(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ増幅、ＤＮＡシーケンシング及びジェノタイピングからなる群から選択される、鋳型特異的な様式でプライマーの伸長を行うアッセイにおいて、鋳型ヌクレオチドとハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を防止する方法であって、前記鋳型ヌクレオチド上にＮ2−ベンジル−デオキシグアノシン（Ｎ2−ベンジル−ｄＧ）を取り込むことを含んで成り、ここで、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、Ｎ2−ベンジル−ｄＧヌクレオチドの位置を超えて、２個を超えるヌクレオチドによって伸長され得ない、前記方法。
【請求項２】
前記アッセイがＰＣＲ増幅である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増幅反応の間における核酸の非特異的増幅を減少させるか、又は防止する方法であって、以下のステップ：
標的核酸を増幅することができる少なくとも１対のプライマーオリゴヌクレオチドを提供し；そして
Ｎ2−ベンジル−ｄＧヌクレオチドを取り込むプローブオリゴヌクレオチドを提供すること、
を含んで成り、ここで前記プライマーオリゴヌクレオチドが前記プローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするときに、前記Ｎ2−ベンジル−ｄＧヌクレオチドは、前記Ｎ2−ベンジル−ｄＧヌクレオチドの位置を超えた、２個を超えるヌクレオチドによる、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーオリゴヌクレオチドの伸長を阻害する、前記方法。
【請求項４】
前記増幅反応がＴａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイであり、前記プローブオリゴヌクレオチドが５’ヌクレアーゼプローブである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
核酸の増幅のための反応混合物であって、少なくとも１対のプライマーオリゴヌクレオチド、及び、Ｎ2−ベンジル−ｄＧヌクレオチドを取り込む少なくとも１つのプローブオリゴヌクレオチドを含んで成る、前記反応混合物。
【請求項６】
ヌクレオチド取り込み生体触媒、ヌクレオシド３リン酸、及び、前記ヌクレオチド取り込み生体触媒による核酸の増幅のために適した緩衝液をさらに含んで成る、請求項５に記載の反応混合物。
【請求項７】
核酸の増幅のためのキットであって、少なくとも１対のプライマーオリゴヌクレオチド、及び、Ｎ2−ベンジル−ｄＧヌクレオチドを取り込む少なくとも１つのプローブオリゴヌクレオチド、少なくとも１つのヌクレオチド取り込み生体触媒、ヌクレオシド３リン酸、少なくとも１つの前記ヌクレオチド取り込み生体触媒による核酸の増幅のために適した緩衝液、及び、核酸の増幅を行うための１セットの指示書を含んで成る、前記キット。
【請求項８】
１又は２対以上のプライマーオリゴヌクレオチド、及び、Ｎ2−ベンジル−ｄＧヌクレオチドを取り込む１又は２対以上のプローブオリゴヌクレオチドをさらに含んで成る、請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び核酸化学の分野に関する。より具体的には、本発明は、核酸増幅反応の信頼性を向上させるための方法及び試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明により、核酸配列のインビトロでの増幅が可能となった。ＰＣＲについては、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；及び同第４，９６５，１８８号；Saiki et al., 1985, Science 230:1350-1354；Mullis et al., 1986, Cold Springs Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273；及びMullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol. 155:335-350、に記載されている。ＰＣＲの開発及び適用については、文献に広く記載されている。例えば、PCR Technology - principles and applications for DNA amplification, 1989, (ed. H.A.Erlich) Stockton Press, New York；PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990, (ed. M.A. Innis et al.) Academic Press, San Diego；並びにPCR Strategies, 1995, (ed. M.A. Innis et al.) Academic Press, San Diego、には、ＰＣＲに関連する様々な事項が考察されている。アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）（フォスターシティ，カリフォルニア州）などの市販業者が、ＰＣＲ試薬を販売し、ＰＣＲプロトコルを公開している。
【０００３】
核酸増幅が最初に公開されて以来、様々なプライマーに基づく核酸増幅法が報告されており、これらに限定されないが、鎖置換 (strand displacement)アッセイ（Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396、Walker et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:1691-1696、及び米国特許第５，４５５，１６６号）、並びに米国特許第５，４３７，９９０号；同第５，４０９，８１８号；及び同第５，３９９，４９１号に記載の方法を含む転写に基づく増幅系；転写増幅系 (transcription amplification system)（ＴＡＳ）（Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）；及び自家持続配列複製法 (self-sustained sequence replication)（３ＳＲ）（Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878及び国際公開第９２／０８８００号）、などである。増幅系についての概説は、Abramson and Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47、に記載されている。
【０００４】
プライマーに基づく増幅反応の特異性は、主として、プライマーハイブリダイゼーション及び伸長の特異性に依存する。典型的な増幅で用いられる高められた温度下では、プライマーは、意図する標的配列のみにハイブリダイズする。しかし、増幅反応混合物は、通常、プライマーハイブリダイゼーションの特異性を確保するために必要とされる温度よりもかなり低いものである室温にて作り上げられる。そのような低ストリンジェンシー条件下では、プライマーは、部分的にしか相補的ではない他の核酸配列、又は他のプライマーと非特異的に結合して、所望されない伸長産物の合成を開始する場合があり、これは、標的配列と共に増幅され得る。非特異的プライマー伸長産物の増幅は、所望される標的配列の増幅と競合し得るものであり、所望される配列の増幅効率を大きく低下させる恐れがある。
【０００５】
観察されることの多いタイプの非特異的増幅産物の１つは、「プライマー二量体 (primer dimer)」と称される増幅反応の鋳型非特異的人工物である。プライマー二量体は、その長さが、通常は、２つのプライマー長の合計に近い二本鎖断片であり、一方のプライマーが他方のプライマーまで伸長された場合に発生するものと考えられる。得られた伸長産物は、所望されない鋳型を形成し、これは、その長さが短いことにより、効率的に増幅される。
【０００６】
非特異的増幅は、反応開始前にプライマー伸長産物の形成を抑制することによって減少させることができる。「ホットスタート」プロトコルと称される１つの方法では、必要なハイブリダイゼーション特異性を得るために充分に温度が上昇されるまで、１又は２つ以上の不可欠な試薬が反応混合物への投入を保留される。最初の高温インキュベーション工程後に反応管を開けて、投入さていなかった試薬を添加するというマニュアルホットスタート法は、労力を要し、反応混合物が汚染されるリスクを高めるものである。別の選択肢として、米国特許第５，４１１，８７６号及びChou et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20(7):1717-1723、に記載のように、ワックスなどの熱感応性物質を用いて、反応成分を分離又は隔離することもできる。このような方法では、高温による反応前インキュベーションによって熱感応性物質が融解され、それによって、試薬の混合が可能となる。
【０００７】
反応の開始前にプライマー伸長産物の形成を抑制する別の方法は、ＤＮＡポリメラーゼの熱可逆的不活性化に依存するものである。米国特許第５，７７３，２５８号及び同第５，６７７，１５２号には、修飾基の共有結合によって可逆的に修飾されたＤＮＡポリメラーゼについて記載されている。不活性化ＤＮＡポリメラーゼを高温にてインキュベートすることにより、修飾基−酵素結合が開裂され、それによって酵素が再活性化される結果となる。
【０００８】
米国特許第５，３３８，６７１号には、ＤＮＡポリメラーゼ特異的抗体による、非共有結合でのＤＮＡポリメラーゼの可逆的阻止について記載されている。
【０００９】
非特異的増幅はまた、米国特許第５，４１８，１４９号に記載の方法を用いて、形成された伸長産物を反応開始前に酵素分解することによって減少させることもできる。新しく合成された伸長産物の分解は、増幅反応を行う前に、ｄＵＴＰ及びＵＮＧを反応混合物に取り込ませ（incorporating）、この反応混合物を４５〜６０℃にてインキュベートすることによって達成される。プライマー伸長は、ウラシル含有ＤＮＡの形成をもたらし、これは、プレ増幅条件下にて、ＵＮＧによって分解される。この方法の欠点は、伸長産物の分解が伸長産物の形成と競合し、非特異的プライマー伸長産物の排除が不完全であり得ることである。この方法の利点は、前の反応からの汚染物として反応混合物中に導入されてしまったウラシル含有ＤＮＡも分解されることであり、従って、この方法はまた、前の反応からの増幅核酸によるＰＣＲの汚染の問題も低減する。
【００１０】
反応開始前にプライマー伸長産物の形成を抑制する別の方法は、米国特許第６，００１，６１１号に記載のように、ある部分を環外アミンへ付加することによって３’末端又はその近傍で修飾されたプライマーの使用に依存するものである。
【００１１】
当業者の技能の範囲内である分子生物学及び核酸化学の従来の技術は、文献に充分に説明されている。例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins. eds., 1984)；PCR Technology - principles and applications for DNA amplification, 1989, (ed. H.A.Erlich) Stockton Press, New York；PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990, (ed. M.A. Innis et al.) Academic Press, San Diego；及びPCR Strategies, 1995, (ed. M.A. Innis et al.) Academic Press, San Diego、を参照されたい。
【発明の概要】
【００１２】
発明の概要
本発明は、特定の増幅反応において、特に、複数の標的核酸の増幅及び検出のための複数のプライマー並びにプローブを含有する反応において（例：マルチプレックスＰＣＲ反応）、１若しくは複数のプローブが、続いて偽陽性のシグナルを与えることになる非特異的増幅に繋がる可能性のあるテンプル（temple）として作用し得るという驚くべき発見に基づいている。ＰＣＲにおいてプローブに基づく非特異的増幅を減少させるために、ＤＮＡポリメラーゼの活性に干渉するが、相補ヌクレオチドとの塩基対形成を行うことは依然としてできるマイナーグルーブ修飾剤（minor groove modifiers）を用いることができる。そのようなマイナーグルーブ修飾剤の１つの例は、デオキシグアノシン類似体、Ｎ2−ベンジル−グアノシン（Ｎ2−ベンジル−ｄＧ）であり、これは、本明細書で述べるように、本発明の主題である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明の１つの態様は、鋳型特異的な様式（template-dependent manner）でプライマーの伸長を行うアッセイにおいて、鋳型ヌクレオチド配列とハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼによる伸長を防止する方法に関し、その方法は、鋳型ヌクレオチド配列上にマイナーグルーブバインダー (minor groove binder)を取り込むことを含んで成り、ここで、プライマーオリゴヌクレオチドは、マイナーグルーブバインダーの位置を超えて、２個を超えるヌクレオチドによって伸長され得ない。１つの実施形態では、マイナーグルーブバインダーは、修飾ヌクレオシドである。別の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ2−ベンジル−デオキシグアノシン（Ｎ2−ベンジル−ｄＧ）である。
【００１４】
本発明の別の態様は、増幅反応の間における核酸の非特異的増幅を減少させるか、又は防止する方法であって、標的核酸配列を増幅することができる少なくとも１対のプライマーオリゴヌクレオチドを提供し；マイナーグルーブバインダーを取り込むプローブオリゴヌクレオチドを提供すること、を含んで成り、ここで前記プライマーオリゴヌクレオチドが前記プローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするときに、前記マイナーグルーブバインダーは、前記マイナーグルーブバインダーの位置を超えた、２個を超えるヌクレオチドによる、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーオリゴヌクレオチドの伸長を阻害する、前記方法に関する。１つの実施形態では、前記マイナーグルーブバインダーは、修飾ヌクレオシドである。別の実施形態では、前記修飾ヌクレオシドは、Ｎ2−ベンジル−デオキシグアノシン（Ｎ2−ベンジル−ｄＧ）である。
【００１５】
本発明の第三の態様は、核酸の増幅のための反応混合物であって、少なくとも１対のプライマーオリゴヌクレオチド、及び、Ｎ2−ベンジル−ｄＧヌクレオチドを取り込む少なくとも１つのプローブオリゴヌクレオチドを含んで成る、前記反応混合物に関する。
【００１６】
本発明の第四の態様は、核酸の増幅のためのキットであって、少なくとも１対のプライマーオリゴヌクレオチド、Ｎ2−ベンジル−ｄＧヌクレオチドを取り込む少なくとも１つのプローブオリゴヌクレオチド、少なくとも１つのヌクレオチド取り込み生体触媒（nucleotide-incorporating biocatalyst）、ヌクレオシド３リン酸、少なくとも１つのヌクレオチド取り込み生体触媒による核酸の増幅のために適した緩衝液、及び、核酸の増幅を行うための１セットの指示書を含んで成る、前記キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、（Ａ）Ｎ2−ベンジル−デオキシグアノシン（Ｎ2−ベンジル−ｄＧ）の構造、及び（Ｂ）Ｎ2−ベンジル−デオキシグアノシン（Ｎ2−ベンジル−ｄＧ）とデオキシシトシン（ｄＣ）との間の塩基対形成を示す。
【図２】図２は、Ｎ2−ベンジル−ｄＧを含有する鋳型核酸を用いたプライマー伸長の阻害を図示するものであり：（Ａ）は、修飾無しの鋳型を示し、（Ｂ）及び（Ｃ）は、修飾有りの鋳型を示し、ここで、Ｘは、Ｎ2−ベンジル−ｄＧである。
【図３Ａ−１】図３Ａ−１は、実施例１のプライマー伸長反応の、０分の時間点での結果を示す。
【図３Ａ−２】図３Ａ−２は、実施例１のプライマー伸長反応の、０分の時間点での結果を示す。
【図３Ａ−３】図３Ａ−３は、実施例１のプライマー伸長反応の、０分の時間点での結果を示す。
【図３Ｂ−１】図３Ｂ−１は、実施例１のプライマー伸長反応の、５分の時間点での結果を示す。
【図３Ｂ−２】図３Ｂ−２は、実施例１のプライマー伸長反応の、５分の時間点での結果を示す。
【図３Ｂ−３】図３Ｂ−３は、実施例１のプライマー伸長反応の、５分の時間点での結果を示す。
【図４】図４は、３つの試験オリゴヌクレオチド、１つの未修飾コントロールオリゴヌクレオチド、及びコントロールオリゴヌクレオチドと同一の配列を有するが、Ｎ−４又はＮ−９位にＮ2−ベンジル−ｄＧ修飾を有する２つのオリゴヌクレオチド、に対する相補オリゴヌクレオチドの融解温度を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｎ2−ベンジル−ｄＧ残基含有ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの、同一の配列を有するコントロールＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと比較した開裂効率を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｎ2−ベンジル−ｄＧ残基含有ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの、同一の配列を有するコントロールＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと比較した開裂効率を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ｎ2−ベンジル−ｄＧ残基含有ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの、同一の配列を有するコントロールＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと比較した開裂効率を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、Ｎ2−ベンジル−ｄＧ残基含有ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの、同一の配列を有するコントロールＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと比較した開裂効率を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、Ｎ2−ベンジル−ｄＧ残基含有ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの、同一の配列を有するコントロールＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと比較した開裂効率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
定義
特に断りのない限り、本明細書で用いられるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本発明の記載及び請求において、以下の定義が用いられる。
【００１９】
「核酸」の用語は、ヌクレオチド（例：リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体など）のポリマーを意味し、直鎖状又は分岐鎖状の様式にて共有結合で一緒に連結されたヌクレオチドを含んで成るデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ペプチド核酸 (peptide nucleic acid)（ＰＮＡ）、ＰＮＡ−ＤＮＡ結合体、ＰＮＡ−ＲＮＡ結合体などを含んで成る。核酸は、通常、一本鎖又は二本鎖であり、一般的には、リン酸ジエステル結合を含有するが、いくつかの場合では、例えば、ホスホラミド（Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49(10):1925）；ホスホロチオエート（Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437；及び米国特許第５，６４４，０４８号)、ホスホロジチオエート(Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321）、Ｏ−メチルホホロアミダイト結合（O-methylphophoroamidite linkages）（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992)参照）、並びにペプチド核酸バックボーン及び結合（Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895参照）を含む別のバックボーンを有し得る核酸類似体が含まれる。その他の類似体核酸としては、正電荷を有するバックボーン（Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）；非イオン性バックボーン（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号、及び同第４，４６９，８６３号）、並びに米国特許第５，２３５，０３３号及び同第５，０３４，５０６号に記載のものを含む非リボースバックボーンを有するものが挙げられる。１又は２つ以上の炭素環式糖を含有する核酸も、核酸の定義に含まれ（Jenkins et al. (1995) Chem. Soc. Rev. pp. 169-176参照）、類似体 (analogue) については、例えば、Rawls, C & E News Jun. 2, 1997 page 35にも記載されている。リボース−リン酸バックボーンのこのような修飾は、標識などの追加部分の付加を容易とするために、又は生理学的環境中でのそのような分子の安定性及び半減期を改変するために行われ得る。
【００２０】
核酸中に通常見出される天然のヘテロ環式塩基（例：アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）に加えて、ヌクレオチド類似体は、例えば、Seela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640、に記載のものなど、非天然ヘテロ環式塩基を含んでいてもよい。ヌクレオチド類似体中に用いられる特定の塩基は、融解温度（Ｔｍ）修飾剤として作用する。例えば、これらのいくつかとしては、７−デアザプリン（例：７−デアザグアニン、７−デアザアデニンなど）、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、プロピニル−ｄＮ（例：プロピニル−ｄＵ、プロピニル−ｄＣなど）などが挙げられ、例えば、米国特許第５，９９０，３０３号を参照されたい。その他の代表的なヘテロ環式塩基としては、例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン、及びキサンチンの８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン、及びキサンチンの７−デアザ−８−アザ誘導体；６−アザシチジン；５−フルオロシチジン；５−クロロシチジン；５−ヨードシチジン；５−ブロモシチジン；５−メチルシチジン；５−プロピニルシチジン；５−ブロモビニルウラシル；５−フルオロウラシル;５−クロロウラシル;５−ヨードウラシル;５−ブロモウラシル;５−トリフルオロメチルウラシル;５−メトキシメチルウラシル;５−エチニルウラシル;５−プロピニルウラシルなどが挙げられる。
【００２１】
「ヌクレオシド」は、糖部分（リボース糖又はデオキシリボース糖）、糖部分の誘導体、若しくは糖部分の機能性同等物（例：炭素環式環）と共有結合によって連結した塩基又は塩基性基（少なくとも１つのホモ環式環、少なくとも１つのヘテロ環式環、及び／又は少なくとも１つのアリール基などを含んで成る）を含んで成る核酸成分を意味する。例えば、ヌクレオシドが糖部分を含む場合、塩基は、通常、その糖部分の１’−位へ連結している。上述のように、塩基は、天然の塩基であっても、又は非天然の塩基であってもよい。代表的なヌクレオシドとしては、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、ジデオキシリボヌクレオシド、及び炭素環式ヌクレオシドが挙げられる。
【００２２】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのエステル、例えば、ヌクレオシドの糖部分の５’位へ共有結合で連結した１、２、３、又は４つ以上のリン酸基を有するヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。
【００２３】
「プリンヌクレオチド」は、プリン塩基を含んで成るヌクレオチドを意味し、一方、「ピリミジンヌクレオチド」は、ピリミジン塩基を含んで成るヌクレオチドを意味する。
【００２４】
「修飾ヌクレオチド」は、希少な若しくはマイナーな核酸塩基、ヌクレオチド、及び従来の塩基若しくはヌクレオチドの修飾、誘導体化、又は類似体を意味し、修飾された塩基部分及び／又は修飾された糖部分を有する合成ヌクレオチドを含む（Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Methods in Molecular Biology, Vol. 26 (Suhier Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, N.J., (1994))；及びOligonucleotides and Analogues, A Practical Approach (Fritz Eckstein, Ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford）参照)。
【００２５】
「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２個、しかし典型的には、５〜５０個のヌクレオチド、より典型的には、１５から３５個のヌクレオチドを含む核酸ポリマーを意味する。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、一般的に、オリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途を含む種々の因子に依存する。オリゴヌクレオチドは、本技術分野にて公知の適切な、いかなる方法で作製されてもよく、例えば、適切な配列のクローニング及び制限消化、又はNarang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90-99のリン酸トリエステル法；Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:109-151のリン酸ジエステル法；Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862のジエチルホスホラミダイト法（diethylphosphoramidite method）；Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191のトリエステル法；自動合成法；米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法、若しくは本技術分野にて公知のその他のいずれかの化学的方法などの方法による直接化学合成が挙げられる。
【００２６】
「ワトソン・クリック塩基対形成」又は単に「塩基対形成」は、二本鎖核酸分子内の「従来の (conventional)」水素結合を意味する。ワトソン・クリック塩基対形成は、アデニンとチミジンとの間、グアニンとシトシンとの間、アデニンとウラシルとの間、及びこれらの塩基の類似体間の水素結合である。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、「ハイブリダイゼーション」及び「アニーリング」などの用語は、交換可能に用いられ、通常はハイブリダイゼーション複合体と称される二重又はより高次の構造の形成をもたらす、１つのポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチド（通常は逆平行（antiparallel）ポリヌクレオチド）との塩基対形成相互作用を意味する。逆平行ポリヌクレオチド分子間の主たる相互作用は、通常は、ワトソン／クリック及び／又はフーグスティーン (Hoogsteen) タイプの水素結合による、Ａ／Ｔ及びＧ／Ｃを例とする塩基特異的相互作用である。ハイブリダイゼーションの達成のために、２つのポリヌクレオチドがそれらの全長にわたって１００％の相補性を有することは必要条件ではない。いくつかの態様では、ハイブリダイゼーション複合体は、分子間相互作用から形成されてよく、又は、別の選択肢として、分子内相互作用から形成されてもよい。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、「増幅」及び「増幅する」などの用語は、一般的に、分子、又は関連する１セットの分子のコピー数の増加をもたらすいかなるプロセスをも意味する。ポリヌクレオチド分子に適用される場合、増幅とは、ポリヌクレオチド分子、又はポリヌクレオチド分子の一部の複数のコピーを、通常は少量のポリヌクレオチド（例：ウイルスゲノム）から開始して作製することを意味し、ここで、増幅された物質（例：ウイルスＰＣＲアンプリコン (amplicon)）は、通常は、検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅は、様々な化学的及び酵素的プロセスを包含する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅 (strand displacement amplification) （ＳＤＡ）反応、転写増幅 (transcription mediated amplification) （ＴＭＡ）反応、核酸配列ベース増幅 (nucleic acid sequence-based amplification) （ＮＡＳＢＡ）反応、又はリガーゼ連鎖反応 (ligase chain reaction) （ＬＣＲ）の間に、鋳型ＤＮＡ分子の１若しくは数個のコピーから複数のＤＮＡコピーを作製することは、増幅の形態である。増幅は、出発分子の厳密な複製に限定されない。例えば、サンプル中の限定された量のウイルスＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲを用いて複数のｃＤＮＡ分子を作製することは、増幅の一形態である。さらに、転写プロセスの間に、単一のＤＮＡ分子から複数のＲＮＡ分子が作製されることも、増幅の一形態である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、増幅に続いて、所望に応じて追加の工程が行われてよく、例えば、これらに限定されないが、標識化 (labeling)、シーケンシング (sequencing)、精製、単離、ハイブリダイゼーション、サイズ分割（size resolution）、発現、検出、及び／又はクローニング (cloning)である。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）の用語は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドのセグメントの濃度を増加させるための、本技術分野にて公知の増幅法であり、ここで、サンプルは、単一のポリヌクレオチド種、又は複数のポリヌクレオチドであってよい。一般的に、ＰＣＲプロセスは、１若しくは複数の所望される標的配列を含んで成る反応混合物へ、モル過剰の２又は３つ以上の伸長可能オリゴヌクレオチドプライマーを導入することから成り、ここで、プライマーは、二本鎖標的配列の反対側の鎖と相補的である。反応混合物は、ＤＮＡポリメラーゼの存在下にて熱サイクルのプログラムにかけられ、その結果、ＤＮＡプライマーに隣接する所望の標的配列の増幅が得られる。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＲＮＡ鋳型、及び逆転写酵素又は逆転写酵素活性を有する酵素を用いるＰＣＲ反応であり、一本鎖ＤＮＡ分子がまず生成され、その後、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの延長の複数のサイクルが行われる。マルチプレックスＰＣＲとは、単一の反応で２つ以上の増幅産物を生成するＰＣＲ反応を意味し、通常は、単一の反応に３つ以上のプライマーを含有させることによる。広範囲の様々なＰＣＲ適用方法が、本技術分野にて広く知られており、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Section 15, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994)、を例とする多くの文献に記載されている。
【００３１】
「プライマー核酸」又は「プライマー」は、鋳型核酸とハイブリダイズし、ヌクレオチド取り込み生体触媒（nucleotide incorporating biocatalyst）を用いて鎖の伸長又は延長を可能とすることができるオリゴヌクレオチドである。他のプライマー長が用いられる場合もあるが、通常、プライマーは、１５から３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー核酸は、一般的には、より低い温度を用いて、鋳型核酸との充分に安定なハイブリッド複合体を形成する。鋳型核酸のサブ配列と少なくとも部分的に相補的であるプライマー核酸が、通常は、伸長を起こすために鋳型核酸とハイブリダイズするのに充分である。しかし、伸長を成功させるためには、一般的に、プライマーの３’末端にてより高い相補性（すなわち、鋳型とのミスマッチがより少ない）が必要である。プライマー核酸は、所望される場合、放射線学的、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的技術によって検出可能である標識を組み込むことによって標識されてよい。
【００３２】
「伸長されたプライマー」とは、１又は２個以上の追加のヌクレオチドが付加されたプライマーを意味する。「プライマー伸長」は、それによって追加のヌクレオチドがプライマーに付加される、酵素の作用である。
【００３３】
「鋳型核酸」、「鋳型」、又は「標的」とは、プライマー核酸が、それにハイブリダイズ可能であり、適切な条件下にて伸長可能である核酸を意味する。核酸増幅に関する場合、「標的」は、好ましくは、少なくとも２つのプライマー配列と少なくとも部分的に相補的である配列、及び介在配列から成る二本鎖核酸の領域である。標的はまた、１つのプライマーと少なくとも部分的に相補的である配列、及び第二のプライマーと部分的に同一である配列から成る一本鎖核酸であってもよい。鋳型核酸は、単離された核酸断片として存在してよく、又はより大きい核酸断片の一部であってもよい。標的核酸は、培養微生物、未培養微生物、複雑な生物学的混合物、組織、血清、古代若しくは保存された組織又はサンプル、又は環境分離株（environmental isolates）など、本質的にいかなる入手源から得られても、又は単離されてもよい。さらに、鋳型核酸は、所望に応じて、ｃＤＡＮ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、クローン化ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、酵素的断片化ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、化学的断片化ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は物理的断片化ＤＮＡ若しくはＲＮＡなどを含むか、又はこれらから得られてもよい。鋳型核酸はまた、本技術分野にて公知の技術を用いて、化学的に合成されてもよい。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、「プローブ」の用語は、通常、目的の標的核酸とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを意味する。プローブは、絶対ではないが通常は、プローブ（及び従ってその標的）の検出、可視化、測定、及び／又は定量が可能となるように、適切な標識又はレポーター部分と会合されている。標識プローブの検出系としては、これらに限定されないが、蛍光、蛍光消光（例：ＦＲＥＴ対検出系を用いる場合）、酵素活性、吸光度、分子質量、放射活性、発光、又はレポーターの特異的結合を可能とする結合特性（例：レポーターが抗体である場合）の検出が挙げられる。いくつかの実施形態では、プローブは、ポリヌクレオチドではなく、目的の核酸ヌクレオチド配列に対する結合特異性を有する抗体であってよい。本発明は、特定のいかなるプローブ標識又はプローブ検出系に限定されることをも意図するものではない。プローブに用いられるポリヌクレオチドの入手源は限定されず、非酵素系において合成によって作製されてよく、又は生物学的（例：酵素的）系（例：細菌細胞中）を用いて産生されるポリヌクレオチド（又はポリヌクレオチドの一部）であってもよい。
【００３５】
通常、プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件などであるがこれに限定されない選択されたハイブリダイゼーション条件下にて標的配列と安定なハイブリダイゼーション複合体を形成するのに充分な相補性を、核酸中に含有される特異的標的配列に対して有する。充分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にてプローブを用いて実施されるハイブリダイゼーションアッセイにより、特異的標的配列の選択的検出が可能となる。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、プライマーが鋳型配列に対して「特異的」であるのは、プライマー配列と標的配列との間に存在するミスマッチ数が、プライマー配列とサンプル中に存在し得る非標的配列との間に存在するミスマッチ数よりも少ない場合である。存在するミスマッチ数が、プライマー配列と標的配列との間に存在するミスマッチ数以下である場合にのみ安定な二重鎖が形成されるハイブリダイゼーション条件が選択されてよい。そのような条件下では、プライマーは、標的配列とのみ安定な二重鎖を形成することができる。従って、標的プライマー結合部位を含有するそれらの標的配列の適切なストリンジェントな増幅下での標的特異的プライマーの使用。配列特異的増幅条件の使用により、厳密に相補的なプライマー結合部位を含有する標的配列の特異的増幅が可能となる。
【００３７】
「非特異的増幅」の用語は、プライマーが標的配列以外の配列とハイブリダイズし、続いてプライマー伸長の基質として作用することに起因する、標的配列以外の核酸配列の増幅を意味する。非標的配列へのプライマーのハイブリダイゼーションは、「非特異的ハイブリダイゼーション」と称され、温度がより低く、ストリンジェンシーが低下されたプレ増幅条件の間に起こり得るものである。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、「アンプリコン」の用語は、特定の標的核酸の増幅に続いて作製されるポリヌクレオチド分子（又は集合的に複数の分子）を意味する。アンプリコンの作製に用いられる増幅法は、適切ないかなる方法であってもよく、最も典型的には、例えば、ＰＣＲ法を用いることによる。アンプリコンは、絶対ではないが通常は、ＤＮＡアンプリコンである。アンプリコンは、一本鎖、又は二本鎖、又はいずれかの濃度比率でのそれらの混合物であってよい。
【００３９】
本明細書で用いられる場合、「アンプリコン蓄積のリアルタイム検出」の表現は、増幅の完了後に検出又は定量の工程を必要とすることなく、特定の１若しくは複数のアンプリコンが（通常はＰＣＲによって）生成されているときに、当該アンプリコンを検出、通常は定量することを意味する。「リアルタイムＰＣＲ」又は「キネティックＰＣＲ（kinetic PCR）」の用語は、ＰＣＲにて生成されたアンプリコンのリアルタイム検出及び／又は定量を意味する。
【００４０】
アンプリコン蓄積のリアルタイム検出のための一般的な方法は、ＴａｑＭａｎ分析を例とする、蛍光発生５’−ヌクレアーゼアッセイとも称される５’−ヌクレアーゼアッセイによるものであり；Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280 (1991)；及びHeid et al., Genome Research 6:986-994 (1996)、を参照されたい。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ手順では、ＰＣＲ反応に特異的なアンプリコンの作製のために、２つのオリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。第三のオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）が、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するアンプリコン中のヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計される。プローブは、ＰＣＲ反応で用いられるＤＮＡポリメラーゼによって伸長できない構造を有してよく、通常は（必須ではないが）、互いに近接する蛍光レポーター染料及び消光剤部分によって共標識される。レポーター染料からの発光は、蛍光体及び消光剤が、プローブ上でそうであるように、近接している場合に、消光部分によって消光される。いくつかの場合では、プローブは、蛍光レポーター染料又は別の検出可能部分だけで標識されてよい。
【００４１】
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応は、５’−３’ヌクレアーゼ活性を持つ熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いる。ＰＣＲ増幅反応の間、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性により、鋳型特異的な様式でアンプリコンとハイブリダイズする標識プローブを開裂する。得られるプローブ断片は、プライマー／鋳型複合体から解離し、そして、レポーター染料は、消光剤部分の消光効果から解放される。新たに合成される各アンプリコン分子に対しておよそ１分子のレポーター染料が遊離され、未消光レポーター染料を検出することで、放出される蛍光レポーター染料の量がアンプリコン鋳型の量に正比例するという形でのデータの定量的解釈のベースが提供される。
【００４２】
ＴａｑＭａｎアッセイデータの１つの尺度は、通常、閾値サイクル (threshold cycle) （ＣＴ）として表される。蛍光レベルは、各ＰＣＲサイクルの間に記録され、増幅反応にてその時点までに増幅された産物の量に比例している。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録された際の、又は蛍光シグナルが他の何らかの任意レベル（例：任意蛍光レベル (arbitrary fluorescence level) 、又はＡＦＬ）を超える場合のＰＣＲサイクルが、閾値サイクル（ＣＴ）である。
【００４３】
５’−ヌクレアーゼアッセイのためのプロトコル及び試薬は、当業者に公知であり、様々な参考文献に記載されている。例えば、５’−ヌクレアーゼ反応及びプローブは、Gelfand et al.に対して２００１年４月１０日に発行された発明の名称が“HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM”である米国特許第６，２１４，９７９号；Gelfand et al.に対して１９９８年９月８日に発行された発明の名称が“REACTION MIXTURES FOR DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACIDS”である米国特許第５，８０４，３７５号；Gelfand et al.に対して１９９６年１月３０日に発行された発明の名称が“NUCLEIC ACID DETECTION BY THE 5’-3’EXONUCLEASE ACTIVITY OF POLYMERASES ACTING ON ADJACENTLY HYBRIDIZED OLIGONUCLEOTIDES”である米国特許第５，４８７，９７２号；及びGelfand et al.に対して１９９３年５月１１日に発行された発明の名称が“HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM USING THE NUCLEASE ACTIVITY OF A NUCLEIC ACID POLYMERASE”である米国特許第５，２１０，０１５号、に記載されている。
【００４４】
リアルタイムアンプリコン検出のための方法の変形も公知であり、特には、５’−ヌクレアーゼプローブが、増幅反応中に存在する二本鎖アンプリコンの量に依存する蛍光をもたらす二本鎖ＤＮＡインターカレーティング染料（double-stranded DNA intercalating dye）によって置き換えられる変形であり、例えば、Higuchiに対して２００１年１月９日に発行された発明の名称が“METHODS AND DEVICES FOR HEMOGENEOUS NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND DETECTOR”である米国特許第６，１７１，７８５号；及びHiguchiに対して１９９９年１１月３０日に発行された発明の名称が“HOMOGENEOUS METHODS FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND DETECTION”である米国特許第５，９９４，０５６号、を参照されたい。
【００４５】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、市販のキット及び装置を用いて行うことができ、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems），フォスターシティ，カリフォルニア州）又はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（ロシェアプライドサイエンス（Roche Applied Sciences），マーンハイム，ドイツ）などである。好ましい実施形態では、５’−ヌクレアーゼアッセイ手順は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍなどのリアルタイム定量的ＰＣＲ装置上で行われる。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）、カメラ、及びコンピュータから成る。このシステムは、サーモサイクラー上の９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマット中のサンプルを増幅する。増幅の間、９６のウェルすべてについて、レーザー誘導蛍光シグナルが光ファイバーケーブルを通してリアルタイムで集められ、ＣＣＤカメラで検出される。このシステムは、機器の運転及びデータの解析のためのソフトウェアを含む。
【００４６】
本明細書で用いられる場合、「遺伝子」とは、生物学的機能を伴うＤＮＡのいかなる断片をも意味する。従って、遺伝子は、コード配列を含み、所望に応じて、コード配列の発現に必要である制御配列を含んでよい。
【００４７】
核酸が「伸長された (extended)」又は「延長された (elongated)」とは、追加のヌクレオチドが、例えばヌクレオチド取り込み生体触媒により、核酸の３’末端にて核酸中に取り込まれた場合のことである。
【００４８】
「部分 (moiety)」又は「基 (group)」とは、分子などの何かをいくつかの部分に分割したもののうちの１つを意味する（例：官能基又は置換基など）。例えば、ヌクレオチドは、通常、塩基（例：アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル、又は類似体）、糖部分、及び１又は２つ以上のリン酸基を含んで成る。
【００４９】
「ベンジル基」とは、式Ｃ6Ｈ5ＣＨ2−を有する一価の芳香族基を意味し、「フェニルメチル」の用語と交換可能に用いられる。
【００５０】
「ジェノタイプ」とは、細胞若しくは対象、又は細胞若しくは対象の群の遺伝子構成のすべて、又は一部を意味する。例えば、ジェノタイプには、ある遺伝子座に存在する、若しくはゲノム中に分布される特定の変異及び／又はアレル（例：一塩基多型（ＳＮＰ）などの多型）が含まれる。「ジェノタイピング」とは、細胞又は対象のジェノタイプを特定するアッセイを意味する。
【００５１】
「ヌクレオチド取り込み生体触媒」又は「ヌクレオチド取り込み酵素」とは、核酸中へのヌクレオチドの取り込みを触媒する触媒（又は酵素）を意味する。代表的なヌクレオチド取り込み酵素としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、及びテロメラーゼなどが挙げられる。
【００５２】
「熱安定性酵素」とは、選択された時間にわたって高められた温度にかけられた場合に、安定であり（すなわち、分解又は変性に耐える）、充分な触媒活性を維持する酵素を意味する。例えば、熱安定性ポリメラーゼは、二本鎖核酸の変性に必要な時間にわたって高められた温度にかけられた場合、続いて行われるプライマー伸長反応を起こすのに充分な活性を維持する。核酸変性に必要な加熱条件は、本技術分野にて公知であり、米国特許第４，６８３，２０２号及び同第４，６８３，１９５号に例示されている。本明細書で用いられるように、熱安定性ポリメラーゼは、通常、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）などの温度サイクル反応での使用に適している。熱安定性核酸ポリメラーゼの例としては、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス属Ｚ０５ポリメラーゼ、サーマス・フラブス（Thermus flavus）ポリメラーゼ、ＴＭＡ−２５及びＴＭＡ−３０ポリメラーゼなどのサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）ポリメラーゼ、並びにＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
【００５３】
「修飾酵素」とは、酵素の天然若しくは野生型の形態、又は酵素の別の修飾された形態などの参照配列から少なくとも１つのモノマーが異なっているアミノ酸ポリマーを含んで成る酵素を意味する。代表的な修飾としては、モノマーの挿入、欠失、及び置換が挙げられる。修飾酵素はまた、２又は３つ以上の親に由来する識別可能な構成成分配列（例：構造又は機能ドメインなど）を有するキメラ酵素も含む。また、修飾酵素の定義には、参照配列の化学修飾を含んで成るものも含まれる。修飾ポリメラーゼの例としては、Ｇ４６Ｅ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｌ３２９Ａ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｌ３２９Ａ  Ｄ６４０Ｇ  Ｓ６７１Ｆ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｌ３２９Ａ  Ｄ６４０Ｇ  Ｓ６７１Ｆ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ６  ＤＮＡポリメラーゼ、ΔＺ０５ポリメラーゼ、ΔＺ０５−Ｇｏｌｄポリメラーゼ、ΔＺ０５Ｒポリメラーゼ、Ｅ６１５Ｇ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ６７８Ｇ  ＴＭＡ−２５ポリメラーゼ、及びＥ６７８Ｇ  ＴＭＡ−３０ポリメラーゼなどが挙げられる。
【００５４】
「５’から３’ヌクレアーゼ活性 (5' to 3' nuclease activity)」又は「５’−３’ヌクレアーゼ活性」とは、核酸鎖の５’末端からヌクレオチドが除去される、通常は核酸鎖合成に伴う核酸ポリメラーゼの活性を意味し、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩはこの活性を持つが、一方クレノウ断片 (Klenow fragment)は持たない。
【００５５】
「実質的に５’−３’ヌクレアーゼ活性を欠いている」ポリメラーゼとは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと比較して、５０％以下（例：＜２５％、＜２０％、＜１５％、＜１０％）の５’−３’ヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼを意味する。５’−３’ヌクレアーゼ活性を測定する方法及び測定のための条件は、本技術分野にて公知であり、例えば、米国特許第５，４６６，５９１号を参照されたい。実質的に５’から３’ヌクレアーゼ活性を欠いているＤＮＡポリメラーゼの例としては、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片；Ｎ末端の２３５のアミノ酸を欠くサーマス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）（例：米国特許第５，６１６，４９４号に記載の通りであり、本技術分野では、一般的に、「ストッフェル断片（Stoffel fragment）」と称される）が挙げられる。その他の例としては、５’−３’ヌクレアーゼ活性を担うドメインを除去又は不活性化するのに充分な欠失（例：Ｎ末端欠失）、変異、又は修飾を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、例えば、米国特許第５，７９５，７６２号を参照されたい。
【００５６】
「標識」とは、分子と結合され（共有結合又は非共有結合により）、その分子に関する情報を提供することができる部分を意味する。代表的な標識としては、蛍光標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、質量修飾基、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、及び酵素（ペルオキシダーゼ、ホスファターゼなどを含む）が挙げられる。
【００５７】
核酸増幅反応に関する「ホットスタート」とは、１若しくは複数のプライマーの必要なハイブリダイゼーション特異性を提供するのに充分に温度が上昇されるまで、少なくとも１つの不可欠な試薬が反応混合物への投入を保留される（又は、反応混合物中に存在する場合は、その試薬が不活性に維持される）プロトコルを意味する。「ホットスタート酵素」は、ホットスタートプロトコルにおいて、「投入を保留される」又は不活性な試薬として作用することができる酵素であり、通常は核酸ポリメラーゼである。
【００５８】
「反応混合物」の用語は、ある反応を実施するのに必要である試薬を含有する溶液を意味する。増幅反応を実施するのに必要である試薬を含有する溶液を意味する「増幅反応混合物」は、通常、適切な緩衝液中に、オリゴヌクレオチドプライマー及びＤＮＡポリメラーゼ又はリガーゼを含有する。「ＰＣＲ反応混合物」は、通常、適切な緩衝液中に、オリゴヌクレオチドプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ  ｄＮＴＰ、及び二価金属カチオンを含有する。反応混合物は、それが反応を可能とするのに必要であるすべての試薬を含有する場合は、完全である (complete)と、それが必要である試薬のサブセットのみを含有する場合は、不完全である (incomplete)と称される。反応成分は、便益性、保存、安定性、又は成分濃度の用途に応じた調節を可能とするという理由から、各々が全成分のサブセットを含有する別々の溶液として慣行的に保存されること、並びに反応成分は、反応の前に組み合わされて完全な反応混合物が作製されることは、当業者であれば理解されるであろう。
【００５９】
本明細書で用いられる場合、「キット」の用語は、サンプルに対するプロセス、方法、アッセイ、分析、又は操作を容易とする物品の組み合わせに関して用いられる。キットは、キットの使用方法を記載した文書での指示書（例：本発明の方法を記載する指示書）、その方法に必要とされる化学試薬又は酵素、プライマー及びプローブ、並びにその他の成分を含んでよい。
【００６０】
本発明は、特定の修飾ヌクレオチドは、鋳型核酸上に存在する場合に、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーオリゴヌクレオチドの伸長を防止又は阻止することができるが、プライマー上のその相補性塩基とのワトソン・クリック塩基対形成は依然として維持することができるという発見に基づいている。１つのそのような修飾ヌクレオチドは、デオキシグアノシン類似体のＮ2−ベンジル−デオキシグアノシン（Ｎ2−ベンジル−ｄＧ）であり、これは、図１Ａに示されるように、環外アミノ基のＣ−２窒素上にベンジル基を有する。環外アミノ基の共有結合による修飾を有するヌクレオチドは、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。そのようなヌクレオチド、及びそのようなヌクレオチドを取り込んだオリゴヌクレオチドの合成も、‘６１１特許に記載されている。
【００６１】
理論に束縛されるものではないが、Ｎ2−ベンジル−ｄＧは、二本鎖ＤＮＡのマイナーグルーブを占有し、それによって「マイナーグルーブバインダー (minor groove binder)」として挙動してＤＮＡポリメラーゼの活性部位に干渉することで、プライマーの伸長を防止することができるものと考えられる。しかしながら、３つの水素結合がベンジル部分の存在によって影響されないことから、相補性デオキシシトシン（ｄＣ）ヌクレオチドとの塩基対形成を起こすことは依然として可能である（図１Ｂ）。
【００６２】
従って、１つの態様では、本発明は、鋳型ヌクレオチド配列とハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼによる伸長を防止する方法に関し、その方法は、鋳型ヌクレオチド配列上にマイナーグルーブバインダーを取り込むことを含んで成り、ここで、マイナーグルーブバインダーは、修飾ヌクレオチドであり、修飾ヌクレオチドは、Ｎ2−ベンジル−ｄＧであり、並びにここで、プライマーは、Ｎ2−ベンジル−ｄＧヌクレオチドの位置を超えて、２個を超えるヌクレオチドによって伸長され得ない。この方法は、ＰＣＲ増幅、核酸シーケンシング、ジェノタイピング、及び鋳型特異的な様式でのプライマーの伸長を用いるその他の用途の実施に適用可能であろう。
【００６３】
Ｎ2−ベンジル−ｄＧの独特の特性はまた、プライマーに基づく増幅反応における非特異的増幅の減少又は防止にそれを用いることを可能とするものである。非特異的増幅は不安定で一過性のハイブリダイゼーション二重鎖がプライマーと非標的分子との間に形成される場合に発生するものと考えられ、この場合、プライマーの３’末端が、他の分子の相補性塩基と一時的に対形成される。最初のプライマー伸長は、その二重鎖を安定化し、さらなる伸長を可能とする相補性配列の形成をもたらす。米国特許第６，００１，６１１号には、一過性ハイブリダイゼーション二重鎖がプライマーと別のプライマーとの間に形成されるプライマー二量体の形成に起因する非特異的増幅を防止するための修飾ヌクレオチド含有プライマーの使用が開示されている。Ｎ2−ベンジル−ｄＧは、続いての増幅サイクルの鋳型として用いられるプライマー伸長産物中にそれが存在すると、プライマー伸長の停止を引き起こすことから、非特異的増幅の防止のためのプライマーには用いられない。しかし、プローブ（例えば、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲアッセイにおける５’ヌクレアーゼプローブ）を用いる増幅反応では、Ｎ2−ベンジル−ｄＧを取り込むことで、プライマーとプローブとの間で発生するハイブリダイゼーションに起因する非特異的増幅の減少又は防止という結果が得られた。
【００６４】
従って、別の態様では、本発明は、増幅反応の間における核酸の非特異的増幅を減少させるか、又は防止する方法に関し、その方法は、標的核酸配列を増幅することができる少なくとも１対のプライマーオリゴヌクレオチドを提供すること；プライマーがプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするときに、マイナーグルーブバインダーの位置を超えた、２個を超えるヌクレオチドによる、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長を阻害するマイナーグルーブバインダーを取り込むプローブオリゴヌクレオチドを提供することを含んで成る。１つの実施形態では、マイナーグルーブバインダーは、修飾ヌクレオチドである。別の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、Ｎ2−ベンジル−ｄＧである。
【００６５】
別の態様では、本発明は、核酸の増幅のための反応混合物を提供し、少なくとも１対のプライマーオリゴヌクレオチド、及び、Ｎ2−ベンジル−ｄＧヌクレオチドを取り込む少なくとも１つのプローブオリゴヌクレオチドを含んで成る。いくつかの実施形態では、反応混合物は、さらに、核酸の増幅に一般的に必要である試薬及び溶液も含んで成り、ヌクレオチド取り込み生体触媒、核酸前駆体、すなわちヌクレオシド３リン酸、並びにヌクレオチド取り込み生体触媒の活性の補助に適する有機及び無機イオンが挙げられる。
【００６６】
別の態様では、本発明は、本発明に従う増幅反応を実施するためのキットを提供する。キットは、一般的には、アッセイに特異的な成分、並びにＤＮＡ増幅アッセイの実施に一般的に必要とされる成分を含む。アッセイに特異的な成分として、本発明の増幅キットは、通常、少なくとも１対のプライマーオリゴヌクレオチド、Ｎ2−ベンジル−ｄＧヌクレオチドを取り込む少なくとも１つのプローブオリゴヌクレオチド、及び本発明の増幅反応を行うための１セットの指示書を含む。ある実施形態では、キットは、２又は３対以上のプライマーオリゴヌクレオチド及び２又は３対以上のプローブオリゴヌクレオチドを含み、ここで、各プローブオリゴヌクレオチドは、Ｎ2−ベンジル−ｄＧヌクレオチドを取り込む。核酸増幅に一般的に必要とされる成分として、本発明のキットは、通常、１又は２つ以上のヌクレオチド取り込み生体触媒、ヌクレオシド３リン酸（デオキシリボヌクレオシド３リン酸又はリボヌクレオシド３リン酸）などの核酸前駆体、所望に応じて含んでよいものとして、核酸の加ピロリン酸分解 (pyrophosphorolysis) を最小限に抑えるためのピロホスファターゼ、増幅反応の過程で持ち越される汚染物に対する保護のためのウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）、及び予め作製された試薬、並びに増幅反応及び検出に必要である緩衝液を含む。
【００６７】
以下の実施例及び図面は、添付の請求項にその正確な範囲が示される本発明の理解を補助するために提供される。
【実施例】
【００６８】
実施例１  プライマー伸長
図２に図で示されるように、Ｎ2−ベンジル−ｄＧを含有する鋳型核酸がＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長を阻害することができることを実証するために、以下に示す配列を有するＦＡＭ標識プライマーオリゴヌクレオチド及び３つの相補性鋳型オリゴヌクレオチドを用いたプライマー伸長実験を設定した。
【００６９】
ＮＪＳ０１    ＦＡＭ−ＣＣＣＴＣＧＣＡＧＣＣＧＴＣＣＡＡＣＣＡＡＣＴＣＡ（配列番号１）
ＮＪＳ０３    ＧＧＧＡＧＣＧＴＣＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＴＴＧＡＧＴＡＧＧＴＣＴＴＧＴＴＴ（配列番号２）
ＮＪＳ３３９−１Ａ    ＣＧＧＡＧＣＧＴＣＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＴＴＧＡＧＴＡＧＥＴＣＴＴＧＴＴＴ（配列番号３）
ＮＪＳ３３９−２Ａ    ＣＧＧＡＧＣＧＴＣＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＴＴＧＡＧＴＡＧＧＴＣＴＴＥＴＴＴ（配列番号４）
（Ｅ＝Ｎ2−ベンジル−ｄＧ）
【００７０】
各プライマー伸長反応液（５０μＬ）は、５０ｎＭ  プライマー及び７５ｎＭ  鋳型オリゴヌクレオチドを、１５ユニット（２０ｎＭ）  Ｚ０５Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰを各々３３７．５μＭ、５０ｍＭ  トリシン（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  酢酸カリウム（ｐＨ７．０）、３ｍＭ  酢酸マンガン、４％  グリセロール、５％  ＤＭＳＯ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０と共に含有していた。Ｚ０５Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を、６０℃で実施し、様々な時間点にてＥＤＴＡを添加することで反応を停止した。プライマー伸長産物は、ホルムアミドを含むローディング緩衝液で希釈し、標識サイズ標品の存在下でのキャピラリー電気泳動（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）で分析した。
【００７１】
結果を図３に示す。Ｎ2−ベンジル−ｄＧを含有する鋳型からの伸長産物は、コントロール鋳型からの伸長産物よりも明らかに小さい。このことは、Ｎ2−ベンジル−ｄＧ残基を含有する鋳型核酸が、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長速度を停止、又は劇的に低下させることができることを示している。
【００７２】
実施例２  二重鎖安定性
ハイブリダイゼーションに対するＮ2−ベンジル−ｄＧの効果を調べるために、未修飾相補性オリゴヌクレオチド、及び３つの試験オリゴヌクレオチドを用いた融解温度実験を行った。融解温度の特定を行った３つの試験オリゴヌクレオチドは、（ａ）未修飾コントロールオリゴヌクレオチド、（ｂ）Ｎ−９位にＮ2−ベンジル−ｄＧを有する（ａ）と同一の配列を持つオリゴヌクレオチド、並びに（ｃ）Ｎ−４位にＮ2−ベンジル−ｄＧを有する（ａ）と同一の配列を持つオリゴヌクレオチドを表す。これらのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は以下の通りである：
【００７３】
相補鎖    ３’−ＡＡＡＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＣＧＡＣＧＣＴＣＣＧ（配列番号５）
試験コントロール    ５’−ＴＴＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＧＡＧＴＴＧＧＴＴＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＣ（配列番号６）
試験Ｎ−９    ５’−ＴＴＴＧＴＴＣＴＥＧＡＴＧＡＧＴＴＧＧＴＴＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＣ（配列番号７）
試験Ｎ−４    ５’−ＴＴＴＥＴＴＣＴＧＧＡＴＧＡＧＴＴＧＧＴＴＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＣ（配列番号８）
【００７４】
実験条件は以下の通りとした。各反応液は、５０μＬの体積にて、２つの反復サンプルとして調製し、９０ｍＭ  酢酸カリウム（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ  トリシン（ｐＨ８．３）、３ｍＭ  酢酸第一マンガン、３％グリセロール、５％  ＤＭＳＯ、各々３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及び６００μＭのｄＵＴＰを含有する緩衝液中に、各試験オリゴヌクレオチドの４０ｐｍｏｌ及び相補性オリゴヌクレオチドの４０ｐｍｏｌを含有していた。各試験オリゴヌクレオチドと相補性オリゴヌクレオチドとの間で形成されたハイブリダイゼーション二重鎖の融解温度を、以下の条件下にて、ＬｉｇｈＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０の機器を用いて特定した。各反応ウェルを、まず９１℃まで加熱し、４０℃まで急冷して、アニーリングを起こさせた。次に、０．０６℃／秒の昇温速度にて温度を連続的に９０℃まで上昇させた。二本鎖ＤＮＡ結合染料Ｓｙｔｏ−１３（最終濃度１００μＭ）による蛍光の変化を介して、ＤＮＡ二重鎖融解を検出した。
【００７５】
実験の結果を図４に示し、上側のパネルは、温度の関数としてプロットした絶対蛍光を示し、下側のパネルは、同じ融解曲線データであるが、一次導関数プロット（温度の関数として）として示している。コントロールオリゴヌクレオチドとＮ2−ベンジル−ｄＧを含有するオリゴヌクレオチドとの間には、僅かな融解温度差しか観察されず、ΔＴｍ値は０．３℃〜０．５℃であった。従って、オリゴヌクレオチド中にＮ2−ベンジル−ｄＧが存在することは、Ｎ2−ベンジル−ｄＧ含有オリゴヌクレオチドと相補性核酸配列との間で形成されたハイブリダイゼーション二重鎖の大きな不安定化には繋がらない。この実験は、プローブのハイブリダイゼーション特性に悪影響を及ぼすことなく、Ｎ2−ベンジル−ｄＧをプローブオリゴヌクレオチド（例：ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）中に取り込むことができることを実証するものである。
【００７６】
実施例３  開裂効率
Ｎ2−ベンジル−ｄＧを含有する５’−ヌクレアーゼオリゴヌクレオチドプローブを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイにおいて、ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’ヌクレアーゼ活性によって効果的に開裂可能であるかどうかを調べるために、以下の実験を行った。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＢＶ、及びＨＣＶ中の特定のウイルス配列を標的とするＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを、Ｎ2−ベンジル−ｄＧ残基を１つ含有するように修飾した。次に、修飾ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの各々を、ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’ヌクレアーゼ活性によっていかに効果的にプローブが開裂されるかを示すものであるそのアンプリコン検出能について、標的特異的プライマー及びＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼを用いた標準的なキネティックＰＣＲにて、その対応物である未修飾ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと比較した。
【００７７】
ＰＣＲサイクル数に対して蛍光をプロットした各ＰＣＲ反応に対する成長曲線で表される結果を図５に示す。各標的に対して、Ｎ2−ベンジル−ｄＧ修飾ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて作成した成長曲線と、未修飾ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたものとの間には、ほとんど又はまったく違いがない。このことは、Ｎ2−ベンジル−ｄＧ含有ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのＤＮＡポリメラーゼによる開裂効率が、Ｎ2−ベンジル−ｄＧを含有しないＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのそれと同一であることを実証するものである。
【００７８】
実施例４  偽陽性 (false positive) の低減
蛍光ＪＡ２７０染料で標識したＨＣＶ特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを含有するチャネルにて、非特異的増幅に起因する偽陽性データの出現が観察された。表１に示されるように、Ｎ2−ベンジル−ｄＧをＨＣＶ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ中に取り込むことにより、ＪＡ２７０チャネル（チャネル３）中の偽陽性シグナルの存在を取り除くことができた。
【００７９】
【表１】
0006001674.tif 000002
【００８０】
実施例５  マルチプレックスＰＣＲアッセイにおける偽陽性の減少
偽陽性を減少させる手段としてのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのＮ2−ベンジル−ｄＧ修飾の可能性を示す目的で、従来のプローブ、及びプローブ配列中の特定の位置にＮ2−ベンジル−ｄＧを持つプローブを用いて偽陽性発生率を測定する実験を行った。高度に最適化された増幅系では、偽陽性は比較的稀であることから、非特異的増幅産物の生成に有利である修飾ＰＣＲマスターミックスを開発した。このモデル系では、比較的限定された数のインプットサンプルから、発生率間の統計的な有意差が明らかとなるように、高レベルの偽陽性を誘発することができる。
【００８１】
検出されるべきウイルスについて陰性であることが既に確認されている正常ヒト血清（ＮＨＰ、各々８５０μＬ、試験した各条件についてＮ＝３８８）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のサンプルを、自動ＤＮＡ調製及び増幅システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｉｌｏｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて処理した。サンプル調製システムを経た各サンプルからの溶出液を回収し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ検出のために、増幅プレートへ分配した（各ウェルに２５μＬ）。次に、フォワード及びリバースプライマー、並びにＮ2−ベンジル−ｄＧ有り又は無しのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを含有する２５μＬの活性化マスターミックス（６．６ｍＭ  酢酸マンガン  ｐＨ  ６．１、０．０３６μＭ  酢酸ナトリウム、１０．８％  ＤＭＳＯ、０．０５４μＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ７．０、２４０ｍＭ  酢酸カリウム  ｐＨ  ７．０、６％  グリセロール、１２０ｍＭ  トリシン  ｐＨ  ８．０、０．４Ｕ／μＬ  ＵＮＧ、８００μＭ  ｄＧＴＰ、８００μＭ  ｄＡＴＰ、８００μＭ  ｄＣＴＰ、１６００μＭ  ｄＵＴＰ、１．８Ｕ／μＬ  ＺＯ５−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼ）を添加して、最終反応体積を５０μＬとし、プレートをシールし、サーモサイクラーへ導入した。熱サイクルプロファイルを、以下の表２に示すように実施した。
【００８２】
【表２】
0006001674.tif 000003
【００８３】
この実験で用いたフォワード及びリバースプライマー配列は、０．１２５μＭから０．３μＭの最終濃度範囲であり、以下から選択した。ＨＩＶ１型（ＨＩＶ−１）ＧＡＧには配列番号９から２４；ＨＩＶ−１  ＬＴＲには配列番号２５から３２；ＨＩＶ２型（ＨＩＶ−２）には配列番号３３から３５；ＨＢＶには配列番号３６及び３７；ＨＣＶには配列番号３８〜５９。
【００８４】
この実験で用いたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ配列は、０．１５μＭから０．３μＭの最終濃度範囲であり、以下から選択した。ＨＩＶ−１  ＧＡＧには配列番号６０から６４；ＨＩＶ−１  ＬＴＲには配列番号６５及び６６；ＨＩＶ−２には配列番号６７；ＨＢＶには配列番号６８；ＨＣＶには配列番号６９〜７６。プローブはすべて５’末端にて蛍光染料で標識され：ＨＩＶ（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の両方）プローブにはＦＡＭ、ＨＢＶプローブにはＨＥＸ、及びＨＣＶプローブにはＪＡ２７０であり、内部ＢＨＱ−２消光剤分子を含有していた。
【００８５】
Ｎ2−ベンジル−ｄＧ修飾ヌクレオチドを含有するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの場合、プローブのおよそ中央の位置に配置される内部デオキシグアノシン残基を、ｄＧからＮ2−ベンジル−ｄＧに修飾した。例えば、ＨＩＶ−２プローブ（配列番号６７）では、５’末端からの１２位におけるｄＧ残基をＮ2−ベンジル−ｄＧに変換した。同様に、ＨＢＶプローブ（配列番号６８）では、５’末端からの２０位にＮ2−ベンジル−ｄＧを配置した。
【００８６】
Ｎ2−ベンジル−ｄＧによる偽陽性減少のための上述した実験の結果は以下の通りである。従来のプローブ（すなわち、Ｎ2−ベンジル−ｄＧ無し）を用いたアッセイでは、３８８サンプルのうち、ＦＡＭシグナル（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の検出用）はいずれも検出されず、ＨＥＸシグナル（ＨＢＶ検出用）は１サンプルで、ＪＡ２７０シグナル（ＨＣＶ検出用）は３９サンプルで検出された。このことから、偽陽性率１０．３％、特異性３４８／３８８、又は８９．７％が導かれる。Ｎ2−ベンジル−ｄＧプローブを用いたアッセイでは、ＦＡＭシグナルは検出されず、ＨＥＸシグナルは１サンプルで、ＪＡ２７０シグナルは１９サンプルで検出され、このことからは、偽陽性率５．１５％、特異性３６８／３８８、又は９４．８５％が導かれる。従って、ＨＣＶ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ中にＮ2−ベンジル−ｄＧを取り込むことによって、ＪＡ２７０チャネルにおいて、偽陽性シグナルの５０％の減少が得られた。
【００８７】
本発明を具体的な例を参照して詳細に述べてきたが、当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な改変を行うことが可能であることは明らかであろう。
【図１（Ａ）】
0006001674.tif 000004
【図１（Ｂ）】
0006001674.tif 000005
【図２（Ａ）】
0006001674.tif 000006
【図２（Ｂ）】
0006001674.tif 000007
【図２（Ｃ）】
0006001674.tif 000008
【図３Ａ−１】
0006001674.tif 000009
【図３Ａ−２】
0006001674.tif 000010
【図３Ａ−３】
0006001674.tif 000011
【図３Ｂ−１】
0006001674.tif 000012
【図３Ｂ−２】
0006001674.tif 000013
【図３Ｂ−３】
0006001674.tif 000014
【図４】
0006001674.tif 000015
【図５Ａ】
0006001674.tif 000016
【図５Ｂ】
0006001674.tif 000017
【図５Ｃ】
0006001674.tif 000018
【図５Ｄ】
0006001674.tif 000019
【図５Ｅ】
0006001674.tif 000020
【配列表】
0006001674000001.app