(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3並びに重鎖CDR1、CDR2及びCDR3を含む抗BLyS抗体であって、
前記軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列並びに前記重鎖CDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列として、以下のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの組の中から一組選択される、抗BLyS抗体：
【表１】
0006006404.tif 000008
ここで、前記抗BLyS抗体はマウス抗体又はヒト化抗体である。
【請求項２】
前記抗BLyS抗体は軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列及び前記重鎖可変領域のアミノ酸配列として、以下の各組中から一組選択される、請求項１に記載の抗BLyS抗体：
ａ：SEQ ID NO. 31及びSEQ ID NO. 32で表されるアミノ酸配列；
ｂ：SEQ ID NO. 33及びSEQ ID NO. 34で表されるアミノ酸配列；
ｃ：SEQ ID NO. 35及びSEQ ID NO. 36で表されるアミノ酸配列；
ｄ：SEQ ID NO. 37及びSEQ ID NO. 38で表されるアミノ酸配列；
ｅ：SEQ ID NO. 39及びSEQ ID NO. 40で表されるアミノ酸配列。
【請求項３】
前記抗BLyS抗体は軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列及び前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の各組中から一組選択される、請求項１に記載の抗BLyS抗体：
Ｉ：SEQ ID NO. 41及びSEQ ID NO. 42で表されるアミノ酸配列；
ＩＩ：SEQ ID NO. 43及びSEQ ID NO. 44で表されるアミノ酸配列；
ＩＩＩ：SEQ ID NO. 45及びSEQ ID NO. 46で表されるアミノ酸配列；
ＩＶ：SEQ ID NO. 47及びSEQ ID NO. 48で表されるアミノ酸配列。
【請求項４】
さらにヒト軽鎖定常領域及びヒト重鎖定常領域、並びに前記ヒト軽鎖定常領域及び前記ヒト重鎖定常領域にそれぞれ結合する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項３に記載の抗BLyS抗体。
【請求項５】
前記ヒト軽鎖定常領域はヒト軽鎖κ定常領域である、請求項４に記載の抗BLyS抗体。
【請求項６】
前記ヒト重鎖定常領域はヒト重鎖Fcフラグメントである、請求項４又は５に記載の抗BLyS抗体。
【請求項７】
請求項１−６のいずれかに記載の抗BLyS抗体をコードするDNA分子。
【請求項８】
SEQ ID NO. 49-58から選択される核酸配列を有する、請求項７に記載のDNA分子。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のDNA分子を含むことを特徴とする組み換えDNAベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組み換えDNAベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１１】
Ｂ細胞の過剰な増殖によって引き起こされる疾病を予防及び／又は治療するための薬物の製造における、請求項１から６のいずれかに記載の抗BLyS抗体の使用であって、
前記薬物は請求項１から６のいずれかに記載の抗BLyS抗体を有効量含有する使用。
【請求項１２】
前記Ｂ細胞の過剰な増殖によって引き起こされる疾病は全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強直性関節炎、及びＢ細胞リンパ腫から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
請求項１から６のいずれかに記載の抗体であって有効量の抗体及び薬学的に許容される担体を含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１４】
抗BLyS抗体を調製する方法であって、請求項１０に記載の宿主細胞を培養すること、及び抗体を得ることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物医薬の分野におけるものであり、抗BLyS抗体及びその使用に関する。かかる抗BLyS抗体はＢリンパ球刺激因子と結合することができ、Ｂリンパ球刺激因子と受容体BR3-Fcとの結合を阻害することができる。さらにMHC II因子と低い親和性を有するヒト化抗BLyS抗体に関する及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患の一種である全身性エリテマトーデス（全身性紅斑性狼瘡、Systemic lupus erythematosus、SLE）は皮膚、関節、心臓、肺、腎臓、血液、脳のような複数の組織、器官に関連するものであり、拡散的に進行し、寛解及び再発を繰り返す。全身性エリテマトーデスは主にアフリカ系カリブ人、アジア人及びヒスパニックに発症する。一方でコーカソイド（白色人種）に発症することは少ない。米国狼瘡財団（Lupus Foundation of America）によれば、アメリカで全身性エリテマトーデスを発症している人は慎重に見積もっても300,000人に上っている。データ監視会社の推定によれば、中国、インド及びメキシコだけでも全身性エリテマトーデスに苦しむ患者は220万人に上る。中国国内で全身性エリテマトーデスに苦しむ患者は100万人に上り、世界で最も多い。全身性エリテマトーデスの初期症状は顕在化しないため、実際の患者数は現行の推定よりも大きい可能性がある。このため臨床においてSLEの診断及び治療が強く必要とされていた。
【０００３】
SLEの原因は複雑であり、また不明な点がある。一つの要因で引き起こされるものではなく、遺伝、環境、性ホルモン及び免疫等、様々な要因と関連すると考えられている。
現在の多くの科学者の見解によればSLEの病因は、細胞レベルにおいて、自己反応性のＢ細胞が抹消組織にとても長く留まることによる。かかるＢ細胞はヒト自己抗原を生じ、自己免疫を引き起こす。このため、初期のＢ細胞の成長と増殖を阻害できれば、SLEの治療も可能性が開ける。
【０００４】
Ｂリンパ球刺激因子（B Lymphocyte Stimulator、BLyS）は、腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor、TNF）ファミリーに属するTall-1（TNF and Apol related leukocyte expressed ligand 1）、BAFF（B cell activating factor belonging to the TNF family）、THANK（TNF homologues that activate apoptosis, NF-κB and JNK）として知られる。またBLySは1999年に舒紅兵らによって発見され、かつクローン化された新しいサイトカインである。Ｂリンパ球の共刺激因子として、BLySは、抗IgM及びIL-4の存在下で、もっぱらＢ細胞の増殖と分化を活性化し、体液性免疫において非常に重要な役割を果たす。また体内でのBLySの過剰発現は自己免疫疾患と密接に関連する。
【０００５】
in vitro実験によれば、Ｂ細胞が予めIgMによって活性化されると、BLySによりＢ細胞は大量に増殖し、IgM及びIgAを分泌するようになる。しかしながらそれ以降の期間のＢ細胞では、かかる刺激による明らかな効果は見られない。さらなる研究により、BLySは主に前Bリンパ系細胞、未成熟Bリンパ系細胞、及び活性化リンパ系細胞に作用することと、形質細胞及びリンパ性の多能性幹細胞に対して影響がないことが示された。大部分のサイトカインと同様、BLySはＢ細胞表面の受容体を通して、その下流のシグナル伝達を刺激する。多くの研究グループがBLySと結合する受容体の存在を確認しており：Ｂ細胞活性化因子受容体（BR3、BLyS receptor 3又はBAFF-R）、膜貫通型活性化因子（transmembrane activator-1 and calcium modulator and cyclophilin ligand-interactor、TACI）及びＢ細胞成熟抗原（BCMA）がある。
かかる特異性があるためBLySはＢ細胞抗体による自己免疫疾患及びリンパ腫の標的として非常に好適である。
【０００６】
治療用の抗BLyS抗体によりＢ細胞の成長、並びにIgA及びIgMの分泌を効果的に阻害することで、SLEの治療効果を得られることがin vivo及びin vitroで示されている（Edwards BM et al, The remarkable flexibility of the human antibody repertoire; isolation of over one thousand different antibodies to a single protein, BLyS. J Mol Biol. 2003 Nov 14; 334(1):103-18; Baker KP et al, Generation and characterization of LymphoStat-B, a human monoclonal antibody that antagonizes the bioactivities of B lymphocyte stimulator. Arthritis Rheum. 2003 Nov; 48(11): 3253-65）。抗BLyS抗体弁ベンリスタ（Benlysta）は米国ヒューマンゲノムサイエンス社により開発され、SLE治療のための新薬としては60年ぶりのものである。ベンリスタBLySにより刺激されたＢ細胞のみを標的とするため、化学療法剤に比べ治療中の副作用が非常に少ない。このため、SLE患者に安全で効果的な治療を行うことができる。近年BLySを標的とした治療の研究及び臨床応用が急速に進められており、ヒューマンゲノムサイエンス社以外の多くの企業は、BLyS又はそれらの受容体を基礎として改変した融合タンパク質を用いている。米国ジェネンテック社はBR3-FC製剤を開発し、ザイモジェネティクスはTACI-FC製剤を開発し、アムジェンはポリペプチド-FCを開発した。ベンリスタと比較すると、これらの薬剤は特異性が低く、結合力が弱く、比較的治療効果が弱く、また、より毒性が強い。３つの薬剤はいずれも第II相臨床試験で中断、又は終了した。このため、抗BLyS抗体医薬は、かかる標的に対して正しく効果的な薬物治療であると言える。
【０００７】
ベンリスタはファージディスプレイライブラリにより提供される。なおファージディスプレイライブラリの欠点は次の通りである：重鎖及び軽鎖の対合がin vivoによる選別によらない人工的なものと考えられる（Greg Winter, et al., Making Antibodies by Phage Display Technology. Annual Review of Immunology Vol. 12: 433-455）；ライブラリが未成熟なヒトPBMCから構築されていることから、候補となる抗体の親和性が低い（Edwards BM, et al., The remarkable flexibility of the human antibody repertoire; isolation of over one thousand different antibodies to a single protein, BLyS. J Mol Biol. 2003 Nov 14; 334(1):103-18）；ファージディスプレイライブラリから得た薬剤の候補には、収量が低い、安定性が低い、生体内で薬物動態特性が悪いという欠点がある（Ponsel D, et al., High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 2011 May 3; 16(5):3675-700）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本技術分野において、抗BLyS抗体には、なお次のような特性が必要とされている：ファージディスプレイライブラリを用いず、例えばヒト化マウス抗体技術等を用いて製造されること；Ｂリンパ球刺激因子に結合し高い親和力を有することで、Ｂリンパ球刺激因子がその受容体であるBR3-Fc3に結合するのを阻害すること；抗原性が低いこと；及び／又はMHC-II受容体との弱い親和性を有することで、（Ｂリンパ球刺激因子との）親和性を高める一方で、免疫応答を最小限にすること。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様において、本発明は抗BLyS抗体又はそれらの機能性変異体を提供する。かかる抗BLyS抗体の軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3、同様に重鎖CDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列として、以下の各組中から一組選択される。
【００１０】
【表１】
0006006404.tif 000002
【００１１】
一態様において、前記抗BLyS抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列及び重鎖可変領域のアミノ酸配列として、以下の各組中から一組選択される、：
ａ：SEQ ID NO.（配列番号）31及びSEQ ID NO. 32で表されるアミノ酸配列又はこれらの機能性変異体；
ｂ：SEQ ID NO. 33及びSEQ ID NO. 34で表されるアミノ酸配列又はこれらの機能性変異体；
ｃ：SEQ ID NO. 35及びSEQ ID NO. 36で表されるアミノ酸配列又はこれらの機能性変異体；
ｄ：SEQ ID NO. 37及びSEQ ID NO. 38で表されるアミノ酸配列又はこれらの機能性変異体；
ｅ：SEQ ID NO. 39及びSEQ ID NO. 40で表されるアミノ酸配列又はこれらの機能性変異体。
【００１２】
好ましい態様において、本発明の抗BLyS抗体はヒト化されている。
【００１３】
一態様において、前記抗BLyS抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列及び重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の各群から選ばれる：
Ｉ：SEQ ID NO. 41及びSEQ ID NO. 42で表されるアミノ酸配列又はこれらの機能性変異体；
ＩＩ：SEQ ID NO. 43及びSEQ ID NO. 44で表されるアミノ酸配列又はこれらの機能性変異体；
ＩＩＩ：SEQ ID NO. 45及びSEQ ID NO. 46で表されるアミノ酸配列又はこれらの機能性変異体；
ＩＶ：SEQ ID NO. 47及びSEQ ID NO. 48で表されるアミノ酸配列又はこれらの機能性変異体。
【００１４】
好ましい態様において、前記BLyS抗体はさらにヒトの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域、並びに軽鎖定常領域及び重鎖定常領域にそれぞれ結合する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。一態様において、前記ヒト軽鎖定常領域はヒト軽鎖κ定常領域である。一態様において、前記ヒト重鎖定常領域はヒト重鎖Fcフラグメントである。
【００１５】
本発明はさらに、本発明に係る抗BLyS抗体をコードするDNA分子を提供する。前記DNA分子はSEQ ID NO. 49-58から選ばれる核酸配列を有することが好ましい。
【００１６】
本発明は、本発明に係る抗BLyS抗体のDNA分子を含む組み換えDNAベクターを提供する。
【００１７】
本発明はさらに、本発明に係る組み換えDNAベクターを有する宿主細胞を提供する。
【００１８】
他の態様において、本発明はＢ細胞の過剰な増殖によって引き起こされる疾病を予防及び／又は治療するための方法を提供する。かかる方法は請求項１から７のいずれかに係る有効量の抗BLyS抗体を投与するものである。いくつかの態様において、Ｂ細胞の過剰な増殖によって引き起こされる疾病はSLE、関節リウマチ、強直性関節炎、又はＢ細胞リンパ腫である。
【００１９】
本発明はさらに医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は有効量の本発明に係る抗体及び薬学的に許容される担体を含む。
【００２０】
本発明はさらに抗BLyS抗体を調製する方法を提供する。かかる方法では本発明に係る宿主細胞を培養することで前記抗体を得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例１に係るSDS-PAGEの検出写真である。
【図２】実施例２に係るフローサイトメトリーのグラフである。
【図３】実施例３に係るフローサイトメトリーのグラフである。
【図４】実施例４に係るフローサイトメトリーのグラフである。
【図５】実施例４に係るフローサイトメトリーのグラフである。
【図６】実施例４に係るフローサイトメトリーのグラフである。
【図７】実施例４に係るELISAの結果である。
【図８】実施例９に係るin vitroのＢ細胞増殖抑制の結果である。
【図９】リンパ節過形成に対する抗体分子の抑制効果である。
【図１０】血清IgAの増加に対する抗体分子の抑制効果である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
特別に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語は当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。定義及び技術用語に関し、当業者は特にCurrent Protocols in Molecular Biology（Ausubel著）を参照してもよい。アミノ酸残基は当該技術分野において通常使用される20種のL-アミノ酸の一つを示す3文字及び／又は1文字の略号で表す。
【００２３】
本発明の目的の一つは抗BLyS抗体を提供することである。かかる抗体はＢリンパ球刺激因子に結合し、BR3-Fc受容体へのそれらの結合を阻害する。
【００２４】
本発明は以下の技術的な解決手段に適合することで、かかる本発明の目的を達成することができる。ヒト末梢血よりRNAを抽出し、さらに遺伝子工学により、かかるヒト末梢血のRNAを鋳型として用い逆転写することでヒトBLySのcDNAを得る。その後、ヒトBLySのcDNAをそれぞれ鋳型として増幅することでヒトBLySの遺伝子領域を得る。さらにヒトBLySの遺伝子領域を真核生物発現系にクローニングし、宿主細胞に遺伝子導入し、その後発現及び精製を行うことで、ヒトBLySの精製タンパク質を得る。
【００２５】
ヒトBLySの精製タンパク質をマウスに免疫するための抗原として用いることで、2000系統の異なるモノクローナルハイブリドーマ細胞を得る。この中から合計でBLySタンパク質に結合可能な抗体を分泌するクローンの211系統を酵素標識反応によって選抜する。211系統のモノクローナルハイブリドーマ細胞についてBJAB細胞上のBLyS受容体への結合特性を試験することで、ビオチン標識BLySのBJAB細胞上のBLyS受容体への結合を阻害することのできる抗体を分泌し、かつ異なる特性を有する5系統のモノクローナルハイブリドーマ細胞を得る。これらはそれぞれ1D12、2B10、2G3、5A5及び13G8と称する。
【００２６】
得られた5個のモノクローナルハイブリドーマ細胞系統から分泌される抗体の免疫特性を特定するためELISAを用いる。結果は、本発明により選抜されたモノクローナルハイブリドーマ細胞系統から分泌される抗体はいずれもBLySに対して特異的であり、TNF-α、TNF-βといったTNFファミリーの他の抗原には反応しないことを示す。
【００２７】
さらに各モノクローナルハイブリドーマ細胞のRNAを抽出し、さらに逆転写することでcDNAを得る。その後cDNAを鋳型として用い、各モノクローナルハイブリドーマ細胞の可変領域のDNA配列を増幅する。配列決定後、www.expasy.chに従い、得られた配列に対してSAGE法（serial analysis）を実施する。さらにこれに依拠するアミノ酸配列に対してKabat分類による分析を行う。以上によりモノクローナルハイブリドーマ細胞から分泌される抗体の軽鎖及び重鎖のFR領域及びCDR領域を決定する。
【００２８】
BLySがＢ細胞の成長を活性化させ、生存を維持させる効果を有することから、抗体は、特にBLySに対する効果を中和することで、Ｂ細胞の成長を阻害すると考えられる。さらにＢ細胞は抗体を産生する、生体にとって特別な種類の細胞であることから、それ自身の成長を害する抗体を産生することは難しい（Thomas Schirrmann, et al., Phage display for the generation of antibodies for proteome research, diagnostics and therapy, Molecules, 2011, 16, 412-426）。このため、マウスを免疫することで抗BLyS抗体を産生することは比較的困難である。しかしながら、本発明においては免疫マウスにより抗BLyS抗体を得えられたため、マウス抗体としての利点を有する。
【００２９】
一面において、本発明は抗BLyS抗体又はそれらの機能性変異体に関する。かかる抗BLyS抗体の軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3、同様に重鎖CDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列は、それぞれ以下の各群から選ばれる。
【００３０】
【表２】
0006006404.tif 000003
【００３１】
一態様において、モノクローナルハイブリドーマ細胞1D12から分泌される抗BLyS抗体はSEQ ID NO. 31で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及びSEQ ID NO. 32で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する。かかる抗体をモノクローナル抗体1D12と称する。
【００３２】
一態様において、モノクローナルハイブリドーマ細胞2B10から分泌される抗BLyS抗体はSEQ ID NO. 33で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及びSEQ ID NO. 34で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する。かかる抗体をモノクローナル抗体2B10と称する。
【００３３】
一態様において、モノクローナルハイブリドーマ細胞2B10から分泌される抗BLyS抗体はSEQ ID NO. 35で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及びSEQ ID NO. 36で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する。かかる抗体をモノクローナル抗体2G3と称する。
【００３４】
一態様において、モノクローナルハイブリドーマ細胞2B10から分泌される抗BLyS抗体はSEQ ID NO. 37で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及びSEQ ID NO. 38で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する。かかる抗体をモノクローナル抗体5A5と称する。
【００３５】
一態様において、モノクローナルハイブリドーマ細胞2B10から分泌される抗BLyS抗体はSEQ ID NO. 39で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及びSEQ ID NO. 40で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を有する。かかる抗体をモノクローナル抗体13G8と称する。
【００３６】
抗体の基本的な活性に対して影響を与えない限り、当業者により、本発明にかかるアミノ酸配列中において、一又は二以上（例えば１，２，３，４，５，６，７，８，９若しくは１０又はそれ以上）のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を行ってもよい。これにより同等の機能を有するアミノ酸配列、すなわち、かかるアミノ酸配列の機能性変異体を得てもよい。これらは全て本発明の範囲内に含まれる。例えば可変領域のアミノ酸を同等の性質を有するものに置換することができる。
【００３７】
本発明に係るアミノ酸配列の機能性変異体はそれらの元の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%一致するものでもよい。本発明にかかる配列の一致は配列分析ソフトウェアで測定できる。例えば、コンピュータプログラムであるBLASTを既定の変数値で用いてもよく、特にBLASTP又はTBBLASTNを用いてもよい。
【００３８】
さらに抗原性を低下させるため、生成したマウス抗体をヒト化しヒト化抗BLyS抗体を得てもよい。ヒト化抗体を生成する方法は当業者によく知られたものでよい。例えば、本発明に係るヒト化抗BLyS抗体は本発明に係るCDR配列をヒト抗体の可変領域に転移させることで生成してもよい。ヒト化抗体は抗抗体反応（AAR）及びヒト抗マウス抗体反応（HAMA）を生じないと考えられる。またヒト化抗体は抗体によって中和されたり速やかに除去されたりしない。このためADCC作用及びCDC作用のような免疫機能を有する。
【００３９】
一態様において、本発明に係るヒト化抗BLyS抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列及び重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の各群から選ばれる：
Ｉ：SEQ ID NO. 41及びSEQ ID NO. 42で表されるアミノ酸配列又はこれらの機能性変異体；
ＩＩ：SEQ ID NO. 43及びSEQ ID NO. 44で表されるアミノ酸配列又はこれらの機能性変異体；
ＩＩＩ：SEQ ID NO. 45及びSEQ ID NO. 46で表されるアミノ酸配列又はこれらの機能性変異体；
ＩＶ：SEQ ID NO. 47及びSEQ ID NO. 48で表されるアミノ酸配列又はこれらの機能性変異体。
【００４０】
本発明に係るヒト化抗BLyS抗体はＢリンパ球刺激因子と結合しそのBR3-Fc受容体への結合を阻害することができるだけでなく、MHC II因子と弱い親和性を有することで親和性を保ちつつ免疫反応を最小化することができる。
【００４１】
他の好ましい態様において、
好ましい態様において、本発明のBLyS抗体はさらにヒトの軽鎖定常領域及び重鎖定常領域、並びに軽鎖定常領域及び重鎖定常領域にそれぞれ結合する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。一態様において、かかるヒト化抗BLyS抗体は完全長の軽鎖及び完全長の重鎖を有する。かかる完全長の軽鎖は抗BLyS抗体に含まれる軽鎖可変領域をヒト軽鎖定常領域に結合することで形成する。かかる完全長の重鎖は抗BLyS抗体に含まれる重鎖可変領域をヒト重鎖定常領域に結合することで形成する。
【００４２】
かかるヒト軽鎖定常領域はヒト軽鎖κ定常領域であることが好ましい。
【００４３】
かかるヒト重鎖定常領域はヒト重鎖Fcフラグメントであることが好ましい。
【００４４】
一態様において、ヒト軽鎖κ定常領域及びヒト重鎖Fcフラグメントは健康なヒトＢリンパ球から得る。遺伝子工学技術によって、かかる可変領域及び定常領域は重複伸長PCRによって結合されることでヒト化抗BLyS抗体の完全長の軽鎖及び重鎖が得られる。
【００４５】
本発明はさらに、本発明に係る抗BLyS抗体又はヒト化抗BLyS抗体をコードするDNA分子を提供する。コドンの縮重性により、本発明に係る抗体をコードするDNA分子は数多くある。
【００４６】
一態様において、本発明はSEQ ID NO. 31で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードするDNA分子であって、塩基配列がSEQ ID NO. 49で表されるものを提供する。
【００４７】
一態様において、本発明はSEQ ID NO. 32で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をコードするDNA分子であって、塩基配列がSEQ ID NO. 50で表されるものを提供する。
【００４８】
一態様において、本発明はSEQ ID NO. 33で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードするDNA分子であって、塩基配列がSEQ ID NO. 51で表されるものを提供する。
【００４９】
一態様において、本発明はSEQ ID NO. 34で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をコードするDNA分子であって、塩基配列がSEQ ID NO. 52で表されるものを提供する。
【００５０】
一態様において、本発明はSEQ ID NO. 35で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードするDNA分子であって、塩基配列がSEQ ID NO. 53で表されるものを提供する。
【００５１】
一態様において、本発明はSEQ ID NO. 36で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をコードするDNA分子であって、塩基配列がSEQ ID NO. 54で表されるものを提供する。
【００５２】
一態様において、本発明はSEQ ID NO. 37で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードするDNA分子であって、塩基配列がSEQ ID NO. 55で表されるものを提供する。
【００５３】
一態様において、本発明はSEQ ID NO. 38で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をコードするDNA分子であって、塩基配列がSEQ ID NO. 56で表されるものを提供する。
【００５４】
一態様において、本発明はSEQ ID NO. 39で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードするDNA分子であって、塩基配列がSEQ ID NO. 57で表されるものを提供する。
【００５５】
一態様において、本発明はSEQ ID NO. 40で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をコードするDNA分子であって、塩基配列がSEQ ID NO. 58で表されるものを提供する。
【００５６】
本明細書における「抗BLyS抗体」の用語には、同等の抗体若しくは同等の免疫グロブリン、又は抗原に対して特異的な結合能を有する抗原結合性の断片を含む。かかる用語にはFv、scFv（scは一本鎖を表す）、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv-Fc断片、二重特異性抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、及び抗体の抗原結合部及び非抗体タンパク質を有する融合タンパク質を含む。例えば放射性同位体、検出可能な物質を産生する酵素、蛍光タンパク質、ビオチンその他で、抗体を標識しさらに検出してもよい。抗体は固相担体に結合していてもよい。固相担体としてポリスチレンの平板又はビーズ等が含まれるが、これに限定されない。
【００５７】
当業者の手によって本発明に係る抗BLyS抗体をコードするDNA分子をさらにベクターにクローニングし、宿主細胞を形質転換してもよい。このため、本発明はさらに組み換えDNAベクターを提供する。DNAベクターは本発明に係る抗BLyS抗体をコードするDNA分子を有する。
【００５８】
組み換えDNAベクターは発現ベクターであることが好ましい。かかる抗体のDNA分子は当業者の手によって発現ベクターにクローニングされる。発現ベクターにより宿主細胞が形質転換されると、発現を誘導することで一本鎖抗体が得られる。
【００５９】
一態様において、本発明の組み換えDNAベクターは本発明に係るヒト化抗BLyS抗体をコードするDNA分子を備える。ヒト化抗BLyS抗体のDNA分子は哺乳類での転写及び発現のためのベクターを構築するために組み換えてもよい。本発明の発現ベクターはコードされたヒト化抗BLySモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域及び定常領域のDNA配列を有する。しかしながら二つの発現ベクターをそれぞれ構築してもよい。すなわち一方は重鎖の可変領域及び定常領域を有し、他方は軽鎖の可変領域及び定常領域を有してもよい。これらは一まとめに哺乳類に遺伝子導入する。
【００６０】
好ましい態様において発現ベクターはさらにプロモーター及び分泌シグナルペプチドをコードするDNA配列を有する。さらに発現ベクターは少なくとも一つのスクリーニング用の薬物耐性遺伝子を有する。使用される方法にはDNA合成技術及びin vitro組み換え技術が含まれる。
【００６１】
本発明はさらに、本発明に係る組み換えDNAベクターを有する、宿主細胞を提供する。本発明に係る宿主細胞は原核宿主細胞でもよく、真核宿主細胞でもよくバクテリオファージでもよい。
【００６２】
特に、原核宿主細胞は大腸菌、枯草菌、ストレプトミセス又はプロテウス・ミラビリスでもよい。真核宿主細胞はピキア・パストリス、出芽酵母、分裂酵母、トリコデルマ等のような菌類；ヨトウムシのような昆虫の細胞；タバコ等のような植物の細胞；及びBHK細胞、CHO細胞、COS細胞、骨髄腫細胞等のような哺乳細胞でもよい。
【００６３】
所定の態様において、本発明の宿主細胞は哺乳細胞であることが好ましく、BHK細胞、CHO細胞、NSO細胞又はCOS細胞であることがより好ましい。
【００６４】
本発明に係る上記ヒト化抗BLyS抗体の免疫性中和活性はin vitro細胞実験によって測定することができる。その結果から本発明に係るヒト化抗BLyS抗体が異なる度合でＢ細胞の増殖を抑制することがわかる。このため本発明はＢ細胞の過剰な増殖によって引き起こされる疾病を予防及び／又は治療するための方法を提供する。かかる方法は請求項１から７のいずれかに係る有効量の抗BLyS抗体を投与するものである。本発明はさらにＢ細胞の過剰な増殖によって引き起こされる疾病を予防及び／又は治療するための医薬の調製における上記抗BLyS抗体又はヒト化抗BLyS抗体の利用に係るものである。Ｂ細胞の過剰な増殖によって引き起こされる疾病はSLE、関節リウマチ、強直性関節炎、又はＢ細胞リンパ腫を含むがこれらに限定されない。
【００６５】
本発明はさらに医薬組成物を提供する。本発明に係る有効量の抗BLyS抗体又はヒト化抗BLyS抗体及び薬学的に許容される担体（carrier）を含有する。医薬組成物は本発明に係る抗BLyS抗体又はヒト化抗BLyS抗体のいずれか及び一又は二以上の薬学的に許容される担体を通常の方法により混合することで調製してもよい。また医薬品としてもよい。「薬学的に許容される担体」の用語は、一又は二以上の有機若しくは無機、天然又は合成された担体であって、当業者によく知られたものを表す。また抗体と組み合わせることで抗体の安定化と臨床適用を助けるものであってもよい。好適な担体には当業者に知られている、薬学的に許容可能な、滅菌生理食塩水及び水性の又は無水の等張性滅菌溶液並びに滅菌懸濁液が含まれる。本発明に係る有効量及び投与方法は多くの要因に依拠して定まる。かかる要因には患者の年齢、体重、性別、元々の健康状態、及び栄養状態、化合物の活性の強さ、投与時間、代謝率、疾病の重症度、並びに医師による判断が含まれる。上述の要因に沿って、当業者は有効量及び投与方法を適宜決定してもよい。
【００６６】
本発明に係る医薬組成物は好適な担体、賦形剤及び他の試薬を用いて調製してもよい。かかる試薬等により可搬性、送達性、許容性、その他を高めてもよい。剤形は例えば錠剤、散剤、パスタ剤、軟膏、ジェル、ワックス、油、脂質、小胞に包む油、DNA複合体、その他でもよい。本発明に係る医薬組成物は任意の好適な経路で投与してもよい。例えば経口投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与としてもよい。
【００６７】
図面の説明
【００６８】
図１は実施例１に係るSDS-PAGEの検出写真を示す。レーンＡは本発明に係る組み換えプラスミドによって発現させたタンパク質である。レーンＢは組み換え空のベクターを有するプラスミドである。レーンＣはタンパク質の分子量マーカーである；
【００６９】
図２は実施例２における異なる濃度のビオチン標識his-hBLyS組み換えタンパク質とBJAB細胞との結合に係るフローサイトメトリーのグラフを示す。ここで、黒線は200ng/mLのビオチンで標識されたhis-hBLyS組み換えタンパク質の群である。赤線は100ng/mLのビオチンで標識されたhis-hBLyS組み換えタンパク質の群である。青線は50ng/mLのビオチンで標識されたhis-hBLyS組み換えタンパク質の群である。紫線は25ng/mLのビオチンで標識されたhis-hBLyS組み換えタンパク質の群である。緑線はビオチン標識his-hBLyS組み換えタンパク質を含ままずSA-APCのみを含む群である；
【００７０】
図３は実施例３における免疫したマウスの血清とBJAB細胞との結合に係るフローサイトメトリーのグラフを示す。
【００７１】
図４は実施例４におけるモノクローナルハイブリドーマ細胞から分泌される抗体とBJAB細胞上のBLyS受容体との結合に係るフローサイトメトリーのグラフを示す。ここで、黒線はIgG陰性対照の群である。赤線はビオチン標識his-hBLyS組み換えタンパク質を含まずSA-APCのみを含む群である。紫線はハイブリドーマ細胞3H9の群である。青線はハイブリドーマ細胞13G8の群である；
【００７２】
図５は実施例４におけるモノクローナルハイブリドーマ細胞から分泌される抗体とBJAB細胞上のBLyS受容体との結合に係るフローサイトメトリーのグラフを示す。ここで、黒線はIgG陰性対照の群である。赤線はハイブリドーマ細胞1D12の群である。青線はハイブリドーマ細胞2G3の群である；
【００７３】
図６は実施例４におけるモノクローナルハイブリドーマ細胞から分泌される抗体とBJAB細胞上のBLyS受容体との結合に係るフローサイトメトリーのグラフを示す。ここで、黒線はIgG陰性対照の群である。赤線はハイブリドーマ細胞5A5の群である。紫線はハイブリドーマ細胞1D7の群である。青線はハイブリドーマ細胞4D3の群である；
【００７４】
図７は実施例４におけるモノクローナルハイブリドーマ細胞1D12、2B10、2G3、5A5及び13G8から分泌される抗体とhis-hBLyS組み換えタンパク質及び腫瘍壊死因子（TNF）ファミリーのタンパク質とののELISA（enzyme linked immunosorbent assay）の結果で示す。
【００７５】
図８は実施例９におけるヒト化抗BLyS 抗体によるin vitroのＢ細胞増殖抑制の結果を示す。ここで横軸はヒト化抗BLyS 抗体の濃度を表し、縦軸は蛍光強度を表す。
【００７６】
図９はBLySによって誘導されるリンパ節過形成に対する、候補となる抗体分子の抑制効果を示す。
【００７７】
図１０はBLySによって誘導される血清IgAの増加に対する、候補となる抗体分子の抑制効果を示す。
【実施例】
【００７８】
本発明の実施例は抗BLyS抗体及びその利用を開示する。かかる内容を参照して工程パラメータを適宜調整することで当業者によりこれらを実施することができる。特に、あらゆる同等の要素で置き換えること又はあらゆる同等の要素に改変することは当業者にとって自明のことであり、本発明の範囲内にある。本発明に係る産物は好ましい例として記載される。本発明の概念、思想及び範囲を超えない限り本明細書に記載される方法に則って当業者がこれを修正又は変更し、適切に組み合わせてもよい。またこれにより、本発明の技術を達成しかつ応用してもよい。
【００７９】
本発明の理解を深めるため、本発明の詳細を以下の実施例とともに紹介する。
【００８０】
実施例１：ヒトBLyS遺伝子のクローニング及び発現
【００８１】
健康なヒト末梢血を単離した後、全RNA（total RNA）を抽出し市販のRNAキット（キアゲン社）を用いて精製した。cDNAの一次鎖は精製した全RNAを鋳型として逆転写によって合成した。cDNA反応系は以下の通りであった：
【００８２】
RNase free dH2O                              9.5μL
5xRT buffer (with 25mM Mg2+)                  4μL
dNTP (10 mM each)                              2μL
RNase Inhibitor (10 U/μL)                    0.5μL
Oligo (dT) 20 (10 μmol/L)                    1μL
鋳型全RNA                                      2μL
ReverTra Ace                                  1μL
【００８３】
滅菌蒸留水を系に加え体積を合計20μLとした。
【００８４】
反応条件は：30℃  10分、42℃  30分、99℃  5分、4℃  5分。
【００８５】
反応終了後、系を5分間氷冷した。
【００８６】
ヒトBLySの完全長DNA配列を基にして、分泌型BLySクローニング用のプライマーP1及びP2を設計し合成した。逆転写により合成されたcDNAを鋳型として上流プライマーP1及び下流プライマーP2を用いてPCR増幅を行った。P1及びP2の核酸配列は以下の通りである。
【００８７】
P1：5'tacgaagctt gcatcatcat catcatcatg gcggcggctc cggcggcggc tccccgttca gggtccagaa gaa；
【００８８】
P2：5'cgacgtcgac tcacagcagt ttcaatgcac caaaaaatgt gacatc。
【００８９】
PCR増幅反応系は以下の通りであった：
【００９０】
10xtaq buffer (with 1.5 mM Mg2+)              5μL
dNTP (5 mM)                                    4μL
上流プライマー（100 ng/μL）                  1μL
下流プライマー（100 ng/μL）                  1μL
鋳型（5-50 ng/μL）                            1μL
Taq酵素（2 U/μL）                          0.5μL
【００９１】
滅菌蒸留水を系に加え体積を合計50μLとした。
【００９２】
PCRの反応手順は以下の通りであった：
【００９３】
94℃  300秒の予備変性
94℃  45秒の変性
55℃  45秒のアニーリング
72℃  45秒の伸長
変性、アニーリング及び伸長を32サイクル
72℃  200秒の伸長
【００９４】
PCR増幅産物をゲル電気泳動で回収し、Sal I及びHind IIIでダブルダイジェストし、pCDNA3.1真核生物発現プラスミド系にクローニングした。空のベクターを対照として形質転換したプラスミドを用い293T細胞（中国典型培養物保存センター）に遺伝子導入した。3日後に培地上清を回収し、Hisアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、his-hBLySの精製タンパク質を得た。SDS-PAGEで評価した。結果を図１に表す。
【００９５】
図１の結果に示されるように、本発明の組み換えプラスミドによりタンパク質が発現した。一方で、タンパク質の発現を示す明確なバンドは空のベクターに係る組み換えプラスミドにおいて見られなかった。本発明に係る組み換えプラスミドのタンパク質は約23Kbであった。これはヒトBLySアミノ酸配列から推測される分子量23Kbに近い。
【００９６】
実施例２：BJAB細胞の受容体に対する結合能の評価
【００９７】
１．his-hBLyS組み換えタンパク質のビオチン標識
【００９８】
実施例１より得られた精製後のhis-hBLyS組み換えタンパク質をDMSOに溶解したbiotin-xx-NHSと重量体積比1:4 ng/mLで混合し、室温で1時間恒温放置した。反応混合液をゲルカラムに通してクロマトグラフィーを行い、ビオチン標識his-hBLyS及び遊離ビオチンを単離した。
【００９９】
２．ビオチン標識his-hBLyS組み換えタンパク質とBJAB細胞との結合
【０１００】
単離したビオチン標識his-hBLyS組み換えタンパク質を25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL及び200 ng/mLの異なる濃度の4つの群に分けた。それぞれ1x106個のヒトバーキットリンパ腫細胞（human Burkitt lymphoma cell、BJAB）と混合し、4℃で15分間恒温放置した。PBSで3回洗浄し、最終濃度が0.2μg/mLとなるようストレプトアビジン−アロフィコシアニン（streptavidin-allophycocyanin、SA-APC）を添加した。4℃で20分間恒温放置した。PBSで3回洗浄し、フローサイトメーターで評価した。結果を図２に表す。
【０１０１】
図２の結果から、ビオチン標識組み換えヒトBLySタンパク質は様々な濃度においてBJAB細胞に結合できることが示された。
【０１０２】
実施例３：免疫マウス
【０１０３】
実施例１で得られたHis-hBLyS組み換えタンパク質を抗原として同一量の免疫アジュバント（フロイントアジュバント）と混合するために用いた。４匹の６週齢のFVBマウスのメスで試験した。３匹に免疫し、残りの一匹を対照模擬実験に利用した。一回目の免疫後、一週間に一回ずつ免疫強化をした。最後の免疫強化前に免疫したマウスの尾静脈から採血した。血清をビオチン標識his-hBLyS組み換えタンパク質に（濃度50 ng/mLで）混合し、室温で20分間恒温放置した。その後、混合液をBJAB細胞と4℃で15分間恒温放置した。通常の生理食塩水で3回洗浄し、0.2μg/mLのストレプトアビジン−アロフィコシアニンを添加して、4℃で15分間恒温放置した。通常の生理食塩水で3回洗浄した後、サンプルをフローサイトメーターで評価した。これにより免疫したマウスの血清はBLySがそのBR3-Fc受容体に結合することを阻害できるかどうか試験した。結果を図３に表す。
【０１０４】
図３の結果から、免疫された3匹のマウスのマウス１から得られた血清はビオチン標識his-hBLyS組み換えタンパク質のBJAB細胞への結合を効果的に阻害することが示された。以上により、マウス１を次の融合試験を行うための追跡試験用の個体として選抜した。
【０１０５】
実施例４：細胞融合及びモノクローナルハイブリドーマ細胞のスクリーニング
【０１０６】
最後の免疫強化後に、マウスの腿の付け根のリンパ節を回収し、通常の生理食塩水中で粉砕した。Ｂ細胞を豊富に含む上清を取り、通常の方法で電気穿孔してミエローマ細胞SP2/0と融合した。融合した細胞を96ウェルプレートに分配した。HATを含有する完全培地RPMI-1640にて、5%CO2、37℃の条件で培養した。酵素ラベル法により、各モノクローナルハイブリドーマ細胞に対してスクリーニングし、BLySタンパク質に対して結合能を有する抗体を分泌する211クローンを得た。
【０１０７】
211クローンから産生する抗体はBLySタンパク質に結合し得るものである。これらの抗体をそれぞれビオチン標識his-hBLyS組み換えタンパク質と混合し、室温で20分間恒温放置した。その後、混合液をBJAB細胞とともに4℃で15分間恒温放置した。通常の生理食塩水で3回洗浄し、0.2μg/mLのストレプトアビジン−アロフィコシアニンを加えて4℃で15分間恒温放置した。通常の生理食塩水で3回洗浄し、試料をフローサイトメーターで評価した。これにより、ビオチン標識his-hBLyS組み換えタンパク質のBJAB細胞への結合を阻害することができるモノクローナルハイブリドーマ細胞をスクリーニングした。表３に示すように、11個のモノクローナルハイブリドーマ細胞から分泌される抗体が、ビオチン標識his-hBLyS組み換えタンパク質のBJAB細胞上のBLyS受容体への結合を異なる度合で阻害するという結果を得た。1D12、2B10、2G3、5A5及び13G8と命名したモノクローナルハイブリドーマ細胞から分泌される抗体の阻害能は、3H9、1D7及び4D3と命名したモノクローナルハイブリドーマ細胞から分泌される抗体よりも強かった。1D12、2B10、2G3、5A5及び13G8の評価結果を図４から６に示す。
【０１０８】
表３  細胞から分泌され、ビオチン標識his-hBLyS組み換えタンパク質のBJAB上のBLyS受容体への結合を阻害する抗体のサブタイプ
【０１０９】
【表３】
0006006404.tif 000004
【０１１０】
実施例５：他のタンパク質である腫瘍壊死因子（TNF）ファミリーへの結合試験
【０１１１】
候補となる抗体の結合特異性をさらに試験するために、1μg/mLのhis-hBLyS組み換えタンパク質、腫瘍壊死因子−α（TNF-α）、腫瘍壊死因子−β（TNF-β）、及びBSAを96ウェルのELISAプレートに導入した。0.05MでpH9.0の炭酸塩のコート用緩衝液中にて4℃で一晩放置した。翌日、ウェル中の溶液を廃棄し、ウェルを洗浄用緩衝液で3回洗浄した。その後、3%BSAを含有するPBS溶液を添加し20分間密閉した。洗浄用緩衝液で3回洗浄した後、モノクローナルハイブリドーマ細胞1D12、2B10、2G3、5A5及び13G8から分泌される抗体の希釈液を100μＬ添加した。室温で1時間恒温放置し洗浄用緩衝液で3回洗浄した。ヤギ抗マウス抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horseradish Peroxidase、HRP）と架橋し洗浄用緩衝液で1:10000に希釈した。その後室温で１時間恒温放置した。洗浄用緩衝液で3回洗浄した後、発色のために50μＬの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（Tetramethylbenzidine、TMB）基質溶液を添加した。さらに室温で10分間反応させた。その後25μＬの0.5M硫酸溶液で反応を終了させた。450 nmの吸光度を測定した。統計結果を図７に表す。
【０１１２】
図７より、モノクローナルハイブリドーマ細胞1D12、2B10、2G3、5A5及び13G8から分泌される抗体はいずれもBLySを識別しかつ結合する一方でTNF-α又はTNF-βを識別しないことが分かる。
【０１１３】
実施例６：モノクローナルハイブリドーマ細胞から分泌される抗体の可変領域の配列の決定
【０１１４】
スクリーニングで得られたモノクローナルハイブリドーマ細胞1D12、2B10、2G3、5A5及び13G8を培養した。1000 rpmの遠心分離にて細胞を回収した。実施例１の方法に従い抽出した個々のハイブリドーマ細胞RNAを逆転写してcDNAの一次鎖を合成した。合成されたcDNA一次鎖を鋳型として用いてハイブリドーマ細胞ごとの可変領域のDNA配列を増幅した。かかる増幅反応に用いたプライマーの配列は以下の通りである：
【０１１５】
重鎖の増幅に必要なプライマーは以下の通りである：
【０１１６】
プライマー１：5'atg g(ag)a tg(cg) agctg(tg) gt(ca) at(cg) ctc tt；
【０１１７】
プライマー２：5'ggg gatatc cacc atg (ag)ac ttc ggg (tc) tg agc t(tg )g gtt tt；
【０１１８】
プライマー３：5'ggg tatatc cacc atg gct gtc ttg gggctg ctcttct；
【０１１９】
軽鎖の増幅に必要なプライマーは以下の通りである：
【０１２０】
プライマー１：5' atg gag aca gac aca ctcctgctat；
【０１２１】
プライマー２：5'atg gattttcaa gtg cag a tt tic ag；
【０１２２】
プライマー３：5'atg gag (ta)ca ca(gt)(ta)ct cag gtc ttt (ga)t a；
【０１２３】
プライマー４：5'atg (gt)cc coat) (ga) ct cag (ct)t(ct) ct(tg)gt。
【０１２４】
増幅反応系は：
【０１２５】
10xPCR buffer (with 25 mM Mg2+)                5μL
dNTP (5 mM)                                    1μL
重鎖のプライマー混合液又は軽鎖のプライマー混合液（各プライマーは100 ng/μL）
1μL
cDNA (5-50 ng/μL)                              1μL
Taq enzyme (2 U/μL)                            1μL
【０１２６】
滅菌蒸留水を系に加え体積を合計50μLとした。
【０１２７】
PCRの反応手順は：
【０１２８】
95℃  10分の予備変性
94℃  1分の変性
55℃  1分のアニーリング
72℃  115秒の伸長
変性、アニーリング及び伸長を30サイクル
72℃  10分の伸長
【０１２９】
PCR増幅産物をゲル電気泳動で回収し、生物学の会社に送り配列決定した。www.expasy.chによって配列を得るためにSAGE法を行った。軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を表４に示す。導き出したアミノ酸配列を基にKabat分類による分析を行い個々のハイブリドーマ細胞1D12、2B10、2G3、5A5及び13G8の重鎖及び軽鎖のFR領域及びCDR領域を決定した。個々のハイブリドーマ細胞1D12、2B10、2G3、5A5及び13G8の軽鎖可変領域のアミノ酸配列及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を表４に示す。
【０１３０】
表４  抗BLyS抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列
【０１３１】
【表４】
0006006404.tif 000005
【０１３２】
実施例７：抗BLyS抗体のヒト化
【０１３３】
個々のハイブリドーマから分泌される抗体の可変領域配列に対してヒト化を行った。
【０１３４】
ヒト化の手順は主に以下の重要な工程からなる。
【０１３５】
Ａ．個々のハイブリドーマから分泌される抗体の遺伝子配列をヒト胚系の抗体遺伝子配列と比較し高い相同性を有する配列を見つける。
【０１３６】
Ｂ．in silico分析によってHLA-DRとの親和性を試験し、ヒト胚系の読み枠の配列であって弱い親和性を有するものを選抜する。
【０１３７】
Ｃ．可変領域及びそれらの周辺の読み枠のアミノ酸配列をコンピューターシミュレーション技術による分子の結合を利用して分析し立体的な組み合わせ形状を調べた。静電力、ファンデルワールス力、疎水性及び親水性、並びにエントロピー値を計算することで、
個々のハイブリドーマ細胞から分泌される抗体の遺伝子配列中の個々の重要なアミノ酸であってBLySと相互作用し特別なフレームワークを維持することができるものを分析する。かかるアミノ酸を選択されたヒト胚系の遺伝子の読み枠に移入する。以上により４種のヒト化抗BLyS抗体を得た。それらの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列を表５に表す。
【０１３８】
表５  ヒト化抗BLyS抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列
【０１３９】
【表５】
0006006404.tif 000006
【０１４０】
実施例８：ヒト化抗BLyS抗体の発現ベクターの構築
【０１４１】
上流プライマーVH5及び下流プライマーVH3を用いてヒト血球から重鎖定常領域のFcフラグメントを増幅した。上流プライマーVL5及び下流プライマーVL3を用いてヒト血球から軽鎖k定常領域のFcフラグメントを増幅した。Xho Iエンドヌクレアーゼ認識部位及びAge Iエンドヌクレアーゼ認識部位を重鎖に設けた。Sma Iエンドヌクレアーゼ認識部位及びDra IIIエンドヌクレアーゼ認識部位を軽鎖フラグメントに設けた。pCDNA 3.1プラスミドに導入し、クローンが正確であることを配列解読により確認した。以降の実験材料はいずれも上記一連のプラスミドによって形質導入した細胞から抽出した。VH5、VH3、VL5及びVL3の核酸配列は以下の通りである：
【０１４２】
VH5：5'gcggaattc(c/g)a ggtg(a/c)agct(g/t)c a(c/g)(c/g)a(a/g)tc(a/t)gg；
【０１４３】
VH3：5'accgccggat ccaccaccgc ccg agccacc gccacctgcg gagacgatga cc(a/g)tgg tccc；
【０１４４】
VL5：5'ggtggtggatccggcggtgg cggttccgacattgtgatgacccagtctcca；
【０１４５】
VL3：5'ggatacagttggtgcagcctcgagctacc gttt。
【０１４６】
得られた４種のヒト化抗体をBLyS-I、BLyS-II、BLyS-III及びBLyS-IVと命名した。
【０１４７】
実施例９：ヒト化抗BLyS抗体によるin vitroのＢ細胞増殖阻害
【０１４８】
ヒト末梢血からCD19標識MACS磁気ビーズを用いてＢ細胞を抽出した。Ｂ細胞はプレートあたり100,000個ずつ96ウェルプレート内で継代培養した。組み換えBLyS（10 ng/mL）及びヤギ抗ヒトIgMFabフラグメント（4 μg/mL）を完全培地中に添加しＢ細胞を刺激して成長を促進した。実施例８で得られた個々のヒト化抗BLyS抗体を各種濃度で培地中に添加し6日間培養した。その後、Ｂ細胞の数をプロメガ社のCelltiter Gloで測定した。数値（RLU）は蛍光により計数されたものである。結果を図１３に表す。
【０１４９】
図８は、実施例８で作製した４種のヒト化抗BLyS抗体BLyS-I、BLyS-II、BLyS-III及びBLyS-IVはＢ細胞の成長を異なる度合で阻害できることを示す。
【０１５０】
上記実施例は本発明の方法及びその概念の理解を助けるためにのみ用いられる。本発明の本質から離れない限り、本発明の範囲内で、当業者の手により本発明の改変又は修正を行ってもよい。
【０１５１】
実施例１０：ヒト化抗BLyS抗体に対するin vivoの薬物動態試験
【０１５２】
１）Ｂ細胞を刺激し増殖させるためのBLySの分量の決定
【０１５３】
異なる濃度の組み換えBLySをマウスの尾静脈に注射した。マウスの体重（グラム）、脾臓重量（mg）、リンパ節重量（mg）を一週間後に測定した。結果を表６に示す。
【０１５４】
【表６】
0006006404.tif 000007
【０１５５】
結果から、in vivoにおいて自己の産生するBLySが0.3 mg/kgあることでＢ細胞を効果的に刺激し成長を促すことが示された。BLySによって刺激された細胞の増殖を評価するための主要な薬力学的評価指標としてリンパ節の重量を用いることができる。これはリンパ節の50%はＢ細胞であるためである。またＢ細胞の比率はBLySで刺激されるとより高くなる。
【０１５６】
２）BLySに対する抗BLyS抗体の阻害効果のin vivo試験
【０１５７】
上記に基づき、0.3 mg/kgのBLySを0.05 mg/kgのマウス1D12、2B10、2G3及び5A5並びにヒトBLyS-I（13G8）と混合した。その後、これらのリンパ節重量及び血清中のIgA量を測定した（図９及び図１０参照）。
【０１５８】
結果から以下が示された：マウス1D12、2B10、2G3、5A5及びヒトBLyS-I（13G8）はBLySを効果的に阻害する。
【図１】
0006006404.tif 000009
【図２】
0006006404.tif 000010
【図３】
0006006404.tif 000011
【図４】
0006006404.tif 000012
【図５】
0006006404.tif 000013
【図６】
0006006404.tif 000014
【図７】
0006006404.tif 000015
【図８】
0006006404.tif 000016
【図９】
0006006404.tif 000017
【図１０】
0006006404.tif 000018
【配列表】
0006006404000001.app