(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つの異なるエフェクター部分を含むＤＮＬ（ドックアンドロック）構築体であって、前記エフェクター部分が、ヒトＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩα、又はＲＩＩβタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）に由来するＤＤＤ（二量体化及びドッキングドメイン）部分又はＡＫＡＰタンパク質に由来するＡＤ（アンカードメイン）部分のいずれか一方に結合されており、２つのコピーの前記ＤＤＤ部分が、二量体を形成し、前記ＡＤ部分に結合して、前記ＤＮＬ構築体を形成するＤＮＬ構築体であって、
前記エフェクター部分が、第１の抗体及びその抗原結合抗体断片、第２の抗体及びその抗原結合抗体断片、サイトカイン、毒素、リボヌクレアーゼ、異種抗原、免疫調節物質、抗血管新生作用剤、アポトーシス促進剤からなる群から選択され（但し、前記エフェクター部分が、第１の抗体若しくはその抗原結合抗体断片、第２の抗体若しくはその抗原結合抗体断片、及びサイトカインを含む場合を除く。）、
前記第１の抗体若しくはその抗原結合抗体断片が、前記第２の抗体若しくはその抗原結合抗体断片が結合する抗原とは異なる抗原に結合する、ＤＮＬ構築体。
【請求項２】
前記第１及び第２の抗体又はそれらの抗原結合抗体断片が、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ〜ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ−６、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、Ｈ因子、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様増殖因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、補体成分Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、及びＣ５からなる群から選択される抗原に結合する、請求項１に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項３】
前記第１及び第２の抗体又はそれらの抗原結合抗体断片が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ムチン）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ−１）、及びｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）からなる群から選択される、請求項２に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項４】
前記サイトカインが、ヒトＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）、ＨＭＧＢ−１（高移動度群ボックスタンパク質１）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＥＮＡ−７８、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、エオタキシン、インターフェロン−α、−β、−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン、ＣＮＴＦ、レプチン、オンコスタチンＭ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰｌＧＦ、インスリン、ｈＧＨ、カルシトニン、第ＶＩＩＩ因子、ＩＧＦ、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲン活性化因子、及びＬＩＦからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項５】
前記３つのエフェクター部分が、融合タンパク質であり、各融合タンパク質がＡＤ及びＤＤＤ部分を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項６】
前記ＤＤＤ部分のアミノ酸配列が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０の最初の４４個アミノ酸、配列番号２１の最初の４４個アミノ酸、配列番号２２、及び配列番号５９からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項７】
前記ＡＤ部分のアミノ酸配列が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、Ｍ配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、又は配列番号５８からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤＮＬ構築体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＬ構築体を含む、薬学的組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＬ構築体を得る方法であって、
ＤＤＤ部分又はＡＤ部分に結合した３つの異なるエフェクター部分を混合し、三量体複合体を生成するステップと、
３つの連続するアフィニティークロマトグラフィーにより３つの異なるエフェクター部分を含むＤＮＬ構築体を精製するステップとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年４月６日に出願された米国特許出願第１２／７５４，７４０号、２０１０年４月５日に出願された米国特許出願第１２／７５４，１４０号；２０１０年４月１日に出願された米国特許出願第１２／７５２，６４９号、２０１０年３月２５日に出願された米国特許出願第１２／７３１，７８１号、２００９年１２月２２日に出願された米国特許出願第１２／６４４，１４６号、２００９年８月３１日に出願された米国特許仮出願第６１／２３８，４２４号の優先権を主張する。各優先出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
財政援助
本研究は、国立癌研究所、国立衛生研究所からの助成金２Ｒ４４ＣＡ１０８０８３−０２Ａ２により部分的に支援された。連邦政府は、本発明にある種の権利を有する場合がある。
【０００３】
本発明は、第１及び第２の抗体又は抗原結合性抗体断片及び１つ又は複数コピーのサイトカインを含む二重特異性抗体免疫サイトカインＤＮＬ構築体の組成物及び使用法に関する。より一般的には、本発明は、３つの異なるエフェクター部分が、下述のＤＤＤ（二量体化及びドッキングドメイン）及びＡＤ（アンカードメイン）結合技術を使用して共に結合されている任意のＤＮＬ構築体の組成物及び使用法に関する。第１及び第２の抗体又はその断片は、好ましくは、２つの異なる標的抗原に結合する。治療用サイトカインを含む二重特異性免疫サイトカインＤＮＬ構築体を投与することにより、標的細胞、組織、又は器官に対する非常に効果的なサイトカインの送達が提供され、薬物動態、投薬スケジュール、及び／又は効能の向上が可能になる。二重特異性免疫サイトカイン構築体は、標的細胞に対して、親抗体単独、サイトカイン単独、抗体及びサイトカインの非結合的組み合わせ、又は対照抗体に結合されたサイトカインよりも大きな効力を示す。より好ましい実施形態では、ＤＮＬ構築体は、抗ＣＤ２０ＩｇＧ及び抗ＨＬＡ−ＤＲ  Ｆａｂに結合されたインターフェロン−α２ｂを含んでいてもよい。最も好ましい実施形態では、抗ＣＤ２０ＩｇＧは、ベルツズマブ（ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）であり、抗ＨＬＡ−ＤＲ  Ｆａｂは、ヒト化Ｌ２４３抗体に由来する。ＤＮＬ複合体は、ヒトリンパ腫細胞、多発性骨髄腫細胞、及び他の造血器癌に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで高い毒性を示す。しかしながら、当業者であれば、主題のＤＮＬ複合体は、任意の腫瘍、自己免疫疾患細胞、又は他の疾患細胞により発現される可能性のある標的抗原に対する特異性を有する任意の組み合わせの抗体又は抗体断片を含むことができることを理解するだろう。同様に、主題のＤＮＬ複合体は、癌、免疫機能不全、又は自己免疫疾患等の種々多様な疾患を治療するための任意の治療用サイトカインの送達に使用することができる。当業者であれば、主題の二重特異性複合体は、サイトカインの送達に限定されず、当技術分野で公知の任意の治療用タンパク質、ペプチド、又は他の治療用エフェクター部分の非常に効率的な送達を提供することができることを理解するだろう。
【背景技術】
【０００４】
米国では、２００９年に、６５，９８０件の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の新症例があり、１９，５００人がこの疾患で死亡した（Ｊｅｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ２００９；５９：２２５−４９）。ＮＨＬ患者のおよそ半数は、一次治療が失敗しており、ほとんど治癒していない（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９８；１６：２８２５−３３）。ＮＨＬに加えて、２０，５８０件の多発性骨髄腫（ＭＭ）の新症例があり、１０，５８０人が死亡した（Ｊｅｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ２００９；５９：２２５−４９）。インターフェロン−アルファ（ＩＦＮα）の臨床活性は、ＮＨＬ治療で確立されており（Ａｒｍｉｔａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００６；３８：７０１−２；  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０００；１１：３５９−６１）、リツキシマブ免疫療法にＩＦＮαを追加することは、幾つかの臨床的利点を示している（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００；６：２６４４−５２；Ｋｉｍｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２００８；４９：１０２−１２）。入手可能なデータによると、ＭＭ患者の無進行生存はＩＦＮαにより向上するが、有益性は少なく、毒性があるため、その使用には依然として議論の余地があることが示唆されている（Ｇｉｓｓｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｅｅｓ，  Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  ２００３；１１５：４５１−６１）。
【０００５】
インターフェロン−α（ＩＦＮα）は、癌の動物モデル（Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５３：４６０４−１５）及びヒト癌患者（Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０，  Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ９３：３９９−４０６）の両方において抗腫瘍活性を有することが報告されている。ＩＦＮαは、癌遺伝子の下方制御、腫瘍抑制因子の上方制御、腫瘍表面のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現増加による免疫認識の増強、アポトーシスの増強、及び化学療法剤に対する増感化を含む様々な直接的抗腫瘍効果を発揮することができる（Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：１１９８−２０５；Ｍａｔａｒｒｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６０：１５０７−２０；  Ｍｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７：１６７−７９；Ｓａｂａａｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  １４：１１４３−５１；Ｔａｋａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：５１６−２３）。
【０００６】
幾つかの腫瘍の場合、ＩＦＮαは、ＳＴＡＴ１の活性化により直接的で強力な抗増殖効果を示すことができる（Ｇｒｉｍｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８  Ｂｌｏｏｄ  ９１：３０１７−２７）。間接的には、ＩＦＮαは、血管新生を阻害し（Ｓｉｄｋｙ  ａｎｄ  Ｂｏｒｄｅｎ，  １９８７，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４７：５１５５−６１）、宿主免疫細胞を刺激することができ、これは全体的な抗腫瘍性応答に重要であり得るが、非常に過小評価されている（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １７：３６９−７２）。ＩＦＮαは、骨髄性細胞（Ｒａｅｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，  １９８５，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３５：２５０７−１２；Ｌｕｆｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：１９４７−５３）、Ｔ細胞（Ｃａｒｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：９３３−４０；Ｐｉｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｏｌ  ２９：１０４１−５０）、及びＢ細胞（Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １４：４６１−７０）に対する効果により、免疫応答に多面的な影響を及ぼす。先天性免疫系の重要なモジュレーターとして、ＩＦＮαは、樹状細胞の迅速な分化及び活性化を誘導し（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：６８２７−３０；Ｐａｑｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  ｂｉｏｌ  ６４：３５８−６７；Ｓａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊ  Ｅｘｐ  ｍｅｄ  １９１：１７７７−８８）、ＮＫ細胞の細胞毒性、遊走、サイトカイン産生、及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強する（Ｂｉｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：１８９−２２０；Ｂｒｕｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．  １９８４，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４４：５９７−６０１）。
【０００７】
癌治療剤としてのＩＦＮαの有望性は、主としてその血中半減期が短いこと及び全身毒性があることにより妨げられている。ペグ化形態のＩＦＮα２は、循環時間の増加を示し、それにより、ＩＦＮα２の生物学的効能が増大される（Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｓｓ，  ２００３，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２：２１４−２１；Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３０３：５４０−８）。ＩＦＮαをモノクローナル抗体（ＭＡｂ）と融合させることにより、腎クリアランスの低減、溶解度及び安定性の向上、並びに血中半減期の顕著な増加を含む、ペグ化と同様の利点を提供することができる。この直接的な臨床有益性は、より少ない使用頻繁及びより低い用量の必要条件であり、治療濃度の持続を可能にする。
【０００８】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対するＭＡｂを使用してＩＦＮαを腫瘍に標的化することにより、ＩＦＮαの全身濃度を制限しつつ、ＩＦＮαの腫瘍への付着及び保持を著しく増加させ、それにより治療指数を増加させることができる。ＩＦＮαの腫瘍濃度増加は、その直接的な抗増殖活性、アポトーシス活性、及び抗血管新生活性を増大させ、並びに抗腫瘍免疫応答を刺激及び集中させることができる。実際、同系マウスＩＦＮα分泌トランスジェニック腫瘍を使用したマウスでの研究は、免疫応答の増強が、局在化濃度のＩＦＮαにより誘発されることが実証された（Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８９：８８４−９３）。
【０００９】
ＣＤ２０は、ＭＡｂ−ＩＦＮαを使用したＢ細胞リンパ腫治療の魅力的なＴＡＡ候補である。リツキシマブを用いた抗ＣＤ２０免疫療法は、リンパ腫に対する最も成功した治療の１つであり、毒性は比較的低い（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １６：２８２５−３３）。リツキシマブは、幾つかの患者集団で免疫原性を示すことができるキメラ抗体であり、初期投与にはかなり長期の点滴時間がかかるため（Ｃｈｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  ＮＥＪＭ  ３５９：６１３−２６）、ＣＤ２０標的化のより良好な候補は、ヒト化ＭＡｂ、ベルツズマブである（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：２８６８−７８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
現在臨床評価中のリツキシマブ及びＩＦＮαの併用療法は、リツキシマブ単独を超える効能の向上を示している（Ｋｉｍｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ４９：１０２−１２；Ｓａｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｂｌｏｏｄ  １１２：４８２４−３１）。これら研究では、この組み合わせの幾つかの利点並びにＩＦＮαに伴う欠点が示されている。リツキシマブによる週１回の点滴に加えて、典型的には３回／週で数か月間ＩＦＮαが患者に投与され、それにより患者はＩＦＮα治療に伴う一般的な副作用であるインフルエンザ様症状を呈し、それにより許容用量が制限される。抗体−ＩＦＮα結合体は、より低い用量の単一作用剤をより低頻度で投与することを可能にし、副作用を制限又は排除し、はるかに優れた効能をもたらすことができる。しかしながら、ＣＤ２０をほとんど又は全く発現しないリンパ腫及び白血病は、免疫結合された抗ＣＤ２０−ＩＦＮα構築体による治療に耐性であることが予測される。ＩＦＮ−α又は他の治療用サイトカインを、ＣＤ２０及びＨＬＡ−ＤＲ等の１つ又は複数の異なる腫瘍関連抗原に標的化して、幅広く多様な造血器疾患及び他の悪性疾患に対するより効果的な治療剤を提供することができる二重特異性免疫サイトカイン構築体の分野には、必要性が存在する。
【００１１】
ヒト白血球抗原ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）は、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩＩ抗原の３つのアイソタイプのうちの１つである。ＨＬＡ−ＤＲは、様々な血液悪性腫瘍及び幾つかの固形癌で高度に発現され、抗体に基づくリンパ腫治療のために盛んに研究されている（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｃｌｉｎ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２：１８８−９０；ＤｅＮａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：７０７５ｓ−９ｓ；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｂｌｏｏｏｄ  １０８：２７３６−４４）。予備的な研究では、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験では、リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫の現行臨床的関心である他のネイクドｍＡｂ（ｎａｋｅｄ  ｍＡｂ）よりも著しく強力であることが示されている（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｒｅｓｕｌｔｓ）。ＨＬＡ−ＤＲは、Ｂ細胞、単球／マクロファージ、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、及び活性化Ｔ細胞を含む正常免疫細胞の一部でも発現される（Ｄｅｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３０：４６５−７５）。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、抗体、抗体断片、及びサイトカイン等の３つ以上の異なるエフェクター部分を含むドック−アンド−ロック（ＤＮＬ、ｄｏｃｋ−ａｎｄ−ｌｏｃｋ）構築体（複合体）の組成物及び使用方法に関する。しかしながら、当業者であれば、ＤＮＬ構築体にはそのような制限はなく、使用するエフェクター部分は、ＤＤＤ又はＡＤ部分に結合することができる任意のタンパク質、ペプチド、又は他の分子を含むことができることに気づくであろう。ＤＮＬ構築体に使用するエフェクター部分には、これらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体断片、免疫調節物質、サイトカイン、ホルモン、酵素、ｓｉＲＮＡ等のアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボヌクレアーゼ、異種抗原、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び他のポリマー等の毒素、抗血管新生作用剤、細胞毒性剤、アポトーシス促進剤、並びに他の既知治療剤が含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
好ましい実施形態は、３つの異なるエフェクター部分、つまり第１及び第２の抗体又は抗体断片及び１つ又は複数コピーのサイトカインを含むＤＮＬ構築体に関する。最も好ましい実施形態では、ＤＮＬ構築体は、ベルツズマブ等の抗ＣＤ２０抗体、ｈＬ２４３等の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体断片、及びＩＦＮ−α２ｂ等のサイトカインを含む。そのようなＤＮＬ構築体は、ＣＤ２０、ＨＬＡ−ＤＲ、又はその両方を発現する造血器腫瘍及び他の腫瘍の治療に非常に効果的である。多機能性複合体の各成分（ベルツズマブ、抗ＨＬＡ−ＤＲ  Ｆａｂ、及びＩＦＮ−α２ｂ）は、独立して抗腫瘍活性を有するが、この複合構築体は、いずれの個々の成分よりも、又は非結合形態で投与された個々の成分の総和よりも大きな効能を示す。
【００１４】
特定の実施形態では、ＤＮＬ構築体は、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号１）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＲＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ、配列番号２）、及びＣＤＲ３（ＤＩＴＡＶＶＰＴＧＦＤＹ、配列番号３）、並びに軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＲＡＳＥＮＩＹＳＮＬＡ、配列番号４）、ＣＤＲ２（ＡＡＳＮＬＡＤ、配列番号５）、及びＣＤＲ３（ＱＨＦＷＴＴＰＷＡ、配列番号６）を含み、ヒト抗体フレームワーク（ＦＲ）及び定常領域配列に結合されたｈＬ２４３抗体等のヒト化抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体又はその断片を含んでいてもよい（例えば、米国特許第７，６１２，１８０号を参照。その実施例部分は、参照により本明細書に組み込まれる）。好ましい実施形態では、ヒト化Ｌ２４３抗体は、マウスＬ２４３（ｍＬ２４３）重鎖から置換されたフレームワーク残基２７、３８、４６、６８、及び９１の１つ又は複数、及び／又はｍＬ２４３軽鎖から置換されたフレームワーク残基３７、３９、４８、及び４９の１つ又は複数を更に含んでいてもよい。ｍＬ２４３は、アメリカ培養細胞系統保存機関、ロックビル、メリーランド州から取得することができる（受入番号ＡＴＣＣ  ＨＢ５５を参照）。
【００１５】
他の特定の実施形態では、ＤＮＬ構築体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ１（ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ、配列番号７）、ＣＤＲ２（ＡＴＳＮＬＡＳ、配列番号８）、及びＣＤＲ３（ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ、配列番号９）、並びに重鎖可変領域ＣＤＲ１（ＳＹＮＭＨ、配列番号１０）、ＣＤＲ２（ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ、配列番号１１）、及びＣＤＲ３（ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＤＶ又はＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号１２）を含む、ベルツズマブ等のヒト化抗ＣＤ２０抗体又はその断片を含んでいてもよい（例えば、米国特許第７，４３５，８０３号を参照。その実施例部分は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００１６】
より特定の実施形態では、ＤＮＬ構築体は、ヒトＩＦＮ−α２ｂアミノ酸配列を含んでいてもよい。そのような配列を含むクローンは、全長ヒトＩＦＮα２ｂ  ｃＤＮＡクローン（Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＯＲＦヒトクローン  カタログ番号  ＨＯＲＦ０１  クローンＩＤ  ＩＯＨ３５２２１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア州）等、様々な供給源から商業的に入手可能である。
【００１７】
種々の実施形態では、ＤＮＬ構築体は、ＣＤ２０及び／又はＨＬＡ−ＤＲ以外の抗原に結合する１つ又は複数の抗体又はその断片を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、抗原（複数可）は、以下のものからなる群から選択されていてもよい：炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ〜ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ−６、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様増殖因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、補体成分Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、及び癌遺伝子産物。
【００１８】
使用することができる例示的な抗体には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ、３／１２／１０に出願された米国特許出願第１２／７２２，６４５号）、ｈＰＡＭ４（抗ムチン、米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０、米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９、米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ、米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４、米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２、米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ、米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ、米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５、米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許第７，５４１，４４０号）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ−１、米国特許第７，２３８，７８５号）、及びｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許出願第７，５４１，４４０号）、各引用された特許又は出願の実施例部分は参照により本明細書に組み込まれる。当業者であれば、このリストが限定的ではなく、下記でより詳細に考察されているように、任意の既知抗体を使用することができることを理解するだろう。
【００１９】
ＤＮＬ構築体に組み込むことができる例示的なサイトカインには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）、ＨＭＧＢ−１（ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １、高移動度群ボックスタンパク質１）、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＥＮＡ−７８、ＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、エオタキシン、インターフェロン−α、−β、−λ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ、ＭＳＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン、ＣＮＴＦ、レプチン、オンコスタチンＭ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰｌＧＦ、インスリン、ｈＧＨ、カルシトニン、第ＶＩＩＩ因子、ＩＧＦ、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲン活性化因子、及びＬＩＦ。列挙されているサイトカインの各々のヒト型の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、ＮＣＢＩデータベースを参照）、多くの例示的なサイトカインをコードするクローンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、アメリカ培養細胞系統保存機関、及び当技術分野で公知の他の供給源から商業的に入手可能である。
【００２０】
種々の実施形態は、これらに限定されないが、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性及び慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性及び慢性骨髄白血病、Ｔ細胞性リンパ腫及び白血病、多発性骨髄腫、神経膠腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、癌腫、メラノーマ、肉腫、神経膠腫、及び皮膚癌を含む疾患を治療又は診断するために、主題のＤＮＬ構築体を使用することに関する。癌腫は、口腔、胃腸管、肺管、肺、乳房、卵巣、前立腺、子宮、子宮内膜、頚部、膀胱、膵臓、骨、肝臓、胆嚢、腎臓、皮膚、及び精巣の癌腫からなる群から選択されていてもよい。加えて、主題のＤＮＬ構築体は、以下を治療するために使用することができる：自己免疫疾患、例えば、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、狼瘡性腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、又は線維化性肺胞炎。ある実施形態では、主題の抗体は、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄白血病、又は急性骨髄白血病等の白血病を治療するために使用することができる。
【００２１】
１つの実施形態では、本発明の医薬組成物は、アミロイドーシス等の代謝性疾患、又はアルツハイマー病等の神経変性疾患を有する対象体を治療するために使用することができる。加えて、本発明の医薬組成物は、免疫調節不全障害を有する対象体を治療するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
以下の図面は本明細書の一部を形成しており、本発明のある実施形態を更に実証するために含まれている。実施形態は、本明細書に提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これら図面の１つ又は複数を参照することにより、より良く理解することができる。
【図１】ペグ化ＩＦＮα又は天然ＩＦＮαと比較した、サイトカイン−ＭＡｂ  ＤＮＬ構築体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＦＮα活性を示す図である。比活性（ＩＵ／ｐｍｏｌ）は、実施例に記載のように測定した。既知濃度の各試験物質の活性は、ｒｈＩＦＮα２ｂ検量線から推定した。培養を、増加する濃度の２０−２ｂ（●）、７３４−２ｂ（■）、ｖ−ｍａｂ（○）、ｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂ（□）、ＰＥＧＡＳＹＳ（▼）、ＰＥＧ−イントロン（▲）、又は１Ｒ−２ｂ（▽）の存在下で増殖させ、相対的生細胞密度をＭＴＳで測定した。未処理細胞から得られたシグナルの％を、モル濃度のｌｏｇに対してプロットした。用量反応曲線及びＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して生成した。エラーバー、ＳＤ。（Ａ）細胞に基づくレポーター遺伝子アッセイ。（Ｂ）ＥＭＣウイルス及びＡ５４９細胞を用いたウイルス防御アッセイ。（Ｃ）Ｄａｕｄｉ細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏリンパ腫増殖アッセイ。（Ｃ）Ｊｅｋｏ−１細胞を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏリンパ腫増殖アッセイ。
【図２】Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける薬物動態学的分析の結果を示す図である。マウスに、２０−２ｂ、α２ｂ−４１３、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ、又はＰＥＧＡＳＹＳを投与し、血清試料を、ＩＦＮα２ｂ濃度について９６時間にわたってＥＬＩＳＡにより分析した。血清消失曲線が示されている。血清半減（Ｔ１／２）消失速度及び平均滞留時間（ＭＲＴ）は、挿入されている表に要約されている。
【図３】（Ａ）２０−２ｂのＡＤＣＣエフェクター機能を例示する図である。Ｄａｕｄｉ又はＲａｊｉ細胞を、細胞溶解の定量化４時間前に新たに単離したＰＢＭＣの存在下で５μｇ／ｍｌの２０−２ｂ、２２−２ｂ、ｖ−ｍａｂ、エピラツズマブ（ｅ−ｍａｂ）、又はｈ７３４と共にインキュベートした。（Ｂ）２０−２ｂのＣＤＣエフェクター機能を示す図である。Ｄａｕｄｉ細胞を、ヒト補体の存在下で２０−２ｂ（●）、７３４−２ｂ（■）、又はｖ−ｍａｂ（○）の連続希釈液と共にインキュベートした。補体対照％（補体のみで処理した細胞と比較した、試験試料中の生細胞の数）を、ｎＭ濃度のｌｏｇに対してプロットした。エラーバー、ＳＤ。
【図４】ＮＨＬ細胞の全血からの枯渇が、２０−２ｂにより増強されたことを示す図である。新たにヘパリン処理したヒト血液を、Ｄａｕｄｉ又はＲａｍｏｓのいずれかと混合し、０．０１、０．１、又は１ｎＭの２０−２ｂ（●）、ｖ−ｍａｂ（○）、７３４−２ｂ（■）、又はｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂ（□）と共に２日間インキュベートした。リンパ腫及び末梢血リンパ球に対する表示されている治療の効果を、フローサイトメトリーを使用して評価した。エラーバー、ＳＤ。
【図５】（Ａ）播種性バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）異種移植モデルにおける２０−２ｂの治療効能を示す生存曲線を例示する図である。０日目にＤａｕｄｉ細胞を雌Ｃ．Ｂ．１７ＳＣＩＤマウスに静脈内投与した。治療は、単回皮下用量として投与された２０−２ｂ（●）、７３４−２ｂ（■）、ｖ−ｍａｂ（○）、ＰＥＧＡＳＹＳ（▼）、又は生理食塩水（×）からなっていた。治療の日数は、矢印で示されている。生存曲線は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。初期Ｄａｕｄｉモデルでは、０．７ｐｍｏｌ（実線）又は０．０７ｐｍｏｌ（点線）の単回用量を、１日目に１０匹のマウス群に投与した。（Ｂ）図６（Ａ）に類似しているが、進行Ｄａｕｄｉモデルにおける研究を示す図である。０．７ｐｍｏｌ（実線）、７ｐｍｏｌ（点線）、又は７０ｐｍｏｌ（灰色線）の単回用量を、７日目に１０匹のマウス群に投与した。
【図６】（Ａ）播種性バーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ及びＮＡＭＡＬＷＡ）異種移植モデルにおける２０−２ｂの治療効能を示す生存曲線を提示する図である。雌Ｃ．Ｂ．１７ＳＣＩＤマウスに、ＮＨＬ細胞を０日目に静脈内投与した。治療は、皮下用量として投与した２０−２ｂ（●）、７３４−２ｂ（■）、ｖ−ｍａｂ（○）、又は生理食塩水からなっていた。治療の日数は、矢印で示されている。生存曲線は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。進行Ｒａｊｉモデルでは、１０匹の群は、５、７、９、１２、１４、及び１６日目に２５０ｐｍｏｌの用量を受容した。（Ｂ）図７（Ａ）に類似しているが、初期ＮＡＭＡＬＷＡモデルにおける研究を示す図である。６匹の群は、１、３、５、８、１０、及び１２日目に２５０ｐｍｏｌ用量の２０−２ｂ若しくは７３４−２ｂ、又は１、５、９、１３、１７、２１、及び２５日目に３．５ｎｍｏｌ用量のｖ−ｍａｂを受容した。
【図７】ＥＰＯ標準物質、７３４−ＥＰＯ、又はＥＰＯ−ＤＤＤ２で７２時間処理したＴＦ１細胞を使用した、ＥＰＯ活性に関する細胞に基づくアッセイの結果を示す図である。用量反応曲線及びＥＣ５０値は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して生成した。
【図８】２０−Ｃ２−２ｂの生物活性を示す図である。Ａ及びＢ、間接免疫蛍光は、生存ＮＨＬ細胞（Ｒａｊｉ又はＲＬ）に対するＭＡｂ及びＭＡｂ−ＩＦＮαの結合を示す。ＰＥ結合ヤギ抗ヒトＦｃで探索する前に、細胞を、５ｎＭ（Ａ）又は０．２〜５０ｎＭ（Ｂ）の表示されている構築体の存在下で、１時間４℃にてインキュベートした。ＭＦＩ、平均蛍光強度；エラーバー、９５％ＣＩ。（Ｃ）細胞に基づくレポーター遺伝子アッセイを使用して決定されたＩＦＮα２比活性は、分子全体のＩＵ／ｐｍｏｌ及びＩＦＮ２ｂのＩＵ／ｐｍｏｌとして示されている
【図９】ＮＨＬ及びＭＭ細胞のアポトーシスを示す図である。フローサイトメトリーによりアネキシン−Ｖ陽性細胞％を定量化する前に、細胞を４８時間処理した。（Ａ）Ｄａｕｄｉの場合：ｖ−ｍａｂ及びｈＬ２４３γ４ｐは、１０ｐＭだった；２０−Ｃ２−２ｂ、２０−２ｂ−２ｂ、及びＶ＋Ｌ２４３＋２ｂ（ｖ−ｍａｂ、ｈＬ２４３γ４ｐ、及び７３４−２ｂ−２ｂの混合物）は、１ｐＭだった。Ｊｅｋｏ−１の場合、処理は全て０．５ｎＭだった。（Ｂ）ＣＡＧを、１、０．１、及び０．０１ｎＭで処理した。（Ｃ）ＫＭＳ１２−ＢＭを、２０及び２ｎＭで処理した。Ｖ＋Ｌ２４３、ｖ−ｍａｂ及びｈＬ２４３γ４ｐの混合物；Ｌ２４３＋２ｂ、ｈＬ２４３γ４ｐ及び７３４−２ｂ−２ｂの混合物。
【図１０】多発性骨髄腫細胞系の特徴付けを示す図である。（Ａ）選択された骨髄腫系のＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２０の抗原密度。ｈＬ２４３γ４ｐ、ｖ−ｍａｂ、又はｈＭＮ−１４（アイソタイプ対照ＭＡｂ）と共に３０分間インキュベートした後、細胞を、ＰＥ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）で探索し、フローサイトメトリーで分析した。（Ｂ）ＩＦＮα２に対する骨髄腫系の相対的感受性。ＭＴＳで生細胞を定量化する前に、細胞を、３ｎＭペグインターフェロンアルファ−２ｂの存在下又は非存在下で４日間インキュベートした。
【図１１】多発性骨髄腫のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。表示されている細胞系を、増加する濃度の表示されている構築体又は組み合わせの存在下で培養し、相対的生細胞密度をＭＴＳで測定した。未処理細胞から得られたシグナルの％を、モル濃度のｌｏｇに対してプロットした。用量反応曲線及びＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して生成した。エラーバー、ＳＤ。
【図１２】ＮＨＬ細胞の全血からの枯渇が増強されたことを示す図である。新たにヘパリン処理したヒト血液をＤａｕｄｉと混合し、１ｎＭの表示されているＭＡｂ−ＩＦＮα又はＭＡｂと共に２日間インキュベートした。Ｄａｕｄｉ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び単球に対する効果を、フローサイトメトリーで評価した。エラーバー、ＳＤ。     （発明を実施するための形態）
【００２３】
定義
別様の指示がない限り、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、「１つ又は複数」を意味する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「及び」及び「又は」は、接続的又は選言的のいずれを意味するように使用することができる。すなわち、両用語は、別様の記載がない限り、「及び／又は」と同じであると理解されるべきである。
【００２５】
「治療剤」は、疾患の治療に有用な原子、分子、又は化合物である。治療剤の例には、抗体、抗体断片、ペプチド、薬物、毒素、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、キレート剤、ホウ素化合物、光活性作用剤、染料、及び放射性同位元素が含まれる。
【００２６】
「診断薬」は、疾患を診断するのに有用な原子、分子、又は化合物である。有用な診断薬には、これらに限定されないが、放射性同位元素、染料（ビオチン−ストレプトアビジン複合体等を有する）、造影剤、蛍光化合物又は分子、及び磁気共鳴画像（ＭＲＩ）用の促進剤（例えば、常磁性イオン）が含まれる。
【００２７】
「抗体」は、本明細書で使用される場合、全長（つまり、天然に存在するか、又は通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスにより形成された）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、又は抗体断片のような免疫グロブリン分子の免疫学的活性（つまり、特異的に結合する）部分を指す。「抗体」には、モノクローナル、ポリクローナル、二重特異的、多重特異的、マウス、キメラ、ヒト化、及びヒト抗体が含まれる。
【００２８】
「ネイクド抗体」は、治療薬又は診断薬に結合されていない抗体又はその抗原結合断片である。完全なネイクド抗体のＦｃ部分は、補体結合及びＡＤＣＣ等のエフェクター機能を提供することができる（例えば、Ｍａｒｋｒｉｄｅｓ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ５０：５９−８７，  １９９８を参照、）。ネイクド抗体が細胞死を誘導する他の機序には、アポトーシスが含まれていてもよい。（Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ａｎｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８１：  １０５−１１９，１９９８）。
【００２９】
「抗体断片」は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、及びｓｃＦｖ等の完全な抗体の部分である。構造に関わらず、抗体断片は、全長抗体が認識するのと同じ抗原と結合する。例えば、抗体断片には、重鎖及び軽鎖の可変領域で構成される「Ｆｖ」断片等の可変領域で構成される単離された断片、又は軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーにより接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）が含まれる。「単鎖抗体」は、「ｓｃＦｖ」と略されることが多く、相互作用して抗原−結合部位を形成するＶＨ及びＶＬドメインを両方とも含むポリペプチド鎖で構成される。ＶＨ及びＶＬドメインは、通常、１〜２５個アミノ酸残基のペプチドにより結合されている。抗体断片には、二重特異性抗体、三重特異性抗体、及び単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）も含まれる。
【００３０】
本明細書に記載の抗体又は免疫複合体調製物又は組成物は、投与される量が生理学的に有効である場合、「治療上有効量」で投与されたと言われる。作用剤は、その存在が受容対象体の生理に検出可能な変化をもたらす場合、生理学的に有効である。特定の実施形態では、抗体調製物は、その存在が抗腫瘍性応答引き起こすか、又は自己免疫疾患状態の徴候及び症状を緩和する場合、生理学的に有効である。また、生理学的に有効な効果は、標的細胞の増殖阻害又は死滅に結びつく、受容対象体の体液性及び／又は細胞性免疫応答の誘起であってもよい。
【００３１】
ドックアンドロック（ＤＮＬ）法
「ドックアンドロック」（ＤＮＬ）法では、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の制御（Ｒ）サブユニットと、Ａキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）のアンカードメイン（ＡＤ）との間に生じる特異的タンパク質間相互作用が活用される（Ｂａｉｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．  ２００５；  ５７９：  ３２６４。Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００４；  ５：  ９５９）。ＰＫＡは、Ｒサブユニットに対するセカンドメッセンジャーｃＡＭＰの結合により引き起こされる、最もよく研究されているシグナル伝達経路の１つに中心的な役割を果たしており、１９６８年にウサギ骨格筋から最初に単離された（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９６８；２４３：３７６３）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットにより不活性形態に保持される２つの触媒サブユニットで構成される（Ｔａｙｌｏｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８９；２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムは、２つのタイプのＲサブユニット（ＲＩ及びＲＩＩ）に見出され、各タイプは、α及びβアイソフォームを有する（Ｓｃｏｔｔ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １９９１；５０：１２３）。Ｒサブユニットは、安定した二量体としてのみ単離されており、二量体化ドメインは、最初の４４個アミノ末端残基で構成されることが示されている（Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １９９９；６：２２２）。Ｒサブユニットに対するｃＡＭＰの結合は、広域性セリン／トレオニンキナーゼ活性の活性触媒サブユニットを解放することに結び付き、それは、ＡＫＡＰとのドッキングによるＰＫＡの区画化により、選択された基質に向かって配向される（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９０；２６５；２１５６１）。
【００３２】
最初のＡＫＡＰ、微小管結合タンパク質−２が、１９８４年に特徴付けられて以来（Ｌｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １９８４；８１：６７２３）、原形質膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリア、及び小胞体を含む種々の細胞内部位に局在化する５０種を超えるＡＫＡＰが、酵母からヒトに及ぶ種の多様な構造で特定されている（Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００４；５：９５９）。ＰＫＡに対するＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８残基の両親媒性ヘリックスである（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９１；２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は、個々のＡＫＡＰで非常に異なっており、２〜９０ｎＭの範囲の、ＲＩＩ二量体に対する結合親和性が報告されている（Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ２００３；１００：４４４５）。興味深いことには、ＡＫＡＰは、二量体Ｒサブユニットにのみ結合する。ヒトＲＩＩαの場合、ＡＤは、２３個のアミノ末端残基により形成された疎水性表面に結合する（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９９；  ６：２１６）。従って、ヒトＲＩＩαの二量体化ドメイン及びＡＫＡＰ結合ドメインは両方とも、同じＮ末端４４個アミノ酸配列内に位置しており（Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １９９９；６：２２２；Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２００１；２０：１６５１）、本明細書ではＤＤＤと称する。
【００３３】
リンカーモジュールとしてのヒトＲＩＩαのＤＤＤ及びＡＫＡＰのＡＤ
本発明者らは、以降Ａ及びＢと呼ぶ任意の組み合わせの物質とドッキングして非共有結合性複合体になり、ジスルフィド結合の形成を容易にする戦略的位でＤＤＤ及びＡＤの両方にシステイン残基を導入することにより安定した係留構造に更にロックすることができる優れた一対のリンカーモジュールとして、ヒトＲＩＩαのＤＤＤ及びＡＫＡＰタンパク質のＡＤを使用するプラットフォーム技術を開発した。「ドックアンドロック」手法の一般的な方法は、以下の通りである。物質Ａは、ＤＤＤ配列をＡの前駆体に結合することにより構築され、以降ａと呼ぶ第１の成分がもたらされる。ＤＤＤ配列は、二量体の自然形成を生じさせることになるため、従ってＡは、ａ２で構成されることになる。物質Ｂは、ＡＤ配列をＢの前駆体に結合することにより構築され、以降ｂと呼ぶ第２の成分がもたらされる。ａ２に含まれるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含まれるＡＤ配列と結合するためのドッキング部位を生成し、それによりａ２及びｂの容易な結合を促進し、ａ２ｂで構成される三量体複合体を形成することになる。この結合事象は、ジスルフィド架橋により２つの物質を共有結合で固定するその後の反応により不可逆的となり、これは、最初の結合相互作用が、ＤＤＤ及びＡＤの両方に配置された反応性チオール基を接近させ（Ｃｈｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ２００１；９８：８４８０）、部位特異的にライゲーションするはずであるため、有効局所濃度の原理に基づき非常に効率的に生じる。ある実施形態では、ａ２サブユニットは、２つの同一エフェクター部分を含有していてもよいが、下記に記載の好ましい実施形態では、ａ２サブユニットは、各々が同一のＤＤＤ配列に結合されている２つの異なるエフェクター部分を含んでいてもよい。従って、三量体ａ２ｂ複合体は、３つの異なるエフェクター部分を含んでいてもよい。
【００３４】
好ましい実施形態では、免疫サイトカインＤＮＬ構築体は、第１及び第２のエフェクターがＤＤＤ部分に結合されており、第３のエフェクターがＡＤ部分に結合されているａ２ｂ構造の変異型に基づいていてもよい。各ＡＤ部分は、二量体形態の２つのＤＤＤ部分に結合することが可能である。ＤＤＤ及びＡＤを前駆体の官能基から遠ざけて結合させることにより、そのような部位特異的ライゲーションが、前駆体の元々の活性を保存することも予想される。この手法は、性質がモジュール式であり、潜在的に、広範な物質を部位特異的に共有結合で結合するために応用することができる。ＤＮＬ法は、米国特許第７，５５０，１４３号、第７，５２１，０５６号、第７６，５３４，８６６号、第７，５２７，７８７号、及び第７，６６６，４００号に開示されており、各々の実施例部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３５】
好ましい実施形態では、エフェクター部分は、タンパク質又はペプチド、より好ましくは抗体、抗体断片、又はサイトカインであり、それらは、ＤＤＤ又はＡＤ部分に結合されて、融合タンパク質又はペプチドを形成することができる。目的の融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を産生する核酸合成、ハイブリダイゼーション、及び／又は増幅を含む、融合タンパク質を製作するための様々な方法が知られている。そのような二本鎖核酸は、標準的分子生物学技術により、融合タンパク質産生用の発現ベクターに挿入することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ，  １９８９を参照）。そのような好ましい実施形態では、ＡＤ及び／又はＤＤＤ部分は、エフェクタータンパク質又はペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれに結合されていてもよい。しかしながら、当業者であれば、エフェクター部分に対するＡＤ又はＤＤＤ部分の結合部位は、その生理学的活性に関与するエフェクター部分及びエフェクター部分の一部（複数可）の化学的性質に依存して、異なる場合があることを理解するだろう。最も好ましい実施形態では、抗体又は抗体断片に対するＡＤ又はＤＤＤ部分の結合は、分子の抗原結合部位の反対側端部の、重鎖サブユニットのＣ末端で生じる。しかしながら、下記で考察されているように、抗原結合活性を保持させつつ、抗体又は抗体断片に対するＮ末端結合を使用することもできる。様々なエフェクター部分の部位特異的な結合は、二価架橋結合試薬及び／又は他の化学的結合技術の使用等の、当技術分野で公知の技術を使用して実施することができる。
【００３６】
ＤＤＤ及びＡＤ配列変異体
ある実施形態では、免疫サイトカインＤＮＬ複合体に組み込まれたＡＤ及びＤＤＤ配列は、以下のＤＤＤ１及びＡＤ１のアミノ酸配列を含む。より好ましい実施形態では、ＡＤ及びＤＤＤ配列は、ＤＤＤ部分とＡＤ部分との間のジスルフィド結合形成を容易にするように設計されているＤＤＤ２及びＡＤ２のアミノ酸配列を含む。
ＤＤＤ１
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１３）
ＤＤＤ２
ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１４）
ＡＤ１
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１５）
ＡＤ２
ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号１６）
【００３７】
当業者であれば、ＤＤＤ１及びＤＤＤ２は、タンパク質キナーゼＡのヒトＲＩＩα型のＤＤＤ配列を含むことを理解するだろう。しかしながら、代替的な実施形態では、ＤＤＤ及びＡＤ部分は、下記のＤＤＤ３、ＤＤＤ３Ｃ、及びＡＤ３に例示されているように、タンパク質キナーゼＡのヒトＲＩＩα型のＤＤＤ配列及び対応するＡＫＡＰ配列に基づいてもよい。
ＤＤＤ３
ＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号１７）
ＤＤＤ３Ｃ
ＭＳＣＧＧＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号１８）
ＡＤ３
ＣＧＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＧＣ（配列番号１９）
【００３８】
公知のヒトＲＩβ及びＲＩＩβアミノ酸配列に基づく更に他の代替的ＤＤＤ部分を、設計及び使用することができる（例えば、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１１５８２３３及びＮＰ＿００２７２７、下記の配列を参照）。
ヒトＰＫＡ  ＲＩβアミノ酸配列
ＭＡＳＰＰＡＣＰＳＥ  ＥＤＥＳＬＫＧＣＥＬ  ＹＶＱＬＨＧＩＱＱＶ  ＬＫＤＣＩＶＨＬＣＩ  ＳＫＰＥＲＰＭＫＦＬ  ＲＥＨＦＥＫＬＥＫＥ  ＥＮＲＱＩＬＡＲＱＫ  ＳＮＳＱＳＤＳＨＤＥ  ＥＶＳＰＴＰＰＮＰＶ  ＶＫＡＲＲＲＲＧＧＶ  ＳＡＥＶＹＴＥＥＤＡ  ＶＳＹＶＲＫＶＩＰＫ  ＤＹＫＴＭＴＡＬＡＫ  ＡＩＳＫＮＶＬＦＡＨ  ＬＤＤＮＥＲＳＤＩＦ  ＤＡＭＦＰＶＴＨＩＡ  ＧＥＴＶＩＱＱＧＮＥ  ＧＤＮＦＹＶＶＤＱＧ  ＥＶＤＶＹＶＮＧＥＷ  ＶＴＮＩＳＥＧＧＳＦ  ＧＥＬＡＬＩＹＧＴＰ  ＲＡＡＴＶＫＡＫＴＤ  ＬＫＬＷＧＩＤＲＤＳ  ＹＲＲＩＬＭＧＳＴＬ  ＲＫＲＫＭＹＥＥＦＬ  ＳＫＶＳＩＬＥＳＬＥ  ＫＷＥＲＬＴＶＡＤＡ  ＬＥＰＶＱＦＥＤＧＥ  ＫＩＶＶＱＧＥＰＧＤ  ＤＦＹＩＩＴＥＧＴＡ  ＳＶＬＱＲＲＳＰＮＥ  ＥＹＶＥＶＧＲＬＧＰ  ＳＤＹＦＧＥＩＡＬＬ  ＬＮＲＰＲＡＡＴＶＶ  ＡＲＧＰＬＫＣＶＫＬ  ＤＲＰＲＦＥＲＶＬＧ  ＰＣＳＥＩＬＫＲＮＩ  ＱＲＹＮＳＦＩＳＬＴ  Ｖ（配列番号２０）
ヒトＰＫＡ  ＲＩＩβアミノ酸配列
ＭＳＩＥＩＰＡＧＬＴ  ＥＬＬＱＧＦＴＶＥＶ  ＬＲＨＱＰＡＤＬＬＥ  ＦＡＬＱＨＦＴＲＬＱ  ＱＥＮＥＲＫＧＴＡＲ  ＦＧＨＥＧＲＴＷＧＤ  ＬＧＡＡＡＧＧＧＴＰ  ＳＫＧＶＮＦＡＥＥＰ  ＭＱＳＤＳＥＤＧＥＥ  ＥＥＡＡＰＡＤＡＧＡ  ＦＮＡＰＶＩＮＲＦＴ  ＲＲＡＳＶＣＡＥＡＹ  ＮＰＤＥＥＥＤＤＡＥ  ＳＲＩＩＨＰＫＴＤＤ  ＱＲＮＲＬＱＥＡＣＫ  ＤＩＬＬＦＫＮＬＤＰ  ＥＱＭＳＱＶＬＤＡＭ  ＦＥＫＬＶＫＤＧＥＨ  ＶＩＤＱＧＤＤＧＤＮ  ＦＹＶＩＤＲＧＴＦＤ  ＩＹＶＫＣＤＧＶＧＲ  ＣＶＧＮＹＤＮＲＧＳ  ＦＧＥＬＡＬＭＹＮＴ  ＰＲＡＡＴＩＴＡＴＳ  ＰＧＡＬＷＧＬＤＲＶ  ＴＦＲＲＩＩＶＫＮＮ  ＡＫＫＲＫＭＹＥＳＦ  ＩＥＳＬＰＦＬＫＳＬ  ＥＦＳＥＲＬＫＶＶＤ  ＶＩＧＴＫＶＹＮＤＧ  ＥＱＩＩＡＱＧＤＳＡ  ＤＳＦＦＩＶＥＳＧＥ  ＶＫＩＴＭＫＲＫＧＫ  ＳＥＶＥＥＮＧＡＶＥ  ＩＡＲＣＳＲＧＱＹＦ  ＧＥＬＡＬＶＴＮＫＰ  ＲＡＡＳＡＨＡＩＧＴ  ＶＫＣＬＡＭＤＶＱＡ  ＦＥＲＬＬＧＰＣＭＥ  ＩＭＫＲＮＩＡＴＹＥ  ＥＱＬＶＡＬＦＧＴＮ  ＭＤＩＶＥＰＴＡ（配列番号２１）
【００３９】
他の代替的な実施形態では、ＡＤ及び／又はＤＤＤ部分の様々な配列変異体を、二重特異性免疫サイトカインＤＮＬ複合体の構築に使用することができる。ＡＤ及びＤＤＤドメインの構造機能相関性は、研究の主題となっている。（例えば、Ｂｕｒｎｓ−Ｈａｍｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：２９８２−９２；Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１７３３２−３８；Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５−５０；Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９６：２９７−３０６；Ｓｔｏｋｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４００：４９３−９９；Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３８３−９５；Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３９７−４０８を参照、それらの各々の全文は、参照により本明細書に組み込まれる。）
【００４０】
例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６年）では、ＡＤ−ＤＤＤ結合相互作用の結晶構造が検討され、ヒトＤＤＤ配列は、下記の配列の下線で示されている、二量体形成又はＡＫＡＰ結合のいずれかに重要な多数の保存アミノ酸残基を含有すると結論付けられた。（参照により本明細書に組み込まれるＫｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６の図１を参照。）当業者であれば、ＤＤＤ配列の配列変異体を設計する際には、下線の残基のいずれの変更も回避することが望ましいが、二量体化及びＡＫＡＰ結合にはそれほど重要ではない残基の保存的アミノ酸置換は、なされていてもよいことを理解するだろう。従って、ＤＮＬ複合体を構築するための使用される可能性のある代替的ＤＤＤ配列は、以下の配列で示されており、そこでは「Ｘ」は、保存的アミノ酸置換を表す。保存的アミノ酸置換には、下記により詳細に考察されているが、例えば、グルタミン酸残基のアスパラギン酸残基への置換、又はイソロイシン残基のロイシン若しくはバリン残基への置換等が含まれる。そのような保存的アミノ酸置換は、当技術分野で周知である。
タンパク質キナーゼＡに由来するヒトＤＤＤ配列
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１３）
ＸＸＩＸＩＸＸＸＬＸＸＬＬＸＸＹＸＶＸＶＬＸＸＸＸＸＸＬＶＸＦＸＶＸＹＦＸＸＬＸＸＸＸＸ（配列番号２２）
【００４１】
Ａｌｔｏら（２００３年）は、種々のＡＫＡＰタンパク質のＡＤ配列のバイオインフォマティクス解析を実施し、下記に示されているＡＫＡＰ−ＩＳと呼ばれる、ＤＤＤに対する結合定数が０．４ｎＭであるＲＩＩ選択的ＡＤ配列を設計した。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列は、ＰＫＡに対するＡＫＡＰ結合のペプチドアンタゴニストとして設計された。置換がＤＤＤに対する結合を低下させる傾向があるＡＫＡＰ−ＩＳ配列の残基は、下記の配列において下線で示されている。従って、当業者であれば、ＤＮＬ構築体に機能することができる変異体は、「Ｘ」が保存的アミノ酸置換である下記の配列により示されていることを理解するだろう。
ＡＫＡＰ−ＩＳ配列
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１５）
ＸＸＸＸＸＡＸＸＩＶＸＸＡＩＸＸＸ（配列番号２３）
【００４２】
同様に、Ｇｏｌｄ（２００６年）は、結晶学及びペプチドスクリーニングを使用して、ＲＩアイソフォームと比較して５桁高い、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対する選択性を示す、下記に示されているＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列を開発した。下線の残基は、ＡＫＡＰ−ＩＳ配列と比べた、ＲＩＩαのＤＤＤ部分に対する結合を増加させるアミノ酸置換の位置を示す。この配列では、Ｎ末端Ｑ残基が残基番号４と付番されており、Ｃ末端Ａ残基が残基番号２０と付番されている。置換を行って、ＲＩＩαに対する親和性に影響を及ぼすことができる残基は、残基８、１１、１５、１６、１８、１９、及び２０であった（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。ある代替的な実施形態では、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列を、ＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ部分の配列の代わりに用いて、二重特異性免疫サイトカインＤＮＬ構築体を調製してもよいことが企図される。ＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ配列の代わりに用いることができる他の代替的配列は、下記に示されている。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列と比べた置換は、下線で示されている。また、ＡＫＡＰ−ＩＳ配列のように、ＡＤ部分は、追加的なＮ末端残基システイン及びグリシン、並びにＣ末端残基グリシン及びシステインを含んでいてもよいことが予想される。
ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＹＡＩＨＱＡ（配列番号２４）
代替的ＡＫＡＰ配列
ＱＩＥＹＫＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号２５）
ＱＩＥＹＨＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号２６）
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号２７）
【００４３】
Ｇｏｌｄらの図２には、下記に示されている様々なＡＫＡＰタンパク質に由来する追加的なＤＤＤ結合配列が開示された。
ＲＩＩ特異的ＡＫＡＰ
ＡＫＡＰ−ＫＬ
ＰＬＥＹＱＡＧＬＬＶＱＮＡＩＱＱＡＩ（配列番号２８）
ＡＫＡＰ７９
ＬＬＩＥＴＡＳＳＬＶＫＮＡＩＱＬＳＩ（配列番号２９）
ＡＫＡＰ−Ｌｂｃ
ＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫ（配列番号３０）
ＲＩ特異的ＡＫＡＰ
ＡＫＡＰｃｅ
ＡＬＹＱＦＡＤＲＦＳＥＬＶＩＳＥＡＬ（配列番号３１）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＶＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴ（配列番号３２）
ＰＶ３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦ（配列番号３３）
二重特異性ＡＫＡＰ
ＡＫＡＰ７
ＥＬＶＲＬＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶ（配列番号３４）
ＭＡＰ２Ｄ
ＴＡＥＥＶＳＡＲＩＶＱＶＶＴＡＥＡＶ（配列番号３５）
ＤＡＫＡＰ１
ＱＩＫＱＡＡＦＱＬＩＳＱＶＩＬＥＡＴ（配列番号３６）
ＤＡＫＡＰ２
ＬＡＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＶＭＱＱ（配列番号３７）
【００４４】
また、Ｓｔｏｋｋａら（２００６年）は、下記に示されている、ＰＫＡに対するＡＫＡＰ結合のペプチド競合体を開発した。このペプチドアンタゴニストは、Ｈｔ３１、ＲＩＡＤ、及びＰＶ−３８と称されていた。Ｈｔ−３１ペプチドは、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対してより大きな親和性を示し、ＲＩＡＤ及びＰＶ−３８は、ＲＩに対してより高い親和性を示した。
Ｈｔ３１
ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ（配列番号３８）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ（配列番号３９）
ＰＶ−３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＣ（配列番号４０）
【００４５】
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６年）は、ＰＫＡのＲＩＩ型のＤＤＤに対して０．４ｎＭと低い結合定数を有する、ＰＫＡに対するＡＫＡＰ結合の更に他のペプチド競合体を開発した。種々のＡＫＡＰアンタゴニストペプチドの配列は、下記に再現されているＨｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒらの表１に提供されている。
【００４６】
【表１】
0005999217.tif 000002
【００４７】
様々なＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメインで高度に保存されていた残基は、下記のＡＫＡＰ−ＩＳ配列を参照して下線を施すことより下記に示されている。これら残基は、Ａｌｔｏら（２００３年）により観察されたものと同じであり、Ｃ末端アラニン残基が加えられている。（参照により本明細書に組み込まれるＨｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）の図４を参照。）ＲＩＩ  ＤＤＤ配列に対して特に高い親和性を有するペプチドアンタゴニストの配列は、ＡＫＡＰ−ＩＳ、ＡＫＡＰ７δ−ｗｔ−ｐｅｐ、ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０４Ｔ−ｐｅｐ、及びＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０８Ｄ−ｐｅｐの配列であった。
ＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１５）
【００４８】
Ｃａｒｒら（２００１年）は、ヒト及び非ヒトタンパク質とは異なるＡＫＡＰ結合ＤＤＤ配列間の配列相同性の度合いを検討し、様々なＤＤＤ部分で最も高度に保存されていると考えられたＤＤＤ配列の残基を特定した。それらは、ヒトＰＫＡ  ＲＩＩα  ＤＤＤ配列を参照して下線を施すことにより、下記に示されている。特に保存されていた残基は、更に斜字体により示されている。これら残基は、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６年）が、ＡＫＡＰタンパク質に対する結合に重要であると示唆したものと重複するが、同一ではない。従って、「Ｘ」が保存的アミノ酸置換を表す、可能なＤＤＤ配列が、下記に示されている。
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１３）
ＸＨＩＸＩＰＸＧＬＸＥＬＬＱＧＹＴＸＥＶＬＲＸＱＰＸＤＬＶＥＦＡＸＸＹＦＸＸＬＸＥＸＲＸ（配列番号５９）
【００４９】
当業者であれば、一般的に、様々なタンパク質に由来するＤＤＤ及びＡＤ配列で高度に保存されているそれらアミノ酸残基は、アミノ酸置換を行う際に依然として変わらないままであることが好ましい残基であるが、それほど高度に保存されない残基は、本明細書に記載のＡＤ及び／又はＤＤＤ配列の配列変異体を生成するためにより安易に変化させてもよいことを理解するだろう。
【００５０】
ＤＤＤ及び／又はＡＤ部分の配列変異体に加えて、ある実施形態では、抗体部分、又は抗体をＡＤ配列に結合するリンカーペプチド配列に配列変異を導入することが好ましい場合がある。１つの例示的な例として、融合タンパク質配列の３つの考え得る変異体が、下記に示されている。
（Ｌ）
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＬＧＳＧＧＧＧＳＧＧＣＧ（配列番号６０）
（Ａ）
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＡＧＳＧＧＧＧＳＧＧＣＧ（配列番号６１）
（−）
ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＣＧ（配列番号６２）
【００５１】
アミノ酸置換
ある実施形態では、開示された方法及び組成物には、１つ又は複数の置換アミノ酸残基を有するタンパク質又はペプチドの産生及び使用が伴っていてもよい。天然、キメラ、ヒト化、若しくはヒト抗体、又はＡＤ若しくはＤＤＤ配列の構造的、物理的、及び／又は治療的特徴は、１つ又は複数のアミノ酸残基の置換により最適化することができる。例えば、ヒト化抗体の機能的特徴は、限定された数のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）アミノ酸を、親マウス抗体の対応するＦＲアミノ酸で置換することにより向上させることができることは、当技術分野で周知である。フレームワーク領域アミノ酸残基がＣＤＲ残基に近接している場合、これは特に当てはまる。
【００５２】
他の場合には、標的抗原に対する結合親和性、その標的抗原からの抗体の解離速度又はオフ速度、又は更に抗体によるＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）若しくはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）の誘導有効性等の、抗体の治療特性は、限定された数のアミノ酸置換により最適化することができる。
【００５３】
代替的な実施形態では、主題のＤＮＬ構築体の製作に使用されるＤＤＤ及び／又はＡＤ配列は、例えば、ＤＤＤ−ＡＤ結合親和性を増加させるために更に最適化されていてもよい。ＤＤＤ又はＡＤ配列における可能な配列変異は、上記で議論されている。
【００５４】
当業者であれば、一般的に、アミノ酸置換は、典型的には、あるアミノ酸を比較的類似した特性の別のアミノ酸で置換すること（つまり、保存的アミノ酸置換）を伴うことを認識するだろう。種々のアミノ酸の特性及びタンパク質構造及び機能に対するアミノ酸置換の効果は、当技術分野の広範な研究及び知識の主題である。
【００５５】
例えば、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮してもよい（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  １９８２，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５７：１０５−１３２）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性特徴は、その結果生じるタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質の他の分子との相互作用を規定する。各アミノ酸には、疎水性及び電荷の特徴に基づいて、その疎水性親水性指標が割当てられており（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  １９８２）、それらは以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。保存的置換を行う際は、その疎水性親水性指標が±２以内のアミノ酸を使用することが好ましく、±１以内がより好ましく、及び±０．５以内が更により好ましい。
【００５６】
また、アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性を考慮に入れてもよい（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号）。アミノ酸残基には、親水性値が割当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０）；グルタミン酸（＋３．０）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５．＋−．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、親水性が類似した他のアミノ酸に置換することが好ましい。
【００５７】
他の考慮すべきことには、アミノ酸側鎖のサイズが含まれる。例えば、一般的には、グリシン又はセリン等の小型側鎖を有するアミノ酸を、かさ高い側鎖を有するアミノ酸、例えばトリプトファン又はチロシンに置換することは、好ましくないだろう。タンパク質二次構造に対する種々のアミノ酸残基の影響も、考慮すべきことである。実証的研究により、タンパク質ドメインがアルファヘリックス、ベータシート、又は逆向ターンの二次構造をとる傾向に対する様々なアミノ酸残基の影響が決定されており、当技術分野で公知である（例えば、Ｃｈｏｕ  ＆  Ｆａｓｍａｎ，  １９７４，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３：２２２−２４５；  １９７８，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４７：  ２５１−２７６；  １９７９，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．，  ２６：３６７−３８４を参照）。
【００５８】
そのような考慮及び広範な実証的研究に基づいて、保存的アミノ酸置換の表が作られており、当技術分野で公知である。例えば、アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；並びにバリン、ロイシン、及びイソロイシンである。或いは：Ａｌａ（Ａ）ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ；Ａｒｇ（Ｒ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ｌｙｓ；Ａｓｎ（Ｎ）ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、ａｒｇ、ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）ａｓｎ、ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）ａｌａ、ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）ｇｌｕ、ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｅ）ｇｌｎ、ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｉｌｅ（Ｉ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｉｌｅ；Ｌｙｓ（Ｋ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）ｐｈｅ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）、ｔｈｒ；Ｔｈｒ（Ｔ）ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）ｐｈｅ、ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒ；Ｖａｌ（Ｖ）ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａである。
【００５９】
アミノ酸置換に関する他の考慮事項には、残基が、タンパク質の内部に位置しているか否か、又は溶媒に露出しているか否かが含まれる。内部残基の場合、保存的置換には以下のものが含まれるだろう：Ａｓｐ及びＡｓｎ；Ｓｅｒ及びＴｈｒ；Ｓｅｒ及びＡｌａ；Ｔｈｒ及びＡｌａ；Ａｌａ及びＧｌｙ；Ｉｌｅ及びＶａｌ；Ｖａｌ及びＬｅｕ；Ｌｅｕ及びＩｌｅ；Ｌｅｕ及びＭｅｔ；Ｐｈｅ及びＴｙｒ；Ｔｙｒ及びＴｒｐ（例えば、ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕのＰＲＯＷＬウェブサイトを参照）。溶媒露出残基の場合、保存的置換には以下のものが含まれるだろう：Ａｓｐ及びＡｓｎ；Ａｓｐ及びＧｌｕ；Ｇｌｕ及びＧｌｎ；Ｇｌｕ及びＡｌａ；Ｇｌｙ及びＡｓｎ；Ａｌａ及びＰｒｏ；Ａｌａ及びＧｌｙ；Ａｌａ及びＳｅｒ；Ａｌａ及びＬｙｓ；Ｓｅｒ及びＴｈｒ；Ｌｙｓ及びＡｒｇ；Ｖａｌ及びＬｅｕ；Ｌｅｕ及びＩｌｅ；Ｉｌｅ及びＶａｌ；Ｐｈｅ及びＴｙｒ（同上）。ＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス、Ｄａｙｈｏｆｆマトリックス、Ｇｒａｎｔｈａｍマトリックス、ＭｃＬａｃｈｌａｎマトリックス、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅマトリックス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆマトリックス、Ｍｉｙａｔａマトリックス、Ｆｉｔｃｈマトリックス、Ｊｏｎｅｓマトリックス、Ｒａｏマトリックス、Ｌｅｖｉｎマトリックス、及びＲｉｓｌｅｒマトリックス等の種々のマトリックスが、アミノ酸置換の選択を支援するために作られている（同上）。
【００６０】
また、アミノ酸置換を決定する際には、正荷電残基（例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）及び負荷電残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）間のイオン結合（塩橋）の形成、又は近隣システイン残基間のジスルフィド結合の形成等の、分子間又は分子内結合の存在を考慮してもよい。
【００６１】
コードされたタンパク質配列の任意のアミノ酸を任意の他のアミノ酸と置換する方法は周知であり、例えば、指定部位突然変異誘発の技術により、又はアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドを合成及び構築して、発現ベクター構築体にスプライシングすることによる当業者の日常的な実験作業の問題である。
【００６２】
サイトカイン及び他の免疫調節物質
ある好ましい実施形態では、エフェクター部分は、免疫調節物質であってもよい。免疫調節物質は、存在すると、体内の免疫系を変更、抑制、刺激する作用剤である。使用される免疫調節物質には、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン、及びそれらの組み合わせが含まれていてもよい。特に有用なのは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等のリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）等の造血因子、果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等のコロニー刺激因子、インターフェロン−α、−β、又は−γ等のインターフェロン、及び「Ｓ１因子」と命名されているもの等の幹細胞増殖因子である。
【００６３】
より好ましい実施形態では、エフェクター部分は、リンホカイン等のサイトカイン、モノカイン、増殖因子、及び従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、以下のものが含まれる：ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン等の成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）等の糖タンパク質ホルモン；胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、肝性増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミューラー阻害物質；マウスゴナドトロピン結合ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等の形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ；エリトロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インターフェロン−α、−β、及び−−γ等のインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）等のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５等のインターロイキン（ＩＬ）、ＬＩＦ、ｋｉｔ−リガンド又はＦＬＴ−３、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α等のＴＮＦ）、及びＬＴ。
【００６４】
サイトカイン等のタンパク質又はペプチド免疫調節物質のアミノ酸配列は、等当技術分野で周知であり、任意のそのような公知の配列を、本発明の実施に使用することができる。当業者は、サイトカイン配列に関する多数の公開情報源を認識している。例えば、ＮＣＢＩデータベースには、エリトロポイエチン（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ０００７９９）、ＩＬ−１ベータ（ＧｅｎＰｅｐｔ  ＡＡＨ０８６７８）、ＧＭ−ＣＳＦ（ＧｅｎＰｅｐｔ  ＡＡＡ５２５７８）、ＴＮＦ−α（ＧｅｎＰｅｐｔ  ＣＡＡ２６６６９）、インターフェロン−アルファ（ＧｅｎＰｅｐｔ  ＡＡＡ５２７１６．１）インターフェロン−アルファ２ｂ（ＧｅｎＰｅｐｔ  ＡＡＰ２００９９．１）等の多数のサイトカイン及び免疫調節物質の、並びに上記に列挙されている事実上全てのペプチド又はタンパク質のタンパク質配列及びコード核酸配列が両方とも含まれている。本質的にあらゆる目的タンパク質又はペプチドエフェクター部分の適切なアミノ酸及び／又は核酸配列を特定することは、当業者にとっては日常作業の問題である。
【００６５】
抗体及び抗体断片
事実上あらゆる標的抗原に対してモノクローナル抗体を調製する技術は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：  ４９５  （１９７５）、及びＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，  ＶＯＬ．  １，  ｐａｇｅｓ  ２．５．１−２．６．７  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）を参照されたい。手短に言えば、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注射し、脾臓を取り出してＢリンパ球を取得し、Ｂリンパ球をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを産生し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養から抗体を単離することにより得ることができる。
【００６６】
ＭＡｂは、様々な十分に確立されている技術によりハイブリドーマ培養から単離及び精製することができる。そのような単離技術には、プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎの２．７．１〜２．７．１２頁及び２．９．１〜２．９．３頁を参照されたい。また、Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  （ＩｇＧ），”  ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  ＶＯＬ．  １０，  ｐａｇｅｓ  ７９−１０４  （Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９９２）を参照されたい。
【００６７】
免疫原に対する抗体を最初に誘発した後、抗体を配列決定し、その後組換え技術により調製することができる。マウス抗体及び抗体断片のヒト化及びキメラ化は、当業者に周知である。ヒト化、キメラ、又はヒト抗体に由来する抗体成分を使用することにより、マウス定常領域の免疫原性に伴う潜在的な問題が排除される。
【００６８】
キメラ抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の可変領域と置換されている組換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象体に投与した際に、免疫原性の減少及び安定性の増加を示す。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：  ３８３３  （１９８９）に開示されている。キメラ抗体を構築するための技術は、当業者に周知である。一例として、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４６９  （１９９４）では、マウスＬＬ２、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体のＶκ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、それぞれのヒトκ及びＩｇＧ１定常領域ドメインと組み合わせることによるＬＬ２キメラが産生された。
【００６９】
ヒト化抗体
ヒト化ＭＡｂを産生するための技術は、当技術分野で周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：  ５２２  （１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：  ３２３  （１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：  １５３４  （１９８８）、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：  ４２８５  （１９９２）、Ｓａｎｄｈｕ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １２：  ４３７  （１９９２）、及びＳｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  １５０：  ２８４４  （１９９３）を参照）。キメラ又はマウスモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変鎖に由来するマウスＣＤＲを、ヒト抗体の対応する可変ドメインに移植することによりヒト化することができる。キメラモノクローナル抗体のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）も、ヒトＦＲ配列と置換される。マウスＣＤＲを単にヒトＦＲに移植することでは、抗体親和性の低減がもたらされることが多く、又は喪失がもたらされることさえあり、マウス抗体の元々の親和性を回復するには、追加的な修飾が必要な場合がある。これは、ＦＲ領域の１つ又は複数のヒト残基を、それらのマウス対応物と置換して、そのエピトープに対する良好な結合親和性を有する抗体を得ることにより達成することができる。例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６  （１９９１）及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：  １５３４  （１９８８）を参照されたい。一般的に、それらのマウス対応物とは異なっており、１つ又は複数のＣＤＲアミノ酸残基に接近して位置するか又は接しているヒトＦＲアミノ酸残基が、置換の候補になるだろう。
【００７０】
ヒト抗体
コンビナトリアル手法又はヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換されたトランスジェニック動物のいずれかを使用して完全ヒト抗体を産生する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２７：３１５−２８；Ｃｏｎｒａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，  ２００５，  Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．  ８：１１７−２６；Ｂｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  Ｌｏｓｅｔ，  ２００３，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｍａｃｏｌ．  ３：５４４−５０）。完全ヒト抗体は、遺伝子又は染色体形質移入法、並びにファージディスプレイ技術によっても構築することができ、それらは全て当技術分野で公知である。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３  （１９９０）を参照されたい。そのような完全ヒト抗体は、キメラ又はヒト化抗体よりも更に少ない副作用を示し、本質的に内因的なヒト抗体としてｉｎ  ｖｉｖｏで機能すると予測される。ある実施形態では、特許請求されている方法及び手順には、そのような技術により産生されるヒト抗体が使用されてもよい。
【００７１】
１つの代替案では、ファージディスプレイ技術を使用して、ヒト抗体を産生してもよい（例えば、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｇｅｎｅｔ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｓ．  ４：１２６−４０）。ヒト抗体は、正常なヒト、又は癌等の特定の疾患状態を示すヒトから産生することができる（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。疾患個体からヒト抗体を構築する利点は、循環中の抗体レパートリーが、疾患関連抗原に対する抗体に偏っている場合があるということである。
【００７２】
この方法の１つの非限定的な例では、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら（２００５年）は、骨肉腫患者からヒトＦａｂ抗体断片のファージディスプレイライブラリーを構築した。一般的に、全ＲＮＡが、循環中の血液リンパ球から取得された（同上）。組換えＦａｂが、μ、γ、及びκ鎖抗体レパートリーからクローニングされ、ファージディスプレイライブラリーに挿入された（同上）。ＲＮＡが、ｃＤＮＡに変換され、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列に対する特異的プライマーを使用して、Ｆａｂ  ｃＤＮＡライブラリーを製作するために使用された（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１−９７）。ライブラリー構築は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら（２０００，  Ｉｎ：  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ），  １ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  ｐｐ．  ９．１  ｔｏ  ９．２２）に従って実施された。最終Ｆａｂ断片は、制限エンドヌクレアーゼで消化され、バクテリオファージゲノムに挿入され、ファージディスプレイライブラリーが製作された。そのようなライブラリーは、当技術分野で公知の標準的ファージディスプレイ法によりスクリーニングすることができる（例えば、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  １９９６，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４−３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，  １９９９，  Ｔｈｅ  Ｑｕａｒｔ．  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４３：１５９−１６２を参照）。
【００７３】
ファージディスプレイは、様々な形式で実施することができ、それらの総説は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ３：５５６４−５７１  （１９９３）を参照されたい。ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞により産生することもできる。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号を参照されたい。当業者あれば、これら技術は例示であり、ヒト抗体又は抗体断片を製作及びスクリーニングするための任意の公知な方法が使用できることを理解するだろう。
【００７４】
別の代替案では、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物を使用して、本質的にあらゆる免疫原標的に対する抗体を、標準的免疫プロトコールを使用して産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：１３  （１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６  （１９９４）、及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６：５７９  （１９９４）により開示されている。そのような系の非限定的な例は、Ａｂｇｅｎｉｘ社製（フリーモント、カリフォルニア州）のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）である（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）及び類似の動物では、マウス抗体遺伝子が不活化され、機能的なヒト抗体遺伝子と置換されているが、マウス免疫系の残りは無傷のままである。
【００７５】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、アクセサリー遺伝子及び調節配列と共に、大部分の可変領域配列を含むヒトＩｇＨ及びＩｇｋａｐｐａ遺伝子座の一部分を含有していた生殖系構成のＹＡＣ（酵母人工染色体）で形質転換されていた。ヒト可変領域レパートリーを使用して、抗体産生Ｂ細胞を生成することができ、それを公知の技術で処理してハイブリドーマにすることができる。標的抗原で免疫されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、通常の免疫応答によりヒト抗体を産生することになり、抗体は、上記で考察された標準的技術により回収及び／又は産生することができる。様々な系統のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）が入手可能であり、それらの各々は、様々なクラスの抗体を産生することが可能である。トランスジェニック的に産生されたヒト抗体は、治療能力を有し、その一方で通常のヒト抗体の薬物動態学的特性を保持することが示されている（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。当業者であれば、特許請求されている組成物及び方法は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系の使用に限定されず、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたあらゆるトランスジェニック動物を使用することができることを理解するだろう。
【００７６】
抗体断片
特定のエピトープを認識する抗体断片を、公知の技術により産生することができる。抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓＦｖ等の、抗体の抗原結合部分である。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子のペプシン消化により産生することができ、Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成することができる。或いは、Ｆａｂ’発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６：１２７４−１２８１）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’断片の迅速で容易な特定を可能にすることができる。Ｆ（ａｂ）２断片は、抗体のパパイン消化により生成することができ、Ｆａｂ断片は、ジスルフィド還元により得ることができる。
【００７７】
単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む。ＶＬ及びＶＨドメインは、結合して標的結合部位を形成する。これら２つのドメインは、ペプチドリンカー（Ｌ）により、更に共有結合で結合される。ｓｃＦｖ分子を製作し、好適なペプチドリンカー設計する方法は、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｒ．  Ｒａａｇ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｗｈｉｔｌｏｗ，  “Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｆｖｓ．”  ＦＡＳＥＢ  Ｖｏｌ  ９：７３−８０  （１９９５）、及びＲ．Ｅ．  Ｂｉｒｄ  ａｎｄ  Ｂ．Ｗ．  Ｗａｌｋｅｒ，  “Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ，”  ＴＩＢＴＥＣＨ，  Ｖｏｌ  ９：  １３２−１３７  （１９９１）に記載されている。
【００７８】
また、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）を産生するための技術は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＣｏｓｓｉｎｓら（２００６，  Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｕｒｉｆ  ５１：２５３−２５９）に開示されているように、当技術分野で公知である。
【００７９】
抗体断片は、全長抗体のタンパク質加水分解により、又は断片をコードするＤＮＡを大腸菌若しくは別の宿主で発現させることにより調製することができる。抗体断片は、従来方法により全長抗体をペプシン又はパパイン消化することにより得ることができる。これら方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，０３６，９４５号、及び第４，３３１，６４７号、並びにそこに含まれている参考文献により記載されている。また、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ８９：  ２３０  （１９６０）；Ｐｏｒｔｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ７３：  １１９  （１９５９）、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  ＶＯＬ．  １，  ｐａｇｅ  ４２２  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７）、及びＣｏｌｉｇａｎの２．８．１〜２．８．１０頁及び２．１０．〜２．１０．４頁を参照されたい。
【００８０】
公知の抗体
使用される抗体は、幅広く多様な公知の供給源から商業的に取得することができる。例えば、様々な抗体分泌ハイブリドーマ系統が、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）から入手可能である。腫瘍関連抗原を含むがそれに限定されない種々の疾患標的に対する多数の抗体が、ＡＴＣＣに寄託されており、及び／又は可変領域配列が公表されており、特許請求されている方法及び組成物で使用するために入手可能である。例えば、以下を参照されたい：米国特許第７，３１２，３１８号；第７，２８２，５６７号；第７，１５１，１６４号；第７，０７４，４０３号；第７，０６０，８０２号；第７，０５６，５０９号；第７，０４９，０６０号；第７，０４５，１３２号；第７，０４１，８０３号；第７，０４１，８０２号；第７，０４１，２９３号；第７，０３８，０１８号；第７，０３７，４９８号；第７，０１２，１３３号；第７，００１，５９８号；第６，９９８，４６８号；第６，９９４，９７６号；第６，９９４，８５２号；第６，９８９，２４１号；第６，９７４，８６３号；第６，９６５，０１８号；第６，９６４，８５４号；第６，９６２，９８１号；第６，９６２，８１３号；第６，９５６，１０７号；第６，９５１，９２４号；第６，９４９，２４４号；第６，９４６，１２９号；第６，９４３，０２０号；第６，９３９，５４７号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，５３３号；第６，９１９，４３３号；第６，９１９，０７８号；第６，９１６，４７５号；第６，９０５，６８１号；第６，８９９，８７９号；第６，８９３，６２５号；第６，８８７，４６８号；第６，８８７，４６６号；第６，８８４，５９４号；第６，８８１，４０５号；第６，８７８，８１２号；第６，８７５，５８０号；第６，８７２，５６８号；第６，８６７，００６号；第６，８６４，０６２号；第６，８６１，５１１号；第６，８６１，２２７号；第６，８６１，２２６号；第６，８３８，２８２号；第６，８３５，５４９号；第６，８３５，３７０号；第６，８２４，７８０号；第６，８２４，７７８号；第６，８１２，２０６号；第６，７９３，９２４号；第６，７８３，７５８号；第６，７７０，４５０号；第６，７６７，７１１号；第６，７６４，６８８号；第６，７６４，６８１号；第６，７６４，６７９号；第６，７４３，８９８号；第６，７３３，９８１号；第６，７３０，３０７号；第６，７２０，１５号；第６，７１６，９６６号；第６，７０９，６５３号；第６，６９３，１７６号；第６，６９２，９０８号；第６，６８９，６０７号；第６，６８９，３６２号；第６，６８９，３５５号；第６，６８２，７３７号；第６，６８２，７３６号；第６，６８２，７３４号；第６，６７３，３４４号；第６，６５３，１０４号；第６，６５２，８５２号；第６，６３５，４８２号；第６，６３０，１４４号；第６，６１０，８３３号；第６，６１０，２９４号；第６，６０５，４４１号；第６，６０５，２７９号；第６，５９６，８５２号；第６，５９２，８６８号；第６，５７６，７４５号；第６，５７２，８５６号；第６，５６６，０７６号；第６，５６２，６１８号；第６，５４５，１３０号；第６，５４４，７４９号；第６，５３４，０５８号；第６，５２８，６２５号；第６，５２８，２６９号；第６，５２１，２２７号；第６，５１８，４０４号；第６，５１１，６６５号；第６，４９１，９１５号；第６，４８８，９３０号；第６，４８２，５９８号；第６，４８２，４０８号；第６，４７９，２４７号；第６，４６８，５３１号；第６，４６８，５２９号；第６，４６５，１７３号；第６，４６１，８２３号；第６，４５８，３５６号；第６，４５５，０４４号；第６，４５５，０４０号、第６，４５１，３１０号；第６，４４４，２０６号、第６，４４１，１４３号；第６，４３２，４０４号；第６，４３２，４０２号；第６，４１９，９２８号；第６，４１３，７２６号；第６，４０６，６９４号；第６，４０３，７７０号；第６，４０３，０９１号；第６，３９５，２７６号；第６，３９５，２７４号；第６，３８７，３５０号；第６，３８３，７５９号；第６，３８３，４８４号；第６，３７６，６５４号；第６，３７２，２１５号；第６，３５９，１２６号；第６，３５５，４８１号；第６，３５５，４４４号；第６，３５５，２４５号；第６，３５５，２４４号；第６，３４６，２４６号；第６，３４４，１９８号；第６，３４０，５７１号；第６，３４０，４５９号；第６，３３１，１７５号；第６，３０６，３９３号；第６，２５４，８６８号；第６，１８７，２８７号；第６，１８３，７４４号；第６，１２９，９１４号；第６，１２０，７６７号；第６，０９６，２８９号；第６，０７７，４９９号；第５，９２２，３０２号；第５，８７４，５４０号；第５，８１４，４４０号；第５，７９８，２２９号；第５，７８９，５５４号；第５，７７６，４５６号；第５，７３６，１１９号；第５，７１６，５９５号；第５，６７７，１３６号；第５，５８７，４５９号；第５，４４３，９５３号、第５，５２５，３３８号。これらは例示に過ぎず、幅広く多様な他の抗体及びそれらのハイブリドーマが、当技術分野で公知である。当業者であれば、ほとんど全ての疾患関連抗原に対する抗体配列又は抗体分泌ハイブリドーマは、選択された目的の疾患関連標的に対する抗体について、ＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ、及び／又はＵＳＰＴＯデータベースを単に検索することにより得ることができることを理解するだろう。クローニングされた抗体の抗原結合ドメインは、当技術分野で周知の標準的技術を使用して、増幅し、切断し、発現ベクターにライゲーションし、適した宿主細胞に形質移入し、タンパク質産生に使用することができる。
【００８１】
免疫複合体
ある実施形態では、抗体又はその断片は、１つ又は複数の治療薬又は診断薬に結合されていてもよい。治療薬は同じである必要はなく、異なっていてもよく、例えば薬物及び放射性同位元素であってもよい。例えば、１３１Ｉを抗体又は融合タンパク質のチロシンに組み込み、薬物をリジン残基のイプシロンアミノ基に結合することができる。また、治療薬及び診断薬を、例えば、還元型ＳＨ基及び／又は糖側鎖に結合させることができる。治療薬又は診断薬と抗体又は融合タンパク質との共有結合又は非共有結合による結合体を製作するための多数の方法が、当技術分野で公知であり、任意のそのような公知の方法を使用することができる。
【００８２】
治療薬又は診断薬は、ジスルフィド結合の形成により、還元型抗体成分のヒンジ領域に結合させることができる。或いは、そのような作用剤は、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）等のヘテロ二官能性架橋剤を使用して結合させることができる。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５６：  ２４４  （１９９４）。そのような結合形成の一般的技術は、当技術分野で周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”  ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，  Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐａｇｅｓ  １８７−２３０  （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９９５）；Ｐｒｉｃｅ，  “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”  ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，  Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐａｇｅｓ  ６０−８４  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照されたい。或いは、治療薬又は診断薬は、抗体のＦｃ部分の糖部分を介して結合させることができる。糖基を使用して、チオール基に結合されている同じ作用剤の負荷量を増加させてもよく、又は糖部分を使用して異なる治療薬又は診断薬を結合させてもよい。
【００８３】
抗体糖部分を介してペプチドを抗体成分に結合させるための方法は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４１：  ８３２  （１９８８）；Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４６：  １１０１  （１９９０）；及びＳｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，０５７，３１３号を参照されたい。一般的な方法には、酸化された糖部分を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有する担体ポリマーと反応させることが伴う。この反応により、最初にシッフ塩基（イミン）結合がもたらされ、第二級アミンを還元することによりそれが安定化されて、最終結合体が形成される。
【００８４】
免疫複合体の抗体成分として使用される抗体が抗体断片である場合、Ｆｃ領域は存在しなくともよい。しかしながら、全長抗体又は抗体断片の軽鎖可変領域に糖部分を導入することは可能である。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４：  ５９１９  （１９９５）；Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，４４３，９５３号（１９９５年）、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，２５４，８６８号を参照されたい。操作された糖部分を使用して、治療薬又は診断薬を結合させる。
【００８５】
幾つかの実施形態では、キレート剤を、抗体、抗体断片、又は融合タンパク質に結合させ、放射性核種等の治療薬又は診断薬をキレートするために使用することができる。例示的なキレート剤には、これらに限定されないが、ＤＴＰＡ（Ｍｘ−ＤＴＰＡ等）、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡ、又はＮＯＴＡが含まれる。金属又は他のリガンドをタンパク質に結合させるためのキレート剤の結合方法及び使用方法は、当技術分野で周知である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１２／１１２，２８９号を参照）。
【００８６】
ある実施形態では、放射性金属又は常磁性イオンを、イオンと結合するための複数のキレート基をそれに結合させることができる長い尾部を有する試薬と反応させることにより、タンパク質又はペプチドに結合することができる。そのような尾部は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシム（ｐｏｌｙｏｘｉｍ）、及びこの目的に有用であることが知られているような基等の、キレート基に結合することができるペンダント基を有するポリリシン、ポリサッカライド、又は他の誘導体化された鎖若しくは誘導体化可能な鎖等のポリマーであってもよい。
【００８７】
キレート剤は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，８２４，６５９号に開示されているように、抗体又はペプチドに直接結合されていてもよい。特に有用な金属キレート剤の組み合わせには、放射性イメージング用に、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７６Ｂｒ等の６０〜４，０００ｋｅＶの一般的エネルギー範囲の診断用同位体と共に使用される２−ベンジル−ＤＴＰＡ並びにそのモノメチル及びシクロヘキシル類似体が含まれる。同じキレート剤は、マンガン、鉄、及びガドリニウム等の非放射性金属と錯体化させると、ＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、及びＴＥＴＡ等の大環状キレート剤は、それぞれ、様々な金属及び放射性金属と共に、最も具体的にはガリウム、イットリウム、及び銅の放射性核種と共に使用される。そのような金属キレート剤錯体は、環サイズを目的金属に合わせることにより非常に安定化させることができる。ＲＡＩＴ用の２２３Ｒａ等の核種に安定的に結合することが興味深い大環状ポリエーテル等の他の環型キレート剤が包含される。
【００８８】
より最近には、例えばＦ−１８をアルミニウム等の金属又は他の原子と反応させることによる、ＰＥＴ走査技術に使用される１８Ｆの標識方法が開示されている。１８Ｆ−Ａｌ結合体は、抗体に直接結合されるか、又は事前標的法で標的設定可能な構築体を標識するために使用されるＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、又はＮＥＴＡ等のキレート基と錯体化させてもよい。そのようなＦ−１８標識技術は、米国特許第７，５６３，４３３号に開示されており、その実施例部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８９】
治療薬
代替的な実施形態では、細胞毒性薬、抗血管新生作用剤、アポトーシス促進剤、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、又は他の作用剤等の治療薬を、主題のＤＮＬ複合体に結合させるか、又は抗体の前に、同時に、若しくは後で別々に投与するかのいずれかで使用することができる。使用される薬物は、抗有糸分裂剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、アルカロイド、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される医薬品特性を有していてもよい。
【００９０】
有用な例示的な薬物には、以下のものが含まれる：５−フルオロウラシル、アプリジン（ａｐｌｉｄｉｎ）、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン１、ブスルファン、カリチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルマスティン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ、２−ｐｙｒｒｏｌｉｎｏｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｅ）、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、エトポシドホスファート、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レノリドアミド（ｌｅｎｏｌｉｄａｍｉｄｅ）、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、ミトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ｔｅｍａｚｏｌｏｍｉｄｅ）（ＤＴＩＣの水性形態）、トランス白金（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビンカアルカロイド。
【００９１】
使用される毒素には、以下のものが含まれていてもよい：リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えばオンコナーゼ、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌腸毒素Ａ、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、及びシュードモナス内毒素。
【００９２】
使用されるケモカインには、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−アルファ、ＭＩＰ１−ベータ、及びＩＰ−１０が含まれていてもよい。
【００９３】
ある実施形態では、アンギオスタチン、バキュロスタチン（ｂａｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）、カンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰｌＧＦペプチド及び抗体、抗血管増殖因子抗体、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗Ｆｌｔ−１抗体及びペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻害因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール（ｃａｒｂｏｘｉａｍｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅ）、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリスルファート、アンギオポエチン−２、インターフェロン−アルファ、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノミド（ロキニメックス）、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン（ａｃｃｕｔｉｎ）、アンギオスタチン、シドホビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板第４因子、又はミノサイクリン等の抗血管新生剤を使用することができる。
【００９４】
使用される免疫調節物質は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン、及びそれらの組み合わせから選択されてもよい。特に有用なのは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等のリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）等の造血因子、果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等のコロニー刺激因子、インターフェロン−α、−β、又は−γ等のインターフェロン、及び「Ｓ１因子」と命名されているもの等の幹細胞増殖因子である。サイトカインには、以下のものが含まれる：ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン等の成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）等の糖タンパク質ホルモン；肝性増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミューラー阻害物質；マウスゴナドトロピン結合ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等の形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ；エリトロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インターフェロン−α、−β、及び−γ等のインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）等のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５等のインターロイキン（ＩＬ）、ＬＩＦ、ｋｉｔ−リガンド又はＦＬＴ−３、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、及びＬＴ。
【００９５】
使用される放射性核種には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、及び２１１Ｐｂ。好ましくは、治療用放射性核種は、オージェ放射体の場合は２０〜６，０００ｋｅＶの範囲の、好ましくは６０〜２００ｋｅＶの範囲の、ベータ放射体の場合は１００〜２，５００ｋｅＶの、アルファ放射体の場合は４，０００〜６，０００ｋｅＶの崩壊エネルギーを有する。有用なベータ粒子放射核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、及び最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。オージェ放射粒子と共に実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、１−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ、及びＩｒ−１９２である。有用なベータ粒子放射核種の崩壊エネルギーは、好ましくは１，０００ｋｅＶ未満、より好ましくは１００ｋｅＶ未満、及び最も好ましくは７０ｋｅＶ未満である。アルファ粒子の生成と共に実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。そのような放射性核種には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、及びＦｍ−２５５。有用なアルファ粒子放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、及び最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。使用される更なる潜在的な放射性同位元素には、以下のものが含まれる：１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、及び１６９Ｙｂ等。幾つかの有用な診断用核種には、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、又は１１１Ｉｎが含まれていてもよい。
【００９６】
治療薬には、光活性剤又は染料が含まれていてもよい。蛍光色素等の蛍光組成物、及び可視光線に感受性のポルフィリン等の他の色原体又は染料は、病変に好適な光を向けることにより病変を検出及び治療するために使用されている。治療では、これは、光放射線治療、光線治療、又は光力学治療と呼ばれている。Ｊｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ＰＨＯＴＯＤＹＮＡＭＩＣ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＯＦ  ＴＵＭＯＲＳ  ＡＮＤ  ＯＴＨＥＲ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  （Ｌｉｂｒｅｒｉａ  Ｐｒｏｇｅｔｔｏ  １９８５）；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈ，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｒｉｔａｉｎ  （１９８６），  ２２：４３０を参照されたい。更に、光線治療を達成するために、モノクローナル抗体が光活性化染料と結合されている。Ｍｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９８３），１３０：１４７３；同上、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （１９８５），  ４５：４３８０；Ｏｓｅｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９８６），  ８３：８７４４；同上、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．  （１９８７），  ４６：８３；Ｈａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｇ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｓ．  （１９８９），  ２８８：４７１；Ｔａｔｓｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｓｅｒｓ  Ｓｕｒｇ．  Ｍｅｄ．  （１９８９），  ９：４２２；Ｐｅｌｅｇｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  （１９９１），  ６７：２５２９を参照されたい。
【００９７】
他の有用な治療薬は、好ましくは、ｂｃｌ−２又はｐ５３等の癌遺伝子及び癌遺伝子産物に対して向けられるオリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。治療用オリゴヌクレオチドの好ましい形態は、ｓｉＲＮＡである。
【００９８】
診断薬
診断薬は、好ましくは、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤、及び光活性剤からなる群から選択される。そのような診断薬は周知であり、任意のそのような公知の診断薬を使用することができる。診断薬の非限定的な例には、以下のもの等の放射性核種が含まれていてもよい：１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４〜１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、又は他のガンマ−、ベータ−、又はポジトロン−放射体。使用される常磁性イオンには、以下のものが含まれていてもよい：クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、又はエルビウム（ＩＩＩ）。金属造影剤には、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、又はビスマス（ＩＩＩ）が含まれていてもよい。超音波造影剤は、ガス入りリポソーム等のリポソームを含んでいてもよい。放射線不透過性診断薬は、化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、及びタリウム化合物から選択されてもよい。幅広く多様な蛍光標識が当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリテリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタアルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）、及びフルオレサミンが含まれる。使用される化学発光標識には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、又はシュウ酸エステルが含まれていてもよい。
【００９９】
治療的処置の方法
種々の実施形態は、ヒト、イヌ及びネコ等の家庭内又は伴侶ペットを含む哺乳動物等の対象体の癌を治療する方法であって、治療上有効量の二重特異性免疫サイトカインＤＮＬ構築体を対象体に投与することを含む方法に関する。
【０１００】
１つの実施形態では、主題のＤＮＬ構築体で治療することができる免疫疾患には、以下のものが含まれる：例えば、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、関節リウマチ等の関節疾患；多発性硬化症及び重症筋無力症等の神経疾患；糖尿病、特に若年性糖尿病等の膵臓疾患；慢性活動性肝炎、セリアック病、潰瘍性大腸炎、クローン病、悪性貧血等の胃腸管疾患；乾癬又は強皮症等の皮膚疾患；喘息等のアレルギー疾患、及び移植片対宿主病及び同種移植拒絶等の移植関連状態。
【０１０１】
二重特異性免疫サイトカインＤＮＬ構築体の投与は、標的細胞の表面の別の抗原に結合又は反応する治療上有効量の別の抗体を同時に又は順次投与することにより、補完することができる。好ましい追加的なＭＡｂは、以下のものと反応するＭＡｂからなる群から選択される少なくとも１つのヒト化、キメラ、又はヒトＭＡｂを含む：ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、Ｂ７、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＭ４抗原、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、Ｉａ、ＭＩＦ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｆｌｔ−３、ＶＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、テネイシン、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、補体因子Ｃ５、癌遺伝子産物、又はそれらの組み合わせ。抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、及び抗ＣＤ２２抗体等の、使用される種々の抗体は、当業者に公知である。例えば、以下を参照されたい：Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８：２６１０  （１９８８）；Ｈｅｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ３２：３６４  （１９９１）；Ｌｏｎｇｏ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ８：３５３  （１９９６）、米国特許第５，７９８，５５４号；第６，１８７，２８７号；第６，３０６，３９３号；第６，６７６，９２４号；第７，１０９，３０４号；第７，１５１，１６４号；第７，２３０，０８４号；第７，２３０，０８５号；第７，２３８，７８５号；第７，２３８，７８６号；第７，２８２，５６７号；第７，３００，６５５号；第７，３１２，３１８号；及び米国特許出願公開第２００８０１３１３６３号；第２００８００８９８３８号；第２００７０１７２９２０号；第２００６０１９３８６５号；第２００６０２１０４７５号；第２００８０１３８３３３号；及び第２００８０１４６７８４号、各々の実施例部分は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
ＤＮＬ構築体治療は、少なくとも１つの治療薬の同時投与又は順次投与のいずれかで更に補完することができる。例えば、「ＣＶＢ」（１．５ｇ／ｍ２のシクロホスファミド、２００〜４００ｍｇ／ｍ２のエトポシド、及び１５０〜２００ｍｇ／ｍ２のカルマスティン）は、非ホジキンリンパ腫を治療するために使用される投薬計画である。Ｐａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ５１：  １８  （１９９３）。他の好適な多剤併用化学療法の投薬計画は、当業者に周知である。例えば、Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，”  ｉｎ  ＣＡＮＣＥＲ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，  ＶＯＬＵＭＥ  ２，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ｐａｇｅｓ  ２０２８−２０６８  （Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９３）を参照されたい。例示として、中悪性度の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を治療するための第一世代化学療法投薬計画には、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジン、及びプレドニゾン）及びＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾン）が含まれる。有用な第二世代の化学療法投薬計画には、ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン、及びロイコボリン）であり、好適な第三世代投薬計画は、ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシン、及びロイコボリン）である。追加的な有用薬物には、フェニルブチラート、ベンダムスチン、及びブリオスタチン１が含まれる。
【０１０３】
主題のＤＮＬ構築体は、薬学的に有用な組成物を調製する公知の方法により製剤化することができ、それによりＤＮＬ構築体は、薬学的に好適な賦形剤を有する混合物と混合される。無菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に好適な賦形剤の一例である。他の好適な賦形剤が、当業者に周知である。例えば、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，  ５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ  （ｅｄ．），  ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、及びそれらの改訂版を参照されたい。
【０１０４】
主題のＤＮＬ構築体は、例えば、ボーラス注入又は持続点滴による静脈内投与用に製剤化することができる。好ましくは、ＤＮＬ構築体は、約４時間未満の期間、より好ましくは約３時間未満の期間にわたって点滴される。例えば、最初の２５〜５０ｍｇを３０分以内に、好ましくは１５分以内にでさえ点滴することができ、残りを次の２〜３時間にわたって点滴することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えばアンプル又は多用量容器で、保存剤を添加して提供することができる。組成物は、懸濁剤、溶液、又は油性又は水性媒体中の乳剤等の形態をとることができ、懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散剤等の製剤化剤を含有することができる。或いは、活性成分は、使用前に好適な媒体、例えば発熱性物質除去滅菌水で構成するための粉末形態であってもよい。
【０１０５】
追加的な製薬方法を使用して、ＤＮＬ構築体の作用持続時間を制御することができる。放出制御調製物は、ＤＮＬ構築体と複合体化するか又は吸着するポリマーを使用することにより調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーには、ポリ（エチレン−酢酸ビニル共重合体）のマトリックス、及びステアリン酸二量体及びセバシン酸のポリ酸無水物コポリマーのマトリックスが含まれる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：  １４４６  （１９９２）。そのようなマトリックスからの放出速度は、ＤＮＬ構築体の分子量、マトリックス内のＤＮＬ構築体の量、及び分散粒子のサイズに依存する。Ｓａｌｔｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ５５：  １６３  （１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．、上記。他の固形剤形は、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，  ５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ  （ｅｄ．），  ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、及びその改訂版に記載されている。
【０１０６】
また、ＤＮＬ構築体は、哺乳動物に皮下投与してもよく、又は他の非経口経路ででさえも投与することができる。更に、投与は、持続点滴によるものであってもよく、又は単一又は複数ボーラスによるものであってもよい。好ましくは、ＤＮＬ構築体は、約４時間未満の期間、より好ましくは約３時間未満の期間にわたって点滴される。
【０１０７】
より一般的には、ヒトに投与するＤＮＬ構築体の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身病状、及び以前の病歴等の要因に依存して変動するだろう。単回の静脈内点滴として約１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量のＤＮＬ構築体を受容者に提供することが望ましい場合があるが、状況によっては、より低いか又はより高い用量を投与してもよい。１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量は、例えば、７０ｋｇの患者の場合は７０〜１，４００ｍｇであり、又は１．７ｍの患者の場合は４１〜８２４ｍｇ／ｍ２である。投与は、必要に応じて繰り返してもよく、例えば、週１回で４〜１０週間、週１回で８週間、又は週１回で４週間である。また、投与は、維持療法に必要とされるように、隔週で数か月間、又は毎月若しくは年４回で何ヶ月間も等、それほど頻繁でなくともよい。
【０１０８】
或いは、ＤＮＬ構築体は、２週間毎又は３週毎に１用量を投与して、それを合計少なくとも３用量繰り返してもよい。又は、構築体は、週２回で４〜６週間投与してもよい。用量を、およそ２００〜３００ｍｇ／ｍ２（１．７ｍの患者の場合は１用量当たり３４０ｍｇ、又は７０ｋｇの患者の場合は４．９ｍｇ／ｋｇ）に低下させる場合、週１回で４〜１０週間投与してもよく、又は週２回で４〜１０週間の投与であってさえよい。或いは、投与スケジュールは、少なくしてもよい、つまり隔週又は３週毎で２〜３か月間でもよい。しかしながら、２０ｍｇ／ｋｇを週１回又は２〜３週毎に１回等の、更により高用量を、遅速静脈内点滴で投与サイクルを繰り返すことにより投与することができることが判明している。投薬スケジュールは、随意に他の間隔で繰り返すことができ、用量は、種々の非経口経路により、用量及びスケジュールを適切に調節して投与することができる。
【０１０９】
好ましい実施形態では、ＤＮＬ構築体は癌の治療に有用である。癌の例には、これらに限定されないが、癌腫、リンパ腫、神経膠芽腫、メラノーマ、肉腫、及び白血病、骨髄腫、又はリンパ性悪性疾患が含まれる。そのような癌のより多くの特定の例は、下記に注記されており、以下のものが含まれる：扁平細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、肺小細胞癌を含む肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化官癌を含む胃癌又は胃の癌、膵臓癌、多形膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、肝細胞癌、神経内分泌腫瘍、髄様甲状腺癌、分化甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓又は腎癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頸部癌。「癌」という用語は、原発性の悪性細胞又は腫瘍（例えば、元の悪性疾患又は腫瘍の部位以外の対象体中の部位にその細胞が移動していないもの）、及び続発性の悪性細胞又は腫瘍（例えば、転移、悪性細胞又は腫瘍細胞が元の腫瘍部位とは異なる二次的部位に移動することにより生じるもの）を含む。本発明の治療方法を実施することができる癌には、ＩＧＦ−１Ｒを発現、過剰発現、又は異常発現する細胞が関与する。
【０１１０】
癌又は悪性疾患の他の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：急性幼年期リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝癌、成人軟部組織肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連悪性疾患、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂及び尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頚癌、幼年期（原発性）肝細胞癌、幼年期（原発性）肝臓癌、幼年期急性リンパ芽球性白血病、幼年期急性骨髄白血病、幼年期脳幹神経膠腫、幼年期小脳星細胞腫、幼年期大脳星状細胞腫、幼年期頭蓋外胚細胞腫瘍、幼年期ホジキン病、幼年期ホジキンリンパ腫、幼年期視床下部及び視路神経膠腫、幼年期リンパ芽球性白血病、幼年期髄芽細胞腫、幼年期非ホジキンリンパ腫、幼年期松果体及びテント上方未分化神経外胚葉性腫瘍、幼年期原発性肝癌、幼年期横紋筋肉腫、幼年期軟部組織肉腫、幼年期視路及び視床下部神経膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌、子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫及び関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼球内黒色腫、島細胞癌、島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽細胞腫、メラノーマ、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平上皮頚部癌、転移性原発性扁平上皮頚部癌、転移性扁平上皮頚部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性障害、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非メラノーマ皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頚部癌、口腔咽頭癌、骨／悪性繊維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球症、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度潜在的腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、真性赤血球増加症、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、肺小細胞癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮頚部癌、胃癌、テント上原発性神経外胚葉及び松果体腫瘍、Ｔ細胞性リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、遷移性腎盂及び尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管及び腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視路及び視床下部神経膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ヴィルムス腫瘍、及び上記に列挙した臓器系に位置する腫瘍形成以外の任意の他の過剰増殖性疾患。
【０１１１】
本明細書に記載されている及び特許請求されている方法及び組成物を使用して、悪性又は前悪性状態を治療し、上記に記載のそれら障害を含むがそれらに限定されない新生物性状態又は悪性状態への進行を防止することができる。そのような使用は、腫瘍形成又は癌への進行に先行することが知られているか又は疑われている状態、特に過形成、異形成、又は最も具体的には形成異常で構成される非新生物性細胞増殖が生じている状態に適用される（そのような増殖異常状態に関する総説は、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｌ，  Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ２ｄ  Ｅｄ．，  Ｗ．  Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ｐｐ．  ６８−７９  （１９７６）を参照）。
【０１１２】
形成異常は、癌の前兆であることが多く、主として上皮に見出される。形成異常は、個々の細胞均一性、及び細胞の構築配向性の喪失を伴う、最も無秩序な形態の非腫瘍性細胞増殖である。形成異常は、慢性的刺激又は炎症が存在するところに生じることが特徴である。治療することができる形成異常障害には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：無汗性外胚葉性形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭形成異常、心房指形成異常、気管支肺異形成、終脳形成異常、子宮頚部形成異常、軟骨外胚葉性形成異常、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉性形成異常、頭蓋骨幹形成異常、頭蓋手根足根骨形成異常、頭蓋骨幹端形成異常、象牙質形成異常、骨幹形成異常、外胚葉性形成異常、エナメル質形成異常、脳眼形成異常、骨端半肢形成異常（ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌｉｓ  ｈｅｍｉｍｅｌｉａ）、多発性骨端形成異常、点状骨端形成異常、上皮性形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、家族性線維性下顎形成異常、家族性白色襞性形成異常、線維筋性形成異常、線維性骨形成異常、開花性骨形成異常、遺伝性腎網膜形成異常、発汗性外胚葉性形成異常、発汗低下性外胚葉性形成異常、リンパ性減少性胸腺形成異常、乳腺形成異常、下顎顔面形成異常、骨幹端形成異常、モンディーニ型内耳形成異常、単骨性線維性形成異常、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎形成異常、歯牙形成異常、眼下顎形成異常（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖性セメント質形成異常、多骨性線維性形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔視覚形成異常、脊椎骨端形成異常、及び心室橈骨形成異常。
【０１１３】
治療することができる追加的な前新生物性疾患には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：良性増殖不全障害（例えば、良性腫瘍、繊維性嚢胞性状態、組織肥大、腸管ポリープ、又は腺腫及び食道形成異常）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、及び日光角化症。
【０１１４】
好ましい実施形態では、本発明の方法を使用して、癌、特に上記に列挙したものの増殖、進行、及び／又は転移を阻害する。
【０１１５】
追加的な過剰増殖性疾患、障害、及び／又は状態には、これらに限定されないが、以下のもの等の悪性疾患及び関連障害の進行及び／又は転移が含まれる：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病（骨髄芽球、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病））及び慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ性白血病）を含む）、真性赤血球増加、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、並びにこれらに限定されないが、以下のもの等の肉腫及び癌腫を含む固形腫瘍：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛膜癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫（ｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、及び網膜芽細胞腫。
【０１１６】
発現ベクター
更に他の実施形態は、抗体、抗体断片、サイトカイン、又はＤＮＬ構築体の構成融合タンパク質をコードする核酸を含むＤＮＡ配列に関していてもよい。融合タンパク質は、例えばＡＤ又はＤＤＤ部分に結合された抗体又は断片又はサイトカインを含んでいてもよい。
【０１１７】
種々の実施形態は、コードＤＮＡ配列を含む発現ベクターに関する。ベクターは、キメラ、ヒト化、又はヒト可変領域配列が結合されていてもよいヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖定常領域並びにヒンジ領域をコードする配列を含有することができる。ベクターは、選択された宿主細胞でコード化タンパク質（複数可）を発現するプロモーター、エンハンサー、及びシグナル又はリーダー配列を更に含有することができる。特に有用なベクターは、ｐｄＨＬ２又はＧＳである。より好ましくは、軽鎖及び重鎖定常領域並びにヒンジ領域は、随意に、アロタイプ位置のアミノ酸の少なくとも１つが、異なるＩｇＧ１アロタイプに見出されるものに変更されており、随意に、ＥＵ付番系に基づくＥＵ重鎖のアミノ酸２５３が、アラニンで置換されていてもよいヒトＥＵミエローマ免疫グロブリンに由来してもよい。Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：  ７８−８５  （１９６９）を参照されたい。他の実施形態では、ＩｇＧ１配列は、ＩｇＧ４配列に変換されていてもよい。
【０１１８】
当業者であれば、発現構築体を遺伝子操作し、宿主細胞に挿入して操作されたタンパク質を発現させる方法は、当技術分野で周知であり、日常的な実験作業の問題であることを理解するだろう。宿主細胞及びクローニングされた抗体又は断片の発現方法は、例えば、米国特許第７，５３１，３２７号及び第７，５３７，９３０号に記載されており、各々の実施例部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
キット
種々の実施形態は、患者の疾患組織を治療又は診断するのに好適な成分を含有するキットに関していてもよい。例示的なキットは、本明細書に記載の１つ又は複数のＤＮＬ構築体を含有していてもよい。投与成分を含有する組成物が、経口送達等による消化管を介した送達用に製剤化されていない場合、幾つかの他の経路によりキット成分を送達することが可能なデバイスが含まれていてもよい。非経口送達等の適用用の１つのタイプのデバイスは、対象体の体内に組成物を注射するために使用される注射器である。吸入器を使用することもできる。ある実施形態では、治療薬は、滅菌の液体製剤又は凍結乾燥調製物を含有する事前充填の注射器又はペン型自動注射器の形態で提供することができる。
【０１２０】
キット成分は、一緒に包装されていてもよく、又は２つ以上の容器に分離されてもよい。幾つかの実施形態では、容器は、再構成に好適である、組成物の滅菌凍結乾燥製剤を含有するバイアルであってもよい。また、キットは、再構成及び／又は他の試薬の希釈に好適な１つ又は複数の緩衝液を含有していてもよい。使用することができる他の容器には、これらに限定されないが、ポーチ、トレー、箱、又はチューブ等が含まれる。キット成分は、容器内に滅菌包装及び滅菌維持されていてもよい。含まれていてもよい別の要素は、キットを使用する人に対する使用説明書である。
【０１２１】
実施例
以下の例は、例示のために提供されており、本発明の特許請求の範囲を制限するものではない。
【０１２２】
実施例１．モジュール型Ｆａｂサブユニットを産生するための基本戦略
Ｆａｂモジュールは、ＤＤＤ又はＡＤ配列のいずれかを含有する融合タンパク質として産生することができる。独立したトランスジェニック細胞系を、各融合タンパク質について開発した。産生したら、必要に応じてモジュールを精製してもよく、又は細胞培養上清液中で維持してもよい。産生後、任意のＤＤＤ２モジュールを任意のＡＤモジュールと組み合わせて、三価ＤＮＬ構築体を生成することができる。
【０１２３】
プラスミドベクターｐｄＨＬ２は、多数の抗体及び抗体に基づく構築体を生成するために使用されている。Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９８９），  １２５：１９１−２０２；Ｌｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  （Ｐｈｉｌａ）  （１９９７），  ８０：２６６０−６を参照されたい。２シストロン性哺乳動物発現ベクターは、ＩｇＧの重鎖及び軽鎖の合成を指図する。ベクター配列は、多数の異なるＩｇＧ−ｐｄＨＬ２構築体とほとんど同一であり、唯一の違いは、可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）配列に存在する。当業者に公知である分子生物学ツールを使用することにより、これらＩｇＧ発現ベクターを、Ｆａｂ−ＤＤＤ又はＦａｂ−ＡＤ発現ベクターに変換することができる。Ｆａｂ−ＤＤＤ発現ベクターを生成するためには、重鎖のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインのコード配列を、ヒンジの最初の４残基をコードする配列、１４残基のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー、及びヒトＲＩＩαの最初の４４残基と置換する（ＤＤＤ１と呼ぶ）。Ｆａｂ−ＡＤ発現ベクターを生成するためには、ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインの配列を、ヒンジの最初の４残基、１５残基のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー、及びバイオインフォマティクス及びペプチドアレイ技術を使用して生成し、ＲＩＩα二量体に非常に高い親和性（０．４ｎＭ）で結合することが示されたＡＫＡＰ−ＩＳと呼ばれる１７残基の合成ＡＤ（ＡＤ１と呼ぶ）をコードする配列と置換する。Ａｌｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ  （２００３），  １００：４４４５−５０を参照されたい。
【０１２４】
ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターの、Ｆａｂ−ＤＤＤ１又はＦａｂ−ＡＤ１発現ベクターのいずれかへの変換を容易にするために、２つのシャトルベクターを下述のように設計した。
【０１２５】
ＣＨ１の調製
ｐｄＨＬ２プラスミドベクターをテンプレートとして使用して、ＣＨ１ドメインをＰＣＲで増幅した。左ＰＣＲプライマーは、ＣＨ１ドメインの上流（５’）及びＣＨ１コード配列の５’のＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位で構成される。右プライマーは、ヒンジの最初の４残基をコードする配列、その後の短いリンカーで構成されており、最後の２つのコドンはＢａｍＨＩ制限部位を含む。
ＣＨ１  Ｌｅｆｔプライマーの５’
５’ＧＡＡＣＣＴＣＧＣＧＧＡＣＡＧＴＴＡＡＧ−３’（配列番号６３）
ＣＨ１＋Ｇ４Ｓ−Ｂａｍ  Ｒｉｇｈｔ
５’ＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号６４）
【０１２６】
４１０ｂｐのＰＣＲアンプライマーを、ｐＧｅｍＴ  ＰＣＲクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングし、Ｔ７（５’）配向性のインサートを求めてクローンをスクリーニングした。
【０１２７】
（Ｇ４Ｓ）２ＤＤＤ１の構築
リンカーペプチドの１１残基が先行するＤＤＤ１のアミノ酸配列をコードし、最初の２つのコドンがＢａｍＨＩ制限部位を含む、（Ｇ４Ｓ）２ＤＤＤ１と称する二本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社（ヘーヴァリル、英国）により合成された。終止コドン及びＥａｇＩ制限部位は、３’末端に付加されている。コードされたポリペプチド配列を下記に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号６５）
【０１２８】
それらの３’末端の３０塩基対が重複する、ＲＩＩＡ１−４４ｔｏｐ及びＲＩＩＡ１−４４ｂｏｔｔｏｍと称する２つのオリゴヌクレオチドを合成し（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社）、１７４ｂｐのＤＤＤ１配列の中央の１５４塩基対を含むように組み合わせた。オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、Ｔａｑポリメラーゼを用いたプライマー伸長反応にかけた。
ＲＩＩＡ１−４４  Ｔｏｐ
５’ＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＧＡＣＡＧ−３’（配列番号６６）
ＲＩＩＡ１−４４  Ｂｏｔｔｏｍ
５’ＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＡＣＴＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧ−３’（配列番号６７）
【０１２９】
プライマーを伸長した後、以下のプライマーを使用して、二本鎖をＰＣＲで増幅した：
Ｇ４Ｓ  Ｂａｍ−Ｌｅｆｔ
５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴ−３’（配列番号６８）
１−４４  ｓｔｏｐ  Ｅａｇ  Ｒｉｇｈｔ
５’−ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＡＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧ−３’（配列番号６９）
【０１３０】
このアンプライマーを、ｐＧｅｍＴにクローニングし、Ｔ７（５’）配向性のインサートを求めてスクリーニングした。
【０１３１】
（Ｇ４Ｓ）２−ＡＤ１の構築
リンカーペプチドの１１残基が先行するＡＤ１のアミノ酸配列をコードし、最初の２つのコドンがＢａｍＨＩ制限部位を含む、（Ｇ４Ｓ）２−ＡＤ１と称する二本鎖オリゴヌクレオチドを合成した（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社）。終止コドン及びＥａｇＩ制限部位は、３’末端に付加されている。コードされたポリペプチド配列を下記に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号７０）
【０１３２】
ＡＫＡＰ−ＩＳ  Ｔｏｐ及びＡＫＡＰ−ＩＳ  Ｂｏｔｔｏｍと称する２つの相補的重複オリゴヌクレオチドを合成した。
ＡＫＡＰ−ＩＳ  Ｔｏｐ
５’ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＣＧ−３’（配列番号７１）
ＡＫＡＰ−ＩＳ  Ｂｏｔｔｏｍ
５’ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＴＣＣＡＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号７２）
【０１３３】
以下のプライマーを使用して、二本鎖をＰＣＲで増幅した：
Ｇ４Ｓ  Ｂａｍ−Ｌｅｆｔ
５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴ−３’（配列番号７３）
ＡＫＡＰ−ＩＳ  ｓｔｏｐ  Ｅａｇ  Ｒｉｇｈｔ
５’−ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧ−３’（配列番号７４）
【０１３４】
このアンプライマーを、ｐＧｅｍＴベクターにクローニングし、Ｔ７（５’）配向性のインサートを求めてスクリーニングした。
【０１３５】
ＤＤＤ１とＣＨ１とのライゲーション
ＤＤＤ１配列をコードする１９０ｂｐ断片を、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素を用いてｐＧｅｍＴから切り出し、その後ＣＨ１−ｐＧｅｍＴの同じ部位にライゲーションして、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ｐＧｅｍＴを生成した。
【０１３６】
ＡＤ１とＣＨ１とのライゲーション
ＡＤ１配列を含有する１１０ｂｐ断片を、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを用いてｐＧｅｍＴから切り出し、その後ＣＨ１−ｐＧｅｍＴの同じ部位にライゲーションして、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ｐＧｅｍＴを生成した。
【０１３７】
ｐｄＨＬ２に基づくベクターへのＣＨ１−ＤＤＤ１又はＣＨ１−ＡＤ１のクローニング  このモジュール設計により、ＣＨ１−ＤＤＤ１又はＣＨ１−ＡＤ１のいずれかを、ｐｄＨＬ２ベクター中の任意のＩｇＧ構築体に組み込むことができる。ｐｄＨＬ２からＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ制限断片（ＣＨ１−ＣＨ３）を除去し、それを、それぞれのｐＧｅｍＴシャトルベクターから切り出される、ＣＨ１−ＤＤＤ１又はＣＨ１−ＡＤ１のＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ断片と置換することにより、重鎖定常ドメイン全体を、上記の構築体のうちの１つと置換する。
【０１３８】
Ｎ末端ＤＤＤドメイン
ＤＤＤ又はＡＤの位置は、ＣＨ１のカルボキシル末端に限定されない。ＤＤＤ１配列がＶＨドメインのアミノ末端に結合された構築体を作り上げた。
【０１３９】
実施例２：発現ベクター
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２の構築
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２は、１４個アミノ酸残基で構成される可撓性Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドスペーサーを介してＦｄのＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に結合されたＡＤ１を有するｈ６７９  Ｆａｂを産生するための発現ベクターである。ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩを用いてＣＨ１−ＡＤ１−ＳＶ３シャトルベクターから切り出したＣＨ１−ＡＤ１断片を有するＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ断片の置換により、ｈ６７９の可変ドメインを含有するｐｄＨＬ２に基づくベクターを、ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２に変換した。
【０１４０】
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２の構築
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、ＤＤＤ１が、可撓性ペプチドスペーサーを介してＣＨ１のカルボキシル末端のｈＭＮ−１４  Ｆａｂに結合されている融合タンパク質Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を産生するための発現ベクターである。ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩ制限エンドヌクレアーゼで消化してＣＨ１−ＣＨ３ドメインを取り除き、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩを用いてＣＨ１−ＤＤＤ１−ＳＶ３シャトルベクターから切り出したＣＨ１−ＤＤＤ１断片を挿入することにより、ｈＭＮ−１４  ＩｇＧを産生するために使用されたプラスミドベクターｈＭＮ１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２を、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２に変換した。
【０１４１】
Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２の構築
Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、ＤＤＤ１が、可撓性ペプチドスペーサーを介してＶＨのアミノ末端のｈＭＮ−１４  Ｆａｂに結合されている２つのコピーの融合タンパク質Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を含む安定した二量体を産生するための発現ベクターである。発現ベクターを以下のように操作した。下記に示されている２つのプライマーを使用して、ＤＤＤ１ドメインをＰＣＲで増幅した。
ＤＤＤ１  Ｎｃｏ  Ｌｅｆｔ
５’ＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣ−３’（配列番号７５）
ＤＤＤ１−Ｇ４Ｓ  Ｂａｍ  Ｒｉｇｈｔ
５’ＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＧＴＧ−３’（配列番号７６）
【０１４２】
ＰＣＲの結果、ＮｃｏＩ制限部位、及びＢａｍＨＩ制限を含有するリンカーの一部分のコード配列が、それぞれ５’及び３’末端に付加された。１７０ｂｐのＰＣＲアンプライマーを、ｐＧｅｍＴベクターにクローニングし、Ｔ７（５’）配向性のインサートを求めてクローンをスクリーニングした。１９４ｂｐインサートを、ＮｃｏＩ及びＳａｌＩ制限酵素を用いてｐＧｅｍＴベクターから切り出し、それら同じ酵素を用いて消化することにより調製したＳＶ３シャトルベクターにクローニングして、中間ベクターＤＤＤ１−ＳＶ３を生成した。
【０１４３】
下記に示されているオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ｈＭＮ−１４  Ｆｄ配列をＰＣＲで増幅した。
ｈＭＮ−１４ＶＨ  ｌｅｆｔ  Ｇ４Ｓ  Ｂａｍ
５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧ−３’（配列番号７７）
ＣＨ１−Ｃ  ｓｔｏｐ  Ｅａｇ
５’−ＣＧＧＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＴＡＧＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣ−３’（配列番号７８）
【０１４４】
ＰＣＲの結果、ＢａｍＨＩ制限部位、及びリンカーの一部分のコード配列が、アンプライマーの５’末端に付加された。終止コドン及びＥａｇＩ制限部位は、３’末端に付加された。１０４３ｂｐアンプライマーを、ｐＧｅｍＴにクローニングした。ｈＭＮ−１４−Ｆｄインサートを、ＢａｍＨＩ及びＥａｇＩ制限酵素を用いてｐＧｅｍＴから切り出し、その後それら同じ酵素で消化することにより調製したＤＤＤ１−ＳＶ３ベクターにライゲーションして、構築体Ｎ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４Ｆｄ−ＳＶ３を生成した。
【０１４５】
Ｎ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４  Ｆｄ配列を、ＸｈｏＩ及びＥａｇＩ制限酵素を用いて切り出し、１．２８ｋｂのインサート断片を、それら同じ酵素を用いてＣ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２を消化することにより調製したベクター断片にライゲーションした。最終発現ベクターは、Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐＤＨＬ２である。
【０１４６】
実施例３．ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１の産生及び精製
６７９個の抗体がＨＳＧ標的抗原に結合し、アフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２ベクターを、ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することにより線形化し、エレクトロポレーションでＳｐ／ＥＥＥミエローマ細胞に形質移入した。２シストロン性発現ベクターは、合わせてｈ６７９Ｆａｂ−ＡＤ１を形成するｈ６７９カッパ軽鎖及びｈ６７９Ｆｄ−ＡＤ１の両方の合成及び分泌を指図する。エレクトロポレーションした後、細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種し、形質移入クローンを、０．０５μＭメトトレキサート（ＭＴＸ）で選択した。ＢＳＡ−ＩＭＰ−２６０（ＨＳＧ）結合体でコーティングされたマイクロタイタープレートを使用し、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＦａｂで検出したＥＬＩＳＡにより、クローンをタンパク質発現についてスクリーニングした。ＨＳＧ（ＩＭＰ−２３９）センサーチップを使用したＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して、希釈培地試料の注入から得られる初期傾きを測定することにより生産性を決定した。生産性が最も高いクローンは、およそ３０ｍｇ／Ｌの初期生産性を示した。合計２３０ｍｇのｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１を、一段階のＩＭＰ−２９１アフィニティークロマトグラフィーで、４．５リットルの回転ボトル培養から精製した。培地を、ＩＭＰ−２９１−ａｆｆｉｇｅｌカラムに負荷する前に、限外ろ過によりおよそ１０倍に濃縮した。基線に達するまでカラムをＰＢＳで洗浄し、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１を、１Ｍイミダゾール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．５で溶出した。溶出液のＳＥ−ＨＰＬＣ分析は、５０ｋＤａタンパク質と一致する滞留時間（９．６３分）を示す単一の鋭いピークを示した（非表示）。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、ｈ６７９−ＡＤ１のポリペプチド成分を表す２つのバンドのみが明白だった（非表示）。
【０１４７】
実施例４．Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４及びＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の産生及び精製
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２及びＮ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２ベクターを、エレクトロポレーションによりＳｐ２／０由来ミエローマ細胞に形質移入した。Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、２シストロン性発現ベクターであり、合わせてＣ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４  Ｆａｂを形成するｈＭＮ−１４カッパ軽鎖及びｈＭＮ−１４  Ｆｄ−ＤＤＤ１の両方の合成及び分泌を指図する。Ｎ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、２シストロン性発現ベクターであり、合わせてＮ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を形成するｈＭＮ−１４カッパ軽鎖及びＮ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４の両方の合成及び分泌を指図する。各融合タンパク質は、ＤＤＤ１ドメインの相互作用により、安定したホモ二量体を形成する。
【０１４８】
エレクトロポレーションした後、細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種し、形質移入クローンを、０．０５μＭメトトレキサート（ＭＴＸ）で選択した。ＷＩ２（ｈＭＮ−１４に対するラット抗ｉｄモノクローナル抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートを使用し、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＦａｂで検出したＥＬＩＳＡにより、クローンをタンパク質発現についてスクリーニングした。最も大量に産生するＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ１４  Ｆａｂ及びＮ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ１４  Ｆａｂクローンの初期生産性は、それぞれ６０ｍｇ／Ｌ及び６ｍｇ／Ｌだった。
【０１４９】
ＡＤ１−ＡｆｆｉｇｅｌによるＮ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４及びＣ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４の親和性精製
ＤＤＤ／ＡＤ相互作用を使用して、ＤＤＤ１含有構築体を親和性精製した。ＡＤ１−Ｃは、ＡＤ１配列、及びスルフヒドリル基とクロロ酢酸無水物を反応させた後でペプチドをＡｆｆｉｇｅｌに結合するのに使用したカルボキシル末端システイン残基で構成される合成的に製作されたペプチドである。ＤＤＤ含有ａ２構造は、中性ｐＨでＡＤ１−Ｃ−Ａｆｆｉｇｅｌ樹脂と特異的に結合し、低ｐＨ（例えば、ｐＨ２．５）で溶出することができる。
【０１５０】
合計８１ｍｇのＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を、一段階のＡＤ１−Ｃアフィニティークロマトグラフィーにより、１．２リットルの回転ボトル培養から精製した。培地を、ＡＤ１−Ｃ−ａｆｆｉｇｅｌカラムに負荷する前に、限外ろ過によりおよそ１０倍に濃縮した。基線に達するまでカラムをＰＢＳで洗浄し、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５で溶出した。溶出液のＳＥ−ＨＰＬＣ分析は、１０７ｋＤａタンパク質と一致する滞留時間（８．７分）を示す単一の鋭いピークを示した（非表示）。また、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の２つのポリペプチド成分に予想される分子サイズの２つのバンドのみを示す還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、純度を確認した（非表示）。
【０１５１】
合計１０ｍｇのＮ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４を、一段階のＡＤ１−Ｃアフィニティークロマトグラフィーにより、１．２リットルの回転ボトル培養から精製した。溶出液のＳＥ−ＨＰＬＣ分析は、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４と類似した、１０７ｋＤａタンパク質と一致する滞留時間（８．７７分）を示す単一のタンパク質ピークを示した（非表示）。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４のポリペプチド成分に起因する２つのバンドのみを示した（非表示）。
【０１５２】
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の結合活性を、試験物質を種々の量のＷＩ２と混合した試料のＳＥ−ＨＰＬＣ分析で決定した。ＷＩ２  Ｆａｂ及びＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を０．７５：１のモル比で混合することにより調製した試料は、未結合Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ１４（８．７１ｍｉｎ）、１つのＷＩ２  Ｆａｂに結合したＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（７．９５ｍｉｎ）、及び２つのＷＩ２  Ｆａｂに結合したＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ１４（７．３７ｍｉｎ）に起因する３つのピークを示した（非表示）。４のモル比でＷＩ２  Ｆａｂ及びＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を含有する試料を分析した際には、７．３６分の単一ピークのみが観察された（非表示）。これらの結果は、ｈＭＮ１４−Ｆａｂ−ＤＤＤ１が二量体であり、２つの活性結合部位を有することを実証している。この実験をＮ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４で繰り返すと、非常に類似した結果が得られた。
【０１５３】
競合ＥＬＩＳＡにより、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４及びＮ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４は両方とも、ｈＭＮ−１４  ＩｇＧに類似した結合活性で、一価のｈＭＮ−１４  Ｆａｂよりも著しく強くＣＥＡに結合することが実証された（非表示）。ＥＬＩＳＡプレートは、ｈＭＮ−１４が特異的であるＣＥＡのエピトープ（Ａ３Ｂ３）を含有する融合タンパク質でコーティングされていた。
【０１５４】
実施例５．ａ２ｂ複合体の形成
ａ２ｂ複合体形成の根拠は、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（ａ２として）及びｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１（ｂとして）を等モル量で含有する混合物のＳＥ−ＨＰＬＣ分析により提供された。そのような試料を分析すると、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１（９．５５分）又はＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（８．７３分）のいずれよりも大きな新しいタンパク質の形成と一致する８．４０分の滞留時間を有する単一のピークが観察された（非表示）。ｈＭＮ−１４Ｆ（ａｂ’）２をｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１と混合したか、又はＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を６７９−Ｆａｂ−ＮＥＭと混合した場合には、アップフィールドシフトは観察されず、相互作用が、ＤＤＤ１及びＡＤ１ドメインを介して特異的に媒介されることが実証された。非常に類似した結果が、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１及びＮ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を使用して得られた（非表示）。
【０１５５】
ＢＩＡｃｏｒｅを使用して、ＤＤ１及びＡＤ１融合タンパク質間の特異的相互作用を更に実証及び特徴付けた。最初に、高密度ＨＳＧ結合（ＩＭＰ２３９）センサーチップの表面にｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１又は６７９−Ｆａｂ−ＮＥＭのいずれかを結合させ、次にＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４又はｈＭＮ−１４Ｆ（ａｂ’）２をその後に注入することによる実験を実施した。予想通り、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１及びＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の組み合わせのみが、後者を注入した際の応答単位の更なる増加をもたらした（非表示）。類似の結果が、Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４及びｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１を使用して得られた（非表示）。
【０１５６】
平衡ＳＥ−ＨＰＬＣ実験を実施して、それぞれの融合タンパク質に存在するＡＤ１及びＤＤＤ１間の特異的な相互作用の結合親和性を決定した。Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４、Ｎ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４、及び組換えヒトＲＩＩαの市販試料に対するｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１の結合の解離定数（Ｋｄ）は、それぞれ１５ｎＭ、８ｎＭ、及び３０ｎＭであることが見出された。
【０１５７】
実施例６．ＤＤＤ又はＡＤ融合タンパク質のいずれかの親和性精製
より低い親和性ドッキングを示すＤＤＤ又はＡＤタンパク質を産生することにより、汎用親和性精製系を開発することができる。ＲＩα二量体により形成されたＤＤＤは、ＲＩＩαと比較して、５００倍弱い親和性（２２５ｎＭ）でＡＫＡＰ−ＩＳ（ＡＤ１）と結合する。従って、最初の４４個アミノ酸残基で形成されるＲＩα二量体を産生し、樹脂に結合させて、任意のＡＤ１含有融合タンパク質を精製するための親和性マトリックスを製作することができる。
【０１５８】
多くの低親和性（０．１μＭ）ＡＫＡＰアンカードメインが、自然界に存在する。必要に応じて、高度に予想可能なアミノ酸置換を導入して、結合親和性を更に低下させることができる。低親和性ＡＤは、合成的又は生物学的のいずれでも産生することができ、任意のＤＤＤ１融合タンパク質の親和性精製に使用される樹脂に結合させることができる。
【０１５９】
実施例７．ジスルフィドで安定化された構造を産生するためのベクター
Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２
Ｎ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、Ｆｄのアミノ末端に付加されたＤＤＤ２の二量体化及びドッキングドメイン配列を有するＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を産生するための発現ベクターである。ＤＤＤ２は、１５個アミノ酸残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＶＨドメインに結合される。ＤＤＤ２は、二量体化及びドッキング配列に先行するシステイン残基を有し、それはＤＤＤ１のものと同一だった。
【０１６０】
発現ベクターを以下のように操作した。ＤＤＤ２の残基１〜１３を含む、２つの重複する相補的オリゴヌクレオチド（ＤＤＤ２  Ｔｏｐ及びＤＤＤ２  Ｂｏｔｔｏｍ）を合成的に製作した。オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）でリン酸化し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化されたＤＮＡとのライゲーションに適合する５’及び３’末端突出をもたらした。
ＤＤＤ２  Ｔｏｐ
５’ＣＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡ−３’（配列番号７９）
ＤＤＤ２  Ｂｏｔｔｏｍ
５’ＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＡ−３’（配列番号８０）
【０１６１】
二本鎖ＤＮＡを、ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで消化することにより調製したベクター断片、ＤＤＤ１−ｈＭＮ１４  Ｆｄ−ＳＶ３にライゲーションして、中間構築体ＤＤＤ２−ｈＭＮ１４  Ｆｄ−ＳＶ３を生成した。ＤＤＤ２−ｈＭＮ１４  Ｆｄのコード配列を含有していた１．２８ｋｂインサート断片を、ＸｈｏＩ及びＥａｇＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて中間構築体から切り出し、それら同じ酵素で消化することにより調製したｈＭＮ１４−ｐｄＨＬ２ベクターＤＮＡにライゲーションした。最終発現ベクターは、Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２である。
【０１６２】
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、１４個アミノ酸残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＦｄのカルボキシル末端に付加されたＤＤＤ２の二量体化及びドッキングドメイン配列を有するＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を産生するための発現ベクターである。発現ベクターを以下のように操作した。リンカーペプチドの一部（ＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧ、配列番号８１）及びＤＤＤ２の残基１〜１３のコード配列を含む２つの重複する相補的オリゴヌクレオチドを、合成的に製作した。オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、Ｔ４  ＰＮＫでリン酸化し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化されたＤＮＡとのライゲーションに適合する５’及び３’末端突出をもたらした。
Ｇ４Ｓ−ＤＤＤ２  ｔｏｐ
５’ＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡ−３’（配列番号８２）
Ｇ４Ｓ−ＤＤＤ２  ｂｏｔｔｏｍ
５’ＧＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＡＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧ−３’（配列番号８３）
【０１６３】
二本鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化することにより調製したシャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ｐＧｅｍＴにライゲーションして、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ２−ｐＧｅｍＴを生成した。５０７ｂｐ断片を、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩを用いてＣＨ１−ＤＤＤ２−ｐＧｅｍＴから切り出し、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩで消化することにより調製したＩｇＧ発現ベクターｈＭＮ１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２にライゲーションした。最終発現構築体は、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２である。
【０１６４】
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２は、１４個アミノ酸残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加されたＡＤ２のアンカードメイン配列を有するｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を産生するための発現ベクターである。ＡＤ２は、ＡＤ１のアンカードメイン配列の前に１つシステイン残基、及び後に別のシステイン残基を有する。
【０１６５】
発現ベクターを以下のように操作した。ＡＤ２及びリンカーペプチドの一部のコード配列を含む２つの重複する相補的オリゴヌクレオチド（ＡＤ２Ｔｏｐ及びＡＤ２Ｂｏｔｔｏｍ）を、合成的に製作した。オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、Ｔ４  ＰＮＫでリン酸化し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩでそれぞれ消化されたＤＮＡとのライゲーションに適合する５’及び３’末端突出をもたらした。
ＡＤ２  Ｔｏｐ
５’ＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡ−３’（配列番号８４）
ＡＤ２  Ｂｏｔｔｏｍ
５’ＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＴＣＣＡＣＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧ−３’（配列番号８５）
【０１６６】
二本鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩで消化することにより調製したシャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ｐＧｅｍＴにライゲーションして、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ２−ｐＧｅｍＴを生成した。ＣＨ１及びＡＤ２コード配列を含有する４２９塩基対断片を、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩ制限酵素を用いてシャトルベクターから切り出し、それら同じ酵素で消化することにより調製したｈ６７９−ｐｄＨＬ２ベクターにライゲーションした。最終発現ベクターは、ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２である。
【０１６７】
実施例８．ＴＦ１の生成
ＴＦ１と称する三価ＤＮＬ構築体の大規模調製を、以下のように実施した。最初に、Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（タンパク質Ｌで精製）及びｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２（ＩＭＰ−２９１で精製）を、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で、おおよそ化学量論的な濃度に混合した。ＴＣＥＰを添加する前では、ＳＥ−ＨＰＬＣは、ａ２ｂ形成の痕跡を一切示さなかった（非表示）。その代りに、ａ４（７．９７分；２００ｋＤａ）、ａ２（８．９１分；１００ｋＤａ）、及びＢ（１０．０１分；５０ｋＤａ）を表すピークが存在した。５ｍＭ  ＴＣＥＰを添加すると、１５０ｋＤａタンパク質と一致する８．４３分の新しいピークにより示されるａ２ｂ複合体の形成が、迅速にもたらされた（非表示）。この実験では、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２（９．７２分）に起因するピークが依然として明白だったため、Ｂが過剰に存在していたことは明らかだったが、ａ２又はａ４のいずれに対応する明白なピークも観察されなかった。１時間の還元後、ＰＢＳを数回交換して一晩透析することにより、ＴＣＥＰを除去した。その結果生じた溶液を１０％ＤＭＳＯに調整し、室温で一晩保持した。
【０１６８】
ＳＥ−ＨＰＬＣで分析すると、ａ２ｂを表すピークは鋭くなり、０．１分〜８．３１分だけ滞留時間がわずかに遅くなったことが観察された（非表示）。これは、本発明者らの以前の知見に基づくと、結合親和性の増加を示している。複合体をＩＭＰ−２９１アフィニティークロマトグラフィーで更に精製して、カッパ鎖夾雑物を除去した。予想通り、過剰ｈ６７９−ＡＤ２が同時に精製され、その後分離用ＳＥ−ＨＰＬＣで除去された。
【０１６９】
ＴＦ１は、非常に安定した複合体である。ＴＦ１をＨＳＧ（ＩＭＰ−２３９）センサーチップに対する結合について試験すると、試料注入の終了時に応答の明白な減少は観察されなかった。対照的に、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４及びｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１の両方の等モル混合物を含有する溶液を、同様の条件下で試験すると、応答単位の観察された増加には、試料注入間及び直後に検出可能な低下が伴い、最初に形成されたａ２ｂ構造が不安定だったことを示した。更に、その後ＷＩ２を注入することにより、ＴＦ１の応答単位に実質的な増加がもたらされたが、Ｃ−ＤＤＤ１／ＡＤ１混合物の場合は、増加は明白ではなかった。
【０１７０】
センサーチップに固定されたＴＦ１に対するＷＩ２の結合に起因する応答単位の更なる増加は、２つの完全に機能的な結合部位に対応し、Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の１つのサブユニットがその各々に寄与していた。これは、ＷＩ２の２つのＦａｂ断片に結合するＴＦ１の能力により確認された（非表示）。ＴＦ１と全く同様に還元及び酸化されたｈ６７９−ＡＤ２及びＮ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ１４を含有する混合物を、ＢＩＡｃｏｒｅで分析すると、ＷＩ２の更なる結合はほとんど無く（非表示）、ＴＦ１等のジスルフィドで安定化されたａ２ｂ複合体は、ＤＤＤ２及びＡＤ２の相互作用によってのみ生じ得ることが示された。
【０１７１】
プロセスの時間及び効率を低減する２つの改良をプロセスに施した。第１に、ａ４／ａ２構造の混合物として存在するわずかにモル過剰量のＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を使用して、遊離ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２が残留せず、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２に係留されていないあらゆるａ４／ａ２構造並びに軽鎖が、ＩＭＰ−２９１アフィニティークロマトグラフィーにより除去されることになるように、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２と反応させた。第２に、還元後にＴＣＥＰを除去する手段として、透析又はダイアフィルトレーションの代わりに、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用した。それにより、プロセス時間が短縮されるだけでなく、ウイルス除去ステップが追加される可能性もあるだろう。Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４及び６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を、室温で１時間、５ｍＭ  ＴＣＥＰと混合及び還元した。溶液を０．７５Ｍ硫酸アンモニウムに調整し、その後ブチルＦＦ  ＨＩＣカラムに負荷した。カラムを、０．７５Ｍ硫酸アンモニウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳで洗浄して、ＴＣＥＰを除去した。還元されたタンパク質を、ＰＢＳでＨＩＣカラムから溶出し、１０％ＤＭＳＯに調整した。室温で一晩インキュベーションした後、高度に精製されたＴＦ１を、ＩＭＰ−２９１アフィニティークロマトグラフィーで単離した（非表示）。ゲルろ過等の追加的な精製ステップは必要ではなかった。
【０１７２】
実施例９．ＴＦ２の生成
ＴＦ１の生成に成功した後、ＴＦ２と称する類似体を、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４をｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２と反応させることにより得た。ＴＦ２の試験的バッチを、９０％を超える収率で以下のように生成した。タンパク質Ｌで精製したＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（２００ｍｇ）を、１．４：１のモル比でｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２（６０ｍｇ）と混合した。総タンパク質濃度は、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中で１．５ｍｇ／ｍｌだった。ＴＣＥＰ還元、ＨＩＣクロマトグラフィー、ＤＭＳＯ酸化、及びＩＭＰ−２９１アフィニティークロマトグラフィーを伴うその後のステップは、ＴＦ１についての記載と同じだった。ＴＣＥＰを添加する前、ＳＥ−ＨＰＬＣは、ａ２ｂ形成の痕跡を一切示さなかった（非表示）。その代りに、ａ４（８．４０分；２１５ｋＤａ）、ａ２（９．３２分；１０７ｋＤａ）、及びｂ（１０．３３分；５０ｋＤａ）に対応するピークが存在した。５ｍＭ  ＴＣＥＰを添加すると、二元構造の場合に予想される１５７ｋＤａタンパク質と一致する８．７７分の新しいピーク（非表示）により示されるａ２ｂ複合体の形成が、迅速にもたらされた。ＴＦ２を、ＩＭＰ−２９１アフィニティークロマトグラフィーで、ほぼ均質に精製した（非表示）。ＩＭＰ−２９１未結合画分をＳＥ−ＨＰＬＣで分析することにより、ａ４、ａ２、及び遊離カッパ鎖が産物から除去されたことを実証した（非表示）。
【０１７３】
ＴＦ２の機能性を、ＴＦ１について記載したようにＢＩＡＣＯＲＥで決定した。ＴＦ２、Ｃ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ１（非共有結合性ａ２ｂ複合体の対照試料として使用した）又はＣ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ２（非還元ａ２及びｂ成分の対照試料として使用した）を、１μｇ／ｍｌ（総タンパク質）に希釈し、ＨＳＧを固定化したセンサーチップに通した。ＴＦ２の応答は、２つの対照試料の応答のおよそ２倍であり、対照試料中のｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ成分のみが結合してセンサチップに残留することになることを示した。その後にＷＩ２  ＩｇＧを注入することにより、ＴＦ２のみが、追加的なシグナル応答により示されたようにｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤに強力に結合したＤＤＤ−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４成分を有することが実証された。また、センサーチップに固定されたＴＦ２に対するＷＩ２の結合に起因する応答単位の更なる増加は、２つの完全に機能的な結合部位に対応し、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の１つのサブユニットがその各々に寄与していた。これは、ＷＩ２の２つのＦａｂ断片に結合するＴＦ２の能力により確認された（非表示）。
【０１７４】
ＴＦ２の相対的ＣＥＡ結合活性を、競合ＥＬＩＳＡで決定した。プレートを、ｈＭＮ−１４によって認識されるＣＥＡのＡ３Ｂ３ドメインを含有する融合タンパク質でコーティングした（０．５μｇ／ウェル）。ＴＦ１、ＴＦ２、及びｈＭＮ−１４  ＩｇＧの連続希釈を四重重複で行い、ＨＲＰ結合ｈＭＮ−１４  ＩｇＧ（１ｎＭ）を含有するウェル中でインキュベートした。データは、ＴＦ２が、ＩｇＧの結合活性と少なくとも同様であり、ＴＦ１よりも２倍強力な結合活性でＣＥＡと結合することを示す（非表示）。
【０１７５】
実施例１０．ＴＦ１及びＴＦ２の血清安定性
ＴＦ１及びＴＦ２は、血液及び組織で広範な希釈が生じるｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる安定的に係留された構造であるように設計されていた。ヒト血清中でのＴＦ２の安定性を、ＢＩＡＣＯＲＥを使用して評価した。ＴＦ２を、４人の供与者から貯溜した新鮮なヒト血清で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、５％ＣＯ２下で７日間３７℃にてインキュベートした。連日試料を１：２５に希釈し、その後ＩＭＰ−２３９ＨＳＧセンサーチップを使用してＢＩＡＣＯＲＥで分析した。ＷＩ２  ＩｇＧの注入を使用して、完全で十分に活性なＴＦ２の量を定量化した。血清試料を、原液から直接希釈した対照試料と比較した。ＴＦ２は、血清中で高度に安定しており、７日後にその二重特異性結合活性の９８％を保持する（非表示）。ヒト又はマウス血清のいずれにおいても、ＴＦ１に関して同様の結果が得られた（非表示）。
【０１７６】
実施例１１．Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターの生成
ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターは、多数の組換えＩｇＧの発現を媒介するために使用されている（Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００５，  ３６：８４−９５）。任意のＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターの、Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターへの変換を容易にするために、プラスミドシャトルベクターを生成した。ｐｄＨＬ２ベクターをテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＦｃ  ＢｇｌＩＩ  Ｌｅｆｔ及びＦｃ  Ｂａｍ−ＥｃｏＲＩ  Ｒｉｇｈｔをプライマーとして使用して、Ｆｃ（ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）の遺伝子を増幅した。
Ｆｃ  ＢｇｌＩＩ  Ｌｅｆｔ
５’−ＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧ−３’（配列番号８６）
Ｆｃ  Ｂａｍ−ＥｃｏＲＩ  Ｒｉｇｈｔ
５’−ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ−３’（配列番号８７）
【０１７７】
アンプライマーを、ｐＧｅｍＴ  ＰＣＲクローニングベクターにクローニングした。Ｆｃインサート断片を、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素を用いてｐＧｅｍＴから切り出し、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩでｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２を消化することにより調製されたＡＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターにライゲーションして、シャトルベクターＦｃ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２を生成した。
【０１７８】
任意のＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターをＣ−Ｈ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターに変換するために、８６１ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限断片を前者から切り出して、Ｆｃ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターから切り出した９５２ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限断片と置換した。ＢｓｒＧＩはＣＨ３ドメインを切断し、ＮｄｅＩは、発現カセットの下流（３’）を切断する。
【０１７９】
実施例１２．Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＬＬ２  ＩｇＧの産生
エピラツズマブ、又はｈＬＬ２  ＩｇＧは、ヒト化抗ヒトＣＤ２２  ＭＡｂである。Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＬＬ２  ＩｇＧの発現ベクターを、実施例１１に記載のようにｈＬＬ２  ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２から生成し、エレクトロポレーションによりＳｐ２／０ミエローマ細胞を形質移入するために使用した。形質移入した後、細胞を９６ウェルプレートに播種し、トランスジェニッククローンを、メトトレキサートを含有する培地中で選択した。ｈＬＬ２特異的抗イディオタイプＭＡｂでコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレートを使用し、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧで検出するサンドイッチＥＬＩＳＡにより、Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＬＬ２  ＩｇＧ生産性についてクローンをスクリーニングした。クローンをタンパク質産生用の回転ボトルで増殖させ、Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＬＬ２  ＩｇＧを、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、一段階で使用済培地から精製した。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析により、２つのタンパク質ピークが分離された（非表示）。より遅い溶出ピークの滞留時間（８．６３分）は、ｈＬＬ２  ＩｇＧに類似していた。より迅速に溶出したピークの滞留時間（７．７５分）は、約３００ｋＤａタンパク質と一致した。後に、このピークは、ジスルフィドで結合されたＣ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＬＬ２−ＩｇＧの二量体であることが判明した。この二量体は、ＤＮＬ反応中にモノマー形態に還元される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、精製されたＣ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＬＬ２−ＩｇＧが、モジュールの単量体形態及びジスルフィドで結合されたモジュールの二量体形態の両方で構成されることを示した（非表示）。これら２つの形態を表すタンパク質バンドは、非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥで明白だったが、還元条件下では、全ての形態が、成分ポリペプチド（重鎖−ＡＤ２及びカッパ鎖）を表す２つのバンドに還元された（非表示）。他の夾雑物バンドは検出されなかった。
【０１８０】
実施例１３．Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＡ２０  ＩｇＧの産生
ｈＡ２０  ＩｇＧは、ヒト化抗ヒトＣＤ２０  ＭＡｂである。Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＡ２０  ＩｇＧの発現ベクターを、実施例２７に記載のようにｈＡ２０  ＩｇＧ−ｐＤＨＬ２から生成し、エレクトロポレーションによりＳｐ２／０ミエローマ細胞を形質移入するために使用した。形質移入した後、細胞を９６ウェルプレートに播種し、トランスジェニッククローンを、メトトレキサートを含有する培地中で選択した。ｈＡ２０特異的抗イディオタイプＭＡｂでコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレートを使用し、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧで検出するサンドイッチＥＬＩＳＡにより、Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＡ２０  ＩｇＧ生産性についてクローンをスクリーニングした。クローンをタンパク質産生用の回転ボトルで増殖させ、Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＡ２０  ＩｇＧを、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、一段階で使用済培地から精製した。ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、実施例２８でＣ−Ｈ−ＡＤ２−ｈＬＬ２  ＩｇＧについて得られた結果と非常に類似した結果をもたらした。
【０１８１】
実施例１４．複数の抗体に由来するＡＤ及びＤＤＤ結合Ｆａｂ及びＩｇＧ融合タンパク質の産生
上記の実施例に記載の技術を使用して、以下のＩｇＧ又はＦａｂ融合タンパク質を構築し、ＤＮＬ構築体に組み込んだ。融合タンパク質は、親抗体の抗原結合特徴を保持し、ＤＮＬ構築体は、組み込んだ抗体又は抗体断片の抗原結合活性を示した。
【０１８２】
【表２】
0005999217.tif 000003
【０１８３】
実施例１５．インターフェロン（ＩＦＮ）−α２ｂに基づくＤＤＤモジュールの産生
哺乳動物細胞での発現用ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２の構築
ＩＦＮ−α２ｂのｃＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅して、そのＣ末端で以下の配列のポリペプチドに融合されたＩＦＮ−α２ｂを含む配列がもたらされた：
ＫＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号８８）。
【０１８４】
ＰＣＲ増幅は、全長ヒトＩＦＮα２ｂ  ｃＤＮＡクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＯＲＦヒトクローン  カタログ番号ＨＯＲＦ０１クローンＩＤ  ＩＯＨ３５２２１）をテンプレートとして使用し、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して達成した：
ＩＦＮＡ２  Ｘｂａ  Ｉ  Ｌｅｆｔ
ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＡＣＴＧＧ（配列番号８９）
ＩＦＮＡ２  ＢａｍＨＩ  ｒｉｇｈｔ
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣ（配列番号９０）
【０１８５】
ＰＣＲアンプライマーを、ｐＧｅｍＴベクターにクローニングした。ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターを、以下のようにＩＦＮ−α２ｂにライゲーションするために調製した。ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００６，  １０３：６８４１−６）ベクターをＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した。それによりＦａｂ遺伝子配列は全て除去されるが、ＤＤＤ２コード配列は後に残る。ＩＦＮ−α２ｂアンプライマーを、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩを用いてｐＧｅｍＴから切り出し、ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターにライゲーションして、発現ベクターＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２を生成した。
【０１８６】
ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２の哺乳動物細胞発現
ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２を、ＳａｌＩで消化することにより線形化し、エレクトロポレーションによりＳｐ／ＥＳＦミエローマ細胞に安定的に形質移入した。ＥＬＩＳＡにより、２つのクローンが、検出可能なレベルのＩＦＮ−α２ｂを有することを見出した。９５と称する、２つのクローンのうちの１つは、無血清培地での増殖に適しており、生産性を実質的に減少させなかった。その後そのクローンを、０．１〜０．８μＭの増加するＭＴＸ濃度で５週間にわたって増幅させた。この段階で、それを限界希釈法によりサブクローニングし、最も多く産生するサブクローン（９５−５）を増殖させた。振とうフラスコで増殖させた９５−５の生産性は、標準物質として市販のｒＩＦＮ−α２ｂ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製  ＩＦ００７、ロット０６００８０３９０８４）を使用して、２．５ｍｇ／Ｌであると推定した。
【０１８７】
回転ボトルで増殖したバッチ培養からのＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２の精製
クローン９５−５を、０．８μＭ  ＭＴＸを有する合計２０Ｌの無血清ハイブリドーマＳＦＭを含有する３４個の回転ボトルで増殖して、最終培養に到達させた。培養ブロスを処理し、ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）で以下のように精製した。上清液を遠心分離で清澄化し、０．２μＭろ過し、１×結合緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）にダイアフィルトレーションし、３１０ｍＬに濃縮し、Ｔｗｅｅｎ２０を終濃度が０．１％になるように添加し、３０ｍＬ  Ｎｉ−ＮＴＡカラムに負荷した。試料を負荷した後、カラムを、５００ｍＬの１×結合緩衝液中０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、その後２９０ｍＬの３０ｍＭイミダゾール、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５で洗浄した。産物を、１１０ｍＬの２５０ｍＭイミダゾール、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５で溶出した。およそ６ｍｇのＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２を精製した。
【０１８８】
大腸菌でのＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２の産生
また、ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２を、微生物発酵により大腸菌中の可溶性タンパク質として発現させた。ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２  ＤＮＡをテンプレートとして使用して、コード配列をＰＣＲで増幅した。アンプライマーを、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位を使用して、ｐＥＴ２６ｂ大腸菌発現ベクターにクローニングした。ＬＢ振とうフラスコを１８℃にて１２時間１００μＭのＩＰＴＧで誘導することにより、タンパク質をＢＬ２１ｐＬｙｓＳ宿主細胞で細胞内発現させた。可溶性ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２を、上述のように細胞溶解産物からＩＭＡＣで精製した。
【０１８９】
実施例１６．ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧに結合されたＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２を含むＤＮＬ結合体の産生
１つのＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧに結合された４つのコピーのＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２を含む２０−２ｂと称するＤＮＬ構築体を、各々がＳｐ／ＥＳＦで発現された２つのＤＮＬモジュール、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｖ−ｍａｂ及びＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２を組み合わせることによるＤＮＬで産生した。２０−２ｂ（ヒト化ＩｇＧ１＋４ＩＦＮα２ｂ）と設計が類似しているが、異なる標的化ＭＡｂを有する追加的なＤＮＬで生成したＭＡｂ−ＩＦＮα構築体を、幾つかの実験で対称として使用した。２２−２ｂは、そのＡＤ２モジュールとして、ＣＤ２２に対して向けられた、リンパ腫に結合するＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｅ−ｍａｂ（エピラツズマブ）を有し、７３４−２ｂは、そのＡＤ２モジュールとして、ハプテン、Ｉｎ−ＤＴＰＡに対して向けられた、動物タンパク質又は組織には一切結合しないＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈ７３４を有し、Ｒ１２ｂは、ヒトインスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に結合するＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＲ１を使用する。
【０１９０】
２０−２ｂ  ＤＮＬ構築体を以下のように製作した。選択したＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧを、およそ２モル当量のＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２と混合し、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を添加した後、混合物を穏やかな条件下で一晩室温にて還元した。酸化型グルタチオンを、２ｍＭになるように添加し、混合物を室温で更に１２〜２４時間保持した。ＤＮＬ結合体を、プロテインＡアフィニティカムにかけて精製した。２０−２ｂ、２２−２ｂ、ｈＲ１−２ｂ、及び２４３−２ｂと称する４つのそのようなＤＮＬ結合体を調製した。その各々は、それぞれＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＡ２０（ＣＤ２０に特異性を有する）、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＬＬ２（ＣＤ２２に特異性を有する）、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＲ１（ＩＧＦ−１Ｒに特異性を有する）、及びＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＬ２４３（ＨＬＡ−ＤＲに特異性を有する）に係留された４つのコピーのＩＦＮ−α２ｂを含んでいた。哺乳動物（ｍ）又は大腸菌（ｅ）で産生されたＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２から生成された２０−２ｂのＳＥ−ＨＰＬＣ分析は、各々が、ＩｇＧ及びＩＦＮ−α２群で構成される共有結合性複合体と一致する滞留時間を示す主要ピークを示した。同様のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルが、他の３つのＩＦＮ−ＩｇＧ結合体について観察された。
【０１９１】
ＩＦＮ−ＩｇＧ結合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの２０−２ｂのＩＦＮα生物活性を、細胞に基づくリポーター、ウイルス防御、及びリンパ腫増殖アッセイを使用して、市販のペグ化ＩＦＮα２作用剤、ＰＥＧＡＳＹＳ、及びＰＥＧ−イントロンのＩＦＮα生物活性と比較した。比活性は、インターフェロン刺激応答エレメントに融合されたレポーター遺伝子を保持するトランスジェニックヒト前単球細胞系を使用する、細胞に基づくキットを使用して決定した（図１Ａ〜１Ｄ）。２０−２ｂの比活性（５３００ＩＵ／ｐｍｏｌ）は、ＰＥＧＡＳＹＳ（１７０ＩＵ／ｐｍｏｌ）及びＰＥＧ−イントロン（３４００ＩＵ／ｐｍｏｌ）の両方より大きかった（図１Ａ）。２０−２ｂと同様に産生した７３４−２ｂ、１Ｒ−２ｂ、及び５つの更なるＭＡｂ−ＩＦＮα構築体（データ非表示）は、各々が同様の比活性（４０００〜８０００ＩＵ／ｐｍｏｌ）を示し、そのような構造を生成するためのＤＮＬ法の一貫性を実証した（図１Ａ）。４つのＩＦＮα２ｂ群を有することは、ＭＡｂ−ＩＦＮαの効力増強に寄与した。ＩＦＮα当量に正規化すると、比活性／ＩＦＮαは、ＰＥＧＡＳＹＳよりも約１０倍大きく、ＰＥＧ−イントロンより約２倍低いに過ぎなかった。
【０１９２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス防御アッセイでＭＡｂ−ＩＦＮα、ＰＥＧＡＳＹＳ、及びＰＥＧ−イントロンを比較することにより、ＭＡｂ−ＩＦＮαが、ＰＥＧ−イントロンと同様で、ＰＥＧＡＳＹＳよりも１０倍大きな比活性を有するＩＦＮα２ｂ抗ウイルス活性を保持することが実証された（図１Ｂ）。
【０１９３】
ＩＦＮα２ｂは、幾つかの腫瘍系に対して直接的抗増殖性又は細胞毒性効果を示すことができる。２０−２ｂの活性を、ＩＦＮαに高度に感受性であるバーキットリンパ腫細胞系（Ｄａｕｄｉ）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイで測定した（図１Ｃ）。ＩＦＮα２作用剤の各々は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤａｕｄｉを効率的（＞９０％）に阻害した（ＥＣ５０＝４〜１０ｐＭ）。しかしながら、２０−２ｂ（ＥＣ５０＝０．２５ｐＭ）は、非標的化Ｍａｂ−ＩＦＮα構築体よりも約３０倍強力だった。２０−２ｂの親抗ＣＤ２０ＭＡｂは、著しくより高い濃度（ＥＣ５０＞１０ｎＭ）で、Ｄａｕｄｉ（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：８３８４−９２）を含む多数のリンパ腫細胞系に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗増殖活性を示す。
【０１９４】
また、２０−２ｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を、ＩＦＮα及び抗ＣＤ２０の両方に対してより低い感受性を有するマントル細胞リンパ腫系であるＪｅｋｏ−１を使用して評価した（図１Ｄ）。Ｊｅｋｏ−１は、ほぼ１ｎＭのＥＣ５０で１０％最大阻害（Ｉｍａｘ）を有する親抗ＣＤ２０  ＭＡｂに対してわずかに感受性であるにすぎない。７３４−２ｂで示されたように、Ｊｅｋｏ−１（Ｉｍａｘ＝４３％；ＥＣ５０＝２３ｐＭ）は、ＩＦＮα２ｂに対してＤａｕｄｉ（Ｉｍａｘ＝９０％；ＥＣ５０＝７．５ｐＭ）ほど応答性ではない。７３４−２ｂと比較して、２０−２ｂは、Ｊｅｋｏ−１をより大きな程度に阻害し（Ｉｍａｘ＝６５％）、２相性の用量反応曲線を示した（図１Ｄ）。１０ｐＭ未満では、ＩＦＮα２ｂ活性に起因する低濃度応答が観察され、７３４−２ｂと同様にＩｍａｘ＝４３％で安定水準に達した。高濃度応答は、Ｉｍａｘが６５％に達した約１００ｐＭ超で明白であった。２０−２ｂの低濃度ＩＦＮα２ｂ応答（ＥＣ５０＝０．９７ｐＭ）は、Ｄａｕｄｉによる結果と同様に、７３４−２ｂよりも２５倍強力だった。
【０１９５】
２０−２ｂの効力増加が、ＣＤ２０及びＩＦＮαシグナル伝達の相加的／相乗的効果によるものであるかどうかを解明するために、親抗ＣＤ２０抗体及び７３４−２ｂ（ｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂ）の組み合わせを分析した。ｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂの用量応答曲線は、７３４−２ｂ単独とおおよそ類似していたが、１ｎＭを超える場合は例外であり、前者の阻害は増加したが後者の場合は増加しなかった。これらの結果は、ＭＡｂ標的化が、より低い２０−２ｂのＥＣ５０の原因であるが、そのＩｍａｘがより大きいのは、明らかにＩＦＮα２ｂ及びＣＤ−２０シグナル伝達の相加的活性によることを示唆する。ＣＤ２０シグナル伝達の効果は、２０−２ｂの高濃度応答（ＥＣ５０＝０．８５ｎＭ）でのみ明白であった。これは、ｖ−ｍａｂに対する応答（ＥＣ５０＝１．５ｎＭ）と同様である。ｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂの場合、２相性の用量反応曲線は、２つの応答が重複するため明白ではなかった。しかしながら、相加的効果は、１ｎＭを超える濃度で明白だった。２０−２ｂのＩｍａｘ（６５％）は、ＩＦＮα２ｂ（Ｉｍａｘ＝４３％）及びｖ−ｍａｂ（Ｉｍａｘ＝１０％）を加算した応答よりも大きく、ＩＦＮα２ｂ及びｖ−ｍａｂの作用間に相乗性がある可能性を示唆した。
【０１９６】
ＡＤＣＣ活性
ＩＦＮαは、ＮＫ細胞及びマクロファージを活性化することにより、抗ＣＤ２０免疫療法の基本的作用機構（ＭＯＡ）であるＡＤＣＣ活性を強化することができる。本発明者らは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用して、２０−２ｂ及びｖ−ｍａｂのＡＤＣＣを２つのＮＨＬ細胞系で比較した。複数の供与者に由来するＰＢＭＣを使用した重複アッセイは、Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ細胞の両方について示されたように、ｖ−ｍａｂと比較して、２０−２ｂがＡＤＣＣを増強したことを一貫して実証した（図３Ａ）。この効果は、わずかなＡＤＣＣを示す（Ｃａｒｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４：１３３１−４１）、抗ＣＤ２２  ＭＡｂ、エピラツズマブを含むＭＡｂ−ＩＦＮαである２２−２ｂでも示された。
【０１９７】
ＣＤＣ活性
ＣＤＣは、Ｉ型の抗ＣＤ２０  ＭＡｂ（ｖ−ｍａｂ及びリツキシマブを含む）の重要なＭＯＡであると考えられている。しかしながら、この機能は、トシツモマブにより代表されるＩＩ型のＭＡｂには欠如しており（Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５１：１５−２４）、にもかかわらず、それは抗リンパ腫活性を有する。ｖ−ｍａｂとは異なり、２０−２ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤＣ活性を示さない（図３Ｂ）。これらの結果は、補体結合が恐らくは立体障害により明らかに損なわれるＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｖ−ｍａｂモジュールに基づく他のＤＮＬ構造の結果と一致している。
【０１９８】
実施例１７．２０−２ｂの薬物動態学的（ＰＫ）分析
２０−２ｂの薬物動態学的（ＰＫ）特性を、雄Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスで評価し、ＰＥＧＡＳＹＳ、ＰＥＧ−イントロン、及びα２ｂ−４１３（ＤＮＬにより製作されたペグ化ＩＦＮ、米国特許出願第１１／９２５，４０８号を参照）の薬物動態学的特性と比較した。種々の時点における血清試料中のＩＦＮ−αの濃度を、ＥＬＩＳＡで決定した。ＩＦＮα２ｂ比活性を、製造業者（ＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ社）の示唆するプロトコールに従って、ｉＬｉｔｅヒトインターフェロンアルファ細胞ベースアッセイキットを使用して決定した。図２は、他の作用剤と比較して、２０−２ｂの著しくより遅い除去及びより長い血清残留を示したＰＫ分析の結果を示す。２１０ｐｍｏｌの注射用量では、時間で計算された薬物動態学的血清半減期は、８．０時間（２０−２ｂ）、５．７時間（α２ｂ−４１３）、４．７時間（ＰＥＧＡＳＹＳ）、及び２．６時間（ＰＥＧ−イントロン）だった。除去速度（１／時間）は、０．０８７（２０−２ｂ）、０．１２１（α２ｂ−４１３）、０．１４９（ＰＥＧＡＳＹＳ）、及び０．２６５（ＰＥＧ−イントロン）だった。計算されたＭＲＴ０．０８→∞（時間）は、２２．２（２０−２ｂ）、１２．５（α２ｂ−４１３）、１０．７（ＰＥＧＡＳＹＳ）、及び６．０（ＰＥＧ−イントロン）だった。薬物動態パラメーターは、個々の抗体又はサイトカインよりも複合体の性質により決定されるため、サイトカイン−ＤＮＬ複合体のＰＫ特徴は、他のサイトカイン部分及び抗体部分に一般化され、上記で考察された特定の２０−２ｂ構築体に限定されないことが予想される。
【０１９９】
実施例１８．２０−２ｂのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
血清安定性
２０−２ｂは、３７℃のヒト血清（１０日以上）又は全血（６日以上）中で安定していた（非表示）。２０−２ｂ複合体の濃度は、二重特異性ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した。アッセイ期間にわたって、全血又は血清のいずれかにおいても血清２０−２ｂレベルに検出可能な変化は本質的に存在しなかった。
【０２００】
ヒト全血由来のリンパ腫細胞に対する２０−２ｂのｅｘ  ｖｉｖｏ効能
本発明者らは、全血由来のリンパ腫又は正常Ｂ細胞を除去する、２０−２ｂ、ｖ−ｍａｂ、７３４−２ｂ、又はｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂの能力をｅｘ  ｖｉｖｏの設定で比較した（図４）。ネイクド抗ＣＤ２０  ＭＡｂの治療効能は、３つの作用機序（ＭＯＡ）：シグナル伝達誘導性アポトーシス又は増殖停止、ＡＤＣＣ、及びＣＤＣにより達成されると考えられている（Ｇｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４：３８２３−３７）。このアッセイでは、ｖ−ｍａｂは、３つのＭＯＡを全て使用することができるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの知見に基づくと、２０−２ｂは、シグナル伝達及びＡＤＣＣ増強を活用できる可能性はあるが、ＣＤＣを活用できない。この短期のモデルでは、２０−２ｂ及び７３４−２ｂのＩＦＮα２ｂ群は、腫瘍細胞に直接的に作用し、ｖ−ｍａｂのＡＤＣＣ活性を増大させ、恐らくは幾つかの免疫賦活性効果を示すことができる。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じる可能性がある、先天性免疫系及び適応免疫系のＩＦＮα−媒介性活性化の完全な範囲は、この２日間のｅｘ  ｖｉｖｏアッセイでは理解されない。
【０２０１】
０．０１ｎＭでは、２０−２ｂが、ｖ−ｍａｂ（２２．８％）、７３４−２ｂ（３８．６％）、又はｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂ（４１．７％）よりも著しく多くのＤａｕｄｉ細胞を枯渇させた（６０．５％）（図４）。０．１ｎＭでは、２０−２ｂ及びｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂが、Ｄａｕｄｉを同程度に枯渇させ（８８．９％）、それは、ｖ−ｍａｂ（８２．４％）又は７３４−２ｂ（４０．７％）よりも多かった（図４）。１ｎＭでは、各作用剤は、７３４−２ｂ（５５．７％）を除いて、９５％を超えるＤａｕｄｉを枯渇させた（図４）。示されている違いの各々は、統計的に有意だった（Ｐ＜０．０１）。
【０２０２】
Ｒａｍｏｓは、ＩＦＮα２ｂ及びｖ−ｍａｂの両方に対してＤａｕｄｉほど感受性ではない。７３４−２ｂの効果は、わずかであるに過ぎず、各濃度において２０％未満のＲａｍｏｓの枯渇がもたらされた（図４）。０．０１及び０．１ｎＭの両方で、２０−２ｂは、ｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂよりも多くのＲａｍｏｓを枯渇させ、それは、次いではｖ−ｍａｂよりも多くの細胞を除去した（図４）。１ｎＭでは、７３４−２ｂ以外の全ての処理が、同様にＲａｍｏｓの枯渇（７５％）をもたらした（図４）。示されている違いの各々は、統計的に有意だった（Ｐ＜０．０２）。
【０２０３】
７３４−２ｂで実証されたように、ＩＦＮα２ｂ単独は、このアッセイで正常Ｂ細胞を枯渇させない。これらの低濃度では、２０−２ｂ、ｖ−ｍａｂ、及びｖ−ｍａｂ＋７３４−２ｂは各々、Ｄａｕｄｉ又はＲａｍｏｓのいずれの枯渇よりも著しく少ない、類似したＢ細胞の用量応答性枯渇を示す。どの処理も、Ｔ細胞の著しい枯渇を引き起こさなかった（データ非表示）。
【０２０４】
ＳＣＩＤマウスにおける２０−２ｂのｉｎ  ｖｉｖｏ効能
マウスモデルの制限は、ヒトＩＦＮα２ｂに対するマウス細胞の感受性が非常に低いことである。ヒトで達成される可能性がある２０−２ｂの全体的な治療上の利点は、先天性免疫及び適応免疫の両方の増強を伴う場合がある。これらの制限を念頭において、本発明者らは、ＳＣＩＤマウスにおける播種性バーキットリンパ腫モデルに対する２０−２ｂの抗リンパ腫ｉｎ  ｖｉｖｏ効能を研究した。本発明者らは、最初に、高度に感受性の初期Ｄａｕｄｉモデルを試験した（図５Ａ）。接種の１日後に、単回低用量の２０−２ｂ、ｖ−ｍａｂ、又は７３４−２ｂを群に投与した。０．７ｐｍｏｌ（１７０ｎｇ）のｖ−ｍａｂ又は７３４−２ｂの単回投与は、ｖ−ｍａｂの代わりの生理食塩水と比較して、生存の有意な向上をもたらしたが（Ｐ＜０．０００１）、無関係のＭＡｂ−ＩＦＮα対照、７３４−２ｂの代わりの生理食塩水との比較では向上をもたらさなかった（図５Ａ）。この向上は、わずかであり、生存期間中央値（ＭＳＴ）は、生理食塩水の場合の２７日からｖ−ｍａｂの場合の３４日に増加した。しかしながら、０．７ｐｍｏｌ（１７０ｎｇ）の２０−２ｂの単回投与は、生理食塩水及びｖ−ｍａｂ群の両方よりも１００日を超えてＭＳＴを向上させた（Ｐ＜０．０００１）（図５Ａ）。この研究は１９週後に終了し、その時点で、０．７ｐｍｏｌの２０−２ｂ治療群の７匹の長期生存動物（ＬＴＳ）を剖検して、目に見える疾患の痕跡が無い（治癒した）ことを見出した（図５Ａ）。驚くべきことに、０．０７ｐｍｏｌ（１７ｎｇ）という低用量の２０−２ｂでさえ、ＭＳＴは２倍を超えた（図５Ａ）。
【０２０５】
次に、本発明者らは、治療の前に実質的により大きな腫瘍量をマウスに発生させたより挑戦的な進行Ｄａｕｄｉモデルにおいて、２０−２ｂの効能を評価した（図５Ｂ）。腫瘍を接種した７日後に、単回低用量の２０−２ｂ、ｖ−ｍａｂ、７３４−２ｂ、又はＰＥＧＡＳＹＳ（０．７、７．０、又は７０ｐｍｏｌ）を群に投与した。生理食塩水対照マウスのＭＳＴは、２１日だった（図５Ｂ）。その各々がＰｋを増強するが（組換えＩＦＮα２ｂと比較して）、腫瘍を標的としない最大用量のＰＥＧＡＳＹＳ又は７３４−２ｂ（７０ｐｍｏｌ）は、ＭＳＴを２倍にした（４２日；Ｐ＜０．０００１）（図５Ｂ）。１００倍低い用量（０．７ｐｍｏｌ）の２０−２ｂによる治療は、最大用量（７０ｐｍｏｌ）のＰＥＧＡＳＹＳ又は７３４−２ｂのいずれかと同様の結果（３８．５日）をもたらした（図５Ｂ）。１０倍低い用量（７ｐｍｏｌ）の２０−２ｂによる治療は、７０ｐｍｏｌのＰＥＧＡＳＹＳ又は７３４−２ｂによる治療より著しく向上した生存（８０．５日、２０％ＬＴＳ）をもたらした（Ｐ＜０．００１２）（図５Ｂ）。試験した最大用量（７０ｐｍｏｌ）では、２０−２ｂは、ＭＳＴを１０５日を超えて向上させ、ＬＴＳは１００％だった（図５Ｂ）。本発明者らは、ｖ−ｍａｂが、比較的低い用量（３．５ｐｍｏｌ）でＤａｕｄｉ保持マウスの生存を増加させることができ、より高い用量はＬＴＳをもたらすことを、初期腫瘍モデルで以前に実証した。しかしながら、この進行腫瘍モデルでは、７０ｐｍｏｌのｖ−ｍａｂの単回投与は、生存に対してわずかである過ぎないが有意である効果を示した（ＭＳＴ＝２４日、Ｐ＝０．０００１）（図５Ｂ）。
【０２０６】
本発明者らは、その後、ＩＦＮαによる直接的阻害がＤａｕｄｉほど感受性でなく、ｖ−ｍａｂによる免疫療法にそれほど応答しない、より挑戦的なモデルで２０−２ｂをアッセイした。Ｒａｊｉは、Ｄａｕｄｉと比較して、ＩＦＮα２ｂの直接作用に対して感受性が約１０００倍低い。しかしながら、Ｒａｊｉは、Ｄａｕｄｉと同様のＣＤ２０抗原密度を有し（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｂｌｏｏｄ  １０８：２７３６−４４）、Ｄａｕｄｉより著しく少ないとはいえ、ｖ−ｍａｂに応答する（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｂｌｏｏｄ  １１３，  １０６２−７０）。２０−２ｂの効能を、腫瘍を接種した５日後に開始した治療により、進行Ｒａｊｉモデルで研究した（図６Ａ）。群には、２週間にわたって合計６回の注射（各々２５０ｐｍｏｌ）を投与した。７３４−２ｂは、生理食塩水より生存を向上させず（ＭＳＴ＝１６日）、ＩＦＮαに対するＲａｊｉの非感受性と一致した（図６Ａ）。Ｖ−ｍａｂは、生理食塩水より生存を有意に向上させた（ＭＳＴ＝２６日、Ｐ＜０．０００１）（図６Ａ）。２０−２ｂは、他の全ての治療より優れていた（ＭＳＴ＝３３日、Ｐ＜０．０００１）（図６Ａ）。
【０２０７】
最後に、本発明者らは、ＩＦＮαの直接的作用に対する感受性が低く、Ｄａｕｄｉ又はＲａｊｉと比較してＣＤ２０抗原密度が約２５倍低く、抗ＣＤ２０免疫療法に耐性であると考えられているヒトリンパ腫であるＮＡＭＡＬＷＡを用いて２０−２ｂの効能を研究した（図６Ｂ）。群には、合計６用量の２０−２ｂ又は７３４−２ｂのいずれかを（各々２５０ｐｍｏｌ）投与した。別の群には、合計７用量のｖ−ｍａｂ（各々３．５ｎｍｏｌ）を投与した。生理食塩水で治療した群は、１７日のＭＳＴを示した（図６Ｂ）。７３４−２ｂによる治療は、非常にわずかではあるが有意な生存の向上を示した（ＭＳＴ＝２０日、Ｐ＝０．００１２）（図６Ｂ）。２０−２ｂ（ＭＳＴ＝３４日）は、１４倍高い用量で投与された７３４−２ｂ（Ｐ＝０．０００４）並びにｖ−ｍａｂより優れていた（ＭＳＴ＝２４日、Ｐ＝０．００２６）（図６Ｂ）。
【０２０８】
結論
これらの結果は、抗ＣＤ２０  ＭＡｂでＩＦＮαを標的化することにより、免疫サイトカインが、いずれか一方の作用剤単独又は組み合わせよりも強力で効果的になることを疑いの余地無く実証する。腫瘍に対するＩＦＮαのＭＡｂ標的化は、単一作用剤の投与スケジュールをより低頻度にし、ＩＦＮ治療に伴う副作用を低減又は排除し、効能の顕著な増強をもたらすことができる可能性がある。加えて、標的とされたＩＦＮαは、急性腫瘍に向けられる免疫応答を誘導し、恐らくは先天性免疫及び適応免疫の多面的刺激により免疫記憶を誘起することができる（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １２：１１９−３４）。他のグループは、そのような構築体の潜在的な臨床利益の幾つかを明らかにした化学的結合により製作されたＭＡｂ−ＩＦＮαを生成している（Ｐｅｌｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  １５：２１０−１６；Ｏｚｚｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ４８：１３５−４７）。マウスＩＦＮα及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＭＡｂを含む組換えＭＡｂ−ＩＦＮαは、免疫応答性マウスにおいて、トランスジェニック（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）マウスＢ細胞リンパ腫の強力な阻害を示し、免疫記憶による防御的適応免疫応答を誘導することもできた（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９：６８８１−８８）。
【０２０９】
本発明者らは、２０−２ｂによる治療が、ＮＫ、Ｔ４、Ｔ８、及び樹状細胞を含む多くの免疫細胞の局所的な動員及び活性化を刺激して、細胞毒性及びＡＤＣＣの増強をもたらし、腫瘍に向けられる免疫記憶を潜在的に誘導することができることを予想する。しかしながら、マウス細胞は、ヒト細胞よりもヒトＩＦＮα２ｂに対する感受性が非常に低い（約４ｌｏｇ）（Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ  ３：４２５−３５；  Ｗｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ５７：２３３−３７）。従って、上述のｉｎ  ｖｉｖｏ研究におけるマウスモデルでは、２０−２ｂの抗リンパ腫活性は、マウス免疫応答のＩＦＮα２ｂ活性化に、もしあったとしてもごくわずかしか寄与することができない。むしろ、死滅は、主にリンパ腫細胞に対するＩＦＮα２ｂの直接的作用による。
【０２１０】
本発明者らは、２０−２ｂが、抗ＣＤ２０免疫療法の最も重要なＭＯＡであり得るＡＤＣＣを増大させたことを示した。しかしながら、ヒトＩＦＮα２ｂは、マウス宿主の免疫エフェクター細胞の非常に弱い刺激因子に過ぎず、ＩＦＮα増強性ＡＤＣＣは、恐らくは、それがヒトで実現するようには実現しない。これらの制限があったとしても、ｉｎ  ｖｉｖｏでの結果は、２０−２ｂが非常に有効な抗リンパ腫薬であり得ることを実証しており、ＩＦＮα感受性Ｄａｕｄｉモデルにおいてｖ−ｍａｂ又は非標的化ＭＡｂ−ＩＦＮαの１００倍を超える効力を示す。ＩＦＮαの直接的作用に対して比較的非感受性であるか（Ｒａｊｉ／ＮＡＭＡＬＷＡ）、又は抗ＣＤ２０免疫療法に耐性のある（ＮＡＭＡＬＷＡ）リンパ腫モデルを用いてでさえ、２０−２ｂは、ｖ−ｍａｂ又は非標的化ＭＡｂ−ＩＦＮαよりも優れた効能を示した。
【０２１１】
ＩＦＮα２ｂをｖ−ｍａｂに融合させることにより、そのｉｎ  ｖｉｖｏ効力が増加し、循環時間が延長され、腫瘍標的化が可能になる。Ｐｋの治療有意性は、Ｄａｕｄｉモデルで実証され、そこでは、遅延除去ＰＥＧＡＳＹＳは、より高い比活性を示す迅速除去ＰＥＧ−イントロンよりも優れていた（データ非表示）。２０−２ｂは、ＰＥＧＡＳＹＳ又は７３４−２ｂのいずれかよりも著しく強力であり、抗ＣＤ２０  ＭＡｂによるリンパ腫標的化が、その優れた効力及び効能に重要であることを示唆した。驚くべきことに、標的化の影響は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてでさえ明白だった。シグナル伝達によりリンパ腫阻害を可能にしたに過ぎないｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖実験では、２０−２ｂは、単独又はｖ−ｍａｂとの組み合わせのいずれかである非標的化ＭＡｂ−ＩＦＮαと比較して、２５倍低い濃度で活性を示した。ｅｘ  ｖｉｖｏの設定では、抗ＣＤ２０の３つのＭＯＡ全てを関与させることが可能である。ＣＤＣ活性がない場合でさえ、２０−２ｂは、単独又はｖ−ｍａｂとの組み合わせのいずれかであるＩＦＮα又はｖ−ｍａｂよりも、血液からのリンパ腫の枯渇により有効だった。ＭＡｂ、エフェクター、及び標的細胞は全て、実験の全体にわたって限局されているため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏ研究におけるＭＡｂ標的化の影響は、いささか驚くべきものである。本発明者らは、２０−２ｂが、ヒト患者のｉｎ  ｖｉｖｏで実質的により大きな影響を示すだろうと予想する。
【０２１２】
２０−２ｂのＩＦＮα２ｂ及びｖ−ｍａｂ成分は、明らかに相加的又は相乗的に作用して、その増強された効力に寄与することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイでは、少なくとも相加的な効果が示唆され、それは、ｖ−ｍａｂ及び７３４−２ｂの組み合わせが、いずれか一方の作用剤単独より優れていたというｅｘ  ｖｉｖｏ研究の結果で確立された。これは、２０−２ｂの一部としての又は７３４−２ｂと組み合わせた場合のｖ−ｍａｂのＡＤＣＣ活性増加によりｅｘ  ｖｉｖｏで達成することができるが、ＡＤＣＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイでは機能せず、更なる機序があることを示唆している。ｖ−ｍａｂと結合したＣＤ２０により伝達されるシグナルは、ＩＦＮαシグナルを増強し、効力の増強をもたらすことができる。或いは、ゆっくりと内部移行するＭＡｂであるｖ−ｍａｂの結合は、Ｉ型のＩＦＮ受容体の内部移行／下方制御を防止し、より長期にわたる有効なＩＦＮα−誘導性シグナルをもたらすことができる。
【０２１３】
実施例１９．エリスロポイエチン（ＥＰＯ、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｉｔｉｎ）に基づくＤＤＤモジュールの産生
哺乳動物細胞での発現用ＥＰＯ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２の構築
ＥＰＯのｃＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅し、そのＣ末端で、以下のもので構成されるポリペプチドに融合されたＥＰＯがもたらされた：
ＫＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号８８）
【０２１４】
ＰＣＲ増幅は、全長ヒトＥＰＯ  ｃＤＮＡクローンをテンプレートとして使用し、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して達成された：
ＥＰＯ  Ｘｂａ  Ｉ  ｌｅｆｔ
ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＴＣＣ（配列番号９１）
ＥＰＯ  ＢａｍＨＩ  Ｒｉｇｈｔ
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧ（配列番号９２）
【０２１５】
ＰＣＲアンプライマーを、ｐＧｅｍＴベクターにクローニングした。ＥＰＯをライゲーションするためのＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターを、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することにより調製した。ＥＰＯアンプライマーを、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩを用いてｐＧｅｍＴから切り出し、ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターにライゲーションして、発現ベクターＥＰＯ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２を生成した。
【０２１６】
ＥＰＯ−ＤＤＤ２の哺乳動物細胞発現
ＥＰＯ−ｐｄＨＬ２を、ＳａｌＩ酵素で消化することにより線形化し、エレクトロポレーションによりＳｐ／ＥＳＦミエローマ細胞に安定的に形質移入した。クローンを、０．１５μＭ  ＭＴＸを含有する培地で選択した。クローン番号４１、４９、及び３７は各々、Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒニッケルキレートプレートを使用してＨｉｓタグ融合タンパク質を捕捉し、抗ＥＰＯ抗体で検出するＥＬＩＳＡにより、約０．５ｍｇ／ＬのＥＰＯを産生することが示された。およそ２．５ｍｇのＥＰＯ−ＤＤＤ２を、９．６リットルの無血清回転ボトル培養からＩＭＡＣで精製した。
【０２１７】
実施例２０．  ７３４−ＥＰＯ、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈ７３４に結合された４つのＥＰＯ−ＤＤＤ２部分を含むＤＮＬ結合体の産生
７３４−ＥＰＯを、２０−２ｂについて上述したように産生した。プロテインＡで精製した７３４−ＥＰＯのＳＥ−ＨＰＬＣ分析は、主要ピーク及びより高い分子サイズのショルダー部分を示した（非表示）。主要ピークの滞留時間は、ＩｇＧ及び４つのＥＰＯ群で構成される共有結合性複合体と一致した。ショルダー部分は、ＩｇＧ−ＥＰＯ結合体の非共有結合性二量体による可能性が高い。クマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び抗ＥＰＯ免疫ブロット分析は、非還元条件下では、産物が２６０ｋＤａを超えるＭｒを有し（非表示）、約３１０ｋＤａの推定ＭＷと一致したことを示した。還元条件下では、７３４−ＥＰＯの３つの成分ポリペプチド（ＥＰＯ−ＤＤＤ２、重鎖−ＡＤ２、及び軽鎖）に対応するバンドが明白であり、量的に同様であると考えられた（非表示）。非産物夾雑物は検出されなかった。
【０２１８】
組換えヒトＥＰＯ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を陽性対照として使用して、ＥＰＯ応答性ＴＦ１細胞の増殖を刺激するそれらの能力（ＡＴＣＣ）について、ＥＰＯ−ＤＤＤ２及び７３４−ＥＰＯをアッセイした。ＴＦ１細胞を、１×１０４細胞／ウェルを含有する９６ウェルプレート中の、２０％ＦＢＳで補完されているがＧＭ−ＣＳＦで補完されていないＲＰＭＩ  １６４０培地で増幅させた。ＥＰＯ構築体の濃度（単位／ｍｌ）は、市販のキット（ヒトエリスロポエチンＥＬＩＳＡキット、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、カタログ番号０１６３０）を使用して決定した。細胞を、９００Ｕ／ｍｌ〜０．００１Ｕ／ｍｌの範囲の濃度のｒｈＥＰＯ、ＥＰＯ−ＤＤＤ２、又は７３４−ＥＰＯの存在下で７２時間培養した。２０μｌのＭＴＳ試薬／ウェルを使用して６時間インキュベートした後で、９６ウェルプレートリーダーでＯＤ４９０を測定したＭＴＳアッセイで、生細胞密度を比較した。用量反応曲線及びＥＣ５０値は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して生成した（図７）。ＥＰＯ−ＤＤＤ２及び７３４−ＥＰＯは両方とも、ｒｈＥＰＯのおよそ１０％だったｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を示した。
【０２１９】
実施例２１．果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に基づくＤＤＤモジュールの生成
哺乳動物細胞での発現用Ｇ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２の構築
Ｇ−ＣＳＦのｃＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅し、そのＣ末端で、配列番号８８で構成されるポリペプチドに融合されたＧ−ＣＳＦがもたらされた。ＰＣＲ増幅は、全長ヒトＧ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＩＭＡＧＥ  ヒト  カタログ番号９７００２ＲＧ  クローンＩＤ５７５９０２２）をテンプレートとして使用し、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して達成された：
Ｇ−ＣＳＦ  ＸｂａＩ  Ｌｅｆｔ
ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧ（配列番号９３）
Ｇ−ＣＳＦ  ＢａｍＨＩ−Ｒｉｇｈｔ
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧ（配列番号９４）。
【０２２０】
ＰＣＲアンプライマーを、ｐＧｅｍＴベクターにクローニングした。Ｇ−ＣＳＦをライゲーションするためのＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターを、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することにより調製した。Ｇ−ＣＳＦアンプライマーを、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩを用いてｐＧｅｍＴから切り出し、ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターにライゲーションして、発現ベクターＧ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２を生成した。
【０２２１】
Ｇ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２の哺乳動物細胞発現
Ｇ−ＣＳＦ−ｐｄＨＬ２を、ＳａｌＩ酵素で消化することにより線形化し、エレクトロポレーションによりＳｐ／ＥＳＦミエローマ細胞に安定的に形質移入した。クローンを、０．１５μＭ  ＭＴＸを含有する培地で選択した。クローン番号４は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより、０．１５ｍｇ／ＬのＧ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２を産生することが示された。
【０２２２】
回転ボトルで増殖されたバッチ培養からのＧ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２の精製
クローン番号４を、０．４μＭ  ＭＴＸを有する合計２０ＬのハイブリドーマＳＦＭを含有する３４個の回転ボトルで増殖して、最終培養に到達させた。上清液を遠心分離で清澄化し、ろ過し（０．２μＭ）、１×結合緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）にダイアフィルトレーションし、濃縮した。濃縮物をＩＭＡＣで精製した。
【０２２３】
大腸菌でのＧ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２の構築及び発現
また、Ｇ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２を、微生物発酵により大腸菌中の可溶性タンパク質として発現させた。Ｇ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２  ＤＮＡをテンプレートとして使用して、コード配列をＰＣＲで増幅した。アンプライマーを、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位を使用して、ｐＥＴ２６ｂ大腸菌発現ベクターにクローニングした。ＬＢ振とうフラスコを１８℃にて１２時間１００μＭのＩＰＴＧで誘導することにより、タンパク質をＢＬ２１ｐＬｙｓＳ宿主細胞で細胞内発現させた。可溶性Ｇ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２を、細胞溶解産物からＩＭＡＣで精製した。
【０２２４】
大腸菌でのＮ−ＤＤＤ２−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）の構築及び発現
代替的Ｇ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２モジュールを、１７位の非対形成システイン残基がセリンに置換されていることにより野生型と異なるＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）のＮ末端にＤＤＤ２配列及びペプチドスペーサーを融合させることにより製作した。Ｎ−ＤＤＤ２−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）を、大腸菌で発現させ、ＩＭＡＣで精製した。
【０２２５】
実施例２２．ｈＲ１−１７Ｓ、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＲ１に結合された４つのＮ−ＤＤＤ２−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）部分を含むＤＮＬ結合体の生成
酸化還元条件下でＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｈＲ１を過剰Ｎ−ＤＤＤ２−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）と混合し、その後プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製することにより、ｈＲ１−１７Ｓを産生した。プロテインＡで精製したｈＲ１−１７ＳのＳＥ−ＨＰＬＣ分析は、主要ピーク及びより高い分子サイズのショルダー部分を示した（非表示）。主要ピークの滞留時間は、ＩｇＧ及び４つのＧ−ＣＳＦ群で構成される共有結合性複合体と一致した。ショルダー部分は、ＩｇＧ−Ｇ−ＣＳＦ結合体の非共有結合性二量体による可能性が高い。クマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び抗Ｇ−ＣＳＦ免疫ブロット分析は、非還元条件下では、産物が約２６０ｋＤａの還元ＭＷと一致したＭｒを有することを示した。還元条件下では、ｈＲ１−１７Ｓの３つの成分ポリペプチド（Ｎ−ＤＤＤ２−Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ｓ）、重鎖−ＡＤ２、及び軽鎖）を表すバンドが検出された（非表示）。
【０２２６】
実施例２３．２つの異なる抗体部分及びサイトカインを含むＤＮＬ構築体の産生及び使用
上記で考察したように、ヒト化抗ＣＤ２０  ｍＡｂであるベルツズマブに共有結合で結合された四量体ＩＦＮ−α２ｂを含むようにドック−アンド−ロック（ＤＮＬ）法により生成された単一特異性免疫サイトカインである２０−２ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びヒトリンパ腫異種移植片において非常に強力な抗腫瘍活性を示した。しかしながら、ＣＤ２０をほとんど又は全く発現しないリンパ腫及び白血病は、２０−２ｂによる治療に耐性であることが予想される。ＨＬＡ−ＤＲは、多くの造血器腫瘍及び幾つかの固形癌で発現される。ＣＤ２０及びＨＬＡ−ＤＲの両方に対してＩＦＮ−αを標的化することができる二重特異性免疫サイトカインは、ＣＤ２０、ＨＬＡ−ＤＲ、又はその両方を発現するものを含む幅広く多様な造血器悪性疾患に対するより有効な治療薬であり得る。多機能性複合体の各成分（ベルツズマブ、抗ＨＬＡ−ＤＲ  Ｆ（ａｂ）２、及びＩＦＮ−α２ｂ）は、独立して抗腫瘍活性を有するため、本発明者らは、二重特異性免疫サイトカインが、潜在的に、単一特異性免疫サイトカイン、２０−２ｂよりも更により強力であり得るか否かを評価した。
【０２２７】
本発明者らは、本明細書において、２つのコピーのＩＦＮ−α２ｂ、及びベルツズマブ（ヒト化抗ＣＤ２０）に部位特異的に結合されたｈＬ２４３（ヒト化抗−ＨＬＡ−ＤＲ；ＩＭＭＵ−１１４）の安定化Ｆ（ａｂ）２を含む、２０−Ｃ２−２ｂと称する最初の二重特異性ＭＡｂ−ＩＦＮαの生成及び特徴付けを報告する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、２０−Ｃ２−２ｂは、４種のリンパ腫及び８種の骨髄腫細胞系の各々を阻害し、１つの（ＨＬＡ−ＤＲ−／ＣＤ２０−）骨髄腫系以外の全てで、単一特異性ＣＤ２０標的化ＭＡｂ−ＩＦＮα、又は親抗体及びＩＦＮαを含む混合物よりも有効であり、２０−Ｃ２−２ｂが、種々の造血器悪性疾患の治療に有用であるはずであることを示唆した。２０−Ｃ２−２ｂは、ＫＭＳ１２−ＢＭ（ＣＤ２０＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋骨髄腫）に対して、ＨＬＡ−ＤＲ又はＣＤ２０のみを標的とする単一特異性ＭＡｂ−ＩＦＮαよりも大きな細胞毒性を示し、２０−Ｃ２−２ｂの３つの成分が全て毒性に寄与することができることを示した。本発明者らの知見は、ＭＡｂ−ＩＦＮαに対する所与の細胞の応答性が、ＩＦＮα及び特異的抗体に対するその感受性、並びに標的とされた抗原の発現及び密度に依存することを示している。
【０２２８】
２０−Ｃ２−２ｂは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示すが、ＣＤＣを示さず、ＣＤ２０及びＨＬＡ−ＤＲの両方を標的とすることができるため、どちらか一方又は両方の抗原を発現する広範な造血器癌の治療に有用である。二重特異性免疫サイトカインは、現行の治療投薬計画に耐性であり、ＣＤ２０を発現すると報告されている骨髄腫に関連する推定癌幹細胞の除去に特に有効であると考えられる。
【０２２９】
物質及び方法
抗体及び細胞培養。以下の考察で使用される略語は以下の通りである：２０（ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｖ−ｍａｂ、抗ＣＤ２０  ＩｇＧ  ＤＮＬモジュール）；Ｃ２（ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＬ２４３、抗ＨＬＡ−ＤＲ  Ｆａｂ２  ＤＮＬモジュール）；２ｂ（二量体ＩＦＮα２Ｂ−ＤＤＤ２  ＤＮＬモジュール）；７３４（非標的化対照として使用される抗ｉｎ−ＤＴＰＡ  ＩｇＧ  ＤＮＬモジュール）。以下のＭＡｂは、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．社から提供された：ベルツズマブ又はｖ−ｍａｂ（抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１）、ｈＬ２４３γ４ｐ（Ｉｍｍｕ−１１４、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＩｇＧ４）、マウス抗ＩＦＮα  ＭＡｂ、及びｖ−ｍａｂ（ＷＲ２）及びｈＬ２４３（ＷＴ）に対するラット抗イディオタイプＭＡｂ。加熱不活性化ＦＢＳは、Ｈｙｃｌｏｎｅ社（ローガン、ユタ州）から得た。他の細胞培養培地及び補完剤は全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カールズバッド、カリフォルニア州）から購入した。
【０２３０】
Ｓｐ／ＥＳＦ細胞、優れた増殖特性を有するＳｐ２／０に由来する細胞系を、ハイブリドーマ無血清培地で維持した。ＮＨＬ及びＭＭ細胞を、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを有するＲＰＭＩ  １６４０培地で増殖させた。Ｄａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、Ｊｅｋｏ−１、ＮＣＩ−Ｈ９２９、及びＵ２６６ヒトリンパ腫細胞系は、ＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア州）から購入した。ＭＭ細胞系の供給源は、以下の通りである：ＫＭＳ１１、ＫＭＳ１２−ＰＥ、及びＫＭＳ１２−ＢＭは、Ｔａｋｅｍｉ  Ｏｔｓｕｋｉ博士から（川崎医科大学、岡山、日本）；ＣＡＧ、ＯＰＭ−６、及びＭＭ．１Ｒは、それぞれＪｏｓｈｕａ  Ｅｐｓｔｅｉｎ博士（アーカンソー大学、リトルロック、アラスカ州）、Ｋｅｎｊｉ  Ｏｒｉｔａｎｉ博士（大阪大学、大阪、日本）、及びＳｔｅｖｅｎ  Ｒｏｓｅｎ博士（ノースウェスタン大学、シカゴ、イリノイ州）からである。細胞系は全て供給者により確認されており、それらの使用の６か月以内に取得され、継代は５０回未満だった。本発明者らは、細胞系を再確認しなかった。
【０２３１】
ＤＮＬ構築体。単一特異性ＭＡｂ−ＩＦＮα（２０−２ｂ−２ｂ、７３４−２ｂ−２ｂ、及びＣ２−２ｂ−２ｂ）及び二重特異性ＨｅｘＡｂ（２０−Ｃ２−Ｃ２）を、上記の実施例に記載のようにＤＮＬ法を使用して、ＩｇＧ−ＡＤ２モジュールをＤＤＤ２モジュールと組み合わせることにより生成した。四量体のＩＦＮα２ｂ及びＭＡｂ  ｈ７３４［抗インジウム−ＤＴＰＡ  ＩｇＧ１］を含む７３４−２ｂ−２ｂを、非標的化対照ＭＡｂ−ＩＦＮαとして使用した。
【０２３２】
哺乳動物発現ベクターの構築、並びにその後の産生クローンの生成及びＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｖ−ｍａｂの精製は、上記の実施例に開示されている。発現された組換え融合タンパク質は、長さが１５個アミノ酸の可撓性リンカーペプチドを介して、ｖ−ｍａｂのＣＨ３ドメインのカルボキシル末端に結合されたＡＤ２ペプチドを有する。重鎖−ＡＤ２及び軽鎖ポリペプチドを同時発現させることにより、２つのＡＤ２ペプチドを備えるＩｇＧ構造の形成がもたらされる。発現ベクターを、エレクトロポレーションによりＳｐ／ＥＳＦ細胞（Ｓｐ２／０の操作された細胞系）に形質移入した。ｐｄＨＬ２ベクターは、ジヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子を含有しており、従ってメトトレキサート（ＭＴＸ）によるクローン選択並びに遺伝子増幅を可能にする。安定クローンを、０．２μＭ  ＭＴＸを含有する培地で選択された９６ウェルプレートから単離した。サンドイッチＥＬＩＳＡにより、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｖｍａｂ生産性について、クローンをスクリーニングした。無血清培養を用いた回転ボトル培養でモジュールを産生した。
【０２３３】
長さが１８個アミノ酸の可撓性リンカーペプチドを介してヒトＩＦＮα２ｂのカルボキシル末端にＤＤＤ２ペプチドを組換え融合することにより、実施例１６で考察したように、ＤＤＤモジュール、ＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２を生成した。全てのＤＤＤモジュールの場合と同じように、発現された融合タンパク質は、自然に安定したホモダイマーを形成する。
【０２３４】
実施例１〜７で考察されているように、様々なＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂモジュールの産生、特徴付け、及び使用を実施した。ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩ制限酵素を用いてＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインの配列を切り出し、それを、同じ酵素を用いてＣ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２発現ベクターから切り出したＣＨ１−ＤＤＤ２をコードする５０７ｂｐの配列と置換することにより、ｈＬ２４３−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターからＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＬ２４３発現ベクターを生成した。エレクトロポレーションによりＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＬ２４３−ｐｄＨＬ２をＳｐ／ＥＳＦ細胞に形質移入した後、マウス抗ヒトカッパ鎖でコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレートを使用して融合タンパク質を捕捉し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＦａｂで検出したサンドイッチＥＬＩＳＡにより、安定したＭＴＸ耐性クローンを、生産性についてスクリーニングした。モジュールを回転ボトル培養で産生した。
【０２３５】
無血清Ｈ−ＳＦＭ培地での回転ボトル培養及び流加培養バイオリアクター産生により、現在までに生成されている他のＩｇＧ−ＡＤ２モジュール及びサイトカイン−ＤＤＤ２モジュールに匹敵する収量がもたらされた。ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）及びＨｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔ  ＨＦニッケル親和性ゲル（Ｓｉｇｍａ社製）を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｖ−ｍａｂ及びＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２を、以前に記述されているように（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００９，  １１４：３８６４−７１）、それぞれ培養ブロスから精製した。ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＬ２４３モジュールを含有する培養ブロスを、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ親和性ゲル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に直接アプライし、それをＰＢＳでベースラインまで洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５で溶出した。
【０２３６】
ＤＮＬモジュールの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥ−ＨＰＬＣで評価した（非表示）。非還元条件下での分析は、ＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２及びＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＬ２４３が、ＤＮＬ反応の前は、ジスルフィドで結合された二量体として存在することを示す（非表示）。ＤＤＤモジュールで常に見られるこの現象は、反応性スルフヒドリル基を不可逆的酸化から保護するために有益である。それに比べて、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｖ−ｍａｂ（非表示）は、単量体及びジスルフィドで結合された二量体の両方として存在し、ＤＮＬ反応中に単量体に還元される。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果と一致し、単量体種、並びに還元時に単量体形態に変換された二量体モジュールを示した。スルフヒドリル基は、ＡＤ２システイン残基間のジスルフィド結合に寄与することにより両形態で保護される。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、各モジュールがほぼ均質に精製されたことが示され、各モジュールを含む成分ポリペプチドが特定された（非表示）。ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｖ−ｍａｂの場合、重鎖−ＡＤ２及びカッパ軽鎖が特定された。ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＬ２４３の場合、ｈＬ２４３−Ｆｄ−ＤＤＤ２及びカッパ軽鎖ポリペプチドが分離された（非表示）。ＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２の場合、１つの主要バンド及び１つの微量バンドが分離され（非表示）、それらは、それぞれ非グリコシル化及びＯ−グリコシル化種であることが決定された。
【０２３７】
ＤＮＬによる２０−Ｃ２−２ｂの産生。３つのＤＮＬモジュール（ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｖ−ｍａｂ、ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＬ２４３、及びＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２）を等モルの量で混合して、ｂｓＭＡｂ−ＩＦＮα、２０−Ｃ２−２ｂを生成した。室温で穏やかな還元条件下（１ｍＭ還元型グルタチオン）で一晩のドッキングステップの後、酸化型グルタチオンを添加して（２ｍＭ）、ジスルフィド結合形成（ロッキング）を促進させた。３つの連続するアフィニティークロマトグラフィーステップを使用して、２０−Ｃ２−２ｂを、ほぼ均質に精製した。最初に、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｖ−ｍａｂ群に結合し、未反応ＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２又はＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＬ２４３を除去するプロテインＡ（ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ）で、ＤＮＬ混合物を精製した。プロテインＡに結合した物質を、ＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２部分に特異的に結合し、この群を欠如するあらゆる構築体を除去するＨｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔ  ＨＦニッケル親和性ゲルを使用したＩＭＡＣにより更に精製した。ｈＬ２４３−抗イディオタイプ親和性ゲルを使用した最終処理ステップにより、ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＬ２４３を欠如するあらゆる分子を除去した。
【０２３８】
当業者であれば、３つのエフェクター部分の各々に対するリガンドを取得し、カラム材料に結合することができる限り、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、あらゆる組み合わせのエフェクター部分を含むＤＮＬ複合体を精製することができることを理解するだろう。選択されたＤＮＬ構築体は、３つのエフェクター部分の各々に対するリガンドを含有する３つのカラムの各々に結合し、洗浄して未結合複合体を除去した後で溶出することができるものである。
【０２３９】
以下の例は、２０−Ｃ２−２ｂの幾つかの類似した調製を表す。等モル量のＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｖ−ｍａｂ（１５ｍｇ）、ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＬ２４３（１２ｍｇ）、及びＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２（５ｍｇ）を、３０ｍＬ反応容積中で混合し、１ｍＭ還元型グルタチオンを溶液に添加した。室温で１６時間後、２ｍＭの酸化型グルタチオンを混合物に添加し、それを更に６時間室温で保持した。反応混合物を、５ｍＬプロテインＡアフィニティカムにアプライし、それをＰＢＳでベースラインまで洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５で溶出した。約２０ｍｇのタンパク質を含有していた溶出液を３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６で中和し、５ｍＬのＨｉｓＳｅｌｅｃｔ  ＩＭＡＣカラムにアプライする前に、ＨｉｓＳｅｌｅｃｔ結合緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）に透析した。カラムをＨｉｓＳｅｌｅｃｔ結合緩衝液でベースラインまで洗浄し、２５０ｍＭイミダゾール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０で溶出した。
【０２４０】
約１１．５ｍｇのタンパク質を含有していたＩＭＡＣ溶出液を、ＷＰ（抗ｈＬ２４３）アフィニティカムに直接アプライし、それをＰＢＳでベースラインまで洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５で溶出した。このプロセスにより、７ｍｇの高度に精製された２０−Ｃ２−２ｂがもたらされた。これは、２０−Ｃ２−２ｂの理論的収率のおよそ４４％であり、それは総出発物質の５０％（この例では１６ｍｇ）であり、各々２５％の２０−２ｂ−２ｂ及び２０−Ｃ２−Ｃ２が副産物として生成された。
【０２４１】
分析法。サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を、ＢｉｏＳｕｉｔｅ２５０、４μｍ  ＵＨＲ  ＳＥＣカラムを備えたＡｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．社製、ミルフォード  マサチューセッツ州）を使用して実施した。免疫反応性を、その結果生じた免疫複合体のＳＥ−ＨＰＬＣによる分析の前に、過剰量のＷＴ、抗ＩＦＮα、又はＷＲ２を２０−Ｃ２−２ｂと混合することにより評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、１２％及び４〜２０％勾配Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）を使用して、それぞれ還元及び非還元条件下で実施した。
【０２４２】
エレクトロスプレーイオン化飛行時間型（ＥＳＩ−ＴＯＦ）液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）を、６２１０型ＴＯＦ  ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、サンタクララ、カリフォルニア州）に取り付けられた１２００シリーズＨＰＬＣで実施した。２０−Ｃ２−２ｂを、６０℃にて３０分間１０ｍＭ  ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンで還元し、０．１％ギ酸水溶液中２０〜９０％アセトニトリルの１０分間勾配を使用して、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ、５μｍ  Ｃ８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いた逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により分離した。ＴＯＦ  ＭＳについては、キャピラリー電圧及びフラグメンター電圧を、それぞれ５５００及び２００Ｖに設定した。
【０２４３】
ＩＦＮα２ｂ特異的活性を、ｉＬｉｔｅヒトインターフェロンアルファ細胞ベースアッセイキット（ＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ社製、ピスカタウエイ、ニュージャージー州）を使用して決定した。ペグインターフェロンアルファ−２ｂ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ社製）を、陽性対照として使用した。
【０２４４】
細胞結合及びアポトーシス。細胞結合及びアポトーシスを、それぞれ、Ｇｕａｖａ  ＰＣＡ並びにＧｕａｖａ  Ｅｘｐｒｅｓｓ及びＧｕａｖａ  Ｎｅｘｉｎ用の試薬、ソフトウェア、及び推奨プロトコール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ビルリカ、マサチューセッツ州）を使用して、フローサイトメトリーで評価した。結合アッセイの場合、生細胞を、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈したＭＡｂ又はＭＡｂ−ＩＦＮαと共に、４℃で１時間インキュベートした。細胞をペレットにし、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２回洗浄し、その後２μｇ／ｍＬのＰＥ結合マウス抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、バーミンガム、アラバマ州）と共に、４℃で１時間インキュベーションした。３回洗浄した後、結合をフローサイトメトリーで測定した。アポトーシスアッセイの場合、細胞（５×１０５／ｍｌ）を、表示されているＭＡｂ又はＭＡｂ−ＩＦＮαと共に、２４ウェルプレートで４８時間インキュベートし、その後アネキシン−Ｖ陽性細胞％を定量化した。
【０２４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性。細胞を、増加する濃度の表示されている作用剤の存在下で所定の至適初期密度（１〜２．５×１０５細胞／ｍＬ）で、４８ウェルプレート（３００μｌ／ウェル）に播種し、未処理細胞の密度が１０倍以上増加するまで３７℃でインキュベートした（４〜７日間）。アッセイ終了時の相対的生細胞密度を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、マディソン、ウィスコンシン州）を使用して決定した。
【０２４６】
全血からのＤａｕｄｉのｅｘ  ｖｉｖｏ枯渇。ニューイングランド施設内治験審査委員会（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）（ウェルズリー、マサチューセッツ州）により承認されたプロトコールに基づいて血液試料を収集した。Ｄａｕｄｉ（５×１０４）細胞を、健康志願者に由来するヘパリン処理全血（１５０ｍＬ）と混合し、１ｎＭのＭＡｂ又はＭＡｂ−ＩＦＮαと共に、３７℃及び５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。細胞を、ＦＩＴＣ抗ＣＤ１９、ＦＩＴＣ抗ＣＤ１４、ＡＰＣ抗ＣＤ３、又はＡＰＣマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照ＭＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、サンホゼ、カリフォルニア州）で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用してフローサイトメトリーで分析した。Ｄａｕｄｉ細胞は、単球ゲートのＣＤ１９＋である。正常Ｂ及びＴ細胞は、リンパ球ゲートのそれぞれＣＤ１９＋及びＣＤ３＋細胞である。単球は、単球ゲートのＣＤ１４＋細胞である。
【０２４７】
結果
２０−Ｃ２−２ｂの精製及び特徴付け。二重特異性ＭＡｂ−ＩＦＮαは、ＩｇＧ−ＡＤ２モジュール、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｖ−ｍａｂを、２つの異なる二量体ＤＤＤモジュール、ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＬ２４３、及びＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２と混合することにより生成した。いずれかのＤＤＤモジュールと２つのＡＤ２群が無作為に結合するため、２０−Ｃ２−２ｂに加えて、２つの副産物、２０−Ｃ２−Ｃ２及び２０−２ｂ−２ｂが形成されることが予想される。
【０２４８】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非表示）では、２０−Ｃ２−Ｃ２（約３６５ｋＤａ）及び２０−２ｂ−２ｂ（２５５ｋＤａ）のバンド間に位置したバンドのクラスターとして、２０−Ｃ２−２ｂ（約３０５ｋＤａ）が分離された。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、２０−Ｃ２−２ｂを含む５つのポリペプチド（ｖ−ｍａｂ  ＨＣ−ＡＤ２、ｈＬ２４３  Ｆｄ−ＤＤＤ２、ＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２及び同時泳動ｖ−ｍａｂ、並びにｈＬ２４３カッパ軽鎖）が分離された（非表示）。ＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２及びｈＬ２４３  Ｆｄ−ＤＤＤ２は、２０−Ｃ２−Ｃ２及び２０−２ｂ−２ｂには存在しない。ＭＡｂＳｅｌｅｃｔは、ＤＮＬ反応で生成された主要種の３つ全てに結合するが、あらゆる過剰量のＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２及びＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＬ２４３を除去する。Ｈｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔ未結合画分は、主に２０−Ｃ２−Ｃ２を含有していた（非表示）。ＷＴアフィニティークロマトグラフィーからの未結合画分は、２０−２ｂ−２ｂを含んでいた（非表示）。試料の各々を、ＳＥ−ＨＰＬＣ及び免疫反応性分析にかけた。これら分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果及び結論を裏付けた。
【０２４９】
２０−Ｃ２−２ｂを還元した後、その５つの成分ポリペプチドを、ＲＰ−ＨＰＬＣで分離し、各ピークについて、個々のＥＳＩ−ＴＯＦデコンボリューション質量スペクトルを生成した（非表示）。天然であるが細菌で発現された組換えＩＦＮα２は、Ｔｈｒ−１０６がＯ−グリコシル化されている（Ａｄｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９１；２７６  （  Ｐｔ  ２）：５１１−８）。本発明者らは、ＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２モジュールを含むポリペプチドの約１５％がＯ−グリコシル化されており、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、非グリコシル化ポリペプチドから分離することができることを決定した（非表示）。２０−Ｃ２−２ｂのＬＣ／ＭＳ分析により、それぞれ１５ｐｐｍ及び２ｐｐｍの質量精度で、ＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２のＯ−グリコシル化及び非グリコシル化種が両方とも特定された（非表示）。Ｏ−グリコシル化形態の観測質量は、構造ＮｅｕＧｃ−ＮｅｕＧｃ−Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃを有するＯ−結合型グリカンを示しており、これも２０−２ｂ−２ｂの場合に予想（＜１ｐｐｍ）されていた（非表示）。ＬＣ／ＭＳにより、ｖ−ｍａｂ及びｈＬ２４３カッパ鎖の両方、並びにｈＬ２４３−Ｆｄ−ＤＤＤ２（非表示）が、計算質量と一致する観測質量を有する単一の未修飾種として特定された（＜３５ｐｐｍ）。ｖ−ｍａｂ  ＨＣ−ＡＤ２の２つの主要な糖型は、５３，７１４．７３（７０％）及び５３，８７７．３３（３０％）の質量を有することが特定され、それぞれ、典型的にはＩｇＧに関連するＧ０Ｆ及びＧ１Ｆ  Ｎ−グリカンであることが示された（非表示）。この分析により、アミノ末端グルタミンを有するポリペプチドの場合に予想されるように、ＨＣ−ＡＤ２のアミノ末端が、ピログルタミン酸に修飾されていることも確認された。
【０２５０】
２０−Ｃ２−２ｂのＳＥ−ＨＰＬＣ分析では、その計算質量と一致する滞留時間（６．７分）を示し、より大きな２０−Ｃ２−Ｃ２（６．６分）の質量とより小さな２０−２ｂ−２ｂ（６．８５分）の質量との間にある主要なタンパク質ピーク、並びにＩＦＮα２ｂの自己結合により形成された非共有結合性二量体を表している可能性が高い幾つかのより高分子量のピークが分離された（非表示）。
【０２５１】
免疫反応アッセイは、各分子が３つの機能性群を含有する２０−Ｃ２−２ｂの均質性を実証した（非表示）。３つの成分モジュールのいずれかに対する過剰量の抗体と共に２０−Ｃ２−２ｂをインキュベーションすることにより、高分子量免疫複合体の定量的形成及び２０−Ｃ２−２ｂピークの消失がもたらされた。Ｈｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔ及びＷＴアフィニティ未結合画分は、それぞれＷＴ及び抗ＩＦＮαと免疫反応しなかった（非表示）。
【０２５２】
細胞結合性。ＭＡｂ−ＩＦＮαは、それらの親ＭＡｂと類似した結合活性を示した（図８Ａ）。飽和濃度未満において、類似した結合レベルが、２０−Ｃ２−２ｂ及びｈＬ２４３γ４ｐで観察された。ＨＬＡ−ＤＲの抗原密度は、これら細胞ではＣＤ２０よりも約６倍大きく、２０−２ｂ−２ｂと比較して、より多くの２０−Ｃ２−２ｂの結合を可能にする。１部位結合非線形回帰モデルを使用して分析した結合曲線は、２０−Ｃ２−２ｂが、２０−２ｂ−２ｂと比較して４．７倍高いＢｍａｘを達成することができ、それらの結合親和性間（Ｋｄは約４ｎＭ）に有意差は観察されなかったことを実証した（図８Ｂ）。
【０２５３】
ＩＦＮα生物活性。種々のＭＡｂ−ＩＦＮαの比活性を、細胞に基づくレポーター遺伝子アッセイを使用して測定し、ペグインターフェロンアルファ−２ｂと比較した（図８Ｃ）。予想した通り、２つのＩＦＮα２ｂ群を有する２０−Ｃ２−２ｂの比活性（２４５４ＩＵ／ｐｍｏｌ）は、２０−２ｂ−２ｂ（４４４７ＩＵ／ｐｍｏｌ）又は７３４−２ｂ−２ｂ（３７６４ＩＵ／ｐｍｏｌ）の比活性よりも有意に低いが、ペグインターフェロンアルファ−２ｂよりも大きい（Ｐ＜０．００１）。２０−２ｂ−２ｂ及び７３４−２ｂ−２ｂ間の差は、有意ではなかった。総ＩＦＮαのＩＵ／ｐｍｏｌに正規化すると、全ての作用剤間の比活性の変動は非常に小さいである。これらデータに基づくと、ＭＡｂ−ＩＦＮαの各ＩＦＮα２ｂ群の比活性は、組換えＩＦＮα２ｂ（約４０００ＩＵ／ｐｍｏｌ）のおよそ３０％である。
【０２５４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性：ＮＨＬ。Ｂ細胞ＮＨＬによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイの結果は、表３に要約されている。各細胞系のＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２０の相対的抗原密度は、報告されている（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２０１０、近刊）。標的化インデックス（ＴＩ）は、非標的化ＭＡｂ−ＩＦＮα（７３４−２ｂ−２ｂ）と比較した、標的化ＭＡｂ−ＩＦＮαの効力の増加倍数を表し、ＥＣ５０値は、総ＩＦＮα濃度（Ｉ−ＥＣ５０）に変換される。Ｄａｕｄｉは、非標的化ＭＡｂ−ＩＦＮα、７３４−２ｂ−２ｂで実証されたように、ＩＦＮα２による細胞致死に非常に感受性である（Ｉ−ＥＣ５０＝１４ｐＭ）。単一特異性２０−２ｂ−２ｂを有するＤａｕｄｉに対してＣＤ２０を標的化することにより（Ｉ−ＥＣ５０＝０．４ｐＭ）、更に効力が２５倍増強され（ＴＩ＝２５）、以前の結果と一致した（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００９；１１４：３８６４−７１）。二重特異性２０−Ｃ２−２ｂの効力増強（Ｉ−ＥＣ５０＝０．０８ｐＭ；ＴＩ＝１２５）は、２０−２ｂ−２ｂよりも５倍大きく、これは、ＨＬＡ−ＤＲの抗原密度が追加されていること及び恐らくはその高結合活性四価腫瘍結合性に帰することができる。ｈＬ２４３誘導性シグナル伝達が、これら低濃度で更なる細胞毒性に寄与する可能性は少ない。ｖ−ｍａｂ、ｈＬ２４３γ４ｐ、及び７３４−２ｂ−２ｂの混合物（ｖ−ｍａｂ＋ｈＬ２４３＋７３４−２ｂ）は、７３４−２ｂ−２ｂ単独と等しく、ｈＬ２４３誘導性シグナル伝達が、２０−Ｃ２−２ｂの高ＴＩに寄与しないという結論を支持した。
【０２５５】
Ｄａｕｄｉでは、いずれのＭＡｂ−ＩＦＮαでもわずか１ｐＭでアポトーシスが誘導されたが、１０ｐＭのｖ−ｍａｂ又はｈＬ２４３γ４ｐでは誘導されなかった（図９Ａ）。２０−２ｂ−２ｂ又は２０−Ｃ２−２ｂによる治療は、７３４−２ｂ−２ｂ又はｖ−ｍａｂ＋ｈＬ２４３＋７３４−２ｂよりも、有意により多くのアポトーシス細胞をもたらした（Ｐ＜０．０００５）。７３４−２ｂ−２ｂと混合物との間に有意差は観察されなかった。
【０２５６】
７３４−２ｂ−２ｂは、Ｒａｊｉ（Ｉ−ＥＣ５０＝３２ｎＭ）及びＲａｍｏｓ（Ｉ−ＥＣ５０＞８０ｎＭ）に対してそれほど効果を示さず、それぞれ、わずか６２％及び３５％の最大阻害（Ｉｍａｘ）をもたらした。これら条件下では、ｈＬ２４３γ４ｐは、これらバーキットリンパ腫系を阻害したが、ｖ−ｍａｂは阻害しなかった（非表示）。２０−Ｃ２−２ｂの効力の観察された増強は（ＴＩ＝１１８）、ＣＤ２０よりはるかに高いＨＬＡ−ＤＲ抗原密度を有するＲａｊｉの場合、２０−２ｂ−２ｂ（ＴＩ＝２）よりも５０倍を超えて大きかった。Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉとは異なり、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ−２０の密度はＲａｍｏｓと類似しているが、２０−Ｃ２−２ｂのＴＩは２０−２ｂ−２ｂよりも１５倍大きく、ｈＬ２４３及びＩＦＮα２ｂの活性が相加的であることを示す。
【０２５７】
ｖ−ｍａｂ＋ｈＬ２３４＋７３４−２ｂ混合物は、Ｒａｊｉ及びＲａｍｏｓの場合、いずれの単一作用剤単独よりも強力だった。ＩＦＮα２ｂを標的とすることは、最大効力の達成に重大だった。３つのバーキットリンパ腫系の各々において、２０−Ｃ２−２ｂは、同数の抗ＣＤ２０及び抗−ＨＬＡ−ＤＲ  Ｆａｂ並びに２倍の量（及び活性）のＩＦＮα２ｂを含むｖ−ｍａｂ＋ｈＬ２３４＋７３４−２ｂよりも有効だった。
【０２５８】
マントル細胞リンパ腫、Ｊｅｋｏ−１は、ｈＬ２４３γ４ｐに対して著しくより感受性であり（ＥＣ５０＝０．４ｎＭ）、ＩＦＮα２ｂにはそれほど感受性でなかった（７３４−２ｂ−２ｂで効力が最小）。ｈＬ２４３を含むあらゆる治療が、２０−２ｂ−２ｂより優れていた（ＥＣ５０＝１ｎＭ）。２０−Ｃ２−２ｂは、ｈＬ２４３γ４ｐ又はｖ−ｍａｂ＋ｈＬ２４３＋７３４−２ｂと比較して、２倍の効力増強を示した。０．５ｎＭでは、ｈＬ２４３γ４ｐ及び７３４−２ｂ−２ｂは、類似したレベルのアポトーシスを誘導し、ｖ−ｍａｂ＋ｈＬ２４３＋７３４−２ｂによる治療は、いずれか一方の作用剤単独と比較して、２倍の数のアネキシン−Ｖ陽性細胞をもたらしたため、それらの効果は相加的であると考えられる（図９Ａ）。ｖ−ｍａｂは、単独ではわずかな効果を示したに過ぎなかったため、混合物にはほとんど寄与しない可能性が高い。２０−Ｃ２−２ｂ及び混合物は両方とも、ｈＬ２４３の作用のため、２０−２ｂ−２ｂより優れていた（Ｐ＜０．００２）。
【０２５９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性：骨髄腫。８つのＭＭ細胞系は、ＨＬＡ−ＤＲレベル（及びＫＭＳ１２−ＢＭのみがＣＤ２０を発現する）、及びＩＦＮα２ｂに対する感受性が様々であるが（図１０）、全てが２０−Ｃ２−２ｂに応答する。試験した８つのＭＭ細胞系の各々の用量反応曲線は、図１１に示されており、結果は、表３に要約されている。例えば、５は、ＩＦＮα２に高度に応答性だったが（７３４−２ｂ−２ｂの場合、Ｉ−ＥＣ５０＜１ｎＭ）、ＨＬＡ−ＤＲ抗原密度は様々であった。これらのうち、高ＨＬＡ−ＤＲ密度を有するＣＡＧのみが、ｈＬ２４３γ４ｐにより阻害され（＞１ｎＭ）、より高い濃度では、ｈＬ２４３γ４ｐ及び７３４−２ｂ−２ｂの混合物（ｈＬ２４３＋７３４−２ｂ）に対する（相加的）応答性増加を示した。２０−Ｃ２−２ｂ（Ｉ−ＥＣ５０＝１０ｐＭ）は、ＣＡＧに対する著しい効力増強を示した（ＴＩ＝５５）。
【０２６０】
ＣＡＧのアポトーシスは、１ｎＭのｈＬ２４３γ４ｐ、２０−２ｂ−２ｂ、７３４−２ｂ−２ｂ、又はｈＬ２４３＋７３４−２ｂによる処理後に明白だったが、０．１又は０．０１ｎＭでは明白ではなかった（図９Ｂ）。２０−Ｃ２−２ｂは、０．０１ｎＭでさえアポトーシスを誘導し、０．１ｎＭの２０−Ｃ２−２ｂで観察されたレベルは、１０倍より高い（１ｎＭ）濃度の任意の他の治療に起因するものと等しかったか又はそれより高かった。
【０２６１】
２０−Ｃ２−２ｂの効力増強は、ＯＰＭ６（ＴＩ＝２）、Ｕ２６６（ＴＩ＝７）、及びＭＭ．１Ｒ（ＴＩ＝１０）で明白だったがより低く、これらは各々が、高度にＩＦＮα応答性であったが、より低いＨＬＡ−ＤＲ密度を有しており、ｈＬ２４３γ４ｐにより阻害されなかった。高度にＩＦＮα応答性だったが、ＨＬＡ−ＤＲ−であったＮＣＩ−Ｈ９２９に対する効力増加は、２０−Ｃ２−２ｂでは観察されなかった。
【０２６２】
ＫＭＳ１２−ＢＭは、高いＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２０抗原密度を有し、驚くべきことに、２０−２ｂ−２ｂにより阻害されたが（Ｉ−ＥＣ５０＝３１ｎＭ）、７３４−２ｂ−２ｂ（Ｉ−ＥＣ５０＞１００ｎＭ）又はｖ−ｍａｂによっては阻害されなかった。ＫＭＳ１２−ＢＭは、ｈＬ２４３＋７３４−２ｂ（ＥＣ５０＝０．７ｎＭ）と比較して、ｖ−ｍａｂ＋ｈＬ２４３＋７３４−２ｂに対してより感受性であり（ＥＣ５０＝３ｎＭ）、次いでｈＬ２４３γ４ｐ単独より優れていた（ＥＣ５０＝３．５ｎＭ）。これらの処理の各々は、アポトーシスの強力な誘導をもたらし、相対的レベルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性の結果と一致した（図９Ｃ）。加えて、ｖ−ｍａｂ＋ｈＬ２４３は、ｈＬ２４３γ４ｐ単独よりも多くのアポトーシスを誘導したが、ｖ−ｍａｂ＋ｈＬ２４３＋７３４−２ｂよりも少なかった。これらの結果は、ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ２０＋ＭＭ細胞に対して、２０−Ｃ２−２ｂの３つの成分全ての活性（ＥＣ５０＝０．１ｎＭ）は、組み合わされた場合には細胞毒性に寄与することができるが、それらのうちの２つが、単独で使用された場合は事実上効果を示さないことを示唆する。
【０２６３】
２つの更なるＤＮＬ構築体をＫＭＳ１２−ＢＭで評価することにより、２０−Ｃ２−２ｂ効力増強の解明が支援された。ｈＬ２４３  ＩｇＧ１及び四量体ＩＦＮα２ｂ（２０−Ｃ２−２ｂのＩＦＮα２ｂの２倍）を含む、Ｃ２−２ｂ−２ｂと称するＭＡｂ−ＩＦＮαは、２０−Ｃ２−２ｂと比較して、それほど強力でない細胞毒性（ＥＣ５０＝０．４ｎＭ）及びより弱いアポトーシス誘導を示し、ｖ−ｍａｂの寄与があることを支持した。より関連性があるのは、２０−Ｃ２−Ｃ２、ｖ−ｍａｂ及び４つのＨＬＡ−ＤＲ  Ｆａｂを含む二重特異性ＭＡｂが、ｈＬ２４３γ４ｐと比較して、高レベルのアポトーシス誘導及び５０倍を超える効力増強（ＥＣ５０＝０．０６ｎＭ）を示し、２０−Ｃ２−２ｂで生じるＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２０の架橋が、恐らくは固有のシグナル伝達カスケードにより細胞毒性を誘導することを示したという知見であった。各構築体は強力だったが（ＥＣ５０＜０．５ｎｍ）、２０−Ｃ２−Ｃ２（Ｉｍａｘ＝６７％）及びＣ２−２ｂ−２ｂ（Ｉｍａｘ＝７０％）は、２０−Ｃ２−２ｂ（Ｉｍａｘ＝９９％）ほど効果的にＫＭＳ１２−ＢＭを死滅させず、最大効果を達成するためには３つの成分全てが必要であることを支持した。ｖ−ｍａｂ＋ｈＬ２４３＋７３４−２ｂ（Ｉｍａｘ＝８７％）混合物が、７０％を超える死滅をもたらす唯一の他の処理だったことは、この仮説を実証している。
【０２６４】
まとめると、これらのデータは、抗原密度、及びＩＦＮα２ｂ作用に対する感受性、並びにそれらのＭＡｂ標的化は全て、種々のＭＡｂ−ＩＦＮαに対する特定の細胞系のｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答性の重要な決定要因であることを実証する。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍致死は、高い局所濃度のＩＦＮα２ｂにより刺激することができるＡＤＣＣ及び免疫エフェクター細胞の作用により増大させることができる。
【０２６５】
エフェクター機能及びヒト血清中での安定性。本発明者らは、２０−２ｂ−２ｂが、その親ｖ−ｍａｂと比較して、ＡＤＣＣの増強を示すことを以前に報告した（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００９；１１４：３８６４−７１）。設計により、ｈＬ２４３γ４ｐは、ＡＤＣＣを減少させる（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００６；１０８：２７３６−４４）しかしながら、２０−Ｃ２−Ｃ２は、ｖ−ｍａｂと比較して、有意に（Ｐ＝０．００９１）より大きなＡＤＣＣを誘導した（非表示）。特に、２０−Ｃ２−２ｂは、２０−２ｂ−２ｂ（Ｐ＝０．００４０）又は２０−Ｃ２−Ｃ２（Ｐ＝０．０１１５）のいずれよりも有意に大きなＡＤＣＣを誘導し、ＩＦＮα２ｂの存在によるエフェクター機能の増強を示した。２０−２ｂ−２ｂについて以前に実証されているように（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００９；１１４：３８６４−７１）、２０−Ｃ２−２ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤＣを誘導しない（非表示）。
【０２６６】
２０−Ｃ２−２ｂのヒト血清中での安定性に関する２つの異なるアッセイは、非常に類似した結果をもたらし、約３．５％／日の喪失を示し、３７℃で１１日後には、およそ６５％が残留していた（非表示）。
【０２６７】
ヒト全血からのＮＨＬのｅｘ  ｖｉｖｏ枯渇。図１２に示されているように、Ｄａｕｄｉ細胞は、２０−２ｂ−２ｂ（６９％）、ｖ−ｍａｂ（４９％の枯渇）、ｈＬ２４３γ４ｐ（４６％）、又は７３４−２ｂ−２ｂ（１０％）と比較して、２０−Ｃ２−２ｂ（９１％）により、より効果的に全血（ｅｘ  ｖｉｖｏ）から枯渇された。両標的化ＭＡｂＩＦＮαは、Ｄａｕｄｉと比較して、正常Ｂ細胞に対してそれほど毒性ではなかった。これら条件下では、Ｂ細胞は、２０−Ｃ２−２ｂ（５７％）及びｈＬ２４３γ４ｐ（４１％）により有意に枯渇されたが、ｖ−ｍａｂ、７３４−２ｂ、又は２０−２ｂ−２ｂによっては枯渇されなかった。単球は、ｈＬ２４３γ４ｐ（４８％）、７３４−２ｂ−２ｂ（３０％）、及び２０−２ｂ−２ｂ（２１％）により枯渇されたが、ｖ−ｍａｂによっては枯渇されなかった。２０−Ｃ２−２ｂ（９８％）は、単球に対して高度に毒性である。どの作用剤も、Ｔ細胞に対して著しい影響を及ぼさなかった。Ｐ＜０．００１を有する統計的有意差は、上記に示されている枯渇％の差の各々についてスチューデントｔ検定で決定した。
【０２６８】
考察
本発明者ら及び他者は、ＣＤ２０を標的とするＭＡｂ及びＩＦＮαを含む融合タンパク質が、異種移植片及び同系マウスモデルにおいて、ＭＡｂ及びＩＦＮαの組み合わせと比較して、ＮＨＬに対してより有効であり、ＭＡｂ−ＩＦＮαが、ＩＦＮαに伴う毒性及びＰｋ制限を克服することができることを示したことを報告している（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００９；１１４：３８６４−７１；Ｘｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２０１０；１１５：２８６４−７１）。ＣＤ２０は、Ｂ細胞リンパ腫の標的化ＭＡｂ−ＩＦＮα治療の魅力的な候補であるが、その発現は、大部分がこの系統の悪性疾患に制限されており、幾つかの個体は低抗原密度を示す。本明細書において、本発明者らは、ＩＦＮα２ｂをＣＤ２０及びＨＬＡ−ＤＲの両方に特異的に標的化し、従ってこの免疫サイトカイン治療に応答する造血器腫瘍タイプを拡張する可能性がある最初の二重特異性免疫サイトカイン、２０−Ｃ２−２ｂを報告する。
【０２６９】
抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＭＡｂは、追加的な架橋を必要とせず直接的シグナル伝達により媒介されるアポトーシスを効率的に誘導し、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの強力な誘導因子でもある（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００６；１０８：２７３６−４４；Ｒｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２００６；４７：２１４７−５４）。ＡＤＣＣは、治療能力を増強することができるが、ＣＤＣは、ＭＡｂ点滴に伴う副作用の病理の主な原因である（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｏｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２００１；１１５：８０７−１１）。この研究で対照として使用されたヒト化抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＭＡｂ、ｈＬ２４３γ４ｐは、ヒトＩｇＧ４アイソタイプの定常領域を使用し、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの減少をもたらすことにより、臨床安全性が向上するように操作された。２０−Ｃ２−２ｂは、ｈＬ２４３γ４ｐと同様にＣＤＣを欠如するが、強力な（増強された）ＡＤＣＣを示し、この作用剤を免疫療法の魅力的な候補するという点で、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＭＡｂの中でも独特である。
【０２７０】
ｅｘ  ｖｉｖｏの設定では、ｖ−ｍａｂは、シグナル伝達誘導性アポトーシス、ＡＤＣＣ、及びＣＤＣにより細胞を枯渇させることができる。ＭＡｂ−ＩＦＮαは、増強されたＡＤＣＣ、並びにＭＡｂ誘導性及びＩＦＮα２ｂ誘導性シグナル伝達の両方を使用することができるが、ＣＤＣを使用することはできず、ｈＬ２４３−γ４ｐは、直接的シグナル伝達のみに制限される（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００６；１０８：２７３６−４４）。ｉｎ  ｖｉｖｏで生じ得る先天性免疫及び適応免疫の広範なＩＦＮα−媒介性活性化は、この設定では実現されないが、それは薬力学的データを提供する。２０−Ｃ２−２ｂは、正常Ｂ細胞よりも効果的にリンパ腫細胞を枯渇させ、Ｔ細胞に影響を及ぼさなかった。しかしながら、２０−Ｃ２−２ｂは単球を効率的に除去した。ｖ−ｍａｂは、単球に影響を及ぼさず、枯渇は、ｈＬ２４３α４ｐ及びＭＡｂ−ＩＦＮαによる処理後に観察され、２０−２ｂ−２ｂ及び７３４−２ｂ−２ｂは同様の毒性を示した。したがって、２０−Ｃ２−２ｂの予想通りに高い効力は、抗ＨＬＡ−ＤＲ及びＩＦＮαの複合作用に起因し、それはＨＬＡ−ＤＲ標的化により増大させることができる。これらのデータは、単球枯渇が、抗ＨＬＡ−ＤＲ並びにＩＦＮα治療に伴う薬力学的効果である可能性を示唆するが、単球集団は造血幹細胞から再生されるはずであるため、この副作用は一時的である可能性が高いだろう。
【０２７１】
本発明者らが研究した４つのＮＨＬ及び８つのＭＭ細胞系は、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２０の発現及び抗原密度に天然で生じる異質性、並びにＩＦＮα、ｈＬ２４３、及びｖ−ｍａｂの作用に対する応答性に天然で生じる異質性を包含し、これらの全ては、ＭＡｂ−ＩＦＮα免疫療法に影響を及ぼす。６及び８系統（１２系統のうちの）は、ｈＬ２４３γ４ｐ及び７３４−２ｂ―２ｂにより、それぞれ異なる度合いで阻害された（Ｉｍａｘ＞３０％）。２０−Ｃ２−２ｂは、１２細胞系のうちの１１系統を強力に阻害し（ＥＣ５０＜１ｎＭ）、５系統は、ＥＣ５０≦０．０１ｎＭだった。７３４−２ｂ―２ｂにより阻害されず最も影響を受けなかったＭＭ系（ＫＭＳ１１）でさえ、２０−Ｃ２−２ｂに応答した（ＥＣ５０＝１７ｎＭ）。
【０２７２】
７３４−２ｂ−２ｂを超える２０−Ｃ２−２ｂの効力増強は、ＨＬＡ−ＤＲ−／ＣＤ２０−であるＮＣＩ−Ｈ９２９以外の全ての系統で観察された。より高いレベルのＨＬＡ−ＤＲ抗原密度並びにｈＬ２４３の応答性は、２０−Ｃ２−２ｂのＴＩがより高いことと相関しており、ＩＦＮα及びｈＬ２４３の相加的活性を実証し、標的化がｉｎ  ｖｉｔｒｏででさえ有意であることも同様に実証した。２０−Ｃ２２ｂは、上記系統のうちの１０系統で、ｖ−ｍａｂ＋ｈＬ２４３＋７３４−２ｂの混合物より優れており、腫瘍標的化の影響を更に強調した。この影響は、２０−２ｂ−２ｂについて以前に実証されているように、ｉｎ  ｖｉｖｏでは著しくより大きくなるだろう（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００９；１１４：３８６４−７１）。更に、ｉｎ  ｖｉｖｏ標的化ＭＡｂ−ＩＦＮαは、強力な抗腫瘍免疫応答を誘発する可能性がある。
【０２７３】
初代ＭＭ標本を含む大部分の細胞は、非クローン原性であり、形質細胞表現型（ＣＤ１３８＋／ＣＤ１９−／ＣＤ２０−）を有するが、推定ＭＭ癌幹細胞はＣＤ１３８−であり、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ２２を含むＢ細胞表面抗原を発現し、記憶Ｂ細胞と良く似ている（Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０３：２３３２−６）。様々な臨床的手法が応答を引き起こしているが、ＭＭは、癌幹細胞により媒介されると考えられている再発のため、多くの場合依然として不治のままであり、種々の治療に耐性である。推定幹細胞がＢ細胞表現型であることは、ＭＭにおけるリツキシマブによる臨床研究を促した。しかしながら、実現されたのは、転帰に対する限定的な効果だった（Ｔｒｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００２；２５：７２−８１）。
【０２７４】
ＫＭＳ１２−ＢＭによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果は、ＫＭＳ１２−ＢＭが、提唱ＭＭ幹細胞と同様にＣＤ２０＋であるため、説得力がある。２０−Ｃ２−２ｂは、強力な細胞毒性を示し、ＫＭＳ１２−ＢＭのアポトーシスをロバストに誘導した。非標的化ＭＡｂ−ＩＦＮα及びｖ−ｍａｂが、単一作用剤として非効果的であったとしても、ｈＬ２４３と組み合わせて使用すると、それらは両方とも明らかに細胞毒性に寄与する。上記結果は、ＣＤ２０及びＨＬＡ−ＤＲの二重特異性結合が、これら細胞に対する毒性を更に増強する追加的な（強力な）シグナルを誘導することができ、ＩＦＮαに対してそれらを感受性にすることができることも示す。
【０２７５】
ＤＮＬにより産生されたＭＡｂ−ＩＦＮαは、組換えＩＦＮαに対して同様の活性を示す。最近、Ｘｕａｎらは、従来の組換え操作により製作された抗ＣＤ２０−ＩＦＮα融合タンパク質が、ＩＦＮα活性の３００倍低減を示したことを報告した（Ｘｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２０１０；１１５：２８６４−７１）。これは、類似のＤａｕｄｉ異種移植研究と比較すると注目に値する。その研究では、単回の１７ｎｇ用量の２０−２ｂ−２ｂが、組換え抗ＣＤ２０−ｈＩＦＮαに使用された３回の３０μｇの用量（５０００倍を超えて多い）と比較して（Ｘｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２０１０；１１５：２８６４−７１）、生存を著しく向上させた（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００９；１１４：３８６４−７１）。ＩＦＮα分泌腫瘍を使用した研究により、免疫応答の増強が、局在化濃度のＩＦＮαにより誘発されることが実証された（Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ２００７  ８９：８８４−９３）。これは、高度に活性のＭＡｂ−ＩＦＮαで達成することもできるが、Ｘｕａｎら（Ｂｌｏｏｄ  ２０１０；１１５：２８６４−７１）により報告されたように、活性が低い従来の組換えＭＡｂ−ＩＦＮαは、抗腫瘍免疫応答を効率的に動員及び刺激することができない。
【０２７６】
二重特異性ＭＡｂ−ＩＦＮα  ２０−Ｃ２−２ｂは、３つの成分の各々がこの疾患に対して活性であるため、ＮＨＬの治療に魅力的である。また、この研究は、２０−Ｃ２−２ｂが、ＭＭ及び他の造血器悪性疾患の治療に有用であり得ることを示す。
【０２７７】
当業者であれば、二重特異性免疫サイトカイン、又は３つの異なるエフェクター部分を含む他のＤＮＬ構築体を産生及び使用するための、本明細書に記載の手法は、ＤＮＬ構築体に組み込むことができる抗体、抗体断片、サイトカイン、又は他のエフェクターを任意の組み合わせで使用することができることを理解するだろう。
【０２７８】
本明細書で開示及び特許請求されている組成物及び方法は全て、本開示に照らして、過度の実験作業をすることなく、製作及び使用することができる。本組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点から記述されているが、当業者であれば、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物及び方法に、及び本方法のステップ又はステップの順序に変異を適用することができることは明らかである。より詳しくは、化学的に及び生理学的にの両方で関連するある作用剤を、本明細書に記載の作用剤の代わりに用いることができ、同じ又は類似の結果が達成されるだろう。当業者にとって明らかなそのような類似の代用物及び改変は全て、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の趣旨、範囲、及び概念内にあるとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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