(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３．６°、５．３°、１８．３°、１９．３°および２１．７°の２θ値（波長  ０．１５４０６ｎｍのＣｕ−Ｋα放射線を使用して測定される）を含むＸＲＤピークを特徴とする、１型結晶変態の、（Ｒ）−ＤＯＰＣの結晶、（Ｓ）−ＤＯＰＣの結晶、または、前記（Ｒ）−ＤＯＰＣの結晶と前記（Ｓ）−ＤＯＰＣの結晶の混合物の調製する方法であって、
該調製方法は、
１種または複数の非プロトン性溶媒から結晶化する工程を含み；
（Ｒ）−ＤＯＰＣは、下記の化学式の
（Ｒ）−２，３−ビス（オレオイルオキシ）プロピル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、または、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを意味し、
【化１】
0005972323.tif 000005
（Ｓ）−ＤＯＰＣは、下記の化学式の
（Ｓ）−２，３−ビス（オレオイルオキシ）プロピル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、または、２，３−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−１−ホスホコリンを意味し、
【化２】
0005972323.tif 000006
前記（Ｒ）−ＤＯＰＣの結晶中の（Ｒ）−ＤＯＰＣの純度は１００％であり；
前記（Ｓ）−ＤＯＰＣの結晶中の（Ｓ）−ＤＯＰＣの純度は１００％である
ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
用いられる前記１種または複数の非プロトン性溶媒の一つは、エーテルである
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
用いられる前記１種または複数の非プロトン性溶媒の一つは、ケトンである
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
用いられる前記１種または複数の非プロトン性溶媒の一つは、ニトリルである
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
用いられる前記１種または複数の非プロトン性溶媒の一つは、
ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、炭酸ジメチル、炭酸ジエチルおよび１，３−ジオキソリジン−２−オンまたはこれらの混合物の群から選択されるエステルである
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１種または複数の非プロトン性溶媒に、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソ−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、エチレングリコール、メトキシエタノール、エトキシエタノールならびにこれらの混合物からなる群から選択されるアルコールが混合されている
ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
予め精製することなく、結晶化を反応溶液から直接実施する
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該調製方法は、
非結晶性または結晶性の、（Ｒ）−ＤＯＰＣ、（Ｓ）−ＤＯＰＣ、または、（Ｒ）−ＤＯＰＣ、（Ｓ）−ＤＯＰＣの混合物を、再結晶化の出発原料として使用し、１種または複数の非プロトン性溶媒から再結晶化する工程をさらに含み、
前記再結晶化工程は、
（Ｒ）−ＤＯＰＣ、（Ｓ）−ＤＯＰＣの結晶、または、（Ｒ）−ＤＯＰＣと（Ｓ）−ＤＯＰＣの混合物の調製された溶液を、−１０℃まで、ゆっくり冷却することで実施される
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＯＰＣの結晶変態（ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、その調製方法および医薬組成物の調製におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
上記および下記のＤＯＰＣは、
天然の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、また、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン、
（Ｒ）−２，３−ビス（オレオイルオキシ）プロピル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、
１，２−ジオレオイル−Ｌ−α−レシチン、または
（Ｒ）−ＤＯＰＣ；
天然ではないこれらの鏡像異性体、
２，３−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−１−ホスホコリン；
ラセミ体（Ｒ，Ｓ）−ＤＯＰＣ、および上記の鏡像異性体の他の混合物を意味する。
【０００３】
【化１】
0005972323.tif 000002
【０００４】
Ｃ44Ｈ84ＮＯ8Ｐ， Ｍｗ７８６．１１
ＣＡＳ番号：４２３５−９５−４（Ｒ型）および８４３６６−６７−６（Ｓ型）
リポソームは、通常は天然の脂質である両親媒性（ａｍｂｉｐｈｉｌｉｃ）物質を含む合成多層小胞（閉鎖膜の球形）であり、親水性物質を水性内部に封入することができ、また、親油性物質を脂質膜の内部に組み込むこともできる。
リポソームは、特に化粧品および医薬品に、とりわけ皮膚科学において用いられる。特に、ビタミン、補酵素、皮膚保護剤および日焼け止めが埋め込まれている。リポソームは、一般に局所適用される。
しかし、リポソームの非経口投与により、活性化合物を自由に溶解した形態で使用する場合に比べてより特定された臓器分布の達成が可能になるので、リポソームは製薬技術において更なる重要性を得つつある。
したがって、US2006/0067998A1は、癌疾患の治療または予防のために、クルクミンまたはクルクミン誘導体を活性物質として含むコロイド状封入製剤を投与する方法を開示している。適切な製剤は、例えばリポソーム、ナノ粒子、微粒子またはブロックポリマーから形成されるコポリマーミセルなどの、脂質に基づいたコロイド系とポリマーコロイド系の両方を含む。
ＤＮＡ−、ＲＮＡ−またはタンパク質が含まれる場合、リポプレックスが得られる。
【０００５】
ナノ粒子（ナノパーツ（ｎａｎｏｐａｒｔ））は、リポソームとほぼ同じ大きさの粒子であるが、内部に水相を有さず、代わりに油相または固体コアを有する。ナノ粒子は、親油性物質の封入に特に適している。
マイクロエマルションは、水性の脂質様成分および界面活性剤様成分を含むコロイド状に分散した単相系である。これらは、１〜５００ｎｍの粒径を有し、液体と同様の挙動をする。
【０００６】
上記の用途における可溶化作用は、特に、通常は可溶性の低いペプチド様活性化合物、ヌクレオチド、ワクチンおよび他の生物薬剤に関して非常に大きな重要性がある。
加えて、体内における活性化合物の分解を遅延することができ、この方法により持続放出効果を達成することができる。
【０００７】
（Ｒ）−ＤＯＰＣは、天然の双性イオン性ホスホコリンの部類に属する。双性イオン性脂質を含むリポソームは、単独でまたは他のホスホコリンともしくは他の非荷電脂質様化合物と組み合わされて、中性の表面を有する。
しかし、ＤＯＰＣに基づいたリポソームおよびリポプレックスが細胞内に浸透し、したがって、その中に含まれた活性化合物を細胞内部に輸送する（移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）する）能力は、特に重要である。そのようなリポソームは、多くの場合、荷電脂質、特にカチオン性脂質を含む。しかし、リポプレックスがＤＯＰＣのみからなる適用も、例えば、SoodらによりJournal of the National Cancer Institute(2008)、100、359-372において発表されている。
これらの特性全ても、ＤＯＰＣを癌治療にとって非常に興味深いものにしている。これらの特性によって、ＤＯＰＣリポソームに含まれるＲＮＡ、ＤＮＡまたは従来の細胞増殖抑制剤を投与する可能性をもたらす。
【０００８】
医療、特に非経口の適用では、活性化合物および使用される助剤の品質および純度について要求が極めて高くなる。したがって、当局側において、これらの化合物の調製、調製の再現性および副産物プロフィールに関して非常に厳しい規制がある。非経口投与される物質の場合、病原性微生物および内毒素に起因する微生物学的不純物も、厳しく回避および制御される必要がある。
【０００９】
ＤＯＰＣは室温で不安定であり、したがって、医薬製剤の調製での使用に適するように許容される純度に調製することは、それ自体困難である。
例えば天然リン脂質のＰＯＰＣおよびＤＯＰＥなどのオレイン酸残基を有するあらゆる脂質と同様に、ＤＯＰＣは非常に酸素感受性である。しかし、不飽和脂肪酸誘導体の酸化生成物は一般に高い毒性を有する。
ここで、適切な調製および精製方法が必要とされる。ＤＯＰＣは、例えば、凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）またはロウ状固体の形態であり、したがって、工業的に大きな困難を伴うことでしか適合した品質を得ることができない。
例えばトコフェロールまたは還元型Ｌ−グルタチオンの形態の酸化防止剤の添加などの不安定性を克服する従来の方法は、後で埋め込まれる活性化合物との相互作用を排除することができないので、ＤＯＰＣの一般的な有用性を大きく限定する。調製、保存および使用の際に酸素を完全に排除することは、実質的に不可能であるか、または非常に多大な努力を伴うことでしか達成することができない。
したがって、製造者は、凍結乾燥ＤＯＰＣを保護ガス下、−２０℃で保存することを一般に推奨し、約１２カ月の保存寿命しか保証していない。ロウ状ＤＯＰＣではより長い保存寿命が保証されているが、酸化保護が加えられており、保存は、同様に−２０℃で行われなければならない。
【００１０】
凍結乾燥およびロウ状のＤＯＰＣは両方とも非結晶性物質の含有量が非常に高い。
酸化（ｏｘｉｄａｔｉｄａｔｉｏｎ）感受性の他に、この非結晶性ＤＯＰＣは極めて吸湿性でもあり、通常の大気湿度レベルでは極めて短い時間内に潮解して、べたべたした膜となる。加えて、ロウ状ＤＯＰＣは、困難を伴うことでしか微粉砕することができず、凍結乾燥ＤＯＰＣと同様に、困難を伴うことでしか計量することができない。このことは、この化合物の取扱を更により困難にしている。
【００１１】
文献は、非結晶性ＤＯＰＣの調製について多様な合成経路を開示しているだけである：
Ichiharaら、Chemistry and Physics of Lipids(2005)、137(1-2)、94-99は、ＳＮ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＧＰＣ）からのＤＯＰＣの合成を概説している。
Roodsariら、Journal of Organic Chemistry(1999)、64(21)、7727-7737は、トリチルグリセロールから出発するＤＯＰＣの全合成を記載している。
ＤＯＰＣの合成および使用についての他の多くの出版物が発行されてきたが、結晶性材料を記載したものはない。
Lewisら、Biochemistry(1988)、27(3)、880-7およびBiochemistry(1989)、28(2)、541-8は、凍結乾燥ＤＯＰＣについて報告している。
BaerおよびKindlerはBiochemistry(1962)、1(3)、518-21においてロウ状ＤＯＰＣについて言及している。
Lekim、BiedermannおよびGhyczyのDE2647395は、結晶化によるＧＰＣエステルの精製を一般的に記載しているが、明確なＤＯＰＣの結晶化は記載されていない。
【００１２】
ラセミ体ＤＯＰＣは、鏡像異性体について記載された方法と同様にしてラセミ出発材料から得ることができる。
加えて、多くの出版物のうちＤＯＰＣの融点を示したものはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】US2006/0067998A1
【特許文献２】DE2647395
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ichiharaら、Chemistry and Physics of Lipids(2005)、137(1-2)、94-99
【非特許文献２】Roodsariら、Journal of Organic Chemistry(1999)、64(21)、7727-7737
【非特許文献３】Lewisら、Biochemistry(1988)、27(3)、880-7
【非特許文献４】Biochemistry(1989)、28(2)、541-8
【非特許文献５】BaerおよびKindler、Biochemistry(1962)、1(3)、518-21
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明の目的は、高純度な、可能であれば結晶形態のＤＯＰＣを提供することである。本発明の更なる目的は、医薬製剤の調製に用いることができるように、長い保存寿命および良好な取扱特性をこの化合物にもたらすことである。更に、工業規模で実施することができる安定した形態のＤＯＰＣを調製する、再現可能な方法に対する強い必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
驚くべきことに、現在、高い化学純度および優れた安定性を有する、ラセミ的に、また、鏡像異性的にも純粋な結晶性ＤＯＰＣを簡単に得られることが、実験を介して見出された。この方法により得られる結晶性の生成物は、保護ガス下、室温で実質的に無限の時間安定している。
結晶性ＤＯＰＣは、改善された吸湿性を有する取扱容易なルーズ材料（ｌｏｏｓｅｍａ
ｔｅｒｉａｌ）としても生成される。
したがって、これらは医薬形態の調製のための構成成分または出発材料として適している。したがって、本発明は、ＤＯＰＣ鏡像異性体の安定した結晶変態および同じ結晶形態を
有する鏡像異性体の混合物に関する。
【００１７】
安定した結晶変態は、結晶性および部分的に結晶性の形態であることができる。これらは、これまで達成されていない＞９８％の純度と共に、大気を遮断して、４０℃、相対大気湿度７５％で１２カ月保存した後、ならびに２５℃、相対大気湿度６０％で１８カ月後（酸化保護を加えておらず、この点に関して表１を参照のこと）に、これまで達成されていない初期値に基づいて＞９９％の安定性を有する。ＤＯＰＣ結晶変態は、ＤＯＰＣ１当量あたり１当量未満の水または結晶化溶媒の含有量を有する。
【００１８】
鏡像異性的に純粋なＤＯＰＣは、例えば、１型結晶変態であり、Ｘ線粉末回析測定において中狭帯域（ｍｅｄｉｕｍ−ｓｈａｒｐ ｂａｎｄｓ）を示す（この点に関して、図１および表２を参照のこと）。多様な結晶変態の選択された２θ値は、Ｃｕ Ｋα放射線により測定した、３．６°、５．３°、１８．３°、１９．３°および２１．７°（１型）である。反射もしくは透過、または毛細管もしくは窓のような異なる機器または記録方法を選択した場合、あるいは大気湿度または温度に関して異なる記録条件が支配している場合、これらの値の個々の帯域において僅かな差が生じうる。
【００１９】
結晶変態の一部は、非常に高い結晶含有量を有し、このことは４８Ｊ／ｇを超える溶融エンタルピーにより明白である。結晶変態の融点は、一般に６０℃を超える（図９）。
加えて、本発明の結晶変態は、取扱が容易なルーズ材料として生成される（図４）。結晶性は、偏光顕微鏡により明らかになる（図６）。
例えば結晶性ラセミ化合物などの結晶性ＤＯＰＣの鏡像異性体の混合物も、同じＸＲＤスペクトルを有しうる。
【００２０】
本発明は、更に、ＤＯＰＣ結晶変態の調製方法に関し、これはＤＯＰＣを非プロトン性媒質から結晶化させることを特徴とする。この目的に使用される非プロトン性媒質は、非プロトン性溶媒またはその混合物である。非プロトン性媒質は、例えば水などのプロトン性溶媒を少ない割合で含むこともできる。例外的な場合では、２５重量％のプロトン性溶媒が適切な条件下で存在することもできる。本明細書において、予め精製することなく、ＤＯＰＣの結晶化を、反応溶液から直接実施することができる。結晶性ＤＯＰＣは、同様に、非結晶性、部分的に結晶性または結晶性の材料の再結晶によって得ることができる。
【００２１】
適切な非プロトン性溶媒は、特に、
例えば、テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフランおよびジオキサンなどのエーテル、
例えば、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、炭酸ジメチル、炭酸ジエチルおよび１，３−ジオキソリジン−２−オンなどのエステル、
例えば、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン、メチルイソプロピルケトンなどのケトン、ならびに
例えばアセトニトリルなどのニトリルである。
【００２２】
プロトン性溶媒添加物は、典型的には、
例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソ−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、エチレングリコール、メトキシエタノール、エトキシエタノールなどのアルコール、
水、または
これらの混合物からなる。
【００２３】
ＤＯＰＣ結晶変態の結晶化は、一般に、調製した溶液を３０℃より低い温度に特にゆっくりと冷却することにより実施される。結晶は、自然にまたは対応するＤＯＰＣ結晶変態の添加により形成する。
多様なＤＯＰＣ結晶変態を互いに変換することができる。変換は、単離した結晶変態の高温での温度処理により、または結晶化条件下での懸濁液の長時間の撹拌により達成することができる。
【００２４】
記載された方法における再結晶の出発材料として非結晶性または部分的に結晶性のＤＯＰＣを使用することは、これまで達成されていない純度と共にこれまで達成されていない安定性を有する実質的に結晶性のＤＯＰＣを与える。
結晶性ＤＯＰＣが所定の条件下において固体形態で優れた安定性、および一定の非常に良好な品質を実質的に無限の時間にわたって有するので、本発明は医薬製剤の調製のための結晶性ＤＯＰＣの使用にも関する。
したがって、本発明は、更に、特許請求されるＤＯＰＣ形態の使用によってもたらされる医薬組成物にも関する。これらは、例えば、リポソーム、リポプレックス、マイクロエマルションおよびナノ粒子の形態であることができ、例えば、ペプチド、ヌクレオチド、ワクチンおよび細胞増殖抑制剤の群からの活性化合物を含むことができる。
本記載は、当業者が本発明を包括的に使用することを可能にする。したがって、更なる記述がなくても、当業者は最も広い範囲で上記記載を利用することができると想定される。したがって、本記載は、当業者が本発明を包括的に使用および実施することを可能にする。
明瞭性が欠如している場合には、引用されている出版物および特許文献を利用するべきであることは言うまでもない。したがって、これらの文書は、本記載の開示内容の一部として考慮される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】１型ＤＯＰＣのＸＲＤスペクトルを示す図である。
【図２】凍結乾燥ＤＯＰＣのＸＲＤスペクトルを示す図である。
【図３】ロウ状ＤＯＰＣのＸＲＤスペクトルを示す図である。
【図４】１型ＤＯＰＣ結晶を示す図である。
【図５】ロウ状ＤＯＰＣを示す図である。
【図６】偏光顕微鏡による１型ＤＯＰＣ結晶の図である。
【図７】偏光顕微鏡による凍結乾燥ＤＯＰＣの図である。
【図８】偏光顕微鏡によるロウ状ＤＯＰＣの図である。
【図９】１型ＤＯＰＣの溶融挙動を示す図である。
【図１０】凍結乾燥ＤＯＰＣの溶融挙動を示す図である。
【図１１】ロウ状ＤＯＰＣの溶融挙動を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明のより良好な理解および本発明を説明するために、以下に例を示すが、これらは本発明の保護の範囲内である。これらの例は、可能な変形形態を説明するためにも役立つ。しかし、本発明の原則の一般的な有効性のために、例は本出願の保護範囲をそれらのみに減少するには適していない。
【００２７】
例および記載、ならびに請求項に示されている温度は、常に℃である。特に指示のない限り、含有データは、重量％で示される。
更に、示された例および残りの記載の両方において、組成物中に存在する成分量は、組成物全体に基づいて、合計して常にちょうど１００重量％または１００ｍｏｌ％になり、示されるパーセント範囲からより高い値が生じうる場合でも、これを超えることはない。特に指示のない限り、体積データで示されている比を除いて、％データは重量％である。
【実施例】
【００２８】
本発明の説明の例
例１
（Ｒ）−ＤＯＰＣの結晶化
２００ｇの非結晶性（Ｒ）−ＤＯＰＣを、１７００ｍｌのアセトニトリルに２５℃で溶解する。溶液を０．１℃／分で−１０℃に冷却する。結晶化は１０℃で始まる。結晶化が完了したら、生成物を濾過により単離し、真空下で乾燥する。（Ｒ）−ＤＯＰＣ結晶の収量は、１８０ｇ（９０％）である。
【００２９】
該結晶変態の（Ｒ，Ｓ）−ＤＯＰＣおよび（Ｓ）−ＤＯＰＣの結晶を同様に得ることができる。
【００３０】
例１ａ
酢酸エチルからのＤＯＰＣの再結晶化
２０．０ｇのＤＯＰＣを１００ｍｌの酢酸エチルに３５℃で溶解する。溶液を、２０℃まで急速に冷却し、次いで０．０１℃／分の速度で−１０℃まで冷却し、その間に結晶化が始まる。結晶性物質（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｅ）を濾取し、真空下、室温で乾燥する。収量は、結晶性ＤＯＰＣ１９．６ｇ（理論量の９８．１％）である。５℃／分の加熱速度では、該生成物は、７１℃の融点および４９．４Ｊ／ｇの溶融エンタルピーを示す。
【００３１】
例２
安定性
結晶性ＤＯＰＣの安定性を決定するために、外気を遮断して、２５℃および相対湿度６０％、ならびに４０℃および相対湿度７５％において、物質を、比較試料と共に保存する。ＤＯＰＣの残留含有量を、定期的な間隔で測定し、初期値と比較して示す。
【００３２】
ＤＯＰＣの純度および含有量をＨＰＬＣにより決定する。
【００３３】
１型結晶変態では、以下の値が見出された：
【００３４】
【表１】
0005972323.tif 000003
【００３５】
例３
Ｘ線粉末回析パターン
ＤＯＰＣ結晶変態の特性決定を行うために、これらの物質のＸ線粉末回析パターン（ＸＲＤ回析スペクトル）を記録する。比較の目的で、凍結乾燥およびロウ状のＤＯＰＣ異形のＸ線粉末回析パターン（ＸＲＤ回析スペクトル）も記録する。
１型ＤＯＰＣ結晶変態については、比較的高解像度の中狭帯域スペクトルが該脂質において得られる。このスペクトルは高い結晶含有量を示す。偏光顕微鏡で認められる非結晶性成分はない。
例示のスペクトルを図１（１型）において見ることができる。比較として、市販の非結晶性試料のスペクトルを、類似の条件下で同様に記録し、図２（凍結乾燥）および図３（ロウ状）に示す。
表２は、１型ＤＯＰＣ結晶変態における選択された２θ値（単位  °；波長  ０．１５４０６ｎｍのＣｕ−Ｋα放射線を使用して測定される）を提示する。
【００３６】
【表２】
0005972323.tif 000004
【００３７】
例４
結晶変態
１型ＤＯＰＣ結晶変態を、顆粒状のルーズ材料（図４）として生成し、一方、市販のＤＯＰＣ試料を、凍結乾燥物またはロウ状塊（図５）のいずれかとして得る。偏光顕微鏡では、１型ＤＯＰＣ結晶変態は、結晶性物質であることは全く明白であり（図６）、一方、凍結乾燥（図７）およびロウ状の比較材料（図８）は非結晶性と思われる。
【００３８】
例５
溶融挙動
示差走査熱量（ＤＳＣ）測定も同様に、１型ＤＯＰＣ結晶変態（図９）と凍結乾燥（図１０）およびロウ状の比較材料（図１１）の明確な差を示す。
【図１】
0005972323.tif 000007
【図２】
0005972323.tif 000008
【図３】
0005972323.tif 000009
【図４】
0005972323.tif 000010
【図５】
0005972323.tif 000011
【図６】
0005972323.tif 000012
【図７】
0005972323.tif 000013
【図８】
0005972323.tif 000014
【図９】
0005972323.tif 000015
【図１０】
0005972323.tif 000016
【図１１】
0005972323.tif 000017