(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲルグルカン生成物を製造する方法であって、以下のステップ：
ａ）可溶性グルカン分子の水溶液を１２０℃〜１３０℃の温度に加熱し、１０〜３０分間、その温度で溶液を保持し；
ｂ）３５℃〜５０℃の温度に８０分未満の間にわたってグルカン溶液を冷却すること、を含み、
ステップ（ａ）において、前記グルカンは酵母に由来し、１．５％〜６％の濃度の水溶液で存在し、前記グルカンは、凝集体基準で水溶液中に４〜２０×１０５ｇ／ｍｏｌの重量平均モル質量、及び単一鎖基準で１５，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均モル質量を有する、製造方法。
【請求項２】
前記グルカンが、単一鎖基準で２０，０００〜４０，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均モル質量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グルカンが、単一鎖基準で２５，０００〜３０，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均モル質量を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記グルカンが、２〜４％の濃度の水溶液で存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記グルカンが、２％の濃度の水溶液で存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記グルカンが、サッカロミュケス・ケレウィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記グルカンが、β−（１，３）連結グルコシル残基の骨格、及び２個以上のβ−（１，３）連結グルコシル残基を含む側鎖を含むベータグルカンであり、側鎖がβ−（１，６）連結経由で骨格に結合している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記グルカンが、繰り返しのβ−（１，６）連結グルコシル残基を本質的に含まない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）において、グルカン分子の水溶液が１２０℃〜１２５℃の温度に加熱される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップａ）において、グルカンが１２０℃〜１２５℃または１２０℃〜１３０℃の温度で２０分間保持される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記グルカンが５０〜６０分間にわたって冷却される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
β−（１，６）結合グルコシル側鎖を除去し微粒子グルカンを可溶性化するために、微粒子グルカン出発物質をギ酸に懸濁する、加ギ酸分解のステップが先に実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
加ギ酸分解された生成物が０．２μのメッシュで濾過される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によって入手可能なゲルグルカン生成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載のゲルグルカン生成物、および１種または複数の薬学的に許容される希釈剤または担体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
創傷または潰瘍の治癒を支援するまたは口腔の粘膜炎または癌を治療する必要のある対象の創傷または潰瘍の治癒を支援するまたは口腔の粘膜炎または癌を治療するめの、請求項１４に記載のゲルグルカン生成物を含む医薬組成物であって、該対象に投与される、医薬組成物。
【請求項１７】
対象に局所的に適用される、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記潰瘍が糖尿病性潰瘍である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
創傷または潰瘍の治癒を支援するまたは口腔の粘膜炎または癌を治療する必要のある対象の創傷または潰瘍の治癒を支援するまたは口腔の粘膜炎または癌を治療するための医薬を製造するための、請求項１４に記載のゲルグルカン生成物の使用。
【請求項２０】
前記潰瘍が糖尿病性潰瘍である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
請求項１４に記載のゲルグルカン生成物が適用または含浸されている、物理的支持体。
【請求項２２】
織布、不織布、編み物、発泡体または接着性の基材；貼付剤、包帯、膏薬、絆創膏、フィルムまたはガーゼからなる群から選択される、請求項２１に記載の物理的支持体。
【請求項２３】
請求項１４に記載のゲルグルカン生成物に皮膚細胞の集団を接触させることを含む、皮膚細胞増殖のインビトロの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療機器に組み込まれる医薬品、栄養補助食品、化粧用生成物などとしての新規のグルカン生成物、その製造のための方法、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルカンは、とりわけ、植物、細菌、真菌類および原生動物の細胞壁に見られるグルコースポリマーの不均質な一群である。グルカンは、主鎖、およびいくつかの事例において側鎖を有し、側鎖は、グルカンの起源に応じて、β（１，３）、β（１，４）および／またはβ（１，６）−連結グルコシル単位を含む。起源および単離方法に応じて、ベータグルカンは、骨格および側鎖において様々な分枝度および連結の型を有している。側鎖中の連結の頻度および型は、分子の生物学的活性に非常に重要である。グルカンはまた、鎖の凝集に対する傾向のみならず、分子量が非常に異なり、これらは共に、これらの分子の効能プロファイルに関する基本的な特色である。菌類および酵母起源のほとんどのベータグルカンは、本来の状態では水に不溶性であるが、酸による加水分解によって、または例えば−ホスファート、−スルファート、−アミン、−カルボキシメチルなどの外来の基を分子に導入する誘導体化によって可溶性にすることができる。
【０００３】
欧州、アジアおよび米国において、特にパン酵母からのベータグルカンは、動物用の飼料添加剤として、化粧品に、ヒト用の栄養補助食品として、例えば、創傷の治療における免疫調節薬として、および皮膚クリーム製剤中の活性成分として長く用いられてきた。グルカンは、国際公開第０２／０５８７１１号に示されているように癌の治療に用いられている。ベータグルカンは、この文脈において、一部は、癌に局所化された、うまく調節され部位限定された炎症反応を誘発することによって、白血球の活性を増やす免疫賦活剤と見なされている。炎症性腸疾患の治療におけるそれらの使用はまた、国際公開第２００９／０６３２２１号に記載されている。創傷治療のうちグルカンのさらなる適用は、欧州特許第８１５１４４号および米国特許第６８７５７５４号に、また、米国特許仮出願第１２／５２８，２１５号に記載されているような喘息およびアレルギーの治療に関しても記載されている。
【０００４】
穀物グルカンは、一般にβ（１，３）の非分枝鎖および著しい占有率のβ（１，４）連結を含むが、一方で、酵母グルカンは、β（１，３）連結グルコシル残基から主に構成され、β（１，３）およびβ（１，６）連結グルコシル残基の両方を含み得る側鎖に対する分岐点として働くβ（１，６）連結を含む。グルカンとして分類されるその他の分子はカードランを含み、これは、分岐のないβ（１，３）連結グルコシル残基で構成される基本的に線状分子である。レンチナンは、β（１，３）連結骨格を有するグルカンであるが、本質的に規則的に骨格に結合した単一β（１，６）連結グルコシル残基を組み込んでおり、この分子に櫛構造を与えている。単一β（１，６）連結グルコシル残基はβ（１，３，６）連結点と同等の骨格に結合しているが、それ以上の分子はこの連結点に結合しておらず、したがって、レンチナンのようなグルカンは側鎖を有していない。この群のグルカンの他の例は、スクレログルカン、ラミナリンおよびシゾフィランである。
【０００５】
分岐および側鎖の長さおよび構造における変異は、対照をなす、二次および三次構造、したがって生物学的活性をもたらす。グルカンのより高次の秩序構造は相当に変動し、分子量、溶解性および粒子の大きさはすべて、一般に予測不能なように活性に影響を及ぼす。いくつかの生成物は、標的細胞中の炎症性サイトカインの極めて強力な誘発因子であるが、その他は反対の作用を有し、完全にサイトカイン放出を阻害する。多くの不溶性ベータグルカン生成物に対して典型的なのは、全般の炎症応答の誘発であり、例えば、不溶性ベータグルカン製剤の注射は、肉芽腫形成、関節炎誘発およびグラム陰性菌敗血に対する感受性の増加に関連している。他の側面で、可溶性ベータグルカンは、そのような負の副作用で妨害されると報告されていないが、免疫賦活剤としての効能は実質的に変動することが知られている。
【０００６】
国際公開第９５／３００２２で、例えば、（１，６）連結側鎖を選択的に除去するグルカナーゼ処理によって変性した酵母由来のグルカン生成物が、魚類の免疫系の刺激において無傷の（１，６）連結側鎖を有する生成物より強力であることが示された。
【発明の概要】
【０００７】
グルカンは治療剤およびアジュバントとして高い潜在能力を有するが、広い範囲の構造的ばらつき、そのような大きく複雑な分子を含む分析の問題、これらの分子に関する作用機序および受容体についての理解の不足は、改善されたグルカン生成物、および均質な生成物の製造のための制御可能、かつ反復可能な方法に対する大きい必要性がなお存在することを意味する。本発明はこれらの問題に取り組む。本発明は、最終生成物中の薬学的に有益な三次構造を確立するためにグルカンの一次および二次分子構造を操作することにより、グルカン効能を強化する。
【０００８】
ベータグルカンは、幾つかの病原性（微小）生命体、特に真菌類の表面で見出されるような、いわゆる病原体関連分子パターンであることが知られている。より高等な生命体は、それにより、この種類の生命体に属する侵入者を発見し破壊するために、これらの型の構造を認識するメカニズムを進化させた。哺乳動物において、いわゆる生得の免疫細胞は、ベータグルカンを認識する特定の受容体を発現し、最も顕著な受容体の１つはデクチン−１と呼ばれるが、しかし、他の受容体もベータグルカンによって誘発される認識またはシグナル伝達に関与し、これらの中には、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（ＣＲ３）、ならびにＴｏｌｌ受容体２および４（ＴＬＲ２およびＴＬＲ４）がある。ベータグルカンの認識に関与する細胞のうち、生得の免疫系の典型的な食細胞、すなわち単球、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球があるのみならず、ナチュラルキラー細胞、ならびに、幾つかの内皮細胞、および他の、より組織特定の細胞も、ベータグルカン受容体を発現する能力を有している。
【０００９】
標的細胞中で生体応答を誘発する決定的なステップは、受容体への最初の結合であり、さらに、十分なシグナル伝達を細胞中に誘発するためのベータグルカン製剤が十分な数の受容体と架橋する能力と思われる。本発明は、特定の型の生物学的活性を誘発する受容体を交差結合する能力を有する生成物および生成物を製造する方法を記載する。これは、幾つかの受容体を交差結合することによって大量の応答を誘発し、次に細菌が食菌し、不溶性の（「または結晶様」）グルカンの性質によってＮＬＲＰインフラマソーム活性化を誘発する細胞内のリソソームの破壊をもたらし得る不溶性生成物と対照的である。不溶性ベータグルカンはまた、不利な炎症反応をもたらすインフラマソーム活性化の引き金も引くＲＯＳ（活性酸素種）を誘発し得る。本発明は、いくつかの免疫メカニズムを活性化する著しい炎症応答を誘発することができるが、幾つかの（凝集した不溶性の）ベータグルカン生成物に関して典型的なインフラマソーム活性化の引き金を引かないベータグルカン生成物を記載する。
【００１０】
本発明は、最終生成物中に薬学的に有益な超分子構造を確立することにより、グルカン効能を強化する。
【００１１】
β−グルカン中のより高次の秩序構造の重要性および個々のグルカンのストランドまたは鎖およびグルカン生成物の全体的な活性に対するより高次の秩序構造の両方の特性の寄与が、Ｓｌｅｔｍｏｅｎ  ｅｔ  ａｌによって．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｖｏｌ．  ８９，  Ｎｏ．  ４  ｐｐ  ３１０−３２１，  ２００８に記載されている。より高次の秩序構造は、三重螺旋またはより緩い凝集などの規則的な構成を含み得る。
【００１２】
本発明は、標的細胞が遭遇した場合、中程度の大きさの存在として知覚され、食菌された場合、グルカンは、リソソームの破壊を誘発せずに食作用胞へ容易に取り込まれるグルカン製剤を与える。したがって本発明は、良好なゲル化特性を有する非常に強力な可溶性ベータグルカンの新規の組織を記載する。理論に拘束されることを望むわけではないが、グルカン分子は、グルカン骨格構造に沿った頻繁な−ＯＨ基の間の比較的弱い水素結合によって束ねられた、一種のより高度に複雑で緩い「干し草の山」の構成に配置されていると思われる。「干し草の山」組織は、標的細胞上の特定のグルカン受容体による認識に利用可能なその表面の幾つかの部位を提示する潜在能力を有している。しかしながら、「干し草の山」に組織化された分子は、不溶性生成物の剛性を保持しないが、はるかに簡単に「分解される」ようになり、それにより、その部位で、または食作用後に「固定化される。」そのような大きなより高度の秩序組織は、不溶性のおよび既知の可溶性の生成物のいずれと比較しても有利である。その理由は、それが、不溶性ベータグルカンに関連すると知られているそれほど制御可能でなく起こり得る有害な影響を誘発することなく、微粒子および不溶性ベータグルカンで観察される影響の多くを模倣する免疫調節応答を与えるからである。
【００１３】
一態様において、本発明は、１５，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌの単一鎖基準の重量平均モル質量、および水溶液中で４〜２０×１０５ｇ／ｍｏｌの凝集体基準の重量平均モル質量を有するグルカンであって、濃度≧１％で２５℃および中性のｐＨで水に溶解された場合、ゲル形態で存在し、２％の濃度で水に溶解された場合、３０〜４４℃の間、好ましくは約３３℃の（ゲルからゾルへの）融解温度を有する、グルカンを提供する。重量平均モル質量値は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩ分析によって好都合に求めることができる。
【００１４】
好ましくは、グルカンは、１．５〜６％、より好ましくは１．５〜５％、なお好ましくは２〜４％、最も好ましくは約２％の濃度の水溶液である。「ゲル」形態は水溶液と考えることができると理解されている。
【００１５】
好ましい態様において、グルカンは、ベータグルカンであり、好ましくはβ（１，３）連結グルコシル残基の骨格、およびβ（１，６）連結を介してそれに結合した、β（１，３）連結グルコシル残基の側鎖（例えば、少なくとも２、５、１０または２０個の連結グルコシル残基の側鎖）を有する。
【００１６】
本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例および図においてさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｄｎ／ｄｃ＝０．１２を仮定して０．５％ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃ中で分析された、＜２％の繰返しのβ（１，６）連結グルコシル単位を含む分枝β（１，３）グルカンの幾つかのバッチのＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩクロマトグラムを示す図である。分子量分布が、単一鎖レベルで約１０，０００ｇ／ｍｏｌから約２００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲にあることがわかる。
【図２】ｄｎ／ｄｃ＝０．１５を仮定して水性緩衝剤（０．１Ｍ  ＮａＮＯ３）中で分析されたグルカン生成物の幾つかのバッチのＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩクロマトグラムを示す図である。分子量分布が、約１０，０００ｇ／ｍｏｌから１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌ超の範囲にあることがわかる。水性ＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩの結果は、ＤＭＡｃ／ＬｉＣｌ中の結果と組み合わせると、グルカンが水溶液中で凝集体として存在することを示す。
【図３】本発明によるグルカンゲルに関して温度に対してプロットされた貯蔵弾性率、Ｇ’（Ｐａ）を示す図である。データは、Ｓｔｒｅｓｓｔｅｃｈ  ＨＲレオメーターおよび以下の温度スキャンを使用して、小歪み振動測定によって得られた：１／３℃／ｍｉｎの速度で７０〜１０℃に、１０℃で２時間維持し、次いで１／３℃／ｍｉｎの速度で１０〜７０℃に。このゲルの（ゲルからゾルへの）融解温度は、昇温曲線が平坦化するところに（Ｇ’≒０Ｐａ）に基いて約３３℃に求められる。
【図４】アップダウン速度傾斜法を使用する、本発明による２％のグルカンゲルの粘度測定を示す図である。データは３０℃で得られ、最初の測定前に２ｒｐｍで３分の平衡時間、およびその後の各連続した速度での測定の前に３０秒の平衡を用いた。算定された１０ｒｐｍの粘度は、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．のＲｈｅｏｃａｌｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅのＩＰＣペーストモデルから１７７２ｃＰであった。
【図５】本発明のグルカンゲル、カードラン＊ｃｕｒｄｕｌａｎまたはＬＰＳの２００μｇ／ｍｌの存在下で培養された末梢血単球に由来するヒト骨髄性樹状細胞からのＴＮＦ−αの放出を記載する図である。サイトカインは、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して刺激２４時間後の培地上澄中で測定した。
【図６】本発明のグルカンゲル、カードランまたはＬＰＳの２００μｇ／ｍｌの存在下で培養された末梢血単球に由来するヒト骨髄性樹状細胞からのＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）の放出を説明する図である。ケモカインは、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、刺激２４時間後の培地上澄中で測定した。
【図７】ＬＰＳおよび本発明のグルカンゲルによってインビトロで共刺激されたｄｂ／ｄｂマウスから収穫されたマクロファージからのＣＸＣＬ−１０の分泌を示す図である。レーン１；ＬＰＳ単独、レーン２；本発明のグルカンゲルのＬＰＳ＋２０μｇ／ｍｌ、レーン３；本発明のグルカンゲルのＬＰＳ＋２μｇ／ｍｌ。＊  ｐ＜０．０５．＊  ｐ＜０．０１
【図８】公知の効能プロファイルを有する成長因子カクテルと比較した、本発明によるグルカンゲルを使用する、水溶液中の２％および４％の濃度での創傷治癒治験の結果を示す図である。包帯＋水はビヒクル対照として使用した。ＧＦカクテルほど有効でないが、２％および４％の濃度は共に有効であり、４％はより有効である。
【図９】ベータグルカンの種々の貼付剤による補体の活性化を示す図である。ヒト血清中の液相終末補体複合体の蓄積を測定した。２４１−７、２３１−０、４１１−８、３９１−８は、本発明のグルカンを表すゲル形態のベータグルカンである。ＶＬＭＳＧは、ゲル形態でない可溶性ベータグルカンの非補体活性化製剤を表す。水平の点線は、ヒト血清中で自発的な補体活性化を表す。
【図１０】デクチン−１過剰発現ＲＡＷ細胞系変種からのＴＮＦαの分泌を示す図である。１６１１９４、３０３９５、ｘｘ０９９５および５１１９６は、透明な非ゲル化変種であるが、可溶性酵母ベータグルカン４２１−４は、本発明のグルカンを表す。
【図１１】実施例１で記載されている加熱および急冷（ＨＣ）にかけた可溶性グルカン（ＳＧ）のデクチン−１過剰発現ＲＡＷ細胞株における生物学的作用を示す図である。ＧＣ０６５  ｒｎ  ９２７０は、表１に記載されているように、壊れたゲルを含む可溶性グルカン生成物である。実施例１による処理は、壊れた生成物の生物学的作用を救う。
【図１２】実施例１で記載されている加熱および急冷（ＨＣ）にかけた可溶性グルカン（ＳＧ）のデクチン−１過剰発現ＲＡＷ細胞株における生物学的作用を示す図である。４２１−４は、表１の軟質ゲルとして記載されている生成物に対応するＳＧ生成物である。実施例１による治療は、ＳＧバッチ４２１−４の生物学的作用を増強する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
「中性のｐＨ」とはｐＨ７を意味する。
【００１９】
「単一鎖」は、個々のグルカン分子、すなわちグリコシル残基が共有結合で連結されたものを指す。「凝集体」は、水素結合相互作用によって形成され、超分子またはより高次の秩序構造を規定する。そのような会合は共有結合によって得られるほど永続的ではないが、本明細書に記載される方法は、認識し得るパターンの凝集をもたらし、その平均モル質量は本明細書に言及される技法を使用して分析することができる。「水溶液」は通常ｐＨ７である。
【００２０】
代替として眺めれば、本発明は、１〜６％の濃度の水溶液のグルカンを含むゲルグルカン生成物であって、グルカンが４〜２０×１０５ｇ／ｍｏｌの凝集体基準の重量平均モル質量および１５，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌの単一鎖基準の重量平均モル質量を有し、ゲルグルカン生成物が、３０〜４４℃の間、好ましくは約３３℃の（ゲルからゾルへの）融解温度を有する、ゲルグルカン生成物を提供する。
【００２１】
言及したように、ゲルグルカン生成物は、グルカンが２％の濃度で水に溶解された場合、３０〜４４℃の間、好ましくは約３３℃の（ゲルからゾルへの）融解温度を有している。より高い融解温度が、追加の薬剤、例えばゲル化剤の生成物への包含によって、および／またはグルカンのより高濃度の使用によって達成し得ることは理解されよう。
【００２２】
グルカン生成物は、通常微粒子、半可溶性であり、またはいくつかの事例において水溶液に完全に可溶性であり、後者は、例えば、米国特許第５，３２２，８４１号に記載されたような液状の透明溶液を与えるか、またはあるものはＳｔｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （Ｐｒｏｇ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７７，  １９８８）に記載されているような粘稠溶液を与える。可溶性ベータグルカンの真のゲル形態は、特に可溶性酵母グルカンとしては普通でないが、本ゲル生成物は、他のグルカン生成物と比較して、優れた生物学的活性を、特に創傷治癒において提供することが見出された。創傷治癒において、創傷の湿度化を確保するように医薬品または医療機器を適用することが最も重要であり、生成物は、感染を回避するために創面を覆い粘着し、医師によって適切と、または創傷の型により必要と見なされる投与プロファイルを提供しなければならない。通常、微粒子、半可溶性または液状形態のグルカンは、有効ではないか、創傷治癒目的に適用できない状態であるといういずれか、またはその両方の理由で、これらの基本的要件を満たさない。本発明のグルカンは、それにより純粋なグルカンゲルが適当な使用を見出し得るすべての用途のために有用にするこれらの必要な特性を組み合わせている。厳密に局所用の適用に加えて、他の可能な使用は、癌治療に加えて胃腸管または口腔の疾患を治療する経口および／または粘膜の投与であってもよい。本発明によるグルカンの優れた接着性によって粘膜壁を作用点で覆うことができ、それにより治癒過程を加速する。したがって、本発明のグルカンは、口腔の粘膜炎および粘膜に影響を与える他の徴候の治療において特に有用性を有している。
【００２３】
本発明によれば、ラジカルの加熱および冷却工程が、好ましい三次元複合体および連続的グルカン構造を確立および「凍結」するために実施される。この加熱および急冷は、本明細書において例示されるような優れた治癒プロファイルを示す、グルカン鎖の非常に有益な三次元構造を有するゲル網目を構築する。ベータグルカンの三次の、または三次元の構造、この場合、全体としてグルカンゲル内の分子鎖の構成は、効能にとって最も重要に思われる。理論に拘束される制約を設けるわけではないが、生物学上有効な分子構造のみが、標的細胞で異なる受容体に結合することを可能にするように思われる。好適な三次元の複雑な方式で構築されていない単一鎖、短鎖または生成物は、同じ方法で身体免疫系を刺激することはできない。
【００２４】
単一鎖が含むゲルの三次元の（三次または超分子の構造としても定義される）分子構造を特性評価する方法は限定されている。そのようなゲルを記載する一般方法は、単一鎖の平均モル質量およびモル質量分布、ならびに粘性などの物理的特性によることができる。免疫調節生成物の場合には、ゲルはまた、それらの生物学的な効能プロファイルによって間接的に記載することができ、または、言いかえれば、いわゆる「生物学的な指紋」を測定する。規定する物理的特性として分子量を使用する場合、生物学上有効な三次元三次構造を与えるために必要なこれらの単一鎖の間の分子相互作用の詳細な絵を与えるのではなく、ゲル生成物、またはより小さい凝集構造の単一鎖成分の分析をもたらす分析法が一般に破壊的であることは認識されている。それにもかかわらず、生物学的な効能プロファイルと組み合わせたそれらの粘性を含むグルカンの他のいくつかの物理的特性の詳細な分析によって、熟練者は、様々な異なるグルカンを識別することができる。これらの判定基準の一つは特定の分子量範囲である。グルカンのモル質量は異なる方法で求めることができる。可溶性グルカン生成物の場合には、モル質量がＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩ分析によって好都合に測定され、そのような分析は試料の重量平均モル質量値（ＭＷ）、ならびに試料内の異なる分子量の分布を提供する。本発明において、重量平均分子量（ＭＷ）は以下のように定義される：
【００２５】
【数１】
0005932824.tif 000002
【００２６】
式中、ｎｉは、モル質量Ｍｉを有する分子数である。モル質量Ｍｉを有する分子の重量濃度ｃｉは、モル質量Ｍｉおよび分子数ｎｉに比例する。
【００２７】
【数２】
0005932824.tif 000003
【００２８】
クロマトグラムにおいて各切片の重量濃度は、ＲＩ検出器によって求められるが、一方、各切片のモル質量は、ＲＩ検出器と組み合わせたＭＡＬＳ検出器によって測定される。その計算は光散乱理論に基く。
【００２９】
具体的には、本発明による平均モル質量（単一鎖の）は、この溶媒中でグルカンに対して０．１２のｄｎ／ｄｃを仮定して、０．５％ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃ（０．５％の塩化リチウムを含むジメチルアセトアミド）中でＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩによって求められる。ＤＭＡｃ／ＬｉＣｌ溶媒は、前記グルカンを単一鎖へ完全に溶解する。それに続く溶離液としての０．５％ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃでのＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩ分析は、したがって単一鎖レベルでの分子量分布の尺度を与える。手短に言えば、ＤＭＡｃ／ＬｉＣｌ中のグルカンの分析は、３×ＰＬｇｅｌ  Ｍｉｘｅｄ−Ａ  ＬＳカラムおよび溶離液としての０．５％ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃを使用するＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩによる分析前に、約３ｍｇ／ｍｌの濃度で室温で終夜溶液を撹拌し、１００℃で１時間それを加熱することによる乾燥したグルカンの溶媒への溶解を必要とする。この方法によって求められる単一鎖基準の本発明のグルカンの重量平均モル質量は、１５，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは２５，０００〜４５，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは３０，０００〜４０，０００ｇ／ｍｏｌである。
【００３０】
水溶液中で、主としてより高次の秩序構造および存在する凝集体の重量平均モル質量は、４〜２０×１０５ｇ／ｍｏｌ、好ましくは５〜１５×１０５ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは６〜１２×１０５ｇ／ｍｏｌである。これらの平均は、非常に大きな凝集体、すなわち、１．０×１０７ｇ／ｍｏｌを超えるモル質量が除外される場合に計算される。水溶液中でのグルカンの分析は、０．０２％のＮａＮ３を含む０．１Ｍ  ＮａＮＯ３中で約３ｍｇ／ｍｌにゲル溶液を希釈すること、ふたをしたガラス管中で３０分間１００℃に加熱すること、室温に冷却すること、０．２μｍ注射器フィルターで濾過すること、および、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ５０００  ＰＷＸＬ＋ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ４０００  ＰＷＸＬ  カラムおよび溶離液として０．０２％ＮａＮ３を含む０．１Ｍ  ＮａＮＯ３を使用するＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩによる分析を伴う。溶媒／溶離液として、例えば０．０５Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４／０．０１  Ｍ  ＥＤＴＡを含む類似の設定は同等の結果を与える。水溶液中の、単一鎖に対するモル質量値およびより高次の秩序構造／凝集体の組み合わせは、ゲルの分子および三次構造の良好な指標を全体として与え、本発明のグルカンを有用に定義する。
【００３１】
本発明のグルカンは、１％の最小濃度を含む水溶液中で２５℃で、３〜８の間のｐＨでゲル形態であることをさらに特徴とする。本発明のグルカンゲルは、３０〜４４℃、好ましくは正常体温を超える、より好ましくは３９〜４４℃の間のゲルの（ゲルからゾルへの）融解温度によって例示される粘性プロファイルをさらに特徴とする。
【００３２】
グルカン生成物のゲル融点、すなわち、ゲル→ゾル転移温度は、好都合には、Ｓｔｒｅｓｓｔｅｃｈ  ＨＲレオメーターまたは類似機を使用し、グルカン溶液の冷却（７０→１０℃）および加熱（１０→７０℃）の間の粘弾性の変化を調べる小歪み振動の測定によって求められる。そのような実験において温度に対してプロットされた貯蔵弾性率（Ｇ’）の例は、図３に示される。この特定の試料のための融解温度は、温度の上昇に対して貯蔵弾性率の曲線が（約０Ｐａで）平坦になるところと等価であり、これは約３３℃である。ゲルのおよその融解温度を求める別の方法は、粘性が本質的になくなり、ゲルが溶液へ転換するまで、ゲルの粘性（例えば、回転粘度計を使用して）を連続してより高温で測定することである。局所適用のための安定したグルカンゲルを保証するために、融解温度は好ましくは約３０〜４４℃であり、好ましくは体温を超える。局所投与は、経口投与または感染部位への投与と比較して低い融解温度を要求する。
【００３３】
本発明のグルカンゲルは水性ゲルであり、目視検査によってゲル形態を確証することができるが、グルカンゲルの非ニュートン粘性プロファイルならびに擬塑性およびチキソトロピーの性質はまた、粘度測定によって、例えば、回転粘度計の使用によって求めることができる。本発明による２％のグルカンゲルは、少なくとも１０００ｃＰ、好ましくは少なくとも１５００ｃＰの粘性を有し、これは、小さい試料アダプターおよびスピンドルＳＣ４−３１（３．４０ｓｅｃ−１の剪断速度に対応する）を有するＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＤＶ−ＩＩ＋Ｐｒｏ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ粘度計を使用して、２５℃および１０ｒｐｍの回転速度で測定される。この擬塑性およびチキソトロピーのゲルの粘性を測定する好都合な方法は、例えば２ｒｐｍで開始し２ｒｐｍの増分で１０ｒｐｍまで上げ、次いで、２ｒｐｍステップで下げ戻す、いわゆるアップダウン速度傾斜を使用することである。そのような実験からのデータは、ゲルの擬塑性（剪断速度の増加につれて粘性が減少する）およびチキソトロピー（剪断を施すと経時的に粘性が低下する）の特性を示し、しかも例えば１０ｒｐｍの粘性の測定を提供することができる。２％のグルカンゲルのそのようなデータの例は、図６において示される。
【００３４】
本発明のグルカンは、通常酵母に由来し、好ましくはサッカロミュケス・ケレウィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形態である。これらのグルカンの基本的な分子構造は、通常β−１，３−骨格（β−１，３連結によって連結したグルコース分子の鎖を意味する）であり、それに加えて、β−１，３側鎖（β−１，３連結によって連結した少なくとも２個のグルコース分子の鎖を意味する）、および側鎖を骨格に連結したβ−１，３，６−連結点である。さらに、酵母からのグルカンは、側鎖または直接骨格に連結されていてもよいβ−１，６連結を含む。さらなる型の連結も存在するが、比較的低濃度である。グルカンの起源として提供し得る他の酵母は、ビール酵母（Ｂｒｅｗｅｒｓ  ｙｅａｓｔ）、カンディダ種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ）、例えばカンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンディダ・クロアカエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｌｏａｃａｅ）、カンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、ハンセヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ）、例えばハンセヌラ・ウィンゲイ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｗｉｎｇｅｉ）、ハンセヌラ・アルニ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｒｎｉ）、ハンセヌラ・ヘンリキイ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｈｅｎｒｉｃｉｉ）およびハンセヌラ・アメリカーナ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、ヒストプラスマ種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ）、クロエケラ種（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ  ｓｐ）、クルュウェロミュケス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ）、例えばクルュウェロミュケス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルュウェロミュケス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルュウェロミュケス・ポリュスポルス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ）、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ）、ロドトルラ種（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ）、サッカロミュケス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ）、例えばサッカロミュケス・デルブルエキイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ）、サッカロミュケス・ロセイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｉ）、サッカロミュケス・マイクロエッリプソデス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｄｅｓ）、サッカロミュケス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）または別のサッカロミュケス株、例えばサッカロミュケス・ケレウィシアエＲ４（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｒ４）（ＮＲＲＬ  Ｙ−１５９０３）およびＲ４  Ａｄ（受入番号７４１８１）、シゾフュッルム種（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｐ）、シゾサッカロミュケス種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ）、例えばシゾサッカロミュケス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、トルラ種（Ｔｏｒｕｌａ  ｓｐ）およびトルロプシス種（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｓｐ）が挙げられる。
【００３５】
しかし、本発明のゲルグルカンは他の適切な起源、例えば細菌、菌類、穀物グルカンに由来してもよい。様々なグルカンの治療活性は当業界で十分立証され、本発明の方法は、一般にグルカンの活性を増強するために、特に、グルカン生成物の物理的形態および分子間構造が特に意義深いことが本発明者らによって示されている創傷治癒において、使用することができる。理論に拘束されることを望むわけではないが、一般則によれば、本発明に従って使用されるグルカンの単一鎖基準の重量平均モル質量が高いほど、より効果的なグルカンゲルを製造することができる。
【００３６】
本発明のグルカンゲルの側鎖は、通常２個以上のβ（１，３）連結グルコシル単位を含む。本発明によれば、主鎖に連結した単一分子は「側鎖」と見なされない。
【００３７】
本発明のグルカンは、好ましくは、β（１，３）連結グルコシル単位の側鎖を有する、すなわち、β（１，３）連結グルコシル単位からなる、またはβ（１，３）連結グルコシル単位から本質的になる。このβ（１，３）連結側鎖に加えて、グルカンはまた１個または複数のβ（１，６）連結側鎖があってもよい。構造の鎖を改変することによって、最終生成物の特性を変えることが可能である。酵素処理、ギ酸もしくは塩酸のような酸または異なる塩基の使用ならびに他の手段を含むグルカンを改変する様々な方法がある。好ましいグルカンは、酸（例えばギ酸）もしくは酵素または他の適切な方法によって処理され、
グルカン内の繰返しの（１，６）連結グルコース分子の数を著しく減らした、またはなくしたものである。これらの（１，６）連結グルコシル部分は、酵母に由来するベータグルカンの側鎖中で通常見出される。結果として得られたグルカンは、β（１，３）脱離処理によって切断されない単一β（１，６）連結によってそれに連結した主鎖およびβ（１，３）側鎖を有する。
【００３８】
好ましいグルカンは、繰返しのβ（１，６）連結グルコシル残基を本質的に含まない。分岐点（β（１，３，６）分岐点）での単一（１，６）連結は、「繰返しの」β（１，６）連結グルコシル単位を与えない。「本質的に含まない」によって、グルコシル単位全体の６％未満、好ましくは４％、最も好ましくは３％未満を意味する。
【００３９】
酵素処理などのいくつかの処理は、側鎖中に切断されない最大４個のベータ−１，６−連結を、しかし、通常は、２個のベータ１，６連結グルコシル単位を残すことがある。そのような分子はまた、繰返しのベータ１，６−連結グルコシル単位を「本質的に含まない」。
【００４０】
本発明の好ましいグルカンの内の連結の分布は以下のように表すことができる。
【００４１】
【表１】
0005932824.tif 000004
【００４２】
β（１，３，６）は、骨格中で（１，３）連結した分岐点残基を指し、（１，６）接続に関与して、側鎖を与える。
【００４３】
本発明のグルカンは、単一の形態、または抽出分画もしくは異なる平均分子量を有する２以上の異なる分画であってもよい。
【００４４】
グルカンは、化学変性基の点からは誘導体化されていない。
【００４５】
本発明のグルカンは新規の方法によって生成される。本発明者らは、特定の加熱および冷却ステップを実施することによって他の類似したグルカン生成物と比較して、改善された活性を有する新規のゲルグルカン生成物が得られることを見出した。こうすることによって、非常にランダムに組織化された「干し草の山」ゲルは、「アニールされた」ベータグルカン鎖の典型的な三重螺旋構造を有することなく作られる。驚くべきことに、この種のゲル構造は、三重螺旋配座または多重螺旋のいずれかにおいても、古典的な組織化された可溶性ベータグルカンより免疫調節薬として有意により強力であることが観察された。この加熱および冷却ステップによれば、存在するより高次の秩序構造を壊し、遊離の単一鎖分子の大きい比率（例えば＞４０％、好ましくは＞５０％、より好ましくは＞６０％または＞７０％）を有するランダムな組織を誘導するために、可溶化したベータグルカン製剤はエネルギーを与えられる。
【００４６】
本発明による急冷によって、分子は速やかに分子間相互作用を構築することにより、生成物が三重螺旋構造を主として形成しない、新規の分子配座に「凍結している。」分子は、それによってよりランダムな分子の位置で凍結され、新規の分子間組織を作り出す。次いでこの超分子組織は、ゲル形態にある最終生成物を結果としてもたらす。驚くべきことに、これらの新規の生成物は、この処理を受けないものまたはそのようなゲル構造を有しない生成物と比較して、免疫調節薬としてはるかに良好な効能プロファイルを有している。
【００４７】
したがって、さらなる態様において、本発明は、上記に定義されるゲルグルカン生成物を製造する方法であって、グルカン分子の水溶液が１２０〜１３０℃、好ましくは１２０〜１２５℃の温度に加熱され、１０〜３０分間その温度で保持され、次いで、グルカン溶液は、３５〜５０℃、好ましくは３５〜４０℃の温度に８０分以下、好ましくは６０分未満、例えば５０〜６０分の時間にわたって冷却される方法を提供する。
【００４８】
上記の冷却の継続時間は、グルカン分子の２２０リットルの水溶液が出発物質として使用される工業的方法に基いている。より小量が使用される場合、冷却ステップの継続時間は、上記のそれより短く、例えば５０分未満、例えば２０〜５０分であってよいことが理解されよう。
【００４９】
加熱は、好ましくは、貯槽の外側の加熱を可能にするジャケットまたは類似した構造を有する、生成物のバッチ全体を保持するに十分なほど大きい、孤立した揺動貯槽中で実施される。バッチ全体の均一加熱を保証しつつ、バッチ全体が妥当な時間内に規定温度に加熱されるような方法で、バッチの大きさ、加熱システムの能力、貯槽の容量対表面の比率および揺動機の効果が均衡されるべきである。代替として、生成物がその最終容器に充填された後、オートクレーブ中での加熱、または、エネルギーを与える代替方式、例えば超音波もしくはマイクロ波のいずれかによって、エネルギーを与えるステップが行われてもよい。
【００５０】
したがって、さらなる態様において、本発明は、上記に定義されるゲルグルカン生成物を製造する方法であって、グルカン鎖間のより高次の秩序構造を妨害するために、グルカン分子の水溶液がエネルギー源で処理され、次いで、分子間相互作用の迅速な再確立を可能にするために処理される方法を提供する。加熱に加えて、適切なエネルギー源は超音波およびマイクロ波を含む。超音波およびマイクロ波の場合は、分子間相互作用の迅速な再確立には、超音波またはマイクロ波への曝露を単純に止めることで十分であり得る。
【００５１】
エネルギーを与えるステップが貯槽中のバッチ全体のために実施された場合、積極的な冷却が同一貯槽中で実施されるのが好ましく、タンク表面を冷却するための貯槽のジャケットを使用する能力を必要とする。バッチ全体を均一冷却することを保証しつつ規定時間内に冷却が行われるために、重ねてバッチの大きさ、冷却システムの能力、貯槽の容量対表面の比率および揺動機の効果が均衡されるべきである。最初の冷却の後、最終容器中への生成物の充填および室温への容器の冷却が続くべきである。好ましくは、冷却ステップは、加熱ステップの直後に、すなわち、グルカンが１０〜３０分間高温で保持された後直ちに（関係装置にとって現実的である限り）実施される。
【００５２】
工業的プロセスにおいて加熱および冷却ステップを実施するための適切な手順は、実施例１に記載されている。
【００５３】
エネルギーを与えるステップが最終容器中で実施される場合、これらの容器は上記の時間枠内で室温に冷却されなければならない。
【００５４】
上記の加熱および冷却ステップは、例えば、もう一度反復されてもよい。
【００５５】
加熱および急冷ステップの前の水溶液のグルカン濃度は、好ましくは１．５〜６％、より好ましくは２〜４％、最も好ましくは約２％である。好ましくはグルカンゲル中のグルカン濃度は、約２％、例えば１．８％から２．２％である。したがって、好ましくは、加熱および急冷ステップの前の水溶液中のグルカン濃度はまた、約２％である。本発明の方法は、追加の薬剤または物質が溶液に添加されるさらなるステップの存在を除外しない。そのようなステップが実施されたら、それによって水溶液の体積が増し、その結果、溶液中のグルカン濃度が低下し得る。しかしながら、好ましくは溶液の体積は著しく変更されず、出発および最終生成物中でのグルカン濃度はほぼ等しい。所望の場合、追加のステップにおける薬剤または物質の添加が最終生成物中で所望の正確なグルカン濃度をもたらすように、出発生成物中にグルカンのより高濃度を使用することができることを熟練者は、当然、理解している。熟練者は、結果として得られたゲル生成物中で所望のグルカン濃度を達成するために、出発生成物中の好適なグルカン濃度、および添加する薬剤および物質の好適な量を計算することができる。
【００５６】
上記の加熱および冷却ステップは、グルカン分子の任意の水溶液で実施されてもよい。変性した分岐を含むグルカンを含む好ましいグルカンは上で論じられ、グルカン溶液は、好ましくは酵母グルカン溶液である。出発溶液中のグルカンの重量平均モル質量（Ｍｗ）は、好ましくは高く、好ましくは、単一鎖基準で、溶液中のグルカンの重量平均モル質量は、１５，０００を超え、より好ましくは２０，０００を超え、最も好ましくは２５，０００ｇ／ｍｏｌを超える。これらの質量値を求める適切な方法は上記のとおりである。
【００５７】
グルカンは、一般に、微粒子形態のそれらの原材料（例えば真菌類、酵母または穀物）から抽出されるが、微粒子グルカンから可溶性形態を生成する方法は当業界で公知であり、国際公開第９５／３００２２号に記載されている加ギ酸分解（ｆｏｒｍｏｌｙｓｉｓ）ステップなどの酸またはアルカリ処理を含む。大麦のような穀物からの可溶性グルカン生成物はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手可能である。本発明によれば、国際公開第９５／３００２２号の実施例１のプロトコルによって調製することができるような微粒子の出発物質は、少なくとも２時間ギ酸中で加熱することによって好ましくは可溶化される。微粒子グルカン出発物質で実施される加ギ酸分解は、好都合に、任意のβ（１，６）連結グルコシル側鎖の選択的な除去、ならびに微粒子グルカンの可溶化を引き起こすことができる。
【００５８】
本発明の方法はまた、好ましくは、ギ酸処理した生成物が少なくとも３０分間沸騰される（＞１００℃）予備的な加熱ステップを、上記の加熱および急冷ステップ前に含む。生成物が冷却された後、好ましくは、微粒子物質を除去するために当業界で公知の一般的な方法によって、例えば、遠心分離または濾過によって処理される。
【００５９】
本発明による加工のための可溶性形態を得るために処理される微粒子グルカンは、好ましくは細胞壁、特に酵母細胞壁に由来し、これは、例えば洗浄によってそこから除去したタンパク質成分およびマンナンおよびキチンのような他の残存物を含んでいたものである。
【００６０】
適切な微粒子酵母グルカン生成物の１つの例はＢｉｏｔｅｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｎ  ＡＳＡによって製造されており、これはパン酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）に由来し、ＮＢＧ  Ｃｏｓ（登録商標）として知られている。微粒子グルカン原料の別の例は、生成物Ｉｍｐｒｉｍｅ  ＷＧＰ（商標）のような全グルカン粒子である。ＮＢＧ  Ｃｏｓ（登録商標）は、天然の誘導体化されていない（化学変性基の点で）微粒子β（１，３）／（１，６）グルカンであり、ＮＭＲおよび化学分析によって特性評価され、ベータ−１，３  およびベータ−１，６連結Ｄグルコースの側鎖を含有するベータ−１，３−連結Ｄグルコースのポリマーからなる。
【００６１】
本発明の好ましいゲル生成物の外観は、固く不透明で白っぽく、他の表面に対し強い接着能力を有する。
【００６２】
さらなる態様において、本発明は、前述の方法のいずれかによって得られたまたは入手可能なグルカン生成物を提供する。
【００６３】
本発明のグルカンは強力な治療剤であり、さらなる態様において、本発明は、治療に使用するために、特に対象が、免疫応答の全身的または局所的な増強を必要としている、例えば、組織損傷または感染症がある、症状の治療のために、本明細書に記載されるグルカンを提供する。グルカンは、創傷または潰瘍の治癒の支援に、ならびに口腔の粘膜炎および癌または腫瘍の大きさを低下させる治療において特に有益である。
【００６４】
さらなる態様において、本発明は、したがって、本明細書に記載される本発明のグルカンの対象への投与を含む、それを必要とする前記対象において創傷または潰瘍の治癒を支援する、または口腔の粘膜炎を治療する方法を提供する。
【００６５】
創傷または潰瘍が自然に治る場合があるが、そうでない場合もあり、本発明のグルカンは創傷および潰瘍の治癒を加速することが示されるので、創傷または潰瘍の治癒を「支援すること」が言及される。いくつかの事例において、治癒は、治療なしでは十分でない。治癒に対して治療を必要とするような創傷の例は糖尿病性足部潰瘍である。この徴候において、患者は、糖尿病である根底の原因に基く創傷を発症する。多くの場合治療していない根底の原因およびこれらの創傷が患者の足で見つけられることになるという事実により、これらの潰瘍は独力で治らず、足の切断で通常終わる患者にとって大きな問題を引き起こす。
【００６６】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載される本発明のグルカンの対象への投与を含む、前記対象の癌を治療する、または腫瘍の大きさを低下させる方法を提供する。
好ましくは、グルカンは経口で投与される。好ましくはグルカンは、５〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは２０〜１００ｍｇ／ｋｇの投薬量／日が投与される。
【００６７】
さらなる態様において、本発明はまた、上記に定義されるゲル形態のグルカン、および１種もしくは複数の薬学的に許容される希釈剤または担体、好ましくは水および場合によって、１種もしくは複数の生理学的に許容される安定剤、または追加の希釈剤もしくは担体を含む医薬組成物を提供する。組成物は、好都合に、任意の局所用剤形へ製剤化されてもよい。局所用剤形は、クリーム剤、ローション剤、溶液、ゲル剤、軟膏剤、パスタ剤、スプレー、フィルムなどであってもよい。
【００６８】
いくつかの変形において、本明細書に記載される組成物は、軟膏剤の形態をしている。軟膏基剤は、脂肪性基剤、乳化可能な基剤、乳濁液基剤、または水溶性基剤であってもよい。他の変形において、本発明による組成物は、クリーム剤の形態をしている。クリーム剤は、粘稠な液剤または水中油または油中水型いずれかの半固体乳濁液であってもよい。クリーム基剤は水洗濯可能であり、油相、乳化剤、および水相を含んでいてもよい。またさらなる変形において、本発明の組成物は、ローション剤の形態をしている。ローション剤は固体の懸濁液として製剤化され、より良好な分散液を生ずるように懸濁化剤を含んでいてもよい。本発明による組成物はまた製剤化されたパスタ剤であってもよい。パスタ剤は、活性剤が適切な基剤に懸濁された半固体の剤形である。基剤の性質に応じて、パスタ剤は、脂肪質ペーストまたは単相水性ゲルから生じるものとの間で分割される。
【００６９】
いくつかの変形において、組成物は創面でフィルムを形成する。フィルム形成を助けるために、フィルム形成剤、例えばアクリル酸およびその誘導体、ポリアクリル酸およびポリブチルメタクリラートおよびポリメタクリル酸、ポリメタクリラートなどのその誘導体、パルミチン酸アスコルビル、カルボマー、カルナバワックス、酢酸フタル酸セルロース、ロスカメロースナトリウム（ｒｏｓｃａ  ｍｅｌｌｏｓｅ  ｓｏｄｉｕｍ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロースおよび関連化合物、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、ヒプロメロースフタラートなどのセルロース誘導体、セチルアルコールおよび誘導体、微結晶性＊ｍｉｃｒｏｃｙｓｔａｌｌｉｎｅワックス、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルフタラート、ポリビニルアルコール、シリコーンゴムおよび誘導体、シェラック、トリグリセリド誘導体、およびその組み合わせが使用されるが、これらに限定されない。
【００７０】
組成物はまた、亀裂または剥離なしで身体の領域で適用され動かすのに十分な可撓性になるように、フィルム形成剤によって形成されたポリマーフィルムを柔らかくする役目をし得る少なくとも１種のフィルム可塑剤を含むことができる。
【００７１】
いくつかの変形において、組成物は創傷への適用前にフィルムにキャストされてもよく、または創傷に直接適用され、インサイチューで重合されてもよい。皮膚に適用されたら、「スプレッドオン」フィルムは重合し、チューブ、ロールオン、スプレー剤などからクリーム剤または軟膏剤として送達されてもよい。フィルムは外相にシリコーンゴムを組み込むことにより作られてもよい。内相と混合すると、結果として生じた乳濁液を硬化し、創傷に適用されたら重合する「スプレッドオン」フィルムを提供する。乳濁液は、基材上に広げ所望の厚さを達成することができる。
【００７２】
他の場合、組成物は層または貼付剤に前もって形成されてもよい。貼付剤は厚さが変動するものであってもよい。貼付剤はまた、一般に創傷端部に従う形状を有するように切断することができる。
【００７３】
いくつかの変形において、貼付剤は、創傷または皮膚に貼付剤を固定する役目をする薬学的に許容される接着剤を含んでいてもよい。貼付剤裏板もまた含まれていてもよい。
【００７４】
スプレー剤として使用された時、本発明による組成物は少なくとも１種の有機溶媒を含んでもよい。
【００７５】
組成物は、創傷に直接配置されるか、または創傷に適用するための基材に配置されてもよい。任意の基材（担体）が、本明細書に記載される組成物と共に使用されてもよい。例えば、織布、不織布、編み物、発泡体および接着性の基材が使用されてもよい。吸収性または非吸収性基材も使用されてもよい。いくつかの変形において、組成物は基材上に散布または展開される。他の変形において、組成物は基材内に含浸される。
【００７６】
創傷包帯が任意の適切な時間適用されてもよい。例えば、それらは、１日の時間にわたって数日にわたって、数週間にわたって、または数か月間以上適用されてもよい。一般に、創傷が治癒するまで、創傷包帯は再適用される。本明細書に記載される包帯で創傷を治療する継続時間は、治療されている創傷の型、創傷の位置、および適用されている組成物の形態などの因子に依存し得る。使用される形態に応じて、組成物は水で除去する、または創傷から拭き取る、もしくは剥ぎ取ることができる。
【００７７】
本明細書に記載される組成物は、任意の病因学から結果として得られる創傷を治療するために使用されてもよい。例えば、創傷は、熱傷、感染、虚血、リンパ浮腫、新生物、神経病変、放射線損傷、外科手術手順、静脈不全、および外傷によるものであってよい。本発明の組成物は、創傷または潰瘍の治癒を支援する際に特に有益である。
【００７８】
本発明は、物理的支持体、例えば、本明細書に定義される本発明のグルカンをそこに適用した（そこへの含浸を含む）、医療用の任意の医療機器または材料をさらに提供する。
【００７９】
そのようなベータグルカンの重要な一特性は、非中性ｐＨのような条件またはゲルでの治癒を促進し得る陽イオンの欠如した状態においてさえ、その水収容力およびゲル形成特性があることである。いくつかのベータグルカンは、１％もの低濃度で、しかしより典型的には２〜４％の範囲でゲルを形成する。本明細書に記載されるもののような酵母からの可溶性ベータグルカンは、陽イオンの存在と無関係に、１〜６％の濃度で３〜７のｐＨ範囲で水溶液に溶解されると、チキソトロピーおよび擬塑性のゲルを形成する。
【００８０】
本発明の組成物は、好ましくは水溶液中に１．５〜６％のベータグルカンを含み、より好ましくは、組成物は、水溶液中に約２〜５％のグルカンを含む。異なる濃度の使用は、投与の目的および種々の様式に依存する。概して、水溶液中で４〜５％を超える濃度を有し、他の安定化物質を含まない、上記の酵母グルカンは、固体のゲル特性により製造するのが困難な最終ゲル生成物をもたらす。
【００８１】
用語「創傷」および「潰瘍」が包含するのは、表面創傷、外科的創傷、熱傷、解放骨折、下腿潰瘍、アフター性＊ａｐｔｈｏｕｓ潰瘍、糖尿病潰瘍および褥瘡性潰瘍である。創傷は損傷、手術または疾患の結果であってもよいが、すべては、皮膚の完全性の損失を特徴とする。皮膚は裂かれ、切断され、または穴をあけられたかもしれず、皮膚の再生には開口を密封する必要がある。本発明のグルカンは、創傷閉鎖を加速することが示されている。実施例で示されるように、効能は、開いた創傷の大きさの測定により容易に示すことができる。
【００８２】
本組成物は、例えば、ゲル剤、経皮貼布剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤などとして、好ましくは局所的に適用される。組成物は、毎日、より頻繁にまたはそれほど頻繁でなく、例えば、１日２回、または隔日に、および臨床医によって、またはある場合には患者または他の健康助言者によって決定される継続時間の間、適用されてもよい。治療の継続時間は、一般に目視検査によって容易に決定されている進展と共に創傷または潰瘍の性質および重症度に依存する。
【００８３】
局所投与は口腔内の投与を含み、口腔粘膜への送達に適切なゲル剤、ロゼンジ、貼付剤、スプレーなどが当業界で知られている。
【００８４】
グルカンおよびそれを含有する組成物は、ヒトおよび畜産の医学に有用性を見出す。本明細書において使用される場合、用語「医学の」は、畜産の用途および文脈を含む。ヒトは治療にとって好ましい対象であるが、有用に治療されてもよい他の動物は、家畜およびコンパニオンアニマルを含む。
【００８５】
本発明のグルカンおよびそれを含有する組成物は、創傷または潰瘍部位に適用することができる、例えば貼付剤、包帯、膏薬、絆創膏、フィルム、ガーゼなどの物理的／固体支持体に塗布、または組み込むことができ、そのような生成物は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００８６】
本発明のグルカンはまた、皮膚細胞株の培養、例えば、皮膚移植における使用のための、インビトロの用途に対応する有用性がある。したがって、さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載される本発明のグルカンと皮膚細胞集団を接触させることを含む、皮膚細胞を増殖するインビトロの方法を提供する。
【００８７】
本発明の一態様または一実施形態に適用できる好ましい特色は、必要な変更を加えて、すべての態様および実施形態に対して当てはまることは理解されよう。
【００８８】
本発明のグルカンは、実施例で示されるように抗ガン剤および創傷治癒剤として優れたインビボの効能を有している。実施例はまた、様々な治療の文脈で関係のあるサイトカインの産生を刺激する、本発明のグルカンの能力を示す。実施例は、本発明の好ましいグルカンが、マウス腹腔マクロファージ中で、ＴＮＦαおよびＣＸＣＬ２／ＭＩＰ２αの発現の引き金を引くことを示す。カードランまたはＬＰＳ応答と比較して、ＴＮＦαの弱い誘発はまた、末梢血単球に由来するヒト骨髄性樹状細胞において見られる。
【００８９】
ＴＮＦαの放出に対する好ましいベータグルカンの効果は用量依存性であり、ベータグルカン受容体デクチン−１を過剰発現するＲＡＷ細胞株の変種において一定の閾値、例えば２〜４μｇ／ｍｌを超えるグルカン濃度で縮小するように思われる。ＴＮＦαおよびＣＸＣＬ−２の中程度から低い誘発は、本発明の生成物に特有である。ＴＮＦαおよびＣＸＣＬ−２の両方が創傷の治癒において役立つ。ネズミのケモカインＣＸＣＬ２は細胞移動および血管新生を刺激し、炎症性肉芽組織中で脈管形成活性の代用薬マーカーとして使用することができる。
【００９０】
本発明の好ましいグルカンは、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ−１０）の強力な発現の引き金を引かない。ＩＰ−１０は、走化性サイトカインのアルファまたはシステイン−Ｘアミノ酸システイン（ＣＸＣ）ケモカインファミリーの成員である。高レベルのＩＰ−１０の発現は、乾癬、皮膚の普通の炎症性疾患を含む、幾つかの慢性ヒト炎症性症状において検出されている。患者は、損なわれた血管新生と共に、より強い炎症期および長期の無秩序な粒状化期を特徴とした異常な創傷治癒応答を一般に示している。本発明のグルカンは、ヒト樹状細胞からのＩＰ１０のＬＰＳに誘発される発現を増強するべきでなく、好ましくは、ｄｂ／ｄｂマウスから収穫されたマクロファージからのＩＰ−１０のＬＰＳに誘発される発現を阻害する。このことは、本発明による好ましいグルカンは、創傷治癒過程の有益な要素を開き、一方で、長期の治癒期をもたらす阻害薬を閉じることを示す。
【００９１】
さらに、実施例は、終末補体複合体（ＴＣＣ）の蓄積によって示される補体系を活性化する、本発明のゲルグルカンの能力を示す。
【実施例】
【００９２】
実施例１
本発明のゲルグルカン生成物の調製
１．５〜２％の酵母グルカン分子の水溶液を下記のように処理した。この水溶液を加ギ酸分解によって微粒子グルカン調製品から調製し、選択的にβ−１，６側鎖を除去し、続く精製および透析濾過によって加ギ酸分解溶液からの粒子状物質および低分子量成分を除去した。適切な加ギ酸分解ステップは、欧州特許第０７５９０８９Ｂ１号の実施例３に開示されている。微粒子グルカンは、アルカリ、エタノールおよび水での別々の抽出によってパン酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞壁からそれ自体調製し、各抽出に続いて好適な乾燥（噴霧乾燥および真空乾燥）を行った。
【００９３】
ａ．熱処理：
グルカン溶液の濃度を調節した後、貯槽を取り囲むジャケットに水蒸気を導入することによって加熱される、閉じて揺動した８００リットルの貯槽中で熱処理を行い、約６０℃の温度で約２２０リットルの生成物量を通常与える。
【００９４】
バッチ全体の均一加熱を保証するために、生成物を約１０５℃に徐々に、次いでより速やかに１２３℃に加熱した。６０〜１２３℃までの通常の加熱時間は４０〜５０分である。次いで、生成物は、１２３〜１２５℃で２０分間保持する。
【００９５】
積極的な冷却：
次いで、積極的な冷却を始める。それは、手で操作する弁の直接の開閉によって手で操作される。先ず、水蒸気をジャケットから注意深く排出して流出させ、ドレーンバルブを開いたままにする。次いで、冷却水をジャケットに注意深く、初めは徐々に導入し、貯槽の鋼鉄に対して過剰の熱応力を回避する。温度が下がると、水の流量を増加させる。生成物温度が３５〜４０℃に到達するまで、冷却は通常継続する。１２３℃から４０℃までの通常の冷却時間は、５０〜６０分である。
【００９６】
実施例２
マウスモデルにおけるインビボ創傷治癒
糖尿病性（ｄｂ／ｄｂ）マウスモデル（すなわちＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ  Ｄｏｃｋ７ｍ  ＋／＋  Ｌｅｐｒｄｂ  ／Ｊマウス）において、創傷治癒への試験グルカンおよび対照の影響を全層除去した皮膚創傷の修復を分析することにより調べた。順応させた後（外乱がない５〜７日）、動物は、本社規則および糖尿病動物の特定要件に従って５匹の動物の群で収容した。実験的に傷つけた後、個々のケージ（ケージ寸法３５×１５×１５ｃｍ、週に２度交換するおがくずを敷いた）に、１２時間の明／暗サイクルで２３℃の常温に維持した環境に動物を収容した。マウスには、食物（標準げっ歯類食餌）および水を適宜提供した。すべての麻酔事象の後、処置から完全に回復するまで動物を暖かい環境に置きモニターした。動物にはすべて、必要とされる手術および付加的な鎮痛薬の後、好適な無痛法（ブプレノルフィン）を受けさせた。動物の処置はすべて、本社ライセンスの下（ＰＣＤ：  ５０／２５０５；  ＰＰＬ：  ４０／３３００；  ＰＩＬ：  ５０／３４８２；  ＰＩＬ：  ７０／４９３４）で本社の許可を設定して行った。動物の健康を調査の全体にわたって一日単位で病気のモニターをした。
【００９７】
第０日に、動物に麻酔をかけ（イソフルオランおよび空気）、毛を剃り、食塩水を吸わせたガーゼで浄化した。標準化した単一の全層創傷（１０．０ｍｍ×１０．０ｍｍ）を、各実験動物の左の背側横腹皮膚に作り出した。すべての処置群中の創傷は、続いて透明フィルム包帯Ｂｉｏｃｌｕｓｉｖｅ（商標）（Ｓｙｓｔａｇｅｎｉｘ  Ｗｏｕｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，  ＵＫ）の円周バンドで巻いた；その後、それらは、Ｂｉｏｃｌｕｓｉｖｅフィルムを通して２９ゲージ針を使用し、精製水中の２％溶液５０μｌの注射によってグルカンまたは対照を受けさせた。糖尿病動物を好適なソフトウェアを使用して、処置方式の１つに無作為化した。グルカンを受けさせた実験群に対して、処置を負傷後２、４および６日に再適用した。これらの動物の創傷部位は、適用した薬剤の過剰集積および過剰な創傷部位での水和について入念にモニターした；過剰に適用した薬剤の蓄積／水和が明白であれば、先に適用した材料は再適用前に吸引によって除去した。正の対照群の処置に対して、負傷後６日まで処置を毎日再適用した。−この群の創傷は、成長因子合剤処置の合計７つの適用を受けた。負傷後４、８および１２日に、動物すべてを再度麻酔をかけ、そのフィルム包帯およびなんらかの遊離デブリを除去し、食塩水を含ませた滅菌ガ−ゼを使用して創傷を浄化した。撮影後４および８日に、創傷は上記のようにＢｉｏｃｌｕｓｉｖｅフィルム包帯で再度巻いた。治癒は、０日目の創傷の大きさに対する創傷閉鎖として求めた。
【００９８】
結果は、以下の表１および図８に示される。
【００９９】
【表２】
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【０１００】
軟質ゲルグルカン生成物および固体ゲルグルカン生成物は共に、本発明の方法によって調製された、酵母に由来するグルカンである。両者とも、ギ酸で処理し、天然酵母グルカン側鎖に見られるβ（１，６）連結グルコシル単位を除去した酵母に由来するグルカンである。固体および軟質ゲルグルカンは、本明細書に記載される（実施例１）新規の加熱および急冷プロトコルを使用して調製されている。驚くべきことに、軟質ゲルグルカン生成物（２％の生成物）と比較して、固体ゲル（４％の生成物）は増強された創傷治癒活性を示す。
【０１０１】
「壊れたゲル生成物」は、ゲル中の分子の（分子間）配座が水素結合に干渉する薬剤への曝露によって高度に破壊されている、酵母に由来するグルカン生成物を記載する。このグルカンは、本発明のゲル生成物と比較して、類似した有益な効能／治癒プロファイルを働かせることができない。この結果は、本発明によるグルカンのゲル構造が、インビボ効能のための驚くほど重要な特性であることを明白に示す。
【０１０２】
この結果は、本発明に従って製造されたグルカンゲルの使用が、送達ビヒクルおよび負の対照と比較して、創傷治療モデルのより強力な応答を誘発することを明白に示す。「壊れたゲル」生成物が劣った結果を与えるという事実はまた、無傷のゲル構造またはグルカンゲル内の特定の高次の秩序配座の存在の必要性を示している。
【０１０３】
実施例３
モル質量の測定
一連の酵母グルカン生成物のモル質量を明細書において先に定義されたサイズ排除クロマトグラフィーを使用して求めた。実験は水溶液中のグルカンで実施し、それにより単一鎖基準ではなくグルカン試料内のグルカン凝集体に対するモル質量値を求めた。５つのグルカン試料を試験し、すべてが酵母に由来し、すべてがβ（１，６）連結側鎖が縮小していた。４つは溶液にあり、５番目は本発明によるゲルグルカンであった（実施例１に従って調製した）。
【０１０４】
水溶液中の４つのグルカンに算定した平均モル質量は１．０〜３．７４×１０５ｇ／ｍｏｌに変動した。
【０１０５】
本発明のグルカンは、８×１０５ｇ／ｍｏｌの平均モル質量を有する。
【０１０６】
他の実験において、本発明のグルカンは、モル質量が５〜１５×１０５ｇ／ｍｏｌに変動した。
【０１０７】
実施例４
融点の測定
本明細書に記載されているように、本発明に従って製造されたグルカンゲルの融点の測定を実施した。結果は図３に示される。
【０１０８】
実施例５
粘度測定
明細書に記載されているように、本発明に従って製造されたグルカンゲル（実施例１に従って調製された）の粘度の測定を実施した。結果は図４に示される。
【０１０９】
実施例６
生物学的活性
ＴＮＦαならびにＣＸＣＬ−２および−１０の放出への、実施例１に従ってそれぞれ異なるバッチとして調製した、本発明のゲルグルカンの効果は、本明細書に記載され、図に示される。
【０１１０】
さらに、ベータグルカンが補体系を活性化する能力を測定した。補体系は一連の血清タンパク質で構成される。この系は生得の免疫系の一部であり、病原体関連分子パターンの感染または検出で活性化される。系の活性化は、補体タンパク質の開裂のカスケードを結果として生じ、終末補体複合体（ＴＣＣ）の形成を究極的にもたらす。ＴＣＣの蓄積は、モノクローナル抗体を使用してネオエピトープの検出によって測定することができ、それにより補体活性化の指標として果たすことができる。
【０１１１】
グルカンをヒト血清に１００μｌの量に希釈した（１：１０）。混合物は３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳに１：５で希釈し、次に、ヒトＴＣＣ用の市販ＥＬＩＳＡ試験キットを使用して液相ＴＣＣの相対量を３回繰り返して求めた。結果は図９に示される。
【０１１２】
ゲル形態の本発明の可溶性ベータグルカンは、ヒト血清中で補体系を活性化する。しかし、補体の活性化は、図９のＶＬＭＳＧによって例示されるように、可溶性ベータグルカンの一般的な特色ではない。ＶＬＭＳＧの分子量は、１０３〜約５×１０６ｇ／ｍｏｌの範囲であり、平均値が１．３×１０４ｇ／ｍｏｌで、透明な溶液が得られた。
【０１１３】
実施例１に従って調製された本発明のゲル形成性可溶性酵母ベータグルカンは、デクチン−１過剰発現ＲＡＷ細胞からＴＮＦαの放出を刺激し、一方、可溶性酵母ベータグルカンの、ゲル化しない透明な変種は、明らかに、到底及ばないことが示された（図１０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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