(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反芻動物の消化活動に由来するメタン生成を低減するための動物飼養における活性化合物としての、式（Ｉ）
【化１】
0005984189.tif 000033
（式中、
Ｙは、次の組成：ＣａＨｂＯｄＮｅＳｇの有機分子であり、
ここで、
ａは、１〜２５に含まれ、
ｂは、２〜５１に含まれ、
ｄは、０〜８に含まれ、
ｅは、０〜５に含まれ、
ｇは、０〜３に含まれる）
により定義される少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも１種の有機分子またはその塩の使用であって、
式（ＩＩ）
【化２】
0005984189.tif 000034
（式中、
ｕは、０〜２３に含まれ、ここで、ｕ≠０のとき、炭素鎖は、モノ不飽和またはポリ不飽和であってもよいかつ任意の異性体形であってもよい、線状、環状、または分岐線状もしくは分岐環状の脂肪族炭素鎖であり、
Ｚは、独立して、Ｏ、ＮＨ、またはＮ−Ｒ３であり、ここで、Ｒ１≠Ｈのとき、Ｚ−Ｒ１は、エステル誘導体または第二級アミド誘導体を表し、
Ｒ１は、独立して、水素、または１〜１０個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、
Ｒ２は、独立して、水素、または１〜２３個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、かつ
Ｒ３は、独立して、水素、または１〜１０個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基である）
により定義されるニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体が除外される、使用。
【請求項２】
ａが、１〜１０に含まれ、
ｂが、２〜２１に含まれ、
ｄが、０〜６に含まれ、
ｅが、０〜３に含まれ、
ｇが、０〜１に含まれる
請求項１に記載の使用。
【請求項３】
式（Ｉ）で示される少なくとも１種の有機分子が、式（ＩＩＩ）
【化３】
0005984189.tif 000035
（式中、
ｎは、０〜１２に含まれ、ここで、ｎ≠０のとき、炭素鎖は、非置換であっても、３個までのヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、もしくはニトロオキシ基で置換されていてもよい、線状、環状、もしくは分岐状の脂肪族炭素鎖、またはモノ不飽和もしくはポリ不飽和のかつ任意の異性体形のアルケニル炭素鎖もしくはアルキニル炭素鎖であり、
Ｒ４は、独立して、水素、または１〜１２個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、
Ｘは、水素、Ｒ５、Ｒ５≡Ｎ、−ＯＲ５、−ＯＣＯＲ５、−ＮＲ５Ｒ６、−ＯＮＯ２、−ＣＯＯＲ５、−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨＳＯ２Ｒ５、または−ＳＯ２ＮＨＲ５であり、
Ｒ５およびＲ６は、独立して、水素、または非置換の、もしくは３個までのヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、もしくはニトロオキシ基で置換された、Ｃ１〜Ｃ１２の直線状、分岐状、もしくは環状のアルキル鎖、モノ不飽和もしくはポリ不飽和であってもよいかつ任意の異性体形であってもよいアルケニル炭素鎖もしくはアルキニル炭素鎖である）
で示される化合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ｎが０〜６に含まれる、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ４が独立して、水素、または１〜６個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基である、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
式（Ｉ）で示される少なくとも１種の有機分子またはその塩が、３−ニトロオキシプロパノール、ラセミ体−４−フェニルブタン−１，２−ジイルジニトレート、２−（ヒドロキシメチル）−２−（ニトロオキシメチル）−１，３−プロパンジオール、Ｎ−エチル−３−ニトロオキシ−プロピオン酸スルホニルアミド、５−ニトロオキシ−ペンタンニトリル、５−ニトロオキシ−ペンタン、３−ニトロオキシ−プロピルプロピオネート、１，３−ビス−ニトロオキシプロパン、１，４−ビス−ニトロオキシブタン、１，５−ビス−ニトロオキシペンタン、３−ニトロオキシ−プロピルベンゾエート、３−ニトロオキシ−プロピルヘキサノエート、３−ニトロオキシ−プロピル５−ニトロオキシ−ヘキサノエート、ベンジルニトレート、イソソルビド−ジニトレート、ならびにＮ−［２−（ニトロオキシ）エチル］−３−ピリジンカルボキサミド、２−ニトロ−５−ニトロオキシメチル−フラン、およびビス−（２−ニトロオキシエチル）エーテルから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
式（Ｉ）で示される少なくとも１種の有機分子またはその塩が、３−ニトロオキシプロパノール、５−ニトロオキシ−ペンタンニトリル、５−ニトロオキシ−ペンタン、３−ニトロオキシ−プロピルプロピオネート、１，３−ビス−ニトロオキシプロパン、１，４−ビス−ニトロオキシブタン、１，５−ビス−ニトロオキシペンタン、３−ニトロオキシ−プロピルベンゾエート、３−ニトロオキシ−プロピルヘキサノエート、３−ニトロオキシ−プロピル５−ニトロオキシ−ヘキサノエート、イソソルビド−ジニトレート、ならびにＮ−［２−（ニトロオキシ）エチル］−３−ピリジンカルボキサミド、およびビス−（２−ニトロオキシエチル）エーテルから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
式（Ｉ）で示される少なくとも１種の有機分子が、３−ニトロオキシプロパノールと１，３−ビス−ニトロオキシプロパンとの混合物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
式（Ｉ）で示される少なくとも１種の有機分子またはその塩が、ジアリルジスルフィド、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、少なくとも１種の追加の活性物質と組み合される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記反芻動物が、ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、スイギュウ、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ウィルドビースト、アンテロープ、プロングホーン、およびニルガイからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
代謝チャンバー内で測定したときに乾物摂取量１キログラムあたりのリットル数で計算される反芻動物のメタン生成量が少なくとも１０％低減される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記反芻動物に投与される式（Ｉ）に定義される少なくとも１種の活性化合物の量が、飼料１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｇである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
式（Ｉ）により定義される少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも１種の有機分子またはその塩を含む、飼料組成物または飼料添加物。
【化４】
0005984189.tif 000036
（式中、
Ｙは、次の組成：ＣａＨｂＯｄＮｅＳｇの有機分子であり、
ここで、
ａは、１〜１０に含まれ、
ｂは、２〜２１に含まれ、
ｄは、０〜６に含まれ、
ｅは、０〜３に含まれ、
ｇは、０〜１に含まれる
ただし、式（ＩＩ）により定義されるニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体が除外される
【化５】
0005984189.tif 000037
（式中、
ｕは、０〜２３に含まれ、ここで、ｕ≠０のとき、炭素鎖は、モノ不飽和またはポリ不飽和であってもよいかつ任意の異性体形であってもよい、線状、環状、または分岐線状もしくは分岐環状の脂肪族炭素鎖であり、
Ｚは、独立して、Ｏ、ＮＨ、またはＮ−Ｒ３であり、ここで、Ｒ１≠Ｈのとき、Ｚ−Ｒ１は、エステル誘導体または第二級アミド誘導体を表し、
Ｒ１は、独立して、水素、または１〜１０個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、
Ｒ２は、独立して、水素、または１〜２３個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、かつ
Ｒ３は、独立して、水素、または１〜１０個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基である））
【請求項１４】
式（Ｉ）で示される少なくとも１種の有機分子が、式（ＩＩＩ）
【化６】
0005984189.tif 000038
（式中、
ｎは、０〜１２に含まれ、ここで、ｎ≠０のとき、炭素鎖は、非置換であっても、３個までのヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、もしくはニトロオキシ基で置換されていてもよい、線状、環状、もしくは分岐状の脂肪族炭素鎖、またはモノ不飽和もしくはポリ不飽和のかつ任意の異性体形のアルケニル炭素鎖もしくはアルキニル炭素鎖であり、
Ｒ４は、独立して、水素、または１〜１２個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、
Ｘは、水素、Ｒ５、Ｒ５≡Ｎ、−ＯＲ５、−ＯＣＯＲ５、−ＮＲ５Ｒ６、−ＯＮＯ２、−ＣＯＯＲ５、−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨＳＯ２Ｒ５、または−ＳＯ２ＮＨＲ５であり、
Ｒ５およびＲ６は、独立して、水素、または非置換の、もしくは３個までのヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、もしくはニトロオキシ基で置換された、Ｃ１〜Ｃ１２の直線状、分岐状、もしくは環状のアルキル鎖、モノ不飽和もしくはポリ不飽和であってもよいかつ任意の異性体形であってもよいアルケニル炭素鎖もしくはアルキニル炭素鎖である）
で示される化合物である、請求項１３に記載の飼料組成物または飼料添加物。
【請求項１５】
式（Ｉ）で示される少なくとも１種の有機分子またはその塩が、３−ニトロオキシプロパノール、ラセミ体−４−フェニルブタン−１，２−ジイルジニトレート、２−（ヒドロキシメチル）−２−（ニトロオキシメチル）−１，３−プロパンジオール、Ｎ−エチル−３−ニトロオキシ−プロピオン酸スルホニルアミド、５−ニトロオキシ−ペンタンニトリル、５−ニトロオキシ−ペンタン、３−ニトロオキシ−プロピルプロピオネート、１，３−ビス−ニトロオキシプロパン、１，４−ビス−ニトロオキシブタン、１，５−ビス−ニトロオキシペンタン、３−ニトロオキシ−プロピルベンゾエート、３−ニトロオキシ−プロピルヘキサノエート、３−ニトロオキシ−プロピル５−ニトロオキシ−ヘキサノエート、ベンジルニトレート、イソソルビド−ジニトレート、ならびにＮ−［２−（ニトロオキシ）エチル］−３−ピリジンカルボキサミド、２−ニトロ−５−ニトロオキシメチル−フラン、およびビス−（２−ニトロオキシエチル）エーテルから選択される、請求項１３または１４に記載の飼料組成物または飼料添加物。
【請求項１６】
式（Ｉ）で示される少なくとも１種の有機分子またはその塩が、３−ニトロオキシプロパノール、５−ニトロオキシ−ペンタンニトリル、５−ニトロオキシ−ペンタン、３−ニトロオキシ−プロピルプロピオネート、１，３−ビス−ニトロオキシプロパン、１，４−ビス−ニトロオキシブタン、１，５−ビス−ニトロオキシペンタン、３−ニトロオキシ−プロピルベンゾエート、３−ニトロオキシ−プロピルヘキサノエート、３−ニトロオキシ−プロピル５−ニトロオキシ−ヘキサノエート、イソソルビド−ジニトレート、ならびにＮ−［２−（ニトロオキシ）エチル］−３−ピリジンカルボキサミド、およびビス−（２−ニトロオキシエチル）エーテルから選択される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の飼料組成物または飼料添加物。
【請求項１７】
式（Ｉ）で示される少なくとも１種の有機分子が、３−ニトロオキシプロパノールと１，３−ビス−ニトロオキシプロパンとの混合物である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の飼料組成物または飼料添加物。
【請求項１８】
ミネラルプレミックス、ビタミンプレミックス、もしくはビタミンとミネラルとを含むプレミックス、またはボーラスである、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
式（Ｉ）
【化７】
0005984189.tif 000039
（式中、
Ｙは、次の組成：ＣａＨｂＯｄＮｅＳｇの有機分子であり、
ここで、
ａは、１〜２５に含まれ、
ｂは、２〜５１に含まれ、
ｄは、０〜８に含まれ、
ｅは、０〜５に含まれ、
ｇは、０〜３に含まれる）
により定義される少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも１種の有機分子またはその塩を十分量で動物に経口投与することを含む、反芻動物の消化活動に由来するメタン生成を低減するための方法であって、
式（ＩＩ）
【化８】
0005984189.tif 000040
（式中、
ｕは、０〜２３に含まれ、ここで、ｕ≠０のとき、炭素鎖は、モノ不飽和またはポリ不飽和であってもよいかつ任意の異性体形であってもよい、線状、環状、または分岐線状もしくは分岐環状の脂肪族炭素鎖であり、
Ｚは、独立して、Ｏ、ＮＨ、またはＮ−Ｒ３であり、ここで、Ｒ１≠Ｈのとき、Ｚ−Ｒ１は、エステル誘導体または第二級アミド誘導体を表し、
Ｒ１は、独立して、水素、または１〜１０個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、
Ｒ２は、独立して、水素、または１〜２３個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、かつ
Ｒ３は、独立して、水素、または１〜１０個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基である）
により定義されるニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体が除外される、方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１種の有機分子が、ジアリルジスルフィド、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、少なくとも１種の追加の活性物質との組合せで、前記動物に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記反芻動物が、ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、スイギュウ、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ウィルドビースト、アンテロープ、プロングホーン、およびニルガイからなる群から選択される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記反芻動物に投与される式（Ｉ）に定義される少なくとも１種の活性化合物の量が、飼料１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｇである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
代謝チャンバー内で測定したときに乾物摂取量１キログラムあたりのリットル数で計算される反芻動物のメタン生成量が少なくとも１０％低減される、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、反芻動物の消化活動に由来するメタン生成を低減するためのおよび／または反芻動物の生産性を向上させるための、少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも１種の有機分子の使用に関する。
【０００２】
本発明はまた、以上に挙げた分子を含む、動物用飼料または動物用飼料組成物および飼料添加物に関する。飼料または飼料組成物という用語は、動物による摂取に好適なまたはそれが目的の、任意の化合物、調製物、混合物、または組成物を意味する。
【０００３】
本発明との関連では、反芻動物とは、最初に、ルーメンとして知られる動物の第一胃内で植物性食物を軟化させ、次いで、反芻食塊として現在知られる半消化態塊を吐き戻し、そしてそれを再度噛み砕くことにより、植物性食物を消化する偶蹄目（Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）の哺乳動物のことである。植物質をさらに分解して消化を促進すべく反芻食塊を再度噛み砕く過程は、「反芻」と呼ばれる。
【０００４】
ルーメン発酵は、いくつかの欠点をもたらす。嫌気性発酵の当然の帰結としてメタンが生成されることは、宿主動物にとってエネルギー損失になる。炭水化物は、典型的な乳牛用飼料中の乾物の７０〜８０％を構成するが、これにもかかわらず、胃腸管からの炭水化物の吸収は、通常、非常に限られている。この理由は、ルーメン内での炭水化物の大量発酵により、主生成物として酢酸、プロピオン酸、および酪酸が生成されることにある。これらの生成物は、いわゆる揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）の一部である。エネルギー損失以外に、メタンはまた、ＣＯ２よりも何倍も強力な温室効果ガスである。大気中のその濃度は、前世紀を通じて２倍になっており、引き続き驚くほど増加している。反芻動物は、生物起源メタン生成の主要寄与因子であり、反芻動物からのメタン生成を防止すれば、大気中メタン濃度はほぼ安定化するであろうと推定されている。
【０００５】
さらに、京都議定書およびそれに続く２００９年のＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ気候サミットの評価では、マルチガス戦略の一部としてメタン排出低減の優先度が引き上げられている。メタン生成を低減すべく現在使用されている最も有効な添加物は、メタン生成菌に水素（Ｈ２）を提供する微生物の増殖を減少させる抗生物質を含有する（Ｓａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；７６：９０６−９１４）。しかしながら、微生物叢の急速な適応化および／または耐性発現により意図した効果が短期間（２〜３週間）内で完全消失するので、かつ抗生物質の使用が欧州では非治療的使用の場合には禁止されているので、メタンの生成に対する抗生物質の効果は、いくつかの欠点を伴う。
【０００６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏルーメンシミュレーションモデルを用いて試験したときにメタン排出低減をもたらす非抗生物質生成物（胆汁酸誘導体）が最近公開された（国際公開第２０１０／０７２５８４号パンフレット）。しかしながら、適度のメタン排出低減を生じるのに必要な量は、反芻動物用飼料工業のコスト制約に適合しうるものではない。
【０００７】
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験に基づいて、反芻動物でのメタン排出低減の強力な解決策として、いくつかの天然植物抽出物（ニンニク：国際公開第２００９／１５０２６４号パンフレット、ユッカ、シナモン、ダイオウ．．．）が科学文献に記載されてきた。しかしながら、副作用があるため（乳中の残留物）、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験で効力不足であるため、または有意なメタン低減を生じるように動物に供給する必要のある添加物量が非常に多いため、これらの解決策はいずれも、市販品に至らなかった。
【０００８】
こうした状況下では、メタン生成を低減する、かつ信頼性のある一般に認められた規範に適合する、かつ医薬的性質のない、新しい物質を開発する必要性が、依然として存在する。メタン排出低減に加えて、そのような物質はまた、飼料要求率の改善、飼料摂取量の低減、体重増加の改善、および／または枝肉歩留りもしくは乳量の改善により、反芻動物の生産性向上にも寄与しうる。
【０００９】
このたび、本発明者らは、驚くべきことに、これ以降に明記された化合物が、宿主動物に有害な形で微生物発酵に影響を及ぼすことのなくメタン生成を本質的に低減すべく、動物用飼料中で使用できる大きな可能性を有することを見いだした。さらに、本発明に係る化合物はまた、飼料要求率、飼料摂取量、体重増加、枝肉歩留り、または乳量により測定される動物の生産性全体に関して、大きな利点を有する。前記化合物はまた、先行技術に記載のものより安定であり、動物およびヒトに対してより安全であり、持続的なメタン低減効果をもたらし、嗜好性に影響を及ぼさず、動物栄養産業に適合可能なコストで工業規模で製造可能であり、なかでもとくに、補給された動物の乳中または肉中にいかなる代謝物の蓄積も誘発せず、しかもルーメン内で非常に低濃度で活性である。
【００１０】
特定的には、本発明者らは、少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも１種の有機分子を反芻動物に供給することが、全ＶＦＡ生成に悪影響を及ぼすことなく反芻動物の消化活動に由来するメタン生成を低減するのに、および／または反芻動物の生産性を向上させるのに、非常に有効であることを観測した。さらに、本発明者らは、ニトロオキシ基を類似の物理化学的性質の他の化学基で置き換えた場合、メタン生成に及ぼす技術的効果が失われることから、ニトロオキシ基が本発明に係るメタン低減効果の鍵となることが実証されることを示した。
【００１１】
ニトロオキシ−カルボン酸誘導体がｉｎ  ｖｉｔｒｏさらにはｉｎ  ｖｉｖｏでルーメンメタン生成の強力な阻害剤であることは、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６９３３８号パンフレットから公知である。したがって、これらの分子は、本発明の特許請求の範囲からとくに除外される。
【００１２】
したがって、本発明は、反芻動物の消化活動に由来するメタン生成を低減するためのおよび／または反芻動物の生産性を向上させるための、動物飼養における活性化合物としての、式（Ｉ）により定義される少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも１種の有機分子またはその塩の使用を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、式（Ｉ）により定義される少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも１種の有機分子またはその塩を十分量で動物に経口投与することを含む、反芻動物の消化活動に由来するメタン生成を低減するためのおよび／または反芻動物の生産性を向上させるための方法を提供する。経口投与とは、単純な給餌またはボーラスの手動投与とみなされるものとする。
【００１４】
本発明の実施形態ではすべて、少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された有機分子またはその塩は、以下の式（Ｉ）
【化１】
0005984189.tif 000002
（式中、
Ｙは、次の組成：ＣａＨｂＯｄＮｅＳｇの有機分子であり、
ここで、
ａは、１〜２５、好ましくは１〜１０に含まれ、
ｂは、２〜５１、好ましくは２〜２１に含まれ、
ｄは、０〜８、好ましくは０〜６に含まれ、
ｅは、０〜５、好ましくは０〜３に含まれ、
ｇは、０〜３、好ましくは０〜１に含まれる）
で示される化合物により定義されるが、ただし、式（ＩＩ）
【化２】
0005984189.tif 000003
（式中、
ｕは、０〜２３に含まれ、ここで、ｕ≠０のとき、炭素鎖は、モノ不飽和またはポリ不飽和であってもよいかつ任意の異性体形であってもよい、線状、環状、または分岐線状もしくは分岐環状の脂肪族炭素鎖であり、
Ｚは、独立して、Ｏ、ＮＨ、またはＮ−Ｒ３であり、ここで、Ｒ１≠Ｈのとき、Ｚ−Ｒ１は、エステル誘導体または第二級アミド誘導体を表し、
Ｒ１は、独立して、水素、または１〜１０個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、
Ｒ２は、独立して、水素、または１〜２３個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、かつ
Ｒ３は、独立して、水素、または１〜１０個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基である）
により定義されるニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体は、除外される。
【００１５】
他の実施形態では、本発明に係る式（Ｉ）で示される好ましい化合物は、ａが３〜８に含まれる、好ましくは１〜１０に含まれる化合物である。
【００１６】
他の実施形態では、本発明に係る式（Ｉ）で示される好ましい化合物は、式（ＩＩＩ）
【化３】
0005984189.tif 000004
（式中、
ｎは、０〜１２に含まれ、好ましくは０〜６に含まれ、ここで、ｎ≠０のとき、炭素鎖は、非置換であっても、３個までのヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、もしくはニトロオキシ基で置換されていてもよい、線状、環状、もしくは分岐状の脂肪族炭素鎖、またはモノ不飽和もしくはポリ不飽和のかつ任意の異性体形のアルケニル炭素鎖もしくはアルキニル炭素鎖であり、
Ｒ４は、独立して、水素、または１〜１２個、好ましくは１〜６個の炭素原子を含有する、飽和の直鎖、環状鎖、もしくは分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニル基であり、
Ｘは、水素、Ｒ５、Ｒ５≡Ｎ、−ＯＲ５、−ＯＣＯＲ５、−ＮＲ５Ｒ６、−ＯＮＯ２、−ＣＯＯＲ５、−ＣＯＮＲ５Ｒ６、−ＮＨＳＯ２Ｒ５、または−ＳＯ２ＮＨＲ５であり、
Ｒ５およびＲ６は、独立して、水素、または非置換の、もしくは３個までのヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、もしくはニトロオキシ基で置換された、Ｃ１〜Ｃ１２の直線状、分岐状、もしくは環状のアルキル鎖、モノ不飽和もしくはポリ不飽和であってもよいかつ任意の異性体形であってもよいアルケニル炭素鎖もしくはアルキニル炭素鎖である）
で示される化合物である。
【００１７】
本発明の実施形態ではすべて、式（Ｉ）で示される化合物および式（ＩＩＩ）で示される化合物は、任意の異性体形でありうるとみなされるものとする。
【００１８】
式（ＩＩＩ）で示される化合物の以上の定義では、ｎ＞２のとき、炭素鎖は、線状でありうるまたは炭素鎖に沿って任意の位置で分岐しうるとみなされるものとする。それに加えて、炭素鎖は、炭素鎖に沿って異なる位置で複数の分岐枝により分岐しうる。さらに、ｎ＞３のとき、脂肪族炭素鎖は、環状部分を形成してもよい。この環状部分は、任意の位置（２、３、４）にニトロオキシ部分を有しうるとともに、任意の脂肪族基により複数の位置で分岐しうる。分岐脂肪族基は、好ましくは、メチル、エチル、またはプロピルである。そのうえ、炭素鎖は、３個までのヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、またはニトロオキシ基でさらに置換されていてもよい。
【００１９】
式（ＩＩＩ）で示される誘導体の以上の定義では、好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、第二級ブチル、イソブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ならびに２−エチル−ヘキシルおよびオクチルである。さらに、３個以上の炭素原子を含有するアルキル基またはアルケニル基はいずれも、直鎖状、分岐状、または環状でありうる。それに加えて、直鎖状または分岐状のＣ２〜Ｃ１０−アルケニレン基に対して、これは、１つまたは（Ｃ４から）それより多くの二重結合を有するアルケニレン基を包含するとみなされ、そのようなアルケニレン基の例は、式−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−、および−（ＣＨ＝ＣＨ）２−で示されるものである。
【００２０】
他の実施形態では、本発明に係る式（Ｉ）で示されるより好ましい化合物は、表１に列挙される、３−ニトロオキシプロパノール、ラセミ体−４−フェニルブタン−１，２−ジイルジニトレート、２−（ヒドロキシメチル）−２−（ニトロオキシメチル）−１，３−プロパンジオール、Ｎ−エチル−３−ニトロオキシ−プロピオン酸スルホニルアミド、５−ニトロオキシ−ペンタンニトリル、５−ニトロオキシ−ペンタン、３−ニトロオキシ−プロピルプロピオネート、１，３−ビス−ニトロオキシプロパン、１，４−ビス−ニトロオキシブタン、１，５−ビス−ニトロオキシペンタン、３−ニトロオキシ−プロピルベンゾエート、３−ニトロオキシ−プロピルヘキサノエート、３−ニトロオキシ−プロピル５−ニトロオキシ−ヘキサノエート、ベンジルニトレート、イソソルビド−ジニトレート、ならびにＮ−［２−（ニトロオキシ）エチル］−３−ピリジンカルボキサミド、２−ニトロ−５−ニトロオキシメチル−フラン、およびビス−（２−ニトロオキシエチル）エーテルを含む化合物およびその塩のリストから選択される。
【００２１】
【表１】
0005984189.tif 000005
【００２２】
【表２】
0005984189.tif 000006
【００２３】
【表３】
0005984189.tif 000007
【００２４】
他の実施形態では、メタン低減効果の強さに基づいて式（ＩＩＩ）で示されるさらにより好ましい化合物は、表２に列挙される、３−ニトロオキシプロパノール、５−ニトロオキシ−ペンタンニトリル、５−ニトロオキシ−ペンタン、３−ニトロオキシ−プロピルプロピオネート、１，３−ビス−ニトロオキシプロパン、１，４−ビス−ニトロオキシブタン、１，５−ビス−ニトロオキシペンタン、３−ニトロオキシ−プロピルベンゾエート、３−ニトロオキシ−プロピルヘキサノエート、３−ニトロオキシ−プロピル５−ニトロオキシ−ヘキサノエート、イソソルビド−ジニトレート、ならびにＮ−［２−（ニトロオキシ）エチル］−３−ピリジンカルボキサミド、およびビス−（２−ニトロオキシエチル）エーテルを含む化合物およびその塩のリストから選択される。
【００２５】
【表４】
0005984189.tif 000008
【００２６】
【表５】
0005984189.tif 000009
【００２７】
他の実施形態では、メタン低減効果の強さと製造プロセスとに基づいて式（Ｉ）で示される最も好ましい化合物は、３−ニトロオキシプロパノールと１，３−ビス−ニトロオキシプロパンとの混合物である。好ましくは、３−ニトロオキシプロパノール／１，３−ビス−ニトロオキシプロパンの比は、１／１０〜１０００／１、より好ましくは１／５〜１００／１、最も好ましくは１／１〜１０／１に含まれる。
【００２８】
本発明に係る化合物はまた、ニトロオキシ有機分子の塩を含む。塩調製用の好ましいカチオンは、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、リチウム（Ｌｉ＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、バリウム（Ｂａ２＋）、ストロンチウム（Ｓｒ２＋）、およびアンモニウム（ＮＨ４＋）からなる群から選択可能である。塩はまた、アルカリ金属またはアルカリ土類金属から調製可能である。
【００２９】
本発明に係る化合物は、原理的には、ニトロオキシ有機分子のそれ自体公知の合成方法に従っておよび／または実施例に記載の方法に基づいて、製造可能である。
【００３０】
これらの場合にはすべて、生成物（式（Ｉ）で示される化合物）の適切な精製方法を当業者により選択することが可能であるか、すなわち、カラムクロマトグラフィーによるか、またはそれ自体公知の方法により、たとえば、反応後にジエチル−エーテルやエチルアセテートなどの溶媒を添加して混合物からの粗生成物の分離を誘導して、捕集した粗生成物をＮａ２ＳＯ４で脱水することにより、式（Ｉ）で示される化合物を単離精製することが可能である。
【００３１】
反芻動物によるメタン排出は、当技術分野で公知の方法により代謝チャンバー内で個別動物で容易に測定可能である（Ｇｒａｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；９０：２７５５−２７６６）。さらに、それはまた、レーザービームを用いた最新技術により畜舎レベルで評価可能である（ＭｃＧｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｑｕａｌｉｔｙ；３８：１７９６−１８０２）。他の選択肢として、泌乳反芻動物により生成されるメタンはまた、国際公開第２００９／１５６４５３号パンフレットに従って乳中のＶＦＡプロファイルを測定することにより評価可能である。
【００３２】
反芻動物の生産性は、当技術分野で周知の方法により評価可能であり、通常、飼料要求率、飼料摂取量、体重増加、枝肉歩留り、または乳量により特徴付けられる。
【００３３】
本発明はまた、ルーメン内でのメタン生成に関して類似の効果を示すかつジアリルジスルフィド、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、少なくとも１種の追加の活性物質との組合せでの、式（Ｉ）により定義される少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも１種の有機分子またはその塩の使用に関する。
【００３４】
本発明に係る化合物と一緒に与えることが可能なさらなる成分は、たとえば、酵母、精油、およびモネンシン、ルメンシンのようなイオノフォアである。
【００３５】
現時点では、ジアリルジスルフィド、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、およびそれらの誘導体を、独立して、たとえば、飼料１ｋｇあたり０．０１〜５００ｍｇ（ｐｐｍ）の活性物質の投与量範囲で投与することが考えられる。これらの化合物は、市販されているか、または先行技術で周知のプロセスおよび方法を用いて当業者が容易に調製可能であるか、のいずれかである。
【００３６】
本発明に係る反芻哺乳動物は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、スイギュウ、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ウィルドビースト、アンテロープ、プロングホーン、およびニルガイを含む。
【００３７】
本発明の実施形態ではすべて、家畜のウシ、ヒツジ、およびヤギは、より好ましい種である。本発明の目的では、最も好ましい種は、家畜のウシである。この用語は、すべての品種の家畜のウシおよびすべての生産種のウシ、特定的には乳牛および肉牛を含む。
【００３８】
本発明はまた、代謝チャンバー内で測定したときに乾物摂取量１キログラムあたりのリットル数で計算される反芻動物のメタン生成量が少なくとも１０％低減される、式（Ｉ）により定義される少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも１種の有機分子またはその塩の使用に関する。好ましくは、メタン低減は、少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも３０％である。レーザービームを用いたりまたは泌乳反芻動物の場合にはメタン生成を乳中のＶＦＡプロファイルに相関付けたりするなど、他の選択肢のメタン排出測定を使用することも可能である。
【００３９】
本発明はまた、従来の生産性試験で測定したときに反芻動物の飼料要求率が少なくとも１％低減される、式（Ｉ）により定義される少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも１種の有機分子またはその塩の使用に関する。好ましくは、飼料要求率は、少なくとも２％、より好ましくは少なくとも２．５％、さらにより好ましくは少なくとも３％、最も好ましくは少なくとも３．５％低減される。
【００４０】
本発明はまた、反芻動物に投与される式（Ｉ）に定義される少なくとも１種の活性化合物の量が、飼料１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは飼料１ｋｇあたり１０ｍｇ〜１ｇ、より好ましくは飼料１ｋｇあたり５０ｍｇ〜５００ｍｇである、式（Ｉ）により定義される少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも１種の有機分子またはその塩の使用に関する。しかしながら、動物用飼料中での使用では、式（Ｉ）により定義される少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された有機分子またはその塩は、それほど純粋である必要はなく、たとえば、他の化合物および誘導体を含んでいてもよい。
【００４１】
以上に示されたように、本発明に係る化合物は、反芻動物に対して飼料添加物および動物用飼料組成物のための化合物として有用であり、したがって、動物の消化管内でのメタン生成を低減すべくおよび／または反芻動物の生産性を向上させるべく、そのような飼料中の活性成分として有用である。反芻動物の飼料用のそのような成分としてのその使用を実現するために、飼料の配合および加工の技術分野でそれ自体公知の方法により、化合物を飼料中に組み込むことが可能である。
【００４２】
したがって、本発明のさらなる態様は、以上に定義された化合物を含有する配合物、すなわち、飼料添加物および動物用飼料組成物である。したがって、本発明はまた、式（Ｉ）で示される少なくとも１種の化合物またはその塩を含む飼料組成物または飼料添加物に関する。好ましくは、飼料組成物または飼料添加物は、反芻動物用ベースミックスである。好ましい実施形態では、組成物は、ミネラルプレミックス、ビタミンとミネラルとを含むビタミンプレミックス、またはボーラスである。
【００４３】
飼料摂取により動物に提供される本発明に係る化合物の通常の一日投与量は、動物の種類およびその状態に依存する。通常、この投与量は、飼料１ｋｇあたりの化合物換算で、約１ｍｇ〜約１０ｇ、好ましくは約１０ｍｇ〜約１ｇ、より好ましくは５０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲内にすべきである。
【００４４】
式（Ｉ）により定義される少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも１種の有機分子またはその塩は、動物用飼料組成物（食餌）中に存在する従来の成分、たとえば、炭酸カルシウム、塩化アンモニウムなどの電解質、ダイズ粕などのタンパク質、コムギ、デンプン、ヒマワリ粕、トウモロコシ、肉骨粉、アミノ酸、動物性脂肪、ビタミン、および微量ミネラルと組み合わせて使用可能である。
【００４５】
本発明に係る組成物の特定例は、以下のとおりである。
・（ａ）表１から選択される少なくとも１種の化合物と、（ｂ）少なくとも１種の脂溶性ビタミン、（ｃ）少なくとも１種の水溶性ビタミン、（ｄ）少なくとも１種の微量ミネラル、および／または（ｅ）少なくとも１種の多量ミネラルと、を含む動物用飼料添加物、
・表１から選択される少なくとも１種の化合物と、５０〜８００ｇ／ｋｇ飼料の粗タンパク質分と、を含む動物用飼料組成物。
【００４６】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、反芻動物用の飼料組成物または飼料添加物に関する。
【００４７】
いわゆるプレミックスは、本発明に係る動物用飼料添加物の例である。プレミックスとは、１種以上の微量成分と希釈剤および／または担体との好ましくは均一な混合物を意味する。プレミックスは、より多量のミックス中への微量成分の均一分散を促進すべく使用される。
【００４８】
本発明に係る活性成分のほかに、本発明に係るプレミックスは、少なくとも１種の脂溶性ビタミン、および／または少なくとも１種の水溶性ビタミン、および／または少なくとも１種の微量ミネラル、および／または少なくとも１種の多量ミネラルを含有する。言い換えれば、本発明に係るプレミックスは、脂溶性ビタミン、水溶性ビタミン、微量ミネラル、および多量ミネラルからなる群から選択される少なくとも１種の追加成分と一緒に、本発明に係る少なくとも１種の化合物を含む。
【００４９】
多量ミネラルは、個別に飼料に添加可能である。したがって、特定の実施形態では、プレミックスは、脂溶性ビタミン、水溶性ビタミン、および微量ミネラルからなる群から選択される少なくとも１種の追加成分と一緒に、本発明に係る活性成分を含む。
【００５０】
以下は、これらの成分の例のリストであるが、これらに限定されるものではない。
・脂溶性ビタミンの例は、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、およびビタミンＫ、たとえば、ビタミンＫ３である。
・水溶性ビタミンの例は、ビタミンＢ１２、ビオチンおよびコリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸、およびパントテン酸、たとえば、Ｃａ−Ｄ−パントテン酸である。
・微量ミネラルの例は、マンガン、亜鉛、鉄、銅、ヨウ素、セレン、およびコバルトである。
・多量ミネラルの例は、カルシウム、リン、およびナトリウムである。
【００５１】
ウシなどの反芻動物用の飼料組成物に関しては、その成分に加えて、反芻動物の食餌は、通常、易分解性部分（濃厚飼料と称される）と高繊維低易分解性部分（乾草、茎葉飼料、または粗飼料と称される）とで構成される。
【００５２】
乾草は、乾燥されたイネ科牧草、マメ科牧草、または穀草で作られる。イネ科牧草は、とくに、チモシー、ライグラス、フェスクを含む。マメ科牧草は、とくに、クローバー、ルーサンまたはアルファルファ、エンドウ、インゲン、およびベッチを含む。穀草は、とくに、オオムギ、メイズ（トウモロコシ）、エンバク、ソルガムを含む。他の茎葉作物は、サトウキビ、ケール、アブラナ、およびキャベツを含む。また、反芻動物に給餌するために、カブ、スウェーデンカブ、マンゲル（ｍａｎｇｌｅｓ）、飼料ビート、およびサトウダイコン（シュガービートパルプおよびビートモラセスを含む）などの根菜作物が使用される。そのほかのさらなる作物は、ジャガイモ、キャッサバ、およびサツマイモなどの塊茎作物である。サイレージは、高繊維部分（たとえば、イネ科牧草、マメ科牧草、または穀草からの部分）をサイレージ化したものであり、その際、高水分含有率を有する材料が制御下の嫌気性発酵プロセス（自然発酵または添加物処理）で処理される。
【００５３】
濃厚飼料は、主に、穀物（たとえば、醸造粕や蒸留粕を含めてオオムギ、メイズ、コムギ、ソルガム）から構成されるが、ダイズ、ナタネ、パーム核、綿実、ヒマワリなどの高タンパク質飼料成分を含有することも多い。
【００５４】
すべての食餌成分、たとえば、茎葉飼料、サイレージ、および濃厚飼料が給餌前に混合される完全混合飼料（ＴＭＲ）をウシに給餌することも可能である。
【００５５】
以上に述べたように、プレミックスは、本発明に係る活性化合物を含みうる飼料添加物の例である。化合物は、さまざまな他の形態で動物に投与可能であるものとみなされる。たとえば、化合物はまた、ルーメン内に配置される、かつ特定の期間にわたり明確に規定された投与量で連続的に規定量の活性化合物を放出する、ボーラスに組み込むことも可能である。
【００５６】
本発明はさらに、以上に記載の好ましい実施形態を用いて、式（Ｉ）により定義される少なくとも１個のニトロオキシ基により任意の位置で置換された少なくとも１種の有機分子またはその塩を十分量で経口投与することを含む、反芻動物の消化活動に由来するメタン生成を低減するためのおよび／または反芻動物の生産性を改善させるための方法に関する。
【００５７】
そのうえ、本発明はさらに、ジアリルジスルフィド、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、およびそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の追加の活性物質との組合せで、式（Ｉ）で示される化合物が動物に投与される、以上で説明した方法に関する。
【００５８】
本発明はまた、反芻動物が、ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、スイギュウ、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ウィルドビースト、アンテロープ、プロングホーン、およびニルガイからなる群から、より好ましくはウシ、ヤギ、およびヒツジからなる群から選択される、以上で説明した方法に関する、
【００５９】
本発明はまた、反芻動物に投与される式（Ｉ）で定義される少なくとも１種の活性化合物の量が、飼料１ｋｇあたり約１ｍｇ〜約１０ｇ、好ましくは約１０ｍｇ〜約１ｇ、より好ましくは飼料１ｋｇあたりの化合物換算で５０ｍｇ〜５００ｍｇである、以上で説明した方法に関する。
【００６０】
本発明はまた、代謝チャンバー内で測定したときに乾物摂取量１キログラムあたりのリットル数で計算される反芻動物のメタン生成量が少なくとも１０％低減される、以上で説明した方法に関する。好ましくは、メタン低減は、少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも３０％である。レーザービームを用いたりまたは泌乳反芻動物の場合にはメタン生成を乳中のＶＦＡプロファイルに相関付けたりするなど、他の選択肢のメタン排出測定を使用することも可能である。
【００６１】
本発明はまた、従来の生産性試験で測定したときに反芻動物の飼料要求率が少なくとも１％低減される、以上で説明した方法に関する。好ましくは、飼料要求率は、少なくとも２％、より好ましくは少なくとも２．５％、さらにより好ましくは少なくとも３％、最も好ましくは少なくとも３．５％低減される。
【００６２】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、これらを本発明の範囲を限定するものとみなしてはならない。
【００６３】
［実施例］
［実施例１：メタン生成のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験］
このｉｎ−ｖｉｔｒｏ系により模倣したルーメン機能に及ぼす特定化合物の効果を試験するために、「Ｈｏｈｅｎｈｅｉｍ茎葉飼料値試験（ＨＦＴ）」の改変版を使用した。
【００６４】
［原理：］
ルーメン液組成物および適切な緩衝液混合物と共に、飼料をシリンジ中に入れる。溶液を３９℃でインキュベートする。８時間後、生成したメタンの量（また組成）を測定して、変換式に代入する。
【００６５】
［試薬：］
多量元素溶液：
・６．２ｇのリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）
・０．６ｇの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）
・９ｍｌの濃リン酸（１ｍｏｌ／ｌ）
・蒸溜水に溶解して１ｌにする（ｐＨ約１．６）
緩衝溶液：
・３５．０ｇの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）
・４．０ｇの炭酸水素アンモニウム（（ＮＨ４）ＨＣＯ３）
・蒸溜水に溶解して１ｌにする
微量元素溶液：
・１３．２ｇの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）
・１０．０ｇの塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）
・１．０ｇの塩化コバルト（ＩＩ）六水和物（ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）
・８．０ｇの塩化鉄（ＩＩＩ）（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）
・蒸溜水に溶解して１００ｍｌにする
ナトリウム塩溶液：
・１００ｍｇのナトリウム塩
・蒸溜水に溶解して１００ｍｌにする
還元溶液：
・最初に３ｍｌの水酸化ナトリウム（ｃ＝１ｍｏｌ／ｌ）、次いで４２７．５ｍｇの硫化ナトリウム水和物（Ｎａ２Ｓ・Ｈ２Ｏ）を７１．２５ｍｌのＨ２Ｏに添加する
・媒体溶液に添加する直前に溶液を調製しなければならない
【００６６】
［手順：］
［サンプル秤量：］
飼料原料を１ｍｍの篩にかけて−通常はＴＭＲ（４４％の濃厚飼料、６％の乾草、３７％のメイズサイレージ、および１３％のイネ科牧草サイレージ）−６４個のシリンジ中に正確に秤取する。これらのシリンジのうちの４個は、試験化合物の効果を含まないガス生成を呈する基質対照である。４個の他のシリンジは、ブロモエタンスルホネートが０．１ｍＭになるように添加された陽性対照である。必要な場合、４個のシリンジは、担体対照を含有する（試験化合物が担体を必要とする場合）。残りのシリンジは、１グループあたり４個のシリンジで、試験物質を含有する。
【００６７】
［媒体溶液の調製：］
以下の順序でＷｏｕｌｆｆ瓶中で成分を混合する。
・７１１ｍｌの水
・０．１８ｍｌの微量元素溶液
・３５５．５ｍｌの緩衝溶液
・３５５．５ｍｌの多量元素溶液
完成溶液を３９℃まで加温し、続いて、１．８３ｍｌのナトリウム塩溶液の添加および３６℃で還元溶液の添加を行う。指示薬が無色になった時、ルーメン液を添加する。
【００６８】
［ルーメン液の採取：］
連続撹拌下およびＣＯ２ガス供給下で、７５０ｍｌのルーメン液を約１，４００ｍｌの媒体溶液に添加する。
【００６９】
シリンジへの充填、インキュベーション、ならびにガス体積およびＶＦＡ値の決定：
希釈ルーメン流体（２４ｍｌ）をガラスシリンジに添加する。次いで、緩速撹拌下３９℃でシリンジを８時間インキュベートする。８時間後、生成したガスの体積を測定し、気相中のメタンのパーセントをガスクロマトグラフィーにより決定する。
【００７０】
［結果］
発酵食物は、人工ＴＭＲ（４４％の濃厚飼料、６％の乾草、３７％のメイズサイレージ、および１３％のイネ科牧草サイレージ）であった。実施例２〜１４で説明したように生成された化合物を２〜０．００５％の乾物（ＤＭ）濃度になるように発酵シリンジに添加した。結果を以下の表に示す。
【００７１】
【表６】
0005984189.tif 000010
【００７２】
【表７】
0005984189.tif 000011
【００７３】
【表８】
0005984189.tif 000012
【００７４】
［実施例２：比較例：  メタン生成のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験］
ニトロオキシ基を異なる有機基で置き換えた一連の分子を用いて、実施例１で説明したのと同一のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを行った。さらに、無機塩ＮａＮＯ３も試験した。表４に示される結果を参照されたい。一連の分子のうちニトロオキシ基が存在する場合にのみ、有意なメタン低減活性が観測されることが、このデータから実証される。
【００７５】
【表９】
0005984189.tif 000013
【００７６】
［実施例３：３−ニトロオキシプロパノールの合成：］
【化４】
0005984189.tif 000014
１００ｍｌのアセトニトリル中に溶解された５０．１ｍｍｏｌの３−ブロモプロパノールおよび１２５．２５ｍｍｏｌの硝酸銀を、光から保護されたフラスコ内に添加した。この懸濁液を７０℃で２１時間攪拌した。室温に冷却後、懸濁液を濾過して、減圧下で濃縮した。残渣を水中に溶解して、ＴＭＢＥで２回抽出した。有機相を水およびブラインで洗浄し、組み合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去したところ、５．６３ｇが残った。
【００７７】
ヘプタン／エチルアセテート２：１を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。収量：４．８２ｇ（３８．８ｍｍｏｌ、７７．４％）。
【００７８】
［実施例４：２−（ヒドロキシメチル）−２−（ニトロオキシメチル）−１，３−プロパンジオールの合成：］
【化５】
0005984189.tif 000015
２０ｍｌのアセトニトリル中に溶解された５ｍｍｏｌの２−（ブロモメチル）−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオールおよび１５ｍｍｏｌの硝酸銀を、光から保護されたフラスコ内に添加した。この懸濁液を７０℃で２４時間攪拌した。室温に冷却後、懸濁液を濾過して、溶媒を減圧下で除去したところ、３．０５ｇが残った。
【００７９】
ジクロロメタン／メタノール５０：１を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。収量：０．３６ｇ（１．９９ｍｍｏｌ、４０．２％）。
【００８０】
［実施例５：ｒａｃ−４−フェニルブタン−１，２−ジイルジニトレートの合成：］
【化６】
0005984189.tif 000016
４０ｍｌのアセトニトリル中に溶解された７．５ｍｍｏｌの４−フェニル−１−ブテン、２０．３ｍｍｏｌの硝酸銀、および７．５ｍｍｏｌのヨウ素（ｌｏｄｅ）を、光から保護されたフラスコ内に添加した。この懸濁液を２５℃で３０分間、次いで、７９℃で１６時間攪拌した。室温に冷却後、懸濁液を濾過して、エチルアセテートで洗浄した。濾液を水で３回抽出してブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去したところ、１．９２ｇが残った。
【００８１】
ヘキサン／エチルアセテート１０：１を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。収量：０．５２ｇ（２．０３ｍｍｏｌ、２７％）。
【００８２】
［実施例６：Ｎ−エチル−３−ニトロオキシ−プロピオン酸スルホニルアミドの合成：］
【化７】
0005984189.tif 000017
フラスコ内で、１７ｍｍｏｌの３−クロロプロピオン酸スルホニルクロリドを５ｍｌのテトラヒドロフラン中に溶解した。４５分間にわたり３３．３ｍｍｏｌのエチルアミンを添加した。その後、溶媒を減圧下で除去した。残渣を水中に溶解して、エチルアセテートで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去した。
【００８３】
残渣を５０ｍｌのアセトニトリル中に溶解し、そして６０ｍｍｏｌの硝酸銀を、光から保護されたフラスコ内に添加した。この懸濁液を７０℃で４１時間攪拌した。室温に冷却後、懸濁液を濾過して、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタン中に溶解して、水で抽出した。再度、水相をジクロロメタンで２回洗浄した。合わせた有機相を水およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去した。収量：３．０５ｇ（１４．５ｍｍｏｌ；８４．５％）。
【００８４】
［実施例７：３−ニトロオキシ−プロピルプロピオネートの合成：］
【化８】
0005984189.tif 000018
９．１ｍｍｏｌのプロピオニルクロリドを１０ｍｌのＴＭＢＥ中に溶解して、３℃に冷却した。５ｍｌのＴＭＢＥ中の８．２５ｍｍｏｌの３−ニトロオキシプロパノールおよび９．１ｍｍｏｌのトリエチルアミンを、３〜６℃で５分間かけて滴下した。冷却せずに２時間３０分撹拌した後、反応混合物を１Ｎ  ＨＣｌ、水で２回抽出し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去したところ、１．３５ｇが残った。
【００８５】
ヘキサン／エチルアセテート４：１を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。収量：１．１４ｇ（６．４ｍｍｏｌ、７８．０％）。
【００８６】
［実施例８：３−ニトロオキシ−プロピルベンゾエートの合成：］
【化９】
0005984189.tif 000019
１０ｍｌのＴＭＢＥ中に溶解された１６．５ｍｍｏｌの３−ニトロオキシプロパノールおよび１８．２ｍｍｏｌのトリエチルアミンを３℃に冷却した。５ｍｌのＴＭＢＥ中の１８．２ｍｍｏｌのベンゾイルクロリドを、３〜６℃で７分間にわたり滴下した。冷却せずに２４時間３０分撹拌した後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３、水、１Ｎ  ＨＣｌ、水で２回抽出し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去したところ、３．３ｇが残った。
【００８７】
ヘキサン／エチルアセテート１：０〜２：１のグラジエントを用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。収量：０．６６ｇ（２．９ｍｍｏｌ、１７．７％）。
【００８８】
［実施例９：３−ニトロオキシ−プロピルヘキサノエートの合成：］
【化１０】
0005984189.tif 000020
１０ｍｌのジエチルエーテル中に溶解された２０ｍｍｏｌの３−ニトロオキシプロパノールおよび２０ｍｍｏｌのトリエチルアミンを０℃に冷却した。１８．２ｍｍｏｌのヘキソイルクロリドを、０〜５℃で５分間にわたり滴下した。冷却せずに１９時間撹拌した後、反応混合物を１Ｎ  ＨＣｌ、水で２回抽出し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去したところ、３．１ｇが残った。
【００８９】
ヘプタン／エチルアセテート４：１を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。収量：２．４ｇ（１０．９ｍｍｏｌ、６０．０％）。
【００９０】
［実施例１０：３−ニトロオキシ−プロピル５−ニトロオキシ−ヘキサノエートの合成：］
【化１１】
0005984189.tif 000021
１０ｍｌのジエチルエーテル中に溶解された２０ｍｍｏｌの３−ニトロオキシプロパノールおよび２０ｍｍｏｌのトリエチルアミンを０℃に冷却した。１８．２ｍｍｏｌの５−ニトロオキシペントイルクロリドを、０〜５℃で５分間かけて滴下した。冷却せずに一晩撹拌した後、反応混合物を１Ｎ  ＨＣｌ、水で２回抽出し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去した。
【００９１】
ヘプタン／エチルアセテート４：１を用いてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製した。収量：２．４ｇ（９．１ｍｍｏｌ、５０．０％）。
【００９２】
［実施例１１：ベンジルニトレートの合成：］
【化１２】
0005984189.tif 000022
８０ｍｌのアセトニトリル中に溶解された１０ｍｍｏｌのベンジルブロミドおよび２５ｍｍｏｌの硝酸銀を、光から保護されたフラスコ内に添加した。この懸濁液を７０℃で５時間攪拌した。室温に冷却後、懸濁液を濾過して、減圧下で濃縮した。残渣をジクロロメタン中に溶解して、水で抽出した。再度、水相をジクロロメタンで２回洗浄した。合わせた有機相を水およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去した。収量：１．５５ｇ（１０．１ｍｍｏｌ；１００％）。
【００９３】
［実施例１２：１，３−ビス−ニトロオキシ−プロパンの合成：］
【化１３】
0005984189.tif 000023
２０．０ｍＬの無水アセトニトリル中の１，３−ジブロモプロパン（２．００ｇ、１．０ｅｑ）の溶液に、硝酸銀（３．７０ｇ、２．２ｅｑ）を添加した。暗所において反応混合物を７０℃で２時間加熱した。得られた混合物をセライトに通して濾別し、そして濾液を濃縮した。残渣を水（５０．０ｍＬ）中に溶解し、ジクロロメタン（２×５０．０ｍＬ）で抽出し、硫酸マグネシウムで脱水し、そして溶媒を減圧下で蒸発させたところ、無色液体として１．４４ｇの化合物が得られた（収率＝８７％）。
【００９４】
［実施例１３：１，４−ビス−ニトロオキシ−ブタンの合成：］
【化１４】
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２０．０ｍＬの無水アセトニトリル中の１，４−ジブロモブタン（２．００ｇ、１．０ｅｑ）の溶液に、硝酸銀（３．５０ｇ、２．２ｅｑ）を添加した。暗所において反応混合物を７０℃で２時間加熱した。得られた混合物をセライトに通して濾別し、そして濾液を濃縮した。残渣を水（５０．０ｍＬ）中に溶解し、ジクロロメタン（２×５０．０ｍＬ）で抽出し、そして硫酸マグネシウムで脱水した。溶媒を減圧下で蒸発させたところ、無色液体として１．４９ｇの化合物が得られた（収率＝８９％）。
【００９５】
［実施例１４：１，５−ビス−ニトロオキシ−ペンタンの合成］
【化１５】
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２０．０ｍＬの無水アセトニトリル中の１，５−ジブロモペンタン（２．００ｇ、１．０ｅｑ）の溶液に、硝酸銀（３．３０ｇ、２．２ｅｑ）を添加した。暗所において反応混合物を７０℃で２時間加熱した。得られた混合物をセライトに通して濾別し、そして濾液を濃縮した。残渣を水（５０．０ｍＬ）中に溶解し、ジクロロメタン（２×５０．０ｍＬ）で抽出し、そして硫酸マグネシウムで脱水した。溶媒を減圧下で蒸発させたところ、無色液体として１．３８ｇの化合物が得られた（収率＝８２％）。
【００９６】
［実施例１５：５−ニトロオキシ−ペンタンニトリルの合成：］
【化１６】
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４０．０ｍＬの無水アセトニトリル中の５−ブロモバレロニトリル（４．００ｇ、１．０ｅｑ）の溶液に、硝酸銀（４．６０ｇ、１．１ｅｑ）を添加した。暗所において反応混合物を７０℃で２時間加熱した。得られた混合物をセライトに通して濾別し、そして濾液を濃縮した。残渣を水（５０．０ｍＬ）中に溶解し、ジクロロメタン（２×５０．０ｍＬ）で抽出し、そして硫酸マグネシウムで脱水した。溶媒を減圧下で蒸発させたところ、無色液体として３．５６ｇの化合物が得られた（収率＝９９％）。
【００９７】
［実施例１６：ビス−（２−ニトロオキシエチル）エーテルの合成］
【化１７】
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３０ｍｌのアセトニトリル中に溶解された１６．０５ｍｍｏｌのビス（２−ブロモエチル）エーテルおよび４０．１３ｍｍｏｌの硝酸銀を、光から保護されたフラスコ内に添加した。この懸濁液を７０℃で１６時間攪拌した。室温に冷却後、懸濁液を濾過して、減圧下で濃縮した。残渣を水中に溶解して、ＴＭＢＥで２回抽出した。有機相を水およびブラインで洗浄し、組み合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、そして溶媒を減圧下で除去したところ、３．０６ｇが残った。ヘプタン／エチルアセテート１：１を用いてシリカゲルで粗生成物を濾過した。収量：２．９４ｇ（１５．０ｍｍｏｌ、９３．４％）。
【００９８】
［実施例１７：エチル−３−ニトロオキシプロピオネートと比較した３−ニトロオキシプロパノールのｉｎ  ｖｉｖｏ効果：］
［材料および方法］
１０頭のヒツジのルーメンにカニューレを挿入した。外科手術の１ヶ月後に試験を開始した。３種の処理、すなわち、対照、添加物１、および添加物２（いずれも単回用量）を施した。添加物１は、エチル−３−ニトロオキシプロピオネートであり、添加物２は、本発明に係る３−ニトロオキシプロパノールである。実験計画は、各期間および３つの連続期間で１種の処理あたり３頭のヒツジを用いる３×３ラテン方格で構成した。各期間は、処理への適応の２８日間と、チャンバー内でのメタン測定およびルーメンサンプル採取の連続２日間と、を含んでいた。適応期全体を通じて、１４日目に中期のメタン測定を行った。それに加えて、２２日目および２３日目の時に、ナイロンバッグ中に入れられたアルファルファ乾草およびエンバクのサンプルをヒツジのルーメン内でインキュベートして、乾物ルーメン分解を決定した。チャンバー内でのメタン測定の２日間（２９日目および３０日目）では、朝の給餌の２時間後、ルーメン内容物サンプルを採取し、サブサンプル化し、ただちに凍結し、その後、ＤＮＡの抽出さらには揮発性脂肪酸およびアンモニア態窒素の濃度の決定を行った。実験動物をそれぞれ３頭の動物からなる３つのサブグループにランダムに割り付けて、３種の処理（対照、添加物１、および添加物２）の１つに無作為に帰属した。３つのサブグループは、チャンバー内でのメタン測定前の適応日数が同一になるように、２日間の間隔をあけて食餌への適応を開始した。新鮮な水が常に得られる檻の中に動物を個別に維持した。６０：４０の比の１５〜２０ｃｍに裁断されたアルファルファ乾草およびエンバクと、ミネラル−ビタミン栄養補助剤と、で構成される食餌を、９：００および１４：００の２回の等しい給餌時刻でエネルギー維持レベルの約１．１倍で動物に提供した。新たな物質摂取量を試験全体にわたり動物ごとに毎日モニターした。飼料と同一の時刻にルーメンカニューレを介して添加物を１日２回提供した。ルーメンに入れる直前に、各添加物の対応量（いずれの添加物についても、１頭の動物あたり１日につき１００ｍｇ）を１０グラムの粉砕エンバク中にピペット添加し、セルロース紙で包んだ。活性分子が揮発性であるので、以上に挙げた手順は、４℃の低温室で行った。
【００９９】
［メタン測定およびサンプル採取］
４つのメタンチャンバーのセットを使用した。１４、２９、および３０日目、動物をメタン測定用チャンバー内に入れた。各測定チャンバーは、幅１．８ｍ×深さ１．８ｍ×高さ１．５ｍの大きさであった。チャンバーの気温を１５〜２０℃に維持した。各チャンバー内で、動物を適応時と同一の檻の中に個別に拘束した。毎日０９：００に割込みを行って、チャンバーの床を清掃し、動物に給餌した。流量を１日３回計算してから平均して２３時間排出値を導出したので、これらの割込みは、毎日のメタン排出にほとんど影響しなかった。空気流量およびメタン濃度を各チャンバーの流入ダクトおよび流出ダクトで測定した。各チャンバーの排気ダクトで空気速度を終日にわたり連続的にモニターした。４つのダクト（チャンバー１、２、および３、ならびにバックグラウンド）のそれぞれの空気流をサブサンプル化して、ガスアナライザーＡＤＭ  ＭＧＡ３０００（Ｓｐｕｒｌｉｎｇ  ｗｏｒｋｓ，Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）を用いてメタン濃度を連続的に測定した。チャンバーのすべての流入ダクトおよび排気ダクトで逐次的に空気流をサンプリングするのに、１１分間を要した（チャンバー１、２、３で３分間、バックグラウンドで２分間）。要約すると、各測定日に、新鮮な空気の流入とチャンバー排気とのメタン濃度差および平均空気速度から、各チャンバーのメタン流量を計算した。
【０１００】
［ルーメンサンプル分析］
ルーメン内容物のサンプルを凍結乾燥し、ビーズビーター（Ｍｉｎｉ−ｂｅａｄ  Ｂｅａｔｅｒ；ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ，ＵＳＡ）を用いて物理的破壊により十分混合し、その後、溶解インキュベーションでより高い温度（９５℃）を用いるように変更を加えて、製造業者の説明書に従って、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｌｔｄ，Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）を用いて、約５０ｍｇのサンプルでＤＮＡ抽出を行った。ＤＮＡサンプルを定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）増幅用の鋳型として使用した。全細菌、全原生動物、および全メタン生成古細菌の存在量を、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により定量した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子標的の全細菌（Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）および１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子標的の全原生動物（Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００５）を増幅するために、異なるプライマーセットを使用した。メタン生成古細菌の検出用に設計されたプライマーは、メチル補酵素Ｍレダクターゼ（ｍｃｒＡ）遺伝子（Ｄｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を標的とした。増幅混合物は、２３μｌの最終体積中に、１１．５μｌの２×ＲＴ−ＰＣＲスーパーミックスＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、０．４μｌの各プライマー、および０．５μｌのサンプルを含有していた。蛍光発光測定のために、次のプログラム、すなわち、９５℃で５分間のサイクル、９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で５５秒間、および７５℃で６秒間の４０回のサイクルを用いて、各ペアのプライマーに対して増幅効率を評価した。５５℃から９５℃に温度を上昇させることにより融解曲線を作成し、５℃ごとに読み値を取得した。次のプログラム、すなわち、９５℃で５分間のサイクル、９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、および７２℃で４５秒間の４０回のサイクル（蛍光発光測定を含む）、ならびに４５℃の設定温度および９５℃の最終温度の融解曲線を用いて、各標的グループの増幅を行った。プラスミドｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を標準として用いて、ＤＮＡのコピー数として表される、細菌、原生動物、およびメタン生成古細菌の絶対量を決定した。それぞれのプライマーセットを用いて得られたＰＣＲ産物を精製し、次いで、ｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中にクローニングして、組換えプラスミドを生成した。ＰＣＲを用いて予想インサートが検証された単一コロニーを、抗生物質およびＸ−ｇａｌと共に、固体培地で一晩増殖させた。その後、形質転換Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーのスクリーニングを行って、陽性コロニーのいくつかをランダムに選択した。ＰＣＲによりコロニー中の挿入断片の存在を検査した後、液体培地で陽性コロニーの大量培養を一晩行った。Ｐｕｒｅ  Ｌｉｎｋ（商標）  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、これらの培養物に���するプラスミドを抽出し、次いで、配列決定して挿入断片の存在を検証した。プラスミドＤＮＡ濃度およびインサートを有するベクターの分子質量を用いて、プラスミド抽出物中に存在する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を計算した。１０８〜１０２個のコピー数範囲を提供するように濃縮プラスミドを逐次希釈（１０倍）して、標準曲線を作成した。１６ｓＲＮＡを参照遺伝子として用いて、Ｄｅｎｍａｎ  ａｎｄ  ＭｃＳｗｅｅｎｙ（２００６）に記載のように、メタン生成古細菌および原生動物の相対存在量の定量化に利用した。ガスクロマトグラフィーにより揮発性脂肪酸を分析し、我々の研究室（Ｍａｒｔｉｎ−Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）で確立したプロトコルに従って比色法によりアンモニア態Ｎ濃度を分析した。
【０１０１】
［ルーメン分解性］
５０μｍの細孔サイズを有する５ｃｍ×１０ｃｍナイロンバッグ（＃Ｒ５１０  Ａｎｋｏｍ  ｉｎ  ｓｉｔｕバッグ、Ｍａｃｅｄｏｎ  ＮＹ）中に３グラムの２ｍｍ粉砕飼料を入れた。動物の食餌に使用される２種の成分、すなわち、エンバクおよびアルファルファ乾草を試験した。エンバクの入ったバッグは、ルーメン内で２４時間インキュベートしたが、アルファルファ乾草の入ったバッグは、４８時間インキュベートした。異なる飼料原料のルーメン内の平均滞留時間に基づいて、インキュベーション時間を選択した。２２日目および２３日目、１種の飼料および１頭の動物および１つの期間あたり２個のバッグであった。朝の給餌の直前にバッグをルーメン内に入れた。２４または４８時間でそれらをルーメンから取り出し、冷水で洗浄し、そして−２０℃で凍結させた。すべての期間の終了時、溶解性を考慮してルーメン内でインキュベートしなかった１種の飼料あたり２個のバッグを含めて、短時間冷水プログラムを用いて、凍結バッグを洗浄機で洗浄した。洗浄後、バッグを６０℃のオーブン中に４８時間入れた。インキュベーション時間にわたる乾物の損失としてルーメン分解性（％）を計算した。
【０１０２】
［実験動物のケア］
ヒツジに対する管理および実験手順はすべて、実験動物保護のためにスペインガイドライン（２００５年１０月１０日のＡｃｔ  Ｎｏ．１２０１／２００５）に厳格に従って熟練者により行った。動物保護条件を考慮して、チャンバー内の温度、湿度、および排気を注意深くモニターした。また、良好な空気の質および更新速度を保証する限界内に維持すべく、ＣＯ２濃度を連続的にモニターした。チャンバー内に割り付けられた間、動物は、なんらストレス挙動を示さなかった。
【０１０３】
［統計解析］
添加物を含む効果を調べるために、個別のメタン排出、ＶＦＡプロファイル、酢酸対プロピオン酸の比、アンモニア態Ｎ濃度、全細菌、全原生動物、および全メタン生成古細菌の濃度のｌｏｇ１０変換、ならびに相対存在量を解析した。各解析に対して平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を計算した。最小有意差（ＬＳＤ）試験を用いて、平均値をさらに比較した。
【０１０４】
［結果］
乾物摂取量は、処理により影響を受けず（Ｐ＞０．０５）、１４日目および３０日目に動物をメタンチャンバー内に導入した時、摂取量のごくわずかな減少が観測された。
【０１０５】
摂取量に関して説明したように、体重（チャンバー測定の前後に記録した体重の平均値として）は、処理間で差異がなかった（Ｐ＞０．０５）（表５）。両者の添加物が食餌中に組み込まれた時、新たな物質摂取量１ｋｇあたりのリットル数として表されるメタン排出は、１４日目に有意に低減した（Ｐ＝０．０２０）。対照に対して観測された低減は、添加物１および２では、それぞれ、１４％および２３％であった。２週間後、２９日目、および３０日目にメタン排出を記録した時、依然として数値の低減が見られたが、統計的有意差に達しなかった（２９日目および３０日目で、それぞれ、Ｐ＝０．０６１および０．１８３）。最後の連続２日間に記録した測定値を一緒にプールした場合、添加の効果は、値を独立して考慮したときと類似の傾向を示す（Ｐ＝０．０９２）。
【０１０６】
【表１０】
0005984189.tif 000028
【０１０７】
【表１１】
0005984189.tif 000029
【０１０８】
２９日目および３０日目に採取したルーメンサンプルのルーメン発酵パラメーターの研究は、対照と比較して両者の添加物を摂取した動物のルーメン内でより多くのプロピオン酸プロファイルの方向に発酵経路のシフトを示した（表５）。したがって、両者の処理で、酢酸対プロピオン酸の比は、有意に低減した（Ｐ＝０．００２）。アンモニア態Ｎ濃度は、処理間で類似しており、動物に供給された食餌に対して予想される範囲内にあった。第２２日目および第２３日目のｉｎ  ｓａｃｃｏ分解研究は、アルファルファ乾草およびエンバクの両者のルーメン分解性に及ぼす添加処理の効果を示さなかった。
【０１０９】
【表１２】
0005984189.tif 000030
【０１１０】
ルーメン内の分析された微生物群の全濃度および相対濃度は、処理間で差異を示さなかった（Ｐ＞０．０５）。原生動物およびメタン生成古細菌の両者の存在量を全細菌に対して表した時、同一の影響の欠如が観測された。
【０１１１】
［結論］
両者の添加物の使用は、メタン生成の有意な低減をもたらし、そのうえさらに、ＶＦＡプロファイルによれば、Ｈ２移動が関与する代謝経路のシフトは、添加物により促進された。この試験の目的は、１ヶ月間の動物の処理が、２週間の処理にわたり観測された結果の持続性を示すかを確認することであった。このことは、飼料添加物の実用の好適性を評価する場合、不可欠である。この研究では、両者の添加物は、発酵パターンのシフトによりさらに確認されるメタン排出における効果を１ヶ月間の処理にわたり示した。
【０１１２】
一方、発酵パターンの変化は、メタン生成の低減に起因するだけでなく、より低い繊維分解性にも起因する可能性があり、その結果、より少ない酢酸が生成されることにより、酢酸対プロピオン酸の比が低減されるであろう。このことが起こるのを排除するために、エンバクおよびアルファルファ乾草の入ったナイロンバッグを動物のルーメン内でインキュベートすることにより、ルーメン分解性評価は行った。その結果は、乾物分解に及ぼすそのような効果を示さなかった。このことは、無処理の動物と比較して、添加物を摂取した動物で記録された同一の細菌または原生動物のバイオマスによっても支持される。
【０１１３】
［実施例１８：乳牛における３−ニトロオキシプロパノールのｉｎ  ｖｉｖｏ効果］
［材料および方法］
動物：  ２産以上の産次かつ５５０〜８００ｋｇの体重の６頭のルーメン瘻孔形成泌乳Ｈｏｌｓｔｅｉｎ  Ｘ  Ｆｒｉｅｓｉａｎ乳牛を研究に使用した。ウシは、研究の開始時、泌乳中期であった。
【０１１４】
実験食餌：  研究全体を通じて、単一の完全混合飼料（ＴＭＲ）食餌をすべてウシに提供した。試験期間中、ウシに不断給餌を行った（５％拒否）。
【０１１５】
実験計画：  泌乳中期（３０リットル以上の乳量を有する）から開始して、３×３ラテン方格法で６頭のウシを３種の追加処理の１つに無作為に帰属した（表８）。処理期間は、５週間の継続期間であった。
【０１１６】
【表１３】
0005984189.tif 000031
【０１１７】
３−ニトロオキシプロパノールまたはプラセボの投与：  朝夕の給餌時間にルーメンカニューレを介して所定用量の３−ニトロオキシプロパノールまたはプラセボを動物に投与した。
【０１１８】
期間計画：  任意の時点で一度に２頭のウシしか、間接熱量計に収容することできないので、１週間ごとにウシを移動させてペアで入れ替えた。４週目の終了時、４頭の動物を間接熱量計に移動させて、個別のタイストール内に維持し、そこで、呼吸交換（メタンおよび二酸化炭素の生成および酸素の消費）の完全２４時間測定値を得た（Ｃａｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０１１９】
［結果］
飼料摂取量：  毎日の乾物摂取量（ＤＭＩ）に及ぼす生成物（３−ニトロオキシプロパノール）の有意な影響はなかった（表９参照）。
【０１２０】
メタン生成：  メタン生成（リットル／日）およびメタン収率（リットル／ｋｇ  ＤＭＩ）は、３−ニトロオキシプロパノールにより有意に低減された。メタン生成は、５００および２５００ｍｇ／日の用量で投与した場合、それぞれ、対照値の９３および９０％であった（表９参照）。メタン収率に関しては、対応する値は、低用量および高用量で、それぞれ、対照メタン収率の９６および９３％であった。
【０１２１】
【表１４】
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【０１２２】
動物間で大きい変化が観測され、いくつかの動物は、他のいくつかの動物よりも大きい応答を示した。この結果は、乳牛のメタン生成低減における本発明に係る化合物の能力を示しており、給餌レジメンのさらなる改善に光明を投じる。