(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造（Ａ２）：
（Ａ２）  ５’      Ｎ１−（Ｎ）ｘ−Ｚ        ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−Ｎ２−（Ｎ’）ｙ−ｚ’’  ５’（センス鎖）
ここで、Ｎ２、ＮおよびＮ’の各々は、非修飾リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドまたは非定型部分であり、
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの各々は、各々の連続するＮまたはＮ’が隣接するＮまたはＮ’に共有結合によって連結したオリゴヌクレオチドであり、
ｘとｙの各々は、独立して１７〜３９の間の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は（Ｎ）ｘの配列に相補性を有し、（Ｎ）ｘは、ｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡの連続する配列に相補性を有し、
Ｎ１は（Ｎ）ｘに共有結合的に結合しており、ｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡに対してミスマッチであるか、または、ｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡに対する相補的ＤＮＡ部分であり、
Ｎ１は、天然または修飾ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシンまたはデオキシアデノシンからなる群から選択される部分であり、
ｚ’’は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、連続する非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
センス鎖は配列番号１０１に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号１６８に記載の配列を含む
を有する、二本鎖核酸化合物。
【請求項２】
ｘ＝ｙ＝１８である、請求項１に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項３】
構造
【化１】
0005972408.tif 000138
を有し、ここで、各々の
【化２】
0005972408.tif 000139
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、ＧおよびＵの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
Ａ、Ｃ、ＧおよびＵの各々は、隣接するＡ、Ｃ、ＧまたはＵに共有結合で連結しており、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ’’は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はセンス鎖の５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である、請求項１または２に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項４】
Ａ、Ｃ、ＧおよびＵの各々は、非修飾リボヌクレオチドであり、ｚ’’、ＺおよびＺ’は不在である、請求項３に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項５】
ＺおよびＺ’の各々が存在する、請求項３に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項６】
ＺおよびＺ’の各々が、独立して、ヌクレオチド部分または非ヌクレオチド部分を含む、請求項５に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項７】
Ｚ’がＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨを含み、ＺがＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨを含む、請求項５または６に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項８】
アンチセンス鎖が、１、８および１５位（５’＞３’）に２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドを含む、請求項３、５〜７のいずれか一項に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項９】
アンチセンス鎖が、５、６、７または８位（５’＞３’）に２’５’リボヌクレオチドを含む、請求項３、５〜８のいずれか一項に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項１０】
センス鎖が、９または１０位（５’＞３’）に２’５’リボヌクレオチドを含む、請求項３、５〜９のいずれか一項に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項１１】
センス鎖が、４、１１、１３および１７位（５’＞３’）に２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドを含む、請求項３、５〜１０のいずれか一項に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項１２】
ｚ’’が存在し、キャッピング部分が、無塩基リボース部分およびその修飾体、逆位無塩基リボース部分およびその修飾体、逆位無塩基デオキシリボース部分およびその修飾体、無塩基デオキシリボース部分およびその修飾体、Ｃ６−イミノ−Ｐｉ、ミラーヌクレオチド、５’ＯＭｅヌクレオチド、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、５’−アミノ−アルキルホスフェート、１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート、６−アミノヘキシルホスフェート、１２−アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位無塩基部分、１，４−ブタンジオールホスフェート、５’−アミノおよび架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分から選択される、請求項３、５〜１１のいずれか一項に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項１３】
Ａ、Ｃ、ＧおよびＵの各々を隣接するＡ、Ｃ、ＧまたはＵに連結する共有結合が、ホスホジエステル結合である、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項１４】
センス鎖が、４、１１、１３および１７位（５’＞３’）における２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基キャッピング部分を含み、アンチセンス鎖が、
ａ）１、８および１５位（５’＞３’）における２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチド、６または７位（５’＞３’）における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、または、
ｂ）１、４、８、１３および１５位（５’＞３’）における２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチド、６または７位（５’＞３’）における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、または、
ｃ）１、４、８、１１および１５位（５’＞３’）における２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチド、６位（５’＞３’）における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、または、
ｄ）１、３、８、１２、１３および１５位（５’＞３’）における２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチド、６位（５’＞３’）における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分
を含む、請求項３に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項１５】
センス鎖が、９または１０位（５’＞３’）における２’５’リボヌクレオチドをさらに含む、請求項１４に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項１６】
センス鎖が、４、１１、１３および１７位（５’＞３’）における２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチド、９位（５’＞３’）における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基キャッピング部分を含み、アンチセンス鎖が、（５’＞３’）１、４、８、１１および１５位（５’＞３’）における２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチド、６位（５’＞３’）における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分を含む、請求項１５に記載の二本鎖核酸化合物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の二本鎖核酸化合物を含む組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の二本鎖核酸化合物を含む、線維症を処置するための組成物。
【請求項１９】
線維症が、肝線維症、肝硬変、肺線維症、腎線維症、腹膜線維症、慢性肝損傷、心線維症、網膜線維症、眼窩線維症、涙腺線維化、骨髄線維症、腸管線維症、声帯粘膜線維症、喉頭線維症、腎性全身性線維症、先天性肝線維症および口腔粘膜下線維症からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
線維症が、皮膚、腹膜、肝臓、膵臓、腎臓、心臓、肺、骨髄、眼、腸管、声帯および／または脈管の線維症である、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する特許出願
この出願は、いずれも「ＨＳＰ４７発現の調節」という名称の、２０１０年８月９日に出願された米国仮出願第61/372,072号、２０１０年２月２３日に出願された米国仮出願第61/307,412号、および２００９年１２月９日に出願された米国仮出願第61/285,149号の利益を主張し、これらの全体をあらゆる目的のために本明細書に援用する。
【０００２】
配列表
本出願は220_PCT1_ST25_07-Dec-10.txtと題する配列表を含み、２０１０年１２月７日に作成された、５３３ｋｂのサイズのそのASCIIコピーは、その全体を本明細書に援用する。
【０００３】
発明の分野
本明細書において提供されるのは、ｈｓｐ４７の発現を調節するための組成物および方法である。
【背景技術】
【０００４】
Sato, Y.らは、肝硬変ラット動物モデルへの、ヒト熱ショックタンパク質４７のラットホモログであるｇｐ４６に対する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を送達するための、ビタミンＡ結合リポソームの投与を開示している。Sato, Y., et al., Nature Biotechnology, vol. 26(4), p. 431-442 (2008)。
【０００５】
Chen, J-J.らは、ケロイド線維芽細胞の増殖を検討するために、ＨＳＰ４７−ｓｈＲＮＡ（短鎖ヘアピンＲＮＡ）をヒトケロイドサンプルにトランスフェクションすることを開示している。Chen, J-J., et al., British Journal of Dermatology, vol. 156, p. 1188-1195 (2007)。
【０００６】
ＰＣＴ特許公開ＷＯ  ２００６／０６８２３２は、レチノイド誘導体および／またはビタミンＡアナログを含む星細胞特異的薬物担体を開示している。
【発明の概要】
【０００７】
標的遺伝子の発現を調節するための組成物、方法およびキットが、本明細書において提供される。様々な側面および態様において、本明細書において提供される組成物、方法およびキットは、ＳＥＲＰＩＮＨ１としても知られる、熱ショックタンパク質４７（ｈｓｐ４７）の発現を調節する。本組成物、方法およびキットは、ｈｓｐ４７をコードするヌクレオチド配列（ｍＲＮＡ配列など）、例えば配列番号１によって例示されるヒトｈｓｐ４７のためのｍＲＮＡコード配列を結合する核酸分子（例えば短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖（double-stranded）ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））の使用を伴い得る。一部の好ましい態様において、本明細書で開示される組成物、方法およびキットは、ｈｓｐ４７の発現を阻害する。例えば、ｈｓｐ４７の発現を低減するか、阻害するｓｉＮＡ分子（例えばＲＩＳＣ長ｄｓＮＡ分子またはダイサー長ｄｓＮＡ分子）が提供される。また、ｈｓｐ４７に関連する疾患、状態または障害、例えば肝線維症、肝硬変、肺線維症（ＩＬＦを含む）を含む肺の線維症、任意の状態に起因する腎線維症（例えばＥＳＲＤを含むＣＫＤ）、腹膜線維症、慢性肝損傷、原線維形成、他の器官における線維性疾患、偶発的および医原性（手術）の全ての可能な種類の皮膚損傷に関連する異常な瘢痕化（ケロイド）、強皮症、心線維症、緑内障濾過手術の失敗、および腸管癒着症などを治療および／または予防するための組成物、方法およびキットも提供される。
【０００８】
一側面において、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）であって、（ａ）該核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、（ｂ）該核酸分子の各々の鎖は、独立して１５〜４９ヌクレオチドの長さであり、（ｃ）アンチセンス鎖の１５〜４９のヌクレオチド配列は、ヒトｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡの配列（例えば、配列番号１）に相補的であり、かつ（ｄ）センス鎖の１５〜４９のヌクレオチド配列はアンチセンス鎖の配列に相補的であり、ヒトｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号１）の１５〜４９のヌクレオチド配列を含む、核酸分子が提供される。
【０００９】
一部の態様において、ヒトｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡの配列に相補的であるアンチセンス鎖の配列は、配列番号１のヌクレオチド６００〜８００の間、または８０１〜８９９の間、または９００〜１０００の間、または１００１〜１３００の間、または配列番号１のヌクレオチド６５０〜７３０の間、または９００〜９７５の間の配列に相補的な配列を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド６７４〜６９３もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド６９８〜７１６もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド６９８〜７２２もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド７０１〜７２０もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド９２０〜９３９もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド９６３〜９８２もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド９４７〜９７２もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド９４８〜９６６もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド９４５〜９６９もしくはその部分、または配列番号１のヌクレオチド９４５〜９６３もしくはその部分に一致する、ヒトｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡの配列に相補的な配列を含む。
【００１０】
一部の態様において、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のアンチセンス鎖は、配列番号４もしくはその部分、または配列番号６もしくはその部分、または配列番号８もしくはその部分、または配列番号１０もしくはその部分、または配列番号１２もしくはその部分、または配列番号１４もしくはその部分、または配列番号１６もしくはその部分、または配列番号１８もしくはその部分、または配列番号２０もしくはその部分、または配列番号２２もしくはその部分、または配列番号２４もしくはその部分、または配列番号２６もしくはその部分、または配列番号２８もしくはその部分、または配列番号３０もしくはその部分、または配列番号３２もしくはその部分、または配列番号３４もしくはその部分、または配列番号３６もしくはその部分、または配列番号３８もしくはその部分、または配列番号４０もしくはその部分、または配列番号４２もしくはその部分、または配列番号４４もしくはその部分、または配列番号４６もしくはその部分、または配列番号４８もしくはその部分、または配列番号５０もしくはその部分、または配列番号５２もしくはその部分、または配列番号５４もしくはその部分、または配列番号５６もしくはその部分、または配列番号５８もしくはその部分に一致する配列を含む。一部の態様において、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のセンス鎖は、配列番号３もしくはその部分、または配列番号５もしくはその部分、または配列番号７もしくはその部分、または配列番号９もしくはその部分、または配列番号１１もしくはその部分、または配列番号１３もしくはその部分、または配列番号１５もしくはその部分、または配列番号１７もしくはその部分、または配列番号１９もしくはその部分、または配列番号２１もしくはその部分、または配列番号２３もしくはその部分、または配列番号２５もしくはその部分、または配列番号２７もしくはその部分、または配列番号２９もしくはその部分、または配列番号３１もしくはその部分、または配列番号３３もしくはその部分、または配列番号３５もしくはその部分、または配列番号３７もしくはその部分、または配列番号３９もしくはその部分、または配列番号４１もしくはその部分、または配列番号４３もしくはその部分、または配列番号４５もしくはその部分、または配列番号４７もしくはその部分、または配列番号４９もしくはその部分、または配列番号５１もしくはその部分、または配列番号５３もしくはその部分、または配列番号５５もしくはその部分、または配列番号５７もしくはその部分に一致する配列を含む。
【００１１】
一部の好ましい態様において、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のアンチセンス鎖は、表Ａ−１９に示すアンチセンス配列のいずれかに一致する配列を含む。一部の好ましい態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、表Ａ−１９に示す配列のペアから選択される。いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１８、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿８８に記載の配列のペアから選択される。いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４（配列番号１９５および２２０）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２（配列番号１９６および２２１）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０（配列番号１９９および２２４）およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８（配列番号２０８および２３３）に記載の配列のペアから選択される。
【００１２】
いくつかの態様において、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４に記載の配列のペア（配列番号１９５および２２０）を含む。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のいくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２に記載の配列のペア（配列番号１９６および２２１）を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０に記載の配列のペア（配列番号１９９および２２４）を含む。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のいくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８に記載の配列のペア（配列番号２０８および２３３）を含む。
【００１３】
一部の態様において、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のアンチセンス鎖は、表ＢまたはＣのいずれかに示すアンチセンス配列のいずれかに一致する配列を含む。
【００１４】
一部の好ましい態様において、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のアンチセンス鎖は、表Ａ−１８に示すアンチセンス配列のいずれかに一致する配列を含む。一部の好ましい態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、表Ａ−１８に示す配列のペアから選択される。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のいくつかの態様は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２（配列番号６０および１２７）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６（配列番号６３および１３０）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１（配列番号６８および１３５）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３（配列番号６９および１３６）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５（配列番号９７および１６４）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ（配列番号９８および１６５）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１（配列番号１０１および１６８）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２（配列番号１０２および１６９）またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６（配列番号１２３および１９０）に記載の配列のペアから選択されるアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの好ましい態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２（配列番号６０および１２７）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６（配列番号６３および１３０）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ（配列番号９８および１６５）およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１（配列番号１０１および１６８）に記載の配列のペアから選択される。
【００１５】
いくつかの好ましい態様において、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２に記載の配列のペア（配列番号６０および１２７）から選択されるアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６に記載の配列のペア（配列番号６３および１３０）を含む。いくつかの好ましい態様において、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１に記載の配列のペア（配列番号６８および１３５）のアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖はＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３に記載の配列のペア（配列番号６９および１３６）である。いくつかの態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５に記載の配列のペア（配列番号９７および１６４）である。いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａに記載の配列のペア（配列番号９８および１６５）である。いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１に記載の配列のペア（配列番号１０１および１６８）である。
【００１６】
一部の態様において、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のアンチセンス鎖は、表ＤまたはＥのいずれかに示すアンチセンス配列のいずれかに一致する配列を含む。
【００１７】
本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の種々の態様において、アンチセンス鎖は長さが１５〜４９ヌクレオチド（例えば長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチド）、または長さが１７〜３５ヌクレオチド、または長さが１７〜３０ヌクレオチド、または長さが１５〜２５ヌクレオチド、または長さが１８〜２５ヌクレオチド、または長さが１８〜２３ヌクレオチド、または長さが１９〜２１ヌクレオチド、または長さが２５〜３０ヌクレオチド、または長さが２６〜２８ヌクレオチドであってもよい。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のいくつかの態様において、アンチセンス鎖は長さが１９ヌクレオチドであってもよい。同様に、本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のセンス鎖は、長さが１５〜４９ヌクレオチド（例えば長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチド）、または長さが１７〜３５ヌクレオチド、または長さが１７〜３０ヌクレオチド、または長さが１５〜２５ヌクレオチド、または長さが１８〜２５ヌクレオチド、または長さが１８〜２３ヌクレオチド、または長さが１９〜２１ヌクレオチド、または長さが２５〜３０ヌクレオチド、または長さが２６〜２８ヌクレオチドであってもよい。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のいくつかの態様において、センス鎖は長さが１９ヌクレオチドであってもよい。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のいくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、長さが１９ヌクレオチドであってもよい。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の二重鎖（duplex）領域は、長さが１５〜４９ヌクレオチド（例えば、長さが約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチド）、長さが１５〜３５ヌクレオチド、または長さが１５〜３０ヌクレオチド、または長さが約１５〜２５ヌクレオチド、または長さが１７〜２５ヌクレオチド、または長さが１７〜２３ヌクレオチド、または長さが１７〜２１ヌクレオチド、または長さが２５〜３０ヌクレオチド、または長さが２５〜２８ヌクレオチドであってもよい。本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の種々の態様において、二重鎖領域は長さが１９ヌクレオチドであってもよい。
【００１８】
一部の態様において、本明細書において提供される核酸（例えばｓｉＮＡ核酸分子）のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、別々のポリヌクレオチド鎖である。いくつかの態様において、別々のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、水素結合、例えばワトソン−クリック型塩基対形成を介して、二本鎖構造を形成する。いくつかの態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、互いに共有結合的に連結された２つの別々の鎖である。他の態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス領域およびアンチセンス領域を有する単一のポリヌクレオチド鎖の一部であり、いくつかの好ましい態様において、ポリヌクレオチド鎖は、ヘアピン構造を有する。
【００１９】
一部の態様において、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、オーバーハングに関して対称な二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）分子であり、両端に平滑末端を有する。他の態様において、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、オーバーハングに関して対称なｄｓＮＡ分子であり、ｄｓＮＡ分子の両端にオーバーハングを有し、好ましくは、分子は、１、２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチドのオーバーハングを有し、好ましくは、分子は２ヌクレオチドのオーバーハングを有する。いくつかの態様において、オーバーハングは５’オーバーハングであり、代替的な態様において、オーバーハングは３’オーバーハングである。一部の態様において、オーバーハングヌクレオチドは、本明細書に開示される修飾で修飾されている。いくつかの態様において、オーバーハングヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。
【００２０】
一部の好ましい態様において、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、オーバーハングに関して非対称なｄｓＮＡ分子であり、分子の一端に平滑末端を有し、分子の他端にオーバーハングを有する。一部の態様において、オーバーハングは１、２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチドである、好ましくは、オーバーハングは２ヌクレオチドである。いくつかの好ましい態様において、非対称なｄｓＮＡ分子は、センス鎖に存在する二重鎖の一方の側に３’オーバーハング（例えば２ヌクレオチドの３’オーバーハング）を、分子の他方の側に平滑末端を有する。いくつかの好ましい態様において、非対称ｄｓＮＡ分子は、センス鎖に存在する二重鎖の一方の側に、５’オーバーハング（例えば２ヌクレオチドの５’オーバーハング）を、分子の他方の側に平滑末端を有する。他の好ましい態様において、非対称ｄｓＮＡ分子は、アンチセンス鎖に存在する二重鎖の一方の側に、３’オーバーハング（例えば２ヌクレオチドの３’オーバーハング）を、分子の他方の側に平滑末端を有する。いくつかの好ましい態様において、非対称ｄｓＮＡ分子は、アンチセンス鎖に存在する二重鎖の一方の側に、５’オーバーハング（例えば２ヌクレオチドの５’オーバーハング）を、分子の他方の側に平滑末端を有する。一部の好ましい態様において、オーバーハングは２’−デオキシヌクレオチドである。
【００２１】
いくつかの態様において、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、一端がループ構造であり、他端が平滑末端であるヘアピン構造（１つのポリヌクレオチドにセンス鎖とアンチセンス鎖を有する）を有する。いくつかの態様において、核酸分子は、一端がループ構造であり、他端がオーバーハング末端である（例えば１、２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチドのオーバーハング）ヘアピン構造を有し、一部の態様において、オーバーハングは３’オーバーハングであり、一部の態様において、オーバーハングは５’オーバーハングであり、一部の態様において、オーバーハングはセンス鎖にあり、一部の態様において、オーバーハングはアンチセンス鎖にある。
【００２２】
いくつかの好ましい態様において、核酸分子は、表Ｉに示す核酸分子から選択される。
【００２３】
本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、本明細書に記載の１または２以上の修飾または修飾ヌクレオチドを含んでもよい。例えば、本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、修飾糖を有する修飾ヌクレオチド、修飾核酸塩基を有する修飾ヌクレオチド、または修飾リン酸基を有する修飾ヌクレオチドを含んでもよい。同様に、本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、修飾ホスホジエステル骨格を含んでもよく、かつ／または、修飾末端リン酸基を含んでもよい。
【００２４】
提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、例えば本明細書に記載のような、修飾糖部分を含む１個または２個以上のヌクレオチドを有してもよい。いくつかの好ましい態様において、修飾糖部分は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−デオキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’チオ、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’架橋、２’ロックド核酸、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）からなる群から選択される。
【００２５】
提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、例えば本明細書に記載の１または２以上の修飾核酸塩基を有してもよく、これは好ましくは、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよびアシクロヌクレオチドからなる群から選択されるものであってもよい。
【００２６】
提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、ホスホジエステル骨格への１または２以上の修飾（例えば、本明細書に記載のもの）を有してもよい。いくつかの好ましい態様において、ホスホジエステル結合は、ホスホジエステル結合を、ホスホロチオエート、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または−５’）チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−（または−５’）デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または５’−）アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノリン酸エステル、ホスホルアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルまたはリン結合で置換することにより修飾されている。
【００２７】
種々の態様において、提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、１または２以上の修飾をアンチセンス鎖ではなくセンス鎖に含んでもよい。いくつかの態様において、提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、１または２以上の修飾をセンス鎖ではなくアンチセンス鎖に含む。いくつかの態様において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、１または２以上の修飾をセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に含む。
【００２８】
提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）が修飾を有するいくつかの態様において、センス鎖は修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとが交互するパターンを含み、かつ／または、アンチセンス鎖は修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとが交互するパターンを含む。かかる態様のいくつかの好ましいバージョンにおいて、修飾は２’−Ｏ−メチル（２’メトキシまたは２’ＯＭｅ）糖部分である。修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとが交互するパターンは、一方の鎖の５’末端または３’末端の修飾ヌクレオチドから始まってもよい。例えば、修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとが交互するパターンは、センス鎖の５’末端または３’末端の修飾ヌクレオチドから始まってもよく、かつ／または、修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとが交互するパターンは、アンチセンス鎖の５’末端または３’末端の修飾ヌクレオチドから始まってもよい。アンチセンス鎖およびセンス鎖の両方が修飾ヌクレオチドが交互するパターンを含む場合、修飾ヌクレオチドのパターンは、センス鎖の修飾ヌクレオチドがアンチセンス鎖の修飾ヌクレオチドに対向するように構成されてもよく、または、センス鎖の修飾ヌクレオチドがアンチセンス鎖の非修飾ヌクレオチドに対向するか、センス鎖の非修飾ヌクレオチドがアンチセンス鎖の修飾ヌクレオチドに対向するといったように、パターンに位相シフトがあってもよい。
【００２９】
本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、センスおよび／またはアンチセンス鎖の３’末端に１〜３個（すなわち１、２または３個）のデオキシヌクレオチドを含んでもよい。
【００３０】
本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、センスおよび／またはアンチセンス鎖の５’末端にリン酸基を含んでもよい。
一側面において、構造（Ａ１）：
（Ａ１）  ５’        （Ｎ）ｘ−Ｚ        ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ’’  ５’（センス鎖）
を有する二本鎖核酸分子が提供され、
ここで、各々のＮおよびＮ’は非修飾であっても、修飾されていてもよいヌクレオチドであるか、非定型部分（unconventional moiety）であり、
各々の（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、各々の連続するＮまたはＮ’が次のＮまたはＮ’に共有結合的に連結されたオリゴヌクレオチドであり、
各々のＺおよびＺ’は、独立して、存在するか、不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した１〜５個の連続したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分またはその組合せを含み、
ｚ’’は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分であり、
ｘおよびｙの各々は、独立して１８〜４０の間の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補的であり、（Ｎ）ｘは、配列番号１に対するアンチセンス配列を含む。いくつかの態様において（Ｎ）ｘは、表Ａ−１９に存在するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。他の態様において、（Ｎ）ｘは、表ＢまたはＣに存在するアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。
【００３１】
いくつかの態様において、各々の連続するＮまたはＮ’を連結する共有結合はホスホジエステル結合である。
【００３２】
いくつかの態様において、ｘ＝ｙであり、ｘとｙの各々は１９、２０、２１、２２または２３である。種々の態様において、ｘ＝ｙ＝１９である。
【００３３】
本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）のいくつかの態様において、二本鎖核酸分子はｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
【００３４】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４（配列番号１９５および２２０）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２（配列番号１９６および２２１）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０（配列番号１９９および２２４）およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８（配列番号２０８および２３３）に記載の配列のペアから選択される。
【００３５】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖はＳＥＲＰＩＮＨ１＿４（配列番号１９５および２２０）に記載の配列のペアである。いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖はＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２（配列番号１９６および２２１）に記載の配列のペアである。いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖はＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０（配列番号１９９および２２４）に記載の配列のペアである。いくつかの態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖はＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８（配列番号２０８および２３３）に記載の配列のペアである。
【００３６】
いくつかの態様において、二本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖の１位（５’末端）に、ＤＮＡ部分または標的に対するミスマッチを含む。かかる構造は本明細書に記載されている。提供される１つの態様は、下記の構造：
（Ａ２）  ５’        Ｎ１−（Ｎ）ｘ−Ｚ      ３’（アンチセンス鎖）
３’  Ｚ’−Ｎ２−（Ｎ’）ｙ−ｚ’’  ５’（センス鎖）
を有する修飾核酸分子であり、
ここで、Ｎ２、ＮおよびＮ’の各々は、非修飾リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドまたは非定型部分であり、
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの各々は、各々の連続するＮまたはＮ’が隣接するＮまたはＮ’に共有結合によって連結したオリゴヌクレオチドであり、
ｘとｙの各々は、独立して１７〜３９の間の整数であり、
（Ｎ’）ｙの配列は（Ｎ）ｘの配列に相補性を有し、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡの連続する配列に相補性を有し、
Ｎ１は（Ｎ）ｘに共有結合的に結合しており、標的ＲＮＡに対してミスマッチであるか、または、標的ＲＮＡに対する相補的ＤＮＡ部分であり、
Ｎ１は、天然または修飾ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシンまたはデオキシアデノシンからなる群から選択される部分であり、
ｚ’’は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、連続する非ヌクレオチド部分またはその組合せである。
【００３７】
いくつかの態様において、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に完全に相補的である。種々の態様において、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの配列は、Ｎ１−（Ｎ）ｘの配列に相補的である。いくつかの態様において、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡにおける約１７〜約３９の連続するヌクレオチドに完全に相補的であるアンチセンスを含む。他の態様において、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡにおける約１７〜約３９の連続するヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンスを含む。
【００３８】
いくつかの態様において、Ｎ１とＮ２とは、ワトソン−クリック塩基対を形成する。いくつかの態様において、Ｎ１とＮ２とは、非ワトソン−クリック塩基対を形成する。いくつかの態様において、塩基対はリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの間で形成される。
【００３９】
いくつかの態様において、ｘ＝ｙ＝１８、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２０である。好ましい態様において、ｘ＝ｙ＝１８である。Ｎ１−（Ｎ）ｘにおいてｘ＝１８である場合、Ｎ１は１位を指し、２〜１９位は（Ｎ）１８に含まれる。Ｎ２−（Ｎ’）ｙにおいてｙ＝１８である場合、Ｎ２は１９位を指し、１〜１８位は（Ｎ）１８に含まれる。
【００４０】
いくつかの態様において、Ｎ１は（Ｎ）ｘと共有結合的に結合しており、かつ標的ＲＮＡとミスマッチである。種々の態様において、Ｎ１は（Ｎ）ｘと共有結合的に結合しており、かつ標的ＲＮＡに相補的なＤＮＡ部分である。
【００４１】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖の１位のウリジンは、アデノシン、デオキシアデノシン、デオキシウリジン（ｄＵ）、リボチミジンまたはデオキシチミジンから選択されるＮ１で置換されている。種々の態様において、Ｎ１はアデノシン、デオキシアデノシンまたはデオキシウリジンから選択される。
【００４２】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖の１位のグアノシンは、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジンまたはデオキシチミジンから選択されるＮ１で置換されている。種々の態様において、Ｎ１はアデノシン、デオキシアデノシン、ウリジンまたはデオキシウリジンから選択される。
【００４３】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖の１位のシチジンは、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジンまたはデオキシチミジンから選択されるＮ１で置換されている。種々の態様において、Ｎ１はアデノシン、デオキシアデノシン、ウリジンまたはデオキシウリジンから選択される。
【００４４】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖の１位のアデノシンは、デオキシアデノシン、デオキシウリジン、リボチミジンまたはデオキシチミジンから選択されるＮ１で置換されている。種々の態様において、Ｎ１はデオキシアデノシンまたはデオキシウリジンから選択される。
【００４５】
いくつかの態様において、Ｎ１とＮ２とは、ウリジンまたはデオキシウリジンと、アデノシンまたはデオキシアデノシンとの間で塩基対を形成する。他の態様において、Ｎ１とＮ２とは、デオキシウリジンとアデノシンとの間で塩基対を形成する。
【００４６】
いくつかの態様において、二本鎖核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡまたはｍｉＲＮＡである。本明細書において提供される二本鎖核酸分子はまた、二重鎖（duplex）とも称する。
【００４７】
いくつかの態様において、（Ｎ）ｘは、表Ａ−１８に存在するアンチセンスオリゴヌクレオチド含む。いくつかの態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、表Ａ−１８に存在するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２０である。一部の好ましい態様において、ｘ＝ｙ＝１８である。いくつかの態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘおよびＮ２−（Ｎ’）ｙの配列は、表Ａ−１８に記載のオリゴヌクレオチドのペアから選択される。いくつかの態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘおよびＮ２−（Ｎ’）ｙの配列は、表ＤおよびＥに記載のオリゴヌクレオチドのペアから選択される。いくつかの態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２（配列番号６０および１２７）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６（配列番号６３および１３０）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１（配列番号６８および１３５）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３（配列番号６９および１３６）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５（配列番号９７および１６４）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ（配列番号９８および１６５）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１（配列番号１０１および１６８）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１ａ（配列番号１０５および１７２）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２（配列番号１０２および１６９）またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６（配列番号２３および１９０）に記載の配列のペアから選択される。いくつかの好ましい態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２（配列番号６０および１２７）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６（配列番号６３および１３０）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ（配列番号９８および１６５）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１（配列番号１０１および１６８）およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１ａ（配列番号１０５および１７２）に記載の配列のペアから選択される。
【００４８】
いくつかの好ましい態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２に記載の配列のペア（配列番号６０および１２７）から選択される。いくつかの態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６に記載の配列のペア（配列番号６３および１３０）である。いくつかの態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１に記載の配列のペア（配列番号６８および１３５）である。いくつかの態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３に記載の配列のペア（配列番号６９および１３６）である。いくつかの態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５に記載の配列のペア（配列番号９７および１６４）である。いくつかの態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａに記載の配列のペア（配列番号９８および１６５）である。いくつかの態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１に記載の配列のペア（配列番号１０１および１６８）である。いくつかの態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１ａに記載の配列のペア（配列番号１０５および１７２）である。いくつかの態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２に記載の配列のペア（配列番号１０２および１６９）である。いくつかの態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖はＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペア（配列番号２３および１９０）である。いくつかの好ましい態様においてアンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２（配列番号６０および１２７）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６（配列番号６３および１３０）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ（配列番号９８および１６５）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１（配列番号１０１および１６８）およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１ａ（配列番号１０５および１７２）に記載の配列のペアから選択される。
【００４９】
いくつかの態様において、Ｎ１とＮ２とは、ワトソン−クリック塩基対を形成する。他の態様において、Ｎ１とＮ２とは、非ワトソン−クリック塩基対を形成する。いくつかの態様において、Ｎ１は修飾リボアデノシンまたは修飾リボウリジンである。
【００５０】
いくつかの態様において、Ｎ１とＮ２とは、ワトソン−クリック塩基対を形成する。他の態様において、Ｎ１とＮ２とは、非ワトソン−クリック塩基対を形成する。一部の態様において、Ｎ１は、リボアデノシン、修飾リボアデノシン、デオキシリボアデノシン、修飾デオキシリボアデノシンからなる群から選択される。他の態様において、Ｎ１は、リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジンおよび修飾デオキシリボウリジンからなる群から選択される。
【００５１】
一部の態様において、アンチセンス鎖の１位（５’末端）は、デオキシリボウリジン（ｄＵ）またはアデノシンを含む。いくつかの態様において、Ｎ１は、リボアデノシン、修飾リボアデノシン、デオキシリボアデノシン、修飾デオキシリボアデノシンからなる群から選択され、Ｎ２は、リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジンおよび修飾デオキシリボウリジンからなる群から選択される。一部の態様において、Ｎ１は、リボアデノシンおよび修飾リボアデノシンからなる群から選択され、Ｎ２は、リボウリジンおよび修飾リボウリジンからなる群から選択される。
【００５２】
一部の態様において、Ｎ１はリボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジンおよび修飾デオキシリボウリジンからなる群から選択され、Ｎ２はリボアデノシン、修飾リボアデノシン、デオキシリボアデノシン、修飾デオキシリボアデノシンからなる群から選択される。一部の態様において、Ｎ１はリボウリジンおよびデオキシリボウリジンからなる群から選択され、Ｎ２はリボアデノシンおよび修飾リボアデノシンからなる群から選択される。一部の態様において、Ｎ１はリボウリジンであり、Ｎ２はリボアデノシンである。一部の態様において、Ｎ１はデオキシリボウリジンであり、Ｎ２はリボアデノシンである。
【００５３】
構造（Ａ２）のいくつかの態様において、Ｎ１は２’ＯＭｅ糖修飾リボウラシルまたは２’ＯＭｅ糖修飾リボアデノシンを含む。構造（Ａ）の一部の態様において、Ｎ２は２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む。
【００５４】
構造（Ａ２）のいくつかの態様において、Ｎ１は２’ＯＭｅ糖修飾リボウラシルまたは２’ＯＭｅ糖修飾リボシトシンを含む。構造（Ａ）の一部の態様において、Ｎ２は２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
【００５５】
いくつかの態様において、ＮおよびＮ’の各々は、非修飾ヌクレオチドである。いくつかの態様において、ＮまたはＮ’の少なくとも１つは、化学的に修飾されたヌクレオチドまたは非定型部分を含む。いくつかの態様において、非定型部分は、ミラー（mirror）ヌクレオチド、無塩基（abasic）リボース部分および無塩基デオキシリボース部分から選択される。いくつかの態様において、非定型部分は、ミラーヌクレオチド、好ましくはＬ−ＤＮＡ部分である。いくつかの態様において、ＮまたはＮ’の少なくとも１つは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
【００５６】
いくつかの態様において、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に完全に相補的である。他の態様において（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に実質的に相補的である。
【００５７】
いくつかの態様において、（Ｎ）ｘは、標的ｍＲＮＡの約１７〜約３９の連続するヌクレオチドに完全に相補的なアンチセンス配列を含む。他の態様において、（Ｎ）ｘは、標的ｍＲＮＡの約１７〜約３９の連続するヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
【００５８】
構造Ａ１および構造Ａ２のいくつかの態様において、化合物は平滑末端を有し、例えば、ＺおよびＺ’の両方が不在である。代替的な態様において、ＺまたはＺ’の少なくとも１つは存在する。ＺおよびＺ’は、独立して、１または２以上の共有結合的に連結した修飾および／または非修飾ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む）、または非定型部分、例えば逆位（inverted）無塩基デオキシリボース部分または無塩基リボース部分、非ヌクレオチドＣ３、Ｃ４またはＣ５部分、アミノ−６部分、ミラーヌクレオチドなどを含む。いくつかの態様において、ＺおよびＺ’の各々は、独立して、Ｃ３部分またはアミノ−Ｃ６部分を含む。いくつかの態様において、Ｚ’は不在であり、Ｚは存在し、非ヌクレオチドＣ３部分を含む。いくつかの態様において、Ｚは不在であり、Ｚ’存在し、非ヌクレオチドＣ３部分を含む。
【００５９】
構造Ａ１および構造Ａ２のいくつかの態様において、各々のＮは非修飾リボヌクレオチドからなる。構造Ａ１および構造Ａ２のいくつかの態様において、各々のＮ’は非修飾ヌクレオチドからなる。好ましい態様において、ＮおよびＮ’の少なくとも１つは、修飾リボヌクレオチドまたは非定型部分である。
【００６０】
他の態様において、構造Ａ１または構造Ａ２の化合物は、糖残基が修飾された少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、化合物は糖残基の２’位に修飾を含む。いくつかの態様において、２’位における修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。一部の態様において、２’修飾はアルコキシ部分を含む。好ましい態様において、アルコキシ部分はメトキシ部分である（別名２’−Ｏ−メチル、２’ＯＭｅ、２’−ＯＣＨ３）。いくつかの態様において、核酸化合物は、アンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方に、交互する２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。他の態様において、化合物は２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドをアンチセンス鎖、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘのみに含む。一部の態様において、アンチセンス鎖の中央のリボヌクレオチド、例えば、１９ｍｅｒ鎖の１０位のリボヌクレオチドは、非修飾である。種々の態様において、核酸化合物は、少なくとも５個の交互する２’ＯＭｅ糖修飾および非修飾リボヌクレオチドを含む。さらなる態様において、構造Ａ１または構造Ａ２の化合物は、交互する位置に修飾リボヌクレオチドを含み、ここで、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘの５’および３’末端の各々のリボヌクレオチドは、その糖残基が修飾されており、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ’）ｙの５’および３’末端の各々のリボヌクレオチドは、その糖残基が非修飾である。
【００６１】
いくつかの態様において、二本鎖分子は、以下の修飾の１または２以上を含む
ａ）アンチセンス鎖の５’末端から５、６、７、８または９位の少なくとも１つのＮが、２’５’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドから選択される、
ｂ）センス鎖の５’末端から９または１０位の少なくとも１つのＮ’が、２’５’ヌクレオチドおよびシュードウリジンから選択される、および
ｃ）（Ｎ’）ｙの３’末端位の４、５または６個の連続する位置のＮ’が、２’５’ヌクレオチドを含む。
【００６２】
いくつかの態様において、二本鎖分子は、以下の修飾の組合せを含む
ａ）アンチセンス鎖は、５’末端から５、６、７、８または９位の少なくとも１つに、２’５’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドを含む、および
ｂ）センス鎖は、５’末端から９または１０位に、２’５’ヌクレオチドおよびシュードウリジンの少なくとも１つを含む。
【００６３】
いくつかの態様において、二本鎖分子は、以下の修飾の組合せを含む
ａ）アンチセンス鎖は、５’末端から５、６、７、８または９位の少なくとも１つに、２’５’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドを含む、および
ｃ）センス鎖は、３’の最後から２番目または３’末端位に、４、５または６個の連続する２’５’ヌクレオチドを含む。
【００６４】
いくつかの態様において、センス鎖［（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘ］は、１、２、３、４、５、６、７、８または９個の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位に、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の態様において、アンチセンス鎖は、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位に、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の態様において、アンチセンス鎖は、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位に、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖は１または２以上の２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖の全てのピリミジンヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾を有する。いくつかの態様において、センス鎖は２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンを含む。
【００６５】
構造Ａ１および構造Ａ２のいくつかの態様において、センス鎖もアンチセンス鎖も、３’および５’末端がリン酸化されない。他の態様において、センス鎖またはアンチセンス鎖の一方または両方は、３’末端がリン酸化されている。
【００６６】
構造Ａ１および構造Ａ２のいくつかの態様において、（Ｎ’）ｙは、ミラーヌクレオチド、２’５’ヌクレオチドおよびＴＮＡから選択される少なくとも１個の非定型部分を含む。いくつかの態様において、非定型部分はミラーヌクレオチドである。種々の態様において、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−リボヌクレオチド（Ｌ−ＲＮＡ）およびＬ−デオキシリボヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡ）から選択される。好ましい態様において、ミラーヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。一部の態様において、センス鎖は、非定型部分を９または１０位（５’末端から）に含む。好ましい態様において、センス鎖は、非定型部分を９位（５’末端から）に含む。いくつかの態様において、センス鎖は長さが１９ヌクレオチドであり、４、５または６個の連続する非定型部分を１５位（５’末端から）に含む。いくつかの態様において、センス鎖は４個の連続する２’５’リボヌクレオチドを、１５、１６、１７および１８位に含む。いくつかの態様において、センス鎖は５個の連続する２’５’リボヌクレオチドを、１５、１６、１７、１８および１９位に含む。種々の態様において、センス鎖はＺ’をさらに含む。いくつかの態様において、Ｚ’は、Ｃ３ＯＨ部分またはＣ３Ｐｉ部分を含む。
【００６７】
構造Ａ１のいくつかの態様において、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１個のＬ−ＤＮＡ部分を含む。いくつかの態様において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１７および１９位における非修飾リボヌクレオチドと、３’の最後から２番目の位置の１個のＬ−ＤＮＡ（１８位）とからなる。他の態様において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１６および１９位の非修飾リボヌクレオチドと、３’の最後から２番目の位置の２個の連続するＬ−ＤＮＡ（１７および１８位）とからなる。種々の態様において、非定型部分は、隣接するヌクレオチドに２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合で連結したヌクレオチドである。種々の態様によれば、（Ｎ’）ｙは、２’−５’ヌクレオチド間結合で連結された２、３、４、５または６個の連続するリボヌクレオチドを３’末端に含む。一態様において、（Ｎ’）ｙの３’末端の４個の連続するヌクレオチドは、３個の２’−５’ホスホジエステル結合で連結しており、ここで、２’−５’ホスホジエステル結合を形成する２’−５’ヌクレオチドの１個または２個以上は、３’−Ｏ−メチル（３’ＯＭｅ）糖修飾をさらに含む。好ましくは、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。一部の態様において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは１５、１６、１７、１８および１９位に２個または３個以上の連続するヌクレオチドを含み、これは、隣接するヌクレオチドに２’−５’ヌクレオチド間結合で連結したヌクレオチド（２’−５’ヌクレオチド）を含む。種々の態様において、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチド（３’ＯＨの代わりに、３’Ｈまたは３’ＯＭｅ）を含む。いくつかの態様において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、２’−５’ヌクレオチドを、１５、１６および１７位に、隣接するヌクレオチドが１５〜１６、１６〜１７および１７〜１８位の間で２’−５’ヌクレオチド間結合により連結するように含むか、１５、１６、１７、１８および１９位に、隣接するヌクレオチドが１５〜１６、１６〜１７、１７〜１８および１８〜１９位の間で２’−５’ヌクレオチド間結合により連結し、かつ、３’ＯＨが３’末端ヌクレオチドにおいて利用可能となるように含むか、１６、１７および１８位に、隣接するヌクレオチドが１６〜１７、１７〜１８および１８〜１９位の間で２’−５’ヌクレオチド間結合により連結するように含む。いくつかの態様において、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、２’−５’ヌクレオチドを、１６および１７位または１７および１８位または１５および１７位に、隣接するヌクレオチドが１６〜１７および１７〜１８の間または１７〜１８および１８〜１９の間または１５〜１６および１７〜１８の間でそれぞれ２’−５’ヌクレオチド間結合により連結するように含む。他の態様において、（Ｎ’）ｙ中のピリミジンリボヌクレオチド（ｒＵ、ｒＣ）は、隣接するヌクレオチドに２’−５’ヌクレオチド間結合で連結するヌクレオチドに置換されている。いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１８、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８８に記載の配列ペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、３’末端に４個の２’−５’結合、特に、１５〜１６、１６〜１７、１７〜１８および１８〜１９位のヌクレオチドの間の結合で連結した５個の連続するヌクレオチドを含む。
【００６８】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１８、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８８に記載の配列ペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、３’末端に４個の２’−５’結合で連結した５個の連続するヌクレオチドを含み、任意に、独立して、逆位無塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３、１，３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップから選択されるＺ’およびｚ’をさらに含む。Ｃ３アルキルキャップは、３’または５’末端ヌクレオチドに共有結合的に連結している。いくつかの態様において、３’Ｃ３末端キャップは、３’ホスフェートをさらに含む。いくつかの態様において、３’Ｃ３末端キャップは、３’末端ヒドロキシ基をさらに含む。
【００６９】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１８、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８８に記載の配列ペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、Ｌ−ＤＮＡを１８位に含み、（Ｎ’）ｙは、任意に、独立して、逆位無塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３、１，３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップから選択されるＺ’およびｚ’をさらに含む。
【００７０】
いくつかの態様において、（Ｎ’）ｙは、３’末端ホスフェートを含む。いくつかの態様において、（Ｎ’）ｙは、３’末端ヒドロキシルを含む。
【００７１】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１８、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８８に記載の配列ペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位または２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１８、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８８に記載の配列ペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンを含む。いくつかの態様において、（Ｎ）ｘにおける全てのピリミジンは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。
【００７２】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２はリボアデノシン部分である。
【００７３】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、３’末端に４個の２’−５’結合、特に、１５〜１６、１６〜１７、１７〜１８および１８〜１９位のヌクレオチドの間の結合で連結した５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、結合はホスホジエステル結合を含む。
【００７４】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、３’末端に４個の２’−５’結合で連結した５個の連続するヌクレオチドを含み、任意に、独立して、逆位無塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３、１，３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップから選択されるＺ’およびｚ’をさらに含む。
【００７５】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、Ｌ−ＤＮＡを１８位に含み、（Ｎ’）ｙは、任意に、独立して、逆位無塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３、１，３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップから選択されるＺ’およびｚ’をさらに含む。
【００７６】
いくつかの態様において、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、３’末端ホスフェートを含む。いくつかの態様において、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、３’末端ヒドロキシルを含む。
【００７７】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ１＿５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位、または１、３、５、９、１１、１３、１５、１７、１９位、または３、５、９、１１、１３、１５、１７位、または２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ１＿５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、１１、１３、１５、１７および１９位（５’末端から）に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ１＿５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位、または、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ１＿５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列のペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
【００７８】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮ１＿５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２またはＳＥＲＰＩＮＨ１＿８６に記載の配列ペアから選択され、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンを含む。いくつかの態様において、（Ｎ）ｘにおける全てのピリミジンは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖はＬ−ＤＮＡまたは２’−５’ヌクレオチドを、５、６または７位（５’＞３’）にさらに含む。他の態様において、アンチセンス鎖は、５〜６または６〜７位（５’＞３’）のリボヌクレオチドの間に２’５’ヌクレオチド間結合を生成するリボヌクレオチドをさらに含む。
【００７９】
さらなる態様において、Ｎ１−（Ｎ）ｘはＺをさらに含み、ここでＺは非ヌクレオチドオーバーハングを含む。いくつかの態様において、非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３−Ｃ３［１，３−プロパンジオールモノ（リン二水素酸）］２である。
【００８０】
構造Ａ２のいくつかの態様において、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１個のＬ−ＤＮＡ部分を含む。いくつかの態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１６および１８位の非修飾リボヌクレオチドと、３’の最後から２番目の位置（１７位）の１個のＬ−ＤＮＡとからなる。他の態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１５および１８位の非修飾リボヌクレオチドと、３’の最後から２番目の位置の２個の連続するＬ−ＤＮＡ（１６および１７位）とからなる。種々の態様において、非定型部分は、隣接するヌクレオチドに２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合で連結しているヌクレオチドである。種々の態様によると、（Ｎ’）ｙは、３’末端における２’−５’ヌクレオチド間結合で連結された２、３、４、５または６個の連続するリボヌクレオチドを含む。一態様において、（Ｎ’）ｙの３’末端の４個の連続するヌクレオチドは、３個の２’−５’ホスホジエステル結合で連結しており、ここで、２’−５’ホスホジエステル結合を形成する２’−５’ヌクレオチドの１個または２個以上は、３’−Ｏ−メチル（３’ＯＭｅ）糖修飾をさらに含む。好ましくは、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。一部の態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙにおいて、１４、１５、１６、１７および１８位における２個または３個以上の連続するヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドに２’−５’ヌクレオチド間結合で連結したヌクレオチドを含む。種々の態様において、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１４〜１５、１５〜１６、１６〜１７および１７〜１８位の間、または、１５〜１６、１６〜１７および１７〜１８位の間、または１６〜１７および１７〜１８位の間、または１７〜１８位の間、または１５〜１６位および１７〜１８位の間の２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接するヌクレオチドに連結したヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１５〜１６、１６〜１７および１７〜１８位の間、または、１６〜１７および１７〜１８位の間の２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接するヌクレオチドに連結したヌクレオチドを含む。他の態様において、（Ｎ’）ｙ中のピリミジンリボヌクレオチド（ｒＵ、ｒＣ）は、隣接するヌクレオチドに２’−５’ヌクレオチド間結合で連結するヌクレオチドに置換されている。
【００８１】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、表Ａ−１８に記載され、本明細書中で、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２（配列番号６０および１２７）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６（配列番号６３および１３０）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ（配列番号９８および１６５）、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１（配列番号１０１および１６８）およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１ａ（配列番号１０５および１７２）として同定されるオリゴヌクレオチドペアから選択される。
【００８２】
いくつかの態様において、二本鎖核酸分子は、配列番号１２７に記載のアンチセンス鎖と、配列番号６０に記載のセンス鎖とを含み、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿２として同定される。いくつかの態様において、二本鎖核酸分子は、構造
【化１】
0005972408.tif 000002
を有し、ここで、各々の
【化２】
0005972408.tif 000003
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ’’は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である。
【００８３】
いくつかの態様において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、１個または２個以上の２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンおよび／またはプリン、５、６、７または８位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハングを含む、二本鎖核酸分子である。いくつかの態様において、センス鎖（配列番号６０）は、３’末端または３’の最後から２番目の位置における４個または５個の連続する２’５’ヌクレオチド、３’末端に共有結合により付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合により付着したキャップ部分を含む。他の態様において、センスが鎖（配列番号６０）は、１個または２個以上の２’ＯＭｅピリミジン、３’末端に共有結合により付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合により付着したキャップ部分を含む。
【００８４】
いくつかの態様において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、（５’＞３’）１、３、５、９、１１、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号６０）が、
ａ）１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、Ｃ３ＯＨ  ３’末端非ヌクレオチドオーバーハング、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または、
ｂ）１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端ホスフェート、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または、
ｃ）５、７、１３および１６位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、１８位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または、
ｄ）７、１３、１６および１８位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、９位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または、
ｅ）１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−Ｐｉ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分
を含むセンス鎖から選択される二本鎖核酸分子である。
【００８５】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、（５’＞３’）１、３、５、９、１１、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号６０）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、Ｃ３  ３’末端オーバーハング、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【００８６】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、（５’＞３’）１、３、５、９、１１、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ  ３’末端オーバーハングを含み、センス鎖（配列番号６０）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端ホスフェート、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【００８７】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、（５’＞３’）１、３、５、９、１１、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号６０）が、５、７、１３および１６位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、１８位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【００８８】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、（５’＞３’）１、３、５、９、１１、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号６０）が、７、１３、１６および１８位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、９位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【００８９】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、（５’＞３’）１、３、５、９、１１、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号６０）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−Ｐｉ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【００９０】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、（５’＞３’）１、３、５、９、１１、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドおよびＣ３-Ｃ３  ３’末端オーバーハングを含み、センス鎖（配列番号６０）が、７、９、１３、１６および１８位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【００９１】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号６０）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端ホスフェート、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１２７）が、
ａ）（５’＞３’）１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または
ｂ）（５’＞３’）１、３、６、８、１０、１２、１４、１７、１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分
の１つから選択されるアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子である。
【００９２】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるのは、配列番号１３０に記載のアンチセンス鎖と、配列番号６３に記載のセンス鎖とを含み、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿６として同定される二本鎖核酸分子である。いくつかの態様において二重鎖は、構造
【化３】
0005972408.tif 000004
を有し、ここで、各々の
【化４】
0005972408.tif 000005
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ’’は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である。
【００９３】
いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号６３）が、１個または２個以上の２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジン、３’末端ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハング、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む、二本鎖核酸分子である。いくつかの態様において、アンチセンス鎖（配列番号１３０）は、１個または２個以上の２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジン、３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む。
【００９４】
いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号６３）が、（５’＞３’）２、１４および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨまたはＣ３Ｐｉ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１３０）アンチセンス鎖が、
ａ）（５’＞３’）１、３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
ｂ）（５’＞３’）１、３、５、７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
ｃ）（５’＞３’）３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
ｄ）（５’＞３’）３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、１位におけるｄＵ、７位における２’−５’リボヌクレオチドおよび３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分
を含むアンチセンス鎖から選択される、二本鎖核酸分子である。
【００９５】
いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号６３）が、（５’＞３’）２、１４および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１３０）が、（５’＞３’）１、３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【００９６】
いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号６３）が、（５’＞３’）１４および１８位および任意に２位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１３０）が、（５’＞３’）１、３、５、７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二重鎖オリゴヌクレオチド分子である。
【００９７】
いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号６３）が、（５’＞３’）１４および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１３０）が、
ａ）（５’＞３’）１、３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
ｂ）（５’＞３’）１、３、５、７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分
を含むアンチセンス鎖から選択される、二重鎖オリゴヌクレオチド分子である。
【００９８】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号６３）が、（５’＞３’）１４および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１３０）が、（５’＞３’）１、３、５、７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【００９９】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号６３）が、（５’＞３’）１４および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１３０）が、（５’＞３’）１、３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、およびＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ  ３’末端オーバーハングを含む、二本鎖核酸分子である。
【０１００】
いくつかの態様において、二重鎖は、配列番号１６５に記載のアンチセンス鎖と、配列番号９８に記載のセンス鎖とを含み、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａとして同定される。いくつかの態様において二重鎖は、構造
【化５】
0005972408.tif 000006
を有し、ここで、各々の
【化６】
0005972408.tif 000007
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ’’は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である。
【０１０１】
いくつかの態様において，センス鎖（配列番号９８）は、（５’＞３’）１５、１６、１７および１８位、または１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分、および、５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む。いくつかの態様において、アンチセンス鎖（配列番号１６５）は、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンおよび／またはプリン、５、６、７または８位（５’＞３’）における２’−５’ヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分を含む。
【０１０２】
いくつかの態様において、センス鎖（配列番号９８）は、（５’＞３’）１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、Ｃ３ＰｉまたはＣ３−ＯＨ  ３’末端非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１６５）は、
ａ）（５’＞３’）２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、およびＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ  ３’末端オーバーハング、または、
ｂ）（５’＞３’）２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、およびＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ  ３’末端のオーバーハング、
ｃ）（５’＞３’）１、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、およびＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ  ３’末端オーバーハング、または、
ｄ）（５’＞３’）１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、およびＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ  ３’末端のオーバーハング
の１つから選択されるアンチセンス鎖を含む。
【０１０３】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号９８）が、（５’＞３’）１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、Ｃ３−ＯＨ  ３’末端部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１６５）が、（５’＞３’）２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、およびＣ３Ｐｉ−ＣＯＨ  ３’末端オーバーハングを含む、二本鎖核酸分子である。
【０１０４】
いくつかの態様において、二本鎖核酸分子は、配列番号１６８に記載のアンチセンス鎖と、配列番号１０１に記載のセンス鎖とを含み、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１として同定される。いくつかの態様において二重鎖は、構造
【化７】
0005972408.tif 000008
を有し、ここで、各々の
【化８】
0005972408.tif 000009
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ’’は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である。
【０１０５】
いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号１０１）が、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジン、任意に、９または１０位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分、および、任意に、５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む、二本鎖核酸分子である。いくつかの態様において、アンチセンス鎖（配列番号１６８）は、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンおよび／またはプリン、５、６、７または８位（５’＞３’）における２’−５’ヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分を含む。
【０１０６】
いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号１０１）が、（５’＞３’）４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジン、任意に、９または１０位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１６８）が、
ａ）（５’＞３’）１、８および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６または７位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨオーバーハング、または、
ｂ）（５’＞３’）１、４、８、１３および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６または７位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨオーバーハング末端、または、
ｃ）（５’＞３’）１、４、８、１１および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨオーバーハング、または、
ｄ）（５’＞３’）１、３、８、１２、１３および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分
を含むアンチセンス鎖から選される、二本鎖核酸分子である。
【０１０７】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０１）が、（５’＞３’）４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、任意に、９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１６８）が、（５’＞３’）１、８および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１０８】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０１）が、（５’＞３’）４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、任意に、９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１６８）が、（５’＞３’）１、４、８、１３および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１０９】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０１）が、（５’＞３’）４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１６８）が、（５’＞３’）１、４、８、１１および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１１０】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０１）が、（５’＞３’）４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１６８）が、（５’＞３’）１、３、８、１２、１３および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１１１】
いくつかの態様において、二本鎖核酸分子は、配列番号１７２に記載のアンチセンス鎖と、配列番号１０５に記載のセンス鎖とを含み、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１ａとして同定される。いくつかの態様において二重鎖は、構造
【化９】
0005972408.tif 000010
を有し、ここで、各々の
【化１０】
0005972408.tif 000011
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ’’は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である。
【０１１２】
いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号１０５）が、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジン、任意に、９または１０位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分、および、任意に、５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む二本鎖核酸分子である。いくつかの態様においてアンチセンス鎖（配列番号１７２）は、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンおよび／またはプリン、５、６、７または８位（５’＞３’）における２’−５’ヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分を含む。
【０１１３】
いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号１０５）が、（５’＞３’）４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジン、任意に、９または１０位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＰｉまたはＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１７２）が、
ａ）（５’＞３’）８および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６または７位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
ｂ）（５’＞３’）４、８、１３および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６または７位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
ｃ）（５’＞３’）４、８、１１および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
ｄ）（５’＞３’）３、８、１２、１３および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分
を含むアンチセンス鎖から選択される、二本鎖核酸分子である。
【０１１４】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０５）が、（５’＞３’）４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、任意に、９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１７２）が、（５’＞３’）８および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１１５】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０５）が、（５’＞３’）４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、任意に、９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１７２）が、（５’＞３’）４、８、１３および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１１６】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０５）が、（５’＞３’）４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１７２）が、（５’＞３’）４、８、１１および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１１７】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１０５）が、（５’＞３’）４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号１７２）が、（５’＞３’）３、８、１２、１３および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１１８】
いくつかの態様において、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、表Ａ−１９に記載され、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿４（配列番号１９５および２２０）およびＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２（配列番号１９６および２２１）として同定されるオリゴヌクレオチドペアから選択される。
【０１１９】
いくつかの態様において、二本鎖核酸分子は、配列番号２２０に記載のアンチセンス鎖と、配列番号１９４に記載のセンス鎖とを含み、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿４として同定される。いくつかの態様において二重鎖は、構造
【化１１】
0005972408.tif 000012
を有し、ここで、各々の
【化１２】
0005972408.tif 000013
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ’’は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である。
【０１２０】
いくつかの態様において、提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、（５’＞３’）３、５、９、１１、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号１９５）が
ａ）１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または
ｂ）１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端ホスフェート、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または、
ｃ）（５’＞３’）５、７、１３および１６位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、１８位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または、
ｄ）（５’＞３’）７、１３、１６および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、９位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分、または、
ｅ）１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分
を含むセンス鎖から選択される、二本鎖核酸分子である。
【０１２１】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、（５’＞３’）３、５、９、１１、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号１９５）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１２２】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、（５’＞３’）３、５、９、１１、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号１９５）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端ホスフェート、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１２３】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、（５’＞３’）３、５、９、１１、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号１９５）が、（５’＞３’）５、７、１３および１６位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、１８位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１２４】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、（５’＞３’）３、５、９、１１、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号１９５）が、（５’＞３’）７、１３、１６および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、９位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１２５】
本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、（５’＞３’）３、５、９、１１、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号１９５）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１２６】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるのは、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、（５’＞３’）３、５、９、１１、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含み、センス鎖（配列番号１９５）が、（５’＞３’）７、９、１３、１６および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１２７】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１９５）が、１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端ホスフェート、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号２２０）が、
ａ）（５’＞３’）３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または
ｂ）（５’＞３’）１、３、６、８、１０、１２、１４、１７、１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分
の１つから選択されるアンチセンス鎖を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１２８】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるのは、配列番号１３０に記載のアンチセンス鎖と、配列番号６３に記載のセンス鎖とを含み、本明細書においてＳＥＲＰＩＮＨ１＿４として同定される二本鎖核酸分子である。いくつかの態様において二重鎖は、構造
【化１３】
0005972408.tif 000014
を有し、ここで、各々の
【化１４】
0005972408.tif 000015
は、リボヌクレオチド間の塩基対合を表し、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕの各々は、独立して、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非定型部分であり、
ＺおよびＺ’の各々は、独立して、存在するか、または不在であるが、存在する場合は、独立して、それが存在する鎖の３’末端に共有結合的に付着した、１〜５個の連続するヌクレオチド、または非ヌクレオチド部分またはその組合せであり、
ｚ’’は存在しても、または不在であってもよいが、存在する場合はＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に付着したキャッピング部分である。
【０１２９】
いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号１９６）が、１個または２個以上の２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジン、３’末端ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドオーバーハング、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む、二本鎖核酸分子である。いくつかの態様において、アンチセンス鎖（配列番号２２１）は、１個または２個以上の２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジン、３’末端に共有結合的に付着したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む。
【０１３０】
いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号１９６）が、（５’＞３’）２、１４および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号２２１）が、
ａ）（５’＞３’）３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
ｂ）（５’＞３’）３、５、７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分
を含むアンチセンス鎖から選択される、二本鎖核酸分子である。
【０１３１】
いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号１９６）が、（５’＞３’）２、１４および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号２２１）が、（５’＞３’）３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１３２】
いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号１９６）が、（５’＞３’）１４および１８位および任意に２位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号２２１）が、（５’＞３’）３、５、７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二重鎖オリゴヌクレオチド分子である。
【０１３３】
いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖（配列番号１９６）が、（５’＞３’）１４および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号２２１）が、
ａ）（５’＞３’）３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分、または、
ｂ）（５’＞３’）３、５、７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分
を含むアンチセンス鎖から選択される、二重鎖オリゴヌクレオチド分子である。
【０１３４】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１９６）が、（５’＞３’）１４および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号２２１）が、（５’＞３’）１、３、５、９、１１、１３、１５および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含むアンチセンス鎖から選択される、二本鎖核酸分子である。
【０１３５】
本明細書において提供されるのは、センス鎖（配列番号１９６）が、（５’＞３’）１４および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖（配列番号２２１）が、（５’＞３’）１、３、５，７、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分を含む、二本鎖核酸分子である。
【０１３６】
構造Ａ１およびＡ２のさらなる態様において、（Ｎ’）ｙは、１〜８個の修飾リボヌクレオチドを含み、ここで、修飾リボヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドである。一部の態様において、（Ｎ’）ｙは、１、２、３、４、５、６、７個または８個までのＤＮＡ部分を含む。
【０１３７】
いくつかの態様において、ＺおよびＺ’のいずれか一方が存在し、独立して２個の非ヌクレオチド部分を含む。
【０１３８】
さらなる態様において、ＺおよびＺ’が存在し、各々は独立して、２個の非ヌクレオチド部分を含む。
【０１３９】
いくつかの態様において、ＺおよびＺ’の各々は、無塩基部分、例えばデオキシリボ無塩基部分（本明細書において「ｄＡｂ」と称する）またはリボ無塩基部分（本明細書において「ｒＡｂ」と称する）を含む。いくつかの態様において、Ｚおよび／またはＺ’の各々は、２個の共有結合的に連結した無塩基部分を含み、例えば、ｄＡｂ−ｄＡｂまたはｒＡｂ−ｒＡｂまたはｄＡｂ−ｒＡｂまたはｒＡｂ−ｄＡｂであり、ここで、各々の部分は隣接する部分に共有結合により、好ましくはリン酸ベース（phospho-based）の結合を介して、付着している。いくつかの態様において、リン酸ベースの結合は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテートまたはホスホジエステル結合を含む。好ましい態様において、リン酸ベースの結合は、ホスホジエステル結合を含む。
【０１４０】
いくつかの態様において、Ｚおよび／またはＺ’の各々は、独立して、アルキル部分、任意にプロパン［（ＣＨ２）３］部分（Ｃ３）、または、プロパノール（Ｃ３−ＯＨ）およびプロパンジオール（「Ｃ３〜３’Ｐｉ」）を含むその誘導体を含む。いくつかの態様において、Ｚおよび／またはＺ’の各々は、アンチセンス鎖またはセンス鎖の３’末端にホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して共有結合により結合し、互いにホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して共有結合により結合した２個のアルキル部分を含み、いくつかの例において、これはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨである。センス鎖の３’末端および／またはアンチセンス鎖の３’末端は、Ｃ３部分にリン酸ベースの結合を介して共有結合的に付着しており、Ｃ３部分は、Ｃ３−ＯＨ部分にリン酸ベースの結合を介して共有結合的に結合している。いくつかの態様において、リン酸ベースの結合は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテートまたはホスホジエステル結合を含む。好ましい態様において、リン酸ベースの結合は、ホスホジエステル結合を含む。
【０１４１】
構造Ａ１または構造Ａ２の種々の態様において、ＺおよびＺ’は不在である。他の態様において、ＺまたはＺ’は存在する。いくつかの態様において、Ｚおよび／またはＺ’の各々は、独立して、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６アルキル部分、任意に、Ｃ３［プロパン、−（ＣＨ２）３−］部分、または、プロパノール（Ｃ３−ＯＨ／Ｃ３ＯＨ）、プロパンジオール、およびプロパンジオールのホスホジエステル誘導体（「Ｃ３Ｐｉ」）を含むその誘導体を含む。好ましい態様において、Ｚおよび／またはＺ’の各々は、２個の炭化水素部分を含み、いくつかの例においてそれはＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。各々のＣ３は、共有結合、好ましくはリン酸ベースの結合を介して、隣接するＣ３に共有結合している。いくつかの態様において、リン酸ベースの結合は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテートまたはホスホジエステル結合である。
【０１４２】
具体的な態様において、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｚは、少なくとも１個のＣ３アルキルオーバーハングを含む。いくつかの態様において、Ｃ３−Ｃ３オーバーハングは、（Ｎ）ｘまたは（Ｎ’）ｙの３’末端に、共有結合、好ましくはホスホジエステル結合を介して、共有結合的に付着している。いくつかの態様において、第１のＣ３と第２のＣ３との間の結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの態様において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。いくつかの態様において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓである。いくつかの態様において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ（ＯＨは、ヒドロキシである）である。いくつかの態様において、３’非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨである。
【０１４３】
種々の態様において、アルキル部分は、末端ヒドロキシル基、末端アミノ基または末端リン酸基を含む、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキルまたはＣ６アルキル部分を含むアルキル誘導体を含む。いくつかの態様において、アルキル部分は、Ｃ３アルキルまたはＣ３アルキル誘導体部分である。いくつかの態様において、Ｃ３アルキル部分は、プロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエートまたはこれらの組合せを含む。Ｃ３アルキル部分は、（Ｎ’）ｙの３’末端および／または（Ｎ）ｘの３’末端に、ホスホジエステル結合を介して共有結合的に連結している。いくつかの態様において、アルキル部分は、プロパノール、プロピルホスフェートまたはプロピルホスホロチオエートを含む。いくつかの態様において、ＺおよびＺ’の各々は、独立して、プロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、これらの組合せまたはこれらを複数含むもの（multiple）、特に共有結合的に連結した２個または３個のプロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエートまたはその組合せから選択される。いくつかの態様において、ＺおよびＺ’の各々は、独立して、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホ−プロパノール、プロピルホスホ−プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホ−プロピルホスフェート、（プロピルホスフェート）３、（プロピルホスフェート）２−プロパノール、（プロピルホスフェート）２−プロピルホスホロチオエートから選択される。任意のプロパンでもまたはプロパノール結合部分を、ＺまたはＺ’に含めることができる。
【０１４４】
例示的な３’末端の非ヌクレオチド部分の構造は以下のとおりである：
【化１５】
0005972408.tif 000016
【０１４５】
いくつかの態様において、ＺおよびＺ’の各々は、独立して、プロパノール、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、これらの組合せまたはまたはこれらを複数含むものから選択される。
【０１４６】
いくつかの態様において、ＺおよびＺ’の各々は、独立して、プロピルホスフェート、プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホ−プロパノール、プロピルホスホ−プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホ−プロピルホスフェート、（プロピルホスフェート）３、（プロピルホスフェート）２−プロパノール、（プロピルホスフェート）２−プロピルホスホロチオエートから選択される。任意のプロパンでもまたはプロパノール結合部分を、ＺまたはＺ’に含めることができる。
【０１４７】
さらなる態様において、Ｚおよび／またはＺ’の各々は、無塩基部分と非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは非修飾リボヌクレオチドとの組合せ、または、炭化水素部分と非修飾デオキシリボヌクレオチドまたは非修飾リボヌクレオチドとの組合せ、または、無塩基部分（デオキシリボまたはリボ）と炭化水素部分との組合せを含む。かかる態様において、Ｚおよび／またはＺ’の各々はＣ３−ｒＡｂまたはＣ３−ｄＡｂを含み、ここで各々の部分は、隣接する部分に、リン酸ベースの結合、好ましくはホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホノアセテート結合を介して、共有結合的に結合している。
【０１４８】
一部の態様において、本明細書で開示される核酸分子は、下記の表Ａ−１８およびＡ−１９にそれぞれ示す、オリゴ番号２〜６７または６８〜９２のいずれかから選択されるセンスオリゴヌクレオチド配列を含む。
【０１４９】
一部の好ましい態様において、提供される化合物は、本明細書に記載の化合物＿１、化合物＿２、化合物＿３、化合物＿４、化合物＿５、化合物＿６、化合物＿７、化合物＿８および化合物＿９を含む。
【０１５０】
いくつかの態様（例えば、本明細書に記載の化合物＿１、化合物＿５および化合物＿６など）において、提供されるのは、アンチセンス鎖が配列番号１２７であり、センス鎖が配列番号６０である、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。一部の態様において、提供されるのは、アンチセンス鎖が配列番号１２７であり、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、少なくとも１、５、６または７位における２’−５’リボヌクレオチド、および、３’末端に共有結合的に付着した３’末端非ヌクレオチド部分を含み、センス鎖が配列番号６０であり、少なくとも１個の２’５’リボヌクレオチドまたは２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含む、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。いくつかの態様において、提供されるのは、アンチセンス鎖が配列番号１２７であり、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した３’末端Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分を含み、センス鎖が配列番号６０であり、３’末端の１５、１６、１７、１８および１９位（５’＞３’）における５個の連続する２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含む、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。
【０１５１】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿１であり、ここで、アンチセンス鎖は配列番号１２７であり、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分を含み、センス鎖は配列番号６０であり、３’末端の１５、１６、１７、１８および１９位（５’＞３’）における５個の連続する２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含み、アンチセンス鎖の１位に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドをさらに含む。
【０１５２】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿６であり、ここで、アンチセンス鎖は配列番号１２７であり、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分を含み、センス鎖は配列番号６０であり、３’末端の１５、１６、１７、１８および１９位（５’＞３’）における５個の連続する２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含み、アンチセンス鎖の１位に２’５’リボヌクレオチドをさらに含む。
【０１５３】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿６であり、ここで、アンチセンス鎖は配列番号１２７であり、１、３、５、９、１１、１３、１５、１７および１９位（５’＞３’）における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分を含み、センス鎖は配列番号６０であり、（５’＞３’）７、１３、１６および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基部分を含む。
【０１５４】
いくつかの態様（例えば、本明細書に記載の化合物＿２および化合物＿７など）において、提供されるのは、センス鎖が配列番号６３であり、アンチセンス鎖が配列番号１３０である、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖が配列番号６３であり、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンリボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含み、アンチセンス鎖が配列番号１３０であり、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分を含む、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖が配列番号６３であり、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含み、アンチセンス鎖が配列番号１３０であり、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、５、６または７位の少なくとも１つにおける２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分を含む、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。
【０１５５】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿２であり、ここで、センス鎖は配列番号６３であり、（５’＞３’）２、１４および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号１３０であり、（５’＞３’）１、３、５、９、１２、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、５、６または７位の少なくとも１つにおける２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分を含む。
【０１５６】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿７であり、ここで、センス鎖は配列番号６３であり、（５’＞３’）２、１４および１８位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号３０であり、（５’＞３’）１、３、５、９、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分を含む。
【０１５７】
いくつかの態様（例えば、本明細書に記載の化合物＿３など）において、提供されるのは、センス鎖が配列番号９８であり、アンチセンス鎖が配列番号１６５である、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖が配列番号９８であり、３’末端の位置における２個以上の２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分、および、５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号１６５であり、２個以上の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、５、６または７位の少なくとも１つにおける２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分を含む、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿３であり、ここで、センス鎖は配列番号９８であり、（５’＞３’）１５、１６、１７、１８および１９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３−ＯＨ  ３’部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号1６５であり、（５’＞３’）２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、７位における２’−５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着したＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｏを含む。
【０１５８】
いくつかの態様（例えば、本明細書に記載の化合物＿４、化合物＿８および化合物＿９など）において、提供されるのは、センス鎖が配列番号１０１であり、アンチセンス鎖が配列番号１６８である、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子でである。いくつかの態様において、提供されるのは、センス鎖が配列番号１０１であり、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンリボヌクレオチド、任意に９または１０位のうちの１つにおける２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分および５’末端に共有結合的に付着したキャップ部分を含み、アンチセンス鎖が配列番号１６８であり、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、５、６または７位の少なくとも１つにおける２’５’リボヌクレオチドおよび３’末端に共有結合的に付着した非ヌクレオチド部分を含む、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である。
【０１５９】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿４であり、ここで、センス鎖は配列番号１０１であり、（５’＞３’）４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、９位における２’−５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号１６８であり、（５’＞３’）１、４、８、１１および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した３’Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨオーバーハングを含む。
【０１６０】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿８であり、ここで、センス鎖は配列番号１０１であり、（５’＞３’）４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号１６８であり、（５’＞３’）１、４、８、１３および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、および３’末端に共有結合的に付着した３’Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨオーバーハングを含む。
【０１６１】
一態様において、提供されるのは、１９ｍｅｒの二本鎖核酸分子である化合物＿８であり、ここで、センス鎖は配列番号１０１であり、（５’＞３’）２、４、１１、１３および１７位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着したＣ３ＯＨ非ヌクレオチド部分、および５’末端に共有結合的に付着した逆位無塩基デオキシリボヌクレオチド部分を含み、アンチセンス鎖は配列番号１６８であり、（５’＞３’）１、４、８、１１および１５位における２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド、６位における２’５’リボヌクレオチド、３’末端に共有結合的に付着した３’Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ非ヌクレオチド部分を含む。
【０１６２】
別の側面において、提供されるのは、本明細書において提供される核酸分子を、ｈｓｐ４７の発現を低減するのに十分な量で細胞に導入することにより、細胞においてｈｓｐ４７の発現を低減する方法である。一態様において、細胞は肝星細胞である。別の態様において、細胞は腎臓または肺組織における星細胞である。一部の態様において、方法はin vitroで行われ、他の態様において、方法はin vivoで行われる。
【０１６３】
さらに別の側面において、提供されるのは、ｈｓｐ４７に関連する疾患を患う個体を処置する方法である。方法は、個体に、例えば本明細書において提供される核酸分子などを、ｈｓｐ４７の発現を低減するのに十分な量で投与することを含む。一部の態様において、ｈｓｐ４７に関連する疾患は肝線維症、肝硬変、肺線維症（ＩＬＦを含む）を含む肺の線維症、腎線維症を惹起するあらゆる状態（例えば、ＥＳＲＤを含むＣＫＤ）、腹膜線維症、慢性肝損傷、原線維形成、他の臓器における線維性疾患、偶発的および医原性（手術）の全ての可能な種類の皮膚損傷に関連する異常な瘢痕化（ケロイド）、強皮症、心線維症、緑内障濾過手術の失敗、および腸管癒着症からなる群から選択される疾患である。いくつかの態様において、化合物は臓器特異的な適応症、例えば下記の表２に示すものを含む適応症の処置に有用たり得る。
【０１６４】
【表１】
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【０１６５】
いくつかの態様において、好ましい適応症は、肝移植後Ｃ型肝炎による肝硬変、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）による肝硬変、特発性肺線維症、肺線維症につながる放射線肺炎、糖尿病性腎症、持続携帯式腹膜透析（ＣＡＰＤ）に関連する腹膜硬化症および眼瘢痕性類天疱瘡を含む。
【０１６６】
線維性の肝の適応症は、アルコール性肝硬変、Ｂ型肝炎肝硬変、Ｃ型肝炎肝硬変、同所性肝移植後のＣ型肝炎（Ｈｅｐ  Ｃ）肝硬変、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤ、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、胆道閉鎖症、アルファ１抗トリプシン欠乏症（Ａ１ＡＤ）、銅蓄積症（ウイルソン病）、フルクトース血症、ガラクトース血症、糖原病（特にＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＩＸおよびＸ型）、鉄過剰症候群（ヘモクロマトーシス）、脂質異常（例えばゴーシェ病）、ペルオキシソーム障害（例えばツェルヴェーガー症候群）、チロシン血症、先天性肝線維症、細菌感染症（例えばブルセラ症）、寄生虫疾患（例えば包虫症）、バット・キアリ症候群（肝静脈閉塞性疾患）を含む。
【０１６７】
肺の適応症は、特発性肺線維症、珪肺症、塵肺症、新生児呼吸窮迫症候群に続発する新生児における気管支肺異形成症、ブレオマイシン／化学性肺損傷、肺移植後閉塞性細気管支炎（ＢＯＳ）、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、喘息を含む。
【０１６８】
心臓の適応症は、心筋症、アテローム性硬化症（バージャー病など）、心内膜心筋線維症、心房細動、心筋梗塞（ＭＩ）後瘢痕形成を含む。
他の胸部の適応症は、テクスチャードタイプの乳房インプラント周囲における放射線による被膜組織反応（Radiation-induced capsule tissue reactions）および口腔粘膜下線維症を含む。
【０１６９】
腎臓の適応症は、常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）、糖尿病性腎症（糖尿病性糸球体硬化症）、ＦＳＧＳ（崩壊性、他の組織学的変種）、ＩｇＡ腎症（バージャー病）、ループス腎炎、ウェゲナー病、強皮症、グッドパスチャー症候群、尿細管間質性線維症、薬剤性（保護的）、ペニシリン、セファロスポリン、鎮痛性腎症、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、先天性腎症、腎髄質嚢胞症、爪膝蓋骨症候群およびアルポート症候群を含む。
【０１７０】
骨髄の適応症は、リンパ脈管筋腫症（ＬＡＭ）、慢性移植片対宿主病、真性多血症、本態性血小板血症、骨髄線維症を含む。
【０１７１】
眼の適応症は、未熟児網膜症（ＲｏＰ）、眼瘢痕性類天疱瘡、涙腺線維化、網膜復位術、角膜混濁、ヘルペス角膜炎、翼状片、緑内障、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ／ＡＲＭＤ）、真性糖尿病（ＤＭ）網膜症に関連する網膜線維症を含む。
【０１７２】
婦人科の適応症は、瘢痕形成の防止のためにホルモン療法に合併する子宮内膜症、ＳＴＤ後の線維症／卵管炎を含む。
【０１７３】
全身性の適応症は、デュピュイトラン病、手掌線維腫症、ペイロニー病、レダーホース病、ケロイド、多巣性線維硬化症、腎性全身性線維症、腎性骨髄線維症（貧血症）を含む。
【０１７４】
傷害関連性線維性疾患（injury associated fibrotic diseases）は熱傷性（化学物質を含む）の皮膚および軟部組織の瘢痕形成および収縮、がん放射線治療後の放射線による皮膚および器官の瘢痕形成、ケロイド（皮膚）を含む。
【０１７５】
外科的な適応症は、腹膜透析カテーテル後の腹膜線維症、角膜移植、人工内耳、他の移植物、胸部へのシリコーン移植物、慢性副鼻腔炎、癒着、透析グラフトの偽内膜過形成を含む。
【０１７６】
他の適応症は、慢性膵炎を含む。
【０１７７】
いくつかの態様において、提供されるのは、肝線維症を患う対象を処置する方法であって、該対象に、本明細書に開示される核酸分子の有効量を投与することを含み、それによって肝線維症を処置する方法である。いくつかの態様において、対象は肝炎による肝硬変を患っている。いくつかの態様において、対象はＮＡＳＨによる肝硬変を患っている。
【０１７８】
いくつかの態様において、提供されるのは、肝線維症を処置するための薬物の製造のための、本明細書に開示される核酸分子の使用である。いくつかの態様において、肝線維症は、肝炎によるものである。いくつかの態様において、肝線維症は、ＮＡＳＨによるものである。
【０１７９】
いくつかの態様において、提供されるのは、瘢痕組織をリモデリングするための方法であって、本明細書に開示される核酸分子の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、それによって瘢痕組織リモデリングをもたらす方法である。いくつかの態様において、瘢痕組織は肝臓にある。いくつかの態様において、対象は肝炎による肝硬変を患っている。いくつかの態様において、対象はＮＡＳＨによる肝硬変を患っている。
【０１８０】
いくつかの態様において、提供されるのは、線維化の消退をもたらすための方法であって、本明細書に開示される核酸分子の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、それによって線維化の消退をもたらす方法である。
【０１８１】
いくつかの態様において、提供されるのは、対象における瘢痕組織の縮小のための方法であって、瘢痕組織を縮小するために、該対象に本明細書に開示される核酸分子の有効量を投与するステップを含む方法である。いくつかの態様において、提供されるのは、対象における瘢痕組織を縮小するための方法であって、瘢痕組織を縮小するために、本明細書に開示される核酸分子の有効量を瘢痕組織に局所的に適用するステップを含む方法である。
【０１８２】
いくつかの態様において、提供されるのは、瘢痕組織の外観を改善する方法であって、瘢痕組織の外観を改善するために、本明細書に開示される核酸分子の有効量を瘢痕組織に局所的に適用するステップを含む方法である。
【０１８３】
いくつかの態様において、提供されるのは、肺線維症を患う対象の処置のための方法であって、対象に本明細書に開示される核酸分子の有効量を投与することを含み、それによって肺線維症を処置する方法である。いくつかの態様において、対象は間質性肺線維症（ＩＬＦ）を患っている。いくつかの態様において、対象は肺線維症につながる放射線肺炎を患っている。いくつかの態様において、対象は薬剤性肺線維症を患っている。
【０１８４】
いくつかの態様において、提供されるのは、肺線維症を処置するための薬物の製造のための、本明細書に開示される核酸分子の使用である。いくつかの態様において、肺線維症はＩＬＦである。いくつかの態様において、肺線維症は、薬剤性または放射線性肺線維症である。
【０１８５】
一側面において、提供されるのは、薬学的に許容し得る担体中の、本明細書に記載の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）を含む医薬組成物である。一部の態様において、医薬製剤は、患者などの個体に核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）を送達するのに適した送達システム、例えば、以下にさらに詳細に記述される送達システムを含むか、これを伴う。
【０１８６】
関連する側面において、提供されるのは、患者による使用のためにパッケージされた、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）を含む組成物またはキットである。パッケージは、ラベルを付されていても、パッケージラベルまたは添付文書を含んでいてもよく、これは、パッケージの内容を示し、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）が患者によりどのように使用されるべきか、または、どのように使用することができるかに関するある種の情報を提供し、例えば、ラベルは投薬情報および／または使用適応を含んでもよい。一部の態様において、ラベルの内容は、政府関係機関、例えば米国食品医薬品局によって定められた形式の通知を有する。一部の態様において、ラベルは核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）が、ｈｓｐ４７に関連する疾患を患う患者を処置するために適することを示してもよく、例えば、ラベルは、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）が線維性疾患を治療するために適することを示してもよく、または、例えば、ラベルは、核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）が線維症、肝線維症、肝硬変、肺線維症、腎線維症、腹膜線維症、慢性肝損傷および原線維形成からなる群から選択される疾患を処置するために適することを示してもよい。
【０１８７】
本明細書で用いる場合、用語「熱ショックタンパク質４７」または「ｈｓｐ４７」または「ＨＳＰ４７」は互換可能に用いられ、あらゆる熱ショックタンパク質４７、あらゆるｈｓｐ４７タンパク質活性を有するペプチドまたはポリペチドを指す。熱ショックタンパク質４７はセリンプロテイナーゼ阻害剤（セルピン）であり、例えば、セルピンペプチダーゼ阻害剤、クレードＨ（clade H）、メンバー１（ＳＥＲＰＩＮＨ１）、ＳＥＲＰＩＮＨ２、コラーゲン結合タンパク質１（ＣＢＰ１）、ＣＢＰ２、ｇｐ４６、ヒ素トランス活性化タンパク質３（ＡｓＴＰ３）、ＨＳＰ４７、増殖誘導遺伝子１４（ＰＩＧ１４）、ＰＰＲＯＭ、関節リウマチ抗原Ａ−４７（ＲＡ−Ａ４７）、コリジン（colligin）−１およびコリジン−２としても知られている。一部の好ましい態様において、「ｈｓｐ４７」はヒトｈｓｐ４７を指す。熱ショックタンパク質４７（または、より具体的にヒトｈｓｐ４７）は、配列番号２（図７）と同じか、または実質的に同じアミノ酸配列を有してもよい。
【０１８８】
本明細書で用いる場合、用語「ｈｓｐ４７をコードするヌクレオチド配列」は、ｈｓｐ４７タンパク質またはその部分をコードするヌクレオチド配列を意味する。用語「ｈｓｐ４７をコードするヌクレオチド配列」はまた、ｈｓｐ４７コード配列、例えばｈｓｐ４７アイソフォーム、変異体ｈｓｐ４７遺伝子、ｈｓｐ４７遺伝子のスプライスバリアント、およびｈｓｐ４７遺伝子多型を含むものとする。ｈｓｐ４７をコードする核酸配列は、ｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡ配列を含み、それはまた、「ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡ」と称することもある。ヒトｈｓｐ４７  ｍＲＮＡの例示的な配列は、配列番号１である。
【０１８９】
本明細書で用いる場合、用語「核酸分子」または「核酸」は、互換可能に用いられ、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。「核酸分子」のバリエーションは、本明細書にさらに詳細に記載されている。核酸分子は、本明細書に記載の修飾核酸分子と非修飾核酸分子の両方を含む。核酸分子は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを、あらゆる組合せで含んでもよい。
【０１９０】
本明細書で用いる場合、用語「ヌクレオチド」は、糖（またはそのアナログ、または修飾糖）、ヌクレオチド塩基（またはそのアナログ、または修飾塩基）およびリン酸基（またはそのアナログ、または修飾リン酸基）を有する化学部分を指す。ヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドの両方を含む。本明細書で用いる場合、ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド（例えば非修飾デオキシリボヌクレオチド）、リボヌクレオチド（例えば非修飾リボヌクレオチド）、および修飾ヌクレオチドアナログを含んでもよく、修飾ヌクレオチドアナログは、とりわけ、ロックド核酸および非ロックド（unlocked）核酸、ペプチド核酸、Ｌ−ヌクレオチド（ミラーヌクレオチドとも称する）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アラビノシド、ＰＡＣＥ、六炭糖を有するヌクレオチド、ならびに、しばしば非ヌクレオチドとみなされるヌクレオチドアナログ（無塩基ヌクレオチドを含む）を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチドは、糖、ヌクレオチド塩基および/またはリン酸基が、当該技術分野において既知の任意の修飾（例えば、本明細書に記載された修飾）で修飾されていてもよい。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、連結されたヌクレオチドの鎖を指す。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、同様に、当該技術分野において周知のように、および/または、本明細書に開示されているように、ヌクレオチド糖、ヌクレオチド塩基およびリン酸骨格に修飾を有してもよい。
【０１９１】
本明細書で用いる場合、用語「短鎖干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」または「短鎖干渉核酸分子」は、遺伝子発現またはウイルス複製を調節することができるあらゆる核酸分子を指す。好ましくは、ｓｉＮＡは遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方調節する。ｓｉＮＡは、限定されずに、配列特異的ＲＮＡｉを誘導することができる核酸分子、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）などを含む。本明細書で用いる場合、「短鎖干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」または「短鎖干渉核酸分子」は、本明細書の別の箇所でより詳細に記載された意味を有する。
【０１９２】
本明細書で用いる場合、用語「相補的」は、核酸が、他の核酸配列と、古典的なワトソン−クリック型か、または他の非古典的なタイプにより水素結合を形成できることを意味する。本明細書に開示される核酸分子に関して、核酸分子の、その相補配列との結合自由エネルギーは、核酸が、関連する機能、例えばＲＮＡｉ作用を遂行することを許容するのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は当該技術分野において周知である（例えば、Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp. 123-133、Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377、Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785を参照）。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対）を形成することができる核酸分子の連続する残基のパーセンテージを示す（例えば、第１のオリゴヌクレオチドの合計１０ヌクレオチドのうち５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、１０個のヌクレオチドを有する第２の核酸配列と塩基対を形成することは、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％の相補性を表す）。「完全に相補的」は、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列における同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。一態様において、本明細書に開示される核酸分子は、１または２以上の標的核酸分子またはその部分に相補的なヌクレオチドを、約１５〜約３５個以上（例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５個以上）含む。
【０１９３】
本明細書で用いる場合、用語「センス領域」は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域と（部分的にまたは完全に）相補的なｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含んでもよい。本明細書で用いる場合、「センス鎖」は、センス領域を含み、また追加のヌクレオチドを含んでもよい核酸分子を指す。
【０１９４】
本明細書で用いる場合、用語「アンチセンス領域」は、標的核酸配列と（部分的にまたは完全に）相補的なｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖は、ｓｉＮＡ分子のセンス領域に相補的な核酸配列を任意に含むことができる。本明細書で用いる場合、「アンチセンス鎖」はアンチセンス領域を含み、また追加のヌクレオチドを含んでもよい核酸分子を指す。
【０１９５】
本明細書で用いる場合、用語「ＲＮＡ」は、少なくとも１個のリボヌクレオチド残基を含む分子を指す。
【０１９６】
本明細書で用いる場合、用語「二重鎖領域」は、相補的か実質的に相補的な２個のオリゴヌクレオチドにおいて、ワトソン−クリック型塩基対、または、相補的か実質的に相補的な２個のオリゴヌクレオチド鎖の間での二重鎖を可能にする他の任意の方法によって、互いに塩基対を形成する領域を指す。例えば、２１ヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチド鎖は、２１ヌクレオチド単位の別のオリゴヌクレオチドと塩基対を形成するが、二重鎖領域が１９塩基対からなるよう、各々の鎖の１９塩基のみが相補的か実質的に相補的であってもよい。残りの塩基対は、例えば、５’および３’オーバーハングとして存在してもよい。さらに、二重鎖領域内で１００％の相補性は必要とされず、実質的な相補性が二重鎖領域内で許容される。実質的な相補性は、生物学的条件下でアニーリングできる鎖間の相補性を指す。２本の鎖が生物学的条件下でアニーリングができるかを実験的に決定する技法は、当該技術分野において周知である。あるいは、２本の鎖を合成し、生物学的条件下で一緒に添加して、これらが互いにアニーリングするかを決定することができる。
【０１９７】
本明細書で用いる場合、用語「非対合（non-pairing）ヌクレオチドアナログ」は、非塩基対部分を含むヌクレオチドアナログを意味し、非塩基対部分は、限定されずに、６デスアミノアデノシン（ネブラリン）、４−Ｍｅ−インドール、３−ニトロピロールｎ、５−ニトロインドール、Ｄｓ、Ｐａ、Ｎ３−ＭｅリボＵ、Ｎ３−ＭｅリボＴ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＴ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＡ、Ｎ３−エチル−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣを含む。いくつかの態様において、非塩基対ヌクレオチドアナログは、リボヌクレオチドである。他の態様において、それはデオキシリボヌクレオチドである。
【０１９８】
本明細書で用いる場合、用語「末端官能基」は、限定されずに、ハロゲン、アルコール、アミン、カルボン酸、エステル、アミド、アルデヒド、ケトン、エーテル基を含む。
【０１９９】
本明細書で用いる「無塩基ヌクレオチド」または「無塩基ヌクレオチドアナログ」は、本明細書および当該技術分野において、しばしば、偽ヌクレオチドまたは非定型部分とも称することがある。ヌクレオチドは核酸のモノマー単位であり、一般的に、リボースまたはデオキシリボース糖、リン酸、および塩基（ＤＮＡにおけるアデニン、グアニン、チミンまたはシトシン、ＲＮＡにおけるアデニン、グアニン、ウラシルまたはシトシン）からなるが、無塩基または偽ヌクレオチドは塩基を欠き、したがって、厳密には、当該技術分野で一般的に用いられる用語としてのヌクレオチドではない。無塩基デオキシリボース部分は、例えば、無塩基デオキシリボース−３’−ホスフェート、１，２−ジデオキシ−Ｄ−リボフラノース−３−ホスフェート、１，４−アンヒドロ−２−デオキシ−Ｄ−リビトール−３−ホスフェートを含む。逆位無塩基デオキシリボース部分は、逆位デオキシリボ無塩基、３’，５’逆位デオキシ無塩基５’−ホスフェートを含む。
【０２００】
本明細書で用いる用語「キャッピング部分」（ｚ’’）は、（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合的に連結できる部分を含み、無塩基リボース部分、無塩基デオキシリボース部分、無塩基リボースおよび無塩基デオキシリボース部分の修飾体（２’Ｏアルキル修飾体を含む）、逆位無塩基リボースおよび無塩基デオキシリボース部分およびその修飾体、Ｃ６−イミノ−Ｐｉ、Ｌ−ＤＮＡとＬ−ＲＮＡを含むミラーヌクレオチド、５’ＯＭｅヌクレオチド、および、ヌクレオチドアナログ、例えば、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、５’−アミノ−アルキルホスフェート、１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート、６−アミノヘキシルホスフェート、１２−アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位無塩基部分、１，４−ブチレングリコールホスフェート、５’−アミノおよび架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分を含む。
【０２０１】
一部のキャッピング部分は、無塩基リボースまたは無塩基デオキシリボース部分、逆位無塩基リボースまたは無塩基デオキシリボース部分、Ｃ６−アミノ−Ｐｉ、Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡを含むミラーヌクレオチドであってもよい。本明細書に開示される核酸分子は、１個または２個以上の逆位ヌクレオチド、例えば、逆位チミジンまたは逆位アデニンを用いて合成してもよい（例えば、Takei, et al., 2002. JBC 277(26):23800-06参照）。
【０２０２】
本明細書で用いる用語「非定型部分」は、無塩基部分、逆位無塩基部分、炭化水素（アルキル）部分およびその誘導体を含む非ヌクレオチド部分を指し、さらに、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡ）、非塩基対ヌクレオチドアナログおよび２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合で隣接するヌクレオチドと連結したヌクレオチド、ＬＮＡおよびエチレン架橋核酸を含む架橋核酸、結合修飾ヌクレオチド（例えばＰＡＣＥ）および塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、本明細書で非定型部分として明示的に開示されているさらなる部分を含む。
【０２０３】
本明細書で用いる場合、用語「阻害する」、「下方調節する」または「低減する」は、遺伝子発現に関して、遺伝子の発現、または１または２以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子または同等のＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）のレベル、または１または２以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、阻害因子（核酸分子、例えばｓｉＮＡ、例えば、本明細書に記載の構造的特徴を有するものなど）の非存在下で観察されるものよりも低減していることを意味し、例えば、発現は、インヒビターの非存在下で観察されるものの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％またはそれ未満に低減していてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】図１は、種々のレポーター細胞系に対するＧＦＰ  ｓｉＮＡの効果を示した棒グラフである。細胞系は、ＨＥＫ２９３、ヒト線維肉腫細胞系ＨＴ１０８０、ヒトＨＳＣ系ｈＴＥＲＴまたはＮＲＫ細胞系への、ヒトＨＳＰ４７ｃＤＮＡ−ＧＦＰまたはラットＧＰ４６ｃＤＮＡ−ＧＦＰ構築物のレンチウイルスによる導入によって樹立した。ＧＦＰに対する陰性対照ｓｉＮＡまたはｓｉＮＡを細胞に導入し、ＧＦＰ蛍光を測定した。結果は、ＧＦＰに対するｓｉＮＡが、異なる細胞系において異なる程度で蛍光をノックダウンすることを示した。２９３＿ＨＳＰ４７−ＧＦＰおよび２９３＿ＧＰ４６−ＧＦＰ細胞系を、トランスフェクションの容易さと、蛍光ノックダウンに対する感度により、ｓｉＨｓｐ４７のスクリーニングのために選択した。
【０２０５】
【図２】図２は、２９３＿ＨＳＰ４７−ＧＦＰおよび２９３＿ＧＰ４６−ＧＦＰ細胞系における、種々のｓｉＨｓｐ４７の細胞毒性およびノックダウン効率を示した一連の棒グラフである。結果は、ｓｉＨｓｐ４７−Ｃ、ｓｉＨｓｐ４７−２およびｓｉＨｓｐ４７−２ｄ、実質的な細胞毒性なしに、ヒトＨＳＰ４７およびラットＧＰ４６（ヒトｈｓｐ４７ホモログ）の両方を効果的にノックダウンしたことを示した。ＧＰ４６に対するｓｉＧｐ４６Ａは、ヒトＨＳＰ４７をノックダウンしない。さらに、新しく設計されたｓｉＨｓｐ４７は、ラットＧＰ４６のノックダウンに関して、ｓｉＧｐ４６Ａを上回った。
【０２０６】
【図３】図３は、ヒトＨＳＣ細胞系ｈＴＥＲＴを用いてＴａｑＭａｎ(R)ｑＰＣＲにより測定した、ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡに対する種々のｓｉＨｓｐ４７のノックダウン効果を示した棒グラフである。Ｙ軸は、ｈｓｐ４７の残存するｍＲＮＡレベルを表す。試験した全てのｓｉＮＡの中で、ＨＳＰ４７−Ｃが最も効果的だった。
【０２０７】
【図４】図４は、ｈＴＥＲＴ細胞におけるコラーゲンＩ発現に対する、様々なｈｓｐ４７  ｓｉＮＡの効果を示した棒グラフである。コラーゲンＩ  ｍＲＮＡのレベルは、ＴａｑＭａｎ(R)プローブを用いたリアルタイム定量ＰＣＲで測定した。Ｙ軸は、コラーゲンＩの残存するｍＲＮＡ発現レベルを表す。結果は、コラーゲンＩ  ｍＲＮＡレベルが、候補のいくつか（ｓｉＨｓｐ４７−２、ｓｉＨｓｐ４７−２ｄ、および、これらとｓｉＨｓｐ４７−１との組合せ）で処理した細胞において顕著に低下していることを示した。
【０２０８】
【図５】図５は、ｓｉＨＳＰ４７で処置した動物における肝臓の線維化領域の減少をした図である。
【０２０９】
【図６】図６は、ヒトｈｓｐ４７  ｍＲＮＡ  ｃＤＮＡの例示的な核酸配列（配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２３５に開示されたｃＤＮＡに基づく）を示した図である。
【０２１０】
【図７】図７は、ヒトｈｓｐ４７の例示的なアミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。
【０２１１】
【図８】図８は、配列番号１のヌクレオチド２３０〜１４８６と一致する、ヒトｈｓｐ４７  ｃＤＮＡのタンパク質をコードする核酸配列（配列番号５９）を示した図である。
【０２１２】
【図９Ａ】図９Ａは、エチジウムブロマイド染色によって検出した、化合物＿１の血漿安定性を示した図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、エチジウムブロマイド染色によって検出した、化合物＿２の血漿安定性を示した図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、エチジウムブロマイド染色によって検出した、化合物＿３の血漿安定性を示した図である。
【図９Ｄ】図９Ｄは、エチジウムブロマイド染色によって検出した、化合物＿４の血漿安定性を示した図である。
【図９Ｅ】図９Ｅは、エチジウムブロマイド染色によって検出した、化合物＿５の血漿安定性を示した図である。
【図９Ｆ】図９Ｆは、エチジウムブロマイド染色によって検出した、化合物＿６の血漿安定性を示した図である。
【図９Ｇ】図９Ｇは、エチジウムブロマイド染色によって検出した、化合物＿７の血漿安定性を示した図である。
【図９Ｈ】図９Ｈは、エチジウムブロマイド染色によって検出した、化合物＿８の血漿安定性を示した図である。
【図９Ｉ】図９Ｉは、エチジウムブロマイド染色によって検出した、化合物＿９の血漿安定性を示した図である。
【０２１３】
【図１０Ａ】図１０Ａは、化合物＿１のオンターゲット／オフターゲット活性を示す。ＡＳ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、ＡＳ＿ＳＭは、シード配列インサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、Ｓ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のセンス鎖の活性を示す。アッセイは、ヒト細胞で行った。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、化合物＿２のオンターゲット／オフターゲット活性を示す。ＡＳ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、ＡＳ＿ＳＭは、シード配列インサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、Ｓ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のセンス鎖の活性を示す。アッセイは、ヒト細胞で行った。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、化合物＿３のオンターゲット／オフターゲット活性を示す。ＡＳ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、ＡＳ＿ＳＭは、シード配列インサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、Ｓ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のセンス鎖の活性を示す。アッセイは、ヒト細胞で行った。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、化合物＿４のオンターゲット／オフターゲット活性を示す。ＡＳ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、ＡＳ＿ＳＭは、シード配列インサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、Ｓ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のセンス鎖の活性を示す。アッセイは、ヒト細胞で行った。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、化合物＿５のオンターゲット／オフターゲット活性を示す。ＡＳ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、ＡＳ＿ＳＭは、シード配列インサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、Ｓ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のセンス鎖の活性を示す。アッセイは、ヒト細胞で行った。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは、化合物＿６のオンターゲット／オフターゲット活性を示す。ＡＳ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、ＡＳ＿ＳＭは、シード配列インサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、Ｓ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のセンス鎖の活性を示す。アッセイは、ラットＲＥＦ５２細胞で行った。
【図１０Ｇ】図１０Ｇは、化合物＿７のオンターゲット／オフターゲット活性を示す。ＡＳ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、ＡＳ＿ＳＭは、シード配列インサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、Ｓ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のセンス鎖の活性を示す。アッセイは、ヒト細胞で行った。
【図１０Ｈ】図１０Ｈは、化合物＿８のオンターゲット／オフターゲット活性を示す。ＡＳ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、ＡＳ＿ＳＭは、シード配列インサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、Ｓ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のセンス鎖の活性を示す。アッセイは、ヒト細胞で行った。
【図１０Ｉ】図１０Ｉは、化合物＿９のオンターゲット／オフターゲット活性を示す。ＡＳ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、ＡＳ＿ＳＭは、シード配列インサートを含むプラスミドに対する化合物のアンチセンス鎖の活性を示し、Ｓ＿ＣＭは、完全にマッチするインサートを含むプラスミドに対する化合物のセンス鎖の活性を示す。アッセイは、ヒト細胞で行った。
【発明を実施するための形態】
【０２１４】
発明の詳細な説明
ＲＮＡ干渉およびｓｉＮＡ核酸分子
ＲＮＡ干渉は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって誘導される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す（Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33、Fire et al., 1998, Nature, 391, 806、Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950-951、Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129、Sharp, 1999, Genes & Dev., 13:139-141およびStrauss, 1999, Science, 286, 886）。植物における対応するプロセス（Heifetz et al., ＰＣＴ国際公開WO 99/61631）は、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）またはＲＮＡサイレンシングとしばしば称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防止するのに用いられる進化的に保存された細胞防衛機構であると考えられている（Fire et al., 1999, Trends Genet., 15, 358）。外来遺伝子の発現からのかかる保護は、ウイルス感染、または宿主ゲノムへのトランスポゾン要素のランダムな統合に由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生に対応して、相同な一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞反応を介して進化したと考えられる。細胞におけるｄｓＲＮＡの存在は、まだ完全に特徴づけられていないメカニズムによって、ＲＮＡｉ反応を引き起こす。このメカニズムは、二本鎖ＲＮＡに特異的なリボヌクレアーゼを伴う他の既知のメカニズム、例えば、プロテインキナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニル酸合成酵素の活性化によって生じ、リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断をもたらすインターフェロン反応などとは異なるようである（例えば、米国特許第６，１０７，０９４号、第５，８９８，０３１号、Clemens et al., 1997, J. Interferon & Cytokine Res., 17, 503-524、Adah et al., 2001, Curr. Med. Chem., 8, 1189参照）。
【０２１５】
細胞における長いｄｓＲＮＡの存在は、ダイサーと称するリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する（(Bass, 2000, Cell, 101, 235、Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33、Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293）。ダイサーは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短い部分へのｄｓＲＮＡのプロセッシングに関与している（Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33、Bass, 2000, Cell, 101, 235、Berstein et al., 2001, Nature, 409, 363）。ダイサー活性に由来する短鎖干渉ＲＮＡは典型的には長さが約２１〜約２３ヌクレオチドであり、約１９塩基対の二重鎖を含む（Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33、Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188）。ダイサーはまた、翻訳調節に関与する保存された構造の前駆体ＲＮＡから、２１およびと２２ヌクレオチドの短鎖一過性ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切り出しにも関与している（Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834）。ＲＮＡｉ反応はまた、一般にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称されるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし、これはｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を誘導する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で生じる（Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188）。
【０２１６】
ＲＮＡｉは、種々の系で研究されている。Fire et al., 1998, Nature, 391, 806は、 C. elegansにおいてＲＮＡｉを観察した最初のものであった。Bahramian and Zarbl, 1999, Molecular and Cellular Biology, 19, 274-283およびWianny and Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70は、哺乳動物の系におけるｄｓＲＮＡによって誘導されるＲＮＡｉを記載している。Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293は、ｄｓＲＮＡをトランスフェクションしたショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉを記載している。Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494およびTuschl et al., ＰＣＴ国際公開WO 01/75164は、ヒト胎児腎臓細胞とＨｅＬａ細胞を含む培養哺乳動物細胞への合成２１ヌクレオチドＲＮＡの二重鎖の導入によって誘導されるＲＮＡｉを記載している。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究（Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877およびTuschl et al., ＰＣＴ国際公開WO 01/75164）は、ｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成および効果的なＲＮＡｉ活性を誘導するために重要な配列に関する特定の必要条件を明らかにした。
【０２１７】
核酸分子（例えば、本明細書に記載の構造特徴を有するもの）は、配列特異的にＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」または遺伝子サイレンシングを誘導することによって、遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方調節することができる（例えば、Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33、Bass, 2001, Nature, 411, 428-429、Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498、およびKreutzer et al., ＰＣＴ国際公開WO 00/44895、Zernicka-Goetz et al., ＰＣＴ国際公開WO 01/36646、Fire, ＰＣＴ国際公開WO 99/32619、Plaetinck et al., ＰＣＴ国際公開WO 00/01846、Mello and Fire, ＰＣＴ国際公開WO 01/29058、Deschamps-Depaillette, ＰＣＴ国際公開WO 99/07409、およびLi et al., ＰＣＴ国際公開WO 00/44914、Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819、Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837、Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218、およびHall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237、Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60、McManus et al., 2002, RNA, 8, 842-850、Reinhart et al., 2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626、およびReinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831参照）。
【０２１８】
ｓｉＮＡ核酸分子は、２個の別々のポリヌクレオチド鎖から組み立てられてもよく、ここで一方の鎖はセンス鎖であり、他方の鎖はアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補性である（すなわち、各々の鎖は、他の鎖におけるヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む）。例えば、アンチセンス鎖とセンス鎖は、提供される核酸分子について、本明細書に記載の任意の長さおよび構造を有する二重鎖または二本鎖構造を形成する。例えば、ここで、二本鎖領域（二重鎖領域）は約１５〜約４９（例えば約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９）塩基対であり、アンチセンス鎖は、標的核酸分子（すなわちｈｓｐ４７  ｍＲＮＡ）におけるヌクレオチド配列またはその部分に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、標的核酸配列またはその部分と一致するヌクレオチド配列を含む（例えば、この中の核酸分子の約１７〜約４９以上のヌクレオチドは、標的核酸またはその部分に相補的である）。
【０２１９】
一部の側面および態様において、本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、以下でさらに詳細に解説されるように、「ＲＩＳＣ長」分子であってもよく、ダイサー基質であってもよい。
【０２２０】
ｓｉＮＡ核酸分子は、別々のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含んでもよく、ここで、センスおよびアンチセンス領域は、当該技術分野で既知のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合的に連結されるか、あるいはイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用および／またはスタッキング相互作用によって非共有結合的に連結されている。核酸分子は、標的遺伝子ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでもよい。核酸分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列と、標的遺伝子の発現阻害を引き起こす仕方で相互作用することができる。
【０２２１】
あるいは、ｓｉＮＡ核酸分子は、単一のポリヌクレオチドから組み立てられ、ここで、核酸分子の自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって連結されている。すなわちアンチセンス鎖およびセンス鎖は、折り畳まれて二重鎖領域を形成する（例えば、当該技術分野において周知のヘアピン構造を形成する）アンチセンス領域とセンス領域とを有する単一のポリヌクレオチドの一部である。かかるｓｉＮＡ核酸分子は、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を有し、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するポリヌクレオチドであってもよく、ここで、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子またはその部分におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列（例えば、ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡの配列）に対応するヌクレオチド配列を有する。かかるｓｉＮＡ核酸分子は、２個または３個以上のループ構造と、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含むステムとを有する環状の一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、ここで、アンチセンス領域は標的核酸分子またはその部分におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその部分に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、in vivoまたはin vitroでプロセシングされ、ＲＮＡｉを誘導することができる活性核酸分子を生成することができる。
【０２２２】
以下の命名法が、ｓｉＮＡ分子の長さとオーバーハングを記述するために当該技術分野においてしばしば用いられ、本明細書および例の全体にわたって用いることができる。二重鎖に付与される名称は、オリゴマーの長さとオーバーハングの有無を示す。例えば、「２１＋２」二重鎖は、２本の核酸鎖を含み、その両方が２１ヌクレオチドの長さであり（２１ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ二重鎖または２１ｍｅｒ核酸とも呼ばれる）、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。「２１−２」のデザインは、２ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する２１ｍｅｒ核酸二重鎖を指す。２１−０のデザインは、オーバーハングを有しない（平滑な）２１ｍｅｒ核酸二重鎖である。「２１＋２ＵＵ」は２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有し、３’末端の末端の２ヌクレオチドが両方ともＵ残基である、２１ｍｅｒ二重鎖である（それは、標的配列とのミスマッチをもたらし得る）。前記の命名法は、様々な長さの鎖、二重鎖およびオーバーハングのｓｉＮＡ分子に適用することができる（例えば、１９−０、２１＋２、２７＋２、など）。代替的だが、類似した命名法において、「２５／２７」は、２５塩基のセンス鎖と２７塩基のアンチセンス鎖とを有し、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを伴う非対称の二重鎖である。「２７／２５」は、２７塩基のセンス鎖と２５塩基のアンチセンス鎖とを有する非対称の二重鎖である。
【０２２３】
化学修飾
一部の側面および態様において、本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、１または２以上の修飾（または化学修飾）を含む。一部の態様において、かかる修飾は、分子を、「非修飾」リボヌクレオチドまたは非修飾リボ核酸と称することがある、標準的なリボヌクレオチドまたはＲＮＡ分子（すなわち、標準的なアデノシン、シトシン、ウラシルまたはグアノシン部分を含むもの）とは異なるようにする、核酸分子またはポリヌクレオチドへの任意の変化を含む。アデノシン、シトシン、チミンまたはグアノシン部分によって代表される、２’−デオキシ糖を有する伝統的なＤＮＡ塩基およびポリヌクレオチドは、「非修飾デオキシリボヌクレオチド」または「非修飾デオキシリボ核酸」と称することができる。したがって、本明細書で用いる用語「非修飾ヌクレオチド」または「非修飾核酸」は、それと異なる明確な指示がない限り、「非修飾リボヌクレオチド」または「非修飾リボ核酸」を指す。かかる修飾は、ヌクレオチド糖、ヌクレオチド塩基、ヌクレオチドリン酸基および／またはポリヌクレオチドのリン酸骨格におけるものであってもよい。
【０２２４】
一部の態様において、本明細書に開示される修飾は、分子のＲＮＡｉ活性を増大させるため、および／または分子のin vivoでの安定性、特に血清中の安定性を増大させるため、および/または分子の生体利用能を増大させるために用いてもよい。修飾の非限定例は、限定されずに、ヌクレオチド間またはヌクレオシド間結合、核酸分子の任意の位置および鎖におけるデオキシヌクレオチドまたはジデオキシリボヌクレオチド、２’位における、好ましくはアミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシおよびアルキルから選択される修飾を有する核酸（例えばリボ核酸）、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、ビオチン基、および末端グリセリルおよび/または逆位デオキシ無塩基残基の導入、立体障害分子、例えば、蛍光分子などを含む。他のヌクレオチド修飾因子は、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、および３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを含んでもよい。種々の修飾に関するさらなる詳細は、以下でさらに詳細に解説する。
【０２２５】
修飾ヌクレオチドは、ノーザンコンフォメーション（例えば、ノーザン擬似回転サイクル、例えばSaenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984参照）を有するものを含む。ノーザンコンフォメーションを有するヌクレオチドの非限定例は、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メチルチオエチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。ロックド核酸またはＬＮＡは、例えば、Elman et al., 2005、Kurreck et al., 2002、Crinelli et al., 2002、Braasch and Corey, 2001、Bondensgaard et al., 2000、Wahlestedt et al., 2000、および国際特許公開WO 00/47599、WO 99/14226、およびWO 98/39352およびWO 2004/083430に記載されている。一態様において、ＬＮＡはセンス鎖の５’末端に組み込まれている。
【０２２６】
化学修飾はまた、アンロックド核酸またはＵＮＡを含み、これはＣ２’−Ｃ３’結合が存在しない非ヌクレオチド、非環式アナログである（ＵＮＡは、真の意味でのヌクレオチドではないが、ここで考慮する「修飾」ヌクレオチドまたは修飾核酸の範囲に明示的に含まれる）。具体的な態様において、オーバーハングを有する核酸分子は、オーバーハングの位置（すなわち２ヌクレオチドオーバーハング）にＵＮＡを有するよう修飾されてもよい。他の態様において、ＵＮＡは３’または５’末端に含まれる。ＵＮＡは、核酸鎖に沿ってどこに位置してもよく、すなわち７位に位置してもよい。核酸分子は、１個または２個以上のＵＮＡを含んでもよい。例示的なＵＮＡは、Nucleic Acids Symposium Series No. 52 p. 133-134 (2008)に開示されている。一部の態様において、本明細書に記載の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、１個または２個以上のＵＮＡ、または１個のＵＮＡを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の３’オーバーハングを有する核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、３’オーバーハングに１個または２個のＵＮＡを含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、アンチセンス鎖、例えばアンチセンス鎖の６位または７位に、ＵＮＡ（例えば１個のＵＮＡ）を含む。化学修飾はまた、非対合ヌクレオチドアナログ、例えば、本明細書に開示されるものを含む。化学修飾はさらに、本明細書に開示される非定型部分をさらに含む。
【０２２７】
化学修飾はまた、オリゴヌクレオチドの５’または３’部分に末端修飾を含み、これはキャッピング部分としても知られる。かかる末端修飾は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脂質、ペプチドおよび糖から選択される。
【０２２８】
化学修飾はまた、６員の「６員環ヌクレオチドアナログ」を含む。６員環ヌクレオチドアナログの例は、Allart, et al., Nucleosides & Nucleotides, 1998, 17:1523-1526およびPerez-Perez, et al., 1996, Bioorg. and Medicinal Chem Letters 6:1457-1460に開示されている。ヘキシトールおよびアルトリトールヌクレオチドモノマーを含む６員環ヌクレオチドアナログは、国際特許出願公開WO 2006/047842に開示されている。
【０２２９】
化学修飾はまた、正常な天然に存在するヌクレオチドと比較して逆のキラリティーを有する「ミラー」ヌクレオチドを含む。つまり、ミラーヌクレオチドは、天然に存在するＤ−ヌクレオチドのＬ−ヌクレオチドアナログであってもよい（米国特許第6,602,858号参照）。ミラーヌクレオチドは、少なくとも１つの糖または塩基修飾および／または骨格修飾、例えば、本明細書に記載のもの、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホネート部分などをさらに含んでもよい。米国特許第6,602,858号は、少なくとも１個のＬ−ヌクレオチド置換を含む核酸触媒を開示している。ミラーヌクレオチドは、例えば、Ｌ−ＤＮＡ（Ｌ−デオキシリボアデノシン−３’−ホスフェート（ミラーｄＡ）、Ｌ−デオキシリボシチジン−３’−ホスフェート（ミラーｄＣ）、Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート（ミラーｄＧ）、Ｌ−デオキシリボチミジン−３’−ホスフェート（鏡像チミジン））およびＬ−ＲＮＡ（Ｌ−リボアデノシン−３’−ホスフェート（ミラーｒＡ）、Ｌ−リボシチジン−３’−ホスフェート（ミラーｒＣ）、Ｌ−リボグアノシン−３’−ホスフェート（ミラーｒＧ）、Ｌ−リボウラシル−３’−ホスフェート（ミラーｄＵ）を含む。
【０２３０】
いくつかの態様において、修飾リボヌクレオチドは、修飾デオキシリボヌクレオチド、例えば、５’末端位（１位）におけるヌクレオチドとして有用たり得る５’ＯＭｅ  ＤＮＡ（５−メチル−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート）、ＰＡＣＥ（デオキシリボアデノシン  ３’ホスホノアセテート、デオキシリボシチジン  ３’ホスホノアセテート、デオキシリボグアノシン  ３’ホスホノアセテート、デオキシリボチミジン  ３’ホスホノアセテート）を含む。
【０２３１】
修飾は、本明細書に開示される核酸分子の１または２以上の鎖、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖に存在してもよい。一部の態様において、アンチセンス鎖は修飾を含んでもよく、センス鎖は非修飾ＲＮＡのみを含んでもよい。
【０２３２】
核酸塩基
本明細書に開示される核酸の核酸塩基は、非修飾リボヌクレオチド（プリンおよびピリミジン）、例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルを含んでもよい。一方または両方の鎖の核酸塩基は、天然核酸塩基および合成核酸塩基、例えばチミン、キサンチン、ヒポキサンチン、イノシン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、任意の「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよび５−置換シトシン、７−メチルグアニン、デアザプリン、プリンおよびピリミジンの複素環置換アナログ、例えばアミノエチオキシフェノキサジン、プリンおよびピリミジンの誘導体（例えば１−アルキル誘導体、１−アルケニル誘導体、複素芳香環誘導体および１−アルキニル誘導体）およびその互変異性体、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−ジアザキサンチン、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５（１−プロピニル）ウラシル、５−（１−プロピニル）シトシンおよび４，４−エタノシトシンなどにより修飾されていてもよい。好適な塩基の他の例は、非プリン塩基および非ピリミジン塩基、例えば２−アミノピリジンおよびトリアジンなどを含む。
【０２３３】
糖部分
本明細書に開示される核酸の糖部分は、何ら修飾のない２’−ヒドロキシル−ペントフラノシル糖部分を含んでもよい。あるいは、糖部分は修飾されていてもよく、例えば２’−デオキシ−ペントフラノシル糖部分、Ｄ−リボース、ヘキソース、ペントフラノシル糖部分の２’位における修飾、例えば、２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−エチルを含む）、すなわち２’−アルコキシ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｓ−アルキル、２’−ハロゲン（２’−フルオロ、２’−クロロおよび２’−ブロモを含む）、２’−メトキシエトキシ、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−２−メトキシエチル、２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−プロパルギル、２’−プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル、ＣＦ、シアノ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノまたは置換シリル、特に、例えば、欧州特許EP 0 586 520 B1またはEP 0 618 925 B1に記載のものなどであってもよい。
【０２３４】
アルキル基は、飽和脂肪族基を含み、これは直鎖アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基を含む。一部の態様において、直鎖または分枝鎖アルキルはその骨格に６個またはそれ未満の炭素原子を有し（例えば、直鎖についてはＣ１〜Ｃ６、分枝鎖についてはＣ３〜Ｃ６）、より好ましくは４個またはそれ未満の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、その環構造中に３〜８個の炭素原子を有してもよく、より好ましくは５個または６個の炭素を環構造中に有してもよい。用語Ｃ１〜Ｃ６は、１〜６個の炭素原子を含有するアルキル基を含む。アルキル基は、置換アルキル基、例えば、炭化水素骨格の１個または２個以上の炭素上で水素に置換する置換基を有するアルキル部分であってもよい。かかる置換基は、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは、芳香族部分または複素環式芳香族部分を含んでもよい。
【０２３５】
アルコキシ基は、酸素原子に共有結合的に連結した、置換および非置換アルキル、アルケニルおよびアルキニル基を含む。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシおよびペントキシ基を含む。置換アルコキシ基の例は、ハロゲン化アルコキシ基を含む。アルコキシ基は、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、硫酸塩、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族部分または複素環式芳香族部分で置換されていてもよい。ハロゲン置換アルコキシ基の例は、限定されずに、フルオロメトキシに、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシなどを含む。
【０２３６】
いくつかの態様において、ペントフラノシル環は、ペントフラノシル環のＣ２’−Ｃ３’結合を欠く非環式誘導体と置き換わっていてもよい。例えば、アシクロヌクレオチドはｄＮＭＰに通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖の２’−ヒドロキシエトキシメチル基と置換してもよい。
【０２３７】
ハロゲンは、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素を含む。
【０２３８】
骨格
本明細書に開示される核酸のヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合によって互いに連結されていてもよい。ホスホジエステル結合は、任意に、他の結合で置換されていてもよい。例えば、ホスホロチオエート、チオリン酸−Ｄ−リボース体、トリエステル、チオエート、２’−５’架橋骨格（５’−２’または２’５’ヌクレオチドまたは２’５’リボヌクレオチドとも称する）、ＰＡＣＥ、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または−５’）チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−（または−５’）デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または５’−）アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ホスホネート、ボラノリン酸エステル、ホスホルアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステル修飾、アルキルホスホトリエステル、ホスホトリエステルリン結合、５’−エトキシホスホジエステル、Ｐ−アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホネートなど、および非リン含有結合、例えば、炭酸塩、カルバメート、シリル、硫黄、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセチル、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノなどである。
【０２３９】
本明細書に開示される核酸分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格を含んでもよい。ＰＮＡ骨格は、ペプチド結合で連結されたＮ（２−アミノエチル）グリシン単位の繰り返しを含む。種々の塩基、例えば、プリン、ピリミジン、天然および合成塩基は、メチレンカルボニル結合によって骨格に連結している。
【０２４０】
末端ホスフェート
修飾は、末端リン酸基でなされてもよい。様々な安定化化学の非限定例を、例えば、核酸配列の３’末端を安定させるのに用いてもよく、これは、（１）［３〜３’］−逆位デオキシリボース、（２）デオキシリボヌクレオチド、（３）［５’−３’］−３’−デオキシリボヌクレオチド、（４）［５’−３’］−リボヌクレオチド、（５）［５’−３’］−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、（６）３’−グリセリル、（７）［３’−５’］−３’−デオキシリボヌクレオチド、（８）［３’−３’］−デオキシリボヌクレオチド、（９）［５’−２’］−デオキシリボヌクレオチドおよび（１０）［５−３’］−ジデオキシリボヌクレオチドを含む。さらに、非修飾骨格化学は、本明細書に記載の１または２以上の異なる骨格修飾と組み合わせることができる。
【０２４１】
例示的な化学的に修飾した末端リン酸基は、以下に示すものを含む：
【化１６】
0005972408.tif 000018
【０２４２】
コンジュゲート（conjugate）
本明細書で提供される修飾ヌクレオチドおよび核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）はコンジュゲート、例えば化学修飾核酸分子に共有結合的に付着したコンジュゲートを含んでもよい。コンジュゲートの非限定例は、Vargeese et al., U.S. Ser. No. 10/427,160に記載のコンジュゲートおよびリガンドを含む。コンジュゲートは、生分解可能なリンカーを介して核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）に共有結合的に付着していてもよい。コンジュゲート分子は、化学修飾核酸分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか一方または両方の鎖の３’末端に付着していてもよい。コンジュゲート分子は、化学修飾核酸分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか一方または両方の鎖の５’末端に付着していてもよい。コンジュゲート分子は、化学修飾核酸分子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれか一方または両方の鎖の３’末端および５’末端の両方に付着していてもよく、またはこれらの任意の組合せであってもよい。一態様において、コンジュゲート分子は、生物系（例えば細胞）への化学修飾核酸分子の送達を容易にする分子を含んでもよい。別の態様において、化学修飾核酸分子に付着するコンジュゲート分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミンまたは細胞取り込みを誘導することができる細胞レセプターに対するリガンドである。化学修飾核酸分子に付着することができる、本発明で企図される具体的なコンジュゲート分子の例は、Vargeese et al., U.S. Ser. No. 10/427,160に記載されている。
【０２４３】
リンカー
本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ）は、核酸のセンス領域と核酸のアンチセンス領域とを連結する、ヌクレオチドリンカー、非ヌクレオチドリンカー、またはにヌクレオチド／非ヌクレオチド複合リンカーを含んでもよい。ヌクレオチドリンカーは、長さが≧２ヌクレオチド、例えば長さが約３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチドのリンカーであってもよい。ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーであってもよい。本明細書で用いる「アプタマー」または「核酸アプタマー」は、標的分子に特異的に結合する核酸分子を指し、ここで、前記核酸分子は、標的分子がその天然の状態で認識する配列を含む配列を有する。あるいは、アプタマーは、標的分子が天然では核酸と結合しない標的分子（例えばｈｓｐ４７  ｍＲＮＡ）に結合する核酸分子であってもよい。例えば、アプタマーはタンパク質のリガンド結合領域と結合することに用いることができ、それによって天然に存在するリガンドのタンパク質との相互作用を防止する。これは非限定例であり、当業者は、他の態様が、当該技術分野において一般的に知られている技術を用いて容易に生成できることを認識している。例えば、Gold et al., 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763、Brody and Gold, 2000, J. Biotechnol., 74, 5、Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther., 2, 100、Kusser, 2000, J. Biotechnol., 74, 27、Hermann and Patel, 2000, Science, 287, 820およびJayasena, 1999, Clinical Chemistry, 45, 1628参照。
【０２４４】
非ヌクレオチドリンカーは、無塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素または他の高分子化合物（例えばポリエチレングリコール（例えば、２〜１００エチレングリコール単位を有するもの））を含んでもよい。具体的な例は、Seela and Kaiser, Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353およびNucleic Acids Res. 1987, 15:3113、Cload and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:6324、Richardson and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:5109、Ma et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21:2585およびBiochemistry 1993, 32:1751、Durand et al., Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353、McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides 1991, 10:287、Jschke et al., Tetrahedron Lett. 1993, 34:301、Ono et al., Biochemistry 1991, 30:9914、Arnold et al.,国際公開公報WO 89/02439、Usman et al.,国際公開公報WO 95/06731、Dudycz et al.,国際公開公報WO 95/11910 およびFerentz and Verdine, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:4000に記載されたものを含む。
【０２４５】
５’末端、３’末端およびオーバーハング
本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、両端が平滑であっても、両端にオーバーハングを有しても、または平滑末端およびオーバーハング末端の組合せを有してもよいグ。オーバーハングは、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端または３’末端のいずれかに存在してもよい。
【０２４６】
二本鎖核酸分子（例えばｓｉＮＡ）の５’末端および／または３’末端は、平滑末端であっても、オーバーハングを有してもよい。５’末端は平滑末端であってもよく、３’末端は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかにおいてオーバーハングを有する。他の態様において、３’末端は平滑末端であってもよく、５’末端はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかにおいてするオーバーハングを有する。さらに他の態様においては、５’末端および３’末端の両方が平滑末端であるか、５’末端および３’末端の両方がオーバーハングを有する。
【０２４７】
核酸の一方または両方の鎖の５’末端および／または３’末端は、フリーのヒドロキシル基を含んでもよい。任意の核酸分子の鎖の５’末端および／または３’末端は、化学修飾を含むように改変されていてもよい。かかる修飾は核酸分子を安定させることができ、例えば、３’末端は核酸分子修飾の存在により安定性が増大していてもよい。末端修飾（例えば末端キャップ）の例は、限定されずに、無塩基、デオキシ無塩基、逆位（デオキシ）無塩基、グリセリル、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、メトキシ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノまたは置換シリル、特に、欧州特許EP 586,520およびEP 618,925に記載のもの、および本明細書に開示される他の修飾を含む。
【０２４８】
核酸分子は、平滑末端、すなわちオーバーハングヌクレオチドも全く含まない末端を有するものを含む。核酸分子は、１個または２個以上の平滑末端を含むことができる。平滑末端核酸分子は、核酸分子の各々の鎖に存在するヌクレオチドの数に等しい数の塩基対を有する。核酸分子は１個の平滑末端を含むことができ、例えば、ここで、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端はオーバーハングヌクレオチドを全く有しない。核酸分子は１個の平滑末端を含んでもよく、例えば、ここで、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端はオーバーハングヌクレオチドを全く有しない。核酸分子は２個の平滑末端を含んでもよく、例えば、ここで、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端、ならびに、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端はオーバーハングヌクレオチドを全く有しない。平滑末端核酸分子に存在する他のヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡ干渉を誘導するための核酸分子の活性を調節するための、ミスマッチ、バルジ、ループまたはゆらぎ（wobble）塩基対を含んでもよい。
【０２４９】
本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の一部の態様において、分子の少なくとも一端は、少なくとも１ヌクレオチドのオーバーハング（例えば、１〜８個のオーバーハングヌクレオチド）を有する。例えば、本明細書に開示される二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖は、５’末端または３’末端または両方にオーバーハングを有してもよい。オーバーハングは、核酸分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方に存在してもよい。オーバーハングの長さは、わずか１ヌクレオチドであっても、１〜８ヌクレオチド程度またはそれを超えてもよく（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチド）、いくつかの好ましい態様において、オーバーハングは２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチドであり、例えば、オーバーハングは２ヌクレオチドであってもよい。オーバーハングを形成する１個または２個以上のヌクレオチドは、１個または２個以上のデオキシリボヌクレオチド、１個または２個以上のリボヌクレオチド、天然もしくは非天然核酸塩基、または糖、塩基もしくはリン酸基が修飾された任意のヌクレオチド、例えば本明細書に開示されるものなどを含んでもよい。二本鎖核酸分子は、５’オーバーハングおよび３’オーバーハングの両方を有してもよい。５’末端および３’末端のオーバーハングは、異なる長さであってもよい。オーバーハングは少なくとも１個の核酸修飾を含んでもよく、それはデオキシリボヌクレオチドであってもよい。１個または２個以上のデオキシリボヌクレオチドが５’末端にあってもよい。核酸分子のそれぞれの反対鎖（counter-strand）の３’末端は、オーバーハングを有しなくてもよく、より好ましくはデオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有しなくてもよい。１個または２個以上のデオキシリボヌクレオチドは、３’末端にあってもよい。ｄｓＲＮＡのそれぞれの反対鎖の５’末端は、オーバーハングを有しなくてもよく、より好ましくはデオキシリボヌクレオチドオーバーハングを有しなくてもよい。好ましくは、鎖の５’末端または３’末端のいずれかにおけるオーバーハングは、１〜８個（例えば、約１、２、３、４、５、６、７または８個）の不対ヌクレオチドであってもよく、オーバーハングは２〜３個の不対ヌクレオチドであり、より好ましくは２個の不対ヌクレオチドである。核酸分子は、約１〜約２０（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）、好ましくは１〜８（例えば、約１、２、３、４、５、６、７または８）ヌクレオチドのオーバーハング末端を有する二重鎖核酸分子、例えば約１９個の塩基対と３’末端モノヌクレオチド、ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドオーバーハングとを有する約２１ヌクレオチドの二重鎖を含んでもよい。本明細書に記載の核酸分子は、平滑末端を有する二重鎖核酸分子を含んでもよく、ここで、両端は平滑であるか、あるいは、末端の１つは平滑である。本明細書に開示される核酸分子は、１個または２個以上の平滑末端を含むことができ、すなわち、ここで、平滑末端はオーバーハングヌクレオチドを全く有しない。一態様において、平滑末端核酸分子は、核酸分子の各々���鎖に存在するヌクレオチドの数に等しい数の塩基対を有する。核酸分子は１個の平滑末端を含むことができ、例えば、ここで、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端はオーバーハングヌクレオチドを全く有しない。核酸分子は１個の平滑末端を含んでもよく、例えば、ここで、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端はオーバーハングヌクレオチドを全く有しない。核酸分子は２個の平滑末端を含んでもよく、例えば、ここで、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端、ならびに、アンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖の５’末端はオーバーハングヌクレオチドを全く有しない。一部の好ましい態様において、核酸化合物は平滑末端を有する。平滑末端ｓｉＮＡ分子に存在する他のヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡ干渉を誘導するための核酸分子の活性を調節するための、ミスマッチ、バルジ、ループまたはゆらぎ塩基対を含んでもよい。
【０２５０】
多くの態様において、本明細書に記載の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）の、１個もしくは２個以上、または、全てのオーバーハングヌクレオチドは、本明細書に記載のとおりに修飾されており、例えば、１個もしくは２個以上、または全てのヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドであってもよい。
【０２５１】
修飾の数、位置およびパターン
本明細書に開示される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、核酸分子に存在するヌクレオチドの総数のパーセンテージとしての、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。このように、核酸分子は、約５％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（例えば約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の修飾ヌクレオチド）を含んでもよい。所定の核酸分子に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、核酸に存在するヌクレオチドの総数に依存する。核酸分子が一本鎖の場合、パーセント修飾は一本鎖核酸分子に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。同様に、核酸分子が二本鎖の場合、パーセント修飾はセンス鎖、アンチセンス鎖またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。
【０２５２】
本明細書に開示される核酸分子は、核酸分子における総ヌクレオチドのパーセンテージとしての、非修飾ＲＮＡを含んでもよい。このように、核酸分子は約５％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（例えば、核酸分子に存在する総ヌクレオチドの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％）を含んでもよい。
【０２５３】
核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、約１個〜約５個、具体的には約１、２、３、４または５個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１個または２個以上（例えば、約１、２、３、４、５個または６個以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、および／または１個または２個以上（例えば、約１、２、３、４、５個または６個以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および任意に、センス鎖の３’末端、５’末端または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含むセンス鎖を含んでもよく、ここで、アンチセンス鎖は、約１個〜約５個、具体的には約１、２、３、４、５個または６個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１個または２個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１１個以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、および／または１個または２個以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１１個以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および任意に、アンチセンス鎖の３’末端、５’末端または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ分子を含む。核酸分子は、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチルおよび／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾され、約１個〜約５個または６個以上、例えば、約１、２、３、４、５個または６個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、または有しない、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１１個以上の、センス鎖および／またはアンチセンス核酸鎖のピリミジンヌクレオチド、および／または、３’末端、５’末端、または、同じ鎖もしくは異なる鎖に存在する３’末端および５’末端の両方における末端キャップ分子を含んでもよい。
【０２５４】
核酸分子は、約１個〜約５個または６個以上（具体的には、約１、２、３、４、５個または６個以上）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を核酸分子の各々の鎖に含んでもよい。
【０２５５】
核酸分子は、２’−５’ヌクレオチド間結合を、例えば、一方または両方の核酸配列鎖の３’末端、５’末端または３’末端および５’末端の両方に含んでもよい。さらに、１個または２個以上の２’−５’ヌクレオチド間結合は、一方または両方の核酸配列鎖内の他の様々な位置に存在してもよく、ヌクレオチド間にそのうえ、分子が含むことができる、例えば、ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖におけるピリミジンヌクレオチドの全てのヌクレオチド間結合を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所または１１箇所以上が、２’−５’ヌクレオチド間結合を含んでもよく、または、ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖におけるプリンヌクレオチドの全てのヌクレオチド間結合を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所または１１箇所以上が、２’−５’ヌクレオチド間結合を含んでもよい。
【０２５６】
化学修飾短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は、アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個または２個以上または全ての）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または、複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個または２個以上または全ての）プリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）アンチセンス領域を含んでもよい。
【０２５７】
化学修飾短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は、アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個または２個以上または全ての）ピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または、複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する任意の（例えば、１個または２個以上または全ての）プリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）アンチセンス領域を含んでもよい。
【０２５８】
細胞または再構成されたin vitroの系の内部でｈｓｐ４７に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる化学修飾短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子は、センス領域に存在する１個または２個以上のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または、複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、とセンス領域に存在する１個または２個以上のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチド（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）センス領域、および、アンチセンス領域に存在する１個または２個以上のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または、複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する１個または２個以上のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）アンチセンス領域を含んでもよい。センス領域および／またはアンチセンス領域は、末端キャップ修飾、例えば、センス配列および／またはアンチセンス配列の３’末端、５’末端または３’末端および５’末端の両方に任意に存在する任意の修飾などを有してもよい。センス領域および／またはアンチセンス領域は、任意に、約１個〜約４個の（例えば約１、２、３または４個の）２’−デオキシヌクレオチドを有する３’末端ヌクレオチドオーバーハングをさらに含んでもよい。オーバーハングヌクレオチドは、１個または２個以上（例えば、１、２、３、４個または５個以上）のホスホロチオエート、ホスホノアセテート、および／または、チオホスホノアセテートヌクレオチド間結合をさらに含んでもよい。センス領域のプリンヌクレオチドは、代替的に２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであってもよく（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する１個または２個以上のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。センス領域の１個または２個以上のプリンヌクレオチドは、代替的にプリンリボヌクレオチドであってもよく（例えば、全てのプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドである）、アンチセンス領域���存在する任意のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。センス領域における、および／またはアンチセンス領域に存在する１個または２個以上のプリンヌクレオチドは、代替的に、２’−デオキシヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群から選択されてもよい（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群から選択されるか、または、複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群から選択される）。
【０２５９】
いくつかの態様において、本明細書に記載の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、アンチセンス鎖に修飾ヌクレオチド（例えば１個の修飾ヌクレオチド）を、例えばアンチセンス鎖の６位または７位に含む。
【０２６０】
修飾パターンおよび交互する修飾
【０２６１】
本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、修飾核酸および非修飾核酸のパターンを有してもよい。ヌクレオチドの連続するストレッチ（stretch）におけるヌクレオチドの修飾のパターンは、単一のヌクレオチド、または、標準的なホスホジエステル結合、もしくは少なくとも部分的に、ホスホロチオエート結合を介して互いに共有結合的に連結されたヌクレオチドの群に含まれる修飾であってもよい。したがって、本明細書で企図する「パターン」は、必ずしも反復単位を伴う必要はないが、反復単位を伴ってもよい。本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）に関連して用いることができる修飾パターンの例は、Giese、米国特許第7,452,987号に開示されるものを含む。例えば、本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、例えば、Giese、米国特許第7,452,987号の図２に図式的に示されているパターンに類似の修飾パターン、またはそれと同じ修飾パターンを有するものを含む。
【０２６２】
修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの群はセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端または３’末端にあってもよく、隣接するヌクレオチドまたはヌクレオチドの群は、修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの群の両側に配列し、隣接するヌクレオチドまたはヌクレオチドの群は非修飾であるか、前のヌクレオチドまたはヌクレオチドの群と同じ修飾は有しない。隣接するヌクレオチドまたはヌクレオチドの群は、しかしながら、異なる修飾を有してもよい。それぞれ、修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの群、および、非修飾か、異なる修飾を有するヌクレオチド、または非修飾か、異なる修飾を有するヌクレオチドの群のこの配列は、１回または２回以上繰り返されてもよい。
【０２６３】
いくつかのパターンにおいて、鎖の５’末端ヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり、一方、他のパターンにおいて、鎖の５’末端ヌクレオチドは非修飾ヌクレオチドである。いくつかのパターンにおいて、鎖の５’末端は修飾ヌクレオチドの群で開始し、一方、他のパターンにおいて、５’末端は、非修飾ヌクレオチドの群である。このパターンは、核酸分子の第１のストレッチもしくは第２のストレッチのいずれか、またはその両方にあってもよい。
【０２６４】
核酸分子の一方の鎖の修飾ヌクレオチドは、他方の鎖の修飾または非修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドの群に対し、位置について相補的であってもよい。
【０２６５】
修飾群が重ならないように、一方の鎖の修飾または修飾のパターンの間に、他の鎖の修飾のパターンに対する位相シフトがあってもよい。１つの例において、シフトは、センス鎖の修飾ヌクレオチドの群が、アンチセンス鎖の非修飾ヌクレオチドの群に対応するもの、およびその逆のものである。
【０２６６】
修飾群が重なるように、修飾のパターンの部分的なシフトがあってもよい。任意の所定の鎖における修飾ヌクレオチドの群は、任意に同じ長さであってもよいが、異なる長さであってもよい。同様に、任意の所定の鎖の非修飾ヌクレオチドの群は、任意に、同じ長さであっても、または異なる長さであってもよい。
【０２６７】
いくつかのパターンにおいて、鎖の末端の２番目の（最後から２番目の）ヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドであるか、または非修飾ヌクレオチドの群の始まりである。好ましくは、この非修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドの群は、センス鎖およびアンチセンス鎖の一方または両方の５’末端、より一層好ましくはセンス鎖の末端に位置する。非修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドの群は、センス鎖の５’末端に位置してもよい。好ましい態様において、パターンは交互する単一の修飾ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチドを含む。
【０２６８】
いくつかの二本鎖核酸分子において、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチド、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾を有しないヌクレオチドが、両方の鎖に交互する様式で組み込まれ、その結果、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドと、非修飾か、または、少なくとも２’−Ｏ−メチル修飾を含まないヌクレオチドが交互するパターンがもたらされる。一部の態様において、同じ２’−Ｏ−メチル修飾および非修飾の配列は第２の鎖に存在し、他の態様において、交互する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドはセンス鎖のみに存在し、アンチセンス鎖には存在せず、さらに他の態様において、交互する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のみに存在し、センス鎖には存在しない。一部の態様において、２本の鎖の間に位相シフトが存在し、例えば、第１の鎖における２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドは第２の鎖の１個または２個以上の非修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、この逆もまた同様である。この特定の配置、すなわち、両方の鎖における１個または２個以上の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチドの塩基対形成は、一部の態様において特に好ましい。一部の態様において、交互する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドのパターンは、核酸分子全体、または二重鎖領域全体にわたって存在する。他の態様において、交互する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドのパターンは、核酸の部分、または二重鎖領域の部分にのみに存在する。
【０２６９】
「位相シフト」パターンにおいて、アンチセンス鎖が５’末端の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドから開始し、その結果、２番目のヌクレオチドが非修飾であり、３番目、５番目、７番目といったヌクレオチドが再び２’−Ｏ−メチル修飾であり、２番目、４番目、６番目、８番目といったヌクレオチドが非修飾ヌクレオチドとなることが好ましいことがある。
【０２７０】
例示的な修飾位置およびパターン
例示的なパターンを以下でさらに詳細に提供するが、本明細書に開示される、および、当該技術分野において既知の、核酸分子の全ての可能な特徴（例えば、特徴は、限定されずに、センス鎖の長さ、アンチセンス鎖の長さ、二重鎖領域の長さ、オーバーハングの長さ、二本鎖核酸分子の一方または両方の末端が平滑であるか、または、オーバーハングを有するか、修飾核酸の数、修飾の種類、ダブルオーバーハング核酸分子が、各側のオーバーハングに同じか、または、異なる数のヌクレオチドを有するか、核酸分子において用いられている修飾は１種類か、または１種類を超えるか、および、連続する修飾／非修飾ヌクレオチドの数を含む）を有する全てのパターンの置換が企図される。以下で提供される全ての詳細な例に関して、二重鎖領域は１９ヌクレオチドであることが示されているが、二重鎖領域の各々の鎖は独立して１７〜４９ヌクレオチドの長さであることができるため、本明細書において提供される核酸分子は１〜４９ヌクレオチドの長さの範囲の二重鎖領域を有することができる。例示的なパターンを本明細書において提供する。
【０２７１】
核酸分子は、単一の修飾核酸または修飾核酸の連続したセットを含む両方の末端に、平滑末端（ｎが０である場合）を有してもよい。修飾核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかに沿った任意の位置に位置してもよい。核酸分子は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９個の連続する修飾ヌクレオチドの群を含んでもよい。修飾核酸は、核酸鎖の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または１００％を形成してもよい。すぐ下の例の修飾核酸は、センス鎖のみ、アンチセンス鎖のみ、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方にあってもよい。
【０２７２】
一般的な核酸パターンを以下に示し、ここで、Ｘ＝二重鎖領域におけるセンス鎖ヌクレオチド、Ｘａ＝センス鎖における５’オーバーハングヌクレオチド、Ｘｂ＝センス鎖における３’オーバーハングヌクレオチド、Ｙ＝二重鎖領域におけるアンチセンス鎖ヌクレオチド、Ｙａ＝アンチセンス鎖における３’オーバーハングヌクレオチド、Ｙｂ＝アンチセンス鎖における５’オーバーハングヌクレオチド、およびＭ＝二重鎖領域における修飾ヌクレオチドである。各々のａおよびｂは、独立して０〜８（例えば０、１、２、３、４、５、６、７または８）である。各々のＸ、Ｙ、ａおよびｂは、独立して修飾または非修飾である。センス鎖およびアンチセンス鎖は、各々独立して１７〜４９ヌクレオチドの長さであることができる。以下で提供される例は、１９ヌクレオチドの二重鎖領域を有する。しかし、本明細書に開示される核酸分子は、１７〜４９ヌクレオチドの二重鎖領域をどこにでも有することができ、ここで、各々の鎖は独立して１７〜４９ヌクレオチドの長さである。
【化１７】
0005972408.tif 000019
【０２７３】
さらなる例示的な核酸分子パターンを以下に示し、ここで、Ｘ＝非修飾センス鎖ヌクレオチド、ｘ＝センス鎖における非修飾オーバーハングヌクレオチド、Ｙ＝非修飾アンチセンス鎖ヌクレオチド、ｙ＝アンチセンス鎖における非修飾オーバーハングヌクレオチド、Ｍ＝修飾ヌクレオチドである。センス鎖およびアンチセンス鎖は、各々独立して１７〜４９ヌクレオチドの長さであることができる。以下で提供される例は、１９ヌクレオチドの二重鎖領域を有する。しかし、本明細書に開示される核酸分子は、１７〜４９ヌクレオチドの二重鎖領域をどこにでも有することができ、ここで、各々の鎖は独立して１７〜４９ヌクレオチドの長さである。
【化１８】
0005972408.tif 000020
【０２７４】
核酸分子は、両方の末端に平滑末端を有し、交互する修飾核酸を伴ってもよい。修飾核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖に沿った任意の位置に位置してもよい。
【化１９】
0005972408.tif 000021
【０２７５】
平滑な５’末端および３’末端のオーバーハング末端を有し、単一の修飾核酸を含む核酸分子である。
【０２７６】
５’末端オーバーハングおよび平滑な３’末端を有し、単一の修飾核酸を含む核酸分子である。
【０２７７】
両方の末端にオーバーハングを有し、全てのオーバーハングが修飾核酸である核酸分子である。すぐに下のパターンにおいて、Ｍはｎ個の修飾核酸であり、ここで、ｎは０〜８の整数（すなわち０、１、２、３、４、５、６、７および８）である。
【化２０】
0005972408.tif 000022
【０２７８】
両方の末端にオーバーハングを有し、いくつかのオーバーハングヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである核酸分子である。すぐに下のパターンにおいて、Ｍはｎ個の修飾核酸であり、ｘはセンス鎖におけるｎ個の非修飾オーバーハングヌクレオチドであり、ｙはアンチセンス鎖におけるｎ個の非修飾オーバーハングヌクレオチドであり、ここで、各々のｎは、独立して、０〜８の整数（すなわち０、１、２、３、４、５、６、７および８）であり、各々のオーバーハングは最大２０ヌクレオチド、好ましくは最大８ヌクレオチド（修飾および／または非修飾）である。
【化２１】
0005972408.tif 000023
【化２２】
0005972408.tif 000024
【化２３】
0005972408.tif 000025
【０２７９】
センス領域の３’末端における修飾ヌクレオチド。
【化２４】
0005972408.tif 000026
【０２８０】
センス領域の５’末端におけるオーバーハング。
【化２５】
0005972408.tif 000027
【０２８１】
アンチセンス領域の３’末端におけるオーバーハング。
【化２６】
0005972408.tif 000028
【０２８２】
センス領域内における１個または２個以上の修飾ヌクレオチド。
【化２７】
0005972408.tif 000029
【０２８３】
例示的な核酸分子を、上記で用いた記号に沿った同等の一般構造とともに、以下に提供する：
【０２８４】
１９ヌクレオチド（すなわち１９ｍｅｒ）の二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトおよびラットｈｓｐ４７に対するｓｉＨＳＰ４７−Ｃ  ｓｉＲＮＡである。
【化２８】
0005972408.tif 000030
【０２８５】
２５ｍｅｒの二重鎖領域と、アンチセンス鎖の３’末端における２ヌクレオチドオーバーハングと、センス鎖の５’末端位および最後から２番目の位置における２個の修飾ヌクレオチドとを有する、ヒトおよびラットｈｓｐ４７に対するｓｉＨＳＰ４７−Ｃｄ  ｓｉＲＮＡである。
【化２９】
0005972408.tif 000031
【０２８６】
１９ｍｅｒの二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトおよびラットｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ７１９〜７３７に対するｓｉＨＳＰ４７−１  ｓｉＲＮＡである。
【化３０】
0005972408.tif 000032
【０２８７】
センス鎖の３’末端における平滑末端と、アンチセンス鎖の３’末端における２ヌクレオチドオーバーハングと、センス鎖の５’末端位および最後から２番目の位置における２個の修飾ヌクレオチドとを有する、２５ｍｅｒのヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ７１９〜７４３に対するｓｉＨＳＰ４７−１ｄ  ｓｉＲＮＡである。
【化３１】
0005972408.tif 000033
【０２８８】
１９ｍｅｒの二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ４６９〜４８７に対するｓｉＨＳＰ４７−２  ｓｉＲＮＡである。
【化３２】
0005972408.tif 000034
【０２８９】
センス鎖の３’末端における平滑末端と、アンチセンス鎖の３’末端における２ヌクレオチドオーバーハングと、センス鎖の５’末端位および最後から２番目の位置における２個の修飾ヌクレオチドとを有する、２５ｍｅｒの二重鎖領域を有するヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ４６９〜４９３に対するｓｉＨＳＰ４７−２ｄ  ｓｉＲＮＡである。
【化３３】
0005972408.tif 000035
【０２９０】
センス鎖の３’末端における平滑末端と、アンチセンス鎖の３’末端における２ヌクレオチドオーバーハングと、センス鎖の５’末端位および最後から２番目の位置における２個の修飾ヌクレオチドとを有する、２５ｍｅｒの二重鎖領域を有するラットＧＰ４６ｃＤＮＡ  ４６６〜４９０に対するｓｉＨＳＰ４７−２ｄラットｓｉＲＮＡである。
【化３４】
0005972408.tif 000036
【０２９１】
１９ｍｅｒの二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ９８０〜９９８に対するｓｉＨＳＰ４７〜３  ｓｉＲＮＡである。
【化３５】
0005972408.tif 000037
【０２９２】
センス鎖の３’末端における平滑末端と、アンチセンス鎖の３’末端における２ヌクレオチドオーバーハングと、センス鎖の５’末端位および最後から２番目の位置における２個の修飾ヌクレオチドとを有する、２５ｍｅｒの二重鎖領域を有するヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ９８０〜１００４に対するｓｉＨＳＰ４７〜３ｄ  ｓｉＲＮＡである。
【化３６】
0005972408.tif 000038
【０２９３】
１９ｍｅｒの二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ７３５〜７５３に対するｓｉＨＳＰ４７−４  ｓｉＲＮＡである。
【化３７】
0005972408.tif 000039
【０２９４】
センス鎖の３’末端における平滑末端と、アンチセンス鎖の３’末端における２ヌクレオチドオーバーハングと、センス鎖の５’末端位および最後から２番目の位置における２個の修飾ヌクレオチドとを有する、２５ｍｅｒの二重鎖領域を有するヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ７３５〜７５９に対するｓｉＨＳＰ４７−４ｄ  ｓｉＲＮＡである。
【化３８】
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【０２９５】
１９ｍｅｒの二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ６２１〜６３９に対するｓｉＨＳＰ４７−５  ｓｉＲＮＡである。
【化３９】
0005972408.tif 000041
【０２９６】
１９ｍｅｒの二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ４４６〜４６４に対するｓｉＨＳＰ４７−６  ｓｉＲＮＡである。
【化４０】
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【０２９７】
１９ｍｅｒの二重鎖領域と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端における修飾２ヌクレオチド（すなわちデオキシヌクレオチド）オーバーハングとを有する、ヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡ  ６９２〜７１０に対するｓｉＨＳＰ４７−７  ｓｉＲＮＡである。
【化４１】
0005972408.tif 000043
【０２９８】
核酸鎖におけるニックおよびギャップ
本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、ニックまたはギャップを有する鎖、好ましくはセンス鎖を有してもよい。このように、核酸分子は、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０７／０８１８３６に開示されている部分二重鎖ＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）のような、３本または４本以上の鎖を有してもよい。ニックまたはギャップを有する鎖を有する核酸分子は、約１〜４９ヌクレオチドであってもよく、または、ＲＩＳＣ長（例えば約１５〜２５ヌクレオチド）またはダイサー基質長（例えば約２５〜３０ヌクレオチド）、例えば本明細書に開示されているものなどであってもよい。
【０２９９】
３本または４本以上の鎖を有する核酸分子は、例えば、「Ａ」（アンチセンス）鎖、「Ｓ１」（第２の）鎖および「Ｓ２」（第３）鎖を含み、ここで、「Ｓ１」鎖および「Ｓ２」鎖は、「Ａ」鎖の非オーバーラップ領域に相補的であり、これと塩基対を形成する（例えば、ｍｄＲＮＡはＡ：Ｓ１Ｓ２の形態をとり得る）。Ｓ１、Ｓ２またはさらなる鎖は、一緒に、「Ａ」アンチセンス鎖に対するセンス鎖に実質的に類似するものを形成する。「Ｓ１」鎖と「Ａ」鎖のアニーリングによって形成される二重鎖領域は、「Ｓ２」鎖と「Ａ」鎖のアニーリングによって形成される二重鎖領域とは異なるものであり、オーバーラップしない。核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は「ギャップ」を有する分子であってもよく、これは０ヌクレオチドから約１０ヌクレオチド（例えば０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド）の範囲の「ギャップ」を意味する。好ましくは、センス鎖がギャップ有する。いくつかの態様において、Ａ：Ｓ１二重鎖は、Ａ：Ｓ２二重鎖から、Ａ：Ｓ１二重鎖とＡ：Ｓ２二重鎖との間に位置し、「Ａ」鎖、「Ｓ１」鎖および「Ｓ２」鎖の１または２以上の３’末端の１個または２個以上の不対ヌクレオチドのいずれとも異なる、少なくとも１個の不対ヌクレオチド（約１０個までの不対ヌクレオチド）によって生じるギャップによって分離している。Ａ：Ｓ１二重鎖は、Ａ：Ｓ２二重鎖から、Ａ：Ｓ１二重鎖とＡ：Ｓ２二重鎖との間のゼロヌクレオチドのギャップ（すなわち、ポリヌクレオチド分子において２ヌクレオチド間のホスホジエステル結合だけが壊れているか、欠けているニック）によって分離していてもよく、これはニック入り（nicked）ｄｓＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ）と呼ぶこともできる。例えば、Ａ：Ｓ１Ｓ２は、合計で約１４塩基対から約４０塩基対を組み合わせた少なくとも２個の二重鎖領域を有し、二重鎖領域が約０〜約１０ヌクレオチドのギャップによって分離され、任意に平滑末端を有するｄｓＲＮＡを含んでもよく、または、Ａ：Ｓ１Ｓ２は、１０ヌクレオチドまでのギャップによって分離された少なくとも２個の二重鎖領域を有するｄｓＲＮＡを含んでもよく、ここで二重鎖領域の少なくとも１つは約５塩基対〜１３塩基対を含む。
【０３００】
ダイサー基質
一部の態様において、本明細書において提供される核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）は、例えばRossi、米国特許出願20050244858に記載されているような、in vivoでプロセシングされ、活性な核酸分子を生成する前駆体「ダイサー基質」分子、例えば二本鎖核酸であってもよい。一部の条件および状況において、これらの比較的長いｄｓＲＮＡ  ｓｉＮＡ種、例えば約２５〜約３０ヌクレオチドのものが、効力および作用持続時間に関して予想外に効果的な結果をもたらすことができることが見出されている。いかなる特定の理論に束縛されることを望むものではないが、より長いｄｓＲＮＡ種は、細胞の細胞質における酵素ダイサーの基質として用いられると考えられる。二本鎖核酸をより短いセグメントに切断することに加えて、ダイサーは、切断されたｄｓＲＮＡに由来する一本鎖切断産物の、標的遺伝子に由来する細胞質内ＲＮＡの破壊に関与するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ複合体）への組込みを容易にすることができる。
【０３０１】
ダイサー基質は、ダイサーによるそのプロセシングを強化するある種の特性を有してもよい。ダイサー基質は、それがダイサーによってプロセシングされ、活性な核酸分子を生成するのに十分な長さであり、以下の特性の１または２以上をさらに含んでもよい：（ｉ）ｄｓＲＮＡは非対称であり、例えば、第１の鎖（アンチセンス鎖）に３’オーバーハングを有する、および、（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、ダイサーの結合の方向およびｄｓＲＮＡの活性なｓｉＲＮＡへのプロセシングを誘導するための、第２の鎖（センス鎖）における修飾３’末端を有する。一部の態様において、ダイサー基質における最長の鎖は、２４〜３０ヌクレオチドであってもよい。
【０３０２】
ダイサー基質は対称性であっても非対称性であってもよい。ダイサー基質は、２２〜２８ヌクレオチドを含むセンス鎖を有してもよく、アンチセンス鎖は２４〜３０ヌクレオチドを含んでもよい。したがって、いくつかの態様において、結果として生じるダイサー基質は、アンチセンス鎖の３’末端に、オーバーハングを有してもよい。ダイサー基質は、長さが２５ヌクレオチドのセンス鎖と、２塩基の３’オーバーハングを有し、２７ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖とを有してもよい。オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドであってもよい。センス鎖はまた、５’ホスフェートを有してもよい。
【０３０３】
非対称性ダイサー基質は、リボヌクレオチドのうちの２個の代わりに、センス鎖の３’末端に２個のデオキシヌクレオチドをさらに含んでもよい。いくつかの例示的なダイサー基質長および構造は、２１＋０、２１＋２、２１−２、２２＋０、２２＋１、２２−１、２３＋０、２３＋２、２３−２、２４＋０、２４＋２、２４−２、２５＋０、２５＋２、２５−２、２６＋０、２６＋２、２６−２、２７＋０、２７＋２および２７−２である。
【０３０４】
ダイサー基質のセンス鎖は、長さが約２２〜約３０（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）、約２２〜約２８、約２４〜約３０、約２５〜約３０、約２６〜約３０、約２６〜２９、または約２７〜約２８ヌクレオチドであってもよい。一部の好ましい態様において、ダイサー基質は、長さが少なくとも約２５ヌクレオチドであり、約３０ヌクレオチドよりは長くないか、約２６〜２９ヌクレオチドか、または長さが２７ヌクレオチドの、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。センス鎖およびアンチセンス鎖は、同じ長さ（平滑末端）であっても、異なる長さ（オーバーハングを有する）であっても、または組合せであってもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖は、同じポリヌクレオチドに存在しても、異なるポリヌクレオチドに存在してもよい。ダイサー基質は、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２７ヌクレオチドの二重鎖領域を有してもよい。
【０３０５】
本明細書において提供される他のｓｉＮＡ分子と同様に、ダイサー基質のアンチセンス鎖は、生物学的条件下、例えば、真核細胞の細胞質内などにおいて、アンチセンス鎖にアニーリングする任意の配列を有してもよい。
【０３０６】
ダイサー基質は、ヌクレオチド塩基、糖またはリン酸骨格に対する、当該技術分野において既知の、および／または、本明細書において他の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）について記載された、任意の修飾を有してもよい。一部の態様において、ダイサー基質は、センス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によってダイサープロセシングのために修飾されたセンス鎖を有してもよい。すなわち、このｄｓＲＮＡはダイサーの結合およびプロセシングの方向を誘導するように設計されている。好適な修飾因子は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および、立体障害（sterically hindered）分子、例えば、蛍光分子などを含む。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰにおいて通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖における２−ヒドロキシエトキシメチル基を置換する。ダイサー基質ｓｉＮＡ分子において用いることができる他のヌクレオチド修飾因子は、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを含む。一態様において、デオキシヌクレオチドが修飾因子として用いられる。ヌクレオチド修飾因子を利用する場合、ダイサー基質の長さが変わらないように、それらはリボヌクレオチドを置換してもよい（例えば、１〜３個のヌクレオチド修飾因子または２個のヌクレオチド修飾因子が、センス鎖の３’末端におけるリボヌクレオチドと置き換わる）。立体障害分子を利用する場合、これらはアンチセンス鎖の３’末端のリボヌクレオチドに付着させてもよい。したがって、一部の態様において、鎖の長さは、修飾因子の組込みによって変化しない。一部の態様において、ｄｓＲＮＡの２個のＤＮＡ塩基が、アンチセンス鎖のダイサープロセシングの方向を誘導するために置換されている。さらなる態様において、２個の末端ＤＮＡ塩基が、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端において、二重鎖の平滑末端を形成しているセンス鎖の３’末端の２個のリボヌクレオチドと置き換わり、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングがアンチセンス鎖の３’末端に位置する。これは、平滑末端におけるＤＮＡとオーバーハング末端におけるＲＮＡ塩基を有する非対称性の構成である。
【０３０７】
一部の態様において、修飾は、修飾が核酸分子がダイサーのために基質として機能することを妨げないように、ダイサー基質に含められる。一態様において、ダイサー基質のダイサープロセシングを強化する１または２以上の修飾がなされる。より効果的なＲＮＡｉの生成をもたらす１または２以上の修飾がなされてもよい。より大きなＲＮＡｉ効果を支持する１または２以上の修飾がなされてもよい。各々のダイサー基質につき、細胞に送達されるより大きな能力をもたらす１または２以上の修飾がなされる。修飾は、３’末端領域、５’末端領域、３’末端領域および５’末端領域の両方、または配列内の種々の位置に組み込まれてもよい。修飾が核酸分子がダイサーのために基質として機能することを妨げない限り、任意の数と組合せの修飾をダイサー基質に組み込むことができる。複数の修飾が存在する場合、それらは同じであっても、異っていてもよい。塩基、糖部分、リン酸骨格に対する修飾、およびこれらの組合せが企図される。どちらの５’末端もリン酸化することができる。
【０３０８】
ダイサー基質リン酸骨格修飾の例は、メチルホスホネートを含むホスホネート、ホスホロチオエートおよびホスホトリエステル修飾、例えばアルキルホスホトリエステルなどを含む。ダイサー基質糖部分修飾の例は、２’−アルキルピリミジン、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、アミノおよびデオキシ修飾などを含む（例えば、Amarzguioui et al., 2003参照）を含む。ダイサー基質塩基基修飾の例は、無塩基糖、２’−Ｏ−アルキル修飾ピリミジン、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシルおよび５−（３−アミノアリル）−ウラシルなどを含む。ロックド核酸またはＬＮＡもまた組み込むことができる。
【０３０９】
センス鎖は、センス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によってダイサープロセシングのために修飾されいてもよい。すなわち、このダイサー基質はダイサーの結合およびプロセシングの方向を誘導するように設計されている。好適な修飾因子は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および、立体障害分子、例えば、蛍光分子などを含む。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰにおいて通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖における２−ヒドロキシエトキシメチル基を置換する。他のヌクレオチド修飾因子は、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを含む。一態様において、デオキシヌクレオチドが修飾因子として用いられる。ヌクレオチド修飾因子を利用する場合、１〜３個のヌクレオチド修飾因子または２個のヌクレオチド修飾因子が、センス鎖の３’末端におけるリボヌクレオチドと置き換わる。立体障害分子を利用する場合、これらはアンチセンス鎖の３’末端のリボヌクレオチドに付着させる。したがって、一部の態様において、鎖の長さは、修飾因子の組込みによって変化しない。別の態様において、本発明は、ダイサー基質の２個のＤＮＡ塩基を、アンチセンス鎖のダイサープロセシングの方向を誘導するために置換することを企図する。本発明のさらなる態様において、２個の末端ＤＮＡ塩基が、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端において、二重鎖の平滑末端を形成しているセンス鎖の３’末端の２個のリボヌクレオチドと置き換わり、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングがアンチセンス鎖の３’末端に位置する。これは、平滑末端におけるＤＮＡとオーバーハング末端におけるＲＮＡ塩基を有する非対称性の構成である。
【０３１０】
アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によってダイサープロセシングのために修飾されいてもよい。すなわち、このｄｓＲＮＡはダイサーの結合およびプロセシングの方向を誘導するように設計されている。好適な修飾因子は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなど、および、立体障害分子、例えば、蛍光分子などを含む。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰにおいて通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖における２−ヒドロキシエトキシメチル基を置換する。他のヌクレオチド修飾因子は、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドを含む。一態様において、デオキシヌクレオチドが修飾因子として用いられる。ヌクレオチド修飾因子を利用する場合、１〜３個のヌクレオチド修飾因子または２個のヌクレオチド修飾因子が、アンチセンス鎖の３’末端におけるリボヌクレオチドと置き換わる。立体障害分子を利用する場合、これらはアンチセンス鎖の３’末端のリボヌクレオチドに付着させる。したがって、一部の態様において、鎖の長さは、修飾因子の組込みによって変化しない。別の態様において、本発明は、ｄｓＲＮＡの２個のＤＮＡ塩基を、アンチセンス鎖のダイサープロセシングの方向を誘導するために置換することを企図する。本発明のさらなる態様において、２個の末端ＤＮＡ塩基が、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端において、二重鎖の平滑末端を形成しているアンチセンス鎖の３’末端の２個のリボヌクレオチドの代わりに位置し、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングがセンス鎖の３’末端に位置する。これは、平滑末端におけるＤＮＡとオーバーハング末端におけるＲＮＡ塩基を有する非対称性の構成である。
【０３１１】
センス鎖およびアンチセンス鎖を有するダイサー基質は、第３の構造で連結されていてもよい。第３の構造は、ダイサー基質におけるダイサーの活性を妨害せず、標的遺伝子から転写されるＲＮＡの有向性の破壊（directed destruction）を妨げない。第３の構造は、化学的連結基（chemical linking group）であってもよい。好適な化学的連結基は当該技術分野において既知であり、使用可能である。あるいは、第３の構造は、ｄｓＲＮＡの２個のオリゴヌクレオチドを、この２個のオリゴヌクレオチドのアニーリングによりヘアピン構造が生じ、ダイサー基質が生成される様式で連結するオリゴヌクレオチドであってもよい。ヘアピン構造は、好ましくはダイサー基質におけるダイサーの活性を妨害せず、または、標的遺伝子から転写されるＲＮＡの有向性の破壊を妨げない。
【０３１２】
ダイサー基質のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、完全に相補的であることを要しない。それらは、生物学的条件下でアニーリングし、標的配列と十分に相補的なｓｉＲＮＡを生じる、ダイサーのための基質を提供するために、実質的に相補的であることが必要とされるにすぎない。
【０３１３】
ダイサー基質は、ダイサーによるそのプロセシングを強化するある種の特性を有してもよい。ダイサー基質は、それがダイサーによってプロセシングされ、活性な核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）を生成するのに十分な長さを有してもよく、以下の特性の１または２以上を含んでもよい：（ｉ）ダイサー基質は非対称であり、例えば、第１の鎖（アンチセンス鎖）に３’オーバーハングを有する、および、（ｉｉ）ダイサー基質は、ダイサーの結合の方向およびｄｓＲＮＡの活性なｓｉＲＮＡへのプロセシングを誘導するための、第２の鎖（センス鎖）における修飾３’末端を有する。ダイサー基質は、センス鎖が２２〜２８ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が２４〜３０ヌクレオチドを含むように、非対称であってもよい。したがって、結果として生じるダイサー基質は、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有する。オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドである。センス鎖はまた、５’ホスフェートを有してもよい。
【０３１４】
ダイサー基質は、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有してもよく、センス鎖は、ダイサープロセシングのために修飾されている。センス鎖の５’末端は、ホスフェートを有してもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖は、生物学的条件、例えば細胞の細胞質で見出される条件下でアニーリングしてもよい。ダイサー基質の１方の鎖、特にアンチセンス鎖の領域は、少なくとも１９ヌクレオチドの配列長を有してもよく、ここで、これらヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する２１ヌクレオチドの領域にあり、標的遺伝子から生成されるＲＮＡのヌクレオチド配列と十分に相補的である。ダイサー基質はまた、以下のさらなる特性の１または２以上を有してもよい：（ａ）アンチセンス鎖は、対応する２１ｍｅｒに対して右へのシフトを有する（すなわち、対応する２１ｍｅｒと比較した場合、アンチセンス鎖は分子の右側にヌクレオチドを含む）、（ｂ）鎖は完全には相補的でなくてもよく、すなわち、鎖は単純なミスマッチ対を含んでもよい、および（ｃ）塩基修飾、例えば１個または２個以上のロックド核酸は、センス鎖の５’末端に含まれてもよい。
【０３１５】
ダイサー基質核酸分子のアンチセンス鎖は、５’末端に１〜９個のリボヌクレオチドを含み、２２〜２８ヌクレオチドの長さを与えるように修飾されてもよい。アンチセンス鎖が２１ヌクレオチドの長さを有する場合、１〜７個のリボヌクレオチド、または２〜５個のリボヌクレオチド、および／または、４個のリボヌクレオチドが、３’末端に追加されてもよい。追加されたリボヌクレオチドは、任意の配列を有してもよい。追加されたリボヌクレオチドは標的遺伝子配列に相補的であってもよいが、標的配列とアンチセンス鎖との間の完全な相補性は必要ではない。つまり、結果として得られるアンチセンス鎖は、標的配列と十分に相補的である。センス鎖は、したがって、２４〜３０ヌクレオチドを有してもよい。センス鎖は、生物学的条件下でアンチセンス鎖にアニーリングするために、アンチセンス鎖と実質的に相補的であってもよい。一態様において、アンチセンス鎖は、ダイサープロセシングを誘導するために、修飾３’末端を含むように合成されてもよい。センス鎖は、３’オーバーハングを有してもよい。アンチセンス鎖は、ダイサーの結合およびプロセシングのための修飾３’末端をむように合成されてもよく、センス鎖は３’オーバーハングを有する。
【０３１６】
熱ショックタンパク質４７
熱ショックタンパク質４７（ＨＳＰ４７）は、コラーゲン特異的分子シャペロンであり、小胞体に存在する。これは、フォールディング、組立ておよび小胞体からの輸送プロセスの間、プロコラーゲンと相互作用する（Nagata Trends Biochem Sci 1996; 21:22-6、Razzaque et al. 2005; Contrib Nephrol 2005; 148: 57-69、Koide et al. 2006 J. Biol. Chem.; 281: 3432-38、Leivo et al. Dev. Biol. 1980; 76:100-114、Masuda et al. J. Clin. Invest. 1994; 94:2481-2488、Masuda et al. Cell Stress Chaperones 1998; 3:256-264）。ＨＳＰ４７は種々の組織線維症（Koide et al. J Biol Chem 1999; 274: 34523-26）、例えば、肝硬変（Masuda et al. J Clin Invest 1994; 94:2481-8）、肺線維症（Razzaque et al. Virchows Arch 1998; 432:455-60、Kakugawa et al. Eur Respir J 2004; 24: 57-65）、および糸球体硬化症（Moriyama et al. Kidney Int 1998; 54: 110-19）において、発現が上方調節されていることが報告されている。標的ヒトｈｓｐ４７ｃＤＮＡの例示的な核酸配列は、GenBankアクセッション番号NM_001235、および対応するｍＲＮＡ配列、例えば配列番号１としてリストされたものに開示されている。当業者は、所定の配列が時間とともに変化し得、それにしたがって、本明細書における核酸分子に必要なあらゆる変化を組み込むことを理解する。
【０３１７】
広範なコラーゲン型とのＨＳＰ４７の特異的な結合は、ＨＳＰ４７を線維症の処置の潜在的な標的とする。ｈｓｐ４７発現の阻害は、細胞外コラーゲンＩ分泌を防止することができる。Sato et al.（Nat Biotechnol 2008; 26:431-442）は、ｈｓｐ４７発現の阻害のためにｓｉＲＮＡを用い、ラットにおいて肝線維症の進行を防止するによって、この可能性を探った。同様に、Chen et al.（Br J Dermatol 2007; 156: 1188-1195）およびWang et al.（Plast. Reconstr Surg 2003; 111: 1980-7）は、ＲＮＡ干渉技術によるｈｓｐ４７発現阻害を調査した。
【０３１８】
ｈｓｐ４７を阻害するための方法および組成物
【０３１９】
提供されるのは、ｓｐ４７遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉を誘導することができる、または誘導する、短鎖核酸分子、例えば短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などを用いることによる、ｈｓｐ４７発現の抑制のための組成物および方法である。本明細書に開示される組成物および方法はまた、種々の線維症、例えば肝線維症、肺線維症および腎線維症の処置にも有用である。
【０３２０】
本発明の１もしくは２以上の核酸分子および／または方法は、例えば、GenbankアクセッションNM_001235に記載のＲＮＡをコードする１もしくは２以上の遺伝子の発現を下方調節するのに用いられる。
【０３２１】
本明細書において提供される組成物、方法およびキットは、ｈｓｐ４７タンパク質および／またはｈｓｐ４７タンパク質をコードする遺伝子、ｈｓｐ４７と関連する疾患、状態または障害、例えば、肝線維症、肝硬変、肺線維症、腎線維症、腹膜線維症、慢性肝損傷および原線維形成の維持および／または発症に関連するタンパク質および／またはｈｓｐ４７をコードする遺伝子（例えば、GenBankアクセッション番号NM_001235によって言及される配列を含む配列をコードする遺伝子）、またはｈｓｐ４７遺伝子ファミリーメンバー（ここで、遺伝子または遺伝子ファミリー配列は配列相同性を共有する）の発現を、独立して、または、組み合わせて調節する１または２以上の核酸分子（例えばｓｉＮＡ）および方法を含んでもよい。種々の側面および態様の説明は、例示的な遺伝子ｈｓｐ４７に関して提供される。しかしながら、種々の側面および態様はまた、他の関連するｈｓｐ４７遺伝子、例えばホモログ遺伝子および転写変異体、および、一部のｈｓｐ４７遺伝子に関連する多型（例えば、一塩基多型（ＳＮＰｓ））をも対象とする。したがって、種々の側面および態様はまた、ｈｓｐ４７が誘導するシグナル伝達経路に関与している他の遺伝子、または、例えば、本明細書に記載の疾患、形質または状態の維持または発症に関与している遺伝子発現をも対象とする。これらのさらなる遺伝子は、本明細書中ｈｓｐ４７遺伝子に関して記載された方法を用いて、標的部位について分析することができる。したがって、他の遺伝子の調節および他の遺伝子のかかる調節の効果は、本明細書に記載のとおりに実行、決定、および測定することができる。
【０３２２】
一態様において、本明細書において提供される組成物および方法は、ｈｓｐ４７遺伝子（例えば、配列番号１によって例示されるヒトｈｓｐ４７）の発現を下方調節する二本鎖短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含み、ここで該核酸分子は約１５個〜約４９個の塩基対を含む。
【０３２３】
一態様において、開示される核酸は、ｈｓｐ４７遺伝子またはｈｓｐ４７遺伝子ファミリーの発現を阻害するために用いられてもよく、ここで、遺伝子または遺伝子ファミリー配列は配列相同性を共有する。かかる相同配列は、当該技術分野において知られていているように同定することができ、例えば配列アラインメントを用いて同定することができる。核酸分子は、例えば、完全に相補的な配列を用いて、または、さらなる標的配列を提供することができる非正準（non-canonical）塩基対、例えばミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対を組み込むことによって、かかる相同配列を標的とするように設計することができる。ミスマッチが確認された場合、非正準塩基対（例えばミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基）を用いて、複数の遺伝子配列を標的とする核酸分子を生成することができる。非限定例において、非正準塩基対、例えば、ＵＵおよびＣＣ塩基対等を用いて、配列相同性を共有する異なるｈｓｐ４７標的のための配列をターゲティングできる核酸分子を生成する。したがって、本明細書に開示されるｓｉＮＡを用いることの１つの利点は、単一の核酸が、相同遺伝子間で保存されているヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を含むように設計できることである。このアプローチにおいては、複数の核酸分子を異なる遺伝子のターゲティングに用いる代わりに、単一の核酸を複数の遺伝子の発現の阻害に用いることができる。
【０３２４】
核酸分子は、ｈｓｐ４７ファミリー遺伝子などの、１または２以上の遺伝子ファミリーに対応する保存配列のターゲティングに用いることができる。したがって、複数の標的ｈｓｐ４７をターゲティングする核酸分子は、増大した治療効果を提供することができる。そのうえ、核酸は、種々の用途において、遺伝子機能の経路を特徴づけるのに用いることができる。例えば、核酸分子は、遺伝子機能分析、ｍＲＮＡ機能分析または翻訳分析において、ある経路における１種または２種以上の標的遺伝子の活性を阻害し、特徴づけられていない１種または２種以上の遺伝子の機能を決定するために用いることができる。核酸分子は、医薬開発に向けて、種々の疾患および状態に関与する潜在的な標的遺伝子経路を決定するために用いることができる。核酸分子は、例えば、線維症、例えば、肝臓、腎臓または肺線維症および／または炎症性および増殖性の形質、疾患、障害および／または状態に関与する遺伝子発現の経路を理解するために用いることができる。
【０３２５】
一態様において、本明細書において提供される組成物および方法は、ｈｓｐ４７ＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性を有する核酸分子を含み、ここで、核酸分子は、ｈｓｐ４７をコードする配列を有する任意のＲＮＡに相補的な配列、例えば、表Ｉに示す配列を有する配列を含む。別の態様において、核酸分子は、ｈｓｐ４７ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を有してもよく、ここで、核酸分子は、変異体ｈｓｐ４７をコードする配列、例えば表Ｉに示されていないが、線維症の維持および／または発症に関連することが当該技術分野において知られている他の変異ｈｓｐ４７遺伝子、を有するＲＮＡに相補的な配列を含む。表Ｉに示す、または、それとは別に本明細書に記載された化学修飾は、本明細書に開示される任意の核酸構築物に適用することができる。別の態様において、本明細書に開示される核酸分子は、ｈｓｐ４７遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用することができ、それによって、ｈｓｐ４７遺伝子発現のサイレンシングを誘導するヌクレオチド配列を含み、例えば、ここで、核酸分子は、染色体構造またはｈｓｐ４７遺伝子のメチル化パターンを調節し、ｈｓｐ４７遺伝子の転写を防止する細胞プロセスによって、ｈｓｐ４７遺伝子発現の調整を誘導する。
【０３２６】
本明細書に開示される核酸分子は、ｈｓｐ４７ＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性を有してもよく、ここで、核酸分子は、ｈｓｐ４７をコードする配列、例えばGenBankアクセッション番号NM_001235を有する配列、を有する任意のＲＮＡに相補的な配列を含む。核酸分子は、ｈｓｐ４７ＲＮＡに対するＲＮＡｉ活性を有してもよく、ここで、核酸分子は、変異体ｈｓｐ４７をコードする配列、例えば、線維症の維持および／または発症に関連することが当該技術分野において知られている他の変異ｈｓｐ４７遺伝子、を有するＲＮＡに相補的な配列を含む。本明細書に開示される核酸分子は、ｈｓｐ４７遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用することができ、それによって、ｈｓｐ４７遺伝子発現のサイレンシングを誘導するヌクレオチド配列を含み、例えば、ここで、核酸分子は、染色体構造またはｈｓｐ４７遺伝子のメチル化パターンを調節し、ｈｓｐ４７遺伝子の転写を防止する細胞プロセスによって、ｈｓｐ４７遺伝子発現の調整を誘導する。
【０３２７】
処置方法
広範なコラーゲン型とのＨＳＰ４７の特異的な結合は、ＨＳＰ４７を線維症の処置の標的とする。ｈｓｐ４７発現の阻害は、細胞外コラーゲンＩ分泌を防止することができる。Sato et al.（Nat Biotechnol 2008; 26:431-442）は、ｈｓｐ４７発現の阻害のためにｓｉＲＮＡを用い、ラットにおいて肝線維症の進行を防止するによって、この可能性を探った。同様に、Chen et al.（Br J Dermatol 2007; 156: 1188-1195）およびWang et al.（Plast. Reconstr Surg 2003; 111: 1980-7）は、ＲＮＡ干渉技術によるｈｓｐ４７発現阻害を調査した。
【０３２８】
一態様において、核酸分子は、ｈｓｐ４７および／または、ｈｓｐ４７および／または疾患もしくは状態（例えば線維症）と関連するｈｓｐ４７ハプロタイプ多型に起因するｈｓｐ４７タンパク質の発現を下方調節または阻害するのに用いることができる。ｈｓｐ４７および／またはｈｓｐ４７遺伝子、またはｈｓｐ４７および／またはｈｓｐ４７タンパク質の分析またはＲＮＡレベルを、かかる多型を有する対象、または、本明細書に記載の形質、状態または疾患を発症するリスクを有するこれらの対象を同定することに用いることができる。これらの対象は、処置、例えば本明細書に開示される核酸分子およびｈｓｐ４７および／またはｈｓｐ４７遺伝子発現に関連した疾患を処置するのに有用なあらゆる他の組成物による処置に適している。したがって、ｈｓｐ４７および／またはｈｓｐ４７タンパク質またはＲＮＡレベルの分析は、対象の処置における処置の種類および治療過程の決定に用いることができる。ｈｓｐ４７および／またはｈｓｐ４７タンパク質またはＲＮＡレベルのモニタリングは、処置結果の予測、およびして、形質、状態または疾患に関連する特定のｈｓｐ４７および／またはｈｓｐ４７タンパク質のレベルおよび／または活性を調節する化合物および組成物の有効性の決定に用いることができる。
【０３２９】
提供されるのは、ｈｓｐ４７遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉を誘導することができる、または誘導する、本明細書において提供される短鎖核酸分子、例えば短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などを用いることによる、ｈｓｐ４７発現の抑制のための組成物および方法である。本明細書に開示される組成物および方法はまた、種々の線維症、例えば肝線維症、肺線維症および腎線維症の処置にも有用である。
【０３３０】
本明細書に開示される核酸分子は、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、もしくは他の薬剤とともに、ｈｓｐ４７に関連する疾患、形質、状態および／または障害、例えば、肝線維症、肝硬変、肺線維症、腎線維症、腹膜線維症、慢性肝損傷および原線維形成の予防または処置に用いることができる。
【０３３１】
本明細書に開示される核酸分子は、ｈｓｐ４７の発現を配列特異的な様式で阻害することができる。核酸分子は、ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡに少なくとも部分的に相補的（アンチセンス）な連続ヌクレオチドを含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでもよい。
【０３３２】
いくつかの態様において、ｈｓｐ４７に特異的なｄｓＲＮＡは、例えば新たに合成されたタンパク質のフォールディングを補助する他の分子シャペロン、例えば、カルネキシン、カルレティキュリン、ＢｉＰ（Bergeron et al. Trends Biochem. Sci. 1994; 19:124-128、Herbert et al. 1995; Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 60:405-415）に特異的な他のｄｓＲＮＡとともに用いることができる。
【０３３３】
線維症は、本明細書に開示される核酸分子を用いたＲＮＡ干渉により処置することができる。例示的な線維症は、肝線維症、腹膜線維症、肺線維症、腎線維症を含む。本明細書に開示される核酸分子は、配列特異的な様式でｈｓｐ４７の発現を阻害することができる。
【０３３４】
線維症の処置は、当該技術分野で既知の好適な技法を用いて、例えば、抗コラーゲンＩ抗体を用いて、細胞外のコラーゲンのレベルを決定することによりモニタリングできる。処置はまた、罹患組織の細胞におけるｈｓｐ４７  ｍＲＮＡのレベルまたはＨＳＰ４７タンパク質のレベルを決定することによってもモニタリングできる。処置はまた、罹患器官または組織の非侵襲性スキャン、例えば、コンピュータ連動断層撮影スキャン、核磁気共鳴弾性率計測スキャンなどによってもモニタリングできる。
【０３３５】
対象または生体におけるｈｓｐ４７に関連する疾患または状態の処置または予防するための方法は、対象または生体と、本明細書において提供される核酸分子とを、対象または生体におけるｈｓｐ４７遺伝子の発現の調節に好適な条件下で接触させることを含んでもよい。
【０３３６】
対象または生体における線維症を処置または予防するための方法は、対象または生体と、核酸分子とを、対象または生体におけるｈｓｐ４７遺伝子の発現の調節に好適な条件下で接触させることを含んでもよい。
【０３３７】
対象または生体における、肝線維症、腎線維症および肺線維症からなる群から選択される１種または２種以上の線維症を処置または予防するための方法は、対象または生体と、核酸分子とを、対象または生体におけるｈｓｐ４７遺伝子の発現の調節に好適な条件下で接触させることを含んでもよい。
【０３３８】
線維性疾患
線維性疾患は、一般的に、細胞外マトリックス中の線維状物質の過剰な堆積を特徴とし、それは組織構造の異常な変化の一因となり、正常な器官の機能を妨げる。
【０３３９】
外傷によって損傷を受けた組織は全て、創傷治癒プログラムの開始により反応する。過剰な瘢痕化を特徴とする障害の一種である線維症は、創傷治癒反応の正常な自己制御プロセスが妨げられた場合に生じ、コラーゲンの過剰な産生および堆積をもたらす。その結果、器官の正常な組織は瘢痕組織と置き換わり、これがやがては器官の機能不全をもたらす。
【０３４０】
線維症は、多様な原因により、種々の器官で発症し得る。肝硬変、肺線維症、サルコイドーシス、ケロイドおよび腎線維症は全て、進行性の線維症に関連した慢性の状態であり、それによって正常な組織機能の持続的な喪失をもたらす。
【０３４１】
急性線維化（通常、突発性で重篤な発症を伴い、持続期間は短い）は、種々の形態の、偶発的な損傷（特に脊柱および中枢神経系の損傷）を含む外傷、感染症、手術、虚血性疾患（例えば心臓発作後の心臓の瘢痕化）、熱傷、環境汚染物、アルコールおよび他の種類の毒素、急性呼吸不全症候群、放射線および化学療法処置への共通の反応として生じる。
【０３４２】
線維症、線維化に関係する病態、または、細胞タンパク質の異常な架橋に関係する病態は全て本明細書に開示されるｓｉＲＮＡによって処置することができる。線維性疾患または線維化が明白な疾患（線維化に関係する病態）は、組織線維症の急性および慢性形態の両方を含み、これは以下の全ての病因的類似疾患（etiological variant）を含む：間質性肺疾患および線維性肺疾患を含む肺線維症、肝線維症、心筋線維症を含む心線維症、慢性腎不全を含む腎線維症、強皮症を含む皮膚線維症、ケロイドおよび肥厚性瘢痕、骨髄線維症（骨髄の線維症）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、および白内障または緑内障を処置する手術により生じた瘢痕化を含むあらゆる種類の眼の瘢痕化、多様な病因の炎症性腸疾患、黄斑部変性、グレーブス眼症、薬剤誘導性麦角中毒、ケロイド瘢痕、強皮症、乾癬、リ・フラウメニ症候群における膠芽腫、散発性膠芽腫、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性症候群、婦人科がん、カポシ肉腫、ハンセン病および膠原性大腸炎。
【０３４３】
種々の態様において、本明細書に開示される化合物（核酸分子）は線維性疾患、例えば本明細書に開示されるもの、ならびに、繊維性疾患以外の多くの他の疾患および状態、例えば本明細書に開示されるものの処置に用いることができる。処置される他の状態は、他の器官における線維性疾患、あらゆる原因の腎線維症（ＥＳＲＤを含むＣＫＤ）、肺線維症（ＩＬＦを含む）、骨髄線維症、偶発的および医原性（手術）の全ての可能な種類の皮膚損傷に関連する異常な瘢痕化（ケロイド）、強皮症、心線維症、緑内障濾過手術の失敗、および腸管癒着症を含む。
【０３４４】
眼科手術および線維性合併症
眼の手術に起因する瘢痕組織の収縮は頻繁に生じ得る。新たな排出路を形成するための緑内障手術は組織の瘢痕化と収縮のために失敗することが多く、形成した排出システムが閉塞することがあり、さらなる外科的介入が必要となる。現行の抗収縮レジメン（マイトマイシンＣまたは５ＦＵ）は、関連する合併症（例えば失明）によって制限されている（例えば、Cordeiro MF, et al., Human anti-transforming growth factor-beta2 antibody: a new glaucoma anti-scarring agent Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999 Sep;40(10):2225-34参照）。角膜外傷または角膜手術（例えば組織の収縮が不正確な結果をもたらすことがある近視または屈折異常のためのレーザーまたは外科的処置）の後に形成される瘢痕組織の収縮もあり得る。瘢痕組織は、例えば硝子体液または網膜の上／内部に形成されることがあり、一部の糖尿病患者においては最終的に失明を生じ得、網膜剥離手術後に形成されることがあり、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）と呼ばれている。ＰＶＲは網膜剥離後の最もよく見られる合併症であり、網膜孔または網膜裂孔と関係している。ＰＶＲは、網膜色素上皮細胞を含む、硝子体腔内および網膜前面および後面上の細胞膜の増殖を指す。本質的に瘢痕組織であるこれらの膜は網膜を牽引し、当初は成功した網膜剥離治療の後でさえ、網膜剥離の再発をもたらすことがある。
【０３４５】
瘢痕組織は、眼窩内または眼球および眼瞼筋上に、斜視、眼窩または眼瞼の手術後、または甲状腺眼症に生じることがある。そこでは、結膜の瘢痕形成が、緑内障手術後、または、瘢痕性疾患、炎症性疾患、例えば類天疱瘡、または感染症、例えばトラコーマにおいて生じ得るのと同様にして起こる。コラーゲン含有組織の収縮に関連するさらなる眼の問題は、白内障摘出後の水晶体カプセルの不透明化および収縮である。ＭＭＰの重要な役割が、創傷治癒、ドライアイ、無菌性角膜潰瘍、再発性上皮びらん、角膜血管新生、翼状片、結膜弛緩症、緑内障、ＰＶＲおよび眼線維症を含む眼科疾患で認められている。
【０３４６】
肝線維症
肝線維症（ＬＦ）は、複数の病因の肝損傷の一般的に不可逆的な結果である。欧米諸国において、主な病因学的カテゴリーは、アルコール性肝疾患（３０〜５０％）、ウイルス性肝炎（３０％）、胆管疾患（５〜１０％）、原発性ヘモクロマトーシス（５％）、ならびに薬剤性肝硬変および病因不明の特発性肝硬変（１０〜１５％）である。ウイルソン病、α１アンチトリプシン欠損症および他の奇病も、肝線維症を症状の１つとして有する。肝線維症の末期である肝硬変は、肝移植を要することが多く、欧米諸国における死因の上位１０位以内に入っている。
【０３４７】
腎線維症および関連する状態
慢性腎不全（ＣＲＦ）
慢性腎不全は、老廃物を排出し、尿を濃縮し、電解質を維持する腎臓の能力の漸次的かつ進行性の喪失である。ＣＲＦは、ゆっくりと進行する。それは最も多くの場合、腎機能の漸次的な喪失をもたらす任意の疾患から生じ、線維症はＣＲＦを生じさせる主な病態である。
【０３４８】
糖尿病性腎障害
糖尿病性腎障害（その特徴は糸球体硬化症および尿細管間質性線維症である）は、現代社会における末期腎疾患の唯一のもっとも頻度の高い原因であり、糖尿病患者は透析を受ける最大の人口を構成する。かかる治療は効果であり、決して最適なものではない。移植はより良い結果を提供するが、提供者の深刻な不足に悩まされている。
【０３４９】
慢性腎臓病
慢性腎臓病（ＣＫＤ）は、世界的な公衆衛生上の問題であり、心臓血管疾患および慢性腎不全（ＣＲＦ）の増大した危険性と関連している、よく見られる状態であると認識されている。
【０３５０】
米国腎臓財団（ＮＫＦ）の腎臓病成果品質イニシアティブ（Ｋ／ＤＯＱＩ）は、慢性腎臓病を、３ヵ月または４ヶ月以上の腎臓損傷または減少した腎臓糸球体濾過率（ＧＦＲ）として定義する。ＣＫＤの他のマーカーも知られており、診断のために用いられている。一般に、不可逆的な硬化による腎臓マス（renal mass）の破壊およびネフロンの消失は、ＧＦＲの漸進的低下につながる。最近、Ｋ／ＤＯＱＩは、ＣＫＤのステージ分類を発表し、それは以下のとおりであった：
ステージ１：正常または亢進したＧＦＲ（＞９０ｍＬ／分／１．７３ｍ２）を伴う腎臓損傷
ステージ２：ＧＦＲの軽度低下（６０〜８９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）
ステージ３：ＧＦＲの中程度低下（３０〜５９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）
ステージ４：ＧＦＲの重度低下（１５〜２９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）
ステージ５：腎不全（ＧＦＲ＜１５ｍＬ／分／１．７３ｍ２または透析）
【０３５１】
ステージ１および２のＣＫＤでは、ＧＦＲだけでは診断を確定できない。血液または尿組成の異常またはイメージング試験の異常を含む腎臓損傷の他のマーカーに依拠してもよい。
【０３５２】
ＣＫＤの病態生理学
約１００万個のネフロンが各々の腎臓に存在し、各々が総ＧＦＲに寄与する。腎損傷の病因論にかかわりなく、ネフロンの漸進性破壊を受けると、腎臓は、残存する健康なネフロンの過剰ろ過および代償性肥大によって、ＧＦＲを維持することができる。このネフロンの適応性により、血漿溶質の継続的な正常なクリアランスが可能となり、総ＧＦＲが５０％に低下した後に、腎臓の余力が使い果たされて初めて、尿素およびクレアチニンなどの物質の血漿レベルが顕著な上昇を示し始める。血漿クレアチニン値は、ＧＦＲの５０％の低下でほぼ２倍になる。したがって、患者における、０．６ｍｇ／ｄＬのベースライン値から１．２ｍｇ／ｄＬへの血漿クレアチニンの倍加は、機能するネフロン数の５０％の消失を実質的に表す。
【０３５３】
残存するネフロン過剰ろ過と肥大は、指摘した理由のために有益であるが、進行性の腎臓機能障害の主な原因であると考えられている。これは、上昇した糸球体毛細血管圧が原因で生じると思われており、これは毛細血管に損傷を与え、まず最初に巣状分節性糸球体硬化症を、そしてやがては球状糸球体硬化症をもたらす。この仮説は、ＣＫＤを有するヒトで観察されるのと同一の病変を発症する５／６腎摘出ラットの研究に基づいている。
【０３５４】
慢性腎臓病の最も一般的な２つの原因は、糖尿病と高血圧である。他の要因は、造影剤を含む腎毒素による急性傷害、または灌流の低下、タンパク尿症、間質の損傷による腎アンモニア生成の増加、高脂血症、リン酸カルシウムの沈着を伴う高リン酸血症、亜酸化窒素レベルの低下および喫煙を含む。
【０３５５】
アメリカ合衆国においてＣＫＤの発生率および有病率は上昇しており、成果は乏しく、保健システムに対する高いコストを伴う。腎臓病は、米国における死因の第９位である。この高い死亡率により、米国公衆衛生局長官はアメリカ市民のHealthy People 2010に、ＣＫＤに焦点を当てた章を含めることを命じた。この章の目的は、目標を明確化し、米国における慢性腎臓病の発生率、羅病率、死亡率および医療費を低減するための戦略を提供することである。
【０３５６】
末期腎疾患（ＥＳＲＤ）の発生率もまた、１９８９年以降世界的に着実に増加している。アメリカ合衆国はＥＳＲＤの発生率が最も高く、これに日本が続く。日本は人口１００万人あたりの有病率が最も高く、これに米国が続く。
【０３５７】
血液透析に関連する死亡率は目を引くものであり、血液透析を開始する患者の寿命が著しく短くなることを示す。どの年齢においても、透析を受けているＥＳＲＤ患者は、非透析患者および腎疾患を有しない人と比較して顕著に高い死亡率を有する。６０歳において、健康な人は、２０年を超えて生存することを期待できるが、血液透析を始めている６０才の患者の寿命は４年前後である（Aurora and Verelli, May 21, 2009. Chronic Renal Failure: Treatment & Medication. Emedicine. http://emedicine.medscape.com/article/238798-treatment）。
【０３５８】
肺線維症
間質性肺線維症（ＩＰＦ）は、鉱物粒子、有機ダストおよびオキシダントガスを含む種々の吸入物質によって、または未知の理由（特発性肺線維症）に起因する肺の瘢痕形成である。この疾患は世界中で何百万もの人を苦しめており、効果的治療手段がない。有用な処置を欠く主な理由は、治療のための適切な標的を設計するために十分に明らかにされた疾患の分子機構がほとんどないことである（Lasky JA., Brody AR. (2000), “Interstitial fibrosis and growth factors”, Environ Health Perspect.;108 Suppl 4:751-62）。
【０３５９】
心線維症
心不全のみの有病率が高まる一方、他の状態は顕著に減少しているという点で、心不全は、心血管障害の中でユニークな存在である。その一部の原因は、米国および欧州の人口の高齢化に帰することができる。心筋の損傷を有する患者を救助する能力もまた主な要因であるが、それは、これらの患者が心臓の有害なリモデリングによる左室機能不全の進行を起こすことがあるためである。
【０３６０】
正常な心筋は、種々の細胞、心筋細胞と、内皮細胞、血管平滑筋細胞および線維芽細胞を含む非心筋細胞とから構成される。
【０３６１】
心室壁の構造的リモデリングは、心疾患の臨床転帰の重要な決定要因である。かかるリモデリングは、細胞外マトリックスタンパク質の産生および破壊、細胞増殖および遊走、ならびにアポトーシス性および壊死性細胞死を含む。心線維芽細胞はこれらのプロセスに決定的に関与しており、オートクリンおよびパラクリン因子として作用する増殖因子およびサイトカイン、ならびに細胞外マトリックスタンパク質およびプロテイナーゼを産生する。最近の研究は、心線維芽細胞と心筋細胞との相互作用が、心臓リモデリング（その正味の結果は心機能の低下および心不全の発症である）の進行に不可欠であることを示した（Manabe I, et al., (2002), “Gene expression in fibroblasts and fibrosis: involvement in cardiac hypertrophy”, Circ Res. 13;91(12):1103-13）。
【０３６２】
熱傷および瘢痕
特に線維性疾患で起こり得る特有の問題は、組織の収縮、例えば瘢痕の収縮である。細胞外マトリックス成分を含む組織の収縮、特にコラーゲン含有組織の収縮は、多くの異なる病的状態、および外科的または美容的手法に関連して生じることがある。例えば、瘢痕の収縮は、医学的処置が必要となり得るの身体的な問題を引き起こすことがあり、または、純粋に美容的性質の問題を引き起こすことがある。コラーゲンは、瘢痕および他の収縮した組織の主成分であり、したがって、考慮すべき最も重要な構造的成分である。とはいえ、瘢痕および他の収縮した組織はまた、他の構造的成分、特に他の細胞外マトリックス成分、例えばエラスチンを含み、これもまた組織の収縮に関与し得る。
【０３６３】
他の細胞外マトリックス成分を含むことがあるコラーゲン含有組織の収縮は、しばしば熱傷の治癒において生じる。熱傷は、化学熱傷、熱による熱傷または放射線熱傷であってもよく、眼、皮膚表面、または皮膚およびその下にある組織の熱傷であってもよい。放射線処置に起因するもののように、熱傷が内部の組織にあることもある。熱傷した組織の収縮はしばしば問題であり、身体的および／または美容的問題、例えば運動の喪失および／または外観の損傷につながることがある。
【０３６４】
植皮片は種々の理由のために適用することができ、適用後にしばしば収縮をおこし得る。熱傷を受けた組織の治癒と同様に、収縮は身体的問題および美容的問題の両方につながり得る。多くの植皮片が、例えば重度の熱傷のケースで必要となるため、これは特に深刻な問題である。
【０３６５】
収縮はまた、人工皮膚の生産においても問題である。真の人工皮膚を作製するためには、上皮細胞（ケラチノサイト）でできた表皮と、線維芽細胞が存在するコラーゲンでできた真皮とが必要である。両方の種類の細胞を有することが重要である。それは、これらが、増殖因子を使用して互いにシグナルを送り、刺激するからである。人工皮膚のコラーゲン成分は、そこに線維芽細胞が存在する場合、その原面積の１０分の１未満にしばしば収縮する。
【０３６６】
瘢痕収縮、瘢痕の線維組織の縮小による収縮は一般的である。場合によっては、瘢痕は悪性瘢痕、収縮によって重大な変形が生じる瘢痕になることがある。患者の胃は、胃潰瘍が治癒するときに形成される瘢痕組織の収縮によって、砂時計形収縮により事実上２個の別々の室に分かれることがある。通路および管の閉塞、瘢痕性狭窄症は、瘢痕組織の収縮のために生じることがある。血管の収縮は、原発性閉塞（primary obstruction）または外科的な外傷、例えば、手術または血管形成術の後のものであってもよい。他の管腔臓器、例えば尿管の狭窄症もまた生じ得る。偶発的な傷からまたは手術から生じるかどうかに関係なく、あらゆる形の瘢痕形成が起こる所に問題が生じ得る。コラーゲン含有組織の収縮を含む皮膚および腱の状態は、手術または事故から生じる外傷後の状態、例えば、手または足の腱の損傷、移植後の状態および病的状態、例えば強皮症、デュピュイトラン拘縮および表皮水疱症を含む。眼内の組織の瘢痕形成および収縮は、種々の状態、例えば網膜剥離の後遺症または糖尿病性眼疾患（上記のとおり）において生じ得る。眼球と、外眼筋および眼瞼を含むその付属構造のための頭蓋に見出されるくぼみ（socket）の収縮は、そこに外傷または炎症性損傷がある場合に生じ得る。組織はくぼみ内で収縮し、複視および醜い外観を含む種々の問題を引き起こす。
【０３６７】
様々な種類の線維症に関するさらなる情報については、Molina V, et al., (2002), “Fibrotic diseases”, Harefuah, 141(11): 973-8, 1009、Yu L, et al., (2002), “Therapeutic strategies to halt renal fibrosis”, Curr Opin Pharmacol. 2(2):177-81、Keane WF and Lyle PA. (2003), “Recent advances in management of type 2 diabetes and nephropathy: lessons from the RENAAL study”, Am J Kidney Dis. 41(3 Suppl 2): S22-5、Bohle A, et al., (1989), “The pathogenesis of chronic renal failure”, Pathol Res Pract. 185(4):421-40、Kikkawa R, et al., (1997), “Mechanism of the progression of diabetic nephropathy to renal failure”, Kidney Int Suppl. 62:S39-40、Bataller R, and Brenner DA. (2001), “Hepatic stellate cells as a target for the treatment of liver fibrosis”, Semin Liver Dis. 21(3):437-51、Gross TJ and Hunninghake GW, (2001) “Idiopathic pulmonary fibrosis”, N Engl J Med. 345(7):517-25、Frohlich ED. (2001) “Fibrosis and ischemia: the real risks in hypertensive heart disease”, Am J Hypertens;14(6 Pt 2):194S-199S、Friedman SL. (2003), “Liver fibrosis - from bench to bedside”, J Hepatol. 38 Suppl 1:S38-53、Albanis E, et al., (2003), “Treatment of hepatic fibrosis: almost there”, Curr Gastroenterol Rep. 5(1):48-56、(Weber KT. (2000), “Fibrosis and hypertensive heart disease”, Curr Opin Cardiol. 15(4):264-72)を参照のこと。
【０３６８】
核酸分子の送達および医薬製剤
核酸分子は、線維性の（例えば、肝、腎、腹膜、肺）疾患、形質、状態および／または障害および／または、細胞または組織におけるｈｓｐ４７のレベルに関連する、または、反応する他のあらゆる形質、疾患、障害または状態を、単独でまたは他の治療法と組み合わせて、予防または処置することに使用するために適応させることができる。核酸分子は、リポソームを含む、対象に投与するための送達ビヒクル、担体および希釈剤およびその塩を含んでいてもよく、および／または、薬学的に許容し得る製剤中に存在してもよい。
【０３６９】
本明細書に開示される核酸分子は、ウイルスベクター、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチンまたは沈殿剤などを含む、細胞への進入を補助、促進または容易化する作用を有する任意の送達ビヒクルではなく、担体または希釈剤とともに直接送達または投与されてもよい。
【０３７０】
核酸分子は、核酸分子を、担体または希釈剤または、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチンまたは沈殿剤などを含む、細胞への進入を補助、促進または容易化する作用を有する任意の他の送達ビヒクルとともに直接適用することにより、対象に送達または投与されてもよい。所望の対象への核酸の導入を容易にするポリペプチドは、米国出願公開第20070155658号に記載のもの（例えば、２，４，６−トリグアニジノトリアジンおよび２，４，６−トリアミドサルコシルメラミンなどのメラミン誘導体、ポリアルギニンポリペチド、および交互するグルタミンおよびアスパラギン残基を含むポリペチド）など。
【０３７１】
核酸分子の送達のための方法は、Akhtar et al., Trends Cell Bio., 2: 139 (1992)、Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, (1995)、 Maurer et al., Mol. Membr. Biol., 16: 129-140 (1999)、Hofland and Huang, Handb. Exp. Pharmacol., 137: 165-192 (1999)、およびLee et al., ACS Symp. Ser., 752: 184-192 (2000)、米国特許第6,395,713号、第6,235,310号、第5,225,182号、第5,169,383号、第5,167,616号、第4,959217号、第4.925,678号、第4,487,603号、および第4,486,194号、およびSullivan et al., PCT WO 94/02595およびPCT WO 00/03683およびPCT WO 02/08754、および米国特許出願公開第2003077829号に記載されている。これらのプロトコルは、実質的にあらゆる核酸分子の送達のために利用することができる。核酸分子は、限定されずに、リポソームへの封入、イオン泳動法による、または他のビヒクル、例えば生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Gonzalez et al., Bioconjugate Chem., 10: 1068-1074 (1999)、Wang et al.、ＰＣＴ国際公開WO 03/47518およびWO 03/46185参照）、ポリ（ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフェア（例えば、米国特許第6,447,796号および米国出願公開第2002130430号参照）、生物分解性ナノ粒子および生体付着性ミクロスフェアなどへの組込みによる、またはタンパク質性ベクター（O'Hare and Normand、ＰＣＴ国際公開WO 00/53722）によるものを含む、当業者に既知の種々の方法により投与することができる。あるいは、核酸／ビヒクルの組合せは、直接注入により、またはインフュージョンポンプの使用により、局所的に送達される。本発明の核酸分子の直接注入は、皮下にせよ、筋肉内にせよ、皮内にせよ、標準的な針と注射器による方法論を用いて、またはニードルフリー技術、例えばConry et al., Clin. Cancer Res., 5: 2330-2337 (1999)およびBarry et al.、ＰＣＴ国際公開WO 99/31262に記載されたものなどにより行うことができる。本発明の分子は、医薬品として使用することができる。医薬品は、対象における疾病状況を予防、発生を調節、または処置する（症状、好ましくは症状の全てをある程度緩和する）。
【０３７２】
核酸分子は、カチオン性脂質と複合体化されても、リポソームに被包されても、または、別様に標的細胞または組織に送達されてもよい。核酸または核酸複合体は、バイオポリマーに組み込まれ、または組み込まれずに、直接的な皮膚適用、経皮適用または注射を介して、関係する組織にex vivoまたはin vivoで、局所投与することができる。本発明の核酸分子は、表Ｉに示す配列を含んでもよい。かかる核酸分子の例は、本質的に表Ｉで提供される配列からなる。
【０３７３】
送達システムは、ポリ（エチレングリコール）脂質を含む表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾、または長期循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含む。これらの製剤は、標的組織における薬剤の集積を増大する方法を提供する。この種類の薬物担体は、単核職細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン化および排除に耐性であり、それによって、封入された薬剤のより長い血液循環時間および増強された組織への暴露が可能となる（Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627、Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011）。
【０３７４】
核酸分子は、ポリエチレンイミン（例えば、直鎖または分枝ＰＥＩ）、および／または、例えば、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体、グラフトＰＥＩ、例えば、ガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体誘導体化ＰＥＩ、およびこれらのポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体を含む、ポリエチレンイミン誘導体（例えば、Ogris et al., 2001, AAPA PharmSci, 3, 1-11、Furgeson et al., 2003, Bioconjugate Chem., 14, 840-847、Kunath et al., 2002, Pharmaceutical Research, 19, 810-817、Choi et al., 2001, Bull. Korean Chem. Soc., 22, 46-52、Bettinger et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 558-561、Peterson et al., 2002, Bioconjugate Chem., 13, 845-854、Erbacher et al., 1999, Journal of Gene Medicine Preprint, 1, 1-18、Godbey et al., 1999., PNAS USA, 96, 5177-5181、Godbey et al., 1999, Journal of Controlled Release, 60, 149-160、Diebold et al., 1999, Journal of Biological Chemistry, 274, 19087-19094、Thomas and Klibanov, 2002, PNAS USA, 99, 14640-14645、Sagara, 米国特許第6,586,524号および米国特許出願公開第20030077829号参照）と製剤化または複合体化されてもよい。
【０３７５】
核酸分子は、膜破壊剤、例えば米国出願公開第20010007666号に記載のものなどと複合体化されてもよい。１または２以上の膜破壊剤と核酸分子とはまた、カチオン性脂質またはヘルパー脂質分子、例えば米国特許第6,235,310号に記載のものなどと複合体化されてもよい。
【０３７６】
核酸分子は肺送達、例えば、関連する肺組織への核酸分子の迅速な局所取り込みをもたらす吸入装置または噴霧器によって投与されるエアゾールまたは噴霧乾燥製剤の吸入などによって投与することができる。微粉化された核酸組成物の呼吸可能な乾燥粒子を含む固体粒子組成物は、乾燥または凍結乾燥した核酸組成物を粉砕し、次いで、微粉化された組成物を４００メッシュのスクリーンに通し、大きな集塊を分割または分離することにより調製することができる。本発明の核酸組成物を含む固体粒子組成物は、任意に、エアゾールの形成を容易にするのに役立つ分散剤、ならびに、他の治療化合物を含んでもよい。好適な分散剤はラクトースであり、それは任意の好適な比率、例えば１対１の重量比で、核酸化合物と混合することができる。
【０３７７】
液体粒子のエアゾールは、本明細書に開示される核酸分子を含んでもよく、任意の好適な手段、例えば噴霧器（例えば米国特許第4,501,729号参照）などにより製造することができる。噴霧器は、圧縮ガス、典型的には空気または酸素の、狭いベンチュリ開口を介した加速か、または超音波撹拌により、活性成分の溶液または懸濁液を治療的なエアゾールに変換する市販の装置である。噴霧器に用いられる好適な製剤は、活性成分を、製剤の４０％ｗ/ｗまでの量、好ましくは２０％ｗ/ｗ未満の量で液体担体に含む。担体は、典型的には、水または希釈アルコール水溶液であり、好ましくは、例えば塩化ナトリウムまたは他の好適な塩の添加によって体液と等張にされる。任意の添加剤は、製剤が無菌で調製されない場合は防腐剤、例えば、ヒドロキシ安息香酸メチル、抗酸化剤、香味料、揮発油、緩衝剤および乳化剤および他の製剤界面活性剤を含む。活性組成物と界面活性剤とを含む固体粒子のエアゾールは、任意の固体粒子エアゾール発生器で同様に製造することができる。対象に固体粒子治療剤を投与するためのエアゾール発生器は、上記で説明したとおり、吸入可能な粒子を産生し、ヒトへの投与に好適な速度で、治療組成物の予め定められた計量された用量を含むエアゾールの量を生成する。固体粒子エアゾール発生器の１つの例示的な種類は、吸入器（insufflator）である。吸入法による投与のための好適な製剤は、吸入器で送達することができる、微細に粉砕された粉末を含む。吸入器内で、粉末、例えば本明細書に記載の処置を実行するのに有効なその計量された用量は、カプセルまたはカートリッジ（典型的にはゼラチンまたはプラスチック製）に含まれ、それはin situで穿刺されるか開放され、粉末は、吸入により装置を介して吸い込まれる空気によって、または手動ポンプによって送達される。吸入器で使用される粉末は、単に活性成分のみか、または、活性成分、好適な粉末希釈剤、例えばラクトースおよび任意に界面活性剤を含む粉末混合物からなる。活性成分は、典型的には、製剤の０．１〜１００％ｗ／ｗを含む。エアゾール発生器の第２の例示的な種類は、定量式インヘラー（inhaler）を含む。定量式インヘラーは、加圧式エアゾールディスペンサーであり、典型的には、液化噴射剤中の活性成分の懸濁液または溶液製剤を含む。使用の間、これらのデバイスは、計量された容量を送達し、活性成分を含む微粒子スプレーを生成するよう構成されたバルブを介して製剤を放出する。好適な噴射剤は、一部のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンおよびこれらの混合物を含む。製剤は、１種または２種以上の共溶媒、例えば、エチルアルコール、乳化剤および他の製剤界面活性剤、例えば、オレイン酸またはトリオレイン酸ソルビタン、抗酸化剤および好適な香料をさらに含むことができる。肺送達のための他の方法は、例えば、米国特許出願第20040037780号および米国特許第6,592,904号、第6,582,728号、第6,565,885号に記載されている。ＰＣＴ特許公開WO2008/132723は、概してオリゴヌクレオチドの、そして特にｓｉＲＮＡの呼吸器系へのエアゾール送達に関する。
【０３７８】
核酸分子は、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）に投与することができる。実験は、in vivoでのニューロンによる核酸の効果的な取り込みを証明した。例えば、Sommer et al., 1998, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 8, 75、Epa et al., 2000, Antisense Nuc. Acid Drug Dev., 10, 469、Broaddus et al., 1998, J. Neurosurg., 88(4), 734、Karle et al., 1997, Eur. J. Pharmocol., 340(2/3), 153、Bannai et al., 1998, Brain Research, 784(1,2), 304、Rajakumar et al., 1997, Synapse, 26(3), 199、Wu-pong et al., 1999, BioPharm, 12(1), 32、Bannai et al., 1998, Brain Res. Protoc., 3(1), 83、and Simantov et al., 1996, Neuroscience, 74(1), 39を参照のこと。核酸分子は、したがって、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳにおける細胞への送達およびこれらの細胞による取り込みに適している。
【０３７９】
ＣＮＳへの核酸分子の送達は、種々の異なる戦略によって提供される。用いることができるＣＮＳ送達の伝統的なアプローチは、限定されずに、クモ膜下および脳室内投与、カテーテルおよびポンプの移植、損傷部位または病変部位への直接注射または灌流、脳動脈系への注射、または血液脳関門の化学的または浸透圧的開放を含む。他のアプローチは、種々の輸送および担体システムの使用、例えば、コンジュゲートおよび生分解性ポリマーの使用を介するものを含んでもよい。さらに、ＣＮＳで核酸分子を発現させるために、遺伝子治療アプローチ、例えば、Kaplitt et al.、米国特許第6,180,613号およびDavidson、WO 04/013280に記載のものを用いることができる。
【０３８０】
送達システムは、例えば、水性および非水性のゲル、クリーム、複エマルション、マイクロエマルション、リポソーム、軟膏、水性および非水性の溶液、ローション、エアゾール、炭化水素基剤およびパウダーなどを含んでもよく、賦形剤、例えば可溶化剤、浸透促進剤（例えば脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪族アルコールおよびアミノ酸など）および親水性ポリマー（例えばポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドンなど）を含むことができる。一態様において、薬学的に許容し得る担体は、リポソームまたは経皮促進剤である。この発明において用いることができるリポソームの例は、以下を含む：（１）CellFectin（カチオン性脂質Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミチルスペルミンとジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との１：１．５（Ｍ／Ｍ）のリポソーム製剤（GIBCO BRL）、（２）Cytofectin GSV、カチオン性脂質とＤＯＰＥとの２：１（Ｍ／Ｍ）のリポソーム製剤（Glen Research）、（３）ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１（２，３−ジオレオイルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トオリメチルアンモニウムサルフェート（Boehringer Manheim）および（４）Lipofectamine、ポリカチオン性脂質ＤＯＳＰＡ、中性脂質ＤＯＰＥとジアルキル化アミノ酸（ＤｉＬＡ２）との３：１（Ｍ／Ｍ）リポソーム製剤（GIBCO BRL）。
【０３８１】
送達システムは、パッチ、錠剤、坐薬、ペッサリー、ゲルおよびクリームを含んでもよく、賦形剤、例えば可溶化剤および促進剤（例えばプロピレングリコール、胆汁酸塩およびアミノ酸など）、および他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、および親水性ポリマー、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸など）を含むことができる。
【０３８２】
核酸分子は、ポリエチレンイミン（例えば、直鎖または分枝ＰＥＩ）、および／または、例えば、グラフトＰＥＩ、例えば、ガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体誘導体化ＰＥＩ、およびこれらのポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体を含む、ポリエチレンイミン誘導体（例えば、Ogris et al., 2001, AAPA PharmSci, 3, 1-11、Furgeson et al., 2003, Bioconjugate Chem., 14, 840-847、Kunath et al., 2002, Pharmaceutical Research, 19, 810-817、Choi et al., 2001, Bull. Korean Chem. Soc., 22, 46-52、Bettinger et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 558-561、Peterson et al., 2002, Bioconjugate Chem., 13, 845-854、Erbacher et al., 1999, Journal of Gene Medicine Preprint, 1, 1-18、Godbey et al., 1999., PNAS USA, 96, 5177-5181、Godbey et al., 1999, Journal of Controlled Release, 60, 149-160、Diebold et al., 1999, Journal of Biological Chemistry, 274, 19087-19094、Thomas and Klibanov, 2002, PNAS USA, 99, 14640-14645およびSagara, 米国特許第6,586,524号参照）と製剤化または複合体化されてもよい。
【０３８３】
核酸分子は、バイオコンジュゲート、例えばVargeese et al.、米国出願第10/427,160号、米国特許第6,528,631号、米国特許第6,335,434号、米国特許第6,235,886号、米国特許第6,153,737号、米国特許第5,214,136号、米国特許第5,138,045号などに記載の核酸コンジュゲートを含んでもよい。
【０３８４】
本明細書に開示される組成物、方法およびキットは、本発明の少なくとも１個の核酸分子を、該核酸分子の発現を可能にする様式でコードする核酸配列を含む発現ベクターを含んでもよい。核酸分子またはｄｓＲＮＡの鎖を発現することができる１個または２個以上のベクターを細胞の環境に導入する方法は、細胞の種類およびその環境の構成に依存する。核酸分子またはベクター構築物は、細胞の内部に（すなわち、細胞内に）、直接導入しても、または生体の空洞内、間質腔内、循環中に、細胞外導入しても、経口的に導入しても、または、生体または細胞をｄｓＲＮＡを含む溶液に浸すことによって導入してもよい。細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。発現ベクターの核酸分子は、センス領域とアンチセンス領域とを含むことができる。アンチセンス領域は、ｈｓｐ４７をコードするＲＮＡまたはＤＮＡの配列に相補的な配列を含んでもよく、センス領域はアンチセンス領域に相補的な配列を含んでもよい。核酸分子は、相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有する２本の異なった鎖を含んでもよい。核酸分子は、相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有する単一の鎖を含んでもよい。
【０３８５】
標的ＲＮＡ分子と相互作用し、標的ＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号によって示される標的ＲＮＡ分子）をコードする遺伝子を下方調節する核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現させてもよい。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであってもよい。核酸分子を発現するウイルスベクターは、限定されずに、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアルファウイルスをベースに構築することができる。核酸分子を発現させることができる組換えベクターは本明細書に記載のとおりに送達され、標的細胞内に存続することができる。あるいは、ウイルスベクターは、核酸分子の一過性発現をもたらすことに用いることができる。かかるベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。核酸分子は、ひとたび発現されると、結合し、遺伝子機能または発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して下方調節する。核酸分子を発現するベクターの送達は、全身性であってもよく、これは例えば静脈内もしくは筋肉内投与によるもの、対象から外植した標的細胞への投与と、その後の対象への再導入によるもの、または、所望の標的細胞への導入を可能にする他のあらゆる手段によるものであってもよい。
【０３８６】
発現ベクターは、少なくとも１個の本明細書に開示される核酸分子をコードする核酸配列を、該核酸分子の発現を可能にする様式で含んでもよい。例えば、ベクターは、二重鎖を含む核酸分子の両方の鎖をコードする１または２以上の配列を含んでもよい。ベクターはまた、自己相補的で、したがって核酸分子を形成する単一の核酸分子をコードする１または２以上の配列を含んでもよい。かかる発現ベクターの非限定例は、Paul et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505、Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497、Lee et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500、およびNovina et al., 2002, Nature Medicine,オンライン先行発表doi:10.1038/nm725に記載されている。発現ベクターはまた、哺乳動物（例えば、ヒト）の細胞に含まれていてもよい。
【０３８７】
発現ベクターは、同じであっても異なっていてもよい、２個または３個以上核酸分子をコードする核酸配列を含んでもよい。発現ベクターは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２３５で示される核酸分子、例えば表Ｉに示すものに相補的な核酸分子に関する配列を含んでもよい。
【０３８８】
発現ベクターは、核酸二重鎖の一方または両方の鎖、または自己ハイブリダイゼーションして核酸二重鎖となる単一の自己相補的鎖をコードしてもよい。核酸分子をコードする核酸配列は、核酸分子の発現を可能にする様式で作動的に連結することができる（例えばPaul et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505、Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497、Lee et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500、およびNovina et al., 2002, Nature Medicine,オンライン先行発表doi:10.1038/nm725参照）。
【０３８９】
発現ベクターは、以下の１個または２個以上：ａ）転写開始領域（例えば真核生物ｐｏｌ  Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ開始領域）、ｂ）転写終止領域（例えば真核生物ｐｏｌ  Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ終止領域、ｃ）イントロン、およびｄ）核酸分子の少なくとも１個をコードする核酸配列、を含んでもよく、ここで、該配列は、核酸分子の発現および／または送達を可能にする様式で、開始領域および終止領域に作動的に連結している。ベクターは、核酸分子をコードする配列の５’側または３’側に作動的に連結した、タンパク質のためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、および／またはイントロン（介在配列）を任意に含んでもよい。
【０３９０】
核酸分子配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のためのプロモーターから開始されてもよい。ｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写物は、全ての細胞において高レベルで発現される。所定の細胞種における所定のｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適切な細胞で発現されているという条件で、原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターも用いられる（Elroy-Stein and Moss, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6743-7、Gao and Huang 1993, Nucleic Acids Res., 21, 2867-72、Lieber et al., 1993, Methods Enzymol., 217, 47-66、Zhou et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 4529-37）。複数の研究者は、かかるプロモーターから発現される核酸分子が、哺乳動物細胞において機能し得ることを証明した（例えば、Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15、Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6、Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9、Yu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6340-4、L'Huillier et al., 1992, EMBO J., 11, 4411-8、Lisziewicz et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 90, 8000-4、Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259、Sullenger & Cech, 1993, Science, 262, 1566）。より詳細には、転写単位、例えば、Ｕ６低分子核（ｓｎＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものなどが、高濃度の所望のＲＮＡ分子、例えばｓｉＮＡなどを細胞内で生成するのに有用である（上記Thompson et al.、上記Couture and Stinchcomb, 1996、Noonberg et al., 1994, Nucleic Acid Res., 22, 2830、Noonberg et al., U.S. Pat. No. 5,624,803、Good et al., 1997, Gene Ther., 4, 45、Beigelman et al.、ＰＣＴ国際公開WO 96/18736）。上記の核酸転写単位は、限定されずに、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター）またはウイルスＲＮＡベクター（例えばレトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）などを含む、哺乳動物細胞への導入のための様々なベクターに組み込むことができる（上記Couture and Stinchcomb, 1996参照）。
【０３９１】
核酸分子は、細胞内で、真核生物プロモーター（例えば、Izant and Weintraub, 1985, Science, 229, 345、McGarry and Lindquist, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83, 399、Scanlon et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10591-5、Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15、Dropulic et al., 1992, J. Virol., 66, 1432-41、Weerasinghe et al., 1991, J. Virol., 65, 5531-4、Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6、Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9、Sarver et al., 1990 Science, 247, 1222-1225、Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259、Good et al., 1997, Gene Therapy, 4, 45）から発現させることができる。当業者は、あらゆる核酸を、適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから真核細胞において発現させ得ることを理解する。かかる核酸の活性は、酵素核酸による一次転写産物からのその放出によって増大させることができる（Draper et al., PCT WO 93/23569、およびSullivan et al., PCT WO 94/02595、Ohkawa et al., 1992, Nucleic Acids Symp. Ser., 27, 15-6、Taira et al., 1991, Nucleic Acids Res., 19, 5125-30、Ventura et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21, 3249-55、Chowrira et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 25856）。
【０３９２】
ウイルス粒子にパッケージされたウイルス構築物は、細胞への発現構築物の効果的な導入と発現構築物がコードするｄｓＲＮＡ構築物の転写の両方を達成する。
【０３９３】
経口的な導入のための方法は、ＲＮＡと生物の食物との直接の混合、ならびに、食物として用いられる種をＲＮＡを発現するように操作し、次いで、影響を受ける生物に与える、遺伝子工学的アプローチを含む。細胞に核酸分子溶液を導入するために物理的な方法を使用してもよい。核酸を導入する物理的な方法は、核酸分子を含む溶液の注射、核酸分子で被覆した粒子による爆撃、細胞または生物のＲＮＡの溶液への浸漬、または核酸分子の存在下における細胞膜のエレクトロポレーションを含む。
【０３９４】
核酸を細胞に導入するための当該技術分野で既知の他の方法、例えば、脂質媒介性担体輸送、化学物質媒介性輸送、例えばリン酸カルシウムなどを用いてもよい。したがって、核酸分子は、以下の活性の１または２以上を有する成分と共に導入されてもよい：細胞によるＲＮＡの取り込みを強化する、二重鎖のアニーリングを促進する、アニールした鎖を安定させる、または別の方法で標的遺伝子の阻害を増大させる。
【０３９５】
核酸分子またはベクター構築物は、好適な製剤を用いて細胞に導入することができる。１つの好ましい製剤は、脂質製剤、例えばLipofectamineTM 2000（Invitrogen, CA, USA）、ビタミンＡ結合リポソーム（Sato et al. Nat Biotechnol 2008; 26:431-442、PCT特許公開WO 2006/068232）などを伴う。脂質製剤はまた、静脈内、筋肉内もしくは腹膜内注射によって、または経口的に、または吸入もしくは当該技術分野において既知の方法などによって、動物に投与することができる。製剤が、動物、例えば、哺乳動物、そしてより具体的にはヒトへの投与に適している場合、製剤はまた、薬学的に許容し得る。オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容し得る製剤は知られており、用いることができる。場合によって、ｄｓＲＮＡを緩衝液または食塩水で製剤化し、製剤化されたｄｓＲＮＡを、卵母細胞による研究におけるように、直接細胞に注射することが好ましいことがある。ｄｓＲＮＡ二重鎖の直接注射を行ってもよい。ｄｓＲＮＡを導入する好適な方法については、参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第2004/0203145号、第20070265220号を参照のこと。
【０３９６】
ポリマーナノカプセルまたはマイクロカプセルは、封入された、または、結合したｄｓＲＮＡの細胞内への輸送および放出を促進する。これらは、ポリマー材料およびモノマー材料を含み、特にポリブチルシアノアクリレートを含む。材料および作製方法の概要は公開されている（Kreuter, 1991参照）。モノマーおよび／またはオリゴマー前駆体から、重合／ナノ粒子生成ステップにおいて形成されるポリマー材料は、先行技術から自体公知であり、これは、ナノ粒子作製の分野における当業者が、通常の能力に従って好適に選択することができるポリマー材料の分子量および分子量分布と同様である。
【０３９７】
核酸分子は、マイクロエマルションとして製剤化してもよい。マイクロエマルションは、光学的に等方な、熱力学的に安定した単一の溶液である、水、油および両親媒性物質の系である。マイクロエマルションは、典型的には、最初に水性界面活性剤溶液に油を分散させ、次いで十分量の第４の成分、一般に中間的な鎖長のアルコールを添加し、透明な系を形成させることによって調製する。
【０３９８】
マイクロエマルションの調製に用いることができる界面活性剤は、限定されずに、単独のまたは共界面活性と組み合わされた、剤イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Brij 96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、テトラグリセリンモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセリンモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセリンモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセリンペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセリンモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセリンモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセリンセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセリンデカオレエート（ＤＡ０７５０）を含む。共活性剤は、普通は短鎖アルコール、例えばエタノール、１−プロパノールおよび１−ブタノールなどであり、界面活性剤膜に侵入し、その結果、界面活性剤分子の間に生じる隙間により無秩序な膜を生成することによって、界面流動性を増大させるのに役立つ。
【０３９９】
水溶性架橋ポリマー
【０４００】
送達製剤は、１または２以上の分解性架橋脂質部分、１または２以上のＰＥＩ部分、および／または１または２以上のｍＰＥＧ（ＰＥＧのジメチルエーテル誘導体（メトキシポリ（エチレングリコール））を含む、水溶性分解性架橋ポリマーを含んでもよい。
【０４０１】
分解性脂質部分は、好ましくは、以下の構造モチーフを有する化合物を含む：
【化４２】
0005972408.tif 000044
【０４０２】
上記式において、エステル結合は生分解性基であり、Ｒは比較的疎水性の「脂肪（lipo）」基を表し、示した構造モチーフはｍ回現れ、ここでｍは約１〜約３０の範囲にある。例えば、一部の態様において、ＲはＣ２〜Ｃ５０アルキル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ５０がアルケニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルケニル、Ｃ５〜Ｃ５０アリール、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアリール、Ｃ２〜Ｃ５０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ５０ヘテロアルキニル、Ｃ２〜Ｃ５０カルボキシアルケニルおよびＣ２〜Ｃ５０カルボキシヘテロアルケニルからなる群から選択される。好ましい態様において、Ｒは、４〜３０個の炭素、より好ましくは８〜２４個の炭素を有する飽和もしくは不飽和アルキル、またはステロール、好ましくはコレステリル部分である。好ましい態様において、Ｒは、オレイン酸部分、ラウリン酸部分、ミリスチン酸部分、パルミチン酸部分、マルガリン酸部分、ステアリン酸部分、アラキドン酸部分、ベヘン酸部分、またはリグノセリン酸部分である。最も好ましい態様において、Ｒはオレイン酸部分である。
【０４０３】
式（Ａ）のＮは、電子対または水素原子への結合を有してもよい。Ｎが電子対を有する場合、繰返し単位は低ｐＨでカチオン性たり得る。
【０４０４】
分解性架橋脂質部分は、下記のスキームＡに示すように、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と反応させることができる：
【化４３】
0005972408.tif 000045
【０４０５】
スキームＡにおいて、Ｒは上記と同じ意味を有する。ＰＥＩは、式（Ｂ）の繰返し単位を含んでもよく、式中ｘは約１〜約１００の範囲の整数であり、ｙは約１〜約１００の範囲の整数である。
【０４０６】
スキームＡで例示される反応は、ＰＥＩとジアクリレート（Ｉ）とを、相互溶媒、例えばエチルアルコール、メタノールまたはジクロロメタン中、撹拌しながら、好ましくは室温で数時間混合し、次いで溶媒を蒸発させ、結果として生じるポリマーを回収することにより行うことができる。いかなる特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＰＥＩとジアクリレート（Ｉ）との反応が、ＰＥＩの１個または２個以上のアミンと、ジアクリレートの１個または２個以上の二重結合との間のミカエル反応を伴うと考えられる（J. March, Advanced Organic Chemistry 3rd Ed., pp. 711-712 (1985)参照）。スキームＡに示すジアクリレートは、米国特許出願第11/216,986号（米国公開第2006/0258751号）に記載の手法で調製することができる。
【０４０７】
ＰＥＩの分子量は、好ましくは、約２００〜２５，０００ダルトン、より好ましくは、４００〜５，０００ダルトン、より一層好ましくは６００〜２０００ダルトンの範囲にある。ＰＥＩは、分枝状であっても、直鎖状であってもよい。
【０４０８】
ＰＥＩのジアクリレートに対するモル比は、好ましくは約１：２〜約１：２０の範囲にある。カチオン性リポポリマーの重量平均分子量は、約５００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲、好ましくは約２，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンの範囲にあってもよい。分子量は、ＰＥＧ標準物質を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより、またはアガロースゲル電気泳動により測定することができる。
【０４０９】
カチオン性リポポリマーは、好ましくは分解性であり、より好ましくは生分解性であり、例えば、加水分解、酵素的切断、還元、光切断およびソニケーションからなる群から選択されるメカニズムで分解可能である。いかなる特定の理論に束縛されることを望むものではないが、細胞内での式（ＩＩ）のカチオン性リポポリマーの分解はエステル結合の酵素的切断および／または加水分解によって進行すると考えられる。
【０４１０】
合成は、上記のとおり、分解性脂質部分とＰＥＩ部分とを反応させることによって行うことができる。次いで、（ＰＥＧのジメチルエーテル誘導体（メトキシポリ（エチレングリコール））を添加し、分解性架橋ポリマーを形成する。好ましい態様において、反応は室温で行われる。反応生成物は、クロマトグラフィーの技術を含む、当該技術分野において既知の任意の手段で単離することができる。好ましい態様において、反応生成物は、沈殿と、その後の遠心分離によって取り出すことができる。
【０４１１】
投与量
投与すべき有用な投与量および具体的な投与方法は、当業者に直ちに明らかであるように、細胞種、または、in vivoでの使用については、年齢、体重、および処置する動物およびその領域、使用する具体的な核酸と送達方法、考慮される治療的もしくは診断的用途、および製剤の剤形（例えば、懸濁剤、エマルション、ミセルもしくはリポソーム）などの要因に応じて異なる。典型的には、投薬量はより低いレベルで投与され、所望の効果が達成されるまで増量する。
【０４１２】
核酸を送達するのに脂質を用いる場合、投与する脂質化合物の量は異なってもよく、一般に、投与する核酸の量に依存する。例えば、脂質化合物の核酸に対する重量比は、好ましくは約１：１〜約３０：１であり、約５：１〜約１０：１の重量比がより好ましい。
【０４１３】
核酸分子の好適な投与単位は、１日あたりレシピエントの体重１キログラムにつき０．００１〜０．２５ミリグラムの範囲、１日あたり体重１キログラムにつき０．０１〜２０マイクログラムの範囲、１日あたり体重１キログラムにつき０．０１〜１０マイクログラムの範囲、１日あたり体重１キログラムにつき０．１０〜５マイクログラムの範囲、または１日あたり体重１キログラムにつき０．１〜２．５マイクログラムの範囲にあってもよい。
【０４１４】
好適な量の核酸分子を導入することができ、これらの量は、標準的な方法を用いて実験的に決定することができる。細胞の環境における個々の核酸分子種の有効濃度は、約１フェムトモル、約５０フェムトモル、１００フェムトモル、１ピコモル、１．５ピコモル、２．５ピコモル、５ピコモル、１０ピコモル、２５ピコモル、５０ピコモル、１００ピコモル、５００ピコモル、１ナノモル、２．５ナノモル、５ナノモル、１０ナノモル、２５ナノモル、５０ナノモル、１００ナノモル、５００ナノモル、１マイクロモル、２．５マイクロモル、５マイクロモル、１０マイクロモル、１００マイクロモルであっても、またはそれを上回ってもよい。
【０４１５】
投与量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１ｇであってもよい（例えば、１ｋｇあたり０．１μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、２．５μｇ、５μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇまたは５００ｍｇ）。
【０４１６】
１日あたり体重１キログラムにつき約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇ程度の投与量レベルは、上記状態の処置に有用である（１日あたり１対象につき約０．５ｍｇ〜約７ｇ）。単一の投薬形態を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される宿主と、具体的な投与方法によって異なる。投薬単位形態は、一般的に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含む。
【０４１７】
任意の特定の対象のための具体的な用量レベルは、使用する具体的な化合物の活性、年齢、体重、一般健康状態、性別、食事、投与、投与時間、投与経路、および排出速度、併用薬剤および治療を受けている特定の疾患の重篤度を含む種々の要因に依存することが理解される。
【０４１８】
本明細書に開示される核酸分子を含む医薬組成物は、１日１回、ｑｉｄ、ｔｉｄ、ｂｉｄ、ＱＤ、または、医学的に適切な任意の間隔で、任意の期間投与することができる。しかし、治療剤はまた、１日を通して適切な間隔で投与される、２、３、４、５、６または７以上の下位用量を含む投薬単位で投薬することもできる。その場合、各々の下位用量に含まれる核酸分子は、１日の合計投薬単位を達成するために、対応してより少なくてもよい。投薬単位はまた、例えば、数日間にわたってｄｓＲＮＡの持続的な一定の放出をもたらす従来の徐放製剤を用いて、数日にわたる単一の用量のために組み合わせる（compound）ことができる。徐放製剤は当該技術分野において周知である。投薬単位は、対応する複数の一日量を含んでもよい。組成物は、核酸の複数の単位の合計が一緒になって十分な用量を含むように、組み合わせることができる。
【０４１９】
医薬組成物、キットおよび容器
また提供されるのは、本明細書において提供されるｈｓｐ４７の発現を低減するための核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）を含む、該核酸分子を患者に投与または分配するための組成物、キット、容器および製剤である。キットは、少なくとも１個の容器と少なくとも１枚のラベルとを含んでもよい。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。容器は、種々の材料、例えばガラス、金属またはプラスチックから形成されていてもよい。容器は、１または２以上のアミノ酸配列、１または２以上の小分子、１または２以上の核酸配列、１または２以上の細胞集団および／または１または２以上の抗体を保持していてもよい。一態様において、容器は、細胞のｍＲＮＡ発現プロファイルを検査するためのポリヌクレオチドを、この目的のために用いる試薬と共に保持する。別の態様において、容器は、細胞および組織におけるｈｓｐ４７タンパク質の発現の評価に用いるための、または関連する実験室用途、予後判定用途、診断用途、予防用途および治療用途のための抗体、その結合断片または特異的結合タンパク質を含む。これらの用途のための指示および／または使用法が、かかる容器上またはかかる容器と共に含まれていてもよい。これらの目的のために用いる試薬および他の組成物またはツールが、同様に含まれていてもよい。キットは、関連する指示および／または使用法をさらに含んでもよく、かかる目的のために用いる試薬および他の組成物またはツールが含まれていてもよい。
【０４２０】
容器は、代替的に、状態を処置、診断、予後判定または予防するのに有効な組成物を保持することができ、無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば、容器はストッパーを皮下注射針によって穿刺可能な密栓を有する静脈注射用の溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の活性剤は、ｈｓｐ４７に特異的に結合することができる、および／またはｈｓｐ４７の機能を調節することができる核酸分子であってもよい。
【０４２１】
キットは、薬学的に許容し得るバッファー、例えばリン酸緩衝食塩水、リンゲル液および／またはブドウ糖溶液などを含む第２の容器をさらに含んでもよい。それは、適応症および／または使用説明書で他のバッファー、希釈液、フィルター、撹拌器、針、注射器および／または、使用のための指示および／または説明を含む添付文書を含む、商業的見地および使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０４２２】
核酸分子が使用前に包装されている単位投与量アンプルまたは多用量容器は、その薬学的に有効な用量、または複数の有効用量のために適した量のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む溶液が入った密閉容器を含んでもよい。ポリヌクレオチドは無菌製剤として包装され、密閉容器は使用まで製剤の無菌性を維持するように設計されている。
【０４２３】
細胞性免疫応答要素をコードする配列またはその断片を含むポリヌクレオチドを含む容器は、ラベルが付されたパッケージを含んでもよく、ラベルは、政府関係機関、例えば米国食品医薬品局によって定められた形式の通知を有してもよく、その通知は、そこに含まれるポリヌクレオチド材料のヒトへの投与のため製造、使用または販売に関する、前記機関による連邦法上の承認を反映する。
【０４２４】
連邦法は、ヒトの治療における医薬組成物の使用について連邦政府の機関の承認を得ることを義務づけている。米国において、執行は食品医薬品局の管轄であり、同局は、かかる承認を保証するために、21 U.S.C.§301〜392に詳述される、適切な規制を設けている。動物の組織から製造される産物を含む生物学的材料のための規制は、42 U.S.C.§301に設けられている。類似した承認が外国のほとんどで必要とされる。規制は国ごとに異なるが、個々の手続は当業者に周知であり、本明細書において提供される組成物および方法は、好ましくはしかるべくそれに従う。
【０４２５】
投与される投与量は、処置する対象の状態と大きさ、および、処置の頻度と投与経路に大きく依存する。用量および頻度を含む継続的治療のためのレジメンは、初期の反応および臨床判断によってガイドされてもよい。組織間隙への注射の非経口経路が好ましいが、他の非経口経路、例えばエアゾール製剤の吸入などが、特定の投与、例えば鼻の粘膜、喉、気管支組織または肺への投与において必要とされることがある。
【０４２６】
したがって、本明細書において提供されるのは、薬学的に許容し得る注射用担体中の溶液の状態の、細胞性免疫反応要素またはその断片をコードする配列を含み、組織中の間質に導入され、組織の細胞に細胞性免疫反応要素またはその断片を発現させるのに適したポリヌクレオチド、溶液を入れた容器、および、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府関係機関によって定められた形式の容器に関連した通知、を含んでもよい医薬製品であり、その通知は、ポリヌクレオチド溶液のヒトへの投与のための製造、使用または販売に関する、前記機関による承認を反映している。
【０４２７】
適応症
本明細書に開示される核酸分子は、ｈｓｐ４７に関連する疾患、状態または障害、例えば肝線維症、肝硬変、肺線維症、腎線維症、腹膜線維症、慢性肝損傷および原線維形成など、ならびに、細胞または組織におけるｈｓｐ４７のレベルに関係するか、または反応するあらゆる他の疾患または状態を、単独でまたは他の治療法と組み合わせて処置するのに用いることができる。したがって、本明細書に開示される組成物、キットおよび方法は、ラベルまたは添付文書を含む、本明細書に開示される核酸分子の包装を含んでもよい。ラベルは、核酸分子の使用法、例えば、肝線維症、腹膜線維症、腎線維症および肺線維症、ならびに、細胞または組織におけるｈｓｐ４７のレベルに関係するか、または反応するあらゆる他の疾患または状態の、単独での、または他の治療法と組み合わせての処置または予防のための使用法を含んでもよい。ラベルは、ｈｓｐ４７の発現の低減における使用法を含んでもよい。「添付文書」は、治療用製品の商用パッケージに通例含まれる指示を指すのに用い、それは、適応症、用法、用量、投与、禁忌、包装された製品と併用すべき他の治療用製品および／またはかかる治療用製品の使用に関する警告などに関する情報を含む。
【０４２８】
当業者は、当該技術分野において既知の他の抗線維症処置、薬剤および治療法を、本明細書に記載の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）と容易に組み合わせることができることを認識し、それゆえに、これらは本明細書において考慮されている。
【０４２９】
本明細書において提供される方法および組成物は、以下の非限定例を参照して、以下でより詳細に解説される。
【実施例】
【０４３０】
例１
ｈｓｐ４７核酸分子配列の選択
Ｈｓｐ４７に対する核酸分子（例えば、２５ヌクレオチド以下のｓｉＮＡ）は、siRNA at Whitehead（Whitehead Institute for Biomedical Research）、IDT siRNA Design（Integrated DNA Technologies）、BLOCK-iT RNAi Designer（Invitrogen）、siDESIGN Center（Dharmacon)、およびBIOPREDsi（Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research、Novartis Research Foundationの一部、http://www.biopredsi.org/start.htmlで利用可能）を含む複数のコンピュータプログラムを用いて設計した。これらのプログラムから最高のスコアを得たｓｉＲＮＡの配列を比較し、アルゴリズムならびにヒトとラットとの配列相同性に基づいて選択した（表１参照）。候補配列は、in vitroノックダウンアッセイにより有効性を確認した。
【０４３１】
複数のパラメータを、核酸分子（例えば２１ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ）配列を選択するために考慮した。例示的なパラメータは以下を含む：
１）熱力学的安定性（ＲＩＳＣは、より安定性の低い５’末端を有する鎖に有利である）
２）３０〜５２％のＧＣ含量
３）位置的なヌクレオチド選好性：
（Ｃ／Ｇ）ＮＮＮＮＮＮＮＮ（Ａ／Ｕ）１０ＮＮＮＮＮＮＮＮ（Ａ／Ｕ）、ここで
Ｎは任意のヌクレオチドである
４）推定免疫刺激性モティーフの欠如
５）２ヌクレオチドの３’オーバーハング
６）転写物中のｓｉＲＮＡの位置（好ましくはｃＤＮＡ領域内）
７）配列特異性（ＢＬＡＳＴを用いてチェック）
８）ＳＮＰデータベースをチェックすることによる単一のヌクレオチドの変化
【０４３２】
２５個以下のヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡ配列は、前述の方法に基づいて設計した。対応するダイサー基質ｓｉＲＮＡ（例えば２６ヌクレオチド以上）は、より短い配列に基づいて設計され、センス鎖の３’末端に４塩基、および、アンチセンス鎖の５’末端に６塩基を加えることにより、２５ヌクレオチド以下のｓｉＮＡの標的部位を拡張する。作製したダイサー基質は、一般的に、非対称の平滑末端および３’オーバーハング分子を伴う、２５塩基のセンス鎖および２７塩基のアンチセンス鎖を有する。塩基修飾のない（基本配列）および修飾のある（試験配列）、センス鎖およびアンチセンス鎖の配列を表１に提示する。
【０４３３】
例２
ヒトおよびラットｈｓｐ４７遺伝子の両方に対する種々のｓｉＮＡ分子の有効性をスクリーニングするために、２９３、ＨＴ１０８０、ヒトＨＳＣ系ｈＴＥＲＴ、またはＮＲＫ細胞系へのヒトＨＳＰ４７  ｃＤＮＡ−緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはラットＧＰ４６  ｃＤＮＡ−ＧＦＰ構築物のレンチウイルスによる誘導により、種々のレポーター細胞系を樹立した。これらの細胞系は、ＧＦＰに対するｓｉＲＮＡによってさらに評価した。残存する蛍光シグナルを測定し、スクランブルｓｉＲＮＡ（Ambion）に対して正規化し、次いで細胞生存率に対して正規化した。結果は、ＧＦＰに対するｓｉＲＮＡが、異なる細胞系において異なる程度で蛍光をノックダウンすることを示した（図１）。２９３＿ＨＳＰ４７−ＧＦＰおよび２９３＿ＧＰ４６−ＧＦＰ細胞系を、そのトランスフェクションの容易性と、蛍光ノックダウンに対する感度から、ｓｉＨｓｐ４７のスクリーニングのために選択した。
【０４３４】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション：
細胞は、９６穴組織培養プレートにて、Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）を用い、リバーストランスフェクション法により、１ウェルあたりＧＦＰに対するｓｉＮＡ１．５ｐｍｏｌでトランスフェクションした。細胞は、１ウェルあたり６，０００個を播種し、ｓｉＮＡ複合体と混合した。蛍光の読み取りは、７２時間のインキュベーションの後、Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader（BioTek）で行った。
【０４３５】
細胞生存率アッセイ：
ｓｉＮＡ有りまたは無しで処理した細胞の生存率を、７２時間のインキュベーションの後、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit（Promega）用い、マニュアルに従って測定した。測定値は、スクランブルｓｉＮＡ分子で処理したサンプルに対して正規化した。
【０４３６】
例３
レポーター細胞系におけるｈｓｐ４７発現に対するｓｉＨｓｐ４７の阻害効率の評価
ｈｓｐ４７に対するｓｉＮＡは、レポーターＧＦＰからの蛍光シグナルの変化を評価することによって、２９３＿ＨＳＰ４７−ＧＦＰおよび２９３＿ＧＰ４６−ＧＦＰ細胞系におけるその阻害効率について評価した。実験は、例２に記載したとおりに行った。蛍光シグナルは、対照として用いた、スクランブルｓｉＲＮＡ（Ambion）で処理した細胞からの蛍光シグナルに対して正規化した。結果は、試験したｈｓｐ４７  ｓｉＮＡ分子が、両方の細胞系においてｈｓｐ４７  ｍＲＮＡを阻害するのに効果的だったことを示す。しかしながら、ＧＰ４６  ｍＲＮＡに対するｓｉＮＡ（2008年のSatoらの論文で公表されたもの）は、２９３＿ＧＰ４６−ＧＦＰ細胞系においてのみ有効だった。結果を図２Ａ〜Ｂに示す。
【０４３７】
ｈｓｐ４７およびｇｐ４６に対するｓｉＲＮＡで処理した２９３＿ＨＳＰ４７−ＧＦＰおよび２９３＿ＧＰ４６−ＧＦＰ細胞系は、例２に記載の方法を用いて生存率について評価した。細胞生存率は、スクランブルｓｉＲＮＡ（Ambion）で処理した細胞に対して正規化した。結果は、細胞生存率がｓｉＮＡ分子での処置により実質的に影響を受けなかったことを示す。しかしながら、種々のｈｓｐ４７  ｓｉＮＡ分子で処理した２９３＿ＨＳＰ４７−ＧＦＰ細胞系の細胞生存率は用いたｓｉＮＡ分子に応じて異なったが、２９３＿ＧＰ４６−ＧＦＰ細胞系の生存率は似通っていた。２９３＿ＨＳＰ４７−ＧＦＰ細胞の生存率は、ｓｉＨｓｐ４７−６およびＨｓｐ４７−７で処理した細胞において、残りのものより低かった。結果は、図２Ｃ〜Ｄに示す。
【０４３８】
例４
TaqMan(R) qPCRによるｈｓｐ４７  ｍＲＮＡに対するｓｉＨｓｐ４７の阻害効果の評価
例３では、レポーター細胞系におけるｓｉＨｓｐ４７のノックダウン効率を、蛍光シグナルの変化によって評価した。結果をｍＲＮＡレベルで確認するために、内因性のｈｓｐ４７を標的とするｓｉＲＮＡを、例２に記載のとおり、Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）を用い、リバーストランスフェクション法により、ヒトＨＳＣ細胞系ｈＴＥＲＴ細胞にトランスフェクションした。
【０４３９】
ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡレベルは、種々の試験したｓｉＨｓｐ４７  ｓｉＮＡ分子のノックダウン効率について評価した。簡潔に述べると、トランスフェクションの７２時間後に、ｈＴＥＲＴ細胞からｍＲＮＡを、RNeasy mini kit（Qiagen）を用いて単離した。ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡのレベルは、TaqMan(R)プローブを用いた定量ＰＣＲと組み合わせた逆転写により決定した。簡潔に述べると、ｃＤＮＡ合成を、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（ABI）を用い、メーカーの指示に従って行い、TaqMan Gene Expression Assay（ABI、hsp47アッセイID Hs01060395_g1）に供した。ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡのレベルは、メーカーの指示（ABI）に従って、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルに対して正規化した。結果は、ｓｉＨｓｐ４７−Ｃが全てのｈｓｐ４７  ｓｉＲＮＡの中で最も効果的であり、ｓｉＨｓｐ４７−２およびｓｉＨｓｐ４７−２ｄが次に最も効果的だったことを示す。ｓｉＨｓｐ４７−１とｓｉＨｓｐ４７−２との組合せ、またはｓｉＨｓｐ４７−１とｓｉＨｓｐ４７−２ｄとの組合せは、ｓｉＨｓｐ４７−１のみよりも効果的であった。結果は、図３に示す。
【０４４０】
例５
ｓｉＨｓｐ４７のノックダウン効果のタンパク質レベルでの確認
ｈｓｐ４７  ｍＲＮＡ発現に対する種々のＨｓｐ４７  ｓｉＮＡ分子（ｓｉＨｓｐ４７）の阻害効果を、種々のｓｉＨｓｐ４７をトランスフェクションしたｈＴＥＲＴ細胞におけるＨＳＰ４７を測ることにより、タンパク質レベルで確認した。種々のｓｉＨｓｐ４７のｈＴＥＲＴ細胞へのトランスフェクションは、例２に記載のとおりに行った。トランスフェクションしたｈＴＥＲＴ細胞は溶解し、細胞溶解物を遠心分離により清澄化した。清澄化した細胞溶解物中のタンパク質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分割した。細胞溶解物中のＨＳＰ４７タンパク質のレベルを、抗ＨＳＰ４７抗体（Assay Designs）を一次抗体として、ＨＲＰとコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Millipore）を二次抗体として用い、その後Supersignal West Pico Chemiluminescence kit（Pierce）で検出して決定した。抗アクチン抗体（Abcam）を、タンパク質負荷対照として用いた。結果は、ｓｉＨｓｐ４７−Ｃ、ｓｉＨｓｐ４７−２ｄのみ、または、ｓｉＨｓｐ４７−１とｓｉＨｓｐ４７−２ｄとの組合せで処理した細胞における、Ｈｓｐ４７タンパク質のレベルの顕著な減少を示した。
【０４４１】
例６
ｈｓｐ４７  ｓｉＲＮＡによるコラーゲンＩ発現の下方調節
コラーゲンＩ発現レベルに対するｓｉＨｓｐ４７の効果を決定するために、ｈｓｐ４７に対する種々のｓｉＲＮＡで処理したｈＴＥＲＴ細胞におけるコラーゲンＩ  ｍＲＮＡレベルを測定した。簡潔に述べると、ｈＴＥＲＴ細胞に種々のｓｉＨｓｐ４７を例２に記載のとおりにトランスフェクションした。細胞を７２時間後に溶解し、ｍＲＮＡをRNeasy mini kitを用い、マニュアル（Qiagen）に従って単離した。コラーゲンＩ  ｍＲＮＡのレベルは、TaqMan(R)プローブを用いた定量ＰＣＲと組み合わせた逆転写により決定した。簡潔に述べると、ｃＤＮＡ合成を、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（ABI）を用い、メーカーの指示に従って行い、TaqMan Gene Expression Assay（ABI、COL1A1アッセイID Hs01076780_g1）に供した。コラーゲンＩ  ｍＲＮＡのレベルは、メーカーの指示（ABI）に従って、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルに対して正規化した。シグナルは、スクランブルｓｉＮＡをトランスフェクションした細胞から得られるシグナルに対して正規化した。結果は、図４に示すとおり、コラーゲンＩ  ｍＲＮＡレベルが、候補のいくつか、ｓｉＨｓｐ４７−２、ｓｉＨｓｐ４７−２ｄ、およびこれらとｓｉＨｓｐ４７−１との組み合せで処理した細胞において顕著に低下したことを示した。
【０４４２】
例７
ｈｓｐ４７  ｓｉＲＮＡで処理したｈＴＥＲＴ細胞の免疫蛍光染色
ｓｉＨｓｐ４７有りまたは無しでトランスフェクションしたｈＴＥＲＴ細胞における２種の線維症マーカー、コラーゲンＩおよびα平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の発現を視覚化するために、細胞をウサギ抗コラーゲンＩ抗体（Abcam）およびマウス抗アルファＳＭＡ抗体（Sigma）で染色した。Alexa Fluor 594ヤギ抗マウスＩｇＧおよびAlexa Fluor 488ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Invitrogen（Molecular Probes））を、コラーゲンＩ（緑）およびアルファＳＭＡ（赤）を視覚化する二次抗体として用いた。Ｈｏｅｓｃｈｔを、核（青い）を視覚化するために用いた。結果は、標的遺伝子の一部のｓｉＲＮＡによるノックダウンと、コラーゲン／ＳＭＡ発現との間の相関関係を示す。
【０４４３】
例８
肝線維症の動物モデルにおけるｓｉＨＳＰ４７のin vivo試験
ラット肝硬変処置のためのｓｉＲＮＡ
ＨＳＰ４７（ｓｉＨＳＰ４７Ｃ）のためのｓｉＲＮＡ二重鎖配列は以下に列挙するとおりである。
センス（５’→３’）        ｇｇａｃａｇｇｃｃｕｃｕａｃａａｃｕａＴＴ
アンチセンス（５’→３’）  ｕａｇｕｕｇｕａｇａｇｇｃｃｕｇｕｃｃＴＴ
【０４４４】
１０ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ原液を、ヌクレアーゼフリー水（Ambion）に溶解することにより調製した。肝硬変ラットの処置のために、コラーゲンを生産する活性化肝星細胞を標的化する目的で、ｓｉＲＮＡを、Satoら（Sato Y. et al. Nature Biotechnology 2008. Vol.26, p431）によって記載されたビタミンＡ結合リポソームで製剤化した。ビタミンＡ（ＶＡ）−リポソーム−ｓｉＲＮＡ製剤は、５％のグルコース溶液中の、０．３３μｍｏｌ／ｍｌのＶＡ、０．３３μｍｏｌ／ｍｌのリポソーム（Coatsome EL-01-D, NOF Corporation）および０．５μｇ／μｌのｓｉＲＮＡからなる。
【０４４５】
肝硬変動物モデルは、Satoら（Sato Y. et al. Nature Biotechnology 2008. Vol.26, p431）によって報告されている。４週齢の雄性ＳＤ系ラットに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．５％ジメチルニトロソアミン（ＤＭＮ）（Wako Chemicals, Japan）により肝硬変を誘発した。２ｍｌ／ｋｇ体重の用量を、毎週３日連続して、第０、２、４、７、９、１１、１４、１６、１８、２１、２３、２５、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４０日に腹腔内投与した。
【０４４６】
ｓｉＲＮＡ処置：ｓｉＲＮＡ処置は、第３２日から５回の静脈内注射で行った。詳細には、ラットは第３２、３４、３６、３８および４０日にｓｉＲＮＡで処置した。その後、ラットを第４２または４３日に致死させた。３つの異なるｓｉＲＮＡの用量（ｋｇ体重あたり１．５ｍｇのｓｉＲＮＡ、ｋｇ体重あたり２．２５ｍｇのｓｉＲＮＡ、ｋｇ体重あたり３．０ｍｇのｓｉＲＮＡ）を試験した。試験群の詳細および各群の動物数は以下のとおりである：
１）肝硬変をＤＭＮ注射によって誘発し、次いでｓｉＲＮＡの代わりに５％グルコースを注射（ｎ＝１０）
２）ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＨＳＰ４７Ｃ  １．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１０）
３）ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＨＳＰ４７Ｃ  ２．２５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１０）
４）ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＨＳＰ４７Ｃ  ３．０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１０）
５）Ｓｈａｍ（ＤＭＮの代わりにＰＢＳを注射。ｓｉＲＮＡの代わりに５％グルコースを注射）（ｎ＝６）
６）無処置対照（インタクト）（ｎ＝６）
ＶＡ−Ｌｉｐは、ビタミンＡ−リポソーム複合体を指す。
【０４４７】
治療効果の評価：第４３日に、「疾患ラット」群の１０頭のうち２頭と、「ＶＡ−Ｌｉｐ−ｓｉＨＳＰ４７Ｃ  ｓｉＲＮＡ  １．５ｍｇ／ｋｇ」の１０頭のうち１頭が、肝硬変の進行により死亡した。残りの動物は生き残った。ラットを致死させた後、肝臓組織を１０％ホルマリンで固定した。次いで、各々の肝臓の左葉を組織学検査のためにパラフィンに包埋した。組織スライドを、シリウスレッドおよびヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）で染色した。シリウスレッド染色は、コラーゲン沈着を視覚化し、肝硬変のレベルを決定するために用いた。ＨＥ染色は、対比染色としての核および細胞質のためのものであった。各々のスライドは顕微鏡（ＢＺ−８０００（キーエンス社日本））で観察し、スライドあたりのシリウスレッド染色領域のパーセンテージを、顕微鏡に付属する画像分析ソフトウェアで決定した。各々の肝臓につき少なくとも４枚のスライドを画像分析のために調製し、各々のスライド（肝臓の切片）の全領域をカメラで撮像し、分析した。統計分析は、スチューデントのｔ検定によって行った。
【０４４８】
結果：図５は線維性領域を示す。「疾患ラット」の線維化領域は、「ｓｈａｍ」または「無処置対照」群よりも広かった。したがって、ＤＭＮ処置は肝臓にコラーゲン沈着を誘発した。それは肝線維症の典型的所見であった。しかし、線維化領域は、ＨＳＰ４７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの処置によって、「疾患ラット」群と比較して顕著に縮小した（図５）。この結果は、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡが、実際の疾患において治療効果を有することを示す。
【０４４９】
さらなるｓｉＲＮＡ化合物を肝線維症動物モデルで試験し、肝臓における線維性領域を縮小することが示された。
【０４５０】
例９
ＨＳＰ４７／ＳＥＲＰＩＮＨ１に対する活性な二本鎖ＲＮＡ化合物のための配列の生成と、表Ａ−１８、Ａ−１９およびＢ〜Ｅに示すｓｉＲＮＡの製造
独自のアルゴリズムと標的遺伝子の既知の配列を用いて、多くの潜在的ｓｉＲＮＡの配列を生成した。この方法を用いて生成した配列は、対応するｍＲＮＡ配列に相補的である。
【０４５１】
相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、二重鎖を生成する。層流フード内で、ＷＦＩ（注射用蒸留水、Norbrook）で希釈することにより、〜５００μＭの一本鎖オリゴヌクレオチドの原液を調製する。実際のｓｓＲＮＡ濃度は、各々の５００μＭのｓｓＲＮＡをＷＦＩで１：２００に希釈し、Nano Dropを用いてＯＤを測定することにより決定する。手順を３回繰り返し、平均濃度を計算する。次いで、原液を２５０μＭの終濃度に希釈した。相補的な一本鎖を、８５℃に加熱することによりアニーリングし、少なくとも４５分にわたって室温に放冷した。二重鎖は、５μｌを、２０％のポリアクリルアミドゲルおよび染色で試験することにより、完全なアニーリングについて試験した。サンプルを−８０℃で保存した。
【０４５２】
表Ａ−１８、Ａ−１９およびＢ〜Ｅは、ＨＳＰ４７／ＳＥＲＰＩＮＨ１に関するｓｉＲＮＡを提示する。各々の遺伝子について、１９ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ配列の別々のリストがあり、それはヒト遺伝子発現をターゲティングするための最良の配列として、独自のアルゴリズムにおけるそれらのスコアに基づいて優先順位が決められている。
【０４５３】
以下の略語が、本明細書に記載の表Ａ−１８、Ａ−１９およびＢ〜Ｅに用いられている：「他の種またはSp.」は、他の動物との種間同一性を指し、Ｄは犬、Ｒｔはラット、Ｒｂはウサギ、Ｒｈはアカゲザル、Ｐはブタ、Ｍはマウス、ＯＲＦはオープンリーディングフレームを指す。１９ｍｅｒおよび１８＋１ｍｅｒは、それぞれ１９および１８＋１（アンチセンスの１位にＵ、センス鎖の１９位にＡ）リボ核酸の長さのオリゴマーを指す。
【０４５４】
標的遺伝子用ｓｉＲＮＡ化合物のin vitro試験
ヒトおよびラットＳＥＲＰＩＮＨ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡオリゴのためのロースループットスクリーニング（ＬＴＳ）
細胞系：ヒト前立腺腺癌ＰＣ３細胞（ATCC, Cat# CRL-1435）は１０％のＦＢＳおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ培地で生育し、ヒト上皮性子宮頸癌ＨｅＬａ細胞（ATCC, Cat#CCL-2）は１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。細胞は、３７℃にて５％ＣＯ２で維持した。
【０４５５】
ＳＥＲＰＩＮＨ１遺伝子を内因性に発現する約２×１０５個のヒトＰＣ−３細胞を、２４時間後に３０〜５０％コンフルエントに達するよう、１．５ｍｌの増殖培地に接種した。細胞に、トランスフェクション細胞につき０．０１〜５ｎＭの終濃度のLipofectamineTM2000試薬でトランスフェクションした。細胞を、３７±１℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベーションした。ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を採取し、ＲＮＡをEZ-RNA kit（Biological Industries (#20-410-100)）を用いて単離した。
【０４５６】
逆転写は、以下のとおりに行った。ｃＤＮＡの合成を行い、ヒトＳＥＲＰＩＮＨ１  ｍＲＮＡレベルをリアルタイムｑＰＣＲで決定し、各々のサンプルにつき、シクロフィリンＡ（CYNA, PPIA）ｍＲＮＡのレベルに対して正規化した。ｓｉＲＮＡ活性は、ｓｉＲＮＡ処理サンプル中のＳＥＲＰＩＮＨ１  ｍＲＮＡ量対非トランスフェクション対照サンプルの比率に基づいて決定した。
【０４５７】
最も活性な配列をさらなるアッセイから選択した。表Ａ−１８からは、ｓｉＲＮＡ化合物ＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４５ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５１ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５２およびｓＥＲＰＩＮＨ１＿８６が好ましい化合物として選択された。表Ａ−１９からは、ｓｉＲＮＡ化合物ＳＥＲＰＩＮＨ１＿４、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１２、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿１８、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿３０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５８とＳＥＲＰＩＮＨ１＿８８が好ましい化合物として選択された。
【０４５８】
他の好ましい化合物は、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿５０、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿６７、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿７３、ＳＥＲＰＩＮＨ１＿７４を含む。
【０４５９】
ＬＴＳで選択したＳＥＲＰＩＮＨ１  ｓｉＲＮＡオリゴのＩＣ５０値
ＳＥＲＰＩＮＨ１遺伝子を内因性に発現する約２×１０５個のヒトＰＣ−３細胞を、２４時間後に３０〜５０％コンフルエントに達するよう、１．５ｍｌの増殖培地に接種した。細胞に、ＳＥＲＰＩＮＨ１二本鎖ＲＮＡ化合物（すなわちＳＥＲＰＩＮＨ１＿２、４、６、１２、１３、１８、４５、５１、５８、８８）を、０．００２９〜１００ｎＭの範囲の最終的なトランスフェクション濃縮に達するよう、LipofectamineTM2000試薬でトランスフェクションした。陰性対照として、細胞をLipofectamineTM2000試薬または２０〜１００ｎＭの終濃度の合成ランダム化配列の非標的化ｓｉＲＮＡで処理する。Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を、トランスフェクション効率についての陽性対照として用いた。
【０４６０】
細胞を、３７±１℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベーションした。ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を採取し、ＲＮＡをEZ-RNA kit（Biological Industries (#20-410-100)）を用いて単離した。逆転写：ｃＤＮＡの合成を行い、ヒトＳＥＲＰＩＮＨ１  ｍＲＮＡレベルをリアルタイムｑＰＣＲで決定し、各々のサンプルにつき、シクロフィリンＡ（CYNA, PPIA）ｍＲＮＡのレベルに対して正規化した。
【０４６１】
試験したＲＮＡｉ活性のＩＣ５０値は、種々の最終的なｓｉＲＮＡ濃度で得られた活性の結果を用いた用量反応曲線を作成することによって決定した。用量反応曲線は、残存するＳＥＲＰＩＮＨ１  ｍＲＮＡの相対量を、トランスフェクションしたｓｉＲＮＡ濃度の対数に対してプロットすることによって作成した。曲線は、測定したデータに最良のＳ字状曲線をフィットさせることによって計算する。Ｓ字状曲線のフィットのための方法はまた、３点曲線フィット（3-point curve fit）として知られている。
【数１】
0005972408.tif 000046
式中、Ｙは残存するＳＥＲＰＩＮＨ１  ｍＲＮＡの反応であり、ＸはトランスフェクションしたｓｉＲＮＡ濃度の対数であり、ＢｏｔはボトムプラトーにおけるＹ値であり、ＬｏｇＩＣ５０はＹがボトムプラトーとトッププラトーとの中間にあるときのＸ値であり、HillSlopeは曲線の傾き（steepness）である。
【０４６２】
具体的なｓｉＲＮＡを用いた遺伝子発現の阻害パーセントは、内因性遺伝子を発現する細胞における標的遺伝子のｑＰＣＲ分析によって決定した。表Ａ−１８、Ａ−１９およびＢ〜Ｅによる他のｓｉＲＮＡ化合物をin vitroで試験し、そこでは、これらのｓｉＲＮＡ化合物が遺伝子発現を阻害することが示される。活性は、残存するｍＲＮＡのパーセントとして示され、したがって、低い値はより優れた活性を示す。
【０４６３】
ｓｉＲＮＡ化合物の血清中の安定性を試験するために、具体的なｓｉＲＮＡ分子を、４つの異なるバッチのヒト血清（濃度１００％）中、３７℃で、２４時間までインキュベーションした。サンプルは、０．５、１、３、６、８、１０、１６および２４時間で回収した。指標としての移動パターンを、各回収時間において、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により決定した。
【０４６４】
表３は、表Ａ−１８およびＡ−１９から選択した、非修飾二本鎖核酸化合物（センス鎖およびアンチセンス鎖は非修飾、ｄＴｄＴ  ３’末端オーバーハング）に関する、ヒト細胞系におけるＩＣ５０（または、ＩＣ５０が計算されない場合は活性）を示す。
表３
【表２】
0005972408.tif 000047
【０４６５】
ｓｉＲＮＡノックダウン活性：
ＳＥＲＰＩＮＨ１遺伝子を内因性に発現するヒトＰＣ−３細胞を、１ウェルあたり約２×１０５個で６ウェルプレートに接種し、約２４時間生育させて３０〜５０％コンフルエントにした。細胞に、試験するｓｉＲＮＡを種々の濃度で、LipofectamineTM2000試薬（Invitrogen）を用いてトランスフェクションした。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて、４８時間または７２時間インキュベーションした。トランスフェクションの４８〜７２時間後、細胞を採取し、細胞のＲＮＡを抽出した。Ｃｙ３で標識したｓｉＲＮＡ二重鎖を、トランスフェクション効率についての陽性対照として用いた。LipofectamineTM2000試薬で処理したｍｏｃｋ細胞を「対照非活性サンプル」（陰性対照）と定義し、５ｎＭの終濃度の既知の活性なｓｉＲＮＡ（ＨＳＰ４７−Ｃ）で処理した細胞を「対照活性サンプル」（陽性対照）と定義した。Ｚ’および対照倍数（controls fold）｛倍数＝平均（陰性）／平均（陽性）｝は、アッセイ効率を記述する手段である。
【０４６６】
試験した各々のｓｉＲＮＡによる標的遺伝子発現のパーセント阻害は、細胞から標的ｍＲＮＡのｑＰＣＲ分析で決定した。逆転写は細胞からｃＤＮＡを合成することにより行い、標的遺伝子ｍＲＮＡレベルをリアルタイムｑＰＣＲで決定した。測定した細胞ｍＲＮＡレベルは、各々のサンプルにつき、シクロフィリンＡ（CYNA, PPIA）ｍＲＮＡのレベルに対して正規化した。ｓｉＲＮＡ活性は、ｓｉＲＮＡ処理サンプルの標的遺伝子ｍＲＮＡ量に対する非トランスフェクション対照サンプルの比率に基づいて決定した。Ｚ’および対照倍数｛倍数＝平均（陰性）／平均（陽性）｝は、アッセイ効率を記述する手段である。
【０４６７】
ｑＰＣＲの結果は、ＱＣ基準に合格したもの、すなわち、標準曲線の傾きの値が［−４、−３］の範囲内、Ｒ２＞０．９９、プライマーダイマー無しのものである。ＱＣ要件に合格しなかった結果は、分析不適格とした。
【０４６８】
試験したＲＮＡｉ活性のＩＣ５０値は、種々の最終的なｓｉＲＮＡ濃度で得られた活性の結果を用いた用量反応曲線を作成することによって決定した。用量反応曲線は、上記のとおり、残存するＳＥＲＰＩＮＨ１  ｍＲＮＡの相対量を、トランスフェクションしたｓｉＲＮＡ濃度の対数に対してプロットすることによって作成した。
【０４６９】
二本鎖ＲＮＡ分子のオンターゲットおよびオフターゲット試験：
psiCHECKシステムは、ガイド鎖（ＧＳ）（アンチセンス）およびパッセンジャー鎖（ＰＳ）（センス鎖）が、標的化（オンターゲット）効果およびオフターゲット効果を引き起こすかを、その標的配列の発現レベルの変化をモニターすることによって評価することができる。各々の試験分子のＧＳおよびＰＳ鎖の標的活性と、生じ得るオフターゲット活性の評価のために、４個のpsiCHECKTM-2に基づく（Promega）構築物を調製した。各々の構築物において、試験分子のＧＳおよびＰＳの完全な標的配列またはシード（seed）標的配列のいずれかの１コピーまたは３コピーを、３’−ＵＴＲ領域のウミシイタケルシフェラーゼの翻訳停止コドンの下流に位置するマルチクローニングサイトにクローニングした。
【０４７０】
得られたベクターは、以下のように命名した。
【０４７１】
１−完全な標的配列（試験分子のＧＳの全１９塩基配列と完全に相補的なヌクレオチド配列）を１コピー含む、ＧＳ−ＣＭ（ガイド鎖、完全マッチ）ベクター。
【０４７２】
２−完全な標的配列（試験分子のＰＳの全１９塩基配列と完全に相補的なヌクレオチド配列）を１コピー含む、ＰＳ−ＣＭ（パッセンジャー鎖、完全マッチ）ベクター。
【０４７３】
３−シード領域標的配列（試験分子のＧＳのヌクレオチド１〜８に相補的な配列）を１コピーまたは３コピー含む、ＧＳ−ＳＭ（ガイド鎖、シードマッチ）ベクター。
【０４７４】
４−シード領域標的配列（試験分子のＰＳのヌクレオチド１〜８に相補的な配列）を１コピー含む、ＰＳ−ＳＭ（パッセンジャー鎖、シードマッチ）ベクター。
【０４７５】
命名法：
ガイド鎖：ＲＩＳＣ複合体に入り、相補的なＲＮＡ配列の切断／サイレンシングをガイドするｓｉＲＮＡの鎖。
【０４７６】
シード配列：ガイド鎖の５’末端からのヌクレオチド２〜８。
【０４７７】
ｃｍ（完全マッチ）：ｓｉＲＮＡのガイド鎖と完全に相補的なＤＮＡフラグメント。このＤＮＡフラグメントは、レポーター遺伝子の３’ＵＴＲにクローニングされ、直接的なＲＮＡサイレンシングの標的として用いられる。
【０４７８】
ｓｍ（シードマッチ）：ヌクレオチド（ｎｓ）１２〜１８が、ｓｉＲＮＡのガイド鎖のｎｓ２〜８と完全に相補的な１９ｍｅｒのＤＮＡフラグメント。このＤＮＡフラグメントはレポーター遺伝子の３’ＵＴＲにクローニングされ、オフターゲットサイレンシングの標的として用いられる。
【０４７９】
Ｘ１：レポーター遺伝子の３’ＵＴＲにクローニングされた、ｃｍまたはｓｍの単一のコピー。
【０４８０】
Ｘ３：レポーター遺伝子の３’ＵＴＲにクローニングされた、ｃｍまたはｓｍの３個のコピーであり、４個のヌクレオチドで互いに隔てられている。
表４  psiCHECKクローニング化標的の非限定例
【表３】
0005972408.tif 000048
【０４８１】
標的配列は、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩに適合する制限酵素部位を用いてクローニングする。アニーリング混合物は、しっかりと栓をした０．５ｍｌエッペンドルフチューブ内に調製し、ウォーターバスで８５℃に加熱し、沸騰水浴に沈め、最後に室温に徐々に冷却する。
【０４８２】
ライゲーション：アニーリング手順によって生成した二本鎖オリゴヌクレオチドを、（ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩにより）線状化したpsiCHECKTM-2にライゲーションし、標準的な技術を用いて細胞にトランスフェクションする。陽性コロニーを同定し、挿入配列の確認のためにシーケンシングした。表５は、挿入されたオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示す。
表５
【表４−１】
0005972408.tif 000049
【０４８３】
【表４−２】
0005972408.tif 000050
【０４８４】
【表４−３】
0005972408.tif 000051
【０４８５】
【表４−４】
0005972408.tif 000052
【０４８６】
上述の関連する鎖を、（psiCHECKTM-2（Promega）ベクター中のレポーターｍＲＮＡウミシイタケルシフェラーゼの３’ＵＴＲにクローニングした。ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩを、標準的な分子生物学技術を用いてクローニングサイトとして用いた。各々の鎖は化学的に合成し、１００℃に加熱することによりアニーリングし、室温に冷却した。ライゲーションは標準的な分子生物学技術を用いて３時間行い、これで大腸菌ＤＨ５ａ細胞を形質転換した。得られたコロニーを、関連するプライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、プラスミド構築物の存在についてスクリーニングした。プラスミド（ベクター）の各々は、１個の陽性コロニーから精製し、その配列を確認した。
【０４８７】
約１．３×１０６個のヒトＨｅｌａ細胞を１０ｃｍのディッシュに接種した。その後、細胞を３７±１℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間インキュベーションした。接種の１日後に、増殖培地を８ｍＬの新鮮な増殖培地に取り替え、各々のプレートを、LipofectamineTM2000試薬を用いてメーカーのプロトコルに従い、上記のプラスミドの１つでトランスフェクションし、３７±１℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベーションした。インキュベーションの後、細胞を９６穴プレートに、１ウェルあたり８０μｌの増殖培地中５×１０３個の終濃度で再度播種した。１６時間後、細胞に、ＳＥＲＰＩＮＨ１  ｓｉＲＮＡ分子を、LipofectamineTM2000試薬を用いて、１００μＬの終容量中０．００１ｎＭ〜５ｎＭの範囲の種々の濃度でトランスフェクションした。LipofectamineTM2000試薬により対応するpsiCHECKTM-2プラスミドで処理したｍｏｃｋ細胞を「対照非活性サンプル」（陰性対照）と定義し、５ｎＭの終濃度の既知の活性なｓｉＲＮＡ（ＨＳＰ４７−Ｃ）で処理した細胞を「対照活性サンプル」（陽性対照）と定義した。Ｚ’および対照倍数｛倍数＝平均（陰性）／平均（陽性）｝は、アッセイ効率を記述する手段である。
【０４８８】
次いで、細胞を３７±１℃で４８時間インキュベーションし、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼ活性を、ｓｉＲＮＡトランスフェクションサンプルの各々において、メーカーの手順に従い、Dual-Luciferase(R) Assay kit（Promega, Cat#E1960）を用いて測定した。この標的配列に対する合成ｓｉＲＮＡの活性は、融合ｍＲＮＡの切断とその後の分解、または、コードされたタンパク質の翻訳阻害のいずれかをもたらす。したがって、ウミシイタケルシフェラーゼ活性の低下を測定することは、ｓｉＲＮＡ効果をモニターする便利な方法を提供し、一方ホタルルシフェラーゼは、ウミシイタケルシフェラーゼの発現の正規化を可能にする。各々のサンプルについて、ウミシイタケルシフェラーゼ活性値を、ホタルルシフェラーゼ活性値によって除した（正規化）。ウミシイタケルシフェラーゼ活性は、最終的に、「対照非活性サンプル」に対する、試験サンプルにおける正規化された活性値のパーセンテージとして表す。
【０４８９】
非修飾または修飾ｓｉＲＮＡ／LipofectamineTM2000に暴露した末梢血単核細胞（ＰＭＮＣ）のＴＮＦαおよびＩＬ−６レベルの結果である。結果は、標準曲線に基づいて計算されるｐｇ／ｍｌ値で提供される。「対照Lipofec2000」は、トランスフェクション試薬LipofectamineTM2000によって誘発されるサイトカイン分泌のレベルに関する。修飾化合物のサイトカインＴＮＦａまたはＩＬ６のレベルは、いずれも、対照トランスフェクション試薬のものを上回らなかった。
【０４９０】
【表５−１】
0005972408.tif 000053
【０４９１】
【表５−２】
0005972408.tif 000054
【０４９２】
非修飾または修飾二本鎖核酸化合物の、インターフェロン（ＩＦＮ）応答遺伝子、ＭＸ１およびＩＦＩＴ１の誘導に関するデータである。示す結果は、ヒトＰＭＮＣで試験した、残存する（対照Lipofectamine2000処理細胞の倍数）ヒトＩＦＩＴ１およびＭＸ１遺伝子である。データは、全ての修飾化合物が、非修飾の（＿Ｓ７０９）化合物と比較して無視し得るレベルのＩＦＮ下流遺伝子を誘導したことを示す。
【表６−１】
0005972408.tif 000055
【０４９３】
【表６−２】
0005972408.tif 000056
【０４９４】
【表６−３】
0005972408.tif 000057
【０４９５】
下記の表は、ラット細胞における、非修飾の（＿Ｓ７０９）化合物と比較した、化合物＿１、化合物＿２、化合物＿３および化合物＿４の活性を示す。結果は、ＲＥＦ５２細胞における、残存する標的のラットＳＥＲＰＩＮＨ１遺伝子（対照LipofectamineTM2000処理細胞の％）として示す。２つの別々の実験の結果を示す。ラット細胞における標的遺伝子のノックダウンは、ヒト疾患の動物モデルにおける化合物の試験に関連する。
【表７−１】
0005972408.tif 000058
【０４９６】
【表７−２】
0005972408.tif 000059
【０４９７】
血清安定性アッセイ
本発明による修飾化合物を、ヒト血清またはヒト組織抽出物中の二重鎖の安定性について以下のように試験する：
７μＭの終濃度のｓｉＲＮＡ分子を、１００％のヒト血清（Sigma Cat# H4522）中、３７℃でインキュベーションする。（１００μＭのｓｉＲＮＡ原液を、ヒト血清または種々の組織種からのヒト組織抽出物に1：１４．２９で希釈）。５μｌを、異なる時点（例えば、０、３０分、１時間、３時間、６時間、８時間、１０時間、１６時間および２４時間）で、１５μｌの１．５×ＴＢＥローディングバッファーに添加する。サンプルを、直ちに液体窒素中で凍結させ、−２０℃に維持した。
各々のサンプルを、当該技術分野において既知の方法によって調製した非変性の２０％アクリルアミドゲルに負荷する。オリゴを、紫外線下、エチジウムブロマイドで視覚化した。
【０４９８】
エキソヌクレアーゼ安定性アッセイ
核酸分子に対する３’非ヌクレオチド部分の安定化効果を調査するため、センス鎖、アンチセンス鎖およびアニーリングしたｓｉＲＮＡ二重鎖を、種々の細胞種から調製した細胞質抽出物中でインキュベーションする。
抽出物：ＨＣＴ１１６細胞質抽出物（１２ｍｇ／ｍｌ）。
抽出物バッファー：２５ｍＭのＨｅｐｅｓ  ３７℃でｐＨ７．３、８ｍＭのＭｇＣｌ、１ｍＭのＤＴＴを含む１５０ｍＭのＮａＣｌを、使用の直前に新たに加えた。
方法：３．５ｍｌの試験ｓｉＲＮＡ（１００ｍＭ）を、１２０ｍｇのＨＣＴ１１６細胞質抽出物を含む４６．５ｍｌと混合した。この４６．５ｍｌは、１２ｍｌのＨＣＴ１１６抽出物と、ＤＴＴおよびプロテアーゼインヒビターカクテル／１００（Calbiochem, setIII-539134）を添加した３４．５ｍｌの抽出バッファーとからなる。インキュベーションチューブ中のｓｉＲＮＡの終濃度は７ｍＭである。サンプルを３７℃でインキュベーションし、示した時点で、５ｍｌを新たなチューブに移し、１５ｍｌの１×ＴＢＥ−５０％グリセロールローディングバッファーと混合し、液体窒素で急速凍結した。ローディングバッファー中のｓｉＲＮＡの終濃度は、１．７５ｍＭ（２１ｎｇ  ｓｉＲＮＡ／ｍｌ）である。非変性ＰＡＧＥおよびＥｔＢｒ染色による分析については、レーンあたり５０ｎｇを負荷する。ノーザン分析については、レーンあたり１ｎｇの試験ｓｉＲＮＡを負荷した。
【０４９９】
ＳＥＲＰＩＮＨ１  ｓｉＲＮＡ分子に対する自然免疫反応：
新鮮なヒト血液を（ＲＴで）、無菌の０．９％ＮａＣｌとＲＴにて１：１の比率で混合し、フィコール（Lymphoprep, Axis-Shield cat# 1114547）に穏やかに負荷した（１：２の比率）。サンプルを、スイング式遠心機でＲＴにて（２２℃、８００ｇ）３０分間遠心分離し、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、１０分間遠心分離した（ＲＴ、２５０ｇ）。細胞を計数し、増殖培地（なＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）中に１．５×１０６個／ｍｌの終濃度で播種し、ｓｉＲＮＡ処理の前に３７℃で１時間インキュベーションした。
次いで、細胞を、LipofectamineTM2000試薬（Invitrogen）を用い、メーカーの指示に従って、種々の濃度の試験するｓｉＲＮＡで処理し、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間インキュベーションした。
【０５００】
ＩＦＮ反応のための陽性対照として、細胞を、ＴＬＲ３リガンドである二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の合成アナログである、終濃度０．２５〜５．０μｇ/ｍｌのポリ(I:C)（InvivoGen Cat# tlrl-pic）か、ＴＬＲ７／８リガンドである、終濃度０．０７５〜２μｇ／ｍｌのチアゾロキノロン（CLO75）（InvivoGen Cat# tlrl-c75）のいずれかで処理した。LipofectamineTM2000試薬で処理した細胞を、ＩＦＮ反応についての陰性（参照）対照として用いた。
【０５０１】
インキュベーションの約２４時間後に、細胞を回収し、上清を新しいチューブに移した。サンプルを液体窒素中で直ちに凍結し、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αサイトカインの分泌を、IL-6, DuoSet ELISA kit（R&D System DY2060）およびTNF-α, DuoSet ELISA kit（R&D System DY210）を用い、メーカーの指示に従って試験した。ＲＮＡを細胞ペレットから抽出し、ヒト遺伝子ＩＦＩＴ１（テトラトリコペプチドリピート含有インターフェロン誘導タンパク質１）およびＭＸ１（ミクソウイルス（インフルエンザウイルス）耐性１、インターフェロン誘導性タンパク質ｐ７８）のｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲで測定した。測定したｍＲＮＡ量は、参照遺伝子ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（サイクロフィリンＡ、ＣｙｃｌｏＡ）のｍＲＮＡ量に対して正規化した。ＩＦＮシグナリングの誘導は、処理細胞に由来するＩＦＩＴ１およびＭＸ１遺伝子からのｍＲＮＡの量を、無処置細胞の量と比較することによって評価した。ｑＰＣＲの結果は、ＱＣ基準に合格したもの、すなわち、標準曲線の傾きの値が［−４、−３］の範囲内、Ｒ２＞０．９９、プライマーダイマー無しのものである。ＱＣ要件に合格しなかった結果は、分析不適格とした。
【０５０２】
表６は、ｓｉＳＥＲＰＩＮＨ１化合物を示す。化合物の一部についての活性および安定性のデータを表６に提示する。センス鎖およびアンチセンス鎖構造に関するコードを、以下の表７に提示する。
表６：
【表８−１】
0005972408.tif 000060
【０５０３】
【表８−２】
0005972408.tif 000061
【０５０４】
【表８−３】
0005972408.tif 000062
【０５０５】
【表８−４】
0005972408.tif 000063
【０５０６】
【表８−５】
0005972408.tif 000064
【０５０７】
【表８−６】
0005972408.tif 000065
【０５０８】
【表８−７】
0005972408.tif 000066
【０５０９】
【表８−８】
0005972408.tif 000067
【０５１０】
【表８−９】
0005972408.tif 000068
【０５１１】
【表８−１０】
0005972408.tif 000069
【０５１２】
【表８−１１】
0005972408.tif 000070
【０５１３】
【表８−１２】
0005972408.tif 000071
【０５１４】
【表８−１３】
0005972408.tif 000072
【０５１５】
【表８−１４】
0005972408.tif 000073
【０５１６】
【表８−１５】
0005972408.tif 000074
【０５１７】
【表８−１６】
0005972408.tif 000075
【０５１８】
【表８−１７】
0005972408.tif 000076
【０５１９】
【表８−１８】
0005972408.tif 000077
【０５２０】
【表８−１９】
0005972408.tif 000078
【０５２１】
【表８−２０】
0005972408.tif 000079
【０５２２】
表７：本明細書中の表に用いる修飾ヌクレオチド／非定型部分のコード
【表９】
0005972408.tif 000080
【０５２３】
二本鎖ＲＮＡ分子の生成に有用なｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、以下の表Ａ−１８、Ａ−１９およびＢ〜Ｅに開示する。
ｓｉＲＮＡ化合物の調製に有用なＳＥＲＰＩＮＨ１オリゴヌクレオチド配列
表Ａ−１８：
【表１０−１】
0005972408.tif 000081
【０５２４】
【表１０−２】
0005972408.tif 000082
【０５２５】
【表１０−３】
0005972408.tif 000083
【０５２６】
表Ａ−１８  選択ｓｉＲＮＡ
【表１１−１】
0005972408.tif 000084
【０５２７】
【表１１−２】
0005972408.tif 000085
【０５２８】
表Ａ−１９
【表１２】
0005972408.tif 000086
【０５２９】
表Ａ−１９  選択ｓｉＲＮＡ
【表１３】
0005972408.tif 000087
【０５３０】
表Ｂ：さらなる活性な１９ｍｅｒ  ＳＥＲＰＩＮＨ１  ｓｉＲＮＡ
【表１４−１】
0005972408.tif 000088
【０５３１】
【表１４−２】
0005972408.tif 000089
【０５３２】
【表１４−３】
0005972408.tif 000090
【０５３３】
【表１４−４】
0005972408.tif 000091
【０５３４】
【表１４−５】
0005972408.tif 000092
【０５３５】
【表１４−６】
0005972408.tif 000093
【表１４−７】
0005972408.tif 000094
【表１４−８】
0005972408.tif 000095
【０５３６】
表Ｃ：種交差性の１９ｍｅｒ  ＳＥＲＰＩＮＨ１  ｓｉＲＮＡ
【表１５−１】
0005972408.tif 000096
【０５３７】
【表１５−２】
0005972408.tif 000097
【０５３８】
【表１５−３】
0005972408.tif 000098
【０５３９】
【表１５−４】
0005972408.tif 000099
【０５４０】
【表１５−５】
0005972408.tif 000100
【０５４１】
【表１５−６】
0005972408.tif 000101
【０５４２】
【表１５−７】
0005972408.tif 000102
【表１５−８】
0005972408.tif 000103
【表１５−９】
0005972408.tif 000104
【表１５−１０】
0005972408.tif 000105
【表１５−１１】
0005972408.tif 000106
【０５４３】
表Ｄ：ＳＥＲＰＩＮＨ１の活性な１８＋１ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ
【表１６−１】
0005972408.tif 000107
【０５４４】
【表１６−２】
0005972408.tif 000108
【０５４５】
【表１６−３】
0005972408.tif 000109
【０５４６】
【表１６−４】
0005972408.tif 000110
【０５４７】
【表１６−５】
0005972408.tif 000111
【０５４８】
【表１６−６】
0005972408.tif 000112
【０５４９】
【表１６−７】
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【０５５０】
【表１６−８】
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【０５５１】
【表１６−９】
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【０５５２】
【表１６−１０】
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【０５５３】
【表１６−１１】
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【０５５４】
【表１６−１２】
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【０５５５】
【表１６−１３】
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【０５５６】
【表１６−１４】
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【表１６−１５】
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【表１６−１６】
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【表１６−１７】
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【表１６−１８】
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【表１６−１９】
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【表１６−２０】
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【表１６−２１】
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【０５５７】
表Ｅ：ＳＥＲＰＩＮＨ１の種交差性の１８＋１ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ
【表１７−１】
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【０５５８】
【表１７−２】
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【０５５９】
【表１７−３】
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【０５６０】
【表１７−４】
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【表１７−５】
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【表１７−６】
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【０５６１】
例１０
動物モデル
線維性状態のモデル系
本発明の活性なｓｉＲＮＡの試験は、予測動物モデルで行うことができる。腎線維症のラット糖尿病およびエイジングモデルは、Zucker糖尿病肥満（ＺＤＦ）ラット、老齢ｆａ／ｆａ（肥満Zucker）ラット、老齢Sprague-Dawley（ＳＤ）ラットおよびGoto Kakizaki（ＧＫ）ラットを含む。ＧＫラットは、Wisterラットに由来し、ＮＩＤＤＭ（ＩＩ型糖尿病）の自然発生について選択された近交系である。腎線維症の誘導モデルは、健康な非糖尿病動物に生じる急性間質性線維症のモデルである、恒常的片側性尿管閉塞（ＵＵＯ）モデルを含み、腎線維症は、閉塞後で数日のうちに発症する。腎線維症の別の誘導モデルは、５／６腎摘出術である。
【０５６２】
以下の引用で記述されて、ラットにおける肝線維症の２つのモデルは、以下の参考文献に記載の、偽手術を対照とする胆管結紮（ＢＤＬ）と、オリーブ油給餌動物を対照とするＣＣｌ４中毒である：Lotersztajn S, et al Hepatic Fibrosis: Molecular Mechanisms and Drug Targets. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2004 Oct 07、Uchio K, et al., Down-regulation of connective tissue growth factor and type I collagen mRNA expression by connective tissue growth factor antisense oligonucleotide during experimental liver fibrosis. Wound Repair Regen. 2004 Jan-Feb;12(1):60-6、Xu XQ, et al., Molecular classification of liver cirrhosis in a rat model by proteomics and bioinformatics Proteomics. 2004 Oct;4(10):3235-45。
【０５６３】
眼の瘢痕形成に関するモデルは、当該技術分野において周知であり、例えば、Sherwood MB et al., J Glaucoma. 2004 Oct;13(5):407-12. A new model of glaucoma filtering surgery in the rat、Miller MH et al., Ophthalmic Surg. 1989 May;20(5):350-7. Wound healing in an animal model of glaucoma fistulizing surgery in the Rb、vanBockxmeer FM et al., Retina. 1985 Fall-Winter; 5(4): 239-52. Models for assessing scar tissue inhibitors、Wiedemann P et al., J Pharmacol Methods. 1984 Aug; 12(1): 69-78. Proliferative vitreoretinopathy: the Rb cell injection model for screening of antiproliferative drugsなどがある。
【０５６４】
白内障のモデルは、以下の出版物に記載されている：The role of Src family kinases in cortical cataract formation. Zhou J, Menko AS.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002 Jul;43(7):2293-300、Bioavailability and anticataract effects of a topical ocular drug delivery system containing disulfiram and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin on selenite-treated rats. Wang S, et al. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=15370367 Curr Eye Res. 2004 Jul;29(1):51-8、および Long-term organ culture system to study the effects of UV-A irradiation on lens transglutaminase. Weinreb O, Dovrat A.; Curr Eye Res. 2004 Jul;29(1):51-8。
【０５６５】
表Ａ−１８および表Ａ−１９の化合物は、これらの線維性状態のモデルで試験し、そこにおいて、これらが肝線維症および他の線維性状態の処置に効果的であることが明らかになる。
【０５６６】
緑内障のモデル系
本発明の活性なｓｉＲＮＡの緑内障の処置または予防に関する試験は、例えば、Maeda, K. et al., “A Novel Neuroprotectant against Retinal Ganglion Cell Damage in a Glaucoma Model and an Optic Nerve Crush Model in the rat”, Investigative Ophthalmology and visual Science (IOVS), March 2004, 45(3)851に記載の、視神経挫滅ラット動物モデルで行う。具体的には、視神経切断のために、麻酔下ラットの眼窩の視神経（ＯＮ）を眼窩上アプローチで露出し、髄膜を切断し、篩板から２ｍｍのＯＮ内の全ての軸索を、１０秒間鉗子で挫滅することにより切断する。
【０５６７】
本明細書に開示される核酸分子は、この動物モデルで試験し、結果は、これらのｓｉＲＮＡ化合物が緑内障の処置および／または予防に有用であることを示す。
【０５６８】
ラット視神経挫滅（ＯＮＣ）モデル：硝子体内ｓｉＲＮＡ送達および点眼送達
視神経切断のために、麻酔下ラットの眼窩の視神経（ＯＮ）を眼窩上アプローチで露出し、髄膜を切断し、篩板から２ｍｍのＯＮ内の全ての軸索を、１０秒間鉗子で挫滅することにより切断する。
【０５６９】
ｓｉＲＮＡ化合物を、点眼液として５μｌの容量（１０μｇ／μｌ）で、単独でまたは組合せて送達する。視神経圧挫（ＯＮＣ）の直後に、２０μｇ／１０μｌの試験ｓｉＲＮＡまたは１０μｌのＰＢＳを、成体Wisterラットの片方または両方の眼に投与し、注入の５時間後および１日後、および、より遅い２日後、４日後、７日後、１４日後および２１日後に切除し、急速凍結した全網膜から取り出したｓｉＲＮＡのレベルを決定する。類似した実験を、点眼を介して投与したｓｉＲＮＡの活性および有効性を試験するために行う。
【０５７０】
ラットにおける肺移植後の虚血再灌流損傷のモデル系
肺虚血／再灌流損傷を、Mizobuchi et al., The Journal of Heart and Lung Transplantation, Vol 23 No. 7 (2004)およびKazuhiro Yasufuku et al., Am. J. Respir. Cell Mol Biol, Vol 25, pp 26-34 (2001)に記載のラット動物モデルにおいて達成する。
【０５７１】
具体的には、イソフルランで麻酔を誘導した後、気管を１４ゲージテフロンカテーテルでカニューレし、ラットを、毎分７０回の速度および２ｃｍ  Ｈ２Ｏの呼気終末陽圧にて、１００％の酸素を用いた齧歯動物用ベンチレータで機械的に換気する。左肺動脈、静脈および主気管支をCastanedaクランプで閉塞する。術中、肺を食塩水で湿性にし、蒸発損失を最小にするために、切開をカバーする。虚血の期間は、６０分の長さである。虚血期間の終わりにクランプが取り外し、肺虚血誘発後、さらに４時間、２４時間および５日、肺を換気および再灌流させる。実験終了後、肺を慎重に採取し、ＲＮＡ抽出のために凍結するか、または、その後の組織学的分析のためにグルタールアルデヒドカクテルで固定する。
【０５７２】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）のモデルとしてのブレオマイシン動物モデル
健康マウスおよびブレオマイシン処置マウスへのｓｉＲＮＡ−ビタミンＡコートソーム（Coatsome）複合体の静脈内注射および気管内投与により、ビタミンＡコートソーム製剤化ｓｉＲＮＡの肺および肝臓への送達の実現可能性を試験する。
【０５７３】
目的：正常および線維性マウス肺へのビタミンＡコートソーム製剤化ｓｉＲＮＡの送達の実現可能性を、２種の投与経路について試験する。本研究において試験する主要な仮説は、ビタミンＡコートソーム製剤化修飾ｓｉＲＮＡの全身投与が、線維性および正常マウス肺における効率的な取込みおよび細胞特的な分布をもたらすか否かである。ビタミンＡコートソーム製剤化修飾ｓｉＲＮＡの気管内経路を並行して試験する。肺および肝臓におけるｓｉＲＮＡの検出および細胞特異的な分布は、in situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によって行う。
【０５７４】
背景：肺線維症のブレオマイシンモデルは過去３０年にわたって十分に開発され、特徴づけられている（Moeller, et al. Int J Biochem Cell Biol, 40:362-382, 2008、 Chua et al., Am J Respir Cell Mol Biol 33:9-13, 2005）。組織学的特徴、例えば肺胞内肉芽、コラーゲンの壁在および肺胞腔の閉塞は、ＩＰＦ患者と同様にＢＬＭ処置を受けた動物に存在する。初期の研究は、Ｃ５７／Ｂｌマウスが一貫してＢＬＭ誘導性肺線維症を生じやすい一方、Ｂａｌｂ／Ｃマウスが遺伝的に抵抗性であることを示した。投与経路に応じて、異なる線維化パターンが発症する。ＢＬＭの気管内注入は気管支中心性の増強された線維症をもたらす一方、静脈内または腹膜内投与はヒト疾患に類似した胸膜下瘢痕形成を誘発する（同Chua et al）。通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）のマウスモデルを用いる。このモデルは、不均一な分布の線維性増殖（fibroproliferation）を示し、それは主に胸膜下に分布し、特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者の肺で観察されるのと同様の病変を形成する（Onuma, et al., Tohoku J Exp Med 194: 147-156, 2001およびYamaguchi and Ruoslahti, Nature 336: 244-246, 1988）。ＵＩＰは、マウス肺における胸膜下の線維性増殖の持続的な組成のために、ブレオマイシンを１日おきに７日間腹腔内投与することにより誘発される（Swiderski et al. Am J Pathol 152: 821-828, 1998およびShimizukawa et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 284: L526-L532, 2003）。
【０５７５】
以前に示されたとおり、ｓｉＲＮＡを含むビタミンＡ負荷リポソームは、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）と相互作用し、ＲＢＰレセプターを介して肝星細胞への効果的な送達をもたらす（Sato et al. Nat Biotechnol 26:431-442, 2008）。この研究は、ｖｉｔＡ−コートソーム−ｓｉＲＮＡ複合体が、ブレオマイシン処置マウスの肺におけるＲＢＰレセプターを発現する活性化筋線維芽細胞に効率的に取り込まれるかを試験するために計画する。さらに、局所投与ルート（気管内注入）を試験する。
【０５７６】
一般的な実験デザイン
マウス：Ｃ５７  Ｂｌ、雄性
開始Ｎ（ＢＬＭ  Ｉ．Ｐ.）：４０（最初のパイロット群用に６頭、実験用に３４頭、予想される２５％の死亡率を考慮）
開始Ｎ（合計）：６０頭
試験ｓｉＲＮＡ：本明細書に開示されるＳＥＲＰＩＮＨＩ化合物。
【表１８】
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【０５７７】
ブレオマイシン誘導性肺線維症。１２週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺線維症を、０．１ｍｌの生理食塩水に溶解した０．７５ｍｇ／ｋｇ体重の塩酸ブレオマイシンを、１日おきに７日間、０、２、４および６日に腹腔内注入することにより誘導する。
【０５７８】
モデルのフォローアップおよびモニタリング。マウスを、ＢＬＭ処置の前と、毎実験期間中毎週２回体重測定する。
【０５７９】
線維症確立のパイロット評価。マウス（Ｎ＝３０）を、最初に処置した群（Ｎ＝５）と、残りの動物との間に１週間の時間差を生じさせるために、複数の群でＢＬＭ処置に供する。第１４日に、最初の群からの２頭のマウスを致死させ、迅速（fast）ＨＥ染色および線維化の迅速な組織病理学的評価のために、肺を採取する。肺線維症が確認されたら、残りのラットを複数の群に分け、最初のＢＬＭ処置後第１４日にｓｉＲＮＡで処置する。第１４日までに肺で十分な線維化が進行しない場合は、最初に処置した群からの残りのマウスを第２１日に致死させ、次いで線維化の迅速な組織病理学的評価を行う。残りの動物は、ＢＬＭ処置後第２１日から試験ｓｉＲＮＡ複合体で処置する。
【０５８０】
ｓｉＲＮＡ投与。最初のＢＬＭ投与後第１４日または第２１日に（線維症確立のパイロット評価に基づき、実験中に決定）、動物を体重に従って群に分ける。第１群および第２群からの動物に、４．５ｍｇ／ｋｇ体重のｓｉＲＮＡ濃度で、ｓｉＲＮＡ／ｖｉｔＡ／コートソーム複合体を静脈内投与（尾静脈注射）する。同齢の無処置の動物（第５群および第６群）を同様に処置する。ＢＬＭ処置動物（第９群）を、ｖｉｔＡコートソームビヒクル対照として用いる。２４時間後に、上記のとおりの注射を全ての動物に繰り返す。
【０５８１】
第３群および第４群からのＢＬＭ動物と、第７群および第８群からの無処置マウスとをイソフルランで麻酔し、ｖｉｔＡ負荷リポソームで製剤化した２．２５ｍｇ／ｋｇ体重のｓｉＲＮＡの気管内注入に供する。ＢＬＭ群１０からのマウスには、ｖｉｔＡ／コートソームビヒクルのみを投与する。気管内注入を２４時間後に繰り返す。
【０５８２】
実験の終了。第１、３、５、７、９群からの動物を、２回目のｓｉＲＮＡ複合体の注射または注入の２時間後に致死させる。第２、４、６、８、１０群からの動物は、２回目のｓｉＲＮＡ複合体の注射または注入の２４時間後に致死させる。
【０５８３】
動物を致死させた後、マウスを１０％中性緩衝ホルマリンで経心臓的に灌流する。肺を０．８〜１．０ｍｌの１０％ＮＢＦで膨張させ、気管を結紮する。肺を切除し、１０％ＮＢＦで２４時間固定する。肝臓を各々の動物から採取し、２４時間１０％ＮＢＦで固定する。
【０５８４】
切片作製および評価。それに伴うセクションは、肺および肝臓から連続切片を調製する。第１の連続切片は、肺および肝臓の形態学的評価のためにヘマトキシリン−エオジンで染色し、第２の切片は、コラーゲンを同定するためにシリウスレッド（トリクローム）で染色し、第３の連続切片は、ｓｉＲＮＡの検出のためにin situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に供する。
【０５８５】
本明細書に記載の化合物をこの動物モデルで試験し、結果は、これらのｓｉＲＮＡ化合物が肺線維症の処置および／または予防に有用であることを示す。
【０５８６】
【表１９−２】
0005972408.tif 000135
【０５８７】
【表１９−３】
0005972408.tif 000136
【０５８８】
【表１９−４】
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【０５８９】
本明細書で言及または引用した論文、特許および特許出願、および他の全ての文書および電子的に利用可能な情報の内容は、その全体が同程度に、あたかも各々の個々の公表物が、参照により援用されるよう具体的かつ個々に指示されたかのように、参照により本明細書に援用される。
【０５９０】
出願人は、この出願に、あらゆるかかる論文、特許、特許出願、または他の物理的および電子的文書から、任意のおよび全ての資料および情報を、物理的に組み込む権利を保有する。
【０５９１】
様々な置換および改変が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示される発明になされ得ることは、当業者において明白である。したがって、かかるさらなる態様は、本発明および以下の請求の範囲の範囲内である。本発明は、当業者に、本明細書に記載の化学修飾の種々の組合せおよび／または置換を、ＲＮＡｉ活性を誘導するために改善された活性を有する核酸構築物を生成する目的で試験することを教示する。かかる改善された活性は、改善された安定性、改善された生体利用能、および／または、ＲＮＡｉを誘導する細胞反応の改善された活性化を含んでもよい。したがって、本明細書に記載の具体的態様は限定的ではなく、当業者は、改善されたＲＮＡｉ活性を有する核酸分子を同定する目的で、本明細書に記載の具体的な修飾の組合せを、過度な実験なしに試験し得ることを容易に認識することができる。
【０５９２】
本明細書に例示的に記載した発明は、本明細書に具体的に開示されていないあらゆる１または２以上の要素、１または２以上の限定なしに、好適に実施することができる。したがって、例えば、発明の記載するという文脈（特に以下の請求の範囲の文脈）における用語「a」および「an」および「the」および類似の指示語は、本明細書に別記されているか、文脈から明らかに矛盾しないかぎり、単数および複数の両方をカバーするものとする。用語「含む」、「有する」、「包含する」、「含有する」などは、拡張的に、限定なしに（例えば、「限定されずに含む」の意味に）解釈すべきである。本明細書における数値範囲の記載は、本明細書に別記されない限り、単にこの範囲内に属する各々の個々の数値を個別に指す省略法として機能することを意図するものであり、各々の個々の数値は、あたかもそれが本明細書に個々に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に別記されているか、文脈から明らかに矛盾しないかぎり、あらゆる好適な順序で行うことができる。本明細書において提供される、あらゆるおよび全ての例、または例示的文体（例えば、「例えば．．．など」）は、単に発明をよりよく明らかにすることを意図したものであり、請求の範囲に別記されない限り、発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の言葉は、請求の範囲に記載されていない要素が、発明の実施に必須であることを示しているように解してはならない。さらに、本明細書で利用されている用語および表現は、限定の用語としてではなく、説明の用語として用いており、かかる用語および表現の使用において、示され、記載された特徴またはその部分の任意の均等物を除外する意図はないが、請求の範囲に記載された発明の範囲内で、様々な改変が可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい態様および任意の特徴によって具体的に開示されているが、当業者はそこに具現された本明細書に開示されている発明の改変物および変更物を採用することができ、そして、かかる改変物および変更物は、本発明の範囲内とみなされることを理解すべきである。
【０５９３】
本発明は、本明細書に広く、一般的に記載されている。一般的な開示の範囲に属する各々の狭い種（species）および亜属の（subgeneric）群もまた、本発明の一部を形成する。これは、属から任意の主題を取り除く但書または否定的限定を有する発明の一般的記載を含み、それは切り取られたものが本明細書に具体的に記載されているか否かとは無関係である。他の態様は以下の請求の範囲の範囲内である。さらに、発明の特徴または側面がマーカッシュ群の観点で記載されている場合、当業者は、発明がまた、それによって、マーカッシュ群の任意の個別の成員または成員の亜群に関しても記載されていることを認識する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【配列表】
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