(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲルグルカン生成物を製造する方法であって、以下のステップ：
ａ）アルカリ塩、尿素およびホルムアミドから選ばれる、可溶性グルカンの水素結合を解離する薬剤で、グルカン分子の水溶液を処理し；
ｂ）ステップａ）の生成物を、グルカン内の水素結合の再形成を可能にする薬剤と接触させること、ここで、前記薬剤は強酸である、
を含み、
ステップａ）において、前記グルカンは酵母由来であり、１．５〜６％の濃度の水溶液に存在し、
前記ゲルグルカン生成物中のグルカンは、単一鎖基準で１５，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均モル質量、および凝集体基準で４〜２０×１０5ｇ／ｍｏｌの重量平均モル質量を有する、製造方法。
【請求項２】
前記ゲルグルカン生成物中のグルカンが、単一鎖基準で２５，０００〜４５，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均モル質量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲルが、３７〜６０℃の（ゲルからゾルへの）融解温度を有する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲルが、４０℃の（ゲルからゾルへの）融解温度を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記グルカンが２％〜４％の濃度の水溶液で存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記グルカンが２％の濃度の水溶液で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
サッカロミュケス・ケレウィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ゲルグルカン生成物が、β−（１，３）連結グルコシル残基の骨格、および２個以上のβ−（１，３）連結グルコシル残基を含む側鎖を含むベータグルカンであって、側鎖がβ−（１，６）連結経由で骨格に結合している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ゲルグルカン生成物が、繰り返しのβ−（１，６）連結グルコシル残基を本質的に含まない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
水素結合を解離する薬剤が、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、および水酸化ナトリウムから成る群より選ばれる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
水素結合を解離する薬剤が、５０ｍＭを超える最終濃度で使用される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
水素結合を解離する薬剤が、１５０ｍＭの最終濃度で使用される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記強酸が、塩酸、ギ酸、硫酸、リン酸、酢酸またはクエン酸である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップｂ）が１０分未満でゲル形成を引き起こす、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｂ）が４分未満でゲル形成を引き起こす、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップａ）およびｂ）の薬剤が等モル量添加される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
β−（１，６）結合グルコシル側鎖を除去し微粒子グルカンを可溶性化するために、微粒子グルカン出発物質をギ酸に懸濁する、加ギ酸分解のステップが先に実施される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療機器に組み込まれる医薬品、栄養補助食品、化粧用生成物などとしての新規のグルカン生成物、その製造のための方法、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルカンは、植物、細菌、真菌類および原生動物の細胞壁に見られるグルコースポリマーの不均質な一群である。グルカンは、主鎖、およびいくつかの事例において側鎖を有し、側鎖は、グルカンの起源に応じて、β（１，３）、β（１，４）および／またはβ（１，６）−連結グルコシル単位を含む。起源および単離方法に応じて、ベータグルカンは、骨格および側鎖において様々な分枝度および連結の型を有している。側鎖中の連結の頻度および型は、分子の生物学的活性に非常に重要である。グルカンはまた、鎖の凝集に対する傾向のみならず、分子量が非常に異なり、これらは共に、これらの分子の効能プロファイルに関する基本的な特色である。菌類および酵母起源のほとんどのベータグルカンは、本来の状態では水に不溶性であるが、酸による加水分解によって、または例えば−ホスファート、−スルファート、−アミン、−カルボキシメチルなどの外来の基を分子に導入する誘導体化によって可溶性にすることができる。
【０００３】
欧州、アジアおよび米国において、特にパン酵母からのベータグルカンは、動物用の飼料添加剤として、化粧品に、ヒト用の栄養補助食品として、例えば、創傷の治療における免疫調節薬として、および皮膚クリーム製剤中の活性成分として長く用いられてきた。グルカンは、国際公開第０２／０５８７１１号に示されているように癌の治療に用いられている。ベータグルカンは、この文脈において、一部は、癌に局所化された、うまく調節され部位限定された炎症反応を誘発することによって、白血球の活性を増やす免疫賦活剤と見なされている。炎症性腸疾患の治療におけるそれらの使用はまた、国際公開第２００９／０６３２２１号に記載されている。創傷治療のうちグルカンのさらなる適用は、欧州特許第８１５１４４号および米国特許第６８７５７５４号に、また、米国特許仮出願第１２／５２８，２１５号に記載されているような喘息およびアレルギーの治療に関しても記載されている。
【０００４】
穀物グルカンは、一般にβ（１，３）の非分枝鎖および著しい占有率のβ（１，４）連結を含むが、一方で、酵母グルカンは、β（１，３）連結グルコシル残基から主に構成され、β（１，３）およびβ（１，６）連結グルコシル残基の両方を含み得る側鎖に対する分岐点として働くβ（１，６）連結を含む。グルカンとして分類されるその他の分子はカードランを含み、これは、分岐のないβ（１，３）連結グルコシル残基で構成される基本的に線状分子である。レンチナンは、β（１，３）連結骨格を有するグルカンであるが、本質的に規則的に骨格に結合した単一β（１，６）連結グルコシル残基を組み込んでおり、この分子に櫛構造を与えている。単一β（１，６）連結グルコシル残基はβ（１，３，６）連結点と同等の骨格に結合しているが、それ以上の分子はこの連結点に結合しておらず、したがって、レンチナンのようなグルカンは側鎖を有していない。この群のグルカンの他の例は、スクレログルカン、ラミナリンおよびシゾフィランである。
【０００５】
分岐および側鎖の長さおよび構造における変異は、対照をなす、二次および三次構造、したがって生物学的活性をもたらす。グルカンのより高次の秩序構造は相当に変動し、分子量、溶解性および粒子の大きさはすべて、一般に予測不能なように活性に影響を及ぼす。いくつかの生成物は、標的細胞中の炎症性サイトカインの極めて強力な誘発因子であるが、その他は反対の作用を有し、完全にサイトカイン放出を阻害する。多くの不溶性ベータグルカン生成物に対して典型的なのは、全般の炎症応答の誘発であり、例えば、不溶性ベータグルカン製剤の注射は、肉芽腫形成、関節炎誘発およびグラム陰性菌敗血に対する感受性の増加に関連している。他の側面で、可溶性ベータグルカンは、そのような負の副作用で妨害されると報告されていないが、免疫賦活剤としての効能は実質的に変動することが知られている。
【０００６】
国際公開第９５／３００２２で、例えば、（１，６）連結側鎖を選択的に除去するグルカナーゼ処理によって変性した酵母由来のグルカン生成物が、魚類の免疫系の刺激において無傷の（１，６）連結側鎖を有する生成物より強力であることが示された。
【発明の概要】
【０００７】
グルカンは治療剤およびアジュバントとして高い潜在能力を有するが、広い範囲の構造的ばらつき、そのような大きく複雑な分子を含む分析の問題、これらの分子に関する作用機序および受容体についての理解の不足は、あつらえの生物学的活性を有する改善されたグルカン生成物、および均質な生成物の製造のための制御可能、かつ反復可能な方法に対する大きい必要性がなお存在することを意味する。
【０００８】
ベータグルカンは、幾つかの病原性（微小）生命体、特に真菌類の表面で見出されるような、いわゆる病原体関連分子パターンであることが知られている。より高等な生命体は、それにより、この種類の生命体に属する侵入者を発見し破壊するために、これらの型の構造を認識するメカニズムを進化させた。哺乳動物において、いわゆる生得の免疫細胞は、ベータグルカンを認識する特定の受容体を発現し、最も顕著な受容体の１つはデクチン−１と呼ばれる。他の受容体もベータグルカンによって誘発される認識またはシグナル伝達に関与し、これらの中には、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（ＣＲ３）、ならびにＴｏｌｌ受容体２および４（ＴＬＲ２およびＴＬＲ４）がある。ベータグルカンの認識に関与する細胞のうち、生得の免疫系の典型的な食細胞、すなわち単球、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球があるのみならず、ナチュラルキラー細胞、ならびに、幾つかの内皮細胞、および他の、より組織特定の細胞も、ベータグルカン受容体を発現する能力を有している。
【０００９】
標的細胞中で生体応答を誘発する決定的なステップは、受容体への最初の結合であり、さらに、十分なシグナル伝達を細胞中に誘発するためのベータグルカン製剤が十分な数の受容体と架橋する能力と思われる。本発明は、特定の型の生物学的活性を誘発する受容体を交差結合する能力を有する生成物および生成物を製造する方法を記載する。これは、幾つかの受容体を交差結合することによって大量の応答を誘発し、次に細菌が食菌し、不溶性の（「または結晶様」）グルカンの性質によってＮＬＲＰインフラマソーム活性化を誘発する細胞内のリソソームの破壊をもたらし得る不溶性生成物と対照的である。不溶性ベータグルカンはまた、不利な炎症反応を引き起こすインフラマソーム活性化の引き金も引くＲＯＳ（活性酸素種）を誘発し得る。本発明は、いくつかの免疫メカニズムを活性化する著しい炎症応答を誘発することができるが、幾つかの（凝集した不溶性の）ベータグルカン生成物に関して典型的なインフラマソーム活性化の引き金を引かないベータグルカン生成物を記載する。
【００１０】
本発明は、最終生成物中に薬学的に有益な超分子構造を確立することにより、グルカン効能を強化する。
【００１１】
β−グルカン中のより高次の秩序構造の重要性および個々のグルカンのストランドまたは鎖およびグルカン生成物の全体的な活性に対するより高次の秩序構造の両方の特性の寄与が、Ｓｌｅｔｍｏｅｎ  ｅｔ  ａｌによって．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｖｏｌ．  ８９，  Ｎｏ．  ４  ｐｐ  ３１０−３２１，  ２００８に記載されている。より高次の秩序構造は、三重螺旋またはより緩い凝集などの規則的な構成を含み得る。
【００１２】
本発明は、標的細胞が遭遇した場合、中程度の大きさの存在として知覚され、食菌された場合、グルカンは、リソソームの破壊を誘発せずに食作用胞へ容易に取り込まれるグルカン製剤を与える。したがって本発明は、良好なゲル化特性を有する非常に強力な可溶性ベータグルカンの新規の組織を記載する。理論に拘束されることを望むわけではないが、グルカン分子は、グルカン骨格構造に沿った頻繁な−ＯＨ基の間の比較的弱い水素結合によって束ねられた、一種のより高度に複雑で緩い「干し草の山」の構成に配置されていると思われる。「干し草の山」組織は、標的細胞上の特定のグルカン受容体による認識に利用可能なその表面の幾つかの部位を提示する潜在能力を有している。しかしながら、「干し草の山」に組織化された分子は、不溶性生成物の剛性を保持しないが、はるかに簡単に「分解される」ようになり、それにより、その部位で、または食作用後に「固定化される。」  そのような大きなより高度の秩序組織は、不溶性のおよび既知の可溶性の生成物のいずれと比較しても有利である。その理由は、それが、不溶性ベータグルカンに関連すると知られているそれほど制御可能でなく起こり得る有害な影響を誘発することなく、微粒子および不溶性ベータグルカンで観察される影響の多くを模倣する免疫調節応答を与えるからである。
【００１３】
一態様において、本発明は、１５，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌの単一鎖基準の重量平均モル質量、および水溶液中で４〜２０×１０5ｇ／ｍｏｌの凝集体基準の重量平均モル質量を有するグルカンであって、濃度≧１％で２５℃および中性のｐＨで水に溶解された場合、ゲル形態で存在し、２％の濃度で水に溶解された場合、３０℃を超える、好ましくは３５℃〜８０℃の間、より好ましくは３５〜６０℃の間、なおさらに好ましくは３７℃〜６０℃の間、最も好ましくは約４０℃の（ゲルからゾルへの）融解温度を有する、グルカンを提供する。
【００１４】
好ましくは、グルカンは、１．５〜６％、より好ましくは１．５〜５％、なお好ましくは２〜４％、最も好ましくは約２％の濃度の水溶液である。「ゲル」形態は水溶液と考えることができると理解されている。
【００１５】
好ましい態様において、グルカンは、ベータグルカンであり、好ましくはβ（１，３）連結グルコシル残基の骨格、およびβ（１，６）連結を介してそれに結合した、β（１，３）連結グルコシル残基の側鎖（例えば、少なくとも２、５、１０または２０個の連結グルコシル残基の側鎖）を有する。
本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例および図においてさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明によるグルカンゲルに関して温度に対してプロットされた貯蔵弾性率、Ｇ’（Ｐａ）を示す図である。データは、Ｓｔｒｅｓｓｔｅｃｈ  ＨＲレオメーターおよび以下の温度スキャンを使用して、小歪み振動測定によって得られた：１／３℃／ｍｉｎの速度で７０〜１０℃に、１０℃で２時間維持し、次いで１／３℃／ｍｉｎの速度で１０〜７０℃に。このゲルの（ゲルからゾルへの）融解温度は、昇温曲線が平坦化するところに（Ｇ’≒０Ｐａ）に基いて約４０℃に求められる。
【図２ａ】ＳＧ（０８１−５、２５２−７、３４２−８、４２１−４）の異なるバッチおよび濃度、ならびにＳＧ−ＬＳ（４２１−４、新規）の異なる濃度を含むヒトｍＤＣのインビトロ刺激を示す図である。分泌されたａ）ＴＮＦα濃度はＹ軸に沿って示されている。
【図２ｂ】ＳＧ（０８１−５、２５２−７、３４２−８、４２１−４）の異なるバッチおよび濃度、ならびにＳＧ−ＬＳ（４２１−４、新規）の異なる濃度を含むヒトｍＤＣのインビトロ刺激を示す図である。分泌されたｂ）Ｇ−ＣＳＦの濃度はＹ軸に沿って示されている。
【図２ｃ】ＳＧ（０８１−５、２５２−７、３４２−８、４２１−４）の異なるバッチおよび濃度、ならびにＳＧ−ＬＳ（４２１−４、新規）の異なる濃度を含むヒトｍＤＣのインビトロ刺激を示す図である。分泌されたｃ）ＩＬ−１０の濃度はＹ軸に沿って示されている。
【図２ｄ】ＳＧ（０８１−５、２５２−７、３４２−８、４２１−４）の異なるバッチおよび濃度、ならびにＳＧ−ＬＳ（４２１−４、新規）の異なる濃度を含むヒトｍＤＣのインビトロ刺激を示す図である。分泌されたｄ）ＣＸＣＬ−１０の濃度はＹ軸に沿って示されている。
【図２ｅ】ＳＧ（０８１−５、２５２−７、３４２−８、４２１−４）の異なるバッチおよび濃度、ならびにＳＧ−ＬＳ（４２１−４、新規）の異なる濃度を含むヒトｍＤＣのインビトロ刺激を示す図である。分泌されたｅ）ＩＬ−１２ｐ７０の濃度はＹ軸に沿って示されている。
【図３ａ】ＳＧ（０８１−５、２５２−７、３４２−８、４２１−４）の異なるバッチおよび濃度、ならびにＳＧ−ＬＳ（４２１−４、新規）の異なる濃度の、ＬＰＳを含めたヒトｍＤＣのインビトロ共刺激を示す図である。分泌されたａ）ＴＮＦαの濃度はＹ軸に沿って示されている。
【図３ｂ】ＳＧ（０８１−５、２５２−７、３４２−８、４２１−４）の異なるバッチおよび濃度、ならびにＳＧ−ＬＳ（４２１−４、新規）の異なる濃度の、ＬＰＳを含めたヒトｍＤＣのインビトロ共刺激を示す図である。分泌されたｂ）Ｇ−ＣＳＦの濃度はＹ軸に沿って示されている。
【図３ｃ】ＳＧ（０８１−５、２５２−７、３４２−８、４２１−４）の異なるバッチおよび濃度、ならびにＳＧ−ＬＳ（４２１−４、新規）の異なる濃度の、ＬＰＳを含めたヒトｍＤＣのインビトロ共刺激を示す図である。分泌されたｃ）ＩＬ−１０の濃度はＹ軸に沿って示されている。
【図３ｄ】ＳＧ（０８１−５、２５２−７、３４２−８、４２１−４）の異なるバッチおよび濃度、ならびにＳＧ−ＬＳ（４２１−４、新規）の異なる濃度の、ＬＰＳを含めたヒトｍＤＣのインビトロ共刺激を示す図である。分泌されたｄ）ＣＸＣＬ−１０の濃度はＹ軸に沿って示されている。
【図３ｅ】ＳＧ（０８１−５、２５２−７、３４２−８、４２１−４）の異なるバッチおよび濃度、ならびにＳＧ−ＬＳ（４２１−４、新規）の異なる濃度の、ＬＰＳを含めたヒトｍＤＣのインビトロ共刺激を示す図である。分泌されたｅ）ＩＬ−１２ｐ７０の濃度はＹ軸に沿って示されている。
【図４】異なる濃度のＳＧおよびＳＧ−ＬＳによって刺激されたｄｂ／ｄｂマウスからのマクロファージによるＣＸＣＬ２の分泌を示す図である。ＬＳは、ＳＧ−ＬＳを示す。＊ｐ＜０，０５。
【図５】異なる濃度のＳＧおよびＳＧ−ＬＳによって刺激されたｄｂ／ｄｂマウスからのマクロファージによるＰＧＥ２の分泌を示す図である。ＬＳは、ＳＧ−ＬＳを示す。
【図６】異なる濃度のＳＧおよびＳＧ−ＬＳによって刺激されたｄｂ／ｄｂマウスからのマクロファージによるＧＭ−ＣＳＦの分泌を示す図である。ＬＳは、ＳＧ−ＬＳを示す。
【図７】ＳＧ（４２１−４）、ＳＧ−ＬＳ（４２１−４ＬＳ）いずれかによって刺激された、デクチン−１過剰発現ＲＡＷ細胞株によるＴＮＦαの分泌を示す図である。リン酸緩衝生理食塩水は負の対照として役立った。
【図８】ＳＧ１３１−９  ２％および強化された（Ｌ／Ｓ）１３１−９  ２％対ビヒクル（水）および正の対照（ｒｈ−ＰＤＧＦ−ＢＢ（１０μｇ）＋０．５％ＨＰＭＣ中ｒｈ−ＴＧＦ−α（１μｇ））を示す図である。平均値±標準平均誤差。＊ｐ＜０，０５。＊＊ｐ＜０，０１。
【図９】アルカリおよび酸で処理する前の出発グルカンと一緒の、本発明に従って製造された、強化されたグルカンの水溶液中でのＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩクロマトグラムを示す図である。プロファイルは類似しているが、非常に高分子量の凝集体が処置によって除去されたことは明白である。
【図１０】ヌードマウスに皮内移植された異種のＢＴ４７４腫瘍細胞の成長を示す図である。ＳＧ（０９ＢＰ００３）、ＳＧ−ＬＳ（０９ＢＰ００３）または水（溶媒対照）は、一日おきに７日目から３８日目まで経口投与した。
【図１１ａ】ヒトのインビトロ分化させた血液単球由来の骨髄性樹状細胞供給の、２時間ＤＴＡＦ染色したＳＧ（１００μｇ／ｍｌ）およびＳＧ−ＬＳ（２０μｇ／ｍｌ）における蛍光を示す図である。ＤＴＡＦはＦＡＣＳによって検出した。ＤＴＡＦのレベルは、デクチン−１結合抗体（拮抗薬）（ａ）によって前処理した未熟な細胞で調べた。ＰＢＳ単独（ａ）で前処理したグルカン供給の未熟細胞中のＤＴＡＦレベルは、対照（１００％）として役立った。Ｙ軸は、対照と比較した百分率蛍光を示す。
【図１１ｂ】ヒトのインビトロ分化させた血液単球由来の骨髄性樹状細胞供給の、２時間ＤＴＡＦ染色したＳＧ（１００μｇ／ｍｌ）およびＳＧ−ＬＳ（２０μｇ／ｍｌ）における蛍光を示す図である。ＤＴＡＦはＦＡＣＳによって検出した。ＤＴＡＦのレベルは、成熟したｍＤＣ（ｂ）によって前処理した未熟な細胞で調べた。ＰＢＳ単独（ｂ）で前処理したグルカン供給の未熟細胞中のＤＴＡＦレベルは、対照（１００％）として役立った。Ｙ軸は、対照と比較した百分率蛍光を示す。
【図１２ａ】ヒトのインビトロ分化させた血液単球由来の骨髄性樹状細胞供給の、２時間ＤＴＡＦ染色したＳＧ（１００μｇ／ｍｌ）、ＳＧ−ＬＳ（２０μｇ／ｍｌ）、デキストランおよびルシフェラーゼイエロー（ＬＹ）における蛍光を示す図である。デキストランはクラスリン依存性対照リガンドであるが、ＬＹは液相（マクロピノサイトーシス）マーカーである。ＤＴＡＦはＦＡＣＳによって検出した。ＤＴＡＦのレベルは、示した阻害薬によって前処理した未熟細胞で調べた。ＰＢＳ単独で前処理したグルカン供給の未熟細胞中のＤＴＡＦレベルは、対照（１００％）として役立った。Ｙ軸は、対照と比較した百分率蛍光を示す。
【図１２ｂ】ヒトのインビトロ分化させた血液単球由来の骨髄性樹状細胞供給の、２時間ＤＴＡＦ染色したＳＧ（１００μｇ／ｍｌ）、ＳＧ−ＬＳ（２０μｇ／ｍｌ）、デキストランおよびルシフェラーゼイエロー（ＬＹ）における蛍光を示す図である。デキストランはクラスリン依存性対照リガンドであるが、ＬＹは液相（マクロピノサイトーシス）マーカーである。ＤＴＡＦはＦＡＣＳによって検出した。ＤＴＡＦのレベルは、示した阻害薬によって前処理した未熟細胞で調べた。ＰＢＳ単独で前処理したグルカン供給の未熟細胞中のＤＴＡＦレベルは、対照（１００％）として役立った。Ｙ軸は、対照と比較した百分率蛍光を示す。
【図１２ｃ】ヒトのインビトロ分化させた血液単球由来の骨髄性樹状細胞供給の、２時間ＤＴＡＦ染色したＳＧ（１００μｇ／ｍｌ）、ＳＧ−ＬＳ（２０μｇ／ｍｌ）、デキストランおよびルシフェラーゼイエロー（ＬＹ）における蛍光を示す図である。デキストランはクラスリン依存性対照リガンドであるが、ＬＹは液相（マクロピノサイトーシス）マーカーである。ＤＴＡＦはＦＡＣＳによって検出した。ＤＴＡＦのレベルは、示した阻害薬によって前処理した未熟細胞で調べた。ＰＢＳ単独で前処理したグルカン供給の未熟細胞中のＤＴＡＦレベルは、対照（１００％）として役立った。Ｙ軸は、対照と比較した百分率蛍光を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
「中性のｐＨ」とはｐＨ７を意味する。
【００１８】
「単一鎖」は、個々のグルカン分子、すなわちグリコシル残基が共有結合で連結されたものを指す。「凝集体」は、水素結合相互作用によって形成され、超分子またはより高次の秩序構造を規定する。そのような会合は共有結合によって得られるほど永続的ではないが、本明細書に記載される方法は、認識し得るパターンの凝集をもたらし、その平均モル質量は本明細書に言及される技法を使用して分析することができる。「水溶液」は通常ｐＨ７である。
【００１９】
代替として眺めれば、本発明は、１〜６％の濃度の水溶液のグルカンを含むゲルグルカン生成物であって、グルカンが４〜２０×１０5ｇ／ｍｏｌの凝集体基準の重量平均モル質量および１５，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌの単一鎖基準の重量平均モル質量を有し、ゲルグルカン生成物が、３０℃を超える、好ましくは３５℃〜８０℃の間、より好ましくは３５〜６０℃の間、なおさらに好ましくは３７℃〜６０℃の間、最も好ましくは約４０℃の（ゲルからゾルへの）融解温度を有する、ゲルグルカン生成物を提供する。
【００２０】
グルカン生成物は、通常、微粒子、またはある場合、可溶性である。ゲル形態はまったく普通でないが、しかし本ゲル生成物は、他のグルカン生成物と比較して、特に創傷治癒において優れた生物学的活性を提供することが見出された。創傷治癒において、創傷の湿度化を確保するように医薬品または医療機器を適用することが最も重要であり、生成物は、感染を回避するために創面を覆い粘着し、医師によって適切と、または創傷の型により必要と見なされる投与プロファイルを提供しなければならない。通常、微粒子、半可溶性または液状形態のグルカンは、有効ではないか、創傷治癒目的に適用できない状態であるといういずれか、またはその両方の理由で、これらの基本的要件を解決しない。本発明のグルカンは、それにより純粋なグルカンゲルが適当な使用を見出し得るすべての用途のために有用にするこれらの必要な特性を組み合わせている。厳密に局所用の適用に加えて、他の可能な使用は、本ゲル生成物が優れた活性を有することが見出された癌治療に加えて胃腸管または口腔の疾患を治療する経口および／または粘膜の投与であってもよい。本発明によるグルカンの優れた接着性によって粘膜壁を作用点で覆うことができ、それにより治癒過程を加速する。したがって、本発明のグルカンは、口腔の粘膜炎および粘膜に影響を与える他の徴候の治療において特に有用性を有している。
【００２１】
本発明によれば、ゲル構造への可溶性グルカンの新規の組織は、グルカン鎖内のおよびグルカン鎖間の水素結合を共に解離することができる薬剤で、可溶性グルカンの十分に濃い溶液を処理し、続いて、分子鎖間および分子内水素結合相互作用を速やかに回復することができる薬剤を添加することにより得ることができる。グルカンの超分子の三次の、または三次元の構造、この場合、全体としてグルカン生成物内の分子鎖の構成は、効能にとって最も重要に思われる。理論に拘束されることを望むわけではないが、生物学上有効な分子構造のみが、標的細胞で異なる受容体に結合することを可能にするように思われる。好適な三次元の複雑な方式で構築されていない単一鎖、短鎖または生成物は、同じ方法で身体免疫系を刺激することはできない。
【００２２】
単一鎖が含むゲルの三次元の（三次または超分子の構造としても定義される）分子構造を特性評価する方法は限定されている。そのようなゲルを記載する一般方法は、単一鎖の平均モル質量およびモル質量分布、ならびに粘性などの物理的特性によることができる。免疫調節生成物の場合には、ゲルはまた、それらの生物学的な効能プロファイルによって間接的に記載することができ、または、言いかえれば、いわゆる「生物学的な指紋」を測定する。規定する物理的特性として分子量を使用する場合、生物学上有効な三次元超分子構造を与えるために必要なこれらの単一鎖の間の分子相互作用の詳細な絵を与えるのではなく、ゲル生成物、またはより小さい凝集構造の単一鎖成分の分析をもたらす分析法が一般に破壊的であることは認識されている。それにもかかわらず、生物学的な効能プロファイルと組み合わせたそれらの粘性を含むグルカンの他のいくつかの物理的特性の詳細な分析によって、熟練者は、様々な異なるグルカンを識別することができる。これらの判定基準の一つは特定の分子量範囲である。
【００２３】
グルカンのモル質量は異なる方法で求めることができる。可溶性グルカン生成物の場合には、モル質量がＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩ分析（多重角度光散乱および屈折率検出を含むサイズ排除クロマトグラフィー）によって好都合に測定され、そのような分析は試料の重量平均モル質量値（ＭW）、ならびに試料内の異なる分子量の分布を提供する。本発明において、重量平均分子量（ＭW）は以下のように定義される：
【００２４】
【数１】
0005932825.tif 000002
【００２５】
式中、ｎiはモル質量Ｍiを有する分子数である。モル質量Ｍiを有する分子の重量濃度ｃiは、モル質量Ｍiおよび分子数ｎiに比例する。
【００２６】
【数２】
0005932825.tif 000003
【００２７】
クロマトグラムにおいて各切片の重量濃度は、ＲＩ検出器によって求められるが、一方、クロマトグラム中の各切片のモル質量は、ＲＩ検出器と組み合わせたＭＡＬＳ検出器によって測定される。その計算は光散乱理論に基く。
【００２８】
具体的には、本発明による平均モル質量（単一鎖の）は、この溶媒中でグルカンに対して０．１２のｄｎ／ｄｃを仮定して、０．５％ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃ（０．５％の塩化リチウムを含むジメチルアセトアミド）中でＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩによって求められる。ＤＭＡｃ／ＬｉＣｌ溶媒は、前記グルカンを単一鎖へ完全に溶解する。それに続く溶離液としての０．５％ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃでのＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩ分析は、したがって単一鎖レベルでの分子量分布の尺度を与える。手短に言えば、ＤＭＡｃ／ＬｉＣｌ中のグルカンの分析は、３×ＰＬｇｅｌ  Ｍｉｘｅｄ−Ａ  ＬＳ  カラムおよび溶離液としての０．５％ＬｉＣｌを含むＤＭＡｃを使用するＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩによる分析前に、約３ｍｇ／ｍｌの濃度で室温で終夜溶液を撹拌し、１００℃で１時間それを加熱することによる乾燥したグルカンの溶媒への溶解を必要とする。この方法によって求められる単一鎖基準の本発明のグルカンの重量平均モル質量は、１５，０００〜５０，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは２５，０００〜４５，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは３０，０００〜４０，０００ｇ／ｍｏｌである。
【００２９】
水溶液中で、主としてより高次の秩序構造および存在する凝集体の重量平均モル質量は、４〜２０×１０5ｇ／ｍｏｌ、好ましくは５〜１５×１０5ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは６〜１２×１０5ｇ／ｍｏｌである。これらの平均は、非常に大きな凝集体、すなわち、１．０×１０7ｇ／ｍｏｌを超えるモル質量が除外される場合に好ましくは計算される。水溶液中でのグルカンの分析は、０．０２％のＮａＮ3を含む０．１Ｍ  ＮａＮＯ3中で約３ｍｇ／ｍｌにゲル溶液を希釈すること、ふたをしたガラス管中で３０分間１００℃に加熱すること、室温に冷却すること、０．２μｍ注射器フィルターで濾過すること、および、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ５０００  ＰＷＸＬ＋ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ４０００  ＰＷＸＬ  カラムおよび溶離液として０．０２％ＮａＮ3を含む０．１Ｍ  ＮａＮＯ3を使用するＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＲＩによる分析を伴う。溶媒／溶離液として、例えば０．０５  Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４／０．０１  Ｍ  ＥＤＴＡを含む類似の設定は同等の結果を与える。水溶液中の、単一鎖に対するモル質量値およびより高次の秩序構造／凝集体の組み合わせは、ゲルの分子および超分子構造の良好な指標を全体として与え、本発明のグルカンを有用に定義する。
【００３０】
本発明のグルカンは、２５℃で、３〜８の間のｐＨでゲル形態であることをさらに特徴とする。本発明のグルカンゲルは、３０℃を超えかつ最高８０℃、好ましくは正常体温を超え、より好ましくは３７℃〜６０℃の間、最も好ましくは３９℃〜６０℃の間、例えば４０〜５０℃のゲルの（ゲルからゾルへの）融解温度によって例示される粘性プロファイルをさらに特徴とする。上記の図は、２％の濃度の水溶液のグルカンゲルに対して与えられる。
【００３１】
グルカン生成物のゲル融点、すなわち、ゲル→ゾル転移温度は、好都合には、Ｓｔｒｅｓｓｔｅｃｈ  ＨＲレオメーターまたは類似機を使用し、グルカン溶液の冷却（７０→１０℃）および加熱（１０→７０℃）の間の粘弾性の変化を調べる小歪み振動の測定によって求められる。そのような実験において温度に対してプロットされた貯蔵弾性率（Ｇ’）の例は、図１に示される。この特定の試料のための融解温度は、温度の上昇に対して貯蔵弾性率の曲線が（約０Ｐａで）平坦になるところと等価であり、これは約４０℃である。ゲルのおよその融解温度を求める別の方法は、粘性が本質的になくなり、ゲルが溶液へ転換するまで、ゲルの粘性（例えば、回転粘度計を使用して）を連続してより高温で測定することである。局所適用のための安定したグルカンゲルを保証するために、融解温度は好ましくは約３０〜４４℃であり、好ましくは体温を超える。局所投与は、経口投与または感染部位への投与と比較して低い融解温度を要求する。
【００３２】
本発明のグルカンゲルは水性ゲルであり、目視検査によってゲル形態を確証することができるが、グルカンゲルの粘性ならびに擬塑性およびチキソトロピーの性質はまた、粘度測定によって、例えば、回転粘度計の使用によって求めることができる。本発明による２％のグルカンゲルは、少なくとも１０００ｃＰ、好ましくは少なくとも１５００ｃＰの粘性を有し、これは、小さい試料アダプターおよびスピンドルＳＣ４−３１（３．４０ｓｅｃ-1の剪断速度に対応する）を有するＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＤＶ−ＩＩ＋  Ｐｒｏ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ粘度計を使用して、２５℃および１０ｒｐｍの回転速度で測定される。この擬塑性およびチキソトロピーのゲルの粘性を測定する好都合な方法は、例えば２ｒｐｍで開始し２ｒｐｍの増分で１０ｒｐｍまで上げ、次いで、２ｒｐｍステップで下げ戻す、いわゆるアップダウン速度傾斜を使用することである。そのような実験からのデータは、ゲルの擬塑性（剪断速度の増加につれて粘性が減少する）およびチキソトロピー（剪断を施すと経時的に粘性が低下する）の特性を示し、しかも例えば１０ｒｐｍの粘性の測定を提供することができる。
【００３３】
本発明のグルカンは、通常酵母に由来し、好ましくはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形態である。これらのグルカンの基本的な分子構造は、通常β−１，３−骨格（β−１，３連結によって連結したグルコース分子の鎖を意味する）であり、それに加えて、β−１，３側鎖（β−１，３連結によって連結した少なくとも２個のグルコース分子の鎖を意味する）、および側鎖を骨格に連結したβ−１，３，６−連結点である。さらに、酵母からのグルカンは、側鎖または直接骨格に連結されていてもよいβ−１，６連結を含む。さらなる型の連結も存在するが、比較的低濃度である。グルカンの起源として提供し得る他の酵母は、ビール酵母（Ｂｒｅｗｅｒｓ  ｙｅａｓｔ）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ）、例えばカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・クロアカエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｌｏａｃａｅ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ）、例えばハンゼヌラ・ウィングエイ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｗｉｎｇｅｉ）、ハンゼヌラ・アーニ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｒｎｉ）、ハンゼヌラ・ヘンリシイ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｈｅｎｒｉｃｉｉ）およびハンゼヌラ・アメリカーナ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、ヒストプラズマ種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ）、クロエケラ種（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ  ｓｐ）、クルイベロマイセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ）、例えばクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロマイセス・ポリスポラス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ）、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ）、ロドトルラ種（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ）、サッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ）、例えばサッカロマイセス・デルブルエキイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ）、サッカロマイセス・ロゼイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｉ）、サッカロマイセス・マイクロエリプソデス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｄｅｓ）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）または別のサッカロマイセス株、例えばサッカロマイセス・セレビシエＲ４（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｒ４）（ＮＲＲＬ  Ｙ−１５９０３）およびＲ４  Ａｄ（受入番号７４１８１）、シゾフィラム種（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｐ）、シゾサッカロマイセス種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ）、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、トルラ種（Ｔｏｒｕｌａ  ｓｐ）およびトルロプシス種（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｓｐ）が挙げられる。
【００３４】
しかし、本発明のゲルグルカンは他の適切な起源、例えば細菌、菌類、穀物グルカンに由来してもよい。様々なグルカンの治療活性は当業界で十分立証され、本発明の方法は、一般にグルカンの活性を増強するために、特に、グルカン生成物の物理的形態および分子間構造が特に意義深いことが本発明者らによって示されている創傷治癒において、使用することができる。理論に拘束されることを望むわけではないが、一般則によれば、本発明に従って使用されるグルカンの単一鎖基準の重量平均モル質量が高いほど、より効果的なグルカンゲルを製造することができる。
【００３５】
本発明のグルカンゲルの側鎖は、通常２個以上のβ（１，３）連結グルコシル単位を含む。本発明によれば、主鎖に連結した単一分子は「側鎖」と見なされない。
【００３６】
本発明のグルカンは、好ましくは、β（１，３）連結グルコシル単位の側鎖を有する、すなわち、β（１，３）連結グルコシル単位からなる、またはβ（１，３）連結グルコシル単位から本質的になる。このβ（１，３）連結側鎖に加えて、グルカンはまた１個または複数のβ（１，６）連結側鎖があってもよい。構造の鎖を改変することによって、最終生成物の特性を変えることが可能である。酵素処理、ギ酸もしくは塩酸のような酸または異なる塩基の使用ならびに他の手段を含むグルカンを改変する様々な方法がある。好ましいグルカンは、酸（例えばギ酸）もしくは酵素または他の適切な方法によって処理され、グルカン内の繰返しの（１，６）連結グルコース分子の数を著しく減らした、またはなくしたものである。これらの（１，６）連結グルコシル部分は、酵母に由来するベータグルカンの側鎖中で通常見出される。結果として得られたグルカンは、β（１，３）脱離処理によって切断されない単一β（１，６）連結によってそれに連結した主鎖およびβ（１，３）側鎖を有する。
【００３７】
好ましいグルカンは、繰返しのβ（１，６）連結グルコシル残基を本質的に含まない。分岐点（β（１，３，６）分岐点）での単一（１，６）連結は、「繰返しの」β（１，６）連結グルコシル単位を与えない。「本質的に含まない」によって、グルコシル単位全体の６％未満、好ましくは４％、最も好ましくは３％未満を意味する。
【００３８】
酵素処理などのいくつかの処理は、側鎖中に切断されない最大４個のベータ−１，６−連結を、しかし、通常は、２個のベータ１，６連結グルコシル単位を残すことがある。そのような分子はまた、繰返しのベータ１，６−連結グルコシル単位を「本質的に含まない」。
【００３９】
本発明の好ましいグルカンの内の連結の分布は以下のように表すことができる。
【００４０】
【表１】
0005932825.tif 000004
【００４１】
β（１，３，６）は、骨格中で（１，３）連結する分岐点残基を指し、（１，６）接続に関与して、側鎖を与える。
【００４２】
本発明のグルカンは、単一の形態、または抽出分画もしくは異なる平均分子量を有する２以上の異なる分画であってもよい。
【００４３】
グルカンは、化学変性基の点からは誘導体化されていない。
【００４４】
本発明のグルカンは新規の方法によって生成される。本発明者らは、グルカン鎖間の水素結合を解離することができる薬剤で、可溶性グルカンの十分に濃い溶液を処理し、続いて鎖間の相互作用を回復することができる薬剤を添加して、他の類似したグルカン生成物と比較して、改善された活性を有する新規のゲルグルカン生成物が得られることを見出した。こうすることによって、非常にランダムに組織化された「干し草の山」ゲルは、「アニールされた」ベータグルカン鎖の典型的な三重螺旋構造を有することなく作られる。驚くべきことに、この種のゲル構造は、三重螺旋配座または多重螺旋のいずれかにおいても、古典的な組織化された可溶性ベータグルカンより免疫調節薬として有意により強力であることが観察された。
【００４５】
したがって、さらなる態様において、本発明は、グルカン鎖間の水素結合を解離するためにグルカン分子の水溶液を薬剤で処理し、次いで、グルカン鎖間の水素結合の再形成を可能にする薬剤で処理する、上記に定義されるゲルグルカン生成物を製造する方法を提供する。
【００４６】
したがって、本発明は、
ａ）水素結合を解離することができる薬剤でグルカン分子の水溶液を処理するステップと、
ｂ）水素結合を速やかに再形成することができる薬剤を添加するステップとを含むグルカンゲルを製造する方法を提供する。
【００４７】
代替として眺めれば、本発明は、
ａ）グルカンの水素結合を解離する薬剤でグルカン分子の水溶液を処理するステップと、
ｂ）グルカン内の水素結合を再形成することができる薬剤とステップａ）の生成物を接触させるステップとを含む本明細書に記載されているグルカンゲル生成物を製造する方法を提供する。
【００４８】
解離され再形成される水素結合は、分子内、すなわち、単一鎖内、または分子間、すなわち鎖間であってもよく、結果として凝集体を形成する。
【００４９】
好ましくは水素結合を解離することができる薬剤は、アルカリ塩である。好ましくは水素結合を解離することができる薬剤は、５０ｍＭを超える、好ましくは約１５０ｍＭの最終濃度で使用される。
【００５０】
ステップａ）は、好ましくは１０℃〜２５℃、より好ましくは１５℃〜２０℃、最も好ましくは約１８℃の温度で実施される。
【００５１】
水素結合を解離することができる薬剤の添加は、好ましくは徐々に、好ましくは水１０リットルに溶解した２４モルのＮａＯＨを１分当たり約１リットルの速度で２％のグルカン溶液２００リットルに、または体積または濃度が異なる場合、同等の速度で実施される。
【００５２】
ポリグルコース鎖のＯＨ基間の水素結合を溶解する、そのような一薬剤は、鎖中の多数のＯＨ基を脱プロトン化する、十分な濃度の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）である。このことにより、これらの高分子量グルカンに典型的なすべての分子間結合を完全に解離し、結果として溶液中の鎖のランダムな組織をもたらす。アルカリを中和するために酸の添加による溶液を中和することによってＯＨ基は再形成され、鎖間の新しい水素結合を構築することができる。
【００５３】
薬剤としてのＮａＯＨの使用は、通常、例えば、２Ｍ  ＮａＯＨ溶液から、５０ｍＭを超える、またはより好ましくは約１５０ｍＭの最終濃度を水溶液中の１〜６％、より好ましくは１．５〜４％、または最も好ましくは２〜４％の可溶性グルカン濃度に添加する必要がある。
【００５４】
水素結合を再形成するステップはまた、水素結合を解離することができる薬剤の添加後の溶液の中和として眺めることができる。
【００５５】
水素結合を解離することができる薬剤が好ましくはアルカリ塩であるので、好ましくは、速やかに水素結合を再形成することができる薬剤、すなわちステップａ）で生成した溶液を中和する薬剤は、酸、好ましくは強酸である。好ましくは、方法のステップａ）およびステップｂ）の薬剤は、等モル量で添加される。例えば、２Ｍ  ＮａＯＨ溶液がステップａ）で添加された場合、溶液を中和するために、等モル量の、例えば、２Ｍ塩酸（ＨＣｌ）を溶液に添加することができる。好ましくは、中和ステップは、効率的な中和を保証するのに十分に長く、短時間の揺動下に実施される。１０００ｍｌの体積に対して、１分未満、例えば３０秒未満でこのステップを実施することができよう。実施例に示されるように、大量の場合は、必然的に酸がすべて添加され混合されるようにより長時間かかる。この後、溶液はゲル配座を構築するために静置し、１０００ｍｌの体積に対してゲル生成にかかる時間は１〜１０分であり、大量の場合は長時間かかり得る。
【００５６】
水素結合の迅速な再形成は、ゲル形成の速度の点から評価することができる。薬剤（復元剤と考えることができる）の最初の添加から１５分未満でゲルが形成する場合、これは水素結合の迅速な再形成を示すが、「迅速な」は、通常、１０分未満、好ましくは８分または６分未満、より好ましくは４分または３分未満を意味する。それにもかかわらず、大量の場合は、一般にゲル形成／水素結合再形成のためにより長時間を必要とすることは理解されている。
【００５７】
水素結合を解離する能力を有する他の任意の薬剤は、ＮａＯＨを置き換えることができ、「干し草の山」型のゲルを形成する水素結合の再構築を速やかに可能にすることができる他の任意の薬剤はＨＣｌを置き換えることができる。熟練者は、水素結合を妨害すし、次いで、回復することができる他の薬剤に気づいているが、一方が他方に対して容易に均衡させ、水素結合を妨害した薬剤の影響を中和することができるので、塩基および酸は特に好都合である。ギ酸または硫酸などの他の強酸が使用されてもよい。また、水酸化カリウム、水酸化リチウムおよび水酸化カルシウムを含むがこれらに限定されない他のアルカリ塩、ならびに、ことによると超塩基と呼ばれる水素化ナトリウムまたはナトリウムアミドなどは、水素結合のプロトン脱離および妨害にとって潜在的な薬剤になり得る。好適な特質を有する任意の酸もまた、水素結合を回復するために溶液の中和に使用することができる。−これには、リン酸、酢酸およびクエン酸を含むがこれらに限定されない。尿素またはホルムアミドも水素結合を妨害するために普通に使用され、この方法でおそらく使用することができよう。
【００５８】
大きく複雑な有機分子を含む系において、水素結合がすべて妨害され、または、水素結合の修復を可能にする条件が適用された後、すべての分子鎖が相当の水素結合に関与することを保証することは実現可能でなく必要でない。しかしながら、適用した条件は、グルカン溶液全体の組織および水素結合度を根本的に改変するようなものである。熟練した読者は、例えば、１５０ｍＭＮａＯＨのグルカン溶液への影響に気づいており、他の水素結合破壊剤の濃度はそれに応じて選択することができる。水素結合の再構築を可能にする条件が提供される第２のステップの目的は、効果的に速やかに中和する、または水素結合破壊剤の添加によって引き起こされた、分子間静電的相互作用のポテンシャルへの影響を逆転することである。したがって、この第２の薬剤の性質および濃度は水素結合破壊剤の選択から随伴するものである。また、迅速な中和の条件は、エネルギー的にメタ安定な超分子構造の「凍結」を与え、迅速な中和がなければ、エネルギー的により最適な、しかしそれほど生理活性でなく再組織化する傾向があるということに言及することは重要である。本発明による処理から結果として得られた最終生成物の安定性を増やす追加の方法は、当然評価することができる。可能な追加の方法は、その生物学的活性プロファイルを大きく損なわずに最終生成物の安定性を増強する、安定剤の添加またはエネルギー的により最適な分子構造を構築する任意の方法であってもよい。
【００５９】
工業的プロセスにおいて、このステップは、生成物のバッチ全体を保持するほど大きな貯槽において、好都合に実施される。
【００６０】
水素結合妨害およびその次の上記の修復のステップは、反復されてもよく、例えば、もう一度繰り返されてもよい。
【００６１】
好ましくは、本方法は、添加されたイオン（例えばＮａ+およびＣｌ-）が、上記ａおよびｂのステップの間に、例えば濾過によって除去される、さらなるステップｃ）を含む。濾過の方法は当業界で周知である。例えば、生成物を精製水の必要とされる量に対して十字流フィルターで透析濾過することができる。
【００６２】
水素結合の妨害の前の水溶液のグルカン濃度は、好ましくは１．５〜６％、より好ましくは２〜４％、最も好ましくは約２％である。好ましくはグルカンゲル中のグルカン濃度は、約２％、例えば１．８％〜２．２％である。したがって、好ましくは、水素結合の妨害の前の水溶液中のグルカン濃度はまた、約２％である。上記の方法のステップａ）およびｂ）の薬剤の添加によって、水溶液の量を増やし、そのため、溶液中のグルカンの濃度は低下し得る。しかしながら、好ましくはステップａ）およびｂ）で加えられる薬剤の量は、出発および最終生成物のグルカンの濃度がほぼ等しくなるように、溶液の量を著しくは変えない。所望の場合、ステップａ）およびｂ）における薬剤の添加が最終生成物中で所望の正確なグルカン濃度をもたらすように、出発生成物中にグルカンのより高濃度を使用することができることを熟練者は、当然、理解している。熟練者は、結果として得られたゲル生成物中で所望のグルカン濃度を達成するために、出発生成物中の好適なグルカン濃度、およびステップａ）およびｂ）で添加する薬剤の好適な量を計算することができる。
【００６３】
上記の水素結合の妨害および修復は、グルカン分子の任意の水溶液で実施されてもよい。変性した分岐を含むグルカンを含む好ましいグルカンは上で論じられ、グルカン溶液は、好ましくは酵母グルカン溶液である。出発物質はゲルであってもよく、その場合には、ステップａ）では非ゲル溶液を結果として生じ、ステップｂ）はゼラチン状態を呼び戻す。出発溶液中のグルカンの重量平均モル質量（Ｍw）は、好ましくは高く、好ましくは、単一鎖基準で、溶液中のグルカンの重量平均モル質量は、１５，０００を超え、より好ましくは２０，０００を超え、最も好ましくは２５，０００ｇ／ｍｏｌを超える。これらの質量値を求める適切な方法は上記のとおりである。
【００６４】
本発明の方法は、可溶性ベータグルカンの１％〜４％の水溶液が出発物質であり、約２Ｍの濃度から約１５０ｍＭの最終濃度でＮａＯＨが添加され、次いで溶液が完全に可溶化し透明になるまで撹拌される方法を含む。ゲル形態は撹拌しながら等モルの量のＨＣｌの添加により再構築し、生理的なオスモル濃度および約７のｐＨを有するゲルを結果として生じる。ゲルは任意の量で製造することができる。
【００６５】
試薬、すなわち、ステップａ）およびステップｂ）で使用される出発物質および薬剤がキットとして提供されるなら、素人も本発明のゲルを製造することができる。したがって、さらなる態様において、本発明は、グルカン分子の水溶液を含有する密封容器、グルカンの水素結合を解離することができる薬剤を含有する第２の密封容器、およびグルカン内の水素結合を再形成することができる薬剤を含む第３の密封容器を含むキットを提供する。グルカン分子の水溶液およびキットを含む２つの薬剤は、本明細書のどこかに定義される通りであってよい。
【００６６】
そのような一キットは、水溶液中の８５ｍｌの２．２％ベータグルカンの瓶、７．５ｍｌの２Ｍ  ＮａＯＨの封管および７．５ｍｌの２Ｍ  ＨＣｌの封管を含み、後者の２つの試薬は２．２％のベータグルカンの瓶に連続的に添加され、等張の２％の最終ゲルを与える。さらなる実施例は、水溶液中の７０ｍｌの４％ベータグルカンを含む瓶、１５ｍｌの１Ｍ  ＮａＯＨの封管および１５ｍｌの１Ｍ  ＨＣｌの封管を含むキットであり、後者の２つの試薬がベータグルカンの瓶に連続的に添加された場合、約３％（よりやや少ない）の濃度を有する１００ｍｌのゲルを結果として生じる。
【００６７】
グルカンは、一般に、微粒子形態の原材料（例えば真菌類、酵母または穀物）から抽出されるが、微粒子グルカンから可溶性形態を生成する方法は当業界で公知であり、国際公開第９５／３００２２号に記載されている加ギ酸分解（ｆｏｒｍｏｌｙｓｉｓ）ステップなどの酸またはアルカリ処理、および例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌからの大麦のような穀物からの様々なタイプのグルカンを含む。本発明によれば、国際公開第９５／３００２２号の実施例１のプロトコルによって調製することができるような微粒子の出発物質は、少なくとも２時間ギ酸中で加熱することによって好ましくは可溶化される。微粒子グルカン出発物質で実施される加ギ酸分解は、好都合に、任意のβ（１，６）連結グルコシル側鎖の選択的な除去、ならびに微粒子グルカンの可溶化を引き起こすことができる。
【００６８】
本発明の方法はまた、場合によって、ギ酸処理した生成物が少なくとも３０分間沸騰される（＞１００℃）加熱ステップを含む。生成物が冷却された後、好ましくは、微粒子物質を除去するために当業界で公知の一般的な方法によって、例えば、遠心分離または濾過によって処理される。
【００６９】
本発明による加工のための可溶性形態を得るために処理される微粒子グルカンは、好ましくは細胞壁、特に酵母細胞壁に由来し、これは、例えば洗浄によってそこから除去したタンパク質成分およびマンナンおよびキチンのような他の残存物を含んでいたものである。
【００７０】
適切な微粒子酵母グルカン生成物の一例はＢｉｏｔｅｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｎ  ＡＳＡによって製造されており、これはパン酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）に由来し、ＮＢＧ  ＣＯＳ（登録商標）として知られている。微粒子グルカン原料の別の例は、生成物Ｉｍｐｒｉｍｅ  ＷＧＰ（商標）のような全グルカン粒子である。本生成物は、天然の誘導体化されていない（化学変性基の点で）微粒子β（１，３）／（１，６）グルカンであり、ＮＭＲおよび化学分析によって特性評価され、ベータ−１，３およびベータ−１，６連結Ｄグルコースの側鎖を含有するベータ−１，３−連結Ｄグルコースのポリマーからなる。
【００７１】
本発明の好ましいゲル生成物の外観は、固く不透明で白っぽく、他の表面に対し強い接着能力を有する。
【００７２】
さらなる態様において、本発明は、前述の方法のいずれかによって得られたまたは入手可能なグルカン生成物を提供する。
【００７３】
本発明のグルカンは強力な治療剤であり、さらなる態様において、本発明は、治療に使用するために、特に対象が、免疫応答の全身的または局所的な増強を必要としている、例えば、組織損傷または感染症がある、症状の治療のために、本明細書に記載されるグルカンを提供する。グルカンは、創傷または潰瘍の治癒の支援に、ならびに口腔の粘膜炎および癌または腫瘍の大きさを低下させる治療において特に有益である。
【００７４】
さらなる態様において、本発明は、したがって本明細書に記載される本発明のグルカンの対象への投与を含む、それを必要とする前記対象において創傷または潰瘍の治癒の支援、または口腔の粘膜炎を治療する方法を提供する。
【００７５】
創傷または潰瘍が自然に治る場合があるが、そうでない場合もあり、本発明のグルカンは創傷および潰瘍の治癒を加速することが示されるので、創傷または潰瘍の治癒を「支援する」ことが言及される。いくつかの事例において、治癒は、治療なしでは十分でない。治癒に対して治療を必要とするような創傷の例は糖尿病性足部潰瘍である。この徴候において、患者は、糖尿病である根底の原因に基く創傷を発症する。多くの場合治療していない根底の原因およびこれらの創傷が患者の足で見つけられることになるという事実により、これらの潰瘍は独力で治らず、足の切断で通常終わる患者にとって大きな問題を引き起こす。
【００７６】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載される本発明のグルカンの対象への投与を含む、前記対象の癌を治療する、または腫瘍の大きさを低下させる方法を提供する。好ましくは、グルカンは経口で投与される。好ましくはグルカンは、５〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは２０〜１００ｍｇ／ｋｇの投薬量／日が投与される。
【００７７】
さらなる態様において、本発明はまた、上記に定義されるゲル形態のグルカン、および１種もしくは複数の薬学的に許容される希釈剤または担体、好ましくは水および場合によって、１種もしくは複数の生理学的に許容される安定剤、または追加の希釈剤もしくは担体を含む医薬組成物を提供する。組成物は、好都合に、任意の局所用剤形へ製剤化されてもよい。局所用剤形は、ゲル剤、パスタ剤、クリーム剤、スプレー剤、ローション剤、溶液、軟膏剤、フィルムなどであってもよい。
【００７８】
いくつかの変形において、本明細書に記載される組成物は、軟膏剤の形態をしている。軟膏基剤は、脂肪性基剤、乳化可能な基剤、乳濁液基剤、または水溶性基剤であってもよい。他の変形において、本発明による組成物は、クリーム剤の形態をしている。クリーム剤は、粘稠な液剤または水中油または油中水型いずれかの半固体乳濁液であってもよい。クリーム基剤は水洗濯可能であり、油相、乳化剤、および水相を含んでいてもよい。またさらなる変形において、本発明の組成物は、ローション剤の形態をしている。ローション剤は固体の懸濁液として製剤化され、より良好な分散液を生ずるように懸濁化剤を含んでいてもよい。本発明による組成物はまた製剤化されたパスタ剤であってもよい。パスタ剤は、活性剤が適切な基剤に懸濁された半固体の剤形である。基剤の性質に応じて、パスタ剤は、脂肪質ペーストまたは単相水性ゲルから生じるものとの間で分割される。
【００７９】
いくつかの変形において、組成物は創面でフィルムを形成する。このフィルムはスプレー剤または他の適切な手段によって適用することができる。フィルム形成を助けるために、フィルム形成剤、例えば、アクリル酸およびその誘導体、ポリアクリル酸およびポリブチルメタクリラートおよびポリメタクリル酸、ポリメタクリラートなどのその誘導体、パルミチン酸アスコルビル、カルボマー、カルナバワックス、酢酸フタル酸セルロース、ロスカメロースナトリウム（ｒｏｓｃａ  ｍｅｌｌｏｓｅ  ｓｏｄｉｕｍ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロースおよび関連化合物、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、ヒプロメロースフタラートなどのセルロース誘導体、セチルアルコールおよび誘導体、微結晶性ワックス、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルフタラート、ポリビニルアルコール、シリコーンゴムおよび誘導体、シェラック、トリグリセリド誘導体、およびその組み合わせが使用されるが、これらに限定されない。
【００８０】
組成物はまた、亀裂または剥離なしで身体の領域で適用され動かすのに十分な可撓性になるように、フィルム形成剤によって形成されたポリマーフィルムを柔らかくする役目をし得る少なくとも１種のフィルム可塑剤を含むことができる。
【００８１】
いくつかの変形において、組成物は創傷への適用前にフィルムにキャストされてもよく、または創傷に直接適用され、インサイチューで重合されてもよい。皮膚に適用されたら、「スプレッドオン」フィルムは重合し、チューブ、ロールオン、スプレー剤などからクリーム剤または軟膏剤として送達されてもよい。フィルムは外相にシリコーンゴムを組み込むことにより作られてもよい。内相と混合すると、結果として生じた乳濁液を硬化し、創傷に適用されたら重合する「スプレッドオン」フィルムを提供する。乳濁液は、基材上に広げ所望の厚さを達成することができる。他の場合、組成物は層または貼付剤に前もって形成されてもよい。貼付剤は厚さが変動するものであってもよい。貼付剤はまた、一般に創傷端部に従う形状を有するように切断することができる。
【００８２】
いくつかの変形において、貼付剤は、創傷または皮膚に貼付剤を固定する役目をする薬学的に許容される接着剤を含んでいてもよい。貼付剤裏板もまた含まれていてもよい。
【００８３】
組成物は、創傷に直接配置されるか、または創傷に適用するための基材に配置されてもよい。任意の基材（担体）が、本明細書に記載される組成物と共に使用されてもよい。例えば、織布、不織布、編み物、発泡体または接着性の基材が使用されてもよい。吸収性または非吸収性基材も使用されてもよい。いくつかの変形において、組成物は基材上に散布または展開される。他の変形において、組成物は基材内に含浸される。
【００８４】
創傷包帯が任意の適切な時間適用されてもよい。例えば、それらは、１日の時間にわたって  数日にわたって、数週間にわたって、または数か月間以上適用されてもよい。一般に、創傷が治癒するまで、創傷包帯は再適用される。本明細書に記載される包帯で創傷を治療する継続時間は、治療されている創傷の型、創傷の位置、および適用されている組成物の形態などの因子に依存し得る。使用される形態に応じて、組成物は水で除去する、または創傷から拭き取る、もしくは剥ぎ取ることができる。
【００８５】
本明細書に記載される組成物は、任意の病因学から結果として得られる創傷を治療するために使用されてもよい。例えば、創傷は、熱傷、感染、虚血、リンパ浮腫、新生物、神経病変、放射線損傷、外科手術手順、静脈不全、および外傷によるものであってよい。本発明の組成物は、創傷または潰瘍の治癒の支援に特に有益である。
【００８６】
本発明は、物理的支持体、例えば、本明細書に定義される本発明のグルカンをそこに適用した（そこへの含浸を含む）、医療用の任意の医療機器または材料をさらに提供する。
【００８７】
そのようなベータグルカンの重要な一特性は、非中性ｐＨのような条件またはゲルでの治癒を促進し得る陽イオンの欠如した状態においてさえ、その水収容力およびゲル形成特性があることである。いくつかのベータグルカンは、１％もの低濃度で、しかしより典型的には２〜４％の範囲でゲルを形成する。本明細書に記載されるもののような酵母からの可溶性ベータグルカンは、陽イオンの存在と無関係に、１〜６％の濃度で３〜７のｐＨ範囲で水溶液に溶解されると、チキソトロピーおよび擬塑性のゲルを形成する。
【００８８】
本発明の組成物は、水溶液中に１．５〜６％、好ましくは１．５〜５％のベータグルカンを含み、より好ましくは組成物は、水溶液中に約２〜３％のグルカンを含む。異なる濃度の使用は、投与の目的および種々の様式に依存する。概して、水溶液中で６％を超える濃度を有し、他の安定化物質を含まない、酵母グルカンは、固体のゲル特性により製造するのが困難な最終ゲル生成物をもたらす。用語「創傷」および「潰瘍」が包含するのは、表面創傷、外科的創傷、熱傷、解放骨折、下腿潰瘍、アフター性（ａｐｔｈｏｕｓ）潰瘍、糖尿病潰瘍および褥瘡性潰瘍である。創傷は損傷、手術または疾患の結果であってもよいが、すべては、皮膚の完全性の損失を特徴とする。皮膚は裂かれ、切断され、または穴をあけられたかもしれず、皮膚の再生には開口を密封する必要がある。本発明のグルカンは、創傷閉鎖を加速することが示されている。実施例で示されるように、効能は、開いた創傷の大きさの測定により容易に示すことができる。
【００８９】
本組成物は、例えば、ゲル剤、経皮貼布剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤などとして、好ましくは局所的に適用される。組成物は、毎日、より頻繁にまたはそれほど頻繁でなく、例えば、１日２回、または隔日に、および臨床医によって、またはある場合には患者または他の健康助言者によって決定される継続時間の間、適用されてもよい。治療の継続時間は、一般に目視検査によって容易に決定されている進展と共に創傷または潰瘍の性質および重症度に依存する。
【００９０】
局所投与は口腔内の投与を含み、口腔粘膜への送達に適切なゲル剤、貼付剤、スプレー、ロゼンジなどが当業界で知られている。
【００９１】
グルカンおよびそれを含有する組成物は、ヒトおよび畜産の医学に有用性を見出す。本明細書において使用される場合、用語「医学の」は、畜産の用途および文脈を含む。ヒトは治療にとって好ましい対象であるが、有用に治療されてもよい他の動物は、家畜およびコンパニオンアニマルを含む。
【００９２】
本発明のグルカンおよびそれを含有する組成物は、創傷または潰瘍部位に適用することができる、例えば貼付剤、包帯、膏薬、絆創膏、フィルム、ガーゼなどの物理的／固体支持体に塗布、または組み込むことができ、そのような生成物は、本発明のさらなる態様を構成する。
【００９３】
本発明のグルカンはまた、皮膚細胞株の培養、例えば、皮膚移植における使用のための、インビトロの用途に対応する有用性がある。したがって、さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載される本発明のグルカンと皮膚細胞集団を接触させることを含む、皮膚細胞を増殖するインビトロの方法を提供する。
【００９４】
本発明の一態様または一実施形態に適用できる好ましい特色は、必要な変更を加えて、すべての態様および実施形態に対して当てはまることは理解されよう。
【００９５】
本発明のグルカンは、実施例で示されるように抗ガン剤および創傷治癒剤として優れたインビボの効能を有している。実施例はまた、様々な治療の文脈で関係のあるサイトカインの産生を刺激する、本発明のグルカンの能力を示す。実施例は、酵母からまた得られ、可溶性であり、（１，３）連結側鎖を保持しながら  （１，６）連結側鎖を選択的に減少させるように処理された、表面的に類似したグルカン生成物と比較して、本発明のグルカンが、サイトカイン産生の誘発によって示される異なる生物学的活性を有することを示す。特に、本発明のグルカンは、炎症の表現型へのヒト骨髄性樹状細胞の分化を誘発し、ＴＮＦアルファ分泌を著しく刺激し、これらの細胞によるＧ−ＣＳＦおよびＩＬ−１０の発現を誘発することができるが、ＣＸＣＬ−１０の分泌は、基本的に基準線レベルにあり、本明細書に記載される処置に影響されないと思われる。このことは重要であり、本発明の好ましいグルカンが、サイトカインの特定の一組または組み合わせの分泌を刺激することを説明する。本発明のグルカンはまた、糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）からのマクロファージを刺激してＣＸＣＬ２、ＰＧＥ２およびＧＭ−ＣＳＦを分泌させることができ、これらにはすべて創傷治癒において顕著な役割がある。さらに、本発明のゲルグルカンはヒト補体系を活性化する。
【００９６】
ＴＮＦαの放出に対する好ましいベータグルカンの影響は用量依存性であり、ベータグルカン受容体デクチン−１を過剰発現するＲＡＷ細胞株の変種において、一定の閾値、例えば、１００μｇ／ｍｌを超えるグルカン濃度で縮小するように見える。最大のＴＮＦα分泌を与える濃度、およびまた応答の大きさは共に、本明細書に記載される処置にかけられていない可溶性ベータグルカンを使用して見られるものと比較してより大きい。
【実施例】
【００９７】
実施例１
本発明のゲルグルカン生成物の調製（ＳＧ−ＬＳ）
２％の酵母グルカン分子の水溶液を下記のように処理した。この水溶液を加ギ酸分解によって微粒子グルカン調製から調製し、選択的にβ−１，６側鎖を除去し、続く精製および透析濾過によって加ギ酸分解溶液からの粒子状物質および低分子量成分を除去した。適切な加ギ酸分解ステップは、欧州特許第０７５９０８９Ｂ１号の実施例３に開示されている。微粒子グルカンは、アルカリ、エタノールおよび水での別々の抽出によってパン酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞壁からそれ自体調製し、各抽出に続いて好適な乾燥（噴霧乾燥および真空乾燥）を行った。
【００９８】
ａ．水酸化ナトリウムの添加による水素結合の妨害：
グルカン溶液の濃度を調節した後、水酸化ナトリウムの添加を行い、貯槽を取り囲むジャケットに水蒸気または水の導入によって加熱または冷却して、閉じて揺動した８００リットルの貯槽中で約２００リットルの生成物量が得られた。
【００９９】
生成物温度を１８℃に調節し、約１０リットルの精製水に溶解した２４モルのＮａＯＨを、貯槽のハッチを通して徐々に（毎分約１リットル）注いだ。
【０１００】
ｂ．塩酸の添加による水素結合の修復：
最後のＮａＯＨを貯槽へ注いだ直後に、修復工程を始めた。
【０１０１】
精製水中のわずかに２４モルに足りないＨＣｌ、約９リットルの２．４Ｍ溶液を、貯槽へ比較的速やかに（約２分で）注ぎ、生成物のｐＨを測定し、ｐＨが約４に到達するまで追加の酸を少量ずつ加えた。
【０１０２】
ｃ．塩の除去
ステップａおよびｂの間に添加したイオン（Ｎａ+およびＣｌ-）を除去するために、
生成物は、精製水の必要とされる量に対して十字流フィルター上で透析濾過することができる。
【０１０３】
実施例２
ヒト樹状細胞の成熟の刺激
単球由来未熟な樹状細胞（ｉＤＣ）を成熟した樹状細胞（ｍＤＣ）へ分化させる、可溶性ベータグルカンの異なる製剤の効力は異なる。活性化のレベルは、選択したＤＣ細胞表面マーカーの発現の測定により視覚化することができる。
【０１０４】
リンホプレップ勾配によって精製し、続いて抗ＣＤ１４微小ビーズを用いて磁性細胞選別（ＭＡＣＳ）したヒト単球を、未熟樹状細胞への分化を促進する、ＩＬ−４および組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦの組み合わせで５日間培養した。単球由来の未熟樹状細胞（ｉＤＣ）をｐｈｙｓＯ2レベルで栽培した。５日目から６日目に、ｉＤＣを、５０μｇ／ｍｌ可溶性ベータグルカン（ＳＧ）、または１０ｕｇ／ｍｌ不溶性ベータグルカン（ＮＧ）で刺激した。表面分子ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現をｉＤＣの成熟ＤＣへの分化を調査するために使用し、蛍光性活性化細胞選別法ＦＡＣＳによって分析した。また、Ｃタイプレクチン受容体ＤＣ−ＳＩＧＮの発現を分析した。
【０１０５】
負の対照（ＰＢＳ）と比較して、加ギ酸分解後であり、実施例１のＮａＯＨ処理前のグルカンであり、２％の濃度で水溶液中に存在するグルカンである可溶性グルカン（ＳＧ）は、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ  ＤＲ）およびＤＣ−ＳＩＧＮの発現をわずかに下方制御する。下方制御は、本来タンパク質を発現する細胞の恋人数（ａ  ｌｏｖｅｒ  ｎｕｍｂｅｒ  ）の結果であるが、ＣＤ８６タンパク質の発現は一細胞当たりわずかに同様に下方制御されている。対照的に、本発明によるグルカンであり実施例１に従って調製したＳＧ−ＬＳは、ｉＤＣｓを活性化してＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの発現を上方制御する強力な刺激である。また、ＳＧとは対照的に、ＤＣ−ＳＩＧＮの発現は、ＳＧ−ＬＳによって効率的に下方制御される。サッカロマイセス・セレビシエからの不溶性ベータグルカンは、はるかに強力であるが、ＳＧ−ＬＳのように、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＤＣ−ＳＩＧＮの類似したパターンのタンパク質発現を活性化する。ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＭＨＣクラスＩＩの上方制御に関連するＤＣ−ＳＩＧＮの下方制御は、樹状細胞活性化の認められた特徴である。したがって、ＳＧ−ＬＳは樹状細胞をインビトロで活性化するが、ＳＧは活性化せず、この機能に関するＳＧ−ＬＳの特性は、サッカロマイセス・セレビシエからの不溶性ベータグルカン粒子に類似している。
【０１０６】
実施例３
ヒト樹状細胞（ＤＣ）によるサイトカイン分泌の刺激
ヒトＤＣによってインビトロで分泌されたサイトカインプロファイルを求めるために、標準法を使用して末梢血単球を単離しｍＤＣを繁殖させた。続いてｍＤＣを異なる濃度の可溶性ベータグルカンで、単独でまたは細菌性脂質多糖体（ＬＰＳ）（１ｎｇｍｌ-1）と合わせて刺激した。サイトカインプロファイルは、Ｌｕｍｉｎｅｘシステムを使用して多重分析によって求めた。図２は、ＳＧ刺激がＴＮＦα分泌の弱い誘発を引き起こすが、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＣＸＣＬ−１０およびＩＬ−１２は影響されないでいることを示す。対照的に、ＳＧ−ＬＳ（図２中「４２１−４、新規」）は、ＴＮＦα分泌を強く刺激するが、Ｇ−ＣＳＦおよびＩＬ−１０は共に低レベルの分泌である。
【０１０７】
ＳＧは、本発明によるグルカンではないが、本発明によるゲルグルカン生成物であり、実施例１に従って調製したＳＧ−ＬＳによって例証される提示プロトコルに従って強化することができる。
【０１０８】
ＣＸＣＬ−１０の分泌は、ＳＧに関しては、ＳＧ−ＬＳ刺激によって影響を受けなかったが、ＩＬ−１２の産生はＳＧ−ＬＳによって弱く阻害された。
【０１０９】
ＳＧまたはＳＧ−ＬＳを用いるＬＰＳとのヒトｍＤＣｓの共刺激は、ＬＰＳ単独と比較して、ＩＬ−１２の分泌は明らかに下方制御されたが、ＴＮＦα、ＣＸＣＬ−１０、ＩＬ−１０およびＧ−ＣＳＦの分泌に対しＳＧ−ＬＳが相乗効果または相加効果があることを示した（図３）。ＳＧおよびＬＰＳの共刺激は、試験サイトカインのいずれにおいても明瞭な変化を誘発しなかった（図３）。
【０１１０】
ＳＧおよびＳＧ−ＬＳは、一緒に、インビトロ刺激したヒトｍＤＣから際立った生物学的機能を誘発する。
【０１１１】
この実施例は、本明細書に記載された処置にかけない可溶性グルカンと比較して、本発明に従って製造された可溶性グルカンが他の病原体関連分子パターンの影響を調整する、より強い能力を有することを示す。
【０１１２】
実施例４
マウスマクロファージによるサイトカイン分泌の刺激
糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ  Ｄｏｃｋ７m  ＋／＋  Ｌｅｐｒdb／Ｊ）からのマクロファージを、腹腔内の洗浄によってＥＤＴＡで補足したＰＢＳを使用して収穫した。細胞はマイクロプレートに接種し、３７℃で１２時間ＳＧまたはＳＧ−ＬＳのいずれかで、単独でまたはＬＰＳとの組み合わせのいずれかで刺激した。上澄を、創傷治癒および炎症に関与する一連のシグナル伝達分子に関して、ＥＬＩＳＡによって分析した。
【０１１３】
ＳＧおよびＳＧ−ＬＳは共に、ＣＸＣＬ２を分泌するｄｂ／ｄｂマウスからマクロファージを刺激した（図４）。ＳＧ刺激した細胞からの上澄中の分泌されたケモカインの濃度は、リン酸緩衝生理食塩水のみを与えた細胞から測定されたものと有意差がなかった。対照的に、ＳＧ−ＬＳを与えた細胞は、対照細胞より著しくＣＸＣＬ２を分泌した。
【０１１４】
ｄｂ／ｄｂマウスからのマクロファージは、ＳＧ−ＬＳによってＰＧＥ２（図５）およびＧＭ−ＣＳＦ（図６）分泌を刺激する。アッセイでの大きいばらつきにより、シグナル伝達分子の上澄中の濃度は、リン酸緩衝生理食塩水中でインキュベートした細胞からの上澄中の濃度と有意差がなかった。これに反して、ＳＧは、ＰＧＥ２またはＧＭ−ＣＳＦのいずれかの分泌も刺激しなかった（それぞれ、図５および６）。
【０１１５】
実施例５
ＲＡＷ／デクチン−１細胞株によるＴＮＦα分泌の刺激
ＲＡＷ／デクチン−１細胞株は、ベータグルカン受容体、デクチン−１を過剰発現するＲＡＷ２６４．７マウス白血病性単球マクロファージ細胞株の安定なトランスフェクタントである。細胞株はＩｎｖｉｖｏｇｅｎからのＲＡＷ  ｂｌｕｅ（商標）細胞株に対応する。細胞株は、可溶性ベータグルカンの異なる製剤間の個体差を求めるのに適切であり、この細胞株によって増加するベータグルカン応答は、デクチン−１受容体との相互作用を示す。ＳＧおよびＳＧ−ＬＳは共に、３７℃で刺激後２４時間にＥＬＩＳＡ法に基くアッセイで測定してＴＮＦαの分泌を誘発する（図７）。両製剤は、典型的な用量応答を誘発する。ＳＧの最大効果は１〜２μｇ／ｍｌ付近にあり、より低濃度でもより高濃度でも低下する。それに比べて、ＳＧ−ＬＳの最大効果は１００μｇ／ｍｌで見られ、細胞を取り囲む培地中のＴＮＦαの５倍の高濃度を生じる。
【０１１６】
このように、ＳＧおよびＳＧ−ＬＳは共にデクチン−１過剰発現ネズミ細胞株を刺激してＴＮＦαを分泌するが、応答は特徴的であり、容易に識別可能である。ＳＧに対する応答は４μｇ／ｍｌを超えると縮小するにもかかわらず、ＳＧ−ＬＳに対する応答は１００μｇ／ｍｌまでより強くなる。このことは、ＳＧおよびＳＧ−ＬＳが主要なベータグルカン受容体、デクチン−１とは別な風に相互作用することを示唆する。
【０１１７】
実施例６
インビトロ創傷治癒
糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスモデル（すなわちＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ  Ｄｏｃｋ７m＋／＋Ｌｅｐｒdb／Ｊマウス）において、創傷治癒へのＳＧおよびＳＧ−ＬＳの影響を全層除去した皮膚創傷の修復を分析することにより調べた。順応させた後（外乱がない５〜７日）、動物は、本社規則および糖尿病動物の特定要件に従って５匹の動物の群で収容した。実験的に傷つけた後、個々のケージ（ケージ寸法３５×１５×１５ｃｍ、週に２度交換するおがくずを敷いた）に、１２時間の明／暗サイクルで２３℃の常温に維持した環境に動物を収容した。マウスには、食物（標準げっ歯類食餌）および水を適宜提供した。すべての麻酔事象の後、処置から完全に回復するまで動物を暖かい環境に置きモニターした。動物にはすべて、必要とされる手術および付加的な鎮痛薬の後、好適な無痛法（ブプレノルフィン）を受けさせた。動物の処置はすべて、本社ライセンスの下（ＰＣＤ：５０／２５０５；ＰＰＬ：４０／３３００；ＰＩＬ：５０／３４８２；ＰＩＬ：７０／４９３４）で本社の許可を設定して行った。動物の健康を調査の全体にわたって一日単位で病気のモニターをした。
【０１１８】
０日目に、動物に麻酔をかけ（イソフルオランおよび空気）、毛を剃り、食塩水を吸わせたガーゼで浄化した。標準化した単一の全層創傷（１０．０ｍｍ×１０．０ｍｍ）を、各実験動物の左の背側横腹皮膚に作り出した。すべての処置群中の創傷は、続いて透明フィルム包帯Ｂｉｏｃｌｕｓｉｖｅ（商標）（Ｓｙｓｔａｇｅｎｉｘ  Ｗｏｕｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，  ＵＫ）の円周バンドで巻いた；その後、それらは、Ｂｉｏｃｌｕｓｉｖｅフィルムを通して２９ゲージ針を使用し、精製水中の２％溶液５０μｌの注射によってＳＧまたはＳＧ−ＬＳのいずれかを受けさせた。糖尿病動物を好適なソフトウェアを使用して、処置方式の１つに無作為化した。実験群に対して、ＳＧまたはＳＧ−ＬＳのいずれかの処置の施しを負傷後２、４および６日に再適用した。これらの動物の創傷部位は、適用した薬剤の過剰集積および過剰な創傷部位での水和について入念にモニターした；過剰に適用した薬剤の蓄積／水和が明白であれば、先に適用した材料は再適用前に吸引によって除去した。正の対照群の処置に対して、負傷後６日まで処置を毎日再適用した。−この群の創傷は、成長因子合剤処置の合計７つの適用を受けた。負傷後４、８および１２日に、動物すべてを再度麻酔をかけ、そのフィルム包帯およびなんらかの遊離デブリを除去し、食塩水を含ませた滅菌ガ−ゼを使用して創傷を浄化した。撮影後４および８日に、創傷は上記のようにＢｉｏｃｌｕｓｉｖｅフィルム包帯で再度巻いた。治癒は、０日目の創傷の大きさに対する創傷閉鎖として求めた。
【０１１９】
創傷閉鎖データは、各評価時点で各創傷の得られた創傷画像から、計測して求めた。得られた創傷の面積は、所定の時点で、負傷直後（すなわち０日目）のその創傷の面積の百分率として表した。残存している創傷の平均百分率面積（および平均値の標準誤差）を各群に対して計算し、グラフで表示した（図８）。各グルカン調製品の影響は、以下を受けた創傷のものと比較した：ｉ）ビヒクル（水）；ｉｉ）ＰＤＧＦ−ＢＢ＋ＴＧＦ−α（正の対照）。
【０１２０】
ＳＧ１３１−９  ＬＳ  ２％を受けた創傷は、評価した全時点でＳＧ１３１−９  ２％を受けた創傷と比べて高い創傷閉鎖率を示した（図８）。この観察された差異は、４および８日目で統計的に有意であった（それぞれ、ｐ＝０．０１５および０．００１）。初期の時点（４および８日目）で、ＳＧ１３１−９  ＬＳで処置した創傷の創傷閉鎖プロファイルは、正の対照処置の創傷のものと同等であった。
【０１２１】
実施例７
融点の測定
明細書に記載されているように、本発明に従って製造されたグルカンゲルの融点の測定を実施した。結果は図１に示される。アルカリ酸処理は、一般にグルカンゲルの（ゲルからゾルへの）融解温度を上げる。
【０１２２】
実施例８
ＳＧおよびＳＧ−ＬＳそれぞれの抗腫瘍活性に対する影響を、マトリゲル中で１０7ＢＴ４７４細胞の皮内移植を有するＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスを使用して調べた。腫瘍成長の期間の後、明白（８０ｍｍ3）になるまでの７日間、ＳＧおよびＳＧ−ＬＳを経口胃管栄養によって毎日投与した。腫瘍の直径を３１日間にわたって１日おきに測定し、体積を求めた。この分析（図１０）は、ＳＧおよびＳＧ−ＬＳ共に、ビヒクル（水）に比較して腫瘍増殖を遅延することを示した。また、ＳＧ−ＬＳが、ＳＧと比較してより効率的に成長速度を阻害したことは明らかであり、ＳＧの癌抗特性がまた、本明細書において記載された製造方法によって強化されることを示唆する。
【０１２３】
実施例９
ＳＧとＳＧ−ＬＳの間の効能の差を細胞の相互作用のメカニズムを解析することによって調べた。結果は図１１および１２に示される。ヒトのインビトロで生成された血中単球（ｍＤＣ）に由来する骨髄性樹状細胞におけるＬＳ変種の取り込みは、デクチン−１拮抗薬によって阻害される（抗−デクチン−１抗体、図１１ａ）。ＳＧの取り込みは、その抗体によってわずかに阻害され、ＳＧが主としてデクチン−１と無関係のメカニズムによって細胞に進入することを示唆する。成熟したｍＤＣおよび未熟なｍＤＣにおけるフルオレセイン標識付けグルカンの取り込みを調べることによって、この所見がさらに示された。それは周知である、デクチン−１の表面発現は、未熟なｍＤＣと比較して成熟ｍＤＣでは低く、したがって、未熟なｍＤＣ（図１１ｂ、１００％、図示されていない）と比較して、成熟したｍＤＣにおけるＳＧ−ＬＳの取り込みが減少する（〜３０％）。ＳＧの取り込みは、成熟および未熟ｍＤＣにおいて類似し、デクチン−１拮抗薬のデータを支持し、ＳＧ−ＬＳおよびＳＧは細胞と別々に相互作用することを示唆する。
【０１２４】
正確なメカニズムは特異的な阻害薬を使用して求めた（図１２）。ＳＧの取り込みはクロルプロマジンに影響されないが、ＳＧ−ＬＳのエンドサイトーシスはこの化合物によって阻害された。このことは、ＳＧ−ＬＳがクラスリンを媒介したエンドサイトーシスによって取上げられるが、ＳＧはそうではないことを示唆する。これに反して、ＳＧの取り込みは、マクロピノサイトーシスに干渉するロットレリンによって阻害される。ＳＧ−ＬＳの細胞内蓄積はロットレリンによって影響を受けない。サイトカラシンＤは両リガンドの取り込みを部分的に阻害し、細胞骨格の再配置、すなわち食作用にとって細胞に入るために必要な条件を示唆する。これらの結果は、まとめると、ＳＧおよびＳＧ−ＬＳは異なるメカニズムによって取上げられが、食作用は両方に共通であることを示している。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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