(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド又はその製薬上許容される塩を含有する心タンポナーデ治療薬。
【請求項２】
１回当たりの投与量が２〜８ｍｇ／kgであることを特徴とする請求項１に記載の心タンポナーデ治療薬。
【請求項３】
投与時期が心タンポナーデの期間中であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の心タンポナーデ治療薬。
【請求項４】
心タンポナーデの治療に用いる医薬の製造における配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド又はその製薬上許容される塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心タンポナーデの治療薬および治療方法に関する。より詳細には、本発明は、心タンポナーデにより生ずるマクロ循環及び微小循環の悪化を防止・改善し、且つこれらの循環の悪化に付随する局所性及び全身性の炎症を抑制することにより心タンポナーデに伴う合併症の発生を抑制する活性を有するペプチドを有効成分として含有する心タンポナーデの治療薬および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心原性ショックは、心タンポナーデの様な心臓原因性の又は非心臓原因性の心臓充填障害（filling disorders）を発症している患者に共通するものである（非特許文献１参照）。血液、膿、体液又は気体の浸出により生ずる心膜のタンポナーデは生命を脅かす医学的緊急事態であり、直ちに能動的処置を要する（非特許文献２参照）が、心膜穿刺又は心膜切開による心膜腔内の排液術が第一選択である。  【０００３】
心原性ショックは、高頻度に内蔵のマクロ循環及び微小循環の低血流を惹起し、これは引き続いて局所性及び全身性の炎症を活性化させる。心筋ポンプの急性不全は、適切な処置が為された後でさえも高い確率で合併症を併発するが、炎症の活性化がこれらの状況において決定的な役割を演じていることは広く受け入れられている。【０００４】
しかし、血液の低灌流で誘起された生体内プロセスを阻止し又は治療する既存の抗炎症性物質の有効性は非常に限られているため、心タンポナーデにより生じた心膜内圧の除去の後に又はそれと並行して支持療法としての合併症の発生を阻止する新たな薬剤が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Topalian S, Ginsberg F, Parrillo JE:Cardiogenic shock. Crit Care Med 2008; 36:S66-S74
【非特許文献２】Seferovic PM, Ristic AD, Imazio M, et al:Management strategies in pericardial emergencies. Herz 2006; 31:891-900
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、心タンポナーデにより生ずるマクロ循環及び微小循環の悪化を防止・改善し、且つこれらの循環の悪化に付随する局所性及び全身性の炎症を抑制することにより、心タンポナーデに伴う合併症の発生を抑制する心タンポナーデ治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが優れた心タンポナーデの治療効果を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
本発明は、
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド又はその製薬上許容される塩を含有する心タンポナーデ治療薬、
（２）１回当たりの投与量が２〜８ｍｇ／kgであることを特徴とする（１）に記載の心タンポナーデ治療薬、
（３）投与時期が心タンポナーデの期間中であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の心タンポナーデ治療薬、
（４）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド又はその製薬上許容される塩を投与する工程を含む心タンポナーデの治療方法、
（５）１回当たりの投与量が２〜８ｍｇ／kgであることを特徴とする（４）に記載の心タンポナーデの治療方法、
（６）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド又はその製薬上許容される塩を投与する時期が心タンポナーデの期間中であることを特徴とする（４）又は（５）に記載の心タンポナーデの治療方法、
（７）心タンポナーデの治療に用いる医薬の製造における配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド又はその製薬上許容される塩の使用である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、心タンポナーデにより引き起こされ得る合併症の発生原因となる体循環および内臓領域の微小循環の悪化、並びにこれらの循環の悪化に付随する局所性及び全身性の炎症を抑制することにより心タンポナーデを治療し得るペプチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは偽手術グループ（図中Sham-operated、以下同じ。）、非処置グループ(図中Tamponade、以下同じ。)及び処置グループ(図中Tamponade+AcPepA、以下同じ。)における平均動脈圧の変化を示す。図１Ｂは偽手術グループ、非処置グループ及び処置グループにおける心拍出量の変化を示す。
【図２】図２Ａは偽手術グループ、非処置グループ及び処置グループにおける中心静脈圧の変化を示す。図２Ｂは偽手術グループ、非処置グループ及び処置グループにおける心臓拡張末期容量係数の変化を示す。図２Ｃは偽手術グループ、非処置グループ及び処置グループにおける心拍数の変化を示す。
【図３】図３Ａは偽手術グループ、非処置グループ及び処置グループにおける上腸間膜動脈血流の変化を示す。図３Ｂは偽手術グループ、非処置グループ及び処置グループにおける平均赤血球速度の変化を示す。
【図４】図４Ａは偽手術グループ、非処置グループ及び処置グループにおける血漿ヒスタミンレベルの変化を示す。図４Ｂは偽手術グループ、非処置グループ及び処置グループにおける血漿巨大エンドセリン濃度の変化を示す。図４Ｃは偽手術グループ、非処置グループ及び処置グループにおける血漿HMGH-1レベルの変化を示す。
【図５】図５Ａは偽手術グループ、非処置グループ及び  処置グループにおける小腸ミエロペルオキシダーゼ活性の変化を示す。図５Ｂは偽手術グループ、非処置グループ及び処置グループにおける全血スーパーオキサイド生産量の変化を示す。図の全て（図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図５Ａ、図５Ｂ）において、方形の囲み（囲み中にTamponadeと表示）は、心タンポナーデの持続時間を示し、矢印はAcPepAによる処置を示す。プロットは、中央値（長方形の中の横線）、２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルを示す。＊はフリードマンの順位に関する繰り返し測定分散分析とこれに続くダンの方法による、 グループ内対ベースライン時の値の有意差p＜0.05を、xは クラスカル・ワオリスの順序に関する一元配置分散分析とこれに続くダンの方法による、グループ間対偽手術グループの値の有意差p＜0.05を、# はクラスカル・ワオリスの順序に関する一元配置分散分析とこれに続くダンの方法による 処置グループ間対非処置グループの値の有意差p＜0.05を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための好適な形態について詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１２】
本発明におけるペプチドは、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有しており、そのN末端のアラニンのアミノ基がアセチル化されている（本明細書において「AcPepA」ともいう。）。以下該ペプチドについて説明する。
該ペプチドは、アミノ酸をランダムに変更することで標的に対する親和性が高いと予想されるペプチド配列５０００種を設計する遺伝的アルゴリズムを採用し、且つ設計した各ペプチド配列について、疎水性親水性指標の相補性最適化、平均的構造類似性最適化、側鎖の干渉の最小化および骨格の配列を含む幾つかの物理化学的パラメータに基づき点数が割り当てられるＭＩＭＥＴＩＣプログラムと称するソフトウェア（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｗ，Ｋｌｅｉｍａｎ  Ｌ，Ｂａｒａｎｙ  Ｌ，Ｌｉ  Ｚ，Ｋｈｏｒｃｈｉｄ  Ａ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｍｉｍｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；４６：２１１―５.およびＢａｒａｎｙｉ  Ｌ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｗ，Ｏｈｓｈｉｍａ  Ｋ，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  Ｓ，Ｂｏｒｏｓ  Ｍ，Ｏｋａｄａ  Ｈ．  Ｔｈｅ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｂｏｘ：ａ  ｎｅｗ  ｍｏｔｉｆ  ｗｉｔｈｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９５；１：８９４―９０１.を参照）および独自のノウハウを用いて設計された配列表の配列番号１のペプチド（本明細書において「PepA」ともいう。）のN末端をアセチル化した構造を有し、且つPepAよりもより高い安定性を併せ持つものである。
【００１３】
本発明におけるペプチドは、１７個のアミノ酸（Ala Ser Gly Ala Pro Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Leu Arg Pro Met Phe）により構成され、そのN末端のアラニンがアセチル化された構造を有するものであり、その構成アミノ酸Ala、Ser、Gly、Pro、Leu、Arg、Met、Pheは、それぞれ、天然型アミノ酸のアラニン、セリン、グリシン、プロリン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、フェニルアラニンを示す。
【００１４】
PepAは、自体公知の固相合成法（Ｇｅｒａｌｄ  Ｆ．Ｓｉｎｇｌｅｒ，Ａｎｎｅ  Ｋ．Ｓｏｕｔａｒ，Ｌｏｕｉｓ  Ｃ．Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｍ．Ｇｏｔｔｏ，ＪＲ．，Ｊａｍｅｓ  Ｔ．Ｓｐａｒｒｏｗ．Ｔｈｅ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｏｒ  ｌｅｃｉｔｈｉｎ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｐｏＣ−Ｉ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．５，ｐｐ．１４２２−１４２６，Ｍａｙ  １９７６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照）により、又はこれに準じた方法により製造することができる。また、本発明におけるペプチドAcPepAは、PepAから自体公知の方法（例えば、
Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．ａｎｄ  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．（１９８９）Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ．および生化学実験講座 蛋白質の化学IV ｐ449、日本生化学会編、東京化学同人（1977））により、もしくはこれらに準じた方法により製造することができる。
【００１５】
本発明におけるペプチドの薬学的に許容される塩とは、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩等の無機酸との塩、酢酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩などの有機酸との塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩基との塩、イソプロピルアミン、２−エチルアミノエタノール等の有機塩基との塩をいう。
【００１６】
本発明において「心タンポナーデ」（心膜タンポナーデとも称される。）とは、尿毒症、悪性腫瘍転移、心筋梗塞、膠原病、外傷、解離性大動脈瘤、心膜炎、カテーテル手術における穿孔などが原因となって生じる疾患であって、心臓と心膜との間の心膜腔に血液や心嚢液が溜まり、心臓の拡張（拍動）が妨げられる疾患をいい、「心タンポナーデの期間」とは、心タンポナーデを発症している期間をいう。
【００１７】
本発明において「心タンポナーデ治療薬」は、有効成分として前記ペプチド（配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであって、そのN末端のアラニンのアミノ基がアセチル化されているもの）、又はそのペプチドの製薬上許容される塩を含有し、経直腸、経鼻、経肺、経膣、外用（局所）、経口または非経口（皮下、植込み、静脈内および筋肉内を含む）投与に適した固体、半固体または液体（錠剤、ペレット剤、トローチ剤、カプセル剤、坐剤、クリーム剤、軟膏剤、エアゾール剤、散剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、注射液など）等の医薬製剤の形態で使用できる。
本発明において「心タンポナーデ治療薬」は、製薬目的で慣用されている種々の有機または無機担体、例えば賦形剤（スクロース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなど）、縮合剤（セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、スクロース、デンプンなど）、崩壊剤（デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルデンプン、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウムなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、エアロシル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウムなど）、矯味剤（クエン酸、メントール、グリシン、オレンジ末など）、保存剤（安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベンなど）、安定化剤（クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸など）、懸濁剤（メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウムなど）、分散剤（ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、希釈剤（水など）、基材ワックス（カカオバター、ポリエチレングリコール、白色ワセリンなど）を用いる常法によっても製造することができる。
【００１８】
本発明におけるペプチドの投与量は、投与ルート、患者の年齢、体重、症状、治療効果等により異なるが、通常成人一人当たり、１回に０．５ｍｇ乃至３０ｍｇ/kgの範囲、好ましくは２乃至８ｍｇの範囲で１日１回乃至数回投与される。また、本発明におけるペプチド（AcPepA）は、ヒトのみならずヒト以外の動物の心タンポナーデの治療にも用いることができる。
また、本発明におけるペプチドの投与時期は特に制限されないが、通常心タンポナーデ発症後であり、心タンポナーデの期間中が好ましい。
【００１９】
本発明の心タンポナーデの治療方法、すなわち、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチド又はその製薬上許容される塩を投与する工程を含む心タンポナーデの治療方法において、本発明におけるペプチド（AcPepA）は、ヒトを含む哺乳動物に上記慣用の医薬製剤の形で、特に限定なく投与することができる。その中でも静脈内、筋肉内または経口投与するのが好ましい。
【００２０】
本発明におけるペプチドは、製薬業における中間体として、また医薬の製造に使用することができる。
【実施例】
【００２１】
臨床的に適切な実験的心タンポナーデの急性ブタモデルを用いて、早期の循環系及び炎症性の変化に対するAcPepAによる処置の影響を検討した結果を実施例に示す。以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
(動物及び機器)
雌雄の同血統繁殖のベトナム産ミニブタ（ n=19、体重24±3 kg）が手術前に12時間絶食に付され自由給水を受けた。麻酔はケタミン（20mg/kg）とキシラジン（2mg/kg）筋注の混合物を用いて誘導され、プロポホール（50μL/min/kg iv;6mg/kg/hr）の連続点滴により維持された。気管内挿管後、動物は９±２mL/kgに設定した換気量で機械的な人工呼吸に付され、呼吸速度はCO2及びPaCO2の終末換気圧が35-45mmHgの範囲内に維持されるように調整された。陽圧の終末換気圧は心タンポナーデの間は適用しなかった。【００２３】
動物は体温を36℃と37℃の間に維持するために背臥位で電気座布団上に置かれ、実験の間10mL/kg/hの速度で乳酸リンゲル液の点滴を受けた。右大腿動脈及び頚静脈は熱希釈法（PICCOカテーテル、PULSION Medical Systems、Germany）による平均動脈圧（Mean Arterial Pressure、MAP）および心拍出量（Cardiac Output、CO）の測定のために、且つそれぞれ輸液もしくは薬剤の投与のためにカニューレ処置された。正中線開腹手術後、上腸間膜動脈(Superior Mesenteric Artery,SMA)の根部が切り離された。超音波フロープローブ（Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA）が腸間膜の血流を測定するために露出された上腸間膜動脈の周囲に置かれた。全てのプロトコールにおいて、動物は連続してモニターされ、動脈の血液ガスが定期的にチェックされ（Cobas b121、Roche、Austria）、３０分の時間が手術からの回復のために見込まれた。【００２４】
動物は３つの実験グループのいずれかに無作為に配分された。グループ１（n=6）は心タンポナーデを誘起しない点を除いてはグループ２（n=7）及び３（n=6）と同様な時間枠とサンプリングの条件が適用され、偽手術グループとしての役割を果たした。左外側開胸術が全てのグループで行われ、心タンポナーデが惹起されるグループ、即ちAcPepAによる処置を受けないグループ（本明細書において「非処置グループ」という。）及びAcPepAによる処置を受けるグループ（本明細書において「処置グループ」という。）、ではカニューレが心膜腔内に固定された。心膜タンポナーデは平均動脈圧を40-45mmHgの間に維持しつつ、コロイド溶液の心膜腔内投与により６０分間誘起された。この期間経過の後、その液体が心膜腔から除去され、動物はタンポナーデ後180分間モニターされた。グループ３（処置グループ）は、45分の心タンポナーデ後AcPepA（4mg/kg、生理食塩水5mLで5分間の点滴による頸静脈内への単回投与）で処置された。タンポナーデの開始は０分で示す。媒体（食塩水）の投与は、同じプロトコールにより、グループ１および２に対して行なわれた。【００２５】
末梢血サンプルは、タンパク質HMGB-1（High Mobility Group Box 1）、巨大エンドセリン（Big-Endothelin、Big-ET）及び全血スーパーオキサイド生産量のレベルを検出するために、ベースライン時、75分後、150分後及び観察期間の最後（240分）に採取された。小腸組織の生検材料は、ミエロペルオキシダーゼ（Myeloperoxidase、MPO）の活性測定のために実験の最後に採取された。【００２６】
［血液動態測定］
中心静脈圧（Central Venous Pressure、CVP）及び血流シグナルは、コンピュータ化したデータ取得システム（SPELL Haemosys;Experimetria Ltd., Budapest, Hungary）を用いて連続的にモニターされ自動記録された。平均動脈圧、心拍出量及び心拍数（Heart Rate）は、PICCO Plusモニタリングシステム（PULSION Medical Systems, Germany）を用いて測定され、心臓拡張末期容量係数(global end-diastolic volume index,GEDI)はこのPICCOシステムを用いて計算された。なお、中心静脈圧は標準的な換気および輸液置換プロトコールと並行して、これらの因子の影響を除外するために各動物について測定した。【００２７】
［C5a拮抗物質処置］
PepA（ASGAPAPGPAGPLRPMF、配列表の配列番号１）のN-末端アラニンがアセチル化されたAcPepA（配列表の配列番号２）は、株式会社蛋白科学研究所により製造され、且つ精製（＞95%純度）された。ペプチドは生理食塩水に溶解し、2mg/mLの濃度で用いた（Okada H, Imai M, Ono F, et al:
Novel complementary peptides to target molecules.Anticancer Res 2011;
31:2511-2516参照）。【００２８】
［微小循環の生体内ビデオ顕微鏡法］
生体内直交偏光スペクトル画像診断法（Ｃｙｔｏｓｃａｎ  Ａ／Ｒ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ）が小腸の粘膜微小循環の非侵襲的視覚化のために用いられた。この手法は、オキシ及びデオキシヘモグロビンの等吸収点の波長（548nm）の反射偏光を利用している。偏光は反射において維持されるため、200-300μmの深度から散乱した光子のみが画像形成に貢献する。対物レンズ（10x）が上行結腸の漿膜表面に置かれ、顕微鏡画像がS-VHSビデオレコーダー１（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ  ＡＧ−ＴＬ  ７００， 松下電器産業株式会社）を用いて記録された。微小循環パラメータの定量的評価は、ビデオテープに撮られた画像のフレーム間分析（frame to frame analysis）によりオフラインで実行された。後毛細管細静脈の赤血球速度（Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｖｅｒｏｃｉｔｙ，ＲＢＣＶ，μｍ／ｓ）の変化はコンピュータ支援画像分析システム（ＩＶＭ  Ｐｉｃｔｒｏｎ，  Ｂｕｄａｐｅｓｔ，  Ｈｕｎｇａｒｙ）を使用して３つの別の視域において測定された。全ての微小循環の評価は同一の研究者により行われた。【００２９】
［ミエロペルオキシダーゼ活性］
多形核白血球（Polymorphonuclear Leukocyte）活性化のマーカーであるミエロペルオキシダーゼ活性は、Ｋｕｅｂｌｅｒらの方法（Ｋｕｅｂｌｅｒ  ＷＭ，Ａｂｅｌｓ  Ｃ，Ｓｃｈｕｅｒｅｒ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｂｙ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｓｓａｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  １９９６；  １６：８９−９７参照）に従って、回腸生検サンプルを用いて測定された。手短に言えば、50mM K3PO4緩衝液（pH6.0）、2mM の3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine、DMSOに溶解したもの）及び100μLの未希釈の血漿サンプルを含む反応混合物が37℃で５分間培養に付された。反応は0.6mMの過酸化水素（0.75mL K3PO4緩衝液に溶解したもの）を用いて開始し、５分後に0.2mLの硫酸（2M）を用いて停止し、テトラメチルベンジジンの過酸化水素依存酸化は、450nmで分光学的に検出した(UV-1601 spectrophotometer, 島津製作所)。ミエロペルオキシダーゼレベルは、ミエロペルオキシダーゼ標準品（Sigma-Aldrich GmbH、Germany）を用いて作成した検量線により計算した。組織のミエロペルオキシダーゼ活性を検出するために、回腸サンプルが、組織のプロテアーゼをブロックするために0.1mMのフェニルメタンスルフォニルフォルオライド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を含有するトリス塩酸緩衝液（Tris-HCl buffer、0.1M、pH7.4）を用いてホモジナイズされ、次に4℃で20分間、24,000gで遠心分離された。サンプルのミエロペルオキシダーゼ活性は上記のように測定され、データはその蛋白含量に適用された。【００３０】
［全血スーパーオキサイド生産量］
全血スーパーオキサイド生産量の測定のために、チンメルマンらの化学蛍光分析法（chemiluminometric method of Zimmermann et. al.）（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  Ｔ，  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  Ｒ，Ｌａｕｓｃｈｋｅ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ：Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｂｌｏｏｄ−ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｍｄｔｑ−ｄａ  ｔｒａｓｙｌｏｌ  ａｓｃｏｒｂｉｃ−ａｃｉｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎａｌ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  １９９１；  ２５５：３７３−３８１参照）が用いられた。測定中、10μLの全血が1mLのハンクス溶液（PAA Cell Culture Company）に加えられ、その混合物はアッセイに付されるまで37℃に保たれた。化学蛍光分析の反応は、100μLのルシゲニンを添加後３０分間、ルミノメーター（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０７  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定された。【００３１】
［血漿中のタンパク質HMGB-1、巨大エンドセリン及びヒスタミンの測定］
4mLの血液サンプルが頚静脈から、EDTA（1mg/mL）を含有する冷やしたポリプロピレンチューブ内にベースライン時、75分後、150分後及び観察期間の最後（240分）に採血された。血液サンプルは、1200g、10分間、4℃で遠心分離された。次に血漿サンプルは採取されアッセイまで-70℃で保存された。【００３２】
タンパク質HMGB-1の血漿濃度は、商業的に入手可能なタンパク質HMGB-1
エリザキット（ＨＭＧＢ−１  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，株式会社シノテスト）を用いて測定した。38のアミノ酸からなりエンドセリン−１（Endothelin-1、ET-1）の前駆タンパク質である巨大エンドセリンの血漿レベルは商業的に入手可能なキット（Biochemica Hungaria Kft.,Budapest,Hungary）を用いて測定した。血漿ヒスタミン濃度は、商業的に入手可能な酵素結合免疫測定法（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＥＩＡ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ；Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ  Ｈｕｎｇａｒｉａ  Ｋｆｔ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）により測定した。【００３３】
［統計解析］
データ解析は、統計ソフトウェアパッケージ（SigmaStat for Windows（登録商標）; Jandel Scientific, Erkrath, Germany）を用いて実施した。フリードマンの順位に関する繰り返し測定分散分析が各グループ内で適用された。各グループのベースライン時からの時間依存的な差は、ダン法（Dunn’s method）により評価され、グループ間の差は、クラスカル・ワオリスの順序に関する一元配置分散分析、これに続く、対のある多重比較に関するダンの方法により分析された。各図において、中央値、２５番目の百分位数（２５パーセンタイル）及び７５番目の百分位数（７５パーセンタイル）が付与された。P値＜0.05は、有意とみなされた。【００３４】
［結果］
［マクロ血液動態］
偽手術グループにおいては、ベースライン時の値と比較して有意な血液動態の変化は無く、メディエーターレベルは観察期間中有意に変化しなかった。【００３５】
図 1Aに示すように、平均動脈圧は、コロイド溶液の心膜腔への注入による60分間の心タンポナーデ期間中、40-45mmHgの間に維持され、これは、結果として、図 1Bに示すように、心タンポナーデが発症した両グループ、即ち処置グループ及び非処置グループにおいて、偽手術グループに比して心拍出量の有意な65%減少となり、図 2Cに示すように、偽手術グループに比して心拍数の有意な増加となった。【００３６】
タンポナーデ除去後、図 1Aに示すように、平均動脈圧は、非処置グループではコントロールグループに比して有意に減少したが、図 1Bおよび図2Cにそれぞれ示すように、心拍出量及び心拍数は、平均動脈圧の当該減少にも関わらず、ベースライン時の値に戻った。一方、処置グループにおいては、平均動脈圧は有意に上昇し非処置グループに比して有意な高値を示し、且つ偽手術グループと同等の値を示したが、図 1Bおよび図2Cにそれぞれ示すように、心拍出量は影響を受けず、心拍数はタンポナーデ後の期間において非処置グループに比して有意な減少を示した。これらの事実は、AcPepAが心タンポナーデ除去後の平均動脈圧の減少を有意に抑制し且つ心タンポナーデ発症前の平均動脈圧に保つと共に、より低い心拍数を維持することにより心筋の良好な血液循環と酸素供給を実現することにより、心タンポナーデによる合併症の発生を防止する効果を有することを示している。【００３７】
図2Aに示すように、タンポナーデ期間について処置グループおよび非処置グループにおいて、偽手術グループに比して中心静脈圧の有意な増大が認められるが、これは明らかに静脈還流量の低下を示している。また、図 2Bに示すように、処置グループおよび非処置グループにおいて偽手術グループに比して、心臓拡張末期容量係数の有意な減少が同時に生じている。【００３８】
また、図 2Aに示すように、処置グループおよび非処置グループにおいて、心タンポナーデ除去後中心静脈圧は減少傾向を示した。また、図 2Bに示すように、非処置グループにおいて心臓拡張末期容量係数は、処置グループに比して有意な低値を示し、ベースライン時の値に到達しなかった。これらの非処置グループにおける変化は、心タンポナーデ後の静脈還流の持続的障害を示している。一方、処置グループにおいては、中心静脈圧および心臓拡張末期容量係数共に非処置グループに比して有意な高値を示し、且つ偽手術グループと同等の値を示した。この心臓拡張末期容量係数の有意な高値は、非処置グループに比して有意に増加した還流血流を示している。これらの事実は、AcPepAが心タンポナーデ発症後の合併症の原因となる静脈還流の持続的障害の発生を顕著に抑制し且つ心タンポナーデ発症前の静脈還流を回復する効果を有することを示している。【００３９】
図3Aに示すように、タンポナーデ期間の上腸間膜動脈の血流量については、処置グループおよび非処置グループにおいて偽手術グループに比して有意な減少が認められたが、これは再配分が腸間膜循環を悪化させたことを示している。一方、タンポナーデの除去後は、処置グループおよび非処置グループにおいて、上腸間膜動脈の血流はコントロール値に戻り、前記再配分による腸間膜循環の悪化は解消された。なお、タンポナーデの除去後における上腸間膜動脈の血流については、処置グループにおいて、偽手術グループに比して有意な増加が認められている。これらの事実は、AcPepAが心タンポナーデ発症後の合併症の原因となり得る上腸間膜動脈の血流量の回復の遅れを是正して内蔵循環を改善することにより、合併症の発生を阻止する効果を有することを示している。【００４０】
［微小循環］
異質の振動性微小循環が全グループの小腸粘膜で見られたため、赤血球速度の加重平均を計算した（この加重平均された赤血球速度を、本明細書において「平均赤血球速度(average Red Blood Cell Verocity)」という。）。平均赤血球速度は、早い流速及び遅い流速の期間の継続並びに各フェーズの期間中の赤血球速度に基づいて算出される（Ｓｚａｂｏ  Ａ，Ｓｕｋｉ  Ｂ，Ｃｓｏｎｋａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ：Ｆｌｏｗ  ｍｏｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｖｉｌｌｉ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｈｏｃｋ：Ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ｃｈａｎｇｅｓ．Ｓｈｏｃｋ  ２００４；  ２１：３２０−３２８参照）。【００４１】
図3Bに示すように、偽手術グループにおいて平均赤血球速度は何らの変化も示していないが、非処置グループにおいては、心タンポナーデの終わりに、ベースライン時の値からの減少傾向が観察され実験の終わりにはベースライン時に比して有意な減少を示した。また、処置グループにおいては、心タンポナーデ後のフェーズの終わりには、平均赤血球速度はベースライン時及び非処置グループに比して有意に増加した。【００４２】
［生化学的パラメータ］
末梢血サンプルは、ベースライン時、75分後、150分後及び観察期間の最後（240分）に採取したものを用いた。【００４３】
図4Aに示すように、心タンポナーデの結果、心タンポナーデ後のフェーズの15分には、非処置グループにおいて、ヒスタミンレベルは偽手術グループに比して有意に増加した。一方、処置グループにおいては、ヒスタミンの血漿中の濃度は非処置グループに比して有意に減少し、且つ偽手術グループと同等の値を示した。【００４４】
巨大エンドセリンは、比較的長い半減期を有するエンドセリン−１の安定な前駆体であり、種々のタイプの細胞から放出されるものである。この血漿巨大エンドセリンレベルは、図4Bに示すように、心タンポナーデ後、非処置グループにおいて偽手術グループに比して有意に4-5倍増加した。一方、処置グループにおいては、巨大エンドセリンの血漿中の濃度は非処置グループに比して低値を示し、且つ偽手術グループと同等の値を示した。【００４５】
炎症プロセスの段階的拡大を生ずる白血球活性化の非常に有効なシグナルであるタンパク質HMGB-1の血漿レベルは、図4Cに示すように、非処置グループにおいて、心臓の圧迫後にベースライン時および偽手術グループに比して有意に増大した。一方、処置グループにおいては、タンパク質HMGB-1の血漿中の濃度は非処置グループに比して有意な低値を示し、且つ偽手術グループと同等の値を示した。【００４６】
これらの事実は、AcPepAが心タンポナーデの際に生ずる急性の血液動態上の変化に付随するヒスタミン、タンパク質HMGB-1及び巨大エンドセリンを含む血管作用性及び炎症促進性のメディエーターの放出を抑制し、静脈還流量の増加に寄与することにより、心タンポナーデの合併症の発生を防止する効果を有することを示している。【００４７】
多形核白血球の集積速度は、実験の終わりに採取された小腸組織サンプルのミエロペルオキシダーゼ活性の測定により決定された。図5A に示すように、ミエロペルオキシダーゼ活性のレベルは、非処置グループにおいて偽手術グループに比して有意に高く、多形核白血球の集積の増加を示している。一方、処置グループにおいては、非処置グループに比してミエロペルオキシダーゼ活性が有意な低値を示し、且つ偽手術グループと同等の値を示した。この有意な低値は多形核白血球の集積の減少を示している。【００４８】
また、心タンポナーデ後のフェーズの初期の血液において、図5B に示すように、非処置グループでは、偽手術グループに比してスーパーオキサイド生産量の有意な増加が観察され、処置グループにおいては、非処置グループに比してスーパーオキサイド生産量の有意な低値が観察され、且つ偽手術グループと同等の値を示した。【００４９】
これらの事実は、AcPepAが体循環の悪化およびこれに続く内蔵領域の微小循環の類似の障害の発生並びにこれに付随するミエロペルオキシダーゼ活性の増加を抑制し、組織損傷の原因の減少により内皮機能を維持することができその結果として微小循環の改善が生じて、心タンポナーデの合併症の発生を防止し得ることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明に係るペプチド（AcPepA）は、心タンポナーデにより引き起こされる合併症の発生を阻止することができるため、心タンポナーデの治療に利用することができ当該産業分野の発展に貢献することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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