(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法であって、下記の工程：
ａ）少なくとも１つの候補化合物を準備する工程；
ｂ）少なくとも１つの候補化合物を、ＥＲＫ  ＭＡＰＫタンパク質およびＭｙＤ８８タンパク質と、ＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８を前記候補分子の不存在下で相互作用させるのに好適な条件下で接触させる工程；
ｃ）少なくとも１つの候補化合物の存在下および不存在下で測定した場合のＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８の相互作用を決定する工程；および
ｄ）ＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８の相互作用を阻害する候補化合物を選択する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
ＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８の一方または両方が検出可能な標識と結合されている、請求項１に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【請求項３】
ＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８の相互作用が、ツーハイブリッドシステム、アフィニティークロマトグラフィー、共免疫沈降法、細胞下分画および大分子複合体の単離、免疫ブロット法、免疫標識法、近接ライゲーションアッセイ、免疫沈降アッセイ、ｂｉａｃｏｒｅアッセイまたはＧＳＴプルダウンアッセイを用いて決定される、請求項１または２に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬がオキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ブレオマイシン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【請求項５】
前記癌が結腸直腸癌、腸癌、黒色腫、肺癌および頸癌からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【請求項６】
癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法であって、下記の工程：
ａ）少なくとも１つの候補化合物を準備する工程；
ｂ）誘導プロモーターの制御下でＭｙＤ８８を安定発現し、かつ、ＳＲＥプロモーター、ＥＬＫプロモーターおよびＭｙＣプロモーターから選択されるＭＡＰＫ経路由来のプロモーターの制御下でリポーター遺伝子を発現する形質転換細胞を準備する工程；
ｃ）少なくとも１つの候補化合物の存在下で前記形質転換細胞においてＭＹＤ８８の過剰発現を誘導する工程；
ｄ）前記リポーター遺伝子の発現を測定し、前記リポーター遺伝子の発現を阻害する少なくとも１つの候補化合物を選択する工程；
ｅ）ＭｙＤ８８およびＭｙｃ癌遺伝子でのトランスフェクションにより形質転換された不死化線維芽細胞を準備する工程；
ｆ）工程ｄ）で選択された少なくとも１つの候補化合物の存在下および少なくとも１つのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の存在下でフォーカス形成をモニタリングし、フォーカス形成に対する前記ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の阻害効果を増強する候補化合物を選択する工程
を含んでなる、方法。
【請求項７】
工程ｂ）において、ＭＡＰＫ経路由来のプロモーターがＳＲＥプロモーターである、請求項６に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【請求項８】
下記の工程：
・誘導プロモーターの制御下でＭｙＤ８８を安定発現し、かつ、Ｎｆ−ｋＢプロモーターおよびＩＳＲＥプロモーターから選択される炎症経路由来のプロモーターの制御下でリポーター遺伝子を発現する形質転換細胞を準備する工程；
・少なくとも１つの候補化合物の存在下で前記形質転換細胞においてＭＹＤ８８の過剰発現を誘導する工程；
・前記リポーター遺伝子の発現を測定し、前記リポーター遺伝子の発現を阻害しない候補化合物を選択する工程
をさらに含んでなる、請求項６または７に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【請求項９】
前記炎症経路由来のプロモーターがＮｆ−ｋＢである、請求項８に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【請求項１０】
工程ｂ）において、前記細胞がＨＣＴ１１６細胞株、Ａ３７５細胞株およびＨｅＬａ細胞株から選択される、請求項６〜９のいずれか一項に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【請求項１１】
前記誘導プロモーターが抗生物質誘導プロモーターである、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【請求項１２】
前記不死化線維芽細胞がＮＩＨ３Ｔ３不死化線維芽細胞である、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【請求項１３】
前記癌が結腸直腸癌、腸癌、黒色腫、肺癌および頸癌からなる群から選択される、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬がオキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ブレオマイシンおよびそれらの混合物から選択される、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【請求項１５】
前記工程ａ）の候補化合物が請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法に従って選択される、請求項６〜１４のいずれか一項に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療おいて使用するための新規な化合物を同定するための方法、および癌を治療するためのＭｙＤ８８／Ｅｒｋ  ＭＡＰキナーゼ相互作用を阻害する化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症が発癌の促進因子であるということは十分に確立されている。従って、ＴＬＲシグナル伝達経路のアダプタータンパク質であるＭｙＤ８８は、炎症におけるその役割を介して発癌に関連づけられている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明はここで、驚くことに、ＭｙＤ８８が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｒａｓ依存性発癌に本質的役割を果たしていることを示す。具体的には、ＭｙＤ８８は、保存されているモチーフを介してＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼと結合し、従って、その特異的ホスファターゼＭＫＰ３によるＥＲＫの不活性化を遮断し、ｒａｓカノニカル経路の活性の増幅をもたらす。ヒト癌におけるこの機構の関連性が実証され、ＭｙＤ８８は多くのヒト癌で過剰発現され、ホスホ−ＥＲＫに会合していると思われる。さらに、実験データは、ＭｙＤ８８はｒａｓシグナル伝達経路、およびに、この癌遺伝子により誘導される悪性化に直接関与していることを示す。
【０００４】
ＭｙＤ８８／Ｅｒｋ  ＭＡＰキナーゼ相互作用の阻害剤は、腫瘍細胞でアポトーシスを誘導する。興味深いことに、ＭｙＤ８８／Ｅｒｋ  ＭＡＰキナーゼの阻害剤とＤＮＡ損傷誘導化学療法との間には相乗作用が見られる。よって、本発明は、第一選択療法がＤＮＡ損傷誘導化学療法薬に基づくものである癌において新たな治療展望を提供する。ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬とＭｙＤ８８／Ｅｒｋ  ＭＡＰキナーゼ相互作用の阻害との組合せは、感受性腫瘍における用量の減少を可能とし、従って、患者の忍容性を高め、または極めて効率的なＤＮＡ修復機構を有する耐性癌細胞株において感受性を再誘導する。
【０００５】
概要
１）本発明は、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法であって、下記の工程：
ａ）少なくとも１つの候補化合物を準備する工程；
ｂ）少なくとも１つの候補化合物を、ＥＲＫ  ＭＡＰＫタンパク質およびＭｙＤ８８タンパク質と、ＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８を前記候補分子の不存在下で相互作用させるのに好適な条件下で接触させる工程；
ｃ）少なくとも１つの候補化合物の存在下および不存在下で測定した場合のＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８の相互作用を決定する工程；および
ｄ）ＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８の相互作用を阻害する候補化合物を選択する工程
を含んでなる方法に関する。
【０００６】
２）ＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８の一方または両方が検出可能な標識と結合されている、１に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【０００７】
３）ＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８の相互作用が、ツーハイブリッドシステム、アフィニティークロマトグラフィー、共免疫沈降法、細胞下分画および大分子複合体の単離、免疫ブロット法、免疫標識法、近接ライゲーションアッセイ、免疫沈降アッセイ、ｂｉａｃｏｒｅアッセイまたはＧＳＴプルダウンアッセイを用いて決定される、１または２に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【０００８】
４）前記ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬がオキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ブレオマイシン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、１〜３のいずれかに記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【０００９】
５）前記癌が結腸直腸癌、腸癌、黒色腫、肺癌および頸癌（cervical cancer）からなる群から選択される、１〜４のいずれかに記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【００１０】
６）癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法であって、下記の工程：
ａ）少なくとも１つの候補化合物を準備する工程；
ｂ）誘導プロモーターの制御下でＭｙＤ８８を安定発現し、かつ、ＳＲＥプロモーター、ＥＬＫプロモーターおよびＭｙＣプロモーターから選択されるＭＡＰＫ経路由来のプロモーターの制御下でリポーター遺伝子を発現する形質転換細胞を準備する工程；
ｃ）少なくとも１つの候補化合物の存在下で前記形質転換細胞においてＭＹＤ８８の過剰発現を誘導する工程；
ｄ）前記リポーター遺伝子の発現を測定し、前記リポーター遺伝子の発現を阻害する少なくとも１つの候補化合物を選択する工程；
ｅ）ＭｙＤ８８およびＭｙｃ癌遺伝子でのトランスフェクションにより形質転換された不死化線維芽細胞を準備する工程；
ｆ）工程ｄ）で選択された少なくとも１つの候補化合物の存在下および少なくとも１つのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の存在下でフォーカス形成をモニタリングし、フォーカス形成に対する前記ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の阻害効果を増強する候補化合物を選択する工程
を含んでなる、方法。
【００１１】
７）工程ｂ）において、ＭＡＰＫ経路由来のプロモーターがＳＲＥプロモーターである、６に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【００１２】
８）下記の工程：
・誘導プロモーターの制御下でＭｙＤ８８を安定発現し、かつ、Ｎｆ−ｋＢプロモーターおよびＩＳＲＥプロモーターから選択される炎症経路由来のプロモーターの制御下でリポーター遺伝子を発現する形質転換細胞を準備する工程；
・少なくとも１つの候補化合物の存在下で前記形質転換細胞においてＭＹＤ８８の過剰発現を誘導する工程；
・前記リポーター遺伝子の発現を測定し、前記リポーター遺伝子の発現を阻害しない候補化合物を選択する工程
をさらに含んでなる、６または７に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【００１３】
９）前記炎症経路由来のプロモーターがＮｆ−ｋＢである、８に記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【００１４】
１０）工程ｂ）において、前記細胞がＨＣＴ１１６細胞株、Ａ３７５細胞株およびＨｅＬａ細胞株から選択される、６〜９のいずれかに記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【００１５】
１１）前記誘導プロモーターが抗生物質誘導プロモーターである、６〜１０のいずれかに記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【００１６】
１２）前記リポーター遺伝子がルシフェラーゼである、６〜１１のいずれかに記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【００１７】
１３）前記不死化線維芽細胞がＮＩＨ３Ｔ３不死化線維芽細胞である、６〜１２のいずれかに記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【００１８】
１４）前記癌が結腸直腸癌、腸癌、黒色腫、肺癌および頸癌からなる群から選択される、６〜１３のいずれかに記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【００１９】
１５）前記ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬がオキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、およびそれらの混合物から選択される、６〜１４のいずれかに記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【００２０】
１６）前記工程ａ）の候補化合物が１〜５のいずれか一項に記載の方法に従って選択される、６〜１４のいずれかに記載の、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法。
【００２１】
本発明は、癌治療のための化合物選択するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、下記の工程：
ａ）候補化合物を準備する工程；
ｂ）誘導プロモーターの制御下でＭｙＤ８８を安定発現し、かつ、ＳＲＥプロモーター、ＥＬＫプロモーターおよびＭｙＣプロモーターから選択されるＭＡＰＫ経路由来のプロモーターの制御下でリポーター遺伝子を発現する形質転換細胞を準備する工程；
ｃ）前記候補化合物の存在下で前記形質転換細胞においてＭＹＤ８８の過剰発現を誘導する工程；
ｄ）前記リポーター遺伝子の発現を測定し、前記リポーター遺伝子の発現を阻害する候補化合物を選択する工程；
ｅ）ＭｙＤ８８およびＭｙｃ癌遺伝子でのトランスフェクションにより形質転換された不死化線維芽細胞を準備する工程；
ｆ）工程ｄ）で選択された候補化合物の存在下でフォーカス形成をモニタリングし、フォーカス形成が阻害されていれば前記化合物を選択する工程
を含んでなる方法に関する。
【００２２】
好ましくは、本発明の方法において、工程ｂ）におけるＭＡＰＫ経路由来のプロモーターはＳＲＥプロモーターである。
【００２３】
好ましい実施態様において、本発明の方法は、下記の工程：
・誘導プロモーターの制御下でＭｙＤ８８を安定発現し、かつ、Ｎｆ−ｋＢプロモーターおよびＩＳＲＥプロモーターから選択される炎症経路由来のプロモーターの制御下でリポーター遺伝子を発現する形質転換細胞を準備する工程；
・候補化合物の存在下で前記形質転換細胞においてＭＹＤ８８の過剰発現を誘導する工程；
・前記リポーター遺伝子の発現を測定し、前記リポーター遺伝子の発現を阻害しない候補化合物を選択する工程
をさらに含んでなる。
【００２４】
好ましくは、炎症経路由来のプロモーターは、Ｎｆ−ｋＢプロモーターである。
【００２５】
好ましい実施態様において、本発明の方法における細胞は、ＨＣＴ１１６細胞株、Ａ３７５細胞株およびＨｅＬａ細胞株から選択される。
【００２６】
好ましくは、誘導プロモーターは、抗生物質誘導プロモーターである。
【００２７】
好ましくは、リポーター遺伝子はルシフェラーゼである。
【００２８】
本発明の方法において、不死化線維芽細胞は、好ましくは、ＮＩＨ３Ｔ３不死化線維芽細胞である。
【００２９】
本発明はまた、癌治療のための化合物を選択するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、前記化合物がＭｙＤ８８タンパク質およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの間の相互作用を阻害するかどうかを、近接ライゲーションアッセイ、免疫沈降アッセイ、ｂｉａｃｏｒｅアッセイ、ＧＳＴプルダウンアッセイまたは酵母ツーハイブリッドシステムにより決定することを含んでなる方法に関する。
【００３０】
本発明はまた、癌細胞においてアポトーシスを誘導することによる癌の治療において使用するための、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害するペプチドならびにヒトＭｙｄ８８の発現を阻害する干渉ＲＮＡから選択される、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害する化合物に関する。
【００３１】
好ましくは、本発明による化合物は、結腸直腸癌、腸癌、黒色腫、肺癌および頸癌から選択される癌の治療に使用するためのものである。
【００３２】
有利には、癌は結腸直腸癌である。
【００３３】
本発明はまた、癌の治療において使用するための、ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬と、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害するペプチドならびにヒトＭｙｄ８８の発現を阻害する干渉ＲＮＡから選択される、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害する化合物とを含んでなる組成物に関する。
【００３４】
本発明はさらに、癌の治療においてＤＮＡ損傷誘導化学療法薬と併用するための、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害するペプチドならびにヒトＭｙｄ８８の発現を阻害する干渉ＲＮＡから選択される、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害する化合物を含んでなる組成物に関する。
【００３５】
本発明の方法および組成物において、ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬は、好ましくは、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、エトポシドおよびそれらの混合物から選択される。
【００３６】
本発明はまた、癌の治療において使用するための、ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬と、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害するペプチドならびにヒトＭｙｄ８８の発現を阻害する干渉ＲＮＡから選択される、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害する化合物とを含んでなるパーツキットに関する。
【００３７】
配列表
配列番号１：抗ＭｙＤ８８  ｓｉＲＮＡ  ＭｙＤ２
配列番号２：抗ＭｙＦ８８  ｓｉＲＮＡ  ＭｙＤ３
配列番号３：抗ＭｙＤ８８  ｓｈＲＮＡｍｉｒセンス
配列番号４：抗ＭｙＤ８８  ｓｈＲＮＡｍｉｒアンチセンス
配列番号５：抗ＭｙＤ８８  ｓｈＲＮＡｍｉｒ
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】ＭｙＤ８８サイレンシングは、結腸癌細胞株においてｐ５３依存性アポトーシスを誘導する。図１Ａは、ｓｉＲＮＡによるＭｙｄ８８サイレンシング時の種々の結腸癌細胞株におけるアポトーシス分析を示す。
【図１Ｂ】ＭｙＤ８８サイレンシングは、結腸癌細胞株においてｐ５３依存性アポトーシスを誘導する。図１Ｂは、２つの異なるｓｉＲＮＡによるＭｙＤ８８サイレンシング時のＨＣＴ１１６  ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−細胞におけるアポトーシス分析を示す。
【図２】図２は、ｉｎ  ｖｉｖｏ併用アッセイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
炎症は発癌の促進因子であるということは十分に確立されている。従って、ＴＬＲシグナル伝達経路のアダプタータンパク質であるＭｙＤ８８は、炎症におけるその役割を介して発癌に関連づけられている。本発明はここで、驚くことに、ＭｙＤ８８が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｒａｓ依存性発癌に本質的役割を果たしていることを示す。ＭｙＤ８８の阻害は、癌細胞においてアポトーシスを誘導することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで発癌を軽減する。ＤＮＡ損傷誘導化学療法との相乗作用が見られる。
【００４０】
本発明は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路を介してＭｙＤ８８活性を特異的に阻害する化合物を選択および同定するための方法に関する。これらの化合物は、ＤＮＡ修復を阻害し、従って、癌の治療に従来から使用されているＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強する。
【００４１】
用語「ＭｙＤ８８」は、ジーンバンク番号Ｕ７０４５１．１（２１−０３−１９９７）で特定されるミエロイド分化一次応答(Myeloid differentiation primary response)ポリペプチドまたは遺伝子を意味する。ＭｙＤ８８は、ＴＬＲシグナル伝達経路におけるアダプタータンパク質であるとされている。炎症経路において、ＭｙＤ８８は転写因子ＮＦ−κΒを活性化する。本発明は、ここで、驚くことに、ＭｙＤ８８がＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の活性化に関与することを示す。
【００４２】
用語「ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼ」は、ジーンバンク番号（遺伝子ＩＤ：５５９５、ＮＧ＿０２９９３６．１）で特定される細胞外調節キナーゼ(Extracellular regulated kinase)遺伝子を意味する。この遺伝子によりコードされているタンパク質は、ＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーである。細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）としても知られるＭＡＰキナーゼは、様々な細胞外シグナルに応答して増殖、分化、および細胞周期の進行などの様々な細胞プロセスを調節するシグナル伝達カスケードに作用する。このキナーゼは上流のキナーゼによって活性化され、その結果、核へ移行され、そこで核標的をリン酸化する。
【００４３】
用語「ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強する化合物」は、ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を促進するまたは増加させることのできる化合物を意味する。これらの化合物は、ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬と相乗作用を持ち得る。「相乗作用」とは、一緒にした２つの薬物の合わせた作用がその２つの薬物単独の作用の合計値よりも大きいことと定義される。これらの化合物はまた、ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬に耐性のある腫瘍細胞をこれらのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬に対して感受性とすることもできる。これらの化合物は、より活性の高いまたはより効果的なＤＮＡ損傷誘導化学療法薬を作出することができる。
【００４４】
ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬とＭｙＤ８８／Ｅｒｋ  ＭＡＰキナーゼ相互作用の阻害との組合せは、感受性腫瘍における用量減を可能とし、従って、患者の忍容性を高め、または極めて効率的なＤＮＡ修復機構を有する耐性癌細胞株において感受性を再誘導する。
【００４５】
用語「ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬」は、ＤＮＡ付加物、ＤＮＡヌクレオチドの不可逆的修飾、またはＤＮＡ鎖の破断を引き起こす化学薬剤を意味する。修復システムは軽微な損傷は修復することができるが、損傷が修復できない場合は細胞死をもたらす。これらの薬剤は、癌、特に、結腸、腸、肺、乳房、造血系、胃、前立腺などの癌といった、Ｒａｓ経路の１以上の成分（例えば、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、ＭＥＫ、Ｅｒｋその他）の突然変異または活性化を伴う癌の治療に使用される様々な系統の化合物を含んでなる。ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬は、好ましくは、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ブレオマイシンおよびそれらの混合物から選択される。
【００４６】
癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法であって、下記の工程：
ａ）少なくとも１つの候補化合物を準備する工程；
ｂ）少なくとも１つの候補化合物を、ＥＲＫ  ＭＡＰＫタンパク質およびＭｙＤ８８タンパク質と、ＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８を前記候補分子の不存在下で相互作用させるのに好適な条件下で接触させる工程；
ｃ）少なくとも１つの候補化合物の存在下および不存在下で測定した場合のＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８の相互作用を決定する工程；および
ｄ）ＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８の相互作用を阻害する候補化合物を選択する工程
を含んでなる方法に関する。
【００４７】
本発明の方法において、ＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８の一方または両方は、好ましくは、検出可能な標識と結合されている。
【００４８】
本発明の方法において、ＥＲＫ  ＭＡＰＫおよびＭｙＤ８８の相互作用は、好ましくは、ツーハイブリッドシステム、アフィニティークロマトグラフィー、共免疫沈降法、細胞下分画および大分子複合体の単離、免疫ブロット法、免疫標識法、近接ライゲーションアッセイ、免疫沈降アッセイ、ｂｉａｃｏｒｅアッセイまたはＧＳＴプルダウンアッセイを用いて決定される。
【００４９】
本発明の方法において、ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬は、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ブレオマイシン、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００５０】
本発明の方法は、好ましくは、結腸直腸癌、腸癌、黒色腫、肺癌および頸癌からなる群から選択される癌の治療において使用するための化合物を選択するためのものである。
【００５１】
本発明は、より詳しくは、候補化合物をスクリーニングまたは選択する方法であって、候補化合物が、ＭｙＤ８８タンパク質およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を調節する、すなわち、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの結合を妨げる、あるいはまた、このようにして形成されたＭｙＤ８８／ＥＲＫ  ＭＡキナーゼ複合体を部分的または完全に解離させる、その能力に関してアッセイされる方法に関する。好ましくは、本発明は、ＭｙＤ８８／ＥＲＫ  ＭＡＰＫ相互作用を調節することができる化合物、特に、癌治療のために有用な化合物をスクリーニングする方法であって、ＭｙＤ８８／ＥＲＫ  ＭＡＰＫ相互作用のアンタゴニストが同定される方法に関する。候補化合物は、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰＫの相互作用に干渉する、または前記相互作用を妨げる、その能力に関してアッセイすることができる。有利には、ＭｙＤ８８タンパク質、ＥＲＫ  ＭＡＰＫタンパク質および少なくとも１つの候補化合物は、それらを相互作用させる、特にＥＲＫ  ＭＡＰＫ／ＭｙＤ８８複合体を解離させるのに好適な条件下で接触させ、インキュベートする。あるいは、ＭｙＤ８８タンパク質およびＥＲＫ  ＭＡＰＫタンパク質は、ＥＲＫ  ＭＡＰＫ／ＭｙＤ８８複合体の形成に好適な条件下で接触させる。少なくとも１つの候補化合物をさらに加え、これら３つの成分を、それらを相互作用させる、および場合によりＥＲＫ  ＭＡＰＫ／ＭｙＤ８８複合体を解離させるのに好適な条件下で接触させる。
【００５２】
ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰＫの相互作用を調節する、またはＭｙＤ８８／ＥＲＫ  ＭＡＰＫ複合体を結合させて調節する候補化合物の能力の決定は、従来の分離および／または検出方法などの、当業者に周知の任意の適当な手段によって達成することができる。例えば、ＭｙＤ８８／ＥＲＫ  ＭＡＰＫ複合体は、漸増濃度の候補化合物の存在下で定量することができ、ＭｙＤ８８／ＥＲＫ  ＭＡＰＫの結合は、タンパク質またはペプチド結合のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイなどの従来の分析手順を用いて行うことができ、例えば、この場合、ＭＹＤ８８またはＥＲＫ  ＭＡＰＫ成分の一方または両方を検出可能な標識（ＢＲＥＴ、ＦＲＥＴ、ＨＴＲＦ）と結合させ、かつ／または固定化する。一般に、ツーハイブリッドシステム、アフィニティークロマトグラフィー、共免疫沈降法、細胞下分画および大分子複合体の単離、免疫ブロット法、または免疫標識法、近接ライゲーションアッセイ、免疫沈降アッセイ、ｂｉａｃｏｒｅアッセイ、ＧＳＴプルダウンアッセイ、または場合により、蛍光、同位元素または発色標識などの検出可能なマーカーと組み合わせてもよい酵母ツーハイブリッドシステムなど、陽性のタンパク質−タンパク質相互作用の検出に従来から用いられている方法を用いて、前記相互作用に干渉する、または前記相互作用を妨げる化合物を同定することもできる。
【００５３】
本発明はまた、癌治療のためのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の効果を増強することができる化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて選択するための方法であって、下記の工程：
ａ）少なくとも１つの候補化合物を準備する工程；
ｂ）誘導プロモーターの制御下でＭｙＤ８８を安定発現し、かつ、ＳＲＥプロモーター、ＥＬＫプロモーターおよびＭｙＣプロモーターから選択されるＭＡＰＫ経路由来のプロモーターの制御下でリポーター遺伝子を発現する形質転換細胞を準備する工程；
ｃ）少なくとも１つの候補化合物の存在下で前記形質転換細胞においてＭＹＤ８８の過剰発現を誘導する工程；
ｄ）前記リポーター遺伝子の発現を測定し、前記リポーター遺伝子の発現を阻害する少なくとも１つの候補化合物を選択する工程；
ｅ）ＭｙＤ８８およびＭｙｃ癌遺伝子でのトランスフェクションにより形質転換された不死化線維芽細胞を準備する工程；
ｆ）工程ｄ）で選択された少なくとも１つの候補化合物の存在下および少なくとも１つのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の存在下でフォーカス形成をモニタリングし、フォーカス形成に対する前記ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の阻害効果を増強する候補化合物を選択する工程
を含んでなる方法に関する。
【００５４】
本発明の方法は、ＭｙＤ８８によるＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の活性化を阻害する化合物の選択を提供する。
【００５５】
用語「ＭＡＰＫ経路」、「ＥＲＫ経路」および「ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路」は、本明細書では相違なく使用され、種々の遺伝子の転写を調節するタンパク質キナーゼのカスケードに関与するシグナル伝達経路を意味する。この経路は様々な癌に関連づけられている。
【００５６】
任意の候補化合物が本発明の方法において選択可能である。好ましい実施態様において、候補化合物は、化学化合物またはペプチドなどの、細胞に拡散可能な小化合物である。
【００５７】
本発明のアッセイは、誘導プロモーターの制御下でＭｙＤ８８を発現するとともにＳＲＥプロモーター、ＥＬＫプロモーターおよびＭｙＣプロモーターから選択されるＭＡＰＫ経路由来のプロモーターの制御下でリポーター遺伝子を発現する形質転換細胞に基づく。
【００５８】
任意の好適な細胞が本発明の方法において使用可能であり、好ましくは、細胞は真核細胞であり、最も好ましくは、哺乳動物細胞である。不死化細胞株が本発明の方法において好ましい。有利には、細胞は、ＨＣＴ１１６細胞株、Ａ３７５細胞株およびＨｅＬａ細胞株からなる群から選択される。細胞は、既知の技術に従って形質転換される。
【００５９】
ＭｙＤ８８は、形質転換細胞において誘導プロモーターの制御下で発現させる。当業者に公知の任意の誘導プロモーターおよびそれらを活性化する任意の因子が本発明の方法において使用可能である。好ましい実施態様において、誘導プロモーターは抗生物質誘導プロモーターであり、そして、因子／インデューサーは抗生物質である。好ましい実施態様において、プロモーターは、ドキシサイクリン(doxycyclin)により誘導される。
【００６０】
形質転換細胞は、ＳＲＥプロモーター、ＥＬＫプロモーターおよびＭｙＣプロモーターから選択されるＭＡＰＫ経路由来のプロモーターの制御下でリポーター遺伝子をさらに発現する。発現が容易に同定および測定される任意のリポーター遺伝子が本発明の方法において使用可能である。ルシフェラーゼおよびＧＦＰは、慣用されるリポーター遺伝子の一例である。好ましい実施態様において、リポーター遺伝子はルシフェラーゼである。活性が測定されるリポーター遺伝子は、ＳＲＥプロモーター、ＥＬＫプロモーターまたはＭｙＣプロモーターの制御下で発現される。
【００６１】
用語「ＳＲＥプロモーター」は、「血清応答エレメント」を意味し、これはリポーター遺伝子の上流で使用されるＤＮＡ配列（ＣＣ（Ａ／Ｔ）６ＧＧ）であり、ジーンバンク番号（遺伝子ＩＤ：６７２２、ＮＭ＿００３１３１．２）で特定されるＳＲＦ遺伝子によりコードされるＳＲＦ（血清応答因子）タンパク質の結合部位であることが知られている。
【００６２】
用語「ＥＬＫプロモーター」は、ジーンバンク番号（遺伝子ＩＤ：２００２、ＮＧ＿００９２２２．１）で特定されるＥ  ｔｗｅｎｔｙ−ｓｉｘ（ＥＴＳ）様転写因子遺伝子のプロモーターを意味する。この遺伝子によりコードされているタンパク質は、ｒａｓ−ｒａｆ−ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードの核標的である。
【００６３】
用語「ＭｙＣプロモーター」は、ジーンバンク番号（遺伝子ＩＤ：４６０９、ＮＧ＿００７１６１．１）で特定されるＣ−骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ遺伝子のプロモーターを意味する。Ｍｙｃは、ＥＧＦ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路）などの種々のマイトジェンシグナル（mitogenic signal）上で活性化される。その標的遺伝子の発現を改変することにより、Ｍｙｃの活性化は、細胞増殖の誘導、細胞成長、アポトーシス、分化および幹細胞自己再生の調節などの多くの生物作用をもたらす。
【００６４】
好ましくは、本発明の方法において、工程ｂ）におけるＭＡＰＫ経路由来のプロモーターは、ＳＲＥプロモーターである。
【００６５】
ＭｙＤ８８の過剰発現は、因子／インデューサーが培養培地に添加された場合に誘導され、このインデューサーの賦活化の際に解除される。ＭｙＤ８８の過剰発現は、ＭＡＰＫ  ＥＲＫ経路を活性化する。本発明の方法において、ＭｙＤ８８の過剰発現は、候補化合物の存在下で誘導される。ＭｙＤ８８によるＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路活性化の、候補化合物による阻害は、ＳＲＥ、ＥＬＫおよびＭｙＣから選択されるＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路由来のプロモーターの制御下でリポーター遺伝子の発現を測定することによってモニタリングする。形質転換細胞においてリポーター遺伝子の発現を阻害する候補化合物が、本発明の方法において選択される。
【００６６】
ＭｙＤ８８は炎症経路の活性化に関して知られているので、本発明の方法は、有利には、炎症経路を阻害する化合物を排除するための工程、または炎症経路を有意には阻害しない化合物を選択するための工程を含んでなり得る。よって、本発明の方法は、下記の工程：
・誘導プロモーターの制御下でＭｙＤ８８を安定発現し、かつ、Ｎｆ−ｋＢプロモーターおよびＩＳＲＥプロモーターから選択される炎症経路由来のプロモーターの制御下でリポーター遺伝子を発現する形質転換細胞を準備する工程；
・少なくとも１つの候補化合物の存在下で前記形質転換細胞においてＭＹＤ８８の過剰発現を誘導する工程；
・前記リポーター遺伝子の発現を測定し、前記リポーター遺伝子の発現を阻害しない候補化合物を選択する工程
をさらに含んでなり得る。
【００６７】
これらの付加的工程は上記のように実施される。
【００６８】
用語「Ｎｆ−ｋＢプロモーター」は、活性化されたＢ細胞の核因子κ軽鎖エンハンサーのプロモーターを意味し、ジーンバンク番号（ｐ６５  ＲＥＬＡ＝遺伝子ＩＤ：５９７０、ＮＧ＿０２９９７１．１／ｐ５０＝遺伝子ＩＤ：４７９０、ＮＭ＿００１１６５４１２．１）で特定される遺伝子によりコードされているタンパク質二量体ｐ６５  ＲＥＬＡ／ｐ５０により構成される。ＮＦ−κΒは明らかに、炎症誘発性遺伝子発現の最も重要なレギュレーターの１つである。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＩＬ−８などのサイトカインの合成は、シクロオキシゲナーゼ２（Ｃｏｘ−２）の発現の場合と同様に、ＮＦ−κΒにより仲介される。
【００６９】
用語「ＩＳＲＥプロモーター」は、インターフェロン感受性応答エレメント、すなわち、リポーター遺伝子の上流で使用されるＤＮＡ配列（ＴＴＴＣＡＴ）を意味し、ＳＴＡＴ３（ＮＧ＿００７３７０．１、ＮＭ＿００３１５０．３）などのＳＴＡＴ（シグナル伝達兼転写活性化因子タンパク質(Signal Transducers and Activators of Transcription protein)）ファミリータンパク質およびＩＲＦ３（ＮＧ＿０３１８１０．１、ＮＭ＿００１１９７１２２．１）などのＩＲＦ（インターフェロン応答因子）ファミリータンパク質の結合部位であることが知られている。ＳＴＡＴ経路は、サイトカインシグナルを、免疫細胞の増殖および分化を調節する遺伝子発現プログラムに変換する１つの主要なシグナル伝達経路である。ＳＴＡＴタンパク質ファミリーのいくつかのメンバーは、炎症誘発応答および抗炎症性応答の調節において転写因子として働く。
【００７０】
好ましくは、炎症経路由来のプロモーターは、Ｎｆ−ｋＢプロモーターである。
【００７１】
これらの付加的工程は、炎症経路におけるＭｙＤ８８の役割に干渉しない化合物を選択する。前記付加的工程は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の活性化を阻害する候補化合物の選択と同時にまたはその後に行うことができる。
【００７２】
上記の方法は、ＭｙＤ８８によるＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の活性化を阻害し、かつ、有利には炎症経路におけるＭｙＤ８８の役割に干渉しない候補化合物を提供する。
【００７３】
選択された候補化合物は、線維芽細胞におけるＭｙＤ８８によって活性化される発癌に対するＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の阻害効果を増強するそれらの能力に関してさらにスクリーニングされる。不死化線維芽細胞を、ＭｙＤ８８およびＭｙｃ癌遺伝子で形質転換させる。用語「Ｍｙｃ」は、ジーンバンク番号（遺伝子ＩＤ：４６０９、ＮＧ＿００７１６１．１）で特定されるＣ−骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ遺伝子を意味する。Ｍｙｃは、ＥＧＦなどの種々のマイトジェンシグナル上で活性化される（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路を介する）。その標的遺伝子の発現を改変することにより、Ｍｙｃの活性化は、細胞増殖の誘導、細胞成長、アポトーシス、分化および幹細胞自己再生の調節などの多くの生物作用をもたらす。
【００７４】
本発明の方法において、不死化線維芽細胞は好ましくは、ＮＩＨ３Ｔ３不死化線維芽細胞である。
【００７５】
線維芽細胞のフォーカス形成を、上記のように選択した少なくとも１つの候補化合物の存在下および少なくとも１つのＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の存在下でモニタリングする。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養におけるフォーカス形成に対するＤＮＡ損傷誘導化学療法薬の阻害効果を増強する少なくとも１つの候補化合物を選択する。
【００７６】
好ましくは、本発明の方法は、癌の治療において使用するための化合物のスクリーニング、同定または選択を提供し、ここで、癌は、結腸直腸癌、腸癌、黒色腫、肺癌および頸癌からなる群から選択される。
【００７７】
上記の方法において、ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬は、好ましくは、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ブレオマイシンおよびそれらの混合物から選択される。
【００７８】
本発明のもう１つの目的は、癌細胞にアポトーシスを誘導することによる癌の治療において使用するための、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害するペプチドならびにヒトＭｙＤ８８の発現を阻害する干渉ＲＮＡから選択される、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害する化合物である。
【００７９】
用語「ペプチド」は、ペプチドおよび修飾ペプチドを意味する。
【００８０】
好ましい実施態様において、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害する化合物は、ヒトＭｙＤ８８の発現を阻害する干渉ＲＮＡである。
【００８１】
干渉ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を特異的に標的とするために使用され、干渉ＲＮＡはｍＲＮＡとハイブリダイズし、その結果、単純な立体障害またはｍＲＮＡ切断の促進のいずれかにより、対応するタンパク質の翻訳を阻害する。
【００８２】
干渉ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、「低分子干渉」ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、「低分子ヘアピン型」ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはリボソームＲＮＡなどの複数の形態から選択することができる。
【００８３】
ｓｉＲＮＡ、すなわち、「低分子干渉ＲＮＡ」は、約１５〜３０塩基対の短い配列である。それらは、第１鎖および標的遺伝子のＲＮＡの標的領域と同一の付加な鎖を含む。
【００８４】
ｓｈＲＮＡ、すなわち「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」は、Ｄｉｃｅｒおよびｌｏｑｕａｃｉｏｕｓ複合体による切断の後にヘアピン型を採るＲＮＡ分子をコードする、発現ベクターにおいてクローニング配列により産生される二本鎖ＲＮＡである。
【００８５】
干渉ＲＮＡの設計および作製ならびにそれらの使用は周知であり、多くの刊行物に広く記載されている。
【００８６】
好ましい実施態様において、ｓｉＲＮＡは、配列番号１のｓｉＲＮＡおよび配列番号２のｓｉＲＮＡから選択される。別の実施態様において、干渉ＲＮＡは、配列番号３〜４の配列を含んでなるｓｈＲＮＡｍｉｒである。最も好ましくは、干渉ＲＮＡは、配列番号５のｓｈＲＮＡｍｉｒである。
【００８７】
本発明はまた、
ａ）有効量の上記化合物、および
ｂ）不活性であっても生理学的に活性であってもよい薬学的に許容される担体
を含んでなる医薬組成物も提供する。
【００８８】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合する溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤などのいずれかおよび総てを含む。好適な担体、希釈剤および／または賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、およびエタノールなどの１以上、ならびにそれらの組合せが挙げられる。多くの場合、組成物中に糖類、ポリアルコール類、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。特に、好適な担体の適切な例としては、（１）約１ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミンを含有するまたは含有しない、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ約７．４）、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが挙げられ、それらは、トリプタミンなどの抗酸化剤およびＴｗｅｅｎ  ２０などの分解防止剤をも含有し得る。
【００８９】
本発明により包含される医薬組成物はまた、癌治療のための、特に、結腸直腸癌、腸癌、黒色腫、肺癌および頸癌の治療のためのさらなる治療薬も含有し得る。
【００９０】
本発明の組成物は、様々な形態であってよい。これらには、例えば、液体、半固体、および固体剤形が含まれるが、好ましい形態は、意図される投与様式および治療適用によって決まる。典型的な好ましい組成物は、注射可能または注入可能な溶液の形態である。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内(intraperinoneal)、皮下）である。好ましい実施態様において、本発明の組成物は、ボーラスとして、または一定の時間にわたって持続的注入により静脈内に投与される。別の好ましい実施態様において、本発明の組成物は、局所治療効果ならびに全身治療効果を働かせるために筋肉内、皮下、関節内、滑液嚢内、腫瘍内、腫瘍周辺、病巣内により、または病巣周囲経路により注射される。
【００９１】
非経口投与用無菌組成物は、適当な溶媒中に必要量の化合物を配合した後に精密濾過による除菌を行うことによって調製することができる。溶媒またはビヒクルとして、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、およびエタノールなど、ならびにそれらの組合せを使用してもよい。多くの場合、組成物中に糖類、ポリアルコール類、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。これらの組成物はまた、佐剤、特に、湿潤剤、等張剤、乳化剤、分散剤および安定剤を含有し得る。非経口投与用の無菌組成物は、使用時に無菌水または他の任意の注射可能な無菌媒体に溶解させることができる無菌固体組成物の形態で調製してもよい。
【００９２】
本明細書に記載の化合物を含んでなる組成物はまた経口投与も可能である。経口投与用の固体組成物としては、錠剤、丸剤、散剤（ゼラチンカプセル剤、サシェ剤）または顆粒が使用可能である。これらの組成物において、本発明による有効成分は、アルゴン流下で、デンプン、セルロース、スクロース、ラクトースまたはシリカなどの１以上の不活性希釈剤と混合する。これらの組成物はまた、希釈剤以外の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの１以上の滑沢剤、着色剤、コーティング剤（糖衣錠）またはグレーズも含んでなり得る。
【００９３】
経口投与用液体組成物としては、水、エタノール、グリセロール、植物油またはパラフィン油などの不活性希釈剤を含有する薬学的に許容される溶液、懸濁液、エマルション、シロップおよびエリキシル剤が使用可能である。これらの組成物はまた、希釈剤以外の物質、例えば、湿潤剤、甘味剤、増粘剤、香味剤、または安定化剤も含んでなり得る。
【００９４】
用量は、所望の効果、処置期間および使用する投与経路によって決まる。
【００９５】
本発明はまた、癌の治療、特に、結腸直腸癌、腸癌、黒色腫、肺癌および頸癌の治療用医薬の製造のための上記化合物の使用に関する。
【００９６】
本発明はまた、有効量の上記化合物を、それを必要とするヒトまたは患者に投与することを含む、癌を治療するための方法を提供する。好ましい実施態様において、本発明は、結腸直腸癌、腸癌、黒色腫、肺癌および頸癌の治療のための方法に関する。
【００９７】
本発明はまた、癌の治療において使用するための、ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬と、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害するペプチドならびにヒトＭｙｄ８８の発現を阻害する干渉ＲＮＡから選択される、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害する化合物とを含んでなる組成物に関する。
【００９８】
本発明はまた、有効量のＤＮＡ損傷誘導化学療法薬と、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害するペプチドならびにヒトＭｙｄ８８の発現を阻害する干渉ＲＮＡから選択される、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害する化合物とを、それを必要とするヒトまたは患者に投与することを含んでなる、癌を治療するための方法に関する。
【００９９】
ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬と、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害する化合物とは、同時に投与しても別個に投与してもよい。
【０１００】
ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬とＭｙＤ８８／Ｅｒｋ  ＭＡＰキナーゼ相互作用の阻害との組合せは、感受性腫瘍における用量の減少を可能とし、従って、患者の忍容性を高め、または極めて効率的なＤＮＡ修復機構を有する耐性癌細胞株において感受性を再誘導する。
【０１０１】
本発明はさらに、癌の治療においてＤＮＡ損傷誘導化学療法薬と併用するための、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害するペプチドならびにヒトＭｙｄ８８の発現を阻害する干渉ＲＮＡから選択される、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害する化合物を含んでなる組成物に関する。
【０１０２】
本発明の方法および組成物において、ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬は、好ましくは、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ブレオマイシンおよびそれらの混合物から選択される。
【０１０３】
本発明はまた、癌の治療において使用するための、ＤＮＡ損傷誘導化学療法薬と、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害するペプチドならびにヒトＭｙｄ８８の発現を阻害する干渉ＲＮＡから選択される、ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの相互作用を阻害する化合物とを含んでなるパーツキットに関する。
【０１０４】
好ましい実施態様において、本発明の化合物および組成物は、癌の治療、より詳しくは、結腸直腸癌、腸癌、黒色腫、肺癌および頸癌の治療において使用するためのものである。最も有利には、本発明の化合物は、結腸直腸癌の治療において使用するためのものである。
【０１０５】
有利には、本発明の化合物および組成物は、癌細胞にアポトーシスを誘導することにより癌の治療において使用するためのものである。
【実施例】
【０１０６】
実施例１：ＭｙＤ８８の消衰はｐ５３を活性化し、アポトーシスを誘導する
ＭｙＤ８８は腫瘍の発生に関連することがこれまでに示されていたので、本発明者らはＭｙＤ８８が定着腫瘍の腫瘍表現型の維持に役割を果たし得るかどうかを調べた。特異的ｓｉＲＮＡによるＭｙＤ８８の消衰時、細胞はアポトーシスを受ける。このアポトーシスにおける腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３の役割を解明するために、本発明者らは、ＨＣＴ１１６  ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−細胞株を用いた。本発明者らは、ｐ５３タンパク質の安定化とともに、ｐ５３−／−細胞株に比べてｐ５３＋／＋細胞株においてＭｙＤ８８阻害時の大規模なアポトーシスを観測した。本発明者らは、種々のヒト結腸癌細胞株においても同じ実験を行い、ＭｙＤ８８阻害はこれらの細胞株においてｐ５３依存性アポトーシスを誘導することを確認し、これが少なくとも結腸においては一般的な機構であり得ることが示唆された。
【０１０７】
次に、本発明者らは、ドキシサイクリン誘導性ＭｙＤ８８  ｓｈＲＮＡを安定発現するＨＣＴ１１６  ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−を作出した。これらの細胞株をヌードマウスに皮下移植した後、腫瘍においてＭｙＤ８８の消衰を誘導するためにマウスをドキシサイクリンで処置し、または処置しなかった。この実験は、腫瘍細胞におけるＭｙＤ８８阻害がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍成長を遮断することを示した。
【０１０８】
実施例２：ゲノムの完全性の維持におけるＭｙＤ８８の役割
ＭｙＤ８８は、Ｒａｓ／ＥＲＫシグナル伝達経路に必要である。ＭＡＰＫ経路はＤＮＡ修復機構の誘導に関与していることが知られている。従って、本発明者らは、ＭｙＤ８８阻害時に、ＥＲＫリン酸化の低下がＤＮＡ修復機構の欠如をもたらし、ＤＮＡ損傷の蓄積を誘導し、ｐ５３依存性アポトーシスを誘発するとの仮説を立てた。本発明者らのデータによりこの仮説が確認された。実際に、ＨＣＴ１１６  ｐ５３＋／＋  ｓｈＭｙＤ８８細胞を、活性化ＭＥＫキナーゼを構成的に発現するプラスミドでトランスフェクトすると、ドキシサイクリン処置時に誘導されるそれらのアポトーシスが減少し、このことは、ＭｙＤ８８消衰により誘導されるアポトーシスがＭＡＰＫ経路の阻害に基づくことを示す。ＭＡＰＫ経路はＤＮＡ修復機構、特に、ＥＲＣＣｌタンパク質などのＤＮＡ修復に関連するいくつかの遺伝子の調節に関連づけられており、従って、本発明者らは、ＭｙＤ８８阻害時のＥＲＣＣｌタンパク質レベルを定量した。本発明者らは、ＥＲＣＣｌタンパク質レベルの低下およびｐＨ２ＡＸの蓄積を見出し、このことは二本鎖ＤＮＡ損傷の蓄積を示す。
【０１０９】
ＭｙＤ８８の消衰がいくつかのＤＮＡ修復系を損なうならば、癌細胞における遺伝毒性化学療法薬を用いたＤＮＡ損傷の誘導は、これらの細胞におけるＭｙＤ８８の不存在下でのアポトーシスを著しく増加させるはずである。また実際に、本発明者らは、ＭｙＤ８８の阻害はＤＮＡ損傷化学療法薬および他の経路に作用する非化学療法により誘導されるアポトーシスを相乗作用的に増幅することを示した。
【０１１０】
実施例３：ＭｙＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの間の相互作用を阻害する化合物のスクリーニング
本発明者らの目的は、ＭｙＤ８８およびホスホ−ＥＲＫの相互作用を阻害することのできる小分子またはペプチドを種々のライブラリーから選択することである。本発明者らのデータに基づけば、細胞におけるＭｙｄ８８の過剰発現は、ＥＲＫのリン酸化、ＮＦ−ｋＢの核移行、および下流転写因子の活性化により示されるＥＲＫおよびＮｆ−ｋＢの両経路の活性化を誘導することが分かる。よって、本発明者らは、二段階スクリーニング技術を設計した。
【０１１１】
本発明者らは、２つの異なる構築物：
１）ＳＲＥプロモーター（ＥＲＫ経路）またはＮｆ−ｋＢプロモーター（Ｎｆ−ｋＢ経路）の制御下のルシフェラーゼｃＤＮＡ
２）抗生物質誘導プロモーター（ドキシサイクリン）の制御下のＭｙＤ８８  ｃＤＮＡ
を同時に安定発現する細胞株（ＨＣＴ１１６、Ａ３７５、Ｈｅｌａ）を用いている。
【０１１２】
これらの細胞において、本発明者らは、培養培地にドキシサイクリンを添加して２４時間の時点で、ＭｙＤ８８の過剰発現を誘導し、ＥＲＫおよびＮｆ−ｋＢの両経路を活性化し、従って、ルシフェラーゼ活性が活性化される。
【０１１３】
ＭｙＤ８８相互作用に対する小分子またはペプチドの効果を評価するために、候補分子をドキシサイクリンと同時に培地に加え、２４時間後にルシフェラーゼ活性をモニタリングする。この段階で、下記に示される４つの異なる結果が確認される。
【表１】
0006049751.tif 000002
【０１１４】
この試験は、ハイスループットスクリーニング分析に適合させることができる。
【０１１５】
最初のスクリーニングでＭｙＤ８８−ＥＲＫ相互作用の阻害能を示すとして検出された分子を、フォーカス形成アッセイに基づく次の機能試験で使用する。
【０１１６】
ＮＩＨ３Ｔ３不死化線維芽細胞はＲａｓおよびＭｙｃ癌遺伝子の組合せのトランスフェクションにより形質転換可能であることが知られている。本発明者らは、ＭｙＤ８８によるＲａｓの置換は形質転換を誘導することもできるが、ＥＲＫと結合することができないＭｙＤ８８の変異型は形質転換を誘導することができないことを示す。このアッセイの読み取りは、クリスタルバイオレット染色である。
【０１１７】
これらのデータに基づき、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＭｙＤ８８およびＭｙｃ癌遺伝子でトランスフェクトし、同時に最初のスクリーニングから選択された分子で処理し、フォーカス形成をモニタリングする。分子がＭｙＤ８８−ＥＲＫ相互作用を遮断することができれば、これはフォーカス形成を遮断する。
【０１１８】
実施例４：併用試験
ＨＣＴ１１６  ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−  ｓｈＭｙＤ８８細胞株で併用試験を行った（なお、ＭｙＤ８８の消衰はドキシサイクリン処理の４８時間後に得られる）。４つの異なる化学療法薬を用いた（シスプラチン、オキサリプラチン、エトポシド、およびパクリタキセル(Pacitaxel)）。各組合せアッセイは３つのセットから構成される。
【０１１９】
セット１＝細胞＋ドキシサイクリン単独
セット２＝細胞＋化学療法単独
セット３＝細胞＋ドキシサイクリン＋化学療法
各セットは下記のように５種類の異なる濃度範囲を含む（二反復で実施）。
【０１２０】
・ドキシサイクリン処理：０−１−２−４−８−１６μｇ／ｍＬ
・シスプラチン処理：０−６．２５−１２．５−２５−５０−１００μΜ
・オキサリプラチン処理：０−８．７５−１７．５−３５−７０−１４０μΜ
・エトポシド処理：０−５２０．５−１０４１−２０８２−４１６４−８３２８ｎＭ
・パクリタキセル処理：０−４．５−９−１８−３６−７２ｎＭ
０日目に、ＨＣＴ１１６  ｓｈＭｙｄ８８  ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−細胞株を９６ウェルプレートに１００００細胞／ウェルで播種した。
【０１２１】
１日目に、セット１および３の細胞をドキシサイクリンで処理し、セット２の細胞は培養培地に残した。
【０１２２】
３日目に、セット１の細胞をドキシサイクリン含有培地に残し、セット２および３の細胞は化学療法で処理した。
【０１２３】
６日目に、各ウェルの生存細胞のパーセンテージをＭＴＳ試験により測定した。生データを、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウエアを用いて解析し、相乗作用の有無を示す併用係数を作成した。
【０１２４】
これらの結果は、Ｍｙｄ８８サイレンシングがＤＮＡ損傷誘導化学療法と相乗作用を示すことを実証する。
【０１２５】
ＨＣＴｌ１６  ｐ５３＋／＋またはｐ５３−／−  ＤＯＸ誘導性ｓｈＭｙＤ８８細胞における、ＭｙＤ８８サイレンシング（ドキシサイクリン処理）と化学療法の種々の薬剤との間の種々の併用条件の併用係数を下表に示す。
【表２】
0006049751.tif 000003
【０１２６】
実施例５：ｉｎ  ｖｉｖｏ併用アッセイプロトコール
ＨＣＴ１１６  ｐ５３＋／＋  ｓｈＭｙＤ８８細胞をヌードマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍発生（２００ｍｍ３）後、４群のマウスを設定した。
【０１２７】
・対照群：飲用水中のグルコース３％を受容するマウス
・ドキシサイクリン群：飲用水中のグルコース３％＋ドキシサイクリン２ｍｇ／ｍＬを受容するマウス
・シスプラチン群：飲用水中のグルコース３％と、２日ごとの用量０．５ｍｇ／ｋｇのシスプラチンの腹腔内注射とを受容するマウス
・併用群：飲用水中のグルコース３％＋ドキシサイクリン２ｍｇ／ｍＬと、２日ごとの用量０．５ｍｇ／ｋｇのシスプラチンの腹腔内注射とを受容するマウス
プロトコールの終了まで３日ごとに腫瘍体積を測定し、モニタリングを行った。
【０１２８】
実施例６：ＭＹＤ８８およびＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの間の相互作用の阻害を測定するためのアッセイ
１）近接ライゲーションアッセイ
近接ライゲーションアッセイは、標的抗原を認識する異なる種で生じた２つの一次抗体に基づき、内因性のタンパク質−タンパク質相互作用を決定するために使用する。それぞれユニークな短いＤＮＡ鎖が結合している種特異的二次抗体（ＰＬＡプローブと呼ぶ）が前記の一次抗体に結合する。
【０１２９】
ＰＬＡプローブが近接している場合（＜４０ｎｍ）、これらのＤＮＡ鎖は、次に他の２つのサークル形成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを添加することによって相互作用することができる。添加した２つのオリゴヌクレオチドの酵素結合による連結の後、ポリメラーゼを用いるローリングサークル型増幅によってそれらを増幅する。
【０１３０】
よって、このＤＮＡサークルは数百倍の複製がなされており、標識された相補的オリゴヌクレオチドプローブにより生成物が強調される。各一分子増幅産物において生じた高濃度の蛍光が、蛍光顕微鏡で観察した際に明瞭な明るいドットとして容易に見える。
【０１３１】
詳細なプロトコール：
・細胞を５分および１０分間１０％ＦＣＳで刺激し、４％ＰＦＡで固定し、透過処理を施し、ＰＢＳ中０．３％サポニン、１０％ＢＳＡでブロッキングした。
・次に、細胞をＭｙＤ８８に対する一次抗体（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ）およびｐ−ＥＲＫ（Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに一晩インキュベートした。
・１倍ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を３７℃で２時間、適当なＤＮＡ結合二次抗体（ＰＬＡ）とともにインキュベートした。
・１倍ＰＢＳで２回洗浄した後、ハイブリダイゼーション溶液を３７℃で１５分加える。
・ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄した後、Ｄｕｏｌｉｎｋポリメラーゼを３７℃で９０分加える。
・ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄した後、検出溶液を３７℃で６０分加える。
・その後、２分の洗浄を示したように順次行う：ＳＳＣ  ２倍、ＳＳＣ  １倍、ＳＳＣ  ０，２倍、ＳＳＣ  ０．０２倍およびＥｔＯＨ７０％。
・細胞をＤｕｏｌｉｎｋ封入剤を用いてマウントする。
【０１３２】
２）免疫沈降アッセイ：
免疫沈降アッセイは、タンパク質−タンパク質相互作用を可視化するために使用する。
【０１３３】
・３．１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍプレートに播種する。
・２４時間後、ＨＥＫ２９３Ｔを３μｇの目的プラスミドでトランスフェクトする。
・トランスフェクション４８時間後に、細胞を採取し、１％ＮＰ４０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する溶解バッファーを用いて溶解する。
・溶解およびタンパク質投与の後、各条件につき１〜２ｍｇのタンパク質を用いて免疫沈降実験を行う。
・溶解液を３０μＬのプロテインＡセファロースビーズとともに、４℃にてローター上で３０分間インキュベートする。
・これらのチューブを４℃、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
・上清を新しいチューブに移す。
・予め明澄化した溶解液に２〜５μｇの抗体を加える。４℃にてローター上で２〜４時間インキュベートする。
・５０μＬのプロテインＡでファロースビーズを加える。チューブを４℃にてローター上で１時間インキュベートする。
・４℃、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を捨て、ビーズを保持する。
・前記ビーズを１ｍＬの溶解バッファーで３〜４回洗浄する。４℃、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
・タンパク質を溶出させるために前記ビーズに５０μＬのＬａｅｍｅｌｌｉ２倍バッファーを加える。
・前記２つのタンパク質間の相互作用をＷＢで可視化する。
【０１３４】
参照文献
Rakoff-Nahoum S. et al. 2007. Science
Coste I et al. 2010. J Clin Invest
Dai Y et al. 2008. Blood
Yacoub A. et al. 2003. Radiat Res
【図２】
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【図１Ａ】
0006049751.tif 000005
【図１Ｂ】
0006049751.tif 000006
【配列表】
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