(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＳＫ９に特異的に結合し、配列番号４もしくは配列番号５で示されるＶＨアミノ酸配列の重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を包含し、配列番号３で示されるＶＬアミノ酸配列の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を包含する、単離された抗体。
【請求項２】
ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号６で示されるアミノ酸配列を有し、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号７で示されるアミノ酸配列を有し、ＶＨ  ＣＤＲ３が配列番号８または９で示されるアミノ酸配列を有し、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有し、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有し、ＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
ＶＨ  ＣＤＲ３が配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
ＶＨ領域が配列番号４または配列番号５を包含し、ＶＬ領域が配列番号３を包含する、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項５】
ＶＨ領域が配列番号５を包含する、請求項４に記載の単離された抗体。
【請求項６】
ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４７またはＰＴＡ−１０５４８および／またはＰＴＡ−１０５４９を有するプラスミドによってコードされている、抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
治療上効果的な量の請求項１から６のいずれかに記載の抗体を包含する医薬組成物。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の抗体を組換えにより産生する宿主細胞。
【請求項９】
請求項１から６のいずれかに記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項１０】
ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４７またはＰＴＡ−１０５４８および／またはＰＴＡ−１０５４９を有する、単離されたプラスミド。
【請求項１１】
それを必要とする対象の血液におけるＬＤＬコレステロールのレベルを低減させるための、治療上効果的な量の請求項１から６に記載の抗体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドソームのｐＨ／生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ５．５／ｐＨ７．４またはｐＨ６．０／ｐＨ７．４）でのＫＤ比率および／またはｋｏｆｆ比率が２以上となるようなｐＨ依存性の結合を有する抗体、例えば、完全長抗体またはその抗原結合部分に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、多くの疾患で、重要な治療の選択肢となっている（ＢｒｅｋｋｅおよびＳａｎｄｌｉｅ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２：５２〜６２、２００３；Ｍａｇｇｏｎ、Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １４：１９７８〜１９８７、２００７）。現在市場に出ているｍＡｂのほとんどは、ＩｇＧ抗体である。これらの比較的長い半減期は、ＦｃＲｎ結合によって仲介される。細胞内へのＩｇＧの取り込みは、液相ピノサイトーシスを介して生じ、ＩｇＧはその後、エンドソーム区画の酸性化された環境（ｐＨ６．０）でＦｃＲｎに結合する（Ｌｏｂｏら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９３：２６４５〜２６６８、２００４）。ＦｃＲｎに結合したＩｇＧは、中性ｐＨが循環内へのＩｇＧの解離および放出を促進する細胞表面へリサイクリングされることによって、分解から保護されると考えられている。結合していないＩｇＧは、逆に、リソソームに運ばれ、その後分解されると考えられている（ＬｅｎｃｅｒおよびＢｌｕｍｂｅｒｇ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５：１５：５〜９、２００５）。
【０００３】
近年、特異的置換の導入によってＩｇＧ抗体の機能的活性を最適化するための様々な技術が、用量および／または投与頻度を低減させるため、ならびに有効性および安全性を向上させるために適用されている（Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０：４６０〜４７０、２００８）。通常、ＩｇＧ抗体の最適化は、ＦｃＲｎ、ＦｃγＲ、および補体系への抗体の結合に影響を与えるためのＦｃ定常領域の操作、ならびに結合親和性に影響を与えるための可変領域の操作に分類することができる。
【０００４】
いくつかの研究が、Ｆｃγ受容体への結合を増大させ、したがってＩｇＧ１抗体のエフェクター機能を強化するための、定常領域の操作について記載している（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：８８８２〜８８９０、２００７；Ｚａｌｅｖｓｋｙら、Ｂｌｏｏｄ  １１３：３７３５〜３７４３、２００９）。ＩｇＧ１内へのＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０ＬまたはＦ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌなどの置換は、Ｆｃγ受容体ＩＩＩａの結合を向上させることおよび野生型ＩｇＧ１と比較してインビトロでの優れた抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性およびインビボでの優れた有効性を示すことが示されている。したがって、野生型抗体と比較して、このような置換を有する抗体は、同一の用量で優れた有効性を示すか、または低用量でおよび／もしくはヒトへの低頻度の投与で同等の有効性を示すことが期待される。
【０００５】
用量および／または投与頻度を減らすための別の方法は、ＩｇＧ抗体の排出を低減させることである。ＩｇＧ抗体の長い半減期は、ＦｃＲｎへのその結合に依存することが報告されている。したがって、定常領域を操作することによる、相互作用のｐＨ依存性を維持しながらｐＨ６．０でのＦｃＲｎへのＩｇＧの結合親和性を増大させる置換が、広く研究されている（Ｇｈｅｔｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：６３７〜６４０、１９９７；Ｈｉｎｔｏｎら、ＪＢＣ  ２７９：６２１３〜６２１６、２００４；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１７：１１２９〜１１３８、２００６）。Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓなどの置換は、変異体において、半減期を延ばし、薬力学的効果を増大させた（Ｚａｌｅｖｓｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１５７〜１５９、２０１０）。いくつかの研究が、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８ＬまたはＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅなどの置換を導入して酸性ｐＨでのＦｃＲｎへの結合を増大させることによって、半減期を増大させることに成功したことを報告している。非ヒト霊長類の薬物動態学的研究において、ＩｇＧ１に対するＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ置換は、３５日の半減期を示し、これは、野生型ＩｇＧ１の１４日間の半減期より大幅に増大している（Ｈｉｎｔｏｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：３４６〜３５６、２００６）。
【０００６】
定常領域における置換は、治療的ＩｇＧ抗体の機能を顕著に向上させ得るが、完全に保存された定常領域における置換は、ヒトにおける免疫原性のリスクを有し（上記のＰｒｅｓｔａ、２００８；Ｄｅ  ＧｒｏｏｔおよびＭａｒｔｉｎ、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３１：１８９〜２０１、２００９）、多様性の高い可変領域配列における置換は、免疫原性が低い可能性がある。可変領域に関する報告には、抗原への結合親和性を向上させるためのＣＤＲ残基の操作（Ｒｏｔｈｅら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ６：１７７〜１８７、２００６；Ｂｏｓｔｒｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５２５：３５３〜３７６、２００９；Ｔｈｉｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５２５：３０９〜３２２、２００９）、ならびに安定性を向上させるためのＣＤＲ残基およびフレームワーク残基の操作（ＷｏｒｎおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０５：９８９〜１０１０、２００１；Ｅｗｅｒｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４：１８４〜１９９、２００４）、ならびに免疫原性リスクの低下（上記のＤｅ  ＧｒｏｏｔおよびＭａｒｔｉｎ、２００９；Ｊｏｎｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ  ５２５：４０５〜４２３、ｘｉｖ、２００９）が含まれる。報告されているように、抗原への親和性の向上は、ランダム化ライブラリーのファージディスプレイまたはリボソームディスプレイを用いる親和性突然変異によって達成することができる。安定性の向上は、配列に基づく、および構造に基づく合理的設計から、合理的に得ることができる。免疫原性リスクの低下（脱免疫化）は、インシリコ技術を用いて予測され得るかまたはインビトロアッセイによって決定され得る、様々なヒト化方法およびＴ細胞エピトープの除去によって達成することができる。さらに、可変領域が、ｐＩを低下させるように設計されている。長い半減期が、野生型抗体と比較して、同等のＦｃＲｎ結合にもかかわらず、これらの抗体で観察された（Ｉｇａｗａら、ＰＥＤＳ、Ａｄｖａｎｃｅ  Ａｃｃｅｓｓ、ｄｏｉ：１０．１０９３／Ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｑ００９、２０１０）。
【０００７】
本発明は、抗体および／または抗原の半減期を変化させるための、ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗体の操作または選択に関する。抗原介在性のクリアランス機構が、抗原に結合している場合に抗体を正常に分解すると、ＩｇＧ２抗体の半減期は短縮され得る。同様に、抗原：抗体複合体は抗原の半減期に影響し得、典型的な分解プロセスから抗原を保護することによって半減期を延長するか、または抗体介在性の分解を介して半減期を短縮する。本発明は、ｐＨ５．５／ｐＨ７．４またはｐＨ６．０／ｐＨ７．４でのＫＤ比率が２以上となるような、エンドソームのｐＨ（すなわち、ｐＨ５．５〜６．０）と比較してｐＨ７．４で抗原への高い親和性を有する抗体に関する。
【０００８】
本発明は、抗原へのこのようなｐＨ依存性の結合を有する抗体、ならびにこのような抗体を設計、作製、および使用する方法に関する。有用な抗体の例は、ＮＡＲＣ−１としても知られている前駆タンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、ＩｇＥ、ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）、補体５（Ｃ５）、スクレロスチン（ＳＯＳＴ）、およびＧＭＣＳＦ受容体などの抗原を標的化する。
【０００９】
ＰＣＳＫ９は、一部の形態の家族性高コレステロール血症において遺伝子突然変異を有するタンパク質であると同定された。ＰＣＳＫ９は、小胞体において特定のモチーフで自己触媒性のプロセシングを受ける酵素前駆体として合成される。集団研究は、一部のＰＣＳＫ９突然変異が「機能獲得型」であり、常染色体優性の高コレステロール血症を有する個体において見られるが、他の「機能喪失型」（ＬＯＦ）突然変異は血漿コレステロールの低減に関連していることを示している。この群における罹患率および死亡率の研究は、ＰＣＳＫ９機能の低減が、心血管疾患のリスクを顕著に低下させることを明らかに実証した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、生理学的なｐＨ（すなわち、ｐＨ７．４）での抗原結合に対する親和性がエンドソームのｐＨ（すなわち、ｐＨ６．０または５．５）を超えるような、抗原へのｐＨ依存性の結合を有する抗体に関する。言い換えると、ｐＨ５．５／ｐＨ７．４またはｐＨ６．０／ｐＨ７．４でのＫＤ比率またはｋｏｆｆ比率は、２、３、４、８、１０、１６、２０、３０、４０、または１００以上を超えるか、またはこの間の範囲である。このようなｐＨ依存性の抗体は、エンドソームにおいて抗原から優先的に解離する。これは、抗原が抗原介在性のクリアランスを受けるものである場合（例えば、ＰＣＳＫ９）、ｐＨ７．４で同等のＫＤを有するがｐＨ依存性の結合は有さない抗体と比較して、抗体半減期を増大させ得る。ｐＨ依存性の結合を有する抗体は、抗原が抗体に結合している場合に低減したクリアランスを受ける場合（例えば、ＩＬ６）、全抗原半減期を減少させ得る。ｐＨ依存性の結合を有する抗体はまた、抗体に結合していない抗原の、抗体介在性の減少を引き延ばし得る。これは、典型的には高レベルで存在する標的抗原（例えば、ＩｇＥ、ＤＫＫ１、Ｃ５、およびＳＯＳＴ）と拮抗する場合に重要であり得る。さらに、このような抗体は、抗原が受容体であり、受容体が、抗体に結合している場合に増大したクリアランスを有する場合（例えば、ＧＭＣＳＦ受容体）、抗原の半減期を増大させ得る。以下に記載される本発明のあらゆる実施形態において、ＫＤおよびｋｏｆｆは、２５℃または３７℃で測定され得る。
【００１２】
好ましい実施形態において、ｐＨ依存性の結合を有する抗体は、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４で高い親和性で抗原に特異的に結合し、ｐＨ６．０／ｐＨ７．４および２５℃でのＫＤ比率および／またはｋｏｆｆ比率は、２、３、４、８、１０、１６、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、抗体は、ｐＨ７．４で抗原に対する類似の親和性を有するが２未満であるｐＨ６．０／ｐＨ７．４での比較ＫＤ比率および／またはｋｏｆｆ比率を有する、ｐＨ依存性の結合を有さない抗体と比較して、前記抗原に曝露された場合にインビボでの低減した血漿クリアランスを有する。好ましくは、抗原は、インターロイキン−６受容体（ＩＬ６Ｒ）ではないか、または好ましくは、ＷＯ２０１０／１０６８１２またはＷＯ２００９／０４１６２１において開示されているように、抗体は、抗ＩＬ６Ｒ抗体Ｆｖ３−ｍ７３、Ｆｖ４−ｍ７３、もしくはＨ３ｐＩ／Ｌ７３ではない。
【００１３】
別の好ましい実施形態において、ｐＨ依存性の結合を有する抗体は、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４で高い親和性で抗原に特異的に結合し、ｐＨ６．０／ｐＨ７．４および２５℃でのＫＤ比率および／またはｋｏｆｆ比率は、２、３、４、８、１０、１６、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、抗体は、膜に結合しており、かつインビボで可溶性であり、抗体は、ｐＨ７．４で抗原に対する類似の親和性を有するが２未満であるｐＨ６．０／ｐＨ７．４での比較ＫＤ比率および／またはｋｏｆｆ比率を有する抗体と比較して、細胞膜受容体への増大した局在化を仲介する。好ましくは、抗原は、ＩＬ６Ｒではないか、または好ましくは、ＷＯ２０１０／１０６８１２またはＷＯ２００９／０４１６２１において開示されているように、抗体は、抗ＩＬ６Ｒ抗体Ｆｖ３−ｍ７３、Ｆｖ４−ｍ７３、もしくはＨ３ｐＩ／Ｌ７３ではない。別の好ましい実施形態において、抗原は、非シグナル伝達デコイである可溶性受容体である。さらに他の好ましい実施形態において、ｐＨ依存性の結合を有する抗体は、抗体薬剤コンジュゲートであり、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を仲介する。
【００１４】
本発明は、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４で高い親和性で抗原に特異的に結合する、ｐＨ依存性の結合を有する抗体であって、ｐＨ６．０／ｐＨ７．４および２５℃でのＫＤ比率および／またはｋｏｆｆ比率が２、３、４、８、１０、１６、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、ｐＨ７．４で抗原に対する類似の親和性を有するが２未満であるｐＨ６．０／ｐＨ７．４での比較ＫＤ比率および／またはｋｏｆｆ比率を有する、ｐＨ依存性の結合を有さない抗体と比較して、前記抗体に曝露された場合に、抗体に結合していない抗原のインビボでの量の減少が引き延ばされる、抗体を含む。
【００１５】
本発明は、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４で高い親和性で抗原に特異的に結合する、ｐＨ依存性の結合を有する抗体であって、ｐＨ６．０／ｐＨ７．４および２５℃でのＫＤ比率および／またはｋｏｆｆ比率が２、３、４、８、１０、１６、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、ｐＨ７．４で抗原に対する類似の親和性を有するが２未満であるｐＨ６．０／ｐＨ７．４での比較ＫＤ比率および／またはｋｏｆｆ比率を有する、ｐＨ依存性の結合を有さない抗体と比較して、抗体に結合している抗原のインビボでの量が減少する、抗体を提供する。好ましい実施形態において、抗原はオステオポンチンである。
【００１６】
本発明はまた、ｐＨ６．０よりもｐＨ７．４で高い親和性で抗原に特異的に結合する、ｐＨ依存性の結合を有するアゴニスト抗体であって、ｐＨ６．０／ｐＨ７．４および２５℃でのＫＤ比率および／またはｋｏｆｆ比率が２、３、４、８、１０、１６、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であり、抗原が受容体であり、受容体が、ｐＨ７．４で受容体に対する類似の親和性を有するが２未満であるｐＨ６．０／ｐＨ７．４での比較ＫＤ比率および／またはｋｏｆｆ比率を有する抗体と比較して、前記抗体に曝露された場合にインビボでの低減したクリアランスを有する、抗体を提供する。好ましい実施形態において、受容体はＧＭＣＳＦ受容体である。
【００１７】
あらゆる前述の抗体の他の好ましい実施形態において、ｐＨ６．０／ｐＨ７．４でのＫＤ比率またはｋｏｆｆ比率は、２０、３０、４０、または１００以上を超えるか、またはこの間の範囲である。他の好ましい実施形態において、ｐＨ６．０／ｐＨ７．４での好ましいＫＤ比率またはｋｏｆｆ比率は、２〜３、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、もしくは２〜２０以上、または３〜４、３〜８、３〜１０、３〜１６、もしくは３〜２０、または４〜８、４〜１０、４〜１６、もしくは４〜２０以上、または８から１０、８〜１６、８〜２０以上、１０〜１６、１０〜２０以上、または１６〜２０以上の範囲である。
【００１８】
先に記載された抗体の他の好ましい実施形態において、ｐＨ７．４および２５℃での抗原への抗体の結合は、約０．０１ｎＭから約１００ｎＭ、またはさらに好ましくは約０．１ｎＭから約１０ｎＭのＫＤを有する。
【００１９】
先に記載された抗体の他の好ましい実施形態において、ｐＨ７．４での抗原への抗体の結合は、約１×１０Ｅ−４ｓ−１から約１×１０Ｅ−１ｓ−１、さらに好ましくは、約１×１０Ｅ−３ｓ−１から約１×１０Ｅ−１ｓ−１のｋｏｆｆを有する。
【００２０】
先に記載された抗体の別の好ましい実施形態において、抗原はＰＣＳＫ９である。１つの好ましい実施形態において、抗ＰＣＳＫ９抗体は、ＰＣＳＫ９抗体Ｈ１Ｍ３００Ｎではない（ＵＳ２０１０／０１６６７６８を参照されたい）。他の好ましい実施形態において、抗原は、ＩｇＥ、Ｃ５、またはＤＫＫ１であり、好ましい実施形態において、ＫＤは、１．０ｎＭから約１０ｎＭの間または１．０ｎＭから約１００ｎＭの間の範囲である。
【００２１】
本発明はまた、治療用抗体で患者を治療するための間隔投与を延長する方法および／または治療用量を減少させる方法を提供し、前記方法は、治療上効果的な量の、本発明の先に記載された抗体のいずれかの抗体を患者に投与するステップを包含し、前記抗体は、ｐＨ７．４で類似の親和性を有するが２未満であるｐＨ６．０／７．４および２５℃でのＫＤ比率および／またはｋｏｆｆ比率を有する抗体と比較して、延長された薬力学的効果および／または半減期を有する。
【００２２】
また、ｐＨ依存的に抗体結合親和性を調節することによって引き延ばされた半減期および／または薬力学的効果を有する抗体を作製する方法が、本発明によって考慮され、前記方法は、抗体抗原結合が、２、３、４、８、１０、１６、またはそれ以上を超えるか、またはこの間の範囲であるｐＨ６．０／ｐＨ７．４でのＫＤ比率および／またはｋｏｆｆ比率を有するように、ｐＫａに影響する微小環境を最適化する抗体ＣＤＲのヒスチジン残基または他の残基を選択するステップを包含する。本発明はまた、ｐＫａに影響する微小環境を最適化するＣＤＲ残基内に１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のヒスチジン置換を有する抗体を含む、この方法によって作製される抗体を考慮する。
【００２３】
上記の方法の好ましい実施形態において、本方法は、抗体に突然変異を誘発して、２５℃で測定すると少なくとも１００ｎＭのｐＨ７．４でのＫＤを有する抗体親和性を達成するステップをさらに包含する。別の実施形態において、本発明は、ｐＫａに影響する微小環境を最適化するＣＤＲ残基または他の残基においてヒスチジンに富む抗体ライブラリーを提供する。
【００２４】
他の好ましい実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９に特異的に結合し、配列番号４もしくは配列番号５で示されるＶＨアミノ酸配列の重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を包含する、単離された抗体、または、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３に１個、２個、３個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体を提供する。
【００２５】
好ましい実施形態において、抗体は、配列番号３で示されるＶＬアミノ酸配列の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３をさらに包含し、または、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３に１個、２個、３個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体である。
【００２６】
本発明はまた、ＰＣＳＫ９に特異的に結合し、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、および／もしくは配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を包含する、単離された抗体、または、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３に１つまたは複数の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体、ならびに、ＰＣＳＫ９に特異的に結合し、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、および／もしくは配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を包含する、単離された抗体、または、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３に１個、２個、３個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体を提供する。
【００２７】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、および／もしくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を包含する、単離された抗体、または、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３に１個、２個、３個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体を考慮する。
【００２８】
上記の好ましい実施形態において、抗体は、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、および／または配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３をさらに包含し、または、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／もしくはＣＤＲ３に１個、２個、３個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体であり、好ましくは、ＶＨ領域は配列番号４または配列番号５を包含し、ＶＬ領域は、配列番号３を包含し、または配列番号４、配列番号５、および／もしくは配列番号３において１個、２個、３個、もしくはそれ以上の保存的なアミノ酸置換を有するその変異体である。
【００２９】
本発明のＰＣＳＫ９抗体の別の好ましい実施形態において、抗体は、１つまたは複数のＦｃ突然変異、好ましくは、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ｈ、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｈ二重突然変異体、Ｍ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ａ二重突然変異体、Ｔ２５０Ｑ−Ｍ４２８Ｌ二重突然変異体、およびＭ４２８Ｌ−Ｎ４３４Ｓ二重突然変異体を有する。
【００３０】
別の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４７またはＰＴＡ−１０５４８および／またはＰＴＡ−１０５４９を有するプラスミドによってコードされている、抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００３１】
また、治療上効果的な量の上記に記載された抗体のいずれか、先に記載された抗体のいずれかの抗体を組換えにより産生する宿主細胞、先に記載された抗体のいずれかをコードしている単離された核酸を包含する医薬組成物が、本発明によって考慮される。
【００３２】
また、それを必要とする対象の血液におけるＬＤＬコレステロールのレベルを低減させるための方法であって、治療上効果的な量の、ＰＣＳＫ９抗原を標的化する本発明の抗体のいずれかを対象に投与するステップを包含する方法が、本発明によって考慮される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＫＤ比率に応じた、経時的な抗体濃度の増大を示すグラフである。
【図２】ＫＤ比率に応じた、経時的な遊離リガンド（抗原）の減少を示すグラフである。
【図３】経時的な抗体濃度に対するｋｏｆｆおよびｋｏｎの変化の効果を示すグラフである。
【図４】ｐＨ依存性の結合を有する抗体が、ＫＤ（Ｒ）、抗原の血清半減期、および抗原の血清濃度に応じて血清抗原濃度を何日長く減少させるかを示すヒートマップ表示である。Ｒは、生理学的ｐＨに対するエンドソームのｐＨでのＫＤ比率に等しい。
【図５】ｐＨ依存性抗体のモデリングの予測可能性を立証する図である。モデルは、５Ａ１０についての全抗体濃度の予測に成功した（図５Ａ）。図５Ｂは、ＬＤＬに対する５Ａ１０の経時的効果を実証するグラフである。
【図６】同様に、ｐＨ依存性抗体のモデリングの予測可能性を立証する図である。モデルは、５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３（６Ｌ３Ｈ３）についての全抗体濃度を成功裏に予測した（図６Ａ）。図６Ｂは、ＬＤＬに対する６Ｌ３Ｈ３の経時的効果を実証するグラフである。ｐＨ依存性結合抗体６Ｌ３Ｈ３は、ＬＤＬが５Ａ１０と比較して低下する間隔を延長した。
【図７】様々なＰＣＳＫ９抗体を投与した場合の総コレステロールの効果の経時的変化を示す図である。図７Ａは、総コレステロールに対する５Ａ１０の用量依存的な効果を示す。図７Ｂは、ｐＨ依存性抗体５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｈ３の用量依存的な効果を示す。この効果は、５Ａ１０の効果と比較して延長している。
【図８】ｐＨ依存性の結合を有する抗体５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｈ３および５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３が、ｐＨ依存性の結合を有さない抗体と比較して、抗体の分解が低減しており、半減期が延長していることを示すグラフである。図８Ｂは、図８Ａにおいて示される効果が、標的介在性の分解に起因することを実証するグラフである。ＰＣＳＫ９ヌルマウスにおける抗体の分解は、ＰＣＳＫ９を注入した後に大きく増大した。
【図９】サルにおけるコレステロールレベルに対するｐＨ感受性のＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体および非ｐＨ感受性のＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体の効果を説明するグラフである。ＨＤＬレベルの大きな変化は検出されなかったが（図９Ａ）、ｐＨ感受性抗体は、非ｐＨ依存性抗体Ｌ１Ｌ３と比較して、ＬＤＬレベルのさらに引き延ばされた低減を仲介した。
【図１０】ｐＨ依存性の結合を有するＰＣＳＫ９抗体が、非ｐＨ依存性の抗体と比較してインビボでの半減期が引き延ばされることを示すグラフである。
【図１１】ｐＨ依存性の結合についての一般的なモデリングを示すヒートマップである。抗原ＤＫＫ１、ＩｇＥ、またはＣ５に対するこのような抗体は、ｐＨ依存性の結合を有さない抗体と比較して低減した抗原のレベルを抗原が経験した日数を顕著に増大させ得る。
【図１２】抗原ＩｇＥに対するｐＨ依存性の結合を有する抗体を投与した後の抗原濃度の経時的変化をモデリングする図である。
【図１３】抗原ＤＫＫ１に対するｐＨ依存性の結合を有する抗体を投与した後の抗原濃度の経時的変化をモデリングする図である。
【図１４】抗原Ｃ５に対するｐＨ依存性の結合を有する抗体を投与した後の抗原濃度の経時的変化をモデリングする図である。
【図１５】モデリングに用いられるｐＨ依存性の結合を有する抗体のトラフィックモデルの詳細を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、生理学的なｐＨ（すなわち、ｐＨ７．４）での抗原結合に対する親和性がエンドソームのｐＨ（すなわち、ｐＨ６．０または５．５）を超えるような、抗原へのｐＨ依存性の結合を有する抗体に関する。言い換えると、ｐＨ５．５／ｐＨ７．４またはｐＨ６．０／ｐＨ７．４でのＫＤ比率またはｋｏｆｆ比率は、２、３、４、８、１０、１６、２０、３０、４０、または１００以上を超えるか、またはこの間の範囲である。このようなｐＨ依存性の抗体は、エンドソームにおいて抗原から優先的に解離する。これは、抗原が抗原介在性のクリアランスを受けるものである場合（例えば、ＰＣＳＫ９）、ｐＨ７．４で同等のＫＤを有するがｐＨ依存性の結合は有さない抗体と比較して、循環における抗体の半減期を増大させ得る。ｐＨ依存性の結合を有する抗体は、抗原が抗体に結合している場合に低減したクリアランスを受ける場合（例えば、ＩＬ６）、全抗原半減期の平均を減少させ得る。ｐＨ依存性の結合を有する抗体はまた、抗体に結合していない抗原の減少を引き延ばし得る。これは、典型的には高レベルで存在する標的抗原と拮抗する場合（例えば、ＩｇＥ、ＤＫＫ１、Ｃ５、およびＳＯＳＴ）に重要であり得る。さらに、このような抗体は、抗原が受容体であり、受容体が、抗体に結合している場合に増大したクリアランスを有する場合（例えば、ＧＭＣＳＦ受容体）、抗原の半減期を増大させ得る。
【００３５】
抗原が標的介在性の分解を仲介するならば、例えば抗原が標的介在性のクリアランスを受ける場合、ｐＨ依存性の結合を有するこのような抗体を用いてエンドソームにおける解離を達成することによって、抗体の薬力学的効果を増大させることができる（例えば、ＰＣＳＫ９）。ｐＨ依存性の結合を有する抗体は抗原から解離し、抗原介在性の分解を回避し、ＦｃＲｎ結合を介して細胞の外でリサイクリングされ得、ｐＨ７．４で類似のＫＤを有するがｐＨ依存性の結合は有さない抗体よりも長い半減期を有する。
【００３６】
ｐＨ依存性の結合を有するこのような抗体の使用はまた、可溶性抗原が高濃度で存在する場合に（例えば、ＩｇＥ、Ｃ５、ＤＫＫ１、またはＳＯＳＴ）、治療的に有用である。エンドソームにおいて抗原から解離し、リソソームにおいて抗原が分解されると、抗体は、血漿内にリサイクリングされてさらなる遊離抗原に結合することができ、抗体に結合していない抗原の減少を引き延ばすことができ、ｐＨ７．４で類似のＫＤを有するがｐＨ依存性の結合は有さない抗体と比較して、所要の治療用量を減少させることができる。
【００３７】
さらに、ｐＨ依存性の結合を有する抗体の使用は、抗原が膜結合形態および可溶性形態で存在する場合、例えば受容体である場合に、有用であり得、膜結合形態への結合を増強することが望ましい。可溶性形態から解離することによって、抗体は、膜形態に再結合する機会が増大し、細胞膜に近接した抗体が増大する。二価様式で膜形態に結合すると、効果的な親和性が高くなり得るか、または、親和力の効果を介して、効果的な解離速度が緩やかになり得る。
【００３８】
これは、膜結合形態および可溶性形態の両方で存在する抗原を標的化する場合に抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を用いるために適用される。内皮におけるＦｃＲｎ含有細胞において、可溶性抗原は、ＡＤＣのリサイクリングで血漿区画に一掃され、膜結合抗原に結合する機会が得られる。ｐＨ依存性の結合を有する抗体では、二価または一価での膜結合形態への結合の増大によって、膜結合抗原との抗体の内在化および細胞死が増大する。二価様式で受容体に結合すると、親和力は、効果的な親和性を増大させ得るか、または効果的な解離速度を緩やかにし得る。
【００３９】
ＡＤＣＣおよび補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）の機構はまた、ｐＨ依存性の結合を有する抗体の使用において活用することができる。内皮におけるＦｃＲｎ含有細胞において、可溶性抗原は一掃され、ＡＤＣは血漿区画にリサイクリングされ、膜結合抗原に結合する機会が得られる。可溶性受容体から抗体が遊離すると、利用可能な遊離抗体が増大し、これが次に膜結合抗原に結合して細胞の死滅を増大させ得る。
【００４０】
一般的な技術
本発明の実施は、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を採用し、これらは当技術分野の技術の範囲内である。このような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｌｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３〜１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などの文献において完全に説明されている。
【００４１】
定義
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的結合し得る、免疫グロブリン分子である。本明細書において用いられる場合、この用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、あらゆるその抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはその一本鎖、抗体を包含する融合タンパク質、および抗原認識部位を包含する免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾された立体構造を包含し、これには、例えば、限定はしないが、一本鎖（ｓｃＦｖ）抗体およびドメイン抗体（例えば、ヒト、ラクダ、またはサメのドメイン抗体）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖＮＡＲ、およびビスｓｃＦｖが含まれる（例えば、ＨｏｌｌｉｎｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３：１１２６〜１１３６、２００５を参照されたい）。抗体には、あらゆるクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）の抗体が含まれ、抗体は、いずれかの特定のクラスのものである必要はない。抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要なクラスの免疫グロブリン、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００４２】
抗体の「抗原結合部分」という用語は、本明細書において用いられる場合、所与の抗原（例えば、標的Ｘ）に特異的に結合する能力を保持している、無傷抗体の１つまたは複数の断片を言う。抗体の抗原結合機能は、無傷抗体の断片によって行われ得る。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインから構成されるＦｄ断片、抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインから構成されるＦｖ断片、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６、１９８９）、ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。
【００４３】
本明細書において用いられる場合、「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、拡張定義、ＡｂＭの定義、接触定義、および／または立体構造定義のいずれかに従って定義され得る。ＣＤＲを構成する特定の抗体におけるアミノ酸残基の同一性は、当技術分野において周知の方法を用いて決定することができる。本明細書において用いられる場合、抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによって最初に定義された超可変領域として同定することができる。例えば、Ｋａｂａｔら、１９９２、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．を参照されたい。ＣＤＲの位置はまた、Ｃｈｏｔｈｉａらによって最初に記載された構造的ループ構造として同定することができる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７〜８８３、１９８９を参照されたい。ＣＤＲを同定するための他のアプローチには、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの間の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ'ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在はＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を用いて誘導される、「ＡｂＭ定義」、またはＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５、１９９６において説明されている、観察された抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」が含まれる。本明細書においてＣＤＲの「立体構造定義」と呼ばれる別のアプローチにおいて、ＣＤＲの位置は、抗原結合に対するエンタルピーの寄与を生じさせる残基として同定することができる。例えば、Ｍａｋａｂｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６、２００８を参照されたい。さらに他のＣＤＲ結合定義は、上記のアプローチの１つに厳密に従っていないかもしれないが、それでも、前記定義は、特定の残基もしくは残基群またはさらにＣＤＲ全体が抗原結合に顕著には影響しないという予測または実験的所見に照らして短くまたは長くされ得るものの、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲの少なくとも一部とオーバーラップする。本明細書において用いられる場合、ＣＤＲは、アプローチの組み合わせを含む、当技術分野において知られている任意のアプローチによって定義されるＣＤＲを言い得る。
【００４４】
本明細書において用いられる場合、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を言い、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る考えられる天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に対するものである。修飾語「モノクローナル」は、抗体の特徴が、実質的に均質な抗体集団から得られることを示し、あらゆる特定の方法によって抗体が生産されることを要するとは解釈されない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製することができるか、または米国特許第４，８１６，５６７号において記載されているような組換えＤＮＡ法によって作製することができる。モノクローナル抗体はまた、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４において記載されている技術を用いて生成されるファージライブラリーから単離することができる。
【００４５】
本明細書において用いられる場合、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列）である、非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を言う。好ましくは、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも組み込まれたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列でも見られないが抗体の性能をさらに洗練および最適化するために含まれる残基を包含し得る。通常、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域に相当する、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを包含する。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリンの定常領域または定常ドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域または定常ドメインの少なくとも一部を包含する。好ましいものは、ＷＯ９９／５８５７２において記載されているように修飾されたＦｃ領域を有する抗体である。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体と比較して改変されている１つまたは複数のＣＤＲ（ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、および／またはＣＤＲ  Ｈ３）を有し、これはまた、元の抗体の１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる。
【００４６】
本明細書において用いられる場合、「ヒト抗体」は、ヒトによって産生され得る抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、および／または当業者に知られているかもしくは本明細書において開示されているヒト抗体を作製するための技術のいずれかを用いて作製されている抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを包含する抗体が含まれる。１つのこのような例は、マウス軽鎖ポリペプチドおよびヒト重鎖ポリペプチドを包含する抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において知られている様々な技術を用いて生産することができる。１つの実施形態において、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０９〜３１４；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６１５７〜６１６２；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１）。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン位置が内在位置の代わりにトランスジェニックによって導入されている動物、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているマウスの免疫化によって作製することができる。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、および米国特許第５，６６１，０１６号において記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することによって調製することができる（このようなＢリンパ球は、個体から回収することができるか、またはインビトロで免疫化されていてよい）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７、１９８５；Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。
【００４７】
抗体の「可変領域」は、単独の、または組み合わされた、抗体軽鎖可変領域または抗体重鎖可変領域を言う。当技術分野において知られているように、重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域を含む３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって繋がれている４つのフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。それぞれの鎖におけるＣＤＲは、ＦＲによって近位で結び付けられており、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するために少なくとも２つの技術が存在する：（１）異種間の配列多様性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版、１９９１、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ））、および（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７〜９４８）。本明細書において用いられる場合、ＣＤＲは、いずれかのアプローチによってまたは両アプローチの組み合わせによって規定されるＣＤＲを言うことができる。
【００４８】
当技術分野において知られているように、抗体の「定常領域」は、単独の、または組み合わされた、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を言う。
【００４９】
本明細書において用いられる場合、用語「ＰＣＳＫ９」は、あらゆる形態のＰＣＳＫ９、およびＰＣＳＫ９の活性の少なくとも一部を保持しているその変異体を言う。ヒトＰＣＳＫ９への具体的な言及などによる別段の指示がない限り、ＰＣＳＫ９には、全ての哺乳動物種、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシの、非変性配列ＰＣＳＫ９が含まれる。１つの典型的なヒトＰＣＳＫ９は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ８ＮＢＰ７（配列番号１６）として見ることができる。
【００５０】
本明細書において用いられる場合、「ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体」は、ＰＣＳＫ９の生物学的活性を阻害し得る抗体、ならびに／または、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９介在性の下方調節およびＬＤＬの血液クリアランスのＰＣＳＫ９介在性の減少を含む、ＰＣＳＫ９シグナル伝達によって仲介される下流経路（１つまたは複数）を阻害し得る抗体を言う。ｐＨ依存性のＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体は、ＬＤＬＲ相互作用および／またはＰＣＳＫ９に対する細胞応答の誘出などの、ＰＣＳＫ９シグナル伝達によって仲介される下流経路を含む、ＰＣＳＫ９の生物学的活性を、（顕著な程度を含むあらゆる程度まで）ブロックする、前記活性に拮抗する、抑制する、または低減させる抗体を包含する。本発明の目的では、用語「ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体」が、ＰＣＳＫ９自体、ＰＣＳＫ９の生物学的活性（限定はしないが、ＬＤＬＲとの相互作用、ＬＤＬＲの下方調節、および血液ＬＤＬクリアランスの減少のあらゆる態様を仲介するその能力を含む）、または生物学的活性の結果を、あらゆる有意義な程度で、実質的に無効にする、減少させる、または中和する、全ての先に同定された用語、表題、機能的状態、および機能的特徴を包含することが明確に理解されよう。いくつかの実施形態において、ｐＨ依存性のＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体は、ＰＣＳＫ９に結合し、ＬＤＬＲとの相互作用を防ぐ。ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体の例は、本明細書において提供される。
【００５１】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において、あらゆる長さの、好ましくは比較的短い（例えば、１０〜１００アミノ酸）のアミノ酸鎖を言うために、区別せずに用いられる。鎖は、線状または分枝鎖状であり得、これは、修飾されたアミノ酸を包含し得、かつ／または非アミノ酸によって中断されている場合がある。この用語はまた、天然にまたは介入によって、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、またはあらゆる他の操作もしくは修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションによって修飾されているアミノ酸鎖を包含する。同様にこの定義に含まれるものは、例えば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）および当技術分野において知られている他の修飾を含むポリペプチドである。ポリペプチドが一本鎖または会合した鎖として生じ得ることが理解される。
【００５２】
当技術分野において知られているように、本明細書において区別せずに用いられる「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、あらゆる長さのヌクレオチド鎖を言い、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはその類似体、あるいはＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによって鎖内に組み込まれ得るあらゆる基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化されたヌクレオチドおよびその類似体を包含し得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、鎖の組み立ての前または後に行われ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合の後に、標識成分とのコンジュゲーションなどによってさらに修飾され得る。他のタイプの修飾には、例えば、「キャップ」、類似体での天然のヌクレオチドの１つまたは複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）での修飾、懸垂部分、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）を含む修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレンなど）での修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含む修飾、アルキル化剤を含む修飾、修飾された結合（例えば、アルファアノマー核酸など）での修飾、ならびに未修飾の形態のポリヌクレオチド（１つまたは複数）が含まれる。さらに、糖に元々存在するヒドロキシル基のいずれかを、例えばホスホン酸基、リン酸基によって置き換えるか、標準的な保護基によって保護するか、またはさらなるヌクレオチドに対するさらなる結合を調製するために活性化するか、または固体担体にコンジュゲートすることができる。５’末端および３’末端のＯＨは、リン酸化するか、またはアミンもしくは１から２０個の炭素原子から構成される有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルはまた、標準的な保護基に誘導体化することができる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−アリルリボース、２’−フルオロリボース、または２’−アジドリボース、炭素環式の糖類似体、アルファアノマー糖またはベータアノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース、またはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式の類似体、および脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドを含む、当技術分野において一般に知られている類似形態のリボース糖またはデオキシリボース糖を含み得る。１つまたは複数のホスホジエステル結合は、別の結合基によって置き換えることができる。これらの別の結合基には、限定はしないが、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、ＲまたはＲ’は独立して、Ｈであるか、または、置換されたもしくは置換されていない、エーテル（−Ｏ−）結合を含んでいてもよいアルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルキルによって置き換えられている実施形態が含まれる。ポリヌクレオチド内の全ての結合が同一である必要はない。先の記載は、本明細書において言及される、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００５３】
抗体は、それが他の物質に結合するよりも優れた親和性、親和力で、より容易に、かつ／または長い期間で結合するならば、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、ＰＣＳＫ９エピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体は、それが他のＰＣＳＫ９エピトープまたは非ＰＣＳＫ９エピトープに結合するよりも優れた親和性、親和力で、より容易に、かつ／または長い期間でこのエピトープに結合する抗体である。この定義を読むことで、例えば、第１の標的に特異的にまたは優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）が、第２の標的に特異的にまたは優先的に結合する可能性もしない可能性もあることも理解される。このように、「特異的な結合」または「優先的な結合」は、（それが含み得るとしても）必ずしも排他的な結合を要するわけではない。通常、しかしそうとは限らないが、結合への言及は、優先的な結合を意味する。
【００５４】
「非シグナル伝達デコイ」は、リガンドをその同族受容体（１つまたは複数）から隔離する可溶性受容体アイソフォームまたは結合タンパク質である。
【００５５】
本明細書において用いられる場合、「実質的に純粋な」は、少なくとも５０％純粋な（すなわち、汚染物質を有さない）、さらに好ましくは少なくとも９０％純粋な、さらに好ましくは少なくとも９５％純粋な、さらに好ましくは少なくとも９８％純粋な、および最も好ましくは少なくとも９９％純粋な材料を言う。
【００５６】
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチドインサートを組み込むためのベクター（１つまたは複数）のレシピエントであり得るか、または前記レシピエントとなっている、個別の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異に起因して、元の親細胞に必ずしも完全に同一である必要はない（形態学的にまたはゲノムＤＮＡ相補鎖において）。宿主細胞には、インビボで本発明のポリヌクレオチド（１つまたは複数）でトランスフェクトされた細胞が含まれる。
【００５７】
当技術分野において知られているように、用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために用いられる。「Ｆｃ領域」は、非変性配列のＦｃ領域または変異体Ｆｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで延びていると規定される。Ｆｃ領域における残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵ指標のものである。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は、通常、２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３を包含する。
【００５８】
当技術分野において用いられるように、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは、非変性配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体を結合するもの（ガンマ受容体）であり、対立遺伝子変異体を含む、ＦｃγＲＩサブクラス、ＦｃγＲＩＩサブクラス、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、あるいは、これらの受容体のスプライシングされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれる。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２；Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４；およびｄｅ  Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１において概説されている。「ＦｃＲ」にはまた、胎児への母親のＩｇＧの移入に関与する、新生児受容体ＦｃＲｎが含まれる（Ｇｕｙｅｒら、１９７６  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７；およびＫｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９）。
【００５９】
用語「競合する」は、抗体に関して本明細書において用いられる場合、第１の抗体またはその抗原結合部分が、第２の抗体またはその抗原結合部分の結合に十分に類似の様式でエピトープに結合し、その結果、第１の抗体とその同族エピトープとの結合の結果が、第２の抗体の不存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下で検出可能に低下することを意味する。しかし、第２の抗体がそのエピトープに結合することもまた第１の抗体の存在下で検出可能に減少するという別の可能性は、必ずしも当てはまらなくてよい。すなわち、第１の抗体がそのそれぞれのエピトープに結合することを第２の抗体が阻害することを伴わずに、第１の抗体は、第２の抗体がそのエピトープに結合することを阻害し得る。しかし、各抗体が他の抗体とその同族エピトープまたはリガンドとの結合を検出可能に阻害する場合、それが同程度であろうと、より大きな程度であろうと、より小さな程度であろうと、抗体は、それらのそれぞれのエピトープ（１つまたは複数）の結合について互いに「相互競合する」と言われる。競合抗体および相互競合抗体の両方が、本発明に包含される。このような競合または相互競合が生じる機構（例えば、立体障害、立体構造の変化、または共通のエピトープもしくはその一部への結合）に関わらず、当業者には、本明細書において提供される教示に基づいて、このような競合抗体および／または相互競合抗体が包含され、本明細書において開示されている方法に有用であり得ることが理解されよう。
【００６０】
「機能的なＦｃ領域」は、非変性配列のＦｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を有する。典型的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑの結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体の結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節などが含まれる。このようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされていることを要し、このような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野において知られている様々なアッセイを用いて評価され得る。
【００６１】
「非変性配列のＦｃ領域」は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を包含する。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって非変性配列のＦｃ領域のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を包含し、それでも、非変性配列のＦｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持している。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、非変性配列のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、非変性配列のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域における約１から約１０のアミノ酸の置換、好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。本明細書における変異体Ｆｃ領域は、非変性配列のＦｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性を好ましくは有し、最も好ましくは、それと少なくとも約９０％の配列同一性を有し、さらに好ましくは、それと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。
【００６２】
「推定最小薬理作用量（ＭＡＢＥＬ）」は、ヒトにおける最小薬理作用をもたらす推定最小用量を意味する。安全係数が、通常、ＭＡＢＥＬからのヒトにおける初回投与についての計算に適用される。ＭＡＢＥＬの計算は、全ての関連するインビトロおよびインビボでの薬物動態学的および薬力学的な情報を利用するべきである。
【００６３】
本明細書において用いられる場合、「治療」および「治療上効果的な」は、有利なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。ｐＨ依存性のＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体に関連する本発明の目的では、有利なまたは所望の臨床結果には、限定はしないが、ＬＤＬクリアランスの増強；ならびに代謝障害および／もしくは摂食障害により生じる、または家族性高コレステロール血症、アテローム性脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、およびさらに一般には、心血管疾患（ＣＶＤ）を含む、異常なコレステロールレベルおよび／またはリポタンパク質レベルの発生の低減または改善の、１つあるいは複数が含まれる。
【００６４】
「発生の低減」は、重症度のあらゆる低減を意味する（この症状に一般に用いられる他の薬剤および／または治療法（例えば、前記薬剤および／または治療法への曝露）の必要性および／または量の低減を含み得る。当業者には理解されるように、個体は、治療に対する応答の点で様々であり得、したがって、例えば、「発生を低減させる方法」は、このような投与がその特定の個体において発生をこのように低減させる可能性が高い場合があるという妥当な期待に基づいて、ｐＨ依存性の抗体の投与を反映する。
【００６５】
「改善」は、治療を投与していない場合と比較して、治療を投与した後に１つまたは複数の症候が軽減または向上することを意味する。「改善」にはまた、症候の期間を短縮するかまたは低減させることが含まれる。
【００６６】
本明細書において用いられる場合、薬剤、化合物、または医薬組成物の「効果的な投与量」または「効果的な量」は、あらゆる１つまたは複数の有利なまたは所望の結果に影響するために十分な量である。予防的使用では、有利なまたは所望の結果には、疾患の生化学的、組織学的、および／または行動的症候、その合併症、ならびに疾患の発症の間に現れる中間の病理学的表現型を含む、疾患の、リスクの排除もしくは低減、重症度の軽減、または発生の遅延が含まれる。ｐＨ依存性のＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体の治療的使用では、有利なまたは所望の結果には、高コレステロール血症、または脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、ＣＶＤ、もしくは冠動脈性心疾患の１つもしくは複数の症候の低減、疾患の治療に必要な他の医薬品の用量の減少、別の医薬品の効果の増強、および／あるいは患者の疾患の進行の遅延などの臨床結果が含まれる。効果的な投与量は、１回または複数回の投与で投与され得る。本発明の目的では、薬剤、化合物、または医薬組成物の効果的な投与量は、直接的にまたは間接的に予防的または治療的な治療を達成するために十分な量である。臨床的な背景において理解されるように、薬剤、化合物、または医薬組成物の効果的な投与量は、別の薬剤、化合物、または医薬組成物と組み合わせて達成されてもされなくてもよい。したがって、「効果的な投与量」は、１つまたは複数の治療物質を投与する背景において考慮され得、単一の作用物質は、１つまたは複数の他の作用物質と組み合わせて、所望の結果が得られ得るかまたは得られる場合、効果的な量で与えられていると考えられ得る。
【００６７】
「個体」または「対象」は、哺乳動物であり、さらに好ましくはヒトである。哺乳動物にはまた、限定はしないが、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットが含まれる。
【００６８】
本明細書において用いられる場合、「ベクター」は、宿主細胞において１つまたは複数の目的の遺伝子（１つまたは複数）または配列（１つまたは複数）を送達し得、好ましくは発現し得る構築物を意味する。ベクターの例には、限定はしないが、ウイルスベクター、裸ＤＮＡ発現ベクターまたは裸ＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドベクターまたはファージベクター、カチオン縮合物質を伴うＤＮＡ発現ベクターまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム内にカプセル化されたＤＮＡ発現ベクターまたはＲＮＡ発現ベクター、および特定の真核細胞、例えばプロデューサー細胞が含まれる。
【００６９】
本明細書において用いられる場合、「発現制御配列」は、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター、例えば構成的なもしくは誘導性のプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に機能可能に結合している。
【００７０】
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」には、活性成分と組み合わされた場合にその成分が生物学的活性を保持することを可能にし、かつ対象の免疫系と非反応性である、あらゆる材料が含まれる。例には、限定はしないが、あらゆる標準的な薬学的担体、例えばリン酸緩衝溶液、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤が含まれる。エアゾールまたは非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または通常の（０．９％）生理食塩水である。このような担体を包含する組成物は、周知の従来の方法によって製剤される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００を参照されたい）。
【００７１】
用語「ｋｏｎ」は、本明細書において用いられる場合、抗原への抗体の会合の速度定数を言う。具体的には、速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）および平衡解離定数は、Ｆａｂ抗体断片（すなわち、一価の）および抗原を用いて測定される。
【００７２】
用語「ｋｏｆｆ」は、本明細書において用いられる場合、抗体／抗原複合体からの抗体の解離の速度定数を言う。
【００７３】
用語「ＫＤ」は、本明細書において用いられる場合、抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を言う。
【００７４】
ＫＤ比率およびｋｏｆｆ比率を決定するための、それぞれｋａおよびｋｄである会合速度定数および解離速度定数の決定は、捕捉試薬を介してセンサー表面上に低能力で固定されるリガンドの結合に関して分析物が一価である条件下で、分析物／リガンド相互作用を特徴付けするための、表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサーを用いて行われる。分析は、Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３４９、１３６〜１４７、２００６において記載されているような動態滴定方法を用いて行われる。所与のアッセイに採用されるセンサーチップ、捕捉試薬、およびアッセイ緩衝液は、センサー表面上へのリガンドの安定な捕捉をもたらし、表面への分析物の非特異的な結合を最小にし、かつＭｙｓｚｋａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １２、２７９〜２８４、１９９９における推奨による動態分析に適切な分析物結合応答をもたらすように選択される。分析物／リガンド相互作用当たりの分析物結合応答は二重参照され、ＭｙｓｚｋａおよびＭｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ  ６４、１２７〜１３７（１９９７）において記載されているようなグローバルパラメータとしてｋａ、ｋｄ、およびＲｍａｘを有する、１：１のラングミュア「マストランスポート限定モデル」に適合させられる。平衡解離定数ＫＤは、運動速度定数の比率から推定され、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａである。このような決定は、好ましくは、２５℃または３７℃で行われる。
【００７５】
Ａ．障害を予防または治療するための方法
ｐＨ依存性のＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体に関する１つの態様において、本発明は、効果的な量の、循環ＰＣＳＫ９に拮抗するｐＨ依存性のＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体を個体に投与するステップを包含する、個体における高コレステロール血症、および／または脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、ＣＶＤ、もしくは冠動脈性心疾患の少なくとも１つの症候を治療または予防するための方法を提供する。
【００７６】
さらなる態様において、本発明は、個体における高コレステロール血症、および／または脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、ＣＶＤ、もしくは冠動脈性心疾患の少なくとも１つの症候の治療または予防において用いるための、効果的な量の、循環ＰＣＳＫ９に拮抗するｐＨ依存性のＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体を提供する。本発明はさらに、個体における高コレステロール血症、および／または脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、ＣＶＤ、もしくは冠動脈性心疾患の少なくとも１つの症候を治療または予防するための製剤の製造における、効果的な量の、細胞外ＰＣＳＫ９または循環ＰＣＳＫ９に拮抗するｐＨ依存性のＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体の使用を提供する。
【００７７】
有利には、抗体の治療的投与によって、血液コレステロールが低下し、かつ／または血液ＬＤＬが低下する。好ましくは、血液コレステロールおよび／または血液ＬＤＬは、投与前よりも少なくとも約１０％または１５％低い。さらに好ましくは、血液コレステロールおよび／または血液ＬＤＬは、抗体の投与前よりも少なくとも約２０％低い。さらに好ましくは、血液コレステロールおよび／または血液ＬＤＬは、抗体の投与前よりも少なくとも３０％低い。有利には、血液コレステロールおよび／または血液ＬＤＬは、抗体の投与前よりも少なくとも４０％低い。さらに有利には、血液コレステロールおよび／または血液ＬＤＬは、抗体の投与前よりも少なくとも５０％低い。非常に好ましくは、血液コレステロールおよび／または血液ＬＤＬは、抗体の投与前よりも少なくとも６０％低い。最も好ましくは、血液コレステロールおよび／または血液ＬＤＬは、抗体の投与前よりも少なくとも７０％低い。
【００７８】
本明細書において記載されている全ての方法に関して、あらゆる適切な抗原に対するｐＨ依存性の抗体への言及にはまた、１つまたは複数のさらなる作用物質を包含する組成物が含まれる。これらの組成物はさらに、適切な賦形剤、例えば、当技術分野において周知の、緩衝液を含む薬学的に許容できる賦形剤を包含し得る。本発明は、単独で、または他の従来の治療方法と組み合わせて用いることができる。
【００７９】
ｐＨ依存性の抗体は、あらゆる適切な経路を介して個体に投与することができる。当業者には、本明細書において記載されている実施例は限定することを意図したものではなく、利用可能な技術の例示を意図したものであることが理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態において、ｐＨ依存性の抗体は、既知の方法に従って、例えば、例えばボーラス注入としてのもしくは一定時間にわたる連続点滴による静脈内投与、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、経皮経路、皮下経路、関節内経路、舌下経路、滑液嚢内経路、吹送を介する経路、髄腔内経路、経口経路、吸入経路、または局部経路によって、個体に投与される。投与は、全身的なもの、例えば静脈内投与であり得るか、または局所的なものであり得る。ジェットネブライザーおよび超音波ネブライザーを含む、液体製剤のための市販されているネブライザーが、投与に有用である。液体製剤は直接的に噴霧することができ、凍結乾燥された粉末は、再構成した後に噴霧することができる。あるいは、ｐＨ依存性の抗体は、フッ化炭素製剤および定量吸入器を用いてエアゾール化することができるか、または凍結乾燥および粉砕された粉末として吸入され得る。
【００８０】
１つの実施形態において、ｐＨ依存性の抗体は、部位特異的送達技術または標的化された局所的送達技術を介して投与される。部位特異的送達技術または標的化された局所的送達技術の例には、ｐＨ依存性の抗体の様々な移植可能な貯蔵源、または局所的送達カテーテル、例えば点滴カテーテル、留置カテーテル、もしくは針付きカテーテル、人工血管移植、外膜ラップ、シャントおよびステント、もしくは他の移植可能な装置、部位特異的担体、直接的な注入、または直接的な塗布が含まれる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／５３２１１および米国特許第５，９８１，５６８号を参照されたい。
【００８１】
ｐＨ依存性の抗体の様々な製剤を投与に用いることができる。いくつかの実施形態において、ｐＨ依存性の抗体は、薄めることなく投与することができる。いくつかの実施形態において、ｐＨ依存性の抗体および薬学的に許容できる賦形剤は、様々な製剤の形態であり得る。薬学的に許容できる賦形剤は、当技術分野において知られており、薬理学的に効果的な物質の投与を容易にする、比較的不活性の物質である。例えば、賦形剤は、形状もしくは稠度を付与し得るか、または希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤には、限定はしないが、安定剤、湿潤剤、および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、緩衝液、および皮膚浸透エンハンサーが含まれる。非経口および経口の薬剤送達のための賦形剤および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）において説明されている。
【００８２】
これらの作用物質は、薬学的に許容できる媒体、例えば生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などと組み合わせることができる。特定の投薬レジメン、すなわち、用量、タイミング、および反復は、特定の個体およびその個体の病歴に応じる。
【００８３】
ｐＨ依存性の結合を有する抗体はまた、本明細書において記載されているように、吸入を介して投与することができる。通常、ｐＨ依存性の抗体の投与では、最初の候補投与量は、約２ｍｇ／ｋｇであり得る。本発明の目的では、典型的な１日投与量は、上記の因子に応じて、約３μｇ／ｋｇから３０μｇ／ｋｇのいずれかから、３００μｇ／ｋｇまで、３ｍｇ／ｋｇまで、３０ｍｇ／ｋｇまで、１００ｍｇ／ｋｇまで、またはそれ以上の範囲であり得る。例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、および約２５ｍｇ／ｋｇの投与量を用いることができる。数日以上にわたる反復投与では、条件に応じて、治療は、症候の所望の抑制が生じるまで、または十分な治療レベルが達成されるまで、例えば血液ＬＤＬレベルを低減させるために持続される。典型的な投与レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初回用量の投与、その後の約１ｍｇ／ｋｇの維持用量の抗体の週１回の投与、またはその後の約１ｍｇ／ｋｇの維持用量の１週間おきの投与を包含する。しかし、医師が達成することを望む薬物動態学的な減衰のパターンに応じて、他の投与レジメンが有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、週に１から４回の投与が考慮される。他の実施形態において、月に１回または１ヶ月おきもしくは３ヶ月おきに１回の投与が考慮される。この治療法の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。投与レジメン（用いられる抗体を含む）は、経時的に変化し得る。
【００８４】
本発明の目的では、ｐＨ依存性の抗体の適切な投与量は、採用される抗体（またはその組成物）、治療すべき症候のタイプおよび重症度、作用物質が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、これまでの治療法、患者の病歴および作用物質に対する応答、患者の血液抗原レベル、患者の抗原の合成速度およびクリアランス速度、患者の投与される作用物質のクリアランス速度、ならびに主治医の裁量に応じる。典型的には、臨床医は、所望の結果を達成する投与量に達するまで、ｐＨ依存性の抗体を投与する。用量および／または頻度は、治療の過程で変化し得る。半減期などの経験的考察は、通常、投与量の決定に寄与する。例えば、ヒト免疫系と適合する抗体、例えばヒト化抗体または完全なヒト抗体は、抗体の半減期を引き延ばすため、および抗体が宿主の免疫系によって攻撃されることを防ぐために用いることができる。投与の頻度は、治療法の過程で決定および調節することができ、通常は、症候、例えば、高コレステロール血症の治療および／または抑制および／または改善および／または遅延に基づくが、必ずしもというわけではない。あるいは、抗体の持続連続放出製剤が適切であり得る。持続放出を達成するための様々な製剤および装置は、当技術分野において知られている。
【００８５】
１つの実施形態において、アンタゴニスト抗体の投与量は、アンタゴニスト抗体を１回または複数回投与されている個体において経験的に決定することができる。個体は、漸増的な投与量の抗体を投与される。有効性を評価するために、疾患の指標を追跡することができる。
【００８６】
本発明における方法に従ったｐＨ依存性の抗体の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的なものであるか予防的なものであるか、および熟練医師に知られている他の因子に応じて、連続的なまたは断続的なものであり得る。ｐＨ依存性の抗体の投与は、事前に選択された期間にわたって基本的に連続的であり得るか、または間隔をあけた一連の投与であり得る。
【００８７】
いくつかの実施形態において、２つ以上のアンタゴニスト抗体が存在し得る。少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの異なる、またはさらなるアンタゴニスト抗体および／またはペプチドが存在し得る。通常、これらの抗体またはペプチドは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有し得る。ｐＨ依存性の抗体はまた、他の治療法と組み合わせて用いることができる。ｐＨ依存性の抗体はまた、作用物質の有効性を増強するおよび／または補う働きをする他の作用物質と組み合わせて用いることができる。
【００８８】
許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、採用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸などの緩衝液；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を包含し得る。
【００８９】
ｐＨ依存性の抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８；Ｈｗａｎｇら、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および米国特許第４，５４４，５４５号において記載されているような、当技術分野において知られている方法によって調製される。循環時間が増強したリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号において開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を包含する脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを得るための、規定された孔径のフィルターを介して押し出される。
【００９０】
活性成分はまた、例えばコアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製されるマイクロカプセル内、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）内に、またはマクロエマルジョン内に封入することができる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）において開示されている。
【００９１】
持続放出調製物を調製することができる。持続放出調製物の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは、造形物の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸および７−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性のエチレン酢酸ビニル、分解性の乳酸グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注入可能なミクロスフェア）、スクロースアセテートイソブチレート、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【００９２】
インビボでの投与に用いるための製剤は無菌でなくてはならない。これは、例えば滅菌濾過膜を介する濾過によって、容易に達成される。治療的なｐＨ依存性抗体組成物は、通常、無菌のアクセスポートを有する容器内、例えば、皮下注入針によって穴をあけることが可能なストッパーを有する静脈内溶液袋またはバイアル内に置かれる。
【００９３】
適切なエマルジョンは、市販されている脂肪エマルジョン、例えばＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）、およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）を用いて調製することができる。活性成分は、余混合されたエマルジョン組成物内に溶解することができるか、あるいは、油（例えば、大豆油、べにばな油、綿実油、ごま油、とうもろこし油、またはアーモンド油）内に溶解することができ、リン脂質（例えば、卵リン脂質、大豆リン脂質、または大豆レシチン）および水と混合するとエマルジョンが形成される。エマルジョンの張性を調節するために、他の成分、例えばグリセロールまたはグルコースを添加してもよいことが理解されよう。適切なエマルジョンは、典型的には、最大２０％の、例えば５から２０％の間の油を含有する。脂肪エマルジョンは、０．１から１．０μｍの間、特に０．１から０．５μｍの間の脂肪滴を包含し得、５．５から８．０の範囲のｐＨを有する。
【００９４】
エマルジョン組成物は、ｐＨ依存性の抗体とＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはその成分（大豆油、卵リン脂質、グリセロール、および水）とを混合することによって調製されるものであり得る。
【００９５】
吸入または吹送のための組成物には、薬学的に許容できる水性溶媒もしくは有機溶媒内の溶液および懸濁液またはその混合物、ならびに粉末が含まれる。液体組成物または固体組成物は、上記に説明されるような、適切な薬学的に許容できる賦形剤を含有し得る。いくつかの実施形態において、組成物は、局所的なまたは全身的な効果のために、経口経路または経鼻呼吸器経路によって投与される。好ましく無菌の薬学的に許容できる溶媒内の組成物は、気体を用いることによって噴霧することができる。噴霧された溶液は、噴霧装置から直接的に吸い込むことができるか、または噴霧装置をフェイスマスク、テント、もしくは間欠的陽圧呼吸機に設置することができる。溶液組成物、懸濁液組成物、または粉末組成物は、製剤を適切な様式で送達する装置から、好ましくは経口的にまたは経鼻的に投与することができる。
【００９６】
Ｂ．ｐＨ依存性の抗体
本発明において有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異的抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を包含する融合タンパク質（例えば、ドメイン抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ならびに、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有結合によって修飾された抗体を含む、所要の特異性を有する抗原認識部位を包含する免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾された立体構造を包含し得る。抗体は、マウス、ラット、ヒト、またはあらゆる他のものに由来し得る（キメラ抗体またはヒト化抗体を含む）。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ｐＨ依存性の抗体はモノクローナル抗体である。ｐＨ依存性の抗体はまた、ヒト化することができる。他の実施形態において、抗体はヒト抗体である。
【００９８】
いくつかの実施形態において、抗体は、修飾された定常領域、例えば免疫学的に不活性な定常領域を包含し、すなわち、免疫応答を引き起こす可能性が低減している。いくつかの実施形態において、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４；ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２、および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号において記載されているように修飾されている。Ｆｃは、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４であり得る。Ｆｃは、突然変異Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（ＩｇＧ２Δａ）を含むヒトＩｇＧ２であり得、前記突然変異において、アミノ酸残基は、野生型ＩｇＧ２配列を参照して番号付けされている。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４。いくつかの実施形態において、抗体は、突然変異（Ａｒｍｏｕｒら、２００３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０  ５８５〜５９３）Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５（ＩｇＧ４ΔＣ）を包含するＩｇＧ４の定常領域を包含し、前記突然変異において、番号付けは、野生型ＩｇＧ４を参照している。さらに別の実施形態において、ＦｃはＧ２３６が欠失しているヒトＩｇＧ４Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５（ＩｇＧ４Δｂ）である。別の実施形態において、Ｆｃは、ヒンジ安定化突然変異Ｓ２２８からＰ２２８を含むあらゆるヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、またはＩｇＧ４Δｃ）である（Ａａｌｂｅｒｓｅら、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌｇｙ  １０５、９〜１９）。別の実施形態において、Ｆｃは、非グリコシル化Ｆｃであり得る。
【００９９】
いくつかの実施形態において、定常領域は、オリゴ糖付着残基（例えばＡｓｎ２９７）、および／または定常領域におけるグリコシル化認識配列の一部である隣接残基を突然変異させることによって、非グリコシル化されている。いくつかの実施形態において、定常領域は、Ｎ結合型のグリコシル化のために酵素的に非グリコシル化されている。定常領域は、Ｎ結合型のグリコシル化のために、酵素的に、またはグリコシル化のない宿主細胞における発現によって、非グリコシル化され得る。
【０１００】
抗原に対する抗体の結合親和性を決定する１つの手段は、抗体の単機能のＦａｂ断片の結合親和性を測定することによる。単機能のＦａｂ断片を得るために、抗体（例えば、ＩｇＧ）は、パパインで切断することができるか、または組換えにより発現させることができる。抗体のＦａｂ断片の親和性は、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５のＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｖ/ｖの界面活性剤Ｐ２０）を用いて、事前に固定されたストレプトアビジンセンサーチップ（ＳＡ）を備えた表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）によって決定することができる。ビオチン化抗原は、０．５μｇ／ｍＬ未満の濃度までＨＢＳ−ＥＰ緩衝液内に希釈され得、詳細な動態研究では５０〜２００応答単位（ＲＵ）の、またはスクリーニングアッセイでは８００〜１，０００ＲＵの、２つの範囲の抗原密度を達成するように、様々な接触時間を用いて個別のチップチャネルを通して注入され得る。再生研究は、２５％ｖ/ｖのエタノール内の２５ｍＭのＮａＯＨが、２００を超える注入にわたりチップ上の抗原の活性を維持しながら、結合型Ｆａｂを効果的に除去することを示した。典型的には、精製されたＦａｂ試料の連続希釈物（推定ＫＤの０．１〜１０倍の濃度にわたる）は、１分間にわたり１００μＬ／分で注入され、最大２時間の解離時間が可能である。Ｆａｂタンパク質の濃度は、既知の濃度（アミノ酸分析によって決定される）のＦａｂを標準として用いて、ＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって決定される。動的会合速度（ｋｏｎ）および動的解離速度（ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いてデータを全体的に１：１ラングミュア結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ、Ｒ．Ｒｏｏｓ、Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ、Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．、１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６．９９〜１１０）に適合させることによって、同時に得ることができる。平衡解離定数（ＫＤ）値は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。このプロトコルは、ヒトまたは別の哺乳動物種（例えば、マウス、ラット、霊長類）を含むあらゆる抗原に対する抗体の結合親和性の決定における使用に適切である。抗体の結合親和性は、通常、２５℃で測定されるが、３７℃でも測定することができる。
【０１０１】
抗体は、当技術分野において知られている任意の方法によって作製することができる。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは、通常、本明細書においてさらに記載されているような、抗体の刺激および産生のための確立された技術および従来の技術に従っている。ヒト抗体およびマウス抗体を生産するための通常の技術は、当技術分野において知られており、かつ／または本明細書において記載されている。ＰＣＳＫ９に対するｐＨ依存性の抗体では、抗体を作製するための現在の好ましい方法は、本明細書において開示されるような、ＰＣＳＫ９ノックアウト（ＰＣＳＫ９−／−）動物の免疫化を包含する。
【０１０２】
ヒトを含むあらゆる哺乳動物対象またはそれに由来する抗体産生細胞は、ヒトを含む哺乳動物のハイブリドーマ細胞系を産生するための基礎として役立つように操作され得ることが考慮される。典型的には、宿主動物は、腹腔内に、筋肉内に、経口的に、皮下に、足底内に、および／または皮内に、本明細書において記載されているものを含む、一定量の免疫原を接種される。
【０１０３】
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７の、またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら、１９８２、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、１８：３７７〜３８１によって変更されているような、通常の体細胞ハイブリダイゼーション技術を用いて、リンパ球および不死化された骨髄腫細胞から調製することができる。限定はしないがＸ６３−Ａｇ８．６５３、およびＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡのものを含む、利用可能な骨髄腫系を、ハイブリダイゼーションにおいて用いることができる。通常、この技術は、ポリエチレングリコールなどのフソゲンを用いて、または当業者に周知の電気的手段によって、骨髄腫細胞とリンパ系細胞とを融合することを伴う。融合の後、細胞は、融合培地から分離され、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択的成長培地において成長させられて、ハイブリダイズしていない親細胞が排除される。血清を補われていてもいなくても、本明細書において記載されているあらゆる培地は、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために用いることができる。細胞融合技術の別の代替として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を、本発明のＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の生産に用いることができる。必要に応じて、ハイブリドーマは増殖およびサブクローニングされ、上清は、従来の免疫アッセイ手順（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光免疫アッセイ）によって、抗免疫原活性についてアッセイされる。
【０１０４】
抗体源として用いられ得るハイブリドーマは、ＰＣＳＫ９に特異的なモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマの全ての誘導体、子孫細胞、またはその一部を包含する。
【０１０５】
このような抗体を産生するハイブリドーマは、既知の手順を用いてインビトロまたはインビボで成長させることができる。モノクローナル抗体は、必要に応じて、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過によって、培養培地または体液から単離することができる。望ましくない活性がある場合には、例えば、固相に付着した免疫原で作製された吸着剤上で調製物をランさせることによって、および免疫原から所望の抗体を溶出または放出させることによって、除去することができる。二機能性物質または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は、異なるアルキル基である）を用いて、免疫化すべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、もしくは大豆トリプシン阻害剤にコンジュゲートした、ヒトＰＣＳＫ９、または標的アミノ酸配列を含む断片で宿主動物を免疫化することによって、抗体集団（例えば、モノクローナル抗体）を得ることができる。
【０１０６】
抗体が生成または選択されると、抗体は、本明細書の実施例１において開示されているように、ｐＨ依存性の結合に最適化され得る。
【０１０７】
必要に応じて、目的のｐＨ依存性抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）は配列決定することができ、ポリヌクレオチド配列は次に、発現または増殖のためにベクター内にクローニングすることができる。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞においてベクター内に維持することができ、宿主細胞は次に増殖させて、今後の使用のために凍結することができる。細胞培養物における組換えモノクローナル抗体の生産は、当技術分野において知られている手段による、Ｂ細胞から抗体遺伝子のクローニングを介して実施することができる。例えば、Ｔｉｌｌｅｒら、２００８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２９、１１２；米国特許第７，３１４，６２２号を参照されたい。
【０１０８】
あるいは、ポリヌクレオチド配列は、抗体を「ヒト化」するためまたは親和性もしくは抗体の他の特徴を向上させるための遺伝子操作に用いることができる。例えば、定常領域は、抗体を臨床試験およびヒトにおける治療において用いる場合に免疫応答を避けるために、さらに似たヒト定常領域に操作することができる。抗原に対するさらに優れた親和性および優れた有効性を得るために、抗体配列を遺伝子操作することが望ましい場合がある。当業者には、１つまたは複数のポリヌクレオチド変化がｐＨ依存性の抗体になされ得、前記変化が依然として前記抗体の抗原結合能力を維持し得ることが明らかとなろう。
【０１０９】
モノクローナル抗体をヒト化するために、４つの一般的なステップがある。これらは、（１）開始抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を決定すること、（２）ヒト化抗体を設計すること、すなわち、どの抗体フレームワーク領域をヒト化プロセスの間に用いるかを決定すること、（３）実際のヒト化方法／技術、ならびに（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第５，８０７，７１５号、米国特許第５，８６６，６９２号、米国特許第６，３３１，４１５号、米国特許第５，５３０，１０１号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，５８５，０８９号、および米国特許第６，１８０，３７０号を参照されたい。
【０１１０】
ヒト定常ドメインに融合した齧歯動物のまたは修飾された齧歯動物のＶ領域およびその会合したＣＤＲを有するキメラ抗体を含む、非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を包含する多くの「ヒト化」抗体分子が記載されている。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０〜４２２４；Ｓｈａｗら、１９８７、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４〜４５３８；およびＢｒｏｗｎら、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７〜３５８３を参照されたい。他の参考文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前の、ヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）内にグラフトされた齧歯動物のＣＤＲを記載している。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６；およびＪｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５を参照されたい。別の参考文献は、組換えによって操作された齧歯動物のフレームワーク領域によって支持されている齧歯動物のＣＤＲを記載している。例えば、欧州特許公開第０５１９５９６号を参照されたい。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこの部分の治療的適用の期間および有効性を限定する、齧歯動物の抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小にするように設計されている。例えば、抗体の定常領域は、それが免疫学的に不活性である（例えば、補体の溶解を引き起こさない）ように操作することができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２、英国特許出願第９８０９９５１．８号を参照されたい。同様に利用され得る、抗体をヒト化する他の方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、１９９１、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：２４７１〜２４７６、ならびに米国特許第６，１８０，３７７号、米国特許第６，０５４，２９７号、米国特許第５，９９７，８６７号、米国特許第５，８６６，６９２号、米国特許第６，２１０，６７１号、および米国特許第６，３５０，８６１号、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ０１／２７１６０によって開示されている。
【０１１１】
さらに別の代替において、完全にヒトの抗体は、特異的なヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作されている、市販されているマウスを用いることによって得ることができる。さらに望ましい、またはさらに堅固な免疫応答をもたらすように設計されているトランスジェニック動物もまた、ヒト化抗体またはヒト抗体の生成に用いることができる。このような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）のＨｕＭＡｂ−マウス（登録商標）およびＴＣマウス（商標）、ならびにＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）のＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）マウスである。
【０１１２】
あるいは、抗体は、組換えにより作製することができ、当技術分野において知られている任意の方法を用いて発現させることができる。別の代替において、抗体は、ファージディスプレイ技術によって、組換えにより作製することができる。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、米国特許第５，５８０，７１７号、米国特許第５，７３３，７４３号、および米国特許第６，２６５，１５０号、ならびにＷｉｎｔｅｒら、１９９４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３〜４５５を参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５３）を用いて、免疫化されていないドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体および抗体断片をインビトロで生産することができる。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージの主要のまたは微量の外被タンパク質の遺伝子、例えばＭ１３またはｆｄ内にインフレームでクローニングされ、機能的な抗体断片として、ファージ粒子の表面上に提示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体の機能的特性に基づく選択によって、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子もまた選択される。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、様々なフォーマットで行われ得る。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ、Ｄａｖｉｄ  Ｊ．、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４〜５７１を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの由来源をファージディスプレイに用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８は、免疫化されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダム組み合わせライブラリーから、多様な抗オキサゾロン抗体を単離した。免疫化されていないヒトドナーからのＶ遺伝子レパートリーを構築することができ、多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を、Ｍａｒｋら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、１９９３、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５〜７３４によって記載されている技術に基本的に従って単離することができる。天然の免疫応答において、抗体遺伝子は、高い比率で突然変異を蓄積する（体細胞超変異）。導入される変化の一部によって親和性が高まり、高い親和性の表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞は、その後の抗原チャレンジの間に、優先的に複製され、分化する。この天然のプロセスは、「鎖シャッフリング」として知られている技術を採用することによって模倣することができる（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９〜７８３）。この方法において、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子を、免疫化されていないドナーから得られるＶドメイン遺伝子の天然の変異体（レパートリー）のレパートリーで連続的に置き換えることによって向上し得る。この技術によって、ｐＭ〜ｎＭの範囲の親和性を有する抗体および抗体���片の生産が可能になる。非常に大きなファージ抗体レパートリー（「全ライブラリーの源」としても知られている）を作製するための戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、１９９３、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５〜２２６６によって記載されている。遺伝子シャッフリングはまた、齧歯動物抗体からヒト抗体を誘導するために用いることができ、ここで、ヒト抗体は、開始齧歯動物抗体に類似の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法に従って、ファージディスプレイ技術によって得られる齧歯動物抗体の重鎖または軽鎖のＶドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換えられ、齧歯動物−ヒトキメラを生じさせる。抗原の選択によって、機能的な抗原結合部位を回復させ得るヒト可変領域が単離され、すなわち、エピトープは、パートナーの選択を左右する（インプリントする）。残りの齧歯動物のＶドメインを置き換えるためにプロセスを反復すると、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０６２１３を参照されたい）。ＣＤＲグラフティングによる齧歯動物抗体の従来のヒト化とは異なり、この技術は、齧歯動物由来のフレームワーク残基またはＣＤＲ残基を有さない、完全にヒトの抗体をもたらす。
【０１１３】
上記の議論はヒト化抗体に関するものであるが、論じられる一般原則は、抗体を例えばイヌ、ネコ、霊長類、ウマ、およびウシにおける使用にカスタマイズするために適用可能であることは明らかである。本明細書において記載されている、抗体をヒト化する１つまたは複数の態様を、例えばＣＤＲグラフティング、フレームワーク突然変異、およびＣＤＲ突然変異と組み合わせることができることも明らかである。
【０１１４】
抗体は、抗体および抗体産生細胞を宿主動物からまず単離し、遺伝子配列を得、そして、この遺伝子配列を用いて宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において抗体を組換えにより発現させることによって、組換えにより作製することができる。採用され得る別の方法は、植物（例えば、タバコ）またはトランスジェニックミルクにおいて抗体配列を発現させることである。抗体を組換えにより植物またはミルクにおいて発現させるための方法は、開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓら、２００１、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２７５６；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ、１９９５、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５；ならびにＰｏｌｌｏｃｋら、１９９９、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１４７を参照されたい。抗体の誘導体、例えば、ヒト化抗体、一本鎖抗体などを作製するための方法は、当技術分野において知られている。
【０１１５】
免疫アッセイ技術およびフローサイトメトリー選別技術、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）もまた、所望の抗原に特異的な抗体を単離するために採用することができる。
【０１１６】
抗体は、多くの異なる担体に結合させることができる。担体は、活性および／または不活性であり得る。周知の担体の例には、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然のおよび修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびにマグネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の目的では、可溶性または不溶性であり得る。当業者であれば、抗体を結合するための他の適切な担体を知っているか、または、通常の試験を用いて、前記担体を確認することができる。いくつかの実施形態において、担体は、心筋を標的化する部分を包含する。
【０１１７】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離および配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい由来源として役立つ。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に置くことができ（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２において開示されている発現ベクター）、これを次に、このＤＮＡを含まなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２を参照されたい。ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列を置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１）、または免疫グロブリンのコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を共有結合させることによって、修飾することができる。この様式で、本明細書におけるモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」抗体または「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０１１８】
ｐＨ依存性の抗体および抗体に由来するポリペプチドは、当技術分野において知られている方法を用いて同定または特徴付けることができ、これによって、生物学的活性の低減、改善、または中和が検出および／または測定される。いくつかの実施形態において、ｐＨ依存性の抗体またはポリペプチドは、候補作用物質を抗原とインキュベートすること、ならびに結合、および／またはそれに付随する、生物学的活性の低減もしくは中和をモニタリングすることによって同定される。結合アッセイは、精製された抗原ポリペプチド（１つまたは複数）を用いて、またはポリペプチド（１つまたは複数）を天然に発現するかもしくは発現するようにトランスフェクトされた細胞を用いて行うことができる。１つの実施形態において、結合アッセイは、候補抗体が結合について既知のアンタゴニストと競合する能力が評価される、競合結合アッセイである。このアッセイは、ＥＬＩＳＡフォーマットを含む様々なフォーマットで行うことができる。他の実施形態において、ｐＨ依存性の抗体は、候補作用物質を抗原とインキュベートすること、ならびに結合と、それに付随する、ＬＤＬＲの発現の阻害および／または血液コレステロールのクリアランスとをモニタリングすることによって同定される。
【０１１９】
最初の同定に従って、候補ｐＨ依存性抗体の活性はさらに、標的化された生物学的活性を試験するために知られているバイオアッセイによって確認および洗練することができる。あるいは、バイオアッセイを用いて、候補を直接的にスクリーニングすることができる。抗体、ペプチド、またはアプタマーを同定および特徴付けするための方法の一部は、実施例において詳細に記載されている。
【０１２０】
ｐＨ依存性の結合を有する抗体は、当技術分野において周知の方法を用いて特徴付けすることができる。例えば、１つの方法は、前記抗体が結合するエピトープを同定すること、すなわち「エピトープマッピング」である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９）の第１１章に記載されているような、抗体抗原複合体の結晶構造を明らかにすること、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドに基づくアッセイを含む、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴付けするための、当技術分野において知られている多くの方法がある。さらなる実施例において、エピトープマッピングを用いて、ｐＨ依存性の抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープマッピングは、様々な販売元、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ  １５、８２１９  ＰＨ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から市販されている。エピトープは、線状エピトープであり得、すなわち、単一のストレッチのアミノ酸内に含まれてもよいし、または必ずしも単一のストレッチ内に含まれていなくてもよいアミノ酸の三次元相互作用によって形成される立体構造エピトープであってもよい。様々な長さ（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸長）のペプチドを、単離または合成することができ（例えば、組換えによって）、抗体との結合アッセイに用いることができる。別の実施例において、ｐＨ依存性の抗体が結合するエピトープは、抗原配列に由来するペプチドをオーバーラップさせることおよび抗体による結合を決定することを用いることによる系統的スクリーニングで決定することができる。遺伝子断片発現アッセイに従うと、抗原をコードするオープンリーディングフレームは、ランダムに、または特異的な遺伝子構築によって断片化され、発現した抗原断片の、試験対象の抗体との反応性が決定される。遺伝子断片は、例えばＰＣＲによって生産することができ、次に、放射性アミノ酸の存在下で、インビトロでタンパク質に転写および翻訳することができる。放射性標識された断片に対する抗体の結合は次に、免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定される。特定のエピトープはまた、ファージ粒子の表面上に提示されたランダムなペプチド配列の大きなライブラリー（ファージライブラリー）を用いて同定することができる。あるいは、オーバーラップするペプチド断片の規定されたライブラリーを、単純な結合アッセイにおいて、試験抗体に対する結合について試験することができる。さらなる実施例において、抗原結合ドメインの突然変異生成、ドメイン交換実験、およびアラニンスキャニング突然変異生成を行って、エピトープ結合に所要の、十分な、および／または必要な残基を同定することができる。例えば、ドメイン交換実験は、様々なポリペプチド断片が別の種の抗原の配列で置き換えられている（交換されている）突然変異抗原、または密接に関連しているが抗原性が異なるタンパク質（例えば、前駆タンパク質転換酵素ファミリーの別のメンバー）を用いて行うことができる。突然変異抗原への抗体の結合を評価することによって、抗体結合に対する特定の抗原断片の重要性を評価することができる。
【０１２１】
ｐＨ依存性の抗体を特徴付けするために用いることができるさらに別の方法は、同一の抗原に結合することが知られている他の抗体との競合アッセイを用いて、ｐＨ依存性の抗体が他の抗体と同一のエピトープに結合するかどうかを決定することである。競合アッセイは、当業者に周知である。
【０１２２】
発現ベクターを用いて、ｐＨ依存性の抗体の発現を指示することができる。当業者であれば、外因性タンパク質をインビボで発現させるための発現ベクターの投与を熟知している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号、米国特許第６，４１３，９４２号、および米国特許第６，３７６，４７１号を参照されたい。発現ベクターの投与には、注入、経口投与、粒子銃、またはカテーテル投与、および局部投与を含む、局所的投与または全身投与が含まれる。別の実施形態において、発現ベクターは、交感神経幹もしくは神経節に、または冠動脈内、心房内、心室内、もしくは心膜内に、直接的に投与される。
【０１２３】
発現ベクターまたはサブゲノムのポリヌクレオチドを含有する治療用組成物の標的化された送達もまた用いることができる。受容体介在性のＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、１９９３、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら、１９９４、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）；Ｗｕら、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６２１；Ｗｕら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：３６５５；Ｗｕら、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３３８において記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療用組成物は、遺伝子療法プロトコルにおいて、局所的投与では約１００ｎｇから約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与される。約５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、および約２０μｇから約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲もまた、遺伝子療法プロトコルの間に用いることができる。治療用のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達媒体を用いて送達され得る。遺伝子送達媒体は、ウイルス由来のものであってもなくてもよい（全体として、Ｊｏｌｌｙ、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１；Ｋｉｍｕｒａ、１９９４、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、１９９５、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１４８を参照されたい）。このようなコード配列の発現は、内在性の哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを用いて誘導することができる。コード配列の発現は、構成的であるか、または制御されたものであり得る。
【０１２４】
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のための、ウイルスに基づくベクターは、当技術分野において周知である。典型的な、ウイルスに基づく媒体には、限定はしないが、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、米国特許第５，２１９，７４０号および米国特許第４，７７７，１２７号、英国特許第２，２００，６５１号、ならびに欧州特許第０３４５２４２号を参照されたい）、アルファウイルスに基づくベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、およびＷＯ９５／００６５５を参照されたい）が含まれる。Ｃｕｒｉｅｌ、１９９２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７において記載されている、死滅アデノウイルスに結合したＤＮＡの投与もまた、採用することができる。
【０１２５】
限定はしないが、死滅アデノウイルスのみに結合している、または結合していないポリカチオン性濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ、１９９２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７を参照されたい）、リガンド結合ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ、Ｊ．、１９８９、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５を参照されたい）、真核細胞の送達媒体細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７９９４、ＷＯ９６／１７０７２、ＷＯ９５／３０７６３、およびＷＯ９７／４２３３８）、および核荷電の中和、または細胞膜との融合を含む、非ウイルス送達媒体および非ウイルス送達方法もまた、採用することができる。裸ＤＮＡもまた、採用することができる。典型的な裸ＤＮＡ導入方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号において記載されている。遺伝子送達媒体として作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、およびＥＰ０５２４９６８において記載されている。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ、１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１４：２４１１、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１５８１において記載されている。
【０１２６】
本発明は、本明細書において記載されているかまたは本方法によって作製され、本明細書において記載されている特徴を有する抗体を包含する、医薬組成物を含む組成物を包含する。本明細書において用いられる場合、組成物は、１つもしくは複数のｐＨ依存性の抗体および／または１つもしくは複数のこれらの抗体をコードする配列を包含する１つもしくは複数のポリヌクレオチドを包含する。これらの組成物は、さらに、当技術分野において周知の適切な賦形剤、例えば、緩衝液を含む薬学的に許容できる賦形剤を包含し得る。
【０１２７】
本発明はまた、ｐＨ依存性の抗体のＣＤＲ部分（Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲおよびＫａｂａｔ  ＣＤＲを含む）を提供する。ＣＤＲ領域の決定は、当技術分野の技術の範囲内である。いくつかの実施形態において、ＣＤＲがＫａｂａｔ  ＣＤＲおよびＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲの組み合わせ（「組み合わされたＣＤＲ」または「拡張されたＣＤＲ」とも呼ばれる）であり得ることが理解される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲはＫａｂａｔ  ＣＤＲである。他の実施形態において、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲである。言い換えると、２つ以上のＣＤＲを伴う実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ、組み合わせＣＤＲ、またはその組み合わせのいずれかであり得る。
【０１２８】
本発明はまた、これらの抗体またはポリペプチドのいずれかを作製する方法を提供する。本発明の抗体は、当技術分野において知られている手順によって作製することができる。ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解または他の分解によって、上記の組換え方法（すなわち、単一ポリペプチドまたは融合ポリペプチド）によって、または化学合成によって生産することができる。抗体のポリペプチド、特に最大約５０アミノ酸の短いポリペプチドは、化学合成によって都合良く作製される。化学合成の方法は、当技術分野において知られており、市販されている。例えば、抗体は、固相方法を採用する自動ポリペプチド合成装置によって生産することができる。米国特許第５，８０７，７１５号、米国特許第４，８１６，５６７号、および米国特許第６，３３１，４１５号も参照されたい。
【０１２９】
別の代替において、抗体およびペプチドは、当技術分野において周知の手順を用いて組換えにより作製することができる。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、抗体４Ａ５、５Ａ１０、６Ｆ６、７Ｄ４、またはＬ１Ｌ３の重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードする配列を包含する。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞においてベクター内に維持することができ、宿主細胞は次に増殖させて、今後の使用のために凍結することができる。ベクター（発現ベクターを含む）および宿主細胞は、本明細書においてさらに記載されている。
【０１３０】
本発明はまた、本発明の抗体のｓｃＦｖを包含する。一本鎖可変領域断片は、短い結合ペプチドを用いて軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を結合することによって作製される。Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６。結合ペプチドの例は、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２２）であり、これは、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間でおよそ３．５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーが設計および使用されている。上記のＢｉｒｄら、１９８８。リンカーは短く柔軟なポリペプチドであり、好ましくは、約２０未満のアミノ酸残基からなる。リンカーは、次に、さらなる機能、例えば薬剤の付着または固体担体への付着のために修飾することができる。一本鎖変異体は、組換えにより、または合成によって生産することができる。合成でのｓｃＦｖの生産では、自動合成装置を用いることができる。組換えによるｓｃＦｖの生産では、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドを、真核細胞、例えば酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、もしくは哺乳動物細胞、または原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、適切な宿主細胞内に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの通常の操作によって作製することができる。得られたｓｃＦｖは、当技術分野において知られている標準的なタンパク質精製技術を用いて単離することができる。
【０１３１】
ダイアボディなどの他の形態の一本鎖抗体もまた包含される。ダイアボディは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現している二価の二重特異的抗体であるが、同一の鎖上でこの２つのドメインの間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることで、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させて、２つの抗原結合部位を生じさせる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１〜１１２３を参照されたい）。
【０１３２】
例えば、二重特異的抗体、すなわち少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体は、本明細書において開示されている抗体を用いて調製することができる。二重特異的抗体を作製するための方法は、当技術分野において知られている（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０を参照されたい）。従来、二重特異的抗体の組換えによる生産は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対と、異なる特異性を有する２つの重鎖との共発現に基づくものであった（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５、５３７〜５３９）。
【０１３３】
二重特異的抗体を作製するための１つのアプローチに従って、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメインの配列に融合される。融合体は、好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を包含する、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を融合体の少なくとも１つにおいて存在させることが好ましい。免疫グロブリン重鎖の融合体と必要に応じて免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡが、個別の発現ベクター内に挿入され、適切な宿主生物内にコトランスフェクトされる。これによって、構築において用いられる３つのポリペプチド鎖の比率が等しくないことによって最適な収量が得られる実施形態における、３つのポリペプチド断片の相互割合の調整における優れた柔軟性がもたらされる。しかし、等しい比率での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収量をもたらす場合、または比率が特に重要ではない場合、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１３４】
１つのアプローチにおいて、二重特異的抗体は、一方のアームにある、第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにある、ハイブリッド免疫グロブリン重鎖軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）から構成される。二重特異的分子の片方においてのみ免疫グロブリン軽鎖を有する、この非対称の構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの、所望の二重特異的化合物の分離を容易にする。このアプローチは、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０４６９０において記載されている。
【０１３５】
２つの共有結合した抗体を包含するヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内である。このような抗体は、免疫系細胞を望ましくない細胞に対して標的化するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染を治療するため（ＰＣＴ公開ＷＯ９１／００３６０およびＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）に用いられている。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる都合の良い架橋方法を用いて作製することができる。適切な架橋剤および架橋技術は当技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号において記載されている。
【０１３６】
キメラ抗体またはハイブリッド抗体はまた、架橋剤を伴うものを含む既知の合成タンパク質化学方法を用いてインビトロで調製することができる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって、構築することができる。この目的のための適切な試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが含まれる。
【０１３７】
抗体５Ａ１０もしくは７Ｄ４の１つもしくは複数のＣＤＲまたは抗体５Ａ１０もしくは７Ｄ４に由来する１つもしくは複数のＣＤＲを包含するヒト化抗体は、例えば、当技術分野において知られている任意の方法を用いて作製することができる。例えば、４つの一般的なステップを用いて、モノクローナル抗体をヒト化することができる。これらは、（１）開始抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を決定すること、（２）ヒト化抗体を設計すること、すなわち、どの抗体フレームワーク領域をヒト化プロセスの間に用いるかを決定すること、（３）実際のヒト化方法／技術を使用すること、ならびに（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第５，８０７，７１５号、米国特許第５，８６６，６９２号、米国特許第６，３３１，４１５号、米国特許第５，５３０，１０１号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，５８５，０８９号、および米国特許第６，１８０，３７０号を参照されたい。
【０１３８】
組換えヒト化抗体において、Ｆｃ部分は、Ｆｃγ受容体および補体および免疫系との相互作用を避けるように修飾することができる。このような抗体を調製するための技術は、ＷＯ９９／５８５７２において記載されている。例えば、定常領域は、抗体を臨床試験およびヒトにおける治療において用いる場合の免疫応答を避けるために、さらに似たヒト定常領域に操作することができる。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号および米国特許第５，８６６，６９２号を参照されたい。
【０１３９】
抗体の軽鎖もしくは重鎖の可変領域、または１つもしくは複数のＣＤＲもしくはその変異体、または抗体に由来する１つまたは複数のＣＤＲもしくはその変異体を包含するヒト化抗体は、当技術分野において知られている任意の方法を用いて作製することができる。
【０１４０】
ヒト化抗体は、当技術分野において知られている任意の方法によって作製することができる。
【０１４１】
本発明は、その特性に顕著に影響しない機能的に同等な抗体ならびに活性および／または親和性が増強または低下しているその変異体を含む本発明の抗体およびポリペプチドに対する修飾を包含する。例えば、アミノ酸配列は、抗原に対する所望の結合親和性を有する抗体を得るために突然変異させることができる。ポリペプチドの修飾は、当技術分野における通常の実務であり、本明細書において詳細に記載される必要はない。ポリペプチドの修飾は、実施例において例示されている。修飾されたポリペプチドの例には、アミノ酸残基の保存的な置換を伴うポリペプチド、機能的活性を顕著に有害に変化させない、もしくはリガンドに対するポリペプチドの親和性を成熟させる（増強する）、アミノ酸の１つもしくは複数の欠失もしくは付加を伴うポリペプチド、または化学的類似体の使用を伴うポリペプチドが含まれる。
【０１４２】
アミノ酸配列の挿入には、長さが１残基から、１００以上の残基を含むポリペプチドまでの範囲の、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の融合、ならびに単一のまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端のメチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、血液循環における抗体の半減期を増大させる酵素またはポリペプチドの、抗体のＮ末端またはＣ末端への融合体が含まれる。
【０１４３】
置換変異体は、抗体分子における少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されており、その場所に、異なる残基が挿入されている。置換による突然変異生成のために最も興味深い部位には、超可変領域が含まれるが、ＦＲの改変もまた考慮される。保存的な置換を、「保存的な置換」という表題で表１に示す。このような置換によって生物学的活性が変化すると、「典型的な置換」と名付けられたまたはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載されるさらに実質的な変化が導入され得、生成物がスクリーニングされる。
【０１４４】
【表１】
0005932670.tif 000002
【０１４５】
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えばシートもしくはらせん立体構造としての、置換区域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持する効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成される。天然の残基は、共通の側鎖特性に基づいて群に分けられる：（１）非極性残基：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、（２）荷電を有さない極性残基：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性（負に荷電した）残基：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、（４）塩基性（正に荷電した）残基：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、（５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および（６）芳香族残基：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【０１４６】
非保存的な置換は、これらのクラスのうち１つのクラスのメンバーを別のクラスに交換することによって行われる。
【０１４７】
抗体の適正な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化安定性を向上させるためおよび異常な架橋を防ぐために、通常はセリンで置換することができる。逆に、システイン結合（１つまたは複数）は、特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合、抗体の安定性を向上させるために、抗体に付加することができる。
【０１４８】
アミノ酸修飾は、１つまたは複数のアミノ酸の変化または修飾から、可変領域などの領域の完全な再設計にわたり得る。可変領域における変化は、結合親和性および／または特異性を改変し得る。いくつかの実施形態において、１つから５つの保存的なアミノ酸置換しかＣＤＲドメイン内で生じない。他の実施形態において、１つから３つの保存的なアミノ酸置換しかＣＤＲドメイン内で生じない。さらに他の実施形態において、ＣＤＲドメインは、ＣＤＲ  Ｈ３および／またはＣＤＲ  Ｌ３である。
【０１４９】
修飾にはまた、グリコシル化されたおよびグリコシル化されていないポリペプチド、ならびに、例えば、異なる糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの、他の翻訳後修飾を有するポリペプチドが含まれる。抗体は、その定常領域における保存された位置でグリコシル化される（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、１９９７、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１１１〜１２８；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、ＴｉｂＴＥＣＨ  １５：２６〜３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１〜１３１８；ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５〜４１８０）、ならびに、糖タンパク質の立体構造および示される三次元表面に影響し得る糖タンパク質の部分間の分子内相互作用（上記のＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ；ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９〜４１６）に影響する。オリゴ糖はまた、特異的な認識構造に基づいて所与の糖タンパク質を特定の分子に標的化させるために役立ち得る。抗体のグリコシル化はまた、ＡＤＣＣに影響することが報告されている。特に、バイセクティングＧｌｃＭＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリン調節型の発現を有するＣＨＯ細胞は、ＡＤＣＣ活性が向上していることが報告された（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６〜１８０）。
【０１５０】
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型は、糖質部分がアスパラギン残基の側鎖に付着している状態を言う。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システイン（式中、Ｘは、プロリンを除くあらゆるアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖質部分の酵素的付着についての認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのいずれかのトリペプチド配列の存在は、潜在的なグリコシル化部位を生じさせる。Ｏ結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つがヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはスレオニンに付着した状態を言うが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた用いることができる。
【０１５１】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が上記のトリペプチド配列の１つまたは複数を含むようにアミノ酸配列を改変することによって、都合良く達成される（Ｎ結合型グリコシル化部位では）。改変はまた、１つまたは複数のセリン残基またはスレオニン残基を元の抗体の配列に付加することによって、または前記残基で元の抗体の配列を置換することによって行うことができる（Ｏ結合型グリコシル化部位では）。
【０１５２】
抗体のグリコシル化パターンはまた、根本的なヌクレオチド配列を改変することなく改変することができる。グリコシル化は主に、抗体を発現させるために用いられる宿主細胞に応じる。潜在的な治療法としての、組換え糖タンパク質、例えば抗体の発現に用いられる細胞型は、非変性細胞であることはほとんどないため、抗体のグリコシル化パターンの変化が予想され得る（例えば、Ｈｓｅら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９０６２〜９０７０を参照されたい）。
【０１５３】
宿主細胞の選択に加えて、組換えによる抗体生産の間のグリコシル化に影響する因子には、成長様式、培地配合、培養密度、酸素化、ｐＨ、精製スキームなどが含まれる。オリゴ糖の産生に関与する特定の酵素を導入するかまたは過剰発現させることを含む、特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを改変するための様々な方法が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号、米国特許第５，５１０，２６１号、および米国特許第５，２７８，２９９号）。グリコシル化または特定のタイプのグリコシル化は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を用いて、糖タンパク質から酵素的に除去することができる。さらに、組換え宿主細胞は、特定のタイプの多糖のプロセシングを欠くように遺伝子操作することができる。これらのおよび類似の技術は、当技術分野において周知である。
【０１５４】
他の修飾方法には、限定はしないが、酵素的手段、酸化的置換、およびキレート化を含む、当技術分野において知られている結合技術の使用が含まれる。修飾は、例えば、免疫アッセイのための標識の付着に用いることができる。修飾されたポリペプチドは、当技術分野において確立された手順を用いて作製され、当技術分野において知られている標準的なアッセイを用いてスクリーニングすることができ、前記アッセイの一部は、以下に、および実施例に記載されている。
【０１５５】
本発明のいくつかの実施形態において、抗体は、免疫学的に不活性のもしくは部分的に不活性の、例えば、補体介在性の溶解を引き起こさない、ＡＤＣＣを刺激しない、もしくはミクログリアを活性化しない定常領域、または、補体介在性の溶解の引き起こし、ＡＤＣＣの刺激、もしくはミクログリアの活性化のいずれか１つまたは複数において（未修飾抗体と比較して）活性が低減している定常領域などの、修飾された定常領域を包含する。定常領域の異なる修飾を用いて、エフェクター機能の最適なレベルおよび／または組み合わせを達成することができる。例えば、Ｍｏｒｇａｎら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９〜３２４；Ｌｕｎｄら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５７：４９６３〜９  １５７：４９６３〜４９６９；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６４：４１７８〜４１８４；Ｔａｏら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３：２５９５〜２６０１；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６３：５９〜７６を参照されたい。いくつかの実施形態において、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２、および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号において記載されているように修飾されている。他の実施形態において、抗体は、突然変異Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生ＩｇＧ２配列を参照したアミノ酸の番号付け）を包含するヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を包含する。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４。さらに他の実施形態において、定常領域は、Ｎ結合型グリコシル化のために非グリコシル化されている。いくつかの実施形態において、定常領域は、グリコシル化されたアミノ酸残基、または定常領域におけるＮ−グリコシル化認識配列の一部である隣接残基を突然変異させることによって、Ｎ結合型グリコシル化のために非グリコシル化されている。例えば、Ｎ−グリコシル化部位Ｎ２９７は、Ａ、Ｑ、Ｋ、またはＨに突然変異させることができる。Ｔａｏら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３：２５９５〜２６０１；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６３：５９〜７６を参照されたい。いくつかの実施形態において、定常領域は、Ｎ結合型グリコシル化のために非グリコシル化されている。定常領域は、Ｎ結合型グリコシル化のために、酵素的に（例えば、酵素ＰＮＧａｓｅによる糖質の除去）、またはグリコシル化を欠いた宿主細胞における発現によって、非グリコシル化され得る。
【０１５６】
他の抗体修飾には、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２において記載されているように修飾されている抗体が含まれる。これらの抗体は、標的分子に向けられた結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの全てまたは一部に実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを包含する。これらの抗体は、標的の顕著な補体依存性の溶解または細胞介在性の破壊を引き起こすことなく、標的分子を結合し得る。いくつかの実施形態において、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂを特異的に結合し得る。これらは、典型的には、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。この様式で修飾された抗体は、従来の抗体療法に対する炎症反応および他の拒絶反応を避けるための長期抗体療法における使用に特に適している。
【０１５７】
本発明には、親和性が成熟した実施形態が含まれる。例えば、親和性成熟抗体は、当技術分野において知られている手順によって生産することができる（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３；Ｂａｒｂａｓら、１９９４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ  ９１：３８０９〜３８１３；Ｓｃｈｉｅｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９；Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６；およびＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０５８１８４）。
【０１５８】
以下の方法は、抗体の親和性を調整するため、およびＣＤＲを特徴付けするために用いることができる。抗体のＣＤＲの特徴付けおよび／または抗体などのポリペプチドの結合親和性の改変（向上など）の１つの手段は、「ライブラリースキャニング突然変異生成」と呼ばれる。通常、ライブラリースキャニング突然変異生成は、以下のようにして機能する。ＣＤＲにおける１つまたは複数のアミノ酸位置を、当技術分野において認識されている方法を用いて、２つ以上（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個）のアミノ酸で置き換える。これによって、それぞれが２つ以上のメンバーの複雑性を有する（２つ以上のアミノ酸が全ての位置で置換されている場合）、クローン（いくつかの実施形態においては、分析される全てのアミノ酸位置についてのクローン）の小さなライブラリーが生じる。通常、ライブラリーにはまた、非変性の（置換されていない）アミノ酸を包含するクローンが含まれる。各ライブラリーからの少数のクローン、例えば約２０〜８０のクローン（ライブラリーの複雑性に応じる）が、標的ポリペプチド（または他の結合標的）への結合親和性についてスクリーニングされ、結合が増大した、同一の、減少した、またはない候補が同定される。結合親和性を決定するための方法は、当技術分野において周知である。結合親和性は、結合親和性における約２倍以上の差を検出するＢｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を用いて決定することができる。Ｂｉａｃｏｒｅは、開始抗体が既に、例えばＫＤが約１０ｎＭ以下の比較的高い親和性で結合している場合に、特に有用である。Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴を用いるスクリーニングは、本明細書において、実施例で記載されている。
【０１５９】
結合親和性は、Ｋｉｎｅｘａ  Ｂｉｏｃｅｎｓｏｒ、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫アッセイ（ＩＧＥＮ）、蛍光クエンチング、蛍光移動、および／または酵母ディスプレイを用いて決定することができる。結合親和性はまた、適切なバイオアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、ＣＤＲにおける全てのアミノ酸位置は、当技術分野において認識されている突然変異生成方法（このうち一部は、本明細書において記載されている）を用いて、２０個全ての天然アミノ酸で（いくつかの実施形態においては１個ずつ）置き換えられる。これにより、それぞれが２０のメンバーの複雑性を有する（２０個全てのアミノ酸が全ての位置で置換されている場合）、クローン（いくつかの実施形態においては、分析される全てのアミノ酸位置についてのクローン）の小さなライブラリーが生じる。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、スクリーニングされるライブラリーは、同一のＣＤＲまたは２つ以上のＣＤＲ内に存在し得る２つ以上の位置における置換を包含する。したがって、ライブラリーは、１つのＣＤＲ内の２つ以上の位置における置換を包含し得る。ライブラリーは、２つ以上のＣＤＲ内の２つ以上の位置における置換を包含し得る。ライブラリーは、３個、４個、５個、またはそれ以上の位置における置換を包含し得、前記位置は、２個、３個、４個、５個、または６個のＣＤＲにおいて見られる。置換は、低冗長性のコドンを用いて調製することができる。例えば、Ｂａｌｉｎｔら、１９９３、Ｇｅｎｅ  １３７（１）：１０９〜１８のＴａｂｌｅ  ２を参照されたい。
【０１６２】
ＣＤＲは、ＣＤＲ  Ｈ３および／またはＣＤＲ  Ｌ３であり得る。ＣＤＲは、ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、および／またはＣＤＲ  Ｈ３の１つまたは複数であり得る。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ、または拡張されたＣＤＲであり得る。
【０１６３】
結合が向上した候補を配列決定することができ、これによって、親和性の向上をもたらすＣＤＲ置換突然変異体（「向上した」置換とも呼ばれる）が同定される。結合する候補もまた配列決定することができ、これによって、結合を保持するＣＤＲ置換が同定される。
【０１６４】
複数回のスクリーニングを行うことができる。例えば、結合が向上した候補（それぞれ、１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数の位置でアミノ酸置換を包含する）はまた、それぞれの向上したＣＤＲ位置（すなわち、置換突然変異体が結合の向上を示した、ＣＤＲにおけるアミノ酸位置）で少なくとも元のアミノ酸および置換されたアミノ酸を含む、第２のライブラリーの設計に有用である。このライブラリーの調製、スクリーニング、および選択は、以下でさらに議論される。
【０１６５】
ライブラリースキャニング突然変異生成はまた、結合が向上した、結合が同一の、結合が低下した、または結合がないクローンの頻度もまた抗体抗原複合体の安定性に対する各アミノ酸位置の重要性に関する情報を提供する限り、ＣＤＲを特徴付けするための手段を提供する。例えば、ＣＤＲの位置が、２０個全てのアミノ酸に対して変化している場合に結合を保持するならば、その位置は、抗原の結合に必要である可能性が低い位置であると同定される。逆に、ＣＤＲの位置がわずかなパーセンテージの置換で結合を保持するならば、その位置は、ＣＤＲの機能にとって重要な位置であると同定される。したがって、ライブラリースキャニング突然変異生成方法は、多くの異なるアミノ酸（２０個全てのアミノ酸を含む）に対して変化し得るＣＤＲ内の位置、および、変化し得ないまたは数個のアミノ酸に対してのみ変化し得るＣＤＲ内の位置に関する情報を生じさせる。
【０１６６】
親和性が向上した候補は、向上したアミノ酸、元のアミノ酸を含み、ライブラリーの所望の複雑性に応じて、その位置でのさらなる置換をさらに含み得る、第２のライブラリー内に組み合わせることができるか、または、所望のスクリーニング方法もしくは選択方法を用いることが可能となっている。さらに、必要に応じて、隣接したアミノ酸位置を、少なくとも２つ以上のアミノ酸にランダム化することができる。隣接したアミノ酸のランダム化によって、突然変異体ＣＤＲにおけるさらなる立体構造上の柔軟性が可能になり得、これによって、多数の向上突然変異の導入が可能になり得るかまたは容易になり得る。ライブラリーはまた、第１回目のスクリーニングで親和性の向上を示さなかった位置での置換を包含し得る。
【０１６７】
第２のライブラリーは、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴分析を用いるスクリーニング、ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含む当技術分野において知られている任意の選択方法を用いる選択を含む、当技術分野において知られている任意の方法を用いて、結合親和性が向上および／または改変したライブラリーメンバーについてスクリーニングまたは選択される。
【０１６８】
本発明はまた、本発明の抗体またはポリペプチドの１つまたは複数の断片または領域を包含する融合タンパク質を包含する。１つの実施形態において、配列番号３で示される軽鎖可変領域の少なくとも１０個の連続するアミノ酸および／または配列番号４もしくは５で示される重鎖可変領域の少なくとも１０個のアミノ酸を包含する融合ポリペプチドが提供される。他の実施形態において、軽鎖可変領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、もしくは少なくとも約３０個の連続するアミノ酸、および／または重鎖可変領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、もしくは少なくとも約３０個の連続するアミノ酸を包含する融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、１つまたは複数のＣＤＲ（１つまたは複数）を包含する。さらに他の実施形態において、融合ポリペプチドは、ＣＤＲ  Ｈ３（ＶＨ  ＣＤＲ３）および／またはＣＤＲ  Ｌ３（ＶＬ  ＣＤＲ３）を包含する。本発明の目的では、融合タンパク質は、１つまたは複数の抗体、および非変性分子においてはそれが付着していない別のアミノ酸配列、例えば別の領域の異種配列または相同配列を含有する。典型的な異種配列には、限定はしないが、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグなどの「タグ」が含まれる。タグは、当技術分野において周知である。
【０１６９】
融合ポリペプチドは、当技術分野において知られている方法によって、例えば、合成または組換えにより生成することができる。典型的には、本発明の融合タンパク質は、本明細書において記載されている組換え方法を用いて、それをコードするポリヌクレオチドを調製し発現させることによって作製することができるが、これらはまた、例えば化学合成を含む、当技術分野において知られている他の手段によって調製することができる。
【０１７０】
本発明はまた、固体担体（例えば、ビオチンまたはアビジン）への結合を容易にする作用物質にコンジュゲートした（例えば、結合した）抗体またはポリペプチドを包含する組成物を提供する。簡潔にするために、言及は、これらの方法を本明細書において記載されているいかなる抗原結合および／またはアンタゴニストの実施形態にも適用するという理解を伴って、全体として抗体に対して行う。コンジュゲーションは通常、本明細書において記載されているようなこれらの成分の結合を言う。結合（通常、少なくとも投与のために、密接にこれらの成分を固定している）は、多くの手段で達成することができる。例えば、他者と反応し得る置換基をそれぞれが有する場合、作用物質と抗体との間の直接的な反応が可能である。例えば、一方の上にある例えばアミノ基またはスルフヒドリル基などの求核基は、他方の上にある無水物もしくは酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と、または良好な遊離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と、反応し得る。
【０１７１】
本発明の抗体またはポリペプチドは、当技術分野において知られている標識物質、例えば蛍光分子、放射性分子、またはあらゆる他の標識に結合し得る。シグナルを通常提供する（直接的にまたは間接的に）標識は、当技術分野において知られている。
【０１７２】
本発明はまた、本開示が明らかにするように、本明細書において記載されている抗体および／またはポリペプチドのいずれかまたは全てを包含する、組成物（医薬組成物を含む）およびキットを提供する。
【０１７３】
本発明はまた、本発明の抗体およびペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、ならびにそのポリヌクレオチドを包含するベクターおよび宿主細胞を提供する。
【０１７４】
別の態様において、本発明は、本明細書において記載されている抗体（抗体断片を含む）およびポリペプチドのいずれか、例えば、エフェクター機能が低下した抗体およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野において知られている手順によって作製し、発現させることができる。
【０１７５】
別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを包含する組成物（医薬組成物など）を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書において記載されている抗体をコードするポリヌクレオチドを包含する発現ベクターを包含する。他の実施形態において、組成物は、本明細書において記載されている抗体またはポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを包含する発現ベクターを包含する。さらに他の実施形態において、組成物は、配列番号２３および配列番号２４で示されるポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を包含する。発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与は、本明細書においてさらに記載されている。
【０１７６】
別の態様において、本発明は、本明細書において記載されているポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法を提供する。
【０１７７】
任意のこのような配列に相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）または二本鎖であり得、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）分子またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子には、イントロンを含み、１対１の様式でＤＮＡ分子に対応する、ＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含まないｍＲＮＡ分子が含まれる。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るが、その必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に結合し得るが、その必要はない。
【０１７８】
ポリヌクレオチドは、非変性配列（すなわち、抗体またはその一部をコードする内在性配列）を包含し得るか、または、このような配列の変異体を包含し得る。ポリヌクレオチド変異体は、非変性の免疫反応性分子と比較して、コードされているポリペプチドの免疫反応性が弱まらないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失、および／または挿入を含む。コードされているポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、通常、本明細書において記載されているようにして評価することができる。変異体は、非変性抗体またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約８０％の同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９０％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示す。
【０１７９】
２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、２つの配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が以下に記載されるように最大の対応でアラインされた場合に同一であるならば、「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウにわたり配列を比較して配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行われる。本明細書において用いられる「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の、通常は３０から約７５個の、または４０から約５０個の連続する位置からなるセグメントを言い、このセグメントにおいて、配列が、同数の連続する位置の参照配列と、この２つの配列を最適にアラインした後に、比較され得る。
【０１８０】
比較のための配列の最適なアラインメントは、デフォルトパラメータを用いて、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅパッケージソフトにおけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて行うことができる（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。このプログラムは、以下の参考文献において記載されているいくつかのアラインメントスキームを統合するものである：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、１９７８、Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎs−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ  Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ）、Ｖｏｌ．５、補対３、ｐｐ．３４５〜３５８；Ｈｅｉｎ  Ｊ．、１９９０、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．６２６〜６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６〜４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ（Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６〜７３０。
【０１８１】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインされた配列を少なくとも２０個の位置の比較ウィンドウにわたり比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントでは、参照配列（付加または欠失を包含していない）と比較して、２０パーセント以下の、通常は５から１５パーセント、または１０から１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を包含し得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において生じる位置の数を決定して、適合する位置の数を得、適合する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果を１００倍して配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【０１８２】
変異体はまた、またはあるいは、非変性遺伝子またはその部分もしくは相補鎖に実質的に相同であり得る。このようなポリヌクレオチド変異体は、中程度にストリンジェントな条件下で、非変性抗体（または相補配列）をコードする天然のＤＮＡ配列にハイブリダイズし得る。
【０１８３】
適切な「中程度にストリンジェントな条件」には、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液内での前洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣでの一晩のハイブリダイゼーション；その後の、０．１％ＳＤＳを含有する、２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ、および０．２×ＳＳＣのそれぞれでの、６５℃で２０分にわたる２回の洗浄が含まれる。
【０１８４】
本明細書において用いられる場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高いストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄に、低いイオン強度および高い温度、例えば、５０℃での０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを採用するか、（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドなどの変性剤、例えば、４２℃での、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を有する、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを採用するか、または（３）４２℃での、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを採用し、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）内で洗浄し、５５℃で５０％ホルムアミド内で洗浄し、その後、５５℃で、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄液によって洗浄するというものである。当業者には、プローブの長さなどの因子を適合させるために必要な温度、イオン強度などを調整する方法が認識されよう。
【０１８５】
当業者には、遺伝子コードの縮重の結果、本明細書において記載されている１つのポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが理解されよう。これらのポリヌクレオチドの一部は、あらゆる非変性遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それでも、コドン使用頻度の差に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に考慮される。さらに、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列を包含する遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１つまたは複数の突然変異、例えばヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換の結果改変されている内在性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、構造または機能が改変されている可能性があるが、その必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列の比較など）を用いて同定することができる。
【０１８６】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え方法、またはＰＣＲを用いて得ることができる。化学的なポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野において周知であり、本明細書において詳細に記載される必要はない。当業者は、所望のＤＮＡ配列を生産するために、本明細書において提供される配列および市販のＤＮＡ合成装置を用いることができる。
【０１８７】
組換え方法を用いてポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を包含するポリヌクレオチドを適切なベクター内に挿入することができ、本明細書においてさらに論じられるように、ベクターを次に、複製および増幅のために、適切な宿主細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野において知られている任意の手段によって宿主細胞内に導入することができる。細胞は、直接的な取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ交配、またはエレクトロポレーションによって外因性のポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。導入されると、外因性のポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクター（プラスミドなど）として細胞内に維持され得るか、または宿主細胞ゲノム内に組み込まれ得る。このように増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい。
【０１８８】
あるいは、ＰＣＲによって、ＤＮＡ配列の再生が可能になる。ＰＣＲ技術は、当技術分野において周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，８００，１５９号、米国特許第４，７５４，０６５号、および米国特許第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら、１９９４編（Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）において記載されている。
【０１８９】
ＲＮＡは、適切なベクター内の単離されたＤＮＡを用いること、およびそれを適切な宿主細胞内に挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されると、ＲＮＡは次に、例えば上記のＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９において説明されているように、当業者に周知の方法を用いて単離され得る。
【０１９０】
適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築することができるか、または当技術分野において利用可能な多くのクローニングベクターから選択することができる。選択されるクローニングベクターは、使用が意図されている宿主細胞に従って変化し得るが、有用なクローニングベクターは、通常、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼについての単一の標的を有し得、かつ／またはベクターを含むクローンの選択において用いられ得るマーカーの遺伝子を坦持し得る。適切な例には、プラスミドウイルスおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）、およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにシャトルベクター、例えばｐＳＡ３およびｐＡＴ２８が含まれる。これらのおよび多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの市販の販売者から入手可能である。
【０１９１】
発現ベクターは通常、本発明に従ったポリヌクレオチドを含む、複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターはエピソームとして、または染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主細胞において複製可能でなければならないことが黙示される。適切な発現ベクターには、限定はしないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２において開示されている発現ベクター（１つまたは複数）が含まれる。ベクターの成分には、通常、限定はしないが、シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、適切な転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなど）の１つまたは複数が含まれ得る。発現（すなわち、翻訳）では、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンなどの、１つまたは複数の翻訳制御エレメントもまた通常必要である。
【０１９２】
目的のポリヌクレオチドを含むベクターは、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を採用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性物質である場合）を含む、多くの適切な手段のいずれかによって宿主細胞内に導入することができる。導入するベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、宿主細胞の特徴に応じることが多い。
【０１９３】
本発明はまた、本明細書において記載されているポリヌクレオチドのいずれかを包含する宿主細胞を提供する。異種ＤＮＡを過剰発現し得るあらゆる宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的で用いることができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例には、限定はしないが、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＳＯ細胞、およびＣＨＯ細胞が含まれる。ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２も参照されたい。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）など）および酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｕｌｉｓａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、またはクルイベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））が含まれる。好ましくは、宿主細胞は、宿主細胞内にもし存在する場合には、対応する内在性の目的の抗体またはタンパク質のレベルよりも、約５倍高い、さらに好ましくは１０倍高い、さらに好ましくは２０倍高いレベルでｃＤＮＡを発現する。抗原への特異的結合についての宿主細胞のスクリーニングは、免疫アッセイまたはＦＡＣＳによって行われる。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。
【０１９４】
Ｃ．組成物
本発明の方法において用いられる組成物は、効果的な量のｐＨ依存性の抗体、または、本明細書において記載されているｐＨ依存性の抗体に由来するポリペプチドを包含する。このような組成物の例、およびこれらを製剤する方法もまた、先の節および以下に記載されている。１つの実施形態において、組成物は、１つまたは複数のｐＨ依存性の抗体を包含する。他の実施形態において、ｐＨ依存性の抗体は、ヒトＰＣＳＫ９を認識する。さらに他の実施形態において、ｐＨ依存性の抗体はヒト化されている。さらに他の実施形態において、ｐＨ依存性の抗体は、抗体介在性の溶解またはＡＤＣＣなどの望ましくないまたは好ましくない免疫応答を引き起こさない定常領域を包含する。他の実施形態において、ｐＨ依存性の抗体は、抗体の１つまたは複数のＣＤＲ（１つまたは複数）（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、またはいくつかの実施形態においては６個全てのＣＤＲ）を包含する。いくつかの実施形態において、ｐＨ依存性の抗体はヒト抗体である。
【０１９５】
本発明において用いられる組成物はさらに、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態の、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤を包含し得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ編、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、その投与量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストランを含む単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を包含し得る。薬学的に許容できる賦形剤は、本明細書においてさらに記載されている。
【０１９６】
１つの実施形態において、抗体は、約５．０から約６．５にわたるｐＨを有し、約１ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌの抗体、約１ミリモル濃度から約１００ミリモル濃度のヒスチジン緩衝液、約０．０１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、約１００ミリモル濃度から約４００ミリモル濃度のトレハロース、および約０．０１ミリモル濃度から約１．０ミリモル濃度のＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物を包含する、無菌水溶液としての製剤で投与される。
【０１９７】
ｐＨ依存性の抗体およびその組成物はまた、作用物質の有効性を増強するおよび／または補うために役立つ他の作用物質と組み合わせて用いることができる。
【０１９８】
Ｄ．キット
本発明はまた、本方法において用いるためのキットを提供する。本発明のキットには、本明細書において記載されているｐＨ依存性の抗体（ヒト化抗体など）またはペプチドを包含する１つまたは複数の容器と、本明細書において記載されているあらゆる本発明の方法に従った使用のための指示とが含まれる。通常、これらの指示は、上記に記載された治療的治療のためのｐＨ依存性の抗体の投与の説明を包含する。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗体はヒト抗体である。他の実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。ｐＨ依存性の抗体の使用に関する指示には通常、意図する治療のための投与量、投与スケジュール、および投与経路についての情報が含まれる。容器は、単位用量、大量包装（例えば、多用量包装）、またはサブユニット用量であり得る。本発明のキットにおいて提供される指示は、典型的には、ラベルまたは包装挿入物上に書かれた指示（例えば、キットに含まれる紙片）であるが、機械可読の指示（例えば、磁気式または光学式記憶ディスク上にある指示）もまた許容できる。
【０２００】
本発明のキットは適切な包装内にある。適切な包装には、限定はしないが、バイアル、ボトル、瓶、柔軟な包装（例えば、密封されたマイラーまたはプラスチック袋）などが含まれる。また、特定の装置、例えば吸入器、経鼻投与装置（例えば、アトマイザー）、またはミニポンプなどの点滴装置と組み合わせて用いるための包装も意図される。キットは、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注入針によって穴をあけることが可能なストッパーを有する静脈内溶液袋またはバイアルであり得る）。容器もまた、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注入針によって穴をあけることが可能なストッパーを有する静脈内溶液袋またはバイアルであり得る）。組成物内の少なくとも１つの活性物質は、ｐＨ依存性の抗体である。容器（例えば、充填済みシリンジまたは自己注射器）は、第２の薬学的に活性な作用物質をさらに包含し得る。
【０２０１】
キットは、緩衝液および説明情報などのさらなる構成要素を提供してもよい。通常、キットは、容器と、容器上のまたは容器に付随したラベルまたは包装挿入物（１つまたは複数）とを包含する。
【０２０２】
突然変異および修飾
本発明の抗体を発現させるために、ＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片をまず、上記の方法のいずれかを用いて得ることができる。様々な修飾、例えば、突然変異、欠失、および／または付加をまた、当業者に知られている標準的な方法を用いてＤＮＡ配列内に導入することができる。例えば、突然変異生成は、標準的な方法、例えば、突然変異したヌクレオチドをＰＣＲプライマー内に組み込んでＰＣＲ産物が所望の突然変異または部位特異的突然変異生成を含むようにする、ＰＣＲ介在性の突然変異生成を用いて実施することができる。
【０２０３】
例えば、行われ得る置換の１つのタイプは、抗体における化学的に反応性であり得る１つまたは複数のシステインを、別の残基、例えば、限定はしないが、アラニンまたはセリンに変更することである。例えば、非正準的なシステインの置換があり得る。置換は、抗体の、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域において、または定常ドメインにおいて行うことができる。いくつかの実施形態において、システインは正準的である。
【０２０４】
抗体はまた、例えば、抗体の結合特性を改変するために、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインにおいて修飾することができる。例えば、突然変異は、抗原に対する抗体のＫＤを増大もしくは減少させるため、ｋＯｆｆを増大もしくは減少させるため、または抗体の結合特異性を改変するために、ＣＤＲ領域の１つまたは複数において行うことができる。部位特異的突然変異生成の技術は、当技術分野において周知である。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。
【０２０５】
修飾または突然変異はまた、ｐＨ依存性の半減期を増大させるために、フレームワーク領域または定常ドメインにおいて行うことができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０９５６０を参照されたい。フレームワーク領域または定常ドメインにおける突然変異はまた、抗体の免疫原性を改変するため、別の分子への共有結合もしくは非共有結合のための部位を提供するため、または補体の固定、ＦｃＲ結合、および抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用などの特性を改変するために行うことができる。本発明に従うと、単一の抗体は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域のあらゆる１つまたは複数において、または定常ドメインにおいて、突然変異を有し得る。
【０２０６】
「生殖細胞系化」として知られているプロセスにおいて、ＶＨ配列およびＶＬ配列における特定のアミノ酸を、生殖細胞系のＶＨ配列およびＶＬ配列において天然に見られるアミノ酸に適合するように突然変異させることができる。特に、ＶＨ配列およびＶＬ配列におけるフレームワーク領域のアミノ酸配列は、抗体が投与された場合に免疫原性のリスクを低減させるために、生殖細胞系の配列に適合するように突然変異させることができる。ヒトのＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、当技術分野において知られている（例えば、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベースを参照されたい；また、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１〜３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；およびＣｏｘら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７〜８３６も参照されたい。
【０２０７】
行われ得る別のタイプのアミノ酸置換は、抗体における潜在的なタンパク質分解部位を除去することである。このような部位は、抗体の可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域において、または定常ドメインにおいて生じ得る。システイン残基の置換およびタンパク質分解部位の除去は、抗体生成物の不均質性のリスクを減少させ得、したがって、その均質性を増大させる。別のタイプのアミノ酸置換は、残基の一方または両方を改変することによって、潜在的な脱アミド化部位を形成するアスパラギン−グリシン対を取り除く。別の実施例において、本発明のｐＨ依存性の抗体の重鎖のＣ末端リジンを切断することができる。本発明の様々な実施形態において、抗体の重鎖および軽鎖は、シグナル配列を含んでいてもよい。
【０２０８】
本発明のＶＨセグメントおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片はさらに、例えば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するための標準的な組換えＤＮＡ技術によって、さらに操作することができる。これらの操作において、ＶＬをコードするＤＮＡ断片またはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体の定常領域または柔軟なリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に機能可能に結合される。用語「機能可能に結合される」は、この文脈において用いられる場合、２つのＤＮＡ断片によってコードされているアミノ酸配列がインフレームであり続けるように２つのＤＮＡ断片が結合されることを意味することを意図している。
【０２０９】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に機能可能に結合することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１〜３２４２を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤの定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の定常領域である。ＩｇＧの定常領域配列は、異なる個体の間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子またはアロタイプ、例えば、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、およびＧｍ（１７）であり得る。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域における天然のアミノ酸置換に相当する。Ｆａｂ断片の重鎖遺伝子では、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に機能可能に結合され得る。ＣＨ１重鎖定常領域は、重鎖遺伝子のいずれかに由来し得る。
【０２１０】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に機能可能に結合することによって、完全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１〜３２４２を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ定常領域またはラムダ定常領域であり得る。カッパ定常領域は、異なる個体の間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子、例えばＩｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）、およびＩｎｖ（３）であり得る。ラムダ定常領域は、３つのラムダ遺伝子のいずれかに由来し得る。
【０２１１】
ｓｃＦｖ遺伝子を生成するために、ＶＨをコードするＤＮＡ断片およびＶＬをコードするＤＮＡ断片が、柔軟なリンカーをコードしている、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードしている別の断片に機能可能に結合され、その結果、ＶＨ配列およびＶＬ配列は、ＶＬ領域およびＶＨ領域が柔軟なリンカーによって結合した、連続した一本鎖タンパク質として発現され得る（例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４を参照されたい）。一本鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみが用いられれば一価であり得、２つのＶＨおよびＶＬが用いられれば二価であり得、または、３つ以上のＶＨおよびＶＬが用いられれば多価であり得る。抗原および別の分子に特異的に結合する二重特異的抗体または多価抗体が生成され得る。
【０２１２】
別の実施形態において、別のポリペプチドに結合した、本発明の抗体の全てまたは一部を包含する、融合抗体またはイムノアドヘシンを作製することができる。別の実施形態において、抗体の可変ドメインのみがポリペプチドに結合している。別の実施形態において、抗体のＶＨドメインは第１のポリペプチドに結合しているが、抗体のＶＬドメインは第２のポリペプチドに結合しており、第２のポリペプチドは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成するように、第１のポリペプチドと会合している。別の好ましい実施形態において、ＶＨドメインは、リンカーによってＶＬドメインから分離されており、その結果、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは互いに相互作用し得る。ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体は、次に、目的のポリペプチドに結合している。さらに、２つ（またはそれ以上）の一本鎖抗体が互いに結合している融合抗体が生成し得る。これは、単一のポリペプチド鎖で二価抗体もしくは多価抗体を生成したい場合に、または二重特異的抗体を生成したい場合に、有用である。
【０２１３】
他の実施形態において、他の修飾された抗体を、核酸分子をコードするｐＨ依存性の抗体を用いて調製することができる。例えば、「カッパボディ」（Ｉｌｌら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：９４９〜５７）、「ミニボディ」（Ｍａｒｔｉｎら、１９９４、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：５３０３〜９）、「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８）、または「Ｊａｎｕｓｉｎｓ」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５〜３６５９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（補追）７：５１〜５２）を、明細書の教示に従って、標準的な分子生物学的技術を用いて調製することができる。
【０２１４】
二重特異的抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含む様々な方法によって生産することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、１９９０、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３を参照されたい。さらに、二重特異的抗体は、「ダイアボディ」または「Ｊａｎｕｓｉｎｓ」として形成され得る。いくつかの実施形態において、二重特異的抗体は、２つの異なる抗原エピトープに結合する。いくつかの実施形態において、上記の修飾された抗体は、本明細書において提供されるヒト抗体の可変ドメインまたはＣＤＲ領域の１つまたは複数を用いて調製される。
【０２１５】
抗原特異的な抗体の生成
代表的な本発明の抗体、５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３および５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３の重鎖および軽鎖のＤＮＡは、２００９年１２月２２日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され（ブダペスト条約の条件のもとで）、表２に示す受託番号を割り当てられた。このように寄託されたプラスミドの、公衆にとっての利用性に対するすべての制限は、本発明の明細書の特許が発行されることで変更不可能に取り除かれる。５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３の重鎖および軽鎖についての抗体参照番号は、それぞれ、ＵＣ−Ｈ５Ｈ２３およびＵＣ−Ｈ５Ｌ１７２１−６Ｌ３である。５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３の重鎖および軽鎖についての抗体参照番号は、それぞれ、ＵＣ−Ｈ５Ｈ２３−６Ｈ３およびＵＣ−Ｈ５Ｌ１７２１−６Ｌ３である。
【０２１６】
【表２】
0005932670.tif 000003
【実施例】
【０２１７】
（実施例１）ＰＣＳＫ９抗原に対する抗体のｐＨ依存性の結合のモデリング
コンピュータモデリングを用いて、ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗体が、抗体の半減期、ＰＣＳＫ９血清濃度が低下する期間に影響し得るかどうかを予測した。このモデリングの目的で、以下の仮定を行った：血液中１ｕＭ用量の抗体；２１日の（非ｐＨ依存性の）抗体の半減期；１００日の刺激付与期間；ｐＨ依存性の抗体では、Ｋｏｎ＝１ｅ５／Ｍ／ｓ、中性ｐＨでのＫｏｆｆ＝ＫＤ×Ｋｏｎ、ｐＨ依存性の結合は、酸性のエンドソームにおけるＫｏｆｆの増大としてモデリングされる；酸性ｐＨでのＫｏｆｆ＝Ｒ×中性ｐＨでのＫｏｆｆ。
【０２１８】
モデルにおける種の変化の時間率は、以下の微分方程式によって、モデルパラメータに関して特定される。通常、モデルは、それが定常状態に達するまで、ゼロに設定された抗体レベルで進行することが可能となっており、定常状態の時点では、［ｍＡｂ］をゼロから用量を反映するレベルまで再設定することによって抗体のボーラスが刺激され、その後、以下に記載されているモデルの進行が可能になる。
【０２１９】
【数１−１】
0005932670.tif 000004
【０２２０】
【数１−２】
0005932670.tif 000005
【０２２１】
【数１−３】
0005932670.tif 000006
【０２２２】
【数１−４】
0005932670.tif 000007
【０２２３】
モデルにおいて用いられるパラメータを、表３において以下に記載する。いくつかのケースにおいて、パラメータは、他の生理学的に関連する量または測定された量から誘導される。これらも同様に表において示されている。
【０２２４】
【表３】
0005932670.tif 000008
【０２２５】
モデリングの１つの描写を図１に示す。エンドソームのｐＨ（すなわち、ｐＨ５．５または６．０）／生理学的なｐＨ７．４のＫＤ比率が１から２に増大すると、経時的に抗体濃度が増大し、これは、ＫＤ比率の値と相関した。ＫＤ比率またはｋｏｆｆもしくはｋｏｎが変化すると、抗原を有さないリガンドの濃度（図２）および抗体濃度（図３）が、ＫＤ比率の増大（図２）、ｋｏｆｆの増大（図３Ａ）、およびｋｏｎの減少（図３Ｂ）と相関して変化した。これらの結果は、エンドソームのｐＨが５．５であったか６．０であったかの指定には依存しなかった。
【０２２６】
ヒートマップ表示（図４）を、ｐＨ依存性の結合を有する抗体の一般的モデルについて構築し、これは、ｐＨ依存性の結合を有する抗体が非ｐＨ依存性の抗体で観察されるものよりも抗原の血清濃度を何日長く減少させるかを効果的に示している。ノックダウン日数は、０日目から１００日目の１−（Ｃ血清（ｔ））／（Ｃ血清（ｔ＝０））の積分によって規定され、例えば、Ｎ日間にわたる血清濃度の１００％の低減の後に処理前レベルまで戻ると、Ｎ日のノックダウン日数に対応する。ヒートマップは、中性ｐＨでのＫＤおよびＫＤ比率（Ｒ）に基づいて対照抗体と比較した、ｐＨ依存性の抗体についてのノックダウン日数の増大を示す。効果は、モデリングされた全てのＫＤ値にわたって見られ、特に０．０１と１００ｎＭとの間、さらに特に０．１と１０ｎＭとの間のＫＤで見られる。特定のパラメータ、例えば用量サイズ、抗体の動態、刺激期間、または他の量の変化によって、ヒートマップ上で示される値がある程度異なる。
【０２２７】
ｐＨ依存性の結合を有するかまたは有さないＰＣＳＫ９抗体の性能についてのモデリング予測は、実際の実験結果と良好に相関した。図５Ａに、ｐＨ依存性の結合を有さずＫＤ比率が１．１の抗体５Ａ１０を投与した後の経時的な総抗体濃度を示す。対応のＬＤＬレベルを図５Ｂに示す。図６Ａには、ｐＨ依存性の結合を有しＫＤ比率が１４．４の抗体５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３を投与した後の経時的な総抗体濃度を示す。対応のＬＤＬレベルもまた図６Ｂに示す。図５および図６におけるこれらのモデルおよび実験では、５．５のｐＨが仮定され、抗体の実験的ＫＤ値はｐＨ５．５で計算された。ｐＨ依存性の結合をする抗体は、５Ａ１０と比較して、総抗体濃度が引き延ばされ、ＬＤＬレベルの阻害が引き延ばされた。ｐＨ依存性の結合を有する抗体の一般的モデルについてのさらなる議論を、実施例４において示す。
【０２２８】
（実施例２）ｐＨ依存性のＰＣＳＫ９結合を有する抗ＰＣＳＫ９抗体の生成およびスクリーニング
ヒスチジンスキャン突然変異生成を、モノクローナル抗体ｈ５Ａ１０（５Ａ１０  ｈｕフレームとしても知られている）の全ＣＤＲについて行った。この抗体は、マウスモノクローナル抗体５Ａ１０（５Ａ１０．Ｂ８としても知られている）に由来するが、ヒトフレームワーク領域を有する。開始鋳型として用いられるｈ５Ａ１０抗体の配列を以下に示す（ＣＤＲは太字である）。
軽鎖可変領域：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＲＹＳＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１）
重鎖可変領域：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＮＰＳＧＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＰＬＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２）
【０２２９】
抗体ｈ５Ａ１０を細菌発現ベクター内にクローニングし、これによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズムにおけるＦａｂの発現が可能になる。プライマーを用いて、全てのＣＤＲ位置をヒスチジンに突然変異させ、その結果、ｈ５Ａ１０抗体の５８個の単一ヒスチジン突然変異体が生じた。
【０２３０】
これらの単一ヒスチジン突然変異体を有する抗体を、ＩＰＴＧで誘発した後に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズムにおいて発現させ、ＣＨ１のＣ末端上にあるヒスチジンタグを用いて精製した。精製されたＦａｂの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、ｐＨ５．５および７．４で測定した。ｐＨ５．５／ｐＨ７．４のＫＤ比率に影響する突然変異は、４つの異なるＣＤＲ（Ｌ１、Ｌ２、Ｈ２、およびＨ３）において見られた。ｐＨ依存性のＫＤ変化は、わずかな減少から顕著な減少にまでわたった。
【０２３１】
３つのＣＤＲ（Ｌ１、Ｌ２、およびＨ２）からの突然変異は、ｐＨ７．４での親和性を破壊することなく、ｐＨ５．５／ｐＨ７．４のＫＤ比率を増大させ、これらの突然変異を含むＣＤＲを組み合わせる抗体が生じた。ｈ５Ａ１０および全ての突然変異体では、重鎖ＣＤＲ１（Ｈ１）の配列は、ＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨ（配列番号６）である。５Ａ１０、単一の、二重の、および三重の突然変異体、ならびに５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｈ３では、軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ３）はＱＱＲＹＳＴＰＲＴ（配列番号２７）である。他の親和性成熟した突然変異体およびＬ１Ｌ３に基づく突然変異体では、Ｌ３はＱＱＲＹＳＬＷＲＴ（配列番号１２）である。突然変異のこれらの様々な組み合わせを含む抗体のＣＤＲ配列を、以下の表４に示す。配列番号の識別子は、括弧内に示されている。
【０２３２】
【表４】
0005932670.tif 000009
【０２３３】
５Ａ１０．Ｂ８と比較して、これらの抗体のフレームワーク配列において変化は生じなかった。例えば、５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３および５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３の重鎖可変領域の配列を以下に示す。同一の軽鎖可変領域をこれらの抗体のそれぞれにおいて用い、これらもまた以下に示す。ＣＤＲは太字で強調されている。
５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３および５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３の軽鎖可変領域：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＨＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＲＹＳＬＷＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３）
重鎖可変領域５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＨＰＳＧＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＰＬＹＡＭＤＹ  ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号４）
重鎖可変領域５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＨＰＳＧＧＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＰＬＹＡＳＤＬ  ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号５）
５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３および５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３の軽鎖可変領域（カッパ）
ｇａｔａｔｃｃａｇａｔｇａｃａｃａｇｔｃｃｃｃａｔｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｇｇｇｃｇａｃｃｇｃｇｔｃａｃｃａｔｃａｃｃｔｇｃａａｇｇｃｃｔｃｔｃａｇｇａｔｇｔｇｃａｔａｃｔｇｃｔｇｔａｇｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａｇｃｃａｇｇｃａａａｇｃｃｃｃａａａａｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃｃａｔｇｃａｔｃｃｔａｃｃｇｃｔａｃａｃｔｇｇｔｇｔｃｃｃａｔｃａｃｇｃｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｃｔｃｔｇｇｔａｃａｇａｔｔｔｃａｃｃｔｔｃａｃｃａｔｔａｇｃａｇｃｃｔｇｃａａｃｃａｇａａｇａｔａｔｔｇｃｃａｃｔｔａｔｔａｃｔｇｃｃａｇｃａａｃｇｔｔａｔａｇｔｃｔｇｔｇｇｃｇｃａｃｇｔｔｃｇｇｔｃａａｇｇｃａｃｃａａｇｃｔｇｇａｇａｔｃａａａ（配列番号２３）
５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３の重鎖可変領域
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇｔｃｔｇｇｔｇｃｔｇａｇｇｔｇａａｇａａｇｃｃｔｇｇｃｇｃｔｔｃｃｇｔｇａａｇｇｔｔｔｃｃｔｇｃａａａｇｃａｔｃｔｇｇｔｔａｃａｃｃｔｔｔａｃｃａｇｃｔａｃｔａｔａｔｇｃａｃｔｇｇｇｔｇｃｇｃｃａａｇｃｃｃｃｔｇｇｔｃａａｇｇｃｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｇｇｇｃｇａｇａｔｔｃａｔｃｃｔａｇｃｇｇｃｇｇｔｃｇｔａｃｔａａｃｔａｃａａｔｇａｇａａｇｔｔｃａａｇａｇｃｃｇｃｇｔｇａｃｔａｔｇａｃｔｃｇｃｇａｔａｃｃｔｃｃａｃｃａｇｃａｃｔｇｔｃｔａｃａｔｇｇａａｃｔｇａｇｃｔｃｔｃｔｇｃｇｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃｔｇｃｔｇｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｇｃｃｃｇｃｇａｇｃｇｃｃｃｃｃｔｇｔａｔｇｃｔａｇｃｇａｃｃｔｇｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｔａｃｃａｃｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａ（配列番号２４）
【０２３４】
これらの抗体を、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファーを用いて、研究グレードのセンサーチップを備えた表面プラズモン共鳴Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００バイオセンサーで測定する、７．４でのそれらのＫＤおよびｐＨ５．５／ｐＨ７．４のそれらのＫＤ比率を決定するために（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ−現在はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、発現させ、精製した。ウサギポリクローナル抗Ｍｓ  ＩｇＧを、標準的なＮ−ヒドロキシスクシンイミド／エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＮＨＳ／ＥＤＣ）化学を用いて、チップ上に飽和レベルでアミン結合した。緩衝液を、ＨＢＳ−ＥＰ＋１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ＋１ｍｇ／ｍＬのＣＭ−デキストランに交換した。完全長ＰＣＳＫ９  ＩｇＧを約１５μｇ／ｍＬに希釈し、５μＬ／分で１分間捕捉して、参照チャネルとして用いるための１つのブランクを残して、フローセル当たり約５００ＲＵのレベルを得た。３．７３〜３０２ｎＭのｈＰＣＳＫ９または２．５４〜２０６ｎＭのｍＰＣＳＫ９を、５回３セットで、１００μＬ／分で１分間にわたり注入した。解離を５分間にわたりモニタリングした。チップを、１００ｍＭのリン酸の３０秒のパルスを２回行う各滴定の最後の注入の後に再生させた。緩衝液サイクルによって、データを二重参照するためのブランクが提供され、データを次に、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ．４．１を用いて、単純結合モデルに全体的に適合させた。運動速度定数の商（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）から親和性を推定した。ヒトＰＣＳＫ９に対する親和性についての結果を表５に示し、マウスＰＣＳＫ９に対する親和性についての結果を表６に示す。これらのデータは、抗体が、ヒトまたはマウスのＰＣＳＫ９にｐＨ７．４で高い親和性を有し、ｐＨ５．５で低い親和性を有するように、設計および選択され得ることを示す。
【０２３５】
【表５】
0005932670.tif 000010
【０２３６】
【表６】
0005932670.tif 000011
【０２３７】
ＰＣＳＫ９抗体ｈ５Ａ１０および５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３ならびにＰＣＳＫ９抗体Ｈ１Ｍ３００Ｎについての親和性および動態パラメータ（ＵＳ２０１０／０１６６７６８、例えば、Ｔａｂｌｅ  ７を参照されたい）。全ての実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００バイオセンサーで行った。
【０２３８】
抗ヒトＦｃセンサーチップを、４００ｍＭのＥＤＣおよび１００ｍＭのＮＨＳの１：１（ｖ／ｖ）混合物を用いて、１０μＬ／分の流速で７分間にわたり、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ４センサーチップの全てのフローセルを活性化することによって調製した。抗ヒトＦｃ試薬（ヒトＩｇＧ  Ｆｃに対するヤギＦ（ＡＢ’）２断片、Ｃａｐｐｅｌカタログ番号：５５０５３）を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）内に６０μｇ／ｍＬまで希釈し、全てのフローセル上に２０μＬ／分で７分間にわたり注入した。全てのフローセルを、１５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）内の１００ｍＭのエチレンジアミンで、１０μＬ／分で７分間にわたりブロックした。
【０２３９】
動態アッセイを、Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３４９、１３６〜１４７（２００６）において記載されているような動態滴定方法を用いて行った．
【０２４０】
同一の抗体（例えば、５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３）を、１０μＬ／分の流速でフローセル２、３、および４でそれぞれ３０秒、６０秒、および１２０秒にわたり、２μｇ／ｍＬで下流のフローセル（フローセル２、３、および４）に捕捉した。フローセル１を参照表面として用いた。抗体を捕捉した後、ＰＣＳＫ９を、低濃度から高濃度の一連の注入で、３０μＬ／分で全てのフローセルに注入した。最高濃度は２００ｎＭのＰＣＳＫ９であり、希釈倍数は３倍であった。各ＰＣＳＫ９注入は２分であり、２００ｎＭのＰＣＳＫ９を注入した後の解離時間は２０分であった。類似の注入セットを、二重参照の目的で、ＰＣＳＫ９の代わりにランニングバッファーを用いて行った（Ｍｙｓｚｋａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １２、２７９〜２８４、１９９９において記載されているような二重参照）。各分析サイクルの後、全てのフローセルを、７５ｍＭのリン酸の３０秒の注入を３回行って、再生した。所与のＰＣＳＫ９／抗体対についての、フローセル２および３から得られるセンサーグラムを、マストランスポート結合モデルを用いて、単純な１：１のラングミュアに全体的に適合させた。
【０２４１】
実験は、試料と、それぞれ１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０からなるランニングバッファー（ｐＨ６）、および１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０からなるランニングバッファー（ｐＨ７．４）とを用いて、ｐＨ６．０および７．４で行った。
【０２４２】
【表７】
0005932670.tif 000012
【０２４３】
（実施例３）ｐＨ依存性ＰＣＳＫ９結合抗体は、コレステロールの低下に対して延長された薬力学的効果を有する
Ａ．ｐＨ依存性ＰＣＳＫ９結合アンタゴニスト抗体は、マウスにおいて、延長した時間にわたり、血清コレステロールを低下させる
ｐＨ依存性ＰＣＳＫ９結合アンタゴニスト抗体が、非ｐＨ依存性の抗体と比較して、延長した期間にわたりコレステロールレベルをインビボで低下させ得るかどうかを決定するために、酸感受性抗体５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｈ３および５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３ならびに非酸性感受性抗体ｈ５Ａ１０（１０ｍｇ／ｋｇでのみ投与する）および５Ａ１０．Ｂ８の経時的な効果を、１、３、または１０ｍｇ／ｋｇでマウスに注入した場合の血清コレステロールについて試験した。４つの抗体全ては、中性ｐＨ（ＰＨ７．４）で、マウスＰＣＳＫ９に対して５〜１４ｎＭの類似の結合親和性を有する。抗体５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｈ３および５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３は、ｐＨ５．５で、それぞれ１１７ｎＭおよび４０８ｎＭの低減した親和性を有するが、ｈ５Ａ１０および５Ａ１０．Ｂ８は、ｐＨ５．５で、７．４でのＫＤ（５．２ｎＭ）に類似したＫＤを有する。６から７週齢のオスＣ５７／ｂｌ６マウスを、１２時間の明／暗サイクルで維持し、７日目に採血しておよそ７０μｌの血清を回収した。アンタゴニストＰＣＳＫ９抗体、およびいかなる既知の哺乳動物タンパク質にも結合しない対照のアイソタイプ適合モノクローナル抗体を、オスの７週齢のＣ５７／ｂｌ６マウスにＩＶ注入し、血清試料を、注入後５日目、１２日目、１９日目、２６日目、６１日目、および７５日目に回収した。全ての血清試料を、Ａｃｅ  Ａｌｅｒａ機器（Ａｌｆａ  Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ、Ｗｅｓｔ  Ｃａｌｄｗｅｌｌ、ＮＪ）で、総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロールについて分析し、ＬＤＬコレステロールレベルを、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄの式を用いて計算した。図７は、ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体を注入した後の、総コレステロールレベルの迅速かつ用量依存的な減少を示す。マウスにおけるＬＤＬコレステロールレベルは、確実に測定および計算するには低すぎた。１０ｍｇ／ｋｇの用量では、４つの抗体全ては、５日目および１２日目に、ＨＤＬコレステロールを３５〜４０％低下させたが、５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｈ３および５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３を注入された動物は６１日目まで回復せず、ｈ５Ａ１０および５Ａ１０．Ｂ８を注入された動物は、それぞれ２６日目および３３日目にベースラインレベルまで回復した。
【０２４４】
Ｂ．ｐＨ依存性ＰＣＳＫ９結合抗体は、マウスにおいて延長した半減期を有する
抗体の血清濃度を、実施例ｂにおいて記載されているものと同一の研究で決定して、ＰＨ感受性の抗ＰＣＳＫ９抗体が延長した抗体半減期をもたらすかどうかを決定した。ｈ５Ａ１０および５Ａ１０．Ｂ６などの正常な抗ＰＣＳＫ９抗体は、抗体／抗原複合体のＰＣＳＫ９介在性の分解に起因して、他の可溶性抗原に結合する抗体と比較して、用量依存的な短い半減期を有する。図８Ａにおいて示されるように、ｐＨ依存性の結合特性は、抗体の分解を低減させ、抗ＰＣＳＫ９抗体５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｈ３および５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３の半減期を延長させた。５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｈ３および５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３の引き延ばされたＰＫが抗体のＰＣＳＫ９介在性のクリアランスの低下により生じたということをさらに実証するために、類似の経時的研究をＰＣＳＫノックアウトマウスにおいて行った。ｐＨ感受性抗体と非感受性抗体との間の血清抗体濃度および低減速度の差は、３ｍｇ／ｋｇのヒトＰＣＳＫ９をマウスに注入するまで顕著ではなかった。この注入の後、非ｐＨ感受性のＰＣＳＫ９抗体は、ｐＨ感受性の抗体および陰性対照抗体と比較して分解の増大を示した（図８Ｂ）。これらの結果は、ｐＨ依存性ＰＣＳＫ９結合ＰＣＳＫ９抗体の分解の観察された減少が、ＰＣＳＫ９からの抗体の解離、つまりＰＣＳＫ９介在性の分解からの抗体の救出によって生じることを示す。
【０２４５】
Ｃ．ｐＨ感受性のＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体は、サルにおいて、延長した期間にわたり、血清コレステロールを低下させる
図９Ｂは、パーセント対照であるカニクイザルの血清ＬＤＬコレステロールレベルに対する、ＰＨ感受性の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｈ３および５Ｌ１７２１Ｈ２３＿６Ｌ３Ｈ３ならびに非感受性の抗ＰＣＳＫ抗体Ｌ１Ｌ３の効果を説明するものである。抗体（それぞれ１．５ｍｇ／ｋｇ）を、０日目にメスのカニクイザルにｉ．ｖ．ボーラス注入を介して投与した。ＬＤＬコレステロールは、３つ全ての抗体で処理した群において、日目までにベースラインの５０％まで低減した。ＬＤＬコレステロールレベルは、非ｐＨ感受性の抗体を投与した後１０日目までにベースラインに戻ったが、ＬＤＬコレステロールは、ｐＨ感受性の抗体で処理したサルにおいては、２１日目まで抑制されたままであった。ＨＤＬレベルは、抗体治療の結果、基本的に不変のまま維持された（図９Ａ）。図１０は、ｐＨ感受性の抗ＰＣＳＫ９抗体の半減期が非ｐＨ感受性のＬ１Ｌ３と比較して延長したことを示す。
【０２４６】
（実施例４）ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗体についての一般的モデリング
コンピュータモデリングを用いて、その包括的な抗原に対するｐＨ依存性の結合を有する抗体が抗体の半減期および／または抗原の量もしくは血清濃度を低下させる期間に影響し得るかどうかを予測した。このモデリングの目的で、以下の仮定を行った：１）抗体；血液中１ｕＭ用量の抗体；２１日の抗体半減期；２）１００日の刺激付与；抗体の結合およびｐＨ依存性の結合；Ｋｏｎ＝１ｅ５／Ｍ／ｓ；中性ｐＨでのＫｏｆｆ＝ＫＤ×Ｋｏｎ；ｐＨ依存性の結合は、酸性のエンドソームにおけるＫｏｆｆの増大としてモデリングされる；酸性ｐＨでのＫｏｆｆ＝Ｒ×中性ｐＨでのＫｏｆｆ。
【０２４７】
図１５は、モデリングに用いられたｐＨ依存性の結合を有する抗体についてのトラフィックモデルを詳述し、モデルを定義する方程式は以下の通りである。
【０２４８】
【数２−１】
0005932670.tif 000013
【０２４９】
【数２−２】
0005932670.tif 000014
【０２５０】
モデルにおいて用いられるパラメータを、表８において以下に記載する。
【０２５１】
【表８】
0005932670.tif 000015
【０２５２】
図４において示されるヒートマップは、ｐＨ依存性の結合を有する抗体が、ｐＨ依存性の結合を有さない抗体によるノックダウンよりもどれほど多く抗原のノックダウンに影響するかを示す。このノックダウン量は、１００日間の刺激にわたる２つの抗体の遊離抗原曲線の間の領域を測定することによって決定される。これは、ｐＨ依存性の結合を有する抗体がｐＨ依存性の結合を有さない抗体によるノックダウンよりも何日長く抗原のノックダウンに影響するかということであると考えることができるが、これらの２つの測定基準は、正確に相関する必要はない。マップ上の明るい領域は、長い期間および／または遊離抗原の強いノックダウンを反映する。図１１のヒートマップは、ｐＨ依存性の抗原結合を有する潜在的な抗体が、抗原がＤＫＫ１、ＩｇＥ、またはＣ５であった場合にいかに抗原のノックダウンに影響するかを示す。これらの抗原のそれぞれで、ｐＨ依存性の結合を有する抗体は、抗原のノックダウンを延長し得た。
【０２５３】
図１２は、ＩｇＥに対するｐＨ依存性の結合を有する抗体についてのさらに詳細なモデリングを示す。抗体の、生じた、ＩｇＥノックダウンの期間の延長は、ＫＤが約１ｎＭ以上であり、ｐＨ６．０／ｐＨ７．４でのＫＤ比率（Ｒ）が３以上である。
【０２５４】
抗原ＤＫＫ１についての類似の分析を図１３に示し、Ｃ５についての類似の分析を図１４に示す。ＤＫＫ１では、ＫＤの理想的な範囲は、３〜３０の範囲のＫＤ比率にわたり、１．０〜１００ｎＭである。Ｃ５では、ＫＤの理想的な範囲はまた、３〜３０の範囲のＫＤ比率で１．０〜１００ｎＭである。
【０２５５】
（実施例５）ｐＨ依存性のＩｇＥ結合を有する抗ＩｇＥ抗体の生成およびスクリーニング
ヒスチジン置換を、以下の軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（ＣＤＲは太字である）を有する抗ＩｇＥ抗体５．９４８−Ｈ１００Ｙにおける、下線を引かれた残基の位置で行った。
ＶＬ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＲＮＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＰＡＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２５）
ＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＤＩＮＷＶＲＱＡＴＧＱＧＬＥＷＭＧＷＭＤＰＮＳＧＮＴＧＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＮＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＹＤＳＤＧＹＹＳＦＳＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２６）
【０２５６】
抗体を、２５℃で、ＩｇＥの結合について試験した。親和性および速度定数を決定するために、全ての実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００バイオセンサーで行った。
【０２５７】
ビオチン捕捉表面を、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎの固定によって調製した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ４センサーチップの全てのフローセルを、１０μＬ／分の流量で、４００ｍＭのＥＤＣおよび１００ｍＭのＮＨＳの１：１（ｖ／ｖ）混合物で７分間にわたり活性化した。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、製品番号：３１０００）を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）内に１００μｇ／ｍＬまで希釈し、全てのフローセル上に２０μＬ／分で７分間にわたり注入した。全てのフローセルを、１５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）内の１００ｍＭのエチレンジアミンで、１０μＬ／分で７分間にわたりブロックした。
【０２５８】
ＩｇＥ構築物（社内で発現および精製されたヒトＩｇＥ−Ｆｃ（Ｃｈ２−Ｃｈ３−Ｃｈ４））を、ＩｇＥを等モル濃度量のＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２１３４３）と共に室温で３０分間にわたりインキュベートすることによって、最低限ビオチン化した。遊離ビオチンを、緩衝液の交換によって除去した。
【０２５９】
全てのＢｉａｃｏｒｅ実験は、センサーチップの４つのフローセルの２つ（１および２、または３および４）を並行して用いて行った。下流のフローセルを分析フローセルとして用い、一方、他方のフローセルを参照表面として用いた。したがって、ビオチン化されたＩｇＥ（Ｂ−ＩｇＥ）は分析フローセル上に捕捉され、全ての精製されたＦａｂ断片が両方の上に注入された。参照フローセルのセンサーグラムを、分析フローセルのセンサーグラムから差し引いた。
【０２６０】
Ｂ−ＩｇＥを、捕捉の直前に、ランニングバッファー内に５ｕｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈した。ｐＨ６．０では、Ｂ−ＩｇＥは、１０ｕＬ／分で６０秒間にわたり注入した。ｐＨ７．４では、Ｂ−ＩｇＥは、類似の捕捉レベルを得るために８０秒にわたり注入した。動態アッセイを、Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３４９：１３６〜１４７、２００６において記載されているような動態滴定方法を用いて行った。
【０２６１】
Ｂ−ＩｇＥを捕捉した後、精製されたＦａｂ断片を、低濃度から高濃度の一連の注入で、３０μＬ／分で分析フローセルおよび参照フローセルに注入した。Ｆａｂの最高濃度は３０ｎＭから２００ｎＭの範囲であり、希釈倍数は３倍であった。各Ｆａｂ希釈物を２分間にわたり注入し、その後、最後の注入の後に、３０分の最終解離時間があった。類似の注入セットを、二重参照の目的で、Ｆａｂの代わりにランニングバッファーを用いて行った（Ｍｙｓｚｋａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １２、２７９〜２８４、１９９９において記載されているような二重参照）。二重参照したセンサーグラムを、マストランスポート結合モデルを用いて、単純な１：１のラングミュアに全体的に適合させた。
【０２６２】
実験は、試料と、それぞれ１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなるランニングバッファー（ｐＨ６）、および１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなるランニングバッファー（ｐＨ７．４）とを用いて、ｐＨ６．０および７．４で行った。
【０２６３】
以下の表９においてにおいて示されるように、ＩｇＥ抗体５．９４８−Ｈ１００Ｙにおけるヒスチジン置換によって、ｐＨ６．０での速いｋｏｆｆならびにｐＨ６．０／ｐＨ７．４での高いＫＤ比率およびｋｏｆｆ比率を有する抗体を生じさせるのに成功した。
【０２６４】
【表９】
0005932670.tif 000016
【０２６５】
本明細書において引用される全ての参考文献の開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。
【受託番号】
【０２６６】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０５４７
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０５４８
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１０５４９
【図１】
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【図２】
0005932670.tif 000018
【図３】
0005932670.tif 000019
【図４−１】
0005932670.tif 000020
【図４−２】
0005932670.tif 000021
【図５】
0005932670.tif 000022
【図６】
0005932670.tif 000023
【図７】
0005932670.tif 000024
【図８】
0005932670.tif 000025
【図９】
0005932670.tif 000026
【図１０】
0005932670.tif 000027
【図１１】
0005932670.tif 000028
【図１２】
0005932670.tif 000029
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0005932670.tif 000032
【配列表】
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