(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. 陽イオン交換成分および疎水性フェニル環成分を含む、硫黄を含まない混合モードクロマトグラフィーマトリックスに抗体を含有する第一の溶液を接触させる段階であって、それによって該抗体の少なくとも一部を該マトリックスに結合させる、段階;
b. 該抗体が結合した該マトリックスを第一の溶液から分離する段階;
c. 該マトリックスおよび該結合抗体と接触している溶液のpHを上昇させることによって該結合抗体を溶出させる段階であって、それによって溶出抗体を含む溶液を産生する、段階;
d. ヒドロキシアパタイト(HT)またはフルオロアパタイト(FT)を含む固体支持体マトリックスに該溶出抗体を接触させる段階であって、該抗体の少なくとも一部が該固体支持体マトリックスに結合する、段階;
e. 該固体支持体マトリックスおよび結合抗体を第二の溶液から分離する段階; ならびに
f. 該結合抗体を該固体支持体マトリックスから溶出させる段階であって、それによって該抗体を該溶液から精製する、段階
を含む、抗体を含有する溶液から抗体を精製するための方法。
【請求項２】
段階cの溶出抗体の溶液が段階dの前に実質的に変化しない、請求項1記載の方法。
【請求項３】
接触段階aが7未満のpHで前記マトリックスに前記抗体を結合させることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記マトリックスが7未満のpHで荷電部分を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
接触段階aが、少なくとも1 Mの塩の存在下で前記マトリックスに前記抗体を結合させることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
接触段階aが、1 Mまたはそれ以下の塩の存在下で前記マトリックスに前記抗体を結合させることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
溶出段階(c)が前記pHをpH 7未満からpH 7超のpHに上昇させることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスが、フェニルアラニンを含んだ混合モードリガンドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記フェニルアラニンのアミンがアセチル化される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
陰イオン交換クロマトグラフィー段階、陽イオン交換クロマトグラフィー段階、疎水性クロマトグラフィー段階、限外ろ過段階、沈降段階、結晶化段階、または液体相間の分配をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記固体支持体マトリックスがセラミックヒドロキシアパタイト(CHT)を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記固体支持体マトリックスがセラミックフルオロアパタイト(CFT)を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
第一のカラム管および第二のカラム管を備えた、抗体を精製するための装置であって、
第一および第二のカラム管が流入口と流出口とを備え、第一のカラム管が第二のカラム管と流体連通するように第一のカラム管の流出口が第二のカラム管の流入口に接続し、
第一のカラム管が、陽イオン交換成分および疎水性フェニル環成分を含む、硫黄を含まない混合モードクロマトグラフィーマトリックスを含有し、かつ第二のカラム管が固体支持体マトリックスを含有し、該固体支持体マトリックスがヒドロキシアパタイト(HT)またはフルオロアパタイト(FT)を含む、装置。
【請求項１４】
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスが、フェニルアラニンを含んだ混合モードリガンドを含む、請求項１３記載の装置。
【請求項１５】
前記フェニルアラニンのアミンがアセチル化される、請求項１４記載の装置。
【請求項１６】
前記固体支持体マトリックスがセラミックヒドロキシアパタイト(CHT)を含む、請求項１３記載の装置。
【請求項１７】
前記固体支持体マトリックスがセラミックフルオロキシアパタイト(CHT)を含む、請求項１３記載の装置。
【請求項１８】
陽イオン交換成分および疎水性フェニル環成分を含む、硫黄を含まない混合モードクロマトグラフィーマトリックス; および
ヒドロキシアパタイト(HT)またはフルオロアパタイト(FT)を含んだ、固体支持体マトリックス
を含む、抗体を精製するためのキット。
【請求項１９】
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスを含んだ、第一のカラム管またはカートリッジ; および
固体支持体マトリックスを含んだ、第二のカラム管またはカートリッジ
をさらに含む、請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
前記第一および第二のカラム管が流入口と流出口とを備え、取り付け時に該第一のカラム管が該第二のカラム管と流体連通するように該第一のカラム管の該流出口が該第二のカラム管の該流入口に取り付けられる、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスが、フェニルアラニンを含んだ混合モードリガンドを含む、請求項１８記載のキット。
【請求項２２】
前記フェニルアラニンのアミンがアセチル化される、請求項２１記載のキット。
【請求項２３】
前記固体支持体マトリックスがセラミックヒドロキシアパタイト(CHT)を含む、請求項１８記載のキット。
【請求項２４】
前記固体支持体マトリックスがセラミックフルオロキシアパタイト(CFT)を含む、請求項１８記載のキット。
【請求項２５】
a. フェニルアラニンを含む混合モードクロマトグラフィーマトリックスに抗体を含有する第一の溶液を接触させる段階であって、それによって該抗体の少なくとも一部を該マトリックスに結合させる、段階;
b. 該抗体が結合した該マトリックスを第一の溶液から分離する段階;
c. 該マトリックスおよび該結合抗体と接触している溶液のpHを変化させることによって該結合抗体を溶出させる段階であって、それによって溶出抗体を含む溶液を産生し、かつ抗体を含有する溶液から抗体を精製する、段階
を含む、抗体を含有する溶液から抗体を精製するための方法であって、
前記フェニルアラニンのアミンがアセチル化される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、2008年4月8日付で出願した米国特許仮出願第61/123,518号に対する優先権の恩典を主張し、これは全ての目的で参照により組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
混合モードクロマトグラフィーは、タンパク質または他の溶質を吸着するために複数の化学的機構を利用する固相クロマトグラフィー支持体の使用を伴う。例としては以下の機構: 陰イオン交換、陽イオン交換、疎水性相互作用、親水性相互作用、水素結合、π-π結合、および金属親和性の二つまたはそれ以上の組み合わせを活用するクロマトグラフィー支持体が挙げられるが、これらに限定されることはない。混合モードクロマトグラフィー支持体は、イオン交換のような単一モードクロマトグラフィー法では再現できない特有の選択性を提供する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、抗体を含有する溶液から抗体を精製する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は
a. 硫黄を含まない混合モードクロマトグラフィーマトリックスに抗体を含有する第一の溶液を接触させる段階であって、それによって少なくとも一つの抗体、例えば、該抗体の一部(例えば、該溶液中の該抗体の少なくとも10%、20%、50%、80%、90%)を該マトリックスに結合させる、段階;
b. 該抗体が結合した該マトリックスを該第一の溶液から分離する段階;
c. 該マトリックスおよび結合抗体と接触している溶液のpHまたは塩濃度を変化させることによって該結合抗体を溶出させる段階であって、それによって溶出抗体を含む溶液を産生する、段階;
d. ヒドロキシアパタイト(HT)またはフルオロアパタイト(FT)を含む固体支持体マトリックスに該溶出抗体を接触させる段階であって、該抗体の少なくとも一部(例えば、少なくとも10%、20%、50%、80%、90%)が該固体支持体マトリックスに結合する、段階;
e. 該固体支持体マトリックスおよび結合抗体を第二の溶液から分離する段階; ならびに
f. 該結合抗体を固体支持体マトリックスから溶出させる段階であって、それによって該抗体を該溶液から精製する段階
を含む。
【０００４】
いくつかの態様において、段階cの溶出抗体の溶液は段階dの前に実質的に変化しない。
【０００５】
いくつかの態様において、接触段階aは、7未満のpHで混合モードマトリックスに抗体を結合させることを含む。いくつかの態様において、マトリックスは7未満のpHで荷電部分を含む。
【０００６】
いくつかの態様において、接触段階aは、7のまたは7超のpHでマトリックスに抗体を結合させることを含む。
【０００７】
いくつかの態様において、接触段階aは、少なくとも1 Mの塩の存在下でマトリックスに抗体を結合させることを含む。いくつかの態様において、接触段階aは、1 Mの塩またはそれ以下の存在下でマトリックスに抗体を結合させることを含む。いくつかの態様において、例えば、0.5 M未満または0.25 M未満が用いられる。
【０００８】
いくつかの態様において、溶出段階(c)は、マトリックスおよび結合抗体と接触している溶液の塩濃度を変化させ、それによって抗体を溶出することを含む。
【０００９】
いくつかの態様において、溶出段階(c)は、マトリックスおよび結合抗体と接触している溶液のpHを変化させ、それによって抗体を溶出することを含む。いくつかの態様において、pHをpH 7未満のpHからpH 7超のpHに変化させる。
【００１０】
いくつかの態様において、溶出段階(f)は、塩濃度を変化させ、それによって抗体を溶出することを含む。
【００１１】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィーマトリックスは、4〜10個の炭素を含むアルキル酸を含んだ混合モードリガンドを含む。
【００１２】
いくつかの態様において、混合モードリガンドはヘキサン酸を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィーマトリックスは、フェニルアラニンを含んだ混合モードリガンドを含む。いくつかの態様において、フェニルアラニンのアミンはアセチル化されまたは別の形でキャップされる。
【００１４】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィーマトリックスは、ポリメタクリレートのt-ブチルエーテル誘導体を含んだ混合モードリガンドを含む。
【００１５】
いくつかの態様において、この方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー段階、陽イオン交換、疎水性相互作用もしくは限外ろ過段階、沈降段階、結晶化段階、または液体相間の分配をさらに含む。
【００１６】
いくつかの態様において、溶出段階cは、マトリックスおよび結合抗体と接触している溶液のpHを増大させることを含む。
【００１７】
いくつかの態様において、固体支持体マトリックスはセラミックヒドロキシアパタイト(CHT)を含む。いくつかの態様において、固体支持体マトリックスはセラミックフルオロキシアパタイト(CFT)を含む。
【００１８】
本発明は、抗体を精製するための装置も提供する。いくつかの態様において、装置は
第一のカラム管および第二のカラム管を備え、
第一および第二のカラム管が流入口と流出口とを備え、第一のカラム管が第二のカラム管と流体連通するように第一のカラム管の流出口が第二のカラム管の流入口に接続し、
第一のカラム管が、硫黄を含まない混合モードクロマトグラフィーマトリックスを含有し、かつ第二のカラム管が、ヒドロキシアパタイト(HT)またはフルオロアパタイト(FT)を含む固体支持体マトリックスを含有する。
【００１９】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィーマトリックスは、4〜10個の炭素を含むアルキル酸を含んだ混合モードリガンドを含む。
【００２０】
いくつかの態様において、混合モードリガンドはヘキサン酸を含む。
【００２１】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィーマトリックスは、フェニルアラニンを含んだ混合モードリガンドを含む。いくつかの態様において、フェニルアラニンのアミンはアセチル化されまたは別の形でキャップされる。
【００２２】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィーマトリックスは、ポリメタクリレートのt-ブチルエーテル誘導体を含んだ混合モードリガンドを含む。
【００２３】
いくつかの態様において、固体支持体マトリックスはセラミックヒドロキシアパタイト(CHT)を含む。いくつかの態様において、固体支持体マトリックスはセラミックフルオロキシアパタイト(CFT)を含む。
【００２４】
本発明は、抗体を精製するためのキットも提供する。いくつかの態様において、キットは
硫黄を含まない、混合モードクロマトグラフィーマトリックス; および
ヒドロキシアパタイト(HT)またはフルオロアパタイト(FT)を含んだ、固体支持体マトリックス
を含む。
【００２５】
いくつかの態様において、キットは
混合モードクロマトグラフィーマトリックスを含んだ、第一のカラム管またはカートリッジ; および
HTまたはFT固体支持体マトリックスを含んだ、第二のカラム管またはカートリッジ
をさらに含む。
【００２６】
いくつかの態様において、第一および第二のカラム管は流入口と流出口とを備え、取り付け時に第一のカラム管が第二のカラム管と流体連通するように第一のカラム管の流出口が第二のカラム管の流入口に取り付けられる。
【００２７】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィーマトリックスは、4〜10個の炭素を含むアルキル酸を含んだ混合モードリガンドを含む。
【００２８】
いくつかの態様において、混合モードリガンドはヘキサン酸を含む。
【００２９】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィーマトリックスは、フェニルアラニンを含んだ混合モードリガンドを含む。いくつかの態様において、フェニルアラニンのアミンはアセチル化されまたは別の形でキャップされる。
【００３０】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィーマトリックスは、ポリメタクリレートのt-ブチルエーテル誘導体を含んだ混合モードリガンドを含む。
【００３１】
いくつかの態様において、固体支持体マトリックスはセラミックヒドロキシアパタイト(CHT)を含む。いくつかの態様において、固体支持体マトリックスはセラミックフルオロキシアパタイト(CFT)を含む。
【００３２】
定義
「抗体」とは免疫グロブリン、複合体またはそれらの断片形態をいう。この用語は、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組み換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、移植抗体およびインビトロで作出された抗体のような天然形態また遺伝子改変形態を含め、ヒトまたは他の哺乳類の細胞株から導出されるIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMクラスのポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含むことができるが、これらに限定されることはない。「抗体」とは、免疫グロブリン部分を含有する融合タンパク質を含むがこれに限定されない複合体形を含むこともできる。「抗体」とは、それらが抗原結合機能を保持するかどうかにかかわらず、Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fcおよび他の組成物のような抗体断片を含むこともできる。
【００３３】
「混合モードクロマトグラフィー支持体」とは、2種またはそれ以上の化学機構の組み合わせを実質的に含むクロマトグラフィーの固相をいう。混合モード支持体に組み合わせることができる化学機構の例としては、陽イオン交換、陰イオン交換、疎水性相互作用、親水性相互作用、水素結合、π-π結合、および金属親和性が挙げられるが、これらに限定されることはない。固相は多孔質粒子、非多孔質粒子、膜またはモノリスであることができる。
【００３４】
「ヒドロキシアパタイト」とは、構造式Ca10(PO4)6(OH)2を有するリン酸カルシウムの不溶性ヒドロキシル化鉱物を含む、混合モード支持体をいう。その相互作用の主要な様式は、ホスホリル陽イオン交換およびカルシウム金属親和性である。ヒドロキシアパタイトは、セラミック形、結晶形および複合体形を含むがこれらに限定されない、さまざまな形態で市販されている。複合体形は、アガロースまたは他のビーズの細孔内に捕捉されたヒドロキシアパタイト微結晶を含有する。
【００３５】
「フルオロアパタイト」とは、構造式Ca10(PO4)6F2を有するリン酸カルシウムの不溶性フッ素化鉱物を含む混合モード支持体をいう。その相互作用の主要な様式は、ホスホリル陽イオン交換およびカルシウム金属親和性である。フルオロアパタイトは、セラミックおよび結晶複合体形を含むがこれらに限定されない、さまざまな形態で市販されている。
【００３６】
「セラミック」ヒドロキシアパタイト(CHT)または「セラミック」フルオロアパタイト(CFT)とは、ナノ結晶を粒子に凝塊形成し、かつ高温で溶融してクロマトグラフィー用途に適した安定なセラミック小球体に作出した各鉱物の形態をいう。セラミックヒドロキシアパタイトの市販品の例としてはCHTタイプIおよびCHTタイプIIが挙げられるが、これらに限定されることはない。フルオロアパタイトの市販品の例としてはCFTタイプIおよびCFTタイプIIが挙げられるが、これらに限定されることはない。特定されない限り、CHTおよびCFTとは、約10、20、40および80ミクロンを含むが、これらに限定されない任意の平均直径のほぼ球状の粒子をいう。ヒドロキシアパタイトまたはフルオロアパタイトの選択、タイプおよび平均粒径は、当業者によって決定されうる。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
a. 硫黄を含まない混合モードクロマトグラフィーマトリックスに抗体を含有する第一の溶液を接触させる段階であって、それによって該抗体の少なくとも一部を該マトリックスに結合させる、段階;
b. 該抗体が結合した該マトリックスを第一の溶液から分離する段階;
c. 該マトリックスおよび該結合抗体と接触している溶液のpHを上昇させることによって該結合抗体を溶出させる段階であって、それによって溶出抗体を含む溶液を産生する、段階;
d. ヒドロキシアパタイト(HT)またはフルオロアパタイト(FT)を含む固体支持体マトリックスに該溶出抗体を接触させる段階であって、該抗体の少なくとも一部が該固体支持体マトリックスに結合する、段階;
e. 該固体支持体マトリックスおよび結合抗体を第二の溶液から分離する段階; ならびに
f. 該結合抗体を該固体支持体マトリックスから溶出させる段階であって、それによって該抗体を該溶液から精製する、段階
を含む、抗体を含有する溶液から抗体を精製するための方法。
［２］
段階cの溶出抗体の溶液が段階dの前に実質的に変化しない、［1］記載の方法。
［３］
接触段階aが7未満のpHで前記マトリックスに前記抗体を結合させることを含む、［1］記載の方法。
［４］
前記マトリックスが7未満のpHで荷電部分を含む、［3］記載の方法。
［５］
接触段階aが、少なくとも1 Mの塩の存在下で前記マトリックスに前記抗体を結合させることを含む、［1］記載の方法。
［６］
接触段階aが、1 Mまたはそれ以下の塩の存在下で前記マトリックスに前記抗体を結合させることを含む、［1］記載の方法。
［７］
溶出段階(c)が前記pHをpH 7未満からpH 7超のpHに上昇させることを含む、［1］記載の方法。
［８］
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスが、4〜10個の炭素を含むアルキル酸を含んだ混合モードリガンドを含む、［1］記載の方法。
［９］
前記混合モードリガンドがヘキサン酸を含む、［1］記載の方法。
［１０］
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスが、フェニルアラニンを含んだ混合モードリガンドを含む、［1］記載の方法。
［１１］
前記フェニルアラニンのアミンがアセチル化される、［10］記載の方法。
［１２］
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスが、ポリメタクリレートのt-ブチルエステル誘導体を含んだ混合モードリガンドを含む、［1］記載の方法。
［１３］
陰イオン交換クロマトグラフィー段階、陽イオン交換クロマトグラフィー段階、疎水性クロマトグラフィー段階、限外ろ過段階、沈降段階、結晶化段階、または液体相間の分配をさらに含む、［1］記載の方法。
［１４］
溶出段階cが、前記マトリックスおよび結合抗体と接触している前記溶液のpHを増大させることを含む、［1］記載の方法。
［１５］
前記固体支持体マトリックスがセラミックヒドロキシアパタイト(CHT)を含む、［1］記載の方法。
［１６］
前記固体支持体マトリックスがセラミックフルオロアパタイト(CFT)を含む、［1］記載の方法。
［１７］
第一のカラム管および第二のカラム管を備えた、抗体を精製するための装置であって、
第一および第二のカラム管が流入口と流出口とを備え、第一のカラム管が第二のカラム管と流体連通するように第一のカラム管の流出口が第二のカラム管の流入口に接続し、
第一のカラム管が混合モードクロマトグラフィーマトリックスを含有し、該マトリックスは硫黄を含まず、かつ第二のカラム管が固体支持体マトリックスを含有し、該固体支持体マトリックスがヒドロキシアパタイト(HT)またはフルオロアパタイト(FT)を含む、装置。
［１８］
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスが、4〜10個の炭素を含むアルキル酸を含んだ混合モードリガンドを含む、［17］記載の装置。
［１９］
前記混合モードリガンドがヘキサン酸を含む、［17］記載の装置。
［２０］
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスが、フェニルアラニンを含んだ混合モードリガンドを含む、［17］記載の装置。
［２１］
前記フェニルアラニンのアミンがアセチル化される、［20］記載の装置。
［２２］
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスが、ポリメタクリレートのt-ブチルエーテル誘導体を含んだ混合モードリガンドを含む、［17］記載の装置。
［２３］
前記固体支持体マトリックスがセラミックヒドロキシアパタイト(CHT)を含む、［17］記載の装置。
［２４］
前記固体支持体マトリックスがセラミックフルオロキシアパタイト(CHT)を含む、［17］記載の装置。
［２５］
硫黄を含まない、混合モードクロマトグラフィーマトリックス; および
ヒドロキシアパタイト(HT)またはフルオロアパタイト(FT)を含んだ、固体支持体マトリックス
を含む、抗体を精製するためのキット。
［２６］
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスを含んだ、第一のカラム管またはカートリッジ; および
固体支持体マトリックスを含んだ、第二のカラム管またはカートリッジ
をさらに含む、［25］記載のキット。
［２７］
前記第一および第二のカラム管が流入口と流出口とを備え、取り付け時に該第一のカラム管が該第二のカラム管と流体連通するように該第一のカラム管の該流出口が該第二のカラム管の該流入口に取り付けられる、［25］記載のキット。
［２８］
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスが、4〜10個の炭素を含むアルキル酸を含んだ混合モードリガンドを含む、［25］記載のキット。
［２９］
前記混合モードリガンドがヘキサン酸を含む、［25］記載のキット。
［３０］
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスが、フェニルアラニンを含んだ混合モードリガンドを含む、［25］記載のキット。
［３１］
前記フェニルアラニンのアミンがアセチル化される、［30］記載のキット。
［３２］
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスが、ポリメタクリレートのt-ブチルエステル誘導体を含んだ混合モードリガンドを含む、［25］記載のキット。
［３３］
前記固体支持体マトリックスがセラミックヒドロキシアパタイト(CHT)を含む、［25］記載のキット。
［３４］
前記固体支持体マトリックスがセラミックフルオロキシアパタイト(CFT)を含む、［25］記載のキット。
［３５］
a. フェニルアラニン、2〜10個の炭素を含むn-アルキル酸、またはポリメタクリレートのt-ブチルエーテル誘導体を含む混合モードクロマトグラフィーマトリックスに抗体を含有する第一の溶液を接触させる段階であって、それによって該抗体の少なくとも一部を該マトリックスに結合させる、段階;
b. 該抗体が結合した該マトリックスを第一の溶液から分離する段階;
c. 該マトリックスおよび該結合抗体と接触している溶液のpHまたは塩濃度を変化させることによって該結合抗体を溶出させる段階であって、それによって溶出抗体を含む溶液を産生し、かつ抗体を含有する溶液から抗体を精製する、段階
を含む、抗体を含有する溶液から抗体を精製するための方法。
［３６］
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスがフェニルアラニンを含む、［35］記載の方法。
［３７］
前記フェニルアラニンのアミンがアセチル化される、［36］記載の方法。
［３８］
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスが、2〜10個の炭素を含んだn-アルキル酸を含む、［35］記載の方法。
［３９］
前記n-アルキル酸がブタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸およびデカン酸からなる群より選択される、［38］記載の方法。
［４０］
前記混合モードクロマトグラフィーマトリックスがポリメタクリレートのt-ブチルエーテル誘導体を含む、［35］記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】UNOsphereフェニルアラニンに対する細胞培養ろ液からの抗体捕捉のクロマトグラムを例証する。電導度プロファイルは、細胞培養上清中で遭遇するような、多かれ少なかれ生理的条件に対応する電導度値でサンプル負荷を達成できることを実証し、1 M NaClでの洗浄が適用される場合でさえも抗体が結合したままであることを例証する。電導度プロファイルはUVプロファイルとともに、抗体を低電導度のpH勾配で溶出させて、CHTへのまたはイオン交換担体への溶出IgGの適用を促進できることをさらに例証する。
【図２】図1のUNOsphereフェニルアラニンから溶出された抗体のヒドロキシアパタイトに対する最終精製(polishing purification)を例証するクロマトグラムである。試薬および条件は次の通りであった: CHTタイプ1、40 μm。1 mL 5 mm×5 cm、300 cm/時間。緩衝液A: 10 mMリン酸、pH 6.7。緩衝液B: 10 mM緩衝液、1.5 M NaCl、pH 6.7。緩衝液C: 500 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0。緩衝液Aを含むEQカラム。UNOsphereフェニルアラニンに対する捕捉段階からのIgG溶出液をヒドロキシアパタイトカラムに対して負荷し、緩衝液Aで洗浄し、緩衝液Bへの30 CVの直線勾配で溶出した。カラムを緩衝液Cで洗った。
【図３】実施例で論じられるように負荷され、Flamingo染色された、還元SDS-PAGEゲルである。
【図４】実施例で論じられるように非アセチル化フェニルアラニンUNOsphere樹脂から精製された免疫グロブリンの結合および溶出を示すクロマトグラムである。
【図５Ａ】実施例で論じられるようにアセチル化フェニルアラニンUNOsphere樹脂から精製された免疫グロブリンの結合および溶出を示すクロマトグラムである。
【図５Ｂ】実施例で論じられるようにアセチル化フェニルアラニンUNOsphere樹脂から精製された免疫グロブリンの結合および溶出を示すクロマトグラムである。
【図６】プロテインA精製モノクローナルヒトIgG1を用いて疎水性モードで実践される結合および溶出を示すクロマトグラムである。使用したカラムは1 mL UNOsphereフェニルアラニン5 mm×5 cm、300 cm/時間から構成された。カラムを緩衝液A (4 M NaCl、0.01 Mクエン酸、0.01 Mリン酸、pH 4.5)で平衡化し、ろ過された非平衡サンプル100 μLを注入した。カラムを、およそ2.5カラム容量(CV)の緩衝液Aで洗浄し、その後、100% Aから100% B (緩衝液B。0.01 Mクエン酸、0.01 Mリン酸、pH 7.5)への15CVの直線勾配で溶出した。緩衝液Bで平衡に達するまでカラムをBで洗浄した。
【図７】実施例で論じられるようにMacro Prep t-ブチルHIC樹脂に対する細胞培養ろ液からの抗体捕捉を示すクロマトグラムである。
【図８】実施例で論じられるように負荷され、クマシーブリリアントブルー染色された、還元SDS-PAGEゲルを例証する。
【図９】実施例で論じられるようにアミノカプロン酸UNOsphere樹脂から精製された免疫グロブリンの結合および溶出を示すクロマトグラムである。
【図１０】実施例で論じられるようにアセチル化アミノカプロン酸UNOsphere樹脂から精製された免疫グロブリンの結合および溶出を示すクロマトグラムである。
【図１１】実施例で論じられるようにヘキサン酸UNOsphere樹脂から精製された免疫グロブリンの結合および溶出を示すクロマトグラムである。
【図１２】実施例で論じられるようにヘキサン酸アガロース樹脂から精製された免疫グロブリンの結合および溶出を示すクロマトグラムである。
【図１３】実施例で論じられるようにヘキサン酸セファロース樹脂から精製された免疫グロブリンの結合および溶出を示すクロマトグラムである。
【図１４】実施例で論じられるようにカルボキシル基を含有するUNOsphereジオール樹脂のフェニル誘導体から精製された免疫グロブリンの結合および溶出を示すクロマトグラムである。
【図１５】実施例で論じられるようにMacro Prep t-ブチルHIC樹脂から精製された免疫グロブリンの結合および溶出を示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
I. 序論
本発明は、種々の混合モードクロマトグラフィー試薬を用いての抗体および他のタンパク質の精製を提供する。例えばフェニルアラニン、アルキル酸およびポリメタクリレートのt-ブチルエーテル誘導体を含めて、いくつかの混合モードリガンドが記述されている。他のタイプの混合モードリガンドを用いて抗体および他のタンパク質を効果的に精製できることも本明細書における論述から理解されよう。
【００３９】
本発明の一つの局面は、混合モードクロマトグラフィー段階とヒドロキシアパタイト(HT)またはフルオロアパタイト(FT)を用いてのクロマトグラフィー段階との組み合わせである。この第二段階は、凝集体または細胞夾雑物をほとんど含まない高度に精製された最終生成物をもたらす種々の「最終精製(polishing)」の局面に有用である。さらに、抗体を精製するために用いられる場合、混合モードクロマトグラフィー(HT/FTを含まない)とHTまたはFTに対する後続のクロマトグラフィーとの組み合わせは、プロテインAクロマトグラフィー媒体を用いての親和性クロマトグラフィーによる抗体捕捉を伴った、抗体精製に関する現行の業界標準の何分の1かの費用で作出される、高度に精製された生成物を可能にする。
【００４０】
いくつかの態様において、混合モード段階は、ヒドロキシアパタイト(HT)またはフルオロアパタイト(FT)クロマトグラフィー媒体に直接添加できる溶出液をもたらし、それによって精製工程中の何らかのサンプル操作の必要性を低減する。この局面は、タンパク質の大規模な商業的精製に特に有益であるが、もっと小さな実験室規模の調製にも好都合である。
【００４１】
天然源、合成源または組み換え源由来の未精製または部分精製の抗体を含め、任意の抗体調製物を本発明において使用することができる。未精製の抗体調製物は、血漿、血清、腹水、乳、植物抽出物、細菌溶解物、酵母溶解物または馴化細胞培地を含むが、これらに限定されない種々の供給源に由来することができる。部分精製の調製物は、少なくとも一つのクロマトグラフィー、沈降、他の分画段階、または前記の任意の組み合わせによって処理された、未精製の調製物に由来することができる。いくつかの態様において、抗体は、本明細書において記述の精製の前にプロテインA親和性によって精製されていない。
【００４２】
II. 混合モードクロマトグラフィー
A. リガンド
本発明は、例えば、HTまたはFTクロマトグラフィーを含みうる他の精製段階と任意で組み合わされてもよい、クロマトグラフィー固相がHTまたはFTでない混合モードクロマトグラフィーを用いての抗体の精製を提供する。
【００４３】
さまざまな混合モードクロマトグラフィー媒体が市販されており、これらのいずれかを本発明の実践のために用いることができる。市販品の例としてはMEP-Hypercel(商標)、Capto-MMC(商標)、Capto-Adhere(商標)およびABx(商標)が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００４４】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィー支持体は、陰イオン交換および疎水性相互作用の機能性の組み合わせを活用する。このような支持体の市販品の例としてはMEP-Hypercel(商標)およびCapto Adhere(商標)が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００４５】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィー支持体は、陽イオン交換および親水性相互作用の機能性の組み合わせを活用する。このような支持体の市販品の例としてはCapto-MMC(商標)が挙げられるが、これに限定されることはない。
【００４６】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィー支持体は、陽イオン交換、陰イオン交換および疎水性相互作用の機能性の組み合わせを活用する。このような支持体の市販品の例としてはABx(商標)が挙げられるが、これに限定されることはない。
【００４７】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィー支持体は水素結合およびπ-π結合の可能性の有る陰イオン交換および疎水性相互作用の機能性の組み合わせを活用する。このような支持体の市販品の例としてはCapto-Adhere(商標)が挙げられるが、これに限定されることはない。
【００４８】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィー支持体は水素結合およびπ-π結合の可能性の有る陽イオン交換および疎水性相互作用の機能性の組み合わせを活用する。このような支持体の市販品の例としてはCapto-MMC(商標)が挙げられるが、これに限定されることはない。
【００４９】
他の非商業的な混合モード媒体には、例えば、同じリガンドでの、またはリガンドの組み合わせでの陽イオンまたは陰イオン交換と疎水性相互作用の機能性との組み合わせを活用した混合モードクロマトグラフィー支持体が含まれる。このようなリガンドのいくつかの例が、例えば、米国特許第7,008,542号; 同第6,498,236号; および同第5,945,520号に記述されている。
【００５０】
いくつかの態様において、陽イオン交換と疎水性相互作用の機能性との組み合わせを活用した混合モードクロマトグラフィー支持体を用いることができる。例えば、カルボキシル基のような少なくとも一つの酸性部分を含む、かつフェニル環または脂肪族炭化水素鎖のような少なくとも一つの疎水性部分を同様に含むリガンドを用いることができる。
【００５１】
いくつかの態様において、フェニルアラニンは固体支持体に共有結合される。例えば、フェニルアラニンはフェニルアラニンのアミンを介して固体支持体に共有結合されることができる。フェニルアラニンは、例えば、固体支持体上の脱離基の求核置換によって、または当業者に公知の他の化学的反応によって固体支持体に結合させることができる。
【００５２】
フェニルアラニン上の第二級アミノをさらなる部分で「キャップ」して第二級アミンを形成させ、それによってクロマトグラフィーが行われるpHでの陽イオン性アンモニウムの形成(それゆえ両性イオンの形成)を阻止または低減することができる。いくつかの態様において、アミンをアセチル基でキャップする。アミンをアセチル化するための方法がいくつか存在することを当業者は理解するであろう。いくつかの態様において、ビーズを乾燥し、次いで塩化アセチルに曝露する。いくつかの態様において、ビーズを乾燥ではなく、アセトンとの溶媒交換にかけ、次いで塩化アセチルに曝露する。
【００５３】
別の態様において、ポリメタクリレートのt-ブチルエーテル誘導体を混合モードリガンドとして用いる。このタイプの誘導体の例はMacro-Prep t-ブチルHIC (商標)であり、これはBio-Rad, Inc. (Hercules, CA)から市販されている。t-ブチルエーテル誘導体は、(1) メタクリル酸グリシジル基を含む重合体ビーズから形成させることができる。例えば、エポキシドによってt-ブトキシドの反応が進行する間に重合体骨格上のエステル基の一部がカルボン酸基に加水分解されることができる。これを以下の略図に例証する。
0005999899.tif 000002
【００５４】
Macro-Prep t-ブチルHICは、典型的には、131〜266マイクロモルのカルボキシル基/mlおよび25〜45マイクロモルのt-ブチル基/mlの樹脂を含有するが、これらの二つの基の総量および比率は必要に応じて変わりうることを当業者は理解するであろう。
【００５５】
さらに他の態様において、アルキル酸(例えば、カルボン酸)を混合モードリガンドとして用いる。いくつかの態様において、アルキル酸は、4〜10、4〜6、4〜8、6〜8または5〜7個の炭素、例えば、2、3、4、5、6、7、8個の炭素を有するn-アルキル酸である。実施例でさらに詳細に論じられるように、ヘキサン酸を用いることができる。あるいは、いくつかの態様において、酢酸、ブタン酸、オクタン酸またはデカン酸を用いる。
【００５６】
アルキル酸をヒドロキシ官能化固体マトリックスに結合させることができる。ハロゲン化アルキル酸をヒドロキシ官能化固体マトリックスと直接反応させることができる。例えば、6-ブロモヘキサン酸のような、ブロモアルキル酸をUNOsphereジオールにカップリングさせることができる。例えば、過剰のブロモ酸の存在下において1 M NaOHで、反応を行うことができる。
【００５７】
さらに別の態様において、Macro-Prep t-ブチルHIC樹脂に類似の、骨格カルボキシレートを含んだ、Tosoh HIC媒体をNaOHで処理して、Macro-Prep t-ブチルHICに類似の混合モードを生ずる、骨格カルボキシレートを形成させる。
【００５８】
いくつかの態様において、混合モードマトリックス(すなわち、リガンドまたは固体支持体)は硫黄を含まない。
【００５９】
クロマトグラフィー条件
当技術分野において理解されるように、本発明の混合モードクロマトグラフィーで用いる負荷、洗浄および溶出の条件は、用いられる具体的なクロマトグラフィー媒体/リガンドに依るであろう。抗体を混合モード樹脂に最適に結合するために、pH調整だけで、およびサンプルの電導度を最小限に抑えるための抗体細胞培養ろ液の調整なしで、抗体が混合モード樹脂に結合されることが最適である。
【００６０】
いくつかの態様において、負荷(すなわち、マトリックスへの抗体の結合)および任意で洗浄は7未満の、例えば、3〜7、4〜7、3〜5、4〜5、4〜6などのpHで行われる。7未満のpHは、陽イオン性/疎水性混合モードリガンドが利用される場合に特に有用である。いくつかの態様において、マトリックスは7未満のpHで荷電(例えば、負荷電または正荷電)部分を含む。
【００６１】
いくつかの態様において、負荷(すなわち、マトリックスへの抗体の結合)および任意で洗浄は7超の、例えば、7〜8、7〜9などのpHで行われる。7のまたは7超のpHは、陰イオン性/疎水性混合モードリガンドが利用される場合に特に有用である。
【００６２】
いくつかの態様において、負荷(すなわち、マトリックスへの抗体の結合)および任意で洗浄は少なくとも1 Mの塩(例えば、ナトリウム)の存在下で行われる。他の態様において、負荷(すなわち、マトリックスへの抗体の結合)および任意で洗浄は1 M未満の塩の存在下で行われる。
【００６３】
陽イオン交換と親水性相互作用の機能性との組み合わせを活用した混合モードクロマトグラフィー支持体を利用する態様において、サンプルをカラムに負荷し、その後、カラムを低いpH (例えば、pH 3〜5、例えば、4〜5)で洗浄することが有用でありうる。次いでpHを、例えば、およそpH 6超に上昇させることにより、所望のタンパク質(例えば、抗体)を溶出する。いくつかの態様において、pHを洗浄条件から少なくとも6.5、7またはそれ以上のpHに、例えば、およそpH 7.2に上昇させることにより、タンパク質を溶出する。これらの態様のいくつかにおいて、塩濃度は溶出段階の間に実質的に変化しない。これらの態様のいくつかにおいて、塩は低濃度で(例えば、およそ50 mM未満で、例えば、20 mM未満で、例えば、0〜20 mMで、例えば、10 mMで)維持される。例示的な塩および緩衝液としては、例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムまたは酢酸カリウムが挙げられる。CHTへの後続の適用にともに適合するコハク酸緩衝液またはMES緩衝液を含め、低pHでの混合モード樹脂への結合に使用できる他の酸性緩衝液が存在する。クエン酸緩衝液を使用することもできるが、CHTへの溶出IgGの適用前に除去しなければならないであろう。
【００６４】
ほぼ中性のpH (例えば、pH 6〜8、例えば、およそpH 7)および低塩(例えば、0〜50 mM)をもたらす溶出条件は、特に有用である。というのは、所望の溶出タンパク質を含む溶液を、その後、溶液を実質的に変化させることなくCHTもしくはCFTカラムまたは他の固体支持体に負荷することができるためである。これは、第二ラウンドのクロマトグラフィーまたは他の精製の前に、他の形で使用されうる透析または限外ろ過のような介入段階の除外を可能にする。「実質的に変化させる」とは、pH、塩濃度および/または電導度の変化がないまたは5%未満であることをいう。
【００６５】
B. 支持体マトリックス
本発明にしたがって種々の支持体マトリックスを用いることができる。一般的に、支持体マトリックスは、任意でスペーサーを介して、リガンドの結合を可能にする親水性重合体であろう。
【００６６】
いくつかの態様において、ベースマトリックスは親水性であり、重合体、例えば、不溶性であるかつ多かれ少なかれ水中で膨潤性である重合体の形態である。適当な重合体は、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルランなどのような、例えば多糖類に基づく、ポリヒドロキシ重合体、ならびにポリアクリル酸アミド、ポリメタクリル酸アミド、ポリ(ヒドロキシアルキルビニルエーテル)、ポリ(ヒドロキシアルキルアクリレート)およびポリメタクリレート(例えば、ポリグリシジルメタクリレート)のような、完全合成重合体、スチレンおよびジビニルベンゼンに基づくポリビニルアルコールおよび重合体、ならびに上記の重合体に対応する単量体の二つまたはそれ以上が含まれる共重合体である。水溶性である重合体を、例えば架橋結合により、および吸着または共有結合を介した不溶性体へのカップリングにより誘導体化して不溶性にしてもよい。OH基に変換できる基を呈する単量体の重合により、または最終重合体の親水性化により、例えば親水性重合体のような、適当な化合物の吸着により、疎水性重合体上に(例えばモノビニルおよびジビニルベンゼンの共重合体上に)親水性基を導入することもできる。いくつかの態様において、支持体は水溶性の親水性単量体から作出された重合体UNOsphere(商標)の支持体(Bio-Rad, Hercules, CA)である。あるいは、マトリックスはアガロース(GE SepharoseまたはSterogene SuperflowおよびUltraflow)である。
【００６７】
III. HT/FTクロマトグラフィー段階
本発明のいくつかの態様において、HTまたはFTクロマトグラフィーは、HTまたはFTを伴わなかった前の混合モードクロマトグラフィー段階の後に抗体に対して行われる。いくつかの態様において、HTまたはFTはセラミックHTまたはセラミックFTである。セラミックヒドロキシアパタイトの市販品の例としてはCHTタイプIおよびCHTタイプIIが挙げられるが、これらに限定されることはない。フルオロアパタイトの市販品の例としてはCFTタイプIおよびCFTタイプIIが挙げられるが、これらに限定されることはない。特定されない限り、CHTおよびCFTとは、約10、20、40および80ミクロンを含むが、これらに限定されない任意の平均直径のほぼ球状の粒子をいう。ヒドロキシアパタイトまたはフルオロアパタイトの選択、タイプおよび平均粒径は、当業者によって決定されうる。他の形態のHTは、例えばBio-Rad, Pall Corp.およびAmerican International Chemical, Inc.から市販されている。「ウルトロゲル」といわれるHTの複合体ゲル形態は、Pall Corp.から市販されている。
【００６８】
必要に応じて、種々の異なる負荷、洗浄および溶出条件を用いることができる。いくつかの態様において、初期の非HT、非FT混合モード段階から溶出されたタンパク質(例えば、抗体)がHT/FTカラムに直接適用されるような、初期の負荷条件が適合される。
【００６９】
溶出は、例えば、液相中の塩濃度を変化させることにより、達成することができる。例えば、液相の塩および/または電導度を、抗体が溶出するポイントまで(直線的にまたは段階的に)増加させる。例示的な洗浄条件としては、例えば、10 mMリン酸, pH 6.7が挙げられ、塩濃度を(段階的にまたは直線的に) (例えば、10 mMリン酸, 1.5 M NaCl, pH 6.7に)増加させることによって溶出を達成する。
【００７０】
IV. 一般的なクロマトグラフィー情報
抗体調製物を混合モード支持体と接触させることに備えて、カラム内部の化学的環境は典型的には平衡化される。これは、平衡化緩衝液をカラムに流して最適なpH; 電導度; 非イオン性有機重合体の同一性、分子量および濃度(以下でさらに論じられる); ならびに他の関連する変量を確立することによって一般的に達成される。
【００７１】
いくつかの態様において、抗体調製物も、本発明が実践されうる前にカラム平衡化緩衝液に適合する条件に平衡化される。これは一般的に、抗体調製物のpHを調整することからなる。
【００７２】
いくつかの態様において、カラムおよび抗体調製物が平衡化されたら、抗体調製物をカラムと接触させることができる。抗体調製物は、例えば、約50〜300 cm/時間の範囲内の直線流速で適用することができる。当業者は適切な流速を判定することができる。
【００７３】
いくつかの態様において、本発明は、充填層カラム、流動/膨張層カラム、および/または混合モード支持体が抗体調製物と一定時間混合されるバッチ操作で実践される。
【００７４】
いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィー支持体は、カラムに充填される。
【００７５】
いくつかの態様において、混合モード支持体は少なくとも5 mmの内径および少なくとも25 mmの高さのカラムに充填される。このような態様は、例えば、特定の抗体に対する種々の条件の効果を評価するために有用である。
【００７６】
別の態様では、分取用途を支持するために必要な任意の寸法のカラムに充填された混合モード担体を利用する。特定の用途の要件に応じて、カラムの直径は1 cm未満から1メートル超までに及ぶことができ、カラムの高さは1 cm未満から30 cm超までに及ぶことができる。当業者は適切なカラム寸法を判定することができる。
【００７７】
使用後、混合モードカラムは任意で洗浄、清浄化および適切な薬剤中で保管されてもよく、任意で再使用されてもよい。
【００７８】
必要に応じて、混合モードおよび/またはHTもしくはFTクロマトグラフィー段階中の負荷、洗浄または溶出段階の一つまたは複数で用いられる溶液は、非イオン性有機重合体を含む。任意で、非イオン性重合体はHT/FT段階中に使用されるだけであり、前の混合モード段階中には使用されない。非イオン性有機重合体の例としてはポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、セルロース、デキストラン、デンプンおよびポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００７９】
非イオン性有機重合体の存在はHTまたはFTに対する抗体の結合能力を増強し、それによってより高いレベルの生産性が達成されることを可能にし、考慮されうる方法の範囲を広げる。非イオン性有機重合体の存在はまた、ほとんどの夾雑タンパク質と比較して、HTまたはFTに対する抗体の保持を選択的に増強し、それによって非抗体タンパク質の除去向上のための新規の選択性を増強する。さらに、非イオン性有機重合体の存在は、非凝集抗体と比較して、HTまたはFTに対する凝集抗体および他の非常に大きな分子の保持を選択的に増強し、それによって大きな夾雑物の除去のための新規の選択性および優れた分離性能を可能にする。PEGは、本発明の関連の中で可溶性の非イオン性有機重合体の挙動に関する一般モデルを提供する。したがって、以下の本文にはPEGが論じられるが、その情報は本明細書において具体的に記載されるものを含むがそれに限定されない、他の非イオン性重合体に等しく当てはまることが認識されるべきである。
【００８０】
本発明は、約100から約10,000ダルトンに及ぶ平均重合体分子量を有するPEGで実践することができる。例示的なPEGとしては、例えば、200、300、400、500、900、1000、1400、2000、3300、4500、8000、10000、14000などの平均分子量を有するPEGが挙げられる。いくつかの態様において、PEGは400〜1000、200〜1000、400〜2000または1000〜5000の平均重量を有する。多種多様の異なるPEGは、例えば、Aldrichから入手可能である。
【００８１】
PEGまたは他の有機重合体は直線状または分枝状の重合体であることができる。
【００８２】
より低分子量のPEGがより高分子量のPEGと同様の効果を達成するには、より高濃度を一般に要するであろう。
【００８３】
より大きな抗体および融合タンパク質の結合を増強するのに、より小さなタンパク質の同量の結合増強をもたらすPEGの濃度と比べて、より低濃度の所与の分子量のPEGが一般に用いられる。例えば、約960 kDの概算分子量を有するIgMは、160 kDの概算分子量を有するIgGよりも一定の結合増強度を達成するのに、より低濃度のPEGを一般に要するであろう。凝集体、複合体、および他の大きな分子である夾雑物の保持は一般に、それらが由来するタンパク質の非凝集形態よりもさらに大きく増強されるであろう。
【００８４】
混合モードクロマトグラフィー支持体によって強く保持される分子の結合を増強するには、弱く保持される分子に対して同一の結合増強を達成するためのPEG濃度と比べて、より低濃度のPEGが一般に必要とされるであろう。
【００８５】
二つの前段落に記述した効果は一般に、組み合わされると考えられる。非イオン性有機重合体の非存在下で強く保持される大きな分子の保持は、本発明の適用によって、より少なくかつ弱く保持されるか、より少なくかつ強く保持されるか、またはより多くかつ弱く保持される分子よりも増強されるであろう。
【００８６】
いくつかの態様において、約6,000ダルトンの平均分子量を有するPEGを0.0〜7.5%の濃度範囲で利用して、凝集形態から無傷のIgGを分離する。
【００８７】
いくつかの態様において、約2,000ダルトンの平均分子量を有するPEGを0.0〜15.0%の濃度範囲で利用して、凝集形態から無傷のIgGを分離する。
【００８８】
当業者は、本発明を実践するための有機重合体の同一性、適切な平均分子量および濃度を判定することができる。
【００８９】
V. 任意のさらなる段階
本発明は、より高レベルの精製を達成するために他の精製方法と組み合わせてもよい。例としては、プロテインAおよび他の形態の親和性クロマトグラフィー法、陰イオン交換クロマトグラフィー法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性相互作用クロマトグラフィー法、固定化金属親和性クロマトグラフィー法、ならびにさらなる混合モードクロマトグラフィー法のような、抗体の精製のために一般的に用いられる他の方法が挙げられるが、これらに限定されることはない。他の選択肢には沈降法、結晶化法および/または液体分配法が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００９０】
VI. 装置
本発明は、本発明の方法を実行するのに有用な装置を提供する。例えば、本発明は、抗体を精製するための装置であって、第一のカラム管(またはカートリッジ)と第二のカラム管(またはカートリッジ)とを含み、第一および第二のカラム管は流入口と流出口とを含み、第一のカラム管が第二のカラム管と流体連通するように第一のカラム管の流出口は第二のカラム管の流入口に(直接的にまたは、例えば接続管を通じて、間接的に)接続し、第一のカラム管は混合モードクロマトグラフィーマトリックスを含有しかつ第二のカラム管は固体支持体マトリックスを含有し、固体支持体マトリックスがヒドロキシアパタイト(HT)またはフルオロアパタイト(FT)を含む、該装置を提供する。この配置を有する装置は任意で、最初の混合モードクロマトグラフィーカラムからHT/FTカラムの上部までの連続流を可能にしてもよい。任意で、さまざまな流入口および流出口を含めて、条件の変更を可能にしてもよい(例えば、流入口を介して洗浄および溶出溶液を添加してもよく、流出口から試験サンプルを回収してもよい)。
【００９１】
装置は制限なく、例えば、本方法に関連して上記で論じられる、任意の混合モード支持体またはリガンドを含んでもよい。
【００９２】
VII. キット
タンパク質(例えば、抗体)の精製で用いるためのキットも提供される。いくつかの態様において、キットは混合モードクロマトグラフィーマトリックス; および/またはヒドロキシアパタイト(HT)もしくはフルオロアパタイト(FT)を含む固体支持体マトリックスを含む。上記のマトリックスは、カラムへ充填できる試薬の形態で提供されてもよく、または別個のカラムに充填できるように包装されてもよい。任意で、キットは、使用者が選択する、一度に充填される別個のカラムを含んでもよい。
【００９３】
いくつかの態様において、キットは、混合モードクロマトグラフィーマトリックスを含んだ第一のカラム管またはカートリッジ; および固体支持体マトリックスを含んだ第二のカラム管またはカートリッジを含む。いくつかの態様において、第一および第二のカラム管は流入口と流出口とを含み、二つの管が接続される接続時に第一のカラム管が第二のカラム管と流体連通するように第一のカラム管の流出口は第二のカラム管の流入口に接続されることができる。
【００９４】
さらに、キットは、本発明の方法の実践のための説明書(すなわち、プロトコル)を含んだ教材を含んでもよい。教材は、典型的には、書面にされまたは印刷された教材を含むが、これらに限定されることはない。このような説明書を格納し、かつ最終使用者にこれらを伝達しうる任意の媒体も本発明によって企図される。このような媒体は、電子記憶媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光媒体(例えば、CD ROM)などを含むが、これらに限定されることはない。このような媒体は、このような教材を提供するインターネットサイトへのアドレスを含むことができる。
【実施例】
【００９５】
実施例1: フェニルアラニンリガンドカラムの作出
UNOsphereクロマトグラフィー媒体は、水溶性の、親水性アクリルアミドおよびポロジェンの存在下で重合されて球状粒子を生ずるビニル単量体に基づく(米国特許第6,423,666号)。UNOsphereジオールは、実験室規模および工程のクロマトグラフィーで用いるための種々の機能媒体を作出するために使用できる、懸垂ジオール基で作出される重合体である。UNOsphereフェニルアラニン混合モード樹脂はUNOsphereジオールベースビーズから二段階で作出された: (a) UNOsphereジオールのUNOsphereアルデヒドへの酸化; および(b) 還元的アミノ化を介したUNOsphereマトリックス上へのフェニルアラニンのカップリング。フェニルアラニンのアミノ基は還元的アミノ化反応の後に第二級になる。必要なら、この第二級アミノ基をアセチル化して、酸性pHでのそのプロトン化を断ち切ることができる。フェニルアラニンリガンドのカップリングレベルは、酸塩基滴定によって判定される。
【００９６】
この手順の一般的スキームを以下に示す。
0005999899.tif 000003
【００９７】
詳細な手順
UNOsphereジオールのUNOsphereアルデヒドへの酸化。カラム中400 ml×4の脱イオン水で沈殿UNOsphereジオール樹脂40 mlを洗浄する。洗浄された樹脂ケーキを250 mlのポリエチレンボトルに移し入れる。0.2 M NaIO4溶液100 mlをボトルに添加し、回転装置により常温で内容物を転倒混和する。1時間の混合の後、カラム中400 ml×4の脱イオン水で樹脂を洗浄する。
【００９８】
還元的アミノ化を介したUNOsphereアルデヒド上へのL-フェニルアラニンのカップリング。70℃でPBS 25 mlにL-フェニルアラニン0.49 gを溶解する。L-フェニルアラニン溶液を常温まで冷却させる。UNOsphereアルデヒド樹脂ケーキ10 mlをL-フェニルアラニン溶液に懸濁する。NaCNBH3 125 mgを懸濁液に添加し、懸濁液を回転装置により常温で終夜穏やかに転倒混和する。カラム中100 ml×4の脱イオン水で樹脂を洗浄する。
【００９９】
リガンド含量の判定。酸塩基滴定法を用いてL-フェニルアラニンリガンド含量を判定することができる。UNOsphere L-フェニルアラニン樹脂10 mlを1.0 N HClで酸性化し、次いで100 ml×4の脱イオン水で樹脂を洗浄する。pHが11.4に達するまで0.10 N NaOHにより0.20 mlずつ増量して酸性化樹脂を滴定する。この工程をUNOsphereジオール樹脂10 mlについて繰り返す。これらの二種の樹脂についてリガンド含量を計算するために、滴定剤0.10 N NaOHの体積差を用いる。リガンド含量は樹脂1 mlあたり約0.043 mmolのL-フェニルアラニンである。
【０１００】
第二級アミノ基のアセチル化。(c)由来のUNOsphere L-フェニルアラニン樹脂10 mlを脱イオン水100 ml×4およびMeOH 50 mlで洗浄する。樹脂を真空オーブン中、屋内真空(house vacuum)下60℃で終夜乾燥する。樹脂を常温に冷却し、それをアセトン(分子篩で乾燥された) 25 mlに懸濁する。懸濁液を-10℃に冷却し、ジイソプロピルエチルアミン78 μl、引き続き塩化アセチル32 μlをゆっくり添加する。反応混合物を35分間-5〜-10℃で穏やかに撹拌する。樹脂をアセトン50 ml、MeOH 50 mlおよび脱イオン水100 ml×3で洗浄する。
【０１０１】
実施例2: フェニルアラニンリガンド - 陽イオン交換モード
本発明の一つのモードは「陽イオン交換モード」ということができる。というのは(フェニルアラニンの疎水性部分が抗体相互作用に寄与し続けるが)カルボン酸基を陽イオン交換体として活用することによってフェニルアラニンカラムが操作されるからである。リガンドの疎水性が従来の親水性陽イオン交換体によって通常許容されうるよりも、より大量の塩の存在下での媒体による良好な結合能力(IgG取り込み)を(疎水性効果を介して)可能にする。
【０１０２】
この具体例は以下の条件の下で行われた: フェニルアラニンUNOsphere 1 mLを5 mm×5 cmカラムに充填し、300 cm/時間の線流速にて、5カラム容量(CV)の0.05 M酢酸緩衝液pH 4.5で平衡化した。約1 mg/mLのモノクローナルキメラIgGを含有する清澄化された細胞培養上清15 mLを0.1 M酢酸の漸次添加によってpH 4.7まで滴定し、次いでカラムに加えた。UVプロファイルがベースラインに戻るまでカラムを平衡化緩衝液で洗浄した。次いでこれを5 CVの0.05 M酢酸, 1 M NaCl, pH 4.5で洗浄し、次いで平衡化緩衝液に戻した。次にカラムを10 mMリン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.2への15 CVの直線勾配で溶出した。溶出の結果を図1に示す。
【０１０３】
陽イオン交換または疎水性相互作用モードのいずれかでのフェニルアラニンUNOsphereに対する初期分画の後、溶出されたIgGをヒドロキシアパタイト(CHTタイプ1 40ミクロン)に負荷し、多数の最近のBio-Rad社刊行物に記述の塩化ナトリウム勾配で溶出した。これは抗体の純度を増大し、特に抗体凝集体、DNA、内毒素およびウイルスを除去する。CHTクロマトグラフィーの条件は次の通りである。
CHTタイプ1, 40 μm。1 mL 5 mm×5 cm、300 cm/時間。
緩衝液A: 10 mMリン酸ナトリウム, pH 6.7。
緩衝液B: 10 mMリン酸ナトリウム, 1.5 M NaCl, pH 6.7。
緩衝液C: 500 mMリン酸ナトリウム, pH 7.0。
【０１０４】
カラムを緩衝液Aで平衡化した。UNOsphereフェニルアラニンクロマトグラフィーからの抗体溶出液を負荷し、次いで緩衝液Aで洗浄した。緩衝液Bへの30 CVの直線勾配で溶出を達成した。次にカラムを緩衝液Cで洗った。溶出のクロマトグラムを図2に示す。
【０１０５】
各種精製段階のサンプルをSDS-PAGEに負荷し分析して、精製工程をモニターした(図3)。
【０１０６】
レーン4は、フェニルアラニンカラムに加えられた未精製の細胞培養上清を表す。
【０１０７】
レーン9は、カラムに加えた際にカラムに結合しなかった物質を表す。これは、図1の約15〜45 mLに及ぶピークに対応する物質であろう。抗体重鎖に対応するバンドがないことから、抗体がカラムに効果的に結合されることが示唆される。抗体軽鎖とおおよそ一致するバンドから、カラムが軽鎖の選択的除去を支持することが示唆される。
【０１０８】
レーン5は、図1の約45〜53 mLから生じるピークに対応する後期溶出性の未結合物質を表す。この物質は、抗体軽鎖とおおよそ一致するバンドによって占められ、それがカラムを通過することを遅らせるには十分な、しかしそれを結合するには不十分な、軽鎖に対する弱い親和性をカラムが有することを実証する。このことから、カラムを遊離軽鎖および無傷の抗体の分離に使用できることが実証され、抗体断片の精製のための潜在用途が示唆される。
【０１０９】
レーン10は、図1の約53〜65 mLに対応する、高塩洗浄段階でフェニルアラニン樹脂から溶出された物質を表す。重鎖の存在は抗体のいくらかの喪失を示唆するが、軽鎖の優占は、喪失の大部分が無傷の抗体ではないことを示唆する。
【０１１０】
レーン1は、図の約80〜85 mLに対応する、溶出ピークの立ち上がりの肩を表す。これは微量の軽鎖を含むが、有意濃度の無傷の抗体を含まない。
【０１１１】
レーン6は、図1の約85〜92 mLに対応する、フェニルアラニン樹脂からの主な溶出ピークを表す。それが、抗体重鎖および軽鎖を比例的に表す二つのピークによって占められており、画分全体の組成を占める、無傷の抗体であることを示唆している。クロマトグラム(図1)と組み合わせて、このことは、カラムが夾雑物の大部分の除去に有効であることを示す。二つの溶出画分(レーン5および6)間の組成の差異から、さらに高い純度を提供するために溶出条件を最適化できることが示唆される。レーン6に対応するカラム画分をCHT (ヒドロキシアパタイト段階)に持ち込んだ。
【０１１２】
レーン11は、CHTカラムに結合しなかった物質を表す。これは約205〜220 mLのクロマトグラムの部分に対応する(図2)。抗体含量は皆無であり、夾雑物の良好な除去を示唆している。
【０１１３】
レーン2は、約232〜240 mLに対応する、CHTからの主な溶出ピークを表す。このピークは、典型的には、非凝集抗体と一致しており、高い精製度、無傷の抗体からの抗体断片の選択的分画、および(無傷の)非凝集抗体からの抗体凝集体の選択的分画を支持するための組み合わせ技術(フェニルアラニンおよびCHT)の実用性を示唆している。
【０１１４】
レーン7は、約245〜260 mLに対応する、CHTからの立ち下がりのピークを表す。このピークは、典型的には、これらの条件下で抗体が分画されるときの抗体凝集体と一致する。
【０１１５】
レーン12は、図2の約26〜264 mLに対応する、CHTからの洗浄ピークを表す。この画分は夾雑物によって占められるが、少量の抗体を含むように思われる。この画分に現れる抗体は、典型的には、高度に凝集されていることが明らかである。
【０１１６】
レーン3および8はブランクである。
【０１１７】
実施例3: フェニルアラニンリガンドのキャッピングの効果
フェニルアラニンのアミノがアセチル化された、またはアセチル化されなかったUNOsphereフェニルアラニンについて精製免疫グロブリンの結合および溶出を調べた。図4〜5は、アセチル化UNOsphereフェニルアラニンより結合されかつ溶出されたIgG (図5)と比べて非アセチル化UNOsphereフェニルアラニンより結合されかつ溶出されたIgG (図4)がごく少量しかないことを示す。図5の上のクロマトグラムは、初め水からアセトンに溶媒交換され、次に塩化アセチルで処理されたUNOsphereフェニルアラニンを表す。図5の下のクロマトグラムは、ビーズが真空乾燥され、次に塩化アセチルで処理されたUNOsphereフェニルアラニンを表す。
【０１１８】
実施例4: フェニルアラニンリガンド - 疎水性相互作用モード
本発明の別のモードは「疎水性相互作用モード」ということができる。というのはフェニル基を疎水性相互作用基として活用することによってフェニルアラニンカラムが操作されるからである。これは図6に例証されている。この実験では、(プロテインA精製)抗体を4 M NaClの存在下でUNOsphereフェニルアラニンカラムに負荷した。塩がカラムから洗い出されたら(赤色の記録波形)、4.5〜7.5までのpH勾配を開始し(薄灰色の記録波形)、これによって結合抗体が溶出された(青色の記録波形)。
【０１１９】
実施例5: ポリメタクリレートのt-ブチルエステル誘導体
Macro-Prepエポキシドベース重合体は、メタクリル酸グリシジルおよびジエチレングリコールジメタクリレート架橋剤から作出されるポリメタクリレート重合体である。Macro-Prepエポキシドベースビーズは疎水性基を含まない; 疎水性基は後重合反応中に重合体に導入される。Macro-Prep t-ブチルHIC樹脂は、t-ブタノールおよびカリウムt-ブトキシドとMacro-Prepエポキシドとの反応によって作出される混合モード樹脂である。t-ブチル誘導体化反応中、t-ブタノールが懸垂エポキシド基と反応する間に、重合体骨格上のエステル基のごく一部がカルボン酸基に加水分解される。Macro-Prep t-ブチルHICは、典型的には、131〜266マイクロモルのカルボキシル基/ml樹脂および25〜45マイクロモルのt-ブチル基/ml樹脂を含有する。本発明者らがフェニルアラニンを用いて実証した統合型の混合モードリガンド手法とは異なり、Macro-Prep t-ブチルHICではカルボキシル基が疎水性基から分離されている。Macro-Prep t-ブチルHIC重合体は、免疫グロブリンを含め、より大きなタンパク質を結合するのに十分に多孔質である。
【０１２０】
モノクローナル抗体細胞培養ろ液を以下の条件の下、Macro Prep t-ブチルHIC樹脂上で精製した。クロマトグラフィー条件: T-ブチルHR 10/10 (Macro-Prep t-ブチルHIC樹脂8 mLを10 mm×10 cmのクロマトグラフィーカラムに充填した)。カラムを25 mM酢酸, pH 4.5、およそ0.3 mS/cm 4 mL/分 (300 cm/時間)で平衡化した。サンプルを調製するため、それを25 mM酢酸で1:1希釈し、pH 4.75、約11 mS/cmの電導度に滴定した。サンプル100 mLを負荷し、カラムをその後、25 mM酢酸, pH 4.5で洗浄した。次いで流速を150 cm/時間(2 mL/分)に減らし、抗体を10 mMクエン酸、10 mMリン酸, pHおよそ7.5 (電導度およそ4.6 mS/cm)への直線勾配で10カラム容量により溶出した。溶出の後、カラムを1 M NaCl、その後1 M NaOHでストリップした。
【０１２１】
Macro-Prep t-ブチルHICに対するモノクローナル抗体細胞培養ろ液のクロマトグラフィーを例証するクロマトグラムを図7に示す。クロマトグラム由来の画分をSDS PAGEによって分析した(図8)。抗体はMacro-Prep t-ブチルHICに効率的に捕捉された(未結合画分または洗浄画分中に抗体バンドなし)。pH勾配によって溶出された抗体は、非特異的な喪失なしに、細胞培養ろ液から十分に精製され濃縮された(カラムストリップ画分中に抗体は検出されなかった)。画分のポリアクリルアミドゲル電気泳動パターン(図8)は、上述のフェニルアラニンカラムからの溶出液で観察されたものと同様である。Macro-Prep t-ブチルHICに関するこれらの結果は、統合型の混合モードリガンドが本発明者らの混合モード/CHT抗体精製法に必要でないことを実証している。
【０１２２】
上記の例に記述した本発明者らの取り組みに基づき、Macro-Prep t-ブチルHICからpHによって溶出された抗体画分のクロマトグラフィー最終精製(polishing)を、フェニルアラニン混合モード媒体から溶出された抗体プールと同様、CHTに対するクロマトグラフィー法で分析して、微量タンパク質、夾雑物、抗体凝集体、DNAおよび内毒素をさらに除去することができる。
【０１２３】
実施例6: ヘキサン酸リガンド
アルキル酸およびアミノアルキル酸をその抗体精製能について比較した。アミノカプロン酸を還元的アミノ化(フェニルアラニンカップリングに類似の反応)によってUNOsphereジオールにカップリングした。本発明者らの精製IgG取り込みアッセイ法においてIgG結合は検出されなかった(図9)。この材料のアセチル化から、本発明者らのアッセイ法において精製IgGのごくわずかな取り込みおよび放出しかないことが実証された(図10)。対照的に、UNOsphereジオールへのブロモヘキサン酸のカップリングはpH変化により鋭く溶出されるピークを伴ってIgG結合をもたらす(図11)。ブロモヘキサン酸がアガロース(Sterogene Ultraflow、図12)にまたはGEアガロース(セファロース4B、図13)に同様にカップリングされた場合、SterogeneアガロースはUNOsphereヘキサン酸のものと非常に類似したプロファイルをもたらしたのに対し、セファロース4BはpHに基づく溶出でずっと高いIgG結合を示した。
【０１２４】
重合体上のヒドロキシル基にカップリングされた場合、アミノカプロン酸とブロモヘキサン酸、[-HN(CH2)5COOH] vs [-(CH2)5COOH]には微妙な違いがあり、これによってIgG結合特性の有意差が生じる。この効果は、過去の取り組みに基づいては、予想されなかった。Lihme (米国特許第6,498,236号)らは、エピクロルヒドリン、アリルグリシジルエーテル、ビス-エポキシドおよびグルタル酸ジアルデヒドを含めて種々の活性化スペーサー基を用いた。Burton (米国特許第5,652,348号)は、アミンをカップリングするために種々の活性化基を用いた。非荷電アミド結合を作出したものもいれば、エポキシド、臭化シアン、トシル、ジビニルスルホンを含めて酸性のpHで正電荷をもたらしうる第二級アミン誘導体を作出したものもいた。任意の動作理論により束縛されることを意図するわけではないが、本発明者らは、その差異が低pHで両性イオンを形成する第二級アミン窒素のプロトン化に起因し、それが酸性のpH、つまりカルボキシル基がおおかたプロトン化され(かつ非荷電化され)る条件で、ビーズから(正荷電) IgG分子をはねつけてしまうものと仮定している。アミン窒素のアセチル化または他の「キャッピング」は、アミノカプロン酸の場合にもフェニルアラニンの場合にも、アミンをプロトン化して両性イオンを形成する能力をなくすであろう。
【０１２５】
実施例7: さらなる混合モードマトリックス
重合体の骨格中にカルボキシル基を有するUNOsphereジオール重合体を作出し、次にこのビーズをフェニル基で誘導体化して、Macro-Prep t-ブチルHIC重合体にやや似通った、別個の疎水性基およびイオン基を有する材料を作出した。図14は、この材料に関する精製IgG結合のクロマトグラムである。IgGの溶出プロファイルは、弱酸および疎水性基の両方で構成された単一のリガンドを含有する媒体のものとはわずかに異なる。酸および疎水性基が必ずしもすぐ近くにない、この媒体の場合、pH勾配の記録波形が上昇する前にもかかわらず始まる、IgGに対するいっそう広範な溶出プロファイルが認められる。比較のため、Macro-Prep t-ブチルHICに対するIgG結合/溶出プロファイルを図15に示す。
【０１２６】
本明細書において引用される全ての参考文献は、各個別の刊行物または特許もしくは特許出願が、全ての目的のためにその全体が参照により組み入れられると具体的かつ個別的に示されているかのように、その全体が参照によりおよび全ての目的のために組み入れられる。参照により組み入れられる刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示に矛盾する限りにおいて、本明細書は、このような矛盾的材料のいずれに対しても優るおよび/または優先するよう意図される。
【０１２７】
当業者には明らかであるように、本発明の多くの変更および変形を、その趣旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書において記述される特定の態様はほんの一例として提示され、決して限定することを意図するものではない。本明細書および実施例は単なる例示的なものに過ぎず、以下の特許請求の範囲によって示される本発明の真の範囲および趣旨とともに考慮されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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