(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体（Ｏ）の制御可能なシール付着のための開口領域（１０）を有し、
開口領域（１０）は、少なくとも１つの開口（１４）、および壁領域（１１）を有して形成され、壁領域（１１）は、開口（１４）を包囲して、該開口を形成する、電気生理学的測定装置（１００）のための支持体（１２）において、
壁領域（１１）は、該壁領域の内部に埋設され、制御可能な電圧源に接続された制御電極部（２０）を含み、
電気ポテンシャルが、制御可能な方法で制御電極部（２０）に付与され、それによって、少なくとも壁領域（１０）の開口（１４）に臨む内壁（１１ｉ）が、表面電荷を有して制御可能に形成されることができ、それによって、開口領域（１０）における生体（Ｏ）のシール付着が制御可能であることを特徴とする支持体。
【請求項２】
開口領域（１０）は、支持体（１２）の領域に形成され、該支持体は、上側（１２ａ）および下側（１２ｂ）を含み、
開口（１４）を形成するそれぞれの壁領域（１１）が、部分的にまたは完全に、支持体（１２）の上側（１２ａ）および／または下側（１２ｂ）に対して、突出していることを特徴とする、請求項１に記載の支持体（１２）。
【請求項３】
開口（１４）を形成する壁領域（１１）は、側面の形状で、または側面の組み合わせとして、円柱、角柱、円錐台、および／または角錐台の側面に基づいて、それぞれ形成されることを特徴とする、請求項１または２に記載の支持体（１２）。
【請求項４】
開口（１４）を形成する壁領域（１１）は、ガラス、石英ガラス、シリコーン、および炭素を含む材料の群からの材料から形成されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の支持体（１２）。
【請求項５】
制御電極部（２０）は、開口（１４）を形成する壁領域（１１）の内部で一体化された、円、またはストライプの形状の、１つまたは複数の電極素子を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の支持体（１２）。
【請求項６】
制御電極部（２０）は、開口（１４）を形成する壁領域（１１）の壁厚に対して、非対称に形成されるとともに、開口（１４）に臨む内壁（１１ｉ）に近接して配置されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の支持体（１２）。
【請求項７】
制御電極部（２０）は、金属材料、金、タンタル、白金、金−タンタル−白金、ドープされたポリシリコン、インジウムスズ酸化物、導電性有機材料、ならびに、それらの組み合わせ、および誘導体を含む材料の群の材料を含んで、または該材料から形成されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の支持体（１２）。
【請求項８】
開口（１４）の直径、および、開口（１４）を形成する壁領域（１１）の内径が、約１μｍ〜約５０μｍの範囲の値を有し、および／または
開口（１４）を形成する壁領域（１１）は、支持体（１２）の上側（１２ａ）または下側（１２ｂ）に対して、約０μｍ〜約２０μｍの範囲の高さ、または深さを有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の支持体（１２）。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の支持体（１２）を備える電気生理学的測定装置（１００）であって、
測定電極（３０）が、領域（７０）、開口（１４）の内部、または支持体（１２）の下側（１２ｂ）における領域（６０）に設けられ、
対向電極（５０）が、開口（１４）の外側、および支持体（１２）の上側（１２ａ）の領域（４０）に設けられることを特徴とする、電気生理学的測定装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の電気生理学的測定装置を使用する電気生理学的測定方法であって、
測定されるべき生体（Ｏ）が開口（１４）に付着され、その後、電気生理学的に測定され、
開口領域（１０）の開口（１４）上への測定されるべき生体（Ｏ）のシール付着を制御するために、壁領域（１１）の内壁（１１ｉ）は、制御された方法で、それに応じて適合した表面電荷を有して形成され、シール付着を防止または支援するために、測定されるべき生体（Ｏ）の種類に応じて、負または正の表面電荷が形成され、シール付着を支援するために、正または負の表面電荷が形成され、
前記方法は、
（１）支持体（１２）上に、接着している、または懸垂された生体（Ｏ）を提供する工程と、
（２）開口（１４）の領域に位置する生体の膜を、負圧によって吸引および吸入する工程と、
（３）制御電極部（２０）の電極素子を帯電させる工程と、
（４）吸引および吸入された膜（Ｍ）の部分の、この横方向の引力によって、吸引および吸入された膜（Ｍ）の部分を開口（１４）の内壁（１１ｉ）にシール付着させる工程と、
（５）開口（１４）の領域に位置する生体（Ｏ）の電気生理学的測定を実行する工程と、
を含むことを特徴とする電気生理学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気生理学的測定装置のための支持体、電気生理学的測定装置、および電気生理学的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気生理学の分野において、さまざまな方法および装置が、生体、特に、最も広い意味における、細胞、細胞小器官、卵母細胞、およびそれらの断片を、それぞれの膜に一体化および／または付着されたタンパク質、ならびにそれらの輸送特性に関して、精査するために使用されており、ベシクル、リポソーム、または実質的に人工的なシステムがまた、使用されてもよい。この過程において、生体が配置される測定電極と対向電極との間の、電流および／または電圧が測定され、そのことは、根本的な電気生理学的過程、特に、輸送過程、および構造変化などについての情報を与えるであろう。
【０００３】
大抵の場合に得られる、比較的に非常に低い信号強度によって、膜、または精査されるべき生体の膜と開口壁との接触領域の、適切な信号対雑音比シール抵抗、すなわち可能な限り小さい電気的残留導電性を達成することは有利である。
【０００４】
現在までのところ、測定されるべき生体の細胞内部と細胞外部との間、より一般的には膜内部と膜外部との間の、シール抵抗および電気的残留導電性は、知られている電気生理学的測定方法および測定装置を用いて、満足できる方法で制御することはできない。したがって、一般に、シール抵抗は、大抵の場合、あまりにも低く、望ましくない信号対雑音比が得られる。しかしながら、大抵の場合、シール抵抗の正確な付着および形成それ自体は、格別に悪い経時的制御性を有し、たとえば、既に測定の準備段階中において、測定装置における付着は、この時点においても依然として不所望であるが、溶解された場合、汚染、およびしたがって所望の付着と比較したさらなる悪化をもたらす、あるいは後の付着を妨げる。
米国特許出願公開第２００３／００９８２４８号明細書は、細胞の位置づけのための複数の開口を有する解析システムであって、開口は、基板の貫通孔として形成され、基板は、含水測定媒体内に位置し、測定および対向電極が、基板の上部および下部に形成される、解析システムを開示している。細胞をそれぞれの開口の領域に配置することによって、シール抵抗が、付着中に生成される。その後、測定されるべき細胞の電流および／または電圧が、測定および対向電極を介して、条件を変化させる状況下において決定される。
Khoshmanesh、Khashayer等著、“Dielectrophoretic platform for bio-microfluidic systems”、Biosensors and bioelectronics 26(5)、２０１１年、１８００〜１８１４頁は、装置であって、該装置によって、測定されるべきプローブ、およびそれらの構成要素が、誘電泳動工程を介して、移動され、空間的に配置されてもよいことを記載している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、前述の課題を解決し、測定されるべき生体の付着、および、付着中における、測定されるべき生体と測定されたシステムとの間のシール抵抗の形成を、可能な限り確実に制御することを可能にする、電気生理学的測定装置のための支持体、電気生理学的測定装置、および電気生理学的測定方法を提供する。
【０００６】
本発明の目的は、独立請求項１の特徴を有する発明に従う電気生理学的測定装置のための支持体、および独立請求項９の特徴を有する発明に従う電気生理学的測定装置を用いて達成される。さらに、本発明の目的は、独立請求項１０の特徴を有する発明に従う電気生理学的方法によって達成される。有利な実施形態は、従属請求項に記載される。
【０００７】
本発明は、一方において、開口領域、すなわち少なくとも１つの開口または測定開口を含む、または形成する領域を有する電気生理学的測定装置であって、生体、たとえば細胞、細胞小器官、ベシクル、リポソーム、天然もしくは人工膜、たとえば脂質二重層、それらの類似物、またはそれらの断片の、制御された付着のための電気生理学的測定装置を提供する。この目的のために、開口領域は、少なくとも１つの開口、および壁領域を有して形成され、該壁領域は、開口を包囲して、開口を形成する。壁領域は、その内部に埋設された制御電極部を含む。制御電極部は、該制御電極部に付与された電気ポテンシャルによって、この過程によって、少なくとも開口に臨む壁領域の内壁が、表面電荷によって制御可能に形成されてもよく、表面電荷によって、開口領域における生体のシール付着が制御可能である。
【０００８】
付加的に、電界によって、および、たとえば環電流を生成することによって、たとえば誘導によって、すなわち電磁的に、壁に近接する分子に直接または間接的な影響が及ぼされてもよい。
【０００９】
したがって、本発明の本旨は、電気生理学的測定装置において、開口領域を設けることであり、該開口領域は、シール付着のために、すなわち、開口領域の開口を形成し、かつ該開口を包囲する壁領域であって、その内部に制御電極部が埋設される壁領域において、解析されるべき生体に対する高シール抵抗を付着するために形成される。この制御電極部は、測定装置の残部、特に、生体、生体が含まれる電解質浴、考えられる測定、および対向電極に対して、電気的に孤立しており、電気的ポテンシャルが、制御電極部に、制御可能に付与され、少なくとも壁領域の上または内部において、すなわち開口に臨んで、表面電荷が、制御された方法で形成される。
【００１０】
表面電荷の制御された形成は、対応する電気的相互作用によって、すなわち、不所望の付着を防止して、防止されるべき汚染を防止する反発相互作用を引き起こすことによって、または、求引相互作用を介して、精査されるべき生体に対するシールによる付着およびシールを支援することのいずれかによって、精査されるべき生体のシール抵抗を制御することができるという結果をもたらす。
【００１１】
したがって、本発明によれば、所望の生体を付着させ、開口、および開口の壁領域と一緒にシールを形成し、かつ増大されたシール抵抗または強く低減された残留導電性、および増大されたシールの機械的安定性の意味において、シールの強度を改善するために、測定の準備段階において、実際の測定段階中、またはその直前における付着およびシールを防止することができる。
【００１２】
この過程において、解析が適用されてもよい生体として、最も広い意味における、細胞、細胞小器官、卵母細胞、細菌、またはそれらの組み合わせ、もしくは断片が使用されてもよい。さらに、原理的には、人工的な、または部分的に人工的な生物学的構造、たとえばベシクル、リポソーム、ミセル、膜断片、またはそれらの類似物が考えられ、タンパク質が、自然または人工的な方法で、それらに埋め込まれている、または吸着されている。
【００１３】
精査されるべき対象は、一般に、自然生体、または部分的にもしくは完全に人工的な生体であってもよい。さらに、たとえば純脂質構造およびそれらの修飾を解析するために、非生体が精査されてもよい。以下においては、生体だけが記載されるが、それによって上述の全ての変形物が解析対象として含まれるべきである。
【００１４】
換言すると、本発明によれば、一方において、準備段階において、付着領域、すなわち開口の壁の汚染を防止することができる。他方において、選択された精査されるべき生体を、改善されたシール抵抗を有して付着させることができ、より良好な信号対雑音比が達成され、付着は、機械的に安定化され、たとえば、測定期間の延長、および測定結果に対する改善された信頼性をもたらす。さらに、本発明によれば、付着領域、たとえば開口壁の既に発生している汚染を、対応して選択された直流電圧、または交番電圧を制御電極部によって付与することによって低減する、あるいは除去さえする可能性が存在する。
【００１５】
制御電極部に付与される電気的ポテンシャルの極性を選択することによって、壁の内側、または開口の壁領域の内壁における表面電荷の極性が、それに応じて影響される。この過程において、相互作用の種類および強さが、生体の膜の外側および内側の、生体の膜の電荷に応じて影響されてもよい。
【００１６】
本発明に従う測定装置の実施形態によれば、開口領域が、上側および下側を有する支持体の領域に形成される。したがって、開口を形成する対応する壁領域は、部分的または完全に、支持体の上側および／または下側に対して、突出してもよい。設けられるべき支持体は、基体、基板、または基本基板として示されてもよい。そのような基板、または支持体を設けることは、測定装置を、特に配置された精査されるべき生体の配置を安定させ、測定および対向電極の区画における、測定キュべットまたは濡れた細胞の分割によって規定されるように、測定の基になっている電解質浴に対する、測定装置の巨視的分割を可能にする。
【００１７】
開口を形成する対応する壁領域が、穴の内壁の内部において、電極部との組み合わせにおいて、一体的に形成されてもよい。
【００１８】
基板または支持体に基づいて、それぞれの壁領域を有する、１つまたは幾つかの開口が、上側に対して、突出して、または外側を向いて形成されてもよい。あるいは、これらは、内部へ反転され、平坦、かつ上側と同一面になるとともに、支持体または基板の下側において突出してもよいが、このことは、必要ではなく、膜の厚さが適切である場合には、省略されてもよい。それぞれの陥入または突出の程度は、それぞれの壁領域の内壁、および、それによって、生体の膜との利用可能な相互作用領域に影響する。陥入または突出の程度を選択することは、追加的に、それぞれの利用可能な測定対象の調整、たとえば測定溶液におけるそれらの形状または数の調整を可能にする。
【００１９】
支持体は、前側または上側、および後側または下側を有する板状要素、特に平坦な板状要素として形成されてもよい。他の形状も考えられる。
【００２０】
代替的に、板状の形状を、たとえば標準的なパッチピペットの意味の範囲内のピペットの形状を用いることによって変形してもよい。
【００２１】
開口を形成する壁領域が、側面の形状に、または側面の組み合わせとして形成されてもよい。この目的のために、対応する壁厚を有する、円柱、角柱、円錐台、および／または角錐の側面がそれぞれ用いられてもよい。したがって、開口を形成するための壁領域の形状に対する複数の可能性がある。これらは、精査されるべき生体の形状、および機械的、幾何学的、および／または電気的特徴に応じて選択されてもよい。
【００２２】
このことの代わりに、開口を形成する壁領域は、開口が、ほぼ、基礎をなす基盤の内部で平坦穴として形成され、制御電極部が、平坦穴の縁領域に埋設され、対応する表面電荷を付与し、支援または抑制する方法で付着およびシールの影響を及ぼすように、縁、または縁領域によって形成されてもよい。
【００２３】
開口を形成する壁領域は、ガラス、石英ガラス、シリコン、炭素、ならびにそれらの組み合わせを含む材料の群からの材料から形成されてもよい。さらに、材料の選択に関しては、基本となる生体の特徴、たとえば膜の外部および／または膜の内部の表面構造または表面電荷、さらに、特に強い接着、およびしたがってシール中におけるシール抵抗の増大への支援が考慮されてもよい。
【００２４】
制御電極部は、開口形成壁領域の内部に一体化または埋設された、１つまたは複数の電極素子を含んでもよい。これらは、任意の形状、特に円、ストライプ、またはそれらの類似物の形状を有してもよい。しかしながら、電解質浴、精査されるべき生体、ならびに特に測定電極部および対向電極部に対する電気的孤立が保障される限り、全ての形状が、制御電極部の電極素子のために考えられる。さらに、電極素子の形状および数は、開口の構成、形状、および構造、ならびに壁領域に依存してもよい。このことは、より良い制御性のために、特に、生体と開口の壁領域との間の相互作用を強化するために有利に用いられてもよい。
【００２５】
電極は、生成されるべき電界、および電極の簡単な一体化性に応じた、壁表面までの特定の距離を有してもよい。
【００２６】
制御電極部、特に該制御電極部の電極素子は、開口形成領域の壁厚に対して非対称に形成されてもよく、特に開口に臨む内壁に近接して配置されてもよい。このことは、ポテンシャルの形状、およびしたがって生体、開口、および該開口の壁領域の間の相互作用の適合のために機能してもよい。
【００２７】
制御電極部、および特に該制御電極部の電極素子は、金属材料、金、タンタル、白金、金−タンタル−白金、ドープされた、特に高度にドープされたポリシリコン、インジウム−スズ−酸化物、導電性有機材料、ならびに、それらの組み合わせ、および誘導体を含む材料の群からの材料を含んで、または該材料から形成されてもよい。しかしながら、基本的に、電気ポテンシャルの伝達を可能にする、全ての導電性を有する材料、または部分的に導電性を有する材料が考えられ、さらに、製造の態様も考慮されてもよい。特に、たとえば高プロセス温度などにおける使用された材料の安定性に対する技術的障害が存在しない限り、導電性有機材料、ドープされた半導体材料、またはそれらの類似物を使用することも考えられる。
【００２８】
開口の直径、特に開口を形成する壁領域の内径は、約０μｍ〜約５０μｍの範囲の値、好ましくは約１μｍ〜約５０μｍの範囲の値を有してもよい。開口を形成する壁領域は、支持体または基体の上側または下側の上方に延びる、約０μｍ〜約２０μｍの範囲の高さまたは深さを有してもよい。
【００２９】
それらの寸法の目安は、限定しているものとして解釈すべきではない。代わりに、壁領域の高さおよび深さに関する寸法、および壁領域の直径は、幾何学的設定、および精査されるべき生体、特にそれらのサイズ、およびそれらの膜の機械的特性に基づく。
【００３０】
測定ループを形成するために、測定電極が、開口の領域もしくは開口の内部、または支持体もしくは基体の後側もしくは下側に設けられてもよい。
【００３１】
対向電極が、開口の外側、および支持体の前側または上側の領域に設けられてもよい。
【００３２】
好ましくは、測定電極、および対向電極は、測定されるべき好ましくは生体の付着において、生体が、電極間に配置され、適切なシール、好ましくは非常に高い抵抗、理想的には１ＧΩよりも大きい抵抗を形成することによって電極を実質的に分離するように、支持体もしくは基体、または測定開口の相対する側に配置される。
【００３３】
本発明に従う電気生理学的測定装置の基本的配置は、本実施形態に従って、特に、測定電極部、および対向電極部を設けることを含み、測定電極部と対向電極部との間で、電流、および／または電圧が測定されてもよく、実際に測定された電流、および／または電圧が、生体の膜の特徴、たとえば輸送過程、膜の内部における、または膜を横断する電荷変位から、基質結合、基質分離、またはそれらの類似要因によって生成されたと想定できるようにすべく、シール付着によって、残留導電性、すなわち生体の膜と開口の壁領域との間の導電性が、可能な限り小さくなるように、測定電極部と対向電極部との間で、特に測定されるべき生体が、開口の領域に配置される。
【００３４】
本発明のさらなる態様に従って、電気生理学的測定方法が説明される。該方法は、特に本発明に従う電気生理学的測定方法を使用することによって実行される。この目的のために、開口形成壁領域の内壁の上の開口領域の開口への、測定されるべき生体のシール付着を制御するために、表面電荷が、制御された方法、特に、円電流を生成することによって、および／または誘導によって、すなわち電磁的に、壁領域に近接している分子に、直接または間接的に、電界による影響を及ぼすことによって形成され、特に、シール付着を防止するための負の表面電荷、およびシール付着を支援するための正の表面電荷が形成されてもよい。極性は、付着されるべき膜の電気的特性に従って、必要に応じて、相互に選択されなければならない。
【００３５】
付着は、適切な交番電圧によって、誘電泳動の意味において、改良されてもよい。
【００３６】
したがって、本発明に従う測定方法により、電界によって、または、たとえば誘導すなわち電磁気的に、円電流を誘導することによって、壁に近接する分子への直接の影響が発生してもよい。
【００３７】
したがって、本発明に従う電気生理学的測定方法の基礎にある主要な特徴は、開口、および特に壁領域への表面電荷の制御された付与であり、表面電荷は、生体との電気的相互作用を介して、支援または抑制の意味の範囲内において、シール付着を制御する。この過程において、場の影響は、壁表面の直上だけに発生するのではなく、壁から離れて発生してもよい。
【００３８】
本発明に従う測定方法、および本発明に従う測定装置において、測定信号は、特に容量性の方法において測定され、たとえば単一チャネルの活動を推定してもよい。
【００３９】
本発明に従う制御電極部を帯電させることによって、解析されるべき生体、すなわち、たとえば細胞は、たとえば電気浸透の意味において、反発、または挿入される。
【００４０】
幾つかの制御電極、または改良された構造を用いて、本発明に従って、力に対応する場のプロファイルに関して、たとえば適切な場の形状、および／または標準プロトコルを実現することによって、電気力をモデル化することも可能である。
【００４１】
本発明のこれらの態様、および本発明のさらなる態様が、添付の図面に基づいて説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】本発明に従う電気生理学的測定装置の第１実施形態の断面図であり、開口の壁領域が基礎をなす支持体の上側の上部に延びている。
【図１Ｂ】開口および基礎をなす壁領域の異なる断面形状を示す概略平面図である。
【図１Ｃ】開口および基礎をなす壁領域の異なる断面形状を示す概略平面図である。
【図１Ｄ】開口および基礎をなす壁領域の異なる断面形状を示す概略平面図である。
【図２】図２Ａ，２Ｂは、壁領域における制御電極の対称配置または非対称配置のための、開口の壁領域における表面電荷形成の詳細を示す概略断面図である
【図３】図１Ａに類似する、本発明に従う電気生理学的測定装置の実施形態の概略断面図であり、開口が、異なる幾何学的本体の側面に対応する壁領域によって形成される。
【図４】図１Ａに類似する、本発明に従う電気生理学的測定装置の実施形態の概略断面図であり、開口が、異なる幾何学的本体の側面に対応する壁領域によって形成される。
【図５】図１Ａに類似する、本発明に従う電気生理学的測定装置の実施形態の概略断面図であり、開口が、異なる幾何学的本体の側面に対応する壁領域によって形成される。
【図６】図１Ａに類似する、本発明に従う電気生理学的測定装置の実施形態の概略断面図であり、開口が、異なる幾何学的本体の側面に対応する壁領域によって形成される。
【図７】図１Ａに類似する、本発明に従う電気生理学的測定装置の実施形態の概略断面図であり、開口が、異なる幾何学的本体の側面に対応する壁領域によって形成される。
【図８】いわゆるパッチピペットの形状に形成された、本発明の実施形態に従う電気生理学的測定装置である
【図９】図９Ａ〜図９Ｅは、本発明に従う電気生理学的測定装置の使用の異なる態様を示す概略断面図である。
【図１０】電気生理学的測定装置の実施形態への生体の付着の詳細を示す概略断面図である。
【図１１】電気生理学的測定装置の実施形態への生体の付着の詳細を示す概略断面図である。
【図１２】電気生理学的測定装置の実施形態への生体の付着の詳細を示す概略断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下において、本発明の実施形態が記載される。本発明の全ての実施形態、ならびにそれらの技術的特徴および特性は、別々に分離され、任意に組み立てられてもよく、制限なく結合されてもよい。
【００４４】
以下において、構造的および／または機能的に同一、類似、もしくは同様に機能する特徴または要素は、図面において、同一の参照符号が付される。これらの特徴または要素の詳細な説明は、それらが現れるごとに繰り返すことはない。
【００４５】
先ず、図面を一般的に参照する。
【００４６】
電気生理学において、とりわけパッチクランプ技術が、たとえば薬剤試験のためのイオンチャネル解析を実行するために用いられている。手動パッチクランプ方法、およびその改良を用いるにおいて、たとえば単一細胞上に、たとえばイオンチャネルによって生体の膜に生成される、電流および電圧が測定されてもよい。
【００４７】
電気生理学的解析の重要性の高まり、およびその遂行における個人的および時間的取り組みによって、自動化された電気生理学的測定技術、特に平坦パッチクランプ、さらに自動化されたパッチクランプ、またはＡＰＣシステムに対する需要が発生した。
【００４８】
手動パッチクランプ方法が機能する方法、およびＡＰＣシステムが機能する方法は、基本的に同一である。両方の種類のシステムにおいて、たとえば細胞である測定対象Ｏと測定装置１００との間に高オームシール抵抗を形成する必要があることが問題である。いわゆるギガシール、すなわちギガオーム程度のシール抵抗が必要となる。したがって、たとえば細胞内部の細胞外部に対する電気的孤立が、たとえば図１０に示されているようなパッチピペットによって、または図１１のＡＰＣスキームに従う平坦細胞配置において記載される。
【００４９】
パッチピペットを用いることによって、必要に応じて、細胞が生体Ｏとして吸引される。この過程において、パッチと呼ばれる、細胞膜の狭い限定された部分が、小さな負圧によって吸引される。この過程において、図９Ｂの細胞接着測定に従って測定領域が、または図９Ｄの全細胞測定に従って細胞内部が、細胞の外側に対して、メガオームからギガオームの範囲でシールされる。細胞接着構成は、細胞膜の内部の別個のイオンチャネルにおいても、電流測定を可能にする
【００５０】
手動パッチクランプおよびＡＰＣシステムにおいて、ギガシール比率およびシール抵抗は、可能なイオンチャネル測定の品質に対する尺度である。現在までのところ、１００％のギガシール比率は、不可能である。
【００５１】
ギガシールの形成は、多くの要因に依存し、それらは、現在までのところ、能動的影響のために利用可能ではない。したがって、測定過程におけるギガシールの実際の制御が不足している。
【００５２】
手動パッチクランプ方法において、十分に高いギガシール比率は、新たに形成されたガラスピペットだけによって達成されている。ＡＰＣシステムの開発において、表面粗さの低減、鋭い縁の回避に注意が払われてきた。さらに、細胞内バッファおよび細胞外バッファの慎重な組み合わせが、ギガシールの改善をもたらしてもよい。しかしながら、電気生理学的バッファを用いる必要性によって、このことは、限定された可能性だけを提供する。さらに、全ての改善は、実際の実験の前に検討されなければならない。
【００５３】
自動化された測定システム、特に細胞ネットワークまたは細胞培養のための自動化された測定システムにおいて、付着している培養物内の細胞Ｏは、自発的かつ不所望にギガシールを形成してもよい。しかしながら、ギガシールは、時間的に限定された過程であり、その終了においてギガシールは取り除かれ、その代わりの、シールの連続する新たな形成、およびしたがって新たな測定が妨げられる。したがって、ピペット、およびその開口１４の再利用は、もはや不可能である。
【００５４】
したがって、特にギガシールの制御の自動化が必要である。このことは、現在までのところ、不可能である。
【００５５】
本発明は、たとえばパッチピペットである測定開口１４の内壁１１ｉの上または内部の負または正の電荷が、ギガシールの形成を支援する、またはギガシール自体を改善してもよいという洞察に基づく。測定開口１４の内壁１１ｉの上または内部の正または負の電荷による、方向を有し空間的に分解された電荷密度の増加によって、ギガシールを形成する、またはギガシールを抑制するための工程に影響を及ぼすことが可能になり、交流場の使用の状況下において、電気運動学効果が、必要に応じて用いられてもよい。
【００５６】
ピペット壁１１の上または内部において電荷密度を制御することは、本発明に従って、測定開口１４に内側に対して、たとえば層２０の形状で、孤立されている導電性制御電極２０を、測定開口壁１１内に一体化するとともに、所定の電圧の付与、および対向電極３０，５０によって達成される。
【００５７】
これらの構造を制御することは、制御可能な電圧源を介して行われる。この導電性制御電極２０は、測定開口１４に対して対称であってもよい。対向電極は、たとえば測定システム、またはパッチクランプシステムの測定電極３０，５０であってもよく、該測定電極は、測定開口１４内の導電性流体４０，６０、またはこの目的のために特別に設けられた電極を介して接続される。
【００５８】
配置は、可能な限り円柱キャパシタに対応してもよい。電極２０または導電層２０と測定開口１４との間の孤立層が格別に薄い実施形態が、特に好ましい。電荷の変位は、測定開口１４の内側１０ｉ，１１ｉの上または内部の、正電荷、または負電荷だけの蓄積に影響する。
【００５９】
したがって、本発明は、たとえば細胞またはその類似物である生体Ｏのシール付着の制御された確立または抑制を、ギガシールの意味において、測定開口１４の内壁１０ｉ，１１ｉの上または内部における電荷密度を生成および制御することによって提供する。
【００６０】
このことは、本発明に従って、孤立導体２０を測定開口１４の壁１１に一体化することによって達成される。
【００６１】
本発明によって可能になる比較的に高い電荷密度は、正または負であってよく、従来では達成することができなかった。しかしながら、本発明において、測定開口は、常に、制御可能に帯電される。
【００６２】
したがって、本発明は、開口領域１０の開口１４を形成する壁１１の内部に、壁の内部に埋設された制御電極部２０を設けることによって、測定装置１００の支持体１２への解析されるべき生体Ｏのシール付着を制御することができる、電気生理学的測定装置１００、および電気力学的測定方法に関する。制御電極部には、電気ポテンシャルが制御可能に付与可能であり、この過程によって、少なくとも壁領域１１の開口に臨む内壁１０ｉ，１１ｉが、表面電極を有して、強さ、時間および空間的分布、および／または極性において、制御可能に形成されることができ、解析されるべき生体Ｏの膜との相互作用を介して、シール付着を制御可能に抑制または支援する。
【００６３】
適切に選択された電極の組み合わせを用いることによって、ピペットにおける、または一般に開口の領域における、円電流が生成され、それによって、測定対象の付着も抑制可能になる。
【００６４】
ここで、図面を詳細に参照する。
【００６５】
図１Ａは、本発明に従う電気生理学的測定装置１００の第１実施形態の概略的な断面を示す。
【００６６】
本実施形態の基本要素は、支持体１２であり、該支持体１２は、基体１２または基板１２として示されてもよい。この支持体１２は、測定中に提供される電解質浴４０，６０，７０を、少なくとも２つの区画に分割し、第１の区画６０は、支持体１２または基板１２の下側１２ｂに臨み、第２の区画４０は、支持体１２または基板１２の上側１２ａに臨む。
【００６７】
いわゆる開口領域１０が、支持体１２に組み込まれる。開口領域１０は、少なくとも１つの開口１４、すなわち、たとえば貫通孔の形状で、層厚方向、すなわち上側１２ａから下側１２ｂの方向に、局所的かつ完全に支持体を貫通する開口１４を含む。開口１４の領域において、電解質浴４０，６０，７０の一部７０が設けられる。
【００６８】
全体として、開口領域１０の開口１４を介して上側１２ａと下側１２ｂとの間に、流体力学的接続が存在し、かつ場合により存在する電解質浴の導電性、大抵の場合は電気生理学的溶液を介して、電気的接続が存在する。
【００６９】
図１Ａに従う実施形態において、支持体１２の下側１２ｂに設けられた測定電極３０に対する対向電極５０は、上側区画４０に配置され、導体５１を介して接続される。したがって、測定電極３０は、電解質浴４０，６０，７０の下側区画６０に位置し、導体３１を介して接続される。対向電極５０、または測定電極３０に対する導体５１，３１は、それ自体が孤立しており、図示されていない、対応する制御および測定ループをもたらす。
【００７０】
支持体１２の内部で、制御導体２１が、制御および測定ループから到来して延びており、該制御導体は、制御電極装置２０をもたらす。この制御電極部２０は、壁領域１１内で、その内部に形成され、したがって、電解質浴４０，６０，７０に対して、ならびに測定電極３０および対向電極５０に対して、電気的に孤立している。
【００７１】
あるいは、制御電極部２０は、棒状に形成されなくてもよく、たとえば、円錐の形状で形成され、その形状が電荷担体密度を規定してもよく、この場合、恐らく単一の電極で十分であろうが、適応した形状に改良されてもよい。その他に、付加的または代替的に、制御電極部２０の分割された電極が、特に交番電圧動作の状況において考えられる。
【００７２】
壁領域１１は、それ自体、内側１０ｉ，１１ｉまたは内壁１０ｉ，１１ｉ、および外側１０ａ，１１ａまたは外壁１０ａ，１１ａを有する側面の形状の閉鎖された壁を形成する。このようにして、本発明に従う電気生理学的測定装置１００の開口領域１０の開口１４が形成され、壁領域１１の内側または内壁１０ｉ，１１ｉは、開口１４に臨み、それに対して、壁領域１１の外壁または外側１０ａ，１１ａは、開口１４から逸れているが、電解質浴４０，６０，７０の区画４０に臨む。
【００７３】
図１Ａの実施形態において、壁領域１１は、支持体または基板１２の上側１２ａだけを越えて延びる。基板または支持体１２の下側１２ｂにおいて、開口領域１０は、ほぼ平坦に形成される。しかしながら、そのような構造は、必要ではなく、図３〜図７は、この点に関して改良された実施形態を示し、後に詳細に説明される。
【００７４】
前述のように、開口１４を形成する壁領域１１は、幾何学的本体の側面の形状に形成される。図１Ｂに従って、この側面は、図１Ａと併せて、基本形状としての直立した円柱に起因してもよい。
【００７５】
図１Ａ、および図１Ｂにおいて、導電体２１を介して接続された制御電極部２０に正の電荷が付与される。しかしながら、このことは一例にすぎない。状況、および解析されるべき対象に応じて、適切な相互作用が形成されるように、電気ポテンシャルが、制御電極部２０に付与されてもよい。
【００７６】
基本形状として、直立した円柱の側面として形成することは、必須ではない。図１Ｃ、および図１Ｄは、概略平面図における円柱形状の代わりに、ベース領域としての四辺形を示し、空間的には、直立した四辺形の角柱、または、図１Ｄに示されているように、長円、準四辺形、もしくは丸められた角を有する矩形のベース領域を有する角柱となる。
【００７７】
基本的に、基本領域の任意の形状が可能である。しかしながら、表面粗さ、および鋭い縁が防止されなければならない前述の環境に応じて、特に丸められた構造を有する形状、すなわち、たとえば図１Ｂに従う幾何学的基本形状としての直立した円柱を有する形状が好ましい。
【００７８】
制御電極装置の電荷に関する態様は、基本的に、側面の形状の選択から独立している。
【００７９】
図３および図４は、図１Ａと同様に、本発明の測定装置の他の実施形態の概略的な断面を示すが、図３に従って、開口１４のための壁領域１１が、支持体１２の上側１２ａと同一平面となり、支持体１２の下側１２ｂだけから突出し、全体として、上側１２ａの、区画６０への方向における内側への一種の陥入が、開口１４のために生成されるという点において差異がある。
【００８０】
図４において、開口１４の壁領域１１の一部分が、基体１２の上側１２ａに突出しているが、他方において、壁領域１１の一部分が、基体１２の下側１２ｂから区画６０に突出している。
【００８１】
上側１２ａおよび下側１２ｂに対する高さであって、それによって開口１４のための壁部が突出する高さは、それぞれ同一であってもよい。しかしながら、このことは必須ではない。図４において、それらは、異なって形成されている。
【００８２】
図１Ａ、図３、および図４の実施形態において、壁領域１１が延びる方向に沿った断面または直径は、基板１２の上側１２ａに垂直、または基板１２の下側１２ｂに垂直であり、その形状は一定である。
【００８３】
このことは必須ではない。先細になる、または広がる断面形状が提供されてもよい。このことは、図５〜図７に示されており、図５は、本発明に従う測定装置の実施形態を示し、図１の実施形態に対応しているが、開口１４の断面形状は、上側１２ａからの距離が増加するにつれて狭くなる。
【００８４】
それに対して、図６の実施形態において、図３の実施形態と同様に、図３の実施形態と比較して、開口１４は、断面形状が、基体１２の下側１２ｂから離れた位置で先細になるように形成されている。
【００８５】
図５および図６の実施形態の組み合わせにおいて、図４の実施形態と類似して、図７は、支持体１２の高さにおいて最大直径を有し、支持体の上側１２ａからの距離、および支持体１２の下側１２ｂからの距離が増加するにつれて先細になる開口１４を示す。
【００８６】
図１Ａの実施形態において、接続または導体３１を有する測定電極３０は、開口１４を有する開口領域に非常に近接して形成され、該開口領域に部分的に挿入されている。測定電極３０の位置は、変更されてもよく、たとえば開口１４内の電解質領域７０に深く挿入されてもよく、または該電界質領域から遠ざけられてもよい。
【００８７】
図８は、本発明に従う電気生理学的測定装置１００の実施形態の概略的な断面を示し、開口領域１０は、壁領域１１から形成され、全体として、パッチピペットの形状に形成されている。
【００８８】
この場合も、開口１４に臨む内壁領域１０ｉ，１１ｉ、および外壁領域１０ａ，１１ａが存在し、外壁領域１０ａ，１１ａは、動作中、電解質浴４０，６０，７０のうちの外部に存在する電解質区画４０に臨み、内壁領域１０ｉ，１１ｉは、電解質浴４０，６０，７０のうちの開口の内部に設けられる電解質区画７０に臨む。壁領域の内部で、したがって電解質浴４０，６０，７０から電気的に孤立して、導体２１を介して接続された制御電極部２０も形成され、該制御電極部は、少なくとも壁領域１１の内壁１０ｉ，１１ｉの上に、電気的ポテンシャルの付与を介して、表面電荷を生成することが可能であり、それによって、解析されるべき生体Ｏのシール付着を防止、または支援する。
【００８９】
この場合も、帯電の手順および効果は、原理的に、開口１４の形状とは別個に検討されなければならない。
【００９０】
図２Ａ、および図２Ｂは、図１Ａの部分Ｘをより詳細に示す、すなわち制御電極部２０に、ここでは正の、電荷を付与することによって、内壁１０ｉ，１１ｉおよび外壁１０ａ，１１ａの上に、ここでは正の、表面電荷を誘導する。
【００９１】
図２Ａにおいて、制御電極装置２０は、壁領域１１の厚みに対して対称に、形成、かつ配置される。したがって、同一強度の正電荷密度が、内壁１０ｉ，１１ｉ、および外壁１０ａ，１１ａに生成される。それに対して、図２Ｂに従う実施形態において、制御電極装置２０は、壁領域１１の内壁１０ｉ，１１ｉ、または外壁１０ａ，１１ａに近接して、形成、かつ配置され、外壁１０ａ，１１ａへのより大きな距離によって、内壁１０ｉ，１１ｉにおける正電荷密度よりも小さな正電荷密度が外壁１０ａ，１１ａに生成される。
【００９２】
図９Ａ〜図９Ｅは、異なる測定原理の概略的な断面を示し、該異なる測定原理は、本発明に従う、電気力学的測定装置１００および対応する電気力学的測定方法において用いられてもよい。
【００９３】
図９Ａに示されているような状況から、測定開口１４による電解質浴４０，６０，７０の軽い吸引、すなわち区画４０から、開口１４の内部の区画７０を介した、区画６０への吸い込みによって、生体Ｏが、この場合においてはたとえば細胞が、吸引され、開口１４に接近する。
【００９４】
接近の機構は、異なる操作方法、たとえば別個のピペット、レーザピンセット、またはその類似物を介して行われてもよい。
【００９５】
図９Ｂに従う小さな負圧を介して、細胞は、破壊されることなく、測定開口１４に付着される。測定が、この状態において行われると、いわゆる細胞接着モードと呼ばれる。
【００９６】
機械的引き出しによって、図９Ｂに記載された状態から、膜スポットが、生体Ｏの膜から破裂し、破裂した膜スポット、いわゆるパッチが、測定開口１４の内部でシールされた状態に留まり、実際の測定対象Ｏを形成してもよい。この過程において、膜スポットの以前には内側に位置していた側は、破裂によって、外側、すなわち区画４０の方向を向く。この理由により、この測定はまた、インサイドアウトモードと呼ばれる。
【００９７】
他方、図９Ｂに示された状態から、新たな負圧、すなわち、たとえば圧力パルスの方法によって、細胞Ｏは、全体として、いわゆる細胞接着モードから全細胞モードへの転移が発生するように、全体として開放されてもよく、全細胞モードにおいては、測定電極３０が細胞の内部全体への直接のアクセスを有する。このことは、細胞の内部が、区画７０，６０に向かって開放されるが、区画４０に対しては基本的に孤立していることを意味する。
【００９８】
図９Ｄに従う状況から、すなわち全細胞モードから、機械的引き出しによって、膜の断片が、再び、生体の膜から破裂することが達成されてもよい。全細胞モードが先立って存在しているので、この過程において、破裂した膜スポットが、測定開口１４において、実際の測定対象Ｏとしての役割を果たすとともに、図９Ｅに従って、細胞膜の外側または生体の膜が、依然として外側に留まる、ある程度の可能性が存在する。この場合、測定装置１００のアウトサイドアウトモードと言う。
【００９９】
図１０は、再び、幾何学的状況の詳細を示し、該状況は、測定されるべき生体のシール付着中に、該生体の膜Ｍと測定開口１４との間、特に壁領域の内壁１０ｉ，１１ｉに存在する。図１０は、再び、全細胞モードを示し、細胞Ｏ全体が、その内部を、測定電極３０に向け、かつ電解質区画６０，７０に向けた状態で、開放されている。本発明に従う電気生理学的測定装置１００の本実施形態は、ここでは、パッチピペットの方法で形成される。
【０１００】
本発明によれば、測定されるべき生体Ｏの細胞膜Ｍと測定開口１４の壁領域１１の内壁１０ｉ，１１ｉとの間のシール抵抗は、細胞膜Ｍの表面電荷、すなわちここでは細胞膜Ｍの外側における電荷と反対の電荷が、壁１０ｉの内側に形成されることによって改善される。
【０１０１】
このことは、生体Ｏの負に帯電した膜Ｍの場合、開口１４の壁領域１１の内壁１０ｉ，１１ｉは、正に帯電されなければならないことを意味しており、そのことは、導体２１を介した制御電極２０の正の帯電によって発生する。
【０１０２】
それに対して、付着されるべき生体Ｏの細胞膜Ｍが正に帯電していれば、開口１４の壁領域１１の壁１０ｉ，１１ｉの内側は、負に帯電される必要があり、そのことは、導体２１を介する制御電極部２０の負の帯電を必要とする。
【０１０３】
付着、およびしたがってシールが防止されるべき場合、たとえば実験のための準備段階中に、開口１４の壁領域１１の内壁１０ｉ，１１ｉの表面電荷は、生体Ｏの膜Ｍの表面における電荷と同じ電荷の種類によって帯電されなければならない。
【０１０４】
したがって、本発明によれば、膜の異なる表面における異なる状況、細胞膜、細胞小器官の膜、または人工物体の膜を考慮することができる。このことは、現在までのところ、不可能であり、付着およびシールを、制御可能に防止する、もしくは支援する、または、シールが一旦生成されたときに、シールを安定化させる可能性を提供する。
【０１０５】
図１１に従う実施形態において、基板は、細胞Ｏ´の層によって、ほとんど覆われている。開口壁１１の内部に設けられた、本発明に従う制御電極部２０の使用、および該制御電極部の制御された帯電の状況下での機械的および／または電気的相互作用によって、細胞Ｏ´の集合のうちの単一の細胞Ｏが、図９Ｄに従う状況と同様の、全細胞モードにおける測定対象として、改善されたシール付着を有する電気生理学的測定にとって、利用可能になる。
【０１０６】
図１２は、本発明に従う測定装置１００の配置を示し、開口１４を形成する壁領域１１は、開口１４が、ほぼ、基礎をなす基板１２の内部の平坦穴として形成されるように、縁または縁領域によって形成され、この過程において、制御電極部２０が、対応する表面電荷を縁領域に付与して、付着およびシールに、支援または抑制する方法で影響を及ぼす。
【符号の説明】
【０１０７】
１０  開口領域
１０ａ  外壁、外壁領域、開口領域１０の外側
１０ｉ  内壁、内壁領域、開口領域１０の内側
１１  壁領域、壁
１１ｉ  内壁、内壁領域、壁領域１１の内側
１１ａ  外壁、外壁領域、壁領域１１の外側
１２  基板、支持体、基体、基本基板
１２ａ  上側、前側
１２ｂ  下側、後側
１４  開口、測定開口
２０  制御電極部、電荷電極部、制御電極、電荷電極
２１  導電体、制御
３０  測定電極、測定電極部
３１  測定導体、導体
４０  電解質区画、電解質浴
５０  対向電極、対向電極部
５１  導体
４０  電解質区画、電解質浴
６０  電解質区画、電解質浴
７０  電解質区画、電解質浴
１００  電気生理学的測定装置
Ｍ  生体Ｏの膜
Ｏ  生体、細胞、リポソーム、ベシクル、ミセル、卵母細胞、測定対象
Ｏ´  生体、細胞、リポソーム、ベシクル、ミセル、卵母細胞
【図１Ａ−１Ｂ】
0005932060.tif 000002
【図１Ｃ−１Ｄ】
0005932060.tif 000003
【図２Ａ】
0005932060.tif 000004
【図２Ｂ】
0005932060.tif 000005
【図３】
0005932060.tif 000006
【図４】
0005932060.tif 000007
【図５】
0005932060.tif 000008
【図６】
0005932060.tif 000009
【図７】
0005932060.tif 000010
【図８】
0005932060.tif 000011
【図９】
0005932060.tif 000012
【図１０】
0005932060.tif 000013
【図１１】
0005932060.tif 000014
【図１２】
0005932060.tif 000015