(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムベ（Ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ  Ｈｅｘａｐｈｙｌｌａ）葉の熱水抽出物を有効成分として添加することを特徴とする抗炎組成物の製造方法。
【請求項２】
前記ムベ葉の熱水抽出物は、ムベ葉の熱水抽出物にエチルアセテートまたはクロロホルムを分画溶媒として分画した分画物であることを特徴とする請求項１に記載の抗炎組成物の製造方法。
【請求項３】
ムベ（Ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ  Ｈｅｘａｐｈｙｌｌａ）葉の熱水抽出物を有効成分として添加することを特徴とする炎症疾患治療及び予防用薬学組成物の製造方法。
【請求項４】
前記ムベ葉の熱水抽出物は、ムベ葉の熱水抽出物にエチルアセテートまたはクロロホルムを分画溶媒として分画した分画物であることを特徴とする請求項３に記載の炎症疾患治療及び予防用薬学組成物の製造方法。
【請求項５】
前記炎症疾患は、皮膚炎、皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ）、アレルギー、全身性紅斑性狼瘡、天疱瘡、アフター性口内炎、網膜炎、胃炎、肝炎、気管支炎、食道炎、腸炎、膵臓炎、大膓炎、腎臓炎、床擦れ、狼瘡、慢性甲状腺炎、多発性硬化症、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、放射線損傷、臓器移植の拒絶反応、全身性浮腫及び局所性浮腫からなる群から選択される何れか１つであることを特徴とする請求項３または４に記載の炎症疾患治療及び予防用薬学組成物の製造方法。
【請求項６】
ムベ（Ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ  Ｈｅｘａｐｈｙｌｌａ）葉の熱水抽出物を有効成分として添加することを特徴とする炎症緩和または改善用化粧料組成物の製造方法。
【請求項７】
前記ムベ葉の熱水抽出物は、ムベ葉の熱水抽出物にエチルアセテートまたはクロロホルムを分画溶媒として分画した分画物であることを特徴とする請求項６に記載の炎症緩和または改善用化粧料組成物の製造方法。
【請求項８】
ムベ（Ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ  Ｈｅｘａｐｈｙｌｌａ）葉の熱水抽出物を有効成分として添加することを特徴とする解熱用組成物の製造方法。
【請求項９】
前記ムベ葉の熱水抽出物は、ムベ葉の熱水抽出物にクロロホルム、ブタノールまたはエチルアセテートを分画溶媒として分画した分画物であることを特徴とする請求項８に記載の解熱用組成物の製造方法。
【請求項１０】
前記分画溶媒は、エチルアセテートまたはクロロホルムであることを特徴とする請求項９に記載の解熱用組成物の製造方法。
【請求項１１】
前記分画溶媒はエチルアセテートであることを特徴とする請求項１０に記載の解熱用組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記解熱用組成物は解熱剤または解熱鎮痛剤であることを特徴とする請求項８〜１１何れか１項に記載の解熱用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムベ抽出物を含む組成物及びムベ抽出物の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症反応は、バクテリア、かび、ウイルスまたは様々なアレルギー誘発物質などの外部感染原を含んでいる、外部から入ってきた有害物質や有機体などに露出されるなどの様々な要因によって、細胞や組織が損傷または破壊された時、その損傷を最小化して損傷部位を元の状態に回復（原状回復）させるために、局所的に作用する免疫反応を意味する。
【０００３】
また、前記炎症を誘発する色々な要因は、外傷、火傷、凍傷、放射能などによる物理的要因、酸（ａｃｉｄ）などの化学物質による化学的要因、及び抗体反応による免疫学的要因があり、その他、血管やホルモンの不均衡によって発生することもある。
【０００４】
前記炎症反応は、生体を保護し、組織損傷から生成された産物を除去するに効果的な防御メカニズムであって、局所血管と体液に存在する各種炎症媒介因子及び免疫細胞により、酵素活性化、炎症媒介物質の分泌、体液浸潤、細胞移動、組織破壊、紅斑、浮腫、発熱または痛みなどの症状が生じ、前記症状によって機能障害が誘発されることもある。
【０００５】
前記炎症は、正常状態では生体内で炎症反応によって外部感染源を除去、または発病要因を中和または除去し、破壊された組織を再生して正常な構造と機能を回復させる作用をする。しかし、抗原が除去できない場合や、特定の内部物質が原因となって炎症が一定水準以上に酷いか、慢性化された場合は、過敏性疾患や慢性炎症のような疾病に進むことがある。臨床疾患において、ほとんどの全疾患に亘って炎症反応が観察でき、発癌過程（ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）においても炎症反応に関連する酵素が重要な役割をすると知られている。また、輸血、薬物投与または臓器移植などの治療過程でも障害要因となる。
【０００６】
生体の炎症反応では様々な生化学的な現象が関係しており、特に、免疫細胞によって生産される炎症反応に係る色んな酵素により反応が開始または調節される。
【０００７】
最近、体内における炎症反応の進行は、ＣＯＸ（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）酵素活性に係ることが明らかになった。前記ＣＯＸ酵素は、生体内に存在するプロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）の生合成に係る主酵素であって、２種類の異性酵素であるＣＯＸ−１とＣＯＸ−２が存在すると知られている。前記ＣＯＸ−１は胃や腎臓のような組織に一定に存在し、正常な恒常性を維持することに関与し、前記ＣＯＸ−２は炎症やその他の免疫反応時の細胞分裂因子（ｍｉｔｏｇｅｎ）やサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）類によって細胞内で一時的に早く発現する酵素である。
【０００８】
また、他の強力な炎症媒介物である一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ、ＮＯ）は、ＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）によってＬ−アルギニンから生成され、ＵＶのような外部ストレスやエンドトキシンまたはサイトカインのような物質によって多くの種類の細胞で生成される。前記炎症刺激は細胞内の誘導性ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）の発現を増加させ、これによって、細胞内でＮＯ生成を誘導して大食細胞を活性化させることで炎症反応を起こすことがある。
【０００９】
したがって、近来、効果的に炎症を緩和するために、ＮＯの生成を抑制する物質に関する研究が盛んである。しかし、これら研究によって開発された抗炎物質は、いくつかの副作用がある。例えば、急性炎症疾患または慢性炎症疾患の治療に用いられる非ステロイド性消炎薬は、ＣＯＸ−２酵素を抑制するだけでなく、ＣＯＸ−１酵素も抑制するため、胃腸障害のような副作用を引き起こす。
【００１０】
一方、日常生活で使用する化粧品は、皮膚を保護し、美化清潔のために用いられる製品であるが、化粧品の組成物を分析すると、皮膚を保護するために使用する成分とは異なる成分が必須不可欠に製品に使用される。例えば、界面活性剤、防腐剤、香料、紫外線遮断剤、色素、及びその他の効能や効果を付与するために用いられる様々な成分がある。前記化粧品の製造に用いられる必須成分は、一般的に皮膚に炎症や、吹き出物または浮腫などと色んな副作用を発生することがある。
【００１１】
また、体内から排出される皮脂、汗及び化粧品などの成分のうち、脂肪酸、高級アルコール、蛋白質などが皮膚上に存在する皮膚常在菌によって毒性の強い物質に分解されると、これらによって、皮膚炎症が誘発されることもあり、太陽からの紫外線によっても皮膚炎症が誘発されることもある。
【００１２】
上述したように、化粧品において、皮膚に対する副作用の誘発要因は常に潜んでおり、これを解決するために多様な研究が行われてきた。現在、紅斑や浮腫のような刺激緩和及び炎症緩和のために用いられている物質は、非ステロイド系はフルフェナム酸（ｆｌｕｆｅｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）、イブプロフェン（ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）、ベンジダミン（ｂｅｎｚｙｄａｍｉｎｅ）、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）などがあり、ステロイド系はプレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）などがあり、アラントイン、アズレン、ε−アミノカプロン酸、ヒドロコルチゾン、甘草酸及びその誘導体（β−グリチルリチン酸、グリチルリチン酸誘導体）などが抗炎症に効果があると知られている。
【００１３】
しかし、一般的に抗炎剤として使用される前記インドメタシンは、化粧料には使用できない物質であり、前記ヒドロコルチゾンは使用量が制限されており、甘草酸及びその誘導体は安定化しにくいか、溶解度が低いため、実際に適用する場合、濃度の制限によって実質的な効果が得にくいなど、今まで知られている抗炎剤は、皮膚安全性や化粧料の配合安定性において問題がある場合が大部分であるため、その使用が制限されている。
【００１４】
また、最近、胃炎治療剤の作用機序は、２番目のヒスタミン受容体（Ｈ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を防いで胃壁細胞での胃酸の分泌を減少させるＨ２阻害剤（Ｈ２−Ｂｌｏｃｋｅｒｓ）がメインとなる。胃酸が減ることにより、既に損傷された胃壁細胞（胃潰瘍など）のさらなる損傷を防止する。このようなＨ２阻害剤は、肝では他の薬の代謝を妨害するため（ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｐ−４５０）、他の薬と共に服用する場合は注意を要し、抗アンドロゲン（Ａｎｔｉ−Ａｎｄｒｏｇｅｎ）効果があるため、男性にとって女性化乳房（ｇｙｎｅｃｏｍａｓｔｉａ）、勃起不全（ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ）、性欲減少などの副作用が発生することがある。また、胎盤と脳血管障壁を通過するため、妊産婦や老人にとって副作用がさらに危険であり、頭痛や混同、混迷、目まいなどを引き起こすこともある。
【００１５】
したがって、天然由来の物質として効果的にＮＯの生成、ｉＮＯＳ及びＴＮＦ−αの発現、ＣＯＸ−２酵素の活性などを抑制でき、抗炎効果に優れ、上述したような副作用や細胞毒性に対する危険がないか、極めて少なく、その使用含量の制限がほとんどない物質の開発が求められている。
【００１６】
特に、最近、消費者の要求に応じるために、天然原料を用いた天然物医薬品として抗炎症剤または天然素材を用いた化粧料または化粧品の成分に対する研究開発が盛んである。
【００１７】
また、解熱剤（ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ ｄｒｕｇ）は、発熱状態の体温を下げる作用をする薬剤であって、一般的に鎮痛作用も同時に行うので解熱鎮痛剤ともいう。
【００１８】
前記解熱剤に係る作用機序として現在支持されている主な見解は、前記解熱剤がプロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ；ＰＧ）の生合成を阻害することにより、発熱を和らげ、解熱を可能にするということである。
【００１９】
具体的に、発熱時には視床下部の体温調節中枢のプロスタグランジン濃度が上昇するため、前記体温調節中枢のプロスタグランジン含量を低減すると、発熱作用を抑制して解熱効果が得られる。また、前記プロスタグランジンは、痛み誘発の媒介物質であると知られている。しかし、その他にも発熱症状に関連して多様なメカニズムが提示されている。
【００２０】
現在、処方されている解熱剤としては、アスピリンなどのサリチル酸誘導体、アセトアニリド、フェナセチンなどのアニリン誘導体、アンチピリン、アミノピリンまたはスルピリンなどのパラゾロン誘導体などがある。また、抗炎症剤において、インドメタシンのような非ステロイド系抗炎症剤にも解熱鎮痛作用を有するものがある。
【００２１】
上述したように、解熱鎮痛作用と抗炎効果、すなわち消炎効果は、一部の関連性が見出される場合もあるが、抗炎症作用はほとんどなく、解熱作用は強い薬剤がある反面、解熱作用はほとんどないが、抗炎効果に優れた物質もあるため、抗炎効果と解熱及び鎮痛効果が必ず相互直接的な相関関係があるとはいえないと判断される。
【００２２】
したがって、急性中毒症を起こすアニリン剤などのように、最近、色々な副作用が問題となる化合物質由来の成分でなく、天然物由来の成分からなるため解熱作用に優れ、それだけでなく、天然由来の物質であるためこれら副作用や細胞毒性に対する危険がほとんどない物質の開発が求められている。
【００２３】
特に、最近、消費者の要求に応じるために、天然原料を用いた天然物医薬品として解熱剤に関する研究開発が盛んである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明は、副作用が発生する可能性の低い植物抽出物を有効成分とする抗炎組成物を提供することをその目的とする。
【００２５】
また、本発明は、前記要求に応じるために、副作用が発生する可能性の低い植物抽出物を有効成分とする解熱用組成物を提供することをその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
前記目的を達成するために、本発明は、ムベ抽出物を有効成分として含む抗炎組成物を提供する。前記抗炎組成物は、医薬用組成物であってもよく、例えば消炎鎮痛剤であり得る。また、前記抗炎組成物は、炎症を抑制するために化粧料組成物の有効成分として提供されることができる。
【００２７】
また、本発明は、ムベ抽出物を有効成分として含む抗炎症剤を提供する。
【００２８】
また、本発明は、ムベ抽出物を有効成分として含む炎症改善または緩和用化粧料組成物を提供する。
【００２９】
また、本発明は、ムベ抽出物を有効成分として含む解熱用組成物を提供する。前記解熱用組成物は医薬用組成物であってもよく、例えば解熱剤または解熱鎮痛剤であり得る。
【００３０】
本発明者らは、天然物由来の抗炎に関して研究していたところ、ムベ抽出物が抗炎効果に優れたことを確認した。具体的には、ムベ抽出物は、ＮＯ分泌を効果的に抑制し、ＮＯの生成に関連するｉＮＯＳの発現を抑制し、生体内に存在するプロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）の生合成に関連して炎症反応を進行させるＣＯＸ（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）酵素の活性を阻害することを確認した。さらに、前記ムベ葉の抽出物の様々な溶媒分画のうち、エチルアセテート分画は、毒性が問題にならない範囲内で他の分画に比べてＮＯ生成量を効果的に抑制するだけでなく、ＣＯＸ酵素の活性も有効に阻害することを確認した。
【００３１】
また、本発明者らは天然物由来の解熱鎮痛素材に関して研究していたところ、ムベ抽出物が解熱効果に優れたことを確認した。具体的に、抗炎効果を有する他の植物抽出物は解熱効果がないか、ほとんどないが、これとは異なり、ムベ抽出物は顕著に優れた解熱効果があることを確認した。さらに、前記ムベ抽出物の様々な溶媒分画のうち、エチルアセテート分画は、毒性が問題にならない範囲内で他の分画に比べて解熱効果に優れたことを確認した。
【００３２】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００３３】
本発明は、ムベ抽出物を有効成分として含む抗炎組成物に関するものである。
【００３４】
前記ムベ（Ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ ｈｅｘａｐｈｙｌｌａ）は、双子葉植物のキンポウゲ目アケビ科ムベ属の常緑つる性木本植物であって、トキワアケビともいう。
【００３５】
前記ムベは雌雄同株である。前記ムベの葉は互生で、通常５あるいは７枚あり、掌状複葉である。前記ムベの花期は５月であり、薄い黄色で、総状花序を出す。前記ムベの果実は、卵形状または楕円形の漿果で、長さが５ｃｍ〜１０ｃｍであり、１０月に熟すと赤褐色となる。果肉はアケビよりも甘い。種子は卵形状または楕円形で、黒色である。前記ムベは、主に韓国、日本、台湾または中国などに分布する。韓国では主に全羅南道、慶尚南道、及び忠清南道などの南部地方の渓谷や森でよく生育する。
【００３６】
前記ムベ抽出物は、通常の植物抽出物の製造方法で製造されてもよいが、例えば、ムベの果実、花、葉、枝、幹、根または皮やその粉砕物、好ましくはムベの葉またはムベの果実、さらに好ましくはムベの葉に抽出溶媒を加えて抽出することで製造するか、抽出溶媒で抽出して製造した粗抽出物に分画溶媒を加えて分画して製造してもよい。前記ムベ葉は、他の部位に比べて収穫量が多くて生産が容易であり、抗炎効果も優れたものであるため、前記ムベ抽出物は、好ましくはムベ葉の抽出物であり得る。
【００３７】
前記抽出溶媒は、水及び有機溶媒からなる群から選択された１種以上であり得る。前記有機溶媒は、炭素数１〜５のアルコール、前記アルコール希釈水、エチルアセテートまたはアセトンなどの極性溶媒と、エーテル、クロロホルム、ベンゼン、ヘキサンまたはジクロロメタンの非極性溶媒、またはこれらの混合溶媒であり得る。前記炭素数１〜５のアルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノールなどであり得るが、これに限定されることはない。また、アルコール希釈水は、アルコールを水に希釈して５０％（ｖ／ｖ）〜９９．９％（ｖ／ｖ）にしたものであり得る。
【００３８】
本発明のムベ抽出物の抽出溶媒は、好ましくは水、炭素数１〜５のアルコール、アルコール希釈水、及びこれらの混合物からなる群から選択された１種以上であり、さらに好ましくは水、炭素数１〜４のアルコール、及びこれらの混合物からなる群から選択された何れか１つであり、最も好ましくは水であり得る。
【００３９】
前記抽出過程は、例えば、５０℃〜１５０℃、または７５℃〜１３０℃、または９０℃〜１２０℃で行われるが、これに限定されることはない。また、前記抽出時間は、特に限ることはないが、１０分〜１２時間、または３０分〜６時間、または２時間〜４時間であり得る。
【００４０】
本発明のムベ抽出物は、通常の植物抽出物の製造方法で製造されてもよいが、具体的には熱水抽出法を含む熱抽出法、冷浸抽出法、温浸抽出法、超音波抽出法などであり、通常の抽出機器、超音波粉砕抽出器または分画器を使用することができる。
【００４１】
また、前記溶媒で抽出した抽出物は、その後、ヘキサン、クロロホルム、エチルアセテート、メチレンクロリド、エチルエーテル、アセトン、ブタノール、水、及びこれらの混合物からなる群から選択された１つ以上の溶媒で分画過程をさらに実施することができる。前記分画時、溶媒は２種以上を使用してもよく、溶媒の極性によって順次使用または混合使用し、各溶媒抽出物を製造することができる。
【００４２】
前記ムベ抽出物の分画物は、好ましくはエチルアセテート分画物またはクロロホルム分画物であり、さらに好ましくはエチルアセテート分画物であり得る。
【００４３】
前記製造された抽出物または前記分画過程から得られた分画物は、その後、濾過、濃縮または乾燥過程を行って溶媒を除去でき、濾過、濃縮及び乾燥を全て行ってもよい。具体的に、前記濾過は濾過紙または減圧濾過器を用いることができ、前記濃縮は減圧濃縮器、例えば、回転蒸発器を用いて減圧濃縮でき、前記乾燥は凍結乾燥法により行うことができる。
【００４４】
前記ムベ抽出物、例えば、ムベ葉の熱水抽出物及びムベ果実の熱水抽出物は、ＭＴＴ分析結果、２００μｇ／ｍＬの濃度を処理した場合にも細胞毒性がないと確認された。
【００４５】
したがって、前記抗炎組成物は、炎症の抑制や、炎症の治療、改善、緩和または予防のために使用することができる。
【００４６】
前記炎症は、一般的な炎症疾患を含んでおり、例えば、前記炎症疾患は、アトピー性皮膚炎を含む各種皮膚炎、皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ）、アレルギー、全身性紅斑性狼瘡、天疱瘡、アフター性口内炎、網膜炎、胃炎、肝炎、気管支炎、食道炎、腸炎、膵臓炎、大膓炎、腎臓炎、床擦れ、狼瘡、慢性甲状腺炎、多発性硬化症のような各種慢性炎症疾患、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、ショック、放射線損傷、臓器移植の拒絶反応のような各種急性炎症疾患、全身性浮腫及び局所性浮腫からなる群から選択される１種以上であり得る。
【００４７】
したがって、前記抗炎組成物は、前記炎症疾患の治療、予防または改善のために使用することができる。
【００４８】
前記アレルギーは、過敏症（ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）、アレルギー性鼻炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔｉｓ）、喘息（ａｓｔｈｍａ）、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、接触性皮膚炎、じんましん（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）、昆虫アレルギー、食品アレルギー、及び薬品アレルギーを含む。
【００４９】
前記全身性浮腫は、具体的にうっ血性心不全、収縮性心膜炎、拘束性心筋症、肝硬変、腎不全、ネフローゼ症候群、及びこれらの組み合わせからなる群から選択された何れか１つであり、前記局所性浮腫は、皮膚と軟部組織の一部が腫れている状態を意味し、具体的に皮膚と軟部組織に炎症が発生する蜂巣炎、静脈やリンパ管の還流障害、皮膚と軟部組織の一部が損傷される火傷、虫刺され、細菌感染などを含むことができる。
【００５０】
したがって、本発明の抗炎組成物は、炎症疾患の治療または予防用組成物、あるいは前記炎症疾患の予防または改善用食品組成物として応用される。前記食品組成物は、例えば、前記炎症疾患の予防または改善のための健康機能食品組成物であり得る。
【００５１】
前記健康機能食品は、食品に物理的、生化学的、生物工学的手法などを適用して該当食品の機能を特定目的に合わせて作用、発現するように付加価値を付与した食品群や、食品組成が有する生体防御リズムの調節、疾病防止と回復などに関する生体調節機能を生体に対して十分に発現するように設計して加工した食品を意味する。前記健康機能食品は、食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含むことができ、健康機能食品の製造に通常的に用いられる適切な担体、賦形剤、及び希釈剤をさらに含むことができる。
【００５２】
本発明の炎症疾患の予防または改善用健康機能食品組成物は、前記ムベ抽出物を全食品重量の０．００１重量％〜９９．９重量％、または０．０１重量％〜５０重量％、または０．１重量％〜３０重量％、または０．１重量％〜１５重量％を含むことができる。
【００５３】
前記抗炎組成物は、薬剤として、あるいは医薬または薬学的用途として使用でき、この点で前記抗炎組成物は医薬用組成物であってもよく、例えば消炎鎮痛剤であり得る。
【００５４】
前記ムベ抽出物を有効成分として含む抗炎組成物は、人間を含む動物に直接適用される。前記動物は、植物に対応する生物群であって、主に有機物を栄養分として摂取し、消化器官、排せつ器官、及び呼吸器官が分化されているものをいい、好ましくは哺乳類、さらに好ましくは人間であり得る。
【００５５】
前記ムベ抽出物は、前記抗炎組成物内に単独使用されてもよく、その他薬理学的に許容可能な担体、賦形剤、希釈剤または副成分をさらに含んでもよい。より詳細には、前記ムベ抽出物を含む組成物が薬剤として、あるいは医薬または薬学的用途として用いられる場合、前記ムベ抽出物は、通常的な方法により薬学的に許される担体または賦形剤と混合するか、または希釈剤で希釈して使用することができる。
【００５６】
この場合、前記組成物内のムベ抽出物の含量は０．００１重量％〜９９．９重量％、０．１重量％〜９９重量％、または１重量％〜５０重量％であり得るが、これに限定されることはなく、組成物の使用態様及び使用方法により、前記抽出物の含量は好ましい含量に適切に調節して使用することができる。
【００５７】
前記薬学的に許される担体、賦形剤または希釈剤の例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油、デキストリン、炭酸カルシウム、プロピレングリコール、リキッドパラフィン及び生理食塩水からなる群から選択された１以上が挙げられるが、これに限定されることはなく、通常の担体、賦形剤または希釈剤が全て使用可能である。また、前記薬学組成物は、通常の充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、ｐＨ調節剤、栄養剤、ビタミン、電解質、アルギン酸及びその塩、ペクチン酸及びその塩、保護コロイド、グリセリン、香料、乳化剤または防腐剤などをさらに含むことができる。前記成分は、前記有効成分のムベ抽出物に独立してまたは組み合わせてさらに加えられる。
【００５８】
また、本発明の組成物は、前記有効成分以外に、公知の抗炎効果を有するものと認められた物質、例えばＣＯＸ−２阻害剤、ＮＯ阻害剤または抗炎症剤などに用いられる物質をさらに含むことができる。
【００５９】
前記組成物を薬剤として使用する場合、投与方法は経口または非経口を両方とも使用でき、例えば、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む多様な経路を通して投与される。
【００６０】
また、前記組成物の剤形は、使用方法により変われるが、哺乳動物に投与した後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供するように、本発明が属する技術分野でよく知られている方法を用いて剤形化される。一般的には、経口投与のための固形製剤は、錠剤（ＴＡＢＬＥＴＳ）、丸薬、軟質または硬質カプセル剤（ＣＡＰＳＵＬＥＳ）、丸剤（ＰＩＬＬＳ）、散剤（ＰＯＷＤＥＲＳ）及び顆粒剤（ＧＲＡＮＵＬＥＳ）などを含み、このような製剤は１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用できる。経口のための液状製剤は、懸濁剤（ＳＵＳＴＥＳＩＯＮＳ）、耐容液剤、油剤（ＥＭＵＬＳＩＯＮＳ）及びシロップ剤（ＳＹＲＵＰＳ）などを含み、よく用いられる単純希釈剤の水、リキッドパラフィン以外に、多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。
【００６１】
非経口投与のための形態は、クリーム（ＣＲＥＡＭ）、ローション剤（ＬＯＴＩＯＮＳ）、軟膏剤（ＯＮＩＴＭＥＮＴＳ）、硬膏剤（ＰＬＡＳＴＥＲＳ）、液剤（ＬＩＱＵＩＤＳ ＡＮＤ ＳＯＵＬＴＩＯＮＳ）、エアロゾル剤（ＡＥＲＯＳＯＬＳ）、流動エキス剤（ＦＲＵＩＤＥＸＴＲＡＣＴＳ）、エリキシル剤（ＥＬＩＸＩＲ）、浸剤（ＩＮＦＵＳＩＯＮＳ）、匂い袋（ＳＡＣＨＥＴ）、パッチ剤（ＰＡＴＣＨ）または注射剤（ＩＮＪＥＣＴＩＯＮＳ）などの形態であり得る。
【００６２】
さらに、本発明の組成物は、当該技術分野で公知された適切な方法を用いて、またはレミングトンの文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を用いて剤形化されてもよい。
【００６３】
前記組成物の投与量は、投与方法、服用者の年齢、性別、患者の重症度、状態、体内活性成分の吸収度、非活性率及び併用される薬物を考慮して決定するが、例えば、１日有効成分を基準として、０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）、０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜４００ｍｇ／ｋｇ（体重）または１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜３００ｍｇ／ｋｇ（体重）を投与でき、１回または数回に分けて投与することができる。いずれにせよ、前記投与量は本発明の範囲を限定することはない。
【００６４】
また、本発明は、前記ムベ抽出物を有効成分として含む抗炎組成物を提供する。
【００６５】
また、本発明は、ムベ抽出物を有効成分として含む抗炎症剤を提供する。
【００６６】
前記ムベ抽出物は、好ましくはムベ葉の熱水抽出物、さらに好ましくはムベ葉の熱水抽出物のエチルアセテート分画物であり得る。
【００６７】
前記抗炎症剤は、前記有効成分を単独成分として含んでもよく、その他剤形、使用方法及び使用目的により薬剤学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含むことができる。混合物として提供される場合、前記有効成分は、抗炎症剤全体に対して０．１重量％〜９９．９重量％を含むが、通常０．００１重量％〜５０重量％の含量を含む。
【００６８】
前記抗炎剤は、狼瘡、多発性硬化症のような各種慢性炎症疾患、敗血症、ショック、臓器移植の拒絶反応のような各種急性炎症疾患、眼疾患、気管支炎、または炎症性腸疾患の予防及び治療のために使用することができる。
【００６９】
前記担体または賦形剤の一例は、水、デキストリン、炭酸カルシウム、ラクトース、プロピレングリコール、リキッドパラフィン、生理食塩水、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、及び鉱物油があるが、これに限定されることはない。担体または賦形剤は２種以上を使用してもよい。
【００７０】
また、抗炎症剤を薬剤化する場合、通常の充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤または防腐剤などをさらに含んでもよい。
【００７１】
また、本発明の抗炎症剤は、前記有効成分以外に、公知の抗炎活性を有する化合物または植物抽出物をさらに含んでもよく、前記有効成分１００重量部に対してそれぞれ０．１重量部〜９９．９重量部または０．５重量部〜２０重量部を含むことができる。
【００７２】
抗炎症剤の剤形は、使用方法によって好ましい形態にすることができるが、特に哺乳動物に投与した後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供するように、当業界で公知の方法を採択して剤形化することができる。具体的な剤形の例は、硬膏剤、顆粒剤、ローション剤、塗布剤、リモナーデ剤、散剤、シロップ剤、眼軟膏剤、液剤、エアロゾル剤、エキス剤（ＥＸＴＲＡＣＴＳ）、エリキシル剤、軟膏剤、流動エキス剤、油剤、懸濁剤、煎剤、浸剤、点眼剤、錠剤、坐剤、注射剤、酒精剤、カプセル剤、クリーム剤、丸剤、軟質または硬質ゼラチンカプセルなどがある。
【００７３】
本発明による抗炎症剤は、経口または非経口に使用されるが、例えば真皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下内、鼻内、硬膜外及び口腔経路を通して使用され、この投与量は、投与方法、服用者の年齢、性別、体重、及び疾患の重症度などを考慮して決めることがよい。例えば、本発明の抗炎症剤は有効成分を基準として、１日０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）で１回以上投与可能である。しかし、前記投与量は、ただ一例に過ぎず、前記範囲に限定されることはない。
【００７４】
また、本発明は、前記ムベ抽出物を有効成分として含む化粧料組成物を提供する。
【００７５】
前記ムベ抽出物は、天然物質由来のものであるため、副作用が問題とならず、細胞毒性もなく、かつ、炎症抑制効果も優れるため、抗炎及び抗刺激活性に優れ、化粧品に含まれた成分から誘導される炎症及び外部環境から誘導される炎症を効果的に制御することができる。したがって、前記ムベ抽出物は、炎症改善、予防及び緩和効果を有する化粧料組成物の有効成分として使用することができる。このような側面で前記化粧料組成物は炎症改善または緩和用化粧料組成物であり得る。
【００７６】
前記ムベ抽出物は、好ましくはムベ葉の熱水抽出物、さらに好ましくはムベ熱水抽出物のエチルアセテート分画物であり得る。
【００７７】
前記化粧料組成物は、基礎化粧料、メーキャップ化粧料、ボディー化粧料、頭髪用化粧料、頭皮用化粧料、髭剃り用化粧料または口腔用化粧料の用途で提供されることができる。
【００７８】
前記基礎化粧料の例はクリーム、化粧水、パック、マッサージクリーム、乳液などがあり、前記メーキャップ化粧料の例はファウンデーション、メーキャップベース、リップスティック、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ、アイブローペンシルなどがあり、前記ボディー化粧料の例は石鹸、液体洗浄剤、入浴剤、サンスクリーンクリーム、サンオイルなどがあり、前記頭髪用化粧料の例はシャンプー、リンス、ヘアトリートメント、ヘアムース、ヘアリキッド、ポマード、ヘアカラーリング剤、ヘアブリーチ剤またはカラーリンスなどがあり、前記頭皮用化粧料の例はヘアトニックまたはスカルプトリートメントなどがあり、前記髭剃り用化粧料の例はアフターシェーブローションまたはシェービングクリームなどがあり、前記口腔用化粧料の例は歯磨き粉またはマウスウォッシュなどがある。
【００７９】
前記化粧料組成物は、有効成分以外に、使用用途及び化粧料組成物の性質により、通常、化粧料組成物に配合される成分、例えば、保湿剤、紫外線吸収剤、ビタミン類、動植物抽出成分、消化剤、美白剤、血管拡張剤、収斂剤、清涼剤、ホルモン剤などをさらに配合してもよい。また、前記化粧料組成物は、薬品または有効成分を皮膚組織に浸透または移行させるために必要な機序をさらに含んでもよい。
【００８０】
前記化粧料組成物の剤形は、使用用途及び化粧料組成物の性質によって適切な形態を有するが、例えば、水溶液系、可溶化系、乳化系、乳液系、ゲル系、ペースト系、軟膏系、エアロゾル系、水−油の２層系または水−油−粉末の３層系であるが、前記剤形の例は単なる例示に過ぎず、前記例示によって本発明の化粧料組成物の剤形及び形態が制限されることはない。
【００８１】
前記有効成分は、前記化粧料組成物の総重量を基準として０．００１重量％〜５０重量％を含むことができ、好ましくは０．０１重量％〜２０重量％であるが、前記含量は剤形または化粧料組成物に含まれている有効成分以外の成分の含量により適切に調節でき、前記含量によって本発明に含まれる有効成分の含量が制限されることはない。
【００８２】
また、本発明は、ムベ抽出物を有効成分として含む解熱用組成物に関するものである。
【００８３】
前記ムベ抽出物は、通常の植物抽出物の製造方法により製造されるが、例えば、ムベの葉、枝、幹、根または皮やその粉砕物、好ましくはムベの葉に抽出溶媒を加えて抽出することによって製造するか、抽出溶媒で抽出して製造した粗抽出物に分画溶媒を加えて分画して製造してもよい。
【００８４】
前記ムベ葉は、他の部位に比べて収穫量が多くて生産が容易であり、解熱効果も優れたものであるため、前記ムベ抽出物は、好ましくはムベ葉の抽出物であり得る。
【００８５】
前記抽出溶媒は、水及び有機溶媒からなる群から選択された１種以上であり得る。前記有機溶媒は、炭素数１〜５のアルコール、前記アルコール希釈水、エチルアセテートまたはアセトンなどの極性溶媒と、エーテル、クロロホルム、ベンゼン、ヘキサンまたはジクロロメタンの非極性溶媒、またはこれらの混合溶媒であり得る。
【００８６】
本発明のムベ抽出物の抽出溶媒は、好ましくは水、炭素数１〜５のアルコール、アルコール希釈水及びこれらの混合物からなる群から選択された１種以上であり、さらに好ましくは水、炭素数１〜４のアルコール及びこれらの混合物からなる群から選択された何れか１つであり、最も好ましくは水であり得る。前記抽出過程は、例えば、５０℃〜１５０℃、または７５℃〜１２０℃、または９０℃〜１１５℃で行われるが、これに限定されることはない。また、前記抽出時間は特に限ることはないが、１０分〜１２時間、または３０分〜８時間、または２時間〜６時間であり得る。
【００８７】
本発明のムベ葉の抽出物は、通常の植物抽出物の製造方法により製造されることができ、具体的には熱水抽出法を含む熱抽出法、冷浸抽出法、温浸抽出法、超音波抽出法などであり、通常の抽出機器、超音波粉砕抽出器または分画器を使用することができる。
【００８８】
また、前記溶媒で抽出した抽出物は、その後、ヘキサン、クロロホルム、メチレンクロリド、エチルアセテート、エチルエーテル、アセトン、ブタノール、水、及びこれらの混合物からなる群から選択された１以上の溶媒で分画過程をさらに実施することができる。前記分画時、溶媒は２種以上を使用してもよく、溶媒の極性によって順次使用または混合使用し、各溶媒抽出物を製造することができる。
【００８９】
前記製造されたムベ溶媒抽出物の分画物、具体的にムベ葉の熱水抽出物の分画物は、好ましくはエチルアセテート分画物、クロロホルム分画物、またはブタノール分画物であり、さらに好ましくはエチルアセテート分画物またはクロロホルム分画物であり、最も好ましくはエチルアセテート分画物であり得る。
【００９０】
前記製造された抽出物または前記分画過程から得られた分画物は、その後、濾過、濃縮または乾燥過程を行って溶媒を除去でき、濾過、濃縮及び乾燥を全て行ってもよい。具体的に、前記濾過は濾過紙または減圧濾過器を用いることができ、前記濃縮は減圧濃縮器、例えば、回転蒸発器を用いて減圧濃縮でき、前記乾燥は凍結乾燥法により行うことができる。
【００９１】
前記解熱用組成物は、薬剤として、あるいは医薬または薬学的用途として使用され、この点で前記解熱用組成物は医薬用組成物であってもよく、例えば解熱剤または解熱鎮痛剤であり得る。
【００９２】
前記解熱用組成物が医薬または薬学的用途として用いられる場合、前記解熱用組成物は異常発熱の抑制、または疾病に伴った異常発熱を治療または予防するために使用される。
【００９３】
上述したように、本発明は、ムベ抽出物を有効成分として含む解熱用組成物に関するものであり得る。前記ムベ抽出物、好ましくはムベ葉の抽出物を有効成分として含む解熱用組成物は、異常発熱または疾病や疾患に伴った異常発熱の抑制、または治療、改善または予防のために使用され、具体的に解熱剤または解熱鎮痛剤であり得る。
【００９４】
前記ムベ抽出物を有効成分として含む解熱用組成物において、前記ムベ抽出物は、ムベ葉の熱水抽出物、好ましくはムベ葉の熱水抽出物のクロロホルム分画物、エチルアセテート分画物またはブタノール分画物、さらに好ましくはムベ葉の熱水抽出物のエチルアセテート分画物またはクロロホルム分画物、最も好ましくはムベ葉の熱水抽出物のエチルアセテート分画物であり得る。
【００９５】
前記異常発熱とは、体温が異常に高いことを意味する。
【００９６】
前記解熱剤は、解熱または異常発熱を解消するために用いられる薬であって、体温が異常に高い時、熱を下げるために用いられる医薬品をいい、既存に報告された解熱剤は、アンチピリン（ａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ）、アンチフェブリン（ａｎｔｉｆｅｂｒｉｎ）、アスピリン（ａｓｐｙｒｉｎ）またはサリピリン（ｓａｌｉｐｙｒｉｎ）などがある。前記解熱剤は鎮痛緩和効果があるので、解熱鎮痛剤とも呼ばれる。
【００９７】
前記ムベ抽出物を有効成分として含む解熱用組成物は、人間を含む動物に直接適用される。前記動物は、植物に対応する生物群であって、主に有機物を栄養分として摂取し、消化器官、排せつ器官、及び呼吸器官が分化されているものをいい、好ましくは哺乳類、さらに好ましくは人間であり得る。
【００９８】
前記ムベ抽出物は、前記解熱用組成物内に単独使用されてもよく、その他薬理学的に許容可能な担体、賦形剤、希釈剤または副成分をさらに含んでもよい。
【００９９】
より詳細には、前記ムベ抽出物を含む組成物が薬剤として、あるいは医薬または薬学的用途として用いられる場合、前記ムベ抽出物は、通常的な方法により薬学的に許される担体または賦形剤と混合するか、または希釈剤で希釈して使用することができる。
【０１００】
この場合、前記組成物内のムベ抽出物の含量は０．００１重量％〜９９．９重量％、０．１重量％〜９９重量％、または１重量％〜５０重量％であり得るが、これに限定されることはなく、組成物の使用態様及び使用方法により、前記抽出物の含量は好ましい含量に適切に調節して使用することができる。
【０１０１】
前記薬学的に許される担体、賦形剤または希釈剤の例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油、デキストリン、炭酸カルシウム、プロピレングリコール、リキッドパラフィン及び生理食塩水からなる群から選択された１以上が挙げられるが、これに限定されることはなく、通常の担体、賦形剤または希釈剤が全て使用可能である。担体または賦形剤は２種以上使用されてもよい。
【０１０２】
また、前記解熱用組成物は、通常の充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、ｐＨ調節剤、栄養剤、ビタミン、電解質、アルギン酸及びその塩、ペクチン酸及びその塩、保護コロイド、グリセリン、香料、乳化剤または防腐剤などをさらに含むことができる。前記成分は、前記有効成分のムベ葉の抽出物に独立してまたは組み合わせてさらに加えられる。
【０１０３】
また、本発明の解熱用組成物は、前記有効成分以外に、公知の解熱効果があるものと認められた物質をさらに含むことができる。
【０１０４】
また、本発明の解熱剤は、前記有効成分以外に、公知の解熱作用をする化合物または植物抽出物をさらに含むことができ、前記有効成分１００重量部に対して、それぞれ０．１重量部〜９９．９重量部または０．５重量部〜２０重量部を含むことができる。
【０１０５】
前記組成物を薬剤として使用する場合、投与方法は経口または非経口を両方とも使用でき、例えば、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む多様な経路を通して投与される。
【０１０６】
また、前記組成物の剤形は、使用方法により変われるが、哺乳動物に投与した後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供するように、本発明が属する技術分野でよく知られている方法を用いて剤形化される。
【０１０７】
一般的には、経口投与のための固形製剤は、錠剤（ＴＡＢＬＥＴＳ）、丸薬、軟質または硬質カプセル剤（ＣＡＰＳＵＬＥＳ）、丸剤（ＰＩＬＬＳ）、散剤（ＰＯＷＤＥＲＳ）及び顆粒剤（ＧＲＡＮＵＬＥＳ）などを含み、このような製剤は１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用できる。経口のための液状製剤は、懸濁剤（ＳＵＳＴＥＳＩＯＮＳ）、耐容液剤、油剤（ＥＭＵＬＳＩＯＮＳ）及びシロップ剤（ＳＹＲＵＰＳ）などを含み、よく用いられる単純希釈剤の水、リキッドパラフィン以外に、多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。
【０１０８】
非経口投与のための形態は、クリーム（ＣＲＥＡＭ）、ローション剤（ＬＯＴＩＯＮＳ）、軟膏剤（ＯＮＩＴＭＥＮＴＳ）、硬膏剤（ＰＬＡＳＴＥＲＳ）、液剤（ＬＩＱＵＩＤＳ ＡＮＤ ＳＯＵＬＴＩＯＮＳ）、エアロゾル剤（ＡＥＲＯＳＯＬＳ）、流動エキス剤（ＦＲＵＩＤＥＸＴＲＡＣＴＳ）、エリキシル剤（ＥＬＩＸＩＲ）、浸剤（ＩＮＦＵＳＩＯＮＳ）、匂い袋（ＳＡＣＨＥＴ）、パッチ剤（ＰＡＴＣＨ）または注射剤（ＩＮＪＥＣＴＩＯＮＳ）などの形態であり得る。
【０１０９】
さらに、本発明の組成物は、当該技術分野で公知された適切な方法を用いて、またはレミングトンの文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を用いて剤形化されてもよい。
【０１１０】
前記組成物の投与量は、投与方法、服用者の年齢、性別、患者の重症度、状態、体内活性成分の吸収度、非活性率及び併用される薬物を考慮して決定するが、例えば、１日有効成分を基準として、０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）、０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜４００ｍｇ／ｋｇ（体重）または１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜３００ｍｇ／ｋｇ（体重）を投与でき、１回または数回に分けて投与することができる。いずれにせよ、前記投与量は本発明の範囲を限定することはない。
【発明の効果】
【０１１１】
本発明のムベ抽出物は、食用に用いられる植物由来の抽出物であって、副作用や安全性の問題がなく、ＭＴＴ分析結果、細胞毒性が非常に低く、それだけでなく、抗炎効果及び解熱効果にも優れるため、抗炎効果が要求される医薬または化粧品及び解熱効果が要求される医薬品に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】本発明の一実施例による、ムベ葉の熱水抽出物と前記熱水抽出物の溶媒分画物を製造する過程を示す模式図である。
【図２】本発明の一実施例による、ムベ果実の熱水抽出物と前記熱水抽出物の溶媒分画物を製造する過程を示す模式図である。
【図３】本発明の一実施例による、ＲＡＷ２６４．７細胞株を用いてムベ葉の抽出物の細胞毒性をＭＴＴ分析（ａｓｓａｙ）法で測定した結果を示すグラフであって、前記グラフにおいて、＋はＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）または抽出物を処理したことを意味し、−は処理しなかったことを意味し、横軸のＳＨＬ数値はムベ葉の熱水抽出物の投与量（μｇ／ｍＬ）を示す数値であり、縦軸は試料を投与していない対照群に対する細胞毒性を示す数値（％）である。
【図４】本発明の一実施例による、ＲＡＷ２６４．７細胞株を用いてムベ果実の抽出物の細胞毒性をＭＴＴ分析法で測定した結果を示すグラフであって、前記グラフにおいて、＋はＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）または抽出物を処理したことを意味し、−は処理しなかったことを意味し、横軸のＳＨ数値はムベ果実の熱水抽出物の投与量（μｇ／ｍＬ）を示す数値である。
【図５】本発明の一実施例による、ＲＡＷ２６４．７細胞株を用いてムベ葉の熱水抽出物の抗炎効果を確認するために、ＮＯ分泌量を測定した結果を示すグラフであって、＋はＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を共に処理したことを意味し、−はＬＰＳを処理しなかったことを意味し、横軸のＳＨＬ数値はムベ葉の熱水抽出物の投与量（μｇ／ｍＬ）を意味し、縦軸はＬＰＳだけ処理した対照群に対するＮＯ分泌量の相対値（％）を意味する。
【図６】本発明の一実施例による、ムベ葉の熱水抽出物の抗炎効果を確認するために、炎症に関するサイトカインｉＮＯＳ ｍＲＮＡの水準を測定した結果を示すグラフであって、＋はＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）または溶媒分画物を処理したことを意味し、−は試料を処理しなかったことを意味し、横軸の数値はムベ葉の熱水抽出物の投与量（μｇ／ｍＬ）を意味する。
【図７】本発明の一実施例による、ムベ葉の熱水抽出物の抗炎効果を確認するために、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２の発現程度を測定した結果を示すグラフであって、＋はＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）または溶媒分画物を処理したことを意味し、−は試料を処理しなかったことを意味し、横軸の数値はムベ葉の熱水抽出物の投与量（μｇ／ｍＬ）を意味する。
【図８】本発明の一実施例による、大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）を用いてムベ果実の抽出物の抗炎効果を確認するために、炎症に関するサイトカインのｍＲＮＡ転写量をＲＴ−ＰＣＲ法で確認した結果を示す写真であって、前記写真において、＋はＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を共に処理したことを意味し、−はＬＰＳを処理しなかったことを意味し、横軸はムベ果実の熱水抽出物の投与量（μｇ／ｍＬ）を示す数値であり、縦軸はサイトカインの種類を示している。
【図９】本発明の一実施例による、大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）を用いてムベ果実の抽出物の抗炎効果を確認するために、炎症に関するサイトカインのうち、ＴＮＦ−αの生産量を確認した結果を示すグラフであって、前記グラフにおいて、＋はＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を共に処理したことを意味し、−はＬＰＳを処理しなかったことを意味し、横軸はムベ果実の熱水抽出物の投与量（μｇ／ｍＬ）を示す数値であり、縦軸はＴＮＦ−αの生産量を示している。
【図１０】本発明の一実施例による、ＲＡＷ２６４．７細胞株を用いてムベ葉の抽出物の分画物の細胞毒性をＭＴＴ分析法で測定した結果を示すグラフであって、前記グラフにおいて、＋はＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）または溶媒分画物を処理したことを意味し、−は試料を処理しなかったことを意味し、横軸の各数値はムベ葉の熱水抽出物の各分画溶媒別の分画物の投与量（μｇ／ｍＬ）を示す数値であり、縦軸は試料を投与していない対照群に対する細胞毒性を示す数値（％）である。
【図１１】本発明の一実施例による、ＲＡＷ２６４．７細胞株を用いてムベ葉の熱水抽出物の分画物の抗炎効果を確認するために、ＮＯ分泌量を測定した結果を示すグラフであって、＋はＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）または溶媒分画物を処理したことを意味し、−は試料を処理しなかったことを意味し、横軸の文字及び数値はムベ葉の熱水抽出物の各分画溶媒別の分画物の種類及び投与量（５０μｇ／ｍＬ）を意味し、縦軸はＬＰＳだけ処理した対照群に対するＮＯ分泌量の相対値（％）を意味する。
【図１２】本発明の一実施例による、ムベ葉の熱水抽出物の各溶媒別の分画物の抗炎効果を確認するために、ＣＯＸ−２の活性によってＣＯＸ−２の阻害活性を測定した結果を示すグラフであって、各グラフで区分されている溶媒は分画溶媒を意味し、横軸は処理後の経過時間を、縦軸はＣＯＸ−２の活性を意味する。
【図１３】本発明の一実施例による、実験動物を用いてムベ葉の熱水抽出物の解熱効果を確認するために、ＬＰＳによって誘導された発熱を解熱した結果を示すグラフであって、横軸の数値は試料投与後の経過時間（ｈｏｕｒ、ｈ）を意味し、縦軸の数値は測定された体温を意味する。
【図１４】本発明の一実施例による、実験動物を用いて、ムベ葉の熱水抽出物の分画物の解熱効果を確認するために、ＬＰＳによって誘導された発熱を解熱した結果を示すグラフであって、横軸の数値は試料投与後の経過時間（ｈｏｕｒ、ｈ）を意味し、縦軸の数値は試料投与前に測定された体温から変わった体温の変化、すなわち、該当時間に測定された実験動物の体温から、試料投与前に測定された実験動物の体温を差し引いた値を意味する。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
以下、本発明の理解を助けるために具体的な実施例及び比較例を挙げて本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明をより明確に理解させるためのものであり、本発明の下記実施例に限定されることはなく、本発明の保護範囲は特許請求の範囲によって解釈すべきであり、それと同等な範囲内のあらゆる技術思想は本発明の権利範囲に属する。
【０１１４】
＜実施例１＞ムベ抽出物及び分画物の製造
１−１．ムベ抽出物の製造
ムベ（Ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ ｈｅｘａｐｈｙｌｌａ）葉の熱水抽出物は、ムベ葉１０ｋｇを熱水を用いて１１０℃で図１に示すような熱水抽出法を行って製造した。また、ムベ果実の熱水抽出物は、ムベ果実２，１００ｇを熱水４０Ｌを用いて１００℃で図２に示すような熱水抽出法を行って製造した。
【０１１５】
より具体的に、蒸溜水で水洗したムベ葉１０ｋｇに蒸溜水２００Ｌを加えた後、電気薬湯器を用いて１００℃で３時間加熱して熱水抽出を行った。また、蒸溜水で水洗したムベ果実２，１００ｇに蒸溜水４０Ｌを加えた後、電気薬湯器を用いて１００℃で３時間加熱して熱水抽出を行った。
【０１１６】
前記抽出を行った後、それぞれの抽出物は４００メッシュ濾過布で濾過した後、得られた濾液を減圧回転濃縮器を用いてそれぞれ濃縮した。濾過後、残った残渣に再び同量の蒸溜水を使用して同じ過程で２回の抽出、濾過及び減圧過程をさらに行った。
【０１１７】
前記過程により製造されたムベ葉の熱水抽出液とムベ果実の熱水抽出液を凍結乾燥器（Ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｅｒ）で凍結乾燥した。前記凍結乾燥により、１ｋｇのムベ葉の熱水抽出物を得るようになり、これによって、前記ムベ葉の熱水抽出法による収率が１０％であることが確認された。また、前記凍結乾燥により、１４８ｇのムベ果実の熱水抽出物を得るようになり、これによって、前記ムベ果実の熱水抽出法による収率が７％であることが確認された。
【０１１８】
１−２．ムベ抽出物の分画物の製造
ムベ葉の熱水抽出物及びムベ果実の熱水抽出物の分画物を製造することは図１または図２に示した製造方法によって行った。
【０１１９】
具体的に、前記ムベ葉の熱水抽出物２５０ｇを５Ｌの蒸溜水に完全に溶解させた後、分画濾斗に入れてヘキサン（Ｈｅｘａｎｅ）５Ｌを添加混合して分画し、ヘキサン可溶性層のヘキサン層と、ヘキサン不溶性層の水層を分離し、ヘキサン層だけ取ることで、ヘキサン分画液を製造した。
【０１２０】
残り溶液（水層）にクロロホルム５Ｌを添加混合して分画し、クロロホルム可溶性層のクロロホルム層と、クロロホルム不溶性層の水層を分離し、クロロホルム層だけ取ることで、クロロホルム分画液を製造した。
【０１２１】
残り溶液（水層）にエチルアセテート５Ｌを添加混合して分画し、エチルアセテート可溶性層のエチルアセテート層と、エチルアセテート不溶性層の水層を分離し、エチルアセテート層だけ取ることで、エチルアセテート分画液を製造した。
【０１２２】
残り溶液（水層）にブタノール５Ｌを添加混合して分画し、ブタノール可溶性層のブタノール層と、ブタノール不溶性層の水層を分離し、ブタノール層だけ取ることで、ブタノール分画液を製造した。
【０１２３】
前記ブタノール可溶性層を分画分離した後、残ったブタノール不溶性層を濃縮して残っている有機溶媒を除去することで、水分画液を製造した。
【０１２４】
前記得られたそれぞれの分画液を減圧濾過装置で濾過して濃縮し、−２０℃で凍結乾燥して溶媒を完全に除去した後、本実験に使用した。前記過程で、０．０２ｇのヘキサン分画物（０．０１５％）、０．６７ｇのクロロホルム分画物（０．２７％）、２ｇのエチルアセテート分画物（１．０５％）、６８．７５ｇのブタノール分画物（２７．５％）を得て試料として使用した。
【０１２５】
前記製造工程において、ヘキサン分画物は、収率が低すぎて産業化で工程上の問題が発生する虞があり、不適切であると評価した。前記得られた抽出物及び分画物は、実験に使用するまで冷凍保管した。また、ブタノール分画と水分画は、高収率が確認され、分画物の製造において効率的で、経済性が認められ、産業的に効果が高いと評価される。
【０１２６】
また、前記ムベ果実の熱水抽出物の分画物は、前記ムベ果実の熱水抽出物４０ｇを１Ｌの蒸溜水に完全に溶解させた後、分画濾斗に入れて上述した方法でそれぞれの分画溶媒、すなわち、ヘキサン、クロロホルム、エチルアセテート、及びブタノール１Ｌを添加混合して分画し、溶媒可溶性層を分離する方法で製造した。
【０１２７】
前記得られたムベ果実の熱水抽出物の分画液を減圧濾過装置で濾過して濃縮し、−２０℃で凍結乾燥して溶媒を完全に除去した後、本実験に使用した。前記過程で、０．１ｇのヘキサン分画物、０．６ｇのクロロホルム分画物、２ｇのエチルアセテート分画物、１５ｇのブタノール分画物を得て試料として使用した。
【０１２８】
＜実施例２＞抽出物及び分画物の細胞毒性の実験
前記実施例１で製造されたムベ葉の熱水抽出物、ムベ果実の熱水抽出物、及びムベ葉の熱水抽出物の分画物の細胞毒性を測定するために、マウスの大食細胞であるＲＡＷ２６４．７細胞をＡＴＣＣで購入して利用した。
【０１２９】
前記細胞の培養（Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）に使用されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２）、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、Ｌ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、及びペニシリン−ストレプトマイシンはＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ（ＵＳＡ）で購入した。
【０１３０】
前記ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１０％ＦＢＳ、１％ペニシリンストレプトマイシン及び１％Ｌ−グルタミンを添加した培養液を用いて培養し、３７℃の湿潤なＣＯ２培養器（５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ）で培養した。
【０１３１】
前記細胞が培養皿の約８０％を占めるように培養させた後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で細胞の断層を洗浄し、０．２５％トリプシン及び２．５６ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを処理して継代培養した。培地は２日ごとに交換した。
【０１３２】
前記培養した細胞は、５０，０００セル／ウェルの密度で４８ウェル−プレートに分注して２４時間さらに培養した。前記２４時間経過後、何の処理もせずにＬＰＳだけ処理した対照群と、ＬＰＳと前記実施例１のムベ葉の抽出物及び分画物を、細胞生存に特に影響を及ぼさないことが確認されたＤＭＳＯを用いて多様な濃度に製造したムベ葉の抽出物及び分画物を処理した実験群に分けて２４時間さらに培養させた後、培養液を除去してＭＴＴ分析（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）方法で生きている細胞の数を測定した。前記ＭＴＴ分析は次のような方法で行った。
【０１３３】
まず、細胞培養培地を除去した後、ＭＴＴを１ｍｇ／ｍＬ含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地をウェル当たり１ｍＬずつ処理し、３７℃の湿潤なＣＯ２培養器で４時間さらに培養した。その後、培地を除去した後、テトラゾリウムブロミド塩（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ｓａｌｔ）を除去し、ＤＭＳＯ ２００μＬを分注して各ウェルに生成されたホルマザンクリスタルを溶解させ、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて５４０ｎｍ波長で吸光度を測定して細胞生存率を確認した。
【０１３４】
前記ムベ葉の抽出物で処理した結果は、前記同じ実験を３回行って測定された値を平均して図３に示し、前記ムベ果実の熱水抽出物で処理した結果は、前記同じ実験を３回行って測定された値を平均して図４に示し、前記ムベ葉の熱水抽出物の分画物で処理した結果は、前記同じ実験を３回行って測定された値を平均して図１０に示した。
【０１３５】
前記図３に示すように、前記実施例１−１で製造されたムベ葉の熱水抽出物を多様な濃度、具体的にムベ葉の熱水抽出物を５０μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬまで濃度別に処理し、２４時間経過した場合にも、何の試料も処理せずにＬＰＳだけ処理した対照群と比較して細胞の増殖にあまり影響を及ぼさないと確認された。したがって、前記結果から、ムベ葉の抽出物は２００μｇ／ｍＬまでは細胞毒性がないと確認された。
【０１３６】
また、前記図４に示すように、前記実施例１−１で製造されたムベ果実の抽出物を多様な濃度、具体的に１０μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬまで濃度別に処理し、２４時間経過した場合にも、何の試料も処理せずにＬＰＳだけ処理した対照群と比較した結果、前記実施例１で製造されたムベ果実の抽出物を多様な濃度で処理した場合、細胞の増殖にあまり影響を及ぼさないと確認された。したがって、前記結果から、ムベ果実の抽出物は２００μｇ／ｍＬまでは細胞毒性がないと確認された。
【０１３７】
また、前記図１０に示すように、前記実施例１−２で製造されたムベ葉の熱水抽出物の分画物は、ヘキサン分画物では２５μｇ／ｍＬ投与した実験群で細胞生存率が有意義に減少したことが確認され、細胞毒性があると確認された。また、エチルアセテート分画物では１００μｇ／ｍＬ投与した実験群で有意義でないが、多少細胞生存率が減少し、さらに２００μｇ／ｍＬ投与した実験群で細胞生存率が有意義に減少したので、１００μｇ／ｍＬまで安全であると確認された。その他、他の溶媒の場合にも５０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬで細胞生存率が維持され、ヘキサンを除いた他の溶媒を分画溶媒として用いた分画物は５０μｇ／ｍＬ投与した場合には細胞毒性がなく、安全であると確認された。
【０１３８】
＜実施例３＞ムベ葉の抽出物及び分画物の抗炎効果の測定
前記実施例１で製造されたムベ葉の抽出物及び分画物の抗炎効果を確認するために、前記実施例２で培養したＲＡＷ２６４．７細胞を使用した。
【０１３９】
前記実施例１で製造されたムベ葉の熱水抽出物またはムベ葉の熱水抽出物の溶媒分画物と共にＬＰＳを添加した後、前記実施例２の方法で２４時間培養した。前記培養した培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清液を分離し、前記分離した上清液に同量のグリース（Ｇｒｉｅｓｓ）試薬（１％スルファニルアミド（ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅ）、０．１％ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（ｎａｐｈｔｈｙｌ−ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、２％リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を処理して反応させた後、ＮＯの分泌量を５４０ｎｍで測定し、その結果を図５及び図１１に示した。
【０１４０】
前記図５に示すように、ＬＰＳを処理しなかった対照群は低いＮＯ分泌量が確認された。反面、ＬＰＳを添加した実験群はＬＰＳによって炎症が誘発されることにより、ＮＯの含量が顕著に増加したことが確認された。また、ＬＰＳ処理にもかかわらず、前記実施例１で製造されたムベ葉の熱水抽出物を処理した場合は濃度依存的にＮＯ分泌量が減少し、特にムベ葉の熱水抽出物の場合、１００μｇ／ｍＬの処理時、ＬＰＳによって炎症を誘発した対照群に対して約８０％にＮＯ分泌量が減少し、２００μｇ／ｍＬの処理時、ＬＰＳによって炎症を誘発した対照群に対して７０％未満にＮＯ分泌量が減少したので、ムベ葉の抽出物の抗炎効果を確認することができた。
【０１４１】
前記ムベ葉の熱水抽出物は、前記実施例２で２００μｇ／ｍＬを処理した場合も細胞生存に影響を及ぼさず、細胞毒性がないと確認され、本発明のムベ葉の抽出物は、細胞毒性がなく、安全性が確保され、かつ、抗炎効果も優れたことがわかる。
【０１４２】
また、前記図１１に示すように、実施例２で全種類の分画物が安全であると確認された５０μｇ／ｍＬを処理した時、水分画の場合はＮＯ分泌量がほとんど減少しなかった。また、ブタノール分画の場合にも対照群に対して６０％のＮＯ分泌量が確認され、抗炎効果が認められた。一方、ムベ葉の熱水抽出物のクロロホルム分画物及びエチルアセテート分画物の場合は対照群に対してＮＯ分泌量が２０％未満であるため、細胞毒性が問題にならない濃度でエチルアセテート分画物及びクロロホルム分画物は顕著に優れたＮＯ生成抑制効果を有すると確認された。
【０１４３】
＜実施例４＞炎症関連サイトカインｍＲＮＡ水準測定による抗炎効果の確認
前記実施例３でＮＯ分泌量により抗炎効果に優れたと確認されたムベ葉の熱水抽出物の抗炎効果を再び確認するために、炎症反応に関連したサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、具体的にｉＮＯＳのｍＲＮＡ含量の変化を大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）を用いて確認した。
【０１４４】
前記大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）を得るために、体重１５ｇ〜２０ｇを有する４週齢の雄マウス（ＩＣＲ ｍｏｕｓｅ、ｍａｌｅ）とＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＳＡＭＴＡＫＯ社（大韓民国）からそれぞれ３２匹ずつ購入し、それぞれ１６群に分け、各群当たり４匹ずつ配置して飼育した。前記実験動物の飼育は２０℃〜２４℃の温度条件、６０％〜７０％の湿度条件、及び１２時間周期の昼夜照明条件で行い、水と食餌は自由に摂取するようにした。前記食餌は固形飼料（三養飼料、大韓民国）を利用した。前記実験動物は前記条件で７日間飼育して実験室の環境に適応させて実験に使用した。
【０１４５】
前記実験動物から得られた大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を血清飢餓培地（ｓｅｒｕｍ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）で２４時間培養した。前記培養後、ＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍＬ）またはＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍＬ）と多様な濃度のムベ葉の熱水抽出物で処理した後、２４時間培養した。前記２４時間後、前記培養されたそれぞれの細胞からＲＮＡを分離した。前記ＲＮＡの分離は次のような方法で行った。
【０１４６】
具体的に、前記培養した細胞をＧＩＴ溶液（ｅａｓｙ ＢＬＵＥ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、（株）イントロンバイオテクノロジ、大韓民国）で溶解（ｌｙｓｉｓ）させ、室温で１０，０００ｒｐｍ条件で５分間遠心分離した後、上澄液を除去してペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を得た。前記ペレットに０．１％ＤＥＰＣ溶液（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）１ｍＬを添加し、１２，０００ｒｐｍ条件で２分間再び遠心分離して上澄液を除去した後、ペレットを得た。前記得られたペレットにグアニジウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）０．５ｍＬを添加してボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した。さらに、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏ−ａｍｙｌａｌｃｈｏｌ）混合溶液（２５：２４：１）を０．５ｍＬ添加してボルテックスした後、１２，０００ｒｐｍの条件で３分間遠心分離して上澄液を得た。前記上澄液と同量のイソプロピルアルコール（ｉｓｏ−ｐｒｏｐｙｌａｌｃｏｌ）を添加してよく混合した後、−２０℃で３０分間放置した。その後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液を除去した後、ペレットを７０％エタノール水溶液で洗い出し（ｗａｓｈｉｎｇ）、真空下で乾燥させてＲＮＡを分離した。
【０１４７】
前記分離したＲＮＡは０．１％ＤＥＰＣ溶液１ｍＬに溶かして炎症関連サイトカインのｍＲＮＡ含量を測定するために使用した。前記炎症関連サイトカインのｉＮＯＳのｍＲＮＡ含量測定は次のような方法で行った。
【０１４８】
前記分離したＲＮＡ３μｇにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を添加し、４２℃で１時間４５分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、７０℃で１５分間インキュベーションしてｃＤＮＡを得た。前記得られたｃＤＮＡは、リアルタイムＰＣＲ法で定量した。前記リアルタイムＰＣＲを行うためのプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ）の序列と実験条件は下記表１に記載した。
【０１４９】
【表１】
0006049721.tif 000002
【０１５０】
前記リアルタイムＰＣＲ結果はβ−アクチン含量と比較して写真撮影した結果を図６に示した。
【０１５１】
前記図６に示すように、ＬＰＳを処理しなかった対照群は、炎症に関連したサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）のｉＮＯＳのｍＲＮＡが全く確認できなかった反面、ＬＰＳだけ処理した場合は顕著に高いｉＮＯＳのｍＲＮＡが確認された。また、ＬＰＳ処理にもかかわらず、前記実施例１で製造されたムベ葉の熱水抽出物が処理される場合は濃度依存的にｉＮＯＳのｍＲＮＡ含量が減少した。前記ムベ葉の熱水抽出物が処理される場合は濃度依存的にｉＮＯＳのｍＲＮＡ含量が減少した結果から、前記ムベ葉の熱水抽出物は優れた抗炎効果を有すると確認された。
【０１５２】
＜実施例５＞炎症関連ｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２発現抑制活性の確認
前記実施例３及び実施例４でＮＯ分泌量及びｉＮＯＳのｍＲＮＡ含量の減少効果から、抗炎効果に優れたと確認されたムベ葉の熱水抽出物の抗炎効果を再び確認するために、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ２発現抑制活性を確認した。
【０１５３】
具体的に、前記実施例４で得られた大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）をＤＭＥＭ培地を用いて１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調節した後、２４ウェルプレートに接種し、５％ＣＯ２恒温器で１８時間前培養した。前記培養後、ムベ葉の熱水抽出物を濃度別（０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び２００μｇ／ｍＬ）に処理し、１時間培養後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を処理して前培養と同じ条件で培養した。２４時間後、培養が終わった細胞を収集してリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ））で３回洗浄した後、細胞溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＮａＶＯ３、１０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、２５μｇ／ｍＬアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）、２５μｇ／ｍＬロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ））を添加して３０分間４℃で溶解させ、４℃及び１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞膜成分などを除去した。
【０１５４】
蛋白質の濃度は、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ））を標準化してバイオ・ラッドプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）を用いて定量した。分離された蛋白質２０μｇを１０％のｍｉｎｉ ｇｅｌ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに載せて変性分離し、これをニトロセルロース（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）メンブレイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に３５０ｍＡ条件で１時間移動（ｔｒａｎｓｆｅｒ）させた。前記蛋白質を移動させたメンブレイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）のブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）は５％スキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を含むＴＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０＋ＴＢＳ）溶液で室温で２時間実施した。
【０１５５】
ｉＮＯＳの発現量を検討するための抗体は抗マウス（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）ｉＮＯＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＵＳＡ）を、ＣＯＸ−２の発現量を検討するための抗体は抗マウスＣＯＸ−２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＵＳＡ）をＴＴＢＳ溶液で１：１０００に希釈して室温で２時間反応させ、ＴＴＢＳで３回洗浄した。２次抗体はＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）を１：５０００に希釈して室温で３０分間反応させ、ＴＴＢＳで３回洗浄してＥＣＬ基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）と３０秒間反応した後、化学発光イメージシステム（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、ＡＴＴＯ ＡＥ−９１５０ ＥＺ−Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ、Ｊａｐａｎ）を用いて発現量を測定した。前記発現量を測定した結果を図７に示した。
【０１５６】
前記図７に示すように、ＬＰＳを処理しなかった対照群は炎症に関連した蛋白質、すなわちｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２が全く確認できなかった反面、ＬＰＳだけ処理した場合は顕著に高いｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２が確認された。また、ＬＰＳ処理にもかかわらず、前記実施例１で製造されたムベ葉の熱水抽出物が処理された場合は濃度依存的にｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２含量が減少した。前記ムベ葉の熱水抽出物が処理された場合は濃度依存的にｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２含量が減少した結果から、前記ムベ葉の熱水抽出物は優れた抗炎効果を有すると確認された。
【０１５７】
＜実施例６＞炎症関連サイトカインｍＲＮＡ水準測定による抗炎効果の確認
前記実施例１で製造されたムベ果実の熱水抽出物の抗炎効果を確認するために、炎症反応に関連したサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）のｍＲＮＡ含量の変化を大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）を用いて確認した。
【０１５８】
前記大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）を得るために、体重１５ｇ〜２０ｇを有する４週齢の雄マウス（ＩＣＲ  ｍｏｕｓｅ、ｍａｌｅ）とＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＳＡＭＴＡＫＯ社でそれぞれ３２匹ずつ購入し、それぞれ１６群に分けて各群当たり４匹ずつ配置して飼育した。前記実験動物の飼育は２０℃〜２４℃の温度条件、６０％〜７０％の湿度条件及び１２時間周期の昼夜照明条件で行い、水と食餌は自由に摂取するようにした。前記食餌は固形飼料（三養飼料、大韓民国）を利用した。前記実験動物は前記条件で７日間飼育して実験室環境に適応させて実験に使用した。
【０１５９】
前記実験動物から得られた大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を血清飢餓培地（ｓｅｒｕｍ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）で２４時間培養した。前記培養後、ＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍＬ）またはＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍＬ）と多様な濃度のムベ果実の熱水抽出物で処理した後、２４時間培養した。前記２４時間後、前記培養されたそれぞれの細胞からＲＮＡを分離した。前記ＲＮＡの分離は次のような方法で行った。
【０１６０】
具体的に、前記培養した細胞をＧＩＴ溶液（ｅａｓｙ ＢＬＵＥ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、（株）イントロンバイオテクノロジ）で溶解（ｌｙｓｉｓ）させ、室温で１０，０００ｒｐｍ条件で５分間遠心分離した後、上澄液を除去してペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を得た。前記ペレットに０．１％ＤＥＰＣ溶液（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）１ｍＬを添加し、１２，０００ｒｐｍ条件で２分間再び遠心分離して上澄液を除去してペレットを得た。前記得られたペレットにグアニジウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）０．５ｍＬを添加してボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した。さらに、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏ−ａｍｙｌａｌｃｈｏｌ）混合溶液（２５：２４：１）を０．５ｍＬ添加してボルテックスした後、１２，０００ｒｐｍの条件で３分間遠心分離して上澄液を得た。前記上澄液と同量のイソプロピルアルコール（ｉｓｏ−ｐｒｏｐｙｌａｌｃｏｌ）を添加してよく混合した後、−２０℃で３０分間放置させた。その後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液を除去させた後、ペレットを７０％エタノール水溶液で洗い出し（ｗａｓｈｉｎｇ）、真空下で乾燥させてＲＮＡを分離した。
【０１６１】
前記分離されたＲＮＡは０．１％ＤＥＰＣ溶液１ｍＬに溶かして炎症関連サイトカインのｍＲＮＡ含量を測定するために使用した。
【０１６２】
前記炎症関連サイトカインのＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのｍＲＮＡ含量測定は次のような方法で行った。
【０１６３】
前記分離されたＲＮＡ３μｇにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を添加し、４２℃で１時間４５分間インキュベーションした後、７０℃で１５分間インキュベーションしてｃＤＮＡを得た。前記得られたｃＤＮＡはリアルタイムＰＣＲ法で定量した。前記リアルタイムＰＣＲを行うためのプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ）の序列と実験条件は下記表２に記載した。
【０１６４】
【表２】
0006049721.tif 000003
【０１６５】
前記リアルタイムＰＣＲ結果はβ−アクチン含量と比較して写真撮影した結果を図８に示した。
【０１６６】
前記図８に示すように、ＬＰＳを処理しなかった対照群は炎症に関連したサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）のＩＬ−１βのｍＲＮＡ、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡ及びＴＮＦ−αのｍＲＮＡが全く確認できなかった反面、ＬＰＳだけ処理した場合は顕著に高いＩＬ−１βのｍＲＮＡ、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡ及びＴＮＦ−αのｍＲＮＡが確認された。また、ＬＰＳ処理にもかかわらず、前記実施例１で製造されたムベ果実の抽出物が処理された場合は濃度依存的にＩＬ−１βのｍＲＮＡ、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡ及びＴＮＦ−αのｍＲＮＡ含量が減少し、特にＩＬ−１βのｍＲＮＡ含量は顕著に減少したことが確認された。
【０１６７】
＜実施例７＞炎症関連サイトカインＴＮＦ−α水準測定による抗炎効果の確認
前記実施例６で炎症反応に関連したサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）のｍＲＮＡ含量の変化から、抗炎効果に優れていると確認されたムベ果実の熱水抽出物の抗炎効果を再び確認するために、炎症反応に関連したサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）のうち、ＴＮＦ−αの変化を大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）を用いて確認した。
【０１６８】
前記大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）は前記実施例６と同じ方法で実験動物を飼育して得た。前記実験動物から得られた大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）は前記実施例５のような方法で培養した。前記ＴＮＦ−αの生産量変化の測定はＵＶＩＴＥＣ蛍光イメージシステムから提供されるイメージ分析プログラム（ＵＶＩｂａｎｄ）を用いて行った。
【０１６９】
具体的に、アガロースゲル電気泳動から分離されたＴＮＦ−αとβ−アクチンバンドをＵＶＩＴＥＣ蛍光イメージシステムでイメージスキャンした。前記スキャンしたイメージからイメージ分析プログラム（ＵＶＩｂａｎｄ）を用いて正常群、ＬＰＳに誘導された対照群、そしてムベ果実の抽出物を濃度別に処理した実験群のＴＮＦ−αバンドとβ−アクチンバンドのボリューム（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を定量した。前記測定された値は、正常群から発現されたβ−アクチンに対するＴＮＦ−αの相対的な含量（ｒｅｌａｔｉｖｅ％、ＴＮＦ−α／β−アクチン）を示す方法でＴＮＦ−αの含量を測定し、その結果を図９に示した。
【０１７０】
前記図９に示すように、ＬＰＳを処理しなかった対照群は炎症に関連したサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）のＴＮＦ−αのｍＲＮＡが少量確認された反面、ＬＰＳだけ処理した場合は顕著に高いＴＮＦ−α含量が確認された。また、ＬＰＳ処理にもかかわらず、前記実施例１で製造されたムベ果実の抽出物が処理された場合は濃度依存的にＴＮＦ−αの含量が減少したことが確認された。
【０１７１】
＜実施例８＞分画物のＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ酵素−２）阻害効果の確認
前記実施例３でＮＯ分泌量により抗炎効果に優れたことが確認されたムベ葉の熱水抽出物の分画物の抗炎効果を再び確認するために、ＣＯＸ−２酵素阻害活性を確認した。
【０１７２】
まず、５週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄白ラット（（株）ＳＡＭＴＡＫＯ社、大韓民国）を１週間の環境適応をして実験に使用した。前記実験動物の飼育は２０℃〜２４℃の温度条件、５０％〜５５％の湿度条件及び１２時間周期の昼夜照明条件で行い、水と食餌は自由に摂取するようにした。前記食餌は固形飼料（三養飼料、大韓民国）を利用した。前記実験動物は前記条件で７日間飼育して実験室の環境に適応させて実験に使用した。
【０１７３】
前記実験動物（ＳＤ雄白ラット）の腹腔に４％チオグリコレート（ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌａｔｅ）１０ｍＬを投与して腹腔大食細胞を３日間増殖させてから頚椎脱臼した。頚椎脱臼したＳＤ雄白ラットから腹腔大食細胞を収集した。
【０１７４】
具体的に、腹腔にＨＢＳＳ１０ｍＬを注入し、注射器（ｓｙｒｉｎｇｅ）を用いて腹腔大食細胞を取った後、円錐管（ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に移した。腹腔大食細胞を１３，０００ｒｐｍ条件で５分間遠心分離し、ＤＭＥＭ培地で２回洗浄後、ペトリ皿（直径６０ｍｍ）に分注してＣＯ２細胞培養器で４時間培養した。培養後、浮遊細胞を除去し、付着されている細胞を２４時間安定化させた後、蛋白質を分離した。
【０１７５】
前記実施例１で得られたムベ葉の熱水抽出物の分画物をそれぞれ５０ｍｇ／ｍＬずつ分離された蛋白質に処理し、３０分間安定化させた後、ＣＯＸ活性蛍光測定キット（ＣＯＸ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉａｃｌ Ｃｐｍｐａｎｙ、Ｉｔｅｍ Ｎｏ．７００２００））に準ずる方法でシクロオキシゲナーゼ酵素活性を測定した。前記測定した酵素活性測定結果を図１２に示した。
【０１７６】
前記図１２に示すように、ムベ葉の熱水抽出物の水分画物の場合は全く阻害効果がなく、ヘキサン分画とブタノール分画の場合も阻害活性が低いと確認された反面、エチルアセテート分画及びクロロホルム分画は阻害活性がとても優れたことが確認された。特に、時間が経つにつれてその阻害活性の差が著しいと確認された。さらに、ムベ葉の熱水抽出物のエチルアセテート分画物が最もＣＯＸ−２阻害活性に優れたことが確認された。
【０１７７】
＜実施例９＞抽出物及び分画物の解熱効果の測定
９−１．ムベ葉の抽出物の解熱効果の確認
前記実施例１で製造されたムベ葉の抽出物及び分画物の解熱効果を確認するために、実験動物を利用した。
【０１７８】
前記実験動物は５週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）雄白ラット（（株）ＳＡＭＴＡＫＯ社、大韓民国）を購入して使用した。前記実験動物の飼育は２０℃〜２４℃の温度条件、５０％〜６０％の湿度条件及び１２時間周期の昼夜照明条件で行い、水と食餌は自由に摂取するようにした。前記食餌は固形飼料（三養飼料、大韓民国）を利用した。前記実験動物は前記条件で７日間飼育して実験室の環境に適応させて実験に使用した。
【０１７９】
前記実験動物を用いた解熱作用効能を確認するための微生物毒素（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）のリポ多糖体（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ））誘導性発熱（ＬＰｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｅｖｅｒ）実験は、Ｖｉｌｅｌａ ＦＣなどの方法（Ｖｉｌｅｌａ ＦＣ ｅｔ ａｌ、Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７；１２７（３）：７３７−４１（２０１０））を応用して行った。
【０１８０】
具体的に、前記実験動物のうち、任意に５匹を選択して１群にし、リポ多糖体（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ））５００μｇ／ｋｇを腹腔注射して発熱を誘導させた。前記体温測定は直腸体温測定器（Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｕｐｌｅ Ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｅｒ（Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ））及びＳｔａｉｎｌｅｓｓ Ｓｔｅｅｌ Ｒｅｃｔａｌ Ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ Ｒａｔｓ（Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ））を用いて直腸体温を測定し、実験前に白ラットの体温を３回測定して温度測定ストレスによる温度上昇を最小化した。
【０１８１】
まず、ムベ葉の熱水抽出物の解熱効果を確認するために、何の試料も投与しなかった陰性対照群（ＬＰＳ）と既存の解熱効果が確認されたアセトアミノフェン（Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ、ＡＰＡＰ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を５０ｍｇ／ｋｇ経口投与した第１陽性対照群（ＡＰＡＰ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を１ｍｇ／ｋｇ経口投与した第２陽性対照群（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を使用した。
【０１８２】
まず、前記温度測定ストレスによる温度上昇を最小化するための準備を終えた実験動物に発熱物質（ＬＰＳ）５００μｇ／ｋｇを腹腔注射（ｉ．ｐ．）して投与し、実験群の種類によって何の試料も投与せず（ＬＰＳ）、ムベ葉の熱水抽出液２００ｍｇ／ｋｇを経口投与（ＳＨＬ−２００）、アセトアミノフェンを５０ｍｇ／ｋｇ経口投与（ＡＰＡＰ）、及びデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を１ｍｇ／ｋｇ経口投与（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）した。また、前記ムベ葉の熱水抽出液２００ｍｇ／ｋｇを、前記発熱物質を投与した後、１時間が経過してから経口投与（ＳＨＬ−２００（１ｈ））し、発熱物質を投与した後、８時間に亘って１時間、４時間及び８時間経過時点で直腸体温を測定した。前記測定結果を図１２及び下記表３に示した。下記表３の数値は各時間別に測定した体温（℃）を意味する。
【０１８３】
【表３】
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【０１８４】
前記図１３及び表３に示したように、発熱物質（ＬＰＳ）を投与した場合、１時間が経過した時点で体温が約１℃〜１．８℃以上急激に増加した。しかし、本発明のムベ葉の熱水抽出液（ＳＨＬ−２００）を投与した場合は、かえって顕著に体温が減少し、このような減少程度はデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を１ｍｇ／ｋｇ経口投与（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）した場合よりもさらに優れ、また、解熱剤として広く使われているアセトアミノフェンを５０ｍｇ／ｋｇ経口投与（ＡＰＡＰ）した場合とほぼ同様の程度で、優れた解熱効果を示し、４時間が経過した時点ではアセトアミノフェンを５０ｍｇ／ｋｇ経口投与（ＡＰＡＰ）した場合よりも体温が増加しないため、持続性も優れたことが確認された。
【０１８５】
また、発熱物質（ＬＰＳ）を投与した後、１時間が経過した時点でムベ葉の熱水抽出液２００ｍｇ／ｋｇを経口投与（ＳＨＬ−２００（１ｈ））した場合、対照群のように体温が急激に増加して再び顕著に減少し、４時間が経過した時点では発熱物質と共にアセトアミノフェンを５０ｍｇ／ｋｇ経口投与（ＡＰＡＰ）した場合とほぼ同様の程度に減少するため、ムベ葉の熱水抽出液は発熱が始まった以後、すなわち、一定水準に体温が上昇した後にも有効に作用することが確認された。
【０１８６】
９−２．ムベ葉の抽出物の分画物の解熱効果の確認
前記実施例１−２で製造されたムベ葉の抽出物の分画物の解熱効果を確認するために、前記実施例９−１の方法で飼育された実験動物（５週齢のＳＤ雄白ラット（（株）ＳＡＭＴＡＫＯ社、大韓民国））を利用した。
【０１８７】
前記実験動物を用いた解熱作用効能を確認する前記実施例９−１と同様に、実験はＶｉｌｅｌａ ＦＣなどの方法を応用して微生物毒素（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ））を用いた微生物毒素誘導性発熱（ＬＰｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｅｖｅｒ）を行った後、直腸体温測定器で体温を測定した。
【０１８８】
まず、ムベ葉の熱水抽出物の解熱効果を確認するために、何の試料も投与しなかった陰性対照群（ＬＰＳ）と既存の解熱効果が確認されたイブプロフェン（大熊製薬、大韓民国）を２０ｍｇ／ｋｇ経口投与した陽性対照群（Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）を使用した。また、実験群として、ヘキサン分画物（Ｈｘ）、クロロホルム分画物（ＣＨＣｌ３）、エチルアセテート分画物（ＥＡ）及びブタノール分画物（ＢｕＯＨ）を２０ｍｇ／ｋｇを投与した。
【０１８９】
まず、実験前、実験動物の体温を体温計（Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｕｐｌｅ Ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｅｒ、ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ、ＵＳＡ）を用いて直腸体温を測定する方法で３回測定して温度測定ストレスによる温度上昇を最小化した。
【０１９０】
前記温度測定した実験動物に前記発熱物質の微生物毒素（ＬＰＳ）を投与する５分前に各試料を含量別に経口投与した後、５分が経過した後、微生物毒素５００μｇ／ｋｇを腹腔注射（ｉ．ｐ．）で投与し、２時間３０分ごとに実験動物の直腸体温を測定した。前記測定結果を図１４に示した。
【０１９１】
前記図１４に示すように、何の試料も投与しなかった正常群（Ｎｏｒｍａｌ）の場合はほとんど体温変化がなかったが、発熱物質（ＬＰＳ）を投与した場合は３０分経過時点から体温が急激に上昇して１℃以上体温が上昇し、１時間が経過した時点でも体温が約１℃  程度増加した体温が維持され、２時間が経過した時点でも約０．５℃ほど増加したことが確認された。一方、本発明のムベ葉の熱水抽出液のヘキサン分画を投与した場合は発熱物質を投与した場合に比べて温度上昇幅は低いが、２時間が経過した時点での最終温度はかえって高く、ブタノール分画の場合もヘキサン分画に比べて温度上昇幅は低いが、全体的に体温上昇効果が低いことが確認された。一方、クロロホルム分画を投与した場合は初期には温度が上昇したが、２時間が経過した時点でほとんど体温が正常に戻って体温増加抑制効果、すなわち解熱効果を有することがと確認され、エチルアセテート分画物は１時間経過した時点で体温が正常に戻り、２時間経過時点ではかえって体温が初期温度よりも低くなって、解熱剤として広く使用されて効果が検証されたイブプロフェンとほぼ同様に優れた解熱効果を有することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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