(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｆ１の第一の機能的部分を含む式Ｒ１−Ｈの化合物を式Ｆ２の第二の機能的部分に連結するための試薬としての、式（Ｉａ）の化合物の使用：
【化１】
0005954789.tif 000175
式中、
Ｘ及びＸ’はそれぞれ酸素を示し；
Ｙは求電子性脱離基であり；
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示すか、又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；
Ｒ２は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示し；
式Ｙのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し；
式Ｎｕのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２及び−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）から選択される求核剤を示し；
式Ｌのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し；
式Ｚのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項1に記載の第二の機能的部分を含む
化合物と反応し得る、式Ｌの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Ｌの基に連結され；
ｎは、１、２又は３であり；
式ＩＧのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、これらの基において、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基に置き換わっており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基に置き換わっており、これらの基において、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ニトロ及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基に置き換わっており；
・該第一の機能的部分及び第二の機能的部分のいずれか一方は、抗体又は抗体断片であるタンパク質であり、該第一の機能的部分及び第二の機能的部分のもう一方は薬物であるか；
・該第一の機能的部分及び第二の機能的部分のいずれか一方は、ペプチド、タンパク質、多糖、ポリエーテル、ポリアミノ酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（メタ）アクリル酸及びその誘導体、ポリウレタン及びポリホスファゼンから選択されるポリマー部分であり、該第一の機能的部分及び第二の機能的部分のもう一方は薬物であるか；又は
・該第一の機能的部分及び第二の機能的部分のいずれか一方は、抗体又は抗体断片であるタンパク質であり、該第一の機能的部分及び第二の機能的部分のもう一方は検出可能部分であり；
基Ｒ１は、式（Ｉａ）の化合物の２位において、式Ｒ１−Ｈの化合物中の第一のＳＨ基の求核攻撃によって式（Ｉａ）の化合物に結合され、その結果２位の基Ｙが基Ｒ１に置き換わられる。
【請求項２】
（Ａ）：
Ｙが、ハロゲン原子又はトリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、Ｃ１−６アルキルチオ、５〜１０員のヘテロシクリルチオ、Ｃ６−１０アリールチオ、Ｃ３−７カルボシクリルチオ、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３、フェニルオキシ、−ＮＲｘＲｙＲｚ＋若しくは−ＰＲｘＲｙＲｚ＋基であり、式中、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは、同じ又は異なって、水素原子並びにＣ１−６アルキル及びフェニル基から選択される；及び／又は
（Ｂ）：
Ｌが、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキレン基、Ｃ２−２０アルケニレン基又はＣ２−２０アルキニレン基である部分を示し、これらの基において、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基に置き換わっており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基に置き換わっており、これらの基において、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ニトロ及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基に置き換わっている；及び／又は
（Ｃ）：
Ｚが、
（ａ）式−ＬＧ、−Ｃ（Ｏ）−ＬＧ、−Ｃ（Ｓ）−ＬＧ又は−Ｃ（ＮＨ）−ＬＧの基（式中、ＬＧは求電子性脱離基である）；
（ｂ）−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２基から選択される求核剤Ｎｕ’；
（ｃ）求核剤と開環求電子反応し得る環式部分Ｃｙｃ；
（ｄ）式−Ｓ（Ｏ２）（Ｈａｌ）の基（式中、Ｈａｌはハロゲン原子である）；
（ｅ）式−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ又は−Ｎ＝Ｃ＝Ｓの基；
（ｆ）式−Ｓ−Ｓ（ＩＧ’）の基（式中、ＩＧ’は、請求項２に記載の式ＩＧの基を示す）；
（ｇ）１個以上のハロゲン原子によって置換されたＣ６−１０アリール基である、基ＡＨ；
（ｈ）紫外線光への曝露によって活性化され得る光反応性基；
（ｉ）式−Ｃ（Ｏ）Ｈ又は−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−６アルキル）の基；
（ｊ）マレイミド基；
（ｋ）式−Ｃ（Ｏ）ＣＨＣＨ２の基；
（ｌ）式−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｎ２）Ｈ又は−ＰｈＮ２＋の基（式中、Ｐｈはフェニル基を示す）；若しくは
（ｍ）エポキシド基、
を示す；及び／又は
（Ｄ）：
ＩＧが、非置換のＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基又はＣ２−６アルキニル基である部分を示し、これらの基において、（ａ）０又は１個の炭素原子は、フェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基に置き換わっており、該フェニレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシ基から選択される１又は２個の置換基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｃ（Ｏ）−基から選択される基に置き換わっている；及び／又は
（Ｅ）：
ｎが１である、
請求項１に記載の使用。
【請求項３】
式（Ｉａ）の化合物が式（Ｉｂ）の化合物
【化２】
0005954789.tif 000176
であり、式中、
Ｘ及びＸ’はそれぞれ酸素原子を示し；
Ｒ３３’は水素原子又はＣ１−６アルキル基を示し；
Ｙはハロゲン原子を示し；
Ｒ２は水素若しくはハロゲン原子又はＣ１−６アルキル基を示す、
請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ１が式−Ｆ１の基であり；
Ｆ１が、少なくとも第一のシステイン残基を含むペプチド又はタンパク質であり；
基Ｒ１が、式（Ｉａ）の化合物の２位において、該第一のシステイン残基のチオール基の求核攻撃によって式（Ｉａ）の化合物に結合され、その結果基Ｙが基Ｒ１中の第一のシステイン残基中のチオール基に由来する式−Ｓ−の基に置き換わった請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ２が式Ｙの基であり；
Ｒ１がさらに、少なくとも第二のシステイン残基を含み；かつ
基Ｒ１が、式（Ｉａ）の部分の３位において、該第二のシステイン残基のチオール基の求核攻撃によって式（Ｉａ）の化合物にさらに結合され、その結果基Ｒ２が基Ｒ１中の第二のシステイン残基中のチオール基に由来する式−Ｓ−の基に置き換わった、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
コンジュゲートを産生するためのプロセスであって、
（ｉ）式（Ｉａ）の化合物を式Ｒ１−Ｈの化合物と反応させて、式（ＩＩ）の化合物を産生する工程
【化３】
0005954789.tif 000177
（ｉｉ）その後、式Ｆ２の部分を該式（ＩＩ）の化合物に連結する工程
を含み、
工程（ｉ）は、式（Ｉａ）の化合物の２位において、式Ｒ１−Ｈの化合物中の第一のＳＨ基の求核攻撃によって基Ｒ１を結合させることを含み、その結果２位の基Ｙは基Ｒ１によって置き換わられ、
Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ３’、及びＦ２は全て、請求項１〜５のいずれか１項に記載したとおりである、プロセス。
【請求項７】
請求項６に記載のプロセスであって、
（Ａ）：
該プロセスは、式（ＩＩ）の２位と３位との間の炭素−炭素二重結合へのＦ２の求電子付加反応によって、Ｆ２を式（ＩＩ）の化合物に連結する工程を含む；又は
（Ｂ）：
Ｒ３及びＲ３’が一緒になって式−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ若しくは−Ｌ（Ｚ）ｎの基を示し、該プロセスは、Ｆ２と（ｉ）式−Ｎ（Ｒ３３’）−の部分の窒素原子又は（ｉｉ）式Ｙ、Ｎｕ若しくは−Ｌ（Ｚ）ｎの基との間の反応によって、Ｆ２を式（ＩＩ）の部分に連結する工程を含む；又は
（Ｃ）：
Ｒ２が、式Ｙ、Ｎｕ又は−Ｌ（Ｚ）ｎの基を示し、該プロセスは、Ｆ２と式Ｙ、Ｎｕ又は−Ｌ（Ｚ）ｎの基との間の反応によって、Ｆ２を式（ＩＩ）の化合物に連結する工程を含む。
【請求項８】
コンジュゲートを産生するためのプロセスであって、該プロセスは、
式Ｒ１−Ｈの化合物を、式（ＩＩａ）の化合物：
【化４】
0005954789.tif 000178
と反応させる工程を含み、式中、
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示すか、又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、各Ｒ３３ａ’は、同じ又は異なって、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し；
Ｒ２ａは、式Ｒ２の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し；
ｍは、０からｎまでの値を有する整数であり；
式（ＩＩａ）の化合物は、少なくとも１個の式Ｆ２の基を含み；
Ｆ２は、請求項１に記載したとおりであり；
Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ３３’、Ｒ２、Ｌ、Ｚ及びｎは全て、請求項１〜３のいずれか１項に記載したとおりであり；
Ｒ１は、請求項１、４又は５に記載したとおりであり；
該プロセスは、式（ＩＩａ）の化合物の２位において、式Ｒ１−Ｈの化合物中の第一のＳＨ基の求核攻撃によって基Ｒ１を結合させることを含み、その結果２位の基Ｙが基Ｒ１に置き換わられる、プロセス。
【請求項９】
（ｉ）式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩａ）の化合物を、提供する工程；及び
（ｉｉ）ホスフィン化合物、亜リン酸塩化合物、チオール、セレノール、アミン及びソフトカーボン求核化合物から選択される試薬と共に、式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩａ）の化合物をインキュベートすることにより、式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩａ）の化合物の２位において、基Ｒ１と炭素原子との間の結合を切断する工程、
を含み、
【化５】
0005954789.tif 000179
［式中、
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示すか、又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、各Ｒ３３ａ’は、同じ又は異なって、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し、；
Ｒ２ａは、式Ｒ２の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し；
ｍは、０からｎまでの値を有する整数であり；
Ｒ１は、請求項１、４又は５に記載したとおりであり；
Ｆ２は、請求項１に記載したとおりであり；
Ｘ、Ｘ’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ３３’、Ｒ２、Ｌ、Ｚ及びｎは全て、請求項１〜３のいずれか１項に記載したとおりである。］
該プロセスが式（ＩＩＩａ）の化合物を含む場合、
式（ＩＩＩａ）の化合物のＲ１は、少なくとも第一のチオール基及び第二のチオール基を含み、該第一のチオール基は、式（ＩＩＩａ）の化合物中の２位に結合し、第二のチオール基は、式（ＩＩＩａ）の化合物中の３位に結合しており；
工程（ｉｉ）が、ホスフィン化合物、亜リン酸塩化合物、チオール、セレノール、アミン及びソフトカーボン求核化合物から選択される試薬と共に、式（ＩＩＩａ）の化合物をインキュベートすることにより、式（ＩＩＩａ）の部分の３位において、基Ｒ１と炭素原子との間の結合を切断することを更に含む、プロセス。
【請求項１０】
請求項８に記載の式（ＩＩａ）の化合物（但し、Ｒ２ａは、グルコピラノシルチオではない。）。
【請求項１１】
式Ｆ２の基を少なくとも１個含み、Ｒ２ａが水素原子ではない、請求項９に記載の式（ＩＩＩ）の化合物。
【請求項１２】
請求項９に記載の、式（ＩＩＩａ）の化合物。
【請求項１３】
式Ｆ２の基を少なくとも１個含む、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ１が、少なくとも第１のシステイン残基と第２のシステイン残基を含むペプチド又はタンパク質であり、
Ｒ１は、該第１のシステイン残基中のチオール基に由来する式−Ｓ−の基により式（ＩＩＩａ）の化合物中の２位に結合し、かつ
Ｒ１は、該第２のシステイン残基中のチオール基に由来する式−Ｓ−の基により式（ＩＩＩａ）の化合物中の３位に結合する、請求項１２又は１３に記載の化合物。
【請求項１５】
式（ＩＶａ）又は（ＩＶｂ）の化合物
【化６】
0005954789.tif 000180
［式中、
Ｒ１は、請求項１、４又は５に記載したとおりであり；
Ｘ、Ｘ’、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は、請求項９に記載したとおりであり；
Ｒ４は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルコキシ、チオール、Ｃ１−６アルキルチオ若しくはＣ１−６アルキルカルボニルオキシ基、又は式Ｆ２の基であり；
基Ｒ２ａ及びＲ４の少なくとも一方は、式Ｆ２の基を含み；
Ｆ２は、請求項１に記載したとおりである］。
【請求項１６】
請求項１１、請求項１３又は請求項１５に記載の化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１７】
コンジュゲートがマレイミド環を含み、該プロセスが該マレイミド環の開環をもたらす工程を更に含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１８】
式（ＩＩＩａ）の化合物において、Ｒ１の第１のシステイン残基と第２のシステイン残基が該ペプチド又はタンパク質中で形成された内部ジスルフィド結合に由来する、請求項１４に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（導入）
それぞれが特定の機能的特性を有する２以上の分子を一緒に連結することが望ましい場合があることは周知である。この方法では、コンジュゲートとして知られる新たな分子を生成することが可能となり、このコンジュゲートはそれらの成分を合わせた特徴を有する。この技術は、広く適用可能な制御された様式で、機能的に有用な分子の既存の特性を修飾するため又は全く新たな機能的側面をかかる分子に付加するための魅力的な手段を提供する。
【背景技術】
【０００２】
２つ以上の機能的化合物を一緒にコンジュゲート化する可能性は、バイオテクノロジー分野で特に強い興味を刺激している。タンパク質などの生体分子又は薬物などの生物活性分子の、二次的な機能的分子へのコンジュゲート化は、検出技術、プロテオミクス研究、精製法、並びに疾患の診断及び治療を含む広汎な適用において使用されてきた。これらの方法論は、この話題に特化した標準的教科書が現在入手可能なほど、普遍的である。１つのかかる教科書は「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，１９９６）であり、その内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０００３】
多様な機能的化合物を一緒に連結するための方法は典型的に、比較的小さいクロスリンカー（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）分子の使用に注目したものである。このタイプの連結試薬は、少なくとも２つの官能基を含む。これらの官能基の各々は、架橋された最終コンジュゲート分子を生成するために、機能的分子と反応することができる。
【０００４】
クロスリンカー試薬のための非常に広範な種々の官能基が、一緒に連結される機能的分子上に存在する特定の標的官能基と反応するために開発されている。例えば、活性化エステル基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を含むクロスリンカーが、反応性アミン基を含む機能的部分（例えばタンパク質）との反応のために長い間使用されてきた。ヒドラジン含有クロスリンカー（例えば、アジピン酸ジヒドラジド）は、カルボキシル含有機能的分子（例えば糖タンパク質）を官能化するために使用されている。
【０００５】
１つの機能的分子の別の機能的分子への架橋は、機能的分子中の反応性チオール基を標的化することによっても達成できる。このアプローチは、問題の機能的分子がペプチド又はタンパク質の場合に特に魅力的であり得る。この理由の１つは、チオール含有システイン残基が、典型的にはタンパク質中での天然含量が低いことであり、従って、高度に選択的な修飾手段の可能性を開いている。標準的な部位特異的変異誘発技術は、タンパク質中の特定の位置でシステイン残基を容易に挿入して反応性チオール基を生じることも可能にし、これは次いで、適切なクロスリンカーを介して機能的化合物によって修飾され得る。
【０００６】
種々の化合物が、チオール基と反応できる架橋試薬として使用されてきた。これらの試薬としては、１，２−ジカルボニルエテン誘導体、α−ハロカルボニル化合物及びチオスルホネートが挙げられる。これらのうち、１，２−ジカルボニルエテン誘導体（例えばマレイミド）は一般に、チオール、特にシステイン部分との反応のための最も選択的な試薬であると認識されている。チオール含有機能的分子（「Ｒ−ＳＨ」）中のチオール基は、マレイミドと反応して、以下のようにチオエーテル結合を生じる：
【０００７】
【化１】
0005954789.tif 000002
【０００８】
マレイミド中の反応性アミド部分は、さらなる機能的化合物との反応のために利用可能であり、チオール含有機能的分子がさらなる機能的部分に結合されたコンジュゲートを生じる。マレイミド試薬は従って、システイン含有タンパク質を、種々の二次的分子（例えば、フルオロフォア、ビオチン、ポリエチレングリコール又は炭水化物）とコンジュゲート化するのに有用である。これらの二次的分子は、化学的に不活性なリンカー種によって、マレイミド環に連結されることが多い。
【０００９】
しかし残念ながら、コンジュゲート生成のためのこのアプローチにはいくつかの欠点がある。例えば、反応生成物の化学的操作は典型的に、アミド部分でのみ可能である。このことは、単一のマレイミドリンカーでは、１つより多いさらなる官能基をチオール含有化合物に付加することが困難であり得ることを意味する。さらに、チオール含有機能的分子とマレイミドクロスリンカーとの間に形成されるチオエーテル結合は不可逆的である。従って、クロスリンカーを介してもたらされる誘導体化は恒久的であり、天然のチオール含有試薬を再生することができない。
【００１０】
チオール含有試薬とマレイミド含有クロスリンカーとの間の公知の誘導体化反応の不可逆性は、タンパク質精製、定量的プロテオミクス解析、結合部位の探索、有効な構造研究などの分野及び薬物送達におけるその実用性に対し厳しい制限を課し得る。例えば、チオール含有タンパク質とアフィニティタグ（例えばビオチン）との間のコンジュゲートの生成を含む精製方法では、精製後にマレイミドからの脱離によりネイティブタンパク質を再生することはできないであろう。チオール含有試薬を再生できないことは、発現が困難なタンパク質（例えば、多くのＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役型レセプター））に関連する手順を実施する場合にも、深刻な問題になり得る。架橋プロセスの不可逆性はまた、クロスリンカーとタンパク質との間の結合の不安定さが重要である分野（例えば、限定的な、好ましくは制御可能な期間のみにわたって酵素の活性を遮断するように、架橋実体が設計される場合）におけるバイオコンジュゲート方法論の利用を妨げる。
【００１１】
本発明は、公知の１，２−ジカルボニルエテン架橋試薬のＣ＝Ｃ二重結合に求電子性脱離基を組み込むことが有利であるという、驚くべき知見に基づいている。その化学的修飾により、Ｃ＝Ｃ二重結合を保持したまま、ペプチド又はタンパク質などのチオール含有機能的部分が架橋試薬に連結することが可能となる。これには以下の利点がある：
・クロスリンカーとチオール化合物との間の反応が、実質的に化学量論的な量のみのクロスリンカーを使用して、迅速かつ高収率で実施できることが多い。
・クロスリンカーとチオール含有分子との間のチオエーテル結合が、容易に逆転可能であり、特に、当業者によって選択された時間で、制御された様式で切断できる。
・クロスリンカーへのチオール含有機能的部分の連結後に得られる化合物中の二重結合の保持が、さらなる機能的化合物への連結のための反応部位を構成する。したがって、コンジュゲートに余分な機能的部分を付加することが、より容易であり得る。
【００１２】
新たな架橋方法論は、当該分野において現在慣用的に実施されている機能的部分のコンジュゲート化を含む公知方法の全範囲にわたって、容易に適用可能である。
【００１３】
米国特許第４，６８０，２７２号は、アミン基又はチオール基を有するタンパク質を検出するための蛍光「染色剤」としての、ハロゲン化マレイミド及びその誘導体の使用を記載している。しかしながら、米国特許第４，６８０，２７２号は、コンジュゲート分子を構築するための、Ｃ＝Ｃ二重結合に求電子性脱離基を有する１，２−ジカルボニルエテン架橋試薬の使用を開示していないし、チオール化合物とかかるクロスリンカーとの間で形成された結合が容易に逆転可能であることも、実質的に化学量論的な量のクロスリンカーを使用して高収率で実施できることが多いことも、開示していない。
【００１４】
Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００９，１３１（２９），ｐｐ  ９９８６−９９９４）は、７−オキサノルボルナジエンフレームワークに基づく、チオールに対する蛍光発生プローブの新たなクラスを記載している。この論文に記載された１つの具体的な実験において、ダンシル蛍光発生部分を有する７−オキサノルボルナジエン試薬は、ウシ血清アルブミンと反応した。得られた生成物は、逆Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応を受けて、Ｃ＝Ｃ二重結合の一方の炭素原子にウシ血清アルブミンを有し、Ｃ＝Ｃ二重結合のもう一方の炭素原子に水素原子を有する、マレイミド架橋部分を含む生成物を生じた。しかしながら、Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、コンジュゲート分子を構築するための試薬としての、求電子性脱離基を有する１，２−ジカルボニルエテンの使用を記載していない。
【００１５】
米国特許第７，５０４，４３０号Ｂ２及びＫａｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００６；５（６）Ｊｕｎｅ  ２００６  ｐｐ  １５１１−１５１９）は、３，４−ジブロモマレイミド誘導体が、置換されていてもよい低分子量メルカプトアルキル化合物と反応する、マレイミド含有医薬化合物を製造するためのプロセスを記載している。しかしながら、これらの文献は、本明細書中に記載される少なくとも２つの機能的部分を含むコンジュゲート分子を構築するためのプロセスを記載していないし、チオール化合物と本発明に従うクロスリンカーとの間で形成された結合が容易に逆転可能であることも、実質的に化学量論的な量のクロスリンカーを使用して高収率で実施できることが多いことも記載していない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
本発明は、（１）式Ｆ１の第一の機能的部分を含む式Ｒ１−Ｈの化合物を式Ｆ２の第二の機能的部分に連結するための試薬としての、式（Ｉ）の部分を含む化合物の使用を提供する：
【００１７】
【化２】
0005954789.tif 000003
【００１８】
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
Ｙは求電子性脱離基であり；
Ｒ１は、式−Ｆ１又は−Ｌ−Ｆ１の基であり、Ｌはリンカー基であり、かつＲ１−Ｈは少なくとも第一のＳＨ基を含み；
第一の機能的部分及び第二の機能的部分は、同じ又は異なって、それぞれ、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択され；
基Ｒ１は、式（Ｉ）の部分の２位において、式Ｒ１−Ｈの化合物中の第一のＳＨ基の求核攻撃によって式（Ｉ）の部分に結合され、その結果２位の基Ｙが基Ｒ１によって置換される。
【００１９】
本発明はまた、（２）コンジュゲートを産生するためのプロセスを提供し、このプロセスは、
（ｉ）式（Ｉ）の部分を含む化合物を式Ｒ１−Ｈの化合物と反応させて、式（ＩＩ）の部分を含む化合物を産生する工程
【００２０】
【化３】
0005954789.tif 000004
【００２１】
（ｉｉ）その後、式Ｆ２の部分を該式（ＩＩ）の部分に連結する工程
を含み、
工程（ｉ）は、式（Ｉ）の部分の２位において、式Ｒ１−Ｈの化合物中の第一のＳＨ基の求核攻撃によって基Ｒ１を結合させることを含み、その結果２位の基Ｙは基Ｒ１によって置換され、
Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｒ１、Ｆ２、及び式（Ｉ）の部分を含む化合物は全て、上記（１）に記載したとおりである。
【００２２】
本発明はさらに、（３）コンジュゲートを産生するためのプロセスを提供し、このプロセスは、式Ｒ１−Ｈの化合物を、（ａ）式（Ｉ）の部分及び（ｂ）それに連結された少なくとも１個の式Ｆ２の部分を含む化合物と反応させる工程を含み、
式（Ｉ）及びＦ２の部分は、それぞれ上記（１）に記載したとおりであり；
Ｒ１は、上記（１）に記載したとおりであり；
このプロセスは、式（Ｉ）の部分の２位において、式Ｒ１−Ｈの化合物中の第一のＳＨ基の求核攻撃によって基Ｒ１を結合させることを含み、その結果２位の基Ｙが基Ｒ１によって置換される。
【００２３】
なおさらに、本発明は、（４）
（ｉ）式（ＩＩ）の部分を含む化合物を提供する工程；及び
（ｉｉ）式（ＩＩ）の部分の２位において、基Ｒ１と炭素原子との間の結合を切断する工程、を含むプロセスを提供し、ここで、
Ｒ１は、上記（１）に記載したとおりであり；
式（ＩＩ）の部分は、上記（２）に記載したとおりである。
【００２４】
熟練の化学者に明らかなように、これらの使用及びプロセスは全て、公知のジカルボニルエテン架橋試薬のＣ＝Ｃ二重結合に求電子性脱離基を組み込むことが有利であるという知見によって関連している。さらに、これらの使用及びプロセスに関与する中間体及び生成物の多くは、新規であると考えられる。従って、本発明は、以下の実施形態（５）〜（９）も提供する。
【００２５】
本発明は、（５）式（ＩＩａ）の化合物を提供する：
【００２６】
【化４】
0005954789.tif 000005
【００２７】
式中、
以下のいずれかであり：
Ｒ３ａは、式Ｒ３の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し、Ｒ３ａ’は独立して、式Ｒ３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、各Ｒ３３ａ’は、同じ又は異なって、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；
Ｒ２ａは、式Ｒ２の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し；
ｍは、０からｎまでの値を有する整数であり；
式（ＩＩａ）の化合物は、少なくとも１個の式Ｆ２の基を含み；
Ｆ２は、上記（１）に記載したとおりであり；
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ、水素原子又は式Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；
Ｒ２は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示し；
式Ｅ及びＹのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し；
式Ｎｕのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２及び−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）から選択される求核剤を示し；
式Ｌのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し；
式Ｚのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項１に記載の第二の機能的部分を含む化合物と反応し得る、式Ｌの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Ｌの基に連結され；
ｎは、１、２又は３であり；
式ＩＧのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン（ｃａｒｂｏｃｙｃｌｙｌｅｎｅ）及び５〜１０員のヘテロシクリレン（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌｅｎｅ）基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ニトロ及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されている。
【００２８】
本発明は、（６）式（ＩＩｂ）の化合物も提供する：
【００２９】
【化５】
0005954789.tif 000006
【００３０】
式中、
Ｒ１は、上記（１）に記載したとおりであり、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ、水素原子又は式Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；
Ｒ２は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示し；
式Ｅ及びＹのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し；
式Ｎｕのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２及び−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）から選択される求核剤を示し；
式Ｌのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し；
式Ｚのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項１に記載の第二の機能的部分を含む化合物と反応し得る、式Ｌの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Ｌの基に連結され；
ｎは、１、２又は３であり；
式ＩＧのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ニトロ及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されている［但し、Ｒ３及びＲ３’は、一緒になって式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成しない］。
【００３１】
本発明はさらに、（７）式Ｆ２の基を少なくとも１個含み、Ｒ２ａが水素原子ではない、式（ＩＩＩ）の化合物を提供する：
【００３２】
【化６】
0005954789.tif 000007
【００３３】
式中、
以下のいずれかであり：
Ｒ３ａは、式Ｒ３の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し、Ｒ３ａ’は独立して、式Ｒ３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、各Ｒ３３ａ’は、同じ又は異なって、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；
Ｒ２ａは、式Ｒ２の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し；
ｍは、０からｎまでの値を有する整数であり；
Ｒ１は、上記（１）に記載したとおりであり；
Ｆ２は、上記（１）に記載したとおりであり；
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ、水素原子又は式Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；
Ｒ２は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示し；
式Ｅ及びＹのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し；
式Ｎｕのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２及び−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）から選択される求核剤を示し；
式Ｌのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し；
式Ｚのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項１に記載の第二の機能的部分を含む化合物と反応し得る、式Ｌの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Ｌの基に連結され；
ｎは、１、２又は３であり；
式ＩＧのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ニトロ及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されている。
【００３４】
なおさらに、本発明は、（８）式（ＩＩＩａ）の化合物を提供する：
【００３５】
【化７】
0005954789.tif 000008
【００３６】
式中、
以下のいずれかであり：
Ｒ３ａは、式Ｒ３の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し、Ｒ３ａ’は独立して、式Ｒ３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、各Ｒ３３ａ’は、同じ又は異なって、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；
ｍは、０からｎまでの値を有する整数であり；
Ｒ１は、上記（１）に記載したとおりであり、かつＲ１は、少なくとも第一のチオール基及び第二のチオール基を含み、該第一のチオール基は、式の化合物中の２位に結合し、第二のチオール基は、式（ＩＩＩａ）の化合物中の３位に結合している；
Ｆ２は、上記（１）に記載したとおりであり；
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ、水素原子又は式Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；
Ｒ２は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示し；
式Ｅ及びＹのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し；
式Ｎｕのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２及び−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）から選択される求核剤を示し；
式Ｌのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し；
式Ｚのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項１に記載の第二の機能的部分を含む化合物と反応し得る、式Ｌの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Ｌの基に連結され；
ｎは、１、２又は３であり；
式ＩＧのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ニトロ及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されている。
【００３７】
本発明は、（９）式（ＩＶａ）又は（ＩＶｂ）の化合物を提供する：
【００３８】
【化８】
0005954789.tif 000009
【００３９】
式中、
Ｒ１は、上記（１）に記載したとおりであり；
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
以下のいずれかであり：
Ｒ３ａは、式Ｒ３の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し、Ｒ３ａ’は独立して、式Ｒ３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、各Ｒ３３ａ’は、同じ又は異なって、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；
Ｒ２ａは、式Ｒ２の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し；
ｍは、０からｎまでの値を有する整数であり；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子又は式Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；
Ｒ２は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示し；
式Ｅ及びＹのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し；
式Ｎｕのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２及び−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）から選択される求核剤を示し；
式Ｌのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し；
式Ｚのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項１に記載の第二の機能的部分を含む化合物と反応し得る、式Ｌの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Ｌの基に連結され；
ｎは、１、２又は３であり；
式ＩＧのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ニトロ及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されており；
Ｒ４は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルコキシ、チオール、Ｃ１−６アルキルチオ若しくはＣ１−６アルキルカルボニルオキシ基、又は式Ｆ２の基であり；
基Ｒ２ａ及びＲ４の少なくとも一方は、式Ｆ２の基を含み；
Ｆ２は、上記（１）に記載したとおりである。
【００４０】
本発明はまた、（１０）上記（９）に記載された式（ＩＶａ）又は（ＩＶｂ）の化合物を産生するためのプロセスを提供し、このプロセスは、
（ｉ）式（ＩＩＩ）の化合物：
【００４１】
【化９】
0005954789.tif 000010
【００４２】
を提供する工程；及び
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物を式Ｒ４−Ｈの化合物と反応させる工程（式中、Ｒ４は上記（９）に記載したとおりである）
を含み、式中、
以下のいずれかであり：
Ｒ３ａは、式Ｒ３の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し、Ｒ３ａ’は独立して、式Ｒ３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、各Ｒ３３ａ’は、同じ又は異なって、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；
Ｒ２ａは、式Ｒ２の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し；
ｍは、０からｎまでの値を有する整数であり；
Ｒ１は、上記（１）に記載したとおりであり；
Ｆ２は、上記（１）に記載したとおりであり；
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ、水素原子又は式Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；
Ｒ２は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示し；
式Ｅ及びＹのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し；
式Ｎｕのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２及び−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）から選択される求核剤を示し；
式Ｌのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し；
式Ｚのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項１に記載の第二の機能的部分を含む化合物と反応し得る、式Ｌの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Ｌの基に連結され；
ｎは、１、２又は３であり；
式ＩＧのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ニトロ及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されている。
【００４３】
本発明はさらに、（１１）サンプル中の式Ｒ１−Ｈの化合物を検出するためのプロセスを提供し、このプロセスは、サンプル中の式Ｒ１−Ｈの化合物の検出を可能にする条件下で、該サンプルを、（ａ）式（Ｉ）の部分及び（ｂ）それに連結された式Ｆ２の化合物を含む化合物とインキュベートする工程を含み、
（ａ）式（Ｉ）の部分及び（ｂ）それに連結された式Ｆ２の化合物を含む化合物は、上記（３）に記載したとおりであり；
式Ｆ２の化合物は、式Ｒ１の基によって修飾され得るシグナルを生成し得る検出可能部分である。
【００４４】
なおさらに、本発明は、（１２）物質がサンプル中に存在するか否かを検出するためのプロセスを提供し、このプロセスは、
上記（７）、（８）及び（９）のいずれか１つに記載の化合物（但し、（８）に記載の化合物は、少なくとも１個の式Ｆ２の基を含む）を提供する工程であって、第一の機能的部分及び第二の機能的部分の一方は、検出可能なシグナルを生成し得る機能的部分であり、第一の機能的部分及び第二の機能的部分のもう一方は、該物質と相互作用し得る機能的部分である、工程；
該サンプルを該化合物とインキュベートする工程；及び
検出可能なシグナルを生成し得る機能的部分からの検出可能なシグナルの生成を可能にする条件下で、シグナルをモニタリングする工程、
を含む。
【００４５】
本発明はまた、（１３）物質が、式Ｒ１の機能的部分と相互作用するか否かを同定するためのプロセスを提供し、このプロセスは、
（ａ）式Ｒ１の機能的部分及び（ｂ）該物質により修飾され得るシグナルを生成し得る検出可能部分を含むコンジュゲートを、上記（２）〜（１３）のいずれかに記載のプロセスを実行することにより産生する工程；
該コンジュゲートを該物質とインキュベートする工程；
該検出可能部分からのシグナルを得る工程；及び
該シグナルを、該コンジュゲートが該物質と接触していない場合に得られ得るコントロールシグナルと比較し、それによって、該物質が該コンジュゲートと相互作用するか否かを決定する工程、
を含む。
【００４６】
さらに、本発明は、（１４）ヒト又は動物の身体に対して実施される手術若しくは治療又は診断方法によって該ヒト又は動物の身体を治療する方法において使用するための、上記（７）、（８）及び（９）のいずれか１つに記載の化合物（但し、（８）に記載の化合物は、少なくとも１個の式Ｆ２の基を含む）を提供する。
【００４７】
本発明は、式（ＶＩ）の部分及びそれに連結された機能的部分を含む化合物：
【００４８】
【化１０】
0005954789.tif 000011
【００４９】
も提供し、式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
該機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、実施例３１に記載されるプロトコルの結果を示し、該実施例では、タンパク質／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物及び未修飾のモデルタンパク質溶液（Ｉｎ）を、ニュートラアビジン被覆したアガロースビーズに添加し、遠心分離し、フロースルー（ＦＴ）収集し、ビーズをＰＢＳで洗浄し、両方の洗浄画分を収集し（Ｗ１及びＷ２）、タンパク質を、β−メルカプトエタノールを含むＰＢＳ中でインキュベートすることによりビーズから放出させ、サンプルを遠心分離し、切断されたタンパク質を含む溶離液（Ｅｌ）を収集した。
【図２】図２は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、実施例３９に記載されるプロトコルに従った、ハロマレイミドからのソマトスタチン−マレイミド付加物の生成を示す。左上：ジクロロマレイミド（丸）、ジブロモマレイミド（四角）及びジヨードマレイミド（三角）からのソマトスタチン付加物の生成。右上：モノブロモマレイミド（丸）、Ｎ−メチルモノブロモマレイミド（四角）及びＮ−メチルジブロモマレイミド（三角）からのソマトスタチン付加物の生成。左下：Ｎ−フルオレセイン−ジブロモマレイミド（丸）、Ｎ−ビオチン−ジブロモマレイミド（四角）、Ｎ−ＰＥＧ  ５０００−ジブロモマレイミド（三角）、Ｎ−ＰＥＧ−５０００−ジチオフェノールマレイミド（菱形）及びＮ−ＰＥＧ  ３００−ジブロモマレイミド（卵型）からのソマトスタチン付加物の生成。
【図３】図３は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、実施例３９に記載されるプロトコルに従った、ジチオマレイミドからのソマトスタチン−マレイミド付加物の生成を示す。左上：当量（丸）、５当量（四角）及び１０当量（三角）における、ジ−２−メルカプトエタノールマレイミドからのソマトスタチン付加物の生成。右上：１当量（丸）、５当量（四角）及び１０当量（三角）における、ジシステインマレイミドからのソマトスタチン付加物の生成。左下：１当量（丸）、５当量（四角）及び１０当量（三角）における、ジチオフェノールマレイミドからのソマトスタチン付加物の生成。右下：１当量（丸）、５当量（四角）及び１０当量（三角）における、ジ−２−メルカプトピリジンマレイミドからのソマトスタチン付加物の生成。
【図４】図４は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝分（ｍｉｎ）、時間（ｈ）及び日（ｄ）で示される時間）によって測定される、実施例３９に記載されるプロトコルに従った、種々の還元剤によるマレイミド架橋ソマトスタチンの切断を示す。左上：ＤＴＴによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。上中：２−メルカプトエタノールによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。右上：ＧＳＨによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。左下：ＴＣＥＰによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。右下：１，２−エタンジチオールによる総修飾ソマトスタチン−マレイミド（白丸）及び副産物の総量（黒丸）。
【図５】図５は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、実施例３９に記載されるプロトコルに従った、種々の量のＤＴＴ及び２−メルカプトエタノールによるマレイミド架橋ソマトスタチンの切断を示す。左：５０当量（白丸）、２０当量（白三角）及び１０当量（白四角）のＤＴＴによるソマトスタチンの再生。右：５０当量（白丸）、２０当量（白三角）及び１０当量（白四角）の２−メルカプトエタノールによるソマトスタチンの再生、並びに５０当量（黒丸）、２０当量（黒三角）及び１０当量（黒四角）での副産物の総量。
【図６】図６は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、実施例３９に記載されるプロトコルに従った、架橋ソマトスタチンの触媒された切断を示す。図に示すのは、２−メルカプトエタノール（白丸）、２−メルカプトエタノールと共にＮａＩ（白四角）、及び２−メルカプトエタノールと共にベンゼンセレノール（白三角）による、ソマトスタチンの再生、並びに２−メルカプトエタノール（黒丸）、２−メルカプトエタノールと共にＮａＩ（黒四角）、及び２−メルカプトエタノールと共にベンゼンセレノール（黒三角）を使用したときの、総副産物である。
【図７】図７は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝分（ｍｉｎ）、時間（ｈ）及び日（ｄ）で示される時間）によって測定される、実施例３９に記載されるプロトコルに従った、２−メルカプトエタノールによるＮ−官能化マレイミド架橋ソマトスタチンの切断を示す。左上：Ｎ−メチルマレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。上中：Ｎ−ビオチンマレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。右上：Ｎ−フルオレセインマレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。左下：Ｎ−ＰＥＧ  ５０００マレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。下中：Ｎ−ＰＥＧ  ３００マレイミドソマトスタチン付加物の切断により、ソマトスタチン（白丸）及び総副産物（黒丸）が生じる。
【図８】図８は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｈｏｕｒｓ）によって測定される、実施例３９に記載されるプロトコルに従った、モノブロモマレイミドとソマトスタチンとのジ付加生成物の切断を示す。左上：２−メルカプトエタノールを使用した、ソマトスタチン−マレイミド（白丸）、ソマトスタチン−ビス−マレイミド（黒丸）及び総副産物（三角）。右上：ＤＴＴを使用した、ソマトスタチン−マレイミド（白丸）、ソマトスタチン−ビス−マレイミド（黒丸）及び総副産物（三角）。左下：ＴＣＥＰを使用した、ソマトスタチン−マレイミド（白丸）、ソマトスタチン−ビス−マレイミド（黒丸）及び総副産物（三角）。
【図９】図９は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、実施例３９に記載されるプロトコルに従った、種々の量のジチオマレイミドによるソマトスタチンの比較上のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋を示す。本図は、３：５の比率のＴＣＥＰ開始剤及びチオフェノール（丸）、５：１０の比率のセレノール開始剤とチオフェノール（四角）、及び１０：２０の比率のセレノール開始剤と２−メルカプトエタノール（三角）、を使用した架橋ソマトスタチンの生成を示す。
【図１０】図１０は、ＬＣ−ＭＳ（ｙ軸＝シグナル％；ｘ軸＝時間／ｍｉｎ）によって測定される、実施例３９に記載されるプロトコルに従った、ソマトスタチンのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＥＧ化を示す。本図は、５当量のＮ−ＰＥＧ５０００−ジチオフェノールマレイミド及び３当量のＴＣＥＰを使用した（丸）、並びに１０当量のＮ−ＰＥＧ５０００−ジチオフェノールマレイミド及び５当量のベンゼンセレノールを使用した（四角）、ＰＥＧ化ソマトスタチンの生成を示す。
【図１１】図１１は、実施例３９に記載されたパッチクランプアッセイで得られたホールセルパッチクランプ電流記録を示す。本図は、ＳＳＴＲ２を発現するＧＩＲＫ  １／２Ａ株化細胞から記録された、代表的な出力波形を示す。細胞を−６０ｍＶでクランプし、２０μＭのソマトスタチン又はその誘導体を２０秒間適用した。左上：ソマトスタチン（示された軸において、垂直線は１０００ｐＡを示し、水平線は２０ｍｓを示す）。右上：ジブロモマレイミド架橋ソマトスタチン（示された軸において、垂直線は１０００ｐＡを示し、水平線は２０ｍｓを示す）。左下：フルオレセインジブロモマレイミド架橋ソマトスタチン（示された軸において、垂直線は１０００ｐＡを示し、水平線は２０ｍｓを示す）。右下：ＰＥＧ化ジブロモマレイミド架橋ソマトスタチン（示された軸において、垂直線は１０００ｐＡを示し、水平線は２０ｍｓを示す）。
【図１２】図１２は、実施例３９に記載されたパッチクランプアッセイにおける、ソマトスタチン及びそのアナログにより活性化された電流の振幅を示す。ｘ軸は、電流の振幅をｐＡ／ｐＦで示す。上の２本のバーはフルオレセインジブロモマレイミド架橋ソマトスタチンに由来し（黒のバーは、百日咳毒素による２４時間にわたる細胞の前処理後であり；灰色のバーは前処理なしである）、次の２本のバーはＰＥＧ化ジブロモマレイミド架橋ソマトスタチンに由来し（黒のバーは、百日咳毒素による２４時間にわたる細胞の前処理後であり；灰色のバーは前処理なしである）、次の３本のバーはジブロモマレイミド架橋ソマトスタチンに由来し（白のバーは、ＧＩＲＫ阻害剤ＴｅｒｔｉａｐｉｎＱ（１００ｎＭ）との５分間のプレインキュベーション後であり；黒のバーは、百日咳毒素による２４時間にわたる細胞の前処理後であり；灰色のバーは前処理なしである）、下の２本のバーはソマトスタチンに由来する（黒のバーは、百日咳毒素による２４時間にわたる細胞の前処理後であり；灰色のバーは前処理なしである）。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本明細書中で使用する場合、用語「機能的部分」とは、コンジュゲートの一部を形成する部分であって、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡのうちの１つであるものを意味する。
【００５２】
当業者が容易に理解するように、化合物内（例えば、コンジュゲート分子内）に含まれる機能的部分は、対応する「機能的化合物」をそれに結合させることによって得られ得る。機能的化合物が二次的化合物に結合する場合、新たな結合が二次的化合物に形成できるように、その機能的化合物中のいずれかの場所の結合が破壊される必要がある。かかるプロセスの例としては、機能的化合物が二次的分子に結合した機能的部分になる場合には機能的化合物からの脱離基の喪失、機能的化合物が水素原子含有求核基（例えば、−ＯＨ又は−ＳＨ基）を介して反応する場合にはプロトンの喪失、又は機能的化合物が求電子又は求核付加反応を介して二次的化合物と反応する場合には機能的化合物中の二重結合の単結合への変換、が挙げられる。従って、当業者であれば、例えば「タンパク質」である機能的部分が、対応するタンパク質化合物と比較した内部結合の喪失（例えば、かかる部分が二次的分子への結合を形成する場合、−ＯＨ、−ＳＨ又は−ＮＨ２部分からのプロトンの喪失）を伴った、二次的分子へのタンパク質化合物の組込みによって形成される部分を意味することを理解するであろう。
【００５３】
機能的部分は典型的に、そのネイティブな形態で（即ち、バイオコンジュゲートの一部でないとき）別個の生物学的重要性を有する部分である。好ましくは、本発明で使用される任意の機能的部分は、少なくとも２００、より好ましくは少なくとも５００、最も好ましくは少なくとも１０００の相対分子量を有する。好ましくは、本明細書中に記載される機能的部分は生体分子である。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、用語「検出可能部分」とは、試験サンプルにおいて検出可能なシグナルを生成し得る部分を意味する。明らかに、検出可能部分は、対応する「検出可能化合物」に由来する、本発明のコンジュゲートにおいてクロスリンカーを介して別の機能的部分に連結された場合に検出可能なシグナルを生成する能力を保持した部分であると理解され得る。検出可能部分はまた、「タグ」、「プローブ」及び「標識」としても当該分野で一般に公知である。検出可能部分の例としては、発色性部分、蛍光性部分、放射性部分及び電気化学的に活性な部分が挙げられる。本発明では、好ましい検出可能部分は、発色性部分及び蛍光性部分である。蛍光性部分が最も好ましい。
【００５５】
発色性部分は着色する部分であり、コンジュゲート中に組み込まれたときに着色するか、或いはコンジュゲート中に組み込まれ、このコンジュゲートが次に二次的標的種と相互作用したとき（例えば、コンジュゲートがタンパク質を含む場合、これが次に別の標的分子と相互作用する）に着色するものである。
【００５６】
典型的には、用語「発色性部分」とは、少なくとも２つのエネルギー状態（比較的低いエネルギーの基底状態と、放射線スペクトルの特定の領域からの光エネルギーの吸収によって上昇し得る励起状態）で存在し得る、会合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）原子の基をいう。しばしば、会合した原子の基は、非局在化電子を含む。本発明での使用に適した発色性部分には、π系及び金属錯体を含むコンジュゲート化部分が挙げられる。例としては、ポルフィリン、ポリエン、ポリイン及びポリアリールが挙げられる。好ましい発色性部分は以下である：
【００５７】
【化１１】
0005954789.tif 000012
【００５８】
蛍光性部分は、蛍光性の化学的部分であるフルオロフォアを含む部分である。本発明のコンジュゲートなどの二次的分子中に蛍光性部分として一般に組み込まれる蛍光性化合物の例には、以下が挙げられる：
【００５９】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素系；
シアニン及びメロシアニン；
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＢＯＤＩＰＹ（ホウ素−ジピロメテン）色素系；
ＡＴＴＯ−ＴＥＣ  ＧｍｂＨが製造するＡＴＴＯ色素系；
フルオレセイン及びその誘導体；
ローダミン及びその誘導体；
ナフタレン誘導体（例えば、そのダンシル誘導体及びプロダン誘導体）；
ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール及びベンゾオキサジアゾール誘導体；
クマリン及びその誘導体；
ピレン誘導体；並びに
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能な、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッド、カスケードブルー及びナイルレッド。
【００６０】
本発明での使用に好ましい蛍光性部分としては、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、スルホローダミン１０１酸塩化物（テキサスレッド）及びダンシルが挙げられる。フルオレセイン及びダンシルが特に好ましい。
【００６１】
放射性部分は、放射性核種を含む部分である。放射性核種の例としては、ヨウ素−１３１、ヨウ素−１２５、ビスマス−２１２、イットリウム−９０、イットリウム−８８、テクネチウム−９９ｍ、銅−６７、レニウム−１８８、レニウム−１８６、ガリウム−６６、ガリウム−６７、インジウム−１１１、インジウム−１１４ｍ、インジウム−１１４、ホウ素−１０、トリチウム（水素−３）、炭素−１４、硫黄−３５、フッ素−１８及び炭素−１１が挙げられる。フッ素−１８及び炭素−１１は、例えば、陽電子放出断層撮影で頻繁に使用される。
【００６２】
１実施形態において、放射性部分は、放射性核種単独からなり得る。別の実施形態において、放射性核種は、例えば、リンカー基（例えばチオール基含有リンカー）に直接共有結合することにより、又はキレート剤と配位錯体を形成することにより、より大きな放射性部分に組み込まれ得る。当該分野で公知の適切なキレート剤としては、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン−五酢酸無水物）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラ−デカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）、ＤＴＴＡ（Ｎ１−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−ジエチレン−トリアミン−Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３−四酢酸）及びＤＦＡ（Ｎ’−［５−［［５−［［５−アセチルヒドロキシアミノ）ペンチル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］ヒドロキシアミノ］ペンチル］−Ｎ−（５−アミノペンチル）−Ｎ−ヒドロキシブタンジアミド）が挙げられる。
【００６３】
電気化学的に活性な部分は、電流測定法又はボルタメトリ法などの電気化学的方法において、電気化学的シグナルを生成し得る基を含む部分である。典型的には、電気化学的に活性な部分は、少なくとも２つの別個の酸化還元状態で存在することができる。
【００６４】
慣用的に入手可能な非常に多数の検出可能化合物から、本発明に従う使用に適するであろう検出可能化合物を当業者が容易に選択できることは当然である。従って、本発明の方法論は、検出可能部分を含むコンジュゲートを産生するために使用され得、このコンジュゲートは次いで、かかる種の検出を含む任意の慣用の生化学的技術で使用され得る。
【００６５】
本明細書中で使用する場合、用語「酵素活性部分」とは、酵素、酵素基質又は酵素の補因子を意味する。好ましくは、酵素活性部分は酵素である。
【００６６】
本明細書中で使用する場合、用語「アフィニティタグ」とは、アフィニティタグとアフィニティパートナーの両方が単一のサンプル中に存在する場合に、第二の化学的部分である「アフィニティパートナー」と相互作用し得る化学的部分を意味する。典型的には、アフィニティタグは、アフィニティパートナーとの特異的結合相互作用を形成することができる。特異的結合相互作用は、サンプル中に存在するアフィニティパートナーと任意の他の化学物質との間で生じ得る任意の結合相互作用よりも強い結合相互作用である。特異的結合相互作用は、例えば、酵素とその基質との間で生じ得る。
【００６７】
アフィニティタグは、タンパク質などの生体分子の検出又は精製などの適用において有用であり得る。かかる適用において、生体分子及びアフィニティタグを含むコンジュゲートは、アフィニティタグとそのアフィニティパートナーとの間での特異的結合相互作用を利用することによって検出又は精製され得る。
【００６８】
生化学で特に広く使用される１つのアフィニティタグ／アフィニティパートナー対は、ビオチン／（ストレプト）アビジン対である。アビジン及びストレプトアビジンは、ビオチン（５−［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ペンタン酸）由来のアフィニティタグに対し高い親和性及び特異性で結合するアフィニティパートナーとして使用され得るタンパク質である。当該分野で一般に使用される他のアフィニティタグ／アフィニティパートナー対としては、アミラーゼ／マルトース結合タンパク質、グルタチオン／グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ及び金属（例えば、ニッケル又はコバルト）／ポリ（Ｈｉｓ）が挙げられる。当業者であれば、対のいずれかのメンバーが「アフィニティタグ」として機能し得、対のもう一方のメンバーが「アフィニティパートナー」として機能することを理解するであろう。従って、用語「アフィニティタグ」及び「アフィニティパートナー」は相互交換可能である。
【００６９】
当業者は、生化学、及び特にバイオコンジュゲート技術の背景におけるアフィニティタグ／アフィニティパートナー相互作用の慣用的な使用を認識しているであろう。従って当業者には、本発明に従う使用のためにアフィニティタグを選択するにあたり何らの困難もないであろう。従って、本発明の方法論は、アフィニティタグ／アフィニティパートナー相互作用を使用する慣用的な生化学的技術での使用に適応させたコンジュゲートを産生するために使用され得る。
【００７０】
本発明に従う好ましいアフィニティタグは、ビオチン、アミラーゼ、グルタチオン及びポリ（Ｈｉｓ）である。特に好ましいアフィニティタグはビオチンである。
【００７１】
本明細書中で使用する場合、用語、用語「ハプテン」とは、そのネイティブ形態ではｉｎ  ｖｉｖｏの免疫応答を刺激できないが、免疫原性担体分子に連結されるとｉｎ  ｖｉｖｏの免疫応答を刺激できる、エピトープを含む部分を意味する。典型的には、ハプテンは、比較的低い分子量（例えば１０００未満の分子量）の非タンパク質性部分である。エピトープは、免疫系によって認識され、免疫応答を刺激する、分子又は部分の一部である。
【００７２】
本明細書中で使用する場合、用語「免疫原性担体」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたときに免疫応答を促進できる、ハプテンにカップリングされ得る抗原を意味する。免疫原性担体の例としては、タンパク質、リポソーム、合成又は天然のポリマー部分（例えば、デキストラン、アガロース、ポリリジン及びポリグルタミン酸部分）、及び合成により設計された有機部分が挙げられる。一般に使用されるタンパク質免疫原性担体としては、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、アミノエチル化又はカチオン化されたウシ血清アルブミン、サイログロブリン、オボアルブミン及び種々のトキソイドタンパク質（例えば、破傷風トキソイド及びジフテリアトキソイド）が挙げられる。合成により設計された周知の有機分子担体には、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）が挙げられる。
【００７３】
生化学の当業者が認識するように、ハプテン−免疫原性担体コンジュゲートは、例えば免疫学及びプロテオミクスにおいて広く使用される。従って、当業者は、本発明の方法論が、ハプテン及び免疫原性担体を含むコンジュゲートを産生するために容易に適用でき、次いでこのコンジュゲートがこれらの十分に確立された慣用技術において使用され得ることを、認識するであろう。従って、本発明の好ましい１実施形態において、第一の機能的部分及び第二の機能的部分の一方はハプテンであり、第一の機能的部分及び第二の機能的部分のもう一方は免疫原性担体である。
【００７４】
本明細書中で使用する場合、用語「抗体又は抗体断片」とは、特異的抗原上のエピトープを介してその抗原に結合可能なタンパク質、又はかかるタンパク質の断片を意味する。抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体が好ましい。
【００７５】
本明細書中で使用する場合、用語「抗原」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたときに免疫応答を刺激でき、その免疫応答の間に産生される抗体に結合できる物質を意味する。
【００７６】
本明細書中で使用する場合、用語「リガンド」とは、生体分子の機能的特性を修飾するような方法で生体分子（例えばタンパク質）と相互作用できる部分を意味する。典型的には、リガンドは、標的タンパク質上の部位に結合する部分である。リガンドと生体分子との間の相互作用は、典型的には非共有結合である。例えば、相互作用は、イオン結合、水素結合又はファンデルワールス相互作用を介した相互作用であり得る。しかしながら、ある種のリガンドについては生体分子と共有結合を形成する可能性もある。典型的には、リガンドは、相互作用したときに生体分子の化学的コンフォメーションを変更することができる。
【００７７】
タンパク質と相互作用することができるリガンドの例としては、基質（例えば、酵素により触媒される化学反応に参加することにより、結合に際し酵素によって作用される）、阻害剤（結合に際しタンパク質活性を阻害する）、活性化因子（結合に際しタンパク質の活性を増加させる）及び神経伝達物質が挙げられる。
【００７８】
本明細書中で使用する場合、用語「生物活性部分」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたときに生化学的応答を誘導することができる部分を意味する。
【００７９】
生物活性部分は薬物であり得る。薬物には、細胞傷害剤（例えば、ドキソルビシン、メトトレキサート及びそれらの誘導体）、ｉｎ  ｖｉｖｏで代謝されて細胞傷害剤を生じ得る細胞毒前駆体、抗悪性腫瘍剤、降圧薬、心保護剤、抗不整脈薬、ＡＣＥ阻害剤、抗炎症薬、利尿薬、筋弛緩薬、局所麻酔薬、ホルモン、コレステロール降下薬、抗凝固薬、抗うつ薬、精神安定薬、神経遮断薬、鎮痛薬（例えば、麻薬性鎮痛薬又は解熱鎮痛薬）、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗真菌薬、静菌薬（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔ）、ＣＮＳ活性薬剤、抗痙攣薬、抗不安薬、制酸薬、麻薬、抗生物質、呼吸器薬剤（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）、抗ヒスタミン剤、免疫抑制剤、免疫活性化剤（ｉｍｍｕｎｏａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、栄養添加物、鎮咳薬、診断剤、催吐薬及び制吐薬、炭水化物、グリコサミノグリカン、糖タンパク質及び多糖、脂質、例えば、ホスファチジル−エタノールアミン、ホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）及びその誘導体、スフィンゴシン、ステロイド、ビタミン、抗生物質（ランチビオティク剤、静菌（ｂａｃｔｅｒｉｓｔａｔｉｃ）剤及び殺菌剤を含む）、抗真菌薬、駆虫剤、及び単細胞病原体を含む感染性因子に対する他の有効な薬剤、低分子エフェクター分子、例えば、ノルアドレナリン、αアドレナリンレセプターリガンド、ドパミンレセプターリガンド、ヒスタミンレセプターリガンド、ＧＡＢＡ／ベンゾジアゼピンレセプターリガンド、セロトニンレセプターリガンド、ロイコトリエン及びトリヨードサイロニン（ｔｒｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）、並びにそれらの誘導体が含まれる。
【００８０】
生物活性部分はまた、生体膜を容易に架橋できかつ二次的な機能的部分とコンジュゲート分子を形成する場合にはその二次的な機能的部分が生体膜を横切る能力を増強できる化合物に由来する、部分であり得る。例えば、生物活性部分は、ＷＯ  ２００９／０２７６７９（その内容は、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）に記載されるものなどの、「タンパク質形質導入ドメイン」（ＰＴＤ）又は低分子担体（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）（「ＳＭＣ」又は「分子タグ（ｔｕｇ）」）であり得る。従って、本発明の１つの好ましい実施形態において、第一の機能的部分及び第二の機能的部分の一方は、かかるタンパク質形質導入ドメイン又は低分子担体であり、第一の機能的部分及び第二の機能的部分のもう一方は薬物である。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態において、生物活性部分は薬物である。
【００８２】
本明細書中で使用する場合、用語「リポソーム」とは、両親媒性の特性を有するリン脂質二重層からなる構造を意味する。本発明に従う使用に適したリポソームには、単層小胞及び多重層小胞が挙げられる。
【００８３】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリマー部分」とは、対応する単一のポリマー分子から誘導される、単一のポリマー鎖（分枝又は非分枝）を意味する。ポリマー部分は、天然ポリマーでも合成ポリマーでもよい。しかし典型的には、ポリマー分子はポリヌクレオチドではない。
【００８４】
生化学の分野で周知のとおり、ポリマー部分を含むコンジュゲートの創出は、多くのｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの適用において有用である。例えば、高分子（例えばタンパク質）の種々の特性（溶解度特性、表面特徴、及び溶液中又は冷凍時の安定性が含まれる）は、ポリマー部分をそれに結合させることによって、修飾され得る。別の一般的な適用は、生体適合性を増強すること、投与時の免疫応答を低減若しくは除去すること、及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を増大させることを目的として、ポリマー部分を生物活性化合物（例えば薬物）にコンジュゲート化することを含む。
【００８５】
従って当業者であれば、ポリマー部分を含むコンジュゲートを調製するために本発明の方法論が使用でき、このコンジュゲートが次いでポリマー部分含有コンジュゲートのための任意の公知の適用において使用できることを認識するであろう。当業者であれば、当該分野で慣用的に使用されるポリマー部分に基づいて、本発明に従う使用に適したポリマー部分を容易に選択できるであろう。
【００８６】
従って、ポリマー部分の性質は、コンジュゲート分子の意図した使用に依存するであろう。本発明に従う使用のための例示的なポリマー部分としては、多糖、ポリエーテル、ポリアミノ酸（例えばポリリジン）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（メタ）アクリル酸及びその誘導体、ポリウレタン並びにポリホスファゼンが挙げられる。典型的には、かかるポリマーは、少なくとも１０個のモノマー単位を含む。従って、例えば、多糖は、少なくとも１０個の単糖単位を典型的に含む。
【００８７】
２つの特に好ましいポリマー分子は、デキストラン及びポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、並びにこれらの分子の誘導体（例えば、モノメトキシポリエチレングリコール、「ｍＰＥＧ」）である。好ましくは、ＰＥＧ又はその誘導体は、２０，０００未満の分子量を有する。好ましくは、デキストラン又はその誘導体は、１０，０００〜５００，０００の分子量を有する。１つの好ましい実施形態において、本発明の化合物は、生物活性部分（例えば薬物）、及びＰＥＧ又はその誘導体を含む。
【００８８】
本明細書中で使用する場合、用語「アミノ酸」とは、アミン官能基及びカルボキシル官能基の両方を含む部分を意味する。しかしながら、好ましいアミノ酸はα−アミノ酸である。好ましくは、アミノ酸は、タンパク新生アミノ酸、即ち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、ピロリジン、セレノシステイン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンから選択されるアミノ酸である。しかしながら、アミノ酸は、非タンパク新生アミノ酸であってもよい。非タンパク新生アミノ酸の例としては、ランチオニン、２−アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、γ−アミノ酪酸、オルニチン、シトルリン、カナバリン及びミモシンが挙げられる。本発明に従う特に好ましいアミノ酸は、システインである。
【００８９】
本明細書中で使用する場合、用語「ペプチド」及び「タンパク質」とは、アミノ酸残基からなるポリマー部分を意味する。当業者が認識するように、用語「ペプチド」は典型的に、比較的短い長さのポリマーを示すために当該分野で使用され、用語「タンパク質」は典型的に、比較的長い長さのポリマーを示すために当該分野で使用される。本明細書中で使用する場合、ペプチドは最大５０アミノ酸残基を含み、対してタンパク質は５０アミノ酸より多くを含むことが慣用である。しかしながら、本出願で同定される機能的部分は、ペプチド又はタンパク質のいずれかを典型的に示し得るので、この区別は重要ではないことが理解されよう。
【００９０】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、「タンパク質」と相互交換可能に使用される。
【００９１】
本明細書中で使用する場合、ペプチド又はタンパク質は、任意の天然又は非天然のアミノ酸を含み得る。例えば、ペプチド又はタンパク質は、例えば天然のα−アミノ酸に対応する、α−アミノ酸残基のみを含んでいてもよい。或いは、ペプチド又はタンパク質はさらに、１以上の化学的修飾を含んでいてもよい。例えば、化学的修飾は、その翻訳後にタンパク質にｉｎ  ｖｉｖｏで生じる修飾である翻訳後修飾に対応し得、例えば、アシル化（例えば、アセチル化）、アルキル化（例えば、メチル化）、アミド化、ビオチン化、ホルミル化、グリコシル化、糖化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、酸化、硫酸化又はリン酸化である。当業者は当然、かかる翻訳後修飾されたペプチド又はタンパク質が、依然として本発明の意味の範囲内の「ペプチド」又は「タンパク質」を構成することを認識するであろう。例えば、糖タンパク質（１以上のオリゴ糖側鎖を有するタンパク質）がタンパク質の一種であることは当該分野で十分確立されている。
【００９２】
本明細書中で使用する場合、用語「細胞」は、生きた生物の単一の細胞を意味する。
【００９３】
本明細書中で使用する場合、用語「炭水化物」には、単糖類及びオリゴ糖類が含まれる。典型的には、オリゴ糖は、２〜９個の単糖単位を含む。従って、本明細書中で使用する場合、多糖は、炭水化物としてではなく「ポリマー部分」として分類される。しかしながら、本発明に従って使用される機能的部分は、「炭水化物」及び「多糖」のいずれかを典型的に構成するので、当業者はこの区別が重要ではないことを理解するであろう。
【００９４】
本明細書中で使用する場合、用語「ＤＮＡ」は、１以上のヌクレオチドから構成されるデオキシリボ核酸を意味する。ＤＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。好ましくは、ＤＮＡは１より多いヌクレオチドを含む。
【００９５】
本明細書中で使用する場合、用語「ＲＮＡ」は、１以上のヌクレオチドを含むリボ核酸を意味する。好ましくは、ＲＮＡは１より多いヌクレオチドを含む。
【００９６】
本明細書中で使用する場合、「コンジュゲート」とは、第一の機能的部分及び第二の機能的部分を含む分子を意味する。第一の機能的部分及び第二の機能的部分は、本明細書中に記載されるように、クロスリンカー部分を介して互いに共有結合される。
【００９７】
本明細書中で使用する場合、用語「基」及び「部分」は相互交換可能に使用される。
【００９８】
本明細書中で使用する場合、「反応性基」とは、第一の分子と第二の分子との間に共有結合が形成するように第二の分子上の官能基との化学反応に参加することができる、第一の分子上の官能基を意味する。反応性基には、脱離基、求核基及び本明細書中に記載される他の反応性基が挙げられる。
【００９９】
本明細書中で使用する場合、用語「求電子性脱離基」とは、その炭素原子における求核攻撃後に求核剤により置換され得る、飽和又は不飽和の炭素原子に結合した置換基を意味する。当業者は、特定の化合物上に位置付けるため及び特定の求核剤と反応するために適した求電子性脱離基を、慣用的に選択できる。
【０１００】
本明細書中で使用する場合、用語「求核剤」とは、電子対を提供することによって化学結合を形成することができる官能基又は化合物を意味する。
【０１０１】
本明細書中で使用する場合、用語「リンカー基」とは、ある化学的部分を別の化学的部分に連結することができる基を意味する。本発明に従って使用されるリンカー基の性質は、重要ではない。当業者であれば、リンカー基がコンジュゲート分子の構築に慣用的に使用されることを認識するであろう。典型的には、本発明で使用するためのリンカー基は有機基である。典型的には、かかるリンカー基は、５０〜１０００、好ましくは１００〜５００の分子量を有する。本発明に従う使用に適切なリンカー基の例は、当該分野の共通の一般的知識であり、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，１９９６）（その内容は本明細書中で参照によりその全体が組み込まれる）などの標準的な参考教科書に記載されている。
【０１０２】
本明細書中で使用する場合、用語「アルキル」には、直鎖及び分枝鎖の両方の飽和アルキル基が含まれる。好ましくは、アルキル基は、Ｃ１−２０アルキル基、より好ましくはＣ１−１５、なおより好ましくはＣ１−１２アルキル基、なおより好ましくはＣ１−６アルキル基であり、最も好ましくはＣ１−４アルキル基である。特に好ましいアルキル基には、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル及びヘキシルが挙げられる。用語「アルキレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１０３】
本明細書中で使用する場合、用語「アルケニル」とは、分枝鎖でも非分枝鎖でもよい、１個以上の炭素−炭素二重結合を含む基をいう。好ましくは、アルケニル基は、Ｃ２−２０アルケニル基、より好ましくはＣ２−１５アルケニル基、なおより好ましくはＣ２−１２アルケニル基、又は好ましくはＣ２−６アルケニル基であり、最も好ましくはＣ２−４アルケニル基である。用語「アルケニレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１０４】
本明細書中で使用する場合、用語「アルキニル」とは、分枝鎖でも非分枝鎖でもよい、１個以上の三重結合を含む炭素鎖をいう。好ましくは、アルキニル基は、Ｃ２−２０アルキニル基、より好ましくはＣ２−１５アルキニル基、なおより好ましくはＣ２−１２アルキニル基、又は好ましくはＣ２−６アルキニル基であり、最も好ましくはＣ２−４アルキニル基である。用語「アルキニレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１０５】
特に指定しない場合、アルキル、アルケニル又はアルキニル基は、典型的には非置換である。しかしながら、かかる基が非置換又は置換であると示されている場合、１個以上の水素原子が、ハロゲン原子又はスルホン酸基で置換されていてもよい。好ましくは、置換されたアルキル、アルケニル又はアルキニル基は、１〜１０個の置換基、より好ましくは１〜５個の置換基、なおより好ましくは１、２又は３個の置換基、最も好ましくは１又は２個の置換基、例えば１個の置換基を有する。好ましくは、置換されたアルキル、アルケニル又はアルキニル基は、２個以下のスルホン酸置換基を有する。ハロゲン原子が好ましい置換基である。しかし好ましくは、アルキル、アルケニル又はアルキニル基は、非置換である。
【０１０６】
アルキル、アルケニル若しくはアルキニル基、又はアルキレン、アルケニレン若しくはアルキニレン基である部分において、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されていてもよく、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されていてもよく、合計で０、１又は２個の該炭素原子及び−ＣＨ２−基が置換されていることが好ましく、合計で０又は１個がより好ましい。最も好ましくは、炭素原子又は−ＣＨ２−基のいずれも置換されていない。
【０１０７】
−ＣＨ２−基を置換するための好ましい基は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｃ（Ｏ）−基である。炭素原子を置換するための好ましい基は、フェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基である。本明細書中で使用する場合、「０、１又は２個の炭素原子」への言及は、アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖中の任意の末端又は非末端炭素原子（その炭素原子に結合した任意の水素原子を含む）を意味する。本明細書中で使用する場合、「０、１又は２個の−ＣＨ２−基」への言及は、アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖中の末端炭素原子に対応しない基をいう。
【０１０８】
本明細書中で使用する場合、Ｃ６−１０アリール基は、６〜１０個の炭素原子を有する、単環式又は多環式の６〜１０員の芳香族炭化水素環系である。フェニルが好ましい。用語「アリーレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１０９】
本明細書中で使用する場合、５〜１０員のヘテロアリール基は、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される少なくとも１個のヘテロ原子、例えば、１、２、３又は４個のヘテロ原子を含む、単環式又は多環式の５〜１０員の芳香族環系（例えば、５〜６員環）である。環が４個のヘテロ原子を含む場合、これらは好ましくは全てが窒素原子である。用語「ヘテロアリーレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１１０】
単環式ヘテロアリール基の例としては、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル及びテトラゾリル基が挙げられる。
【０１１１】
多環式ヘテロアリール基の例としては、ベンゾチエニル、ベンゾフリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾトリアゾリル、インドリル、イソインドリル及びインダゾリル基が挙げられる。好ましい多環式基としては、インドリル、イソインドリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル及びベンゾイソチアゾリル基が挙げられ、より好ましくはベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル及びベンゾチアゾリルであり、最も好ましくはベンゾチアゾリルである。しかしながら、単環式ヘテロアリール基が好ましい。
【０１１２】
好ましくは、ヘテロアリール基は、５〜６員のヘテロアリール基である。特に好ましいヘテロアリール基は、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル及びピラジニル基である。より好ましい基は、チエニル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピロリル及びトリアジニルでり、最も好ましくはピリジニルである。
【０１１３】
本明細書中で使用する場合、５〜１０員のヘテロシクリル基は、１個以上の炭素原子、例えば１、２、３又は４個の炭素原子が、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）及びＳ（Ｏ）２から選択される部分で置換されている、非芳香族の、飽和又は不飽和の、単環式又は多環式のＣ５−１０炭素環式環系である。好ましくは、５〜１０員のヘテロシクリル基は５〜６員環である。用語「ヘテロシクリエン（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｅｎｅ）」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１１４】
ヘテロシクリル基の例としては、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル（ｔｈｉｅｔａｎｙｌ）、ピロリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ジチオラニル（ｄｉｔｈｉｏｌａｎｙｌ）、ジオキソラニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、メチレンジオキシフェニル、エチレンジオキシフェニル、チオモルホリニル、Ｓ−オキソ−チオモルホリニル、Ｓ，Ｓ−ジオキソ−チオモルホリニル、モルホリニル、１，３−ジオキソラニル、１，４−ジオキソラニル、トリオキソラニル（ｔｒｉｏｘｏｌａｎｙｌ）、トリチアニル（ｔｒｉｔｈｉａｎｙｌ）、イミダゾリニル、ピラニル、ピラゾリニル、チオキソラニル（ｔｈｉｏｘｏｌａｎｙｌ）、チオキソチアゾリジニル、１Ｈ−ピラゾール−５−（４Ｈ）−オニル、１，３，４−チアジアゾール−２（３Ｈ）−チオニル、オキソピロリジニル、オキソチアゾリジニル、オキソピラゾリジニル、スクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）及びマレイミド基及び部分が挙げられる。好ましいヘテロシクリル基は、ピロリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ジチオラニル、ジオキソラニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、チオモルホリニル及びモルホリニル基及び部分である。より好ましいヘテロシクリル基は、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、チオモルホリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピペリジニル、モルホリニル及びピロリジニル基である。
【０１１５】
疑義を回避するため、ヘテロアリール基及びヘテロシクリル基の上記定義は、環中に存在し得る「Ｎ」部分をいうが、熟練の化学者に明らかなように、Ｎ原子は、単結合を介して隣接する環原子のそれぞれに結合した場合、プロトン化される（又は以下に規定する置換基を有する）であろう。
【０１１６】
本明細書中で使用する場合、Ｃ３−７カルボシクリル基は、３〜７個の炭素原子を有する、非芳香族の、飽和又は不飽和の炭化水素環である。好ましくは、Ｃ３−７カルボシクリル基は、３〜７個の炭素原子、より好ましくは５〜６個の炭素原子を有する、飽和又はモノ不飽和の炭化水素環（即ち、シクロアルキル部分又はシクロアルケニル部分）である。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシル、並びにそれらのモノ不飽和バリアントが挙げられる。特に好ましい炭素環式基は、シクロペンチル及びシクロヘキシルである。用語「カルボシクリレン」は、しかるべく解釈されるべきである。
【０１１７】
具体的には、カルボシクリル又はヘテロシクリル基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基で置換され得る。本明細書中で使用する場合、置換される「炭素原子」は、それらが結合する水素原子を含むことが理解される。１又は２個の炭素原子が置換される場合、２個のかかる炭素原子が置換されることが好ましい。好ましいかかるカルボシクリル基としてはベンゾキノン基が挙げられ、好ましいかかるヘテロシクリル基としてはスクシンイミド及びマレイミド基が挙げられる。
【０１１８】
特に指定しない場合、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、典型的には非置換である。しかしながら、かかる基が非置換又は置換であると示されている場合、１個以上の水素原子が、ハロゲン原子又はＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ニトロ若しくはスルホン酸基で置換されていてもよい。好ましくは、置換されたアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、１〜４個の置換、より好ましくは１〜２個の置換基、最も好ましくは１個の置換基を有する。好ましくは、置換されたアリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、２個以下のニトロ置換基及び２個より多いスルホン酸置換基を有する。好ましい置換基は、ハロゲン原子並びにＣ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシ基である。特に好ましい置換基はハロゲン原子である。しかし好ましくは、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリル基は、非置換である。
【０１１９】
本明細書中で使用する場合、ハロゲン原子は、典型的にはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ原子であり、好ましくはＢｒ又はＣｌ原子であり、より好ましくはＢｒ原子である。
【０１２０】
本明細書中で使用する場合、Ｃ１−６アルコキシ基は、酸素原子に結合したＣ１−６アルキル（例えば、Ｃ１−４アルキル）基である。
【０１２１】
本明細書中で使用する場合、Ｃ１−６アルキルチオール基は、硫黄原子に結合したＣ１−６アルキル（例えば、Ｃ１−４アルキル）基である。
【０１２２】
本明細書中で使用する場合、５〜１０員のヘテロシクリルチオールは、硫黄原子に結合した５〜１０員の（例えば、５〜６員の）ヘテロシクリル基である。
【０１２３】
本明細書中で使用する場合、Ｃ６−１０アリールチオールは、硫黄原子に結合したＣ６−１０アリール（例えば、フェニル）基である。
【０１２４】
本明細書中で使用する場合、Ｃ３−７カルボシクリルチオールは、硫黄原子に結合したＣ３−７カルボシクリル（例えば、Ｃ５−６カルボシクリル）基である。
【０１２５】
本発明において、式（Ｉ）の部分は、チオールを含有する第一の機能的部分と第二の機能的部分とを一緒に連結できる架橋反応性部分を構成する。
【０１２６】
好ましくは、Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＨの基を示す。より好ましくは、Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素又は硫黄を示す。好ましくは、Ｘ及びＸ’の少なくとも一方は酸素を示す。最も好ましくは、Ｘ及びＸ’は共に酸素である。
【０１２７】
Ｙは、好ましくは、ハロゲン原子又はトリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、Ｃ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール、Ｃ３−７カルボシクリルチオール、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３、フェニルオキシ、−ＮＲｘＲｙＲｚ＋若しくは−ＰＲｘＲｙＲｚ＋基である。より好ましくは、Ｙは、ハロゲン原子又はトリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、Ｃ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール若しくはＣ３−７カルボシクリルチオールである。なおより好ましくは、Ｙは、ハロゲン原子又はＣ１−６アルキルチオール、５〜１０員のヘテロシクリルチオール、Ｃ６−１０アリールチオール若しくはＣ３−７カルボシクリルチオール基である。最も好ましくは、Ｙは、ハロゲン原子、特に臭素原子である。
【０１２８】
Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚはそれぞれ、好ましくは、水素原子及びＣ１−６アルキル基から選択される。より好ましくは、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚはそれぞれ、好ましくは、水素原子並びにメチル及びエチル基から選択される。好ましくは、特定の−ＮＲｘＲｙＲｚ＋又は−ＰＲｘＲｙＲｚ＋基では、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは同じである。
【０１２９】
式Ｒ１−Ｈの化合物は、少なくとも第一のチオール基ＳＨを含む。本発明において、この第一のチオール基は、２位での求核攻撃によって式（Ｉ）の部分と反応することができる。式Ｒ１−Ｈの化合物と式（Ｉ）の部分との反応の所産は、式（Ｉ）の部分中の２位における式Ｙの求電子性脱離基が式Ｒ１の基によって置換された部分である。より具体的には、式Ｒ１の基は、式Ｒ１−Ｈの対応する化合物上の第一のＳＨ基に由来する式−Ｓ−のチオール結合を介して、２位において結合される。従って、Ｒ１−Ｈの第一のチオール基ＳＨ中の水素原子は、式Ｒ１の基に結合した水素原子を構成することは明らかであろう。従って、Ｒ１がクロスリンカーに結合している場合、Ｒ１とクロスリンカーとの間の−Ｓ−結合を形成するために、この第一のチオール基中の水素原子は失われる。
【０１３０】
Ｒ１は、式−Ｓ−Ｌ−Ｆ１の基であり得、このとき、第一のチオール基の硫黄原子は、式Ｌのリンカー基に結合している。従って、この実施形態において、リンカーが、式（Ｉ）の部分と反応できるチオール基を提供するために使用され得、次いでこのリンカー基が、かかるチオール基を含まない第一の機能的部分に結合されることが明らかとなろう。しかしながら、好ましくは、Ｒ１は式Ｆ１の基であり、より具体的には、第一の機能的部分は、式Ｒ１−Ｈの化合物中のそれが結合したＨ原子と一緒に、第一のＳＨ基を含む。
【０１３１】
好ましい実施形態において、第一の機能的部分及び第二の機能的部分の少なくとも１つは、酵素活性部分、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ＤＮＡ又はＲＮＡである。好ましくは、第一の機能的部分は、酵素活性部分、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ＤＮＡ又はＲＮＡである。第一の機能的部分／第二の機能的部分の好ましい組合わせとしては、以下の表１に示す組合わせが挙げられる。
【０１３２】
【表１】
0005954789.tif 000013
【０１３３】
特に好ましい実施形態において、Ｒ１は式Ｆ１の基であり、Ｆ１は、少なくとも第一のシステイン残基を含むペプチドタンパク質である。疑義を回避するため、ペプチド又はタンパク質中のシステイン残基は、式：
【０１３４】
【化１２】
0005954789.tif 000014
【０１３５】
の残基であり、式Ｒ１−Ｈの化合物において、ペプチド又はタンパク質は、システイン残基の硫黄原子を介して水素原子に結合される。この実施形態において、「第一のシステイン残基」とは、式（Ｉ）の部分と反応できるようなペプチド又はタンパク質上の位置に位置したシステイン残基を意味することが理解されよう。より具体的には、基Ｒ１は、式（Ｉ）の部分の２位において、第一のシステイン残基のチオール基の求核攻撃によって式（Ｉ）の部分に結合され、その結果、基Ｙは基Ｒ１中の第一のシステイン残基中のチオール基によって置換される。
【０１３６】
Ｒ１が式Ｆ１の基であり、Ｆ１が、少なくとも第一のシステイン残基を含むペプチド又はタンパク質である、本発明の特に好ましい実施形態において、Ｒ１は、少なくとも第二のシステイン残基をさらに含む。疑義を回避するため、第二のシステイン残基もまた、式（Ｉ）の部分と反応できるようなペプチド又はタンパク質上の位置に位置している。さらに、この実施形態において、式（Ｉ）の部分は式（Ｉａ）の化合物であり、式中基Ｒ２は式Ｙの求電子性脱離基である。次いで基Ｒ１は、式（Ｉａ）の部分の３位において、第二のシステイン残基のチオール基の求核攻撃によって式（Ｉａ）の化合物にさらに結合され、その結果基Ｒ２が、基Ｒ１中の第二のシステイン残基中のチオール基によって置換される。本発明のこの実施形態は、第一の機能的部分がジスルフィド結合を含むペプチド又はタンパク質である場合には、ジスルフィド結合にクロスリンカー試薬が付加されることがそれによって可能になるため、特に有用である。好ましくは、ジスルフィド結合を含むペプチド又はタンパク質は式（Ｉ）の部分と反応することになり、ジスルフィド結合が最初に、当該分野で公知の技術を使用して還元される。例えば、還元は、標準的なホスフィン試薬（例えば、（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン））を使用することによって、又はチオール−ジスルフィド交換反応を実施することによって、実施できる。
【０１３７】
ジスルフィド基の還元は、還元剤（例えば、ホスフィン、チオール又は水素化物剤）との反応によって実施できる。好ましい還元剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、グルタチオン、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールである。試薬の好ましい群は、１，２−エタンジチオール、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、グルタチオン及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンである。
【０１３８】
式（Ｉ）の部分は、本発明に従ってチオール含有機能的部分を二次的な機能的部分にコンジュゲート化させる重要な反応性部分を示すことが明らかであろう。従って、式（Ｉ）の部分を含む化合物は、第一の機能的部分を第二の機能的部分に連結するための試薬として使用できる。式（Ｉ）の部分（及び式（ＩＩ）の部分、別の箇所で詳細に記載される）において、記号
【０１３９】
【化１３】
0005954789.tif 000015
【０１４０】
は、別の基への結合点を意味する。これらの結合点を介して結合した基の正体は、本発明には重要でないことが理解されよう。当業者であれば、特定の目的に合うように、これらの結合点を介して結合した基を、例えば、一緒に連結される機能的部分の具体的な正体に基づいて、選択することが可能であることが容易に理解できよう。当業者に周知のように、特定の反応性基を有する機能的部分と反応するように適応された官能基を保有し、かつリンカー基（典型的には、反応中に重要な役割を果たさない）によって間隔を空けられた架橋試薬が、慣用的に設計される。当業者であれば、式（Ｉ）の部分が、例えば、チオール基と反応するように設計された従来の部分（例えばマレイミド基）を置換することによって、慣用のクロスリンカー試薬中に容易に組み込まれ得ることを、即座に理解するであろう。この様式での適応に適したクロスリンカー試薬の設計についての詳細な情報は、例えば、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，１９９６）（その内容は、その全体が本明細書中で参照により組み込まれる）中に見出すことができる。
【０１４１】
式（Ｉ）の部分は、少なくとも第一の機能的部分及び第二の機能的部分を一緒に連結することができる。式（Ｉ）の部分を含むクロスリンカー化合物が、式（Ｉ）の部分上の反応性基以外に反応性基を有さない場合、第一の機能的部分は、脱離基Ｙを置換することによって２位において反応でき、次いで第二の機能的部分が、２位と３位との間の炭素−炭素二重結合への求電子付加によって付加され得る。或いは、クロスリンカー試薬は、さらなる機能的部分と反応できる１個以上のさらなる反応性基を含み得る。
【０１４２】
さらなる実施形態において、第二の機能的部分は、アルケン部分を含む部分であり得、式（Ｉ）の部分の２位と３位との間の炭素−炭素二重結合との光触媒的［２＋２］環化付加に参加することによって、式（Ｉ）の部分に結合され得る。この手順は、式（Ｉ）の部分由来の２−炭素原子及び３−炭素原子を含むシクロブタン環部分を生じ、環中、炭素−炭素二重結合は飽和されている。
【０１４３】
好ましくは、本発明に従う式（Ｉ）の部分を含む化合物は、式（Ｉａ）の化合物
【０１４４】
【化１４】
0005954789.tif 000016
【０１４５】
であり、式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
以下のいずれかであり：
Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ、水素原子又は式Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；又は
Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す；
Ｒ２は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示し；
式Ｅ及びＹのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し；
式Ｎｕのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２及び−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）から選択される求核剤を示し；
式Ｌのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し；
式Ｚのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項１に記載の第二の機能的部分を含む化合物と反応し得る、式Ｌの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Ｌの基に連結され；
ｎは、１、２又は３であり；
式ＩＧのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基又はＣ２−２０アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０、１又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ニトロ及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されている。
【０１４６】
好ましくは、式（Ｉａ）の化合物において、Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ、水素原子又は式Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示すか；或いは、Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、式中Ｒ３３’は、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す。
【０１４７】
式（Ｉａ）中の好ましい基Ｘ、Ｘ’及びＹは、上で規定したとおりである。
【０１４８】
Ｒ３及びＲ３’が、同じ又は異なって、それぞれ、水素原子又は式Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す場合、好ましくは、Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ、式Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す。この実施形態において、好ましくは、Ｒ３及びＲ３’の少なくとも一方は、式Ｅ、Ｎｕ又は−Ｌ（Ｚ）ｎの基を示す。
【０１４９】
好ましくは、Ｒ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成する。
【０１５０】
Ｒ３３’は好ましくは、水素原子又は式−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す。特に好ましいＲ３３’基は、水素原子、及び式ＩＧの基である。最も好ましくは、Ｒ３３’は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。
【０１５１】
Ｒ２は好ましくは、水素原子又は式Ｙ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基である。より好ましくは、Ｒ２は好ましくは、水素原子又は式Ｙ若しくはＩＧの基である。最も好ましくは、Ｒ２は、水素若しくはハロゲン原子又はＣ１−６アルキル基である。
【０１５２】
Ｅは好ましくは、ハロゲン原子、又はＣ１−６アルコキシ、チオール、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、トリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、イミダゾリル、フェニルオキシ若しくはニトロフェニルオキシ基である。より好ましい式Ｅの基は、ハロゲン原子並びにトリフレート、トシレート及びメシレート基である。
【０１５３】
Ｎｕは好ましくは、式−ＯＨ又は−ＳＨの基である。別の実施形態において、Ｎｕは好ましくは、式−ＯＨ、−ＮＨ２又は−ＳＨの基であり、より好ましくは−ＮＨ２又は−ＳＨである。
【０１５４】
リンカー部分Ｌは、本発明の化合物中の２つの他の部分を一緒に連結する（即ち、これは少なくとも２価の部分である）。しかしながら、いくつかの実施形態において、特定のリンカー部分Ｌは、２個より多い他の部分を一緒に連結し得（例えば、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ３’又はＲ３３’が−Ｌ（Ｚ）ｎ（ｎは２又は３である）を示す場合）、この場合、３つ目の他の部分及び任意のさらなる他の部分のそれぞれが、対応する２価のリンカー部分Ｌ上の水素原子を置換することが理解されよう。
【０１５５】
Ｌは好ましくは、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基で置換されている、Ｃ１−２０アルキレン基、Ｃ２−２０アルケニレン基又はＣ２−２０アルキニレン基である部分を示し、式中、（ａ）０、１、又は２個の炭素原子は、Ｃ６−１０アリーレン、５〜１０員のヘテロアリーレン、Ｃ３−７カルボシクリレン及び５〜１０員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−及び−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−基から選択される基によって置換されており、式中、
（ｉ）該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオール、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、ニトロ及びスルホン酸基から選択される１個以上の置換基によって置換されており；
（ｉｉ）該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の０、１又は２個の炭素原子は、−Ｃ（Ｏ）−基によって置換されている。
【０１５６】
より好ましくは、Ｌは、非置換のＣ１−６アルキレン基、Ｃ２−６アルケニレン基又はＣ２−６アルキニレン基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、フェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、該フェニレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシ基から選択される１又は２個の置換基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｃ（Ｏ）−基から選択される基によって置換されている。
【０１５７】
最も好ましくは、Ｌは非置換のＣ１−４アルキレン基である部分であり、式中、０又は１個の炭素原子は、非置換のフェニレン基によって置換されている。
【０１５８】
Ｚは、機能的部分と反応できる、式Ｌの基に結合した反応性基を示し、その結果、この機能的部分は式Ｌの基に連結される。当業者が理解するように、反応性基自体の性質は重要ではない。非常に広範な反応性基が、機能的部分をクロスリンカー試薬に接続するために、当該分野で現在慣用的に使用されている。かかる反応性基は、例えば、アミン化合物、チオール化合物、カルボキシル化合物、ヒドロキシル化合物、カルボニル化合物、又は反応性水素を含む化合物を、クロスリンカーに結合できるものであり得る。当業者であれば当然、任意のかかる反応性基が、本発明に従う使用に適切であることを即座に認識するであろう。当業者は、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，１９９６）（その内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）などの標準的教科書を参照して、共通の一般知識から、適切な反応性基を選択することができるであろう。
【０１５９】
Ｚは好ましくは以下である：
（ａ）式−ＬＧ、−Ｃ（Ｏ）−ＬＧ、−Ｃ（Ｓ）−ＬＧ又は−Ｃ（ＮＨ）−ＬＧの基（式中、ＬＧは求電子性脱離基である）；
（ｂ）−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）及び−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２基から選択される求核剤Ｎｕ’；
（ｃ）求核剤と開環求電子反応し得る環式部分Ｃｙｃ；
（ｄ）式−Ｓ（Ｏ２）（Ｈａｌ）の基（式中、Ｈａｌはハロゲン原子である）；
（ｅ）式−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ又は−Ｎ＝Ｃ＝Ｓの基；
（ｆ）式−Ｓ−Ｓ（ＩＧ’）の基（式中、ＩＧ’は、本明細書中に記載したとおりの式ＩＧの基を示す）；
（ｇ）１個以上のハロゲン原子によって置換されたＣ６−１０アリール基である、基ＡＨ；
（ｈ）紫外線光への曝露によって活性化され得る光反応性基；
（ｉ）式−Ｃ（Ｏ）Ｈ又は−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−６アルキル）の基；
（ｊ）マレイミド基；
（ｋ）式−Ｃ（Ｏ）ＣＨＣＨ２の基；
（ｌ）式−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｎ２）Ｈ又は−ＰｈＮ２＋の基（式中、Ｐｈはフェニル基を示す）；又は
（ｍ）エポキシド基。
【０１６０】
最も好ましくは、Ｚは以下から選択される：
（ａ）式−ＬＧ、−Ｃ（Ｏ）−ＬＧ及び−Ｃ（Ｓ）−ＬＧの基（式中、ＬＧは、ハロゲン原子並びに−Ｏ（Ｃ１−６アルキル）、−ＳＨ、−Ｓ（Ｃ１−６アルキル）、トリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル基から選択される）；
（ｂ）式−ＯＨ、−ＳＨ及び−ＮＨ２の基；
（ｃ）式
【０１６１】
【化１５】
0005954789.tif 000017
【０１６２】
又は式
【０１６３】
【化１６】
0005954789.tif 000018
【０１６４】
の基；及び
（ｄ）マレイミド基。
【０１６５】
ＬＧは好ましくは、ハロゲン原子並びに−Ｏ（ＩＧ’）、−ＳＨ、−Ｓ（ＩＧ’）、−ＮＨ２、ＮＨ（ＩＧ’）、−Ｎ（ＩＧ’）（ＩＧ’’）、−Ｎ３、トリフレート、トシレート、メシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、イミダゾリル及びアジド基から選択され、式中、ＩＧ’及びＩＧ’’は、同じ又は異なって、それぞれ式ＩＧの基を示す。
【０１６６】
Ｎｕ’は好ましくは、−ＯＨ、−ＳＨ及び−ＮＨ２基から選択される。
【０１６７】
Ｃｙｃは好ましくは、基
【０１６８】
【化１７】
0005954789.tif 000019
【０１６９】
及び
【０１７０】
【化１８】
0005954789.tif 000020
【０１７１】
から選択される。
【０１７２】
Ｈａｌは好ましくは塩素原子である。
【０１７３】
ＡＨは好ましくは、少なくとも１個のフッ素原子で置換されたフェニル基である。
【０１７４】
光反応性基は、好ましくは以下から選択される：
（ａ）少なくとも１個の式−Ｎ３の基によって置換されており、１個以上のハロゲン原子によって更に置換されていてもよい、Ｃ６−１０アリール基；
（ｂ）ベンゾフェノン基；
（ｃ）式−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｎ２）ＣＦ３の基；及び
（ｄ）式−ＰｈＣ（Ｎ２）ＣＦ３の基（式中、Ｐｈはフェニル基を示す）。
【０１７５】
ｎは好ましくは１又は２であり、最も好ましくは１である。
【０１７６】
ＩＧは好ましくは、非置換のＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基又はＣ２−６アルキニル基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、フェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、該フェニレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにＣ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシ基から選択される１又は２個の置換基によって置換されており、かつ（ｂ）０、１又は２個の−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−及び−Ｃ（Ｏ）−基から選択される基によって置換されている。
【０１７７】
より好ましくは、ＩＧは、非置換のＣ１−６アルキル基である部分を示し、式中、（ａ）０又は１個の炭素原子は、非置換のフェニレン、５〜６員のヘテロアリーレン、Ｃ５−６カルボシクリレン及び５〜６員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されている。
【０１７８】
最も好ましくは、ＩＧは、非置換のＣ１−６アルキル基を示す。
【０１７９】
好ましくは、式（Ｉａ）の化合物は、式（Ｉｂ）の化合物：
【０１８０】
【化１９】
0005954789.tif 000021
【０１８１】
であり、式中、Ｘ、Ｘ’、Ｙ、Ｒ２及びＲ３３’は全て、本明細書中に記載したとおりである。
【０１８２】
式（Ｉｂ）の化合物において、好ましくは、
Ｘ及びＸ’はそれぞれ酸素原子を示し；
Ｒ３３’は水素原子又はＣ１−６アルキル基を示し；
Ｙはハロゲン原子を示し；
Ｒ２は水素若しくはハロゲン原子又はＣ１−６アルキル基を示す。
【０１８３】
本発明の実施形態（１）は、式Ｆ１の第一の機能的部分を含む式Ｒ１−Ｈの化合物を式Ｆ２の第二の機能的部分に連結するための試薬としての、上記のような式（Ｉ）の部分を含む化合物の使用に関する。典型的には、この使用は、以下に記載される実施例（２）又は実施形態（３）に記載される本発明のプロセスを実施することを含む。
【０１８４】
好ましくは、実施形態（１）の使用において、式Ｒ１−Ｈの化合物が２−メルカプトエタノールである場合、式（Ｉ）の部分を含む化合物はジブロモマレイン酸ではない。
【０１８５】
本発明の実施形態（２）は、コンジュゲートを産生するためのプロセスに関する。このプロセスの工程（ｉ）では、式（Ｉ）の部分を含む化合物を式Ｒ１−Ｈの化合物と反応させて、式（ＩＩ）の部分を含む化合物を産生する：
【０１８６】
【化２０】
0005954789.tif 000022
【０１８７】
この工程（ｉ）は、式（Ｉ）の部分の２位において、式Ｒ１−Ｈの化合物中の第一のＳＨ基の求核攻撃によって基Ｒ１を結合させることを含み、その結果２位の基Ｙは基Ｒ１によって置換される。
【０１８８】
実施形態（２）のプロセスの工程（ｉｉ）では、式Ｆ２の部分が式（ＩＩ）の部分に連結され、それによってコンジュゲートが産生される。いくつかの手順（例えば、以下の段落（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の下に示される手順）が、工程（ｉｉ）を実施するために使用できる：
（ａ）このプロセスは、式（ＩＩ）の２位と３位との間の炭素−炭素二重結合へのＦ２の求電子付加反応によって、式（ＩＩ）の部分にＦ２を連結することを含み得る。
（ｂ）式（Ｉ）の部分を含む化合物が式（Ｉａ）の化合物であり、Ｒ３及びＲ３’が一緒になって式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成し、Ｒ３３’が水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ若しくは−Ｌ（Ｚ）ｎの基を示す場合、このプロセスは、Ｆ２と、（ｉ）式−Ｎ（Ｒ３３’）の部分の窒素原子又は（ｉｉ）式Ｙ、Ｎｕ若しくは−Ｌ（Ｚ）ｎの基との間の反応によって、式（ＩＩ）の部分にＦ２を連結することを含み得る。
（ｃ）式（Ｉ）の部分を含む化合物が式（Ｉａ）の化合物であり、Ｒ３及びＲ３’が一緒になって式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成せず、Ｒ３及びＲ３’の少なくとも一方が式Ｅ、Ｎｕ又は−Ｌ（Ｚ）ｎの基を示す場合、このプロセスは、Ｆ２と式Ｅ、Ｎｕ若しくは−Ｌ（Ｚ）ｎの基との間の反応によって、式（ＩＩ）の部分にＦ２を連結することを含み得る。
（ｄ）式（Ｉ）の部分を含む化合物が式（Ｉａ）の化合物であり、Ｒ２が式Ｙ、Ｎｕ若しくは−Ｌ（Ｚ）ｎの基を示す場合、このプロセスは、Ｆ２と式Ｅ、Ｎｕ若しくは−Ｌ（Ｚ）ｎの基との間の反応によって、式（ＩＩ）の部分にＦ２を連結することを含み得る。
【０１８９】
さらなる実施形態において、式Ｆ２の部分は、式Ｆ２の部分上のアルケン基と、式（ＩＩ）の２位と３位との間の炭素−炭素二重結合との間の、光触媒的［２＋２］環化付加反応をもたらすことによって、式（ＩＩ）の部分に連結される。この手順は、式（ＩＩ）の部分由来の２−炭素原子及び３−炭素原子を含むシクロブタン環部分を生じ、環中、炭素−炭素二重結合は飽和されている。
【０１９０】
なおさらなる実施形態において、Ｒ３及びＲ３’が一緒になって式−Ｏ−の基を形成し、式Ｆ２の部分が求核基（例えば、第一級又は第二級アミン基）を保有する場合、式Ｆ２の部分は、求核開環反応及び次いで求核閉環反応に参加することによって、式（ＩＩ）の部分に連結され得る。例えば、Ｘ及び／又はＸ’がＯであり、Ｒ３及びＲ３’が一緒になって式−Ｏ−の基を形成する場合、式（ＩＩ）の部分は環式酸無水物である。従って、アミン基などを保有する式Ｆ２の部分は、求核開環及び次いで求核閉環に参加し得、基−Ｏ−が基−Ｎ（機能的部分）−によって置換されるという全体的効果が生じることが理解できる。
【０１９１】
コンジュゲートを産生するための代替的プロセスは、本発明の実施形態（３）により提供される。このプロセスでは、式Ｒ１−Ｈの化合物を、（ａ）式（Ｉ）の部分及び（ｂ）それに連結された少なくとも１個の式Ｆ２の部分を含む化合物と反応させる。このプロセスは、式（Ｉ）の部分の２位における、式Ｒ１−Ｈの化合物中の第一のＳＨ基の求核攻撃によって基Ｒ１を結合させることを含み、その結果２位の基Ｙが基Ｒ１によって置換される。
【０１９２】
好ましくは、上記実施形態（３）のプロセスによれば、（ａ）式（Ｉ）の部分及び（ｂ）それに連結された少なくとも１個の式Ｆ２の部分を含む化合物は、式（ＩＩａ）の化合物
【０１９３】
【化２１】
0005954789.tif 000023
【０１９４】
であり、式中、
以下のいずれかであり：
Ｒ３ａは、式Ｒ３の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し、Ｒ３ａ’は独立して、式Ｒ３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、各Ｒ３３ａ’は、同じ又は異なって、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；
Ｒ２ａは、式Ｒ２の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し；
ｍは、０からｎまでの値を有する整数であり；
式（ＩＩａ）の化合物は、少なくとも１個の式Ｆ２の基を含み；
Ｆ２、Ｘ、Ｘ’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ３３’、Ｒ２、Ｌ、Ｚ及びｎは全て、本明細書中に記載したとおりである。
【０１９５】
好ましくは、上記実施形態（３）のプロセスによれば、Ｒ３ａは、式Ｒ３の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し、Ｒ３ａ’は独立して、式Ｒ３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示すか；或いは、Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す。
【０１９６】
当業者に明らかなように、式（ＩＩａ）の化合物は、上記式（ＩＩ）の化合物に関連する。しかしながら、式（ＩＩａ）の化合物は、少なくとも１個の機能的部分Ｆ２を含む。従って、式（ＩＩａ）の化合物は、当該分野で通常知られる方法を使用して、その対応する式（ＩＩ）の化合物に機能的部分Ｆ２を連結することによって、容易に調製され得る。
【０１９７】
好ましくは、上記実施形態（３）のプロセスによれば、（ａ）式（Ｉ）の部分及び（ｂ）それに連結された少なくとも１個の式Ｆ２の部分を含む化合物は式（ＩＩａ）の化合物であって、式中、
以下のいずれかであり：
Ｒ３ａは、式Ｒ３の基又は式Ｆ２の基を示し、Ｒ３ａ’は独立して、式Ｒ３’の基又は式Ｆ２の基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２の基を示し；
Ｒ２ａは、式Ｒ２の基又は式Ｆ２の基を示す。
【０１９８】
好ましくは、式（ＩＩａ）の化合物は、最大３個の式Ｆ２の基、より好ましくは１又は２個の式Ｆ２の基、最も好ましくは１個の式Ｆ２の基を含む。
【０１９９】
明らかに、本発明の実施形態（２）又は（３）のプロセスを実施した後、１個以上のさらなる反応性基は、コンジュゲート生成物（クロスリンカー試薬の２位及び３位に対応する位置に位置する炭素−炭素二重結合、並びにさらなる求核基、求電子基及び式Ｚの反応性基を含む）上に残り得る。従って、さらなる態様において、本発明の実施形態（２）及び（３）のプロセスは、１個以上のさらなる機能的部分をこのコンジュゲートに連結する工程をさらに含み、各さらなる機能的部分は、同じ又は異なって、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される。
【０２００】
実施形態（２）及び（３）のプロセスにおいて生じる化学反応は、クロスリンカー試薬を機能的部分に結合するための当該分野で公知の慣用技術（例えば、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，１９９６）（その内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載される技術）を使用して実施できる。かかる反応を実施するのに適した条件のさらなる例は、本明細書の実施例のセクションに見出すことができる。
【０２０１】
当業者が理解するように、試薬（例えば、機能的部分を保有する化合物又はクロスリンカー試薬）が１個より多い反応性基を保有する場合、反応に関与することが意図されない反応性基の化学的保護をもたらすことが望ましい場合がある。例えば、基（例えば、ヒドロキシル、アミノ及びカルボキシ基）が最終生成物中に望まれる場合、これらの基を保護して、反応への望ましくない関与を回避することが必要な場合がある（例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９を参照のこと）。従来の保護基が標準的な慣例と合わせて使用され得る。ある場合には、脱保護は中間又は最終の工程で使用され得、従って、本明細書中に記載される本発明に従う実施形態（２）及び（３）のプロセスは、かかる保護基の付加及び除去にまでおよぶことが理解される。
【０２０２】
好ましくは、実施形態（２）において、式Ｒ１−Ｈの化合物が２−メルカプトエタノールである場合、式（Ｉ）の部分を含む化合物はジブロモマレイン酸ではない。
【０２０３】
好ましくは、実施形態（３）において、式Ｒ１−Ｈの化合物が２−メルカプトエタノールである場合、（ａ）式（Ｉ）の部分及び（ｂ）それに連結された少なくとも１個の式Ｆ２の部分を含む化合物は、Ｎ−フェニル  ３，４−ジブロモマレイミドではなく、式中、Ｎ−フェニル基は、置換又は非置換である。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、実施形態（２）又は（３）のプロセスに従って産生されるコンジュゲートは、マレイミド環を含むことになることが理解されるだろう。具体的には、式（Ｉ）の部分において１位及び４位の炭素原子が基−Ｎ（Ｒ３３’）−を介して一緒に連結されている場合に、これが生じる。コンジュゲートがマレイミド環を含む場合、実施形態（２）又は（３）のプロセスは、このマレイミド環の開環をもたらすことをさらに含み得る。マレイミド環の開環は、当該分野で公知の加水分解反応によってもたらされ得る。マレイミドの開環をもたらすことは、機能的部分をコンジュゲートに不可逆的に結合させることができるので、特定の適用で有利な場合がある。
【０２０５】
実施形態（４）において、本発明は、チオール含有機能的部分とクロスリンカー部分（これは、１個以上のさらなる機能的部分にさらに連結されていてもよい）との間の結合を切断するためのプロセスに関する。より具体的には、この切断は、式（ＩＩ）の部分を含む化合物に対してもたらされる。
【０２０６】
実施形態（４）のプロセスが特に有用な技術の例には、タンパク質精製、プロテオミクス分析、及び酵素の結合部位を探索するためのプロセスが挙げられる。実施形態（４）のプロセスの好ましい実施形態において、式Ｆ１の第一の機能的部分は、タンパク質、特に高価であるか取得に時間がかかるタンパク質（例えば、発現が困難なタンパク質（例えばＧＰＣＲタンパク質））である。実施形態（４）のプロセスの別の好ましい実施形態において、式Ｆ１の第一の機能的部分は、生物活性部分（例えば、薬物）である。なぜなら本明細書中では、この方法論は薬物送達方法などで利用され得るからである。
【０２０７】
実施形態（４）のプロセスの第一の好ましい実施形態において、式（ＩＩ）の部分を含む化合物は、式（ＩＩＩ）の化合物
【０２０８】
【化２２】
0005954789.tif 000024
【０２０９】
であり、式中、
以下のいずれかであり：
Ｒ３ａは、式Ｒ３の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し、Ｒ３ａ’は独立して、式Ｒ３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、各Ｒ３３ａ’は、同じ又は異なって、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；
Ｒ２ａは、式Ｒ２の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し；
ｍは、０からｎまでの値を有する整数であり；
Ｒ１、Ｆ２、Ｘ、Ｘ’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ３３’、Ｒ２、Ｌ、Ｚ及びｎは全て、本明細書中に記載したとおりである。
【０２１０】
より好ましくは、この実施形態において、Ｒ３ａは、式Ｒ３の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し、Ｒ３ａ’は独立して、式Ｒ３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示すか、或いはＲ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す。
【０２１１】
実施形態（４）のプロセスの第二の好ましい実施形態において、式（ＩＩ）の部分を含む化合物は、式（ＩＩＩａ）の化合物
【０２１２】
【化２３】
0005954789.tif 000025
【０２１３】
であり、式中、
以下のいずれかであり：
Ｒ３ａは、式Ｒ３の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し、Ｒ３ａ’は独立して、式Ｒ３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；又は
Ｒ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−Ｎ（Ｒ３３ａ’）−の基を形成し、各Ｒ３３ａ’は、同じ又は異なって、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す；
ｍは、０からｎまでの値を有する整数であり；
Ｒ１は、本明細書中で前記したとおりであり、ここでＲ１は、少なくとも第一のチオール基及び第二のチオール基を含み、この第一のチオール基は、式（ＩＩＩａ）の化合物中の２位に結合しており、第二のチオール基は、式（ＩＩＩａ）の化合物中の３位に結合しており；
Ｆ２、Ｘ、Ｘ’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ３３’、Ｌ、Ｚ及びｎは全て、本明細書中に記載したとおりであり；
工程（ｉｉ）はさらに、式（ＩＩＩａ）の部分の３位において、基Ｒ１と炭素原子との間の結合を切断することを含む。
【０２１４】
この第二の好ましい実施形態において、Ｒ３ａは好ましくは、式Ｒ３の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し、Ｒ３ａ’は独立して、式Ｒ３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示すか、或いはＲ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す。
【０２１５】
従って、この第二の好ましい実施形態は、少なくとも２個のチオール基を含む機能的部分から、クロスリンカー部分を切断するためのプロセスを提供する。かかる機能的部分の例は、ジスルフィド基を含む部分、例えば、ジスルフィド結合を介して互いに連結された２個のシステイン残基を含むタンパク質である。
【０２１６】
好ましくは、実施形態（４）のプロセスでは、式（ＩＩ）の部分を含む化合物はまた、式Ｆ２の機能的部分を少なくとも１個含む。
【０２１７】
実施形態（４）のプロセスでは、式Ｒ１の基への結合（複数可）を切断する工程（ｉｉ）は、不飽和炭素中心でチオール結合を切断するための慣用的な方法を使用して、例えば、電子不足型アルケンに結合したチオールを切断するための慣用的な方法を使用して、実施できる。
【０２１８】
好ましくは、実施形態（４）のプロセスの工程（ｉｉ）は、Ｍｉｃｈａｅｌ反応において求核剤として作用できる試薬と共に、化合物をインキュベートすることによってもたらされる。Ｍｉｃｈａｅｌ反応において求核剤として作用できることが周知の試薬の例としては、ホスフィン化合物、亜リン酸塩化合物、チオール、セレノール、アミン及びソフトカーボン求核化合物が挙げられる。ホスフィン化合物及び亜リン酸塩化合物は共に、３価のリン原子を含む。ホスフィンでは、このリン原子は水素又は炭素原子に結合されるが、亜リン酸塩では、このリン原子は酸素原子に結合される（炭素原子及び酸素原子自体は、それぞれの化合物中の他の基にさらに結合されることが理解される）。チオールは、チオール基−ＳＨを含む有機化合物である。セレノールは、−ＳｅＨ基を含む有機化合物である。アミンは、アミン官能基を含む化合物である。ソフトカーボン求核剤は、ソフトな求核炭素中心を含む化合物である。例示的なソフトカーボン求核剤は、米国特許第５，４１４，０７４号に開示されており、その内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。当業者であれば当然、慣用として、例えば、本明細書中に記載される試薬のクラスの例示的リストのなかから適切な試薬を慣用的に選択することによって、Ｍｉｃｈａｅｌ反応において求核剤として作用できる適切な試薬を選択することができるであろう。
【０２１９】
本明細書中で好ましい試薬は、ホスフィン化合物及びチオールである。特に好ましいホスフィンは、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンであり、これは、「ＴＣＥＰ」として一般に知られ、化合物（例えばタンパク質）中のジスルフィド結合を還元するために、当該分野において一般に使用される。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンはまた、その塩酸塩などの塩の形態でも供給され得る。特に好ましいチオールはグルタチオンである。さらに好ましいチオールは、１，２−エタンジチオール、２−メルカプトエタノール及びジチオスレイトール（即ち、ＨＳＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＳＨ、ＤＴＴとして一般に知られる）である。試薬の好ましい群は、１，２−エタンジチオール、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、グルタチオン及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンである。
【０２２０】
疑義を回避するために、本明細書中で使用する場合、用語「Ｍｉｃｈａｅｌ反応において求核剤として作用できる試薬」とは、化合物中のα，β−不飽和部分、特に式（Ｖ）の部分
【０２２１】
【化２４】
0005954789.tif 000026
【０２２２】
と反応できる試薬を意味し、式中、Ｘは本明細書中に記載したとおりである。かかる試薬は、ある場合には「コンジュゲート付加反応において求核剤として作用できる試薬」としても知られる。明らかに、これらの試薬は、求核炭素中心を介して反応する試薬（例えば、ソフトカーボン求核剤）に限定されず、求核非炭素中心を介して反応する試薬（例えば、本明細書中に記載される例示的試薬）も含む。
【０２２３】
本発明は、以下を含むプロセスも提供する：
（ｉ）実施形態（２）又は（３）に記載された、コンジュゲートを産生するためのプロセスを実施する工程；及び
（ｉｉ）その後、該コンジュゲートから式Ｒ１−Ｈの化合物を再生する工程。
【０２２４】
典型的には、このプロセスにおいて、工程（ｉｉ）は、Ｍｉｃｈａｅｌ反応において求核剤として作用できる試薬（例えば、実施形態（４）に関連して記載された試薬）と共に化合物をインキュベートすることによってもたらされる。
【０２２５】
本発明の方法論は、本発明の実施形態（５）、（６）、（７）、（８）及び（９）を構成する、一連の新規化合物もまた生じさせる。
【０２２６】
本発明の実施形態（５）は式（ＩＩａ）の化合物に関する。この化合物は、（ａ）式（Ｉ）の部分及び（ｂ）それに連結された少なくとも１個の式Ｆ２の部分を含む。従って、この化合物は、具体的には実施形態（３）のプロセスを実施する際に試薬としてこれを使用することによって、チオール含有機能的化合物（本明細書中で化合物Ｒ１−Ｈと呼ぶ）を、式Ｆ２の部分で官能化するために使用できることが明らかである。
【０２２７】
好ましくは、実施形態（５）において、式（ＩＩａ）の化合物はＮ−フェニル  ３，４−ジブロモマレイミドではなく、ここでＮ−フェニル基は置換又は非置換である。
【０２２８】
好ましくは、実施形態（５）の式（ＩＩａ）の化合物において、Ｒ３ａは、式Ｒ３の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示し、Ｒ３ａ’は独立して、式Ｒ３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示すか、或いはＲ３ａ及びＲ３ａ’は一緒になって、式−Ｎ（Ｒ３３ａ’）の基を形成し、Ｒ３３ａ’は、式Ｒ３３’の基又は式Ｆ２若しくは−Ｌ（Ｆ２）ｍ（Ｚ）ｎ−ｍの基を示す。
【０２２９】
本発明の実施形態（６）は、Ｒ３及びＲ３’が一緒になって式−Ｎ（Ｒ３３’）の基を形成しないという条件で、式（ＩＩｂ）の化合物に関する。従って、疑義を回避するために、この化合物中、Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子又は式Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示すか、或いはＲ３及びＲ３’は一緒になって、式−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ３３’）−Ｎ（Ｒ３３’）−の基を形成し、各Ｒ３３ａ’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Ｙ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す。好ましくは、Ｒ３及びＲ３’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子又は式Ｅ、Ｎｕ、−Ｌ（Ｚ）ｎ若しくはＩＧの基を示す。
【０２３０】
従って、実施形態（６）の化合物は、本発明の実施形態（２）のプロセスの工程（ｉ）を実施することによって得られる中間体を構成し、具体的には、これは、本発明の反応性架橋試薬に結合した第一の機能的部分を保有する中間体である。次いで、この中間体は、本発明の実施形態（２）のプロセスの工程（ｉｉ）を実施することによって、第二の機能的部分をさらに含むコンジュゲート分子へと容易に変換され得る。
【０２３１】
本発明の実施形態（７）は、式Ｆ２の基を少なくとも１個含む式（ＩＩＩ）の化合物に関し、式中、Ｒ２ａは水素原子ではない。従って明らかに、この化合物は、本発明の使用及びプロセスに従って得られ得るコンジュゲートを構成し、これは、本発明の架橋部分によって架橋された第一の機能的部分及び第二の機能的部分の両方を含む。Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００９，１３１（２９），ｐｐ  ９９８６−９９９４）に記載される１つの実験は、置換された７−オキサノルボルナジエン部分をクロスリンカーとして使用して、マレイミドクロスリンカーを含むコンジュゲートを生成している。しかしながら、この方法論は、Ｒ２ａ置換基に対応する置換基位置で水素原子を必然的に生じる。対照的に、コンジュゲートを合成するのに適切なプロセスを実施する際に、式（Ｉ）の部分に結合させる水素以外の基を単に選択することによって、水素以外のＲ２ａ置換基を得るために本発明の方法論が容易に適用できることは、当業者に即座に明らかとなろう。従って、実施形態（７）に従う式（ＩＩＩ）の化合物（式中、Ｒ２ａは、求電子性脱離基、求核基、又は反応性基を保有するリンカー基である）は、例えば、さらなる官能化をもたらすために使用され得る。或いは、第二の機能的部分Ｆ２自体が、この置換基位置に位置していてもよい（３位に直接結合しているか、リンカー基を介してそこに結合しているかのいずれか）。またさらに、式Ｒ２ａの基は、式ＩＧの不活性基（例えば、コンジュゲート分子を生じるさらなる反応が起きないようにする、嵩高い化学的に非反応性の置換基）を構成し得る。
【０２３２】
好ましくは、実施形態（７）において、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（Ｎ）の化合物及びその医薬上許容される塩：
【０２３３】
【化２５】
0005954789.tif 000027
【０２３４】
ではなく、式中、
ＲＮ１及びＲＮ２は独立して、水素、アミノ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、カルボキシレート、カルボキサミド、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよい炭素環式アリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいメルカプトアルキル、置換されていてもよいモノ−若しくはジ−アルキルアミノ、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素脂環式（ｈｅｔｅｒｏａｌｉｃｙｃｌｉｃ）、又は置換されていてもよいアミノアルキルから選択され；
ＲＮ３は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよい炭素環式アリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、又は置換されていてもよい複素脂環式基である。
【０２３５】
本発明の実施形態（８）は、式（ＩＩＩａ）の化合物に関する。特に、この化合物は、クロスリンカー試薬に結合した少なくとも第一のチオール基及び第二のチオール基を有する、第一の機能的部分を含む。この化合物は、少なくとも１個のさらなる機能的部分をさらに含んでいてもよい。好ましくは、式（ＩＩＩａ）の化合物は、式Ｆ２の機能的部分を少なくとも１個含む。好ましくは、式Ｒ１の基は、少なくとも２個のシステイン残基を含むペプチド又はタンパク質であり、例えば、未結合のペプチド又はタンパク質中の２つのシステイン残基は、そのペプチド又はタンパク質中で内部ジスルフィド結合を典型的に形成する。
【０２３６】
本発明の実施形態（９）は、式（ＩＶａ）又は（ＩＶｂ）の化合物に関する。これらの化合物は、第一の機能的部分及び第二の機能的部分の両方を含むので、コンジュゲート分子を構成すること、さらには、これらの化合物が、２位と３位との間に炭素−炭素二重結合ではなく炭素−炭素単結合を含むことが、理解されよう。しかしながら、従来のマレイミド試薬を使用して調製されたコンジュゲートとは異なり、式（ＩＶａ）及び（ＩＶｂ）の化合物は、２位及び３位に合計で少なくとも２個の機能的部分を有する。
【０２３７】
式（ＩＶａ）及び（ＩＶｂ）の化合物は、簡単な方法を使用して調製できる。１つのかかる方法では、コンジュゲート分子は、本発明の実施形態（２）のプロセスを実施することによって調製され、このプロセスにおいて、工程（ｉｉ）は、式（ＩＩ）の２位と３位との間の炭素−炭素二重結合へのＦ２の求電子付加反応を含む。別の方法では、２位と３位との間の炭素−炭素二重結合を依然として含むコンジュゲートが最初に調製され、次いで、求電子付加反応が実施されて二重結合を飽和する。この求電子付加反応は、さらなる機能的部分（例えば、チオールを含有するさらなる機能的部分）の付加を含み得る。或いは、これは、不飽和の炭素−炭素中心において求電子付加反応を実施するために慣用的に使用される任意の他の試薬を含み得る。例えば、この試薬は、ハロゲン化水素、ジハロゲン、硫酸、水、アルコール、Ｈ２Ｓ、メルカプタン又はカルボン酸であり得る。
【０２３８】
本発明の実施形態（１０）は、式（ＩＶａ）又は（ＩＶｂ）の化合物を産生するためのプロセスに関する。式Ｒ４−Ｈの化合物由来の基Ｒ４が式（ＩＩＩ）の化合物に付加される位置は、式（ＩＩＩ）の化合物の正確な構造、試薬Ｒ４−Ｈの性質、及び反応が実施される反応条件に依存することが理解されよう。通常、式Ｒ４の基は、式（ＩＩＩ）の化合物へのプロトンの付加の際に最も安定なカチオン性中間体を形成できる炭素原子に付加されるであろう（即ち、Ｍａｒｋｏｖｎｉｋｏｖ則に従う）。当業者であれば、式Ｒ４の基の付加に特定の位置が望ましい場合、反応条件及び式（ＩＩＩ）の化合物上の他の基の正体の慣用的な選択により、かかる位置選択性が達成できることを理解するであろう。
【０２３９】
当業者に明らかなように、本発明の方法論は、機能的部分のコンジュゲート化を含む公知のプロセス及び方法に広く適用可能である。典型的には、このタイプの従来のプロセス及び方法は、２つの機能的分子を一緒に連結する架橋分子上の従来公知のチオール反応性基（例えばマレイミド基）を、本発明の式（Ｉ）の部分によって置換することによって、簡単に改変することができる。
【０２４０】
慣用的プロセスの例には、物質、特に抗原又はＤＮＡなどの生物学的に興味深い物質を検出するためのプロセス、機能的部分を含むチオール化合物を精製するためのプロセス、及び物質がかかる化合物と相互作用するか否かを同定するためのアッセイプロセスが挙げられる。従って、本発明は、以下の実施形態（１１）、（１２）及び（１３）もまた提供し、これらは、本発明の方法論に従って実施される検出、精製及びアッセイのプロセスに関する。
【０２４１】
実施形態（１１）は、物質がサンプル中に存在するか否かを検出するためのプロセスに関する。典型的には、この物質は、生物学的に興味深い物質（例えば、抗原、抗体、ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。本発明の化合物は、サンプルと共にインキュベートされる。この化合物は、少なくとも２個の機能的部分：第一には検出可能なシグナルを生成し得る機能的部分、及び第二には試験下で該物質と相互作用し得る機能的部分、を含むコンジュゲートである。検出可能なシグナルを生成し得る機能的部分は、最も好ましくは酵素であるが、例えば、検出可能部分又はアフィニティタグでもあり得る。明らかに、試験下で該物質と相互作用し得る機能的部分の性質は、その物質自体の性質に依存する。例えば、物質が抗原である場合、この機能的部分は典型的には抗体である。物質がＤＮＡ又はＲＮＡである場合、この機能的部分は典型的には、ＤＮＡ又はＲＮＡの相補鎖であり、ここで「相補（的）」とは、その機能的部分がその物質と相互作用し得る（即ち、それとハイブリダイズし得る）ことを意味する。
【０２４２】
好ましくは、インキュベートする工程の後に、試験下で該物質と相互作用（即ち、結合）しなかったコンジュゲートの量を除去する工程、例えば洗浄する工程、が続く。これは、例えば、物質を固体基材に結合させる（例えば、該物質と、（ａ）該物質と相互作用し得かつ（ｂ）該基材に結合したさらなる機能的部分との間の相互作用を介して）アッセイを使用することによって達成され得る。その場合、試験下で該物質に結合したコンジュゲートを保持したままで、相互作用しないコンジュゲートが洗浄によって容易に除去され得る。
【０２４３】
実施形態（１１）のプロセスは、検出可能なシグナルを生成し得る機能的部分からの検出可能なシグナルの生成を可能にする条件下で、シグナルをモニタリングする工程もまた含む。例えば、この機能的部分が酵素である場合、この工程は、酵素によって変換されると検出可能なシグナルを生成する（例えば、着色産物又は蛍光性産物を生じる）酵素基質を添加することを含む。好ましい酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼが挙げられる。
【０２４４】
好ましくは、実施形態（１１）のプロセスは、ＥＬＩＳＡ（「酵素結合免疫吸着検定法」）プロセス、ＬＡＢ（「標識アビジン−ビオチン」）アッセイプロセス又はＢＲＡＢ（「架橋アビジン−ビオチン」）アッセイプロセス又はＡＢＣ（「アビジン−ビオチン複合体」）アッセイプロセスを構成する。これらのアッセイプロセスは全て、慣用的なイムノアッセイプロセスであり、当業者によく知られている。最も好ましくは、実施形態（１１）のプロセスは、ＥＬＩＳＡプロセスを構成する。
【０２４５】
実施形態（１２）は、サンプルから式Ｒ１−Ｈの化合物を精製するためのプロセスに関する。このプロセスは、サンプルを、（ａ）式（Ｉ）の部分及び（ｂ）それに連結された少なくとも１個のアフィニティタグを含む化合物と共にインキュベートして、実施形態（３）に従うプロセスをもたらし、それによって、基Ｒ１及びアフィニティタグを含むコンジュゲートを得る工程を含む。次いで、このコンジュゲートは、サンプルからのコンジュゲートの精製を可能にする条件下で、少なくとも１個のアフィニティタグパートナーを含む化合物と共にインキュベートされる。特に適切なアフィニティタグはビオチンであり、特に適切なアフィニティタグパートナーはアビジン又はストレプトアビジンである。
【０２４６】
実施形態（１２）は、物質が、式Ｒ１の機能的部分と相互作用するか否かを同定するためのプロセスに関する。このプロセスは以下の工程を含む：
（ａ）式Ｒ１の機能的部分及び（ｂ）該物質により修飾され得るシグナルを生成し得る検出可能部分を含むコンジュゲートを、実施形態（２）又は（３）のプロセスを実施することにより産生する工程；
該コンジュゲートを該物質とインキュベートする工程；
該検出可能部分からのシグナルを得る工程；及び
該シグナルを、該コンジュゲートが該物質と接触していない場合に得られ得るコントロールシグナルと比較し、それによって、該物質が該コンジュゲートと相互作用するか否かを決定する工程。
【０２４７】
フェルスター共鳴エネルギー移動即ち「ＦＲＥＴ」アッセイは、実施形態（１２）のプロセスの例示的実施形態である。ＦＲＥＴアッセイにおいて、式Ｒ１の機能的部分に結合した検出可能部分はドナー発色団であり、物質は、アクセプター発色団で標識される。ドナー発色団／アクセプター発色団対は、当該分野で周知である。一例は、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）／黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）対である。ＦＲＥＴアッセイは、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用及びタンパク質コンフォメーション変化を研究するために使用され得る。
【０２４８】
本発明のコンジュゲート、具体的には実施形態（７）、（８）及び（９）のコンジュゲートは、医学的治療又は診断の方法で使用するのにも適切である。従って、本発明は、実施形態（１４）において、ヒト又は動物の身体に対して実施される手術若しくは治療又は診断方法によって該ヒト又は動物の身体を治療する方法における、かかる化合物の使用を提供する。実施形態（１４）はまた、かかる化合物をヒト又は動物の身体に投与することを含む、ヒト又は動物の身体の治療方法或いはヒト又は動物の身体に対して実施される診断方法に関する。
【０２４９】
当業者が即座に認識するように、実施形態（１４）での使用に適したコンジュゲートは、典型的には、少なくとも１個の生物活性部分を含むコンジュゲートである。好ましい１実施形態において、第一の機能的部分は生物活性部分であり、第二の機能的部分はポリマー部分（例えば、バイオアベイラビリティ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を増強し得る部分、例えばポリエチレングリコール部分）又は抗体（例えば、癌の治療などにおいて特異的抗原を標的化する際に使用するための免疫毒素コンジュゲートを形成するため）である。別の好ましい実施形態において、ＰＥＴ（ポジトロン放出断層撮影）診断方法において使用するために、コンジュゲートは、放射性部分及び生物活性部分を含む。
【０２５０】
任意の特定の患者に対する特定の用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的健康、性別、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、薬物の組合わせ、及び治療を受ける特定の疾患の重篤度を含む種々の因子に依存することが理解されるであろう。最適な用量レベル及び投薬頻度は臨床試験によって決定されるであろうが、例示的な投薬量は、１日当たり０．１〜１０００ｍｇであろう。本発明に関する医療用化合物は、それらの薬物動態学的特性と合致した任意の経路による投与のために調製され得る。経口投与可能な組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、ロゼンジ、液体又はゲル製剤、例えば、経口、局所、又は無菌の非経口溶液若しくは懸濁物、の形態であり得る。経口投与用の錠剤及びカプセルは、単位用量提示形態であり得、結合剤（例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガント又はポリビニルピロリドン）；充填剤（例えば、ラクトース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン）；錠剤化滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン）、又は許容可能な湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの、従来の賦形剤を含み得る。錠剤は、通常の製薬実務で周知の方法に従ってコーティングされ得る。経口液体製剤は、例えば、水性又は油性の、懸濁物、溶液、エマルジョン、シロップ又はエリキシルの形態であってもよく、使用前に水又は他の適切なビヒクルで再構成するための乾燥製品として提示してもよい。かかる液体製剤は、従来の添加剤（例えば、懸濁剤（例えば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン又はアカシア）；非水性ビヒクル（これは食用油を含み得る）（例えば、アーモンド油、分留ココナツ油、油状エステル、例えばグリセリン、プロピレングリコール、又はエチルアルコール）；防腐剤（例えば、メチル若しくはプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸塩又はソルビン酸）、及び所望の場合には従来の調味料又は着色剤）を含み得る。
【０２５１】
皮膚への局所適用のために、医療用化合物は、クリーム、ローション又は軟膏にされ得る。薬物のために使用され得るクリーム又は軟膏製剤は、例えば英国薬局方などの薬剤学の標準的教科書に記載されるような、当該分野で周知の従来の製剤である。
【０２５２】
吸入による局所適用のために、医療用化合物は、例えば、圧力駆動型ジェットアトマイザ又は超音波アトマイザによる、或いは好ましくは噴霧剤駆動型の定量エアロゾル又は噴霧剤なしの微粉化粉末の投与（例えば、吸入カプセル又は他の「乾燥粉末」送達システム）による、エアロゾル送達のために製剤化され得る。賦形剤、例えば、噴霧剤（例えば、定量エアロゾルの場合Ｆｒｉｇｅｎ）、表面活性物質、乳化剤、安定剤、防腐剤、調味料及び充填剤（例えば、粉末吸入器の場合ラクトース）が、かかる吸入製剤中に存在し得る。吸入目的のために、多数の器具（ａｐｐａｒａｔａ）が利用可能であり、これにより、患者に適した吸入技術を使用して、最適な粒子サイズのエアロゾルが生成され投与され得る。定量エアロゾル（特に粉末吸入器の場合）のための、アダプタ（スペーサー、エキスパンダ）及び洋ナシ形容器（例えば、Ｎｅｂｕｌａｔｏｒ（登録商標）、Ｖｏｌｕｍａｔｉｃ（登録商標））、及びパッファースプレー（ｐｕｆｆｅｒ  ｓｐｒａｙ）を放射する自動デバイス（Ａｕｔｏｈａｌｅｒ（登録商標））の使用に加えて、多数の技術的解決法が利用可能である（例えば、Ｄｉｓｋｈａｌｅｒ（登録商標）、Ｒｏｔａｄｉｓｋ（登録商標）、Ｔｕｒｂｏｈａｌｅｒ（登録商標）、又は欧州特許出願ＥＰ  ０  ５０５  ３２１に記載される吸入器などの吸入器）。
【０２５３】
眼への局所的適用のために、医療用化合物は、適切な無菌の水性又は非水性ビヒクル中の溶液又は懸濁物にされ得る。添加剤、例えば、緩衝剤（例えば、メタ重亜硫酸ナトリウム又はエデト酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｅｄｅａｔｅ））；防腐剤（酢酸フェニル水銀又は硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウム又はクロルヘキシジンなどの殺菌剤及び殺真菌剤を含む）、及び増粘剤（例えば、ヒプロメロース）なども含まれ得る。
【０２５４】
活性成分は、無菌媒体中で非経口投与されてもよい。使用されるビヒクル及び濃度に依存して、薬物は、ビヒクル中に懸濁又は溶解され得る。有利には、局所麻酔薬、防腐剤及び緩衝剤などの補助剤が、ビヒクル中に溶解され得る。
【０２５５】
本発明の医療用化合物は、多数の公知の医薬上活性な物質と合わせて使用され得る。
【０２５６】
本発明はさらに、式（ＶＩ）の部分及びそれに連結された機能的部分を含む化合物を提供する。
【０２５７】
【化２６】
0005954789.tif 000028
【０２５８】
式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される。
【０２５９】
典型的には、この機能的部分は、式（ＶＩ）の部分の５位又は６位に連結される。従って、この化合物は、アルケン部分を含む機能的部分を、光触媒的［２＋２］環化付加反応において、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の部分を含む化合物、又は式（Ｉａ）（Ｉｂ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩＩ）若しくは（ＩＩＩａ）の化合物の、２位と３位との間の炭素−炭素二重結合と反応させることによって、産生され得る。
【０２６０】
好ましくは、式（ＶＩ）の部分は、少なくとも１個（例えば１個）のさらなる機能的部分を含み、このさらなる機能的部分自体は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから独立して選択される。この実施形態において、好ましくは１個のかかるさらなる機能的部分は、チオール部分を有し、このチオール部分の硫黄原子を介して式（ＶＩ）の部分の２位に連結される。従って、この化合物は、以下によって、式（Ｉ）の部分を含む化合物から産生され得る：
式（Ｉ）の部分を含む化合物を、チオール基を有するさらなる機能的部分と反応させることによって、式（ＩＩ）の部分を含む化合物である中間体生成物を創出すること；及び
この中間体化合物を、アルケン部分を含む機能的部分と反応させて、このアルケン部分と、中間体生成物の２位と３位との間の炭素−炭素二重結合との間の光触媒的［２＋２］環化付加反応をもたらすこと。
【０２６１】
好ましくは、式（ＶＩ）の部分及びそれに連結された機能的部分を含む化合物は、式（ＶＩａ）の化合物
【０２６２】
【化２７】
0005954789.tif 000029
【０２６３】
であり、式中、
Ｘ及びＸ’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式＝ＮＱの基を示し、Ｑは、水素、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル又はフェニルであり；
ＹＲ１は、式Ｙ又はＲ１の基であり；
Ｙは求電子性脱離基であり；
Ｒ１は、式−Ｆ１又は−Ｓ−Ｌ−Ｆ１の基であり、Ｒ１はチオール部分を有し、このチオール部分の硫黄原子を介して式（ＶＩａ）の部分の２位に連結されており；
Ｒ２ａ、Ｒ３ａ及びＲ３ａ’はそれぞれ、式（ＩＩａ）の化合物に関して記載されたとおりであり；
Ｒａｌｋ１、Ｒａｌｋ２、Ｒａｌｋ３及びＲａｌｋ４のそれぞれは、同じ又は異なって、式Ｒ２ａの基であり、ただし、Ｒａｌｋ１、Ｒａｌｋ２、Ｒａｌｋ３及びＲａｌｋ４の少なくとも１つは式Ｆ２の基を含み；
Ｆ１、及び式Ｆ２の任意の基は、同じ又は異なって、それぞれ、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡから選択される。
【０２６４】
好ましくは、ＹＲ１は式Ｒ１の基であり、Ｒ１は好ましくは、式−Ｆ１の基である。好ましくは、式（ＶＩａ）の化合物は、式Ｆ２の基を１個含む。
【実施例】
【０２６５】
以下の実施例は、本発明の根底をなす科学原理を説明する。実施例の多くは、２つの機能的化合物の連結を含まないため、参考例である。しかしながら、本発明に適した連結基への機能的部分の連結、そこからの機能的部分の切断、及び本発明に適した連結基を介した多数の他の二次的部分（他の機能的部分を含む）への機能的部分の連結が、網羅的に実証されている。高い程度の構造的バリエーションが容易に許容されることが示され、本発明の広い適用可能性を証明している。
【０２６６】
Ａ）予備的実施例
１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、１Ｈについては５００ＭＨｚ、１３Ｃについては１２５ＭＨｚの周波数で作動するＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００機器で、室温で記録した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３（７．２６ｐｐｍ）シグナルを参照とした。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３（７７．６７ｐｐｍ）シグナルを参照とした。
赤外線スペクトルは、センチメートルの逆数（ｃｍ−１）で与えられる周波数で、ＡＴＲモードで作動するＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  １００  ＦＴ−ＩＲスペクトロメータで実行した。
質量スペクトル及び高分解能質量データは、ＶＧ７０−ＳＥ質量分析計（ＥＩモード及びＣＩモード）で記録した。
融点（ｍ．ｐ．）はＧａｌｌｅｎｋａｍｐ加熱ブロックで取得したものであり、未補正である。
旋光度測定は、１０ｃｍのセル長さでＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ３４３旋光計を使用して実施した。
【０２６７】
略号
Ｂｏｃ                Ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基
Ｃｙｓ                システイン
Ｍａｌ                マレイミド
ＤＭＦ                ジメチルホルムアミド
ＴＣＥＰ              （トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）
ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ    液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析
【０２６８】
参考例１：ブロモマレイミド（化合物１）の調製
【０２６９】
【化２８】
0005954789.tif 000030
【０２７０】
クロロホルム（１５ｍＬ）中のマレイミド（２．００ｇ、０．０２ｍｏｌ）に、クロロホルム（１５ｍＬ）の臭素（１．１６ｍＬ、０．０２ｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を２時間還流し、１時間かけて室温まで冷却した。固体の黄色沈殿物を濾去し、冷クロロホルム（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄して、粗製２，３−ジブロモスクシンイミド（４．０９ｇ、０．０１６ｍｏｌ）の白色結晶を得た。粗製スクシンイミドをテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中に溶解し、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のトリエチルアミン（２．４ｍＬ、０．０１７ｍｏｌ）を、０℃で５分間かけて添加した。反応混合物を室温まで温め、４８時間撹拌した。固体を濾去し、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）で洗浄して、淡黄色（ｐａｌｅ  ｙｅｌｌｏｗ）粉末（２．１４ｇ、０．０１２ｍｏｌ）を５９％の収率で得た。
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 7.67 (br s, 1H, NH), 6.89 (s, 1H, C=CH); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 173.8 (C=O), 170.5 (C=O), 136.9 (-(Br)C=C-), 135.4 (-C=CH-); IR (固体, cm-1): 3235 (s), 1709 (s); MS (CI+) m/z, (%): 178 (81M+, 32), 176 (79M+, 32), 125 (25), 86 (100); C4H3O2N79Brについて計算した質量: 175.93472. 実測値: 175.93493; m.p. 148 - 151℃.   
【０２７１】
参考例２：Ｎ−メチルブロモマレイミド（化合物２）の調製
【０２７２】
【化２９】
0005954789.tif 000031
【０２７３】
メタノール（２２．５ｍＬ）中のＮ−メチルマレイミド（０．５ｇ、４．５ｍｍｏｌ）に、臭素（０．５２ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、反応塊をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中に溶解し、トリエチルアミン（０．８ｍＬ、５．８５ｍｍｏｌ）を添加し、次いで室温で２４時間撹拌した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、７：３）で精製して、青白い（ｐａｌｅ  ｗｈｉｔｅ）粉末（０．７６１ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を８９％の収率で得た。
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 6.90 (s, 1H, C=CH), 3.09 (s, 3H, N-CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 168.6 (C=O), 165.4 (C=O), 131.9 (-C=CH-), 131.4 ((Br)C=C-), 24.7 (-N-CH3); IR (固体, cm-1): 3106 (s), 1708 (s); MS (CI) m/z, (%):192 (81M+, 99), 190(79M+, 100);  C5H5O2N79Brについて計算した質量: 189.95037. 実測値: 189.95052; m.p: 77-79℃   
【０２７４】
参考例３：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅ（化合物４）の調製
【０２７５】
【化３０】
0005954789.tif 000032
【０２７６】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（化合物３）（３６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール（３ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。１分後、溶媒を真空中で除去した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、淡黄色粉末（５１ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）を１００％の収率で得た。
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ =7.63 (s, 1H, NH), 6.27 (s, 1H, C=CH), 5.40 (d, 1H, J = 6.8, NH), 4.67 (ddd, 1H, J = 6.8, 5.4及び5.1, -HN-CH-C(O)-), 3.80 (s, 3H, O-CH3), 3.48 (dd, 1H, J = 13.8及び5.1, -S-CHH-), 3.62 (dd, 1H, J = 14.1及び5.4, -S-CHH-) 1.45 (s, 9H, 3 x CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 170.2 (C=O), 168.9 (C=O), 167.6 (C=O), 155.2 (C=O), 155.9 (-C=CH-), 119.7 (-C=CH-), 81.1 ((CH3)CO-), 53.3 (O-CH3), 52.7 (CH), 34.0 (CH2), 28.3 (3 x CH3); IR (固体, cm-1) 3236 (w), 1715 (s); MS (CI+) m/z, (%): 331 (M+H, 5), 275 (20), 231 (100); [C13H18O6N2S]+Hについて計算した質量: 331.09638. 実測値: 331.09684; 20αD: -41.9o (c = 1.0, メタノール); m.p. 145-147℃.
【０２７７】
参考例４：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎ−Ｍｅ−Ｍａｌ）−ＯＭｅ（化合物５）の調製
【０２７８】
【化３１】
0005954789.tif 000033
【０２７９】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３２ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）のメタノール（４ｍＬ）中撹拌溶液に、酢酸ナトリウム（８２ｍｇ、０．４０８ｍｍｏｌ）を添加した。メタノール（４ｍＬ）中のＮ−メチルブロモマレイミド（２５．８ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）を１０分間かけてこれに添加した。この反応は淡黄色（ｌｉｇｈｔ  ｙｅｌｌｏｗ）に変化した。溶媒を真空中で除去し、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、青白い粉末（３９．３ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）を８４％の収率で得た。
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 6.26 (s, 1H, C=CH), 5.36 (d, 1H, J = 6.3, NH), 4.66 (m, 1H, -HN-CH-), 3.79 (s, 3H, O-CH3), 3.46 (dd, 1H, J = 5.2及び5.0, -S-CHH-), 3.35 (dd, 1H, J = 13.7及び5.1, -S-CHH-), 3.00 (s, 3H, -N-CH3), 1.44 (s, 9H, 3 x CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 170.2 (C=O), 169.5 (C=O), 167.9 (C=O), 155.0 (C=O), 149.9(-C=CH-), 118.7 (-C=CH-), 80.9 ((CH3)3CO-), 53.1 (O-CH3), 52.7 (CH), 33.8 (CH2), 28.3 (3 x CH3), 24.1 (-N-CH3); IR (固体, cm-1) 3367.8, 2977.1, 1694.7; MS (ES+) m/z, (%): 367(46), 311 (M, 100); C14H20N2O6NaSについて計算した質量: 367.0940. 実測値: 367.0931; 20αD: -18.55o (c = 1.0, メタノール); m.p. 101-103℃.
【０２８０】
参考例５：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｓｕｃｃ）−ＯＭｅ（化合物６）の調製
【０２８１】
【化３２】
0005954789.tif 000034
【０２８２】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール（３ｍＬ）のマレイミド（１７ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。１分後、溶媒を真空中で除去した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール、９９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、無色油状物（５１ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）を１００％の収率で得た。これは、ジアステレオマーの１：１混合物であった。
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ =9.00 (s, 1H, NH), 8.95 (s, 1H, NH), 5.59 (1H, d, J = 7.6, NH),  5.41 (d, 1H, J = 7.6, NH), 4.65 - 4.56 (m, 2H, 2 x -HN-HC-C(O)-) C=CHH), 3.93 (dd, 1H, J = 9.3及び3.9,CH), 3.86 (dd, 1H, J = 9.2及び4.2, CH), 3.76 (s, 3H, OCH3), 3.76 (s, 3H, OCH3), 3.51 (dd, 1H, J = 13.8及び4.6, -CHH-), 3.36 (dd, 1H, J = 14.1及び6.0, -CHH-), 3.19-3.11 (m, 3H, 3 x -CHH-), 2.96 (dd, 1H, J = 13.1及び7.1, - CHH-), 2.54-2.02 (m, 2H, -CHH-) 1.43 (s, 18H, 9 x CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 177.2 (C=O), 177.1 (C=O), 175.1 (C=O), 175.0 (C=O), 172.0 (C=O), 171.5 (C=O), 155.5 (C=O), 155.3 (C=O), 80.6(2 x -OCCH3), 53.6 (CH), 52.91 (OCH3), 52.85 (OCH3), 50.8 (CH), 40.6 (CH), 40.0 (CH), 37.3 (CH2), 37.0 (CH2), 34.6 (CH2), 34.1 (CH2), 28.3 (6 x CH3); IR (油, cm-1) 3233 (w), 2980 (w), 1783 (w), 1709 (s); MS (CI+) m/z, (%): 333 (M+H, 15), 277 (50), 233 (100); C13H20O6N2Sについて計算した質量: 332.10420. 実測値: 332.10475;   
【０２８３】
参考例６：マレイミドがＮ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅのチオールを置換しないこと及びブロモマレイミドがＮ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｓｕｃｃ）−ＯＭｅのチオールを置換しないことの実証
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール（３ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。１０分後、マレイミド（１７ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。溶媒を真空中で除去した。１Ｈ  ＮＭＲ分析は化合物４及び未反応のマレイミドのみを示した。
【０２８４】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール（３ｍＬ）中のマレイミド（１７ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。１０分後、ブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。溶媒を真空中で除去した。１Ｈ  ＮＭＲ分析は、化合物６及び未反応のブロモマレイミドのみを示した。
【０２８５】
参考例７：ブロモマレイミドとマレイミドとの間での、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｏｍｅをめぐる競合反応
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、ブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）及びマレイミド（１７ｍｇ、０．１６９ｍｇ）のメタノール（３ｍＬ）中混合物を添加した。１分後、溶媒を真空中で除去した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、７０％の収率で淡黄色粉末４（３６ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）を得、３０％の収率で無色油状物６（１５ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を得た。
【０２８６】
参考例６により、一旦スクシンイミド又はマレイミド部分に結合すると、システイン部分はこれらの試薬の存在下で脱離できなくなることが実証された。従って、参考例７は、システイン試薬が、マレイミドとよりもブロモマレイミドとより迅速に反応することを実証している（即ち、反応速度論は、化合物４の形成に、より好都合である）。
【０２８７】
参考例８：プロピルアミンと比較した、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｏｍｅに対するブロモマレイミド試薬の選択性の実証
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３６ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）及びプロピルアミン（１０μＬ、０．１５３ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール（３ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）を添加した。１分後、溶媒を真空中で除去した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、淡黄色粉末（５１ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）を１００％で得た。データは、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅ  ４について上記で得たものと一致した。
【０２８８】
実施例１：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅを再生するためのＮ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅの切断
【０２８９】
【化３３】
0005954789.tif 000035
【０２９０】
４（５０ｍｇ、０．１５１ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中撹拌溶液に、２０ｍＬの水性緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）を添加した。水性緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）２０ｍＬ中のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（４３０ｍｇ  １．５１ｍｍｏｌ）を、この溶液に添加した。５分後、この水溶液を酢酸エチル（３ｘ２５ｍＬ）で抽出し、飽和塩化リチウム溶液（５ｘ２５ｍＬ）、水（２５ｍＬ）及びブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空中で除去して、無色油状物（３４．５ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）を９８％の収率で得た。この油状物の１Ｈ ＮＭＲ及び１３Ｃ ＮＭＲは、これが市販のＮ−Ｂｏｃ−システイン  メチルエステル３であることを示した。
【０２９１】
実施例２：２，３−ジブロモマレイミドとソマトスタチンとの反応
ソマトスタチンは、分子内の２つのシステイン残基がジスルフィド結合で結合した形態で存在することが知られたペプチドホルモンである。
【０２９２】
１ｍｇの凍結乾燥ソマトスタチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、２ｍｌの５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４−、ｐＨ６．２、４０％  ＭｅＣＮ、２．５％  ＤＭＦ中に再可溶化した。５００μｌを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ反応チューブに移し、同緩衝液中で希釈して最終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ（１５２．６μＭ）にした。２．０当量のＴＣＥＰ（５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４−、ｐＨ６．２、４０％  ＭｅＣＮ中１００ｘストック溶液）を添加し、反応を周囲温度で１時間インキュベートした。ジスルフィド結合の還元後、１．４当量の２，３−ジブロモマレイミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４−、ｐＨ６．２、４０％  ＭｅＣＮ、２．５％  ＤＭＦ中１００ｘストック溶液）を添加し、溶液を穏やかに混合して、４℃でさらに１２時間インキュベートした。
【０２９３】
マレイミド架橋されたソマトスタチンが、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（ＥＳ＋／ＥＳ−）によって検出された。コントロールには、未処理のペプチド、及び２，３−ジブロモマレイミド又はＴＣＥＰのみで処理したソマトスタチンを含めた。完全な還元は、ＴＣＥＰ処理したペプチドとマレイミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４−、ｐＨ６．２、４０％  ＭｅＣＮ、２．５％  ＤＭＦ中の１００ｘストック溶液）との反応によって検出された。
【０２９４】
実験データ：
未処理のソマトスタチン：[ES+]1638.04(m/z 1), 819.82 (m/z 2), 546.95 (m/z 3).
マレイミド架橋されたソマトスタチン：[ES+] 1734.14 Da (m/z 1), 867.40 Da (m/z 2), 578.73 (m/z 3).
【０２９５】
参考例９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃの発現
【０２９６】
【化３４】
0005954789.tif 000036
【０２９７】
タンパク質ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃをモデルタンパク質として使用した。このモデルタンパク質は単一のシステイン残基を含む。
【０２９８】
ＬＣ−ＭＳは、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｄ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＳＱＤ）に接続したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ｕＰＬＣで実施した。カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ｕＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ  ２．１ｘ５０ｍｍ。波長：２５４ｎｍ。移動相：９５：５  水（０．１％ギ酸）：ＭｅＣＮ（０．１％ギ酸）、４分間にわたる勾配（５：９５  水（０．１％ギ酸）：ＭｅＣＮ（０．１％ギ酸）まで。流速：０．６ｍＬ／分。ＭＳモード：ＥＳ＋。スキャン範囲：ｍ／ｚ＝８５−２０００。スキャン時間：０．２５秒。データは連続体モードで得た。ＭＳのエレクトロスプレー供給源は、３．５ｋＶのキャピラリー電圧及び５０Ｖのコーン電圧で操作した。窒素を、総流量６００Ｌ／ｈで、ネブライザー及び脱溶媒和ガスとして使用した。総質量スペクトルを、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアにプレインストールされたＭａｘＥｎｔ  １アルゴリズムを使用して、イオンシリーズから再構築した。
【０２９９】
モデルタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で過剰発現させ、６Ｈｉｓタグ化タンパク質を、標準的な技術によって、Ｎｉ−アフィニティクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーの両方を使用して精製した。ＬＣ−ＭＳを用いた分析により、所望のタンパク質に対応する質量１４１６９の単一のタンパク質種が示された。
【０３００】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｅｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）を０℃で添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、１０分間０℃で維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、単一の反応が生じて１４３６６の質量を有する単一の生成物が得られたことが示され、Ｃ１１１が官能化に利用可能であることが示された。
【０３０１】
参考例１０：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃとブロモマレイミドとの反応
【０３０２】
【化３５】
0005954789.tif 000037
【０３０３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望のタンパク質に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０３０４】
この混合物を、０℃にてＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、Ｅｌｌｍａｎ試薬との明白な反応がなかったことが示され、これは、ブロモマレイミドの官能化がＣ１１１で生じたことを強調する。
【０３０５】
参考例１１：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１ＣとＮ−メチルブロモマレイミドとの反応
【０３０６】
【化３６】
0005954789.tif 000038
【０３０７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望のタンパク質に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０３０８】
この混合物を、０℃にてＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、００℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、Ｅｌｌｍａｎ試薬との明白な反応がなかったことが示され、これは、Ｎ−メチルブロモマレイミドの官能化がＣ１１１で生じたことを強調する。
【０３０９】
実施例３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のホスフィン媒介性の還元的切断
【０３１０】
【化３７】
0005954789.tif 000039
【０３１１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０３１２】
この混合物を、０℃にてＴＣＥＰ．ＨＣｌ（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ（質量＝１４１６８）を８５％の収率で生じたことが示された。残りの物質は、未反応のタンパク質／ブロモマレイミド付加物であった。
【０３１３】
実施例４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物のホスフィン媒介性の還元的切断
【０３１４】
【化３８】
0005954789.tif 000040
【０３１５】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０３１６】
この混合物を、０℃にてＴＣＥＰ．ＨＣｌ（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ（質量＝１４１６８）を８５％の収率で生じたことが示された。残りの物質は、未反応のタンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物であった。
【０３１７】
実施例５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物の合成
【０３１８】
【化３９】
0005954789.tif 000041
【０３１９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０３２０】
この混合物を、０℃にて２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物（質量＝１４３３９）が５５％の収率で形成されたことが示された。残りの物質はＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０３２１】
実施例６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物の合成
【０３２２】
【化４０】
0005954789.tif 000042
【０３２３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０３２４】
この混合物を、０℃にて２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物（質量＝１４３５６）が６１％の収率で形成されたことが示された。残りの物質は、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０３２５】
参考例１２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド付加物の合成
【０３２６】
【化４１】
0005954789.tif 000043
【０３２７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０３２８】
実施例７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物の合成
【０３２９】
【化４２】
0005954789.tif 000044
【０３３０】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０３３１】
この混合物を、０℃にてグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が、唯一の存在したタンパク質種（質量＝１４５７２）であることが示された。
【０３３２】
実施例８：生理学的に適当なグルタチオン濃度（５ｍＭ）での、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０３３３】
【化４３】
0005954789.tif 000045
【０３３４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０３３５】
この混合物を、０℃にてグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が、存在する唯一のタンパク質種（質量＝１４５７２）であることが示された。
【０３３６】
この混合物を、０℃にてグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の１００ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃが、存在する唯一のタンパク質種（質量＝１４１７３）であることが示された。
【０３３７】
Ｂ）さらなる実施例
一般的手順
１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、１Ｈについては５００ＭＨｚ、１３Ｃについては１２５ＭＨｚの周波数で作動するＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００機器で、室温で記録した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３（７．２６ｐｐｍ）シグナルを参照とした。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３（７７．６７ｐｐｍ）シグナルを参照とした。赤外線スペクトルは、センチメートルの逆数（ｃｍ−１）で与えられる周波数で、ＡＴＲモードで作動するＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  １００  ＦＴ−ＩＲスペクトロメータで実行した。低分子に関する質量スペクトル及び高分解能質量データは、ＶＧ７０−ＳＥ質量分析計（ＥＩモード及びＣＩモード）で記録した。融点はＧａｌｌｅｎｋａｍｐ加熱ブロックで取得したものであり、未補正である。３，４−ジブロモマレイミド、凍結乾燥ソマトスタチン、ＰＥＧ５０００、ＴＣＥＰ及びベンゼンセレノールは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、さらなる精製なしに使用した。
【０３３８】
タンパク質及びペプチドの質量分析
タンパク質サンプルに対するＬＣ−ＭＳは、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｄ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＳＱＤ）に接続したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ｕＰＬＣを使用して実施した。カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ｕＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ  ２．１ｘ５０ｍｍ。波長：２５４ｎｍ。移動相：９５：５  水（０．１％ギ酸）：ＭｅＣＮ（０．１％ギ酸）、４分間にわたる勾配（５：９５  水（０．１％ギ酸）：ＭｅＣＮ（０．１％ギ酸）まで。流速：０．６ｍＬ／分。ＭＳモード：ＥＳ＋。スキャン範囲：ｍ／ｚ＝８５−２０００。スキャン時間：０．２５秒。データは連続体モードで得た。ＭＳのエレクトロスプレー供給源は、３．５ｋＶのキャピラリー電圧及び５０Ｖのコーン電圧で操作した。窒素を、総流量６００Ｌ／ｈで、ネブライザー及び脱溶媒和ガスとして使用した。総質量スペクトルを、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアにプレインストールされたＭａｘＥｎｔ  １アルゴリズムを使用して、イオンシリーズから再構築した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、ＭＡＬＤＩ  ｍｉｃｒｏ  ＭＸ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）で実施した。データは、３３７ｎｍのレーザー波長で、１２ｋＶのソース電圧及び５ｋＶのリフレクション電圧で、リフレクトロン陽イオンモードで得た。サンプルは以下に概説したように調製し、ペプチドを含むサンプルを、脱イオンＨ２Ｏ中で２４時間透析した。ペプチド及びその誘導体（０．１〜０．３ｍｇ／ｍｌ）を、トリフルオロ酢酸（１０ｍｇ／ｍｌ）を予めスポットした後に、２μｌシナピン酸（１０ｍｇ／ｍｌ）中でＭＡＬＤＩプレート上にスポットした。ＡＣＴＨ（１０ｎｇ／ｍｌ）を質量較正に使用した。
【０３３９】
参考例１３：ブロモマレイミドの調製
【０３４０】
【化４４】
0005954789.tif 000046
【０３４１】
クロロホルム（１５ｍＬ）中のマレイミド（２．００ｇ、０．０２ｍｏｌ）に、クロロホルム（１５ｍＬ）中の臭素（１．１６ｍＬ、０．０２ｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を２時間還流し、１時間かけて室温まで冷却した。固体の黄色沈殿物を濾去し、冷クロロホルム（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄して、粗製２，３−ジブロモスクシンイミド（４．０９ｇ、０．０１６ｍｏｌ）のオフホワイトの結晶を得た。粗製スクシンイミドをテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中に溶解し、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のトリエチルアミン（２．４ｍＬ、０．０１７ｍｏｌ）を５分間かけて０℃で添加した。反応混合物を室温まで温め、４８時間撹拌した。固体を濾去し、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）で洗浄した。フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中５％の酢酸エチル）で、所望の化合物（２．１４ｇ、０．０１２ｍｏｌ）が淡黄色粉末として５９％の収率で得られた。
δH (500 MHz, CDCl3) 7.67 (br s, 1H, NH), 6.89 (s, 1H, H-3); δC(125 MHz, CDCl3) 173.8 (C=O), 170.5 (C=O), 136.9 (C2), 135.4 (C3); IR (固体, cm-1) 3235 (s), 1709 (s); MS (CI+) m/z, (相対強度): 178 ([81M+H], 32), 176 ([79M+H], 32), 125 (25), 86 (100); [C4H2O2N79Br]+Hについて計算した質量: 175.9347 実測値 175.9349 (CI+); m.p. 148 - 151℃; UV (アセトニトリル) ε242= 13800及びε276 = 1700 cm-1M-1d3.
【０３４２】
参考例１４：Ｎ−メチルブロモマレイミドの調製
【０３４３】
【化４５】
0005954789.tif 000047
【０３４４】
メタノール（１０ｍＬ）中のＮ−メチルマレイミド（０．５ｇ、４．５ｍｍｏｌ）に、メタノール（５ｍＬ）中の臭素（２３２μＬ、４．５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中に溶解した。テトラヒドロフラン（５ｍＬ）中のトリエチルアミン（８１５μＬ、５．９ｍｍｏｌ）を５分間かけて添加したところ、沈殿が形成された。反応混合物を２４時間撹拌した。固体を濾去し、テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）で洗浄した。フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）で、所望の化合物（５６３ｍｇ、２．９６ｍｍｏｌ）が淡黄色粉末として６６％の収率で得られた。 δH (500 MHz, CDCl3) 6.90 (s, 1H, H-3), 3.09 (s, 3H, H3-6); δC (125 MHz, CDCl3) 168.6 (C=O), 165.4 (C=O), 131.9 (C3), 131.4 (C2), 24.7 (C6); IR (固体, cm-1) 3106 (s), 1708 (s); MS (CI+) m/z, (相対強度):192 ([81M+H], 99), 190([79M+H], 100);  [C5H4O2N79Br]+Hについて計算した正確な質量は、189.9504を要する。実測値189.9505 (CI+); m.p: 77-79℃; UV (アセトニトリル) ε209 = 17100, ε238 = 13200, ε299 = 290 cm-1M-1d3.
【０３４５】
参考例１５：Ｎ−フェニルブロモマレイミドの調製
【０３４６】
【化４６】
0005954789.tif 000048
【０３４７】
クロロホルム（１５ｍＬ）中のＮ−フェニルマレイミド（２ｇ、１１．５０ｍｍｏｌ）に、クロロホルム（５ｍＬ）中の臭素（０．６５ｍＬ、１２．７０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を１時間還流し、次いで室温まで冷却した。沈殿物を濾去し、クロロホルム（５０ｍＬ）で洗浄した。この固体（２．７０ｇ、８．１０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中に溶解し、トリエチルアミン（１．２ｍＬ、８．９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中溶液を０℃でこれに滴下し、混合物を２時間撹拌した。混合物を室温まで温め、溶媒を真空中で除去した。残渣を酢酸エチル中に溶解し、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）  ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。溶媒を真空中で除去して、所望の化合物（１．８０ｇ、７．１４ｍｍｏｌ）を淡黄色固体として６２％の収率で得た。データは文献：Ｓａｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２００３，３４６と一致した。
【０３４８】
参考例１６：Ｎ−フェニルジブロモマレイミドの調製
【０３４９】
【化４７】
0005954789.tif 000049
【０３５０】
アニリン（７２μＬ、０．７８８ｍｍｏｌ）を、ジブロモマレイン酸無水物（２００ｍｇ、０．７８８ｍｍｏｌ）のＡｃＯＨ（１０ｍＬ）溶液に添加した。混合物を室温で３時間撹拌し、１３０℃で９０分間撹拌した。冷却後、混合物を乾燥するまで濃縮し、微量のＡｃＯＨをトルエンとの共沸混合物によって除去した。黄褐色（ｔａｎ）の残渣を、シリカフラッシュクロマトグラフィー（５％ＥｔＯＡｃ／９５％石油エーテル）を使用して精製して、所望の化合物を淡黄色固体として得た（１６６ｍｇ、６０％）。δH (600 MHz, CDCl3) 7.48 (m, 2H, ArH), 7.41 (tt, 1H, J = 7.4及び1.1 Hz, ArH), 7.33 (m, 2H, ArH).; δC (150 MHz, CDCl3) 163.0, 131.0, 130.0, 129.5, 128.8, 126.2.
【０３５１】
参考例１７：３，４−ジヨード−ピロール−２，５−ジオンの調製
【０３５２】
【化４８】
0005954789.tif 000050
【０３５３】
酢酸（５０ｍｌ）中のジブロモマレイミド（５００．０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）に、ヨウ化ナトリウム（８８６．５ｍｇ、５．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１２０℃に加熱し、２時間還流した。反応を室温まで冷却し、Ｈ２Ｏ（５０ｍｌ）を添加し、４℃で１５時間維持した。黄色沈殿物を濾去し、風乾し、所望の化合物をオレンジ色の結晶性粉末として得た（４１５ｍｇ、６０％）。 1H NMR (500MHz, MeOD):シグナルなし; 13C NMR (125MHz, MeOD): δ = 169.3 (C), 119.5 (C); IR (固体, cm-1): 3244 (s), 2944 (m), 2833 (m); MS (EI) m/z, (%): 349 (M, 83), 179 (100); C4H12O2Nについて計算した質量: 348.80912. 実測値: 348.81026. m.p. 238-241 ℃ (文献値: 254-255 ℃). 
【０３５４】
参考例１８：３，４−ビス−（２−ヒドロキシ−エチルスルファニル）−ピロール−２，５−ジオンの調製
【０３５５】
【化４９】
0005954789.tif 000051
【０３５６】
緩衝液（１００ｍｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、５．０％ＤＭＦ）中の２−メルカプトエタノール（６８３．８μｌ、９．８ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ（２．５ｍｌ、最終濃度ＤＭＦ  ７．５％）中のジブロモマレイミド（１ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応を室温で３０分間撹拌し、塩化リチウム（２０ｇ）を添加した。水性反応混合物を酢酸エチル（７ｘ１５０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、溶媒を真空中で除去し、残留物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、１：１から１：９の勾配溶出）で精製した。生成物を含む画分を収集し、溶媒を真空中で除去した。なお不純な生成物を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン、０．５から１０．０％のメタノールの勾配溶出）で精製して、所望の化合物を黄色固体として得た（５１８ｍｇ、５３％）。λmax (50 mM リン酸ナトリウム, pH 6.2, 40 % MeCN, 2.5 % DMF)/ 318 nm (ε/ dm3 mol-1 cm-1 1855); 1H NMR (500MHz, MeOD): δ = 3.74 (t, 4H, J = 6.4, 2x HO-CH2), 3.41 (t, 4H, J = 6.3, 2x S-CH2) 13C NMR (125MHz, MeOD): δ = 168.5 (C), 137.2 (C), 62.3 (CH2), 34.4 (CH2); IR (固体, cm-1): 3344 (s), 2500 (m), 2078 (w); MS (EI) m/z, (%): 250 (M, 43), 232 (100), 161 (37); C8H11O4NS2について計算した質量: 250.02077. 実測値: 250.02126; m.p. 46-50 ℃.
【０３５７】
参考例１９：３，４−ビス−フェニルスルファニル−ピロール−２，５−ジオンの調製
【０３５８】
【化５０】
0005954789.tif 000052
【０３５９】
メタノール（６ｍｌ）中のジブロモマレイミド（８０．０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム（１３０．２ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）に、メタノール（１ｍｌ）のベンゼンチオール（６６．６μｌ、０．７ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。反応を室温で１５分間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、９：１から７：３の勾配溶出）で精製して、所望の生成物を、鮮黄色の結晶として得た（７３ｍｇ、７５％）。λmax (50 mM リン酸ナトリウム, pH 6.2, 40 % MeCN, 2.5 % DMF)/ 412 nm (ε/ dm3 mol-1cm-1 2245); 1H NMR (500MHz, MeOD): δ = 7.27-7.22 (m, 6H, Ar-H), 7.16-7.14 (m, 4H, Ar-H); 13C NMR (125MHz, MeOD): δ = 169.3 (C), 137.6 (C), 135.4 (C), 132.4 (CH), 130.1 (CH), 129.1 (CH); IR (固体, cm-1): 3285 (m), 3059 (w), 2924 (w), 1774 (m), 1715 (s); MS (CI) m/z, (%): 314 (M+H, 100), 206 (13), 111 (12); C16H11O2NS2[+H]について計算した質量: 314.0231. 実測値: 314.0309; m.p. 102-104 ℃ (文献値: 123-126 ℃).
【０３６０】
参考例２０：３，４−ビス−（ピリジン−２−イルスルファニル）−ピロール−２，５−ジオンの調製
【０３６１】
【化５１】
0005954789.tif 000053
【０３６２】
メタノール（１５ｍｌ）中のジブロモマレイミド（３００．０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（４８０．０ｍｇ、５．９ｍｍｏｌ）に、メタノール（４ｍｌ）の１Ｈ−ピリジン−２−チオン（２７５．８ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。反応を室温で１５分間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン、０．５〜３．０％の勾配溶出）で精製して、所望の生成物を暗黄色粉末として得た（１９０ｍｇ、５１％）。λmax (50 mM リン酸ナトリウム, pH 6.2, 40 % MeCN, 2.5 % DMF)/ 395 nm (ε/ dm3 mol-1cm-1 3508); 1H NMR (500MHz, MeOD): δ = 8.37 (d, 2H, J = 3.8, 2x N-CH), 7.70 (t, 2H, J = 6.9, 2x C-CH-CH), 7.38 (d, 2H, J = 7.9, 2x C-CH), 7.26 (t, 2H, J = 6.5, 2x N-CH-CH); 13C NMR (125MHz, MeOD): δ = 168.5 (C), 154.7 (C), 150.9 (CH), 140.0 (C), 139.0 (CH), 126.8 (CH), 123.7 (CH); IR (固体, cm-1): 2926 (m), 2734 (w), 1771 (w), 1726 (s), 1619 (m); MS (CI) m/z, (%): 316 (M+H, 5), 152 (10), 126 (34), 112 (100); C14H9O2N3S2[+H]について計算した質量: 316.0214. 実測値: 316.0223.; m.p. 70-72 ℃.
【０３６３】
参考例２１：Ｎ−ＰＥＧ３００ジブロモマレイミドの調製
【０３６４】
【化５２】
0005954789.tif 000054
【０３６５】
反応は、完全に乾燥した条件下で実施した。ＴＨＦ（５ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（１９３．９ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）に、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（１４５．６μｌ、０．７ｍｍｏｌ）を−７８℃で滴下した。反応を５分間撹拌し、ＴＨＦ（４ｍＬ）中のＰＥＧ３００（２００．０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を滴下した。反応を５分間撹拌し、ＴＨＦ（１ｍｌ）中のネオペンチルアルコール（４５．８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応を５分間撹拌し、ＴＨＦ（２ｍｌ）中の３，４−ジブロモマレイミド（１８９．４ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）を添加した。反応を１０分間撹拌し、冷浴を取り除き、周囲温度で２０時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン、０．５〜５．０％メタノールの勾配溶出）で精製した。生成物を含む画分を収集し、溶媒を真空中で除去した。なお不純な生成物を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル、７：３から２：８の勾配溶出）で精製して、所望の化合物（１３７ｍｇ、４０％）を黄色油状物として９７．５％の純度で得た。 1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 3.76 (t, 2H, J = 5.6, N-CH2), 3.64-3.52 (m, 24H, 12x CH2-O), 3.49 (t, 2H, J = 4.4, N-CH2-CH2), 3.32 (s, 3H, O-CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 163.8 (2x C), 129.5 (2x C), 72.0 (CH2), 70.7-70.5 (9x CH2), 70.1 (2x CH2), 67.5 (CH2), 59.1 (CH3), 39.0 (CH2); IR (固体, cm-1): 3496 (w), 2869 (m), 1786 (m), 1720 (s), 1594 (m); MS (CI) m/z, (%): 580 (81M+H, 12), 578 (81, 79 M+H, 23), 576 (79M+H, 12), 279 (100), 84 (61); C19H3179Br2O9N[+H]について計算した質量: 576.0444. 実測値: 576.0437.
【０３６６】
参考例２２：Ｎ−ＰＥＧ５０００ジブロモマレイミドの調製
【０３６７】
【化５３】
0005954789.tif 000055
【０３６８】
反応は、完全に乾燥した条件下で実施した。ＴＨＦ（８ｍＬ）及びＤＣＭ（３ｍＬ）の混合物中のトリフェニルホスフィン（１５４．６ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）に、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（１１６．０μｌ、０．６ｍｍｏｌ）を−７８℃で滴下した。反応を５分間撹拌し、ジクロロメタン（７ｍＬ）中のＰＥＧ５０００（２９５０．０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を滴下した。反応を５分間撹拌し、ＴＨＦ（１ｍｌ）及びＤＣＭ（１ｍｌ）の混合物中のネオペンチルアルコール（２６．５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応を５分間撹拌し、ＴＨＦ（２ｍｌ）中の３，４−ジブロモマレイミド（１５０．０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応を５分間撹拌し、冷浴を取り除き、周囲温度で２０時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン、０．５〜５．０％メタノールの勾配溶出）で精製した。生成物を含む画分を収集し、溶媒を真空中で除去した。なお不純な生成物を、非常にゆっくりしたシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン、０．５〜６．０％メタノールの勾配溶出）で精製して、所望の化合物を淡緑色の結晶性粉末として得た（４１７ｍｇ、１３％）。1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 3.58 (s, 4x n H, CH2); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 163.8 (C), 129.5 (C), 70.6 (CH2); IR (固体, cm-1): 3517 (w), 2872 (s), 1977 (w), 1727 (m), 1641 (w); m.p. 51-55 ℃.
【０３６９】
参考例２３：Ｎ−ＰＥＧ５０００ジチオフェノールマレイミドの調製
【０３７０】
【化５４】
0005954789.tif 000056
【０３７１】
反応は、完全に乾燥した条件下で実施した。ＴＨＦ（８ｍｌ）及びＤＣＭ（３ｍｌ）の混合物中のトリフェニルホスフィン（１６７．７ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）に、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（１２５．９μｌ、０．６ｍｍｏｌ）を−７８℃で滴下した。反応を５分間撹拌し、ＤＣＭ（７ｍｌ）中のＰＥＧ５０００（１６００．０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を滴下した。反応を５分間撹拌し、ＴＨＦ（１ｍｌ）及びＤＣＭ（１ｍｌ）の混合物中のネオペンチルアルコール（５６．３ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応を５分間撹拌し、ＴＨＦ（３ｍｌ）中の３，４−ジチオフェノールマレイミド（２００．０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応を５分間撹拌し、冷浴を取り除き、周囲温度で２０時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン、０．５〜１０．０％メタノールの勾配溶出）で精製した。生成物を含む画分を収集し、溶媒を真空中で除去した。なお不純な生成物を、ＴＬＣグレードのシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン、０．０〜１０．０％メタノールの勾配溶出）で精製して、所望の化合物を鮮黄色の結晶性粉末として得た（１．２４ｇ、７３％）。1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 7.26 (dd, H, J = 7.7, J = 4.5, CH), 7.23 (dd, 2H, J = 8.4, J = 6.6, CH), 7.19 (dd, 2H, J = 8.4, J = 6.8, CH), 3.63 (s, 4x n H, CH2); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 166.7 (C), 135.7 (C), 131.9 (CH), 129.1 (C), 129.0 (CH), 128.4 (CH), 70.6 (CH2); IR (固体, cm-1): 3498 (w), 2881 (s), 1959 (w), 1711 (m); m.p. 57-59 ℃.
【０３７２】
参考例２４：２，３−ジブロモマレイン酸無水物の調製
【０３７３】
【化５５】
0005954789.tif 000057
【０３７４】
不活性雰囲気下で、無水マレイン酸（１．５０ｇ、１５．３ｍｍｏｌ、１当量）、三塩化アルミニウム（３００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、触媒）及び臭素（４．９５ｇ、３０．６ｍｍｏｌ、２当量）の溶液を、密封アンプル（注意−ブラストシールド）中で１６０℃で１６時間加熱した。２１℃まで冷却し、反応混合物をさらに２４時間撹拌し、注意深く開放した。ＥｔＯＡｃを添加し、固体を濾去し、さらなるＥｔＯＡｃで繰り返し洗浄した。最後に濾液を真空中で濃縮して、表題化合物を黄色固体として得、これをさらなる精製なしに使用した（３．０５ｇ、１１．９ｍｍｏｌ、７８％収率）。m.p 107-110 ℃; 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 163.33 (s), 125.28 (s); IR (MeOH) 1769, 1706, 1590 cm-1; C4O3Br2 [M]+ について計算したHRMS (CI) 253.82087, 実測値253.82082.
【０３７５】
参考例２５：ｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバメートの調製
【０３７６】
【化５６】
0005954789.tif 000058
【０３７７】
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネート（１．１０ｇ、５．００ｍｍｏｌ、１当量）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中溶液を、２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エタンアミン（７．３２ｍＬ、５０．０ｍｍｏｌ、１０当量）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中溶液に滴下した。得られた反応混合物を、２１℃で２４時間撹拌した。次いでＣＨ２Ｃｌ２を真空中で除去して、無色の残渣を得た。ＥｔＯＡｃ（１２５ｍＬ）の添加により、白色沈殿物の形成が起こり、これをＮａ２ＣＯ３の飽和溶液（３ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮した。カラムクロマトグラフィー（８：２  ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）によるさらなる精製で、所望のモノ保護されたアミンが無色油状物として得られた（０．６９ｇ、２．８０ｍｍｏｌ、５６％収率）。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5.27 (bs, 1H, NH), 3.54-3.52 (m, 4H, OCH2), 3.47-3.42 (m, 4H, OCH2), 3.23-3.22 (m, 2H, NCH2), 2.80 (t, J = 5.0, 2H, NCH2), 2.05 (bs, 2H, NH), 1.35 (s, 9H, CH3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 156.08 (s), 79.09 (s), 73.19 (t), 70.21 (t), 70.16 (t), 41.59 (t), 40.32 (t), 28.40 (q), * 1 t 欠落; IR (ニート) 3344, 2869, 1692 cm-1; C11H25N2O4[M + H]+について計算したHRMS (CI) 249.18143, 実測値249.18251. 
【０３７８】
参考例２６：ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−（２−（２−（２−（５−（２−オキソ−１，３，３ａ，４，６，６ａ−ヘキサヒドロチエノ（３，４−ｄ）イミダゾール−６−イル）ペンタノイルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメートの調製
【０３７９】
【化５７】
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【０３８０】
ビオチン（０．５９ｇ、２．４２ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＨＢＴＵ（０．７９ｇ、２．１０ｍｍｏｌ、１．３当量）及びＤＩＥＡ（０．４５ｍＬ、２．６０ｍｍｏｌ、１．６当量）のＤＭＦ（１５ｍＬ）溶液を、２１℃で２０分間撹拌し、その後、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（４００ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に滴下した。反応混合物を２１℃で２時間撹拌し、その後、ＤＭＦを真空中で除去して黄色残渣を得た。粗製生成物をカラムクロマトグラフィー（勾配  ２〜１０％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製して、所望の化合物を白色固体として得た（０．６１ｇ、１．２９ｍｍｏｌ、８０％収率）。m.p. 106-108 ℃; [α]D20.0 +23.0 (c 0.6, CH2Cl2); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.55 (dd, J = 5.0, 7.5 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 4.36 (dd, J = 5.0, 7.5 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 3.62 (bs, 6H, OCH2), 3.59-3.55 (m, 2H, OCH2), 3.46 (m, 2H, NCH2), 3.31 (m, 2H, NCH2), 3.17 (dt, 3.0, 5.0 Hz, 1H, SCH), 2.92 (dd, J = 5.0, 13.0 Hz, 1H, SCHH), 2.79 (d, J = 13.0 Hz, 1H, SCHH), 2.27 (t, J = 7.0 Hz, 2H, NHC(O)CH2CH2CH2), 1.71 (m, 4H, NHC(O)CH2CH2CH2CH2), 1.47 (br, 11H, C(CH3)3 & NHC(O)CH2CH2CH2CH2); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 173.69 (s), 163.92 (s), 155.99 (s), 79.14 (s), 70.03 (t), 69.69 (br t), 61.58 (d), 60.06 (d), 55.19 (d), 40.16 (t), 39.96 (t), 38.91 (t), 35.44 (t), 28.09 (q), 27.80 (t), 27.67 (t), 25.23 (t), * 2 t 非存在; IR (ニート) 3307, 2933, 1691 cm-1; C21H38N4O6NaS [M+Na]+について計算したHRMS (ES) 497.2410, 実測値497.2423.
【０３８１】
参考例２７：２−（２−（２−（５−（２−オキソ−１，３，３ａ，４，６，６ａ−ヘキサヒドロチエノ（３，４−ｄ）イミダゾール−６−イル）ペンタノイルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチルアンモニウム；２，２，２−トリフルオロアセテートの調製
【０３８２】
【化５８】
0005954789.tif 000060
【０３８３】
ｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ−（２−（２−（２−（５−（２−オキソ−１，３，３ａ，４，６，６ａ−ヘキサヒドロチエノ（３，４−ｄ）イミダゾール−６−イル）ペンタノイルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（０．６１ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）及びＴＦＡ（５ｍＬ）中溶液を、２１℃で２４時間撹拌した。次いでトルエンを添加し（ｘ２）、溶媒を真空中で除去して、所望の化合物を油状物として得た（０．６３ｇ、１．２９ｍｍｏｌ、１００％収率）。[α]D20.0 +41.0 (c 0.49, MeOH); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.53 (dd, J = 5.0, 7.5 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 4.33 (dd, J = 5.0, 7.5 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 3.71 (t, J = 5.0 Hz, 2H, OCH2CH2NH3), 3.65 (br, 4H, OCH2), 3.57 (t, J = 5.0 Hz, 2H, OCH2), 3.38 (t, J = 5.0 Hz, 2H, OCH2), 3.22 (dt, J = 5.0, 8.5 Hz, 1H, SCH), 3.13 (t, J = 5.0 Hz, 2H, C(O)NHCH2CH2O), 2.94 (dd, J = 5.0, 13.0 Hz, 1H, SCHH), 2.74 (d, J = 13.0 Hz, 1H, SCHH), 2.24 (t, J = 7.5 Hz, 2H, NHC(O)CH2CH2CH2), 1.76-1.43 (m, 6H, NHC(O)CH2CH2CH2CH2); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 174.98 (s), 164.76 (s), 69.92 (t), 69.83 (t), 69.22 (t), 66.46 (t), 62.08 (d), 60.36 (d), 55.59 (d), 39.65 (t), 39.24 (t), 38.77 (t), 35.29 (t), 28.29 (t), 28.06 (t), 25.44 (t); IR (MeOH) 3300, 2941, 1686 cm-1; C16H31N4O4S [M+H]+について計算したHRMS (ES) 375.2066, 実測値375.2060.
【０３８４】
参考例２８：Ｎ−（２−（２−（２−（３−ブロモ−２，５−ジオキソ−ピロール−１−イル）エトキシ）エトキシ）エチル）−５−（２−オキソ−１，３，３ａ，４，６，６ａ−ヘキサヒドロチエノ（３，４−ｄ）イミダゾール−６−イル）ペンタンアミドの調製
【０３８５】
【化５９】
0005954789.tif 000061
【０３８６】
モノブロモマレイン酸無水物（４５．０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１当量）を、２−（２−（２−（５−（２−オキソ−１，３，３ａ，４，６，６ａ−ヘキサヒドロチエノ（３，４−ｄ）イミダゾール−６−イル）ペンタノイルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチルアンモニウム  ２，２，２−トリフルオロアセテート（１２４ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１当量）のＡｃＯＨ（１０ｍＬ）溶液に一度に添加し、反応混合物を１７０℃で３時間加熱した。２１℃まで冷却してトルエンを添加し、ＡｃＯＨを共沸により真空中で除去して（ｘ２）、粗製生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（勾配  ２〜１０％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により、所望の化合物を白色固体として得た（７０．０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、５２％収率）。m.p. 95-98 ℃; [α]D20.0 +65.1 (c 0.15, MeOH); 1H NMR (600 MHz,  CD3OD) δ 7.17 (s, 1H, CHCBr), 4.51 (dd, J = 5.0, 8.0 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 4.33 (dd, J = 5.0, 8.0 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 3.77 (t, J = 5.5 Hz, 2H, OCH2), 3.68 (t, J = 5.5 Hz, 2H, OCH2), 3.63 (m, 2H, OCH2), 3.58 (m, 2H, OCH2), 3.53 (t, J = 5.5 Hz, 2H, NCH2), 3.37 (t, J = 5.5 Hz, 2H, NCH2), 3.24 (td, J = 5.0, 8.0 Hz, 1H, SCH), 2.95 (dd, J = 5.0, 12.5 Hz, 1H, SCHH), 2.73 (d, J = 12.5 Hz, 1H, SCHH), 2.26 (t, J = 7.0 Hz, 2H, NHC(O)CH2CH2CH2), 1.69 (m, 4H, CH2CH2CH2), 1.47 (クインテット, J = 7.0 Hz, 2H, CH2CH2CH2); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 176.12 (s), 170.13 (s), 166.97 (s), 166.08 (s), 133.63 (s), 132.05 (d), 71.22 (t), 71.11 (t), 70.61 (t), 68.69 (t), 63.35 (d), 61.61 (d), 57.03 (d), 41.09 (t), 40.31 (t), 39.09 (t), 36.75 (t), 29.78 (t), 29.50 (t), 26.87 (t); IR (MeOH) 3355, 2970, 1737 cm-1; C20H29N4O6 NaSBr [M+Na]+について計算したHRMS (ES)555.0889, 実測値555.0905.
【０３８７】
参考例２９：Ｎ−（２−（２−（２−（３，４−ジブロモ−２，５−ジオキソ−ピロール−１−イル）エトキシ）エトキシ）エチル）−５−（２−オキソ−１，３，３ａ，４，６，６ａ−ヘキサヒドロチエノ（３，４−ｄ）イミダゾール−６−イル）ペンタンアミドの調製
【０３８８】
【化６０】
0005954789.tif 000062
【０３８９】
ジブロモマレイン酸無水物（１０８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１当量）を、２−（２−（２−（５−（２−オキソ−１，３，３ａ，４，６，６ａ−ヘキサヒドロチエノ（３，４−ｄ）イミダゾール−６−イル）ペンタノイルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチルアンモニウム  ２，２，２−トリフルオロアセテート（２０５ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１当量）のＡｃＯＨ（１０ｍＬ）溶液に一度に添加し、反応混合物を１７０℃で２時間加熱した。２１℃まで冷却してトルエンを添加し、ＡｃＯＨを共沸により真空中で除去して（ｘ２）、粗製生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（勾配  ２〜７％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により、所望の化合物を白色固体として得た（１２３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、４８％収率）。m.p. 100-102 ℃; [α]D20.0 +71.0 (c 0.15, MeOH); 1H NMR (600 MHz,  CD3OD) δ 4.53 (dd, J = 5.0, 8.0 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 4.34 (dd, J = 5.0, 8.0 Hz, 1H, NHC(O)NHCH), 3.82 (t, J = 5.5 Hz, 2H, OCH2), 3.70 (t, J = 5.5 Hz, 2H, OCH2), 3.63 (m, 2H, OCH2), 3.59 (m, 2H, OCH2), 3.53 (t, J = 5.5 Hz, 2H, NCH2), 3.37 (t, J = 5.5 Hz, 2H, NCH2), 3.24 (dt, J = 5.0, 8.0 Hz, 1H, SCH), 2.96 (dd, J = 5.0, 13.0 Hz, 1H, SCHH), 2.73 (d, J = 13.0 Hz, 1H, SCHH), 2.26 (t, J = 7.5 Hz, 2H, NHC(O)CH2CH2CH2), 1.74 (m, 4H, CH2CH2CH2), 1.49 (クインテット, J = 7.5 Hz, 2H, CH2CH2CH2); 13C NMR (150 MHz, CD3OD) δ 174.83 (s), 164.71 (s), 164.06 (s), 129.00 (s), 69.80 (t), 69.72 (t), 69.24 (t), 67.19 (t), 61.97 (d), 60.22 (d), 55.64 (d), 39.67 (t), 39.03 (t), 38.56 (t), 35.42 (t), 28.39 (t), 28.11 (t), 25.47 (t); IR (MeOH) 2970, 1724, 1365, 1217 cm-1; C20H28N4O6NaSBr2[M+Na]+について計算したHRMS (ES) 631.9916, 実測値631.9937.
【０３９０】
参考例３０：Ｎ−フルオレセインブロモマレイミドの調製
【０３９１】
【化６１】
0005954789.tif 000063
【０３９２】
ジブロモマレイン酸無水物（３４６ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を、フルオレセインアミン異性体１（６７８ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）の酢酸（６５ｍＬ）溶液に一度に添加し、反応混合物を密封管中で室温で１２時間撹拌した。次いで、反応混合物を１５０℃で３時間加熱した。室温まで冷却して固体を濾過し、乾燥させて（トルエン共沸混合物）、所望の化合物をオレンジ色の固体として得た（７２２ｍｇ、１．４３ｍｍｏｌ、７３％収率）。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 7.99 (d, 1H, J = 1.7, 1H, H-11), 7.77 (dd, 1H, J = 1.9及び8.2, 1H, H-7), 7.73 (s, 1H, H-3), 7.43 (d, J = 8.2, 1H, H-8), 6.69 (m, 6H, 2 x H-16, 2 x H-17, 2 x H-18); 13C NMR (175 MHz, DMSO) δ 167.93 (C=O), 167.63 (C=O), 164.48 (C=O), 159.62 (2 x C18), 151.79 (2 x C20), 151.52 (C6), 133.68 (C7), 133.02 (Ar), 132.90 (C3),  131.23(C), 129.15 (2 x Ar-H), 126.73 (C), 124.82 (C11), 122.29 (C8), 112.77 (2 x Ar-H), 109.08 (2 x Ar), 102.30 (2 x Ar-H), 83.36 (C14); IR (固体, cm-1) 3064 (w), 1726 (s); MS (ES+) m/z, (相対強度): 508 ([81M], 95), 506([79M], 100); [C24H13O7N79Br] について計算した正確な質量は505.9875を要求、実測値 505.9833 (ES+).
【０３９３】
参考例３１：Ｎ−フルオレセインジブロモマレイミドの調製
【０３９４】
【化６２】
0005954789.tif 000064
【０３９５】
ジブロモマレイン酸無水物（７７．０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を、フルオレセインアミン異性体１（１０５ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）の酢酸（１０ｍＬ）溶液に一度に添加し、反応混合物を室温で６時間撹拌した。次いで固体を濾去し、酢酸エチルで洗浄し、酢酸（１０ｍＬ）中に再溶解した。次いで反応混合物を３時間加熱還流した。室温まで冷却してトルエン（１０ｍｌ）を添加し、溶媒を真空中で除去し、所望の化合物をオレンジ色の固体として得た（１４８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、８４％収率）。δ 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.07 (d, 1H, J = 1.5, H-11), 7.81 (dd, 1H, J = 1.5及び8.0, H-7), 7.34 (d, 1H, J = 8.5, H-8), 6.71-6.58 (m, 6H, 6 x Ar-H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 170.23 (C=O), 164.34 (2 x C=O), 161.63 (2 x C), 154.18 (2 x C), 152.93 (C), 134.59 (C), 134.19 (Ar-H), 131.01 (C), 130.35 (Ar-H), 129.25 (2 x C), 126.25 (2 x Ar-H), 123.63 (Ar-H), 113.84 (2 x Ar-H), 111.02 (2 x C), 103.55 (2 x Ar-H); IR (固体, cm-1) 3064 (w), 1732 (s); MS (ES+) m/z, (相対強度): 586 ([81+81M], 30), 584([79+81M], 100), 582([79+79M], 100); [C24H10O7N79Br2] について計算した正確な質量は581.8824を要求、実測値 581.8824 (ES+).
【０３９６】
参考例３２：Ｔｅｒｔ−ブチル  ２−アミノエチルカルバメートの調製
【０３９７】
【化６３】
0005954789.tif 000065
【０３９８】
ＤＣＭ（３０ｍＬ）中のジ−ｔｅｒｔブチルジカーボネート（３．２６ｇ、１５ｍｍｏｌ、１当量）を、オートインジェクターを使用して２時間かけて、アルゴン雰囲気下でエチレンジアミン（１０ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ、１０当量）のＤＣＭ（３０ｍＬ）溶液に滴下した。ＴＬＣ分析（溶離液：９０％ＥｔＯＡｃ：１０％ＭｅＯＨ  Ｒｆ（８）＝０．２３）に基づけば、添加終了の３０分後に反応は完了した。ＤＣＭを、Ｂｕｅｃｈｉを使用して減圧下で除去した。得られた残渣をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）中に取り、飽和Ｎａ２ＣＯ３（３ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮して、所望の生成物を白色泡状物として得た（２．０８ｇ；１２．９８ｍｍｏｌ、８７％）。 mp (104-106℃), δH 1H NMR (300MHz CDCl3): 4.95 (ブロードシングレット, 1H, NH), 3.12(q, J=6.4Hz, 2H, CH2), 2.78(t, J=5.9Hz, 2H, CH2), 1.42(s, 9H, 3CH3). 13C NMR (CDCl3): 28.06, 41.51, 43.02, 78.82, 155.9 IR: 3354.9cm-1,  [M + H]+: 161.00
【０３９９】
参考例３３：ｔｅｒｔ−ブチル  ２−（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホンアミド）エチルカルバメートの調製
【０４００】
【化６４】
0005954789.tif 000066
【０４０１】
丸底フラスコを火炎乾燥させ、スターラーバー及びアミン（０．５７ｇ、３．６ｍｍｏｌ、１当量）の乾燥ＤＣＭ（１５０ｍＬ）溶液をアルゴン雰囲気下で投入した。乾燥ＤＣＭ（１５０ｍＬ）及びトリエチルアミン（１．３ｍｌ、９．２９ｍｍｏｌ、２．５当量）中のダンシルクロリド（１．０５ｇ、３．９２ｍｍｏｌ、１．１当量）を、隔壁を介して一度に添加した。反応をＴＬＣ（溶離液：３５％ＥｔＯＡｃ：６５％石油エーテル  Ｒｆ（９）＝０．２７，長波ＵＶ下での緑色蛍光）でモニタリングしたところ、反応は４時間後に完了した。カラムクロマトグラフィー（溶離液：３５％ＥｔＯＡｃ：６５％石油エーテル）での精製後、所望の化合物が粘着性の透明な緑色油状物として形成された（１．２４ｇ、３．１５ｍｍｏｌ、８８％）。
δH 1H NMR (CDCl3): 8.55(d, J=8.55Hz, 1H, CH),8.46(d, J=8.51Hz, 1H, CH), 8.33(d, J=8.67Hz, 1H, CH), 7.57(m, 2H, 2xCH), 7.26(d, J=7.08Hz, 1H, CH), 3.07(カルテット, J=6.58Hz, 2H, CH2), 2.89(m, 2H, CH2), 2.85(s, 6H, 2xCH3), 1.35(s, 9H, 3xCH3). 13C NMR (CDCl3): 158.01, 153.05, 136.5, 131.49, 131.09, 130.02, 129.54, 124.48, 120.59, 116.41, 80.41, 45.9, 43.81, 41.5, 28.5. MS: [M + H]+: 393.16.
【０４０２】
参考例３４：５−（３−アミノプロピルスルホニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルナフタレン−１−アミン  ２，２，２−トリフルオロアセテートの調製
【０４０３】
【化６５】
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【０４０４】
ＢＯＣ−カルバメート（１．２４ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）を含むフラスコに、ＴＦＡ（４０ｍｌ）を一度に添加した。得られた灰色溶液を室温（約２５℃）で２時間撹拌した。完了に際し、溶液を真空中で濃縮し、トルエンと共沸混合した（５ｘ１０ｍｌ）。次いで、得られた粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー（溶離液：ＥｔＯＡｃ  １：２  石油エーテル  Ｒｆ（１０）＝０．２０）で精製した。適切な画分を真空中で濃縮後、得られた黄色油状物にＤＣＭ（１００ｍｌ）を添加し、溶液を氷浴中に２時間配置したところ、この溶液は、長波ＵＶ下で蛍光性であった。所望の化合物（１．２５ｇ、３．１０ｍｍｏｌ、９７％）は、白色固体として溶液から析出し（ｃｒａｓｈｅｄ）、これを濾去して、重力下でジエチルエーテルで洗浄した。Mp (114-116℃); δH 1H NMR (500MHz MeOD): 8.64(d, J=8.3Hz, 1H, CH), 8.35(d, J=8.45Hz, 1H, CH), 8.32(d, J=8.65Hz, 1H, CH), 7.67(m, 2H, 2xCH), 7.34(d, J=7.3Hz, 1H, CH), 3.03(カルテット, 4H, 2 xCH2), 2.84(s, 6H, 2 x CH3). δc 13C NMR (500 MHz MeOD): 153.41, 135.78,  131.69, 131.32, 130.81, 130.56, 129.48, 124.29, 120.07, 116.635, 66.91, 45.79, 41.27, 40.78, 15.45. 19F NMR( 300 MHz CDCl3); -76.89;  IR: 3092cm-1, 2901.5cm-1 , MS: [M + H]+: 294
【０４０５】
参考例３５：（Ｅ）−２−ブロモ−４−（２−（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホンアミド）エチルアミノ）−４−オキソブト−２−エン酸の調製
【０４０６】
【化６６】
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【０４０７】
オーブン乾燥した５００ｍｌの丸底フラスコにスターラーバーを投入した。アミン塩（１．０９ｇ、）を２５ｍｌ酢酸中に溶解し、フラスコに添加した。得られた淡黄色（ｌｉｇｈｔ  ｙｅｌｌｏｗ）の溶液に、ブロモマレイン酸無水物を添加し、反応をＴＬＣ（溶離液；１０％メタノール：９０％ＥｔＯＡｃ、Ｒｆ（１１）＝０．７）でモニタリングした。室温（２５℃）で１．５時間撹拌した後、酢酸を真空中で除去した。所望の化合物を、さらなる精製なしに使用した。1H NMR (500Mz CDCl3 (粗製)): δH 8.6(d, J=8.56Hz, 1H, CH), 8.35(d, 1H, J=8.27Hz, CH), 8.22(d, 1H, J=8.57Hz, CH), 7.64(m, 2H, 2 x CH), 7.30(d, J=7.60Hz, 1H, CH), 5.48(s, 1H, CH)/5.03(s, 1H, CH), 3.00(m, 4H, 2x CH2), 2.88(s, 9H, 2 x CH3)
【０４０８】
参考例３６：Ｎ−（２−（３−ブロモ−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）−５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホンアミドの調製
【０４０９】
【化６７】
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【０４１０】
この酸を酢酸（２５ｍＬ）中に溶解し、オーブン乾燥した５００ｍｌの丸底フラスコに投入した。コンデンサーを取り付け、反応を２時間還流（１７０℃）下に置いた。次いで酢酸を、真空中で粗製混合物から除去し、得られた油状物をトルエンと共沸混合した（５ｘ１０ｍｌ）。得られた油状物をカラムクロマトグラフィー（溶離液：３０％酢酸エチル：７０％石油エーテル、上記溶離液系においてＲｆ（１２）＝０．２）で精製した。非常にゆっくりしたカラムが完了したところで、さらなる移動画分を収集し、溶媒を除去した。得られた褐色油状物を、氷浴中で１時間、ニート酢酸エチル（５０ｍｌ）中に静置した。所望の生成物（０．９６１ｇ、８０％）は、褐色固体として溶液から析出し（粉末様のテクスチャ）、これを重力下で濾過し、ジエチルエーテル（２０ｍｌ）で洗浄した。 mp (166-170℃); 1H NMR (600 MHz DMSO): δH 8.53(d, J=8.46Hz, 1H, CH), 8.21(d, 1H, J=8.40Hz, CH), 8.17(d, 1H, J=8.58Hz, CH), 7.56(m, 2H, 2 x CH), 7.18(d, J=7.50Hz, 1H, CH), 6.46 (s, 1H, マレイミドオレフィン C-H), 5.11(t, J=6.24,1H, NH), 3.56(m, 2H, CH2), 3.2(m, 2H, CH2), 3.91(s, 6H, 2 xCH3). δC 13C NMR (600 MHz DMSO): 168.62, 165.33, 151.38, 151.38,135.62, 132.33, 130.13, 129.60, 129.09, 128.85, 128.30, 127.96, 123.61, 118.99, 115.22, 45.11, 40.05, 39.37, 38.47.
【０４１１】
参考例３７：４−ブロモ−１，２−ジエチル−１，２−ジヒドロ−ピリダジン−３，６−ジオン（ＢｒＤＤＰＤ）の調製
【０４１２】
【化６８】
0005954789.tif 000070
【０４１３】
モノブロモマレイン酸無水物（１７７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジエチルヒドラジン（８８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の氷ＡｃＯＨ（３ｍＬ）中混合物を、１３０℃で１６時間加熱した。溶媒を真空中で除去し、粗製残渣をカラムクロマトグラフィー（ニートＣＨ２Ｃｌ２〜５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製して、４−ブロモ−１，２−ジエチル−１，２−ジヒドロ−ピリダジン−３，６−ジオンを黄色固体として得た（１５９ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ、６４％）: 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.31 (s, 1H), 4.14 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 4.07 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.26 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.22 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 156.2 (s), 154.3 (s), 136.0 (d), 133.7 (s), 41.9 (t), 40.7 (t), 13.3 (q), 13.3 (q); IR (固体) 3058, 2979, 2938, 1631, 1595 cm-1; LRMS (CI) 249 (100, [M81Br+H]+), 247 (100, [M79Br+H]+); C8H12BrN2O2[M+H]+について計算したHRMS (CI) 249.0082, 実測値249.0086.
【０４１４】
参考例３８：４，５−ジブロモ−１，２−ジエチル−１，２−ジヒドロ−ピリダジン−３，６−ジオン（ＤｉＢｒＤＤＰＤ）の調製
【０４１５】
【化６９】
0005954789.tif 000071
【０４１６】
ジブロモマレイン酸無水物（２５６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジエチルヒドラジン（８８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の氷ＡｃＯＨ（３ｍＬ）中の混合物を、１３０℃で１６時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、粗製残渣をカラムクロマトグラフィー（ニートＣＨ２Ｃｌ２〜５％  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製して、４，５−ジブロモ−１，２−ジエチル−１，２−ジヒドロ−ピリダジン−３，６−ジオンを黄色固体として得た（２０２ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ、６２％）: 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 4.17 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 153.3 (s), 136.1 (s), 42.4 (t), 13.2 (q); IR (固体) 2979, 2937, 1630, 1574 cm-1; LRMS (EI) 328 (50, [M81Br81Br]+・), 326 (100, [M81Br79Br]+・), 324 (50, [M79Br79Br]+・); C8H10Br2N2O2 [M79Br79Br]+・について計算したHRMS (EI) 323.9104, 実測値 323.9097.
【０４１７】
参考例３９：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅの調製
【０４１８】
【化７０】
0005954789.tif 000072
【０４１９】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール（３ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加した。１分後、溶媒を真空中で除去した。フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中５０％の酢酸エチルから酢酸エチルでの勾配溶出）により、淡黄色粉末Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅ（５１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）が１００％で得られた。 δH (500 MHz, CDCl3) 7.63 (s, 1H, mal-NH), 6.27 (s, 1H, 9-H), 5.40 (d, 1H, J = 6.8, NH), 4.67 (ddd, 1H, J = 5.1, 5.4及び6.8, H-4), 3.80 (s, 3H, H3-6), 3.48 (dd, 1H, J = 5.1及び13.8, HH-7), 3.62 (dd, 1H, J = 5.4及び14.1, HH-7) 1.45 (s, 9H, 3 x H3-1-); δC (125 MHz, CDCl3) 170.2 (C=O), 168.9 (C=O), 167.6 (C=O), 155.2 (C=O), 155.9 (C8), 119.7 (C9), 81.1 (C2), 53.3 (C6), 52.7 (C4), 34.0 (C7), 28.3 (3 x C1); IR (固体, cm-1) 3236 (w), 1715 (s); MS (CI+) m/z, (相対強度): 331 ([M+H], 5), 275 (20), 231 (100); [C13H18O6N2S]+Hについて計算した質量は331.0964を要求、実測値 331.0968 (CI+); 20αD: -41.9o (c = 1.0, メタノール); m.p. 145-147℃; UV (アセトニトリル) ε245 = 14200及びε339= 8600 cm-1M-1d3.
【０４２０】
参考例４０：Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎ’−Ｍｅ−Ｍａｌ）−ＯＭｅの調製
【０４２１】
【化７１】
0005954789.tif 000073
【０４２２】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３２ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）のメタノール（４ｍＬ）中撹拌溶液に、酢酸ナトリウム（８２ｍｇ、０．４０８ｍｍｏｌ）を添加した。これに、メタノール（４ｍＬ）中のＮ−メチルブロモマレイミド（２５．８ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）を、１０分間かけて添加した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（３９．３ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）を青白い粉末として８４％の収率で得た。δH (500MHz, CDCl3) 6.26 (s, 1H, H-9), 5.36 (d, 1H, J = 6.3, ‘Boc’ NH), 4.66 (m, 1H, H-4), 3.79 (s, 3H, H3-6), 3.46 (dd, 1H, J = 5.0及び5.2, HH-7), 3.35 (dd, 1H, J = 5.1及び13.7, HH-7), 3.00 (s, 3H, H3-13), 1.44 (s, 9H, 3 x H3-1); δC (125MHz, CDCl3) 170.2 (C=O), 169.5 (C=O), 167.9 (C=O), 155.0 (C=O), 149.9 (C8), 118.7 (C9), 80.9 (C2), 53.1 (C6), 52.7 (C4), 33.8 (C7), 28.3 (3 x C1), 24.1 (C13); IR (固体, cm-1) 3368 (m), 2977 (m), 1695 (s); MS (ES+) m/z, (相対強度): 311 (M+, 100); C14H20N2O6NaSについて計算した質量は367.0940を要求。実測値: 367.0931; 20αD: -18.55o (c = 1.0, メタノール); m.p. 101-103℃.
【０４２３】
実施例９：２，３−ジ（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）スクシンイミド（ジアステレオマーの混合物）の調製
【０４２４】
【化７２】
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【０４２５】
ブロモマレイミド（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の水性緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）：ＤＭＦ、９５：５（９．２５ｍＬ）中撹拌溶液に、ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）中のＮ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（６６０ｍｇ、２．８１ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、水性反応混合物を酢酸エチル（３ｘ２５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を飽和塩化リチウム水溶液（５ｘ２５ｍＬ）、水（２５ｍＬ）及びブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を真空中で除去した。カラムクロマトグラフィー（石油エーテル中１０〜４０％の酢酸エチル）による精製により、２，３−ジ（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）スクシンイミド（ジアステレオマーの混合物）を、黄色ワックス状油状物（１５０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、９４％収率）（２つの対称なジアステレオマーの分離不能な１：１混合物）として得た; δH (400 MHz, CDCl3) 8.62 (s, 1H, １つの対称なジアステレオマーからのマレイミド NH), 8.66 (s, 1H, １つの対称なジアステレオマーからのマレイミド NH), 5.62 (d, 2H, J = 8.4, １つの対称なジアステレオマーからの2  x ‘Boc’ NH), 5.51 (d, 2H, J = 8.0, １つの対称なジアステレオマーからの2  x ‘Boc’ NH), 4.72-4.58 (m, 両方のジアステレオマーからの4 x H-4), 3.80 (s, 6H, １つの対称なジアステレオマーからの2 x H3-6), 3.79 (s, 6H, １つの対称なジアステレオマーからの2 x H3-6), 3.68 (s, 2H, １つの対称なジアステレオマーからの2 x H-8), 3.64 (s, 2H, １つの対称なジアステレオマーからの 2 x H-8), 3.46 (dd, 2H, J = 4.8及び12.0 Hz, １つの対称なジアステレオマーからの2 x HH-7*), 3.37 (dd, 2H, J = 6.0及び14.4, １つの対称なジアステレオマーからの2 x HH-7†), 3.21 (dd, 2H, J = 4.8及び14.0 Hz, １つの対称なジアステレオマーからの2 x HH-7†), 3.11 (dd, 2H, J = 6.4及び14.0 Hz, １つの対称な ジアステレオマーからの2 x HH-7*), 1.463 (s, 18H, １つの対称なジアステレオマーからの6 x H3-1), 14.460 (s, 18H, １つの対称な ジアステレオマーからの6 x H3-1);
*-HMQCデータにより同じABシステムの一部として示されるシグナル
†-HMQCデータにより同じABシステムの一部として示されるシグナル
δC (125 MHz, CDCl3) 174.32 (2 x C=O), 171.25 (2 x C=O), 155.33 (2 x C=O), 80.61 (2 x C2), 80.58 (2 x C2), 53.51 (2 x C4), 53.18 (2 x C4), 52.91 (2 x C6), 52.90 (2 x C6), 48.45 (2 x C8), 47.89 (2 x C8), 34.66 (2 x C7), 34.59 (2 x C7), 28.37 (6 x C1), 28.36 (6 x C1)いくつかの炭素シグナルは、ジアステレオマーの重複に起因して欠落している; IR (薄膜、ニート) 3348, 2978, 1719 cm-1; MS (EI) m/z (相対強度): 566 ([M+H], 20), 564 ([M-H], 100); [C22H35N3O10S2]-Hについて計算した正確な質量は564.1669を要求、実測値 564.1686.
【０４２６】
参考例４１：Ｎ−Ａｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ベンジルアミンの調製
【０４２７】
【化７３】
0005954789.tif 000075
【０４２８】
メタノール（４２ｍＬ）中のＮ−Ａｃ−Ｃｙｓ−ベンジルアミン（１．００ｇ、４．００ｍｍｏｌ）上記）に、メタノール（４２ｍＬ）中のブロモマレイミド（７７７ｍｇ、４．３７ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下した。１０分後、溶媒を真空中で除去し、残渣を、石油エーテル中１０％の酢酸エチルを使用するフラッシュクロマトグラフィーに供して、所望の化合物（４２９ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）をオフホワイトの固体として、ブロモマレイミドの６９％の回収率に基づき１００％の収率で得た。 δH (500 MHz, MeOD) 7.32-7.20 (m, 5H, 5 x Ar-H), 6.45 (s, 1H, H-12), 4.71 (t, 1H, J = 7.3, H-3), 4.38 (d, 2H, J = 2.7, H2-5), 3.40 (dd, 1H, J = 7.0及び13.6, HH-10), 3.25 (dd, 1H, J = 7.2及び13.6, HH-10), 1.99 (s, 3H, H3-1); δC (125 MHz, MeOD) 173.51 (C=O), 172.22 (C=O), 171.44 (C=O), 170.51 (C=O), 151.58 (C11), 139.48 (C6), 129.54 (2 x Ar-H), 128.51 (2 x Ar-H), 128.26 (C9), 121.01 (C12) 53.04 (C3), 44.25 (C5), 33.72 (C10), 22.42 (C1); IR (薄膜, cm-1) 3187 (w), 1717 (s), 1646 (s); MS (ES+) m/z (相対強度): 370 ([M+Na], 20), 337 (50), 325 (90), 309(100); [C16H17N3O4SN]+Naについて計算した正確な質量はm/z 370.0873を要求、実測値 370.0852 (ES+); UV (アセトニトリル) ε213= 19400, ε247 = 4800及びε337 = 2700 cm-1M-1d3; 白色固体は180℃で分解する。
【０４２９】
参考例４２：Ｎ−メチルヘキシルスルファニルマレイミドの調製
【０４３０】
【化７４】
0005954789.tif 000076
【０４３１】
メタノール（１５ｍＬ）中のＮ−メチルブロモマレイミド（１００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム三水和物（７０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）に、メタノール（１００ｍＬ）中のヘキサンチオール（７４μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）を、激しく撹拌しながら１時間かけて滴下した。５分後、溶媒を真空中で除去した。カラムクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）での精製により、所望の化合物（９９ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を、鮮黄色の固体として、８３％の収率で得た。δH (600 MHz, CDCl3) 6.03 (s, 1H, H-2), 3.01 (s, 3H, H3-5), 2.89 (t, 2H, J = 7.6, 2H, H2-11), 1.76-1.71 (m, 2H, H2-10), 1.46-1.41 (m, 2H, H2-9), 1.33-1.27 (m, 4H, H2-7及びCH2-8), 0.89 (t, 3H, J = 6.5, H3-6); δC (125 MHz, CDCl3) 171.47 (C=O), 169.94 (C=O), 151.84 (C3), 117.27 (C2), 31.92 (C11), 31.31 (CH2), 28.64 (CH2), 27.75 (CH2), 24.10 (C5), 24.10 (C7), 14.09 (C6); IR (油, cm-1) 2727 (w), 1708 (s); MS (FAB+) m/z (相対強度): 250 ([M+Na], 40), 228 (35), 199 (30), 176 (100); [C11H17NO2S]+Naについて計算した正確な質量はm/z 250.0878を要求、実測値 250.0880 (FAB+)
【０４３２】
参考例４３：２，３  ジヘキシルスルファニルスクシンイミド及びヘキシルスルファニルマレイミドの調製
【０４３３】
【化７５】
0005954789.tif 000077
【０４３４】
方法Ａ
メタノール（６０ｍＬ）中のブロモマレイミド（３００ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３８ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）に、ヘキサンチオール（３５６μＬ、２．５０ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）による精製により、２，３  ジヘキサンチオスクシンイミド（１３ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を鮮黄色のペーストとして２％の収率で得、ヘキシルスルファニルマレイミド（アルケン３１０ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）をクリーム色の粉末として８６％の収率で得た。
【０４３５】
２，３  ジヘキシルスルファニルスクシンイミド
δH (500 MHz, CDCl3) 8.21 (s, 1H, NH), 3.49 (s, 2H, 2 x H-7), 2.89-2.83 (m, 2H, 2 x HH-6), 2.79-2.83 (m, 2H, 2 x HH-6), 1.71-1.57 (m, 4H, 2 x CH2), 1.44-1.37 (m, 4H, 2 x CH2), 1.34-1.26 (m, 8H, 4 x CH2), 0.89 (t, 6H, J = 6.8, 2 x H3-1); δC (125 MHz, CDCl3) 174.60 (2 x C=O), 48.23 (2 x C7), 32.34 (2 x CH2), 31.26 (2 x CH2), 28.99 (2 x CH2) 28.46 (2 x CH2), 22.56 (2 x CH2), 14.27 (2 x C1-); IR (固体, cm-1) 3198 (m), 2928 (m), 1703 (s); 質量イオンは見出されず。
【０４３６】
ヘキシルスルファニルマレイミド
δH (500 MHz, CDCl3) 7.35 (s, 1H, NH), 6.04 (s, 1H, H-8), 2.91 (t, 2H, H2-6), 1.78-1.72 (m, 2H, H2-5), 1.48-1.42 (m, 2H, CH2), 1.33-1.30 (m, 4H, 2 x CH2), 0.90 (t, 3H, J = 6.9, H3-1); δC (125 MHz, CDCl3) 169.06 (C=O), 167.69 (C=O), 152.74 (C7), 118.24 (C8), 32.06 (C6), 31.26 (CH2), 28.58 (CH2), 27.70 (CH2), 22.52 (CH2), 14.03 (C1); IR (固体, cm-1) 3200 (m), 2918 (m), 1703 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 212 ([M-H], 100); [C10H15NO2S]-Hについて計算した正確な質量はm/z 212.0745を要求、実測値 212.0753 (ES-); m.p. 99-101℃; UV (アセトニトリル) ε247 = 12000及びε347 = 9500 cm-1M-1d3.
【０４３７】
方法Ｂ
メタノール（１００ｍＬ）中のブロモマレイミド（３００ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１３８ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）に、ヘキサンチオール（２３７μＬ、１．６９ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）による精製により、ヘキシルスルファニルマレイミド（３６２ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）をクリーム色の粉末として１００％の収率で得た。
【０４３８】
参考例４４：Ｎ−メチレンシクロヘキサンヘキシルスルファニルマレイミドの調製
【０４３９】
【化７６】
0005954789.tif 000078
【０４４０】
メタノール（５０ｍＬ）中のＮ−メチレンシクロヘキサンブロモマレイミド（５０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）に、メタノール（５０ｍＬ）中のヘキサンチオール（５２μＬ、０．３７ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（５０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を、５分間かけて滴下した。１０分後、溶媒を真空中で除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル）に供して、所望の化合物（２９ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）をオフホワイトの固体として８４％の収率で得た。δH (600 MHz, CDCl3) 6.01 (s, 1H, H-3), 6.27 (s, 1H, 9-H), 3.42 (d, 1H, J = 6.8, NH), 4.67 (ddd, 1H, J = 5.1, 5.4及び6.8, H-4), 3.80 (s, 3H, H3-6), 3.48 (dd, 1H, J = 5.1及び13.8, HH-7), 3.62 (dd, 1H, J = 5.4及び14.1, HH-7) 1.45 (s, 9H, 3 x H3-1); δC (125 MHz, CDCl3) 170.23 (C=O), 16844 (C=O), 151.49 (C2), 117.08 (C3), 44.36 (C16), 37.00 (C15), 31.91 (2 x CH2), 31.32 (2 x CH2), 30.73 (CH2), 28.66 (CH2), 27.78 (CH2), 26.33 (CH2), 25.73 (2 x CH2), 22.58 (CH2), 14.10 (C6); IR (固体, cm-1) 2927 (m), 1700 (s); MS (ES+) m/z, (相対強度): 310 ([M+H], 100), 180 (40); [C17H27O2NS]+Hについて計算した質量は310.1841 を要求、実測値 310.1828 (ES+).
【０４４１】
参考例４５：３−メルカプトプロピルチオマレイミド及び１，５−ジチオ−８−アザ−ビシクロ［５，３，０］デカン−７，９−ジオンの調製
【０４４２】
【化７７】
0005954789.tif 000079
【０４４３】
メタノール（６ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）に、１，３−プロパンジチオール（１７μｌ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）による精製により、３−メルカプトプロピルチオマレイミド及び１，５−ジチオ，８−アザ−ビシクロ［５，３，０］デカン−７，９−ジオンを、２つの分離不能な異性体の混合物である淡黄色粉末として、３−メルカプトプロピルチオマレイミド（７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を２１％の収率で、１，５−ジチオ，８−アザ−ビシクロ［５，３，０］デカン−７，９−ジオン（１２ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を３４％の収率で得た。δH (500 MHz, MeOD) 6.28 (s, 1H, H-5), 4.41 (s, 3.2H, 2 x H-10), 3.15 (t, 2H, J = 7.3, H2-3), 2.82-2.77 (m, 3.2H, CH2), 2.35 (t, 3.2H, J = 13.1, CH2), 2.30-2.25 (m, 2H, CH2), 2.20-2.13 (m, 2H, CH2), 1.91-1.83 (m, 3.2H, CH2); δC (125 MHz, MeOD) 177.79 (2 x C11), 172.33 (C=O), 170.56 (C=O), 152.37 (C4), 120.30 (C5), 54.52 (2 x C10), 34.94 (2 x C9), 32.16 (CH2), 31.10 (CH2) 30.96 (CH2), 27.49 (CH2); IR (固体, cm-1) 3246 (m), 1703 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 202 ([M-H], 100); [C7H9NO2S2]-H について計算した正確な質量はm/z 201.9996を要求、実測値 201.9996 (ES-). 
【０４４４】
参考例４６：Ｎ−フェニルヘキシルスルファニルマレイミドの調製
【０４４５】
【化７８】
0005954789.tif 000080
【０４４６】
メタノール（６０ｍＬ）中のヘキサンチオール（１１１μＬ、０．７９ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム三水和物（１０８ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）に、メタノール（６０ｍＬ）中のＮ−フェニルモノブロモマレイミド（２００ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を、激しく撹拌しながら１時間かけて滴下した。５分後、溶媒を真空中で除去した。カラムクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）での精製により、所望の化合物（１０９ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を淡黄色固体として４８％の収率で得た。 δH (600 MHz, CDCl3) 7.45 (dd, 2H, J = 7.1及び8.0, 2 x H-12), 7.36 (d, 2H, J = 6.0,  H-11), 7.35 (d, 2H, J = 8.1, 2 x H-13), 6.19 (s, 1H, H-2), 2.96 (t, 2H, J = 7.9, H2-10), 1.81-1.76 (m, 2H, H2-9), 1.50-1.45 (m, 2H, H2-8), 1.34-1.32 (m, 4H, H2-6及びH2-7), 0.91 (t, 3H, J = 6.9, H3-5); δC (125 MHz, CDCl3) 168.59 (C=O), 166.96 (C=O), 152.20 (C3), 131.53 (C14), 129.21 (2 x Ar-H), 127.93 (C11), 126.09 (2 x Ar-H), 117.24 (C2),  32.03 (C10), 31.33 (CH2), 28.68 (CH2), 27.78 (CH2), 22.59 (CH2), 14.11 (C5); IR (油, cm-1) 2931 (w), 1703 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 290 ([M+H], 100); [C16H20NO2S]+H について計算した正確な質量はm/z 290.1215を要求、実測値 290.1224 (CI+); 
【０４４７】
参考例４７：フェニルチオマレイミドの調製
【０４４８】
【化７９】
0005954789.tif 000081
【０４４９】
メタノール（３０ｍＬ）中のチオフェノール（５７μＬ、０．５６ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム三水和物（１３６ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）に、メタノール（３０ｍＬ）中のモノブロモマレイミド（１００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を、激しく撹拌しながら１時間かけて滴下した。５分後、溶媒を真空中で除去した。カラムクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）での精製により、所望の化合物（２２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を淡黄色固体として１９％の収率で得た。δH (600 MHz, CDCl3) 7.56 (dd, 2H, J = 1.6及び7.8, 2 x H-7), 7.50-7.48 (m, 3H, 3 x Ar), 5.63 (s, 1H, H-2); δC (125 MHz, CDCl3) 169.42 (C=O), 167.98 (C=O), 153.60 (C3), 134.45 (2 x Ar-H), 130.68 (C5), 130.42 (2 x Ar-H), 127.27 (C8), 119.91 (C2); IR (油, cm-1) 3265 (m), 1770 (m), 1701 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 206 ([M+H], 100), 111 (40); [C10H7NO2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 206.0276を要求、実測値 206.0273 (CI+); 
【０４５０】
参考例４８：１，４−ジチア−７−アザ−スピロ［４．４］ノナン−６，８−ジオンの調製
【０４５１】
【化８０】
0005954789.tif 000082
【０４５２】
メタノール（６ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）に、１，２−エタンジチオール（１７μｌ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）による精製により、所望の化合物（１３ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を淡黄色粉末として４１％の収率で得た。 δH (500 MHz, CDCl3) 8.39 (s, 1H, NH), 3.75-3.69 (m, 2H, HH-2及びHH-3), 3.60-3.53 (m, 2H, HH-2及びHH-3), 3.30 (s, 2H, H2-9); δC (125 MHz, CDCl3) 177.93 (C=O), 172.76 (C=O), 61.23 (C5), 43.12 (C9), 41.05 (C2及びC3); IR (固体, cm-1) 3290 (m), 1703 (m), 1629 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 188 ([M-H], 100); [C6H7NO2S2]-Hについて計算した正確な質量はm/z 187.9840を要求、実測値 187.9839 (ES-); m.p. 112-115℃.
【０４５３】
実施例１０：（Ｓ）−メチル  ２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−（１−（２−（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホンアミド）エチル）−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イルチオ）プロパノアートの調製
【０４５４】
【化８１】
0005954789.tif 000083
【０４５５】
ヒートガンを使用して撹拌溶液を短時間加熱することにより、ダンシル−ブロモマレイミド（１００ｍｇ）をメタノール（２００ｍｌ）中に溶解した。得られた淡黄色溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（２２μｌ、０．１ｍｍｏｌ、０．５当量）及び酢酸ナトリウム（１４．５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、０．５当量））を、３時間かけて添加した。反応をＴＬＣ（溶離液：４０％ＥｔＯＡｃ：６０％石油エーテル）でモニタリングした。添加が完了したところでメタノールを真空中で除去して、黄色油状物を得た。カラムクロマトグラフィーでの精製により、所望の生成物を得た（４８．２９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、７９．７％）。 1H NMR (600MHz CDCl3): δH 8.54(d, J=8.56Hz, 1H, CH), 8.21(d, 1H, J=8.27Hz, CH), 8.13(d, 1H, J=8.57Hz, CH), 7.55(m, 2H, 2 x CH), 7.25(d, J=7.60Hz, 1H, CH), 5.92(s, 1H, CH), 4.44(m, 1H, HN-CH-CO), 3.77(s, 3H, OMe), 3.48(m, 2H, CH2), 3.44(m, 2H, CH2), 3.38(s, 6H, 2 xCH3), 3.13(t, J=5.79, 2H, S-CH2) 2.88(s, 9H, 3 x CH3). 13C NMR (600MHz CDCl3): 173.08, 170.52, 169.69, 168.96 (4x C=O), 157.73 (-C=CH), 153.16, 150.71, 136.48, 131.39, 131.25, 131.18, 130.74, 130.65, 129.31, 124.35, 120.61, 119.22, 81.12, 53.58, 52.95, 45.89, 41.53, 33.98, 28.66. IR: 3324.7 cm-1, 1775 cm-1. [M + H]+: 605.1756, 計算値; 605.1740
【０４５６】
実施例１１：（２Ｒ，２’Ｒ）−ジメチル  ３，３’−（１−（２−（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホンアミド）エチル）−２，５−ジオキソピロリジン−３，４−ジイル）ビス（スルファンジイル）ビス（２−（ｔブトキシカルボニルアミノ）プロパノアート）の調製
【０４５７】
【化８２】
0005954789.tif 000084
【０４５８】
ダンシル／マレイミド／システイン付加物（１５ｍｇ、０．０２４７ｍｍｏｌ、１当量）をメタノール（１００ｍｌ）中に溶解した。得られた透明溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ（３．１μｌ、０．０２４７ｍｍｏｌ、１当量）を１時間かけて添加した。反応をＴＬＣ（溶離液：４０％ＥｔＯＡｃ：６０％石油エーテル）でモニタリングした。反応が完了したところで、メタノールを真空中で除去し、所望の生成物を得た（１２．５１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、６０％）。 1H NMR (600MHz CDCl3): δH 8.44(d, J=8.56Hz, 1H, CH), 8.13(m, 2H, 2 x CH), 7.49(m, 2H, 2x CH), 7.17(m, 2H, 2 x CH), 4.49(bs,1H, HN-CH-CO), 3.77(s, 3H, OMe), 3.48(m, 2H, CH2), 3.44(m, 2H, CH2), 3.38(s, 6H, 2 xCH3), 3.13(t, J=5.79, 2H, S-CH2) 2.88(s, 9H, 3 x CH3).
【０４５９】
実施例１２：ジ−ダンシル−シスタミン−マレイミドの調製
【０４６０】
【化８３】
0005954789.tif 000085
【０４６１】
丸底フラスコに、ジ−ダンシルシスタミン（１００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＴＣＥＰ（４６ｍｇ、１当量）及びＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を投入した。反応混合物をアルゴン下周囲温度で３時間撹拌した。次いで、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）中のジブロモマレイミド（３６ｍｇ、０．９当量）を反応混合物に添加した。３０分後、ＮａＯＡｃ（５６ｍｇ、４当量）を反応混合物に添加し、溶媒を真空中で留去した。残渣をＤＣＭ及びブラインでワークアップした。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０〜２０％のＥｔＯＡｃ−ＤＣＭ）による精製により、所望の化合物を黄色ゴムとして得た（４０ｍｇ、４０％）。 1HNMR (CDCl3, 600MHz), δ8.5 (2H, d J 8.5 Hz 芳香族H), δ8.2 (4H, m 芳香族H), δ7.53 (1H, s CONH), δ7.46 (4H, m, 芳香族H), δ7.1 (2H, d, J 7.4 Hz 芳香族H), δ5.65 (2H, t, J 6.27 SO2NH), δ3.3 (4H, t, J 6.0 SCH2), δ3.17 (4H, q, J 6.0 NHCH2), δ2.8 (12H, s NCH3); 13CNMR (CDCl3, 150MHz), δ165.9, 152.0, 136.5, 134.7, 130.7, 129.94, 129.85, 129.62, 129.57, 128.63, 123.3, 118.8, 115.4, 45.5, 43.6, 31.8; IR (cm-1) 3288 (br) 1720 (s) MS (Na+) m/z 相対強度: 736 (M, 100); [C32H35N5O6NaS4]について計算した正確な質量はm/z 736.1368を要求、実測値 736.1390 (Na+).
【０４６２】
参考例４９：ブロモ−ダンシル−シスタミン−マレイミドの調製
【０４６３】
【化８４】
0005954789.tif 000086
【０４６４】
丸底フラスコに、ジ−ダンシルシスタミン（４８ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、ＴＣＥＰ（２３ｍｇ、１当量）及びＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を投入した。反応混合物を、アルゴン下周囲温度で３時間撹拌した。ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中のジブロモマレイミド（４１ｍｇ、２当量）を反応混合物に添加した。１６時間後、反応混合物を真空中で濃縮した。残渣をＤＣＭ及びブラインでワークアップした。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０〜１５％のＥｔＯＡＣ−ＤＣＭ）で精製して、所望の化合物を得た（１７ｍｇ、２２％）。 1HNMR (CDCl3, 600MHz), δ8.5 (1H, d J 8.5 Hz 芳香族H), δ8.2 (2H, m 芳香族H), δ7.6 (1H, s CONH), δ7.53 (2H, m, 芳香族H), δ7.15 (1H, d, J 7.4 Hz 芳香族H), δ5.30 (1H, t, J 5.6 SO2NH), δ3.38 (2H, t, J 6.3 SCH2), δ3.26 (2H, q, J 6.3 NHCH2), δ2.88 (6H, s NCH3); 13CNMR (CDCl3, 150MHz), δ165.5, 162.9, 152.2, 142.5, 134.5, 130.95, 129.94, 129.92, 129.5, 128.7, 123.3, 119.0, 118.5, 115.4, 45.5, 43.7, 30.5; IR (cm-1) 3295 (br) 1726 (s) MS (ES+) m/z 相対強度: 485 (M, 100); [C18H19N3O4S2Br]について計算した正確な質量はm/z 484.0000を要求、実測値 783.9982.
【０４６５】
参考例５０：ダンシル−シスタミン−マレイミドの調製
【０４６６】
【化８５】
0005954789.tif 000087
【０４６７】
丸底フラスコに、ジ−ダンシルシスタミン（１００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＴＣＥＰ（４６ｍｇ、１当量）及びＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を投入した。反応混合物を、アルゴン下周囲温度で３時間撹拌した。ＭｅＯＨ（５ｍｌ）中のブロモマレイミド（５６ｍｇ、２当量）を反応混合物に添加した。１６時間後、反応混合物を真空中で濃縮した。残渣をＤＣＭ及びブラインでワークアップした。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０〜３０％のＥｔＯＡＣ−ＣＨＣｌ３）で精製して、所望の化合物（７３ｍｇ、５５％）を得た。 1HNMR (CDCl3, 600MHz), δ8.5 (1H, d J 8.5 Hz 芳香族H), δ8.2 (2H, m 芳香族H), δ8.1 (1H, s CONH), δ7.5 (2H, m, 芳香族H), δ7.15 (1H, d, J 7.5 Hz 芳香族H), δ6.0 (1H, s, CO2CH) δ5.89 (1H, t, J 6.4 SO2NH), δ3.20 (2H, q, J 6.7 NHCH2), δ3.99 (2H, t, J 6.9 SCH2), δ2.86 (6H, s NCH3); 13CNMR (CDCl3, 150MHz), δ169.6, 168.0, 152.0, 150.7, 134.4, 131.0, 129.9, 129.7, 129.5, 128.8, 123.4, 119.3, 118.7, 115.6, 45.5, 41.0, 31.8; IR (cm-1) 3277 (br) 1720 (s) MS (ES-) m/z 相対強度: 404 (M, 100); [C18H18N3O4S2] について計算した正確な質量はm/z 404.0739を要求、実測値 404.0733.
【０４６８】
実施例１３：Ｎ−プロピオン酸−メチル−エステル−ジ−ダンシル−シスタミン−マレイミドの調製
【０４６９】
【化８６】
0005954789.tif 000088
【０４７０】
丸底フラスコに、ジ−ダンシルシスタミン（１３２ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ）、ＴＣＥＰ（６１ｍｇ、１当量）及びＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を投入した。反応混合物を、アルゴン下周囲温度で３時間撹拌した。次いで、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）中のジブロモマレイミド（７０ｍｇ、１当量）を反応混合物に添加した。３０分後、ＮａＯＡｃ（８８ｍｇ、５当量）を反応混合物に添加し、溶媒を真空中で留去した。残渣をＤＣＭ及びブラインでワークアップした。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０〜２０％のＥｔＯＡｃ−ＤＣＭ）による精製により、所望の化合物を黄色ゴムとして得た（３２ｍｇ、２０％）。1HNMR (CDCl3, 300MHz), δ8.5 (2H, d J 8.5 Hz 芳香族H), δ8.2 (4H, m 芳香族H), δ7.53 (1H, s CONH), δ7.45 (4H, m, 芳香族H), δ7.1 (2H, d, J 7.5 Hz 芳香族H), δ5.7 (2H, t, J 6.1 SO2NH), δ3.75 (2H, t, J 7.0 CONCH2), δ3.6(3H, s, OCH3), δ3.2 (4H, m, SCH2), δ3.18 (4H, m, NHCH2), δ2.9 (12H, s, NCH3), δ2.6 (2H, t, J 7.1 NHCH2) ; 13CNMR (CDCl3, 75MHz), δ171.3, 165.9, 135.8, 134.8, 130.5, 129.8, 129.5, 129.4, 128.4, 123.3, 119.0, 115.3, 51.9, 45.5, 43.5, 34.3, 32.6 31.9; IR (cm-1) 3295 (br) 2948 (br) 1702 (s) MS (ES-) m/z 相対強度: 798 (M, 100); [C36H40N5O8S4] について計算した正確な質量はm/z 798.1760を要求、実測値 798.1715.
【０４７１】
参考例５１：Ｎ−プロピオン酸−メチル−エステル−ブロモ−ダンシル−シスタミン−マレイミドの調製
【０４７２】
【化８７】
0005954789.tif 000089
【０４７３】
丸底フラスコに、ジ−ダンシルシスタミン（６６ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）、ＴＣＥＰ（３１ｍｇ、１当量）及びＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を投入した。反応混合物を、アルゴン下周囲温度で３時間撹拌した。次いで、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）中のジブロモマレイミド（７０ｍｇ、０．５当量）を反応混合物に添加した。１６時間後、ＮａＯＡｃ（８８ｍｇ、５当量）を反応混合物に添加し、溶媒を真空中で留去した。残渣をＤＣＭ及びブラインでワークアップした。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０〜２％のＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ３）による精製により、所望の化合物を黄色ゴムとして得た（２０ｍｇ、１６％）。 1HNMR (CDCl3, 300MHz), δ8.5 (1H, m, 芳香族H), δ8.2 (2H, m 芳香族H), δ7.5 (2H, m, 芳香族H), δ7.2 (1H, d, J 7.5 Hz 芳香族H), δ5.2 (1H, t, J 6.1 SO2NH), δ3.8 (2H, t, J 7.0 CONCH2), δ3.7(3H, s, OCH3), δ3.4 (2H, m, SCH2), δ3.3 (2H, m, NHCH2), δ2.9 (6H, s, NCH3), δ2.6 (2H, t, J 7.1 NHCH2) ; 13CNMR (CDCl3, 75MHz), δ170.95, 165.5, 163.3, 141.6, 134.5, 130.8, 129.8, 129.5, 128.5, 123.2, 118.6, 115.3, 52.0, 45.4, 43.6, 34.8, 32.5 30.6; IR (cm-1) 3296 (br) 2948 (br) 1713 (s)
【０４７４】
実施例１４：Ｎ−ジエチレン−グリコール−モノメチル−エーテル−ジ−ダンシル−シスタミン−マレイミドの調製
【０４７５】
【化８８】
0005954789.tif 000090
【０４７６】
丸底フラスコに、ジ−ダンシルシスタミン（１５５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＣＥＰ（７２ｍｇ、１当量）及びＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を投入した。反応混合物を、アルゴン下周囲温度で３時間撹拌した。次いで、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）中のＰＥＧ−ジブロモマレイミド（１００ｍｇ、１当量）を反応混合物に添加した。１６時間後、ＮａＯＡｃ（１０２ｍｇ、５当量）を反応混合物に添加し、溶媒を真空中で留去した。残渣をＤＣＭ及びブラインでワークアップした。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、０〜１０％のＴＨＦ−ＤＣＭ）による精製により、所望の化合物を黄色ゴムとして得た（１３ｍｇ、６％）。 1HNMR (MeOH, 300MHz), δ8.5 (2H, m, 芳香族H), δ8.3 (2H, m 芳香族H), δ8.13 (2H, m, 芳香族H), δ7.5 (4H, m, 芳香族H), δ7.2 (2H, m, 芳香族H), δ3.5 (12H, m, CONCH2, OCH2), δ3.3(3H, s, OCH3), δ3.1 (8H, m, SCH2, NHCH2), δ2.8 (12H, s, NCH3); 13CNMR (CDCl3, 150MHz), δ167.4, 153.2, 136.9, 136.2, 131.3, 131.2, 130.9, 130.2, 129.6, 124.3, 120.5, 116.4, 72.9, 71.4, 71.3, 71.1, 68.7, 59.1, 45.8, 44.5, 38.98, 36.97; IR (cm-1) 3323 (br) 2946 (br) 2946 (s) 1017 (s) MS (Na+) m/z 相対強度: 882 (M, 100); [C39H49N5O9NaS4] について計算した正確な質量はm/z 882.2311を要求、実測値 882.2294 (Na+).
【０４７７】
参考例５２：Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−Ｇｌｙの調製
【０４７８】
【化８９】
0005954789.tif 000091
【０４７９】
メタノール（３ｍＬ）中のグルタチオン（４７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）に、メタノール（３ｍＬ）中のブロモマレイミド（３０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。５分後、溶媒を真空中で除去して、所望の化合物（６２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として１００％の収率で得た。δH  (500 MHz, MeOD) 6.47 (s, 1H, H-12), 4.79 (dd, 1H, J = 5.7及び8.2, H-6), 4.06 (t, 1H, J = 6.5, H-2), 3.95 (s, 2H, H2-8), 3.49 (dd, 1H, J = 5.8及び13.9, HH-10), 3.29 (dd, 1H, J = 8.3及び13.6, HH-10), 2.61 (t, 2H, J = 7.1, H2-4), 2.29-2.15 (m, 2H, H2-3);  δC(125 MHz, MeOD) 174.68 (C=O), 172.81 (C=O), 172.39 (C=O), 171.89 (C=O), 171.62 (C=O), 170.59 (C=O), 151.75 (C11), 120.91 (C12), 53.79 (C6), 52.76 (C2), 42.01 (C8), 33.92 (C10) 32.42 (C4), 27.03 (C3); IR (油, cm-1) 3259 (m), 2928 (m), 1717 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 401 ([M-H], 100), 272 (30); [C14H18N4O8S]-Hについて計算した正確な質量はm/z 401.0767を要求、実測値 401.0773 (ES-); UV (アセトニトリル) ε204= 8100, ε253 = 5600及びε342 = 1900 cm-1M-1d3.
【０４８０】
参考例５３：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＭｅＭａｌ）−Ｐｈｅ−ｉＰｒの調製の調製
【０４８１】
【化９０】
0005954789.tif 000092
【０４８２】
Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（３４４ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）を、（２Ｒ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−３−［（１−メチル−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）スルファニル］プロパン酸（３１３ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１３９ｍｇ）のＤＭＦ（２ｍＬ）中撹拌溶液に添加し、反応を２１℃で３分間撹拌した。（２Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−１−（プロパン−２−イルアミノ）プロパン−２−アンモニウム  トリフルオロアセテート（２６２ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１．５ｍＬ）中溶液を反応混合物に添加し、その後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２９４μＬ、１．６４ｍｍｏｌ）を添加し、反応を２１℃で４時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残渣をＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）中に溶解し、１Ｍ  ＨＣｌ（ｘ３）、Ｈ２Ｏ（ｘ１）、飽和ＮａＨＣＯ３（ｘ３）、１０％ＬｉＣｌ（ｘ１）及び飽和ＮａＣｌ（ｘ１）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を真空中で除去した。沈殿（ＣＨＣｌ３／石油エーテル  ４０〜６０）での精製により、所望の化合物を淡褐色固体として得た（３５９ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ、８４％収率）: 1H NMR (600 MHz, CD3CN, 25 ℃) δ 7.32-7.28 (m, 2H), 7.25-7.21 (m, 3H), 7.11 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 4.46 (td, J = 7.6, 6.5 Hz, 1H), 4.31 (td, J = 7.3, 6.4 Hz), 3.88 (ダブレットのセプテット, J = 6.6, 6.3 Hz, 1H), 3.30 (dd, J = 13.7, 5.8 Hz, 1H), 3.16 (dd, J = 13.7, 7.4 Hz, 1H), 2.95 (dd, J = 13.8, 7.5 Hz, 1H), 2.93 (s, 3H), 1.43 (s, 9H), 1.07 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.02 (d, J = 6.6 Hz, 3H); 13C NMR (151 MHz, CD3CN, 25 ℃) δ 169.39, 168.84, 168.77, 167.85, 155.17, 149.33, 136.77, 129.10, 127.98, 126.30, 118.57, 79.49, 54.10, 52.62, 40.91, 37.44, 32.43, 27.15, 22.95, 21.24, 21.17; IR (薄膜) 3301, 2973, 1770, 1701, 1674, 1641, 1525 cm-1; LRMS (EI) 518 (24%, [M]+・), 432 (23), 219 (33), 149 (21) 110 (27), 86 (37), 84 (100); C25H34N4O6S [M]+・について計算したHRMS (EI)  518.2194, 実測値518.2199.
【０４８３】
参考例５４：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＭｅＭａｌ）−Ｐｈｅ−ｉＰｒの脱保護
【０４８４】
【化９１】
0005954789.tif 000093
【０４８５】
１５０ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ８、２５ｍＬ）中のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（１３８ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＭｅＭａｌ）−Ｐｈｅ−ｉＰｒ（５０ｍｇ、９７μｍｏｌ）のＭｅＣＮ（２５ｍＬ）中撹拌溶液に添加し、反応を２１℃で１０分間撹拌した。Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−ｉＰｒの合成はＬＣＭＳ（ＥＳ−）４０８．７（１００％）で確認した。
【０４８６】
参考例５５：Ｇｒｂ２−ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃ変異体のクローニング及び発現
【０４８７】
【化９２】
0005954789.tif 000094
【０４８８】
Ｇｒｂ２−ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃの配列（残基５３−１６３）：M G I E M K P H P W F F G K I P R A K A E E M L S K Q R H D G A F L I R E S E S A P G D F S L S V K F G N D V Q H F K V C R D G A G K Y F L W V V K F N S L N E L V D Y H R S T S V S R N Q Q I F L R D I E Q V P Q Q P T Y V Q A G S R S H H H H H H 終止。質量計算値＝１４１７１
【０４８９】
Ｇｒｂ２  ＳＨ２ドメインのためのＤＮＡ構築物は、１次アミノ酸配列５３−１６３を含んでおり、プラスミドＱＥ−６０（Ｑｉａｇｅｎ）にクローニングした。Ｇｒｂ２  ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃ変異体は、変異残基をコードするオリゴヌクレオチドを使用した部位特異的変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｋｉｔ）によって構築した。両方の構築物を、Ｔ５プロモーターを使用してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］、Ｑｉａｇｅｎ）中で発現させ、Ｃ末端に６−Ｈｉｓ  Ｔａｇを精製のために組み込んだ。培養物（１Ｌ）を、シングルコロニーからＴ．Ｂ．中で３７℃で増殖させ、０．９のＯ．Ｄ．λ６００に達した時点で１．０ｍＭ  ＩＰＴＧによって発現を誘導した。培養物に、ほぼ３時間にわたってタンパク質を発現させ、その後細胞をペレット化した。ペレットを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２中で溶解させた。溶解物を遠心分離し、上清をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライした。Ｇｒｂ２−ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃを、０．１Ｍリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．２）によってＮｉ−ＮＴＡカラムから溶出させた。収集したＧｒｂ２  ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃは、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化したとき、約９５％の純度であった。ドメインスワッピングによるＧｒｂ２  ＳＨ２ドメインの二量体化は、以前に観察されている。二量体及び単量体のＧｒｂ２−ＳＨ２を、０．１Ｍリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００カラム（３２０ｍＬ）で分離した。単量体Ｇｒｂ２−ＳＨ２の分子量（約１４ｋＤａ）及び二量体Ｇｒｂ２−ＳＨ２の分子量（約２８ｋＤａ）に対応する２つのピークが溶出した。Ｇｒｂ２−ＳＨ２  Ｌ１１１Ｃドメインのほぼ６０％が、カラムから単量体として溶出した。４℃で数ヶ月の過程にわたって相互変換が殆ど認められなかったことから、分離された単量体及び二量体は、驚くべきことに動力学的に安定であることが見出された。単量体を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−４遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、タンパク質の最終濃度を、ＭｃＮｅｍａｒ及び共同研究者が得た吸光係数（１５，６００Ｍ−１）を用い、２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。タンパク質を、１００ｍＬアリコート中２ｍｇ／ｍＬの濃度で凍結させ、これを実験の際に必要に応じて解凍した。単量体タンパク質の質量（質量１４１７０）はＥＳＩ−ＭＳを使用して得た。
【０４９０】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、０℃でＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、単一の反応が起こって、１４３７０の質量を有する単一の生成物が生じたことが示され、これは、Ｃ１１１が官能化に利用可能であることを示す。
【０４９１】
参考例５６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物の調製
【０４９２】
【化９３】
0005954789.tif 000095
【０４９３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的変換で形成されたことが示された（質量１４２６６）。
【０４９４】
混合物を、０℃でＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、Ｅｌｌｍａｎ試薬との反応は明白には表れないことが示され、これは、ブロモマレイミド官能化がＣ１１１で生じたことを強調する。
【０４９５】
参考例５７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物の調製
【０４９６】
【化９４】
0005954789.tif 000096
【０４９７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した、ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的変換で形成されたことが示された（質量１４２８０）。
【０４９８】
混合物を、０℃でＥｌｌｍａｎ試薬（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で１０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、Ｅｌｌｍａｎ試薬との反応は明白には表れないことが示され、これは、Ｎ−メチルブロモマレイミド官能化がＣ１１１で生じたことを強調している。
【０４９９】
参考例５８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のホスフィン媒介性の還元的切断
【０５００】
【化９５】
0005954789.tif 000097
【０５０１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０５０２】
混合物を、０℃でＴＣＥＰ．ＨＣｌ（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１６９）が８０％の変換で得られたことが示された。
【０５０３】
参考例５９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の還元的切断
【０５０４】
【化９６】
0005954789.tif 000098
【０５０５】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０５０６】
混合物を、β−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０５０７】
参考例６０：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０５０８】
【化９７】
0005954789.tif 000099
【０５０９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０５１０】
混合物をグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０５１１】
参考例６１：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物のホスフィン媒介性の還元的切断
【０５１２】
【化９８】
0005954789.tif 000100
【０５１３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０５１４】
混合物を、０℃でＴＣＥＰ．ＨＣｌ（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１６８）が８５％の変換で得られたことが示された。
【０５１５】
参考例６２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の還元的切断
【０５１６】
【化９９】
0005954789.tif 000101
【０５１７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２８０の単一のタンパク質種が示された。
【０５１８】
混合物を、β−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０５１９】
参考例６３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０５２０】
【化１００】
0005954789.tif 000102
【０５２１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２８０の単一のタンパク質種が示された。
【０５２２】
混合物を、グルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０５２３】
参考例６４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド付加物のエタンジチオール媒介性の切断
【０５２４】
【化１０１】
0005954789.tif 000103
【０５２５】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０５２６】
混合物を、エタンジチオール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理し、１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で得られたことが示された。
【０５２７】
参考例６５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物の調製
【０５２８】
【化１０２】
0005954789.tif 000104
【０５２９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０５３０】
混合物を、０℃で２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物（質量＝１４３４５）が５４％の収率で形成されたことが示された。残りの物質はＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０５３１】
参考例６６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド／２−メルカプトエタノール付加物の調製
【０５３２】
【化１０３】
0005954789.tif 000105
【０５３３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０５３４】
混合物を、０℃で２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４３５９）が９０％の収率で形成されたことが示された。残りの物質はＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０５３５】
実施例１５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ブロモマレイミド／グルタチオン付加物の調製
【０５３６】
【化１０４】
0005954789.tif 000106
【０５３７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２６５の単一のタンパク質種が示された。
【０５３８】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド／グルタチオン付加物（質量＝１４５７４）が４４％の変換で形成されたことが示された。残りの物質はＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０５３９】
実施例１６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−メチルブロモマレイミド／グルタチオン付加物の調製
【０５４０】
【化１０５】
0005954789.tif 000107
【０５４１】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−メチルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド付加物に対応する質量１４２７８の単一のタンパク質種が示された。
【０５４２】
混合物を、０℃で２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で３時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−メチルブロモマレイミド／グルタチオン付加物（質量＝１４５８８）が９５％の変換で形成されたことが示された。残りの物質はＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃであった。
【０５４３】
参考例６７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド付加物の調製
【０５４４】
【化１０６】
0005954789.tif 000108
【０５４５】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３４５）。
【０５４６】
参考例６８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド付加物の２−メルカプトエタノール媒介性の還元的切断
【０５４７】
【化１０７】
0005954789.tif 000109
【０５４８】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５４９】
混合物を、０℃で２−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７１）が定量的収率の収率で得られたことが示された。
【０５５０】
参考例６９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド付加物のグルタチオン媒介性の還元的切断
【０５５１】
【化１０８】
0005954789.tif 000110
【０５５２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５５３】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ブロモマレイミド付加物が明らかに切断されて、所望の生成物（質量＝１４１７０）が定量的収率で得られたことが示された。
【０５５４】
実施例１７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物の調製
【０５５５】
【化１０９】
0005954789.tif 000111
【０５５６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５５７】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４５７３）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０５５８】
実施例１８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物の調製
【０５５９】
【化１１０】
0005954789.tif 000112
【０５６０】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５６１】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース、ナトリウム塩（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４４６１）がほぼ定量的収率で形成されたことが示された。
【０５６２】
実施例１９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０５６３】
【化１１１】
0005954789.tif 000113
【０５６４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５６５】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が、唯一の存在するタンパク質種であることが示された（質量＝１４５７３）。
【０５６６】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７３）が、定量的収率で形成されたことが示された。
【０５６７】
実施例２０：生理学的に適切なグルタチオン濃度（５ｍＭ）での、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０５６８】
【化１１２】
0005954789.tif 000114
【０５６９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５７０】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５７３）。
【０５７１】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の１００ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的収率で形成されたことが示された。
【０５７２】
実施例２１：生理学的に適切なグルタチオン濃度（１ｍＭ）での、ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０５７３】
【化１１３】
0005954789.tif 000115
【０５７４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５７５】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５７３）。
【０５７６】
タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物の溶液を、緩衝液交換（Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ  ６  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に供して、付加物（９５μＬ、［付加物］０．２ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を得た。これに、グルタチオン（５μＬ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中２０ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で４時間維持した。分析により、Ｇｒｂ２−ＳＨ２（Ｌ１１１Ｃ）（質量）１４１７０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０５７７】
実施例２２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０５７８】
【化１１４】
0005954789.tif 000116
【０５７９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５８０】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／グルタチオン付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５７３）。
【０５８１】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７２）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０５８２】
実施例２３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物のグルタチオン媒介性の切断
【０５８３】
【化１１５】
0005954789.tif 000117
【０５８４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５８５】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４４６１）。
【０５８６】
混合物を、０℃でグルタチオン（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７３）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０５８７】
実施例２４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０５８８】
【化１１６】
0005954789.tif 000118
【０５８９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で４時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド付加物に対応する質量１４３４６の単一のタンパク質種が示された。
【０５９０】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４４６１）。
【０５９１】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７２）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０５９２】
参考例７０：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルブロモマレイミド付加物の調製
【０５９３】
【化１１７】
0005954789.tif 000119
【０５９４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３５１）。
【０５９５】
参考例７１：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物の調製
【０５９６】
【化１１８】
0005954789.tif 000120
【０５９７】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４３１）。
【０５９８】
参考例７２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０５９９】
【化１１９】
0005954789.tif 000121
【０６００】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４３１）。
【０６０１】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７９）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０６０２】
実施例２５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物の調製
【０６０３】
【化１２０】
0005954789.tif 000122
【０６０４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４３１）。
【０６０５】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５４７）。
【０６０６】
実施例２６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６０７】
【化１２１】
0005954789.tif 000123
【０６０８】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に、Ｎ−フェニルブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４３１）。
【０６０９】
混合物を、０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／Ｎ−フェニルジブロモマレイミド／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５４７）。
【０６１０】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７８）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０６１１】
実施例２７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物の調製
【０６１２】
【化１２２】
0005954789.tif 000124
【０６１３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４６３４）。
【０６１４】
実施例２８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６１５】
【化１２３】
0005954789.tif 000125
【０６１６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４６３４）。
【０６１７】
混合物を、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０６１８】
実施例２９：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド付加物の調製
【０６１９】
【化１２４】
0005954789.tif 000126
【０６２０】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で２時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が＞８０％の収率で形成されたことが示された（質量１４７０１）。
【０６２１】
実施例３０：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６２２】
【化１２５】
0005954789.tif 000127
【０６２３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ビオチン−ＰＥＧ−ジブロモマレイミド付加物が＞８０％の変換で形成されたことが示された（質量１４７０１）。
【０６２４】
混合物を、０℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、０℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７１）が＞８０％の変換で形成されたことが示された。
【０６２５】
実施例３１：ニュートラアビジン被覆したアガロースビーズ上へのＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物のプルダウン及び放出
【０６２６】
【化１２６】
0005954789.tif 000128
【０６２７】
０℃のモデルタンパク質溶液（２００μＬ、［タンパク質］１．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４６３４）。
【０６２８】
タンパク質／ビオチン−ＰＥＧ−ブロモマレイミド付加物（２００μＬ）及び非修飾モデルタンパク質（２００μＬ）を、濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ、カットオフ１０ｋ）中でＰＢＳ緩衝液（３ｘ５００μＬ）で独立して洗浄し、タンパク質溶液（３００μＬ）（Ｉｎ）を得た。得られたタンパク質溶液のそれぞれについて、ニュートラアビジン被覆したアガロースビーズ（５０％水性スラリー７５０μＬ）を、ＰＢＳ（２ｘ５００μＬ）で洗浄した。次いで、タンパク質溶液（３００μＬ）をビーズに添加し、混合物を４℃で３０分間インキュベートした。混合物を遠心分離し、フロースルー（ＦＴ）を収集した。ビーズをＰＢＳ（２ｘ５００μＬ）で洗浄し、両方の洗浄画分を収集した（Ｗ１及びＷ２）。タンパク質を、β−メルカプトエタノール（２５ｍＭ）を含むＰＢＳ（３００μＬ）中で３７℃で２時間インキュベートすることにより、ビーズから放出させた。サンプルを遠心分離し、切断されたＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃを含む溶離液（Ｅｌ）を収集した。結果を図１に示す。
【０６２９】
回収されたタンパク質の量は、デンシトメトリーによるタンパク質希釈系列との比較により、４４％と決定された。しかしながら、不可逆的に物理吸着されたタンパク質（未修飾のタンパク質コントロールを使用して決定した）に対して補正すると、補正された回収率は７１％であった。
【０６３０】
実施例３２：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フルオレセインブロモマレイミド付加物の調製
【０６３１】
【化１２７】
0005954789.tif 000129
【０６３２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に、Ｎ−フルオレセインブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が９０％の変換で形成されたことが示された（質量１４５９７）。
【０６３３】
実施例３３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フルオレセインブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６３４】
【化１２８】
0005954789.tif 000130
【０６３５】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に、Ｎ−フルオレセインブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／フルオレセインブロモマレイミド付加物が９０％の変換で形成されたことが示された（質量１４５９７）。
【０６３６】
混合物を、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７１）が８７％の変換で形成されたことが示された。
【０６３７】
実施例３４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フルオレセインジブロモマレイミド付加物の調製
【０６３８】
【化１２９】
0005954789.tif 000131
【０６３９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｎ−フルオレセインジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が６１％の変換で形成されたことが示された（質量１４６７５）。
【０６４０】
実施例３５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｎ−フルオレセインジブロモマレイミド付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６４１】
【化１３０】
0005954789.tif 000132
【０６４２】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に、Ｎ−フルオレセインジブロモマレイミド（５μＬ、ＤＭＦ中の２．８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで０℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／フルオレセインジブロモマレイミド付加物が６１％の変換で形成されたことが示された（質量１４５９７）。
【０６４３】
混合物を、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で４時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１７１）が８５％の変換で形成されたことが示された。
【０６４４】
参考例７３：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＢｒＤＤＰＤ付加物の調製
【０６４５】
【化１３１】
0005954789.tif 000133
【０６４６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３４８）。
【０６４７】
参考例７４：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＢｒＤＤＰＤ付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６４８】
【化１３２】
0005954789.tif 000134
【０６４９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３４８）。
【０６５０】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２Ｍ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０６５１】
参考例７５：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物の調製
【０６５２】
【化１３３】
0005954789.tif 000135
【０６５３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＤｉＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４２７）。
【０６５４】
参考例７６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６５５】
【化１３４】
0005954789.tif 000136
【０６５６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＤｉＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４２７）。
【０６５７】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、次いで３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２Ｍ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０６５８】
実施例３６：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＤｉＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物の調製
【０６５９】
【化１３５】
0005954789.tif 000137
【０６６０】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＤｉＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４２７）。
【０６６１】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、次いで０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８．２ｍＭ）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、室温で１時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５４３）。
【０６６２】
実施例３７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＤｉＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６６３】
【化１３６】
0005954789.tif 000138
【０６６４】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＤｉＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４４２７）。
【０６６５】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、次いで０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８．２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、室温で１時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ＤｉＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物が存在する唯一のタンパク質種であることが示された（質量＝１４５４３）。
【０６６６】
混合物を、室温でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２Ｍ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、室温で３０分間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０６６７】
実施例３８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／ＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物の調製
【０６６８】
【化１３７】
0005954789.tif 000139
【０６６９】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、ＢｒＤＤＰＤ（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、タンパク質／ＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３４８）。
【０６７０】
混合物を、４℃で４０時間透析し（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、次いで０℃でβ−１−チオグルコース（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２８．２ｍＭ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で１時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、タンパク質／ＢｒＤＤＰＤ／β−１−チオグルコース付加物が１７％の変換で形成されたことが示された（質量＝１４５４３）。
【０６７１】
参考例７７：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｚ−２，３−ジブロモ−ブタ−２−エン二酸ジメチルエステル付加物の調製
【０６７２】
【化１３８】
0005954789.tif 000140
【０６７３】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｚ−２，３−ジブロモ−ブタ−２−エン二酸ジメチルエステル（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が形成されたことが示された（質量１４４４０）。
【０６７４】
参考例７８：ＧｒＢ２−ＳＨ２ドメインＬ１１１Ｃ／Ｚ−２，３−ジブロモ−ブタ−２−エン二酸ジメチルエステル付加物のβ−メルカプトエタノール媒介性の切断
【０６７５】
【化１３９】
0005954789.tif 000141
【０６７６】
０℃のモデルタンパク質溶液（１００μＬ、［タンパク質］２．０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に、Ｚ−２，３−ジブロモ−ブタ−２−エン二酸ジメチルエステル（５μＬ、ＤＭＦ中の２８２ｍＭ溶液）を添加した。この混合物を１秒間ボルテックスし、次いで３７℃で１時間維持した。ＬＣ−ＭＳを使用した分析により、所望の生成物が定量的収率で形成されたことが示された（質量１４３７０）。
【０６７７】
混合物を、３７℃でβ−メルカプトエタノール（５μＬ、Ｈ２Ｏ中の２．８２Ｍ溶液）で処理した。この混合物を１秒間ボルテックスし、３７℃で２時間維持し、その後、混合物をＬＣ−ＭＳで分析した。分析により、所望の生成物（質量＝１４１８０）が定量的変換で形成されたことが示された。
【０６７８】
実施例３９：ソマトスタチンの修飾及び再生
還元型ソマトスタチンの調製
【０６７９】
【化１４０】
0005954789.tif 000142
【０６８０】
凍結乾燥したソマトスタチン（質量＝１６３８）を、緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ）中に可溶化して、１５２．６μＭの濃度（０．２５ｍｇ／ｍｌ）とし、１．１当量のＴＣＥＰで、周囲温度で１時間還元した。還元の完了は、４当量のジブロモマレイミドをサンプルアリコートに添加し、ＬＣ−ＭＳで分析して確認した。
【０６８１】
ハロマレイミド及び誘導体によるソマトスタチンの架橋
還元型ソマトスタチンは記載したとおりに生成した。１．１当量のハロマレイミド又はジブロモマレイミド誘導体（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５〜１５．０％ＤＭＦ中１００ｘストック）を周囲温度で添加し、生成物の生成をＬＣ−ＭＳで１時間にわたりモニタリングした。結果を図２に示す。
【０６８２】
ジチオマレイミドによるソマトスタチンの架橋
還元型ソマトスタチンは記載したとおりに生成した。種々の量のジチオマレイミド（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５〜７．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）を周囲温度で添加し、生成物の生成をＬＣ−ＭＳで１時間にわたりモニタリングした。結果を図３に示す。
【０６８３】
ブロモマレイミドによるソマトスタチンの修飾
【０６８４】
【化１４１】
0005954789.tif 000143
【０６８５】
還元型ソマトスタチンは記載したとおりに生成した。２．１当量のブロモマレイミド（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、７．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）を周囲温度で添加したところ、ジ−付加生成物への完全な変換がＬＣ−ＭＳによって１時間以内に観察された。
【０６８６】
ジブロモマレイン酸無水物によるソマトスタチンの修飾
【０６８７】
【化１４２】
0005954789.tif 000144
【０６８８】
還元型ソマトスタチンは記載したとおりに生成した。５当量のジブロモマレイン酸無水物（ＤＭＦ中）を添加し、生成物の生成をＬＣ−ＭＳでモニタリングした。１７．３％の架橋ソマトスタチンが９０分以内に生成した。
【０６８９】
種々の還元剤による架橋ソマトスタチンの切断
マレイミド架橋ソマトスタチンは、記載したように調製した。１００当量の種々の還元剤（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、未修飾ペプチド及び副産物（還元剤と遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成を、ＬＣ−ＭＳによって４℃で２日間モニタリングした。ソマトスタチンとＧＳＨとの混合型ジスルフィドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳでのみ検出できた。結果を図４に示す。
【０６９０】
種々の量のＤＴＴ及び２−メルカプトエタノールによる、架橋ソマトスタチンの切断
マレイミド架橋ソマトスタチンは、記載したように調製した。種々の量のＤＴＴ又は２−メルカプトエタノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、未修飾ペプチド及び副産物（還元剤と遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成を、ＬＣ−ＭＳによって４℃で６時間モニタリングした。結果を図５に示す。
【０６９１】
架橋ソマトスタチンの触媒された切断
マレイミド架橋ソマトスタチンは、記載したように調製した。２０当量の２−メルカプトエタノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、その後、緩衝液又は５当量のヨウ化ナトリウム若しくはベンゼンセレノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、７．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）のいずれかを添加し、未修飾ペプチド及び副産物（２−メルカプトエタノール又はベンゼンセレノールと遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成を、ＬＣ−ＭＳによって周囲温度で２０分間モニタリングした。結果を図６に示す。
【０６９２】
Ｎ−官能化マレイミド架橋ソマトスタチンの切断
ソマトスタチンを、記載したとおりに還元し、Ｎ−官能化マレイミド誘導体で架橋した。１００当量の２−メルカプトエタノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、未修飾ペプチド及び副産物（２−メルカプトエタノールと遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成をＬＣ−ＭＳにより４℃で２日間モニタリングした。結果を図７に示す。
【０６９３】
ソマトスタチンへのモノブロモマレイミドのジ−付加生成物の切断
還元型ソマトスタチンを、２．１当量のモノブロモマレイミドと反応させて、ジ−付加生成物を得た。次に、１００当量の２−メルカプトエタノール（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１０００ｘストック）を添加し、モノ−付加生成物、未修飾ペプチド及び副産物（２−メルカプトエタノールと遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド）の生成を、ＬＣ−ＭＳにより周囲温度で２．５時間モニタリングした。結果を図８に示す。
【０６９４】
ソマトスタチンの比較上のｉｎ  ｓｉｔｕ架橋
ソマトスタチンに、種々の量のジチオマレイミド（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５−７．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）を添加し、反応を周囲温度で１０分間インキュベートした。次に、種々の量のＴＣＥＰ又はベンゼンセレノール（１００ｘストック、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５〜７．５％ＤＭＦ中で新たに調製した）を添加し、架橋ソマトスタチンの生成を、ＬＣ−ＭＳにより周囲温度で１時間にわたりモニタリングした。結果を図９に示す。
【０６９５】
ソマトスタチンのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＥＧ化
ソマトスタチンに、５当量のＮ−ＰＥＧ５０００−ジチオフェノールマレイミド又は１０当量のＮ−ＰＥＧ５０００−ジチオフェノールマレイミド（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ中１００ｘストック）のいずれかを添加し、反応を周囲温度で１０分間インキュベートした。次に、３当量のＴＣＥＰそれぞれ５当量のベンゼンセレノール（１００ｘストック、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５−７．５％ＤＭＦ中に新たに調製）を添加し、ＰＥＧ化ソマトスタチンの生成を、ＬＣ−ＭＳによって周囲温度で２時間にわたってモニタリングした。結果を図１０に示す。
【０６９６】
ＤｉＢｒＤＤＰＤによるソマトスタチンの修飾
【０６９７】
【化１４３】
0005954789.tif 000145
【０６９８】
凍結乾燥ソマトスタチン（質量＝１６３８）を、緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、４０％ＭｅＣＮ、２．５％ＤＭＦ）中に可溶化して、１５２．６μＭの濃度（０．２５ｍｇ／ｍＬ）にし、１．１当量のＴＣＥＰで２１℃で１時間還元した。還元の完了はＬＣＭＳによって確認した（質量＝１６４０）。ＤｉＢｒＤＤＰＤ（１００ｍｏｌ当量）を添加し、反応を２１℃で１０分間維持した。ソマトスタチン／ＤｉＢｒＤＤＰＤ付加物が定量的変換で形成したことが観察された（質量＝１８０３）。
【０６９９】
パッチクランプを使用した、架橋ソマトスタチンの生物活性保持の実証
得られたソマトスタチンアナログの活性に対して架橋修飾が有害な影響を有するか否かを試験するために、本発明者らは、ジブロモマレイミド架橋アナログ、ＰＥＧ化ジブロモマレイミド架橋アナログ及びフルオレセインジブロモマレイミド架橋アナログを、パッチクランプアッセイによって試験した。ＨＫＩＲ３．１／３．２チャネル及びヒトソマトスタチンレセプター２を発現するＨＥＫ２９３細胞をこれらの化合物で処理し、ホールセルパッチクランプ電流記録を採取した。３つ全てのアナログが、ソマトスタチン自体と匹敵する振幅で、ＧＩＲＫ電流の強い活性化を誘導した。コントロールとして細胞を百日咳毒素又はＧＩＲＫ阻害剤Ｔｅｒｔｉａｐｉｎ  Ｑで処理したとき、電流は大きく阻害された。このデータにより、架橋ソマトスタチンアナログが、ソマトスタチンレセプター２のアゴニズムに関して、ソマトスタチンの生物活性を保持していることが確認される。
【０７００】
細胞培養
細胞培養方法及び安定細胞株の生成は、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，９２１−９（２０００）に記載のとおりに実施した。Ｋｉｒ３．１チャネル及びＫｉｒ３．２Ａチャネルを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎細胞株）を、１０％胎仔ウシ血清及び７２７μｇのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した最小必須培地中で、加湿雰囲気（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）中３７℃で維持した。細胞を、落射蛍光を使用したトランスフェクト細胞の可視化のためのｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に、ＳＳＴＲ２  ＤＮＡ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｓ＆Ｔ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）で一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションは、細胞培養培地（血清も抗生物質も含まない）９７μｌ当たり、５μｌのＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）並びに８００ｎｇのＳＳＴＲ２−ＤＮＡ及び４０ｎｇのＥＧＦＰ−ＤＮＡで実施した。
【０７０１】
パッチクランプ実験のためのソマトスタチン及びアナログの調製
架橋ソマトスタチンは上記のように調製した。ソマトスタチン及びそのアナログを、緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２）中で４℃で２４時間透析して、有機溶媒を除去した。透析後、濃度を決定し、ペプチドを４℃で保存した。最終濃度２０μＭのソマトスタチン及びアナログを使用した（希釈は、細胞外パッチクランプ緩衝液中で行った）。
【０７０２】
電気生理学
ホールセルパッチクランプ電流記録を、フィラメント化ホウケイ酸ガラスキャピラリー（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、１．５ｍｍ  ＯＤｘ１．１７ｍｍ  ＩＤ）から引き出される３−４ＭΩの抵抗を有するファイアポリッシュピペットを使用して、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で実施した。データを取得し、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａインターフェイス（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及びｐＣＬＡＭＰソフトウェア（バージョン８．１、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で分析した。速い灌流システムを使用して、ソマトスタチン及びアナログをアプライした（Ｒａｐｉｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈａｎｇｅｒ、ＲＳＣ−１６０、Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ  Ｆｒａｎｃｅ）。細胞を−６０ｍＶでクランプした。細胞外溶液は以下であった（ｍＭ）：ＮａＣｌ  ８０、ＫＣｌ  ６０、ＣａＣｌ２  ２、ＭｇＣｌ２  １、ＨＥＰＥＳ  １０、ＮａＨ２ＰＯ４  ０．３３、グルコース  １０、ｐＨ７．４；一方、細胞内溶液は以下であった（ｍＭ）：グルコン酸Ｋ  １１０、ＫＣｌ  ２０、ＮａＣｌ  １０、ＭｇＣｌ２  １、ＭｇＡＴＰ  ２、ＥＧＴＡ  ２  ＧＴＰ  ０．３、ｐＨ７．４。アゴニストの適用後、電流は、遅延「ラグ」とその後のピーク振幅への迅速な上昇「ピークまでの時間」で活性化した。アゴニストの除去後、電流は、減衰してベースラインに戻った。各細胞について、薬物適用の圧力から生じたフローアーチファクト（ｆｌｏｗ  ａｒｔｉｆａｃｔ）が存在するか否かを評価した。これは、記録の開始時に、排水管の１つからの浴溶液を適用することによって行った。ＧＩＲＫ電流の阻害剤Ｔｅｒｔｉａｐｉｎ（Ａｌｏｍｏｎｅ）を、最終濃度１００ｎＭで使用した。細胞を、Ｇｉ／ｏタンパク質の阻害剤である百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ、１００ｎｇ／ｍｌ）と共に一晩インキュベートした。薬物は濃ストック溶液として調製し、−２０℃で維持した。
【０７０３】
結果を図１１及び図１２に示す。
【０７０４】
参考例７９：プロピルアミノマレイミドの調製
【０７０５】
【化１４４】
0005954789.tif 000146
【０７０６】
メタノール（１５ｍＬ）中のプロピルアミン（７５μＬ、１．０９ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（９２ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）に、メタノール（１５ｍＬ）中のブロモマレイミド（２００ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を滴下した。１０分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）による精製により、所望の化合物（８２ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を鮮黄色のワックス状固体として４９％の収率で得た。 δH (500 MHz, CDCl3) 7.36 (s, 1H, NH), 5.45 (s, 1H, NH), 4.80 (d, 1H, J = 1.3, H-5), 3.14 (dt, 2H, J = 6.2及び7.2, H2-3), 1.71-1.63 (m, 2H, H2-2), 0.99 (t, 3H, J = 7.4, H3-1); δC (125 MHz, CDCl3) 172.31 (C=O), 167.73 (C=O), 149.83 (C4), 85.29 (C5), 46.16 (C3), 21.91 (C2), 11.42 (C1); IR (固体, cm-1) 3190 (m), 2962 (m), 1693 (m), 1627 (s); MS (EI) m/z (相対強度): 154 (M+, 60), 125 (98), 84 (100); [C7H10N2O2]+ について計算した正確な質量はm/z 154.0737を要求、実測値 154.0734 (EI); UV (アセトニトリル) ε240= 7400及びε348 = 5700 cm-1M-1d3.
【０７０７】
参考例８０：ブト−３−エニルアミノマレイミドの調製
【０７０８】
【化１４５】
0005954789.tif 000147
【０７０９】
メタノール（１５ｍＬ）中の３−ブテニルアミン塩酸塩（２００ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（１８４ｍｇ、２．２４ｍｍｏｌ）に、メタノール（１５ｍＬ）中のブロモマレイミド（２００ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を滴下した。１０分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）による精製により、所望の化合物（１４２ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を鮮黄色のワックス状固体として７６％の収率で得た。δH (500 MHz, CDCl3) 7.10 (s, 1H, NH), 5.77 (tdd, 1H, J = 6.9, 10.7及び17.4, H-2), 5.38 (s, 1H, NH), 5.18-5.15 (m, 2H, H2-1), 4.83 (d, 1H, J = 1.3, H-6), 3.24 (t, 2H, J = 6.7, H2-4), 2.40 (dtd, 2H, J = 1.2, 6.8及び6.9, H2-3); δC (125 MHz, CDCl3) 171.94 (C=O), 167.45 (C=O), 149.53 (C5), 133.89 (C2), 118.51 (C1), 85.80 (C6), 43.30 (C4), 32.68 (C3); IR (固体, cm-1) 3290 (m), 1703 (m), 1629 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 165 ([M-H], 100); [C8H10N2O2]-Hについて計算した正確な質量はm/z 165.0659を要求、実測値165.0664 (ES-); m.p. 68-76℃; UV (アセトニトリル) ε241 = 8300及びε348= 6100 cm-1M-1d3.
【０７１０】
参考例８１：Ｎ−メチルプロピルアミノマレイミドの調製
【０７１１】
【化１４６】
0005954789.tif 000148
【０７１２】
メタノール（３０ｍＬ）中のプロピルアミン（５２μＬ、０．７８ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（６４ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）に、メタノール（３０ｍＬ）中のＮ−メチルモノブロモマレイミド（１５０ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を滴下した。１０分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中１０％の酢酸エチル）による精製により、所望の化合物（４１ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を鮮黄色のワックス状固体として３１％の収率で得た。 δH (500 MHz, CDCl3) 5.43 (s, 1H, NH), 4.80 (s, 1H, H-2), 3.16-3.13 (m, 2H, H2-9), 2.98 (s, 3H, H3-6), 1.71-1.64 (m, 2H, H2-8), 0.99 (t, J = 7.5, H3-7); δC (125 MHz, CDCl3) 172.71 (C=O), 167.66 (C=O), 149.51 (C3), 83.84 (C2), 46.01 (C9), 23.44 (C6), 21.87 (C8), 11.38 (C7); IR (薄膜, cm-1) 3317 (m), 2944 (w), 1698 (s), 1651 (s); MS (EI) m/z (相対強度): 168 (M+, 70), 139 (100), 111 (40); [C8H12N2O2]+について計算した正確な質量はm/z 168.0893を要求、実測値168.0887 (EI); UV (アセトニトリル) ε210 = 15900, ε240 = 2800, ε283 = 500及びε368 = 500 cm-1M-1d3.
【０７１３】
参考例８２：２，９−アザトリシクロ［５，３，０，０１０−４］デカン−１，３−ジオンの調製
【０７１４】
【化１４７】
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【０７１５】
ブト−３−エニルアミノマレイミド（４２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．０１Ｍ溶液を提供した。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら４分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（酢酸エチルから酢酸エチル中５％メタノールでの勾配溶出）により、所望の化合物（３９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をオフホワイトの固体として９３％の収率で得た。 δH (500 MHz, CDCl3) 3.50 (ddd, 1H, J = 2.6, 4.8及び11.8, HH-8), 3.18-3.12 (m, 2H, HH-8及びH-6), 2.98 (dd, 1H, J = 3.9及び10.7, H-4), 2.21 (ddd, 1H, J = 4.0, 8.6及び13.2, HH-5), 2.01 (ddd, 1H, 5.8, 10.5及び13.4, HH-5), 1.79 (m, 2H, H2-7); δC (125 MHz, CDCl3) 179.04 (C=O), 178.95 (C=O), 70.85 (C10), 48.43 (C8), 44.25 (C4), 43.82 (C6), 32.93 (C7) 24.96 (C5); IR (固体, cm-1) 3198 (m), 2944 (m), 1701 (s); MS (EI) m/z (相対強度): 166 (M+, 45), 125 (100); [C8H10N2O2]+ について計算した正確な質量はm/z 166.07387を要求、実測値166.07386 (EI); m.p. 110-113℃.
【０７１６】
参考例８３：（４ＳＲ，６ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−６−カルボニトリル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−カルボニトリル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７１７】
【化１４８】
0005954789.tif 000150
【０７１８】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（２２．５ｍＬ）及びアクリロニトリル（２．５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を提供した。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（勾配溶出、石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中５０％の酢酸エチル）により、（４ＳＲ，６ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−６−カルボニトリル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（９ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として２９％の収率で得、（４ＲＳ，７ＲＳ，５ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−カルボニトリル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（１２ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として３９％の収率で得た。
【０７１９】
（４ＳＲ，６ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−６−カルボニトリル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン  δH (500 MHz, CDCl3) 3.53 (dt, 1H, J = 1.4及び8.1, H-6), 3.16-3.10 (m, 2H, HH-5及びH-7), 2.89-2.80 (m, 2H, H2-13), 2.56-2.50 (m, 1H, HH-5), 1.67-1.55 (m, 4H, H2-12及びH2-11), 1.42-1.37 (m, 2H, H2-10), 1.33-1.27 (m, 2H, H2-9), 0.89 (t, 3H, J = 6.9, H3-8); δC (125 MHz, CDCl3) 174.49 (C=O), 172.91 (C=O), 116.82 (C4), 52.38 (C14), 44.16 (C6), 31.33 (C13), 30.87 (C7), 30.29 (CH2), 29.26 (CH2), 28.64 (CH2), 25.92 (CH2), 22.82 (C5), 14.11 (C8); IR (油, cm-1) 3223 (w), 2926 (w), 1778 (w), 1714 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 267 ([M+H], 40), 213 (70), 180 (100); [C13H18N2O2S]+H について計算した正確な質量はm/z 267.1167を要求、実測値267.1175 (CI+). 
【０７２０】
（４ＲＳ，７ＲＳ，５ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−カルボニトリル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン  δH (500 MHz, CDCl3) 3.66 (dd, 1H, J = 6.0及び9.5, H-5), 3.23 (dd, 1H, J = 5.2及び10.9, H-7), 3.01-2.82 (m, 3H, HH-6及びH2-13), 2.67 (ddd, 1H, J = 5.3, 9.6及び14.7, HH-6), 1.65-1.60 (m, 2H, H2-12), 1.42-1.36 (m, 2H, H2-11), 1.32-1.27 (m, 4H, H2-9及びH2-10), 0.88 (t, 3H, J = 6.8, H3-8); δC (125 MHz, CDCl3) 175.08 (C=O), 174.82 (C=O), 117.13 (C4), 51.24 (C14), 44.26 (C5), 31.36 (C13), 30.96 (C7), 29.82 (CH2), 29.19 (CH2), 28.62 (CH2), 25.72 (C6), 22.58 (CH2), 14.26 (C8); IR (油, cm-1) 3247 (w), 2927 (w), 1717 (s); MS (CI) m/z (相対強度): 267 ([M+H], 75), 214 (100), 180 (70); [C13H18N2O2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 267.1167を要求、実測値267.1158 (CI).
【０７２１】
参考例８４：（５ＲＳ，９ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−２−アザ−トリシロ（ｔｒｉｃｙｌｏ）［３．５．０．０５，９］ジ−１，３−オンの調製
【０７２２】
【化１４９】
0005954789.tif 000151
【０７２３】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（２２．５ｍＬ）及びシクロペンテン（３ｍＬ、３６ｍｍｏｌ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（勾配溶出、石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中５０％の酢酸エチル）による精製により、所望の化合物（１２ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物（２つの分離不能なジアステレオマーの１：１混合物）として７７％の収率で得た。ＣＯＳＹ分析は、特定のシグナル（下付の「ａ」及び「ｂ」で示す）が同じ化合物から生じるが、各ジアステレオマーの具体的な正体が未知であることを示している。シグナルの重複がＮＯｅ分析を妨げている。 δH (500 MHz, CDCl3) 3.15-3.07 (m, 2H, H-5a及びH-10a), 3.00 (t, 1H, J = 6.8, H-5b), 2.94 (td, 1H, J = 3.9及び6.6,  H-9b), 2.87-2.82 (m, 2H, H-9a及びHH-16a), 2.64-2.59 (m, 1H, HH-16b), 2.52-2.47 (m, 3H, H-10b, HH-16a及びHH-16b), 2.07 (dd, 2H, J = 6.3及び6.9, HH-15a及びHH-15b), 1.96-1.89 (m, 2H, HH-15a及びHH-15b) 1.88-1.82 (m, 4H, H2-7a及びH2-7b) 1.64-1.50 (m, 8H, H2-6a, H2-6b, H2-8a及びH2-8b), 1.38-1.25 (m, 12H, H2-12a, H2-12b, H2-13a, H2-13b, H2-14a及びH2-14b), 0.89-0.86 (m, 6H, H3-11a及びH3-11b); δC (125 MHz, CDCl3) 179.09 (C=O), 177.12 (C=O), 176.93 (C=O), 171.83 (C=O), 51.31 (C4), 51.33 (C4), 50.68 (C10), 45.32 (C10), 43.26 (C9), 41.70 (C5), 32.38 (CH2), 30.98 (CH2), 30.95 (CH2), 30.78 (CH2), 28.92 (CH2), 28.50 (CH2), 28.30 (CH2), 28.22 (CH2), 28.10 (CH2), 28.13 (CH2), 25.09 (CH2), 22.14 (CH2), 22.11 (CH2), 13.66 (2 x C11) いくつかの炭素 シグナルは、ジアステレオマーの重複に起因して欠落している; IR (油, cm-1) 3120 (w), 2927 (m), 1711 (s), 1627 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 280 ([M-H], 50), 212 (100); [C15H23NO2S]-H について計算した正確な質量はm/z 280.1371を要求、実測値280.1382 (ES-).
【０７２４】
参考例８５：４−ヘキシルスルファニル−１−フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７２５】
【化１５０】
0005954789.tif 000152
【０７２６】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を提供した。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１３３μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、４−ヘキシルスルファニル−１−フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン（１１ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として３０％の収率で得、（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（２６ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として７０％の収率で得た。
【０７２７】
４−ヘキシルスルファニル−１−フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 7.34-7.24 (m, 5H, 5 x Ar-H), 6.15 (d, 1H, J = 1.5, H-5), 4.11 (t, 1H, J = 7.7, H-1), 3.01 (ddd, 1H, J = 1.5, 7.8及び15.8, HH-7), 2.96 (dd, 1H, J = 7.8及び15.6, HH-7), 2.36-2.26 (m, 2H, H2-13), 1.50-1.41 (m, 2H, H2-12), 1.35-1.33 (m, 6H, H2-9, H2-10及びH2-11), 0.85 (t, 3H, J = 7.0, H3-8); δC (150 MHz, CDCl3) 170.96 (C=O), 169.95 (C=O), 147.26 (C4), 141.10 (C14), 129.41 (C5), 128.89 (2 x Ar-H), 127.86 (C17), 127.71 (2 x Ar-H), 47.24 (C1), 32.47 (C13), 31.43 (CH2), 29.19 (CH2), 28.61 (CH2), 22.60 (CH2), 14.10 (C8); IR (油, cm-1) 3288 (w), 2928 (w), 1775 (w), 1717 (s); MS (FAB+) m/z (相対強度): 340 ([M+Na], 20), 329 (35), 207 (20), 176 (100); [C16H23NO2S]+Naについて計算した正確な質量はm/z 340.1347を要求、実測値340.1351 (FAB+).
【０７２８】
（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 8.77 (s, 1H, NH), 7.39-7.31 (m, 5H, 5 x Ar-H), 4.05 (t, 1H, J = 8.8, H-5), 3.17 (dd, 1H, J = 3.4及び10.9, H-7), 3.04 (ddd, 1H, J = 8.4, 11.1及び12.7, HH-6), 2.63 (ddd, 1H, J = 3.6, 9.0及び12.8, HH-6), 2.43 (ddd, 1H, J = 6.7, 7.9及び11.3, HH-17), 2.13 (ddd, 1H, J = 6.6, 8.0及び11.3, HH-17), 1.30-1.08 (m, 8H, H2-13, H2-14及びH2-15及びH2-16), 0.83 (t, 3H, J = 7.3, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 178.76 (C=O), 177.62 (C=O), 136.51 (C11), 128.77 (2 x Ar-H), 128.70 (2 x Ar-H), 128.03 (C8), 57.17 (C4), 45.70 (C5), 43.87 (C7), 31.26 (C17), 28.70 (CH2), 28.65 (CH2), 28.52 (CH2), 26.22 (C6), 22.46 (CH2), 14.10 (C12); IR (油, cm-1) 3218 (w), 2926 (w) 1771 (m), 1703 (s); MS (FAB+) m/z (相対強度): 340 ([M+Na], 20), 199 (25), 176 (100); [C16H23NO2S]+Na について計算した正確な質量はm/z 340.1347を要求、実測値 340.1357 (FAB+).
【０７２９】
参考例８６：（４ＲＳ，７ＳＲ，５ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−カルボン酸メチルエステル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７３０】
【化１５１】
0005954789.tif 000153
【０７３１】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２１．９ｍＬ）及びメチルアクリレート（３．１ｍＬ、３６ｍｍｏｌ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を提供した。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中５０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（１７ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として４８％の収率で得た。 δH (600 MHz, CDCl3) 8.50 (s, 1H, NH), 3.81 (s, 3H, H3-8), 3.57 (dd, 1H, J = 5.8及び8.5, H-5), 3.18 (dd, 1H, J = 5.0及び10.7, H-7), 3.11 (ddd, 1H, J = 5.5, 11.0及び12.9, HH-6), 2.73 (dt, 1H, J = 7.5及び11.5, HH-15), 2.64 (dt, 1H, J = 7.5及び11.5, HH-15), 2.29 (ddd, 1H, J = 5.2, 8.5及び13.2, HH-6), 1.52-1.47 (m, 2H, H2-14), 1.35-1.30 (m, 2H, H2-13), 1.29-1.21 (m, 4H, H2-11及びH2-12), 0.87 (t, 3H, J = 6.7, H-3-10); δC (150 MHz, CDCl3) 176.65 (C=O), 171.13 (C=O), 170.48 (C=O), 52.59 (C8), 52.39 (C4), 44.56 (C7), 44.06 (C5), 31.41 (C15), 29.73 (CH2), 29.16 (CH2), 28.68 (CH2), 23.57 (C12), 22.57 (C11), 14.11 (C10); IR (油, cm-1) 3244 (w), 2928 (w) 1778 (w), 1714 (s); MS (FAB+) m/z (相対強度): 322 ([M+Na], 100), 300 (30), 214 (25); [C14H21NO4SN]+Na について計算した正確な質量はm/z 322.1089を要求、実測値 322.1082 (FAB+).
【０７３２】
参考例８７：（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−カルボン酸フェニルエステル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７３３】
【化１５２】
0005954789.tif 000154
【０７３４】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、フェニルアクリレート（１６０μＬ、１．２０ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（２１ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として４８％の収率で得、ヘキシルスルファニルマレイミド二量体（１２ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）を４７％の収率で得た。 δH (600 MHz, CDCl3) 8.41 (s, 1H, NH), 7.41-7.39 (m, 2H, 2 x Ar-H), 7.27-7.25 (m, 1H, H-8), 7.20 (d, 1H, J = 7.8, 2 x Ar-H), 3.80 (dd, 1H, J = 5.1及び8.5, H-5), 3.29 (dd, 1H, J = 5.1及び10.7, H-7), 3.20 (ddd, 1H, J = 5.5, 10.9及び13.0, HH-6), 2.62 (dt, 1H, J = 7.5及び11.5, HH-18), 2.73 (dt, 1H, J = 7.5及び11.5, HH-18), 2.40 (ddd, 1H, J = 5.6, 8.8及び13.5, HH-6), 1.54-1.48 (m, 2H, H2-17), 1.33-1.16 (m, 6H, H2-14, H2-15及びH2-16), 0.84 (t, 3H, J = 6.9, H3-13); δC (150 MHz, CDCl3) 176.35 (C=O), 176.19 (C=O), 168.85 (C=O), 150.66 (C11), 129.64 (2 x Ar-H), 126.34 (C8), 121.54 (2 x Ar-H), 52.59 (C4), 44.78 (C7), 44.17 (C5), 31.36 (CH2), 29.94 (C18), 29.09 (CH2), 28.68 (CH2), 23.83(C6), 22.56 (CH2), 14.08 (C13); IR (油, cm-1) 3213 (w), 2927 (w) 1757 (m), 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 362 ([M+H], 35), 268 (100), 149 (25); [C19H23NO4S]+H について計算した正確な質量はm/z 362.1426を要求、実測値362.1431 (CI+).
【０７３５】
参考例８８：（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｐ−アミノ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７３６】
【化１５３】
0005954789.tif 000155
【０７３７】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、４−ビニルアニリン（１３６μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（７ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として１７％の収率で得た。δH (600 MHz, CDCl3) 8.17 (s, 1H, NH), 7.10 (d, 2H, J = 8.5, 2 x Ar-H), 6.67 (d, 2H, J = 8.5, 2 x Ar-H), 3.94 (t, 1H, J = 9.0, H-5), 3.13 (dd, 1H, J = 3.7及び11.1, H-7), 2.98 (ddd, 1H, J = 8.8, 11.2及び12.9, HH-6), 2.58 (ddd, 1H, J = 3.5, 9.1及び12.8, HH-6), 2.42 (dt, 1H, J = 7.5及び11.5, HH-17), 2.17 (dt, 1H, J = 7.5及び11.5, HH-17), 1.34-1.29 (m, 2H, H2-16), 1.25-1.11 (m, 6H, H2-13, H2-14及びH2-15), 0.80 (t, 3H, J = 7.4, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 178.64 (C=O), 177.48 (C=O), 146.28 (C8), 129.81 (2 x Ar-H), 126.20 (C11), 114.81 (2 x Ar-H), 57.97 (C4), 45.48 (C5), 43.79 (C7), 31.35 (CH2), 29.07 (CH2), 28.65 (C17), 26.41 (C6), 22.54 (CH2), 14.12 (C12); IR (油, cm-1) 3214 (w), 2928 (w) 1769 (m), 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 333 ([M+H], 55), 119 (100); [C18H24N2O2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 333.1637を要求、実測値333.1642 (CI+).
【０７３８】
参考例８９：４−ヘキシルスルファニル−１−（ｍ−ニトロ）フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン、（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｍ−ニトロ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｍ−ニトロ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７３９】
【化１５４】
0005954789.tif 000156
【０７４０】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、３−ニトロスチレン（１３６μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、４−ヘキシルスルファニル−１−（ｍ−ニトロ）フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン（２３ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として５５％の収率で得、（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｍ−ニトロ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（０．５ｍｇ，０．００１ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として１％の収率で得（４−ヘキシルスルファニル−１−（ｍ−ニトロ）フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオンと同時に）、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｍ−ニトロ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（１２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を粘度のある無色油状物として２１％の収率で得た（二量体と同時に）。
【０７４１】
２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−１−（ｍ−ニトロ）フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 8.22 (s, 1H, H-16), 8.14 (d, 1H, J = 8.5, Ar-H), 7.68 (t, 1H, J = 7.6, Ar-H), 7.53 (t, 1H, J = 7.8, H-19), 7.20 (s, 1H, NH), 6.29 (s, 1H, H-5), 4.25 (t, 1H, J = 7.9, H-1), 3.03 (dd, 1H, J = 8.4及び15.4, HH-7), 2.98 (dd, 1H, J = 7.4及び15.2, HH-7), 2.37-2.26 (m, 2H, H2-13), 1.30-1.24 (m, 2H, H2-12), 1.21-1.08 (m, 6H, 3 x CH2), 0.81 (t, 3H, J = 7.1, H3-8); δC (150 MHz, CDCl3) 170.70 (C=O), 169.54 (C=O), 148.60 (C16), 146.35 (C4), 143.94 (C14), 133.83 (Ar-H), 129.96 (Ar-H), 129.86 (C5), 122.96 (Ar-H), 122.59 (Ar-H), 46.78 (C1), 32.52 (C7), 31.56 (CH2), 31.37 (C13), 29.03 (CH2), 28.52 (CH2), 22.57 (CH2), 14.11 (C8); IR (油, cm-1) 3282 (w), 2928 (m) 1775 (w), 1717 (s); 質量イオンは見出されず。
【０７４２】
（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｍ−ニトロ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンのシグナルは太字である。
【０７４３】
【化１５５】
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【０７４４】
（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｍ−ニトロ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 8.59 (s, 1H, NH), 8.22-8.16 (m, 2H, 2 x Ar-H), 7.66 (d, 1H, J = 7.5, Ar-H), 7.56 (t, 1H, J = 8.0, H-11), 4.14 (t, 1H, J = 8.6, H-5), 3.23 (dd, 1H, J = 3.0及び11.6, H-7), 3.05 (ddd, 1H, J = 8.5, 11.1及び13.1, HH-6), 2.73 (ddd, 1H, J = 3.6, 9.0及び12.9, HH-6), 2.45 (ddd, 1H, J = 6.7, 8.1及び11.4, HH-19), 2.13 (ddd, 1H, J = 6.8, 8.0及び11.3, HH-19), 1.30-1.24 (m, 2H, H2-18), 1.21-1.08 (m, 6H, H2-15, H2-16及びH2-17), 0.81 (t, 3H, J = 7.1, H3-14); δC (150 MHz, CDCl3) 177.94 (C=O), 176.84 (C=O), 148.14 (C9), 138.76 (C13), 135.29 (Ar-H), 129.24 (Ar-H), 123.39 (Ar-H), 123.16 (Ar-H), 56.71 (C4), 45.09 (C5), 43.69 (C7), 31.26 (CH2), 28.88 (CH2), 28.84 (C19), 28.51 (C6), 26.33 (CH2), 22.57 (CH2), 14.06 (C14); IR (油, cm-1) 3214 (w), 2928 (w) 1773 (m), 1709 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 363 ([M+H], 10), 214 (15), 84 (100); [C18H22N2O4S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 363.1379を要求、実測値363.1394 (CI+).
【０７４５】
参考例９０：（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７４６】
【化１５６】
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【０７４７】
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ＯＭｅ（５０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３０ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１３６μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（１６ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）を、粘度のある無色油状物として２４％の収率で、２つの主要なジアステレオマーの混合物として得た（小さいシグナルは、おそらくスチレンの付加に関して位置異性体の、２つの他のジアステレオマーを示唆する）。粗製物の再分析は、この反応が少なくとも８０％達成できたことを示唆する。δH (600 MHz, CDCl3) 8.08 (s, 2H, 2 x H-2), 7.40-7.31 (m, 10H, 10 x Ar-H), 5.0 (d, 1H, J = 8.2, H-15), 4.9 (d, 1H, J = 7.5, H-15), 4.26-4.23 (m, 1H, H-16), 4.18-4.12 (m, 1H, H-16), 4.06 (t, 2H, J = 8.5, 2 x H-5), 3.669 (s, 3H, H3-18), 3.674 (s, 3H, H3-18), 3.19 (ddd, 1H, J = 2.4及び11.0, H-7), 3.11 (dd, 1H, J = 3.2及び11.0, H-7) 3.04-2.93 (m, 3H, 2 x HH-6及びHH-19), 2.91 (dd, 1H, J = 6.6及び12.8, HH-19), 2.64-2.60 (m, 2H, 2 x HH-6), 2.51 (dd, 1H, J = 4.6及び12.8, HH-19), 2.43 (dd, 1H, J = 7.3及び13.0, HH-19), 1.45 (s, 9H, 3 x H3-12), 1.43 (s, 9H, 3 x H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 178.41 (C=O), 177.25 (C=O), 177.20 (C=O), 171.40 (C=O), 171.10 (C=O), 170.98 (C=O), 155.28 (C=O), 155.18 (C=O), 136.28 (C11), 136.25 (C11), 128.94 (2 x Ar-H), 128.93 (2 x Ar-H), 128.49 (2 x Ar-H), 128.46 (2 x Ar-H), 128.38 (C8), 128.33 (C8), 80.44 (2 x C13), 56.71 (C4), 56.48 (C4), 53.03 (C16), 52.87 (C16), 52.78 (C18), 52.75 (C18), 45.92 (C5), 45.82 (C5), 43.76 (C7), 43.61 (C7), 31.28 (C6), 31.09 (C6), 28.38 (6 x C12), 26.33 (C19), 26.21 (C19); IR (油, cm-1) 3215 (w), 2971 (w) 1738 (s), 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 435 ([M+H], 10), 379 (30), 335 (100); [C21H27N2O6S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 435.1590を要求、実測値 435.1576 (CI+).
【０７４８】
参考例９１：１−（ｐ−メトキシ）フェニル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｐ−メトキシ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｐ−メトキシ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７４９】
【化１５７】
0005954789.tif 000159
【０７５０】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、４−メトキシスチレン（１５４μＬ、１．２０ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、１−（ｐ−メトキシ）フェニル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン（１０ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）を無色油状物として２５％の収率で得、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｐ−メトキシ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（メジャー）及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｐ−メトキシ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（マイナー）（２７ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を、無色油状物として６７％の収率で、ジアステレオマー混合物（１０：１）として得た。
【０７５１】
４−ヘキシルスルファニル−１−（ｐ−メトキシ）フェニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン δH (600 MHz, CDCl3) 7.21 (d, 2H, J = 8.5, 2 x Ar-H), 7.18 (s, 1H, NH), 6.84 (d, 2H, J = 9.0, 2 x Ar-H), 6.13 (s, 1H, H-5), 4.08 (t, 1H, J = 7.9, H-1), 3.80 (s, 3H, H3-18), 2.99 (dd, 1H, J = 7.2及び15.7, HH-7), 2.91 (dd, 1H, J = 8.7及び15.7, HH-7), 2.35-2.26 (m, 2H, H2-13), 1.51-1.43 (m, 2H, H2-12), 1.33-1.16 (m, 6H, H2-9 H2-10及びH2-11), 0.85 (t, 3H, J = 7.0, H3-8); δC (150 MHz, CDCl3) 171.03 (C=O), 170.05 (C=O), 159.06 (C17), 147.37 (C4), 132.92 (C14), 129.37 (C5), 128.79 (2 x Ar-H), 114.18  (2 x Ar-H), 55.38 (C18), 46.61 (C1), 32.59 (C7), 31.45 (C13), 31.38 (CH2), 29.22 (CH2), 28.64 (CH2), 22.61 (CH2), 14.14 (C8); IR (油, cm-1) 3275 (w), 2927 (m) 1774 (w), 1717 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 347 ([M+], 15), 237 (70), 230 (100), 202 (60); [C19H25NO3S]+について計算した正確な質量はm/z 347.1550を要求、実測値363.1553 (CI+).
【０７５２】
（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｐ−メトキシ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（太字）及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−（ｐ−メトキシ）フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
【０７５３】
【化１５８】
0005954789.tif 000160
【０７５４】
メジャーなジアステレオマー のシグナルのみが以下を示した：δC (150 MHz, CDCl3) 177.81 (C=O), 175.48 (C=O), 159.39 (C9), 129.94 (2 x Ar-H), 128.56 (C12), 113.65 (2 x Ar-H), 57.63 (C4), 55.38 (C8), 45.25 (C5), 43.78 (C7), 31.33 (CH2), 29.23 (CH2), 29.01 (CH2), 28.62 (CH2), 26.53 (C18), 22.52 (C6), 14.10 (C13); IR (油, cm-1) 3216 (w), 2928 (m) 1771 (m), 1707 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 348 ([M+H], 20), 135 (20), 134 (100); [C19H25NO3S]+H について計算した正確な質量はm/z 348.1633を要求、実測値363.1642 (CI+).
【０７５５】
参考例９２：（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−（Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ｃｙｓ−ベンジルアミン）−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７５６】
【化１５９】
0005954789.tif 000161
【０７５７】
Ｎ−Ａｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ベンジルアミン（２９ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５０ｍＬ）中に溶解して、０．００２Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１０μＬ、０．０８４ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中３０％の酢酸エチルから酢酸エチル中１０％のメタノールでの勾配溶出）により、所望の化合物（３３ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を無色油状物として、［２＋２］反応のジアステレオマー混合物として８７％で得た。粗製物の再分析は、この反応がほぼ７０％達成できたことを示唆する。
【０７５８】
Ｎ−Ａｃ−Ｃｙｓ（Ｍａｌ）−ベンジルアミン（５８ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（８０ｍＬ）中に溶解して、０．００２Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１９１μＬ、１．７０ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中３０％の酢酸エチルから酢酸エチル中１０％のメタノールでの勾配溶出）により、所望の化合物（１４ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）を無色油状物として１９％の収率で得た。粗製物の再分析は、この反応が少なくとも７５％達成できたことを示唆する。
δH (600 MHz, CDCl3) 8.69 (s, 1H, H-2), 7.36-7.26 (m, 8H, 8 x Ar-H), 7.18 (d, 2H, J = 7.0, 2 x Ar-H), 6.65 (t, 1H, J = 5.6, H-17), 6.51 (d, 1H, J = 7.4, H-14), 4.33 (d, 2H, J = 6.0, H2-18), 4.30 (td, 1H, J = 1.2及び5.4, H-15), 4.05 (t, 1H, J = 8.9, H-5), 3.16 (dd, 1H, J = 3.1及び11.1, H-7),  3.04 (ddd, 1H, J = 8.9, 11.1及び12.8, HH-23), 2.94 (dd, 1H, J = 6.6及び13.3, HH-6), 2.59 (ddd, 1H, J = 3.4, 8.9及び12.5, HH-23), 2.31 (dd, 1H, J = 5.3及び13.6, HH-6), 1.98 (s, 3H, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 179.07 (C=O), 176.97 (C=O), 171.10 (C=O), 169.67 (C=O), 137.67 (Ar), 136.16 (Ar), 129.02 (2 x Ar-H), 128.80 (2 x Ar-H), 128.55 (2 x Ar-H), 128.35 (Ar-H), 128.78 (2 x Ar-H), 127.66 (Ar-H), 57.44 (C4), 52.61 (C15), 46.09 (C5), 43.68 (C7), 43.66 (C18), 30.58 (C6), 26.15 (C23), 23.17 (C12); IR (油, cm-1) 3437 (w), 1726 (s); MS (FAB+) m/z (相対強度): 695 ([M+H], 10), 439 (10), 286 (100); [C32H34N6O8S2]+H について計算した正確な質量はm/z 695.1958を要求、実測値695.1964 (FAB+).
【０７５９】
参考例９３：（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７６０】
【化１６０】
0005954789.tif 000162
【０７６１】
Ｎ−メチルヘキシルスルファニルマレイミド（２７ｍｇ、０．１１９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１３６μＬ、１．１９ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を無色油状物として１３％の収率で得、（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（２３ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）を無色油状物として５８％の収率で得た。
【０７６２】
（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 7.32-7.30 (m, 3H, 3 x Ar-H), 7.13 (d, 2H, J = 7.9, 2 x H-10), 3.99 (dd, 1H, J = 7.8及び10.2, H-5), 3.20 (dd, 1H, J = 4.8及び10.3, H-7), 3.13-3.07 (m, 1H, HH-6), 2.93 (s, 3H, H3-18), 2.65 (td, 1H, J = 7.5及び11.4, HH-17), 2.58 (td, 1H, J = 7.5及び11.8, HH-17), 2.46 (ddd, 1H, J = 4.9, 7.7及び12.0, HH-6), 1.55-1.25 (m, 8H, H2-13, H2-14, H2-15及びH2-16), 0.87 (t, 3H, J = 7.0, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 177.78 (C=O), 175.17 (C=O), 137.21 (C11), 128.71 (2 x Ar-H), 127.93 (C8), 127.24 (2 x Ar-H), 48.23 (C5), 42.71 (C7), 31.42 (CH2), 30.07 (C17), 29.33 (CH2), 28.69 (CH2), 25.71 (CH2), 25.25 (C18), 22.58 (CH2), 14.12 (C12); IR (油, cm-1) 2927 (w) 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 332 ([M+H], 40), 228 (40), 86 (70), 84 (100); [C19H25NO2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 332.1684を要求、実測値 333.1697 (CI+).
【０７６３】
（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 7.39-7.30 (m, 5H, 5 x Ar-H), 3.90 (t, 1H, J = 8.7, H-5) 3.13-3.11 (m, 4H, H3-18及びH-7), 3.00 (ddd, 1H, J = 8.5, 11.0及び12.8, HH-6), 2.53 (ddd, 1H, J = 3.7, 9.1及び12.8,  HH-6), 2.40 (ddd, 1H, J = 6.4, 8.1及び11.3, HH-17), 2.06 (ddd, 1H, J = 6.5, 8.3及び11.3, HH-17), 1.25-1.08 (m, 8H, H2-13, H2-14, H2-15及びH2-16), 0.82 (t, 3H, J = 7.4, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 178.73 (C=O), 177.70 (C=O), 136.77 (C11), 128.89 (2 x Ar-H), 128.27 (2 x Ar-H), 127.99 (C8), 55.69 (C4), 45.62 (C5), 42.61 (C7), 31.29 (CH2), 28.94 (CH2), 28.68 (CH2), 28.55 (C17), 26.26 (C6), 25.70 (C18), 22.58 (CH2), 14.09 (C12); IR (油, cm-1) 2927 (w) 1703 (s),; MS (CI+) m/z (相対強度): 332 ([M+H], 100); [C19H25NO2S]+H について計算した正確な質量はm/z 332.1684を要求、実測値332.1680 (CI+).
【０７６４】
参考例９４：（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン、（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び１−フェニル−３−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオンの調製
【０７６５】
【化１６１】
0005954789.tif 000163
【０７６６】
Ｎ−フェニルヘキシルスルファニルマレイミド（３４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１３５μＬ、１．１８ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（３７ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を無色油状物として８０％の収率で、ジアステレオマー混合物（１１：２）として得、１−フェニル−３−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン（０．５ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ）を無色油状物として１％の収率で得た。（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
【０７６７】
（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（太字）
【０７６８】
【化１６２】
0005954789.tif 000164
【０７６９】
１−フェニル−３−フェニル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 7.54-7.27 (m, 10H, 10 x Ar-H), 6.32 (s, 1H, H-6), 4.19 (t, 1H, J = 88.0, H-1), 3.14-3.03 (m, 2H, H2-2), 2.39-2.29 (m, 2H, H2-13), 1.61-1.10 (m, 8H, 4 x CH2),  0.89-0.81 (m, 3H, H3-8); δC (150 MHz, CDCl3) 146.31 (C=O), 141.19 (C=O), 130.19 (Ar), 129.41 (Ar), 129.20 (Ar-H), 128.93 (2 x Ar-H), 128.49 (2 x Ar-H), 127.90 (Ar-H), 127.76 (2 x Ar-H), 126.03 (2 x Ar-H), 47.19 (C1), 32.70 (CH2), 31.43 (CH2), 29.83 (CH2), 29.20 (CH2), 28.63 (CH2), 22.61 (CH2), 14.13 (C8); IR (油, cm-1) 2926 (m) 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 394 ([M+H], 40), 278 (100); [C24H27NO2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 394.1841を要求、実測値394.1829 (CI+).
【０７７０】
参考例９５：（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−フェニルチオ−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−フェニルチオ−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７７１】
【化１６３】
0005954789.tif 000165
【０７７２】
フェニルチオマレイミド（１７ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００３Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１１１μＬ、０．８２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−フェニルチオ−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（１．５ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）を無色油状物として６％の収率で得、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−フェニルチオ−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（１７．５ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）を無色油状物として６９％の収率で得た。
【０７７３】
（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−フェニルチオ−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 8.05 (s, 1H, NH), 7.42-7.41 (m, 2H, 2 x Ar-H), 7.35-7.17 (m, 8H, 8 x Ar-H), 4.05 (t, 1H, J = 10.1, H-5), 3.29 (dd, 1H, J = 5.5及び13.0, H-7), 3.01 (dt, 1H, J = 10.3及び13.0, HH-6), 2.56 (ddd, 1H, J = 5.6, 10.1及び13.4, HH-6); δC (150 MHz, CDCl3) 176.69 (C=O), 174.10 (C=O), 136.56 (C11), 136.01 (2 x Ar-H), 130.13 (Ar-H), 129.66 (2 x Ar-H), 129.28 (C15), 128.72 (2 x Ar-H), 128.01 (Ar-H), 127.32 (2 x Ar-H), 60.59 (C4), 46.32 (C5), 43.70 (C7), 25.51 (C6); IR (油, cm-1) 3226 (w), 2925 (w) 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 310 ([M+H], 10), 206 (30), 111 (100); [C18H15NO2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 310.0902を要求、実測値310.0901 (CI+).
【０７７４】
（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−フェニルチオ−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 8.24 (s, 1H, NH), 7.43-7.30 (m, 6H, 8 x Ar-H), 7.27-7.24 (m, 2H, 2 x Ar-H), 4.13 (t, 1H, J = 9.0, H-5), 3.20-3.13 (m, 2H, HH-6及びH-7), 2.55 (ddd, 1H, J = 5.6, 8.3及び13.4, HH-6); δC (150 MHz, CDCl3) 177.99 (C=O), 177.17 (C=O), 135.80 (C11), 135.80 (2 x Ar-H), 129.64 (Ar-H), 129.54 (2 x Ar-H), 128.95 (C15), 128.51 (2 x Ar-H), 128.45 (2 x Ar-H), 128.22 (Ar-H), 60.72 (C4), 45.80 (C5), 43.39 (C7), 25.20 (C6); IR (油, cm-1) 3211 (w), 1772 (w) 1707 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 310 ([M+H], 50), 206 (100), 104 (40); [C18H15NO2S]+H について計算した正確な質量はm/z 310.0902を要求、実測値310.0905 (CI+).
【０７７５】
参考例９６：（４ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプト−５−エン−１，３−ジオンの調製
【０７７６】
【化１６４】
0005954789.tif 000166
【０７７７】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、フェニルアセチレン（１２８μＬ、１．１６ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら３０分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（４．５ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）を無色油状物として１８％の収率（回収されたＳＭに基づく）で得、同時にＳＭ（１．５ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を６％の収率で得た。 δH (600 MHz, CDCl3) 7.86 (s, 1H, NH), 7.68 (d, 2H, J = 7.86, 2 x Ar-H), 7.40-7.34 (m, 3H, 3 x Ar-H), 6.58 (s, 1H, H-5), 3.73 (s, 1H, H-7), 2.57 (dt, 1H, J = 2.3及び7.4, H2-13), 1.77-1.19 (m, 8H, 4 x CH2), 0.85 (t, 3H, J = 7.3, H3-8); δC (150 MHz, CDCl3) 173.46 (C=O), 173.28 (C=O), 149.72 (C17), 130.25 (C6), 130.02 (C14), 128.85 (2 x Ar-H), 126.32 (2 x Ar-H), 125.76 (C5), 53.78 (C7), 31.33 (CH2), 29.70 (CH2), 29.32 (CH2), 28.61 (CH2), 22.55 (CH2), 14.11 (C8); IR (油, cm-1) 3228 (w), 2925 (m), 1770 (w) 1709 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 316 ([M+H], 100), 214 (30); [C18H22NO2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 316.0371を要求、実測値316.1365 (CI+).
【０７７８】
参考例９７：１−ブチル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−ブチル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７７９】
【化１６５】
0005954789.tif 000167
【０７８０】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０．７ｍＬ）及びヘキサ−１−エン（４．３ｍＬ、１１．６ｍｍｏｌ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、１−ブチル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン（４ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を無色油状物として１２％の収率で得（（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−ブチル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンと同時に）及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−ブチル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（１６ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を無色油状物として４７％の収率で得た。
【０７８１】
１−ブチル−４−ヘキシルスルファニル−１，７−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピン−３，６−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 7.29 (s, 1H, NH), 6.43 (s, 1H, H-5), 2.91-2.76 (m, 3H, H-1及びH2-17), 2.70 (dd, 1H, J =1.4及び5.8, HH-7), 2.64 (dd, 1H, J = 1.4及び7.9, HH-7), 2.49 (t, 1H, J = 7.4, H2-13), 1.81-1.25 (m, 12H, 6 x CH2), 0.93-0.85 (m, 6H, H3-8及びH3-14); δC (150 MHz, CDCl3) 174.39 (C=O), 171.40 (C=O), 148.19 (C4), 129.28 (C5), 43.90 (C1), 34.97 (CH2), 31.53 (CH2), 30.60 (CH2), 29.70 (CH2), 29.07 (CH2), 28.76 (CH2), 28.51 (CH2), 22.66 (CH2), 22.65 (CH2), 14.16 (CH3), 14.13 (CH3); IR (油, cm-1) 3226 (w), 2927 (m) 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 298 ([M+H], 80), 187 (100); [C16H27NO2S]+H について計算した正確な質量はm/z 298.1841を要求、実測値298.1841 (CI+).
【０７８２】
（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−ブチル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 8.19 (s, 1H, NH), 3.09 (dd, 1H, J = 4.5及び10.2, H-7), 2.70-2.64 (m, 1H, H-5), 2.53-2.45 (m, 2H, H2-17), 2.37-2.28 (m, 2H, H2-6), 1.80-1.73 (m, 1H, HH-11), 1.59-1.50 (m, 2H, HH-11及びHH-10), 1.38-1.20 (m, 11H, HH-10及び5 x CH2), 0.90 (t, 3H, J = 7.1, CH3), 0.87 (t, 3H, J = 7.3, CH3); δC (150 MHz, CDCl3) 178.73 (C=O), 177.81 (C=O), 56.10 (C4), 44.29 (C7), 40.99 (C5), 31.42 (C17), 29.24 (CH2), 28.99 (CH2), 28.90 (CH2), 28.74 (CH2), 28.73 (CH2), 27.92 (CH2), 22.59 (CH2), 22.58 (CH2), 14.12 (CH3), 14.09 (CH3); IR (油, cm-1) 3209 (w), 2927 (m) 1774 (w), 1711 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 298 ([M+H], 100); [C16H27NO2S]+H について計算した正確な質量はm/z 298.1841を要求、実測値298.1845 (CI+).
【０７８３】
参考例９８：（４ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−エチル−６−エチル−ビシクロ［３．２．０］ヘプト−５−エン−１，３−ジオンの調製
【０７８４】
【化１６６】
0005954789.tif 000168
【０７８５】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２１．１ｍＬ）及びヘキシ−３−イン（３．９ｍＬ、１１．６ｍｍｏｌ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（１７ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）を無色油状物として４９％の収率で得た。 δH (600 MHz, CDCl3) 8.26 (s, 1H, NH), 3.88 (s, 1H, H-7), 2.99 (ddd, 1H, J = 7.5, 9.1及び12.8, HH-18), 2.87 (ddd, 1H, J =5.1, 8.7及び12.9, HH-18), 2.39-2.20 (m, 2H, HH-9及びHH-11), 1.95-1.75 (m, 2H, HH-9及びHH-11), 1.56-1.10 (m, 8H, 4 x CH2), 0.90-0.86 (m, 9H, H3-8, H3-10及びH3-12); δC(150 MHz, CDCl3) 172.66 (C=O), 171.34 (C=O), 148.84 (C=C), 142.53 (C=C), 70.45 (C4), 48.86 (C18), 48.09 (C7), 31.45 (CH2), 28.51 (CH2), 23.53 (CH2), 22.50 (CH2), 21.89 (CH2), 21.62 (CH2) 14.09 (C12), 12.03 (CH3), 11.84 (CH3); IR (油, cm-1) 2931 (m) 1717 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 312 ([M+OH], 100), 178 (100); [C16H25NO2S]+OH について計算した正確な質量はm/z 312.1633を要求、実測値312.1648 (CI+).
【０７８６】
参考例９９：１−エチル−２−エチル−６−ヘキシルスルファニル−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−アゼピン−４，７−ジオンの調製
【０７８７】
【化１６７】
0005954789.tif 000169
【０７８８】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２１．１ｍＬ）及びｔｒａｎｓ−ヘキサ−３−エン（３．９ｍＬ、１１．６ｍｍｏｌ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（２ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を無色油状物として６％の収率で得た。 δH (600 MHz, CDCl3) 7.32 (s, 1H, NH), 6.49 (s, 1H, H-6), 2.92 (ddd, 1H, J = 4.6, 6.3及び10.8, H-1), 2.83 (ddd, 1H, J =5.2, 9.4及び12.8, HH-13), 2.75 (dd, 1H, J = 5.9及び10.9, H-2), 2.62 (ddd, 1H, J = 6.7, 9.6及び12.7 HH-13), 2.07-2.00 (m, 1H, HH-17), 1.89-1.83 (m, 1H, HH-15), 1.79-1.40 (m, 6H, HH-15, HH-17及び2 x CH2), 1.33-1.30 (m, 4H, 2 x CH2), 1.10 (t, 3H, J = 7.5, H3-16), 0.92 (t, 3H, J = 7.4, CH3), 0.89 (t, 3H, J = 7.0, CH3); δC (150 MHz, CDCl3) 171.00 (C=O), 169.53 (C=O), 149.76 (C5), 129.27 (C6), 62.54 (C2), 51.16 (C13), 40.42 (C1), 31.48 (CH2), 28.65 (CH2), 23.65 (CH2), 23.32 (CH2), 22.52 (CH2), 17.23 (C17) 14.11 (CH3), 13.96 (CH3), 12.33 (CH3); IR (油, cm-1) 2962 (m) 1717 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 314 ([M+OH], 75), 180 (100); [C16H26NO2S]+OHについて計算した正確な質量はm/z 314.1790を要求、実測値314.1799 (CI+).
【０７８９】
参考例１００：（４ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５，５−ジフェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７９０】
【化１６８】
0005954789.tif 000170
【０７９１】
ヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２１ｍＬ）及び１，１−ジフェニルエチレン（２０３μＬ、１．１６ｍｍｏｌ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、所望の化合物（３０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を無色油状物として６４％の収率で得た。 δH (600 MHz, CDCl3) 8.15 (s, 1H, NH), 7.42 (m, 2H, 2 x H-8), 7.36-7.21 (m, 8H, 8 x Ar-H), 3.54 (dd, 1H, J =10.3及び12.9, HH-6), 3.34 (dd, 1H, J = 5.7及び10.3, H-7), 3.18 (dd, 1H, J = 5.8及び12.9, HH-6), 2.43 (dt, 1H, J =7.3及び11.0, HH-17), 2.34 (dt, 1H, J = 7.4及び11.0, HH-17), 1.40-1.34 (m, 2H, H2-16), 1.26-1.20 (m, 4H,  H2-14及びH2-15), 1.18-1.13 (m, 2H, H2-13), 0.84 (t, 3H, J = 7.5, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 177.16 (C=O), 175.87 (C=O), 142.09 (2 x Ar), 141.80 (2 x Ar), 128.17 (2 x Ar-H), 128.13 (2 x Ar-H), 128.10 (2 x Ar-H), 128.06 (2 x Ar-H), 127.44 (Ar-H), 127.32 (Ar-H), 63.03  (C5), 57.20 (C4), 44.38 (C7), 35.17 (C6), 31.35 (CH2), 30.07 (C17), 28.77 (CH2), 28.71 (CH2) 22.53 (CH2), 14.11 (C12); IR (油, cm-1) 2927 (m) 1772 (w), 1709 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 392 ([M], 10), 212 (100); [C24H26NO2S] について計算した正確な質量はm/z 392.1684を要求、実測値392.1674 (ES-) 
【０７９２】
参考例１０１：（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチレンシクロヘキサン−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチレンシクロヘキサン−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７９３】
【化１６９】
0005954789.tif 000171
【０７９４】
Ｎ−メチレンヘキシルスルファニルマレイミド（２５ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２１ｍＬ）及び１，１−ジフェニルエチレン（２０３μＬ、１．１６ｍｍｏｌ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、撹拌しながら５分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチレンシクロヘキサン−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチレンシクロヘキサン−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（３０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を無色油状物として、ジアステレオマー混合物（１０：１）として６４％の収率で得た。
【０７９５】
（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＲＳ）２−アザ−２−メチレンシクロヘキサン−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（太字）
【０７９６】
【化１７０】
0005954789.tif 000172
【０７９７】
参考例１０２：（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−７−ヘキシルスルファニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−７−ヘキシルスルファニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０７９８】
【化１７１】
0005954789.tif 000173
【０７９９】
２，３  ジヘキシルスルファニルマレイミド（３８ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２５ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１３３μＬ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら２０分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−７−ヘキシルスルファニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（３ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を無色油状物として６％の収率で得、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−７−ヘキシルスルファニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン（３ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を無色油状物として６％の収率で得た。
【０８００】
（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−７−ヘキシルスルファニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 7.96 (s, 1H, NH), 7.33 (d, 2H, J = 7.0, 2 x Ar-H), 7.28 (t, 1H, J = 7.0, H-8), 7.21 (d, 2H, J = 7.5, 2 x Ar-H), 4.02 (t, 1H, J = 10.0, H-5), 2.98-2.92 (m, 2H, HH-6及び-S-CHH-), 2.87 (dd, 1H, J = 10.8及び13.6, HH-6), 2.83-2.72 (m, 2H, -S-CHH-及び-S-CHH-), 2.69 (dt, 1H, J = 7.4及び10.8, -S-CHH-) 1.68-1.57 (m, 4H, H2-16及びH2-22), 1.45-1.31 (m, 4H, H2-15及びH2-21), 1.31-1.25 (m, 8H, H2-13, H2-14, H2-19及びH2-20), 0.86 (t, 6H, J = 7.0, H3-12及びH3-18); δC (150 MHz, CDCl3) 176.91 (C=O), 172.96 (C=O), 136.09 (C11), 128.83 (2 x Ar-H), 128.13 (C8), 127.41 (2 x Ar-H), 62.86 (C4), 54.36 (C7), 46.49 (C5), 33.28 (C6), 31.51 (CH2), 31.47 (CH2), 30.65 (SCH2), 30.09 (SCH2), 29.22 (CH2), 28.96 (CH2), 28.80 (CH2), 28.74 (CH2), 22.63 (CH2), 22.60 (CH2), 14.17 (CH3), 14.15 (CH3); IR (油, cm-1) 3194 (w), 2928 (m) 1774 (w), 1722 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 432 ([M-H], 5), 332 (50), 316 (95), 207 (100); [C24H35NO2S2]-Hについて計算した正確な質量はm/z 432.2026を要求、実測値432.2029 (CI+).
【０８０１】
（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−ヘキシルスルファニル−５−フェニル−７−ヘキシルスルファニル−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン
δH (600 MHz, CDCl3) 8.10 (s, 1H, NH), 7.41 (d, 2H, J = 6.9, 2 x Ar-H), 7.37 (t, 1H, J = 6.9, H-8), 7.33 (d, 2H, J = 6.9, 2 x Ar-H), 3.92 (t, 1H, J = 8.9, H-5), 2.95 (dd, 1H, J = 8.9及び12.9, HH-6), 2.86 (dt, 1H, J = 6.9及び14.2, -S-CHH-), 2.78-2.66 (m, 2H, HH-6及び-S-CHH-), 2.60 (ddd, 1H, J = 6.3, 8.3及び10.9, -S-CHH-) 2.00 (ddd, 1H, J = 5.6, 8.6及び10.7, -S-CHH-), 1.65-1.60 (m, 2H, HH-16及びHH-22), 1.43-1.06 (m, 14H, HH-16, HH-22, H2-13, H2-14, H2-15, H2-19, H2-20及びH2-21), 0.88 (t, 3H, J = 6.7, CH3), 0.82 (t, 3H, J = 7.1, CH3); δC (150 MHz, CDCl3) 176.59 (C=O), 176.44 (C=O), 136.03 (C11), 129.50 (2 x Ar-H), 128.83 (C8), 128.29 (2 x Ar-H), 62.32 (C4), 54.58 (C7), 45.33 (C5), 34.85 (C6), 31.48 (CH2), 31.33 (CH2), 30.51 (CH2), 29.21 (CH2), 29.06 (CH2), 28.90 (CH2), 28.76 (CH2), 28.53 (CH2), 22.62 (CH2), 22.50 (CH2), 14.16 (CH3), 14.11 (CH3); IR (油, cm-1) 3215 (w), 2926 (m) 1774 (w), 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 432 ([M-H], 5), 329 (60), 207 (100), 161 (60); [C24H35NO2S2]-Hについて計算した正確な質量はm/z 432.2026 を要求、実測値 432.2034 (CI+).
【０８０２】
実施例４０：（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−５−フェニル−７−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンの調製
【０８０３】
【化１７２】
0005954789.tif 000174
【０８０４】
２，３−ジ−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−マレイミド（７６ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２９ｍＬ）中に溶解して、０．００５Ｍ溶液を得た。得られた溶液を３０分間脱気し、スチレン（１４８μＬ、１．３５ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌しながら３０分間、パイレックスガラス器中で照射した。溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィーによる精製（石油エーテル中１０％の酢酸エチルから石油エーテル中３０％の酢酸エチルでの勾配溶出）により、（４ＲＳ，５ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−５−フェニル−７−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンと（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＳＲ）２−アザ−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−５−フェニル−７−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンとの混合物（２８ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）を、無色油状物として３６％の収率で得た。この混合物からのスペクトルは非常に複雑であったが、全てが同じ質量を有するので、ＭＳにより、化合物の正体が確認された。４ＲＳ，５ＲＳ，７ＳＲ）２−アザ−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−５−フェニル−７−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオン及び（４ＲＳ，５ＳＲ，７ＳＲ）２−アザ−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−５−フェニル−７−（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）−ビシクロ［３．２．０］ヘプタン−１，３−ジオンもまた、無色油状物（４６ｍｇ）として［５＋２］生成物と同時に単離された。１Ｈ  ＮＭＲ及びＭＳのデータは、このうち４０％（質量）が、所望のコンジュゲーション生成物（１８ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）（２０％の収率）であることを示唆する。 δH (600 MHz, CDCl3) 8.32 (d, 4.7H, J = 8.7, N-H), 8.05 (s, 1.2H, N-H), 7.79 (s, 1H, N-H), 7.40-7.20 (m, 60H, Ar-H), 5.65 (d, 1H, J = 7.2, H-N), 5.57 (d, 5.2H, J = 8.2, H-N), 5.45 (d, 4.9H, J = 7.3, H-N), 5.40 (d, 1.9H, J = 7.8, H-N), 4.92 (d, 2.5H, J = 7.3, H-14), 4.74 (d, 3.7H, J = 7.8, H-14), 4.62-4.54 (m, 8H, H-14), 4.16-4.11 (m, 2.7H), 4.09-4.06 (m, 3.9H), 3.97-3.9 (m, 7.8H), 3.80-3.75 (m, 50.5H, H3-12), 3.66 (s, 22.6H, H3-12) 3.47-3.04 (m, 41.4, H2-18), 2.99-2.94 (m, 9.5H, H2-18), 2.82-2.73 (m, 9.5H, H2-18), 1.46-1.42 (m, 240H, H3-17); δC (150 MHz, CDCl3) 175.94 (C=O), 175.84 (C=O), 175.82 (C=O), 171.10 (C=O), 171.04 (C=O), 170.95 (C=O), 155.28 (Ar), 129.63 (Ar-H), 129.50 (Ar-H), 128.96 (Ar-H), 128.88 (Ar-H), 128.80 (Ar-H), 128.75 (Ar-H), 128.59 (Ar-H), 128.53 (Ar-H), 128.41 (Ar-H), 80.51 (C16), 80.22 (C16), 52.97 (C12), 52.93 (C12), 52.71 (C14), 52.61 (C14), 45.25 (C5), 32.92 (C18), 32.86 (C18), 31.19 (C18), 31.08 (C18), 29.83 (C6), 28.42 (C17) いくつかの炭素 シグナルは、ジアステレオマーの重複に起因して欠落している; IR (油, cm-1) 2924 (m), 1712 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 666 ([M-H], 100); [C30H41N3O10S2]-Hについて計算した正確な質量はm/z 666.2155を要求、実測値 666.2188 (CI+).
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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