(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシル−ＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ／ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２６）の活性、すなわちａｒｅ１およびａｒｅ２の活性が対応する野生型生物と比較して低減または排除されており、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４）の活性が、対応する野生型生物と比較して増強されており、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼの活性の増強は、生物において、酵素の触媒領域のみをコードし、膜結合ドメインはコードしないＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ遺伝子を発現させることによって、または、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼを、異種プロモーター制御下において生物中に置くことによって達成される、単離された、遺伝的に改変された非哺乳類生物。
【請求項２】
対応する野生型生物の脂質粒子に蓄積される少なくとも第一の脂質、すなわちトリアシルグリセロールおよび／またはステリルアシルエステルおよび／またはワックスエステルがもはや合成されず、
該第一の脂質とは異なる第二の脂質が遺伝的に改変された生物の脂質粒子に蓄積され、
該第二の脂質がスクアレン、スクアレン誘導体（ここで、スクアレン誘導体は、スクアレンの主鎖炭素原子に結合した水素原子の代わりに主鎖炭素原子に結合した１以上の付加的メチルまたはエチル基を含む）およびステロール脂質のアシルエステルから選択される、
請求項１に記載の生物。
【請求項３】
ＳＡＭ：Ｃ−２４ステロールメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．４１）、Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．１４．−）およびＣ−５ステロールデサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．２１．６）からなる群から選択される活性のうち１つまたは２つまたは全てが、対応する野生型生物と比較して低減または排除されている、請求項１または２に記載の生物。
【請求項４】
スクアレンモノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．９９．７）、ステロール１４−デメチラーゼ（ＥＣ１．１４．１３．７０）および７−デヒドロコレステロールレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．２１）からなる群から選択される活性のうち１つまたは２つまたは全てが、対応する野生型生物と比較して増強されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生物。
【請求項５】
前記ステロール脂質がステロールまたはステロイドであって、
該ステロールが、コレステロール、コレステロール誘導体、７−デヒドロ−コレステロール、ラノステロール、ラノステロール誘導体、チモステロール、チモステロール誘導体、ラトステロール、ラトステロール誘導体、ククルビタシン、ククルバチン（ｃｕｃｕｒｂａｔｉｎ）誘導体、エピステロール、エピステロール誘導体、テアステロン、テアステロン誘導体、カスタステロン、カスタステロン誘導体、チファステロール、チファステロール誘導体、カタステロン、カタステロン誘導体、シクロオイカレノール、シクロオイカレノール誘導体、シトステロール、シトステロール誘導体、イソフコステロール、イソフコステロール誘導体、フコステロール、フコステロール誘導体、ゴルゴステロール、ゴルゴステロール誘導体、エルゴステロール、エルゴステロール誘導体、スチグマステロールまたはスチグマステロール誘導体であるか、または
該ステロイドが、アンドロステロン、アンドロステロン誘導体、テストステロン、テストステロン誘導体、アンドロステンジオール、アンドロステンジオール誘導体、アンドロステンジオン、アンドロステンジオン誘導体、カルステロン、カルステロン誘導体、メタンドリオール、メタンドリオール誘導体、ボラステロン、ボラステロン誘導体、エピアンドロステロン、エピアンドロステロン誘導体、メスタノロン、メスタノロン誘導体、スタノロン、スタノロン誘導体、ステンボロン、ステンボロン誘導体、エピテストステロン、エピテストステロン誘導体、コルチゾール、コルチゾール誘導体、アルドステロン、アルドステロン誘導体、プレグネノロン、プレグネノロン誘導体、コルチゾン、コルチゾン誘導体、コルチコステロン、コルチコステロン誘導体、ノレシンドロン、ノレシンドロン誘導体、ウロコルチゾールまたはウロコルチゾール誘導体である、
請求項２に記載の生物。
【請求項６】
生物が、マイコバクテリア属、ストレプトミセス属、ロドコッカス属、ノカルジア属、バチルス属、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム属、アセトバクター属、アシネトバクター属、シュードモナス属、乳酸菌種またはストレプトミセス種からなる群から選択される細菌か、または
生物が、ヤルロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、リポミセス・スタルケイイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ）、カンジダ・クルバタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｕｒｖａｔａ）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｔｕｌｏｉｄｅｓ）、モルチエレラ・イサベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、ムコール・ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖｏｎｉｃｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃ）、リゾープス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フシジウム属（Ｆｕｓｉｄｉｕｍ）、ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、モルチエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃ）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｅｃ）またはディクチオステリウム種（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｓｐｅｃ）、サッカロミセス属、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・デルブルエキイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｌｂｒｕｃｋｉｉ）、サッカロミセス・イタリカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ）、サッカロミセス・エリプソイデウス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）、サッカロミセス・フェルメンタティ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・クルセイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｒｕｓｅｉ）、サッカロミセス・ラクティス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・マルキシアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、サッカロミセス・ミクロエリプソイデス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ）、サッカロミセス・モンタヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｎｔａｎｕｓ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オレアセウス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｅａｃｅｕｓ）、サッカロミセス・パラドキサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロミセス・プレトリエンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・ロゼイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｉ）、サッカロミセス・ロウキシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、サッカロミセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）、サッカロミセス・ルドウィギイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ  ｌｕｄｗｉｇｉｉ）、またはクルイベロミセス・ラクティス（Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス・バー・マルキシアヌス（Ｋ．  ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ．  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋ．  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）などのクルイベロミセス属、カンジダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびカンジダ・ベルサチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）などのカンジダ属、ピキア・スティピディス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｄｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉａｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびピキア・ソルビトフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｏｒｂｉｔｏｐｈｉｌａ）などのピキア属、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サッカロミコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｏｐｓｉｓ）、サッカロミコデス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ウィッケルハミア属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンセニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、オガタエア属（Ｏｇａｔａｅａ）、クライシア属（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ）、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）、メトシュニコウィア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、ナカザワエア属（Ｎａｋａｚａｗａｅａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ブルレラ属（Ｂｕｌｌｅｒａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ウィロプシス属（Ｗｉｌｌｏｐｓｉｓ）およびスポロボロミセス属の酵母からなる群から選択される真菌、
またはラッカセイ、ナタネ、カノーラ、ヒマワリ（ｕｎｆｌｏｗｅｒ）、アフロール（ａｆｆｌｏｒ）、ケシ、マスタード、アサ、トウゴマ（Ｒｉｚｉｎｕｓ）、オリーブ、アマランス、メキシカンチーア種子、ゴマ、キンセンカ、ザクロ、サンカップ、モウズイカ、アザミ、ノバラ、ヘーゼルナッツ、アーモンド、マカダミア、アボカド、ゲッケイジュ、カボチャ、アマ、ダイズ、ピスタチオ、ルリチザ、ココナッツ、クルミ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、エンバク、ライコムギ、コメ、オオムギ、ワタ、キャッサバ、コショウ、マリーゴールド、ナス科植物、ジャガイモ、ヤシ、タバコ、ナス、ビジア属（Ｖｉｃｉａ）、エンドウ、アルファルファ、コーヒー、ココア、茶、ヤナギ、牧草、フィスコミトレラ・オデル・セラトドン（ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｏｄｅｒ  ｃｅｒａｔｏｄｏｎ）からなる群から選択される植物、
またはクリプチスタ（Ｃｒｙｐｔｉｓｔａ）、緑色鞭藻類（Ｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｄｏｐｈｙｃｅａｅ）、黄緑藻類（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｃｅａ）、海産渦鞭毛藻類（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、黄金色植物（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）、珪藻類（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）、褐藻類（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）、紅藻類（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑藻類（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、ハプト植物、クリプチスタ（Ｃｒｙｐｔｉｓｔａ）、ユーグレナ動物門（Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ）、渦鞭毛動物門（Ｄｉｎｏｚｏａ）、クロララクニオン植物門（Ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔａ）からなる群から選択される藻類、
またはヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、キンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）からなる群から選択される昆虫細胞
から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生物。
【請求項７】
生物を培養すること、およびその生物から脂質を単離することを含む、脂質の生産のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の生物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある特定の酵素活性が低減および／または増強された、脂質、特に中性脂質の工業的生合成に有用な遺伝的に改変された非哺乳類生物、特に微生物に関する。本発明はさらに、このような生物の使用、このような生物を作出するためのシャトルビヒクルおよびこのような生物の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景および技術の現状
脂質は、もっぱらまたは部分的に、脂肪酸もしくはポリケチドのようなチオエステルのカルボアニオンに基づく縮合によって、および／またはプレノールもしくはステロールのようなイソプレン単位のカルボカチオンに基づく縮合によって生じる疎水性または両親媒性の小分子である。この群には、経済上極めて重要ないくつかの物質が含まれる。トリアシルグリセロール脂質群には例えば油脂類またはワックス類が含まれ、これらは例えば食品の成分としてまたは調理用に、石鹸、スキン製品、香料ならびに他のパーソナルケアおよび化粧製品の製造のために、塗料および他の木材処理製品の製造のために、電気工業における生分解性絶縁体として、生分解性作動液の製造のため、潤滑剤として、またはさらには従来のディーゼルの代替に使用可能なバイオディーゼルの主成分としてなど、極めて多様な状況で用いられる。イソプレノイド脂質スクアレンは、例えば、ワクチンまたは他の薬剤、栄養、化粧品ならびにＯＴＣ（ｏｖｅｒ−ｔｈｅ−ｃｏｕｎｔｅｒ）薬のアジュバントとして用いられる。スクアレンはまた、テルペン合成の構成ブロックとしても使用することができる。さらに、スクアレンは、生分解性潤滑剤として工業的に使用することができる。他の経済上重要な脂質としては、サポニン、ステロイドホルモン、ビタミンおよび原薬のような化合物の生産のための中枢的出発材料として用いられる、エルゴステロール、チモステロール、エピステロール、７−デヒドロコレステロールまたはラノステロールのようなステロールがある。
【０００３】
脂質、特に中性脂質は、通常、細胞内の、脂質粒子として知られる特定の細胞内オルガネラに貯蔵される。これらの粒子は、ほんの少量のタンパク質が埋め込まれた極めて疎水性の高い単層からなる単純な構造を特徴とする。脂質は、加水分解がそれらの成分のリターンを代謝経路および／または異化経路に向けるまで、脂質粒子に貯蔵される。この脂質貯蔵物形成のプロセスは自然界で広く用いられ、あらゆるタイプの真核細胞が、脂肪体、脂質滴、油体またはオレオソームとも呼ぶことができる細胞内脂質粒子を含む。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）脂質滴は、細胞の総脂質含量の７０％まで蓄積する。
【０００４】
記載されている脂質の大部分は植物、動物または微生物などの天然源に由来するので、生きている細胞において脂質量を増やす、すなわち、脂質粒子中により多くの脂質を蓄積させる試みがなされた。この目的で、生物の代謝経路を改変することが知られている。特許文献１には、酵母におけるエルゴステロール代謝の遺伝子の過剰発現が細胞のエルゴステロール量の増大をもたらすとの記載がある。特許文献２には、ラノステロール−Ｃ１４−デメチラーゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ活性の増強に基づくチモステロールの生産方法が開示されている。特許文献３には、Δ２２−デサチュラーゼ活性が低減され、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ラノステロールＣ１４−デメチラーゼ、スクアレンエポキシダーゼおよびスクアレンシンセターゼ活性が増強されたトランスジェニック生物が記載されている。これらの生物は、ステロール脂質エルゴスタ−５，７−ジエノールの生産に使用することができる。従って、脂質生成生物を生物学的に改変することによって、生産される脂質の収量を著しく増大させることができる。
【０００５】
しかしながら、得られる脂質化合物はほとんどの場合、不純で、混ざり合い、特に、その脂質がさらなる化学合成または改変の出発材料として用いられる場合には、分離および／または精製する必要がある。さらに、いずれの精製手順も、特に工業的規模で行われる場合には、高くつき、労力がかかり、環境を汚染する傾向がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】欧州特許第ＥＰ０４８６２９０Ａ号
【特許文献２】国際公開第０３／０６４６５２Ａ号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／０８３４０７Ａ号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
よって、本発明の基礎にある技術課題は、労力がかかり、コストがかかる精製手順を避けるために、より純度の高い形態で生物による脂質生産を可能とする手段および方法を提供することである。
【０００８】
発明の概要および好ましい実施形態
この技術課題を解決するために、本発明は、請求項１に記載の生物を教示する。好ましい実施形態は、請求項１の従属項で明示する。その中の、「遺伝的に改変された」とは、現状の遺伝子工学の方法によってゲノムが改変された生物だけでなく、所望の遺伝子改変に従う突然変異体群から選択された生物（従来の突然変異誘発）も含むものとする。
【０００９】
本発明は、特定の（中性）脂質がより純度の高い形態で脂質粒子に蓄積されるように生物を遺伝的に操作する、または生物学的に改変することができるという発見に基づく。本発明の生物は、生物によってより高い純度で生産させようとする脂質に応じて、所望でないステリルアシルエステルおよび／またはトリアシルグリセロールおよび／またはワックスエステルの合成を排除または低減するように改変される。中性脂質のより純度の高い形態での蓄積の他、驚くことに、潜在的に混入するステリルアシルエステルおよび／またはトリアシルグリセロールおよび／またはワックスエステルの低減または排除も所望の脂質のレベルおよび収量に増大をもたらす。これは、特定の理論に縛られるものではないが、脂質粒子内の貯蔵空間の増大および／または所望の脂質の合成のための基質の利用能の上昇によるものである可能性がある。
【００１０】
「中性脂質」とは、荷電基を欠き、従って、二重膜に実質的な量では組み込まれ得ない脂質を意味する。この用語には、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、ステリルアシルエステル（ＳＡＥ）およびワックスエステル（ＷＥ）が含まれる。スクアレンもこの種の「中性脂質」に属す。通常、脂質粒子の内容物は、組換え生物での所望の特定中性脂質の効率的生産に支障を来す種々の中性脂質の混合物である。この問題は、本発明により、生物の脂質体内で本来生成する中性脂質の少なくとも１つの種類をそこではもはや合成されないように生産者生物を改変することによって克服される。結果として、脂質粒子内に含まれる残りの中性脂質の組成はより純粋となり、従って、市販の商業目的での生産により魅力あるものとなる。
【００１１】
一般に、より高い純度で合成させようとする中性脂質に応じて、または生合成において望ましくない混入物として除去しようとする中性脂質に応じて、請求項１に記載のいずれか１つの活性または種々の活性（２つ、３つまたは４つ）の組合せを用いることができる。よって、本発明の種々の実施形態が存在するが、以下、いくつかの特定の実施形態だけを詳細に記載する。
【００１２】
よって、第一の実施形態では、本発明の生物は、ステリルアシルエステル（ＳＡＥ）をもはや合成しないように改変される。ステリルアシルエステルは、ステロールと長鎖脂肪酸とのエステルである。一般に、ＳＡＥの合成は、細胞内でアシル−ＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ／ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２６）を含む酵素機構によって遂行される。触媒される反応は、ステロールと長鎖脂肪酸とのエステル化である。よって、好ましい実施形態では、本発明の生物は、アシル−ＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ／ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２６）の活性が、対応する非改変生物、好ましくは対応する野生型生物と比較して低減されるように改変される。
【００１３】
酵母、特にＳ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、ステリルアシルエステルを生じるステロールエステル化は、ステリルアシルトランスフェラーゼの２つのイソ酵素、すなわち、異なるステロール中間体に対して異なる特異的親和性を有するＡｒｅ１ｐおよびＡｒｅ２ｐによって遂行される。Ａｒｅ１ｐは、特に、ラノステロール、チモステロール、エルゴスタ−５，７−ジエノールなどのエルゴステロール前駆体と、７−デヒドロコレステロールなどの酵母にとって外来の物質とのエステル化をもたらす。Ａｒｅ２ｐは、酵母におけるエルゴステロール生合成経路の最終産物であるエルゴステロールのエステル化を優先的にもたらす。生物が酵母生物体、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のもの、好ましくはＳ．セレビシエである場合、Ａｒｅ１ｐまたはＡｒｅ２ｐまたはその両者Ａｒｅ１ｐとＡｒｅ２ｐの活性を、対応する非改変酵母生物、好ましくは対応する野生型生物と比較して低減または排除することができる。両酵素活性が排除される場合、細胞内でステロールのエステル化は起こらない。一方の活性のみを排除し、他方を維持することにより、所望により、ある特定のステロールをもたらす酵素活性がその生物において相応に維持または適合されていれば、細胞内のある特定のタイプのステリルアシルエステルを得ることが可能である。
【００１４】
生物がステリルアシルエステルをもはや合成しないことを特徴とする本発明の第一の態様に関して、本発明の生物は、原則として、存在し得る任意の生物、植物生物、真菌生物または細菌生物であってよい。しかしながら、好ましくは、該生物は、その脂質粒子内にワックスエステルを本来貯蔵しないが、トリアシルグリセロールおよびステリルアシルエステルのような他の脂質だけを貯蔵する生物に由来する。よって、ステリルアシルエステルの合成のための生合成経路を排除することにより、このような生物はその脂質粒子内に本質的にトリアシルグリセロールのみを蓄積し、それにより、このような生物において、脂質粒子からかなり純粋な形態でトリアシルグリセロールを生産することが可能となる。それらの脂質粒子内にワックスエステルを本来蓄積しない生物の例としては、特に、大部分の動物、真菌細胞、および藻類とプランクトン細胞を除く大部分の植物細胞である。本発明の第一の態様に関する特に好ましい実施形態では、生物は真菌生物、好ましくは、ヤルロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、リポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、モルチエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）およびディクチオステリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）からなる群から選択される属の真菌生物である。ヤルロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、リポミセス・スタルケイイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ）、カンジダ・クルバタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｕｒｖａｔａ）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｔｕｌｏｉｄｅｓ）、モルチエレラ・イサベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、ムコール・ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖｏｎｉｃｕｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃ）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃ）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｅｃ）またはディクチオステリウム種（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｓｐｅｃ）の真菌生物が特に好ましい。本発明の第一の態様の特に好ましい実施形態では、生物はＳ．セレビシエである。
【００１５】
第二の実施形態では、本発明の生物は、ステリルアシルエステル（ＳＡＥ）およびワックスエステル（ＷＥ）をもはや合成しないように改変される。
【００１６】
一般に、ＷＥの合成は、細胞内でアシルＣｏＡ−ワックスアルコールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．７５）を含む酵素機構によって遂行される。よって、本発明の第二の態様の好ましい実施形態では、本発明の生物は、アシル−ＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ／ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２６）およびアシルＣｏＡ−ワックスアルコールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．７５）の活性が、対応する非改変生物、好ましくは対応する野生型生物と比較し低減されるように改変される。
【００１７】
本発明の第二の態様に関する本発明の生物は、ステリルアシルエステルおよびワックスエステルの合成が低減されている、好ましくは完全に排除されているので、脂質粒子内に主としてトリアシルグリセロールを蓄積する。従って、このような生物は、特に工業規模で、トリアシルグリセロールを純粋な形態で生産するのに好適である。
【００１８】
本発明の第二の態様の生物は、好ましくは、ワックスエステルを本来生産し、それらを細胞の脂質粒子に蓄積する生物に由来する。ワックスエステルを生産し、貯蔵する生物は、例えば、表面の脱水を最小限にするために組織の疎水性被膜を設けるために用いられる植物および昆虫、藻類、プランクトン生物および細菌である。本発明の第二の態様の好ましい実施形態では、生物は細菌生物、好ましくは、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）または乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のものである。最も好ましくは、生物は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００１９】
さらに、このような本発明の生物では、その生物で本来生産されるトリアシルグリセロールを、またはその生物で本来生産される量で生産することが可能であるだけでなく、このような生物を該生物で本来生産される１以上の特定のトリアシルグリセロールの量を増大させるように遺伝的に改変すること、またはこのような生物をこのような生物によって本来生産されない１以上のトリアシルグリセロールの合成をもたらすように遺伝的に改変することも可能である。
【００２０】
特に好ましい一実施形態では、本発明の生物によって蓄積されるトリアシルグリセロールは、グリセロールと少なくとも１つの不飽和脂肪酸とのエステルであり、より好ましくは、該不飽和脂肪酸はω−３脂肪酸である。原則として、該ω−３脂肪酸は存在し得る任意のω−３脂肪酸であり得るが、好ましくは、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、トリアシルグリセロール中の不飽和脂肪酸は、ω−６脂肪酸である。原則として、該ω−６脂肪酸は存在し得る任意のω−６脂肪酸であり得るが、好ましくは、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸またはカレンド酸である。
【００２２】
別の好ましい実施形態では、トリアシルグリセロール中の不飽和脂肪酸は、ω−９脂肪酸である。原則として、ω−９脂肪酸は存在し得る任意のω−９脂肪酸であり得るが、好ましくは、オレイン酸、エイコセン酸、ミード酸、エルカ酸またはネルボン酸である。
【００２３】
第一および第二の実施形態は、以下に記載されるようにさらに改変することができる。トリアシルグリセロールは一般に、ジアシルグリセロールと長鎖脂肪酸またはリン脂質のエステル化によって形成される。長鎖脂肪酸とのエステル化は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ／ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２０）によって触媒される。リン脂質とのエステル化は、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ／リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５８）によって触媒される。特に好ましい実施形態では、本発明の第一または第二の態様の生物は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ／ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２０）の活性および／またはレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ／リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５８）の活性が、対応する非改変生物、好ましくは対応する野生型生物と比較して増強されていることを特徴とする。上述の２つの酵素の一方または両方の活性の増強は、生物の細胞内でのＴＡＧ合成の増大をもたらす。
【００２４】
この他、生物がＴＧＡに組み込まれるある特定の脂肪酸を生産可能となるように、またはそれらがこのような生物ですでに本来生産されている場合にはこのような脂肪酸の生産を増大させてその生物で生産されるＴＧＡにおけるそれらの含量を増大させるように生物を遺伝的に改変することも可能である。例えば、生物で生産されるＴＧＡにおいてエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）および／またはドコサヘキサン酸（ＤＨＡ）などのω−３脂肪酸の量を増大させることが意図される場合には、Δ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．１９）、Δ１５−デサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．１９）、Δ６脂肪酸デサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．１９．３）、脂肪エロンガーゼ、Δ５−デサチュラーゼ／Δ５−脂肪酸デサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．１９）およびΔ４脂肪酸デサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．１９）の酵素活性を増強することが有利であろう。よって、好ましい実施形態では、生物（ｏｒｇａｎｉｓ）は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ／ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２０）および／またはレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ／リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５８）の活性と、Δ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．１９）、Δ１５−デサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．１９）、Δ６脂肪酸デサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．１９．３）、脂肪酸エロンガーゼ、Δ５−デサチュラーゼ／Δ５−脂肪酸デサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．１９）およびΔ４脂肪酸デサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．１９）からなる群から選択される少なくとも１つの活性が、対応する非改変生物、好ましくは対応する野生型生物と比較して増強されていることを特徴とする。例えば、植物およびいくつかの真菌はω−３およびω−６脂肪酸を生産することができるが、例えばサッカロミセス・セレビシエは、ω−９脂肪酸のみ合成可能である。よって、本発明の生物がサッカロミセス・セレビシエである場合、ω−３脂肪酸および／またはω−６脂肪酸の生産に必要な酵素活性を細胞に導入することが望ましいと思われる。対応する遺伝子を酵母細胞に導入するためのアプローチは文献（例えば、国際公開第２００４／１０１５７５号）に対応する遺伝子とともにすでに記載されている。特定の脂肪酸の、例えば酵母細胞での異種生合成は、例えば、Ｂｅａｕｄｏｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７（２０００），  ６４２１−６４２６）およびＶｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６３（２００４），  ６３５−６４６）に記載されている。
【００２５】
本発明はまた、本発明の第一または第二の態様の生物を培養することを含む、トリアシルグリセロールの生産方法に関する。上記のように、これらの生物は、それらの脂質粒子内に本質的に純粋な形態で多量のトリアシルグリセロールを蓄積することができる。これらのＴＡＧは、当技術分野で周知の方法に従って生物から単離することができる。例えば、細胞から脂質粒子を単離する方法およびこれらからその中に含まれている中性脂質を単離する方法は当技術分野で公知である。このような方法の例は、添付の実施例においてサッカロミセス・セレビシエ生物体に関して記載されている。
【００２６】
本発明はまた、グリセロールと少なくとも１つの不飽和脂肪酸とのエステルであるトリアシルグリセロールの生産方法に関し、その方法は、
（ｉ）阻害剤により、アシル−ＣｏＡ：ステロールアシル−トランスフェラーゼ／ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２６）および／またはアシルＣｏＡ−ワックスアルコールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．７５）の活性を低減または排除すること；および
（ｉｉ）生物においてジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ／ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２０）および／またはレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ／リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５８）の活性を、対応する非改変生物、好ましくは対応する野生型生物と比較して増強することを含む。この生物を培養し、ＴＡＧを単離することができる。
【００２７】
生産されるトリアシルグリセロールに含まれる不飽和脂肪酸に関しては、好ましい実施形態では、ポリ不飽和脂肪酸の性質および増強される酵素活性の性質に関してすでに上記したものと同じことが当てはまる。特に好ましい実施形態では、ポリ不飽和脂肪酸はω−３脂肪酸であり、増強される酵素活性は、本発明の上記でω−３脂肪酸に関して詳しく記載されているものの少なくとも１つである。
【００２８】
第三の実施形態では、本発明の生物は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）およびステリルアシルエステル（ＳＡＥ）をもはや合成しないように改変される。上記のように、一般に、ＴＡＧの合成はジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ／ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２０）およびレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ／リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５８）の酵素活性によって遂行される。よって、好ましい実施形態では、本発明の生物は、アシル−ＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ／ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２６）、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ／ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２０）およびレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ／リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５８）の活性が、対応する非改変生物、好ましくは対応する野生型生物と比較して低減されるように改変される。
【００２９】
好ましい実施形態では、本発明の第三の態様の生物は、ワックスエステルを本来生産および貯蔵する生物に由来する生物である。このような生物はすでに上記されている。好ましくは、生物はすでに上記されている細菌生物であり、最も好ましくは大腸菌である。ＴＡＧおよびＳＡＥの合成が排除されているために、このような生物は主としてその脂質粒子内にワックスエステルを蓄積するのに好適である。特に好ましい実施形態では、このような生物はさらに、対応する非改変株、好ましくは対応する野生型株と比較してアシル−ＣｏＡワックスアルコールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．７５）の活性に増強を示すことを特徴とする。これにより、生物において合成されるワックスエステルの量を増大されることが可能となる。生物の細胞内で所望の酵素の活性を増強するための手段および方法は当業者に公知であり、本明細書の以下に詳しく記載される。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、本発明の第三の態様の生物は、ワックスエステルを本来生産および貯蔵しない生物に由来する。このような生物は本発明の第一の態様に関して上記されている。好ましくは、このような生物は上記のような真菌生物、より好ましくはサッカロミセス属、最も好ましくはサッカロミセス・セレビシエ種である。ＴＡＧおよびＳＡＥの合成が排除されているために、このような生物の脂質粒子は、以下に詳しく記載されるように、目的の脂質、例えば、スクアレンを蓄積するために使用することができる。
【００３１】
第四の実施形態では、本発明の生物は、ワックスエステル（ＷＥ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）およびステリルアシルエステル（ＳＡＥ）をもはや合成しないように改変される。この態様では、生物は本質的にその脂質粒子内にいずれのＷＥ、ＴＡＧおよびＳＥも貯蔵しない。このような生物は、その脂質粒子に、特に望まれる脂質を向けることができる生物を設計するのに特に有用である。例えば、このような生物に、後に脂質粒子に蓄積される別のタイプの脂質の合成を可能とする核酸分子を導入することができる。これにより、脂質粒子における本質的に純粋な目的脂質の合成を可能とする生物を提供することができる。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明の第四の態様の生物は、アシル−ＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ／ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２６）、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ／ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２０）、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ／リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５８）およびアシルＣｏＡ−ワックスアルコールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．７５）の活性が、対応する非改変生物、好ましくは対応する野生型生物と比較して低減されるように改変される。
【００３３】
第五の実施形態では、本発明の生物は、細胞において脂質粒子内に蓄積される中性脂質を生産し、かつ、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）をもはや合成しないように遺伝的に改変された、従って、該粒子において、その脂質粒子内に本来存在する該トリアシルグリセロールをもはや含まない生物である。上記のように一般に、ＴＡＧの合成は、例えば酵母においては、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ／ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２０）およびレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ／リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５８）の酵素活性によって遂行される。よって、好ましい実施形態では、本発明の第五の態様の生物は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ／ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２０）およびレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ／リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５８）の活性が、対応する非改変生物、好ましくは対応する野生型生物と比較して低減されるように遺伝的に改変される。
【００３４】
本発明の第五の態様の好ましい実施形態では、生物は、ワックスエステルを本来生産せず、その脂質粒子内に貯蔵しない生物に由来する。このような生物は上記されている。好ましくは、生物は上記のような真菌生物、より好ましくはサッカロミセス属、最も好ましくはサッカロミセス・セレビシエ種である。
【００３５】
第六の実施形態では、本発明の生物は、細胞において脂質粒子内に蓄積される中性脂質を生産し、かつ、ワックスエステル（ＷＥ）およびトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）をもはや合成しないように遺伝的に改変された、従って、該粒子において、その脂質粒子内に本来存在するトリアシルグリセロールおよびワックスエステルをもはや含まない生物である。好ましい実施形態では、本発明の第六の態様の生物は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ／ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２０）、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ／リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５８）およびアシルＣｏＡ−ワックスアルコールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．７５）の活性が、対応する非改変生物、好ましくは対応する野生型生物と比較して低減されるように遺伝的に改変される。
【００３６】
好ましい実施形態では、本発明の第五または第六の態様の生物、すなわち、トリアシルグリセロールをもはや合成しない、またはトリアシルグリセロールおよびワックスエステルをもはや合成しない生物は、その脂質粒子内にステロール脂質のアシルエステルを蓄積することができる。脂質粒子におけるステロール脂質のアシルエステルの蓄積は、その生物がこのようなエステルを本来合成するという事実によるものであり得、またはそれはステロール脂質のアシルエステルの生合成をもたらす対応する酵素をコードする遺伝子がそれらの細胞に導入されているという事実によるものであり得る。
【００３７】
コレステロールおよびその誘導体などのステロール脂質は、グリセロリン脂質およびスフィンゴミエリンとともに膜脂質の重要な成分である。これらのステロイドは、同じ縮合４環コア構造も含むが、ホルモンおよびシグナル伝達分子として異なる生物学的役割を有する。Ｃ１８ステロイドはエストロゲンファミリーを含み、Ｃ１９ステロイドはテストステロンおよびアンドロステロンなどのアンドロゲンを含む。Ｃ２１サブクラスは、プロゲストゲンならびに糖質コルチコイドおよび鉱質コルチコイドを含む。種々の形態のビタミンＤを含むセコステロイドは、コア構造のＢ環の開裂を特徴とする。ステロールの他の例は胆汁酸およびそれらの結合体であり、これらは哺乳類ではコレステロールの酸化誘導体であり、肝臓で合成される。
【００３８】
好ましい実施形態では、ステロール脂質はステロールまたはステロイドである。ステロイドは、一般に６−６−６−５様式で配置された４つの縮合環を有する炭素主鎖を特徴とするテルペノイド脂質である。ステロイドはこれらの環と結合している官能基およびこれらの環の酸化状態によって異なる。植物、動物および真菌には、何百もの異なるステロイドが見られる。全てのステロイドが細胞においてステロールラノステロール（動物および真菌）またはステロールシクロアルテノール（植物）のいずれかから製造される。両ステロールとも、トリテルペンスクアレンの環化に由来する。ステロイドには、エストロゲン、プロゲステロンおよびテストステロンが含まれる。
【００３９】
ステロール（またはステロイドアルコール）は、Ａ環の３位にヒドロキシル基を有するステロイドのサブグループである。それらはアセチル補酵素Ａ（ａｃｅｔｙｌ−ｃｏｎｅｎｚｙｍｅ  Ａ）から合成される両親媒性脂質である。この分子全体は極めて平坦である。Ａ環上のヒドロキシル基には極性がある。この脂肪鎖の残りの部分は非極性である。植物のステロールは植物ステロール（ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌｓ）と呼ばれ、動物のステロールは動物ステロール（ｚｏｏｓｔｅｒｏｌｓ）と呼ばれる。最も重要な動物ステロールはコレステロールおよびいくつかのステロイドホルモンであり、最も重要な植物ステロールはカンペステロール、シトステロールおよびスチグマステロールである。ステロールは、真核生物の生理に不可欠な役割を果たす。例えば、コレステロールは細胞膜の一部を形成し、その存在は細胞膜の流動性に影響を及ぼし、発生シグナル伝達における第二のメッセンジャーとして働く。植物ステロールはまた、ヒトの腸においてコレステロール吸収部位を遮断することも知られており、従って、ヒトにおいてコレステロールの低減を助ける。ヒトでは、ステロールは、例えば、日内周期、血液凝固などの重要なシグナルおよび代謝コミュニケーションを提供する働きをする。
【００４０】
好ましい実施形態では、ステロールはコレステロール、コレステロール誘導体、７−デヒドロ−コレステロール、ラノステロール、ラノステロール誘導体、チモステロール、チモステロール誘導体、ラトステロール、ラトステロール誘導体、ククルビタシン、ククルバチン（ｃｕｃｕｒｂａｔｉｎ）誘導体、エピステロール、エピステロール誘導体、テアステロン、テアステロン誘導体、カスタステロン、カスタステロン誘導体、チファステロール、チファステロール誘導体、カタステロン、カタステロン誘導体、シクロオイカレノール、シクロオイカレノール誘導体、シトステロール、シトステロール誘導体、イソフコステロール、イソフコステロール誘導体、フコステロール、フコステロール誘導体、ゴルゴステロール、ゴルゴステロール誘導体、エルゴステロール、エルゴステロール誘導体、スチグマステロールまたはスチグマステロール誘導体である。
【００４１】
特に、７−デヒドロ−コレステロールのアシルエステルが蓄積される生物では、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４）および／またはΔ２４−レダクターゼおよび／またはラノステロールＣ１４−デメチラーゼ／シトクロムＰ４５０  ５１（ＥＣ１．１４．１３．７０）および／またはスクアレン−エポキシダーゼ／スクアレン−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．９９．７）の活性を、対応する野生型生物と比較して増強することができる。さらに、ＳＡＭ：Ｃ−２４ステロールメチルトランスフェラーゼおよび／またはＣ−２２ステロールデサチュラーゼおよび／またはＣ−５ステロールデサチュラーゼの活性を、対応する野生型生物と比較して低減または排除することができる。エルゴステロールのアシルエステルが蓄積される生物では、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４）および／またはラノステロールＣ１４−デメチラーゼ／シトクロムＰ４５０  ５１（ＥＣ１．１４．１３．７０）および／またはスクアレン−エポキシダーゼ／スクアレン−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．９９．７）の活性を、対応する野生型生物と比較して増強することができる。エピステロールのアシルエステルが蓄積される生物では、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４）および／またはラノステロールＣ１４−デメチラーゼ／シトクロムＰ４５０  ５１（ＥＣ１．１４．１３．７０）および／またはスクアレン−エポキシダーゼ／スクアレン−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．９９．７）の活性を、対応する野生型生物と比較して増強することができ、かつ／またはΔ２２−デサチュラーゼ／シトクロムＰ４５０  ６１（ＥＣ１．１４．１４．１）活性を、対応する野生型生物と比較して低減することができる。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、ステロイドはアンドロステロン、アンドロステロン誘導体、テストステロン、テストステロン誘導体、アンドロステンジオール、アンドロステンジオール誘導体、アンドロステンジオン、アンドロステンジオン誘導体、カルステロン、カルステロン誘導体、メタンドリオール、メタンドリオール誘導体、ボラステロン、ボラステロン誘導体、エピアンドロステロン、エピアンドロステロン誘導体、メスタノロン、メスタノロン誘導体、スタノロン、スタノロン誘導体、ステンボロン、ステンボロン誘導体、エピテストステロン、エピテストステロン誘導体、コルチゾール、コルチゾール誘導体、アルドステロン、アルドステロン誘導体、プレグネノロン、プレグネノロン誘導体、コルチゾン、コルチゾン誘導体、コルチコステロン、コルチコステロン誘導体、ノレシンドロン、ノレシンドロン誘導体、ウロコルチゾールまたはウロコルチゾール誘導体である。
【００４３】
本発明の第五および第六の態様の好ましい実施形態では、ステロール脂質のアシルエステルを蓄積することができる生物は、個々のステロール脂質の合成に至る生合成経路を本来保有し、より好ましくは、個々のステロール脂質のより高い蓄積を得るために、対応する経路の酵素活性が対応する非改変生物と比較して増強されている生物である。
【００４４】
好ましい実施形態では、本発明の態様１〜６の生物は、その脂質粒子内にプレノール脂質を蓄積することができる。プレノール脂質は、主としてメバロン酸（ＭＶＡ）経路を介して生産される５炭素前駆体であるイソペンテニル二リン酸およびジメチルアリル二リン酸から合成される。プレノール脂質はイソプレノイド、キノンおよびヒドロキノン、ポリプレノール、ホパノイドおよび他のいくつかの希少なタイプを包含する。単純イソプレノイド（直鎖アルコール、二リン酸塩など）はＣ５単位の連続的付加によって形成され、これらのテルペン単位の数によって分類される。４０を超える炭素を含む構造はポリテルペンとして知られる。カロテノイドは、抗酸化剤としておよびビタミンＡ前駆体として働く重要な単純イソプレノイドである。別の生物学的に重要なクラスの分子としては、非イソプレノイド起源のキノノイドコアと結合したイソプレノイドテールを含むキノンおよびヒドロキノンが挙げられる。ビタミンＥおよびビタミンＫならびにユビキノンがこのクラスの例である。細菌は、酸素と結合している末端のイソプレノイド単位が不飽和のままであるポリプレノール（バクトプレノールと呼ばれる）を合成するが、動物ポリプレノール（ドリコール）では、末端イソプレノイドは還元されている。
【００４５】
好ましい実施形態では、脂質粒子内に蓄積されるプレノール脂質はイソプレノイドである。イソプレノイドとしては、例えば、Ｃ５イソプレノイド、Ｃ１０イソプレノイド（モノテルペン）、Ｃ１５イソプレノイド（セキテルペン）、Ｃ２０イソプレノイド（ジテルペン）、Ｃ２５イソプレノイド（セステルテルペン）、Ｃ３０イソプレノイド（トリテルペン）、Ｃ４０イソプレノイド（テトラテルペン）、ポリテルペンおよびレチノイドが挙げられる。
【００４６】
特に好ましい実施形態では、イソプレノイドはトリテルペンである。トリテルペンは、６つのイソプレン単位からなり、基本分子式Ｃ３０Ｈ４８ー５０を有する。この群は、例えば３Ｓ−スクアレン−２，３−エポキシド、スクアレン、プレスクアレン二リン酸、テトラヒマノール、α−アミリン、β−アミリン、ルペオール、酢酸ルペオール、タラキサステロール、アザジラクチンＡ、ネオクアッシン、クアッシンおよび３−アセチル−１−チグロイルアザジラクチニンを包含する。サメ肝油の成分である直鎖トリテルペンスクアレンは、２分子のピロリン酸ファルネシルの還元的結合から誘導される。その後、スクアレンは生合成的にプロセシングされ、全てのステロイドの構造前駆体であるラノステロールまたはシクロアルテノールのいずれかを生成する。
【００４７】
特に好ましい実施形態では、脂質粒子内に蓄積されるプレノール脂質はスクアレンまたはスクアレン誘導体である。スクアレン誘導体は、スクアレンの場合には主鎖炭素原子に結合している水素原子の代わりに、主鎖炭素原子に結合している１以上の、特に、１〜１０個または１〜４個の、付加的メチルまたはエチル基を含む。
【００４８】
特に好ましい実施形態では、本発明の生物は好ましくは、本発明の第一、第三および第五の態様の態様に関して、その脂質粒子においてワックスエステルを生産および貯蔵しない生物、例えば、上記のような真菌生物、より好ましくはサッカロミセス属の真菌生物、最も好ましくは、サッカロミセス・セレビシエである。本発明の第一、第三および第五の態様に従い、トリアシルグリセロールおよび／またはステリルアシルエステルを合成しないように改変されたこのような生物は、その脂質粒子においてプレノール脂質、特に、スクアレンを合成および貯蔵することができ、それにより、脂質粒子内でこのようなプレノール脂質を本質的に純粋またはより高い純度の形態で生産することができる。よって、酵母生物においてＴＡＧおよび／またはＳＡＥの生合成のための合成経路を排除することにより、このような生物によって生産されるスクアレンの量および純度に関して生産を劇的に改善することがすでに可能である。
【００４９】
このような生物におけるスクアレン生産のさらなる改善は、スクアレンの合成をもたらす酵素活性を増強し、かつ、スクアレンを他の化合物に変換する経路の酵素活性を低減するように生物の代謝を改変することによって達成することができる。
【００５０】
スクアレン生合成経路の遺伝子は既知であり、例えば酵母Ｓ．セレビシエにおいてクローニングされている。主要なボトルネック酵素はＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ（ＨＭＧ１）（Ｂａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８  （１９８８），  ３７９３−３８０８）。よって、好ましい実施形態では、本発明の第一、第三または第五の態様の生物は脂質粒子内にスクアレンを蓄積することができ、かつ、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４）の活性が対応する非改変生物、好ましくは対応する野生型生物と比較して増強されていることを特徴とする。ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ活性の増強は、当業者に周知の手段および方法によって達成することがき、それらは以下にもさらに詳細に記載される。好ましい実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼの活性の増強は、その生物において、その酵素の触媒領域のみをコードし、膜結合ドメインはコードしないＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ遺伝子を発現させることによって達成される。このような変更は欧州特許第ＥＰ−Ａ４８６２９０にすでに記載されている。この改変により、エルゴステロール生合成経路の中間体によるＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼのフィードバック調節が回避される。別の好ましい実施形態では、本発明の生物においてＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼをコードする遺伝子を、異種プロモーター、すなわち、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ遺伝子にとって外来のプロモーターの制御下に置くが、特に、このプロモーターは、エルゴステロール生合成経路の中間体によってはその活性が調節されないプロモーターである。好適なプロモーターの例はＡＤＨ１プロモーター、特に、おおよそ構成的発現を示すＡＤＨ１「アベレージ」プロモーターである（Ｒｕｏｈｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３９  （１９９５），  １９３−２０３）。
【００５１】
酵母などのいくつかの生物では、スクアレンは他の化合物、特に、エルゴステロールに、また、エルゴステロール生合成経の中間体に変換され得る。ステロールエルゴステロール（（２２Ｅ）−エルゴスタ−５，７，２２−トリエン−３−β−オール）の形成をもたらす化学反応および経路が麦角、酵母および糸状菌に見られる。これらの生物では、スクアレンはスクアレンモノオキシゲナーゼ／スクアレンエポキシダーゼ（ＥＣ１．１４．９９．７；スクアレンエポキシダーゼまたはＥＲＧ１とも呼ばれる）によって（Ｓ）−２，３−エポキシスクアレンに変換され、これは次に２，３−オキシドスクアレン−ラノステロールシクライズ（ｃｙｃｌｉｓｅ）（ＥＣ５．４．９９．７；ＥＲＧ７）によってラノステロールに変換される。ラノステロールは次にシトクロムＰ４５０ラノステロール１４ａ−デメチラーゼ（ＥＣ１．１４．１３．７０；ＥＲＧ１１）によって、ＮＡＤＰＨおよびＯ２を用いて、４，４−ジメチル−コレスタ−８，１４，２４−トリエノールに変換され、その後、Ｃ１４ステロールレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．７０；ＥＲＧ２４）によって、ＮＡＤＰＨを用いて、４，４−ジメチル−８，２４−コレスタジエノールに変換される。この化合物は次にＣ−４ステロールメチルオキシダーゼ（ＥＣ１．１４．１３．７２；ＥＲＧ２５）の作用によってさらに４−メチル−８，２４−コレスタジエノールに変換される。この物質はＣ−３ステロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１７０；ＥＲＧ２６）によって３−ケト−４−メチルチモステロールに変換される。次に、３−ケト−４−メチルチモステロールは、３−ケトステロールレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２７０；ＥＲＧ２７）によってチモステロールに変換される。チモステロールはそれ自体、次に、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンとともに、ＳＡＭ：Ｃ−２４ステロールメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．４１；ＥＲＧ６）の作用によってフェコステロールおよびＳ−アデノシル−ホモシステインに変換される。フェコステロールは次にＣ−８ステロールイソメラーゼ（ＥＲＧ２）の作用によってエピステロールに変換され、その後、Ｃ−５ステロールデサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．２１．６；ＥＲＧ３）の作用によって、ＮＡＤＰＨおよびＯ２を用いて、５，７，２４（２８）−エルゴスタトリエノールに変換される。この化合物はさらにＣ−２２ステロールデサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．１４；ＥＲＧ５）の作用によって５，７，２２，２４（２８）−エルゴスタテトラエノールに変換される。５，７，２２，２４（２８）−エルゴスタテトラエノールは次にＣ−２４ステロールレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．７１；ＥＲＧ４）の作用によってエルゴステロールに変換される。本発明の生物が脂質粒子内にスクアレンを蓄積することが望まれる場合、また、この生物がエルゴステロール、またはスクアレンから始まるエルゴステロール経路の中間体を本来合成することができる生物に由来する場合には、その生物におけるスクアレンからエルゴステロールに至る経路の上述の酵素活性の１以上の活性を低減することが望ましいと思われる。原則として、上記エルゴステロール経路の上述の酵素のいずれか１つ、２以���または全てを低減することができる。好ましい実施形態では、スクアレンモノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．９９．７；スクアレンエポキシダーゼまたはＥＲＧ１とも呼ばれる）の活性が低減されるが、一部のステロール合成は酵母細胞の生存に必要であるので完全には排除されない。また、エルゴステロールの生合成に関与する以下の酵素：ＳＡＭ：Ｃ−２４ステロールメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．４１）、Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．１４）およびＣ−５ステロールデサチュラーゼ（ＥＣ１．１４．２１．６）の１以上の活性を低減することも可能である。このことは全てにおいて本発明の上述のいずれの実施形態にも当てはまる。
【００５２】
本発明の一部として、しかしながら独立に、遺伝的に改変された生物に関して以下の特徴を適用する。
【００５３】
本発明の範囲内で、酵母サッカロミセス・セレビシエにおける遺伝子ＳＡＫ１および／またはＨＡＰ４の構成的過剰発現が脂質、特にスクアレンおよびステロールの生産性の著しい増大をもたらすことも判明した。遺伝子ＳＡＫ１およびＨＡＰ４は呼吸−発酵フラックス分布に関連づけられる。
【００５４】
遺伝子ＳＡＫ１は、Ｓｎｆ１ｐ／Ｓｎｆ４ｐ複合体のリン酸化を担う上流セリン／トレオニンキナーゼをコードする。このリン酸化は、核に局在される活性なＳｎｆ１ｐ／Ｓｎｆ４ｐ複合体をもたらす。Ｓｎｆ１ｐ／Ｓｎｆ４ｐ複合体はタンパク質セリン／トレオニンキナーゼに属し、「ジオーキシーシフト（ｄｉａｕｘｉｃ  ｓｈｉｆｔ）」の際のグルコース抑制の軽減に中心的役割を果たす。このジオーキシーシフトとは、培地中のグルコースまたは他の発酵炭素源が消耗された際の発酵代謝から呼吸代謝への移行を表す。Ｓｎｆ１／Ｓｎｆ４複合体はそれぞれグルコース抑制および抑制解除を担うカスケードの階層を遙かに超える範囲である。ジオーキシーシフトの過程では、サッカロミセス・セレビシエの６０００の遺伝子の約４分の１の発現レベルが有意に変化を受ける。これらの主要な変化は主として、発酵モードから呼吸モードへと移行される中枢代謝に携わる。発酵モードでは、酵母細胞はグルコースのような発酵可能な炭素源をエタノールと二酸化炭素へと代謝する。呼吸モードでは、生産されたエタノールが呼吸されて、細胞においてエネルギーを供給するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が得られる。ジオーキシーシフトの過程で、Ｓｎｆ１ｐ／Ｓｎｆ４ｐ複合体はリン酸化され、従って、Ｓｎｆ１−キナーゼＳａｋ１ｐ、Ｔｏｓ１ｐおよびＥｌｍ１ｐによって活性化される。活性化された複合体は核に局在され、そこでそれは２つの転写因子Ｍｉｇ１ｐおよびＣａｔ８ｐに影響を及ぼす。ジンクフィンガータンパク質Ｍｉｇ１ｐは転写レプレッサーであり、複合体としての多数のグルコース抑制遺伝子の特定のコンセンサス配列と結合するためにタンパク質Ｔｕｐ１ｐおよびＣｙｃ８ｐを動員し、それにより、このコンセンサス配列の下流の遺伝子の転写が抑制される。Ｃａｔ８ｐは転写アクチベーターであり、培地中のグルコースが枯渇した際に少なくとも３４の遺伝子の発現を誘導する。これらの遺伝子は主として、エタノールまたはアセテートのようなＣ２化合物の代謝に必要なグリオキシル酸シャントの遺伝子である。これに加え、クエン酸回路およびグリオキシル酸シャントの中間体の細胞内輸送を担う遺伝子もＣａｔ８ｐによって調節される。活性なＳｎｆ１ｐ／Ｓｎｆ４ｐ複合体はＭｉｇ１ｐをリン酸化し、それによりこのタンパク質は不活性化され、核の外へ転流され、機能的ホモログであるＣａｔ８ｐおよびＳｉｐ１ｐをリン酸化し、これがこれら２つのタンパク質の不活性をもたらす。従って、核に局在された活性なＳｎｆ１ｐ／Ｓｎｆ４ｐ複合体は、抑制カスケードのいくつかの転写因子に影響を及ぼすことから、グルコース抑制の軽減および発酵から呼吸への移行に大きく寄与する。よって、本発明の生物は、グルコースの存在下であってもより活性なＳｎｆ１ｐ／Ｓｎｆ４ｐ複合体を呈するようにさらに発達させることができる。この改変は、主要キナーゼとしてＳｎｆ１ｐ／Ｓｎｆ４ｐ複合体のリン酸化、従って、活性化を担うタンパク質Ｓａｋ１ｐの転写脱調節によって達成される。
【００５５】
Ｈａｐ２／３／４／５タンパク質複合体は、多数のグルコース抑制遺伝子を調節する。これらは呼吸鎖およびクエン酸回路の主要な遺伝子である。この複合体はジオーキシーシフトの際にアクチベーターとしてこれらの遺伝子の転写を誘導し、呼吸−発酵バランスの呼吸方向へのシフトに強く寄与する。遺伝子ＨＡＰ２、ＨＡＰ３およびＨＡＰ５は構成的に発現される。本来、ＨＡＰ４は、非発酵性炭素源での増殖の場合にのみ発現される。ＨＡＰ４過剰発現変異株の培養の際に、この突然変異は増殖速度の増大、バイオマスおよび酢酸の生産、ならびにグリセロールおよびエタノールの生成の低下をもたらすのが見られた。Ｈａｐ２／３／４／５タンパク質複合体は、呼吸能、ミトコンドリアの生合成およびクエン酸回路の炭素フラックスを高めることによって呼吸系を拡張する。
【００５６】
本発明の範囲内での別の観察として、遺伝子ＦＬＤ１の欠失が、酵母、特に酵母サッカロミセス・セレビシエのような生物において脂質生産、特に、スクアレン生産の予期できない著しい増大をもたらすというものがある。遺伝子ＦＬＤ１は、脂質滴の形態、数および大きさに関与するタンパク質セイピンをコードする。ＦＬＤ１の過剰発現は脂質粒子の融合をもたらし、その結果、酵母細胞において著しく拡大した、しかしながら数は少ない脂質粒子が形成されることが報告されている。野生型酵母株では、スクアレンはステロール生合成経路の中間体であり、細胞に蓄積されない。酵母において、欧州特許第ＥＰ−Ａ４８６２９０号に記載されるように酵素の触媒部分のみをコードし、膜結合ドメインはコードしないＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ遺伝子を発現させることによって達成されるＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ活性の増強は、細胞においてスクアレンの蓄積をもたらす。この蓄積は、エルゴステロール生合成経路の中間体によるＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼのフィードバック調節の回避によるものである。本発明の枠組みの範囲で、遺伝子ＦＬＤ１の欠失は、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ活性の増強を示す酵母株において、脂質生産、特にスクアレン生産の予期できない著しい増大をもたらすことが認められた。
【００５７】
ＳＡＫ１、ＨＡＰ４およびＦＬＤ１に関する上記の発見は、上記のような本発明の６つの態様のいずれにおいても、さらなる改変および実施形態をもたらす。しかしながら、これらの発見は、上記の改変を含まないが、個々の非改変生物によって典型的に合成されるあらゆる脂質を合成する能力を有する生物にも独立した価値を持つ。これに関して、非改変生物は、野生型の他、対応する野生型生物と比較して高いＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４）活性を有する生物を含む。
【００５８】
よって、本発明はまた、遺伝子ＨＡＰ４および／またはＳＡＫ１が、転写において脱調節され、かつ／または過剰発現され、かつ／また遺伝子ＦＬＤ１が抑制もしくは不活性化もしくは欠失された（全て、対応する野生型生物と比較して）、単離された遺伝的に改変された非哺乳類生物を含む。具体的には、遺伝子ＨＡＰ４およびＳＡＫ１の一方または双方を（所望により）ＡＤＨ１プロモーターのような構成的に活性なプロモーターの制御下に置くことができる。この変形形態のさらなる実施形態では、遺伝子ＲＥＧ１を、対応する野生型生物と比較して抑制または不活性化または欠失させる。この他、本発明に関してこれまでに述べたことも全て、同様にこの独立した態様に当てはまり、これまでに開示された特徴はいずれも、同様にこの独立した態様に組み込むことができる。
【００５９】
本発明はまた、第二の脂質を生産する方法に関し、その方法では、本発明の生物を用い、培養し、その生物から第二の脂質を単離する。例えば、プレノール脂質を生産するための本発明の方法は、その脂質粒子内にプレノール脂質を蓄積することができる、上記のような本発明の第三または第四の態様の生物を培養することを含む。蓄積されるプレノール脂質に関しては、好ましい実施形態では、本発明の第三および第四の態様の生物に関して上記したものと同じことが当てはまる。対応する生物において低減または増強される酵素活性についても同じことが言える。別の例として、ステリルアシルエステルを生産する方法は、本発明の第五または第六の態様による生物を培養することを含む。
【００６０】
上記のようなタンパク質または酵素の活性における、対応する非改変生物と比較しての低減は、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、いっそうより好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％である。１００％の低減は、該生物に存在する該酵素のタンパク質または酵素活性が存在しないことを意味する。上記のようなタンパク質または酵素の活性における、対応する非改変生物と比較しての増強は、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、いっそうより好ましくは少なくとも２００％、特に好ましくは少なくとも１０００％である。「増強する」とは、また、非改変生物が測定可能なこのような活性を含まない場合の、酵素またはタンパク質の酵素活性（測定できる場合はもちろん）の存在も含む。「活性が増強する」とは、さらに、タンパク質が酵素ではないあらゆる場合において（ＨＡＰ４など）、タンパク質の量の増加を包含する。そして、上記の増強のパラメーターは同様に量にも当てはまる。酵素活性は、所定量の抽出物に、その抽出物から生成物への反応を触媒する所定量の酵素および所望によりさらに必要な反応成分を加えること、および所定時間内に合成された生成物の量を測定することによって測定することができる。上述の酵素の活性の具体的な測定方法は、例えば、国際公開第０３／０６４６５０Ａ１号に開示されている。その文献に記載されていない上述の酵素の活性の測定も同様に実施される。
【００６１】
細胞において、ある酵素の活性を低減する方法は、例えば、その酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現を低減または排除することであり、例えば、対応する遺伝子の上流により弱いプロモーターを付与することによるか、またはその遺伝子および／もしくは関連のプロモーターを完全もしくは部分的に欠失させ、かつ／もしくは生物の細胞内に酵素阻害剤を加えて翻訳される酵素を阻害する、かつ／または細胞にｓｉＲＮＡを組み込んで活性な転写物の量を低減する、かつ／またはその遺伝子の突然変異によって活性の低い変異体を生成することによる。
【００６２】
遺伝子発現の低減とは、個々の酵素をコードするヌクレオチド配列の遺伝子発現のレベルが、対応する非改変生物、好ましくは対応する野生型生物における該ヌクレオチド配列の遺伝子発現レベルと比較して低減されることを意味する。活性に関して上記に示したものと同じレベルの低減を適用する。遺伝子発現レベルを低減する手段および方法は、例えば、合成される対応するｍＲＮＡもしくはタンパク質の量の決定、または個々のタンパク質の酵素活性の決定を含む。好ましい実施形態では、遺伝子発現のレベルは、例えばノーザンブロットにおいてｍＲＮＡの量を測定することによって決定される。別の好ましい実施形態では、遺伝子発現のレベルは、例えばウエスタンブロットにおいて合成される対応するタンパク質の量を測定することにより、または対応する酵素活性の量を決定することによって決定される。遺伝子発現の低減はまた、着目する遺伝子を機能しないようにすることによって達成することもできる。遺伝子を機能しないようにするための１つの可能性のある手段が遺伝子破壊である。
【００６３】
酵素の活性を増強する方法は、その酵素をコードする遺伝子（異種または同種）が構成的に活性な（同種または異種）プロモーターの制御下に配置されるように、かつ／またはその酵素をコードする（異種または同種）遺伝子のコピー数が増え、かつ／もしくは突然変異によって活性が増強されるように転写の脱調節が達成されるような細胞の形質転換を含む。
【００６４】
酵素活性の増強または低減を果たすための具体例を実施例に示す。しかしながら、当業者ならば、本明細書で特に開示する必要なく、当技術分野で周知の他の方法を適用することもできよう。
【００６５】
本発明で用いる酵素として好適な遺伝子配列を以下に開示するが、同じ酵素活性を有する他の遺伝子配列も同様に使用可能である。特定の遺伝子配列またはそれによりコードされるタンパク質配列には本発明の範囲内の関連のある構造的特徴はないが、同じＥＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ）番号に分類されている。
【００６６】
アシル−ＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ／ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２６）の遺伝子配列は、ＮＣ＿００１１３５．４、ＮＣ＿００１１４７．６、ＮＭ＿００５８９１、ＮＭ＿１４４７８４、ＮＭ＿１５３７２８を含む。
【００６７】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ／ジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２０）の遺伝子配列は、ＮＣ＿００１１４７．５、ＸＭ＿００２４７８７８７、ＮＭ＿１２３０８９、ＸＭ＿００２３７８０８２、ＮＭ＿０３２５６４、ＮＭ＿００１０１２３４５、ＮＭ＿０１００４６、ＸＭ＿００２１４６４９７を含む。
【００６８】
レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ／リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５８）の遺伝子配列は、ＮＣ＿００１１４７．６、ＮＭ＿００８４９０、ＮＭ＿００１１６２５６８、ＮＭ＿０００２２９、ＮＭ＿００１００５７１５、ＮＭ＿０１７０２４、ＮＭ＿００１０８２１９０を含む。
【００６９】
アシルＣｏＡ−ワックスアルコールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．７５）の遺伝子配列は、ＮＭ＿１２３０８９、ＮＭ＿１７７４４８を含む。
【００７０】
ＨＭＧ−Ｃｏ０Ａ−レダクターゼの遺伝子配列は、ＮＣ＿００１１４５、ＮＭ＿１０６２９９、ＮＣ＿００３４２１．２、ＮＣ＿００９７８４．１、ＮＣ＿００３０２８．３、ＮＣ＿００７３０８．３、および図５の配列（末端切断型ｔＨＭＧ１）を含む。
【００７１】
Ｃ−２４ステロールメチルトランスフェラーゼの遺伝子配列は、ＮＣ＿００１１４５、ＮＣ＿０００９１１．１、ＮＣ＿００３４２３．３、ＸＭ＿５０５１７３、ＸＭ＿７１６６１５を含む。
【００７２】
Ｃ−２２ステロールデサチュラーゼの遺伝子配列は、ＮＣ＿００３４２４．３、ＮＣ＿００９０４６．１、ＮＣ＿００１１４５．２、ＸＭ＿５００１８８、ＸＭ＿７１１８４０を含む。
【００７３】
Ｃ−５ステロールデサチュラーゼの遺伝子配列は、ＮＣ＿００１１４４、Ｓ４６１６２、ＮＧ＿００９４４６、ＮＭ＿０５３６４２、ＮＭ＿００１０３５３５６、ＸＭ＿５０３０９０、ＸＭ＿７０８５１９を含む。
【００７４】
ＨＡＰ４の遺伝子配列は、ＮＣ＿００１１４３．７、ＸＭ＿４４８５９６、ＸＭ＿００１６４５３２９を含む。
【００７５】
ＳＡＫ１の遺伝子配列は、ＮＣ＿００１１３７．２、ＸＭ＿５０２５９１、ＸＭ＿４４８３１９、ＸＭ＿４５３４７８、ＮＭ＿２０８７０４を含む。
【００７６】
ＲＥＧ１の遺伝子配列は、ＮＣ＿００１１３６．８、ＸＭ＿５００９９０、ＸＭ＿４４８７２９、ＸＭ＿４５５２７６を含む。
【００７７】
ＦＬＤ１の遺伝子配列は、ＮＣ＿００１１４４．４、ＮＭ＿２１０２８６、ＸＭ＿００１６４７１６６、ＸＭ＿４４９７７８を含む。
【００７８】
７−デヒドロコレステロールレダクターゼの遺伝子配列は、ＮＭ＿１０３９２６、ＮＭ＿００１３６０、ＮＭ＿００７８５６、ＮＭ＿２０３９０４、ＮＭ＿００１０１４９２７、ＮＭ＿２０１３３０、ＮＭ＿０２２３８９、ＮＭ＿００１１３１７２７、ＮＭ＿００１０８７０８７、ＸＭ＿００１４９７５９８、ＸＭ＿００１１７４１６０、ＸＭ＿００１０９９１０１、ＢＭ４９０４０２、ＣＡ７５３５４５を含む。
【００７９】
２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの遺伝子配列は、ＮＭ＿０１４７６２、ＮＭ＿００１０１６８００、ＮＭ＿００１０９４４５６、ＮＭ＿００１００８６４５、ＮＭ＿００１１０３２７６、ＮＭ＿００１０８０１４８、ＮＭ＿０５３２７２、ＮＭ＿００１０３１２８、ＸＭ＿００１４８８２４７、ＡＢ１２５２０２、ＸＭ＿００１１５３７５１を含む。
【００８０】
ラノステロールステロール１４−デメチラーゼの遺伝子配列は、ＮＣ＿００１１４０．５、ＸＭ＿５００５１８、ＥＦ０５９１６５、ＸＭ＿４４５８７６、ＸＭ＿４５４１０９を含む。
【００８１】
スクアレンモノオキシゲナーゼの遺伝子配列は、ＮＣ＿００１１３９．８、Ｍ６４９９４、ＸＭ＿５０３９９４、ＸＭ＿７０６８０１、ＸＭ＿４５５７６３を含む。
【００８２】
好適なプロモーター（異種発現される個々の異なる酵素のプロモーターは同じまたは異なる場合がある）の遺伝子配列は、ＮＣ＿００１１４２、ＮＣ＿００１１３９、ＮＣ＿００１１４７、ＮＣ＿００１１３９、ＮＣ＿００１１４８、ＮＣ＿００１１３５、ＮＣ＿００１１３６を含む。
【００８３】
一般に、本発明の生物（上記の態様のそれに関わらず）存在し得る任意の非ヒト、好ましくは非哺乳類生物であり得る。好適な生物の例は、特許請求の範囲に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】酵母サッカロミセス・セレビシエの構築された変異株由来の全脂質抽出物の薄層クロマトグラフィー。
【図２】酵母サッカロミセス・セレビシエにおけるスクアレンの生合成を模式的に示す。
【図３】酵母サッカロミセス・セレビシエにおけるトリアシルグリセロールの生合成を模式的に示す。
【図４】酵母サッカロミセス・セレビシエにおけるステリルアシルエステルの生合成を模式的に示す。
【図５】末端切断型ＨＭＧ  ＣｏＡ−レダクターゼ、ｔＨＭＧ１の配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
以下の実施例は単に本発明を説明するためのものである。
【００８６】
実施例では、以下の材料および方法を用いた。
【００８７】
１．制限切断
プラスミド（１〜１０μｇ）の制限酵素処理は３０μｌバッチで行った。このために、２４μｌのＨ２Ｏ中にＤＮＡを取り、３μｌの対応するバッファー、１μｌのＲＳＡ（ウシ血清アルブミン）および２μｌの酵素と混合した。酵素濃度は、ＤＮＡ量に応じて１単位／μｌまたは５単位／μｌとした。場合によっては、バッチにさらに１μｌのＲＮアーゼを加えてｔＲＮＡを分解した。この制限バッチを３７℃で２時間インキュベートした。制限酵素処理はミニゲルで管理した。
【００８８】
２．ゲル電気泳動
ゲル電気泳動はミニゲルまたはワイドミニゲル装置で行った。ミニゲル（約２０ｍｌ、８バッグ）およびワイドミニゲル（５０ｍｌ、１５または３０バッグ）はＴＡＥ中１％のアガロースからなった。移動バッファーとして１＊ＴＡＥを用いた。サンプル（１０μｌ）と３μｌの停止液を混合し、適用した。ＨｉｎｄＩＩＩで切断したＩ−ＤＮＡを標品として用いた（２３．１ｋｂ；９．４ｋｂ；６．６ｋｂ；４．４ｋｂ；２．３ｋｂ；２．０ｋｂ；０．６ｋｂにバンド）。分離のために、４５〜６０分間、８０Ｖの電圧をかけた。その後、ゲルを臭化エチジウム溶液で染色し、ビデオ撮影システムＩＮＴＡＳを用いてＵＶ光下で保持、またはオレンジ色のフィルターを用いて写真撮影した。
【００８９】
３．ゲル溶出
所望の断片を、ゲル溶出を用いて単離した。この制限調製物をミニゲルのいくつかのバッグに適用し、分離した。［λ］−ＨｉｎｄＩＩＩおよび「サクリファイス・トレース（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ  ｔｒａｃｅ）」のみを臭化エチジウム溶液で染色し、ＵＶ光下で観察し、所望の断片を標識した。結果として、残りのバッグでは臭化エチジウムおよびＵＶ光によってＤＮＡを損傷させずにすんだ。染色されたゲル片と非染色ゲル片をアラインすることにより、非染色ゲル片から所望の断片を、その標識に基づいて切り出すことができた。単離する断片を含むこのアガロース片を透析管に入れ、少量のＴＡＥバッファーとともに気泡が入らないように密閉し、ＢｉｏＲａｄ−ミニゲル装置に入れた。移動バッファーは１＊ＴＡＥからなり、４０分間、電圧を１００Ｖとした。次に、流動極性を２分間変更して透析管に付着しているＤＮＡを遊離させた。透析管の、ＤＮＡ断片を含むバッファーを反応槽に移し、エタノール沈殿法を行った。このために、ＤＮＡ溶液に、一部（１／１０）量の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｔＲＮＡ（１μｌ／５０μｌ溶液）および２．５倍の容量の氷冷９６％エタノールを加えた。このバッチを−２０℃で３０分間インキュベートした後、４℃で３０分間、１２，０００ｒｐｍにて遠心分離した。ＤＮＡペレットを乾燥させ、１０〜５０μｌのＨ２Ｏ（ＤＮＡ量による）に取った。
【００９０】
４．クレノウ処理
ＤＮＡ断片の突出末端をクレノウ処理により作出し、「平滑末端」を得た。ＤＮＡ１μｇ当たり、以下のバッチをピペットで一緒に吸い取った。この場合、夾雑物がクレノウ−ポリメラーゼを阻害しないように、ＤＮＡはエタノール沈殿法からのものとするべきである。インキュベーションは３７℃で３０分間、その後、７０℃でさらに５分間行い、反応を停止させた。ＤＮＡはこのバッチからエタノール沈殿法によって得、１０μｌのＨ２Ｏに取った。
【００９１】
５．ライゲーション
連結させるＤＮＡ断片を合わせた。最終量１３．１μｌには、ベクター−インサート比１：５で約０．５μｇのＤＮＡを含んだ。このサンプルを７０℃で４５秒間インキュベートし、室温まで冷却し（約３分）、その後、氷上で１０分間インキュベートした。次に、ライゲーションバッファー：２．６μｌの５００ｍｍｏｌ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５および１．３μｌの１００ｍｍｏｌ  ＭｇＣｌ２を加え、それらを氷上でさらに１０分間インキュベートした。１μｌの５００ｍｍｏｌ  ＤＴＴおよび１μｌの１０ｍｍｏｌ  ＡＴＰを加えた後、１μｌのリガーゼ（１単位／μｌ）を氷上でさらに１０分間加えた。この処理は全体的に、隣接するＤＮＡ末端が再び分離しないようできる限り振盪させないように行うべきである。ライゲーションは４℃で一晩行った。
【００９２】
６．大腸菌の形質転換
成分大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＮＭ５２２細胞をライゲーション調製物のＤＮＡで形質転換させた。陽性対照として、バッチに５０ｎｇのｐＳｃＬ３プラスミドを供給し、ヌル対照として、バッチにＤＮＡを供給しなかった。各形質転換調製物について、１００μｌの８％ＰＥＧ溶液、１０μｌのＤＮＡおよび２００μｌのコンピテント細胞（大腸菌ＮＭ５２２）をピペットで卓上遠沈管に入れた。これらのバッチを氷上に３０分間置き、断続的に振盪した。その後、４２℃で１分間熱ショックを行った。再生のため、１ｍｌのＬＢ培地を細胞に加え、３７℃にて９０分間シェーカー上でインキュベートした。各１００μｌの未希釈バッチ、１：１０希釈液および１：１００希釈液をＬＢ＋アンピシリンプレートに平らに拡げ、３７℃で一晩インキュベートした。
【００９３】
７．大腸菌からのプラスミド単離（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）
大腸菌コロニーを卓上遠沈管の１．５ｍｌのＬＢ＋アンピシリン培地中で、３７℃および１２０ｒｐｍにて一晩培養した。翌日、細胞を５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、ペレットを５０μｌのＴＥバッファーに取った。各バッチを１００μｌの０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ溶液と混合し、氷上に５分間置いた（細胞の溶解）。次に、４００μｌの酢酸Ｎａ／ＮａＣｌ溶液（２３０μｌのＨ２Ｏ、１３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、および４０μｌの５Ｍ  ＮａＣｌ）を加え、バッチを混合し、氷上にさらに１５分間置いた（タンパク質の沈殿）。１１，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、プラスミドＤＮＡを含む上清をエッペンドルフ管に移した。上清が完全に透明でなければ、もう一度遠心分離を行った。この上清を３６０μｌの氷冷イソプロパノールと混合し、−２０℃で３０分間インキュベートした（ＤＮＡの沈殿）。ＤＮＡを遠心分離し（１５分、１２，０００ｒｐｍ、４℃）、上清を廃棄し、ペレットを１００μｌの氷冷９６％エタノールで洗浄し、−２０℃で１５分間インキュベートし、再び遠心分離を行った（１５分、１２，０００ｒｐｍ、４℃）。ペレットをスピードバキュームで乾燥させた後、１００μｌのＨ２Ｏに取った。制限分析により、プラスミドＤＮＡの特性決定を行った。このために、各バッチ１０μｌを制限酵素で処理し、ワイドミニゲルでのゲル電気泳動により分離した（上記参照）。
【００９４】
８．大腸菌でのプラスミド単離（Ｍａｘｉｐｒｅｐ）
より多量のプラスミドＤＮＡを単離するために、ｍａｘｉｐｒｅｐ法を行った。１００ｍｌのＬＢ＋アンピシリン培地を含む２つのプランジャーに、単離されるプラスミドを担持するコロニーまたは１００μｌの凍結培養物を接種し、３７℃、１２０ｒｐｍで一晩インキュベートする。翌日、培養物（２００ｍｌ）をＧＳＡビーカーに移し、１０分間４０００ｒｐｍ（２６００＊ｇ）で遠心分離した。細胞ペレットを６ｍｌのＴＥバッファーに再懸濁させた。細胞壁を消化するために、１．２ｍｌのリゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌＴＥバッファー）を加え、室温で１０分間インキュベートした。次に、１２ｍｌの０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ溶液を用いて細胞溶解を行い、室温でさらに５分間インキュベートした。９ｍｌの冷却した３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．８）を加え、１５分間氷上でインキュベートすることによってタンパク質を沈殿させた。遠心分離（ＧＳＡ：１３，０００ｒｐｍ（２７，５００＊ｇ）、２０分、４℃）の後、ＤＮＡを含む上清を新しいＧＳＡビーカーに移し、１５ｍｌの氷冷イソプロパノールを用い、−２０℃で３０分間インキュベートしてＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡペレットを５ｍｌの氷冷エタノールで洗浄し、風乾した（約３０〜６０分）。その後、これを１ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁させた。このプラスミドを制限分析により調査した。濃度はミニゲルに希釈液を加えることによって求めた。塩含量を引き下げるために、３０〜６０分微量透析を行った（孔径０．０２５μｍ）。
【００９５】
９．酵母の形質転換
酵母の形質転換のため、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２株の前培養物を調製した。２０ｍｌのＹＥ培地を含むプランジャーに１００μｌの凍結培養物を接種し、２８℃、１２０ｒｐｍで一晩インキュベートした。主培養は、１０μｌ、２０μｌまたは５０μｌの前培養物を接種した１００ｍｌのＹＥ培地を含むプランジャーにて同じ条件下で行った。
【００９６】
９．１  コンピテント細胞の作製
翌日、トーマチャンバー（Ｔｈｏｍａ  ｃｈａｍｂｅｒ）を用いてプランジャーを計数し、３〜５＊１０７細胞／ｍｌを保有するプランジャーを用いてこの手順を続けた。遠心分離（ＧＳＡ：５０００ｒｐｍ（４０００＊ｇ）、１０分）により細胞を採取した。細胞ペレットを１０ｍｌのＴＥバッファーに再懸濁させ、２本の卓上遠沈管に分けた（各５ｍｌ）。細胞を６０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、各５ｍｌのＴＥバッファーで２回洗浄した。次に、細胞ペレットを１０９細胞につき３３０μｌの酢酸リチウムバッファーに取り、無菌の５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに移し、２８℃で１時間振盪させた。結果として、これらの細胞は形質転換能があった。
【００９７】
９．２  形質転換
各形質転換調製物について、１５μｌのニシン精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）、１０μｌの形質転換されるＤＮＡ（約０．５μｇ）および３３０μｌの成分細胞をピペットで卓上遠沈管に入れ、２８℃で３０分間インキュベートした（振盪させない）。次に、７００μｌの５０％ＰＥＧ６０００を加え、振盪させずに２８℃でさらに１時間インキュベートした。その後、４２℃で５分間熱ショックを行った。１００μｌのこの懸濁液を選択培地（ＹＮＢ、Ｄｉｆｃｏ）に播種し、ロイシン原栄養株を選択した。Ｇ４１８耐性の選択の場合には、熱ショック後に細胞の再生を行う（９．３再生段階を参照）。
【００９８】
９．３  再生段階
選択マーカーはＧ４１８耐性であるので、細胞は耐性遺伝子の発現に時間を要した。形質転換調製物を４ｍｌのＹＥ培地と混合し、シェーカー（１２０ｒｐｍ）にて２８℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を遠心分離し（６，０００ｒｐｍ、３分）、１ｍｌのＹＥ培地に取り、１００μｌまたは２００μｌをＹＥ＋Ｇ４１８プレートに平らに拡げた。これらのプレートを２８℃で数日間インキュベートした。
【００９９】
１０．ＰＣＲの反応条件
ポリメラーゼ連鎖反応の反応条件は個々の場合ごとに至適化しなければならず、いずれのバッチにも必ずしも有効というわけではない。従って、とりわけ、ＤＮＡの使用量、塩濃度および融解温度は変動し得る。課題の本発明者らの処方物では、エッペンドルフキャップ中に、サーモサイクラーで用いるのに好適な以下の物質：ＰＣＲ調製物として総容量５０μｌとなるように水に溶解させた５μｌのスーパーバッファー、８μｌのｄＮＴＰ（各０．６２５μＭ）、５’−プライマー、３’−プライマーおよび０．２μｇのマトリックスＤＮＡを合わせるのが有利であることが分かり、２μｌ（〜０．１Ｕ）のＳｕｐｅｒ  Ｔａｑポリメラーゼに加えた。このバッチを短時間で遠心分離し、１滴のオイルでカバーした。増幅には３７〜４０回のサイクルを選択した。
【０１００】
１１．Ｓ．セレビシエからの脂質粒子の単離
酵母細胞を２８℃で７２時間、２５０ｒｐｍで往復振盪しながら、５０ｍｌのＷＭＶＩＩＩ最小培地中で増殖させた。細胞を遠心分離により採取し、Ｌｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌｅｂｅｒ  Ｒ，Ｚｉｎｓｅｒ  Ｅ，Ｚｅｌｌｎｉｇ  Ｇ，Ｐａｌｔａｕｆ  Ｆ，Ｄａｕｍ  Ｇ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｙｅａｓｔ．  １９９４  Ｎｏｖ；１０（１１）：１４２１−１４２８）に従って脂質粒子を単離および精製した。ステロール分析では、脂質粒子は、ＧＣにより総ステロールを定量するために室温、３０％メタノール性ＫＯＨ中で１６時間鹸化するか、またはクロロホルム／メタノール（４：１）でステロールを直接抽出し、遊離ステロールとエステル化ステロールを識別するためのＴＬＣによって、もしくは遊離ステロールの定量のためのＧＣによって分析するかのいずれかを行った。
【０１０１】
１２．スクアレンおよびステロールの分析
細胞全体の脂質および脂質粒子中の総脂質を定量するために、ＧＣ分析の前にサンプルを鹸化した。１２５ＯＤ６００の細胞を０．５Ｎ  ＨＣｌ中、１００℃で２０分間処理し、室温まで冷却した。その後、３ｇのＫＯＨ、およびピロガロール（２ｇ／ｌ）を含む１２．５ｍｌのメタノールを加えた。鹸化のために、混合物を水浴中、７０℃で２時間インキュベートした。加水分解されたエステルをｎ−ヘキサンで抽出した。非鹸化画分を２ｍｌのｎ−ヘキサンに再懸濁させた。スクアレンおよびステロールを、スクアレンおよびコレステロールを内部標準としてＧＣにより定量した。スクアレンおよびステロールを、１５０から２５０℃までプログラムされたキャピラリーカラム（２５ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ［膜厚］；Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ  ＣＰＳｉｌ５）を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０ガスクロマトグラフで分離した。温度は最初２分間１５０℃とした後、１５℃／分で最終温度２５０℃まで昇温し、この温度で２０分間保持した。直線的速度を３０ｃｍ／秒とし、ヘリウムをキャリアガスとして用い、注入はスプリットレスモードで行った。注入容量は１μｌとした。各ピークの面積を計算し、細胞乾重１ｇに対して換算した。各サンプルを２回測定した。同定にはエルゴステロールおよびスクアレンの標品を用いた。
【０１０２】
中性脂質を抽出し、Ｓｏｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｕｍ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４（２００２），５１９−５２４）の方法で定量した。詳細には、中性脂質の定量では、抽出物をシリカゲル６０プレートに適用し、クロマトグラムを、軽質石油−ジエチルエーテル−酢酸（２５：２５：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）の溶媒系を用いて３分の１の距離まで展開させた。その後、プレートを軽く乾燥させ、軽質石油−ジエチルエーテル（４９：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）の溶媒系を用いてプレートの上部までさらに展開させた。中性脂質は、ＴＬＣチャンバー内で薄層プレートをヨウ素蒸気で染色することにより可視化した。定量は比重走査によって行った。
【０１０３】
スクアレンおよびステロール分析のための酵母サッカロミセス・セレビシエ株の標準的な培養手順は次の通りとした。
前培養：１００ｍｌ振盪フラスコ中の２０ｍｌのＷＭＶＩＩＩ培地に２０μｌの対応するグリセロール保存液に接種し、３０℃、１５０ｒｐｍで４８時間培養した。
主培養：バッフル付き２５０ｍｌ振盪フラスコ中の５０ｍｌのＷＭＶＩＩＩ培地に１％の前培養物を接種し、３０℃、１５０ｒｐｍで７２時間培養した。
【０１０４】
実施例１
Ｓ．セレビシエＡＨ２２ｕｒａ３における遺伝子ＡＲＥ１およびＡＲＥ２の欠失
ベクターｐＵＧ６（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ  Ｕ，Ｈｅｃｋ  Ｓ，Ｆｉｅｄｌｅｒ  Ｔ，Ｂｅｉｎｈａｕｅｒ  ＪＤ  ａｎｄ  Ｈｅｇｅｍａｎｎ  ＪＨ  （１９９６）．Ａ  ｎｅｗ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｆｏｒ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｙｅａｓｔ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４  ２５１９−２４）を用いて、遺伝子ＡＲＥ１およびＡＲＥ２を欠失させた。
【０１０５】
両遺伝子の欠失は、同じ方法によって連続的に行った。まず、ＡＲＥ１を欠失させ、その後、ＡＲＥ２を欠失させた。プラスミドを調製した後、ｐＵＧ６の断片をＰＣＲによって増幅し、ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰからなるツールを得た。ＡＲＥ１  ｒｅｓｐｅｃ．ＡＲＥ２コード配列の５’および３’配列をｐＵＧ６ベクターのｌｏｘＰ領域と融合させるためのプライマーを構築した。
【０１０６】
得られたＰＣＲ産物は、ＫａｎＲ遺伝子、ｌｏｘＰ部位およびＳ．セレビシエＡＨ２２ｕｒａ３における組込み形質転換のためのＡＲＥ１  ｒｅｓｐｅｃ．ＡＲＥ２相同領域からなる。酵母における相同組換えが、標的配列の欠失をもたらす。
【０１０７】
Ｇ４１８に対する耐性を陽性クローンの選択に用いた。この酵母株においてＡＲＥ１  ｒｅｓｐｅｃ．ＡＲＥ２コード領域は欠失されていた。さらなる遺伝子を欠失させるための株を作製するために、この株からＧ４１８耐性を除去した。この目的で、この株をｐＳＨ４７で形質転換させた（Ｇｕｌｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。このベクターは、ｌｏｘＰ部位に隣接するＫａｎＲ遺伝子を除去するためのｃｒｅ−リコンビナーゼを有する。
【０１０８】
ｐＳＨ４７を定着させるため、この株を５−ＦＯＡ（５−フルオロオロト酸）（１ｇ／Ｌ）寒天プレート上で対抗選択した。得られた株は遺伝子ＡＲＥ１およびＡＲＥ２の双方を欠失している。
【０１０９】
実施例２
Ｓ．セレビシエＡＨ２２ｕｒａ３における遺伝子ＤＧＡ１およびＬＲＯ１の欠失
ベクターｐＵＧ６（Ｇｕｌｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）を用いて、遺伝子ＤＧＡ１およびＬＲＯ１を欠失させた。
【０１１０】
両遺伝子の欠失は、同じ方法によって連続的に行った。まず、ＤＧＡ１を欠失させ、その後、ＬＲＯ１を欠失させた。プラスミドを調製した後、ｐＵＧ６の断片をＰＣＲによって増幅し、ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰからなるツールを得た。
【０１１１】
ＤＧＡ１  ｒｅｓｐｅｃ．ＬＲＯ１コード配列の５’および３’配列をｐＵＧ６ベクターのｌｏｘＰ領域と融合させるためのプライマーを構築した。
【０１１２】
得られたＰＣＲ産物は、ＫａｎＲ遺伝子、ｌｏｘＰ部位およびＳ．セレビシエＡＨ２２ｕｒａ３における組込み形質転換のためのＤＧＡ１  ｒｅｓｐｅｃ．ＬＲＯ１相同領域からなる。酵母における相同組換えが、標的配列の欠失をもたらす。
【０１１３】
Ｇ４１８に対する耐性を陽性クローンの選択に用いた。この酵母株においてＤＧＡ１  ｒｅｓｐｅｃ．ＬＲＯ１コード領域は欠失されていた。さらなる遺伝子を欠失させるための株を作製するために、この株からＧ４１８耐性を除去した。この目的で、この株をｐＳＨ４７で形質転換させた（Ｇｕｌｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。このベクターは、ｌｏｘＰ部位に隣接するＫａｎＲ遺伝子を除去するためのｃｒｅ−リコンビナーゼを有する。
【０１１４】
ｐＳＨ４７を定着させるため、この株を５−ＦＯＡ（５−フルオロオロト酸）（１ｇ／Ｌ）寒天プレート上で対抗選択した。
【０１１５】
得られた株は遺伝子ＤＧＡ１およびＬＲＯ１の双方を欠失している。
【０１１６】
実施例３
Ｓ．セレビシエＡＨ２２ｕｒａ３ａｒｅ１ａｒｅ２における遺伝子ＤＧＡ１およびＬＲＯ１の欠失
ベクターｐＵＧ６（Ｇｕｌｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）を用いて、遺伝子ＤＧＡ１およびＬＲＯ１を欠失させた。
【０１１７】
両遺伝子の欠失は、同じ方法によって連続的に行った。まず、ＤＧＡ１を欠失させ、その後、ＬＲＯ１を欠失させた。プラスミドを調製した後、ｐＵＧ６の断片をＰＣＲによって増幅し、ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰからなるツールを得た。ＤＧＡ１  ｒｅｓｐｅｃ．ＬＲＯ１コード配列の５’および３’配列をｐＵＧ６ベクターのｌｏｘＰ領域と融合させるためのプライマーを構築した。
【０１１８】
得られたＰＣＲ産物は、ＫａｎＲ遺伝子、ｌｏｘＰ部位およびＳ．セレビシエＡＨ２２ｕｒａ３における組込み形質転換のためのＤＧＡ１  ｒｅｓｐｅｃ．ＬＲＯ１相同領域からなる。酵母における相同組換えが、標的配列の欠失をもたらす。
【０１１９】
Ｇ４１８に対する耐性を陽性クローンの選択に用いた。この酵母株においてＤＧＡ１  ｒｅｓｐｅｃ．ＬＲＯ１コード領域は欠失されていた。さらなる遺伝子を欠失させるための株を作製するために、この株からＧ４１８耐性を除去した。この目的で、この株をｐＳＨ４７で形質転換させた（Ｇｕｌｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。このベクターは、ｌｏｘＰ部位に隣接するＫａｎＲ遺伝子を除去するためのｃｒｅ−リコンビナーゼを有する。
【０１２０】
ｐＳＨ４７を定着させるため、この株を５−ＦＯＡ（５−フルオロオロト酸）（１ｇ／Ｌ）寒天プレート上で対抗選択した。
【０１２１】
得られた株は遺伝子ＡＲＥ１、ＡＲＥ２、ＤＧＡ１およびＬＲＯ１の４つを欠失している。
【０１２２】
実施例４
エピソームプラスミドを用いた、実施例１〜３から得られた酵母株および参照株としてのＡＨ２２ｕｒａ３におけるｔ−ＨＭＧ１の発現
ｔＨＭＧのＤＮＡ配列（Ｂａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８  （１９８８），  ３７９３−３８０８））を、標準的な方法を用いてサッカロミセス・セレビシエＳ２８８Ｃ（Ｍｏｒｔｉｍｅｒ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１３  （１９８６），  ３５−４３））のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。この場合に用いるプライマーはＤＮＡオリゴマーｔＨＭＧ−５’およびｔＨＭＧ−３’である。得られたＤＮＡ断片を、クレノウ処理後にクローニングベクターｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）：  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍ１３  ｐｈａｇｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｓｔｒａｉｎｓ：  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍ１３ｍｐ１８  ａｎｄ  ｐＵＣ１９  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｉｎ：  Ｇｅｎｅ．  Ｂｄ．  ３３，  Ｓ．  １０３−１１９）に導入し、ベクターｐＵＣ１９−ｔＨＭＧを得た。プラスミドを単離し、ｐＵＣ１９−ｔＨＭＧをエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで制限処理した後、得られた断片を、これもまたＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで処理した酵母発現ベクターｐＰＴ２ｂ（Ｌａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｏｍａｎ  （Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４４（１９９５），１４７−１５６））に導入した。作出されたプラスミドｐＰＴ２ｂ−ｔＨＭＧは、末端切断型ＡＤＨ１−プロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ  （Ｙｅａｓｔ  ７（１９８２），４７５−４７７））およびＴＲＰ１−ターミネーター（Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ  Ｇ，  Ｃａｒｂｏｎ  Ｊ．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｙｅａｓｔ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＴＲＰ１  ｇｅｎｅ．  Ｇｅｎｅ．  １９８０  Ｊｕｌ；１０（２）：１５７−１６６）を含み、その間にｔＨＭＧ−ＤＮＡ断片が見られる。ベクターｐＰＴ２ｂ−ｔＨＭＧからエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶおよびＮｒｕＩによってＤＮＡ切片を単離した。このＤＮＡ切片は、いわゆる中程度の長さのＡＤＨ１−プロモーター、ｔＨＭＧ遺伝子およびＴＲＰ１−ターミネーターを含む。このＤＮＡ切片を、エンドヌクレアーゼＳｐｈＩおよびＤＮＡポリメラーゼで処理した酵母ベクターＹＥｐ１３（Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｇｅｎｅ  ２７  （１９８４），  ２３９−２５１））に導入した。
【０１２３】
Ｓ．セレビシエＡＨ２２ＵＲＡ３ａｒｅ１ａｒｅ２、ＡＨ２２ＵＲＡ３ｄｇａ１ｌｒｏ１、ＡＨ２２ＵＲＡ３ａｒｅ１ａｒｅ２ｄｇａ１ｌｒｏ１およびＡＨ２２ＵＲＡ３をＹＥｐＨ２で形質転換した。参照として、プラスミドＹＥｐ１３を用いた。
【０１２４】
実施例５
染色体組込みプラスミドＹＤｐＵＨＫ３を用いた、実施例１〜３から得られた酵母株および参照株としてのＡＨ２２ｕｒａ３におけるｔ−ＨＭＧ１の染色体組込みおよび過剰発現
ベクターＹＥｐＨ２をエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶおよびＮｒｕＩで処理した。このようにして、以下の領域：テトラサイクリン耐性遺伝子由来の転写活性化領域（Ｓｉｄｈｕ  ａｎｄ  Ｂｏｌｌｏｎ  （１０  （１９９０）  １５７−１６６））、中程度の長さのＡＤＨ１−プロモーター、ｔＨＭＧおよびＴＲＰ１−ターミネーター（発現カセット）を有するＤＮＡ断片を作出した。このＤＮＡ断片を、ＳｔｕＩで処理したベクターＹＤｐＵ（Ｂｅｒｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１  Ｂｅｒｂｅｎ  Ｇ．，  Ｄｕｍｏｎｔ  Ｊ．，  Ｇｉｌｌｉｑｕｅｔ  Ｖ，  Ｂｏｌｌｅ  Ｐ−Ａ．  ａｎｄ  Ｈｉｌｇｅｒ  Ｆ．  （１９９１）：  ”Ｔｈｅ  ＹＤｐ  ｐｌａｓｍｉｄｓ：  ａ  ｕｎｉｆｏｒｍ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｆｏｒ”  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ”．  ”Ｙｅａｓｔ  ７，  ４７５−４７７）に導入した。作出されたベクターＹＤｐＵＨ２／１２をエンドヌクレアーゼＳｍａＩで処理し、カナマイシン耐性をコードするＤＮＡ配列と連結する（Ｗｅｂｓｔｅｒ，  Ｔ．  Ｄ．，  Ｄｉｃｋｓｏｎ，  Ｒ．  Ｃ．  （１９８３）  Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃ  Ｇ４１８  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ＤＮＡ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｔｎ９０３．  Ｇｅｎｅ  ２６：  ２４３−２５２）。作出された構築物（ＹＤｐＵＨＫ３）をＥｃｏＲＶで処理した。酵母株サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２をこの構築物で形質転換させた。この例の場合と同様に、酵母を線状化ベクターで形質転換すると、染色体のＵＲＡ３遺伝子座にベクター全体が組み込まれる。組み込まれたベクターに由来する、発現カセット（大腸菌起源、Ｅ．ｃｏｌｉ−アンピシリン耐性遺伝子、ＴＥＦ−プロモーターおよびカナマイシン耐性遺伝子）の部分ではない領域を除去するために、形質転換酵母を、ウラシル栄養要求酵母を増長するＦＯＡ選択（Ｂｏｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５４  （１９８７），  １６４−１７５））による選択圧に曝した。選択でいうところのウラシル栄養要求株はＡＨ２２ｔＨ３ｕｒａ８の名称を持ち、ＵＲＡ３遺伝子に染色体組込みとしてのｔＨＭＧ１発現カセットを有する。
【０１２５】
表１に示される酵母株を、それらのスクアレン生産性／含量について評価した。この目的で、これらの株を３０℃、１５０ｒｐｍで振盪しながら７２時間、ＷＭＶＩＩＩ培地で培養した。細胞を０．５Ｍ煮沸ＨＣｌ中で破砕した後、脂質を２０ｍｌのｎ−ヘキサンで２回抽出し、ＧＣ／ＭＳで分析／定量した（詳細は第１２項を参照）。以下のデータが得られた（表１）。
【０１２６】
【表１】
0005954544.tif 000002
【０１２７】
実施例６
Ｓ．セレビシエＡＨ２２ｔＨ３ｕｒａ８ａｒｅ１ａｒｅ２における遺伝子ＦＬＤ１の欠失
ベクターｐＵＧ６（Ｇｕｌｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）を用いて、遺伝子ＦＬＤ１を欠失させた。
【０１２８】
プラスミドを調製した後、ｐＵＧ６の断片をＰＣＲにより増幅し、ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰからなるツールを得た。ＦＬＤ１コード配列の５’および３’配列をｐＵＧ６ベクターのｌｏｘＰ領域と融合させるためのプライマーを構築した。
【０１２９】
得られたＰＣＲ産物は、ＫａｎＲ遺伝子、ｌｏｘＰ部位およびＳ．セレビシエＡＨ２２ｔＨ３ｕｒａ８ａｒｅ１ａｒｅ２における組込み形質転換のためのＦＬＤ１相同領域からなる。酵母における相同組換えが、標的配列の欠失をもたらす。
【０１３０】
Ｇ４１８に対する耐性を陽性クローンの選択に用いた。この酵母株においてＦＬＤ１コード領域は欠失されていた。さらなる遺伝子を欠失させるための株を作製するために、この株からＧ４１８耐性を除去した。この目的で、この株をｐＳＨ４７で形質転換させた（Ｇｕｌｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。このベクターは、ｌｏｘＰ部位に隣接するＫａｎＲ遺伝子を除去するためのｃｒｅ−リコンビナーゼを有する。
【０１３１】
ｐＳＨ４７を定着させるため、この株を５−ＦＯＡ（５−フルオロオロト酸）（１ｇ／Ｌ）寒天プレート上で対抗選択した。
【０１３２】
得られた株は遺伝子ＡＲＥ１、ＡＲＥ２およびＦＬＤ１の３つを欠失しており、ＡＨ２２ｔＨ３ｕｒａ８ａｒｅ１ａｒｅ２ｆｌｄ１と呼ばれる。
【０１３３】
表２に示される酵母株を、それらのスクアレン生産性／含量について評価した。この目的で、これらの株を３０℃、１５０ｒｐｍで振盪しながら７２時間、ＷＭＶＩＩＩ培地で培養した。細胞を０．５Ｍ煮沸ＨＣｌ中で破砕した後、脂質を２０ｍｌのｎ−ヘキサンで２回抽出し、ＧＣ／ＭＳで分析／定量した（詳細は第１２項を参照）。以下のデータが得られた（表２）。
【０１３４】
【表２】
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【０１３５】
実施例７
実施例１〜５から得られた酵母株における遺伝子ＳＡＫ１およびＨＡＰ４のエピソーム過剰発現
遺伝子ＳＡＫ１およびＨＡＰ４のエピソーム過剰発現のため、これらの遺伝子を発現ベクターｐＦｌａｔ１およびｐＦｌａｔ３にそれぞれクローニングした。この目的で、これら２つの遺伝子をＳ．セレビシエＳ２８８ｃ株由来の染色体ＤＮＡから、５’末端にＮｏｔＩ制限部位を、３’末端にＸｈｏＩ制限部位を導入するプライマーを用いて増幅した。得られたＰＣＲ断片、ならびにベクターｐＦｌａｔ１およびｐＦｌａｔ３を制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで制限処理した。制限酵素で処理したＰＣＲ断片および線状化ベクターを連結し、ベクターｐＦｌａｔ１−ＳＡＫ１およびｐＦｌａｔ３−ＨＡＰ４を得た。これらのベクターはそれぞれ、ＳＡＫ１およびＨＡＰ４の強い構成的発現をもたらすために、構成型のＡＤＨ１プロモーターとＴＲＰ１ターミネーターの隣接した１コピーの遺伝子ＳＡＫ１およびＨＡＰ４を有する。
【０１３６】
プラスミドｐＦｌａｔ３を構築するために、プラスミドＹＥｐ２４をＳｐｈＩで切断し、ＡＤＨ１プロモーターとＴＲＰ１ターミネーターを含み、その間にプラスミドｐＵＣ１９の多重クローニング部位を有する９００ｂｐのＳｐｈＩ断片を、プラスミドｐＰＴ２Ｂから挿入した。この多重クローニング部位を、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩの制限部位を含むポリリンカーを挿入することにより拡大した。選択のためのＵＲＡ３遺伝子を有する、得られたプラスミドｐＦｌａｔ１をＮｃｏＩ制限処理によって線状化し、クレノウポリメラーゼで平滑末端とし、酵母ＬＥＵ２遺伝子を含むＹＤｐＬの、平滑末端化されたＢａｍＨＩ断片を組み込んだ。得られたベクターをｐＦｌａｔ３とした。
【０１３７】
プラスミドｐＦｌａｔ１−ＳＡＫ１およびｐＦｌａｔ３−ＨＡＰ４、また、対照としてのエンプティープラスミドｐＦｌａｔ１およびｐＦｌａｔ３を用い、実施例１〜６から得られた酵母株を形質転換した。
【０１３８】
表３に示される酵母株を、それらのスクアレン生産性／含量について評価した。この目的で、これらの株を３０℃、１５０ｒｐｍで振盪しながら７２時間、ＷＭＶＩＩＩ培地で培養した。細胞を０．５Ｍ煮沸ＨＣｌ中で破砕した後、脂質を２０ｍｌのｎ−ヘキサンで２回抽出し、ＧＣ／ＭＳで分析／定量した（詳細は第１２項を参照）。以下のデータが得られた（表３）。
【０１３９】
【表３】
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【０１４０】
実施例８
構築された株の中性脂質組成を薄層クロマトグラフィーにより評価した。全脂質抽出および薄層クロマトグラフィーは第１２項に従って行った。図１は、野生型株ＡＨ２２ｕｒａ３、脱調節型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを有するＡＨ２２ｔＨ３ｕｒａ８株、および２つの二重欠失株ＡＨ２２ｔＨ３ｕｒａ８Δａｒｅ１Δａｒｅ２とＡＨ２２ｔＨ３ｕｒａ８Δｄｇａ１Δｌｒｏ１の全脂質／中性脂質組成を示す。図１は、脱調節型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを発現し、高い量のスクアレンを生産するレーン３〜８の株に比べ、野生型株（ＡＨ２２ｕｒａ３、レーン１および２）は極めて低量のスクアレンしか生産しないことを示唆する。ステリルエステルの形成を担う酵素をコードする遺伝子（ａｒｅ１、ａｒｅ２）およびトリアシルグリセロールの形成を担う酵素をコードする遺伝子（ｄｇａ１、ｌｒｏ１）の欠失は、対応する株においてこれらの成分の完全な欠失をもたらす（レーン５〜８に黒い四角で示す）。これらの脂質成分をスクアレン、オレイン酸コレステリル、トリオレイン酸、オレイン酸およびエルゴステロールの標品によって同定した（示されていない）。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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