(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキセンジンリンカー複合体Ｄ−Ｌ［式中、
Ｄは、エキセンジン部分を表し；そして
−Ｌは、式（Ｉ）
【化１】
0005932796.tif 000044
（式中、点線は、アミド結合の形成によるエキセンジンのアミノ基の１つへの結合を示し；
Ｒ1は、Ｃ1-4アルキルから選ばれ；
Ｒ2、Ｒ2aは、Ｈ及びＣ1-4アルキルからなる群より独立して選ばれる）
によって表される生物活性のないリンカー部分−Ｌ1
（ここにおいて、Ｌ1は、１つのＬ2−Ｚで置換され、但し、式（Ｉ）中のアスタリスクでマークされた水素は、置換基によって置き換えられず、そしてここにおいて、
Ｌ2は、単化学結合又はＣ1-20アルキル鎖であり、これは、−Ｏ−；及びＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ3aa）から独立して選ばれる１つ又はそれ以上の基によって場合により中断され；
ＯＨ；及びＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ3aaＲ3aaa）から独立して選ばれる１つ又はそれ以上の基で場合により置換され；
そして、ここにおいてＲ3aa、Ｒ3aaaは、Ｈ；及びＣ1-4アルキルからなる群より独立して選ばれ；そして
Ｌ2が
【化２】
0005932796.tif 000045
から選ばれる末端基を介してＺに結合し、
Ｚは、骨格鎖部分が式Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）4のヒドロゲルであり、
各Ａは、式−（ＣＨ2）n1（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＸ−から独立して選ばれ、
ｎ１は１又は２であり
ｎは５〜５０までの整数；そして
Ｘは、Ａ及びＨｙｐを結合しているアミド結合；各Ｈｙｐはリシンを含む超分枝ポリペプチドから独立して選ばれ；
骨格鎖部分はｍ個のエチレングリコール単位を含むポリエチレングリコールベースのクロスリンカー部分により架橋結合し、
ｍは３から１００までの整数であり、少なくとも２つの加水分解により分解可能な結合によって終結される］
を含むプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩。
【請求項２】
Ｒ1が−ＣＨ3である、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項３】
Ｌが式（Ｉａ）
【化３】
0005932796.tif 000046
（式中、点線は、アミド結合の形成によるエキセンジンの窒素への結合を示す）
によって表される、請求項１又は２に記載のプロドラッグ。
【請求項４】
Ｌが式（ＩＩ）
【化４】
0005932796.tif 000047
（式中、点線は、アミド結合の形成によるエキセンジンの窒素への結合を示す）
によって表される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項５】
骨格鎖部分が、以下の式：
【化５】
0005932796.tif 000048
（式中、点線は骨格鎖部分の残りへの結合を示す）
の分枝コアを含む、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項６】
骨格鎖部分が、以下の式：
【化６】
0005932796.tif 000049
（式中、ｎは５から５０の整数であり、そして点線は分子の残りへの結合を示す）
の構造を含む、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項７】
骨格鎖部分が、以下の式：
【化７】
0005932796.tif 000050
（式中、点線は残りの分子への結合を示し；そしてアスタリスクでマークされた炭素原子はＳ配置を示す）
の超分枝部分Ｈｙｐを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項８】
骨格鎖部分が、以下の式：
【化８】
0005932796.tif 000051
（式中、点線の１つは、超分枝部分Ｈｙｐへの結合を示し、そして第２の点線は、分子の残りへの結合を示し；そして
ｍは２から４までの整数である）
の少なくとも１つのスペーサーを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項９】
骨格鎖部分が、以下の式：
【化９】
0005932796.tif 000052
（式中、アスタリスクでマークされた点線は、ヒドロゲルとチオスクシンイミド基のＮとの間の結合を示し、
他の点線はＨｙｐへの結合を示し、そしてｐは、０から１０の整数である）
の少なくとも１つのスペーサーを含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１０】
骨格鎖部分が、以下の構造
【化１０】
0005932796.tif 000053
（式中、ｍは３から１００の整数である）
を含むクロスリンカー部分を通して一緒に連結される、請求項８又は９に記載のプロドラッグ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩を少なくとも１つの薬学的に許容しうる賦形剤と共に含んでなる糖尿病治療のための薬学的組成物。
【請求項１２】
薬剤として使用するための請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロドラッグ又は請求項１１に記載の糖尿病治療のための薬学的組成物。
【請求項１３】
エキセンジンによって治療することができる疾患又は障害の治療又は予防方法に使用するための請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロドラッグ又は請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロドラッグの製造方法であって、
（ａ）マレイミド官能化ヒドロゲル微粒子を含む水性懸濁液を、ｐＨ５．５〜８の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で、エキセンジン−リンカー試薬を含む溶液と接触させてエキセンジン−リンカー−ヒドロゲル複合体を生成させる工程；
（ｂ）場合により、工程（ａ）からのエキセンジン−リンカー−ヒドロゲル複合体を、ｐＨ５．５〜８の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で３４Ｄａ〜５００Ｄａのチオール含有化合物により処理する工程；
を含み、
前記エキセンジン−リンカー試薬が、
エキセンジン−リンカー試薬Ｄ−Ｌ*［式中、
Ｄは、エキセンジン部分を表し；そして
Ｌ*は、式（ＩＶ）
【化１１】
0005932796.tif 000054
（式中、点線は、アミド結合の形成によるエキセンジンのアミノ基の１つへの結合を示し；
Ｒ1は、Ｃ1-4アルキルから選ばれ；
Ｒ2、Ｒ2aは、Ｈ及びＣ1-4アルキルからなる群より独立して選ばれる）
によって表される生物活性のないリンカー試薬であり、
ここにおいてＬ*は、１つのＬ2*で置換され、但し、式（ＩＶ）中のアスタリスクでマークされた水素は、置換基によって置き換えられることはなく、そしてここにおいて、
Ｌ2*は、Ｌ*に連結したスペーサーであり、そしてヒドロゲルに複合するための化学官能基を含む］
であって、Ｌ2*の化学官能基がチオール基を含むものである
上記方法。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロドラッグの製造方法であって、
（ａ）チオール官能化ヒドロゲル微粒子を含む水性懸濁液を、ｐＨ５．５〜８の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で、エキセンジン−リンカー試薬を含む溶液と接触させてエキセンジン−リンカー−ヒドロゲル複合体を生成させる工程；
（ｂ）場合により、工程（ａ）からのエキセンジン−リンカー−ヒドロゲル複合体を、ｐＨ５．５〜８の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で１００〜３００Ｄａのマレイミド含有化合物により処理する工程；
を含み、
前記エキセンジン−リンカー試薬が、
エキセンジン−リンカー試薬Ｄ−Ｌ*［式中、
Ｄは、エキセンジン部分を表し；そして
Ｌ*は、式（ＩＶ）
【化１２】
0005932796.tif 000055
（式中、点線は、アミド結合の形成によるエキセンジンのアミノ基の１つへの結合を示し；
Ｒ1は、Ｃ1-4アルキルから選ばれ；
Ｒ2、Ｒ2aは、Ｈ及びＣ1-4アルキルからなる群より独立して選ばれる）
によって表される生物活性のないリンカー試薬であり、
ここにおいてＬ*は、１つのＬ2*で置換され、但し、式（ＩＶ）中のアスタリスクでマークされた水素は、置換基によって置き換えられることはなく、そしてここにおいて、
Ｌ2*は、Ｌ*に連結したスペーサーであり、そしてヒドロゲルに複合するための化学官能基を含む］
であって、Ｌ2*の化学官能基がマレイミド基を含むものである
上記方法。
【請求項１６】
注射針で注射可能なプロドラッグの製造方法であって、
（ａ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の微粒子形態のプロドラッグを製造する工程；
（ｂ）微粒子を篩分けする工程；
（ｃ）プロドラッグビーズ径２５〜８０μｍを有する画分を選別する工程；
（ｄ）工程（ｃ）のビーズ画分を注射に適した水性緩衝液中に懸濁する工程；
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エキセンジンプロドラッグ、前記プロドラッグを含んでなる薬学的組成物並びにエキセンジンによって治療することができる疾患又は障害を治療又は予防する薬剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エキセンジン−４は、有毒なアメリカドクトカゲ（Gila monster）（Heloderma suspectum）の唾液分泌物から単離された３９アミノ酸ペプチドである。それは、グルカゴン様ペプチドファミリーのいくつかのメンバーに対していくらかの配列類似性を有し、グルカゴン様ペプチド−１［７−３６］−アミド（ＧＬＰ−１）に対する最も高い相同性は５３％である。エキセンジン−４は、ＧＬＰ−１受容体においてＧＬＰ−１アゴニストとして作用し、そして単離されたラット脾島においてＧＬＰ−１様のインスリン分泌促進作用を担っている。エキセンジン−４は、高い効力のアゴニストであり、そして切断エキセンジン（truncated exendin）−（９−３９）−アミドは、インスリン分泌性ベータ細胞のグルカゴン様ペプチド１−（７−３６）−アミド受容体のアンタゴニストである。（例えば非特許文献１を参照のこと）。エキセンジン−４（「エクセナチド」）は、最近、メトホルミン及び／又はスルホニル尿素を摂取している２型糖尿病患者の血糖管理を改善するために米国及び欧州連合で承認されたが、十分な血糖管理は達成されていない。
【０００３】
エクセナチドによる現在の治療は、頻回注射（１日２回）を必要とし、注射後に高い血漿レベルを生じ、それは悪心（非特許文献２を参照のこと）、そして低いトラフ濃度と関連があり、不完全な血糖管理を招く（非特許文献３を参照のこと）。これらの問題を克服するには、エキセンジン−４の持効型製剤（longer-acting formulation）が非常に望ましい。
【０００４】
理想的には、ペプチドは、ヒトの体に適用後、少なくとも１週間、ヒト中で持続した血漿レベルをもたらす様式で処方され、週１回又はそれより長い注射頻度となる。いくつかの持効型エキセンジンが提案されている。
【０００５】
生体内での薬物の物理化学的又は薬物動態学的性質、例えばその半減期を強化するため、このような薬物は、担体と結合させることができる。薬物が担体及び／又はリンカーに一時的に結合される場合、このような系は、一般に担体結合プロドラッグ（carrier-linked prodrugs）と称する。ＩＵＰＡＣによって提供された定義（２００９年７月２２日にアクセスされたhttp://www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchem下に記載された）によれば、担体結合プロドラッグは、改善された物理化学的又は薬物動態学的性質をもたらし、そして、通常、加水分解によって生体内で容易に除去することができる、所定の活性物質と一過性の担体基（transient carrier group）との一時的な結合を含むプロドラッグである。
【０００６】
このような担体結合されたプロドラッグ中に用いられるリンカーは一過性であってもよく、それは、例えば１時間から３ヵ月までの範囲の半減期を有し、生理学的条件（ｐＨ７．４、３７℃の水性バッファー）下で非酵素的加水分解により分解可能（切断可能）であることを意味している。適切な担体はポリマーであり、リンカーに直接結合するか又は切断されないスペーサーを介して結合することができる。
【０００７】
痕跡を残さない（traceless）プロドラッグリンカーによる一過性ポリマー結合は、ポリマー結合により延長された循環時間の利点と、ポリマー複合体（polymer conjugate）
から放出後の天然ペプチド本来の薬理の回復とを兼ね備えている。
【０００８】
ポリマー−リンカーペプチド複合体を用いると、患者に適用後、天然の未変化ペプチドがゆっくり放出され、リンカーの放出動態及びポリマー担体の薬物動態によってのみ支配される。放出動態は、体液中のプロテアーゼ又はエステラーゼのような酵素の存在から独立して、一貫して均一な放出パターンが保証されるのが理想的である。
【０００９】
特許文献１は、リンカーがエキセンジンのような生物活性部分に切断可能な結合を介して共有結合された薬物リンカー複合体を含んでなるプロドラッグに関する。生物活性部分は、環式イミド形成によって環化活性化されるとプロドラッグから放出される。リンカーがＬ−アラニンに基づくエキセンジン−プロドラッグが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際特許出願ＷＯ−Ａ ２００９／０９５４７９
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】J. Biol. Chem. 268(26):19650-19655
【非特許文献２】Nauck M. A., Meier J. J. (2005), Regul Pept.128(2):135-148
【非特許文献３】Kim D., et al. (2007), Diabetes Care. 30(6):1487-1493
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
それでも、より長い半減期を有する持効型エキセンジンプロドラッグを開発する必要性が残っている。従って、本発明の１つの目的は、より長い半減期を有するエキセンジンプロドラッグを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
これは、式Ｄ−Ｌ［式中、
Ｄは、エキセンジン部分を表し；そして
−Ｌは、式（Ｉ）
【化１】
0005932796.tif 000002
（式中、点線は、アミド結合の形成によるエキセンジンのアミノ基の１つへの結合を示し；
Ｒ1は、Ｃ1-4アルキル、好ましくはＣＨ3から選ばれ；
Ｒ2、Ｒ2aは、Ｈ及びＣ1-4アルキルからなる群より独立して選ばれる）
によって表される生物活性のないリンカー部分−Ｌ1
（ここにおいて、Ｌ1は、１つのＬ2−Ｚで置換され、そして場合によりさらに置換されるが、但し、式（Ｉ）中のアスタリスクでマークされた水素は、置換基によって置き換えられず、そしてここにおいて、
Ｌ2は、単化学結合又はスペーサーであり；そして
Ｚは、ヒドロゲルである）
である］
の共有結合性エキセンジンプロドラッグを含むプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる
塩によって達成される。
【００１４】
式（Ｉ）に示された立体化学に基づく、すなわちそのＤ型においてアミノ酸を有するプロドラッグリンカーは、そのＬ型のアミノ酸に基づくこのようなプロドラッグリンカーと比較して好都合な半減期を有することが見出された。さらに、このようなプロドラッグは、投与間の少なくとも２日の期間にわたって構造的に無傷の形態で皮下デポ剤（subcutaneous depot）からのエキセンジン放出を提供することができる。さらなる利点として、エキセンジン分子の分子間接触を最小限にする十分に水和されたポリマーマトリックスによって、放出されたエキセンジンの構造的一体性（structural integrity）を提供することができ、そしてエキセンジンとポリマーマトリックスとの間の自己切断性プロドラッグリンカーによって持続放出が可能となりうる。
【００１５】
従って、本発明のプロドラッグ形態のエキセンジンは、現在の持効型エキセンジンより少ない頻度で投与可能なはずである。さらなる利点は、小さなピーク対トラフ比（peak to trough ratio）であり、それにより悪心や胃腸合併症といったような有害事象のリスクが大いに低下するはずである。これは、エキセンジンの血漿レベル、そして結果的に血糖の最適制御を維持することができると同時に、患者の注射頻度を減らすのを助けることができる。
【００１６】
「エキセンジン」という用語は、エキセンジンアゴニスト、エキセンジン類似体、エキセンジン誘導体、切断（truncated）エキセンジン、切断エキセンジンアゴニスト、切断エキセンジン誘導体、切断エキセンジン類似体、延長（extended）エキセンジン、延長エキセンジンアゴニスト、延長エキセンジン誘導体、延長エキセンジン類似体、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体、又はＧＬＰ−１誘導体、例えばアミド化、切断又は延長形態のＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１類似体のことである。好ましくは、エキセンジンは、配列ＩＤ（sequence ID）１〜ＩＤ２１のエキセンジン又はエキセンジンアゴニスト（以下参照）であり、そしてより好ましくは、配列ＩＤ２を有するエキセンジン−３又は配列ＩＤ１を有するエキセンジン−４である。
【００１７】
「延長」という用語は、そのＮ末端若しくはＣ末端でさらなるアミノ酸残基を有するか又は内部挿入物を有するペプチド又はタンパク質のことである。また、その用語は、例えば、ＧＳＴタンパク質、ＦＬＡＧペプチド、hexa-hisペプチド、マルトース−結合タンパク質のような前記ペプチド又はタンパク質と他のペプチド又はタンパク質との融合のことでもある。
【００１８】
本明細書に用いられるエキセンジンアゴニストの例は、
（ｉ）配列中の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、Ｎ末端修飾を含む異なるアミノ酸残基によって置き換えられた、エキセンジン−４類似体及びアミド化エキセンジン−４類似体；
（ｉｉ）エキセンジン−４の切断及び延長形態並びにアミド化された切断及び延長形態；
（ｉｉｉ）配列中の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基によって置き換えられた、切断及び延長エキセンジン−４並びにアミド化された切断及び延長形態；
（ｉｖ）ＧＬＰ−１及びアミド化されたＧＬＰ−１；
（ｖ）Ｎ末端修飾を含む、配列中の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基によって置き換えられた、ＧＬＰ−１−類似体及びアミド化されたＧＬＰ−１類似体；
（ｖｉ）切断及び延長ＧＬＰ−１並びにアミド化された切断及び延長形態；
（ｖｉｉ）配列中の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基によって置き換えられた、切断ＧＬＰ−１及びアミド化された切断形態；
（ｖｉｉｉ）すでに知られた物質ＡＶＥ−００１０／ＺＰ−１０／リキシセナチド（Sanofi-Aventis Zealand Pharma；配列ＩＤ２１）、ＢＡＹ−７３−７９７７（Bayer）、ＴＨ−０３１８、ＢＩＭ−５１０７７（Ipsen, Tejin, Roche）、ＮＮ２２１１（Novo Nordisk）、ＬＹ３１５９０２；
を含むが、それらに限定されるわけではないエキセンジン−３又はエキセンジン−４アゴニストである。
【００１９】
上記のようにエキセンジンアゴニストの例は、エキセンジン−４の類似体が、
Ｈ−ｄｅｓＰｒｏ36−エキセンジン−４−Ｌｙｓ6−ＮＨ2、
Ｈ−ｄｅｓ（Ｐｒｏ36,37）−エキセンジン−４−Ｌｙｓ4−ＮＨ2及び
Ｈ−ｄｅｓ（Ｐｒｏ36,37）−エキセンジン−４−Ｌｙｓ5−ＮＨ2
を含む群から選ばれるもの
又はその薬理学的に許容しうる塩
であってもよい。
【００２０】
上記のようなエキセンジンアゴニストのさらなる例は、エキセンジン−４の類似体が、
ｄｅｓＰｒｏ36［Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）、
ｄｅｓＰｒｏ36［ＩｓｏＡｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）、
ｄｅｓＰｒｏ36［Ｍｅｔ（Ｏ）14，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）、
ｄｅｓＰｒｏ36［Ｍｅｔ（Ｏ）14，ＩｓｏＡｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）、
ｄｅｓＰｒｏ36［Ｔｒｐ（Ｏ2）25，Ａｓｐ28］エキセンジン−２（１−３９）、
ｄｅｓＰｒｏ36［Ｔｒｐ（Ｏ2）２５，ＩｓｏＡｓｐ28］エキセンジン−２（１−３９）、
ｄｅｓＰｒｏ３６［Ｍｅｔ（Ｏ）14Ｔｒｐ（Ｏ2）25，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）及び
ｄｅｓＰｒｏ36［Ｍｅｔ（Ｏ）14Ｔｒｐ（Ｏ2）25，ＩｓｏＡｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）
を含む群から選ばれるもの
又はその薬理学的に許容しうる塩
であってもよい。
【００２１】
前段落に記載されたエキセンジンアゴニストのさらなる例は、ペプチド−Ｌｙｓ6−ＮＨ2がエキセンジン−４の類似体のＣ末端に結合されたものあってもよい。
【００２２】
上記のようにエキセンジンアゴニストのさらなる例は、エキセンジン−４の類似体が、
Ｈ−（Ｌｙｓ）6−ｄｅｓ Ｐｒｏ36［Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2
ｄｅｓ Ａｓｐ28Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38エキセンジン−４（１−３９）−ＮＨ2、
Ｈ−（Ｌｙｓ）6−ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−ＮＨ2、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）5 ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−ＮＨ2、
ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−（Ｌｙｓ）６−ＮＨ2、
Ｈ−（Ｌｙｓ）6−ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）5−ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2、
Ｈ−（Ｌｙｓ）6−ｄｅｓ Ｐｒｏ36［Ｔｒｐ（Ｏ2）25，Ａｓｐ28］エキセンジン−４
（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2、
Ｈ−ｄｅｓ Ａｓｐ28 Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｔｒｐ（Ｏ2）25］エキセンジン−４（１−３９）−ＮＨ2、
Ｈ−（Ｌｙｓ）6−ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｔｒｐ（Ｏ2）25，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−ＮＨ2、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）5−ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｔｒｐ（Ｏ２）25，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−ＮＨ2、
ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｔｒｐ（Ｏ2）25，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2、
Ｈ−（Ｌｙｓ）6−ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｔｒｐ（Ｏ2）25，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）5−ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｔｒｐ（Ｏ2）25，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2、
Ｈ−（Ｌｙｓ）６−ｄｅｓ Ｐｒｏ３６［Ｍｅｔ（Ｏ）１４,Ａｓｐ２８］エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2、
ｄｅｓ Ｍｅｔ（Ｏ）14 Ａｓｐ28Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38エキセンジン−４（１−３９）−ＮＨ2、
Ｈ−（Ｌｙｓ）6−ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｍｅｔ（Ｏ）14，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−ＮＨ2、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）5−ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｍｅｔ（Ｏ）14，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−ＮＨ2、
ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｍｅｔ（Ｏ）14，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2、
Ｈ−（Ｌｙｓ）6−ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｍｅｔ（Ｏ）14，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）5 ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｍｅｔ（Ｏ）14，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2、
Ｈ−（Ｌｙｓ）6−ｄｅｓ Ｐｒｏ36［Ｍｅｔ（Ｏ）14 Ｔｒｐ（Ｏ2）25，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−Ｌｙｓ6−ＮＨ2、
ｄｅｓ Ａｓｐ28 Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｍｅｔ（Ｏ）14，Ｔｒｐ（Ｏ2）25］エキセンジン−４（１−３９）−ＮＨ2、
Ｈ−（Ｌｙｓ）6−ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｍｅｔ（Ｏ）14，Ｔｒｐ（Ｏ2）25，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−ＮＨ2、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）5−ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｍｅｔ（Ｏ）14，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−ＮＨ2、
ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｍｅｔ（Ｏ）14，Ｔｒｐ（Ｏ2）25，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2、
Ｈ−（Ｌｙｓ）6−ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｍｅｔ（Ｏ）14，Ｔｒｐ（Ｏ2）25，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2、
Ｈ−Ａｓｎ−（Ｇｌｕ）5−ｄｅｓ Ｐｒｏ36，Ｐｒｏ37，Ｐｒｏ38［Ｍｅｔ（Ｏ）14，Ｔｒｐ（Ｏ2）25，Ａｓｐ28］エキセンジン−４（１−３９）−（Ｌｙｓ）6−ＮＨ2
を含む群から選ばれるもの
又はその薬理学的に許容しうる塩
であってもよい。
【００２３】
上記のようなエキセンジンアゴニストのさらなる例は、Ａｒｇ34，Ｌｙｓ26（Ｎε（γ−グルタミル（Ｎα−ヘキサデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）［リラグルチド］又はその薬理学的に許容しうる塩である。
【００２４】
エキセンジンアゴニストは、エキセンジン−３又はエキセンジン−４が、インスリン分泌促進物質として、そして真性糖尿病の治療において有益であるその作用を発揮する受容体を結合することによって、又はエキセンジンが効果を生じる受容体に結合して尿流においてエキセンジンの効果を模倣する、胃排出を遅らせる、満腹を誘導する、尿ナトリウム排泄を高める及び／又は尿カリウム濃度を低下させることによってエキセンジン−３又はエキセンジン−４の活性を模倣する。
【００２５】
一実施態様において、配列ＩＤ番号（Sequence ID NOs）：１−２２のエキセンジン又はエキセンジンアゴニストは、本発明の持効型ポリマー複合体の製造に用いることができる：
［配列ＩＤ番号：１］エキセンジン−４
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧ  ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２
［配列ＩＤ番号：２］エキセンジン−３
ＨＳＤＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧ  ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２
［配列ＩＤ番号：３］
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧ  Ｐ
［配列ＩＤ番号：４］
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧ  Ｙ
［配列ＩＤ番号：５］
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧ
［配列ＩＤ番号：６］
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧ−ＮＨ２
［配列ＩＤ番号：７］
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＷＬＫＮ−ＮＨ２
［配列ＩＤ番号：８］
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＬＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＦＬＫＮＧＧ  ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２
［配列ＩＤ番号：９］
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＬＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＦＬＫＮ−ＮＨ２
［配列ＩＤ番号：１０］
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＬＥＥＥＡＶＲ  ＬＡＩＥＦＬＫＮ−ＮＨ２
［配列ＩＤ番号：ｌｌ］
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＬＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧ  ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２
［配列ＩＤ番号：１２］ＨＧＤＧＴＦＴＳＤＬ  ＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲ  ＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧ  ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２
［配列ＩＤ番号１３］ＧＬＰ−ｌ（７−３６）アミドＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ  ＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−ＮＨ２
［配列ＩＤ番号１４］
ＨＳＥＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ  ＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−ＮＨ２
［配列ＩＤ番号１５］ＧＬＰ−ｌ（７−３７）
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ  ＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ
［配列ＩＤ番号１６］
ＨＡＸａａＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ  ＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−ＮＨ２
Ｘａａ＝Ｐ、Ｆ、Ｙ
［配列ＩＤ番号１７］
ＨＸａａＥＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ  ＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−ＮＨ２
Ｘａａ＝Ｔ、ａ−アミノ酪酸、Ｄ−Ａｌａ、Ｖ、Ｇｌｙ、
［配列ＩＤ番号１８］
ＨａＥＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ  ＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧ
［配列ＩＤ番号１９］
Ｒ−ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ  ＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−ＮＨ２
Ｒ＝アセチル、ピログルタミル、Ｎ−２−ヒドロキシベンゾイル、Ｎ−トランス−３−ヘキサノイル
［配列ＩＤ番号２０］
ＨＸａａＡＥＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ  ＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−ＮＨ２
Ｘａａ＝６−アミノ−ヘキサノイル。
［配列ＩＤ番号２１］
ＡＶＥ−００１０／ＺＰ−１０／リキシセナチドＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＳＫＫＫＫＫＫ−ＮＨ２
［配列ＩＤ番号２２］
Ａｒｇ34，Ｌｙｓ26（Ｎε（γ−グルタミル（Ｎα−ヘキサデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）［リラグルチド］ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＧＱＡＡＸａａＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
Ｘａａ＝Ｌｙｓ（Ｎε（γ−グルタミル（Ｎα−ヘキサデカノイル）））
好ましくは、エキセンジンは、配列ＩＤ１、ＩＤ１３、ＩＤ１５、ＩＤ２１又はＩＤ２２を有する。
【００２６】
より好ましくは、エキセンジンは、配列ＩＤ１、ＩＤ１３又はＩＤ２１を有する。
【００２７】
一実施態様において、エキセンジンは、配列ＩＤ１を有するエキセンジン−４である。
【００２８】
別の実施態様では、エキセンジンは、配列ＩＤ１３を有する類似体である。
【００２９】
別の実施態様では、エキセンジンは、配列ＩＤ２１を有する類似体である。
【００３０】
本発明のエキセンジン及びエキセンジンアゴニスト誘導体は、親の非修飾分子によって示されるなんらかの及びすべての活性を発揮するだけでなく、持続作用を有する。
【００３１】
生物活性のないリンカーに結合されたエキセンジンは、エキセンジン部分と称する。
【００３２】
「生物活性のないリンカー」は、生物活性物質（biologically active agent）から誘導された薬物の薬理学的効果を示さないリンカーを意味する。
【００３３】
「保護基」は、その後の化学反応において化学選択性を得るために合成中に分子の化学官能基を一時的に保護する部分のことである。アルコールの保護基は、例えば、ベンジル及びトリチルであり、アミンの保護基は、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル及びベンジルであり、そしてチオールについて、保護基の例は、２,４,６−トリメトキシベンジル、フェニルチオメチル、アセトアミドメチル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、トリフェニルメチル、３−ニトロ−２−ピリジルチオ、４−メチルトリチルである。
【００３４】
「保護された官能基」は、保護基によって保護された化学官能基を意味する。
【００３５】
「アシル化剤」は、場合により、酸塩化物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノール及びパラ−ニトロフェノールのような脱離基に結合された、アシル化反応においてアシル基を供給する構造Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−の部分を意味する。
【００３６】
「アルキル」は、直鎖又は分枝炭素鎖を意味する。アルキル炭素の各水素は、置換基によって置き換えられてもよい。
【００３７】
「アリール」は、複素環式環、例えばフェニル、チオフェン、インドリル、ナフチル、ピリジルを含む、単環式又は多環式又は縮合芳香環から誘導されたあらゆる置換基のことであり、それらは場合によりさらに置換されてもよい。
【００３８】
「アシル」は、構造Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−の化学官能基を意味し、ここにおいて、Ｒはアルキル又はアリールである。
【００３９】
「Ｃ1-4アルキル」は、１〜４個の炭素原子を有するアルキル鎖、例えば分子の末端に存在する場合：メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル  ｔｅｒｔ−ブチル、又は例えば分子の２つの部分がアルキル基によって結合されている場合、−ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＨ3）−、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）−、−Ｃ（ＣＨ3）2−を意味する。Ｃ1-4アルキル炭素の各水素は、置換基によって置き換えられてもよい。
【００４０】
「Ｃ1-6アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル鎖、例えば分子の末端に存在する場合：Ｃ1-4アルキル、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル；ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、又は例えば分子の２つの部分がアルキル基によって結合されている場合、−ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＨ3）−、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−、−ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）−、−Ｃ（ＣＨ3）2−を意味する。Ｃ1-6アルキル炭素の各水素は、置換基によって置き換えられてもよい。
【００４１】
従って、「Ｃ1-18アルキル」は、１〜１８個の炭素原子を有するアルキル鎖を意味し、そして「Ｃ8-18アルキル」は、８〜１８個の炭素原子を有するアルキル鎖を意味する。従って、「Ｃ1-50アルキル」は、１〜５０個の炭素原子を有するアルキル鎖を意味する。
【００４２】
「Ｃ2-50アルケニル」は、２〜５０個の炭素原子を有する分枝又は非分枝アルケニル鎖、例えば分子の末端に存在する場合：−ＣＨ＝ＣＨ2、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−ＣＨ3、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ2、又は例えば分子の２つの部分がアルケニル基によって結合されている場合、−ＣＨ＝ＣＨ−を意味する。Ｃ2-50アルケニル炭素の各水素は、さらに明記された置換基によって置き換えられてもよい。従って、「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する炭素鎖のことである。場合により、１つ又はそれ以上の三重の結合が存在してもよい。
【００４３】
「Ｃ2-50アルキニル」は、２〜５０個の炭素原子を有する分枝又は非分枝アルキニル鎖、例えば分子の末端に存在する場合：−Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨ2−Ｃ≡ＣＨ、ＣＨ2−ＣＨ2−Ｃ≡ＣＨ、ＣＨ2−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ3、又は例えば分子の２つの部分がアルキニル基によって結合されている場合、−Ｃ≡Ｃ−を意味する。Ｃ2-50アルキニル炭素の各水素は、さらに明記された置換基によって置き換えられてもよい。従って、「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する炭素鎖のことである。場合により、１つ又はそれ以上の二重結合が存在してもよい。
【００４４】
「Ｃ3-7シクロアルキル」又は「Ｃ3-7シクロアルキル環」は、少なくとも部分的に飽和された炭素−炭素二重結合を有しうる３〜７個の炭素原子を有する環式アルキル鎖、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチルを意味する。シクロアルキル炭素の各水素は、置換基によって置き換えられてもよい。また、「Ｃ3-7シクロアルキル」又は「Ｃ3-7シクロアルキル環」という用語は、ノルボナン又はノルボネンの様な架橋されたビシクルを含む。従って、「Ｃ3-5シクロアルキル」は、３〜５個の炭素原子を有するシクロアルキルを意味する。
【００４５】
従って、「Ｃ3-10シクロアルキル」は、３〜１０個の炭素原子を有する環式アルキル、例えばＣ3-7シクロアルキル；シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシルを意味する。また、「Ｃ3-10シクロアルキル」という用語は、少なくとも部分的に飽和したカルボモノ−及び−ビシクルを含む。
【００４６】
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを意味する。一般に、ハロゲンは、フルオロ又はクロロであることが好ましい。
【００４７】
「４〜７員ヘテロシクリル」又は「４〜７員複素環」は、４個までの環原子のうちの少なくとも１個の環原子が硫黄（−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−を含む）、酸素及び窒素（＝Ｎ（Ｏ）−を含む）からなる群より選ばれるヘテロ原子によって置き換えられており、そして環が炭素又は窒素原子を介して残りの分子に結合されている、最大数までの二重結合を含んでもよい４、５、６又は７個の環原子を有する環（完全飽和、部分飽和又は不飽和の芳香環又は非芳香環）を意味する。４〜７員複素環の例は、アゼチジン、オキセタン、チエタン、フラン、チオフェン、ピロール、ピロリン、イミダゾール、イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、オキサゾール、オキサゾリン、イソオキサゾール、イソオキサゾリン、チアゾール、チアゾリン、イソチアゾール、イソチアゾリン、チアジアゾール、チアジアゾリン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、チアジアゾリジン、スルホラン、ピラン、ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、イミダゾリジン、ピリジン、ピリダジン、ピラジン、ピリミジン、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、テトラゾール、トリアゾール、トリアゾリジン、テトラゾリジン、ジアゼパン、アゼピン又はホモピペラジンである。
【００４８】
「９〜１１員ヘテロビシクリル」又は「９〜１１員ヘテロビシクル」は、６個までの環原子のうちの少なくとも１個の環原子が硫黄（−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−を含む）、酸素及び窒素（＝Ｎ（Ｏ）−を含む）からなる群より選ばれるヘテロ原子によって置き換えられており、そして環が炭素又は窒素原子を介して残りの分子に結合されている、少なくとも１つの環原子が両方の環によって共有されており、そして最大数までの二重結合を含んでもよい９〜１１個の環原子を有する２環の複素環式系（完全飽和、部分飽和又は不飽和の芳香環又は非芳香環）を意味する。９〜１１員ヘテロビシクルの例は、インドール、インドリン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサゾール、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイソチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾイミダゾリン、キノリン、キナゾリン、ジヒドロキナゾリン、キノリン、ジヒドロキノリン、テトラヒドロキノリン、デカヒドロキノリン、イソキノリン、デカヒドロイソキノリン、テトラヒドロイソキノリン、ジヒドロイソキノリン、ベンゾアゼピン、プリン又はプテリジンである。また、９〜１１員ヘテロビシクルという用語は、１,４−ジオキサ−８−アザスピロ［４.５］デカンのような２環のスピロ構造又は８−アザ−ビシクロ［３.２.１］オクタンのような架橋された複素環も含む。
【００４９】
また、式（Ｉ）による化合物を含むエキセンジンプロドラッグが１つ又はそれ以上の酸性又は塩基性基を含む場合、本発明は、その対応する薬学的に又は毒物学的に許容しうる塩、特にその薬学的に使用可能な塩を含む。従って、酸性基を含む式（Ｉ）の化合物を含むエキセンジンプロドラッグは、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩として又はアンモニウム塩として本発明により用いることができる。このような塩のより詳しい例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩又はアンモニア若しくは例えばエチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミン若しくはアミノ酸のような有機アミンとの塩が含まれる。１つ又はそれ以上の塩基性基、すなわち、プロトン化できる基を含む式（Ｉ）の化合物を含むエキセンジンプロドラッグは、無機又は有機酸とのその付加塩の形態において本発明により存在することができ、そして用いることができる。適した酸の例には、塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、シュウ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、サリチル酸、安息香酸、ギ酸、プロピオン酸、ピバル酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、スルファミン酸、フェニルプロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、イソニコチン酸、クエン酸、アジピン酸、及び当業者に知られている他の酸が含まれる。また、式（Ｉ）の化合物を含むエキセンジンプロドラッグが分子中に酸性及び塩基性基を同時に含む場合、本発明は、記載された塩形態に加えて、分子内塩又はベタイン（両性イオン）も含む。式（Ｉ）を含むエキセンジンプロドラッグによるそれぞれの塩は、当業者に知られている慣用の方法によって、例えば、溶媒若しくは分散媒中でこれらを有機若しくは無機の酸若しくは塩基と接触させることによって、又は他の塩との陰イオン交換若しくは陽イオン交換によって得ることができる。また、本発明は、低い生理学的適合性のため、医薬に使用するには直接適していないが、例えば、化学反応の中間体として又は薬学的に許容しうる塩を製造するために用いることができる、式（Ｉ）の化合物を含むエキセンジンプロドラッグのすべての塩を含む。
【００５０】
生体内でエキセンジンのような薬物の物理化学的又は薬物動態学的性質を強化するため、このような薬物を担体と結合させることができる。薬物が担体及び／又はリンカーに一時的に結合される場合、このような系を、一般に担体結合プロドラッグ（carrier-linked prodrugs）と称する。ＩＵＰＡＣによって提供された定義（２００９年７月２２日にアクセスされたhttp://www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchem下に記載された）によれば、担体結合プロドラッグは、改善された物理化学的又は薬物動態学的性質をもたらし、そして、通常、加水分解によって生体内で容易に除去することができる、所定の活性物質と一過性担体基（transient carrier group）との一時的な結合を含むプロドラッグである。
【００５１】
このような担体結合プロドラッグに用いられるリンカーは、一過性（transient）であり、それは、例えば１時間から３ヵ月までの範囲の半減期を有し、生理学的条件（ｐＨ７．４、３７℃の水性バッファー）下で非酵素的加水分解により分解可能（切断可能）であることを意味している。
【００５２】
ヒドロゲル担体は、適切な担体はポリマーであり、リンカーＬに直接結合するか又はスペーサー、好ましくは切断されないスペーサーを介して結合することができる。「エキセンジンヒドロゲルプロドラッグ」という用語は、エキセンジンの担体結合プロドラッグのことであり、ここにおいて、担体はヒドロゲルである。「ヒドロゲルプロドラッグ」及び「ヒドロゲル結合プロドラッグ（hydrogel-linked prodrug）」という用語は、ヒドロゲルに一時的に結合された生物活性物質（biologically active agents）のプロドラッグのことであり、そして同義的に用いられる。
【００５３】
「ヒドロゲル」は、大量の水を取り込むことができる三次元的な親水性又は両親媒性ポリマーネットワークと定義することができる。ネットワークは、ホモポリマー又はコポリマーで構成されており、共有結合性の化学的又は物理的（イオン性、疎水性相互作用、エンタングルメント（entanglements））架橋の存在のため不溶性である。架橋は、ネットワーク構造及び物理的一体性（physical integrity）をもたらす。ヒドロゲルは、水性媒体中でそれを膨潤させる水との熱力学的適合性を示す。ネットワークの鎖は、孔が存在し、これらの孔の実質部分が１ｎｍ〜１０００ｎｍの寸法であるような形態で結合されている。
【００５４】
薬物の「遊離形態」とは、ポリマー複合体から放出された後のような、その改変されてない薬理活性形態の薬物のことである。
【００５５】
また、エキセンジンの薬理活性形態が酸化された及び脱アミド化された薬物を含むことは理解される。
【００５６】
「薬物」、「生物活性分子（biologically active molecule）」、「生物活性部分（biologically active moiety）」、「生物活性物質（biologically active agent）」、「活性物質（active agent）」という用語は、同義的に用いられ、その結合又は遊離形態のいずれかのエキセンジンのことである。
【００５７】
本明細書に用いられるエキセンジンの「治療有効量」は、所定の疾患及びその合併症の臨床症状を治癒、緩和又は部分的に抑制するのに十分な量を意味する。これを達成するために適当な量は、「治療有効量」として定義される。それぞれの目的の有効量は、疾患又は損傷の重症度並びに被験者の体重及び全身状態に左右される。適当な用量の決定は、数値の行列（matrix）を構成し、そして行列中のさまざまなポイントを試験することによって常用実験を用いて達成してもよく、それはすべて熟練医師の通常のスキル内にあることが理解される。
【００５８】
「安定な」及び「安定性」は、指示された保存時間内において、ヒドロゲル複合体が結合したままであり、実質的な程度まで加水分解しておらず、そしてエキセンジンに関して許容しうる不純物プロファイルを示すことを意味する。安定とみなすには、組成物は、その遊離形態の薬物を５％より少なく含む。
【００５９】
「薬学的に許容しうる」という用語は、動物、好ましくはヒトに使用するため、例えばＥＭＥＡ（欧州）及び／又はＦＤＡ（米国）のような監督機関及び／又は任意の他国の監督機関によって承認されたことを意味する。
【００６０】
「薬学的組成物」又は「組成物」は、１つ又はそれ以上の活性成分、及び１つ又はそれ以上の不活性成分、並びにいずれか２つ若しくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、若しくは凝集から、又は１つ若しくはそれ以上の成分の解離から、又は１つ若しくはそれ以上の成分の他のタイプの反応若しくは相互作用から直接的又は間接的に生じるあらゆる生成物を意味する。従って、本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物及び薬学的に許容しうる賦形剤（薬学的に許容しうる担体）を混合することによって製造されるあらゆる組成物を包含する。
【００６１】
「乾燥組成物」は、エキセンジンヒドロゲルプロドラッグ組成物が容器中に乾燥形態で提供されることを意味する。適した乾燥方法は、噴霧乾燥及び凍結乾燥（フリーズドライ）である。エキセンジンヒドロゲルプロドラッグのこのような乾燥組成物は、最大１０％、好ましくは５％未満、そしてより好ましくは２％未満の残留水分含量を有する（カールフィッシャー（Karl Fischer）に従って決定）。好ましい乾燥方法は、凍結乾燥である。「凍結乾燥された組成物」は、エンキセンディンヒドロゲルポリマープロドラッグ組成物が最初に凍結され、そして、その後、減圧による水分低下にかけられることを意味する。この用語は、組成物を最終容器に充填する前に製造過程で生じるさらなる乾燥工程を排除するわけではない。
【００６２】
「凍結乾燥」（フリーズドライ）は、組成物を凍結し、次いで周囲圧力を下げ、そして場合により加熱して組成物中の凍結した水を固相から気体に直接昇華させることを特徴とする脱水過程である。典型的に、昇華された水は、凝結によって集められる。
【００６３】
「再構成」は、乾燥組成物に液体を添加してそれを液体又は懸濁液組成物の形態にすることを意味する。「再構成」という用語は、水の添加に限定されず、例えばバッファー又は他の水溶液を含むなんらかの液体の添加のことであると理解される。
【００６４】
「再構成溶液」は、それを必要とする患者に投与する前にエキセンジンヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物を再構成するために用いられる液体のことである。
【００６５】
「容器」は、その中にエキセンジンヒドロゲルプロドラッグ組成物を含み、そして再構成まで保存することができるあらゆる容器を意味する。
【００６６】
「バッファー」又は「緩衝剤」は、所望の範囲にｐＨを維持する化学化合物のことである。生理学的に許容しうるバッファーは、例えば、ナトリウムのリン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、炭酸水素塩、クエン酸塩及び酢酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物、ピルビン酸塩である。Ｍｇ（ＯＨ）2又はＺｎＣＯ3のような酸中和剤を用いてもよい。緩衝能力は、ｐＨ安定性に最も感受性な条件に適合するよう調整することができる。
【００６７】
「賦形剤」は、治療剤と共に投与される化合物、例えば、緩衝剤、等張性調整剤（isotonicity modifiers）、防腐剤、安定剤、抗吸着剤、酸化防止剤、又は他の補助剤のことである。しかしながら、いくつかの場合、１つの賦形剤は、２つ又は３つの機能を有することがある。
【００６８】
「リオプロテクタント（lyoprotectant）」は、興味のタンパク質と合わせたときに、一般に乾燥したときの、そして特に凍結乾燥及びその後の保存中のタンパク質の化学的及び／又は物理的不安定性を有意に防止する又は低下させる分子である。例となるリオプロテクタントとしては、糖、例えばスクロース又はトレハロース；アミノ酸、例えばアルギニン、グリシン、グルタメート又はヒスチジン；メチルアミン、例えばベタイン；リオトロピック塩（lyotropic salts）、例えば硫酸マグネシウム；ポリオール、例えば３価の又はより高級な糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトール；エチレングリコール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；プルロニック；ヒドロキシアルキルデンプン、例えばヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、並びにそれらの組み合わせが含まれる。
【００６９】
「界面活性剤」は、液体の表面張力を低下させる湿潤剤のことである。
【００７０】
「等張性調整剤」は、注射デポ剤の浸透圧の違いのため細胞損傷から生じることがありうる疼痛を最小限にする化合物のことである。
【００７１】
「安定剤」という用語は、ポリマープロドラッグの安定化に用いられる化合物のことである。安定化は、タンパク質安定化力の強化、変性状態の不安定化、又はタンパク質への賦形剤の直接結合によって達成される。
【００７２】
「抗吸着剤」は、組成物の容器の内表面をコートする又はそれに競合的に吸着するのに用いられる主にイオン性若しくは非イオン性界面活性剤又は他のタンパク質又は可溶性ポリマーのことである。選択される賦形剤の濃度及びタイプは、回避すべき効果に左右されるが、典型的には、ＣＭＣ値よりすぐ上の界面で界面活性剤の単層が形成される。
【００７３】
「酸化防止剤」は、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、エクトイン、グルタチオン、メチオニン、モノチオグリセロール、モリン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、没食子酸プロピル、ビタミンＥ、キレート剤、例えばクエン酸、ＥＤＴＡ、六リン酸、チオグリコール酸のことである。
【００７４】
「抗菌剤」は、細菌、真菌、酵母、原生動物のような微生物の殺す又は成長を阻害する及び／又はウイルスを撲滅する化学物質のことである。
【００７５】
「容器を密閉する」とは、容器が気密性であり、外部と内部との間でガス交換することなく、そして内容物を無菌に保つように容器が閉じられていることを意味する。
【００７６】
「試薬」又は「前駆体」という用語は、本発明のプロドラッグに至る製造過程に用いられる中間体又は出発物質のことである。
【００７７】
「化学官能基」という用語は、カルボン酸及び活性化誘導体、アミノ、マレイミド、チオール及び誘導体、スルホン酸及び誘導体、カーボネート及び誘導体、カルバメート及び誘導体、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、イソシアネート、イソチオシアネート、リン酸及び誘導体、ホスホン酸及び誘導体、ハロアセチル、アルキルハライド、アクリロイル及び他のアルファ−ベータ不飽和マイケル受容体、フッ化アリールのようなアリール化剤、ヒドロキシルアミン、ピリジルジスルフィドのようなジスルフィド、ビニルスルホン、ビニルケトン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、オキシラン、並びにアジリジンのことである。
【００７８】
化学官能基が別の化学官能基に結合される場合、生成した化学構造を、「結合（linkage）」と称する。例えば、アミン基とカルボキシル基の反応は、アミド結合を生じる。
【００７９】
「反応性官能基」は、骨格鎖部分（backbone moiety）の化学官能基であり、これは超分枝部分（hyperbranched moiety）に結合されている。
【００８０】
「官能基」は、「反応性官能基」、「分解性相互結合官能基（degradable interconnected functional group）」、又は「複合体官能基（conjugate functional group）」に用いられる集合名である。
【００８１】
「分解性相互結合官能基」は、一方の側で骨格鎖部分に結合したスペーサー部分に結合しており、そしてもう一方の側で架橋部分に結合した生分解性結合（biodegradable bond）を含む結合である。「分解性相互結合官能基」、「生分解性相互結合官能基（biodegradable interconnected functional group）」、「相互結合生分解性官能基（interconnected biodegradable functional group）」及び「相互結合官能基（interconnected functional group）」という用語は、同義的に用いられる。
【００８２】
「ブロック基（blocking group）」又は「キャッピング基（capping group）」という用語は、同義的に用いられ、そして反応性官能基に不可逆的に結合してそれを、例えば化学官能基と反応できなくする部分のことである。
【００８３】
「保護基（protecting group）」又は「保護基（protective group）」という用語は、反応性官能基に可逆的に結合してそれを、例えば他の化学官能基と反応できないようにする部分のことである。
【００８４】
「相互結合性官能基（interconnectable functional group）」という用語は、ラジカル重合反応に参入し、そしてクロスリンカー試薬又は骨格鎖試薬の部分である化学官能基のことである。
【００８５】
「重合性官能基（polymerizable functional group）」という用語は、ライゲーション型重合反応（ligation-type polymerization reaction）に参入し、そしてクロスリンカ
ー試薬及び骨格鎖試薬の部分である化学官能基のことである。
【００８６】
骨格鎖部分は、一方の末端で骨格鎖部分に、そしてもう一方の側で架橋部分に結合されたスペーサー部分を含んでもよい。
【００８７】
「誘導体」という用語は、保護基及び／又は活性化基で適切に置換された化学官能基又は当業者に知られている対応する化学官能基の活性化形態のことである。例えば、カルボキシル基の活性化形態には、スクシンイミジルエステル、ベンゾトリアジルエステル、ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、アザベンゾトリアジルエステル、アシルハロゲン化物、混合又は対称性無水物、アシルイミダゾールのような活性エステルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００８８】
「非酵素的に切断可能なリンカー」という用語は、酵素活性のない生理学的条件下で加水分解により分解可能であるリンカーのことである。
【００８９】
「生物活性のないリンカー（non-biologically active linker）」は、生物活性部分から誘導された薬物（Ｄ−Ｈ）の薬理学的効果を示さないリンカーを意味する。
【００９０】
「スペーサー」、「スペーサー基」、「スペーサー分子」、及び「スペーサー部分」という用語は、同じ意味で用いられ、そして本発明のヒドロゲル担体中に存在する部分を記載するために用いられる場合、その断片が、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−4アルキル）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ1-4アルキル）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、４〜７員ヘテロシクリル、フェニル又はナフチルから選ばれる１つ又はそれ以上の基によって場合により中断された、Ｃ1-50アルキル、Ｃ2-50アルケニル又はＣ2-50アルキニルのような２つの部分を結合するのに適したあらゆる部分のことである。
【００９１】
「末端の」、「末端」又は「遠位端（distal end）」という用語は、２つの部分の間の結合に隣接して若しくはその中に又はオリゴマー若しくはポリマー鎖の終端に位置することを特徴とする、分子又は部分内の官能基又は結合の位置のことであり、それによってこのような官能基は化学官能基となることができ、そして結合は分解可能な又は永続的結合となることができる。
【００９２】
「結合形態における」又は「部分」という表現は、より大きな分子の部分である下部構造のことである。「結合形態における」という表現は、試薬、出発物質又は当分野でよく知られている仮定的な出発物質の命名又は列記によって部分への表示を簡略化するために用いられ、そして、それによって「結合形態における」は、例えば試薬又は出発物質中に存在する１つ若しくはそれ以上の水素基（−Ｈ）、又は１つ若しくはそれ以上の活性化若しくは保護基が部分中に存在しないことを意味する。
【００９３】
ポリマー部分を含むすべての試薬及び部分は、分子量、鎖長若しくは重合度、又は官能基の数に関して多様性を示すことが知られている高分子単位のことであると理解される。従って、骨格鎖試薬、骨格鎖部分、クロスリンカー試薬及びクロスリンカー部分について示した構造は、ほんの代表例である。
【００９４】
試薬又は部分は、線状又は分枝であってもよい。試薬又は部分が２つの末端基を有する場合、それを線状試薬又は部分と称する。試薬又は部分が２つを超える末端基を有する場合、それは分枝又は多官能性の試薬又は部分とみなされる。
【００９５】
「ポリ（エチレングリコール）ベースのポリマー鎖」又は「ＰＥＧベースの鎖」という
用語は、オリゴ−又はポリマー分子鎖のことである。
【００９６】
好ましくは、このようなポリ（エチレングリコール）ベースのポリマー鎖は、分枝コア（branching core）に結合されており、それは、そのうちの一方の末端が分枝コアに、そしてもう一方が超分枝樹枝状部分に結合された線状ポリ（エチレングリコール）鎖である。ＰＥＧベースの鎖は、ヘテロ原子及び化学官能基で場合により置換されたアルキル又はアリール基によって終結又は中断されてもよいことが理解される。
【００９７】
「ポリ（エチレングリコール）ベースのポリマー鎖」という用語がクロスリンカー試薬に関して用いられる場合、それは、少なくとも２０質量％エチレングリコール部分を含むクロスリンカー部分又は鎖のことである。
【００９８】
以下の段落では、本発明をさらに詳細に説明する。
【００９９】
本発明は、式Ｄ−Ｌ［式中、
Ｄは、エキセンジン部分を表し；そして
−Ｌは、式（Ｉ）
【化２】
0005932796.tif 000003
（式中、点線は、アミド結合の形成によるエキセンジンのアミノ基の１つへの結合を示し；
Ｒ1は、Ｃ1-4アルキル、好ましくはＣＨ3から選ばれ；
Ｒ2、Ｒ2aは、Ｈ及びＣ1-4アルキルからなる群より独立して選ばれる）
によって表される生物活性のないリンカー部分−Ｌ1 
（ここにおいて、Ｌ1は、１つのＬ2−Ｚで置換され、そして場合によりさらに置換されるが、但し、式（Ｉ）中のアスタリスクでマークされた水素は、置換基によって置換されず、そしてここにおいて、
Ｌ2は、単化学結合又はスペーサーであり；そして
Ｚは、ヒドロゲルである）
である］
の共有結合性エキセンジンプロドラッグを含むプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩に関する。
【０１００】
好ましくは、式（Ｉ）中、Ｒ2はＬ2−Ｚによって置き換えられる。
【０１０１】
好ましくは、式（Ｉ）中、Ｒ1はＣＨ2−Ｌ2−Ｚである。
【０１０２】
好ましくは、Ｌ1は、さらに置換されない。
【０１０３】
好ましくは、エキセンジン部分は、Ｎ末端窒素を通して又はエキセンジン部分のリシン側鎖の窒素を通してＬ1に結合されている。最も好ましくは、エキセンジン部分は、Ｎ末端窒素を通してＬ1に結合されている。
【０１０４】
本発明の好ましいプロドラッグは、インスリンリンカー複合体Ｄ−Ｌ、
［式中、Ｌは、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）：
【化３】
0005932796.tif 000004
｛式中、Ｄ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ2a、Ｌ2、Ｚは、本明細書に記載された意味及び好ましい意味を有し、そしてＬ1は場合によりさらに置換されるが、但し、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）中のアスタリスクでマークされた水素は、置換基によって置き換えられないが、好ましくは、Ｌはさらに置換されない（式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）にすでに示された必須の置換基Ｌ2−Ｚは別にして）｝によって表される］を含む。
【０１０５】
例えば、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）中に示されたように、式（Ｉ）のＬ1の１つの水素は、基Ｌ2−Ｚによって置き換えられる。
【０１０６】
式（Ｉ）中のアスタリスクでマークされた水素の置き換えは別として、Ｌ2はあらゆる位置でＬ1に結合することができる。好ましくは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ2aによって表わされる水素の１つは、直接又はＣ1-4アルキル若しくはさらなる基の水素としてＬ2−Ｚによって置き換えられる。
【０１０７】
さらにまた、式（Ｉ）のＬ1は場合によりさらに置換されてもよい。一般に、原則が影響を受けない限り、あらゆる置換基を用いてもよい。しかしながら、Ｌ1はさらに置換されないことが好ましい。
【０１０８】
好ましくは、１つ又はそれ以上のさらなる場合による置換基は、ハロゲン；ＣＮ；ＣＯＯＲ9；ＯＲ9；Ｃ（Ｏ）Ｒ9；Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ9Ｒ9a）；Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ9Ｒ9a）；Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ9Ｒ9a）；Ｓ（Ｏ）2Ｒ9；Ｓ（Ｏ）Ｒ9；Ｎ（Ｒ9）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ9aＲ9b）；ＳＲ9；Ｎ（Ｒ9Ｒ9a）；ＮＯ2；ＯＣ（Ｏ）Ｒ9；Ｎ（Ｒ9）Ｃ（Ｏ）Ｒ9a；Ｎ（Ｒ9）Ｓ（Ｏ）2Ｒ9a；Ｎ（Ｒ9）Ｓ（Ｏ）Ｒ9a；Ｎ（Ｒ9）Ｃ（Ｏ）ＯＲ9a；Ｎ（Ｒ9）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ9aＲ9b）；ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ9Ｒ9a）；Ｔ；Ｃ1-50アルキル；Ｃ2-50アルケニル；又はＣ2-50アルキニルからなる群より独立して選ばれ、ここにおいてＴ；Ｃ1-50アルキル；Ｃ2-50アルケニル；及びＣ2-50アルキニルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のＲ10で場合により置換されており、そしてＣ1-50アルキル；Ｃ2-50アルケニル；及びＣ2-50アルキニルは、Ｔ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11）−；−Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ11）−；−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11）−；−Ｓ（Ｏ）2−；−Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ11）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ11a）−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｒ11）−；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ11−；−Ｎ（Ｒ11）Ｃ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ11）Ｓ（Ｏ）2−；−Ｎ（Ｒ11）Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ11）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ11）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11a）−；及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11Ｒ11a）−からなる群より選ばれる１つ又はそれ以上の基によって場合により中断されており；
Ｒ9、Ｒ9a、Ｒ9bは、Ｈ；Ｔ；及びＣ1-50アルキル；Ｃ2-50アルケニル；又はＣ2-50アルキニルからなる群より独立して選ばれ、ここにおいてＴ；Ｃ1-50アルキル；Ｃ2-50アルケニル；及びＣ2-50アルキニルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のＲ10で場合により置換されており、そしてＣ1-50アルキル；Ｃ2-50アルケニル；及びＣ2-50アルキニルは、Ｔ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11）−；−Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ11）−；−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11）−；−Ｓ（Ｏ）2−；−Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ11）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ11a）−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｒ11）−；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ11−；−Ｎ（Ｒ11）Ｃ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ11）Ｓ（Ｏ）2−；−Ｎ（Ｒ11）Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ11）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ11）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11a）−；及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11Ｒ11a）−からなる群より選ばれる１つ又はそれ以上の基によって場合により中断されており；
Ｔは、フェニル；ナフチル；インデニル；インダニル；テトラリニル；Ｃ3-10シクロアルキル；４〜７員ヘテロシクリル；又は９〜１１員ヘテロビシクリルからなる群より選ばれ、ここにおいて、Ｔは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のＲ10で場合により置換されており；
Ｒ10は、ハロゲン；ＣＮ；オキソ（＝Ｏ）；ＣＯＯＲ12；ＯＲ12；Ｃ（Ｏ）Ｒ12；Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ12Ｒ12a）；Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ12Ｒ12a）；Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ12Ｒ12a）；Ｓ（Ｏ）2Ｒ12；Ｓ（Ｏ）Ｒ12；Ｎ（Ｒ12）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ12aＲ12b）；ＳＲ12；Ｎ（Ｒ12Ｒ12a）；ＮＯ2；ＯＣ（Ｏ）Ｒ12；Ｎ（Ｒ12）Ｃ（Ｏ）Ｒ12a；Ｎ（Ｒ12）Ｓ（Ｏ）2Ｒ12a；Ｎ（Ｒ12）Ｓ（Ｏ）Ｒ12a；Ｎ（Ｒ12）Ｃ（Ｏ）ＯＲ12a；Ｎ（Ｒ12）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ12aＲ12b）；ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ12Ｒ12a）；又はＣ1-6アルキルであり、ここにおいて、Ｃ1-6アルキルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のハロゲンで場合により置換されており；
Ｒ11、Ｒ11a、Ｒ12、Ｒ12a、Ｒ12bは、Ｈ；又はＣ1-6アルキルからなる群より独立して選ばれ、ここにおいて、Ｃ1-6アルキルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のハロゲンで場合により置換されている。
【０１０９】
「中断された」という用語は、２個の炭素間に又は炭素と水素との間の炭素鎖の末端に基が挿入されることを意味する。
【０１１０】
Ｌ2は、単化学結合又はスペーサーである。Ｌ2がスペーサーである場合、上に定義された１つ又はそれ以上の場合による置換基として定義されることが好ましいが、但し、Ｌ2はＺで置換される。
【０１１１】
従って、Ｌ2が単化学結合とは異なるとき、Ｌ2−Ｚは、ＣＯＯＲ9；ＯＲ9；Ｃ（Ｏ）Ｒ9；Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ9Ｒ9a）；Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ9Ｒ9a）；Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ9Ｒ9a）；Ｓ（Ｏ）2Ｒ9；Ｓ（Ｏ）Ｒ9；Ｎ（Ｒ9）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ9aＲ9b）；ＳＲ9；Ｎ（Ｒ9Ｒ9a）；ＯＣ（Ｏ）Ｒ9；Ｎ（Ｒ9）Ｃ（Ｏ）Ｒ9a；Ｎ（Ｒ9）Ｓ（Ｏ）2Ｒ9a；Ｎ（Ｒ9）Ｓ（Ｏ）Ｒ9a；Ｎ（Ｒ9）Ｃ（Ｏ）ＯＲ9a；Ｎ（Ｒ9）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ9aＲ9b）；ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ9Ｒ9a）；Ｔ；Ｃ1-50アルキル；Ｃ2-50アルケニル；又はＣ2-50アルキニルであり、ここにおいてＴ；Ｃ1-50アルキル；Ｃ2-50アルケニル；及びＣ2-50アルキニルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のＲ10で場合により置換されており、そしてＣ1-50アルキル；Ｃ2-50アルケニル；及びＣ2-50アルキニルは、−Ｔ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11）−；−Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ11）−；−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11）−；−Ｓ（Ｏ）2−；−Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ11）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ11a）−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｒ11）−；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ11−；−Ｎ（Ｒ11）Ｃ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ11）Ｓ（Ｏ）2−；−Ｎ（Ｒ11）Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ11）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ11）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11a）−；及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11Ｒ11a）からなる群より選ばれる１つ又はそれ以上の基によって場合により中断されており；
Ｒ9、Ｒ9a、Ｒ9bは、Ｈ；Ｚ；Ｔ；及びＣ1-50アルキル；Ｃ2-50アルケニル；又はＣ2-50アルキニルからなる群より独立して選ばれ、ここにおいてＴ；Ｃ1-50アルキル；Ｃ2-50アルケニル；及びＣ2-50アルキニルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のＲ10で場合に
より置換されており、そしてＣ1-50アルキル；Ｃ2-50アルケニル；及びＣ2-50アルキニルは、Ｔ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11）−；−Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ11）−；−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11）−；−Ｓ（Ｏ）2−；−Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ11）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ11a）−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｒ11）−；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ11−；−Ｎ（Ｒ11）Ｃ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ11）Ｓ（Ｏ）2−；−Ｎ（Ｒ11）Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ11）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ11）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11a）−；及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ11Ｒ11a）からなる群より選ばれる１つ又はそれ以上の基によって場合により中断されており；
Ｔは、フェニル；ナフチル；インデニル；インダニル；テトラリニル；Ｃ3-10シクロアルキル；４〜７員ヘテロシクリル；又は９〜１１員ヘテロビシクリルからなる群より選ばれ、ここにおいてｔは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のＲ10で場合により置換されており；
Ｒ10は、Ｚ；ハロゲン；ＣＮ；オキソ（＝Ｏ）；ＣＯＯＲ12；ＯＲ12；Ｃ（Ｏ）Ｒ12；Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ12Ｒ12a）；Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ12Ｒ12a）；Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ12Ｒ12a）；Ｓ（Ｏ）2Ｒ12；Ｓ（Ｏ）Ｒ12；Ｎ（Ｒ12）Ｓ（Ｏ）2Ｎ（Ｒ12aＲ12b）；ＳＲ12；Ｎ（Ｒ12Ｒ12a）；ＮＯ2；ＯＣ（Ｏ）Ｒ12；Ｎ（Ｒ12）Ｃ（Ｏ）Ｒ12a；Ｎ（Ｒ12）Ｓ（Ｏ）2Ｒ12a；Ｎ（Ｒ12）Ｓ（Ｏ）Ｒ12a；Ｎ（Ｒ12）Ｃ（Ｏ）ＯＲ12a；Ｎ（Ｒ12）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ12aＲ12b）；ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ12Ｒ12a）；又はＣ1-6アルキルであり、ここにおいてＣ1-6アルキルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のハロゲンで場合により置換されており；
Ｒ11、Ｒ11a、Ｒ12、Ｒ12a、Ｒ12bは、Ｈ；Ｚ；又はＣ1-6アルキルからなる群より独立して選ばれ、ここにおいてＣ1-6アルキルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のハロゲンで場合により置換されており；
但し、Ｒ9、Ｒ9a、Ｒ9b、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ11a、Ｒ12、Ｒ12a、Ｒ12bの１つだけがＺである。
【０１１２】
より好ましくは、Ｌ2は、Ｃ1-20アルキル鎖であり、これは、−Ｏ−；及びＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ3aa）から独立して選ばれる１つ又はそれ以上の基によって場合により中断されており；ＯＨ；及びＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ3aaＲ3aaa）から独立して選ばれる１つ又はそれ以上の基で場合により置換されており；そして、ここにおいてＲ3aa、Ｒ3aaaは、Ｈ；及びＣ1-4アルキルからなる群より独立して選ばれる。
【０１１３】
好ましくは、Ｌ2は１４ｇ／ｍｏｌから７５０ｇ／ｍｏｌまでの範囲の分子量を有する。
【０１１４】
好ましくは、Ｌ2は、
【化４】
0005932796.tif 000005
から選ばれる末端基を介してＺに結合される。
【０１１５】
さらにまた、Ｌ2がこのような末端基を有する場合、Ｌ2がこのような末端基なしで算出された１４ｇ／ｍｏｌから５００ｇ／ｍｏｌまでの範囲の分子量を有することが好ましい。
【０１１６】
好ましくは、リンカーとヒドロゲルＺとの間に形成された共有結合は、永続的結合である。
【０１１７】
好ましくは、ヒドロゲルＺは、生分解性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースの水不溶性ヒドロゲルである。本明細書において理解される「ＰＥＧベースの」という用語は、ヒドロゲル中のＰＥＧ鎖の質量比がヒドロゲルの全質量に基づいて少なくとも１０質量％、好ましくは少なくとも２５％であることを意味する。残りは、他のスペーサー及び／又はオリゴマー又はポリマー、例えばオリゴ−又はポリリシンで構成することができる。
【０１１８】
さらに、「水不溶性」という用語は、ヒドロゲルを形成する膨潤可能な三次元的に架橋された分子ネットワークのことである。ヒドロゲルは、大過剰の水又は生理学的浸透圧の水性バッファー中に懸濁された場合、例えば質量基準当たり質量において１０倍までの実質的な量の水を取り込み、そのため膨潤可能であるが、過剰の水を除去した後でも、ゲルの物理的安定性及び形状を保持している。このような形状は、あらゆる幾何学的形状であってもよく、そしてこのような独特のヒドロゲル物体は、各成分が化学結合を通してそれぞれ他の成分に結合された成分からなる単一分子とみなすべきであることが理解される。
【０１１９】
本発明によれば、ヒドロゲルは、加水分解により分解可能な結合によって相互結合された骨格鎖部分で構成することができる。好ましくは、ＰＥＧベースのヒドロゲルは、骨格鎖部分を含む。
【０１２０】
好ましくは、Ｌ2は骨格鎖部分に結合される。
【０１２１】
好ましくは、骨格鎖部分は、１ｋＤａから２０ｋＤａまで、より好ましくは１ｋＤａから１５ｋＤａまで、そしてさらにより好ましくは１ｋＤａから１０ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。また、骨格鎖部分は、１つ又はそれ以上のＰＥＧ鎖を含むＰＥＧベースであることが好ましい。
【０１２２】
本発明によるエキセンジン−リンカー複合体を担持しているヒドロゲルにおいて、骨格鎖部分は、相互結合した生分解性官能基及びヒドロゲル結合薬物−リンカー複合体、並びに場合によりキャッピング基を含む多くの官能基を特徴とする。これは、骨格鎖部分が、多くのヒドロゲル結合薬物−リンカー複合体；生分解性相互結合官能基を含む官能基；及び場合によりキャッピング基を特徴とすることを意味する。好ましくは、相互結合生分解性官能基及び薬物−リンカー複合体及びキャッピング基の合計は、１６〜１２８個、好ましく２０〜１００個、より好ましくは２４〜８０個、そして最も好ましくは３０〜６０個である。
【０１２３】
好ましくは、相互結合官能基及びヒドロゲル結合薬物−リンカー複合体及び骨格鎖部分のキャッピング基の合計は、分枝コアから延びたＰＥＧベースのポリマー鎖の数によって等しく分割される。例えば、３２個の相互結合官能基及びヒドロゲル結合薬物−リンカー複合体及びキャッピング基がある場合、８個の基は、核から延びた４本のＰＥＧベースのポリマー鎖のそれぞれによって、好ましくは各ＰＥＧベースのポリマー鎖の末端に結合された樹枝状部分によって提供されてもよい。代わりに、４個の基が、核から延びた８本のＰＥＧベースのポリマー鎖のそれぞれによって、又は２個の基が１６本のＰＥＧベースのポリマー鎖のそれぞれによって提供されてもよい。分枝コアから延びたＰＥＧベースのポリマー鎖の数が等しく分配することができない場合、ＰＥＧベースのポリマー鎖当たりの相互結合官能基及びヒドロゲル結合薬物−リンカー複合体及びキャッピング基の合計の平均数からの偏差を最小に保つことが好ましい。
【０１２４】
本発明によるこのような担体結合プロドラッグでは、有意量の骨格鎖部分の放出（＜１０％）が行われる前に、ほとんどすべての薬物放出（＞９０％）が起こっていることが望ましい。これは、本発明によるヒドロゲルの分解速度に対する担体結合プロドラッグの半減期を調整することによって達成することができる。
【０１２５】
優先的に、骨格鎖部分は、少なくとも３本のＰＥＧベースのポリマー鎖が延びた分枝コアを有することを特徴とする。従って、本発明の好ましい態様において、骨格鎖試薬は、少なくとも３本のＰＥＧベースのポリマー鎖が延びた分枝コアを含む。このような分枝コアは、結合形態においてポリ−若しくはオリゴアルコール、好ましくはペンタエリスリトール、トリペンタエリスリトール、ヘキサグリセリン、スクロース、ソルビトール、フルクトース、マンニトール、グルコース、セルロース、アミロース、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン、ポリビニルアルコール、デキストラン、ヒアルロナンを含んでもよく、又は分枝コアは、結合形態においてポリ−若しくはオリゴアミン、例えばオルニチン、ジアミノ酪酸、トリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン、オクタリシン、ノナリシン、デカリシン、ウンデカリシン、ドデカリシン、トリデカリシン、テトラデカリシン、ペンタデカリシン又はオリゴリシン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミンを含んでもよい。
【０１２６】
好ましくは、分枝コアは、３〜１６本、より好ましくは４〜８本のＰＥＧベースのポリマー鎖を延ばしている。好ましい分枝コアは、結合形態においてペンタエリスリトール、オルニチン、ジアミノ酪酸、トリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン又はオリゴリシン、低分子量ＰＥＩ、ヘキサグリセリン、トリペンタエリスリトールを含んでもよい。好ましくは、分枝コアは、３〜１６本、より好ましくは４〜８本のＰＥＧベースのポリマー鎖を延ばしている。好ましくは、ＰＥＧベースのポリマー鎖は、そのうちの一方の末端が分枝コア、そしてもう一方が超分枝樹枝状部分に結合している、線状ポリ（エチレングリコール）鎖である。ポリマーＰＥＧベースの鎖は、ヘテロ原子及び化学官能基で場合により置換されたアルキル又はアリール基によって終結又は中断されてもよいことが理解される。
【０１２７】
好ましくは、ＰＥＧベースのポリマー鎖は、適切に置換されたポリエチレングリコール誘導体（ＰＥＧベース）である。
【０１２８】
骨格鎖部分に含まれる分枝コアから延びた対応するＰＥＧベースのポリマー鎖の好ましい構造は、例えば、JenKem Technology、米国（２００９年７月２８日にwww.jenkemusa.comからダウンロードによってアクセスされた）の製品リストに詳述されたようなマルチアーム（multi-arm）ＰＥＧ誘導体、４ＡＲＭ−ＰＥＧ誘導体（ペンタエリスリトール核）、８ＡＲＭ−ＰＥＧ誘導体（ヘキサグリセリン核）及び８ＡＲＭ−ＰＥＧ誘導体（トリペンタエリスリトール核）である。最も好ましいのは、４アームＰＥＧアミン（ペンタエリスリトール核）及び４アームＰＥＧカルボキシル（ペンタエリスリトール核）、８アームＰＥＧアミン（ヘキサグリセリン核）、８アームＰＥＧカルボキシル（ヘキサグリセリン核）、８アームＰＥＧアミン（トリペンタエリスリトール核）及び８アームＰＥＧカルボキシル（トリペンタエリスリトール核）である。骨格鎖部分中のこのようなマルチアームＰＥＧ誘導体の好ましい分子量は、１ｋＤａ〜２０ｋＤａ、より好ましくは１ｋＤａ〜１５ｋＤａ、そしてさらにより好ましくは１ｋＤａ〜１０ｋＤａである。
【０１２９】
上記のマルチアーム分子の末端アミン基は、骨格鎖部分に結合形態で存在し、骨格鎖部分のさらに相互結合された官能基及び反応性官能基を提供することが理解される。
【０１３０】
相互結合官能基及び骨格鎖部分の反応性官能基の合計は、分枝コアから延びたＰＥＧベースのポリマー鎖の数によって等しく分割されることが好ましい。分枝コアから延びたＰＥＧベースのポリマー鎖の数が等しく分配することができない場合、ＰＥＧベースのポリマー鎖当たりの相互結合官能基及び反応性官能基の合計の平均数からの偏差が最小に保たれることが好ましい。
【０１３１】
より好ましくは、骨格鎖部分の相互結合官能基及び反応性官能基の合計は、分枝コアから延びたＰＥＧベースのポリマー鎖の数によって等しく分割される。例えば、３２個の相互結合官能基及び反応性官能基がある場合、８個の基は、核から延びた４本のＰＥＧベースのポリマー鎖のそれぞれによって、好ましくは各ＰＥＧベースのポリマー鎖の末端に結合された樹枝状部分によって提供されてもよい。代わりに、４個の基が、核から延びた８本のＰＥＧベースのポリマー鎖のそれぞれによって、又は２個の基が１６本のＰＥＧベースのポリマー鎖のそれぞれによって提供されてもよい。
【０１３２】
このようなさらなる官能基は、樹枝状部分によって提供されてもよい。好ましくは、各樹枝状部分は、０．４ｋＤａから４ｋＤａまで、より好ましくは０．４ｋＤａ〜２ｋＤａの範囲の分子量を有する。好ましくは、各樹枝状部分は、少なくとも３個の分枝及び少なくとも４個の反応性官能基、そして多くとも６３個の分枝及び６４個の反応性官能基、好ましくは、少なくとも７個の分枝及び少なくとも８個の反応性官能基、そして多くとも３１個の分枝及び３２個の反応性官能基を有する。
【０１３３】
このような樹枝状部分の例には、結合形態においてトリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン、オクタリシン、ノナリシン、デカリシン、ウンデカリシン、ドデカリシン、トリデカリシン、テトラデカリシン、ペンタデカリシン、ヘキサデカリシン、ヘプタデカリシン、オクタデカリシン、ノナデカリシンが含まれる。このような好ましい樹枝状部分の例には、結合形態においてトリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン、最も好ましくは、結合形態においてトリリシン、ペンタリシン又はヘプタリシン、オルニチン、ジアミノ酪酸が含まれる。
【０１３４】
最も好ましくは、本発明のヒドロゲル担体は、骨格鎖部分が式Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）4の第四級炭素を有し、ここにおいて各Ａは、独立して永続的共有結合によって第四級炭素に末端結合されたポリ（エチレングリコール）ベースのポリマー鎖であり、そしてＰＥＧベースのポリマー鎖の遠位末端は、樹枝状部分Ｈｙｐに共有結合されており、各樹枝状部分Ｈｙｐは、相互結合官能基及び反応性官能基を表す少なくとも４個の官能基を有することを特徴とする。
【０１３５】
好ましくは、各Ａは、式−（ＣＨ2）n1（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＸ−から独立して選ばれ、ここにおいて、ｎ１は１又は２であり；ｎは５から５０までの範囲の整数であり；そしてＸはＡ及びＨｙｐを共有結合している化学官能基である。
【０１３６】
好ましくは、Ａ及びＨｙｐは、アミド結合によって共有結合される。
【０１３７】
好ましくは、樹枝状部分Ｈｙｐは、超分枝ポリペプチドである。好ましくは、超分枝ポリペプチドは、結合形態においてリシンを含む。好ましくは、各樹枝状部分Ｈｙｐは、０．４ｋＤａから４ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。骨格鎖部分Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）4は、同一又は異なる樹枝状部分Ｈｙｐからなることができ、そして各Ｈｙｐは、独立して選ぶことができることが理解される。各部分Ｈｙｐは、５〜３２個のリシン、好ましくは少なくとも７個のリシンからなり、すなわち、各部分Ｈｙｐは、結合形態において５〜３２個のリシン、好ましくは結合形態において少なくとも７個のリシンを含む。最も好ましくは、Ｈｙｐはヘプタリシニルを含む。
【０１３８】
重合性官能基と骨格鎖試薬との反応、より具体的にはＨｙｐとポリエチレングリオールベースのクロスリンカー試薬の重合性官能基との反応は、永続的アミド結合を生じる。
【０１３９】
好ましくは、Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）4は、１ｋＤａから２０ｋＤａまで、より好ましくは１ｋＤａ〜１５ｋＤａ、そしてさらにより好ましくは１ｋＤａ〜１０ｋＤａの反応の分子量を有する。
【０１４０】
１つの好ましい骨格鎖部分を以下：
【化５】
0005932796.tif 000006
に示し、点線は、クロスリンカー部分への生分解性結合を相互結合していることを示し、そしてｎは５から５０の整数である。
【０１４１】
本発明によるヒドロゲルの生分解性は、加水分解により分解可能な結合の導入によって達成される。
【０１４２】
「加水分解により分解可能な」、「生分解性の（biodegradable）」又は「加水分解により切断可能な」、「自動切断可能な（auto-cleavable）」、若しくは「自己切断（self-cleavage）」、「自己切断可能な」、「一過性」又は「一時的な」という用語は、本発明に関して、１時間から３ヵ月までの範囲の半減期を有し、生理学的条件（ｐＨ７．４、３７℃の水性バッファー）下で非酵素的加水分解により分解可能又は切断可能である結合（bonds）及び結合（linkages）のことであり、アコニチル、アセタール、アミド、カルボン無水物、エステル、イミン、ヒドラゾン、マレアミド酸アミド、オルトエステル、ホスファミド、リン酸エステル、ホスホシリルエステル、シリルエステル、スルホンエステル、芳香族カルバメート、それらの組み合わせ、及び同様ものが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１４３】
本発明によるヒドロゲル中に分解可能な相互結合官能基として存在する場合、好ましい生分解性結合は、カルボン酸エステル、カーボネート、リン酸エステル及びスルホン酸エステルであり、そして最も好ましいのは、カルボン酸エステル又はカーボネートである。
【０１４４】
永続的結合は、例えば、アミドのように６カ月又はそれより長い半減期を有し、生理学的条件（ｐＨ７．４、３７℃の水性バッファー）下で非酵素的加水分解により分解可能である。
【０１４５】
加水分解により切断可能な結合を本発明のヒドロゲル担体に導入するために、骨格鎖部分を生分解性結合によって相互に直接結合することができる。
【０１４６】
一実施態様において、生分解性ヒドロゲル担体の骨格鎖部分は、直接、すなわちクロスリンカー部分なしで一緒に結合してもよい。このような生分解性ヒドロゲルの２つの骨格鎖部分の超分枝樹枝状部分は、いずれも、２つの超分枝樹枝状部分を結合する相互結合官能基を通して直接結合してもよい。代わりに、２つの異なる骨格鎖部分の２つの超分枝樹枝状部分は、骨格鎖部分に結合された２つのスペーサー部分を通して相互結合してもよく、そしてもう一方の側では、相互結合官能基によって隔てられた架橋部分に結合している。
【０１４７】
代わりに、骨格鎖部分がクロスリンカー部分を通して一緒に結合してもよく、各クロスリンカー部分は、少なくとも２つの加水分解により分解可能な結合によって終結される。終端の分解可能な結合に加えて、クロスリンカー部分は、さらに生分解性結合を含んでもよい。従って、骨格鎖部分に結合されたクロスリンカー部分の各末端は、加水分解により分解可能な結合を含み、そしてさらなる生分解性結合が場合によりクロスリンカー部分に存在してもよい。
【０１４８】
好ましくは、生分解性ヒドロゲル担体は、加水分解により分解可能な結合によって相互結合された骨格鎖部分で構成され、そして骨格鎖部分は、クロスリンカー部分を通して一緒に連結される。
【０１４９】
生分解性ヒドロゲル担体は、１つ又はそれ以上の異なるタイプの、好ましくは１つのクロスリンカー部分を含んでもよい。クロスリンカー部分は、線状又は分枝分子であってもよく、そして好ましくは線状分子である。本発明の好ましい実施態様において、クロスリンカー部分は、少なくとも２つの生分解性結合によって骨格鎖部分に結合される。
【０１５０】
好ましくは、クロスリンカー部分は、６０ｄａから５ｋＤａまで、より好ましくは０．５ｋＤａから４ｋＤａまで、さらにより好ましくは１ｋＤａから４ｋＤａまで、さらにより好ましくは１ｋＤａから３ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。一実施態様において、クロスリンカー部分は、ポリマーからなる。
【０１５１】
オリゴマー又はポリマー架橋部分に加えて、特に本発明による生分解性ヒドロゲルの形成のため親水性高分子量骨格鎖部分を用いるときは、低分子量架橋部分を用いてもよい。
【０１５２】
好ましくは、ポリ（エチレングリコール）ベースのクロスリンカー部分は、エチレングリコール単位を含み、場合によりさらなる化学官能基を含む炭化水素鎖であり、ここにおいて、ポリ（エチレングリコール）ベースのクロスリンカー部分は、少なくともそれぞれｍ個のエチレングリコール単位を含み、ここにおいて、ｍは３から１００まで、好ましくは１０から７０までの範囲の整数である。好ましくは、ポリベースの（エチレングリコール）クロスリンカー部分は、０．５ｋＤａから５ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。
【０１５３】
クロスリンカー部分又は分枝コアに結合されたＰＥＧベースのポリマー鎖の表示に用いる場合、「ＰＥＧベースの」という用語は、少なくとも２０質量％のエチレングリコール部分を含むクロスリンカー部分又はＰＥＧベースのポリマー鎖のことである。
【０１５４】
一実施態様において、ポリマークロスリンカー部分を構成するモノマーは、生分解性結合によって結合されている。このようなポリマークロスリンカー部分は、クロスリンカー部分の分子量及びモノマー単位の分子量に応じて１００個までの又はそれ以上の生分解性結合を含んでもよい。このようなクロスリンカー部分の例は、ポリ（乳酸）又はポリ（グリコール酸）ベースのポリマーである。このようなポリ（乳酸）又はポリ（グリコール酸）鎖は、アルキル又はアリール基によって終結又は中断されてもよく、そしてそれらはヘテロ原子及び化学官能基で場合により置換されてもよいことが理解される。
【０１５５】
好ましくは、クロスリンカー部分はＰＥＧベースであり、好ましくは、１つのＰＥＧベースの分子鎖によってのみ表される。好ましくは、ポリベースの（エチレングリコール）クロスリンカー部分は、エチレングリコール単位を含み、場合によりさらなる化学官能基を含む炭化水素鎖であり、ここにおいて、ポリ（エチレングリコール）ベースのクロスリンカー部分は、少なくともそれぞれｍ個のエチレングリコール単位を含み、ここにおいて、ｍは、３から１００まで、好ましくは１０から７０までの範囲の整数である。好ましくは、ポリ（エチレングリコール）ベースのクロスリンカー部分は、０．５ｋＤａから５ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。
【０１５６】
本発明の好ましい実施態様において、クロスリンカー部分はＰＥＧからなり、これは、永続的なアミド結合を通して超分枝樹枝状部分に結合された骨格鎖部分によって提供される２つのアルファ、オメガ−脂肪族ジカルボン酸スペーサーにエステル結合を介して対称的に結合されている。
【０１５７】
骨格鎖部分に及びもう一方の側に結合されたスペーサー部分のジカルボン酸は、３〜１２個の炭素原子、最も好ましくは５〜８個の炭素原子からなり、そして１つ又はそれ以上の炭素原子において置換されてもよい架橋部分に結合されている。好ましい置換基は、アルキル基、ヒドロキシル基又はアミド基又は置換されたアミノ基である。脂肪族ジカルボン酸のメチレン基の１つ又はそれ以上は、Ｏ又はＮＨ又はアルキル置換されたＮによって場合により置換されてもよい。好ましいアルキルは、１〜６個の炭素原子を有する線状又は分枝アルキルである。
【０１５８】
好ましくは、超分枝樹枝状部分と骨格鎖部分とに結合されたスペーサー部分との間には永続的なアミド結合があり、そしてもう一方の側では架橋部分に結合されている。
【０１５９】
１つの好ましいクロスリンカー部分を以下：
【化６】
0005932796.tif 000007
（式中、ｎは５から５０の整数である）
に示し；点線は、骨格鎖部分に相互結合された生分解性結合を示す。
【０１６０】
好ましくは、ヒドロゲル担体は、加水分解により分解可能な結合によって相互結合された骨格鎖部分で構成される。
【０１６１】
より好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：
【化７】
0005932796.tif 000008
（式中、点線は骨格鎖部分の残りへの結合を示す）
の分枝コアを含む。
【０１６２】
より好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：
【化８】
0005932796.tif 000009
（式中、ｎは５から５０の整数であり、そして点線は骨格鎖部分の残りへの結合を示す）の構造を含む。
【０１６３】
好ましくは、骨格鎖部分は、超分枝部分Ｈｙｐを含む。
【０１６４】
より好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：
【化９】
0005932796.tif 000010
（式中、点線は分子の残りへの結合を示し、そしてアスタリスクでマークされた炭素原子はＳ−配置を示す）
の超分枝部分Ｈｙｐを含む。
【０１６５】
好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：
【化１０】
0005932796.tif 000011
（式中、点線の１つは超分枝部分Ｈｙｐへの結合を示し、そして第２の点線は残りの分子への結合を示し；そして
ｍは２から４の整数である）
の少なくとも１つのスペーサーに結合している。
【０１６６】
好ましくは、骨格鎖部分は、以下の構造
【化１１】
0005932796.tif 000012
（式中、ｑは３から１００まで、好ましくは５から５０の整数である）
を有するクロスリンカー部分を通して一緒に連結される。
【０１６７】
本発明のヒドロゲルプロドラッグでは、骨格鎖部分とクロスリンカー部分との間の生分解性結合の加水分解速度は、ＰＥＧ−エステルカルボキシ基に隣接して結合された原子の数及びタイプによって影響を受けるか又は決定される。例えば、ＰＥＧエステル形成に関してコハク酸、脂肪酸又はグルタル酸を選択することによって本発明による生分解性ヒドロゲル担体の分解半減期を変えることは可能である。
【０１６８】
好ましくは、Ｌ2は、オリゴエチレングリコール鎖のようなスペーサーを通してヒドロゲルの骨格鎖部分にさらに結合されたチオスクシンイミド基を通してＺに結合されている。好ましくは、骨格鎖部分へのこのスペーサー鎖の結合は、永続的な結合、好ましくはアミド結合である。
【０１６９】
本発明によるヒドロゲルの生分解性は、加水分解により分解可能な結合の導入によって達成される。
【０１７０】
相互結合官能基について、「加水分解により分解可能である」という用語は、本発明に関して、１時間から３ヵ月までの範囲の半減期を有し、生理学的条件（ｐＨ７．４、３７℃の水性バッファー）下で非酵素的加水分解により分解可能である結合のことであり、アコニチル、アセタール、カルボン無水物、エステル、イミン、ヒドラゾン、マレアミド酸アミド、オルトエステル、ホスファミド、リン酸エステル、ホスホシリルエステル、シリルエステル、スルホン酸エステル、芳香族カルバメート、それらの組み合わせ及び同様のものが含まれるが、それらに限定されるわけではない。好ましい生分解性結合は、カルボン酸エステル、カーボネート、リン酸エステル及びスルホン酸エステルであり、そして最も好ましいのは、カルボン酸エステル又はカーボネートである。インビトロ研究では、例えば、ｐＨ９、３７℃、水性バッファーのような加速条件を実際的に用いてもよいことが理解される。
【０１７１】
永続的な結合は、例えば、アミドのように、６カ月又はそれより長い半減期を有し、生理学的条件（ｐＨ７．４、３７℃の水性バッファー）下で非酵素的加水分解により分解可能である。
【０１７２】
本発明による生分解性ヒドロゲル担体の分解は、多数の分解可能な結合が切断されて水溶性又は水不溶性でありうる分解生成物を生じる多段階反応である。しかし、水不溶性分解生成物は、切断されて水溶性分解生成物が得られるように分解可能な結合をさらに含んでもよい。これらの水溶性分解生成物は、１つ又はそれ以上の骨格鎖部分を含んでもよい。放出された骨格鎖部分は、例えば、スペーサー又はブロック若しくはリンカー基又は親和性基（affinity groups）及び／又はプロドラッグリンカー分解生成物に永続的に結合されてもよく、そしてまた、水溶性分解生成物は、分解可能な結合を含んでもよいことが理解される。
【０１７３】
分枝コア、ＰＥＧベースのポリマー鎖、超分枝樹枝状部分及び超分枝樹枝状部分に結合された部分の構造は、本発明のヒドロゲル担体を扱う段落に記載された対応する説明から推測することができる。分解物の構造は、分解を受ける本発明によるヒドロゲルのタイプに左右されることが理解される。
【０１７４】
骨格鎖部分の総量は、本発明によるヒドロゲルが完全に分解した後、そして分解中に溶液中で測定することができ、可溶性の骨格鎖分解生成物の画分は、本発明による不溶性ヒドロゲルから分離することができ、そして本発明によるヒドロゲルから放出された他の可溶性分解生成物からの干渉なしに定量化することができる。本発明によるヒドロゲル物体は、沈降又は遠心分離によって生理学的浸透圧のバッファーの過剰の水から分離してもよい。遠心分離は、上澄みが本発明による膨潤したヒドロゲルの体積の少なくとも１０％になるようなやり方で実施してもよい。可溶性のヒドロゲル分解生成物は、このような沈降又は遠心分離工程後に水性上澄み中に残り、そして１つ又はそれ以上の骨格鎖部分を含む水溶性分解生成物は、このような上澄みのアリコートを適切な分離及び／又は分析方法にかけることによって検出可能である。
【０１７５】
好ましくは、水溶性分解生成物は、０．４５μｍフィルターを通した濾過によって水不溶性分解生成物から分離してもよく、その後、水溶性分解生成物は、フロースルー（flow-through）中に見出すことができる。また、水溶性分解生成物は、遠心分離及び濾過工程の組み合わせによって水不溶性分解生成物から分離してもよい。
【０１７６】
例えば骨格鎖部分は、他の分解生成物がＵＶ吸収を示さない波長でＵＶ吸収を示す基を担持してもよい。このような選択的ＵＶ吸収基は、アミド結合のような骨格鎖部分の構成成分であってもよく又はインドイル基のような芳香環系によってその反応性官能基に結合することによって骨格鎖に導入してもよい。
【０１７７】
本発明によるこのようなヒドロゲル結合エキセンジンプロドラッグにおいて、有意量の骨格鎖分解生成物（＜１０％）の放出が起こる前に、ほとんどすべてのエキセンジン放出（＞９０％）が起こることが望ましい。これは、ヒドロゲル分解速度に対してヒドロゲル結合エキセンジンプロドラッグの半減期を調整することによって達成することができる。
【０１７８】
好ましくは、エキセンジンプロドラッグＤ−Ｌは、Ｌが式（ＩＩ）
【化１２】
0005932796.tif 000013
（式中、点線は、アミド結合の形成によるエキセンジンの窒素、好ましくはＮ−末端窒素への結合を示し、そしてＺはヒドロゲルである）
によって表される構造を有する。
【０１７９】
好ましくは、式（ＩＩ）のヒドロゲルは、生分解性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースの水不溶性ヒドロゲルである。
【０１８０】
好ましくは、式（ＩＩ）のヒドロゲルは、加水分解により分解可能な結合によって相互結合された骨格鎖部分で構成される。
【０１８１】
より好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：
【化１３】
0005932796.tif 000014
（式中、点線は骨格鎖部分の残りへの結合を示す）
の分枝コアを含む。
【０１８２】
より好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：
【化１４】
0005932796.tif 000015
（式中、ｎは５から５０の整数であり、そして点線は分子の残りへの結合を示す）
の構造を含む。
【０１８３】
好ましくは、骨格鎖部分は、超分枝部分Ｈｙｐを含む。
【０１８４】
より好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：
【化１５】
0005932796.tif 000016
（式中、点線は残りの分子への結合を示し、そしてアスタリスクでマークされた炭素原子はＳ配置を示す）
の超分枝部分Ｈｙｐを含む。
【０１８５】
好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：
【化１６】
0005932796.tif 000017
（式中、点線の１つは、超分枝部分Ｈｙｐへの結合を示し、そして第２の点線は、分子の残りへの結合を示し；そして
ｍは２から４の整数である）
の少なくとも１つのスペーサーに結合している。
【０１８６】
好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：
【化１７】
0005932796.tif 000018
（式中、アスタリスクでマークされた点線は、ヒドロゲルとチオスクシンイミド基のＮとの間の結合を示し、
他の点線はＨｙｐへの結合を示し、そして
ｐは、０から１０の整数である）
の少なくとも１つのスペーサーに結合している。
【０１８７】
好ましくは、骨格鎖部分は、以下の構造
【化１８】
0005932796.tif 000019
（式中、ｑは３から１００の整数である）
を有するクロスリンカー部分を通して一緒に連結される。
【０１８８】
骨格鎖とクロスリンカー部分との間の生分解性結合の加水分解速度は、ＰＥＧ−エステルカルボキシ基に隣接して結合された原子の数及びタイプによって決定される。例えばＰＥＧエステル形成のためコハク酸、脂肪酸又はグルタル酸から選択することによってクロスリンカーの分解半減期を変えることが可能である。
【０１８９】
本発明のヒドロゲル結合したインスリンプロドラッグは、当分野で知られている都合のよい方法によって本発明のヒドロゲルから出発して製造することができる。いくつかの経路が存在することは、当業者には明らかである。例えば生物活性部分が共有結合された上記プロドラッグリンカーを、部分的に又は全体として活性部分を有する又はすでに担持している本発明のヒドロゲルの反応性官能基と反応させることができる。
【０１９０】
好ましい製造方法において、ヒドロゲルは、化学ライゲーション反応を通して生成される。ヒドロゲルは、縮合又は付加のような反応を受ける相補的な官能基を有する２つの巨大分子遊離体から形成してもよい。これらの出発物質の一方は、少なくとも２つの同一官能基を有するクロスリンカー試薬（crosslinker reagent）であり、そしてもう一方の出発物質は、ホモ多官能性骨格鎖試薬（homomultifunctional backbone reagent）である。クロスリンカー試薬に存在する適切な官能基としては、末端アミノ、カルボン酸及び誘導体、マレイミド並びにビニルスルホンのような他のアルファ、ベータ不飽和マイケル受容体、チオール、ヒドロキシル基が含まれる。骨格鎖試薬中に存在する適切な官能基としては、アミノ、カルボン酸及び誘導体、マレイミド並びにビニルスルホンのような他のアルファ、ベータ不飽和マイケル受容体、チオール、ヒドロキシル基が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１９１】
クロスリンカー試薬反応性官能基が骨格鎖反応性官能基に関して化学量論量未満で（substoichiometrically）用いられる場合、生成したヒドロゲルは、骨格鎖構造に結合された遊離反応性官能基と反応性のヒドロゲルである。
【０１９２】
場合により、プロドラッグリンカーをエキセンジンに最初に結合してもよく、次いで生成したエキセンジン−プロドラッグリンカー複合体をヒドロゲルの反応性官能基と反応させてもよい。別法として、プロドラッグリンカーの官能基の１つを活性化した後、リンカー−ヒドロゲル複合体を第２の反応工程でエキセンジンと接触させてもよく、そしてヒドロゲル結合プロドラッグリンカーにエキセンジンを結合した後、過剰のエキセンジンを濾過によって除去してもよい。
【０１９３】
本発明によるプロドラッグの好ましい製造方法は、以下の通りである：
骨格鎖試薬合成の好ましい出発物質は、４−アームＰＥＧテトラアミン又は８−アームＰＥＧオクタアミンであり、ＰＥＧ試薬は、２０００〜１００００ダルトン、最も好ましくは２０００〜５０００Ｄａの範囲の分子量を有する。このようなマルチアームＰＥＧ−誘導体に、リシン残基を逐次的にカップリングして超分枝骨格鎖試薬を形成する。リシンは、カップリング工程中に保護基によって部分的に又は完全に保護することができ、そしてまた、最終的な骨格鎖試薬は、保護基を含んでもよいことが理解される。好ましい構成ブロックは、ビス−ｂｏｃリシンである。別法として、リシン残基の逐次付加の代わりに、樹枝状ポリリシン部分を最初に構成し、その後、４−アームＰＥＧテトラアミン又は８−アームＰＥＧオクタアミンにカップリングさせてもよい。３２個のアミノ基を担持する骨格鎖試薬を得ることが望ましく、結果的に、７個のリシンを４−アームＰＥＧの各アームに結合させるか、又は５個のリシンを８−アームＰＥＧの各アームに結合させる。別の実施態様において、マルチアームＰＥＧ誘導体は、テトラ−又はオクタカルボキシＰＥＧである。この場合、樹枝状部分は、グルタル又はアスパラギン酸から生成してもよく、そして生成した骨格鎖試薬は、３２個のカルボキシ基を担持する。骨格鎖試薬の官能基のすべて又は一部は、塩として、遊離形態で存在するか、又は保護基に結合してもよいことが理解される。実際的な理由のため、ＰＥＧ−アーム当たりリシンの骨格鎖試薬の数は、６〜７個、より好ましくは約７個であることが理解される。
【０１９４】
好ましい骨格鎖試薬を以下に示す：
【０１９５】
【化１９】
0005932796.tif 000020
【０１９６】
クロスリンカー試薬の合成は、０．２〜５ｋＤａ、より好ましくは０．６〜２ｋＤａの範囲の分子量を有する線状ＰＥＧ鎖から開始され、これはアジピン酸又はグルタル酸のようなジカルボン酸の半エステルでエステル化されている。半エステル形成の好ましい保護基は、ベンジル基である。生成したビスジカルボン酸ＰＥＧ半エステルをアシルクロリド又は活性エステルのようなより反応性のカルボキシ化合物、例えばペンタフルオロフェニル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、最も好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに転換し、そのうちの好ましい選ばれた構造を以下に示す。
【０１９７】
【化２０】
0005932796.tif 000021
【０１９８】
別法として、ビスジカルボン酸ＰＥＧ半エステルをＤＣＣ又はＨＯＢｔ又はＰｙＢＯＰのようなカップリング剤の存在下で活性化してもよい。
【０１９９】
別の実施態様において、骨格鎖試薬は、カルボキシ基を担持し、そして対応するクロスリンカー試薬は、エステル含有アミノ末端ＰＥＧ鎖から選ばれる。
【０２００】
逆相乳化重合を用いて骨格鎖試薬及びクロスリンカー試薬を重合して本発明によるヒドロゲルを形成してもよい。骨格鎖とクロスリンカー官能基との間で所望の化学量論を選択した後、骨格鎖及びクロスリンカーをＤＭＳＯ中に溶解し、そして適当に選ばれたＨＬＢ値を有する適切なエマルゲーター（emulgator）、好ましくはArlacel P135を用い、機械的撹拌機を用いて撹拌速度を制御して逆エマルションを形成する。重合は、適切な塩基、好ましくはＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミンの添加によって開始する。適当な時間撹拌した後、酢酸のような酸及び水の添加によって反応をクエンチする。ビーズを集め、洗浄し、そして機械的篩分けによって粒径に従って分別する。場合により、この段階で保護基を除去してもよい。
【０２０１】
さらに、ヒドロゲルによって得られるのとは異なる反応性官能基を担持するスペーサーを用いて本発明によるこのようなヒドロゲルを官能化してもよい。例えば、Ｍａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳのような適切なヘテロ二官能性スペーサーをヒドロゲルにカップリングすることによってマレイミド反応性官能基をヒドロゲルに導入してもよい。このような官能化ヒドロゲルを、リンカー部分に反応性チオール基を担持するエキセンジン−リンカー試薬にさらに結合して、本発明によるヒドロゲル結合エキセンジンプロドラッグを形成することができる。
【０２０２】
エキセンジン−リンカー複合体を官能化マレイミド基含有ヒドロゲルに装填した後、すべての残っている官能基をメルカプトエタノールのような適切なブロッキング試薬でキャップ形成して望ましくない副反応を防止する。
【０２０３】
本発明の別の好ましい実施態様では、リンカー部分に結合された遊離チオール基を担持するエキセンジン−リンカー複合体を、ｐＨ５．５〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で、より好ましくは室温でマレイミド官能化ヒドロゲルと反応させる。その後、生成した薬物−リンカー−ヒドロゲル複合体をｐＨ５．５〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で、より好ましくは室温で、チオール基を含む低分子量の化合物、好ましくは３４〜５００Ｄａのチオール含有化合物、最も好ましくはメルカプトエタノールにより処理する。
【０２０４】
本発明の別の好ましい実施態様では、マレイミド基を担持するエキセンジン−リンカー複合体を、ｐＨ５．５〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で、より好ましくは室温で、本発明によるチオール官能化ヒドロゲルと反応させる。その後、対応する生成した薬物−リンカー−ヒドロゲル複合体をｐＨ５．５〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で、より好ましくは室温で、マレイミド基を含む低分子量化合物、好ましくは１００〜３００Ｄａのマレイミド含有化合物、例えばＮ−エチル−マレイミドにより処理する。
【０２０５】
本発明の別の態様は、
（ａ）マレイミド官能化ヒドロゲル微粒子を含む水性懸濁液を、ｐＨ５．５〜８の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で、Ｌ2*の化学官能基がチオール基を含む本発明のエキセンジン−リンカー試薬を含む溶液と接触させてエキセンジン−リンカー−ヒドロゲル複合体を生成させる工程；
（ｂ）場合により、工程（ａ）からのエキセンジン−リンカー−ヒドロゲル複合体をｐＨ５．５〜８の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で３４Ｄａ〜５００Ｄａのチオール含有化合物により処理する工程；
を含む方法である。
【０２０６】
本発明の別の態様は、
（ａ）チオール官能化ヒドロゲル微粒子を含む水性懸濁液を、ｐＨ５．５〜８の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で、Ｌ2*の化学官能基がマレイミド基を含む本発明のエキセンジン−リンカー試薬を含む溶液と接触させてエキセンジン−リンカー−ヒドロゲル複合体を生成させる工程；
（ｂ）場合により、工程（ａ）からのエキセンジン−リンカー−ヒドロゲル複合体をｐＨ５．５〜８の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で１００〜３００Ｄａのマレイミド含有化合物により処理する工程；
を含む方法である。
【０２０７】
本発明のプロドラッグの特に好ましい製造方法は、
（ａ）式Ｃ（Ａ'−Ｘ1）4（式中、Ａ'−Ｘ1はＨｙｐ又はＨｙｐの前駆体に結合する前のＡを表し、そしてＸ1は適切な官能基である）の化合物を、式Ｈｙｐ'−Ｘ2（式中、Ｈｙｐ'−Ｘ2はＡに結合する前のＨｙｐ又はＨｙｐの前駆体を表し、そしてＸ2はＸ1と反応する適切な官能基である）の化合物と反応させる工程；
（ｂ）場合により工程（ａ）から生成した化合物を１つ又はそれ以上のさらなる工程で反応させて少なくとも４つの官能基を有する式Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）4の化合物を得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）から生成した化合物の少なくとも４つの官能基をポリ（エチレングリオール）ベースのクロスリンカー前駆体と反応させ、ここにおいて、Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）4の反応性官能基の総数と比較してクロスリンカー前駆体の活性なエステル基を化学量論量未満の量で用いてヒドロゲルを得る工程；
（ｄ）工程（ｃ）のヒドロゲル骨格鎖中に残っている未反応の官能基（ヒドロゲル中に含まれる骨格鎖の反応性官能基を表す）を生物活性部分及び一過性プロドラッグリンカーの共有結合性複合体と反応させるか又は最初に未反応の官能基を一過性プロドラッグリンカー、続いて生物活性部分と反応させる工程；
（ｅ）場合により残っている未反応の官能基にキャップ形成して本発明のプロドラッグを得る工程；
を含む。
【０２０８】
具体的には、本発明のエキセンジンプロドラッグのヒドロゲルは、以下のように合成される：
バルク重合では、骨格鎖試薬及びクロスリンカー試薬をアミン／活性エステル２：１〜１．０５：１の比率で混合する。
【０２０９】
骨格鎖試薬及びクロスリンカー試薬の両方をＤＭＳＯ中に溶解して１００ｍＬ当たり５〜５０ｇ、好ましくは１００ｍｌ当たり７．５〜２０ｇ、そして最も好ましくは１００ｍｌ当たり１０〜２０ｇの濃度の溶液を得る。
【０２１０】
重合を実施するには、２〜１０％（体積）のＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）を、クロスリンカー試薬及び骨格鎖試薬を含むＤＭＳＯ溶液に加え、そして混合物を１〜２０秒間振盪し、そして放置したままにする。混合物は１分未満のうちに凝固する。
【０２１１】
本発明によるこのようなヒドロゲルは、機械的方法、例えば撹拌、破砕、切断 加圧成形、又はミル処理、及び場合により篩分けによって粉砕されるのが好ましい。
【０２１２】
乳化重合では、反応混合物は、分散相及び連続相を含む。
【０２１３】
分散相のため、骨格鎖試薬及びクロスリンカー試薬をアミン／活性エステル比２：１〜１．０５：１で混合し、そしてＤＭＳＯ中に溶解して１００ｍＬ当たり５〜５０ｇ、好ましくは１００ｍｌ当たり７．５〜２０ｇ、そして最も好ましくは１００ｍｌ当たり１０〜２０ｇの濃度の溶液を得る。
【０２１４】
連続相は、ＤＭＳＯと混和性でなく、塩基性でなく、非プロトン性であり、そして１０Ｐａ*ｓより低い粘度を示す任意の溶媒である。好ましくは、溶媒は、ＤＭＳＯと混和性でなく、塩基性でなく、非プロトン性であり、２Ｐａ*ｓより低い粘度を示し、そして非毒性である。より好ましくは、溶媒は５〜１０個の炭素原子を有する飽和線状又は分枝炭化水素である。最も好ましくは、溶媒はｎ−ヘプタンである。
【０２１５】
連続相中の分散相のエマルションを形成するには、分散相を加える前に乳化剤を連続相に加える。乳化剤の量は、分散相１ｍＬ当たり２〜５０ｍｇ、より好ましくは、分散相１ｍＬ当たり５〜２０ｍｇ、最も好ましくは、分散相１ｍＬ当たり１０ｍｇである。
【０２１６】
乳化剤は、ＨＬＢ値３〜８を有する。好ましくは、乳化剤は、ソルビトール及び脂肪酸のトリエステル又はポリ（ヒドロキシル脂肪酸）−ポリ（エチレングリコール）複合体である。より好ましくは、乳化剤は、鎖の各末端において０．５ｋＤａから５ｋＤａまでの範囲の分子量の線状ポリ（エチレングリコール）及び０．５ｋＤａから３ｋＤａの範囲の分子量のポリ（ヒドロキシ−脂肪酸）単位を有するポリ（ヒドロキシ−脂肪酸）−ポリエチレングリコール複合体である。最も好ましくは、乳化剤は、ポリ（エチレングリコール）ジポリヒドロキシステアレート、シトロールＤＰＨＳ（Cithrol DPHS）（Cithrol DPHS, 以前のアラセルＰ１３５（Arlacel P135）, Croda International Plc）である。
【０２１７】
分散相の液滴は、Isojet、Intermig、Propeller（EKATO Ruhr- und Mischtechnik GmbH, Germany)）のような撹拌機に類似した、最も好ましくは反応器直径の５０〜９０％の直径を有するIsojetに類似した形状を有する軸流羽根車（axial flow impeller）を用いた撹拌によって生成される。好ましくは、分散相を添加する前に撹拌を開始する。撹拌機の速度は、０．６〜１．７ｍ／秒に設定する。分散相を室温で加え、そして分散相の濃度は、全反応体積の２％〜７０％、好ましくは５〜５０％、より好ましくは１０〜４０％、そして最も好ましくは２０〜３５％である。塩基を効果重合（effect polymerization）に加える前に、分散相、乳化剤及び連続相の混合物を５〜６０分間撹拌する。
【０２１８】
塩基５〜１０当量（形成される各アミド結合に関して）を分散及び連続相の混合物に加える。塩基は、分散相中で非プロトン性、非求核性及び可溶性である。好ましくは、塩基は、分散相及びＤＭＳＯの両方において非プロトン性、非求核性、十分に可溶性である。
より好ましくは、塩基は、分散相及びＤＭＳＯの両方において非プロトン性、非求核性、十分に可溶性、アミン塩基、そして非毒性である。最も好ましくは、塩基は、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）である。塩基存在下での撹拌を、１〜１６時間継続する。
【０２１９】
撹拌中に、分散相の液滴が硬化して本発明による架橋されたヒドロゲルビーズになり、これを集め、そして７５μｍ及び３２μｍデッキを有する振動連続篩分け装置においてサイズによる分別を実施して本発明によるヒドロゲル微粒子を得ることができる。
【０２２０】
本発明の別の態様は、エキセンジン−リンカー複合体中間体Ｄ−Ｌ'であり、ここにおいて、Ｌ'は、式（ＩＩＩ）
【化２１】
0005932796.tif 000022
（式中、点線は、アミド結合の形成によるエキセンジン部分のアミノ基の１つへの結合を示す）
である。
【０２２１】
本発明の別の態様は、エキセンジン−リンカー試薬Ｄ−Ｌ*、
｛式中、
Ｄは、エキセンジン部分を表し；そして
Ｌ*は、式（ＩＶ）、
【化２２】
0005932796.tif 000023
（式中、点線は、アミド結合の形成によるインスリンのアミノ基の１つへの結合を示し；
Ｒ1は、Ｃ1-4アルキル、好ましくはＣＨ3から選ばれ；
Ｒ2、Ｒ2aは、Ｈ及びＣ1-4アルキルからなる群より独立して選ばれる）
によって表される生物活性のないリンカー試薬であり、
Ｌ*は、１つのＬ2*で置換されており、そして場合によりさらに置換されるが、但し、式（ＩＶ）中のアスタリスクでマークされた水素は、置換基によって置き換えられることはなく、そしてここにおいて、
Ｌ2*は、Ｌ*に結合されたスペーサーであり、そしてヒドロゲルに結合するための化学官能基を含む｝
である。
【０２２２】
好ましくは、式（ＩＶ）中のＲ2は、Ｌ2*によって置き換えられる。
【０２２３】
好ましくは、式（ＩＶ）中のＲ1は、ＣＨ2−Ｌ2*である。
【０２２４】
好ましくは、式（ＩＶ）中のＬ*は、さらに置換されない。
【０２２５】
好ましくは、Ｌ2*は、チオール基を含む。
【０２２６】
好ましくは、Ｌ2*は、マレイミド基を含む。
【０２２７】
好ましくは、Ｌ2*は、Ｌ2−Ｈである。
【０２２８】
本発明のプロドラッグのためのヒドロゲルは、メッシュ又はステント又は微粒子のような形状の物品の形態で製造方法から得ることができる。最も好ましくは、ヒドロゲルは、標準注射器によって皮下又は筋肉内注射として投与することができる微粒子ビーズに形成される。このような軟質ビーズは、１〜５００マイクロメートルの直径を有してもよい。
【０２２９】
好ましくは、微粒子は、等張性の水性製剤バッファー中に懸濁される場合、１０〜１００マイクロメートルの直径、より好ましくは２０〜１００マイクロメートルの直径、最も好ましくは２５〜８０マイクロメートルの直径を有する。
【０２３０】
好ましくは、微粒子は、内径０．６ｍｍより小さな針を通して、好ましくは、内径０．３ｍｍより小さな針を通して、より好ましくは、内径０．２２５ｍｍより小さな針を通して、さらにより好ましくは、内径０．１７５ｍｍより小さな針を通して、そして最も好ましくは内径０．１６ｍｍより小さな針を通して注射によって投与することができる。
【０２３１】
「注射によって投与することができる」、「注射可能な」又は「注射可能性（injectability）」という用語は、一定濃度（ｗ／ｖ）及び一定温度の液体中で膨潤した本発明による生分解性ヒドロゲルを含む注射器のプランジャーにかかる一定の力、このような注射器の排出口につながれた所定の内径の針、並びに本発明による生分解性ヒドロゲルの一定体積を注射器から針まで押し出すのに必要な時間といったような要因の組み合わせのことであると理解される。
【０２３２】
注射可能性を得るためには、水中で少なくとも５％（ｗ／ｖ）濃度に膨潤し、そして直径４．７ｍｍのプランジャーを保持する注射器中に含まれた本発明によるエキセンジンプロドラッグ１ｍＬの体積を、５０ニュートン未満の力を適用することによって室温で１０秒以内に押し出さなければならない。
【０２３３】
好ましくは、水中で約１０％（ｗ／ｖ）の濃度に膨潤した本発明によるエキセンジンプロドラッグについて注射可能性が達成される。
【０２３４】
本発明の別の態様は、
（ａ）微粒子形態で本発明のエキセンジンヒドロゲルプロドラッグを製造する工程；
（ｂ）微粒子を篩にかける工程；
（ｃ）２５〜８０μｍのプロドラッグビーズ直径の画分を選ぶ工程；
（ｄ）工程（ｃ）のビーズ画分を注射に適した水性緩衝溶液中で懸濁する工程；
を含む、注射針で注射可能なプロドラッグの製造方法である。
【０２３５】
本発明の別の態様は、上記の方法から入手可能な注射針で注射可能なプロドラッグであって、注射針注射可能なプロドラッグが内径３００μｍ未満の注射針を通して、好ましくは内径２２５μｍ未満の注射針を通して、そしてより好ましくは内径１７５μｍ未満の注射針を通して注射可能である、注射針で注射可能なプロドラッグである。
【０２３６】
本発明の別の態様は、本発明のプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩を薬学的に許容しうる賦形剤と共に含む薬学的組成物である。薬学的組成物を以下の段落でさらに説明する。
【０２３７】
エキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグの組成物は、懸濁液組成物として又は乾燥組成物として提供してもよい。好ましくは、エキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグの薬学的組成物は、乾燥組成物である。適切な乾燥方法は、例えば、噴霧乾燥及び凍結乾燥（フリーズドライ）である。好ましくは、エキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグの薬学的組成物は、凍結乾燥によって乾燥される。
【０２３８】
好ましくは、エキセンジンヒドロゲルプロドラッグは、１回の適用で少なくとも３日間、治療有効量のエキセンジンを供給する組成物において十分に投薬される。より好ましくは、１週間に１回のエキセンジンヒドロゲルプロドラッグの適用で十分である。
【０２３９】
本発明によるエキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグの薬学的組成物は、１つ又はそれ以上の賦形剤を含む。
【０２４０】
非経口組成物に用いられる賦形剤は、緩衝剤、等張性調整剤、防腐剤、安定剤、抗吸着剤、酸化防止剤、増粘剤（viscosifiers）／粘度増強剤（viscosity enhancing agents）、又は他の補助剤として分類してもよい。いくつかの場合、これらの成分は、二つ又は三つの機能を有してもよい。本発明によるエキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグの組成物は、以下の群から選ばれる１つ又はそれ以上の賦形剤を含む：
（ｉ）緩衝剤：所望の範囲にｐＨを維持する生理学的に許容しうるバッファー、例えばナトリウムのリン酸塩、炭酸水素塩、コハク酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩及び酢酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物、ピルビン酸。また、酸中和剤、例えばＭｇ（ＯＨ）2又はＺｎＣＯ3を用いてもよい。緩衝能力は、ｐＨ安定性に最も感受性の状態に合わせて調整してもよい。
（ｉｉ）等張性調整剤：注射デポ剤での浸透圧の違いによる細胞損傷から生じることがある疼痛を最小限にするため。例として、グリセリン及び塩化ナトリウムがある。有効濃度は、血清について２８５〜３１５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの推定浸透圧を用いて浸透圧測定によって決定することができる。
（ｉｉｉ）防腐剤及び／又は抗菌剤：反復投与の非経口製剤では、患者が注射時に感染するリスクを最小限にするために十分な濃度で防腐剤を添加する必要があり、そして対応する規制上の要件は確立されている。典型的な防腐剤としては、ｍ−メタクレゾール、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロソール（thimerosol）、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸、クロロクレゾール、及び塩化ベンザルコニウムが含まれる。
（ｉｖ）安定剤：安定化は、タンパク質安定化力を強化することによって、変性したステーター（stater）の不安定化によって、又は賦形剤をタンパク質に直接結合することによって達成される。安定剤は、アミノ酸、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、リシン、プロリン、糖、例えばグルコース、スクロース、トレハロース、ポリオール、例えばグリセロール、マンニトール、ソルビトール、塩、例えばリン酸カリウム、硫酸ナトリウム、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、ヘキサホスフェート、リガンド、例えば二価金属イオン（亜鉛、カルシウム、など）、他の塩又は有機分子、例えばフェノール系誘導体であってもよい。さらに、オリゴマー又はポリマー、例えばシクロデキストリン、デキストラン、デンドリマー、ＰＥＧ又はＰＶＰ又はプロタミン又はＨＳＡを用いてもよい。
（ｖ）抗吸着剤：主にイオン性若しくは非イオン性界面活性剤又は他のタンパク質又は可溶性のポリマーを用いて組成物又は組成物の容器の内表面にコーティングする又は競合的に吸着させる。例えば、ポロキサマー（プルロニック（Pluronic）Ｆ−６８）、ＰＥＧドデシルエーテル（ブリッジ（Brij）３５）、ポリソルベート２０及び８０、デキストラン、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ−ポリヒスチジン、ＢＳＡ及びＨＳＡ並びにゼラチン。賦形剤の濃度及びタイプの選択は、回避すべき効果により左右されるが、典型的にＣＭＣ値のすぐ上では界面に界面活性剤の単層が形成される。
【０２４１】
（ｖｉ）リオプロテクタント（lyoprotectants）及び／又は凍結防止剤：凍結乾燥又は噴霧乾燥中に、賦形剤は、水素結合切断及び水除去によって生じる不安定化効果を打ち消しうる。この目的のため、糖及びポリオールを用いてもよいが、対応する陽性効果は、界面活性剤、アミノ酸、非水性溶媒、及び他のペプチドについても観察されている。トレハロースは、水分に誘発された凝集を低下させるのに特に有効であり、そしてまた、タンパク質の疎水基が水に曝露されることによって生じる可能性がある熱安定性を改善する。また、マンニトール及びスクロースは、単独のリオプロテクタント／凍結防止剤として又は相互の組み合わせのいずれかで用いてもよく、その際、より高い比率のマンニトール：スクロースは、凍結乾燥されたケークの物理的安定性を強化することが知られている。また、マンニトールをトレハロースと合わせてもよい。また、トレハロースをソルビトールと合わせてもよく、又はソルビトールは単独の保護剤として用いられる。また、デンプン又はデンプン誘導体を用いてもよい。
（ｖｉｉ）酸化防止」剤：抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、エクトイン、メチオニン、グルタチオン、モノチオグリセロール、モリン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、没食子酸プロピル、ビタミンＥ、キレート剤、例えばクエン酸、ＥＤＴＡ、ヘキサホスフェート、チオグリコール酸
（ｖｉｉｉ）増粘剤（viscosifiers）又は粘度増強剤（viscosity enhancers）：バイアル及び注射器中で粒子の沈降を遅らせ、そして粒子の混合及び再懸濁を促進するため、そして懸濁液を注射し易くする（すなわち、注射器のプランジャーにおける力を弱める）ために用いられる。適切な増粘剤又は粘度増強剤は、例えば、カルボポール（Carbopol）９４０、カルボポールウルトレッツ（Carbopol Ultrez）１０のようなカルボマー増粘剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ヒプロメロース、ＨＰＭＣ）又はジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ又はＤＥＡＥ−Ｃ）のようなセルロース誘導体、コロイド状ケイ酸マグネシウム（Veegum）又はケイ酸ナトリウム、ヒドロキシアパタイトゲル、リン酸三カルシウムゲル、キサンタン、サチアガム（Satia gum）ＵＴＣ３０のようなカラゲナン、脂肪族ポリ（ヒドロキシ酸）、例えばポリ（Ｄ，Ｌ−又はＬ−乳酸）（ＰＬＡ）及びポリグリコール酸（ＰＧＡ）並びにそれらのコポリマー（ＰＬＧＡ）、Ｄ，Ｌ−ラクチド、グリコリド及びカプロラクトンのターポリマー、ポロキサマー、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）−ポリ（オキシエチレン）のトリブロック（例えばプルロニックR）を構成するための親水性ポリ（オキシエチレン）ブロック及び疎水性ポリ（オキシプロピレン）ブロック、ポリエチルエステルコポリマー、例えばポリエチレングリコールテレフタレート／ポリブチレンテレフタレートコポリマー、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル（ＳＡＩＢ）、デキストラン又はその誘導体、デキストラン及びＰＥＧの組み合わせ、ポリジメチルシロキサン、コラーゲン、キトサン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び誘導体、ポリアルキルイミド、ポリ（アクリルアミド−コ−ジアリルジメチルアンモニウム（ＤＡＤＭＡ））、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、例えばデルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン、疎水性Ａブロック、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）又はポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及び親水性Ｂブロック、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリビニルピロリドンで構成されたＡＢＡトリブロック又はＡＢブロックコポリマーである。上記のポロキサマーと同様にこのようなブロックコポリマーは、逆熱ゲル化（reverse thermal gelation）挙動（投与を容易にするため室温で流体状態、そして注射後に体温でゾル−ゲル転移温度より上のゲル状態）を示すことがある。
（ｉｘ）拡散（spreading）又は拡散剤（diffusing agent）：限定されるわけではないが、結合組織の細胞間隙に見出される多糖類、ヒアルロン酸のような組織間隙（intrastitial space）中の細胞外マトリックス成分の加水分解を通して結合組織の透過性を改良する。ヒアルロニダーゼのような拡散剤は、一時的に、細胞外マトリックスの粘度を低下さ
せ、そして注射された薬物の拡散を促進する。
（ｘ）他の補助剤：例えば湿潤剤、粘度調整剤、抗生物質、ヒアルロニダーゼ。酸及び塩基、例えば塩酸及び水酸化ナトリウムは、製造中のｐＨ調整に必要な補助剤である。
【０２４２】
好ましくは、エキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグの組成物は、１つ又はそれ以上の増粘剤及び／又は粘度調整剤を含む。
【０２４３】
「賦形剤」という用語は、好ましくは、治療剤と共に投与される希釈剤、佐剤（adjuvant）又は媒体（vehicle）のことである。このような薬学的賦形剤は、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油及び同様のものを含むが、それらに限定されるわけではない、石油、動物、植物又は合成由来のものを含む水及び油のような滅菌液であることができる。薬学的組成物を経口投与するとき、水は好ましい賦形剤である。生理食塩水及び水性デキストロースは、薬学的組成物を静脈内に投与するとき、好ましい賦形剤である。生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、注射剤用の液体賦形剤として用いることが好ましい。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、穀粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール及び同様のものが含まれる。組成物は、所望により、少量の湿潤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含むこともできる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとることができる。組成物は、従来の結合剤及び賦形剤、例えばトリグリセリドを用いて坐剤として処方することができる。経口製剤は、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準賦形剤を含むことができる。適切な薬学的賦形剤の例は、E.W. Martinによって"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。このような組成物は、患者に適当な投与形態を提供するために治療有効量の治療剤を、好ましくは精製された形態で適切な量の賦形剤と共に含む。製剤は投与方法に適していなければならない。
【０２４４】
一般的な実施態様において、本発明の薬学的組成物は、乾燥形態で又は懸濁液として又は別の形態であるかどうかにかかわらず、単回又は反復投与組成物として提供されうる。
【０２４５】
本発明の一実施態様において、エキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物は、一回量として提供され、それを供給する容器が１回の薬学的用量を含むことを意味する。
【０２４６】
従って、本発明の別の態様において、組成物は単回投与組成物として提供される。
【０２４７】
好ましくは、懸濁液組成物は反復投与組成物であり、それは１回を超える治療用量を含むことを意味する。好ましくは、反復投与組成物は、少なくとも２用量を含む。エキセンジン−ヒドロゲルのこのような反復投与組成物は、それを必要とする異なる患者に用いるか又は１人の患者に用いることを意図するかいずれかであることができ、その際、初回投与を適用した後、残りの用量は、必要になるまで保存される。
【０２４８】
本発明の別の態様において、組成物は容器中に含まれる。好ましくは、容器はデュアルチャンバー型注射器（dual-chamber）である。特に、本発明による乾燥組成物はデュアルチャンバー型注射器の第１のチャンバーに提供され、そして再構成溶液はデュアルチャンバー型注射器の第２のチャンバーに提供される。
【０２４９】
エキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物を、それを必要とする患者に適用する前に、乾燥組成物を再構成する。再構成は、バイアル、注射器、デュアルチャンバー型注射器、アンプル、及びカートリッジ中のようなエキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物が提供される容器中で行うことができる。再構成は、所定量の再構成溶液を乾燥組成物に加えることによって行われる。再構成溶液は、水又はバッファーのような滅菌液であり、それは防腐剤及び／又は抗菌剤のようなさらなる添加剤を含んでもよい。エキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグ組成物が一回量として提供される場合、再構成溶液は、１つ又はそれ以上の防腐剤及び／又は抗菌剤を含んでもよい。好ましくは、再構成溶液は滅菌水である。エキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグの組成物が反復投与組成物である場合、再構成溶液は、例えばベンジルアルコール及びクレゾールのような１つ又はそれ以上の防腐剤及び／又は抗菌剤を含むことが好ましい。
【０２５０】
本発明のさらなる態様は、再構成されたエキセンジンヒドロゲルプロドラッグ組成物の投与方法に関する。エキセンジンヒドロゲルプロドラッグ組成物は、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、及び腹腔内を含む注射又は注入方法によって投与することができる。
【０２５１】
さらなる態様は、治療有効量のエキセンジンヒドロゲルプロドラッグ、及び場合により１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる賦形剤を含み、ここにおいて、エキセンジンがヒドロゲルに一時的に結合された、再構成された組成物の製造方法であって、
・本発明の組成物を再構成溶液と接触させる工程
を含む前記方法である。
【０２５２】
別の態様は、治療有効量のエキセンジンヒドロゲルプロドラッグ、及び場合により１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる賦形剤を含む再構成された組成物であって、ここにおいて、エキセンジンが上の方法によって入手可能なヒドロゲルに一時的に結合された前記組成物である。
【０２５３】
本発明の別の態様は、エキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物の製造方法である。一実施態様において、このような懸濁液組成物は、
（ｉ）エキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグを１つ又はそれ以上の賦形剤と混合し、
（ｉｉ）単回又は反復投与に相当する量を適切な容器に移し、
（ｉｉｉ）前記容器中の組成物を乾燥し、そして
（ｉｖ）容器を密閉すること
によって製造される。
【０２５４】
適切な容器は、バイアル、注射器、デュアルチャンバー型注射器、アンプル、及びカートリッジである。
【０２５５】
別の態様は、パーツのキットである。投与器具が単に皮下注射器であるとき、キットは、注射器、注射針並びに注射器に使用するための乾燥エキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグ組成物を含む容器及び再構成溶液を含む第２の容器を含んでもよい。より好ましい実施態様において、注射器具は、単純な皮下注射器とは異なり、従って、再構成されたエキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグを有する別々の容器は、使用する際に容器中の液体組成物が、注射器具の排出口とつながった液体中にあるように注射器具と係合するよう構成されている。投与器具の例としては、皮下注射器及びペン型注入器具が含まれるが、それらに限定されるわけではない。特に好ましい注射器具は、ペン型注入器具であり、その場合、容器はカートリッジ、好ましくは使い捨てのカートリッジである。
【０２５６】
好ましいパーツのキットは、注射針及び本発明による組成物を含み、そして場合によりさらに再構成溶液を含む容器を含み、容器は注射針用に合わせてある。好ましくは、容器はデュアルチャンバー型注射器である。
【０２５７】
別の態様において、本発明は、ペン型注入器具の使用について先に記載されたようにエキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグの組成物を含むカートリッジを提供する。カートリッジは、一回量又は反復用量のエキセンジンを含んでもよい。
【０２５８】
本発明の一実施態様において、エキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグの懸濁液組成物は、エキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグ及び１つ又は１つを超える賦形剤を含むだけでなく、また他の生物活性物質（biologically active agents）を、その遊離形態で又はプロドラッグとしてのいずれかで含む。好ましくは、このようなさらなる１つ又はそれ以上の生物活性物質は、プロドラッグ、より好ましくはヒドロゲルプロドラッグである。このような生物活性物質には、以下の種類の化合物が含まれるが、それらに限定されるわけではない：
（ｉ）スルホニル尿素、例えば、クロルプロパミド、トラザミド、トルブタミド、グリブリド、グリピジド、グリメピリド、及び同様のものなど；
（ｉｉ）メグリチニド、例えば、レパグリニド、ナテグリニド又はミチグリニドなど；
（ｉｉｉ）グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）及びその模倣剤、グルコース−インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）及びその模倣剤、エキセンジン及びその模倣剤、及びジペプチルプロテアーゼ阻害剤（Dipeptyl Protease Inhibitors）（ＤＰＰＩＶ）；
（ｉｖ）ビグアニド、例えば、メトホルミンなど；
（ｖ）チアゾリジンジオン、例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、イサグリタゾン（isaglitazone）（ＭＣＣ−５５５として知られる）、２−［２−［（２Ｒ）−４−ヘキシル−３,４−ジヒドロ−３−オキソ−２Ｈ−１,４−ベンゾオキサジン−２−イル］エトキシ］−ベンゼン酢酸、シグリタゾン、ロシグリタゾン、特に５−［［４−［３,４−ジヒドロ−３−メチル−４−オキソ−２−キナゾリニルメトキシ］フェニル］メチル］−２,４−チアゾリジンジオン及び同様のものなど；
（ｖｉ）ＧＷ２５７０、及び同様のもの、
（ｖｉｉ）レチノイド−Ｘ受容体（ＲＸＲ）モジュレーター、例えば、ターグレチン、９−シス−レチノイン酸、及び同様のものなど、
（ｖｉｉｉ）他のインスリン抵抗性改善剤（insulin sensitizing agents）、例えば、ＩＮＳ−１、ＰＴＰ−１Ｂ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼａ阻害剤、フルクトース−１,６−ビスホスファターゼ阻害剤、及び同様のものなど；
（ｉｘ）レギュラーすなわち速効型、中間型、及び持効型インスリンを含むインスリン、吸入用インスリン並びにインスリン類似体、例えば天然アミノ酸配列において少しの違いを有するインスリン分子；
（ｘ）Ｌ−７８３２８１、ＴＥ−１７４１１、及び同様のものを含むが、それらに限定されるわけではないインスリンの小分子模倣剤；
（ｘｉ）ナトリウム依存性グルコース輸送体１及び／又は２阻害剤（ＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２）、例えばＫＧＡ−２７２７、Ｔ−１０９５、Ｔ−１０９５Ａ、ＳＧＬ−００１０、ＡＶＥ ２２６８、ＳＡＲ ７２２６、ＳＧＬ−５０８３、ＳＧＬ−５０８５、ＳＧＬ−５０９４、ＩＳＩ−３８８６２６、セルグリフロジン、ダパグリフロジン又はレモグリフロジンエタボナート、カナグリフロジン、フロリジン、及び同様のもの；
（ｘｉｉ）プラムリンチド、及び同様のものを含むが、それらに限定されないアミリン作動剤；
（ｘｉｉｉ）グルカゴン拮抗剤、例えばＡＹ−２７９９５５、及び同様のもの。
（ｘｉｖ）腸ホルモン及び腸ホルモン活性のモジュレーター、例えばソマトスタチン、オキシントモジュリン、コレシストキニン、インクレチン、グレリン、ＰＹＹ３−３６、及び同様のもの。
【０２５９】
上記のようなインスリンは、ウシインスリン、ブタインスリン、及びヒトインスリンからなる群より独立して選ばれうる。より好ましくは、インスリンはヒトインスリンから独立して選ばれる。インスリンは、未修飾インスリンから、より詳しくはウシインスリン、ブタのインスリン、及びヒトインスリンから選ばれうる。
【０２６０】
インスリン誘導体は、天然に存在するインスリンの誘導体及び／又はインスリン類似体であり、それらは化学修飾によって得られる。化学修飾は、例えば、１つ又はそれ以上のアミノ酸上への１つ又はそれ以上の定義された化学基の付加からなってもよい。
【０２６１】
ＥＰ ０ ２１４ ８２６、ＥＰ ０ ３７５ ４３７、ＥＰ ０ ６７８ ５２２、ＥＰ ０ ８８５ ９６１、ＥＰ ０ ４１９ ５０４、ＷＯ ９２／００３２１、ドイツ特許出願１０ ２００８ ００３ ５６８．８及び１０ ２００８ ００３ ５６６．１並びにＥＰ−Ａ ０ ３６８ １８７に記載されたインスリン類似体は、本発明の組み合わせの部分であってもよい。文献ＥＰ ０ ２１４ ８２６、ＥＰ ０ ３７５ ４３７、ＥＰ ０ ６７８ ５２２、ＥＰ ０ ４１９ ５０４、ＷＯ ９２／００３２１、及びＥＰ−Ａ ０ ３６８ １８７は、参照により本明細書に含まれる。
【０２６２】
１つの好ましいインスリン類似体は、Ｇｌｙ（Ａ２１）−Ａｒｇ（Ｂ３１）−Ａｒｇ（Ｂ３２）ヒトインスリン（インスリングラルギン、ランタス）；Ａｒｇ（Ａ０）−Ｈｉｓ（Ａ８）−Ｇｌｕ（Ａ１５）−Ａｓｐ（Ａ１８）−Ｇｌｙ（Ａ２１）−Ａｒｇ（Ｂ３１）−Ａｒｇ（Ｂ３２）ヒトインスリンアミド、Ｌｙｓ（Ｂ３）−Ｇｌｕ（Ｂ２９）ヒトインスリン；ＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン（インスリンリスプロ）、Ｂ２８ Ａｓｐヒトインスリン（インスリンアスパルト）、Ｂ２８位のプロリンがＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＡｌａによって置換されており、そしてＢ２９位のＬｙｓがＰｒｏによって置換されてもよいヒトインスリン；ＡｌａＢ２６ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ｂ２８−Ｂ３０）ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ｂ２７）ヒトインスリン又はＢ２９Ｌｙｓ（ε−テトラデカノイル），ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン（インスリンデテミル）からなる群より選ばれうる。
【０２６３】
好ましいインスリン誘導体は、Ｂ２９−Ｎ−ミリストイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−パルミトイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−ミリストイルヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−パルミトイルヒトインスリン、Ｂ２８−Ｎ−ミリストイルＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、Ｂ２８−Ｎ−パルミトイル−ＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン、Ｂ３０−Ｎ−ミリストイル−ＴｈｒB29ＬｙｓB30ヒトインスリン、Ｂ３０−Ｎ−パルミトイル−ＴｈｒB29ＬｙｓB30ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−（Ｎ−パルミトイル−Ｙ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−（Ｎ−リトコリル−Ｙ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、及びＢ２９−Ｎ−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）ヒトインスリンからなる群から選ばれうる。
【０２６４】
より高度に好ましいインスリン誘導体は、Ｇｌｙ（Ａ２１）−Ａｒｇ（Ｂ３１）−Ａｒｇ（Ｂ３２）ヒトインスリン、ＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン（インスリンリスプロ）、Ｂ２８ Ａｓｐヒトインスリン（インスリンアスパルト）、Ｂ２９Ｌｙｓ（ε−テトラデカノイル），ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン（インスリンデテミル）からなる群より選ばれる。
【０２６５】
好ましくは、このようなさらなる１つ又はそれ以上の生物活性剤は、ＷＯ２０１１／０１２７１８、及びＷＯ２０１１／０１２７１９に記載されたようなインスリンのヒドロゲルプロドラッグである。
【０２６６】
抗糖尿病剤に加えて、生物活性化合物には、肥満防止剤、例えばオーリスタット、脂肪の分解及び吸収を予防する膵リパーゼ阻害剤；又はシブトラミン、食欲抑制剤並びに脳内のセロトニン、ノルエピネフリン及びドーパミンの再取り込み阻害剤、脂肪動員を増強する成長因子（例えば、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、成長ホルモン放出因子）、オキシントモジュリン及びグレリンモジュレーターであってもよい。他の潜在的生物活性肥満防止剤としては、アドレナリン作動性機構を通して作用する食欲抑制剤、例えば、ベンズフェタミン、フェンメトラジン、フェンテルミン、ジエチルプロピオン、マジンドール、シブトラミン、フェニルプロパノラミン又はエフェドリン；セロトニン作動性機構を通して作用する食欲抑制剤、例えばキパジン、フルオキセチン、サートラリン、フェンフルラミン、又はデクスフェンフルラミン；ドーパミン機構を通して作用する食欲抑制剤、例えば、アポモルヒネ；ヒスタミン作動性機構を通して作用する食欲抑制剤（例えば、ヒスタミン模倣剤、Ｈ３受容体モジュレーター）；エネルギー消費の促進剤、例えばベータ−３アドレナリン作動剤及び脱共役タンパク質機能の刺激剤；レプチン及びレプチン模倣剤（例えば、メトレレプチン）；ニューロペプチドＹ拮抗剤；メラノコルチン−１、３及び４受容体モジュレーター；コレシストキニン作動剤；グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）模倣剤及び類似体（例えば、エキセンジン）；アンドロゲン（例えば、デヒドロエピアンドロステロン及び誘導体、例えばエチコランジオン（etiocholandione））、テストステロン、アナボリックステロイド（例えば、オキサンドロロン）、及びステロイド性ホルモン；ガラニン受容体拮抗剤；サイトカイン剤（cytokine agent）、例えば毛様体神経栄養因子；アミラーゼ阻害剤；エンテロスタチン作動剤／模倣剤；オレキシン／ヒポクレチン拮抗剤；ウロコルチン拮抗剤；ボンベシン作動剤；プロテインキナーゼＡのモジュレーター；副腎皮質刺激ホルモン放出因子模倣剤；コカイン及びアンフェタミンで調節された転写物模倣剤（cocaine- and amphetamine-regulated transcript mimetics）；カルシトニン遺伝子関連ペプチド模倣剤；並びに脂肪酸合成酵素阻害剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２６７】
別の実施態様において、最初にエキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグを、それを必要とする患者に投与し、その後、第２の化合物を投与するようなやり方で本発明によるエキセンジン−ヒドロゲルプロドラッグ組成物を、第２の生物活性化合物と組み合わせる。別法として、別の化合物を同じ患者に投与した後、エキセンジン−ヒドロゲル組成物を、それを必要とする患者に投与する。
【０２６８】
本発明のさらに別の態様は、薬剤として使用するための本発明のプロドラッグ又は本発明の薬学的組成物である。
【０２６９】
本発明のさらに別の態様は、エキセンジンによって治療することができる疾患又は障害の治療又は予防方法に使用するための本発明のプロドラッグ又は本発明の薬学的組成物である。
【０２７０】
前記組成物は、エキセンジン及びエキセンジン作動剤について知られている疾患又は障害の治療又は予防方法に使用するため、例えば、高血糖症の治療及び予防のため、そして任意のタイプの真性糖尿病、例えばインスリン依存性真性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、糖尿病前症、又は妊娠期真性糖尿病の治療及び予防のため、代謝症候群及び／又は肥満及び／又は摂食障害、インスリン抵抗性症候群、血漿脂質レベルの低下、心臓リスクの低下、食欲の低下、体重減少などの予防及び治療のためである。
【０２７１】
本発明に記載された持効型エキセンジン組成物による治療を必要とする患者は、共存症を発症する危険性が高い。従って、本持効型エキセンジンと適切な生物活性化合物との組み合わせを、例えば、高血圧症（収縮期高血圧症及び家族性脂質異常性高血圧症を含むが、これらに限定されるわけではない）、うっ血性心不全、左心室肥大、末梢動脈疾患、糖尿病性網膜症、黄斑変性、白内障、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、慢性腎不全、糖尿病性神経障害、Ｘ症候群、月経前症候群、冠動脈性心疾患、狭心症、血栓症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、一過性虚血発作、脳卒中、血管再狭窄、高血糖症、高インスリン血症、高脂質血症、高トリグリセリド血症、インスリン抵抗性、グルコース代謝障害（impaired glucose metabolism）、耐糖能異常（impaired glucose tolerance）の状態、空腹時血漿グルコース異常（impaired fasting plasma glucose）の状態、肥満、勃起障害、皮膚及び結合組織障害、足潰瘍及び潰瘍性大腸炎、内皮機能不全及び血管コンプライアンス障害（impaired vascular compliance）からなる群より選ばれる疾患及び障害の予防、進行の遅延又は治療に用いてもよい。
【０２７２】
上の群から選ばれる疾患及び障害の予防、進行の遅延又は治療は、本発明の持効型エキセンジン組成物とＡＴ1−受容体拮抗剤；アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；レニン阻害剤；ベータアドレナリン受容体遮断剤；アルファアドレナリン受容体遮断剤；カルシウムチャネル遮断剤；アルドステロン合成酵素阻害剤；アルドステロン受容体拮抗剤；中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害剤；二重アンギオテンシン変換酵素／中性エンドペプチダーゼ（ＡＣＥ／ＮＥＰ）阻害剤；エンドセリン受容体拮抗剤；利尿剤；スタチン；ニトラート；抗凝固剤；ナトリウム利尿ペプチド；ジギタリス化合物；ＰＰＡＲモジュレーターを含む、前記状態の治療に用いられる薬物種から選ばれる少なくとも１つの生物活性化合物との組み合わせによって達成することができる。
【０２７３】
また、生物活性物質；プロドラッグ、特にヒドロゲルプロドラッグが１つ又はそれ以上の酸性又は塩基性基を含む場合、本発明は、それらの対応する薬学的に又は毒物学的に許容しうる塩、特にそれらの薬学的に利用できる塩も含む。従って、酸性基を含むプロドラッグは、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩として又はアンモニウム塩として本発明に従って用いることができる。このような塩のより具体的な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩又はアンモニア若しくは有機アミン、例えば、エチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミン若しくはアミノ酸などとの塩が含まれる。１つ又はそれ以上の塩基性基、すなわち、プロトン化されうる基を含むプロドラッグは、存在することができ、そして無機又は有機酸とのそれらの付加塩の形態で本発明により用いることができる。適切な酸の例としては、塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、シュウ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、サリチル酸、安息香酸、ギ酸、プロピオン酸、ピバル酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、スルファミン酸、フェニルプロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、イソニコチン酸、クエン酸、アジピン酸、及び当業者に知られている他の酸が含まれる。また、プロドラッグが分子中に酸性及び塩基性基を同時に含む場合、本発明は、記載された塩形態に加えて分子内塩又はベタイン（両性イオン）を含む。それぞれの塩は、当業者等に知られている慣用の方法によって、例えば、それらを溶媒若しくは分散媒中で有機若しくは無機の酸若しくは塩基と接触させることによって、又は他の塩を用いて陰イオン交換若しくは陽イオン交換によって得ることができる。また、本発明は、低い生理学的適合性のため、薬剤に使用するには直接適してないが、例えば、化学反応の中間体として又は薬学的に許容しうる塩を製造するために用いることができるプロドラッグのすべての塩を含む。
【０２７４】
「薬学的に許容しうる」という用語は、動物、好ましくはヒトに使用するために監督機関、例えばＥＭＥＡ（欧州）及び／又はＦＤＡ（米国）及び／又は任意の他国の監督機関によって認可されたことを意味する。
【０２７５】
本発明のさらに別の態様は、治療有効量の本発明のプロドラッグ又は本発明の薬学的組成物又はその薬学的に許容しうる塩を患者に投与することを含む、１つ又はそれ以上の状態の治療を必要とする哺乳動物患者、好ましくはヒトにおける治療、抑制、遅延又は予防方法である。
【図面の簡単な説明】
【０２７６】
【図１】ｐＨ７．４、３７℃での化合物８、１０、１２、１４及び１６の放出動態を示す。
【実施例】
【０２７７】
物質及び方法
Ｆｍｏｃ戦略によって合成された樹脂上のエキセンジン−４［配列ＩＤ番号（Seq ID No）：１］（約０．１ｍｍｏｌ／ｇ装填）をCASLO Laboratory Aps, Lyngby,デンマークから入手した。Ｆｍｏｃ戦略によって合成された樹脂上のリキシセナチド［配列ＩＤ番号２１］及びＧＬＰ−１［配列ＩＤ番号１３］（約０．１ｍｍｏｌ／ｇ装填）をPeptide Specialty Laboratories, Heidelberg,ドイツから入手した。ペプチドは、完全に側鎖が保護されており、そして遊離Ｎ末端を有した。
【０２７８】
アミノ４−アームＰＥＧ ５ｋＤａを、JenKem Technology, Beijing, P. R. Chinaから入手した。Ｎ−（３−マレイミドプロピル）−２１−アミノ−４,７,１０,１３,１６,１９−ヘキサオキサ−ヘンエイコサン酸ＮＨＳエステル（Ｍａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳ）をCelares GmbH, Berlin, ドイツから入手した。６−（Ｓ−トリチルメルカプト）ヘキサン酸を、Polypeptide, Strasbourg,フランスから購入した。使用したアミノ酸は、特に明記しない限り、Ｌ配置であった。他のすべての化学物質は、Sigma-ALDRICH Chemie GmbH, Taufkirchen,ドイツからであった。
【０２７９】
Ｆｍｏｃ脱保護：
Ｆｍｏｃ保護基除去のため、樹脂を、ピペリジン／ＤＢＵ／ＤＭＦ２／２／９６（ｖ／ｖ／ｖ）（２回、それぞれ１０分）と共に撹拌し、そしてＤＭＦ（１０回）で洗浄した。
【０２８０】
ＲＰ−ＨＰＬＣ精製：
ＲＰ−ＨＰＬＣは、特に明記しない限り、Waters 600 HPLCシステム及びWaters 2487吸光度検出器に接続された１００×２０ｍｍ又は１００×４０ｍｍC18 ReproSil-Pur 300 ODS-3 ５μカラム（Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany）において実施した。溶液Ａ（Ｈ2Ｏ中の０．１％ＴＦＡ）及び溶液Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）の線形勾配を用いた。生成物を含むＨＰＬＣ画分を貯めて凍結乾燥した。
【０２８１】
フラッシュクロマトグラフィ
フラッシュクロマトグラフィ精製は、Biotage KP-Silシリカカートリッジ並びに溶離液としてｎ−ヘプタン及び酢酸エチルを用いてBiotage AB, スウェーデンからのIsolera Oneシステムにおいて実施した。生成物は、２５４ｎｍで検出された。
【０２８２】
ヒドロゲルビーズのため、ポリプロピレンフリットを備えた注射器を反応容器として又は洗浄工程に用いた。
【０２８３】
分析用超高性能（analytical ultra-performance）ＬＣ（ＵＰＬＣ）は、Thermo ScientificからのLTQ Orbitrap Discovery質量分析器に接続されたWaters BEH300 C18カラム（２．１×５０ｍｍ，粒径１．７μｍ）を備えたWaters Acquityシステムにおいて実施した。
【０２８４】
ＰＥＧ生成物のＭＳは、ＰＥＧ出発物質の多分散性のため一連の（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n部分を示した。解釈をより簡単にするため、単一の代表的ｍ／ｚシグナルを１つだけ実施例中に示した。
【０２８５】
ヒドロゲルのペプチド含量：
ペプチド含量は、ヒドロゲル総質量（マレイミド官能化ヒドロゲル及びペプチドリンカーチオールの質量の合計）に対する％ペプチド質量として表した。ヒドロゲル中のペプチドリンカーチオールの質量（及び、従ってペプチド単独の質量）は、マレイミド官能化ヒドロゲルとの結合反応中のペプチドリンカーチオールの消費によって決定した。ペプチドリンカーチオールの消費は、エルマン試験（Ellman, G. L. et al., Biochem. Pharmacol., 1961, 7, 88-95）によって決定した。
【０２８６】
実施例１
骨格鎖試薬１ｇの合成
【化２３】
0005932796.tif 000024
【０２８７】
以下のスキームに従ってアミノ４−アームＰＥＧ５０００ １ａから骨格鎖試薬１ｇを合成した：
【化２４】
0005932796.tif 000025
【０２８８】
化合物１ｂを合成するため、アミノ４−アームＰＥＧ５０００ １ａ（ＭＷ約５２００ｇ／ｍｏｌ，５．２０ｇ，１．００ｍｍｏｌ，ＨＣｌ塩）をＤＭＳＯ（無水）２０ｍＬ中に溶解した。ＤＭＳＯ（無水）５ｍＬ中のＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２．１７ｇ，６．２５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ ＨＣｌ（１．１５ｇ，６．００ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ2Ｏ（０．９６ｇ，６．２５ｍｍｏｌ）、及びコリジン（５．２０ｍＬ，４０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。
【０２８９】
反応混合物をＤＣＭ１２００ｍＬで希釈し、そして０．１Ｎ Ｈ2ＳＯ4（２×）６００ｍＬ、ブライン（１×）、０．１Ｍ ＮａＯＨ（２×）、及びブライン／水１／１（ｖ／ｖ）（４×）で洗浄した。水層をＤＣＭ５００ｍＬで再抽出した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過し、そして蒸発させて粗生成物１ｂ ６．３ｇを無色の油として得た。化合物１ｂをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
収量３．８５ｇ（５９％）無色のガラス状生成物１ｂ
ＭＳ：ｍ／ｚ １２９４．４＝［Ｍ＋５Ｈ］5+（［Ｍ＋５Ｈ］5+のＭＷ計算値＝１２９４．６）
【０２９０】
化合物１ｂ ３．４０ｇ（０．５２１ｍｍｏｌ）をメタノール５ｍＬ及びジオキサン中の４Ｎ ＨＣｌ９ｍＬ中、室温で１５分間撹拌することによって化合物１ｃを得た。揮発性物質を真空で除去した。生成物をさらに精製することなく次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ １１５１．９＝［Ｍ＋５Ｈ］5+（［Ｍ＋５Ｈ］5+のＭＷ計算値＝１１５２．０）
【０２９１】
化合物１ｄを合成するため、化合物１ｃ ３．２６ｇ（０．５４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（無水）１５ｍＬ中に溶解した。ＤＭＳＯ（無水）１５ｍＬ中のＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ ２．９９ｇ（８．６４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ ＨＣｌ １．５５ｇ（８．１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ2Ｏ １．２４ｇ（８．１ｍｍｏｌ）、及びコリジン５．６２ｍＬ（４３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ８００ｍＬで希釈し、そして０．１Ｎ Ｈ2ＳＯ4 ４００ｍＬ（２×）、ブライン（１×）、０．１Ｍ ＮａＯＨ（２×）、及びブライン／水１／１（ｖ／ｖ）（４×）で洗浄した。水層をＤＣＭ ８００ｍＬで再抽出した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過し、そして蒸発させてガラス状の粗生成物を得た。
【０２９２】
生成物をＤＣＭ中に溶解し、そして冷却された（−１８℃）ジエチルエーテルを用いて沈殿させた。この手順を２回繰り返し、そして沈殿を真空で乾燥した。
収量：４．０１ｇ（８９％）無色のガラス状生成物１ｄ、これをさらに精製することなく次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ １４０５．４＝［Ｍ＋６Ｈ］6+（［Ｍ＋６Ｈ］6+のＭＷ計算値＝１４０５．４）
【０２９３】
メタノール７ｍＬ及びジオキサン中４Ｎ ＨＣｌ ２０ｍＬ中の化合物１ｄ（３．９６ｇ，０．４７ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１５分間撹拌することによって化合物１ｅを得た。揮発性物質を真空で除去した。生成物をさらに精製することなく次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ ９６９．６＝［Ｍ＋７Ｈ］7+（［Ｍ＋７Ｈ］7+のＭＷ計算値＝９６９．７）
【０２９４】
化合物１ｆを合成するため、化合物１ｅ（３．５５ｇ，０．４８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（無水）２０ｍＬ中に溶解した。ＤＭＳＯ（無水）１８．８ｍＬ中のＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（５．３２ｇ，１５．４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ ＨＣｌ（２．７６ｇ，１４．４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ2Ｏ（２．２０ｇ，１４．４ｍｍｏｌ）、及びコリジン１０．０ｍＬ（７６．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で６０分間撹拌した。
【０２９５】
反応混合物をＤＣＭ ８００ｍＬで希釈し、そして０．１Ｎ Ｈ2ＳＯ4 ４００ｍＬ（２×）、ブライン（１×）、０．１Ｍ ＮａＯＨ（２×）、及びブライン／水１／１（ｖ／ｖ）（４×）で洗浄した。水層をＤＣＭ ８００ｍＬで再抽出した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過し、そして蒸発させて無色の油として粗生成物１ｆを得た。
【０２９６】
生成物をＤＣＭ中に溶解し、そして冷却された（−１８℃）ジエチルエーテルを用いて沈殿させた。この工程を２回繰り返し、そして沈殿を真空で乾燥した。
収量４．７２ｇ（８２％）無色のガラス状生成物１ｆ、これをさらに精製することなく次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ １５０５．３＝［Ｍ＋８Ｈ］8+（［Ｍ＋８Ｈ］8+のＭＷ計算値＝１５０５．４）
【０２９７】
メタノール２０ｍＬ及びジオキサン中の４Ｎ ＨＣｌ ４０ｍＬ中の化合物１ｆ（ＭＷ約１２０３５ｇ／ｍｏｌ，４．７２ｇ，０．３９ｍｍｏｌ）の溶液を室温で３０分間撹拌することによって骨格鎖試薬１ｇを得た。揮発性物質を真空で除去した。
収量３．９１ｇ（１００％）、ガラス状生成物骨格鎖試薬１ｇ
ＭＳ：ｍ／ｚ ９７７．２＝［Ｍ＋９Ｈ］9+（［Ｍ＋９Ｈ］9+のＭＷ計算値＝９７７．４）
【０２９８】
１ｇの別の合成経路
化合物１ｂを合成するため、ｉＰｒＯＨ（無水）２５０ｍＬ中の４−アーム−ＰＥＧ５０００テトラアミン（１ａ）（５０．０ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）の懸濁液にｂｏｃ−Ｌｙｓ（ｂｏｃ）−ＯＳｕ（２６．６ｇ，６０．０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２０．９ｍＬ，１２０ｍｍｏｌ）を４５℃で加え、そして混合物を３０分間撹拌した。
【０２９９】
続いて、ｎ−プロピルアミン（２．４８ｍＬ，３０．０ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、溶液をＭＴＢＥ１０００ｍＬで希釈し、そして撹拌することなく−２０℃で一夜保存した。上澄み約５００ｍＬをデカントして捨てた。冷ＭＴＢＥ３００ｍＬを加え、そして１分振盪した後、ガラスフィルターを通して濾過することによって生成物を集め、そして冷ＭＴＢＥ５００ｍＬで洗浄した。生成物を真空で１６時間乾燥した。
収量：６５．６ｇ（７４％）塊の多い白色固形物として１ｂ
ＭＳ：ｍ／ｚ ９３７．４＝［Ｍ＋７Ｈ］7+（［Ｍ＋７Ｈ］7+のＭＷ計算値＝９３７．６）
【０３００】
前工程からの化合物１ｂ（４８．８ｇ，７．４４ｍｍｏｌ）を２−プロパノール１５６ｍＬ中、４０℃で撹拌することによって化合物１ｃを得た。２−プロパノール１９６ｍＬ及びアセチルクロリド７８．３ｍＬの混合物を、撹拌下で１〜２分以内に加えた。溶液を４０℃で３０分間撹拌し、そして撹拌することなく−３０℃で一夜冷却した。冷ＭＴＢＥ１００ｍＬを加え、懸濁液を１分間振盪し、そして−３０℃に１時間冷却した。ガラスフィルターを通して濾過することによって生成物を集め、そして冷ＭＴＢＥ２００ｍＬで洗浄した。生成物を真空で１６時間乾燥した。
収量：３８．９ｇ（８６％）白色粉末として１ｃ
ＭＳ：ｍ／ｚ ９６０．１＝［Ｍ＋６Ｈ］6+（［Ｍ＋６Ｈ］6+のＭＷ計算値＝９６０．２）
【０３０１】
化合物１ｄを合成するため、２−プロパノール８０ｍｌ中の前工程からの１ｃ（１９．０ｇ，３．１４ｍｍｏｌ）の懸濁液にｂｏｃ−Ｌｙｓ（ｂｏｃ）−ＯＳｕ（１６．７ｇ，３７．７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１３．１ｍＬ，７５．４ｍｍｏｌ）を４５℃で加えた。その後、ｎ−プロピルアミン（１．５６ｍＬ，１８．９ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、冷ＭＴＢＥ ６００ｍＬを用いて溶液を沈殿させ、そして遠心分離した（３０００分-1，１分）。沈殿を真空で１時間乾燥し、そしてＴＨＦ ４００ｍＬ中に溶解した。ジエチルエーテル２００ｍＬを加え、そして撹拌することなく生成物を−３０℃に１６時間冷却した。ガラスフィルターを通して懸濁液を濾過し、そして冷ＭＴＢＥ ３００ｍＬで洗浄した。生成物を真空で１６時間乾燥した。
収量：２１．０ｇ（８０％）白色固形物として１ｄ
ＭＳ：ｍ／ｚ １４０５．４＝［Ｍ＋６Ｈ］6+（［Ｍ＋６Ｈ］6+のＭＷ計算値＝１４０５．４）
【０３０２】
前工程からの化合物１ｄ（１５．６ｇ，１．８６ｍｍｏｌ）をメタノール中の３Ｎ ＨＣｌ（８１ｍＬ，２４３ｍｍｏｌ）中に溶解し、そして４０℃で９０分間撹拌することによって化合物１ｅを得た。ＭｅＯＨ２００ｍＬ及びｉＰｒＯＨ７００ｍＬを加え、そして混合物を−３０℃で２時間保存した。完全に結晶化させるため、ＭＴＢＥ１００ｍＬを加え、そして懸濁液を−３０℃で一夜保存した。冷ＭＴＢＥ２５０ｍＬを加え、懸濁液を１分間振盪し、そしてガラスフィルターを通して濾過し、そして冷ＭＴＢＥ１００ｍＬで洗浄した。生成物を真空で乾燥した。
収量：１３．２ｇ（９６％）白色粉末として１ｅ
ＭＳ：ｍ／ｚ ６７９．１＝［Ｍ＋１０Ｈ］10+（［Ｍ＋１０Ｈ］10+のMW計算値＝６７９．１）
【０３０３】
化合物１ｆを合成するため、２−プロパノール１６５ｍｌ中の前工程からの１ｅ（８．２２ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）の懸濁液にｂｏｃ−Ｌｙｓ（ｂｏｃ）−ＯＳｕ（１１．９ｇ，２６．８ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（９．３４ｍＬ，５３．６ｍｍｏｌ）を４５℃で加え、そして混合物を３０分間撹拌した。続いて、ｎ−プロピルアミン（１．４７ｍＬ，１７．９ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、溶液を−１８℃に２時間冷却し、次いで冷ＭＴＢＥ１６５ｍＬを加え、懸濁液を１分間振盪し、そしてガラスフィルターを通して濾過した。続いて、濾過ケークを冷ＭＴＢＥ／ｉＰｒＯＨ４：１の４×２００ｍＬ及び冷ＭＴＢＥ１×２００ｍＬで洗浄した。生成物を真空で１６時間乾燥した。
収量：１２．８ｇ、ＭＷ（９０％）淡黄色の塊の多い固形物として１ｆ
ＭＳ：ｍ／ｚ １５０５．３＝［Ｍ＋８Ｈ］8+（［Ｍ＋８Ｈ］8+のMW計算値＝１５０５．４）
【０３０４】
４ＡｒｍＰＥＧ５ｋＤａ（−ＬｙｓＬｙｓ2Ｌｙｓ4（ｂｏｃ）8）4（１ｆ）（１５．５ｇ，１．２９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ３０ｍＬ中に溶解し、そして０℃に冷却することによって骨格鎖試薬１ｇを得た。ジオキサン中の４Ｎ ＨＣｌ（１２０ｍＬ，４８０ｍｍｏｌ，０℃に冷却）を３分以内に加え、そして氷浴をはずした。２０分後、メタノール中の３Ｎ ＨＣｌ（２００ｍＬ，６００ｍｍｏｌ，０℃に冷却）を１５分以内に加え、そして溶液を室温で１０分間撹拌した。冷ＭＴＢＥ４８０ｍＬを用いて生成物溶液を沈殿させ、そして３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。沈殿を真空で１時間乾燥し、そしてＭｅＯＨ９０ｍＬ中に再溶解し、冷ＭＴＢＥ２４０ｍＬを用いて沈殿させ、そして懸濁液を３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。生成物１ｇを真空で乾燥した。
収量：１１．５ｇ（８９％）淡黄色フレークとして
ＭＳ：ｍ／ｚ １１０４．９＝［Ｍ＋８Ｈ］8+（［Ｍ＋８Ｈ］8+のMW計算値＝１１０４．９）
【０３０５】
実施例２
クロスリンカー試薬２ｄの合成
クロスリンカー試薬２ｄは、アジピン酸モノベンジルエステル（English, Arthur R. et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1990, 33(1), 344-347）及びＰＥＧ２０００から以下のスキームに従って製造した：
【化２５】
0005932796.tif 000026
【０３０６】
ＤＣＭ（９０．０ｍＬ）中のＰＥＧ２０００（２ａ）（１１．０ｇ，５．５ｍｍｏｌ）及びアジピン酸ベンジル半エステル（４．８ｇ，２０．６ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（４．４７ｇ，２１．７ｍｍｏｌ）、続いて触媒量のＤＭＡＰ（５ｍｇ）を加え、そして溶液を撹拌し、そして一夜かけて室温に到達するにまかせた（１２時間）。フラスコを＋４℃で５時間保存した。固形物を濾過し、そして真空で蒸留することによって溶媒を完全に除去した。残留物をジエチルエーテル／酢酸エチル１／１（ｖ／ｖ）１０００ｍＬ中に溶解し、そして室温で２時間保存し、その間に少量の薄片状固形物が形成された。セライトRのパッドを通して濾過することによって固形物を除去した。結晶化が完了するまで、冷凍庫中、−３０℃で１２時間きつく密閉したフラスコ中に溶液を保存した。ガラスフリットを通して結晶質生成物を濾過し、そして冷却されたジエチルエーテル（−３０℃）で洗浄した。濾過ケークを真空で乾燥した。収量：１１．６ｇ（８６％）無色の固形物として２ｂ。生成物をさらに精製することなく次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ ８１３．１＝［Ｍ＋３Ｈ］3+（［Ｍ＋３Ｈ］3+のＭＷ計算値＝８１３．３）
【０３０７】
５００ｍＬのガラスオートクレーブ中、ＰＥＧ２０００−ビス−アジピン酸−ビス−ベンジルエステル２ｂ（１３．３ｇ，５．５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１８０ｍＬ）中に溶解し、そして木炭上の１０％パラジウム（０．４ｇ）を加えた。水素消費が終わるまで（５〜１２時間）、溶液を６ｂａｒ（４０℃）で水素化した。セライトRのパッドを通して濾過することによって触媒を除去し、そして溶媒を真空で蒸発させた。
収量：１２．３ｇ（定量的）黄色がかった油として２ｃ。生成物をさらに精製することなく次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ ７５３．１＝［Ｍ＋３Ｈ］3+（計算値＝７５３．２）
【０３０８】
ＤＣＭ（無水）７５ｍＬ中のＰＥＧ２０００−ビス−アジピン酸半エステル２ｃ（９．４３ｇ，４．１８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．９２ｇ，１６．７ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（３．４４ｇ，１６．７ｍｍｏｌ）の溶液を室温で一夜撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、そして沈殿を濾過した。ＤＣＭを蒸発させ、そして残留物をＴＨＦから再結晶させた。
収量： ８．７３ｇ（８５％）無色の固形物としてクロスリンカー試薬２ｄ
ＭＳ：ｍ／ｚ ８１７．８＝［Ｍ＋３Ｈ］3+（計算値＝８１７．９ｇ／ｍｏｌ）
【０３０９】
実施例３
遊離アミノ基を含むヒドロゲルビーズ（３）の製造
ＤＭＳＯ２８．６ｍＬ中の１ｇ １２００ｍｇ及び２ｄ ３８４０ｍｇの溶液をヘプタン１００ｍＬ中の Arlacel P135（Croda International Plc）４２５ｍｇの溶液に加えた。バッフルを備えた２５０ｍｌ反応器中、２５℃で１０分間、プロペラ撹拌機を用いて６５０ｒｐｍで混合物を撹拌して懸濁液を形成した。ＴＭＥＤＡ ４．３ｍＬを加えて重合を実施した。２時間後、撹拌機の速度を４００ｒｐｍに下げ、そして混合物をさらに１６時間撹拌した。酢酸６．６ｍＬを加え、それから１０分後、水５０ｍＬ及び飽和塩化ナトリウム水溶液を加えた。５分後、撹拌機を停止し、そして水相を排出した。ビーズサイズ分別のため、水−ヒドロゲル懸濁液を７５、５０、４０、３２及び２０μｍメッシュのスチール篩上で湿式篩にかけた（wet-sieved）。３２、４０及び５０μｍの篩上に残ったビーズ画分を貯め、そして水で３回、エタノールで１０回洗浄し、そして０．１ｍｂａｒで１６時間乾燥して白色粉末として３を得た。
【０３１０】
ヒドロゲルのアミノ基含量は、Gude, M., J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide
Science 9(4): 203-206によって記載されたように、ヒドロゲル上の遊離アミノ基へのｆｍｏｃアミノ酸の結合、そしてその後のｆｍｏｃ測定によって決定した。
【０３１１】
異なるバッチについて、３のアミノ基含量は０．１１〜０．１６ｍｍｏｌ／ｇであると決定された。
【０３１２】
実施例４
マレイミド官能化ヒドロゲルビーズ（４）の製造及びマレイミド置換の決定
【化２６】
0005932796.tif 000027
ヒドロゲルビーズ３をＤＭＳＯ／ＤＩＥＡ９９／１（ｖ／ｖ）で予め洗浄し、ＤＭＳＯで洗浄し、そしてＤＭＳＯ中のＭａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳ（ヒドロゲル上のアミノ基の理論量に対して２．０当量）の溶液を用いて４５分間定温放置した。ビーズ４をＤＭＳＯで５回、そしてコハク酸塩ｐＨ３．０（２０ｍＭ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で５回洗浄した。サンプルを、リン酸ナトリウムｐＨ６．０（５０ｍＭ，５０ｍＭエタノールアミン，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、そして同じバッファー中、室温で１時間定温放置した。その後、ビーズをコハク酸ナトリウムｐＨ３．０（２０ｍＭ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で５時間洗浄した。
【０３１３】
マレイミド含量を決定するため、ヒドロゲルビーズ４のアリコートを、水及びエタノールでそれぞれ３回洗浄した。サンプルを凍結乾燥し、そして計量した。ヒドロゲルビーズ４の別のアリコートを、過剰のメルカプトエタノールと反応させ（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中、室温で３０分）、そしてメルカプトエタノール消費を、エルマン（Ellman）試験（Ellman, G. L. et al., Biochem. Pharmacol., 1961, 7, 88-95）によって検出した。マレイミド含量は、０．１０〜０．１３ｍｍｏｌ／ｇ乾燥ヒドロゲルであると決定された。
【０３１４】
実施例５
リンカー試薬５ｃの合成
リンカー試薬５ｃを、以下のスキームに従って合成した：
【化２７】
0005932796.tif 000028
【０３１５】
リンカー試薬中間体５ａの合成：
４−メトキシトリチルクロリド（３ｇ，９．７１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）中に溶解し、そしてＤＣＭ（２０ｍＬ）中のエチレンジアミン（６．５ｍＬ，９７．１ｍｍｏｌ）の溶液を滴加した。２時間後、溶液をジエチルエーテル（３００ｍＬ）中に注ぎ、そしてブライン／０．１ Ｍ ＮａＯＨ ３０／１（ｖ／ｖ）溶液で３回（それぞれ５０ｍｌ）、そしてブライン（５０ｍＬ）で１回洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、そして揮発性物質を減圧下で除去してＭｍｔ−保護された中間体（３．１８ｇ，９．５６ｍｍｏｌ）を得た。
【０３１６】
Ｍｍｔ−保護された中間体（３．１８ｇ，９．５６ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）中に溶解した。６−（トリチルメルカプト）−ヘキサン酸（４．４８ｇ，１１．４７ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（５．６７ｇ，１１．４７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（５．０ｍＬ，２８．６８ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を室温で３０分間撹拌した。溶液をジエチルエーテル（２５０ｍＬ）で希釈し、そしてブライン／０．１Ｍ ＮａＯＨ ３０／１（ｖ／ｖ）溶液で３回（それぞれ５０ｍＬ）、そしてブライン（５０ｍＬ）で１回洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、そして揮発性物質を減圧下で除去した。５ａをフラッシュクロマトグラフィによって精製した。
収量：５．６９ｇ（８．０９ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ７０５．４＝［Ｍ＋Ｈ］+（MW計算値＝７０５．０）
【０３１７】
リンカー試薬中間体５ｂの合成：
無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の５ａ（３．１９ｇ，４．５３ｍｍｏｌ）の溶液にＢＨ3・ＴＨＦ（１M溶液，８．５ｍＬ，８．５ｍｍｏｌ）を加え、そして溶液を室温で１６時間撹拌した。さらにＢＨ3・ＴＨＦ（１Ｍ溶液，１４ｍＬ，１４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。メタノール（８．５ｍＬ）を添加して反応をクエンチし、Ｎ,Ｎ−ジメチル−エチレンジアミン（３ｍＬ，２７．２ｍｍｏｌ）を加え、そして溶液を還流に加熱し、そして３時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却するにまかせ、次いで酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、飽和Ｎａ2ＣＯ3水溶液（２×１００ｍＬ）、そして飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、そして揮発性物質を減圧で除去して粗アミン中間体（３．２２ｇ）を得た。
【０３１８】
アミン中間体をＤＣＭ（５ｍＬ）中に溶解した。ＤＣＭ（５ｍＬ）及びＤＩＥＡ（３．９５ｍＬ，２２．６５ｍｍｏｌ）中に溶解したＢｏｃ2Ｏ（２．９７ｇ，１３．６９ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製してＢｏｃ−及びＭｍｔ−保護された粗中間体（３ｇ）を得た。
ＭＳ：ｍ／ｚ ７９１．４＝［Ｍ＋Ｈ］+，５１９．３＝［Ｍ−Ｍｍｔ＋Ｈ］+（ＭＷ計算値＝７９１．１）
【０３１９】
０．４Ｍ水性ＨＣｌ（４８ｍＬ）をアセトニトリル（４５ｍＬ）中のＢｏｃ−及びＭｍｔ−保護された中間体の溶液に加えた。混合物をアセトニトリル（１０ｍＬ）で希釈し、そして室温で１時間撹拌した。続いて、５Ｍ ＮａＯＨ溶液を添加することによって反応混合物のｐＨ値を５．５に調整した。アセトニトリルを減圧下で除去し、そして水溶液をＤＣＭ（４×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、そして揮発性物質を減圧下で除去した。粗５ｂをさらに精製することなく次の工程に用いた。
収量：２．５２ｇ（３．１９ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ５１９．３＝［Ｍ＋Ｈ］+（ＭＷ計算値＝５１８．８ｇ／ｍｏｌ）
【０３２０】
リンカー試薬５ｃの合成：
中間体５ｂ（９８５ｍｇ，１．９ｍｍｏｌ）及びｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（３３０ｍｇ，２．５ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中に溶解した。ＤＩＰＥＡ（０．６５３ｍＬ，３．７ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を室温で２時間撹拌した。酢酸（１ｍＬ）の添加によって溶液を酸性化した。５ｃをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。収量：７７６ｍｇ（１．１３ｍｍｏｌ）
ＭＳ ｍ／ｚ ７０６．３＝［Ｍ＋Ｎａ］+（ＭＷ計算値＝７０６．３）
【０３２１】
実施例６
エキセンジンリンカー試薬６ｄの合成
エキセンジンリンカー試薬６ｄを、以下のスキーム従って合成した：
【化２８】
0005932796.tif 000029
【０３２２】
エキセンジンリンカー試薬中間体６ａの合成：
樹脂上の遊離Ｎ末端を有する、側鎖が完全に保護されたエキセンジン−４（２．００ｇ，０．２ｍｍｏｌ，約０．１ｍｍｏｌ／ｇ装填）を、フィルターフリットを備えた２０ｍＬ注射器に移した。無水ＤＭＦ ８ｍＬを注射器に吸い込み、そして樹脂を予め膨潤させるため、注射器を１５分間振盪（６００ｒｐｍ）させた。溶媒を捨て、そして無水ＤＭＦ（４ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｄ−アラニン−ＯＨ（１８７ｍｇ，０．６ｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（３１２ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（１７４μＬ，１．０ｍｍｏｌ）の溶液を注射器に吸い込んだ。注射器を室温及び６００ｒｐｍで６０分間振盪させた。溶液を排出し、そして樹脂をＤＭＦで１０回洗浄した。
“Materials and Methods”に従ってＦｍｏｃ−脱保護を実施した。
【０３２３】
エキセンジンリンカー試薬中間体６ｂの合成：
無水ＤＭＦ（３ｍＬ）中の５ｃ（１３７ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）の溶液、続いて無水ＤＭＦ（４．５ｍＬ）中のＤＩＰＥＡ（８０μＬ，０．４６ｍｍｏｌ）の溶液を樹脂６ａ（０．２ｍｍｏｌ）に加え、そして反応混合物を２２℃で１５時間振盪（６００ｒｐｍ）した。樹脂をＤＭＦで１０回、そしてＤＣＭで１０回洗浄し、そして真空で乾燥した。
【０３２４】
エキセンジンリンカー試薬中間体６ｃの合成：
６ｂ（０．０５ｍｍｏｌ，０．５ｇ）を含む注射器に３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニルクロリド（４８ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を入れた。無水ＤＣＭ（４ｍＬ）を注射器に吸い込み、そして混合物を室温で振盪（６００ｒｐｍ）した。２時間後、溶液を捨て、そして樹脂をＤＣＭで１４回洗浄し、そして真空で乾燥した。
【０３２５】
エキセンジンリンカー試薬中間体６ｄの合成：
丸底フラスコ中で、ｏ−クレゾール（１．５ｍＬ）、チオアニソール（１．５ｍＬ）、ＤＴＴ（１．１２５ｇ）、ＴＥＳ（１．１２５ｍＬ）及び水（１．５ｍＬ）をＴＦＡ（３７．５ｍＬ）中に溶解した。均一な懸濁液を得るため、室温で撹拌された（２５０〜３５０ｒｐｍ）溶液に６ｃ（０．１５ｍｍｏｌ，１．５ｇ）を加えた。撹拌を４５分間続けた。濾過によって樹脂ビーズから溶液を分離し、ビーズをＴＦＡで２回（それぞれ２ｍＬ）洗浄し、そして洗浄溶液を濾液と合わせた。窒素流れ中で、合わせた溶液からＴＦＡを除去した。
【０３２６】
ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を加えて激しく振盪することによって濃縮溶液（約１０ｍＬ）から粗物質６ｄを沈殿させた。遠心分離（２分、５０００ｒｐｍ）後、上澄みを捨て、そして沈殿をジエチルエーテルで２回（各２０ｍＬ）洗浄した。
【０３２７】
乾燥した沈殿を、０．０１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含むアセトニトリル／水１／１９（ｖ／ｖ）３０ｍｌ中のＴＣＥＰ（１１４ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）の溶液中に溶解した。混合物を、室温で１５時間定温放置した。１５０×３０ｍｍ Waters XBridgeTM BEH300 C18
１０μｍカラム及び４０ｍｌ／分の流量を用いてMaterials and Methodsに記載されたようにＲＰ−ＨＰＬＣによって６ｄを精製した。最大１２ｍＬの混合物をカラムに装填した。溶媒Ｂ５％から３０％までの直線勾配（５分）、続いて溶媒Ｂ３０％から３５％までの直線勾配（４０分）を用いて溶離を実施した。生成物６ｄを含む画分を貯めて凍結乾燥した。
純度：８６％（２１５ｎｍ）
収量：８５．２ｍｇ（１９．２μｍｏｌ，樹脂２．００ｇから出発）
ＭＳ ｍ／ｚ １４８６．７＝［Ｍ＋３Ｈ］3+，（ＭＷ計算値＝４４６０．０ｇ／ｍｏｌ）
【０３２８】
実施例７
エキセンジンリンカー試薬７の合成
【化２９】
0005932796.tif 000030
Ｆｍｏｃ−Ｄ−アラニン−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｌ−アラニン−ＯＨを使用したことを除いて、遊離Ｎ末端を有する樹脂上で側鎖が完全に保護されたエキセンジン−４（３３６ｍｇ，３４ｍｏｌ）から出発して、エキセンジンリンカー試薬６ａ〜６ｄについて記載されたようにエキセンジンリンカー試薬７を合成した。６ａ〜６ｄで用いたのと同じ比率を得るため、それに応じて試薬を計量した。
収量：１３．４ｍｇ
ＭＳ：ｍ／ｚ １４８７．４＝［Ｍ＋３Ｈ］3+（ＭＷ計算値：４４６０．０）
【０３２９】
実施例８
エキセンジンリンカーヒドロゲル８の合成
【化３０】
0005932796.tif 000031
マレイミド官能化ヒドロゲル４（マレイミド基２５．０μｍｏｌ）２４２．５ｍｇを、コハク酸バッファー（２０ｍＭ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）ｐＨ３．０中の懸濁液として、フィルターフリットを備えた注射器に充填した。ヒドロゲルを、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含むアセトニトリル／水１／１（ｖ／ｖ）で１０回洗浄した。アセトニトリル／水１／１（ｖ／ｖ）＋０．１％ＴＦＡ（３．７ｍＬ）中のエキセンジンリンカー試薬６ｄ（１２２．７ｍｇ，２７．５μｍｏｌ）の溶液を吸い込み、そして室温で２分間振盪させて平衡懸濁液を得た。リン酸バッファー（ｐＨ７，４、０．５Ｍ）３３４μＬを加え、そして注射器を室温で１５分間撹拌した（６００ｒｐｍ）。チオールの消費をエルマン試験によってモニターした。ヒドロゲルを、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含むアセトニトリル／水１／１（ｖ／ｖ）で１０回洗浄した。
【０３３０】
メルカプトエタノール（４７μＬ）を、アセトニトリル／水１／１（ｖ／ｖ）＋０．１％ＴＦＡ（３ｍＬ）及びリン酸バッファー（０．５ｍＬ，ｐＨ７．４，０．５Ｍ）中に溶解した。溶液を注射器に吸い込み、そしてサンプルを室温で１時間撹拌（６００ｒｐｍ）した。溶液を捨て、そしてヒドロゲルをアセトニトリル／水１／１（ｖ／ｖ）＋０．１％ＴＦＡで１０回洗浄した。ヒドロゲルをコハク酸バッファー（１０ｍＭコハク酸塩，４６ｇ／Ｌマンニトール，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴｒｉｓでｐＨ５．０に調整した）で１０回洗浄した後、そして４℃で保存した。
【０３３１】
エキセンジンリンカーヒドロゲルのエキセンジン含量を、Materials and Methodsに従って決定した。
エキセンジン含量３０％（質量）を得た。
【０３３２】
実施例９
in vitro放出動態
エキセンジンリンカーヒドロゲル８（０．５ｍｇエキセンジン）のアリコートを、フィルターフリットを備えた注射器に移し、そしてリン酸バッファー（６０ｍＭ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）ｐＨ７．４で５回洗浄した。ヒドロゲルを同じバッファー中に懸濁し、そして３７℃で定温放置した。所定の時点で（それぞれ定温放置１〜７日後）、上澄みを交換し、そして遊離されたエキセンジンを２１５ｎｍでＲＰ−ＨＰＬＣによって定量化した。遊離エキセンジンに関連するＵＶ−シグナルを積分し、そして定温放置時間に対してプロットした。曲線適合ソフトウェアを適用して対応する放出半減期を算定した。半減期４５日の一次放出動態を得た（図１参照）。
【０３３３】
実施例１０
エキセンジンリンカーヒドロゲル１０の合成
【化３１】
0005932796.tif 000032
エキセンジンリンカーチオール６ｄの代わりにエキセンジンリンカーチオール７を使用したことを除いて、エキセンジンリンカーヒドロゲル８について記載されたように、エキセンジンリンカーヒドロゲル１０を合成した。
【０３３４】
エキセンジンリンカーヒドロゲルのエキセンジン含量を、Materials and Methodsに従って決定した。エキセンジン含量３０．５％（質量）を得た。
【０３３５】
実施例１１
リキシセナチドリンカー試薬１１ｄの合成
【化３２】
0005932796.tif 000033
【０３３６】
合成スキーム：
【化３３】
0005932796.tif 000034
【０３３７】
リキシセナチドリンカー試薬中間体１１ａの合成：
遊離Ｎ末端を有する樹脂上で側鎖を完全に保護されたリキシセナチド（３００ｍｇ，約０．１ｍｍｏｌ／ｇ装填）を、フィルターフリットを備えた５ｍＬ注射器に移した。無水ＤＭＦ４ｍＬを注射器に吸い込み、そして樹脂を予め膨潤させるため、注射器を１５分間振盪（６００ｒｐｍ）させた。溶媒を捨て、そして無水ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｄ−アラニン−ＯＨ（２８ｍｇ，９０μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（４７ｍｇ，９０μｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（２６μＬ，１５０μｍｏｌ）の溶液を注射器に吸い込んだ。注射器を室温及び６００ｒｐｍで６０分間振盪させた。溶液を排出し、そして樹脂をＤＭＦで１０回洗浄した。
Ｆｍｏｃ−脱保護を、“Materials and Methods”に従って実施した。
【０３３８】
リキシセナチドリンカー試薬中間体１１ｂの合成：
無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の５ｃ（４１ｍｇ，６０μｍｏｌ）の溶液を、樹脂１１ａ（３０μｍｏｌ）に加え、続いてＤＩＰＥＡ（１３μＬ，７５μｍｏｌ）を加え、そして均質化された反応混合物を２２℃で２２時間振盪（６００ｒｐｍ）した。
樹脂をＤＭＦで１０回、そしてＤＣＭで１０回洗浄し、そして真空で乾燥した。
【０３３９】
リキシセナチドリンカー試薬中間体１１ｃの合成：
１１ｂを含む、フィルターフリットを備えた注射器に、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニルクロリド（３８ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）を入れた。無水ＤＣＭ（２ｍＬ）を注射器に吸い込み、そして混合物を室温で振盪（６００ｒｐｍ）した。３．５時間後、溶液を捨て、そして樹脂をＤＣＭで１５回洗浄し、そして真空で乾燥した。
【０３４０】
リキシセナチドリンカー試薬１１ｄの合成：
５０ｍＬ−ファルコンチューブ中で、ＮＢｕ4Ｂｒ（２．９ｍｇ）、チオアニソール（５８．３μＬ）、ＤＴＴ（１７０ｍｇ）、ＴＥＳ（１７０μＬ）、及び水（１１３．３μＬ）をＴＦＡ（５．８３ｍＬ）中に溶解した。均一な懸濁液を得るため、室温で撹拌（２００ｒｐｍ）された溶液に１１ｃ（３０μｍｏｌ）を加えた。撹拌を１時間続けた。ビーズを濾過し、そしてＴＦＡで２回（各１ｍＬ）洗浄した。洗浄溶液を濾液と合わせた。
【０３４１】
冷ジエチルエーテル（−１８℃，４０ｍＬ）を加えて激しく振盪することによって濾液（約１０ｍＬ）から粗物質１１ｄを沈殿させた。懸濁液を−１８℃でさらに１５分間冷却し、そして遠心分離した（２分，５０００ｒｐｍ）。上澄みを捨て、そして沈殿をジエチルエーテルで２回（各２０ｍＬ）洗浄し、そして減圧下で乾燥した。沈殿を、０．０１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含むアセトニトリル／水１／１（ｖ／ｖ）２．５ｍｌ中のＴＣＥＰ（２７ｍｇ，０．９４μｍｏｌ）の溶液に溶解した。混合物を室温で１５時間定温放置した。水２０ｍＬを加え、そして溶媒Ｂ５％から３０％（５分）の直線勾配、続いて溶媒Ｂ３０％から３５％まで（４０分）の直線勾配を用いることにより２つのランでＲＰ−ＨＰＬＣによって１１ｄを精製した。１５０×３０ｍｍ Waters XBridgeTM BEH300 C18 １０μｍカラム及び４０ｍｌ／分の流量を用いた。生成物１１ｄを含む画分を貯め、そして凍結乾燥した。
収量６．１ｍｇ
ＭＳ：ｍ／ｚ １２８４．３＝［Ｍ＋４Ｈ］4+（ＭＷ計算値＝５１３１．９）
【０３４２】
実施例１２
リキシセナチドリンカーヒドロゲル１２の合成
【化３４】
0005932796.tif 000035
エキセンジンリンカーチオール６ｄの代わりにリキシセナチドリンカーチオール１１ｄを使用したことを除いて、エキセンジンリンカーヒドロゲル８について記載されたように、リキシセナチドリンカーヒドロゲル１２を合成した。
【０３４３】
リキシセナチドリンカーヒドロゲルのリキシセナチド含量を、Materials and Methods.に従って決定した。リキシセナチド含量３２．４％を得た。
【０３４４】
実施例１３
リキシセナチドリンカー試薬１３の合成
【化３５】
0005932796.tif 000036
Ｆｍｏｃ−Ｄ−アラニン−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｌ−アラニン−ＯＨを使用したことを除いて、遊離Ｎ末端を有する樹脂上で側鎖を完全に保護されたリキシセナチド（３３５ｍｇ，３４μｍｏｌ）から出発して、リキシセナチドリンカー試薬１１ａ〜１１ｄについて記載されたように、リキシセナチドリンカー試薬１３を合成した。１１ａ〜１１ｄで用いたのと同じ比率を得るためにそれに応じて試薬を計量した。
収量７．３ｍｇ
ＭＳ：ｍ／ｚ １２８３．９＝［Ｍ＋４Ｈ］4+（ＭＷ計算値＝５１３１．９）
【０３４５】
実施例１４
リキシセナチドリンカーヒドロゲル１４の合成
【化３６】
0005932796.tif 000037
エキセンジンリンカーチオール６ｄの代わりにリキシセナチドリンカーチオール１３を使用したことを除いて、エキセンジンリンカーヒドロゲル８について記載されたように、リキシセナチドリンカーヒドロゲル１４を合成した。
【０３４６】
リキシセナチドリンカーヒドロゲルのリキシセナチド含量を、Materials and Methodsに従って決定した。リキシセナチド含量３４．５％（質量）を得た。
【０３４７】
ＧＬＰ−１リンカー試薬１５の合成
【化３７】
0005932796.tif 000038
樹脂上のエキセンジンの代わりに、遊離Ｎ末端を有する樹脂上で側鎖を完全に保護されたＧＬＰ−１（２５８ｍｇ，３０μｍｏｌ）から出発したことを除いて、リキシセナチドリンカー試薬１１ａ〜１１ｄについて記載されたように、ＧＬＰ−１リンカー試薬１５を合成した。１１ａ〜１１ｄに用いたのと同じ比率を得るため、それに応じて試薬を計量した。
収量５．０ｍｇ
ＭＳ：ｍ／ｚ １１９１．４＝［Ｍ＋３Ｈ］3+（ＭＷ計算値＝３５７１．１）
【０３４８】
実施例１６
ＧＬＰ−１リンカーヒドロゲル１６の合成
【化３８】
0005932796.tif 000039
エキセンジンリンカーチオール６ｄの代わりにＧＬＰ−１リンカーチオール１５を使用したことを除いて、エキセンジンリンカーヒドロゲル８について記載されたように、ＧＬＰ−１リンカーヒドロゲル１６を合成した。
【０３４９】
ＧＬＰ−１リンカーヒドロゲルのＧＬＰ−１含量をMaterials and Methodsに従って決定した。ＧＬＰ−１含量２６．３％（質量）を得た。
【０３５０】
実施例１７
in vitro放出動態
ｐＨ７．４、３７℃での、ヒドロゲル１０からエキセンジンの、ヒドロゲル１２及び１４からリキシセナチドの、並びにヒドロゲル１６からＧＬＰ−１の放出半減期を実施例９に記載されたように決定した。化合物８、１０、１２、１４及び１６の放出動態を図１に示す。
【０３５１】
【表１】
0005932796.tif 000040
【０３５２】
実施例１８
リンカー試薬１８ｅの合成
リンカー試薬１８ｅを、以下のスキームに従って合成した：
【化３９】
0005932796.tif 000041
【０３５３】
リンカー試薬中間体１８ｂの合成は、窒素雰囲気下で実施した。ＴＨＦ（乾燥、モレキュラーシーブ（mol. sieve））３０ｍＬ中のアミン１８ａ（１．６９ｇ，４．５ｍｍｏｌ，製造についてはＷＯ−Ａ ２００９／１３３１３７を参照のこと）の溶液を０℃に冷却した。ＴＨＦ（乾燥、モレキュラーシーブ）３ｍＬ中のクロロギ酸ブチル（６３０μｌ，４．９５ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（９８０μｌ，５．６３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を０℃で１０分間撹拌し、冷却をはずし、そして混合物を室温でさらに２０分間撹拌した。ＴＨＦ中の１Ｍ ＬｉＡｌＨ４（９ｍＬ，９ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を１．５時間還流させた。メタノール（１１ｍＬ）及び飽和Ｎａ／酒石酸カリウム溶液１００ｍＬをゆっくり加えることによって反応をクエンチした。混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、そして溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物１８ｂ（１．９７ｇ）をさらに精製することなく次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ ３９０．２＝［Ｍ＋Ｈ］+（ＭＷ計算値＝３８９．６）
【０３５４】
アセトニトリル１２０ｍＬ中の粗生成物１８ｂ（１．９７ｇ）、Ｎ−（ブロモエチル）−フタルイミド（１．４３ｇ，５．６３ｍｍｏｌ）及びＫ2ＣＯ3（１．２４ｇ，９．０ｍｍｏｌ）の溶液を６時間還流させた。飽和ＮａＨＣＯ3溶液６０ｍＬを加え、そして混合物を酢酸エチルで３×抽出した。合わせた有機物を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）し、そして溶媒を減圧下で除去した。溶離液としてヘプタン（０．０２％ＮＥｔ3を含む）及び漸増量（ascending amount）の酢酸エチル（０．０２％ＮＥｔ３を含む）を用いることによりシリカ上でフタルイミド１８ｃを精製した。
収率：０．８２ｇ（１．４６ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ５６３．３＝［Ｍ＋Ｈ］+（ＭＷ計算値＝５６２．８）
【０３５５】
フタルイミド１８ｃ（８１９ｍｇ，１．４６ｍｍｏｌ）をエタノール３５ｍＬ中に溶解し、そしてヒドラジン水和物（１７６μｌ，３．６４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３時間還流させた。沈殿を濾過した。溶媒を減圧下で除去し、そして残留物をジクロロメタン１５ｍＬで処理された。沈殿を濾過し、そしてジクロロメタンを減圧下で除去した。残留物をＲＰ ＨＰＬＣによって精製した。貯めたＨＰＬＣ画分にＮａＨＣＯ3を加えてｐＨ７に調整し、そしてジクロロメタンで数回抽出した。合わせた有機物を乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）し、そして溶媒を減圧下で除去してアミン１８ｄを得た。
収量：５７９ｍｇ（１．３４ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ４３３．３＝［Ｍ＋Ｈ］+（ＭＷ計算値＝４３２．７）
【０３５６】
パラ−ニトロフェニルクロロホルメート（４８３ｍｇ，２．４０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（乾燥、モレキュラーシーブ）１０ｍＬ中に溶解した。ジクロロメタン（乾燥、モレキュラーシーブ）５ｍＬ及び合成コリジン１．８ｍＬ中のアミン１８ｄ（１．００ｇ，２．３１ｍｍｏｌ）の溶液を加え、そして混合物を室温で４０分間撹拌した。ジクロロメタンを減圧下で除去し、残留物を酢酸で酸性化し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣにより精製してパラ−ニトロフェニルカルバメート１８ｅを得た。
収量：３３９ｍｇ（０．５７ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ５９８．３＝［Ｍ＋Ｈ］+（ＭＷ計算値＝５９７．８）
【０３５７】
ＧＬＰ−１リンカー試薬１９の合成
【化４０】
0005932796.tif 000042
遊離Ｎ末端を有する樹脂上で側鎖を完全に保護されたＧＬＰ−１（１５０ｍｇ，１６．５μｍｏｌ）から出発して、リンカー試薬５ｃの代わりにリンカー試薬１８ｅを使用したことを除いて、ＧＬＰ−１リンカー試薬１５について記載されたように、ＧＬＰ−１リンカー試薬１９を合成した。１１ａ〜１１ｄに用いたのと同じ比率を得るため、それに応じて試薬を計量した。
収量１．３３ｍｇ
ＭＳ：ｍ／ｚ １１９６．０＝［Ｍ＋３Ｈ］3+（ＭＷ計算値＝３５８５．１）
【０３５８】
実施例２０
ＧＬＰ−１リンカーヒドロゲル２０の合成
【化４１】
0005932796.tif 000043
エキセンジンリンカーチオール６ｄの代わりにＧＬＰ−１リンカーチオール１９を使用したことを除いて、エキセンジンリンカーヒドロゲル８について記載されたように、ＧＬＰ−１リンカーヒドロゲル２０を合成した。
【０３５９】
略語：
ＡｃＯＨ                    酢酸
ＡｃＯＥｔ                  酢酸エチル
Ｂｎ                        ベンジル
Ｂｏｃ                      ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＢＵ                      １,３−ジアザビシクロ［５.４.０］ウンデセン
ＤＣＣ                      Ｎ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ                      ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ                  ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ                    ジメチルアミノ−ピリジン
ＤＭＦ                      Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ                    ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ                      ＤＬジチオトレイトール
ＥＤＣ                      １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＤＴＡ                    エチレンジアミン四酢酸
ｅｑ                        化学量論的当量
ＥｔＯＨ                    エタノール
Ｆｍｏｃ                    ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＰＬＣ                    高性能液体クロマトグラフィ
ＨＯＢｔ                    Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ｉＰｒＯＨ                  ２−プロパノール
ＬＣＭＳ                    質量分析連動液体クロマトグラフィー
Ｍａｌ                      ３−マレイミドプロピル
Ｍａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳ    Ｎ−（３−マレイミドプロピル）−２１−アミノ−４,７,１０,１３,１６,１９−ヘキサオキサ−ヘンエイコサン酸ＮＨＳエステル
Ｍｅ                        メチル
ＭｅＯＨ                    メタノール
Ｍｍｔ                      ４−メトキシトリチル
ＭＳ                        質量スペクトル／質量分析
ＭＴＢＥ                    メチルｔｅｒｔ．−ブチルエーテル
ＭＷ                        分子量
ＮＨＳ                      Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＰＥＧ                      ポリ（エチレングリコール）
ＰｙＢＯＰ                  ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｐｈｔｈ                    フタルイミド
ＲＰ−ＨＰＬＣ              逆相高性能液体クロマトグラフィー
ｒｐｍ                      １分当たりの回転
ＲＴ                        室温
ＳＥＣ                      サイズ排除クロマトグラフィー
ＴＣＥＰ                    トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩
ＴＥＳ                      トリエチルシラン
ＴＦＡ                      トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ                      テトラヒドロフラン
ＴＭＥＤＡ                  Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン
Ｔｒｉｓ                    トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
Ｔｒｔ                      トリフェニルメチル、トリチル
ＵＰＬＣ                    超高性能液体クロマトグラフィー
Ｖ                          体積
【図１】
0005932796.tif 000056
【配列表】
0005932796000001.app