(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを作製する方法であって、前記シアリルトランスフェラーゼがＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩであり、
ａ）ＣＨＯ細胞においてシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現させ、発現されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを含有する細胞培養培地を回収する工程と、
ｂ）前記細胞培養培地を、（ｉ）少なくとも１回のアフィニティークロマトグラフィー及び／又は混合モードクロマトグラフィー工程と、（ｉｉ）少なくとも１回の陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー工程とに供することにより、前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを該細胞培養培地から精製する工程と、
を含む、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを作製する方法。
【請求項２】
前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドがシアリルトランスフェラーゼ活性ドメインのみを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）を、所定の細胞密度に達した後、３７℃±１℃から３２℃±１℃へのインキュベーション温度変化を適用することにより行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）が、（ｉ）２回のアフィニティークロマトグラフィー工程、又は１回のアフィニティークロマトグラフィー工程及び１回の混合モードクロマトグラフィー工程と、（ｉｉ）１回の陰イオン交換クロマトグラフィー工程と、（ｉｉｉ）１回の陽イオン交換クロマトグラフィー工程とを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）を以下の順番で行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法：
ｉ．陰イオン交換クロマトグラフィー；
ｉｉ．第１のアフィニティークロマトグラフィー；
ｉｉｉ．第２のアフィニティークロマトグラフィー又は混合モードクロマトグラフィー；
ｉｖ．陽イオン交換クロマトグラフィー。
【請求項６】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーを、官能基として第四級アンモニウムを保有する樹脂を用いて行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のアフィニティークロマトグラフィーを、色素アフィニティークロマトグラフィーを用いて行う、請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記混合モードクロマトグラフィーを、ヒドロキシアパタイト樹脂を用いて行う、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーをスルホプロピル陽イオン交換材料を含有する樹脂によって行う、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
治療用ポリペプチドのグリコシル化又は糖ペグ化のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により作製されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの使用方法。
【請求項１１】
前記治療用ポリペプチドがヒトＧ−ＣＳＦである、請求項１０に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシアリルトランスフェラーゼポリペプチド、特にＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ）ポリペプチドを作製及び精製する方法に関する。本方法はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞においてシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを作製する工程と、該ポリペプチドをクロマトグラフィー工程の組合せを用いて精製する工程とを含む。本方法により、非常に純粋で、酵素的に活性型のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドが高収率で得られる。得られたシアリルトランスフェラーゼ、特にＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩをＧ−ＣＳＦ等の治療用タンパク質のグリコシル化に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
多種多様なオリゴ糖構造及び多くのタイプの糖ペプチドが自然界で見出されており、これらは一部、多くのグリコシルトランスフェラーゼにより合成される。グリコシルトランスフェラーゼは、活性化した単糖残基又はオリゴ糖残基をドナーから存在するアクセプター分子へと移動させ、炭水化物鎖を開始する又は伸長することにより、糖脂質、糖ペプチド及び多糖の合成を触媒する。触媒反応はグリコシルトランスフェラーゼの好適なドメイン及び酵素の触媒部位によるドナー及びアクセプターの両方の認識を伴うと考えられる。
【０００３】
全ての治療用タンパク質の３０％超及び多くの潜在的なペプチド治療薬は、グリコシル化ペプチドである。正しいグリカン構造の付着が、治療用ペプチドのフォールディング、生体活性、生体分布及び薬理学的有効性に重要な役割を果たし得ることは当該技術分野で既知である。さらに、グリコシル化は治療用ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期及び免疫原性に影響を与える極めて重要な因子である。実際、ヒトは通常特定のタイプの炭水化物が付着した生物学的治療薬しか許容せず、非哺乳動物のオリゴ糖付着を含む糖タンパク質を拒絶することが多い。例えば、低グリコシル化ペプチドは肝臓によって「古い」と認識され、このため適切にグリコシル化されたペプチドよりも迅速に身体から排出される。これに対して、高グリコシル化ペプチド又は誤ってグリコシル化されたペプチドは免疫原性となる可能性がある。
【０００４】
組換え非グリコシル化ペプチドとは異なり、組換え糖ペプチドの作製には、組換えによって作製されたペプチドに、細胞内においてｉｎ  ｖｉｖｏで又は細胞によってペプチドが産生された後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで更なるプロセシング工程を行う必要がある。該ペプチドをグリコシルトランスフェラーゼを用いて酵素的に処理し、グリコシル基（単数又は複数）をペプチドに共有結合的に付着させることにより、１つ又は複数のグリコシル基をペプチドに導入することができる。
【０００５】
ペプチドプロセシングの生体外のｉｎ  ｖｉｔｒｏ工程による糖ペプチドの作製は時間及び費用がかかり得る。これは一部、ペプチド及び糖ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏグリコシル化のための組換えグリコシルトランスフェラーゼを作製し、糖ペプチド治療薬を作製するのにかかる負担及びコストによるものである。組換え糖治療薬の要求及び用法が増大するとともに、糖ペプチドをより効率的に調製するために新たな方法が必要となる。
【０００６】
その上、より多くの糖ペプチドが多様な疾患の治療に有用であることが発見されるに伴い、それらの生産コストを下げる方法が必要となる。さらに、糖ペプチド治療薬を開発及び改良するのに使用される組換え糖ペプチドをより効率的に作製する方法を開発することも、当該技術分野において必要とされている。
【０００７】
グリコシルトランスフェラーゼ及びタンパク質のグリコシル化のためのその使用は、特許文献１に開示されている。
【０００８】
シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）の糖タンパク質及び糖脂質の末端位置でのアクセプターオリゴ糖基質への翻訳後移動を触媒するグリコシルトランスフェラーゼのファミリーを構成する（非特許文献１）。ヒトゲノムは、哺乳動物細胞に存在する全ての既知のシアロオリゴ糖構造を合成するのに必要とされる２０個を超える様々なシアリルトランスフェラーゼをコードすることが推測されているが、１６個の異なるヒトシアリルトランスフェラーゼのｃＤＮＡしかクローニングされていない（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。当初、シアリルトランスフェラーゼは生化学的に精製され、そのｃＤＮＡはＮ末端配列を用いてクローニングされていた。得られたｃＤＮＡ配列の比較により、基質結合に関与する２つの高度に保存された領域（Ｌ−シアリルモチーフ及びＳ−シアリルモチーフと呼ばれる）が明らかになった。続いて、幾つかのシアリルトランスフェラーゼを、シアリルモチーフ内で設計された縮重プライマーを用いるＰＣＲにより又は発現クローニングによりクローニングした（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。ディファレンシャルディスプレイによる遺伝子クローニングにより、疾患関連プロセスにおいて推定される機能的重要性を有する新規のシアリルトランスフェラーゼの同定に対して全く異なるアプローチが与えられる。
【０００９】
シアリルトランスフェラーゼは、その基質特異性及び組織分布が異なり、合成する炭水化物連結に従って４つのファミリーに分類される：ＳＴ３Ｇａｌファミリー、ＳＴ６Ｇａｌファミリー、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃファミリー及びＳＴ８Ｓｉａファミリー。各ファミリーのメンバーは或る特定のアクセプター基に対して強い活性を示すが、これらの酵素の基質特異性は重複し、複数の酵素により１つの連結が合成されることがある。
【００１０】
治療用糖ペプチドの開発及び作製における有用性を有するかかる特定のシアリルトランスフェラーゼの１つが、シアル酸のシアル酸ドナーからシアル酸アクセプターへの移動を触媒するＮ−アセチルガラクトサミン−α２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ）である。全長ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ酵素は例えば、非特許文献８に開示されている。
【００１１】
これまでは、糖ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ作製に対する組換えシアリルトランスフェラーゼのアベイラビリティを増大することに注力されてきた。
【００１２】
Institute of Physical & Chemical Researchの特許文献２及び特許文献３は、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩから誘導され、その活性に関与する部分、すなわち活性ドメインを含む分泌型のタンパク質を作製するための大腸菌の使用に言及している。
【００１３】
Neose Technologies Inc.の特許文献４は、原核宿主細胞における修飾されたＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩポリペプチドの発現に好適な条件下で組換え原核宿主細胞を成長させることを含む、修飾されたＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩポリペプチドを作製する方法を記載している。これらの修飾されたＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩポリペプチドは、Ｇａｌ−β１，３ＧａｌＮＡｃ−α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧａｌＩ）ポリペプチドの第１部分と、ＧａｌＮＡｃ−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ）ポリペプチドの第２部分とを含むキメラポリペプチドである。修飾されたＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩポリペプチドは更に、真核宿主細胞又は原核宿主細胞においてＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩシグナルドメインの全て若しくは一部、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ膜貫通ドメインの全て若しくは一部、及び／又はＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩステムドメインの全て若しくは一部を欠いている切断型ポリペプチドであり得る。
【００１４】
Neose Technologies Inc.の特許文献５は、ａ）原核微生物において真核生物グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を発現すること、及びそれからｂ）原核微生物の細胞内コンパートメント内で可溶性の活性型真核生物グリコシルトランスフェラーゼの発現を可能にする条件下で原核微生物を成長させることにより、酸化環境を有する原核微生物において可溶性の真核生物グリコシルトランスフェラーゼを作製する方法を開示している。
【００１５】
非特許文献９は、或る特定のタイプの酸化細胞質を保有するか、又は分子シャペロン／コシャペロントリガー因子、ＤｎａＫ／ＤｎａＪ、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ及びＳｋｐを同時発現する、改変された大腸菌株においてヒトシアリルトランスフェラーゼＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを発現する方法に関するものであり、大幅に増大した量の可溶性ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを作製することができる。
【００１６】
しかしながら、タンパク質フォールディング及びジスルフィド結合の形成に対する大腸菌の能力は十分ではなく、これらの制限を克服するために開発されたツールが数多く存在する。さらに、大腸菌発現系における組換えタンパク質の高い発現収率は多くの場合、可溶性の活性型タンパク質を得る際に重大な障害となり得る封入体を形成する不溶性の凝集タンパク質の集積を引き起し得る（非特許文献１０）。
【００１７】
大腸菌培養物における組換えシアリルトランスフェラーゼ作製に関連する課題を克服するために、昆虫細胞培養系が開発されている。
【００１８】
特許文献６及び特許文献７は、組換えポリペプチド、例えばシアリルトランスフェラーゼを含む組成物を作製する方法であって、ポリペプチドが（例えばバキュロウイルス発現系を用いて）昆虫細胞で発現され、組成物がエンドグルカナーゼ活性を本質的に有しない、組換えポリペプチド、例えばシアリルトランスフェラーゼを含む組成物を作製する方法を開示している。該方法は、（ｉ）混合物と混合モードクロマトグラフィー媒体とを接触させる工程と、（ｉｉ）ポリペプチドを含むフロースルー画分を発生させる混合モードクロマトグラフィー媒体からポリペプチドを溶出する工程とを含む、ポリペプチドを含む混合物を、混合モードクロマトグラフィーに供することを含む。
【００１９】
しかしながら、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系が複雑であること、要求されるウイルス種ストックの貯蔵安定性の制限、及び有効な感染に対する非常に高いウイルス力価の要件により、大規模の生物学的生産ではその使用が制限される場合がある。さらに、バキュロウイルス等のウイルスベクターが、哺乳動物細胞、特にヒト細胞に感染する可能性があることが分かっている（非特許文献１１、非特許文献１２）。このため、これらのベクターは、特に大規模の組換えタンパク質生産に適用する場合に、大量の感染細胞を取り扱うことから安全性の問題に関して脅威となる。
【００２０】
昆虫細胞培養系の使用の記載の制限を克服する代替方法は、組換えシアリルトランスフェラーゼの製造に哺乳動物細胞系を使用することである。
【００２１】
Neose Technologies Inc.の特許文献８は、原核宿主細胞又は昆虫宿主細胞においてＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩシグナルドメインの全て若しくは一部、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ膜貫通ドメインの全て若しくは一部、及び／又はＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩステムドメインの全て若しくは一部を欠いている、単離された切断型ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩポリペプチドを作製する方法を開示しており、概して該ポリペプチドは哺乳動物細胞でも作製することができることを言及している。
【００２２】
カルフォルニア大学の特許文献３は、宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞に、膜アンカーと開裂可能な分泌シグナルセグメントで置き換えたステム領域のほとんどとを有する、グリコシルトランスフェラーゼを発現する遺伝子を保有するベクターをトランスフェクトする方法を記載している。得られる可溶性グリコシルトランスフェラーゼは、細胞で発現される場合、細胞により分泌される。それから分泌された可溶性グリコシルトランスフェラーゼは工業用途又は炭水化物合成研究に使用するために細胞培養培地から分離される。さらに、特許文献３はアフィニティークロマトグラフィーを使用することにより可溶性グリコシルトランスフェラーゼを精製する方法を開示している。
【００２３】
しかしながら、哺乳動物細胞における組換えシアリルトランスフェラーゼの作製に関して言及された文献はいずれも、活性が高く、医薬品グレードまで精製され、また大規模生産に適した、組換えシアリルトランスフェラーゼを提供する方法を開示してはいない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】国際公開第２００３／０３１４６４号
【特許文献２】欧州特許出願公開第０７３７７４５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，０３２，５１９号明細書
【特許文献４】国際公開第２００７／０５６５２４号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００６／０２３４３４５号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００６／０２４６５４４号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００８／０２０７４８７号明細書
【特許文献８】国際公開第２００５／１２１３３２号
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Paulson et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 17615-17618
【非特許文献２】Tsuji S et al., 1996, Glycobiology 6: 5-7
【非特許文献３】Tsuji S, 1996, J. Biochem. 120: 1-13
【非特許文献４】Weinstein J et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 13835-13844
【非特許文献５】Nara K et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7952-7956
【非特許文献６】Nakayama J et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 3684-3691
【非特許文献７】Nakayama J et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7031-7035
【非特許文献８】Kurosawa et al. (1994, J. Biol.  Chem., 269:1402-1409)
【非特許文献９】Skretas et al. (2009, Microbial Cell Factories, 8:50)
【非特許文献１０】Brondyk W.H., 2009, Methods in Enzymology, Vol. 463, Ch.11
【非特許文献１１】Boyce FM and Buchner NL, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2348-2352
【非特許文献１２】Lundstrom et al., 2001, Cytotechnology, 35: 213-221
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
したがって、「薬学的規模の」プロセス及び反応に、特に糖ペプチド治療薬の作製に好適な活性及び純度を有する組換えシアリルトランスフェラーゼを作製する効率的な方法が依然として必要とされている。そのため、本発明の根底にある課題は、組換えシアリルトランスフェラーゼを作製するためにかかる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
この課題は、一態様においては、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを作製する方法であって、
ａ）ＣＨＯ細胞においてシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現させ、発現されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを含有する培養培地を回収する工程と、
ｂ）前記細胞培養培地を、（ｉ）少なくとも１回のアフィニティークロマトグラフィー及び／又は１回の混合モードクロマトグラフィー工程と、（ｉｉ）少なくとも１回の陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は１回の陽イオン交換クロマトグラフィー工程とに供することにより、前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを該培養培地から精製する工程と、
を含む、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを作製する方法を提供することによって本発明に従って解決される。
【００２８】
１つの実施の形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼシグナルドメインの全て若しくは一部、シアリルトランスフェラーゼ膜貫通ドメインの全て若しくは一部、及び／又はシアリルトランスフェラーゼステムドメインの全て若しくは一部を欠いている切断型シアリルトランスフェラーゼポリペプチドである。好ましくは、前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドはシアリルトランスフェラーゼ活性ドメインのみを含む。
【００２９】
好ましい実施の形態において、前記シアリルトランスフェラーゼはＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩである。典型的には、前記ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩは、ヒト、チンパンジー、オランウータン、ブタ、ウシ、イヌ、ラット、マウス及びニワトリのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩからなる群から選択される。好ましい実施の形態において、前記ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩはニワトリのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩである。最も好ましくは、前記ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのポリペプチドは、配列番号４又は配列番号６によるアミノ酸配列を含む。本発明の実施の形態によれば、ＥＰＯシグナル配列及びシアリルトランスフェラーゼポリペプチド配列をコードする発現カセットを、ＣＨＯ細胞において前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現するのに使用する。
【００３０】
好ましくは、作製方法の工程ａ）を、無血清フェドバッチ培養を使用することにより、及び／又は所定の細胞密度に達した後、３７℃±１℃から３２℃±１℃へのインキュベーション温度変化を行うことにより行う。
【００３１】
さらに、本発明は、工程ｃ）が、２回のアフィニティークロマトグラフィープロセス、又は１回のアフィニティークロマトグラフィープロセス及び１回の混合モードクロマトグラフィープロセスと、１回の陰イオン交換クロマトグラフィープロセスと、１回の陽イオン交換クロマトグラフィープロセスとを含む、方法を含む。最も好ましい実施の形態において、工程ｃ）を以下の順番で行う：
ｉ．陰イオン交換クロマトグラフィー；
ｉｉ．第１のアフィニティークロマトグラフィー；
ｉｉｉ．第２のアフィニティークロマトグラフィー又は混合モードクロマトグラフィー；
ｉｖ．陽イオン交換クロマトグラフィー。
【００３２】
典型的には、陰イオン交換クロマトグラフィーは、官能基としてジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル基（ＱＡＥ）、第四級アンモニウム基（Ｑ）、ジメチルアミノエチル基（ＤＭＡＥ）及び／又はトリメチルアミノエチル基（ＴＭＡＥ）を含有する陰イオン交換樹脂又は陰イオン交換膜によって行う。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーは、溶離液として７．０〜８．０の範囲のｐＨでＮａＣｌ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを用いて市販のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂によって行う。
【００３３】
概して、アフィニティークロマトグラフィーは、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂、Ｔａｌｏｎ樹脂、色素クロマトグラフィー樹脂、抗体親和性樹脂、レクチン親和性樹脂及び／又はペプチド−リガンド親和性樹脂によって行う。好ましい実施形態では、（第１の）アフィニティークロマトグラフィーを、好ましくは溶離液として７．０〜８．０の範囲のｐＨで塩酸Ｌ−アルギニン／リン酸カリウムバッファーを用いて市販のＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ樹脂によって行い、混合モードクロマトグラフィーを、好ましくは溶離液として７．０〜８．０の範囲のｐＨでＮａＣｌ／リン酸カリウムバッファーを用いて市販のヒドロキシアパタイト樹脂によって行う。
【００３４】
典型的には、陽イオン交換クロマトグラフィーは、スルホプロピル陽イオン交換材料を含有する樹脂又は同様の特性を有する樹脂によって行う。好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィーは、より好ましくは溶離液として６．０〜７．０の範囲のｐＨでＮａＣｌ／リン酸カリウムバッファーを用いて市販のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ樹脂によって行う。
【００３５】
別の態様では、本発明は、本発明による方法のいずれか１つによって作製された、少なくとも９８％の純度、好ましくは少なくとも９９％の純度、最も好ましくは９９％を超える純度のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。好ましい実施の形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドはＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩである。
【００３６】
更なる態様では、本発明は、治療用タンパク質のグリコシル化のための、例えばヒトサイトカインのグリコシル化のための、特にヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のグリコシル化のための本発明による方法のいずれか１つによって作製されたＳＴ６ＧａｌＮａｃＩポリペプチドの使用を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】シアリルトランスフェラーゼ製造プロセス：細胞の培養及び回収を示す図である。
【図２】シアリルトランスフェラーゼ製造プロセス：精製を示す図である。
【図３】実施例１の様々な精製工程後にクマシーブルーで染色したタンパク質ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す図である。６６ｋＤａ前後のバンドは配列番号６による精製されたＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩポリペプチドに対応する。
【図４】実施例２による第３のカラムの精製後の３つの異なるクローンＣ１、Ｃ２及びＣ３のｃＳＴ６プールのクマシーブルーで染色したタンパク質ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す図である。６６ｋＤａ前後のバンドは配列番号６による精製されたＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩポリペプチドに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、活性及び純度が高い改良されたシアリルトランスフェラーゼを作製及び精製する方法を提供する。この目的は、ＣＨＯ細胞においてシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現すること、発現されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを含有する細胞培養培地を回収すること、並びに培養培地を、（ｉ）少なくとも１回のアフィニティークロマトグラフィー及び／又は１回の混合モードクロマトグラフィープロセスと、（ｉｉ）少なくとも１回の陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は１回の陽イオン交換クロマトグラフィープロセスとに供することにより、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを培養培地から精製することにより達成される。
【００３９】
より具体的には、本発明は、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドの精製を以下の順番で行う方法に関する：
ｉ．陰イオン交換クロマトグラフィー；
ｉｉ．第１のアフィニティークロマトグラフィー；
ｉｉｉ．第２のアフィニティークロマトグラフィー又は混合モードクロマトグラフィー；
ｉｖ．陽イオン交換クロマトグラフィー。
【００４０】
他に特に規定がなければ、本明細書に用いられる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の又は同等のあらゆる方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を本明細書に記載している。
【００４１】
Ａ．シアリルトランスフェラーゼポリペプチド及び発現カセット
一実施形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼシグナルドメインの全て若しくは一部、シアリルトランスフェラーゼ膜貫通ドメインの全て若しくは一部、及び／又はシアリルトランスフェラーゼステムドメインの全て若しくは一部を欠いている切断型シアリルトランスフェラーゼポリペプチドである。好ましくは、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドはシアリルトランスフェラーゼ活性ドメインのみを含む。シアリルトランスフェラーゼポリペプチドはシグナルペプチドを更に含むことができる。
【００４２】
好ましい実施形態では、ＥＰＯシグナル配列及びシアリルトランスフェラーゼポリペプチド配列をコードする発現カセットを、ＣＨＯ細胞においてシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現するのに使用する。
【００４３】
「ポリペプチド」（代替的には「タンパク質」と称される）は、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合によって結合しているポリマーを指す。加えて、ポリペプチドには、非天然アミノ酸、例えばＰ−アラニン、フェニルグリシン及びホモアルギニンも含まれる。遺伝子によってコードされないアミノ酸も本発明に使用することができる。さらに、反応基、グリコシル化部位、ポリマー、治療部分、生体分子等を含むように修飾されているアミノ酸も本発明に使用することができる。本発明に使用されるアミノ酸は全て、Ｄ−異性体又はＬ−異性体のいずれであってもよい。通常Ｌ−異性体が好ましい。さらに、他のペプチド模倣体も本発明に有用である。本明細書で使用される場合、「ペプチド」はグリコシル化ペプチド及び非グリコシル化ペプチドの両方を指す。ペプチドには、ペプチドを発現する系により不完全にグリコシル化されているペプチドも含まれる。概評に関しては、Spatola, A. F., in "Chemistry and biochemistry of amino acids, peptides and proteins", B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983)を参照されたい。「ポリペプチド」という用語には、一般的にタンパク質又はペプチドと称される分子が含まれる。
【００４４】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、α−（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３Ｇａｌ３）（Kitagawa and Paulson, 1994, J. Biol. Chem. 269: 1394-1401）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ）（非特許文献８）、及びβ１，３ＧａｌＮＡｃ−α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧａｌＩ）（Gillespie et al., 1992, J. Biol. Chem. 267(29): 21004-10）を含むがそれらに限定されない、当業者によって既知の任意のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドであり得る。
【００４５】
「切断型シアリルトランスフェラーゼポリペプチド」は、天然のシアリルトランスフェラーゼよりも少ないアミノ酸残基を有するが、酵素活性を保持するシアリルトランスフェラーゼを指す。酵素が活性を保持していれば、いずれの数のアミノ酸残基が欠失してもよい。幾つかの実施形態では、ドメイン又はドメインの一部が欠失していてもよい。本発明の好ましい実施形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドはシアリルトランスフェラーゼ活性ドメインのみを含む。
【００４６】
「活性ドメイン」又は「触媒ドメイン」は、酵素により行われる酵素反応を触媒するタンパク質ドメイン又はその部分配列を指す。例えば、シアリルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、ドナーからアクセプター糖へとシアル酸残基を移動するのに十分なシアリルトランスフェラーゼの部分配列を含む。触媒ドメインは、酵素全体、その部分配列を含み得るか、又は天然の酵素若しくはその部分配列には付着しない更なるアミノ酸配列を含み得る。触媒領域の例としては、配列番号２による全長配列の２３２位のアミノ酸残基から５６６位のアミノ酸残基を含む、ニワトリＳＴ６ＧａｌＮａｃＩの触媒ドメインであるが、それに限定されない。ニワトリＳＴ６ＧａｌＮａｃＩの触媒ドメインを配列番号４に示す。好ましい実施形態では、シアリルトランスフェラーゼはＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩである。典型的には、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩは、ヒト、チンパンジー、オランウータン、ブタ、ウシ、イヌ、ラット、マウス及びニワトリのＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩからなる群から選択される（非特許文献８、非特許文献９、特許文献８）。最も好ましい実施形態では、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩは、配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされるニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩである。好ましくは、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩポリペプチドは、配列番号３又は配列番号５によるヌクレオチド配列によりコードされ、それぞれ配列番号４又は配列番号６によるアミノ酸配列を有する。
【００４７】
Ｂ．発現系
本発明によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをＣＨＯ細胞又は当業者に既知の同等の細胞株で発現する。可溶性シアリルトランスフェラーゼの発現のために各遺伝物質を宿主細胞に導入するのに使用される特定の手法は特に重要ではない。当業者により理解されるように、プロモーターの選択、並びに本発明のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現するのに使用される宿主細胞に遺伝物質を導入するための方法及び戦略が当該技術分野で既知である。
【００４８】
これらには、プラスミドベクター、ウイルスベクター、及びクローニングしたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の既知の方法のいずれかの使用が含まれる。用いられる特定の遺伝子工学的手法は、全長又は遺伝子修飾型又は切断型のシアリルトランスフェラーゼを発現することが可能な宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を首尾よく導入することができさえすれば十分である。
【００４９】
「ベクター」は単離核酸を含み、単離核酸を細胞の内部に送達するのに使用することができる物質の組成物である。様々な種類のベクターが当該技術分野で既知であり、これには直鎖核酸、イオン性化合物又は両親媒性化合物に関連する核酸、プラスミド及びウイルスが含まれるが、それらに限定されない。このため、「ベクター」という用語には、自己複製するプラスミド又は遺伝子修飾したウイルスが含まれる。この用語は、例えばポリリシン化合物、リポソームのような核酸の細胞への移動を促進する非プラスミド化合物及び非ウイルス化合物を含むように解釈されるものとする。
【００５０】
好適なベクターは、例えばＣＭＶプロモーターを伴う、ｐＳＶ４０ベクター、ｐＥＦ−１−αベクター、ｐＳＶ２ベクター、ｐＴ−Ｒｅｘベクター、ｐＳｅｃＴａｇ２ベクター、ｐＢｕｄＣＥ４．１ベクター、又はｐＣＤＮＡ／Ｈｉｓ  Ｍａｘベクターを含む。本発明の好ましい実施形態では、異種遺伝子の高レベルの発現のために設計されているｐＭＯＺ−Ｇ８ベクターをシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの発現に使用する。中でも好適な選択マーカーは、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）である。
【００５１】
Ｃ．ＣＨＯ細胞培養
本発明の実施形態によれば、作製方法の工程ａ）を、無血清フェドバッチ培養を使用することにより、及び５×１０５生存細胞数／ｍＬ以上、好ましくは１．５×１０６生存細胞数／ｍＬ以上の所定の細胞密度に達した後、３７℃±１℃から３２℃±１℃へのインキュベーション温度変化を用いることにより行う。本発明者らは、この温度変化が細胞の生存率を増大させ、それにより細胞を培養物中でより長期間維持することができることを見出している。これにより、より高い生産収率がもたらされる。
【００５２】
例えば、温度変化を用いないと、細胞は５日間しか培養することができず、約２４ｍｇ／ｌという生産収率が得られる。これに対して、温度変化を適用する場合、細胞を９日間培養することができ、６８ｍｇ／ｌという生産収率が得られる。
【００５３】
シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１を過剰発現するように改変されたＣＨＯ由来の細胞株を用いて無血清フェドバッチ培養において作製する。発酵プロセスのための接種材料を、マスターセルバンク（ＭＣＢ）の１つのバイアルからＴフラスコ又はスピナーフラスコを用いて成長させ、その後シードバイオリアクターで培養する。それから接種材料を生産用バイオリアクターに移し、そこで細胞密度が作製に適したレベルに達するまで更に細胞の増殖を行う。
【００５４】
温度変化は規定の細胞密度で開始し、グルコースレベルをグルコース溶液の供給により規定の範囲内に維持する。培養の終了時に、培養物を回収する。培養物中の細胞及び残屑を深層ろ過により回収物から取り除く。回収物をタンパク質精製を開始するまで２℃〜８℃で保管する。
【００５５】
図１は本発明の好ましい実施形態の様々な細胞培養工程及び回収工程を示している。
【００５６】
Ｄ．シアリルトランスフェラーゼの精製
本発明の更なる態様によれば、培養培地からのシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの精製を、培養培地を少なくとも１回のアフィニティークロマトグラフィー工程及び／又は混合モードクロマトグラフィー工程と、少なくとも１回の陰イオン交換クロマトグラフィー工程及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー工程とに供することにより行う。
【００５７】
好ましい実施形態では、精製は以下の順番で達成される：
ｉ．酵素を含有する溶液を濃縮し、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及び発酵培地化合物等の夾雑物の最初の低減をもたらす陰イオン交換クロマトグラフィー、
ｉｉ．シアリルトランスフェラーゼ酵素を濃縮し、宿主細胞タンパク質を枯渇させる中間精製工程として用いられる第１のアフィニティークロマトグラフィー、
ｉｉｉ．宿主細胞タンパク質レベルを効果的に低減させるのに用いられる第２のアフィニティークロマトグラフィー又は混合モードクロマトグラフィー、及び
ｉｖ．あらゆる残存する宿主細胞タンパク質及び他の夾雑物を取り除くのに用いられる陽イオン交換クロマトグラフィー。
【００５８】
図２は本発明の好ましい実施形態の様々な精製工程を示している。
【００５９】
Ｉ．陰イオン交換クロマトグラフィー工程
本発明の実施形態によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド精製プロセスには、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）工程が含まれる。
【００６０】
ＡＥＣは、サンプル中のタンパク質と樹脂上に固定化された電荷との間の電荷間相互作用によるものである。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、タンパク質の結合イオンが負電荷であり、樹脂上に固定化された官能基は正電荷である。一般的に用いられる陰イオン交換樹脂は、Ｑ樹脂、第四級アミン及びＤＥＡＥ（ジエチルアミノエタン）樹脂である。しかしながら概して、陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、あらゆる一般的な市販の陰イオン交換樹脂又は陰イオン交換膜によって行うことができる。陰イオン交換樹脂をプレパックドカラムの形態で使用することができる。代替的に、カラムを自ら調製することができる。通常のカラム以外のカラムには容積及び形状に関して特別な制限はない。当業者であれば、使用する陰イオン交換樹脂の量が、捕捉工程においてカラムに適用される細胞培養液又は任意の他の液体、例えば先行するクロマトグラフィー工程の溶出液の総タンパク質含有量に応じて変わることを認識している。
【００６１】
本発明で使用することができる典型的な強陰イオン交換樹脂は、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）部分、第四級アンモニウム（Ｑ）部分、及びトリメチルアンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）基等の官能基を含む。
【００６２】
第四級アミノエチル（ＱＡＥ）部分を有する樹脂としては、例えばＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＱＡＥ（Tosoh Bioscience, Germanyから入手可能）、Ｓｅｌｅｃｔａｃｅｌ  ＱＡＥ（セルロースの第四級アミノエチル誘導体、Polysciences Inc., Pennsylvania USAから入手可能）等が挙げられる。第四級アンモニウム（Ｑ）部分を有する樹脂としては、例えばＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ（GE Healthcare, Germanyから入手可能）、Ｍａｃｒｏ  Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ（Bio-Rad, California, USA）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｑ（Tosoh Bioscience, Germanyから入手可能）、及びＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ（Bio-Rad, California, USAから入手可能）が挙げられる。トリメチルアンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）基を有する樹脂としては、例えばＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Merck, Germanyから入手可能）が挙げられる。
【００６３】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、−Ｎ＋（ＣＨ３）３官能基を有する強陰イオン交換樹脂、又は同様の特性を有する樹脂を用いて行われる強陰イオン交換クロマトグラフィーであるのが好ましい。本発明で使用することができる強陰イオン交換樹脂の好ましい例は、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、及び第四級アンモニウム（Ｑ）部分を有する他の樹脂として当該技術分野で知られる第四級アンモニウム強陰イオン交換樹脂である。本発明の最も好ましい実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーを市販のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂によって行う。
【００６４】
陰イオン交換クロマトグラフィーの工程を、弱アルカリ性のｐＨを有する平衡バッファーを用いて行うのが好ましい。好適なバッファーとしては、例えばホウ酸バッファー、トリエタノールアミン／イミノ二酢酸、Ｔｒｉｓ、酢酸アンモニウム、トリシン、ビシン、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳが挙げられる。Ｔｒｉｓバッファーの使用が好ましく、バッファーは、７．６のｐＨで２０ｍＭのＴｒｉｓを含有するのがより好ましい。陰イオン交換樹脂を平衡バッファーで１回又は複数回洗浄し、フロースルー画分を廃棄する。陰イオン交換樹脂からの溶出は通常、塩、好ましくは塩化ナトリウムの添加により移動相の導電率を増大することにより達成される。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーは、溶離液として７．０〜８．０の範囲のｐＨでＮａＣｌ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを用いて行う。より好ましくは、溶出バッファーは、７．６のｐＨで８００ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌを含有する。
【００６５】
ＩＩ．第１のアフィニティークロマトグラフィー工程
本発明の実施形態によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド精製プロセスには、アフィニティークロマトグラフィー工程（好ましくは色素アフィニティークロマトグラフィーである）が含まれる。
【００６６】
好ましい実施の形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを精製する方法は、単一のアフィニティークロマトグラフィー工程を含み、単一のアフィニティークロマトグラフィー工程が色素アフィニティークロマトグラフィー工程であるのがより好ましい。
【００６７】
色素アフィニティークロマトグラフィーは、サンプルのタンパク質上の結合部位に対する固定化色素の高い親和性に基づくものである。色素アフィニティークロマトグラフィーの工程は、固定化リガンドとして当業者に既知の色素化合物、すなわちＣｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  Ｆ３Ｇ−Ａを有する樹脂を用いて行う。「固定化」という用語は、当業者によって十分に理解されるものであり、リガンドが樹脂と化学的に連結するという意味でリガンドを誘導体化することを意味する。特に好ましい樹脂は、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Amersham Biosciences Inc.から入手可能）である。
【００６８】
本方法は同様の特性を有する代替的な樹脂により行うことができることが理解される。代替的な樹脂の例としては、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−ｂｌｕｅ−ＨＣ−６５０Ｍ（Tosoh Bioscience）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＢｕｔｙｌ  ５５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ  ６５０、Ｂｌｕｅ  Ｃｅｌｌｔｈｒｕ  ＢｉｇＢｅａｄ（Sterogene）、ＳｗｅｌｌＧｅｌ  Ｂｌｕｅ（Pierce）、Ｃｉｂａｃｈｒｏｍｅ  ｂｌｕｅ  ３ＧＡ−ａｇａｒｏｓｅ  １００（Sigma）、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ（BioRad）、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  ｂｌｕｅカートリッジ（Bio-Rad）、Ｂｌｕｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（Amersham）、Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  ３ＧＡ（Sigma）、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ（GE Healthcare）、ＰｒｏＳｅｐ  ＰＢ（Millipore）、Ｍｅｔｈｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、及びＣＤＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Calbiochem）が挙げられる。
【００６９】
色素アフィニティークロマトグラフィーの工程を、弱アルカリ性のｐＨを有する平衡バッファーを用いて行うのが好ましい。好適なバッファーとしては、例えばＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが挙げられる。好ましくは、平衡バッファーは、リン酸カリウムバッファー及びＮａＣｌを含む。より好ましくは、平衡バッファーは、２５ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）及び５０ｍＭのＮａＣｌを含む。親和性樹脂を平衡バッファーで１回又は複数回洗浄し、フロースルー画分を廃棄する。より好ましい実施形態では、色素アフィニティークロマトグラフィーを、溶離液として７．０〜８．０の範囲のｐＨで塩酸Ｌ−アルギニン／リン酸カリウムバッファーを用いて行う。最も好ましくは、タンパク質を７．５のｐＨで５００ｍＭの塩酸Ｌ−アルギニン及び２５ｍＭのリン酸カリウムを含有するバッファーによって溶出させる。
【００７０】
ＩＩＩ．第２のアフィニティークロマトグラフィー工程又は混合モードクロマトグラフィー
本発明の実施形態によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド精製プロセスは、先の第ＩＩ章に記載された第２のアフィニティークロマトグラフィー工程、又は混合モードクロマトグラフィー、好ましくはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む。
【００７１】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、マトリクス及びリガンドの両方を形成する不溶性の水酸化リン酸カルシウムＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２を利用する混合モードクロマトグラフィーである。官能基は、正に帯電したカルシウムイオン対（Ｃ部位）及び負に帯電したリン酸基の集団（Ｐ部位）からなる。ヒドロキシアパタイトとタンパク質との間の相互作用は複雑かつ多重モードである。相互作用の方法の１つでは、タンパク質上の正に帯電したアミノ基が負に帯電したＰ部位と結び付き、タンパク質上の負に帯電したカルボキシル基がＣ部位との配位錯体形成により相互作用する（Shepard (2000) J. of Chromatography 891:93-98）。
【００７２】
結晶性ヒドロキシアパタイトは、クロマトグラフィーに用いられた最初のタイプのヒドロキシアパタイトであった。セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおける更なる改良型である。セラミックヒドロキシアパタイトは、ナノ結晶が凝集し、粒子となり、高温で融解して、クロマトグラフィー用途に好適な安定したセラミックミクロスフェアを生じる形態のヒドロキシアパタイトを指す。セラミックヒドロキシアパタイトの市販例としては、ＣＨＴタイプＩ及びＣＨＴタイプＩＩが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７３】
セラミックヒドロキシアパタイトは、耐久性が高く、タンパク質結合能が良好であり、結晶性ヒドロキシアパタイトよりも高い流速及び圧力で使用することができる（Vola et al. (1993) BioTechniques 14:650-655）。ヒドロキシアパタイトはタンパク質、核酸及び抗体のクロマトグラフィーによる分離に用いられている。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーでは、通常カラムを平衡状態にし、サンプルを低濃度のリン酸バッファー中で適用した後、吸着したタンパク質をリン酸バッファーの濃度勾配で溶出させる（Giovannini, (2000) Biotechnology and Bioengineering 73:522-529）。
【００７４】
任意のヒドロキシアパタイト樹脂を用いて、本発明による方法の混合モードクロマトグラフィー工程を行うことができる。好ましい実施形態では、混合モードクロマトグラフィー工程は、タイプＩ又はタイプＩＩのヒドロキシアパタイト樹脂等のセラミックヒドロキシアパタイト樹脂で行う。ヒドロキシアパタイト樹脂は、２０μｍ、４０μｍ又は８０μｍのような任意のサイズの粒子を有し得る。非常に好ましい実施形態では、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂は４０μｍのサイズを有する粒子を含む。特に好適なヒドロキシアパタイト樹脂は、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイトタイプＩ（４０μｍ）という商品名で市販されているカラムである。
【００７５】
平衡バッファーは６．３〜７．３のｐＨでリン酸カリウムバッファーを含むのが好ましく、平衡バッファーはｐＨ６．８で５ｍＭのリン酸カリウムバッファーを含むのがより好ましい。ヒドロキシアパタイト樹脂を平衡バッファーで１回又は複数回洗浄し、フロースルー画分を廃棄する。本発明のより好ましい実施形態では、ヒドロキシアパタイトアフィニティークロマトグラフィーを、溶離液として６．３〜７．３の範囲のｐＨでＮａＣｌ／リン酸カリウムバッファーを用いて行う。最も好ましくは、溶出バッファーは、６．８のｐＨで５ｍＭのリン酸カリウムバッファー及び１ＭのＮａＣｌを含有する。
【００７６】
ＩＶ．陽イオン交換クロマトグラフィー工程
本発明の実施形態によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド精製プロセスには、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）工程が含まれる。
【００７７】
ＣＥＣは、サンプル中のタンパク質と樹脂上に固定化された電荷との間の電荷間相互作用によるものである。陽イオン交換クロマトグラフィーでは、タンパク質の結合イオンが正電荷であり、固定化された官能基は負電荷である。一般的に用いられる陽イオン交換樹脂は、Ｓ樹脂、硫酸塩誘導体、及びＣＭ（カルボキシメチル）樹脂、カルボキシル化誘導イオンである。
【００７８】
しかしながら概して、陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、あらゆる一般的な市販の陽イオン交換樹脂又は陽イオン交換膜によって行うことができる。陽イオン交換樹脂を、官能基、例えばスルホン酸が固定されている充填済みのカラム又は膜の形態で使用することができる。代替的に、カラムを自ら調製することができる。通常のカラム以外のカラムには容積及び形状に関して特別な制限はない。当業者であれば、使用する陽イオン交換樹脂の量が、細胞培養液又は任意の他の液体、例えば先行するクロマトグラフィー工程の溶出液の総タンパク質含有量に応じて変わることを認識している。
【００７９】
様々なタイプの陽イオン交換材料は、Ｂｉｏ−Ｒｅｘ（商標）（例えばタイプ７０）、Ｃｈｅｌｅｘ（商標）（例えばタイプ１００）、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）（例えばタイプＣＭ、Ｈｉｇｈ  Ｓ、２５  Ｓ）、ＡＧ（商標）（例えばタイプ５０Ｗ、ＭＰ）（全てBioRad Laboratoriesから入手可能）；ＷＣＸ  ２（Ciphergenから入手可能）、Ｄｏｗｅｘ（商標）ＭＡＣ−３（Dow Chemical companyから入手可能）、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｃ及びＭｕｓｔａｎｇ  Ｓ（Pall Corporationから入手可能）、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ＣＭ（例えばタイプ２３、５２）、ｈｙｐｅｒ−Ｄ、ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ（Whatman plc．から入手可能）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＩＲＣ（例えばタイプ７６、７４７、７４８）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＧＴ  ７３、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）（例えばタイプＳＰ、ＣＭ、６５０Ｍ）（全てTosoh Bioscience GmbHから入手可能）、ＣＭ  １５００及びＣＭ  ３０００（BioChrom Labsから入手可能）、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（GE Healthcareから入手可能）、Ｐｏｒｏｕｓ樹脂（PerSeptive Biosystemsから入手可能）、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＥＳ（例えばタイプ５０２Ｃ）、ＣＸｐａｋ  Ｐ、ＩＥＣ  ＣＭ（例えばタイプ８２５、２８２５、５０２５、ＬＧ）、ＩＥＣ  ＳＰ（例えばタイプ４２０Ｎ、８２５）、ＩＥＣ  ＱＡ（例えばタイプＬＧ、８２５）（Shoko America Inc.から入手可能）、５０Ｗ陽イオン交換樹脂（Eichrom Technologies Inc.から入手可能）のように様々な商品名で、多くの供給業者から入手可能である。好ましくは、陽イオン交換材料は、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｓ若しくは２５Ｓ、ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＳＰ  ６５０Ｍ、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、又はＰＯＬＹＣＡＴ  Ａ等の強陽イオン交換材料である。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態では、陽イオン交換工程は、スルホプロピル陽イオン交換材料を含有する樹脂又は同様の特性を有する樹脂によって行う。本発明の最も好ましい実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーは、市販のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ樹脂によって行う。
【００８１】
陽イオン交換クロマトグラフィーの工程を、弱酸性のｐＨを有する平衡バッファーを用いて行うのが好ましい。好適なバッファーとしては、例えばマレイン酸、マロン酸、クエン酸、乳酸、ギ酸、ブタン二酸、酢酸、リン酸、ＨＥＰＥＳ及びＢＩＣＩＮＥが挙げられる。リン酸バッファーの使用が好ましく、平衡バッファーは、６．０のｐＨで２５ｍＭのリン酸カリウムバッファーを含有するのがより好ましい。陽イオン交換樹脂を平衡バッファーで１回又は複数回洗浄し、フロースルー画分を廃棄する。陽イオン交換樹脂からの溶出は通常、塩、好ましくは塩化ナトリウムの添加により移動相の導電率を増大することにより達成される。好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィーは、溶離液として６．０〜７．０の範囲のｐＨを有するＮａＣｌ／リン酸カリウムバッファーを用いて行う。より好ましくは、溶出バッファーは、６．０のｐＨで２５０ｍＭのＮａＣｌ及び２５ｍＭのリン酸カリウムを含有する。
【００８２】
Ｖ．更なる精製工程
さらに、本方法はろ過工程を含むことができる。ろ過プロセスは、当業者によって既知であり、あらゆる一般的な方法を使用することができる。本方法は、本方法の様々な工程で１つ又は複数の限外ろ過プロセスを含むことができる。本方法は、例えば最終的なウイルス除去のためにナノろ過を含むことができる。
【００８３】
限外ろ過は静水圧によって液体が半透膜に押し付けられる形態の膜ろ過である。高分子量の懸濁固体及び溶質が保持される一方で、水及び低分子量の溶質が膜を通過する。限外ろ過は、巨大分子の溶液、特にタンパク質溶液を精製及び濃縮するのに一般的に用いられる分離方法である。限外ろ過はナノろ過に類似しているが、保持される分子のサイズが異なる。本発明の構成では、１０ｋＤａの分子量カットオフが好ましい（１０ｋＤａ  ＵＦ）。ＵＦ膜を希釈及び再濃縮の反復又は継続により、溶液から塩及び他の微細種を取り除く透析ろ過にも使用することができる。
【００８４】
好ましくは、精製プロセスは１回又は複数回の限外／透析ろ過工程を含む。これらのろ過工程は、クロマトグラフィー工程の前に、その間に、及び／又はその後に行うことができる。好ましくは、１回の透析ろ過工程をクロマトグラフィー工程の間に、例えば混合モードクロマトグラフィー工程と陽イオン交換クロマトグラフィー工程との間に行い、１回の限外ろ過／透析ろ過工程をクロマトグラフィー工程の後に行う。これらのろ過工程は、市販のろ過デバイス、例えばGE Healthcare又はSartoriusから入手可能なろ過デバイスを用いて行うことができる。限外ろ過は、Sartoriusが提供するＳａｒｔｏｃｏｎカセット及びＳａｒｔｏｃｏｎ  Ｓｌｉｃｅカセットを用いて行うのが好ましい。
【００８５】
Ｅ．作製されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチド
別の態様では、本発明は、本発明による方法のいずれか１つにより作製されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。
【００８６】
一実施形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼシグナルドメインの全て若しくは一部、シアリルトランスフェラーゼ膜貫通ドメインの全て若しくは一部、及び／又はシアリルトランスフェラーゼステムドメインの全て若しくは一部を欠いている切断型シアリルトランスフェラーゼポリペプチドである。本発明の好ましい実施形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドはシアリルトランスフェラーゼ活性ドメインのみを含み、上記ポリペプチドは可溶性である。最も好ましい実施形態では、シアリルトランスフェラーゼは、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ、好ましくはニワトリ由来のＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩであり、最も好ましくはシアリルトランスフェラーゼは配列番号４又は配列番号６によるタンパク質である。
【００８７】
本発明の方法により作製されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドには、従来技術のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを上回る幾つかの利点がある。本発明の新規の改良された作製方法により、活性が高く、医薬品グレードまで精製され、また大規模生産に適したシアリルトランスフェラーゼポリペプチドが提供される。
【００８８】
「純粋な（pure）」という用語は、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、ポリペプチドを調製するのに用いられる混合物中に通常該材料とともに存在する構成要素、例えばＤＮＡ又は宿主細胞タンパク質を実質的に又は本質的に含まないことを指す。典型的には、本発明の方法により作製されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、少なくとも９８％の純度、好ましくは少なくとも９９％の純度である。純度は任意の当該技術分野で認識される分析方法（例えば銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ又は同様の手段）により決定される。
【００８９】
「活性型（active）」という用語は本発明の方法により作製されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの比活性を指し、その活性はシアル酸部分をドナー分子からアクセプター分子へと移動させるシアリルトランスフェラーゼの触媒活性を意味する。
【００９０】
ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの触媒活性は、α２，６連結によりシアル酸部分をＣＭＰ−シアル酸から糖タンパク質のアミノ酸スレオニン／セリンとＯ連結したＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基に移動させることを指す。比活性は活性単位で表すことができる。本明細書で使用される場合、１活性単位は、所与のアクセプター基質、温度及びｐＨ値で１分当たり１μｍｏｌの生成物の形成を触媒するものである。本発明では、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの比活性は、５Ｕ／ｍｇ〜１０Ｕ／ｍｇ、好ましくは６Ｕ／ｍｇ〜９Ｕ／ｍｇ、最も好ましくは７Ｕ／ｍｇ〜８Ｕ／ｍｇの範囲である。
【００９１】
シアリルトランスフェラーゼ活性は既知の方法により決定することができる。かかる方法としては、蛍光アッセイ、ＲＰ−ＨＰＬＣベースのアッセイ及び放射性アプローチが挙げられる（Spiegel et al., 1992, J Chromatogr., 573(1):23-7、Gross et al., 1990, Anal Biochem., 186(1):127-34、非特許文献９）。
【００９２】
Ｆ．シアリルトランスフェラーゼの使用
更なる態様では、本発明は治療用タンパク質のグリコシル化のための、特にヒトＧ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ＩＦＮ、ｈＧＨ、ＦＳＨ、インスリン又は抗体の糖ＰＥＧ化のための本発明による方法により作製されたＳＴ６ＧａｌＮａｃＩの使用を含む。
【００９３】
グリコシルトランスフェラーゼＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩは、治療用タンパク質のグリコシル化に必須の成分である。加えて、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩは、治療的に重要な糖ペプチド及びオリゴ糖治療薬の研究及び開発に重要な成分である。
【００９４】
本発明の修飾されたＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩシアリルトランスフェラーゼ酵素は、グリコシル化ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの調製に、並びに本発明の修飾されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素により移動することができる特定のグリコシル残基を含有するオリゴ糖の作製に有用である。修飾型のＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩポリペプチドは、その全長ポリペプチド対応物に匹敵する、場合によってはそれを超える生体活性を保有することができる。
【００９５】
「グリコシル化」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の方法により調製されるシアリルトランスフェラーゼによる被修飾糖種と、ポリペプチド、例えばエリスロポエチンペプチドのアミノ酸残基又はグリコシル残基との酵素によって媒介される共役を指す。グリコシル化の下位種（Subgenera）は、「複合糖質化（glycoconjugation）」、及び被修飾糖の修飾基がポリ（エチレングリコール）、そのアルキル誘導体（例えばｍ−ＰＥＧ）又は反応性誘導体（例えばＨ２Ｎ−ＰＥＧ、ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）である「糖ＰＥＧ化」である。
【００９６】
「治療用タンパク質」は、本明細書で使用される場合、疾患若しくは機能不全を治療するために、又は被験体の健康状態を改善するために被験体に投与されるタンパク質、ペプチド、糖タンパク質又は糖ペプチドを指す。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。更に好ましい実施形態では、治療用タンパク質はヒトタンパク質である。更なる実施形態では、治療用タンパク質はＣＨＯ細胞で作製される１つ又は複数のグリコシルトランスフェラーゼによりグリコシル化されるか、又はそうでなければ修飾される。
【００９７】
Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）は、造血前駆細胞の増殖及び分化、並びに成熟好中球の活性化を刺激する造血成長因子である。Ｇ−ＣＳＦはｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで好中球増殖を支持することが可能である。ヒト型のＧ−ＣＳＦは１９８６年に日本及び米国のグループによってクローニングされた（例えばNagata et al., 1986, Nature 319: 415-418を参照されたい）。天然のヒト糖タンパク質は２つの形態で存在し、１つは１７４個のアミノ酸を有し、もう１つは１７７個のアミノ酸を有する。より豊富でかつ活性が高い１７４アミノ酸型が組換えＤＮＡ技術による医薬品の開発に使用されている。
【００９８】
以下の実施例は、切断型のニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩポリペプチドの作製及び精製を表し、本発明の方法を更に説明するために与えられているにすぎない。本発明の範囲が以下の実施例のみで構成されるものであるとは解釈されない。
【実施例】
【００９９】
１．発現カセットの構築
発現カセットは、介在配列の８つのアミノ酸がＮ末端に付着した、アミノ酸Ｋ２３２でＮ末端切断したニワトリグリコシルトランスフェラーゼ（α−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−β−ガラクトシル−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミニドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ）からなるＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩポリペプチドの発現のために作製した。発現に用いられる全アミノ酸配列を配列番号６に示す。
【０１００】
翻訳開始シグナルを付加するため、及び発現率を増大するため、切断型ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩポリペプチドをコードする核酸をヒトゲノムのエリスロポエチン（ＥＰＯ）の発現カセットに導入し、ＥＰＯのコード配列を置き換えた。
【０１０１】
ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ転写ユニットは全体として、以下の要素を含有するように設計された：
ＥＰＯシグナル配列（ヒトエリスロポエチンエキソン１（４つのアミノ酸をコードする）、イントロン１、及びエキソン２の一部（２７個のアミノ酸：ＭＧＶＨＥＣＰＡＷＬＷＬＬＬＳＬＬＳＬ  ＰＬＧＬＰＶＬＧをコードする）からなる）；
ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ及び介在配列のヌクレオチド配列（配列番号５）；
ヒトエリスロポエチンの３’−ＵＴＲ、２８５ｂｐ；
５’−Ｎｏｔ  Ｉ部位を有する４５ｂｐのリンカー（３’−ＭｕｎＩ部位はＳＶ４０配列の不可欠部分である）。
【０１０２】
配列番号６で提示されるアミノ酸配列に基づき、成熟ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩのヌクレオチド配列を、ＣＨＯ細胞でのコドン使用頻度に合わせて最適化した。しかしながら、ゲノムＥＰＯ配列から誘導されるヌクレオチドは、天然ヒトエリスロポエチン配列に適合しておらず、また対応していなかった。得られる発現カセットはＥｃＳＴ６と略される。ＥｃＳＴ６のヌクレオチド配列はシークエンシングにより確認された（配列番号７）。配列一致度は１００％であった。
【０１０３】
２．発現ベクターの構築
合成ＥｃＳＴ６画分をＮｏｔＩ／ＭｎｕＩ画分として発現ベクターｐＭＯＺ−Ｇ８にクローニングした。
【０１０４】
このベクターは、アンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ発現ユニットと、原核生物要素としてｐＢＲ３２２複製起点と、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターにより誘導される真核生物選択マーカーであるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）と、対応するＳＶ４０  ３’−ＵＴＲとを含有するｐＳＶ２骨格に基づくものである。元のマウスＤＨＦＲ選択マーカーをＣＨＯ  ＤＨＦＲ遺伝子との部分融合により修飾し、選択剤メトトレキサート（ＭＴＸ）に対する１０分の１の親和性を示す組換えハイブリッドＤＨＦＲ（ＤＨＦＲｅｃ）を得た。ＤＨＦＲｅｃ選択マーカーをトランスフェクトした細胞をより大量のＭＴＸによって選択し、初めにＣＨＯＳＩ  ＣＨＯ  ＤＨＦＲ前駆細胞株に存在する内因性ＤＨＦＲをブロックし、プラスミド由来のＤＨＦＲｅｃを保有する遺伝子操作した細胞のみを濃縮することができる。遺伝子発現は強いｍＣＭＶプロモーターの制御下にある。ｍＣＭＶプロモーターの下流には、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）及びウサギβ−グロビンイントロン、並びにｃＤＮＡ転写産物の有効な発現を可能にする３’−ＵＴＲがある。
【０１０５】
カセットのベクターｐＭＯＺ−Ｇ８への挿入をＰＣＲで確かめた。
【０１０６】
大腸菌細胞を発現プラスミドｐＭＯ７−Ｇ８  ＥｃＳＴ６によって形質転換した。様々な形質転換体のコロニースクリーニングを行い、プラスミドＤＮＡを選択クローンから調製した。ｐＭＯ７−Ｇ８  ＥｃＳＴ６の同一性を確認するために、全ヌクレオチド配列をＤＮＡシークエンシングで確かめた。
【０１０７】
３．ＣＨＯ細胞株
分泌型のニワトリＳＴ６Ｇａｌ−ＮＡｃＩの発現のために、チャイニーズハムスター卵巣細胞株を使用した。ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの作製に用いられる親細胞株は、無血清及び無タンパク質の培地での成長に適しているジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）活性を欠いたチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−）であるＣＨＯＳＩ  ４の誘導体である。
【０１０８】
宿主細胞株ＣＨＯＳＩ  ４の概要：
ＣＨＯＳＩ  ４宿主細胞株をＣＨＯ  ｄｈｆｒ−から誘導した（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−９０９６；DSMZ, Braunschweig, GermanyによるＡＣＣ１２６）。
ＣＨＯＳＩ  ４宿主細胞株は、ＭＡＭ−ＰＦ２培地中の長期培養による無血清及び無タンパク質の既知組成培地中の成長に適していた。
ＣＨＯＳＩ  ４の形態は円形である。培養物は単一細胞懸濁液として成長させる。
ＣＨＯＳＩ  ４は血清、タンパク質、ペプチド又は加水分解物を含有しない、無動物成分の既知組成ＭＡＭ−ＰＦ培地での成長に適している。また、細胞株を他の市販の無血清培地中で培養することができる。
ＣＨＯＳＩ  ４を１週間当たり１：５０の総分割比で継代培養する。細胞を初めに１：２０で分割し、新たなフラスコに入れ、４日後に初期容量の３／２の新鮮な培地を得る。ＣＨＯＳＩ  ４は、１日当たり１を超える比成長速度（Ｄ＞１×ｄ−１）及び撹拌培養系においてバッチモードで２×１０６細胞数／ｍＬ、及びフェドバッチモードで１×１０７細胞数／ｍＬという細胞密度を示す。
付着因子又はウシ胎仔血清を細胞培養培地に添加することにより、細胞形態が変化し、上皮層へとＣＨＯＳＩ  ４細胞が逆戻りする。
【０１０９】
４．細胞の培養及び回収
Ｔフラスコ及びスピナーフラスコ内での細胞の解凍及び接種材料の増殖
ＭＣＢの単一バイアルを液体窒素の気相中での保管から取り出し、３７±１℃の温浴で加温した。細胞を遠心分離により予め加温した新鮮な培養培地の入ったＴフラスコ内に回収した。更なる接種材料の増殖は、スピナーフラスコ内での希釈工程及び継代培養工程により、培養培地の容量をバイオリアクター内でのシードとして用いるのに適切な最終容量まで増大することで達成された。
【０１１０】
シードバイオリアクター内での細胞増殖
スピナーフラスコ内での細胞の増殖後、接種材料をシードバイオリアクターに移し、新鮮な培地を用いて、容量を１０Ｌの最終実施容量まで増大させた。生産用バイオリアクターでの接種に適切な細胞数が達成されるまで、細胞を３日間シードバイオリアクター内で培養した。
【０１１１】
生産用バイオリアクター内での培養
シードバイオリアクター内での成長後、シードバイオリアクターの内容物を無菌状態で生産用バイオリアクターに移し、移した培養物を新鮮な培養培地を用いて最終実施容量まで増殖させた。１．５×１０６生存細胞数／ｍＬ以上の所定の細胞密度に達した後、３７℃±１℃から３２℃±１℃へとインキュベーション温度を下げた。グルコースレベルは４ｇ／Ｌ〜８ｇ／Ｌの濃度のグルコース溶液を供給することにより、規定の範囲内に維持した。発酵プロセスは生産用バイオリアクター内での培養開始の１４日〜１７日後に終了させた。
【０１１２】
回収及び保管
発酵の終了後、滅菌使い捨てバッグでの回収物の深層ろ過により、生産用バイオリアクターの細胞懸濁液から細胞及び残屑を取り除いた。使い捨て深層フィルターを回収物のろ過に用いた。回収物を更なる下流の処理まで２℃〜８℃で保管した。
【０１１３】
５．精製
精製−実施例１
ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの精製プロセスは、陰イオン交換カラムを用いる捕捉クロマトグラフィー工程から開始した。続く精製工程には、アフィニティークロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外ろ過／透析ろ過、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び１５ｎｍのＰｌａｎｏｖａ（商標）膜に通す最後のナノろ過が含まれていた。クロマトグラフィー工程は勾配クロマトグラフィー系を用いて行い、自動で実行した。ＵＶ吸収、導電率、ｐＨ、流速及び背圧をクロマトグラフィー工程ごとに好適なソフトウェアにより記録した。
【０１１４】
用いられるカラムのタイプ及び樹脂を表１に示す。
【０１１５】
【表１】
0005984267.tif 000002
【０１１６】
第１のカラム：陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂による陰イオン交換クロマトグラフィーを第１のクロマトグラフィー工程として使用し、回収物中でＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを捕捉し、容量を低減した。
【０１１７】
ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中での８００ｍＭのＮａＣｌの塩添加工程を適用することにより溶出した。溶出液をＵＶ吸収プロファイルに基づき回収した。
【０１１８】
クロマトグラフィー条件は表２にまとめる。
【０１１９】
【表２】
0005984267.tif 000003
【０１２０】
第２のカラム：アフィニティークロマトグラフィー（Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ）
Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦは、色素Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ（商標）と共有結合的に連結するアガロース樹脂であり、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液に含有される夾雑物の存在下でＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩと優先的に結合させるのに使用した。ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを２５ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）中の５００ｍＭの塩酸Ｌ−アルギニンによって溶出した。溶出液をＵＶ吸収プロファイルに基づき回収した。
【０１２１】
クロマトグラフィー条件を表３にまとめる。
【０１２２】
【表３】
0005984267.tif 000004
【０１２３】
第３のカラム：混合モードクロマトグラフィー（ヒドロキシアパタイト）
ヒドロキシアパタイト樹脂での混合モードクロマトグラフィーを、中間工程として使用して、ＨＣＰ及びＤＮＡのレベルを更に低減した。ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを５ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．８）中の１．０ＭのＮａＣｌによって溶出した。溶出液をＵＶ吸収プロファイルに基づき回収した。
【０１２４】
クロマトグラフィー条件を表４にまとめる。
【０１２５】
【表４】
0005984267.tif 000005
【０１２６】
限外ろ過／透析ろ過
ヒドロキシアパタイト溶出液を、３０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）でＳａｒｔｏｃｏｎスライスモジュールを用いて透析ろ過した。接線流ろ過を実施し、生成物を脱塩及び濃縮して、最終的にバッファーを２５ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）に交換した。
【０１２７】
第４のカラム：陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
陽イオン交換クロマトグラフィーを最終精製（polishing）工程として用い、残りの残存するＨＣＰを可能な限り全て除去した。特定条件下で、適用されるＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを２５ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）中の２５０ｍＭのＮａＣｌによって溶出した。
【０１２８】
クロマトグラフィー条件を表５にまとめる。
【０１２９】
【表５】
0005984267.tif 000006
【０１３０】
限外ろ過／透析ろ過及び配合
ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出液を３０ｋＤａのＭＷＣＯでＳａｒｔｏｃｏｎスライスモジュールによって透析ろ過した。接線流ろ過を実施し、生成物を脱塩及び濃縮して、バッファーを５０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ（ｐＨ６．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％ソルビトールに交換した。
【０１３１】
透析ろ過の完了後、Ｔｗｅｅｎ  ８０を最終濃度が０．００３％になるまで添加した。
【０１３２】
精製−実施例２
第１のカラム：陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）
このプロセス工程を陰イオン交換クロマトグラフィーによる、清澄化した（clarified）滅菌ろ過済みのバイオリアクター回収物からのｃＳＴ６の捕捉に用いる。バイオリアクターからの１０００ｍＬの上清をバッファーＡ（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６））で１：３に希釈して、omni ２５／１５０  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに充填した。ｃＳＴ６を線形ＮａＣｌ勾配（０−１Ｍ、２０ＣＶ）により溶出した。
【０１３３】
第２のカラム：アフィニティークロマトグラフィー（ＣＤＰアフィニティーマトリクス）
このアフィニティークロマトグラフィープロセス工程は、ｃＳＴ６純度を増大するのに重要な中間工程である。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ捕捉工程からの画分９〜画分１１のプールをバッファーＡ（１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．８）、２５％グリセロール）で１：３に希釈して、ＸＫ  １０／５５  ＣＤＰアフィニティーカラムに充填した。ＣＤＰカラムの過充填を避けるために、充填物を２つの同一のＣＤＰ操作に適用した。ｃＳＴ６を線形ＮａＣｌ勾配（０−１Ｍ、１０ＣＶ）により溶出した。
【０１３４】
第３のカラム：陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
この陰イオン交換クロマトグラフィーを最終精製工程として用いた。ＣＤＰ中間工程からのｃＳＴ６画分のプールをバッファーＡ（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６））で１：１０に希釈し、Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  １０／１０カラムに充填した。ｃＳＴ６を線形ＮａＣｌ勾配（０−０．６Ｍ、５ＣＶ）により溶出した。
【０１３５】
精製−実施例３
第１のカラム：陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂による陰イオン交換クロマトグラフィーを第１のクロマトグラフィー工程として使用し、回収物中でＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを捕捉し、容量を低減した。フェドバッチ培養バイオリアクターからの３００ｍＬの清澄化した滅菌ろ過済みの上清を精製した。
【０１３６】
クロマトグラフィー条件を表６にまとめる。
【０１３７】
【表６】
0005984267.tif 000007
【０１３８】
第２のカラム：中間アフィニティークロマトグラフィー（Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）
このアフィニティークロマトグラフィープロセス工程はｃＳＴ６純度を増大するのに重要な中間工程である。捕捉クロマトグラフィー工程の溶出液（２９ｍＬ）を希釈し、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー工程により精製した。
【０１３９】
クロマトグラフィー条件を表７にまとめる。
【０１４０】
【表７】
0005984267.tif 000008
【０１４１】
第３のカラム：精製アフィニティークロマトグラフィー（Ｐｒｏｓｅｐ  ＰＢ）
ＰｒｏＳｅｐ−ＰＢ媒体は孔径を制御したガラスビーズに固定化された合成ｍ−アミノフェニルリガンドで構成されている。
【０１４２】
このアフィニティークロマトグラフィーを最終精製工程として用いた。１５ｍＬの中間溶出液をこのクロマトグラフィー工程で精製した。
【０１４３】
クロマトグラフィー条件を表８にまとめる。
【０１４４】
【表８】
0005984267.tif 000009
【０１４５】
６．生成物のＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ純度、比活性及び収率
実施例１
実施例１に従って精製したＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの純度を、３つのバッチにおいてクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３を参照されたい）、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ及び閾値アッセイにより測定した。ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの比活性をＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した。
【０１４６】
純度及び比活性は表９に示したとおりであった。
【０１４７】
【表９】
0005984267.tif 000010
【０１４８】
精製したＳＴ６ＧａｌＮａｃＩの生産収率は６５ｍｇ／Ｌ〜７５ｍｇ／Ｌの範囲であった。
【０１４９】
比較研究を行い、ＣＨＯ細胞におけるＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの発現と、昆虫細胞におけるＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの発現とを比較した。昆虫細胞由来のＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩは２．５Ｕ／ｍｇという比活性を示し、ＣＨＯ由来のＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩは７．８Ｕ／ｍｇというより高い比活性を示した。
【０１５０】
実施例２
実施例２による精製したｃＳＴ６画分をプールし、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を分析した（図４を参照されたい）。３つの異なるクローンＣ１、Ｃ２及びＣ３から得られたｃＳＴ６サンプルプールを、希釈せずに充填し、１：５に希釈して充填し、１：１０に希釈して充填した。
【０１５１】
表１０はサンプルの調製及び充填を示す。
【０１５２】
【表１０】
0005984267.tif 000011
【０１５３】
図４に示されるように、希釈していないプールは２０ｋＤａ未満の微量の夾雑を示す。１：１０に希釈したプールのシグナルは、希釈していないサンプルでの不純物のシグナルよりも強かった。これにより、純度は９０％を超えると推測することができる。
【０１５４】
実施例３
実施例３に従って精製したＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの純度を、３つのバッチにおいてクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ及び閾値アッセイにより測定した。ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩの比活性をＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した。
【配列表フリーテキスト】
【０１５５】
配列番号５：介在配列を持つ切断型ニワトリＳＴ６ＧａｌＮａｃＩ
配列番号６：介在配列を持つ切断型ニワトリＳＴ６ＧａｌＮａｃＩ
配列番号７：発現カセットＥｃＳＴ６
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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