(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される機能化ポリエチレングリコール：
【化１】
0005999659.tif 000012
式中、
【化２】
0005999659.tif 000013
部分（Ａ部分ともいう）は、下記の基ａ〜ｋからなる群より選ばれ、
【化３】
0005999659.tif 000014
上記基において、
各Ｘは、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−を表し、
各ｍおよびｎは、独立して、整数１〜１２から選ばれ、
各ＰＥＧは、独立して−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）ｑＲ１を表し、
各Ｒ１は独立して水素原子もしくはＣ１−６アルキルを表し、
各ｑは、独立して、整数５〜３０００から選ばれる。
【請求項２】
Ａ部分が、基ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｆおよびｇよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の機能化ポリエチレングリコール。
【請求項３】
Ａ部分が、基ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｆおよびｇよりなる群から選ばれ、かつ、Ｘが−Ｏ−である、請求項１に記載の機能化ポリエチレングリコール。
【請求項４】
Ａ部分が、基ａまたはｇであり、各Ｘが−Ｏ−であり、かつ、各ｑが独立して、８〜１０００である、請求項１に記載の機能化ポリエチレングリコール。
【請求項５】
少なくとも１つの反応し得るアミノ基を分子中に有する生物活性物質と反応し得る請求項１に記載の機能化ポリエチレングリコールを反応体として含んでなる、生物活性物質を修飾するためのポリエチレングリコール化作用剤。
【請求項６】
少なくとも１つの反応し得るアミノ基を分子内に有する有機化合物を修飾するための反応体としての請求項１に記載の式（Ｉ）で表される機能化ポリエチレングリコールの使用。
【請求項７】
請求項１に記載の機能化ポリエチレングリコールと少なくとも１つの反応しうるアミノ基を有する生物活性物質とを前者の２つのアルデヒド基と後者のアミノ基が反応し得る条件下で反応させる工程を含んでなる、ＰＥＧ化生物活性物質の製造方法。
【請求項８】
生物活性物質が治療用タンパク質である、請求項５に記載の作用剤。
【請求項９】
生物活性物質が治療用タンパク質である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１０】
治療用タンパク質が、酵素、サイトカイン、可溶性受容体タンパク質、抗体および抗体フラグメントからなる群より選ばれる、請求項５に記載の作用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規分岐ポリエチレングリコール及びその用途に関し、より具体的には、機能化二分岐ポリエチレングリコール及びその生活性タンパク質を初めとするアミノ基含有薬剤の体内動態を改善するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品候補となるタンパク質または核酸の生体内での動態（生体内滞留性、プロテアーゼもしくはヌクレアーゼに対する安定性、免疫原性、等）を改善する技術として当該タンパク質等のポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化：ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）が有用であり、これまでにいくつものＰＥＧ化タンパク質が医薬品として、ＦＤＡで承認され、また、開発途上のものもある。典型的には、承認され、上市された医薬品としては、ＰＥＧ−アスパラギナーゼ、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ、ＰＥＧ−インターフェロンα２ａ、ＰＥＧ−インターフェロンα２ｂ、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ、ＰＥＧ−成長ホルモン受容体アンタゴニスト、また、非タンパク質医薬品として、分岐型ＰＥＧ−抗ＶＥＧＦアプタマー、等を挙げることができる。なかでもタンパク質に結合した際に分岐型となる枝分かれＰＥＧは近年特に注目され新規の医薬品開発が困難な昨今の状況においても新規のＰＥＧ化医薬品開発に貢献している（非特許文献１）。【０００３】
これまでにＰＥＧ化医薬品で使用されている分岐ＰＥＧは活性エステルで機能化されているものがほとんどであり、当該活性エステルを介してタンパク質中のアミノ基と反応させることが可能である。しかしながら、このような活性エステル基は、一般に、タンパク質中のリジンだけでなくヒスチジンとも反応してしまう。また、活性エステルを末端基とするＰＥＧをタンパク質のアミノ基と反応させるＰＥＧ化では、アミド結合によりアミノ基の塩基性（または陽荷電性）は大きく変化してしまうため、しばしばタンパク質活性の大幅な減少を招いてしまう。そのため、アミノ基の塩基性（または陽荷電性）を維持したままＰＥＧ化タンパク質を製造する技術の確立が望まれている。さらに、従来の分岐型ＰＥＧの合成及び精製には煩雑なステップを含むという欠点も存在する。このような反応条件の厳しさ、反応効率の悪さ及び副生成物の問題などから、医薬品としての効果が期待されながらも現状のＰＥＧ化技術では開発に至らなかったタンパク質も数多く存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
非特許文献１：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １９９５，  ６，  ６２−６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明は、ＰＥＧ化に際して、例えば標的タンパク質中の１級アミンであるリジン残基、または存在する場合には、Ｎ−末端アミノ酸残基のアミノ基と反応し、アミノ基の陽荷電性を変化させず、製造工程も従来の分岐ＰＥＧ化用化合物と比較し簡便な方法で製造できるＰＥＧ化用化合物またはＰＥＧ化技術を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段【０００６】
本発明者等は、今回、例えば、以下の反応スキームで選択的にアミノ基のみをＰＥＧ化できることを新たに解明した。【０００７】
【化１】
0005999659.tif 000002
【０００８】
上式中、ＰＥＧはポリエチレングリコール鎖であり、Ｒはアミノ化合物のアミノ基以外の残基または部分である。【０００９】
理論により拘束されるものではないが、この反応スキームでは、被修飾分子中のアミノ基と修飾分子中アルデヒド基（又はホルミル）を２つ有するジアルデヒド体が反応し、環構造を形成することによりアミノ基の効果的な修飾が可能であるものと理解できる。当該修飾方法は、中性の水溶液中で反応が進行することから様々な生体分子へ展開が可能である。この反応では第一級アミン（アミノ基）のみ反応するためヒスチジン等の第二級アミン（イミノ基）とは反応しない。また、この反応は中性付近の温和な条件で効率よく反応し、これまでのＰＥＧ化機構とは全く異なる結合様式にてタンパク質のアミノ基をアルキル化できる。したがって、当該反応スキームに従うジアルデヒド体または当該ジアルデヒド体と同様に環構造を形成し得るその類似体である機能化ポリエチレングリコールを用いるＰＥＧ化は、少なくとも１個の反応しうるアミノ基を有する化合物、特に、生物活性物質である、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、その他の低分子有機化合物等、を中性付近の水溶液中で容易にポリエチレングリコールによる修飾ができ、しかも、当該アミノ基の塩基性（または陽荷電性）を変えないので、非修飾生物活性物質の活性を大きく損なうことなく目的のＰＥＧ化化合物を提供できることが確認された。【００１０】
したがって、本発明によれば、下記式（Ｉ）で表される機能化ポリエチレングリコールが提供される。【００１１】
【化２】
0005999659.tif 000003
【００１２】
式中、【００１３】
【化３】
0005999659.tif 000004
【００１４】
部分（以下、単にＡ部分とも称す場合あり）は、下記の基ａ〜ｋからなる群より選ばれ、【００１５】
【化４】
0005999659.tif 000005
【００１６】
上記基において、
各Ｘは、独立して−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−を表し、
各ＰＥＧは、独立して−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）ｑＲ１を表し、
各ｍおよびｎは、独立して、整数１〜１２から選ばれ、
各Ｒ１は、独立して水素原子もしくはＣ１−６アルキルを表し、
各ｑは、独立して整数５〜３０００から選ばれる。【００１７】
前記機能化ポリエチレングリコールは、上述したとおりアミン化合物または生理活性物質中のアミノ基（−ＮＨ２）のみと反応し得るので、アミノ基、イミノ基、さらにはヒドロキシル基等と反応し得る活性エステルを末端基とするポリエチレングリコールと異なり反応選択性を有し、しかも生物活性物質中のアミノ基の陽荷電性を変化させない。【００１８】
したがって、別の態様の本発明として、
前記式（Ｉ）で表される機能化ポリエチレングリコールを反応体として含んでなる、少なくとも１つの反応し得るアミノ基を分子内に有する有機化合物の修飾用作用剤、または
少なくとも１つの反応し得るアミノ基を分子内に有する有機化合物を修飾するための反応体としての前記式（Ｉ）で表される機能化ポリエチレングリコールの使用、または
前記式（Ｉ）で表される機能化ポリエチレングリコールと少なくとも１つの反応し得るアミノ基を分子内に有する生物活性物質とを前者の２つのアルデヒド基と後者のアミノ基が反応し得る条件下で反応させる工程を含んでなる、ＰＥＧ化生物活性物質の製造方法、
も提供される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の前記式（Ｉ）で表される機能化ポリエチレングリコールは、それらを用いて少なくとも１つの反応し得るアミノ基を分子内に有する生物活性物質を修飾（または、ＰＥＧ化）することにより、未修飾生理活性物質の活性を少なくとも一部は保持しながら、未修飾体に比べて体内動態（生体内滞留性、生体内代謝に対する抵抗性、免疫原性、等）が大きく改善された生成物を提供できる。
【発明の詳細な記述】
【００２０】
本発明について、より具体的に説明する。
【００２１】
本願発明に関して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化とは、タンパク質、ペプチドまたは非ペプチド分子の１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の共有結合を介する修飾を意味する。
【００２２】
前記式（Ｉ）で表される機能化ポリエチレングリコールは、分子中の２つのアルデヒド基（またはホルミル）が一緒になって、少なくとも１つの反応しうるアミノ基を有する化合物、例えば、生物活性物質である、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、その他の低分子有機化合物の１つのアミノ基と反応して環構造を有するアミン化合物を形成するように機能化されている。反応しうるアミノ基とは、機能化ポリエチレングリコールの２つのアルデヒド基と反応できる状態にあるアミノ基を意味し、該当する生理活性物質の分子の如何なる位置に存在するものであっても、前記２つのアルデヒド基の結合したアルキレン部分と一緒になって環構造を形成するように反応する状態にあるアミノ基を制限することなく包含する。このようなアミノ基は、該当する分子中に１以上存在することができる。
【００２３】
環構造を形成し、特に、タンパク質のような複数のアミノ基を有する化合物をＰＥＧ化するとの観点に立てば、式（Ｉ）で表される機能化ポリエチレングリコールは、式中のＡ部分が、基ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｇで表されるものが好ましく、基ａ、ｂ、ｃおよびｇで表されるものがより好ましく、基ａおよびｇで表されるものが特に好ましい。
【００２４】
一方、分子内に少なくとも１つの反応し得るアミノ基を有する化合物は、遊離の状態にあるもの、または何らかの支持体（例えば、生体内移植用担体またはバイオセンサーの表面等）に固定ないし結合された状態にあることができる。また、生物活性物質は、医療用、例えば、治療用または診断用タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、アプタマー等）であることができる。タンパク質は、糖タンパク質、リポタンパク質を包含する概念として使用しており、それらには、天然由来のもの、遺伝子操作による組換え由来のもの、融合タンパク質が包含される。したがって、式（Ｉ）の機能化ポリエチレングリコールの反応対象たるアミノ基は、糖タンパク質にあっては、糖残基中に存在するものであることもできる。
【００２５】
生理活性物質としては、医療用、例えば、治療用または診断用タンパク質またはペプチドが好ましく、酵素（例えば、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ等）、サイトカイン（例えば、インターロイキン１、２、６、等、インターフェロンα、β、γ、腫瘍壊死因子、リンホトキシン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、等）、可溶性受容体タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子受容体、各種インターロイキン受容体、チロシンキナーゼ受容体等由来）、ホルモン（例えば、インスリン、ヒト成長ホルモン等）、抗体（例えば、抗癌用、抗アレルギー用および抗感染症用抗体）ならびにこれらの活性フラグメント等を挙げることができる。
【００２６】
式（Ｉ）のＡ部分としての基ａ〜ｋにおいて、ｍおよびｎは、相互に独立して、整数１〜１２、好ましくは、１〜６から選ばれる。ＰＥＧは、各々独立して−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）ｑＲ１を表し、ここで、Ｒ１は水素原子又はＣ１−６アルキルを表し、このアルキル基は直鎖又は分岐であることができ、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルを挙げることができ、好ましくはメチル又はエチルである。各ｑは、一般的に、本発明の目的に沿う限りいかなる整数であることもでき、限定されるものでないが、５〜３０００、好ましくは８〜１０００、より好ましくは１２〜７００、特に好ましくは２０〜６００であることができる。また、Ａ部分における各Ｘは、独立して−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であることができるが、結合の安定性等を考慮すると、−Ｏ−であることが好ましい。
【００２７】
本発明の機能化ポリエチレングリコールは、当業者であれば、式（Ｉ）で表される構造を参考に、当該技術分野に公知の出発原料又は公知の方法を利用して容易に提供できるものと理解するが、都合よくは次の反応スキームにしたがって製造するのが効果的である。
【００２８】
【化５】
0005999659.tif 000006
【００２９】
上記式中、Ａ部分は、式（Ｉ）について定義したのと、Ｘが−Ｏ−であり、Ｒ１がメチル基であること以外は同義であり、Ａ１部分は、次の基ａ’〜ｋ’から選ばれ、Ａ２部分はＡ部分について定義したのと、Ｒ１がＨであること以外は同義である。
【００３０】
【化６】
0005999659.tif 000007
【００３１】
上記反応スキームの各反応はそれ自体公知であり、必要があれば、後述する実施例に記載の工程を参照し、または改良して行うことができる。例えば、第一の工程は、エチレンオキシドの開環アニオン重合、好ましくはリビングアニオン重合に相当する。第二の工程は、ＰＥＧ化したポリエチレングリコールの成長末端のヒドロキシル基のエーテル化（又はアルキル化）であり、また、それ自体公知の合成反応を利用できる。第三の工程は、不飽和二重結合の酸化ヒドロキシル化であり、また、第四の工程はビシナル（ｖｉｃｉｎａｌ）の２個のヒドロキシル基間をマラプラード（Ｍａｌａｐｒａｄｅ）型酸化に供する工程であり、第四の工程はＰＥＧの末端ヒドロキシル基のアルキル化であり、いずれも、当該技術分野で十分に検討され、熟知されている反応である。したがって、上記反応スキームの各工程に従えば、式（Ｉ）の機能化ポリエチレングリコールを効果的に製造できる。こうして提供できる機能化ポリエチレングリコールは、Ｍｗ／Ｍｎが１．０７以下、好ましくは１．０５以下の、所謂、単分散性ポリマーと称することができる。
【００３２】
式（Ｉ）の機能化ポリエチレングリコールは、アミノ基を分子内に有する遊離化合物または材料表面上もしくは材料チップ等に固定化されたアミノ基を分子内に有する化合物と、例えば、水、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の如き反応溶媒中で、必要があれば、緩衝化された溶液中、冷却温度（例えば、４℃）〜１００℃、好ましくは、４〜３７℃の温度で、目的の反応が完了するまで反応せしめることにより、上述したアミノ基を有する生理活性物質の分岐ポリエチレングリコール化を達成することができる。
【００３３】
したがって、本発明の製造方法にいう、機能化ポリエチレングリコールの２つのアルデヒドと生物活性物質のアミノ基が反応し得る条件は、好ましくは、４〜３７℃で４〜７２時間反応混合物を撹拌することにある。こうして、生物活性物質、例えば、タンパク質又はペプチドは分岐ポリエチレングリコールにより効果的に修飾することができる。
【００３４】
なお、前記Ａ１部分を有する上記出発原料は、それ自体公知であるか、本発明者等の一部の発明を開示する、例えば、特表２０１１−８４４９６号公報に記載されているとおり公知であるか、かような公知化合物の製造方法を、必要により、改良して製造したものであることができる。かような原料の代表的なものとしては次の構造式で表される化合物を挙げることができる。
【００３５】
【化７】
0005999659.tif 000008
【００３６】
上記式中、ｎ及びｍは、上記式（Ｉ）について定義したのと同義である。
【００３７】
別法として、上記のごときＡ１部分を有する出発原料は、それぞれ、−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨおよび−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨにおける、−ＣＨ２ＯＨ部分を酸化して−ＣＯＯＨに転化した後、ＨＯ−ＰＥＧまたはＨ２Ｎ−ＰＥＧと反応せしめ、上記式（Ｉ）のＸが、独立して−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−で表される機能化ポリエチレングリコールを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】後述する実施例の例２において、リゾチームを本発明の機能化ポリエチレングリコールでＰＥＧ化して得られた反応生成物のＨＰＬＣの解析結果を表すＨＰＬＣチャートである。図中のｐｅａｋ  １が反応生成物を含む画分のピーク１に相当し、ＬｙｓｏｚｙｍｅはＰＥＧ化する前のリゾチームを含む画分のピークに相当する。
【図２】図１のピーク１の画分、リゾチーム及び分子量マーカーについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った結果を表す図に代わる写真である。レーン（Ｌａｎｅ）１はマーカーに由来し、レーン（Ｌａｎｅ）２はリゾチーム由来し、レーン（Ｌａｎｅ）３はピーク１の画分（ＰＥＧ化リゾチーム）に由来する泳動結果を示す。
【図３】リゾチームを本発明に従う機能化ポリエチレングリコールまたは従来の活性エステル型ポリエチレングリコールでＰＥＧ化して得られたＰＥＧ化リゾチームの、未修飾リゾチームの活性に対する相対残存活性を示すグラフである。
【図４】後述する実施例の例４において、リゾチームを本発明の機能化ポリエチレングリコールでＰＥＧ化して得られた反応生成物（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った結果を表す図に代わる写真である。レーン１は、タンパク質マーカーを、レーン２はリゾチームを、レーン３はＰＥＧ化リゾチーム画分に由来する泳動結果を示す。
【発明を実施するための態様】
【００３９】
以下、限定されるものでないが、本発明関して、具体例を挙げながらさらに具体的に説明する。本発明によれば、生物活性タンパク質を、その一定の活性を保持したま効果的なＰＥＧ化を効率よく行うことが実現できた。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明の説明を簡潔にする目的で上記式（Ｉ）のＡ部分が基（ｂ）および（ｇ）で表され、Ｘが−Ｏ−であり、ｍ及びｎがそれぞれ整数１である化合物の例を挙げるが、本発明をこれに限定することを意図するものではない。【００４１】
例１：  機能化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の製造（下記合成スキームにしたがった）【００４２】
【化８】
0005999659.tif 000009
【００４３】
（１）化合物２の合成
本合成で用いる器具はあらかじめ１２０℃にて１０時間乾燥庫で乾燥させておいた。２００ｍナスフラスコに化合物１（６４ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）を加え、三方活栓を取り付けた。窒素置換しながら蒸留ＴＨＦ溶媒（３０ｍＬ）、カリウムナフタレン（０．３０Ｍ，３．３７ｍＬ，１．００ｍｍｏｌ）を加え１５分攪拌した。エチレンオキシド（５．５８ｍＬ，０．１１ｍｏｌ）を加え、２５℃で６０時間攪拌した。反応後、冷凍庫で冷やした２−プロパノール（ＩＰＡ）１．５０Ｌにより再沈殿を行った。遠心分離により反応物を分離させ、上澄み液を除いた。反応物をメタノールに溶かし２００ｍＬナスフラスコに回収し、エバポレーターにて反応物を濃縮させ、再び再沈殿を行った。再沈殿は３回行った。３回目のエバポレートの終了後、１，４−ジオキサン１０ｍＬに反応物を溶解させ、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、化合物２を収率９３％で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）
５．５３ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ），３．８３−３．４５ｐｐｍ（ｍ，９７６Ｈ），３．３６ｐｐｍ（ｓ，４Ｈ），２．７６ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ），２．１８ｐｐｍ（ｓ，４Ｈ）
ＧＰＣ  Ｍｎ９４５９，Ｍｗ／Ｍｎ１．１９【００４４】
（２）化合物３の合成
１００ｍＬナスフラスコに化合物２（９２０ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）を入れ三方活栓を取り付けた。ＴＨＦ溶媒１５ｍＬを加え、０℃の氷浴につけながらＮａＨ（２４．０ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌した。続いて、ＣＨ３Ｉ（０．５ｍＬ，８．０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０時間攪拌した。反応後、セライトろ過にてＮａＨを除去し、エバポレーターで反応物を濃縮させた。冷凍庫で冷した２−プロパノール（ＩＰＡ）２００ｍＬで再沈殿を行った。遠心分離により反応物を分離させ、溶媒のみを捨てた。反応物をメタノールに溶かし２００ｍＬナスフラスコに回収し、エバポレーターにて反応物を濃縮させた。再沈殿は３回行った。３回目のエバポレーターが終了後、１，４−ジオキサン５ｍＬに反応物を溶解させ、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、化合物３を収率８５％で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）
５．５４ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ），３．８３−３．４５ｐｐｍ（ｍ，９７６Ｈ），３．３８ｐｐｍ（ｓ，６Ｈ），３．３６（ｓ，４Ｈ），２．１８（ｓ，４Ｈ）
ＧＰＣ  Ｍｎ１００１５，Ｍｗ／Ｍｎ１．１３【００４５】
（３）化合物４の合成
１００ｍＬバイアル瓶で化合物３（５００ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）をアセトン（３ｍＬ）、水（３ｍＬ）、アセト二トリル（３．０ｍＬ）に溶解させ、Ｎ−メチルモルホリン  Ｎ−オキシド（６０．０ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、マイクロカプセル化四酸化オスミウム（１０．１ｍｇ）を加えた。室温にて４８時間振とうさせた。反応後、ろ過により四酸化オスミウムを取り除き、エバポレートし反応物を濃縮した。続いて、冷凍庫で冷した２−プロパノール（ＩＰＡ）２００ｍＬで再沈殿を行った。遠心分離により反応物を分離させ、上澄み液を除いた。反応物をメタノールに溶かし２００ｍＬナスフラスコに回収し、エバポレーターにて反応物を濃縮させ、再び再沈殿を行った。再沈殿は３回行った。３回目のエバポレーターが終了後、１，４−ジオキサン５ｍＬに反応物を溶解させ、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、化合物４を収率９１％で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）
３．９２−３．９０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ），３．８３−３．４５ｐｐｍ（ｍ，９７６Ｈ），３．３８ｐｐｍ（ｓ，６Ｈ），３．３５ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ），３．２６−３．２８（ｍ，２Ｈ），３．２１ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ），１．８５−１．６５（ｍ，４Ｈ）
ＧＰＣ  Ｍｎ９３１９，Ｍｗ／Ｍｎ１．１４【００４６】
（４）化合物５の合成
水（５００μＬ）に過ヨウ素酸ナトリウム（２．７０ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）を溶解させ、化合物４（１０１ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）に滴下して加え、室温で１時間攪拌した。反応後、ジクロロメタンを用いて抽出し、硫酸ナトリウムにより脱水し、エバポレーターにより反応物を濃縮した。１，４−ジオキサン５ｍＬに反応物を溶解させ、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、化合物５を収率１５％で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）
９．７９−９．７８ｐｐｍ（ｔ，２Ｈ），３．８３−３．４５ｐｐｍ（ｍ，９７６Ｈ），３．５１ｐｐｍ（ｓ，４Ｈ），３．３８（ｓ，６Ｈ），２．５７（ｄ，４Ｈ）
ＧＰＣ  Ｍｎ１０３２５，Ｍｗ／Ｍｎ１．２３【００４７】
例２：  化合物５を用いた分岐型ＰＥＧ化タンパク質の合成
合成した分岐型ＰＥＧ（化合物５、１０ｋＤａ）をニワトリリゾチーム（分子量約１４．３ｋＤａ）に対して５倍当量加え０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、４℃で、６時間反応させた。【００４８】
リゾチーム及び反応生成物について行ったＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）の結果を表すＨＰＬＣチャートの解析結果を図１に示す。【００４９】
ＨＰＬＣにより得られたピーク１（ｐｅａｋ  １）を分取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果を、図２に示す。【００５０】
上記の解析結果、および後述のモデル合成の結果より、ピーク１はリゾチームより分子量が約１０ｋＤａ大きい、分岐型ＰＥＧが１個リゾチームに結合したＰＥＧ化リゾチームに相当することが確認された。【００５１】
例３：  機能化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の製造（下記合成スキームにしたがった）
【化９】
0005999659.tif 000010
【００５２】
（１）化合物２の合成
本合成で用いる器具はあらかじめ１２０℃にて１０時間乾燥庫で乾燥させておいた。１００ｍＬナスフラスコに化合物１（０．０７ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、三方活栓を取り付けた。窒素置換しながら蒸留ＴＨＦ溶媒（３０ｍＬ）、カリウム・ナフタレン（０．３０Ｍ、３．３７ｍＬ、１．００ｍｍｏｌ）を加え１５分攪拌した。蒸留後のエチレンオキサイド（５．６０ｍＬ、０．１１ｍｏｌ）を加え、６０時間攪拌した。反応後、冷凍庫で冷やしたＩＰＡ１．５０Ｌにより再沈殿を行った。遠心分離により反応物を分離させ、上澄み液を除いた。反応物をメタノールに溶かし２００ｍＬナスフラスコに回収し、エバポレーターにて反応物を濃縮させ、再び再沈殿を行った。再沈殿は３回行った。３回目のエバポレーターが終了後、１，４−ジオキサン５ｍＬに反応物を溶解させ、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、化合物２を収率８６％で得た。
ＧＰＣ  Ｍｎ７８１５，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０５【００５３】
（２）化合物３の合成
２００ｍＬナスフラスコに化合物２（７２３ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を入れ三方活栓を取り付けた。ＴＨＦ溶媒１５ｍＬを加え、０℃の氷浴につけながら水素化ナトリウム（５８．８ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌した。続いて、ヨウ化メチル（０．７５ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて４８時間攪拌した。反応後、セライトろ過にて不溶物を除去し、エバポレーターで反応物を濃縮させた。冷凍庫で冷やしたＩＰＡ（１．５Ｌ）で再沈殿を行った。遠心分離により反応物を分離させ、溶媒のみを捨てた。反応物をメタノールに溶かし２００ｍＬナスフラスコに回収し、エバポレーターにて反応物を濃縮させた。再沈殿は３回行った。３回目のエバポレーターが終了後、１，４−ジオキサン５ｍＬに反応物を溶解させ、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、化合物３を収率７３％で得た。
ＧＰＣ  Ｍｎ７８０３，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０５【００５４】
（３）化合物４の合成
１００ｍＬバイアル瓶で化合物３（４３４ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）をアセトン（３．０ｍＬ）、水（３．０ｍＬ）、アセト二トリル（３．０ｍＬ）に溶解させ、Ｎ−メチルモルホリン  Ｎ−オキシド（５７．３ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）、四酸化オスミウム（１２．５ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を加えた。室温にて４８時間振とうさせた。反応後、ろ過により四酸化オスミウムを取り除き、エバポレートし反応物を濃縮した。続いて、冷凍庫で冷したＩＰＡ（２００ｍＬ）で再沈殿を行った。遠心分離により反応物を分離させ、上澄み液を除いた。反応物をメタノールに溶かし２００ｍＬナスフラスコに回収し、エバポレーターにて反応物を濃縮させ、再び再沈殿を行った。再沈殿は３回行った。３回目のエバポレーターが終了後、１，４−ジオキサン５ｍＬに反応物を溶解させ、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、化合物４を収率８７％で得た。
ＧＰＣ  Ｍｎ７８６９，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０４【００５５】
（４）化合物５の合成
水（１００μＬ）とメタノール（４００μＬ）の混合液に過ヨウ素酸ナトリウム（５．２３ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を溶解させ、化合物４（１４７ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）に滴下して加え、１時間攪拌した。反応後、ジクロロメタンを用いて抽出し、硫酸ナトリウムにより脱水し、エバポレーターにより反応物を濃縮した。１，４−ジオキサン５ｍＬに反応物を溶解させ、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、化合物５を収率４５％で得た。
ＧＰＣ  Ｍｎ７８４９，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０５【００５６】
例４：  化合物５を用いた分岐型ＰＥＧ化タンパク質の合成
リゾチーム１．５ｍｇをｐＨ１０．３５（０．０５ｍＭ）の炭酸バッファー１５０μＬに溶解させた。この溶液７０μＬを、化合物５を４．０ｍｇ（リゾチームに対し５倍当量）が入ったエッペンに入れ、さらにｐＨ１０．３５（０．０５ｍＭ）の炭酸バッファー６００μＬを加え、室温にて３６時間静置させ反応させた。反応後の溶液をＨＰＬＣにて解析し、ＰＥＧ化リゾチームのピークを分取し脱塩カラムにて精製した。
ＨＰＬＣにより得られたＰＥＧ化リゾチーム含有画分を分取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果を、図４に示す。【００５７】
例５：  モデル合成
合成した分岐型ＰＥＧ化合物とアミノ基の結合部位の構造を解析するため、上記の両化合物５と同様に合成した分岐型ＰＥＧ（約５ｋＤａ）と２−アミノエタノールを反応させ、構造解析を行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの結果より以下の反応スキームで示されるようにアミノ基と分岐型ＰＥＧが結合していることがわかった。【００５８】
【化１０】
0005999659.tif 000011
【００５９】
計算値（ｎ＋ｍ＝９８）：４５６７．４０８［Ｍ＋Ｈ］＋  ，
実験値：４５６９．９６１［Ｍ＋Ｈ］＋【００６０】
試験例１：  ＰＥＧ化リゾチームの活性の評価
この試験例は、上記の例２の方法で得られた分岐型ＰＥＧ（１０ｋＤａ）化リゾチーム（本発明例）と従来のＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルＰＥＧ（日油株式会社：ＭＥ−０５０ＨＳ；比較例）をニワトリリゾチーム（分子量約１４．３ｋＤａ）に対して５倍当量加え０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、４℃において３時間反応させて合成し、単離精製して得られた単鎖ＰＥＧ（５ｋＤａ）化リゾチーム（コントロール）との活性を未ＰＥＧ化リゾチームの活性の相対的な残存活性について対比評価するものである。【００６１】
試験は、基質として、ミクロコッカス・リゾディクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）を用い、基質０．２４ｍｇを含む６６ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）８００μＬにＰＥＧ化リゾチーム（０．８μｇ）及びウシ血清アルブミン（２０μｇ）を含む６６ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）を２００μＬ加え４５０ｎｍの吸収を５分間測定し当該基質の加水分解活性を測定した。結果を、図３のグラフに示す。図３から、コントロールのＰＥＧ化リゾチームは直鎖ＰＥＧが一つ結合するだけで活性が大きく失われ、本来の活性のおよそ１％となるのに対し、本発明に従う分岐型ＰＥＧ化により得られるＰＥＧ化リゾチームのでは、有意に高いリゾチーム活性が残存していることが確認できる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明によれば、例えば、アミノ基を有する各種生物活性化合物を分岐ポリエチレングリコールで、アミノ基の陽荷電性を変化させることなく効果的に修飾することができる機能化ポリエチレングルコールを提供できる。したがって、本発明は限定されるものではないが医薬製造業で利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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