(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド及び前記ポリペプチドに共有結合する少なくとも１つのグリコシド部分を有するグリコペプチドと、
少なくとも１つのアミノ基を有するアミノチオール部分とを含む医薬用高分子であって、
前記アミノチオール部分の前記少なくとも１つのアミノ基は、前記グリコペプチドに共有結合し、
前記アミノチオール部分は、下記式（Ｉ）：
（Ｒ１ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＲ２）ｘ                （Ｉ）
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数２〜７のアルケニル基、炭素数２〜７のアルキニル基、炭素数５〜７のアリール基、又は、炭素数２〜７のアシル基であり、Ｒ２は水素原子又はホスフェート基であり、ｎは１〜１０の整数であり、ｍは１〜１０の整数であり、ｘは１〜５の整数である。）
で表され、
前記ポリペプチドは、少なくとも１つのカルボン酸基を有し、
前記アミノチオール部分の前記少なくとも１つのアミノ基は、前記ポリペプチドの前記少なくとも１つのカルボン酸基に共有結合しており、かつ
前記ポリペプチドは、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、又は、これらの組み合わせを含む医薬用高分子。
【請求項２】
前記少なくとも１つのグリコシド部分は、前記ポリペプチドの前記少なくとも１つのカルボン酸基に共有結合している
請求項１に記載の医薬用高分子。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、グルタミン酸、アスパラギン酸、又は、これらの組み合わせを含む少なくとも１つのサブユニットを有する
請求項１に記載の医薬用高分子。
【請求項４】
前記医薬用高分子の分子量は、６，３００〜１２，０００ダルトンである
請求項１に記載の医薬用高分子。
【請求項５】
前記少なくとも１つのグリコシド部分は、少なくとも１つのアミノ基を有する
請求項１に記載の医薬用高分子。
【請求項６】
前記少なくとも１つのグリコシド部分の前記少なくとも１つのアミノ基は、前記ポリペプチドの前記少なくとも１つのカルボン酸基に共有結合する
請求項５に記載の医薬用高分子。
【請求項７】
前記少なくとも１つのグリコシド部分は、キトサン、コラーゲン、コンドロイチン、ヒアルロン酸塩、ヘパリン、又は、これらの組み合わせを含む
請求項１に記載の医薬用高分子。
【請求項８】
前記アミノチオール部分は、２−［（アミノプロピル）アミノ］エタンチオール（ＷＲ−１０６５）、３−（３−メチルアミノプロピルアミノ）プロパンチオール二塩酸塩（ＷＲ−１５１３２６）、Ｓ−３−（３−メチルアミノプロピルアミノ）プロピルホスホロチオ酸（ＷＲ１５１３２７）、Ｓ−１−（アミノエチル）ホスホロチオ酸（ＷＲ６３８）、Ｓ−［２−（３−メチルアミノプロピル）アミノエチル］ホスホロチオ酸（ＷＲ３６８９）、Ｓ−２−（４−アミノブチルアミノ）エチルホスホロチオ酸（ＷＲ２８２２）、３−［（２−メルカプトエチル）アミノ］プロピオンアミド  ｐ−トルエンスルホネート（ＷＲ−２５２９）、Ｓ−１−（２−ヒドロキシ−３−アミノ）プロピルホスホロチオ酸（ＷＲ７７９１３）、２−［３−（メチルアミノ）プロピルアミノ］エタンチオール（ＷＲ−２５５５９１）、Ｓ−２−（５−アミノペンチルアミノ）エチルホスホロチオ酸（ＷＲ２８２３）、１−［３−（３−アミノプロピル）チアゾリジン−２−Ｙ１］−Ｄ−グルコ−１，２，３，４，５ペンタン−ペントール二塩酸塩（ＷＲ−２５５７０９）、［２−［（アミノプロピルアミノ］エタンチオール］Ｎ，Ｎ’−ジチオジ−２，１−（エタンジイル）ビス−１，３−プロパンジアミン（ＷＲ−３３２７８）、Ｓ−２−（３−アミノプロピルアミノ）エチルホスホロチオ酸（ＷＲ２７２１（アミホスチン））、その塩、水和物、活性代謝物、及び、プロドラッグ、並びに、これらの組み合わせからなる群より選択される
請求項１に記載の医薬用高分子。
【請求項９】
前記アミノチオール部分は、アミホスチンである
請求項１に記載の医薬用高分子。
【請求項１０】
請求項１に記載の医薬用高分子と、
医薬的に許容される担体と
を含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬的に許容される担体は、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、デンプン、デキストリン、シクロデキストリン、ポリビニルピロリドン、アルギン酸、チロース、ケイ酸、セルロース、セルロース誘導体、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、又は、これらの組み合わせである
請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年６月３日に出願された米国仮特許出願第６１／４９３，００４号を優先権主張の基礎とする。当該出願のすべての記載内容を本願明細書に援用する。
【０００２】
技術分野
本発明は、抗フリーラジカル医薬用高分子に関する。より具体的には、アミノチオール部分を有する抗フリーラジカル医薬用高分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
放射線の影響から細胞組織を薬理学的に保護することは長年の関心事であった。その結果開発された非常に有望な放射線防護薬の１つに、アミホスチン（メディミューンオンコロジー社、米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）がある。この放射線防護薬は、放射性降下物の潜在的影響からの防護を目的として、米陸軍により第二次世界大戦後に開発された有機チオリン酸塩（ＷＲ−２７２１）である。その活性代謝物（ＷＲ−１０６５）は遊離チオールであり、遊離チオールは、ＤＮＡに代わってアルキル化剤から生じる反応種の標的となり、電離放射線と水の相互作用により発生するフリーラジカルのスカベンジャーとして機能すると考えられている。この防護薬の広範な研究の結果、研究者の間では、ＷＲ−２７２１は正常組織では選択的に蓄積されるが、腫瘍組織では受動的にしか吸収されず、これは血管分布の差によるものであると結論付けられている。ＷＲ−２７２１により、食道、肺、腎臓、肝臓、骨髄、免疫系、皮膚、大腸、小腸、唾液腺、口腔粘膜、及び精巣を含む正常組織はファクター（ｆａｃｔｏｒ）３までの放射線損傷から保護されたが、脳と脊髄は保護されなかった。また、腫瘍組織が放射線又は化学治療の影響を免れたという証拠はなかった。
【０００４】
ウォルター・リード研究所（Ｗａｌｔｅｒ  Ｒｅｅｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって最初に開発されたアミホスチン（ホスホロチオ酸二水素Ｓ−２−（３−アミノプロピル）アミノエチル、ｅｔｈｉｏｆｏｓ、Ｅｔｈｙｏｌ（商標名）、ＮＳＣ  ２９６９６１、又はＷＲ−２７２１としても知られる）は、武力衝突中に遭遇するＸ線や核放射線に対して、抗放射線物質として軍事利用された。アミホスチン及びその他のホスホロチオ酸二水素アミノアルキル、並びにその製造方法は、特許文献１に記載されている。当該特許の内容を本願に援用する。
【０００５】
アミホスチンはまた、アルキル化剤や有機白金製剤、アントラサイクリン、及びタキサンといった種々の細胞毒性剤から正常組織を保護することが示されている。したがってアミホスチンには、細胞保護剤として幅広い適用性が見込まれる。米国内では、国際多施設共同第ＩＩＩ相比較試験に基づいて、アミホスチンの放射線防護薬としての使用が既に承認されている。この試験では、毎回、放射線治療の前に患者にアミホスチンを静脈注射投与すると、急性及び晩期の口腔乾燥症の重症度が顕著に低下したことが示された。
【０００６】
最近では、テキサス州立大学ＭＤアンダーソンがんセンターにて、前向き比較試験が行われている（２００１年１１月１２〜１５日にカリフォルニア州サンフランシスコで開催された、２００１年ＡＳＣＯ会議で報告）。この試験は、アミホスチンが、決定臓器に対する化学放射線治療の主な毒性影響を縮小することで、化学療法と放射線療法の併用療法を強化し、それにより非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者の腫瘍管理及び生存率を向上するかどうかを判断する目的で行われた。最短経過観察を１２か月、追跡期間中央値を２４か月として、１９９８年１１月〜２００１年１月の間に６２人の患者が登録された。患者と腫瘍の特徴は、（Ａ）アミホスチン不使用群と（Ｂ）アミホスチン使用群とに均等に分けられた。生存時間中央値は、患者群１で２０か月、患者群２で１９か月であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第３８９２８２４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、アミホスチンの全身投与にはいくつか欠点がある。第一に、アミホスチンを全身投与された患者には、吐き気、嘔吐、及び低血圧のような望ましくない副作用に加え、ほてりや熱感、冷え、悪寒、めまい、眠気、しゃっくり、くしゃみなどの症状が出る場合がある。更に、高用量のアミホスチンの全身投与は、有毒となり得る。第二に、アミホスチンは、１時間以内にヒトの体外に排出される傾向があり、所望の放射線防護効果が効果的に得られない。
【０００９】
つまり、望ましくない副作用を低減し、その放射線防護効果を増強する為には、より長い滞留時間と、細胞組織又は器官における特異的局在とを達成できるよう、アミホスチンを適切に修飾する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ポリペプチド及びそのポリペプチドに共有結合する少なくとも１つのグリコシド部分を有するグリコペプチドと、少なくとも１つのアミノ基を有するアミノチオール部分とを含み、上記アミノチオール部分の上記少なくとも１つのアミノ基は、上記グリコペプチドに共有結合する医薬用高分子に関する。
【００１１】
上記ポリペプチドは、少なくとも１つのカルボン酸基を有することが好ましい。
【００１２】
上記少なくとも１つのグリコシド部分は、上記ポリペプチドの上記少なくとも１つのカルボン酸基に共有結合していることが好ましい。
【００１３】
上記アミノチオール部分の上記少なくとも１つのアミノ基は、上記ポリペプチドの上記少なくとも１つのカルボン酸基に共有結合することが好ましい。
【００１４】
上記ポリペプチドは、グルタミン酸、アスパラギン酸、又は、これらの組み合わせを含む少なくとも１つのサブユニットを有することが好ましい。
【００１５】
上記ポリペプチドは、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、又は、これらの組み合わせからなることが好ましい。
【００１６】
上記医薬用高分子の分子量は、６，３００〜１２，０００ダルトンであることが好ましい。
【００１７】
上記少なくとも１つのグリコシド部分は、少なくとも１つのアミノ基を有することが好ましい。
【００１８】
上記少なくとも１つのグリコシド部分の上記少なくとも１つのアミノ基は、上記ポリペプチドの上記少なくとも１つのカルボン酸基に共有結合することが好ましい。
【００１９】
上記少なくとも１つのグリコシド部分は、キトサン、コラーゲン、コンドロイチン、ヒアルロン酸塩（ｈｙａｕｒａｎｉａｔｅ）、ヘパリン、又は、その組み合わせを含むことが好ましい。
【００２０】
上記アミノチオール部分は、下記式（Ｉ）で表されることが好ましい。
（Ｒ１ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＲ２）ｘ        （Ｉ）
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数２〜７のアルケニル基、炭素数２〜７のアルキニル基、炭素数５〜７のアリール基、又は炭素数２〜７のアシル基であり、Ｒ２は水素原子又はホスフェート基であり、ｎは１〜１０の整数であり、ｍは１〜１０の整数であり、ｘは１〜５の整数である。）
【００２１】
上記アミノチオール部分は、ＷＲ−１０６５、ＷＲ−１５１３２６、ＷＲ１５１３２７、ＷＲ６３８、ＷＲ３６８９、ＷＲ２８２２、ＷＲ−２５２９、ＷＲ７７９１３、ＷＲ−２５５５９１、ＷＲ２８２３、ＷＲ−２５５７０９、ＷＲ−３３２７８、ＷＲ２７２１（アミホスチン）、その塩、水和物、活性代謝物、及びプロドラッグ、並びにこれらの組み合わせからなる群より選択されることが好ましい。
【００２２】
上記アミノチオール部分は、アミホスチンであることが好ましい。
【００２３】
本発明はまた、有効量の上記医薬用高分子を対象に投与することを含む、フリーラジカルを消去する方法に関する。
【００２４】
上記投与は、経口又は静脈注射によるものであることが好ましい。
【００２５】
上記フリーラジカルは、上記対象を放射線に曝露することにより発生するものであることが好ましい。
【００２６】
上記投与は、上記曝露の前又は後に行われることが好ましい。
【００２７】
上記放射線は、Ｘ線、核放射線、ガンマ線、アルファ線、ベータ線、又は、これらの組み合わせであることが好ましい。
【００２８】
上記有効量は、１００〜５，０００ｍｇ／ｍ２であることが好ましい。
【００２９】
上記対象は、動物であることが好ましい。
【００３０】
上記動物は、ヒトであることが好ましい。
【００３１】
上記医薬用高分子の上記ポリペプチドは、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、又は、これらの組み合わせからなることが好ましい。
【００３２】
上記医薬用高分子の上記少なくとも１つのグリコシド部分は、キトサン、コラーゲン、コンドロイチン、ヒアルロン酸塩（ｈｙａｕｒａｎｉａｔｅ）、ヘパリン、又は、これらの組み合わせを含むことが好ましい。
【００３３】
上記アミノチオール部分は、下記式（Ｉ）で表されることが好ましい。
（Ｒ１ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＲ２）ｘ        （Ｉ）
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数２〜７のアルケニル基、炭素数２〜７のアルキニル基、炭素数５〜７のアリール基、又は炭素数２〜７のアシル基であり、Ｒ２は水素原子又はホスフェート基であり、ｎは１〜１０の整数であり、ｍは１〜１０の整数であり、ｘは１〜５の整数である。）
【００３４】
上記医薬用高分子のアミノチオール部分は、アミホスチンであることが好ましい。
【００３５】
本発明はまた、請求項１に係る医薬用高分子と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００３６】
上記医薬的に許容される担体は、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、デンプン、デキストリン、シクロデキストリン、ポリビニルピロリドン、アルギン酸、チロース、ケイ酸、セルロース、セルロース誘導体、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、又は、これらの組み合わせであることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、ＧＰの生体内分布を示す。
【図２】図２（ａ）及び図２（ｂ）はそれぞれ、アミホスチン及びＧＰ−アミホスチンの酸化還元電位を示す。
【図３】図３は、ＵＶ及びＨ２Ｏ２処理済プラスミドＤＮＡに対する、アミホスチン、ＧＰ−アミホスチン、及びＧＰの保護能力を示す。
【図４】図４（ａ）及び図４（ｂ）は、ＧＰ−アミホスチンを９９ｍＴｃで標識した場合の、生成物の高い放射化学的純度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、医薬用高分子及びその使用に関する。上記医薬用高分子は、グリコペプチド及びアミノチオール部分を含む。上記本発明の医薬用高分子の使用は、フリーラジカルを消去するものである。
【００３９】
本発明の主な発明概念の１つは、グリコペプチドを結合させることによってアミノチオール医薬品化合物を修飾することである。この結合には、上記アミノチオール医薬品化合物が特異的に局在化するとともに、該化合物の滞留時間が長くなるという利点がある。
【００４０】
本発明を十分理解可能なものにするため、以下に、測定手順及びシステムを具体的に説明する。本願はもちろん、当業者に知られた特定の細部に制限されるものではない。一方で、公知の一般的方法及び手順については、発明が必要以上に制限されないよう、詳述しない。以下に、本発明の好ましい実施形態のいくつかをより詳細に説明する。ただし本発明は、明示的に記載された実施形態に加え、幅広い他の実施形態に従っても実施可能である。すなわち、本発明は、他の実施形態に広く適用することができ、本発明の範囲は、請求の範囲に記載された特徴以外には特に制限されない。
【００４１】
上述の通り、本発明の医薬用高分子は、グリコペプチド及びアミノチオール部分を含む。上記グリコペプチドは、ポリペプチド及び少なくとも１つのグリコシド部分を有する。
【００４２】
上記ポリペプチドと上記少なくとも１つのグリコシド部分との結合は、上記少なくとも１つのグリコシド部分が、共有結合を介して上記ポリペプチドに結合するものである。
【００４３】
上記ポリペプチドは、少なくとも１つのカルボン酸基を有することが好ましい。したがって、好ましい実施形態においては、上記少なくとも１つのグリコシド部分が、上記ポリペプチドの上記少なくとも１つのカルボン酸基に共有結合する。他の好ましい実施形態においては、上記グリコシド部分は、少なくとも１つのアミノ基を有し、上記少なくとも１つのグリコシド部分の上記少なくとも１つのアミノ基が、上記ポリペプチドの上記少なくとも１つのカルボン酸基に共有結合する。
【００４４】
好ましい実施形態においては、上記ポリペプチドは、グルタミン酸、アスパラギン酸、又は、これらの組み合わせを含む少なくとも１つのサブユニットを有する。あるいは、上記ポリペプチドは、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、又は、それらを組み合わせたものである。他の好ましい実施形態においては、上記医薬用高分子の分子量は、６，３００〜１２，０００ダルトンである。
【００４５】
上記グリコシド部分は、キトサン、コラーゲン、コンドロイチン、ヒアルロン酸塩（ｈｙａｕｒａｎｉａｔｅ）、ヘパリン、又はこれらの組み合わせから選択されることが好適である。なぜなら、これらのグリコシド部分により、特異的局在化及び滞留時間の延長という特性を本発明の構造に付与することができるからである。
【００４６】
上記アミノチオール部分は、少なくとも１つのアミノ基を有する。上記アミノチオール部分と上記グリコペプチドとの結合は、上記アミノチオール部分の上記少なくとも１つのアミノ基が、上記グリコペプチドに共有結合するものである。好ましい実施形態においては、上記アミノチオール部分の上記少なくとも１つのアミノ基が、上記ポリペプチドの上記少なくとも１つのカルボン酸基に共有結合する。
【００４７】
好ましい実施形態においては、上記アミノチオール部分は、下記式（Ｉ）で表される。
（Ｒ１ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ（ＣＨ２）ｍＳＲ２）ｘ        （Ｉ）
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜７のアルキル基、炭素数２〜７のアルケニル基、炭素数２〜７のアルキニル基、炭素数５〜７のアリール基、又は炭素数２〜７のアシル基であり、Ｒ２は水素原子又はホスフェート基であり、ｎは１〜１０の整数であり、ｍは１〜１０の整数であり、ｘは１〜５の整数である。）
【００４８】
上記アミノチオール部分としては限定されず、例えば、ＷＲ−１０６５、ＷＲ−１５１３２６、ＷＲ１５１３２７、ＷＲ６３８、ＷＲ３６８９、ＷＲ２８２２、ＷＲ−２５２９、ＷＲ７７９１３、ＷＲ−２５５５９１、ＷＲ２８２３、ＷＲ−２５５７０９、ＷＲ−３３２７８、ＷＲ２７２１（アミホスチン）、その塩、水和物、活性代謝物、及び、プロドラッグ、並びに、これらの組み合わせが挙げられる。
【００４９】
本発明の方法は、フリーラジカルを生体内で消去するものである。上記方法は、有効量の上記医薬用高分子を、経口又は静脈注射により対象に投与することを含む。
【００５０】
上記フリーラジカルは、上記対象を、Ｘ線、核放射線、ガンマ線、アルファ線、ベータ線、又はこれらの組み合わせ等の放射線に曝露することにより発生するものであってもよい。また、上記投与は、医師のアドバイスに基づいて上記曝露の前又は後に行うことができる。
【００５１】
上記有効量は、１００〜５，０００ｍｇ／ｍ２である。好適な有効量は、対象の健康状態や体重、及び照射する放射線の強度による。
【００５２】
上記医薬用高分子は、医薬的に許容される担体、又は医薬組成物に好適な他の添加剤と共に投与することができる。上記担体又は添加剤は、上記医薬用高分子の所望の効果に悪影響を及ぼすものではない。ここで、「悪影響」とは、フリーラジカルを消去する能力、滞留時間に影響する能力、又は、医薬用高分子を摂取する能力を低下させることを意味する。
【００５３】
上記医薬的に許容される担体は、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、デンプン、デキストリン、シクロデキストリン、ポリビニルピロリドン、アルギン酸、チロース、ケイ酸、セルロース、セルロース誘導体、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、又は、これらの組み合わせであってもよい。上記添加剤は、緩衝剤、保存料、懸濁化剤、増粘剤、界面活性剤、等張化剤、又は、これらの組み合わせであってもよい。
【実施例】
【００５４】
実施例１：ＧＰにより誘導される局在化
米国特許出願第１２／９７０，０２６号には、薬剤と結合する担体としてグリコペプチド（ＧＰ）が示されている。ＧＰの分布は肺、腎臓、肝臓、炎症部分、赤色骨髄、及び腫瘍部位を含むことが知られている。ここでは、ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影法）スキャンを使用し、ＶＸ−２腫瘍細胞を注入されたニュージーランドウサギにおける、二種類の異なる造影剤６８Ｇａ−ＧＰ（左）及び１８Ｆ−ＦＴＧ（右）の局在化を検出した。
【００５５】
簡潔に説明すると、テキサス州立大学ＭＤアンダーソンがんセンターに動物を収容した。ラット及び放射性同位体に関するプロトコルは、ＭＤアンダーソン動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）及び放射線安全委員会（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。雌のＦｉｓｃｈｅｒ３４４ラット（１５０〜１７５ｇ）（ハーラン・スプラグ・ドーリー（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）社、インディアナ州インディアナポリス）の右脚皮下に、乳腺細胞株（ＤＭＢＡ誘発乳癌細胞株として知られる）の乳癌細胞（１０６細胞／ラット）を接種した。
【００５６】
接種後１４日目に、本実施例における局在化を検討した。雌のＦｉｓｃｈｅｒ３４４腫瘍ラット群の尾静脈に、６８Ｇａ−ＧＰ（左）又は１８Ｆ−ＦＴＧ（右）を静脈注射した。注入された質量はラット１匹当たり３０μｇであった。ＰＥＴスキャンは、注射の４５分後に行った。
【００５７】
図１は、ＰＥＴスキャンの結果を示す。ここで、ＧＰの分布は肺、腎臓、肝臓、炎症部分、赤色骨髄、及び腫瘍部位に及んでいる。この実験結果は、以下の試験において、ＧＰがアミノチオール医薬品化合物の修飾における潜在的な候補であることを示している。
【００５８】
実施例２：本発明の医薬用高分子の調製
本発明の医薬用高分子の調製は下記反応スキーム１に示される。
【００５９】
【化１】
0005952392.tif 000002
スキーム１：ＧＰ−Ａの合成
【００６０】
上記の通り、本実施例において使用されたポリペプチドはポリグルタミン酸であり、使用されたグリコシド部分はキトサンであり、使用されたアミノチオール部分はアミホスチン又はＷＲ１０６５（図示せず）であった。この合成プロトコルを簡単に説明すると、以下の通りである。
・ポリ−Ｌ−グルタミン酸溶液を得る。これは、０．５８５ｇのポリ−Ｌ−グルタミン酸を２５ｍＬの水に溶解したものである。このポリ−Ｌ−グルタミン酸溶液のｐＨ価を、約７．１に調節する。
・キトサン溶液を得る。これは、０．７４ｇのキトサンを１８ｍＬの水に溶解したものである。このキトサン溶液のｐＨ価も、約７．１に調節する。
・０．７４３ｇのＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を、上記ポリ−Ｌ−グルタミン酸溶液と混合する。
・上記ポリ−Ｌ−グルタミン酸溶液に、０．５７ｇのアミホスチンを溶解する。
・上記キトサン溶液と上記ポリ−Ｌ−グルタミン酸溶液とを混合し、この混合液を２４時間撹拌する。
・当該混合液を、２回の透析（使用した膜の分子量は１０ｋ）により精製する。
・上記混合物を凍結乾燥し、本実施例における、本発明の医薬用高分子である生成物を得る。この生成物を、以下の段落又は実験において、それぞれＧＰ−アミホスチン（ＧＰ−Ａ）及びＧＰ−ＷＲ１０６５と呼ぶ。
【００６１】
遊離アミホスチン及びＷＲ−１０６５は、どちらも硫黄性イオン及び／又はリン酸塩基を含むが、ＧＰ単体ではどちらの官能基も含まないため、ＧＰ−Ａ結合率（アミホスチンのＧＰへの結合率）を確認する技術としては、ＩＣＰ（誘導結合プラズマ）又はＥＡ（元素分析）を用いた。本実施例におけるアミホスチンのＧＰへの結合率は、１〜３０ｗｔ％と測定されている。さらに、本実施例で調製したＧＰ−アミホスチンの分子量は、６，３００〜１１，７００ダルトンであったが、これは結合率によって異なっていた。
【００６２】
ＧＰ−アミホスチンの合成には、純水又は共溶媒を使用することができる。共溶媒は、アミホスチン中のリン酸塩基の加水分解を低減させ、それによりＧＰ−アミホスチン／ＧＰ−ＷＲ１０６５の生産率を増加させることができる。
【００６３】
実施例３：本発明のＧＰ−Ａの生体内分布
本実施例においては、ＧＰ−Ａを過テクネチウム酸ナトリウム（Ｎａ９９ｍＴｃＯ４）で標識し、これを、経口投与の０．５時間後、２時間後、及び４時間後にＰＥＴで検出することにより、ラットにおけるＧＰ−Ａの生体内局在化を監視した。
【００６４】
実験は、実施例１をわずかに変更して行った。動物は、テキサス州立大学ＭＤアンダーソンがんセンターに収容した。ラット及び放射性同位体に関するプロトコルは、ＭＤアンダーソン動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）及び放射線安全委員会（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。雌のＦｉｓｃｈｅｒ３４４ラット（１５０〜１７５ｇ）（ハーラン・スプラグ・ドーリー（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）社、インディアナ州インディアナポリス）の右脚皮下に、乳腺細胞株（ＤＭＢＡ誘発乳癌細胞株として知られる）の乳癌細胞（１０６個の細胞／ラット）を接種した。
【００６５】
接種後１４日目に、本実施例における生体分布を検討した。９匹の腫瘍担持マウスを用い、それらを時間間隔別に３つのグループに分けた（０．５時間、２時間、及び４時間、ｎ＝３／時間点）。２０μＣｉの９９ｍＴｃ−ＧＰ−Ａを、外側尾静脈に注射した。投与の一定時間後にマウスを屠殺し、選択した細胞組織を切除、計量し、ガンマ・カウンターで放射能を計測した。各器官における放射性トレーサーの分布を、細胞組織１ｇに対する注射量の割合として表した（％ＩＤ／ｇ）。腫瘍／正常組織の計数比は、対応する％ＩＤ／ｇ値から決定された。統計分析では、生体内分布試験における細胞組織１ｇに対する注射量の割合（％ＩＤ／ｇ）及び腫瘍／細胞組織の比率は、平均±標準偏差（ｍｅａｎｓ±ＳＤ）として示す。この結果を、以下の表１に示す。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
上記表１に示されるように、投与の４時間後でも、ラットの体内に９９ｍＴｃ−ＧＰ−Ａが残存していた。さらに、９９ｍＴｃ−ＧＰ−Ａは、肝臓、脾臓、及び腎臓で特に蓄積されたが、血中及び筋肉中では減少していた。また、腫瘍組織においても９９ｍＴｃ−ＧＰ−Ａの蓄積が観察された。これは、化学治療及び／又は放射線治療において、本発明のＧＰ−Ａを正常組織の放射線防護体又は化学防護体として使用する場合は、治療への影響を最小限にするために、化学治療及び／又は放射線治療での曝露後にＧＰ−Ａの投与を行うことが好ましいであろうということを意味する。
【００６８】
しかしながら、実験結果からは、開示された構造のＧＰ−Ａが、ほとんどの器官におけるアミホスチンの滞留時間を少なくとも４時間に延ばすことができることと、肝臓、脾臓、腎臓等の重要な器官におけるＧＰ−Ａ蓄積に特に好適であることが分かる。したがって、アミホスチン固有の放射線防護能力に加え、本発明のＧＰ−アミホスチン構造は、フリーラジカルによる損傷をより有効に低減する能力を有するものと期待される。
【００６９】
ＧＰ−Ａに対する９９ｍＴｃ標識が成功したことを確認するための補足実験も行なった。図４（ａ）及び図４（ｂ）の両方に示されるように、９９ｍＴｃは完全にＧＰ−Ａに標識され、図４（ｂ）中では遊離９９ｍＴｃは観察されなかった。これら２つの図は、９９ｍＴｃがＧＰ−Ａに標識された時の、生成物の高い放射化学的純度を示す。このＴＬＣ分析では、他の形態の分子は見当たらない。つまり、９９ｍＴｃの検出により決定された上記生体内分布データは、信頼性を有するものである。
【００７０】
実施例４：ヨウ素滴定実験
上記実施例３の結果によって、本発明のＧＰ−Ａは、滞留時間がより長く、かつ特異的に局在（蓄積）する、という利点を有することが実証された。本実施例では、アミホスチン上のグリコペプチドを修飾することで、アミホスチン固有のフリーラジカル消去能力に影響があるかを確かめる。アミホスチン及びＧＰ−アミホスチンの還元力を調べるため、ヨウ素滴定実験を行った。ここで、還元力は、フリーラジカル消去能力の指標であると考えられる。
【００７１】
ヨウ素滴定実験は、この分野で周知のプロトコルに基づいて行なわれた。つまり、アミホスチン及びＧＰ−アミホスチンを、それぞれ様々な濃度となるよう０．９％ＮａＣｌ溶液に溶解した。異なる濃度のアミホスチン／ＮａＣｌ溶液又はＧＰ−アミホスチン／ＮａＣｌ溶液を、ＣＨ３ＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＯＯＮａ緩衝系と混合した。
【００７２】
これらのアミホスチン／ＮａＣｌ溶液又はＧＰ−アミホスチン／ＮａＣｌ溶液を１ｍＬのデンプン溶液（１％ｖ／ｖ）と混合した後、０．００１Ｎヨウ素溶液を用いて、完全に濃青色になるまで滴定を行った。
【００７３】
図２（ａ）及び図２（ｂ）はそれぞれ、アミホスチン及びＧＰ−アミホスチンの酸化還元電位を示す。この結果によれば、アミホスチンの還元力が基本的に変化しなかったことから、グリコペプチドの結合／修飾は、アミホスチン固有のフリーラジカル消去能力に悪影響を及ぼすことはないといえる。
【００７４】
実施例５：プラスミドＤＮＡに対する保護能力
本実施例においては、ＧＰ−Ａが、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）及びＵＶへの曝露からプラスミドＤＮＡを保護する能力を調べた。フリーラジカルはＤＮＡ構造を攻撃する傾向があるため、この能力もまた、フリーラジカル消去能力の指標となる。アミホスチン、ＧＰ−アミホスチン、及びＧＰを、それぞれ様々な濃度となるよう脱イオン蒸留水（ｄｄ−ｗａｔｅｒ）に溶解させた。下記表２に示すように、９つの実験グループを作成した。
【００７５】
【表２】
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【００７６】
プラスミドＤＮＡの完全性を観察するために、上記９つの実験グループを、３μｌの電気泳動用負荷染料と混合した。
【００７７】
図３は、アミホスチン及びＧＰ−アミホスチンの両方が、ＵＶ＆Ｈ２Ｏ２処理プラスミドＤＮＡを保護する能力を、わずかではあるけれども確実に有することを示す。上述した観察結果（図２（ａ）、図２（ｂ）、及び図３）に基づき、アミホスチン及び本発明のＧＰ−アミホスチンの両方が、フリーラジカルの拡散を阻止する防護能力を有することが確認された。
【図２】
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【図４】
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【図１】
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【図３】
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