(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化合物を有する化合物。
（化合物１）
0006049719.tif 000015
（２Ｓ，４ａＳ，４ｂＲ，８ａＲ，１０ａＳ）−２，４ｂ，８，８−テトラメチル−２−ビニルドデカヒドロ−８ａ，１０ａ−エピジオキシフェナントレン−４ａ−オル  
（化合物２）
0006049719.tif 000016
（２Ｓ，４ａＲ，４ｂＲ，８ａＲ，９Ｒ，１０ａＳ）−２，４ｂ，８，８−テトラメチル−２−ビニルテトラデカヒドロフェナントレン−８ａ，９，１０ａ−トリオール  
（化合物３）
0006049719.tif 000017
（２Ｓ，４ａＳ，４ｂＳ，８ａＲ，９Ｒ，１０ａＳ）−２，４ｂ，８，８−テトラメチル−２−ビニルテトラデカヒドロフェナントレン−４ａ，８ａ，９，１０ａ−テトラオール  
【請求項２】
前記化合物は、Ａｎｉｓｏｃｈｉｌｕｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓから単離された請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１に記載の前記化合物を有効成分とする、哺乳類におけるがん／結核活性の予防、治療、抑制または成長と増殖のコントロール剤。
【請求項４】
請求項１に記載の前記化合物を有効成分とする、哺乳類における結核の治療または増殖のコントロール剤。
【請求項５】
化合物３のＴｈｐ−１細胞株抑制％が１００μｇ／ｍｌあたり５７．２３である請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
ヒト型結核菌に対するＩＣ９０値が、１２．５〜４２．９２μｇ／ｍｌの範囲内である請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
（ｉ）Ａ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓの地上部を粉砕した後、２５〜３０℃の範囲内の室温にてアセトン抽出し、アセトン可溶分をろ過し、５０〜１００ｍｍＨｇの範囲内の減圧下にて濃縮し、緑色を帯びたアセトン抽出物を得る工程と、
（ｉｉ）石油エーテル中のアセトンを５〜５０％まで勾配を持たせることで極性溶媒の極性を高めたカラムクロマトグラフィ（ＣＣ）を用いて、ステップ（ｉ）の抽出物を分離し、１８個の留出物（ＡＶ１〜ＡＶ１８）を得る工程と、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の留出物ＡＶ３に、クロロホルム中のアセトニトリルを０．５％〜３％まで勾配を持たせたＣＣを行い、８個の留出物（ＡＶ３ａ〜ｈ）を回収する工程と、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）の留出物ＡＶ４に、クロロホルム中のアセトニトリルを１％〜４％まで勾配を持たせたＣＣを行い、１３個の留出物（ＡＶ４ａ〜ｍ）を回収する工程と、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）の留出物ＡＶ４ｉ、ＡＶ４ｊ及びステップ（ｉｉｉ）のＡＶ３ｈとを組み合わせ、クロロホルム中のアセトニトリル３％のＣＣを行い、化合物１と２の混合物を得た後、生成システムとしての、シクロヘキサン中のアセトン２０％の分取薄層クロマトグラフィを行い、分離及び精製する工程と、
（ｖｉ）ステップ（ｉｖ）の留出物ＡＶ４ｋ、ＡＶ４ｌ及びＡＶ４ｍから晶出し、化合物３を得る工程と、
（ｖｉｉ）ステップ（ｉｉ）の留出物ＡＶ５に、クロロホルム中のアセトニトリル溶出を１％〜１５％まで勾配を持たせたＣＣを行い、１５個の留出物（ＡＶ５ａ〜ｏ）を回収する工程と、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の留出物ＡＶ５ｎ及びＡＶ５ｏに、ベンゼン中の酢酸エチル１０％の生成システムを用いて分取薄層クロマトグラフィを行い、４−アリルベンゼン−１，２−ジオールの式である化合物４を単離する工程と、
を含む、請求項１に記載の化合物を抽出するためのプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なソース由来の、一般式Ｉで表される新規なジテルペン系化合物を開示する。より具体的には、本発明は、哺乳類における抗酸菌活性の予防、治療、抑制又は成長と増殖のコントロールに有用である、Ａｎｉｓｏｃｈｉｌｌｕｓ（シソ科）由来のピマランジテルペンを含む抽出物／留出物に関する。本発明はさらに、がん治療に有用である新規なジテルペン系化合物としてスタンダード化される抽出物、留出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬学及び植物科学の分野において、様々な領域において多様な有用性を有する、人に有用な生活活性を有する新規な化合物または公知の化合物の新規なソースを発見するために、継続的な研究が行われている。慢性病に対して活性を有する新規な化合物ソースを発見するためや、栄養学、農学、健康面またはそれらの影響、あるいは生活様式の向上等の領域への適用のために、かなりの研究が行われている。本発明者らは、この目的のため、Ａｎｉｓｏｃｈｉｌｕｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓからの単離の研究を行っている。
【０００３】
Ａｎｉｓｏｃｈｉｌｕｓは、アジアの草本及び低木の属である。前記属は、１６個の種を含み、主に、インド、スリランカ、ヒマラヤ、ビルマ、中国南部、タイ及びインドシナに、１４個の種はインドに分布している。８個の種は、デカン半島の固有種である。Ａｎｉｓｏｃｈｉｌｕｓは、マハラシュトラにある３つの種、すなわち、Ａ．ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ａ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ及びＡ．ｅｒｉｏｃｅｐｈａｌｕｓの典型である。
【０００４】
この種における研究は、ほとんど行われていないが、２つの種、Ａ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ及びＡ．ｅｒｉｏｃｅｐｈａｌｕｓに関する研究は、全く報告もされていない。
【０００５】
米国特許４０８８６５９は、Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ属、Ｃｏｌｅｕｓ属、Ａｎｉｓｏｃｈｉｌｕｓ属、Ｌａｖａｎｄｕｌａ属及びシソ科植物／シソ科のレオノチスに属する植物の乾燥根から、心臓病および循環器疾患の治療用である式−Ｉの薬理有効成分（テルペノイド）を単離することに関する。
【０００６】
Ｌｅｋｐｈｒｏｍ  Ｒ．らによるＰｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．２０１０  Ｍａｙ；７６（７）：７２６−８．の“Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｅｒｉａｌ  ｐａｒｔｓ  ｏｆ  Ａｎｉｓｏｃｈｉｌｕｓ  ｈａｒｍａｎｄｉｉ”という記事は、Ａｎｉｓｏｃｈｉｌｕｓ  ｈａｍａｎｄｉｉ（シソ科）の地上部から単離された８つのジテルペンとしても知られている２つの新規なジテルペン、４−−トリプトベンゼンＬ及び１２−Ｏ−デアセチル−６−Ｏ−アセチル−１９−アセチルオキシコレオンを開示している。
【０００７】
上述の目的に基づき、幅広い植物抽出物が結核に対するその抑制可能性を検査された。Ａｎｉｓｏｃｈｉｌｕｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓの抽出物は、検査された抽出物の中でも予測以上の強い抗結核特性の効果があると示された。また、前記抽出物は、抗がん剤として公知のパクリキタセルと同等の抗がん特性も示された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明は、Ａｎｉｓｏｃｈｉｌｕｓ（シソ科）由来の、一般式Ｉで表される新
規なジテルペン系化合物を提供する。
【０００９】
（式Ｉ）
0006049719.tif 000002
式中、Ｒ１、Ｒ、Ｒ３及びＲ４は、αまたはβのいずれかに配位される。
Ｒ１及びＲ３は、それぞれ−ＯＨを含む群から選択されるか、置換基Ｒ１とＲ３は共に過酸化物結合（−Ｏ−Ｏ−）を形成する；
Ｒ２及びＲ４は、それぞれＨまたはＯＨの群から選択される。
【００１０】
本発明の一実施形態によると、前記化合物は以下の化合物群からなる、式Ｉで表される化合物である。
【００１１】
（化合物１）
0006049719.tif 000003
（２Ｓ，４ａＳ，４ｂＲ，８ａＲ，１０ａＳ）−２，４ｂ，８，８−テトラメチル−２−ビニルドデカヒドロ−８ａ，１０ａ−エピジオキシフェナントレン−４ａ−オル
式中、置換基Ｒ１とＲ３は、共に過酸化物結合（−Ｏ−Ｏ−）を形成する；
Ｒ２は水素、Ｒ４はＯＨ；置換基Ｒ１〜Ｒ４は、α配位である。
【００１２】
（化合物２）
0006049719.tif 000004
（２Ｓ，４ａＲ，４ｂＲ，８ａＲ，９Ｒ，１０ａＳ）−２，４ｂ，８，８−テトラメチル−２−ビニルテトラデカヒドロフェナントレン−８ａ，９，１０ａ−トリオール
式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれＯＨであり、Ｒ４はＨである；置換基Ｒ１とＲ２はトランスであり、Ｒ２とＲ４もまたトランスである。
【００１３】
（化合物３）
0006049719.tif 000005
（２Ｓ，４ａＳ，４ｂＳ，８ａＲ，９Ｒ，１０ａＳ）−２，４ｂ，８，８−テトラメチル−２−ビニルテトラデカヒドロフェナントレン−４ａ，８ａ，９，１０ａ−テトラオール
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれＯＨである；置換基Ｒ１及びＲ２は、トランスであり、Ｒ２とＲ４もまたトランスである。
【００１４】
本発明の他の実施形態によると、前記化合物は、Ａｎｉｓｏｃｈｉｌｕｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓから単離された、式１で表される化合物である。
【００１５】
本発明の他の実施形態によると、一般式Ｉで表される化合物は、哺乳類におけるがん／結核活性の予防、治療、抑制または成長と増殖のコントロールに有用である。
【００１６】
本発明の他の実施形態によると、一般式Ｉで表される化合物は、哺乳類における結核の治療または増殖のコントロールに有用である。
【００１７】
本発明の他の実施形態によると、化合物３のＴｈｐ−１細胞株抑制％が１００μｇ／ｍｌあたり５７．２３である、一般式Ｉで表される化合物である。
【００１８】
本発明の他の実施形態によると、一般式Ｉで表される化合物のヒト型結核菌に対するＩＣ９０値が、１２．５〜４２．９２μｇ／ｍｌの範囲内である、一般式Ｉで表される化合物である。
【００１９】
本発明の他の実施形態によると、
（ｉ）Ａ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓの地上部を粉砕した後、２５〜３０℃の範囲内の室温にてアセトン抽出し、アセトン可溶分をろ過し、５０〜１００ｍｍ  Ｈｇの範囲内の減圧下にて濃縮し、緑色を帯びたアセトン抽出物を得る工程と、
（ｉｉ）石油エーテル中のアセトンを５〜５０％まで勾配を持たせることで極性溶媒の極性を高めたカラムクロマトグラフィ（ＣＣ）を用いて、ステップ（ｉ）の抽出物を分離し、１８個の留出物（ＡＶ１〜ＡＶ１８）を得る工程と、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の留出物ＡＶ３に、クロロホルム中のアセトニトリルを０．５％〜３％まで勾配を持たせたＣＣを行い、８個の留出物（ＡＶ３ａ〜ｈ）を回収する工程と、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）の留出物ＡＶ４に、クロロホルム中のアセトニトリルを１％〜４％まで勾配を持たせたＣＣを行い、１３個の留出物（ＡＶ４ａ〜ｍ）を回収する工程と、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）の留出物ＡＶ４ｉ、ＡＶ４ｊ及びステップ（ｖ）のＡＶ３ｈとを組み合わせ、クロロホルム中のアセトニトリル３％のＣＣを行い、化合物１と化合物２の混合物を得た後、生成システムとしての、シクロヘキサン中のアセトン２０％の分取薄層クロマトグラフィを行い、分離及び精製する工程と、
（ｖｉ）ステップ（ｉｖ）の留出物ＡＶ４ｋ、ＡＶ４ｌ及びＡＶ４ｍから化合物３を晶出
する工程と、
（ｖｉｉ）ステップ（ｉｉ）の留出物ＡＶ５に、クロロホルム中のアセトニトリル溶出を１％〜１５％まで勾配を持たせたＣＣを行い、１５個の留出物（ＡＶ５ａ〜ｏ）を回収する工程と、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の留出物ＡＶ５ｎ及びＡＶ５ｏに、ベンゼン中の酢酸エチル１０％の生成システムを用いて分取薄層クロマトグラフィを行い、化合物４を単離する工程と、
を含む、請求項１に記載の一般式Ｉで表される化合物を抽出するためのプロセスである。
【００２０】
本発明の他の実施形態によると、哺乳類における結核の予防、治療、抑制または成長と増殖のコントロールに有用な、一般式Ｉで表されるピマランジテルペン系化合物から選択される少なくともひとつの化合物を含む、医薬組成物である。
【００２１】
本発明の他の実施形態によると、哺乳類における様々ながんの予防、治療、抑制または成長と増殖のコントロールに有用な、一般式Ｉで表されるピマランジテルペン系化合物から選択される少なくともひとつの化合物を含む、医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１ａ】図１ａは、化合物１の１Ｈ  ＮＭＲを表す。
【図１ｂ】図１ｂは、化合物１の１３Ｃ  ＮＭＲを表す。
【図１ｃ】図１ｃは、化合物１のＤＥＰＴ  ＮＭＲを表す。
【図２ａ】図２ａは、化合物２の１Ｈ  ＮＭＲを表す。
【図２ｂ】図２ｂは、化合物２の１３Ｃ  ＮＭＲを表す。
【図２ｃ】図２ｃは、化合物２のＤＥＰＴ  ＮＭＲを表す。
【図３ａ】図３ａは、化合物３の１Ｈ  ＮＭＲを表す。
【図３ｂ】図３ｂは、化合物３の１３Ｃ  ＮＭＲを表す。
【図３ｃ】図３ｃは、化合物３のＤＥＰＴ  ＮＭＲを表す。
【図４ａ】図４ａは、化合物４の１Ｈ  ＮＭＲを表す。
【図４ｂ】図４ｂは、化合物４の１３Ｃ  ＮＭＲを表す。
【図４ｃ】図４ｃは、化合物４のＤＥＰＴ  ＮＭＲを表す。
【００２３】
［発明の詳細な説明］
本発明は、Ａｎｉｓｏｃｈｉｌｌｕｓ（シソ科）から単離された、一般式Ｉで表されるピマランジテルペン系化合物としてスタンダード化される抽出物／留出物に関する。Ａ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓは、１ｍの高さまで成長する直生の一年草であり、デカン半島に生息するインドの固有種である。成熟植物は、開花時、２００８年１０月にプネー，プランダールフォート地区で収集された。植物標本集は、プネー，ウエスタンサークルのインド植物調査局内に預けられている（受入番号ＳＰＪ−１）。植物原料に付着したゴミや不要な植物原料を拭き落とした。根は取り除き、地上部を陰干しし、切断及び粉砕した。
【００２４】
粉砕された地上部に、アセトン等の従来の溶媒を用いて抽出を行った。さらに、抽出物にアセトン、メタノール、酢酸エチル、アセトニトリル、クロロホルム、石油エーテルまたはそれらの組合せ等の従来の移動相を用いた一連のカラムクロマトグラフィ（ＣＣ）を行い、化合物の単離となる。前記単離の構想をスキーム１に示す。
【００２５】
（スキーム１）
0006049719.tif 000006
【００２６】
スキーム１から単離された化合物に、当業者において公知の方法及び分析技法により構造解釈を行い、式１、２及び３と、公知の化合物４（ヒドロキシキャビコール）を包含する、式Ｉで表される新規なピマランジテルペン系化合物を含むことが分かった。ＮＭＲスペクトルを表す図中に示されるＮＭＲスペクトル及び表１及び表２の詳細からも、さらに確認することができる。本発明の方法に基づきスタンダード化される抽出物／留出物から単離された、式１〜３で表されるそれぞれの化合物を包含する式Ｉで表される、新規なピマランジテルペン系化合物を以下に示す。
【００２７】
粉砕された地上部（１．１３ｋｇ）を室温にて、アセトンで抽出（３Ｌ×３×１４時間）する。アセトン可溶物をろ過し、減圧下にて濃縮し、石油エーテル中のアセトン溶出を極性５〜５０％に高めたカラムクロマトグラフィ（ＣＣ）を用いて分離し、緑色を帯びたアセトン抽出物を生成し、１８個の留出物（ＡＶ１〜ＡＶ１８）を回収する。
【００２８】
留出物ＡＶ３に、クロロホルム中のアセトニトリル溶出を０．５％〜３％まで勾配を持たせたＣＣを行い、８個の留出物（ＡＶ３ａ〜ｈ）を回収する。
【００２９】
留出物ＡＶ４に、移動相としてのクロロホルム中のアセトニトリルを１％〜４％まで勾配を持たせたＣＣを行い、１３個の留出物（ＡＶ４ａ〜ｍ）を回収する。
【００３０】
留出物ＡＶ４ｉ、ＡＶ４ｊ及びＡＶ３ｈを組み合わせ、クロロホルム中のアセトニトリル３％のＣＣを行い、生成システムとしての、シクロヘキサン中のアセトン２０％の分取薄層クロマトグラフィを行い、分離及び精製し、化合物１と２の混合物を得る。
【００３１】
留出物ＡＶ４ｋ、ＡＶ４ｌ及びＡＶ４ｍから化合物３を晶出により分離する。
【００３２】
留出物ＡＶ５に、クロロホルム中のアセトニトリル溶出を１％〜１５％まで勾配を持たせたＣＣを行い、１５個の留出物（ＡＶ５ａ〜ｏ）を回収する。留出物ＡＶ５ｎ及びＡＶ
５ｏは、ベンゼン中の酢酸エチル１０％の生成システムを用いて分取薄層クロマトグラフィを行うことで精製した化合物４を含む。
【００３３】
（一般式Ｉ）
0006049719.tif 000007
式中、Ｒ１、Ｒ、Ｒ３及びＲ４は、αまたはβのいずれかに配位される。
Ｒ１及びＲ３は、それぞれ−ＯＨを含む群から選択されるか、置換基Ｒ１とＲ３は共に過酸化物結合（−Ｏ−Ｏ−）を形成する；
Ｒ２及びＲ４は、それぞれＨまたはＯＨの群から選択される。
【００３４】
本発明は、式１で表される新規な化合物を包含する。
【００３５】
（化合物１）
0006049719.tif 000008
（２Ｓ，４ａＳ，４ｂＲ，８ａＲ，１０ａＳ）−２，４ｂ，８，８−テトラメチル−２−ビニルドデカヒドロ−８ａ，１０ａ−エピジオキシフェナントレン−４ａ−オル
式中、置換基Ｒ１とＲ３は、共に過酸化物結合（−Ｏ−Ｏ−）を形成する；
Ｒ２は水素、Ｒ４はＯＨ；置換基Ｒ１〜Ｒ４は、α配位である。
【００３６】
従って、本発明は、式２で表される新規な化合物を包含する。
【００３７】
（化合物２）
0006049719.tif 000009
（２Ｓ，４ａＲ，４ｂＲ，８ａＲ，９Ｒ，１０ａＳ）−２，４ｂ，８，８−テトラメチル−２−ビニルテトラデカヒドロフェナントレン−８ａ，９，１０ａ−トリオール
式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれＯＨであり、Ｒ４はＨである；
置換基Ｒ１とＲ２はトランスであり、Ｒ２とＲ４もまたトランスである。
【００３８】
従って、本発明はさらに、式３で表される新規な化合物を包含する。
【００３９】
（化合物３）
0006049719.tif 000010
（２Ｓ，４ａＳ，４ｂＳ，８ａＲ，９Ｒ，１０ａＳ）−２，４ｂ，８，８−テトラメチル−２−ビニルテトラデカヒドロフェナントレン−４ａ，８ａ，９，１０ａ−テトラオール
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれＯＨである；置換基Ｒ１及びＲ２は、トランスであり、Ｒ２とＲ４もまたトランスである。
【００４０】
以下に示すように、式４で表される公知の化合物もまた、Ａ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓから単離された規格化抽出物から単離された：
【００４１】
（４）
0006049719.tif 000011
４−アリルベンゼン−１，２−ジオール
【００４２】
従って、本発明は、Ａ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ（シソ科）から単離され、少なくともひとつの医薬品賦形剤／担体と任意に組み合わせられる化合物１〜４、すなわち、ピマラン−５，８−パーオキサイド、ピマラン−トリオール、ピマラン−テトロール、及びヒドロキシキャビコールからなる、式Ｉで表されるピマランジテルペン系化合物としてスタンダード化される抽出物／留出物を提供する。
【００４３】
化合物１〜４は、分離、沈殿、結晶化、順相クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィ、またはそれらの組合せから選択される分離技術の少なくともひとつを使用することにより、留出物／抽出物から単離される。
【００４４】
化合物の構造を、図１〜４及び表１と２に示すＮＭＲスペクトルによる詳細分析により、説明する。
【００４５】
【表１】
0006049719.tif 000012
【００４６】
【表２】
0006049719.tif 000013
【００４７】
他の実施形態によると、単離された化合物は、ヒト型結核菌に対する有効作用の可能性や薬物療法に限定されない他の使用方法を含む、さまざまな活性について研究がされている。
【００４８】
表３に示すように、本発明の化合物１〜４の抗菌活性を検査し、前記化合物は、ヒト（型）結核菌に対して良好な抗菌活性を持つことが分かった。表３に示すように、前記化合物３の、その抗腫瘍活性を検査し、化合物３の活性は、公知の標準薬であるパクリタキセルに相当するものと分かった。
【００４９】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、哺乳類における結核の予防、治療、抑制または成長と増殖のコントロールのための、Ａ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓから単離され、ピマランジテルペン系化合物としてスタンダード化される抽出物または留出物から選択される、少なくとも一成分を含む医薬組成物である。
【００５０】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、哺乳類における様々ながんの予防、治療、抑制または成長と増殖のコントロールのための、Ａ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓから単離され、ピマランジテルペン系化合物としてスタンダード化される抽出物または留出物から選択される、少なくとも一成分を含む医薬組成物である。
【００５１】
前記がんは、乳がん、前立腺がん、膵臓（すいぞう）がんまたは膀胱がん等から選択されてもよい。
【００５２】
他の好ましい実施形態において、本発明は、生物学的に活性の原料（哺乳類における結核活性の予防、治療、抑制または成長と増殖のコントロールのための、薬学的または栄養学的に許容可能な活性材料、ビタミン、アミノ酸、ミネラル、並びに、薬学的または栄養学的に許容可能な賦形剤、媒体、キャリア、及び希釈剤またはそれらの混合物）から選択される少なくとも一成分と組み合わせ、Ａｎｉｓｏｃｈｉｌｕｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓから単離され、ピマランジテルペン系化合物としてスタンダード化される抽出物または留出物から選択される、少なくとも一成分を含む医薬組成物である。
【００５３】
さらに他の好ましい実施形態において、本発明は、生物学的に活性の原料（；哺乳類におけるがんの予防、治療、抑制または成長と増殖のコントロールのための、薬学的または栄養学的に許容可能な活性材料、ビタミン、アミノ酸、ミネラル、並びに、薬学的または栄養学的に許容可能な賦形剤、媒体、キャリア、及び希釈剤またはそれらの混合物）から選択される少なくとも一成分と組み合わせ、Ａ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓから単離され、ピマランジテルペン系化合物としてスタンダード化される抽出物または留出物から選択される、少なくとも一成分を含む医薬組成物である。
【００５４】
薬学的または栄養学的に許容可能な賦形剤は、当技術分野で周知の界面活性剤、バインダー、崩壊剤、潤滑剤、防腐剤、安定剤、緩衝材等の媒体、希釈剤及びキャリアを包含する。本発明の組成物は、錠剤、顆粒、軟カプセル剤、硬カプセル剤、小丸薬、軟質ゲル剤、丸剤、粉末、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、エアロゾル、食料、飲料、注射及び坐剤等の従来の投薬剤形で処方されてもよい。
【００５５】
他のさらに好ましい実施形態において、本発明は、Ａ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓから単離され、ピマランジテルペン系化合物としてスタンダード化された抽出物及び留出物あるいはそれらの医薬組成物を投与することを含む、哺乳類における結核の治療または増殖のコントロールの方法を提供する。
【００５６】
他の好ましい実施形態において、本発明は、被験対象に対する結核の治療または増殖のコントロールに有用な薬品の製造において、Ａ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓから単離され、ピマランジテルペン系化合物としてスタンダード化された抽出物及び留出物あるいはそれらの医薬組成物の使用を提供する。
【００５７】
他の好ましい実施形態において、本発明は、被験対象に対するがんの治療または増殖のコントロールに有用な薬品の製造において、Ａ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓから単離され、ピマランジテルペン系化合物としてスタンダード化された抽出物及び留出物あるいはそれらの医薬組成物の使用を提供する。本発明における前記被験対象とは、哺乳類である。
【００５８】
他の好ましい実施形態において、本発明は、濃度を０．０１％〜９９質量％とすることで所望の治療効果をもたらす抽出物及び留出物と、賦形剤または追加作用剤となる残存分とがこの組成物にシナジー効果をもたらす、Ａ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ由来の抽出物及び留出物を提供する。
【００５９】
本発明における組成物は、経口的、局所的、非経口的、または吸入により、必要な被験対象または哺乳類または温血動物に投与され、前記成分または組成物は、１日１回または１日複数回または内科医／医師の処方通りに投与される。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態を含む以下実施例は、本発明の実施形態を説明するために例示されるものであり、当然のことながら、その示された詳細は実施例によるものであり、本発明の好ましい実施形態に係る事例説明を目的とするものである。
【実施例】
【００６１】
（実施例１）
粉砕されたＡｎｉｓｏｃｈｉｌｕｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓの地上部（１．１３ｋｇ）を２５℃の温度で、アセトンで抽出（３×３Ｌ，１４時間）する。その混合物をろ過し、減圧下にて濃縮し、緑色を帯びたアセトン抽出物（３９．７ｇ）を生成する。アセトン抽出物、３８ｇに、石油エーテル中のアセトンを極性５〜５０％に高めたカラムクロマトグラフィ（ＣＣ）を用いて留出し、緑色を帯びたアセトン抽出物を生成し、１８個の留出物（ＡＶ１〜ＡＶ１８）を生成する。
【００６２】
留出物ＡＶ４（１．８ｇ）に、クロロホルム中のアセトニトリルを１％〜４％のＣＣを行い、１３個の副留出物（ＡＶ４ａ〜ＡＶ４ｍ）を得る。留出物ＡＶ４ｉ、ＡＶ４ｊ及びＡＶ３ｈを組み合わせ、クロロホルム中のアセトニトリル３％のＣＣを行い、化合物１と２の混合物を得た後、シクロヘキサン中の酢酸エチル３０％の分取薄層クロマトグラフィを行い、分離及び精製する。留出物ＡＶ４ｋ、ＡＶ４ｌ及びＡＶ４ｍから化合物３を晶出する。
【００６３】
留出物ＡＶ５（４．０ｇ）に、クロロホルム中のアセトニトリル１％〜１５％のＣＣを行い、１５個の副留出物（ＡＶ５ａ〜ｏ）を生成する。副留出物ＡＶ５ｎ及びＡＶ５ｏは、ベンゼン中の酢酸エチル１０％の分取薄層クロマトグラフィを行い精製された化合物４を含む。
【００６４】
（実施例２）
抗抗酸菌活性
全ての単離された化合物及びアセトン抽出物について、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において、室内で維持されたヒト型結核菌Ｈ３７Ｒａ培養物に対する効果を検査した。
【００６５】
ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒａ（ＡＴＣＣ  ２５１７７）細胞は、増殖期（Ｏ．Ｄ．５９５〜１．０）、好気条件下、合成培地（Ｍ．ｐｈｅｌｉ  ｍｅｄｉｕｍ）にて、３７℃及び１５０ｒｐｍにて維持された振とう培養機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  ４８１）内で成長させた。成長後、培養物を２分間、超音波
処理器で超音波分解した。超音波分解された細胞を、マイクロウェルプレートへの接種に使用した。９６個のウェルプレートのそれぞれのウェルに、〜１０５細胞／ｍｌを含む培養物２５０μｌを添加した。予備検査用に、終濃度１００ｕｇ／ｍｌを得るため、ＤＭＳＯに溶解させた試験試料２．５μｌをそれぞれのウェルに添加する。活性化合物の容量反応曲線は、試験試料を段階希釈することにより得られた。それから、プレートをＣＯ２培養器内にて３７℃で培養する。
【００６６】
生存細胞数を測定するため、培養８日目にプレートを取り除いた。ＸＴＴの添加前に、ＭＩＣ算出のためのブランクとして用いられる培養物について、４７０ｎｍでの光学濃度を測定した。２００μＭ  ＸＴＴを添加し、１分間振った後、３７℃で２０分間培養した。２０分間培養した後、６０μＭのメナジオンを添加し、１分間混合し、それからさらに３７℃で４０分間培養した。最後に、懸濁液について、マイクロプレートリーダを用い、４７０ｎｍでの光学濃度を測定した。
【００６７】
化合物１〜４は、ヒト型結核菌に対して抑制を示した（表３）。
【００６８】
（実施例３）
細胞毒性研究
化合物３について、インド、国立細胞貯蔵所から入手したＴＨＰ−１（ヒト型急性白血病細胞（Ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ））細胞株に対する、ＩＣ９０値およびさらに高濃度の１００μｇ／ｍｌでの、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）における細胞毒性を検査した。その抑制割合値を表３に示す。
【００６９】
９６個の組織培養ウェルプレートのそれぞれから約１０，０００個の細胞を取り出し、化合物３と共に、ＩＣ９０値及び高濃度の１００μｇ／ｍｌで７２時間、処理をした。溶媒対照（ＤＭＳＯ、１％）及び陽性対照（パクリタキセル、１００μｇ／ｍｌ）を同時に行った。細胞増殖は、細胞培養地に溶解され、その後、３７℃、５％のＣＯ２及び９５％の水分の培養器内でさらに１時間培養されたテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）の５ｍｇ／ｍｌ原液から１０μｌを用いて評価した。形成されたすみれ色のホルマザン水晶をイソプロパノール２００μｌ中で可溶化し、さらに４時間培養した。
【００７０】
４９０ｎｍフィルターのマイクロプレートリーダ（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｐｌｕｓ３８４プレートリーダー、モレキュラーデバイスインク）を用いて、細胞の入っていないウェルから準備されたブランクについて光学濃度を測定した。ＤＭＳＯキャリア単独で処理された細胞の吸光度を、１００％の細胞成長とした。全ての検査は３回実施され、その定量値は、平均値±標準偏差であった。
【００７１】
化合物３は、１００μｇ／ｍｌあたりで、Ｔｈｐ−１細胞株に対して５７．２３％の抑制を示した（表３）。
【００７２】
【表３】
0006049719.tif 000014
ａ１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、
ｂヒト型結核菌の成長に対して抑制９０％を示す化合物の濃度
ｃ１００μｇ／ｍｌあたりの抑制％
ｄＩＣ５０＝ヒト型結核菌の成長に対して抑制５０％を示す化合物の濃度。上記表より、化合物３は抗がん活性をもつこと、化合物１〜４は抗抗酸菌活性をもつことが明白である。
【００７３】
（実施例４）
Ａｎｉｓｏｃｈｉｌｕｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ由来の組成物
【００７４】
実施例（ｉ）
組成：
化合物１                  １０．０％  ｗ／ｗ
アマランス色              ０．３  ｗ／ｗ
ラズベリーフレーバー      ０．７％  ｗ／ｗ
ステアリン酸マグネシウム  ２．０％  ｗ／ｗ
マンニトール              適量〜１００．０％  ｗ／ｗ  
活性成分とステアリン酸マグネシウムとを混合し、適当な大きさのカプセルに入れる。
投与方法：前記カプセルは、水または抽出液（ｊｕｉｃｅ）で投与する。
【００７５】
実施例（ｉｖ）
組成：
式Ｉの化合物              ２０．０％  ｗ／ｗ
アマランス色              ０．３  ｗ／ｗ
ラズベリーフレーバー      ０．７％  ｗ／ｗ
ステアリン酸マグネシウム  ２．０％  ｗ／ｗ
マンニトール              適量〜１００．０％  ｗ／ｗ  
手段：マンニトールを水に溶解し、それに色とフレーバーを添加する。
マンニトールに色とフレーバーを吸収させるために、水を蒸発させる。
活性成分とステアリン酸マグネシウムとを混合し、適当な大きさのカプセルに入れる。
投与方法；  
投与方法：前記カプセルは、水または抽出液（ｊｕｉｃｅ）で投与する。
【００７６】
実施例（ｖ）
組成：
式Ｉの化合物              １０．０％  ｗ／ｗ
アマランス色              ０．３  ｗ／ｗ
ラズベリーフレーバー      ０．７％  ｗ／ｗ
ステアリン酸マグネシウム  ２．０％  ｗ／ｗ
マンニトール              適量〜１００．０％  ｗ／ｗ  
手段：マンニトールを水に溶解し、それに色とフレーバーを添加する。
マンニトールに色とフレーバーを吸収させるために、水を蒸発させる。
活性成分とステアリン酸マグネシウムとを混合し、錠剤として圧縮する。
投与方法；
投与方法：前記錠剤は、水または抽出液（ｊｕｉｃｅ）で投与する。
【００７７】
実施例（ｖｉ）
組成：
式Ｉの化合物              １０．０％  ｗ／ｗ
アマランス色              ０．３  ｗ／ｗ
ラズベリーフレーバー      ０．７％  ｗ／ｗ
ステアリン酸マグネシウム  ２．０％  ｗ／ｗ
マンニトール              適量〜１００．０％  ｗ／ｗ  
手段：マンニトールを水に溶解し、それに色とフレーバーを添加する。
マンニトールに色とフレーバーを吸収させるために、水を蒸発させる。
活性成分とステアリン酸マグネシウムとを混合し、錠剤として圧縮する。
投与方法：前記錠剤は、水または抽出液（ｊｕｉｃｅ）で投与する。
【００７８】
実施例（ｖｉｉ）
組成：
式Ｉの化合物              ５．０％  ｗ／ｗ
アマランス色              ０．３  ｗ／ｗ
ラズベリーフレーバー      ０．７％  ｗ／ｗ
ステアリン酸マグネシウム  ２．０％  ｗ／ｗ
マンニトール              適量〜１００．０％  ｗ／ｗ  
手段：マンニトールを水に溶解し、それに色とフレーバーを添加する。
マンニトールに色とフレーバーを吸収させるために、水を蒸発させる。
活性成分とステアリン酸マグネシウムとを混合し、ポーチまたはボトルに入れる。
投与方法：水／抽出液（ｊｕｉｃｅ）中で粉を分散させる。
【００７９】
（発明の効果）
本発明の化合物１、２、３及び４の分析後、それらの抗結核特性からヒト型結核菌に対して有効であると分かった。
化合物３は、ＴＨＰ−１細胞株に対し抗がん活性を示す。
本研究の植物は、抗結核及び抗がん活性の両方を示すことから、結核及びがんの治療に使用される見込みがある。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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