(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４未満の等電点を有するエリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＥＰＯ）類似体の精製方法であって、前記４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体は、Ｎ−結合型糖鎖が５本であるＮＥＳＰであり、次の段階を含み、：
（ａ）前記４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体を発現する動物細胞の培養液から動物細胞を除去して、前処理溶液を取得する段階と、
（ｂ）前記前処理溶液を１次陰イオン交換クロマトグラフィーに適用して、前記エリスロポエチン類似体を含む第１分画物を取得する段階と、
（ｃ）前記第１分画物をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに適用して、前記エリスロポエチン類似体を含む第２分画物を取得する段階と、
（ｄ）前記第２分画物を２次陰イオン交換クロマトグラフィーに適用して、前記エリスロポエチン類似体を含む第３分画物を取得する段階、
前記段階（ｂ）の１次陰イオン交換クロマトグラフィーは、洗浄溶液としてｐＨ４．０未満の緩衝液を使い、
前記段階（ｄ）の２次陰イオン交換クロマトグラフィーは、洗浄溶液としてｐＨ２．０−４．０の緩衝液を使う。
【請求項２】
前記エリスロポエチン類似体を発現する動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞またはＭＤＣＫ細胞を含む請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
前記段階（ａ）は、（ｉ）深層濾過フィルター及びメンブレン濾過フィルターによる濾過後、限外濾過して実施するか、または（ｉｉ）遠心分離後、限外濾過して実施することを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項４】
前記段階（ｃ）と段階（ｄ）とを１つの工程で処理することを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−結合型糖鎖の追加によって４未満の低い等電点を有するエリスロポエチン類似体（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  Ａｎａｌｏｇ）を高純度に精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチンは、赤血球生成刺激因子であって、造血母細胞を刺激し、赤血球への分化を促進して、赤血球の生成を増加させる。エリスロポエチンあるいはＥＰＯは、３本のＮ−結合型糖鎖と１本のＯ−結合型糖鎖とが結合されたタンパク質であって、慢性腎不全患者及び癌患者などの貧血治療剤として使われる。ＥＰＯの糖鎖にあるシアル酸の個数は、ＥＰＯの血液内半減期と生物学的活性とに影響を及ぼし、シアル酸の個数がさらに多いアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）は、生体内分解が抑制されることによって、さらに高い生物学的活性を有する（Ｅｇｒｉｅ  ＪＣ．，ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎｅ  ＪＫ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００１；８４，３−１０  ａｎｄ  Ｅｇｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，１９９３；１０：２６３−２６９）。
【０００３】
さらに高い生物学的活性を有するように、天然型ヒトエリスロポエチンにＮ−結合型糖鎖を追加するように遺伝子操作して得られた低い等電点を有するエリスロポエチン類似体は、ＮＥＳＰ（Ｎｏｖｅｌ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）とも呼ばれ、ダルべポエチンα（Ｄａｒｂｅｐｏｅｔｉｎ  ａｌｆａ）は、ＮＥＳＰのうちから現在医薬品として開発されたタンパク質である（Ｅｇｒｉｅ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎｅ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８４  Ｓｕｐｐｌ．１，３−１０（２００１））。ＮＥＳＰは、１６５個のアミノ酸で構成された糖タンパク質であって、ＥＰＯが最高１４個のシアル酸（ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ）を有するものとは異なって、最高１８個あるいは２２個のシアル酸を有するように、Ｎ−結合型糖鎖を追加した。シアル酸は、酸性糖であって、Ｎ−結合型糖鎖の追加によってシアル酸個数が増加するにつれて、ＮＥＳＰ分子の全体ｐＩ値はさらに低くなる（Ｒｕｓｈ  ＲＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５；６７：１４４１−５２）。
【０００４】
シアル酸個数の追加によってＮＥＳＰの血清半減期は、既存の組換えヒトエリスロポエチンより３倍も長いために、慢性腎不全患者の貧血治療で少ない投与頻度で同等な治療効果を期待することができる。ＥＰＯのシアル酸含量は、体内薬物投与持続期間と直接的な関連があって、シアル酸含量は、糖タンパク質の重要な性質と思われる。ＥＰＯ糖鎖末端のシアル酸残基は、糖鎖の二番目のガラクトース基を保護することによって、肝細胞受容体によるガラクトース基の分解を遮断して、ＥＰＯの生体内半減期を延長させて、生体内活性度に影響を及ぼす（Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９，４２０２−４２０６（１９７４），Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１８５，１０２−１０３（１９６０））。
【０００５】
動物細胞を使ってＥＰＯを生産する方法が、下記に提示された特許に記載されている。特許文献１では、ＥＰＯ生産細胞を無血清フラスコまたはローラーで培養した後、ブルーセファロース（Ｂｌｕｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）吸着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、及び高速液状クロマトグラフィーの４段階のクロマトグラフィー工程を順次に行って、エリスロポエチンを製造する方法を記述した。しかし、前記特許では、ＮＥＳＰを生産する方法については記述せず、４段階のクロマトグラフィー工程を行うことによって、精製工程が複雑になる面がある。
【０００６】
また、免疫吸着クロマトグラフィーを使う特許文献２と特許文献３とがあり、染料親和性クロマトグラフィーを使う特許文献４と特許文献１とがあり、逆相クロマトグラフィーを使う特許文献５、特許文献１、特許文献６及び特許文献７がある。また、疎水性クロマトグラフィーを利用する特許文献８及び特許文献９があり、イオン交換を回分式クロマトグラフィーとして使う特許文献１０がある。最後に、ヒドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）クロマトグラフィーを使う特許文献４、特許文献３及び特許文献１１がある。前記国内に公開された技術は、ＥＰＯの精製方法について記述するが、ＥＰＯよりも等電点が低いＮＥＳＰの精製に対しては記述していない。
【０００７】
一方、特許文献１２は、ＮＥＳＰの物質特許であって、実施例で陰イオン交換クロマトグラフィーを使う方法を提示している。
【０００８】
また、特許文献１３では、ＮＥＳＰの精製方法として陰イオンあるいは吸着クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーとを利用する方法を提示している。特に、陽イオン交換非結合クロマトグラフィーを通じてシアル酸が多く結合された同形体を分離する方法を提示している。
【０００９】
このように、既存のＥＰＯ関連特許での精製方法は、ほとんど産業的な生産規模に合わないカラムを使うか、４段階以上の精製工程を用いて複雑な工程を行っており、追加された糖鎖で物理化学的特性が変わった等電点が低いＮＥＳＰでは、その方法を適用することができない。そして、最近公示されたＮＥＳＰの精製工程についての唯一の特許では、４段階の工程を経り、シアル酸が多く結合された同形体を分離する主工程は、陽イオン非結合クロマトグラフィー方法を使っている。本発明では、シアル酸が多く結合された同形体のよりも精密な分離が可能な陰イオン交換結合クロマトグラフィーを使っており、相対的に簡単な３段階のクロマトグラフィー工程で低コストと短時間とに低い等電点を有するエリスロポエチン類似体を精製することができる方法を提供する。
【００１０】
本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】大韓民国登録特許第１０−０４２３６１５号
【特許文献２】大韓民国登録特許第１０−０１５３８０８号
【特許文献３】大韓民国登録特許第１０−０９０００１３号
【特許文献４】大韓民国登録特許第１０−０３９０３２５号
【特許文献５】大韓民国登録特許第１０−００６５１９７号
【特許文献６】大韓民国公開特許第１０−２００４−００６５５６７号
【特許文献７】大韓民国登録特許第１０−０９０００３３号
【特許文献８】大韓民国登録特許第１０−０３４４０５９号
【特許文献９】大韓民国登録特許第１０−０５６７４４８号
【特許文献１０】大韓民国登録特許第１０−０２９７９２７号
【特許文献１１】米国特許第７，６１９，０７３号
【特許文献１２】米国特許第７，２１７，６８９号
【特許文献１３】国際特許第ＷＯ２０１０／００８８２３  Ａ２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、天然型エリスロポエチンに比べて、低い等電点を有するエリスロポエチン類似体を、動物細胞培養液から高純度に精製することができる方法を開発するために努力してきた。その結果、本発明者らは、動物細胞から発現された低い等電点を有するエリスロポエチン類似体に対する新規な精製プロトコルを開発し、その精製プロトコルによって、等電点４未満のエリスロポエチン類似体を簡単かつ迅速に高効率及び高純度に精製することができるということを確認することによって、本発明を完成した。
【００１３】
したがって、本発明の目的は、４未満の等電点及び複雑な糖構造を有するエリスロポエチン類似体の精製方法を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の様態によれば、本発明は、次の段階を含む４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体の精製方法を提供する：
（ａ）前記４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体を発現する動物細胞の培養液から動物細胞を除去して、前処理溶液を取得する段階と、（ｂ）前記前処理溶液を１次陰イオン交換クロマトグラフィーに適用して、前記エリスロポエチン類似体を含む第１分画物を取得する段階と、（ｃ）前記第１分画物を吸着クロマトグラフィーに適用して、前記エリスロポエチン類似体を含む第２分画物を取得する段階と、（ｄ）前記第２分画物を２次陰イオン交換クロマトグラフィーに適用して、前記エリスロポエチン類似体を含む第３分画物を取得する段階。
【００１６】
本発明者らは、天然型エリスロポエチンに比べて、低い等電点を有するエリスロポエチン類似体を、動物細胞培養液から高純度に精製することができる方法を開発するために努力してきた。その結果、本発明者らは、動物細胞から発現された低い等電点を有するエリスロポエチン類似体に対する新規な精製プロトコルを開発し、その精製プロトコルによって、等電点４未満のエリスロポエチン類似体を簡単かつ迅速に高効率及び高純度に精製した。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体の新規な精製方法を提供する。
（ｂ）Ｎ−結合型糖鎖が３本であるＥＰＯは、最高１４個のシアル酸を含むが、Ｎ−結合型糖鎖が少なくとも１つ以上追加されたエリスロポエチン類似体は、さらに多いシアル酸を含有することができる。これにより、ＥＰＯは、４以上の等電点を有する一方、Ｎ−結合型糖鎖が少なくとも４本以上であるエリスロポエチン類似体は、４未満の等電点を有して、製造することが相対的に難しい。本発明では、低い等電点を有するエリスロポエチン類似体の物理化学的性質による製造上の難点を克服し、産業的規模で量産することができる製造方法を提供する。
（ｃ）本発明は、３段階のクロマトグラフィーを通じて不純タンパク質が効果的に除去されて、高純度のエリスロポエチン類似体を取得することができる精製方法を提供する。
（ｄ）本発明は、吸着クロマトグラフィー及び２次イオン交換クロマトグラフィーを１つの工程で処理することができて、それぞれ行うのに必要な時間を短縮して、全体精製工程にかかる時間を減らすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明による動物細胞培養液から４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体を精製する方法を簡略に示す図である。
【図２】本発明による精製方法のうち、１次イオン交換クロマトグラフィーを用いて４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体を含む第１分画物を取得したクロマトグラムである。矢印は、目的タンパク質のクロマトグラムピークを示す。
【図３】本発明による精製方法のうち、吸着クロマトグラフィーを用いて４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体を含む第２分画物を取得したクロマトグラムである。矢印は、目的タンパク質のクロマトグラムピークを示す。
【図４】本発明による精製方法の段階別に取得した分画物に対してドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシー染色した結果を示す図である。矢印は、目的タンパク質及びＮＥＳＰ標準品のバンドを示す。レーン１：分子量標準品（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、レーン２：動物細胞培養液（限外濾過濾過液）、レーン３：１次イオン交換クロマトグラフィー第１分画物、レーン４：吸着クロマトグラフィー第２分画物、レーン５：２次イオン交換クロマトグラフィー第３分画物、レーン６：ＮＥＳＰ標準品。
【図５】本発明による最終精製段階で取得した第３分画物に対する等電点検査ゲルクマシー染色結果を示す図である。レーン１：２次イオン交換クロマトグラフィー注入分画、レーン２：２次イオン交換クロマトグラフィーｐＨ洗浄精製分画、レーン３：２次イオン交換クロマトグラフィー精製分画、レーン４：ＮＥＳＰ標準品。
【図６】本発明による精製方法のうち、２次陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体を含む第３分画物を取得したクロマトグラムである。矢印は、目的タンパク質のクロマトグラムピークを示す。
【図７】本発明による分析方法のうち、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてＮＥＳＰの純度を分析したクロマトグラムである。矢印は、目的タンパク質のクロマトグラムピークを示す。
【図８】本発明による吸着クロマトグラフィーと２次イオン交換クロマトグラフィーとを結合した精製方法で取得した分画物に対する等電点検査ゲルクマシー染色結果を示す図である。レーン１：ＮＥＳＰ標準品、レーン２：２次イオン交換クロマトグラフィー精製分画。
【図９ａ】本発明による工程段階別取得物をサイズ排除クロマトグラフィーを用いて純度を分析したクロマトグラフィーである。
【図９ｂ】本発明による工程段階別取得物をサイズ排除クロマトグラフィーを用いて純度を分析したクロマトグラフィーである。
【図９ｃ】本発明による工程段階別取得物をサイズ排除クロマトグラフィーを用いて純度を分析したクロマトグラフィーである。
【図９ｄ】本発明による工程段階別取得物をサイズ排除クロマトグラフィーを用いて純度を分析したクロマトグラフィーである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のエリスロポエチン類似体の精製方法を、各段階別に詳細に説明すれば、次の通りである：
段階（ａ）：エリスロポエチン類似体を発現する動物細胞の培養液から前処理溶液の取得
本発明によれば、まず、４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体を発現する動物細胞の培養液から動物細胞を除去して、前処理溶液を取得する。
【００２０】
本発明で利用される４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体を発現する動物細胞は、望ましくは、哺乳類、齧歯類、鳥類または昆虫細胞であり、より望ましくは、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ細胞、ＷＩ３８、ＢＨＫ（Ｂａｂｙ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｋｉｄｎｅｙ）、ＣＯＳ細胞またはＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ）細胞を含み、さらに望ましくは、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａまたはＭＤＣＫであり、最も望ましくは、ＣＨＯ細胞である。
【００２１】
本発明の精製対象である４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体は、天然型ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列で１つまたはそれ以上が変異を含む。等電点が低いエリスロポエチン類似体は、アミノ酸残基の追加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）、削除（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を通じて変異を生成（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）することで製作することができ、これを通じて、糖鎖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）位置（ｓｉｔｅ）を増加させるか、その位置を変えることができる。等電点が低いエリスロポエチン類似体は、天然型ヒトエリスロポエチンよりも多数の炭水化物鎖（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｃｈａｉｎ）を有し、少なくとも１つ以上の追加された糖鎖を含む。また、等電点が低いエリスロポエチン類似体は、追加された糖鎖によって天然型（ｎａｔｕｒａｌ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ヒトエリスロポエチンよりも高いシアル酸レベルを表わすが、それによって、生物学的活性に重要なタンパク質の２次構造または３次構造が変わらない。
【００２２】
Ｎ−結合型糖鎖が３本である天然型ヒトエリスロポエチンは、最高１４個のシアル酸を含むが、Ｎ−結合型糖鎖が少なくとも１つ以上追加されたエリスロポエチン類似体は、さらに多いシアル酸を含有することができる。シアル酸は、陰性電荷を帯びる酸性糖であって、Ｎ−結合型糖鎖が３本である天然型ヒトエリスロポエチンは、４以上の等電点を有する一方、Ｎ−結合型糖鎖が少なくとも４本以上であるエリスロポエチン類似体は、４未満の等電点を有して、製造することが相対的に難しい。
【００２３】
本発明の４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体の例は、ＥＰＯ配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ１１３１９の配列）から３０、５１、５７、６９、８８、８９、１３６、及び１３８番の位置から選択される少なくとも１つの位置に追加的な糖鎖化位置が導入されたものである。最も望ましくは、４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体は、Ａ３０Ｎ、Ｈ３２Ｔ、Ｐ８７Ｖ、Ｗ８８Ｎ、及びＰ９０Ｔ変異を含むＮＥＳＰである。
【００２４】
エリスロポエチン類似体を発現する動物細胞の培養方法は、当業界に公知の多様な方法を通じて実施することができる。例えば、当業界に公知のＣＨＯ細胞培養方法のうち１つである流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）あるいは反復流加培養（Ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を実施するか、連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を実施することができる。最も望ましくは、反復流加培養である。
【００２５】
動物細胞の培養液は、一般的にタンパク質、糖類、脂肪など多様な成分（不純物）からなっているために、前処理が必要である。
【００２６】
本明細書で、用語‘前処理’は、本発明による精製方法の精製効率を高めるために、前記カラムクロマトグラフィーを行う前に不純物を除去する工程を意味する。
【００２７】
本発明の望ましい具現例によれば、前処理段階は、請求項１において、前記段階（ａ）は、（ｉ）深層濾過フィルター及びメンブレン濾過フィルターによる濾過後、限外濾過して実施するか、または（ｉｉ）遠心分離後、限外濾過を実施して、動物細胞の培養液から動物細胞を除去する。
【００２８】
前記深層濾過フィルターによる前処理は、当業界に公知の多様な方法を通じて実施することができる。深層濾過フィルターは、培養液から一定サイズの粒子の除去に利用される。深層濾過フィルターは、メンブレンフィルターとは異なって、マトリックス内に粒子をキャプチャリングして培養液から粒子を除去する。典型的に、深層濾過フィルターは、セルロース、ガラス線維またはポリプロピレンのようなファイバー媒体からなっている。前記メンブレン濾過フィルターによる前処理は、当業界に公知の多様な方法を通じて実施することができる。例えば、一定サイズの空隙サイズを有する多様なメンブレンを用いて、このような前処理を実施することができる。
【００２９】
深層濾過フィルター及びメンブレン濾過フィルターによるフィルタリングを行って得られた濾過液に対して限外濾過を実施する。限外濾過は、適した分画分子量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｕｔ−ｏｆｆ、ＭＷＣＯ）を有する限外濾過膜を用いて実施する。例えば、分画分子量５−３０ｋＤａである限外濾過膜を使って限外濾過を実施する。限外濾過は、濾過だけではなく、濃縮の効果も発生させることができる。
【００３０】
択一的に、前記前処理は、細胞培養液を遠心分離した後、限外濾過して実施することができる。前記遠心分離は、２０００〜５０００ｒｐｍで実施することができる。
【００３１】
このような前処理段階によって、４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体が含まれた動物細胞培養液の体積を減らし、培養液内に存在する多様な不純物を除去して、クロマトグラフィーのカラムにかかる負荷を減らすことができる。
【００３２】
段階（ｂ）：１次陰イオン交換クロマトグラフィーによる第１分画物の取得
前記前処理段階によって得られた前処理溶液を１次陰イオン交換クロマトグラフィーに適用して、エリスロポエチン類似体を含む第１分画物を得る。
【００３３】
１次陰イオン交換クロマトグラフィーは、当業界に公知の多様な陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて実施することができる。より望ましくは、強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィーである。
【００３４】
本発明で利用される陰イオン交換樹脂には、正に帯電された（ｃｈａｒｇｅｄ）機能基が共有結合されている。望ましくは、陰イオン交換樹脂に帯電された機能基は、アミンまたはアミノ基、より望ましくは、一次アミン、二次アミン、三次アミンまたは四次アミン、最も望ましくは、四次アミンである。陰イオン交換樹脂に帯電された機能基の例は、四次アミン（例えば、トリメチルアミノメチル及びトリエチルアミノエチル）、アミノエチル、ジエチルアミノエチル及びパラアミノベンジルを含む。
【００３５】
本発明で利用される陰イオン交換樹脂の支持体は、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｔｅ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）、及びトヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）であり、望ましくは、セルロース、デキストラン及びアガロースであり、最も望ましくは、アガロースである。本発明で利用される陰イオン交換剤は、Ｑセファロース、ＤＥＡＥセファロースであり、望ましくは、Ｑセファロースである。
【００３６】
本発明の１次陰イオン交換クロマトグラフィー過程で利用される緩衝液は、緩衝力（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｐｏｗｅｒ）を有する如何なる緩衝液も使用可能であり、例えば、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、グリシン−ＨＣｌ及びＴｒｉｓを含む。
【００３７】
平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）溶液としては、多様な緩衝液、特に、Ｔｒｉｓを利用し、利用されるｐＨは、６−８、望ましくは、７．０−７．６である。洗浄溶液として望ましくは、ｐＨ４．０未満の緩衝液（望ましくは、酢酸緩衝液）が使われ、より望ましくは、ｐＨ３．０−６．０、さらに望ましくは、４．０−４．５の緩衝液が使われる。
【００３８】
溶出溶液としては、適した塩（望ましくは、塩化ナトリウム）を含む多様な緩衝液、特に、Ｔｒｉｓを利用し、ｐＨは、６−８、望ましくは、７．０−７．６である。
【００３９】
４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体を強塩基性陰イオン交換剤から溶出させるのに望ましいｐＨ及び／またはイオン強度は、経験的に決定することが望ましく、これは、多様な要因（例えば、強塩基性陰イオン交換剤の種類、温度など）によって多様な値を表わす。溶出溶液に利用されるイオン強度は、多様な塩によって与えられ、例えば、塩化ナトリウムによってイオン強度が与えられる。
【００４０】
本発明の具体的な一実施例を参照して、前記段階（ｂ）を説明すれば、次の通りである：強塩基性陰イオン交換樹脂の一種であるＱセファロースＦＦレジン（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を８００ｍＬ充填したカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＰＧ１００／５００）に平衡緩衝液（例えば、１０ｍＭトリス緩衝溶液、ｐＨ７．４）で樹脂を平衡化させる。引き続き、前記段階（ａ）で取得した前処理溶液を前記Ｑセファロースカラムに適用させた後、前記レジンに結合された物質のほとんどが４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体成分になるように、汚染物を除去する洗浄段階を利用できる。本発明の望ましい具現例によれば、洗浄溶液として望ましくは、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を利用する。４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体は、クロマトグラム上で塩化ナトリウムを含んだトリス緩衝溶液を用いて溶出することができる。溶出に使われる塩化ナトリウムの濃度は、望ましくは、５０−５００ｍＭであり、より望ましくは、１００−４００ｍＭであり、最も望ましくは、２００−３００ｍＭである。
【００４１】
段階（ｂ）で、段階（ａ）の前記前処理溶液を１次イオン交換クロマトグラフィーに適用して、前記エリスロポエチン類似体を含む第１分画物を取得する。
【００４２】
段階（ｃ）：吸着クロマトグラフィーによる第２分画物の取得
前記１次イオン交換クロマトグラフィー段階によって得られた第１分画物を吸着クロマトグラフィーに適用して、エリスロポエチン類似体を含む第２分画物を得る。
【００４３】
吸着クロマトグラフィーは、移動相である液体と固定相である固体（吸着レジン）との間で試料が固定相に吸着される程度によって分離が起こる。
【００４４】
本発明で利用される吸着クロマトグラフィーの固定相は、望ましくは、シリカ、アルミナ、酸化マグネシウム、及びリン酸カルシウム（望ましくは、ヒドロキシアパタイト）を含み、これらに限定されるものではない。より望ましくは、固定相は、リン酸カルシウムであり、最も望ましくは、ヒドロキシアパタイトである。ヒドロキシアパタイトは、卓越した分離能及び解像度を有する。ヒドロキシアパタイトを利用する場合、望ましい移動相は、リン酸緩衝溶液である。
【００４５】
ヒドロキシアパタイトを利用する場合、平衡溶液として、特に、リン酸緩衝溶液を利用し、利用されるｐＨは、６−８、望ましくは、６．０−７．０である。溶出溶液としては、適した塩（望ましくは、塩化ナトリウム）を含むリン酸緩衝溶液を利用し、ｐＨは、６−８、望ましくは、６．０−７．０である。
【００４６】
本発明の具体的な一実施例を参照して、前記段階（ｃ）を説明すれば、次の通りである：ヒドロキシアパタイト（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ＴｙｐｅＩまたはＴｙｐｅＩＩ、２０−４０μｍ）レジンを充填したカラムに平衡緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸緩衝溶液、ｐＨ６．０−７．０）で樹脂を平衡化させる。引き続き、前記段階（ｂ）で取得した前記第１分画物を前記ヒドロキシアパタイトカラムに適用させた後、４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体をレジンに吸着されていない非吸着分画物に分画する。前記ヒドロキシアパタイトレジンに吸着された不純タンパク質は、溶出溶液（例えば、５００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０−７．０）を用いて溶出することができる。
【００４７】
段階（ｄ）：２次陰イオン交換クロマトグラフィーによる第３分画物の取得
前記吸着クロマトグラフィー段階によって得られた第２分画物を２次陰イオン交換クロマトグラフィーに適用して、エリスロポエチン類似体を含む第３分画物を得る。
【００４８】
２次陰イオン交換クロマトグラフィーは、当業界に公知の多様な陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて実施することができる。望ましくは、強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィーである。
【００４９】
本発明で利用される陰イオン交換樹脂に帯電された機能基は、アミンまたはアミノ基、より望ましくは、一次アミン、二次アミン、三次アミンまたは四次アミン、最も望ましくは、四次アミンである。
【００５０】
本発明で利用される陰イオン交換樹脂の支持体は、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリスチレン／ジビニルベンゼン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ／ｄｉｖｉｎｙｌ  ｂｅｎｚｅｎｅ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）、及びトヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）であり、望ましくは、アガロースあるいはポリスチレン／ジビニルベンゼンである。
【００５１】
本発明で利用される陰イオン交換剤は、Ｑセファロース、ＤＥＡＥセファロース、ＳＯＵＲＣＥ  １５Ｑ、ＳＯＵＲＣＥ  ３０Ｑ、Ｃａｐｔｏ  ＤＥＡＥ、Ｃａｐｔｏ  Ｑなどであり、望ましくは、ＳＯＵＲＣＥ  １５ＱあるいはＳＯＵＲＣＥ  ３０Ｑである。
【００５２】
本発明の２次陰イオン交換クロマトグラフィー過程で利用される緩衝液は、緩衝力を有する如何なる緩衝液も使用可能であり、例えば、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、グリシン−ＨＣｌ及びＴｒｉｓを含む。
【００５３】
平衡溶液としては、多様な緩衝液、特に、酢酸緩衝液を利用し、利用されるｐＨは、３−６、望ましくは、４−５である。洗浄溶液として望ましくは、ｐＨ２．０−４．０の緩衝液（望ましくは、グリシン緩衝液）、より望ましくは、ｐＨ３．０−４．０の緩衝液が利用される。溶出溶液としては、適した塩（望ましくは、塩化ナトリウム）を含む多様な緩衝液、特に、リン酸緩衝液を利用し、ｐＨは、６−８、望ましくは、７．０−７．６である。溶出溶液に含まれる塩、特に、塩化ナトリウムの濃度は、望ましくは、１００−５００ｍＭである。
【００５４】
本発明の具体的な一実施例を参照して、前記段階（ｄ）を説明すれば、次の通りである：強塩基性陰イオン交換樹脂の一種であるＱセファロースＳＯＵＲＣＥ  １５Ｑまたは３０Ｑレジン（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を２００ｍＬ充填したカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＸＫ５０／３０）に平衡緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸緩衝溶液、ｐＨ６．０−７．０）で樹脂を平衡化させる。引き続き、前記吸着クロマトグラフィーに適用して取得した前記エリスロポエチン類似体を含む第２分画物を前記ＳＯＵＲＣＥ  １５Ｑまたは３０Ｑカラムに適用させた後、第１次洗浄緩衝液（例えば、２０ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ４．０−５．０）及び第２次洗浄緩衝液（２０ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２．２〜２．４を用いてレジンを洗浄する。
【００５５】
本発明の望ましい具現例によれば、前記段階（ｃ）と段階（ｄ）とを１つの工程で処理する。前記段階（ｄ）を行う前に、前記第２分画物に如何なる処理も行う必要がないために、前記段階（ｃ）及び段階（ｄ）のカラムを連結して運行することによって、前記段階（ｃ）及び段階（ｄ）をそれぞれ行うのにかかる時間を減らすことができて、早い時間内に前記第２分画物及び第３分画物を取得することができる。
【００５６】
本発明によれば、段階（ｄ）で、４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体を除いたタンパク質同形体（ｉｓｏｆｏｒｍ）を効果的に除去することができ、段階（ｃ）で吸着していない少量の不純タンパク質は、段階（ｄ）で効果的に除去されて、高純度の４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体を分画物として取得することができる。
【００５７】
本発明の方法は、４未満の等電点を有するエリスロポエチン類似体、特に、Ｎ−結合型糖鎖が４本以上である赤血球刺激因子、最も望ましくは、ＮＥＳＰの精製に非常に有効である。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
【００５９】
実施例１：エリスロポエチン類似体生産細胞株の培養
ＥＰＯで５個のアミノ酸（Ａ３０Ｎ、Ｈ３２Ｔ、Ｐ８７Ｖ、Ｗ８８Ｎ、及びＰ９０Ｔ）が置換された糖タンパク質を生産するＣＨＯ細胞を５０Ｌ規模で浮遊培養した。当業界に公知のＣＨＯ細胞培養方法のうち１つである反復流加培養を実施し、化学的糾明培地またはＨｙｃｌｏｎｅ社から求めることができるＳＦＭ４ＣＨＯ培地のような無血清培地を使った。５日内外の生産期（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）以後に培養液を回収し、この際、細胞濃度は、８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、細胞生存率は、９５％以上であった。
【００６０】
実施例２：精密濾過及び限外濾過
前記実施例１で得た動物細胞培養液を、それぞれ深層濾過フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ）及びメンブレンフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、０．２μｍ）を用いて細胞及び細胞滓を除去した。引き続き、前記精密濾過液を限外濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＷＣＯ５−３０ｋＤａ）を用いて５−３０ｋＤａよりも小さな塩と糖類は、限外濾過膜を通過して除去した。ここで、初期濃縮された体積よりも１０倍多い量のトリス緩衝溶液で希釈しながら、希釈濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）及び濃縮を行った。
【００６１】
実施例３：１次陰イオン交換クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＡＫＴＡｐｉｌｏｔシステム（ＧＥ社，米国）を使い、カラムとしては、ＱセファロースＦＦ（ＧＥ社）レジンを８００ｍＬ充填したＧＥ社のＢＰＧ１００／５００を使った。前記カラムをｐＨ７．４の１０ｍＭトリス緩衝溶液（平衡溶液）で３００ｍＬ／分の流速で平衡化させた。洗浄溶液としてｐＨ４．０の１００ｍＭ酢酸緩衝液を用いてカラムを洗浄し、３００ｍＭ塩化ナトリウムを含有した平衡溶液を用いてＱセファロースＦＦゲルに吸着されたタンパク質を溶出した。前記１次陰イオン交換クロマトグラムを図２に示した。
【００６２】
実施例４：吸着クロマトグラフィー
吸着クロマトグラフィーは、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒシステムを使い、カラムとしては、ヒドロキシアパタイト（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ＴｙｐｅＩまたはＴｙｐｅＩＩ、２０−４０μｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社）レジンを４３０ｍＬ充填したＧＥ社のＸＫ５０／３０を使った。前記カラムをｐＨ６．０−７．０の２０ｍＭリン酸緩衝溶液で２０ｍＬ／分の流速で平衡化させ、１次陰イオン交換で得られた分画物をカラムに通過させて、エリスロポエチン類似体は、カラムに吸着させず、非吸着分画物で回収した。洗浄溶液としてｐＨ６．０−７．０の５００ｍＭリン酸緩衝液を用いてカラムに残っている不純タンパク質を除去した。この際、吸着クロマトグラフィーに後続して施行される２次イオン交換クロマトグラフィーを円滑に行うために、吸着クロマトグラフィーを施行する前に限外濾過（ＭＷＣＯ５−３０ｋＤａ）を実施した。前記吸着クロマトグラムは、図３に示した。
【００６３】
実施例５：２次陰イオン交換クロマトグラフィー
２次陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒシステムを使い、カラムとしては、ＳＯＵＲＣＥ  １５Ｑまたは３０Ｑ（ＧＥ社）レジンを２００ｍＬ充填したＧＥ社のＸＫ５０／３０を使った。前記カラムをｐＨ４．０−５．０の２０ｍＭ酢酸緩衝溶液で２５ｍＬ／分の流速で平衡化させた。洗浄溶液としてｐＨ２．２〜２．４の２０ｍＭグリシン緩衝液を使ってカラムを洗浄し、１００−５００ｍＭ塩化ナトリウムを含有したリン酸緩衝液を用いてＳＯＵＲＣＥ  １５Ｑまたは３０Ｑゲルに吸着されたタンパク質を溶出した。そして、各分画物は、タンパク質定量を通じて適正量を計算して、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルクマシー染色と等電点検査ゲルクマシー染色とを通じて不純物の含有有無（図４）とエリスロポエチン類似体の同形体（図５）とを分析した。同形体分析では、最終分画物とＮＥＳＰ標準品とのタンパク質バンド様相が類似していることを確認した。前記２次陰イオン交換クロマトグラムを図６に示した。また、２次陰イオン交換クロマトグラムで取得した精製されたタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で分析して、純度が９８％以上であることを図７に示した。
【００６４】
実施例６：吸着クロマトグラフィー及び２次イオン交換クロマトグラフィーの同時施行
ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒシステムを使って吸着クロマトグラフィーと２次陰イオン交換クロマトグラフィーとを同時に施行する方法を行った。ヒドロキシアパタイトレジンを４３０ｍＬ充填したＧＥ社のＸＫ５０／３０カラムと、ＳＯＵＲＣＥ  １５Ｑまたは３０Ｑレジンを２００ｍＬ充填したＧＥ社のＸＫ５０／３０カラムとをコネクタで連結し、ｐＨ６．０−７．０の２０ｍＭリン酸緩衝溶液（平衡溶液）で２０ｍＬ／分の流速で平衡化させた。そして、１次陰イオン交換クロマトグラフィーで得た分画物を限外濾過（ＭＷＣＯ５−３０ｋＤａ）した濾過液を、連結されているカラムに注入後、平衡溶液を２０ｍＬ／分の流速で注入してカラムに吸着されていない不純タンパク質を洗浄した。該洗浄が完了すれば、ヒドロキシアパタイトカラムは、除去し、ＳＯＵＲＣＥカラムのみをＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒシステムに装着して、実施例５で記述した実験方法を使って目的タンパク質を溶出した。そして、最終精製物は、タンパク質定量を通じて適正量を計算して、等電点検査ゲルクマシー染色を通じて同形体を分析した（図８）。同形体分析結果、吸着クロマトグラフィー及び２次イオン交換クロマトグラフィーをそれぞれ行う方法と吸着クロマトグラフィー及び２次イオン交換クロマトグラフィーを１つの工程で連結して行う方法とで最終分画物の純度に差のないことが確認された。また、最終分画物とＮＥＳＰ標準品とのタンパク質バンド様相が類似していることを確認した。
【００６５】
実施例７：工程段階別の分画物分析
４−１２％濃度勾配ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に分析のためのそれぞれの分画物を分子量標準品と共に各ウェルに注入して、１５０Ｖの定電圧で１時間電気泳動させた。電気泳動済みのゲルは、クマシー染色液で３０分間染色した。
【００６６】
２−５％等電点検査ゲルに分析のためのそれぞれの分画物をタンパク質定量を通じて１０μｇずつ加えて、１００Ｖの定電圧で１時間、２００Ｖで１時間、４００Ｖで１時間、５５０Ｖで１時間電気泳動した。電気泳動済みのゲルは、クマシー染色液で３０分間染色した。
【００６７】
実施例８：Ｐｉｌｏｔ精製工程の確立
本発明の精製工程を用いてＰｉｌｏｔレベルで生産工程を確立した。その結果、各精製段階別収率及び最終収率、そして、各段階別純度を表１に示した。医薬品として高い純度と品質とのために、等電点が高い異性質体を除去しながらも、高収率が得られた。
【００６８】
【表１】
0006049740.tif 000002
【００６９】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したので、当業者において、このような具体的な技術は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、低い等電点を有するエリスロポエチン類似体の精製方法に関連する分野に適用されうる。
【図１】
0006049740.tif 000003
【図２】
0006049740.tif 000004
【図３】
0006049740.tif 000005
【図４】
0006049740.tif 000006
【図５】
0006049740.tif 000007
【図６】
0006049740.tif 000008
【図７】
0006049740.tif 000009
【図８】
0006049740.tif 000010
【図９ａ】
0006049740.tif 000011
【図９ｂ】
0006049740.tif 000012
【図９ｃ】
0006049740.tif 000013
【図９ｄ】
0006049740.tif 000014