(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識物質を含む検出物質を光電気化学的に検出する方法であって、
カオトロピックイオン又はアセトニトリルを含む誘引液と、標識物質を含む検出物質と、を混合する工程と、
カオトロピックイオン又はアセトニトリルを含む誘引液中で、標識物質を含む検出物質を、標識物質を含む検出物質を捕捉する捕捉物質が存在しない作用電極に誘引する工程と、
標識物質を含む検出物質を、光電気化学的に検出する工程と、
を含み、
誘引工程は、標識物質を含む検出物質を電気泳動により、捕捉物質が存在しない作用電極に誘引する工程を含む検出物質の光電気化学的検出方法。
【請求項２】
標識物質は、光化学的に活性な物質である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標識物質は、金属錯体、有機蛍光体、量子ドット及び無機蛍光体からなる群より選択された少なくとも１つである、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
標識物質を含む検出物質が、標識物質で標識された核酸である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
カオトロピックイオンが、ヨウ化物イオン、臭化物イオン、グアニジンイオン、チオシアン酸イオン、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、塩化物イオン、酢酸イオン、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン及びマグネシウムイオンからなる群より選択された少なくとも１つである、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
誘引液が、アセトニトリルを含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
誘引工程は、標識物質を含む検出物質を、前記捕捉物質が存在しない作用電極との間で電子輸送が可能な領域、又は、前記捕捉物質が存在しない作用電極によって標識物質を電子励起可能な領域に誘引する工程である、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
誘引工程は、標識物質を含む検出物質を、極性の違いによって、捕捉物質が存在しない作用電極に誘引する工程である、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
誘引工程は、標識物質を含む検出物質を作用電極に固定する工程を含む、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
検出工程が、電解液の存在下において、標識物質を含む検出物質を電気化学的に検出する工程である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
電解液が、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）、水又はアセトニトリルと水との混合物を含有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
作用電極が、半導体を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
作用電極が、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジウム、酸化タングステン、酸化タンタル及びチタン酸ストロンチウムからなる群より選択された少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
作用電極が、スズを含む酸化インジウム又はフッ素を含む酸化スズを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
被検物質を光電気化学的に検出する方法であって、
固相上に、標識物質と被検物質とを含む複合体を形成する工程と、
複合体が形成された固相を単離する工程と、
単離工程で得られた、固相上に形成された複合体から、標識物質を含む検出物質を分離する工程と、
分離された標識物質を含む検出物質を、カオトロピックイオン又はアセトニトリルを含む誘引液中で、標識物質を含む検出物質を捕捉する捕捉物質が存在しない作用電極に誘引する工程と、
標識物質を含む検出物質を、光電気化学的に検出する工程と、を含む被検物質の光電気化学的検出方法。
【請求項１６】
形成工程が、被検物質と、被検物質を捕捉する捕捉物質が固定化された固相と、被検物質を捕捉する結合物質が標識物質で標識された標識結合物質とを接触させ、固相上に、標識物質と被検物質とを含む複合体を形成する工程である、
請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
単離工程が、複合体が形成された固相を試料中の他の成分から単離する工程である、
請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
固相が、磁性粒子である請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
単離工程が、複合体が形成された固相を磁気分離によって液相から単離する工程である、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
光化学的に活性な被検物質を光電気化学的に検出する方法であって、
固相上に、被検物質を固定する工程と、
被検物質が固定された固相を単離する工程と、
単離工程で得られた被検物質が固定された固相から、被検物質又は被検物質の一部を分離する工程と、
分離された被検物質又は被検物質の一部を、カオトロピックイオン又はアセトニトリルを含む誘引液中で、被検物質又は被検物質の一部を捕捉する捕捉物質が存在しない作用電極に誘引する工程と、
被検物質又は被検物質の一部を、光電気化学的に検出する工程と、
を含む被検物質の光電気化学的検出方法。
【請求項２１】
被検物質が、核酸である請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出物質の電気化学的検出方法、被検物質の電気化学的検出方法及び検出セットに関する。より詳しくは、核酸、タンパク質等の被検物質の検出や定量等や、これらを利用する疾病の臨床検査、診断等に有用な、検出物質の電気化学的検出方法、被検物質の電気化学的検出方法及び検出セットに関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の臨床検査や診断は、生体試料中に含まれる前記疾病に関連する遺伝子やタンパク質等を、遺伝子検出法や免疫学的検出法等の検出法によって検出することにより行なわれている。前記検出法としては、例えば、イムノクロマトグラフィー法、ラテックス凝集法、酵素免疫法、化学発光免疫法、ＰＣＲ法等が挙げられる。
【０００３】
一方、検出感度、定量性、簡易性等を向上させることを目的として、光化学的に活性な標識物質を光励起させることにより生じる電流や、電気化学的に活性な標識物質に対する電圧印加により生じる光又は電流を、遺伝子やタンパク質等の被検物質の検出に利用する方法が提案されている（例えば、特許文献１、特許文献２等を参照）。
【０００４】
前記特許文献１には、光化学的に活性な増感色素で標識された標識被検物質に光を照射し、当該標識被検物質中に含まれる増感色素が光励起して生じる電流を測定することにより、被検物質を検出すること（以下、「光電気化学検出」）が記載されている。前記特許文献１に記載の方法では、前記標識被検物質と、この標識被検物質と直接的又は間接的に結合可能な捕捉物質を表面に備えた作用電極とを接触させる。これにより、当該標識被検物質を、前記捕捉物質を介して作用電極に固定させる。つぎに、この作用電極及び対電極を電解質媒体に接触させ、前記作用電極に固定化された標識被検物質に光を照射して前記増感色素を光励起させる。その後、光励起された増感色素から作用電極への電子移動に起因して作用電極と対電極との間に流れる光電流を測定することにより、被検物質が特異的に検出される。
【０００５】
また、前記特許文献２には、目的遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸からなるプローブが表面に固定化された電極と、二本鎖核酸に特異的に結合し、かつ電気化学的に活性な標識物質を含む二本鎖認識物質とを用いる遺伝子検出法が開示されている。前記特許文献２に記載の方法では、一本鎖に変性された核酸を含む試料とプローブと二本鎖認識物質とを接触させる。そして、目的遺伝子に対応する核酸とプローブとのハイブリダイゼーションにより形成された、二本鎖核酸に結合した二本鎖認識物質に含まれる標識物質に基づく酸化還元電流や電気化学発光を測定することにより、目的遺伝子が検出される。
【０００６】
これらの検出法では、電気化学的又は光化学的に活性な標識物質を介して被検物質を検出する。そのために、被検物質の量に応じて作用電極の近傍に標識物質が存在するように、被検物質を捕捉するための捕捉物質が表面に固定化された作用電極が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４０８６０９０号公報
【特許文献２】特許第２５７３４４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ここで、捕捉物質が固定化された作用電極は、その再利用が困難である。なぜなら、捕捉物質が固定化された作用電極の再利用を行なうためには、洗浄により、作用電極上の捕捉物質以外の物質を取り除く必要があるからである。しかし、洗浄に際して、作用電極から、捕捉物質も取り除かれてしまう場合がある。また、洗浄に用いられる洗浄剤等によって、作用電極上の捕捉物質が変性してしまう場合がある。そのため、捕捉物質が固定化された作用電極の再利用時は、測定結果に影響するおそれがある。したがって、通常、捕捉物質が固定化された作用電極を含む検出部は、測定ごとに使い捨てされる。結果として、捕捉物質が固定化された作用電極を用いる検出系は、１測定あたりのコストが高くなるという欠点がある。
また、捕捉物質が固定化された作用電極を用いる検出系は、被検物質が大きい場合には、立体障害のために作用電極の近傍に標識物質を存在させることが困難となり、検出性能が低下することがある。
【０００９】
本発明は、前述の事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、捕捉物質が固定された作用電極を用いる従来の電気化学検出法により得られる測定感度等における原理的な利点を有し、かつ作用電極を再利用することができる、検出物質の電気化学的検出方法、被検物質の検出方法及び検出セットを提供することにある。
また、本発明は、被検物質の大きさによらず、被検物質を検出することができる、検出物質の電気化学的検出方法、被検物質の検出方法及び検出セットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、標識物質を含む検出物質を、特定の液体試料等によって作用電極の表面の近傍に移送させることで、この標識物質を電気化学的に検出することができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
本発明の第１の側面に係る検出物質の電気化学的検出方法は、標識物質を含む検出物質を電気化学的に検出する方法であって、液体試料中の標識物質を含む検出物質を、標識物質を含む検出物質を捕捉する捕捉物質が存在しない作用電極に誘引する工程と、標識物質を含む検出物質を、電気化学的に検出する工程と、を含む検出物質の電気化学的検出方法である。
【００１２】
また、本発明の第２の側面に係る被検物質の電気化学的検出方法は、被検物質を電気化学的に検出する方法であって、固相上に、標識物質と被検物質とを含む複合体を形成する工程と、複合体が形成された固相を単離する工程と、単離工程で得られた、固相上に形成された複合体から、標識物質を含む検出物質を分離する工程と、分離された標識物質を含む検出物質を、標識物質を含む検出物質を捕捉する捕捉物質が存在しない作用電極に誘引する工程と、標識物質を含む検出物質を、電気化学的に検出する工程と、を含む被検物質の電気化学的検出方法である。
【００１３】
さらに、本発明の第３の側面に係る被検物質の電気化学的検出方法は、電気化学的又は光化学的に活性な被検物質を電気化学的に検出する方法であって、固相上に、被検物質を固定する工程と、被検物質が固定された固相を単離する工程と、単離工程で得られた被検物質が固定された固相から、被検物質又は被検物質の一部を分離する工程と、分離された被検物質又は被検物質の一部を、被検物質又は被検物質の一部を捕捉する捕捉物質が存在しない作用電極に誘引する工程と、被検物質又は被検物質の一部を、電気化学的に検出する工程と、を含む被検物質の電気化学的検出方法である。
【００１４】
本発明の第４の側面に係る検出キットは、被検物質を電気化学的に検出するための検出セットであって、被検物質を捕捉する第１の捕捉物質が固定された固相と、被検物質を捕捉する結合物質が標識物質で標識された標識結合物質と、結合物質から分離された標識物質を含む検出物質を捕捉する第２の捕捉物質が存在しない作用電極と導電性材料からなる対極とを備えた検査チップと、を含む検出キットである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の標識物質を含む検出物質の電気化学的検出方法、被検物質の電気化学的検出方法及び検出セットによれば、標識物質を含む検出物質を作用電極の近傍に移送させることができる。そのため、作用電極上に、標識物質を含む検出物質を捕捉するための捕捉物質が固定化されていなくても、標識物質を含む検出物質又は被検物質を電気化学的に検出することができる。したがって、本発明の標識物質を含む検出物質の電気化学的検出方法、被検物質の電気化学的検出方法及び検出セットは、捕捉物質が固定された作用電極を用いる従来の電気化学検出法により得られる測定感度等における原理的な利点を有する。
しかも、用いられる作用電極には、洗浄等によりダメージを受ける捕捉物質が存在しないため、簡便な処理で当該作用電極を再利用可能な状態に戻すことができる。したがって、本発明の標識物質を含む検出物質の電気化学的検出方法、被検物質の電気化学的検出方法及び検出セットは、作用電極を再利用することができるという優れた効果を奏する。これにより、一度、検出に用いられた作用電極を再利用することができるので、捕捉物質が固定された作用電極を用いる従来の電気化学検出法と比べて、経済性が向上し、低コストでの臨床検査や診断が可能になる。
【００１６】
また、上述した第２〜４の側面に係る本発明の被検物質の電気化学的検出方法及び検出セットでは、固相上に形成された標識物質と被検物質とを含む複合体から、標識物質を含む検出物質を分離する。そして、分離された標識物質を含む検出物質を、捕捉物質が存在しない作用電極を用いて、電気化学的に検出する。したがって、本発明の被検物質の電気化学的検出方法及び検出セットによれば、被検物質の大きさによらず、被検物質を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】固相上に形成された被検物質と検出物質とを含む複合体の概略説明図である。
【図２】本発明の一実施の形態に係る検出物質の電気化学的検出方法及び被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出装置を示す斜視図である。
【図３】図２に示される検出装置の構成を示すブロック図である。
【図４】本発明の一実施の形態に係る検出物質の電気化学的検出方法及び被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検査チップを示す斜視図である。
【図５】図４に示される検査チップを示す断面図である。
【図６】図４に示される検査チップの上基板を下面側から見た斜視図である。
【図７】図４に示される検査チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【図８】図４に示される検査チップの電極部分の一例を模式的に表した概略図である。
【図９】図４に示される検査チップの電極部分の他の例を模式的に表した概略図である。
【図１０】図４に示される検査チップの電極部分の他の例を模式的に表した概略図である。
【図１１】本発明の一実施の形態に係る検出物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図１２】本発明の他の実施の形態に係る検出物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図１３】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図１４】本発明の他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図１５】図１３に示される被検物質の電気化学的検出方法の変形例の処理手順を示す工程説明図である。
【図１６】図１４に示される被検物質の電気化学的検出方法の変形例の処理手順を示す工程説明図である。
【図１７】実施例１において、実験番号１〜３での光電流の測定結果を示すグラフである。
【図１８】実施例２において、実験番号４〜６での光電流の測定結果を示すグラフである。
【図１９】実施例３において、実験番号７〜９での光電流の測定結果を示すグラフである。
【図２０】実施例４において、実験番号１０〜１２での光電流の測定結果を示すグラフである。
【図２１】実施例５において、実験番号１３〜１６での光電流の測定結果を示すグラフである。
【図２２】実施例６において、実験番号１７及び１８での光電流の測定結果を示すグラフである。
【図２３】実施例７において、実験番号１９及び２０での光電流の測定結果を示すグラフである。
【図２４】実施例８における被検物質の電気化学的検出方法の処理手順を示す工程説明図である。
【図２５】実施例８において、実験番号２１〜２４での光電流の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
［用語の定義］
本発明の実施の形態を説明するにあたり、まず、本明細書で用いられる用語の定義を示す。
本明細書において、「標識物質を含む検出物質」とは、「標識物質２１ａのみ」又は「標識物質２１ａと、誘引用修飾物質２１ｂ、被検物質１０を捕捉する結合物質２２、被検物質１０、被検物質１０を捕捉するための捕捉物質３２及びこれらのいずれかの物質の一部からなる群より選ばれた少なくとも１つとを含む物質」をいう（図１参照）。なお、「標識物質２１ａと誘引用修飾物質２１ｂとからなる物質」を「修飾標識物質」（図１中、２３）ともいう。また、「被検物質１０を捕捉する結合物質２２が標識物質２１ａで標識された物質」を「標識結合物質」（図１中、２４）ともいう。「標識結合物質」は、被検物質１０を捕捉し、かつ標識物質として利用可能な物質を用いる場合、被検物質１０を捕捉する結合物質２２又は標識物質２１ａと等価となり得る。
【００１９】
また、「固相」（図１中、３１）とは、被検物質の単離に用いられる支持体をいう。かかる固相３１は、被検物質１０を捕捉するための捕捉物質３２を介して、被検物質１０を捕捉する。
【００２０】
さらに、「誘引液」とは、検出物質、検出物質を作用電極の近傍に誘引させるための液体試料に用いられる溶媒をいう。
【００２１】
［検出装置の構成］
つぎに、本発明の標識物質を含む検出物質の電気化学的検出方法及び被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出装置の一例を添付図面により説明する。
図２は、本発明の一実施の形態に係る標識物質を含む検出物質の電気化学的検出方法及び被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出装置を示す斜視図である。この検出装置１０１は、光化学的に活性な物質を標識物質として用い、光電気化学的に前記標識物質を含む検出物質を検出する電気化学的検出方法に用いる検出装置である。
【００２２】
検出装置１０１は、検査チップ１０４が挿入されるチップ受入部１０３と、検出結果を表示するディスプレイ１０２とを備えている。
【００２３】
図３は、図２に示される検出装置の構成を示すブロック図である。検出装置１０１は、光源１０５と、電流計（電流測定部）１０６と、電源（電位印加部）１０９と、Ａ／Ｄ変換部１０７と、制御部１０８と、ディスプレイ１０２とを備えている。
光源１０５は、検査チップ１０４の作用電極の近傍に移送させた標識物質を含む検出物質に光を照射し、当該標識物質を励起させる。電流計１０６は、励起された標識物質から放出される電子に起因して検査チップ１０４内を流れる電流を測定する。電源１０９は、検査チップ１０４に設けられた電極に対して所定の電位を印加する。Ａ／Ｄ変換部１０７は、電流計１０６によって測定された電流値をデジタル変換する。制御部１０８は、ＣＰＵ(Central Processing Unit)、ＲＯＭ(Read Only Memory)、ＲＡＭ(Random Access Memory)等から構成され、光源１０５、電流計１０６、電源１０９、及びディスプレイ１０２の動作を制御する。また、制御部１０８は、Ａ／Ｄ変換部１０７でデジタル変換された電流値を予め作成された電流値と検出物質の量との関係を示す検量線に基づき、標識物質を含む検出物質の量を概算する。ディスプレイ１０２は、制御部１０８で概算された標識物質を含む検出物質の量を表示する。
【００２４】
なお、本発明において、前記標識物質を含む検出物質を後述の酸化還元電流・電気化学発光検出法にしたがって検出する場合、検出装置は、光源１０５を備えていなくともよい（図示せず）。
前記標識物質を含む検出物質を電気化学発光により検出する場合、検出装置は、標識物質から生じる光等を検出するためのセンサをさらに備えていればよい。
【００２５】
［検査チップの構成］
つぎに、本発明の一実施の形態に係る標識物質を含む検出物質の電気化学的検出方法及び被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検査チップ１０４の構成を説明する。
図４は、検査チップ１０４の斜視図、図５は、検査チップ１０４の断面図（図４のＡ-Ａ線での断面図）である。
【００２６】
検査チップ１０４は、上基板１１３と、上基板１１３の下方に設けられた下基板１１４と、上基板１１３と下基板１１４とに挟まれた間隔保持部材１１２とを備えている。
図６は、上基板１１３を下面側から見た斜視図である。上基板１１３は矩形状に形成され、上基板１１３の表面（下面）には、作用電極１２１と、作用電極１２１に接続されている電極リード１２２とが形成されている。作用電極１２１はほぼ四角形状に形成されて上基板１１３の一側部（図６の左側）に配置され、電極リード１２２は作用電極１２１から上基板１１３の他側部（図６の右側）に向けて延びている。
【００２７】
図７は、下基板１１４を上面側からみた斜視図である。下基板１１４は、上基板１１３と略同一寸法の矩形状に形成され、下基板１１４の表面（上面）には、対極１２４と、この対極に接続された電極リード１２５と、参照電極１２８と、この参照電極１２８に接続された電極リード１２９とが形成されている。
【００２８】
対極１２４の電極リード１２５と参照電極１２８の電極リード１２９とは、それぞれ下基板１１４の一側部から他側部へ向けて延びている。対極１２４、及び参照電極１２８の各電極リード１２５，１２９は、下基板１１４の他側部において互いに並列するように配置されている。
【００２９】
図４及び図５に示すように、上基板１１３と下基板１１４とは、各々に形成された電極部分が上下方向に対向するように、一側部において重複して配置されている。そして、上基板１１３と下基板１１４とが重複（対向）する部分には間隔保持部材１１２が介在している。上基板１１３と下基板１１４とに形成された電極リード１２２，１２５，１２９は、上基板１１３と下基板１１４とが重複する部分からはみ出して外部に露出している。
【００３０】
図６及び図７に示すように、間隔保持部材１１２は、矩形の環状体形状に形成され、絶縁体であるシリコーンゴムからなっている。この間隔保持部材１１２は、作用電極１２１と、対極１２４及び参照電極１２８とが互いに対向する領域を取り囲むように配置されている。上基板１１３と下基板１１４との間にはシリコーンゴム１１２の厚さに相当する間隔が形成され、これによって各電極１２１，１２４，１２８の間には試料や電解液を収容するための空間１３０（図５参照）が形成されている。上基板１１３に形成された試料注入口１１１は、当該空間１３０内に、標識物質を含む検出物質又は被検物質、電解液、液体試料等を注入することが可能なように上基板１１３を貫通して形成されている。
【００３１】
なお、本実施の形態では、上基板１１３の表面に作用電極１２１を形成し、下基板１１４の表面に対極１２４と参照電極１２８とを形成している。しかし、作用電極１２１、対極１２４、及び参照電極１２８の配置関係は、各電極が他の電極と接触せずに間隔保持部材１１２の枠内に配置されている限り、特に制限されない。例えば、同一基板上に、作用電極１２１と、対極１２４と、参照電極１２８とが配置されていてもよい。また、参照電極１２８を配置せず、対極１２４が参照電極１２８の役割を兼ねてもよい。
【００３２】
図８は、検査チップ１０４の電極部分の一例を模式的に表した概略説明図である。図８に示される検査チップは、後述の酸化還元電流・電気化学発光検出法に用いられる。
この場合、作用電極１２１は、用いられる溶液等に対して安定であり、かつ導電性を有する電極であればよい。
【００３３】
一方、検査チップを後述の光電気化学検出法に用いる場合、作用電極１２１として、図９に示されるように、上基板１１３の表面に形成された導電層１３２と、この導電層１３２の表面に形成された電子受容層（半導体層；半導体電極）１３３とから構成された電極を用いることができる。
導電層１３２は、導電性材料からなる。
電子受容層１３３は、電子を受容可能な物質を含んでいる。また、作用電極１２１の電極リード１２２は、導電層１３２に接続されている。
【００３４】
この作用電極１２１の電子受容層１３３上には、従来の電気化学的検出方法に用いられる装置とは異なり、標識物質を含む検出物質を捕捉するための捕捉物質は設けられていない。このように、かかる作用電極１２１は、洗浄等によりダメージを受ける捕捉物質を有していないため、作用電極１２１は、簡便な処理で再利用可能な状態に戻すことができる。かかる作用電極１２１を有する検査チップ１０４は、再利用することができるので、捕捉物質が固定化された作用電極を有する従来の検査チップと比べて、経済性が高くなっている。そのため、標識物質を含む検出物質又は被検物質を電気化学的に検出するのに要するコストを低減させることができる。したがって、低コストでの臨床検査や診断が可能になる。
【００３５】
なお、後述の光電気化学検出法に用いる検査チップにおいては、作用電極１２１は、図１０に示されるように、上基板１１３の表面に形成された電子受容層（半導体層；半導体電極）１３３から構成されていてもよい。
これらの作用電極の構成は、検査チップの用途、電気化学的検出方法の種類等に応じて適宜選択することができる。なお、かかる作用電極の構成については、下記の電気化学的検出方法とともに説明する。
【００３６】
［検出物質の電気化学的検出方法］
本発明の検出物質の電気化学的検出方法は、標識物質を含む検出物質を電気化学的に検出する方法であって、液体試料中の標識物質を含む検出物質を、標識物質を含む検出物質を捕捉する捕捉物質が存在しない作用電極に誘引する工程と、標識物質を含む検出物質を、電気化学的に検出する工程と、を含むことを特徴とする。本発明の検出物質の電気化学的検出方法には、上述した検出装置及び検査チップを用いることができるが、本発明は、上述した検出装置及び検査チップにより限定されるものではない。以下、「検出物質の電気化学的検出方法」を、「方法（Ａ）」と表記する場合がある。
【００３７】
方法（Ａ）は、標識物質を含む検出物質を捕捉するための捕捉物質が存在しない作用電極（図８、図９及び図１０の作用電極１２１参照）が用いられる点に１つの大きな特徴がある。かかる作用電極は、再利用することができるので、方法（Ａ）によれば、標識物質を含む検出物質の検出を低コストで行なうことができる。
【００３８】
また、方法（Ａ）は、標識物質を含む検出物質を捕捉する捕捉物質が存在しない作用電極の近傍に、標識物質を含む検出物質を移送させる点にも１つの特徴がある。これにより、標識物質を含む検出物質を電気化学的に検出することができる。
【００３９】
方法（Ａ）では、前記標識物質としては、電気化学的又は光化学的に活性な物質が用いられる。電気化学的に活性な物質は、当該物質に基づく酸化還元電流及び／又は電気化学発光を用いて検出される。一方、光化学的に活性な物質は、当該物質が光により励起されることにより放出される電子を用いて検出される。かかる方法（Ａ）は、標識物質の検出技術の種類によって、光電気化学検出法（図１１参照）及び酸化還元電流・電気化学発光検出法（図１２）に大別することができる。
【００４０】
１．光電気化学検出法
光電気化学検出法では、まず、標識物質を含む検出物質を準備する〔図１１中、（Ａ）を参照〕。図１１においては、標識物質を含む検出物質として、標識物質２１ａと誘引用修飾物質２１ｂとからなる修飾標識物質２３ａを用いる場合を例として挙げて説明している（なお、図１３及び図１５においても同様である）。光電気化学検出法では、標識物質２１ａとして、光を照射することにより励起状態となり電子を放出する標識物質が用いられる。
【００４１】
標識物質２１ａとして、金属錯体、有機蛍光体、量子ドット及び無機蛍光体からなる群より選択された少なくとも１つを用いることができる。
前記標識物質の具体例としては、金属フタロシアン、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、鉄錯体、亜鉛錯体、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、ポルフィリン系色素、フタロシアニン系色素、ローダミン系色素、キサンテン系色素、クロロフィル系色素、エオシン系色素、マーキュロクロム系色素、インジゴ系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素、ＣＡＬＦｌｕｏｒ系色素、オレゴングリーン系色素、ロードル（Ｒｈｏｄｏｌ）グリーン、テキサスレッド、カスケードブルー、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、セレン化カドミウム、テルル化カドミウム、Ｌｎ2Ｏ3：Ｒｅ、Ｌｎ2Ｏ2Ｓ：Ｒｅ、ＺｎＯ、ＣａＷＯ4、ＭＯ・ｘＡｌ2Ｏ3：Ｅｕ、Ｚｎ2ＳｉＯ4：Ｍｎ、ＬａＰＯ4：Ｃｅ、Ｔｂ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５及びＣｙ９（いずれも、アマシャムバイオサイエンス社製）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０（いずれも、モレキュラープローブ社製）；ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、ＥＶＯｂｌｕｅ１０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５１、ＤＹ−８００、ＤＹＱ−６６０及びＤＹＱ−６６１（いずれも、Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）；Ａｔｔｏ４２５、Ａｔｔｏ４６５、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ４９５、Ａｔｔｏ５２０、Ａｔｔｏ５３２、Ａｔｔｏ５５０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５９０、Ａｔｔｏ５９４、Ａｔｔｏ６１０、Ａｔｔｏ６１１Ｘ、Ａｔｔｏ６２０、Ａｔｔｏ６３３、Ａｔｔｏ６３５、Ａｔｔｏ６３７、Ａｔｔｏ６４７、Ａｔｔｏ６５５、Ａｔｔｏ６８０、Ａｔｔｏ７００、Ａｔｔｏ７２５及びＡｔｔｏ７４０（いずれも、Ａｔｔｏ−ＴＥＣ  ＧｍｂＨ社製）；ＶｉｖｏＴａｇＳ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ６８０及びＶｉｖｏＴａｇＳ７５０（いずれも、ＶｉｓＥｎＭｅｄｉｃａｌ社製）等が挙げられる。なお、前記ＬｎはＬａ、Ｇｄ、Ｌｕ又はＹを示し、Ｒｅはランタニド族元素を示し、Ｍはアルカリ土類金属元素を示し、ｘは０．５〜１．５の数を示す。標識物質の他の例については、例えば、特許第４０８６０９０号公報、特開平７−８３９２７号公報、特願２００８−１５４１７９号公報等を参照することができる。
【００４２】
誘引用修飾物質２１ｂとしては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸等が挙げられる。
【００４３】
なお、標識物質を含む検出物質は、作用電極へ誘引可能であれば、誘引用修飾物質２１ｂを標識物質２１ａに結合させなくてもよい。
【００４４】
標識物質を含む検出物質は、作用電極１２１への誘引が容易であることから、標識物質で標識された核酸（標識核酸）であることが好ましい。
【００４５】
光電気化学検出法では、つぎに、作用電極１２１に、標識物質を含む検出物質を誘引する〔図１１中、（Ｂ）、「誘引工程」〕。
かかる誘引工程は、標識物質を含む検出物質を、捕捉物質が存在しない作用電極との間で電子輸送が可能な領域に誘引する工程である。前記誘引工程では、標識物質を含む検出物質を作用電極に固定する。
【００４６】
ここで、「捕捉物質が存在しない作用電極との間で電子輸送が可能な領域」は、通常、作用電極から０〜１０ｎｍの範囲の領域である。
【００４７】
光電気化学検出法に用いられる作用電極１２１は、標識物質２１ａの光励起により放出される電子を受容可能な電極である。したがって、作用電極１２１の構成及び材料は、標識物質２１ａとの間で電子輸送が生じるものであればよい。
【００４８】
作用電極１２１は、図９に示されるように、導電層１３２と、この導電層１３２の表面に形成された電子受容層１３３とから構成されていてもよく、図１０に示されるように、電子受容層１３３のみから構成されていてもよい。
【００４９】
電子受容層を構成する電子受容物質は、光励起された標識物質２１ａからの電子注入が可能なエネルギー準位をとり得る物質であればよい。ここで、「光励起された標識物質からの電子注入が可能なエネルギー準位」とは、例えば、電子受容性物質として半導体を用いる場合には、伝導帯（コンダクションバンド）を意味する。すなわち、電子受容物質は、標識物質２１ａの最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー準位よりも低いエネルギー順位を有すればよい。
【００５０】
電子受容物質としては、例えば、シリコン、ゲルマニウム等の単体半導体；チタン、スズ、亜鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸化物を含む酸化物半導体；チタン酸ストロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バナジウム、ニオブ酸カリウム等のペロブスカイト型半導体；カドニウム、亜鉛、鉛、銀、アンチモン、ビスマス等の硫化物を含む硫化物半導体；カドミウム、鉛のセレン化物からなる半導体；カドミウムのテルル化物を含む半導体；亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリン化合物からなる半導体；ガリウム砒素、銅−インジウム−セレン化物、銅−インジウム−硫化物等の化合物を含む半導体が挙げられる。なお、前記半導体は、真性半導体及び不純物半導体のいずれであってもよい。
【００５１】
前記半導体のなかでは、酸化物半導体が好ましい。前記酸化物半導体のうち、真性半導体のなかでは、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジウム、酸化タングステン、酸化タンタル及びチタン酸ストロンチウムが好ましい。また、前記酸化物半導体のうち、不純物半導体のなかでは、スズを含む酸化インジウム及びフッ素を含む酸化スズが好ましい。スズを含む酸化インジウム又はフッ素を含む酸化スズは、電子受容物質としてのみならず導電性基材としても機能する性質を有する。そのため、これらの材料を使用することにより導電性基材を用いることなく電子受容層のみで作用電極として機能させることができる。
【００５２】
さらに、導電層１３２を構成する導電性基材は、ガラス、プラスチック等の非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性を有する材料からなる導電材層が設けられた複合基材であってもよい。かかる導電材層の形状は、薄膜状及びスポット状のいずれであってもよい。
前記複合基材を用いる場合、電子受容層１３３は、前記導電材層上に形成される。導電材層を構成する導電性を有する材料としては、例えば、白金、金、銀、銅、アルミニウム、ロジウム、インジウム等の金属；炭素、炭化物、窒化物等の導電性セラミックス；スズを含む酸化インジウム、フッ素を含む酸化スズ、アンチモンを含む酸化スズ、ガリウムを含む酸化亜鉛、アルミニウムを含む酸化亜鉛等の導電性の金属酸化物等が挙げられる。これらのなかでは、好ましくはスズを含む酸化インジウム及びフッ素を含む酸化スズである。
導電性基材は、導電性を確保できる材料であれば、特に限定されない。したがって、導電性基材には、それ自体では支持体としての強度を有しない導電材層も包含される。
なお、前述のように、電子受容層１３３に用いられる電子受容物質が導電性基材としても機能する物質である場合、作用電極１２１は、かかる導電層１３２を有しなくてもよい。
【００５３】
なお、作用電極１２１には、シランカップリング剤等を用いた表面処理が施されていてもよい。かかる表面処理により、作用電極１２１の表面を親水性又は疎水性を有するように適宜調節することができる。前記シランカップリング剤としては、例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）等のカチオン性シランカップリング剤等が挙げられる。
【００５４】
作用電極１２１への標識物質を含む検出物質の誘引は、検出物質、誘引液及び作用電極との間の疎水性相互作用若しくは親水性相互作用、又は、作用電極又は対極に電圧を印加することによる電気泳動効果を利用すること等により行なうことができる。
【００５５】
本誘引工程は、例えば、
１）  誘引液の疎水性・親水性を変更することにより、検出物質と作用電極１２１との間の疎水性相互作用若しくは親水性相互作用を大きくすること〔すなわち、標識物質を含む検出物質を、極性の違いによって、捕捉物質が存在しない作用電極（作用電極１２１）に誘引すること〕（誘引方法１）、
２）  標識物質を含む検出物質の電荷に応じて、正又は負の電圧を作用電極１２１に印加することにより、電気泳動効果を大きくすること〔すなわち、標識物質を含む検出物質を、電気泳動効果を利用することによって、捕捉物質が存在しない作用電極（作用電極１２１）に誘引すること〕（誘引方法２）
等によって行なうことができる。前記の誘引方法１及び誘引方法２は、それぞれ単独で行なってもよく、両者を組み合わせて行なってもよい。
【００５６】
誘引方法１では、誘引用修飾物質２１ｂとして核酸を用いる場合、誘引液は、検出物質と作用電極１２１との間の疎水性相互作用又は親水性相互作用を大きくして、作用電極１２１の近傍に検出物質を誘引しやすくする観点から、カオトロピックイオンを含有することが好ましい。
【００５７】
前記カオトロピックイオンとしては、例えば、ヨウ化物イオン、臭化物イオン、グアニジンイオン、チオシアン酸イオン、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、塩化物イオン、酢酸イオン、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン等が挙げられる。
【００５８】
誘引液がカオトロピックイオンを含有する場合、誘引液中におけるカオトロピックイオンの濃度は、用いられるカオトロピックイオンの種類により異なる。前記濃度は、通常１．０〜８．０ｍｏｌ／Ｌである。カオトロピックイオンがグアニジンイオンである場合、誘引液中におけるカオトロピックイオンの濃度は、通常、４．０〜７．５ｍｏｌ／Ｌである。また、チオシアン酸イオンである場合、誘引液中におけるカオトロピックイオンの濃度は、通常、３．０〜５．５ｍｏｌ／Ｌである。
【００５９】
なお、標識物質２１ａ又は誘引用修飾物質２１ｂとして核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を用いる場合、慣用の核酸抽出・精製方法を利用して、標識物質を含む検出物質を、作用電極１２１の近傍に誘引させることができる。
【００６０】
前記核酸抽出・精製方法としては、液相を用いる方法、核酸結合用担体を用いる方法等が挙げられる。液相を用いる方法としては、例えば、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ、１９６３年発行、第７２巻、ｐｐ．６１９−６２９）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９７９年発行、第７巻、ｐｐ．１５１３−１５２３）、塩酸グアニジンを含有する緩衝液にエタノールを加え核酸を沈降させる方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６２、１９８７、４６３）等が挙げられる。核酸結合用担体を用いる方法としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液とを用いて核酸をガラス粒子に吸着させ、単離する方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６−２：６１５−６１９，１９７９）や、シリカ粒子とカオトロピックイオンを用いる方法〔例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９０年発行、第２８巻、ｐｐ．４９５−５０３、特許第２６８０４６２号公報等を参照〕等が挙げられる。シリカ粒子とカオトロピックイオンを用いる方法では、まず、核酸が結合するシリカ粒子と試料中の核酸を遊離する能力を有するカオトロピックイオンを含む溶液とを試料と混合して核酸をシリカ粒子に結合させる。つぎに、夾雑物質を洗浄により除去する。その後、シリカ粒子に結合した核酸を回収する。前記方法によれば、簡便、かつ迅速に核酸を抽出することができる。しかも、かかる方法は、ＤＮＡの抽出だけではなく、より不安定であるＲＮＡの抽出にも好適であり、純度の高い核酸が得られるという点で非常に優れている。
そこで、標識物質を含む検出物質が、標識物質２１ａ又は誘引用修飾物質２１ｂとして核酸を含む場合、前記核酸抽出・精製方法に用いられる溶媒を誘引液として用いることにより、検出物質を作用電極１２１の近傍に誘引させることができる。この場合、カオトロピックイオンとして、グアニジンイオン、ヨウ化物イオン、臭化物イオン、チオシアン酸イオン又はこれらの任意の組み合わせを用い、作用電極として核酸を結合する電極（例えば、スズを含む酸化インジウム等）を用いることが好ましい。
【００６１】
また、標識物質を含む検出物質が、標識物質２１ａ又は誘引用修飾物質２１ｂとして核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を含む場合、誘引液は、必要に応じて、緩衝液を含有していてもよい。前記緩衝液は、核酸を安定に保持するために一般に用いられる緩衝液であればよい。前記緩衝液は、核酸を安定に保持する観点から、中性付近、すなわちｐＨ５．０〜９．０において緩衝能を有することが好ましい。前記緩衝液としては、例えば、トリス−塩酸塩、四ホウ酸ナトリウム−塩酸、リン酸二水素カリウム−四ホウ酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。緩衝液の濃度は、１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
【００６２】
一方、誘引方法２では、標識物質を含む検出物質の電荷に応じて、正又は負の電圧を作用電極に印加する。例えば、標識物質を含む検出物質が、標識物質２１ａ又は誘引用修飾物質２１ｂとして核酸を含む場合、核酸は負に荷電している。したがって、作用電極１２１に正の電圧を印加することにより、標識物質を含む検出物質を作用電極１２１の近傍に誘引させることができる。
【００６３】
光電気化学検出法では、つぎに、作用電極１２１の近傍に存在する標識物質を含む検出物質に光を照射して標識物質２１ａを励起させ、光電流を測定することにより、検出物質を検出する〔図１１中、（Ｃ）、「検出工程」〕。
【００６４】
本検出工程では、誘引工程において誘引液を用いた場合、必要に応じて、誘引液を、電気化学的な検出に適した電解液に置換することができる。この場合、電解液の存在下において、標識物質を含む検出物質を電気化学的に検出する。
なお、誘引液が、酸化された状態の標識物質２１ａに電子を供給する性質を有し、検出物質の電気化学的な検出が可能である場合、検出工程において、この誘引液をそのまま用いてもよい。
【００６５】
前記電解液として、酸化された状態の標識物質２１ａに電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性極性溶媒、プロトン性極性溶媒又は非プロトン性極性溶媒とプロトン性極性溶媒との混合物とを含む溶液を用いることができる。この電解液は、所望により、他の成分をさらに含んでいてもよい。
【００６６】
電解質としては、例えば、ヨウ化物、臭化物、金属錯体、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、これらの混合物等が挙げられる。前記電解質の具体例としては、ＬｉＩ、ＮａＩ、ＫＩ、ＣｓＩ、ＣａＩ2等の金属ヨウ化物；テトラアルキルアンモニウムヨーダイド、ピリジニウムヨーダイド、イミダゾリウムヨーダイド等の４級アンモニウム化合物のヨウ素塩；ＬｉＢｒ、ＮａＢｒ、ＫＢｒ、ＣｓＢｒ、ＣａＢｒ2等の金属臭化物；テトラアルキルアンモニウムブロマイド、ピリジニウムブロマイド等の４級アンモニウム化合物の臭素塩；フェロシアン酸塩、フェリシニウムイオン等の金属錯体；チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸アンモニウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸カルシウム等のチオ硫酸塩；亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸鉄、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カルシウム等の亜硫酸塩；及びこれらの混合物等が挙げられる。これらのなかでは、テトラプロピルアンモニウムヨーダイド及びＣａＩ2が好ましい。
【００６７】
電解液の電解質濃度は、好ましくは０．００１〜１５Ｍである。
【００６８】
プロトン性極性溶媒として、水、水を主体に緩衝液成分を混合した極性溶媒等を用いることができる。
非プロトン性極性溶媒としては、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）等のニトリル類；プロピレンカーボネート、エチレンカーボネート等のカーボネート類、１，３−ジメチルイミダゾリノン、３−メチルオキサゾリノン、ジアルキルイミダゾリウム塩等の複素環化合物；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホラン等が挙げられる。非プロトン性極性溶媒のなかでは、アセトニトリルが好ましい。プロトン性極性溶媒及び非プロトン性極性溶媒は、単独で、又は両者を混合して用いることができる。プロトン性極性溶媒と非プロトン性極性溶媒との混合物は、水とアセトニトリルとの混合物が好ましい。
【００６９】
標識物質を含む検出物質への光の照射には、標識物質を光励起することができる波長の光を照射できる光源を用いることができる。かかる光源は、標識物質の種類等に応じて、適宜選択することができる。前記光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸レーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。前記光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ又は太陽光が好ましい。また、検出工程においては、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて特定波長領域の光のみを標識物質を含む検出物質に照射してもよい。
【００７０】
標識物質を含む検出物質に由来する光電流の測定には、例えば、電流計、ポテンショスタット、レコ−ダ及び計算機を備える測定装置等を用いることができる。
本検出工程では、光電流を定量することにより、検出物質の量を調べることができる。
【００７１】
なお、本光電気化学検出法に用いられる作用電極１２１上には、標識物質を含む検出物質を捕捉する捕捉物質が存在しない。したがって、作用電極１２１を簡便な処理で洗浄することができ、再利用することができる。
作用電極の洗浄は、紫外線―オゾン洗浄（ＵＶ-Ｏ3洗浄）等により行なうことができる。前記ＵＶ-Ｏ3洗浄では、紫外線による有機化合物の分解とＯ3の生成及び分解の過程における強力な酸化作用により有機化合物が分解され、電極の表面から除去される。
また、標識物質２１ａ又は誘引用修飾物質２１ｂとして核酸を用いた場合、適切な溶液中で、作用電極上にマイナスの電圧を印加することで、検出物質を作用電極から解離させることもできる。これは、核酸がマイナスに帯電しているからである。前記溶液としては、例えば、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）、ＴＥＢ〔組成：１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕水等が挙げられる。
【００７２】
２．酸化還元電流・電気化学発光検出法
酸化還元電流・電気化学発光検出法においても、前記光電気化学検出法の場合と同様に、まず、標識物質を含む検出物質を準備する。図１２においては、標識物質を含む検出物質として、標識物質２１ａと誘引用修飾物質２１ｂとからなる修飾標識物質２３bを用いる場合を例として挙げて説明する（なお、図１４及び図１６においても同様である）。酸化還元電流・電気化学発光検出法では、標識物質２１ａとして、電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質又は電圧を印加することにより発光する標識物質が用いられる。
【００７３】
電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質としては、例えば、電気的に可逆的な酸化還元反応を起こす金属を中心金属として含む金属錯体等が挙げられる。このような金属錯体としては、例えば、トリス（フェナントロリン）亜鉛錯体、トリス（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、トリス（フェナントロリン）コバルト錯体、ジ（フェナントロリン）亜鉛錯体、ジ（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、ジ（フェナントロリン）コバルト錯体、ビピリジンプラチナ錯体、タ−ピリジンプラチナ錯体、フェナントロリンプラチナ錯体、トリス（ビピリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニュウム錯体、トリス（ビピリジル）コバルト錯体、ジ（ビピリジル）亜鉛錯体、ジ（ビピリジル）ルテニュウム錯体、ジ（ビピリジル）コバルト錯体等が挙げられる。
また、酸化還元電流・電気化学発光検出法においても、誘引用修飾物質としても利用可能な核酸を標識物質として用いてもよい。標識物質として核酸を用いた場合、核酸由来の酸化還元電流として、アデニン、チミン、グアニン、シトシン又はウラシルに由来する酸化還元電流を利用することができる。
【００７４】
電圧を印加することにより発光する標識物質としては、例えば、ルミノ−ル、ルシゲニン、ピレン、ジフェニルアントラセン、ルブレン等が挙げられる。
これらの標識物質の発光は、例えば、ホタルルシフェリン、デヒドロルシフェリンのようなルシフェリン誘導体、フェニルフェノ−ル、クロロフェノ−ルのようなフェノ−ル類若しくはナフト−ル類のようなエンハンサ−を用いることにより増強することが可能である。
【００７５】
酸化還元電流・電気化学発光検出法では、つぎに、作用電極１２１に、標識物質を含む検出物質を誘引する〔図１２中、（Ｂ）、「誘引工程」〕。
【００７６】
かかる誘引工程は、捕捉物質が存在しない作用電極によって標識物質を電子励起可能な領域に誘引する工程である。
【００７７】
作用電極１２１への標識物質を含む検出物質の誘引は、前記光電気検出法における誘引工程と同様の操作により行なうことができる。
【００７８】
ここで、「捕捉物質が存在しない作用電極によって標識物質を電子励起可能な領域」は、電圧を印加することにより作用電極から標識物質に電子が移動し、当該標識物質を電子励起状態にすることができる領域である。前記領域は、通常、作用電極から０〜１０ｎｍの範囲の領域である。
【００７９】
酸化還元電流・電気化学発光検出法に用いられる作用電極１２１（図９参照）としては、例えば、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバー等からなる炭素電極、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム等からなる貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等からなる酸化物電極、電子重要物質としてのＳｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ、ＴｉＯ2、ＧａＡｓ等からなる半導体電極、チタンからなるチタン電極等が挙げられる。
【００８０】
なお、酸化還元電流・電気化学発光検出法に用いられる作用電極１２１には、前記光電気化学検出法に用いられる作用電極１２１と同様に、例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）等のカチオン性シランカップリング剤等のシランカップリング剤等を用いた表面処理が施されていてもよい。かかる表面処理により、作用電極１２１の表面を親水性又は疎水性を有するように適宜調節することができる。
【００８１】
酸化還元電流・電気化学発光検出法では、つぎに、作用電極１２１の近傍に存在する標識物質を含む検出物質に電圧を印加する。そして、標識物質に基づく酸化還元電流又は光を測定することにより、検出物質を検出する〔図１２中、（Ｃ）、「検出工程」〕。なお、図１２中の（Ｃ）は、光を測定する場合を例として挙げて示している。
【００８２】
本検出工程では、誘引工程において誘引液を用いた場合、光電気化学検出法の場合と同様に、必要に応じて、誘引液を、電気化学的な検出に適した電解液に置換することができる。この場合、電解液の存在下において、標識物質を含む検出物質を電気化学的に検出する。
【００８３】
本検出工程において、酸化還元電流を測定する場合、酸化還元電流の測定には、例えば、ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ、レコ−ダ及び計算機を備える測定装置等を用いることができる。
この場合、酸化還元電流を定量することにより、検出物質の量を調べることができる。
【００８４】
本検出工程において、標識物質に基づく光を測定する場合、当該光の測定には、フォトンカウンタ等を用いることができる。また、この場合、電極の代わりに、光ファイバ−の先端に透明電極を形成することにより得られる光ファイバ−電極を用いて間接的に検出することもできる（特許第２５７３４４３号公報を参照）。
【００８５】
本酸化還元電流・電気化学発光検出法に用いられる作用電極１２１上にも、標識物質を含む検出物質を捕捉する捕捉物質が存在しない。したがって、光電気化学検出法に用いられる作用電極１２１の場合と同様に、簡便な処理で作用電極１２１を洗浄することができ、再利用することができる。
作用電極の洗浄は、光電気化学検出法における作用電極の洗浄と同様の操作により行なうことができる。
【００８６】
［被検物質の電気化学的検出方法］
本発明の被検物質の電気化学的検出方法は、被検物質を電気化学的に検出する方法であって、固相上に、標識物質と被検物質とを含む複合体を形成する工程と、複合体が形成された固相を単離する工程と、単離工程で得られた、固相上に形成された複合体から、標識物質を含む検出物質を分離する工程と、分離された標識物質を含む検出物質を、標識物質を含む検出物質を捕捉する捕捉物質が存在しない作用電極に誘引する工程と、標識物質を含む検出物質を、電気化学的に検出する工程と、を含むことを特徴とする。
本発明の被検物質の電気化学的検出方法には、上述した検出装置及び検査チップを用いることができる。しかし、本発明は、上述した検出装置及び検査チップにより限定されるものではない。以下、「被検物質の電気化学的検出方法」を、「方法（Ｂ）」と表記する場合がある。
【００８７】
方法（Ｂ）では、前記標識物質としては、電気化学的又は光化学的に活性な物質が用いられる。かかる方法（Ｂ）は、方法（Ａ）の場合と同様に、標識物質の検出技術の種類によって、光電気化学検出法（図１３参照）及び酸化還元電流・電気化学発光検出法（図１４）に大別することができる。
【００８８】
方法（Ｂ）は、被検物質の量に応じた標識物質を含む検出物質を得る工程〔「被検物質捕捉工程」（図１３及び図１４中の（Ａ））、「検出物質付加工程」（図１３及び図１４中の（Ｂ））、「単離工程」（図１３及び図１４中の（Ｃ））並びに「分離工程」（図１３及び図１４中の（Ｄ））〕が含まれている点で、方法（Ａ）と異なっている。
なお、方法（Ｂ）では、誘引工程〔図１３及び図１４中の（Ｅ）を参照〕及び検出工程〔図１３及び図１４中の（Ｆ）を参照〕は、方法（Ａ）における誘引工程及び検出工程と同様である。また、方法（Ｂ）に用いられる標識物質、誘引用修飾物質、誘引液、作用電極、電解液等は、方法（Ａ）に用いられる標識物質、誘引用修飾物質、誘引液、作用電極、電解液等と同様である。
【００８９】
以下、方法（Ｂ）において、被検物質の量に応じた標識物質を含む検出物質を得る工程について説明する。
【００９０】
方法（Ｂ）では、まず、被検物質１０を、捕捉物質（第１の捕捉物質）３２を介して固相３１上に捕捉する〔図１３及び図１４中の（Ａ）、「被検物質捕捉工程」〕。本被検物質捕捉工程では、固相３１上に第１の捕捉物質３２と被検物質１０とを含む複合体が形成される。このとき、被検物質１０以外の成分は、第１の捕捉物質３２に捕捉されておらず、遊離している。
【００９１】
固相３１は、磁気分離、溶液置換等により、単離可能なものであればよい。かかる固相３１としては、例えば、磁気ビーズ、基板等が挙げられる。
【００９２】
第１の捕捉物質３２は、被検物質１０の種類に応じて適宜選択される。例えば、被検物質１０が核酸である場合、第１の捕捉物質３２は、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ又は前記核酸に対する抗体であればよい。また、被検物質１０がタンパク質又はペプチドである場合、第１の捕捉物質３２は、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体、タンパク質に対するリガンド、ペプチドに対するレセプタータンパク質等であればよい。
【００９３】
第１の捕捉物質３２による被検物質１０の捕捉は、第１の捕捉物質３２と被検物質１０とが結合する条件下で行なうことができる。第１の捕捉物質３２と被検物質１０とが結合する条件は、被検物質１０の種類、固相３１の種類等に応じて適宜選択することができる。
例えば、被検物質が核酸である場合、第１の捕捉物質３２による被検物質１０の捕捉は、リン酸緩衝生理的食塩水等の溶液中で行なうことができる。第１の捕捉物質３２による被検物質１０の捕捉は、例えば、マイクロチューブ（例えば、エッペンドルフチューブ等）中で行なうことができる。
【００９４】
その後、標識物質を含む検出物質（標識結合物質２４）を被検物質１０に付加する〔図１３及び図１４の（Ｂ）、「検出物質付加工程」〕。
被検物質１０への標識物質を含む検出物質（標識結合物質２４）の付加は、標識結合物質２４に含まれる結合物質２２と被検物質１０とが結合する条件下で行なうことができる。結合物質２２と被検物質１０とが結合する条件は、被検物質１０の種類等に応じて適宜選択することができる。
例えば、被検物質が核酸である場合、被検物質１０への標識物質を含む検出物質（標識結合物質２４）の付加は、リン酸緩衝生理的食塩水等の溶液中で行なうことができる。被検物質１０への標識物質を含む検出物質（標識結合物質２４）の付加は、例えば、マイクロチューブ（例えば、エッペンドルフチューブ等）中で行なうことができる。
なお、被検物質１０が核酸である場合、被検物質の捕捉に関与しない部分に制限酵素で切断可能な認識配列を含み、かつ標識物質が結合された核酸（「切断可能な核酸」ともいう）を用いることができる。この場合、固相３１上では、第１の捕捉物質３２と被検物質１０と標識物質とを少なくとも含む複合体が形成される。したがって、後述の分離工程で制限酵素を用いることにより、被検物質の量に応じた標識物質を含む検出物質を簡単に得ることができる。
また、被検物質１０が核酸であり、かつ標識物質を含む検出物質に核酸が含まれる場合には、後述の分離工程において、固相３１上に形成された複合体を加熱してもよい。これにより、被検物質の量に応じた標識物質を含む検出物質を簡単に得ることができる。
【００９５】
なお、検出物質付加工程では、標識物質を含む検出物質として、固相３１上に形成された第１の捕捉物質３２と被検物質１０とを含む複合体を認識して捕捉する物質を用いてもよい。
例えば、被検物質１０が核酸であり、第１の捕捉物質３２が核酸を含む場合、標識物質を含む検出物質として、二本鎖核酸を認識する挿入剤(ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ)を用いることができる挙げることができる。前記挿入剤は、その分子中にフェニル基等の平板状挿入基を有している。この平板状挿入基は、二本鎖核酸（被検物質１０と第１の捕捉物質３２との複合体）の塩基対と塩基対との間に介入する。これにより、前記挿入剤は、前記二本鎖核酸と結合する。
前記挿入剤のなかには、電気化学的変化を生じる挿入剤（電気化学的に活性な物質）や光学的変化を生じる挿入剤（光化学的に活性な物質）がある。これらの挿入剤が結合した二本鎖核酸は、前記挿入剤の電気化学的変化又は光学的変化を測定することによって検出することができる。したがって、電気化学的変化を生じる挿入剤又は光学的変化を生じる挿入剤を標識物質として用いてもよい。前記挿入剤としては、特に限定されないが、例えば、エチジウム、エチジウムブロマイド、アクリジン、アミノアクリジン、アクリジンオレンジ、プロフラビン、エリブチシン、アクチノマイシンＤ、ドーノマイシン、マイトマイシンＣ等を用いることができる。また、その他の使用可能な挿入剤としては、特開昭６２−２８２５９９号公報、特許第２５７３４４３号公報等に記載の挿入剤等が挙げられる。
【００９６】
つぎに、複合体が形成された固相３１を単離する〔図１３及び図１４の（Ｃ）、「単離工程」〕。
【００９７】
本単離工程では、固相３１の単離方法は、固相３１の種類等に応じて適宜選択することができる。
例えば、固相３１が磁気ビーズである場合、磁石に固相３１（磁気ビーズ）が引き寄せられる。この場合、磁石を用いることにより、固相３１（磁気ビーズ）を簡単に単離することができる。
また、固相３１が基板である場合、基板上の溶液を新しい溶液に置換することにより、被検物質１０以外の成分を除去することができる。この場合、基板上の溶液の置換により、固相３１を簡単に単離することができる。
【００９８】
つぎに、単離工程で得られた、固相３１上に形成された複合体から、標識物質を含む検出物質（図１３及び図１４の（Ｄ）中、修飾標識物質２３）を分離する〔図１３及び図１４の（Ｄ）、「分離工程」〕。
【００９９】
本分離工程では、前記検出物質付加工程で用いられた標識物質を含む検出物質（標識結合物質２４）の種類に応じた分離方法により、標識物質を含む検出物質を分離する。
【０１００】
例えば、被検物質１０が核酸であり、被検物質と相補的な配列を有する核酸が修飾された標識物質が用いられる場合、固相３１上に形成された複合体を含む溶液を加熱することにより、被検物質の量に応じた標識物質を含む検出物質を簡単に固相から分離することができる。
また、標識物質に前記切断可能な核酸が修飾されている場合、制限酵素で前記切断可能な核酸中の認識配列を切断することにより、被検物質の量に応じた標識物質を含む検出物質を得ることができる。
上述のように、標識物質を含む検出物質に核酸が含まれる場合には、誘引工程において、核酸抽出・精製に用いられる溶液（例えば、キアジェン社製、商品名：ＰＢ  ｂｕｆｆｅｒ等）を用いることができる。この場合、まず、前記溶液を、分離工程で回収された前記液相に添加する。そして、得られた混合物を作用電極１２１上に滴下する。これにより、標識物質を含む検出物質（修飾標識物質２３）を作用電極１２１の近傍に誘引させることができる。
被検物質が核酸以外の物質である場合、標識物質２１ａ又は誘引用修飾物質２１ｂとして核酸を用いてもよい。これにより、前記と同様に簡便に被検物質の検出を行なうことができる。
【０１０１】
なお、方法（Ｂ）では、図１５及び図１６に示されるように、単離工程の後に、検出物質付加工程を行なってもよい。
【０１０２】
さらに、本発明の被検物質の電気化学的検出方法には、電気化学的又は光化学的に活性な被検物質を電気化学的に検出する方法であって、固相上に、被検物質を固定する工程と、被検物質が固定された固相を単離する工程と、単離工程で得られた被検物質が固定された固相から、被検物質又は被検物質の一部を分離する工程と、分離された被検物質又は被検物質の一部を、被検物質又は被検物質の一部を捕捉する捕捉物質が存在しない作用電極に誘引する工程と、被検物質又は被検物質の一部を、電気化学的に検出する工程と、を含む被検物質の電気化学的検出方法も含まれる〔方法（Ｃ）という〕。
【０１０３】
方法（Ｃ）によれば、具体的には、被検物質１０が核酸である場合、まず、被検物質１０を磁気ビーズ等の固相３１に固定された第１の捕捉物質３２を介して当該固相３１上に固定化する。つぎに、得られた固相３１を単離することにより被検物質１０以外の成分を除去する。そして、被検物質１０と第１の捕捉物質３２とを含む複合体が形成された固相３１に加熱処理又は制限酵素処理を施して被検物質１０又は被検物質１０の一部（あるいは、標識物質）を分離する。その後、検出物質を、誘引液を用いて作用電極の近傍に誘引させ、酸化還元電流を測定して、被検物質１０を検出する。
【０１０４】
［検出キット］
本発明の検出キットは、被検物質を電気化学的に検出するための検出セットであって、被検物質を捕捉する第１の捕捉物質が固定された固相と、被検物質を捕捉する結合物質が標識物質で標識された標識結合物質と、結合物質から分離された標識物質を含む検出物質を捕捉する第２の捕捉物質が存在しない作用電極と導電性材料からなる対極とを備えた検査チップと、を含むことを特徴とする。
かかる検出キットは、標識物質と被検物質とを含む複合体が形成された固相から、標識物質を含む検出物質を分離する分離剤をさらに含んでいてもよい。
【０１０５】
前記固相、標識結合物質及び検査チップは、前述のとおりである。
【０１０６】
分離剤は、被検物質及び第１の捕捉物質の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質が核酸である場合、分離剤として、制限酵素等を用いることができる。
【実施例】
【０１０７】
以下、実施例等により、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本実施例においては、被検物質の光電気化学検出法に関する実施例を示す。
【０１０８】
（実施例１）
極性の違いを利用することにより、標識物質を含む検出物質を作用電極の近傍に誘引することができるかどうかを検証した。
【０１０９】
（１）作用電極部の作製
二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板上に、スパッタリングにより、スズを含む酸化インジウムからなる厚さ２００ｎｍの半導体層を形成し、半導体電極部を得た。前記半導体電極部には、電流計と接続するための半導体電極リードを接続した。
【０１１０】
（２）対極部の作製
二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板上に、スパッタリングにより、白金薄膜からなる厚さ２００ｎｍの導電層を形成し、対極部を得た。この対極部には電流計と接続するための対極リードを接続した。
【０１１１】
（３）標識物質を含む検出物質の調製
標識物質を含む検出物質として、２４ヌクレオチド長のＤＮＡ（誘引用修飾物質）とＡｌｅｘａ  ７５０（インビトロジェン社製）（標識物質）とからなる複合体（標識物質と誘引用修飾物質とからなる修飾標識物質）を使用した。
【０１１２】
（４）誘引液及び電解液の調製
標識物質を作用電極の近傍へ誘引させるための誘引液と、電気化学検出に用いるための電解液は、必ずしも同一である必要はないが、本実施例においては、同一の液体で固定・検出が可能である液体（「誘引電解液」ともいう）及び標識物質を含む検出物質の組み合わせを使用した。なお、本実施例では、誘引電解液に用いられる溶媒として非プロトン性極性溶媒を用いた。
【０１１３】
アセトニトリルとエチレンカーボネートとを体積比で２：３となるように混合し、非プロトン性極性溶媒を得た。かかる非プロトン性極性溶媒を誘引電解液に用いる溶媒とした。
【０１１４】
また、前記非プロトン性極性溶媒に、電解質塩として、テトラプロピルアンモニウムヨーダイドをその濃度が０．６Ｍとなるように溶解させた。得られた溶液に、さらに電解質として、ヨウ素をその濃度が０．０６Ｍとなるように溶解させ、誘引電解液を得た。
【０１１５】
（５）光電流の測定
標識物質を含む検出物質を固定した作用電極部を有する基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。
【０１１６】
電解液で検出物質の濃度を０Ｍ（実験番号１）又は１ｎＭ（実験番号２）となるように調整し、検出液を得た。なお、「検出液」とは、電気化学的な検出を行なう際、測定の対象となる液体をいう。前記シリコーンゴムで形成された空間に、前記検出液１０μＬを充填した。そして、前記検出液が充填された空間を、作用電極部を有する基板の上方から、対極部を有する基板で密封した。これにより、作用電極部と対極部とを電解液に接触させた。つぎに、作用電極リードと対極リードとを電流計に接続した。
【０１１７】
作用電極部側から対極部に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射した。光照射により、標識物質が励起され、電子を生じる。そして、前記電子が半導体層に輸送されることにより、作用電極部と対極部との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。
【０１１８】
なお、実験番号２においては、実験番号１で用いた作用電極とは異なる作用電極を用いた。また、実験番号２で用いた作用電極をエタノールで洗浄、風乾させた後、シリコーンゴムで形成された空間内へ検出物質を含まない検出液を充填し、再度測定を行なった（実験番号３）。
【０１１９】
実施例１において、実験番号１〜３での光電流の測定結果を図１７に示す。
【０１２０】
図１７に示された結果から、検出物質を含む検出液（実験番号２）において、標識物質を含む検出物質由来の光電流が流れたことがわかる。したがって、前記修飾標識物質、誘引電解液及び作用電極との間の極性の違いを利用して、標識物質を含む検出物質を検出できることが示唆される。
また、図１７に示された結果から、検出物質を含まない検出液（実験番号３）において、実験番号２と同程度の光電流が流れたことがわかる。したがって、実験番号２で得られた光電流は、作用電極に誘引された標識物質を含む検出物質に由来していることがわかる。また、誘引された検出物質は溶液を置換した後も作用電極上に保持されていることがわかる。
【０１２１】
（実施例２）
実施例１における非プロトン性極性溶媒の代わりに、プロトン性極性溶媒である水を用いた。また、カオトロピックイオンを含む誘引電解液として、ヨウ化カルシウムをその濃度が１．５Ｍとなるように水で溶解させて得られた液体を用いた。さらに、検出液として、検出物質の濃度が０Ｍ（実験番号４）又は１μＭ（実験番号５）の検出液を用いた。これらの点を除き、実施例１と同様に操作を行なった。そして、極性の違いを利用することにより、標識物質を含む検出物質を作用電極の近傍に誘引することができるかどうかを検証した。
【０１２２】
なお、光電流の測定に際し、実験番号５においては、実験番号４で用いた作用電極とは異なる作用電極を用いた。また、実験番号５で用いた作用電極をエタノールで洗浄、風乾させた後、シリコーンゴムで形成された空間内へ検出物質を含まない検出液を充填し、再度測定を行なった（実験番号６）。
【０１２３】
実施例２において、実験番号４〜６での光電流の測定結果を図１８に示す。
【０１２４】
図１８に示された結果から、検出物質を含む検出液（実験番号５）において、標識物質を含む検出物質由来の光電流が流れたことがわかる。したがって、誘引電解液に用いられる溶媒として、プロトン性極性溶媒が用いた場合であっても、当該検出物質を検出できることが示唆される。
また、図１８に示された結果から、検出物質を含まない検出液（実験番号６）において、実験番号５と同程度の光電流が流れたことがわかる。したがって、実験番号５で得られた光電流は、作用電極に誘引された標識物質を含む検出物質に由来していることがわかる。また、誘引された検出物質は溶液を置換した後も作用電極上に保持されていることがわかる。
【０１２５】
（実施例３）
本実施例では、標識物質を含む検出物質として、Ａｌｅｘａ７５０（インビトロジェン社）を用いた。また、検出液として、検出物質の濃度が０Ｍ（実験番号７）又は１μＭ（実験番号８）の検出液を用いた。これらの点を除き、実施例１と同様に操作を行なった。そして、標識物質を含む検出物質が標識物質のみからなるものである場合においても、検出物質を作用電極の近傍に誘引できるかどうかを検証した。
【０１２６】
なお、光電流の測定に際し、実験番号８においては、実験番号７で用いた作用電極とは異なる作用電極を用いた。また、実験番号８で用いた作用電極をエタノールで洗浄、風乾させた後、シリコーンゴムで形成された空間内へ検出物質を含まない検出液を充填し、再度測定を行なった（実験番号９）。
【０１２７】
実施例３において、実験番号７〜９での光電流の測定結果を図１９に示す。
【０１２８】
図１９に示された結果から、検出物質を含む検出液（実験番号８）において、標識物質を含む検出物質由来の光電流が流れたことがわかる。したがって、この結果から、標識物質を含む検出物質として、標識物質のみを用いた場合であっても、当該検出物質を検出できることが示唆される。
また、図１９に示された結果から、検出物質を含まない検出液（実験番号９）において、実験番号８と同程度の光電流が流れたことがわかる。したがって、実験番号８で得られた光電流は、作用電極に誘引された標識物質を含む検出物質に由来していることがわかる。また、誘引された検出物質は溶液を置換した後も作用電極上に保持されていることがわかる。
また、実験番号２（図１７）は、実験番号８（図１９）に比べて、検出物質濃度に対する光電流値が大きいことから、ＤＮＡは、作用電極に標識物質を誘引させる誘引用修飾物質として機能することがわかる。
【０１２９】
（実施例４）
簡便な処理により作用電極を洗浄することにより、作用電極を再利用することができるかどうかを検証した。
【０１３０】
実施例１において、標識物質を含む検出物質の濃度が１０ｎＭとなるように調整された検出液を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行なうことにより、光電流を測定した（実験番号１０：初回測定）。
【０１３１】
また、再利用のための洗浄処理として、先ず、実験番号１０で用いた作用電極をエタノールで洗浄し、風乾した。つぎに、リン酸緩衝生理的食塩水で、シリコーンゴムで形成された空間内の溶液を置換し、作用電極に直流電圧（−１Ｖ）を２分間印加した。その後、作用電極をエタノールで洗浄し、風乾させた。
洗浄処理の後、前記作用電極を用い、検出物質の濃度が０ｎＭである検出液について、光電流を測定した（実験番号１１）。
【０１３２】
さらに、実験番号１１で用いた作用電極をエタノールで洗浄、風乾させた。その後、前記作用電極を用い、検出物質の濃度が１０ｎＭである検出液について、光電流を測定した（実験番号１２：再測定）。
【０１３３】
実施例４において、実験番号１０〜１２での光電流の測定結果を図２０に示す。
【０１３４】
図２０に示された結果から、作用電極を洗浄した場合でも標識物質を含む検出物質由来の光電流が流れたこと（実験番号１２）が確認できたことから、本発明の方法によれば、作用電極が再利用できることがわかる。
【０１３５】
（実施例５）
測定を行なう前に再利用のための洗浄処理を行なった同一の作用電極を用いて、検出物質の濃度が０ｎＭ（実験番号１３）、０．１ｎＭ（実験番号１４）、１ｎＭ（実験番号１５）又は１０ｎＭ（実験番号１６）である検出液を測定したことを除き、実施例１と同様の操作を行なうことにより、光電流を測定した。なお、再利用のための洗浄処理を、実施例４における実験番号１１の場合と同様に行なった。
【０１３６】
実施例５において、実験番号１３〜１６での光電流の測定結果を図２１に示す。
【０１３７】
図２１に示された結果から、検出物質の濃度が高くなるにつれて、光電流が増加したことから、本発明の方法によれば、標識物質を含む検出物質を定量できることがわかる。
【０１３８】
（実施例６）
実施例１の（１）で得られた作用電極の光照射部の表面に対して、シランカップリング剤であるＡＰＴＥＳにより表面処理を施した。
【０１３９】
実施例１において、ＡＰＴＥＳで表面が処理された作用電極を用い、標識物質を含む検出物質の濃度が１ｎＭである検出液を用いたことを除き、実施例１における実験番号１と同様の操作を行ない、光電流を測定した（実験番号１８）。
【０１４０】
また、前記において、ＡＰＴＥＳで表面が処理されていない作用電極を用いたことを除き、前記と同様にして、光電流を測定した（実験番号１７）。
【０１４１】
実施例６において、実験番号１７及び１８での光電流の測定結果を図２２に示す。
【０１４２】
図２２に示された結果から、表面処理を施した作用電極を用いた場合においても、標識物質を含む検出物質由来の光電流を検出することができることが示唆される。
【０１４３】
（実施例７）
誘引液がカオトロピックイオンを含まない場合においても、検出物質を作用電極近傍に誘引できるかどうかを検証した。
本実施例では、標識物質を含む検出物質として、被検物質を捕捉する結合物質（抗マウスＩｇＧ抗体）が標識物質〔インビトロジェン社製、Ａｌｅｘａ  ７５０〕で標識された標識結合物質を用いた。また、誘引液の溶媒として、カオトロピックイオンを含まないプロトン性溶媒と非プロトン性溶媒との混合液〔トリス緩衝食塩液（ＴＢＳ）とアセトニトリル（ＡＮ）とエチレンカーボネート（ＥＣ）との混合液（ＴＢＳ：ＡＮ：ＥＣ（体積比）＝５：２：３）を用いた。電解液に用いられる溶媒として非プロトン性溶媒〔アセトニトリルとエチレンカーボネートとの体積比が２：３である混合液〕を用いた。前記非プロトン性極性溶媒に、電解質塩として、テトラプロピルアンモニウムヨーダイドをその濃度が０．６Ｍとなるように溶解させた。得られた溶液に、さらに電解質として、ヨウ素をその濃度が０．０６Ｍとなるように溶解させ、電解液を得た。
【０１４４】
実施例１の（１）で得られた作用電極部を有する基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。前記シリコーンゴムで形成された空間に、標識物質を含む検出物質の濃度が０ｇ／ｍＬ（実験番号１９）又は１μｇ／ｍＬ（実験番号２０）である誘引液１０μＬを注入した。そして、前記誘引液が充填された空間を、作用電極部を有する基板の上方から、カバーガラスで密封し、１０分間静置させた。その後、カバーガラス及びシリコーンゴムを外し、作用電極をエタノールで洗浄、風乾させた（誘引工程）。
【０１４５】
つぎに、作用電極部を有する基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。前記シリコーンゴムで形成された空間に、電解液１０μＬを注入した。そして、前記電解液が充填された空間を、作用電極部を有する基板の上方から、実施例１の（２）で得られた対極部を有する基板で密封した。これにより、作用電極部と対極部とを電解液に接触させた。つぎに、作用電極リードと対極リードとを電流計に接続した。
【０１４６】
作用電極部側から対極部に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射した。これにより、標識物質が励起され、励起された標識物質から発生した電子が半導体層に輸送され、作用電極部と対極部との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。
【０１４７】
実施例７において、実験番号１９及び２０での光電流の測定結果を図２３に示す。
【０１４８】
図２３に示された結果から、実験番号２０において、標識物質を含む検出物質由来の光電流が流れたことがわかる。したがって、誘引液がカオトロピックイオンを含まない場合であっても、標識物質を含む検出物質を検出することができることが示唆される。
また、本実施例では、誘引工程後、検出物質を含まない検出液へ溶液を置換し、検出物質由来の光電流を検出している。したがって、実験番号２０で得られた光電流は、作用電極に誘引された標識物質を含む検出物質に由来していることがわかる。また、誘引された検出物質は溶液置換後も作用電極上に保持されていることがわかる。
【０１４９】
（実施例８）
本実施例では、固相上に、標識物質と被検物質とを含む複合体を形成する工程と、複合体が形成された固相を単離する工程と、単離工程で得られた、固相上に形成された複合体から、標識物質を含む検出物質を分離する工程とを含む、「被検物質の電気化学的検出方法」（「方法（Ｂ）」）により、被検物質を定量できるかどうかを検証した。
【０１５０】
（１）被検物質
本実施例では、被検物質として、マウスＩｇＧ（シグマ社製）を使用した。
【０１５１】
（２）捕捉物質が修飾された固相の調製
捕捉物質として抗マウスＩｇＧ抗体（カッペル社製）を用い、固相として、アミノ基修飾されたビーズ（住友ベークライト社製、アフィニティビーズ粒径５μｍ）を使用した。前記ビーズ３７ｍｇをタンパク質固定化用緩衝液（住友ベークライト社製）１ｍＬと混合し、抗マウスＩｇＧ抗体をその濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、得られた混合物を３７℃で４時間攪拌した。つぎに、遠心分離操作により、上澄み液を除去し、沈殿物をＰＢＳで洗浄した。その後、不活性化用緩衝液（住友ベークライト社製）１ｍＬを添加し、室温で１時間攪拌した。遠心分離操作により、上澄み液を除去し、沈殿物をＰＢＳで洗浄した。これらの手順により、捕捉物質が修飾された固相を調製した。
【０１５２】
（３）標識結合物質の調製
標識結合物質として、捕捉物質に用いるものと同様の抗マウスＩｇＧ抗体に、Ａｌｅｘａ  ７５０（標識物質）（インビトロジェン社製）が結合されたものを用いた。
【０１５３】
上記したもの以外の作用電極部及び対極部は、実施例１で用いたものと同様のものを用いた。また、誘引液及び電解液については実施例７で用いたものと同様のものを用いた。
【０１５４】
（４）処理手順
本実施例における処理手順を図２４に基づき説明する。
【０１５５】
（ａ）被検物質捕捉工程
１％  Ｔｗｅｅｎを混合したトリス緩衝液（ＴＢＳＴ）を溶媒として用いた。この溶媒に、被検物質であるマウスＩｇＧを、その濃度が０．０１ｎｇ／ｍＬ（実験番号２１）、０．１ｎｇ／ｍＬ（実験番号２２）、１ｎｇ／ｍＬ（実験番号２３）又は１０ｎｇ／ｍＬ（実験番号２４）となるように添加して５００μＬの混合物を得た。マイクロチューブ内にて、前記混合物を、捕捉物質が修飾された固相と混合し、得られた混合物を室温で１時間攪拌することにより、固相上に被検物質を捕捉した（図２４（Ａ）参照）。
【０１５６】
（ｂ）単離工程
前記被検物質捕捉工程において被検物質を捕捉した固相を、遠心分離によって単離し、ＴＢＳＴで洗浄した（図２４（Ｂ）参照）。
【０１５７】
（ｃ）検出物質付加工程
ＴＢＳＴを溶媒として用いた。この溶媒に上記した標識結合物質をその濃度が１μｇ／ｍＬとなるように添加して５００μＬの混合物を得た。得られた混合物をマイクロチューブに添加し、混合し、室温で１時間攪拌した。その後、遠心分離により、固相−捕捉物質−被検物質−標識結合物質からなる複合体を単離した（図２４（Ｃ）参照）。
【０１５８】
（ｄ）分離工程
遠心分離操作により、前記検出物質付加工程で得られた複合体をＴＢＳＴで洗浄した後、溶媒をＴＢＳＴからＴＢＳへ置換し、前記複合体を含む混合物の最終液量が１０μＬとなるように調整した。その後、前記混合物を６０℃で１５分間加熱することにより、標識結合物質を複合体より分離した。加熱により被検物質と捕捉物質との結合が切断される場合と被検物質と結合物質との結合が切断される場合とが生じ得るが、いずれの場合でも標識結合物質が分離されてくることとなる。ついで、遠心分離により上澄みを採取した（図２４（Ｄ）参照）。
【０１５９】
以降の誘引工程及び検出工程については、シリコーンゴムで形成された空間に、採取した溶液（上澄み）５μＬを作用電極へ滴下後、誘引溶媒５μＬを添加したことを除き、実施例７に記載した方法により行った（図２４（Ｅ）及び（Ｆ）参照）。
【０１６０】
実施例８において、実験番号２１〜２４での光電流の測定結果を図２５に示す。図２５に示された結果から、被検物質の濃度が高くなるにつれて、光電流が増加したことから、本発明の方法（Ｂ）によっても、被検物質を定量できることがわかった。
【符号の説明】
【０１６１】
１０    被検物質
２１ａ  標識物質
２１ｂ  誘引用修飾物質
２２    結合物質
２３    修飾標識物質
２４    標識結合物質
３０    複合体
３１    固相
３２    捕捉物質
１０１  検出装置
１０２  ディスプレイ
１０３  チップ受入部
１０４  検査チップ
１０５  光源
１０６  電流計（電流測定部）
１０７  Ａ／Ｄ変換部
１０８  制御部
１０９  電源（電位印加部）
１１２  間隔保持部材
１１３  上基板
１１４  下基板
１２１  作用電極
１２２  電極リード
１２４  対極
１２５  電極リード
１２８  参照電極
１２９  電極リード
１３０  空間
１３２  導電層
１３３  電子受容層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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