(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
超分子構造に薬剤をカプセル化する方法であって、
a. (i) ポリ(エチレングリコール)およびポリ(プロピレンスルフィド)を含むブロックコポリマー、(ii)両親媒性添加剤、ならびに(iii)薬剤、の混合物に、前記混合物を均質化するのに十分な量の熱を加えるステップと、
b. 水性溶液中で前記混合物を希釈するステップ
とを含む方法。
【請求項２】
前記超分子構造がミセルである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記超分子構造がベシクルである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記両親媒性添加剤がDBUまたはPEGである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
ベシクルの製造方法であって、
a. ポリ(エチレングリコール)およびポリ(プロピレンスルフィド)を含むブロックコポリマーからミセルを形成させるステップ（ここで、前記ブロックコポリマーのベシクルはミセルよりも熱力学的に安定している）と；
b. 前記ミセルに熱を加え、前記ベシクルを形成させるステップ
とを含む方法。
【請求項６】
前記ベシクルが70〜800nmのサイズを有する、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記ミセルが、ステップ(b)で前記ベシクルへカプセル化される薬剤を含む溶液中に懸濁される、請求項5または6に記載の方法。
【請求項８】
(i) ポリ(エチレングリコール)およびポリ(プロピレンスルフィド)を含むブロックコポリマー、(ii)両親媒性添加剤、ならびに(iii)薬剤、を含むベシクル。
【請求項９】
ポリ(エチレングリコール)およびポリ(プロピレンスルフィド)を含むブロックコポリマーを含んでなるミセルを含む乾燥製剤であって、5重量％未満の水を含む前記製剤。
【請求項１０】
前記製剤が2重量％未満の水を含む、請求項9に記載の製剤。
【請求項１１】
前記ミセル中にカプセル化された薬剤をさらに含む、請求項8または9に記載の製剤。
【請求項１２】
第1および第2のブロックコポリマーを含み、10〜60nmのサイズを有するミセルであって、前記第1のブロックコポリマーがポリ(エチレングリコール)およびポリ(プロピレンスルフィド)を含み、第2のブロックコポリマーがポリ(エチレンイミン)およびポリ(プロピレンスルフィド)を含む、前記ミセル。
【請求項１３】
前記ミセルが10〜40nmのサイズを有する、請求項12に記載のミセル。
【請求項１４】
PEG-PPSを含む第1のブロックコポリマーと、PEG-PPS-PEIを含む第2のブロックコポリマーと、遺伝子ベースの薬剤を含むミセル。
【請求項１５】
前記ミセルが直径20〜50nmである、請求項14に記載のミセル。
【請求項１６】
請求項12〜15のいずれか1項に記載のミセルと、製薬上許容可能な希釈剤とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2008年11月25日に出願の米国仮出願第61/117,892号(これは参照により本明細書に組み入れるものとする)の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明はポリマー化学の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
薬剤送達の分野において、水性環境中で安定性のある超分子構造へ自己組織化することができる両親媒性ブロックコポリマーに大きな関心がもたれている。様々な超分子構造によって、薬剤学的用途で重要となり得るミセルおよびベシクルを得ることができる。これまで、ポリ(エチレングリコール)(PEG)含有ブロックコポリマー、例えば、ポリ(プロピレングリコール)およびポリ(エチルエチレン)のコポリマーなどで幅広い研究が行われてきた。こうしたブロックコポリマーは、通常、厳密な無水条件下のイオン重合により調製されるが、非対称ブロックコポリマーを得ること、または生体分子を導入することは困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、新規のブロックコポリマーが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要約
酸化または加水分解に感受性の高い荷電ブロックまたは化学的部分を含有するブロックコポリマーを開発した。本発明者らは、超分子構造(例えば、ミセルまたはベシクル)および医薬組成物、ならびに前記超分子構造および医薬組成物の調製方法における、こうしたブロックコポリマーの使用を記載する。本発明は、細胞への薬剤(例えば核酸)の送達に特に有用である。
【０００６】
したがって、一態様においては、本発明は、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含むブロックコポリマーであって、ブロックの少なくとも1種が加水分解可能または酸化高感受性の化学的部分で分断されている、前記コポリマーを特徴とする。ブロックコポリマーは、超分子構造(例えば、ミセルまたはベシクルなど)へ自己組織化することができることが望ましい。特定の実施形態においては、加水分解可能な化学的部分は、エステル、アミド、チオエステル、無水物またはケタールである。別の実施形態においては、親水性ブロックはポリ(エチレングリコール)(PEG)であり、疎水性ブロックはポリ(プロピレンスルフィド)(PPS)である。
【０００７】
別の態様では、本発明は、(i)親水性ブロックおよび疎水性ブロックのブロックコポリマーと、(ii)添加剤と、を含有する、超分子構造(例えばミセルまたはベシクル)を特徴とする。望ましくは、添加剤は両親媒性分子である。好ましい実施形態においては、添加剤は、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン(DBU)または分子量400〜800のPEGである。超分子構造は、疎水性または親水性の薬剤をさらに含有していてもよい。薬剤は、例えば、ペプチド、核酸、抗生物質または化学療法剤である。特定の実施形態では、薬剤は、デキサメタゾン、パクリタキセル、シクロスポリンA、シロリムス、エベロリムス、タクロリムス、アンフォテリシンBまたはアドリアマイシンから選択される。他の実施形態では、薬剤は、ポリペプチド、例えばタンパク質、または抗体もしくは抗体の抗原結合性フラグメントである。好ましい実施形態では、薬剤は、5％、25％、50％、75％、90％または95％を超える効率で超分子構造内にカプセル化される。超分子構造は、製薬上許容可能な希釈剤と一緒に医薬組成物に含まれていてもよい。
【０００８】
関連する態様では、本発明は、超分子構造(例えばミセル、ベシクル)中に薬剤をカプセル化する方法を特徴とする。本方法は、薬剤を、添加剤ならびに親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含有するブロックコポリマーと接触させるステップと、薬剤、添加剤およびブロックコポリマーの混合物を均質化するために熱を加えるステップと、水溶液中の均質化混合物を希釈するステップとを含む。特定の実施形態では、添加剤は、DBUまたは分子量が400〜800のPEGである。
【０００９】
さらに本発明は、ベシクルの製造方法であって、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含有するブロックコポリマーからミセルを形成させるステップであって、ブロックコポリマーにより形成されるベシクルがブロックコポリマーにより形成されるミセルよりも熱力学的に安定性が高いステップと、ミセルを加熱してベシクルを形成させるステップとを含む、前記方法を特徴とする。特定の実施形態では、本方法により形成されるベシクルは直径70〜800nmである。他の実施形態では、ミセルは薬剤を含有する溶液中に懸濁され、薬剤は溶液を加熱する際にベシクル中にカプセル化される。別の実施形態では、ブロックコポリマーの親水性ブロックはPEGを含有し、ブロックコポリマーの疎水性ブロックはPPSを含有する。また本発明は、この方法により調製されるベシクルも提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、親水性ブロックおよび疎水性ブロックを有するブロックコポリマーのミセルを含有する乾燥製剤であって、製剤の含水量が5％未満、例えば2％未満である、乾燥製剤を特徴とする。本乾燥製剤はさらに薬剤を含有していてもよい。特定の実施形態では、ブロックコポリマーの親水性ブロックはPEGを含有し、ブロックコポリマーの疎水性ブロックはPPSを含有する。
【００１１】
さらに本発明は、正荷電ブロックを含有するブロックコポリマーおよび核酸を含む超分子構造であって、超分子構造の最大直径が60nm未満である、超分子構造を特徴とする。ブロックコポリマーは、親水性ブロック(例えばPEG)および疎水性ブロック(例えばPPS)をさらに含んでいてもよい。一実施形態では、ブロックコポリマーはPPS、PEGおよびポリエチレンイミン(PEI)を含有する。別の実施形態では、核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチド、短鎖干渉RNA(short-interfering RNA)、アプタマーまたはプラスミドDNAである。望ましくは、超分子構造の最大直径は40nm未満である。関連する態様では、本発明は、細胞を、正荷電ブロックを含有するブロックコポリマーおよび核酸を含む超分子構造と接触させることを含む、細胞を核酸でトランスフェクトする方法を特徴とする。
【００１２】
別の態様では、本発明は、PPS、PEGおよびPEIを含有するブロックコポリマーを特徴とする。特定の実施形態では、PPSブロックおよびPEIブロックは、エンドソーム内で不安定な結合、例えばジスルフィド結合、ビニルエーテル、オルトエステル、アシルヒドラゾンまたは-N-PO3-基を介して結合されている。別の実施形態では、ブロックコポリマーは、PEIブロックに結合されている核酸を含む。ブロックコポリマーは、薬剤および製薬上許容可能な希釈剤を含有する医薬組成物に含まれていてもよい。
【００１３】
さらに本発明は、2種のブロックコポリマーを含有する直径が10〜60nmのミセルであって、第1のコポリマーが親水性ブロックおよび疎水性ブロックを含有し、第2のコポリマーが親水性ブロック、疎水性ブロックおよび正荷電ブロックを含有する、前記ミセルを特徴とする。特定の一実施形態では、第1のブロックコポリマーはPEGおよびPPSを含有し、第2のブロックコポリマーはPEG、PPSおよびPEIを含有する。他の実施形態では、ミセルは20〜50nmの最大直径を有する。ミセルは、薬剤および製薬上許容可能な希釈剤を含有する医薬組成物に含まれていてもよい。
【００１４】
別の態様では、本発明は、親水性ブロック(例えばPEG)および疎水性ブロック(例えばPPS)を含有するブロックコポリマーを含む超分子構造であって、ブロックコポリマー中の反復単位の5〜25％が超分子構造の外表面に配置されている荷電化学的部分を有する、超分子構造を特徴とする。特定の実施形態では、荷電化学的部分はカルボン酸、硫酸塩またはスルホンである。超分子構造は、薬剤および製薬上許容可能な希釈剤を含有する医薬組成物に含まれていてもよい。
【００１５】
本発明の任意の実施形態において、親水性ブロックは、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)-コ-ポリ(プロピレンオキシド)ジブロックもしくはマルチブロックコポリマー、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(エチレン-コ-ビニルアルコール)、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポリ(アルキルアクリレート)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(N-アルキルアクリルアミド)、ポリペプチド、多糖類、ポリ(N,N-ジアルキルアクリルアミド)、ヒアルロン酸、またはポリ(N-アクリロイルモルホリン)を含有し得る。疎水性ブロックは、ポリ(プロピレンスルフィド)、ポリ(プロピレングリコール)、エステル化ポリ(アクリル酸)、エステル化ポリ(グルタミン酸)、エステル化ポリ(アスパラギン酸)またはポリペプチドを含有し得る。特定の実施形態では、荷電ブロックは、PEI、ポリペプチド、ポリ(アミドアミン)、ポリ(ナトリウム 1-(N-アクリロイルピペラジン-1-イル)ジアゼン-1-イウム-1,2-ジオレート)、ポリ(ナトリウム 1-(N-アクリロイルホモピペラジン-1-イル)ジアゼン-1-イウム-1,2-ジオレート)、またはポリ(ナトリウム 1-(N-アクリロイル-2,5-ジメチルピペラジン-1-イル)ジアゼン-1-イウム-1,2-ジオレート)である。
【００１６】
「ブロックコポリマー」とは、2つ以上の化学的部分の反復単位をそれぞれ含有する、少なくとも2つのブロックを含有する化合物を意味する。1つのブロックの化学的部分は、ブロックコポリマーの別のブロックに存在する化学的部分とは異なる。例えば、ブロックコポリマーは、ポリ(エチレングリコール)(PEG)ブロックおよびポリ(プロピレンスルフィド)(PPS)ブロックを含有し得る。一般的に、ブロック中の反復単位の数は4〜250である。一例としての親水性ブロックは250以下の反復単位を含有し、また一例としての疎水性ブロックは100以下の反復単位を含有する。ブロックの反復単位は、望ましい機能性(例えば、加水分解能力)を付与する基により分断されていてもよいし、改変されていてもよい。
【００１７】
加水分解可能な化学的部分「で分断される」ブロックとは、化学的部分が加水分解された場合に、ブロック中の反復単位の数が減少するような、その内部に加水分解可能な化学的部分を含む、同一反復単位のブロックを意味する。加水分解に際し、ブロックは、規模として、少なくとも、例えば2、4、10、15、20、30、50、75または115の反復単位まで減少し得る。加水分解可能な部分としては、例えば、エステル、アミド、チオエステル、無水物、およびケタールなどが挙げられる。加水分解可能な化学的部分で分断されるブロックの一例は、PEG4にエステル化されるPEG46である。
【００１８】
「加水分解可能な化学的部分」とは、pH 7.4および37℃での半減期が1年またはそれ未満である、水性溶液中で開裂される化学的部分を意味する。好ましくは、pH 7.4および37℃におけるその部分の半減期は、1か月またはそれ未満である。
【００１９】
「核酸」とは、任意の核酸塩基オリゴマーを意味する。本明細書の目的においては、ヌクレオシド骨格中にリン原子を有していない改変オリゴヌクレオチドも核酸塩基オリゴマーであると考えるものとする。核酸の具体例(これらに限定されるものではない)は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA群(small interfering RNAs)、アプタマーおよびプラスミドDNAである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】ポリ(エチレングリコール)モノメチルエーテル(PEG MME)のPEGチオアセテート(PEG TAc)への変換を示す図である。ディーン・スターク管を使用してPEG MMEを乾燥させ、臭化チオニル2.5 eqを加えた。次いで、反応物を140℃で4時間還流した。トルエンを蒸発させ、ポリマーをジクロロメタン(DCM)中に溶解させ、冷ジエチルエーテル中に沈殿させた。最終変換は、5 eqのK2CO3および5 eqのチオ酢酸を含むジメチルホルムアミド(DMF)中にPEG-Brを溶解させ、一晩撹拌することにより行った。生成物を濾過し、DMFを蒸発させ、DCM中に溶解させた。PEG-TAcを活性炭で精製し、冷ジエチルエーテル中に沈殿させた。
【図１Ｂ】PEG-TAcを過剰量のPEG(200)ジアクリレートと反応させることにより、PEG-TAcをPEG-エステル-EG4-アクリレートに変換した図である。PEG-TAcをテトラヒドロフラン(THF)中に溶解させ、完全に脱気した。次に、塩基としてトリエチルアミン1 eqを含むTHF中のPEGジアクリレート50 eqに、その溶液を加えた。反応物を一晩撹拌し、冷ジエチルエーテル中で2回析出を行い、精製した。
【図１Ｃ】ベンゼンチオールから開始されるPPSブロックを形成し、エンドキャッピング試薬としてPEGアクリレートモノマーを使用することにより、最終ポリマーを合成した図である。これは、THFへDBU塩基を溶解させ、脱気することにより行った。ベンゼンチオールをアルゴン流下で加え、プロピレンスルフィドモノマーを、気密隔壁を通して加えた。1時間後、PEG-エステル-EG4-エステル-アクリレートを加え、THF中に溶解させ、脱気した(0.5 eq)。反応物を一晩撹拌した。この最終生産物は、トルエン中にこの乾燥混合物を溶解させ、フィルタ濾過することにより精製した。トルエンを蒸発させた後、ポリマーをDCM中に溶解させ、冷ジエチルエーテル中に沈殿させた。
【図２】図2Aは、各種pH値における時間に対する25℃でのPEG-PPSの加水分解を示す図である。ポリマーはTHFから溶媒分散により調製した。THFは、試験開始前に真空下で除去した。分解はゲル透過クロマトグラフィーにより定量し、遊離PPSおよびPEGブロックに関するピークを定量した。高いpH(8.4)では急速に分解されたが、pH 5.4では分解は認められなかった。図2Bは、図2Aで示したものと同じポリマー調製品の分解を37℃で定量した図である。分解は高pH値で最も大きく、これらの条件下におけるエステル結合の迅速な加水分解によると考えられる。予想外に、20日以降にpH 5.4でも分解が認められた。
【図３】添加剤DBUおよびPEG600を、95℃で撹拌しながらブロックコポリマーPEG-PPSと混合した。
【図４】DBU-HClと混合したPEG-PPSの動的走査熱量測定を示す図である。ポリマーおよび塩は一緒に溶解し、2種の材料の均質混合物を生成した。
【図５】吸光度を使用する各種PEG-PPS処理方法の特性決定の図である。試料は、同一濃度(5mg/mL)で調製した直後に分析した。凡例は、溶媒分散(SD)、薄膜押し出し(TFE)および直接水和(DII)を表す。
【図６】3時間95℃でインキュベートした製剤vs対照のゲル浸透クロマトグラフを示す図である。データは屈折率検出器を使用して求めた。透明度については、対照はbottomで示され、180分試料は5％までoffsetする。両クロマトグラムは標準化した。
【図７】時間経過に伴う95℃におけるPEG-PPSの分解試験を示す図である。棒グラフは、注入した試料の平均数平均分子量(Mn)を表す。左から右へ、非加熱ポリマー対照(対照)；塩無しで15分対照加熱(15C)；塩と15および30分加熱(15、30)；塩無しで60分加熱(60C)；塩と60、120および180分加熱(60、120、180)。非加熱対照を95℃、180分のものと比較するStudent's t-検定からは、差が統計的に有意ではないことがわかった。Mpはピーク分子量を表し、Mvは重量平均分子量を表す。ゲル透過クロマトグラフィー(GPC)を使用するPDIは、Mw/Mnにより計算する。Mn = Sum (NiMi) / Sum (Ni)、およびMw = Sum (NiMi2) / Sum (NiMi))。
【図８】プロトンNMRを使用して分析した分解試験を示す図である。ポリマーEG46-PS12を使用する、非加熱調製品、加熱調製品、および塩との加熱調製品を比較した。ポリマー試料およびポリマーおよび塩の試料を95℃で3時間加熱した後、THFで抽出し、ジエチルエーテル中で沈澱させた。精製画分は、内部標準としてクロロホルムD含有0.1％TMS中でプロトン-NMRにより測定した。
【図９】個別の成分および互いに混合した成分の動的走査熱量測定を示す図である。混合物は、EG46-PS12 50/50 wt/wtをDBU-HClと混合し、95℃で60分間加熱して調製した。試料を完全に混合し、DSCにて測定した。比較にあたり、ポリマーおよびDBU-HCl塩も別々に測定した。塩およびポリマーは、加熱時に溶融状態に溶解された。
【図１０】低温電子顕微鏡(低温TEM)を使用する、直接水和により形成されたベシクルの画像を示す図である。形成された層状の相は、画像診断前に、穴のある炭素グリッド上でガラス化した凝集体は、低温TEMを使用する分析の前に押し出された。
【図１１】図11Aは、薄膜水和押し出し成形と比較したDBU-HCl製剤のカプセル化効果を示す図である。オボアルブミンはTCEPを使用して還元し、Sephadex G50を用いて精製し、凍結乾燥した。26mgの還元オボアルブミンを蒸留水500μL中に溶解し、DBU-HClを混合したPEG-PPSの調製物に95℃で15分間添加した。上記に、この溶液10μLを加え、混合し、蒸留水でゆっくりと希釈した。結果は、同一還元オボアルブミン試料で作製した標準曲線から算出した。薄膜水和押し出し成形の結果は、Jousmaら, Int. J. Pharm. 35 (1987) 263-274から得た。図11Bは、PEG製剤におけるデキサメタゾンおよびパクリタキセルのカプセル化効果を示す図である。デキサメタゾンまたはパクリタキセルは、本発明の方法に従い、示したブロックコポリマーおよび示したPEGまたは対照製剤とインキュベートした。図11Cは、ウシ血清アルブミンおよびオボアルブミンは蒸留水中50mg/mLで調製した。製剤は以下のように調製した。10ミリグラムのPEG-PPSを10mgのPEG500ジメチルエーテルと加熱し、95℃で15分間加熱した。溶融物を混合し、室温まで冷却させた。その後、一定量のタンパク質溶液(5μLまたは10μL)を加え、混合しながら1mLまで蒸留水でゆっくりと希釈した。カプセル化効率を計算するため、標準曲線は、BSA(フルオレサミンを使用)またはオボアルブミン(FITCオボアルブミンを使用)の両方について作製した。分散させたベシクル溶液を10分間10,000gの遠心分離にかけてベシクルを沈殿させ、上清中の遊離タンパク質を測定した。
【図１２】95℃でポリマーを加熱した場合の時間経過に伴う吸光度の変化を示す図である。PEG-PPS(EG46-PS64)ミセルは、THFを使用し、水中の溶媒分散から調製した。1時間真空下でTHFを除去した後、10mg/mLの懸濁液を1.5mLのエッペンドルフチューブへそれぞれ1mLずつ入れた。このアリコートに、THFを200μL加えた。時間=0 吸光度(OD)および動的光散乱(DLS)に対する初期試料を取り出し、チューブを95℃の予熱インキュベータに入れた。試料を特定の時点で一試料当たり100μL取り、氷上の96ウェルプレートへアリコートした。最終試料を取り出した後、各試料50μLを新しい96ウェルプレートに加え、吸光度モードのプレートリーダーを使用し、吸光度を400nmで測定した。
【図１３】吸光度用試料(50μL)を再蒸留水550μLに分散させ、DLSを使用して測定した。ODおよびDLSの両データは、粒径が大きくなる傾向と形態学的変化を明らかに示唆している。
【図１４】PEG-PPSミセルのベシクル内への熱転移の低温透過型電子顕微鏡を示す図である。ミセル試料(左)は、図2から得られたDLS結果を有する、良好な凝集体中のPEG-PPSの微小凝集体を示す。30分試料(右)は、加熱中に生成されたベシクル(ポリマーソーム(polymersomes))を示す。
【図１５】ネガティブ染色TEMを使用してとらえた、加熱中のPEG-PPSミセルの凝集体を示す図である。この場合、加熱実験から得た3分試料を、グロー放電によって調製した、400メッシュ炭素をコートした銅グリッドに加えた。次いで、試料を60秒後にブロットし、2％酢酸ウラニルで30秒染色した。上記画像は75,000xで得た。2-D表面ベシクルは、ショートワーム様のミセルまでゆっくりと形成される。
【図１６Ａ】PEG44-PPS20シクロスポリンAを充填したポリマーミセルの動的光散乱による粒度分布。
【図１６Ｂ】乾燥および再水和した後の図16Aのミセルの粒度分布。
【図１７Ａ】ゲル透過クロマトグラフィーにより測定した、胃内pHに曝露した後のPEG44-PPS20の安定性。
【図１７Ｂ】動的光散乱により測定した、胃内pHへ曝露した後のPEG44-PPS20の安定性。
【図１８】PEG-PPS-PEIへの合成経路を示す図である。PPSブロックとPEIブロックの間のジスルフィド結合は、細胞内取込後にポリマーを不安定化させる。
【図１９】PEG-PPS-PEIは、プラスミドDNAをトランスフェクション用の粒度分布のナノ粒子に縮合することを示した。
【図２０】PEG-PPS-PEIは、ここで示したように、3T3繊維芽細胞などのトランスフェクトが困難な細胞であっても、細胞を非常に効率的にトランスフェクトすることを示した。他の細胞は、さらに高いトランスフェクション効率(例えば、239T細胞はPEG2kDa-PPS27-PEI96で96％)でトランスフェクトされた。
【図２１】PEG-PPS-PEIによる細胞毒性は、同一PEI濃度における同一分子量の直鎖PEIによる毒性に比べると非常に低い。
【図２２】得られた遺伝子薬剤複合体のサイズは、使用されるポリマーとミセル混合構築物との比率をはじめとする、多様な手段により調節することができる。
【図２３】PEG-PPS-ベースのポリマーは、siRNA配列を含む本明細書のオリゴヌクレオチド薬剤と縮合させることで、例えば、ゲル泳動を防ぐことができる。これは、これらのポリマーのオリゴヌクレオチド配列およびプラスミドDNAとの多用途性を示唆するものである。
【図２４】PEG-PPS-ベースのポリマーは、HeLa細胞のラミンA/Cの発現をノックダウンするsiRNAを含む本明細書のオリゴヌクレオチド薬剤とのトランスフェクションを高い効率で誘導した。
【図２５】10:1の比のPEG-PPS-PEI：PEG-PPS効率的トランスフェクト細胞で形成された遺伝子複合体。PEG-PPSはPEG-PPS-PEIミセルのサイズを低減するのに使用され、その結果、遺伝子ベースの薬剤を含むより微小な複合体が得られた。ここでは、細胞は、緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子配列を含有する30nm複合体とインキュベートした。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、1つが親水性で1つが疎水性の少なくとも2種のブロックを有する様々なブロックコポリマーを提供する。さらに、ブロックコポリマーは追加のブロックを含んでいてもよいし、加水分解可能な化学的部分で分断されていてもよく、あるいは改変されていてもよい。コポリマーのそれぞれのブロックは、自己組織化および生物学的機能にとって重要である。各ブロックのサイズは、他のブロックとは無関係に、例えば、各ブロックの機能を調整するように決定することができる。それぞれのブロックは、例えば、US 2003/0059906およびWO 2007/008300(これらは参照により本明細書に組み入れるものとする)に記載されているような、当技術分野で公知の方法を使用して合成し、別のブロックに結合させることができる。
【００２２】
ブロックコポリマー
親水性ブロック
親水性ブロック(例えば、PEG)は、(i)核酸／正荷電ポリマー複合体の体内における血清タンパク質、細胞および組織との非特異的相互作用を防止し、取りこまれたリガンドを介して特異的相互作用が設計されるようにし、また、(ii)水性環境における複合体の溶解性を高めるために利用することができる。
【００２３】
水性環境において可溶性であるか、膨張するポリマーまたは分子は、タンパク質吸収を防止すると同時に、粒子の溶解性をも高める。例えば、炭水化物ポリマー(例えばヒアルロン酸(HA)など)はそれらの容積を約1000倍まで膨張することが可能であり、実際、タンパク質吸収の防止に用いられている。別の炭水化物ポリマーまたは分子の候補は自然界で見つかっている。具体的な親水性ブロックとしては、脂肪鎖中に極性基、イオン性基またはイオン化基(ionizable groups)を潜在的に有する、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)-コ-ポリ(プロピレンオキシド)ジ-もしくはマルチブロックコポリマー、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(エチレン-コ-ビニルアルコール)、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポリ(アルキルアクリレート)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(N-アルキルアクリルアミド)、ポリペプチド、多糖類、ポリ(N-アクリロイルモルホリン)、またはポリ(N,N-ジアルキルアクリルアミド)が挙げられる。
【００２４】
より高い分子量の親水性ブロックを用いてもよいが、500〜10,000 Daの分子量を有する親水性ブロックが実用的で都合がよい。親水性ブロックに関し、反復単位数は約10〜約250であるのが好ましい。それは、その数値の場合には、これらの材料が腎濾過によって体内から排出されやすいからである。PEG親水性ブロックは、好ましくは750〜5500 Da、例えば、2〜5 kDaである(例えば、115単位を含有するブロック)。反復単位数が大きい親水性ブロックも腎臓により濾過されるが、反復単位数の小さい親水性ポリマーと比べるとその速度が緩慢であるため、施用できる用量に制限を設けてもよい。
【００２５】
疎水性ブロック
疎水性ブロックは、本明細書において、疎水性であるあらゆるポリマーを含み得る。好ましい疎水性ブロックはPPSである。骨格中の硫黄原子の代わりに酸素原子を有するPPSの構造相同体であるポリ(プロピレングリコール)(PPG)を使用することもできる。有用なPPS鎖の長さに比べて、より長いPPG鎖が必要とされ得る。一般的に、融解温度またはガラス転移温度の低いポリマーが最も望ましい。それは、この特性が最も効果的なミセル化を促すからである。
【００２６】
側鎖上の疎水性官能基で誘導体化されてはいるが、その他では親水性である別のポリマーは、疎水性ブロックにおいて使用することができる。例としては、エステル化ポリ(アクリル酸)、エステル化ポリ(グルタミン酸)またはポリ(アスパラギン酸)、および疎水性ペプチドまたはペプトイド(例えば、N-置換グリシン)が挙げられる。300〜5000 Daの分子量を有する疎水性ブロックが実用的かつ便利であるが、より分子量の大きい疎水性ブロックも使用することができる。疎水性ブロックに関し、反復単位数は、例えば約4〜約240、好ましくは4〜70である。例えば、ポリプロピレンスルフィド疎水性ブロックは、使用する初期親水性ブロック(例えばPEG)および希望の用途に応じて、150〜16,000 Da、例えば200〜15,000 Daで変動し得る。より反復単位数の大きいものも利用することができる。しかし、こうしたポリマーから得られる自己組織化構造は、それらの平衡形態から程遠い可能性がある。
【００２７】
追加ブロック
特定の実施形態においては、本発明のコポリマーは2種のみのポリマーブロックを有するが、他の化学的部分、例えば、加水分解可能部分、荷電部分または生物学的活性部分が存在していてもよい。他の実施形態では、コポリマーは3種以上のポリマーブロックを含んでいてもよい。こうした追加ブロックは、例えば、(i)静電的相互作用を介して核酸または他の荷電分子を結合させるため、(ii)自己組織化構造が細胞に入るのを促進するため、および／または(iii)他の生物学的機能を果たすために用いることができる。追加ブロックは、荷電分子(例えば核酸)の結合に用いられる場合、荷電分子との可逆性結合を生じるようなサイズにされるのが好ましい。例えば、荷電分子の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または95％までもが、例えば、細胞質ゾル中または核内で、適切な細胞条件下にブロックから解離可能である。さらに、短いブロックは、任意の毒性を低減または除去するために用いることができる。
【００２８】
ブロックコポリマーにおける正荷電ブロックの使用は、例えば核酸との小型複合体の形成に特に有利である。具体的な正荷電ブロックは、ポリペプチド(例えばポリリシン)、ポリ(エチレンイミン)(PEI)、ポリ(アミドアミン)、ポリ(ナトリウム 1-(N-アクリロイルピペラジン-1-イル)ジアゼン-1-イウム-1,2-ジオレート)、ポリ(ナトリウム 1-(N-アクリロイルホモピペラジン-1-イル)ジアゼン-1-イウム-1,2-ジオレート)またはポリ(ナトリウム 1-(N-アクリロイル-2,5-ジメチルピペラジン-1-イル)ジアゼン-1-イウム-1,2-ジオレート)である。生理学的pHで5〜20の陽電荷を有するブロックが実用的で都合がよいが、多数の陽電荷を有するブロックも使用することができる。500〜10000 Daの正荷電ブロックの分子量が好ましい。PEIなどのポリマーに関しては、約10〜約250の反復単位数が好ましい。荷電ブロックが長くなると、一般に、対応する細胞毒性がより高くなる。
【００２９】
追加ブロックはペプチドであってもよい。ペプチドは、それらが発現可能な数多くの化学的および生物学的機能により、薬剤送達および他の医学的用途の分野において幅広く利用されている。荷電ペプチドの例としては、生物活性のあるTATペプチドおよびオリゴ(リシン)(例えば、Lys9)ペプチドが挙げられる。両ペプチドは荷電されており、核酸および他の負荷電分子に結合することができる。荷電ブロックのさらなる例としては、オリゴ(ヒスチジン)、オリゴ(アルギニン)(例えば、Arg9)、ならびにLys、ArgおよびHisのコポリマーが挙げられる。
【００３０】
さらに、ポリ(アミドアミン)(PAMAM)デンドリマーは核酸を複合体形成するために用いられており、荷電ブロックに含めることができる。PAMAMはエンドソームを効果的に回避し、細胞質ゾルにおいて複合体形成された内容物を放出させることができることがわかっている。
【００３１】
ポリマー改変
本発明のコポリマー中のポリマーブロックは改変可能である。こうした改変としては、荷電基(例えばカルボン酸基、硫酸塩、スルホンおよびアミン)、親水基(例えばヒドロキシル)、疎水基(例えばフェニルもしくはメチル)、加水分解可能な基(例えばエステル、アミド、チオエステル、無水物もしくはケタール部分)、または酸化に感受性のある基を加えることが挙げられる。特に、超分子構造中の水性溶液に暴露されるポリマーブロックの部分は、本明細書に記載の通り、in vivoでのより効果的な取り込みが可能なように1種または複数の荷電基を含めるよう改変することができる。またブロックコポリマーは、本明細書に記載し、当技術分野で公知の各種の基で末端封止することができる。
【００３２】
加水分解可能な化学的部分により改変されるブロックコポリマーの特定の一例は、実施例1で説明する。こうした加水分解可能なブロックコポリマーに関して、PEGジアクリレートは、200〜600 Daの分子量を有するのが好ましい。使用することができる他の加水分解可能なブロックとしては、ラクチド基またはカプロラクトン基を挙げることができる。
【００３３】
in vivoにおける分解
本自己組織化担体は、標的器官における不可逆的蓄積を回避するため、in vivoでのある種の分解を示し得る。ポリスルフィドは、例えば、過酸化水素などの穏やかな酸化剤の作用により、ポリスルホキシドへ、さらにはポリスルホンへまでもの酸化を容易に受けることが知られている。この酸化は、生物学的条件下で、例えば、マクロファージにより細胞外的に、あるいはエンドソームもしくはリソソーム区画への細胞取り込み後、細胞内的に行われ得る。同様の種類の反応は、廃水泡を消泡するため、チオエテール末端化PEG(パルプおよび紙加工で乳化剤として使用されるもの)の酸化に使用されている(例えば、米国特許第4,618,400号を参照)。
【００３４】
ポリスルフィドをポリスルホキシドへ変換すると、水におけるブロックコポリマーの可溶化が可能となり、排出により除去され得る(Napoli Aら, Nature Materials, 2004. 3(3)：p. 183-189.)。変換、例えば、ゲルのミセルもしくは可溶性ポリマーへの変換、ベシクルのミセルもしくは可溶性ポリマーへの変換、またはミセルの異なるサイズおよび形状ミセルへもしくは可溶性ポリマーへの変換は、自己組織化凝集体の不安定化を招く可能性がある。また凝集体の不安定化は、任意のカプセル化した薬剤(例えば、核酸)の放出を招く可能性もある。可溶性ポリマーのクリアランスの機序は比較的よく理解されている。最も重要なかかる機序は腎濾過によるクリアランスであり、その有効分子量カットオフは約30,000である。サイズが約100nm未満の粒子は、肝臓において血流から除去され得る。またリンパ管取り込みも、クリアランスにおいて重要な役割を果たしている。
【００３５】
本発明のコポリマーは、それらが変化するエンドソームの環境に応答するように合成することもできる。例えば、エンドソームの環境が還元するようになるにつれて、結合が切断され、それによりエンドソーム内の複合体が不安定化されるように、ジスルフィド結合をコポリマーに導入することができる。また、例えば、エンドソームの低pHに応答するN-PO3結合も構造中に導入することができる。さらに、細胞内分解に感受性があるビニルエーテル、オルトエステルおよびアシルヒドラゾンなどのさらなる結合も用いることができる。
【００３６】
また本発明のコポリマーは、疎水性または親水性ブロックが加水分解可能な化学的部分(例えばエステルまたはアミド)で分断されるように合成することもできる。前記部分の加水分解により、疎水性または親水性ブロックの相対量に変化が生じ、次にこれが、その好ましい自己組織化形態に変化を生じさせることにより超分子複合体が不安定化される。一実施形態においては、加水分解可能な結合の半減期は、pH 7.4および37℃の水性溶液中で1時間〜1年である。望ましくは、半減期は1日〜9か月、さらに好ましくは2日〜6か月、最も好ましくは4日〜3週間である。特定の実施形態において、チオエテールまたは第二級アミンは、加水分解可能な結合に対してα位またはβ位に存在する。
【００３７】
自己組織化
両親媒性ブロックコポリマーは、広範囲の用途において界面活性剤および分散剤として長い間使用されてきた。ブロックの1つとして選択できる溶媒中の組織化構造の形成は、この性質に基づく。
【００３８】
球状もしくは円柱状ミセル、ラメラ、またはベシクルなどの明確に定義された自己組織化構造(Booth et al., Macromol. Chem., Rapid Commun. 2000, 21, 501-527； Won, Science 1999, 283, 960-963； Discher et al., Science 1999, 284, 1143-1146；およびEisenberg et al., Macromolecules 1998, 31, 3509)がポリ(オキシアルキレン)ブロックコポリマーで確認されている。ポリマー溶液の濃度および温度は、形成され得る凝集体の種類に大いに影響を及ぼす。例えば、温度が上昇すると、液体球状ミセル相から球状ミセルの立方相へ、また最終的には、円柱状ミセルの六方相へと変化する(Mortensen, Progr. Coll. Polym. Sci. 1993, 93, 72-75)。両親媒性ブロックコポリマーの相図および到達可能構造は、ブロックの長さおよび数、すなわち、基本的には親水性／親油性バランスに依存性があることを示す。
【００３９】
PEGとポリ(エチルエチレン)とのブロックコポリマーは、親水性反復単位と疎水性反復単位との比率が55/45で虫状の(worm-like)ミセルを形成し(総MW=4900)、また比率40：37でラメラ構造を形成する(総MW=3900)という傾向があることがわかった。
【００４０】
本発明は、様々な構造を生成する能力のある物質を提供する。例えば、親水基の長い配列を含有する物質はミセルを形成することができるが、高疎水性内容物は、ラメラゲル、また好適な条件下でベシクルの形成を促進する。
【００４１】
またベシクルの形成は、有機溶媒に溶解したコポリマーの溶液またはコロイド懸濁液を水に加え、その後、有機溶媒を除去することにより行うことができる。
【００４２】
さらに、本発明の2種以上のブロックコポリマーの組み合わせも超分子構造の形成に用いることができる。一般的に、約0.99〜0.7のMv画分を有するPEG-PPS(fPEG)はミセルを形成するが、約0.30〜0.25のMv画分(fPEG)はベシクルを形成する。
【００４３】
ブロックコポリマー組織構造体の熱転移
本発明はまた、ベシクルからミセルを作製する方法を特徴とする。これらの実施形態においては、ミセルは、熱力学的にベシクルを形成する傾向にあるブロックコポリマーから形成される。ミセルの加熱時に、これらは自然にベシクルを形成する。溶解された化合物(例えば薬剤)を含む水系懸濁液剤中にミセルが存在する場合、ベシクルの形成方法によって、ベシクル内部で薬剤のカプセル化が起こる。
【００４４】
例えば、ポリマーミセルは、熱力学的にベシクルを形成する傾向にあるfPEGを含むポリマー組成物を使用して形成される。懸濁液で、ミセルは準安定性で、高度に濃縮することができる。準安定性ミセルに熱を加えると、粒度分布において非常に小さく、均質なベシクルの自発的形成が誘導される。ミセル懸濁液に加えられた薬剤は、それらの形成中にベシクル内部に充填される。ミセルは、そうでない場合にベシクルを形成し得るコポリマーから、すなわち、非平衡条件下で、例えば、粉末化または凍結乾燥したポリマーから加熱を行わずにポリマーを急速に溶解／分散させることを含む手段によって調製することができる。この急速な溶解により、速度論的には、ミセル形態にポリマーが閉じ込められる。流動性が加わることで非平衡形態が平衡に近づく機会が生じ、この場合、さらに好ましいベシクル形態が形成される。
【００４５】
本発明者らは、ブロックコポリマーおよび塩を含有する混合物に熱が加えらた場合、混合物は溶解して均質組成物になることがわかった。小分子薬剤もまた加熱中に製剤中に溶ける。この方法で、ブロックコポリマーによって形成された超分子構造(例えば、ミセルまたはベシクル)中に薬剤がカプセル化される。
【００４６】
ブロックコポリマー組織構造体の乾燥および再水和
本発明の超分子構造(例えばベシクル)を脱水し、乾燥製剤に調製することができる。こうした乾燥製剤は、投与時にin vivoで再水和することができ、in vitroでは投与または他の使用前に再水和することができる。好ましくは、乾燥製剤は、5重量％未満の水を含む。乾燥製剤で許容され得る含水量の限界は、標準方法に従って、保存期間の測定により決定することができる。乾燥製剤は、2週間、1か月、6か月または1年以上の間、安定可能である。例えば本明細書に記載の方法によって超分子構造内にカプセル化された薬剤は、再水和時に活性形態に再構成することができる。乾燥組成物は、任意の水性溶液中で、例えば、製薬上許容可能な希釈剤中で再水和することができる。従来の製剤過程では、多数の乾燥方法により、容易に含水量を実質的に5％未満にすることができる。
【００４７】
医薬組成物
例えば熱処理によるミセル生成に適する条件において、本発明のブロックコポリマーは、薬剤、例えば、ペプチド、核酸、抗生物質(例えばアンピシリンもしくはテトラサイクリン)、化学療法剤(例えばアドリアマイシン)または他の小分子薬剤のカプセル化に使用することができる。ラメラ相が形成されることになっている場合、ベシクルはラメラ構造曲変形から生成することができる。このようにして、水に溶解した薬剤は、ベシクルの内部空洞に封入することができる。また医薬組成物は、親水性、疎水性または両親媒性の薬剤に対する1種または複数のブロックコポリマーのカプセル化効率を高める添加剤を使用してもよい。添加剤は、薬剤とブロックコポリマー中の1種または複数のブロックとの適合性を、例えば、薬剤とブロックコポリマーの1種または複数のブロックとの間の反発力を低減させるか、引力を増強させることにより高めることができる。
【００４８】
適した添加剤の例は、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン(DBU)およびポリエチレングリコール(例えばPEG 600)である。分子量が400〜800 DaのPEGが添加剤として有効である。この範囲外のポリエチレングリコールは有効ではなかった。使用可能な他の添加剤は、PPS-PEGコポリマーおよびトリエタノールアミン、トリエチルアミンまたはピリジンなどの慣用の有機塩基の臭化水素酸塩または塩酸塩である。ブロックコポリマーおよび薬剤を含有する混合物へ添加剤を添加すると、薬剤のカプセル化の効率が1.5倍、3倍、5倍、10倍または50倍を上回るまで高くなる。添加剤の存在下で薬剤のカプセル化が改良された例を本明細書に記載している。
【００４９】
本発明のコポリマーは、製薬上許容可能な希釈剤中で分散させることができる。さらに、本発明の自己組織化構造は、薬剤または生物学上活性な化合物を含んでいてもよい。様々な実施形態において、医薬組成物は、約1ng〜約20mgの薬剤、例えば核酸または疎水性化合物(例えばパクリタキセルまたはデキサメタゾン)を含む。一部の実施形態においては、本組成物は、約10ng〜約10mg、約0.1mg〜約500mg、約1mg〜約350mg、約25mg〜約250mg、または約100mgの薬剤を含有する。臨床薬理学分野の当業者は、日常的な実験を行い、投与量を容易に得ることができる。
【００５０】
好適な希釈剤としては、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。組成物は投与様式に適応可能であり、例えば、丸薬、錠剤、カプセル剤、スプレー剤、粉末剤または液剤の剤形をとり得る。いくつかの態様において、医薬組成物は、選択した投与経路および様式に適した1種または複数の薬学的に許容可能な添加剤を含有する。これらの組成物は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、髄腔内をはじめとする任意の非経口経路により、加えて、局所的に、経口的に、および鼻腔内、吸入、直腸、膣、口腔および舌下などの粘膜送達経路により投与され得るが、これらに限定されるものではない。いくつかの態様において、本発明の医薬組成物は、滅菌済みの非発熱性注射用液体をはじめとする液剤、エマルション剤、粉末剤、エアゾール剤、錠剤、カプセル剤、腸溶性コーティング錠剤、または坐剤の剤形をとって脊椎動物(例えば、哺乳動物)被験体へ投与するために調製される。好適な製剤を選択および調製するための従来の方法および成分については、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (2003 - 第20版)および1999年発行のThe United States Pharmacopeia： The National Formulary (USP 24 NF19)に記載されている。
【００５１】
薬剤は、親水性、疎水性または両性であってよい。薬剤のカプセル化に用いられる超分子構造のタイプは、薬剤およびコポリマーの溶解性に依存する。一般的に、親水性薬剤はベシクル内部にカプセル化され、疎水性薬剤はミセル内部にカプセル化される。本発明のコポリマーと一緒に用いることができる薬剤は、以下の治療活性を有する天然および合成の化合物(例えば核酸)が挙げられるが、これらに限定されるものではない：抗関節炎薬、抗不整脈剤、抗細菌剤、抗コリン作用剤、抗癌剤、抗凝血剤、抗利尿剤、解毒剤、抗てんかん剤、抗真菌剤、抗炎症剤、抗代謝剤、片頭痛治療剤、抗腫瘍剤、駆虫剤、解熱剤、抗発病剤、抗血清剤、鎮痙剤、鎮痛剤、麻酔薬、ベータ遮断薬、生体応答変化剤、骨代謝制御剤、心血管剤、利尿剤、酵素剤、受胎強化剤、成長促進剤、止血剤、ホルモン剤、ホルモン抑制剤、高カルシウム血症緩和剤、低カルシウム血症緩和剤、低血糖緩和剤、高血糖緩和剤、免疫抑制剤、免疫増強剤、筋肉弛緩剤、神経伝達剤、副交感神経作用剤、交感神経様血漿増量剤(sympathominetric plasma extending)、血漿増量剤(plasma expanding)、向精神剤、血栓溶解剤、化学療法剤、および血管拡張剤。
【００５２】
核酸
本発明の特定の実施形態では、ブロックコポリマー組成物は核酸を含有する。核酸はコポリマーの1種または複数のブロックと結合可能であり、また、ブロックコポリマーを含有する超分子構造(例えばミセル、ベシクル)へ組み入れることができる。好ましい実施形態においては、核酸は、1種または複数のブロックコポリマーを含有する医薬組成物中に治療上有効な量で存在する。例としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉RNAs (small interfering RNAs)、アプタマーおよびプラスミドDNAがある。
【００５３】
改変骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドを用いてもよい。改変オリゴヌクレオチド骨格を有する核酸塩基オリゴマーとしては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに標準3'-5'結合を有するボラノホスフェート、これらの2'-5'結合類似体、およびヌクレオシド単位の隣接対が3'-5'から5'-3'へ、または2'-5'から5'-2'へ連結されている逆方向性を有するものが挙げられる。各種の塩、混合塩および遊離酸の形態も含まれる。上記のリンを含有する結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5,177,196号；第5,188,897号；第5,264,423号；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321,131号；第5,399,676号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,519,126号；第5,536,821号；第5,541,306号；第5,550,111号；第5,563,253号；第5,571,799号；第5,587,361号；および第5,625,050号(これらの各特許は参照により本明細書に組み入れるものとする)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
本明細書において、リン原子を含まない改変オリゴヌクレオチド骨格を有する核酸塩基オリゴマーは、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、または1種もしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式のヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらとしては、モルホリノ結合(一部はヌクレオシドの糖部分から形成されているもの)；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合されたN、O、S、およびCH2部分を有する他のものが挙げられる。上記オリゴヌクレオチドの調製を教示している代表的な米国特許は、米国特許第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,264,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,610,289号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号；および第5,677,439号(これらの各特許は、参照により本明細書に組み入れるものとする)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
他の核酸塩基オリゴマーにおいて、糖およびヌクレオシド間結合(すなわち骨格)の両方は、新しい基で置換される。そのような核酸塩基オリゴマーの1つは、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれている。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子へ直接的または間接的に結合している。これらの核酸塩基オリゴマーを作製および使用する方法は、例えば、「Peptide Nucleic Acids： Protocols and Applications」Ed. P.E. Nielsen, Horizon Press, Norfolk, United Kingdom, 1999に記載されている。PNAの調製を教示している代表的な米国特許は、米国特許第5,539,082号；第5,714,331号；および第5,719,262号(これらの各特許は、参照により本明細書に組み入れるものとする)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。PNA化合物に関するさらなる開示は、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500で確認することができる。
【００５６】
本発明の特定の態様において、核酸塩基オリゴマーは、ホスホロチオエート骨格、ならびにヘテロ原子骨格、特に、-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(メチレン(メチルイミノ)またはMMI骨格として知られているもの)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-、および-O-N(CH3)-CH2-CH2-を有するヌクレオシドを有する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、米国特許第5,034,506号に記載のモルホリノ骨格構造を有する。
【００５７】
また核酸塩基オリゴマーは、1つまたは複数の置換糖部分を含有していてもい。核酸塩基オリゴマーは、2'位に以下の1つを含む：OH；F；O-、S-、もしくはN-アルキル；O-、S-、もしくはN-アルケニル；O-、S-、もしくはN-アルキニル；またはO-アルキル-O-アルキル(ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換のC1〜C10アルキル、またはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルであってもよい)。特に好ましいのは、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3]2(式中、nおよびmは1〜約10である)である。他の好ましい核酸塩基オリゴマーは、2'位に以下の1つを含む：C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリル、またはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、核酸塩基オリゴマーの薬物動態学的性質を改善するための基、核酸塩基オリゴマーの薬力学的性質を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基。好ましい修飾は、2'-O-メチルおよび2'-メトキシエトキシ(2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOEとしても知られている、2'-O-CH2CH2OCH3)である。別の望ましい修飾は、2'-DMAOEとしても知られる、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ(すなわち、O(CH2)2ON(CH3)2)である。他の修飾としては、2'-アミノプロポキシ(2'-OCH2CH2CH2NH2)および2'-フルオロ(2'-F)が挙げられる。同様の修飾もまた、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸塩基オリゴマー上の他の位置、特に、3'末端ヌクレオチド上の糖の3'位、または2'-5'連結オリゴヌクレオチドにおいて、5'末端ヌクレオチドの5'位で行われ得る。また核酸塩基オリゴマーは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有していてもよい。かかる修飾糖構造の調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第4,981,957号；第5,118,800号；第5,319,080号；第5,359,044号；第5,393,878号；第5,446,137号；第5,466,786号；第5,514,785号；第5,519,134号；第5,567,811号；第5,576,427号；第5,591,722号；第5,597,909号；第5,610,300号；第5,627,053号；第5,639,873号；第5,646,265号；第5,658,873号；第5,670,633号；および第5,700,920号(これらの各特許は、全体として参照により本明細書に組み入れるものとする)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
また核酸塩基オリゴマーは、核酸塩基修飾または置換を含んでいてもよい。本明細書で使用する場合、「非修飾の」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン(A)およびグアニン(G)、ならびにピリミジン塩基のチミン(T)、シトシン(C)、およびウラシル(U)を包含する。修飾核酸塩基は、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン、2-チオシトシン、5-ハロウラシル、シトシン、5-プロピニルウラシル、6-アゾウラシル、チミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、および他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ(例えば、5-ブロモ)、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニン、7-メチルアデニン、8-アザグアニン、8-アザアデニン、7-デアザグアニン、7-デアザアデニン、ならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンなどが挙げられる。さらなる核酸塩基は、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, 858-859頁, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されているもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613により開示されているもの、およびSanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, 289-302頁, Crooke, S.T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993に開示されているものを含む。特定のこれらの核酸塩基は、特に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは(部分的)相補オリゴヌクレオチドの標的核酸に対する結合親和性を高めるのに有用である。これらとしては、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびにN-2、N-6およびO-6置換プリンが挙げられる。5-メチルシトシン置換は0.6〜1.2℃で、核酸二重鎖安定性を増加させることが明らかとなっており(Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T.およびLebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)、よりいっそう詳細には、2'-O-メトキシエチルまたは2'-O-メチル糖修飾と組み合わせた場合に望ましい塩基置換である。上記のある特定の修飾核酸塩基および他の修飾核酸塩基の調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第4,845,205号；第5,130,302号；第5,134,066号；第5,175,273号；第5,367,066号；第5,432,272号；第5,457,187号；第5,459,255号；第5,484,908号；第5,502,177号；第5,525,711号；第5,552,540号；第5,587,469号；第5,594,121号；第5,596,091号；第5,614,617号；第5,681,941号；および第5,750,692号(これらの各特許は、参照により本明細書に組み入れるものとする)が挙げられる。
【００５９】
本発明の核酸塩基オリゴマーの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する1つもしくは複数の部分または結合体を核酸塩基オリゴマーへ化学的に結合することを含む。そのような部分としては、コレステロール部分(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：6553-6556, 1989)、コール酸(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let, 4：1053-1060, 1994)、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 660：306-309, 1992； Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 3：2765-2770, 1993)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 20：533-538： 1992)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 10：1111-1118, 1991； Kabanov et al., FEBS Lett., 259：327-330, 1990； Svinarchuk et al., Biochimie, 75：49-54, 1993)、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36：3651-3654, 1995； Shea et al., Nucl. Acids Res., 18：3777-3783, 1990)、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 14：969-973, 1995)、またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36：3651-3654, 1995)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1264：229-237, 1995)、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール成分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 277：923-937, 1996)などの脂肪部分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような核酸塩基オリゴマー結合体の調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第4,587,044号；第4,605,735号；第4,667,025号；第4,762,779号；第4,789,737号；第4,824,941号；第4,828,979号；第4,835,263号；第4,876,335号；第4,904,582号；第4,948,882号；第4,958,013号；第5,082,830号；第5,109,124号；第5,112,963号；第5,118,802号；第5,138,045号；第5,214,136号；第5,218,105号；第5,245,022号；第5,254,469号；第5,258,506号；第5,262,536号；第5,272,250号；第5,292,873号；第5,317,098号；第5,371,241号；第5,391,723号；第5,414,077号；第5,416,203号；第5,451,463号；第5,486,603号；第5,510,475号；第5,512,439号；第5,512,667号；第5,514,785号；第5,525,465号；第5,541,313号；第5,545,730号；第5,552,538号；第5,565,552号；第5,567,810号；第5,574,142号；第5,578,717号；第5,578,718号；第5,580,731号；第5,585,481号；第5,587,371号；第5,591,584号；第5,595,726号；第5,597,696号；第5,599,923号；第5,599,928号；第5,608,046号；および第5,688,941号(これらの各特許は、参照により本明細書に組み入れるものとする)が挙げられる。
【００６０】
また本発明は、キメラ化合物である核酸塩基オリゴマーも包含する。「キメラ」核酸塩基オリゴマーは、それぞれが少なくとも1つのモノマー単位(すなわち、オリゴヌクレオチドの場合ヌクレオチド)から構成される、2つ以上の化学的に異なる領域を含む核酸塩基オリゴマー、特にオリゴヌクレオチドである。キメラ核酸塩基オリゴマーは、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増強、細胞取り込みの向上、および/または標的核酸に対する結合親和性の増強を付与する1つまたは複数の領域を含み得る。
【００６１】
キメラ核酸塩基オリゴマーは、上記のような2つ以上の核酸塩基オリゴマーの複合構造として形成することができる。そのような核酸塩基オリゴマーは、オリゴヌクレオチドの場合、当技術分野ではハイブリッドまたはギャップマーとも呼ばれている。かかるハイブリッド構造の調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第5,013,830号；第5,149,797号；第5,220,007号；第5,256,775号；第5,366,878号；第5,403,711号；第5,491,133号；第5,565,350号；第5,623,065号；第5,652,355号；第5,652,356号；および第5,700,922号(これらの各特許は、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする)が挙げられる。
【００６２】
ロックド核酸類(LNAs)は、本発明に用いることができる核酸塩基オリゴマーである。LNA類は、ヌクレオチド類似体のリボフラノース環の柔軟性を制限し、強固な二環式N型立体構造へそれをロックする、2'O,4'-Cメチレン架橋を含有する。LNA類は、特定のエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対する抵抗性の改善を示し、RNAse Hを活性化し、ほぼいずれの核酸塩基オリゴマーへも取り込まれる可能性がある。さらに、LNA含有核酸塩基オリゴマーは、標準ホスホルアミダイト合成プロトコールを用いて調製することができる。LNA類に関するさらなる詳細は、PCT公報 WO 99/14226および米国特許出願公開番号 US 2002/0094555 A1(これらの各公報は、参照により本明細書に組み入れるものとする)で確認することができる。
【００６３】
またアラビノ核酸類(ANAs)も本発明の方法および試薬に用いることができる。ANA類は、天然のD-2'-デオキシリボース糖の代わりにD-アラビノース糖をベースとする核酸塩基オリゴマーである。非誘導体化ANA類似体は、ホスホロチオエートと類似したRNAに対する結合親和性を有する。アラビノース糖がフッ素で誘導体化されている場合(2'F-ANA)、結合親和性における増強が生じ、結合したRNAの選択的加水分解が、生じたANA/RNAおよびF-ANA/RNA二重鎖において効率的に起こる。それらの末端におけるL単糖との誘導体化により、これらの類似体を細胞培地において安定化させることができる。治療におけるANA類の使用は、例えば、Damha et al., Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids 20：429-440, 2001で論じられている。
【００６４】
ポリペプチド
ポリペプチドは本発明の実施形態で用いることができる。ポリペプチドのアミノ酸は、天然、非自然またはそれらの混合物であってもよい。ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を使用し、組換え遺伝子工学手法または化学合成法により得ることができる。ポリペプチドの具体例は、単鎖ペプチド断片(例えば、従来のペプチド結合により連結されている5〜20個のアミノ酸のポリペプチド)、天然型タンパク質、および抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントである。
【００６５】
内在化方法および治療方法
コポリマーは、送達および治療作用の両方に関する生物学的経路を利用することができる。一実施形態において、水性環境においてナノスケールミセルまたはベシクルに自己組織化するブロックコポリマーは、siRNAまたは他の核酸などの薬剤の送達に利用することができる。さらに、本発明のブロックコポリマーは、薬剤の効率的送達のために、変化する細胞内環境、例えば、エンドソームの還元的環境、および治療作用のための生物学的経路、例えば、遺伝子サイレンシングのためのRNAi経路の活性化を利用することができる。初期エンドソーム内で治療剤の放出を誘導し、それを不安定にし得る生物学的応答性物質の開発は、現在の送達系の限界を克服することができる送達系の開発として見込みがある。
【００６６】
ナノスフェア、リポソーム、およびミセルなどのコロイド粒子は、部位特異的薬物送達に関し、幅広く研究されている。細網内皮系(RES)が標的でない限り、粒子は肝臓のRESおよび肺の濾過活性による捕獲を回避しなければならない。血液中でのコロイド系の長時間存続は、PEG含有両親媒性物質を使用することにより達成されている(Lasic et al., Ed. Stealth Liposomes； CRC Press： Boca Raton, FL, 1995)。血漿タンパク質によるオプソニン化の顕著な低下により、PEGベースのリポソームのマクロファージクリアランスが劇的に低下した(Torchilin et al., Biochim Biophys Acta 1994, 1195, 11-20)。
【００６７】
様々な内在化剤、すなわち、本発明のコポリマーの内在化を強化する化合物または種(例えば、抗体、増殖因子、サイトカイン、接着因子、オリゴヌクレオチド配列、および核移行配列など)は、PEGコーティングリポソームの送達能力を強化するように機能しており、最大活性は、PEG鎖の遠位末端に連結されているリガンドにより示されることが実証されている(Blume et al., Biochim. Biophys. Acta 1993, 1149, 180-184； Zalipsky et al., Bioconjugate Chem. 1995, 6, 705-708； Zalipsky, J. Controlled Release 1996, 39, 153-161； Gabizon, Bioconjugate Chem. 1999, 10, 289-298)。この手法が本発明のポリマーに関して使用可能である。いくつかの内在化剤は、増殖因子(例えば線維芽細胞増殖因子)の使用など、非常に効率的な取り込みを誘導することができ、DNA製剤の細胞取り込みを達成することができる。他の内在化剤は、核局在化配列などの非常に効率的な細胞内輸送をもたらすことが可能で、これらを本発明に用いることができる。さらなる内在化剤としては、トランスフェリン、葉酸、レクチン、増殖因子、RGDペプチド、およびマンノース含有糖ペプチドが挙げられる。
【００６８】
本発明のコポリマーは、例えばサイトゾルまたは核における薬剤(例えば核酸)の徐放に関する任意の適用に有用である。ミセルまたはベシクルなどの自己組織化凝集体の内容物(例えば核酸)の放出は、エンドソームからリソソームへの細胞内輸送の過程でのpHの低下、酸化程度の増加、およびプロテアーゼ濃度の増加に基づいて放出を引き起こすような、環境に対する凝集体の感受性を介して達成することができる。また賦形剤は、薬剤と共に取り込まれて、それがその最終生物学的標的に到達するのを助けることができる(例えば、エンドソーム膜またはリソソーム膜などの生体膜を不安定化または透過処理するのを補助し、核酸の細胞質への、または最終的には核への輸送を増強する、薬剤の取り込み)。
【００６９】
またポリマーも、薬剤の混合物、例えば、2種以上の異なる核酸、または核酸および薬剤(例えば抗生物質)の送達に使用することができる。
【００７０】
遺伝子をベースとした薬剤
本発明のブロックコポリマーは、遺伝子を上方または下方制御するための核酸を送達するのに用いることができる。核酸の例としては、siRNA、ODN(アンチセンス)、および治療用タンパク質をコードするpDNAを含むpDNAが挙げられる。
【００７１】
DNA／正荷電ポリマー複合体の内在化は、トランスフェリン、葉酸、レクチン、上皮細胞増殖因子(EGF)、RGDペプチド、およびマンノース受容体に結合するマンノース含有糖ペプチドなどのマンノースを含有する種などのリガンドの共有結合性付着により増強され得る(Kircheis, R., et al., Gene Ther, 1997. 4(5)： p. 409-18； Gottschalk, S., et al., Gene Ther, 1994. 1(3)： p. 185-91； Erbacher, P., et al., Hum Gene Ther, 1996. 7(6)： p. 721-9； Blessing, T., et al., Bioconjug Chem, 2001. 12(4)： p. 529-37； Harbottle, R.P., et al., Hum Gene Ther, 1998. 9(7)： p. 1037-47； East L, Isacke CM. Biochimica et Biophysica Acta, 2002 1572：p. 364-386.)。リガンドは、受容体に特異的に結合し、エンドサイトーシスを媒介することによりDNA複合体を細胞表面へ導くように機能する。融合ペプチドおよび他の官能基は、DNA複合体のエンドソーム回避を増強するために付着していた(Carlisle, R.C., Curr Opin Mol Ther, 2002. 4(4)： p. 306-12； Bell, P.C., et al., J Am Chem Soc, 2003. 125(6)： p. 1551-8)。
【００７２】
ODNおよびpDNAを含む他の遺伝子ベースの薬剤の送達について、同様の必要性が存在する。この場合、薬剤はまた、細胞およびその細胞質へ、最終的には核へ送達されなければならない。ODNに関しては、それらは化学量論的競合により機能するため、その必要性はより一層重大である。プラスミドに関しては、プラスミドの大きなサイズが細胞の膜、例えば、血漿膜およびエンドソーム膜を介するその通過を著しく阻害するため、その課題はより一層優先的である。
【００７３】
薬剤の送達方法
本発明は、本発明の医薬組成物を細胞と接触させること、または動物に投与することにより、細胞または動物(例えば哺乳動物)または植物に薬剤(例えば核酸)を送達する方法を提供する。送達は、細胞(例えば、真核細胞、植物細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、哺乳動物もしくはヒト細胞などの脊椎動物細胞、または病原体細胞)において標的遺伝子の発現を低下または阻害し得るか、あるいは、医薬組成物に含有されている薬剤に特異的な任意の機序によって動物または細胞を治療することができる。方法は、病原体による感染症の処置に、または非病原性疾患、例えば、癌、術後癒着、瘢痕形成、もしくは(例えば、バルーン血管形成またはステントグラフト留置術による)動脈閉塞の除去後の再狭窄の処置に用いることができる。典型的には、細胞において内部移行した核酸は、標的遺伝子、例えば、疾患に関連したもの(例えば、遺伝子の全部またはある領域、遺伝子プロモーター、または遺伝子およびそのプロモーターの一部)の発現を特異的に低下または阻害する。具体的な病原体としては、細菌、原生動物、酵母、および真菌が挙げられる。いくつかの態様において、核酸または他の分子は、脊椎動物細胞もしくは病原体細胞(例えば、細菌細胞、酵母細胞、または真菌細胞)において内因性遺伝子の発現を阻害するか、あるいは病原体に感染した細胞(例えば、植物細胞または動物細胞)において病原体遺伝子の発現を阻害する。また核酸または他の分子は、例えば、癌細胞または望ましくない効果(例えば、再狭窄、瘢痕形成、および術後癒着)を生じる細胞において、内因性遺伝子の発現を低下または阻害することもできる。いくつかの態様において、標的遺伝子は、発癌遺伝子などの癌に関連した遺伝子、または突然変異体タンパク質、ドミナントネガティブタンパク質、もしくは過剰発現したタンパク質などの疾患関連タンパク質をコードする遺伝子である。
【００７４】
あるいは、送達される核酸または他の薬剤は、遺伝子の発現を増加させることができる。例えば、本発明のコポリマーは、プラスミドまたは他の遺伝子ベクターを核へ送達し、プラスミド上に含まれる1種または複数の遺伝子が発現され得るように用いることができる。こうした系は、内因性遺伝子産物の発現を増加させるために、また、突然変異しているか、そうでなければ機能していない遺伝子産物を置換するために、内因的に発現していない遺伝子産物の発現を可能にするために用いることができる。ある場合には、以下に限定されるものではないが、血管内皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、血小板由来増殖因子、線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、骨形成タンパク質、増殖分化因子、神経増殖因子、ニューロトロフィン、サイトカイン、ならびに転写因子(例えば、hif-1α、runx2およびsox-9)を含むような、これらの遺伝子の局所性発現が大いに望まれる。
【００７５】
核酸または他の薬剤は、標的遺伝子の発現を少なくとも20％、40％、60％、80％、90％、95％または100％低下、阻害または増加させ得る。また本発明の方法を用いて、1種もしくは複数の他の標的遺伝子の発現を増加させると同時に、1種もしくは複数の標的遺伝子の発現を低下または阻害させることもできる。
【００７６】
疾患の治療
本発明の組成物は、動物(例えばヒト)における疾患(例えば癌)の治療に使用することができる。本明細書に記載の方法を用いて治療することができる具体的な癌としては、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、消化管癌、肺癌、結腸癌、黒色腫、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、および癌腫が挙げられる。また良性腫瘍も本発明の方法を用いて治療または予防することができる。標的とすることができる他の癌および癌関連遺伝子は当技術分野において公知である。
【００７７】
疾患に関連し得る具体的な内因性タンパク質としては、SLE(全身性エリテマトーデス)で発見されたANA(抗核抗体)、IgGおよびIgAを含む異常免疫グロブリン、様々な多発性骨髄腫と関連のあるベンズ・ジョーンズタンパク質、ならびに遺伝性アミロイドーシスおよびアルツハイマー病を含む様々なアミロイドーシスにおける異常アミロイドタンパク質が挙げられる。ハンチントン病において、HD(huntingtin)遺伝子における遺伝的異常によって、反復グルタミン残基の拡大区域が生じる。この突然変異体遺伝子に加えて、HD患者は、正常なサイズのCAGリピートのある第4染色体のコピーを有する。従って、本発明の方法は、異常遺伝子を沈黙させるが、正常遺伝子を沈黙させないために用いることができる。
【００７８】
本方法で治療可能な具体的な疾患としては、ウイルス、細菌、酵母、真菌、原生動物、または寄生生物などの病原体による感染症が挙げられる。核酸は、病原体へ、または病原体に感染した細胞へと送達することができる。病原体は、細胞内病原体または細胞外病原体であり得る。標的核酸配列は、例えば、複製および／もしくは病原性に必要である病原体の遺伝子、または病原体に感染し得る細胞に必要な細胞受容体をコードする遺伝子である。そのような方法は、感染を防止するため、患者に留置器具を投与する前後または投与と同時に用いることができる。留置器具としては、これらに限定されるものではないが、外科的インプラント、人工器官、およびカテーテルが挙げられ、すなわち、個体の体内へ導入され、長時間、適切な位置に保持される器具のことである。そのような器具としては、例えば、人工関節、心臓弁、ペースメーカー、血管移植片、血管カテーテル、脳脊髄液シャント、尿路カテーテルおよび持続的携帯型腹膜透析(CAPD)カテーテルが挙げられる。
【００７９】
細菌感染は、以下の1種または複数の細菌によるものであってよい：クラミドフィラ・ニューモニエ(Chlamydophila pneumoniae)、C. シッタシ(C. psittaci)、C. アボルツス(C. abortus)、クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)、シンカニア・ネゲベンシス(Simkania negevensis)、パラクラミジア・アカントアメーバ(Parachlamydia acanthamoebae)、シュードモナス・アエルギノサ(Psedomonas aeruginosa)、P. アルカリゲネス(P. alcaligenes)、P. クロロラフィス(P. chlororaphis)、P. フルオレセンス(P. fluorescens)、P. ルテオーラ(P. luteola)、P. メンドシナ(P. mendocina)、P. モンテリー(P. monteilii)、P. オリジハビタンス(P. oryzihabitans)、P. ペルトシノゲナ(P. pertocinogena)、P. シューダルカリゲネス(P. pseudalcaligenes)、P. プチダ(P. putida)、P. スツツェリ(P. stutzeri)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、アエロモナス・ヒドロフィリア(Aeromonas hydrophilia)、大腸菌(Escherichia coli)、シトロバクター・フロインディ(Citrobacter freundii)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、S. チフィ(S. typhi)、S. パラチフィ(S. paratyphi)、S. エンテリティディス(S. enteritidis)、シゲラ・ディゼンテリエ(Shigella dysenteriae)、S. フレックスネリ(S. flexneri)、S. ソンネイ(S. sonnei)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、E. アエロゲネス(E. aerogenes)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、K. オキシトカ(K. oxytoca)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、モルガネラ・モルガニ(Morganella morganii)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens))、P. レットゲリ(P. rettgeri)、P. スツアルティー(P. stuartii)、アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)、A. ヘモリティカス(A. haemolyticus)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、Y. ペスティス(Y. pestis)、Y. シュードツベルクローシス(Y. peudotuberculosis)、Y. インテルメディア(Y. intermedia)、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertussis)、B. パラペルツシス(B. parapertussis)、B. ブロンチセプティカ(B. bronchiseptica)、ヘモフィラス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、H. パラインフルエンザ(H. parainfluenzae)、H. ヘモリティカス(H. haemolyticus)、H. パラヘモリティカス(H. parahaemolyticus)、H. デュクレイ(H. ducreyi)、パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)、P. ヘモリティカ(P. haemolytica)、ブランハメラ・カタルハリス(Branhamella catarrhalis)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、カンピロバクター・フェツス(Campylobacter fetus)、C. ジェジュニ(C. jejuni)、C. コリ(C. coli)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、V. コレラ(V. cholerae)、V. パラヘモリティカス(V. parahaemolyticus)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ナイセリア・ゴノルヘア(Neisseria gonorrhea)、N. メニンジティディス(N. meningitidis)、キンゲラ・デントリフィカンス(Kingella dentrificans)、K. キンガエ(K. kingae)、K. オラリス(K. oralis)、モラクセラ・カタルハリス(Moraxella catarrhalis)、M. アトランテ(M. atlantae)、M. ラクナタ(M. lacunata)、M. ノンリクエファシエンス(M. nonliquefaciens)、M. オスロエンシス(M. osloensis)、M. フェニルピルビカ(M. phenylpyruvica)、ガルドネレラ・バジナリス(Gardnerella vaginalis)、バクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)、バクテロイデス・ディスタソニス(Bacteroides distasonis)、バクテロイデス(Bacteroides)3452A相同性群、バクテロイデス・ブルガツス(Bacterodies vulgatus)、B. オバルス(B. ovalus)、B. テタイオタオミクロン(B. thetaiotaomicron)、B. ウニホルミス(B. uniformis)、B. エッグエルチー(B. eggerthii)、B. スプランクニカス(B. splanchnicus)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、M. アビウム(M. avium)、M. イントラセルラレ(M. intracellulare)、M. レプラエ(M. leprae)、C. ジフテリア(C. diphtheriae)、C. ウルセランス(C. ulcerans)、C. アコレンス(C. accolens)、C. アフェルメンタンス(C. afermentans)、C. アミコラツム(C. amycolatum)、C. アルゲントレンセ(C. argentorense)、C. アウリス(C. auris)、C. ボビス(C. bovis)、C. コンフスム(C. confusum)、C. コイレアエ(C. coyleae)、C. デュルム(C. durum)、C. ファルセニ(C. falsenii)、C. グルクロノリティカム(C. glucuronolyticum)、C. イミタンス(C. imitans)、C. ジェイケイウム(C. jeikeium)、C. クツシェリ(C. kutscheri)、C. クロッペンステッドティ(C. kroppenstedtii)、C. リポフィルム(C. lipophilum)、C. マクジンレイ(C. macginleyi)、C. マツルコティ(C. matruchoti)、C. ムシファシエンス(C. mucifaciens)、C. ピロスム(C. pilosum)、C. プロピンクウム(C. propinquum)、C. レナレ(C. renale)、C. リエゲリ(C. riegelii)、C. サングイニス(C. sanguinis)、C. シングラレ(C. singulare)、C. ストリアツム(C. striatum)、C. スンドスバレンセ(C. sundsvallense)、C. トムセニ(C. thomssenii)、C. ウレアリティカム(C. urealyticum)、C. キセロシス(C. xerosis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、S. アガラクティエ(S. agalactiae)、S. ピロゲネス(S. pyrogenes)、エンテロコッカス・アビウム(enterococcus avium)、E. カセリフラブス(E. casseliflavus)、E. セコルム(E. cecorum)、E. ディスパル(E. dipar)、E. デュランス(E. durans)、E. フェカリス(E. faecalis)、E. フェシウム(E. faecium)、E. フラベセンス(E. flavescens)、E. ガリナルム(E. gallinarum)、E. ヒラエ(E. hirae)、E. マロドラツス(E. malodoratus)、E. ムンドティ(E. mundtii)、E. シュードアビウム(E. pseudoavium)、E. ラフィノスス(E. raffinosus)、E. ソリタリウス(E. solitarius)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、S. エピデルミディス(S. epidermidis)、S. サプロフィティカス(S. saprophyticus)、S. インテルメディウス(S. intermedius)、S. ヒイカス(S. hyicus)、S. ヘモリティカス(S. haemolyticus)、S. ホミニス(S. hominis)、および／またはS. サッカロリティカス(S. saccharolyticus)。
【００８０】
ウイルス感染は、以下の1種または複数のウイルスによるものであってよい：B型肝炎(Hepatitis)ウイルス、C型肝炎ウイルス、ピコルナウイルス(picornavirus)、ポリオウイルス、HIV、コクサッキー(coxsacchie)ウイルス、単純ヘルペス(herpes simplex)ウイルス1型および2型、セントルイス脳炎(St. Louis encephalitis)ウイルス、エプスタイン・バー(Epstein-Barr)ウイルス、ミクソウイルス(myxovirus)、JC、コクサッキーウイルス(coxsakievirus)B、トガウイルス(togavirus)、麻疹ウイルス、パラミクソウイルス(paramyxovirus)、エコウイルス(echovirus)、ブンヤウイルス(bunyavirus)、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus)、水痘帯状疱疹(varicella-zoster)ウイルス、流行性耳下腺炎(mumps)ウイルス、ウマ脳症(equine encephalitis)ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎(lymphocytic choriomeningitis)ウイルス、狂犬病(rabies)ウイルスを含むラブドウイルス(rhabdovirus)、シミアンウイルス(simian virus)40、ヒトポリオーマ(human polyoma)ウイルス、パルボウイルス(parvovirus)、パピローマ(papilloma)ウイルス、霊長類アデノウイルス(adenovirus)、コロナウイルス(coronavirus)、レトロウイルス(retrovirus)、デング熱(Dengue)ウイルス、黄熱病(yellow fever)ウイルス、日本脳炎(Japanese encephalitis)ウイルス、BKウイルス、レトロウイルス(Retrovirus)、ヘルペスウイルス(Herpesvirus)、ヘパデノウイルス(Hepadenovirus)、ポックスウイルス(Poxvirus)、パルボウイルス(Parvovirus)、パピローマウイルス(Papillomavirus)、およびパポバウイルス(Papovavirus)。標的ウイルス核酸配列は、例えば、感染した細胞におけるウイルスの複製および／または病原性に必要である。そのようなウイルス標的遺伝子はウイルスの増殖に必要であり、例えば、HIV gag、env、およびpol遺伝子、HPV6 L1およびE2遺伝子、HPV II LIおよびE2遺伝子、HPV 16 E6およびE7遺伝子、BPV 18 E6およびE7遺伝子、HBV表面抗原、HBVコア抗原、HBV逆転写酵素、HSV gD遺伝子、HSV vp 16遺伝子、HSV gC、gH、gL、およびgB遺伝子、HSV ICPO、ICP4、およびICP6遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスgB、gC、およびgH遺伝子、ならびにBCR-abl染色体配列、ならびに細胞から細胞への感染の伝播に必要な制御機能を提供する非コードウイルスポリヌクレオチド配列、例えば、HIV LTR、および他のウイルス性プロモーター配列、例えば、HSV vp 16プロモーター、HSV-ICPOプロモーター、HSV-ICP4、ICP6、およびgDプロモーター、HBV表面抗原プロモーター、HBVプレゲノムプロモーターなどが挙げられる。
【００８１】
本発明のコポリマーは、HIV gagなどのウイルス複製および／または病原性に必須のウイルス遺伝子機能を停止または阻害することを目的として、HIVなどのウイルスにすでに感染している被験体を治療するために用いることができる。あるいは、この方法は、潜伏ウイルス、例えば、水痘帯状疱疹ウイルス、帯状疱疹の原因物質として哺乳動物に存在するウイルスの機能を阻害するために用いることができる。同様に、少なくとも一部が、ウイルス、細菌、または他の病原体により発症されることが判明している、アテローム性動脈硬化症、潰瘍、慢性疲労症候群、および自己免疫疾患、HSV-1およびHSV-2の再発、HPV持続性感染、例えば、生殖器疣、ならびに慢性BBV感染症などの疾患は、本方法に従い、哺乳動物被験体においてウイルス複製および／または病原性に必須の特定のウイルスポリヌクレオチド配列を標的にすることにより治療することができる。
【００８２】
好ましくは、核酸または他の分子は、病原体の増殖の防止、安定化もしくは阻害を、または病原体の死滅を、または発現不足もしくは過剰発現が疾患を誘発する内因性遺伝子の発現の増加もしくは減少を目的として、疾患または症状を治療するのに十分な量で投与される。
【００８３】
実施例
【実施例１】
【００８４】
ブロックコポリマーの機能性は、加水分解感受性および酸化感受性を有効にするように設計することができる。
【００８５】
PPSは、それが酸化されて親水性スルホンおよびスルホキシド生成物を形成し、その後、それが腎濾過により体内から排出され得ると推測されるので、ミセルおよびベシクル形成において有用な疎水性ブロックとして役立つ。ブロックコポリマーの両親媒性物質に他の分解性部分、例えば加水分解可能な化学的部分を組み込むことができる。こうした部分は、水に対する部分の近接性が加水分解速度、ついては遊離速度における阻害要因とならないように、ブロックコポリマーの親水性ドメイン内に配置することができる。これを達成するための一経路を図1に示す。
【００８６】
図1に示した合成の効果は、PEG鎖内に加水分解性結合を挿入し、それからPEG-PPSブロックコポリマーが調製されること、すなわち、PEGブロックが加水分解可能な化学的部分で分断されることである。結果として加水分解が生じ、親水性物質からなるブロックコポリマーの画分(fPEG)は著しく変化し、かくして、形成する組織構造体の性質が変化し、例えばブロックコポリマーから形成されているベシクルの内容物を遊離する。この不安定性は図2で説明している。
【実施例２】
【００８７】
添加剤は、ミセルでの疎水性薬剤のカプセル化効率の促進に用いることができる。
【００８８】
ミセル化中にポリマーミセル内へ疎水性分子をカプセル化することは困難であるといってよい。図3に示したように、本発明者らは、ポリマーに可溶性で、かつ水にも可溶性である添加剤をカプセル化工程で使用することを含む、ポリマーミセルを形成する新規方法を、例として有機基剤DBUとポリマーPEGで検討して明示した。図4は、表1および2と一緒に、添加剤を用いてカプセル化が困難である薬剤を極めて高い効率でカプセル化できることを、例としてパクリタキセルおよびデキサメタゾンを使用して明示する。
【表１】
0005995939.tif 000002
【００８９】
表1：薬剤を充填したPEG-PPSミセルの動的光散乱。DLSの測定実施前に、試料100μLを蒸留水900μLに分散させた。PDIは多分散性指数を表す。DLS測定に関するPDIは、ISO 13321：1996で決定した。PDIは粒度分布の幅広さとして定義される無次元パラメーターであって、次のように定義される：
PDI ＝ μ2／(Γ)2
式中、μ2は第2キュムラントであり、Γは崩壊速度である。この場合、崩壊速度は、試料中で確認された崩壊速度に関するガウス分布の典型である。
【表２】
0005995939.tif 000003
【００９０】
表2：添加剤を使用する小分子薬剤のカプセル化効率(EE)。
【００９１】
表2で使用した試料は、以下のようにして調製した。90mgのPEG600またはDBU-HClのいずれかと、2mgのパクリタキセルまたはデキサメタゾンのいずれかを含む1.5mLの遠心分離管に、10mgのPEG-PPSを加えた。これを95℃で15分間加熱し、完全に混合した。RTに冷却した後、混合物を蒸留水にて1mLまで穏やかに希釈した。10,000g、10分間の遠心分離により遊離薬剤がペレットになり、このペレットおよび上清を別々に凍結乾燥させ、ゲル透過クロマトグラフィーによりTHF中で分析した。デキサメタゾンおよびパクリタキセルの結果は、標準曲線を用いて定量した。
【００９２】
デキサメタゾンおよびアンフォテリシンBは、本発明の方法よる場合と比べ、溶媒分散によってより効率的にカプセル化された。一方、パクリタキセルは、本発明の方法によってより効率的にカプセル化された。さらに、シロリムスおよびエベロリムスなどの他の薬剤も、本発明の方法を使用して効率的にカプセル化された。カプセル化効率は、薬剤の構造に依存する。薬剤をカプセル化するPEG-PPS系の適応性は非常に大きい。それは、前記系が様々な技術に適合し、ほとんどの薬剤を高い効率でカプセル化するからである。
【実施例３】
【００９３】
添加剤は、ベシクルでの親水性薬剤のカプセル化効率の促進に用いることができる。
【００９４】
ポリマーベシクルは、ペプチド、タンパク質、核酸および遺伝子などの親水性薬剤を保護および送達にとって非常に強力なツールである。しかし、それらは充填するのが困難である。本発明者らは、非常に高い充填効率でベシクルを充填する新規メカニズムを開発した。1つの方法は、ポリマーミセル形成について上記で説明したように、ポリマーと水の両方に可溶性である添加剤(例えば、DBUまたはPEG)をポリマー中で溶解することである。カプセル化する薬剤の水溶液を、添加剤と一緒にポリマー混合物に加える(いわゆる、直接水和法)。代表的な結果を表3および図5〜11に示す。
【表３】
0005995939.tif 000004
【００９５】
表3：動的光散乱を使用した粒子サイズの測定。値はゼータサイズとして報告している。処理方法は、テトラヒドロフランを使用する溶媒分散(SD)、薄膜押し出し(TFE)、直接水和(DH)、および押し出しを伴う直接水和(DHE)である。
【実施例４】
【００９６】
熱転移は、ミセルからのベシクル形成を誘導することができる。
【００９７】
上述のように、ベシクルは、親水性薬剤をカプセル化し、それらの放出をモジュレートし、それらの放出をターゲットとし、生物学的クリアランスおよび分解機序からそれらを保護する強力なツールである。本発明者らは、熱を加えることを含む、ポリマーミセルの形成方法を開発した。ポリマーミセルは、代わりに熱力学的にベシクルを形成し得るfPEGを有するポリマー組成物を使用することにより形成される。懸濁の際、ミセルは準安定性であってもよいし、高度に濃縮されていてもよい。準安定性のミセルに熱を加えるとベシクルの自発的形成が起こる。それは粒度分布において非常に小さく、かつ均質であり得る。ミセル懸濁液に加えられている薬剤は、ベシクル内にそれらの形成中に充填される。その手法を図12〜15に示す。
【００９８】
この方法で形成される極小サイズのポリマーベシクルは、いくつかの用途において特に有用となり得る。例えば、透過促進および滞留効果によって血流から腫瘍をターゲッティングする場合、より小さい粒子は、腫瘍微小循環における有窓内皮の浸透で大粒子よりも効果が高い。より小さい粒子は、生理学的血圧または軽度の過剰血圧下での動脈壁浸透において、粘膜表面の浸透および樹状細胞などの下の細胞のターゲッティングにおいて、組織部位をドレーンしているリンパ節をターゲットとする間質の浸透において、また腸内リンパ管のターゲッティングにおいて、大粒子に比べると効果的である。
【実施例５】
【００９９】
PEG-PPSベシクル製剤は乾燥および再水和時に安定性であり得る。
【０１００】
疎水性薬剤の溶解が可能で、かつ乾燥形態で投与することができる製剤は、多くの医薬品用途において有用である。本発明者らは、PEG-PPSミセルを錠剤にまで乾燥させ、後で、カプセル化した薬剤を損失することなく、同一粒度分布まで素早く再懸濁することができることを明示した。例えば、シクロスポリンAを充填したPEG44-PPS20ミセルを平均サイズ21nmで形成した(図16A)。その懸濁液を乾燥させ、次いで、その乾燥試料を水中に入れ、短時間で再水和させた。測定した粒度分布は、平均20.3nmであることを確認した(図16B)。そのプロセスを通して、高いカプセル化効率が保持された(表7)。特に酸化に対し感受性の高い粒子は、胃内pHにおいて安定性である(図17)。
【表４】
0005995939.tif 000005
【０１０１】
表7：PEG44-PPS20ミセルでシクロスポリンA(CsA)の高充填値が得られ、この充填は、ミセル懸濁液を80℃で乾燥させ、水中で再水和した後にも保持された。
【実施例６】
【０１０２】
PEG-PPS-PEIコポリマーは、遺伝子ベースの薬剤を効率よく送達することができる。
【０１０３】
以前の研究は、他の実施形態の中で、ポリカチオンブロックがペプチドに基づいている場合を含む、PEG-PPS-ポリカチオントリブロックコポリマーを報告している。本発明者らは、PEG-PPS-PEIブロックコポリマーを含む、類似のポリマーに至る簡易な合成経路を開発した(図18)。これらのコポリマーは、プラスミドDNAと、またさらにsiRNAとのトランスフェクションを高い効率で達成する。またこれらのポリマーは、同一PEI濃度での同一PEI分子量の直鎖状PEIと比べると、その細胞毒性は極めて低いことも証明された。これらの結果を図19〜21に示す。
【実施例７】
【０１０４】
PEG-PPSおよびPPS-PEIの混合物は、遺伝子ベースの薬剤と極小複合体を形成することができる。
【０１０５】
極小の遺伝子ベースの薬剤を含むナノ粒子を得ることが特に望ましい場合がある。これは、PEG-PPSとPPS-PEIの混合ミセルを使用し、極小複合体を得ることにより可能となった。この手法を用いた結果を表8および図22〜24に示す。また、これらの複合体のPPSドメイン内に疎水性薬剤を加え、さらなる作用を誘導する(例えば、生物活性剤を示すか、トランスフェクション効率を促進する薬剤を送達する)こともできる。
【０１０６】
上述のように、極小サイズのポリマーミセルおよび他の粒子は重要となり得る。この方法により形成されるサイズは、一部の用途において特に有用となり得る。例えば、透過促進および滞留効果による血流からの腫瘍ターゲッティングにおいて、生理学的血圧または軽度の過剰血圧下での動脈壁浸透において、腫瘍微小循環における有窓内皮の浸透において、粘膜表面の浸透および樹状細胞などの下の細胞のターゲッティングにおいて、また腸内リンパ管のターゲッティングにおいて、小粒子は大粒子よりもより効果的である。
【表５】
0005995939.tif 000006
【０１０７】
表8：PEG-PPS/PPS-PEI混合ミセルは、遺伝子ベースの薬剤を極小ナノ粒子へ縮合する。
【実施例８】
【０１０８】
PEG-PPSおよびPEG-PPS-PEIの混合物は、遺伝子ベースの薬剤と極小複合体を形成することができる。
【０１０９】
遺伝子および遺伝子ベースの薬剤(例えば、プラスミドDNA、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマーまたはmicroRNA)の送達に関わる多くの状況において、粒子のサイズは有効な送達にとって重要である。小粒子は大粒子よりも組織によく浸透し、また細胞質送達およびトランスフェクション効率も高め得る。例えば、腫瘍床への複合体送達は極小複合体を用いるとより効果的である。PEG-PPS-PEIから形成される遺伝子複合体は、遺伝子が加えられているミセル中にPEG-PPSを加えることにより、実質的にサイズを低減することができる。そのようにして、遺伝子非結合PEG-PPSは、PEG-PPS-PEIから極小サイズミセルの形成を促す。図25は、約30nmのプラスミドDNA複合体が9：1の比のPEG-PPSおよびPEG-PPS-PEIから形成できることを示す。
【実施例９】
【０１１０】
表面修飾ナノ粒子
PEG-PPSナノ粒子が胃内pHなどの厳しい条件に耐えることができることを鑑み、本発明者らは、腸リンパ管におけるそれらの輸送を検討し、腸内の脂肪取り込みと関連のある機序により処理されるそれらの可能性を測定した。これは、caco-2細胞(腸細胞)およびリンパ内皮細胞(LEC)の共培養モデルを使用して測定し、取り込み、パッケージングおよび移送(総称して輸送と称する)について十分に特性決定した。PPSベースのナノ粒子の表面特性を処理し、効果的輸送を提供することができることが測定された。例えば、約10％の末端鎖基がカルボキシル官能基で置換された粒子は、表面電荷を欠いている同等の粒子に比べると、5倍以上の高いレベルで輸送されていた。他の表面帯電部分、例えば硫酸塩およびスルホンなどは、最適化後に同様に効果的である。
【０１１１】
PEG-PPSナノ粒子の取り込みは、対照の高分子デキストランが十分に輸送されず、その輸送が低温で阻害されたので、生体特異的である。
【０１１２】
他の表面特性もまた、輸送の強化をもたらす。末端ヒドロキシル基で形成された粒子は、末端メトキシ基を有する類似の粒子に比べると、その輸送は約10倍良好であった。したがって、90％の-OCH3と10％のCOOHを含むPPSナノ粒子は、LECを介して活発に輸送される(他と比べた場合、5倍良好)。さらに、90％の-OHと10％のCOOHを含むPPSナノ粒子は、Caco-2細胞を介して活発に輸送される(他と比べた場合、10倍良好)。
【０１１３】
他の実施形態
本発明の特定の実施形態の記載は、例示目的で示している。網羅的であることを意図するものではなく、本発明の範囲を本明細書に記載の特定形態に限定することを意図するものでもない。本発明はいくつかの実施形態に関して記載されているが、特許請求の範囲に示した本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることは、当業者により理解されよう。本明細書で参照した全ての特許、特許出願および刊行物は、参照により本明細書に組み入れるものとする。
【０１１４】
他の実施形態は特許請求の範囲内である。
【図１Ａ】
0005995939.tif 000007
【図１Ｂ】
0005995939.tif 000008
【図１Ｃ】
0005995939.tif 000009
【図２】
0005995939.tif 000010
【図３】
0005995939.tif 000011
【図４】
0005995939.tif 000012
【図５】
0005995939.tif 000013
【図６】
0005995939.tif 000014
【図７】
0005995939.tif 000015
【図８】
0005995939.tif 000016
【図９】
0005995939.tif 000017
【図１０】
0005995939.tif 000018
【図１１】
0005995939.tif 000019
【図１２】
0005995939.tif 000020
【図１３】
0005995939.tif 000021
【図１４】
0005995939.tif 000022
【図１５】
0005995939.tif 000023
【図１６Ａ】
0005995939.tif 000024
【図１６Ｂ】
0005995939.tif 000025
【図１７Ａ】
0005995939.tif 000026
【図１７Ｂ】
0005995939.tif 000027
【図１８】
0005995939.tif 000028
【図１９】
0005995939.tif 000029
【図２０】
0005995939.tif 000030
【図２１】
0005995939.tif 000031
【図２２】
0005995939.tif 000032
【図２３】
0005995939.tif 000033
【図２４】
0005995939.tif 000034
【図２５】
0005995939.tif 000035