(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式１で記載されるペプチドとして、
Ａ１はメチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）であり、
Ａ２はアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）及びリシン（Ｋ、Ｌｙｓ）で構成される群から選択されるアミノ酸であり；
ＭＴＤ（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ、巨大分子伝達ドメイン）は配列番号１ないし７で構成される群から選択されるアミノ酸配列を持ち、
上記のペプチドは生物学的活性分子の細胞内への運搬を媒介することができるペプチドであって、配列番号１５ないし３５でなる群より選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、ペプチド。
（式１）
0006001082.tif 000011
【請求項２】
上記のペプチドをエンコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
上記のポリヌクレオチドは配列番号３６ないし５６でなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とする請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
インビトロにおいて、細胞透過性を有する生物学的活性分子を遺伝的に操作する方法として、上記の方法は配列番号１５ないし３５でなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを、正方向に又は逆順で、生物学的活性分子に付着する段階を含み、
上記のペプチドは生物学的活性分子の細胞内への運搬を媒介することができるペプチドであることを特徴とする、方法。
【請求項５】
上記の付着はペプチドのＮ−末端、Ｃ−末端又は両末端に生物学的活性分子が付着されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記の付着はペプチド結合または化学的な結合によりなることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
上記の化学的な結合はジスルフィド結合、ジアミン結合、硫化‐アミン結合（ｓｕｌｆｉｄｅ−ａｍｉｎｅ  ｂｏｎｄｓ）、カルボキシル-アミン結合（ｃａｒｂｏｘｙｌ−ａｍｉｎｅ  ｂｏｎｄｓ）、エステル結合（ｅｓｔｅｒ  ｂｏｎｄｓ）及び共有結合でなる群より選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記の生物学的活性分子はタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドでなる群より選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
上記の生物学的活性分子は成長因子、酵素、転写因子、毒素、抗原性ペプチド、抗体、及び抗体断片でなる群より選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
上記の生物学的活性分子は酵素、ホルモン、運搬体タンパク質、免疫グロブリン、抗体、構造タンパク質、運動機能タンパク質、シグナル伝達タンパク質、膜タンパク質、膜横断（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質、分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、ジスルフィド結合を持つタンパク質、タンパク質複合体、化学的に改質されたタンパク質及びプリオン（ｐｒｉｏｎｓ）でなる群より選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
上記の生物学的活性分子は核酸、コーディング核酸配列、ｍＲＮＡｓ、アンチセンスＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）分子、炭水化物、脂質及び糖脂質でなる群より選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
上記の生物学的活性分子は治療薬物または毒性化合物であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
個体（但し、ヒトを除く）の細胞内に生物学的活性分子を運搬する方法として、上記の方法は生物学的活性分子が付着された配列番号１５ないし３５でなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドを前記個体に投与する段階を含み、
上記のペプチドは生物学的活性分子の細胞内への運搬を媒介することができるペプチドであることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞で生物学的活性分子の伝送を容易にする従来の巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）のアミノ酸配列を変形して従来のＭＴＤに比べて細胞透過能を向上させた改良形ＭＴＤ及びそれを製造する方法、上記の改良形ＭＴＤをエンコードするポリヌクレオチド、上記改良形ＭＴＤを利用して生物学的活性分子が細胞透過性を持つように遺伝的に操作する方法、及び上記の改良形ＭＴＤを利用して細胞内に生物学的活性分子を流入させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜は特有の不透過性によりタンパク質、核酸、ペプチド及び難溶性の化合物質らの細胞内への透過に障壁になっている。薬物の細胞内の伝達は疾病の治療及び予防、診断などの分野で必ず解決されなければならない問題である。
【０００３】
一般的に生物学的活性巨大分子を細胞膜内に透過させる方法には、電気衝撃（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポソームを利用した膜融合、リン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒであるｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ）、ＤＥＡＥ−デキストランを利用したトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ウイルス核酸感染、単一細胞の微細注入方法がある。また、最近では効果的な細胞内薬物伝達のためにナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）のような薬物伝達体のエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を応用した技術が活用されてきたが、毒性、免疫系での早い消失により伝達効率の低下または細胞との相好作用により立体障害（ｓｔｅｒｉｃ  ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）などの問題で更なる多くの研究が必要な実情である。従って、最近細胞膜を破壊せず、細胞の生体膜と核膜を通じてタンパク質、核酸などの巨大分子を伝達する方法の開発が継続的に要求されている。
【０００４】
最初に発見された伝送ドメインは１９８８年ＧｒｅｅｎとＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎグループ（Ｇｒｅｅｎ及びＧｒｅｅｎ、Ｃｅｌｌ ５５、１１７９〜１１８８（１８８）とＦｒａｎｋｅｌとＰａｂｏグループ（Ｆｒａｎｋｅｌ及び Ｐａｂｏ、 Ｃｅｌｌ ５５、１１８９〜１１９３（１８８））がそれぞれ別途に後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＩＤＳ）を発生させるウイルスであるＨＩＶ−１の伝写関連タンパク質Ｔａｔが細胞膜を透過してウイルス遺伝子を交差−活性化（ｔｒａｎｓ‐ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）させることを発見した。細胞透過性を見せるＴａｔドメインはＴａｔタンパク質の４８番から５７番目の塩基性アミノ酸配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）であり、この配列が細胞膜を透過するのに重要な役割をすることが明らかにされた（Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ.,  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１６０１０−１６０１７（１９９７）；Ｆｕｔａｋｉなど、 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６、５８３６−５８４０（２００１）；Ｗａｄｉａ，Ｊ．Ｓ．およびＳ．Ｆ．Ｄｏｗｄｙ，Ｃｕｍ  Ｏｐｉｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｌ，１３（１）；５２−６（２００２）；Ｗａｄｉａなど，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０（３），３１０−３１５（２００４））。
【０００５】
また別の例としては、１６個のペプチドで構成されるアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）ホメオドメイン（ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）由来ペネトラチン（ＲＱＩＫＩＹＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）を挙げられて（Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ  ａｌ.,  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８（１９９１）；Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ.,   Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、１０４４４−１０４５０（１９９４）；Ｊｏｌｉｏｔ，Ａ．及びＡ．Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６（３）：１８９−９６（２００４））、これらを含めて類似な配列とメカニズムを持っているペプチド配列を大きくＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ）、つまり、タンパク質伝送ドメインという。このようなＰＴＤの細胞内物質伝送メカニズムは細胞の表面の細胞膜を破壊して細胞内に伝達するという意見と細胞膜を直接透過することではなく、細胞の表面に存在する多様な膜タンパク質の糖鎖の負電荷とＰＴＤを構成する塩基性アミノ酸残期の正電荷の間の静電気的相互作用で結合して内包作用を起こしてエンドソーム（endosome）の内部に蓄積されることにより細胞内に伝達されるという意見が提示されている（J.S. Wadia，ｅｔ  ａｌ.,  Nat.Med.  １０：３１０‐３１５（２００４）；I．Nakase，ｅｔ  ａｌ．Biochemistry ４６：４９２−５０１（２００７）；H.L. Amand，ｅｔ  ａｌ．Biochim. Biophys.  Acta（２０１１））。しかし、このようなPTDの物質伝送メカニズムは生体内の深い組織まで伝送しようとする物質−ペプチド、タンパク質、核酸などの伝送が困難である。特に、ペプチドまたはタンパク質の場合、エンドソームの内にペプチドまたはタンパク質が蓄積されて、ここに細胞内のリソソームが結合すれば、リソソームのタンパク質の加水分解酵素により容易に分解される。従って、PTDを利用してペプチドまたはタンパク質の伝送の際に十分高い濃度で伝送させて、細胞質の内の標的に作用できる有効成分がエンドソームから放出されて効果を見せるという点がPTDを利用したタンパク質の伝送の際に問題として台頭されている（F.Milletti，Drug  Discovery  Today  １７：８５０−８６０（２０１２））。
【０００６】
その後、２０００年度に入って、FGF（Fibroblast  Growth  Factor）のシグナルペプチドから由来されたMTS（AAVLLPVLLAAP）が合成、製作されて（DaeWoong  Jo  et  al.，Nat．Biotech．Vol．１９，２００１）、これは１２個のアミノ酸であり二つのアラニンが連続された配列の間に一つのバリンと二つのロイシンが存在して、プロリンが含まれた形態で疎水性アミノ酸で構成されて上記の従来のPTDとは相当に違う特性を持っている。また、最近にこれより一歩前進めされた伝送ドメインでPTD、MTSより細胞内の物質伝達効率が向上されて、構造及び静電気的な特性が違う新しい細胞膜透過性ペプチドが開発されて、これがMTD（Macromolecule  Transduction  Domain）、つまり、巨大分子伝送ドメインである（WO２００８／０９３９８２）。
【０００７】
このようなMTDは本発明らにより開発された技術で、HIV‐TAT細胞内の伝送過程とは違って細胞内の物質伝送に内包作用及びエネルギーは必要にしなくて、細胞膜との直接的な相好作用（direct  interaction）のための細胞膜の強直性（rigidity）と完全性（integrity）が重要要素に作用しながら、細胞の間の連続伝送も可能にする。そのため、MTDは従来の細胞膜透過性ペプチドであるTATに比べて標的タンパク質の細胞内の伝達効率が高くて、生体内の深部組織までも伝達を可能にする。また、分泌タンパク質または細胞膜タンパク質のsignal  sequenceで由来した疎水性（hydrophobic）MTDは、大きくN‐末端の疎水性部位（hydrophobic  region）、C‐末端にタンパク質分泌配列の切断部位なと（secreted-protein  cleavage  site）の三つの部分で構成されるシグナルペプチドで螺旋形構造（helix）を形成し細胞膜指向活性を持つようにしてくれる疎水性部位の配列を変形したものである。MTDは細胞に損傷を加えずに直接細胞膜を透過することにより、タンパク質のような巨大分子を細胞内に移動させて本来の機能を発揮するようにする。
【０００８】
しかし、MTDは主に疎水性アミノ酸で構成されて物性及び可溶性が低下されて疎水性が強いペプチドまたはタンパク質と結合させて製造する場合、一般的な緩衝液の条件で一定の濃度以上MTDを溶かす場合、または伝送物質の特性により沈殿を引き起こす恐れがある。これにより伝送させようとする物質の特性を勘案して使用しようとする濃度範囲内で沈殿が発生せず、最適の透過能と活性を示すMTDとの組み合わせが必要な場合も発生することができる。
【０００９】
これに対し、本発明者はこのような従来のMTDの物性及び可溶性を改善して、細胞膜透過性を高めるために、アミノ酸配列上の欠失（deletion）及び修飾（modification）、キメラ融合（chimeric  fusion）などの方法で細胞膜透過性が向上された新規な細胞膜透過性ドメインを開発して、これらの細胞内伝達効果を確認して従来のMTDに比べて改善された効果を表わすことを明らかにすることによって、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記のように従来のMTDペプチドのアミノ酸配列を変形してより優れた細胞透過能を持つペプチドを開発するために考案されたものであり、従来のMTDにアミノ酸配列上の欠失、修飾、キメラ融合などの方法を付与して、細胞膜透過性を改善して、物性を増進させた改良形MTD、及び上記の改良形MTDを暗号化するポリヌクレオチドを提供することを目的にする。
【００１１】
あわせて、本発明の別の目的は上記の改良形MTDを利用して生物学的活性分子が細胞透過性を持つように遺伝的に操作する方法、及び上記の改良形MTDを利用して細胞内に生物学的活性分子を流入させる方法を提供することである。
【００１２】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は上記で説き及んだ課題に制限されていなく、説き及ばないまた別の課題は以下の記載から同業者に明確に理解することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的を達成するために、
本発明は下記の式１で記載されるペプチドとして、
Ａ１はメチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）であり、
Ａ２はアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）及びリシン（Ｋ、Ｌｙｓ）で構成される群から選択されるアミノ酸であり；
ＭＴＤ（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ、巨大分子伝達ドメイン）は配列番号１ないし７で構成される群から選択されるアミノ酸配列を持つことを特徴とする、ペプチド；
（式１）
0006001082.tif 000002
；及び上記のペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
本発明の一具現例として、上記のペプチドは生物学的活性分子の細胞内での運搬を媒介することができるペプチドであって、配列番号１５ないし３５でなる群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００１５】
本発明の別の具現例として、上記のポリヌクレオチドは配列番号３６ないし５６でなる群より選択される塩基配列を有することを特徴とする。
【００１６】
本発明の一具現例で、上記の配列番号１５のアミノ酸配列は配列番号３６のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００１７】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号１６のアミノ酸配列は配列番号３７のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００１８】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号１７のアミノ酸配列は配列番号３８のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００１９】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号１８のアミノ酸配列は配列番号３９のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００２０】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号１９のアミノ酸配列は配列番号４０のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００２１】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号２０のアミノ酸配列は配列番号４１のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００２２】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号２１のアミノ酸配列は配列番号４２のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００２３】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号２２のアミノ酸配列は配列番号４３のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００２４】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号２３のアミノ酸配列は配列番号４４のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００２５】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号２４のアミノ酸配列は配列番号４５のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００２６】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号２５のアミノ酸配列は配列番号４６のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００２７】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号２６のアミノ酸配列は配列番号４７のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００２８】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号２７のアミノ酸配列は配列番号４８のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００２９】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号２８のアミノ酸配列は配列番号４９のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００３０】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号２９のアミノ酸配列は配列番号５０のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００３１】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号３０のアミノ酸配列は配列番号５１のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００３２】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号３１のアミノ酸配列は配列番号５２のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００３３】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号３２のアミノ酸配列は配列番号５３のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００３４】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号３３のアミノ酸配列は配列番号５４のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００３５】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号３４のアミノ酸配列は配列番号５５のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００３６】
本発明の別の具現例で、上記の配列番号３５のアミノ酸配列は配列番号５６のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００３７】
また、本発明は配列番号１５ないし３５である群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを生物学的活性分子に付着する段階を含む細胞透過性を有する生物学的活性分子を遺伝的に操作する方法を提供する。
【００３８】
本発明の一具現例として、上記の付着は上記のペプチドのＮ‐末端、Ｃ‐末端、または両末端に生物学的活性分子が付着されることを特徴とする。
【００３９】
本発明の別の具現例として、上記の付着は生物学的活性分子のＣ‐末端に上記のペプチドのアミノ酸が逆順で配列された形態で付着されることを特徴とする。
【００４０】
本発明の別の具現例として、上記の結合はペプチドの結合または化学的な結合によりなることを特徴とする。
【００４１】
本発明の別の具現例として、上記の化学的な結合はジスルフィド結合、ジアミン結合、硫化‐アミン結合（ｓｕｌｆｗｉｄｅ―ａｍｉｎｅ  ｂｏｎｄｓ）、カルボキシル-アミン結合（ｃａｒｂｏｘｙｌ−ａｍｉｎｅ  ｂｏｎｄｓ）、エステル結合（ｅｓｔｅｒ  ｂｏｎｄｓ）及び共有結合でなる群から選択されることを特徴とする。
【００４２】
本発明の別の具現例で、上記の生物学的活性分子はタンパク質、ポリペプチド及びペプチドでなる群から選択されることを特徴とする。
【００４３】
本発明の別の具現例で、上記の生物学的活性分子は成長因子、酵素、伝写因子、毒素、抗原性ペプチド、抗体、及び抗体断片でなる群から選択されることを特徴とする。
【００４４】
本発明の別の具現例で、上記の生物学的活性分子は酵素、ホルモン、運搬体タンパク質、免疫グロブリン、抗体、構造タンパク質、運動機能タンパク質、水溶体、信号（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質、保存タンパク質、膜タンパク質、膜横断（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質、内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）タンパク質、外部（ｅｘｔｅｒｎａｌ）タンパク質、分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、先天性（ｎａｔｉｖｅ）タンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、 ジスルフィド結合を持つタンパク質、タンパク質複合体、化学的に改質されたタンパク質及びプリオン（ｐｒｉｏｎｓ）でなる群から選択されることを特徴とする。
【００４５】
本発明の別の具現例で、上記の生物学的活性分子は核酸、コーディング核酸配列、ｍＲＮＡｓ、アンチセンスＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）分子、炭水化物、脂質及び糖脂質でなる群から選択されることを特徴とする。
【００４６】
本発明の別の具現例で、上記の生物学的活性分子は治療薬物または毒性化合物であることを特徴とする。
【００４７】
あわせて、本発明は生物学的活性分子が付着された配列番号１５ないし３５でなる群から選択されるアミノ酸配列を持つペプチドを固体に投与する段階を含む、固体の細胞内に生物学的活性分子を運搬する方法を提供する。
【発明の効果】
【００４８】
本発明の改良型ＭＴＤは従来のＭＴＤに比べて、生物学的活性分子を細胞内に運搬できる細胞透過能が著しく優れて、運搬された生物学的活性分子が細胞内で効果的に活性を維持するようにする。従って、本発明の改良型ＭＴＤは薬物伝達システム、組み換えタンパク質ワクチンまたはＤＮＡ／ＲＮＡ治療剤、遺伝子及びタンパク質治療法、薬理学的または医学的に有用なタンパク質の生産または薬理医学的組成物にも利用できるので、新薬開発及び改良新薬開発にも非常に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明によう改良型ＭＴＤの２次構造をＰＥＰ  ＦＯＬＤ  ｓｅｒｖｕｌｅｒプログラムを利用して解析した結果である。
【図２】本発明によう改良型ＭＴＤの２次構造をＰＥＰ  ＦＯＬＤ  ｓｅｒｖｕｌｅｒプログラムを利用して解析した結果である。
【図３】本発明によう改良型ＭＴＤの２次構造をＰＥＰ  ＦＯＬＤ  ｓｅｒｖｕｌｅｒプログラムを利用して解析した結果である。
【図４】本発明によう改良型ＭＴＤの２次構造をＰＥＰ  ＦＯＬＤ  ｓｅｒｖｕｌｅｒプログラムを利用して解析した結果である。
【図５】ヒト大腸がん細胞で本発明による改良型ＭＴＤの定量的細胞透過能をフローサイトメトリーにより解析した結果である。
【図６】ヒト胚腎臓細胞で本発明による改良型ＭＴＤの定量的細胞透過能をフローサイトメトリーにより解析した結果である。
【図７】皮膚由来角質形成細胞で本発明による改良型MTDの可視的細胞透過能を共焦点レーザー走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を利用して観察した結果である。ＭＲ―ｆｏｒｍ：Ａ１―Ａ２―ＭＴＤの式で、Ａ１がメチオニンであり、Ａ２がアルギニンである形態の改良型ＭＴＤ；ＭＨ−ｆｏｒｍ：Ａ１−Ａ２−ＭＴＤの式で、Ａ１がメチオニンであり、Ａ２がヒスチジンである形態の改良型ＭＴＤ；及びＭＫ−ｆｏｒｍ：Ａ１−Ａ２−ＭＴＤの式で、Ａ１がメチオニンであり、Ａ２がリシンである形態の改良型ＭＴＤ。
【図８】皮膚由来角質形成細胞で本発明による改良型MTDの可視的細胞透過能を共焦点レーザー走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を利用して観察した結果である。ＭＲ―ｆｏｒｍ：Ａ１―Ａ２―ＭＴＤの式で、Ａ１がメチオニンであり、Ａ２がアルギニンである形態の改良型ＭＴＤ；ＭＨ−ｆｏｒｍ：Ａ１−Ａ２−ＭＴＤの式で、Ａ１がメチオニンであり、Ａ２がヒスチジンである形態の改良型ＭＴＤ；及びＭＫ−ｆｏｒｍ：Ａ１−Ａ２−ＭＴＤの式で、Ａ１がメチオニンであり、Ａ２がリシンである形態の改良型ＭＴＤ。
【図９】皮膚由来角質形成細胞で本発明による改良型MTDの可視的細胞透過能を共焦点レーザー走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を利用して観察した結果である。ＭＲ―ｆｏｒｍ：Ａ１―Ａ２―ＭＴＤの式で、Ａ１がメチオニンであり、Ａ２がアルギニンである形態の改良型ＭＴＤ；ＭＨ−ｆｏｒｍ：Ａ１−Ａ２−ＭＴＤの式で、Ａ１がメチオニンであり、Ａ２がヒスチジンである形態の改良型ＭＴＤ；及びＭＫ−ｆｏｒｍ：Ａ１−Ａ２−ＭＴＤの式で、Ａ１がメチオニンであり、Ａ２がリシンである形態の改良型ＭＴＤ。
【図１０】子宮頸がん由来細胞で本発明による改良型ＭＴＤの可視的細胞透過能を共焦点レーザー走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を利用して観察した結果である。ＭＲ−ｆｏｒｍ：Ａ１−Ａ２―ＭＴＤの式で、Ａ１がメチオニンであり、Ａ２がアルギニンである形態の改良型ＭＴＤ；ＭＨ―ｆｏｒｍ：Ａ１−Ａ２―ＭＴＤの式で、Ａ１がメチオニンであり、Ａ２がヒスチジンである形態の改良型ＭＴＤ；及びＭＫ―ｆｏｒｍ： Ａ１−Ａ２―ＭＴＤの式で、Ａ１がメチオニンであり、Ａ２がリシンである形態の改良型ＭＴＤ。
【図１１】ＥｐｉＯｒａｌ皮膚モデルで本発明による改良型ＭＴＤの細胞組織内透過能を共焦点レーザー走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で撮影した写真である。
【図１２】生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で本発明による改良型MTDの皮膚透過能を共焦点レーザー走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で確認した結果である。
【図１３】本発明による改良型ＭＴＤにａｃｅｔｙｌｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅを連結したペプチド複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞透過能を共焦点レーザー走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で確認した結果である。
【図１４】改良型ＭＴＤとＬａｃＺ ｓｉＲＮＡが共有結合を構成していることを表す写真である。
【図１５】マウスに静脈投与された本発明による改良型ＭＴＤの生体内肺器官の組織内透過能を共焦点レーザー走査顕微鏡（ ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ）で撮影した写真である。
【図１６】本発明による改良型ＭＴＤをマウスに静脈投与することによって、上記の改良型ＭＴＤが生体内の肺器官の組織内に透過してベータガラクトシターゼ（β‐ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）タンパク質発現を減少させることを表す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
低分子合成化合物または天然化合物は簡単に細胞内に伝達できる反面に、タンパク質、ペプチド、及び核酸のような巨大分子は分子量の大きさのため、二重脂質膜構造である細胞膜の中に透過できない。このような巨大分子が細胞の円形質膜を透過できない弱点を克服するための方法で、巨体分子細胞内伝送技術（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭＩＴＴ、大韓民国公開特許第１０−２００９−０１０３９５７号）が開発された。
【００５１】
上記の技術の場合、物質伝送ドメインが疎水性のアミノ酸のみに構成されていって、ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ（ＨＳＰＧｓ）などのように負電荷を帯びる炭水化物とグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）及びシアル酸（ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ）などのように負電荷を帯びる糖類に適用する際に負電荷は親水性の性格を有する細胞膜に接近する能力において制限的になる場合がある。
【００５２】
本発明者は上記の技術に使用されたＮ−末端のシグナルペプチドがタンパク質の後‐翻訳運搬（ｐｏｓｔ―ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）を指示する短いペプチドであり、多様なタンパク質に対する信号ペプチドの一般的な構造はタンパク質の開始コドンであるＭを含む両新媒性のドメインで構成されていて、両新媒性分子は二つのドメイン：親水性（極性）ドメイン及び疎水性（非‐極性）ドメインで構成されていることと正義できるので、シグナルペプチドの両新媒性の特性を考慮してみたとき、二つのドメインとしての役割が明らかであるため、シグナルペプチドの連続性がよく保存されているものと予想した。
【００５３】
しかし、正電荷を帯びるアミノ酸が連続されたり、連続されたまたは五つのアミノ酸配列に三つ以上の正電荷を帯びるアミノ酸が含まれた配列が疎水性のペプチドと結合すれば、むしろ疎水性のペプチドが直接細胞膜を透過して細胞の中に伝送されるものではなく、ＰＴＤのようにエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により細胞内に伝送されることを予想した。
【００５４】
このような仮説に基ついて、本発明者は従来に疎水性巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）に正電荷を帯びる１〜２個の親水性（極性）アミノ酸を疎水性ドメインに適用して負電荷を帯びている細胞膜での接近性を高めることにより、結果的により効率的に生物学的活性分子を細胞内に伝達する新しい改良型巨大分子伝達ドメインを提供することによって、本発明を完成することになった。
【００５５】
本発明は下記の式１に記載されるペプチドとして、
Ａ１はメチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）であり、
Ａ２はアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）及びリシン（Ｋ、Ｌｙｓ）でなる群から選択されるアミノ酸であって；
ＭＴＤは配列番号１ないし７でなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、ペプチド：
（式１）
0006001082.tif 000003
；及び上記のペプチドをエンコードするポリヌクレオチドに関するものである。
【００５６】
上記のペプチドは生物学的活性分子の細胞内への運搬を媒介できるペプチドとして、大韓民国公開特許第１０−２００９−０１０３９５７号に記載されたＭＴＤに比べて、優れた細胞透過能を表すペプチドで、本発明ではこれを「改良型ＭＴＤ」と名づけた。
【００５７】
上記のペプチドは配列番号１５ないし３５でなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができるが、これに限定されるものではない。
【００５８】
上記のペプチドは大韓民国公開特許第１０−２００９−０１０３９５７号で開発された１９３個の巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）の中で、定量化されて相対比較が可能な配列の中、下記の条件を満たす配列であることが望ましいが、これに限定されるものではない：
１）Ｐｒｏｌｉｎｅの位置が配列の中央に位置して；
２）Ｓｉｇｎａｌ  Ｐプログラムを利用した細胞外分泌誘導可能性の評価結果値が、各ドメインに対して６０％以上に評価されて；
３）Ｐｒｏｔｐａｒａｍプログラム（http://web.expasy.org/protparam/  参考）を利用して評価されたａｌｉｐｈａｔｉｃ  ｉｎｄｅｘが１００ないし３００の間の値で評価されて；
４）Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ（Ａｖｅｒａｇｅ  ｆｌｅｌｉｂｙｉｔｙ）プログラム（http://web.expasy.org/protscale/  参考）を利用して評価されたｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙが０．３６以上に評価されて；
５）Ｐｒｏｔｐａｒａｍプログラムを利用して評価されたｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙが３．０以下に評価されて；
６）Ｐｒｏｔｐａｒａｍプログラムを利用して評価されたｉｎｓｔａｂｙｉｔｙ  ｉｎｄｅｘが３０ないし６０の間の値で評価されて；
７）Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ（ｐｏｌａｒｉｔｙ）プログラムを利用したｐｏｌａｒｉｔｙの評価結果が０．１以上に評価される配列。
【００５９】
上記の配列番号１のアミノ酸配列は配列番号８のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００６０】
上記の配列番号２のアミノ酸配列は配列番号９のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００６１】
上記の配列番号３のアミノ酸配列は配列番号１０のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００６２】
上記の配列番号４のアミノ酸配列は配列番号１１のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００６３】
上記の配列番号５のアミノ酸配列は配列番号１２のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００６４】
上記の配列番号６のアミノ酸配列は配列番号１３のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００６５】
上記の配列番号７のアミノ酸配列は配列番号１４のポリヌクレオチド配列によりエンコードできるが、これに限定されない。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡの形態であることもあるが、上記のＤＮＡはｃＤＮＡ及び合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは単一筋や二重筋であることもある。仮に単一筋であるなら、これはコーディング筋または非コーディング（アンチセンス）筋であることもある。上記のコーディング配列は配列番号３６ないし５６から選択される塩基配列と同一であることもあるし、または別のコーディング配列もできるので、上記のコーディング配列は、遺伝的コードの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）または中複製（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）の結果として、同一なポリペプチドをエンコードする。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチドは、または上記に技術されたポリヌクレオチドの変異体を含むが、これは配列番号１５ないし３５の演繹された（ｄｅｄｕｃｅｄ）アミノ酸配列を特徴とするポリヌクレオチドの断片、類似体、及び誘導体をエンコードする。上記のポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレオチドの自然的に発生する対立（ａｌｌｅｌｉｃ）変異体またはポリヌクレオチドの非‐自然的に発生される変異体であることもできる。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドは配列番号３６ないし５６から選択される塩基配列を特徴とするコーディング配列の自然的に発生する対立変異体であるコーディング配列を有することができる。対立変異体は、エンコードされるポリヌクレオチドの機能を実質的に変更しない、一つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有することができるポリ塩基配列の交代（alternate）形態である。
【００６９】
単一アミノ酸が一つ以上のヌクレオチドコドンによりエンコードできて、上記のポリヌクレオチドが同一なペプチドをエンコードする交代ポリヌクレオチドを製造するよう容易に変形できることが当業界によく知られている。従って、本発明の別の実施形態は先に技術されたようなアミノ酸配列を含むペプチドをエンコードする交代塩基配列を含む。上記に請求されたアミノ酸配列を含むペプチドをエンコードする核酸分子は上記に請求されたアミノ酸配列のN−末端またはC−末端に位置した任意のアミノ酸の任意の組み合わせをエンコードする塩基配列を含む。
【００７０】
本発明の別の側面は、上記の改良型MTDを利用して細胞透過性を有するよう生物学的活性分子を遺伝的に操作する方法に関するものである。
【００７１】
生物学的活性分子の治療的用度はこれらの低い細胞透過性によりしばしば制限される。生物学的活性分子が細胞内移入（endocytic）過程を通じて細胞内に流入されるように見えるとしても、このような方式で細胞内に入り込む分子は一般的に細胞内移入ベシクル（vesicle）内に捕獲されてリソゾーム（lysosome）の内で分解される。
【００７２】
本発明の改良型MTDは従来のMTDに比べて効果的な細胞透過能を有することが明らかになった。本発明の改良型MTDはキットの形態で提供できるが、これは標的ポリペプチドに対するペプチドの連結を容易にするために当業界の熟練者に公知された必要な構成要素を含む。このような方式で改良型MTDに付着される標的タンパク質は続いての細胞内流入のためにin  vitroまたはin  vivoで細胞に伝達できる。
【００７３】
上記に技術されたポリヌクレオチドは本願に技術された改良型MTDの作用により細胞の外部から内部に流入できるタンパク質を生産できるようにタンパク質の発現ベクトル内に挿入できる。
【００７４】
発現ベクトルは生物学的活性分子として、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質ドメイン、または、関心対象の全長タンパク質をエンコードする核酸配列のN−末端及び／またはC−末端方向で、そして巨大分子伝達ドメインと標的生物学的活性分子でなる組み換えタンパク質が発現できるように正確な読み枠（reading  frame）の内に改良型MTDをエンコードする核酸配列を導入するため遺伝的に操作される。発現ベクトルは原核（prokaryotic）または真核（eukaryotic）発現システムで使用する際簡単に利用できるようなものの中で選択することができる。
【００７５】
本願で使用されるように、MTDは細胞の外部から内部に標的タンパク質の細胞内運搬を指示する、巨大分子伝達ドメインであり、改良型MTDは従来のMTDで細胞透過能が向上された巨大分子伝達ドメインである。本発明の別の実施形態で、改良型MTDは細胞膜を貫通して細胞の内部にペプチドまたはポリペプチドの流入を媒介する交代配列を含みことができる。
【００７６】
標的タンパク質は一般的に細胞膜を貫通する最適以下の透過性を表すが、本発明の改良型MTDのN-末端及び／またはC−末端に付着されれば、細胞の外部から内部に運搬されるタンパク質である。
【００７７】
上記の標的タンパク質は改良型MTDと標的ポリペプチド、タンパク質ドメイン、または全長タンパク質の間に切断部位（cleavage  site）が位置することができるし、これは代案的に対象ペプチドまたはポリペプチドから改良型MTDを物理的に除去するために組み替えタンパク質の切断と関連して当業界の熟練者に公知されている因子（factor）X部位または別の部位であることもできる。
【００７８】
本願で使用されたように、用語「生物学的活性分子」は、細胞内に流入される場合、生物学的効果を表せる任意の分子を含む。約１００，０００ないし約１００万範囲の分子量を有する非常に大きなタンパク質（例えば、抗体、フィブリノゲン、及び、マクログロブリン）は細胞により流出（export）されるので、非常に大きいタンパク質は本発明の方法により細胞内に流入できる。生物学的活性分子の例示には、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドが含まれて、これらは成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  factor）、酵素、伝写因子（transcription  factor）、毒素、抗原ペプチド（ワクチン用）、抗体、及び抗体断片のような、生物学的活性分子の機能的ドメインが含まれるが、これらに制限されるものではない。生物学的活性分子の付加的な例示にはプラスミド（plasmid）、コーディング核酸配列、ｍRNAｓ及びアンチセンスRNA分子のような核酸、炭水化物、脂質及び糖脂質が含まれる。生物学的活性分子の別の例示には疾病の診断、治療及び／または予防、具体的に低い細胞膜透過性を持つものが含まれる。このような治療剤の一部の例示にはダウノルビシン（Daunorubicin）のような抗がん剤、及びこの方法により投与される際に使用できるより低い投与量により、もっと安全に投与できる、毒性化合物が含まれる。生物学的活性分子の別の例示は抗原性（antigenic）ペプチドである。抗原性ペプチドは免疫反応に関与する細胞により流入されて免疫学的保護を提供できるように投与できる。別の例示には、免疫抑制（immunosuppressive）ペプチド（例えば、当業界に公知された自己反応（autoreactive）T細胞を遮断するペプチド）が含まれる。数多くの例示が熟練された当業者に自明だろう。
【００７９】
本発明に適合した生物学的活性分子の代表的な例示ではこれらの機能面で酵素、ホルモン、運搬タンパク質免疫グロブリンまたは抗体、構造タンパク質、運動機能タンパク質、水溶体、信号（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質及び保存タンパク質；及びこれらの位置及び役割面で膜または膜横断（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質、内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）タンパク質、外部（ｅｘｔｅｒｎａｌ）又は分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、先天性（ｎａｔｉｖｅ）タンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、ジスルフィド結合を有するタンパク質、タンパク質複合体、化学的に改質されたタンパク質及びプリオン（ｐｒｉｏｎｓ）が含まれる。
【００８０】
標準組み替え核酸方法が遺伝的に操作された組み替えタンパク質を発現させるために使用できる。本発明の改良形巨大分子伝達ドメインをエンコードする核酸配列は、例えば、適合な信号及び処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）配列及び伝写及び翻訳のための調節配列を有する、核酸発見ベクトルの内にクローニングできるし、タンパク質は自動化（ａｕｔｏｍａｔｅｄ）有機合成方法を利用して合成できる。タンパク質を生産するための合成方法は、例えば、文献（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２８９：Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｇｒｅｇｇ  Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｓｉｄｎｅｙ  Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，Ｍｅｌｖｉｎ Ｉ．Ｓｉｍｏｎ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７））に技術されている。
【００８１】
クローニングされた遺伝子または核酸、例えばＭＴＤをエンコードするｃＤＮＡの高い水準の発現を得るために、ＭＴＤの配列は典型的に伝写を誘導する強力なプロモーター、伝写・翻訳終結因子（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、及びタンパク質をエンコードする核酸の場合には、伝写開始のためのリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を含む発現ベクトル内にサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ）できる。適合な細菌性プロモーターは当業界によく知られていて、例えば、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＡｕｓｕｂｅｌなど，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））に開示されている。本発明の改良形ＭＴＤを発現するための細菌性発見システムは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ）、及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（Ｐａｌｖａなど、Ｇｅｎｅ ２２：２２９−２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈなど、Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：５４３−５４５（１９８３））で利用可能である。このような発見システムのためのキットが商業的に利用可能である。哺乳動物の細胞、酵母、及び、昆虫細胞用真核発現システムが当業界によく知られていて、また商業的に利用可能である。上記の真核発見ベクトルはアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ）ベクトル、アデノ‐関連ウイルス（ａｄｅｎｏ―ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ベクトル、またはレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ）ベクトルであることもできる。
【００８２】
一般的に本発明の改良型ＭＴＤのＮ-末端、Ｃ−末端または両末端にタンパク質を付着した細胞透過性組み替えタンパク質を発見させるための発見ベクトルは、例えば、巨大分子伝達ドメインをエンコードする配列に作動的に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）付着された、プロモーターを含む調節配列を含むことができる。使用できる誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）プロモーターの非‐制限的な例示にはステロイド‐ホルモン反応性プロモーター（例えば、エクダイソン（ｅｃｄｙｓｏｎｅ）−反応性、エストロゲン（ｅｓｔｒｏｇｅｎ）‐反応性、及びグルタコルチコイド（ｇｌｕｔａｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）‐反応性プロモーター）、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）「Ｔｅｔ―Ｏｎ」及び「Ｔｅｔ―Ｏｆｆ」システム、及び金属‐反応性プロモーターが含まれる。上記のコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は適合な宿主細胞、例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または組織培養細胞内に導入できる。上記のコンストラクトは、またはモデル対象として形質転換（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）有機体を形成するための胚幹細胞の内に導入できる。非常に多くの適合なベクトル及びプロモーターが当業界の熟練者に公知されていて、本発明の組み替えコンストラクトを形成するために商業的に利用可能である。
【００８３】
本発明のポリヌクレオチド及び適合な伝写・翻訳調節信号を含むベクトルを製作するために公知された方法が使用できる。このような方法にはｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み替えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ  ｖｉｖｏ組み替え・遺伝的組み替えが含まれる。例えば、このような技術は文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＡｕｓｕｂｅｌなど、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））に技術されている。
【００８４】
細胞透過性組み替えタンパク質を生産するために適合な宿主細胞には細菌細胞及び真核細胞（例えば、真菌、昆虫、植物、及び哺乳動物の細胞）が含まれる。宿主細胞は冷凍‐解凍循環（ｆｒｅｅｚｅ‐ｔｈａｗ  ｃｙｃｌｉｎｇ）、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、機械的破壊、または、細胞の融解剤（ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）の使用を含む、任意の便利な方法により破壊できる。文献（Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９４））は組み替え（及び非‐組み替え）タンパク質を精製するために数多くの一般的な方法を技術する。上記の方法で、例えば、イオン‐交換クロマトグラフィー（ｉｏｎ‐ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、サイズ‐排除（ｓｉｚｅ‐ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）クロマトグラフィー、選択的な沈殿、透析、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれることができる。これらの方法は細胞透過性組み替えタンパク質のための精製戦略を考案するように改造できる。仮に、上記の細胞透過性組み替えタンパク質がエピトープタッグ（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｔａｇ）または金属キレート（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ）配列のような、精製道具（ｈａｎｄｌｅ）を含むならば、親和クロマトグラフィーが上記のタンパク質を容易に精製するのに使用できる。
【００８５】
生産されたタンパク質の量は直接的に（例えば、ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）解析の利用）または間接的に（例えば、ゲルシフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ）特異的ＤＮＡ結合活性に対して、細胞由来物質を解析することにより）巨大分子伝達ドメインを検出することにより評価できる。タンパク質は精製の前に、精製の任意の段階中、または精製後に検出できる。一部の実行では、精製または完璧な精製が必要ではないこともある。
【００８６】
本発明の方法により製造された遺伝的に操作された組み替えタンパク質は細胞透過性タンパク質であり、特に死滅されたまたは弱毒化された（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）全（ｗｈｏｌｅ）有機体ワクチンが実用的でない場合に、タンパク質‐系ワクチンで使用できる。本発明の方法により製造された細胞透過性タンパク質は、また多様な疾患、特に免疫疾患、またはがんの治療に使用できる。細胞透過性タンパク質は組み替えベクトルで、細胞を形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）または形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）させる必要性を排除しながら、細胞の内部に伝達できる。本発明の細胞透過性タンパク質はタンパク質の機能を調査するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ上で使用できたり、細胞を望ましい状態に維持するために使用できる。
【００８７】
本発明の改良型ＭＴＤはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏに標的細胞の内部にペプチド、ポリペプチド、タンパク質ドメイン、またはタンパク質を伝達するために使用できる。上記の改良型ＭＴＤは組み替えＤＮＡまたはＲＮＡ分子から組み替えタンパク質の発現により形成されたペプチド結合（ｌｉｎｋａｇｅ）により標的タンパク質に付着されることができる。共有結合は細胞内にの流入のために、ポリヌクレオチドのような、非‐タンパク質分子に本発明の改良型ＭＴＤを付着するために使用できる。
【００８８】
本発明による細胞膜透過性を有するタンパク質を遺伝的に操作する方法は、細胞内に治療的タンパク質生成物を伝達する手段を提供する。本発明と細胞外タンパク質伝達の以前に技術された方法との組合せは制御‐分泌（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ―ｒｅｌｅａｓｅ）方式で安定された、機能性形態に細胞内での流入のためのタンパク質を伝達する方法を提供する。
【００８９】
ポリペプチドが適合な発現ベクトル及び発現システムを利用して製造される。細胞透過性が上記の発現されたポリペプチドのＮ−末端、及び／またはＣ−末端に位置したＭＴＤと組み替えタンパク質の発現によりタンパク質またはポリペプチドに付与される。安定化が少し足りないタンパク質は当業界の熟練者に公知されて、前に記述された方法により安定化される。細胞外の環境での伝達はマイクロスフィア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）担体のような、適当な担体の内に安定化された組み替えタンパク質を提供することにより達成される。精選されたタンパク質は適当な安定化及び伝達技術だけでなく、適当なベクトル及び発現システムを指定することである。薬物伝達システム分野の通常の知識を有するものは記述されたものから適当な技術を選択できる。
【００９０】
本願で使用されたように、用語「細胞膜」は細胞外の空間から細胞または細胞集団を分離する脂質‐含有障壁（ｌｉｐｉｄ―ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂａｒｒｉｅｒ）を称する。細胞膜は円形質膜、細胞壁、細胞小器官（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ）膜、例えば、ミトコンドリア膜、核膜などを含むが、これらに限定されるものではない。
【００９１】
本願に使用されたように、用語「生物学的活性分子」は体系内で生物学的反応を触発させたり、変形させたりすることができる化合物または分子を称する。生物学的活性分子の非‐制限的な例示には抗体（例えば、単一クローン、キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄなど）、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス剤（ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ）、ペプチド、タンパク質、化学療法剤（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、小分子、ビタミン、補助因子（ｃｏ―ｆａｃｔｏｒｓ）、 ヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ）核酸、アンチセンス核酸、 三重鎖形成性（Ｔｒｉｐｌｅｘ  ｆｏｒｍｉｎｇ）オリゴヌクレオチド、２，５-Aキメラ（ｃｈｉｍｅｒａｓ）、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡi抑制剤、ｄｓＲＮＡ、アロザイム（ａｌｌｏｚｙｍｅｓ）、アプタマ（ａｐｔａｍｅｒｓ）、これらの誘引物（ｄｅｃｏｙｓ）及び類似体が含まれる。本発明の生物学的活性分子は、また別の生物学的活性分子、例えば、脂質及びポリアミン（ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ）、ポリアミド（ｐｏｌｙａｍｉｄｅｓ）、ポリエチレングリコール及び別のポリエーテルのような重合体の薬物動態学（ｐｈａｒｍａｃｏｌｉｎｅｔｉｃｓ）及び／または薬動学（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ）を調節できる分子を含む。特定実施形態で、用語生物学的活性分子は用語「巨大分子」と交換的に使用される。
【００９２】
本願に使用されたような用語「巨大分子」はペプチド、タンパク質、及び生物学的または合成起源のオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドで例示される大きい分子（１０００ダルトン以上の分子量）を称するが、これらに制限されるものではない。
【００９３】
本願に使用されたように用語「ペプチド」は単一直鎖のＤ−またはＬ−アミノ酸またはペプチド結合により連結されたＤ−及びＬ−アミノ酸の混合物で作られた化合物を称する。望ましくは、ペプチドは二つ以上のアミノ酸残基を含めて、長さが約５０個のアミノ酸以下である。
【００９４】
本願に使用されたように用語「タンパク質」はペプチド結合により付着された線形的（ｌｉｎｅａｒｌｌｙ）配列されたアミノ酸で構成されるが、ペプチドとは違って、明瞭な（ｗｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ）形態を有する。ペプチドとは対照的に、タンパク質は望ましくは５０個以上のアミノ酸直鎖を含む。
【００９５】
本願に使用されたように用語「ポリペプチド」は一つ以上のペプチド結合を含む二つ以上のアミノ酸残基の重合体を称する。ポリペプチドが明瞭な形態を有するかどうかに関係なく、ポロペプチドはペプチド及びタンパク質を含む。
【００９６】
本願に使用されたように用語「核酸」は、例えば、それらのすべてが単一または二本鎖の形態であるヌクレオチドの類似体から作られる、ＲＮＡまたはＤＮＡの類似体だけでなく、デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＤＮＡ）及びリボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＲＮＡ）のようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを称する。
【００９７】
アミノ酸残基はこれらの標準１−文字または３−文字表示法により、または、これらの完全な名前により本願で言及される：Ａ，Ａｌａ、アラニン；Ｃ、Ｃｙｓ、システイン；Ｄ、Ａｓｐ，アスパラギン酸；Ｅ，Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ｆ、Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｇ、Ｇｌｙ、グリシン；Ｈ、Ｈｉｓ，ヒスチジン；Ｉ、Ｉｌｅ、 イソロイシン；Ｋ、Ｌｙｓ、リシン；Ｌ、Ｌｅｕ、ロイシン；Ｍ、Ｍｅｔ、メチオニン；Ｎ、Ａｓｎ、アスパラギン；Ｐ、Ｐｒｏ、プロリン；Ｑ、Ｇｌｎ、グルタミン；Ｒ、Ａｒｇ、アルギニン；Ｓ、Ｓｅｒ，セリン；Ｔ、Ｔｈｒ、トレオニン；Ｖ、Ｖａｌ，バリン；Ｗ、Ｔｒｐ、トリプトファン；Ｘ、Ｈｙｐ、ヒドロキシプロリン；及びＹ、Ｔｙｒ，チロシン。
【００９８】
本願に使用されたように用語「巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）」は細胞内に巨大分子の運搬を容易にするペプチドを称する。
【００９９】
別に定義しない限り、本願に使われたすべての技術的及び科学的用語は本発明が属する当業界の通常的な知識を有する者に一般的に理解されるものと同一な意味を有する。本願に技術されたものと類似したり同等な任意の方法及び物質が本発明を実行したり検査するのに使用できるとしても、特定の方法及び物質が本願に記述される。本願に言及されたすべての刊行物は上記の刊行物が引用されたものと関連して方法及び／または物質を記述して説明するためにその全体として参考として本願に含まれる。本願及び添付された請求範囲に使われたように、単数形態「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は文脈が別に明確に指示しない限り、複数対象を含むことと理解されなければならない。
【０１００】
本発明の具体的な実施例で、本発明者はｏｎｌｉｎｅで解析可能なＰＥＰ ＦＯＬＤ  ｓｅｒｖｅｒサービスプログラムでＭＴＤペプチドにＥＧＦＰ蛍光タンパク質のＮ−末端配列を融合した入れるを利用してシグナルペプチドから派生された細胞透過性ペプチド先行特許「公開番号１０−２００９−０１０３９５７：新規な巨大分子伝達ドメインならびにこれの同定方法及び用度」に公知された巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）の構造的特徴が毀損されていないことを証明した（図１ないし図４参考）。
【０１０１】
本発明の別の具体的な実施例で、ＭＴＤペプチドの細胞透過性を定量的に決定するためにＭＴＤにＦＩＴＣ蛍光物質を連結した複合体を製造したし、ＦＩＴＣ−ＭＴＤペプチドを細胞に処理した後、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）機で解析した。解析した結果、従来のＭＴＤより本発明を通じて改善されたＭＴＤでより高い蛍光信号を表した。あわせて、ＭＴＤがＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）に比べて非常に効率的にＦＩＴＣを細胞内に伝達したことを確認することによって、改善されたＭＴＤの細胞内の浸透効果を立証した。
【０１０２】
本発明の別の具体的な実施例で、ＭＴＤにＦＩＴＣ蛍光物質を連結した複合体を使用して共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）解析を通じて細胞透過性及び細胞内局在（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を視覚的に確認した。その結果、フローサイトメトリーの結果と同一に従来のＭＴＤより改善されたＭＴＤで高い細胞透過性を表したし、やはりＭＴＤがＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）に比べて細胞透過度が高いことが確認できた。
【０１０３】
あわせて、本発明の別の具体的な実施例で、ＭＴＤ２１７３Ａと融合されたＬａｃＺｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３の場合、マウスを利用して静脈で投与した結果、肺の組織の透過性を共焦点顕微鏡解析を通じて視覚的に確認したし、これとあわせて摘出した肺の組織をＸ−ｇａｌ染色をした後、顕微鏡で観察した結果、ＬａｃＺｓｉＲＮＡによりマウスで持続的に発現されるベータガラクトシターゼタンパク質の生成が減少されたことを確認することによって、改善されたＭＴＤの臓器組織内の浸透効果を立証した。
【実施例】
【０１０４】
以下、本発明の理解を助けるために望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供するに過ぎないものであり、下記の実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
【０１０５】
実施例１．改良形ＭＴＤの考案のため、対象ＭＴＤペプチドの選別
本発明者は従来に本発明者により開発された技術である「大韓民国公開特許第１０−２００９−０１０３９５７号」で開発された１９３個のＭＴＤの中で、定量化されて相対比較が可能な配列の中、下記の条件を充足する配列で伝送能を改良するための対象ＭＴＤ配列を選別した。
【０１０６】
上記の選別のための条件は下記のようである。
１）巨大分子伝達ドメインの配列の中、ｐｒｏｌｉｎｅの位置が配列の中央に位置する配列を選別する。
２）巨大分子伝達ドメインの配列の中、細胞外分泌誘導可能性が高い配列を選別する。
３）巨大分子伝達ドメインの配列の中、巨大分子伝達ドメインの物理化学的特性を決定する要素であるａｌｉｐｈａｔｉｃ  ｉｎｄｅｘの特定の水準を満足する配列を選別する。
４）巨大分子伝達ドメインの配列の中、巨大分子伝達ドメインの物理化学的特性を決定する要素であるｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙが特定の水準を満足する配列を選別する。
５）巨大分子伝達ドメインの配列の中、巨大分子伝達ドメインの物理化学的な特性を決定する要素であるｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙが特定の水準を満足する配列を選別する。
６）巨大分子伝達ドメインの配列の中、巨大分子伝達ドメインの物理化学的な特性を決定する要素であるｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎｄｅｘが特定の水準を満足する配列を選別する。
７）巨大分子伝達ドメインの配列の中、巨大分子伝達ドメインの物理化学的な特性を決定する要素であるｐｏｌａｒｉｔｙが特定の水準を満足する配列を選別する。
【０１０７】
これを具体的に説明すれば、下記のようである。
特定な代表配列を選別するために、上記の段階１）で記述したように、
プロリンの有無とその位置に根拠した代表配列を決定した。巨大分子伝達ドメインの配列を構成するアミノ酸であるアラニン、バリン、プロリン、ロイシン及びイソロイシンの中、小枝の配列が短くサイズが小さいプロリンはアミノ酸配列の二次構造の形成の自由度に影響を及ぼして、これは巨大分子伝達ドメインの細胞膜透過に寄与する。「大韓民国公開番号第１０−２００９−０１０３９５７号：新規な巨大分子伝達ドメインならびにこれの同定方法及び用度」に公知された巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）の中、これを構成する配列上にプロリンが存在して、そのプロリンの位置が巨大分子伝達ドメインのアミノ酸配列の中央に位置してアミノ酸配列の二次構造形成の自由度が高いことと分類される４９個の巨大分子伝達ドメインを決定した。
【０１０８】
続いて、段階１）で選別された巨大分子伝達ドメインの中で、細胞外分泌可能性が高い配列を選別した。一部水溶性タンパク質は輸送を媒介する水溶体と相互作用できる信号を持っているが、信号媒介輸送でタンパク質は伝達されるターゲットを指定する一つまたはそれ以上の信号配列を有している。従って、細胞外分泌誘導配列と類似性が高ければ、伝送能を向上させることができるという仮定の下で、Ｓｉｇｎａｌ  Ｐプログラムを利用して細胞外分泌誘導可能性を評価した。各ドメインに対して１０％から９０％の間の可能性が評価されるが、段階１）で決定された巨大分子伝達ドメインの中、６０％以上に評価された配列を改良型対象配列に選別した。
【０１０９】
続いて、段階２）で選別された巨大分子ドメインの中で、段階３）に記述されたように、巨大分子伝達ドメインの物理化学的な特性を決定する要素であるａｌｉｐｈａｔｉｃ  ｉｎｄｅｘの特定の水準を満足する配列を選別した。Ａｌｉｐｈａｔｉｃ  ｉｎｄｅｘはアミノ酸の小枝の炭素チェーンにより決定される全体分子の体積を決定する物理的特徴で巨大分子伝達ドメインが細胞膜を透過する際に、細胞膜の構造を変形する特徴として評価される。Ａｌｉｐｈａｔｉｃ  ｉｎｄｅｘは巨大分子伝達ドメインのアミノ酸配列のそれぞれの固有な値と全体配列の平均で決定されて、Ｐｒｏｔｐａｒａｍプログラム（http://web.expasy.org/protparam/  参考）を利用して決定された。Ｐｒｏｔｐａｒａｍプログラムはアミノ酸で構成されるタンパク質ないしペプチドの物理的特性を数値化して表す有用な道具としてＡｌｉｐｈａｔｉｃ  ｉｎｄｅｘは１００から３００の間で評価された配列を伝送能改良のための代表配列で選別した。
【０１１０】
続いて、段階３）で選別された巨大分子伝達ドメインの中で段階４）で記述されたように、巨大分子伝達ドメインの物理化学的特性を決定する要素であるｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙが特定の水準を満足する配列を選別した。Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙは巨大分子伝達ドメインのＮ−末端のアミノ酸とＣ−末端のアミノ酸の間の相関程度及び自由度を意味する物理化学的特徴で構造的に柔軟性を付与して、細胞膜に対する親和力と連関されている。Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙはアミノ酸配列の長さとアミノ酸の小枝配列の構成により評価されて、Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）プログラム（http://web.expasy.org/protscale/  参考）を利用して評価された。Ｐｒｏｔｓｃａｌｅプログラムはアミノ酸で構成されるタンパク質ないしペプチドの物理的特性を数値化して現す道具で利用されて、段階３）で決定された巨大分子伝達ドメインの中、Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ（Ａｖｅｒａｇｅ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）プログラムを利用したｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙの評価結果が０．３６以上に評価された配列を伝送能改良のための代表配列で選別した。
【０１１１】
続いて、段階４）で選別された巨大分子伝達ドメインの中で段階５）に記述されたように、巨大分子伝達ドメインの物理化学的特性を決定する要素であるｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙが特定の水準を満足する配列を選別した。Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙはアミノ酸の固有な特徴によって決定される物理的な特徴で物性を決める特徴で見なされて、３．０以上で深刻な縺れ現象をもたらすことで知られている。また、Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙは巨大分子伝達ドメインのアミノ酸配列のそれぞれの固有な値と全体配列の平均で決定されて、Ｐｒｏｔｐａｒａｍプログラムを利用して評価した。これに１．３から３．８の間の値を表わすｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙの結果中、段階４）で選別した巨大分子伝達ドメインの内でｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙが３．０以下に評価された配列を改良のための代表配列で決定した。
【０１１２】
続いて、段階５）で選別された巨大分子伝達ドメインの中で、段階６）で記述されたように、巨大分子伝達ドメインのｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎｄｅｘが特定の水準を満足する配列を決定した。Ｉｎｓａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘはアミノ酸配列の安定性を意味する特性で配列上のアミノ酸の配列順番によって決定されて、その数値が高いほど不安定性を持つ。これは巨大分子伝達ドメインの物理化学的特性を決定する要素でドメインの細胞内安定性に影響を及ぶ特性に見なされて、Ｐｒｏｔｐａｒａｍプログラムを利用して評価した。これに解析結果ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎｄｅｘが０から１３０の間の値で現れる巨大分子伝達ドメインの中、段階５）で決定された巨大分子伝達ドメインの内でｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎｄｅｘが３０から６０の間に位置する配列を改良のための代表配列で選別した。
【０１１３】
続いて、段階６）で選別された巨大分子伝達ドメインの中で、段階７）に記述されたように、巨大分子伝達ドメインの物理化学的特性を決定する要素であるＰｏｌａｒｉｔｙが特定の水準を満足する配列を決定した。Ｐｏｌａｒｉｔｙはアミノ酸の構成成分の中、炭素鎖の長さ及び水酸基の有無で判断されることで水に対する親和度を現す目安である。これはｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙと一緒に巨大分子伝達ドメインの物性を決定する特徴であり、細胞膜に対する親和度にも影響を及ぶものと思われる。Ｐｏｌａｒｉｔｙは巨大分子伝達ドメインのアミノ酸配列、それぞれの固有な値と全体配列の平均で決定されて、Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ（ｐｏｌａｒｉｔｙ）プログラムを利用して評価された。これに段階６）で決定された巨大分子伝達ドメインの中、Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ（ｐｏｌａｒｉｔｙ）プログラムを利用したｐｏｌａｒｉｔｙの評価結果が０．１以上に評価された配列を改良のため代表配列で選別した。
【０１１４】
具体的に、大韓民国公開特許第１０−２００９−０１０３９５７号に記載された巨大分子伝送ドメインの中、改良形ＭＴＤの考案のための対象ＭＴＤであるＪＯ−１０３（配列番号３）は下記の過程により決定された。
【０１１５】
ｉ）「大韓民国公開特許１０−２００９−０１０３９５７：新規な巨大分子伝達ドメインならびにこれの同定方法及び用度」に公知された巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）の中、ＪＯ−１０３はＬＡＬＰＶＬＬＬＡの配列で構成されていて；
ｉｉ）Ｓｉｇｎａｌ Ｐプログラムを利用した細胞外分泌可能性の評価で９０％の可能性を見せて；
ｉｉｉ）Ｐｒｏｔｐａｒａｍプログラムを利用したａｌｉｐｈａｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ評価で２７１の値を表して；
ｉｖ）Ｐｒｏｔｓｃａｌｅプログラムを利用したｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ評価で０．３８に評価されて；
ｖ）Ｐｒｏｔｐａｒａｍプログラムを利用したｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｂｉｔｙ決定で２．８に決定されて；
ｖｉ）Ｐｒｏｔｐａｒａｍプログラムを利用したｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ決定で５２に決定されて；
ｖｉｉ）Ｐｒｏｔｓｃａｌｅプログラムを利用したｐｏｌａｒｉｔｙ評価で０．１３に評価されるので、
従って、伝送能改善のための対象配列に決定されたＪＯ−１０３は上記の７段階をすべて満足する対象ドメインであることが分かる。
【０１１６】
同一な方式を通じて、改良形ＭＴＤの考案のために５個の対象ＭＴＤが選別されて、具体的に、選別された対象ＭＴＤはＭＴＤ ＪＯ−０１８（配列番号１）、ＭＴＤ ＪＯ−０６７（配列番号２）、ＭＴＤ ＪＯ−１０３（配列番号３）、ＭＴＤ ＪＯ−１５９（配列番号４）及びＭＴＤ ＪＯ−１７３（配列番号５）である。
【０１１７】
この中、ＭＴＤ ＪＯ−１７３番について、プロリンの位置を変更して追加的な柔軟性を確保して；中間段階ペプチドであるＭＴＤ１７３Ａ（配列番号７）を製作して、このように製作されたＭＴＤ１７３Ａも上記の７段階の選別条件をすべて満足するので、改良形ＭＴＤの考案のための対象ＭＴＤ配列に含めた。
【０１１８】
また、対象で選別されたＭＴＤの中、ＪＯ−１８番について、配列をｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙが低いアミノ酸で置換して物性を改善するため中間段階ペプチドＭＴＤ１８ｍ（配列番号６）を導出したし、これもやはり上記の７段階の選別条件を満足していて、改良形ＭＴＤの考案のための対象ＭＴＤ配列に含めた。
【０１１９】
実施例２．改良形ＭＴＤの考案
上記の実施例１で選別された７つの対象ＭＴＤを基に、１−２個の親水性（極性）アミノ酸を添加して疎水性ドメインに適用して細胞膜での接近性を高めることによって、より効率的に生物学的活性分子を細胞内に伝達する新しい改良形巨体分子伝達ドメインを製作しようと思って、これを通じて下記の式１で記載されるペプチドを考案した。
（式１）
0006001082.tif 000004
：Ａ１はメチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）であり；
Ａ２は正電荷を帯びるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）及びリシン（Ｋ，Ｌｙｓ）でなる群より選択されるアミノ酸であって；
ＭＴＤは上記の実施例１で選別された配列番号１ないし７よりなる群から選択された７つのアミノ酸配列。
【０１２０】
上記の式１を通じて考案された改良形ＭＴＤの配列は配列番号１５ないし３５に記載されたアミノ酸配列と同じで、考案されたアミノ酸配列を基にペプチドを合成してその細胞透過能を確認した。
【０１２１】
実施例３．改良形ＭＴＤの２次構造解析
上記の実施例２で考案された改良形ＭＴＤの配列について、ＰＥＰ ＦＯＬＤ  ｓｅｒｖｅｒプログラムを利用して２次構造を解析した。
【０１２２】
その結果、図１ないし図４でみるように、上記の実施例２で考案された改良形ＭＴＤが大韓民国公開特許第１０−２００９−０１０３９５７号（新規な巨大分子伝達ドメインならびにそれの同定方法及び用度）に公知された巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）の構造的特徴を毀損させなく、細胞膜の透過性を高めることができるα−ｈｅｌｉｘ構造を維持していることを確認した。
【０１２３】
実施例４．改良形ＭＴＤの合成
上記の実施例２で考案された改良形ＭＴＤの合成は一般的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）方法を利用してＣ−ｔｅｒｍから一つずつカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）した。
【０１２４】
具体的に、まず、ペプチドのＣ−末端一つ目のアミノ酸がレジン（ｒｅｓｉｎ）に付着された（ａｔｔａｃｈｅｄ）者を使用した。使用可能なレジンはＮＨ２−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−２−ｃｈｌｏｒｏ−Ｔｒｉｔｙｌレジン、ＮＨ２−Ｍｅｔ−２−ｃｈｌｏｒｏ−Ｔｒｉｔｙｌレジン、またはＮＨ２−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−２−ｃｈｌｏｒｏ−Ｔｒｉｔｙｌレジンの中で必要により適切なレジンを選定して合成に使用した。
【０１２５】
二つ目、ペプチド合成に使用するすべてのアミノ酸原料はＮ−末端がＦｍｏｃで保護されて、残基はすべて酸から除去されるＴｒｔ、Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｕなどで保護されることを使用した（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ）、特殊アミノ酸の場合にはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨを使用した。
【０１２６】
三つ目、２０％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ＤＭＦを利用して常温で５分間２回反応してＦｍｏｃを除去した。
【０１２７】
四つ目、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＭＣ、ＤＭＦ順で洗浄した。
【０１２８】
五つ目、合成されたペプチドをレジンから分離及び残基の保護基除去にはＴＦＡ／ＥＤＴ／Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ＝９０／２．５／２．５／２．５／２．５を使用する（ＴＦＡ＝ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、ＥＤＴ＝１，２−ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ、ＴＩＳ＝ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ）、最後にＨＰＬＣで精製した後、質量解析（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｏｔｅｒ）で確認して凍結乾燥して改良形ＭＴＤを得た。
【０１２９】
また、蛍光物質（ＦＩＴＣ）が付いたＭＴＤを合成するために上記の合成方法でＭＴＤ合成を進行した後に、最後にリシン（Ｋ，Ｌｙｓ）を追加して、ペプチド合成を進行した後、リシンのフリーアミン残基にＦＩＴＣを結合した。合成されたＭＴＤ−ＦＩＴＣを製造した。その後、合成された改良形ＭＴＤ−ＦＩＴＣは遮光状態で１ｍＭ濃度がなれるように滅菌蒸留水で溶かした後、１．５ｍＬ遠心分利用の容器に少量に株分けして、使用直前まで冷凍保管した。
【０１３０】
実施例５．フローサイトメトリーを利用した改良形ＭＴＤのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞透過能の確認
本発明の改良形ＭＴＤと従来のＭＴＤ（改良形対象ＭＴＤ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞透過性を確認するために、フローサイトメトリーを利用した。
【０１３１】
具体的に１、５または１０ｕＭ濃度のＭＴＤにＦＩＴＣをｌａｂｅｌｌｉｎｇして、合成した試料を大腸がん由来細胞（ＨＣＴ１１６、Ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ、Ｃａｔ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２４７、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）にそれぞれ処理して、４時間の間培養した。上記のＨＣＴ１１６細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００ｕｎｉｔｓ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び１０，０００ｕｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に、５％ＣＯ２の湿潤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）大気の下で３７℃で培養した。培養が終結された後、それぞれの試料が処理されたＨＣＴ１１６細胞の細胞膜に露出されているガラスＭＴＤ−ＦＩＴＣを除去するためにトリプシンを処理して、冷蔵保管したリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）で３回洗浄した。
【０１３２】
洗浄した細胞を回収して、蛍光−活性化細胞分類（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）解析（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｋｔｏｎ‐Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ、ＵＳＡ）に適用した。それぞれの試料について、細胞（１Ｘ１０４）をＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏサイトメトリー解析ソフトウェアを利用して改良したＭＴＤ−ＦＩＴＣと従来のＭＴＤ−ＦＩＴＣの細胞透過性を定量的に比較解析した。
【０１３３】
その結果を図５に現して、具体的に、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）解析結果を現した図５で灰色で埋められた曲線は細胞単独を表して、緑色の曲線は１ｕＭの処理濃度群、オレンジ色の曲線は５ｕＭの処理濃度群、赤色の曲線は１０ｕＭ処理濃度群の細胞透過性を現す。
【０１３４】
図５で見るように、１０ｕＭのＭＴＤ−ＦＩＴＣの幾何平均（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｎ）を比較して見たとき、改良形ＭＴＤが従来のＭＴＤより最小１４０％から最大２７０％まで高い蛍光信号を現したし、改良形ＭＴＤの場合低い濃度でも高い濃度の従来のＭＴＤと似たような水準に細胞透過度が向上したことを見せている。
【０１３５】
これを通じて、本発明で考案された改良形ＭＴＤは従来のＭＴＤに比べて細胞の円形質膜−浸透能力が顕著に向上されたことが分かる。
【０１３６】
実施例６．フローサイトメトリーを利用した改良形ＭＴＤのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞透過能の確認（ＨＥＫ２９３ ｃｅｌｌ）
追加的に、ヒト胚の腎臓細胞から由来したＨＥＫ２９３ｃｅｌｌについて、フローサイトメトリーを利用してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞透過性を確認した。本発明の改良形ＭＴＤと先行の公知されたＭＴＤにＦＩＴＣを連結したそれぞれの試料と細胞透過性が低いと見做されるｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ及び細胞透過性がすでに検証されたｋＦＧＦ４から由来したＭＴＳ（Ｍａｒｃｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｃｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を対照群で使用して実験した。
【０１３７】
具体的に５ｕＭ濃度の試料をヒト胚の腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ）にそれぞれ処理して、６時間の間、培養した。上記のＨＥＫ２９３細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００ｕｎｉｔｓ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び１０，０００ｕｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有してＲＰＭＩ１６４０培地に、５％ ＣＯ２の湿潤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）大気の下で、３７℃で培養した。培養が終結された後、それぞれの試料が処理されたＨＣＴ１１６細胞の細胞膜に露出されているガラスＭＴＤ−ＦＩＴＣを除去するためトリプシンを処理して、冷蔵保管したリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）で３回洗浄した。
【０１３８】
洗浄した細胞を回収して、蛍光−活性化細胞分類（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）解析（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ、ＵＳＡ）のために細胞（１Ｘ１０４）をＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏサイトメトリー解析ソフトウェアを利用して解析を行った。改良したＭＴＤ−ＦＩＴＣを先行技術のＭＴＤ−ＦＩＴＣの細胞透過性を定量的に比較解析した。
【０１３９】
その結果を図６に現したし、その結果、配列番号３のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０３ＭＴＤペプチドは改良の後、１５０‐１９０％の細胞透過性の向上が確認されたし、配列番号４のアミノ酸配列を有するＪＯ−１５９ＭＴＤペプチドは改良の後、１８０‐２１０％の向上された細胞透過性を現すことを確認した。また、配列番号７のアミノ酸配列を有するＪＯ−１７３Ａ ＭＴＤペプチドを改良したＭＴＤペプチドの場合、１９０‐２３０％まで細胞透過性が改善されたことを確認した。
【０１４０】
これを通じて、本発明で考案された改良形ＭＴＤは従来のＭＴＤに比べて細胞透過能が顕著に向上されたことが分かる。
【０１４１】
実施例７．共焦点レーザー走査型顕微鏡を利用した改良形ＭＴＤのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞透過能の確認
本発明の従来のＭＴＤ対比改良形ＭＴＤの機能性改善を確認するために、皮膚由来細胞とがん由来細胞に対して、共焦点レーザー走査型顕微鏡を利用した可視的細胞透過性を確認した。
【０１４２】
７−１．皮膚由来細胞で細胞透過能の確認
皮膚由来細胞では皮膚由来角質形成細胞（ＨａＣａＴ  ｃｅｌｌ、ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、Ｃａｔ  Ｎｏ．３００４９３、ＣＬＳ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用したし、対照群としては細胞透過性がないｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅと細胞透過性があると見なされるＴａｔ及びＭＴＳを一緒に実験した。
【０１４３】
具体的に、実験の前日ＨａＣａＴ細胞をガラスカバースリップが入っている１２−ウェルプレート（１２−ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）内で２４時間の間、培養する。ＨａＣａＴ細胞は１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００ｕｎｉｔｓ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び１０，０００ｕｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ培地で、５％  ＣＯ２の湿潤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）大気の下で、３７℃で培養した。ＨａＣａｔ細胞に５ｕＭの濃度でそれぞれのペプチドを１時間の間、処理した後、細胞透過度の観察のために細胞を室温で４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、ＰＦＡ）で２０分間固定して、これを共焦点顕微鏡を通じて観察した。
【０１４４】
その結果、図７ないし図９のように本発明のペプチド改良を通じて改良形ＭＴＤの細胞透過能が顕著に改善されたことを可視的に確認した。
【０１４５】
７−２．子宮頸がん細胞で細胞透過能の確認
がん由来細胞では子宮頸がん由来細胞であるＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ  ｃｅｌｌ、Ｈｕｍａｎ  ｃｅｒｖｉｘ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ、Ｃａｔ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２、ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）について、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して細胞等透過能を比較した。
【０１４６】
具体的に、実験の前日、ＨｅＬａ細胞をガラスカバースリップが入っている１２−ウェルプレート（１２−ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）内で２４時間の間、培養する。ＨｅＬａ細胞は１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００ｕｎｉｔｓ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び１０，０００ｕｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ培地で、５％  ＣＯ２の湿潤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）大気の下で、３７℃で培養した。ＨｅＬａ細胞に５ｕＭの濃度でそれぞれのＭＴＤ−ＦＩＴＣを６時間の間、処理した。処理の６時間の後、顕微鏡観察のために細胞を室温で４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、ＰＦＡ）で２０分間固定した。
【０１４７】
内在化された（ｉｎｔｅｒｎａｌｚｅｄ）ＭＴＤ−ＦＩＴＣの直接的な検出のために上記の細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄して、核蛍光染色溶液である５ｕＭ濃度のＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）で対照染色（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）を行った。１０分間のＤＡＰＩ染色の後、上記の細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄してタンパク質の蛍光表示を保存するために２０ｕｌの重畳培地（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）をスライドの上に点滴して観察した。上記のそれぞれのＭＴＤ−ＦＩＴＣが処理された細胞は細胞内の伝達部位を確認した。また、共焦点顕微鏡で観察する時ノマルスキーフィルター（ｎｏｍａｒｓｋｉ  ｆｉｌｔｅｒ）を利用して細胞の原型を観察したし、ＦＩＴＣ蛍光及びＤＡＰＩ蛍光をそれぞれのフルオロクロム（ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）に合うフィルターで観察した。
【０１４８】
その結果、図１０に現したように、実験に使用した従来のＭＴＤペプチド（１８ｍ、６７、１０３、１５９及び１７３）より改良形ＭＴＤが細胞内の伝送能が顕著に優れていることが分かった。また、ペプチドが細胞膜の外に付着されているＰＴＤ（Ｔａｔ）結果とは違って、実験に使用した改良形ＭＴＤ（１０１８ｍ、１０６７、１１０３、１１５９、１１７３Ａ、２１０３、及び２１５９）は明らかに細胞質内に分布されることを確認したし、これを通じて、本発明で新しく考案した改良形ＭＴＤの細胞透過能が顕著に改善されたことをがん細胞でも可視的に確認した。
【０１４９】
実施例８．改良形 ＭＴＤのＥｘ  ｖｉｖｏ皮膚組織透過能の確認
本発明の改良形ＭＴＤのＥｘ  ｖｉｖｏ組織透過能力を解析するために、ＥｐｉＯｒａｌ皮膚モデル（ＭａｔＴｅｋ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＦＩＴＣを接合させた従来のＭＴＤ（１８ｍ、１７３）と改良形ＭＴＤ（１０１８ｍと１１７３Ａ）を選別して処理して、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して可視的に観察した。
【０１５０】
具体的に、実験の前日ＭａｔＴｅｋ社で提供する実験培地が０．５ｍｌ入っている１２−ウェルプレート（１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）でＥｐｉＯｒａｌ皮膚モデルを１５時間の間５％ＣＯ２の湿潤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）大気の下で３７℃で培養した。次の日、新しい培地に交換して、５０ｕＭ濃度のそれぞれのＭＴＤ４０ｕｌをＥｐｉＯｒａｌ皮膚の上側に処理して５時間の間、５％ ＣＯ２の湿潤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）大気の下で、３７℃で培養した。４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、ＰＦＡ）に１５時間以上入れてＥｐｉＯｒａｌ皮膚モデルを固定した後、マイクロム冷凍拍節器（Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ５２０  ｃｒｙｏｓｔａｔ、Ｔｈｅｒｍｏ）を利用して、凍結切片（Ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ）（６ｕｍ）を製造して、これをガラススライドの上に載せて、顕微鏡観察用スライドを製作した。製作されたスライドは１０分間リン酸緩衝液で切片を洗浄して、０．５ｍＭ  ＤＡＰＩ溶液で５分間組織内の細胞核を染色した。染色された組織を再び１０分間３回ずつリン酸緩衝液で洗浄した後、重畳培地（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）を利用してスライドに固定した後、共焦点顕微鏡で観察したし、それの結果を図１１に現した。
【０１５１】
その結果、図１１に現したように、陰性対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）では何らかの有意味な水準の蛍光も観察されていない反面、実験で使用した改良形ＭＴＤの場合、時間が経過することによりＥｐｉＯｒａｌ皮膚モデルの内側に透過が起こしていることを確認した。また、実験に使用した従来のＭＴＤ（１８ｍ、及び１７３）に比べて改良形ＭＴＤ（１０１８ｍ、及び１１７３Ａ）でより効果的に深部組織まで伝達されただけではなく、蛍光の明るさも増加されることを確認した。
【０１５２】
実施例９．改良形ＭＴＤのｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚組織透過能の確認
本発明の改良形ＭＴＤのｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚組織透過能力を解析するために、８週齢のメスＩＣＲ  ｍｏｕｓｅ（オリエントバイオ、韓国）を対象に固体ごと２．５ｃｍＸ２．５ｃｍ大きさの滅菌ゴーズに蛍光表示者（ＦＩＴＣ）が付着された改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）−ＦＩＴＣ、Ｔａｔ−ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ単独をそれぞれ１００ｕｇの濃度の溶液１００ｕｌを点滴してマウスの背中部位にＴｅｇａｒｄｅｒｍ（３Ｍ、ＵＳＡ）を利用して固定した。１，３，６，１２時間の結果後、マウスを頸椎脱臼の方法で犠牲させて、薬物が塗布された部位の皮膚を摘出した。その後、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）に２４時間以上入れて組織を固定した後、６ｕｍの厚さで冷凍切片を得てスライドを製作した。製作されたスライドは１０分の間ＰＢＳ緩衝液で切片を洗浄して０．５ｍ  ＭＤＡＰＩ溶液に５分間露出して組織内の細胞核を染色した。染色された組織を再び１０分間３回ずつＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、重畳培地（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）を利用して固定した後に共焦点顕微鏡で観察したし、これを図１２に現した。
【０１５３】
その結果、図１２に現したように、陰性対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）では蛍光信号が全く検出されていなかったし、ＦＩＴＣ単独及びＴａｔ−ＦＩＴＣ処理群では皮膚最上位層である角質層に蛍光信号が特異的に観察されることを通じて皮膚透過が起こらなかったことを確認した。反面、実験に使用した改良形ＭＴＤであるＭＴＤ１０６７の場合、塗布時間が経過することにより深い組織まで皮膚透過が起こったし、透過されたペプチドは皮膚毛嚢細胞の細胞質にも特異的に存在することを確認した。これて、本発明の改良形ＭＴＤがｉｎ  ｖｉｔｒｏのみならずｉｎ  ｖｉｖｏでも顕著に優れた組織透過能を現すことが確認できた。
【０１５４】
実施例１０．改良形ＭＴＤにａｃｅｔｙｌｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅを連結したペプチド複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞透過能の確認
本発明の改良形MTDの方向性及びｃａｒｇｏの組み合わせによる細胞透過能を比較するために、低分子ペプチドａｃｅｔｙｌｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅを連結したペプチド複合体を合成製造して、これのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞透過能実験を行った。
【０１５５】
具体的に、細胞透過能の確認のためにヒトの皮膚由来悪性黒色腫細胞（Ａ３７５ＳＭ、ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ、ＫＣＬＢ  Ｎｏ．８０００４、ＫＣＬｂ、Ｋｏｒｅａ）を利用したし、低分子ペプチドでＡｃｅｔｙｌ  Ｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＨ，シワ改善及び老化防止機能の６つのアミンさんで構成されたペプチド）を適用したし、改良形ＭＴＤでは配列番号１６のアミノ酸配列を有するＭ１０６７ペプチドと配列番号１７のアミノ酸配列を有するＭ１１０３ペプチドを利用した。
【０１５６】
具体的に、実験前日Ａ３７５ＳＭ細胞をガラスカバースリップが入っている１２−ウェルプレート（１２−ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）内で２４時間の間、培養した。Ａ３７５ＳＭ細胞は１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００ｕｎｉｔｓ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び１０，０００ｕｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＭＥＭ培地で５％ＣＯ２の湿潤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）大気の下で、３７℃で培養した。Ａ３７５ＳＭ細胞で５ｕＭの濃度でＭＴＤが連結されていないＡＨと改良形ＭＴＤが連結されたＭＴＤ−ＡＨを６時間の間処理した。ペプチドの処理の後、試験物質の細胞透過度の観察のために細胞を室温で４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、ＰＦＡ）で２０分間固定した。
【０１５７】
内在化された（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）ＭＴＤ−ＡＨの直接的な検出のために上記の細胞をリン酸緩衝液に３回洗浄して、核蛍光染色溶液である５ｕＭ濃度のＤＡＰＩ（４、６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）で対照染色（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）を行った。１０分間のＤＡＰＩ染色の後、上記の細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄して、細胞膜染色溶液である５ｕｇ／ｍＬ濃度のＣｏｎ  Ａ（Ｃｏｎｃａｎａｃａｌｉｎ  Ａ）で追加の対照染色を行った。１０分間のＣｏｎ  Ａ染色の後、上記の細胞をリン酸緩衝液で３回洗浄して、タンパク質の蛍光表示を保存するために２０ｕＬの重畳培地（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）をスライドの上に点滴して観察した。上記のそれぞれの処理された細胞は細胞内伝達部位の区別が容易になるようにＤＡＰＩとＣｏｎ  Ａ染色を通じて核での伝達予備細胞透過性の可否を確認した。また、共焦点顕微鏡で観察の際に、ノマルスキーフィルター（ｎｏｍａｒｓｋｉ  ｆｉｌｔｅｒ）を利用して細胞の原型を観察したし、ＦＩＴＣ蛍光及びＤＡＰＩ蛍光、Ｃｏｎ  Ａ蛍光をそれぞれのフルオロクロム（ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）に合うフィルターで観察した。その結果、図１３に現したように、改良形ＭＴＤであるＭ１０６７がａｃｅｔｙｌｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅに正方向で連結されたＭ１０６７Ｆ−ＡＨとａｃｅｔｙｌｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅのｃ−ｔｅｒｍに逆方向で連結されたＭ１０６７Ｒ−ＡＨ、また、改良形ＭＴＤであるＭ１１０３のアミノ酸配列がａｃｅｔｙｌｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅで正方向で連結されたＭ１１０３Ｆ−ＡＨとａｃｅｔｙｌｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅのｃ−ｔｅｒｍに逆方向で連結されたＭ１１０３Ｒ−ＡＨがＭＴＤが連結されていないａｃｅｔｙｌｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ対照群に比べて、細胞透過性が顕著に優秀に現れることを確認した。
【０１５８】
これを通じて、本発明で考案された改良形ＭＴＤは生物学的活性分子に付着されるこのにおいて、上記の改良形ＭＴＤのアミノ酸配列が正方向に連結されたり、逆順で配列された形態で付着される場合にも優秀な細胞透過能を現すので、その連結方向により制限されないことが分かった。
【０１５９】
実施例１１．改良形ＭＴＤのｉｎ  ｖｉｖｏ肺組織透過能の確認
１１−１．ｓｉＲＮＡが結合されたＭＴＤの製造
本発明の改良形ＭＴＤのｉｎ  ｖｉｖｏ肺組織透過能力解析のために優先的にｓｉＲＮＡが結合されたＭＴＤを製造した。この際に、ペプチドとｓｉＲＮＡの共有結合はｓｏｌｕｌｉｎｋ社のＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ方法により４ＦＢ−ｓｉＲＮＡとＨｙＮｉｃ−ペプチドを利用して共有結合を行った。
【０１６０】
具体的に、まず、ＤＭＦ溶液にＳ−４ＦＢ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−ｆｏｒｍｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ）を溶解させて、ＬａｃＺ  ｓｉＲＮＡとＬａｃＺ  ｓｉＲＮＡ濃度の２０倍になれるようにＳ−４ＦＢをｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｐＨ６．０）に入れた後、２時間の間室温で反応された。反応混合物に存在する剰余Ｓ−４ＦＢと緩衝液の交換のために脱塩精製（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を行った。
【０１６１】
二つ目、ＤＭＦに６−Ｂｏｃ−Ｈｙｎｉｃ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）とＨＢＴう（Ｏ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍｅ）を溶解させてＤｉＰＥＡ（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）をいれった後、Ｈｙｎｉｃ−ペプチドＲｅｓｉｎから分離するためにＴＦＡ／ＴＩＳ／ａｃｅｔｏｎｅ／Ｈ２Ｏ（９２．５／２．５／２．５／２．５）を使用した。ＨＰＬＣで精製した後、ＭＳ確認を通じてＨｙｎｉｃ−ｐｅｐｔｉｄｅを準備した。
【０１６２】
三つ目、準備された４ＦＢ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＬａｃＺ  ｓｉＲＮＡとこれのｍｏｌａｒ比率の５倍に該当するＨｙｎｉｃ−ペプチドをＴｕｒｂｏＬｉｎｋ  Ｃａｔａｌｙｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＰｈｏｓｐｈａｔｅ、１５ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、１０ｍＭ  ａｎｉｌｉｎｅ、ｐＨ  ６．０）溶液で混合して室温で２時間の間、反応させた。
【０１６３】
最後に、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎを利用して反応物に剰余ペプチドを除去して２％ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロースゲル（ａｒｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ）で確認した後、質量分析器で分子量を確認して、凍結乾燥してｓｉＲＮＡ−ｐｅｐｔｉｄｅ共有結合体を製造した。
【０１６４】
１１−２．改良形ＭＴＤのｉｎ  ｖｉｖｏ肺組織透過能の確認
本発明の改良形ＭＴＤのｉｎ  ｖｉｖｏ組織透過能力の解析のために、ベータガラクトシターゼが持続的に発現されるＢ６  ＲＯＳＡ２６マウスに上記の実施例１０−１の方法で製造された改良形ＭＴＤ２１７３Ａに融合されたＬａｃＺ−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３  ２００ｕｇ／ｈｅａｄを３日間静脈に投与して、二日後にマウスを犠牲させて肺を摘出した。摘出された肺は４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、ＰＦＡ）に１５時間以上入れて固定した後、凍結切片（Ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ）をマイクロム冷凍拍節器（Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ５２０  ｃｒｙｏｓｔａｔ、Ｔｈｅｒｍｏ）を利用して製造して、これをガラススライドの上に載せて顕微鏡観察用スライドを製作した。製作されたスライドは１０分の間、リン酸緩衝液で切片を洗浄して０．５ｍＭ  ＤＡＰＩ溶液で５分間組織内細胞核を染色した。染色された組織を再び１０分間３回ずつリン酸緩衝液で洗浄した後、重畳培地（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）を利用して固定した後、共焦点顕微鏡で観察したし、その結果は図１５に現した。その後、上記のように製作されたスライドをＸ−ｇａｌ染色溶液で夜の間、反応させた後、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）で組織を染色した後、ベータガラクトシターゼ活性を観察したし、その結果は図１６に現した。
【０１６５】
その結果、図１５に示したように、陰性対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）では何らかの有意味な水準の蛍光も観察されていない反面、実験で使用したＭＴＤ−ＬａｃＺ  しＲＮＡ−Ｃｙ４の場合、肺組織の細胞内の透過が起きていることを観察することができた。
【０１６６】
また、図１６に示したように、陰性対照群では大部分の臓器切片の全般にベータガラクトシターゼ活性が観察されたが、ＭＴＤ−ＬａｃＺ  ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３を投与したマウスの臓器切片での場合、ベータガラクトシターゼ活性が殆ど観察されていないことを確認した。
【０１６７】
これを通じて、本発明の改良形ＭＴＤは細胞内伝達が難しいｓｉＲＮＡのような物質または薬物の伝達に使用できるし、これを臓器組織内に効果的に伝達させるのみならず、伝達された物質または薬物が伝達された組織内でその効能を効果的に発揮することが分かる。
【０１６８】
これで本発明で考案された改良形ＭＴＤは従来のＭＴＤより細胞内に透過能のみならずｉｎ  ｖｉｖｏ組織内の透過能も向上されたことを分かった。
【０１６９】
実施例１２．皮膚生理活性が、物質が結合された改良形ＭＴＤの皮膚安定性の評価
１２−１．改良形ＭＴＤ−クマル酸の合成
Ｎ−末端のアミノ酸までカップリングされた上記の実施例４で合成された改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）で２０％ピペリジン／Ｎ−メチルピロリドン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ／Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）溶液を加えてＦｍｏｃ基を除去してＮ−メチルピロリドンとジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）で洗浄した後、商業的に販売されている化合物であるクマル酸（ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）をカップリングさせた。カップリングが終わった後、Ｎ−メチルピロリドンとジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）で数回洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。ここにトリフルオロ酢酸：フェノール：チオアニソール：水：トリイソプロピルシラン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ：ｐｈｅｎｏｌ：ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ：ｗａｔｅｒ：ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ）の９０：２．５：２．５：２．５：２．５（ｖ／ｖ）溶液で２時間ないし３時間反応させてペプチド保護基を除去して、レジンからペプチドが結合されたクマル酸を分離させた後、ディエチルエテルでペプチドを沈澱させた。クマル酸のＣの９番炭素に結合されたアルコール基を保護しているベンジル基を除去するために１０％Ｐｄ／Ｃをメタノールに添加して、水素下で約１時間の間、室温で攪拌した後、シーライトを使用してＰｄ／Ｃを除去して得た濾液を減圧濃縮した。このように得た改良形ＭＴＤ−クマル酸誘導体は０．１％トリフルオロ酢酸が含まれたアセトニトリルを勾配にして精製逆相高速液体クロマトグラフィーカラム（ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｌｕｍｎ、Ｚｏｂａｘ、Ｃ８  ３００Å、２１．１ｍｍＸ２５ｃｍ）を利用して精製することで下記の式２でのように配列番号１６番のアミノ酸配列を有する改良形ＭＴＤにクマル酸が結合された改良形ＭＴＤ−クマル酸誘導体を合成した。
【０１７０】
（式２）
0006001082.tif 000005
【０１７１】
１２−２．改良形ＭＴＤ−アセチルペンタペプチドの合成
Ｎ−末端のアミノ酸までカップリングされた上記の実施例４で合成された配列番号１６番アミノ酸配列を有する改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）に化粧品業界で商業的に使用されたいるペプチドであるアセチルペンタペプチド（ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  Ｌｙｓ  Ｔｈｅｒ  Ｔｈｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ）を順次に合成して、２０％ピペリジン／Ｎ−メチルピロリドン溶液を加えて、Ｆｍｏｃ基を除去してＮ−メチルピロリドンとジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）で数回洗浄した後窒素ガスで乾燥させた。これにトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）：フェノール（ｐｈｅｎｏｌ）：チオアニソール（ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）：水（ｗａｔｅｒ）：トリイソプロピルシラン（ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ）を９０：２．５：２．５：２．５：２．５（ｖ／ｖ）比率を混合した溶液を２ないし３時間反応させてペプチド保護基を除去して、レジンからペプチドを分離させた後、ディエチルエテルでペプチドを沈澱させた。このように得た改良形ＭＴＤ−アセチルペンタペプチド誘導体は０．１％トリフルオロ酢酸が含まれたアセトニトリルを勾配にして精製逆相高速液体クロマトグラフィーカラム（ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｌｕｍｎ、Ｚｏｂａｘ、Ｃ８  ３００Å、２１．１ｍｍＸ２５ｃｍ）を利用して精製することで下記の式３でのように配列番号１６番アミノ酸配列を有する改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）にアセチルペンタペプチドが結合されたアセチルペンタペプチド誘導体を合成した。
【０１７２】
（式３）
0006001082.tif 000006
【０１７３】
１２−３．改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）−クマル酸含有の化粧料組成物の製造
改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）−クマル酸または改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）を含有したエッセンス組成物は上記の表１の組成で以下のように剤形化した。
【０１７４】
水相溶解槽に１−６を入れて７０℃まで加温しながら完全溶解させた後、乳化槽に投入する。油相溶解槽に７−１１を入れて７０℃まで加温しながら完全溶解させた後、乳化槽に入れて混合する。内容物を４０℃まで冷却した後、原料１２, 13, 15を乳化槽に投入した後、混合した後、内容物を室温まで冷却させて改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）を含有する組成物を製造した。
【０１７５】
比較例1：水相溶解槽に１−６を入れて７０℃まで加温しながら完全溶解させた後、乳化槽に投入する。油相溶解槽に７−１１を入れて７０℃まで加温しながら完全溶解させた後、乳化槽に入れて混合する。内容物を４０℃まで冷却した後、原料１２−１４を乳化槽に投入した後、混合した後、内容物を室温まで冷却させて改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）を含有する組成物を製造した。
【０１７６】
比較例２： 水相溶解槽に１−６を入れて７０℃まで加温しながら完全溶解させた後、乳化槽に投入する。油相溶解槽に７−１１と１６を入れて７０℃まで加温しながら完全溶解させた後、乳化槽に入れて混合する。内容物を４０℃まで冷却した後、原料１２, 13を乳化槽に投入した後、混合した後、内容物を室温まで冷却させてクマル酸を含有する組成物を製造した。
【０１７７】
【表１】
0006001082.tif 000007
【０１７８】
１２−４．改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）−アセチルペンタペプチド含有の化粧料組成物の製造
改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）−アセチルペンタペプチドまたは改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）を含有したエッセンス組成物は表２の組成で以下のように剤形化した。
【０１７９】
水相溶解槽に１−５を入れて７０℃まで加温しながら、完全溶解させた後、乳化槽に投入する。 油相溶解槽に６−１０を入れて７０℃まで加温しながら完全溶解させた後、油相溶解槽に入れて混合する。内容物を４０℃まで冷却した後、原料１１、１２、１４を乳化槽に投入した後、混合した後、内容物を室温まで冷却させて改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）−アセチルペンタペプチドを含有する組成物を製造した。
【０１８０】
比較例３：水相溶解槽に１−５を入れて、７０℃まで加温しながら、完全溶解させた後、乳化槽に投入する。油相溶解槽に６−１０を入れて７０℃まで加温しながら完全溶解させた後、乳化槽に入れて混合する。内容物を４０℃まで冷却した後、原料１１−１３を乳化槽に投入した後、混合した後、内容物を室温まで冷却させて改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）を含有する組成物を製造した。
【０１８１】
比較例４：水相溶解槽に１−５を入れて７０℃まで加温しながら完全溶解させた後、乳化槽に投入する。油相溶解槽に６−１０を入れて７０℃まで加温しながら完全溶解させた後、乳化槽に入れて混合する。内容物を４０℃まで冷却した後、原料１１、１２、１５を乳化槽に投入した後、混合した後、内容物を室温まで冷却させてアセチルペンタペプチドを含有する組成物を製造した。
【０１８２】
【表２】
0006001082.tif 000008
【０１８３】
１２−５．改良形ＭＴＤと皮膚生理活性物質が結合された複合体の皮膚安定性の評価
上記の実施例４で合成された改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）、実施例１２−１と実施例１２−２で合成された改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）−クマル酸と改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）−アセチルペンタペプチドの安定性を確認するためにヒト皮膚を利用した一次刺激試験を行った。専門臨床試験機関である（株式会社）ＤＥＲＭＡＰＲＯに依頼して行ったし、臨床用組成物は下記に記載されているように準備した。
【０１８４】
臨床試験選定基準に付合して除外基準に該当されない被験者３０名以上を選定した。被験者を対象に背中の部位に資料物質を塗布した後、４８時間後に除去した。除去した後、３０分、２４時間後に試験部位を観察した。皮膚評価はＦｒｏｓｃｈ＆Ｋｌｉｇｍａｎ法（Ｆｒｏｓｃｈ  Ｐ．Ｊ  ａｎｄ  Ｋｌｉｇｍａｎ  Ａ．Ｍ．Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、１（１）：３５−４１（１９７９））とＴｈｅ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ、Ｔｏｉｌｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｇｒａｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．２０００５（１９８１））を反映した表３の基準で評価したし、４８時間及び７２時間の平均反応度を比較したし、各組成物に対する平均反応度を基準にしてその結果を判定した。
【０１８５】
【表３】
0006001082.tif 000009
【０１８６】
【表４】
0006001082.tif 000010
【０１８７】
上記の表４に示したように改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）、改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）−クマル酸及び改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）−アセチルペンタペプチドはヒト皮膚一次刺激側面で低刺激カテゴリー内の物質となった。これで、専門試験機関の臨床試験を通じて改良形ＭＴＤ（Ｍ１０６７）がヒトに対して安全に利用できることを立証した。
【０１８８】
それにのみならず、本発明で考案された改良形ＭＴＤは従来のＭＴＤより細胞内透過能及びｉｎ  ｖｉｖｏ組織内の透過能も向上されたことを前述した実施例を通じて分かることができた。また、ヒトにおいても安全なことが立証されたので、本発明の改良形ＭＴＤは多様な研究分野だけでなく、効率的な薬物伝達が要求される特定疾患患者の治療のためにも効果的に利用できるので、新薬開発及び改良新薬の開発に非常に有用に使用できる。
【０１８９】
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は本発明の技術的な思想や必須的な特徴を変形しなくて、別の具体的な形態で容易に変形ができることを理解できるだろう。従って、以上に記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないことと理解されるべきである。
【配列表フリーテキスト】
【０１９０】
<110>    PROCELL THERAPEUTICS INC.
<120>    Development of the macromolecule transduction domain with
improved cell permeability and its applications
<130>    PCT01613
*316
<150>    US 61/563,110
<151>    2011-11-23
<160>    56
<170>    KopatentIn 2.0
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<213>    Artificial Sequence
<220>
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Ala Ala Leu Ile Gly Ala Val Leu Ala Pro Val Val Ala Val
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Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala
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Leu Ala Leu Pro Val Leu Leu Leu Ala
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Ile Ala Ile Ala Ala Ile Pro Ala Ile Leu Ala Leu
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*372<210>    5
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Ala Val Ile Pro Ile Leu Ala Val Pro
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Pro Ala Ala Leu Ala Ala Leu Pro Val Ala Val Val Ala Val
1               5                  10                
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Pro Ala Val Ile Pro Ile Leu Ala Val
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gcggcggcgc cggcggtggc ggcg                                                24
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<223>    MTD 1067 Amino Acid Sequence
<400>    16
Met Arg Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala
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1               5                  10                
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1               5                  10    
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Met Arg Pro Ala Ala Leu Ala Ala Leu Pro Val Ala Val Val Ala Val
1               5                  10                  15 
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1               5                  10                  15 
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Met His Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala
1               5                  10
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Met His Leu Ala Leu Pro Val Leu Leu Leu Ala
1               5                  10    
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Met His Ile Ala Ile Ala Ala Ile Pro Ala Ile Leu Ala Leu
1               5                  10                
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Met His Pro Ala Val Ile Pro Ile Leu Ala Val
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<223>    MTD 3067 Amino Acid Sequence
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Met Lys Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala
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<210>    31
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<211>    48
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    MTD 2018m polynucleotide Sequence
<400>    48
atgcacccgg cggcgctggc ggcgctgccg gtggcggtgg tggcggtg 48
<210>    49
<211>    33
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    MTD 2173A polynucleotide Sequence
<400>    49
atgcacccgg cggtgattcc gattctggcg gtg  33
<210>    50
<211>    48
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    MTD 3018 polynucleotide sequence
*899<400>    50
atgaaggcgg cgctgattgg cgcggtgctg gcgccggtgg tggcggtg  48
<210>    51
<211>    30
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    MTD 3067 polynucleotide Sequence
*910<400>    51
atgaaggcgg cggcgccggc ggtggcggcg  30
<210>    52
<211>    33
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    MTD 3103 polynucleotide Sequence
*921<400>    52
atgaagctgg cgctgccggt gctgctgctg gcg  33
<210>    53
<211>    42
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    MTD 3159 polynucleotide Sequence
*932<400>    53
atgaagattg cgattgcggc gattccggcg attctggcgc tg 42
<210>    54
<211>    33
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    MTD 3173 polynucleotide Sequence
*943<400>    54
atgaaggcgg tgattccgat tctggcggtg ccg  33
<210>    55
<211>    48
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    MTD 3018m polynucleotide Sequence
<400>    55
atgaagccgg cggcgctggc ggcgctgccg gtggcggtgg tggcggtg 48
<210>    56
<211>    33
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    MTD 3173A polynucleotide Sequence
<400>    56
atgaagccgg cggtgattcc gattctggcg gtg  33
【図１】
0006001082.tif 000012
【図２】
0006001082.tif 000013
【図３】
0006001082.tif 000014
【図４】
0006001082.tif 000015
【図５】
0006001082.tif 000016
【図６】
0006001082.tif 000017
【図７】
0006001082.tif 000018
【図８】
0006001082.tif 000019
【図９】
0006001082.tif 000020
【図１０】
0006001082.tif 000021
【図１１】
0006001082.tif 000022
【図１２】
0006001082.tif 000023
【図１３】
0006001082.tif 000024
【図１４】
0006001082.tif 000025
【図１５】
0006001082.tif 000026
【図１６】
0006001082.tif 000027
【配列表】
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