(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキソソームに結合して分泌され得るキメラポリペプチドであって、以下のドメイン：
（ｉ）目的のペプチドまたはポリペプチド；
（ｉｉ）膜内標的ドメインであって、エキソソームの膜と前記膜内標的ドメインとの間の固定のための、および／または相互作用のための、１もしくは２以上の分子を介して、前記キメラポリペプチドが前記エキソソームの膜に固定されることを可能とし、しかし、前記エキソソームの膜の脂質二重層に挿入されず、前記脂質二重層を貫通することもない、前記膜内標的ドメイン、
ここで、前記膜内標的ドメインの配列は、Ｓｒｃファミリーのタンパク質の断片配列であって、以下の配列：
Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−ＲまたはＭ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｓ−Ｒ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｇを含んでなるか、またはそれらから成る；並びに
（ｉｉｉ）膜タンパク質の細胞質ドメイン（ＣＤ）の変異誘導体であって、前記ＣＤの配列の１または２以上のアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入によって規定される、前記変異誘導体、
ここで、前記ＣＤは、配列番号６のＣＤであって、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）の膜貫通型（ＴＭ）タンパク質のＣＤであり、前記変異誘導体は、前記キメラポリペプチドをエキソソームへ、及び／又は、エキソソームの形成に関与する１又は２以上の細胞区画へ差し向ける、前記ＣＤの能力を保存しており、前記変異誘導体は、ＹＩＮＬ、ＹＳＨＬおよびＤＹＩＮＬから選択される、少なくとも１つのアミノ酸モチーフＹｘｘＬまたはＤＹｘｘＬ、および、ＰＳＡＰおよびＰＴＡＰから選択される、少なくとも１つのアミノ酸モチーフＰｘｘＰを含み、前記変異誘導体は、少なくとも１つのアミノ酸モチーフＰＳＡＰを含み、前記変異誘導体の配列は、配列番号８の配列と少なくとも９０％同一であり、前記変異誘導体の配列は、以下の２つの特徴（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）前記変異誘導体が、配列番号６中に含まれる配列ＫＣＬＴＳＲＬＬＫＬＬＲＱを含まないこと；
（ｂ）配列番号６中に含まれるＰＣＰ配列のシステイン残基が、前記変異誘導体において欠失しているか、又はアラニンで置換されていること、
のうちの少なくとも１つによって、配列番号６の配列とは異なる；
を含んでなるか、またはこれらから成ることを特徴とし；そして、
前記キメラポリペプチド内に存在するドメイン（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）は細胞質ドメインまたは核ドメインであり、
前記キメラポリペプチドは小胞体内への取り込まれるためのシグナルペプチドを欠損しており、
そして、前記ドメイン（ｉ）〜（ｉｉｉ）が、ポリペプチドのＮ末端部からＣ末端部に向かって、以下の：（ｉｉ）−（ｉ）−（ｉｉｉ）、または（ｉｉ）−（ｉｉｉ）−（ｉ）の順で連続して配置されている、前記キメラポリペプチド。
【請求項２】
前記ＣＤが、２つまたは３つの前記モチーフＹｘｘＬを含んでなる、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３】
前記膜内標的ドメインが、複数の塩基性アミノ酸残基を含んでなる、請求項１又は２に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４】
前記膜内標的ドメインが、Ｋ、ＲおよびＨから選択される複数のアミノ酸残基を含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５】
Ｓｒｃファミリーの前記タンパク質が、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｆｇｒ、ＨｃｋおよびＹｒｋから選択されるタンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６】
２つの連続したドメインを連結する少なくとも１つのリンカーであって、ペプチドまたはポリペプチドである前記リンカーをさらに含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項７】
前記変異誘導体の配列は、以下の２つの特徴（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）前記変異誘導体が、配列番号６中に含まれる配列ＫＣＬＴＳＲＬＬＫＬＬＲＱを含まないこと；
（ｂ）配列番号６中に含まれるＰＣＰ配列のシステイン残基が、前記変異誘導体においてアラニンで置換されていること、
のうちの少なくとも１つまたは２つによって、配列番号６の配列とは異なる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項８】
前記ＣＤの前記変異誘導体の配列が、配列番号８の配列と少なくとも９５％同一である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項９】
前記ＣＤの変異誘導体の配列が、以下の配列：
ＰｘｘＰｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘＹｘｘｘｘｘｘｘｘｘＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘＹｘｘｘｘｘｘｘｘＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰＥｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＹｘnＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＹｘnＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰＥｘnＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘｘｘＰｘｘＰｘｘｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＥｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＰｘｘＰｘnＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＥＸｎＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘｘｘＰｘｘＰｘｘｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＥｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＤＹｘｘＬｘｘｘｘ；および
ＰｘｘＰｘnＰｘｘＰｘnＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＥＸｎＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＤＹｘｘＬｘｘｘｘ、
（配列中、ｘおよびｘnはそれぞれ任意のアミノ酸残基および任意の１または２以上のアミノ酸残基を表わし、そして配列中、モチーフＰｘｘＰのうちの少なくとも１つがモチーフＰＳＡＰまたはＰＴＡＰであり、ここで、前記モチーフＹｘｘＬ及びＤＹｘｘＬの少なくとも１つは、ＹＩＮＬ、ＹＳＨＬおよびＤＹＩＮＬから選択される）
から選択される配列を含んでなるか、またはそれらから成る、請求項１〜８のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１０】
前記目的のペプチドまたはポリペプチドが、以下の：
・細胞質タンパク質の１もしくは２以上のドメイン、または前記細胞質タンパク質のドメインの１もしくは２以上の断片；および／または
・核タンパク質の１もしくは２以上のドメイン、または前記核タンパク質のドメインの１もしくは２以上の断片
を含んでなるか、またはこれらから成る、請求項１〜９のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１１】
前記目的のペプチドまたはポリペプチドが、細胞質タンパク質又は核タンパク質の少なくとも６個のアミノ酸の断片である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１２】
前記目的のペプチドまたはポリペプチドが、病原体のタンパク質断片、病原性物質、抗腫瘍抗原、細胞質抗原、リガンド受容体、多数の膜ドメインを有する受容体、７回膜貫通型ドメインを持つ受容体、サイトカイン受容体またはその断片、毒素または毒素部分、酵素、または核酸に結合するポリペプチドであって、前記病原体が、ウイルス、細菌または寄生虫である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１３】
薬剤としての使用のための、あるいは、細菌、ウイルスまたは寄生虫の感染の予防および／または処置のための、あるいは、腫瘍または機能的もしくは代謝的な欠陥の予防および／または処置のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１４】
追加のキメラポリペプチドと組み合わせて使用されることを特徴とし、ここで前記追加のキメラポリペプチドは、エキソソームと一緒になって分泌され得、かつ、前記追加のキメラポリペプチドが、以下のドメイン：
・目的のペプチドまたはポリペプチド；
・膜貫通型ドメイン；および
・配列番号６の、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）の膜貫通型（ＴＭ）タンパク質の細胞質ドメイン（ＣＤ）であるか、または配列番号６の前記ＣＤの変異誘導体であって、ここで前記変異誘導体は、前記ＣＤの配列の１又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入によって規定され、前記変異誘導体は、前記追加のキメラポリペプチドをエキソソームへ、及び／又は、エキソソームの形成に関与する１又は２以上の細胞区画へ差し向ける能力を保存しており、前記ＣＤまたはその変異誘導体は、少なくとも１つのモチーフＹｘｘＬまたはＤＹｘｘＬ、および少なくとも１つのモチーフＰｘｘＰを含み、ここでｘは任意のアミノ酸残基を表わし、そしてＹ、Ｌ、Ｄ、およびＰはそれぞれチロシン、ロイシン、アスパラギン酸、およびプロリン残基を表わす；
を含んでなるか、またはこれらから成り、ここで前記追加のキメラポリペプチドのＣＤまたは変異誘導体が、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチドのＣＤの変異誘導体と同一であるか、または異なる、前記ＣＤ又は前記ＣＤの変異誘導体
を含んでなるか、またはこれらから成ることを特徴とし、
ここで、前記追加のキメラポリペプチドにおける前記ドメインが、ポリペプチド内でＮ末端部からＣ末端部に向かって以下の順：目的のペプチドまたはポリペプチド−膜貫通型ドメイン−ＣＤまたはその変異誘導体、で連続して配置されている、請求項１３に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１５】
前記追加のキメラポリペプチドの少なくとも１つのモチーフＰｘｘＰが、モチーフＰＳＡＰ（配列番号８８）またはＰＴＡＰ（配列番号８９）である、請求項１４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６】
前記追加のキメラポリペプチドのＣＤ、または前記追加のキメラポリペプチドのＣＤの変異誘導体は、ＹＩＮＬ、ＹＳＨＬおよびＤＹＩＮＬから選択される、少なくとも１つのモチーフＹｘｘＬまたはＤＹｘｘＬ、および／または、ＰＳＡＰおよびＰＴＡＰから選択される、少なくとも１つのモチーフＰｘｘＰを含む、請求項１４又は１５に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１７】
前記追加のキメラポリペプチドのＣＤ、または前記追加のキメラポリペプチドのＣＤの変異誘導体は、配列ＫＣＬＴＳＲＬＬＫＬＬＲＱを欠損している、および／または配列ＰＣＰを欠損している、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＣＤの変異誘導体の配列は、配列番号８の配列と少なくとも９０％同一である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１９】
前記追加のキメラポリペプチドの目的のペプチドまたはポリペプチドは、細胞質タンパク質又は核タンパク質の断片、あるいは細胞外タンパク質または表面タンパク質の断片である、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２０】
免疫付与における使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の追加のキメラポリペプチドと組み合わせて使用される、請求項２０に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１〜１３及び２０のいずれか１項に記載のキメラポリペプチドを含んでなるエキソソーム。
【請求項２３】
請求項１４〜１９及び２１のいずれか１項に記載の追加のキメラポリペプチドを更に含んでなる、請求項２２に記載のエキソソーム。
【請求項２４】
追加のキメラポリペプチドの、目的のペプチドまたはポリペプチドが、前記エキソソームの外面に、部分的にまたは完全に曝露される、請求項２３に記載のエキソソーム。
【請求項２５】
活性成分が、１もしくは２以上の、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のエキソソームを含んでなる、治療用組成物。
【請求項２６】
宿主中の標的細胞の処理に使用される、および／または宿主中の標的細胞を破壊するために使用される、および／または宿主の診断を実施するために使用される、および／または、腫瘍に対する、またはウイルス、細菌、もしくは寄生虫感染に対する予防および／または処置のために使用される、請求項２５に記載の治療用組成物。
【請求項２７】
請求項１〜１３及び２０のいずれか１項に記載のキメラポリペプチドをコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項１４〜１９及び２１のいずれか１項に記載の追加のキメラポリペプチドをさらにコードする、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
以下の：
・請求項２７または２８に記載のポリヌクレオチドを含んでなるまたはそれから成ることを特徴とする核酸；および
・薬学的に許容され得る支持体、希釈剤またはビヒクル
を含んでなる、治療用組成物。
【請求項３０】
請求項１４〜１９及び２１のいずれか１項に記載の追加のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるまたはそれから成る核酸をさらに含む、請求項２９に記載の治療用組成物。
【請求項３１】
薬剤としての使用のための、あるいは、細菌、ウイルスもしくは寄生虫の感染または腫瘍の予防および／または処置における使用のための、請求項２９または３０に記載の治療用組成物。
【請求項３２】
組換え型のエキソソーム産生細胞であって：
・前記細胞が、請求項２７または２８に記載の１もしくは２以上のポリヌクレオチドと再結合されることを特徴とするか；あるいは
・前記細胞が、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のエキソソームを吸収したことを特徴とする、前記細胞。
【請求項３３】
請求項１４〜１９及び２１のいずれか１項に記載の追加のキメラポリペプチドをコードする、１または２以上のポリヌクレオチドとさらに再結合されるか；あるいは
請求項１４〜１９及び２１のいずれか１項に記載の追加のキメラポリペプチドを含む、１または２以上のエキソソームをさらに吸収した、請求項３２に記載のエキソソーム産生細胞。
【請求項３４】
免疫系の細胞、マスト細胞、リンパ球、Ｔリンパ球もしくはＢリンパ球、樹状細胞、またはランゲルハンス細胞である、請求項３２または３３に記載のエキソソーム産生細胞。
【請求項３５】
前記目的のペプチドもしくはポリペプチド、または前記ペプチドもしくはポリペプチドの断片、あるいは請求項１４〜１９及び２１のいずれか１項に記載の追加のキメラポリペプチドと相互作用することができる特定のパートナーのインビトロでの検出のための、請求項２４に記載の１もしくは２以上のエキソソームの使用。
【請求項３６】
目的のペプチドまたはポリペプチドを含んでなるエキソソームのインビトロでの産生方法であって、以下のステップ：
ａ）請求項２７または２８に記載の１もしくは２以上のポリヌクレオチドであって、前記目的のペプチドまたはポリペプチドを含んでなるポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドを、エキソソーム産生細胞へ導入し、あるいは前記目的のペプチドまたはポリペプチドを含んでなるポリペプチドを含んでなる、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の１もしくは２以上のエキソソームとエキソソーム産生細胞とを接触させ；
ｂ）前記エキソソーム産生細胞を培養し；
ｃ）前記エキソソーム産生細胞によって産生されるエキソソームを回収すること
を含んでなる、前記方法。
【請求項３７】
ステップａ）とｂ）の間に中間ステップをさらに含んでなり、この間にエキソソームの分泌を誘発および／または増加するために、あるいは特定の細胞タンパク質に関してエキソソーム組成物で特異性を誘発するために、細胞が選択および／または刺激されることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
エキソソームの表面で発現される目的の１もしくは２以上の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを対象とするポリクローナル血清を調製するための方法であって、以下のステップ：
ａ）請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のエキソソーム、請求項２５、２６および２９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項２７もしくは２８に記載のポリヌクレオチドを、アジュバントと結合させてまたは結合させずに、ヒト以外の動物へ投与し；そして
ｂ）１または２以上の目的の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを認識することができる、形成された抗体を回収すること
を含んでなる、前記方法。
【請求項３９】
エキソソーム内またはその表面に発現される１もしくは２以上の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを対象とするモノクローナル抗体を調製するための方法であって、以下のステップ：
ａ）請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のエキソソーム、請求項２５、２６および２９のいずれか１項に記載の組成物、あるいは請求項２７または２８に記載のポリヌクレオチドを投与された非ヒト宿主から得られる脾臓細胞を、ミエローマ細胞と融合し；
ｂ）抗体の産生が可能な条件下でハイブリドーマを培養および選択し；
ｃ）１または２以上の目的の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを対象とするモノクローナル抗体を回収すること
を含んでなる、前記方法。
【請求項４０】
目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいは前記目的のペプチドまたはポリペプチドの断片と相互作用する分子をスクリーニングするためのインビトロでの方法であって、以下のステップ：
ａ）請求項２４に記載のエキソソームを、前記目的のペプチドまたはポリペプチドと相互作用することができる１もしくは２以上の分子と接触させ；
ｂ）前記目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいは前記目的のペプチドまたはポリペプチドの断片と、前記１または２以上の分子との間の任意の相互作用を検出すること
を含んでなる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エキソソームに結合した目的のポリペプチドの分泌を可能にするキメラポリペプチド及びポリヌクレオチドに関し、並びに、キメラポリペプチド、ＤＮＡまたはエキソソームに基づく免疫原性組成物の産生のための、タンパク質相互作用をスクリーニングするための、あるいはタンパク質または核酸の輸送のためのこれらの使用に関する。
【０００２】
本発明は、適当な真核細胞において発現されるときに、エキソソームに結合して分泌されることができるキメラポリペプチドであって、複数のポリペプチドドメインを含んでなるキメラポリペプチド、を提供する。
【０００３】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含んでなる膜小胞、特にエキソソーム、このようなエキソソームに基づく免疫原性組成物、並びにこうしたエキソソームを産生するための方法に関する。
【０００４】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびこれを含んでなる免疫原性組成物、特にこれを含んでなるＤＮＡワクチンを提供する。
【０００５】
本発明はまた、（ヒトまたはヒトでない）宿主においてインビボで、病原性物質、病原体、腫瘍抗原または細胞質抗原による感染の予防および／または処置のために、特にウイルス、細菌、寄生虫または腫瘍に対する体液性および／または細胞性応答を誘発または促進するために、本発明の膜小胞および免疫原性組成物の特性を利用することに関する。
【０００６】
本発明はまた、診断手段としての本発明のポリペプチドを含んでなるエキソソームの使用に関する。
【０００７】
本発明はまた、機能的または代謝的な欠損による疾患の予防および／または処置のために、特にタンパク質もしくは核酸を輸送する、特に酵素の欠損を補うかもしくは埋め合わせるために、または特に適当な標的細胞または臓器における転写もしくは翻訳修飾を誘発するために、あるいはまたは細胞代謝を修飾するために、本発明の膜小胞およびタンパク質組成物の特性を利用することに関する。
【０００８】
本発明はまた、目的のペプチドまたはポリペプチドに対する抗体を産生するための本発明の膜小胞の使用を想定する。
【背景技術】
【０００９】
エキソソームは、脂質二重層によって囲まれた小球の形態で存在する。これらの膜小胞は、様々なタイプの細胞によって、特に上皮細胞、腫瘍細胞および免疫システムの特定の細胞（マスト細胞、ＴおよびＢリンパ球、樹状細胞、特にランゲルハンス細胞）によって自然に分泌される。エキソソームは、特に小さな寸法（直径５０〜１００ｎｍ）によって、並びにこれらの膜タンパク質組成物（とりわけ、接着、輸送、シグナル伝達分子および主要組織適合遺伝子複合体の分子）によって、当該細胞によって分泌される他の膜小胞と区別される。
【００１０】
特に、エキソソームは、これらのエンドソームの原形質膜との融合の間に、細胞から分泌される多胞体エンドソーム（特に後期エンドソーム）の内部小胞としての役割を果たし得る；多胞体エンドソームは通常リソソーム区画（タンパク質分解経路）内の分子の輸送に関与するが、特定の細胞、例えば網状赤血球および特定の抗原提示細胞では、エキソソームを細胞外媒体内に遊離させるためにこれらが融合する原形質膜へ向けられ得る。
【００１１】
以前の研究から、エキソソームは体液性および／または細胞性免疫応答を誘発することができることが実証されている（Delcayre et al, 2002）。エキソソームは、抗原特異的様式でインビトロにおいてＴリンパ球を直接刺激することができる抗原のためのベクターであると考えられている。樹状細胞によって分泌されるエキソソームは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスＩおよびＩＩの分子を発現する。エキソソームによって運搬される機能性ペプチド／ＭＨＣ複合体は、ある樹状細胞から、ＭＨＣ分子と結合するペプチドが由来する抗原に遭遇したことのない他の細胞へ輸送される。未感作の樹状細胞を段階的に刺激することによって、抗原性ペプチドを表面に有する分泌されたエキソソームが特定のＴ ＣＤ４ およびＴ ＣＤ８応答の増幅に寄与する（Delcayre and Le Pecq, 2006）。一例として、エキソソームに腫瘍ペプチドを保持させてそしてマウスへ注射する場合、これらのエキソソームは、強い免疫応答を促進し、そして予め樹立された固形腫瘍を消失させることができる（Zitvogel et al, 1998）。
【００１２】
エキソソームは、天然のタンパク質全体の形でまたはＭＨＣＩおよびＩＩ分子と結合したペプチドの形で外来性抗原を提示することができる（Colino and Snapper 2006）。エキソソームの表面での抗原提示は、細胞またはエンベロープを有するウイルスの膜での提示と類似している。しかしながら、エキソソームは、生きておらず感染性もないので、これらはウイルスとは対照的に、注意しなければならない制限はなく、通常の物質のように操作することができる利点を有する。したがって、エキソソームは、免疫付与の目的のために抗原性ペプチドまたはポリペプチドを提示するのに使用することができる。「エキソソームディスプレー」と呼ばれるこの技術は、ＭＨＣによる抗原の直接提示を必ずしも必要としない（Chaput et al, 2004）。しかしながら、この革新的なワクチン接種技術の発達で、効果的な分子的「手段」がエキソソームを用いて抗原性タンパク質を標的化するために利用できることが想定される。しかしながら、今日まで、このような「手段」は記載されていない。
【００１３】
レトロウイルス、より詳細にはヒト免疫不全ウイルス（HIV）の研究で、これらは原形質膜に出芽するために多胞体エンドソームの生合成の細胞機構を流用する能力を有することが示されている（Pornillos et al, 2002）。これらのウイルスはまた、エンドソームの膜、すなわち通常の機能部位上でこの機構を使用することができる（Raposo et al, 2002）。よって、「トロイ（Trojan）のエキソソーム」（Gould et al, 2003）仮説によると、こうしたウイルスはウイルス粒子の形成のために、予め存在するエキソソーム生合成経路を使用する。
【００１４】
レトロウイルスのエンベロープは、外側のエンベロープタンパク質（SU）、ならびにウイルス膜および細胞膜の融合に関与する膜貫通型糖タンパク質（TM）によって構成される。
【００１５】
これらのエンベロープ糖タンパク質は、ＥＮＶと呼ばれる成熟前駆物質タンパク質の切断に由来する。ｅｎｖ遺伝子の発現によってレトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質がゴルジ体を貫通するタンパク質前駆物質の形態で合成され、そしてウイルス粒子の出芽中にウイルスのエンベロープとして機能するだろう膜（エンドソーム膜または原形質膜）の部分に到達する。途中、このオリゴマーの前駆物質はグリコシル化され、そして表面（SU）および膜貫通型（TM）糖タンパク質に切断される。ＳＵおよびＴＭタンパク質は、結合したままで、そしてＴＭタンパク質の疎水性膜貫通型ヘリックスを介して細胞膜に固定される。
【００１６】
レトロウイルスのＴＭ糖タンパク質は、その外側、膜貫通型および細胞質内（ＣＤTM）ドメインの結合に起因する多くの小面を有し、これによりウイルスおよび感染した細胞の膜の両側でのやりとりを可能にしているレトロウイルスのタンパク質のみが形成される（Cann et al, 1992; Delamarre et al, 1996）。特に、ＴＭタンパク質は、ウイルスの標的細胞への貫通現象に関与し、そしてウイルスおよび細胞の膜の融合を誘発する。さらに、この細胞内の輸送中、ＴＭタンパク質は、細胞骨格並びにユビキチン化および出芽機構との相互作用によって、ウイルス粒子の局在化、転帰、ターゲティングおよび出芽に対して影響しやすい（Cann et al, 1992; Delamarre et al, 1996; Straub and Levy, 1999）。
【００１７】
以前の研究から示された二つのレトロウイルス、ウシ白血病ウイルス（BLV）およびヒト免疫不全ウイルスのＴＭタンパク質の細胞質ドメインは、エキソソームにおける組換え型タンパク質の差し向け（addressage）、および分泌を誘発することができる（De Gassart et al, 2004; 2009）。恒常的な態様でエキソソームを分泌するＫ５６２株由来の細胞（ヒト由来の赤白血病株細胞）は、真核細胞システムで以下の二つのタイプのキメラタンパク質を発現することができるレトロウイルスベクターで核酸を導入された：（ｉ）マウスのＣＤ８タンパク質の細胞外ドメイン並びにＢＬＶのＴＭ糖タンパク質の膜貫通型および細胞質ドメイン（ＴＭ−ＢＬＶ／ＣＤ８キメラ；De Gassart et al, 2004; 2009）を含んでなるキメラ、および（ｉｉ）マウスタンパク質ＣＤ８の細胞外および膜貫通型ドメイン並びにＨＩＶのＴＭタンパク質の細胞質ドメインを含んでなるキメラ（ＴＭ−ＨＩＶ／ＣＤ８キメラ；De Gassart et al, 2004）。この二つのキメラは、核酸が導入されたＫ５６２細胞およびこれらの細胞によって分泌されるエキソソーム中に両方とも発現される。特に、Ｋ５６２株の細胞中のキメラＴＭ−ＢＬＶ／ＣＤ８タンパク質の発現は、トランスゴルジネットワークおよび後期のエンドソーム区画を経由して輸送された後、急速に消滅し、これらの細胞によって分泌されるエキソソームとなる。ＢＬＶのＴＭタンパク質の細胞質ドメインを含んでなるキメラは、ＨＩＶのＴＭタンパク質の細胞質ドメインを含んでなるキメラよりもエキソソームへより強く向かうように思われる。
【００１８】
しかしながら、本出願の実施例部分で提供する結果が示すように、De Gassartらによって記載されるキメラコンストラクトＴＭ−ＢＬＶ／ＣＤ８を運ぶエキソソームは、Ｋ５６２株の細胞で有効に産生されるだけであり、そして他のタイプの細胞、例えばＨＥＫ２９３株の細胞等ではごくわずかに産生されるのみであるかまたは効率よく産生されない。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、エキソソーム中に差し向け特性を有する新規キメラポリペプチドに関する。本発明のキメラポリペプチドは、細胞質ドメインおよび／または核ドメインのみを含んでなり、かつ、小胞または細胞膜の脂質二重層に挿入されず、それらはその脂質二重層を貫通することもなく、膜小胞、特にエキソソームの膜の中に固定される。本願はまた、膜小胞、特にエキソソームの膜の中に固定されることができる他のキメラポリペプチドも記載する。これらの追加のキメラポリペプチドは、１もしくは２以上の膜ドメイン、特に少なくとも１つの膜貫通型ドメインを含んでなる。これらの追加のキメラポリペプチドの小胞または細胞膜の中での固定機能は、それらの１または２以上の膜ドメインによって提供され、そして小胞または細胞膜の脂質二重層の中にそれらが挿入される、そして必要であれば一部がそれを貫通することを可能にする。
【００２０】
本発明の特定の態様によると、これらの追加のキメラポリペプチドは、本発明のキメラポリペプチドと一緒に使用される。
【００２１】
本願に記載のキメラポリペプチド、特に本発明のキメラポリペプチドは、従来技術に記載のポリペプチド、特に、De Gassartらにより記載されるポリペプチドと区別される特定のポリペプチドであって、より一層効果的に目的のペプチドまたはポリペプチドを、ＨＥＫ２９３株の細胞によって産生されるエキソソームへ差し向けることができ、従って目的の当該ペプチドまたはポリペプチドを含んでなるエキソソームの産生を非常に大きく増幅することができる（10〜100倍）。さらに、De Gassartらにより記載される、Ｋ５６２株の細胞でのみ有効に使用することができるコンストラクトとは対照的に、これらのポリペプチドはエキソソーム膜へ差し向けられ、そして異なる細胞タイプ、特にＨＥＫ２９３細胞またはＴまたはＢリンパ球によって、並びに例外的でなくＫ５６２株の細胞によって産生される膜小胞、特にエキソソームと結合して分泌されることができる。本発明は特に、大量の膜小胞、特にエキソソームを産生するために使用することができ、これらは研究手段として、ならびに診断において、医療適用においておよび特に免疫付与、特にワクチン接種のために使用することができる。
【００２２】
このような膜小胞（特にエキソソーム）はまた、例えば免疫付与、特にワクチン接種のために、ヒトまたはヒトでない宿主（特にヒトまたはヒトでない哺乳類あるいはトリ）へ、組成物を、特にその活性成分が本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである免疫原性組成物を、特にＤＮＡに基づく免疫原性組成物を、より具体的にはＤＮＡワクチンを、またはその活性成分が本発明のポリペプチドを含んでなる膜小胞（特にエキソソーム）から成る免疫原性組成物を投与することによって、当該宿主によりインビボで産生することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】試験した様々なタイプのＣＤ８―ＣＤTMのコンストラクトを表わす。コンストラクトＸ２（配列番号７９および配列番号８０）：ＣＤ８の外部ドメイン（ＥＤ）は、ＢＬＶのＴＭタンパク質の膜貫通型（ｔｍＤ）および細胞質（ＣＤ）ドメインと融合されている。このコンストラクトは、ＢＬＶのＴＭタンパク質の２つのパルミトイル化部位Ｃｙｓ１およびＣｙｓ２並びにパルミトイル化できないシステイン残基レギュレーター（Ｃｙｓ３）を保存している。コンストラクトＸ３（配列番号８１および配列番号８２）：ＣＤ８のＥＤおよびｔｍＤの一部分が、ＢＬＶのｔｍＤの一部分およびＣＤTMＢＬＶの全体と融合されている。したがって、ＢＬＶのｔｍＤの最初の１５残基が含まれない。このコンストラクトは、ＢＬＶのＴＭタンパク質の２つのパルミトイル化部位（１５３および１５８位のシステイン残基）、並びにパルミトイル化できないシステイン残基レギュレーター（Ｃ末端位のシステイン残基；Ｃｙｓ３）を保存している。コンストラクトＸ４（配列番号８３〜配列番号８６）：ＣＤTMＢＬＶの主要部分を保存している。このコンストラクトでは、マウスＣＤ８アルファの膜貫通型ドメインは、リンカーを介在して配列「ＲＳＲ」と共にＢＬＶのＴＭタンパク質のＣＤドメインへ結合されている。このコンストラクトは、ＢＬＶのＴＭタンパク質のパルミトイル化できないシステイン残基レギュレーター（Ｃｙｓ３）のみ含む。
【図２】マウスＣＤ８アルファタンパク質およびＢＬＶのＴＭタンパク質から得られるキメラタンパク質の配列の概要を表わす。下線を付した残基は、ＣＤ８アルファおよびＴＭタンパク質の膜貫通のヘリックスの残基に相当する。変異（アラニン残基による置換）がなされた、ＢＬＶのＴＭタンパク質の３つのシステイン残基は、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３によって示される。作成されたキメラタンパク質は、コンストラクトＸ２（配列番号７９および配列番号８０）、Ｘ３（配列番号８１および配列番号８２）並びにＸ４（配列番号８３〜配列番号８６）に相当する。
【図３】ＳＴＥＴ方法によるＤＮＡの調製を表わす。数字１〜７は、ＳＴＥＴ生成物のサンプル番号に相当する。「Ｍ」は、サイズマーカーを表わす。超らせんプラスミドＤＮＡに相当するバンドは、枠で囲まれている。
【図４】カラム精製産物中のＤＮＡの存在の測定を表わす。超らせんプラスミドＤＮＡに相当するバンドは、囲まれている。Ａ：ＳＴＥＴ方法によって得られカラムに堆積したＤＮＡ。ＥおよびＥ’：カラム上に保持され溶出された画分。ＦＴ：保持されなかった画分。Ｍ：サイズマーカー。
【図５】酵素消化後のアリコートの分光測定アッセイおよびＤＮＡ濃度の調整を表わす。二重矢印は、濃度を再調整したことを示す。
【図６】酵素消化後のＤＮＡ同一性の確認を表わす。ＣＤ８―ＣＤTM突然変異体の相違。Ａ：ｐＸ２ ＡＡＣおよびｐＸ２ ＣＣＡ突然変異体の相違。Ｂ：Ｘ２突然変異体の互いの相違。
【図７】様々なＣＤ８―ＣＤTMキメラの発現のウエスタンブロット分析を表わす。キメラＣＤ８―ＣＤTMは、矢印で示される。
【図８】免疫沈降後の様々なＣＤ８―ＣＤTMキメラの発現のウエスタンブロット分析を表わす。キメラＣＤ８―ＣＤTMは、矢印によって示される。
【図９】超遠心分離によって単離されたエキソソーム中のＣＤ８―ＣＤTMの発現のウエスタンブロット分析を表わす。５５ｋＤａのシグナルは、ＣＤ８―ＣＤTMの存在に相当する。
【図１０】突然変異体ｐＸ４−ＣおよびｐＸ４−Ａに関する、ショ糖密度勾配上で沈降後に単離された小胞のＣＤ８―ＣＤTM内容物のウエスタンブロット分析を示す。
【図１１】小胞輸送阻害剤の存在または非存在を示す、細胞溶解後のＣＤ８―ＣＤTMの発現のウエスタンブロット分析を表わす。キメラＣＤ８―ＣＤTMは、矢印によって示される。
【図１２】小胞輸送阻害剤の存在または非存在に依存する、エキソソーム中のＣＤ８−ＣＤTMの発現のウエスタンブロット分析を表わす。ＣＤ８―ＣＤTMキメラは、矢印によって示される。
【図１３】一般的表現型−表現型Ａ−ｐＸ２ ＣＡＣで形質導入したＨＥＫ２９３細胞の共焦点免疫蛍光法イメージによる分析を表わす。この表現型は、Ｃｙｓ３を保存しているｐＸ２突然変異体：ｐＸ２ ＣＣＣ、ｐＸ２ ＡＣＣ、ｐＸ２ ＣＡＣおよびｐＸ２ ＡＡＣで確認される（参照、結果部分：「免疫蛍光法による局在性確認」）。
【図１４】一般的表現型−表現型Ｂ−ｐＸ２ ＣＡＡで形質導入した細胞の共焦点免疫蛍光法イメージによる分析を表わす。この表現型は、Ｃｙｓ３を保存していないｐＸ２突然変異体：ｐＸ２ ＣＣＡ、ｐＸ２ ＡＣＡ、ｐＸ２ ＣＡＡおよびｐＸ２ ＡＡＡで確認される（参照、結果部分：「免疫蛍光法による局在性確認」）。
【図１５】一般的表現型−表現型Ｃ−ｐＸ３ ＣＣＣで形質導入した細胞の共焦点免疫蛍光法イメージによる分析を表わす。この表現型は、試験した２つのｐＸ３突然変異体：ｐＸ３ ＣＣＣおよびｐＸ３ ＡＣＣで確認される（参照、結果部分：「免疫蛍光法による局在性確認」）。
【図１６】一般的表現型−表現型Ｄ−ｐＸ４−Ｃで形質導入した細胞の共焦点免疫蛍光法イメージによる分析を表わす。この表現型は、試験した２つのｐＸ４突然変異体：ｐＸ４−ＣおよびｐＸ４−Ａで確認される（参照、結果部分：「免疫蛍光法による局在性確認」）。
【図１７】一般的表現型−表現型Ｅ−ｐＸ４ ｓｔｐで形質導入した細胞の共焦点免疫蛍光法イメージによる分析を表わす。この表現型は、ｐＸ４ ｓｔｐだけで確認される（参照、結果部分：「免疫蛍光法による局在性確認」）。
【図１８】強いＦＩＴＣシグナルを示している核周囲の共焦点免疫蛍光法イメージによる分析を表わす。ｐＸ３ ＣＣＣで形質導入した細胞。
【図１９】パネルＣＤTM突然変異体を表わす。
【図２０】様々なＰＣＲ生成物をクローン化するために使用したＴＯＰＯ（登録商標）（PCR-Blunt II-TOPO）プラスミドのマップ。ＴＯＰＯ−ｂｌｕｎｔクローニングキット（Invitrogen）中に供給したＴＯＰＯベクターは直線化され、３’リン酸末端各々にワクシニアウイルスのトポイソメラーゼＩを有し、これによりＰＣＲ生成物の配列の直線化したＴＯＰＯベクターとの連結が可能であることを意味した。
【図２１】ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ＩＩ ＫＳ（＋）発現ベクターを表わす。
【図２２】プラスミドｐＫＳＩＩ―ＣＤ８αのマップを表わす。
【図２３】キメラ遺伝子の発現のために使用したレトロウイルスのプラスミドｐＬＰＣＸのマップを表わす。これらの遺伝子は、マルチクローニングサイトへ導入される。
【図２４】レトロウイルスのｐＬＰＣＸ発現ベクター中にクローン化した最終キメラコンストラクトのマップを表わす。
【図２５】キメラタンパク質の発現およびエキソソームターゲティングの視覚化を表わす。突然変異体および野生型ＣＤ８α−ＣＤTMタンパク質（サイズ３１ｋＤａ〜２７ｋＤａ）並びにネガティブコントロール（ＣＤ８αのみを有するｐＬＰＣＸ発現ベクター）の一連の細胞およびエキソソーム可溶化物に関する抗ＣＤTMおよび抗ＣＤ８αウエスタンブロットを表わす。抗ＣＤTMおよび抗ＣＤ８αウサギ血清を１／２００まで希釈した。ペルオキシダーゼと結合させた抗ウサギＩｇＧ二次抗体を１／５０００まで希釈した。
【図２６】エキソソームと結合したＣＤ８αを検出するためのフローサイト蛍光測定法およびウエスタンブロットによる実験結果の比較を表わす。表は、様々なキメラタンパク質の発現およびエキソソームへのターゲティングの分析結果を示している。星で示された突然変異体は、エキソソームターゲティングに関して顕著である。ＣＤ８αタンパク質の立体構造エピトープの特定の蛍光のマウスモノクローナル抗体を使用したフローサイト蛍光測定法によって、エキソソーム上でのＣＤ８αの存在が示された（Pharmingen製の抗体５３−６．７）。
【図２７】エキソソームの表面におけるＣＤ８の発現を表わす。エキソソームの表面における各キメラタンパク質の曝露測定の平均値を表わしているヒストグラムを示す。これらの測定は、フローサイト蛍光測定法によって実施した。各キメラタンパク質の曝露は、野生型ＣＤ８ａ−ＣＤＴＭのキメラタンパク質曝露に関するパーセンテージとして発現されている（ヒストグラム上のコンストラクトｎ°９＝１００％）。標準偏差を表示する。分析したキメラタンパク質：１：ネガティブコントロール（ＣＤ８αのみを含有するｐＬＰＣＸ発現ベクター）；２：ＫＳ５；３：ＫＳ６；４：ＫＳ８；５：ＫＳ９；６：ＫＳ１０；７：ＫＳ１２；８：ＫＳ１４；９：野生型配列；１０：コンストラクトなし；１１：ＫＭ４；１２：ＫＭ５；１３：Ｓ；１４：ＫＴＭＹ；１５：ＫＭ８；１６：Ｅ；１７：ＫＭ９；１８：ＫＭ１１／１；１９：ＫＭ１１／３；２０：Ｄおよび２１：ＫＭ１３。観察される結果から、図２５および２６に表わされた結果が確認される。
【図２８】単一または複数の膜貫通型ドメインを有するタンパク質をコードするキメラ遺伝子のクローニング後に得られた様々なｐＬＰＣＸ発現プラスミドを表わす。
【図２９】Ａ．形質導入していない（Ｎ−Ｔ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または３つのキメラタンパク質をコードする３つのコンストラクトを含有するｐＬＰＣＸ発現ベクターで形質導入したものに由来する細胞タンパク質抽出物で実施した、ウエスタンブロット抗ＣＤTM−ＢＬＶ分析を表わす。抗ウサギＣＤTM―ＢＬＶ一次抗体を、１／２００まで希釈し、使用した。ペルオキシダーゼに結合させた抗ウサギＩｇＧ二次抗体を１／２０００に希釈して使用した。Ｂ．観察されたバンドのサイズは期待されるサイズに一致し、右側に記載する。
【図３０】Ａ．形質導入していない（Ｎ−Ｔ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または３つのキメラタンパク質をコードする３つのコンストラクトを含有するｐＬＰＣＸ発現ベクターで形質導入されたものによって生成されたエキソソームタンパク質抽出物上で実施したウエスタンブロット抗ＣＤTM―ＢＬＶ分析を表わす。抗ウサギＣＤTM−ＢＬＶ一次抗体を１／２００まで希釈し、使用した。ペルオキシダーゼと結合させた抗ウサギＩｇＧ二次抗体を１／２０００に希釈して使用した。Ｂ．観察されたバンドのサイズは期待されるサイズ一致し、右側に記載する。
【図３１】様々な細胞（Ａ）およびエキソソーム（Ｂ）抽出物のタンパク質フィンガープリントのクマシーブルー染色を表わす。
【図３２−１】この遺伝子によってコードされた３つの融合ＤＮＡ断片およびＳＳＣタンパク質の配列に接している制限部位に注釈を付したＳｒｃ−ＳＮＡＰ−ＤＣＴＭ遺伝子の配列（配列番号１２１および１２２）。
【図３２−２】この遺伝子によってコードされた３つの融合ＤＮＡ断片およびＳＳＣタンパク質の配列に接している制限部位に注釈を付したＳｒｃ−ＳＮＡＰ−ＤＣＴＭ遺伝子の配列（配列番号１２１および１２２）。
【図３３】この遺伝子によってコードされた３つの融合ＤＮＡ断片およびＤＳＣタンパク質の配列に接している制限部位に注釈を付したＤ−ＳＮＡＰ−ＤＣＴＭ遺伝子の配列（配列番号１２３および１２４）。
【図３４】ＳＳＣおよびＤＳＣタンパク質のエキソソーム内への標的化の実証。ＨＥＫ２９３細胞（５ｘ１０5個の細胞）を、キメラ遺伝子Ｓｒｃ−ＳＮＡＰ−ＣＤＴＭ（トラック３と６）、またはＤ−ＳＮＡＰ−ＣＤＴＭ（トラック２と５）、あるいはこれらの遺伝子を欠いたもの（トラック１と４）を含む真核細胞ＤＮＡ発現ベクター（ｐＣＤＮＡ３．１）１μｇで、２μＬのJetPrime（PolyPlusトランスフェクション）の存在下でトランスフェクトした。培地と細胞内に分泌されたエキソソーム（Ａ）のタンパク質をゲル電気泳動（ＰＡＧＥ−ＳＤＳ）によって分離し、そしてイモビロン膜（Millipore）上に移し取った。ウエスタンブロット法では、ウサギ抗ＣＤＴＭ血清とペルオキシダーゼによってタグを付与された抗ウサギＩｇＧ二次抗体を使用することで明らかにされた：Ａ）２μｇのエキソソームの分析、Ｂ）２０μｇの細胞抽出物の分析。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
第一の態様では、本発明は、以下のドメイン：
- （ｉ）目的のペプチドまたはポリペプチド；
- （ｉｉ）膜内標的ドメイン；および
- （ｉｉｉ）膜タンパク質の細胞質ドメイン（CD）であって、真核細胞中で、膜小胞へ、特にエキソソーム形成小胞へ、および／または膜小胞の形成に関与する１または２以上の細胞区画へ、特に前記エキソソーム形成小胞へ、キメラポリペプチドを差し向けることができる前記ドメイン、あるいは、前記ＣＤドメインの変異誘導体であって、基準ＣＤドメインの配列中の置換、欠失および／または挿入で規定され、ＣＤドメインの差し向け能力を保存している前記変異誘導体、ここで前記ＣＤドメインまたはその変異誘導体は、モチーフＹｘｘＬおよびモチーフＰｘｘＰ（配列中、ｘは任意の残基を示す）を少なくとも１つ含んでなる；
を含んでなるまたはそれから成るキメラポリペプチドであって；
ここで、前記キメラポリペプチド内に存在するドメイン、特にドメイン（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）は、細胞質または核ドメインであり（例えば、ドメイン（ｉ）および（ｉｉｉ）は細胞質ドメインであり）、そして前記キメラポリペプチドは、小胞体中への取り込みのためのシグナルペプチドを欠損しているものと理解される、ことを特徴とする前記キメラポリペプチドを提供する。本願で使用する用語「残基」は、アミノ酸残基を意味する。これらの残基は、省略された一文字コード（例えば、チロシン残基のＹ、ロイシン残基のＬ、プロリン残基のＰおよび任意の残基のｘ）を使用して表示される。
【００２５】
ＣＤドメインまたはその変異誘導体のモチーフＰｘｘＰは、好ましくはモチーフＰＳＡＰ（配列番号８８）またはモチーフＰＴＡＰ（配列番号８９）である。
【００２６】
本発明のキメラポリペプチドは、適当な真核細胞中で発現されるときに、膜小胞、特にエキソソームに結合して特に分泌され得る。本発明のポリペプチドを含んでなるエキソソームが分泌されるときには、目的のペプチドまたはポリペプチドはこれらのエキソソームの細胞質画分中に（完全に）含まれている。このことは、本発明のキメラポリペプチドに、小胞体中への取り込みを可能にするシグナルペプチドがないことを特に示している。
【００２７】
特定の実施形態よると、ドメイン（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、本発明のキメラポリペプチドにおいてＮ末端からＣ末端へ次の順で、連続して配置される：膜内標的ドメイン（ｉｉ）−目的のペプチドまたはポリペプチド（ｉ）−ＣＤドメインまたはその変異誘導体（ｉｉｉ）。
【００２８】
あるいは、ドメイン（ｉ）〜（ｉｉｉ）は次の順で位置付けられる、例えば：膜内標的ドメイン（ｉｉ）−ＣＤドメインまたはこの変異誘導体（ｉｉｉ）−目的のペプチドまたはポリペプチド（ｉ）。ドメイン（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）の一方もしくは他方、または２つのドメイン（ｉｉ）および（ｉｉｉ）はまた、２つの同一のまたは異なったタイプ（ｉ）ドメイン間に配置されてもよい；それらはまた、例えば（ｉ）のＮ末端−（ｉｉ）［または（ｉｉｉ）］−（ｉｉｉ）［または（ｉｉ）］−（ｉ）の残りのＣ末端断片の順で、１つのドメイン（ｉ）の中に挿入されることもできる。
【００２９】
用語「キメラ」はここでは、機能および／または細胞局在性で異なる少なくとも２つのタイプ由来の複数のドメインであって、当該ドメインの少なくとも２つが異なる分子に、特に同種または異なる種からの異なるタンパク質、あるいは異なる種からの同じタンパク質に由来する、複数のドメインを結合させるポリペプチドを意味する。
【００３０】
本願で規定される「キメラポリペプチド」は、遺伝子組換えポリヌクレオチドの発現産物であり得、宿主細胞の中で遺伝子組換え経路によって発現され得る。よって、当該キメラポリペプチドは、例えば融合ポリペプチドである。
【００３１】
用語タンパク質またはポリペプチドの「ドメイン」は、当該タンパク質または当該ポリペプチドに対して機能特性および／または細胞局在化特性を有する領域を意味する。
【００３２】
用語「膜内標的ドメイン」、「膜差し向け領域」または「膜動員ドメイン」（または細胞もしくは小胞膜に関連して）は、本願において、細胞と、特に真核細胞（例えば、エキソソーム産生細胞）の中で細胞膜および／または小胞膜に、単数もしくは複数の当該膜の中に挿入されることなく固定できるドメインを意味し、そして単数もしくは複数の膜への固定は、１もしくは２以上の固定分子（当該ドメインは単数もしくは複数の当該固定分子と結合することができる）によって、および／または当該膜内標的ドメインと、単数もしくは複数の当該膜との相互作用（特に静電的相互作用）によって達成される。特定の実施形態では、当該ドメインは、細胞、特に真核細胞（例えば、エキソソーム産生細胞）において、１もしくは２以上の固定分子を介しておよび／または相互作用（特に静電的相互作用）によって、原形質膜および／または膜小胞の内表面（すなわち、細胞質面）に結合するかまたは相互作用することができる。
【００３３】
用語「膜内ターゲティング」、「膜差し向け」または「膜動員」は、それが本発明のキメラポリペプチド内に存在するドメイン（ｉｉ）に適用されるときには、（１もしくは２以上の固定分子を介して、および／または相互作用、特に静電的相互作用により）細胞膜（特に原形質膜）および／または小胞膜と相互作用する能力を含意する。必要であれば（必ずではなく）、この用語はまた、当該ドメイン（ｉｉ）を移動させるような細胞荷電の能動的取り込みと、結果としての当該ドメイン（ｉｉ）を含んでなるキメラポリペプチドが細胞膜（特に原形質膜）または小胞膜に、当該膜との相互作用が可能になるように近づくことをも含意する。
【００３４】
膜内標的ドメインは、（１もしくは２以上の固定分子を介した相互作用による）細胞膜または小胞膜の脂質二重層への本発明のキメラポリペプチドの固定を可能にするのに十分である。よって、本発明のキメラポリペプチドの中のその存在により、膜内標的ドメインは、細胞、特に真核細胞で発現された本発明のキメラポリペプチドが細胞または小胞膜に固定されることを、当該ポリペプチドが当該膜の中に挿入されることなしに、可能にする（時折「固定される」と言われる）。本発明の好ましい実施形態では、膜内標的ドメインは、（１もしくは２以上の固定分子を介して、および／または相互作用、特に静電的相互作用により）小胞および細胞膜、特に細胞質膜および膜小胞の内表面に結合する特性を本発明のキメラポリペプチドに提供する。
【００３５】
本発明の特定の実施形態によると、膜内標的ドメインは、５〜４０残基、好ましくは８〜２５または１２〜２５残基、そしてより好ましくは１４〜２５または１６〜２３残基、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５残基を含んでなる。
【００３６】
本願で使用される用語「固定分子」は、細胞膜または小胞膜の脂質二重層（特に脂質二重層の少なくとも１枚のシート）、特に脂質または脂質分子（すなわち、１もしくは２以上の脂質を含んでなる分子）に挿入できる任意の分子も意味する；よって、膜内標的ドメインや本発明のキメラポリペプチドは「脂質に固定される」と言われる。
【００３７】
本発明の特定の実施形態によると、本発明との関連において固定分子は、１もしくは２以上の脂質を含んでなるか、またはそれから成り、そして単数もしくは複数の当該脂質は細胞膜または小胞膜の脂質二重層にそれ自体を埋め込むことができる疎水性炭素鎖を含んでなる。
【００３８】
本発明の特定の実施形態によると、固定分子で存在する単数もしくは複数の脂質は、脂肪酸、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、およびイソプレノイド、特にゲラニル−ゲラニルおよびファルネシルから選択される。
【００３９】
本発明の特定の実施形態によると、単数もしくは複数の固定分子は、共有結合を介して本発明のキメラポリペプチド内に存在する膜内標的ドメインに連結される。
【００４０】
本発明の特定の実施形態によると、「膜内標的ドメイン」は、１もしくは２以上の脂肪酸、特にミリスチン酸、パルミチン酸、およびゲラニル−ゲラニルから選択される１もしくは２以上の脂肪酸を介して、および／または脂質二重層内に存在する１もしくは２以上の脂質または脂質モチーフ、特にリン脂質と相互作用することができるペプチドまたはペプチド構造物を介して、本発明のキメラポリペプチドが脂質二重層に固定されるのを可能にする。よって、本発明のキメラポリペプチドは、細胞膜および小胞膜に、当該膜の中に挿入されることなく固定される。
【００４１】
好ましい実施形態では、このドメインは、脂肪酸、特にミリスチン酸、パルミチン酸またはゲラニル−ゲラニルに結合するのに十分である。当該結合は、膜内標的ドメインのＧ（例えば、ミリスチン酸の場合）、ＣまたはＳ残基に対して特に起こり得る。特に、それはアミドまたはチオエステル結合であり得る。脂肪酸、特にミリスチン酸は、共有結合を介して膜内標的ドメインに結合し得る。
【００４２】
本発明の特定の実施形態によると、膜内標的ドメインは、脂質二重層内に存在する１もしくは２以上の脂質（特に１もしくは２以上の脂肪酸）または１もしくは２以上の脂質モチーフ（特に１もしくは２以上の脂肪酸を含んでなるもしくはこれらから成る１もしくは２以上の脂質モチーフ）、特にリン脂質と相互作用することができるペプチドまたはペプチド構造物（すなわち、１もしくは２以上のアミノ酸残基、そして好ましくは少なくとも２つの連続したアミノ酸残基の１もしくは２以上の連結を含んでなる構造物）を含んでなるか、またはこれらから成る。
【００４３】
本発明のキメラポリペプチドの膜内標的ドメインと目的のペプチドまたはポリペプチドは、同一物、特に同じタンパク質由来であっても由来でなくてもよい。
【００４４】
好ましい実施形態では、膜内標的ドメインは、表在性膜タンパク質のものであるか、または表在性膜タンパク質の膜内標的ドメインの変異誘導体である。
【００４５】
好ましい実施形態では、「膜内標的ドメイン」は、例えば、脂肪酸、特にミリスチン酸、パルミチン酸またはゲラニル−ゲラニルのアシル化またはプレニル化によって、付加が可能になるコンセンサス配列を含んでなるか、またはこれらから成る。
【００４６】
当該コンセンサス配列は、以下の配列を含んでなるか、またはこれらから成ることができる：特にそれがミリスチン酸の付加を可能にする場合、Ｍ−Ｇ−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｓ／Ｃ（配列中、Ｘ1、Ｘ2、およびＸ3は独立して任意の残基を示す）。脂肪酸がこのコンセンサス配列に結合するとき、それはＧ残基、例えば２位に一般に存在する。
【００４７】
特定の実施形態によると、
−Ｘ1がＣ、ＳおよびＬから選択され；および／または
−Ｘ2がＳ、Ｉ、Ｖ、ＭおよびＬから選択され；および／または
−Ｘ3が、Ｋ、Ｑ、Ｈ、Ｆ、ＣおよびＳから選択される。
【００４８】
当該コンセンサス配列がミリスチン酸の付加を可能にするとき、それは膜内標的ドメイン内のＮ末端（例えば２位）、よって本発明のポリペプチド内に好ましくは局所化される。
【００４９】
好ましい実施形態では、「膜内標的ドメイン」は、複数の塩基性アミノ酸残基、特にＫ、Ｒ、およびＨから選択される複数の残基を含んでなる。本明細書中で使用される場合、用語「複数の」は、少なくとも２つ、そして好ましくは少なくとも３つ、例えば２、３、４、５または５以上を意味する。
【００５０】
これらのアミノ酸は、細胞膜または小胞膜の脂質、特にコリン（例えば、ホスファチジルコリン）との相互作用に関与し得るので、よってこれらの膜の膜内ターゲティング親和性を高めることができる。
【００５１】
膜内標的ドメインの塩基性アミノ酸は、先に記載のコンセンサス配列、および／またはこのコンセンサス配列の外側に局所化し得る。
【００５２】
よって本発明の特定の実施形態によると、本発明の膜内標的ドメインは：
−以下の配列から選択される配列を含んでなるか、またはそれらから成り：Ｍ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｋ−Ｓ／Ｃ−Ｋ−ｘ−ＫおよびＭ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｋ−Ｓ／Ｃ−Ｋ−ｘ−Ｋ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−Ｒ−Ｒ（配列中、ｘは任意の残基を示す）；例えば、そのような配列は、（例えば、２位における）ミリスチン酸の付加を可能にし得る；または
−この配列の変異誘導体から成り、当該変異誘導体が細胞膜の脂質二重層に固定されるようになるこのドメインの能力を保存している。
【００５３】
膜内標的ドメインは、Ｓｒｃタンパク質ファミリーのタンパク質、特にタンパク質Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｆｇｒ、ＨｃｋおよびＹｒｋから選択されるタンパク質（Resh, 1994）、より具体的にはこれらのタンパク質のＮ末端部分に特に由来し得る。一例として、このドメインは、タンパク質ｃ−Ｓｒｃまたはｖ−Ｓｒｃ（好ましくはｃ−Ｓｒｃ）に由来し得る。このドメインは、例えば、これらのタンパク質の１つ、特にタンパク質Ｓｒｃの１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のＮ末端アミノ酸を含んでなるか、またはこれらから成ることができる。
【００５４】
あるいは、膜内標的ドメインは、他のアシル化タンパク質、例えば、ウイルスカプシドからの特定のタンパク質、例えばヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）のＭＡタンパク質、またはフィロウイルス・タンパク質に由来することができる。
【００５５】
よって、膜内標的ドメインは、Ｓｒｃタンパク質に由来することができ、特に以下の配列を含んでなるか、またはこれらから成ることができる：Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ（配列番号１０４）またはＭ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｓ−Ｒ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｇ、（配列番号１０５）、あるいは配列Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−ＲまたはＭ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｓ−Ｒ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｇを有するドメインの変異誘導体から成る。
【００５６】
本願で使用される用語「特定のタンパク質由来」は、関連のあるペプチドまたはポリペプチドがアミノ酸の置換または欠失によって特定のタンパク質、当該特定のタンパク質の断片、または当該タンパク質もしくは断片の変異誘導体を含んでなるか、またはこれらから成ることを示す。
【００５７】
細胞膜または小胞膜の内表面を標的化するのに使用できる１もしくは２以上の脂質または特定の脂質モチーフと相互作用することができるその他のペプチドまたはペプチド構造物の中で、次のものが引用できる：ＦＹＶＥドメイン（Hurley, JH; 2006）。よって、本発明の特定の実施形態によると、膜内標的ドメインは、１もしくは２以上のＦＹＶＥドメインを含んでなるか、またはこれらから成る。
【００５８】
本願で使用する表現「膜小胞」は、真核細胞によって産生されるような細胞質画分を含んでなる脂質二重層からなる任意の小胞を意味する。この表現は、特に細胞外間隙に分泌される小胞、すなわちエキソソームを含む。
【００５９】
本願で使用される用語「エキソソーム」は、前記の細胞膜のナノ小胞を意味する。これらのエキソソームは、分画遠心法、限外濾過または担体上への吸着、あるいは実施例で見られる任意の他の方法によって、細胞の培養上清から精製することができる。
【００６０】
本願で使用される表現「膜小胞、特にエキソソームに結合して分泌される」は、本発明のキメラポリペプチドおよび／または少なくともこの分解産物の１つが可溶形態ではなく、膜小胞、特にエキソソームの膜の内面に固定される形態で細胞外間隙中に分泌される、ことを意味する。
【００６１】
本発明のキメラポリペプチドは、小胞体内への取り込みのためのシグナルペプチドを含まないので、細胞質または核の持続的な常住物（細胞質または核内に局在したまま）なので、そのため膜内にも、エキソソーム産生細胞に分泌された膜小胞、特にエキソソームの表面にも結合しないが、その膜小胞の内側（すなわち、管腔内）には結合するであろう。加えて、そのポリペプチドは、膜に向けられ、そして脂質二重層の内層に存在する１もしくは２以上の脂質または脂質モチーフ、特にリン脂質と相互作用することができるペプチドを介して、あるいは望ましくは、膜内標的ドメインと相互作用する１もしくは２以上の脂肪酸（特にミリスチン酸、パルミチン酸、およびゲラニル−ゲラニルから選択される１もしくは２以上の脂肪酸）を介して膜小胞、特にエキソソームの膜に固定される。
【００６２】
細胞の細胞質内で産生されたキメラポリペプチドが細胞膜または小胞膜の中に翻訳後にそれ自体が固定されことを可能にするように、１または２以上のこれらの脂肪酸が同時翻訳様式で結合され得る。
【００６３】
特定の実施形態によれば、本発明のキメラポリペプチドは、エキソソームが細胞から離れる前にこれらによって産生され、そしてエキソソーム内に取り込まれる。
【００６４】
膜小胞（特にエキソソーム）に結合する、ペプチドまたはポリペプチドの分泌は、特に（１）膜小胞特にエキソソームの形成のために当該ペプチドまたはポリペプチドをその位置（単数もしくは複数）へ差し向けること、および（２）当該ペプチドまたはポリペプチドが固定される膜からの小胞の出芽、が必要である。
【００６５】
本願で使用される用語「差し向け(addressing)」は、「ソーティング（sorting）」、「ニードリング（needling）」または「細胞内ルーティング（routing）」とも呼ばれ、細胞質中で合成が開始されるポリペプチドを、膜小胞、特にエキソソーム形成小胞の出芽に関与する区画へ到達させる過程、および／または膜小胞、特にエキソソーム形成小胞へ到達させる過程を意味する。
【００６６】
本発明の文脈で用語「分泌」は、「エキソソーム」とも呼ばれる膜小胞が分泌される、すなわち１または２以上の細胞から細胞外間隙中に放出される過程を意味する。この過程は、特に多胞体エンドソームが細胞の原形質膜に融合するときに生じる可能性があり、この結果これらに含まれる膜小胞を細胞から放出する。
【００６７】
以下の実施例に示すように、本発明のキメラポリペプチドの差し向けおよび分泌の特性を示すための試験は、当該キメラポリペプチドおよび／またはこの分解産物が、当該ポリペプチドが適当な真核細胞で発現されるときに、実際に膜小胞（特にエキソソーム）と結合することを確認することからなる。
【００６８】
「適当な」真核細胞は、好ましくは分泌のための内部小胞を含んでなる真核細胞であり、この小胞は、培養することができ、開口分泌が可能であり、遺伝子的に変更可能であり、そして好ましくは、外部刺激の影響下で内部小胞を分泌することができるものである。特に、これは哺乳類細胞であり、そしてより具体的にはヒト由来の細胞または由来に人間以外の哺乳類を有する細胞である。これはまた、初代培養または不死化株に関する。このような「適当な」真核細胞には、特にもともとエキソソームを産生することができる真核細胞、特にマスト細胞、ＴおよびＢリンパ球並びに樹状細胞（例えば、ランゲルハンス細胞）あるいはこれらの細胞のタイプ由来の細胞、並びにエキソソームを分泌することができるように遺伝子操作によって組み換えられた真核細胞または真核細胞株由来の細胞が含まれる。
【００６９】
用語「脂質二重層」は、原形質膜の基本構造および任意の生体膜、すなわち細胞または小胞をその環境から分離している、および細胞または小胞の細胞質を区切っている、あるいは細胞質内で細胞小器官を区切っている二重シート（または二重層）中の両親媒性の脂質の任意の集合の基本構造を意味する。従って、この用語は、細胞の任意の膜、つまり原形質膜および様々な細胞内区画の膜の両方、特に小胞体のもの、ゴルジのもの、または膜小胞のもの、例えばエキソソームまたはエンドソームのものを包含する。
【００７０】
本願で使用される用語「細胞質ドメイン」（ＣＤ）は、特定の細胞質ドメインを意味し、これは膜小胞へ、特にエキソソーム形成小胞へ、または膜小胞の形成に関与する１または２以上の細胞区画、および特に真核細胞中のエキソソーム形成小胞へ向けることができる；従って、このドメインは適当な真核細胞で発現されるときには、エキソソームに結合する細胞外間隙中へ分泌することができる。それ故に、目的のペプチドまたはポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドの中に取り込まれる場合、このドメインにより当該キメラポリペプチドを膜小胞および／またはこれらが形成される１または２以上の位置へ送ることが可能となり、そして特に当該キメラポリペプチドを膜小胞の膜へ送ることが可能となり、特に適当な真核細胞の、膜小胞（特にエキソソーム）に結合する細胞によって、当該ポリペプチドは分泌されることができるようになる。
【００７１】
本願との関連において、ドメインの「変異誘導体」は、この変異誘導体がこのドメインに通常関連している機能を保存することを条件に、元のまたは基準ドメインに関して修飾された任意のポリペプチドまたはペプチドを指す：この機能とは、例えば、基準ＣＤドメインに通常備わっている小胞膜（そして特にエキソソーム）に向かわせる能力、膜内標的ドメインに通常備わっている脂質二重層に固定する機能、そして追加のキメラペプチドに関して、膜ドメインに通常かかわっている脂質二重層への挿入と固定の機能、そして特に膜貫通型ドメインが通常かかわっているそれ全体として脂質二重層を貫通し、固定される能力である。従って、このような変異誘導体は、例えば、当該膜または細胞質ドメインの隣接する残基から構成される断片（この誘導体は、特に欠失および場合により１または２以上の残基の元の配列中への置換によって得られる）、または対照的に、元の膜または細胞質ドメインより大きなサイズを有するポリペプチド、特に元の膜または細胞質ドメインを含んでなるポリペプチド（特に、１または２以上の残基の元の配列への挿入によって得られるこの誘導体）に相当する。
【００７２】
特定の実施形態によれば、本願との関連において「変異誘導体」は、元のドメインの配列において、連続または非連続であってよい、少なくとも１つの残基、好ましくは１、２、３、４、５または５以上の残基の置換によってドメインの元の配列と異なり、当該置換は場合により、保存的、半保存的、あるいは非保存的であり、並びに／あるいは少なくとも１つの残基、好ましくは１、２、３、４、５または５以上の残基の欠失および／または挿入によるもので、これらは元のドメインの配列において、連続または非連続であってよい。
【００７３】
膜ドメインのこの「変異誘導体」の配列は、元のドメインの完全な配列に関して、これが由来するドメインと、少なくとも６０％または７０％、特に少なくとも８０％、９０％または９５％の類似性または同一性を有してよい。本願で使用される用語「パーセンテージ同一性」は、実験されたペプチドまたはポリペプチドの残基の総数に対する同一残基の数を意味する。用語「パーセンテージ類似性」は、実験されているペプチドまたはポリペプチドの残基の総数に対する、同一のまたは化学的に類似した残基の数を規定する。パーセンテージ同一性または類似性は、比較するために二つの配列をそろえ、そして二つの配列間で全体の配列比較が可能なニードルマンおよびワンチのアルゴニズムを使用することによって決定される。そしてパーセンテージ類似性または同一性は、これら２つの配列の全長に基づいて算出される。
【００７４】
特定の実施形態によれば、ＣＤドメインまたはその変異誘導体は、２または３つのモチーフＹｘｘＬを含んでなり、配列中、ｘは任意の残基を表わす。当該ＹｘｘＬモチーフまたはＣＤドメインのＹｘｘＬモチーフの１つは、例えばモチーフＹＩＮＬ（配列番号９１）またはＹＳＨＬ（配列番号９７）であってよい。
【００７５】
特定の実施形態によれば、ＣＤドメインまたはその変異誘導体は、モチーフＤＹｘｘＬを含んでなり、ｘは任意の残基を表わす。言及する実験セクションで説明する実施例および引用され得る実施例は、モチーフＤＹＩＮＬ（配列番号９３）である。
【００７６】
別の態様あるいは相補的な態様では、ＣＤドメインはモチーフＹｘｘＬと同等である少なくとも１つのモチーフ、例えばモチーフＹｘｘＦまたはモチーフＤＹｘｘＬを含んでなり、配列中、ｘは任意の残基を表わす。例えば、細胞タンパク質であるトランスフェリン受容体は、ドメインＹｘｘＦを含んでなる。
【００７７】
一般にＹｘｘＬドメインに関してなされるまたは特定の配列で示されるような本願の説明はまた、ドメインＤＹｘｘＬまたはＤＹｘｘＦに適用することができ、これらは一般的な用語で規定されるかまたは記載したモチーフの例に由来する特定の配列を有している。
【００７８】
好適な実施形態によれば、当該ＣＤドメインまたはその変異誘導体は、さらに２、３または４つのモチーフＰｘｘＰを含んでなり（配列中、ｘは任意の残基を表わす）、これらのモチーフＰｘｘＰのうちの少なくとも１つは、モチーフＰＳＡＰ（配列番号８８）またはＰＴＡＰ（配列番号８９）である。本発明の特定の実施形態では、ＣＤドメインまたはその変異誘導体のモチーフＰｘｘＰはＰＳＡＰまたはＰＴＡＰ（より好ましくはＰＳＡＰ）であり、そしてモチーフＹｘｘＬは、ＹＩＮＬまたはＹＳＨＬである。
【００７９】
特定の実施形態では、ＣＤドメインのモチーフＹｘｘＬ（例えばモチーフＹＩＮＬまたはＹＳＨＬ）、またはこれらのモチーフの１つは、モチーフＰｘｘＰ（例えばモチーフＰＳＡＰ）に対してＣ末端位に位置するＹｘｘＬである。
【００８０】
特定の実施形態では、ＣＤドメインのモチーフＹｘｘＬ（例えば、モチーフＹＩＮＬまたはＹＳＨＬ）は、モチーフＰｘｘＰ（例えばモチーフＰＳＡＰ）に対してＮ末端位に位置する。
【００８１】
少なくとも１つのモチーフＹｘｘＬを含んでなるＣＤドメインを有するタンパク質は、特に細胞タンパク質およびウイルスタンパク質を含む。これらのウイルスタンパク質は、特にエンベロープを有するウイルスのタンパク質、特にエンベロープを有するウイルス、特にレトロウイルスのＴＭ糖タンパク質である。
【００８２】
特定の実施形態によれば、ＣＤドメインは、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）のＴＭタンパク質のものである。オンコウイルス亜科（Oncovirinae）（オンコウイルス（Oncovirus））の一部を形成するこのレトロウイルスは、ウシにおいて白血病を生じうるＢ細胞の増殖を誘発する。
【００８３】
５８残基から構成されるＢＬＶのＴＭタンパク質のＣＤドメインは、配列番号６の配列を有する。そして、本発明のキメラポリペプチドのＣＤドメインまたはその変異誘導体は、配列番号６のドメインか、または、配列番号６のドメインの変異誘導体に相当する。
【００８４】
本発明の特定の実施形態において、ＣＤドメインの変異誘導体は、本質的にモチーフＰＳＡＰ（またはＰＴＡＰ）から、特定の実施形態ではＣ末端部分でこれに続くモチーフＹｘｘＬ（例えばＹＩＮＬまたはＹＳＨＬ）へ伸びるアミノ酸配列によって構成される天然のＣＤドメインの断片である。必要ならば、これらの２つのモチーフの間の、ＣＤドメインに必然的に存在する１または２以上のアミノ酸残基は、置換または欠失される。
【００８５】
特定の実施形態によれば、本発明のキメラポリペプチドのＣＤドメインまたはその変異誘導体、特にＣＤドメインの変異誘導体は、配列ＫＣＬＴＳＲＬＬＫＬＬＲＱが欠損している。従って、ＣＤドメインの変異誘導体は、この配列は配列ＫＣＬＴＳＲＬＬＫＬＬＲＱが欠損している、という点で、元のＣＤドメインとは異なってよい。
【００８６】
さらに、または代わりに、ＣＤドメインの変異誘導体の配列は、連鎖（concatenation）ＫＣＬＴＳＲＬＬＫＬＬＲＱを欠損している元のＣＤドメインの配列と、少なくとも６０％または７０％、特に少なくとも８０％、９０％または９５％の類似性または同一性を有してよい。
【００８７】
また、ＣＤドメインまたはその変異誘導体、特にその変異誘導体は、配列ＰＣおよび／または配列ＣＰを欠損していることが好適である。特定の実施形態によれば、当該ＣＤドメインまたはその変異誘導、特にその変異誘導体は、特に配列ＰＣＰを欠損している。従って、元のＣＤドメインが配列ＰＣＰを含む場合、この変異誘導体は、特に元のＣＤドメインの配列中の当該配列ＰＣＰのシステイン残基を欠失することによって、または、これを他の残基、好ましくはパルミトイル化可能でない残基、例えばアラニン残基と置換することによって得ることができる。
【００８８】
特定の実施形態によれば、ＣＤドメインまたはこの誘導体は、配列ＰＣＰおよび連鎖ＫＣＬＴＳＲＬＬＫＬＬＲＱどちらも欠損している。
【００８９】
例えば、ＢＬＶのＴＭタンパク質のＣＤドメインの変異誘導体は、１３個のＮ末端残基が欠失されている配列番号６に相当する、配列番号８を含んでなるまたはこれから成ってよい。
【００９０】
また例えば、配列番号８に相当する当該ドメインの配列中の、連続するまたはしない、少なくとも１つの残基、好ましくは１、２、３、４、５または５以上の残基の置換によって、並びに／あるいは連続するまたはしない、少なくとも１つの残基、好ましくは１、２、３、４、５または５以上の残基の欠失および／または挿入によって、ＢＬＶのＴＭタンパク質の変異誘導体の配列は、ＢＬＶのＴＭタンパク質のＣＤドメインの配列と異なる。
【００９１】
また例えば、ＢＬＶのＴＭタンパク質のＣＤドメイン（配列番号６のＣＤドメイン）の変異誘導体の配列は、配列番号８と少なくとも６０％または７０％、特に少なくとも８０％、９０％または９５％の類似性または同一性を有してよい。好ましくは、当該変異誘導体の配列は特に、配列番号８のモチーフＹＩＮＬ、ＹＳＨＬ（または、適当な場合、ＤＹＩＮＬ）およびモチーフＰＳＡＰを保存する。
【００９２】
配列番号６のＣＤドメインの当該変異誘導体の配列は、好ましくはモチーフＰＣ（プロリン−システイン）およびＣＰ（システイン−プロリン）を欠損しており、より好ましくはモチーフＰＣＰ（プロリン−システイン−プロリン）を欠損している。例えば、配列番号１０または配列番号１２を含んでなるまたはこれから成ってよい。
【００９３】
特定の実施形態によれば、ＣＤドメインまたはこの変異誘導体、特に配列番号６のＣＤドメインの変異誘導体は、次の配列：
ＰｘｘＰｘｘｘｘＰｘｘＰｘＳｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＥｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＰｘｘＰｘnＳｘＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＥｘnＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘｘｘＰｘｘＰｘＳｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＥｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＤＹｘｘＬｘｘｘｘ；および
ＰｘｘＰｘnＰｘｘＰｘnＳｘＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＥｘnＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＤＹｘｘＬｘｘｘｘ；
から選択される配列を含んでなるまたはこれから成り、配列中、ｘおよびｘnは各々任意の残基および任意の１または２以上の残基を表わし、かつ、配列中、モチーフＰｘｘＰのうちの少なくとも１つがモチーフＰＳＡＰまたはＰＴＡＰである。
【００９４】
特定の実施形態によれば、ＣＤドメインまたはこの変異誘導体、特に配列番号６のＣＤドメインの変異誘導体は、次の配列：
ＰｘｘＰｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘＹｘｘｘｘｘｘｘｘｘＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘＹｘｘｘｘｘｘｘｘＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰＥｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＹｘnＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＹｘnＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰＥｘnＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘｘｘＰｘｘＰｘｘｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＥｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＰｘｘＰｘnＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＥＸｎＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘｘｘＰｘｘＰｘｘｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＥｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＤＹｘｘＬｘｘｘｘ；および
ＰｘｘＰｘnＰｘｘＰｘnＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＥＸｎＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＤＹｘｘＬｘｘｘｘ、
から選択される配列を含んでなるまたはこれから成り、配列中、ｘおよびｘnは各々任意の残基および任意の１または２以上の残基を表わし、かつ、配列中、モチーフＰｘｘＰのうちの少なくとも１つがモチーフＰＳＡＰまたはＰＴＡＰである。
【００９５】
特に、ｎは１以上５０未満である。ｎは、特に１〜２０の間の任意の値であってよい。
【００９６】
例えば、特定の実施形態では、前述の配列中のＮ末端位にある、モチーフＰｘｘＰは、モチーフＰＳＡＰまたはＰＴＡＰであってよい。
【００９７】
あるいはまたは相補的な態様では、特定の実施形態では前述の配列のＣ末端位にある、モチーフＹｘｘＬは、例えばモチーフＹＩＮＬまたはＹＳＨＬであってよい。
【００９８】
本発明の特定の実施形態では、ＣＤドメインまたはこの変異誘導体が前記配列の１つを含んでなる場合には、この配列の上流または下流に付加される連続したアミノ酸残基は、モチーフＰｘｘＰあるいはモチーフＹｘｘＬ、ＹｘｘＦ、ＤＹｘｘＬまたはＤＹｘｘＦを形成しない。
【００９９】
特定の実施形態によれば、配列番号６のＣＤドメインの当該変異誘導体は、６〜１００の残基、特に２０〜８０、３０〜７０または４０〜６０、例えば４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０残基を含んでなる。
【０１００】
例えば、ＣＤドメインの変異誘導体の配列は、配列番号３０、配列番号４２、配列番号４４または配列番号９５含んでなるか、またはこれから成ってよく、あるいは完全な配列番号３０、配列番号４２、配列番号４４または配列番号９５各々を基準にして、配列番号３０、配列番号４２、配列番号４４または配列番号９５と、少なくとも６０％または７０％、特に少なくとも８０％、９０％または９５％の類似性または同一性を有してよい。
【０１０１】
本願で使用される用語「目的のペプチドまたはポリペプチド」は、ペプチドまたはポリペプチドの構造を形成している、複数の（少なくとも２つの）連続的な残基の完全な配列を意味する。「ペプチド」は、２〜２０の連続的な残基（特に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０残基）の鎖、特に５〜１０、１０〜１５または１５〜２０の連続的な残基の鎖を意味する。タンパク質またはタンパク質の断片も意味する「ポリペプチド」は、２０以上（少なくとも２１）の連続的な残基の配列、特に２１〜１０００の連続的な残基、好ましくは２１〜５００、２１〜２５０または２１〜１５０の連続的な残基、例えば２１〜５０、５０〜１００、または１００〜１５０の連続的な残基の鎖である。目的の当該ペプチドまたはポリペプチドは、特に可溶性タンパク質、膜タンパク質、膜貫通型タンパク質および／または多量体のタンパク質の１または２以上のドメイン含んでなるか、またはこれらから成ってよい。
【０１０２】
特定の実施形態によれば、「目的の当該ペプチドまたはポリペプチド」、特に本発明のキメラポリペプチド内に存在する目的のペプチドまたはポリペプチドは、細胞質タンパク質のまたは核タンパク質の１または２以上のドメイン、あるいはこの（これらの）ドメインの１または２以上の断片含んでなるか、またはこれらから成る。
【０１０３】
本願で使用される用語ドメインの「断片」は、少なくとも６つの隣接する当該ドメインの残基からなる部分、特に当該ドメインの完全な配列と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％または少なくとも９０％、または実に１００％の同一性を有する部分を意味する。どのようなものであれ、断片は大きさが、断片の由来であるタンパク質よりも小さい。
【０１０４】
特定の実施形態によれば、目的の当該ペプチドまたはポリペプチドは、抗原性があり、すなわち、目的の当該ペプチドまたはポリペプチドに対する免疫応答を引き起こすことができる。目的の当該ペプチドまたはポリペプチドは、特にタンパク質の１または２以上のエピトープ含んでなるか、またはこれらから成ってよい。
【０１０５】
特定の実施形態によれば、目的の当該ペプチドまたはポリペプチドは、病原体、例えばウイルス、細菌または寄生虫、あるいは病原性物質、例えば腫瘍細胞、毒等に由来する。これが構造タンパク質であるなしにかかわらず、このような生物または病原性物質の任意の細胞質または核ペプチド成分を使用してよい。これは特に、病原体の抗原、特にウイルスまたは細菌性の抗原あるいは寄生虫由来の抗原であってよい。
【０１０６】
目的の当該ペプチドまたはポリペプチドはまた、細胞質抗原、特に抗腫瘍細胞質抗原、または膜貫通タンパク質の細胞質部分に由来し得る。あるいは、それは、酵素、酵素一部、酵素の変異誘導体、毒素タンパク質、毒素タンパク質の一部、または細胞に対して特異的にの作用するその能力のために選択された化合物であってもよい（当該化合物は標的細胞に対して有害な影響または対照的に、有益な効果を有しているかもしれない）。それはまた、核酸、例えばＭＳ２ファージのカプシドタンパク質を特異的に固定できるタンパク質（例えば、Ｇタンパク質）またはタンパク質断片であってもよい。それはまた、特定の核酸に結合することができるペプチドまたはポリペプチドであってもよい。
【０１０７】
目的のペプチドまたはポリペプチドの選択されるタイプに応じて、本発明は、インビボで、特に医療適用のために、特に免疫付与のために、特にワクチン接種に使用してよい。
【０１０８】
一例として、実施例に記載されている本発明の２つのキメラポリペプチドにおいて、目的のポリペプチドは、タンパク質ｈＡＧＴの変異誘導体である。当該変異誘導体はＳＮＡＰタンパク質（Covalys, NEB）であって、そのタンパク質は市販されている。
【０１０９】
特定の実施形態によれば、本願で規定されるキメラポリペプチドはさらに少なくとも１つの結合分子（またはリンカー）を含んでなる。用語「リンカー」は、二つの連続的なドメインを連結できる任意のエレメントを意味する。これは、可変な長さおよび性質である。
【０１１０】
特定の実施形態によれば、本発明のポリペプチドの少なくとも２つの連続的なドメインは、共有結合的に、例えばペプチド結合を介して結合する。従って、特定の実施形態によれば、当該リンカーは、ポリペプチドまたはペプチドである。このポリペプチドリンカーは、２〜５０残基、好ましくは２〜３０残基、例えば２〜５、５〜１０、１０〜２０または２０〜３０の連続的な残基の配列で構成されてよい。
【０１１１】
特定の実施形態によれば、当該リンカーをコードするヌクレオチド配列は、制限酵素部位を含んでなるか、またはこれから成る。用語「制限酵素部位」は、ＩＩ型制限酵素によって切断部位として認識される、ＤＮＡ分子中の特定のヌクレオチド配列を意味する。従って、このリンカーは、それぞれ制限酵素部位ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、およびＳｂｆＩ−ＡｓｃＩを含んでなるヌクレオチド配列ＴＣＴＡＧＡもしくはＧＣＴＡＧＣ、またはＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣ（配列番号１０７）によってそれぞれコードされた配列ＳＲもしくはＡＳ、またはＰＡＧＳＧＡＰ（配列番号１０６）を有するリンカーであり得る。
【０１１２】
好適な実施形態によれば、目的の当該ペプチドまたはポリペプチドは、本願に記載のキメラポリペプチド、特に本発明のキメラポリペプチド中のこの天然の立体構造に存在する。
【０１１３】
特定の実施形態によれば、本願で規定されるキメラポリペプチドは、多量体であり、特に二量体または三量体の形態である。これは特に、目的のペプチドまたはポリペプチドが、この天然の形態で、二量体または三量体形成するタンパク質に由来する場合である。
【０１１４】
特定の実施形態に従って、本願で規定されるキメラポリペプチドはさらにキメラポリペプチドを精製することができるタグ配列を含んでなる。例えば当該配列タグが、多数の連続的に結合されたヒスチジン残基、特に６つの連続したヒスチジン残基の配列含んでなるか、またはこれから成ってよい。
【０１１５】
特定の実施形態によれば、本願で規定されるキメラポリペプチドは、タグまたはレポーター・タンパク質を含んでなって、例えば、それは酵素であってもよく、そして例えば、フルオロフォアもしくは、その他のタグまたはタグに結合し得る基質（例えば、ビオチン）とそれを結合させることによるポリペプチドの標識を意図する。例えば、そのようなタンパク質は、ＳＮＡＰタンパク質またはＳＮＡＰタンパク質の変異誘導体であり得、通常、それはＳＮＡＰタンパク質に取り付けられたタグ付与特性を保存している。
【０１１６】
特定の実施形態によれば、本願で規定されるキメラポリペプチドは、タンパク質ｈＡＧＴ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ２９９７１．１を持つ）、またはプラスミドｐＳＮＡＰｍ（NEB, USA）に含まれたタンパク質ｈＡＧＴ誘導体もしくは突然変異体（Kepplerら、２００２）を含んでなる。
【０１１７】
特定の実施形態によれば、キメラポリペプチドはさらに、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットによってキメラポリペプチドを検出するためのタグを含んでなる。好ましくは、当該タグは、特定のモノクローナル抗体によって認識されるエピトープ、例えばｍｙｃエピトープである。
【０１１８】
本発明の特定の実施形態では、本願に記載のキメラポリペプチド、特に本発明のキメラポリペプチドにおいて、目的のペプチドまたはポリペプチドはエキソソームと結合する場合には、好適に天然の立体構造を有する（特にこれはマルチマーの形態、例えば二量体または三量体の形態である）。
【０１１９】
本発明はまた、本願で規定する本発明のポリペプチドの使用、（インビボまたはインビトロで）目的のペプチドまたはポリペプチドを、膜小胞、特にエキソソーム形成小胞へ、および／あるいは膜小胞、特にエキソソーム形成小胞の形成に関与する１もしくは２以上の細胞区画へ送ること、およびこの結果、適当な真核細胞によって、当該膜小胞に結合する目的のペプチドまたはポリペプチドの分泌が可能となること、に関する。
【０１２０】
本発明の特定の態様では、以下で「追加のキメラポリペプチド」と呼ばれるキメラポリペプチドと併せて本発明のキメラポリペプチドを使用してもよい。
【０１２１】
本発明の特定の実施形態によれば、追加のキメラポリペプチドは、以下のドメインを含んでなるか、またはこれらから成る：
−ペプチドまたは目的のポリペプチド；
−膜貫通型ドメイン；および
−細胞質ドメイン（ＣＤ）または当該ＣＤドメインの変異誘導体、当該ＣＤドメインおよびその変異誘導体は本願で規定されるとおりのものである；これらのドメインＮ末端部からＣ末端部に向かって以下の順で連続して配置される：目的のペプチドまたはポリペプチド−膜貫通型ドメイン−ＣＤドメインまたはその変異誘導体；またはＣＤドメインまたはその変異誘導体−膜貫通型ドメイン−目的のペプチドまたはポリペプチド。
【０１２２】
追加のキメラポリペプチドは、必ず少なくとも１つの膜ドメイン（膜貫通型ドメイン）を含んでなるが、複数のそれらを含んでいてもよい；目的のペプチドまたはポリペプチドは、１もしくは２以上の膜ドメイン、特に膜貫通を１つも含むことができないので（以下を参照のこと）、追加のキメラポリペプチドが１もしくは２以上の膜ドメイン（特に１または２以上の膜貫通）を含んでなる。当該キメラポリペプチドが、たった１つの膜ドメイン（膜貫通型ドメイン）を含んでなるとき、それを同一物、特に当該ポリペプチドの目的のペプチドまたはポリペプチドと同じタンパク質から得ても、そうでなくてもよい。
【０１２３】
追加のキメラポリペプチドのＣＤドメインまたは変異誘導体は、本発明のキメラポリペプチドのＣＤドメインまたはＣＤドメインの変異誘導体と同一であっても、異なっていてもよい。
【０１２４】
本願では、「膜ドメイン」は、脂質二重層で、特に小胞膜もしくは細胞膜およびエキソソームの膜で、脂質二重層と相互作用することができる、特に固定できる−従ってそれを含んでなるポリペプチドを固定することができる、任意のドメインを意味する。特定の実施形態では、この膜ドメインは、一方で第一のドメイン（例えば、目的のペプチドまたはポリペプチド）、そしてもう一方で第二のドメイン（例えば、細胞質ドメイン）へもまた結合することができる。例えば、１０〜５０残基、好ましくは１５〜４０残基、より好ましくは２０〜３０残基を含んでよい。
【０１２５】
特定の実施形態によると、当該膜ドメインは、膜貫通型ドメイン、すなわち小胞膜または細胞膜の脂質二重層を介して完全に通過する膜ドメインである。膜貫通型ドメインは、一般的には疎水性のαヘリックスに配列される；複数回貫通の膜貫通型タンパク質は、複数、特に２、３、４、５，６、７，８、９、または１０、または実に２０または２０以上の、疎水性αヘリックスを含んでよい。βシートに配列されてもよい。１または２以上の膜貫通型ドメインはまた、βバレル膜貫通構造、通常は８〜２２のβ鎖からなる構造を採用する。
【０１２６】
用語「膜タンパク質」は、１または２以上の上に規定した膜ドメインを含んでなる任意のポリペプチド鎖を意味する。
【０１２７】
本発明のキメラポリペプチドのように、追加のキメラポリペプチドは、それが適当な真核細胞の中で発現されるとき、膜小胞、特にエキソソームに結合して分泌されることができる。
【０１２８】
その膜ドメインのため、特に膜貫通型ドメインのため、追加のキメラポリペプチドまたは当該ポリペプチドの分解産物が膜小胞（特にエキソソーム）の膜の中に、この膜の脂質二重層にそれ自体を挿入することによって、それ自体が固定される。当該キメラポリペプチドの当該分解産物はまた、当該キメラポリペプチドの分解産物が結合されるＭＨＣ分子（クラスＩまたはＩＩ）の膜（特に膜貫通）ドメインを介して膜小胞の膜の中に固定されることもできる。
【０１２９】
それにより膜小胞（特にエキソソーム）の膜の中に固定される追加のキメラポリペプチドにおいて、目的のペプチドまたはポリペプチドは、当該膜小胞の外部に（完全または一部）晒される、および／または当該膜小胞の膜に（完全または一部）含まれている（これは当該目的のペプチドまたはポリペプチドが１もしくは２以上の膜ドメインを含んでなる場合である）、および／または当該膜小胞の細胞質部分に（完全または一部）含まれることができる。
【０１３０】
本発明の特定の実施形態によれば、当該追加のキメラポリペプチドのＣＤドメインと膜貫通型ドメインが同じタンパク質に由来するとき、少なくともＣＤドメイン、変異誘導体またはＣＤドメインと同じタンパク質に由来する膜貫通型ドメインは、元のドメインの配列の１もしくは２以上の残基の置換および／または欠失によって変異させた誘導体である。
【０１３１】
膜貫通型ドメインは、１もしくは２以上の膜貫通タンパク質に由来し、それは、細胞膜を数回、特に２、３、４、５、６、７、８、９または１０回、あるいは実に２０回またはそれ以上通過する。
【０１３２】
当該膜または膜貫通型タンパク質は、特に：ヒトタンパク質、ヒトでない動物のタンパク質、病原体または病原性物質のタンパク質、特にウイルスのタンパク質、細菌のタンパク質あるいは寄生虫または腫瘍細胞によって発現されるタンパク質から選択されてよい。
【０１３３】
追加のキメラポリペプチドのこの膜ドメインまたは少なくとも１つの膜貫通型ドメインは、特に同一の膜貫通型タンパク質のもの、または膜タンパク質の膜貫通型ドメインの変異誘導体のものであってよい。当該変異誘導体は、例えば、他の膜貫通型タンパク質の膜貫通型ドメインに由来する配列のそばの対照ドメインの配列の一部を取替えることによって得ることができる。
【０１３４】
本発明の特定の実施形態によれば、追加のキメラポリペプチドのＣＤドメインまたはその変異誘導体が、配列番号６のＢＬＶのＴＭタンパク質のＣＤドメイン含んでなるか、または当該ドメインからなる場合には、追加の当該キメラポリペプチドの膜貫通型ドメイン（単数もしくは複数）は、配列番号４を有するＢＬＶのＴＭタンパク質の膜ドメインを欠損している。対照的に、追加のキメラポリペプチドの膜貫通型ドメインは配列番号４のドメインの変異誘導体に相当してよく、当該変異誘導体は、配列番号４を含まない。実施例で説明するように、このような変異誘導体は、配列番号４における１または２以上の残基の欠失、場合により置換によって得られてよい。
【０１３５】
特定の実施形態によると、１つの膜貫通型ドメインとＣＤドメインが同じタンパク質に由来するとき、特にそれらがＢＬＶのＴＭタンパク質に由来するとき、配列ＰＣＰ（例えば、配列ＰＣＰの残基Ｃが残基Ａによって置き換えられる）が欠損した、および／または配列ＫＣＬＴＳＲＬＬＫＬＬＲＱが欠損したＣＤドメインの変異誘導体が、ドメイン（ｉｉｉ）として使用される。
【０１３６】
特定の実施形態によれば、追加のキメラポリペプチドの膜ドメインの１つが、配列番号４のＢＬＶのＴＭタンパク質の膜貫通型ドメイン含んでなるか、またはこれから成る場合には、ＣＤドメインまたはこの変異誘導体は、配列番号６のＢＬＶのＴＭタンパク質のＣＤドメインを欠損している。しかしながら、ＣＤドメインまたはこの変異誘導体は、配列番号６のドメインの変異誘導体に相当するまたは含んでよい。実施例で説明するように、このような変異誘導体は、例えば、配列番号６のＮ末端部分に位置する残基を欠失することによって、特に連鎖ＫＣＬＴＳＲＬＬＫＬＬＲＱを欠失することによっておよび／または配列番号６中の配列ＰＣＰを欠失することによって、あるいは、例えば、配列ＰＣＰのシステイン残基を他の残基、好ましくはパルミトイル化可能でない残基、例えばアラニン残基と置換することによって得られることができる。
【０１３７】
この追加のキメラポリペプチド内に存在する目的のペプチドまたはポリペプチドは、本発明のキメラポリペプチドについて本願で規定されるとおりのものであり得る。あるいは、または累積的に、追加のキメラポリペプチドの当該目的のペプチドまたはポリペプチドはまた、細胞外タンパク質または表面タンパク質の１もしくは２以上のドメイン、または１もしくは２以上のこれらのドメインの１もしくは２以上の断片を含んでなるか、またはこれらから成ることもできる。
【０１３８】
特定の実施形態によれば、この追加のキメラポリペプチド内に存在する目的のペプチドまたはポリペプチドは、細胞外または表面タンパク質の１もしくは２以上のドメイン、または１もしくは２以上のこれらのドメインの１もしくは２以上の断片、そして適切であれば、以下の：
−膜タンパク質、特に膜貫通タンパク質の１もしくは２以上の膜ドメイン、または１もしくは２以上のこれらのドメインの断片、および／または
−膜タンパク質、特に膜貫通タンパク質の１もしくは２以上の細胞質ドメイン、または１もしくは２以上のこれらのドメインの断片、
を含んでなるか、またはこれらから成る。
【０１３９】
本発明の特定の実施形態によれば、追加のキメラポリペプチドの目的のペプチドまたはポリペプチドは、受容体、例えば、複数の膜ドメインを持つ受容体、特にＣＸＣＲ４またはＧＰＲ受容体、あるいは標的細胞または特定のタイプの標的細胞（例えば、腫瘍細胞または代謝もしくは機能障害を有する細胞）を標的化するのに使用できるその他のペプチドまたはポリペプチドである。
【０１４０】
本発明の特定の実施形態によれば、この追加のキメラポリペプチドの目的のペプチドまたはポリペプチドは、特に膜タンパク質、特に膜貫通タンパク質の１もしくは２以上のエクトドメイン、１もしくは２以上の膜ドメイン、および／または１もしくは２以上の細胞質ドメイン、あるいは１もしくは２以上のこれらのドメインの１もしくは２以上の断片を含んでなるか、またはこれらから成る。
【０１４１】
本発明の特定の実施形態によれば、この追加のキメラポリペプチドの当該目的のペプチドまたはポリペプチドは、病原菌、例えば、ウイルス、細菌または寄生虫に、または病原物質、例えば、腫瘍細胞、毒素などに、あるいは抗腫瘍抗原、細胞質抗原、リガンド受容体、特に複数の膜ドメインを有する受容体、例えば７回膜貫通型ドメインを持つ受容体、サイトカイン受容体またはリガンド受容体に、特にサイトカインに、あるいはその断片に由来する。生物体または病原物質に由来する任意のペプチド成分もまた、それが構造タンパク質であるか否かに関係なく使用できる。特に、それは、病原性抗原、特にウイルスもしくは細菌性抗原、または寄生虫起源の抗原であり得る。
【０１４２】
この追加のキメラポリペプチドの目的の当該ペプチドまたはポリペプチドはまた、腫瘍抗原、細胞質抗原、膜貫通型タンパク質に、特にインテグリンにまたは共受容体にまたは相互作用に関与するタンパク質（特にタンパク質ＩＣＡＭ、ＣＤ４、ＣＤ８）に、リガンド受容体、特に単一の膜ドメインを有する受容体、例えばサイトカイン受容体（特にＥＧＦに応答するＨＥＲファミリーの受容体、例えば受容体ＥＧＦ−Ｒ１）、特に複数の膜ドメインを有する受容体、例えば７回膜貫通型ドメインを有する受容体（特にＨＩＶの受容体ＣＸＣＲ４またはガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の受容体）に、あるいは受容体リガンド、特にサイトカインの受容体リガンドにあるいはこれらの断片に由来する。
【０１４３】
この追加のキメラポリペプチド内に存在する目的のペプチドまたはポリペプチドのタイプに応じて、本発明は、インビトロで、例えば、目的の当該ペプチドまたはポリペプチドと相互作用する分子をスクリーニングするために使用できる。
【０１４４】
特定の実施形態によれば、目的の当該ペプチドまたはポリペプチドは、ウイルスの表面に存在するタンパク質、例えば標的細胞に位置する受容体へのウイルス粒子の結合に関与するタンパク質、および／もしくは標的細胞の原形質膜とウイルスのエンベロープまたは感染した細胞の原形質膜との融合に関与するタンパク質、あるいはこのようなタンパク質の断片に由来する。
【０１４５】
例えば、ドメイン（ｉ）として、エンベロープを有するウイルスのエンベロープタンパク質またはこのタンパク質の断片を使用することができる。このエンベロープを有するウイルスは、特に次のファミリーから選択してよい：
−ポックスウイルス科（Poxviridae）、そして特にオルトポックス・ウイルス（Orthopoxvirus）属のものであって、特に天然痘ウイルス（smallpox virus）およびワクシニアウイルス（vaccinia virus）が含まれる；
−ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、特にヘルペスウイルス属のものであって、特にヘルペスウイルス１および２型、水疱瘡ウイルス（chicken pox virus）、エプスタイン・バーウイルス（Epstein-Barr virus）、サイトメガロ・ウイルス（Cytomegalovirus）、およびヘルペスウイルス６、７、８型が含まれる；
【０１４６】
−ヘパドナ・ウイルス科（Hepadnaviridae）、特にＢ型肝炎（hepatitis B）ウイルスが含まれる；
−オルトミクソ・ウイルス科（Orthomyxoviridae）、特にインフルエンザＡ、ＢまたはＣ型ウイルス属のものであって、特にＨ５Ｎ１トリＦｌｕウイルスが含まれる；
−パラミクソウイルス科（paramyxoviridae）、特にパラミクソウイルス属のものであって、特にパラインフルエンザ（parainfluenzae）ウイルスおよびムンプスウイルス（mumps virus）が含まれ、また麻疹ウイルス（Morbillivirus）属のものであって、特に麻疹ウイルス（measles virus）が含まれ、並びに肺炎ウイルス属（Pneumovirus）のものであって、特に合胞体（syncytial）呼吸器系ウイルスが含まれる；
−ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、特にリッサ・ウイルス属（Lyssavirus）のものであって、特に狂犬病ウイルス（rabies virus）が含まれる；
【０１４７】
−フィロウイルス科（Filoviridae）、特にマールブルグウイルス（Marburg virus）およびエボラウイルス（Ebola virus）が含まれる；
−トガウイルス科（Togaviridae）、特にフラビ・ウイルス属（Flavivirus）のものであって、特に黄熱病ウイルス（yellow fever virus）およびＣ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus）（ＨＣＶ）が含まれ、アルファ・ウイルス属（Alphavirus）のものおよびルビ・ウイルス属（Rubivirus）のものであって、特に風疹ウイルス（Rubella virus）が含まれる；
−コロナウイルス科（Coronaviridae）、特にコロナウイルス（Coronavirus）属のものであって、特に呼吸器系および消化器系感染症、例えば重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）に関与するウイルスが含まれる；
−アレナ・ウイルス科（Arenaviridae）、特にアレナ・ウイルス（Arenavirus）属のものであって、特にラッサ熱ウイルス（Lassa virus）が含まれる；
−ブニヤウイルス科（Bunyaviridae）、特にブンヤ・ウイルス属（Bunyavirus）、ハンタ・ウイルス属（Hantavirus）、フレボウイルス属（Phlebovirus）のもの；並びに
−レトロウイルス科（Retroviridae）、特にレンチウイルス（Ｌentivirus）属のものであって、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が含まれる。
【０１４８】
また例えば、目的のペプチドまたはポリペプチドは、インフルエンザウイルスのエンベロープのタンパク質、特にインフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）、そしてより具体的にはＨ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質由来であってよい。これは、このタンパク質の外部ドメインまたはこの外部ドメインの断片、あるいはこの外部ドメインの１または２以上のエピトープ含んでなるか、またはこれらから成る断片であってよい。
【０１４９】
これらのウイルスの他の抗原性のポリペプチド、例えばＨＩＶのＧＡＧポリタンパク質のＧＡＧタンパク質または断片、ポリオウイルス（poliovirus）または乳糖腫ウイルス（papillomavirus）のカプシドのタンパク質または断片が、当然ながら使用されてもよい。
【０１５０】
また例えば、目的のペプチドまたはポリペプチドは、これらのウイルスの１つの外側のエンベロープのタンパク質由来であってよい。これは、コロナウイルス（coronavirus）のエンベロープタンパク質、特にコロナウイルス（coronavirus）のスパイク（Ｓ）タンパク質、そしてより具体的には重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（coronavirus）（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）のスパイクタンパク質に由来する。目的のこのペプチドまたはポリペプチドは、特に、このタンパク質の外部ドメイン、あるいはこの外部ドメインの１または２以上のエピトープ含んでなるか、またはこれらから成る断片含んでなるか、またはこれから成ってよい。
【０１５１】
特定の実施形態では、追加のキメラポリペプチドの目的のペプチドまたはポリペプチドは、標的細胞、例えば、樹状細胞、リンパ球、腫瘍細胞などの表面に存在するタンパク質を認識する能力を有する。
【０１５２】
膜小胞の形成位置、特にエキソソームの形成位置への追加のキメラポリペプチドの差し向けは、（膜の中の固定機能が膜貫通型ドメインによって確保されて）当該追加のキメラポリペプチドが小胞膜または細胞膜の中に挿入されるように、当該追加のキメラポリペプチドが小胞体の中に取り込むためのシグナルペプチドを含むべきであることを特に必要とする。よって、特定の実施形態によれば、本発明のキメラポリペプチドとは対照的に、追加のキメラポリペプチドは、小胞体の中への取り込みのための１つ（または２以上）のシグナルペプチドを含み得る。
【０１５３】
用語「小胞体の中に取り込むためのシグナルペプチド」は、約５〜約６０残基、特に１５〜６０残基、より具体的には１５〜３０残基の小さな連続的なポリペプチド配列を意味し、これにより、これを含んでなるタンパク質は場合により完全または一部であるが、小胞体の膜、タンパク質通路を通過することができる；タンパク質通路の停止は、他のさらなるシグナル（またはその他のシグナル）の存在次第である。所定の行き先のシグナルペプチドは、１つのタンパク質から他へ互換性があるので、そこでタンパク質を小胞体へ送らせることができる任意のシグナルペプチドを、本発明の状況で使用してよい。
【０１５４】
例えば、小胞体の中へ取り込むために使用するシグナルペプチドは、配列番号２の２７残基ペプチドを使用することができる。また例えば、膜タンパク質のシグナルペプチド、例えばタンパク質ＣＤ４、ＣＤ８および赤血球凝集素（ＨＡ）等、サイトカイン受容体のシグナルペプチド、例えばＩＬ１Ｒ１、ＥＧＦＲ１（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４等、あるいは分泌されたタンパク質のシグナルペプチド、例えば、サイトカインのもの、を使用することもまた可能である。従って、以下から選択されるシグナルペプチドを使用することが可能である：ヒトＣＤ４タンパク質（配列番号４９のペプチド）またはマウスＣＤ４（配列番号５０のペプチド）のもの、タンパク質であるマウスＣＤ８アルファ（配列番号５１のペプチド）、ウシＣＤ８アルファ（配列番号５２のペプチド）、ヒトＣＤ８アルファ（配列番号５３のペプチド）、またはラットＣＤ８アルファ（配列番号５４のペプチド）のもの、ヒトＩＬ１Ｒ１受容体（配列番号５５のペプチド）、ヒトＥＧＦＲ１（ＨＥＲ１）（配列番号５６のペプチド）、ヒトＨＥＲ２（配列番号５７のペプチド）、ヒトＨＥＲ３（配列番号５８のペプチド）またはヒトＨＥＲ４（配列番号５９のペプチド）のもの、またはサイトカインであるマウスＩＬ−２（配列番号６０のペプチド）、マウスＩＬ−６（配列番号６１のペプチド）、ヒトＩＬ−７（配列番号６２のペプチド）、マウスＩＬ−１０（配列番号６３のペプチド）、またはヒトＭＩＰ−１−アルファケモカイン（配列番号６４のペプチド）のもの、Ｂ型インフルエンザウイルス（配列番号６５のペプチド）の赤血球凝集素のもの、ウイルスであるＨ１Ｎ１型インフルエンザＡ（配列番号６６のペプチド）、Ｈ２Ｎ２型インフルエンザＡ（配列番号６７のペプチド）、Ａ Ｈ３Ｎ２インフルエンザ（配列番号６８のペプチド）、Ｈ４Ｎ６インフルエンザＡ（配列番号６９のペプチド）、Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ（配列番号７０のペプチド）、Ｈ６Ｎ５インフルエンザＡ（配列番号７１のペプチド）、Ｈ７Ｎ７インフルエンザＡ（配列番号７２のペプチド）、Ｈ８Ｎ４インフルエンザＡ（配列番号７３のペプチド）、Ｈ９Ｎ２インフルエンザＡ（配列番号７４のペプチド）、Ｈ１０Ｎ７インフルエンザＡ（配列番号７５のペプチド）、Ｈ１１Ｎ６インフルエンザＡ（配列番号７６のペプチド）、Ｈ１２Ｎ５インフルエンザＡ（配列番号７７のペプチド）、またはＨ１３Ｎ６インフルエンザＡ（配列番号７８のペプチド）の赤血球凝集素のもの。
【０１５５】
他の特定の実施形態によれば、小胞体の中に取り込むための当該シグナルペプチドは、追加のキメラポリペプチドの目的のペプチドまたはポリペプチドの一部を形成してよい。例えばこれは、目的の当該ペプチドまたはポリペプチドが膜タンパク質またはサイトカインの場合である。
【０１５６】
単独でまたは前記実施形態と組合せて、小胞体の中へ取り込むための当該シグナルペプチドは、追加のキメラポリペプチドの膜ドメイン（特に膜貫通型ドメイン）の一部分を形成してよい。例えばこれは、当該ポリペプチドの膜貫通型ドメインまたは膜ドメインの１つが７回膜貫通型ドメインを有する受容体由来の場合である。
【０１５７】
あるいは、他の実施形態によれば、取り込みのための当該シグナルペプチドは、３つの主要なドメイン（すなわち、ドメイン：目的のペプチドまたはポリペプチド；膜貫通型ドメイン；ＣＤドメインまたはその変異誘導体）のいずれかの部分を形成することなく、そして結果として、これらの３つのドメインに加えて追加のキメラポリペプチドの中に加えられる。そして、これを当該ポリペプチドの直鎖状配列の異なる位置に置いてもよいが、通常当該ポリペプチドの一端であり、そして好ましくは当該ポリペプチドのＮ末端位である。
【０１５８】
小胞体の中に取り込むための第二のシグナルペプチドを、追加のキメラポリペプチド中に加える場合、適当であれば膜ターゲティングを増強するために使用できる。
【０１５９】
成熟形態では、特に膜小胞、例えばエキソソームの膜に固定される場合、追加のキメラポリペプチドは一般的に小胞体の中に取り込むためのＮまたはＣ末端シグナルペプチドを全くまたはそれ以上有しない；この機能が満たされた後は、ＮまたはＣ末端のシグナルペプチドは、例えば小胞体またはゴルジで、タンパク質切断によってポリペプチドから分離されてもよい。
【０１６０】
本発明はまた、本発明のキメラポリペプチド、および／あるいは１または２以上の本発明の当該キメラポリペプチドの分解産物を含んでなる、膜小胞、より正確にはエキソソームに関し、適当な場合にこの（これらの）１または２以上の分解産物は、Ｉ型および／またはＩＩ型の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と結合される。
【０１６１】
本発明のキメラポリペプチド並びに／あるいはその１または２以上の分解産物は、これらの膜内標的ドメインまたはこれらの１つを介して、あるいはこれ（これら）が結合する（Ｉ型またはＩＩ型の）ＭＨＣ分子の膜ドメインを介して、当該膜小胞の膜に固定される。特定の実施形態によれば、当該分解産物は、目的のペプチドまたはポリペプチドの断片、特に当該目的のペプチドまたはポリペプチドの１または２以上のエピトープ含んでなるか、またはこれらから成る断片含んでなるか、またはこれから成る。特定の実施形態では、本発明の膜小胞、および、より正確には本発明のエキソソームは、本発明のキメラポリペプチド、および／または１または２以上の任意の分解産物に加えて、１もしくは２以上の本願に記載の追加のキメラポリペプチド、および／またはこの（これら）追加のキメラポリペプチドの１もしくは２以上の分解産物を含んでなり、適当な場合に追加のキメラポリペプチドの分解産物はＩ型および／またはＩＩ型の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合される。
【０１６２】
あるいは、１もしくは２以上の追加のキメラポリペプチドを含んでなる本発明の小胞は、以下に「追加の膜小胞」（特に「追加のエキソソーム」）と呼ばれる膜小胞（特にエキソソーム）に結合して使用することもでき、そしてそれは１もしくは２以上の本発明のキメラポリペプチド、および／または本願に記載のこの（これらの）追加のキメラポリペプチドの１もしくは２以上の分解産物を含んでなり、必要であれば、この（これらの）分解産物はＩ型および／またはＩＩ型の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合される。
【０１６３】
一例として、本発明の膜小胞、より正確には本発明のエキソソームは、以下のものを含み得る：
−  一方では、本発明のキメラポリペプチド（および／または１または２以上の任意の分解産物）、ここで、目的のペプチドまたはポリペプチドが細胞質タンパク質、例えば、抗原、Ｇタンパク質、酵素（例えば、１または２以上の標的細胞で欠損している細胞質酵素）、標的細胞に有害な効果、対照的に有益な効果を有し得る毒素またはその他の細胞質ペプチドまたはポリペプチド、あるいは特定の核酸に結合することができるペプチドまたはポリペプチドであり、そして本発明の当該キメラポリペプチドは、随意に、例えば一次フルオロフォアによってタグを付与される。
−  もう一方では、追加のキメラポリペプチド（および／またはもしあれば１または２以上の分解産物）、ここで、目的のペプチドまたはポリペプチドは、例えば受容体（例えば、複数の膜ドメインを有する受容体、特にＣＸＣＲ４またはＧＰＲ受容体）または標的細胞または特定のタイプの標的細胞（例えば、腫瘍細胞または代謝もしくは機能障害を有する細胞）を標的化する
のに使用できるその他のペプチドまたはポリペプチドであり、そして当該追加のキメラポリペプチドは、例えば、（一次フルオロフォアと異なる）二次フルオロフォアによって好ましくはタグを付与される。
【０１６４】
本発明のそのような小胞は、多くの適用を有することができる；特に、標的細胞の内容物を修飾するのにそれを使用できる。それが細胞もしくは細胞集団、またはヒトもしくはヒト以外の宿主に投与されるとき、この小胞は、この小胞の追加のキメラポリペプチドの中に存在する目的のペプチドまたはポリペプチドを介して（または１または２以上の任意の分解産物を介して）標的化された特定の細胞（例えば、樹状細胞または腫瘍細胞）によって取り込まれる。当該小胞の取り込みによって、標的細胞はこの小胞内に存在する本発明のキメラポリペプチドの目的のペプチドまたはポリペプチドを取り込む；当該目的のペプチドまたはポリペプチドの性質によって、これは様々な適用を有することができる−特に、それは以下のことに使用できる
−  （例えば、酵素を加えることによって）標的細胞を処理する；
−  対照的に、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を破壊する；または
−  例えば、本発明のキメラポリペプチドの目的のペプチドまたはポリペプチドへの核酸の結合を検出することによって、診断をおこなう；
−  例えば本発明のキメラポリペプチドに存在する細胞質抗原に向けて、免疫応答を引き起こす；
−  タンパク質をスクリーニングする、および／または（例えば、使用した２つのフルオロフォア間の任意のエネルギー移動を検出することにより）タンパク質間の任意の相互作用を分析する。
【０１６５】
本発明の膜小胞はまた、それが追加のキメラポリペプチドを含んでなるか否かに関係なく、当該目的のペプチドまたはポリペプチドあるいはこれらの断片に対する、ワクチン接種のためにまたはワクチン接種以外のために、インビボまたはインビトロで、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生するために特に使用してよい。このような抗体は、特に診断で、またはタンパク質相互作用を研究するため、特に、目的のペプチドまたはポリペプチドあるいはこれらの断片との相互作用が可能な分子、例えば薬剤またはサイトカイン等の高処理スクリーニングを実施するために使用してよい。
【０１６６】
さらに、本発明の膜小胞は、それが追加のキメラポリペプチドを含んでなるか否かに関係なく、宿主（ヒトまたはヒトでない）において、目的のペプチドまたはポリペプチドの由来である腫瘍に対する、あるいはウイルス、細菌または寄生虫に対する体液および／または細胞応答を誘発または促進するために、インビボで、免疫付与に使用してよい。本発明の膜小胞によって、特に本発明のエキソソームによって誘発または促進される免疫応答は、エキソソームに結合するポリペプチドの性質に応じて、免疫寛容誘発応答または防御応答であってよい。例えば、免疫寛容誘発応答は、宿主のぜんそくとの闘病または移植片の受容を可能にする。
【０１６７】
追加のキメラポリペプチド（および／またはもしあれば１または２以上の分解産物）を含んでなる膜小胞では、当該追加のキメラポリペプチドの中に起こる目的のペプチドもしくはポリペプチド、または当該目的のペプチドまたはポリペプチドの断片は、膜小胞の外部の表面で、一部または全体が露出される。結果として、追加のキメラポリペプチドを含んでなる本発明の小胞は特に、インビボまたはインビトロで、当該目的のペプチドまたはポリペプチドあるいはこれらの断片と直接または間接的に相互作用している原核細胞または真核細胞あるいはウイルス（例えばファージ）あるいはリボソームを産生または選択するために使用されてよい。好ましい実施形態では、追加のキメラポリペプチドの当該目的のペプチドまたはポリペプチドあるいは当該目的のペプチドまたはポリペプチドの断片は、膜小胞の表面でこの天然の立体構造に（部分的にまたは完全に）露出される。
【０１６８】
特定の実施形態によれば、追加のキメラポリペプチドの目的のペプチドまたはポリペプチドあるいは当該目的のペプチドまたはポリペプチドの断片は、本発明の膜小胞の膜に部分的にまたは完全に含まれる、および／あるいは当該膜小胞の細胞質の画分に部分的にまたは完全に含まれる。
【０１６９】
活性成分が本発明の１または２以上のキメラポリペプチド、あるいは１または２以上の本発明の膜小胞、特に本発明の１または２以上のエキソソームを含んでなる、組成物、特に治療組成物（例えば、医薬組成物）または免疫原性組成物もまた、本発明の一部を形成する。
【０１７０】
特定の実施形態によれば、当該組成物はさらに以下のものを含んでなる：
−  １もしくは２以上の追加のキメラポリペプチド；または
−  １もしくは２以上の追加の膜小胞（特に１もしくは２以上の相加エキソソーム）。
【０１７１】
あるいは、当該組成物は、別の組成物、特に別の治療または免疫原性組成物と共に使用でき（特に、ヒトまたはヒト以外の宿主に投与でき）、そしてそれは、１もしくは２以上の追加のキメラポリペプチドおよび１もしくは２以上の相加膜小胞を含んでなる。
【０１７２】
特定の実施形態によれば、当該組成物は、１または２以上のビヒクル、希釈剤、および／またはアジュバントあるいはこれらの組合せの１つをさらに含んでなる。注射可能な投与の場合に、水溶液、非水溶液または等張液中の形成を選択してよい。
【０１７３】
本願では、用語「ビヒクル」は、本発明の活性物質の生物活性の有効性を変更しない任意の担体（すなわち、少なくとも１つの活性成分を輸送することができる任意のもの）を意味する。当技術分野で多くのビヒクルが知られる。例えば、使用されるビヒクルは、水、食塩水、血清アルブミン、リンガー溶液、ポリエチレングリコール、水混和性溶媒、糖、結合剤、賦形剤、顔料、植物油または鉱油、水溶性高分子、界面活性剤、増粘剤またはゲル化剤、化粧品用物質、可溶化剤、安定剤、防腐剤、アルカリ性化剤または酸性化剤、あるいはこれらの組合せの一つであってよい。
【０１７４】
本願では、用語「希釈剤」は、希釈用物質を意味し、そして溶解性希釈剤および不溶性希釈剤が含まれる。一般的に、活性成分が溶解性の場合には不溶性希釈剤が使用され、そして活性成分が不溶性の場合には溶解性希釈剤が使用される。「不溶性」活性成分は、水媒体中では完全に不溶性であってよく、または水媒体で制限的な溶解度（すなわち、１．０〜７．５のｐＨで、水２５０ｍＬ中に１０ｍｇ／ｍＬ未満の溶解度）を有してよい。不溶性希釈剤の例としては、微結晶性セルロース、シリコン含有微結晶性セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、第二リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸マグネシウム、リン酸三カルシウム等が含まれる。溶解性希釈剤の例としては、マンニトール、グルコース、ソルビトール、マルトース、デキストレート、デキストリン、ブドウ糖等が含まれる。
【０１７５】
本願で使用される用語「アジュバント」は、免疫原性組成物の内容物、特にワクチンに添加する物であって、当該組成物が投与される（ヒトまたはヒトでない）宿主で誘発される免疫反応の強度を増加する生成物を意味する。アジュバントは、当該組成物の投与後に当該哺乳類が産生可能な特定の抗体の量を特に増加することができ、したがって免疫付与の有効性を増加する。アジュバントは、使用した抗原単独では誘発される免疫反応が弱過ぎて、良好な防御を提供し、宿主に投与する抗原の量を減少させ、あるいは例えば粘膜への投与の場合に当該組成物の投与の特定の方法を促進することができない場合に特に有効である。特に、本発明の文脈で使用することができるアジュバントは、サポニン、リン酸アルミニウム（ａｌｕｍ）、ペプチドグリカン、炭水化物、ペプチド、例えばムラミルジペプチド（Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、ＭＤＰ）、油型／水型エマルション、多糖、サイトカイン、ホルモン、リンペットヘモシアニン、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドのファミリー由来のアジュバント、ポリＩＣファミリー由来のアジュバント、モノホスホリルリピッドＡファミリー由来のアジュバントおよび核酸、特に細菌のＤＮＡ、ならびにアジュバント効果を有するタンパク質、例えば成長因子またはサイトカイン、より具体的にはＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ４をコードするＤＮＡが含まれる。
【０１７６】
好適な実施形態では、１また２以上の、ビヒクル、希釈剤および／またはアジュバント、あるいはこれらの組合せは、薬学的に許容される物質または薬学的に許容される物質の組合せであり、すなわち処置または予防目的で宿主（例えばヒト、人間以外の哺乳類または鳥）へ投与するのに適当である。したがって、このような物質または物質の組合せは、好ましくは投与される宿主に対して無毒である。
【０１７７】
本発明はまた、普遍的遺伝暗号に従って、並びにこのコードの縮重を考慮した、キメラポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチドに関する。用語「ポリヌクレオチド」は、任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子（一本鎖または二本鎖）を包含する。このポリヌクレオチドは、むき出し（ｎａｋｅｄ）である、あるいは、クローニングまたは発現ベクター、好ましくは真核細胞での発現に適当であるベクターに挿入されてよい。このベクターは好ましくはプラスミドである。当該ポリヌクレオチドは特に、ＰＣＲによって集合されてよい。これは好ましくは２０００〜５００００ヌクレオチドを含んでなる。
【０１７８】
用語「コード」は、当該ポリヌクレオチドがコード部分のみを有することを必ずしも意味するものではない。実際、当該ポリヌクレオチドは、さらに発現の制御のための配列を含んでよく、特にプロモーター、例えば真核生物プロモーターを含んでよい。
【０１７９】
例えば、本発明のキメラポリペプチドのＣＤドメインまたは当該ＣＤドメインの変異誘導体をコードする配列として、当該ポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号４７および配列番号９４から選択される配列含んでなるか、またはこれから成る配列を含んでなる。
【０１８０】
特定の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、本願で規定される追加のキメラポリペプチドをさらにコードする。あるいは、以下に「追加のポリヌクレオチド」と呼ばれる、本発明のポリヌクレオチドは、異なったポリヌクレオチドと併せて使用でき、それは本願で規定される追加のキメラポリペプチドをコードする。
【０１８１】
特定の実施形態によれば、追加のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、小胞体の中に取り込むためのシグナルをコードする配列を含んでなる。例えば、この配列は、配列番号１、または配列番号４９から配列番号７８のペプチドをコードする配列であってよい。前述のように、この配列によってエンコードされるシグナルペプチドは、当該ポリペプチドによってコードされるポリペプチドのＮ−またはＣ−末端位に存在する場合、キメラポリペプチドの成熟のためのステップの間に切断されてよく、これは一般的に小胞体またはゴルジ体で生じる。
【０１８２】
追加のポリヌクレオチドのように、本発明のポリヌクレオチドは、制御、クローニングまたは発現エレメントの支配下に置かれてよい。
【０１８３】
従って、特定の実施形態によれば、当該ポリヌクレオチドは、クローニングまたは発現ベクター、好ましくは発現ベクター、より好ましくは真核細胞での発現に適当なベクターの中に挿入される。当該ベクターは、好ましくはプラスミドである。本発明のキメラポリヌクレオチドと追加のキメラポリヌクレオチドは、同じベクター内に挿入されても、２つの異なったベクター内に挿入されてもよい。
【０１８４】
当該ポリヌクレオチドは、通常真核生物プロモーター、好ましくは強力な真核生物プロモーター、例えばウイルスのプロモーター、例えば：ＳＶ４０ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（Rous sarcoma virus）、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、成人ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus）、これらのウイルスプロモーター由来のハイブリッドプロモーターまたは組み換え配列を含むウイルスプロモーター、から選択されるウイルスのプロモーターの支配下に置かれる。
【０１８５】
当該ポリヌクレオチドは、さらにコザック配列、特に、配列中の配列ＡＴＧがコード配列の開始コドンに相当するヌクレオチド配列ＡＣＣＡＴＧＧまたは誘導体配列ＡＣＣＡＴＧを含んでよい。
【０１８６】
さらに、当該ポリヌクレオチドは、１つのイントロンを含んでよい。
【０１８７】
特定の実施形態によれば、当該ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの、上に規定したポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチドリンカーを含んでなる。このヌクレオチドリンカーは、特に制限酵素部位含んでなるか、またはこれから成ってよい。用語「制限酵素部位」は、ポリヌクレオチド中の切断部位としてＩＩ型制限酵素によって認識される特定のヌクレオチド配列を意味する。例えば、このヌクレオチドリンカーは、それぞれ制限酵素ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、およびＳｂｆＩ−ＡｓｃＩを含んでなる、ヌクレオチド配列ＴＣＴＡＧＡもしくはＧＣＴＡＧＣ、またはＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣから構成されてよい。
【０１８８】
特定の実施形態によれば、本発明の当該ポリヌクレオチドの配列および／または追加のポリヌクレオチドの配列は、宿主（例えば真核生物宿主）、特にヒト、ヒト以外の哺乳類および／または鳥で使用するために最適化される。
【０１８９】
本発明はまた、クローニングまたは発現ベクター、好ましくはプラスミドであって、制御、クローニングまたは発現要素の調節下において、本発明のポリヌクレオチドによって構成されたポリヌクレオチド挿入物を含んでなることを特徴とするものを提供する。
【０１９０】
このクローニングまたは発現ベクターは、調節、クローニングまたは発現要素の調節下において、追加のポリヌクレオチドによって構成されたポリヌクレオチド挿入物をさらに含み得る。あるいは、このクローニングまたは発現ベクターは、調節、クローニングまたは発現要素の調節下において、追加のポリヌクレオチドによって構成されたポリヌクレオチド挿入物を含んでなる（以下に追加のクローニングまたは発現ベクターと呼ばれる）別のクローニングベクターと併せて使用できる。
【０１９１】
本発明はまた、細菌細胞培養、真核動物細胞および株細胞の初代細胞培養、本発明のポリヌクレオチドを含む当該細胞培養、本発明のクローニングまたは発現ベクター、あるいは本発明のキメラポリペプチドを含んでなる群から選択される細胞培養に関する。適当であれば、当該細胞培養は、追加のポリヌクレオチド、追加のクローニングまたは発現ベクター、または追加のキメラポリペプチドをさらに含んでなることもできる。本発明はまた、核酸、特にＤＮＡを含んでなる組成物、特に治療または免疫原性組成物であって、本発明のポリヌクレオチド、および薬学的に許容される担体、希釈剤またはビヒクル含んでなるか、またはこれらから成ることを特徴とする免疫原性組成物に関する。
【０１９２】
本発明の当該組成物は、追加のキメラポリヌクレオチドを含んでなるか、またはそれらから成る核酸をさらに含んでなることもできる。あるいは、本発明の当該組成物は、追加のポリヌクレオチド、薬学的に許容され得る支持体、希釈剤またはビヒクルを含んでなるか、またはこれらから成る、核酸を含んでなる組成物（追加と呼ばれる）と併せて（特に、ヒトまたはヒト以外の宿主に投与するのに）使用し得る。
【０１９３】
特定の実施形態によれば、当該免疫原性組成物はさらに、本願で規定するアジュバントを含んでなる。
【０１９４】
特定の実施形態によれば、当該核酸はＤＮＡである。ＤＮＡに基づく免疫原性組成物は、インビボで免疫が与えられる宿主の細胞、特に樹状細胞（特にランゲルハンス細胞）をターゲットにし、これらの細胞はワクチン化したエキソソームの優れた産生者である。従って、当該免疫原性組成物は、目的のペプチドまたはポリペプチドあるいはこれらの断片を輸送するエキソソームの当該免疫原性組成物によって免疫を有する宿主自身の細胞により、当該産生を誘発することが可能かもしれない。
【０１９５】
特定の実施形態によれば、１または２以上の当該免疫原性組成物はワクチン、特にＤＮＡワクチンである。
【０１９６】
本発明はまた、遺伝子組換えのエキソソーム産生細胞、特に免疫システムの細胞、より具体的にはマスト細胞、リンパ球、特にＢおよびＴリンパ球、並びに樹状細胞、特にランゲルハンス細胞から選択される免疫システムの細胞に関するもので、当該細胞は本発明の１または２以上のポリヌクレオチド、本発明のクローニングまたは発現ベクター、必要であれば、１もしくは２以上の追加のポリヌクレオチド、または追加クローニングもしくは発現ベクターと再結合すること、あるいは本発明の膜小胞および／または追加の膜小胞を吸収することを特徴とする。さらに本発明はまた、薬剤としての使用のための、本発明のキメラポリペプチド、本発明の１または２以上の膜小胞（特に本発明の１または２以上のエキソソーム）、本発明のポリヌクレオチド、ならびに本発明の組成物に関する。
【０１９７】
前記要素は、特に、細菌、ウイルスまたは寄生虫感染、または腫瘍、あるいは機能的もしくは代謝的欠損（特に酵素の欠損）の予防および／または処置での使用され得る。これらは、特に、（ヒトまたはヒトでない）宿主において、インビボで、目的のペプチドまたはポリペプチドが由来する腫瘍、ウイルス、細菌または寄生虫に対する体液性および／または細胞性応答を誘発または促進するために（すなわち、増幅するために）、特に、免疫付与での使用を目的とする。これらは特に、目的のペプチドまたはポリペプチドに対する特定のＴ ＣＤ４および／またはＴ ＣＤ８応答を誘発または増幅するために、並びに／あるいは目的のペプチドまたはポリペプチドに対するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体、特に１または２以上の立体構造エピトープ含んでなるか、またはこれらから成るペプチドまたはポリペプチドに対する抗体を産生するために、インビボで使用されてよい。
【０１９８】
特定の実施形態では、これらの要素は、インビボにおいて予定された細胞を標的化するのに使用される。
【０１９９】
前記要素は、（例えば、酵素を加えることによって）ヒトまたはヒト以外の宿主の標的細胞を処置する、および／またはヒトまたはヒト以外の宿主の標的細胞を破壊する、および／または例えば、ヒトまたはヒト以外の宿主（例えば、腫瘍細胞）の本発明のキメラポリペプチド内に存在する細胞質抗原に対して、免疫応答を引き起こす、および／または（例えば、本発明のキメラポリペプチドの目的のペプチドまたはポリペプチド結合する核酸を検出することによって）診断を実施するために特に使用できる。
【０２００】
さらに、前記要素は、（例えば、利用した２つのフルオロフォアの間の任意のエネルギー移動を検出することによる）タンパク質をスクリーニングするためおよび／またはタンパク質間の任意の相互作用を分析するためにインビトロで使用できる。
【０２０１】
本発明はまた、機能的もしくは代謝的な欠損、特に酵素の欠損、あるいは腫瘍または病原体もしくは病原性物質による感染症、特に細菌、ウイルスまたは寄生虫感染症の予防および／または処置を目的とした薬剤の製造のための、これらの要素のうちの１つの使用にも関する。活性成分が本発明のポリヌクレオチド（および必要であれば、追加のポリヌクレオチド）あるいは本発明の１または２以上の膜小胞（および必要であれば、１もしくは２以上の追加の膜小胞）である、本発明の組成物の（ヒトまたはヒトでない）宿主への投与の後に、この宿主のエキソソーム産生細胞、特に樹状細胞は、本発明のキメラポリペプチドおよび／あるいはこれらの後者の分解産物を含んでなるエキソソームを産生するであろう。なぜならば、この分解産物は本来主要組織適合遺伝子複合体の分子と結合しやすいからである。これらの膜小胞は、目的のペプチドまたはポリペプチドに対する免疫応答を誘発または促進できるであろう。
【０２０２】
本願の文脈で、「宿主」は、ヒトまたはヒトでない哺乳類を意味する。
【０２０３】
本願で使用される用語「ヒトでない動物」には、任意の人間以外の哺乳類、特にげっ歯類（特にマウス、ラット、ハムスターまたはウサギ）、サル、ラクダ、ネコ、イヌ、ウマ、ラバ、ウシ、ヒツジ、ブタが含まれ、またトリ、特にニワトリが含まれる。
【０２０４】
本願で使用される表現「感染」は、（ヒトまたはヒトでない）宿主が病原体または病原性物質へ、特に本願で規定するエンベロープを有するウイルスへ曝露されていることを意味する。特に、このような感染は、誘発されたまたは当該感染症を併発している疾患の臨床徴候を生じるように進行し得る。したがって、用語「感染」はまた、病原体または病原性物質への曝露に続く、（ヒトまたはヒトでない）宿主に現れている任意の臨床徴候、症状または疾患を包含する。例えば、本願の文脈では「ウイルス感染」または「細菌感染」には、ウイルス、細菌または寄生虫の混入の最初期段階、中間段階、および混入の最終段階、並びにウイルス、細菌または寄生虫による宿主への混入の結果である様々な疾患が含まれ；これにはまた病原体のゲノムの全部または一部の存在も含まれる。
【０２０５】
用語「予防」は、感染または腫瘍、あるいはまたはその他の病理、特に機能的もしくは代謝的な欠損（例えば、酵素の欠損）の臨床徴候または症状が出現する間の遅延の任意の程度、並びに感染のまたは腫瘍における臨床徴候または症状の重症度における抑制の任意の程度を意味し、感染またはガンの完全な予防を含むがこれに限定されない。これは、本願に記載のキメラポリペプチド（特に本発明のキメラポリペプチド）、本願に記載のポリヌクレオチド（特に本発明のポリヌクレオチド）、本願に記載の膜小胞（特に本発明の膜小胞）または本願に記載の組成物（特に本発明の組成物）が、疾患の任意の臨床徴候または症状が出現する前に、病原体または病原性物質へ曝露されやすい並びに／あるいは腫瘍またはその他の病状、特に機能的もしくは代謝的な欠損が発症しやすい宿主へ投与されることが必要である。当該宿主が感染に関与する生物または病原性物質へ曝露される前に、または曝露の瞬間に予防的投与を行ってよい。このような予防的投与は、任意の続発性感染症の重症化を予防および／または減少することに役立つ。本願の文脈において予防はまた、感染症またはガン、あるいはその他の病理の総合的な予防を包含する。
【０２０６】
用語「処置」は、本願に記載のキメラポリペプチド（特に本発明のキメラポリペプチド）、本願に記載のポリヌクレオチド（特に本発明のポリヌクレオチド）、本願に記載の膜小胞（特に本発明の膜小胞）または本願に記載の組成物（特に本発明の組成物）の１つが、病原性生物または物質への曝露の瞬間に、曝露後にまたは感染の臨床徴候または症状の出現後にあるいは腫瘍の出現後に宿主へ投与された場合に、これらによって宿主に産生される治療効果を意味する。ウイルスによる混入後に本発明の活性物質が宿主へ投与される場合、これらは一次感染段階の間に、無症候期の間にまたは疾患の臨床徴候または症状の出現後に投与されてよい。
【０２０７】
用語「処置」には、本発明の活性物質によって得られる任意の治療効果、および（ヒトまたはヒトでない）宿主で観察される臨床徴候または症状における改善、並びに宿主の健康状態における改善が含まれる。したがって、用語「処置」は、特に、ウイルス、細菌もしくは寄生虫の感染、または腫瘍もしくはその他の疾患および／あるいは感染の有害な影響の増殖、あるいは腫瘍もしくはその他の病理の出現の遅延、減少、遮断並びに停止を包含する；処置は必ずしも、感染または腫瘍の全臨床徴候および／または疾患の全症状の完全な解消も、ウイルス、細菌、寄生虫または腫瘍細胞、あるいは機能的に欠損した細胞の完全な除去も必要でない。
【０２０８】
したがって、本発明の活性物質は、病原性生物または物質への曝露および感染または腫瘍の発達のリスクを呈する宿主へ投与することができ（予防）、あるいは宿主の病原体または病原因子への曝露後に、特に疾患の初期臨床徴候または症状の出現後に、例えばウイルス、細菌、寄生虫または腫瘍の特定のタンパク質あるいは抗体が、宿主の血中に検出された後に投与することができる（処置）。
【０２０９】
本発明はまた、ウイルス、細菌または寄生虫感染あるいは腫瘍またはその他の病理を予防および／または処置する方法に関し、当該方法は、インビボでの、キメラポリペプチド、本発明の１または２以上の膜小胞（特に本発明の１または２以上のエキソソーム）、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の免疫原性組成物の、これを必要とする宿主への投与のための少なくとも１つのステップを含んでなる。当該処置方法は、特に、当該宿主において、インビボで、目的のペプチドまたはポリペプチドの由来である腫瘍、ウイルス、細菌または寄生虫に対する体液性および／または細胞性応答に適当であり、また当該応答を誘発または促進することを意図する。
【０２１０】
本願で使用する用語「投与」および「投与する」には、選択された投与経路にかかわらず、任意の投与が含まれる。
【０２１１】
投与経路および薬量は、様々なパラメータに基づいて、例えば処置を受ける宿主の状態、感染のタイプおよび感染の重症度または腫瘍のサイズに依存する。
【０２１２】
本発明の１または２以上の膜小胞（特に本発明の１または２以上のエキソソーム）のようなキメラポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドあるいは本発明の組成物は、乾燥、固体形態で（特に錠剤、粉末、カプセル、丸剤、顆粒、坐薬、高分子カプセルまたは圧縮錠剤、より具体的には即放出性錠剤、胃耐性錠剤または遅放出性錠剤として）、ゲル形態または溶液形態であるいは液体懸濁液として（特にシロップ、注射可能な溶液、輸液または携帯用溶液、ネブライザー、微小胞、あるいはリポソームとして）、あるいはパッチの形態で、ヒトまたはヒトでない宿主へ投与することができる。これらの化合物はまた、使用時に適当な希釈剤を使用して再構成するための乾燥用量（粉末、凍結乾燥体等）の形態でよい。さらに、これらは、単回投与（単回用量）または複数回投与（複数回用量）の形態で投与用に包装してよい。
【０２１３】
本発明の活性物質は、経腸、非経口（静脈内、筋肉内または皮下）、経皮（transcutaneous）（または、経真皮（transdermal）もしくは経皮吸収（percutaneous））、皮膚、経口、粘膜、特に頬側−粘膜、経鼻、眼科的、耳鼻科的（耳内）、経腟、直腸、または胃内、心臓内、腹腔内、肺内もしくは気管内への投与のために処方できる。
【０２１４】
本発明の組成物（特に本発明の免疫原性組成物）の有利な効果を増強するために、特定の時間間隔の後に、１回または複数回繰り返される、複数の連続的な投与形態で、投与を実行することを可能にし得る。さらにこれらは、もう一つの治療薬剤、特に抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗寄生虫剤または抗腫瘍剤と共に投与される。
【０２１５】
ワクチン接種での使用との関連において中では、最初に本発明のポリヌクレオチドに基づく免疫原性組成物、特に本発明のＤＮＡワクチンで、その後本発明の膜小胞、小胞に基づく免疫原性組成物または免疫原性組成物で宿主に免疫を与えることもまた好適かもしれず、この活性成分は、本発明のキメラポリペプチドまたはこれらの１または２以上の断片である（当該キメラポリペプチドまたは１もしくは２以上のこの断片は、精製または化学合成によって得ることができる）。
【０２１６】
また、最初に本発明の膜小胞またはこの小胞に基づく免疫原性組成物で、その後本発明のポリヌクレオチドに基づく免疫原性組成物、特に本発明のＤＮＡワクチンで宿主に免疫を与えることも好適かもしれない。
【０２１７】
本発明のポリヌクレオチドに基づく免疫原性組成物、および特に本発明のＤＮＡワクチンは、好ましくは針およびシリンジまたは無針注射器、特にＤＮＡが積まれた金、タングステンまたは白金のマイクロビーズを宿主の細胞内に推進することができる圧縮空気銃（「微粒子銃」または遺伝子銃）、例えば供給業者BioRad製の「ヘリオス遺伝子銃システム（Helios（登録商標） Gene Gun System）」を使用して、筋肉内にまたは皮下に宿主へ投与される。
【０２１８】
ヒトまたはヒトでない宿主へ投与される活性成分の量は、治療上有効な量、すなわち薬量上活性のある、十分な量、並びに得られる顕著な効果に必要である時間のため、および特に本願で規定する予防または処置を目的とした投与の状況の中で、宿主へ顕著な利益を供するための量である。治療上有効な量はまた、１もしくは２以上の活性成分に起因する任意の有毒または有害な作用を、有利な効果が上回る量である。このような量は、ウイルス複製、細菌増殖または腫瘍の顕著な様式で成長を抑制する、あるいは病原因子または病原体によって誘発される任意の存在する感染を消滅、縮小または改善するのに十分な量に相当する。治療上有効な量は、宿主の感染の状態、年齢、性別または体重等の要因の関数に従って変化する。薬量学的投与計画（posological regimes）は、最適な治療効果を得るために調整してよい。本発明はまた、インビボで膜小胞、特にエキソソームを得るための方法に関し、当該方法は、（ヒトまたはヒトでない）宿主への、本発明のキメラポリペプチド（適当であれば、追加のキメラポリペプチド）の投与、本発明の１または２以上の膜小胞、特に本発明の１または２以上のエキソソーム（適当であれば、１または２以上の追加の膜小胞）、本発明のポリヌクレオチド（適当であれば、追加のポリヌクレオチド）または本発明の組成物（適当であれば、追加の組成物）の投与のためのステップを含んでなることを特徴とする。この方法は、特に腫瘍あるいは病原体または病原性物質による感染、特に細菌、ウイルスまたは寄生虫の感染の予防および／または処置のための方法の中で実施されてよい。
【０２１９】
本発明はさらに、インビトロでの膜小胞および特に目的のペプチドまたはポリペプチド並びに／あるいはこの目的のペプチドまたはポリペプチドの分解産物を含んでなるエキソソームの産生のための方法に関し、この分解産物は適当であれば場合により、主要組織適合遺伝子複合体分子と結合する。当該方法は、次のステップを含んでなる：
ａ）目的のペプチドもしくはポリペプチドを含んでなるポリペプチドをコードする、本発明の１または２以上のポリヌクレオチドを、エキソソーム産生細胞の中へ導入すること、あるいは、目的の当該ペプチドもしくはポリペプチドを含んでなるポリペプチド、および／またはこのポリペプチドの分解産物を含む本発明の１または２以上の膜小胞と、あるいは当該小胞に基づく組成物とエキソソーム産生細胞を接触させること；
ｂ）当該エキソソーム産生細胞を培養すること；
ｃ）前記エキソソーム産生細胞によって産生される膜小胞、特にエキソソームを回収すること。
【０２２０】
特定の実施形態によれば、エキソソーム産生細胞は、ＨＥＫ２９３株の細胞、または誘導体株、あるいは免疫システムの細胞である。特に、免疫システムの細胞は、マスト細胞、リンパ球、特にＴおよびＢリンパ球、並びに樹状細胞から選択されてよい。免疫システムの細胞は、好ましくは樹状細胞、例えばランゲルハンス細胞である。
【０２２１】
特定の実施形態によれば、ステップａ）は、本発明の１または２以上の膜小胞、特に本発明の１または２以上のエキソソームを樹状細胞と接触させることからなる。
【０２２２】
特定の実施形態によれば、当該方法はさらにステップａ）およびｂ）の間に中間ステップを含んでなり、この間にエキソソームの分泌を誘発および／または増加するためにあるいは規定した量を有するエキソソームを得るために、特に特定の細胞タンパク質、例えばタンパク質ＩＣＡＭに関してエキソソームの組成物における特異性を誘発するために、細胞が選択および／または刺激される。
【０２２３】
特定の実施形態によれば、ステップａ）における本発明の１または２以上のポリヌクレオチドのエキソソーム産生細胞中への導入は、核酸の導入または形質導入によって実行される。
【０２２４】
特定の実施形態によれば、ステップｃ）は、分画遠心、限外濾過、担体への吸着、あるいは任意の他の方法によって、エキソソームを精製することにより実行され、膜小胞、特にエキソソーム産生細胞の培養上清から開始される。
【０２２５】
この方法によって得られる膜小胞、特にエキソソームはまた、本発明の一部を形成する。
【０２２６】
本発明はまた、目的のペプチドまたはポリペプチドに対する抗体を産生するための、本発明の膜小胞（適当であれば、１または２以上の追加の膜小胞）、本発明の１または２以上の膜小胞に基づく組成物（適当であれば、１または２以上の追加の組成物）の使用に関し、そしてこの抗体は診断または研究での使用が意図される。
【０２２７】
本発明はまた、膜小胞、特にエキソソームの表面に発現される目的の１または２以上の抗原性ペプチドまたはポリペプチドに対するポリクローナル血清を調製するための方法に関し、当該方法は次のステップを含んでなる：
ａ）アジュバントと結合させてまたは結合させずに、本発明の膜小胞、本発明の免疫原性組成物または本発明のポリヌクレオチドをヒトでない動物へ適当であれば繰り返し投与すること；並びに
ｂ）１もしくは２以上の、目的の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを認識することができる、形成された抗体を回収すること。
【０２２８】
特定の実施形態によれば、ステップａ）は、ヒトでない動物の屠殺のためのステップが続く。
【０２２９】
本発明はまた、膜小胞、特にエキソソームの表面上に発現される１または２以上の抗原性ペプチドまたはポリペプチドに対するモノクローナル抗体を調製するための２つの方法に関する。第一の方法は次のステップを含んでなる：
ａ）本発明の膜小胞、本発明の免疫原性組成物または本発明のポリヌクレオチドが、適当であればアジュバントと結合して投与された、そして適当であれば繰り返しの投与により投与された、（ヒトまたはヒトでない）宿主、例えばＢａｌｂ／ｃマウスから得られた骨髄腫細胞、脾臓細胞に融合すること；
ｂ）抗体の産生が可能な条件下で雑種細胞を培養および選択すること；
ｃ）１もしくは２以上の、目的の抗原性ペプチドまたはポリペプチドに対するモノクローナル抗体を回収すること。
【０２３０】
モノクローナル抗体を調製するための第二の方法は、次のステップを含んでなる：
ａ）適当な場合にアジュバントと結合して、そして適当であれば繰り返される投与によって、本発明の膜小胞、本発明の免疫原性組成物または本発明のポリヌクレオチドを投与した（ヒトまたはヒトでない）宿主、例えばＢａｌｂ／ｃマウスから得られた、造血細胞由来の、より具体的には血液細胞由来の抗体産生細胞、例えばリンパ球またはリンパ芽球を不死化すること；
ｂ）抗体の産生が可能な条件下で不死化細胞を培養および選択すること；
ｃ）１もしくは２以上の、目的の抗原性ペプチドまたはポリペプチドに対するモノクローナル抗体を回収すること。
【０２３１】
特に、本発明は、細胞質抗体を製造するために使用できる。
【０２３２】
ステップａ）における抗体産生細胞の不死化は、特にこれらの細胞を不死化ウイルスに感染させることによって実行されてよい。この不死化ウイルスは、ヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バール（Epstein-Barr）ウイルスであってよい。この不死化はまた、不死化要素を有する抗体産生細胞のゲノムの改変により実行されてよい。この不死化成分は、ウイルス成分、例えばヘルペスウイルスからの成分、あるいは細胞遺伝子、例えばテロメラーゼのための遺伝子であってよい。
【０２３３】
ポリクローナル血清を調製するための方法またはモノクローナル抗体を調製するための方法の中で、本発明の膜小胞、免疫原性組成物またはポリヌクレオチドが投与されるヒトでない動物は、特にげっ歯類（特にマウス、例えばＢａｌｂ／ｃマウス、ラット、ハムスターまたはウサギ）、鳥、特にニワトリ、またはラバであってよい。
【０２３４】
本発明のモノクローナル抗体の調製のための２つの方法の特定の実施形態によれば、ステップａ）の脾臓細胞または抗体産生細胞は、ヒトでない宿主から得られており、そして当該ヒトでない動物の屠殺のステップが続く。
【０２３５】
必要であれば、本発明の抗体の調製のための方法によって生産されるモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、「ヒト化」されてもよく、すなわち最大数の原種の定常断片Ｆｃをヒト断片で置換するように、遺伝子操作によって調整されてよい。
【０２３６】
本発明はまた、当該目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいは当該目的のペプチドまたはポリペプチドの断片と相互作用することができる、（特にインビトロでの）特定のパートナーの検出のための、本発明のキメラポリペプチド（適当であれば、追加のキメラポリペプチド）、本発明の１または２以上の膜小胞（適当であれば、１または２以上の追加の膜小胞）あるいは本発明の組成物（適当であれば、追加の組成物）の使用に関する。本願はまた、インビトロで、目的のペプチドまたはポリペプチドあるいは当該目的のペプチドまたはポリペプチド断片と相互作用している分子のスクリーニングのための方法、あるいは当該分子を産生している細胞を選択するための方法に関し、当該方法には：
ａ）本発明の膜小胞を、追加のキメラポリペプチド内に存在する当該目的のペプチドまたはポリペプチドと相互作用しやすい１または２以上の分子と接触させること；
ｂ）当該目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいは当該目的のペプチドまたはポリペプチドの断片および、１または２以上の当該分子との間の任意の相互作用を検出すること、が含まれる。
【０２３７】
当該目的のペプチドまたはポリペプチドおよび任意のパートナーの間、特にタンパク質およびこのリガンドの間の相互作用は、タンパク質相互作用の証拠となり得る任意の技術を使用することによって、例えば免疫共沈降実験を使用することによって、例えばＥＬＩＳＡ、例えばフロー細胞蛍光定量法（フローサイト蛍光測定法）、例えばＰＡＧＥ−ＳＤＳ電気泳動を使用することによって、あるいはウエスタン型のトランスファー（ウエスタンブロット）によって、並びにタンパク質、特にタンパク質およびこのリガンド間の相互作用を任意の高処理スクリーニング技術、例えばイノシトールリン酸、ｃＡＭＰ、またはカルシウムの変化を測定する技術によって、あるいは分子間または分子の２つのドメイン間のエネルギー移動（例えばＦＲＥＴまたはＢＲＥＴ技術）によって、インビトロで説明し得る。
【０２３８】
特定の実施形態によれば、本発明のスクリーニング方法のステップａ）で使用される膜小胞は、少なくとも１つの目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいは少なくとも１つのこれらの断片が、部分的にまたは完全に、当該膜小胞の外側に露呈されているものである。目的のペプチドまたはポリペプチドは特に、複数の膜貫通型ドメインを有する受容体、例えば受容体ＣＸＣＲ４、または単回の膜貫通型ドメインを含んでなる受容体、例えばＣＤ４またはＥＧＦ−Ｒ１であってよい。
【０２３９】
最後に、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるキットおよび使用説明書に関する。
【０２４０】
本発明の他の特徴および有利な点は、下記の実施例および図から明らかになるであろう。
【実施例】
【０２４１】
実施例１
方法および装置
Ｉ．プラスミドＤＮＡの調製：
Ａ．細菌の形質転換：
コンピテントＤＨ５α細菌（２００μＬ）を、ＢＬＶウイルスの野生型または突然変異体ＣＤTMをコードする試験した１３個のＤＮＡの各々の１２．５ｎｇを用いて、ヒートショックによって、並びにネガティブコントロールとして機能している挿入断片（ｐＬＰＣＸ）の欠損しているプラスミドによって形質転換した。
【０２４２】
その後、この細菌を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ／アガー培地上に、３７℃で１６時間散布した。そしてこれらを４℃で保存した。
【０２４３】
Ｂ．細菌の前培養および培養：
【０２４４】
次に、細菌の各タイプのコロニー１つを、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有する３ｍＬのＬＢ培地中で、攪拌しながら３７℃で約８時間前培養した。
【０２４５】
各前培養物を、各々２５０ｍＬのＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）を含有する２つのフラスコで、１／２００に希釈して植菌に提供した。培養は、３７℃で攪拌と伴に１２〜１６時間実施した。
【０２４６】
Ｃ．ＳＴＥＴマキシ調製：
得られた培養物を、速度３６００ｒｐｍ並びに温度４℃で２０分間遠心分離した（GR 412, Jouan）。ペレットを２５ｍＬのＳＴＥＴ緩衝液（スクロース８％、トリトンＸ１００ ５％、トリス塩酸ｐＨ８、５０ｍＭ、ＥＤＴＡ ５０ｍＭ）に溶解し、５００μＬのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍＬ；Sigma）および２５０μＬのＲＮＡ分解酵素（２ｍｇ／ｍＬ；Sigma）を添加した。そしてチューブを１００℃で１０分間インキュベートし、そして１６０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。１ｍｇ／ｍＬのタンパク質分解酵素Ｋ（Amresco）の存在下で、得られた上清を６５℃で４５分間インキュベートした。上清を除去し、そしてＤＮＡを０．１５ボリュームの酢酸ナトリウム（ＡｃＮａ）３Ｍ、ｐＨ６および０．６ボリュームのイソプロパノ−ルで沈殿させた。この溶液を４℃、次いで１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した（Aventi 30, Beckman）。得られたペレットを、同様のパラメータを使用して再度遠心分離する前に、１０ｍＬのエタノールで洗浄した。得られた核酸を乾燥し、２ｍＬのＴＥ １Ｘに溶解し、そして４℃で保存した。
【０２４７】
超らせんのＤＮＡの存在が、０．８％のアガロ−スゲル電気泳動による０．２μＬおよび１μＬの生成物の電気泳動によって、各マキシ調製生成物で確認された。
【０２４８】
Ｄ．カラム精製：
ＳＴＥＴマキシ調製は、大量のプラスミドを生成するために使用することができるが、純度を改善することが必要である。この目的のために、我々は２つのパスによってＡＸ１００カラムで１４個の各プラスミドを精製した（Kit Nucleobond PC 100, Macherey Nagel）。イソプロパノ−ルでの沈殿の後、得られた精製されたプラスミドを５００μＬのＴＥ１Ｘ中に溶解し、４℃で保存した。
【０２４９】
カラム上で得られた各溶出液および保持されなかった画分（ＦＴ＝流水式）に関して、超らせんＤＮＡの存在がアガロ−スゲル電気泳動（０．８％）によって確認された。
【０２５０】
得られた溶液のＤＮＡ濃度を、波長２６０ｎｍの分光光度法で調べた。
【０２５１】
Ｅ．アリコートの取り出しおよびエタノールでの沈殿：
各ＤＮＡタイプをアリコート５０または１００μｇでチューブ内に置き、そしてプラスミドを滅菌するために層流式フードで、エタノール（ＥｔＯＨ）およびＮａＣｌを使用して沈殿を実施した。得られたペレットを１００μｇのプラスミドあたり２００μＬのＴＥ１Ｘの量、すなわち濃度５００ｎｇ／μＬの量で溶解した。アリコート中のＤＮＡの存在が、０．８％のアガロ−スゲル電気泳動によって確認された。
【０２５２】
Ｆ．得られたアリコートの分光光度アッセイ：
アリコートを、２６０ｎｍの波長の分光光度法でアッセイした。サンプルを１／５０まで希釈し、そして最終容積５００μＬでアッセイした。
【０２５３】
Ｇ．酵素による消化：
制限酵素（New England Biolabs）：ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ ｐａｉｒ、ＸｂａＩ、ＡａｔＩＩ、ＰａｃＩ、ＳｆｏＩでのこれら各々の２０ｎｇの消化によって、各プラスミドの同一性を確認した。各消化生成物のアガロ−スゲル電気泳動（０．８％）の後に、得られるバンドの数およびこれらの分子量に従ってプラスミドを識別した。
【０２５４】
ＩＩ．キメラ発現の分析
Ａ．細胞培養：
ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および２０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを追加したＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）で、５％ＣＯ2の下で３７℃で培養した。
【０２５５】
Ｂ．形質導入：
形質導入するために、５×１０5細胞を９．６ｃｍ2ウェルごとに２ｍＬの培地上に蒔いた（６ウェルプレート）。５％ＣＯ2の下、３７℃でオーバーナイトで培養後、培地を抗生物質非含有の完全ＤＭＥＭで交換した。
【０２５６】
その後、ＮａＣｌ（０．１５Ｍ）緩衝液、６μＬのJet PEI（Qbiogen）および３μｇの試験すべき各核酸中で、錯化剤によって形成されたポリプレックスによって細胞に形質導入した；ＬａｃＺを発現しているプラスミドは、遺伝子導入のポジティブコントロールとして機能した。２４時間の培養後、５％ＣＯ2の下、３７℃で、培地を除去し２０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを有する完全ＤＭＥＭと交換した。プラスミドの最適な発現が、形質導入を開始して４８時間後に得られた。
【０２５７】
特定の場合には、ＣＤTMの分解およびターゲティングにおける小胞輸送の重要性を分析するために、我々は、小胞輸送阻害剤、すなわちバフィロマイシンおよびＬｙ２９４００２を使用した。遺伝子導入の３２時間後、濃度０．５μＭのバフィロマイシン、および１０μＭのＬｙ２９４００２の各阻害剤を培地へ添加した。
【０２５８】
Ｃ．タンパク質抽出：
遺伝子導入の４８時間後、細胞を０．５％のＴＮＥ−ＮＰ４０緩衝液で溶解し、０．１ｍＭのＰＭＳＦを添加した。遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１５分、４℃；Eppendorf 5417R）による清澄後、可溶化物をブラッドフォード法を使用して分光光度法（５９５ｎｍで）でアッセイした。
【０２５９】
各サンプルに関して、２００μｇのタンパク質を除去し、最終容積３０μＬのために溶解緩衝液を追加し、１０μＬのサンプル緩衝液４Ｘ（ＣＢ ４Ｘ：ＮａＯＨ ２００ｍＭ，ＥＤＴＡ ２０ｍＭ，ＳＤＳ ２％，ブロモクレゾールグリーン ０．０５％，グリセロール １０％）を添加した。
【０２６０】
Ｄ．エキソソームの調製：
細胞を溶解する前に培地を回収し、そして温度４℃で２０分間１００００ｒｐｍでプレ遠心分離した（Aventi 30, Beckman）。次に得られた上清を温度４℃で２時間１０００００ｇで超遠心分離した（Optima LE-80K, Ti 50 rotor, Beckman）。得られたペレットを１００μＬのＣＢ １Ｘ中に溶解した。
【０２６１】
我々はまた、エキソソームをショ糖密度勾配沈降により分析した。培地を超遠心分離した後に得られたペレットを、１００μＬの０．２５Ｍショ糖溶液中に溶解した。
【０２６２】
次に小胞を、異なる密度（モル濃度）：０．５／０．７５／１／１．２５／１．５／１．７５／２／２．５の（１．２ｍＬの）８層で調製したショ糖密度勾配上で堆積させた。次にチューブを、温度４℃で１６時間、３９０００ｒｐｍで遠心分離した（Optima LE-80K, SW 41 rotor, Beckman）。
【０２６３】
遠心分離の後、勾配を７００μＬの画分中に回収した。次いで、同容積の３０％ＴＣＡを添加することによって、タンパク質を沈殿させた。チューブを４℃で２時間保存し、次に温度４℃で２０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離した（Eppendorf, 5417R）。ペレットを５００μＬのアセトンに溶解し、そして前述のように再度遠心分離した。
【０２６４】
従って、得られたペレットを８０μＬのＣＢ１Ｘに溶解し、そしてアクリルアミド−ＳＤＳゲル泳動およびウエスタンブロットによって分析した。
【０２６５】
Ｅ．ウエスタンブロットおよび免疫沈降：
得られたタンパク質サンプルを、ウエスタンブロットによって分析した：アクリルアミドゲル（１２．５％）上で泳動および分離後、タンパク質を疎水性のＰＶＤＦ膜（Immobillon-P, Millipore）上に移動した。
【０２６６】
次の抗体を用いて免疫タグ付与することにより、ＴＭタンパク質の突然変異体の存在が明らかとなった：
・一次抗体：ＢＬＶ抗ウサギＣＤTM抗血清（希釈１／２００）
・二次抗体：ペルオキシダーゼでタグ付与した抗ウサギＩｇＧ（希釈１／５０００；Jackson Immuno Research, JIR）
【０２６７】
次の抗体を使用した免疫タグ付与することにより、トランスフェリン受容体の存在が明らかとなった：
・一次抗体：抗ヒトＴＦｒマウスＩｇＧ（希釈１／２００；Zymed）
・二次抗体：抗マウスＩｇＧ（希釈１／５０００；JIR）
【０２６８】
実験しているタンパク質濃度を選択的に増加させるために、ゲル泳動に先立って我々はまた免疫沈降をタンパク質可溶化物上で実施した。タンパク質量を標準化後、非特異的な反応を除去するために、可溶化物吸着をセファロース６Ｂ上で実施し、そして２．５μｇの次の抗体の存在下でタンパク質セファロース６Ａで免疫沈降を実施した：
・一次抗体：
抗マウスＣＤ８マウスＩｇＧ（１９／１７８）（JIR）
抗マウスＣＤ８ラットＩｇＧ（５３／６７２）（JIR）
・二次抗体：
抗マウスＩｇＧ（JIR）
抗ラットＩｇＧ（JIR）
【０２６９】
次に、得られたペレットを７０μＬのＣＢ  １．５Ｘ中に溶解した。
【０２７０】
ＩＩＩ．免疫蛍光法による局在性
Ａ．スライドの調製
層流式フード中で、カバースリップ型スライドをエタノール溶液中で滅菌し、次に１．９ｃｍ2ウェル（２４ウェルプレート）中に置いた後に３７℃で１時間ポリ−Ｌ−リジン（２５μｇ／ｍＬ、Sigma）でコーティングした。ＰＢＳで洗浄後、スライドを１ｍＬのＰＢＳ中で４℃で保存した。
【０２７１】
Ｂ．細胞培養および形質導入
「キメラ発現の分析」のセクションに記述の方法を使用して、ＨＥＫ２９３細胞を培養し、そして形質導入した。形質導入の２４時間後、細胞を３５ｍＬの完全ＤＭＥＭ中に溶解し、続いて滅菌し１ウェルあたり１ｍＬの細胞希釈の量でコーティングしたスライドを含有する、１．９ｃｍ2のウェル（２４ウェルプレート）中に分配した。従って、培養下にあった細胞を、３７℃で５％ＣＯ2の下で２４時間、インキュベートした。
【０２７２】
Ｃ．固定および透過処理
次に、細胞をホルムアルデヒド溶液（４％）で３０分間固定し、そしてトリトンＸ―１００（最終０．２％）で透過処理した。ＰＢＳでの３×１０分のすすぎの後、スライドを１ｍＬのＰＢＳを使用して４℃で保存した。
【０２７３】
Ｄ．免疫蛍光法に関するタグ
我々は様々な抗体を自由に使用でき、このことから免疫蛍光法による局在確認に複数のタグをテストすることができることが示された：
【０２７４】
ＣＤ８タグ：
Ｎ°１：マウスＩｇＧ／抗マウスＣＤ８（１９／１７８）（JIR）＋抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ（JIR）
Ｎ°２：マウスＡｓｃｉｔｅｓ／抗マウスＣＤ８（１９／１７８）（JIR）＋抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ（JIR）
Ｎ°３：ラットＩｇＧ／抗マウスＣＤ８（５３／６７２）（JIR）＋抗ラットＩｇＧ ＦＩＴＣ（JIR）
Ｎ°４：ラットＩｇＧ（５３／６．７）／抗マウスＣＤ８  ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）
【０２７５】
細胞内区画のタグ：
Ｎ°５：マウスＩｇＧ／抗ヒトＣＤ６３（Ｌａｍｐ３）（Ｚｙｍｅｄ）＋抗マウスＩｇＧ Ｃｙ３（Sigma）
Ｎ°６：マウスＩｇＧ／抗ヒトＬａｍｐ１＋抗マウスＩｇＧ Ｃｙ３（Sigma）
Ｎ°７：マウスＩｇＧ／抗ヒトＴｆ２（Ｚｙｍｅｄ）＋抗マウスＩｇＧ Ｃｙ３（Sigma）
Ｎ°８：ウサギＩｇＧ／抗カベオリン（ＢＤ）＋抗ウサギＩｇＧ ＴＲＩＴＣ（JIR）
【０２７６】
結果
エキソソームの形成プロセスの知識は不十分である。同様に、Ｅｎｖの細胞質ドメインに付随した機能は、特徴があまりない。本研究は、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）モデルがエキソソーム形成およびウイルス粒子形成の現象の研究において良好なツールであり、そしてＢＬＶのＴＭタンパク質（ＣＤTM）の細胞質ドメインは「エキソソームディスプレー」によるワクチン接種の発達のために潜在的に重要なツールである、という仮説に基づく。
【０２７７】
この潜在力を評価し、そしてＢＬＶのＴＭタンパク質のターゲティングに関与する機能、より具体的にはパルミトイル化されたまたは非パルミトイル化のシステイン残基の役割を特徴付けるために、我々は、真核細胞で、マウスＣＤ８タンパク質の外部ドメインおよびＣＤTMドメイン（ＣＤ８−ＣＤTMキメラタンパク質）を含んでなるキメラ膜貫通型タンパク質の発現を可能にする複数のベクターを開発した。野生型ＣＤ８―ＣＤTMキメラ並びに変異されたＣＤ８―ＣＤTMキメラが、発現された。
【０２７８】
ヒト細胞では、マウスＣＤ８外部ドメインは、細胞受容体を阻害しない中立の要素である。したがって、使用したキメラでは、タンパク質の外部ドメインおよび細胞構造の間の相互作用のないことが保証される。
【０２７９】
結果として、これらのキメラを、ＴＭタンパク質の外部ドメインおよび関連するＳＵタンパク質によって生じる現象を回避しながら明らかにＴＭタンパク質の細胞質および膜貫通型のドメインを特に実験するために使用できる、ということが示される。
【０２８０】
３つのタイプのコンストラクトを使用した（図１および２を参照のこと）。これらのコンストラクトから、我々は、システイン残基１、２および３（ＣＣＣと略す）において野生型または変異型ＣＤ８―ＣＤTMを発現することが可能な異なるｐＬＰＣＸ発現ベクターを開発した。次に、システイン残基をパルミトイル化することができないアラニン残基と置換するか、または置換しなかった。
【０２８１】
試験した野生型または変異型ＣＤ８―ＣＤTMタンパク質は：
・１：ｐＸ２ ＣＣＣ（野生型表現型）
・２：ｐＸ２ ＡＣＣ
・３：ｐＸ２ ＣＡＣ
・４：ｐＸ２ ＡＡＣ
・５：ｐＸ２ ＣＣＡ
・６：ｐＸ２ ＡＣＡ
・７：ｐＸ２ ＣＡＡ
・８：ｐＸ２ ＡＡＡ
・９：ｐＸ３ ＣＣＣ（野生型表現型）
・１０：ｐＸ３ ＣＡＣ
・１１：ｐＸ４−Ｃ（野生型表現型）
・１２：ｐＸ４−Ａ
・１３：ｐＸ４ ｓｔｐ（ｐＸ４ ｓｔｐは単にＥＤ、ｔｍＤおよびＣＤ８のＣＤTMのごく一部から構成される）、であった。
【０２８２】
これらのコンストラクトによりＴＭタンパク質のターゲティングのレベルで：システイン残基の変異の結果、ＴＭタンパク質の膜貫通型ドメインの完全性の重要性、およびＴＭタンパク質（ＣＤTM）の細胞質ドメインの重要性を分析することができた。
【０２８３】
Ｉ．プラスミドＤＮＡの調製：
最初に、我々は１３個の各ＤＮＡおよびネガティブコントロールとして機能する挿入断片を有しないベクター（ｐＬＰＣＸ）を大量に産生した。我々の様々なプラスミドにより形質転換した細菌を培養後、続いて得られたＤＮＡを連続してカラム上でＳＴＥＴ方法により精製した。そして得られたプラスミドの同一性は酵素消化によって確認した。
【０２８４】
Ａ．ＳＴＥＴ方法によるＤＮＡ調製：
プラスミドＤＮＡの完全性およびＳＴＥＴ調製の収率を確認するために、これらの各１μＬおよび０．２０μＬの泳動をアガロ−スゲル（０．８％；図３を参照のこと）上で実施した。ＤＮＡの非分解が、均一のサイズの超らせんＤＮＡの異なるバンドの存在により実証された。
【０２８５】
Ｂ．カラム精製の生成物におけるＤＮＡの存在の確認：
ＳＴＥＴ方法により得られたＤＮＡをカラム上で精製した；精製され得られたＤＮＡの完全性を確認するために、保持され溶出された画分および保持されなかった画分をゲル電気泳動により分析した。図４に示されたゲルにより、超らせんＤＮＡがカラム（ＥおよびＥ’）から溶出された純粋画分中には実際に存在し、しかしながら非保持画分（ＦＴ）では検出できないことが示された。
【０２８６】
Ｃ．酵素消化後のアリコートの分光測定アッセイおよびＤＮＡ濃度の調整：
次に、精製されたＤＮＡを分光光度法を使用してアッセイした。従って得られた濃度はアリコートに応じて、１４９μｇ／ｍＬ〜５８４μｇ／ｍＬの間で変動した。エタノールでの沈殿後、当該アリコートのＤＮＡをＴＥ１Ｘ中に取り出し、そして同濃度に調製した。
【０２８７】
ＤＮＡの濃度を確認するために、酵素消化によりプラスミドをＨｉｎｄ  ＩＩＩ／ＮｏｔＩペアにより直線化し、次にこれらをゲル電気泳動を使用して分析した（図５、最上部のプロファイルを参照のこと）。得られたバンドの強度は依然として可変であることが明らかとなった。従って、分光測定アッセイおよび消化後得られたバンドの強度（図５−下層のプロファイルを参照のこと）に応じて濃度を再調整した。プラスミドの同一性を確認する場合に、バンドを細胞に導入する前に正確なＤＮＡ濃度が示されることに加えて、等価の強度のバンドの獲得によって、酵素消化に続く電気泳動測定の容易な読み出しを達成することができるであろう。
【０２８８】
Ｄ．酵素消化後のＤＮＡの同一性の確認
１）一般的原理：
調製した１４個のＤＮＡの同一性を確認するために、これらを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ、ＸｂａＩ、ＡａｔＩＩ、ＰａｃＩ並びにＳｆｏＩを使用した消化により全て確認したが、これらは各ＤＮＡのゲルプロファイルの異なる組合せとなる。消化生成物のアガロ−スゲル泳動（０．８％）により、得られたバンドの数およびサイズに応じて、表１に示すようにＤＮＡを識別することができる（ＮＢ：サイズが１００塩基対以下のバンドは、我々のゲル電気泳動像上では観察することができなかった）：
【０２８９】
実験のコンストラクトの消化を、各プラスミドの同一性を確認するために使用した。大きなＣＤ８―ＣＤTMコンストラクト型は、酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩおよびＸｂａＩでの消化後に得られたバンドの数およびサイズ分析によって識別された。様々なシステイン残基突然変異体は、酵素ＡａｔＩＩ、ＰａｃＩおよびＳｆｏＩでの消化後に識別された。従って、得られたバンドの数は、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩおよびＸｂａＩでの消化によるもの以上であり、識別は特定のバンド（太字）の存在または不存在に基づいて主に実施した。
【０２９０】
【表１】
0005932647.tif 000002
【０２９１】
【表２】
0005932647.tif 000003
【０２９２】
２）実施例：
突然変異体ｐＸ２ ＡＡＣおよびｐＸ２ ＣＣＡの識別に関して、得られたゲルを図６Ａに示す。
【０２９３】
解釈：
・ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩでの消化：２つのサンプル各々において、約７２０６ｂｐで得られた単一バンドは、コンストラクトＸ２またはＸ４の存在と一致する。
・ＸｂａＩでの消化：２つのサンプル各々において、約６８２２（または６８１２）および３６７ｂｐで得られている２つのバンドは、コンストラクトＸ２またはＸ３の存在と一致する。
【０２９４】
これらの２つの結果により、我々は実際にＸ２型の２つのコンストラクトの存在下にあったことが照合されそして裏付けられる。
【０２９５】
次に、これらの中のＸ２突然変異体を識別しようとした（図６Ｂを参照のこと）：
【０２９６】
解釈：
・ＡａｔＩＩでの消化：
−  サンプル４：得られている約３４２３ｂｐ（赤）の１つの特定のバンドは、次のＸ２プラスミドの１つの存在と一致する：ｐＸ２ ＣＡＣ、ｐＸ２ ＡＡＣ、ｐＸ２ ＣＡＡまたはｐＸ２ ＡＡＡ。
−  サンプル５：得られている約４２８５ｂｐ（青）の１つの特定のバンドは、次のＸ２プラスミドの１つの存在と一致する：ｐＸ２ ＣＣＣ、ｐＸ２ ＡＣＣ、ｐＸ２ ＣＣＡまたはｐＸ２ ＡＣＡ。
【０２９７】
・ＳｆｏＩでの消化：
−  サンプル４：約２５３８ｂｐ（赤）の得られている１つの特定のバンドは、次のＸ２プラスミドの１つの存在と一致する：ｐＸ２ ＣＣＣ、ｐＸ２ ＡＣＣ、ｐＸ２ ＣＡＣ、ｐＸ２ ＡＡＣ。この結果は、ＡａｔＩＩによる消化のものと照合され、そして我々は次のプラスミドの１つの存在下にあったことを推測することができた：ｐＸ２ ＡＡＣまたはｐＸ２ ＣＡＣ。
−  サンプル５：約１８３９ｂｐ（黒）および６９９ｂｐ（緑）の得られている２つの特定のバンドは、次のＸ２プラスミドの１つの存在と一致する：ｐＸ２ ＣＣＡ、ｐＸ２ ＡＣＡ、ｐＸ２ ＣＡＡ、ｐＸ２ ＡＡＡ。この結果は、ＡａｔＩＩによる消化のものと照合され、次のプラスミドの１つの存在下にあったことを推測することができた：ｐＸ２ ＣＣＡまたはｐＸ２ ＡＣＡ。
【０２９８】
・ＰａｃＩでの消化：
各サンプルに関して、非超らせんＤＮＡｐに一致する低い強度のバンドおよび超らせんＤＮＡｐ（青）に一致する高い強度のバンドを得たが、これからＰａｃＩによる消化がこれらのサンプルにないことが示される。
【０２９９】
サンプル４および５は、各々突然変異体ｐＸ２ ＡＡＣおよびｐＸ２ ＣＣＡに一致する。
【０３００】
このプロセスは、プラスミドの全ての識別に適用した。
【０３０１】
３）結論：
ＤＮＡの調製のためのこのステップの間に、１４個の精製プラスミドが各々数ミリグラムずつ得られ、酵素消化およびゲル分析による確認の後にこれらの同一性は全て確認された。さらに、全ＤＮＡを同濃度に調整した。
【０３０２】
ＩＩ．キメラの発現の分析：
ＤＮＡ発現を調べるために、各プラスミドの同量をＨＥＫ２９３細胞内に導入した。これにより発現されたタンパク質をゲル泳動により分析し、続いてＰＶＤＦ膜上へ輸送した。そして当該膜は、抗ウサギＣＤTM血清およびペルオキシダーゼでタグ付与した二次抗ウサギ抗体を使用して明らかにした。
【０３０３】
Ａ．細胞可溶化物中のＣＤ８―ＣＤTMの存在の分析：
１）未精製の可溶化物の分析：
形質導入の４８時間後、細胞を溶解し、得られた抽出物をブラッドフォード法を使用してアッセイした。これらの可溶化物由来の未精製タンパク質ブルート（ｂｒｕｔｅｓ）の２００μｇを、ゲル泳動およびウエスタンブロットによって分析し、抗ＣＤTM抗体で明らかにした（図７を参照のこと）。
【０３０４】
サンプル中で様々な特定のシグナルを観察することができた：
・ＣＤ８−ＣＤTMの存在に一致する５０ｋＤａの二重バンド（青）。２つのバンドは、ＣＤ８のグリコシル化の２つのレベルに一致する。
・未確定のオリジンの約２０ｋＤａのシグナル（赤）。
【０３０５】
サンプルｐＸ２ ＣＣＣ、ｐＸ２ ＡＣＣ、ｐＸ２ ＣＡＣ、ｐＸ２ ＡＡＣ、ｐＸ４ ｓｔｐおよびｐＬＰＣＸは、これらのバンドを有しなかった。
【０３０６】
２）抗ＣＤ８抗体による免疫沈降の後の可溶化物の分析：
細胞可溶化物中のＣＤ８−ＣＤTMの検出閾値を低下させるために、大量の抽出物を使用し、ＣＤ８の外部ドメインの立体構造エピトープの特定のモノクローナル抗体での免疫沈降によってキメラを濃縮した。
【０３０７】
形質導入４８時間後、細胞を溶解し得られた抽出物をブラッドフォード法を使用してアッセイした。タンパク質濃度の標準化の後、抗ＣＤ８抗体およびタンパク質Ａセファロースの存在下で抽出物を免疫沈降させた。得られた生成物をゲル泳動およびウエスタンブロットにより分析し、抗ＣＤTM抗体（図８を参照のこと）で明らかにした。そしてサンプル中で様々なシグナルを観察することができた：
・ＣＤ８−ＣＤTMの存在と一致する５５ｋＤａの二重バンド（青）；
・約６６ｋＤａで各サンプルで確認される、不明のシグナル；
・おそらく多量体が形成されたＣＤ８−ＣＤTMタンパク質の存在と一致する、６６ｋＤａ以上の分子量を有する１または２以上のシグナル。
【０３０８】
この場合、ｐＸ２ ＡＡＣサンプルは、免疫沈降なく実施した分析と対照的に、５０ｋＤａで検出可能なシグナルを有した。その一方で、サンプルｐＸ２ ＣＣＣ、ｐＸ２ ＡＣＣ、ｐＸ２ ＣＡＣ、ｐＸ４ ｓｔｐおよびｐＬＰＣＸに関して検出可能なシグナルはなかった。
【０３０９】
３）細胞可溶化物中のＣＤ８−ＣＤTMの発現の分析の概要：
各キメラの特徴（ｔｍＤ ＢＬＶの完全性、第三のシステイン残基の存在およびシステイン残基の数）を有する細胞可溶化物上でウエスタンブロットによって得られたデータの相互の関係を比較することによって、以下の表２を作成することができた。
【０３１０】
ＢＬＶのＣＤTMに加え、２つのファクターがＣＤ８−ＣＤTMキメラの存在に作用している、ように見える。これらのファクターは：ｔｍｄ ＢＬＶの存在または非存在、並びに第三のシステイン残基（Ｃｙｓ２１３）の存在または非存在である。
【０３１１】
Ｂ．ＣＤ８−ＣＤTMとエキソソームとの関係の分析：
使用した様々なＤＮＡは２、３のヌクレオチドが相違するだけであった。従って、おそらく合成されたＣＤ８−ＣＤTMの量は同量であった。しかしながら、細胞可溶化物中のＣＤTMの発現の分析の間、形質導入４８時間後に特定のキメラは検出不可能であったことが確認された。このシグナルの見られないことは、キメラタンパク質の一部の消失を反映するかもしれない。この消失は、これらのキメラの急速な分解、またはエキソソームの形態でのこれらの分泌のいずれかが原因であったのかもしれない。
【０３１２】
従って、エキソソーム内のＣＤ８−ＣＤTMの存在を検出しようとした。
【０３１３】
【表３】
0005932647.tif 000004
【０３１４】
１）遠心分離によって単離された小胞中のＣＤ８−ＣＤTM内容物：
形質導入の４８時間後、培地を回収しエキソソームを分離するために遠心分離した。次に得られたペレットをゲル泳動およびウエスタンブロットで分析し、そして抗ＣＤTM抗体で明らかにした（図９を参照のこと）。
【０３１５】
サンプルにより、ＣＤ８−ＣＤTMの存在に一致する５５ｋＤａでシグナルを示した。このシグナルは、サンプルｐＸ２ ＣＣＣ、ｐＸ２ ＡＣＣ、ｐＸ２ ＣＡＣ、ｐＸ２ ＡＡＣ、ｐＸ４ ｓｔｐおよびｐＬＰＣＸに関しては検出不可能であった。
【０３１６】
２）ショ糖密度勾配上での小胞の沈降後のＣＤ８−ＣＤTM内容物：
培地の超遠心分離後に得られたシグナルは実際にエキソソーム中のキメラの存在に起因するものであり、ＣＤ８−ＣＤTMを含有する細胞残屑の存在に起因するものではないということを確認するために、上述の方法に従ってショ糖密度勾配上での沈降によって得られたエキソソームのペレットを分析した。使用した細胞および小胞の組成に応じて１．１３ｇ／ｍＬ〜１．２０ｇ／ｍＬの密度でエキソソームが浮遊した。超遠心分離での沈降後、７００μＬの画分中で勾配を除去した。ＴＣＡを使用してタンパク質を沈殿させ、ゲル泳動、続いてウエスタンブロットで分析し、そして細胞小胞（エンドソームまたはエキソソーム）の存在を検出するために抗ＣＤTM抗体および抗トランスフェリン受容体（ＲＴｆ）抗体で明らかにした。この分析は突然変異体ｐＸ４−ＣおよびｐＸ４−Ａに関して実施した（図１０を参照のこと）。
【０３１７】
ｐＸ４−ＣおよびｐＸ４−Ａにおいて、ＣＤ８−ＣＤTMと一致するシグナルを１．１３ｇ／ｍＬ〜１．２５ｇ／ｍＬの密度を有する画分中で検出した。これらの同密度に関して、ＲＴｆと一致するシグナルを検出することもまたできる。これらの結果は、エキソソームを含有する画分中のＣＤ８−ＣＤTMの存在を明らかにする。
【０３１８】
３）エキソソームとＣＤ８−ＣＤTMとの関係の分析の概要：
Ｃｙｓ２１３を有するｐＸ２を除いた、ＣＤTMを含有する全突然変異体で、ＣＤ８−ＣＤTMとエキソソームとの結合を検出した。ｐＸ４−ＣおよびｐＸ４−Ａ突然変異体は、エキソソーム中で非常に効率的にターゲティングされたと思われる。Ｃｙｓ２１３を有しないｐＸ３およびｐＸ２突然変異体もまたエキソソーム中で確認されたが、ｐＸ４−ＣおよびｐＸ４−Ａ突然変異体よりも少ない割合であった。
【０３１９】
従って、ウイルスのＣＤTMの存在に加え、エキソソームでのＣＤ８−ＣＤTMキメラのターゲティングに２つのファクターが作用するものと思われる。
【０３２０】
これらのファクターは：
・ＢＬＶの膜貫通型ドメインの存在または非存在。
・Ｃｙｓ３の存在または非存在、である。
【０３２１】
Ｃ．ＣＤ８−ＣＤTMキメラの発現への小胞輸送阻害の影響：
キメラｐＸ２ ＣＣＣ、ｐＸ２ ＡＣＣ、ｐＸ２ ＣＡＣおよびｐＸ２ ＡＡＣの検出がないことはエキソソームの分泌の増加に起因しないので、これがＭＶＢタンパク質のリソソームへの局在化による分解に起因するか否かを調べた。
【０３２２】
この目的のために、小胞輸送阻害剤、主にバフィロマイシンおよびＬｙ２９４００２を使用した。これらの阻害剤は、リソソームの分解経路をブロックすることができ、これによりエキソソームによるタンパク質の分泌を促進する。形質導入の３２時間後に阻害剤を培地に添加し；１６時間後に細胞を溶解し培地を回収し、次にエキソソームを分離するために遠心分離した。得られたサンプルをゲル泳動で分析し、抗ＣＤTM抗体によりウエスタンブロットで明らかにした。このようにして、キメラｐＸ２ ＣＣＣ、ｐＸ２ ＣＣＡ、ｐＸ３ ＣＣＣ、ｐＸ４−Ｃ、ｐＸ４−ＡおよびｐＸ４ ｓｔｐの発現を分析した（図１１および１２を参照のこと）。
【０３２３】
これらの突然変異体に関して、得られたタンパク質に対する阻害剤の存在下でのウエスタンブロットプロファイルは、細胞可溶化物およびエキソソームどちらに関しても阻害剤なしの分析の間と同様であった、ように思われる。
【０３２４】
従って、キメラｐＸ２ ＣＣＣ、ｐＸ２ ＡＣＣ、ｐＸ２ ＣＡＣおよびｐＸ２ ＡＡＣの不存在は、明らかに加速されたエキソソーム放出、またはリソソームでの分解のどちらにも起因しない。おそらく、これは小胞体（ＲＥ）およびＴＧＮ中でのフォールディングの制御に関するシステムのレベルでの非常に早期の分解での結果である。
【０３２５】
ＩＩＩ．免疫蛍光法による局在確認：
細胞区画においてＣＤ８−ＣＤTMの膜ターゲティングおよびこの局在性を評価するために、共焦点免疫蛍光顕微鏡を使用して観察を実施した。形質導入４８時間後、細胞を固定し、様々な抗体を使用してタグ付与した。
【０３２６】
Ａ．抗体の選択：
最初に、タグの各タイプ（方法および装置を参照のこと）を、ｐＸ４−ＣまたはｐＬＰＣＸを発現している固定細胞上で可変の抗体希釈を使用してテストした。通常の免疫蛍光顕微鏡（ZEISS Axiovert 200 M）上で観察の後、様々な入手可能な抗体（「方法および装置」部分を参照のこと）をテストし、そしてこれらの有効性およびこれらの最適な希釈を測定した。複数の抗細胞内区画抗体が、ゼロまたは１つの特定のシグナルを有することが観察された。
【０３２７】
従って、共焦点イメージ観察に関して、２つのタイプのタグを使用することができた：
・ＣＤ８−ＣＤTMタグラベル：
ラットＩｇＧ（５３／６．７）抗マウスＣＤ８ ＦＩＴＣ（Pharmingen、希釈１／５０）
・Ｌａｍｐ３ラベル：
抗ヒトＣＤ６３（Ｌａｍｐ３）マウスＩｇＧ（Zymed、希釈１／５０）＋抗マウスＩｇＧ Ｃｙ３（Sigma、希釈１／５００）
【０３２８】
Ｂ．ＣＤ８−ＣＤTMの分布の観察：
細胞の固定および我々の様々な抗体を使用したタグ付与の後、共焦点顕微鏡（ZEISS LSM 510）を使用してＣＤ８−ＣＤTMに由来するタグの分布およびＬａｍｐ３との共局在を観察した。
【０３２９】
ｐＬＰＣＸ（ネガティブコントロール）を発現している細胞はＦＩＴＣシグナルを示さなかった。従って、このコントロールから、他の突然変異体に関して視覚化されたＦＩＴＣ蛍光は実際にはＣＤ８−ＣＤTMの存在に由来することを確認することができた。
【０３３０】
驚いたことに、ウエスタンブロットによって検出されないにもかかわらず、Ｃｙｓ３を含んでなるｐＸ２コンストラクトは弱いものの免疫蛍光法で観察された。
【０３３１】
一般的な表現型の分析：
ＨＥＫ２９３細胞に４８時間形質導入し、固定した。ZEISS LSM 510共焦点顕微鏡（X63 immersion objective）を使用して、観察を実施した。
【０３３２】
ＣＤ８：ＦＩＴＣタグ（緑）からＣＤ８を含んでなるキメラの存在が明らかとなった。
【０３３３】
Ｌａｍｐ３：Ｃｙ３タグ（赤）から後期エンドソームを特徴とするＬａｍｐ３タンパク質の存在が明らかとなった。
【０３３４】
ＣＤ８−ＣＤTM／Ｌａｍｐ３：ＦＩＴＣおよびＣｙ３画像を重ね合わせた。得られた黄色の色調から、ＣＤ８−ＣＤTMとＬａｍｐ３の共局在が証明される。
【０３３５】
この観察から、ＦＩＴＣタグの（小胞、膜または核周囲の）出現および強度に基づき５つの一般的表現型を識別することができる（図１３〜１７を参照のこと）。小胞の出現に関するＦＩＴＣタグのＬａｍｐ３との共局在は、あらゆる突然変異体中に存在するので、これらの表現型の判定のために使用することができない。さらに、この共局在は常に部分的であった。
【０３３６】
強度のＦＩＴＣシグナルを有している核周囲の分析：
ｐＸ４ ｓｔｐを除く全サンプルに関して、大きく均一なＣＤ８の核周囲のシグナルはほぼ常に核の周囲で発見された。細胞に存在するＦＩＴＣ蛍光の主要部を視覚化するために必要である強度パラメータは、この区域の飽和を生じた。このような飽和シグナルは、それほど有用でなく、特にＬａｍｐ３との共局在の妥当性を測定するために、これらの区域の分析に焦点を合わせることによって強度の弱いパラメータを捕捉した。
【０３３７】
ＣＤ８−ＣＤTM／Ｌａｍｐ３［ａ］：ＣＤ８−ＣＤTM（緑）のＬａｍｐ３（赤）との共局在。弱いものの捕捉のための強度パラメータは、核周囲シグナルの飽和およびこのレベルでの黄色の色調の出現を生じ、これによりこれらの２つのタグの間の部分的な共局在が示された。このシグナル飽和のため、生じている共局在が本当のものかまたは人工によるものなのか述べることは不可能であった。
【０３３８】
ＣＤ８−ＣＤTM［ｄ］：ＣＤ８−ＣＤTMに由来するＦＩＴＣシグナル。強度パラメータは、任意のシグナル飽和現象を除去するために大幅に減少させた。ＦＩＴＣシグナルは散在し、均一であり非断続的に現れた。
【０３３９】
ＣＤ８−ＣＤTM／Ｌａｍｐ３［ｄ］：ＣＤ８−ＣＤTM（緑）のＬａｍｐ３（赤）との共局在。強度パラメータを、任意のシグナル飽和現象を除去するために大幅に減少させた。これにより黄色の色調はなくなり、ＦＩＴＣおよびＬａｍｐ３の間の共局在がないことが示された。
【０３４０】
このデータによると、Ｌａｍｐ３に由来するタグ付与は、この核周囲の中に位置するように見えるが、ＦＩＴＣタグと決して共局在しなかった（図１８を参照のこと）。
【０３４１】
さらに、これらの核周囲のＣＤ８−ＣＤTMに由来するタグ付与は散在し、均一であり非断続的に見え、そして細胞組織内のＣＤ８−ＣＤTMの存在を示しているように思われた。このタグ付与の局在性および出現、並びにＬａｍｐ３との本当の共局在の無いことから、ゴルジ体でのＣＤ８−ＣＤTMの存在が示唆される。
【０３４２】
この表現型は、ｐＸ４ ｓｔｐを除いた全突然変異体で多かれ少なかれ確認される。これが常に存在する突然変異体ｐＸ２およびｐＸ３と対照的に、ｐＸ４−ＣおよびｐＸ４−Ａの突然変異体では、この表現型は少数の細胞で確認することができるだけである。
【０３４３】
【表４】
0005932647.tif 000005
【０３４４】
従って、ＦＩＴＣによって強固にタグ付与された核周囲の特定の観察によって、ＴＧＮ中のＣＤ８−ＣＤTMの存在の可能性を示すことができた。
【０３４５】
我々は以下の表（表３を参照のこと）を作成するために、得られたデータを使用した。
【０３４６】
これらの観察から、ウイルスＣＤTMに加えて、２つのファクターがキメラの安定およびターゲティングに関与することが確認される。
【０３４７】
これらのファクターは：
・ｔｍｄ ＢＬＶの存在または非存在；
・ＢＬＶのＣＤTMのＮ末端残基の存在または非存在；
・Ｃｙｓ３の存在または非存在、
である。
【０３４８】
結果：
分析中に、キメラｐＸ４ ｓｔｐは、単に外部ドメインおよびＣＤ８のｔｍｄから構成され、効率よく原形質膜へターゲティングされることによりＨＥＫ２９３細胞中に蓄積することが示された。
【０３４９】
同様の態様で、キメラｐＸ４−ＣおよびｐＸ４−Ａは蓄積し、そしてｐＸ４ ｓｔｐよりも大きな割合で原形質膜で確認される。これらのキメラはエキソソーム内で非常に効率的に分泌される。
【０３５０】
ｐＸ３キメラは、ｐＸ４キメラと対照的に、ゴルジ体中に確実に存在する。原形質膜およびエキソソームでのこれらのターゲティングは、ｐＸ４ キメラほど効率的でないようだが、多量には違いない。
【０３５１】
ｐＸ２キメラは、あまり安定的に見えず、原形質膜ではなくＴＧＮで確認される。Ｃｙｓ３を含んでなるｐＸ２コンストラクトは、細胞内でそれほど安定でなく、そしてエキソソームで検出されない。コンストラクトのこのタイプにおける末端Ｃｙｓの置換は、キメラタンパク質の安定性の増加に寄与するようである。実際、Ｃｙｓ３のないｐＸ２コンストラクトは、細胞およびエキソソームで検出可能である。
【０３５２】
免疫蛍光法において、実験のキメラは全て後期エンドソームのマーカーと部分的に共局在化した小胞タグを有する。
【０３５３】
この実験から、ＣＤ８−ＣＤTMキメラの安定性およびターゲティングにおける、Ｃｙｓ３の存在または非存在の重要性が示された。このシステイン残基のないことは、実験のキメラの安定性および膜ターゲティング並びにエキソソーム中でのこれらの存在に有利と思われる。これらの現象は、Ｃｙｓ３のないことに関係する超パルミトイル化と無関係とすることができる。実際、パルミトイル化されていないコンストラクトｐＸ２ ＡＡＣは、Ｃｙｓ３並びにＣｙｓ１および／またはＣｙｓ２を有する３つのｐＸ２突然変異体より安定であり、パルミトイル化することができる。しかしながら、キメラの安定性およびターゲティングにおいて、パルミトイル化の他の意味は排除することができる。
【０３５４】
この実験から、ＢＬＶ ｔｍＤの根本的な重要性が示された。ｔｍＤ ＢＬＶの全てのあるいは部分的な欠失は、原形質膜でのキメラの安定性およびターゲティングを大幅に増加するものと思われる。従って、驚くことに、ｔｍＤ ＢＬＶの存在は、キメラの早期の分解に寄与し得る。リソソームの分解経路が原因ではないので、この分解は、細胞区画、すなわちＲＥおよびＴＧＮでのフォールディングを調整しているシステムを妨害し得る。小胞輸送阻害剤が無いことは、ＣＤ８−ＣＤTMキメラの安定性およびエキソソームのターゲティング、並びに後期エンドソームとのこれらの非常に部分的な共局在に影響する、という仮設は最も安定でないキメラを考慮しても支持される。
【０３５５】
我々の実験の本質的な魅力は、「エキソソームディスプレー」のコンセプトに基づくワクチン接種モードの開発のための潜在的に有効なツールの発見に属する。実際、ｐＸ４−Ｃ、特にｐＸ４−Ａキメラは、ペプチド抗原（ここではＣＤ８）のエキソソームへの非常に有効なターゲティングを可能にする分子「モーター」を有するようだ。従って、この「モーター」は、ＢＬＶのＴＭタンパク質の細胞質ドメインに位置するであろう。
【０３５６】
実施例２：ＣＤTMペプチドのエキソソームターゲティングに関与するアミノ酸の同定
最初の免疫付与トライアルを始める前に、ＢＬＶ ＴＭタンパク質の細胞質ドメインに位置する「モーター」の正確な特質を特定するために、ＢＬＶ ＴＭタンパク質の細胞質ドメインでの変異の１８タイプの影響を実験した（図１９を参照のこと）：
【０３５７】
−  １３個のＮ末端残基の欠失および第一のＰｘｘＰモチーフの２つのプロリン残基の置換（配列番号１３および配列番号１４；変異ＫＭ４）；
−  １３個の末端残基の欠失および第二のモチーフＰｘｘＰの２つのプロリン残基の置換（配列番号１５および配列番号１６；変異ＫＭ５）；
−  １３個のＮ末端残基の欠失および第三のＰｘｘＰモチーフの２つのプロリン残基の置換（配列番号１７および配列番号１８；変異ＫＭ８）；
−  １３個のＮ末端残基の欠失および第四のＰｘｘＰモチーフの一番目のプロリン残基の置換（配列番号１９および配列番号２０；変異ＫＭ１１／１）；
−  第四のＰｘｘＰモチーフの２つのプロリン残基の置換（配列番号２１および配列番号２２；変異ＫＭ１１／３）；
【０３５８】
−  １３個のＮ末端残基の欠失および第一のＹｘｘＬモチーフのチロシン残基の置換（配列番号２３および配列番号２４；変異ＫＴＭＹ）；
−  １３個のＮ末端残基の欠失および第二のＹｘｘＬモチーフのチロシン残基の置換（配列番号２５および配列番号２６；変異ＫＭ９）；
−  １３個のＮ末端残基の欠失および第三のＹｘｘＬモチーフのチロシン残基の置換（配列番号２７および配列番号２８；変異ＫＭ１３）；
−  １３個のＮ末端残基の欠失および第一のＹｘｘＬモチーフの前のセリン残基の置換（配列番号２９および配列番号３０；変異Ｓ）；
−  １３個のＮ末端残基の欠失および第二のＹｘｘＬモチーフ前に位置するグルタミン酸残基の置換（配列番号３１および配列番号３２；変異Ｅ）；
−  １３個のＮ末端残基の欠失および第三のＹｘｘＬモチーフの前に位置するアスパラギン酸残基の置換（配列番号３３および配列番号３４；変異Ｄ）；
【０３５９】
−  ６つの残基まで切断された配列−１３個のＮ末端残基および３９個のＣ末端残基の欠失（配列番号３５および配列番号３６；変異ＫＳ５）；
−  １５個の残基まで切断された配列−１３個のＮ末端残基および３０個のＣ末端残基の欠失（配列番号３７および配列番号３８；変異ＫＳ６）；
−  ２１個の残基まで切断された配列−１３個のＮ末端残基および２４個のＣ末端残基の欠失（配列番号３９および配列番号４０；変異ＫＳ８）；
−  ２６個の残基まで切断された配列−１３個のＮ末端残基および１９個のＣ末端残基の欠失（配列番号４１および配列番号４２；変異ＫＳ９）；
−  ３１個の残基まで切断された配列−１３個のＮ末端残基および１４個のＣ末端残基の欠失（配列番号４３および配列番号４４；変異ＫＳ１０）；
−  ３７個の残基まで切断された配列−１３個のＮ末端残基および８個のＣ末端残基の欠失（配列番号４５および配列番号４６；変異ＫＳ１２）；
−  ４１個の残基まで切断された配列−１３個のＮ末端残基および４個のＣ末端残基の欠失（配列番号４７および配列番号４８；変異ＫＳ１４）。
【０３６０】
置換および欠失突然変異体は、定方向突然変異誘発によって得られる；置換された残基は、アラニン残基で置換された。欠失突然変異体の翻訳は終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＧまたはＴＡＡコドン）の添加によって停止された。
【０３６１】
１８個の突然変異体をコードするＤＮＡ配列、並びに１３個のＮ末端残基のみが欠失された野生型ＤＮＡ  ＣＤTM配列（配列番号７；ここで「野生型配列」と呼ばれる配列）は、マウスのＣＤ８αの外部ドメインをコードする配列の下流でサブクローン化した。次に得られた１９個のキメラ遺伝子をウイルス発現ベクターの中にクローン化した。従って、生じたキメラタンパク質のエキソソームへのターゲティングを分析するために、得られた遺伝子組換えベクターを真核細胞（ＨＥＫ細胞）の中に導入した。４８時間後、細胞でのタンパク質の発現をウエスタンブロットで調べた。同時に、キメラタンパク質のエキソソーム中の局在化をＦＡＣＳおよびウエスタンブロットで評価するために、エキソソームを超遠心分離により精製した。
【０３６２】
以下に示す結果は、文字通り個々に認識された２つのペプチドモチーフの、ＥＳＣＲＴ機構および膜間のトランスファー機構と関係するタンパク質（特にＡＰ３を含むアダプチン）とのこれらの相互作用のための、必要性を示す。今回初めて、これらの２つのペプチドモチーフがエキソソームターゲティングで相乗効果の決定的機能を有するという実験上の証拠が得られた。
【０３６３】
これらの結果は、エキソソームを使用した細胞間のシグナル伝達に関して新規で重要な情報を提供する。従って、我々はエキソソームでのタンパク質のターゲティングのための明確に規定したツールを有する。産業上の観点から、例えばこれらは新世代ワクチンの産生を促進し、そして処置用の分子または抗体をスクリーニングするための特有のツールを提供するであろう。
【０３６４】
１−分子のコンストラクトの獲得
Ａ−ＰＣＲによる挿入断片の調製：
３つの置換突然変異体Ｓ（Ｓｅｒ→Ａｌａ）、Ｄ（Ａｃ．Ａｓｐ→Ａｌａ）およびＥ（Ａｃ．Ｇｌｕｔ→Ａｌａ）を、以下の変異プライマーを利用の二重ＰＣＲを使用した定方向突然変異誘発によって得た：
【０３６５】
−ＡへのプライマーＳ，順方向：
５’ＣＣＣＴＡＡＡＣＣＣＧＡＴＧＣＴＧＡＴＴＡＴＣＡＧＧＣＧＴＴＧＣＴＡＣＣＡＴＣＣ ３’
−ＡへのプライマーＳ，逆方向：
５’ＣＧＣＧＧＡＴＧＧＴＡＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＡＴＡＡＴＣＡＧＣＡＴＣＧＧＧＴＴＴＡ ３’
−ＡへのプライマーＤ，順方向：
５’ＣＣＡＣＣＡＡＧＣＣＧＧＣＡＴＡＣＡＴＣＡＡＣＣＴ ３’
−ＡへのプライマーＤ，逆方向：
５’ＴＣＧＡＡＧＧＴＴＧＡＴＧＴＡＴＧＣＣＧＧＣＴＴＧＧＴ ３’
−ＡへのプライマーＥ，順方向：
５’ＧＣＴＡＣＣＡＴＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＧＡＴＣＴＡＣ ３’
−ＡへのプライマーＥ，逆方向：
５’ＧＴＡＧＡＴＣＧＣＴＧＧＣＧＣＧＧＡＴＧＧＴＡ ３’。
【０３６６】
ポリメリゼーションの間のエラーを制限し、そして平滑末端を有する断片を得るために、（３’−５’−エクソヌクレアーゼの）校正活性を有する熱安定のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび熱安定のＴｇｏポリメラーゼを含有する酵素混合物を含むExpand High Fidelity PCRシステムキット（Roche（登録商標））を使用してＰＣＲを実施した。試薬の２つの混合物を４℃で調製した：
Ａ（２５μＬ）：増幅のためのＤＮＡの１０ｎｇ、１０ｍＭのｄＮＴＰの１μＬ（最終各々２００μＭ）、１０μＭでの２つの順方向および逆方向プライマーの各々１．５μＬ（最終３００ｎＭ）、滅菌水（ｑｓｐ ２５μＬ）；および
Ｂ（２５μＬ）：５μＬの「エキスパンドハイフィディリティ」緩衝液、１５ｍＭのＭｇＣｌ2を有する１０Ｘ（最終１．５ｍＭ）、０．７５μＬの「ハイフィディリティ」酵素混合物（最終２．６Ｕ）、滅菌水（ｑｓｐ ２５μＬ）。
【０３６７】
ＡおよびＢを４℃で混合し、次の増幅サイクルを実施した：
−  二重鎖ＤＮＡを２分間９４℃で変性させること；
−  変性（９４℃、１０秒）、ハイブリダイゼーション（５０℃、１５秒）および伸長（７２℃、２０秒）を４サイクル；
−  ２５サイクル：９４℃で１０秒、６４℃で１５秒、そして７２℃で２０秒；
−  ７２℃で７分間の最終伸長。
【０３６８】
得られたＰＣＲ生成物を４℃で保存した。
【０３６９】
１８個の突然変異体および野生型ＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで組み換え（定方向突然変異誘発）、これらを特定の制限酵素部位によって取り囲んだ；制限酵素部位ＸｂａＩおよびＮｏｔＩを有する２つのプライマーを使用して、前述のプロトコルを実施した。
【０３７０】
Ｂ−ＴＯＰＯ−ｂｌｕｎｔＩＩでのＰＣＲ生成物およびコントロ−ルのクローニング
１９個の各ＤＮＡを、ケモコンピテント（chemocompetent）細菌中への導入のためのＴＯＰＯ−ｂｌｕｎｔクローニングキット（Invitrogen）のＴＯＰＯクローニングベクター中に連結させた（図２０を参照のこと）。形質転換したクローンが選択され、ＤＮＡ配列の全てがシークエンシングで確認された。
【０３７１】
ａ）プラスミド中への連結およびＴｏｐ１０での形質転換
様々なＰＣＲ生成物の各々は、既に開口され平滑末端を有しカナマイシン耐性遺伝子を輸送するＴＯＰＯ−ＢｌｕｎｔＩＩプラスミド中に取り込まれた。ケモコンピテントＴｏｐ１０細菌はこれらのプラスミドによって形質転換され、そしてＬＢ／アガーディッシュ（１００μｇ／ｍＬのカナマイシン）上で培養した。ネガティブコントロールおよび他のコントロールとして機能する挿入断片のないＴＯＰＯ−ＢｌｕｎｔＩＩプラスミド（１ｎｇのＰＵＣ１９プラスミド）を形質転換用のポジティブコントロールとして使用した。培養後、挿入断片を含むプラスミドまたはＰＵＣ１９（ポジティブコントロール）によって形質転換された細菌のみが、選択的薬剤（抗生物質）の存在下で成長した。
【０３７２】
ｂ）良好なクローンのスクリーニングおよびシークエンシング：
クローニング結果から、プラスミドＤＮＡの抽出を実施するために２〜１０個のコロニーを増幅させた。各コンストラクトおよび各クローンにつき、約１５０ｎｇ／μＬで１００μＬのプラスミドＤＮＡ量を得た。各精製に関して２６０ｎｍでの吸収／２８０ｎｍでの吸収の比率は１．８〜２の範囲に値を有し、これは調製物が純粋であることを証明している（１．８未満の値は、タンパク質混入を証明する）。
【０３７３】
プラスミドでの挿入断片の存在を確認するために、ＤＮＡを目的の配列を取り囲むＥｃｏＲＩ制限酵素によって消化した。（約３００ｐｂの）断片の存在が遺伝子組換えのＤＮＡの証拠を構成する２％のアガロ−スゲル上で、これらの消化を視覚化した。
【０３７４】
一旦良好なクローンが確認されると、目的およびオープンリーディングフレームの各配列の完全性を確認するために、各突然変異体由来の２μｇ〜４μｇのプラスミドＤＮＡを配列決定した。変異および添加した制限酵素部位を同時に確認した。
【０３７５】
Ｃ−ｐＫＳＩＩクローニングベクター中のキメラ遺伝子の獲得
１９個のコンストラクトを提供するために、１９個の配列（１つの野生型および１８個の変異型）各々を、マウスＣＤ８α外部ドメインをコードする配列の下流に置いた。
【０３７６】
ａ）ｐＫＳＩＩ−ＣＤ８クローニングベクターの調製
ｐＫＳＩＩ−ＣＤ８αベクター（図２２を参照のこと）を連続して制限酵素ＸｂａＩおよびＮｏｔＩで消化し、挿入断片を取り入れることができた。一度消化が実施されると、プラスミドは脱リン酸化され、エタノールで沈殿し０．８％のアガロ−スゲル上で精製される。
【０３７７】
ｂ）挿入断片の調製
ＸｂａＩ−ＮｏｔＩ制限酵素部位によって囲まれた様々な挿入断片をプラスミドと同様に同じ制限酵素で消化し、これらを取り込むことができた。
【０３７８】
ｃ）クローニングによるキメラプラスミドの獲得
直線化したｐＫＳＩＩ−ＣＤ８αプラスミドにＤＮＡを挿入した：
【０３７９】
消化した挿入断片を２．５％アガロ−スゲル上で精製した。ゲル連結法を使用してｐＫＳＩＩ−ＣＤ８αベクター中のこれらの再挿入を実施した。未処理のゲルの断片は、ネガティブ連結コントロールとして機能した。
【０３８０】
ベクターおよび挿入断片用に同一の制限酵素を使用したので、従ってこれらは凝集性のある、相補的なＸｂａＩおよびＮｏｔＩサイトを有した：プラスミドおよび挿入断片はこれらの間にバンドを確立することができるであろう。１つの酵素、リガーゼは、２つの核酸の３’−ＯＨ末端および５’−リン酸末端の間のリン酸ジエステル結合の形成を触媒する。
【０３８１】
一度連結ステップが完結すると、ＤＨ５α細菌は、アンピシリン耐性遺伝子を輸送しているこれらのプラスミドによって形質転換された。３７℃でＬＢ／アガー（５０μｇ／ｍＬのアンピシリン）上での形質転換された様々な細菌の培養およびネガティブコントロールとの比較後、コロニーの成長がＣＤTM挿入断片の存在下で連結生成物によって形質転換された細胞上でのみ観察された。このことから、得られたコロニーがＸｂａＩおよびＮｏｔＩサイトの間の挿入断片を含むベクターによって実際に形質転換されたことが示唆される。
【０３８２】
ｄ）スクリーニング：
キメラプラスミドが得られたことを確認するために、プラスミドＤＮＡを２つの酵素、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで消化し消化生成物の０．８％アガロ−スゲル上での泳動後、各突然変異体の様々なクローンをスクリーニングした。この二重の消化は、作成されたあらゆるキメラ遺伝子、すなわちＣＤＴＭと一致するＣＤ８αを有するものを切除する。
【０３８３】
各クローンおよび各コンストラクト（変異型または野生型ｐＫＳＩＩ−ＣＤ８α−ＣＤTM）に関しては、直線化したｐＫＳＩＩプラスミドのサイズに一致する２．９ｋｂｐで第一のバンドが観察された。第二のバンドは約９５０ｂｐで見られる；これは変異型または非変異型のＣＤ８α−ＣＤTMキメラをコードする遺伝子に一致する。
【０３８４】
Ｄ−レトロウイルスの発現ベクターｐＬＰＣＸにおけるキメラ遺伝子の獲得：
発現ベクターｐＫＳＩＩはこのサイズおよび制限酵素部位のため操作することは容易である一方で、真核細胞でのタンパク質発現はできない。それ故、ｐＬＰＣＸ（Clontech Laboratories Inc.、図２３を参照のこと）を選択したが、これはレトロウイルスのベクターを使用した形質移入および形質導入どちらによっても遺伝子を導入することができることを意味するものである。
【０３８５】
精製のために、ヌクレオスピンエクストラ（Nucleospin Extract）ＩＩ（登録商標）キット（Macherey-Nagel）を使用した２％アガロ−スゲル上での抽出によって、ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩサイトの間のｐＫＳＩＩプラスミドから各キメラ遺伝子を切除した。
【０３８６】
また発現ベクターｐＬＰＣＸをＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ酵素ペアで消化し、脱リン酸化し、続いてイソプロパノールで沈殿させた（このステップは、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩの間に位置する、消化の間に遊離したＤＮＡの短い断片（１００ｐｂ未満）の除去のためであった）。
【０３８７】
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Biolabs）を使用してキメラ遺伝子のｐＬＰＣＸとの連結を実施した（約３分子／１分子の挿入断片／ベクターの割合）。これらの連結生成物によってケモコンピテントＳｔｂｌ２細菌（マックスエフィシエンシー（MAX Efficiency）（登録商標）Ｓｔｂｌ２TMコンピテント細胞，Invitrogen）を形質転換した。同時に、ポジティブコントロール（１ｎｇのｐＵＣ１９プラスミド）およびネガティブコントロール（挿入断片なしに「連結させた」ｐＬＰＣＸ）を調製した。５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するゲロース培地上で３０℃での細菌培養後、ポジティブコントロールまたは挿入断片を有する連結生成物によって形質転換した細菌のみが成長した。
【０３８８】
続けてスクリーニングし真核細胞での形質導入に必要な十分量のＤＮＡプラスミドを有することができるようにするため、ミディ調製（Midipreparation）を実施した。ＸｈｏＩ、その後ＮｏｔＩでの消化後、プラスミド中の挿入断片の存在が２％アガロ−スゲル上で確認された。各コンストラクト（変異型および野生型ｐＬＰＣＸ−ＣＤ８α−ＣＤTM；図２４を参照のこと）に関して、直線化されたｐＬＰＣＸに一致する６．３ｋｐｂのバンドおよび切除されたキメラ遺伝子に一致する９５０ｐｂのバンドが観察された。
【０３８９】
２−エキソソームへのターゲティングの発現および分析：
Ａ−ＨＥＨ２９３Ｔ細胞での形質移入：
ＨＥＫ２９３Ｔ真核細胞の形質移入を確認し変換された細胞のパーセンテージを測定するために、細胞にＬａｃｚ遺伝子を含有するプラスミドを導入しＸ−Ｇａｌ溶液中でインキュベートした。
【０３９０】
最初に目測で、次に光学顕微鏡での観察（倍率×４０）によって、細胞の５０％以上が青く染色されたことを観察し、これからＬａｃＺプラスミドによって大多数が変換されたことが分かった。キメラ遺伝子の導入に関して同じ条件を適用し、従ってキメラ遺伝子によって細胞の５０％以上が変換されたであろう。
【０３９１】
同時に、２０個の遺伝子導入をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で同時に実施した。これらは、各プラスミドおよびネガティブコントロール（ＣＤＴＭのないｐＬＰＣＸ−ＣＤ８）と一致した。
【０３９２】
Ｂ−細胞でのキメラタンパク質の発現およびエキソソームへのターゲティング
ａ）ウエスタンブロット分析：
形質導入に由来する細胞およびエキソソーム可溶化物を、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル泳動、続いてＰＶＤＦ膜（ポリフッ化ビニリデンジフロライド、イモビロンＰ、Millipore）上へのトランスファーにより分析した。次にこれらの膜を、一次抗ウサギＣＤTM血清、続いてペルオキシダーゼと結合した二次抗ウサギＩｇＧ抗体を使用して明らかにした。明らかにした後、これらの抗体を除去し同一の方法でしかしながら抗ウサギＣＤ８α血清を使用してトランスファー膜を明らかにした。
【０３９３】
結果を図２５および２６に表わす。
【０３９４】
・細胞およびエキソソームでのキメラの発現レベルの比較：
細胞可溶化物では、キメラタンパク質の弱い発現のみ示したことが認められた。一方で、エキソソーム中では特定のキメラタンパク質が時折非常に大きく存在した。
【０３９５】
この発現レベルに加え、細胞タンパク質およびエキソソームタンパク質で見られる大きな違いは、細胞に関しては２または３つのバンドおよびエキソソームに関してはたった１つのバンドの存在であった。これは、細胞がグリコシル化されていない形態および多かれ少なかれグリコシル化された形態を含有するだからである。エキソソームでは、正確にグリコシル化された形態だけが発見される。
【０３９６】
・ポジティブ（ＣＤ８α−ＣＤTM）およびネガティブ（ＣＤ８α単独）コントロールのエキソソームのターゲティングのウエスタンブロット分析：
抗ＣＤＴＭ血清での、３１ｋＤａへ移動しているバンドは野生型ＣＤ８α−ＣＤTMコントロールのエキソソーム可溶化物中に存在し、一方これはネガティブコントロールによって遺伝子導入された細胞由来の可溶化物中には存在しなかった。このバンドは期待されるキメラタンパク質の特徴を示す。
【０３９７】
抗ＣＤ８α血清では、ネガティブＣＤ８αコントロール単独は、２７ｋＤａ付近にＣＤTMが欠損したＣＤ８αの発現およびエキソソームのターゲティングに一致するバンドを有した。上述と同様に、３１ｋＤａへ移動しているバンドは野生型ＣＤ８α−ＣＤTMコントロ−ルのエキソソーム可溶化物中に存在する。３１ｋＤａおよび２７ｋＤａのバンド間の強度の相違から、ＣＤTMと融合させる場合、ＣＤ８αはエキソソーム上で一層ターゲティングされることが示唆される。
【０３９８】
・変異されたＣＤ８α−ＣＤTMのターゲティングにおけるウエスタンブロット分散分析：
抗ＣＤ８α血清で得られた結果のみ相互に同程度であった。抗ＣＤTM血清で得られた結果を前述の結果を確認するためにのみ使用した。ＣＤTMをコードする配列の変異に応じて、これらの結果はキメラタンパク質の発現およびエキソソームへのターゲティングにおける分散を示す。これは、タンパク質のエキソソームへのターゲティングを強固に阻害する変異に関して特に明らかである。当該突然変異体は、突然変異体ＫＭ８、ＫＭ１３、ＤおよびＫＳ８に関してであった。
【０３９９】
これらの見解から、（ＫＭ８突然変異体の）モチーフＰＳＡＰおよび（（突然変異体ＫＭ１３およびＤの）最後のモチーフＹｘｘＬにおける）モチーフＤＹは、エキソソームのターゲティングに重要であると結論付けることができる。
【０４００】
ｂ）エキソソーム上のキメラタンパク質のＦＡＣＳによる定量化：
キメラタンパク質の存在はまた、蛍光モノクローナル抗ＣＤ８抗体を使用して細胞蛍光測定法分析（FACscan）によって調べた。
【０４０１】
ラテックスビーズ（IDC（Interfacial Dynamics Corporation）超清浄アルデヒド／硫酸ラテックスビーズ）上でエキソソームを固定した後、、エキソソームの表面上に存在するキメラタンパク質をフルオレセイン（Pharmingen製の５３−６．７抗体）と結合したモノクローナルマウス抗ＣＤ８α抗体でタグ付与し、細胞蛍光測定法で分析した（FACScan）。
【０４０２】
得られた結果は突然変異体ＫＭ８、ＫＭ１３およびＤに関して特に明らかであり、エキソソーム上でのキメラタンパク質のターゲティングにおいて変異されたアミノ酸が重要であることは明らかである（図２６および２７を参照のこと）。これらの結果から、ウエスタンブロットの結果によって既に明らかである、タンパク質をエキソソームへターゲティングすることにおけるモチーフＰＳＡＰ、（モチーフＤＹｘｘＬ中の）ＤおよびＹの影響が追認される。
【０４０３】
結果：
本実験において、変異型またはマウスＣＤ８αと結合した野生型ＣＤTMの試験ペプチドを発現するためにキメラ遺伝子を構築した。アミノ酸または注目のＣＤTMのモチーフのこれらの変異はエキソソームへのターゲティングで重要であるアミノ酸およびコンセンサスモチーフを特定することを目的としたものであった。
【０４０４】
様々なキメラ遺伝子のキメラタンパク質の発現を得るために、ＨＥＫ２９３Ｔ真核細胞に形質導入するために、レトロウイルスの発現ベクターの中にこれらの遺伝子を取り込ませた。ウエスタンブロットで観察されたバンドから、天然のＣＤ８αタンパク質のように、これらのタンパク質はゴルジ体を介するこれらの経路中で別々にグリコシル化されることが示唆される。正確にグリコシル化されたタンパク質のみがエキソソームで発見された。これらのタンパク質は、適当な翻訳後の修飾、ワクチン免疫の後の産生または処置用分子のスクリーニングに不可欠な立体構造エピトープの発現に必須の条件を受ける。しかしながら、多かれ少なかれ存在するこれらのグリコシル化は、比較タンパク質の定量化の間に妨害となった複数の散在するバンドを生じる。この課題を克服するために、ゲル上でシグナルバンドを観察するために可溶化物をエンドグリコシラーゼで処理しなければならなかった。
【０４０５】
この結果によると、モチーフＰＳＡＰおよび（最後のＹｘｘＬ由来の）ＤＹは、キメラタンパク質の発現およびエキソソームへのターゲティングに必須である。これらの結果は、根本的な面および産業上の利用の面両方において新規でありそして興味深いものである。
【０４０６】
ＰＳＡＰモチーフはＥＳＣＲＴ複合体のＴｓｇ１０１タンパク質との相互作用に関与するかもしれない。モチーフＤＹｘｘＬに関しては、ＥＳＣＲＴ複合体のＡＬＩＸタンパク質との相互作用に関係するかもしれない。従って、初めて、実験データから、ＥＳＣＲＴ複合体がエキソソームの形成に関与することが示唆される。
【０４０７】
実施例３：膜貫通型ドメインを有する受容体のエキソソームへのターゲティング
膜受容体は、処置用分子の開発のための主な対象である。一般的に、薬剤の高処理スクリーニングは、特に培養下で細胞上に発現された複数の膜ドメインを有する受容体で実施される。細胞表面上での受容体の強い発現を得ることが困難であることに加え、この技術はロボットによるオートメーションに困難をもたらす。しかしながら、精製される遺伝子組換え受容体の使用は現在技術上想定できないので、現在これは唯一の解決策である。
【０４０８】
この文脈中で、受容体、特に複数のドメインを有する受容体を運搬するエキソソームは、安定性および操作の容易性のため使用が簡単でスクリーニングに適当であるツールを構成するかもしれない。
【０４０９】
本実験は、１つのまたは複数の膜貫通型ドメインを有する受容体、特に受容体ＣｘＣＲ４（ケモカインＳＤＳ−１（ＣＸＣＬ−１２）およびＨＩＶに関する受容体）並びにＣＤ４受容体（ＨＩＶ受容体）を輸送するエキソソームを産生することを目的とした。
【０４１０】
３つのキメラ遺伝子を合成した。これらは、３’末端で、配列番号８のＣＤTM−ＢＬＶペプチドを、そして５’末端で、ＣｘＣＲ４ヒト受容体、３０７のアミノ酸（ＣｘＣＲ４（３０７））を含んでなるＣ末端部で切断されたＣｘＣＲ４受容体のバージョン、あるいは４０３アミノ酸（ＣＤ４（４０３））を含んでなるＣ末端部で切断されたＣＤ４受容体バージョンをコードするＤＮＡを含む。
【０４１１】
ＣＤ４およびＣｘＣＲ４受容体は、それぞれ１回および７回膜貫通型ドメインを含んでなる。
【０４１２】
３つのキメラ遺伝子をレトロウイルスの発現ベクターｐＬＰＣＸ中にクローン化した。これらの細胞での様々なキメラタンパク質の発現並びにエキソソームへのこれらの局在化を観察するために、これらの様々なプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔヒト真核細胞に導入した。
【０４１３】
使用したクローニングおよびサブクローニングストラテジーは、実施例２に記載のものと同様であった：
【０４１４】
受容体ＣｘＣＲ４、ＣｘＣＲ４（３０７）およびＣＤ４（４０３）をコードするＤＮＡ並びに試験ペプチドＣＤTMをコードするものを、増幅させた断片の各末端で取り込まれる制限酵素部位のための配列を含んでなるプライマーを使用してＰＣＲにより増幅させた（断片ＣｘＣＲ４、ＣｘＣＲ４（３０７）およびＣＤ４（４０３）は、ＥｃｏＲＩサイト付近の５’末端およびＸｂａＩサイト付近の３’末端に隣接され、そしてＣＤTM／ＢＬＶは、ＸｂａＩサイト付近の５’末端およびＮｏｔＩ付近の３’末端で隣接されるであろう）。
【０４１５】
生成された挿入断片は、ＴＯＰＯ増幅ベクターの中にクローン化した（図２０を参照のこと）。次に得られたプラスミドを制限酵素によって消化し１．５％のアガロ−スゲル上で分析し、次にこれらの配列の完全性を確認するために配列決定した。
【０４１６】
続いて、ＣＤTM／ＢＬＶ挿入断片をＸｂａＩ／ＮｏｔＩカップルを使用して酵素消化によりＴＯＰＯベクターから切除し、ｐＫＳ２増幅ベクターの中にサブクローン化した（図２１を参照のこと）。そして、断片ＣｘＣＲ４、ＣｘＣＲ４（３０７）およびＣＤ４（４０３）を増幅ベクターｐＫＳ２の中にサブクローン化できるように、遺伝子組換えｐＫＳ２ベクター並びに挿入断片ＣｘＣＲ４、ＣｘＣＲ４（３０７）およびＣＤ４（４０３）を含む遺伝子組換えＴＯＰＯベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化したが、当該断片はＣＤTMペプチドをコードする配列の５’末端に置かれていた。
【０４１７】
従って、得られる様々なコンストラクトを、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ酵素ペアを使用した消化により遺伝子組換えｐＫＳ２プラスミドから切除し、次にレトロウイルスの発現ベクターｐＬＰＣＸの中にサブクローン化した（図２２を参照のこと）。得られたベクター（図２８を参照のこと）がＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ酵素ペアを使用した酵素消化によって確認された。
【０４１８】
キメラタンパク質ＣｘＣＲ４／ＣＤTM、ＣｘＣＲ４（３０７）／ＣＤTMおよびＣＤ４（４０３）／ＣＤTMを発現するために、様々なｐＬＰＣＸプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔヒト真核細胞の中に導入した。
【０４１９】
総細胞タンパク質（１００μｇ）および形質導入した細胞の各バッチによって生成されたエキソソームの懸濁タンパク質の抽出物にβ−メルカプトエタノールの存在または非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）泳動を実施した。抗ウサギＣＤTM一次血清およびペルオキシダーゼと結合させた抗ウサギＩｇＧ二次抗体を使用してウエスタンブロットにより、目的のタンパク質を明らかにした。抗体をＥＣＬ溶液を使用して暗室で明らかにした。最終的に、各サンプルのタンパク質フィンガープリントをクマシーブルーでの染色により明らかにした。
【０４２０】
結果を図２９〜３１に表わす。
【０４２１】
キメラＣｘＣＲ４／ＣＤTM、ＣｘＣＲ４（３０７）／ＣＤTMおよびＣＤ４（４０３）／ＣＤTMが細胞タンパク質抽出物中で発現されたことは注目すべきである（図２９を参照のこと）。
【０４２２】
複数のバンド：３６、４２、６２および８７ｋＤａはキメラＣｘＣＲ４／ＣＤTMを特徴付ける。野生型ＣｘＣＲ４受容体の発現は、特にＨＥＫ２９３Ｔ細胞で、複数のアイソフォームによって特徴付けられる；３４、４０、４７、６２、７３および８０ｋＤａのバンドを認識することができる（Sloane JA, et al.）。ＨＥＫ２９３Ｔ中のＣｘＣＲ４／ＣＤTMキメラの大きなサイズのバンドは、ＣｘＣＲ４／ＣＤTMキメラ中の試験ペプチド（ＣＤTMドメイン）の存在に起因する。同様に、３０、４２、６０および８３ｋＤａバンドは、ＣｘＣＲ４（３０７）／ＣＤTMキメラの存在を明らかにした。このキメラの様々なアイソフォームを表わしているバンドのサイズにおけるバリエーションは、ＣｘＣＲ４受容体が切断されるという事実によって説明される。ＣＤ４（４０３）／ＣＤTMキメラは明確に視覚化される５３ｋＤａバンドによって特徴付けられる。
【０４２３】
さらに、これらのキメラは全てエキソソームへ局在化され、（ＣｘＣＲ４／ＣＤTMに関して）３６、４２、６２および８７ｋＤａバンド；（ＣｘＣＲ４（３０７）／ＣＤTMに関して）３０、３８、４８および８３ｋＤａバンド並びに（ＣＤ４（４０３）／ＣＤTMに関して）５３ｋＤａバンドの存在（図３０を参照のこと）によって示される。
【０４２４】
様々なタンパク質フィンガープリントをクマシーブルーで明らかにすることにより、これらの実験の間に使用したエキソソーム由来のタンパク質の総量（図３１Ｂ）が、細胞由来のタンパク質の総量（図３１Ａ）よりはるかに少量であることが示され、一方ウエスタンブロットシグナルは等価である。コントロール細胞可溶化物中に存在する全タンパク質はエキソソームへ局在化されないと見なすことができる。ＣｘＣＲ４／ＣＤTMおよびＣＤ４（４０３）／ＣＤTMキメラは、エキソソームへ非常に強く向けられる。一方で、ＣＤ４（４０３）／ＣＤTMキメラは、ほぼ完全にエキソソームへ局在化される。
【０４２５】
結果
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の様々なｐＬＰＣＸプラスミドでの形質導入は、キメラＣｘＣＲ４／ＣＤTMＢＬＶ、ＣｘＣＲ４（４０３）／ＣＤTMＢＬＶおよびＣＤ４（４０３）／ＣＤTMＢＬＶを発現するために使用されてきた。ウエスタンブロット分析により、細胞可溶化物中のこれらの存在が示されてきた。
【０４２６】
予想通りに、プラスミドｐＬＰＣＸ ＣｘＣＲ４／ＣＤTMＢＬＶおよびｐＬＰＣＸ ＣｘＣＲ４（３０７）／ＣＤTMＢＬＶで形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞で、キメラＣｘＣＲ４／ＣＤTMＢＬＶおよびＣｘＣＲ４（３０７）／ＣＤTMＢＬＶの複数のアイソフォームが発現される。キメラＣｘＣＲ４／ＣＤTMＢＬＶおよびＣｘＣＲ４（３０７）／ＣＤTMＢＬＶは、エキソソームへ効率的に局在化され、これらの融合タンパク質は細胞およびエキソソーム間で同等に分配されるようだ。
【０４２７】
さらに、キメラＣＤ４（４０３）／ＣＤTMＢＬＶの存在が、プラスミドｐＬＰＣＸ ＣＤ４（４０３）／ＣＤTMＢＬＶで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において観察される。試験ペプチドＣＤTMＢＬＶは、キメラＣＤ４（４０３）／ＣＤTMＢＬＶのエキソソームへの主な局在化を助長するように見える。
【０４２８】
上述の結果は、試験ペプチドＣＤTMＢＬＶが単一のまたは複数の膜貫通型ドメインを有するタンパク質をエキソソームへ同等に局在化することができることを示す。
【０４２９】
これらの受容体は原形質膜の中に取り込まれず、そして天然の構造を保持しないので、溶液中でこれらに作用することが非常に困難であることが分かっている。これらのタンパク質に実施した現在の実験は、目的の受容体を発現している安定的な細胞株を使用してしばしばなされる。しかしながら、不適な扱いをした場合に常に死滅するかもしれないこれらの株の入手、培養および維持の時間およびコストの観点からこれは制限される。この理由のため、エキソソームは生存しておらずこれらの研究に関してエキソソームが不都合なく細胞のあらゆる利点を有するので、複数の膜貫通型ドメインを有する受容体を輸送しているエキソソームの使用の事実は興味深い解決策を表わす。
【０４３０】
エキソソームの膜の中に取り込まれる遺伝子組換えタンパク質、特に複数の膜貫通型ドメインを含んでなるタンパク質を有するエキソソームを、ワクチン上およびスクリーニングツールとして使用することができる。
【０４３１】
実施例４
我々は、ペプチドの欠失とシステインのアラニンでの置換によって変異させたＢＬＶのＴＭタンパク質のＣ末端部の断片がそれと融合した目的のペプチドまたはポリペプチドのエキソソームへの高いターゲティング特性を示すことを発見した。このエキソソームターゲティング特性にかかわるアミノ酸の分析で、このペプチドがＥＳＣＲＴの出芽機構のタンパク質と相互作用することを明らかにした。この機構が、膜貫通タンパク質（例えば、受容体）と相互作用し、さらに細胞質性を維持したままそれらが結合する膜と相互作用する細胞質タンパク質（Ｈｒｓ、例えばウイルスカプシド）とも相互作用することが知られている。よって、我々は、２つの特性、１つが膜の内表面への結合、そしてもう１つがエキソソームターゲティング、が付加された細胞質性キメラまたは核タンパク質がエキソソームへと振り分けられるかどうか知りたかった。このために、我々は、この仮説（Covalys、NEB）を実証するために核酸代謝にかかわる細胞の内部タンパク質、すなわちＳＮＡＰタンパク質を使用した。
【０４３２】
ＳＮＡＰタンパク質は、酵素Ｏ６−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）の突然変異体に関してNEB（New England Biochemical, Ipswich, MA, USA）の商品名で使用されている。それは、（ＤＮＡの修復における）ヌクレオチド合成経路に関与する。我々は、ＳｒｃとＣＤTM断片の間に融合したＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のためのマトリックスＤＮＡとしてNEB製のプラスミドｐＳＮＡＰｍからのＤＮＡを使用した。ＳＮＡＰタンパク質は、複数の基質と結合することができる（Keppler et al, 2002; Keppler et al, 2004）。
【０４３３】
細胞膜との相互作用の特性は、多くの細胞タンパク質、特にシグナル伝達にかかわるタンパク質において共通である。これらのタンパク質は、それらが翻訳後に、さらに膜（例えば、コリン）の特定の脂肪酸の極性ヘッド（polar heads）と相互作用する塩基性アミノ酸の存在によっても入手する脂肪酸を介して膜と相互作用する。これらの脂肪酸は、通常ミリスチン酸、パルミチン酸またはゲラニル−ゲラニルである。
【０４３４】
これらのタンパク質の試作品は、２位にミルスチル化可能なグリシンを持っていて、かつ、多くのＮ末端リジンおよびアルギニンを持つ癌遺伝子ｃ−Ｓｒｃである。それが細胞質タンパク質に融合されるとき、このＮ末端断片が細胞膜の内表面に結合する特性をそれに提供することが知られている。膜内に結合する他の多くのタンパク質断片（特に細胞またはウイルスタンパク質）が、これらの断片が細胞質タンパク質に融合された場合に、ｃ−ＳｒｃのＮ末端断片のものと同様に作用できた。融合断片の局在性は、膜固定特性を保存しなければならない。加えて、膜内標的ペプチドにとって融合タンパク質のＮ末端部に局所化されるのが望まれ得る（しかし必ずしも義務的ではない）。例として、ｃ−Ｓｒｃのミリスチル化は、２位のグリシンに対してだけ起こる。他のアシル化について、例えばパルミチル化について、置換アミノ酸の位置は、一般にタンパク質配列のさらに内側に存在する。
【０４３５】
本発明のキメラポリペプチドで使用されたエキソソームターゲティングのためのＣＤTM配列は、異なっていてもよいが（例えば、先の実施例のＣＤTM配列の多くの突然変異体を参照のこと）、それは完全に効果的であるように少なくとも配列ＰＳＡＰ（またはＰＴＡＰ）およびＹｘｘＬを含まなければならない。本発明のキメラポリペプチド内のこのＣＤドメインの局在性は、エキソソームへのターゲティング特性に重要であるように思えない。しかしながら、本発明のキメラポリペプチド内の当該ＣＤドメインの最適局在はＣ末端の位置である。
【０４３６】
本発明のキメラポリペプチドでは、エキソソームターゲティングが得られるようにこれらの２つのペプチド（ＣＤドメイン変異誘導体と膜内標的ドメイン）が付加される目的のペプチドまたはポリペプチドは、異なった性質を有していてもよい：
【０４３７】
例えば、それは以下に記載したポリペプチドＳＮＣとＤＳＣのようにＳＮＡＰタンパク質であってもよい。この場合、フルオロフォアもしくはビオチンまたはその他の分子をエキソソームの特定の部位、例えばＧタンパク質と呼ばれるタンパク質に導入するために、（例えば、Keppler et al, 2002およびKeppler et al, 2004によって記載されているように）このＳＮＡＰタンパク質の特性を使用することが可能である。
【０４３８】
あるいは、本発明のキメラポリペプチドの目的のペプチドまたはポリペプチドはまた、特定の酵素であってもよい。よって、エキソソームは、細胞（特にヒトまたはヒト以外の宿主の細胞）に、またはこの酵素活性が失われた臓器にこの酵素（特に細胞質酵素）を提供するビヒクルとしても使用できる。これは、代謝的または機能的な欠損による障害を患っている患者を治療するのに特に使用できる。
【０４３９】
あるいは、本発明のキメラポリペプチドの目的のペプチドまたはポリペプチドは、（病原性、腫瘍またはその他の）抗原であってもよい。よって、それを含むエキソソームは、この抗原に対して免疫反応をうながすことができ、エキソソームが免疫応答細胞（特に樹状細胞）によって捕捉されることが知られているので、特に有効であるだろう。
【０４４０】
あるいは、本発明のキメラポリペプチドの目的のペプチドまたはポリペプチドは、核配列（例えばＤＮＡ）に特異的に結合するタンパク質であってもよい。次いで、本発明のエキソソームはＰＣＲで容易に検出可能な核酸を結合することができ、そして例えば、診断が行われるのを可能にする。ＲＮＡへのタンパク質の特異的結合のための技術に関する例は、Bertrand et al.（1998）による文献の中に与えられている。Bertrandらによって説明された技術は、一本鎖ＲＮＡ ＭＳ２ファージ（Fouts et al, 1997）およびがこのタンパク質で認識される１９ヌクレオチド配列の多くのコピーを含有しているＲＮＡのカプシドタンパク質の使用に基づいている。
【０４４１】
Ｉ．キメラ遺伝子の合成
我々は、エキソソームへのターゲティングのための機構を有するＢＬＶ（ウシ白血病ウイルス）のＴＭタンパク質由来のペプチドＣＤＴＭ１５の相互作用についての我々の発見した特性と、ｃ−Ｓｒｃタンパク質のＮ末端断片の膜内ターゲティング特性を組み合わせたかった。よって、我々は、この機構のタンパク質とＣＤＴＭとの相互作用を我々が容易にするであろうと確信した。我々の試作品は、レポータータンパク質、ＳＮＡＰタンパク質（CovalysおよびNEB）を組み込んだ。このタンパク質は、その他の目的のタンパク質で置き換えることができた。このために、我々はキメラタンパク質ＳＳＣ（Ｓｒｃ−ＳＮＡＰ−ＣＤＴＭに関する；配列番号１２３；１２４）をコードするキメラ遺伝子Ｓｒｃ−ＳＮＡＰ−ＣＤＴＭ（配列番号１２１；１２２）を作成した。
【０４４２】
ＳＳＣタンパク質をコードするキメラ遺伝子の合成を、多くのステップで実行した。まず第一に、タンパク質ｃ−ＳｒｃのＮ末端部をコードする合成７５ｎｔ ＤＮＡを得た。次に、我々は３つのＤＮＡ断片の別々の増幅を行った：ａ）酵素部位ＥｃｏＲ１上流とＮｈｅＩ下流に接する合成ＤＮＡ；ｂ）部位ＮｈｅＩ上流とＳｂｆＩおよびＡｓｃＩ下流に接するＳＮＡＰタンパク質をコードするＤＮＡ（NEB）；ｃ）部位ＳｂｆＩおよびＡｓｃＩ上流とＮｏｔ１下流に接するＣＤＴＭ断片をコードするＤＮＡ。最終的に、増幅を、重なるその配列をマトリックスＤＮＡとして３つの先のＤＮＡ断片を使用して同時におこない；この後者の増幅は、ＤＮＡがＳｒｃ−ＳＮＡＰ−ＣＤＴＭの順で３つの断片が一緒に接続されて産生されるのを可能にした。
【０４４３】
１）合成ＤＮＡの調製
以下の５オリゴヌクレオチドをＭＷＧによって合成した：
Ｓ１（５’ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣ３’）（配列番号１０８）、
Ｓ２（５’Ｐ−ＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣ３’）（配列番号１０９）、
ＡＳ１（５’ＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＧ３’）（配列番号１１０）、
ＡＳ２（５’Ｐ−ＣＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＧＧＧＣＴＴＧＣＴＣＴＴ３’）（配列番号１１１）、
ＡＳ３（５’Ｐ−ＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣ３’）（配列番号１１２）。
【０４４４】
ＤＮＡ合成：２０μＬのそれぞれのオリゴを、等モル量で混合する（１００μＭのＳ１、Ｓ２、ＡＳ１、ＡＳ２、およびＡＳ３）。ＰＣＲ装置で１回の単一サイクルをおこなう：９５℃、２分、続いてベンチの温度を２５℃に下げる。１１μＬの１０Ｘ連結反応バッファー（NEB）を加えた。９μＬの１０Ｘ連結反応バッファー、８１μＬのＨ2Ｏおよび１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（NEB）を、１０μＬの混合ハイブリダイズオリゴに加える。連結反応を２２℃にて１０分間おこなった。
【０４４５】
その後、合成ＤＮＡを、酵素の供給業者によって設定された条件下、１０ｎｇのマトリックスＤＮＡ、プライマーＳ１およびＡＳ１、４ｄＮＴＰ、１Ｘバッファー、および２．５ＵのPfu Turbo DNAポリメラーゼ（Stratagene）を含む混合物中でＰＣＲによって増幅する。９５℃にて２分の変性後に、２５増幅サイクル（９５℃３０秒、６７℃３０秒、７２℃５秒）をおこなった。
【０４４６】
２）ＰＣＲによる増幅、個々のものは、それらの端部に制限エンドヌクレアーゼ部位を持つ共通配列をグラフトするために、Ｓｒｃ−ＳＮＡＰ−ＣＤ（商標）遺伝子を構成する３つのＤＮＡ断片の各々から成る。（膜内標的ドメインまたはドメイン（ｉｉ）をコードする）Ｓｒｃ断片のヌクレオチド配列は、配列番号１２０である。ＣＤTM断片（ＣＤドメインまたはドメイン（ｉｉｉ）をコードする）のヌクレオチド配列は、配列番号１２０である。
【０４４７】
３つの増幅を、使用したPhusion DNA ポリメラーゼの供給業者であるFinnzymeの推薦する条件下で、それに従いおこなう。
【０４４８】
ａ）Ｓｒｃ断片の増幅と制限部位の付加を、上述のとおり得られた合成ＤＮＡと以下のプライマーを使用することでおこなう：
Ｒ１Ｓｒｃ（ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧ）（配列番号１１３）とＳｒｃＮｈｅ１（ＣＡＴＧＣＴＡＧＣＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣ）（配列番号１１４）。
【０４４９】
ｂ）ＳＮＡＰ断片の増幅と制限部位の付加を、プラスミドｐＳＮＡＰ（NEB）からのＤＮＡと以下のプライマーを使用することでおこなう：
ＮｈｅＳＮＡＰ（ＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＧＡＣＴＧＣＧＡＡＡＴＧＡ）（配列番号１１５）、および
ＳＮＡＰＳｂｆＡｓｃ（ＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＴＴＧ）（配列番号１１６）。
【０４５０】
ｃ）ＤＣＴＭ断片の増幅と制限部位の付加を、Ｃ末端のシステインがアラニンに変異したＢＬＶのＴＭのＣ末端部をコードするＤＮＡを使用することでおこなう：それを以下のプライマーを使用することでおこなう：
ＳｂｆＡｓｃＤＣＴＭ１５（ＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＴＣ）（配列番号１１７）、および
ＤＣＴＭ１５Ｎｏｔ（ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＡＡＣＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡ）（配列番号１１８）。
【０４５１】
３）ＤＮＡ Ｓｒｃ−ＳＮＡＰ−ＤＣＴＭを得るための増幅
先の３つのＤＮＡ断片をゲル上で精製する。マトリックスとしてのこれらの３つのＤＮＡの混合物の増幅を、使用したPhusion DNA ポリメラーゼの供給業者であるFinnzymeの推薦する条件下で、それを使用して、プライマーＲ１ＳｒｃとＤＣＴＭ１５Ｎｏｔ（前記を参照のこと）の存在下でおこなう。得られたＤＮＡを、前述の３つのＤＮＡ一緒に融合する。
【０４５２】
ＩＩ．クローニング・ベクターＰＣＲ（登録商標）ＢＬＵＮＴＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）内へのクローニング
１）クローニング・ベクターＰＣＲ（登録商標）ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）へのＰＣＲ産物の連結反応
連結反応を、その端部にトポイソメラーゼＩ酵素を持っている線状化プラスミドベクターを用いて実行し（図６を参照のこと）、それによりリガーゼの関与なしに統合される挿入を可能にする。加えて、このベクターはその端部のいずれかに平滑末端があるので、挿入物には、連結できるように平滑末端がなければならない。形質転換体を選択するために、プラスミドには、カナマイシンに対する抗生物質抵抗性遺伝子がある。
【０４５３】
以下のものを氷中で混合する：０．３μＬのＰＣＲ産物、０．２５μＬの塩類溶液、０．７μＬの滅菌水、および０．２５μＬのＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔクローニングキット（Invitrogen）からのＴＯＰＯベクター、すなわち、終濃度１．５μＬ。それを、周囲温度にて５〜３０分間インキュベートする。
【０４５４】
２）ＴＯＰ１０ケモコンピテント細菌
ＴＯＰ１０ケモコンピテント細菌（１０μＬ）を、ＴＯＰＯ／挿入物連結混合物の全体によって形質転換する。陽性形質転換対照（１ｎｇのＰＵＣ１９：アンピシリン耐性遺伝子を持つプラスミド）と陰性対照（挿入物を含まないＴＯＰＯプラスミド）があった。氷中での３０分間のインキュベーション後に、熱ショックを４２℃にて３０秒間、混合物に適用する。そしてすぐに、氷中にチューブを戻す。次に、２５０μＬのＳＯＣ培地（バクトトリプトン２％、バクト酵母抽出物０．５％、ＮａＣｌ ０．０５％、およびグルコース０．２％）を加え、それと慎重に均質化し、そして表現型発現までの時間、水浴中で３７℃にて１時間インキュベートする。最終的に、１５０μＬの懸濁液を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えたＬＢ（Luria Broth）／アガーの入ったディッシュ内に播種し、そして３７℃にて２４時間インキュベートする。ディッシュ内で、カナマイシン耐性遺伝子を取得した、よって目的の遺伝子を含むとは限らないが、クローニング・ベクターを持つコロニーが出現した。クローンを再び広げ、３７℃にて２４時間インキュベートした２番目のゲロースディッシュ上でカウントし、そして再播種したクローンの１０ｍＬ（ＬＢ＋１００μＭのカナマイシン）の液体培養を振盪しながら３７℃にて１６時間生じさせた。
【０４５５】
３）DNA プラスミドミニ調製
細菌培養物を、３５００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心分離する。ペレットを２５０μＬのＡ１再懸濁バッファー中に溶かす（plasmid DNA Purification Nucleospinキット（Macherey-Nagel））。細菌を、２５０μＬのＡ２溶解バッファーを用いて周囲温度にて５分間溶解する。次に、３００μＬのＡ３中和バッファーを加え、そして拡散ペレットの製造を予防するために、転倒撹拌によって十分に混合することが重要である。チューブを１１０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離する。上清を、収集チューブ上に置いたカラムに通す；それを１１０００ｒｐｍにて１分間遠心分離する。５００μＬのＡ４洗浄バッファーで洗浄した後に、カラムを１１０００ｒｐｍにて２分間乾燥させる。５０μＬの溶出バッファーを通し、そして溶出液をエッペンドルフチューブで回収する。得られたＤＮＡを、２６０ｎｍの分光測光によってアッセイする。
【０４５６】
４）酵素分解（ＥｃｏＲＩ）とシークエンシング
得られたプラスミドＤＮＡが、実際は再結合されているかどうか確かめるために、そのプラスミドを特異的な制限酵素（Biolabs（登録商標））、ＥｃｏＲＩで消化する（ＥｃｏＲＩは挿入部位を囲んでいる）。約２００ｎｇのそれぞれのプラスミドを、４単位の酵素によって消化する。１μＬのNEB１ １０Ｘバッファーと滅菌水をこれに加え、１０μＬの終量を得た。消化を３７℃にて１時間おこなう。２％のアガロースゲル上で良好なクローンを特定した後に、１．５μｇのプラスミドＤＮＡを、シークエンシングのためにEurofins MWG Operonに送る。これが、加えた制限部位が、突然変異と同様に実際に存在しているかどうかチェックすることによって、それぞれの配列の完全性の確認を可能にする。いくつかのクローンを得、それらのプラスミドＤＮＡを分析し、そして配列決定した。２つのプラスミドを保有する：第１のＳｒｃ−ＳＮＡＰ−ＣＤTMは、予想されたキメラ遺伝子を表し；第２のＤ−ＳＮＡＰ−ＣＤTMは、最後のＰＣＲ中に生じなければならなかったＳｒｃ断片の一部に欠失がある配列に相当する。Ｄ−ＳＮＡＰ−ＣＤTMＤＮＡによってコードされたタンパク質もまた、ミルスチル化可能な位置にグリシンを含んでいるが、膜内固定特性を補強する塩基性アミノ酸の一部を消失している。
【０４５７】
ＩＩＩ．発現ベクターＰＣＤＮＡ３．１内へのクローニング
１）発現ベクターの調製
ベクターｐＣＤＮＡ３．１を、制限酵素ＥｃｏＲ１とＮｏｔＩによって消化し、次に脱リン酸し、そしてフェノール／クロロホルムで抽出する。
【０４５８】
イソプロパノールを用いた沈殿で、消化中に放出された、そしてプラスミドと再連結されるかもしれない、短鎖ＤＮＡ断片（ＥｃｏＲ１とＮｏｔＩの間に位置する１００ｂｐ未満）を排除することを可能にした。０．１５倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムと０．６倍量の冷イソプロパノールを加える。それを４℃にて３０分間インキュベートし、次に４℃、１５０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離する。ペレットを、５００μＬの７０％エタノールで洗浄し、１５０００ｒｐｍで１０分間、再び遠心分離する。ペレットを、１５分間、真空乾燥し、５０μＬのＴＥ中に溶かす。
【０４５９】
２）挿入物の調製
連続したＥｃｏＲ１−ＮｏｔＩ消化：挿入物Ｓｒｃ−ＳＮＡＰ−ＣＤTMとＤ−ＳＮＡＰ−ＣＤTMを含む２μｇのｐＴｏｐｏ ＤＮＡプラスミドを、挿入物を取り囲む２つの制限酵素、すなわちＥｃｏＲ１とＮｏｔＩで連続して消化する。６５℃にて２０分間の酵素の不活性化後に、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、そして２０μＬのＴＥ中に再懸濁する。そして、それを−２０℃にて保存した。
【０４６０】
低融解アガロースゲル（EUROBIO（登録商標））内の挿入物の精製：
挿入物断片を、２％の低融解アガロースゲル上で抽出し、そしてNucleospinキットを使用してカラム精製した（Nucleospin Extract IIR Kit、MACHEREY-NAGEL）。終量は５０μＬである。
【０４６１】
３）連結反応
３５ｎｇの脱リン酸ベクターを、チューブ内、約３／１（分子対分子）の挿入／ベクター比で挿入物と混ぜる。以下のものを加える：１μＬの１０Ｘリガーゼバッファー、滅菌水（ｑｓｐ １０μＬ）、および１ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Biolabs（登録商標））。陰性対照を、同量のＴＥ１Ｘで挿入物の体積を置き換えることによって作り出した。混合物を、周囲温度にて一晩インキュベートする。
【０４６２】
４）ＤＨ５α細菌の形質転換
この形質転換は熱ショックに基づく。２００μＬのＤＨ５α細菌を連結反応生成物に加える；氷中で３０分間；４２℃にて２分間；氷中で５分間；８００μＬのＬＢ培地の添加；振盪しながら３７℃にて１時間のインキュベーション；ＬＢ／アガー／アンピシリン・ディッシュ（５０μｇ／ｍＬ）上に１００μＬを播種、そしてオーブン内、３７℃にて１６時間インキュベーション。
【０４６３】
５）挿入物の存在の検定とアガロースゲル上での目視
ＥｃｏＲ１−ＮｏｔＩ消化によるMidipreparationsと検定を、トランスフェクションとタンパク質発現ステップのために、良好なクローンを選択し、そしてプラスミドＤＮＡのストックを準備するためにおこなう。
【０４６４】
ＩＶ．キメラタンパク質の発現とエキソソームへの標的化
１）細胞培養
ＨＥＫ ２９３Ｔ真核細胞（ヒト胚腎臓）を、フラスコ内で１０％の胎児子ウシ血清（ＦＣＳ）と２０μｇ／ｍＬの濃度のゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル培地）中、５％のＣＯ2、３７℃にて培養する。
【０４６５】
２）トランスフェクション
抗生物質を含まないＤＭＥＭ＋４ｍＬの１０％ＦＣＳ中に１ウェルあたり０．５×１０6個のＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレート内に播種する。５％のＣＯ2中で３７℃にて２４時間の培養後に、細胞を９０％コンフルエントにし、そして５００μＬの培地中、１μｇの目的のプラスミドと２μＬのJetPEI（PolyPlus（登録商標））の間に形成された複合体によって形質移入する；ＤＮＡはエンドサイトーシスによって取り込まれる。６時間のインキュベーション後に、培地を血清中に含まれるエキソソームを含んでいないＦＣＳによる１０％のＤＭＥＭによって置き換える（４２０００ｒｐｍにて１８時間の超遠心分離によって取り除いた（Ｔｉ４５ローター、Beckman））。形質移入の４８時間後に、上清を取り出して生じたエキソソームを回収し、そして細胞タンパク質を得るために細胞を溶解する。
【０４６６】
３）エキソソームの調製
細胞培地を回収すると、それを１４００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して、培地から細胞を取り除く。細胞残屑を排除するために、上清を４℃にて１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清を回収し、２０％のショ糖を含むＴＮＥのクッションをチューブの底に注ぎ入れ、そしてＴｉ５０ローターにより（Beckman）４２０００ｒｐｍ、４℃にて２時間、超遠心分離した。そして、純粋なエキソソームのペレットを１００μＬのＰＢＳ中に溶かす。
【０４６７】
４）タンパク質の抽出
細胞を４℃にてＰＢＳで洗浄し、次にＲＩＰＡバッファー（ＴＮＥ １Ｘ、ＮＰ４０ ０．５％、アプロチニン ２０μｇ／ｍＬ、ロイペプチン ２０μｍ、無菌のＨ2Ｏ、フェニルメチルスルホニルフルオライド ０．２ｍＭ）で溶解する。溶解物を１４，０００ｒｐｍ、４℃にて２０分間遠心分離し、そして上清を回収する。
【０４６８】
細胞抽出物およびエキソソームのタンパク質を、NanoDrop分光光度計およびＢＳＡ較正シリーズ（０−２００μｇ／ｍＬ）を用いてブラッドフォードの方法を使用することで定量する。
【０４６９】
５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動とウエスタンブロット法：
サンプル（細胞タンパク質抽出物２０μｇとエキソソーム溶解物２μｇ）を１０％のポリアクリルアミドゲル上で６０ｍＡにて１時間半分離し、次に、メタノール浴で活性化し、水そしてＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ塩基 ２０ｍＭ ｐＨ７．４；ＮａＣｌ ０．１５Ｍ；Ｔｗｅｅｎ ０．５％）ですすいだＰＶＤＦ膜（重合ビニリデンジフルオライド、Immobilon-P、Millipore）上に冷凍室内、５０ｍＡにて一晩、移し取った。そして、その膜をＴＢＳＴ中、５％の粉ミルクで１時間、飽和させる。次に、それを一次抗体：研究室で準備した抗ウサギＣＤTM血清、と一緒に４℃にて一晩インキュベートする。次に、ＴＢＳＴでそれぞれ５分、３回洗浄し、次に二次抗体であるペルオキシダーゼ（Jackson ImmunoResearch）と結合させた抗ウサギＩｇＧと一緒に膜を１時間インキュベートする。それをＴＢＳＴ中で再び洗浄し、次に、ＥＣＬ（高化学発光、Amersham）の溶液中に浸漬したワットマン紙上に乗せる。Lumi-imager F1カメラ（Roche（登録商標））で像を明らかにする。
【０４７０】
図３４で分かるように、ＤＳＣタンパク質（トラック２と５）およびＳＳＣ  ＣＤＴＭタンパク質（トラック３と６）は、約３０ｋＤＡを形成し、そして細胞で発現される（図３４Ｂを参照のこと）。この２つのタンパク質、ＤＳＣとＳＳＣは、エキソソームに標的化されている（図３４Ａを参照のこと）。エキソソームに分泌されたタンパク質／細胞内で産生されるタンパク質の間の比の検証は、エキソソームにおけるタンパク質ＳＳＣのターゲティングがタンパク質ＤＳＣのそれよりも効果的であることを示唆している。
【０４７１】
引用文献
【化１】
0005932647.tif 000006
【０４７２】
【化２】
0005932647.tif 000007
【図１】
0005932647.tif 000008
【図２】
0005932647.tif 000009
【図３】
0005932647.tif 000010
【図４】
0005932647.tif 000011
【図５】
0005932647.tif 000012
【図６Ａ】
0005932647.tif 000013
【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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