(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤含有担体粒子と、コラーゲン結合インテグリン受容体のサブグループの、インテグリンα２β１受容体α２Ｉドメインに特異的に結合できる環状ペプチドとの結合体および薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を含む、局所適用のための医薬組成物であって、
該ペプチドが、アミノ酸配列
【化１】
0005952840.tif 000002
（配列番号:２）
［ここで、
Ｌは、薬剤含有担体粒子を結合するのに適したチオール基を含むリンカー部である。］を有する、医薬組成物。
【請求項２】
薬剤含有担体粒子がリポソーム、ニオソーム、トランスファーソーム、高分子ナノ粒子または脂質ナノ粒子である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
リポソームが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン、コレステロールまたはコーレートのうち、１つ以上の脂質を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
リポソームに含まれる少なくとも１つの脂質が、リポソームに結合するＰＥＧ基を含んでいる、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
高分子ナノ粒子が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド)、ポリ(ε−カプロラクトン)、ポリビニルアルコール、ポリ（メタクリル酸メチル)、ポリジメチルシロキサンまたはキトサンのうち、１つ以上を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
担体粒子に含有されている薬剤が、ビタミンＤ類似体、コルチコステロイド、カルシニューリン阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ヒスタミン受容体アンタゴニスト、インゲノール−３−アンゲレートまたは天然起源もしくは合成ヌクレオチドである、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
該ヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＬＮＡまたはＰＮＡである、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
ビタミンＤ類似体が、カルシポトリオールである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
治療剤が、インテグリンα２β１受容体を表面に発現しているケラチノサイトを標的とするための、請求項１〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
炎症性皮膚疾患または症状の処置に用いるための、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
炎症性皮膚疾患または症状が、乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹、蕁麻疹、ざ瘡、アレルギー性接触性皮膚炎または刺激性皮膚炎である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケラチノサイトのコラーゲン結合インテグリン受容体に結合することによって、薬剤の標的をケラチノサイトとするための、環状ペプチドおよび薬剤含有担体粒子と該環状ペプチドの結合体に関する。本発明はさらに、かかる結合体を含む、医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは、細胞接着、分化、移動および免疫応答を調節することによって、細胞−細胞間および細胞−細胞外マトリクス間の相互作用を媒介する膜内在性受容体のファミリーである。インテグリンは、αおよびβサブユニットからなるヘテロダイマーである。細胞の種類により、異なるサブユニットの組み合わせを発現し、２５の異なるヘテロダイマーのファミリーが生じている。いくつかのＲＧＤ結合サブグループのインテグリン受容体、例えばα５β１およびαｖβ３インテグリン受容体は、フィブロネクチンのような細胞外マトリクス蛋白質のアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフを認識する。ＲＧＤモチーフを含むペプチドまたはその構造模倣物が作製され、それらは、インテグリン、主にα５β１およびαｖβ３インテグリン受容体に結合し、それによりインテグリン−介在性の、フィブロネクチンのような細胞外マトリクス蛋白質への細胞の結合を阻害する、治療用物質として提案されている(特許文献１;特許文献２;特許文献３; 特許文献４を参照のこと)。これらのペプチドは、創傷治癒および、腫瘍細胞がフィブロネクチンに結合するのを妨げ、そのことにより転移を阻害するのに用いることが示唆されている。これらのペプチドは、増殖している内皮細胞に発現しているインテグリン受容体に結合することによって、がんの進行および炎症の間の、薬物送達を改善することができる（非特許文献１および非特許文献２)。
【０００３】
インテグリンα２β１受容体は、コラーゲン結合受容体のインテグリンサブグループに属する。インテグリンα２β１受容体は、コラーゲンＩのような、いくつかの天然起源のリガンドに、インテグリンα２モノマーの細胞外Ｉドメイン（α２Ｉドメイン）を通して結合し、このドメインは全てのコラーゲン結合インテグリン受容体で保存されている(非特許文献３）。相互作用は、カチオン依存性様式でおこり、コラーゲンＩとインテグリンα２β１の相互作用は、MIDAS モチーフ残基（Ａｓｐ １５１、Ｓｅｒ １５３、Ｔｈｒ ２２１およびＡｓｐ ２５４）に支持されたＭｇ２＋架橋性相互作用を介している（非特許文献４)。コラーゲン由来の、３本の２１アミノ酸ペプチドである、コラーゲン三重ヘリックスとの複合体におけるインテグリンα２ドメインの構造を解いたことによって、α２Ｉドメインは、コラーゲンとの相互作用に伴って、立体構造の変化をおこすことが明らかになった（非特許文献５)。該受容体における、コラーゲンとの相互作用による上記の立体構造変化は、ＮＭＲ分光法によって確認された(上記非特許文献４)。三重鎖ペプチドの存在はまた、インテグリンα２と全長のコラーゲンの相互作用を阻害する（非特許文献６)。
【０００４】
コラーゲンの結合およびフィブリノーゲン依存性血小板活性化は、ヘビ毒由来のポリペプチド毒素により阻害され、これらの毒液の抗凝固効果に貢献しうる。これらのポリペプチド(ディスインテグリンとよばれる）は、細胞外マトリクス蛋白質に見られるＲＧＤモチーフの機能性ホモログである。Bothrops jararaca（ブラジルクサリヘビ）の毒から単離されたヘビ毒（jararhagin）蛋白質は、コラーゲンＩ相互作用を阻害することがわかっている（非特許文献７）。ヘビ毒（jararhagin）中の塩基性モチーフ Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＲＫＫ）が該相互作用に重要である。９アミノ酸長、環状ペプチド（Ｃ２４１ＴＲＫＫＨＤＮＡＱ２４９Ｃ）は、２mM ＭｇＣｌ２の存在下で、α２Ｉドメインに競合的に結合し、細胞のコラーゲンＩへの結合を妨害することで、コラーゲンＩとインテグリンα２β１受容体間の相互作用を阻害することがわかっている（上記非特許文献７)。
【０００５】
上記の非特許文献７に記載された、ＲＫＫモチーフを含む９アミノ酸ペプチドおよび、ヘビ毒由来の、ＲＫＫモチーフを含む他の環状ペプチドは、特許文献５に記載されており、インテグリンの、コラーゲンおよびラミニンとの相互作用の阻止、より具体的には、例えば歯周病で見られるような、細胞のコラーゲン上の移動、または骨肉腫や悪性黒色腫で見られるような悪性細胞の移動の阻止か、あるいは、例えば血栓症および卒中で見られるような、血小板のコラーゲンへの接着を予防するために、治療に用いることが提案されている。特許文献５に記載されたペプチドは、好ましくは、２つのシステイン間でジスルフィド結合を形成して環化できるように、両端にシステイン残基を含む。
【０００６】
インテグリンα２β１受容体は、皮膚ケラチノサイトに高発現していることがわかっている（非特許文献８)。正常な皮膚では、該受容体は、表皮の増殖している基底層に限定されているが、創傷治癒の間および乾癬では、該受容体は、ケラチノサイト分化の変化に関連し、基底上層のケラチノサイトに発現する。インボルクリンプロモーターの制御下で、インテグリンα２β１を発現するトランスジェニックマウスは、乾癬に類似した皮膚障害を自然発症することが以前示されている（非特許文献９)。さらに、インテグリンのトランスジェニックマウスでは、軽度の表皮損傷によって、慢性炎症がひきおこされることが示されている。これは、非病変部位の皮膚の創傷が、しばしば創傷部位での乾癬プラークの発達につながってしまう、乾癬患者におけるケブナー現象に類似している。かかるマウスを５週間観察し、その間を通じて、実質的なケラチノサイトの過剰増殖、炎症性の浸潤および、皮膚内での高レベルのサイトカインを示した。さらに、全身性の免疫応答は、脾臓のサイズの増加、血清のサイトカインレベルの上昇、乾癬患者で見られるものに類似した、リンパ球輸送の変化に、非常に大きく影響を受けた(非特許文献１０)。
【０００７】
本発明の目的は、表皮下層のケラチノサイトならびに皮膚に存在する免疫細胞に発現しているインテグリン受容体を利用して、表皮下層でみられる皮膚疾患（例えば、乾癬、創傷、皮膚がんおよびアトピー性皮膚炎）を処置するために、この皮膚の具体的な層を、薬理学的に有効な化合物の標的とする、経皮薬物送達システムを提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５,５３６,８１４号
【特許文献２】米国特許第５,６２７,２６３号
【特許文献３】米国特許第５,８１７,７５０号;
【特許文献４】米国特許第５,９５５,５７２号
【特許文献５】国際公開９９／０２５５１
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】G.A. Konning et al., Arthritis Rheum 54（4）2006 pp 1198−1208
【非特許文献２】X.B. Xiong et al., J pharm Sci 94（8）2005, pp 1782−1793
【非特許文献３】M. Barczyk et al., Cell tissue Res 339（1）2010 pp 269−280
【非特許文献４】L.J. Lambert et al., J. Biol. Chem. 283（24), 2008, pp. 16665−16672
【非特許文献５】Emsley et al., Cell. 101（1), 2000, pp 47−56
【非特許文献６】Knight et. al., J. Biol. Chem. 275（1), 2000, pp 35−40
【非特許文献７】J. Ivaska et al., J. Biol. Chem. 274（6), 1999, pp. 3513−3521
【非特許文献８】F. Watt, EMBO J., 21（15), 2002, pp 3919−3926
【非特許文献９】J.M. Carroll et al., Cell 83, 1995, pp. 957−968
【非特許文献１０】I. Teige et al., Int. Immunopharmacol. 10, 2010, pp. 107−114
【発明の概要】
【００１０】
したがって、局面の一において、本発明は、コラーゲン結合インテグリン受容体のサブグループの、インテグリン受容体のα２Ｉドメインに特異的に結合できる環状ペプチドに関し、該ペプチドは、アミノ酸配列
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｌｙｓ−Ｌ（配列番号１)
［ここで、
Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群より選択されるアミノ酸残基であり;
Ｘ２は、ＴｈｒおよびＳｅｒからなる群より選択されるアミノ酸残基であり;
Ｘ３はＡｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり;
Ｘ４はＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸残基であり;
Ｘ５はＬｙｓおよびＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸残基であり;
Ｘ６はＨｉｓおよびＬｙｓからなる群より選択されるアミノ酸残基であり;
Ｘ７はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群より選択されるアミノ酸残基であり;
Ｘ８はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、ＧｌｕおよびＡｓｐからなる群より選択されるアミノ酸残基であり;
Ｘ９はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群より選択されるアミノ酸残基であり;
Ｘ１０はＧｌｎ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＡｓｐからなる群より選択されるアミノ酸残基であり;
Ｘ１１はＳｅｒおよびＴｈｒからなる群より選択されるアミノ酸残基であり;
Ｌは、薬剤含有担体粒子に結合するのに適当なリンカー部である。］
を有する。
【００１１】
Ｘ１〜Ｘ１１の位置について提案されている各アミノ酸残基は、これらの各位置で用いるのに適していると上述した該アミノ酸の、構造上、および／または物理化学的な特徴（例えば電荷）を模倣する、アミノ酸類似体によって置換されうる、ということは予想される。
【００１２】
他の局面において、本発明は、該環状ペプチドと、リンカー部Ｌに結合した、薬物含有担体粒子とを含む薬物結合体に関する。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、担体粒子に含有される治療薬の標的を、インテグリンα２β１受容体を表面に発現する細胞とするための、該結合体の使用に関する。
【００１４】
なおさらなる局面において、本発明は、皮膚（表皮）の疾患または症状の処置における、該結合体の使用に関する。
【００１５】
環状ＲＧＤペプチドと薬剤含有リポソームの結合体について、全身投与によって、がんを治療するために、インテグリンαｖ受容体を、リポソームのような、薬物充填粒子の標的とすることは検討されてきた（R. Schiffeler, et al., Int. J. Pharm. 364, 2008, pp 258−264）が、皮膚疾患を処置するために、局所投与によって、ケラチノサイトに発現するインテグリンα２β１受容体のようなコラーゲン結合インテグリン受容体を、リポソームのような薬物含有担体粒子の標的とするのに、本発明の環状ペプチドを用いることは、新規なことであると考えられる。上記非特許文献７および特許文献５に開示されているペプチドは、両端にシステイン残基を含み、その２つのシステイン残基の間にジスルフィド結合を形成することにより、環状化する。このことにより、かかるペプチドは、リポソームや、他の担体粒子に結合するには不適切になる。チオール基はしばしば、結合に用いられるからである（例えば、ＳＡＴＡ）。遊離チオール基が、担体粒子と結合するより、ジスルフィド結合と相互作用して高分子ペプチドを産生しうるか、または、リンカーがシステインのうちの１つと共に環状化しうる。したがって、還元的な条件下では、ジスルフィド結合が開いて、直鎖ペプチドを形成するか、もしくはペプチドのオリゴマー化をひきおこすか、その両方である。さらに、ペプチドリンカーは、新しいペプチドの骨格の、Ｎ−およびＣ−末に加わり、このことは一般的に、生物組織内での、酵素反応による分解に対する、該ペプチドの感受性を低下させる（Lovelace et al., 2006 J. Med. Chem. 49, 6561−6568) 。ペプチドの環状立体構造は、インテグリン受容体との相互作用に重要であり（上記非特許文献７)、それゆえに、環状ペプチドの安定性は生体内環境において重要である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のペプチドの一態様の化学構造
【図２】様々な細胞タイプにおけるインテグリンα２β１受容体の発現を示すウェスタンブロッティング：（１）ヒトインテグリンα２β１受容体に関してホモ接合型の、トランスジェニックマウスモデル由来の組織標本、（２）Ａ４３１細胞（ヒト表皮がん細胞株）からの細胞抽出液、（３）ヒト乳房縮小手術により取り除かれた組織から単離された初代ヒトケラチノサイト、（４）および（５）LEO Pharmaで用いている２つのヒトケラチノサイト細胞株((４）ＨａＣａｔ および（５）Ｋｅｒｔ)
【図３】本発明のペプチド（「ＲＫＫ１２」)または、インテグリンα２β１受容体との親和性は低いが、本発明のペプチドと類似の電荷をもつ対照ペプチド(「ＡＫＫ１２」)のいずれかと結合した、（蛍光色素１,１'−ジオクタデシル−３,３,３',３'−テトラメチルインドジカルボシアニン過塩素酸、ＤｉＤを用いて）蛍光標識したリポソームとともに４℃でインキュベートしたＡ４３１細胞における蛍光を示すグラフ。本発明のペプチドと結合したリポソームとインキュベートした細胞は、対照ペプチドと結合したリポソームとインキュベートした細胞よりはるかに高い蛍光が計測されている。このことは、本発明のペプチドがインテグリンα２β１受容体に特異的に結合することを示唆している。ペプチドと結合させていないリポソームを細胞とともにインキュベートしても、リポソームの会合を全く示さなかった。
【図４】４℃または３７℃でインキュベートした後の、本発明のペプチド（「ＲＫＫ１２」)または、インテグリンα２β１受容体との親和性が低い、対照ペプチド(「ＡＫＫ１２」)のいずれかと結合した、蛍光標識したリポソームの細胞取り込みを示すグラフ。３７℃でのインキュベートは、４℃でのインキュベートに比べ、蛍光細胞の実質的な増加を引き起こした。これは、３７℃でエンドサイトーシスが起こっていることの結果である可能性が高い。エンドサイトーシスによるリポソームの取り込みは、本発明のペプチドと結合したリポソームについて最も高く、このことは、かかる取り込みが特異的なものであり、インテグリンα２β１受容体との親和性に依存していることを示唆している。
【図５】低濃度のＭｇ２＋下で、４℃にてインキュベートした後、本発明のペプチド（「ＲＫＫ１２」)または、α２β１との親和性が低い、対照ペプチド(「ＡＫＫ１２」）のいずれかと結合した、蛍光標識したリポソームの細胞結合を示すグラフ。本発明のペプチドと結合したリポソームの結合は、対照ペプチドと結合したリポソームの取り込みに比べてわずかに高かった。このことは、Ｍｇ２＋イオン濃度が、細胞と本発明のペプチドとの特異的な相互作用に重要なものであることを示唆している。
【図６】ケラチノサイトにおける、カルシポトリオールを充填した、ＲＫＫ−１２に結合したリポソームの生物学的効果を示すグラフ。カテリシジンのレベルは、定量ＰＣＲにより検出し、ＧＡＰＤＨのレベルで標準化した。遺伝子発現レベルの相対的な変化は、ＤＭＳＯ中の０．１μＭのカルシポトリオール溶液を標準（１に設定）として、比較Ct法を用いて算出した。カルシポトリオールを充填したＲＫＫ１２結合リポソーム（中抜きの棒グラフ）、プラシーボＲＫＫ−１２結合リポソーム（灰色の棒グラフ）。カテリシジンのレベルはプラシーボＲＫＫ−１２結合リポソームとインキュベートした後に比べ、カルシポトリオール充填ＲＫＫ−１２結合リポソームとインキュベートした後で、有意に増加していた。＊は、（ｐ＜０．０５）を示す。棒グラフは、平均ΔＣｔ±ＳＤ（n＝３)からの、Ｎ計算値を示す。
【図７】様々なリポソーム製剤においてカルシポトリオールで処理した、インテグリンα２β１のトランスジェニックマウス由来の皮膚組織標本におけるＩＬ−１０レベルを示すグラフ。各マウスについての結果は次のように示されている：黒丸−ＵＶ−Ｂ照射したインテグリンα２β１トランスジェニックマウス、黒正方形−カルシポトリオール充填ＲＫＫ１２−ペプチド結合リポソームで処理した、インテグリンα２β１トランスジェニックマウス、黒三角−カルシポトリオール充填ＡＫＫ１２−ペプチド結合リポソームで処理し、ＵＶ−Ｂ照射したインテグリンα２β１トランスジェニックマウス、黒逆三角−プラシーボＲＫＫ１２−ペプチド結合リポソームで処理し、ＵＶ−Ｂ照射した、インテグリンα２β１トランスジェニックマウス、黒菱形−ＵＶ−Ｂ照射したｗｔマウス、白丸−未処理のｗｔマウス。直線は平均±ＳＤ（ｎ＝８)を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本明細書で使用する用語「ペプチド」は、隣接するカルボキシル基とアミノ基の間の反応によって形成されるペプチド結合により結合しているアミノ酸残基の配列を示すことを意図する。
【００１８】
本明細書で使用する用語「インテグリン受容体」は、コラーゲン結合インテグリン受容体のサブグループに属する受容体であって、全てがインテグリンα２モノマーの細胞外Ｉドメイン（α２Ｉドメイン）を含む受容体を示すことを意図しており、インテグリンα１β１、α２β１、α１０β１およびα１１β１受容体を含む。
【００１９】
本明細書で使用する用語「アミノ酸」は、天然起源のアミノ酸（もしくはアミノ酸残基）、または天然起源でないアミノ酸類似体を示すことを意図している。天然起源のアミノ酸の例は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチンおよびシトルリンから選択される、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸である。天然起源でないアミノ酸の例は、天然起源のアミノ酸の構造上および／または物理化学的な特徴（例えば、電荷）を模倣する合成化合物、例えば、α炭素原子に結合したカルボキシル基およびアミノ基を含有するが、側鎖に修飾や置換がある化合物を含む。
【００２０】
本明細書で使用する用語「特異的に結合する」または「特異的な結合」は、本発明のペプチドの、上記非特許文献７に記載されているＲＫＫペプチドと同じように、α２β１受容体のようなコラーゲン結合インテグリン受容体のα２Ｉドメインへの結合能を示すことを意図している。比較として、本発明のペプチドに類似のアミノ酸組成および電位を有するが、ＲＫＫモチーフを持たないペプチドはコラーゲン結合インテグリン受容体のα２Ｉドメインに特異的に結合しない。
【００２１】
本明細書で使用する用語「リポソーム」は、非小胞薬物送達システムに比べて、薬剤の皮膚内への透過促進、薬理効果の増大、薬剤の安定性の増加、副作用の減少、調節された薬剤放出という面で、好ましい特徴を示す、二層構造をもつ球状の脂質小胞を示すことを意図している。薬剤透過の性質は、調製方法、脂質組成物の平均の大きさおよび、リポソームに含有される薬剤の物理化学的な性質に依存しうる。
【００２２】
本明細書で使用する用語「ニオソーム」は、水性媒体中で、非イオン性の、両親媒性の界面活性剤から形成される小胞を示すことを意図している。ニオソームは、リポソームと類似の、二重構造を示す。
【００２３】
本明細書で使用する用語「トランスファーソーム」は、リン脂質と、小胞の脂質二層を不安定化し、界面張力を下げることによって二層の変形能を増大させる、単一鎖の界面活性剤からなる、超変形が可能な小胞を示すことを意図している。
【００２４】
本明細書で使用する用語「高分子ナノ粒子」は、その中で、薬剤物質が吸着もしくは封入されている、多孔性または高密度の重合体マトリクスを形成する大きさ１μm未満の粒子か、または薬剤含有コアが重合物質の殻によって封入されている、ナノカプセルを示すことを意図している。
【００２５】
本明細書で使用する用語「脂質ナノ粒子」は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）またはナノ構造脂質担体（ＮＬＣ)を示すことを意図している。固体脂質ナノ粒子は、固体脂質および界面活性剤からなり、粒子の平均直径５０〜１０００nmを有する。ナノ構造脂質担体は、固体脂質および液体脂質(油)と界面活性剤の混合物からなる。ＮＬＣは室温で固体であるが、ＳＬＮよりも低い融点を有する。どちらのタイプの脂質ナノ粒子も、固体溶液として、または脂質物質中に分散した形で、治療上有効な成分を含む。
【００２６】
実施態様
本発明の環状ペプチドの態様の一において、Ｘ１はＳｅｒである。
【００２７】
本発明の環状ペプチドの態様の一において、Ｘ２はＴｈｒである。
【００２８】
本発明の環状ペプチドの態様の一において、Ｘ３はＡｒｇである。
【００２９】
本発明の環状ペプチドの態様の一において、Ｘ４はＬｙｓである。
【００３０】
本発明の環状ペプチドの態様の一において、Ｘ５はＬｙｓである。
【００３１】
本発明の環状ペプチドの態様の一において、Ｘ６はＨｉｓである。
【００３２】
本発明の環状ペプチドの態様の一において、Ｘ７はＡｓｐである。
【００３３】
本発明の環状ペプチドの態様の一において、Ｘ８はＡｓｎである。
【００３４】
本発明の環状ペプチドの態様の一において、Ｘ９はＡｌａである。
【００３５】
本発明の環状ペプチドの態様の一において、Ｘ１０はＧｌｎである。
【００３６】
本発明の環状ペプチドの態様の一において、Ｘ１１はＳｅｒである。
【００３７】
現在好まれる態様において、本発明の環状ペプチドは、Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌ（配列番号２)であって、Ｌは上記で定義したとおりである、アミノ酸配列を有する。
【００３８】
本発明の環状ペプチドにおいて、リンカー部Ｌは、Ｍａｌ−ＰＥＧ−リポソームと相互作用しうる任意のＳＨ基を含んでよい。リポソーム結合がマレイミド−ＰＥＧ以外の基によって介される場合、Ｌ部分は、他の基を含んでよい。参照：L. Nobs et al., J. Pharm. Sci. 93, 2004, pp. 1980−1992、表１。
【００３９】
リポソームは、リガンド結合のための基を含んでいてよい。結合に有効な基は、アミノ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、カルボジイミド介在カップリング、ヒドラジン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ＨＳ−ＰＥＧ−ジステアロイルホスフォエタノールアミン（ＤＳＰＥ)、マレイミド−ＰＥＧ または炭酸ニトロフェニルでありうる。適当なリンカー部Ｌの例は、Ｓ−スクシンイミジル−Ｓ−チオ−ルアセテート（ＳＡＴＡ)、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル ３−(２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ)、Ｎ−スクシンイミジル Ｎ−アセチル−チオプロピオネート(ＳＡＴＰ)、スクシンイミジル Ｓ−アセチル(チオテトラエチレングリコール)（ＳＡＴ−ＰＥＯ４−Ａｃ)、カルボジイミド（例えば１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)である。
【００４０】
リンカー部ＬがＳＡＴＡである場合、ペプチドの薬剤担体粒子への結合は、リンカーのチオール基の活性化および、担体粒子の表面上にあるマレイミド基との反応によって、都合良くおこりうる(R. Schiffeler et al., J. Control. Release 91, 2003, pp 115−122)。以前示したように、ＳＡＴＡはかかる理由により、都合の良いリンカー部であるが、上記非特許文献７によって開示された、両端の２つのシステイン残基間の、ジスルフィド結合形成により環状化する環状ペプチドに、このリンカー部を用いるのは適当ではない。というのは、リンカーの活性化チオール基が、担体粒子と結合するより、ジスルフィド結合と相互作用するかもしくは高分子ペプチドを産生するか、または、リンカーがシステインの一つと環状化しうるからである。
【００４１】
本発明のペプチドは、化学合成、例えばFmoc保護アミノ酸を用いて直鎖ペプチド鎖を集める固相ペプチド合成によって、都合の良いように合成されうる(Merrifield, et al., J. Am. Chem. Soc. 85, 1964, p. 2149）。該ペプチドは、樹脂からの放出後、末端のＬｙｓと反対側の末端のアミノ酸との間にアミド結合を形成することにより環状化してもよい。
【００４２】
本発明のペプチドは、好ましくは、表皮下層のケラチノサイトに発現しているインテグリンα２β１受容体に特異的に結合し、それにより薬剤含有担体粒子が、該薬剤がその作用を発揮しうるケラチノサイトを標的とすることを可能にするものである。本発明の環状ペプチドに結合した薬剤含有担体粒子は、都合良く、リポソーム、ニオソーム、トランスファーソーム、高分子ナノ粒子または脂質ナノ粒子であってよい。
【００４３】
担体粒子がリポソームである場合、１つ以上の脂質ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジオレイルオキシプロピルトリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）を都合良く含んでいてよい。また、ステロイド（例えばコレステロール）または界面活性剤（例えば、コーレート、ソルビタンエステルまたはポリソルバンエステル）を含んでいてもよい。リポソームは、乾燥脂質フィルム水和、乳化、逆相蒸発、凍結−融解工程または溶媒導入によって製造されうる。サイズの均一化は、押し出しまたは超音波処理によりなされてよい。
【００４４】
リガンドは、リポソームの表面に２つの方法で、リポソームの製造前に疎水性アンカーにリガンドを結合させるか、製造後にリポソームの表面にリガンドをカップリングさせるかのどちらかで結合しうる（参照、上記 Nobs et al.）。
【００４５】
リポソームに含有される少なくとも１つの脂質が、そこに結合するＰＥＧ基およびマレイミドを含むのは特に有利なことでありうる。リポソームに結合するマレイミド基は、リポソームを、ＳＡＴＡのようなチオール基を含むリンカーに結合させるのに都合が良い。ＰＥＧ基は、リポソームとマレイミド基間の都合の良いリンカーを形成する。
【００４６】
担体粒子がニオソームの場合、ポリエチレングリコールアルキルエーテル（例えば、ポリオキシエチレン−２−ステアリルエーテルまたはポリオキシエチレン−１０−オレイルエーテル）、ソルビタンエステル（例えば、パルミチン酸ソルビタン、ラウリン酸ソルビタン、ステアリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、オレイン酸ソルビタン）、スクロースラウリン酸エステル、ポリソルベートまたはコレステロールからなる群から選択される、１つ以上の非イオン性界面活性剤を都合良く含んでいてよい。ニオソームは、乾燥脂質フィルムの水和、乳化、逆相蒸発、凍結−融解工程または溶媒導入によって製造されうる。サイズの均一化は、押し出しまたは超音波処理により行われてよい。
【００４７】
担体粒子が高分子ナノ粒子である場合、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合）、ポリカプロラクトン、ポリ酢酸ビニル、ポリアルキルシアノアクリレート（polyalcylcyanoacrylates））、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサンまたはキトサンの１つ以上を含んでいてよい。高分子ナノ粒子は予備形成したポリマーの分散を含む手法か、または現場重合技術によって製造されうる。
【００４８】
担体粒子が固体脂質ナノ粒子またはナノ構造の脂質担体である場合、1つ以上の固体脂質、例えばトリグリセリド、部分グリセリド、脂肪族アルコール、ステロイドまたはワックス、ならびに乳化剤、例えばポロキサマー１８８、ポリソルバンエステル、ポリビニルアルコールまたはソルビタンエステルを含んでいてよい。脂質ナノ粒子は、両方のタイプともに、加圧均質化またはマイクロエマルジョン形成を含む手法により製造されうる。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、都合良く、局所的、具体的には経皮適用に適した形態、例えばゲル剤、ローション剤、クリーム剤または他のタイプの液体または半液体の組成物の形態であってよい。該組成物は、上記の結合体に加え、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含んでいてよい。かかる賦形剤は、希釈剤、緩衝剤、界面活性剤、乳化剤、増粘剤、保存剤などを含んでいてよい。具体的には、該組成物は二価金属の塩、例えばカルシウム、亜鉛、またはマグネシウム塩、例えば塩化マグネシウムを含んでよく、これは、Ｍｇ２＋イオンはインテグリン受容体、例えばインテグリンα２β１受容体を発現している細胞において、本発明の環状ペプチドに結合している担体粒子の取り込みを亢進することがわかっているからである。
【００５０】
担体粒子に含まれる治療上有効な薬剤は、都合良くは、ビタミンＤ類似体、例えばカルシポトリオール、カルシトリオール、マキサカルシトールもしくはタカルシトール、コルチコステロイド、例えばベタメタゾン、もしくはベタメタゾンエステル、例えばバレレートもしくはジプロピオネート、クロベタゾールもしくはクロベタゾールエステル例えばプロピオネート、ヒドロコルチゾンもしくはヒドロコルチゾンエステル、例えばアセテートもしくはバレレート、カルシニューリン阻害剤、例えばタクロリムスもしくはピメクロリムス、ＰＤＥ４阻害剤、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ヒスタミン受容体アンタゴニスト、インゲノール−３−アンゲレートまたは天然起源あるいは合成ヌクレオチド例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡであってよく、本発明の結合体／組成物で処置する症状に依存する。薬剤の用量は、幅広い制限の中で、薬剤の型ならびに、処置する症状の型および重症度によって変わってよく、薬剤がビタミンＤ類似体の場合の、数マイクログラム／グラムから、コルチコステロイドなどの他の薬剤の場合の、０.５〜５００mg／gにわたる。
【００５１】
本発明の組成物は、皮膚疾患または症状、例えば皮膚炎症疾患もしくは障害、例えば乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹、蕁麻疹、ざ瘡、アレルギー性接触性皮膚炎、刺激性皮膚炎、ネザートン症候群のようなスキンバリア欠損障害、創傷、疣贅、日光角化症または皮膚がん、例えば基底細胞がんもしくは扁平上皮細胞がんの処置に、局所的に適応することを意図している。
【実施例】
【００５２】
実施例１
ペプチド合成
ヘッドトゥテイルで環状化したペプチドを、JPT Peptide Technologies GmbH（Berlin, Germany)による、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオールアセテート(ＳＡＴＡ)リンカーを用いて、製造者の通常の手法により、Fmoc保護アミノ酸を用いた固相合成法により合成した。ヘッドトゥテイルで環状化したターゲティングペプチドは、Ｈ−ＫＨＤＮＡＱＳ−(ＳＡＴＡ)ＫＳＴＲＫ−ＯＨ（ＲＫＫ１２と表記)の配列を、対照ペプチドは、Ｈ−ＫＨＤＮＲＱＳ−(ＳＡＴＡ)ＫＳＴＡＫ−ＯＨ（ＡＫＫ１２と表記)の配列を有していた。両方のペプチドは、後にリポソームの表面の末端ＰＥＧ鎖に結合するのに用いるＬｙｓ(ＳＡＴＡ）基を含んでいた(R.J. Kok et al., Bioconjug. Chem. 13, 2002, pp. 128−135)。
【００５３】
ＤｉＤ−標識リポソームの製造
リポソーム製剤は、Bangham et al.（A.D. Bangham et al., J. Mol. Biol. 13, 1965, pp. 238−252）に記載された薄膜法により製造した。簡潔には、ＤＳＰＣ（６２mol%)、ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（２.５mol%)、Ｍａｌ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（２.５mol%)およびコレステロール（３３mol%)をクロロホルム：メタノール(９:１ ｗ／ｗ)に溶解した。１ml量のＤｉＤ（エタノール中、２００μg／ml)を標識目的で添加した。有機溶媒を蒸発させ、脂質フィルムを窒素ガスで５分間フラッシュした。脂質フィルムをＨＢＳ−Ｅ緩衝液（１０mM ＨＥＰＥＳ、１３６mM ＮａＣｌおよび１mM ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７.４)で水和し、最終濃度１５mMの脂質に、大きな多重膜小胞（ＬＭＶ)を形成させた。小さな一枚膜小胞(ＳＵＶ)を得るために、積み重ねた２つのWhatman(GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom)の１００nmフィルターにＬＭＶを通して、Northern Lipids inc.（Burnaby, BC, Canada)のLiplex押し出し機を用いて１０回押し出し、４℃で暗所保存した。
【００５４】
カルシポトリオールを充填したリポソームの製造
カルシポトリオールで充填したリポソーム製剤は、以下の例外を除き、本質的には上述したように薄膜法により製造した：製剤はＤＳＰＣ（８４mol%)、コーレート(１１mol%)、ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（２.５mol%)、Ｍａｌ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（２.５mol%)および１mol% カルシポトリオールを含有した。脂質フィルムを６５℃にて、ＨＢＳ−Ｅで１時間水和した。水和脂質分散液は、最終濃度８.５mMの脂質および濃度５０μg／ml（０.１２１mM)のカルシポトリオールを含有した。ＬＭＶを２つ積み重ねた２００nmフィルター（Whatman)を通して２回押し出し、その後、２枚の１００nmフィルターを通して８回押し出した。
【００５５】
リポソームのペプチドへの結合
リポソームの外部表面の末端ＰＥＧ鎖のマレイミド基へのペプチドの結合は、以前に記載されているように行った（R.M. Schiffelers et al., J. Control. Release 91, 2003, pp. 115−122)。環状アセチル−保護ＳＡＴＡペプチドを、０.５M ＨＥＰＥＳ、０.５M ヒドロキシルアミン−ＨＣｌおよび２５mM ＥＤＴＡ（ｐＨ７.０）の水溶液中で、３０分間室温にて脱アセチル化した。該リポソームを活性化ＳＡＴＡ−ペプチドともに、ローラーベンチ上で、４℃で一晩インキュベートした。リポソームを超遠心により、結合していないペプチドから分離した。ＤｉＤで標識したリポソームをＨＢＳ緩衝液（１０mM ＨＥＰＥＳおよび１３６mM ＮａＣｌ、ｐＨ＝７.４)で１:９に希釈し、６０.０００rpmで１時間、４℃で遠心（Beckman LE−80K Ultracentrifuge fixed angle roter Type 70.1 Ti)し、沈殿化させた。沈殿をＨＢＳ緩衝液１０mlに再懸濁し、再び遠心した。リポソームを、次の実験でのＭｇ２＋イオンの枯渇を避けるためにＥＤＴＡを含まない、ＨＢＳ緩衝液で再懸濁した。これはＲＫＫＨ−結合部位とインテグリン受容体の相互作用にＭｇ２＋イオンの存在が重要だからである。カルシポトリオールを含むリポソームをトリス緩衝液(１３mM トリス、ｐＨ＝８.５)で１:３に希釈し、５０.０００rpm、４℃で１時間遠心して沈殿させた（Beckman Ｌ−８０ XP−ULTRA fixed angle rotor type 50.2 Ti)。沈殿をトリス緩衝液２５mlで再び懸濁し、再び遠心した。トリス緩衝液は、カルシポトリオール含有リポソームのために用いた。これは、カルシポトリオールは、ＨＥＰＥＳ緩衝液がもたらす低いｐＨでは安定性が低くなるためである。最終的に、全てのリポソーム分散液を、最終脂質濃度１５mMに希釈し、４℃で暗所保存した。結合していないペプチドをWaters（Milford, MA, USA)の、BEH300 C18 カラム、1.7μm、2.1mm x 500mmを用いた超高速液体クロマトグラフィー(ＵＰＬＣ)により検出した。溶出液勾配は、１００%のアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸(５：９５：０.１、ｖ／ｖ)からアセトニトリル：トリフルオロ酢酸（１００：０.１、ｖ／ｖ）で、１２分間に設定した。該ペプチドは、２１０nmの吸光度により検出され、結合ペプチドの量は、全体量のペプチドから結合していないペプチドの量を引くことによって算出した。
【００５６】
リポソームの性質決定
リポソーム製剤中のカルシポトリオールの最終濃度は、Sunfire C18, 3.5μm, 150x 4.6mmカラム（Waters）を用いて、アセトニトリル：水（６０:４０、ｖ／ｖ)を移動相として、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ)で定量した。検出は２６４nmで行った。ＤｉＤ標識したリポソームの最終脂質濃度は、Rouser定量法（G. Rouser et al., Lipids 5, 1970, pp. 494−496）により評価した。簡潔には、約５０nmolのリン脂質を１８０℃に加熱した。液体を完全に蒸発させた後、過塩素酸３００μlを添加し、蒸発を防ぐために、mateblesをのせた。サンプルを１８０℃で４５分間インキュベートし、室温に冷却し、水１ml、モリブデン酸０.５mlおよび新しく調製した５%アスコルビン酸０.５mlを添加した。サンプルを１００℃の水浴で５分間インキュベートし、室温に冷却し、７９７nmにおける吸光度を計測した。カルシポトリオール含有リポソームについての、脂質濃度は、以前に記載したように(H. Grohganz et al., AAPS; Pharm. Sci. Tech. 4, 2003, E63)、MTI−Diagnostics Gmbh,（Idstein, Germany）のcolorimetric phospholipids B enzymatic assayを用いて評価した。簡潔には、リポソーム分散液を１:４０に希釈し、２.５% Triton Ｘ１００を添加し、サンプルをTmよりも高温に２０分間加熱した。全てのサンプル４５μＬを、マイクロタイタープレートに移し、比色試薬溶液１８０μlを添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。１時間後、４９０nmでの吸光度を、Perkin Elmer(Waltham, MA, USA)のVICTORTM X3 Multilabel Plate Readerを用いて測定した。
【００５７】
平均粒子サイズの分布および多分散指数(PDI)を動的光散乱法光子相関分光分液技術を用いて、ＨＢＳまたはトリス緩衝液中で１:４０に希釈したサンプルについて決定した。粒子の表面の電荷を、ゼータ電位分析によって（レーザードップラー電気泳動法)、水で１:４０に希釈したサンプルについて評価した。測定は、１サンプルあたり３回繰り返した（ｎ＝１)。どちらのタイプの測定も、６３３nmレーザーと１７３°検出オプティクスを備えたZetasizer Nano ZS（Malvern Instruments, Worcestershire, UK)を用いて、２５℃で行った。粘性率と屈折率について、純水の値を用いた。データ取得および分析には、Malvern DTS v.５.１０ ソフトウェアを用いた。
【００５８】
実施例２
ペプチド−結合リポソームの細胞取り込み
ヒト表皮がん細胞Ａ４３１を３.７g／l炭酸水素ナトリウムおよび４.５g／lグルコースを含有し、抗菌剤、２mM Ｌ−グルタミンおよび７.５%（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補充した、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で、５% ＣＯ２を含む加湿雰囲気下で継代培養した。ほぼコンフルエントな単層のＡ４３１細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞をＰＢＳ中の１mM トリス−ＥＤＴＡを用いて剥離した。続いて、細胞を、４℃で、１.２６mM ＣａＣｌ２および０.８１mM ＭｇＳＯ４を補充した冷ＰＢＳで懸濁した。遠心後、細胞数を数え、１００μlの培地中の１０５個の細胞を、１００μlの、１.２６mM ＣａＣｌおよび０.８１mM ＭｇＳＯ４を補充したＰＢＳで希釈したリポソーム、様々な濃度のＤｉＤ−標識リポソーム（全脂質、１０〜２００nmol)、ＲＫＫ１２−結合リポソーム（ＲＫＫ１２−リポソーム）またはＡＫＫ１２−結合リポソーム（ＡＫＫ１２−リポソーム）とともに１時間４℃でインキュベートした。
【００５９】
この実験の結果は、図３に示すとおりである。この結果は、ＲＫＫ１２−リポソームとともにインキュベートした細胞は、ＡＫＫ１２−リポソームまたは非結合リポソームとインキュベートした細胞よりも有意に蛍光が見られることを示唆しており、これはＲＫＫ１２ペプチドが、Ａ４３１細胞の表面に存在するインテグリンα２β１受容体に特異的に結合した結果である。図５から、低いＭｇ２＋濃度においては、ＲＫＫ１２−結合リポソームの会合は、ＡＫＫ１２−結合リポソームよりもわずかに高くなっているのみであることが示されている。このことは、Ｍｇ２＋イオン濃度が、細胞と、ＲＫＫ１２ペプチドに結合したリポソームの特異的な相互作用に重要であることを示している。
【００６０】
リポソームの細胞の内部移行の実験において、同様に様々な濃度のＤｉＤ−標識リポソーム(全脂質１０−２００nmol）ＲＫＫ１２−リポソームを１時間３７℃でインキュベートした。低濃度Ｍｇ２＋の実験において、ペプチドを、ＣａＣｌ２またはＭｇＳＯ４を補充しないＰＢＳで希釈した。インキュベーション期間の最後に、細胞を４℃の、５% BSAを補充したＰＢＳ−緩衝液で３回洗浄し、FACScalibur flow cytometer（Becton−Dickinson)で解析した後、５% BSAを補充したＰＢＳ ２００μlで再懸濁した。結果をWinMDI software version 2.8（Joseph Trotter, USA)を用いて解析した。
【００６１】
内部移行の実験結果は、図４に示すとおりであり、ここから、ペプチド−結合リポソームは、３７℃では、エンドサイト−シスにより内部移行していることが示唆されている。しかし、内部移行はＲＫＫ１２−結合リポソームについて最も高く、取り込みが特異的なものであり、インテグリンα２β１受容体との親和性に依存していることを示している。
【００６２】
実施例３
カルシポトリオールを充填したペプチド−結合リポソームとケラチノサイトの相互作用
ヒト成人表皮ケラチノサイト（HEKa)はCascade Biologics（Portland, OR, USA)より入手し、ヒトケラチノサイト増殖補助栄養剤およびゲンタマイシン／アンフォテリシンB（Cascade Biologics）を含有するEpiLife培地（Cascade Biologics)中で、３７℃にて、５% CO２を含む加湿雰囲気下で培養した。細胞相互作用アッセイについて、２x１０５個の指数関数的に増殖するケラチノサイトを処理の１日前に播種した。次の日、(８０%コンフルエント)、培地を交換し、細胞培養培地にウェル中のカルシポトリオールの最終濃度が１０−７Mになるように、リポソーム懸濁液１５μl、プラシーボリポソーム懸濁液１５μl、または最終濃度１０−７Mになるように、０.１% DMSO中のカルシポトリオール溶液を加え、３７℃で１時間インキュベートした。リポソームはＲＫＫ１２−ペプチドまたはＡＫＫ１２−ペプチドのどちらかと結合させた。１時間後、細胞を、１% BSAを添加したＰＢＳで３回洗浄し、培地１.５mlを添加して、２４時間３７℃で培養した。続いて、培地を除き、ｍＲＮＡをQuiagen（Hilden, Germany)の、RNeasy kitを用いて抽出した。８０ng量のＲＮＡをApplied Biosystems（Foster City, CA, USA)のHigh−Capacity cDNA Reverse Transcription kitを用いて、ｃＤＮＡに翻訳した。ｃＤＮＡを、製造者のプロトコールにしたがって、３つ組みで増幅させた(Applied Biosystems, カテリシジン抗菌ペプチド（ＣＡＭＰ）Hs00189038_m1およびＧＡＰＤＨ Hs99999905_m1)。ＣＡＭＰの発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子のグリセリアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素(ＧＡＰＤＨ)の発現レベルで基準化した。ＣＡＭＰの発現の相対的な変化を、比較CT法(２−ΔΔCt)(K.J. LivakおよびT.D. Schmittgen, Methods 25, 2001, pp. 402−408）を用いて定量した。
【００６３】
カルシポトリオールを充填したＲＫＫ１２−結合リポソームは、ＲＫＫ１２−結合リポソームのプラシーボ製剤に比べて、カテリシジンの発現を有意に上昇させた（図６)。このことにより、カルシポトリオールが、細胞内に送達され、その標的部位である、ビタミンＤ３受容体に、活性化形態で到達することが確かめられる。カテリシジンレベルは、以前、ＨａＣａｔ細胞をカルシポトリオールとともにインキュベートした際に上昇することが観察されている [G. Weber et al., J. Invest. Dermatol. 124, 2004, pp. 1080−1082] 。ＡＫＫ１２−結合リポソームおよび非結合リポソームも試験したが、製剤による有意な違いはみられなかった(結果は示さない)。カテリシジン発現の増加は、カルシポトリオールが、リポソーム内に製剤された場合、細胞内に送達された際に治療上の効果を維持していることを立証している。蛍光標識したリポソームの共焦点画像の結果から、リポソームは細胞の細胞質を標的としていることが示されている。ビタミンＤ３受容体はケラチノサイトの、細胞質および核に局在している（Barsony et al., 1997)。この結果は、カルシポトリオールが、ケラチノサイトの細胞質に送達され、そこで、核に移行して、ＣＡＭＰの転写を誘導する前に、ビタミンＤ３受容体に結合することを示唆している。
【００６４】
実施例４
カルシポトリオールを含有する、ペプチド−結合リポソームのＵＶ−Ｂ照射インテグリンα２β１トランスジェニックマウス（α1β2 transgenic mice）における試験
動物
α２β１インテグリン受容体を、インボルクリンプロモーターの調節下で発現する、ダブルトランスジェニックマウスを、上記非特許文献９で示すように、C57／Bl6をバックグラウンドとして作製した。動物実験は、上記非特許文献１０で述べたものと同様の条件下で行った。動物は、Taconic Europe, Denmarkの特定病原菌除去（ＳＰＦ）施設で繁殖させ、LEO Pharma, Ballerup, DenmarkのＳＰＦ施設に移動させた。マウスは実験を始める３週間前に気候順応させた。全てのマウスは、実験の開始時点で、１６〜３０週齢であった。全ての動物実験は、デンマーク法務省、動物実験検査官の承認を得ている。
【００６５】
皮膚炎症の誘導
０日目、齢および性別を合わせた群のマウスを１００mg／kgケタラールで麻酔し、背中の毛を剃り、ＵＶ−Ｂ ２J／cmで照射した。その後、マウスに０.０５mg／kgのTemgesicを投与し、痛みから解放した。実験の間を通じて、マウスをモニターした。動物のうち、最初の体重から２０％以上体重が減ったものも、傷が大きくなったものもいなかった。従って、早めて安楽死をさせたマウスはいなかった。ＵＶ−Ｂ照射からの回復は、照射した領域の紅斑および落屑について毎日評価した。
【００６６】
終了および評価
７日目に、マウスをイソフランにより安楽死させ、２つの８mm組織標本を 照射領域から採取した。組織標本の１つは、４%ホルマリンで固定し、脱水し、パラフィン封入し、無作為に３μmで切片をつくり、マッソントリクローム染色し、皮膚組織と表皮組織を明確に分離した。組織切片は、顕微鏡観察により評価し、Nikon ECLIPSE E400 顕微鏡に接続したOlympus DP71カメラを用いて４倍の倍率で、各切片の写真を撮った。表皮の平均の厚さを、表皮表面長によってわけられた表皮領域として、Visiopharm Integrator System（VIS)プログラム（Visiopharm, Horsholm, Denmark)を用いて、算出した。もう一つの組織標本は、液体N２で急冷し、サイトカイン発現の解析に用いた。
【００６７】
サイトカイン解析 
組織標本を、プロテアーゼ阻害剤を加えた、Cell Signaling Technology Inc.（Danvers, MA, USA)の細胞溶解緩衝液 ３００μl中で、Precellys（登録商標）組織ホモジナイザーをCryolys cooling（Bertin Technologies, Montigny−le−Bretonneux, France)とともに用いて、ホモジナイズした。標本は３０分間氷上に静置し、１５,０００xgで１５分間遠心して、可溶化液を除いた。蛋白質濃度は、BCA Protein Assay kit（Pierce Biotechnology, Rockford, IL, US）を製造者の手順書にしたがって用いて、定量した。可溶化液を、−８０℃で保存した。インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ)、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ケラチノサイト由来ケモカイン(ＫＣ)（ヒトＩＬ−８のホモログ)、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の具体的なレベルを、MULTI−SPOT assay system、mouse TH1／TH2 9−plex assay（Meso scale discovery, Gaithersburg, MD, US)を製造者の手順書にしたがって用い、決定した。
【００６８】
マウスにおける製剤試験
リポソーム製剤は、５０μg／mlカルシポトリオールを用いて調製され、実施例１で述べたような特徴をもつ。インテグリンα２β１受容体を標的とする様々なリガンドを、リポソーム表面に結合させた。全ての製剤は、８４mol%ＤＳＰＣ、５mol% ＰＥＧ−ＤＳＰＣおよび１１mol%コーレートを含有した。最終製剤は全て、１３mMトリス、ｐＨ＝８.５中の、５０μg／ml濃度のカルシポトリオールを含むリポソーム懸濁剤であった。２０μl量の該製剤を、１日目、ＵＶ−Ｂ照射の１８時間後から、１日２回、７日間投与した。
【００６９】
統計
全てのデータは平均±ＳＤ（各群に８〜９匹のマウス)で表される。結果の統計的有意さは、エクセルで、変動が等しいと仮定して２つの変動を比較するｔ−検定を用いて評価した（p＜０.０５を有意とみなした)。
【００７０】
インテグリンα２β１トランスジェニックマウスでは、ＵＶ−Ｂ照射時の創傷治癒に違いがでた。
ＵＶ−Ｂ照射からの治癒を、顕微鏡的に、毎日紅斑と落屑を点数化(０−なし、１−わずか、２−中程度、３−顕著、４−非常に顕著)することで評価した。ｗｔマウスはＵＶ−Ｂ照射から、水疱を発生させて回復したが、このことは４日目の、落屑のピークに反映されている。水疱は、約５〜６日後にはじけ、その後、目立った紅斑が生じた。インテグリンα２β１トランスジェニックマウスでは、落屑を伴う紅斑がよりはやく増加し、水疱ができるものはなかった。７日目、インテグリンα２β１トランスジェニックマウスでは、境界の決まった紅斑を伴う肥厚した鱗片様（scalp−like）の病変が形成されたが、これは臨床的には乾癬に似た表現型である。ｗｔマウスでは、同様の病変は見られず、病変ではより紅斑が見られ、鱗変（scalp）は全く観察されなかった。インテグリンα２β１トランスジェニックマウスの肉眼での評価は、乾癬のモデルとしてのトランスジェニックマウスに適合するものである。
【００７１】
インテグリンα２β１トランスジェニックマウスにおける、炎症サイトカインのレベルの変化
皮膚のサイトカインレベルを評価すると、照射したマウスでは、照射していないマウスに比べ、炎症促進性のサイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＫＣおよびＴＮＦ−αレベルの有意な上昇が観察された。ＩＬ−１βおよびＫＣのレベルは、ＵＶ−Ｂ照射したインテグリンα２β１トランスジェニックマウスでは、ＵＶ−Ｂ 照射したｗｔマウスに比べ、有意に減少していた（t−検定、p＜０.０５)。ＩＬ−１０が減少しているという傾向もまた見られたが、インテグリンα２β１トランスジェニックマウスとｗｔの差異は有意なものではなかった(t−検定、p＝０.１)。以前、ＩＬ−１０レベルの減少が、通常の創傷治癒と乾癬を区別しているということが示唆されていた（B.J. Nickoloff et al., J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 11(1), 2006, pp. 16−29)。全体的に見て、サイトカインレベルの減少により、インテグリンα２β１トランスジェニックマウスでは、ｗｔマウスに比べて、ＵＶ−Ｂ照射への炎症応答が変化していることは確認されたが、これがヒト尋常性乾癬における不均衡なサイトカインレベルと類似しているかどうかは確かではない。
【００７２】
ＵＶ−Ｂ照射したインテグリンα２β１トランスジェニックマウスにおけるカルシポトリオール製剤の試験
様々なカルシポトリオール含有リポソーム製剤を、インテグリンα２β１トランスジェニックマウスで試験した。処理を受けたインテグリンα２β１トランスジェニックマウスと処理を受けていないトランスジェニックマウスで、統計的に有意な差は見られなかったが、カルシポトリオール処理は、ＩＬ−１０のレベルに影響を与える傾向にある(図７)。ＵＶ−Ｂを照射し、カルシポトリオールを充填したＲＫＫ１２−ペプチド結合リポソーム処理したマウスからの組織標本では、未処理のマウス、プラシーボＲＫＫ１２−ペプチド結合リポソームまたはカルシポトリオールを充填したＡＫＫ１２−ペプチド結合リポソームで処理したマウス由来の組織標本に比べて、ＩＬ−１０レベルの上昇が見られた。
【００７３】
ヒトにおいて、ＩＬ−１０のレベルは、通常の創傷治癒と比較して、乾癬では減少している。この効果は、トランスジェニックマウスにおいても観察された。トランスジェニックマウスでは、その乾癬様の病変において、野生型(ｗｔ)マウスの病変のＩＬ−１０レベルに比べて、ＩＬ−１０のレベルが減少していた(図７)。ヒト乾癬患者が、カルシポトリオール処置を受けると、該病変でのＩＬ−１０レベルは上昇する。カルシポトリオール−充填リポソームでトランスジェニックマウスを処理した後の、マウスの皮膚におけるＩＬ−１０レベルから、カルシポトリオール−充填ＲＫＫ１２−結合リポソームの適用は同様の効果をもたらしうることが示唆される。受容体−標的化リポソームは乾癬の処置におけるカルポシトリオールの効力を上げうることが示唆されている。このことは、実施例２に示される、ＲＫＫ−１２ペプチドのリポソーム表面への結合が、ヒトインテグリンα２β１受容体を発現する細胞へのリポソームの会合と内部移行を増加させるということが見出されたという結果を確証するものである。しかしながら、処理したマウスと未処理のマウスの間のＩＬ−１０レベルの差異は統計的に有意ではないことは注意すべきであるが、これは実験の標準偏差が非常に高いためである。しかし、標的化リガンドが生体内で効果を示すという傾向は見られている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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