(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児を身ごもっている女性対象から得られた生物試料中に配列不均衡が存在するかどうかを決定するための方法であって、ここで、生物試料は、ゲノムの核酸配列の部分である核酸分子を含み、該生物試料は胎児及び女性対象由来の核酸分子を含み、該方法は、
生物試料中の複数の核酸分子の各々について、
該核酸分子のサイズを測定し；
該核酸分子がゲノムのどの核酸配列に由来するかを同定し；
コンピュータシステムにより、第１の配列に由来する核酸分子のサイズから第１統計値を計算し；
第１の配列のＧＣ含量に類似するＧＣ含量を有する１以上の参照配列を同定し、
コンピュータシステムにより、１以上の参照配列由来の核酸分子のサイズから第２統計値を計算し；
第１統計値と第２統計値を用いて、第１統計値と第２統計値の相違又は比率であるパラメータを決定し；及び
パラメータと前記パラメータに対するカットオフ値の比較に基づいて、配列不均衡が該第１の配列に存在するかどうかの分類を決定する
ことを含む方法。
【請求項２】
複数の核酸分子の各々のサイズを測定することが、
生物試料を受入れ；及び
生物試料に含まれる複数の核酸分子の少なくとも一部を配列決定する
ことを含み、ここで、各々の核酸分子の配列決定された部分が各核酸分子の両末端を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１統計値が、第１の配列に由来する核酸分子について測定されたサイズの中央値又は平均サイズを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１の配列が染色体であり、配列不均衡が胎児染色体異数性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
１以上の参照配列が１つの染色体を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１以上の参照配列が複数の染色体である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
１以上の参照配列のＧＣ含量を計算し；及び
第１の配列のＧＣ含量を計算する
ことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
核酸分子がゲノムのどの核酸配列に由来するかを同定することが、
核酸分子の少なくとも一部を配列決定して、配列を得て；及び
ヒトゲノムに対して該配列を整列させる
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
１以上の参照配列のＧＣ含量と第１の配列のＧＣ含量が、特定の配列決定プラットフォームについて得られる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生物試料が、血液、血漿、血清、胎児細胞を含む母親血液、母親血液から得られた胎児細胞、尿、唾液、及び子宮内洗浄液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
胎児を身ごもっている女性対象から得られた生物試料中の配列不均衡の出生前診断を行うためのプログラムであって、ここで、生物試料は、ゲノムの核酸配列の部分である核酸分子を含み、該生物試料は胎児及び女性対象由来の核酸分子を含み、該プログラムは、コンピュータに請求項１、３〜７、９、及び１０のいずれか１項に記載の方法を実行させる上記プログラム。
【請求項１２】
核酸分子がゲノムのどの核酸配列に由来するかを同定することが、
核酸分子の少なくとも一部の配列決定から得られた配列を受入れ；及び
ヒトゲノムに対して該配列を整列させる
ことを含む、請求項１１に記載のプログラム。
【請求項１３】
胎児を身ごもっている女性対象から得られた生物試料中の配列不均衡の出生前診断を行うための装置であって、ここで、生物試料は、ゲノムの核酸配列の部分である核酸分子を含み、該生物試料は胎児及び女性対象由来の核酸分子を含み、該装置は、
請求項１１又は１２に記載のプログラムを記憶するコンピュータ読み取り可能媒体；及び
該コンピュータ読み取り可能媒体に記憶されたプログラムを実行するように構成された１以上のプロセッサ
を含む上記装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００９年１１月６日に出願された「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｉｍｂａｌａｎｃｅ」と題する米国仮特許出願第６１／２５９０７６号、及び２０１０年６月３０日に出願された「Ｓｉｚｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」と題する米国仮特許出願第６１／３６０３９９号からの優先権を主張する非仮特許出願であり、それらの全内容は、全ての目的で参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
また、本出願は、２００８年７月２３日に出願された、「Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  Ｆｅｔａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」と題する米国特許出願第１２／１７８，１８１号（代理人受任番号第０１６２８５−００５２２０ＵＳ）；「Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  Ｆｅｔａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｗｉｔｈ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」と題する米国特許出願第１２／６１４３５０号（代理人受任番号第０１６２８５−００５２２１ＵＳ）；及び「Ｓｉｚｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」と題する米国特許継続出願（代理人受任番号第０１６２８５−００６６７１０ＵＳ）に関連し、それらの全内容は、全ての目的で参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００３】
１９９７年において、母親血漿中に細胞不含胎児核酸の発見が、非侵襲性の出生前診断の新たな可能性を切り開いた（非特許文献１）。この技術は、臨床応用に急速に変えられ、これは、胎児由来の父方遺伝の遺伝子又は配列の決定、例えば、胎児性別決定、胎児ＲｈＤ状態の決定、及び胎児が父方遺伝の突然変異を遺伝したかどうかの決定を行う。しかしながら、母親ゲノム及び父親ゲノムの両方に存在するゲノム標的、例えば、トリソミー２１に関わる出生前診断は非常に多くのチャレンジとなっている。
【０００４】
最近、優れた定量的正確さを有する単一分子カウント技術がこの課題に対する期待できる解決法となり得ることが示されている（非特許文献２；非特許文献３；特許文献１；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。このような方法は、死と正との間の選択されたゲノム位置からの分子数における定量的差異の観察を通じて診断目的を達成する。例えば、胎児ダウン症の診断について、第２１染色体由来の分子数は、トリソミー２１を胎児が被っている場合に増加する（非特許文献７；非特許文献８）。
【０００５】
しかしながら、このようなカウント技術は、限定された数のデータ点又は他の欠点を被る場合がある。したがって、既存技術と比較したある種の利点を有する出生前診断を行うための新規な方法、システム、及び装置お提供することが望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願第１１／７０１，６８６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｏ  ＹＭＤら、Ｌａｎｃｅｔ  １９９７；３５０：４８５−４８７
【非特許文献２】Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７；１０４：１３１１６−１３１２１
【非特許文献３】Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００７；７９：７５７６−７５７９
【非特許文献４】Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ２００９；２５：３２４−３３１
【非特許文献５】Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；１０５：２０４５８−２０４６３
【非特許文献６】Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；１０５：１６２６６−１６２７１
【非特許文献７】Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；１０５：２０４５８−２０４６３
【非特許文献８】Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；１０５：１６２６６−１６２７１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のある種の態様は、妊娠女性対象から得られた生物試料における配列不均衡（例えば、胎児染色体異数性）の出生前診断を行うためのサイズに基づく分析を用いることができるシステム、方法、及び装置を提供することができる。例えば、危険性のある染色体についての核酸分子の断片のサイズ分布を用いて、胎児染色体異数性を決定することができる。また、いくつかの態様では、生物試料（母親と胎児のＤＮＡを含む）における配列不均衡などの他の配列不均衡を検出することができ、この場合、不均衡は母親遺伝子型、突然変異状態、又はハプロタイプに相関する。このような不均衡は、試料が胎児と母親からではなく、純粋に母親からであった場合に期待されるはずのサイズ分布と比較して、特定配列に対応する断片（核酸分子）のサイズ分布を介して決定され得る。（小さいサイズ分布への）シフトはある種の環境における不均衡を表すことができる。
【０００９】
一態様では、互いに比較した各染色体からの断片のサイズ分布のランキング（例えば、サイズ分布を表す統計値）を用いて不均衡を決定する。例えば、試験試料における危険性のある染色体の断片のサイズのランキングは、参照生物試料から得られた危険性のある染色体についてのランキングと対比することができる。診断は、対比に基づいて実施可能である。例として、特定量によってランキングが変化する場合（例えば、核酸断片のサイズの減少を示す）、胎児染色体異数性が危険性のある染色体に存在するという診断がなされ得る。このようなランキング分析を用いた種々の態様では、全ての２２個の常染色体と性染色体が用いられるか、又は一部の染色体が用いられる。
【００１０】
別の態様では、危険性のある染色体の断片のサイズ（例えば、サイズ分布を表す統計値）と参照染色体の断片のサイズとの間の相違が用いられる。例えば、このサイズの相違がカットオフ（又は閾値と呼ばれる）よりも大きいか又は小さい場合、胎児染色体異数性が危険性のある染色体に存在するという診断がなされ得る。
【００１１】
一例の態様によれば、妊娠女性対象から得られた生物試料における配列不均衡の出生前診断を行うための方法が提供される。生物試料は、核酸配列の一部である核酸分子を含む。生物試料中の複数の核酸分子の各々について、核酸分子のサイズが測定され、どの核酸配列に由来するかが同定される。コンピュータシステムは、第１の配列に対応する核酸分子のサイズ分布を決定する。決定されたサイズ分布に基づいて、配列不均衡が第１の配列に存在するかどうかの分類が決定される。
【００１２】
別の例の態様によれば、妊娠女性対象から得られた生物試料中の胎児染色体異数性の出生前診断を行うための方法が提供される。生物試料中の複数の核酸分子の各々について、核酸分子のサイズが測定され、核酸分子がどの染色体に由来するかが同定される。コンピュータシステムは、染色体に対応する核酸分子のサイズから統計値を計算する。統計値は複数の染色体の各々について計算される。染色体のランキングは統計値に基づいて決定される。第１の染色体の決定されたランキングは、参照生物試料から得られた第１の染色体の別のランキングと対比される。対比に基づいて、胎児染色体異数性が第１の染色体に存在するかどうかの分類が決定される。
【００１３】
別の例の態様によれば、妊娠女性対象から得られた生物試料中の胎児染色体異数性の出生前診断を行うための方法が提供される。生物試料中の複数の核酸分子の各々について、核酸分子のサイズが測定され、核酸分子がどの染色体に由来するかが同定される。コンピュータシステムは、第１の染色体に対応する核酸分子のサイズから第１統計値を計算する。コンピュータシステムは、１以上の第２染色体に対応する核酸分子のサイズから第２統計値を計算する。第統計値と第２統計値との間の分離が決定される。分離値は１以上のカットオフ値と対比される。この対比に基づいて、胎児染色体異数性が第１の染色体に存在するかどうかの分類が決定される。
【００１４】
本発明の他の態様は、本明細書に記載されている方法と関連したシステム及びコンピュータ読み取り可能な媒体に関する。一態様では、コンピュータ読み取り可能な媒体は、データ受入れ、データを分析するための指示を含むが、データを作製する（例えば、核酸分子を配列決定する）ように機械を指向するための指示を含まない。別の態様では、コンピュータ読み取り可能な媒体は、データを作製するように機械を指向するための指示を含む。一態様では、コンピュータプログラム製品は、本明細書に記載されている方法のための操作を行うためのプロセッサを制御するための複数の指示を記憶するコンピュータ読み取り可能な媒体を含む。また、態様は、潜在的には、各工程又は工程の各グループを実行するための異なるコンポーネントとともに、本明細書に記載されている方法のいずれかの工程を実施するように構成されたコンピュータシステムに関する。
【００１５】
図面及び特許請求の範囲を含む本明細書の残り部分への参照は、本発明の態様の他の特徴及び利点を実現するであろう。さらなる特徴及び利点、並びに本発明の種々の態様の構造及び操作は、添付の図面を参照して以下に詳細に記載される。図面では、参照番号は同一又は機能的に類似したエレメントを指示し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の態様による妊娠女性対象から得られた生物試料中の配列不均衡の出生前診断を行うための方法１００を例証するフローチャートである。
【図２】本発明の態様による（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔのバージョン１を用いた場合）整列された配列のサイズの寒天で染色体の中央値ランキングを示すプロットである。
【図３】本発明の態様による母親血漿における異なる染色体に由来する配列のサイズ分析は、胎児の第２１染色体異数性の非浸襲性出生前検出のために用いることができる。
【図４】本発明の態様によるサイズの統計値のランキングを用いて、妊娠女性対象から得られた生物試料中の胎児染色体異数性の出生前診断を行うための方法を例証するフローチャートである。
【図５】本発明の態様に従って整列されたサイズに関して、第７染色体と第１４染色体の比較を例証する表である。
【００１７】
【図６】本発明の態様に従ってゲノム位置に関する断片のサイズの統計値の比較を用いて、妊娠女性対象から得られた生物資料における配列不均衡の出生前診断を行うための方法を例証するフローチャートである。
【図７】本発明の態様に従ってカットオフサイズ（ｗ）に対する短い断片（Ｆ）によって寄与された全長の画分のプロット７００を示す。
【図８】本発明の態様に従って正倍数体に関するカットオフサイズに対する第２１染色体（実線）と参照染色体（第１３、１８及び２１を除く全ての常染色体）（破線）によって寄与された全長の画分のプロット８００を示す。
【図９】本発明の態様に従って、トリソミー２１妊娠に関するカットオフサイズに対する第２１染色体（実線）と参照染色体（第１３、１８及び２１を除く全ての常染色体）（破線）に関するＦ値のプロット９００を示す。
【図１０】本発明の態様に従って、正倍数体とトリソミー２１妊娠に関するカットオフサイズに対する第２１染色体と参照染色体（第１３、１８及び２１を除く全ての常染色体）との間のΔＦ(21-Ref)のプロット１０００を示す。
【００１８】
【図１１】本発明に態様に従って１２０人の妊娠の性（ｇｅｎｄｅｒ）と分類のための表１１００を示す。
【図１２】本発明の態様に従って異なる疾患又は非疾患状態の４つの資料についての異なる染色体のランキングを例証する。
【図１３】本発明の態様に従って、常染色体、トリソミー１３、トリソミー１８、及びトリソミー２１の１２０症例についての第１３染色体のランキングを示す。
【図１４】本発明の態様に従って、常染色体、トリソミー１３、トリソミー１８、及びトリソミー２１の１２０症例についての第１８染色体のランキングを示す。
【図１５】本発明の態様に従って、常染色体、トリソミー１３、トリソミー１８、及びトリソミー２１の１２０症例についての第２１染色体のランキングを示す。
【００１９】
【図１６】本発明の態様に従って整列された配列のサイズに関して第１３染色体と第５及び第６染色体との比較を例証する表である。第５及び第６染色体と第１３染色体との比較は、トリソミー１３の妊娠における第２１染色体配列のサイズの変化の検出に使用される。常染色体及びトリソミー１８妊娠の結果は比較について含まれる。
【図１７】本発明の態様に従って整列された配列のサイズに関して第１８染色体と第１２及び第１４染色体との比較を例証する表である。常染色体及びトリソミー１８妊娠の結果は本発明の態様による比較について含まれる。
【図１８】本発明の態様に従って、１５０ｂｐの第１８染色体と参照染色体（ΔＦ(18-Ref)）との間の短い断片によって寄与された全長の画分における相違を示す。
【図１９】本発明の態様に従って、１５０ｂｐの第２１染色体と参照染色体（ΔＦ(21-Ref)）との間の短い断片によって寄与された全長の画分における相違を示す。
【図２０】本発明の態様に従って、異なる染色体（ＢＣＢＩｂｕｉｌｄ  ３６、バージョン４８）のＧＣ含量のリストを示す。
【００２０】
【図２１】本発明の態様に従って、１５０ｂｐの第１３染色体と参照染色体（ΔＦ(18-Ref)）との間の短い断片によって寄与された全長の画分における相違を示す。
【図２２】本発明の態様に従って、第２１染色体に対して整列された配列の中央値サイズとＹ染色体に対して整列された配列の割合との相関を示すプロットである。
【図２３Ａ】本発明の態様に従って、第１８、第１３及び第２１染色体に対して各々整列された配列の中央値サイズとＹ染色体に対して整列された配列の割合との相関を示すプロットである。
【図２３Ｂ】本発明の態様に従って、第１８、第１３及び第２１染色体に対して各々整列された配列の中央値サイズとＹ染色体に対して整列された配列の割合との相関を示すプロットである。
【図２３Ｃ】本発明の態様に従って、第１８、第１３及び第２１染色体に対して各々整列された配列の中央値サイズとＹ染色体に対して整列された配列の割合との相関を示すプロットである。
【図２４】母親血漿ＤＮＡ分析を用いた胎児異数性（トリソミー１３及びトリソミー１８）の非侵襲性検出のための本発明の態様及び別の方法の精度の比較を示す。
【図２５Ａ】本発明に従った妊娠女性と胎児遺伝子型の異なるシナリオについての略図を示す。
【図２５Ｂ】本発明に従った妊娠女性と胎児遺伝子型の異なるシナリオについての略図を示す。
【図２５Ｃ】本発明に従った妊娠女性と胎児遺伝子型の異なるシナリオについての略図を示す。
【００２１】
【図２６】本発明の態様に従って、母親がヘテロ接合えあり、父親がホモ接合である例を示す。
【図２７】本発明の態様に従って、親のハプロタイプが図２６に示されるものである場合に、胎児が母親からＨａｐＩを遺伝する例を示す。
【図２８】本発明の態様に従って、第２２染色体上の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）タイプについてのサイズ分析を例証する表を示す。
【図２９】本発明の態様に従って、第２２染色体上のタイプβＳＮＰについてのサイズ分析を例証する表を示す。
【図３０】本発明の態様に従って、第２２染色体上のタイプαとタイプβＳＮＰについてのΔＦ(HapI-HapII)のプロットを示す。
【００２２】
【図３１Ａ】本発明の態様に従って、標的富化なしに血漿ＤＮＡのサイズ分析を与える表である。
【図３１Ｂ】本発明の態様に従って、標的富化なしに血漿ＤＮＡのサイズ分析を与える表である。
【図３２】本発明の態様に従って、標的富化なしにＴ２１及び正倍数体試料についてのΔＦのプロットである。
【図３３】本発明の態様に従うシステムと方法を用いた使用に適した例示的なコンピュータ装置のブロック図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
用語「生物試料」とは、本明細書で使用するとき、対象（例えば、妊娠女性などのヒト）から採取され、対象とする１以上の核酸分子を含むいずれかの試料を意味する。
【００２４】
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、及び一本又は二本鎖のいずれかの形態であるそのポリマーのことである。具体的に限定されない限り、当該用語は、基準核酸と同程度の結合特性を有する、既知の天然ヌクレオチドアナログを含む核酸を含み、そして天然に存在するヌクレオチドに同様の方法で代謝される。他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰｓ、及び相補的配列、ならびに明確に示された配列を暗黙的に含む。具体的には、縮重コドン置換は、一つ以上選択された（又は全ての）コドンの第三の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じさせることによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、低分子ノンコーディングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ、及び遺伝子又は遺伝子座によってコード化されたショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と交換可能に使用される。
【００２５】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するＤＮＡのセグメント又は転写されたＲＮＡ産物のセグメントを意味する。それは、コード領域に先行する、及びコード領域に続く領域（リーダー及びトレイラー）、ならびに個々のコード断片（エキソン）間の介在配列を含み得る。
【００２６】
本明細書において使用される用語「臨床的に重要な核酸配列」は、その潜在的不均衡が試験される、より大きな遺伝子配列断片に相当するポリヌクレオチド配列のことか、又はそのより大きな遺伝子配列自体に相当するポリヌクレオチド配列のことであり得る。一つの実施例は、第２１番染色体の配列である。他の例は、第１８番、第１３番、Ｘ及びＹ染色体を含む。さらに他の例は、胎児がその親の片方又は両方から受け継いているかもしれない変異遺伝子配列、又は遺伝子多型、又はコピー数変異を含む。さらに他の実施例は、悪性腫瘍中において変異した、欠失した、又は増幅された配列、例えばヘテロ接合性の欠損又は遺伝子重複が起こっている配列を含む。幾つかの実施形態において、複数の臨床的に重要な核酸配列、又は臨床的に重要な核酸配列の同等の複数のメーカーが、当該不均衡を検出するためのデータを提供するために使用され得る。例えば、第２１番染色体上の５つの不連続配列からのデータは、可能性のある第２１番染色体不均衡の決定のための付加的な方法において使用され得、効果的に試料の容量を１／５へと減少させる。
【００２７】
用語「参照核酸配列」とは、本明細書において使用するとき、サイズ分布が標的配列に対して比較するために使用される核酸配列を指す。参照核酸配列の例には、染色体、染色体の一部、特定の遺伝子座（例えば、母親のもの）、特定のハプロタイプ、ゲノム、又は人工的に合成された核酸配列が含まれる。このような参照核酸配列は、試料中に内因的に存在してもよく、又は試料加工若しくは分析中に外因的に添加されてもよい。
いくつかの態様では、参照核酸配列は、疾患のない健常な状態を代表するサイズプロフィールを示す。
【００２８】
本明細書において使用される用語「に基づく」は、「少なくとも一部に基づく」ことを意味し、そして、一つの方法の入力とその方法の出力との関係において生じる、一つの値の決定において使用される別の値（又は結果）のことをいう。本明細書において使用される用語「導く」はまた、一つの方法の入力とその方法の出力との関係のことであり、例えば誘導が公式計算であるときに起こる。
【００２９】
本明細書において使用される用語「パラメータ」は、定量的データのセットを特徴づける数値、及び／又は定量的データセット間における数的関係を意味する。例えば、第一の核酸配列の第一の量と第二の核酸配列の第二の量との間における比率（又は比率の関数）はパラメータである。
【００３０】
本明細書において使用するとき、用語「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」又はその複数形の「遺伝子座（ｌｏｃｉ）」とは、ゲノム全体での改変を有する任意の長さのヌクレオチド（又は塩基対）の局在又は所在を意味する。
【００３１】
用語「配列不均衡」とは、本明細書で使用するとき、参照量からの臨床的に関連した核酸配列における少なくとも１つのカットオフ値によって定義される任意の有意な逸脱を意味する。配列不均衡は、染色体用量不均衡、対立遺伝子不均衡、突然変異用量不均衡、ハプロタイプ用量不均衡、及び他の類似した不均衡を含むことができる。一例として、対立遺伝子不均衡又は突然変異用量不均衡は、胎児が母親由来の異なる遺伝子型を有する場合に生じ、それにより試料中の特定の遺伝子座で不均衡を創出することができる。
【００３２】
本明細書において使用される用語「染色体異数性」は、２倍体ゲノムのもの由来の染色体量における変異を意味する。当該変異は、増加又は欠失であり得る。それは、一つの染色体の全体、又は一つの染色体の領域に関連し得る。
【００３３】
用語「ハプロタイプ」とは、本明細書において使用するとき、同じ染色体又は染色体領域上の一緒に伝えられる、複数の遺伝子座での対立遺伝子の組み合わせを意味する。ハプロタイプは、僅かに一対の遺伝子座、染色体領域、又は全染色体を意味する場合がある。用語「対立遺伝子」とは、異なる表現型形質に帰着するか又は帰着しない可能性がある同じ物理的ゲノム遺伝子座での代替のＤＮＡ配列を意味する。任意の特定の２倍体生物では、各染色体（男性対象における性染色体を除く）の２つのコピーを有し、各遺伝子についての遺伝子型は、ホモ接合体においては同じであり、ヘテロ接合体においては異なる、その遺伝子座に存在する対立遺伝子の対を含む。生物の集団又は種は、典型的には、種々の個体間で各遺伝子座に複数の対立遺伝子を含む。１を超える対立遺伝子がこの集団に見られるゲノム遺伝子座は多形性部位と呼ばれる。遺伝子座での対立遺伝子改変体は、存在する対立遺伝子の数（すなわち、多型の程度）、又は集団におけるヘテロ接合体の比率（すなわち、ヘテロ接合性率）として測定可能である。本明細書において使用するとき、用語「多型」とは、ヒトゲノムにおける任意の個体間改変を意味し、その頻度とは関係しない。このような改変体の例には、限定されないが、単一のヌクレオチド多型、単一のタンデムリピート多型、挿入−欠失多型、突然変異（疾患原因となり得る）、及びコピー数の改変体が含まれる。
【００３４】
妊娠女性の血漿中に存在する胎児ＤＮＡ分子は、一般的には、母親由来の分子よりも短いことが見出されている（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４；５０：８８−９２；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４；５０：１００２−１０１１；米国特許出願第２００５０１６４２４１号）。本発明のある種の態様は、ゲノムの一部に由来するＤＮＡ分子のサイズ変化によって、ゲノムの特定の一部の過剰発現又は過少発現を胎児が有するかどうかを母親血漿ＤＮＡから決定することができる。胎児ＤＮＡは母親血漿中のＤＮＡの少数画分を示すので、母親血漿中のサイズ変化の程度全体は小さい可能性があり、従って、検出が困難となり得る。いくつかの態様では、多数の分子のサイズは、疾患と健康との間の統計的に有意な差に達することが測定されている。
【００３５】
Ｉ．断片のサイズ決定
多数のＤＮＡ分子のサイズが測定可能な１つの方法は、大規模並列ゲノム配列決定による。これは、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒプラットフォーム（合成による配列決定を用いる）（Ｂｅｎｔｌｅｙ  ＤＲ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ２００８；４５６：５３−５９）、ＡＢＩ  ＳＯＬｉＤ（連結による配列決定を用いる）（ＭｃＫｅｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００９；１９：１５２７−１５４１）、Ｒｏｃｈｅ  ４５４プラットフォーム（Ｍａｒｇｕｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ２００５；４３７：３７６−３８０）、及びＨｅｌｉｃｏｓ単一分子配列決定プラットフォーム（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００８；３２０：１０６−１０９）によって実施され得る。また、他の大規模並列配列決定もまた用いることができることが期待され、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（単一分子、リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術（Ｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９；３２３：１３３−１３８）、ナノポア配列決定（Ｃｌａｒｋｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００９；４：４６５−４７０）、半導体配列決定（例えば、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（ｗｗｗ．ｉｏｎｔｏｒｒｅｎｔ．ｃｏｍ）による）が挙げられる。
【００３６】
このような配列決定からＤＮＡサイズ情報を得るための１つの方法は、対末端（ＰＥ）配列決定を行うことであり、この場合、ＤＮＡ分子の両末端が配列される。次に、分子の両末端に対応する配列は、参照ゲノム（例えば、参照ヒトゲノム又は参照ウマゲノム、あるいは対象とする任意の動物のゲノム）に戻ってマッピングすることができる。一態様では、両末端は、各々、各末端について個別に、参照ヒトゲノム（例えば、約１０〜２４塩基又は２５〜３６塩基）に戻ってマッピングするには十分に長い長さで配列決定される。別の態様では、配列の比率だけが、ヒトゲノムの非繰り返し領域に対してミスマッチを含まないで戻ってマッピングされ得る。一局面では、このマッピングは、両配列がともにマッピングに使用される場合、明白であってもよい。このシナリオでは、末端の各々が非常に短いため、信頼をもってマッピングされないとしても、両配列を用いることは明白なマッピングを提供することができる。分子のサイズは、２つの配列の末端のゲノム座標の差し引きによって実施され得る。
【００３７】
別の態様では、分子のサイズは、ちょうど２つの末端の代りに、全ＤＮＡ分子の完全な又は完全に近い配列決定によって得ることができる。これは、相対的に長い読み取り長さを用いた配列決定プラットフォーム、例えば、Ｒｏｃｈｅ  ４５４プラットフォーム、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ単一分子、リアルタイプ（ＳＭＲＴ（商標））技術、及びＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ技術（ｗｗｗ．ｉｏｎｔｏｒｒｅｎｔ．ｃｏｍ）によって効率的に行うことができる。
【００３８】
上記の配列決定に基づく方法のスループットは、インデックス又はバーコード化の使用を用いて増加させることができる（Ｃｒｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００８；３６：ｅｌ２２）。したがって、試料又は患者特異的なインデックス若しくはバーコードは、特定の核酸配列決定ライブラリーにおいて核酸断片に添加し得る。次に、多数のこのようなライブラリーは、各々が試料又は患者特異的なインデックス若しくはバーコードを有するものであり、ともに混ぜられ、ともに配列決定される。配列決定反応後、配列決定データは、各試料又はバーコード若しくはインデックスに基づく患者から回収することができる。この戦略は、スループットを増加させ、したがって、現発明のコストパフォーマンスを増大させ得る。
【００３９】
別の態様では、生物試料中の核酸分子は、サイズ分析前に選択されるか又は分画され得る。１つの変形では、核酸分子は、ゲノム（例えば、第２１、第１８、第１３、又はＸ染色体の１つ）における選択された遺伝子座からの核酸分子を選択的に結合するデバイス（例えば、プローブを含むマイクロアレイ又は溶液）で処理され、その後、サイズ分析は核酸分子の結合サブセット上で実施され得る。このような態様では、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ配列捕捉システム（ｗｗｗ．ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｅｑｃａｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）又はＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｗｗｗ．ｏｐｅｎｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）あるいは類似のプラットフォームを使用することができる。別の態様では、未結合核酸分子サブセットは、別々に除去されるか又は分解されるか又は消化され得る。
【００４０】
少なくともいくつかの態様は、任意の単一分子分析プラットフォームを用いて実施することができ、この場合、分子の染色体起源及び長さは、例えば、電気泳動、光学的方法（例えば、光学的マッピングとその変形、ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｏｐｔｉｃａｌ ｍａｐｐｉｎｇ＃ｃｉｔｅ ｎｏｔｅ−Ｎａｎｏｃｏｄｉｎｇ−３，及びＪｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７；１０４：２６７３−２６７８）、蛍光に基づく方法、プローブに基づく方法、デジタルＰＣＲ（マイクロ流体に基づく、又はエマルションに基づく、例えば、ＢＥＡＭｉｎｇ（Ｄｒｅｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００３；１００：８８１７−８８２２）、ＲａｉｎＤａｎｃｅ（ｗｗｗ．ｒａｉｎｄａｎｃｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｐｃｒ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｒｅｓｅａｒｃｈ．ａｓｐ）、ローリングサイクル増幅、質量分析、融解分析（又は融解曲線分析）、分子ふるいなどにより分析することができる。質量分析の例として、長い分子が大きな分子量（サイズ値の例）を有するであろう。
【００４１】
一例では、血漿ＤＮＡ分子は、対末端の配列決定プロトコールを用いたＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒシステムによって無作為に配列決定された。この実験では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ対末端（ＰＥ）Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ試薬キットのバージョン１を用いた。各々の末端３６ｂｐについて配列決定された。各配列の２つの末端は、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって提供されるＧＡＰｉｐｅｌｉｎｅ−１．０ソフトウェアパッケージを用いて、繰り返しマスクされたヒトゲノム（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６，バージョン４８）に対して整列された。各末端からの３６ｂｐのうちほんの３２ｂｐだけがアラインメント目的で使用された。
【００４２】
いくつかの態様では、ＰＥは、以下の基準が一連の分析について使用され得ることを満たすように読む：（１）各々が示唆された対の個別のメンバーがともに、配列決定フローセル上で同じ染色体一で配列決定され、ヒト参照ゲノムについて期待されるのと同じである、正しい配向を有する染色体に対して整列され得た；（２）対の両メンバーの配列決定された読み取りは、任意のヌクレオチドミスマッチないしに繰り返しマスクされたヒト参照ゲノムに対して整列され得た；（３）対の各メンバーの配列決定された読み取りは一意性スコア＞４であった；及び対は６００ｂｐ未満の挿入サイズを示す。次に、各々の整列された配列のサイズは、２つの末端の各々の位置に従って計算された。
【００４３】
ＩＩ．異数性状態を決定するためのサイズ分布の使用
図１は、本発明の態様による、妊娠女性対象から得られた生物試料における配列不均衡の出生前診断を行うための方法１００を例証するフローチャートである。方法１００は、胎児染色体異数性を分析することに関して主に記載される一方で、方法１００の他の態様、及び本明細書の他の方法は、他の配列不均衡（例えば、遺伝子型又は突然変異の同定）に適用され得る。方法１００及び他の方法は、１以上のプロセッサを含むコンピュータシステムによって、全体的又は部分的に実施されてもよい。
【００４４】
方法１００及び本明細書に記載されている方法のいずれかは、ステップを実行するように構成され得る、プロセッサを含むコンピュータシステムを用いて全体的に又は部分的に実施されてもよい。したがって、態様は、各ステップ又はステップの各グループを実行する異なるコンポーネントを潜在的に用いて、本明細書に記載されている方法のいずれかのステップを実行するように構成されたコンピュータシステムに指向される。番号付けされたステップとして示されているが、本明細書中の方法のステップは、同時に又は異なる順番で実行されてもよい。さらに、これらのステップの一部は、他の方法からの他のステップの一部を用いて使用されてもよい。また、全ての又は一部のステップは任意であってもよい。さらに、方法のいずれかのステップのいずれかは、これらのステップを実行するためのモジュール、回路、又は他の手段を用いて実行され得る。
【００４５】
ステップ１１０では生物試料中の核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の少なくともいくつかのサイズが測定される。また、核酸分子は、全ゲノムの断片であるため、断片とも呼ばれる。このサイズは、任意の適切な方法、例えば、上記の方法を介して測定されてもよい。
【００４６】
ステップ１２０は、核酸分子の各々が由来するゲノムにおける位置を同定する。この位置は、ゲノムの任意の部分であってもよく、提供される例についてはヒトであるが、他のゲノムであってもよい。例えば、位置は、断片がどの染色体番号に由来し、ゲノム座標（例えば、特定の座標又は座標の範囲）によって画定され得るように染色体のどの部分であり、さらに、染色体の２つ（倍数体を想定する）のうちのどの１つが断片に由来（配向）するかであってもよい。
【００４７】
一態様では、同定は、配列情報を配列決定し、それと参照ヒトゲノム配列とを比較することによって実行されてもよい。別の態様では、この同定は、既知の染色体起源を用いて一連のプローブにハイブリダイゼーションさせることによって実行され得る。プローブは、マイクロアレイフォーマット又は溶液中で、１以上の蛍光標識を用いて標識され得る。さらに別の態様では、核酸分子は、溶液中又は固体表面上で一連のプローブによって捕捉されてもよく、次に、捕捉された（又は残りの捕捉されていない）核酸分子が配列決定される。いくつかの態様では、染色体異数性以外の配列不均衡が同定されるべきであるが、断片が起源とする染色体を同定するステップは任意であってもよい。
【００４８】
ステップ１３０では、第１位置（例えば、第１の染色体）に対応する核酸分子のサイズ分布が決定される。種々の態様は、様々なサイズ分布を用いることができる。いくつかの態様では、サイズ分布は、他の染色体の断片と比較して、１つの染色体の断片のサイズのランキング（例えば、平均（ａｖｅｒａｇｅ）、中央値、又は平均（ｍｅａｎ））に関する。他の態様では、サイズ分布は、染色体の断片の実際のサイズの統計値に関してもよい。一実施では、統計値は、染色体の断片の任意の平均（ａｖｅｒａｇｅ）、平均（ｍｅａｎ）、又は中央値のサイズを含むことができる。別の実施では、統計値は、全ての断片の全長によって割ってもよい、カットオフ値を下回る断片の全長を含むことができ、又は少なくとも断片は大きなカットオフ値を下回ってもよい。
【００４９】
配列不均衡（例えば、胎児染色体異数性）は第１位置に存在するかどうかの分類は、決定されたサイズ分布に基づいて決定される。一態様では、染色体のランキングは、参照ランキング（例えば、正倍数体試料の１つ）と比較される。変化が有意である（例えば、閾値を超える）場合、試料は異数性として分類することができる。別の態様では、実際のサイズの統計値は、２つの染色体間、又は染色体グループ間で比較される。例えば、各統計値間の相違を採用してもよく、この相違はカットオフと比較される。
【００５０】
ＩＩ．サイズ分布（ランク）
態様は、染色体不均衡が存在するかどうかを決定するために、試料の核酸断片のサイズの値を用いることができる。また、断片は、配列決定が行われた後に配列と呼ばれる。一態様では、複数の染色体についての断片のサイズの分布が決定され、その染色体が分布の統計値（例えば、平均（ａｖｅｒａｇｅ）、平均（ｍｅａｎ）、又は中央値）に基づいてランキングされる。便宜上、用語「サイズ」は、本明細書においては、同意語としてサイズの統計値とともに使用され得る。用語「サイズ」は、特定の断片のサイズ、及び一連の断片のサイズの統計的測定を指すときは明確であるべきである。
【００５１】
Ａ．ランク
図２は、母親血漿中の異なる染色体に由来するＤＮＡ断片の測定されたサイズ分布を例証するプロット２００である。測定サイズは、インビボでのＤＮＡ断片サイズを反映し得るだけでなく、分析ステップの寄与も反映し得るので、サイズ分布は、（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｅｒ及びＡＢＩ  ＳＯＬｉＤプラットフォームについて）プラットフォームごとに変化し得た。しかしながら、参照試料及び試験試料は同じプラットフォーム又は試薬タイプを用いて分析される限り、態様はプラットフォーム／試薬に独立して用いられ得る。また、いくつかの態様は、例えば、任意のエラーが決定及び修正され得る場合、又はプラットフォーム及び／又は試薬タイプが密接に合致した分析性能をもつことを示し得る場合、異なるプラットフォーム及び／又は試薬タイプを用いて用いられてもよい。
【００５２】
図２では、第２常染色体及びＸ染色体は、それらに整列された断片配列のサイズに関して比較された。Ｙ軸上で、ランクは、配列のサイズの降順であり、即ち、最長配列を有する染色体はランク１位となり、最短配列を有する染色体はランク２３位となる。一態様では、この比較（ランクの分散のＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  Ｏｎｅ  Ｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ修正対比較による）は、ＳｉｇｍａＳｔａｔ（ＳＰＳＳ）ソフトウェアを用いて非パラメトリック的になされた。この比較は、サイズを表す任意の統計値のものであり得て、個々のサイズの各々のランキング、及び各染色体の配列の個別のランキングの統計分析が含まれる。一実施では、ランク番号付けにおける同点及びスキップが許される。
【００５３】
いくつかの態様では、配列の各々は、特定の染色体に対してマッピングされる。次に、各染色体について、１以上の統計値は、その染色体に対してマッピングされた配列について決定される。即ち、異なるタイプの統計値（例えば、平均及び中央値）は、各染色体のサイズについて計算し得る。次に、対応する統計値をランキングすることができる。例えば、各染色体についての平均サイズを互いに比較することができる。１を超える統計値が用いられる場合、（例えば、いくつかの式に従って、例えば、重量平均）統計値を組み合わせることができ、この組み合わせた統計値をランキングすることができる。一態様では、特定の染色体についての統計値のランキングは、（統計値について上記されるように）組み合わせることができ、組み合わせたランキングは互いに比較され得る。
【００５４】
他の態様では、配列の全ては、サイズに従って個別にランキングされる。即ち、１，０００，０００個の配列が存在する場合、ランキングは１〜１００万あり、ランキング番号付けにおいて同点及びスキップがあり得る。次に、同じ染色体に対してマッピングされた全ての配列についてのランキングを一緒に加えることができる。ランキングの合計は、染色体についての配列ランキングに到達する特定の染色体に対して整列された配列の数によって割ることができる。最大平均配列ランキングである染色体は、最長（ランキング１位、Ｙ軸上で最高）として記され、最低平均配列ランキングである染色体は最短（ランキング２３、Ｙ軸上で最低）として記され得る。別の態様では、中央値ランクを決定することができる。正倍数体の雄性胎児、正倍数体の雌性胎児、及びトリソミー２１雄性胎児であるケースの中央値ランクを図２に示す。
【００５５】
Ｘ軸上で、染色体は、各染色体（Ｘ染色体を除く（後記参照））由来のＤＮＡ断片のサイズ分布の降順で整列される。一態様では、このようなランキングについて、正倍数体のケースだけを用いた。最長の測定サイズ（例えば、長さ）を有する染色体が左側に整列される。Ｘ染色体は、胎児の性によってそのランキングが支配されるため、略図の右に置かれている。
【００５６】
上記の通り、測定サイズは、プラットフォームごとに変化してもよい（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムから別のシステムに変更する場合）。このようにして、一局面では、サイズは、実際のサイズとは対照的に、「測定」サイズと称することができる。さらに、サイズは、Ｉｌｌｕｍｉｎａキットの１バージョンから別のものにスイッチする場合、例えば、バージョン１の対末端クラス生成キットからバージョン２に変更する場合、変更してもよい。一態様では、ユーザーは、彼らの特定のシステムについてランキングを行うことができる。
【００５７】
Ｘ染色体の平均ランクは、雄性胎児を持つ妊娠女性と比較した場合、雌性胎児を持つ妊娠女性の血漿中では低い（即ち、短くなっている）ことが図２に示され得る。この観察の説明は、胎児によって放出されるＤＮＡ断片が母親からのＤＮＡ断片よりも短いことである。したがって、Ｘ染色体の二重用量を放出することによって、雌性胎児は、母親血漿中のＸ染色体由来の全体の測定サイズ断片を減少させるであろう。反対に、雄性胎児は、Ｘ染色体の単回用量を放出することができるだけであろう。
【００５８】
また、第２１染色体のランクは、正倍数体胎児を有する妊娠女性と比較した場合、トリソミー２１胎児を有する妊娠女性の血漿中で減少（即ち、短くなる）ことが図２に示され得る。この観察の説明は、再度、母親血漿中の第２１染色体に由来する測定サイズ断片に由来し得る。反対に、正倍数体胎児は、胎児細胞あたり第２１染色体の２用量を放出ことができるだけであろう。
【００５９】
図３は、本発明の態様による母親血漿における異なる染色体由来の配列のサイズ分析が、胎児の第２１染色体の異数性の非侵襲性出生前検出について用いることができることを示すグラフ３００である。この例では、染色体サイズは、他の染色体と比較した場合、サイズランクによって表される。このようにして、より大きなサイズのランク番号は、染色体が母親血漿においてより短いＤＮＡ断片サイズを有することを示す。
【００６０】
グラフ３００は、胎児が正倍数体（ランク９〜１８のランキング）である場合と比較して、トリソミー２１胎児（ランク１８〜２１のランキング）を伴う妊娠について、母親血漿中の第２１染色体のサイズランク数が大きい（即ち、より短いＤＮＡ断片を指示する）ことを示す。この観察の説明は、胎児ＤＮＡが母親ＤＮＡよりも短く、トリソミー２１胎児由来の第２１染色体の追加用量が母親血漿中の第２１染色体配列の統計値の全短縮をもたらすことである。
【００６１】
Ｂ．ランクを用いた方法
図４は、本発明の態様による、統計値のランキングを用いた妊娠女性対象から得られた生物試料における胎児染色体異数性の出生前診断を行うための方法を例証するためのフローチャートである。
【００６２】
ステップ４１０では、生物試料から得られた複数の核酸分子（断片）の各々のサイズを測定する。この複数の核酸分子は、得られた核酸分子の全ての小集団となり得ることに気付かれたい。複数の核酸分子は、されに、配列決定がサイズ測定の一部として行われる場合、配列決定される全ての核酸分子の小集団となり得る。
【００６３】
ステップ４２０では、複数の核酸分子の各々がどの染色体に由来するかが同定される。種々の態様では、ステップ４１０と４２０の順番を反対にしてもよく、又は同時に生じさせてもよい。例えば、対末端の配列決定状況では、配列のゲノムアラインメントは、その染色体位置、及びその長さ（開始と終了のゲノム座標の差し引きによる）を提供することができる。一態様では、染色体はステップ１２０として同定され得る。
【００６４】
ステップ４３０では、複数の染色体の各々について、統計値は、染色体に対応する核酸分子のサイズから計算される。統計値は、本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて計算され得る。例えば、統計値は、上述されるように、初期のランキング段階の結果を含むことができた。一態様では、任意の特定の染色体に対応する核酸分子のほんの一部を用いてもよい。
【００６５】
ステップ４４０では、染色体のランキングは、統計値に基づいて決定される。一態様では、ランキングは、基本のソーティングアルゴリズムを用いて決定されてもよい。別の態様では、より複雑な比較を行うことができ、例えば、ランクの相違のＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ一方向分析、続くＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ修正対末端比較、又は他の適した方法が挙げられる。種々の態様では、ランキングは、整数、画分、実数（例えば、ランキングにおいて）、又は朱書きに基づく英数字ランキング（例えば、Ａ−Ｘ）であってもよい。
【００６６】
ステップ４５０では、第１の染色体の決定されたランキングは、参照生物試料から得られた第１の染色体の別のランキングと比較される。一態様では、この比較は、１以上の参照生物試料のランキングから決定される、カットオフ閾値（例えば、単一の値又は範囲）に対する決定されたランキングの比較である。このようなカットオフ値は、図３から決定され得るように、ランクが１８（若しくは１９）又はそれより高い場合であってもよい。別の態様では、２つの試料間の第１の染色体のランキングにおける相違を決定することができ、この相違はカットオフと比較され得る。一実施では、参照生物試料は、対象とする疾患を含まないことが分析により決定され、さらに、試料が、ランキングにより問題を引き起こす可能性がある任意の関連疾患を含まないことが決定されてもよい。
【００６７】
ステップ４６０では、比較に基づいて、胎児染色体異数性が第１の染色体に存在するかどうかの分類が決定される。一態様では、この分類は疾患の又は疾患でないという二元分類であってもよい。別の態様では、分類は、予測できない分類が用いられ得るという点で三元的であってもよい。さらに別の態様では、分類は、特定の分類の可能性を含むことができ、したがって、ちょうど３つの分類を超える分類を効果的に含むことができる。
【００６８】
ＩＩＩ．サイズ分布（サイズの統計値）
他の態様では、サイズ分布は、ランキングとは対照的に、断片サイズの統計値（例えば、特定のゲノム位置に対する実際値又は絶対値の統計値）を含むことができる。一態様では、第１の染色体の実際のサイズは、同じ試験試料についての１以上の参照染色体の実際のサイズと比較し得る。例えば、第１の染色体と１以上の参照染色体のこれらの実際のサイズ間の分離値（例えば、相違又は比率）をカットオフと比較することができる。一態様では、カットオフは参照試料から決定し得る。別の態様では、試験試料と参照生物試料との間の染色体の断片の実際のサイズ間の分離値は、カットオフとともに用いられてもよい。さらに別の態様では、染色体の断片の実際のサイズは、信頼できる分類を得るためのカットオフに対して比較されてもよい。
【００６９】
Ａ．絶対サイズ
いくつかの例は、第２１染色体由来の断片の絶対サイズと、１以上の参照染色体由来の断片の絶対サイズとを比較することによって、トリソミー２１の非浸襲性出生前検出を達成することができることを示す。一態様では、第７と第１４染色体は、第２１染色体に相対的に近い母親血漿におけるサイズ値（例えば、絶対サイズ又はサイズランキング）を有することができるので、参照染色体として選択され得る。実際には、参照染色体は、正倍数体試料についての第２１染色体（又は他の対象染色体）に関して、例えば、特定の分析プラットフォーム及び／又は試薬タイプ上で、一致するする断片サイズを有する任意の染色体であってもよい。
【００７０】
図５は、本発明の態様による、各染色体に対して整列された配列のサイズに関して、第２１染色体と第染色体及び第１４染色体との比較を例証する表５００である。表５００のデータは、１６個の試験試料から得られる。各試料について、第７、第２１、及び第２１の各々の断片について平均サイズが示される。また、平均値間の相違が提供される。ｐ値は、各相違が健常試料において生じるであろう可能性を示す。
【００７１】
図５の表５００から分かるように、第２１染色体に対して整列された配列は、全てのトリソミー２１の妊娠についての第７染色体と第１４染色体に対して整列された配列よりも（例えば、平均サイズで）有意に短かった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク−ｓｕｍ検定、ｐ値＜０．００１）。この程度の統計的有意性での短縮は、正倍数体妊娠において観察されなかった。したがって、表５００は、第２１と第７染色体間の平均断片サイズの相違が１ｂｐよりも大きかった一方で、正倍数体症例のいずれも１ｂｐよりも大きい相違を示した。したがって、１ｂｐは、分類を決定するための正確なカットオフを提供し得る。同様に、トリソミー２１妊娠の全てについて、第１４染色体からの平均断片サイズが、第２１染色体からの平均断片サイズよりも一貫して大きい。確かに、０．５ｂｐのカットオフが、第２１染色体と比較した場合に第１４染色体断片の観察された「伸長」について用いられる場合、全てのトリソミー２１症例は、非トリソミー２１症例と区別することができる。このようにして、一態様では、カットオフ値は、１以上の参照試料から決定することができる。
【００７２】
Ｂ．絶対サイズを用いた方法
図６は、本発明の態様による、ゲノム位置についての断片のサイズの統計値の比較を用いた、妊娠女性対象から得られた生物試料における配列不均衡の出生前診断を行うための方法を例証するフローチャートである。一局面では、方法６００は、第１の染色体の断片のサイズと１以上の参照染色体の断片のサイズについての分離値（例えば、相違又は比率）に基づく配列不均衡の分類の決定に指向され得る。
【００７３】
ステップ６１０では、生物試料から得られた複数の核酸分子のサイズが測定される。複数の核酸分子が得られ、ステップ４１０に記されたのと同じ断片を含んでもよいことに気付くべきである。
【００７４】
ステップ６２０では、核酸の各々が由来するゲノム位置を同定する。この位置は、ステップ１２０及び他のところで記載されているように、ゲノムの任意の部分であってもよい。例えば、複数の核酸分子の各々がどの染色体に由来するかが同定される。この決定は、本明細書で記載されるように、参照ゲノムに対するマッピングによって行うことができる。
【００７５】
ステップ６３９では、第１統計値は、第１ゲノム位置（例えば、第１の染色体）に対応する核酸分子のサイズから計算される。一態様では、第１統計値は、第１の染色体に対応する断片の平均（ａｖｅｒａｇｅ）、平均（ｍｅａｎ）、又は中央値サイズであってもよい。別の態様では、第１統計値は、カットオフのタイプであってもよい、第１サイズを下回る断片の長さの合計を含むことができる。例えば、２００ｂｐよりも小さい断片の各々は、合計されたそれらの長さを有することができる。この合計は、（第１サイズと同じであってもよい）第１の染色体に対応する全ての断片の長さの合計、又は第２サイズカットオフよりも大きな断片の長さの合計などの別の数によって割られてもよい。例えば、第１統計値は、断片の全長と比較した第１サイズカットオフを下回る断片の全長の比率、又は大きな断片の全長と比較した小断片の全長の比率であってもよい。
【００７６】
ステップ６４０では、第２統計値は、第２ゲノム位置（例えば、第２染色体）に対応する核酸分子のサイズから計算される。第２染色体は参照染色体と考えることができる。一態様では、複数の参照染色体についての統計値を計算することができる。一実施では、統計値は、該統計値が１以上の第２染色体のものとなり得るように組み合わせることができる。別の態様では、複数の参照染色体についての統計値は、以下に示すように、個別に比較されてもよい。
【００７７】
ステップ６５０では、第１統計値と第２統計値は分離値を得るために比較される。一態様では、分離値は、第１統計値と第２統計値との間の相違であり得て、決定される。別の態様では、分離値は、２つの統計値の比率であってもよい。なお別の態様では、複数の分離値は決定され得て、例えば、各参照染色体について計算され得る、各第２統計値についてのものであってもよい。
【００７８】
ステップ６６０では、分離値は、１以上のカットオフ値と比較される。一態様では、この比較は、複数の分離値の各々について行うことができる。例えば、上記されるように、異なる分離値は、第１統計値と各第２統計値との間で決定することができる。種々の実施では、各分離値は、同一又は異なったカットオフ値と比較されてもよい。別の態様では、分離値は、該分離値が特定の範囲内にあるかどうかを決定するために２つのカットオフ値と比較される。この範囲は、非正常なデータ点（異数性）が生じるかどうかを決定するために１つのカットオフを含むことができ、第２カットオフは、データ点が、測定又は分析におけるエラーによって引き起こされる可能性があるかどうか（例えば、分離値が、疾患試料についてでさえ、なおも期待されたであろうものよりも大きいかどうか）を決定するために用いることができた。
【００７９】
ステップ６７０では、配列不均衡が（例えば、胎児染色体異数性）が第１ゲノム位置に存在するかどうかの分類が、比較に基づいて決定される。一態様では、複数のカットオフ（例えば、Ｎ個のカットオフ）が単一の分離値に用いることができる。このような態様では、Ｎ＋１個の分類を決定することができる。例えば、２つのカットオフを用いて、正倍数体（正常又は健常）、中間、及び正倍数体（疾患又は不健康）の分類を決定してもよい。複数の比較が行われる（例えば、各分離値についてのもの）別の態様では、分類は比較の各々に基づくことができる。例えば、ルールに基づく方法は、該比較の各々から得られる分類を調べることができる。一実施では、最終的な分類は、全ての分類が一致している場合に与えられるだけである。別の実施では、大多数の分類が用いられる。なお別の実施では、より複雑な式は、分離値の各々が各カットオフ値にどれくらい近いかに基づいて用いることができ、これらの近さを分析して、分類を決定することができる。例えば、この近さを（他の因子、例えば、標準化とともに）まとえることができ、結果を別のカットオフ値と比較することができた。
【００８０】
他の態様では、方法６００の変形は、参照試料に由来し得る、第１の染色体についての統計値とカットオフ値との直接的比較に適用され得る。いくつかの態様はまた、非妊娠個体からの生物試料を分析するために用いることができる。このような分析は、ちょうど、試料の断片の全てのサイズについての統計値を見ることができ、配列不均衡が存在し得るかどうかを決定するために、統計値と分離値とを比較することができる。不均衡が存在するものとして分類される場合、不均衡の位置のさらなる分析は、例えば、特定のゲノム位置（例えば、染色体）についての統計値及び／又は分離値を分析することによって行うことができる。
【００８１】
Ｃ．短い断片の全長の使用
上述したように、いくつかの態様では、血漿ＤＮＡのサイズ分布はまた、短いＤＮＡ断片によって寄与される全ＤＮＡ長の画分によって反映され得る。例えば、サイズ分布は、カットオフ値を下回る断片の全長を含むことができ、それは、全ての断片の全長、又はより大きなカットオフ値を下回る少なくとも断片で割ってもよい。反対に、血漿ＤＮＡのサイズ分布はまた、長いＤＮＡ断片によって寄与される全ＤＮＡ長の画分によって反映され得る。例えば、サイズ分布は、カットオフ値を上回る断片の全長を含むことができ、それは、全ての断片の全長、又は類似のカットオフ値を下回る少なくとも断片で割ってもよい。別の例として、小比率ｖｓ大比率はまた用いることができる。１つの態様は、短い血漿ＤＮＡ断片を定義するためにカットオフとして１５０ｂｐを用いる。しかしながら、任意のカットオフ、例えば、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１６０ｂｐ及び１７０ｂｐはまた、短いＤＮＡ断片を定義するためのカットオフとして用いることができる。本明細書で使用するとき、塩基対はまた、一本鎖断片の長さを参照して、多数のヌクレオチド（ｎｔ）と同義語として、言及されてもよい。
【００８２】
一態様では、短いＤＮＡ断片によって寄与されるＤＮＡ長の断片の計算は以下の通りであり得る：Ｆ＝短いＤＮＡ断片によって寄与されるＤＮＡ長の画分；Ｓ＝全ての短いＤＮＡ断片の長さ（カットオフに等しいか又は下回る長さ）の合計；及びそれらの長さに関わらずに試料中の全てのＤＮＡ断片の全長。したがって、画分は、サイズの統計値の一例である、Ｆ＝Ｓ／Ｔによって与えることができる。Ｆの計算は、試料由来の全ての断片、又はゲノムの特定の位置、例えば、特定の染色体についてであってもよい。
【００８３】
一実施では、試料中の全てのＤＮＡ断片の全長が決定され得る。次に、ＤＮＡ断片が「短い断片」として定義される下回るカットオフサイズ（ｗ）が選択され得る。カットオフサイズは、異なる診断目的に併せるために変更及び選択され得る。短いＤＮＡ断片の全長は、カットオフサイズに等しいか又は短い全てのＤＮＡ断片の長さを合計することによって計算することができる。短いＤＮＡ断片によって寄与される全長の画分、以下のように計算することができる：
Ｆ＝Σw長さ／Σ600長さ
ここで、Σwは、カットオフ（ｗ）（ｂｐ）に等しいか又は小さい長さを有するＤＮＡ断片の長さの合計を表し；及び
Σ600は、６００ｂｐに等しいか又はそれより小さいＤＮＡ断片の長さの合計を表す。また、統計値は、ランキングを用いた態様において使用され得る。例えば、Ｆは、一連の各ゲノム位置（例えば、染色体）からの断片について計算することができる。
【００８４】
例証の目的で、全長は、以下の実施例における６００ｂｐよりも短い断片の合計によって計算された。しかしながら、他のサイズ限定、例えば、４００ｂｐ、５００ｂｐ及び７００ｂｐは、「全長」を計算するために用いることができる。この例では、全長は、６００ｂｐ以下のＤＮＡ断片に基づいて計算された。これは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｏｌｅｘａ）システムが、６００ｂｐよりも長いＤＮＡ断片の増幅及び配列決定に有効でないためである。さらに、６００ｂｐよりも短いＤＮＡ断片に分析を限定することはまた、ゲノムの構造的変化から生じるバイアスを避けることができる。構造的変化の存在、例えば、再配列（Ｋｉｄｄ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００８；４５３：５６−６４）では、ＤＮＡ断片のサイズは、サイズが参照ゲノムに対してＤＮＡ断片の末端をマッピングすることによって生物情報学的に推定される場合に過大評価され得る。さらに、首尾よく配列決定され、参照ゲノムに対してマッピングされた９９．９％を超える全てのＤＮＡ断片は６００ｂｐ未満であり、したがって、６００ｂｐに等しいか又はそれより短い全ての断片は、試料におけるＤＮＡ断片のサイズ分布の典型的な見積りを与えるであろう。
【００８５】
上記されるように、ＤＮＡ断片について、より短いサイズ分布へのシフトは、胎児が副本を有する染色体について観察され得る。一局面では、異数性の危険性のある染色体（標的染色体）と異数性の危険性がない染色体（参照染色体）との間の短いＤＮＡ断片によって寄与された全長の画分の差異の測定は定量的測定であり、これらの染色体に由来するＤＮＡ断片についてのサイズ分布が異なるかどうかを決定することができる。
【００８６】
一態様では、本発明者らは、それぞれ、異数性の危険性がある染色体と参照染色体（単数又は複数）についての短いＤＮＡ断片によって寄与される全長の画分としてＦ（Ｔａｒ）とＦ（Ｒｅｆ）を定義する。標的染色体と参照染色体（単数又は複数）との間の短いＤＮＡ断片によって寄与される全長の断片の差異（ΔＦ(Tar-Ref)）は、ΔＦ(Tar-Ref)＝ΔＦ(Tar)−ΔＦ(Ref)として計算することができる。例えば、ΔＦ(21-1)は、第２１染色体と第１の染色体についての短いＤＮＡ断片によって寄与された全長の画分間の差異である。胎児染色体異数性の出生前診断におけるΔＦ(Tar-Ref)の適用は、以下の節において検討される。別の態様では、ΔＦ(Tar)／ΔＦ(Ref)の比率はまた、ΔＦ(Tar-Ref)が用いられるのと同じようにして、分離値として使用され得る。
【００８７】
標的染色体と参照染色体のＦ値間の差異は、胎児が標的染色体についてトリソミックであるか否かを決定するための統計値として用いることができる。胎児が標的染色体についてトリソミックである場合、胎児のトリソミー染色体は、母親血漿への短い胎児ＤＮＡの追加用量に寄与するであろう。よって、標染色体配列のサイズ分布の見掛けの短縮をもたらす。標的染色体配列のサイズ分布のこの短縮は、標的配列の短いＤＮＡ断片（Ｆtarget）によって寄与された配列長の画分において増加へと導くであろう。結果として、Ｆtarget及びＦref間の差異ΔＦにおいて増加となるであろう。
【００８８】
図７は、雄性胎児による母親血漿試料のためのカットオフサイズ（ｗ）に対する短い断片（Ｆ）によって寄与された全長の画分のプロット７００を示す。常染色体とＹ染色体に対して整列されたＤＮＡ断片についてのＦ値は、「短いＤＮＡ断片」を定義するために使用されるカットオフサイズに対してＹ軸上にプロットされる。雄性妊娠では、Ｙ染色体に整列されたＤＮＡ分子は、雄性胎児から放出されたＤＮＡを表す。母親血漿における大部分の循環ＤＮＡ分子は母親に由来するため、常染色体に対して整列されたＤＮＡ断片は選択的に母親ＤＮＡ断片を表す。Ｆ値は、試料における全てのＤＮＡ断片がカットオフサイズより短いか又は等しい場合、カットオフサイズとともに増加し、１．０の値に到達する。ＤＮＡ分子の２つの種間のサイズ分布における差異は、それらのＦ値における差異によって反映され得る。より高いＦ値は、全長のより高い画分が短い画分によって寄与されることを指示し、したがって、ＤＮＡ断片のより短いサイズ分布を指示する。
【００８９】
プロット７００に示されるように、Ｙ染色体からのＤＮＡ分子についてのサイズ分布は、常染色体からのＤＮＡのサイズ分布よりも短い。具体的には、Ｙ染色体についてのＦ値は、常染色体よりも先に生じ、８０ｂｐ〜３５０ｂｐ間でＦ常染色体よりも高いＦYをもたらす。Ｙ染色体と常染色体との間のＦ値の差異（ΔＦ(Y-常染色体)）は、カットオフサイズに対してさらにプロットされ、破線によって表され、８０ｂｐ〜３５０ｂｐ間でポジティブである。ΔＦ(Y-常染色体)の最大値は０．２３であり、１５０ｂｐ周辺で生じる。下記の実施例に例証されるように、危険性のある染色体と参照染色体（単数又は複数）との間の短い断片（ΔＦ）によって寄与された全断片長の画分における差異は、それらのサイズ分布における差異を定量するための有用な分離値である。さらに例として、任意のサイズカットオフを用いてΔＦを決定することができ、例えば、１３０ｂｐ〜１７０ｂｐの間である。
【００９０】
図８は、正倍数体妊娠についてのカットオフサイズに対して、第２１染色体（実線）及び参照染色体（第１３、第１８及び第２１染色体を除く全ての常染色体）（破線）に関する短い断片（Ｆ）によって寄与された全長の断片のプロット８００を示す。２つのＦ値（ΔＦ(21-Ref)＝Ｆ(chr21)−Ｆ(Ref)）における差異は、破線によって示されている。第２１染色体と参照染色体からのＤＮＡ断片のサイズ分布が正倍数体妊娠において同じであるため、ΔＦ(21-Ref)はいずれのカットオフサイズについてもゼロに近い。
【００９１】
図９は、トリソミー２１妊娠についてのカットオフサイズに対する第２１染色体（実線）と参照染色体（第１３、第１８及び第２１染色体を除く全ての常染色体）（破線）に関するＦ値のプロット９００を示す。ΔＦ(21-Ref)は破線によって示されている。胎児からの第２１染色体の追加用量によって、第２１染色体についての母親血漿におけるＤＮＡ断片のサイズ分布は、参照染色体よりも短い。ＤＮＡ断片のサイズ分布のこの差異は、約１５０ｂｐで最大である０．０１６に到達する、ΔＦ(21-Ref)のポジティブ値によって反映される。
【００９２】
図１０は、正倍数体とトリソミー２１妊娠についてのサイズカットオフに対する第２１染色体と参照染色体（第１３、第１８及び第２１染色体を除く全ての常染色体）との間のΔＦ(21-Ref)のプロット１０００を示す。ΔＦ(21-Ref)の増加はトリソミー２１において観察されるが、ΔＦ(21-Ref)は正倍数体ケースについての各サイズカットオフで約ゼロである。最大ΔＦ(21-Ref)は１５０ｂｐ周辺で観察されるので、１５０ｂｐでの差異は、第２１染色体配列のサイズ分布の任意の有意な短縮があるかどうかを決定するために分離値として用いることができる。しかしながら、正倍数体とトリソミーケース間の有意差が生じる任意のサイズを用いることができ、例えば、限定されないが、１４０ｂｐ、１４５ｂｐ、１５５ｂｐ及び１６０ｂｐである。この例では、１５０ｂｐで観察された第２１染色体と参照染色体の全長の画分における差異は、それぞれトリソミー２１と正倍数体妊娠について０．０１６と−０．００２である。
【００９３】
短いＤＮＡ断片によって寄与された全ＤＮＡ長の画分の形状におけるこの差異は、正倍数体と異数性胎児間を区別するために使用することができる。種々の方法で差異を試験することができる。一態様では、特定のサイズカットオフでΔＦの値（例えば、分離値の例）は、試料のカテゴリー化（分類）を決定するためにカットオフ値と比較可能である。別の態様では、ΔＦのピーク値を見出すことができ、その値は１以上のカテゴリー化カットオフ値と比較され得る。種々の態様では、ピーク値は、最大若しくは最小値、最大／最小値近くの平均値、又は最大／最小値と関連しているか若しくはそれに由来する他の値であってもよい。分離値（例えば、ΔＦ）の他の統計値も用いることができ、例えば、ピーク幅、又はピークに対応する特定のサイズカットオフの位置である。
【００９４】
一態様では、特定のゲノム位置又は全ゲノムについての複数の断片から得られたＦ値（又は本明細書に記載されている他の統計値、例えば、大きな断片の長さで割った小さな断片の長さ）は、病因が存在するかどうかを決定するために用いることができる。例えば、統計値がカットオフ値を超える場合、病因は、小さな断片量が正常範囲外であるため、存在するものとして同定され得る。これは、妊娠男子以外の患者について行われ、胎児以外の疾患を同定することができた。
【００９５】
いくつかの態様では、物理的サイズの分画が、断片のサイズ分析前に行うことができる。一態様では、核酸分子は、２つのサイズ画分（例えば、２００ｂｐより大きいもの、及び２００ｂｐより小さいか又はそれに等しいもの）に分けることができ、これらのサイズ画分の各々に対する選択された染色体（例えば、第２１染色体）のサイズ分布を比較することができる。胎児トリソミー（例えば、トリソミー２１）の存在下で、より小さい分子サイズのサイズ画分は、より大きな分子サイズのサイズ画分と比較して、相対的に多量に増加するであろう。
【００９６】
他の態様では、長さカットオフ値を下回る多数の画分はサイズ分布の代りに用いることができる。例えば、長さカットオフ値の数は、１以上の参照染色体と比較して、標的染色体（例えば、第２１染色体）について（例えば、差異又は比率）比較することができる。一態様では、長さカットオフ値を下回る断片の数は、割合を得るために、断片の総数によって割られ、この割合は、パラメータを与えるために、染色体と１以上の参照染色体との間で比較され得る。得られたパラメータ（例えば、差異又は比率）は、カットオフ値（例えば、１％）と比較することができる。一局面では、長さカットオフは長さで選択されてもよく、この場合、上記割合は最大である。
【００９７】
Ｖ．ランクを用いた例
トリソミー２１に加えて、母親血漿における断片分析は、他の胎児染色体異数性、例えば、トリソミー１３、トリソミー２１、トリソミー１８及び性染色体の異数性（例えば、ターナー症候群、クラインフェルター症候群及びＸＹＹなど）の非侵襲性出生前検出に用いることもできる。また、態様は、染色体異常が特定の染色体（例えば、染色体転座によって引き起こされるトリソミー２１）の部分だけを伴う場合に用いることができる。このようなシナリオでは、断片サイズ以上は、影響を受けた染色体領域からのＤＮＡ断片について観察されるであろう。
【００９８】
図１１は、製造業者の使用説明書に従って、多重試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて構築された母親血漿ＤＮＡのライブラリーについての表１１００を示す。区別可能なバーコードを付した全ての２つの試料は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｅｒ  ＩＩ上で１つのレーンに導入され、その後、標準の多重化された対末端配列決定に供された。試料はバーコードに基づいて区別され得た。１２０人の妊娠女性の血漿試料を分析した。胎児の性別及び染色体異数性状態を表１１００に示す。
【００９９】
図１２は、本発明に態様に従って、異なる疾患の４つの試料又は非疾患状態について、異なる染色体のランキングを示す。第２２染色体及びＸ染色体は、先に記載されたようにそれらの断片のサイズに従ってランキングされた。見ることができるように、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔのバージョン２に基づく染色体の相対的ランキングは、このキットのバージョン１を用いた場合と異なる（図２）。以下の示すように、態様（例えば、方法４００）は、異数性を正倍数体症例とは区別され得る。
【０１００】
Ａ．トリソミー１３
この例では、本発明者らは、トリソミー１３の出生前診断についての態様の使用を示す。図１３は、例えば、方法４００に起因する場合のように、１２０人の妊娠について第１３染色体に関する第１３染色体のランクのグラフを示す。このグラフでは、Ｔ１３、Ｔ１８、Ｔ２１及びＥｕは、それぞれ、トリソミー１３、トリソミー１８、トリソミー２１及び正倍数体妊娠を指す。２３人のトリソミー１３妊娠のうちの１８人（７８．３％）において、第１３染色体は、２２又はそれを下回ってランキングされる一方で、９７人の非トリソミー１３妊娠のほんの２人（２．１％）において、第１３染色体は２２又はそれを下回ってランキングされた。したがって、２２のカットオフランキングを用いると、胎児のトリソミー１３の出生前診断について染色体断片のランク分析の感受性及び特異性は、それぞれ７８．３％＞及び９７．９％であった。
【０１０１】
図１３では、第１３染色体のランクは正倍数体について高く（即ち、小さい数ランクを示す）、トリソミー１８と２１妊娠は、トリソミー１３妊娠よりも高い。換言すると、他の染色体上の配列と比較すると、第１３染色体配列は、非トリソミー１３妊娠よりもトリソミー１３妊娠について短いようである。トリソミー１３妊娠における第１３染色体配列の見掛けの短縮は、胎児の過剰な第１３染色体により、第１３染色体に対して胎児ＤＮＡの寄与の増加が原因している。
【０１０２】
Ｂ．トリソミー１８
図１４は、１２０症例について染色体１８のランキングを示す。３０人のトリソミー１８のうち２６人（８６．７％）では、第１８染色体のランクは１３よりも低く（即ち、大きな数がランクを示す）、一方、９０人の非トリソミー１８症例のいずれも１３より低いランクはなかった。したがって、カットオフとして１３のランクを用いると、胎児トリソミー１８の出生前診断についての染色体断片のランキング分析の感受性及び特異性は、それぞれ８６．７％及び１００％である。
【０１０３】
この分析では、本発明者らは、トリソミー１８、トリソミー１３、トリソミー２１、及び正倍数体妊娠における第１８染色体のサイズランキングを比較している。第１８染色体に照らして、後者の３つのグループは、第１８染色体に関わる用量異常性がないため、「正常な」対照としてみなすことができる。図１４から分かるように、正倍数体とトリソミー１３についての第１８染色体のランクは約１〜３に集中している。一方、トリソミー１８症例についての第１８染色体のランクは、１３〜２２であり、第１８染色体の断片のサイズが正倍数体、トリソミー２１、及びトリソミー１３症例よりも短いことを示す。再度、過剰な第１８染色体は、これらの観察を説明する。
【０１０４】
Ｃ．トリソミー２１
図１５は、１２０症例についての第２１染色体のランキングを示す。９人のトリソミー２１症例のうち８人（８８．９％）では、第２１染色体は２２又はそれを下回ってランクされ、一方、１１１人の非トリソミー２１症例のうちいずれも、第２１染色体は２２又はそれを下回るランクを有した。したがって、カットオフとして２２のランクを用いると、胎児トリソミー２１の出生前診断についての染色体断片サイズのランキング分析の感受性及び特異性は、それぞれ８８．９％＞及び１００％であったであろう。
【０１０５】
Ｖ．サイズの差異を用いた例
Ａ．トリソミー１３
これらの次の例では、本発明者らは、例えば、方法６００について記載されるように、第１３染色体由来の断片の全体サイズと、１以上の参照染色体由来の断片のものと比較することによって、トリソミー１３の非浸襲性出生前検出を達成できることを示す。この例は、先の例におけるものと同じデータセットを用いる。例証するように、トリソミー１３検出に関しては、参照染色体として第５染色体と第６染色体を選択している。
【０１０６】
図１６の表１６００から分かるように、同じ試料内で、第１３染色体に対して整列された配列は、全てのトリソミー１３妊娠について、第５染色体と第６染色体に対して整列された配列よりも有意に短かった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク−合計検定、ｐ値＜０．００１）。対照として、正倍数体とトリソミー１８妊娠を含む。正倍数体とトリソミー１８妊娠の両方において、第１３染色体の用量は正常であった。表１６００から分かるように、第１３染色体由来の配列についてのこのような統計的有意のサイズ異常性は、正倍数体とトリソミー１８妊娠において観察されなかった。
【０１０７】
さらに、全てのトリソミー１３妊娠について、同じ試料内で、第１３染色体と第５染色体との間の平均断片サイズの差異は０．４ｂｐより大きく、一方、非トリソミー１３のいずれも０．４ｂｐを超える差異を示さなかった。同様に、全てのトリソミー１３妊娠について、第１３染色体と第６染色体との間の平均断片サイズの差異は、０．５ｂｐより多く、一方、非トリソミー１３症例のいずれも０．５ｂｐを超える差異を示さなかった。
【０１０８】
Ｂ．トリソミー１８
例証として、トリソミー１８の検出について、第１４染色体を参照染色体として選択した。非トリソミー１８妊娠について、図１７の表１７００において、第１８染色体由来の配列は、第１４染色体由来の配列よりも統計的有意に長いことが分かる（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク−合計検定、ｐ値＜０．００５）。しかしながら、トリソミー１８症例に関して、第１８染色体配列は、第１４染色体に整列された配列よりも有意に長くなかった。正倍数体とトリソミー１８症例は、０ｂｐのカットオフ値を用いて、第１８と第１４染色体からのＤＮＡ断片ｎｔの平均サイズ間の差異に基づいて決定することができる。これらの観察は、母親よりも短い胎児由来の第１８染色体の追加用量は、胎児がトリソミー１８を有する場合、このような配列の全サイズを減少させたであろうという事実によって説明され得る。次に、これは、第１４染色体の分布に近い第１８染色体の全サイズ分布をもたらす。
【０１０９】
Ｖ．全長寄与を用いた例
以下の例において、参照染色体は、第１３、第１８、及び第２１染色体を除く全ての常染色体からなっていた。
【０１１０】
図１８は、１５０ｂｐで第１８染色体と参照染色体との短い断片によって寄与された全長の画分の差異（ΔＦ(18-Ref)）を示す。ΔＦ(18-Ref)について０．０００３の診断カットオフ値を用いて、トリソミー１８妊娠は９３．３％感受性と１００％特異性で検出可能である。
【０１１１】
図１９は、１５０ｂｐで第２１染色体と参照染色体との間の短い断片によって寄与された全長の画分における差異（ΔＦ(21-Ref)）を示す。ΔＦ(21-Ref)について０．００７の診断カットオフ値を用いて、トリソミー２１妊娠は１００％感受性と１００％特異性で検出可能である。
【０１１２】
ＶＩＩ．参照染色体（単数又は複数）の選択
１以上の参照染色体は、母親血漿ＤＮＡのサイズ分析によって、例えば、方法６００を用いて、胎児染色体異数性の非浸襲性出生前検出について様々な方法において選択され得る。様々な態様では、異なる参照染色体を選択することができる。
【０１１３】
第１タイプの参照染色体は、母親血漿に潜在的に関与する染色体（例えば、第２１、第１８、又は第１３染色体）由来のものとして、特異的分析プラットフォーム（又は密接に合致した分析実行を用いる分析プラットフォーム）上での類似したサイズ分布を、参照染色体由来のＤＮＡ断片が提示するものである。一態様では、このタイプの分析では、胎児染色体異数性は、危険性のある染色体のサイズランキング又は絶対サイズが、参照染色体（単数又は複数）からの統計的有意な減少を示す場合に検出される。
他の態様では、危険性のある染色体由来の断片と参照染色体（単数又は複数）由来の断片との間の平均又は中央値サイズ差異を測定することができる。
【０１１４】
第２タイプの参照染色体は、胎児が正倍数体である場合、母親血漿中の異数性に潜在的に関与する染色体（例えば、第２１、第１８、又は第１３）由来の断片よりも、参照染色体由来のＤＮＡ断片が統計的に短いものである。このタイプのシナリオは、特定のプラットフォームを用いて測定する場合、危険性の染色体が最も長いものの１つであるときに直面することがある。例えば、図１２において、第１８染色体由来のＤＮＡ断片は、母親血漿において測定される場合、常染色体のうち最も長い。したがって、第１８染色体よりも断片が統計的有意に短い参照染色体を選択することができる。一態様では、この体報の分析では、胎児染色体異数性は、危険性のある染色体のサイズランキング又は絶対サイズは、参照染色体（単数又は複数）とは統計的有意に異なることが分からない場合に検出される。例えば、この戦略は、上記されるように、図１７についても分析に用いられている。
【０１１５】
第３のタイプの参照染色体は、胎児が正倍数体である場合、母親血漿中の異数性に潜在的に関与する染色体（例えば、第２１、第１８、又は第１３）由来の断片よりも、参照染色体由来のＤＮＡ断片が統計的に長いものである。このタイプのシナリオは、特定のプラットフォームを用いて測定する場合、危険性の染色体が最も短いものの１つであるときに直面することがある。したがって、断片が危険性のある染色体よりも統計的有意に長い参照染色体を選択することができる。一態様では、このタイプの分析では、胎児染色体異数性は、サイズランキング、ランキングにおける差異、又は参照染色体と危険性のある染色体との間の絶対サイズが増加する場合に検出される。
【０１１６】
第４タイプの参照染色体は類似のＧＣ含量を有するものである。染色体のＧＣ含量は、配列決定反応において定量的読み出しに影響を及ぼす可能性がある。染色体間のＧＣ含量における差異から得られる潜在的なバイアスを最小にする１つの方法は、類似のＧＣ含量を有する適切な参照染色体を選択することである。図２０は、異なる染色体のＧＣ含量のリストを示す（ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３６，バージョン４８）。染色体はＧＣ含量の昇順で列挙される。ここで、類似のＧＣ含量を有する参照染色体を用いた例を示す。
【０１１７】
図２１は、１５０ｂｐで第１３染色体と参照染色体との間の短い断片によって寄与された全長の画分における差異（ΔＦ(13-Ref)）を示す。ここで、例証として、本発明者らは、ΔＦ(21-Ref)分析について参照染色体として第３、第４、第５及び第６染色体を用いた。図２０に示されるように、第３〜６染色体はＧＣ含量が３６．５３％〜３８．７９％であり、第１３染色体の３９．０７％のＧＣ含量に類似している。０．００３８の診断カットオフを用いると、ΔＦ分析は、トリソミー１３症例を検出し、感受性９５．７％、特異性９９．０％であった。
【０１１８】
ＧＣバイアス結果は、異なる程度に異なる配列決定プラットフォームに影響を及ぼす可能性があると期待される。例えば、事前増幅を要求しないプラットフォーム、Ｈｅｌｉｃｏｓプラットフォーム（Ｈａｒｒｉｓ  ＴＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００８；３２０：１０６−９）、ナノ細孔（Ｌｕｎｄ  Ｊ，Ｐａｒｖｉｚ  ＢＡ．Ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ｃｏｒｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９；５７８：１１３−２２）、又はＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子リアルタイプシステム（Ｅｉｄ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９；３２３：１３３−８）の使用は、参照群の染色体のより広い選択を可能にし得た。
【０１１９】
ＩＶ．胎児ＤＮＡ濃度の使用
トリソミー２１（又は他のトリソミー）妊娠では、胎児は、母親細胞由来のものよりは短いであろう第２１染色体断片の過剰用量を母親血漿に放出するであろう。これらの短い断片の濃度は、母親血漿中の胎児ＤＮＡの濃度と相関するであろうと期待される。換言すると、Ｙ染色体由来の配列の画分濃度が高くなるにつれて、トリソミー２１妊娠における第２１染色体由来の配列の測定サイズは短くなるであろう。
【０１２０】
図２２は、男子トリソミー２１胎児を伴う妊娠に油浦することを示す。図２２に示されるように、第２１染色体配列の中央値サイズと、Ｙ染色体に整列された配列の割合との間の負の相関が確かにある（ｒ＝−０．９４２、ピアソン相関）。また、類似の傾向は、第２１染色体のサイズランキングを用いる場合に期待され、即ち、第２１染色体のランク数が増加し、画分胎児ＤＮＡ濃度が増加する場合により短い断片を指示する。相関があるため、態様は、本明細書に記載されている方法のいずれかにおいてパラメータとして胎児ＤＮＡ濃度の測定を用いることができる。
【０１２１】
このタイプの分析では、母親血漿中の胎児ＤＮＡの画分及び絶対濃度は、当業者に知られている任意の方法によって測定可能である。胎児が雄性である場合、胎児ＤＮＡ濃度は、母親血漿中のＹ染色体由来の配列の画分濃度によって測定され得る。別の例は、単一ヌクレオチド多型又は単一タンデムリピート多型又は挿入−欠失多型などの父親遺伝の遺伝子マーカーの使用である。別の例は、胎児と母親のＤＮＡ間で別々にメチル化される領域などのエピジェネティックマーカーの使用である（Ｐｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００２；４８：３５−４１；Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００７；１７０：９４１−９５０；Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００６：５２：２２１１−２２１８；ＵＳ米国特許第６，９２７，０２８号）。上記マーカーは、当業者に知られている方法を用いて分析することができ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、配列決定、大規模な並列配列決定及び標的化された大規模な並列配列決定が挙げられる。
【０１２２】
一態様では、母親血漿中の測定された胎児ＤＮＡ濃度に関連して、染色体異数性を検出するための診断敷地（例えば、本明細書に記載されている任意の方法についてのカットオフ値）を変更することができた。したがって、相対的に高い胎児ＤＮＡを含む母親血漿試料について、異数性を潜在的に伴う染色体由来の血漿ＤＮＡ分子の短縮の程度は、相対的に低い胎児ＤＮＡ濃度を含む母親血漿試料よりも劇的であることが期待されたであろう。
【０１２３】
ΔＦはサイズ分布と関連するため、ΔＦもまた胎児ＤＮＡ濃度と相関を示す。図２３Ａは、ΔＦ(18-Ref)（第１８染色体ｖｓ参照配列）と胎児ＤＮＡ濃度との間の相関を示す。１３人のＴ１８症例のうち１０は雄性胎児を有し、胎児ＤＮＡの画分濃度は、これらの試料における染色体Ｙ配列の画分濃度によって評価され得る。ΔＦ(18-Ref)とＹ染色体配列の画分濃度との間に有意な相関があった（ｒ＝０．８７９、スピアマン相関）。これらの結果は、母親血漿中の第１８染色体配列のサイズ分布における短縮の程度が、トリソミー１８妊娠における母親血漿中の胎児ＤＮＡの画分濃度と相関することを示唆する。
【０１２４】
診断カットオフを下回る症例を白丸で表し、一方、カットオフより大きな差異を有する症例を黒丸で表す。診断カットオフ（０．０００３）より小さいΔＦ値を有する２つの症例（白丸で表される）は、０．０００３より大きなΔＦ値を有する症例（黒丸で表される）と比較した場合、胎児ＤＮＡの相対的に低い画分濃度を有した。低い画分胎児ＤＮＡ濃度は、これらの２つの症例が図１８において実行された分析において失われていた理由であり得た。したがって、一態様では、胎児濃度は試料において低い場合、分類は無視されるか又はやり直しされ得る。
【０１２５】
図２３Ｂは、ΔＦ(21-Ref)（第２１染色体ｖｓ参照染色体）と胎児ＤＮＡ濃度との間の相関を示す。９個のＴ２１症例のうち５つは雄性胎児を有していた。ΔＦ(21-Ref)の値とＹ染色体配列の画分濃度との間に有意な相関があった（ｒ＝０．９、スピアマン相関）。
【０１２６】
図２３Ｃは、ΔＦ(13-Ref)（第１３染色体ｖｓ第３、第４、第５及び第６染色体）と胎児ＤＮＡ濃度との間の相関を示す。２３個のトリソミー１３症例のうちの１４は雄性胎児を有していた。胎児ＤＮＡの画分濃度は、試料におけるＹ染色体配列の画分濃度によって推定され得る。ΔＦ(13-Ref)とＹ染色体配列の画分濃度との間のポジティブな相関があった（ｒ＝０．６４４、スピアマン相関）。診断カットオフ（０．００３８）を下回るΔＦ(13-Ref)を有する症例を白丸で表す。低い画分胎児ＤＮ濃度は、この症例が、図２１において実行された分析において見当たらなかった理由であり得た。
【０１２７】
ＩＸ．サイズ分析と分子カウンティング法の比較
図２４は、母親血漿ＤＮＡ分析を用いて、胎児異数性（トリソミー１３とトリソミー１８）の非浸襲性検出についての本発明の態様の精度と別の方法の精度との比較を示す。この例は、サイズを用いた態様ｖｓ分子カウンティングに基づく方法の比較を例証する（米国特許出願第１１／７０１，６８６号；Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ２００９；２５：３２４−３３１；Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；１０５：２０４５８−２０４６３；Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；１０５：１６２６６−１６２７１；米国特許出願公開第２００９／００２９３７７号）。８つの母親血漿試料（２つの正倍数体、２つのトリソミー１８、及び４つのトリソミー１３）は、Ｃｈｉｕら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；  １０５：２０４５８−２０４６３）によって報告されている方法を用いて分析された。各々の症例について、分子カウンティングを用いたＣｈｉｕらによるｚスコアを用いた従前に報告されている分子カウンティング法は、サイズ分析に基づく態様の結果と比較された。
【０１２８】
ｚスコアの計算について、対象とする染色体の割合表現は、最初に各症例について計算された。次に、染色体表現の平均及び標準偏差を参照症例について計算した。このデータセットは、症例１、２、５、６、８及び８が、第１８染色体表現の平均及び標準偏差の計算について参照群として用いられた。症例１、２、３及び４は、第１３染色体表現の平均及び標準偏差の計算についての参照群として用いられた。ｚスコアは、参照群の平均からの標準偏差の数として定義される。染色体の有意な過剰発現をｚスコア＞３として定義する。症例３及び４はトリソミー１８を担持し、第１８染色体断片はそれらの血漿中で過剰発現された。症例５、６、７及び８はトリソミー１３症例を担持したが、症例５及び７だけがそれらの血漿中で第１３染色体の過剰発現を示した。症例６及び８は、トリソミー１３胎児を持つにも関わらず、母親血漿中に第１３染色体の有意な過剰発現を示さなかった。
【０１２９】
染色体のＤＮＡ断片サイズの有意な短縮は、特定の染色体に対して整列された全ての断片のサイズと、参照染色体に対して整列されたサイズとを比較することによって検出された。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験はこの比較に用いられ、Ｐ値＜０．０００１は、有意差の存在として定義された。第１３染色体断片のサイズの分析について、参照染色体は第５染色体であった。正倍数体又はトリソミー１８胎児を有する全ての症例について、第１３染色体の断片サイズは、第５染色体とは有意に異なっていなかった。トリソミー１３の胎児を有する４つの症例について、第１３染色体談判は、第５染色体断片よりも有意に短く、これは、第１３染色体の断片サイズが非トリソミー１３症例と比較して短くなったことを意味した。したがって、すべての４つのトリソミー１３症例は、ｚスコア法によって、４つのうちの２つと比較して、本発明によって正確に同定された。
【０１３０】
第１８染色体断片のサイズの分析について、参照染色体は第１２染色体であった。正倍数体又はトリソミー１３胎児を持つ全ての症例について、第１８染色体の断片は第１２染色体胎児よりも有意に長かった。トリソミー１８を有する２つの症例について、第１８染色体断片のサイズは、第１２染色体断片と有意に相違しなかった。これは、第１８染色体の断片サイズは、非トリソミー１８胎児を有する症例と比較した場合に短かった。換言すると、両者のトリソミー１８症例は、正確に分類された。
【０１３１】
Ｘ．遺伝子疾患の多型の検出及び診断
また、母親血漿ＤＮＡのサイズ分析は胎児遺伝子型の非侵襲性検出に使用可能である。胎児遺伝子型は、胎児が突然変異遺伝子を遺伝したかどうか、特定の対立遺伝子の不均衡を有するかどうか、又は他の配列不均衡若しくは目的を有するかどうかを決定するために用いることができる。このような態様では、１つの対立遺伝子が参照ゲノム位置（配列）であり得て、異なる対立遺伝子は試験中のゲノム位置であり得る。このようにして、参照配列を用いる方法のいずれかはまた、遺伝子型と他の配列不均衡の決定に適用され得る。
【０１３２】
一態様では、配列不均衡（したがって、可能には遺伝子型）は、サイズ差異（不均衡）が母親試料（例えば、母親が対立遺伝子でヘテロ接合であるとき）中の対立遺伝子間に存在するか又は存在しないことによって決定され得る。例えば、試料中の対立遺伝子間にサイズプロフィールの差異がない場合、胎児は、母親と同じ遺伝子型を有することが決定される場合もある。別の例として、試料中の対立遺伝子間のサイズプロフィールに差異がある場合、胎児は、母親とは異なる遺伝子型を有することが決定され得る。
【０１３３】
以下の例えは、母親は、特定の遺伝子座についてヘテロ接合（即ち、ＮＭによって記されるＮ対立遺伝子の１つのコピーとＭ対立遺伝子の１つのコピーを有する）である。文字ＮとＭは、通常、野生型（正常についてのＮ）と突然変異（突然変異についてのＭ）対立遺伝子をそれぞれ表す。しかしながら、Ｎ及びＭ対立遺伝子は、任意の２つの異なる対立遺伝子に対応することができるが、必ずしも野生型及び／又は突然変異である必要はない。一態様では、Ｍは危険性のあるゲノム配列であり、Ｎは参照配列であると考えることができる。これに関連して、遺伝子型の決定に参照配列を用いる上記方法の応用を理解することができる。
【０１３４】
非妊娠女性では、２つの対立遺伝子を担持する分子の平均サイズは同じであったであろう。しかしながら、妊娠女性の血漿には、母親と胎児のＤＮＡ分子の混合物が存在する。母親由来のＤＮＡ分子は、胎児由来のＤＮＡよりも長い。母親と胎児の両方が２つの対立遺伝子（即ち、ＮとＭの対立遺伝子）を有する場合、これらの対立遺伝子はともに、長い及び短いＤＮＡ分子の等しい寄与を有する。よって、得られたＮとＭの対立遺伝子のサイズ分布は同じであろう。反対に、母親と胎児遺伝子型が異なる場合、例えば、母親がＮＭであり、胎児がＭＭである場合、ＮとＭの対立遺伝子のサイズ分布は異なるであろう。換言すると、血漿中の２つの対立遺伝子のサイズ分布は、胎児遺伝子型によって影響されたであろう。図２５Ａ〜２５Ｃは、本発明の態様に従って、妊娠女性と胎児のいでの異なるシナリオについての略図を示す。
【０１３５】
図２５Ａでは、胎児はＮの遺伝子型を有し、母親遺伝子型はＮＭである。バー２５１０の長さは、それぞれ母親と胎児の２つの対立遺伝子の１つに由来する断片の平均（ａｖｅｒａｇｅ）（平均（ｍｅａｎ））サイズの指標である。上記されるように、胎児は、母親よりも小さな平均サイズを有する。したがって、長いバーは母親ＤＮＡを表し、短いバーは胎児ＤＮＡを表す。
【０１３６】
母親と胎児は対立遺伝子Ｎに寄与し、母親だけが対立遺伝子Ｍに寄与するので、対立遺伝子Ｎを持つ分子のサイズ分布は対立遺伝子Ｍを持つ分子よりも短かったであろう。換言すると、ＮＭの遺伝子型を有する妊娠女性では、対立遺伝子Ｍと比較して対立遺伝子Ｎに対して短いサイズ分布は、胎児遺伝子型がＮＮであることを意味するであろう。よって、Ｎのサイズ分布（例えば、平均サイズ）がある種のカットオフ（例えば、割合又は絶対値）によってＭよりも小さい場合、２つの野生型（Ｎ）を有することが同定し得る。
【０１３７】
図２５Ｂでは、胎児はＮＭの遺伝子型である。母親と胎児はともに対立遺伝子ＮとＭに寄与する。結果として、対立遺伝子ＭとＮを有する分子についてのサイズ分布は同じである。ＮＭの遺伝子型を有する妊娠女性では、対立遺伝子ＭとＮについて同じサイズ分布がＮＭの胎児遺伝子型を指示したであろう。よって、Ｎのサイズ（例えば、平均サイズ）がある種のカットオフ（例えば、割合又は値）内でＭにほぼ等しい場合、胎児は１つの野生型（Ｎ）対立遺伝子Ｍと１つの突然変異（Ｍ）を有することが同定し得る。
【０１３８】
図２５Ｃでは、胎児は、ＭＭの遺伝子型を有する。母親と胎児はともに対立遺伝子Ｍに寄与し、一方、母親だけが対立遺伝子Ｎに寄与するため、対立遺伝子Ｍを有する分子についてのサイズ分布は対立遺伝子Ｎを有する分子よりも短かったであろう。ＮＭの遺伝子型を有する妊娠女性では、対立遺伝子Ｎよりも対立遺伝子Ｍについて短いサイズ分布は、胎児遺伝子型がＭＭであることを指示したであろう。よって、Ｍのサイズ分布（例えば、平均サイズ）はある種のカットオフ（例えば、割合又は値）により小さい場合、胎児は２つの突然変異（Ｍ）対立遺伝子を有することが同定し得る。
【０１３９】
また、本方法は、母親がホモ接合、例えば、ＮＮ又はＭＭである状況を分析するために用いることができる。胎児が異なる遺伝子型を有する場合、母親試料からのサイズ分布はまた変化し、よって、胎児遺伝子型を決定することができる。さらに、サイズ分布が変化しない場合、遺伝子型は、母親がヘテロ接合ケースである場合について上記した通り、母親と同じであることが決定され得る。
【０１４０】
いくつかの態様では、不均衡などが存在するかどうかの決定は、母親遺伝子型と比較して（例えば、１つのＭについて１つのＮが不均衡でないことを意味する）、カットオフ値で行うことができる。例えば、母親遺伝子型からの十分に大きな逸脱（例えば、割合で）が存在する場合、胎児は、より小さなサイズ分布を有する対立遺伝子を遺伝したことが決定され得る。一態様では、カットオフ値は、母親試料中の胎児核酸の割合に依存し得る。胎児核酸のより高い割合が存在する場合、大きな逸脱が期待され、よって、より大きなカットオフを（例えば、別の対立遺伝子と比較して１つの対立遺伝子に関するサイズ分布の差異について）用いることができる。胎児核酸のより低い割合が存在する場合、より小さな逸脱が期待され、よって、より小さなカットオフを用いることができる。
【０１４１】
一態様では、父親の遺伝子型は、母親のどの対立遺伝子が胎児核酸により変化されるそのサイズ分布を有するかを決定するために用いられてもよい。胎児が遺伝子型についてホモ接合である場合において、これは、対立遺伝子が母親から遺伝されるちょうどそのものに、可能な胎児遺伝子型を狭くするのを可能にし得る。それは、父親からどれが来るかが知られているためである。このように狭めた後、胎児genomeの決定は、ほんの２つの可能性を試験するのに必要であるため、より正確になる場合がある。一実施において、同じカットオフ値は、父親からどの遺伝子型が遺伝されるかに関わらずに用いられる。別の実施では、異なるカットオフ値を用いることができる。
【０１４２】
種々の態様では、本明細書に言及されているサイズ分布のいずれかがこのような配列不均衡決定において用いられてもよい。いくつかの態様では、精度レベルがまた提供されてもよい。例えば、「未決定」の分類はまた、不均衡及び均衡分類の他に用いられてもよい。この方法では、いくつかの決定がより信頼度をもって決定され得て、一方、中間領域の値はさらにデータ点を要求してもよい。
【０１４３】
ＸＩ．胎児ハプロタイプ遺伝のサイズ分析
サイズ分析の応用は、母親のどのハプロタイプが胎児に移動するかを決定するために、さらに拡張され得る。ハプロタイプは複数の遺伝子座での対立遺伝子を意味することができる。用語「ハプロタイプ」の定義は、本出願の定義節において見出すことができる。胎児ハプロタイプは、胎児が突然変異した遺伝子を遺伝したかどうか、特定の対立遺伝子の不均衡を有するかどうか、又は他の目的であるかどうかを決定するために用いることができる。よって、ハプロタイプは遺伝子型と同じように用いられてもよいが、より多くの遺伝子座が存在するため、より少量の血液試料が、胎児ハプロタイプの決定の同じか、又はさらには良好な統計的信頼度を達成するために用いられてもよい。一局面では、配列不均衡は、母親ハプロタイプと比較して決定され得る。本明細書では、ハプロタイプは、一連の多型、例えば、各々がゲノムにおける特定位置にあるＳＮＰとして表すことができ、そこでは配列バリエーションが知られている。
【０１４４】
一態様では、母親血漿中の配列不均衡について分析することによって胎児のハプロタイプを決定する方法が提供される。一局面では、ハプロタイプ間のサイズプロフィールにおける分離値（例えば、差異）を用いて配列不均衡を決定する。一態様では、母親ハプロタイプ（例えば、ＨａｐＩ及びＨａｐＩＩ）は、分析（例えば、母親試料（例えば、胎児核酸を含まない試料）の配列決定（Ｈｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０１０；２６：ｉｌ８３−ｉｌ９０）又は単一分子ハプロタイピング（Ｄｉｎｇ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００３；１００：７４４９−７４５３、及びＸｉａｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９；６：１９９−２０１））によって決定される。別の態様では、母親ハプロタイプ（単数又は複数）は、母親の親、兄弟姉妹、以前の子供、又は他の親戚の分析を用いて決定され得る。なお別の態様では、強力な系統不均衡での多型について、１つの遺伝子座での母親遺伝子型を知ることは、例えば、対立遺伝子が同じ配列で、即ち、ハプロタイプで通常見られる場合、別の遺伝子座で遺伝子型を含むことができる。このようにして、母親ハプロタイプは、ゲノムの１つの測定から暗に決定され得る。１を超える遺伝子座での遺伝子型が決定され得て、この場合、各々の決定された遺伝子型は、他の遺伝子座で遺伝子型を暗示し得て、即ち、ハプロタイプが推定される。
【０１４５】
一態様では、父親の遺伝子型も決定される。この情報は、父親が特定のＳＮＰでホモ接合であるか又はヘテロ接合であるかを決定するために用いることができる。各遺伝子座での父親の対立遺伝子の直接的な決定がなされ得る。したがって、各父親の対立遺伝子がタイプα又はタイプβのＳＮＰと称される母親のＨａｐＩ又はＨａｐＩＩ上の対立遺伝子と同じであるかどうかを決定することができる。
【０１４６】
別の態様では、父親のハプロタイプも決定される。父親のハプロタイプは、親の試料の分析（例えば、配列決定（Ｈｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０１０；２６：ｉｌ８３−ｉｌ９０）又は単一分子ハプロタイピング（Ｄｉｎｇ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００３；１００：７４４９−７４５３、及びＸｉａｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９；６：１９９−２０１））によって、あるいは父親の親、兄弟姉妹、以前の子供、又は他の親戚の分析を通じて、決定され得る。あるいは、強力な系統不均衡な多型について、１つの遺伝子座での父親の遺伝子型を知ることは、例えば、対立遺伝子が同じ配列、即ち、ハプロタイプで通常見られる場合、別の遺伝子座で遺伝子型を含むことができる。したがって、父親のハプロタイプは、遺伝子型の１測定から暗に決定され得る。また、１を超える遺伝子座での遺伝子型が決定され得て、この場合、各々の決定された遺伝子型は他の遺伝子座での遺伝子座を暗に意味することができ、よって、ハプロタイプが推定される。
【０１４７】
このような態様の１つの応用は、配列不均衡（例えば、サイズプロフィールの差異を検出することによる）が、父親と母親がともにヘテロ接合である場合のＳＮＰを分析することによって、胎児核酸を含む母親試料に存在するか又は存在しないかを決定するためであり得る。それによって、胎児遺伝子型又はハプロタイプは、配列不均衡が存在するか又は存在しないかにより推定される。
【０１４８】
図２６は、分析されるべきＳＮＰ遺伝子座で母親がヘテロ接合であり、父親がホモ接合である例を示す。サイズ分析を実施するために、母親がヘテロ接合であり、父親がホモ接合であるＳＮＰの小集団に焦点を当てることができる。母親の２つの相同な染色体はそれぞれＨａｐＩとＨａｐＩＩと呼ばれる。これらのＳＮＰの各々について、本発明者らは、２つの母親対立遺伝子のうちのいずれの１つがＨａｐＩ上に位置するか、及びＨａｐＩＩ上ではどうかを決定することができる。ＳＮＰは、父親対立遺伝子がＨａｐＩ上の母親対立遺伝子と同一である場合にタイプα、父親対立遺伝子がＨａｐＩＩ上の母親対立遺伝子に同一である場合にタイプβとして定義される。胎児ゲノムの決定の更なる記載は、上述した出願「Ｆｅｔａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｍａｔｅｒｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ」において見出すことができる。
【０１４９】
母親ハプロタイプと父親遺伝子型又はハプロタイプが分かると、各ＳＮＰに関連した断片のサイズ分布は、ＳＮＰ小集団に配列不均衡が存在するかどうかを同定することによって父親ハプロタイプを決定するために用いることができる。代替の態様では、父親の遺伝子型又はハプロタイプが確実に分からない場合、それにも関わらずに、例えば、試験された集団の既知の遺伝子型又はハプロタイプの頻度に基づいて、可能な父親の遺伝子型又はハプロタイプを、例えば、統計的手法を用いて推定することができた。次に、配列不均衡（サイズ不均衡を介して決定される）は、例えば、Ｘ節で検討したように、各ＳＮＰについて決定される。
【０１５０】
例えば、父親がＨａｐＩ上の対立遺伝子（タイプα）についてホモ接合である場合、サイズ不均衡が存在しないか（胎児は母親からＨａｐＩＩを遺伝し、したがって、まさに母親のようにＨａｐＩとＨａｐＩＩについてヘテロ接合である）、又はＨａｐＩが類似にサイズ分布を有するサイズ不均衡であろう（胎児が母親からＨａｐＩを遺伝子、したがって、ＨａｐＩについてホモ接合である）のいずれかである。父親がＨａｐＩＩ（後述するようにタイプβ）についてホモ接合である場合、不均衡が存在しないか（胎児は母親からＨａｐＩを遺伝し、したがって、まさに母親のようにＨａｐＩとＨａｐＩＩについてヘテロ接合である）、又はＨａｐＩＩが類似にサイズ分布を有する不均衡であろう（胎児が母親からＨａｐＩＩを遺伝子、したがって、ＨａｐＩについてホモ接合である）のいずれかである。また、中間分類を用いてもよく、あるいは、均衡と不均衡との間の確実性のレベルが変更し得る。典型的には、類似のカットオフはいずれかの対応について用いられるであろう。種々の態様では、本明細書に言及されたサイズ分布のいずれかを用いてもよい。
【０１５１】
一態様では、複数のＳＮＰ局在の各々についての断片に関するサイズ分布は、胎児の２つのハプロタイプを決定するために分析され得る。例えば、１つのハプロタイプ上のＳＮＰ対立遺伝子について断片のサイズ分布間の相違は、他のハプロタイプ上のＳＮＰ対立遺伝子のサイズ分布と比較可能である。統計は、種々の方法、例えば、各ＳＮＰについて決定し、ハプロタイプで過半数（均衡、不均衡、及び中間を含んでもよい）を採用することによって分析され得る。別の例として、サイズは、ＳＮＰ全体で（例えば、カットオフ値と比較される平均又は中央値のサイズ分布を得るために）集められ得る。あるいは、この２つの組み合わせを用いることができる。別の実施は、データ点の極値、例えば、特定のＳＮＰについての最小差を用いることであり得た。
【０１５２】
図２７は、父親ハプロタイプが図２６に示されるものである場合、母親からのＨａｐＩを胎児が遺伝する例を示す。タイプαのＳＮＰ（斜線なしのボックスによって囲まれている）について、胎児は、父親から母親のＨａｐＩ上に位置されたものと同一である対立遺伝子を遺伝したであろう。よって、胎児はＨａｐＩ腕の対立遺伝子についてホモ接合であったろう。結果として、ＨａｐＩ上の対立遺伝子のサイズ分布は、母親試料中のＨａｐＩＩ上の対立遺伝子よりも短かったであろう。タイプβのＳＮＰ（斜線ボックスによって囲まれている）について、胎児は父親から母親ＨａｐＩＩ上のものと同一である対立遺伝子を遺伝したであろう。よって、胎児はヘテロ接合であったろう。結果として、ＨａｐＩとＨａｐＩＩ上の対立遺伝子のサイズ分布は母親試料において同じサイズ分布を有したであろう。
【０１５３】
一態様では、同じタイプ（タイプα又はタイプβ）のＳＮＰをともに分析することができる。タイプαのＳＮＰについて、ＨａｐＩ上の対立遺伝子を担持する分子のサイズ分布は、ＨａｐＩＩ上の対立遺伝子を担持する分子のサイズ分布よりも短いであろう。タイプβのＳＮＰについて、ＨａｐＩ及びＨａｐＩＩ上の対立遺伝子を担持する分子のサイズ分布は同じであろう。換言すると、ＨａｐＩを担持する分子のサイズ分布はＨａｐＩＩを担持する分子よりも小さい場合、胎児はＨａｐＩについてホモ接合である。ＨａｐＩとＨａｐＩＩを担持する分子のサイズ分布が同じである場合、胎児はヘテロ接合である。
【実施例】
【０１５４】
下記の実験は、胎児ハプロタイプ遺伝分析の精度を試験するために使用された。βサラセミアの出生前診断について産科クリニックに来ているカップルを採用した。血液試料を父親と母親から採取した。母親については、血液試料は、妊娠１２週で絨毛膜標本サンプリング（ＣＶＳ）前に採取された。ＣＶＳ後、一部を実験のために保存した。
【０１５５】
ＤＮＡは、父親と母親の軟膜、ＣＶＳ試料を抽出した。これらのＤＮＡ試料は、父親、母親及び胎児遺伝子型を決定するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｈｕｍａｎ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ  ６．０システムによって分析に供された。この実験では、ＣＶＳデータは、母親ハプロタイプを推定するために用いられた。しかしながら、試験の臨床的実施において、母親ハプロタイプは、上記されるように他の手段によって推定され得た。また、ＣＶＳデータは、本明細書中の方法を用いた決定の精度を確認するために用いられ、これはＣＢＳを必要としない。
【０１５６】
この例証では、本発明者らは、母親がヘテロ接合であり、父親がホモ接合であるＳＮＰの情報を与える小集団に焦点を合わせる。この小集団のＳＮＰでは、カップルと胎児遺伝子型は、母親ハプロタイプを構築するために用いられる。本発明者らは、母親が胎児に移動した一連の対立遺伝子をハプロタイプＩ（ＨａｐＩ）と定義し、一方、胎児が母親から受領しなかった一連の対立遺伝子をハプロタイプＩＩ（ＨａｐＩＩ）と定義する。
【０１５７】
次に、本発明者らは、情報を与えるＳＮＰを２つの小集団、即ち、タイプαとタイプβに分けた。タイプαのＳＮＰについて、父親の対立遺伝子はＨａｐＩ上の母親の対立遺伝子と同一であった。これらのＳＮＰについて、胎児は、親から同じ対立遺伝子（ＨａｐＩ上の対立遺伝子）を遺伝したであろうし、即ち、胎児は、ＨａｐＩ上にＳＮＰについてホモ接合であったろう。タイプβのＳＮＰについて、父親の対立遺伝子はＨａｐＩＩ上の母親の対立遺伝子と同一であった。これらのＳＮＰについて、胎児は、母親からＨａｐＩ上の対立遺伝子と、父親から異なる対立遺伝子（ＨａｐＩＩ上のものと同一）とを遺伝したであろうし、胎児はヘテロ接合であったろう。
【０１５８】
各配列の２つの末端は、ＳｈｅｎｚｈｅｎのＢｅｉｊｉｎｇ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのＳＯＡＰ２プログラムを用いて非繰り返しマスクされたヒトゲノム（ＵＣＳＣ  ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕからダウンロードされるＨｇ１８  ＮＣＢＩ．２６ダウンロードされる）に対して整列された（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ／）（Ｌｉら．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００９，２５（１５）：  １９６６−７）。
【０１５９】
一態様では、ハプロタイプについての短い断片によって寄与された全長の画分の統計値は、どの母親ハプロタイプが胎児に移動したかを決定するために使用された。例として、第２２染色体は、どの母親ハプロタイプが胎児に移動するかを推定するために、サイズ分析をどのように使用し得るかを例証するために用いられる。第１に、本発明者らは、第２２染色体をいくつかのセグメントに分け、各々のセグメントは、５０の情報を与えるＳＮＰからなり、そこでは、母親はヘテロ接合であり、父親はホモ接合であった（第２２染色体とセグメントはともに配列の例である）。各セグメントについて、これらの情報を与えるＳＮＰをカバーするＤＮＡ断片（配列の部分である分子の例）は、２つの群、即ち、ＨａｐＩとＨａｐＩＩに分けられ、これらの断片は２つの母親ハプロタイプのうちのいずれかに寄与した。各セグメントについて、母親ＨａｐＩと母親ＨａｐＩＩに対してマッピングしている全ての断片の全長の合計が決定された。次に、同時に、各セグメントにおける母親ＨａｐＩとＨａｐＩＩに対してマッピングしている短い断片の全長の合計が決定された。例証の目的で、１５０ｂｐ又はそれより短い断片は、短い断片の全長の計算について、この例において短いものとして定義される。これらの長さから、短い断片によって寄与された全長の断片は、各セグメント内でＨａｐＩとＨａｐＩＩに対してマッピングしているＤＮＡ断片について計算され得る。
【０１６０】
図２８は、本発明の態様による第２２染色体上のタイプαのＳＮＰについてのサイズ分析を例証する表を示す。ΔＦ(HapI-HapII)は、ＨａｐＩとＨａｐＩＩとの間の短い断片によって寄与された全長の画分の差を表す。ほんの２８のＳＮＰからなる最後のセグメントを除いた場合、ΔＦ(HapI-HapII)は０．０２８８〜０．０７０１の範囲であった。ΔＦ(HapI-HapII)のポジティブ値は、ＨａｐＩのＦ値がＨａｐＩＩよりも通常大きいことを表す。Ｆ値が短い断片によって寄与された全長の画分として定義されるので、より高いＦ値は、全長のより高い画分が短い断片によって寄与されることを指示する。換言すると、これらの結果は、ＨａｐＩ上に対立遺伝子を担持するＤＮＡ断片が、分析される５０のＳＮＰからなる領域の各々についてＨａｐＩＩ上の対立遺伝子を担持するＤＮＡ断片よりも短いことを指示する。これは、ＨａｐＩのサイズ分析がＨａｐＩＩよりも短いことを指示する。したがって、本発明者らは、胎児がＨａｐＩ上で対立遺伝子についてホモ接合であると推定できる。上記の通り、一態様では、分類は、ＨａｐＩとＨａｐＩＩにおける２つのゲノム位置間の分離値（例えば、ΔＦ）に基づいて、各セグメントについて行うことができ、次に、全分類は各セグメント分類に基づいて行うことができる。別の態様では、全分離値（例えば、平均分離値）は、各セグメントについての分離値から決定することができ、この全統計値は分類を決定するために用いることができる。
【０１６１】
一態様では、約０．０２のカットオフは、不均衡が存在するかどうかを決定するために用いてもよい。ΔＦの中央値又は平均を用いた場合、より大きなカットオフを使用することができ、されに正確であった。また、カットオフは、中間結果に用いてもよく、例えば、０．０１５と０．０２５との間の領域が中間であってもよく、更なる分析を必要としてもよい。
【０１６２】
図２９は、本発明の態様による第２２染色体上のタイプβのＳＮＰについてのサイズ分析を例証する表を示す。ΔＦ(HapI-HapII)は、ＨａｐＩとＨａｐＩＩについての短い断片によって寄与された全長の画分における差を表す。ΔＦ(HapI-HapII)値は、−０．０２０３〜０．０２０７の範囲であり、中央値は０．００３であった。小さいΔＦ(HapI-HapII)値は、ＨａｐＩとＨａｐＩＩに対してマッピングしている断片に対して同じサイズ分布と匹敵する。よって、本発明者らは、ＨａｐＩとＨａｐＩＩについて胎児がヘテロ接合であると推定できる。タイプβのＳＮＰは、父親の対立遺伝子がＨａｐＩＩ上の母親対立遺伝子と同一であるＳＮＰとして定義されるので、この結果は、胎児が母親からＨａｐＩを遺伝したことを暗に意味する。
【０１６３】
図３０は、本発明の態様による第２２染色体上のタイプαとタイプβのＳＮＰについてのΔＦ(HapI-HapII)のプロットを示す。タイプαのＳＮＰについて、ＨａｐＩ断片のサイズ分布はＨａｐＩＩ断片よりも短く、それは、ゼロより大きいΔＦ(HapI-HapII)の値をもたらす。タイプβのＳＮＰについて、ＨａｐＩとＨａｐＩＩ断片のサイズ分布間の差がない；したがって、ΔＦ(HapI-HapII)値は０周辺に集まる。カットオフ０．０２５を用いて、ΔＦ(HapI-HapII)分析は、１３のタイプαのセグメントと２１のタイプβのセグメントの全てについて、胎児よるＨａｐＩの遺伝を正確に推定することができる。
【０１６４】
ＸＩＩ．標的化配列の使用の例
以下の例は、本発明の態様のサイズに基づく診断アプローチが標的化された配列決定フォーマットに有用であり得ることを示す。このようなフォーマットは、診断対象のゲノム領域が配列決定について特異的に標的化される。このフォーマットは、ランダム配列決定に関わる状況とは対照的に、対象とする領域に焦点を併せるという利点を有し、この場合、配列決定パワーのいくつかは、診断応用と即座に関連しない領域について用いられる。よって、標的化された配列決定フォーマットは、スループットを増加させ、システムコストを削減することが期待され得る。標的化された配列決定は、当業者に知られている任意のフォーマットを用いて行うことができ、例えば、液相捕捉システム（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔシステム）、固相捕捉システム（例えば、Ｒｏｃｈｅ  ＮｉｍｂｌｅＧｅｎシステム）又は標的特異的増幅（例えば、ＲａｉｎＤａｎｃｅシステム）が挙げられる。
【０１６５】
血液試料は妊娠第１期中の８人の妊娠女性から回収した。血漿３．２ｍＬからＤＮＡをＤＳＰ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）によって各ケースについて抽出された。絨毛膜試料（母親試料が採取された後に回収される）について行った染色体分析は、４人の胎児がＴ２１（ＵＫ２２９、ＵＫ５１０、ＵＫ８０７、ＰＷ４２１）を有し、他の４人が正倍数体男子（ＰＷ２２６、ＰＷ２６３、ＰＷ３１６、ＰＷ３７０）であることを示した。
【０１６６】
各ケースについて５〜３０ｎｇの血漿ＤＮＡは、Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ試料調製の製造業者の使用説明書に従って、対末端試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によってＤＮＡライブラリー構築のために用いられた。アダプター−リガンド化されたＤＮＡは、さらにサイズ選択することなしに、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）において与えられるスピンカラムを用いて直接精製された。次に、アダプター−リガンド化されたＤＮＡは、標準プライマーを用いて１５サイクルのＰＣＲにより増幅された。プライマーは、ＩｌｌｕｍｉｎａのＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＰＥ  １．０と２．０であった。ＤＮＡライブラリーは、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて定量され、ＤＮＡ  １０００キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で稼働され、サイズ分布を調べた。０．６〜１μｇの増幅血漿ＤＮＡライブラリーは、約２９０ｂｐの平均サイズで各試料について生成された。
【０１６７】
ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  ＡＬＬ  Ｅｘｏｎ捕捉ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔから得られ、ヒトエクソンの３７．８Ｍｂをカバーした（カタログ番号：５１９０−２３１０）。本研究の８つ全てのケースについて、各ケースの５００ｎｇの増幅血漿ＤＮＡライブラリーを捕捉プローブとともに２４時間６５℃にて、製造業者の使用説明書に従ってインキュベートした。ハイブリダイゼーション後、捕捉された標的は、ストレプトアビジン被覆された磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ  ＤｙｎａＭａｇ−２  Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いることによって、ビオチン化されたプローブ／標的ハイブリダイズを引くことによって選択され、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製された。最後に、標的化されたＤＮＡライブラリーは、ＡｇｉｌｅｎｔからのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＧＡ  ＰＥプライマーを用いた１２サイクルのＰＣＲ増幅によって濃縮された。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製された。
【０１６８】
標的富化の有無による８対のライブラリーは、２つのフローセルの１６レーンに装填され、次に、３６ｂｐ×２の対末端フォーマットを用いたＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって配列決定された。全３６ｂｐの配列決定された読み出しは、Ｓｈｏｒｔｏ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ２（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）を用いて、マスクされていないヒト参照ゲノム（Ｈｇ１８）に対して整列された。対末端読み出しの断片サイズは、４０ｂｐ〜６００ｂｐの範囲として画定された。各配列決定されたＤＮＡ断片のサイズは、両末端で最外部のヌクレオチドの座標から推定された。
【０１６９】
胎児トリソミー２１の親検出のためのサイズ分析
この実施例では、短い断片に寄与された全長の画分は、第２１染色体と参照染色体について計算され、それぞれＦ21とＦrefで表される。参照染色体は、第１３、第１８及び第２１染色体を除く全ての常染色体からなっていた。全長は、６００ｂｐ以下のＤＮＡ断片の全てについて長さの合計によって計算された。第２１染色体と参照染色体間の未時間断片によって寄与された長さの画分の差（ΔＦ）はＦ21−Ｆrefとして計算された。
【０１７０】
図３１Ａは、本発明の態様による、標的富化なしでの血漿ＤＮＡのサイズ分析を与える表である。種々のカラムは、第２１染色体について１５０ｂｐ未満の断片についての全長、第２１染色体について６００ｂｐ未満の断片についての全長、及びＦ21として２つの比を与える。他のカラムは、参照染色体についての１５０ｂｐ未満の断片についての全長、参照染色体についての６００ｂｐ未満の断片についての全長、及びＦrefとして２つの比を与える。最後のカラムは、２つの画分間の差ΔＦである。
【０１７１】
図３１Ｂは、本発明の態様による、標的富化を有する血漿ＤＮＡのサイズ分析を与える表である。図３１Ｂのカラムは、図３１Ｂの表と同じデータフォーマットを有する。
【０１７２】
図３２は、標的富化の有無によるＴ２１と正倍数体についてのΔＦのプロットである。標的富化なしの試料について、ΔＦについてカットオフ値０．００５を用いて、Ｔ２１と正倍数体妊娠からの血漿試料は、１００％精度で分別され得る。標的富化を有する試料について、ΔＦについてカットオフ値を用いて、Ｔ２１と正倍数体妊娠からの血漿試料は１００％精度で分別され得る。この実施例は、サイズに基づく分析が標的化された配列決定を用いて行うことができることを示す。Ｔ２１の検出について、第２１染色体と参照染色体についての標的化された配列決定を用いることは有利であり得て、その結果、５０％の配列決定は前者に指向され、残りは後者に指向される。このような設計は、Ｔ２１検出に即座に関連しない領域について配列決定パワーの浪費を削減し得る。このような設計は、多重配列決定を用いて（例えば、インデックス又はバーコードによる配列決定を用いることによって）、多数の患者からの試料を配列決定することができる。
【０１７３】
本明細書において記載されている任意のソフトウェア・コンポーネント又はソフトウェア関数は、任意の適切なコンピュータ言語、例えばＪａｖａ、Ｃ＋＋又はＰｅｒｌを使用して、例えば従来の又はオブジェクト指向の技術を使用するプロセッサによって実行されるソフトウェアコードとして実行され得る。ソフトウェアコードは、記憶及び／又は送信のためのコンピュータ読み取り可能媒体、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリー（ＲＯＭ）、磁気媒体、例えばハードドライブ若しくはフロッピーディスク、又は光学媒体、例えばコンパクトディスク（ＣＤ）若しくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）、フラッシュメモリーなどを含む好ましい媒体における、一連の指令又はコマンドとして蓄積され得る。コンピュータ読み取り可能媒体は、かかる記憶又は送信装置の任意の組み合わせであり得る。
【０１７４】
また、このようなプログラムは、コード化され、インターネットを含む種々のプロトコールに適合する有線、光、及び／又は無線ネットワークを経由した送信のために適用されるキャリアー信号を使用して送信され得る。したがって、本発明の態様のコンピュータ読み取り可能媒体は、このようなプログラムでコード化されたデータ信号を使用して作られ得る。プログラムコードでコード化されたコンピュータ読み取り可能媒体は、互換性のあるデバイスとともにパッケージされるか、又は他のデバイスからは分離して（例えばインターネットダウンロードを通じて）提供され得る。任意のこのようなコンピュータ読み取り可能媒体は、単一のコンピュータプログラム製品（例えばハードドライブ若しくは全コンピュータシステム）上に又はその中に装備されてもよく、システム若しくはネットワーク内における異なるコンピュータプログラム製品上若しくはその中に存在してもよい。コンピュータシステムは、ユーザーに本明細書において言及された任意の結果を提供するためのモニター、プリンター、又は他の好ましいディスプレイを含んでもよい。
【０１７５】
コンピュータシステムの例を図３３に示す。図３３に示されたサブシステムは、システムバス３３７５を通じて相互接続される。更なるサブシステム、例えばプリンター３３７４、キーボード３３７８、固定ディスク３３７９、ディスプレイアダプター３３８２と連結されたモニター３３７６、及びその他のものが示される。Ｉ／Ｏコントローラー３３７１と連結する、周辺機器及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）装置は、当技術分野において既知である任意の数の手段、例えばシリアルポート３３７７によってコンピュータシステムと接続され得る。例えば、シリアルポート３３７７又は外部インターフェース３３８１は、コンピュータ装置をインターネットのような広域ネットワーク、マウス入力装置、又はスキャナーと接続するために使用され得る。システムバス経由の相互接続により、セントラルプロセッサ３３７３を個々のサブシステムと通信させ、システムメモリー４３７２又は固定ディスク３３７９からの指示の実行、及びサブシステム間の情報の交換をさせることが可能である。システムメモリー３３７２及び／又は固定ディスク３３７９は、コンピュータ読み取り可能媒体を具現化し得る。本明細書に言及されている値のいずれかは、１つのコンポーネントから別のコンポーネントに出力することができ、ユーザーに出力することができる。
【０１７６】
コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェース３３８１又は内部インターフェースによってともに連結される、複数の同じコンポーネント又はサブシステムを含むことができる。いくつかの態様では、コンピュータシステム、サブシステム、又は装置はネットワークを介して通信され得る。このような例において、１つのコンピュータがクライアントであり、別のコンピュータがサーバーであると考えることができ、その場合、各々は同じコンピュータシステムの一部であり得る。クライアント及びサーバーは、各々、多数のシステム、サブシステム、又はコンポーネントを含むことができる。
【０１７７】
特定の態様の特定の詳細は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなし、任意の適切な方法で組み合わせてもよい。しかしながら、本発明の他の態様は、各個々の側面、又はこれらの個々の側面の特定の組み合わせに関連する態様に指向されてもよい。
【０１７８】
本発明の例示的態様の上記記載は、例証及び説明の目的のために存在する。記載された明確な形態に本発明を網羅する、又は限定することは意図されておらず、そして多くの変更及び変形は、上記教示の観点において可能である。該態様は、本発明の原理、並びにそれにより他の当業者が本発明を種々の実施形態で本発明を最もよく利用することができるように、意図された特定の使用に好適である種々の変形を有する、その実用的な利用を最もよく説明するために選択かつ記載された。
【０１７９】
本明細書において引用された全ての出願、特許及び特許出願は、全ての目的のために、それら全体で参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図３０】
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