(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液脳関門機能の低下能を有する血栓溶解薬と併用される、ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分とする脳梗塞治療用の医薬であって、前記ビグアナイド系薬剤がメトホルミン又はブホルミンである、医薬。
【請求項２】
前記ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩がメトホルミン塩酸塩又はブホルミン塩酸塩である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
有効成分投与量が１２５〜３０００ｍｇ／人／日である、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
血液脳関門機能の低下能を有する血栓溶解薬と併用される、脳梗塞治療用の医薬を製造するための、ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩の使用であって、前記ビグアナイド系薬剤がメトホルミン又はブホルミンである、使用。
【請求項５】
前記ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩がメトホルミン塩酸塩又はブホルミン塩酸塩である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
有効成分投与量が１２５〜３０００ｍｇ／人／日である、請求項４又は５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液脳関門障害症候群治療薬に関する。更に詳細には、本発明は血液脳関門機能を強化することにより種々の疾患を治療又は予防するための、ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分とする血液脳関門障害症候群治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ（ＢＢＢ））は脳血管内皮細胞を実体とする循環血液と脳実質を隔てる障壁であり薬物等の物質脳移行を制限している。さらに、脳血管内皮細胞が脳ペリサイト、グリア細胞と共に構成する血液脳関門は、脳神経細胞と共に高度なネットワーク機能から成る「脳神経血管機構」を形成して高次脳機能を維持している。この血液脳関門機能の障害は、様々な脳機能障害の病態形成に関与する（非特許文献１）。
【０００３】
血液脳関門機能低下などの血液脳関門機能障害により生じる病態としては、例えば、（ｉ）薬物の脳内移行量の増加、（ｉｉ）血中アルブミンの脳浸潤による脳浮腫、（ｉｉｉ）白血球の脳内浸潤による脳症、（ｉｖ）アミロイドベータタンパク質（Ａβ）等の生理活性ペプチドの脳クリアランス異常、等がある。前記の病態により、（１）薬物有害事象（副作用）の発生、（２）脳梗塞、脳外傷、（３）脳神経変性疾患、（４）アルツハイマー病、等の血液脳関門機能障害を素因とする疾患（血液脳関門障害症候群）の発症又は悪化が起こる。
【０００４】
慢性骨髄性白血病等の治療薬であるイマチニブが、血液脳関門透過性を抑制することで脳梗塞を抑制することが、知られている（非特許文献２）。また、気管支喘息等の治療薬であるプランルカストが、血管透過性亢進抑制剤として毛細血管の管腔及び管腔構造を構成する血管内皮細胞に作用し、毛細血管内の血漿成分や血球等が組織に漏出することを防ぐことが、知られている（特許文献１）。
【０００５】
しかし、現在、血液脳関門機能を強化して血液脳関門障害症候群を治療する医薬品として、実用化されているものはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
特許文献１  特開２００９−２２１２１７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎｅｕｒｏｎ，２００８，５７，１７８〜２０１
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，Ｊｕｌｙ，１４（７），７３１〜７３７
【非特許文献３】Ｎｉｃｏｌａｓ  Ｗ．，Ｆｌｏｒｅｎｃｅ  Ｍ．，Ｓｙｌｖｉｅ  Ｃ．，Ｐｉｅｒｒｅ−Ｏｌｉｖｉｅｒ  Ｃ．、「Ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｈｏｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、２００９、１７７８、ｐ．８４２〜８５７
【非特許文献４】Ｎｉｓｈｉｏｋｕ  Ｔ．，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ａ．，Ｔａｋａｔａ  Ｆ．，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ．，Ｆｕｒｕｓｈｏ  Ｋ．，Ｓｈｕｔｏ  Ｈ．，Ｄｏｈｇｕ  Ｓ．，Ｋａｔａｏｋａ  Ｙ．、「Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｃ  ｍｉｃｅ」、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２０１０、Ｏｃｔｏｂｅｒ  ４、４８２（３）、ｐ．２０８〜２１１
【非特許文献５】Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ａ．，Ｄｏｈｇｕ  Ｓ．，Ｔａｋａｔａ  Ｆ．，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｏｋｕ  Ｔ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｊ．，Ｏｈｋｕｂｏ  Ｙ．，Ｓｈｕｔｏ  Ｈ．，Ｋａｔａｏｋａ  Ｙ．、「Ｐａｒｔｉａｌ  ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ  ａｇｇｒａｖａｔｅｓ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎ  ｍｉｃｅ」、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１１、Ｍａｒｃｈ  １４、８８（１１−１２）、ｐ．５２９〜５３４
【非特許文献６】Ｄｏｈｇｕ  Ｓ．，Ｓｕｍｉ  Ｎ．，Ｎｉｓｈｉｏｋｕ  Ｔ．，Ｔａｋａｔａ  Ｆ．，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ．，Ｎａｉｔｏ  Ｍ．，Ｓｈｕｔｏ  Ｈ．，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ａ．，Ｋａｔａｏｋａ  Ｙ．、「Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２０１０、Ｏｃｔｏｂｅｒ  １０、６４４（１−３）、ｐ．５〜９
【非特許文献７】Ｄｏｈｇｕ  Ｓ．，Ｎｉｓｈｉｏｋｕ  Ｔ．，Ｓｕｍｉ  Ｎ．，Ｔａｋａｔａ  Ｆ．，Ｎａｋａｇａｗａ  Ｓ．，Ｎａｉｔｏ  Ｍ．，Ｔｓｕｒｕｏ  Ｔ．，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ａ．，Ｓｈｕｔｏ  Ｈ．，Ｋａｔａｏｋａ  Ｙ．、「Ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ  ｏｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ、２７（７）、ｐ．８８９〜８９９
【非特許文献８】Ｔａｋａｔａ  Ｆ．，Ｄｏｈｇｕ  Ｓ．，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ａ．，Ｓｕｍｉ  Ｎ．，Ｎａｋａｇａｗａ  Ｓ．，Ｎａｉｔｏ  Ｍ．，Ｔｓｕｒｕｏ  Ｔ．，Ｓｈｕｔｏ  Ｈ．，Ｋａｔａｏｋａ  Ｙ．、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ」、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、Ｍａｙ、２７（３）、ｐ．３１７〜３２８
【非特許文献９】Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ａ．，Ｓｈｕｔｏ  Ｈ．，Ｄｏｈｇｕ  Ｓ．，Ｎａｋａｎｏ  Ｙ．，Ｅｇａｗａ  Ｔ．，Ｋａｔａｏｋａ  Ｙ．、「Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ  ａｇｇｒａｖａｔｅｓ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｈｏｃｋ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｎｖｕｌｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｍｉｄｄｌｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ」、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００５、Ａｕｇｕｓｔ、２５（５）、ｐ．９２３〜９２８
【非特許文献１０】Ｄｏｈｇｕ  Ｓ．，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ａ．，Ｎａｋａｇａｗａ  Ｓ．，Ｔａｋａｔａ  Ｆ．，Ｋａｉ  Ｍ．，Ｅｇａｗａ  Ｔ．，Ｎａｉｔｏ  Ｍ．，Ｔｓｕｒｕｏ  Ｔ．，Ｓａｗａｄａ  Ｙ．，Ｎｉｗａ  Ｍ．，Ｋａｔａｏｋａ  Ｙ．、「Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎ  ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒａｔ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ」、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００４、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２８、５０５（１−３）、ｐ．５１〜５９
【非特許文献１１】Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ａ．，Ｏｉｓｈｉ  Ｒ．，Ｋａｔａｏｋａ  Ｙ．、「Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｓ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｄ  ｂｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄａｒｋ  ｐｈａｓｅ  ｉｎ  ｒａｔｓ」、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、２００４、Ｏｃｔｏｂｅｒ、２４（５）、ｐ．６９５〜７０４
【非特許文献１２】Ｆｕｊｉｓａｋｉ  Ｙ．，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ａ．，Ｄｏｈｇｕ  Ｓ．，Ｓｕｎａｄａ  Ｋ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｃ．，Ｏｉｓｈｉ  Ｒ．，Ｋａｔａｏｋａ  Ｙ．、「Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａ−ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｄｏｒｓａｌ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｃｏｎｖｕｌｓｉｏｎｓ」、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００２、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０、７２（４−５）、ｐ．５４９〜５５６
【非特許文献１３】Ｔｏｍｉｎａｇａ  Ｋ．，Ｋａｉ  Ｍ．，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ａ．，Ｄｏｈｇｕ  Ｓ．，Ｔｏｄａ  Ｋ．，Ｏｉｓｈｉ  Ｒ．，Ｋａｔａｏｋａ  Ｙ．、「Ｓｕｂｃｈｒｏｎｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＡＢＡＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  ｒａｔｓ」、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００２、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０、７２（４−５）、ｐ．４２５〜４３０
【非特許文献１４】Ｋａｎｏｓｋｉ  ＳＥ，Ｚｈａｎｇ  Ｙ．，Ｚｈｅｎｇ  Ｗ．，Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＴＬ、「Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ−ｅｎｅｒｇｙ  ｄｉｅｔ  ｏｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、２０１０、Ｊａｎｕａｒｙ、２１（１）、ｐ．２０７〜２１９
【非特許文献１５】Ｕｅｎｏ  Ｍ，Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｈ，Ｔｏｍｉｍｏｔｏ  Ｈ，Ａｋｉｇｕｃｈｉ  Ｉ，Ｏｎｏｄｅｒａ  Ｍ，Ｈｕａｎｇ  ＣＬ，Ｋａｎｅｎｉｓｈｉ  Ｋ．、「Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｓ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｏｆ  ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒａｔｓ．」、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ、２００４、Ｊｕｎｅ、１０７（６）、ｐ．５３２−５３８
【非特許文献１６】Ｈｏｎｄａ  Ｍ．，Ｎａｋａｇａｗａ  Ｓ．，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｋ．，Ｋｉｔａｇａｗａ  Ｎ．，Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  Ｋ．，Ｎａｇａｔａ  Ｉ．，Ｎｉｗａ  Ｍ．、「Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｕｄｉｎ−５」、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００６、２６（２）、ｐ．１０９〜１１８
【非特許文献１７】Ｊｉｎ  Ｒ．，Ｙａｎｇ  Ｇ．，Ｌｉ  Ｇ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ：  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ」、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ、２０１０、Ｊｕｎ、３８（３）、ｐ．３７６〜３８５
【非特許文献１８】Ａｂｕ  Ｆａｎｎｅ  Ｒ．，Ｎａｓｓａｒ  Ｔ．，Ｙａｒｏｖｏｉ  Ｓ．，Ｒａｙａｎ  Ａ．，Ｌａｍｅｎｓｄｏｒｆ  Ｉ．，Ｋａｒａｋｏｖｅｓｋｉ  Ｍ．，Ｖａｄｉｍ  Ｐ．，Ｊａｍｍａｌ  Ｍ．，Ｃｉｎｅｓ  Ｄ．Ｂ．，Ｈｉｇａｚｉ  Ａ．Ａ．、「Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔＰＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ」、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２０１０、Ｊｕｎ、５８（７）、ｐ．９７２〜９８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、血液脳関門機能を強化することにより種々の疾患を治療又は予防するための医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
鋭意研究の結果、本発明者は、ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分とする医薬又は前記医薬を含有する医薬組成物が脳血管内皮細胞の密着結合能や経細胞輸送能などを含む血液脳関門機能を強化することにより、脳毛細管内に存在するアルブミンや密着結合能マーカーであるフルオレセインナトリウムの脳組織側への漏出を抑制することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
なお、本明細書及び特許請求の範囲において使用する「強化」という用語は、先天的に又は後天的に低下している機能の強化の他、正常の機能の強化も意味し、さらに、先天的に又は後天的に低下している機能を改善する、「再構築」による機能の強化も意味する。さらにまた、機能が低下することの「抑制」も意味する。
その他、外的又は内的要因によって機能が強化することの「促進」も意味する。
したがって、密着結合能や経細胞輸送能などを含む血液脳関門機能の強化には、血液脳関門機能の強化ばかりではなく、血液脳関門機能の再構築も、血液脳関門機能の低下の抑制も、血液脳関門機能の強化・再構築・低下の抑制の促進も、含まれるものと解釈される。
【００１１】
すなわち、本願は、血液脳関門機能を強化するためのビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分とする医薬又は医薬組成物である血液脳関門障害症候群治療薬を提供する。
より具体的には、本願は、脳梗塞の悪化又は再発を予防するための、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を提供する。また、本願は、脳梗塞に伴う脳浮腫を予防、抑制又は改善するための、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を提供する。また、本願は、敗血症に伴う脳症を予防、抑制又は改善するための、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を提供する。また、本願は、多発性硬化症における白血球脳内浸潤を予防、抑制又は改善するための、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を提供する。また、本願は、アルツハイマー病におけるアミロイドベータタンパク質（Ａβ）の脳内での蓄積を予防、抑制又は改善するための、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を提供する。
さらにまた、本願は、薬物の脳移行を予防又は抑制することにより、動物又はヒトの中枢神経性有害症状を予防、抑制又は改善するための、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を提供する。
【００１２】
いくつかは上記と重複するが、本発明を以下に記す。
（発明１）
血液脳関門機能を強化するための、ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分とする医薬。
（発明２）
前記血液脳関門機能の強化が血液脳関門機能の低下の予防、抑制又は抑制の促進である、発明１のいずれか一項に記載の医薬。
（発明３）
前記血液脳関門機能の低下が、糖尿病、肥満、高血圧、脳梗塞、脳外傷、敗血症、多発性硬化症、アルツハイマー病又はその組合せからなる群から選ばれる疾患によるものである、又は中枢性副作用誘発物質によるものである、発明２に記載の医薬。
（発明４）
前記中枢性副作用誘発物質が免疫抑制薬又は血栓溶解薬である、発明３に記載の医薬。
（発明５）
脳梗塞若しくは脳外傷に伴う脳浮腫を予防、抑制又は改善するための薬物と併用される、発明１に記載の医薬。
（発明６）
前記薬物が血栓溶解薬である、発明５に記載の医薬。
（発明７）
前記血栓溶解薬が組織型プラスミノゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）である、発明６に記載の医薬。
（発明８）
前記医薬が薬物の脳移行を予防又は抑制する、発明１の医薬。
（発明９）
前記薬物が動物又はヒトの中枢神経での作用を期待しない薬物である、発明８に記載の医薬。
（発明１０）
前記薬物の脳移行を予防又は抑制することにより、前記医薬が動物又はヒトの中枢神経性作用の有害症状を予防、抑制又は改善する、発明８又は９に記載の医薬。
（発明１１）
前記有害症状が、振戦、痙攣、白質脳症、頭痛、眠気、意識障害、異常行動、せん妄、幻覚、妄想、てんかん及びそれらの組み合わせから選ばれる、発明１０に記載の医薬。
（発明１２）
前記ビグアナイド系薬剤がメトホルミン又はブホルミンである、発明１〜１１のいずれか一項に記載の医薬。
（発明１３）
前記ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩がメトホルミン塩酸塩又はブホルミン塩酸塩である、発明１２に記載の医薬。
（発明１４）
有効成分投与量が１２５〜３０００ｍｇ／人／日である、発明１〜１３のいずれか一項に記載の医薬。
（発明１５）
疾患を予防、抑制又は改善するための方法であって、
前記疾患が、振戦、痙攣、白質脳症、頭痛、眠気、意識障害、異常行動、せん妄、幻覚、妄想、てんかん、脳梗塞、脳外傷、敗血症、アルツハイマー病、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、
前記方法が、必要としている者に発明１に記載の医薬を投与する工程を含む、
方法。
（発明１６）
血液脳関門障害症候群を治療するための方法であって、
前記方法が、必要としている者にビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含む医薬を投与して、血液脳関門機能を強化する工程を含む、
方法。
さらに、いくつかは上記と重複するが、本発明を以下に記す。
（発明１ａ）
薬物の脳移行を予防又は抑制するための、ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分とする血液脳関門障害症候群治療薬。
（発明２ａ）
前記薬物が動物又はヒトの中枢神経での作用を期待しない薬物である、発明１ａに記載の血液脳関門障害症候群治療薬。
（発明３ａ）
前記薬物の脳移行を予防又は抑制することにより、動物又はヒトの中枢神経性作用の有害症状を予防、抑制又は改善するための、発明１ａ又は２ａに記載の血液脳関門障害症候群治療薬。
（発明４ａ）
前記有害症状が、振戦、痙攣、白質脳症、頭痛、眠気、意識障害、異常行動、せん妄、幻覚、妄想、てんかん及びそれらの組み合わせから選ばれる、発明３ａに記載の血液脳関門障害症候群治療薬。
（発明５ａ）
脳梗塞若しくは脳外傷に伴う脳浮腫を予防、抑制又は改善するための、ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分とする血液脳関門障害症候群治療薬。
（発明６ａ）
敗血症に伴う脳症を予防、抑制又は改善するための、ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分とする血液脳関門障害症候群治療薬。
（発明７ａ）
多発性硬化症における白血球脳内浸潤を予防、抑制又は改善するための、ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分とする血液脳関門障害症候群治療薬。
（発明８ａ）
アルツハイマー病におけるアミロイドベータタンパク質（Ａβ）の脳内での蓄積を予防、抑制又は改善するための、ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分とする血液脳関門障害症候群治療薬。
（発明９ａ）
脳梗塞の悪化又は再発を予防又は抑制するための、ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分とする血液脳関門障害症候群治療薬。
（発明１０ａ）
血液脳関門機能を強化するための、ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分とする血液脳関門障害症候群治療薬。
（発明１１ａ）
前記血液脳関門機能の強化が血液脳関門機能の低下の予防、抑制又は抑制の促進である、発明１０ａに記載の血液脳関門障害症候群治療薬。
（発明１２ａ）
前記血液脳関門機能の低下が、糖尿病、肥満、高血圧又はその組合せからなる群から選ばれる疾患によるものである、発明１１ａに記載の血液脳関門障害症候群治療薬。
（発明１３ａ）
前記ビグアナイド系薬剤がメトホルミン又はブホルミンである、発明１ａ〜１２ａのいずれか一つに記載の血液脳関門障害症候群治療薬。
（発明１４ａ）
前記ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩がメトホルミン塩酸塩又はブホルミン塩酸塩である、発明１３ａに記載の血液脳関門障害症候群治療薬。
（発明１５ａ）
有効成分投与量が１２５〜３０００ｍｇ／人／日である、発明１ａ〜１４ａのいずれか一つに記載の血液脳関門障害症候群治療薬。
加えて、いくつかは上記と重複するが、本発明を以下に記す。
（発明１ｂ）
血液脳関門機能を強化するための、ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分とする医薬。
（発明２ｂ）
前記血液脳関門機能の強化が血液脳関門機能の低下の予防、抑制又は抑制の促進である、発明１ｂに記載の医薬。
（発明３ｂ）
前記血液脳関門機能の低下が、糖尿病、肥満、高血圧、脳梗塞、脳外傷、敗血症、多発性硬化症、アルツハイマー病又はその組合せからなる群から選ばれる疾患によるものである、又は中枢性副作用誘発物質によるものである、発明２ｂに記載の医薬。
（発明４ｂ）
前記中枢性副作用誘発物質が免疫抑制薬又は血栓溶解薬である、発明３ｂに記載の医薬。
（発明５ｂ）
脳梗塞若しくは脳外傷に伴う脳浮腫を予防、抑制又は改善するための薬物と併用される、発明１ｂに記載の医薬。
（発明６ｂ）
前記薬物が血栓溶解薬である、発明５ｂに記載の医薬。
（発明７ｂ）
前記血栓溶解薬が組織型プラスミノゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）である、発明６ｂに記載の医薬。
（発明８ｂ）
前記医薬が薬物の脳移行を予防又は抑制する、発明１ｂの医薬。
（発明９ｂ）
前記薬物が動物又はヒトの中枢神経での作用を期待しない薬物である、発明８ｂに記載の医薬。
（発明１０ｂ）
前記薬物の脳移行を予防又は抑制することにより、前記医薬が動物又はヒトの中枢神経性作用の有害症状を予防、抑制又は改善する、発明８ｂ又は９ｂに記載の医薬。
（発明１１ｂ）
前記有害症状が、振戦、痙攣、白質脳症、頭痛、眠気、意識障害、異常行動、せん妄、幻覚、妄想、てんかん及びそれらの組み合わせから選ばれる、発明１０ｂに記載の医薬。
（発明１２ｂ）
前記ビグアナイド系薬剤がメトホルミン又はブホルミンである、発明１ｂ〜１１ｂのいずれか一つに記載の医薬。
（発明１３ｂ）
前記ビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩がメトホルミン塩酸塩又はブホルミン塩酸塩である、発明１２ｂに記載の医薬。
（発明１４ｂ）
有効成分投与量が１２５〜３０００ｍｇ／人／日である、発明１ｂ〜１３ｂのいずれか一つに記載の医薬。
（発明１５ｂ）
疾患を予防、抑制又は改善するための方法であって、
前記疾患が、振戦、痙攣、白質脳症、頭痛、眠気、意識障害、異常行動、せん妄、幻覚、妄想、てんかん、脳梗塞、脳外傷、敗血症、アルツハイマー病、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、
前記方法が、必要としている者に発明１ｂに記載の医薬を投与する工程を含む、
方法。
（発明１６ｂ）
血液脳関門障害症候群を治療するための方法であって、
前記方法が、必要としている者にビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩を有効成分として含む医薬を投与して、血液脳関門機能を強化する工程を含む、
方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬は、脳血管内皮細胞の密着結合能や経細胞輸送能などを含む血液脳関門機能の強化により、血液脳関門障害を素因とする疾患又は症状を予防、抑制又は改善する効果を有している。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデル試験の概略図である。
【図２】本発明がアルブミン透過を抑制したことを示すグラフである。
【図３】本発明がフルオレセインナトリウム透過を抑制したことを示すグラフである。
【図４】ＣｓＡによる血液脳関門機能低下に対して、本発明がフルオレセインナトリウム透過を抑制したことを示すグラフである。
【図５】ｔ−ＰＡによる血液脳関門機能低下に対して、本発明がフルオレセインナトリウム透過を抑制したことを示すグラフである。
【図６】ｔ−ＰＡによる血液脳関門機能低下に対して、本発明がアルブミン透過を抑制したことを示すグラフである。
【図７】脳梗塞モデルマウスの脳の写真である。
【図８】ｔ−ＰＡによる脳梗塞モデルマウスの血液脳関門機能低下に対して、本発明がフルオレセインナトリウム透過を抑制したことを示すグラフである。
【図９】ｔ−ＰＡによる脳梗塞モデルマウスの血液脳関門機能低下に対して、本発明がアルブミン透過を抑制したことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬は、脳血管内皮細胞の密着結合能や経細胞輸送能などを含む血液脳関門機能を強化する。その結果、本発明の医薬又は医薬組成物は、血液脳関門機能障害により生じる前記病態を予防、抑制又は改善することにより、前記疾患等の血液脳関門機能障害を素因とする疾患又は症状の予防、抑制又は改善に貢献する。
【００１６】
本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬の有効成分としては、例えば、メトホルミン、ブホルミンなどのビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩が挙げられる。
【００１７】
本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬がビグアナイド系薬剤の医薬的に許容される塩を有効成分とする場合において、その塩の種類は、限定されない。無機酸塩でも有機酸塩でもよい。無機酸塩のための無機酸として、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸等が挙げられる。有機酸塩のための塩として、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、安息香酸、シュウ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等が挙げられる。好ましい塩として、塩酸塩が挙げられる。なお、メトホルミン塩酸塩並びにブホルミン塩酸塩は、血糖降下剤として市販されている。
【００１８】
本発明のビグアナイド系薬剤又はその医薬的に許容される塩は、製造方法に限定されず、公知の方法により製造できる。
また、そのまま、又は、公知の薬学的に許容される医薬用担体と組合せて常法に従って製剤化することが出来る。
【００１９】
本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬に関し、投与方法は限定されない。例えば、経口投与、静脈内注射による投与、筋肉内注射による投与、腹腔内注射による投与、皮下又は皮内注射による投与、直腸内投与、経粘膜投与、経気道投与等が挙げられる。好ましい投与方法として、経口投与が挙げられる。
【００２０】
本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬に関し、剤形は限定されない。経口投与用の剤形として、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口投与用の剤形として、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などが挙げられる。
【００２１】
前記剤形の医薬組成物を製造するために、公知の薬学的に許容される医薬用担体を使用出来る。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、着色剤、矯味矯臭剤等を使用出来る。
賦形剤としては、例えばアクリル酸デンプン、アラビアゴム、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウムなどが挙げられる。結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、クエン酸カルシウム、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、デキストリン、ポリリン酸ナトリウム、ペクチンなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えばクロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム等のスーパー崩壊剤と称される崩壊剤；ヒドロキシプロピルセルロース；カルボキシメチルスターチナトリウム；コーンスターチなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、ステアリン酸アルミニウム、乳糖、炭酸マグネシウム、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、硬化植物油などが挙げられる。安定化剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエンなどが挙げられる。着色剤としては、例えばカラメル、食用黄色５号、食用赤色２号、食用青色２号等の食用色素や食用レーキ色素、ベンガラなどが挙げられる。矯味矯臭剤としては、例えば塩酸、オレンジ油、ウイキョウ、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ油、ケイヒ油などが挙げられる。錠剤や顆粒剤には糖衣、ゼラチン衣、その他必要に応じてコーティングすることもできる。
【００２２】
本発明に係る医薬又は医薬組成物は、ヒトに、メトホルミン塩酸塩として１２５〜３０００ｍｇ／人／日で投与出来る。例えば、２５０ｍｇ／人／日でも、５００ｍｇ／人／日でも、７５０ｍｇ／人／日でも、８５０ｍｇ／人／日でも、１５００ｍｇ／人／日でも、１７００ｍｇ／人／日でも、２２５０ｍｇ／人／日でも、２５５０ｍｇ／人／日でも、投与出来る。
【００２３】
上述したように、血液脳関門機能障害は、様々な病態の発症や病態増悪や再発を引き起こし、血液脳関門機能障害に関連する疾患の発症や悪化又は再発などの素因となっている。例えば、敗血症により血液脳関門機能が低下することで、血液中の神経毒が脳内に入り、脳症が引き起こされると考えられている（非特許文献３）。また、血液脳関門を構成する脳血管内皮細胞上の接着分子の発現が増えることで、白血球が血液脳関門を透過しやすくなり、多発性硬化症が進展すると考えられている（非特許文献３及び４）。また、血液脳関門機能の不良によりアミロイドベータタンパク質（Ａβ）が脳内に蓄積することがアルツハイマー症を進展させると考えられている（非特許文献３）。
したがって、本発明の血液脳関門機能強化薬は、血液脳関門機能障害を素因とする前記疾患又は症状の予防、抑制又は改善に有用である。
【００２４】
例えば、脳梗塞の悪化又は再発を予防又は抑制するために、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を使用出来る。また、脳梗塞に伴う脳浮腫を予防、抑制又は改善するために、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を使用出来る。また、脳外傷に伴う脳浮腫を予防、抑制又は改善するために、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を使用出来る。また、敗血症に伴う脳症を予防、抑制又は改善するために、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を使用出来る。また、多発性硬化症における白血球脳内浸潤を予防、抑制又は改善するために、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を使用出来る。また、アルツハイマー病におけるアミロイドベータタンパク質（Ａβ）の脳内での蓄積を予防、抑制又は改善するために、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を使用出来る。
【００２５】
本発明の他の実施態様として、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を、薬物の脳移行を予防又は抑制するために使用出来る。前記薬物は、動物又はヒトの中枢神経での作用を期待しない薬物であってもよい。また、前記薬物が動物又はヒトの中枢神経での作用を期待する薬物であり、且つ、期待を超える量の脳移行を抑制するためにも、本発明の医薬又は医薬組成物を使用してもよい。
また、前記薬物の脳移行を予防又は抑制することにより、動物又はヒトの中枢神経性の有害症状を予防、抑制又は改善するために、本発明の医薬又は医薬組成物を使用出来る。
【００２６】
例えば、シクロスポリン、タクロリムス等の免疫抑制薬による血液脳関門機能低下とそれに伴う血液脳関門透過を原因とする、振戦、痙攣、白質脳症、頭痛等の、中枢性副作用による有害症状が知られている（非特許文献５〜１２）。本発明は血液脳関門機能低下を抑制、血液脳関門機能を強化又は再構築することによって上記有害症状を予防、抑制又は改善することが出来る。
また、本発明は、組織型プラスミノゲン・アクチベーター等の血栓溶解薬による血液脳関門機能低下を予防、抑制又は改善することが出来る。また、本発明は、前記血液脳関門機能低下に伴う出血性梗塞を予防、抑制又は改善することが出来る。また、本発明は、脳梗塞の治療の際の前記血栓溶解薬の使用時における治療可能時間（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）の拡張に用いることが出来る。そのため、本発明は、前記血栓溶解薬と併用して、脳梗塞治療薬として用いることが出来る。
その他、本発明は、抗ヒスタミン薬による眠気や、タミフルによる意識障害、異常行動、せん妄、幻覚、妄想、痙攣等や、インターフェロン・インフリキシマブ・抗うつ薬・ニューキノロン系抗菌薬による痙攣・てんかんや、カルモフール・テガフール・フルオロウラシルによる白質脳症を予防、抑制又は改善することが出来る。
【００２７】
本発明の他の実施態様として、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を、血液脳関門機能の低下を予防、抑制又は改善するために、本発明の医薬又は医薬組成物を使用出来る。
例えば、糖尿病、肥満、高血圧等により血液脳関門機能が低下する可能性があることが知られている（非特許文献１４、１５）。そのため、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を、糖尿病、肥満、高血圧等による血液脳関門機能の低下を予防、抑制又は改善するために使用出来る。前記血液脳関門機能の低下を予防、抑制又は改善は、脳梗塞の悪化又は再発を予防すること、薬物の脳移行を予防又は抑制すること、等へつながる。
また逆に、血液脳関門機能の低下により糖尿病及び／又は肥満が発症又は悪化するとも考えられる。そのため、本発明に係る血液脳関門障害症候群治療薬を、血液脳関門機能の低下に起因する上記疾患の予防、抑制又は改善するためにも使用出来る。
【００２８】
さらにまた、上記各作用又は用途のための動物試験用試薬としても、ビグアナイド系薬剤若しくはその塩又はそれを有効成分とする物質又は組成物を使用出来る。前記動物としては、例えば、メダカ、カエル、トカゲ、ニワトリ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、サルなどから選択することができる。
実施例
【００２９】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものでない。
【００３０】
（例１）
（例１−１）
―ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルの作成―
脳血管内皮細胞（ＲＢＥＣ）を下記参考文献１に従って単離した。詳細は下記の通りである。
３週齢のＷｉｓｔａｒ系ラットをエーテル麻酔後、断頭し大脳を摘出し氷上のディッシュに入れた。髄膜を剥がした後に氷上のディッシュにて大脳皮質を細断し、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（ＣＬＳ２）（１ｍｇ／ｍｌ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）とｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）で３７℃、１．５時間振とう（２００ｒｐｍ）し、酵素処理を行った。遠心分離後、得られたペレットに２０％  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）−ＤＭＥＭを加え、遠心分離（１０００×ｇ、２０分）することでニューロンやグリア細胞を取り除いた。その後ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ／ｄｉｓｐａｓｅ（１ｍｇ／ｍｌ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）で３７℃、３０分振とう（２００ｒｐｍ）して酵素処理をした。遠心分離後、得られたペレットを少量のＤＭＥＭで懸濁し、あらかじめ４℃、３００００×ｇ、１時間で密度勾配を形成させておいた、３３％  ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ  ｈｅｌｔｈｃａｒｅ）溶液に加え、遠心分離することで脳毛細血管片を単離した。
上記の方法で単離した脳毛細血管片を、コラーゲン及びフィブロネクチンでコーティングしたｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈを用いて３７℃、５％ＣＯ２／９５％大気下で、ｐｌａｓｍａ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｅｒｕｍ（ＰＤＳ）  １０％、ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ５０μｇ／ｍＬ、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  １ｍＭ、ｈｅｐａｒｉｎ  １ｍｇ／ｍＬ、ｂＦＧＦ  １．５ｎｇ／ｍＬ、ｉｎｓｕｌｉｎ  ５μｇ／ｍＬ、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ  ５μｇ／ｍＬ、ｓｅｌｅｎｉｕｍ  ５ｎｇ／ｍＬ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ４μｇ／ｍＬを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＲＢＥＣ培養液Ι）にて培養した。４８時間後に、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを除去したＲＢＥＣ培養液Ι（ＲＢＥＣ培養液ΙΙ）に置換し、さらに培養することで脳血管内皮細胞（ＲＢＥＣ）を得た。
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）（２４−ｗｅｌｌ  ｔｙｐｅ、Ｃｏｓｔａｒ、ＭＡ）を用いて、上記の方法で得られたＲＢＥＣからＲＢＥＣ単層培養系であるｍｏｎｏｌａｙｅｒのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを作製した。
すなわち、Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（０．４μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ）をコラーゲン及びフィブロネクチンでコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート（１２−ｗｅｌｌ  ｔｙｐｅ、Ｃｏｓｔａｒ、ＭＡ）を２４−ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ、ＭＡ）のｗｅｌｌに設置し、ＲＢＥＣ（５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を前記インサートの内側に播種した（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）。ＲＢＥＣを播種した翌日、ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（５００ｎＭ）を含むＲＢＥＣ培養液ΙΙに交換し、その２日後に完成したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを用いて実験を行った。
【００３１】
（例１−２）
―透過実験―
メトホルミンのＢＢＢ機能への影響は、フルオレセインナトリウム（Ｎａ−Ｆ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及びＥｖａｎｓ  ｂｌｕｅ−ａｌｂｕｍｉｎ（アルブミン）（（Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅ；Ｓｉｇｍａ、Ｅ２１２９）（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ；Ｓｉｇｍａ、Ａ７９０６））の透過係数を指標として、確認された。
なお、血管弛緩因子であるａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎは血液脳関門機能を強化することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいてフルオレセインナトリウムの透過を抑制する（非特許文献１６、発明者未発表データ）。つまりフルオレセインナトリウムの透過に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験とｉｎ  ｖｉｖｏ試験は正の関係である。
試験サンプルとして、ＰＤＳを除去したＲＢＥＣ培養液ＩＩに溶解した０．１ｍＭメトホルミン（メトホルミン塩酸塩；Ｓｉｇｍａ、Ｄ１５，０９５−９）、０．５ｍＭメトホルミン（同）、１ｍＭメトホルミン（同）を用いた。対照群として、ＰＤＳを除去したＲＢＥＣ培養液ＩＩを用いた。上記で完成したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデル中の培養液を全て取り除き、試験サンプルで置換し、２４時間後に透過性の試験を行った。
フルオレセインナトリウム（１００μｇ／ｍｌ）又はアルブミン（０．０４ｇ／ｍｌ）を含んだｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１ｍｌ）をインサートの血管側に添加した後、１０、２０、３０、６０、１２０、１８０分後にｗｅｌｌ（脳側）からサンプル（０．４ｍｌ）を採取し、新たにｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂｕｆｆｅｒを同量加えた。蛍光プレートリーダー（ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ（登録商標）  Ｓｅｒｉｅｓ  ４０００，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を用いてフルオレセインナトリウムの蛍光強度を測定し（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍ）、吸光プレートリーダー（Ｓｕｎｒｉｓｅ（登録商標）、ＴＥＣＡＮ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてアルブミンの吸光強度を測定し（波長６３０ｎｍ）、検量線よりフルオレセインナトリウム及びアルブミンの濃度を算出した。
クリアランスと透過係数（Ｐ）の算出は下記参考文献１及び２に従った。クリアランスは、血管側のｃｈａｍｂｅｒから脳実質側のｃｈａｍｂｅｒに移行したフルオレセインナトリウム及びアルブミンの量をμＬで表し、血管側に入れたフルオレセインナトリウム及びアルブミンの初濃度［Ｃ］Ｌと脳実質側に移行したフルオレセインナトリウム及びアルブミンの最終濃度［Ｃ］Ａから、以下の式より算出した。
Ｃｌｅａｒａｎｃｅ（μｌ）＝［Ｃ］Ａ × ＶＡ ／［Ｃ］Ｌ
（ＶＡ ： 脳実質側ｃｈａｍｂｅｒの容積（１．５ｍｌ））
透過係数Ｐ（ｃｍ／ｍｉｎ）は以下の式より求めた。
１ ／ ＰＳａｐｐ ＝ １ ／ ＰＳｍｅｍｂｒａｎｅ ＋ １ ／ ＰＳｔｒａｎｓ
ＰＳは時間に対してクリアランスをプロットした直線の傾きで、（透過係数）×（ｍｅｍｂｒａｎｅの表面積）を表している。Ｐａｐｐはみかけの透過係数、Ｐｔｒａｎｓは真の透過係数を表す。Ｐｍｅｍｂｒａｎｅは、チャンバーのｍｅｍｂｒａｎｅのみの透過係数を表す。
【００３２】
上記試験の概略図を図１に示す。
【００３３】
上記試験に関しては、上記の各先行技術文献や下記の各参考文献を参考にした。
［参考文献１］Ｉｓｏｂｅ，Ｉ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．，Ｈａｚｅｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｙａｍａｇａｔａ，Ｋ．，Ｕｅｋｉ，Ｔ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．，Ａｓａｉ，Ｋ．，Ｋａｔｏ，Ｔ．、「Ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  （ＢＢＢ）  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｏｒｔｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ」、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９６、２８、ｐ．５２３−５３３
［参考文献２］Ｄｅｈｏｕｃｋ，Ｍ．−Ｐ．，Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ，Ｐ．，Ｂｒｅｅ，Ｆ．，Ｆｒｕｃｈａｒｔ  Ｊ．−Ｃ．，Ｃｅｃｃｈｅｌｌｉ，Ｒ．，Ｔｉｌｌｅｍｅｎｔ，Ｊ．−Ｐ．，「Ｄｒｕｇ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ：  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｄｅｌｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９２、５８、ｐ．１７９０−１７９７
［参考文献３］Ｈａｙａｓｈｉ  Ｙ．，Ｎｏｍｕｒａ  Ｍ．，Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  Ｓ．，Ｈａｒａｄａ  Ｓ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｊ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｈ．，「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｎｅｕｒａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｌｏｓｅ  ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ」、Ｇｌｉａ、１９９７、１９、ｐ．１３−２６
［参考文献４］Ｔａｋａｔａ  Ｆ，Ｓｕｍｉ  Ｎ，Ｎｉｓｈｉｏｋｕ  Ｔ，Ｈａｒａｄａ  Ｅ，Ｗａｋｉｇａｗａ  Ｔ，Ｓｈｕｔｏ  Ｈ，Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ａ，Ｋａｔａｏｋａ  Ｙ．、「Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ」、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００８、４４１（２）、ｐ．１６３−１６６
【００３４】
対象群を用いた試験結果（透過係数）を１００％としたときの、各濃度（０．１ｍＭ、０．５ｍＭ及び１ｍＭ）のメトホルミンを用いた試験結果を図２及び図３に示す。図２には、アルブミン透過係数の測定結果を、図３にはフルオレセインナトリウム透過係数の測定結果を示す。
【００３５】
アルブミン透過係数の測定試験において、４群の一元ＡＮＯＶＡ法での有意確率Ｐは０．０００９であり、有意水準０．０５として有意差があった。さらに、対照群と各メトホルミン群を、有意水準０．０５とするＤｕｎｎｅｔｔ多重比較検定法を用いて有意差検定を行った結果、１ｍＭメトホルミン群に有意差があった。図２中ではその群に＊印を付した。
【００３６】
フルオレセインナトリウム透過係数の測定試験において、４群の一元ＡＮＯＶＡ法での有意確率Ｐは０．０００１未満であり、有意水準０．０５として有意差があった。さらに、対照群と各メトホルミン群を、有意水準０．０５とするＤｕｎｎｅｔｔ多重比較検定法を用いて有意差検定を行った結果、０．５ｍＭメトホルミン群及び１ｍＭメトホルミン群に有意差があった。図３中ではそれらの群に＊印を付した。
【００３７】
図２及び図３に示すように、対照群に比べて有意に、メトホルミンが脳毛細管内に存在するアルブミンや密着結合能マーカーであるフルオレセインナトリウムの脳組織側への漏出を抑制した。
【００３８】
（例２）
中枢性副作用誘発薬物（ＣｓＡ）による血液脳関門機能低下に対するメトホルミンの保護作用
免疫抑制薬ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ（ＣｓＡ）は、移植の成功率を向上させる有益な医薬品である。一方で副作用も多く、振戦・痙攣などの中枢性副作用が発現すると投与中止を余儀なくされる。これまでに我々は、中枢性副作用発現にＣｓＡの血液脳関門機能低下作用に伴うＣｓＡの脳移行増大が関与することを明らかにした。そこで、ＣｓＡによる血液脳関門機能低下に対するメトホルミンの作用について検討した。
【００３９】
（例２−１）
例１−１にしたがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを作成した。
【００４０】
（例２−２）
例１−２と同様に、透過実験を行った。ただし、薬物の刺激方法が異なる。
試験サンプルとして、エタノールに溶解したＣｓＡ及びＰＤＳを除去したＲＢＥＣ培養液ＩＩに溶解した１ｍＭメトホルミン（メトホルミン塩酸塩；Ｓｉｇｍａ、Ｄ１５，０９５−９）を用いた。対照群として、エタノール及びＰＤＳを除去したＲＢＥＣ培養液ＩＩを用いた。上記で完成したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデル中の培養液を全て取り除き、試験サンプルで置換し、２４時間後に透過性の試験を行った。
【００４１】
この試験結果を図４に示す。図に示されるように、ＣｓＡを負荷したところ、フルオレセインナトリウム透過性は上昇したが、メトホルミンの併用により、ＣｓＡによる血液脳関門機能低下が抑制されて、フルオレセインナトリウムの透過性上昇が有意に抑制された。
【００４２】
（例３）
中枢性副作用誘発薬物（ｔ−ＰＡ）による血液脳関門機能低下に対するメトホルミンの作用（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
脳梗塞に対する血栓溶解薬「組織型プラスミノゲン・アクチベーター（ｔ−ＰＡ）」は、発症から３〜４．５時間までの静脈投与で極めて良好な効果が示されている。しかし、ｔ−ＰＡによる血栓溶解療法には問題点が存在する。虚血病態化でのｔ−ＰＡ使用に伴う血液脳関門障害により、出血性梗塞を合併することがあるため（非特許文献１７及び１８）、治療可能時間（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）が脳梗塞後３時間と極めて短いことがその一つである（非特許文献２）。そこで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルに虚血及びｔ−ＰＡを負荷した、「ｔ−ＰＡ  ＢＢＢ障害モデル」を作製し、メトホルミンの血液脳関門機能保護作用について検討した。
【００４３】
（例３−１）
例１−１にしたがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデルを作成した。
【００４４】
（例３−２）
例１−２と同様に、透過実験を行った。ただし、薬物の刺激方法が異なる。
試験サンプルとして、ｔ−ＰＡ注射剤（アクチバシン；協和発酵）及びＰＤＳを除去したＲＢＥＣ培養液Ｉに溶解した１ｍＭメトホルミン（メトホルミン塩酸塩；Ｓｉｇｍａ、Ｄ１５，０９５−９）を用いた。対照群として、ＰＤＳを除去したＲＢＥＣ培養液Ｉを用いた。上記で完成したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＢＢモデル中の培養液を全て取り除き、試験サンプルで置換し、Ｎ２９５％／ＣＯ２５％（虚血）条件下で４８時間放置した後に透過性の試験を行った。
【００４５】
この試験結果を図５及び図６に示す。両図に示されるように、虚血状態下でｔ−ＰＡを負荷したところ、フルオレセインナトリウム及びアルブミン（Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅ−ａｌｂｕｍｉｎ：ＥＢＡ）の透過性は上昇したが、メトホルミンの併用により、ｔ−ＰＡによる血液脳関門機能低下が抑制されて、フルオレセインナトリウム及びアルブミンの透過性上昇が有意に抑制された。
【００４６】
（例４）
中枢性副作用誘発薬物（ｔ−ＰＡ）による血液脳関門機能低下に対するメトホルミンの作用（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
【００４７】
（例４−１）
ｔ−ＰＡによるｉｎ  ｖｉｖｏ  ＢＢＢ障害モデルの作製
ｄｄｙマウスの両側の総頸動脈を３０分間結紮（２ＶＯ）して脳梗塞モデルマウスを作製した。血管を再開通した後に鎖骨下静脈よりｔ−ＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与し２４時間放置したマウスを、ｔ−ＰＡによるＢＢＢ障害モデルマウスとして用いた。
メトホルミンはｔ−ＰＡと同時に１００ｍｇ／ｋｇを投与した。対照群として、薬物を投与していない脳梗塞モデルマウスを用いた。
【００４８】
（例４−２）
ＢＢＢ機能評価
ｔ−ＰＡを投与して、又はｔ−ＰＡ及びメトホルミンを投与して２４時間後に、フルオレセインナトリウム（Ｎａ−Ｆ）（６ｍｇ／ｍＬ）及びＥｖａｎｓ  ｂｌｕｅ（ＥＢ）（２０ｍｇ／ｍＬ）の混合液２００μＬを鎖骨下静脈に投与して６０分放置した後に全脳を摘出した。ＢＢＢ機能は全脳の写真及びホモジナイズした全脳のＮａ−Ｆ及びＥＢ濃度を用いて評価した。
【００４９】
結果
脳梗塞モデルマウスにｔ−ＰＡを負荷すると脳が青く染まり、血管からＥＢが脳全体に漏れ出ているのが認められた（図７真ん中）。これにメトホルミンを併用すると脳の青色は薄くなったことから（図７右）、血管外へのＥＢ漏出が抑制されたことがわかる。このことよりｔ−ＰＡ負荷によるＢＢＢ機能障害がメトホルミン併用により抑制されたと考えられる。
脳梗塞モデルマウスにｔ−ＰＡを負荷するとＮａ−Ｆ及びＥＢの脳内移行量はそれぞれ１６％及び２０％上昇した（図８及び９）。メトホルミン併用によりＮａ−Ｆ及びＥＢの上昇は７８％及び６６％抑制された（図８及び９）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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