(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヘモグロビン又はミオグロビンである酸素担体と、
（ｂ）電解質、防腐剤、安定剤、抗凝集剤、抗凝固剤、ｐＨ緩衝剤、溶媒、酸化防止剤、被膜形成剤及び架橋剤から選択される少なくとも１つの更なる成分とを含む組成物、
ここで、前記酸素担体の少なくとも４０％において、酸素結合部位が非Ｏ2リガンドによりチャージされており、前記組成物は、前記組成物を、微細スプレー状にスプレーすることを許容する滅菌コンテナーで提供される組成物。
【請求項２】
前記組成物が水溶液又は有機溶液であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の前記酸素担体がリガンドチャージ形態で提供されることを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記非Ｏ2リガンドが一酸化炭素及び一酸化窒素から選ばれることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記酸素担体が、ヒト若しくは動物由来の天然のヘモグロビン若しくはミオグロビンであるか、又は、人工的に処理され、架橋され、若しくは修飾された、ヒト若しくは動物由来のヘモグロビン若しくはミオグロビンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
滅菌形式で提供される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
エアゾール缶、または圧縮パックエアゾール缶として提供される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
創傷の外部治療用である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
（ｉ）酸素担体は、天然環境から単離する間又は後に、保護された非Ｏ2リガンドでチャージされ、
（ｉｉ）少なくとも１つのさらなる成分（ｂ）が添加され、
（ｉｉｉ）組成物は、任意に滅菌され、かつ
（ｉｖ）組成物は、組成物を、微細スプレー状に、スプレーされることを許容する滅菌コンテナー、または、エアゾール缶に充填される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物の製造方法。
【請求項１０】
ステップ（ｉｉｉ）において前記組成物は、加熱、濾過、遠心分離、防腐剤の添加、蒸気適用、ガス適用若しくはＵＶ適用又はこれらのうちの少なくとも２つの組み合わせにより滅菌される請求項９に記載の組成物の製造方法。
【請求項１１】
創傷の外部治療用の材料又は組成物の調製のための、非Ｏ2リガンドで酸素結合部位がチャージされているヘモグロビン又はミオグロビンの使用。
【請求項１２】
治療されるべき外傷が、慢性外傷、手術外傷、怪我外傷、心的外傷（ｔｒａｕｍａ）後の外傷、開放外傷、慢性外傷、不完全治癒又は低酸素症外傷、動脈血管の変質若しくは狭窄に起因する外傷、糖尿病疾患に起因する外傷、慢性静脈不全に起因する外傷、または、褥瘡化膿外傷、或いは、熱傷、化学若しくは凍傷の外傷または熱湯外傷であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
治療されるべき外傷が、慢性外傷、手術外傷、怪我外傷、心的外傷（ｔｒａｕｍａ）後の外傷、開放外傷、慢性外傷、不完全治癒又は低酸素症外傷、動脈血管の変質若しくは狭窄に起因する外傷、糖尿病疾患に起因する外傷、慢性静脈不全に起因する外傷、または、褥瘡化膿外傷、或いは、熱傷、化学若しくは凍傷の外傷または熱湯外傷であることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
（ａ）全血の血漿を分離する工程、
（ｂ）赤血球を溶解する工程、
（ｃ）酸素担体を、非Ｏ2リガンドでチャージする工程、
（ｄ）試料を４０〜８５℃の範囲の温度に加熱する工程、
（ｅ）酸素担体を任意の望ましくない血液成分から分離する工程
を含む、ヘモグロビン又はミオグロビンである酸素担体を全血から精製する方法、
但し、前記工程（ｅ）は少なくとも１つの濾過工程を含む、方法。
【請求項１５】
前記非Ｏ2リガンドが、一酸化炭素又は一酸化窒素である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｅ）における濾過は、滅菌フィルター及び／又はウイルスフィルターの使用を含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビン又はミオグロビン（ここで前記ヘモグロビン又はミオグロビンの少なくとも４０％において、酸素結合部位が非Ｏ2リガンドでチャージされている）及び少なくとも１つの更なる成分を含む組成物、前記組成物を調製する方法、並びに創傷の外部治療における非酸素リガンドでチャージされているヘモグロビン又はミオグロビンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
状態に応じて異なる方法が創傷の治療のために使用される。第１には、依然として開放している創傷は、好ましくは消毒され、それによって外部からの悪影響に対して保護されるべきである。このことは、適切な消毒薬溶液若しくは噴霧式包帯により又はヨウ素溶液の適用によっても実施することができる。実際の創傷治癒は、内部から生じなければならない。これは、依然として所定の位置にある血管が、組織修復機構が始動できるように、十分な量の基質を、破壊された組織に供給しなければならないことを意味する。
【０００３】
創傷は、例えば損傷のような多様な要因によって又は手術若しくは外傷性事象の後でも引き起こされうる。
【０００４】
一方、創傷形成、また特に慢性創傷は疾患によっても誘発される可能性があり、そこでは大及び／又は小血管の変性及び／又は狭窄が生じる。このことは、例えば年配の患者の場合では長期病床（extended stays in bed）（褥瘡）の結果でありうる又は大及び小血管の変性及び動脈硬化（動脈の大血管障害及び微小血管障害）をもたらしうる真性糖尿病（Ｐ．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ、Ａ．Ｆｒａｎｃｏ、Ａｔｌａｓ  ｄｅｒ  Ｋａｐｉｌｌａｒｏｓｋｏｐｉｅ［毛細血管顕微鏡検査法図解（Atlas of Capillaroscopy）］、１９８３年、Ａｂｂｏｔｔ，Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｉｎｓｔ．２，Ｄ−Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）の結果でありうる。酸素欠乏（低酸素症）が創傷領域に存在することも示された。４０ｍｍＨｇが臨界値であると考慮されている（Ｃ．Ｄ．Ｍuｌｌｅｒら、Ｈａｒｔｍａｎｎ創傷フォーラム（Wund［Wound］Forum）１（１９９９年）、１７〜２５）。
【０００５】
血液は、動脈を介して、皮膚を含む組織へ流れ、生命に必要な基質を細胞に供給する。血管のあらゆる変性は、細胞への基質の供給不足をもたらし、細胞の死をもたらす。基質は、拡散により、最小血管（毛細管）からおよそ２０μｍの微細と思われる最後の間隙を通過して細胞に至らなければならず、この点に関して、生体がこの基質を取り扱うことが困難であるので、酸素は特別な役割を果たす。
【０００６】
３つの主な問題が関与する。
（１）酸素が生命にとって必要不可欠であることは確かであるが（ヒトは、彼／彼女の脳が酸素を受け取らないと、僅かおよそ５分後に脳死する）、同時に、酸素は毒性が高い（純酸素で呼吸治療をうける新生児は、僅か数日後に死亡する）。
（２）酸素は、水性媒質においてほとんど可溶性を有さない。このことは、フィックの第一法則（FICK's first law）のよると、酸素の低い拡散率をもたらす。加えて、（酸素の）拡散速度は拡散距離が増加すると減少すると記述する拡散の基本的な法則、すなわちスモルコフスキー及びアインシュタインの法則が存在する。ここで、酸素の拡散係数は非常に低いので、２０μｍ程の小さな拡散距離での拡散速度は、初期値の僅か５％である。例えば５０μｍの水層は、細胞にとってほぼ完全な酸素遮蔽を表す。酸素は、ヘモグロビンに結合して、血流により、肺から足指の先端まで生体の中の長い経路に沿って輸送され、この方法によってのみ、生体に適切な方法で長距離を克服することができる。
（３）酸素には、例えばグルコースと対照的に、体内に貯蔵領域がなく、したがってこの基質は細胞にとって常に、素早く、十分な量で利用可能でなければならず、酸素は、生命に必要ないわゆる即時型基質（immediate substrate）である。
【０００７】
無傷の生体は、幾つかの機構を使用してこれらの問題を解決してきた。酸素の毒性作用は、前者が輸送の際にヘモグロビンと結合し、それにより無害のままでいることによって回避される。同時に、遊離酸素は希釈され、それによりその有害な酸化の可能性が更に失われる。それにもかかわらず、ヘモグロビンとの結合が可逆的であるので、十分な量で瞬時に利用可能である。低い拡散範囲の問題は、生体が非常に微細に枝分かれした血管網状組織（毛細管網）を発達させ、このことが、平均して全細胞が毛細管から最大２５μｍの距離にあることを確実にし、この方法によって、生体中の酸素の拡散経路が臨界長の５０μｍを下回ったままでいることによって解決される。加えて、細胞には幾つかの側面から酸素を拡散的に供給することができ、このことは安全機構を表す。要求に応じた即時利用可能性は（酸素は過剰に利用可能であることは許容されず、そうでなければ有害な効果を有する）、潅流を制御し、それにより酸素の供給を最適化する血管流の血管調節によって、生体において達成される。
【０００８】
開放創傷表面が存在する場合、細胞への酸素供給は中断される。外気からの酸素供給は不十分であり、それは、水性液体膜が（組織）細胞層の上にあり、この膜が、説明されるように拡散酸素遮断層を形成するからである。正常組織における新たな創傷は、下層からの、換言すると内部からの酸素供給が十分であると、数日で治癒することができる。しかし、周囲空気の酸素濃度が増加した場合、新たな創傷でも良好に治癒することが、動物実験で示された（Ｍ．Ｐ．Ｐａｉら、手術、婦人科学及び産科学（Sug. Gyn. Obstet.）１３５（１９７２年）、７５６〜７５８）。古い、特に慢性の創傷は、酸素欠乏に起因して、仮に治癒したとしてもゆっくりと治癒することが知られている。
【０００９】
慢性創傷を良好に治癒するため、同様に、いわゆる高圧酸素療法（ＨＢＯ）が使用されてきた。この治療において、患者は加圧チャンバーに入れられ、そこで純酸素の過剰圧力の約３バールに特定の時間にわたって付される（Ｃ．Ｄ．Ｍuｌｌｅｒら、Ｈａｒｔｍａｎｎ創傷フォーラム（Wund Forum）１（１９９９年）、１７〜２５）。事実、創傷治癒をこの方法により増加することができる。しかし、効果は治療の回数により減少する。
【００１０】
米国特許第２，５２７，２１０号は、静脈内及び例えば噴霧による局所の両方において創傷の治療に使用できるとされるヘモグロビン溶液を記載する。この記載において、ヘモグロビンは、遠心分離後の凍結ショック及び血漿画分の引き出しに付される新たな赤血球から得られる。このことは細胞溶解をもたらし、ヘモグロビンが放出される。分解細胞壁も生成物中に存在する。この配合物は濃縮細胞デトリタス（細胞フラグメント）である。この方法では、５％の亜硫酸ナトリウムを添加した後、そうでなければヨウ素溶液により達成されるような防腐覆い効果が想定される。換言すると、創傷は単に閉鎖されている。酸素輸送は、ここには記述されていない。
【００１１】
ＷＯ９７／１５３１３は、創傷治癒を改善するためのヘモグロビンの治療的使用を記載する。この目的のため、ヘモグロビン無含有間質及び発熱性物質が、血圧を増加させるために、特に手術及び外傷性事象の後で患者に静脈内投与される。特に、ジアスピリンと架橋するヘモグロビンが、この目的のために使用される。
【００１２】
ＷＯ２００３／０７７９４１は、単離され、場合により架橋されたヘモグロビンを含むヘモグロビン溶液による開放創傷の治療を教示する。溶液は、ブタの血液からのヘモグロビンで新たに調製され、慢性創傷に適用された。
【００１３】
ヘモグロビンまたはミオグロビンに基づいた酸素担体の調製及び貯蔵の間、これらは機能性を部分的又は完全に失う可能性がある。このことを防止するため、使用可能な状態を維持し、酸素を輸送できるように、酸素担体を安定化させることが望ましい。
【００１４】
一般に、人工酸素担体の調製において異なる手法があり、そのうちの１つは、未変性又は化学的に改質されたヘモグロビンの適切な溶液の調製である（「代用血液に関する第Ｖ回国際シンポジウムの論点、カリフォルニア州サンディエゴ、１９９３年３月」（Issues from Vth International Symposium on Blood Substitutes, San Diego, Calif., USA, March 1993）、人工細胞、代用血液及び固定化バイオ技術（Artificial Cells, Blood Substitutes, and Immobilization Biotechnology）２２（１９９４年）、第２巻〜第４巻を参照すること）。そのような医薬調合剤の人工酸素担体としての取扱いについての一つの問題は、酸素を輸送することがもはやできなくなるメトヘモグロビンへの自然酸化により、不活性化が増加することである。このことは、通常、製造者による調製、続く貯蔵の際に生じる。
【００１５】
この問題を解決するための幾つかの手法が記載されている。ヘモグロビンの酸化の程度を最小限にすること又は酸化されたヘモグロビンが再び戻ることを低減することのいずれかを試みている。
【００１６】
自然酸化を防止する一つの可能性は、ヘモグロビンを脱酸素化すること（すなわち、調合剤から酸素を完全に除去すること）であり、それはデソキシヘモグロビン（desoxyhemoglobin）がオキシヘモグロビンよりもはるかに遅くメトヘモグロビンに酸化されるからである。
【００１７】
更に、可能な限り低い温度（水溶液では、約４℃）で貯蔵及び／又は調製することにより、酸化の量を最小限にすることが可能である。
【００１８】
加えて、ヘモグロビンの酸化の率は、水素イオン濃度、すなわちｐＨによって左右される。例えば、未変性ヒトヘモグロビンでは、ｐＨ７．５〜９．５の間で最小である。
【００１９】
また、特定のアルコールの添加は、ヘモグロビンの酸化を減少させることができる。これらのうちの幾つかは、低濃度であっても作用する。一つの問題は、これらのアルコールの毒性である。
【００２０】
特定の金属イオン（Ｃｕ2+、Ｆｅ3+など）は、ヘモグロビンの自然酸化を触媒する。これらは、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）との錯化により効果がなくなるが、ＥＤＴＡそれ自体は、ヘモグロビンの自然酸化を促進する。
【００２１】
人工酸素担体を酸化から保護することは、還元物質の添加により更に達成することができる。特定の状況下において、これらは、酸化されたヘモグロビンの再活性化さえもたらす。
【００２２】
ＥＰ０８５７７３３は、ヘモグロビンが、リガンド、特に一酸化炭素を酸素結合部位に結合させることによって安定化されうることを記載する。そのようなカルボニルヘモグロビンを脱配位（de-ligandation）することなく生体に適用することができ、血流内の酸素担体として適していることが見出された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】米国特許第２，５２７，２１０号
【特許文献２】ＷＯ９７／１５３１３
【特許文献３】ＷＯ２００３／０７７９４１
【特許文献４】ＥＰ０８５７７３３
【特許文献５】ＤＥ−Ａ１００３１７４４
【特許文献６】ＤＥ−Ａ１００３１７４２
【特許文献７】ＤＥ−Ａ１００３１７４０
【特許文献８】ＤＥ１９７０１３７
【特許文献９】ＥＰ９７１０００７９０
【特許文献１０】ＤＥ４４１８９３７
【特許文献１１】ＤＥ３８４１１０５
【特許文献１２】ＤＥ３７１４３５１
【特許文献１３】ＤＥ３５７６６５１
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Ｐ．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ、Ａ．Ｆｒａｎｃｏ、Ａｔｌａｓ  ｄｅｒ  Ｋａｐｉｌｌａｒｏｓｋｏｐｉｅ［毛細血管顕微鏡検査法図解（Atlas of Capillaroscopy）］、１９８３年、Ａｂｂｏｔｔ，Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｉｎｓｔ．２，Ｄ−Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ
【非特許文献２】Ｃ．Ｄ．Ｍuｌｌｅｒら、Ｈａｒｔｍａｎｎ創傷フォーラム（Wund[Wound]Forum）１（１９９９年）、１７〜２５
【非特許文献３】Ｍ．Ｐ．Ｐａｉら、手術、婦人科学及び産科学（Sug. Gyn. Obstet.）１３５（１９７２年）、７５６〜７５８
【非特許文献４】「代用血液に関する第Ｖ回国際シンポジウム、カリフォルニア、サンディエゴ、１９９３年３月」（Issues from Vth International Symposium on Blood Substitutes, San Diego, Calif., USA, March 1993）、人工細胞、代用血液及び固定化バイオ技術（Artificial Cells, Blood Substitutes, and Immobilization Biotechnology）２２（１９９４年）、第２巻〜第４巻
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明の目的は、創傷治癒を増加し、取扱いが容易であり、貯蔵可能である、創傷の外部治療用生成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明によると、この目的は、
（ａ）酸素担体、好ましくはヘモグロビン又はミオグロビン（ここで前記酸素担体の少なくとも４０％において、酸素結合部位が非Ｏ2リガンドでチャージされている(charged)）と、
（ｂ）電解質、防腐剤、安定剤、抗凝集剤、抗凝固剤、ｐＨ緩衝剤、溶媒、酸化防止剤、被膜形成剤及び架橋剤から選択される少なくとも１つの更なる成分と
を含む組成物、並びに
創傷の外部治療用の作用物質又は組成物の調製のための、非Ｏ2リガンドで酸素結合部位がチャージされている酸素担体、好ましくはヘモグロビン又はミオグロビンの使用
によって満たされる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明によると、好ましくは天然（未変性）酸素担体、特にヘモグロビン若しくはミオグロビン又はこれらの改質された誘導体若しくはこれらの混合物が使用される。ヒト又は動物由来、特にウマ、ウシ若しくは好ましくはブタ由来のヘモグロビン又はミオグロビンが本発明に特に適している。天然又は下記に記載されているように改質されたヒト又はブタヘモグロビンが、酸素担体として特に適している。酸素担体は、ヒト若しくは動物血液から新たに単離することができる又は人工的に調製することができる。
【００２８】
天然及び改質酸素担体の混合物を、重量を基準にして例えば２０：１〜１：２０のような比で使用することもできる。更に、ヘモグロビン及びミオグロビン又はこれらの改質誘導体の混合物を、前述された比の２０：１〜１：２０で使用することができる。
【００２９】
更なる実施態様において、酸素担体を改質することができる。改質は、分子内架橋、重合（分子間架橋）、ペグ化（ポリアルキレンオキシドとの共有結合）、ピリドキサール−５′−ホスフェート若しくは２−ノル−２−ホルミル−ピリドキサール−５′−ホスフェートのような化学的に反応性のエフェクターによる、又は同様に２，３−ビスホスホグリセレート、イノシトールヘキサホスフェート、イノシトールヘキサスルフェート若しくはメリト酸のような酸素結合の化学的に非反応性のエフェクターによる改質、或いはこれらの組み合わせでありうる。そのような改質は知られており、例えば、ＤＥ−Ａ１００３１７４４、ＤＥ−Ａ１００３１７４２及びＤＥ−Ａ１００３１７４０に記載されている。酸素担体の架橋も、ＤＥ１９７０１３７、ＥＰ９７１０００７９０、ＤＥ４４１８９３７、ＤＥ３８４１１０５、ＤＥ３７１４３５１、ＤＥ３５７６６５１に記載されている。
【００３０】
改質酸素担体の例は、ＷＯ９７／１５３１３による分子内架橋分子、特にポリマー分子のような６５，０００〜１５，０００，０００の分子量を有するヘモグロビン、並びに８０，０００〜１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌ、特に１００，０００〜５，０００，０００の平均分子量を有する分子間架橋生成物又は１６，０００〜５，０００，０００、特に１００，０００〜３，０００，０００、好ましくは１，０００，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する類似的に生成されたミオグロビンである。例えば、ブタジエンジエポキシ、ジビニルスルホン、ジイソシアネート、特にヘキサメチレンジイソシアネート、シクロヘキシルジイソシアネート及び２，５−ビスイソシアネートベンゾールスルホン酸、ジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジイミドエステル若しくはジアルデヒド、特にグリオキサール、類似的に反応するグリコールアルデヒド又はグルタルジアルデヒドなどの二官能性架橋剤のような分子間改質が知られている架橋剤を使用して重合される、これらの酸素担体を使用することができる。
【００３１】
更に、この方法で重合される生成物及びポリエチレングリコール又はその適切な誘導体でペグ化される生成物を使用することができる。これには、例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド若しくはエチレンオキシド及びプロピレンオキシドのコポリマー又はこれらのエステル、エーテル若しくはエステルアミドが含まれる。共有結合されたポリアルキレンオキシドが２００〜５０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有すると、適している場合がある。
【００３２】
ポリアルキレンオキシドの共有結合では、既に官能基と共有結合している結合剤を含有し、それによりヘモグロビンのアミノ、アルコール又はスルフヒドリル基と直接化学反応して、ポリアルキレンオキシドの共有結合の形成を可能にするポリアルキレンオキシドの誘導体が適しており、例えば、反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、エポキシ（グリシジルエーテル）、ルデヒド（ldehyde）、イソシアネート、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド、イミダゾリルホルメート、トレシレート基などを有するポリアルキレンオキシドである。多くのそのような単官能的に活性化されたポリアルキレングリコールが市販されている。
【００３３】
改質酸素担体が使用される場合、改質架橋（分子内若しくは分子間）された又は架橋及びペグ化された、２５０，０００〜７５０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するヘモグロビン生成物、或いは５０，０００〜７５０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有するミオグロビン生成物が好ましい。
【００３４】
特の好ましい実施態様によると、ヒト又は動物由来、特にブタ由来の新たに単離されたヘモグロビン又はミオグロビンが、本発明の組成物の調製に使用される。
【００３５】
本発明によると、酸素担体の酸素結合部位の少なくとも４０％が非Ｏ2リガンドでチャージされている。好ましくは、ヘモグロビン又はミオグロビンの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％又は９５％がリガンドチャージ形態で提供される。この電荷を担体の単離の際に前もって適用することができる又はその更なる精製の後に適用することができるが、酸素担体の単離をその保護形態で実施することが特に好ましく、それは、単離又は精製の際にリガンドに酸素担体が提供されること／リガンドが酸素担体と接触することを意味する。
【００３６】
非Ｏ2リガンドは、好ましくは一酸化炭素（ＣＯ）若しくは一酸化窒素（ＮＯ）又はこれらの混合物である。両方のリガンドは、ヘモグロビン／ミオグロビンのＯ2結合部位に高い親和性を有し、ヘムの中心Ｆｅ3+イオンの酸化に対しての保護物質として機能する。
【００３７】
チャージされた酸素担体は、好ましくは水性又は有機性媒質に溶解し、ここで水溶液は、０．１〜３５重量％、好ましくは０．１〜２０重量％、より好ましくは０．１〜１５重量％の量が適用の準備のために好ましい。
【００３８】
本発明の組成物は、好ましくは電解質、安定剤、抗凝集剤、防腐剤、ｐＨ緩衝剤、溶媒、酸化防止剤及び被膜形成剤を含む群から選択される、より好ましくは電解質、安定剤、抗凝集剤、防腐剤及びｐＨ緩衝剤から選択される、少なくとも１つの更なる添加剤を更に含む。最も好ましくは、組成物は溶液の形態であり、少なくとも電解質及び場合により安定剤を含む。
【００３９】
溶液は、塩のような生理学的に適合する電解質を適切な又は所望の量で含むことができる。電解質は、０．１〜３０重量％、好ましくは０．１〜１０％の量で存在することができるが、好ましくはそれぞれ生理学的濃度で存在する。好ましくは、組成物は、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮＨ4Ｃｌ、ＣａＣＯ3、Ｎａ2ＣＯ3、Ｋ2ＣＯ3、ＭｇＳＯ4、Ｎａ2ＳＯ4、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム又は記述されたもの若しくは同様のものの混合物などであるが、これらの例に限定されない塩を前述の量で含む。最も好ましい塩は、特に０．９％の濃度（等張液）のＮａＣｌである。
【００４０】
本発明によると、組成物が、タンパク質、特にヘモグロビン／ミオグロビンの安定剤及び／又は抗凝集剤として作用する化合物、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、Ｎ−アセチルメチオニン、メチオニン、非カオトロピック塩、ポリオール、糖類、好ましくは二糖、及びアミノ酸を好ましくはそれぞれ０．００１重量％〜２０重量％の量で含むことが特に好ましい。
【００４１】
用いることができるポリオールは、好ましくは低分子量ポリオールであるが、ポリマー誘導体を用いることができる。そのようなポリオールには、エチレングリコール、グリセロール、エリトリトール及びマンニトールが含まれる。用いることができる環状ポリオールは、１つ以上の脂環式の環を組み込み、少なくとも１つの側鎖を有することができる。好ましいポリオールには、二糖及び糖アルコール、例えばラクチトール、ソルビトール及びイノシトールが含まれる。２〜１０個のヒドロキシル基を有する化合物が好ましい。ポリオールの量は、好ましい範囲の０．００１〜２０％、より好ましくは１〜１５％、最も好ましくは２〜１０％ｗ／ｖでありうる。
【００４２】
更に、タンパク質安定剤添加剤は、式１；（ＨＯＣＨ2）3Ｃ−Ｒ（１）のトリス（ヒドロキシメチル）メチル化合物から選択することができ、式中、Ｒは、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、置換Ｃ1〜Ｃ4アルキル、ＮＨ2、ＮＨＣ（ＣＨ2ＯＨ）3、Ｃ1〜Ｃ4ヒドロキシアルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルキルカルボキシレート、ＮＲ1Ｒ2（ここでＲ1及びＲ2は、独立して、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルキルスルホネート、Ｃ1〜Ｃ4ヒドロキシアルキルスルホネートでありうる）である。式（１）の好ましい化合物の例には、トリス（ヒドロキシメチル）エタン；１，１′，１″−トリス（ヒドロキシメチル）プロパン；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン又はその塩、例えば塩化物、マレイン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩；１，３ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン；ビス（２ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン；Ｎ［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホネート；Ｎ［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホネート；Ｎ［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホネート；Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−グリシンが含まれる。前記化合物も、好ましい範囲の０．００１〜２０％、より好ましくは１〜１５％、最も好ましくは２〜１０％ｗ／ｖで添加することができる。
【００４３】
更に、タンパク質安定剤添加剤は、高分子電解質から選択することができる。高分子電解質は、カチオン性又はアニオン性の高分子電解質でありうる。両性高分子電解質を用いることもできる。カチオン性高分子電解質は、好ましくは、分子鎖に沿って分配されたカチオン性基を有するポリマーである。
【００４４】
好ましくは第四級アンモニウム誘導官能基であるカチオン性基は、鎖から垂れ下がっている側鎖に配置されうる又は鎖に組み込まれうる。カチオン性高分子電解質の例には、ビニルピロリドンと第四級メチルメタクリレートのコポリマー、例えばＩＳＰから得られるＧａｆｑｕａｔシリーズ（７５５Ｎ、７３４、ＨＳ−１００）；置換ポリアクリルアミド；ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン及び置換誘導体；ポリアミンホモポリマー（Ｇｏｌｃｈｅｍ  ＣＬ１１８）；ポリアミンコポリマー（例えば、エピクロロヒドリンとモノ又はジメチルアミンの縮合物）；ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド（ポリＤＡＤＭＡＣ）；置換デキストラン；改質グアーガム（ヒドロキシプロプリトリモニウムクロリドで置換されている）；置換タンパク質（例えば、ダイズタンパク質及び加水分解コラーゲンにおいて置換されている第四級基）；ポリアミノ酸（例えば、ポリリシン）；低分子量ポリアミノ化合物（例えば、スペルミン及びスペルミジン）が含まれる。天然又は人工ポリマーを用いることができる。
【００４５】
ＭＷ１５０〜５，０００，０００、好ましくは５０００〜５００，０００、より好ましくは５０００〜１００，０００のカチオン性高分子電解質を用いることができる。０．０１〜１０％の量が好ましく、より好ましくは０．１〜２％、とりわけ０．０５〜５％ｗ／ｖである。
【００４６】
アニオン性高分子電解質は、好ましくは、分子鎖に沿って分配されたアニオン性基を有するポリマーである。カルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩又は他の陰性荷電イオン化されうる群を含むことができるアニオン性基を、鎖から垂れ下がっている基に配置する又はポリマー主鎖に直接結合することができる。天然又は人工ポリマーを用いることができる。
【００４７】
アニオン性高分子電解質の例には、Ｇａｎｔｒｅｚ（Ｓシリーズ、ＡＮ−シリーズ）；アルギン酸及び塩；カルボキシメチルセルロース及び塩；置換ポリアクリルアミド（例えば、カルボン酸基で置換されている）；ポリアクリル酸及び塩；ポリスチレンスルホン酸及び塩；硫酸デキストラン；置換糖類、例えばスクロースオクトスルフェート（octosulphate）；ヘパリンが含まれる。１５０〜５，０００，０００のＭＷを有するアニオン性高分子電解質を使用することができ、好ましくは５０００〜５００，０００、より好ましくは５０００〜１００，０００である。０．０１〜１０％の量が好ましく、特に０．０５〜５％、とりわけ０．１〜２％ｗ／ｖである。
【００４８】
特に好ましい安定剤は、０〜１０％、好ましくは０．０１〜５％のＮ−アセチルシステインである。
【００４９】
更に組成物は、例えばフェノキシエタノール、イソチアゾリン、ソルビン酸又は当業者に既知の他の任意の適切な防腐剤のような任意の防腐剤を含有することができる。
【００５０】
組成物は、好ましくは任意の緩衝剤を更に含むことができる。Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸）、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、トリシン（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、ＴＥＳ（２−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム生理食塩水）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）のような、全ての一般的に既知の緩衝剤を使用することができるが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明の組成物に適した溶媒は、好ましくは水又は水溶液、アルコール、好ましくはエタノールのような有機溶媒又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。前記溶媒の混合物を使用することもできる。更に、天然油を幾つかの成分の溶媒として使用することができ、組成物をエマルションとして提供することができる。特に好ましい溶媒は、水又は水溶液である。
【００５２】
本発明に組成物に有用な酸化防止剤は、例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ、フラボノイド、カロチノイド又はこれらの塩若しくは誘導体でありうる。
【００５３】
好ましい被膜形成剤は、例えばアクリルアミド／ナトリウム、アクリレートコポリマー、アクリレート／アクリルアミドコポリマー、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのブチルエステル、カルボキシメチルキチン、キトサン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリクオタニウム−３６、ＰＶＰ、ＰＶＰ／ＶＡコポリマー、ＶＡ／クロトネートコポリマー又はビニルカプロラクタム／ＰＣＰ／ジメチルアミノオクチルメタクリレートコポリマーのような化粧品用途に一般的に使用されるような作用物質である。
【００５４】
上記に記述された添加剤は、全て、特に上記に記述されていない限り、０〜２０、好ましくは０．００１、０．０１、０．０５又は０．１〜１０、より好ましくは０．５〜５％（ｗ／ｖ）の量で存在することができる。
【００５５】
望ましい場合、更なる添加剤が、特に０〜２０、好ましくは０．１〜２０、好ましくは０．２〜１５、特に０．５〜１０重量％の量で存在することができる。好ましい添加剤は細胞にとっての栄養素である。これらは、例えば０．１〜５重量％の量のグルコース、２５ＩＵ／ｍｌまでの量のインスリン、例えば０．１〜５重量％の天然アミノ酸、特にシステイン又は生理学的量からその１０倍の量までのインターロイキンなどの組織因子から選択することができる。
【００５６】
好ましくは、組成物は、
（ａ）酸素担体、好ましくはヘモグロビン又はミオグロビン（ここで前記酸素担体の少なくとも４０％において、酸素結合部位が非Ｏ2リガンドでチャージされている）と、
（ｂ）電解質、防腐剤、安定剤、抗凝集剤、抗凝固剤、ｐＨ緩衝剤、酸化防止剤、有機溶媒、被膜形成剤及び架橋剤から選択される少なくとも１つの更なる成分と
を含む水溶液を表す。
【００５７】
本発明の好ましい実施態様において、組成物は、ヒト又は動物、好ましくはブタの全血から単離された酸素担体を含む。
【００５８】
したがって、全血からの本発明の組成物に使用可能な酸素担体の精製過程を提供することが、本発明の更なる態様である。
【００５９】
好ましい実施態様の組成物の調製のため、酸素担体は、ヒト又は動物の血液から単離され、血漿及び細胞膜構成成分が本質的に無含有になるように更に精製される。
【００６０】
「本質的に無含有」とは、考慮される化合物又は組成物が２０％以下、好ましくは１０％以下、さらにより好ましくは５％以下、特に好ましくは２％以下又は１％未満の記述された望ましくない化合物を含むことを意味する。
【００６１】
精製は、例えば、選択的溶解若しくは沈殿、遠心分離、超遠心分離（ultracentifugation）、分別遠心分離（fractionated centrifugation）、アニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティー若しくは吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過若しくはモレキュラーシーブクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー方法又は透析のような任意の適切な手段又は方法工程を、これらの例に限定されることなく、適用された方法によって酸素担体が可能な限り少なく変性される限り、含むことができる。好ましくは、単離及び精製の際に酸素担体は本質的に溶液中に留まっている。
【００６２】
酸素担体が全血から単離されるとき、酸素担体を含む細胞は、他の血液成分から分離されること又は前記細胞は選択的に溶解されて、（可溶性）酸素担体を溶液中に送達し、その後、非可溶性成分が分離されること、のいずれかが好ましい。２つの方法の組み合わせも適している。酸素担体含有細胞の溶解は、任意の適切な溶解方法、例えば、化学溶解、浸透圧溶解、機械式溶解、熱溶解又は同様のものによって実施することができる。
【００６３】
細胞片を任意な適切な手段又は方法で分離することができる。これには、例えば、遠心分離、濾過、沈降及びデカンテーション、透析又は任意の同様の方法が含まれる。
【００６４】
溶解された酸素担体から非溶解細胞又は細胞片を分離するために一般的な方法は、固体材料のベレット化（pelletation）である。例えば、遠心分離工程を実施することができる。通常、２〜５０００×ｇの遠心分離が、細胞及び細胞片をベレット化するのに十分である。
【００６５】
精製過程の任意の時点で精製過程において発生した更なる非溶解成分、例えば任意の沈殿物をペレット化するためには、更なる遠心分離工程を、１０6×ｇまでの遠心分離までの高い力の使用により特定の遠心分離工程において実施することができる。
【００６６】
任意の遠心分離工程への追加的な又は代替案としての酸素担体含有溶液の精製は、少なくとも１つの濾過工程、好ましくは少なくとも２つ、３つ又はそれ以上の濾過工程を含むことができる。これは、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個のフィルター（１個を超えるフィルターが本出願において使用される場合、用語「フィルターカスケード」が使用される）の使用又は１つ、２つ、３つ若しくはそれ以上の分離濾過工程のいずれかにより実施することができる。
【００６７】
前記フィルターカスケード又は異なる濾過工程は、異なる種類、異なる材料及び／又は異なる孔径の２、３、４、５個又はそれ以上のフィルターを含むことができる。更に、例えばガラス繊維又は同様のもののような深層フィルターを、好ましくは粗大細胞片を保持するための第１フィルター材料として使用することができる。１個を超えるフィルターが使用される場合、異なる孔直径を減少する順番で提供するフィルターを使用することが好ましい。例えば、３個の異なるフィルターが使用される場合、第１フィルター（深層フィルターの後）は、１〜０．５μｍの平均孔径を有することができ、第２フィルターは０．７〜０．３μｍの孔径を有することができ、第３フィルターは、０．４〜０．１μｍの孔径を有することができ、ここで重複範囲と無関係に、任意の場合において後に続くフィルターの前に引用されたものは、その前のフィルターよりも小さい孔径を有する。前記濾過工程により、使用されたフィルターの孔径よりも大きなサイズを有する固体及び沈殿材料が、本質的に除去される。
【００６８】
更に限外濾過工程を、酸素担体を精製する精製過程に含めることができる。そのような限外濾過工程によって、溶解された望ましくない巨大分子を分離することができる。好ましくは、サイズ排除限界は、所望の酸素担体よりも大きな（大型で高分子量である）巨大分子を分離するように選択され、したがって、前記巨大分子はフィルターに保持される。ヘモグロビンの約６４，０００ダルトンの分子量に起因して、限外濾過フィルターのサイズ排除限界は、より高くなるべきである。ヘモグロビンの収率が限外濾過工程により減少しないことを確実にするため、約１００，０００ダルトン、好ましくは約２００，０００ダルトン、より好ましくは約３００，０００ダルトンにフィルターのサイズ排除を選択することが好ましいが、これらの値に限定されるものではない。
【００６９】
追加的に又は代替案として、任意の適切なクロマトグラフィー工程を実施することができる。特に好ましい種類のクロマトグラフィーは、イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーである。
【００７０】
同じ結果は、上記に記述されたサイズ排除限界を提供し、酸素担体を通過させるが、より大きな分子サイズを有する巨大分子を保持する透析膜を使用する透析工程により得ることができる。
【００７１】
溶液中の小さな分子量の化合物の量を低下するため、追加の透析工程を、サイズ排除限界の約５０，０００ダルトンを有し、より小さな分子を通過させるが、酸素担体を保持する透析膜の使用により実施することができる。
【００７２】
組成物中のウイルス及び／又は微生物汚染を減少させるため、精製過程にウイルス含有量分解の工程を含むことが特に好ましい。ウイルス含有量は、この工程により、１ｍｌあたり好ましくは１０個未満、好ましくは５個未満、より好ましくは２個未満のウイルス粒子、さらにより好ましくは０個の負荷量に低減される。この工程において、酸素担体を含む溶液は、ウイルス含有量分解フィルター（「ウイルスフィルター」）を通過することが好ましい。そのようなフィルターは、一般に知られており、市場で入手可能である。例は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＣＰＶ、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）１５Ｎ、２０Ｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）ＮＦＰ又はＰＡＬＬ  Ｐｅｇａｓｕｓ（登録商標）Ｇｒａｄｅ  ＬＶ６であるがこれらに限定されない。代替的又は追加的に、好ましくはフィルターを通過した後、ＵＶ光線による、特に２４５ｎｍの波長のＵＶ光線による処理を適用して、あらゆる残留ウイルスを処分することができる。
【００７３】
場合により、酸素担体の単離過程の任意の段階において、少なくとも１つの加熱工程を実施することができる。この工程は、単離手順の際に酸素担体含有懸濁液又は溶液を４０〜８５℃、好ましくは６０〜８０℃の範囲、より好ましくは６５〜７５℃の範囲の温度に加熱することを含む。加熱工程は、好ましくは１０分間から６時間、好ましくは２０分間から４時間、最も好ましくは３０分間から３時間実施され、前記に記述された範囲内の幾つかの異なる温度を含むことができる。
【００７４】
本発明の方法によると、酸素担体は精製過程の全体にわたって溶液中に留まることが好ましい。更に酸素担体は、精製過程の全体にわたって及び本発明の組成物の調製において溶液中に留まることが好ましい。このことは、酸素担体が本発明の方法において沈殿せず、したがって天然の環境に存在するように天然の三次元構造を維持することが好ましいことを意味する。
【００７５】
本発明の特に好ましい方法において、全血から酸素担体を精製する過程は、少なくとも以下の工程：
（ａ）全血の血漿を分離する工程、
（ｂ）赤血球を溶解する工程、
（ｃ）酸素担体をリガンドでチャージする工程、
（ｄ）試料を４０〜８５℃の範囲の温度に加熱する工程、
（ｅ）酸素担体を任意の望ましくない血液成分から分離する工程
を含む。
【００７６】
これらの工程によって、酸素担体含有溶液が得られ、これを本発明の組成物の調製に使用することができる。特に、これらの工程により得ることができる酸素担体含有溶液を、酸素担体の所望の量に濃縮することができ、この溶液に少なくとも１つの更なる成分を加えて、本発明の組成物を得る。
【００７７】
本発明の方法の工程（ａ）は、全血から血漿を分離するのに一般的に使用される方法のいずれかにより、好ましくは遠心分離又は濾過により実施することができる。約２０００〜５０００ｒｐｍ、例えば４０００ｒｐｍで約３０分間遠心分離することによって、赤血球はベレット化され、ここで可溶性化合物及び白血球は、主に上澄みに留まる。赤血球の再懸濁及びベレット化を、例えば２〜５回繰り返すことにより、望ましくない血液成分からの赤血球の分離を増加させることができる。
【００７８】
工程（ｂ）は、水、好ましくは蒸留水又は適切な等張以下の（sub-isotonic）緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液を、工程（ａ）の濃縮血液に加えることによって好ましく実施される。赤血球を水又は等張以下緩衝液で溶解した後、好ましくは塩を溶液／懸濁液に加えて、溶液中の前記塩の生理学的濃度を得る。好ましくは、ＮａＣｌを溶液中０．９％の量で加える。
【００７９】
工程（ｃ）は、工程（ａ）の後、工程（ｂ）の後、工程（ｄ）の後又は工程（ｅ）の後で実施することができるが、好ましくは少なくとも工程（ｂ）の後で実施される。工程（ｃ）は、工程（ｂ）の後に次の工程として直ぐに実施される必要はなく、工程（ｄ）の後、工程（ｅ）の後又は任意の続く処理工程において実施又は反復することもできることが特に指摘される。溶液／懸濁液中の酸素担体のチャージは、溶液／懸濁液へのガスの導入、好ましくはＣＯ若しくはＮＯガス又はこれらの混合物の導入により実施することができる。好ましい実施態様において、ＣＯガスは、溶液／懸濁液において＞９０％の飽和、好ましくは＞９５％の飽和を得るのに十分な時間で溶液／懸濁液に導入される。
【００８０】
工程（ｄ）は、工程（ａ）の後、工程（ｂ）の後、工程（ｃ）の後又は工程（ｅ）の後で実施することができるが、好ましくは工程（ｃ）の後で実施される。更に、加熱工程を単離手順の際に繰り返すことができる。この工程は、単離手順の際に酸素担体含有懸濁液又は溶液を４０〜８５℃、好ましくは６０〜８０℃の範囲、より好ましくは６５〜７５℃の範囲の温度に加熱することを含む。加熱工程は、好ましくは１０分間から６時間、好ましくは２０分間から４時間、最も好ましくは３０分間から３時間実施され、前記に記述された範囲内の幾つかの異なる温度を含むことができる。
【００８１】
工程（ｅ）において、酸素担体は、非溶解細胞、細胞片、任意の沈殿物又は他の非可溶性成分のような依然として溶液中に含有されている更なる望ましくない成分から精製される。更に酸素担体は、可溶性巨大分子又は低分子量を有する可溶性化合物のような、少なくとも部分的に望ましくない可溶性化合物から分離することにより更に精製することができる。
【００８２】
したがって、前記工程（ｅ）は、濾過、限外濾過、遠心分離、超遠心分離、クロマトグラフィー、異なるサイズ排除限界を提供する異なる種類の透析膜を使用する透析、洗浄工程、酸素担体含有量の濃縮などのような幾つかの単一工程を含むことができる。上記に引用された方法のいずかを、この精製工程に含めることができる。
【００８３】
好ましくは、少なくとも１つの遠心分離及び／又は少なくとも１つの濾過工程が工程（ｅ）に含まれる。例えば、溶解産物を遠心分離機で回転して、残留細胞及び細胞片を分離することができる又は例えば上記に記載されたフィルターカスケードにより濾過される。溶解産物を、最初に遠心分離し、その後に濾過することもできる又は最初の工程で深層フィルターにより濾過し、その後に少なくとも１つのフィルター又はフィルターカスケードにより濾過することができる。遠心分離又は深層フィルターにより、フィルターに沈降し、目詰まりを起こす材料が少ないので、後に続く任意の濾過工程の際の取扱いは、簡素化される。フィルターカスケードが使用されない場合、懸濁液に含有されている本質的に全ての固体材料を保持することを可能にし、全ての溶解成分を通過させることを可能にする、少なくとも１個のフィルターの使用が好ましい。より好ましい実施態様において、使用されるフィルターの少なくとも１個が、滅菌フィルターとして作用して、微生物を保持することもできる。更に好ましくは、限外濾過工程、並びに／又は溶液中のウイルス及び／若しくは微生物含有量を減少する工程を実施することができる。したがって、工程（ｅ）の後、酸素担体含有溶液は、あらゆる非溶解粒子、フロック（flocks）又は沈殿物を本質的に含まないことが好ましい。
【００８４】
工程（ｅ）において、上記に引用されたいずれかの工程／方法に加えて、所望の酸素担体を含む溶液を洗浄及び／又は濃縮することができる。「洗浄」とは、所望の酸素担体よりも小さい（低い分子量を有する）分子が、好ましくは同一又は数倍（例えば、５〜１０倍）の量の等張溶液を、酸素担体含有溶液に添加し、その後、得られた（希釈された）溶液を、酸素担体を保持し、より小さい分子を通過させるフィルターにより濾過することによって分離されることを意味する。溶液の洗浄には、好ましくは０．９％ＮａＣｌ溶液が使用される。洗浄工程を、２又は３又は４又は５又は１０回まで繰り返すことができる。好ましい実施態様は、より小さい分子の通過を可能にする、５，０００ダルトン、１０，０００ダルトン又は２０，０００ダルトンのサイズ排除限界を有するフィルターの使用により例示される。この工程において、酸素担体含有溶液を（好ましくは、洗浄した後で）、酸素担体の所望の濃度、例えば５０ｇ／ｌ、１００ｇ／ｌ又は２００ｇ／ｌの濃度に濃縮することができるが、これらの量に限定されるものではない。任意の所望の濃度は、濃縮すること又は濾過すること又は０．９％のＮａＣｌ溶液若しくは同様の等張溶液を添加することのいずれかにより得ることができる。
【００８５】
そのようにして得られる酸素担体含有溶液を使用し、上記に記載された少なくとも１つの更なる成分を所望の量で溶液に添加することによって、本発明の組成物を調製することができる。
【００８６】
好ましい実施態様において、本発明の組成物は、少なくとも、防腐剤、好ましくは例えばフェノキシエタノール、パラベン、安息香酸ナトリウム、ベンジルアルコール、ヘキサクロロフェンのような薬学的に許容される防腐剤、並びに例えばＮ−アセチルシステイン、オクタン酸ナトリウム、Ｎ−アセチル−ｌ−トリプトファネート、Ｎ−アセチル−メチオニネート、ビタミンＥ、ビタミンＣ、メチルプレドニゾロン若しくはマンニトールのような酸化防止剤及び／又は安定剤を酸素担体含有溶液に添加することにより調製される。加えて、上記に記載された更なる成分のうちのいずれかを追加的に加えることができる。
【００８７】
最終組成物を、望ましい場合はここでも、例えば加熱、濾過、遠心分離、防腐剤の添加、蒸気適用、ガス適用若しくはＵＶ適用又はこれらのうちの少なくとも２つの組み合わせにより、好ましくは更なる滅菌濾過工程により滅菌することができ、好ましくは保存用滅菌容器又は滅菌バッグに充填される。
【００８８】
好ましい実施態様によると、滅菌バッグは後の使用のためにエアゾール缶の中に配置されている。一つの例は、バッグ、例えば積層アルミニウムバッグ及びアルミニウム又はブリキエアゾール缶を含むバッグオンバルブ（Bag-on-Valve）系でありうる。生成物と噴射剤の分離のために、バッグオンバルブは、圧縮空気又は窒素を例えば２〜９バールの圧力で使用することができる。
【００８９】
本発明によると、組成物は、開放創傷、好ましくはヒト及び動物の慢性創傷の治療に好ましく使用され、ヒトの治療のための使用が好ましい。好ましい使用は、記載されたチャージされた酸素担体による創傷の局所治療によるものである。
【００９０】
驚くべきことに、前記チャージされた酸素担体により開放創傷を効果的に治療することが可能であることが見出された。上記に記載されたように、慢性創傷の治癒は、多くの場合、酸素供給の低下によって減少する。したがって、創傷の治療は治療用の酸素チャージされた酸素担体を必要とすることが理論的あると思われる。しかし、本発明によると、ＣＯ又はＮＯでチャージされた酸素担体を適用することにより、肯定的な外部創傷治癒を得ることが可能であることが見出された。本発明者たちの理論に束縛されるものではないが、空気中の酸素分圧に起因して、リガンドは創傷に適用されたときに酸素に置き換えられることがあり、したがって創傷治癒が支持される。
【００９１】
本発明の組成物は、ＣＯ又はＮＯリガンドによる電荷に基づいた非酸化状態に起因した酸素担体の増加した安定性、その結果としての良好な調製及び保存安定性という明確な利点を有する。更に組成物は、適用することが容易であり、取扱いが良好であり、酸素担体／作用物質により仲介される促進拡散によって創傷治癒を改善する安全で効果的な手法を提供する。
【００９２】
本発明の組成物は外部的に適用される。創傷の状態に応じて、微細噴霧の形態で創傷領域に適用、好ましくは噴霧される。
【００９３】
本発明によると、開放創傷、特に非常に異なる原因を有する慢性創傷も効果的に治療できることが示されている。これらは、手術の後、外傷の後、損傷の後の創傷、不十分な治癒の創傷若しくは低酸素創傷であるか又は組織の変性変化により引き起こされる創傷でもありうる。この点に関して、これらは、動脈血管の変性変化により引き起こされる創傷及び慢性静脈不全によりもたらされる創傷でありうる。これらには、褥瘡のみならず慢性創傷、特に糖尿病によりもたらされるものが特に含まれる。更に、火傷により（熱、化学薬品若しくは凍結のいずれかにより）引き起こされる又は熱傷により引き起こされる創傷を効果的に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】周囲のＯ2分圧に応じたヘモグロビンのＯ2飽和曲線を示す。
【実施例】
【００９５】
実施例１：
ヘモグロビンは、赤血球を血清から分離し、収集した赤血球を溶解し、細胞片をペレット形成し、液体試料の飽和が得られるまでＣＯガスを導入して、ヘモグロビンをＣＯでチャージし、溶液を加熱し、ウイルス濾過工程を含む幾つかの濾過工程を実施し、得られたヘモグロビン溶液を、２倍容積の０．９％生理食塩水を２回添加して洗浄し、溶液を濾過することによって、ブタの赤血球から単離した。
【００９６】
０．９％のＮａＣｌ中に、１０％の精製及び安定化されたヘモグロビン、０．０５％のＮ−アセチルシステイン及び０．７％のフェノキシエタノールを含む、創傷治療に直ぐに使用できる組成物を調製した。この組成物を、ＣＯガスで再びチャージし、１０個の部分に分け、それぞれエアゾール缶に詰めた。
【００９７】
実施例２：
実施例１の組成物の第１の部分を、調製した直後、右足に慢性創傷（７×２ｃｍ）を有する女性患者（診断：糖尿病、高血圧症）の治療に使用した。創傷は、組成物を創傷に噴霧することにより１日に１回治療した。３週間後、治癒の最初の徴候が見られた。翌週には、治癒過程は顕著であり、創傷の完全な閉鎖は１８週間後に得た。
【００９８】
実施例３：
実施例１の組成物の第２の部分を調製後に４℃で２年間保存し、その後、ＩＩ型真性糖尿病を罹患している男性患者の慢性創傷の治療に使用した。組成物を、患者の左脛骨の慢性表在性潰瘍（４×３ｃｍ）に適用した。創傷は１日に１回治療した。２週間後に治癒が現れ、４週間後に創傷は基線の５０％を超えて治癒した。翌週には、素早い治癒が観察され、創傷の完全な閉鎖は８週間後に得た。
【００９９】
実施例４：
実施例１の組成物の第３の部分を１０℃で２年間保存した。その後、ＩＩ型真性糖尿病を罹患している男性患者の右足の慢性表在性潰瘍（４×２ｃｍ）の治療に使用した。創傷は１日に１回治療した。２．５週間後、治癒が見られた。翌週には、素早い治癒が観察され、創傷の完全な閉鎖は１２週間後に得た。
【０１００】
実施例５：
実施例１の組成物の一部を、高温の沸騰水及び蒸気に接触した男性患者の治療に使用した。診断は、顔面の１及び２度火傷であった。
【０１０１】
冷却ゲル及びネオスポリンによる１週間の初期治療は改善を示さず、担当医により、鼻及び眼瞼のような顔面の他の部分への皮膚移植の適用が提案された。
【０１０２】
代わりに、患者を実施例１の組成物で７週間治療した。組成物を１日に３又は４回噴霧して皮膚に適用した。皮膚の素早い改善及び治癒が観察され、患者は７週間後に退院した。皮膚移植は必要なかった。
【０１０３】
実施例６：チャージ／非チャージヘモグロビンの比較
Ａ）チャージヘモグロビン噴霧薬は実施例１に従って調製した。
０．９％のＮａＣｌ中に、１０％の精製及び安定化されたヘモグロビン、０．０５％のＮ−アセチルシステイン及び０．７％のフェノキシエタノールを含む、創傷治療に直ぐに使用できる組成物を調製した。組成物を、ＣＯガスで再びチャージし、２０個の部分に分け、それぞれエアゾール缶に詰めた。
【０１０４】
組成物を４℃から室温で数か月間から数年間にわたって保存することができる。
【０１０５】
Ｂ）ブタ全血の第２の部分を、ＣＯチャージを実施しなかった以外は、実施例１のとおりに処理した。加熱工程の際に、相当量のヘモグロビンが沈殿した。続く濾過工程は、実施することが困難であった。全血１リットルあたりの精製ヘモグロビンの収率は、加熱の前にＣＯチャージを実施した場合の収率の３０％未満に減少した。このことは、調製する際に試料をＣＯでチャージすることは、加熱工程の際に著しく少ないヘモグロビンが沈殿するようにヘモグロビンを安定化させることを示す。
【０１０６】
０．９％のＮａＣｌ中に、１０％の精製されたヘモグロビン、０．０５％のＮ−アセチルシステイン及び０．７％のフェノキシエタノールを含む、創傷治療に直ぐに使用できる組成物を調製した。組成物を分け、それぞれエアゾール缶に詰めた。
【０１０７】
Ｃ）ヘモグロビンの更なる部分を、調製の際にヘモグロビンをチャージすることなく、ＷＯ２００３／０７７９４１の実施例１に記載されている方法によりブタの全血から単離し、ヘモグロビンは、加熱することなく、遠心分離及び限外濾過によって血漿及び細胞膜構成成分が無含有になり、精製された。
【０１０８】
０．９％のＮａＣｌ中に、１０％の精製されたヘモグロビン、０．０５％のＮ−アセチルシステイン及び０．７％のフェノキシエタノールを含む、創傷治療に直ぐに使用できる組成物を調製した。組成物を１０個の部分に分け、それぞれエアゾール缶に詰めた。
【０１０９】
そのように調製した非電荷ヘモグロビン噴霧薬を、治療期間（３日間全て）の間に必要に応じて何度も新たに調製し、使用の１日前に最大４℃で保存した。
【０１１０】
患者の治療：
下腿部に糖尿病性足部潰瘍を有する数人の男性患者（年齢６５〜７５）を、Ａ）のヘモグロビン噴霧薬（１０℃で６か月間まで保存した）又はＣ）の新たに調製したヘモグロビン噴霧薬（４℃で最大３日間保存した、すなわち３日間全てに新たな組成物を使用した）により、全ての患者に完全な創傷治癒を得るまで、３か月間治療した。担当皮膚科医によると、Ａ）の組成物により得られた創傷治癒は、Ｃ）のヘモグロビン噴霧薬で治療した創傷と比較して、特に従来のように治療した創傷と比較して、全ての場合において、少ない分泌物、少ない痂皮形成及び／又は少ない化膿を示した。小さな問題によって、Ａ）のチャージヘモグロビン組成物で治療した創傷は、ｃｍ2あたり、非チャージヘモグロビン噴霧薬Ｃ）で治療した創傷より早い、従来のように治療した創傷よりはるかに早い治癒を示した。組成物Ａ）で治療した患者は、更に、不快感が少ないことを報告した。
【０１１１】
実施例７：
実施例６Ａ）、実施例６Ｂ）又は実施例６Ｃ）それぞれにおいて調製された組成物の試料を、試料のＯ2チャージを考慮して、またＯ2に結合することができない種であるメトヘモグロビンの生成を考慮して試験した。更にメトヘモグロビンは、依然としてＯ2に結合できるが、もはやＯ2を遊離できないように、近接しているヘモグロビン分子に影響を与える。
【０１１２】
表１の全ての試料を０．９％のＮａＣｌ溶液で１：１に希釈して、創傷治療の状態を模倣した。試料７．１〜７．８は、希釈の直後に測定した（試料７．５〜７．８の保存は、希釈前に室温で行った）。ガス処理は、以下のように行った：６ｍｌの前記希釈溶液を３０ｍｌのガラスフラスコにそれぞれ移した。ガス処理は、ガラスフラスコを対応するガスで完全に充填し、フラスコを密閉し、試料を３０秒間回転させることによって実施した。全ての試料を、記述された時間にわたって３０℃で保存した。試料を表１に記載された条件に従って処理し、ヘモグロビンの総量（ヘモグロビン＋メトヘモグロビン）、酸素含有量、メトヘモグロビン含有量及び場合によりＣＯ含有量を測定した。
【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
表１の結果から分かるように、酸素担体がＣＯでチャージされている本発明の組成物は、メトヘモグロビンを形成することなく長時間保存できるばかりでなく、更に、チャージされた酸素担体に提供されたとき、結合ＣＯをＯ2に置き換えることもできる。１００％のＯ2に曝露されると（実施例７．９〜７．１５）、ヘモグロビンのＯ2飽和は、非常に素早く増加する。
【０１１５】
哺乳類経路活性組織の内部の状況を表している、組成物がＣＯ2に曝露される場合、増加量のメトヘモグロビンが形成される（実施例７．１６〜７．２２）。
【０１１６】
空気中のＯ2分圧は、僅か約２１％であり、したがって、図１に示されるヘモグロビンのＯ2飽和曲線によると、空気中の酸素によるヘモグロビンの可能な最大Ｏ2飽和は約２９％である。実施例７．２３〜７．２９を考慮すると、３時間以内に空気に曝露された組成物は２０．７％の酸素でチャージされるが、依然として非常に低いメトヘモグロビン含有量を有することは、驚くべき結果である。外部創傷が治療される場合、組成物は（清浄された）創傷表面に噴霧され、空気との接触を維持する。
【０１１７】
これらの結果は、本発明の組成物が安定化された酸素担体を含み、数か月間の保存の後、空気と接触すると、高い酸素輸送を提供することを示す。
【図１】
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