(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
別個のプロモーターの制御下にある３以上のレポーター遺伝子を有し、第１のレポータ
ー遺伝子が定常発現プロモーターの制御下にあり、第２のレポーター遺伝子が免疫毒性評
価用プロモーターの制御下にあり、第３のレポーター遺伝子が活性評価対象プロモーター
の制御下にあり、前記レポーター遺伝子を哺乳類細胞で一過性または安定発現可能に導入
してなる免疫毒性評価用哺乳類細胞であって、
哺乳類細胞がJurkat細胞であり、
第１、第２及び第３のレポーター遺伝子が、最大発光波長が、相互に２０ｎｍ以上相違す
るルシフェラーゼであり、
免疫毒性評価用プロモーターと活性評価対象プロモーターとの組み合わせが、IL-2遺伝子
プロモーターとIFN-γ遺伝子プロモーターの組み合わせである哺乳類細胞。
【請求項２】
別個のプロモーターの制御下にある３以上のレポーター遺伝子を有し、第１のレポーター遺伝子が定常発現プロモーターの制御下にあり、第２のレポーター遺伝子が免疫毒性評価用プロモーターの制御下にあり、第３のレポーター遺伝子が活性評価対象プロモーターの制御下にあり、前記レポーター遺伝子を哺乳類細胞で一過性または安定発現可能に導入してなる免疫毒性評価用哺乳類細胞であって、
哺乳類細胞がU937細胞であり、
第１、第２及び第３のレポーター遺伝子が、最大発光波長が、相互に２０ｎｍ以上相違す
るルシフェラーゼであり、
免疫毒性評価用プロモーターと活性評価対象プロモーターとの組み合わせが、IL-1βプロ
モーターとIL-8遺伝子プロモーターの組み合わせである哺乳類細胞。
【請求項３】
哺乳類に対する化学物質の免疫毒性を評価する方法であって、以下の工程：
工程１：請求項１又は２に記載の免疫毒性評価用哺乳類細胞に前記化学物質を接触させる工程、及び
工程２：前記化学物質の存在下、非存在下での、第２のレポーター遺伝子の発現の増減を
評価する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項４】
哺乳類に対する化学物質の免疫毒性と活性を同時に評価する方法であって、以下の工程：
工程１：請求項１又は２に記載の免疫毒性及び活性の同時評価用哺乳類細胞に前記化学物質を接触させる工程、及び
工程２：前記化学物質の存在下、非存在下での、第２のレポーター遺伝子及び第３のレポーター遺伝子の発現の増減を評価する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項５】
前記化学物質が薬物候補化合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
免疫毒性のない薬物のスクリーニング方法であって、以下の工程：
工程１：請求項１又は２に記載の免疫毒性評価用哺乳類細胞に薬物候補化合物を接触させる工程、及び
工程２：前記薬物候補化合物の存在下、非存在下での、第２のレポーター遺伝子の発現の増減を評価する工程、
工程３：第２のレポーター遺伝子の発現が変化しない化合物を選択する工程、を含むことを特徴とする、方法。
【請求項７】
免疫毒性がなく活性を有する薬物を選択する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項８】
請求項１又は２のいずれかに記載の哺乳類細胞の培養液中に薬物候補化合物を存在させて該哺乳類細胞を培養する工程、該候補化合物の存在下及び非存在下で前記第１，第２，必要に応じてさらに第３のレポーター遺伝子の発現産物を定量する工程を含む、免疫毒性のない薬物のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の哺乳類細胞の培養液中に薬物候補化合物を存在させて該哺乳類細胞を培養する工程、該候補化合物の存在下及び非存在下で前記レポーター遺伝子の発現産物であるレポーター蛋白量を定量する工程、及び、少なくとも一つのレポーター遺伝子に連結された少なくとも１つの免疫毒性評価用プロモーター、必要に応じてさらに少なくとも１つの評価対象プロモーターに対する該候補化合物の影響を評価する工程を包含する薬物のスクリーニング方法。
【請求項１０】
該候補化合物による処理後又は処理と同時に、phorbol myristate acetate（PMA)とIonomycin（PMA/Ionomycin）又はlipopoly saccharide（LPS）である細胞活性化剤で活性化処理する工程を含む、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
該候補化合物による処理の際に活性酸素阻害剤を加える工程を含む、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
別個のプロモーターの制御下にある２以上のレポーター遺伝子を有し、第１のレポーター遺伝子が定常発現プロモーターの制御下にあり、第２のレポーター遺伝子が免疫毒性評価用プロモーターの制御下にあり、前記レポーター遺伝子を哺乳類細胞で一過性または安定発現可能に導入してなる免疫毒性評価用哺乳類細胞であって、
哺乳類細胞がTHP-1細胞であり、
第１及び第２のレポーター遺伝子が、最大発光波長が、相互に２０ｎｍ以上相違するルシフェラーゼであり、
免疫毒性評価用プロモーターが、IL-8遺伝子プロモーターである哺乳類細胞の培養液中に薬物候補化合物を存在させて該哺乳類細胞を培養し、該候補化合物による処理の際に活性酸素阻害剤を加える工程、
該候補化合物の存在下及び非存在下で前記レポーター遺伝子の発現産物であるレポーター蛋白量を定量する工程、及び
少なくとも一つのレポーター遺伝子に連結された少なくとも１つの免疫毒性評価用プロモーター、必要に応じてさらに少なくとも１つの評価対象プロモーターに対する該候補化合物の影響を評価する工程を包含する薬物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数のレポーター遺伝子を発現可能となるように組み込んだ哺乳類細胞由来培養細胞を用いて複数の転写活性を直接比較することによって、免疫毒性を評価する方法、に関する。さらに詳しくは、種々の刺激によって活性が変化しない遺伝子プロモーターと複数の免疫毒性評価プロモーターなどの転写活性を同一細胞サンプルにおいて直接比較し、プロモーター活性の変化を解析する方法に関する。さらに本発明は、免疫毒性のない生理活性物質などの化学物質、特に薬物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫毒性とは、皮膚、腸管、気道などから生体内に取り込まれた化学物質により免疫系のホメオスタシスに異常を生じ、その結果、人体に何らかの障害が生じることと定義される。近年社会的な問題になっている、身の回りに存在する化学物質による接触皮膚炎、ディーゼルエンジン排気微粒子やホルマリンなどによるアトピー性皮膚炎、喘息などの有病率の増加などは、免疫毒性の代表的な例である。しかし、これまでは、化学物質による免疫毒性の評価は、医薬品、化粧品などの開発分野以外では、ほとんど顧みられてこなかった。また、評価方法も一部の例外を除き、動物実験に依存したもので、現時点では、数万とも言われる化学物質のハザードを免疫毒性の観点から適切に評価できるスクリーニング法は存在しない。最近、これまで主として行われてきた実験動物を用いた免疫毒性評価手法に代わり、化学物質の免疫毒性発現機序の分子レベルの知見に基づいた、培養細胞の評価系を用いた、高機能かつハイスループットな新規評価法が注目されている。【０００３】
特許文献１は、細胞内の複数のプロモーターを解析する手段を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】再表2004/099421
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、従来行われてきた実験動物を用いた免疫毒性評価手法に代わり、化学物質の免疫毒性発現機序の分子レベルの知見に基づいた培養細胞評価系によってハイスループットに解析する技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、T細胞系のJurkat細胞においては、免疫毒性は種々の化学物質刺激後にAP-1、NFAT、NF-κB転写因子活性が影響を受け、例えばそれらにより転写が調節されているIL-2遺伝子が、また、STAT1、STAT4、Tbet、Runx3、Hlx、Smad3/4転写因子活性が影響を受け、例えばそれらにより転写が調節されているIFN-γ遺伝子が指標となる可能性がある点を明らかにした。また、樹状細胞系のU937細胞においてはpurinergic receptorやmitogen activated protein kinaseの関与する刺激伝達系およびAP-1、NF-κB転写因子活性が影響を受け、例えばそれらにより転写が調節されているIL-8遺伝子が、また、NF-κB, AP-1, NF-IL6, CRE/ATF転写因子活性が影響を受け、例えばそれらにより転写が調節されているIL-1β遺伝子が指標となる可能性がある点を明らかにした。【０００７】
一方、免疫毒性を評価するためには複数の遺伝子を同時に解析することが重要であることから多色発光ルシフェラーゼによるマルチ遺伝子発現解析（特許文献１）を用いて、それぞれ遺伝子プロモーター下流に対象となるプロモーター配列を挿入したベクター群を構築、これをT細胞や単球細胞に導入した安定株を作成、免疫毒性の評価を行った。【０００８】
そこで化学物質処理単独刺激後、あるいは化学物質処理と共にphorbol myristate acetate（PMA)とカルシウムイオノフォアの一種であるIonomycinによる細胞活性化処理や、lipopoly saccharide（LPS）による細胞活性化処理を加え各ルシフェラーゼの活性を定量、併せて、各種化学物質評価した結果、デキサメサゾン、シクロスポリンなどの免疫抑制薬剤、ディーゼルエンジン排気微粒子、ホルマリンなどの環境汚染物質、dinitrochlorobenzen、ニッケルなど感作性物質の免疫毒性をハイスループットに評価できることを明らかにし本発明に至った。【０００９】
本発明は、以下の哺乳類細胞、スクリーニング方法、免疫毒性評価システムを提供するものである【００１０】
項１．  別個のプロモーターの制御下にある２以上のレポーター遺伝子を有し、第１のレポーター遺伝子が定常発現プロモーターの制御下にあり、第２のレポーター遺伝子が免疫毒性評価用プロモーターの制御下にあり、前記レポーター遺伝子を哺乳類細胞で一過性または安定発現可能に導入してなる免疫毒性評価用哺乳類細胞。
項２．  活性評価対象プロモーターの制御下にある第３のレポーター遺伝子をさらに有する、項１に記載の哺乳類細胞。
項３．  哺乳類細胞がJurkat細胞、U937細胞、またはTHP-1細胞である、項１又は２に記載の哺乳類細胞。
項４．  レポーター遺伝子がルシフェラーゼである項１〜３のいずれかに記載の哺乳類細胞。
項５．  ２以上のレポーター遺伝子の最大発光波長が、相互に２０ｎｍ以上相違する、項１〜４のいずれかに記載の哺乳類細胞。
項６．  哺乳類細胞がJurkat細胞であり、免疫毒性評価用プロモーターがIL-4、IL-2、IFNγ遺伝子からなる群より選択される遺伝子のプロモーターである、項３に記載の哺乳類細胞。
項７．  哺乳類細胞がU937細胞であり、免疫毒性評価用プロモーターがIL-1β及び／又はIL-8遺伝子のプロモーターである、項１に記載の哺乳類細胞。
項８．  哺乳類細胞がTHP-1細胞であり、免疫毒性評価用プロモーターがIL-1β及び／又はIL-8遺伝子のプロモーターである、項１に記載の哺乳類細胞。
項９．  哺乳類に対する化学物質の免疫毒性を評価する方法であって、以下の工程：
工程１：項１〜５のいずれかに記載の免疫毒性評価用哺乳類細胞に前記化学物質を接触させる工程（ここで、前記哺乳類細胞は、別個のプロモーターの制御下にある２以上のレポーター遺伝子を有し、第１のレポーター遺伝子が定常発現プロモーターの制御下にあり、第２のレポーター遺伝子が免疫毒性評価用プロモーターの制御下にあり、前記レポーター遺伝子は哺乳類細胞で一過性または安定発現可能に導入されている）
工程２：前記化学物質の存在下、非存在下での、第２のレポーター遺伝子の発現の増減を評価する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
項１０．  哺乳類に対する化学物質の免疫毒性と活性を同時に評価する方法であって、以下の工程：
工程１：免疫毒性及び活性の同時評価用哺乳類細胞に前記化学物質を接触させる工程（ここで、前記哺乳類細胞は、別個のプロモーターの制御下にある２以上のレポーター遺伝子を有し、第１のレポーター遺伝子が定常発現プロモーターの制御下にあり、第２のレポーター遺伝子が免疫毒性評価用プロモーターの制御下にあり、第３のレポーター遺伝子が活性評価対象プロモーターの制御下にあり、前記レポーター遺伝子は哺乳類細胞で一過性または安定発現可能に導入されている）
工程２：前記化学物質の存在下、非存在下での、第２のレポーター遺伝子及び第３のレポーター遺伝子の発現の増減を評価する工程、を含むことを特徴とする、方法。
項１１．  前記化学物質が薬物候補化合物である、項１０に記載の方法。
項１２．  免疫毒性のない薬物のスクリーニング方法であって、以下の工程：
工程１：免疫毒性評価用哺乳類細胞に薬物候補化合物を接触させる工程（ここで、前記哺乳類細胞は、別個のプロモーターの制御下にある２以上のレポーター遺伝子を有し、第１のレポーター遺伝子が定常発現プロモーターの制御下にあり、第２のレポーター遺伝子が免疫毒性評価用プロモーターの制御下にあり、前記レポーター遺伝子は哺乳類細胞で一過性または安定発現可能に導入されている）
工程２：前記薬物候補化合物の存在下、非存在下での、第２のレポーター遺伝子の発現の増減を評価する工程、
工程３：第２のレポーター遺伝子の発現が変化しない化合物を選択する工程を含むことを特徴とする、方法。
項１３．  前記哺乳類細胞が活性評価対象プロモーターの制御下にある第３のレポーター遺伝子をさらに有し、免疫毒性がなく活性を有する薬物を選択する工程を含む、項１２に記載の方法。
項１４．  項１〜５のいずれかに記載の哺乳類細胞の培養液中に薬物候補化合物を存在させて該哺乳類細胞を培養する工程、該候補化合物の存在下及び非存在下で前記第１，第２，必要に応じてさらに第３のレポーター遺伝子の発現産物を定量する工程を含む、免疫毒性のない薬物のスクリーニング方法。
項１５．  項１〜５のいずれかに記載の哺乳類細胞の培養液中に薬物候補化合物を存在させて該哺乳類細胞を培養する工程、該候補化合物の存在下及び非存在下で前記レポーター遺伝子の発現産物であるレポーター蛋白量を定量する工程、少なくとも一つのレポーター遺伝子に連結された少なくとも１つの免疫毒性評価用プロモーター、必要に応じてさらに少なくとも１つの評価対象プロモーターに対する該候補化合物の影響を評価する工程を包含する薬物のスクリーニング方法。
項１６．  該候補化合物による処理後又は処理と同時に、細胞活性化剤で活性化処理する工程を含む、項１５に記載のスクリーニング方法。
項１７．  該候補化合物による処理の際に活性酸素阻害剤を加える工程を含む、項１５に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１１】
近年社会的な問題になっている、身の回りに存在する化学物質による接触皮膚炎、ディーゼルエンジン排気微粒子やホルマリンなどによるアトピー性皮膚炎、喘息などの有病率の増加などは、免疫毒性の代表的な例である。【００１２】
本発明の細胞を用いると、T細胞における、IFN-γ遺伝子発現に関与するSTAT1、STAT4、Tbet、Runx3、Hlx、Smad3/4などの転写因子、IL-2遺伝子発現に関与するAP-1、NFAT、NF-κBなどの転写因子活性に影響を及ぼす化学物質の免疫毒性を評価することが可能となる。また、マクロファージ、樹状細胞におけるIL-8遺伝子発現に関与するAP-1、NF-κBなどの転写因子、IL-1β遺伝子発現に関与するNF-κB、AP-1、NF-IL6、CRE/ATFなどの転写因子活性に影響を及ぼす化学物質の免疫毒性を評価することも可能となる。実際、この評価法により、デキサメサゾン、シクロスポリンなどの免疫抑制薬剤、ディーゼルエンジン排気微粒子、ホルマリンなどの環境汚染物質、dinitrochlorobenzen、ニッケルなど感作性物質の免疫毒性をハイスループットに既存の結果と矛盾なく評価することができる。さらに、マクロファージ細胞株THP-1細胞やU937細胞におけるIL-8遺伝子発現に関与する化学物質の感作能を評価、及び活性酸素（Reactive Oxygen Species）産生阻害剤であるN-acetyl-cysteine（NAC）を加えることで、化学物質が接触アレルゲンもしくは一次刺激性物質であるか評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ルシフェラーゼ安定導入用発現プラスミドの構築。
【図２】ルシフェラーゼ安定導入用発現プラスミドの構築。
【図３】ルシフェラーゼ安定導入用発現プラスミドの構築。
【図４】IFN-γ遺伝子プロモーターのクローニングに用いたプライマー配列と配列番号14の塩基配列の位置関係を示した図。
【図５】IFN-γの転写活性を示すSLG発光値をSLRの発光値でそれぞれ正規化し(SLG/SLR)、この正規化された相対発光量をプロットした図。
【図６】PMA/Ionomycinで処理したサンプルと処理していないサンプルの相対発光量の比を算出しプロットした図。
【図７】クローン#8A2、#8G10、#10C6について、PMA/Ionomycinによる活性化処理の有無に対する各ルシフェラーゼの発光量をプロットした図。
【図８】SLRの発光値でそれぞれ正規化されたIL-4転写活性を示すSLG発光正規化値(SLG/SLO)、IFN-γの転写活性を示すSLO発光正規化値(SLO/SLR)、及び、PMA/Ionomycin処理に対する変動比をプロットした図。
【図９】Jurkat :IL2-SLG/IFNγ-SLO/G3PDH-SLR 4クローン#2F12、2H4、2A5、7C12について、PMA/Ionomycinによる活性化処理の有無に対する各ルシフェラーゼの発光量をプロットした図。
【図１０】SLRの発光値でそれぞれ正規化されたIL-2の転写活性を示すSLG発光補正値(SLG/SLO)、IFN-γの転写活性を示すSLO発光正規化値（SLO/SLR）、及び、PMA/Ionomycinによる活性化処理に対する変動比をプロットした図。
【図１１】U937:IL1β-SLG/IL8-SLO/G3PDH-SLRの代表的な6クローンについてのG3PDHの転写活性を示すSLR、IL-1βの転写活性を示すSLG、IL-8の転写活性を示すSLOの発光値をプロットした図。
【図１２】Jurkat #2H4細胞 測定時間の比較
【図１３】U937#6C12細胞 測定時間による刺激応答の比較
【図１４】免疫毒性評価の判定チャート
【図１５】THP-G8細胞を用いた感作性試験法のあらまし
【図１６】THP-G8細胞のDNCBおよびNiCl2に対する応答性
【発明を実施するための形態】
【００１４】
これまでは、化学物質による免疫毒性の評価は、医薬品、化粧品などの開発分野以外では、ほとんど顧みられてこなかった。また、評価方法も一部の例外を除き、動物実験に依存したもので、現時点では、数万とも言われる化学物質のハザードを免疫毒性の観点から適切に評価できるスクリーニング法は存在しなかった。
【００１５】
本発明は、これまで主として行われてきた実験動物を用いた免疫毒性評価手法に変わり、近年の化学物質の免疫毒性発現機序の分子レベルの知見に基づいた、培養細胞を用いた、高機能かつハイスループットな新規評価法を提供するものである。
【００１６】
本明細書において、免疫毒性とは、皮膚、腸管、気道などから生体内に取り込まれた化学物質により免疫系のホメオスタシスに異常を生じ、その結果、人体に何らかの障害が生じることと定義される。免疫毒性は、免疫賦活、免疫抑制、Thバランスなどにより評価することができる。
【００１７】
免疫毒性評価用の哺乳類細胞としては、Jurkat細胞、U937細胞、またはTHP-1細胞などが挙げられ、Jurkat細胞、U937細胞が好ましい。
【００１８】
免疫評価の対象となるプロモーターとしては、IL-4、IL-2、IL-8、IL-22、IL-12p40、HO-1、IL-1β及び／又はIFN-γなどの遺伝子のプロモーターが挙げられる。これらの少なくとも1種の遺伝子のプロモーター活性を定常発現プロモーターの発現を内部標準として評価し、それにより化学物質の毒性評価を行うことができる。免疫毒性評価用の哺乳類細胞と化学物質を接触させたときに、化学物質非接触時と比べ、IL-4、IL-2、IL-8、IL-22、IL-12p40、HO-1、IL-1β及びIFNγのmRNAもしくはタンパク質の発現量が増加(特に有意に増加)した場合、該化学物質は免疫を賦活化したと判断する。一方、IL-4、IL-2、IL-8、IL-22、IL-12p40、HO-1、IL-1β及びIFNγの発現量が低下した場合には、化学物質は免疫を抑制したと判定される。
【００１９】
活性評価に関しては、化学物質(例えば生理活性物質もしくは薬物)が、活性評価対象プロモーターの活性を増加もしくは減少(特に有意に増加もしくは減少)させた場合に、活性が高いもしくは低いと評価する。
【００２０】
免疫評価の対象となるプロモーターは、哺乳類細胞の種類によっても異なる。Jurkat細胞についてはIL-2、IL-4、IL-22、IFN-γが好ましく例示され、IL-2、IL-4、IFN-γが好ましく、これらは1つ又は2つ以上のプロモーターを組み合わせて使用することができる。好ましいJurkat細胞用のプロモーターの組合せとしては、IL-4とIFN-γの組合せ、IL-2とIFN-γの組合せが挙げられる。U937細胞についてはIL-1β、IL-8が好ましく例示され、これらは1つ又は2つ以上のプロモーターを組み合わせて使用することができる。好ましい組合せはIL-1βとIL-8の組合せである。またTHP-1細胞についてはIL-8が好ましく例示され、これらは1つ又は2つ以上のプロモーターを組み合わせて使用することができる。一方プロモーター配列は免疫毒性評価に最適化された転写開始点付近から上流に1 kb以上の配列が例示される。より詳しくは、IL-2遺伝子プロモーターとして配列番号２２（推定転写開始点3,003位）、IL-4遺伝子として配列番号１９（推定転写開始点4,996位）、IFN-γ遺伝子プロモーターとして配列番号１５（推定転写開始点4,986位）、IL-1β遺伝子プロモーターとして配列番号２５（推定転写開始点5,007位）、IL-8（推定転写開始点5.060位）として配列番号２８が例示され、免疫毒性評価に最適化されたプロモーター配列としては、それぞれ転写開始点から上流1kbから転写開始点までの配列を含むことが望ましい。前記推定転写開始点とは、それぞれの遺伝子のmRNAのReference Sequenceの5’末端の塩基とした。
【００２１】
本発明の哺乳類細胞は、定常発現プロモーターを有するものである。定常発現プロモーターとしては、G3PDH、TK、β-actinなどが挙げられ、G3PDHが好ましい。定常発現プロモーターは通常1つが哺乳類細胞内に導入されるが、2以上の定常発現プロモーターを細胞に導入してもよい。
【００２２】
本発明の哺乳類細胞は、免疫毒性の評価を行うための細胞であるので、生理活性物質、薬物候補化合物などの化学物質の活性評価対象遺伝子のプロモーターにレポーター遺伝子を連結した遺伝子構築物を細胞内に導入する必要は必ずしもないが、評価対象遺伝子のプロモーターを導入した細胞に薬物候補物質を作用させれば、薬物候補化合物の免疫毒性と活性評価を同時に行うことができる。
【００２３】
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、着色タンパク質などが挙げられるが、２種以上、好ましくは３種以上のレポーター遺伝子のシグナルを区別して検出することが必要であるので、ルシフェラーゼ遺伝子が好ましい。以下、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子の場合を例に挙げて説明する。
【００２４】
ルシフェラーゼ遺伝子は、２つ以上のルシフェラーゼ由来の発光量を測定し、それらの相対比率を算出することが重要であるので、２つ以上、好ましくは3つ以上のルシフェラーゼについて発光波長が測定条件（例えばｐＨ）に実質的に依存しない光を発光することが必要である。また、ルシフェラーゼが測定条件に依存しない光を発し、それらをカラーフィルター等で相互の光の発光量の比率を測定可能であるなら、フィルター前後での各発光の透過率より各発光は定量できるので、相互に分別可能な光を発光する２以上(好ましくは3以上)のルシフェラーゼが必要である。
【００２５】
本明細書において、「発光波長が測定条件に実質的に依存しない」とは、ｐＨ、温度、濃度などが変化しても、最大発光波長の変動が３ｎｍ以下、好ましくは２ｎｍ以下、さらに好ましくは１ｎｍ以下、特に好ましくは０．５ｎｍ以下である。最大発光波長の変化量がこの範囲内であれば、複数のルシフェラーゼ質の発現量をフィルター等で分離して定量する場合、相互のルシフェラーゼ質の比率がほとんど変化しないため好ましい。
【００２６】
２つ以上のルシフェラーゼが同じルシフェリンにより発光する場合、「発光波長が測定条件に実質的に依存しない」条件に当てはまる。２つ以上のルシフェラーゼについてルシフェリンが異なる場合、全てのルシフェラーゼについて、発光波長が測定条件に実質的に依存しないことが望ましい。
【００２７】
本明細書において、「相互に分別可能な光を発光する２以上(好ましくは3以上)のルシフェラーゼ」とは、例えばフィルター（カラーフィルター、バンドパスフィルターなど）を用いて相互の光の発光量の比率を測定可能であることを意味する。例えば、鉄道虫由来の赤色、緑色ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の橙色、緑色ルシフェラーゼなどは、フィルターを使用することにより、緑色同士を除き、相互の光の発光量の比率を測定可能である。相互の光の発光量の比率を測定可能であるためには、フィルターの性能や各発光スペクトルのピーク形状にもよるが、最大発光波長が通常２０ｎｍ以上、好ましくは３０ｎｍ以上、より好ましくは４０ｎｍ以上、特に好ましくは５０ｎｍ以上離れているのが好ましい。この程度の最大発光波長の分離があれば、例えば各最大波長間のフィルターを使用し、フィルターの前後での各発光の透過率を測定して換算することで、各発光の発光量を同時に定量することができる。
【００２８】
本発明で使用される好ましいルシフェラーゼは、鉄道虫由来の緑〜赤（その変異体を含む、最大発光波長：５３５〜６３５ｎｍ、例えば５４０〜６３０ｎｍ）のルシフェラーゼ、ヒカリコメツキムシのオレンジ〜緑（その変異体を含む、最大発光波長：５３０〜６００ｎｍ）のルシフェラーゼ、イリオモテホタルのオレンジ〜緑（その変異体を含む、最大発光波長：５５０〜５９０ｎｍ）のルシフェラーゼなどが挙げられる。例えば鉄道虫の場合、赤色最大発光波長６２２ｎｍと緑色最大発光波長５４５ｎｍのルシフェラーゼが知られているが（ＵＳ２００２／０１１９５４２−Ａ１）、この２種以外にも５４０〜６３５ｎｍの間の光を発光する多数のルシフェラーゼが存在していることを本発明者は確認しており、これらのルシフェラーゼは、全て使用可能である。例えば、鉄道虫由来の最大発光波長６２２ｎｍ（昆虫または大腸菌で発現）の赤色ルシフェラーゼは、哺乳類細胞中で発現すると最大発光波長が６３０ｎｍにシフトすることを本発明者は確認した。
【００２９】
特に、最大発光波長がある程度離れている複数のルシフェラーゼを有する鉄道虫、イリオモテボタルなどに由来するルシフェラーゼを使用する場合、１つの発光基質（例えば鉄道虫、イリオモテボタル、ヒカリコメツキムシ由来のルシフェラーゼではホタルルシフェリンを使用できる）を使用して、共発現させた複数のルシフェラーゼに由来する発光量の同時定量が可能であり、各プロモーターの発現量の比を正確に測定することができる。また、発光波長が測定条件（例えばｐＨ）に依存しない光を発光するルシフェラーゼとして、青色に発光するウミシイタケ・ルシフェラーゼ、渦鞭毛藻の各種ルシフェラーゼ（全配列或いはドメイン１，ドメイン２，ドメイン３などの発光ドメインを含む；特開２００２−３３５９６１；Ｌｉ Ｌ．，Ｈｏｎｇ Ｒ．，Ｈａｓｔｉｎｇ ＪＷ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）９４，８９５４）、ウミボタル・ルシフェラーゼ、ガウシア・ルシフェラーゼをさらに組み合わせて使用することができる。鉄道虫、イリオモテボタル、ヒカリコメツキムシ由来のルシフェラーゼを使用すると、ホタルルシフェリンを使用できるので、バックグラウンドを低くすることが可能である。また、渦鞭毛藻のルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせについても、バックグラウンドが低く好ましい。さらには、細胞外にルシフェラーゼが分泌するウミボタルやガウシア・ルシフェラーゼの組み合わせも、培養液の一部で細胞の活性を測定することからバックグラウンドに影響しないことから好ましい。
【００３０】
本発明の好ましい組み合わせとしては、定常発現プロモーターを鉄道虫赤色ルシフェラーゼ、毒性評価プロモーター1をイリオモテボタル橙色又は緑色ルシフェラーゼでモニターする方法である。さらに好ましくは、毒性評価プロモーター2または活性評価プロモーターとしてイリオモテボタル緑色又は橙色ルシフェラーゼでモニターすることによって、3つもプロモーター活性を同時に測定することが可能である。赤色、橙色、緑色ルシフェラーゼについては、互いに入れ替えることも可能である。さらに好ましい例として、定常発現プロモーターを鉄道虫赤色ルシフェラーゼ、毒性評価プロモーター1、２をイリオモテボタル緑色、橙色ルシフェラーゼで、活性評価プロモーターをウミボタル／渦鞭毛藻／ガウシア青色ルシフェラーゼで、モニターすることによって、4つのプロモーター活性を同時に測定する方法である。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態の１つにおいて、鉄道虫、イリオモテボタルのルシフェラーゼを使うことで１種類のルシフェリンでも少なくとも３つのプロモーターの発現量の定量が可能である（例えば鉄道虫の赤色ルシフェラーゼと、イリオモテボタルの橙色及び緑色ルシフェラーゼ）（ＶＲ．Ｖｉｖｉａｎｉ，Ａ．Ｕｃｈｉｄａ，Ｎ．Ｓｕｅｎａｇａ，Ｍ．Ｒｙｕｆｕｋｕ ＆ Ｙ．Ｏｈｍｉｙａ：Ｔｈｒ−２２６ ｉｓ ａ ｋｅｙ−ｒｅｓｉｄｕｅ ｆｏｒ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｅｅｔｌｅ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓ（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉ．２８０，１２８６−１２９１）。また、青色ルシフェラーゼ（ウミシイタケ、渦鞭毛藻またはウミボタルの各ルシフェラーゼ）を合わせて４種以上は可能である。上手なフィルター設定により５４０−６３５ｎｍ（緑から赤色）、好ましくは５４０−６３０ｎｍの中で複数の発現解析は可能であり、さらに基質の違う青色のルシフェラーゼにより１種類を加えることができる。よって、ルシフェラーゼの同時測定としては、同じルシフェリンで３つ以上、違うルシフェリンも用いて４つ以上の同時定量が可能である。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態としては、例えばレポーター遺伝子のｍＲＮＡのコピー数を増やすことであるので、例えばｃＤＮＡの配列を、昆虫のコドンユーセージ（コドンの使用頻度の偏り）を哺乳類用に変えること、さらには、余分な転写因子が結合しないように、ｃＤＮＡの配列を変えること、さらに使用上、制限酵素部位が多いことで応用が限定されることからそのｃＤＮＡを変えることが挙げられる。このような手法も、鉄道虫ルシフェラーゼ、イリオモテボタルルシフェラーゼの哺乳類細胞内での発現に有効であった。特にコドンユーセージ（コドンの使用頻度の偏り）を哺乳類用に変えること、さらには、余分な転写因子が結合しないように、ｃＤＮＡの配列を変えることは有効である。
【００３３】
ｃＤＮＡの配列の変更は、以下の点を１）〜４）の順に考慮して行うことができる：
１）ルシフェラーゼのアミノ酸配列はできるだけ変更しないのがよい（好ましくは全く変更しない）；
２）次に、余分な転写因子が結合しないように、ｃＤＮＡの配列を変更する；
３）さらに、ｃＤＮＡの配列において、昆虫のコドンユーセージを哺乳類用に変更する；４）必要に応じてさらに、制限酵素部位をなくすようにｃＤＮＡ配列を変更する。
【００３４】
上記は、鉄道虫由来のルシフェラーゼ、イリオモテボタルルシフェラーゼの発現について記載したが、ヒカリコメツキムシなどの他の生物由来のルシフェラーゼについても同様に当てはまる。
【００３５】
本明細書において、「ルシフェラーゼ」は、ルシフェラーゼなど、ルシフェリン光化学反応を触媒する発光酵素群を包含し、ルシフェラーゼにはエクオリンのようなものも含まれる。また、ルシフェリンの構造を変化させることにより発光作用を有するような、触媒作用（ルシフェリンを酸化して発光物質に変換する作用）の弱いタンパク質も、発光波長が測定条件（例えばｐＨ）に実質的に依存しない限り本発明のルシフェラーゼに含まれ得る。
【００３６】
ルシフェラーゼとしては、同一の発光基質で発光する２以上のルシフェラーゼの組み合わせが望ましい。測定条件により発光波長が実質的に変化せず、且つ、同一の発光基質で発光する好ましいルシフェラーゼとしては、鉄道虫由来の赤色ルシフェラーゼおよび鉄道虫由来の緑色ルシフェラーゼ、或いは５４０〜６３５ｎｍ程度、好ましくは５４０〜６３０ｎｍ程度の範囲の発光波長を有する鉄道虫由来の他のルシフェラーゼ、さらにはイリオモテボタル由来の緑色ルシフェラーゼおよびイリオモテボタル由来の橙色ルシフェラーゼが好ましく例示され、これ以外にも、ヒカリコメツキムシ由来の（５３０〜６００ｎｍ程度）ルシフェラーゼ、が例示される。特に、鉄道虫由来の赤色／緑色ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の橙色／緑色ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ量が同一であれば発光強度も同程度であるので、プロモーターの転写活性をマルチに定量するのに好都合である。
【００３７】
本発明において、哺乳類としては、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌが挙げられ、好ましくはヒトである。
【００３８】
少なくとも２つのルシフェラーゼ遺伝子は、同一の発光基質で異なる色を発光し、細胞内寿命が同程度であるのがよく、この点でも鉄道虫由来の赤色／緑色ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の橙色／緑色ルシフェラーゼは好ましく、特に鉄道虫由来の赤色ルシフェラーゼ、イリオモテボタル由来の橙色／緑色ルシフェラーゼは好ましい。
【００３９】
さらに、本発明で使用する発光波長が測定条件（例えばｐＨ）により変化しない少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのルシフェラーゼ及びこの標準化のための他のルシフェラーゼの各々異なる発光色は、フィルターで分離可能であることが、各発光色の簡単な装置での定量のために好ましい。
【００４０】
本発明のルシフェラーゼ遺伝子としては、野生型又は変異型ルシフェラーゼ遺伝子をそのまま使用することもでき、該ルシフェラーゼ遺伝子とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得るＤＮＡ、該ルシフェラーゼの１又は複数のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入され、且つルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを該ルシフェラーゼ遺伝子として使用することが可能である。
【００４１】
１つの好ましい実施形態において、本発明者は様々な発現系を検討することにより、ルシフェラーゼの哺乳類細胞での安定発現のためには、翻訳を効率化するエレメント及び／又はｍＲＮＡの安定化エレメントを遺伝子構築物に導入することが重要であることを見出した。翻訳を効率化するエレメントとしては、ｋｏｚａｋ配列（Ｋｏ）などが例示され、ｍＲＮＡの安定化エレメントとしては、β−ｇｌｏｂｉｎ ｉｎｔｒｏｎ ＩＩなどが例示される。また、ｃＤＮＡの配列を、昆虫のコドンユーセージ（コドンの使用頻度の偏り）を哺乳類用に変えること、さらには、余分な転写因子が結合しないように、ｃＤＮＡの配列を変えることもルシフェラーゼの哺乳類細胞での安定発現のために好ましいことを確認した。
【００４２】
一つの好ましい実施形態において、本発明の遺伝子構築物にはルシフェラーゼ遺伝子、該遺伝子の上流側にプロモーター、翻訳を効率化するエレメント及び／又はｍＲＮＡの安定化エレメントを含み、さらにエンハンサ、ＩＲＥＳ、ＳＶ４０ｐＡ、薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒなど）を含み得る。
【００４３】
本発明の好ましい遺伝子構築物の例を以下に示す。
（１）（毒性評価もしくは活性評価対象のプロモーター）−（コザック配列）−（赤、緑又は橙色ルシフェラーゼ）−（ＳＶ４０ポリＡ配列）
（２）（毒性評価もしくは活性評価対象のプロモーター）−（コザック配列）−（赤、緑又は橙色ルシフェラーゼ）−（ＩＲＥＳ）−（Ｎｅｏｒ遺伝子などの薬剤耐性遺伝子）−（ＳＶ４０ポリＡ配列）
【００４４】
本発明の遺伝子構築物は、そのままで哺乳類細胞に導入してもよいが、ベクター（例えばプラスミドやウイルスベクターを含む）に組み込んで哺乳類細胞に導入するのが好ましい。遺伝子構築物に複数のルシフェラーゼを発現可能に組み込んだ場合には、１つの遺伝子構築物または発現ベクターを哺乳類細胞に導入すればよいが、１つの遺伝子構築物に１つのルシフェラーゼを組み込んだ場合には、複数の遺伝子構築物または発現ベクターを同時にまたは逐次的に哺乳類細胞に常法に従って導入すればよい。
【００４５】
好ましい実施形態において、免疫毒性の評価法は、Jurkat細胞、U937細胞、THP-1細胞に、以下に述べる遺伝子プロモーター下流に多色発光ルシフェラーゼを含む遺伝子を導入した長期安定培養細胞から構築される。具体的には、東洋紡製赤色発光ルシフェラーゼベクター（pSLR）、橙色発光ルシフェラーゼベクター（pSLO）、緑色発光ルシフェラーゼベクター（pSLG）を好ましく用いることができる。Jurkat細胞においては、種々の化学物質刺激後に変動が予想される細胞数を補正するための内部標準としてG3PDH遺伝子プロモーターをpSLRに、T細胞におけるAP-1、NFAT、NF-κB転写因子活性化の指標としてIL-2遺伝子プロモーターをpSLGに、また、T細胞におけるSTAT1、STAT4、Tbet、Runx3、Hlx、Smad3/4転写因子活性化の指標としてIFN-γ遺伝子プロモーターをpSLOに挿入したプラスミド群を用い、それらを導入した安定細胞株Jurkat#2H4を作成した。IL-2遺伝子及びIFN-γ遺伝子のプロモータ配列は、転写開始点上流1 kb、さらに好ましくは3 kb以上を含むものである。より詳しくは、IL-2遺伝子プロモーターとしては、上流3kbの配列が配列番号22に記載され、転写開始点が3,003位付近と推測されることから、上流1kbとは配列番号22の2,003位付近から下流の配列、上流3kbとは配列番号22の3位付近から下流の配列を意味する。一方、IFN-γ遺伝子プロモーターとしては、上流5kbの配列が配列番号14に記載され、転写開始点が4,986位付近と推測されることから、上流1kbとは3,986付近から下流の配列、上流3kbとは1,986位付近から下流の配列を意味する。また、U937においては、G3PDH遺伝子プロモーターをpSLR、purinergic receptorやmitogen activated protein kinaseの関与する刺激伝達系およびAP-1、NF-κB転写因子活性化の指標としたIL-8遺伝子プロモーターをpSLGに、また、NF-κB、AP-1、NF-IL6、CRE/ATF転写因子活性化の指標としてIL-1β遺伝子プロモーターをpSLOに挿入したプラスミド群を用い、それらを導入した安定細胞株U937#6C12を作成した。IL-8遺伝子及びIL-1β遺伝子のプロモーター配列は転写開始点上流1 kb、さらに好ましくは3 kb以上を含むものである。より詳しくは、IL-8遺伝子プロモーターとしては、上流5kbの配列が配列番号28に記載され、転写開始点が配列番号28の5,060位付近と推定されることから、上流1kbとは4,060位付近から下流の配列、上流3kbとは2,060位付近から下流の配列を意味する。一方、IL-1β遺伝子プロモーターとしては、上流5kbの配列が配列番号25に記載され、転写開始点が5,007位付近と推定されることから、上流1kbとは4,007位付近から下流の配列、上流3kbとは2,007位付近から下流の配列を意味する。さらにTHP-１においてはG3PDH遺伝子をpSLR、purinergic receptorやmitogen activated protein kinaseの関与する刺激伝達系およびAP-1、NF-κB転写因子活性化の指標としたIL-8遺伝子をpSLGに挿入したプラスミド群を用い、それらを導入した安定細胞THP-G8株を作成した。化学物質の評価に際しては、Jurkat#2H4株に関しては、必要に応じて、化学物質処理後にPMAとIonomycinによる刺激を加え、SLO、SLR、SLG３色のルシフェラーゼ活性を定量した。U937#6C12株に関しては、必要に応じて、化学物質処理後にLPSによる刺激を加えルシフェラーゼ活性を定量した。またTHP-G8株に関しては必要に応じて、化学物質処理後にLPSによる刺激を加えルシフェラーゼ活性を定量した。さらにTHP-G8株では活性酸素（Reactive Oxygen Species）産生阻害剤であるN-acetyl-cysteine（NAC）を処理してルシフェラーゼ活性を定量した。いずれの場合も化学物質処理後、24時間培養後に、望ましくは12時間培養後に、さらに望ましくは6時間培養後に測定することでルシフェラーゼ活性を定量した。
【００４６】
その結果、この評価法により、デキサメサゾン、シクロスポリンなどの免疫抑制薬剤、ディーゼルエンジン排気微粒子、ホルマリンなどの環境汚染物質、dinitrochlorobenzen、ニッケルなど感作性物質の免疫毒性をハイスループットに既存の知識と矛盾なく評価できた。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例に従いより詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されないことは言うまでもない。【００４８】
実施例1  ルシフェラーゼ安定導入用発現プラスミドの構築
多色発光細胞の構築にさきがけ、赤、橙、緑の3色の発光ルシフェラーゼ（SLR、SLO、SLG）を発現するスタンダードタイプのベクターpSLR-test、pSLO-test、pSLG-test（東洋紡績）のルシフェラーゼ遺伝子及びそれにつながるpolyA付加シグナルの下流に、ピューロマイシン、ネオマイシン（G418）、ハイグロマイシンBに対する薬剤耐性遺伝子コーディング配列（Streptomyces puromycin N-acethyltransferase、aminoglycoside 3’-transferase遺伝子、E. coliハイグロマイシン耐性遺伝子）を、哺乳類細胞において安定発現可能なようにSV40プロモーター配列及びHSVtk polyA付加配列とともにそれぞれ挿入し、安定導入用のベクターを構築した。【００４９】
まず、図1に示すように、まず、SV40プロモーターについては、5’末端に制限酵素Sac Iの認識配列、3’末端に制限酵素Swa Iの認識配列を付加するように設計したオリゴヌクレオチド（配列番号1、2）をプライマーとして、プラスミドpPur(クロンテック)を鋳型にPCR酵素KOD -Plus-（東洋紡績社製）を用いたPCRで増幅した。この際、Swa I配列を含むオリゴヌクレオチドは、あらかじめT4 Polynucleotide Kinase（東洋紡績）を用いて5’末端をリン酸化した。一方、HSVtk polyA付加配列については、5’末端に制限酵素Pac Iの認識配列、3’末端に制限酵素BamH Iの認識配列を付加するように設計したオリゴヌクレオチド（配列番号3、4）をプライマーとして、プラスミドpTK-hyg（クロンテック）を鋳型にPCRで増幅した。この際、Pac I配列を含むオリゴヌクレオチドは、あらかじめT4 Polynucleotide Kinase を用いて5’末端をリン酸化した。その後、SV40プロモーター断片をSac I、HSVtk polyA断片をBamH I、赤色発光プローブ遺伝子のスタンダードベクターpSLR-test(東洋紡績)とSac IとBamH Iでそれぞれ消化し、ライゲーション、形質転換を実施し、SV40プロモーター、HSVtk polyA付加配列が挿入されたpSLR-test(Pr,pA)を取得した。【００５０】
続いて、pSLR-test(Pr,pA)の制限酵素Swa I、Pac Iサイトの間に、薬剤耐性遺伝子のORFを挿入した。詳しくは、図2に示すように、各薬剤遺伝子の5’末端にSwa I、3’末端にPac Iの認識配列を付加するように設計したオリゴヌクレオチドプライマー（ハイグロマイシン耐性遺伝子については配列番号5、6、ネオマイシン耐性遺伝子については配列番号7、8、ピューロマイシン耐性遺伝子については配列番号9、10）を用いて、プラスミドpTK-hyg、pOPI3CAT（ストラタジーン）、またはpPurを鋳型に、各薬剤耐性遺伝子断片をPCRで増幅し、これら断片とpSLR-test(Pr,pA)をSwa I（Smi I）、Pac Iで消化後、ライゲーション、形質転換を実施し、pSLR-test(Neo)、pSLR-test(Hyg)、pSLR-test(Pur)を取得した。挿入された薬剤耐性遺伝子には、タンパク質への翻訳効率を高めるため、薬剤耐性遺伝子ORFの開始メチオニンに相当するコドン配列のすぐ上流にKozak配列を導入している。【００５１】
最後に、赤色発光ベクターから、ハイグロマイシン、ネオマイシン薬剤耐性遺伝子の発現カセットを緑色、橙色発光ベクターへ移した。具体的には、図3に示すように、pSLR-test(Hyg)、pSLR-test(Neo)をSac I、BamH Iで消化して、(SV40プロモーター)−（Hygromycin耐性遺伝子）−（HSVtk polyA）、または（SV40プロモーター）−（Neomycin耐性遺伝子）−（HSVtk pA）の各カセットを切り出し、同じくSac I、BamH Iで消化したスタンダードタイプのpSLG-test、pSLO-testとそれぞれライゲーション反応を行い、pSLG-test(Hyg)、pSLO-test(Neo)を構築した。【００５２】
実施例２  G3PDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)遺伝子発現制御領域のクローニング
転写開始点データベースDBTSS（非特許文献1）(http://dbtss.hgc.jp/)よりG3PDH遺伝子のmRNAのReference Sequence  No. NM_002046の5’末端を転写開始点として想定し、上流1,373b、下流128 bの配列を抽出した（配列番号11）。当該領域をクローニングすべく、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号12、13）を設計し、ヒトゲノムDNAを鋳型としてPCRによって核酸断片を増幅し、制限酵素Mlu I、EcoR Iで当該断片とpSLR-test/Purを消化した後、ライゲーション反応を行い、pG3PDH-SLR/Purを構築した。
（非特許文献1 Suzuki Y. et al. Nucleic Acids Res. 30, 328-331 (2002)）【００５３】
実施例3  IFN-γ遺伝子発現制御領域のクローニング
転写開始点データベースDBTSSよりIFN-γ遺伝子のmRNAのReference Sequence  No. NM_000619の5’末端を転写開始点として想定し、上流4,985 b、下流91 bの配列を抽出した（配列番号14）。この配列をもとに、上流5 kbp、1 kbpまたは0.5 kbpから下流0.1 kbをクローニングすべく、上流側のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号15、16、17）及び下流側のプライマー（配列番号18）を設計し、ヒトゲノムDNAを鋳型として高正確性PCR酵素KOD -Plus-（東洋紡績）を用いたPCRによって-4985位〜+91位、-965位〜+91位、-480位〜+91位の核酸断片を増幅した。図４に、PCRに用いたプライマーの塩基配列と配列番号14の塩基配列の位置関係を示した。また、このプライマーには、上流側5’末端に制限酵素Sal I、下流側5’末端に制限酵素Nhe Iの認識配列を付加しておき、前記核酸断片及び発光プローブベクターpSLG-test(Hyg)、pSLO-test(Neo)を制限酵素Sal I、Nhe Iで消化した後、ライゲーション反応を行い、pIFNγ 5k-SLG/Hyg，pIFNγ1k-SLG/Hyg，pIFNγ 0.5k-SLG/Hyg，pIFNγ 5k-SLO/Neo，pIFNγ 1k-SLO/Neo, IFNγ 0.5k-SLO/Neoを各々構築した。【００５４】
実施例４  一過的発現によるIFN-γ遺伝子構築物の反応性の確認
Jurkat human acute T lymphoblastic leukemia cell line (ATCC, Manassas, VA, USA) （以下、Jurkat細胞）を10% 非動化済みFetal bovine serum (FBS) (GIBCO)を添加したRPMI1640 (GIBCO)で培養し、トランスフェクションの直前に、24ウェルプレートに1×106cells播種した。1ウェル当たり、IFN-γ発光プローブ発現プラスミドpIFNγ 5k-SLG/Hyg、pIFNγ1k-SLG/Hyg、またはpIFNγ0.5k-SLG/Hygをそれぞれ、インターナルコントロールとなるpG3PDH-SLRと1：1で1 μgとなるように混合し、SuperFect Transfection Reagent (Qiagen社製) 8 μlとインキュベートし、Jurkat細胞にトランスフェクションした。翌日、いったん細胞を回収し、1ウェルあたり1 mlのPRMI1640+10% FBS培地に細胞を懸濁し、1 μM Ionomycin、25 nM PMAで3、5、7、24時間処理し、100 μｌを分取し、同量の発光試薬MultiReporter Assay System Tripluc Assay Reagent（登録商標、東洋紡績）を加えて、AB−2250ルミネッセンサーMCA（アトー）で発光量を測定した。IFN-γの転写活性を示すSLG発光値をインターナルコントロールであるSLRの発光値でそれぞれ正規化し(SLG/SLR)、この正規化された相対発光量をプロットしたものが図５である。さらに、PMA/Ionomycinで処理したサンプルと処理していないサンプルの相対発光量の比を算出しプロットしたものが図６である。この結果、IFN-γの上流5 kbを含む遺伝子構築物について、PMA/Ionomycinによる活性化処理に対し、特に顕著な発現誘導が認められ、マーカーとして有用であると考えられた。【００５５】
実施例５  IL-4、IL-2遺伝子発現制御領域のクローニング
IL-4遺伝子について、転写開始点データベースDBTSSより、mRNAのReference Sequence  No. NM_000589の5’末端を転写開始点として想定し、上流4,995 b、下流166 bの配列を抽出した（配列番号19）。この配列をもとに、上流5 kbpから下流0.2 kbをクローニングすべく、上流側のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号20）及び下流側のプライマー（配列番号21）を設計し、ヒトゲノムDNAを鋳型としてKOD -Plus-を用いたPCRによって当該領域の核酸断片を増幅した。また、IL-2遺伝子については、同様に、転写開始点データベースDBTSSより、mRNAのReference Sequence  No. NM_000586の5’末端を転写開始点として想定し、上流3,002 b、下流280 bの配列を抽出した（配列番号22）。この配列をもとに、上流3 kbpから下流0.3 kbをクローニングすべく、上流側のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号23）及び下流側のプライマー（配列番号24）を設計し、当該領域の核酸断片をPCRで増幅した。この際、IL-4遺伝子については、オリゴヌクレオチドの上流側5’末端に制限酵素Sal I、下流側5’末端に制限酵素Nhe Iの認識配列を、IL-2遺伝子については、オリゴヌクレオチドの上流側5’末端に制限酵素Xho I、下流側5’末端に制限酵素Mlu Iの認識配列を付加しておき、前記核酸断片及び発光ベクターpSLG-test(Hyg)を制限酵素Sal I、Nhe I、またはXho I、Mlu Iで消化した後、ライゲーション反応を行い、pIL4-SLG/Hyg及びpIL2-SLG/Hygを構築した。【００５６】
実施例6  2色細胞Jurkat : IFNγ-SLO/G3PDH-SLRの樹立
24ウェルプレートに1.5×106cells/mlで350 μl/wellずつ4ウェルにJurkat細胞を播種し、1 μg/wellずつpG3PDH-SLR/Purのトランスフェクションし、翌日、細胞を4ウェル分まとめて回収し、0.1 μg/ml Puromycin（Invivogen）を含むRPMI1640+10% FBS培地5 mlに置換して60 mmディッシュで一週間選択培養を実施した。続いて、96ウェルプレートに1 cell/well、または200 cells/wellになるように細胞を播種した後、2週間、二次選択培養を行った。ここで得られた細胞のうち、シグナルが良いクローンについて、Puromycin濃度を0.15 μg/mlに上げて1 cell/wellでリクローニングを実施した。この際、フィーダー細胞として未導入Jurkat細胞を200 cells/well添加した。ここで増殖が認められたクローンについて、2×105 cells(100 μl)の細胞を用いてルシフェラーゼアッセイを行い、G3PDH-SLRの発光シグナルの高い安定導入株Jurkat:G3PDH-SLR #14D1を樹立した。【００５７】
続いて、前記クローン#14D1に、前記と同じ要領でpIFNγ5k-SLO/Neoをトランスフェクションし、翌日、0.15 μg/ml Puromycin 及び300 μg/ml G418（ナカライテスク）を含むRPMI1640+10% FBS培地に置換して一週間選択培養を実施した。さらに、1 cell/well、または100 cells/well で96ウェルプレートに播種して2週間の二次選択培養を行い、ここで増殖が認められたクローンについては、白色96ウェルプレート上で2×105 cells(100μl)の細胞をPMA/Ionomycinで処理してルシフェラーゼアッセイを実施し、ARVOmx（パーキンエルマー社製）を用いて発光量を測定し、各色のシグナル強度及び2色のバランスから、Jurkat : IFNγ-SLO/G3PDH-SLR導入株としてクローン#2B12を樹立した。【００５８】
実施例７  3色細胞Jurkat :IL4-SLG/IFNγ-SLO/G3PDH-SLRの樹立
続いて、前記Jurkat : IFNγ-SLO/G3PDH-SLR #2B12株に、前記と同じ要領でpIL4-SLG/Hygをトランスフェクションし、翌日、0.15 μg/ml Puromycin、300 μg/ml G418、200 μg/ml Hygromycin（Invivogen）を含むRPMI1640+10% FBS培地5 mlに置換して60 mmディッシュで選択培養を実施した。さらに、1 cell/well、または100 cells/well で96ウェルプレートに播種してクローニングを行い、ここで増殖が認められたクローンについては、白色96ウェルプレート上で2×105cells(100 μl)の細胞をPMA/Ionomycinで処理してルシフェラーゼアッセイを実施し、ARVOmx（パーキンエルマー社製）を用いて発光量を測定し、3色のバランスを評価し、3クローンを取得した。図７は、取得したJurkat : IL4-SLG/IFNγ-SLO/G3PDH-SLR導入株としてクローン#8A2、#8G10、#10C6について、PMA/Ionomycinによる細胞活性化処理の有無に対する各ルシフェラーゼの発光量をプロットしている。図８は、インターナルコントロールであるSLRの発光値でそれぞれ正規化されたIL-4転写活性を示すSLG発光正規化値(SLG/SLO)、IFN-γの転写活性を示すSLO発光正規化値(SLO/SLR)、及び、PMA/Ionomycin処理に対する変動比をプロットしている。この結果、いずれのクローンも細胞活性化処理に対して応答性を示すことを確認した。IL-4については、2倍前後の応答性に対し、IFN-γは5〜7倍の大きな応答性を示すことが確認された。【００５９】
実施例8  3色細胞Jurkat :IL2-SLG/IFNγ-SLO/G3PDH-SLRの樹立
続いて、pIL4-SLG/Hygの代わりに、pIL2-SLG/Hygを、前記Jurkat : IFNγ-SLO/G3PDH-SLR #2B12株に、前記と同じ要領でpIL2-SLG/Hygをトランスフェクションし、翌日、0.15 μg/ml Puromycin、300 μg/ml G418、200 μg/ml Hygromycinを含むRPMI1640+10% FBS培地5 mlに置換して60 mmディッシュで選択培養を実施した。さらに、200 cells/well で96ウェルプレートに播種してクローニングを行い、ここで増殖が認められたクローンについては、白色96ウェルプレート上で2×105cells(100 μl)の細胞をPMA/Ionomycinで処理してルシフェラーゼアッセイを実施し、ARVOmx（パーキンエルマー社製）を用いて発光量を測定し、3色のバランスを評価した。図９は、取得したJurkat :IL2-SLG/IFNγ-SLO/G3PDH-SLR 4クローン#2F12、2H4、2A5、7C12について、PMA/Ionomycinによる細胞活性化処理の有無に対する各ルシフェラーゼの発光量をプロットしている。図１０は、インターナルコントロールであるSLRの発光値でそれぞれ正規化されたIL-2の転写活性を示すSLG発光補正値(SLG/SLO)、IFN-γの転写活性を示すSLO発光正規化値（SLO/SLR）、及び、PMA/Ionomycin細胞活性化処理に対する変動比をプロットしている。IL-2については、PMA/Ionomycinによる細胞活性化処理なし時のシグナルがほとんどゼロであったことから、変動比を省略した。この結果、いずれのクローンも細胞活性化処理に対して非常に高い応答性を示すことを確認した。特に、IFN-γについても5〜9倍程度の応答性が認められ、良好なマーカーであるが、さらにIL-2では細胞活性化処理なしではほとんど転写活性が認められず、細胞活性化処理で高いシグナルが認められるようになることから、感度の高いマーカーであることが分かる。以後の解析にはJurkat : :IL2-SLG/IFNγ-SLO/G3PDH-SLR #2H4株（Jurkat#2H4）を用いた。【００６０】
実施例9  IL-1β遺伝子、IL-8遺伝子発現制御領域のクローニング
IL-1β遺伝子について、転写開始点データベースDBTSSより、mRNAのReference Sequence  No. NM_000576の5’末端を転写開始点として想定し、上流5.006 b、下流56 bの配列を抽出した（配列番号25）。この配列をもとに、上流5 kbpから下流0.2 kbをクローニングすべく、上流側のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号26）及び下流側のプライマー（配列番号27）を設計し、ヒトゲノムDNAを鋳型としてKOD -Plus-を用いたPCRによって当該領域の核酸断片を増幅した。また、IL-8遺伝子については、同様に、転写開始点データベースDBTSSより、mRNAのReference Sequence  No. NM_000584の5’末端を転写開始点として想定し、上流5,059 b、下流144 bの配列を抽出した（配列番号28）。この配列をもとに、上流5 kbpから下流0.1kbをクローニングすべく、上流側のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号29）及び下流側のプライマー（配列番号30）を設計し、当該領域の核酸断片をPCRで増幅した。この際、IL-1β遺伝子については、オリゴヌクレオチドの上流側5’末端に制限酵素Cla I、下流側5’末端に制限酵素Mlu Iの認識配列を、IL-8遺伝子については、オリゴヌクレオチドの上流側5’末端に制限酵素SalI、下流側5’末端に制限酵素Mlu Iの認識配列を付加しておき、前記核酸断片及び発光プローブベクターpSLG-test(Hyg)を制限酵素Cla I、Mlu I、またはSal I、Mlu Iで消化した後、ライゲーション反応を行い、pIL1β-SLG/Hyg及びpIL8-SLO/Neoを構築した。【００６１】
実施例10  3色細胞U937 : IL1β-SLG /IL8-SLO/G3PDH-SLRの構築
マクロファージ細胞株U937細胞に対して、24ウェルプレートに1×106cells/mlで500 μl/wellずつ4ウェルに細胞を播種し、Lipofectamine LTX（インビトロジェン）を用いて、2.5μg/wellずつpG3PDH-SLR/Purのトランスフェクションし、翌日、細胞を4ウェル分まとめて回収し、0.15 μg/ml Puromycinを含むRPMI1640+10% FBS培地5 mlに置換して60mmディッシュで一週間選択培養を実施した。続いて、96ウェルプレートを用いて、1 cell/wellで播種し、フィーダー細胞として未導入U937細胞を200 cells/well追加する方法で二次選択を行った。増殖が認められたクローンについて、発光シグナル、細胞の増殖性、pIL1β-SLGのトランスフェクションによる一過的発現を評価し、U937 : G3PDH-SLR #9A6を取得した。【００６２】
次に、前記#9A6株に、同様の要領で、pIL1β-SLG/Hygをトランスフェクションし、一次選択、二次選択を実施した。事前のHygromycin濃度検討を行った結果から、80 μg/ml及び120 μg/mlで薬剤選択を実施した。しかしながら、2週間の一次選択の結果、生細胞が極めて少なかったことから、12日間、抗生物質を抜いて培養し、生存・増殖が確認された後、再度、0.15 mg/ml Puromycin、及び80 μg/mlまたは120 μg/ml Hygromycinを添加した培地に戻し、二次選択を実施した。この結果、120 μg/ml Hygromycin による選択から、良好な2色細胞を獲得した。各色のシグナル強度、バランス、IL-1βの誘導率から7クローンに絞り込み、さらに、細胞増殖性を重視し、2色細胞U937:IL1β-SLG/G3PDH-SLRとして#6C12を選定した。【００６３】
続いて、前記#6C12株に、同様の要領で、pIL8-SLO/Neoをトランスフェクションし、その後、一次選択、二次選択を実施した。選択薬剤は0.15 μg/ml Puromycin、300 μg/ml G418、Hygromycinについては120 μg/mlまたは200 μg/mlで選択を開始し、それぞれの選択で生細胞を確認後、二次選択を行った。その結果、U937 : IL1β-SLG/G3PDH-SLR #6C12を親細胞とした系列で、Hygromycin 120 μg/mlの条件で68クローン、200 μg/mlの条件での選択で17クローンに成功した。取得したクローンについて、1×105 cellsを10 μg/ml LPS (Sigma)で6時間処理し、ルシフェラーゼアッセイを行い、シグナル強度、応答性を評価した。図１１には、そのうち代表的な6クローンについてのインターナルコントロールであるG3PDHの転写活性を示すSLR、IL-1βの転写活性を示すSLG、IL-8の転写活性を示すSLOの発光値をプロットしている。さらに、インターナルコントロールSLRでそれぞれ正規化されたIL-1β転写活性を示すSLG発光正規化値(SLG/SLO)、IL-8の転写活性を示すSLO発光正規化値(SLO/SLR)を算出し、未処理に対するLPS細胞活性化処理後の変動比をプロットしている。【００６４】
この結果、細胞活性化処理によって、IL-1βについては5〜10倍、IL-8については11〜21倍という高い応答を示したことから、マーカーとして良好な転写調節領域を取得できたと考えられる。以後の解析にはU937 : IL1β-SLG /IL8-SLO/G3PDH-SLR  #6C12株（U937#6C12）を用いた。【００６５】
実施例11  Jurakt#2H4細胞における細胞活性化処理時間の検討
Jurkat#2H4細胞における化学物質免疫毒性を高感度に再現性良く評価するためにPMA/Ionomycinによる細胞活性化処理時間を検討した。Jurkat＃2H4細胞を4×105cell/wellで黒色プレートに播種した後、1 μM PMA/25 nM Ionomycinを加えて、一定時間保持後に、540 nm及び590 nmのロングパスフィルターを組み込んだMithrasLB960（ベルトールドテクノロジー）において、ルシフェリン溶液を加えて、２秒間発光値を測定した。図１２は6時間後、24時間後に測定した結果であり、内部標準であるG3PDHの転写活性を示すSLR、IL-2の転写活性を示すSLG、IFN-γの転写活性を示すSLOの発光値をプロットしている。さらに、インターナルコントロールSLRでそれぞれ正規化されたIL-2転写活性を示すSLG発光正規化値(SLG/SLO)、IFN-γの転写活性を示すSLO発光正規化値(SLO/SLR)を算出し、未処理に対するPMA/Ionomycin活性化処理後の変動比をプロットしている。その結果、6時間、24時間後のどちらにおいてもPMA/Ionomycinの添加により、IL2-SLG及びIFNγ-SLOの強度は増強、各標的遺伝子のプロモーター領域は活性化された。【００６６】
しかしながら、内部標準であるG3PDH-SLRの強度は6時間ではほとんど変化がなかったのに対し24時間において非常に低下することが示された。加えてIL-2及びIFN-γの強度も、24時間では低下していることが示されたことから、24時間後のアッセイでは適さないことが示された。処理後6時間では、内部標準が動かないことに加え、PMA/Ionomycin細胞活性化処理により各標的遺伝子の誘導が十分見られた。よって、以後Jurkat#2H4細胞では化学物質処理時間を6時間としてアッセイすることにした。【００６７】
実施例12  U937#6C12細胞における細胞活性化処理時間の検討
U937#6C12細胞における化学物質免疫毒性を高感度に再現性良く評価するためLPSによる細胞活性化処理時間を検討した。U937細胞を5×105 cell/wellで黒色プレートに播種した後、100 ng/ml LPSを加えて、一定時間保持後に、Phelios（アトー）において、ルシフェリン溶液を加えて、5秒間発光値を測定した。図１３で明らかなように、時間が経つに従い、LPSの添加によりIL1β-SLG及びIL8-SLOの強度は増強、各標的遺伝子のプロモーターが活性化されていることを確認した。処理時間と共に活性化を示すシグナル強度は増加したが9時間を経過すると、シグナル強度は低下することが示されたことから、それ以降の測定では、十分な強度が得られなかった。【００６８】
さらに6時間と8時間のLPSに対するシグナル強度の変化がほとんど変わりなかった。よって、以後U937#6C12細胞では化学物質処理時間を6時間としてアッセイすることにした。【００６９】
実施例13 Jurkat#2H4細胞、U937#6C12細胞における化学物質評価
Jurkat#2H4細胞安定株に関しては、サイトカイン(例としてIL-10, IL-4, IFN-γ, IP-10)、医薬品（例としてデキサメサゾン、シクロスポリン、マイトマイシンC、ビタミンD）、環境化学物質(例としてニッケル、ホルマリン、ディーゼルエンジン排気微粒子)、感作性物質(例としてtrimellitic anhydride (TMA)、dinitrochlolobenzene (DNCB))を評価した。また、U937#6C12に関しては、医薬品（例としてデキサメサゾン、シクロスポリン）、環境化学物質(例としてホルマリン、ディーゼルエンジン排気微粒子)を評価した。
Jurkat#2H4細胞については、試験前々日もしくは前日に継代及び培地交換した細胞を、greiner社製の96ウェル黒プレートに4×105cells/wellで播種した。次いでサイトカイン（IL-4、IL-10、IFN-γ、IP-10; 10, 30, 100 ng/ml）、デキサメサゾン（Dex）; 0.1, 1, 10 μM、シクロスポリン（CyA）; 0.01, 0.1, 1 μM、マイトマイシンC; 0.08, 0.4, 2, 10, 50 μg/ml、ビタミンD; 0.1, 1, 10 μM, ニッケル; 100, 300, 1000 μM、ホルマリン; 100, 150, 200, 250, 300 μM, ディーゼルエンジン排気微粒子（Diesel exhaust particles; DEP）; 10, 30, 100 μg/mlで処理を行い、37℃5%CO2でインキュベートした。次いで、化学物質処理して1時間後にPMA (終濃度1 μM) 及びIonomycin (終濃度25 nM)による細胞活性化処理を行い、さらに37℃、5%CO2でインキュベートした。PMA/Ionomycin処理して6時間後にTripluc(R) Assay Reagentを添加し、540 nm及び590 nmのロングパスフィルターを組み込んだMithrasLB960を用いて発光量を測定したのち、G3PDHでデータの正規化をした。化学物質未処理のサンプルのPMA/Ionomycin活性化処理による誘導率を基準に、図１４に示す判定チャートをもとに、抑制率（-値）ないし、賦活化率（+値）を算出し、免疫賦活もしくは免疫抑制効果を判定した。【００７０】
U937#6C12細胞については、試験前々日もしくは前日に継代及び培地交換した細胞を、greiner社製の96ウェル黒プレートに5×104 cells/wellで播種した。次いで、デキサメサゾン（Dex）; 10-7, 10-6, 10-5M、シクロスポリン（CyA）; 10-8, 10-7, 10-6M、ホルマリン; 30, 100, 300μM、ディーゼル排気微粒子（Diesel exhaust particles; DEP）; 10, 30, 100 μg/mlで前処理し、1時間後、LPS（100 μg/ml）による細胞活性化処理を行った。6時間後、Tripluc(R) Assay Reagentを使用し、Pheliosを用い発光量を測定した。化学物質未処理のサンプルをLPSで刺激したときのIL-1β, IL-8レポーター活性を100とし、図１４に示す判定チャートをもとに、各化学物質存在時のIL-1β, IL-8レポーター活性の抑制率（-値）ないし、賦活化率（+値）を算出し、免疫賦活もしくは免疫抑制効果を判定した。なお判定チャートでは化学物質非存在下におけるPMA/Ionomycin、またはLPSでの細胞活性化処理による誘導を100とした場合の化学物質存在下における同処理に対する相対発現量を指標としており、上の数値は免疫抑制／賦活化指数を表し、一方、下の数値はPMA/IonomycinまたはLPSでの細胞活性化処理に対するマーカー遺伝子の相対発現量を表している。【００７１】
結果
１．Jurkat#2H4細胞株に関して
Jurkat#2H4細胞安定株は、ルシフェラーゼ遺伝子上流にIL-2ないしはIFN-γのプロモーター領域を含んでいる。そこで、IL-2遺伝子の転写に関連するNFAT、NF-κB、AP-1およびIFN-γ遺伝子の転写に関連するSTAT1、STAT4、Tbet、Runx3、Hlx、Smad3/4などの活性化に影響を及ぼす化学物質を評価できる。実際に、Jurkat#2H4細胞安定株を用いて上記化学物質を評価したところ以下の表1に示す結果が得られた。【００７２】
【表１】
0005999644.tif 000002
【００７３】
※免疫抑制/賦活化効果 (免疫抑制/賦活化指数=xとする)
0005999644.tif 000003
【００７４】
この結果は、このレポーター細胞を用いることにより、化学物質をIL-2あるいはIFN-γレポーター活性の抑制を指標にしてT細胞の転写因子の活性化に影響を及ぼす種々の化学物質の影響を評価できることを示す。さらに具体的には、この細胞を用いることで、免疫増強作用、抑制作用を推測できること、また、IL-2レポーターのIL-2あるいはIFN-γレポーター活性の抑制/賦活化指数を指標に化学物質のT細胞に対する免疫抑制作用あるいは免疫賦活作用を、また、IL-2とIFN-γレポーター活性の抑制率の比を指標に化学物質のThバランスに及ぼす影響を推測できることを示している。【００７５】
２．U937#6C12細胞安定株に関して
一方、U937#6C12細胞安定株は、ルシフェラーゼ遺伝子上流にIL-1βないしはIL-8のプロモーター領域を含んでいる。そこで、IL-1β遺伝子の転写に関連するNF-κB、AP-1、NF-IL6、CRE/ATFおよびIL-8遺伝子の転写に関連するmitogen activated protein kinaseの活性化、およびAP-1、NF-κBの活性化に影響を及ぼす化学物質を評価できる。実際に、U937#6C12細胞安定株を用いて上記化学物質を評価したところ以下の表２に示す結果が得られた。【００７６】
【表２】
0005999644.tif 000004
【００７７】
※免疫抑制/賦活化効果 (免疫抑制/賦活化指数=xとする)
0005999644.tif 000005
【００７８】
この結果は、このレポーター細胞を用いることにより、化学物質をIL-1βあるいはIL-8レポーター活性の抑制/賦活化指数を指標にしてマクロファージ、樹状細胞の転写因子の活性化に影響を及ぼす種々の化学物質の影響を評価できることを示す。さらに具体的には、この細胞を用いることで、免疫賦活作用、抑制作用を推測できることを示している。【００７９】
実施例14  2色免疫毒性評価THP-1細胞IL8-SLO/G3PDH-SLRの樹立
免疫毒性評価THP-1細胞株を作製するため、内部標準としてG3PDH プロモーター（転写開始点上流1.3 kbを含む）下流にSLRを導入したプラスミド、IL-8プロモーター（転写開始点上流5 kbpを含む）下流にSLOを導入したプラスミドを作成した（実施例９）。なお、これらのプラスミドはSLR、SLOの下流にはそれぞれピューロマイシン、ネオマイシンの各耐性遺伝子を含む。ホストであるTHP-1細胞へのトランスフェクションには、前日に2×105cells/mlで継代したものを使用した。トランスフェクション後の薬剤選択条件は、一次選択では薬剤存在下で1週間し、二次選択培養では一次選択培養で生き残った細胞を96ウェルプレートに1 cell/wellまたは100 cells/wellで播種し、同じ薬剤条件で2週間培養した。二次選択培養後の細胞についてはシグナル強度および薬剤処理によるシグナルの誘導の2点からクローン選択を行った。マクロファージ細胞株THP-1細胞のトランスフェクションでは、1×106 cellsに対し、1 μgのプラスミドをnucleofector（Lonsa） を使用して導入した。まずG3PDHプロモーター-SLRを導入し、選択薬剤0.15 μg/ml ピューロマイシンを用いてシグナルの良い1色安定株TGC17を樹立した。それを親株として、続いてIL-8プロモーター-SLOを導入し、選択薬剤0.15 μg/mlピューロマイシン、300 μg/ml ネオマイシンを用いて2色安定株THP-G8細胞を樹立し、シグナルバランスも良好であったことから、以後の解析にはTHP-1 : IL8-SLO/G3PDH-SLR  #THP-G8株（THP-G8）を用いた。【００８０】
THP-G8細胞については、試験前々日もしくは前日に継代及び培地交換した細胞を、greiner社製の96ウェル黒プレートに5×104 cells/wellで播種した。LPS, DNCB等のハプテンまたはlactic acid等のイリタントで刺激した。6時間後、Tripluc(R) Assay Reagentで処理した後、Pheliosを用いて発光量を測定した。データ取得後、内部標準であるG3PDHプロモーター活性でデータの正規化をした。次いで、溶媒のみで刺激したときのIL-8レポーター活性を1とし化学物質で刺激した時のIL-8誘導率を算出した。図１５は各種化合物質を対象として賦活化を評価した結果である。【００８１】
THP-G8安定細胞株は、他の実施例における安定細胞株と同様、ルシフェラーゼ遺伝子上流にIL-8のプロモーター領域を含んでおり、これらの結果はIL-8遺伝子の転写に関連するmitogen activated protein kinaseの活性化、およびAP-1、NF-κBの活性化に影響を及ぼす化学物質を評価できることを示している。【００８２】
これらの結果は、IL-8レポーター活性の上昇もしくは抑制を指標にして、単球や樹状細胞における転写因子の活性化に影響を及ぼすような種々の化学物質の影響を評価できることを示す。さらに具体的には、この細胞を用いることで、免疫増強作用、抑制作用を推測できることを示している。【００８３】
実施例15  THP-G8細胞における化学物質評価及び化学物質感作能の評価
THP-G8細胞については、試験前々日もしくは前日に継代及び培地交換した細胞を、greiner社製の96ウェル黒プレートに5×104 cells/wellで播種した。N-Acetyl cysteine（NAC）25 mM存在下または非存在下に1時間培養したのち、 LPS, DNCB等のハプテンまたはlactic acid等のイリタントで刺激した。6時間後、Tripluc(R) Assay Reagentで処理した後、Pheliosを用いて発光量を測定した。図１６はデータ取得後、内標であるG3PDHプロモーター活性でデータの正規化をした結果である。次いで、溶媒のみで刺激したときのIL-8レポーター活性を1とし化学物質で刺激した時のIL-8誘導率を算出した。また、NAC存在下のIL-8誘導率をNAC非存在下のIL-8誘導率で除することによりNACによるIL-8誘導の抑制率を算出した。その結果、活性酸素（Reactive Oxygen Species）産生阻害剤であるN-acetyl-cysteine（NAC）を併用することにより、化学物質の感作能を推測できることに加え、化学物質が接触アレルゲンもしくは一次刺激性物質であるかについても、簡便に評価できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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