(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃癌の転移腫瘍細胞を検出する方法であって、
当該方法は、卵巣から得られる試料又はリンパ節から得られる試料、および対照試料を、ＣＬＤ１８Ａ２に特異的に結合する抗体と、前記抗体あるいはその一部とＣＬＤ１８Ａ２との間で複合体の形成を許容する条件下で接触させるものであり、
前記試料における複合体形成の増加量にて前記試料における転移細胞を標示する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記転移腫瘍細胞はクルーケンベルク腫瘍の細胞である、方法。
【請求項３】
抗体及び／又は治療薬に結合した前記抗体を含む複合体、及び医薬的に許容される担体を含有する、胃癌転移を治療する方法に使用される医薬組成物であって、
前記抗体は、ＣＬＤ１８Ａ２に結合する能力を有し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）媒介性細胞溶解、又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介性細胞溶解を誘導することによって、ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞の死滅を媒介する及び／又はＣＬＤ１８Ａ２を発現する前記細胞の増殖の阻害を媒介する、前記胃癌転移を治療する方法に使用される抗体である、医薬組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の医薬組成物であって、
前記抗体は、ＣＬＤ１８Ａ１及びＣＬＤ１８Ａ２に結合する、医薬組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の医薬組成物であって、
前記抗体は、ＣＬＤ１８Ａ２に結合するが、ＣＬＤ１８Ａ１には結合しない、医薬組成物。
【請求項６】
請求項３乃至５いずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記細胞の死滅及び／又は増殖の阻害が、前記細胞によって発現されるＣＬＤ１８Ａ２への前記抗体の結合によって誘導される、医薬組成物。
【請求項７】
請求項３乃至６いずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記細胞の死滅及び／又は増殖の阻害が、前記細胞によって発現されるＣＬＤ１８Ａ１への前記抗体の結合によって誘導されない、医薬組成物。
【請求項８】
請求項３乃至７いずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記抗体は、前記細胞の前記ＣＤＣ媒介性細胞溶解を誘導しない、医薬組成物。
【請求項９】
請求項３乃至８いずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記ＡＤＣＣ媒介性細胞溶解が、単球、単核細胞、ＮＫ細胞及びＰＭＮから成る群より選択されるエフェクター細胞の存在下で起こる、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項３乃至９いずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記抗体は、モノクローナル、キメラ又はヒト化抗体、又は抗体のフラグメントである、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項３乃至１０いずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ抗体から成る群より選択される、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項３乃至１１いずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記ＣＬＤ１８Ａ２が配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項４乃至１２いずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記ＣＬＤ１８Ａ１が配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項３乃至１３いずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記抗体は、胃癌細胞に特異的である、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項３乃至１４いずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記ＣＬＤ１８Ａ２が前記細胞の表面上で発現される、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項３乃至１５いずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記抗体は、配列番号２、４、６、１６、１８、２０〜２３、２６〜３１、１５１、１５３、及び１５５〜１５７から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはペプチド、又は前記タンパク質、ペプチドを発現する核酸又は宿主細胞で動物（ヒトを除く。）を免疫する工程を含む方法によって得られる、医薬組成物。
【請求項１７】
抗体及び／又は治療薬に結合した前記抗体を含む複合体、及び医薬的に許容される担体を含有する、胃癌転移を治療する方法に使用される医薬組成物であって、
前記抗体は、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３７、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３８、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３９、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４０、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４１、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４２、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４３、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４５、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４６、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４７、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４８、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０８、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０９、又はＤＳＭ  ＡＣＣ２８１０の下に寄託されたクローンによって産生される、前記胃癌転移を治療する方法に使用される抗体である、医薬組成物。
【請求項１８】
請求項３乃至１７のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記治療薬が、毒素、放射性同位体、薬剤又は細胞傷害性物質である、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項３乃至１８のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記胃癌転移はリンパ節転移である、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
癌のための抗体に基づく治療法は、従来の薬剤と比較してより高い特異性とより低い副作用プロフィールの潜在的可能性を有する。その理由は、抗体による正常細胞と腫瘍細胞の正確な識別と、それらの作用機構が、補体の活性化及び細胞傷害性免疫細胞の動員などの、より毒性の低い免疫学的抗腫瘍機構に基づくという事実にある。
【０００２】
抗体療法のための標的は、正常細胞と腫瘍細胞の正しい識別の基礎を形成する、特定の性質を有する必要がある。明らかに、腫瘍細胞に排他的に制限され、正常組織では完全に検出不能である標的は、効率的で安全な抗体療法の開発のために理想的である。もう１つの態様では、高レベルの過剰発現が、ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ−２）によって例示される治療ウインドウ及び低い副作用のための基礎とすることができ、遺伝子増幅の結果としてのＨＥＲ−２は、抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の良好な標的である。
【０００３】
腫瘍治療に関して既に承認されている又は臨床開発中である抗体の他の標的は、腫瘍細胞上での標的分子の数的な過剰発現には基づかない、異なる性質を有する。プロテオグリカンＭＵＣ−１に対する抗体の場合は、標的の骨格内のペプチド性反復エピトープが腫瘍細胞ではグリコシル化不十分であり、それ故その正常対応物へと変化する。ＣＤ２０（リツキシマブ）、ＣＤ５２（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）及びＣＤ２２（エプラツズマブ）に対する抗体の場合は、抗体標的が腫瘍細胞と正常リンパ球上で同等の発現レベルを有する。この場合は、標的陰性幹細胞が正常なリンパ球レパートリーを回復するので、抗体による正常細胞の切断は耐容される。抗体標的の区別的アクセス可能性の他の例は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びカルボアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡ９）である。どちらの抗原も、それぞれ結腸及び腎臓の正常上皮で発現される。しかし、放射性標識イメージング抗体は腫瘍と正常組織を正しく識別し、細胞傷害性抗体は良好に耐容される。これは、おそらくＩｇＧ抗体がアクセスできない正常上皮組織の管腔側でのＣＡ９及びＣＥＡの発現が制限されていることによるものであると考えられる。抗原上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）もこのカテゴリーに属する。上皮細胞についての同型細胞接着分子として、Ｅｐ−ＣＡＭは細胞間隙に局在する。興味深いことに、高親和性抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体は非常に毒性が強いが、中間親和性の抗体は良好に耐容される。これは、正常細胞上のＥｐ−ＣＡＭ標的のアクセス可能性を示唆するだけでなく、抗体結合の動力学が治療ウインドウを開き得ることも示す。
【０００４】
１つの可能性として、細胞間接着に関与する他の上皮細胞特異的タンパク質が抗体アプローチにとって魅力的でもある。というのは、それらは、良好に組織化された上皮では抗体にほとんどアクセスできないが、腫瘍細胞上では露出されると考えられるからである。本発明者らはそれ故、治療用抗体の標的としての適切性に関して上皮組織構造を組織化することに関与するタンパク質を分析した。特に本発明者らの関心を引いたタンパク質はクローディン１８である。
【０００５】
クローディン１８（ＣＬＤ１８）分子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：スプライス変異体１（ＣＬＤ１８Ａ１）：ＮＰ＿０５７４５３、ＮＭ＿０１６３６９、及びスプライス変異体２（ＣＬＤ１８Ａ２）：ＮＭ＿００１００２０２６、ＮＰ＿００１００２０２６）は、約２７．９／２７．７２ｋＤの分子量を有する内在性膜貫通タンパク質である。クローディンは、上皮と内皮の密着結合内にある内在性膜タンパク質である。密着結合は、隣接する細胞の間で膜内粒子の相互に連結された鎖のネットワークを組織する。密着結合においては、オクルディンとクローディンが最も著明な膜貫通タンパク質成分である。それらは、強力な細胞間接着特性により一次バリヤーを創製し、溶質の傍細胞輸送を防ぎ、制御する。そして、細胞の極性を維持するために膜脂質及びタンパク質の側方拡散を制限する。密着結合形成タンパク質は、上皮組織構造を組織することに強く関与する。本発明者らは、そのようなタンパク質は良好に組織化された上皮では抗体にかろうじてアクセス可能であり得るが、腫瘍細胞上では露出されると推測した。
【０００６】
ＣＬＤ１８はテトラスパニンであり、それ自体４つの疎水性領域を有する。本発明者らは、ＣＬＤ１８が、抗体によって選択的に指定され得る、いくつかの異なるコンフォメーションを呈することを指示するデータを作成した。１つのコンフォメーション（ＣＬＤ１８−コンフォメーション１）は、４つの疎水性領域すべてが正規膜貫通ドメイン（ＴＭ）としての機能を果たし、クローディンファミリー成員の大部分に関して記述されているように、２つの細胞外ループ（疎水性領域１と疎水性領域２によって囲まれたループ１；疎水性領域３と４によって囲まれたループ２）が形成されることを示唆する。２番目のコンフォメーション（ＣＬＤ１８−コンフォメーション２）は、テトラスパニンファミリーのもう１つの成員であるＰＭＰ２２に関して記述されているように（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．６２：１５−２７，２０００）、２番目と３番目の疎水性ドメインは形質膜を完全には横断していないので、１番目と４番目の膜貫通ドメインの間の部分（ループＤ３）は細胞外であることを示唆する。３番目のコンフォメーション（ＣＬＤ１８−コンフォメーション３）は、正規膜貫通ドメインとして働く、１番目と４番目の疎水性領域によって囲まれた２つの内部疎水性領域を有する大きな細胞外ドメインを示唆する。ループＤ３内に古典的Ｎグリコシル化部位が存在することにより、クローディン１８のトポロジー変異体、ＣＬＤ１８トポロジー２及びＣＬＤ１８トポロジー３は付加的な細胞外Ｎグリコシル化部位を保持する。
【０００７】
マウス及びヒトにおいて記述されている（Ｎｉｉｍｉ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：７３８０−９０，２００１）、２つの異なるスプライス変異体の存在により、ＣＬＤ１８分子にさらにもう１つのレベルの複雑さが加わる。スプライス変異体ＣＬＤ１８Ａ１及びＣＬＤ１８Ａ２は、１番目のＴＭとループ１を含む、最初の２１個のＮ末端アミノ酸が異なるが、Ｃ末端の一次タンパク質配列は同じである。
【０００８】
ＣＬＤ１８Ａ１は正常な肺及び胃上皮で選択的に発現されるが、ＣＬＤ１８Ａ２は胃細胞上でしか発現されない（Ｎｉｉｍｉ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：７３８０−９０，２００１）。最も重要な点として、ＣＬＤ１８Ａ２は胃上皮の分化した短命細胞に限定されるが、胃幹細胞領域からは欠如している。高感度ＲＴ−ＰＣＲを使用して、本発明者らは、両方の変異体がいかなる他の正常ヒト器官においても全く検出不能であるが、胃、食道、膵臓及び肺腫瘍を含むいくつかの癌型並びにヒト癌細胞系において確実に発現されることを示した。発現は、これらの適応症の腺癌亜型において最も著明である。
【０００９】
タンパク質の分子量は、一部の癌と隣接正常組織において異なる。健常組織で認められるより高い分子量のタンパク質は、組織溶解産物を脱グリコシル化化合物ＰＮＧアーゼＦで処理することにより、癌で認められるのと同じ分子量に移すことができる。これは、ＣＬＤ１８が、その正常組織対応物と比較して癌ではよりＮグリコシル化されていないことを示唆する。この構造的な相違は変化したエピトープを生じさせると考えられる。古典的Ｎグリコシル化モチーフは、分子のループＤ３ドメイン内のａａ１１６に位置する。
【００１０】
本発明における「ＣＬＤ１８」及び「ＣＬＤ１８変異体」という用語は、（ｉ）ＣＬＤ１８−スプライス変異体、（ｉｉ）ＣＬＤ１８−Ｎグリコシル化変異体、（ｉｉｉ）ＣＬＤ１８−立体配座変異体、（ｉｖ）細胞間密着結合に局在するＣＬＤ１８−遊離及び同型／異型結合変異体、及び（ｖ）ＣＬＤ１８−癌関連及びＣＬＤ１８−癌細胞非関連変異体を包含する。
【００１１】
ＣＬＤ１８の分子的及び機能的特徴は、この分子を抗体に基づく癌治療のための極めて興味深い標的とする。これらは特に、（ｉ）毒性関連正常組織の大部分におけるＣＬＤ１８の不在、（ｉｉ）ＣＬＤ１８Ａ２変異体の発現が、胃の標的陰性幹細胞によって補充され得る、分化した胃細胞のような欠失可能な細胞集団に限定されること、（ｉｉｉ）正常細胞と腫瘍細胞の間で潜在的に異なるグリコシル化の示唆、及び（ｉｖ）種々の立体配座トポロジーの存在である。さらに、密着結合タンパク質としてのＣＬＤ１８の役割は、良好な治療ウインドウにさらに寄与し得る。腫瘍細胞はクローディンを発現するが、しばしば、正常上皮組織で認められるようなクローディンの同型及び異型結合による古典的密着結合を形成しないので、腫瘍細胞は、細胞外抗体結合及び免疫療法に従いやすい遊離クローディンのかなりのプールを有すると考えられる。健常上皮におけるクローディンの結合エピトープは、密着結合内でそのような抗体によるアクセスから保護されている可能性がある。
【００１２】
さらに、原発性腫瘍だけでなく、ＣＬＤ１８Ａ２発現原発性腫瘍、特に胃腫瘍に由来する転移に関しても、本発明において認められる高い細胞膜発現は、ＣＬＤ１８Ａ２特異的抗体を癌転移、特にリンパ節転移、腹膜転移及びクルーケンベルク腫瘍などの胃腫瘍に由来する転移の予防、治療及び／又は診断のための有用なツールにする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、腫瘍疾患などの、ＣＬＤ１８が発現される疾患の治療のために有用な抗体を提供することである。本明細書で述べる抗体はまた、そのような疾患の診断においても有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、一般に、腫瘍関連疾患、例えば胃癌、食道癌、膵癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝癌、頭頸部癌及び胆嚢癌、及びそれらの転移、特にクルーケンベルク腫瘍、腹膜転移及びリンパ節転移などの胃癌転移を含む、ＣＬＤ１８を発現する細胞に関連する疾患を治療する及び／又は予防するための治療薬として有用な抗体を提供する。
【００１５】
１の態様において、本発明は、ＣＬＤ１８に結合する能力を有する抗体に関する。好ましくは、抗体は、細胞表面で発現されるＣＬＤ１８に結合する能力を有し、好ましくはＣＬＤ１８の細胞外部分内に位置する、好ましくは１番目の細胞外ドメイン（ＣＬＤ１８のアミノ酸２９〜７８位）内に位置する１又はそれ以上のエピトープに結合する。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号１５１、１５３、１５５、１５６及び１５７から成る群より選択される１又はそれ以上のペプチドに結合する。好ましくは、抗体は癌細胞、特に上述した癌型の細胞に結合し、好ましくは、非癌細胞には実質的に結合しない。好ましくは、癌細胞などのＣＬＤ１８を発現する細胞への前記抗体の結合は、ＣＬＤ１８を発現する細胞の死滅を媒介する。好ましくは、抗体はＣＬＤ１８Ａ１及びＣＬＤ１８Ａ２に結合し、より好ましくはＣＬＤ１８Ａ２に結合するが、ＣＬＤ１８Ａ１には結合しない。好ましくは、本発明の抗体はＣＬＤ−コンフォメーション１のループ１又はループ２に結合し、それに対して特異的である。さらなる好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＣＬＤ−コンフォメーション２のループＤ３に結合し、それに対して特異的であり、特にループＤ３内の１１６位の潜在的Ｎグリコシル化部位に結合する又はその周囲に結合する。さらなる実施形態では、本発明の抗体は、ループＤ３内の１１６位の潜在的Ｎグリコシル化部位の非グリコシル化形態に特異的である。
【００１６】
好ましくは、ＣＬＤ１８Ａ２への本発明の抗体の結合は、ＣＬＤ１８Ａ２（配列番号２）の４２位のＡｌａ、４５位のＡｓｎ及び５６位のＧｌｕから成る群より選択される１又はそれ以上のアミノ酸を含む。好ましくは、本発明の抗体は、これらの位置のアミノ酸の１又はそれ以上、好ましくは全部が異なるアミノ酸によって、特にＣＬＤ１８Ａ１（配列番号８）内の対応する位置に認められるアミノ酸（Ａｌａ４２Ｓｅｒ，Ａｓｎ４５Ｇｌｎ及びＧｌｕ５６Ｇｌｎ）によって置換されている、ＣＬＤ１８Ａ２変異体又はそのフラグメントには結合しない。
【００１７】
本発明の抗体による細胞の死滅は、好ましくは前記細胞によって発現されるＣＬＤ１８への抗体の結合によって、より好ましくは前記細胞によって発現されるＣＬＤ１８Ａ２への抗体の結合によって引き起こされる。１の実施形態において、前記細胞によって発現されるＣＬＤ１８Ａ１への本発明の抗体の結合は、前記細胞の死滅を引き起こさない。そのような細胞の死滅は、本明細書で述べるように治療的に利用することができる。特に、細胞の死滅は、癌、特に癌の転移及び癌細胞の転移拡大を治療する又は予防するために利用できる。
【００１８】
ＣＬＤ１８を発現する細胞は、好ましくは癌細胞であり、特に、腫瘍形成性胃癌細胞、食道癌細胞、膵癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、結腸癌細胞、肝癌細胞、頭頸部癌細胞及び胆嚢癌細胞から成る群より選択される。
【００１９】
好ましくは、本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）媒介性細胞溶解、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介性細胞溶解、アポトーシス、同型接着、及び／又は食作用を引き起こすことによって、好ましくはＣＤＣ媒介性細胞溶解及び／又はＡＤＣＣ媒介性細胞溶解を引き起こすことによって、細胞の死滅を媒介する。
【００２０】
１の実施形態において、本発明の抗体は、細胞のＣＤＣ媒介性溶解を引き起こさない。
好ましくは、細胞のＡＤＣＣ媒介性溶解は、特定の実施形態では単球、単核細胞、ＮＫ細胞及びＰＭＮから成る群より選択される、エフェクター細胞の存在下で起こり、食作用はマクロファージによるものである。
【００２１】
本発明の抗体は、モノクローナル、キメラ、ヒト又はヒト化抗体、又は抗体のフラグメントとすることができ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、好ましくはＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ抗体から成る群より選択されることができる。
【００２２】
本発明のすべての態様によれば、ＣＬＤ１８は、好ましくはヒトＣＬＤ１８、好ましくはヒトＣＬＤ１８Ａ２であり、ＣＬＤ１８Ａ２は、好ましくは配列番号２に従ったアミノ酸配列を有し、ＣＬＤ１８Ａ１は、好ましくは配列番号８に従ったアミノ酸配列を有する。
【００２３】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、生細胞の表面上に存在するＣＬＤ１８の天然エピトープに結合する。さらなる好ましい実施形態では、本発明の抗体は、癌細胞、好ましくは胃癌細胞に特異的である。
【００２４】
本発明のある実施形態では、ＣＬＤ１８は細胞の表面上で発現される。
【００２５】
本発明の抗体は、配列番号２、４、６、１６、１８、２０、２１〜２３、２６〜３１、１５１、１５３、及び１５５〜１５７から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはペプチド、又はそれらの免疫原性フラグメントもしくは誘導体、又は前記タンパク質もしくはペプチド、又はそれらの免疫原性フラグメントもしくは誘導体を発現する核酸又は宿主細胞で動物を免疫する工程を含む方法によって得ることができる。好ましくは、本発明の抗体は上述されたタンパク質、ペプチド、又はそれらの免疫原性フラグメントもしくは誘導体に特異的である。免疫において使用されるタンパク質又はペプチドに関連して、誘導体は、それが由来するタンパク質又はペプチドと同じか又は同様の免疫原性を有する、そのようなタンパク質又はペプチドの変異体に関する。特に、タンパク質又はペプチドの誘導体は、抗体、特にモノクローナル抗体の生産のための免疫において使用されるとき、そのタンパク質又はペプチドを免疫において使用したときに得られる抗体と同じ特異性を有する抗体を提供する。例えば、そのような誘導体は１又はそれ以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含んでもよい。特に、Ｎ末端又はＣ末端のいずれか又は両方のシステインなどの１又はそれ以上のアミノ酸の付加、又はセリン残基によるシステイン残基の置換を含んでもよい。本明細書で提示するデータは、抗体結合のために重要でないＣＬＤ１８内のアミノ酸を明らかにする。従って、免疫のために使用される、本明細書で述べるＣＬＤタンパク質、ペプチド、その免疫原性フラグメント又はその誘導体は、抗体結合のために重要でない前記アミノ酸位置のアミノ酸の１又はそれ以上の置換を組み込むことができる。
【００２６】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３７（１８２−Ｄ１１０６−０５５）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３８（１８２−Ｄ１１０６−０５６）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３９（１８２−Ｄ１１０６−０５７）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４０（１８２−Ｄ１１０６−０５８）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４１（１８２−Ｄ１１０６−０５９）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４２（１８２−Ｄ１１０６−０６２）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４３（１８２−Ｄ１１０６−０６７）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４５（１８２−Ｄ７５８−０３５）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４６（１８２−Ｄ７５８−０３６）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４７（１８２−Ｄ７５８−０４０）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４８（１８２−Ｄ１１０６−０６１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０８（１８２−Ｄ１１０６−２７９）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０９（１８２−Ｄ１１０６−２９４）、又はＤＳＭ  ＡＣＣ２８１０（１８２−Ｄ１１０６−３６２）を有するクローンによって産生される。
【００２７】
１の実施形態において、本発明の抗体は、毒素、放射性同位体、薬剤又は細胞傷害性物質などの治療薬に結合される。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体を産生することができるハイブリドーマに関する。好ましいハイブリドーマは、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３７（１８２−Ｄ１１０６−０５５）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３８（１８２−Ｄ１１０６−０５６）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３９（１８２−Ｄ１１０６−０５７）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４０（１８２−Ｄ１１０６−０５８）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４１（１８２−Ｄ１１０６−０５９）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４２（１８２−Ｄ１１０６−０６２）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４３（１８２−Ｄ１１０６−０６７）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４５（１８２−Ｄ７５８−０３５）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４６（１８２−Ｄ７５８−０３６）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４７（１８２−Ｄ７５８−０４０）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４８（１８２−Ｄ１１０６−０６１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０８（１８２−Ｄ１１０６−２７９）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０９（１８２−Ｄ１１０６−２９４）、又はＤＳＭ  ＡＣＣ２８１０（１８２−Ｄ１１０６−３６２）を有するものである。
【００２９】
本発明の抗体は、本明細書では、抗体の名称、例えば１８２−Ｄ７５８−０３５に言及することによって、及び／又は抗体を産生するクローン、例えば２６Ｄ１２に言及することによって指定される。
【００３０】
本発明はまた、本発明の抗体及び／又は治療薬とのその複合体、及び医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物に関する。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、ＣＬＤ１８、好ましくはＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞を本発明の抗体及び／又は治療薬とのその複合体の有効量と接触させることを含む、前記細胞の増殖を阻害する及び／又は細胞を死滅させる方法に関する。ＣＬＤ１８は、好ましくは前記細胞の表面上で発現される。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体、治療薬とその複合体、又は本発明の抗体もしくは治療薬とのその複合体を有する医薬組成物を被験者に投与することを含む、ＣＬＤ１８、好ましくはＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞が関与する疾患又は障害を治療する又は予防する方法に関する。好ましくは、疾患又は障害は腫瘍関連疾患であり、特定の実施形態では、胃癌、食道癌、膵癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝癌、頭頸部癌、胆嚢癌及びそれらから生じる転移から成る群より選択される。ＣＬＤ１８は、好ましくは前記細胞の表面上で発現される。
好ましくは、本発明の抗体は、癌細胞及び非悪性細胞を含む、異なる細胞型によって発現されるＣＬＤ１８変異体を識別する能力を有する。特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＣＬＤ１８Ａ２に結合する能力を有するが、ＣＬＤ１８Ａ１には結合しない、又はＣＬＤ１８Ａ２に対する結合特異性と比較してより低い特異性を有するＣＬＤ１８Ａ１に結合する。
【００３３】
本発明における「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関する。「特異的結合」とは、抗体などの物質が、別の標的への結合と比較して、それが特異的であるエピトープなどの標的により強く結合することを意味する。ある物質は、２番目の標的についての解離定数より低い解離定数（ＫＤ）を有する１番目の標的に結合する場合、２番目の標的と比較して１番目の標的により強く結合する。好ましくは、その物質が特異的に結合する標的についての解離定数（ＫＤ）は、物質が特異的に結合しない標的についての解離定数（ＫＤ）より１０倍以上、好ましくは２０倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらに一層好ましくは１００倍、２００倍、５００倍又は１０００倍以上低い。
【００３４】
好ましくは、本発明の抗体は、ＣＬＤ１８、好ましくはＣＬＤ１８Ａ２に関して１０−６Ｍ又はそれ以下、好ましくは１０−７Ｍ又はそれ以下、好ましくは１０−８Ｍ又はそれ以下、又は好ましくは１０−９Ｍ又はそれ以下の解離定数を有する。好ましくは、本発明の抗体は、ＣＬＤ１８、好ましくはＣＬＤ１８Ａ２に関して１０−８Ｍ〜１０−９Ｍの範囲内の解離定数を有する。
【００３５】
本発明の抗体は、ＣＬＤ１８、好ましくはＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞の死滅を、好ましくは前記細胞の表面上で発現される、ＣＬＤ１８に結合することによって媒介する。１の実施形態において、本発明の抗体は、ＣＬＤ１８を発現する細胞の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を引き起こし、例えば少なくとも約２０〜４０％のＣＤＣ媒介性細胞溶解、好ましくは約４０〜５０％のＣＤＣ媒介性細胞溶解、より好ましくは５０％を超えるＣＤＣ媒介性細胞溶解を引き起こす。そのような抗体は、本明細書では以下の抗体によって例示される：３７Ｈ８、３８Ｇ５、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、６１Ｃ２、２６Ｂ５、２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、１６３Ｅ１２、１７５Ｄ１０、４５Ｃ１、１２５Ｅ１、ｃｈ−１６３Ｅ１２、及びｃｈ−１７５Ｄ１０。あるいは又はＣＤＣを誘導することに加えて、本発明の抗体は、エフェクター細胞（例えば単球、単核細胞、ＮＫ細胞及びＰＭＮ）の存在下でＣＬＤ１８を発現する細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を引き起こすことができる。そのような抗体は、本明細書では以下の抗体によって例示される：３７Ｇ１１、３７Ｈ８、３８Ｇ５、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、４３Ａ１１、６１Ｃ２、２６Ｂ５、２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、４２Ｅ１２、１６３Ｅ１２、１７５Ｄ１０、４５Ｃ１、及び１２５Ｅ１。本発明の抗体は、ＣＬＤ１８を発現する細胞のアポトーシスを引き起こす、ＣＬＤ１８を発現する細胞の同型接着を引き起こす及び／又はマクロファージの存在下でＣＬＤ１８を発現する細胞の食作用を引き起こす能力を有していてもよい。本発明の抗体は、上述した機能特性の１又はそれ以上を有し得る。好ましくは、本発明の抗体は、ＣＬＤ１８を発現する細胞のＣＤＣ媒介性細胞溶解及びＡＤＣＣ媒介性細胞溶解を誘導し、より好ましくはＣＬＤ１８を発現する細胞のＡＤＣＣ媒介性細胞溶解を誘導するが、前記細胞のＣＤＣ媒介性細胞溶解を引き起こさない。本発明の抗体についての例示的な標的細胞は、腫瘍形成性胃癌細胞、膵癌細胞、食道癌細胞及び肺癌細胞などの、ＣＬＤ１８、好ましくはＣＬＤ１８Ａ２を発現する癌細胞を含むが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態では、本発明の抗体によって媒介される細胞の死滅はＣＬＤ１８Ａ２特異的である、すなわち本発明の抗体は、ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞の死滅、好ましくはＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ媒介性細胞溶解を媒介するが、ＣＬＤ１８Ａ１を発現するがＣＬＤ１８Ａ２を発現しない細胞の死滅は媒介しない。上述した抗体は、胃癌、食道癌、膵癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝癌、頭頸部癌及び胆嚢癌及び／又はそれらの転移などの癌の治療又は予防において腫瘍細胞の死滅を媒介するために使用することができる。
【００３６】
本発明の抗体は、それらの結合特性及びＣＬＤ１８を発現する細胞上でエフェクター機能を媒介するそれらの能力に従って異なるクラスに分類することができる。本発明の抗体は、以下に従って分類され得る：
・ＣＬＤ１８Ａ１又はＣＬＤ１８Ａ２のいずれかを発現する細胞上で媒介される結合特性及び／又はエフェクター機能（ＣＬＤ１８スプライス変異体の識別）、
・グリコシル化又は非グリコシル化ＣＬＤ１８変異体のいずれかを発現する細胞上で媒介される結合特性及び／又はエフェクター機能（Ｎグリコシル化を有するＣＬＤ１８変異体とＮグリコシル化を有さないＣＬＤ１８変異体の間の識別）、
・癌細胞又は正常細胞型のいずれかの上で媒介される結合特性及び／又はエフェクター機能（腫瘍細胞又は正常非悪性細胞によって発現されるＣＬＤ１８変異体の間の識別）、
・密着結合の形成によってマスクされたＣＬＤ１８エピトープへの結合特性、
・生細胞上でＣＬＤ１８の集合体形成を引き起こす能力、及び
・非ヒトＣＬＤ１８変異体、特にマウス、ラット、ウサギ及び霊長動物からのＣＬＤ１８変異体に結合する能力。
本発明の抗体は以下の性質の１又はそれ以上を有することができ、それによって本明細書で述べる本発明の抗体の特定例（２４Ｈ５、２６Ｂ５、２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、３７Ｇ１１、３７Ｈ８、３８Ｇ５、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、４１Ｃ６、４２Ｅ１２、４３Ａ１１、４４Ｅ１０、４７Ｄ１２、６１Ｃ２、７５Ｂ８、８５Ａ３、９Ｅ８、１９Ｂ９、４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２、１７５Ｄ１０、ｃｈ−４３Ａ１１、ｃｈ−４５Ｃ１、ｃｈ−１２５Ｅ１、ｃｈ−１６３Ｅ１２、ｃｈ−１６６Ｅ２、ｃｈ−１７５Ｄ１０）が参照される：
ａ）ＣＬＤ１８Ａ２並びにＣＬＤ１８Ａ１への結合（例えば２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、３７Ｈ８、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、６１Ｃ２、及び４１Ｃ６）
ｂ）ＣＬＤ１８Ａ２に結合するがＣＬＤ１８Ａ１には結合しないこと（例えば２６Ｂ５、３７Ｇ１１、３８Ｇ５、４２Ｅ１２、及び４３Ａ１１、４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２、１７５Ｄ１０、ｃｈ−４３Ａ１１、ｃｈ−４５Ｃ１、ｃｈ−１２５Ｅ１、ｃｈ−１６３Ｅ１２、ｃｈ−１６６Ｅ２、ｃｈ−１７５Ｄ１０）
ｃ）腫瘍細胞によって天然に発現されるＣＬＤ１８に結合するが、胃及び肺の細胞などの非癌細胞又は組織によって天然に発現されるＣＬＤ１８には結合しないこと（例えば２６Ｂ５、７５Ｂ８、２４Ｈ５、３９Ｆ１１、４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２、１７５Ｄ１０）
ｄ）ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞のＣＤＣ誘導性死滅を媒介するが、ＣＬＤ１８Ａ１を発現する細胞のＣＤＣ誘導性死滅を媒介しないこと（例えば２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、３７Ｈ８、及び３９Ｆ１１、１６３Ｅ１２、ｃｈ−１２５Ｅ１、ｃｈ−１６３Ｅ１２、ｃｈ−１７５Ｄ１０）
ｅ）ＣＬＤ１８を発現する細胞のＡＤＣＣ誘導性死滅を媒介すること（例えば２６Ｂ５、３７Ｇ１１、３７Ｈ８、３８Ｇ５、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、４３Ａ１１、４７Ｄ１２、及び６１Ｃ２、ｃｈ−１６３Ｅ１２、ｃｈ−１７５Ｄ１０）
ｆ）ＣＬＤ１８を発現する細胞のＡＤＣＣ誘導性死滅を媒介するが、ＣＤＣ媒介性死滅を媒介しないこと（例えば３７Ｇ１１、４２Ｅ１２、及び４３Ａ１１）
ｇ）ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞のＡＤＣＣ誘導性死滅及びＣＤＣ誘導性死滅を媒介すること（例えば３７Ｈ８、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、ｃｈ−１６３Ｅ１２、ｃｈ−１７５Ｄ１０）。
本明細書で例示されるように、本発明の抗体は、
ａ）正常な胃の分化した細胞に結合するが、胃の幹細胞には結合しない（例えば３９Ｆ１１）
ｂ）正常胃組織並びに他の正常器官には結合しないが、癌細胞には排他的に結合する（例えば２６Ｂ５）
ｃ）ＣＬＤ１８の１１６位の非グリコシル化Ａｓｎを含むエピトープに結合する
ｄ）マウスにおける前臨床毒性試験を完全に実施することを可能にするヒトＣＬＤ１８並びにマウスＣＬＤ１８に結合する
という分子をさらに包含する。
【００３７】
本発明の抗体は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット及びヒトを含むがこれらに限定されない、様々な種に由来し得る。本発明の抗体はまた、１つの種、好ましくはヒトに由来する抗体定常領域が別の種に由来する抗原結合部位と組み合わされているキメラ分子を含む。さらに本発明の抗体は、非ヒト種に由来する抗体の抗原結合部位がヒト由来の定常領域及びフレームワーク領域と組み合わされているヒト化分子を含む。
【００３８】
本発明の抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含み、ＩｇＧ２ａ（例えばＩｇＧ２ａ、κ、λ）、ＩｇＧ２ｂ（例えばＩｇＧ２ｂ、κ、λ）、ＩｇＧ３（例えばＩｇＧ３、κ、λ）及びＩｇＭ抗体を含む。しかし、ＩｇＧ１、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ抗体を含む、他の抗体アイソタイプも本発明に包含される。抗体は、全長抗体又は、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖフラグメント又は二重特異性抗体を含む、その抗原結合フラグメントとすることができる。さらに、抗原結合フラグメントは、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド（重鎖可変領域又は軽鎖可変領域など）、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域、を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質を包含する。そのような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、さらに米国特許出願第ＵＳ２００３／０１１８５９２号及び同第ＵＳ２００３／０１３３９３９号に開示されている。
【００３９】
本発明の抗体は、好ましくは約１〜１００ｎＭ又はそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でＣＬＤ１８から解離する。
好ましくは、本発明の抗体は関連細胞表面抗原と交差反応せず、それ故それらの機能を阻害しない。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は以下の性質：
ａ）ＣＬＤ１８に対する特異性、特にＣＬＤ１８Ａ２に対する特異性；
ｂ）約１００ｎＭ又はそれ以下、好ましくは約５〜１０ｎＭ又はそれ以下、より好ましくは約１〜３ｎＭ又はそれ以下のＣＬＤ１８、特にＣＬＤ１８Ａ２に対する結合親和性；
ｃ）ＣＤ５５／５９陰性又はＣＤ５５／５９陽性細胞のいずれかの上で高レベルのＣＤＣを媒介する能力；
ｄ）ＣＬＤ１８を発現する細胞の増殖を阻害する能力；
ｅ）ＣＬＤ１８を発現する細胞のアポトーシスを引き起こす能力；
ｆ）ＣＬＤ１８を発現する細胞の同型接着を引き起こす能力；
ｇ）エフェクター細胞の存在下でＣＬＤ１８を発現する細胞のＡＤＣＣを引き起こす能力；
ｈ）ＣＬＤ１８を発現する腫瘍細胞を有する被験者の生存を延長させる能力；
ｉ）ＣＬＤ１８を発現する細胞を枯渇させる能力；
ｊ）低レベルのＣＬＤ１８を発現する細胞を枯渇させる能力；及び／又は
ｋ）生細胞の表面上でＣＬＤ１８を集合させる能力
の１又はそれ以上によって特徴づけることができる。
【００４１】
本発明の抗ＣＬＤ１８抗体は、他の結合特異性成分に誘導体化する、他の結合特異性成分に連結する、又は他の結合特異性成分と同時発現させることができる。特定の実施形態では、本発明は、ＣＬＤ１８に対する少なくとも１つの第一結合特異性（例えば抗ＣＬＤ１８抗体又はそのミメティック）、及びＦｃ受容体（例えばＦｃγＲＩなどのＦｃγ受容体、又何らかの他のＦｃ受容体）又はＴ細胞受容体、例えばＣＤ３に対する結合特異性などの、エフェクター細胞に対する第二結合特異性を含む、二重特異性又は多重特異性分子を提供する。
【００４２】
従って、本発明は、ＣＬＤ１８とＦｃ受容体又はＴ細胞受容体、例えばＣＤ３の両方に結合する二重特異性及び多重特異性分子を包含する。Ｆｃ受容体の例は、ＩｇＧ受容体、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。ＩｇＡ受容体（例えばＦｃαＲＩ）などの他のＦｃ受容体も標的とすることができる。Ｆｃ受容体は、好ましくはエフェクター細胞の表面上、例えば単球、マクロファージ又は活性化単核細胞上に位置する。好ましい実施形態では、二重特異性及び多重特異性分子は、受容体の免疫グロブリンＦｃ（例えばＩｇＧ又はＩｇＡ）結合部位とは異なる部位でＦｃ受容体に結合する。それ故、二重特異性及び多重特異性分子の結合は生理的レベルの免疫グロブリンによってブロックされない。
【００４３】
さらに他の態様において、本発明の抗ＣＬＤ１８抗体をもう１つ別の機能的分子、例えば別のペプチド又はタンパク質（例えばＦａｂ'フラグメント）で誘導体化する、別の機能的分子に連結する、又は別の機能的分子と同時発現させる。例えば、本発明の抗体を、もう１つ別の抗体（例えば二重特異性又は多重特異性抗体を作製するため）、細胞毒、細胞リガンド又は抗原（例えばイムノトキシンなどの免疫複合体を作製するため）などの、１又はそれ以上の他の分子実体に機能的に連結することができる（例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合又は他の方法によって）。本発明の抗体は、他の治療成分、例えば放射性同位体、低分子抗癌剤、組換えサイトカイン又はケモカインに連結することができる。従って、本発明は、多種多様な抗体複合体、二重特異性及び多重特異性分子、並びに融合タンパク質を包含し、これらのすべては、ＣＬＤ１８発現細胞に結合し、他の分子をそのような細胞に標的するために使用することができる。
【００４４】
さらなる態様では、本発明はまた、非免疫グロブリンドメインに由来するＣＬＤ１８結合タンパク質、特に一本鎖タンパク質を考慮する。そのような結合タンパク質及びそれらの生産のための方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（１０）：１２５７−１２６８に述べられている。免疫グロブリン又は免疫グロブリン由来の結合分子に関して本明細書で与えられる教示は、同様に非免疫グロブリンドメインに由来する結合分子にも適用されることが了解されるべきである。特に、非免疫グロブリンドメインに由来するそのような結合分子を使用して、前記標的を発現する細胞のＣＬＤ１８をブロックし、それにより、本発明の抗体に関して本明細書で開示される治療効果を生じさせる、特に腫瘍細胞の増殖の阻害を生じさせることが可能である。義務的ではないが、例えば抗体のＦｃ領域への融合によって、そのような非免疫グロブリン結合分子に抗体のエフェクター機能を付与することが可能である。
【００４５】
さらに他の１つの態様において、本発明は、本発明の抗体の１つ又は本発明の抗体の組合せと共に製剤された医薬的に許容される担体を有する組成物、例えば医薬組成物及び診断組成物／キットを提供する。特定の実施形態では、組成物は、異なるエピトープに結合する又は、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣを引き起こすこと及びアポトーシスを引き起こすことなどの異なる機能特徴を有する抗体の組合せを含む。本発明のこの実施形態では、抗体は、組合せとして、例えば２又はそれ以上の抗ＣＬＤ１８モノクローナル抗体を含有する医薬組成物として使用することができる。例えば、異なるが補完的な活性を有する抗ＣＬＤ１８抗体を、所望の治療効果を得るために１つの治療において組み合わせることができる。好ましい実施形態では、組成物は、ＣＤＣを媒介する抗ＣＬＤ１８抗体を、アポトーシスを引き起こす別の抗ＣＬＤ１８抗体と組み合わせて含有する。他の実施形態において、組成物は、エフェクター細胞の存在下で標的細胞の極めて有効な死滅を媒介する抗ＣＬＤ１８抗体を、ＣＬＤ１８を発現する細胞の増殖を阻害する別の抗ＣＬＤ１８抗体と組み合わせて含有する。
【００４６】
本発明はまた、本発明の２又はそれ以上の抗ＣＬＤ１８抗体の同時又は連続投与を含み、前記抗体の少なくとも１つはキメラ抗ＣＬＤ１８抗体であり、少なくとも１つのさらなる抗体はヒト抗ＣＬＤ１８抗体であって、前記抗体はＣＬＤ１８の同じか又は異なるエピトープに結合する。好ましくは、本発明のキメラＣＬＤ１８抗体を最初に投与し、次いで本発明のヒト抗ＣＬＤ１８抗体を投与するが、ヒト抗ＣＬＤ１８抗体は、好ましくは長期間にわたって、すなわち維持療法として投与される。
【００４７】
本発明の抗体、免疫複合体、二重特異性及び多重特異性分子、並びに組成物は、細胞の増殖を阻害する及び／又は細胞を死滅させるような有効量の抗体、免疫複合体、二重特異性／多重特異性分子又は組成物を接触させることにより、ＣＬＤ１８、特にＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞の増殖を阻害する及び／又は細胞を選択的に死滅させる様々な方法で使用することができる。１の実施形態でにおいて、その方法は、場合によりエフェクター細胞の存在下で、例えばＣＤＣ、アポトーシス、ＡＤＣＣ、食作用によって、又はこれらの機構の２又はそれ以上の組合せによって、ＣＬＤ１８を発現する細胞を死滅させることを含む。本発明の抗体を用いて阻害する又は死滅させることができる、ＣＬＤ１８を発現する細胞は、腫瘍形成性胃細胞、膵細胞、食道細胞、肺細胞、卵巣細胞、結腸細胞、肝細胞、頭頸部細胞及び胆嚢細胞などの癌細胞を含む。
【００４８】
従って、本発明の抗体は、ＣＬＤ１８を発現する細胞が関与する様々な疾患を、そのような疾患に罹患している患者に抗体を投与することによって治療する及び／又は予防するために使用できる。治療（例えば改善）できる又は予防できる例示的な疾患は、腫瘍形成性疾患を含むが、これらに限定されない。治療できる及び／又は予防できる腫瘍形成性疾患の例は、胃癌、膵癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肝癌、頭頸部癌、胆嚢癌、及びそれらの転移を含む。
【００４９】
本発明の特定の実施形態では、抗体を投与される被験者は、化学療法剤、放射線、又はＦｃ受容体、例えばサイトカインなどのＦｃγ受容体の発現又は活性を調節する、例えば増強する又は阻害する物質で付加的に治療される。治療期間中の投与のための典型的なサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。典型的な治療薬は、中でも特に、ドキソルビシン、シスプラチン、タキソテール、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、ゲムシタビン及びシクロホスファミドなどの抗腫瘍薬を含む。
【００５０】
さらに他の態様において、本発明は、抗体を得るためにマウスなどの非ヒト動物をヒトＣＬＤ１８又はそのペプチドフラグメント、好ましくはＣＬＤ１８Ａ２又はそのペプチドフラグメントで免疫するための免疫方法に関する。免疫のための好ましいペプチドは、配列番号２、４、６、１６、１８、２０〜２３、２６〜３１、１５１、１５３、及び１５５〜１５７から成る群より選択されるもの、又は前記配列を含むペプチドである。従って、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２、４、６、１６、１８、２０〜２３、２６〜３１、１５１、１５３、及び１５５〜１５７から成る群より選択されるペプチドを使用した、又は前記配列を含むペプチドを使用した免疫によって得られるものである。同様に、ＣＬＤ１８に対する抗体は、トランスジェニックマウスなどのトランスジェニック非ヒト動物において作製できる。トランスジェニック非ヒト動物は、抗体の全部又は一部をコードする重鎖導入遺伝子と軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスとすることができる。
【００５１】
野生型並びにトランスジェニック非ヒト動物は、ＣＬＤ１８抗原及び／又はＣＬＤ１８を発現する核酸及び／又は細胞又はそのペプチドフラグメントの精製又は富化製剤で免疫することができる。好ましくは、非ヒト動物は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え及びアイソタイプスイッチを受けることによりＣＬＤ１８に対するヒトモノクローナル抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ）の複数のアイソタイプを産生することができる。アイソタイプスイッチは、例えば古典的又は非古典的アイソタイプスイッチによって起こすことができる。
【００５２】
従って、さらに他の態様において、本発明は、上述したような非ヒト動物から単離されたＢ細胞を提供する。単離Ｂ細胞は、次に、本発明の抗体の供給源（例えばハイブリドーマ）を提供するために不死化細胞への融合によって不死化することができる。そのようなハイブリドーマ（すなわち本発明の抗体を産生する）も、本発明の範囲内に包含される。
【００５３】
本明細書で例示されるように、本発明の抗体は、抗体を発現するハイブリドーマから直接入手できるか、又はクローニングして、宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞又はリンパ球細胞）において組換え発現させることができる。宿主細胞のさらなる例は、大腸菌などの微生物及び酵母などの真菌である。あるいは、本発明の抗体はトランスジェニック非ヒト動物又は植物において組換え生産することができる。
【００５４】
本発明の抗体を生産するための好ましいハイブリドーマ細胞は、配列決定されたもの又は以下の名称とアクセッション番号を有する、ＤＳＭＺ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，３１８２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；新住所：Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，３１８２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託されたものである；
ａ．２００５年１０月１９日に寄託された、１８２−Ｄ１１０６−０５５、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３７
ｂ．２００５年１０月１９日に寄託された、１８２−Ｄ１１０６−０５６、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３８
ｃ．２００５年１０月１９日に寄託された、１８２−Ｄ１１０６−０５７、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３９
ｄ．２００５年１０月１９日に寄託された、１８２−Ｄ１１０６−０５８、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４０
ｅ．２００５年１０月１９日に寄託された、１８２−Ｄ１１０６−０５９、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４１
ｆ．２００５年１０月１９日に寄託された、１８２−Ｄ１１０６−０６２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４２
ｇ．２００５年１０月１９日に寄託された、１８２−Ｄ１１０６−０６７、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４３
ｈ．２００５年１１月１７日に寄託された、１８２−Ｄ７５８−０３５、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４５
ｉ．２００５年１１月１７日に寄託された、１８２−Ｄ７５８−０３６、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４６
ｊ．２００５年１１月１７日に寄託された、１８２−Ｄ７５８−０４０、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４７
ｋ．２００５年１１月１７日に寄託された、１８２−Ｄ１１０６−０６１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４８
ｌ．２００６年１０月２６日に寄託された、１８２−Ｄ１１０６−２７９、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０８
ｍ．２００６年１０月２６日に寄託された、１８２−Ｄ１１０６−２９４、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０９
ｎ．２００６年１０月２６日に寄託された、１８２−Ｄ１１０６−３６２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８１０。
【００５５】
本発明の好ましい抗体は、上記ハイブリドーマによって産生されるもの及び上記ハイブリドーマから入手可能なものである；すなわち１８２−Ｄ１１０６−０５５の場合は３７Ｇ１１、１８２−Ｄ１１０６−０５６の場合は３７Ｈ８、１８２−Ｄ１１０６−０５７の場合は３８Ｇ５、１８２−Ｄ１１０６−０５８の場合は３８Ｈ３、１８２−Ｄ１１０６−０５９の場合は３９Ｆ１１、１８２−Ｄ１１０６−０６２の場合は４３Ａ１１、１８２−Ｄ１１０６−０６７の場合は６１Ｃ２、１８２−Ｄ７５８−０３５の場合は２６Ｂ５、１８２−Ｄ７５８−０３６の場合は２６Ｄ１２、１８２−Ｄ７５８−０４０の場合は２８Ｄ１０、１８２−Ｄ１１０６−０６１の場合は４２Ｅ１２、１８２−Ｄ１１０６−２７９の場合は１２５Ｅ１、１８２−Ｄ１１０６−２９４の場合は１６３Ｅ１２、及び１８２−Ｄ１１０６−３６２の場合は１７５Ｄ１０；及びそれらのキメラ形態及びヒト化形態。
【００５６】
好ましい実施形態では、抗体、特に本発明によるキメラ形態の抗体は、配列番号４６又は１５０によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントなどのヒト重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域（ＣＨ）を含む抗体を包含する。さらなる好ましい実施形態では、抗体、特に本発明によるキメラ形態の抗体は、配列番号４１又は１４８によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントなどのヒト軽鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む抗体を包含する。特に好ましい実施形態では、抗体、特に本発明によるキメラ形態の抗体は、配列番号４６又は１５０によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントなどのヒトＣＨに由来するアミノ酸配列を有するＣＨ及び配列番号４１又は１４８によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントなどのヒトＣＬに由来するアミノ酸配列を有するＣＬを含む抗体を包含する。
【００５７】
配列番号４６によって表されるアミノ酸配列を含むＣＨは、配列番号４５によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番号１５０によって表されるアミノ酸配列を含むＣＨは、配列番号１４９によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号４１によって表されるアミノ酸配列を含むＣＬは、配列番号４０によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１４８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＬは、配列番号１４７によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。
【００５８】
ある好ましい実施形態では、キメラ形態の抗体は、配列番号１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０及びそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖及び／又は配列番号１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９及びそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体を包含する。
【００５９】
ある好ましい実施形態では、キメラ形態の抗体は、以下の可能性（ｉ）〜（ｉｘ）から選択される重鎖と軽鎖の組合せを含む抗体を包含する：
（ｉ）重鎖は配列番号１１５によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、軽鎖は配列番号１２２によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｉｉ）重鎖は配列番号１１６によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、軽鎖は配列番号１２１によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｉｉｉ）重鎖は配列番号１１７によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、軽鎖は配列番号１２３によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｉｖ）重鎖は配列番号１１９によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、軽鎖は配列番号１２６によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｖ）重鎖は配列番号１１８によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、軽鎖は配列番号１２５によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｖｉ）重鎖は配列番号１２０によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、軽鎖は配列番号１２４によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｖｉｉ）重鎖は配列番号１２０によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、軽鎖は配列番号１２７によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｖｉｉｉ）重鎖は配列番号１２０によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、軽鎖は配列番号１２８によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、及び
（ｉｘ）重鎖は配列番号１２０によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、軽鎖は配列番号１２９によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む。
【００６０】
上記で使用される「フラグメント」又は「アミノ酸配列のフラグメント」は、抗体配列の部分、すなわちＮ末端及び／又はＣ末端で短縮された抗体配列である配列であって、抗体内で前記抗体配列に置き換わったとき、ＣＬＤ１８への前記抗体の結合、及び好ましくは本明細書で述べる前記抗体の機能、例えばＣＤＣ媒介性細胞溶解又はＡＤＣＣ媒介性細胞溶解の機能を保持する、抗体配列の部分に関する。好ましくは、アミノ酸配列のフラグメントは、前記アミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含む。配列番号１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８及び１２９から成る群より選択されるアミノ酸配列のフラグメントは、好ましくはＮ末端の１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３アミノ酸が除去されている前記配列に関する。本明細書で述べるアミノ酸配列のフラグメントは、前記アミノ酸配列をコードする核酸配列のそれぞれのフラグメントによってコードされてもよい。
【００６１】
配列番号１１５によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖は、配列番号１００によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１１６によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖は、配列番号１０１によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１１７によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖は、配列番号１０２によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１１９によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖は、配列番号１０４によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１１８によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖は、配列番号１０３によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番号１２０によって表されるアミノ酸配列を含む重鎖は、配列番号１０５によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。
【００６２】
配列番号１２２によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖は、配列番号１０７によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１２１によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖は、配列番号１０６によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１２３によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖は、配列番号１０８によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１２６によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖は、配列番号１１１によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１２５によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖は、配列番号１１０によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番号１２４によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖は、配列番号１０９によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１２７によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖は、配列番号１１２によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番号１２８によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖は、配列番号１１３によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１２９によって表されるアミノ酸配列を含む軽鎖は、配列番号１１４によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。
【００６３】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７及びそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００６４】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６及びそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
ある好ましい実施形態では、本発明の抗体は、以下の可能性（ｉ）〜（ｉｘ）から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）の組合せを含む：
（ｉ）ＶＨは配列番号１３２によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、ＶＬは配列番号１３９によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｉｉ）ＶＨは配列番号１３３によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、ＶＬは配列番号１３８によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｉｉｉ）ＶＨは配列番号１３４によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、ＶＬは配列番号１４０によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｉｖ）ＶＨは配列番号１３６によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、ＶＬは配列番号１４３によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｖ）ＶＨは配列番号１３５によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、ＶＬは配列番号１４２によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｖｉ）ＶＨは配列番号１３７によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、ＶＬは配列番号１４１によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｖｉｉ）ＶＨは配列番号１３７によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、ＶＬは配列番号１４４によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｖｉｉｉ）ＶＨは配列番号１３７によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、ＶＬは配列番号１４５によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、
（ｉｘ）ＶＨは配列番号１３７によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含み、ＶＬは配列番号１４６によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む。
【００６５】
配列番号１３２によって表されるアミノ酸配列を含むＶＨは、配列番号５５によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１３３によって表されるアミノ酸配列を含むＶＨは、配列番号５６によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１３４によって表されるアミノ酸配列を含むＶＨは、配列番号５７によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１３６によって表されるアミノ酸配列を含むＶＨは、配列番号５９によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１３５によって表されるアミノ酸配列を含むＶＨは、配列番号５８によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１３７によって表されるアミノ酸配列を含むＶＨは、配列番号６０によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。
【００６６】
配列番号１３９によって表されるアミノ酸配列を含むＶＬは、配列番号６２によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１３８によって表されるアミノ酸配列を含むＶＬは、配列番号６１によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１４０によって表されるアミノ酸配列を含むＶＬは、配列番号６３によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１４３によって表されるアミノ酸配列を含むＶＬは、配列番号６６によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番号１４２によって表されるアミノ酸配列を含むＶＬは、配列番号６５によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１４１によって表されるアミノ酸配列を含むＶＬは、配列番号６４によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１４４によって表されるアミノ酸配列を含むＶＬは、配列番号６７によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。配列番号１４５によって表されるアミノ酸配列を含むＶＬは、配列番号６８によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番号１４６によって表されるアミノ酸配列を含むＶＬは、配列番号６９によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされてもよい。
【００６７】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、以下の実施形態（ｉ）〜（ｖｉ）から選択される相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のセットを含むＶＨを含む：
（ｉ）ＣＤＲ１；配列番号１１５の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号１１５の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号１１５の１１６〜１２５位、
（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号１１６の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号１１６の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号１１６の１１６〜１２６位、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号１１７の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号１１７の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号１１７の１１６〜１２４位、
（ｉｖ）ＣＤＲ１：配列番号１１８の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号１１８の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号１１８の１１６〜１２６位、
（ｖ）ＣＤＲ１：配列番号１１９の４４〜５１位、ＣＤＲ２：配列番号１１９の６９〜７６位、ＣＤＲ３：配列番号１１９の１１５〜１２５位、
（ｖｉ）ＣＤＲ１：配列番号１２０の４５〜５３位、ＣＤＲ２：配列番号１２０の７１〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２０の１１７〜１２８位。
【００６８】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、以下の実施形態（ｉ）〜（ｉｘ）から選択される相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のセットを含むＶＬを含む：
（ｉ）ＣＤＲ１：配列番号１２１の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号１２１の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２１の１１５〜１２３位、
（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号１２２の４９〜５３位、ＣＤＲ２：配列番号１２２の７１〜７３位、ＣＤＲ３：配列番号１２２の１１０〜１１８位、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号１２３の４７〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号１２３の７０〜７２位、ＣＤＲ３：配列番号１２３の１０９〜１１７位、
（ｉｖ）ＣＤＲ１：配列番号１２４の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号１２４の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２４の１１５〜１２３位、
（ｖ）ＣＤＲ１：配列番号１２５の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号１２５の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２５の１１５〜１２３位、
（ｖｉ）ＣＤＲ１：配列番号１２６の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号１２６の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２６の１１５〜１２２位、
（ｖｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号１２７の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号１２７の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２７の１１５〜１２３位、
（ｖｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号１２８の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号１２８の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２８の１１５〜１２３位、
（ｉｘ）ＣＤＲ１：配列番号１２９の４７〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号１２９の７０〜７２位、ＣＤＲ３：配列番号１２９の１０９〜１１７位。
【００６９】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、各々が以下の実施形態（ｉ）〜（ｉｘ）から選択される相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のセットを含むＶＨとＶＬの組合せを含む：
（ｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１；配列番号１１５の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号１１５の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号１１５の１１６〜１２５位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号１２２の４９〜５３位、ＣＤＲ２：配列番号１２２の７１〜７３位、ＣＤＲ３：配列番号１２２の１１０〜１１８位、
（ｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号１１６の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号１１６の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号１１６の１１６〜１２６位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号１２１の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号１２１の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２１の１１５〜１２３位、
（ｉｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号１１７の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号１１７の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号１１７の１１６〜１２４位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号１２３の４７〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号１２３の７０〜７２位、ＣＤＲ３：配列番号１２３の１０９〜１１７位、
（ｉｖ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号１１９の４４〜５１位、ＣＤＲ２：配列番号１１９の６９〜７６位、ＣＤＲ３：配列番号１１９の１１５〜１２５位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号１２６の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号１２６の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２６の１１５〜１２２位、
（ｖ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号１１８の４５〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号１１８の７０〜７７位、ＣＤＲ３：配列番号１１８の１１６〜１２６位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号１２５の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号１２５の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２５の１１５〜１２３位、
（ｖｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号１２０の４５〜５３位、ＣＤＲ２：配列番号１２０の７１〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２０の１１７〜１２８位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号１２４の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号１２４の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２４の１１５〜１２３位、
（ｖｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号１２０の４５〜５３位、ＣＤＲ２：配列番号１２０の７１〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２０の１１７〜１２８位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号１２７の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号１２７の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２７の１１５〜１２３位、
（ｖｉｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号１２０の４５〜５３位、ＣＤＲ２：配列番号１２０の７１〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２０の１１７〜１２８位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号１２８の４７〜５８位、ＣＤＲ２：配列番号１２８の７６〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２８の１１５〜１２３位、及び
（ｉｘ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号１２０の４５〜５３位、ＣＤＲ２：配列番号１２０の７１〜７８位、ＣＤＲ３：配列番号１２０の１１７〜１２８位、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号１２９の４７〜５２位、ＣＤＲ２：配列番号１２９の７０〜７２位、ＣＤＲ３：配列番号１２９の１０９〜１１７位。
さらなる好ましい実施形態では、本発明の抗体は、好ましくは、ＣＬＤ１８に対するモノクローナル抗体、好ましくは本明細書で述べるＣＬＤ１８に対するモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１又はそれ以上、好ましくは少なくともＣＤＲ３可変領域を含み、また好ましくは、本明細書で述べる重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１又はそれ以上、好ましくは少なくともＣＤＲ３可変領域を含む。１の実施形態において、前記の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１又はそれ以上は、本明細書で述べる相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のセットから選択される。特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、好ましくは、ＣＬＤ１８に対するモノクローナル抗体、好ましくは本明細書で述べるＣＬＤ１８に対するモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、また好ましくは、本明細書で述べる重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
【００７０】
１の実施形態において、本明細書で述べる１又はそれ以上のＣＤＲ、ＣＤＲのセット又はＣＤＲのセットの組合せを含む本発明の抗体は、それらの介在フレームワーク領域と共に前記ＣＤＲを含む。好ましくは、その部分はまた、１番目及び４番目のフレームワーク領域のいずれか又は両方の少なくとも約５０％を含み、その５０％は、１番目のフレームワーク領域のＣ末端側の５０％及び４番目のフレームワーク領域のＮ末端側の５０％である。組換えＤＮＡ手法によって行われる本発明の抗体の構築は、本発明の可変領域を、免疫グロブリン重鎖を含むさらなるタンパク質配列、他の可変ドメイン（例えばダイアボディの生産において）又はタンパク質標識に連結するためのリンカーの導入を含む、クローニング又は他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによってコードされる可変領域のＮ末端側又はＣ末端側の残基の導入を生じさせ得る。
【００７１】
１の実施形態において、本明細書で述べる１又はそれ以上のＣＤＲ、ＣＤＲのセット又はＣＤＲのセットの組合せを含む本発明の抗体は、ヒト抗体フレームワーク内に前記ＣＤＲを含む。
【００７２】
重鎖に関して、特定鎖、又は特定領域もしくは配列を含む抗体への本明細書における言及は、好ましくは、前記抗体のすべての重鎖が前記特定鎖、領域又は配列を含む状況に関する。これは同様に抗体の軽鎖にも適用される。
【００７３】
本発明はまた、本明細書で述べる抗体又はその部分、例えば抗体鎖をコードする遺伝子又は核酸配列を含む核酸に関する。核酸は、ベクター内に、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ又は、例えば遺伝子工学において従来使用される別のベクター内に含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞において及び適切な条件下でベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含んでもよい。さらに、ベクターは、適切な宿主におけるコード領域の適切な発現を可能にする発現制御エレメントを含んでもよい。そのような制御エレメントは当業者に公知であり、プロモーター、スプライスカセット及び翻訳開始コドンを含んでもよい。
【００７４】
好ましくは、本発明の核酸は、真核細胞又は原核細胞における発現を可能にする上記発現制御配列に作動可能に連結される。真核細胞又は原核細胞における発現を確実にする制御エレメントは当業者に周知である。
【００７５】
本発明による核酸分子の構築のため、上記核酸分子を含むベクターの構築のため、適切に選択された宿主細胞へのベクターの導入のため、発現を生じさせる又は達成するための方法は、当技術分野において周知である。
【００７６】
本発明のさらなる態様は、本明細書で開示される核酸又はベクターを含む宿主細胞に関する。
【００７７】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】Ｆｉｇ．１は、緑色蛍光色素に結合したＣＬＤ１８Ａ２でトランスフェクトし、ヘルパーエピトープに融合した配列番号１５によるＤＮＡ免疫後のマウス血清と反応させたＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光分析を示す。
【図２】Ｆｉｇ．２は、ＣＬＤ１８Ａ２−ｍｙｃ（配列番号３）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞及びトランスフェクトしていないＨＥＫ２９３細胞のモノクローナルマウス抗ｃ−ｍｙｃ抗体９Ｅ１１（セロテック社，ＣＲＬ  ＭＣＡ２２００）によるウエスタンブロット分析を示す。
【図３】Ｆｉｇ．３は、ＣＬＤ１８Ａ２でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞とポリクローナルウサギ抗ＣＬＤ１８抗体（ザイメッド社，ＣＲＬ  ３８−８０００）を用いた免疫蛍光分析を示す。
【図４】Ｆｉｇ．４Ａ及びＢは、フローサイトメトリーによって測定した、ヒトＣＬＤ１８Ａ２と蛍光マーカーで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞へのハイブリドーマ上清２４Ｈ５及び８５Ａ３の結合を示す。
【図５】Ｆｉｇ．４Ｃは、ヒトＣＬＤ１８Ａ２で安定にトランスフェクトし、ヨウ化プロピジウムで対比染色したＨＥＫ２９３細胞へのハイブリドーマ上清４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０の結合を示す。
【図６】Ｆｉｇ．５は、フローサイトメトリーによって分析した、蛍光マーカーとヒトＣＬＤ１８Ａ２又はＣＬＤ１８Ａ２−Ｍｙｃ又はＣＬＤ１８Ａ２−ＨＡのいずれかで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞へのハイブリドーマ上清２４Ｈ５（Ａ）、９Ｅ８（Ｂ）、２６Ｂ５（Ｃ）及び１９Ｂ９（Ｄ）の結合を示す。
【図７】Ｆｉｇ．５は、フローサイトメトリーによって分析した、蛍光マーカーとヒトＣＬＤ１８Ａ２又はＣＬＤ１８Ａ２−Ｍｙｃ又はＣＬＤ１８Ａ２−ＨＡのいずれかで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞へのハイブリドーマ上清２４Ｈ５（Ａ）、９Ｅ８（Ｂ）、２６Ｂ５（Ｃ）及び１９Ｂ９（Ｄ）の結合を示す。
【図８】Ｆｉｇ．６Ａ、Ｂは、フローサイトメトリーによって決定した、ヒトＣＬＤ１８Ａ２又はＣＬＤ１８Ａ１のいずれかで安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞へのハイブリドーマ上清３７Ｈ８、４３Ａ１１、４５Ｃ１及び１６３Ｅ１２の結合を示す。
【図９】Ｆｉｇ．６Ａ、Ｂは、フローサイトメトリーによって決定した、ヒトＣＬＤ１８Ａ２又はＣＬＤ１８Ａ１のいずれかで安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞へのハイブリドーマ上清３７Ｈ８、４３Ａ１１、４５Ｃ１及び１６３Ｅ１２の結合を示す。
【図１０】Ｆｉｇ．７は、天然（Ａ、Ｂ）及びパラホルムアルデヒド固定（Ｃ、Ｄ）条件下で、それぞれＣＬＤ１８Ａ２（Ａ、Ｃ）及びＣＬＤ１８Ａ１（Ｂ、Ｄ）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を染色することによる、ＣＬＤ１８Ａ２アイソフォーム特異的モノクローナル抗体３７Ｇ１１の免疫蛍光分析を示す。
【図１１】Ｆｉｇ．７は、天然（Ａ、Ｂ）及びパラホルムアルデヒド固定（Ｃ、Ｄ）条件下で、それぞれＣＬＤ１８Ａ２（Ａ、Ｃ）及びＣＬＤ１８Ａ１（Ｂ、Ｄ）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を染色することによる、ＣＬＤ１８Ａ２アイソフォーム特異的モノクローナル抗体３７Ｇ１１の免疫蛍光分析を示す。
【図１２】Ｆｉｇ．８は、天然（Ａ、Ｂ）及びパラホルムアルデヒド固定（Ｃ、Ｄ）条件下で、それぞれＣＬＤ１８Ａ２（Ａ、Ｃ）及びＣＬＤ１８Ａ１（Ｂ、Ｄ）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を染色することによる、ＣＬＤ１８モノクローナル抗体２６Ｂ５の免疫蛍光分析を示す。
【図１３】Ｆｉｇ．８は、天然（Ａ、Ｂ）及びパラホルムアルデヒド固定（Ｃ、Ｄ）条件下で、それぞれＣＬＤ１８Ａ２（Ａ、Ｃ）及びＣＬＤ１８Ａ１（Ｂ、Ｄ）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を染色することによる、ＣＬＤ１８モノクローナル抗体２６Ｂ５の免疫蛍光分析を示す。
【図１４】Ｆｉｇ．９  細胞系ＲＴ−ＰＣＲ  ＣＬＤ１８Ａ２特異的プライマーによるＲＴ−ＰＣＲ分析は、試験した細胞系の４／５において明らかな発現を示した。
【図１５】Ｆｉｇ．１０は、ＤＡＮ−Ｇ細胞（サブクローンＦ２）及びポリクローナルウサギ抗ＣＬＤ１８抗体（ザイメッド社，ＣＲＬ  ３８−８０００）の免疫蛍光分析を示す。
【図１６】Ｆｉｇ．１１は、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞（サブクローン３Ｂ９  ４Ｄ５）及びポリクローナルウサギ抗ＣＬＤ１８抗体（ザイメッド社，ＣＲＬ  ３８−８０００）の免疫蛍光分析を示す。
【図１７】Ｆｉｇ．１２Ａは、ポリクローナルウサギ抗ＣＬＤ１８抗体（ザイメッド社，ＣＲＬ  ３８−８０００）を用いたＳＮＵ−１６細胞（サブクローンＧ５）の免疫蛍光分析を示す。
【図１８】Ｆｉｇ．１２Ｂは、本発明のモノクローナル抗体を用いたＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞の免疫蛍光分析を示す。
【図１９】Ｆｉｇ．１３は、モノクローナル抗体６１Ｃ２及び１６３Ｅ１２での細胞の染色とそれに続くフローサイトメトリー分析によって分析したＫＡＴＯ−ＩＩＩ及びＮＵＧＣ−４細胞上でのＣＬＤ１８の表面発現を示す。
【図２０】Ｆｉｇ．１４は、ヒトＣＬＤ１８Ａ１（ＮＰ＿０５７４５３）、ヒトＣＬＤ１８Ａ２（ＮＰ＿００１００２０２６）、マウスＣＬＤ１８Ａ１（ＮＰ＿０６２７８９）及びマウスＣＬＤ１８Ａ２（ＡＡＬ１５６３６）のタンパク質アラインメント。
【図２１】Ｆｉｇ．１５Ａ、Ｂは、フローサイトメトリーによって分析した、蛍光マーカーとマウスＣＬＤ１８Ａ１又はマウスＣＬＤ１８Ａ２のいずれかで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞への、それぞれハイブリドーマ上清３８Ｇ５、３８Ｈ３、３７Ｇ１１、４５Ｃ１及び１６３Ｅ１２の結合を示す。
【図２２】Ｆｉｇ．１５Ａ、Ｂは、フローサイトメトリーによって分析した、蛍光マーカーとマウスＣＬＤ１８Ａ１又はマウスＣＬＤ１８Ａ２のいずれかで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞への、それぞれハイブリドーマ上清３８Ｇ５、３８Ｈ３、３７Ｇ１１、４５Ｃ１及び１６３Ｅ１２の結合を示す。
【図２３】Ｆｉｇ．１６は、ポリクローナルＡＢ  ｐ１０５を用いた免疫組織化学分析。正常組織のサブセット（胃、肺、骨髄及び前立腺）に関する免疫組織化学染色は、胃組織の特異性を確認する（Ａ）。胃癌（上の列）及び肺癌（Ｂ）においても発現が検出された。分化した細胞だけがＣＬＤ１８Ａ２を発現し、幹細胞はＣＬＤ１８Ａ２を発現しない（Ｃ）。
【図２４】Ｆｉｇ．１６は、ポリクローナルＡＢ  ｐ１０５を用いた免疫組織化学分析。正常組織のサブセット（胃、肺、骨髄及び前立腺）に関する免疫組織化学染色は、胃組織の特異性を確認する（Ａ）。胃癌（上の列）及び肺癌（Ｂ）においても発現が検出された。分化した細胞だけがＣＬＤ１８Ａ２を発現し、幹細胞はＣＬＤ１８Ａ２を発現しない（Ｃ）。
【図２５】Ｆｉｇ．１６は、ポリクローナルＡＢ  ｐ１０５を用いた免疫組織化学分析。正常組織のサブセット（胃、肺、骨髄及び前立腺）に関する免疫組織化学染色は、胃組織の特異性を確認する（Ａ）。胃癌（上の列）及び肺癌（Ｂ）においても発現が検出された。分化した細胞だけがＣＬＤ１８Ａ２を発現し、幹細胞はＣＬＤ１８Ａ２を発現しない（Ｃ）。
【図２６】Ｆｉｇ．１７は、モノクローナルＡＢ  ３９Ｆ１１Ｄ７を用いた免疫組織化学分析。  （Ａ）正常胃粘膜において特異的タンパク質発現が検出されたが、試験した他のすべての正常組織は陰性であった。  （Ｂ）胃カルシノーマ及び肺カルシノーマにおいて強力なＣＬＤ１８Ａ２発現が認められた。
【図２７】Ｆｉｇ．１７は、モノクローナルＡＢ  ３９Ｆ１１Ｄ７を用いた免疫組織化学分析。  （Ａ）正常胃粘膜において特異的タンパク質発現が検出されたが、試験した他のすべての正常組織は陰性であった。  （Ｂ）胃カルシノーマ及び肺カルシノーマにおいて強力なＣＬＤ１８Ａ２発現が認められた。
【図２８】Ｆｉｇ．１８は、モノクローナルＡＢ  ２６Ｂ５（Ａ）、１７５Ｄ１０（Ｂ）、４３Ａ１１（Ｃ）、１６３Ｅ１２（Ｄ）及び４５Ｃ１（Ｅ）を用いた免疫組織化学分析。すべての抗体は、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２異種移植腫瘍及び胃癌標本の強い染色を示すが、ＨＥＫ２９３−擬似対照でトランスフェクトした腫瘍は染色されない。
【図２９】Ｆｉｇ．１８は、モノクローナルＡＢ  ２６Ｂ５（Ａ）、１７５Ｄ１０（Ｂ）、４３Ａ１１（Ｃ）、１６３Ｅ１２（Ｄ）及び４５Ｃ１（Ｅ）を用いた免疫組織化学分析。すべての抗体は、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２異種移植腫瘍及び胃癌標本の強い染色を示すが、ＨＥＫ２９３−擬似対照でトランスフェクトした腫瘍は染色されない。
【図３０】Ｆｉｇ．１８は、モノクローナルＡＢ  ２６Ｂ５（Ａ）、１７５Ｄ１０（Ｂ）、４３Ａ１１（Ｃ）、１６３Ｅ１２（Ｄ）及び４５Ｃ１（Ｅ）を用いた免疫組織化学分析。すべての抗体は、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２異種移植腫瘍及び胃癌標本の強い染色を示すが、ＨＥＫ２９３−擬似対照でトランスフェクトした腫瘍は染色されない。
【図３１】Ｆｉｇ．１８は、モノクローナルＡＢ  ２６Ｂ５（Ａ）、１７５Ｄ１０（Ｂ）、４３Ａ１１（Ｃ）、１６３Ｅ１２（Ｄ）及び４５Ｃ１（Ｅ）を用いた免疫組織化学分析。すべての抗体は、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２異種移植腫瘍及び胃癌標本の強い染色を示すが、ＨＥＫ２９３−擬似対照でトランスフェクトした腫瘍は染色されない。
【図３２】Ｆｉｇ．１８は、モノクローナルＡＢ  ２６Ｂ５（Ａ）、１７５Ｄ１０（Ｂ）、４３Ａ１１（Ｃ）、１６３Ｅ１２（Ｄ）及び４５Ｃ１（Ｅ）を用いた免疫組織化学分析。すべての抗体は、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２異種移植腫瘍及び胃癌標本の強い染色を示すが、ＨＥＫ２９３−擬似対照でトランスフェクトした腫瘍は染色されない。
【図３３】Ｆｉｇ．１９は、フローサイトメトリーを用いて、ヒトＣＬＤ１８Ａ２で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に対しての８５Ａ３、２８Ｄ１０、２４Ｈ５又は２６Ｄ１２によるＣＤＣの誘導後の死細胞のパーセンテージを比較したグラフである。
【図３４】Ｆｉｇ.２０は、蛍光測定によって決定した、ヒトＣＬＤ１８Ａ２又はヒトＣＬＤ１８Ａ１のいずれかで安定にトランスフェクトした接着ＣＨＯ細胞に対しての２４Ｈ５、２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、３７Ｇ１１、３７Ｈ８、３８Ｇ５、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、４１Ｃ６、４２Ｅ１２、４３Ａ１１、４４Ｅ１０、４７Ｄ１２又は６１Ｃ２によるＣＤＣの誘導後の特異的細胞溶解のパーセンテージを比較したグラフである。
【図３５】Ｆｉｇ.２１は、蛍光測定によって決定した、７５Ｂ８（Ａ）、２８Ｄ１０（Ｂ）又は３７Ｈ８（Ｃ）による、ヒトＣＬＤ１８Ａ２で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対するＣＤＣの濃度依存的誘導を示す。
【図３６】Ｆｉｇ.２１は、蛍光測定によって決定した、７５Ｂ８（Ａ）、２８Ｄ１０（Ｂ）又は３７Ｈ８（Ｃ）による、ヒトＣＬＤ１８Ａ２で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対するＣＤＣの濃度依存的誘導を示す。
【図３７】Ｆｉｇ．２２は、ＭＮＣの存在下での、それぞれ２６Ｂ５、３７Ｈ８、３８Ｇ５、４７Ｄ１２及び６１Ｃ２によるＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２細胞の溶解を示す。
【図３８】Ｆｉｇ．２３は、ＭＮＣの存在下での、それぞれ２６Ｂ５、３７Ｈ８、３８Ｇ５、４７Ｄ１２及び６１Ｃ２によるＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ１細胞の溶解を示す。
【図３９】Ｆｉｇ.２４は、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２細胞を用いた初期治療異種移植モデルでの本発明の抗体による腫瘍増殖の阻害を示す。
【図４０】Ｆｉｇ．２５Ａ、Ｂは、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２細胞を用いた２つの初期治療異種移植モデルにおける、本発明の抗体での治療による生存延長を示す。
【図４１】Ｆｉｇ．２５Ａ、Ｂは、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２細胞を用いた２つの初期治療異種移植モデルにおける、本発明の抗体での治療による生存延長を示す。
【図４２】Ｆｉｇ．２６は、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２細胞を用いた進行後治療異種移植モデルでの本発明の抗体による生存の延長を示す。
【図４３】Ｆｉｇ．２７Ａは、初期治療異種移植モデルでの本発明の抗体による腫瘍増殖の阻害を示す。
【図４４】Ｆｉｇ．２７Ｂは、初期治療異種移植モデルでの本発明の抗体による生存の延長を示す。ＤＡＮ−Ｇ細胞を発現する内因性ＣＬＤ１８Ａ２を使用した。
【図４５】Ｆｉｇ．２８は、マウス組織におけるＣＬＤ１８Ａ２  ｍＲＮＡ発現を示す。ＣＬＤ１８Ａ２特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ試験は、胃を除く試験したすべての正常組織において有意の発現を示さなかった。以下の正常組織を分析した：１：小腸、２：脾臓、３：皮膚、４：胃、５：肺、６：膵臓、７：リンパ節、８：胸腺、９：陰性対照。
【図４６】Ｆｉｇ．２９は、正常な胃におけるＣＬＤ１８発現を示す。マウス胃のＣＬＤ１８特異的抗体を用いた免疫組織化学分析は、保存された発現パターンを明らかにする。表面上皮及びより深部の陰窩はそれらの細胞表面においてＣＬＤ１８を発現するが、中心頸部領域はＣＬＤ１８陰性である。
【図４７】Ｆｉｇ．３０は、マウス胃組織のヘマトキシリン−エオシン染色を示す。ＰＢＳだけで処置した対照マウス（Ｃ及びＤ）と比較して、３７Ｇ１１で処置したマウスの胃の概観（Ａ）及び詳細（Ｂ）が示されている。
【図４８】Ｆｉｇ．３１Ａ、Ｂは、本発明の抗体（４３Ａ１１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０）を用いた、それぞれヒトＣＬＤ１８Ａ１及びＡ２で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞並びにそれらを内因性に発現するＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞のフローサイトメトリー染色を示す。
【図４９】Ｆｉｇ．３１Ａ、Ｂは、本発明の抗体（４３Ａ１１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０）を用いた、それぞれヒトＣＬＤ１８Ａ１及びＡ２で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞並びにそれらを内因性に発現するＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞のフローサイトメトリー染色を示す。
【図５０】Ｆｉｇ．３２は、本発明のキメラ抗体によって媒介されるＣＬＤ１８Ａ２発現細胞上のＣＤＣを示す。
【図５１】Ｆｉｇ．３３は、本発明のキメラ抗体によって媒介されるＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞上のＡＤＣＣを示す。
【図５２】Ｆｉｇ.３４は、初期治療異種移植モデルにおけるキメラ抗体ｃｈ−１７５Ｄ１０及びｃｈ−１６３Ｅ１２での治療による生存延長を示す。
【図５３】Ｆｉｇ．３５は、進行後治療異種移植モデルにおけるキメラ抗体ｃｈ−１７５Ｄ１０及びｃｈ−１６３Ｅ１２での治療による生存の延長を示す。
【図５４】Ｆｉｇ．３６は、抗体ｃｈ−１７５Ｄ１０及びｃｈ−１６３Ｅ１２を用いたエピトープマッピング実験を示す。修飾していない（上の列、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ交換なし）又はシステイン−セリン交換を含む（下の列、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ交換）ＣＬＤ１８Ａ２の１番目の細胞外ドメインのアミノ酸配列を分析した。
【図５５】Ｆｉｇ．３７は、ＣＬＤ１８Ａ２の１番目の細胞外ドメインの３つの異なるタンパク質フォールディングのモデルを示す。
【図５６】Ｆｉｇ．３８Ａ、Ｂ、Ｃは、フローサイトメトリーによって分析した、蛍光マーカーとマウスＣＬＤ１８Ａ１／ＣＬＤ１８Ａ２又はヒトＣＬＤ１８Ａ１／ＣＬＤ１８Ａ２のいずれかで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞へのｃｈ−１７５Ｄ１０、ｃｈ−１６３Ｅ１２及びｃｈ−１２５Ｅ１の結合を示す。トランスフェクトした細胞だけを分析し、死細胞はＰＩ染色による分析から除外した。
【図５７】Ｆｉｇ．３８Ａ、Ｂ、Ｃは、フローサイトメトリーによって分析した、蛍光マーカーとマウスＣＬＤ１８Ａ１／ＣＬＤ１８Ａ２又はヒトＣＬＤ１８Ａ１／ＣＬＤ１８Ａ２のいずれかで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞へのｃｈ−１７５Ｄ１０、ｃｈ−１６３Ｅ１２及びｃｈ−１２５Ｅ１の結合を示す。トランスフェクトした細胞だけを分析し、死細胞はＰＩ染色による分析から除外した。
【図５８】Ｆｉｇ．３８Ａ、Ｂ、Ｃは、フローサイトメトリーによって分析した、蛍光マーカーとマウスＣＬＤ１８Ａ１／ＣＬＤ１８Ａ２又はヒトＣＬＤ１８Ａ１／ＣＬＤ１８Ａ２のいずれかで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞へのｃｈ−１７５Ｄ１０、ｃｈ−１６３Ｅ１２及びｃｈ−１２５Ｅ１の結合を示す。トランスフェクトした細胞だけを分析し、死細胞はＰＩ染色による分析から除外した。
【図５９】Ｆｉｇ．３９は、原発性胃腫瘍及び胃癌転移における高レベルのＣＬＤ１８Ａ２形質膜発現を示す。原発性胃癌及び胃癌転移（クルーケンベルク腫瘍及びリンパ節）からの任意抽出標本をＧＣ１８２特異的ウサギ抗血清で染色した。免疫組織化学並びに染色の強さ（無視し得る、弱い＝１、中等度＝２、強い＝３）及び形質膜染色を示す腫瘍細胞の割合（０〜１００％）の評価が、専門臨床病理学者によって実施された。各々の円は独立した腫瘍標本を表す。転移における統計的に有意に高い染色強度が認められた（ｐ＝０．０３４、フィッシャーの正確確率検定）。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
本明細書で述べる抗体は、ＣＬＤ１８上に存在するエピトープ、好ましくはＣＬＤ１８の細胞外ドメイン内、特に１番目の細胞外ドメイン内に位置するエピトープに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体とすることができる。本発明に包含される単離モノクローナル抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ１−４、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤ抗体を含む。１の実施形態において、抗体はＩｇＧ１抗体、より特定するとＩｇＧ１κ又はＩｇＧ１λアイソタイプである。他の実施形態において、抗体はＩｇＧ３抗体、より特定するとＩｇＧ３κ又はＩｇＧ３λアイソタイプである。さらに他の実施形態において、抗体はＩｇＧ４抗体、より特定するとＩｇＧ４κ又はＩｇＧ４λアイソタイプである。さらに他の実施形態において、抗体はＩｇＡ１又はＩｇＡ２抗体である。さらに他の実施形態において、抗体はＩｇＭ抗体である。
【００８０】
１の実施形態において、本発明は、ＣＬＤ１８を発現する細胞に特異的に結合する抗体、好ましくは（ｉ）ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞に結合し、（ｉｉ）ＣＬＤ１８Ａ２を発現しないがＣＬＤ１８Ａ１を発現する細胞には結合しない抗体に関する。本発明の抗体は、好ましくは（ｉ）ＣＬＤ１８Ａ２を発現する細胞の死滅を媒介し、（ｉｉ）ＣＬＤ１８Ａ２を発現しないがＣＬＤ１８Ａ１を発現する細胞の死滅を媒介しない。
【００８１】
他の実施形態において、本発明は、（ｉ）ＣＬＤ１８を発現する腫瘍細胞に結合し、（ｉｉ）正常胃粘膜のＣＬＤ１８発現細胞には結合せず、及び／又は（ｉｉｉ）非癌性肺組織のＣＬＤ１８発現細胞には結合しない抗体に関する。
【００８２】
本発明はまた、（ｉ）ＣＬＤ１８を発現する腫瘍細胞の死滅を媒介し、（ｉｉ）正常胃粘膜のＣＬＤ１８発現細胞の死滅を媒介せず、及び／又は（ｉｉｉ）非癌性肺組織のＣＬＤ１８発現細胞の死滅を媒介しない抗体を含む。
【００８３】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、（ｉ）ＣＬＤ１８Ａ１上には存在しないＣＬＤ１８Ａ２上のエピトープ、好ましくは配列番号２１、２２及び２３に結合する、（ｉｉ）ＣＬＤ１８Ａ２−ループ１上に局在するエピトープ、好ましくは配列番号２８に結合する、（ｉｉｉ）ＣＬＤ１８Ａ２−ループ２上に局在するエピトープ、好ましくは配列番号３０に結合する、（ｉｖ）ＣＬＤ１８Ａ２−ループＤ３上に局在するエピトープ、好ましくは配列番号３１に結合する、（ｖ）ＣＬＤ１８Ａ２−ループ１及びＣＬＤ１８Ａ２−ループＤ３を含むエピトープに結合する、（ｖｉ）ＣＬＤ１８Ａ２−ループＤ３上に局在する非グリコシル化エピトープ、好ましくは配列番号２９に結合する、又は（ｖｉｉ）ヒト及びマウスＣＬＤ１８に存在するエピトープ（それぞれ配列番号２、配列番号８及び配列番号３５、配列番号３７）に結合する。
【００８４】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＣＬＤ１８Ａ１上には存在しないＣＬＤ１８Ａ２上のエピトープに結合する。
【００８５】
本発明の抗体は、完全ヒト抗体を含む。そのような抗体は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え及びアイソタイプスイッチを受けることによりＣＬＤ１８に対するヒトモノクローナル抗体の複数のアイソタイプを産生することができる非ヒトトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスにおいて産生してもよい。そのようなトランスジェニック動物はまた、米国特許出願第ＵＳ２００３／００１７５３４号に開示されるようなポリクローナル抗体を産生するためのトランスジェニックウサギとすることができる。
【００８６】
ＣＬＤ１８抗原への本発明の抗体の結合は、例えば補体系を活性化することにより、ＣＬＤ１８を発現する細胞（例えば腫瘍細胞）の死滅を媒介することができる。ＣＬＤ１８を発現する細胞の死滅は、以下の機構の１又はそれ以上によって起こすことができる：ＣＬＤ１８を発現する細胞の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；ＣＬＤ１８を発現する細胞のアポトーシス；エフェクター細胞の、ＣＬＤ１８を発現する細胞の食作用；又はエフェクター細胞の、ＣＬＤ１８を発現する細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）。
【００８７】
本発明がより容易に理解され得るために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明全体を通じて述べる。
【００８８】
［用語の定義］
「ＣＬＤ１８」という用語は、クローディン１８に関し、ＣＬＤ１８Ａ１及びＣＬＤ１８Ａ２、細胞によって天然に発現される又はＣＬＤ１８遺伝子でトランスフェクトされた細胞によって発現されるＣＬＤ１８のコンフォメーション、アイソフォーム及び種ホモログを含む、あらゆる変異体を包含する。好ましくは、「ＣＬＤ１８」は、ヒトＣＬＤ１８、特にヒトＣＬＤ１８Ａ２及び／又はヒトＣＬＤ１８Ａ１、より好ましくはヒトＣＬＤ１８Ａ２に関する。ヒトＣＬＤ１８Ａ２は、好ましくは（ｉ）配列番号１の核酸配列を含む核酸などの、配列番号２のアミノ配列をコードする核酸配列を含む核酸、又は（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に関し、細胞によって天然に発現される又はＣＬＤ１８Ａ２遺伝子でトランスフェクトされた細胞によって発現される、そのあらゆる変異体、コンフォメーション、アイソフォーム及び種ホモログを包含する。ヒトＣＬＤ１８Ａ１は、好ましくは（ｉ）配列番号７の核酸配列を含む核酸などの、配列番号８のアミノ配列をコードする核酸配列を含む核酸、又は（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質に関し、細胞によって天然に発現される又はＣＬＤ１８Ａ１遺伝子でトランスフェクトされた細胞によって発現される、そのあらゆる変異体、コンフォメーション、アイソフォーム及び種ホモログを包含する。
【００８９】
「ＣＬＤ１８の変異体」はまた、基本的にＣＬＤ１８の細胞外ドメイン又はエクトドメインから成るＣＬＤ１８の形態を含む。ＣＬＤ１８の「細胞外ドメイン」又は「エクトドメイン」は、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを基本的に含まないＣＬＤ１８ポリペプチドの形態を指す。本発明のＣＬＤ１８ポリペプチドに関して同定されるいかなる膜貫通ドメインも、疎水性ドメインのタイプを同定するために当技術分野で常套的に用いられる判定基準に従って同定されることが了解される。膜貫通ドメインの正確な境界は異なってもよいが、おそらく本明細書で最初に同定されるドメインのいずれかの末端の約５アミノ酸も異ならないと考えられる。それ故、場合により、ＣＬＤ１８ポリペプチドの細胞外ドメインは、実施例又は明細書で同定される膜貫通ドメイン／細胞外ドメイン境界のいずれかの側の約５又はそれ以下のアミノ酸を含むことができ、結合したシグナルペプチドを伴う又は伴わないそのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸が本発明によって考慮される。
【００９０】
「ＣＬＤ１８変異体」という用語は、（ｉ）ＣＬＤ１８スプライス変異体、（ｉｉ）異なるＮグリコシル化状態を有する変異体を特に含む、翻訳後修飾されたＣＬＤ１８変異体、（ｉｉｉ）ＣＬＤ１８−コンフォメーション１、ＣＬＤ１８−コンフォメーション２及びＣＬＤ１８−コンフォメーション３を特に含む、ＣＬＤ１８コンフォメーション変異体、（ｉｖ）細胞間密着結合に局在するＣＬＤ１８遊離及び同型／異型結合変異体、（ｖ）ＣＬＤ１８癌関連及びＣＬＤ１８非癌関連変異体を包含する。
【００９１】
「ラフト」という用語は、細胞の形質膜の外葉領域に位置するスフィンゴ脂質及びコレステロールに富む膜マイクロドメインを指す。特定のタンパク質がそのようなドメイン内で結合する能力及び「集合体」又は「巣状集合体（ｆｏｃａｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）」を形成するそれらの能力が、タンパク質の機能に影響を与えることができる。例えば、そのような構造内へのＣＬＤ１８分子の転位は、本発明の抗体によって結合された後、形質膜において高密度のＣＬＤ１８抗原−抗体複合体を創製する。そのような高密度のＣＬＤ１８抗原−抗体複合体はＣＤＣの間の補体系の効率的な活性化を可能にすることができる。
【００９２】
「コンフォメーション」及び「トポロジー」という用語は、内在性膜分子が細胞表面膜においてどのように位置するか、及び特に、そのいずれの領域が細胞外であり、それ故抗体に対して適格であるかを説明する。ＣＬＤ１８は、例えば、３つの異なるコンフォメーションで存在することができ、これはおそらく、ホモマー又はヘテロマーのいずれとしてより高頻度に存在するか及び超分子密着結合構造内に組み込まれているか又は「遊離」しているかに依存する。これらの異なる状態が抗体に対して適格な異なるエピトープを生じさせる。
【００９３】
本発明によれば、「疾患」という用語は、癌、特に本明細書で述べる癌の形態を含む、何らかの病的状態を指す。本明細書における癌又は癌の特定形態へのいかなる言及も、それらの癌転移を包含する。
【００９４】
「腫瘍」とは、急速で制御されない細胞増殖によって成長し、新たな成長を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける異常な群の細胞又は組織を意味する。腫瘍は、構造的組織化及び正常組織との機能的協調の部分的又は完全な欠如を示し、通常は独特の組織塊を形成し、これは良性又は悪性であり得る。
【００９５】
「転移」とは、その元の部位から身体の別の部分への癌細胞の拡大を意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発性腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの侵襲、体腔及び脈管に侵入するための内皮基底膜の貫入、及び、血液によって運搬された後の標的器官の浸潤に依存する。結局、標的部位での新たな腫瘍の成長は血管新生に依存する。腫瘍転移はしばしば原発性腫瘍の除去後にも起こり、これは、腫瘍細胞又は成分が残存し、転移の潜在能を発現し得るからである。１の実施形態において、本発明による「転移」という用語は、原発性腫瘍及び所属リンパ節系から遠く離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。１の実施形態において、本発明による「転移」という用語は、リンパ節転移に関する。本発明の抗体を使用して治療可能な転移の１つの特定形態は、原発部位として胃癌から生じる転移である。好ましい実施形態では、そのような胃癌転移は、クルーケンベルク腫瘍、腹膜転移及び／又はリンパ節転移である。
【００９６】
クルーケンベルク腫瘍は、すべての卵巣腫瘍の１％〜２％を占める卵巣のまれな転移性腫瘍である。クルーケンベルク腫瘍の予後はまだ非常に不良であり、クルーケンベルク腫瘍の確立された治療は存在しない。クルーケンベルク腫瘍は卵巣の転移性印環細胞腺癌である。大部分のクルーケンベルク腫瘍症例（７０％）における原発部位が胃である。結腸、虫垂及び乳房（主として浸潤小葉癌）のカルシノーマは、その次に最も一般的な原発部位である。胆嚢、胆管、膵臓、小腸、ファーター膨大部、頸部、及び膀胱／尿膜管のカルシノーマから生じるクルーケンベルク腫瘍のまれな症例が報告されている。原発癌の診断とその後の卵巣関与の発見までの間隔は通常６カ月又はそれ以下であるが、より長い期間も報告されている。多くの症例では、原発性腫瘍は非常に小さく、検出を免れることができる。胃又は別の器官の以前の癌の病歴は、症例の２０％〜３０％でしか得ることができない。
【００９７】
クルーケンベルク腫瘍は、癌の選択的拡大、最も一般的には胃−卵巣軸における拡大の一例である。この腫瘍拡大の軸は、歴史的に、特に胃の新生物が他の組織の関与なしに卵巣へと選択的に転移することが発見されたとき、多くの病理学者の関心を引いた。胃カルシノーマの卵巣への転移の経路は長い間謎であったが、現在は逆行性リンパ行性拡大が転移の最も可能性の高い経路であることが明らかになっている。
【００９８】
クルーケンベルク腫瘍を有する女性は、転移性癌を有する患者が典型的には５０歳代であるのに対し、平均年齢４５歳と異常に若い傾向がある。この若年の分布は、一部には、若い女性における胃の印環細胞癌の高い発生率に関連付けることができる。一般的に呈する症状は、通常は卵巣の関与に関連し、その最も一般的なものは腹痛と膨満である（主として、通常は両側性でしばしば大きな卵巣塊のため）。残りの患者は非特異的な胃腸症状を有するか又は無症候性である。加えて、クルーケンベルク腫瘍は、報告によれば卵巣支質によるホルモン産生から生じる男性化に結びつく。腹水は症例の５０％において存在し、通常は悪性細胞を明らかにする。
【００９９】
クルーケンベルク腫瘍は、報告された症例の８０％より多くにおいて両側性である。卵巣は通常、隆起した輪郭を伴って非対称に拡大する。切片の表面は黄色又は白色である；それらは通常固体であるが、時として嚢胞性である。重要な点として、クルーケンベルク腫瘍を有する卵巣の被膜表面は、典型的には滑らかで、癒着又は腹膜沈着物がない。注意すべき点として、卵巣への他の転移性腫瘍は表面インプラントに関連する傾向がある。これにより、クルーケンベルク腫瘍の全体的な形態が一見原発性卵巣腫瘍として現れることがある理由を説明することができる。しかし、クルーケンベルク腫瘍の両側性はその転移性と一致する。
【０１００】
クルーケンベルク腫瘍を有する患者は有意に高い全体的死亡率を有する。大部分の患者は２年以内に死亡する（平均生存期間、１４ヶ月）。いくつかの試験は、卵巣への転移が発見された後に原発性腫瘍が同定されるときは予後が不良であり、原発性腫瘍が隠れたままである場合は予後がさらに悪化することを示す。
【０１０１】
クルーケンベルク腫瘍のための最適治療法は文献では明らかに確立されていない。外科的切除術を実施すべきかどうかも適切には対処されていない。化学療法又は放射線治療は、クルーケンベルク腫瘍を有する患者の予後に有意の作用を及ぼさない。
【０１０２】
「疾患の治療」という用語は、疾患又はその症状の治癒、期間の短縮、改善、予防、進行又は悪化の緩慢化又は阻止、又は発症の予防又は遅延を包含する。
【０１０３】
本発明によれば、試料は、本発明において有用な何らかの試料、特に体液及び／又は細胞試料を含む組織試料などの生物学的試料とすることができ、パンチ生検を含む組織生検などの従来の方法で、及び血液、気管支吸引物、痰、尿、便又は他の体液を採取することによって入手することができる。本発明によれば、「生物学的試料」という用語はまた、生物学的試料の分画を包含する。
【０１０４】
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分を指す。「抗体」という用語はまた、すべての組換え形態の抗体、特に本明細書で述べる抗体、例えば原核生物において発現される抗体、非グリコシル化抗体、及び以下で述べる何らかの抗原結合抗体フラグメント及び誘導体を包含する。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域から成る。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域から成る。ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存された、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域が間に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各々のＶＨとＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲから成る：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【０１０５】
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種からの免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有し、分子の残りの免疫グロブリン構造はヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメイン又は可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）だけを含むことができる。抗原結合部位は、野生型であってもよいし、１もしくはそれ以上のアミノ酸置換によって修飾されてもよい。例えばヒト免疫グロブリンにより密接に類似するように修飾されてもよい。一部の形態のヒト化抗体は、すべてのＣＤＲ配列を保存する（例えばマウス抗体からの６つのＣＤＲ全部を含むヒト化マウス抗体）。また別の形態は、元の抗体に比べて変化した１又はそれ以上のＣＤＲを有する。
【０１０６】
「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列の各々の一部が、特定種に由来する又は特定クラスに属する抗体内の対応する配列と相同であり、鎖の残りのセグメントは別の抗体内の対応する配列に相同である抗体を指す。典型的には、軽鎖と重鎖の両方の可変領域が哺乳動物の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣し、定常部分は別の種に由来する抗体の配列に相同である。そのようなキメラ形態の１つの明らかな利点は、例えばヒト細胞試料に由来する定常領域と組み合わせて、可変領域が、容易に入手可能なＢ細胞又は非ヒト宿主生物からのハイブリドーマを用いて現在公知のソースから好都合に誘導できることである。可変領域は調製の容易さという利点を有し、その特異性がソースに影響されないが、ヒトである定常領域は、非ヒトソースからの定常領域よりも、抗体を注射したヒト被験者から免疫応答を惹起する可能性が低い。しかし、その定義はこの特定例に限定されない。
【０１０７】
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「結合部分」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１又はそれ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって実行され得ることが示された。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨドメインから成る一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の１本の腕のＶＬ及びＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインから成る、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び（ｖｉｉ）場合により合成リンカーによって連結され得る２又はそれ以上の単離ＣＤＲの組合せを含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬとＶＨ領域が対合して一価分子を形成する一本鎖タンパク質（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照）としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーにより、組換え法を用いて連結することができる。そのような一本鎖抗体も抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図されている。さらなる例は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域とすることができる。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、さらに米国特許出願第ＵＳ２００３／０１１８５９２号及び同第ＵＳ２００３／０１３３９３９号に開示されている。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来の手法を用いて得られ、フラグメントは、無傷抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。
【０１０８】
「エピトープ」という用語は、抗体に結合することができるタンパク質決定基を意味し、「結合」という用語は、本明細書では、好ましくは特異的結合に関する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基群から成り、一般に特異的な三次元構造上の特徴、並びに特異的な電荷特性を有する。立体配座及び非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが後者への結合は失われないことによって区別される。
【０１０９】
本明細書で使用される「不連続エピトープ」という用語は、タンパク質の一次配列内の少なくとも２つの別々の領域から形成されるタンパク質抗原上の立体配座エピトープを意味する。
【０１１０】
「二重特異性分子」という用語は、何らかの物質、例えばタンパク質、ペプチド、又はタンパク質もしくはペプチド複合体を含むことが意図され、これらは、２つの異なる結合特異性を有する。例えば、前記分子は、（ａ）細胞表面抗原、及び（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合し又はそれらと相互作用することができる。「多重特異性分子」又は「ヘテロ特異性分子」という用語は、何らかの物質、例えばタンパク質、ペプチド、又はタンパク質もしくはペプチド複合体を含むことが意図され、これらは、３以上の異なる結合特異性を有する。例えば、前記分子は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、及び（ｃ）少なくとも１つの他の成分に結合し又はそれらと相互作用することができる。従って、本発明は、ＣＬＤ１８に対する、及びエフェクター細胞上のＦｃ受容体などの他の標的に対する、二重特異性、三重特異性、四重特異性及び他の多重特異性分子を含むが、これらに限定されない。「二重特異性抗体」という用語はまた、ダイアボディを包含する。ダイアボディは、ＶＨとＶＬドメインが１本のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を許容しないほど短いリンカーを使用し、それによってそれらのドメインをもう１本の鎖の相補的ドメインと対合させて、２つの抗原結合部位を創製する、二価の二重特異性抗体である（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。
【０１１１】
本発明はまた、本明細書で述べる抗体の誘導体を含む。「抗体誘導体」という用語は、何らかの修飾形態の抗体、例えば抗体ともう１つ別の物質又は抗体の複合体を指す。本明細書で使用される場合、抗体が動物を免疫することによって又は免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって系から得られ、選択された抗体が、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに一層好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％同一である場合、その抗体は特定生殖細胞系配列に「由来する」。典型的には、特定生殖細胞系配列に由来する抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０ものアミノ酸相違を示さず、より好ましくは、アミノ酸相違が５以下、又はさらに一層好ましくは４、３、２又は１以下とする。
【０１１２】
本明細書で使用される、「ヘテロ抗体」という用語は、互いに連結された２又はそれ以上の抗体、その誘導体、又は抗原結合領域を指し、そのうちの少なくとも２つが異なる特異性を有する。これらの異なる特異性は、エフェクター細胞上のＦｃ受容体に対する結合特異性、及び標的細胞、例えば腫瘍細胞上の抗原又はエピトープに対する結合特異性を含む。
【０１１３】
本明細書で述べる抗体はヒト抗体とすることができる。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図されている。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えばインビトロでのランダム又は部位特異的突然変異誘発又はインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含むことができる。
【０１１４】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成の抗体分子の製剤を指す。モノクローナル抗体は、特定エピトープに対する単一結合特異性及び親和性を示す。１の実施形態において、モノクローナル抗体は、不死化細胞に融合した、非ヒト動物、例えばマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【０１１５】
「組換え抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、（ａ）免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニック又はトランスクロモソーマルである動物（例えばマウス）又はそれから作製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、及び（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む何らかの他の手段によって作製された、発現された、創製された又は単離された抗体などの、組換え手段によって作製される、発現される、創製される又は単離されるすべての抗体を包含する。
【０１１６】
「トランスフェクトーマ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、植物細胞、又は酵母細胞を含む真菌などの、抗体を発現する組換え真核生物宿主細胞を含む。
【０１１７】
本明細書で使用される、「異種抗体」は、そのような抗体を産生するトランスジェニック生物に関して定義される。この用語は、トランスジェニック生物で構成されず、及び一般にトランスジェニック生物以外の種に由来する生物において認められるものに対応するアミノ酸配列又はコード核酸配列を有する抗体を指す。
【０１１８】
本明細書で使用される、「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物起源の軽鎖と重鎖を有する抗体を指す。例えば、マウス軽鎖と結合したヒト重鎖を有する抗体はヘテロハイブリッド抗体である。
【０１１９】
本明細書で述べる抗体は、好ましくは単離されている。本明細書で使用される「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図されている（例えば、ＣＬＤ１８に特異的に結合する単離抗体は、ＣＬＤ１８以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ヒトＣＬＤ１８のエピトープ、アイソフォーム又は変異体に特異的に結合する単離抗体は、他の関連抗原、例えば他の種からの関連抗原（例えばＣＬＤ１８種ホモログ）に対する交差反応性を有してよい。さらに、単離抗体は、実質的に他の細胞物質及び／又は化学物質不含とすることができる。本発明の１の実施形態において、「単離」モノクローナル抗体の組合せは、異なる特異性を有し、明確な組成で組み合わされる抗体に関する。
【０１２０】
本発明によれば、「結合」という用語は、好ましくは「特異的結合」に関する。本明細書で使用される、「特異的結合」は、あらかじめ定められた抗原への抗体結合を指す。典型的には、抗体は、約１×１０−７Ｍ以下のＫＤに相当する親和性で結合し、あらかじめ定められた抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）への結合に関する親和性より少なくとも２桁低いＫＤに相当する親和性であらかじめ定められた抗原に結合する。
【０１２１】
「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指すことが意図されている。
【０１２２】
本明細書で使用される、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。
【０１２３】
本明細書で使用される、「アイソタイプスイッチ」は、それによって抗体のクラス又はアイソタイプが、ある１つのＩｇクラスからその他のＩｇクラスの１つに変化する現象を指す。
【０１２４】
物体に適用される場合の、本明細書で使用される「天然に生じる」という用語は、物体が自然界で認められ得るという事実を指す。例えば、自然界で供給源から単離できる生物（ウイルスを含む）中に存在し、実験室においてヒトによって意図的に改変されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に生じる。
【０１２５】
本明細書で使用される「再編成された」という用語は、基本的にそれぞれ完全なＶＨ又はＶＬドメインをコードする立体配座においてＶセグメントがＤ−Ｊ又はＪセグメントに直接隣接して位置する、重鎖又は軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の立体配置を指す。再編成された免疫グロブリン（抗体）遺伝子座は、生殖細胞系ＤＮＡとの比較によって同定することができる；再編成された遺伝子座は、少なくとも１つの組み換えられた７量体／９量体相同性エレメントを有する。
【０１２６】
Ｖセグメントに関して本明細書で使用される「再編成されていない」又は「生殖細胞系立体配置」という用語は、Ｖセグメントが、Ｄ又はＪセグメントに直接隣接するように組み換えられていない立体配置を指す。
【０１２７】
「核酸分子」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図されている。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖とすることができるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【０１２８】
本発明に従って述べる核酸は、好ましくは単離されている。「単離核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）インビトロで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断とゲル電気泳動分画によって精製された、又は（ｖｉ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。単離核酸は、組換えＤＮＡ手法による操作のために使用可能な核酸である。
【０１２９】
核酸は、本発明によれば、単独で又は、相同又は異種であってもよく、他の核酸との組合せで存在することができる。好ましい実施形態では、核酸は、前記核酸に関して相同又は異種であり得る発現制御配列に機能的に連結されている。「相同」という用語は、核酸が天然でも発現制御配列に機能的に連結されていることを意味し、「異種」という用語は、核酸が天然では発現制御配列に機能的に連結されていないことを意味する。
【０１３０】
ＲＮＡ及び／又はタンパク質もしくはペプチドを発現する核酸などの核酸と発現制御配列は、それらが、前記核酸の発現又は転写が前記発現制御配列の制御下又は影響下にあるように互いに共有結合されている場合、互いに「機能的に」連結されている。核酸が、その後、コード配列に機能的に連結された発現制御配列により機能的タンパク質へと翻訳されるはずである場合、前記発現制御配列の誘導は、コード配列内のフレームシフトを引き起こさずに又は前記コード配列が所望タンパク質又はペプチドへと翻訳されることができない状態を引き起こさずに、前記核酸の転写を生じさせる。
【０１３１】
「発現制御配列」という用語は、本発明によれば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、及び遺伝子の転写又はｍＲＮＡの翻訳を調節する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列を調節することができる。発現制御配列の正確な構造は、種又は細胞型に応じて異なってよいが、一般に、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列等のような、それぞれ転写及び翻訳の開始に関与する５'非転写並びに５'及び３'非翻訳配列を含む。より詳細には、５'非転写発現制御配列は、機能的に連結された核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含有するプロモーター領域を含む。発現制御配列はまた、エンハンサー配列又は上流活性化配列を含むことができる。
【０１３２】
本発明によれば、「プロモーター」又は「プロモーター領域」という用語は、発現される核酸配列に対して上流（５'側）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼのための認識及び結合部位を提供することによって配列の発現を制御する核酸配列に関する。「プロモーター領域」は、遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子のための認識及び結合部位をさらに含むことができる。プロモーターは、原核生物又は真核生物遺伝子の転写を制御することができる。さらに、プロモーターは「誘導的」であってもよく、誘導物質に応答して転写を開始させてもよいし、又は転写が誘導物質によって制御されない場合は「構成的」であってもよい。誘導的プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導物質が存在しない場合は発現されないか又はわずかだけ発現される。誘導物質の存在下では、遺伝子のスイッチが入って作動するか又は転写のレベルが上昇する。これは、一般に、特異的転写因子の結合によって媒介される。
【０１３３】
本発明による好ましいプロモーターは、ＳＰ６、Ｔ３及びＴ７ポリメラーゼのためのプロモーター、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及びある部分又は複数の部分が、例えばヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）などの他の細胞タンパク質の遺伝子のプロモーターのある部分又は複数の部分に融合しており、付加的なイントロンを含むか又は含まない、それらの人工ハイブリッドプロモーター（例えばＣＭＶ）を包含する。
【０１３４】
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡの生産又はＲＮＡとタンパク質／ペプチドの生産を含む。この語はまた、核酸の部分的発現を包含する。さらに、発現は一過性又は安定に行うことができる。
【０１３５】
好ましい実施形態では、核酸分子は、本発明によれば、適切な場合はプロモーターと共に、核酸の発現を制御するベクター内に存在する。「ベクター」という用語は、本明細書ではその最も一般的な意味で使用され、核酸が、例えば原核及び／又は真核細胞に導入され、適切な場合は、ゲノム内に組み込まれることを可能にする、核酸のための任意の中間媒体を含む。この種のベクターは、好ましくは細胞において複製及び／又は発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ又はウイルスゲノムを含む。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、一般に、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体外遺伝物質の構築物、通常は環状ＤＮＡ二本鎖に関する。
【０１３６】
抗体の発現のためのベクターとして、抗体重鎖と軽鎖が異なるベクター内に存在するベクター型又は重鎖と軽鎖が同じベクター内に存在するベクター型のいずれかが使用できる。
【０１３７】
特異的核酸及びアミノ酸配列、例えば配列表に示すものに関して本明細書で与える教示は、前記特定配列と機能的に等価の配列、例えば特異的アミノ酸配列の性質と同一又は類似の性質を示すアミノ酸配列及び特異的核酸配列によってコードされるアミノ酸配列の性質と同一又は類似の性質を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を生じさせる、前記特定配列の修飾に関しても該当するように解釈されるべきである。１つの重要な性質は、その標的への抗体の結合を保持すること又は抗体のエフェクター機能を維持することである。好ましくは、特定配列に関して修飾された配列は、それが抗体内のその特定配列を置換するとき、ＣＬＤ１８への前記抗体の結合及び、好ましくは本明細書で述べる前記抗体の機能、例えばＣＤＣ媒介性細胞溶解又はＡＤＣＣ媒介性細胞溶解の機能を保持する。
【０１３８】
特にＣＤＲ、超可変及び可変領域の配列は、ＣＬＤ１８に結合する能力を失わずに修飾され得ることが当業者に認識される。例えばＣＤＲ領域は、本明細書で規定する抗体の領域に同一であるか又は高度に相同である。「高度に相同」により、１〜５、好ましくは１〜４、例えば１〜３又は１もしくは２の置換がＣＤＲ内で行われ得ることが想定される。加えて、超可変及び可変領域は、本明細書で特定して開示する抗体の領域と実質的な相同性を示すように修飾することができる。
【０１３９】
本明細書で述べる特異的核酸はまた、特定宿主細胞又は生物においてコドン使用頻度を最適化するために修飾された核酸を包含することが了解されるべきである。生物間でのコドン使用頻度の相違は、異種遺伝子発現に関する様々な問題を導き得る。元の配列の１以上のヌクレオチドを変化させることによるコドン最適化は、前記核酸が発現される同種又は異種宿主における核酸の発現の最適化、特に翻訳効率の最適化をもたらすことができる。例えば、ヒトに由来し、抗体の定常領域及び／又はフレームワーク領域をコードする核酸を、例えばキメラ又はヒト化抗体を作製するために、本発明に従って使用する場合、特に、場合により本明細書で述べるような他の生物に由来する核酸などの異種核酸に融合した前記核酸を、マウス又はハムスターなどのヒトとは異なる生物からの細胞において発現させる場合は、コドン使用の最適化のために前記核酸を修飾することが好ましいと考えられる。例えば、例えば配列番号４０及び４５にそれぞれ従ったヒト軽鎖及び重鎖定常領域をコードする核酸配列は、１以上、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０及び好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０又は１００又はそれ以上までのヌクレオチド置換を含むように修飾することができ、その結果、最適化されたコドン使用をもたらすが、アミノ酸配列の変化は生じさせない。そのようなヌクレオチド置換は、好ましくは、配列番号４０及び４５におけるそれぞれのヌクレオチド置換に関し、これらはそれらの修飾された対応物に、コードされるアミノ酸配列には変化を生じさせない、アラインメントに示す置換から選択されてもよい。また、ヌクレオチド置換は、それぞれヒト軽鎖及び重鎖定常領域をコードする他の核酸配列内の対応位置での対応する置換に関するものであってもよい。好ましくは、次の配列番号４０及び４５にそれぞれ示されるすべての置換であって、修飾された対応物がアミノ酸配列を変化させるものではないものがヒト軽鎖及び重鎖定常領域をコードする核酸配列の中で効果的である。
【０１４０】
0005995919.tif 000002
【０１４１】
0005995919.tif 000003
【０１４２】
さらに、本発明によれば、所望アロタイプ、例えばコーカサス人において認められるアロタイプに配列を適合させるために本明細書で述べるアミノ酸配列、特にヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列を修飾することは望ましいと考えられる。そのような修飾は、好ましくは配列番号４６内の又は他のヒト重鎖定常領域内の対応する位置の以下のアミノ酸置換：Ｋ９３Ｒ、Ｄ２３５Ｅ及びＬ２３７Ｍから成る群より選択される。好ましくは、これらの修飾すべてがヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列に含まれる。
【０１４３】
本発明によれば、「対応する位置」という用語は、２つの核酸又はタンパク質配列の配列アラインメントにおいて互いに整列されるヌクレオチド又はアミノ酸残基に関する。
【０１４４】
好ましくは、本明細書で述べる特異的核酸配列と、前記特異的核酸配列に関して修飾された核酸配列又は前記特異的核酸配列の変異体である核酸配列との間の同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。ＣＬＤ１８核酸変異体に関しては、同一性の程度は、好ましくは少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、又は少なくとも約７８０ヌクレオチドの領域に対して与えられる。好ましい実施形態では、同一性の程度は、配列表で与えられる核酸配列などの、参照核酸配列の全長に対して与えられる。好ましくは、２つの配列は、互いにハイブリダイズして、安定な二本鎖を形成することができ、ハイブリダイゼーションは、好ましくはポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件（ストリンジェント条件）下で実施される。ストリンジェント条件は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに述べられており、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中６５℃でのハイブリダイゼーションが参照される。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが移入された膜を、例えば２×ＳＳＣ中室温で、次に０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中６８℃までの温度で洗浄する。
【０１４５】
好ましくは、本明細書で述べる特異的アミノ酸配列と、前記特異的アミノ酸配列に関して修飾されたアミノ酸配列又は前記特異的アミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の、例えば実質的な相同性を示すアミノ酸配列の間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。ＣＬＤ１８ポリペプチド変異体に関しては、類似性又は同一性の程度は、好ましくは少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、少なくとも約２００、少なくとも約２２０、少なくとも約２４０、少なくとも約２５０又は２６０アミノ酸の領域に対して与えられる。好ましい実施形態では、類似性又は同一性の程度は、配列表で与えられるアミノ酸配列などの、参照アミノ酸配列の全長に対して与えられる。
【０１４６】
上述した修飾配列又は配列変異体はすべて本発明の範囲内である。
【０１４７】
「配列類似性」は、同一であるか又は保存的アミノ酸置換を示すアミノ酸のパーセンテージを示す。２つのポリペプチド又は核酸配列の間の「配列同一性」は、それらの配列の間で同一であるアミノ酸又はヌクレオチドのパーセンテージを示す。
【０１４８】
「同一性パーセンテージ」は最良アラインメント後に得られ、このパーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列の間の相違はランダムに及びそれらの長さ全体にわたって分布する。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の配列比較は、それらを最適に整列した後これらの配列を比較することによって慣例的に実施され、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためにセグメントごとに又は「比較ウインドウ」ごとに実施される。比較のための配列の最適アラインメントは、手操作に加えて、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４の類似性検索法によって、又はこれらのアルゴリズムを用いるコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ及びＴＦＡＳＴＡ）によって作成することができる。
【０１４９】
同一性パーセンテージは、比較する２つの配列の間の同一位置の数を決定し、この数を比較した位置の数で除して、得られた結果に１００を乗じることによってこれら２つの配列の間の同一性パーセンテージを得る。
【０１５０】
「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似度に基づいて行うことができる。例えば：（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含む；（ｂ）極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含む；（ｃ）正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン及びヒスチジンを含む；並びに（ｄ）負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。置換は、典型的には（ａ）〜（ｄ）の群の中で実施されればよい。加えて、グリシンとプロリンは、αへリックスを破壊するそれらの能力に基づいて互いに置換されてもよい。一部の好ましい置換は以下の群の間で実施され得る：（ｉ）ＳとＴ；（ｉｉ）ＰとＧ；及び（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、Ｌ及びＩ。公知の遺伝暗号、並びに組換え及び合成ＤＮＡ手法を考慮して、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【０１５１】
本発明は、抗体の機能的及び薬物動態学的性質を変化させるためにＦｃ領域内で変更が為された抗体を含む。そのような変更は、Ｃ１ｑ結合とＣＤＣ又はＦｃγＲ結合とＡＤＣＣの低下又は上昇を生じさせ得る。置換は、例えば、重鎖定常領域のアミノ酸残基の１以上において行うことができ、それにより、修飾抗体と比較して、抗原に結合する能力を保持しながらエフェクター機能の変化を生じさせることができる。米国特許第５，６２４，８２１号及び同第５，６４８，２６０号参照。
【０１５２】
抗体のインビボ半減期は、分子が無傷ＣＨ２ドメイン又は無傷Ｉｇ  Ｆｃ領域を含まないようにＩｇ定常ドメイン又はＩｇ様定常ドメインのサルベージ受容体エピトープを修飾することによって改善できる。米国特許第６，１２１，０２２号及び同第６，１９４，５５１号参照。インビボ半減期は、Ｆｃ領域内に突然変異を作製することによって、例えば２５２位のロイシンをトレオニンに置換することによって、２５４位のセリンをトレオニンに置換することによって、又は２５６位のフェニルアラニンをトレオニンに置換することによってさらに上昇させることができる。米国特許第６，２７７，３７５号参照。
【０１５３】
さらに、抗体のエフェクター機能を変化させるために抗体のグリコシル化パターンを改変することができる。例えば、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性を高め、次にＮＫ細胞の存在下で抗体のＡＤＣＣ上昇を生じさせるために、通常Ｆｃ領域の２９７位でＡｓｎに結合しているフコース単位を付加しないトランスフェクトーマにおいて抗体を発現させることができる。Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ，２７７：２６７３３参照。さらに、ＣＤＣを改変するためにガラクトシル化の修飾も実施できる。
【０１５４】
あるいは、他の実施形態において、飽和突然変異誘発などにより、抗ＣＬＤ１８抗体コード配列の全部又は一部に沿ってランダムに突然変異を引き起こすことができ、得られる改変された抗ＣＬＤ１８抗体を結合活性に関してスクリーニングすることができる。
【０１５５】
「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、本明細書で使用される場合、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すことが意図されている。そのような用語は、特定被験者細胞だけでなくそのような細胞の子孫も表わすことが意図されていることは了解されるべきである。ある種の修飾が突然変異又は環境影響のために後継世代で起こり得るので、そのような子孫は、事実上、親細胞と同一でないことがあるが、まだ本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に包含される。組換え宿主細胞は、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞及びリンパ球細胞などのトランスフェクトーマを含む。
【０１５６】
本明細書で使用される、「被験者」という用語は、あらゆるヒト又は非ヒト動物を包含する。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生動物、爬虫類などの、哺乳動物及び非哺乳動物を包含する。
【０１５７】
「トランスジェニック動物」という用語は、１以上の導入遺伝子、好ましくは重鎖及び／又は軽鎖導入遺伝子、又は導入染色体（動物の天然ゲノムＤＮＡに組み込まれているか又は組み込まれていない）を含むゲノムを有し、好ましくは導入遺伝子を発現することができる動物を指す。例えば、トランスジェニックマウスは、ヒト軽鎖導入遺伝子、及び、ヒト重鎖導入遺伝子又はヒト重鎖導入染色体のいずれかを有することができ、そうすることで、マウスは、ＣＬＤ１８抗原及び／又はＣＬＤ１８を発現する細胞で免疫されたときヒト抗ＣＬＤ１８抗体を産生する。ヒト重鎖導入遺伝子は、ＨＣｏ７又はＨＣｏｌ２マウスなどのトランスジェニックマウス、例えばＨｕＭＡｂマウスの場合のように、マウスの染色体ＤＮＡに組み込むことができるし、又はヒト重鎖導入遺伝子は、国際公開公報第ＷＯ０２／４３４７８号に述べられているトランスクロモソーマル（例えばＫＭ）マウスの場合のように、染色体外に維持することもできる。そのようなトランスジェニック及びトランスクロモソーマルマウスは、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え及びアイソタイプスイッチを受けることによって、ＣＬＤ１８に対するヒトモノクローナル抗体の多数のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＥ）を産生することができると考えられる。
【０１５８】
本明細書で使用される「低減する」又は「阻害する」とは、レベル、例えば細胞の増殖のレベルの全体的低下、好ましくは５％又はそれ以上、１０％又はそれ以上、２０％又はそれ以上、より好ましくは５０％又はそれ以上、最も好ましくは７５％又はそれ以上の全体的低下を生じさせる能力を意味する。
【０１５９】
［ｍＡｂの作用機構］
以下は本発明の抗体の治療効果の基礎となる機構についての考察を提供するものであるが、いかなる意味においても本発明を限定するとみなされるべきではない。
【０１６０】
本明細書で述べる抗体は、好ましくはＡＤＣＣ又はＣＤＣを通して、好ましくは免疫系の成分と相互作用する。本発明の抗体はまた、ペイロード（例えば放射性同位体、薬剤又は毒素）を標的するためにも使用して、腫瘍細胞を直接死滅させることもできるし、また、伝統的な化学療法剤と協力作用的に使用して、Ｔリンパ球への化学療法剤の細胞傷害性副作用のために損なわれた可能性がある抗腫瘍免疫応答を含み得る補完的作用機構を通して腫瘍を攻撃することもできる。しかし、本発明の抗体はまた、単に細胞表面上のＣＬＤ１８に結合することによっても作用を及ぼすことができ、それにより、例えば細胞の増殖をブロックすることができる。
【０１６１】
［抗体依存性細胞媒介性細胞傷害］
ＡＤＣＣは、好ましくは抗体によって標識された標的細胞を必要とする、本明細書で述べるエフェクター細胞、特にリンパ球の細胞死滅能力を表わす。
【０１６２】
ＡＤＣＣは、好ましくは、抗体が腫瘍細胞上の抗原に結合し、抗体Ｆｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面のＦｃ受容体（ＦｃＲ）にはめ込まれた（ｅｎｇａｇｅ）ときに起こる。Ｆｃ受容体のいくつかのファミリーが同定されており、特定細胞集団は、定義されたＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、抗原提示を導く様々な程度の即時腫瘍破壊及び腫瘍に対するＴ細胞応答の誘導を直接誘導する機構とみなすことができる。好ましくは、ＡＤＣＣのインビボでの誘導は、抗腫瘍Ｔ細胞応答及び宿主由来の抗体応答を導く。
【０１６３】
［補体依存性細胞傷害］
ＣＤＣは、抗体によって指令され得るもう１つの細胞死滅方法である。ＩｇＭは補体活性化のために最も有効なアイソタイプである。ＩｇＧ１及びＩｇＧ３も、古典的補体活性化経路を通してＣＤＣを指令する上で非常に有効である。好ましくは、このカスケードにおいて、抗原−抗体複合体の形成は、ＩｇＧ分子などの関与抗体分子のＣＨ２ドメイン上のごく近接する多数のＣ１ｑ結合部位の暴露を生じさせる（Ｃ１ｑは補体Ｃ１の３つのサブ成分の１つである）。好ましくは、これらの暴露されたＣ１ｑ結合部位は、それまでの低親和性Ｃ１ｑ−ＩｇＧ相互作用を高いアビディティの相互作用へと変換し、それが、一連の他の補体を含む事象のカスケードを引き起こし、エフェクター細胞化学走性／活性化物質Ｃ３ａ及びＣ５ａのタンパク質分解性放出を導く。好ましくは、補体カスケードは、細胞内及び細胞外への水と溶質の自由な通過を促進する細胞膜の孔を作り出す、膜傷害性複合体の形成で終了する。
【０１６４】
［抗体の作製］
本発明の抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）の標準体細胞ハイブリダイゼーション手法を含む、様々な手法によって作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手法は原則として好ましいが、モノクローナル抗体を作製するための他の手法、例えばＢリンパ球のウイルス性又は発癌性形質転換又は抗体遺伝子のライブラリーを使用したファージディスプレイ手法も使用できる。
【０１６５】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するための好ましい動物系は、マウスの系である。マウスにおけるハイブリドーマの作製は極めて広く確立された手順である。免疫プロトコール及び融合する免疫脾臓細胞を単離するための手法は当技術分野において公知である。融合パートナー（例えばマウス骨髄腫細胞）及び融合手順も公知である。
【０１６６】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するための他の好ましい動物系は、ラット及びウサギの系である（例えばＳｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９３４８（１９９５）に述べられている、Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２４：２９５（２００５）も参照のこと）。
【０１６７】
さらにもう１つの好ましい実施形態では、ＣＬＤ１８に対するヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなくヒト免疫系の部分を担持するトランスジェニック又はトランスクロモソーマルマウスを使用して作製することができる。これらのトランスジェニック及びトランスクロモソーマルマウスは、それぞれＨｕＭＡｂマウス及びＫＭマウスとして知られるマウスを含み、本明細書では集合的に「トランスジェニックマウス」と称する。そのようなトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の生産は、国際公開公報第ＷＯ２００４  ０３５６０７号の中でＣＤ２０に関して詳述されているように実施できる。
【０１６８】
モノクローナル抗体を作製するためのさらにもう１つの方法は、定義されている方法の抗体を産生するリンパ球から抗体をコードする遺伝子を直接単離することであり、例えばＢａｂｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ，ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｔｒａｔｅｇｙ参照。組換え抗体工学の詳細については、Ｗｅｌｓｃｈｏｆ  ａｎｄ  Ｋｒａｕｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ＩＳＢＮ−０−８９６０３−９１８−８及びＢｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．Ｌｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＩＳＢＮ  １−５８８２９−０９２−１も参照のこと。
【０１６９】
［免疫］
ＣＬＤ１８に対する抗体を作製するため、上述したように、組換え発現されたＣＬＤ１８抗原又はそのフラグメント及び／又はＣＬＤ１８を発現する細胞の富化製剤である、ＣＬＤ１８配列に由来する担体結合ペプチドでマウスを免疫することができる。あるいは、完全長ヒトＣＬＤ１８（例えば配列番号１）をコードするＤＮＡ又はそのフラグメント、特に配列番号１５、１７及び１９のＤＮＡでマウスを免疫することができる。ＣＬＤ１８抗原の精製又は富化製剤を使用した免疫が抗体を生じない場合は、免疫応答を促進するためにＣＬＤ１８を発現する細胞、例えば細胞系でマウスを免疫することもできる。
【０１７０】
免疫応答は、尾静脈又は眼窩後の採血によって得られる血漿及び血清試料で免疫プロトコールの経過を観測することができる。十分な力価の抗ＣＬＤ１８免疫グロブリンを有するマウスを融合のために使用できる。犠死及び脾切除の３日前にＣＬＤ１８発現細胞により腹腔内又は静脈内経路でマウスを追加免疫して、特異的抗体分泌ハイブリドーマの割合を高めることができる。
【０１７１】
［モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製］
ＣＬＤ１８に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するため、免疫マウスから脾細胞及びリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞系などの適切な不死化細胞系に融合することができる。生じたハイブリドーマを、次に、抗原特異的抗体の産生のためにスクリーニングすることができる。個々のウエルを、その後、ハイブリドーマを分泌する抗体に関してＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。ＣＬＤ１８発現細胞を使用した免疫蛍光及びＦＡＣＳ分析により、ＣＬＤ１８に対して特異性を有する抗体を同定することができる。抗体分泌ハイブリドーマを再び平板培養し、再びスクリーニングして、抗ＣＬＤ１８モノクローナル抗体に関してまだ陽性である場合は限界希釈によってサブクローニングすることができる。その後、安定なサブクローンをインビトロで培養し、特徴づけのために組織培養培地において抗体を作製することができる。
【０１７２】
［モノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製］
本発明の抗体はまた、例えば当技術分野において周知である組換えＤＮＡ手法と遺伝子トランスフェクション法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて生産することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）。
【０１７３】
例えば、１の実施形態において、対象とする遺伝子、例えば抗体遺伝子を、国際公開公報第ＷＯ８７／０４４６２号、同第ＷＯ８９／０１０３６号及び欧州特許第ＥＰ３３８  ８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現系又は当技術分野で周知の他の発現系によって使用されるような、真核生物発現プラスミドなどの発現ベクターに連結することができる。クローニングされた抗体遺伝子を含む精製プラスミドは、真核宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はＨＥＫ２９３細胞、あるいは植物由来細胞、真菌又は酵母細胞のような他の真核細胞に導入することができる。これらの遺伝子を導入するために使用される方法は、電気穿孔、リポフェクチン、リポフェクタミンその他のような当技術分野で記述されている方法とすることができる。宿主細胞へのこれらの抗体遺伝子の導入後、抗体を発現する細胞を同定し、選択することができる。これらの細胞はトランスフェクトーマであり、それらを、その後、発現レベルに関して増幅し、抗体を生産するためスケールアップすることができる。組換え抗体は、これらの培養上清及び／又は細胞から単離し、精製することができる。あるいは、クローニングした抗体遺伝子は、微生物、例えば大腸菌などの原核細胞を含む、他の発現系において発現させることができる。さらに、抗体は、トランスジェニック非ヒト動物において、例えばヒツジ及びウサギからの乳又は雌ニワトリからの卵において、又はトランスジェニック植物において生産することができる；例えば、Ｖｅｒｍａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２１６：１６５−１８１；Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：１４７−１５７；及びＦｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：８２５−８３９参照。
【０１７４】
［無傷抗体を発現するための部分抗体配列の使用（すなわちヒト化及びキメラ化）］
ａ）キメラ化
マウスモノクローナル抗体は、毒素又は放射性同位体で標識したときヒトにおいて治療用抗体として使用できる。非標識マウス抗体はヒトにおいて高度に免疫原性であり、反復適用したとき治療効果の低下を導く。主たる免疫原性は重鎖定常領域によって媒介される。ヒトにおけるマウス抗体の免疫原性は、それぞれの抗体をキメラ化又はヒト化した場合低減する又は完全に回避することができる。キメラ抗体は、抗体であり、その異なる部分は、マウス抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののような、異なる動物種に由来することである。抗体のキメラ化は、マウス抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をヒト重鎖及び軽鎖の定常領域と連結することによって実現される（例えばＫｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ＩＳＢＮ−０−８９６０３−９１８−８に述べられているように）。好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトκ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製される。同じく好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトλ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製できる。キメラ抗体の作製のための好ましい重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。キメラ抗体の作製のための他の好ましい重鎖定常領域は、ＩｇＧ２、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＭである。
【０１７５】
ｂ）ヒト化
抗体は、主として６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を通じて標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列はＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体の間で多様である。ＣＤＲ配列は大部分の抗体−抗原相互作用に関与するので、異なる性質を有する異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された、天然に生じる特定の抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、天然に生じる特定の抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；及びＱｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３参照）。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースから入手できる。これらの生殖細胞系配列は、Ｂ細胞の成熟の間にＶ（Ｄ）Ｊ連結によって形成され、完全に構築された可変遺伝子を含まないので、成熟抗体遺伝子配列とは異なる。生殖細胞系遺伝子配列はまた、個体において可変領域全体にわたって高親和性二次レパートリー抗体の配列と異なる。例えば、体細胞突然変異は、フレームワーク領域１のアミノ末端部分及びフレームワーク領域４のカルボキシ末端部分では比較的頻度が低い。さらに、多くの体細胞突然変異は抗体の結合特性を有意に変化させない。このため、元の抗体と類似の結合特性を有する無傷組換え抗体を再現するために特定抗体のＤＮＡ配列全体を得る必要はない（国際公開公報第ＷＯ９９／４５９６２号参照）。ＣＤＲ領域にわたる部分的重鎖及び軽鎖配列は、典型的にはこの目的のために十分である。部分配列は、いずれの生殖細胞系可変及び連結遺伝子セグメントが組み換えられた抗体可変遺伝子に寄与したかを判定するために使用される。生殖細胞系配列は、次に、可変領域の欠けている部分を埋めるために使用される。重鎖及び軽鎖リーダー配列はタンパク質成熟の間に切断され、最終的な抗体の性質には寄与しない。欠失している配列を加えるために、クローニングされたｃＤＮＡ配列を連結又はＰＣＲ増幅によって合成オリゴヌクレオチドと結合することができる。あるいは、可変領域全体を、短いオーバーラップするオリゴヌクレオチドのセットとして合成し、ＰＣＲ増幅によって結合して完全な合成可変領域クローンを作製することができる。この工程は、特定制限部位の除去又は組込み、又は特定コドンの最適化などのある種の利点を有する。
【０１７６】
ハイブリドーマからの重鎖及び軽鎖転写産物のヌクレオチド配列は、合成オリゴヌクレオチドのオーバーラップするセットを設計するために使用され、天然配列と同じアミノ酸コード能力を有する合成Ｖ配列を作製する。合成重鎖及びκ鎖配列は３つの点で天然配列と異なっていていてもよい：ヌクレオチド塩基の繰り返し鎖が遮断されることでオリゴヌクレオチド合成及びＰＣＲ増幅を容易にする；最適翻訳開始部位がコザック規則（Ｋｏｚａｋ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０）に従って組み込まれる；及びＨｉｎｄＩＩＩ部位が翻訳開始部位の上流に工作される。
重鎖及び軽鎖可変領域の両方に関して、最適化コード鎖及び対応する非コード鎖配列は、対応する非コードオリゴヌクレオチドのほぼ中点で３０〜５０ヌクレオチドに分解される。それ故、各々の鎖について、オリゴヌクレオチドを１５０〜４００ヌクレオチドのセグメントにわたるオーバーラップ二本鎖セットに構築することができる。次に、そのプールを鋳型として使用して１５０〜４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を生成する。典型的には１つの可変領域オリゴヌクレオチドセットを２つのプールに分解し、それらを別々に増幅して２つのオーバーラップするＰＣＲ産物を生成する。次に、これらのオーバーラップ産物をＰＣＲ増幅によって結合し、完全な可変領域を形成する。また、発現ベクター構築物に容易にクローニングすることができるフラグメントを生成するために、重鎖又は軽鎖定常領域のオーバーラップフラグメントをＰＣＲ増幅に含めることが望ましいと考えられる。
【０１７７】
次に、再構築されたキメラ又はヒト化重鎖及び軽鎖可変領域をクローニングされたプロモーター、リーダー、翻訳開始、定常領域、３'非翻訳、ポリアデニル化、及び転写終結配列と結合し、発現ベクター構築物を形成する。重鎖及び軽鎖発現構築物を、単一ベクターに結合し、宿主細胞にコトランスフェクトし、連続的にトランスフェクトし、又は別々にトランスフェクトすることができ、その後それらを融合して、両方の鎖を発現する宿主細胞を形成する。ヒトＩｇＧκについての発現ベクターの構築において使用するプラスミドを以下で述べる。ＰＣＲ増幅したＶ重鎖及びＶκ軽鎖ｃＤＮＡ配列を用いて完全な重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子を再構築できるようにプラスミドを構築した。これらのプラスミドを用いて、ヒト、又はキメラＩｇＧ１κ又はＩｇＧ４κ抗体を完全に発現できる。他の重鎖アイソタイプの発現のため、又は、λ軽鎖を含む抗体の発現のために同様のプラスミドを構築することができる。
【０１７８】
そこで、本発明の他の態様において、本発明の抗ＣＬＤ１８抗体の構造特徴を用い、ＣＬＤ１８への結合などの、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的性質を保持する構造的に関連するヒト化抗ＣＬＤ１８抗体を作製する。より詳細には、マウスモノクローナル抗体の１又はそれ以上のＣＤＲ領域は、公知のヒトフレームワーク領域及びＣＤＲと組換えによって結合して、付加的な、組換え工作された本発明のヒト化抗ＣＬＤ１８抗体を作製することができる。
【０１７９】
［抗原発現細胞への結合］
ＣＬＤ１８に結合する抗体の能力は、実施例で述べるような標準結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫蛍光及びフローサイトメトリー分析）を用いて測定することができる。
【０１８０】
［抗体の結合のキャラクタリゼーション］
抗ＣＬＤ１８抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用の２リットルスピナーフラスコにおいて増殖させることができる。あるいは、抗ＣＬＤ１８抗体を透析バイオリアクターにおいて生産することができる。上清をろ過し、必要に応じて濃縮した後、プロテインＧ−セファロース又はプロテインＡ−セファロースによるアフィニティークロマトグラフィに供することができる。溶出したＩｇＧをゲル電気泳動及び高性能液体クロマトグラフィーによって検査することで、純度を保証することができる。緩衝液をＰＢＳに交換し、１．４３の吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を測定することができる。モノクローナル抗体をアリコートに分け、−８０℃で保存することができる。
選択された抗ＣＬＤ１８モノクローナル抗体がユニークエピトープに結合するかどうかを調べるため、部位指定又は多部位指定突然変異誘発を用いることができる。
【０１８１】
［アイソタイプ決定］
精製抗体のアイソタイプを決定するため、様々な市販のキット（例えばＺｙｍｅｄ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によるアイソタイプＥＬＩＳＡを実施することができる。マイクロタイタープレートのウエルを抗マウスＩｇで被覆することができる。ブロッキング後、プレートを周囲温度で２時間、モノクローナル抗体又は精製アイソタイプ対照と反応させる。ウエルを、次に、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３、ＩｇＡ又はマウスＩｇＭ−特異的ペルオキシダーゼ結合プローブのいずれかと反応させることができる。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で展開し、４０５〜６５０のＯＤで分析することができる。あるいは、ＩｓｏＳｔｒｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（ロシュ、カタログ番号１４９３０２７）を、製造者によって述べられているように使用してもよい。
【０１８２】
［フローサイトメトリー分析］
免疫したマウスの血清における抗ＣＬＤ１８抗体の存在又はＣＬＤ１８を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするため、フローサイトメトリーを使用することができる。天然に又はトランスフェクション後にＣＬＤ１８を発現する細胞系とＣＬＤ１８発現を欠く陰性対照（標準増殖条件下で増殖させた）を、ハイブリドーマ上清中又は１％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で様々な濃度のモノクローナル抗体と混合し、４℃で３０分間インキュベートすることができる。洗浄後、ＡＰＣ又はＡｌｅｘａ６４７標識抗ＩｇＧ抗体を、一次抗体染色と同じ条件下でＣＬＤ１８結合モノクローナル抗体に結合することができる。光散乱及び側方散乱特性を使用するＦＡＣＳ装置でのフローサイトメトリーによって試料を分析することで、単一生細胞にゲートをかけることができる。１つの測定においてＣＬＤ１８特異的モノクローナル抗体を非特異的結合抗体と区別するため、コトランスフェクションの方法が使用できる。ＣＬＤ１８と蛍光マーカーをコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトした細胞を上述したように染色することができる。トランスフェクトした細胞は、抗体染色細胞とは異なる蛍光チャネルで検出できる。トランスフェクト細胞の大部分は両方の導入遺伝子を発現するので、ＣＬＤ１８特異的モノクローナル抗体は蛍光マーカー発現細胞に選択的に結合するのに対し、非特異的抗体は同等の比率で非トランスフェクト細胞に結合する。蛍光顕微鏡検査を用いる選択的アッセイを、フローサイトメトリーアッセイに加えて又はその代わりに使用することができる。細胞を上述したように正確に染色し、蛍光顕微鏡によって検査することができる。
【０１８３】
密着結合タンパク質は、特に接着細胞の近接細胞への接触が、例えば細胞の分離によって失われた場合、インターナリゼーションされる傾向がある。ＣＬＤ１８の細胞表面発現は、ａ）培養条件を調整することによって、例えば標準化された方法でより高い細胞密度で培養すること、穏やかな分離（例えば２ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ又はアキュターゼ）を使用すること、室温で処理すること、及びエンドサイトーシスの阻害剤（例えばアジ化ナトリウム）又はＣＬＤ１８転写又は翻訳活性化因子を添加することによって、及びｂ）細胞表面でＣＬＤ１８を高レベルに維持する細胞の選択とクローニングによって、例えばトランスフェクト細胞に関する抗生物質での選択によって、免疫磁気又はＦＡＣＳセルソーティングによって、及び限界希釈クローニングによって、最適化することができる。
【０１８４】
［免疫蛍光顕微鏡検査］
免疫したマウスの血清における抗ＣＬＤ１８抗体の存在又はＣＬＤ１８を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするため、免疫蛍光顕微鏡分析を使用することができる。例えば自然に又はトランスフェクション後にＣＬＤ１８を発現する細胞系とＣＬＤ１８発現を欠く陰性対照を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、標準増殖条件下にてチェンバースライドで増殖させる。次に、細胞をメタノール又はパラホルムアルデヒドで固定するか又は未処置のままにしておくことができる。その後、細胞をＣＬＤ１８に対するモノクローナル抗体と２５℃で３０分間反応させることができる。洗浄後、細胞を同じ条件下でＡｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と反応させることができる。その後蛍光顕微鏡によって細胞を検査することができる。
【０１８５】
細胞中の総ＣＬＤ１８レベルは、細胞をメタノール固定又はパラホルムアルデヒド固定し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過性を上げたときに観察することができる。生細胞及び透過性を上げていないパラホルムアルデヒド固定細胞においてＣＬＤ１８の表面局在化を検査できる。加えて、密着結合へのＣＬＤ１８のターゲティングは、ＺＯ−１などの密着結合マーカーでの共染色によって分析できる。さらに、抗体結合の影響及び細胞膜内でのＣＬＤ１８局在化が検査できる。
【０１８６】
［ウエスタンブロット法］
抗ＣＬＤ１８  ＩｇＧは、ウエスタンブロット法によってＣＬＤ１８抗原との反応性に関してさらに試験できる。簡単に述べると、ＣＬＤ１８を発現する細胞からの細胞抽出物と適切な陰性対照を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に転写し、ブロックして、試験するモノクローナル抗体でプローブする。抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼを用いてＩｇＧ結合を検出し、ＥＣＬ基質で展開することができる。
【０１８７】
［免疫組織化学］
抗ＣＬＤ１８マウスＩｇＧは、当業者に周知の方法で免疫組織化学によって、ＣＬＤ１８抗原との反応性に関してさらに試験することができる。この方法としては、例えば、常套的外科手術の間に患者から得た非癌組織又は癌組織試料、又はＣＬＤ１８を自然に（例えばＤＡＮ−Ｇ、ＳＮＵ−１６又はＫＡＴＯ−ＩＩＩ）もしくはトランスフェクション後に（例えばＨＥＫ２９３細胞）発現する細胞系を接種した異種移植腫瘍を担持するマウスから得た非癌組織又は癌組織試料からのパラホルムアルデヒド又はアセトン固定した凍結切片又はパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋組織切片を使用する方法がある。免疫染色のため、ＣＬＤ１８に対して反応性の抗体をインキュベートし、次いで供給者の指示に従ってホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス又はヤギ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ）と共にインキュベートすることができる。
【０１８８】
［インビトロでの抗体の食作用及び細胞死滅活性］
ＣＬＤ１８に特異的に結合することに加えて、抗ＣＬＤ１８抗体は、ＣＬＤ１８を発現する細胞の食作用及び死滅を媒介するそれらの能力に関して試験することができる。インビトロでのモノクローナル抗体活性の試験は、インビボモデルにおける試験に先立つ初期スクリーニングを提供する。
【０１８９】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）：
簡単に述べると、健常ドナーからの多形核細胞（ＰＭＮ）、ＮＫ細胞、単球、単核細胞又は他のエフェクター細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ比重遠心分離、次いで夾雑赤血球の溶解によって精製することができる。洗浄したエフェクター細胞を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清又は５％熱不活化ヒト血清を添加したＲＰＭＩに懸濁し、ＣＬＤ１８を発現する５１Ｃｒ標識標的細胞と、エフェクター細胞対標的細胞の様々な比率で混合することができる。あるいは、標的細胞は蛍光増強リガンド（ＢＡＴＤＡ）で標識してもよい。死細胞から放出される増強リガンドを有するユーロピウムの高度蛍光キレートを蛍光光度計によって測定することができる。もう１つの選択的手法として、ルシフェラーゼによる標的細胞のトランスフェクションを利用することができる。添加されたルシファーイエローは生細胞によってのみ酸化され得る。次に精製抗ＣＬＤ１８  ＩｇＧを様々な濃度で添加することができる。無関係なヒトＩｇＧが陰性対照として使用できる。アッセイは、使用するエフェクター細胞型に依存して３７℃で４〜２０時間実施できる。培養上清中の５１Ｃｒ放出又はＥｕＴＤＡキレートの存在を測定することにより、細胞溶解に関して試料を検定することができる。あるいは、ルシファーイエローの酸化により生じる発光によって生細胞の測定をすることができる。抗ＣＬＤ１８モノクローナル抗体はまた、細胞溶解が複数のモノクローナル抗体で増強されるかどうかを調べるために様々な組合せで試験することができる。
【０１９０】
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）：
モノクローナル抗ＣＬＤ１８抗体は、様々な公知の手法を用いてＣＤＣを媒介する能力に関して試験することができる。例えば、補体のための血清は当業者に公知の方法で血液から入手することができる。ｍＡｂのＣＤＣ活性を測定するために種々の方法が使用できる。例えば５１Ｃｒ放出を測定したり、又はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除アッセイを用いて膜透過性上昇を評価したりすることができる。簡単に述べると、標的細胞を洗浄し、５×１０５／ｍｌを様々な濃度のｍＡｂと共に室温又は３７℃で１０〜３０分間インキュベートすることができる。次に、血清又は血漿を２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加し、細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベートすることができる。各々の試料からのすべての細胞をＦＡＣＳチューブ中のＰＩ溶液に添加することができる。その後ＦＡＣＳＡｒｒａｙを用いたフローサイトメトリー分析によって混合物を直ちに分析することができる。選択的アッセイでは、ＣＤＣの誘導を接着細胞に関して測定できる。このアッセイの１の実施形態では、アッセイの２４時間前に細胞を組織培養平底マイクロタイタープレートに３×１０４／ウエルの密度で接種する。その翌日、増殖培地を除去し、細胞を抗体と共に３組重複してインキュベートする。コントロール細胞は、それぞれバックグラウンド溶解及び最大溶解の測定のために増殖培地又は０．２％サポニンを含む増殖培地と共にインキュベートする。室温で２０分間のインキュベーション後、上清を取り、ＤＭＥＭ中の２０％（ｖ／ｖ）ヒト血漿又は血清（あらかじめ３７℃に温めておく）を細胞に添加して、３７℃でさらに２０分間インキュベートする。各々の試料からのすべての細胞をヨウ化プロピジウム溶液（１０μｇ／ｍｌ）に添加する。次に、上清を、２．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含むＰＢＳに置き換え、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅを用いて５２０ｎｍでの励起後の蛍光放出を６００ｎｍで測定する。特異的細胞溶解のパーセンテージを以下のように算定する：特異的細胞溶解％＝（試料蛍光−バックグラウンド蛍光）／（最大細胞溶解蛍光−バックグラウンド蛍光）×１００。
【０１９１】
モノクローナル抗体による細胞増殖の阻害：
アポトーシスを開始させる能力に関して試験するため、モノクローナル抗ＣＬＤ１８抗体を、例えばＣＬＤ１８陽性腫瘍細胞、例えばＳＮＵ−１６、ＤＡＮ−Ｇ、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ又はＣＬＤ１８トランスフェクト腫瘍細胞と共に３７℃で約２０時間インキュベートすることができる。細胞を採集し、アネキシンＶ結合緩衝液（ＢＤ  バイオサイエンス）中で洗浄して、ＦＩＴＣ又はＡＰＣと結合したアネキシンＶ（ＢＤ  バイオサイエンス）と共に暗所で１５分間インキュベートすることができる。各々の試料からのすべての細胞をＦＡＣＳチューブ中のＰＩ溶液（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）に添加し、フローサイトメトリーによって（上記のように）直ちに評価することができる。あるいは、モノクローナル抗体による細胞増殖の一般的阻害は市販のキットで検出し得る。ＤＥＬＦＩＡ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマー、カタログ番号ＡＤ０２００）は、マイクロプレートにおける増殖細胞のＤＮＡ合成の間の５−ブロモ−２'−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の組込みの測定に基づく非同位体免疫検定法である。組み込まれたＢｒｄＵは、ユーロピウム標識モノクローナル抗体を使用して検出される。抗体検出を可能にするために、Ｆｉｘ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用して細胞を固定し、ＤＮＡ変性する。非結合抗体を洗い流し、ＤＥＬＦＩＡ誘導剤を添加して標識抗体からユーロピウムイオンを溶液中に解離し、溶液中で前記イオンはＤＥＬＦＩＡ誘導剤の成分と高度に蛍光性のキレートを形成する。検出において時間分解蛍光光度法を使用して測定した蛍光は、各々のウエルの細胞におけるＤＮＡ合成に比例する。
【０１９２】
［前臨床試験］
ＣＬＤ１８に結合するモノクローナル抗体はまた、インビボモデルにおいて（例えばＣＬＤ１８を発現する細胞系、例えばＤＡＮ−Ｇ、ＳＮＵ−１６又はＫＡＴＯ−ＩＩＩ、又はトランスフェクション後にＣＬＤ１８を発現する細胞系、例えばＨＥＫ２９３を接種した異種移植腫瘍を担持する免疫不全マウスにおいて）試験することで、ＣＬＤ１８を発現する腫瘍細胞増殖を制御する上でのそれらの効果を決定することができる。
【０１９３】
本発明の抗体を使用して、ＣＬＤ１８を発現する腫瘍細胞を免疫無防備状態マウス又は他の動物に異種移植した後のインビボ試験を実施することができる。抗体を腫瘍のないマウスに投与し、次いで腫瘍細胞を注射して、腫瘍の形成又は腫瘍関連症状を予防する抗体の作用を測定することができる。抗体を腫瘍担持マウスに投与して、腫瘍の成長、転移又は腫瘍関連症状を低減するそれぞれの抗体の治療効果を決定することができる。抗体適用は、細胞増殖抑制薬、増殖因子阻害剤、細胞周期ブロッカー、血管新生阻害剤又は他の抗体のような他の物質の適用と組み合わせることで、相乗効果及び併用の潜在的毒性を調べることができる。本発明の抗体によって媒介される毒性副作用を分析するため、動物に抗体又は対照試薬を接種し、ＣＬＤ１８抗体治療に関連する可能性がある症状に関して十分に検討することができる。ＣＬＤ１８抗体のインビボ適用の起こり得る副作用は、特に胃及び肺を含むＣＬＤ１８発現組織における毒性を含む。ヒト及び他の種、例えばマウスにおいてＣＬＤ１８を認識する抗体は、ヒトにおけるモノクローナルＣＬＤ１８抗体の適用によって媒介される潜在的副作用を予測するために特に有用である。
【０１９４】
［エピトープマッピング］
本発明の抗体によって認識されるエピトープのマッピングは、Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓによる「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」ＩＳＢＮ−０８９６０３−３７５−９及びＯｌｗｙｎ  Ｍ．Ｒ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｆｒａｎｋ  Ｃ．Ｈａｙによる「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，２４８の中で詳細に述べられているように実施できる。
【０１９５】
［Ｉ．ＣＬＤ１８に結合する二重特異性／多重特異性分子］
本発明のさらに他の実施形態では、ＣＬＤ１８に対する抗体は、もう１つ別の機能的分子、例えば別のペプチド又はタンパク質（例えばＦａｂ'フラグメント）に誘導体化する又は連結し、複数の結合部位又は標的エピトープに結合する二重特異性又は多重特異性分子を生成することができる。例えば、本発明の抗体は、もう１つ別の抗体、ペプチド又は結合ミメティックなどの１以上の他の結合分子に機能的に連結することができる（例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合的会合等によって）。
【０１９６】
従って、本発明は、ＣＬＤ１８に対する少なくとも１つの第一結合特異性と２番目の標的エピトープに対する第二結合特異性を含む二重特異性及び多重特異性分子を包含する。本発明の特定の実施形態では、２番目の標的エピトープは、Ｆｃ受容体、例えばヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）又はヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）、又はＴ細胞受容体、例えばＣＤ３である。それ故、本発明は、ＦｃγＲ、ＦｃαＲ又はＦｃεＲを発現するエフェクター細胞（例えば単球、マクロファージ又は多形核細胞（ＰＭＮ））とＣＬＤ１８を発現する標的細胞の両方に結合することができる二重特異性及び多重特異性分子を包含する。これらの二重特異性及び多重特異性分子は、ＣＬＤ１８発現細胞をエフェクター細胞に標的し、Ｆｃ受容体を介したエフェクター細胞活性、例えばＣＬＤ１８発現細胞の食作用、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出、又はスーパーオキシドアニオンの生成を引き起こすことができる。
【０１９７】
本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性及び抗ＣＬＤ１８結合特異性に加えて、第三の結合特異性をさらに含むことができる。１の実施形態において、第三結合特異性は、抗増強因子（ＥＦ）部分、例えば、細胞傷害活性に関与する表面タンパク質に結合し、それによって標的細胞に対する免疫応答を上昇させる分子である。「抗増強因子部分」は、所与の分子、例えば抗原又は受容体に結合し、それによってＦｃ受容体又は標的細胞抗原の結合決定基の作用の増強を生じさせる抗体、機能的抗体フラグメント又はリガンドとすることができる。「抗増強因子部分」は、Ｆｃ受容体又は標的細胞抗原に結合することができる。あるいは、抗増強因子部分は、第一及び第二結合特異性部分が結合する実体とは異なる実体に結合できる。例えば、抗増強因子部分は細胞傷害性Ｔ細胞に結合できる（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１又は標的細胞に対する免疫応答増強を生じさせる他の免疫細胞を通して）。
【０１９８】
１の実施形態において、本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、結合特異性部分として、例えばＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ又は一本鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体を含有する。本発明の抗体はまた、軽鎖又は重鎖二量体としてもよいし、又はＦｖもしくはＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号に述べられている一本鎖構築物のようなその何らかの最小フラグメントとしてもよい。抗体はまた、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１１８５９２号及び同第ＵＳ２００３／０１３３９３９号に開示されている結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質としてもよい。
【０１９９】
１の実施形態では、本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、エフェクター細胞の表面上に存在するＦｃγＲ又はＦｃαＲに対する結合特異性、及び標的細胞抗原、例えばＣＬＤ１８に対する第二結合特異性を含む。
【０２００】
１つの実施形態では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性は、モノクローナル抗体によって提供され、その結合は、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）によってブロックされない。本明細書で使用される、「ＩｇＧ受容体」という用語は、第１番染色体上に位置する８個のγ鎖遺伝子のいずれかを指す。これらの遺伝子は合計１２の膜貫通型又は可溶性受容体アイソフォームをコードし、それらは３つのＦｃγ受容体クラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に分類される。１の好ましい実施形態において、Ｆｃγ受容体はヒト高親和性ＦｃγＲＩである。
【０２０１】
これらの好ましいモノクローナル抗体の作製と特徴づけは、国際公開公報第ＷＯ８８／０００５２号及び米国特許第４，９５４，６１７号においてＦａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．によって記述されている。これらの抗体は、受容体のＦｃγ結合部位とは異なる部位でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩのエピトープに結合し、それ故、それらの結合は生理的レベルのＩｇＧによって実質的にブロックされない。本発明において有用な特異的抗ＦｃγＲＩ抗体は、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２及びｍＡｂ１９７である。他の実施形態では、抗Ｆｃγ受容体抗体は、モノクローナル抗体２２のヒト化形態（Ｈ２２）である。Ｈ２２抗体の作製と特徴づけは、Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２及び国際公開公報第ＷＯ９４／１０３３２号に述べられている。Ｈ２２抗体を産生する細胞系は、１９９２年１１月４日にＨＡ０２２ＣＬ１の名称でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、アクセッション番号ＣＲＬ１１１７７を有する。
【０２０２】
さらなる他の好ましい実施形態では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性は、ヒトＩｇＡ受容体、例えばＦｃα受容体（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））に結合する抗体によって提供され、その結合が、好ましくはヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）によってブロックされない。「ＩｇＡ受容体」という用語は、第１９番染色体上に位置する１個のα遺伝子（ＦｃαＲＩ）の遺伝子産物を含むことが意図されている。この遺伝子は、５５〜１１０ｋＤａの数個の選択的にスプライシングされる膜貫通型アイソフォームをコードすることが知られている。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸性及び好中性顆粒球上で構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団では発現されない。ＦｃαＲＩは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２の両方に対して中等度の親和性を有しており、前記親和性はＧ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインへの暴露後に上昇する（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６：４２３−４４０）。ＩｇＡリガンド結合ドメインの外側でＦｃαＲＩに結合し、Ａ３、Ａ５９、Ａ６２及びＡ７７と同定された４つのＦｃαＲＩ特異的モノクローナル抗体が記述されている（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１７６４）。
【０２０３】
ＦｃαＲＩ及びＦｃγＲＩは本発明における使用のための好ましいトリガ受容体であり、その理由は、それらが、（１）主として免疫エフェクター細胞上で、例えば単球、ＰＭＮ、マクロファージ及び樹状細胞上で発現される、（２）高レベル（例えば５，０００〜１００，０００／細胞）で発現される、（３）細胞傷害活性（例えばＡＤＣＣ、食作用）のメディエイタである、（４）それらに標的される、自己抗原を含む抗原の抗原提示増強を媒介するためである。
【０２０４】
他の実施形態において、二重特異性分子は、一方の抗体が主としてＣＤＣを誘導することによって働き、他方の抗体が主としてアポトーシスを誘導することによって作用するような、補完的機能活性を有する本発明による２つのモノクローナル抗体から成る。
【０２０５】
本明細書で使用される「エフェクター細胞特異的抗体」は、エフェクター細胞のＦｃ受容体に結合する抗体又は機能的抗体フラグメントを指す。本発明における使用のための好ましい抗体は、内因性免疫グロブリンによって結合されない部位でエフェクター細胞のＦｃ受容体に結合する。
【０２０６】
本明細書で使用される、「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識相及び活性化相に対して、免疫応答の作動相（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｐｈａｓｅ）に関与する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞は、骨髄系又はリンパ系起源の細胞、例えばリンパ球（例えばＢ細胞及び細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞、及び好塩基球を含む。一部のエフェクター細胞は、特異的Ｆｃ受容体を発現し、特異的免疫機能を実行する。好ましい実施形態では、エフェクター細胞は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができ、例えば好中球はＡＤＣＣを誘導できる。例えば、ＦｃＲを発現する単球、マクロファージは、標的細胞の特異的死滅及び免疫系の他の成分への抗原の提示、又は抗原を提示する細胞への結合に関与する。他の実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原、標的細胞又は微生物を貪食することができる。エフェクター細胞上での特定ＦｃＲの発現は、サイトカインなどの体液性因子によって調節することができる。例えば、ＦｃγＲＩの発現はインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）によって上方調節されることが認められた。この発現増強は、標的に対するＦｃγＲＩ担持細胞の細胞傷害活性を上昇させる。エフェクター細胞は、標的抗原又は標的細胞を貪食する又は溶解することができる。
【０２０７】
「標的細胞」は、本発明の抗体によって標的され得る、被験者（例えばヒト又は動物）における何らかの望ましくない細胞を意味する。好ましい実施形態では、標的細胞は、ＣＬＤ１８を発現する又は過剰発現する細胞である。ＣＬＤ１８を発現する細胞は、典型的には腫瘍細胞を含む。
【０２０８】
本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、化学的手法（例えばＤ．Ｍ．Ｋｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：５８０７参照）、「ポリドーマ」手法（例えばＲｅａｄｉｎｇへの米国特許第４，４７４，８９３号参照）、又は組換えＤＮＡ手法を用いて作製できる。
【０２０９】
特に、本発明の二重特異性分子及び多重特異性分子は、当技術分野で公知の方法を用いて、成分を結合特異性部分、例えば抗ＦｃＲ及び抗ＣＬＤ１８結合特異性部分に結合することによって作製できる。例えば、二重特異性及び多重特異性分子の各々の結合特異性部分を別々に作製し、その後互いに結合することができる。結合特異性部分がタンパク質又はペプチドであるとき、様々なカップリング剤又は架橋剤が共有結合のために使用できる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）（例えばＫａｒｐｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ，ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６４８参照）を含む。他の方法は、Ｐａｕｌｕｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．（１９８５）Ｎｏ．７８，１１８−１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２９：８１−８３）、及びＧｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３９：２３６７−２３７５）によって述べられているものを含む。好ましい結合剤はＳＡＴＡ及びスルホ−ＳＭＣＣであり、どちらもＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能である。
【０２１０】
結合特異性部分が抗体であるとき、それらは、２本の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によって結合することができる。特に好ましい実施形態では、ヒンジ領域は、結合の前に、奇数、好ましくは１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
【０２１１】
あるいは、両方の結合特異性部分が同じベクター内でコードされ、同じ宿主細胞において発現し、構築することができる。この方法は、二重特異性及び多重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ'）２又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異性及び多重特異性分子、例えば二重特異性分子は、一本鎖二重特異性抗体のような一本鎖分子、１つの一本鎖抗体と１つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子、又は２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子とすることができる。二重特異性及び多重特異性分子はまた、一本鎖分子とすることもでき、又は少なくとも２つの一本鎖分子を含んでもよい。二重特異性及び多重特異性分子を作製するための方法は、例えば米国特許第５，２６０，２０３号；同第５，４５５，０３０号；同第４，８８１，１７５号；同第５，１３２，４０５号；同第５，０９１，５１３号；同第５，４７６，７８６号；同第５，０１３，６５３号；同第５，２５８，４９８号；及び同第５，４８２，８５８号に述べられている。
【０２１２】
二重特異性及び多重特異性分子の、特異的標的への結合は、酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、生物学的検定法（例えば増殖阻害）、又はウエスタンブロット法によって確認できる。これらのアッセイの各々は、一般に、対象複合体に特異的な標識試薬（例えば抗体）を用いることによって特定対象とするタンパク質−抗体複合体の存在を、検出する。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば酵素結合抗体又は抗体−ＦｃＲ複合体を認識して特異的に結合する抗体フラグメントを用いて検出することができる。あるいは、複合体は様々な他の免疫測定法のいずれかを用いて検出できる。例えば、抗体を放射性標識し、放射免疫測定法（ＲＩＡ）において使用することができる（例えばＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６参照）。放射性同位体は、γ計数器又はシンチレーション計数器の使用などの手段によって、又はオートラジオグラフィーによって検出できる。
【０２１３】
［ＩＩ．免疫複合体］
他の態様において、本発明は、細胞毒、薬剤（例えば免疫抑制剤）又は放射性同位体などの治療成分又は物質に結合した抗ＣＬＤ１８抗体を特徴とする。そのような複合体を本明細書では「免疫複合体」と称する。１以上の細胞毒を含有する免疫複合体を「免疫毒素」と称する。細胞毒又は細胞傷害性物質は、細胞に有害であって、特に細胞を死滅させるいかなる物質も包含する。その例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにそれらの類似体又はホモログを含む。
【０２１４】
本発明の免疫複合体を形成するための適切な治療薬は、代謝拮抗物質（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）（シスプラチン））、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗有糸分裂薬（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、治療薬は、細胞傷害性物質又は放射性毒性物質である。他の実施形態では、治療薬は免疫抑制剤である。さらに他の実施形態では、治療薬はＧＭ−ＣＳＦである。好ましい実施形態では、治療薬は、ドキソルビシン、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド又はリシンＡである。
【０２１５】
本発明の抗体はまた、放射性同位体、例えばヨウ素１３１、イットリウム９０又はインジウム１１１に結合して、癌などのＣＬＤ１８関連疾患を治療するための細胞傷害性放射性薬剤を生成することもできる。本発明の抗体複合体を用いて、所与の生物学的応答を調節することができ、薬剤成分は古典的化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬剤成分は、所望生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素などの酵素的に活性な毒素又はその活性フラグメント；腫瘍壊死因子又はインターフェロンγなどのタンパク質、又は、例えばリンホカイン、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）又は他の増殖因子などの生物学的応答調節剤を含み得る。
【０２１６】
そのような治療成分を抗体に結合するための手法は周知であり、例えばＡｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  '８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、及びＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）参照。
【０２１７】
さらなる実施形態では、本発明による抗体は、抗体を放射性同位体に結合することを可能にする、リンカー−キレート化剤、例えばチウキセタンに結合される。
【０２１８】
［ＩＩＩ．医薬組成物］
他の態様において、本発明は、本発明の抗体の１つ又は抗体の組合せを含有する組成物、例えば医薬組成物を提供する。医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に開示されているような従来の手法に従って、医薬的に許容される担体又は希釈剤並びに何らかの他の公知のアジュバント及び賦形剤と共に製剤することができる。１つの実施形態において、組成物は、異なる機構によって作用する本発明の複数の（例えば２又はそれ以上の）単離抗体の組合せ、例えば、主としてＣＤＣを誘導することによって働く１つの抗体と、主としてアポトーシスを誘導することによって作用する別の抗体の組合せを含む。
【０２１９】
本発明の医薬組成物はまた、併用療法において、すなわち他の物質と組み合わせて投与できる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの抗炎症薬又は少なくとも１つの免疫抑制剤と本発明の組成物を含むことができる。１の実施形態において、そのような治療薬は、ステロイド系薬剤又はＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症薬）などの１以上の抗炎症薬を含む。好ましい薬剤は、例えばアスピリン及び他のサリチル酸塩、ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ）及びセレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）などのＣｏｘ−２阻害剤、イブプロフェン（Ｍｏｔｒｉｎ、Ａｄｖｉｌ）、フェノプロフェン（Ｎａｌｆｏｎ）、ナプロキセン（Ｎａｐｒｏｓｙｎ）、スリンダック（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ）、ジクロフェナク（Ｖｏｌｔａｒｅｎ）、ピロキシカム（Ｆｅｌｄｅｎｅ）、ケトプロフェン（Ｏｒｕｄｉｓ）、ジフルニサル（Ｄｏｌｏｂｉｄ）、ナブメトン（Ｒｅｌａｆｅｎ）、エトドラク（Ｌｏｄｉｎｅ）、オキサプロジン（Ｄａｙｐｒｏ）、及びインドメタシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ）などのＮＳＡＩＤを含む。
【０２２０】
他の実施形態において、そのような治療薬は、低用量シクロホスファミド、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ２又は抗ＩＬ２受容体抗体のような、制御性Ｔ細胞の枯渇又は機能的不活性化を導く物質を含む。
【０２２１】
さらに他の実施形態において、そのような治療薬は、タキソール誘導体、タキソテール、ゲンシタビン、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ、Ｎｅｏｓａｒ）などの、１以上の化学療法剤を含む。他の実施形態において、本発明の抗体は、好ましくは胃癌、食道癌、膵癌及び肺癌に罹患している患者において治療効果を示す、化学療法剤と組み合わせて投与され得る。
【０２２２】
さらに他の実施形態において、本発明の抗体は、放射線治療及び／又は自己末梢幹細胞又は骨髄移植と組み合わせて投与されてもよい。
【０２２３】
さらに他の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＣＤ２５抗体、抗ＥＰＣＡＭ抗体、抗ＥＧＦＲ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ及び抗ＣＤ４０抗体から選択される１以上の抗体と組み合わせて投与されてもよい。
【０２２４】
さらなる実施形態では、本発明の抗体は、補体活性化を増強するために抗Ｃ３ｂ（ｉ）抗体と組み合わせて投与されてもよい。
【０２２５】
本明細書で使用される、「医薬的に許容される担体」は、生理的に適合性であるありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆物、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤等を包含する。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば注射又は注入による）に適する。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち抗体、二重特異性及び多重特異性分子を物質内に被覆して、酸の作用及び化合物を不活性化し得る他の自然条件の作用から化合物を保護してもよい。
【０２２６】
「医薬的に許容される塩」は、親化合物の所望生物活性を保持し、いかなる望ましくない毒性作用も及ぼさない塩を指す（例えばＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９参照）。
【０２２７】
そのような塩の例は、酸付加塩及び塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等のような非毒性の無機酸から、並びに脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸等のような非毒性の有機酸から誘導されるものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のようなアルカリ土類金属から、並びにＮ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等のような非毒性の有機アミンから誘導されるものを含む。
【０２２８】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法によって投与できる。当業者に認識されるように、投与の経路及び／又は様式は所望の結果に依存して異なる。活性化合物は、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のような、迅速な放出に対して化合物を保護する担体と共に製造することができる。生分解性の生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸が使用できる。そのような製剤の製造のための方法は一般に当業者に公知である。例えばＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８参照。
【０２２９】
特定投与経路によって本発明の化合物を投与するために、化合物の不活性化を防ぐために化合物を物質で被覆するか、又は化合物を物質と同時投与する必要があってもよい。例えば、化合物は、適切な担体、例えばリポソーム、又は希釈剤中で被験者に投与され得る。医薬的に許容される希釈剤は、生理食塩水及び水性緩衝液を含む。リポソームは、水中油中水型ＣＧＦエマルジョン並びに従来のリポソームを含む（Ｓｔｒｅｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）。
【０２３０】
医薬的に許容される担体は、滅菌注射用溶液又は分散の即時調製のための滅菌水溶液又は分散及び滅菌粉末を含む。医薬活性物質のためのそのような媒質及び物質の使用は当技術分野において公知である。任意の従来の媒質又は物質が活性化合物と不適合性である場合を除き、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が考慮される。補足的活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【０２３１】
治療組成物は、典型的には無菌でなければならず、製造及び保存条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬剤濃度に適する他の秩序構造として製剤できる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用によって、分散の場合は必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【０２３２】
滅菌注射用溶液は、上記に列挙する成分の１つ又は成分の組合せと共に適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、必要に応じて、その後滅菌精密ろ過することによって製造できる。
【０２３３】
一般に、分散は、活性化合物を、基本分散媒及び上記に列挙するものから必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の製造のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、あらかじめ滅菌ろ過したその溶液から有効成分プラス任意の付加的な所望成分の粉末を生成する真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０２３４】
投薬レジメンは、最適所望応答（例えば治療応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与し得るか、数回の分割用量を時間をかけて投与してもよく、又は治療状況の緊急性によって指示されるのに比例して用量を減少又は増加してもよい。投与の容易さ及び用量の均一性のために非経口組成物を投与単位形態で製剤することは特に好都合である。本明細書で使用される投与単位形態は、単一投薬量として治療される被験者に適した物理的に分離した単位を指す；各々の単位は、必要とされる医薬担体と共同して所望治療効果を生じさせるように算定された、あらかじめ定められた量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位形態に関する仕様は、（ａ）活性化合物の独自の特徴及び達成されるべき特定治療効果、及び（ｂ）個体の治療感度のためにあるそのような活性化合物を配合することの当技術分野に固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
【０２３５】
医薬的に許容される抗酸化剤の例は：（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等；及び（３）金属キレート化剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等を含む。
【０２３６】
治療組成物に関して、本発明の製剤は、経口、経鼻、局所（口腔及び舌下を含む）、直腸、膣及び／又は非経口投与に適する製剤を含む。製剤は、単位投与形態で適宜提供されることができ、薬学の技術分野において公知の何らかの方法によって製造することができる。担体材料と組み合わせて単一投与形態を生産することができる有効成分の量は、治療される被験者及び特定投与様式によって異なる。担体材料と組み合わせて単一投与形態を生産することができる有効成分の量は、一般に治療効果を生じさせる組成物の量である。
【０２３７】
一般に、１００％のうち、この量は約０．０１％〜約９９％の有効成分、好ましくは約０．１％〜約７０％、最も好ましくは約１％〜約３０％の有効成分の範囲である。
【０２３８】
膣投与に適する本発明の製剤はまた、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡又はスプレー製剤を含み、こうしたキャリアは、当技術分野において適切なものとして知られている。本発明の組成物の局所又は経皮投与用の投与形態は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤を含む。活性化合物は、無菌条件下で医薬的に許容されるキャリア、及び必要とされ得る何らかの防腐剤、緩衝剤又は噴射剤と混合してもよい。
【０２３９】
本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という語句は、通常は注射による、腸内及び局所的投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入を含み、これらに限定されない。
【０２４０】
本発明の医薬組成物において使用し得る適切な水性及び非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルを含む。適切な流動性は、例えばレシチンなどの被覆材料の使用、分散の場合は必要とされる粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０２４１】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントを含有してもよい。微生物の存在の防止は、無菌手順、及び種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の含有の両方によって確保することができる。また、糖類、塩化ナトリウム等のような等張剤を組成物に含めることも望ましいと考えられる。加えて、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる物質を含めることによって注射用医薬形態の長期的吸収を実現してもよい。
【０２４２】
１の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、皮下注射によって結晶形態で投与される。Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ，１００（１２）：６９３４−６９３９参照。本発明の化合物が薬剤としてヒト及び動物に投与されるとき、それらは、単独で、又は医薬的に許容される担体と組み合わせて、例えば０．０１〜９９．５％（より好ましくは０．１〜９０％）の有効成分を含有する医薬組成物として投与することができる。
【０２４３】
選択される投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用され得る本発明の化合物及び／又は本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって医薬的に許容される投与形態で製剤化される。
【０２４４】
患者への毒性を伴わずに、特定の患者、組成物及び投与様式について所望治療応答を達成するために有効な有効成分の量が得られるように、本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の用量レベルを変化させてもよい。選択される用量レベルは、様々な薬物動態因子、例えば使用される本発明の特定組成物の活性、投与経路、投与の時間、使用される特定化合物の排泄速度、治療期間、特定組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康及び過去の病歴、及び医学技術分野において周知の同様の因子に依存する。
【０２４５】
当業者である医師又は獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師又は獣医は、医薬組成物中で使用される本発明の化合物の用量を、所望治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで開始し、所望効果が達成されるまで徐々に投与量を増加することができる。一般に、本発明の組成物の適切な１日用量は、治療効果を生じさせるために有効な最も低い用量の化合物量である。そのような有効用量は、一般に上述した因子に依存する。投与は静脈内、筋肉内、腹腔内又は皮下投与であることが好ましく、好ましくは標的部位の近位に投与される。所望の場合は、治療組成物の有効１日用量を、１日を通じて適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６又はそれ以上の分割用量として、場合により単位投与形態で、投与し得る。本発明の化合物は、単独で投与することが可能であるが、医薬製剤（組成物）として本発明の化合物を投与することが好ましい。
【０２４６】
１の実施形態において、本発明の抗体は、毒性副作用を低減するために注入によって、好ましくは２４時間を超えるような長期間にわたる緩徐な持続注入によって投与してもよい。投与はまた、２〜２４時間、例えば２〜１２時間にわたる持続注入によって実施してもよい。そのようなレジメンは、必要に応じて１回又はそれ以上、例えば６ヵ月後又は１２ヵ月後に繰り返してもよい。抗ＣＬＤ１８抗体を標的する抗イディオタイプ抗体を使用して生物学的試料における投与後の循環モノクローナル抗ＣＬＤ１８抗体の量を測定することによって、投与量を決定する又は調整することができる。
【０２４７】
さらに他の実施形態において、本発明の抗体は、例えば週に１回、６ヶ月又はそれ以上の期間にわたるような、維持療法によって投与される。
【０２４８】
さらに他の実施形態において、本発明による抗体は、ＣＬＤ１８に対する抗体の１回の注入、次いで放射性同位体に結合したＣＬＤ１８に対する抗体の注入を含むレジメンによって投与され得る。レジメンは、例えば７−９日後に反復することができる。
【０２４９】
治療組成物は、当技術分野で公知の医療装置を用いて投与できる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の治療組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号；又は同第４，５９６，５５６号に開示されている装置のような、無針皮下注射装置で投与することができる。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例は、制御された速度で薬剤を供給するための移植可能な微量注入ポンプを開示する、米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通して薬剤を投与するための治療装置を開示する、米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示する、米国特許第４，４４７，２３３号；持続的薬剤送達のための可変流量移植可能注入装置を開示する、米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチェンバー区画を有する浸透圧薬剤送達システムを開示する、米国特許第４，４３９，１９６号；及び浸透圧薬剤送達システムを開示する、米国特許第４，４７５，１９６号に述べられるものを含む。
【０２５０】
多くの他のそのようなインプラント、送達システム及びモジュールが当業者に公知である。ある実施形態では、本発明の抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高度親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを越えることを確実にするため（所望する場合）、それらを、例えばリポソーム中に製剤することができる。リポソームを製造するための方法については、例えば米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；及び同第５，３９９，３３１号参照。リポソームは、特定細胞又は器官内に選択的に輸送され、それ故標的化薬剤送達を促進する１以上の成分を含んでもよい（例えばＶ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５参照）。例示的な標的化成分は、葉酸塩又はビオチン（例えばＬｏｗ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，４１６，０１６号参照）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；及び界面活性剤プロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）を含む。
【０２５１】
本発明の１の実施形態において、本発明の治療化合物はリポソーム中に製剤される。より好ましい実施形態では、リポソームは標的化成分を含む。最も好ましい実施形態では、リポソーム中の治療化合物は、所望領域に近位の部位、例えば腫瘍の部位にボーラス注射によって送達される。組成物は、容易に注射可能である程度に流動性でなければならない。組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、また細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。
【０２５２】
さらなる実施形態では、本発明の抗体は、胎盤を横切る輸送を予防し又は低減するように製剤化することができる。これは、当技術分野で公知の方法によって、例えば抗体のＰＥＧ化によって又はＦ（ａｂ）２'フラグメントの使用によって実施され得る。さらに、「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ−Ｒｕｎｄｌｅｓ  Ｃ，Ｚｈｕｏ  Ｚ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｂ，Ｋｅｅｎａｎ  Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５２：１７７−１９０」；及び「Ｌａｎｄｏｒ  Ｍ．（１９９５）Ｍａｔｅｒｎａｌ−ｆｅｔａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７４：２７９−２８３」が参照できる。
【０２５３】
腫瘍治療のための「治療有効用量」は、完全又は部分的であり得る客観的腫瘍応答によって測定できる。完全応答（ＣＲ）は、疾患の臨床的、放射線医学的又は他の証拠がないことと定義される。部分応答（ＰＲ）は、凝集腫瘍径の５０％を超える減少から生じる。進行までの平均時間は、客観的腫瘍応答の持続性を特徴づける測定値である。
【０２５４】
腫瘍治療のための「治療有効用量」はまた、疾患の進行を安定化するその能力によっても測定できる。癌を抑制する化合物の能力は、ヒト腫瘍における効果を予測する動物モデル系で評価することができる。あるいは、組成物のこの性質は、当業者に公知のインビトロアッセイにより、細胞増殖又はアポトーシスを阻害する化合物の能力を検討することによって評価できる。治療化合物の治療有効量は、腫瘍径を減少させる又はさもなければ被験者において症状を改善することができる。当業者は、被験者の大きさ、被験者の症状の重症度、及び選択される特定組成物又は投与経路などの因子に基づいてその量を決定することができる。
【０２５５】
組成物は、無菌でなければならず、また組成物が注射器によって送達可能である程度に流動性がなければならない。水に加えて、キャリアは、等張緩衝塩類溶液、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用によって、分散の場合は必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトール又はソルビトールなどの多価アルコール、及び塩化ナトリウムを組成物中に含有することが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを組成物中に含めることによって達成することができる。
【０２５６】
上述したように、活性化合物が適切に保護されているとき、化合物は、例えば不活性希釈剤又は同化性食用担体と共に、経口的に投与されてもよい。
【０２５７】
［ＩＶ．本発明の用途及び方法］
本発明の抗体（本明細書で述べる免疫複合体、二重特異性／多重特異性分子、組成物及び他の誘導体を含む）は、ＣＬＤ１８を発現する細胞が関与する疾患の治療を含む数多くの治療上の有用性を有する。抗体は、例えばインビトロもしくはエクスビボで培養下の細胞に、又は例えばインビボでヒト被験者に投与することで、本明細書で述べるような様々な疾患を治療する又は予防することができる。本明細書で使用される、「被験者」という用語は、ＣＬＤ１８に対する抗体に応答するヒト及び非ヒト動物を含むことが意図されている。好ましい被験者は、疾患細胞、特に正常細胞と比較してＣＬＤ１８の変化した発現パターンによって特徴づけられる細胞を死滅させることによって矯正又は改善できる疾患を有するヒト患者を含む。
【０２５８】
本明細書で論じる治療における治療効果は、好ましくは、例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）媒介性細胞溶解、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介性細胞溶解、アポトーシス、同型接着、及び／又は食作用を誘導することによって、好ましくはＣＤＣ媒介性細胞溶解及び／又はＡＤＣＣ媒介性細胞溶解を誘導することによって、細胞の死滅を媒介する本発明の抗体の機能的性質を通して達成される。
【０２５９】
例えば、１の実施形態において、本発明の抗体を使用して、腫瘍形成性疾患、例えば、ＣＬＤ１８を発現する腫瘍細胞の存在によって特徴づけられる疾患、例えば胃癌を有する被験者を治療することができる。治療及び／又は予防できる腫瘍形成性疾患の例は、胃癌、食道癌、膵癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、肝癌、胆嚢癌及び頭頸部癌を含む、ＣＬＤ１８を発現するすべての癌及び腫瘍実体を包含する。これらの癌は、早期、中期又は進行期、例えば転移であり得る。
【０２６０】
本発明に従って述べる医薬組成物及び治療方法はまた、本明細書で述べる疾患を予防するための免疫又はワクチン接種にも使用し得る。
【０２６１】
他の実施形態では、本発明の抗体を使用して、ＣＬＤ１８又はＣＬＤ１８の特定形態のレベル、又はそれらの膜表面にＣＬＤ１８を含む細胞のレベルを検出することができ、そのレベルが上述したような特定の疾患又は疾患症状に結びつけることができる。あるいは、抗体を使用して、ＣＬＤ１８発現細胞の機能を枯渇させるか又はそれらの機能と相互作用して、それによりこれらの細胞を疾患の重要なメディエイタとして関係づけることができる。これは、抗体とＣＬＤ１８との間で複合体の形成を許容する条件下で、試料及び対照試料を抗ＣＬＤ１８抗体と接触させることによって達成できる。抗体とＣＬＤ１８との間で形成される任意の複合体を検出し、試料と対照試料、すなわち標準試料において比較する。
【０２６２】
本発明の抗体は、最初にインビトロでの治療又は診断用途に関連する結合活性について試験することができる。例えば、抗体は、本明細書で述べるフローサイトメトリーアッセイを用いて試験できる。
【０２６３】
さらに、ＣＬＤ１８を発現する細胞の増殖を阻害すること及び／又は細胞を死滅させることを含む、少なくとも１つのエフェクター媒介性エフェクター細胞活性を引き起こす上での抗体の活性を検定することができる。例えば、ＣＤＣ及び／又はアポトーシスを引き起こす抗体の能力が検定できる。ＣＤＣ、同型接着、分子クラスター化又はアポトーシスを検定するためのプロトコールを本明細書で述べる。
【０２６４】
本発明の抗体を使用して、インビボ又はインビトロで以下の生物活性の１又はそれ以上を誘発するために使用することができる：ＣＬＤ１８を発現する細胞の増殖及び／又は分化を阻害すること；ＣＬＤ１８を発現する細胞を死滅させること；エフェクター細胞の存在下でＣＬＤ１８を発現する細胞の食作用又はＡＤＣＣを媒介すること；補体の存在下でＣＬＤ１８を発現する細胞のＣＤＣを媒介すること；ＣＬＤ１８を発現する細胞のアポトーシスを媒介すること；同型接着を誘導すること；及び／又はＣＬＤ１８に結合したとき脂質ラフトへの移行を誘導すること。
特定の実施形態において、抗体は、インビボ又はインビトロで使用して、様々なＣＬＤ１８関連疾患を治療し、予防し又は診断するためにＣＬＤ１８関連疾患の例は、中でも特に、胃癌、膵癌、食道癌、肺癌及び上記で列挙した癌などの癌を含む。
【０２６５】
ＣＬＤ１８Ａ２はまた、分化した正常胃細胞においても発現される。これらの細胞の死滅によって起こり得る抗体誘導性臨床副作用は、制酸薬などの胃保護薬、又はオメプラゾールもしくは関連薬剤などの胃プロトンポンプの阻害剤の並行投与によって低減し得る又は回避してもよい。
【０２６６】
インビボ及びインビトロで本発明の抗体組成物を投与する適切な経路は、当技術分野において周知であり、当業者によって選択することができる。
【０２６７】
上述したように、本発明の抗ＣＬＤ１８抗体は、１又はそれ以上の他の治療薬、例えば細胞傷害性物質、放射性毒性物質、抗血管新生薬及び／又は本発明の抗体に対する免疫応答の誘導を低減する免疫抑制剤と同時投与することができる。抗体は、治療薬と結合し（免疫複合体として）又は治療薬と別途に投与できる。後者（別途投与）の場合、抗体は、薬剤の前、後又は薬剤と同時に投与でき、又は他の公知の治療、例えば抗癌治療、例えば放射線と同時投与できる。そのような治療薬は、中でも特に、上記で列挙したような抗腫瘍薬を含む。化学療法剤と本発明の抗ＣＬＤ１８抗体の同時投与は、腫瘍細胞に細胞傷害作用を生じさせる異なる機構によって働く２つの抗癌剤を提供する。そのような同時投与は、薬剤に対する耐性の発現又は腫瘍細胞を抗体と非反応性にする腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を解決することができる。
【０２６８】
本発明の他の特定の実施形態において、抗体を投与される被験者は、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲを標的する抗体及び血管新生を阻害する１以上の化合物を含む抗血管新生薬でさらに治療される。これらの薬剤による前処置又は並行適用は、バルク腫瘍への抗体の浸透を改善することができる。
【０２６９】
本発明の他の特定の実施形態において、抗体を投与される被験者は、ＥＧＦＲ受容体に結合するモノクローナル抗体並びにＥＧＦＲ、Ｈｅｒ１又はＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体によって開始されるシグナル伝達を阻害する化合物を含む、増殖因子受容体シグナル伝達を阻害する化合物でさらに治療される。
【０２７０】
標的特異的エフェクター細胞、例えば本発明の組成物（例えば抗体、多重特異性及び二重特異性分子）に連結されたエフェクター細胞も治療薬として使用できる。ターゲティングのためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球又は単球などのヒト白血球とすることができる。他の細胞として、好酸球、ナチュラルキラー細胞及び他のＩｇＧ又はＩｇＡ受容体担持細胞を含む。所望する場合は、エフェクター細胞を治療される被験者から入手することができる。標的特異的エフェクター細胞は、生理的に許容される溶液中の細胞の懸濁液として投与できる。投与される細胞の数は約１０８〜１０９とすることができるが、治療目的によって異なる。一般に、その量は、標的細胞、例えばＣＬＤ１８を発現する腫瘍細胞における局在化を得るのにも、及び、例えば食作用によって細胞の死滅を生じさせるのにも十分である。投与経路も異なってよい。
【０２７１】
標的特異的エフェクター細胞による治療は、標的細胞の除去のための他の手法と併用して実施できる。例えば、本発明の組成物及び／又はこれらの組成物を装備したエフェクター細胞を使用する抗腫瘍治療は、化学療法と共に使用することができる。加えて、併用免疫療法は、２つの異なる細胞傷害性エフェクター集団を腫瘍細胞の排除に向けることに使用してもよい。例えば、抗ＦｃＲＩ又は抗ＣＤ３に連結された抗ＣＬＤ１８抗体は、ＩｇＧ又はＩｇＡ受容体特異的結合物質と共に使用することができる。
【０２７２】
本発明の二重特異性及び多重特異性分子はまた、細胞表面上の受容体にキャップ形成して除去することなどにより、エフェクター細胞上のＦｃγＲ又はＦｃαＲレベルを調節するために使用できる。抗Ｆｃ受容体の混合物もこのことに使用できる。
【０２７３】
補体に結合するＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ３又はＩｇＭからの部分などの、補体結合部位を有する本発明の組成物（例えば抗体、多重特異性及び二重特異性分子並びに免疫複合体）も、補体の存在下で使用できる。１の実施形態において、標的細胞を含む細胞の集団の、本発明の結合物質と適切なエフェクター細胞によるエクスビボ治療は、補体又は補体を含む血清の添加によって補足することができる。本発明の結合物質で被覆された標的細胞の食作用は、補体タンパク質の結合によって改善され得る。他の実施形態において、本発明の組成物で被覆された標的細胞は、補体によっても溶解することができる。さらに他の実施形態において、本発明の組成物は補体を活性化しない。
【０２７４】
本発明の組成物はまた、補体と共に投与することができる。従って、抗体、多重特異性又は二重特異性分子及び血清又は補体を含有する組成物は本発明の範囲内である。これらの組成物は、補体が抗体、多重特異性又は二重特異性分子にごく近接して位置するという点で有利である。
【０２７５】
あるいは、本発明の抗体、多重特異性又は二重特異性分子及び補体又は血清は別々に投与することができる。標的細胞への本発明の組成物の結合によって、ＣＬＤ１８抗原−抗体複合体を細胞膜の脂質ラフトへ移行させてよい。そのような移行は、ＣＤＣを効率的に活性化し及び／又は増強し得る高密度の抗原−抗体複合体を形成する。
【０２７６】
本発明の抗体組成物（例えば抗体及び免疫複合体）及び使用のための指示書を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、免疫抑制試薬、細胞傷害性物質又は放射性毒性物質などの１以上の付加的な試薬、又は１以上の付加的な本発明の抗体（例えば補完的活性を有する抗体）をさらに含むことができる。
【０２７７】
従って、本発明の抗体組成物で治療される患者は、本発明の抗体の治療効果を増強し又は上昇させる細胞傷害性物質又は放射性毒性物質などのもう１つ別の治療薬を（本発明の抗体の投与前に、抗体の投与と同時に又は抗体の投与後に）さらに投与することができる。
【０２７８】
他の実施形態では、例えば被験者をサイトカインで治療することによって、被験者は、Ｆｃγ又はＦｃα受容体の発現又は活性を増強したり阻害したりと調節する物質で治療され得る。好ましいサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。本明細書で述べる抗体及び医薬組成物の治療効果を高めるための他の重要な物質は、分枝グルコース残基のホモ多糖であるβ−グルカン、様々な植物及び微生物、例えば細菌、藻類、真菌、酵母及び穀物によって産生されるβ−グルカンである。生物によって産生されるβ−グルカンのフラグメントを使用してもよい。好ましくは、β−グルカンは、骨格グルコース単位の少なくとも一部、例えば骨格グルコース単位の３〜６％がβ（１，６）分枝などの分枝を有する、β（１，３）グルコースのポリマーである。
【０２７９】
特定の実施形態では、本発明は、試料と対照試料をＣＬＤ１８に特異的に結合する抗体と、抗体又はその部分とＣＬＤ１８との間で複合体の形成を許容する条件下で接触させることを含む、試料中のＣＬＤ１８抗原の存在を検出する、又はＣＬＤ１８抗原の量を測定するための方法を提供する。その後、複合体の形成を検出し、対照試料と比較して試料との間での複合体形成の差が試料中のＣＬＤ１８抗原の存在を示す。
【０２８０】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、インビボ又はインビトロでＣＬＤ１８発現細胞の存在を検出する又はＣＬＤ１８発現細胞の量を測定するための方法を提供する。その方法は、（ｉ）検出可能マーカーに結合した本発明の組成物を被験者に投与すること；（ｉｉ）ＣＬＤ１８発現細胞を含む領域を同定するために被験者を前記検出可能マーカーを検出するための手段に暴露することを含む。
上述した方法は、特に、癌疾患などのＣＬＤ１８関連疾患を診断するため及び／又はＣＬＤ１８関連疾患の局在化のために有用である。好ましくは、対照試料中のＣＬＤ１８、好ましくはＣＬＤ１８−Ａ２の量を上回る試料中のＣＬＤ１８、好ましくはＣＬＤ１８−Ａ２の量は、試料が由来する被験者、特にヒトにおけるＣＬＤ１８関連疾患の存在についての指標である。
【０２８１】
さらにもう１つの実施形態では、本発明の免疫複合体は、化合物（例えば治療薬、標識、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剤等）を、そのような化合物を抗体に結合することにより、その表面にＣＬＤ１８を発現する細胞に標的するために使用できる。それ故本発明はまた、循環腫瘍細胞などの、ＣＬＤ１８を発現する細胞をエクスビボ又はインビトロで局在化するための方法を提供する。
【０２８２】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２８３】
［１．ＣＬＤ１８に対するマウス抗体の作製］
ａ．免疫：
ヒトＣＬＤ１８フラグメント（配列番号１５、１６、１７、１８）をコードする真核生物発現ベクターを用い、Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７／ＢＬ６マウスを免疫した。セット１のモノクローナル抗体の作製のため１日目及び１０日目に、または、セット２のモノクローナル抗体の作製のため、アジュバント、例えばＣｐＧの存在下で１日目及び９日目、１日目及び１１日目、又は１日目、１６日目及び３６日目に、プラスミドＤＮＡ  ５０μｇ又は２５μｇを四頭筋に注射（筋肉注射）した（詳細については表１ｂ参照）。ＣＬＤ１８Ａ２（配列番号１）単独でトランスフェクトした細胞、又は、さらにマウス可溶性ＣＤ４０ＬをコードするＲＮＡとともにコトランスフェクトした細胞をＣｐＧとともに筋肉内注射し、ＰＥＩ−Ｍａｎを筋肉内又は腹腔内注射した。１６日から４３日後には、使用した特定免疫プロトコールに依存して、マウスの血清中のヒトＣＬＤ１８に対する抗体の存在が免疫蛍光顕微鏡検査により観測された。免疫蛍光は、ヒトＣＬＤ１８Ａ２（配列番号１、２）と蛍光レポータータンパク質とを含む融合構築物をコードする核酸で一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いて決定された。検出可能な免疫応答を有するマウス（Ｆｉｇ．１（図１））は、セット１のモノクローナル抗体の作製に関しては脾摘出術の３日前に、Ｓｅｔ２のモノクローナル抗体の作製に関しては脾摘出術の３日前、３日前と２日前、又は４日前、３日前及び２日前に、ヒトＣＬＤ１８Ａ２（配列番号１、２）をコードする核酸で一過性にトランスフェクトした５×１０７あるいは１×１０８個のＨＥＫ２９３細胞を腹腔内注射することによって追加免疫された（詳細については表１ｂ参照）。表１ａに、それぞれのモノクローナル抗体のために使用した免疫プロトコールを示す。
【０２８４】
【表１】
0005995919.tif 000004
【０２８５】
【表２】
0005995919.tif 000005
【０２８６】
ｂ．ＣＬＤ１８に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製：
標準プロトコールに基づき、マウス脾細胞を単離して、ＰＥＧを用いてマウス骨髄腫細胞系に融合した。得られたハイブリドーマは、その後、ヒトＣＬＤ１８をコードする核酸でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いて、ＦＡＣＳ分析により、ＣＬＤ１８特異性を有する免疫グロブリンの産生に関してスクリーニングされた。５０％ＰＥＧ（ロシュ・ダイアグノスティックス社，ＣＲＬ  ７３８６４１）を用い、免疫マウスからの脾リンパ球の単一細胞懸濁液とＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ  １５９７）とを２：１の比率で融合した。平底マイクロタイタープレートに約３×１０４個／ウエルで細胞を塗布し、その後、１０％ウシ胎仔血清、２％ハイブリドーマ融合物及びクローニング用添加剤（ＨＦＣＳ，ロシュ・ダイアグノスティックス社，ＣＲＬ  １  ３６３  ７３５）プラス１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１×ＨＡＴ（シグマ社，ＣＲＬ  Ｈ０２６２）を含む選択培地において約２週間インキュベートした。１０〜１４日後、個々のウエルをフローサイトメトリーにより抗ＣＬＤ１８モノクローナル抗体に関してスクリーニングした。抗体分泌ハイブリドーマを再び塗布し、スクリーニングして、抗ＣＬＤ１８モノクローナル抗体に関してまだ陽性である場合は、限界希釈によってサブクローニングした。次に、安定なサブクローンをインビトロで培養し、キャラクタリゼーションのため組織培養培地中に少量の抗体を作製した。親細胞の反応性を保持する（ＦＡＣＳにより）、各々のハイブリドーマから少なくとも１個のクローンを選択した。各クローンについて９バイアルの細胞バンクを生成し、液体窒素中で保存した。
【０２８７】
ｃ．ＣＬＤ１８に結合するモノクローナル抗体の選択：
抗体のアイソタイプを決定するため、アイソタイプＥＬＩＳＡを実施した。マウスモノＡＢ  ＩＤキット（ザイメッド社，ＣＲＬ  ９０−６５５０）あるいはＩｓｏ  Ｓｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ロシュ、カタログ番号１４９３０２７）を使用して、同定したＣＬＤ１８反応性モノクローナル抗体のＩｇサブクラスを決定した。セット１と定義された１９のハイブリドーマ細胞系を作製した。そのうち６つは、ＣＬＤ１８Ａ２−ループＤ３（配列番号１７、１８）で免疫したＣ５７／ＢＬ６マウスからの細胞の融合物から作成され、１３はＣＬＤ１８Ａ２−ループ１（配列番号１５、１６）で免疫したＢａｌｂ／ｃマウスからの細胞の融合物から作製された。これらは、以下の抗体を発現する。：
２４Ｈ５、２６Ｂ５、２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、３７Ｇ１１、３７Ｈ８、３８Ｇ５、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、４１Ｃ６、４２Ｅ１２、４３Ａ１１、４４Ｅ１０、４７Ｄ１２、６１Ｃ２、７５Ｂ８、８５Ａ３、９Ｅ８、１９Ｂ９
２４Ｈ５：マウスモノクローナルＩｇＧ２ｂ、κ抗体、１８２−Ｄ７５８−０３４
２６Ｂ５：マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗体、１８２−Ｄ７５８−０３５、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４５
２６Ｄ１２：マウスモノクローナルＩｇＧ３、κ抗体、１８２−Ｄ７５８−０３６、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４６
２８Ｄ１０：マウスモノクローナルＩｇＧ３、κ抗体、１８２−Ｄ７５８−０４０、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４７
３７Ｇ１１：マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−０５５、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３７
３７Ｈ８：マウスモノクローナルＩｇＧ３、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−０５６、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３８
３８Ｇ５：マウスモノクローナルＩｇＧ３、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−０５７、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７３９
３８Ｈ３：マウスモノクローナルＩｇＧ３、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−０５８、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４０
３９Ｆ１１：マウスモノクローナルＩｇＧ３、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−０５９、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４１
４１Ｃ６：マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−０６０
４２Ｅ１２：マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−０６１、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４８
４３Ａ１１：マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−０６２、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４２
４４Ｅ１０：マウスモノクローナルＩｇＧ３、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−０６３
４７Ｄ１２：マウスモノクローナルＩｇＧ３、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−０６４
６１Ｃ２：マウスモノクローナルＩｇＧ２ｂ、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−０６７、ＤＳＭ  ＡＣＣ２７４３
７５Ｂ８：マウスモノクローナルＩｇＭ、κ抗体、１８２−Ｄ７５６−００１
８５Ａ３：マウスモノクローナルＩｇＭ、κ抗体、１８２−Ｄ７５６−００２
９Ｅ８：マウスモノクローナルＩｇＭ、κ抗体、１８２−Ｄ７５８−０１１
１９Ｂ９：マウスモノクローナルＩｇＭ、κ抗体、１８２−Ｄ７５８−０２４。
【０２８８】
セット２と定義された５つのハイブリドーマ細胞系を作製した。そのうち１つはＣＬＤ１８Ａ２−ループＤ３（配列番号１７、１８）、及び、ＣＬＤ１８Ａ２−ループＤ１（配列番号１５、１６）で免疫したＢａｌｂ／ｃマウスからの細胞の融合物から作製され、４つはＣＬＤ１８Ａ２−ループＤ１（配列番号１５、１６）で免疫したＢａｌｂ／ｃマウスからの細胞の融合物から作製された。これらは以下の抗体を発現する。：
４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２、１７５Ｄ１０
４５Ｃ１：マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗体、１８２−Ｄ７５８−１８７
１２５Ｅ１：マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−２７９、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０８
１６３Ｅ１２：マウスモノクローナルＩｇＧ３、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−２９４、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８０９
１６６Ｅ２：マウスモノクローナルＩｇＧ３、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−３０８
１７５Ｄ１０：マウスモノクローナルＩｇＧ１、κ抗体、１８２−Ｄ１１０６−３６２、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８１０
【０２８９】
［２．モノクローナル抗体の作製］
ＣＬＤ１８に対して反応性のモノクローナル抗体の作製及び精製：
機能的キャラクタリゼーション用にｍｇ量の抗体を作製するため、透析に基づいたバイオリアクター（セルライン  ＣＬ１０００，インテグラ社，クール，スイス）に２×１０６細胞／ｍｌでハイブリドーマ細胞を播いた。抗体含有上清を週に１回採取した。メロンゲル（ピアス社，ロックフォード，アメリカ合衆国）を用いてマウスモノクローナル抗体を精製し、硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮するか、又は、ＦＰＬＣを用いてプロテインＡによって精製した。抗体濃度及び純度をＢＣＡアッセイによって決定し、ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動及びクマシー染色によって純度を確認した。
【０２９０】
［３．モノクローナル抗体の結合特性］
ａ．ウェスタンブロッティング、免疫蛍光法におけるトランスフェクタントの品質管理：
ＣＬＤ１８Ａ２発現細胞を作製するため、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞にＣＬＤ１８Ａ２（配列番号１、２）又はＣＬＤ１８Ａ２−ｍｙｃ（配列番号３、４）をコードする核酸を導入した。
ＨＥＫ２９３は、ＣＬＤＮ１８Ａ２−ｍｙｃ（配列番号３、４）を導入するか又は、トランスフェクトしないままにした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を採取し、溶解して、ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動に供した。ゲルをブロットし、マウス抗ｍｙｃ抗体で染色した。ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体とのインキュベーション後、ブロットをＥＣＬ試薬で展開し、ＬＡＳ−３０００イメージャー（富士）を用いて視覚化した。トランスフェクトした細胞においてのみＣＬＤ１８−ｍｙｃの予想分子量のバンドが認められ、陰性対照では前記バンドは認められなかった（Ｆｉｇ．２（図２））。
【０２９１】
ＣＨＯ細胞にＣＬＤ１８Ａ２（配列番号１、２）を導入し、チェンバースライドで２４時間増殖させた。細胞をメタノールで固定し、ＣＬＤ１８に対するウサギポリクローナル抗体１μｇ／ｍｌにて２５℃で６０分間染色した。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、蛍光顕微鏡検査によって評価した。Ｆｉｇ．３（図３）は、細胞膜上でＣＬＤ１８を発現するトランスフェクトＣＨＯ細胞を非トランスフェクト細胞とともに示す。これらのＣＬＤ１８を異種発現する細胞は、抗体結合の特異性を試験する以下のアッセイのために使用された。
【０２９２】
ｂ．ＣＬＤ１８に結合するモノクローナル抗体の選択／フローサイトメトリーによる一次スクリーニング：
ＨＥＫ２９３細胞は、アッセイの４０時間前にヒトＣＬＤ１８Ａ２（配列番号１、２）及び蛍光レポータータンパク質をコードする発現ベクターでコトランスフェクトされるか、あるいは、ヒトＣＬＤ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２）を使用して、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）でカウンター染色された。２ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳを使用した細胞分離後、細胞を完全増殖培地で洗浄し、Ｕ底マイクロタイタープレートに約１〜５×１０５細胞／ウエルで塗布した。細胞をハイブリドーマ上清と共に４℃で３０分間インキュベートし、次いで１％熱不活性化ＦＢＳ／ＰＢＳで２回の洗浄工程を実施して、最後にＡＰＣ又はＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＩｇＧ特異的二次抗体と共にインキュベートした。２回の洗浄工程後、コトランスフェクトした細胞をセルフィックス（ＢＤバイオサイエンス）で固定した。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙを使用したフローサイトメトリーによって結合を評価した。蛍光マーカー発現を横軸にプロットし、抗体結合を縦軸にプロットする。モノクローナル抗体２４Ｈ５（Ｆｉｇ．４Ａ（図４（Ａ））、Ｑ２内の細胞）、８５Ａ３（Ｆｉｇ．４Ｂ（図４（Ｂ））、１７５Ｄ１０、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び４５Ｃ１（Ｆｉｇ．４Ｃ（図５）、Ｑ１内の細胞）を含むハイブリドーマ上清に関して例示されるように、すべてのマウス抗体、２４Ｈ５、２６Ｂ５、２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、３７Ｇ１１、３７Ｈ８、３８Ｇ５、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、４１Ｃ６、４２Ｅ１２、４３Ａ１１、４４Ｅ１０、４７Ｄ１２、６１Ｃ２、７５Ｂ８、８５Ａ３、９Ｅ８、１９Ｂ９、４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０が、蛍光マーカー発現細胞（Ｆｉｇ．４（図４、５）、Ｑ２内の細胞）の表面に特異的に結合することが検出された。
【０２９３】
ｃ．Ｍｙｃ又はＨＡ標識ＣＬＤ１８Ａ２に結合する抗体の比較：
同定されたＣＬＤ１８特異的モノクローナル抗体の結合特性をさらに特定した。それ故、エピトープタグの挿入によって作製したＣＬＤ１８Ａ２突然変異体へのモノクローナル抗体結合を分析した。ＣＬＤ１８Ａ２−ＨＡ（配列番号６）はＣＬＤ１８Ａ２−ループ１内にＨＡエピトープタグを含み、一方ＣＬＤ１８Ａ２−Ｍｙｃ（配列番号４）はＣＬＤ１８Ａ２−ループ２に挿入されたＭｙｃエピトープタグを含む。これらのタグの挿入はエピトープの破壊を引き起こすので、同定されたモノクローナル抗体は、突然変異体のいずれかへの結合の喪失によって分類することができる。蛍光マーカー及びヒトＣＬＤ１８Ａ２、又は、蛍光マーカー及びＣＬＤ１８Ａ２−ＨＡ、又は、蛍光マーカー及びＣＬＤ１８Ａ２−Ｍｙｃで一過性にコトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞をＣＬＤ１８特異的モノクローナル抗体を含むハイブリドーマ上清と共に４℃で３０分間インキュベートし、次いでＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＩｇＧ二次抗体と共にインキュベートした。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙで分析する前に、セルフィックスを用いて細胞を固定した。Ｆｉｇ．５（図７）において２４Ｈ５、９Ｅ８、２６Ｂ５及び１９Ｂ９に関して例示されるように、モノクローナル抗体はそれらの結合特性に基づいて４つの異なる群に分けられた：（ｉ）ＣＬＤ１８Ａ２−ＨＡ及びＣＬＤ１８Ａ２−Ｍｙｃ並びに非修飾ＣＬＤ１８Ａ２に結合する抗体、例えば２４Ｈ５（Ｆｉｇ．５Ａ（図７（Ａ））、又は（ｉｉ）ＣＬＤ１８Ａ２−ＨＡに結合しない抗体、例えば９Ｅ８（Ｆｉｇ．５Ｂ（図７（Ｂ）））、又は（ｉｉｉ）ＣＬＤ１８Ａ２−Ｍｙｃに結合しない抗体、例えば２６Ｂ５（Ｆｉｇ．５Ｃ（図７（Ｃ））、又は（ｉｖ）ＣＬＤ１８Ａ２−ＨＡにもＣＬＤ１８Ａ２−Ｍｙｃにも結合しない抗体、例えば１９Ｂ９（Ｆｉｇ．５Ｄ（図７（Ｄ））。
【０２９４】
ｄ．フローサイトメトリーによるヒトＣＬＤ１８Ａ１トランスフェクタントとＣＬＤ１８Ａ２トランスフェクタントへの抗体結合の比較：
同定されたモノクローナル抗体のＣＬＤ１８Ａ２アイソフォームへの結合特異性をフローサイトメトリーによって分析した。ヒトＣＬＤ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２）及びヒトＣＬＤ１８Ａ１（配列番号７、８）を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ１）をモノクローナル抗体を含むハイブリドーマ上清と共に４℃で３０分間インキュベートし、次いでＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＩｇＧ二次抗体と共にインキュベートして、細胞を固定するか、又は、代わりに固定せずにＰＩによるカウンター染色を行った。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙを使用したフローサイトメトリーによって結合を評価した。Ｆｉｇ．６（図８、９）は、２４Ｈ５、２６Ｂ５、２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、３７Ｇ１１、３７Ｈ８、３８Ｇ５、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、４１Ｃ６、４２Ｅ１２、４３Ａ１１、４４Ｅ１０、４７Ｄ１２、６１Ｃ２、７５Ｂ８、８５Ａ３、９Ｅ８、１９Ｂ９、４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２、１７５Ｄ１０から成るパネルにおいて同定されたモノクローナル抗体の２つの群についての例を示す：（ｉ）モノクローナル抗体４３Ａ１１、４５Ｃ１及び１６３Ｅ１２は、ヒトＣＬＤ１８Ａ２に特異的に結合するが、ヒトＣＬＤ１８Ａ１には結合せず（Ｆｉｇ．６Ａ（図８）、Ｆｉｇ．６Ｂ（図９））、及び（ｉｉ）モノクローナル抗体３７Ｈ８は両方のヒトアイソフォームに結合する（Ｆｉｇ．６Ａ（図８））。
【０２９５】
ｅ．免疫蛍光顕微鏡検査によるヒトＣＬＤ１８Ａ１トランスフェクタントとＣＬＤ１８Ａ２トランスフェクタントへの抗体結合の比較：
ＣＬＤ１８Ａ１（配列番号８）又はＣＬＤ１８Ａ２（配列番号２）と蛍光レポーターとの融合タンパク質をコードする発現ベクターでＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフェクトし、チェンバースライドで増殖させた。細胞を、固定せずに又はパラホルムアルデヒドで固定した後、モノクローナル抗体含有組織培養上清にて３７℃で３０分間染色した。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。抗体の結合を免疫蛍光顕微鏡検査によって評価した。Ｆｉｇ．７（図１０、１１）に示すように、抗体３７Ｇ１１は、ＣＬＤ１８Ａ２と特異的に反応したが（Ｆｉｇ．７Ａ（図１０（Ａ））、ＣＬＤ１８Ａ１とは反応しなかった（Ｆｉｇ．７Ｂ（図１０（Ｂ））。これに対し、抗体２６Ｂ５は、ＣＬＤ１８Ａ２及びＣＬＤ１８Ａ１の両方と反応性があった（Ｆｉｇ．８（図１２、１３））。
抗体２４Ｈ５、２６Ｂ５、２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、３７Ｇ１１、３７Ｈ８、３８Ｇ５、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、４１Ｃ６、４２Ｅ１２、４３Ａ１１、４４Ｅ１０、４７Ｄ１２、６１Ｃ２、７５Ｂ８、８５Ａ３、９Ｅ８、１９Ｂ９に関して、生細胞とパラホルムアルデヒド固定細胞の染色の間で明らかな相違が認められた。細胞を固定したとき、抗体は均一な膜染色を形成した（Ｆｉｇ．７Ｃ（図１１（Ｃ））、Ｆｉｇ．８Ｃ（図１３（Ｃ））、Ｆｉｇ．８Ｄ（図１３（Ｄ））。これに対し、これらの抗体と生細胞のインキュベーションは、斑点様の染色パターンとして目に見えるタンパク質クラスターの生成を導く（Ｆｉｇ．７Ａ（図１１（Ａ）、Ｆｉｇ．８Ａ（図１２（Ａ））、Ｆｉｇ．８Ｂ（図１２（Ｂ））。これは、すべての抗体が、生細胞の表面で認められる天然エピトープに結合することを示す。
【０２９６】
ｆ．内因性発現細胞系の決定：
ＣＬＤ１８Ａ２遺伝子特異的プライマー対（配列番号１１、１２）をＲＴ−ＰＣＲ分析に使用し、ＣＬＤ１８Ａ２の発現に関して細胞系をスクリーニングした。ヒト胃カルシノーマ細胞系ＮＣＩ−ＳＮＵ−１６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９７４）、ＮＵＧＣ−４（ＪＣＲＢ０８３４）及びＫＡＴＯ−ＩＩＩ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１０３）及びヒト膵腺アデノカルシノーマ細胞系ＤＡＮ−Ｇ（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ２４９）は、ＣＬＤ１８の強固な内因性発現を示すことが認められた（Ｆｉｇ．９（図１４））。発現は、ＣＬＤ１８に対するウサギポリクローナル血清での染色によるタンパク質レベルで確認された。
【０２９７】
ｇ．ＣＬＤ１８特異的抗体での内因性発現細胞系の染色及び免疫蛍光分析：
ＤＡＮ−Ｇ、ＳＮＵ−１６、ＮＵＧＣ−４及びＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞をチェンバースライド上で標準条件下にて増殖させた。細胞を固定せずに、又は、代わりにメタノールで固定して、それぞれの抗体で染色した。抗体２４Ｈ５、２６Ｂ５、２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、３７Ｇ１１、３７Ｈ８、３８Ｇ５、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、４１Ｃ６、４２Ｅ１２、４３Ａ１１、４４Ｅ１０、４７Ｄ１２、６１Ｃ２、７５Ｂ８、８５Ａ３、９Ｅ８、１９Ｂ９に関して、Ｆｉｇ．１０（図１５）、Ｆｉｇ．１１（図１６）及びＦｉｇ．１２Ａ（図１７）に例示されるように細胞表面の染色が認められた。抗体４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０に関して、天然エピトープ認識を検定し、Ｆｉｇ．１２Ｂ（図１８）に示すように非固定細胞で細胞表面染色が認められた。抗体のサブグループは、主として細胞間接着面で又は他の細胞に隣接しない膜のフリーな部分で、細胞膜の均一な染色を示した。他の抗体は細胞膜上の別個の病巣及び凝集物を染色し、全体として、それぞれの抗体が、ＣＬＤ１８の同型又は異型結合によってマスクされているエピトープとともにあらかじめ形成された密着結合内のアクセス可能なＣＬＤ１８エピトープを含む、異なるエピトープに結合することが明らかになった。
【０２９８】
ｈ．フローサイトメトリーによる内因性発現細胞系の染色：
ＫＡＴＯ−ＩＩＩ及びＮＵＧＣ−４生細胞上で構成的に発現されるＣＬＤ１８Ａ２の表面発現をフローサイトメトリーによって分析した。これは、モノクローナル抗体６１Ｃ２又は１６３Ｅ１２で染色し、次いでＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＩｇＧ二次抗体と共にインキュベートして、細胞を固定するか、あるいは、固定しないＫＡＴＯ−ＩＩＩ及びＮＵＧＣ−４細胞によって例示される。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙを使用したフローサイトメトリーによって結合を評価した。Ｆｉｇ．１３（図１９）は、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞への少なくとも７０．３％の６１Ｃ２の強力な結合及びＫＡＴＯ−ＩＩＩ及びＮＵＧＣ−４細胞上のＣＬＤ１８Ａ２への１６３Ｅ１２の強力な結合を示す。
【０２９９】
ｉ．マウスとヒトのＣＬＤ１８Ａ１及びＣＬＤ１８Ａ２の配列アラインメント
配列比較においてヒトＣＬＤ１８Ａ２（ＮＰ＿００１００２０２６）とヒトＣＬＤ１８Ａ１（ＮＰ＿０５７４５３）は、Ｎ末端が異なり、マウスＣＬＤ１８変異体（ＮＰ＿０６２７８９及びＡＡＬ１５６３６）は、分子間で高い相同性及び配列変異部位を示す（Ｆｉｇ．１４（図２０）参照）。
【０３００】
ｊ．フローサイトメトリーによって分析したマウスＣＬＤ１８Ａ１及びマウスＣＬＤ１８Ａ２と抗体の反応性：
同定されたモノクローナル抗体のマウスＣＬＤ１８Ａ２及びＣＬＤ１８Ａ１への結合をフローサイトメトリーによって分析した。蛍光マーカーとマウスＣＬＤ１８Ａ２（配列番号３３、３５）とで、又は、蛍光マーカーとマウスＣＬＤ１８Ａ１（配列番号３６、３７）とで一過性にコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をヒトＣＬＤ１８特異的モノクローナル抗体３８Ｇ５、３８Ｈ３、３７Ｇ１１、４５Ｃ１及び１６３Ｅ１２をそれぞれ含むハイブリドーマ上清と共に４℃で３０分間インキュベートし、次いでＡｌｅｘａ６４７結合抗マウスＩｇＧ二次抗体とインキュベートして、細胞を固定した。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙを使用したフローサイトメトリーによって結合を評価した。Ｆｉｇ．１５（図２１、２２）は３つの異なる結合プロフィールを示す：３８Ｇ５及び４５Ｃ１は、マウスＣＬＤ１８アイソフォームのいずれにも結合せず、３７Ｇ１１及び１６３Ｅ１２は、マウスＣＬＤ１８Ａ２に結合するがマウスＣＬＤ１８Ａ１には結合せず、そして３８Ｈ３は、マウスＣＬＤ１８Ａ１及びＣＬＤ１８Ａ２に結合する。これらの抗体は、前臨床試験においてＣＬＤ１８モノクローナル抗体の潜在的毒性を測定するための貴重なツールである。
全体としてこれらのデータは、ＣＬＤ１８に対して作製した本発明のモノクローナル抗体２４Ｈ５、２６Ｂ５、２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、３７Ｇ１１、３７Ｈ８、３８Ｇ５、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、４１Ｃ６、４２Ｅ１２、４３Ａ１１、４４Ｅ１０、４７Ｄ１２、６１Ｃ２、７５Ｂ８、８５Ａ３、９Ｅ８、１９Ｂ９、４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０が、ヒトＣＬＤ１８の種々のエピトープ及びトポロジーに対して多様な結合特性を示すことを明らかにする。
実施例３ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｇ、ｈ及びｊで述べる種々の性質の組合せは、モノクローナル抗体をそのような種々のクラスに分類するために使用できる。
【０３０１】
［４．免疫組織化学（ＩＨＣ）］
配列番号２１のペプチドでの免疫によって作製されるＣＬＤ１８Ａ２エピトープ特異的抗体がＣＬＤ１８Ａ２発現の免疫組織化学的キャラクタリゼーションのために使用された。正常及び腫瘍組織の包括的パネルに由来するパラフィン包埋組織切片を、タンパク質発現及び局在化分析のために使用した。胃以外のいかなる他の正常器官組織においても有意の発現は検出されなかった（表２、Ｆｉｇ．１６Ａ（図２３）参照）。これに対し、ＣＬＤ１８Ａ２発現は、胃癌及び肺癌を含む種々の癌において免疫組織化学によって確認された（Ｆｉｇ．１６Ｂ（図２４））。
興味深いことに、胃粘膜におけるＣＬＤ１８Ａ２タンパク質の発現は、胃底と胃小窩領域の胃上皮の最終的に分化した細胞に限定された。これに対し、粘膜全体を補充する、胃粘膜の頸部領域の細胞、特に峡部の胃幹細胞は、ＣＬＤ１８Ａ２を発現しない（Ｆｉｇ．１６Ｃ（図２５））。
【０３０２】
【表３】
0005995919.tif 000006
【０３０３】
モノクローナル抗体３９Ｆ１１を免疫組織化学的なＣＬＤ１８Ａ２特異的試験のために使用した。Ｆｉｇ．１７Ａ（図２６）に示すように、胃を除く試験したすべての正常組織で有意の反応性は検出されず（Ｆｉｇ．１７Ａ（図２６））、一方胃カルシノーマ及び肺カルシノーマは強い陽性のままである（Ｆｉｇ．１７Ｂ（図２７））。
本発明の抗体のもう１つの群は、胃癌への結合に関して特異的な癌染色パターンを示すが、正常胃組織とは反応性を示さない。そのような染色パターンをモノクローナル抗体２６Ｂ５に関してＦｉｇ．１８Ａ（図２８）に示す。
免疫組織化学がＨＥＫ２９３腫瘍細胞系に由来する切片についての１７５Ｄ１０（Ｆｉｇ．１８Ｂ（図２９））、４３Ａ１１（Ｆｉｇ．１８Ｃ（図３０））、１６３Ｅ１２（Ｆｉｇ．１８Ｄ（図３０））及び４５Ｃ１（Ｆｉｇ．１８Ｅ（図３２））の特異性分析のために使用した：ヒトＣＬＤ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３腫瘍細胞系（ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２）、ヒトＣＬＤ１８Ａ１を安定に発現するＨＥＫ２９３腫瘍細胞系（ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ１）、又は、選択のための抗生物質耐性遺伝子だけを含む発現対照プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３腫瘍細胞系（ＨＥＫ２９３−ｍｏｃｋ）をマウスに異種移植し、固形腫瘍を形成させた。ｍｏｃｋでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３異種移植腫瘍では発現が検出できなかった。これに対し、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２異種移植腫瘍及び胃癌標本では強い均一な膜染色が認められた。
【０３０４】
［５．補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）］
ａ．フローサイトメトリーによって測定したセット１のモノクローナル抗体のＣＤＣ：
補体溶解のための血漿は、健常志願者からの血液をＳ−Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ−ＥＤＴＡ  ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ｔｕｂｅｓ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社，Ｎｕｒｍｂｒｅｃｈｔ，ドイツ）に採取し、次にそれを６００ｇで２０分間遠心分離することによって調製した。血漿を採取し、−２０℃で保存した。
第一セットの実験では、ヒトＣＬＤ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２）に対して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導するそれらの能力に関してハイブリドーマ上清を分析した。モノクローナル抗体８５Ａ３、２８Ｄ１０、２４Ｈ５又は２６Ｄ１２をそれぞれ含むハイブリドーマ上清と共に細胞を室温で２０分間インキュベートした。遠心分離（４５０ｇで５分間）後、上清を取り除き、ＤＭＥＭ中の２０％ヒト血漿（あらかじめ３７℃に温めた）を細胞に添加して、３７℃でさらに２０分間インキュベートした。その後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色法を用いてＦＡＣＳで細胞溶解を測定した。ＰＩを２．５μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。フローサイトメトリーのために、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用した。前方側方散乱（ＦＣＳ）閾値の調整によって排除された細胞デブリに関する分析のために少なくとも１００００事象を収集した。溶解細胞（ＰＩ陽性細胞）のパーセンテージをＦｉｇ．１９（図３３）に示す。モノクローナル抗体８５Ａ３、２８Ｄ１０及び２６Ｄ１２は、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２細胞のそれぞれ３３．５％、３８．２％及び３９．２％の溶解を誘導したが、２４Ｈ５によって媒介されたＣＤＣは１９．３％だけであった。
【０３０５】
ｂ．セット１のモノクローナル抗体のＣＤＣ：
第二セットの実験では、ＣＬＤ１８Ａ２発現細胞へのＣＤＣを誘導するモノクローナル抗体の特異性を分析した。それ故、ヒトＣＬＤ１８Ａ２に特異的に結合するか又はヒトＣＬＤ１８Ａ１にも結合する抗体のセットが、ヒトＣＬＤ１８Ａ２（ＣＨＯ−ＣＬＤ１８Ａ２）又はヒトＣＬＤ１８Ａ１（ＣＨＯ−ＣＬＤ１８Ａ１）で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対するＣＤＣ誘導に関して試験された。ＣＨＯ−ＣＬＤ１８Ａ２及びＣＨＯ−ＣＬＤ１８Ａ１細胞が、アッセイの２４時間前に、組織培養平底マイクロタイタープレートに３×１０４個／ウエルの密度で播かれた。その翌日、増殖培地を除去し、モノクローナル抗体２４Ｈ５、２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、３７Ｇ１１、３７Ｈ８、３８Ｇ５、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、４１Ｃ６、４２Ｅ１２、４３Ａ１１、４４Ｅ１０、４７Ｄ１２及び６１Ｃ２をそれぞれ含む、１０μｇ／ｍｌの濃度に調整したハイブリドーマ上清と共に細胞を３組重複してインキュベートした。コントロール細胞は、それぞれバックグラウンド溶解と最大溶解の決定のために増殖培地又は０．２％サポニンを含む増殖培地と共にインキュベートした。室温で２０分間のインキュベーション後、上清を取り除き、ＤＭＥＭ中の２０％ヒト血漿（あらかじめ３７℃に温めた）を細胞に添加して、３７℃でさらに２０分間インキュベートした。次に、上清を、２．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含むＰＢＳに交換し、５２０ｎｍで励起した後の蛍光放出をテカン製サフィアを用いて測定した。特異的細胞溶解のパーセンテージを以下のように算定した：特異的細胞溶解％＝（試料蛍光−バックグラウンド蛍光）／（最大細胞溶解蛍光−バックグラウンド蛍光）×１００。Ｆｉｇ．２０（図４６）は、モノクローナル抗体２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、３７Ｈ８、３８Ｈ３及び３９Ｆ１１がＣＨＯ−ＣＬＤ１８Ａ２細胞に対する高いＣＤＣを媒介し、モノクローナル抗体３８Ｇ５が中等度のＣＤＣを媒介し、モノクローナル抗体４１Ｃ６及び６１Ｃ２が低いＣＤＣを媒介し、そしてモノクローナル抗体２４Ｈ５、３７Ｇ１１、４２Ｅ１２、４３Ａ１１、４４Ｅ１０及び４７Ｄ１２はＣＨＯ−ＣＬＤ１８Ａ２細胞に対するＣＤＣを媒介しないことを示す。それに対し、２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、３７Ｈ８、３８Ｈ３、３９Ｆ１１、４１Ｃ６、４７Ｄ１２及び６１Ｃ２は、フローサイトメトリー及び免疫蛍光によって測定したときＣＬＤ１８Ａ１にも結合するが、いずれの抗体も、ＣＨＯ−ＣＬＤＡ１細胞に対するＣＤＣを誘導することはできない。
【０３０６】
ｃ．セット１のモノクローナル抗体を使用したモノクローナル抗体の力価測定及びＣＤＣ
低濃度でＣＤＣを誘導する抗ＣＬＤ１８抗体の能力を測定するため、３つの異なる抗体を力価測定する実験を実施した。マイクロタイタープレートで増殖しているＣＨＯ−ＣＬＤ１８Ａ２細胞をそれぞれ所定の濃度範囲の７５Ｂ８（１００、３０、１０、３及び１μｇ／ｍｌ）、３７Ｈ８（１０、３．３及び１μｇ／ｍｌ）及び２８Ｄ１０（１０、１及び０．１μｇ／ｍｌ）と共に室温で２０分間インキュベートした。上清を取り除き、ＤＭＥＭ中の２０％ヒト血漿（あらかじめ３７℃に温めた）を細胞に添加して、３７℃でさらに２０分間インキュベートした。テカン製サフィアを使用した分析の前に、上清を、２．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含むＰＢＳに交換した。Ｆｉｇ．２１ＡからＦｉｇ．２１Ｃ（図３５、３６）は、抗体濃度の関数としての特異的細胞溶解のパーセンテージを示す。モノクローナル抗体７５Ｂ８は、１０μｇ／ｍｌで３１．０％のＣＨＯ−ＣＬＤ１８Ａ２細胞の溶解を誘導し、１μｇ／ｍｌでは６．２％に低下するが（Ｆｉｇ．２１Ａ（図３５（Ａ））、モノクローナル抗体２８Ｄ１０及び３７Ｈ８は、１μｇ／ｍｌでまだそれぞれ３９％及び２６．５％の特異的細胞溶解を誘導する（Ｆｉｇ．２１Ｂ（図３５（Ｂ））、Ｆｉｇ．２１Ｃ（図３６））。
【０３０７】
ｄ．フローサイトメトリーによって測定したセット２のモノクローナル抗体のＣＤＣ：
補体溶解のための血清は、健常志願者からの血液をＳｅｒｕｍ−Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ｔｕｂｅｓ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｒｍｂｒｅｃｈｔ，ドイツ）に採取し、次にそれを６００ｇで２０分間遠心分離することによって調製した。血清を採取し、−２０℃で保存した。コントロコール血清は、５６℃で３０分間熱不活性化した後、保存した。
ヒトＣＬＤ１８Ａ２を内因性に発現するＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞に対して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導するそれらの能力に関してハイブリドーマ上清を分析した。モノクローナル抗体４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０をそれぞれ含む粗ハイブリドーマ上清又は精製ハイブリドーマ上清と共に細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。ＲＰＭＩ中の２０％ヒト血清を細胞に添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。その後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色法を用いてＦＡＣＳで細胞溶解を決定した。ＰＩを２．５μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。フローサイトメトリーのために、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙフローサイトメーター（ＢＤ  バイオサイエンス，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，カナダ）を使用した。前方側方散乱（ＦＳＣ／ＳＳＣ）閾値の調整によって排除された細胞デブリに関する分析のために少なくとも１００００事象を収集した。特異的細胞溶解を以下の式によって算定した：特異的細胞溶解＝（試料中のＰＩ陽性細胞％−熱不活性化血清を含む試料中のＰＩ陽性細胞％）。強固なＣＤＣ媒介性溶解が、特に１６３Ｅ１２に関して認められた。
【０３０８】
［６．抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）］
ヒトＣＬＤ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２）又はヒトＣＬＤ１８Ａ１を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ１）に対して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するそれらの能力に関してハイブリドーマ上清を分析した。
【０３０９】
ａ．ヒト末梢血単核細胞の富化：健常ドナーからのヒト血液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に２回希釈し、血球をフィコール（リンパ球分離媒体１０７７ｇ／ｍｌ、ＰＡＡ  ラボラトリーズ、カタログ番号Ｊ１５−００４）に重層した。末梢血単核細胞（ＭＮＣ）を間期から収集し、洗浄して、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁した。
【０３１０】
ｂ．ＡＤＣＣの開始：標的細胞を蛍光増強リガンド（ＢＡＤＴＡ，パーキンエルマー細胞傷害性アッセイキットＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性試薬、カタログ番号ＡＤ０１１６）で３０分間標識した。１０ｍＭプロベネシド（シグマ、カタログ番号Ｐ８７６１）、１０〜２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ−１０で十分に洗浄した後、細胞を１×１０５細胞／ｍｌに調整した。標識した標的細胞、エフェクター細胞（ＭＮＣ）、及び１０μｇ／ｍｌの濃度に調整したモノクローナル抗体を含む上清を丸底マイクロタイタープレートに添加した。単離エフェクター細胞に関しては、１００：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比を使用した（５０：１及び２５：１についてはデータを示していない）。インキュベーション（２時間、３７℃）後、遠心分離によってアッセイを停止し、重複する２組の試料からの蛍光リガンド放出を時間分解蛍光光度計におけるユーロピウム計数で測定した。細胞傷害のパーセンテージを以下の式：特異的細胞溶解％＝（実験放出計数−自然放出計数）／（最大放出計数−自然放出計数）×１００を用いて算定し、最大蛍光リガンド放出はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（最終濃度０．２５％）を標的細胞に添加することによって測定し、自然放出は抗体及びエフェクター細胞の非存在下で測定した。Ｆｉｇ．２２（図３７）は、モノクローナル抗体２６Ｂ５、３７Ｈ８、３８Ｇ５、４７Ｄ１２及び６１Ｃ２がＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２細胞に対するＡＤＣＣを媒介することを示す。それに対し、これらの抗体は、ＣＬＤ１８Ａ１標的に対しては有意の細胞傷害を誘導しないか又は低レベルの細胞傷害だけを誘導し、ＣＬＤ１８Ａ２特異的ＡＤＣＣを明らかにした（Ｆｉｇ．２３（図３８））。
【０３１１】
［７．増殖の阻害］
精製マウスモノクローナル抗体を、ヒトＣＬＤ１８Ａ２を内因性に発現するＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞の増殖を阻害するそれらの能力に関して分析した。
ＣＬＤ１８Ａ２を内因性に発現する１×１０４の標的細胞（ＫＡＴＯ−ＩＩＩ）をモノクローナル抗体約１０μｇの存在下で培養した。
ＤＥＬＦＩＡ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマー、カタログ番号ＡＤ０２００）は、マイクロプレートにおける増殖細胞のＤＮＡ合成の間の５−ブロモ−２'−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の組込みの測定に基づく非同位体免疫測定法である。組み込まれたＢｒｄＵを、ユーロピウム標識モノクローナル抗体を用いて検出する。抗体検出を可能にするために、Ｆｉｘ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用して細胞を固定し、ＤＮＡ変性する。非結合抗体を洗い流し、ＤＥＬＦＩＡ誘導剤を添加して標識抗体からユーロピウムイオンを溶液中に解離し、溶液中で前記イオンはＤＥＬＦＩＡ誘導剤の成分と高度蛍光キレートを形成する。検出において時間分解蛍光光度法を利用して測定された蛍光は、各々のウエルの細胞におけるＤＮＡ合成に比例する。
抗体１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、４５Ｃ１、３７Ｇ１１、３７Ｈ８、２８Ｄ１０及び１６６Ｅ２で増殖の強力な阻害がそれぞれ認められた。マウス抗体４３Ａ１１、１７５Ｄ１０、４２Ｅ１２、２６Ｄ１２、６１Ｃ２及び３８Ｈ３で増殖の中等度の阻害がそれぞれ認められた。
【０３１２】
［８．治療的マウス異種移植モデルにおける成績］
ＣＬＤ１８Ａ２に特異的に結合する同定されたモノクローナル抗体の治療上の潜在能を治療的異種移植モデルにおいて検討した。
【０３１３】
ａ．マウスにおけるＣＬＤ１８Ａ２高発現腫瘍の早期治療
ＳＣＩＤマウスに、高レベルのヒトＣＬＤ１８Ａ２を安定に発現する１×１０７個のＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２）を皮下的に接種した。ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２細胞におけるヒトＣＬＤ１８Ａ２の発現レベルは、患者からの原発性胃癌における発現レベルと同等であった。各々の実験処置群は１０匹のマウスを含んだ（各群当たりのマウスの数ｎ＝１０）。腫瘍接種の３日後にマウスの治療を開始した。マウスモノクローナル抗体２６Ｂ５、２６Ｄ１２、２８Ｄ１０、３７Ｇ１１、３７Ｈ８、３８Ｇ５、３９Ｆ１１、４２Ｅ１２、４３Ａ１１、３８Ｈ３又は６１Ｃ２に相当する精製ハイブリドーマ上清２００μｇを週に１回４週間にわたって静脈内注射した。あるいはマウスモノクローナル抗体４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２又は１７５Ｄ１０を含む精製ハイブリドーマ上清２００μｇを週に２回６週間にわたって、静脈内注射と腹腔内注射を交互に実施して投与した。処置したマウスの腫瘍増殖を週に２回観測した（腫瘍容積＝長さ×幅×幅を２で除してｍｍ３で表わす）。腫瘍が５００ｍｍ３の容積に達するか又は重症疾病の場合はマウスを死亡させた。Ｆｉｇ．２４（図３９）は、本発明の抗体によるＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２腫瘍細胞増殖の強固な阻害を例示する。Ｆｉｇ．２５Ａ（図４０）及びＦｉｇ．２５Ｂ（図４１）は、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２細胞を使用した早期治療異種移植モデルにおける、本発明の抗体での治療による生存の延長を示す。
【０３１４】
ｂ．マウスにおける進行したＣＬＤ１８Ａ２高発現腫瘍の末期開始治療（ｌａｔｅ  ｏｎｓｅｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）
上述した早期治療に対して末期治療開始プロトコールとしてＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２細胞に基づく同じ腫瘍異種移植モデルを設計した。腫瘍細胞接種後２７日目に、マウスを各々５〜６匹のマウスを含む試験群に無作為に割り付け、マウスモノクローナル抗体４３Ａ１１、１６３Ｅ１２及び１７５Ｄ１０をそれぞれ含む精製ハイブリドーマ上清２００μｇで治療を開始した。抗体を週に２回６週間にわたって、静脈内注射と腹腔内注射を交互に実施して投与した。このモデルにおいても、本発明の抗体は腫瘍増殖を阻害することが示された。いくつかの抗体に関しては、これは生存の延長を生じさせた（Ｆｉｇ．２６（図４２））。
【０３１５】
ｃ．低レベルのＣＬＤ１８Ａ２を発現する腫瘍の早期治療
ＳＣＩＤマウスに、低レベルのＣＬＤ１８Ａ２タンパク質を構成的に発現する浸潤性ヒト膵腺癌細胞系、ＤＡＮ−Ｇ腫瘍細胞系の２×１０５細胞を皮下的に接種した。腫瘍移植の３日後にマウス（群当たり１０匹）の治療を開始した：マウスモノクローナル抗体４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２又は１７５Ｄ１０を含む精製ハイブリドーマ上清２００μｇを週に２回６週間にわたって、静脈内注射と腹腔内注射を交互に実施して投与した。インビボでの膵ＤＡＮ−Ｇ腫瘍細胞系の攻撃的で急速な腫瘍増殖のために、マウスは腫瘍性悪液質を発症し、数日以内に死亡した。結果として、治療効果を測定するためのウインドウは限定されていたが、本発明の抗体によって媒介される腫瘍増殖の阻害及び生存延長はこのモデルにおいても認められた（Ｆｉｇ．２７Ａ（図４３）及びＦｉｇ．２７Ｂ（図４４））。
【０３１６】
ｄ．本発明の抗体はマウスにおいて副作用を惹起しない
マウスＣＬＤ１８Ａ２特異的プライマー対（センス：ＣＴＡ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＴＴＣ、アンチセンス：ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ）を正常マウス組織の包括的パネルに由来するｃＤＮＡを増幅するためにＲＴ−ＰＣＲ分析において使用した（Ｆｉｇ．２８（図４５）参照）。
マウスＣＬＤ１８Ａ２の発現は、胃を除き、試験したいずれの正常組織でも検出できなかった（Ｆｉｇ．２８（図４５）参照）。さらに、ヒト及びマウスＣＬＤ１８Ａ２と交差反応するＣＬＤ１８Ａ２特異的抗体を、正常マウス組織の大きなパネルにおけるＣＬＤ１８Ａ２発現の免疫組織化学的分析のために使用した（表３参照）。正常胃組織を除き、試験したすべての正常組織がＣＬＤ１８Ａ２発現を示さない。ヒトＣＬＤ１８Ａ２に関して認められたように、本発明者らはまた、表面上皮及びより深部の陰窩細胞はそれらの細胞表面でＣＬＤ１８Ａ２を発現するが、中央頸部領域はＣＬＤ１８Ａ２陰性であることをマウス対応物に関しても認めた（Ｆｉｇ．２９ＡからＦｉｇ．２９Ｃ（図４６）参照）。要約すると、ＣＬＤ１８Ａ２の組織分布はヒトとマウスにおいて同じであると思われる。
【０３１７】
【表４】
0005995919.tif 000007
【０３１８】
本発明者らは、マウスにおいて抗体１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０によって媒介される潜在的副作用をさらに検討した。これらの抗体はすべて、先にＦＡＣＳ分析によってマウスＣＬＤ１８Ａ２並びにそのヒトタンパク質と反応することが示されている。
これらの抗体による治療中及び治療後にマウスにおいて目に見える副作用は認められず、また未処置（ＰＢＳ処置）マウスと比較して抗体処置マウスの胃粘膜において毒性の組織形態学的相関は認められなかった（Ｆｉｇ．３０（図４７）参照）。
【０３１９】
ｅ．キメラモノクローナル抗体を用いたマウスにおけるＣＬＤ１８Ａ２高発現腫瘍の早期治療
実施例８ａと同様に、但しキメラモノクローナル抗体を使用して、本発明の抗体でのマウスにおけるＣＬＤ１８Ａ２高発現腫瘍の早期治療を評価した。簡単に述べると、ＳＣＩＤマウスに、高レベルのヒトＣＬＤ１８Ａ２を安定に発現する１×１０７個のＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２）を皮下的に接種した。各々の実験処置群は１０匹のマウスを含んだ。腫瘍接種の３日後にマウスの治療を開始した。キメラモノクローナル抗体ｃｈ−１６３Ｅ１２又はｃｈ−１７５Ｄ１０（以下の実施例９参照）を産生するように一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の精製した細胞培養上清２００μｇを週に２回６週間にわたって、静脈内注射と腹腔内注射を交互に実施して投与した。本発明のキメラ抗体によるＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２腫瘍細胞増殖の強固な阻害が認められた。Ｆｉｇ．３４（図５２）は、ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２細胞を使用した早期治療異種移植モデルにおける、本発明のキメラ抗体での治療による生存の延長を示す。
【０３２０】
ｆ．キメラモノクローナル抗体を用いたマウスにおける進行したＣＬＤ１８Ａ２高発現腫瘍の末期開始治療
上述した早期治療に対して末期治療開始プロトコールとして上述したＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２細胞に基づく同じ腫瘍異種移植モデルを設計した。腫瘍細胞接種後８日目に、マウスを各々９匹のマウスを含む試験群に無作為に割り付け、キメラモノクローナル抗体ｃｈ−１６３Ｅ１２又はｃｈ−１７５Ｄ１０（以下の実施例９参照）を産生するように一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の精製した細胞培養上清２００μｇで治療を開始した。抗体を週に２回６週間にわたって、静脈内注射と腹腔内注射を交互に実施して投与した。このモデルにおいても、本発明のキメラ抗体は腫瘍増殖を阻害することが示された。いくつかのキメラ抗体に関しては、これは生存の延長を生じさせた（Ｆｉｇ．３５（図５３））。
【０３２１】
［９．抗体のキメラ化］
ａ．マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体の作製
当業者に公知の標準的方法、例えばＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びヒト脾組織から全ＲＮＡ及びその後一本鎖ｃＤＮＡを作製した。
ヒトκ軽鎖の定常領域をＰＣＲによってＰＢＭＣ  ｃＤＮＡから増幅した。センスオリゴマー（配列番号３８）は、定常領域の５'末端にＢａｍＨＩ制限部位を付加し、定常領域の最初の２個のアミノ酸（Ａｒｇ−Ｔｈｒ）をコードする元の核酸配列５'−ＣＧＡＡＣＴ−３'を５'−ＣＧＴＡＣＧ−３'に変化させて、アミノ酸配列を変えずにＢｓｉＷＩ制限部位を生成した。アンチセンスオリゴマー（配列番号３９）は、終結コドンを含み、増幅した定常領域の３'末端にＮｏｔＩ制限部位を付加した。ＰＣＲ産物並びに標準発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３．１（＋），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素と共に連続的にインキュベートした。再循環を防ぐため、ベクターを仔ウシ腸アルカリホスファターゼで付加的に処理した。最後に定常領域をベクターに連結することで、定常領域の前の可変領域のその後の融合が、今度は、残存するベクターのマルチクローニングサイトからのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（５'−ＡＡＧＣＴＴ−３'）によって及びＰＣＲ産物で生成されたＢｓｉＷＩ制限部位（５'−ＣＧＴＡＣＧ−３'）によって可能とした。ベクターに挿入したヒトκ軽鎖定常領域の配列を配列番号４０に列挙し、ヒトκ定常領域のアミノ酸配列を配列番号４１に列挙する。
【０３２２】
ヒトγ１重鎖の定常領域をＰＣＲによって脾ｃＤＮＡから増幅した。５'リン酸化センスオリゴマー（配列番号４２）を定常領域の開始点の１１ヌクレオチド下流に位置する天然に生じるＡｐａＩ制限部位上に位置づけ、定常領域の増幅部分の５'末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を付加した。５'リン酸化アンチセンスオリゴマー（配列番号４３）は、終結コドンを含み、増幅した定常領域の３'末端にＮｏｔＩ制限部位を付加した。このようにして生成したＰＣＲ産物は、平滑末端を有し、５'リン酸化されていた。識別アンチセンスオリゴマー（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ）（配列番号４４）でのＰＣＲ及び配列決定により、増幅したγ定常領域がＩｇＧ１サブクラスであることを確認した。軽鎖の発現のために使用したベクターのもの（例えばネオマイシン）とは異なる抗生物質耐性（例えばハイグロマイシン）を有する標準発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３．１（＋）／Ｈｙｇｒｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、平滑末端を残しつつマルチクローニングサイトを完全に除去するためにＰｍｅＩ制限酵素と共にインキュベートした。再循環を防ぐため、ベクターを仔ウシ腸アルカリホスファターゼで付加的に処理した。最後に定常領域をベクターに連結することで、定常領域の前の可変領域のその後の融合が、今度は、どちらもＰＣＲ産物で生成されたＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（５'−ＡＡＧＣＴＴ−３'）及びＡｐａＩ制限部位（５'−ＧＧＧＣＣＣ−３'）によって可能とした。ベクターにおける定常領域の正しい方向、すなわちベクターの先行するプロモーターのために適切な方向を配列決定によって確認した。ＡｐａＩ制限部位の位置のため、この目的の可変領域の任意の増幅は、ＡｐａＩ部位の配列に加えてヒトγ１定常領域の配列の最初の１１ヌクレオチドを含まなければならない。ベクターに挿入し、このようにして増幅したヒトγ１重鎖定常領域の配列を配列番号４５に列挙し、このようにして発現されたヒトγ１定常領域のアミノ酸配列を配列番号４６に列挙する。
【０３２３】
【表５】
0005995919.tif 000008
【０３２４】
それらのマウス対応物に合わせて、キメラモノクローナル抗体は「ｃｈ」の接頭語を付して、例えばｃｈ−４３Ａ１１、ｃｈ−１６３Ｅ１２、ｃｈ−１２５Ｅ１、ｃｈ−１６６Ｅ２、ｃｈ−１７５Ｄ１０、ｃｈ−４５Ｃ１と命名した。
【０３２５】
軽鎖及び重鎖のマウス可変領域の増幅は、Ｍａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．６）に述べられている「ステップアウトＰＣＲ」法に従って実施した。このために、当業者に公知の標準的方法、例えばＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡをモノクローナルハイブリドーマ細胞系（表４参照）から作製した。一本鎖ｃＤＮＡは、同じくＭａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．６，１５５８）に述べられている「鋳型スイッチ」法に従って作製した。（ｄＴ）３０オリゴマー（配列番号４７）に加えて、一本鎖ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ鎖の重合の間の鋳型スイッチ作用のための５'アダプターとして働くＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドオリゴマー（配列番号４８）を含んだ。このアダプターオリゴマーにおいては、最後の３個のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドではなくリボヌクレオチドであった。その後の「ステップアウトＰＣＲ」は、マウスκ鎖の定常領域又はγ鎖のサブクラス１、２ａ又は３の定常領域（それぞれ配列番号４９〜５２）を標的とするアンチセンスオリゴマーを使用した。ハイブリドーマ細胞系によって産生されるマウスモノクローナル抗体のＩｇＧサブクラスは、事前にＩｓｏＳｔｒｉｐで免疫学的に分析し（実施例１参照）、それに従って適切なアンチセンスオリゴマーを選択した（表４参照）。配列番号５３及び５４に列挙する２つのオリゴマーを含むプライマー混合物は、「ステップアウトＰＣＲ」におけるセンスオリゴマーとしての機能を果たした。一部のハイブリドーマ細胞系は、（ハイブリドーマの作製のために使用した骨髄腫細胞系によって発現される鎖に加えて）２以上の重鎖又は軽鎖を発現した。表４は、クローニングして配列決定したマウス抗体鎖の可変領域の配列番号（配列番号５５〜６９及び配列番号１３２〜１４６）及びクローニングして配列決定した完全長キメラ抗体鎖の配列番号（配列番号１００〜１２９）を要約する。
【０３２６】
同定されたマウス可変領域は、次に、５'ＵＴＲ及び３'マウス定常領域を除くＰＣＲによって増幅し、ヒト定常領域を担持する作製された発現ベクターへのサブクローニングを可能にする制限部位を末端に付加した。加えて、センスオリゴマーはコンセンサスコザック配列（５'−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３'又は５'−ＡＧＣＣＡＣＣ−３'）を提供し、重鎖可変領域のためのアンチセンスオリゴマーは、ＡｐａＩ制限部位に加えてヒトγ１定常領域の配列の最初の１１ヌクレオチドを含んだ（表４参照、配列番号７０〜９９）。κ軽鎖可変領域はＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩ制限酵素を使用してクローニングし、γ重鎖可変領域はＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩ制限酵素が必要であった。モノクローナル抗体４５Ｃ１のγ重鎖可変領域は内部ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含むが、ここでは代わりに適合性ＢｓａＩ酵素を使用した（配列番号８０参照）。配列番号１００〜１１４は、生じたキメラ化抗体の核酸配列を示す（表４参照）。配列番号１１５〜１２９は、それに従って発現されたキメラ抗体のアミノ酸配列を示す（表４参照）。
【０３２７】
ｂ．ＣＬＤ１８に対するキメラ抗体の作製と生産
ＣＬＤ１８特異性を有するキメラ抗体を産生する哺乳動物細胞系を生成した。細胞系はＨＥＫ２９３Ｔ細胞に由来した（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）。トランスフェクションの１日前に、２．５×１０７細胞を１４．５ｃｍ組織培養皿に塗布し、完全培地２０ｍｌ中で培養するか、あるいは１×１０７細胞を１０ｃｍ組織培養皿に塗布し、完全培地１０ｍｌ中で培養するか、あるいは０．６×１０６細胞を１２穴組織プレートのウエルに塗布し、完全培地２〜３ｍｌ中で培養した（完全培地：抗生物質を含まない、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ：Ｆ１２培地）。トランスフェクションの時点での推奨細胞密度は、９０％の集密度とすべきである。トランスフェクションの直前に、培地を新鮮培地に交換した。トランスフェクション試薬、例えばリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１６６８−０１９）あるいはポリエチレンイミン（シグマ・アルドリッチ，４０８７２７）でＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションについて例示したように、１１０μｇ又は２９６μｇの総ＤＮＡ量を１４．５ｃｍ組織皿のために使用し、トランスフェクション試薬対ＤＮＡの比率は、リポフェクタミン２０００及びＰＥＩについてそれぞれ１：２．５及び１：１２であった。トランスフェクションの２４時間後、培地を、ＧＭＰ適合培地、例えばＸ−Ｖｉｖｏ  １５（Ｃａｍｂｒｅｘ）又は血清を含まないＰｒｏ２９３ａ（Ｃａｍｂｒｅｘ）のような化学的に定義された培地と交換した。ＣＬＤ１８に対するキメラモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞をさらに９６時間培養した。粗上清を採取し、滅菌ろ過して、プロテインＡ−セファロースによって精製した。抗体濃度をＢＣＡアッセイによって決定し、純度をドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動及びクマシー染色によって確認した。
【０３２８】
ｃ．キメラモノクローナル抗体の結合特性
クローニングして作製したキメラモノクローナル抗体のＣＬＤ１８Ａ２への結合特異性を、実施例３で述べたようにフローサイトメトリーによって分析した。ヒトＣＬＤ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３生細胞（ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２）及びヒトＣＬＤ１８Ａ１（配列番号７、８）を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ１）を、キメラモノクローナル抗体を含む精製ＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養上清と共に４℃で３０分間インキュベートし、次いでＡＰＣ結合Ｆ（ａｂ'）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ二次抗体と共にインキュベートして、ＰＩでカウンター染色した。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙを使用したフローサイトメトリーによって結合を評価した。
同様に、内因性にＣＬＤ１８Ａ２を発現するヒト腫瘍細胞系、例えばＫＡＴＯ−ＩＩＩ及びＮＵＧＣ−４細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
Ｆｉｇ．３１Ａ及びＢ（図４８、４９）は、キメラ抗体ｃｈ−４３Ａ１１、ｃｈ−１２５Ｅ１、ｃｈ−１６３Ｅ１２、ｃｈ−１６６Ｅ２及びｃｈ−１７５Ｄ１０のフローサイトメトリー分析を示す。それらすべてが天然エピトープ認識を示し、ＣＬＤ１８Ａ２発現細胞への特異的で強い結合を示すが、ＣＬＤ１８Ａ１発現細胞に対しては結合を示さない。
【０３２９】
ｄ．補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）
補体溶解のための血清は、健常志願者からの血液をＳｅｒｕｍ−Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅバキュテイナーチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社，Ｎｕｒｍｂｒｅｃｈｔ，ドイツ）に採取し、次にそれを６００ｇで２０分間遠心分離することによって調製した。血清を採取し、−２０℃で保存した。コントロール血清は、５６℃で３０分間熱不活性化した後、保存した。
ヒトＣＬＤ１８Ａ２を内因性に発現するＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞並びに安定にトランスフェクトしたＣＨＯ−ＣＬＤ１８Ａ２細胞に対して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導するそれらの能力に関して、プロテインＡ−セファロースで精製した本発明のキメラ抗体を分析した。２．５μｇ／ｍｌ〜３５μｇ／ｍｌの最終濃度のモノクローナル抗体ｃｈ−１６３Ｅ１２、ｃｈ−１６６Ｅ２及びｃｈ−１７５Ｄ１０と共に、細胞をそれぞれ、３７℃で３０分間インキュベートした。ＲＰＭＩ中の２０％ヒト血清を細胞に添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。その後、死細胞と生細胞とを２．５μｇ／ｍｌの最終濃度でのＰＩ染色によって識別し、抗体媒介性細胞溶解のパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定した。フローサイトメトリー分析のためにＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙフローサイトメーター（ＢＤ  バイオサイエンス，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，カナダ）を使用した。前方側方散乱（ＦＳＣ／ＳＳＣ）閾値の調整によって排除された細胞デブリに関する分析のために少なくとも１００００事象を収集した。特異的細胞溶解を以下の式によって算定した：特異的細胞溶解＝（試料中のＰＩ陽性細胞％−熱不活性化血清を含む試料中のＰＩ陽性細胞％）。ＣＤＣによって媒介される特異的細胞溶解がいくつかの抗体に関して示された。３つの抗体すべてがＣＨＯ−ＣＬＤ１８Ａ２細胞に対する強固なＣＤＣを媒介した（Ｆｉｇ．３２（図５０））。ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞に関しては、抗体ｃｈ−１６３Ｅ１２及びｃｈ−１７５Ｄ１０が強固なＣＤＣの誘導物質であった。
【０３３０】
ｅ．抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
ヒトＣＬＤ１８Ａ２を内因性に発現するＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞に対して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するそれらの能力に関して、ＦＰＬＣ精製した本発明のキメラ抗体、分析した。
【０３３１】
健常ドナーからのヒト血液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で２回希釈し、血球をフィコール（１０７７ｇ／ｍｌ、ファルマシア）に重層した。遠心分離後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を間期から収集し、洗浄して、５％熱不活性化ヒト血清を添加したＸ−Ｖｉｖｏ−１５培地に再懸濁した。
アッセイの１５時間前に、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞をルシフェラーゼでトランスフェクトし、白色マイクロプレートに５×１０４細胞／ウエルで塗布した。
アッセイのために、２０：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比のエフェクター細胞（ＰＢＭＣ、上述したように調製した）及びＦＰＬＣ精製キメラ抗体を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２〜３時間インキュベートした。ウエル中の抗体の最終濃度は５０μｇ／ｍｌであった。２〜３時間のプレインキュベーション後、ルシファーイエロー（ＢＤ  バイオサイエンス，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  アメリカ合衆国）を１ｍｇ／ｍｌで添加した。生存細胞のルシフェラーゼによるルシファーイエローの酸化から生じる発光をマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００，Ｔｅｃａｎ，スイス）を使用して６時間まで継続的に測定した。細胞傷害のパーセンテージを以下の式：特異的細胞溶解％＝１００−（（試料発光計数−自然発光計数）／（最大発光計数−自然発光計数）×１００）を用いて算定し、自然発光はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（最終濃度０．２％）を添加することによって測定し、最大シグナルは抗体の非存在下で測定した。
このアッセイを使用して、モノクローナル抗体ｃｈ−１６３Ｅ１２及びｃｈ−１７５Ｄ１０がＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞への強力なＡＤＣＣを媒介することが示された（Ｆｉｇ．３３（図５１））。
【０３３２】
ｆ．増殖の阻害
ヒトＣＬＤ１８Ａ２を内因性に発現するＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞の増殖を阻害するそれらの能力に関してＦＰＬＣ精製した本発明のキメラ抗体を分析した。
標的細胞（ＫＡＴＯ−ＩＩＩ）をそれぞれのキメラ抗体の存在下で培養した（マウス抗体の増殖の阻害、実施例７参照）。ＦＰＬＣ精製したキメラ抗体ｃｈ−１６３Ｅ１２及びｃｈ−１６６Ｅ２は細胞増殖を阻害することが示された。
【０３３３】
［１０．臨床先導候補物質（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｌｅａｄ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ）としての抗体の選択］
理想的な臨床先導物質は、広範囲の治療及び診断適用をカバーし得る（第ＩＶ章−本発明の用途及び方法も参照のこと）。本発明によれば、ＣＬＤ１８Ａ２に対する抗体が提供される。本発明において提供される抗体は、特異性、ＣＬＤ１８を発現する細胞、特に腫瘍細胞のＣＤＣ及びＡＤＣＣを誘導し、増殖を阻害する能力に関して広いスペクトルの特性を提供することが示された。さらに、抗体のキメラ化は、親マウス分子には存在しない付加的なＦｃ依存性エフェクター機能の獲得を導き得ることが明らかにされた。例えば、マウスＩｇＧ１を有する抗体１７５Ｄ１０は補体依存性細胞傷害を誘導しないが（実施例５参照）、ヒトＩｇＧ１を有するｃｈ−１７５Ｄ１０は、ＣＬＤ１８を構成的に発現する腫瘍細胞の特異的溶解を誘導することが本明細書において示されている（表５及び表６参照）。
本発明において提供される抗体は、それらの結合特性及びＣＬＤ１８を発現する細胞へのエフェクター機能を媒介するそれらの能力に従って、異なるクラスに分類され得る。本発明において提供される抗体から、それらの機能的特徴に基づいて臨床先導候補物質を選択し得る。選択した本発明のマウス及びキメラ抗体についての性質の概要をそれぞれ表５及び表６に示す。
本発明の臨床先導候補物質は以下の性質の１又はそれ以上を有し得る：
ａ）ヒトＣＬＤ１８Ａ２に結合するがヒトＣＬＤ１８Ａ１には結合しない（例えば４３Ａ１１、４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０、並びにｃｈ−４３Ａ１１、ｃｈ−４５Ｃ１、ｃｈ−１２５Ｅ１、ｃｈ−１６３Ｅ１２、ｃｈ−１６６Ｅ２及びｃｈ−１７５Ｄ１０）。例えば、Ｆｉｇ．６Ａ（図８）及びＦｉｇ．６Ｂ（図９）参照。
ｂ）マウスＣＬＤ１８Ａ２に結合するがマウスＣＬＤ１８Ａ１には結合しない（例えば１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０）。例えば、Ｆｉｇ．１５Ａ（図２１）及びＦｉｇ．１５Ｂ参照（図２２）。
ｃ）腫瘍細胞によって天然に発現されるＣＬＤ１８に結合する（例えば４５Ｃ１、４３Ａ１１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０、並びにｃｈ−４５Ｃ１、ｃｈ−４３Ａ１１、ｃｈ−１２５Ｅ１、ｃｈ−１６３Ｅ１２、ｃｈ−１６６Ｅ２及びｃｈ−１７５Ｄ１０）。例えば、Ｆｉｇ．１３（図１９）参照。
ｄ）細胞間接着帯内のＣＬＤ１８に結合する（例えば４５Ｃ１、４３Ａ１１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０）。例えば、Ｆｉｇ．１２Ａ（図１７）及びＦｉｇ．１２Ｂ（図１８）参照。
ｅ）ＣＬＤ１８を発現する細胞のＣＤＣ誘導性死滅を媒介する（例えば４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０、並びにｃｈ−１６３Ｅ１２及びｃｈ−１７５Ｄ１０）。例えば、Ｆｉｇ．３２（図５０）参照。
ｆ）ＣＬＤ１８を発現する細胞のＡＤＣＣ誘導性死滅を媒介する（例えばｃｈ−１６３Ｅ１２及びｃｈ−１７５Ｄ１０）。例えば、Ｆｉｇ．３３（図５１）参照。
ｇ）ＣＬＤ１８を発現する細胞の増殖を阻害する（例えば４５Ｃ１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０、並びにｃｈ−１６３Ｅ１２及びｃｈ−１６６Ｅ２）。
ｈ）ＣＬＤ１８を発現する細胞による異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する（例えば４３Ａ１１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０）。例えば、Ｆｉｇ．２４（図３９）参照。
ｉ）ＣＬＤ１８を発現する細胞による異種移植モデルにおいて生存を延長する（例えば４３Ａ１１、１２５Ｅ１、１６３Ｅ１２、１６６Ｅ２及び１７５Ｄ１０）。例えば、Ｆｉｇ．２５Ｂ（図４１）参照。
【０３３４】
先導候補物質選択のための性質の例示的概要
【０３３５】
【表６】
0005995919.tif 000009
【０３３６】
【表７】
0005995919.tif 000010
【０３３７】
［１１．エピトープの分析］
本発明の抗体によって認識されるエピトープのマッピングは、Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓによる「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」ＩＳＢＮ−０８９６０３−３７５−９及びＯｌｗｙｎ  Ｍ．Ｒ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｆｒａｎｋ  Ｃ．Ｈａｙによる「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，２４８に詳述されているように実施できる。
【０３３８】
簡単に述べると、エピトープマッピングのために、抗原のアミノ酸配列に由来する合成オーバーラップペプチド（スポット合成によって作製した）によってペプチドスキャンを創製することができる。ペプチドスキャンの膜をＴＢＳで洗浄し、１０％乳／Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＴＢＳでブロックして、ペルオキシダーゼと結合した本発明の抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、５％乳／Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＴＢＳ中に希釈して、次にＴｗｅｅｎ２０−ＴＢＳ及びＴＢＳで洗浄し、例えばＥＣＬ  Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ（ロシュ）で展開して、Ｌｕｍｉ  Ｉｍａｇｅｒによって検出することができる。
【０３３９】
ａ．分子エピトープ分析
ヒトＣＬＤ１８の１番目の細胞外ドメイン（ＥＣＤ１）は、両方のアイソフォームの間で高度の相同性を示し、アミノ酸配列の８つの位置に関してのみ相違を示す（Ｆｉｇ．１４（図２０）参照）。
【０３４０】
胃特異的アイソフォームＣＬＤ１８Ａ２だけを選択的に認識するモノクローナル抗体を選択した（実施例１参照）。２つのアイソフォームの間で異なるものの中から決定的に重要なアミノ酸を決定するため、一方のアイソフォーム内のアミノ酸を他方のアイソフォーム内の対応する位置で認められるものと置換することにより、ＣＬＤ１８タンパク質においてアミノ酸置換を創製した。詳細には、８つの変異体を作製し、各々の変異体においてＣＬＤ１８Ａ１のアミノ酸配列と異なるＣＬＤ１８Ａ２  ＥＣＤ１内の８個のアミノ酸の１つを、ＣＬＤ１８Ａ１内の対応する位置で認められるアミノ酸で置換した。３つのＣＬＤ１８Ａ２変異体を作製し、各々の変異体において２個のアミノ酸をＣＬＤ１８Ａ１内の対応する位置で認められるアミノ酸で置換した：それらの８個のアミノ酸の２番目と３番目、３番目と４番目、及び４番目と５番目のアミノ酸。他方のアイソフォームＣＬＤ１８Ａ１についての対応する１１の構築物を、ＣＬＤ１８Ａ１内のそれぞれのアミノ酸をＣＬＤ１８Ａ２で認められるもので置換することによって作製した。
それぞれのＣＬＤ１８アイソフォームをコードする核酸を突然変異させ、変異した核酸を標準発現ベクターにクローニングすることによって、変化したＣＬＤ１８タンパク質を作製した。
【０３４１】
作製されたＣＬＤ１８Ａ２変異体に対する被験抗体の結合低下及び作製されたＣＬＤ１８Ａ１変異体に対する結合上昇をフローサイトメトリー分析によって観測した。改変していない野生型ＣＬＤ１８Ａ１及びＣＬＤ１８Ａ２も分析に含めた。
【０３４２】
このために、野生型ＣＬＤ１８Ａ１又はＣＬＤ１８Ａ２又はそれらの突然変異体をコードする核酸でＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフェクトして、ヒトＣＬＤ１８Ａ１又はＣＬＤ１８Ａ２発現細胞を作製した。トランスフェクタントを試験した本発明の抗体と共にインキュベートし、結合特性をフローサイトメトリーによって分析した。
【０３４３】
マウスモノクローナル抗体４４  Ｅ４  Ｄ３  Ｆ１１（１８２−Ｄ１１０６−１７９、ＩｇＧ２ａ、κ）は、細胞表面上のＣＬＤ１８Ａ１及びＣＬＤ１８Ａ２の両方を認識する。抗体ｃｈ−１７５Ｄ１０は、野生型ＣＬＤ１８Ａ２への強力で特異的な結合を示した（表７参照）。抗体ｃｈ−１７５Ｄ１０は、以下のアミノ酸置換を有するＣＬＤ１８Ａ２変異体３、４及び６に結合しない：変異体３：Ａ４２Ｓ；変異体４：Ｎ４５Ｑ；変異体６：Ｅ５６Ｑ。また変異体３及び４の単一アミノ酸置換の少なくとも１つを含むＣＬＤ１８Ａ２二重変異体への結合も認められなかった。
【０３４４】
【表８】
0005995919.tif 000011
【０３４５】
ｂ．ペプチドスキャンによるエピトープマッピング
本発明の抗体によって認識されるエピトープを同定し、マッピングするため、ＣＬＤ１８Ａ２の１番目の細胞外ドメインのアミノ酸配列に由来する合成オーバーラップペプチド（スポット合成によって作製した）によってペプチドスキャンを創製した。抗原配列全体は、Ｊｅｒｉｎｉ  ＡＧ，ベルリン，ドイツによって線状１５量体ペプチド（１１アミノ酸の重複を有する）として合成され、その後本発明の抗体による結合に関して試験された。加えて、線状ペプチド間でのジスルフィド結合の形成を回避するため、線状ペプチドのすべてのシステインをセリンで置換した。本発明のキメラモノクローナル抗体を製造者の指示に従って（Ｐｉｅｒｃｅ，ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｐｌｕｓ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｋｉｔ）ペルオキシダーゼと結合し、ペプチドスキャンと共にインキュベートした。ＣＬＤ１８Ａ２に対する特異的エピトープ認識を発光によって観測した。表８において、ＣＬＤ１８Ａ２の１番目の細胞外ドメインのアミノ酸配列に由来する合成ペプチドへのキメラモノクローナル抗体ｃｈ−１７５Ｄ１０及びｃｈ−１６３Ｅ１２の結合強度を示す。
【０３４６】
【表９】
0005995919.tif 000012
【０３４７】
ｃｈ−１７５Ｄ１０及びｃｈ−１６３Ｅ１２の両抗体は、少なくとも２つの結合部位で不連続（立体配座）エピトープを認識し、鍵となるアミノ酸残基が一次タンパク質構造内で分離している２又はそれ以上の結合領域にわたって分布することを示唆する。折りたたみ後、これらの結合領域はタンパク質表面で一つになって複合エピトープを形成する。抗体ｃｈ−１７５Ｄ１０が、システイン置換を実施していないペプチド１及び７には強力に結合するが、２個のシステインの代わりにセリンを含むペプチド７にはわずかしか結合しないことは、エピトープ認識のため及び場合によりタンパク質の折りたたみのためのシステインの中心的役割を示す（Ｆｉｇ．３６（図５４））。本発明者らのデータは、両方のキメラ抗体についてのエピトープを含むＣＬＤ１８Ａ２の１番目の細胞外ドメインに関する３つの異なるタンパク質折りたたみモデルを示唆する（Ｆｉｇ．３７（図５５））。Ｆｉｇ．３７（図５５）に示す最初のモデルは、両方のシステインを含む線状ペプチド７であり、２番目のモデルは、ループを生じさせる分子内ジスルフィド結合を示し、３番目のモデルは、２つの分子間ジスルフィド結合を形成する２個のシステインを表す。
【０３４８】
［１２．抗体親和性の測定］
スカッチャード解析による結合定数の決定のため、ヒトＣＬＤ１８Ａ２への本発明の抗体の結合を、ＣＬＤ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞上で力価測定し、フローサイトメトリーによって分析することができる。本発明のヒト又はキメラ抗体は、非結合マウス抗ヒトＩｇＧ及びＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧのサンドイッチによって検出できる。各々の抗体のインキュベーション工程を４℃で３０分間実施し、続いてＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄する。本発明のマウス抗体は、ＦＩＴＣと結合したヤギ抗マウス二次抗体で直接検出することができる。二次及び三次抗体を使用した本発明の抗体のサンドイッチ検出は、ＱＩＦＩＫＩＴキット（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，デンマーク）を使用することにより、結合した本発明の抗体の数を定量することを必要としてもよい。このキットを用いて、製造者の指示に従ってフローサイトメトリーによって結合抗体の数を測定することができる。平均蛍光強度と結合ＩｇＧの厳密な直線関係を得ることができる。データは、スカッチャードプロット及びＫＤ決定によって結合曲線から直接解析できる。解離定数は、Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．８７：５６−６７，１９９０及びＮａｕｅｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １００：１０１−１２０，２００２に従って算定できる。
【０３４９】
本発明によれば、本発明の抗体についての解離定数を、ＣＬＤ１８Ａ２を安定に発現するＨＥＫ２９３−ＣＬＤ１８Ａ２細胞を使用したフローサイトメトリーに基づく結合アッセイによって決定した。細胞結合データのスカッチャード解析は、マウス及びキメラ１７５Ｄ１０及び１６３Ｅ１２に関して１０−８Ｍ〜１０−９Ｍの一連の解離定数を生じた。解離定数はＫｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．８７：５６−  ６７，１９９０及びＮａｕｅｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １００：１０１−１２０，２００２に従って算定した。
【０３５０】
［１３．オーソロガス交差反応性］
ヒト及びマウスＣＬＤ１８Ａ２及びＣＬＤ１８Ａ１への結合をフローサイトメトリーによって分析した。蛍光マーカー及びマウスＣＬＤ１８Ａ２（配列番号３３、３５）、又は蛍光マーカー及びマウスＣＬＤ１８Ａ１（配列番号３６、３７）、又は蛍光マーカー及びヒトＣＬＤ１８Ａ２（配列番号１、２）、又は蛍光マーカー及びヒトＣＬＤ１８Ａ１（配列番号７、８）で一過性にコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をｃｈ−１７５Ｄ１０、ｃｈ−１６３Ｅ１２及びｃｈ−１２５Ｅ１と共に４℃で３０分間インキュベートし、次いでアロフィコシアニン結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体と共にインキュベートした（４℃で３０分間）。
【０３５１】
Ｆｉｇ．３８（図５６、５７、５８）は、抗体ｃｈ−１７５Ｄ１０、ｃｈ−１６３Ｅ１２及びｃｈ−１２５Ｅ１についての結合プロフィールを示す。これらの抗体は、それらのマウス対応物に関して実施例３ｊで述べたように、前臨床試験においてＣＬＤ１８モノクローナル抗体の潜在的毒性を調べるための貴重なツールである。
【０３５２】
［１４．ＣＬＤ１８Ａ２は原発性胃腫瘍及び胃癌転移において高い形質膜発現を示す］
原発性胃癌及び胃癌転移からの非選択標本（クルーケンベルク腫瘍及びリンパ節）をＧＣ１８２特異的ウサギ抗血清で染色した。免疫組織化学並びに染色強度（無視し得る程度、弱い＝１、中等度＝２、強い＝３）及び形質膜染色を示す腫瘍細胞の割合（０〜１００％）の評価を専門臨床病理学者によって実施した；Ｆｉｇ．３９（図５９）参照。Ｆｉｇ．３９（図５９）において、各々の丸は独立した腫瘍標本を表す。統計的に有意に高い染色強度が転移において認められた（ｐ＝０．０３４、フィッシャーの正確確率検定）。
【図３３】
0005995919.tif 000013
【図３４】
0005995919.tif 000014
【図３５】
0005995919.tif 000015
【図３６】
0005995919.tif 000016
【図３７】
0005995919.tif 000017
【図３８】
0005995919.tif 000018
【図３９】
0005995919.tif 000019
【図４０】
0005995919.tif 000020
【図４１】
0005995919.tif 000021
【図４２】
0005995919.tif 000022
【図４３】
0005995919.tif 000023
【図４４】
0005995919.tif 000024
【図５０】
0005995919.tif 000025
【図５１】
0005995919.tif 000026
【図５２】
0005995919.tif 000027
【図５３】
0005995919.tif 000028
【図５５】
0005995919.tif 000029
【図５６】
0005995919.tif 000030
【図５７】
0005995919.tif 000031
【図５８】
0005995919.tif 000032
【図５９】
0005995919.tif 000033
【図１】
0005995919.tif 000034
【図２】
0005995919.tif 000035
【図３】
0005995919.tif 000036
【図４】
0005995919.tif 000037
【図５】
0005995919.tif 000038
【図６】
0005995919.tif 000039
【図７】
0005995919.tif 000040
【図８】
0005995919.tif 000041
【図９】
0005995919.tif 000042
【図１０】
0005995919.tif 000043
【図１１】
0005995919.tif 000044
【図１２】
0005995919.tif 000045
【図１３】
0005995919.tif 000046
【図１４】
0005995919.tif 000047
【図１５】
0005995919.tif 000048
【図１６】
0005995919.tif 000049
【図１７】
0005995919.tif 000050
【図１８】
0005995919.tif 000051
【図１９】
0005995919.tif 000052
【図２０】
0005995919.tif 000053
【図２１】
0005995919.tif 000054
【図２２】
0005995919.tif 000055
【図２３】
0005995919.tif 000056
【図２４】
0005995919.tif 000057
【図２５】
0005995919.tif 000058
【図２６】
0005995919.tif 000059
【図２７】
0005995919.tif 000060
【図２８】
0005995919.tif 000061
【図２９】
0005995919.tif 000062
【図３０】
0005995919.tif 000063
【図３１】
0005995919.tif 000064
【図３２】
0005995919.tif 000065
【図４５】
0005995919.tif 000066
【図４６】
0005995919.tif 000067
【図４７】
0005995919.tif 000068
【図４８】
0005995919.tif 000069
【図４９】
0005995919.tif 000070
【図５４】
0005995919.tif 000071
【配列表】
0005995919000001.app