されうる。吸入のための、本発明の医薬組成物の送達は、タイマー、ドーズカウンター、時間計測装置を含みうる投薬タイミング用の機器、または、エアロゾル剤の投薬時に、患者に対する投薬の追跡、服用順守の監視、および／または投薬へのきっかけを可能にする装置を包含する時間表示器で仲介されうる。エアロゾル送達のための医薬装置の例として、定量投与吸入器（ＭＤＩｓ）、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩｓ）、およびエアジェットネブライザを含む。
【００５２】
本発明の方法における使用のための化合物は、単位投与剤形で製剤化することができる。「単位投与剤形」という用語は、望ましい治療効果を生じるように算出した活性物質の所定量を含む各単位で、任意に適切な医薬担体を伴って、処置を受けている対象者への単位型投与に適する物質的に個別の単位を指す。単位投与剤形は、１日１回の用量または１日にいずれか複数回の用量でありうる（例えば、１日につき約１〜４回、またはそれ以上の回数）。１日複数回の用量が使用されるときは、単位投与剤形は各用量で同様であるか、または異なりうる。
【００５３】
本発明は、さらに以下の図面および実施例により例証される。しかしながら、これらの実施例および図面は、本発明の範囲を限定するようないかなる点にも解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図1では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇したゲムシタビン（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【図２】図２では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇したアルステルパウロン（Ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ）（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【図３】図３では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇したオバトクラックスメシレート（Ｏｂａｔｏｃｌａｘ  Ｍｅｓｙｌａｔｅ）（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【図４】図４では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇したビンブラスチン（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【図５】図５では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇したメナジオン結晶（Ｍｅｎａｄｉｏｎｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【図６】図６では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇したＧＳＫ３ベータ阻害剤ＶＩＩＩ（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【図７】図７では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇したＧＳＫ３ベータ阻害剤ＸＶ（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【図８】図８では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇したドセタキセル（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【図９】図９では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇したインジルビン−３’−モノオキシム（Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｍｏｎｏｘｉｍｅ）（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【図１０】図１０では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇したフルオシノロンアセトニド（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【図１１】図１１では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇した還元型Ｌ−グルタチオン（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【図１２】図１２では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇したチロフィバン（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【図１３】図１３では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇したＨＡ−１４（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【図１４】図１４では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇した塩酸トポテカン（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【図１５】図１５では、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞を、Ｈ１Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．０１またはＭＯＩ  ０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）またはＨ５Ｎ１（それぞれＭＯＩ  ０．００１またはＭＯＩ  ０．０１）での感染直前に、濃度の上昇したクロファラビン（△）、アマンタジン（抗ウイルス分子対照）（■）、またはＤＭＳＯ（◆）で処理した。感染後２４ｈおよび４８ｈで、上澄みを採取し、蛍光分析を用いてノイラミニダーゼ活性を試験した。蛍光曲線はウイルス複製における分子の作用を示す。
【００５５】
＜実施例＞
＜＜材料および方法＞＞
−細胞およびウイルス−
Ａ５４９ヒト肺上皮細胞株およびメイディン−ダービー・イヌ腎臓細胞（ＥＣＡＣＣ，）を、３７℃、５％ＣＯ２で、１００Ｕ．ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（ＧｉｂＣｏ、１５１４０１３０）、並びに１０％のウシ胎児血清（ＰＡＮ、３３０２−Ｐ２２１１２６）を添加したＤＭＥＭ培地（ＧｉｂＣｏ、４１９６６０５２）で成長させた。
【００５６】
流行性のＡ／Ｈ１Ｎ１／ニューカレドニア／Ｐ１０型、Ａ／Ｈ３Ｎ２／ワイオミング型、およびＡ／Ｈ５Ｎ１／ベトナム型を、１μｇ．ｍｌ−１のＴＰＣＫ修飾トリプシン（Ｓｉｇｍａ、Ｔ３０５３）を添加したＤＭＥＭにおいてＭＤＣＫ細胞で、ＦＣＳなしで、増殖させた。ウイルスストックは、標準的なプラークアッセイにより、ＭＤＣＫ細胞上で、寒天重層培地を使用して滴定した。
【００５７】
−分子−
すべての分子は、２０ｍＭのストック濃度で、ＤＭＳＯにおいて、溶解させた。
【００５８】
−ウイルス感染−
細胞（ＭＤＣＫまたはＡ５４９）を、１ＸのＤ−ＰＢＳ、（ＧｉｂＣｏ、１４１９０）で２度洗浄し、指示された濃度で分子を加えた。そして、ＭＤＣＫおよびＡ５４９細胞を、０．２μｇ．ｍｌ−１のＴＰＣＫトリプシン（感染培地）を添加したＤＭＥＭにおいて、Ｈ１Ｎ１（それぞれ、ＭＯＩ  ０．０１および０．１）、Ｈ３Ｎ２（ＭＯＩ  ０．６）、またはＨ５Ｎ１（それぞれ、ＭＯＩ  ０．００１および０．０１）に感染させ、３７℃、５％ＣＯ２で、２４時間または４８時間、感染培地においてインキュベートした。
【００５９】
−ノイラミニダーゼ活性による力価測定−
インフルエンザウイルスノイラミニダーゼは、用量依存的に、放出波長が変化するメチル−ウンベリフェリル−Ｎ−アセチルノイラミン酸（４−ＭＵＮＡＮＡ、Ｓｉｇｍａ  Ｍ８６３９）を切断することができる。
【００６０】
９６黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３６３１）において、２５μｌの感染上澄みは、カルシウムおよびマグネシウム（ＧｉｂＣｏ、１４０４０）を含む２５μｌのＤ−ＰＢＳ（１Ｘ）並びに５０μｌの２０μＭ・４−ＭＵＮＡＮＡ内で希釈した。３７℃で１時間のインキュベーション後、１００μｌの０．１Ｍグリシン、ｐＨ１０．７の２５％エタノールを添加した。測定は、３６５ｎｍの励起波長および４５０ｎｍの発光波長で、ＴＥＣＡＮ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００計器で行われた。
【００６１】
＜＜結果＞＞
結果はすべて、図１〜１５に示す。
【００６２】
＜参考文献＞
本願を通して、様々な参考文献において、本発明の関わる先端技術が記述されている。これらの参考文献の開示は、本開示の参考文献に盛り込まれている。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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