(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を含むか又はそれからなる細菌感染症を処置するための適切なバクテリオファージの集団であって、該集団の各メンバーが、緑膿菌に対する異なる株特異性を有し、且つ前記集団が、
（ｉ）ＮＣＩＭＢ４１１７４、ＮＣＩＭＢ４１１７５、ＮＣＩＭＢ４１１７６、ＮＣＩＭＢ４１１７７、ＮＣＩＭＢ４１１７８、ＮＣＩＭＢ４１１７９、ＮＣＩＭＢ４１１８０及びＮＣＩＭＢ４１１８１（National Collection of Industrial and Marine Bacteria、Aberdeen、英国、に寄託されている）、並びに
（ii）緑膿菌を標的とする能力を保持するこれらの変異株であって、そのゲノムの全長にわたって、関連する寄託株のゲノムとの少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有する変異株
からなる群から選択される２又は３以上のバクテリオファージからなるバクテリオファージの集団。
【請求項２】
少なくとも９５％が少なくとも９７％である、請求項１に記載のバクテリオファージの集団。
【請求項３】
少なくとも９５％が少なくとも９８％である、請求項１に記載のバクテリオファージの集団。
【請求項４】
少なくとも９５％が少なくとも９９％である、請求項１に記載のバクテリオファージの集団。
【請求項５】
（ｉ）ＮＣＩＭＢ４１１７４、ＮＣＩＭＢ４１１７５、ＮＣＩＭＢ４１１７６、ＮＣＩＭＢ４１１７７、ＮＣＩＭＢ４１１７８、及びＮＣＩＭＢ４１１７９からなるバクテリオファージの集団、又は
（ii）前記バクテリオファージのいずれかが緑膿菌に対して所望の標的株特異性を示すその変異株に置換されている点で（ｉ）の集団とは異なる集団であって、前記変異株が、そのゲノムの全長にわたって、関連する寄託株のゲノムとの少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有する集団から選択される、請求項１に記載のバクテリオファージの集団。
【請求項６】
少なくとも９５％が少なくとも９７％である、請求項５に記載のバクテリオファージの集団。
【請求項７】
少なくとも９５％が少なくとも９８％である、請求項５に記載のバクテリオファージの集団。
【請求項８】
少なくとも９５％が少なくとも９９％である、請求項５に記載のバクテリオファージの集団。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の集団及び製薬用担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
緑膿菌を含むか又はそれからなる細菌感染症を処置する治療方法又は予防方法において使用するための、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
処置が、バクテリオファージの投与に連続して１又は２以上の抗生物質の投与をさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
処置が、バクテリオファージの投与と同時、別個又は連続してアルギナーゼを投与することをさらに含む、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
感染症が、皮膚熱傷部若しくは他の皮膚創傷部の感染症、肺感染症、眼感染症、耳感染症、又は尿路感染症から選択される感染症である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
感染症がイヌの耳感染症である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
処置が予防的である、請求項１０〜１４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１６】
医療移植片に関連する感染症の予防に使用するための、請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を死滅させるウイルス（バクテリオファージ）を含む治療用及び診断用調製物に関する。特に、本発明は好ましい態様において、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）種の病原性細菌により引き起こされる動物及びヒトの感染症に対する制御薬として、バクテリオファージの組み合わせを含む治療用組成物を提供する。本発明はまた、生物膜形成を特徴とする細菌感染症、特に、例えばイヌの耳感染症のような緑膿菌感染症を含む感染症を処置する目的での、抗生物質と併用したバクテリオファージの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質は、長年の間、細菌感染症という問題に対する「解答」としてとらえられてきた。この見方は、最近１０年間のうちに見られた抗生物質に対する広範囲な（時には完全な）抵抗性の確立まで続いた。多くの場合、高価な「最終手段の薬剤」（例えば黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対するバンコマイシン）を使用することが必要であり、それらの薬剤は、通常複雑な投与経路を要し、毒性副作用を示し、長期の病院での処置を必然的に伴う。
【０００３】
これらの薬剤に対してさえ、抵抗性は憂慮すべきレベルに達しつつある。現在、細菌はいかなる抗生物質に抵抗するようにも適合しうることが明らかになっている。リネゾリドのような新世代薬剤でさえ、すでに抵抗性が生じてきており［Mutnickら(2003) An. Pharmacother. 37:769-774；Rahimら(2003) Clin Infect Dis 36: E146-148］、そして、新規の抗生物質が生成され、評価され、規制認可を受けるよりも速く、抵抗性が確立することが近年の発達により明らかである。
【０００４】
抗生物質処置のさらなる欠点は、その特異性の欠如である。抗生物質は広範囲の細菌を死滅させ、このことは、好ましくない、多くの場合有害な細菌による、身体への再定着を引き起こしうる。それゆえ、特定の細菌種に対する特異性を示し、それにより正常細菌叢においてほとんど抵抗性を引き起こさない抗細菌処置が必要とされている。
【０００５】
抗細菌治療の新規の形態の必要性は、グラム陰性好気性細菌である緑膿菌の感染症の場合によってよく例示される。
【０００６】
緑膿菌は、重篤な日和見感染細菌性病原体である。緑膿菌により引き起こされる感染症としては以下のものが挙げられる：
イヌの外耳炎及び中耳炎、体表での生物膜に基づく定着を典型とし、同系交配（純血種）のイヌに一般的な耳感染症；
ヒトの外耳炎（「スイマーズイヤー」）並びに、ヒトの他の耳感染症及び他の局所感染症（緑膿菌性角膜炎及び緑膿菌性毛包炎を含む）；
ヒトでの熱傷部及び皮膚移植片の感染症；
院内感染症；
嚢胞性線維症（ＣＦ）患者での肺感染症。
【０００７】
院内（病院内獲得）感染症の１０〜１５％は緑膿菌によるものであり、米国だけで年間２００万症例である。一部の場合には、発生頻度は更に高い。１年間に米国の病院及び熱傷治療センターで処置される１５０，０００人前後の熱傷患者のうち、２６％が緑膿菌感染症を有している。緑膿菌は抗生物質に対するその抵抗性で有名であり、従ってこれによって引き起こされる感染症は処置が難しい場合がある。その自然界での生息場所の１つは土壌であり、そこで抗生物質を産生する生物に晒されている。このことが、染色体上の遺伝子及びプラスミドとして知られる移動可能な遺伝的エレメントの両者によってコードされる抵抗性メカニズムの発達をもたらしてきたと考えられる。緑膿菌外膜の性質は、抵抗性の付与において重要である。さらなる抵抗性メカニズムは、生物膜として知られる複雑な層として利用可能な表面上での増殖傾向であり［Donlan (2002) Emerging Infectious Diseases 8: 881-890、http://www.cdc.gov/ncidod/EID/vol8no9/02-0063.htm；Fletcher & Decho (2001) Biofilms in Encyclopaedia of Life Sciences, Nature Publishing, London；http://www.els.net］、これは個々の細胞を死滅させるために必要とする濃度よりもはるかに高い濃度の抗生物質に抵抗性である［Chenら(2002) Pseudomonas infection；http://www.emedicine.com/PED/topic2701.htm；Qarahら(2001) Pseudomonas aeruginosa infections；http://www.emedicine.com/MED/topic1943.htm；Todar K. (2002) Todar’s Online Textbook of Bacteriology: Pseudomonas aeruginosa；http://textbookofbacteriology.net/pseudomonas.html；Iglewski B.H (1996) Pseudomonas. Medical Microbiology 第４版, S. Baron (編). University of Texas；http://gsbs.utmb.edu/microbook/ch027.htm］。このことの実際上の効果は嚢胞性線維症患者での感染症によって示されており、これら患者のほとんど全員が最終的に、（たとえ単離株が実験室では感受性であるように見えたとしても）抗生物質の使用によって排除することができない細菌株に感染することになる［Hoiby N (1998) Pseudomonas in cystic fibrosis: past, present, future. European Cystic Fibrosis Society Joseph Levy Memorial Lecture；http://www.ecfsoc.org/pa_review/nh_lect.html］。
【０００８】
緑膿菌は、生物膜形成に寄与する細胞外成分を産生する一定範囲の遺伝子（最も顕著なものはａｌｇＣ遺伝子）を発現し、これらは多くの場合、本質的には多糖である（Friedman及びKolter, Mol. Microbiol. (2004) 3, 675-690）。そのような生物膜形成は現在、抗生物質に対する増大する抵抗性に寄与する、多くの重要な病原性細菌の性質として知られている。そのような生物膜は、分泌された細胞外マトリックスにより支持され且つ取り囲まれた２以上のタイプの細菌を含み、細菌が海洋礁（marine reef）から歯牙エナメル質に至る表面に定着するのを助けることがある。生物膜は、細菌を表面に付着させ、それがなければ支えきれないであろう集団密度を達成させる。これらは、抗生物質に対するのみならず、重金属、漂白剤及び他の洗浄剤のような多くの環境ストレスに対する抵抗性を増大させる。かつては、抗生物質抵抗性への生物膜形成の貢献は主として拡散の制限による物理的なプロセスに起因するものであると考えられていたが、一部の生物膜は抗生物質を捕捉する特異的な能力を有しているようであるとのことが、より最近の証拠から示されてきている（Mahら, Nature (2003) 426, 306-310）。生物膜内の細菌は、単一細胞（「プランクトン性」）形態で増殖する同株の細菌よりも、抗生物質に対して１００〜１０００倍抵抗性を有することが知られている。この増大した抵抗性は、実験室試験では抗生物質に対して感受性であるかに見える細菌が、臨床的環境では治療に抵抗性でありうることを意味する。たとえ一部分が除去されても、生物膜は、抗生物質が存在しなくなったとたん迅速な定着をもたらす抵抗性貯蔵庫を提供しうる。従って、生物膜が多くのヒトの疾患において主要な因子であることは明らかである。
【０００９】
化学的処置は生物膜に対して用いるには適さず、なぜならこれはまさに生物膜が対抗すべく進化してきたものであり、生物膜が細菌性病原体を支援する多くの表面は、厳しい研磨にはあまり適していないからである。物理的磨耗は生物膜を破壊する手段を提供する。しかしながら、生物膜が細菌性病原体を支援する多くの表面は、厳しい磨耗にはあまり適していない。例えば、創傷部又は熱傷部の表面は著しく敏感でデリケートである。磨耗に適していて通常用いられているところであっても、生物膜の除去は制限される。歯牙表面の口腔内歯垢は生物膜であり、習慣的な歯磨きによって部分的に除去される。しかしながら、細菌は磨かれなかった表面（例えば歯の間の隙間）に維持され、除去された表面に迅速且つ効果的に再定着しうる。このことから、生物膜を除去する既存の手法は有効性に限度があることが明らかである。
【００１０】
生物膜の問題に加えて、いずれの場合もほんのわずかな抗生物質（例えばフルオロキノロン類、ゲンタマイシン及びイミペネム）しか緑膿菌に対して有効な作用をもたらすことができず、これらの抗生物質でさえ、全ての株に対して有効ではない。多剤抵抗性は一般的であり、増加してきている［Friedland I.ら(2003). Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 45:245-50；Henwood ら(2001). Journal of Antimicrobial Chemotherapy 47: 789-799］。１９９９年６月のU.S. National Nosocomial Infections Surveillance System Report[Gerberding J.ら(2001). National Nosocomial Infections Surveliance (NNIS) System Report, 1992年1月〜2001年6月のデータのまとめ, 2001年8月刊行. U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, http://www.cdc.gov/ncidod/hip/NNIS/2001nnis_report.PDF]は、１９９９年にＩＣＵの患者の院内感染から単離した緑膿菌の抗生物質抵抗性が、調査した全てのクラスの抗生物質に対して、１９９４〜９８年の期間に比べて増加していたと述べている。従って、緑膿菌感染症の制御に対する新規な手法の必要性が実証されている。これについて、本発明者は新規のバクテリオファージに基づく治療の使用によってこの問題に対処している。
【００１１】
バクテリオファージ（単に「ファージ」としても知られる）は細菌内で増殖するウイルスである。その名前は、「細菌の捕食者」と訳され、ほとんどのバクテリオファージが、それらが増殖する際に、次世代のバクテリオファージを放出しつつ細菌宿主を死滅させる事実を反映している。バクテリオファージに関する初期の研究は、多くの要因により妨げられ、そのうちの１つは、バクテリオファージには１つのタイプしかない、すなわち全ての細菌を死滅させる非特異的なウイルスしかないと広く信じられていたことである。実際には、バクテリオファージの宿主域（それらが感染可能な細菌のスペクトル）は多くの場合非常に特異的である。この特異性は、バクテリオファージの集団を、標的細菌のみを特異的に排除するために選択しうるという治療上の長所として考えることができる。一方で、抗生物質は広範な細菌を死滅させ、それらの使用は結果として正常細菌叢の破壊をもたらし、好ましくない、多くの場合有害な細菌による身体への再定着を引き起こす。
【００１２】
バクテリオファージの宿主特異性によりもたらされる治療上の利点にもかかわらず、この特性は標的株の範囲の広さを達成することが困難でありうるという欠点を有する。この理由から、特定のタイプの細菌感染症との関係で広い標的化能を有するバクテリオファージの組み合わせを見出すことに関心が持たれてきた（例えば、Pirsi, The Lancet (2000) 355,1418を参照）。
【００１３】
これについて、本発明者は緑膿菌に対してそれぞれ異なる株特異性を有する６種類のバクテリオファージからなり、緑膿菌感染症（特に、例えばイヌの耳感染症）の広範な標的化に特に好適なバクテリオファージの組み合わせを確立している。この組み合わせは、イヌの外耳炎及び他のイヌの耳感染症から採取した緑膿菌株の９０％を破壊することが可能であることが明らかになった。さらに、そのようなファージの組み合わせは、抗生物質処置と相乗的に用いて有効性を改善しうることが証明されている。結果として、ここで、ファージ／抗生物質併用治療は、生物膜形成を特徴とする細菌感染症に取り組むための新規の一般的で有利な手法を提供することが推測される。
【００１４】
ファージ及び抗生物質治療は、以前に東ヨーロッパで一緒に用いられてきているが（例えばBradbury, The Lancet (February 2004) 363, 624-625を参照）、生物膜形成との特異的な関連は全くなかった。さらに、バクテリオファージが複製に細菌の代謝機構を利用しており、抗生物質によってこれが阻害されるので、抗生物質はバクテリオファージ治療の使用に悪影響を及ぼしうることが示唆されてきた（Payne及びJanssen, Clinical Pharmacokinetics (2002) 42, 315-325）。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
従って、一態様では、本発明は生物膜形成を特徴とする細菌感染症（例えば緑膿菌を含むか又はそれからなる細菌感染症）を処置する目的で、（ｉ）１若しくはそれ以上のバクテリオファージ、及び（ｉｉ）１若しくはそれ以上の抗生物質、を同時、別個、又は連続投与するための複合製品の製造における、（ｉ）及び（ｉｉ）の使用を提供する。
【００１６】
本明細書において、そのような細菌感染症の処置とは、治療的処置又は予防的処置のいずれかを意味することが理解されるであろう。バクテリオファージは比類なく予防用途に適している。なぜなら：
化学薬剤は、有効であるためには、特異的な最小レベルを超えて用いなければならない。より低いレベルでは、良い場合でも効果がない。最悪の場合、それらは抵抗性の発達を促しうる。 
対照的に、複製型の生物学的薬剤は、非常に低い投入量でさえも、必要なときに必要な治療的用量をもたらす内在的な能力を有している。
【００１７】
本発明はまた、緑膿菌に対して活性で、それぞれ異なる株特異性を示すバクテリオファージの集団（panel）を提供する。より具体的には、本発明は２００３年６月２４日にNational Collection of Industrial and Marine Bacteria、Aberdeen、英国に、ＮＣＩＭＢ４１１７４、ＮＣＩＭＢ４１１７５、ＮＣＩＭＢ４１１７６、ＮＣＩＭＢ４１１７７、ＮＣＩＭＢ４１１７８、ＮＣＩＭＢ４１１７９、ＮＣＩＭＢ４１１８０及びＮＣＩＭＢ４１１８１として寄託された８種類のバクテリオファージ、並びに緑膿菌を標的とする能力を保持したそれらの変異株を提供する。該集団のメンバーは個別に用いてもよいが、これらのファージの組み合わせを用いることが好ましく、それにより標的株有効性を広げることができる。上記のように、これらのファージのうち６種類、とりわけＮ４１１７４〜Ｎ４１１７９の組み合わせは、特に抗生物質処置との併用において、緑膿菌を含むイヌの耳感染症の処置に特に有利であることが見出されており、また他の緑膿菌感染症の処置にも有利に用いることができる。そのようなファージ処置又はファージと抗生物質との併用処置はまた、アルギナーゼの使用と組み合わせてもよい。さらに、それらの処置は予防的処置を包含するものと理解されるであろう。
【００１８】
本発明はまた、生物膜形成を特徴とする細菌汚染を排除、軽減又は防止する、非治療的方法にも及ぶ。一実施形態では、該方法は、該汚染の細菌を標的とすることが可能な１若しくはそれ以上のバクテリオファージ及びそれと同時、別個、又は連続して１若しくはそれ以上の抗生物質又は消毒剤を、汚染部位若しくはその予測部位に対して適用することを含む。別の実施形態では、緑膿菌を含むか又はそれからなる細菌汚染を排除、軽減又は防止する方法であって、上記の寄託バクテリオファージの１若しくはそれ以上を汚染部位又はその予測部位に対して適用することを含む方法が提供される。
【００１９】
また、本発明のファージを、標的緑膿菌株の存在を検出する方法に用いてもよい。従って、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏサンプル（例えば診断のための、ヒト又は動物に由来する生物学的サンプル）中の緑膿菌を検出する方法であって、該サンプルを本発明の１若しくはそれ以上のバクテリオファージと接触させ、そして該バクテリオファージが当該サンプル中の細菌を死滅させることが可能かどうか決定することを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、上記において挙げられた８種類の寄託バクテリオファージから選択されるバクテリオファージの指標となる細菌株を特定する方法であって、いくつかの細菌株における該バクテリオファージによるプラーク形成を測定するステップ、及び該寄託バクテリオファージのうちの他のいずれよりも、当該バクテリオファージにより少なくとも１０００倍多くのプラーク形成を可能にする株を選択するステップを含む方法を提供する。
【００２１】
治療用途を意図する調製物中に存在するバクテリオファージを特定するために、及び／又は該治療用途中若しくはその後に取得した組織サンプル中に存在する株を特定するために用いることができる方法によって特定される細菌株もまた提供される。該細菌株はまた、バクテリオファージ調製物中の、株に感染することが可能な特定のバクテリオファージ量を測定するために、対応株（count strain）として用いることもできる。
【００２２】
図面の簡単な説明
図１
緑膿菌の個々の株に対するバクテリオファージの有効性を示す。名前が太字で示されている株は抵抗性であった。 
□：プラークが観察された
■：プラークなし
×：（１）ある程度の希釈可能な阻害が観察されたが、明らかなプラークはなし、又は（２）目視評価では、緑膿菌単離株はあまり感受性ではないようである、かのいずれか
ＮＤ：不実施。 
６種類のバクテリオファージＢＣ−ＢＰ−０１、ＢＣ−ＢＰ−０２、ＢＣ−ＢＰ−０３、ＢＣ−ＢＰ−０４、ＢＣ−ＢＰ−０５及びＢＣ−ＢＰ−０６（それぞれ寄託バクテリオファージＮＣＩＭＢ４１１７４、ＮＣＩＭＢ４１１７５、ＮＣＩＭＢ４１１７６、ＮＣＩＭＢ４１１７７、ＮＣＩＭＢ４１１７８及びＮＣＩＭＢ４１１７９に対応する）は併せて、スクリーニングを行った緑膿菌株の全部のうち９０％をカバーした。
【００２３】
0005856556.tif 000002
【００２４】
図２
ＢＣ−ＢＰ−０３対応株（count strain）の特定を示す。感染させた対応株の平板は以下の通りである：
Ａ：未感染
Ｂ：ＢＣ−ＢＰ−０３（１，０００，０００倍希釈）感染
Ｃ：ＢＣ−ＢＰ−０１（１０倍希釈）感染
Ｄ：ＢＣ−ＢＰ−０４（１０倍希釈）感染
Ｅ：ＢＣ−ＢＰ−０２（１０倍希釈）感染
【００２５】
図３
バクテリオファージＢＣ−ＢＰ−０４を用いて処置したイヌ耳の感染症の解消を示す：
Ａ：ＢＣ−ＢＰ−０４の４００感染単位を用いた処置の２４時間後の右耳外観
Ｂ：バクテリオファージ処置を受けていない左耳外観
【００２６】
図４
６種類のバクテリオファージＮＣＩＭＢ４１１７４〜ＮＣＩＭＢ４１１７９を含有する複合バクテリオファージ調製物（ＢｉｏＶｅｔ−ＰＡ）を用いた処置２日後の、抗生物質抵抗性耳炎の６頭のイヌにおける、初期レベルに対する％としての総合臨床スコア（閉塞、紅斑、潰瘍、排出物タイプ、排出物容量、異臭）の改善を示す（太実線が平均）。
【００２７】
図５
処置２日後の、同じ処置グループのイヌの初期レベルに対する％としての、シュードモナス（Pseudomonas）細菌数／デトリタスｇを示す（太実線が平均）。
【００２８】
図６
処置２日後の、同じ処置グループのイヌの最初のレベルに対する％（対数目盛）としての、バクテリオファージ数／デトリタスｇを示す（太実線が平均）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、病原性細菌に感染する自然発生ウイルスの集団（panel）を利用する。そのような集団は、臨床試験プロセスを通じた評価に好適な治療用医薬へと製剤化することができる。上記のように、一態様では、本発明は生物膜形成を特徴とする細菌感染症を処置する目的で、（ｉ）１若しくはそれ以上のバクテリオファージ、及び（ｉｉ）１若しくはそれ以上の抗生物質を同時、別個、又は連続投与するための複合製品の製造における、（ｉ）及び（ｉｉ）の使用を提供する。この目的のために、２若しくはそれ以上のバクテリオファージからなる集団を、単一の複合バクテリオファージ調製物の製造において用いてもよい。選択された集団のバクテリオファージは、好ましくは同一の細菌種に感染することが可能であり、且つ異なる株特異性を示すものとしうる。
【００３０】
使用する抗生物質は、生物膜中に存在することが知られているか又は存在しているかもしれないと考えられている細菌種のうちいずれかに対して活性であると分かっている、いずれのクラスに属するものでもよい。好ましくは、１若しくはそれ以上の抗生物質を、１若しくはそれ以上のバクテリオファージの後に投与し、それにより抗生物質処置が開始される前にバクテリオファージの複製が確立されているようになる。この場合、抗生物質処置は１若しくはそれ以上のバクテリオファージの投与から数日まで遅延することができ、好ましくは１〜２、３、４、５、６、７、８、９又は１０日まで遅延することができる。好ましくは、抗生物質処置が開始される前にバクテリオファージの複製が起こっていることをチェックするために、感染部位からサンプルを採取する。集団の各メンバーがそれぞれ異なる株特異性を示すものであるバクテリオファージの集団を用いる場合、該集団の少なくとも一部分が細菌感染症を標的とすることができれば十分である。これは１種類のバクテリオファージであってもよいし、又は２種類以上のバクテリオファージでもよい。
【００３１】
バクテリオファージの集団を用いる場合、バクテリオファージを単一の治療用組成物の形態で提供してもよいし、又は該集団の１若しくはそれ以上のメンバーをそれぞれ含む、複数の分離した組成物として提供してもよい。好適な集団は２若しくはそれ以上、３若しくはそれ以上、４若しくはそれ以上、５若しくはそれ以上、又は６若しくはそれ以上のバクテリオファージ株から構成される。そのような集団は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０若しくはそれ以上の異なるバクテリオファージを含んでよい。バクテリオファージは、同一のウイルス分類群に由来するものでもよいし、異なる群に由来するものでもよい。
【００３２】
細菌感染症を制御する可能性を有するバクテリオファージは、生物資源調査のプロセスにより特定することができる。これは、標的細菌に富む供給源に由来する物質のアッセイ、及び標的細菌の培養物中へのそのような物質の導入による、それら作用物質の特定を含む。好適なサンプルは病院、都市その他の供給源に由来する汚水から採取することができる。
【００３３】
典型的には、汚水サンプルを粉末又は液体細菌増殖培地と混合し、そして特異的なバクテリオファージの単離が望まれる細菌の標的株と混合する。
【００３４】
細菌細胞に対するそれらの作用をモニターすることにより、好適なバクテリオファージの存在についてサンプルをスクリーニングする。典型的には、これは固形基質上で増殖した細菌中での透明領域（「プラーク」）の形成又は液体培養物の濁度の低下を観察することにより細菌の死滅を測定することを含む。
【００３５】
上述したファージと抗生物質の併用治療での使用のための集団の形成を目的として選択されるバクテリオファージ株の各々は、典型的には同一の標的細菌種に対する活性を有するであろう。活性とは、バクテリオファージが該細菌種に感染する能力、及び感染細胞に対して有害な作用を有する能力を意味する。これは感染細胞の一部又は全部の死滅で明らかになりうる。好ましくは、バクテリオファージは標的細菌種に対する活性を有するが、他の細菌種に対しては全く活性を持たないか、より低い活性を有するであろう。
【００３６】
単離後は、バクテリオファージを、その活性及び特異性を決定するために、標的細菌種の複数の株（単離株）に対してアッセイすることができる。これらの単離株は、ある細菌種に感染しているか、それが定着している患者から採取することができる。好適な単離株はまた、土壌サンプルのような、細菌標的株の天然又は環境供給源から取得してもよい。そのようなサンプルから細菌を単離する方法は当技術分野で周知である。例えば、バクテリオファージ集団を試験するために好適な緑膿菌単離株は、外耳炎、局所感染症、熱傷後感染症、院内感染症、又は他の感染症のような公知の緑膿菌感染症から取得することができる。好適な単離株はまた、土壌サンプルのような緑膿菌の天然供給源から取得してもよい。
【００３７】
上記のように、個々の選択されたファージのいずれかよりも標的細菌種に対して広い株特異性を示すファージ集団を形成することが望ましい。すなわち、バクテリオファージの集団は、個々の選択されたファージのいずれかよりも、標的細菌種の株又は単離株をより多くの数死滅させることができる。
【００３８】
標的細菌単離株に対するそれぞれ異なった特異性を有する複数のバクテリオファージ株を調製物中に含め、それにより調製物に個々のバクテリオファージのいずれかよりも多数の株に対する総合的な効力を与えることにより、これを達成することができる。ファージ集団は、標的種の細菌単離株の広範なスペクトルに対して有効な１若しくはそれ以上のバクテリオファージ株を含み、それにより調製物中のバクテリオファージは重複する効力を有し、一部の特定の単離株が複数のバクテリオファージの標的となり、そして抵抗性の発達を最小限に抑えるのを助けることができる。従って、標的細菌種の個々の株は、調製物を構成する１若しくはそれ以上のバクテリオファージにより死滅させられうる。単離株の一定範囲（例えば少なくとも５０の単離株）に対するバクテリオファージの活性について調べることができ、得られる情報を、標的細菌種に対する複合的効力（個々のバクテリオファージのいずれかの効力よりも大きい）を有する、少なくとも２種類の異なるバクテリオファージからなる群を特定するために関連づけることができる。そのような集団の開発は、図１に示されている緑膿菌に対して有効なバクテリオファージの集団の開発に例示されている。
【００３９】
バクテリオファージは、高レベルの増殖を支援する宿主（又は近縁種）の株（増殖株）中で別々に増殖させ、力価を測定し、そして治療的な濃度で混合することができる。典型的には、これは混合物中の各バクテリオファージについて用量あたり１００〜１００，０００，０００感染単位の範囲である。
【００４０】
用いる各バクテリオファージの量は、標的細菌種に対するその毒力（ビルレンス）に依存するであろう。対応細菌株（すなわち、個々の見込みのある集団のメンバーに対する指標である細菌株）を集団の開発に用いることができる。対応株は、ある見込みのあるファージ集団のメンバーによって、他のいずれよりも少なくとも１０００倍多くのプラーク形成を起こさせるものである。このようにして、広範囲の細菌単離株に対して確実に有効な集団を獲得することができる。
【００４１】
上記のように、本発明のファージ／抗生物質併用治療は、例えば緑膿菌を含むか又はそれからなる細菌感染症を標的とするのに特に有用である。そのような感染症は、例えば、皮膚熱傷部又は他の皮膚創傷部におけるものである。それは肺内のもの、眼感染症又は耳感染症であってもよい。本発明に関して、緑膿菌を含むそのような感染症は、本質的に緑膿菌からなる感染症を含むものと理解されるであろう。従って、本発明のファージ療法は、完全に、優勢に又は顕著に緑膿菌により構成される感染症に対して適用してよい。
【００４２】
既に記載したように、本発明は、広範囲の緑膿菌単離株を死滅させるのに有効であると本明細書中に示される８種類の寄託バクテリオファージ、及び同一の細菌種を標的とする能力を保持したそれらの変異株を提供する。２００３年６月２４日にNational Collection of Industrial and Marine Bacteria（23 St Machar Drive, Aberdeen, AB24 3RY, Scotland, UK）に寄託された当該バクテリオファージ株は以下の通りである：
0005856556.tif 000003
【００４３】
これらのバクテリオファージは、緑膿菌感染症に対処するために、治療上個々に用いてもよいし、又はファージ集団の一部として用いてもよい。例えば、本発明の使用のためのファージ集団は、上記寄託株のうち、２、３、４、５、６、若しくは７、又は８種類全てを含んでもよい。前記寄託株のいずれをも、所望の緑膿菌特異性を示すそれらの変異株で置き換えてもよい。上記のように、６種類の株ＢＣ−ＢＰ−０１、ＢＣ−ＢＰ−０２、ＢＣ−ＢＰ−０３、ＢＣ−ＢＰ−０４、ＢＣ−ＢＰ−０５及びＢＣ−ＢＰ−０６によりなる集団は、単独で、又はより好ましくは抗生物質治療との併用において、例えばイヌの耳感染症を標的とするための獣医学的使用に特に適していることが見出されている。しかしながら、このファージ集団の有用性はそのような使用にとどまらない。種々の臨床的状況での緑膿菌感染症の標的化における使用が見出されうる。
【００４４】
さらなる態様では、本発明は上記の８種類の寄託バクテリオファージ株及び緑膿菌を標的とする能力を保持したその変異株から選択される１若しくはそれ以上のバクテリオファージを、製薬用担体又は希釈担体と共に含む医薬組成物を提供する。好適な担体及び希釈剤としては、等張生理食塩液、例えばリン酸緩衝生理食塩液が挙げられる。組成物は非経口、筋内、静脈内、皮下、経皮、眼又は耳投与のために製剤化することができ、例えば点眼薬又は点耳薬としての投与のための液体製剤であってもよい。そのようなバクテリオファージ調製物は、直接用いるか、凍結防止剤（例えば１０％スクロース）を含む水溶液若しくは他の溶液中で凍結貯蔵するか、凍結乾燥し、使用の前に再水和させるか、又は錠剤、懸濁液、軟膏、含浸包帯若しくは他の用品を含む（がこれらに限定されない）他の製剤中に安定に供給されてもよい。
【００４５】
さらに別の態様では、緑膿菌を含むか又はそれからなる細菌感染症を処置する目的での、バクテリオファージ集団の同時、別個、又は連続投与のための複合製品であって、該集団の各メンバーはそれぞれ異なる株特異性を有し、且つ該集団はＮＣＩＭＢ４１１７４、ＮＣＩＭＢ４１１７５、ＮＣＩＭＢ４１１７６、ＮＣＩＭＢ４１１１７７、ＮＣＩＭＢ４１１７８、ＮＣＩＭＢ４１１７９、ＮＣＩＭＢ４１１８０及びＮＣＩＭＢ４１１８１あるいは緑膿菌を標的とする能力を保持したそれらの変異株から選択される２若しくはそれ以上のバクテリオファージからなる、複合製品が提供される。上記のように、実証された実施形態では、該集団はＮＣＩＭＢ４１１７４〜ＮＣＩＭＢ４１１７９の６種類のバクテリオファージからなる。これらを個々に用いてもよいし、より好ましくは単一の医薬組成物中で用いてもよい。上記の寄託バクテリオファージのうち１若しくはそれ以上を含む複合製品又は組成物は、該１若しくはそれ以上のバクテリオファージとの同時、別個、又は連続投与のための１若しくはそれ以上の抗生物質をさらに含んでもよい。そのような複合製品又は組成物は、それの代わり、若しくはそれに加えて、アルギナーゼを含んでもよい。アルギナーゼはまた、選択された１若しくはそれ以上のバクテリオファージとの、同時、別個、又は連続投与のために提供されてもよい。
【００４６】
バクテリオファージの標的特異性は、それを増殖させる基質の選択によって変化しうる。すなわち、異なる基質上で増殖させた場合に、２種類の遺伝学的に同一なバクテリオファージが異なる標的特異性を示しうる。この場合、バクテリオファージをそのゲノムのヌクレオチド配列により同定することができる。上記で挙げた８種類の寄託バクテリオファージのうちの１種類と同じゲノム配列を有するバクテリオファージは、それが示す標的特異性が寄託株のものと同一でないとしても、同じバクテリオファージであるとみなされる。
【００４７】
上記のように、本発明は、標的種の細菌を死滅させる能力を保持した、寄託株の変異株にも及ぶ。特に、本発明は、その由来となる株と同様であるか又はそれより改善された標的特異性を保持するこれらの株の変異株に及ぶ。従って、本発明の組成物又は複合製品中の１若しくはそれ以上のバクテリオファージは、緑膿菌に感染し、且つそれに対する活性を示す能力を保持したこれらの寄託株に由来する変異株であってもよい。
【００４８】
好適な変異型バクテリオファージは、８種類の寄託株ＢＣ−ＢＰ−０１、ＢＣ−ＢＰ−０２、ＢＣ−ＢＰ−０３、ＢＣ−ＢＰ−０４、ＢＣ−ＢＰ−０５、ＢＣ−ＢＰ−０６、ＢＣ−ＢＰ−０７及びＢＣ−ＢＰ−０８のいずれか１つに由来するものでありうる。好適な変異株は、その由来となる株と同じ標的特異性を保持していてもよい。すなわち、これが寄託バクテリオファージと同じ標的細菌種の単離株又は株に感染し、それを死滅させてもよい。同様に、これが寄託バクテリオファージと同じ細菌単離株又は細菌株に対して有効でないものであってもよい。あるいはまた、変化した標的特異性を有し、細菌標的種の特定の単離株若しくは株に感染し、それを死滅させることができる程度がより大きいか又はより小さい変異型バクテリオファージ株を用いてもよい。
【００４９】
好適な変異型バクテリオファージ株は、寄託株と類似するゲノムを有していてもよい。すなわち、変異型バクテリオファージのゲノムのヌクレオチド配列が、その由来となる寄託バクテリオファージのゲノムとの配列同一性を保持していてもよい。好適な変異株は、ゲノムの全長にわたって、寄託株のゲノムとの少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を保持する。あるいはまた、これらの配列同一性のレベルがゲノムの一部分のみ（例えば標的特異性に必要なゲノムの部分）にわたって保持されていてもよい。一実施形態では、変異型バクテリオファージのゲノムは、以下に説明するように、さらなる治療的タンパク質をコードする遺伝子を含んでいてもよい。そのような場合、バクテリオファージゲノムは上述の程度のヌクレオチド配列同一性を有するゲノム、及び追加の治療的タンパク質の発現に必要な配列により構成されるものであってもよい。
【００５０】
ＵＷＧＣＧパッケージは、（例えばそのデフォルト設定で用いて）配列同一性を計算するのに用いることができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Devereuxら(1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395）。あるいは、例えば Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S. F. ら(1990) J Mol Biol 215:403-10 に記載のように、同一性を計算し、又は配列を整列させるのに、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを（典型的にはそのデフォルト設定で）用いることができる。従って、同一性はＵＷＧＣＧパッケージによって、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムをそのデフォルト設定で用いて計算してもよい。あるいはまた、配列同一性はＰＩＬＥＵＰ又はＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて計算することができる。ＢＬＡＳＴはそのデフォルト設定で用いてもよい。
【００５１】
ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、National Centre for Biotechnology Information （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公に利用可能となっている。このアルゴリズムは、初めにハイスコア配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを含み、これは、問い合わせ配列（query sequence）中に長さＷの短い文字列（word）であって、データベース配列中の同じ長さの文字列と整列したときに、一致するか又はいくつかの正に重み付けされた閾値スコアＴを満たす文字列を特定することにより行われる。Ｔは近隣文字列スコア閾値と呼ばれる（Altschulら、上掲）。これらの最初の近隣文字列ヒットは、それらを含むＨＳＰを見つける検索を開始するためのシード（seed）となる。文字列ヒットは、累積アライメントスコアが増大しうる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向での文字列ヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積アライメントスコアが、その最大達成値から量Ｘだけ減少したとき；負のスコアをもたらす残基アライメントが１つ以上蓄積して累積スコアが０以下になったとき；又は、いずれかの配列の末端に達したとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸはアライメントの感度とスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルト値として、文字列長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリクス（Henikoff及びHenikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 参照）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖の比較を用いる。
【００５２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、２つの配列の間の類似性の統計的解析を行う；例えば Karlin及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される１つの類似性の尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率についての指標を与える。例えば、第１の配列と第２の配列との比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満であれば、ある配列が別の配列に類似しているとみなされる。
【００５３】
化学的、放射線学的方法又は当業者に周知の他の方法によって、特定のバクテリオファージに対して突然変異を作り出すことができる。そして、有用な特性を有する変異株を、感染性、物理的な又は遺伝的な特性（例えば以前には抵抗性であった細菌株への感染能力）のアッセイにより選別しうる。突然変異はまた、当業者に周知の相同組換え法により作り出してもよい。変異した配列は、欠失、挿入又は置換（それらのいずれも通常の技術により構築してよい）を含むことができる。挿入は、（例えばβ−ガラクトシダーゼ活性による）組換えウイルスのスクリーニングのための選択マーカー遺伝子（例えばｌａｃＺ）を含んでもよい。
【００５４】
挿入はまた、以下により詳細に記載する、バクテリオファージとの同時投与が所望されるタンパク質をコードする配列を含んでもよい。例えば、本発明の調製物中の１若しくはそれ以上のバクテリオファージがアルギナーゼをコードする配列を含み、それにより感染細菌細胞内でアルギナーゼが発現するようにしてもよい。
【００５５】
本発明のバクテリオファージ含有製品は、通常の抗生物質療法では解決が難しい多くの状況において用いることができる。また別の態様では、本発明は、生物膜形成を特徴とする細菌感染症の治療的又は予防的処置の方法であって、該感染症の細菌を標的とすることが可能な１若しくはそれ以上のバクテリオファージ及びそれと同時、別個、又は連続に１若しくはそれ以上の抗生物質を、それを必要とするヒト又は非ヒト動物に対して投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、用いるバクテリオファージが緑膿菌感染症を標的とすることが可能な上記の寄託バクテリオファージのうちの１若しくはそれ以上であってもよい。本発明はまた、さらに別の態様において、緑膿菌を含むか又はそれからなる細菌感染症の治療的又は予防的処置の方法であって、１若しくはそれ以上の寄託バクテリオファージ又は上述のようなそれらの変異株を、それを必要とするヒト又は非ヒト動物に対して投与することを含む方法を提供する。
【００５６】
特に、本発明の調製物若しくは株を、慢性的又は抗生物質抵抗性の感染症に対処するために用いてもよい。従って、特定されたようなバクテリオファージ調製物及び株の使用は、初めは、感染症が既存の抗生物質を用いて排除することが困難であると分かってきた場合の二次的処置であるか、又は感染症の排除が絶対に必要である場合の併用処置若しくは代替処置であってもよい。よって、特に、例えば緑膿菌感染症及び生物膜形成を特徴とする他の感染症に関して、抗生物質使用を補完又は補助するためにそれらを用いてもよい。
【００５７】
処置される感染症は、ヒト又は動物（例えばイヌ又はネコ）におけるものであってよい。感染症は、例えば耳、眼、皮膚又は他の局所部位の中若しくはその上におけるものであってよい。感染症は全身性であってもよい。本発明の方法により処置されうる緑膿菌感染症としては、外耳炎及び他の耳感染症、角膜炎及び他の眼感染症、毛包炎、熱傷部及び誘導された移植片拒絶反応の感染症、創傷部の感染症、院内感染症及び肺の感染症（例えば嚢胞性線維症）が挙げられる。尿路感染症及び菌血症も処置されうる。
【００５８】
本発明のファージの具体的な予防用途は以下のものである：
眼−点眼薬、コンタクトレンズ用溶液若しくは添加剤中に含めること、コンタクトレンズに包埋するか別の方法で含めること、又は緑膿菌感染症防止の目的で眼の中に投与するために他の方法で製剤化すること。
【００５９】
耳−点耳薬、耳栓、含浸包帯（例えば脱脂綿）、移植のための装置（例えば鼓膜移植片、骨移植片）に含めること、又は緑膿菌感染症防止の目的で耳の中に投与するために他の方法で製剤化すること。創傷用包帯、軟膏、皮膚移植片及び緑膿菌による体表面または体内装置の感染症防止のための他の製剤。医療用装置（例えば人工関節）中への、又はその処置のための製剤化。
【００６０】
本発明の調製物は、別の治療薬をさらに含むか、あるいはそれと同時、別個又は連続して投与してもよい。例えば、本発明の調製物又は株を用いた処置は、処置される症状に関連する別の薬剤と調和的に用いてもよい。本発明の調製物又は株は、抗生物質と一緒に、その作用を補完するか補助するために投与してもよい。本発明の調製物又は株は、患者の症状の他の側面に対処するための薬剤（例えば、炎症を軽減させる薬剤、免疫反応を刺激するか減少させる薬剤、痛みを和らげる薬剤又は他の方法により患者の症状を改善する薬剤）と一緒に投与してもよい。本発明の調製物又は株は、患者の処置に用いられている他の薬剤と一緒に投与してもよく、ここで該他の薬剤が細菌（例えば緑膿菌）感染症のリスクの増大を引き起こす可能性があるものでもよい。例えば、本発明の調製物又は株は、免疫抑制（例えば別の薬剤を用いた処置による局所的な免疫抑制）が起こっている患者に投与してもよい。
【００６１】
一実施形態では、緑膿菌感染症（例えば肺感染症）を処置するための本発明の調製物又は株の使用を、アルギナーゼの投与により補助してもよい。上述のように、シュードモナスは生物膜として知られる複雑な層の中での増殖傾向を有している。生物膜は、細胞外高分子化合物（ＥＰＳ）マトリックス中に封じ込められた表面結合微生物細胞の集合である。アルギン酸塩は緑膿菌のＥＰＳマトリックスの主成分である。従って、アルギナーゼの使用はそのような緑膿菌生物膜の破壊を助け、感染症の排除を増強する。生物膜は種々の緑膿菌感染症（肺及び耳感染症を含む）中に存在しうる。本発明の調製物又は株とのアルギナーゼの共投与は、そのような症状の処置における使用に特に好適であるものと思われる。
【００６２】
アルギナーゼは、１若しくはそれ以上のバクテリオファージと共に本発明の組成物中に含めてもよいし、あるいは１若しくはそれ以上のバクテリオファージとの別個又は連続投与のために別の組成物中に提供してもよい。アルギナーゼはバクテリオファージのゲノム中の配列からもたらされてもよい。これは、環境供給源からのそのようなバクテリオファージを単離してもよいし、又は例えば好適な調節配列と機能的に連結した該配列を含むようにバクテリオファージのゲノムを公知の方法で操作してもよい。
【００６３】
投与するバクテリオファージの量は、処置する領域のサイズ、位置及び性質並びに用いる投与経路に依存するであろう。処置の成功によりバクテリオファージの増幅及び感染細菌の死滅がもたらされる場合、一部の処置（例えば局所的な感染を要するもの）には低用量のバクテリオファージしか必要はないと考えられる。この用量は感染単位で測定され、これは通常細菌培養用平板上に透明領域又は「プラーク」を形成する能力により定義される。そのような単位は「プラーク形成単位」または「ｐｆｕ」として定義される。例えば、一部のケースでは、該用量は数百感染単位（ｐｆｕ）以下でありうる。好適な用量は、１０２〜１０８ｐｆｕ、好ましくは１０４〜１０６ｐｆｕである。他のケース（例えば全身性又は広範な感染症）では、バクテリオファージが全ての感染領域に到達することを確実にするために、より高い用量が必要であるかもしれない。そのようなケースでは、好適な用量は１０４〜１０１０ｐｆｕ、好ましくは１０５〜１０８ｐｆｕの範囲内でありうる。注射する場合には、典型的には製薬上許容される好適な担体又は希釈剤中のバクテリオファージの１０μｌ〜１ｍｌを投与する。局所投与のためには、容量はより大きく、処置する領域のサイズ、位置及び性質に応じて、例えば１００μｌ〜５０ｍｌでありうる。
【００６４】
本発明のバクテリオファージ調製物又は組成物は、局所的に、全身的に、経口的に、又は処置する感染部位への有効用量の送達に好適な何らかの他の方法により、ヒト又は動物患者に対して投与する。バクテリオファージ投与は、バクテリオファージが感染部位で細菌内に組み込まれうるような方法で行う。記載した投与経路及び投与量は、単に指標であることを意図するものであり、技能を有する実施者はいかなる特定の患者及び症状に対しても、最適な投与経路及び投与量を決定することができるであろう。
【００６５】
上記のように、本発明は生物膜形成を特徴とする細菌汚染を排除、軽減又は防止する非治療的方法にも及ぶ。また別の態様では、本発明は、適当な細菌を標的とすることが可能な１若しくはそれ以上のバクテリオファージ及びそれと同時、別個、又は連続して１若しくはそれ以上の抗生物質又は消毒剤を、該汚染部位又はその予測部位に対して適用することを含む方法を提供する。そのような方法を、例えば緑膿菌汚染に適用してもよく、この場合上記の寄託バクテリオファージ又はそれらの変異株のうち１若しくはそれ以上を再び用いることができる。同じバクテリオファージのうち１若しくはそれ以上を、緑膿菌を含むか又はそれからなる細菌汚染を標的とする目的で非治療的にのみ用いてもよい。該方法を医療的及び非医療的状況の両方で、種々の表面（例えばコンタクトレンズ、体内に移植するための装置の表面、管状器官、導管及び細菌感染が成立しうる他の表面）の処置に適用できる。
【００６６】
本発明の調製物及び株はまた、緑膿菌の存在を検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの診断方法に用いてもよい。該方法は、被験サンプルを、上述したような緑膿菌を標的とすることが可能な１若しくはそれ以上のバクテリオファージと接触させるステップ、及び添加されたバクテリオファージのいずれかが被験サンプル中の細菌を死滅させることができるかを決定するステップを含んでよい。好ましくは被験サンプルを、例えば存在する標的種の細菌のいずれを増殖させるのにも好適な条件下で、調製物又は株との接触に先立って培養する。好適な培養条件は当技術分野で公知であり、具体的な細菌標的種に応じて異なるであろう。
【００６７】
緑膿菌を標的とすることが可能な本発明のバクテリオファージの集団は、それが広範なスペクトルの細菌株又は単離株を検出すると予想されるので、そのような方法には特に有用である。本発明の調製物からの単一のバクテリオファージは、ある特定の細菌種の株又は単離株のうち少ない割合（一部）しか検出しない可能性があり、従って、単にこの高い特異性のために、典型的には非常に高い偽陰性率をもたらしうる。しかしながら、２若しくはそれ以上のそのようなバクテリオファージを含む本発明の調製物の使用は、標的細菌種内の株のうち広範なスペクトルの検出を可能にするであろう。
【００６８】
一実施形態では、被験サンプルを寒天平板のような固形増殖培地上で培養してもよい。サンプルは好ましくは該培地上で十分な時間にわたり、該サンプル中に存在するいずれの標的細菌が平板表面上で増殖するのにも好適な条件下で培養する。該平板の表面を本発明の調製物又は株と接触させることにより、添加したバクテリオファージのうちのいずれかが細菌に感染し、それを死滅させることが可能であるかを決定することができる。バクテリオファージが感染した培地は、バクテリオファージ感染及び複製に好適な条件下で維持してもよく、それによりバクテリオファージは平板上のいずれかの標的緑膿菌細胞に感染する機会を有する。このことは、細菌の死滅が起こった透明な区域（プラーク）の形成をもたらし、被験サンプルが標的細菌種を含有することを示すであろう。
【００６９】
別の実施形態では、被験サンプルを液体培地中に維持してもよい。さらに、それを細菌増殖に好適な条件下で培養してもよい。本発明の調製物又は株の添加後、培地をさらなる期間にわたって維持して存在する、いずれかの標的細菌にバクテリオファージを感染させてもよい。このことは、細菌の死滅が起こったときに培地の濁度の低下をもたらし、またこのことは被験サンプルが標的細菌種を含有することを示すであろう。
【００７０】
被験サンプルは標的細菌種の存在が疑われるどのようなサンプルでもよい。被験サンプルは環境的又は生物学的供給源に由来するものであってもよい。そのような被験サンプルは、患者から取得した体液若しくは組織サンプルから採取するか又はそれから誘導してもよい。サンプルは感染部位から取得してもよい。局所感染の場合には、サンプルは感染領域からスワブを採取することにより得られる。本発明の検出方法を、感染症の原因である緑膿菌の特定の株を決定するために用いてもよい。
【００７１】
本発明の調製物又は株を用いて特定することが可能な感染症は、通常同じ調製物又は株を用いて処置しうるものであろう。すなわち、本発明のある調製物中のバクテリオファージが、感染領域から取得した細菌をｉｎ ｖｉｔｒｏで死滅させることが可能な場合には、それらは感染部位においてｉｎ ｓｉｔｕで同じ細菌を死滅させることも可能なはずである。
【００７２】
従って、本発明の検出方法を、処置において用いるために好適な本発明の調製物又は株を特定するために用いてもよい。また、本発明の検出方法を、併用するよりはむしろ単独でそのような処置に用いるのに好適な単一のバクテリオファージを特定するために用いてもよい。すなわち、本発明の検出方法において、種々のバクテリオファージ又はバクテリオファージの組み合わせを用いることにより、特定の感染症の細菌株に対して最も大きな毒力を有するバクテリオファージを、処置における使用のために選択することができる。好ましくは、処置における使用のために、そのような活性を有する２若しくはそれ以上のバクテリオファージからなる組み合わせを選択する。
【００７３】
本発明はまた、上記の寄託バクテリオファージに対する細菌「対応株」（count strain）の特定及び使用を含む。そのような細菌株は、特定された群に由来する１種類のバクテリオファージの増殖を支援するが、その群の全ての他のバクテリオファージ構成員の制限された増殖しか許容しない、標的（又は近縁）細菌の株として定義される。これらの対応株を、その後バクテリオファージストックの力価を評価するのに用いてもよい。
【００７４】
本発明の調製物は少なくとも２種類のバクテリオファージを含む。細菌株の一定のスペクトルの中では、いずれかの１種類のバクテリオファージの増殖は種々の有効性で支援される（又は全く支援されない）であろう。結果として、細菌株の一定範囲にわたるアッセイにより得た力価は、相当に異なるものであろう。各患者に対して投与すべき治療的用量を決定する／標準化する方法を提供するために、「対応」細菌株を用いてもよい。この手法の原理は、各バクテリオファージの増殖が、該細菌株の範囲のうちの１種類によってのみ使用可能なレベルで支援されることである。従って、対応株を混合物中のバクテリオファージの各々に対して選択することができ、これは、バクテリオファージのうちの１種類の増殖は支援するが、該混合物中の他のバクテリオファージの増殖は支援しないか、低いレベルの増殖しか支援しない。混合物の各バクテリオファージ構成員の力価は、個々の対応株の各々において可能な増殖に基づいて計算してもよい。
【００７５】
例えば、好適な対応株は、バクテリオファージの混合物中に用いられる他のバクテリオファージと比較して、１種類のバクテリオファージの、少なくとも１０００倍多い、少なくとも１５００倍多い、少なくとも２０００倍多いか又はそれより多い増殖を可能にするものでもよい。
【００７６】
示差的な増殖は、例えば一定の濃度範囲のバクテリオファージによる、固形増殖培地上で増殖した場合の細菌におけるプラーク形成を力価判定することにより評価してもよい。あるいはまた、示差的な増殖を、そのようにして形成されたプラークの大きさ及び性状を調べることにより評価してもよい。例えば、一実施形態では、対応株は、他のバクテリオファージと比較して１種類のバクテリオファージによるプラーク形成を少なくとも１０００倍多くするものであってもよい。そのような細菌は、当該バクテリオファージに対する対応株とされるであろう。例えば、図２に示したように、ＢＣ−ＢＰ−０３に対する好適な増殖株は、１，０００，０００倍希釈のＢＣ−ＢＰ−０３を用いた感染によって顕著なプラーク形成を示しうるが、１０倍希釈（１００，０００倍高い濃度）の他のバクテリオファージ（ここではＢＣ−ＢＰ−０１、ＢＣ−ＢＰ−０２及びＢＣ−ＢＰ−０４）を用いて感染させても、ほとんど又は全くプラーク形成を示さない。
【００７７】
そのような対応株はまた、本発明の組成物で用いるためのバクテリオファージ生成のための増殖株として用いてもよい。例えば、本発明の組成物を、適当な量の必要とされる対応株と組み合わせることにより構成してもよい。従って、対応株はバクテリオファージ源としてそれ自体を治療的に用いることができる。
【００７８】
この技術はまた、治療用組成物中の各バクテリオファージの複製が臨床的な状況で個々にモニターされることを可能にする。ある特定のバクテリオファージに特異的な対応株を、特に、例えば治療用途を意図する調製物中の、又は該治療用途の過程若しくはその後に取得した組織サンプル中の、当該バクテリオファージの存在を特定するのに用いてもよい。この方法によって、治療用バクテリオファージを患者に感染している株中に存在しうるいかなる無関係のバクテリオファージからも区別することが可能となると予想され、また投与された治療用混合物中のどのバクテリオファージが当該患者の細菌感染症に対して活性であるかの確認も可能となると予想される。「対応」細菌株を、バクテリオファージ療法の適用に先立って、無関係のバクテリオファージを「タイピング」することに用いることができる。従って、組成物又は医薬中の必要とされるバクテリオファージの存在を処置に先立って確かめてもよく、また処置部位でのバクテリオファージの存在を処置の間又はその後にモニターしてもよい。この情報は処置の実施計画をモニターし、適正化するために医師により用いられうる。
【００７９】
以下の実施例は本発明を説明するものである。
【実施例１】
【００８０】
Ｉ．緑膿菌に対して活性なバクテリオファージの初期選別
（ａ）緑膿菌に対して活性なバクテリオファージの単離：
（ｉ） 適当な緑膿菌株の３×１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）を沈殿処理済み汚水及び栄養培養液と共に培養した（総容量２００ｍｌ）。 
（ｉｉ） 懸濁液を３７℃にて２４時間インキュベートした。 
（ｉｉｉ） １ｍｌのアリコートを取り出し、０．４５μｍシリンジトップフィルターに通して濾過した。 
（ｉｖ） 濾過した溶解液をステップ（ｉ）で用いたのと同じ緑膿菌株と共に培養し、バクテリオファージの存在について評価した（以下を参照）。 
（ｖ） 栄養寒天平板を３７℃にて２４時間インキュベートした。 
（ｖｉ） 単一のプラークを、滅菌した１ｍｍ径の針金を用いて「回収」し、ステップ（ｉ）で用いた緑膿菌株５×１０６ｃｆｕ／ｍｌを含む増殖培地（この培地の成分は抽出ごとに異なる）３ｍｌに接種するのに用いた。 
（ｖｉｉ） 懸濁液を細菌が完全に溶解するまで（これには通常５〜８時間かかる）３７℃にてインキュベートし、目視で評価した。目視評価はバクテリオファージ含有細菌懸濁液の濁度を対照懸濁液のそれと比較することにより実施する。対照懸濁液にはバクテリオファージを加えないが、他の点は全て同様とする。 
（ｖｉｉｉ） 溶解液を、０．１μｍシリンジトップフィルターに通して濾過した。 
（ｘｉ） ２％ｖ／ｖグリセロールとなるように溶解液を調整し、バイアル中にアリコートに分け、そして−８０℃にて保存した。 
（ｘｉｉ） 適当な細菌株との共培養によって力価を評価した（以下を参照）。
【００８１】
（ｂ）マスターシードの調製：
以下のように、全てのバクテリオファージについてマスターシードストックを樹立する：
（ｉ） 一次バクテリオファージ調製物を、寒天平板上で適当な緑膿菌増殖株と共培養した（以下を参照）。 
（ｉｉ） 単一のプラークを、滅菌した１ｍｍ径の針金を用いて「回収」し、ステップ（ｉ）で用いた緑膿菌株５×１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌを含む野菜ペプトン培養液４ｍｌに接種するのに用いた。 
（ｉｉｉ） 懸濁液を細菌が完全に溶解するまで（これには通常５〜８時間かかる）３７℃にてインキュベートし、目視で評価した。目視評価はバクテリオファージ含有細菌懸濁液の濁度を対照懸濁液のそれと比較することにより実施する。対照懸濁液にはバクテリオファージを加えないが、他の点は全て同様とする。 
（ｉｖ） 溶解液を、０．１μｍシリンジトップフィルターに通して濾過した。 
（ｖ） ２％ｖ／ｖグリセロールとなるようにマスターストックを調整し、バイアル中にアリコートに分け、そして−８０℃にて保存した。 
（ｖｉ） 適当な細菌株との共培養によって力価を評価した（以下を参照）。
【００８２】
（ｃ）混合集団中の個々のバクテリオファージの力価の評価：バクテリオファージ対緑膿菌「対応」細菌株
（ｉ） 各バクテリオファージ（個々の懸濁液）を全ての対応株において二連でアッセイした。マスターシードを用いた。
（ｉｉ） 各バクテリオファージについて、それぞれの「対応」細菌株において力価を計算した。 
（ｉｉｉ） ステップ（ｉ）〜（ｉｉ）をさらに２回繰り返した。 
（ｉｖ） 最後の回に、等比率の６種類の個々のバクテリオファージ調製物を含む混合バクテリオファージ懸濁液を、全ての「対応」細菌株において二連でアッセイした。 
（ｖ） 各「対応」細菌株におけるバクテリオファージ混合物の力価を計算した。
【００８３】
３セット全ての実験において同様の結果を得て、平均した結果と共に表１に詳細に示してある。 
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【００８４】
（ｄ）精製バクテリオファージ懸濁液の調製：
以下のようにして、マスター懸濁液から使用のためにバクテリオファージを調製する：
（ｉ） 野菜ペプトン培養液中の緑膿菌の適当な増殖株の懸濁液３０ｍｌに適当なバクテリオファージのマスターシードを重複感染度０．１にて接種した。 
（ｉｉ） 懸濁液を細菌が完全に溶解するまで（これには通常５〜８時間かかる）３７℃にてインキュベートし、目視で評価した。目視評価はバクテリオファージ含有細菌懸濁液の濁度を対照懸濁液のそれと比較することにより実施する。対照懸濁液にはバクテリオファージを加えないが、他の点は全て同様とする。 
（ｉｉｉ） サブマスターシードを０．４５μｍシリンジトップフィルター、その後０．１μｍシリンジトップフィルターに通して濾過した。 
（ｉｖ） ３６ｍｌポリプロピレン遠沈管中で、５ｍｌの１０％ｗ／ｖスクロースの「クッション」の上に２７ｍｌのサブマスターシードを慎重に重層した。スクロース「クッション」の目的は、エンドトキシンの沈降を防ぎ、且つウイルス粒子が遠沈管の底にペレットになるようにすることである。 
（ｖ） 全ての遠沈管及びバケットを十分に洗浄し、その後、使用の前に１２１℃にてオートクレーブした。 
（ｖｉ） ベックマン超遠心機中で遠沈管を２３，５００ｒｐｍ、４℃にて３時間遠心した。 
（ｖｉｉ） 上清画分を除き、ペレットの水分を除いた。そしてペレットを１ｍｌのＰＢＳ＋１０％ｖ／ｖグリセロール中に再懸濁し、０．２μｍシリンジトップフィルターに通して濾過した。 
（ｖｉ） 適当な細菌株との共培養によって力価を評価した（以下を参照）。
【００８５】
この材料はｉｎ ｖｉｖｏで用いるために、無菌度管理に供することができる：
（ｅ）無菌度
以下のようにして、最終製品を無菌度について調べた：
（ｉ） 治療用最終製品の０．６ｍｌアリコート３本を無作為に選択した。 
（ｉｉ） 各アリコートを、滅菌針金ループを用いて栄養寒天平板（シュードモナスを含む一定範囲の細菌種の増殖を許容できる）上に広げた。 
（ｉｉｉ） 平板を３７℃で４８時間インキュベートした。 
（ｉｖ） 細菌コロニーの存在について平板を調べた。 
（調製された材料についてのこのような試験では細菌の増殖は見られなかった。）
【００８６】
（ｆ）有効性の評価：
イヌ外耳炎を引き起こす緑膿菌株に対処する目的で設計したバクテリオファージ製品に対しては、製品の開発にはこの役割を果たすために適当なバクテリオファージの選別が必要であった。これは、以下に示すようなイヌ外耳炎感染症に由来する１００種類の臨床的緑膿菌単離株との、２２種類のバクテリオファージの範囲の共培養によりなされた。これらの株のうち９０％は、２２株の当初集団からの６種類の候補バクテリオファージＢＣ−ＢＰ−０１〜ＢＣ−ＢＰ−０６のうち少なくとも１種類に感受性であることが明らかになった（図１）。このｉｎ ｖｉｔｒｏデータが、該製品がｉｎ ｖｉｖｏで臨床的に有効であるという予測を支持することに基づいて、これら６種類のバクテリオファージが臨床試験に進められた。
【００８７】
方法
（ｉ） バクテリオファージ調製物を、室温にてＰＢＳで１０倍希釈系列に希釈した。 
（ｉｉ） １００μｌの適当な希釈物を、５×１０６ｃｆｕの対応する細菌を含む４６℃の溶解寒天２．５ｍｌに加えた。 
（ｉｉｉ） 溶解寒天懸濁物を栄養寒天平板上に注ぎ、室温にて固まらせた。 
（ｉｖ） 平板を３７℃に移し、２４時間インキュベートした。 
（ｖ） プラークを数え、その数を力価（ｐｆｕ／ｍｌ）を計算するのに用いた。１００プラーク／平板前後となる希釈物について数えるようにする。
【００８８】
（ｇ）安全性の評価
バクテリオファージ製品の毒性を評価するために、獣医臨床試験を行った。試験の合計期間は２１日間であった。６頭のイヌ（オス３頭；メス３頭）に、試験の０、３及び６日目の３回、耳投与で、以下の処置処方を適用した：
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【００８９】
処置の適用は、外耳道に懸濁液を滴下し、その後浸透をよくするために揉むことにより行った。
【００９０】
以下の研究を、試験の間に行った：
（ｉ） ０、３及び６日目の微生物叢（サンプルは処置の適用の直前に採取した）を、耳スワブを以下のものの上で平板培養することにより評価した：
１） セトリミド寒天（Pseudomonas sppに選択的）
２） マンニトール塩寒天（Staphylococcus sppに選択的）
３） サブローデキストロース寒天（酵母及びカビに選択的）
４） ＦＰ寒天（ミクロコッカスに選択的）
５） 血液寒天（ほとんどの微生物の増殖を非選択的に許容する）
（ｉｉ） 耳鏡的獣医検査を、試験の８日目まで毎日、その後試験終了まで３日毎に行った。 
（ｉｉｉ） 中核体温を毎日測定した。
【００９１】
試験期間を通して：
（ｉ） 耳鏡的獣医検査では、基準状態の記録及び対照群と比較して、被験群のイヌの耳の状態に顕著な変化は見られなかった。 
（ｉｉ） 基準状態の記録及び対照群と比較して、被験群のイヌの耳内の微生物叢には顕著な変化はなかった。 
（ｉｉｉ） 被験群で、中核体温記録は対照群又は基準状態で記録されたものと顕著に異なることはなかった。
【実施例２】
【００９２】
ＩＩ．選択されたバクテリオファージの臨床的有効性の評価
（ａ）致死的な緑膿菌感染症からのマウスの防御
１． １５０，０００，０００感染単位（１０ＬＤ５０）の緑膿菌を、２０匹のマウスの腹腔内に注射した。 
２． ５匹のマウスからなる群を、４種類の異なる濃度のバクテリオファージＢＣ−ＢＰ−０８で処置した（細菌注射と同時に投与した）。 
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【００９３】
（ｂ）緑膿菌によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのブタ皮膚の破壊の阻止
ヒト血漿に浸した酵素洗浄滅菌凍結乾燥ブタ真皮の４層からそれぞれなる、１４個の創傷部モデルを作製した。１００，０００ｃｆｕの緑膿菌をそれぞれの上に置いた。創傷部モデルのうち７個には１，０００，０００感染単位のファージＢＣ−ＢＰ−０８を加え、残りを対照として残した。１８時間のインキュベーション後、対照８個のうち７個は盲検的に腐敗したと評価されたが、ファージ処置モデルの全てが腐敗していないと評価された。細菌は、被処置ディスクのうち３個においてのみ検出することができた（中央値０；最大値１２，０００）。ファージは該モデルの最下層にまで浸透し、そこで複製していることが明らかとなった（インキュベーション後のモデル中の中央値：３２，０００，０００；範囲１４，０００，０００〜２０，０００，０００，０００）。
【００９４】
（ｃ）緑膿菌感染症からのモルモット体表の皮膚移植片の防御
１． 剃毛皮膚の０．２ｍｍ厚の長方形（２ｃｍ×１ｃｍ）を１４頭のモルモットの背中から切除した。 
２． 創傷部を切除された熱傷部と同様にするため、下層の皮膚層を取り除いた。 
３． ６００，０００感染単位の緑膿菌を創傷部に加えた。 
４． ７頭の動物の創傷部に１２，０００，０００感染単位のバクテリオファージＢＣ−ＢＰ−０８を加え、他の７頭の創傷部にはバクテリオファージを加えなかった。 
５． 長方形の皮膚を戻し、包帯をした。 
６． 移植の成功を、５日後に評価した。 
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【００９５】
（ｄ）外耳炎を患ったイヌの外耳道中での投与された緑膿菌バクテリオファージの増殖
アトピーの病歴を有するイヌが両側性の慢性外耳炎を患った。抗生物質治療にもかかわらず、両耳のスワブでは、数ヶ月間、繰り返し緑膿菌が増殖していた。ファージ治療の前には、当該イヌは、周囲の耳介に及ぶ膿性分泌物及び多量の蝋状分泌物を伴って、両側の外耳道が赤く腫れ上がっていた。その時点でそれぞれの耳から採取したスワブでは、緑膿菌が増殖していた（ＡＰＩ ２０ＮＥ，Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，フランスにて同定した）。両耳からの単離株は、その生化学的反応及びその抗生物質感受性パターンにおいて若干異なっていた。広範囲の緑膿菌株に対して良好な溶解活性を示すものとして以前に特定されていたため、ファージのコレクションから該株に対して試験するために８種類を選択した。当該ファージのうち３種類は、該イヌから取得した両方の単離株に対して良好な溶解活性を示した。いかにわずかのプラーク形成単位で２種類の単離株の標準培養液培養物を溶解するかについて、ファージをさらに試験した。ＢＣ−ＢＰ−０４（溶解に要したｐｆｕ数が最も低かったファージ）をｉｎ ｖｉｖｏ試験のために選んだ。ストック溶液中のファージ濃度を力価判定しておき、該溶液の１０５倍希釈液０．２ｍｌを注射器でイヌの右外耳道に投与した。この容量は約４００感染単位（プラーク形成単位、p.f.u.）を含有していた。
【００９６】
ファージ投与２７時間後に、右耳中のデトリタスのスワブを採取した。スワブ採取の前後に重量を測定し、デトリタスの体積を測定した。寒天重層法を用いた連続１０倍希釈物の平板培養により、デトリタス中のファージを計数した。スワブ上に存在したデトリタス０．０３２ｇ中に１．６×１０８のファージがあり、従ってファージは１００万倍を超えて増殖したようである。この増加は、右耳の著しい臨床的改善を伴っていた。炎症は少なくなり、膿の分泌はなくなり、そして蝋状分泌物の量は減少した（図３ａ）。左耳（ファージを投与しなかった）の外観は変化しないままであった（図３ｂ）。当該変化を考慮に入れ、４００ｐｆｕのファージを左耳に投与すると、２４〜４８時間後にはかなりの臨床的改善が見られた。ファージ投与２週間後、イヌの耳は悪化しており、両耳のスワブは培養で緑膿菌陽性であった。その後、耳の状態は何ヶ月もの間、悪化と改善を繰り返したが、飼い主と獣医は、ファージを投与する前よりも状態はよくなっていると判断した。ファージ投与９ヵ月後、両耳は完全に回復し、緑膿菌はそれから耳スワブから単離されていない。必要であると思われなかったので、ファージ投与後はイヌに対して抗生物質を与えなかった。
【００９７】
（ｅ）ヒト熱傷部の感染症の処置での緑膿菌バクテリオファージの使用
５０％の熱傷を伴う２７歳男性に対して、単一症例試験を行った。熱傷の治癒は、皮膚の崩壊の期間と交互に起こっていた。彼の背部と胸部の皮膚が崩壊しかけていたことが注目された。その時点で、医師（皮膚の崩壊の速さを憂慮していた）は彼の緑膿菌感染症を処置するためのファージを見つけることができないか依頼した。新規のファージＢＣ−ＢＰ−０７が活性であるとして特定された。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では該株に対する非常に高い活性は示されなかったが、時間が限られていたため、それを次の試験のために選択した。精製懸濁液を作製し、ヒト表皮細胞の培養物に加えたときには、それについては毒性の徴候は示されなかった。約１０００感染単位（p.f.u.）のＢＣ−ＢＰ−０７を直径２５ｍｍの２枚の濾紙ディスクのそれぞれに添加した。包帯交換の際に、患者の、緑膿菌が定着していることがわかっている領域にそれらを置いた。４８時間後、ディスク中のファージ数は１．２×１０６及び４．３×１０４であり、１，２００倍及び４３倍に増加していた。この後、患者の熱傷部にファージを噴霧した。これに続いて患者の状態は徐々に改善し、彼は生き延びて最終的に全ての創傷部が治癒した。ファージが患者（抗生物質も与えられていた）の回復に寄与したか否かは不明であるが、ファージは熱傷部で増殖し、これは患者体内又は体表でのバクテリオファージの増殖を表すものなので、バクテリオファージによって細菌が死滅したことを示唆している。
【００９８】
２００３年６月２４日のＮＣＩＭＢへの寄託前には、本明細書中でＢＣ−ＢＰ−０１〜ＢＣ−ＢＰ−０８として言及したバクテリオファージのいずれも公衆に利用可能となっておらず、従ってその日前の刊行物その他の開示物中のそのような株についてのいかなる言及も、先行技術として用いることができるものではない。
【００９９】
以下に提供するさらなる例示において、ＮＣＩＭＢ４１１７４、ＮＣＩＭＢ４１１７５、ＮＣＩＭＢ４１１７６、ＮＣＩＭＢ４１１７７、ＮＣＩＭＢ４１１７８及びＮＣＩＭＢ４１１７９の６種類のバクテリオファージの組み合わせ（ＢｉｏＶｅｔ−ＰＡ組成物)（これはイヌの耳感染症（外耳炎及び他の耳感染症）に由来する試験した緑膿菌単離株のうち９０％に対して活性であることが見出されていた）を用いた。０．２ｍｌのＢｉｏＶｅｔ−ＰＡは、上記の適当な対応株に対して測定したとき、６種類のバクテリオファージのそれぞれを１×１０５感染単位含有していた。
【０１００】
６種類の個々の精製バクテリオファージ懸濁液を、１０％ｖ／ｖグリセロール／ＰＢＳ中に約３×１０６ｐｆｕ／ｍｌの濃度まで希釈した。この希釈ステップは、バクテリオファージ懸濁液のサンプル（−８０℃にて凍結されており、その後解凍してアッセイした）から計算した力価を根拠とした。希釈後、６種類の治療用バクテリオファージを等比率で混合し、従って各バクテリオファージは６分の１に希釈され、個々の成分の濃度は５×１０５ｐｆｕ／ｍｌとなった。これは、０．２ｍｌの希釈液中の各治療用バクテリオファージ１×１０５ｐｆｕに相当する。この時点で、最終混合製品を０．６ｍｌのアリコートに分け、−８０℃で保存した。
【実施例３】
【０１０１】
ＩＩＩ．イヌの耳感染症に対する複合ファージ組成物の試験
上記のように、緑膿菌により引き起こされるイヌの耳感染症（外耳炎及び中耳炎）は体表面での生物膜に基づく定着を伴う臨床疾患の例である。そのような感染症の臨床症状としては、痛み、炎症（紅斑）、潰瘍及び耳からの増加した量の物質の分泌が挙げられる。これは通常自然に化膿し、異臭を伴う。上記の６種類のバクテリオファージのＢｉｏＶｅｔ−ＰＡ複合調製品は、２００３年１１月１７日にＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌ Ｌｉｍｉｔｅｄに対して発行された動物試験認定証第２０５０５／０００１において、英国獣医学理事会によりそのような感染症についてのイヌでの試験が許可された。
【０１０２】
試験の実施
ＢｉｏＶｅｔ−ＰＡは−８０℃にて保存した。投与の直前に、該製品を解凍し、手で温めた。０．２ｍｌ（６種類のバクテリオファージのそれぞれを１×１０５感染単位含有する）を耳の中に滅菌１ｍｌ容量注射器を用いて滴下して投与した。耳の症状及び微生物学的状態を投与２日後に評価した。
【０１０３】
手順は以下の通りである：
特性決定（処置２〜１４日前）：
０日目 獣医が各耳からスワブを採取した。 
それらのスワブを用いて実験室試験を行い、緑膿菌の存在を確かめた。 
緑膿菌が検出されなかったら、そのイヌは試験からはずした。 
１日目 緑膿菌が検出されたら、ＢｉｏＶｅｔ−ＰＡに対する感受性について単離株を試験した。 
イヌが感染している緑膿菌株がＢｉｏＶｅｔ−ＰＡに対して感受性でなかったら、そのイヌは試験からはずした。
【０１０４】
処置：
０日目 耳鏡で耳を検査し、その状態を評価した。 
微生物学的解析のために各耳からスワブを採取した。 
イヌの中核体温を測った。 
イヌに、耳の中に０．２ｍｌの用量のＢｉｏＶｅｔ−ＰＡを与えた（処置は滅菌１ｍｌ容量注射器を用いて滴下して投与し、浸透をよくするために耳道を揉んだ）。 
１日目 耳を検査してその状態を評価した。 
微生物学的解析のために各耳からスワブを採取した。 
イヌの中核体温を測った。 
２日目 耳を検査してその状態を評価した。 
微生物学的解析のために各耳からスワブを採取した。 
イヌの中核体温を測った。
【０１０５】
結果：
ＢｉｏＶｅｔ−ＰＡで処置した重症の抗生物質抵抗性緑膿菌耳感染症を有する６頭のイヌについての試験では、処置の２日間に臨床症状の改善が示され（図４）、同じ時間軸にわたって細菌数の減少が示された（図５）。全てのイヌで、バクテリオファージの複製も観察された（図６）。臨床症状の改善についての解析では、それがｔ−検定及びＷｉｌｃｏｘｏｎマッチドペア検定のいずれによっても、信頼度９５％で有意差があることが示された。
【実施例４】
【０１０６】
ＩＶ．イヌの耳感染症に対する抗生物質との複合ファージ組成物の試験
抗生物質を加えたＢｉｏＶｅｔ−ＰＡ組成物を、抗生物質処置単独に対しては抵抗性であることが証明されているイヌの緑膿菌耳感染症に対して用いた。
【０１０７】
症例１
イヌＭは両側性耳炎の病歴を有し、これはマルボフロキサシン及びゲンタマイシン（緑膿菌性耳炎の処置に用いられる）をはじめとする抗生物質を用いた繰り返し処置クールにもかかわらず、右耳での解消に失敗していた。ファージ試験の開始時（０４年１月２６日）には、右耳は緑膿菌及びＧ群β溶レン菌の両方に感染していた。検査により、紅斑、潰瘍及び異臭を伴う膿の分泌が示された。検査に続いて、イヌＭをＢｉｏＶｅｔ−ＰＡ（希釈剤０．２ｍｌ中の６種類のバクテリオファージそれぞれの１００，０００感染単位）を用いて処置した。
【０１０８】
処置に続く解析では、６種類のバクテリオファージのうち５種類が複製していることが示された。これは耳内に存在するシュードモナス細菌数の低下及び臨床症状の改善を伴った。バクテリオファージ処置に続く２日間の観察期間完了８日後に、イヌＭを、付随する連鎖球菌感染についてＳｙｎｕｌｏｘ（アモキシシリン及びクラバヌレート（clavanulate））を用いて処置した。この治療は、一部のシュードモナス株に対してもいくらか活性を有する。
【０１０９】
結果
０４年３月８日に採取したスワブの解析ではシュードモナスは検出されず、低レベルの連鎖球菌が示された。このことは、抗生物質及び他の化学薬がそれまでに感染症を排除できなかった場合での、生物膜形成を特徴とする系での細菌感染症の解消におけるバクテリオファージの有効性を示し、同様に、そのような処置の後に抗生物質を投与した場合の改善された結果を示すものである。
【０１１０】
症例２
イヌＲは両側性耳炎の病歴を有し、これはゲンタマイシン、マルボフロキサシン（緑膿菌性耳炎の処置に用いられる）、アンピシリン（他の細菌感染症に用いられる）及びリマダイル（抗炎症剤）を用いた処置にもかかわらず、解消に失敗していた。０４年２月１６日にイヌＲを検査した。この時点で、両耳が緑膿菌及び腸内細菌の両方に感染していた。両耳が強い異臭を伴う膿性分泌物を産生していた。紅斑及び潰瘍も記録された。検査に続いて、イヌＲをＢｉｏＶｅｔ−ＰＡ（希釈剤０．２ｍｌ中の６種類のバクテリオファージそれぞれの１００，０００感染単位）を用いて処置した。処置に続く解析により、６種類のバクテリオファージのうち２種類が複製していることが示された。これは耳内に存在するシュードモナス細菌数の低下及び臨床症状の改善を伴っていた。バクテリオファージ処置後の４日間の観察期間に続いて、アモキシシリン・クラブラン酸錠（耳内に存在する腸内細菌に対して）及びＣａｎａｕｒａｌ点耳薬（フシジン酸ジエタノールアミン、硫酸フラマイセチン（framycetin）、ナイスタチン及びプレドニソロンを含む）を用いてイヌＲを処置した。耳内に存在する緑膿菌は、フラマイセチンのようなアミノ配糖体系抗生物質に部分的に抵抗性であることが知られていた。Ｃａｎａｕｒａｌ製剤の他の成分は、シュードモナスに対して用いられるものではない（フシジン酸ジエタノールアミンは腸内細菌をはじめとする他の細菌感染症に対して用いられる抗生物質であり、ナイスタチンは抗真菌剤であり、プレドニソロンは抗炎症剤である）。腸内細菌感染症の抗生物質感受性は知られていないが、０４年１月３０日に完了したアンピシリンのクールは、該感染症を解消することができなかった。
【０１１１】
結果
０４年３月１日のイヌＲの検査により、両耳で、臨床症状は完全に解消したことが示された。紅斑及び潰瘍は見られず、分泌物は正常であり、異臭は検出されなかった。このことから、抗生物質及び他の化学薬が感染症を排除できなかった場合での、感染症の臨床症状の解消におけるバクテリオファージ投与後に行われた抗生物質処置の有効性が示された。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】緑膿菌の個々の株に対するバクテリオファージの有効性を示す。
【図２】ＢＣ−ＢＰ−０３対応株の特定を示す。
【図３】バクテリオファージＢＣ−ＢＰ−０４を用いて処置したイヌ耳の感染症の解消を示す。
【図４】６種類のバクテリオファージＮＣＩＭＢ４１１７４〜ＮＣＩＭＢ４１１７９を含有する複合バクテリオファージ調製物（ＢｉｏＶｅｔ−ＰＡ）を用いた処置２日後の、抗生物質抵抗性耳炎の６頭のイヌの、初期レベルに対する％としての総合臨床スコア（閉塞、紅斑、潰瘍、排出物タイプ、排出物容量、異臭）における改善を示す（太実線が平均）。
【図５】処置２日後の、同じ処置グループのイヌの初期レベルに対する％としての、シュードモナス（Pseudomonas）細菌数／デトリタスｇを示す（太実線が平均）。
【図６】処置２日後の、同じ処置グループのイヌの最初のレベルに対する％（対数目盛）としての、バクテリオファージ数／デトリタスｇを示す（太実線が平均）。
【図１ａｂ】
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【図１ｃｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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