(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効な量の、シス‐イミダゾリン骨格を含むｐ５３アゴニスト化合物を含む、虚血／再灌流障害から保護するための薬剤であって、
前記シス‐イミダゾリン骨格を含むｐ５３アゴニスト化合物が、Ｃａｙｌｉｎ２およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選択される、薬剤。
【請求項２】
前記虚血／再灌流障害が、虚血性梗塞、虚血性梗塞の治療、ならびに臓器移植における虚血および再灌流の期間、からなる群より選択される少なくとも１つの間に生じる組織損傷である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記虚血／再灌流障害が、脳梗塞、心筋梗塞および肺梗塞からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１または請求項２に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血／再灌流障害から保護するための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｕｔｌｉｎ３ａはＭｄｍ２阻害剤であり、Ｎｕｔｌｉｎ３ａには、細胞周期制御、ＤＮＡ修復およびアポトーシスなどの種々の生物学的プロセスに関与する腫瘍抑制因子であるｐ５３を安定化する効力がある（例えば米国特許第７７０５００７号およびＳｃｉｅｎｃｅ（２００４）３０３、８４４‐８４８参照）。
【０００３】
Ｃａｙｌｉｎ２は、２つのフェニル環上の塩素がトリフルオロメチル基に置換された、Ｎｕｔｌｉｎ‐３類似体である。
ｐ５３は、すべてのヒト腫瘍の半数以上で変異または欠失している腫瘍抑制因子である。ｐ５３の生理学的役割は、細胞周期チェックポイントを形成したり、ＤＮＡ修復、アポトーシスおよびエネルギー代謝において機能したりと、多方面にわたる（Ｎａｔｕｒｅ（２００９）４５８：１１２７‐１１３０）。複数の部位におけるリン酸化およびそれに続くプロテアソーム分解がｐ５３タンパク質レベルの制御において重要である、ということが示されている（Ｃｅｌｌ（２００９）１３７；６０９‐６２２）。ｐ５３の分解において必要なｐ５３ユビキチン化は、Ｍｄｍ２、Ｐｉｒｈ２およびＣｏｐ１などのいくつかのユビキチンリガーゼによって触媒される（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．（２０１０）１７；８６‐９２）。特に、Ｍｄｍ２によるｐ５３の制御機構はよく解析されている。ｐ５３産生能を有する腫瘍細胞では、ｐ５３の強力な安定化によって、アポトーシスを誘導することが可能であった（Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５２；３４５‐３４７）ため、Ｍｄｍ２の阻害を介したｐ５３の安定化は、がん治療の魅力的な戦略の１つである。最近では、例えばＮｕｔｌｉｎ３ａおよびＭＩ‐２１９などの低分子化合物が、細胞透過性Ｍｄｍ２アンタゴニストとして働き（Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）３０３；８４４‐８４８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００８）１０５；３９３３‐３９３８）、また、それらの類似体が、抗がん治療のための前臨床開発または初期臨床試験まで進んでいることが報告されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（２００９）４９；２２３‐２４１）。ｐ５３は抗酸化および抗炎症関連遺伝子を上方制御する（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２００５）１１；１３０６‐１３１３、ＦＡＳＥＢ  Ｊ（２００５）１９；１０３０‐１０３２）ので、ｐ５３は、抗酸化および抗炎症性応答を介してＩ／Ｒ誘導性細胞傷害から保護する可能性を有する。
【０００４】
Ｐａｒｐ１は、翻訳後タンパク質修飾であるポリ（ＡＤＰリボシル）化を触媒する主要な酵素である。複製、ＤＮＡ修復および細胞死に関与する（Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．（２００５）６２、７６９‐７８３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．（２００７）９８、１５２８‐１５３５）。Ｐａｒｐ１は、ＤＮＡ切断により劇的に活性化され、次いで、ＤＮＡ修復因子の当該遺伝子座への効率的な動員に必要な、ＤＮＡ損傷領域中の基質タンパク質のポリ（ＡＤＰリボシル）化を触媒する（Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）２３、５９１９‐５９２７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００７）３５、７６６５‐７６７５）。他方では、Ｐａｒｐ１の過剰活性化は、細胞ＮＡＤ＋およびＡＴＰレベルを減少させ、その結果として、エネルギー代謝の破綻により引き起こされる壊死性細胞死をもたらす（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９９）９６、１３９７８‐１３９８２、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）１９、５１２４‐５１３３）。Ｐａｒｐ１の炎症反応への関与についても報告されている。虚血／再灌流誘導性Ｐａｒｐ１過剰活性化は、活性酸素種の産生によって仲介され、また、ＮＦ‐ｋＢのトランス活性化に関与する（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００８）１７３、２‐１３）。なお、全長Ｐａｒｐ１はアポトーシスプロテアーゼであるカスパーゼ‐３および‐７によって、アポトーシスの間に、ｐ８５およびｐ２５断片へと切断されるため、Ｐａｒｐ１は、アポトーシスの有用な証明としても特徴づけられている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３、３９７６‐３９８５、Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７１、３４６‐３４７）。したがって、Ｐａｒｐ１は、がん化学療法および虚血／再灌流障害からの保護の魅力的な標的であり、いくつかのＰａｒｐ１阻害剤は、臨床試験において評価されている（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１０）５３、４５６１‐４５８４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、虚血／再灌流障害から保護するための薬剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様には、以下が含まれる。
【０００７】
＜１＞  治療上有効な量の、シス‐イミダゾリン骨格を含むｐ５３アゴニスト化合物を含む、虚血／再灌流障害から保護するための薬剤であって、
前記シス‐イミダゾリン骨格を含むｐ５３アゴニスト化合物が、Ｃａｙｌｉｎ２およびその薬学的に許容可能な塩からなる群より選択される、薬剤。
【０００９】
＜２＞  前記虚血／再灌流障害が、虚血性梗塞、虚血性梗塞の治療、ならびに臓器移植における虚血および再灌流の期間、からなる群より選択される少なくとも１つの間に生じる組織損傷である、＜１＞に記載の薬剤。
【００１０】
＜３＞  前記虚血／再灌流障害が、脳梗塞、心筋梗塞および肺梗塞からなる群より選択される少なくとも１つである、＜１＞または＜２＞に記載の薬剤。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｎｕｔｌｉｎ３ａは哺乳類細胞株においてＰａｒｐ１タンパク質レベルの減少を誘導するが、Ｃｐｔは誘導しない、ということを示す。マウス線維芽細胞３Ｔ３‐Ｌ１（上パネル）または３Ｔ３‐Ｆ４４２Ａ（下パネル）細胞を、表示されている濃度のＣｐｔまたはＮｕｔｌｉｎ３ａで２４時間処理した。その細胞溶解物を、表示されている抗体を用いて、ウエスタンブロットにより解析した。ＬＥは、長時間曝露（ｌｏｎｇ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ）を意味する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａからの定量的データである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、３Ｔ３‐Ｌ１または３Ｔ３‐Ｆ４４２Ａ細胞を、２５μＭのＮｕｔｌｉｎ３ａで表示されている時間の間処理した、ということを示す。タンパク質をウエスタンブロットに供した。ｐ５３のパネルにおいては、矢印および星印は、それぞれ、ｐ５３および非特異的バンドを示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、３種類のヒト細胞株（Ｕ２ＯＳ、Ａ５４９およびＨｅｐＧ２）を、表示されている濃度のＣｐｔまたはＮｕｔｌｉｎ３ａで２４時間処理した、ということを示す。その細胞溶解物を、表示されている抗体を用いて、ウエスタンブロットにより解析した。  すべての実験は、少なくとも３回行われ、代表的なデータが示されている。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｎｕｔｌｉｎ３ａにより誘導されるＰａｒｐ１タンパク質レベルの減少はｐ５３の状態に依存的である、ということを示す。ｓｈＧＦＰおよびｓｈｐ５３が一過性にトランスフェクションされた３Ｔ３‐Ｌ１。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｐ５３ノックアウトマウス由来のマウス線維芽細胞株であるＨＷ、およびｐ５３安定ノックダウン細胞株である３Ｔ３‐Ｌ１／ｓｈｐ５３を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ｐ５３＋／＋（ｎ＝２）およびｐ５３−／−（ｎ＝３）ＭＥＦを、表示されている濃度のＮｕｔｌｉｎ３ａで２４時間処理した、ということを示す。その細胞溶解物を、表示されている抗体を用いて、ウエスタンブロットにより解析した。ｐ５３のパネルにおいては、矢印および星印は、それぞれ、ｐ５３および非特異的バンドを示す。  すべての実験は、少なくとも２回行われ、代表的なデータが示されている。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｎｕｔｌｉｎ３ａが、プロテアソーム分解によってＰａｒｐ１タンパク質レベルを下方制御する、ということを示す。Ａ、３Ｔ３‐Ｌ１、３Ｔ３‐Ｆ４４２Ａ、３Ｔ３‐Ｌ１／ｓｈｐ５３およびＨＷ細胞を、表示されている濃度のＮｕｔｌｉｎ３ａで２４時間処理した。ＲＴ‐ＰＣＲにより、Ｐａｒｐ１  ｍＲＮＡを検出した。β‐アクチンは、ローディングコントロールとして使用した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、３Ｔ３‐Ｌ１細胞および３Ｔ３‐Ｆ４４２Ａ細胞を、５μＭのプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（ＭＧ）の存在下または非存在下にて、２５μＭのＮｕｔｌｉｎ３ａで８時間処理し、次いで、その細胞溶解物を、表示されている抗体を用いて、ウエスタンブロットに供した、ということを示す。  すべての実験は、少なくとも３回行われ、代表的なデータが示されている。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｃａｙｌｉｎ２は哺乳類細胞株においてＰａｒｐ１タンパク質レベルの減少を誘導するが、Ｎｕｔｌｉｎ‐３ｂは誘導しない、ということを示す。マウス線維芽細胞３Ｔ３‐Ｌ１（上パネル）または３Ｔ３‐Ｆ４４２Ａ（下パネル）を、表示されている濃度のＮｕｔｌｉｎ３ａ、Ｎｕｔｌｉｎ３ｂまたはＣａｙｌｉｎ２で８時間処理した。その細胞溶解物を、表示されている抗体を用いて、ウエスタンブロットにより解析した。ｐ５３のパネルにおいては、矢印および星印は、それぞれ、ｐ５３および非特異的バンドを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａからの定量的データである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、３Ｔ３‐Ｌ１細胞を、表示されている濃度のＣａｙｌｉｎ２で８時間処理した、ということを示す。細胞死の割合を、トリパンブルー染色によって解析した。  すべての実験は、少なくとも３回行われ、代表的なデータが示されている。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｃａｙｌｉｎ２により誘導されるＰａｒｐ１タンパク質レベルの減少はｐ５３の状態に依存的である、ということを示す。ｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＭＥＦを、表示されている濃度のＣａｙｌｉｎ２で８時間処理した。その細胞溶解物を、表示されている抗体を用いて、ウエスタンブロットにより解析した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａからの定量的データである。２〜３クローンづつのｐ５３＋／＋およびｐ５３−／−ＭＥＦが解析され、代表的なデータが示されている。
【図６Ａ】図６Ａは、３Ｔ３‐Ｌ１細胞を、表示されている時間の間、２０μＭのＣａｙｌｉｎ２で処理した、ということを示す。タンパク質をウエスタンブロットに供した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、３Ｔ３‐Ｌ１細胞を、５μＭのプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（ＭＧ）の存在下または非存在下にて、２０μＭのＣａｙｌｉｎ２で８時間処理し、次いで、その細胞溶解物を、表示されている抗体を用いて、ウエスタンブロットに供した、ということを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、治療上有効な量の、シス‐イミダゾリン骨格を含むｐ５３アゴニスト化合物を含む、虚血／再灌流障害から保護するための薬剤を提供する。
【００２１】
Ｎｕｔｌｉｎ３ａを使って、我々は、ＤＮＡ損傷応答に無関係なｐ５３機能を解析し、そして、Ｎｕｔｌｉｎ３ａで処理した細胞ではＰａｒｐ１タンパク質が消失する、ということを偶然発見した。この研究において、我々は、Ｎｕｔｌｉｎ３ａ仲介性Ｐａｒｐ１タンパク質分解の基礎的な特徴を示し、また、治療および虚血／再灌流障害からの保護のためのＰａｒｐ１阻害剤としてのＮｕｔｌｉｎ３ａの使用について検討する。
【００２２】
ここで、我々は、哺乳類細胞におけるＮｕｔｌｉｎ３ａ処理が、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ１（Ｐａｒｐ１）のタンパク質レベルを低下させる、ということを実証する。Ｐａｒｐ１は、ＤＮＡ修復、複製および転写において機能し、また、抗がん治療および虚血／再灌流障害からの保護のための標的分子と考えられてきた。この研究において、まず、我々が発見したのは、カンプトテシン（Ｃｐｔ）およびシスプラチンなどのＤＮＡ損傷剤ではなく、Ｎｕｔｌｉｎ３ａが、Ｐａｒｐ１タンパク質レベルの減少を誘導した、ということであった。この減少は、細胞死を伴わず、また、ｐ５３欠損細胞では観察されなかった。次に、Ｎｕｔｌｉｎ３ａ処理では、Ｐａｒｐ１  ｍＲＮＡレベルは変わらなかったので、我々は、タンパク質分解経路がこの現象に寄与しているかもしれない、と予想した。最後に、我々は、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２が、Ｐａｒｐ１タンパク質のレベルのＮｕｔｌｉｎ３ａ誘導性減少を阻害する、ということを発見した。これらの結果は、Ｎｕｔｌｉｎ３ａが、ｐ５３依存的に、Ｐａｒｐ１のプロテアソーム分解を誘導する、ということを示している。我々の発見は、治療および虚血／再灌流障害からの保護のためのＰａｒｐ１阻害剤としてのＮｕｔｌｉｎ３ａの新規の使用をもたらすであろう。
【００２３】
以下に、本発明を詳細に説明する。構成要素についての下記の記載が、本発明の代表的な実施形態に言及するものであることがあるが、本発明は、これら実施形態に決して限定されるものではない。
本発明において用いられている「虚血／再灌流障害」という語は、Ｐａｒｐ１タンパク質の活性の増加により引き起こされる障害を指す。当該障害の具体例としては、脳梗塞、心筋梗塞および肺梗塞などの虚血性梗塞、そうした梗塞の治療に伴う再灌流障害、ならびに臓器移植の間の血管結紮および再灌流により引き起こされる組織損傷が挙げられる。
本発明において用いられている「ｐ５３アゴニスト化合物」という語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでｐ５３タンパク質蓄積を誘導する効力を有する化合物を指す。シス‐イミダゾリン骨格を含むｐ５３アゴニスト化合物の具体例としては、Ｎｕｔｌｉｎ３ａ、Ｃａｙｌｉｎ２、Ｃａｙｌｉｎ１およびその薬剤的に許容できる塩が挙げられる。
本発明においては、シス‐イミダゾリン骨格を含むｐ５３アゴニスト化合物は、好ましくは、Ｎｕｔｌｉｎ３ａ、Ｃａｙｌｉｎ２およびその薬剤的に許容できる塩からなる群より選択される。
【実施例】
【００２４】
以下に、本発明の実施例を説明する。しかしながら、本発明は、これら実施例によって限定されるものではない。下記の記載において、「％」は、別途記載がない限り、質量を基準とする。
【００２５】
実験手順
【００２６】
細胞培養および薬剤
【００２７】
マウス線維芽細胞株３Ｔ３‐Ｌ１、ヒト肺がん細胞株Ａ５４９およびヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（日本）から購入した。マウス線維芽細胞株３Ｔ３‐Ｆ４４２Ａおよびヒト骨肉腫細胞株Ｕ２ＯＳは、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・ カルチャーズ（英国）から購入した。ｐ５３欠損マウス由来の線維芽細胞株ＨＷ（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１０）５３、４５６１‐４５８４）は、親切にも斉藤昌之博士（天使大学、日本）によって提供された。これらの細胞は、１０％（３Ｔ３‐Ｌ１、３Ｔ３‐Ｆ４４２Ａ、ＨＷ、Ｕ２ＯＳおよびＨｅｐＧ２）または５％（Ａ５４９）ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ社）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（低グルコース）（和光、日本）中で維持した。ＣｐｔおよびＭＧ１３２は、和光（日本）から購入した。Ｎｕｔｌｉｎ３ａ、Ｎｕｔｌｉｎ３ｂおよびＣａｙｌｉｎ２は、Ｃａｙｍａｎ社（米国）により供給された。ｐ５３ノックダウンはｓｈＲＮＡによる
【００２８】
我々は、効果的なｐ５３ノックダウンのために、標的配列に基づいて、以前報告された通り（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００３）２７８、１１７３１‐１１７３４）、マウスｐ５３  ｓｈＲＮＡ発現ベクターを設計した。２種類のオリゴヌクレオチド、５’‐ｇａｔｃｃｃｃＧＴＡＣＧＴＧＴＧＴＡＧＴＡＧＣＴＴＣｔｔｃａａｇａｇａＧＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣＡＣＡＴＧＴＡＣｔｔｔｔｔｇｇａａａ‐３’（配列番号１）および５’‐ａｇｃｔｔｔｔｃｃａａａａａＧＴＡＣＡＴＧＴＧＴＡＡＴＡＧＣＴＣＣｔｃｔｃｔｔｇａａＧＡＡＧＣＴＡＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＡＣｇｇｇ‐３’（配列番号２）（大文字はｐ５３に対する標的配列；小文字はＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩまたはループ構造配列）は化学的に合成した（オペロンバイオテクノロジー社、米国）。アニールしたオリゴは、大野茂男博士（横浜市立大学、日本）からいただいたＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＳＵＰＥＲ‐ｐｕｒｏ  ｓｈＲＮＡ発現ベクターに直接ライゲーションした（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．（２００６）１１９、２１０７‐２１１８）。ｐＳＵＰＥＲ‐ｐｕｒｏ‐ｓｈｍｐ５３と名付けた、作成したベクターを、リポフェクタミンＬＴＸ（インビトロジェン社、米国）を用い、メーカーのプロトコルに従い、３Ｔ３‐Ｌ１細胞にトランスフェクションした。安定ｐ５３ノックダウン細胞株を求めて、トランスフェクションした細胞をピューロマイシンで選別し、耐性クローンを、クローニングシリンダーを用いて、トリプシン処理によって単離した。
【００２９】
初代マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の調製
【００３０】
ｐ５３ヘテロ接合体マウス（アクセッション番号、ＣＤＢ  ０００１Ｋ）（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９３）８、３３１３‐３３２２）は、理研ＢＲＣ（埼玉県、日本）から購入した。ｐ５３ヘテロ接合体オスおよびメスを交配し、その妊娠したメスからＭＥＦを調製した。各１３〜１５日齢の胚を子宮から取り出し、ＰＢＳで洗浄した。頭、尻尾、肢、および血液に富んだ臓器の除去後、そのトリミングされた胚を、ＰＢＳで洗浄し、細かく切り刻んだ。３７℃で１０分間トリプシン処理し、続いて、ＦＣＳの添加によりトリプシンの不活性化を行った後に、セルストレーナーを用いて濾過し、ＭＥＦを分離した。ｐ５３の状態を、以前記述されたプライマー（ｐ５３ゲノム配列に対するフォワードプライマー、５’‐ＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＴＴＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＴＡＣＡ‐３’（配列番号３）；ｐ５３ゲノム配列に対するリバースプライマー、５’‐ＡＣＴＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＡＴ‐３’（配列番号４）、ｎｅｏ配列に対するフォワードプライマー、５’‐ＧＡＡＣＣＴＧＣＧＴＧＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣＡＡＴＧ‐３’（配列番号５））（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９３）８、３３１３‐３３２２）を用いたＰＣＲによって確認し、樹立したＭＥＦは、１０％ＦＣＳ、２‐メルカプトエタノール（２‐ＭＥ）および抗生物質を含有するＤＭＥＭ高グルコース中で維持した。
【００３１】
ウエスタンブロット
【００３２】
細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、５％グリセロール）の添加により溶解し、５分間ボイルし、超音波処理した。可溶性分画のタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（ＰＩＥＲＣＥ社、米国）によりメーカーのプロトコルに従って決定し、溶解緩衝液の添加により標定した。その後に、これらのタンパク質を、それぞれ最終濃度が５％および０．０２５％となるように２‐ＭＥおよびブロモフェノールブルーに加え、５分間ボイルした。等量のタンパク質（５〜２０μｇ）を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜に転写した。これらの膜を、２．５％スキムミルクおよび０．２５％ＢＳＡが入った０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）（ＴＴＢＳ）により、室温で１時間ブロッキングし、次いで、適切な一次抗体により、４℃で一晩または室温で２時間プローブした。一次抗体として、抗Ｐａｒｐ１抗体（クローンＣ‐２‐１０、和光、日本）、抗ｐ５３抗体（クローンＡｂ‐１、カルビオケム社、米国）、抗βアクチン抗体（クローンＡＣ‐１５、シグマ社、米国）または抗カスパーゼ‐３抗体（クローン１Ｆ３、ＭＢＬ社、日本）を用いた。ＴＴＢＳでの洗浄後、これらの膜を、適切な二次抗体である、ヤギ抗マウスＩｇＧまたは抗ウサギＩｇＧのホースラディッシュペルオキシダーゼ結合Ｆ（ａｂ’）２断片（ジャクソン・イムノリサーチ社、米国）と共に、室温で１時間インキュベートした。膜をＴＴＢＳで洗浄後、これらの膜を、イムノスターＬＤ試薬（和光、日本）と共に、インキュベートした。特異的なタンパク質を、ＬＡＳ３０００（富士フイルム社、日本）で可視化し、データは、ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅソフトウェア（富士フイルム社、日本）を用いて解析した。
【００３３】
ＲＮＡ精製およびＲＴ‐ＰＣＲ
【００３４】
細胞をＲＮＡｉｓｏ  ＰＬＵＳ（タカラ社、日本）により溶解し、次いで、ＦａｓｔＰｕｒｅ  ＲＮＡキット（タカラ社、日本）を用い、メーカーのプロトコルに従って、全ＲＮＡを精製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（タカラ社、日本）およびランダムヘキサマー（タカラ社、日本）を用い、１ｍｇのＲＮＡを逆転写に供した。ＰＣＲ反応は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（インビトロジェン社、米国）およびＰａｒｐ１（フォワード、５’‐ＴＧＣＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧ‐３’（配列番号６）；リバース、５’‐ＴＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＴＡＣＣＣＡＴＴＣＣ‐３’（配列番号７））またはβ‐アクチンプライマー（フォワード、５’‐ＴＣＴＴＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＴＴＧ‐３’（配列番号８）；リバース、５’‐ＧＧＣＣＴＣＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＴＡＧ‐３’（配列番号９））を用いて、次の通りに行なった：開始工程、９４℃で１分間；増幅工程、９４℃で１分間、５２℃（Ｐａｒｐ１）または６１℃（β‐アクチン）で１５秒間、６８℃で１５秒間のサイクルを３０回（Ｐａｒｐ１）または２５回（β‐アクチン）；終了工程、６８℃で１５秒。ＰＣＲ産物を、１．８％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色し、ＬＡＳ３０００で可視化した。データは、ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅソフトウェア（富士フイルム社、日本）を用いて解析した。
【００３５】
結果
【００３６】
Ｎｕｔｌｉｎ３ａは哺乳類細胞株においてＰａｒｐ１タンパク質レベルの減少を誘導する
【００３７】
Ｎｕｔｌｉｎ３ａ処理したマウス線維芽細胞株３Ｔ３‐Ｌ１のタンパク質を解析した際に、我々は、ｐ８５およびｐ２５アポトーシス断片への切断を伴わない、全長のＰａｒｐ１タンパク質のレベルの有意な低下を観察した。興味深いことに、この条件下では、トリパンブルー色素排除試験は、この細胞が生存していることを示した（データ不掲載）が、これは、Ｐａｒｐ１タンパク質の当該低下は細胞死に無関係である、ということを示唆するものである。ｐ５３の安定化がＰａｒｐ１タンパク質の減少を誘導するかどうかを調べるために、３Ｔ３‐Ｌ１および３Ｔ３‐Ｆ４４２Ａマウス線維芽細胞を、ＤＮＡ損傷剤であるＣｐｔまたはＮｕｔｌｉｎ３ａで処理した。図１Ａおよび１Ｂに示されているように、両細胞株において、どちらの薬剤もｐ５３の安定化を誘導したが、Ｃｐｔ処理では、Ｐａｒｐ１タンパク質レベルは変わらず、Ｎｕｔｌｉｎ３ａでは、顕著に減少した。さらに、別のＤＮＡ損傷剤、シスプラチン、での処理およびｐ５３タンパク質の過剰発現は、Ｐａｒｐ１タンパク質レベルに影響しなかった（データ不掲載）。我々の以前の観察に一致して、アポトーシスの証拠であるカスパーゼ‐３活性化は、これらの条件では検出されなかった。経時的解析は、２５μＭのＮｕｔｌｉｎ３ａでの８時間の処理によってＰａｒｐ１タンパク質が少なくなった、ことを示した（図１Ｃ）。Ｎｕｔｌｉｎ３ａ誘導性Ｐａｒｐ１減少がヒト細胞において観察されるかどうかを確認するために、我々は、Ｎｕｔｌｉｎ３ａ処理した種々のヒト細胞株、Ａ５４９、Ｕ２ＯＳおよびＨｅｐＧ２を解析した。図１Ｄに示されているように、我々は、Ａ５４９細胞においてのみＮｕｔｌｉｎ３ａ誘導性のＰａｒｐ１減少を検出した。これらの結果は、特定の哺乳類細胞において、Ｎｕｔｌｉｎ３ａは、細胞死非依存的に、Ｐａｒｐ１タンパク質の低下を誘導することを示唆している。
【００３８】
Ｐａｒｐ１タンパク質のＮｕｔｌｉｎ３ａ誘導性減少はｐ５３によって仲介される
【００３９】
Ｎｕｔｌｉｎ３ａはＭｄｍ２の阻害を介してｐ５３を安定化することから、我々は、ｐ５３がＮｕｔｌｉｎ３ａ誘導性Ｐａｒｐ１低下に寄与しているかどうかを調べた。３Ｔ３‐Ｌ１細胞におけるｐ５３のｓｈＲＮＡを介した一過性ノックダウンは、Ｎｕｔｌｉｎ３ａ処理によるＰａｒｐ１の減少を減弱した（図２Ａ）。ｐ５３ノックダウン効率が十分でないため、我々は、次に、これを、２種類のｐ５３欠損細胞株を用いて解析した。３Ｔ３‐Ｌ１／ｓｈｐ５３細胞を、ｐＳＵＰＥＲ‐ｐｕｒｏ‐ｓｈｍｐ５３プラスミドベクターを用いて安定トランスフェクションにより樹立し、その後、クローン単離を行った。そのｐ５３タンパク質発現レベルは、一過性ノックダウンの場合に比べ非常に低かった。ＨＷ細胞は、ｐ５３欠損マウスに由来する線維芽細胞株である。これらの細胞株では、Ｐａｒｐ１のＮｕｔｌｉｎ３ａ誘導性減少は、有意に減弱された（図２Ｂ）。さらに、我々は、Ｎｕｔｌｉｎ３ａ誘導性Ｐａｒｐ１低下におけるｐ５３依存性を、ｐ５３＋／＋または−／−マウスに由来するマウス胚性線維芽細胞を用いることによって確認し、同様の結果を得た（図２Ｃ）。これらの結果は、Ｎｕｔｌｉｎ３ａが、ｐ５３依存的に、Ｐａｒｐ１タンパク質レベルを低下させる、ということを示している。
【００４０】
Ｎｕｔｌｉｎ３ａは、プロテアソームを介してＰａｒｐ１タンパク質を下方制御する。
【００４１】
Ｎｕｔｌｉｎ３ａ処理によるＰａｒｐ１タンパク質の減少が、そのｍＲＮＡの下方制御により引き起こされるかどうかを調べるために、ｐ５３産生能を有する細胞株（３Ｔ３‐Ｌ１および３Ｔ３‐Ｆ４４２Ａ）およびｐ５３欠損細胞株（３Ｔ３‐Ｌ１／ｓｈｐ５３およびＨＷ）を、Ｎｕｔｌｉｎ３ａで処理し、次いで、それぞれのＰａｒｐ１  ｍＲＮＡを、ＲＴ‐ＰＣＲによって解析した。ｐ５３産生能を有する細胞株およびｐ５３欠損細胞株のいずれにおいても、Ｐａｒｐ１  ｍＲＮＡは、Ｐａｒｐ１タンパク質のレベルが完全に少なくなっていたＮｕｔｌｉｎ３ａ用量においてさえ、変化しなかった（図３Ａ）。したがって、我々は、Ｎｕｔｌｉｎ３ａ誘導性Ｐａｒｐ１低下はプロテアソーム分解に関連するものであるのかもしれない、と推測した。そこで、Ｎｕｔｌｉｎ３ａ誘導性Ｐａｒｐ１低下におけるプロテアソーム阻害の効果を調べた。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２単独での処理は、Ｐａｒｐ１タンパク質の基底レベルには影響しなかったが、Ｐａｒｐ１のＮｕｔｌｉｎ３ａ誘導性低下を明らかに阻害した（図３Ｂ）。まとめると、これらの結果は、Ｎｕｔｌｉｎ３ａ処理が、Ｐａｒｐ１タンパク質のプロテアソームを介する分解を誘導した、ということを示している。
【００４２】
Ｎｕｔｌｉｎ３ａの場合と同じ方法を用いて、Ｎｕｔｌｉｎ３ｂおよびＣａｙｌｉｎ２について調べた。結果を図４Ａ〜図６Ｂに示す。
【００４３】
図４Ａおよび４Ｂに示されているように、３Ｔ３‐Ｌ１および３Ｔ３‐Ｆ４４２Ａ細胞株において、Ｎｕｔｌｉｎ３ａおよびＣａｙｌｉｎ２は、Ｐａｒｐ１タンパク質レベルを顕著に減少させ、ｐ５３タンパク質の安定化を誘導したが、Ｎｕｔｌｉｎ３ｂは誘導しなかった。これらの結果は、特定の哺乳類細胞において、Ｃａｙｌｉｎ２も、細胞死非依存的に、Ｐａｒｐ１タンパク質の低下を誘導する、ということを示唆している。興味深いことに、１００μＭのＣａｙｌｉｎ２処理は、アポトーシスの証拠であるＰａｒｐ１切断を誘導したが、２０μＭのＣａｙｌｉｎ２処理は、Ｐａｒｐ１タンパク質減少を、そのアポトーシス切断のいかなる痕跡も伴わずに、誘導した。この結果も、Ｐａｒｐ１タンパク質レベルの減少が、細胞死により引き起こされるものではない、ということを裏づけるものである。
【００４４】
さらに、我々は、Ｃａｙｌｉｎ２誘導性Ｐａｒｐ１低下におけるｐ５３依存性を、ｐ５３＋／＋または−／−マウスに由来するマウス胚性線維芽細胞を用いることによって確認し、Ｎｕｔｌｉｎ３ａ処理の結果と同様の結果を得た（図５Ａおよび５Ｂ）。これらの結果は、Ｃａｙｌｉｎ２が、ｐ５３依存的に、Ｐａｒｐ１タンパク質レベルを低下させる、ということを示している。
【００４５】
プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２単独での処理は、Ｐａｒｐ１タンパク質の基底レベルには影響しなかったが、Ｐａｒｐ１のＣａｙｌｉｎ２誘導性低下を明らかに阻害した（図６Ａおよび６Ｂ）。これらの結果は、Ｃａｙｌｉｎ２処理が、Ｐａｒｐ１タンパク質のプロテアソームを介する分解を誘導したことを示している。
【００４６】
我々は、Ｍｄｍ２阻害剤であるＮｕｔｌｉｎ３ａおよびＣａｙｌｉｎ２が、ｐ５３依存的な機構によって、Ｐａｒｐ１タンパク質の低下を誘導する、ということを実証した。興味深いことに、ＤＮＡ損傷剤（カンプトテシンおよびシスプラチン）、プロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）およびｐ５３タンパク質の過剰発現はＰａｒｐ１タンパク質の有意な低下を誘起しなかったが、これらは、すべて，Ｎｕｔｌｉｎ３ａおよびＣａｙｌｉｎ２に類似したｐ５３蓄積を誘導した。これらの結果は、Ｎｕｔｌｉｎ３ａまたはＣａｙｌｉｎ２誘導性Ｐａｒｐ１低下のプロセスにおいて、Ｍｄｍ２阻害はｐ５３蓄積よりも重要である、ということを示唆している。したがって、我々は、他の市販のＭｄｍ２阻害剤が、３Ｔ３‐Ｌ１およびＡ５４９細胞において、Ｐａｒｐ１タンパク質の低下を誘導するかどうかを調べた（データ不掲載）。しかしながら、我々は、両方の細胞においてＰａｒｐ１タンパク質の低下を誘導するＭｄｍ２阻害剤を同定することができなかった。この問題に結論を出すためには、Ｍｄｍ２ノックダウンを用いたさらなる実験の検討が必要であろう。
【００４７】
我々は、また、ＭＧ１３２が、Ｐａｒｐ１タンパク質の減少を阻害することも示した。Ｐａｒｐ１をｉｎ  ｖｉｖｏでユビキチン化することができることが報告されたが、ユビキチン化がＰａｒｐ１のプロテアソーム分解に関与するかどうかは不明である（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００８）１０４、３１８‐３２８）。我々の発見と共にまとめると、ユビキチン・プロテアソーム経路はＰａｒｐ１タンパク質の分解を直接的に制御していそうである。
【００４８】
進行中の臨床試験において評価された多くのＰａｒｐ１阻害剤（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１０）５３、４５６１‐４５８４）に比べて、我々が発見したＰａｒｐ１タンパク質の制御機構は、いくつかの利点を提供する。１つ目の利点は、Ｐａｒｐ１シグナル伝達経路の阻害剤としての作用の新規の機構である。以前に同定されたＰａｒｐ１阻害化合物のうちの大多数はタンパク質の触媒活性をブロックするので、高度に保存された触媒ドメインを有する他のＰａｒｐファミリータンパク質におけるこれらの薬剤の特異性は大きな問題である（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１０）５３、４５６１‐４５８４）。一方、Ｎｕｔｌｉｎ３ａおよびＣａｙｌｉｎ２は、Ｐａｒｐ１タンパク質分解の誘導を介して、Ｐａｒｐ１シグナル伝達を阻害する。したがって、我々は、Ｐａｒｐファミリーの中でＰａｒｐ１タンパク質に対する阻害特異性は高いであろうと予想する。いずれにせよ、他のＰａｒｐファミリータンパク質のタンパク質レベルに対するＮｕｔｌｉｎ３ａおよびＣａｙｌｉｎ２処理の効果を解析することは重要である。２つ目の利点は、その細胞種選択性である。本研究において使用された細胞株のサブセットは、Ｐａｒｐ１タンパク質の減少が観察され、Ｎｕｔｌｉｎ３ａに応答性であった（図１Ａおよび図１Ｄ）。Ｎｕｔｌｉｎ３ａが、ヒト大腸がん細胞株であるＨＣＴ１１６およびヒト骨髄性白血病細胞株であるＭＬ‐１において、２つのアポトーシス断片へのＰａｒｐ１の切断を誘導する、ということが報告されている（Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００７）５、１１３３‐１１４５、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ（２００９）８、１７１１‐１７１９）。実際に、我々は、種々の用量のＮｕｔｌｉｎ３ａで処理したＨＣＴ１１６細胞において、アポトーシス性の切断以外の、Ｐａｒｐ１タンパク質の有意な低下はみられなかった、ということを確認した（データ不掲載）。まとめると、我々は、Ｎｕｔｌｉｎ３ａまたはＣａｙｌｉｎ２誘導性Ｐａｒｐ１分解には細胞種選択性がある、と考えている。また、その臨床応用として、ＤＮＡ損傷剤との共処理を考えれば、Ｎｕｔｌｉｎ３ａおよびＣａｙｌｉｎ２は、ＤＮＡ損傷剤により引き起こされる副作用を低下させ得る。アルキル化剤がＰａｒｐ１過剰活性化を引き起こし、その結果として、ＮＡＤ＋およびＡＴＰ枯渇により引き起こされる望ましくない壊死性細胞死による重い炎症がもたらされること（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９９）９６、１３９７８‐１３９８２、Ｍｏ．ｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）１９、５１２４‐５１３３）、ならびに、Ｐａｒｐ１は炎症反応に関与するＮＦ‐κＢトランス活性化に必要であること（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００８）１７３、２‐１３）はよく知られている。したがって、Ｎｕｔｌｉｎ３ａまたはＣａｙｌｉｎ２との共処理は、Ｐａｒｐ１過剰活性化により誘導される壊死性細胞死および炎症も減弱し得る。
【００４９】
よって、シス‐イミダゾリン骨格を含むｐ５３アゴニスト化合物がＰａｒｐ１タンパク質の消失を誘導する制御機構の解明は、この現象を誘導する化合物の最適化にとって重要であり、その結果として、がんおよび虚血／再灌流障害に対する選択的化学療法戦略の確立がもたらされる。
【００５０】
本願は、２０１１年１月３１日に出願された米国出願第６１／４３７，６９２号に対する優先権の利益を主張する。その出願の内容は、本明細書において参照によりその全体が組み入れられるものとする。本明細書において言及されたすべての文献、特許出願および技術規格は、個々の文献、特許出願または技術規格が参照により組み入れられると具体的かつ個々に記載された場合と同程度に、本明細書において参照により組み入れられるものとする。
【図１Ｂ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ｂ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図５Ａ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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