(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
γシクロデキストリンとのマクロライドの包接複合体であって、マクロライドとγシクロデキストリンとの重量比が、１：１００〜１：４００に含まれ、
前記マクロライドは、ラパマイシン、ピメクロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、タクロリムスから選択されることを特徴とする複合体。
【請求項２】
前記マクロライドとγデキストリンとの重量比は、１：１１１〜１：３３３に含まれることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
下記のステップ：
ａ．ラパマイシン、ピメクロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、タクロリムスから選択されるマクロライドを有機溶媒に溶解して溶液を得るステップ；
ｂ．前記溶液をγシクロデキストリンに添加するステップ；
ｃ．混合物を蒸発させるステップ；
を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の複合体を調製するための方法。
【請求項４】
前記マクロライドとγシクロデキストリンとの重量比は、１：１００〜１：４００に含まれることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記マクロライドとγシクロデキストリンとの重量比は、１：１１１〜１：３３３に含まれることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記有機溶媒は、極性有機溶媒であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記極性有機溶媒は、アセトン、メタノール、および／またはエタノールから選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記蒸発は、真空、噴霧乾燥、濾過、および／または凍結乾燥の下で行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記濾過は、有機溶媒を用いた希釈によって行われることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機溶媒が、非極性有機溶媒であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機溶媒が、Ｃ5〜Ｃ8直鎖状または分岐状炭化水素であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１または２に記載の複合体と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、固体剤形であることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、水溶液であることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記水溶液は、いかなる有機溶媒も含有しないことを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
経口、眼部、局所、または非経口使用のための請求項１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロライドおよびある特定のシクロデキストリンを含有する、経口、眼部（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）、局所、または非経口使用のための新しい水溶性固体医薬包接複合体およびその水溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
マクロライドは、その活性が、マクロライド環、即ち１種または複数のデオキシ糖が結合されていてもよい大きな大環状ラクトン環、が存在することで生じる薬物（典型的には、抗生物質）の群である。ラクトン環は、通常、１４、１５、または１６員である。マクロライドは、天然物のポリケチドのクラスに属する。このファミリーの中で、登録番号５３１２３−８８−９によって特定される、式１のラパマイシンとしても知られるシロリムスと、登録番号１０４９８７−１１−３によって特定される式２のタクロリムスは、その免疫抑制活性で知られる化合物であり、体内での臓器および骨髄移植の拒絶を予防するのに使用される。
【０００３】
【化１】
0005856769.tif 000002
【０００４】
テムシロリムス、エベロリムス、およびピメクロリムス（アスコマイシンの合成誘導体）などのラパマイシン誘導体は、細胞の成長、増殖、および生存の制御に関与する特定のタンパク質（ｍＴＯＲ）に関して、類似した阻害活性を示す。
【０００５】
登録番号１６２６３５−０４−３によって特定される式３のテムシロリムスは、ラパマイシンに構造的に関係しており、進行性腎細胞癌（腎癌の一タイプ）の治療に使用される。このテムシロリムスは、その他のタイプの癌の治療においても研究されている。
【０００６】
【化２】
0005856769.tif 000003
【０００７】
登録番号１５９３５１−６９−６によって特定される式４のエベロリムスは、ある特定のその他の抗癌剤での治療に応答しない進行性腎癌を、治療するのに使用される。このエベロリムスは、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症または乳癌のようなその他のタイプの癌の治療においても、研究されている。
【０００８】
【化３】
0005856769.tif 000004
【０００９】
登録番号１３７０７１−３２−０によって特定された式５のピメクロリムス、アスコマイシンの合成誘導体は；アトピー性皮膚炎の治療に使用される。
【００１０】
【化４】
0005856769.tif 000005
【００１１】
これら化合物の全ては、０．０１から０．０００００６モル／Ｌの範囲である、室温での不十分な水溶性を有し、貯蔵後の溶液中では不安定でありかつそのエステル結合の加溶媒分解の結果としてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において生物活性の損失をもたらすことが報告されている（非特許文献１および２参照）。
【００１２】
さらに、固体状態では、これらの化合物は、非晶質または結晶質形態で存在してもよく、この非晶質は非常に不安定で酸化分解する（非特許文献３、４、および５参照）。
【００１３】
非晶質形態が、結晶質形態と比較した場合により高い溶解度を有し（結晶質から非晶質材料までの溶解度の上昇は、１０から１６００倍の間であることが報告されている。）、安定性が低く、分解する傾向があることは、常識である。
【００１４】
さらに、低い溶解度は、通常は、体内での不十分な吸収および不十分な利用可能性に関連している。特許文献１は、シクロデキストリンと組み合わせて水にやや溶け難い薬物を溶かした水性非経口溶液が、注射部位または非経口施用後の臓器での薬物沈殿を最小限に抑えることができることを示唆している。
【００１５】
特許文献２は、αまたはβシクロデキストリン上のラパマイシンの固体分散体の形をとる、経口投与用の医薬組成物を調製する可能性について記述している。
【００１６】
実際に、文献データは、細かく微粉化されたラパマイシンまたは非晶質ラパマイシンを、特許文献３、４、５、および６に記載されているように、ポリブチルメタクリレート（ＰＢＭＡ）、ポリエチレン−ｃｏ−ビニルアセテート（ＰＥＶＡ）、または硫酸プロタミンおよびセルロースなどの高分子電解質複合体のようないくつかの合成ポリマーの使用を見越した種々のコーティング技法を用いる製剤目的のために安定化させる必要があることを裏付けている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第５０２４９９８号明細書
【特許文献２】ＥＰ８３９０２８
【特許文献３】国際公開第２００６０２６５３１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００６０３９２３７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００７０１１７０８号パンフレット
【特許文献６】ＥＰ２１３５６０１
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Yuri V. Il'ichev, Lori Alquier, and Cynthia A. Maryanoff, ARKIVOC, 2007 (XII) 110-131
【非特許文献２】Ping Cai, Rushung Tsao, and Mark E. Ruppen, DMD Fast Forward. May 31, 2007
【非特許文献３】Tetrahedron Letters (1990), 31(34), 4845-8
【非特許文献４】Xenobiotica, 27(9), 869 (1997)
【非特許文献５】J. Org. Chem., 63, 10069, (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
しかしこれらのポリマーマトリックスは、難水溶性を示し、または高分子電解質であり、即ち狭いｐＨ範囲でのみ水溶性であってもよいポリマーである。
【００２０】
さらに文献データは、これら複合体の安定性に関する定量データを報告していない。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記引用された理由により、安定化非晶質形態をγシクロデキストリンと組み合わせた使用を通してマクロライドの溶解度および安定性を増大させる可能性が、探究された。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】非晶質ラパマイシンおよび結晶質ラパマイシンのクロマトグラフィ純度（ＨＰＬＣデータ）の低下を示す図である（６０℃で１７日間（４０８時間））。
【図２】種々の溶媒：無水エタノール、エタノール９６％、およびアセトンを使用して調製されたラパマイシンγＣＤ／複合体の安定性を示す図である。
【図３】非晶質エベロリムスに対する、溶媒としてアセトンを使用して調製されたエベロリムスγＣＤ／複合体の安定性を示す図である。
【図４】ラパマイシンγＣＤ複合体のＨＰＬＣ／ＭＳプロファイルを示す図である。
【図５】エベロリムスγＣＤ複合体のＨＰＬＣ／ＭＳプロファイルを示す図である。
【図６】テムシロリムスγＣＤ複合体のＨＰＬＣ／ＭＳプロファイルを示す図である。
【図７】ピメクロリムスγＣＤ複合体のＨＰＬＣ／ＭＳプロファイルを示す図である。
【図８】タクロリムスγＣＤ複合体のＨＰＬＣ／ＭＳプロファイルを示す図である。
【図９】ラパマイシンのＨＰＬＣ／ＵＶおよびＨＰＬＣ／ＭＳプロファイルを示す図である。
【図１０】エベロリムスのＨＰＬＣ／ＵＶおよびＨＰＬＣ／ＭＳプロファイルを示す図である。
【図１１】テムシロリムスのＨＰＬＣ／ＵＶおよびＨＰＬＣ／ＭＳプロファイルを示す図である。
【図１２】ピメクロリムスのＨＰＬＣ／ＵＶおよびＨＰＬＣ／ＭＳプロファイルを示す図である。
【図１３】タクロリムスのＨＰＬＣ／ＵＶおよびＨＰＬＣ／ＭＳプロファイルを示す図である。
【図１４】噴霧乾燥器で処理したラパマイシン（出発材料）のＤＲＸを示す図である。
【図１５】噴霧乾燥器で処理したピメクロリムス（出発材料）のＤＲＸを示す図である。
【図１６】噴霧乾燥器で処理したテムシロリムス（出発材料）のＤＲＸを示す図である。
【図１７】噴霧乾燥器で処理したタクロリムス（出発材料）のＤＲＸを示す図である。
【図１８】噴霧乾燥器で処理したエベロリムス（出発材料）のＤＲＸを示す図である。
【図１９】γＣＤ（出発材料）のＤＲＸを示す図である。
【図２０】結晶質ラパマイシン（出発材料）のＤＲＸを示す図である。
【図２１】ラパマイシンγＣＤシクロデキストリン複合体のＤＲＸを示す図である。
【図２２】γＣＤおよびラパマイシン（０．６％ｗ／ｗ）の物理的混合物のＤＲＸを示す図である。
【図２３】γＣＤおよび結晶質ラパマイシンの物理的混合物（０．６％ｗ／ｗ；緑色）と、結晶質ラパマイシンのＤＲＸ（赤色）と、ラパマイシンγＣＤ複合体のＤＲＸ（青色）との、３から３０  ２θの範囲における、重ね合わせた拡大ＤＲＣスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
下記の定義は、本明細書および特許請求の範囲全体を通して使用される。
【００２４】
「αシクロデキストリン」または「αＣＤ」という用語は、シクロマルトヘキサオースとも呼ばれる、登録番号１００１６−２０−３で特定された化合物を指す。
【００２５】
「βシクロデキストリン」または「βＣＤ」という用語は、シクロマルトヘプタオースとも呼ばれる、登録番号７５８５−３９−９で特定された化合物を指す。「γシクロデキストリン」または「γＣＤ」という用語は、シクロマルトオクタオースとも呼ばれる、登録番号１７４６５−８６−０で特定された化合物を指す。
【００２６】
「非晶質」という用語は、非結晶質である化合物の固体状態を指す。
【００２７】
本明細書で使用される「マクロライド」という用語は、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、ピメクロリムス、およびタクロリムスを指す。
【００２８】
本発明の目的は、包接複合体の形成によって、シクロデキストリンに吸着された場合のマクロライドの安定性および溶解度の両方を改善することであった。
【００２９】
当業者に周知のように、これらの複合体は、水溶性、安定性、またはバイオアベイラビリティの増大など、ゲスト分子に比べて変化した物理化学的性質をしばしば示す。
【００３０】
したがって本発明の目的は、製剤の目的で通常用いられる付随材料（ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ）の毒性をおそらくは低下させながら、製剤の目的で使用してもよい、γシクロデキストリンとのマクロライドの包接複合体を提供することである。
【００３１】
事実、驚くべきことに、γシクロデキストリンは、マクロライドの安定性に良好な作用を示し、かつ共溶媒として有機溶媒を使用することなく過飽和水溶液からの沈殿を防止することがわかった。
【００３２】
したがって、本発明の別の目的は、いかなる有機溶媒も含有しないこれら複合体の水溶液である。
【００３３】
本発明の別の目的は、経口、眼部、局所、および注射可能な製剤を調製するためのこれら複合体の使用、ならびに免疫抑制剤としてのそのような複合体および／または製剤の使用である。
【００３４】
製剤の研究を進めるために、本発明者らは、微粉化したラパマイシン（１０-5ミクロン）および溶液（エタノール）にしたものに対して予備安定性試験を行った。
【００３５】
本発明者らにより得られた結果は、細かく微粉化されまた溶液状態になったこの生成物が、不安定であることを裏付け：数時間以内で、本発明者らは感知可能なアッセイ値の低下（−１０％）を観察した。
【００３６】
分解から、非晶質ラパマイシンまたは細かく微粉化されたラパマイシンを安定化させるため、本発明者らは、いくつかの試みを行ったが成功しなかった：αトコフェロールおよびアスコルビン酸などの抗酸化剤の添加は、不活性雰囲気（窒素）下および冷蔵条件（０〜４℃）での作業であっても、この分解を制御することができなかった。
【００３７】
この挙動は、２０ミクロンよりも小さい微粉化ラパマイシン、非晶質ラパマイシン、および溶液状態でのみ観察され、より大きな粒度（即ち、＞１００ミクロン）の結晶質ラパマイシンでは観察されなかった。
【００３８】
表１および対応する図１では、非晶質および結晶質（粒度＞１００ミクロンの生成物）形態のラパマイシンに関して６０℃で得られた安定性データを報告し：結晶質ラパマイシンは４０８時間（１７日）後に同じクロマトグラフィ純度を示すが、非晶質ラパマイシンは、クロマトグラフィ純度に−１４％の低下を示す。
【００３９】
【表１】
0005856769.tif 000006
【００４０】
本発明者らは、ラパマイシンのいくつかの合成誘導体（即ち、テムシロリムスおよびエベロリムス）で、およびピメクロリムスおよびタクロリムスでも同じ分解が生じることを確認した。
【００４１】
これら安定性の問題を克服するために、本発明者らは、市販のシクロデキストリンと、このファミリーのいくつかの化合物の中でαシクロデキストリン（αＣＤ）、βシクロデキストリン（βＣＤ）、およびγシクロデキストリン（γＣＤ）との複合体の形成を通して、分解からこれらマクロライドを安定化させる可能性について研究することを決定した。これら環状オリゴ糖は、１→４結合された６、７、および８個のα−Ｄ−グルコピラノシド単位からなるという共通の特徴を有する。
【００４２】
シクロデキストリンの存在下での、これらマクロライドのＨＰＬＣクロマトグラフィ移動度に関する予備研究は、これらマクロライドとシクロデキストリンとの相互作用が非常に弱いことを確認する。
【００４３】
本発明者により評価された第１のマクロライドは、αシクロデキストリン（αＣＤ）、βシクロデキストリン（βＣＤ）、およびγシクロデキストリン（γＣＤ）に吸着されたラパマイシンであった。
【００４４】
これらの複合体を調製するために、ラパマイシンを、有機溶媒に、好ましくは、アセトン、メタノール、およびエタノールの間から選択された極性有機溶媒に溶解し、次いでこれら溶液をシクロデキストリンと混合した。水溶性複合体を得るために、ラパマイシン、またはその誘導体の１種と、シクロデキストリンとの重量比は、有利には、１：１００から１：４００の間、より好ましくは１：１１１から１：３３３の間に含まれている。次いで得られた不均一混合物を、真空中で慎重に蒸発させて、複合体を固体粉末として得、次いで湿潤固体粉末を真空乾燥した。
【００４５】
ラパマイシンおよびシクロデキストリンの不均一混合物の真空蒸発の適切な代替例は、噴霧乾燥器技法で、懸濁液の直接濾過によって、または凍結乾燥によって実現させた。前記濾過は、前記不均一混合物を有機溶媒で、好ましくは非極性有機溶媒で、より好ましくはＣ5〜Ｃ8直鎖状または分岐状炭化水素で希釈することによって、任意選択で行うことができる。
【００４６】
得られた複合体を、まず、２０〜２５℃の溶液中および−２０℃で貯蔵された固体粉末として、安定性に関して評価した。
【００４７】
溶液（水／アセトニトリル  １／１  ｖ／ｖ混合物）中での安定性データは、評価されたシクロデキストリン複合体の中で、γＣＤ複合体は、時間ゼロでラパマイシンのより高い含量を示し；さらにγＣＤおよびβＣＤ複合体は、２０〜２５℃の溶液中で１９日後に、初期アッセイ値からの低下を示さないが、同じ貯蔵条件において、αＣＤ複合体は、アッセイ値に−２４％の低下を示す（実験セクションの表２）ことを示している。
【００４８】
２６日後に、−２０℃で貯蔵された固体複合体（粉末）で得られた安定性データは、αＣＤに関してアッセイ値に−１２％の低下を示し、βＣＤに関して−５．４％の低下を示すが、γＣＤ複合体のラパマイシン含量は、同じ実験条件で変化しない（実験セクションの表３）。
【００４９】
驚くべきことに、１および２個のα−Ｄ−グルコピラノシド単位のみ異なる用いられたシクロデキストリンの化学的類似性にも関わらず、ラパマイシンとのγＣＤ複合体のみが、溶液中および固体形態の両方で良好な安定性データを示した。
【００５０】
これら予備データはさらに、固体状態（粉末）で、異なる貯蔵条件：２５℃（相対湿度６０％）および４０℃（相対湿度７５％）で５および１５日後（実験セクションの表４および５）で確認した。
【００５１】
したがって、ラパマイシンγＣＤ複合体が、２５℃および４０℃の両方でαおよびβＣＤ複合体よりも安定であっただけではなく、４０℃でのγＣＤ複合体からのラパマイシンの放出は、ほぼ定量的であることを確認した（ＣＤに投入されたラパマイシンの回収の９５％）。
【００５２】
これらのデータに基づいて、本発明者らは驚くべきことに、本発明者らの実験条件で、γＣＤのみが溶液状態および固体状態の両方で分解からラパマイシンを安定化させることができ、一方αおよびβＣＤ複合体とラパマイシンとの複合体は、不安定であることを見出した。
【００５３】
文献データは、γＣＤとの不安定な複合体の形成を通した分解からラパマイシンを安定化させる可能性について、記述していない。さらに、γシクロデキストリンのこの独特の挙動は、構造的観点から非常に類似しておりかつしばしば製剤目的で利用するのに等価であると見なされる親化合物αおよびβＣＤとは、全く異なっている。
【００５４】
γＣＤとの複合体を通した、分解に対してラパマイシンを安定化させるこの可能性について、本発明者らはエベロリムス、テムシロリムス、タクロリムス、およびピメクロリムスに関してさらに探究し、これら構造的に関連ある化合物は共通する挙動を有することを示しており；一方、非晶質形態または細かく微粉化された（即ち、粒度分布が１０-5ミクロンである、）純粋な化合物は不安定であり、対応するγＣＤ複合体は溶液状態および固体状態の両方で安定であることを示している。
【００５５】
図３および表７において、本発明者らは、エベロリムス複合体対非晶質エベロリムスの安定性データを報告し：６０℃で９６時間後の、エベロリムス複合体に関する分解関連副生成物の増加は＋３６％であり、一方、非晶質エベロリムスに関しては＋５１３％である。類似データが、γＣＤテムシロリムス複合体およびγＣＤピメクロリムス複合体に関して得られた。
【００５６】
これら複合体に関して行われた分析データは、ＨＰＬＣ／ＭＳ、ＨＰＬＣ／ＵＶによる特徴付け（図４〜１３参照）およびＸ線回折データ（ＤＲＸ；図１４〜２３参照）を含み：これら分析データは、用いられた吸収技法がマクロライドおよび固体状態のγＣＤの純度プロファイルを変更せず、一方、溶媒処理後に評価したマクロライドの全ては、大部分が非晶質形態であることを裏付けている。得られた複合体から生成されたＤＲＸデータは、マクロライドが、その大部分を非晶質形態として存在していることを裏付けている。
【００５７】
最後に、試験がなされたγＣＤとのマクロライド複合体の全てに関し、本発明者らは、下記の表８に示されるように、当初のマクロライドからの、水溶性の感知可能な増加を確認した。
【００５８】
【表２】
0005856769.tif 000007
【００５９】
実験セクション
材料および方法
ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、タクロリムス、およびピメクロリムスを、ＰＯＬＩ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡ  ＣＨＩＭＩＣＡ  ＳｐＡにより調製した。αシクロデキストリン（αＣＤ）、βシクロデキストリン（βＣＤ）、およびγシクロデキストリン（γＣＤ）は、Ｆｌｕｋａから購入した。
【００６０】
ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、タクロリムス、およびピメクロリムスに関するアッセイおよび純度を測定するのに使用されるＨＰＬＣ法を、本明細書で報告する。
【００６１】
ラパマイシンのクロマトグラフィ純度のＨＰＬＣ測定：カラム：Ｔｈｅｒｍｏ  ＢＤＳ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｃ１８；３μｍ（１００×４．６ｍｍ）。移動相組成物：定組成溶液
・成分Ａ：アセトニトリル５０％
・成分Ｂ：酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５．８（酢酸アンモニウムの濃度０．８ｇ／ｌ；最終ｐＨ値は、氷酢酸で５．８の最終値にした。）５０％
流量：１．０ｍｌ／分。カラム温度：５５℃。注入体積：１００μｌ。サンプル溶液：ラパマイシン２５ｍｇを計量し、アセトニトリル／水  １／１  ｖ／ｖ  １００ｍｌ（最終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。ＵＶ検出器：２７８ｎｍ
【００６２】
ラパマイシンのＨＰＬＣアッセイ測定：カラム：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＢＤＳ−Ｃ１８；３μｍ（１００×４．６ｍｍ）。移動相組成物：定組成溶液
・成分Ａ：アセトニトリル５８％
・成分Ｂ：酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５．８（酢酸アンモニウムの濃度０．８ｇ／ｌ；最終ｐＨ値は、氷酢酸で５．８の最終値にした。）４２％
流量：１．５ｍｌ／分。カラム温度：５５℃。注入体積：３０μｌ
サンプルおよび標準溶液：アセトニトリル／水  １／１中、０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で母液を調製し、次いで移動相で希釈して、２０マイクログラム／ｍｌの最終濃度を得た。ＵＶ検出器：２７８ｎｍ。
【００６３】
テムシロリムスおよびエベロリムスのクロマトグラフィ純度のＨＰＬＣ測定：カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８；３．５μｍ（７５×４．６ｍｍ）、プレカラム：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８；５μｍ（２０×３．９ｍｍ）。
移動相組成物：
・成分Ａ：水９００ｍｌ、アセトニトリル１００ｍｌ、および５０％酢酸水溶液５０μｌ・成分Ｂ：アセトニトリル１０００ｍｌおよび５０％酢酸水溶液５０μｌ
勾配溶出：
【００６４】
【表３】
0005856769.tif 000008
【００６５】
ピメクロリムスのクロマトグラフィ純度のＨＰＬＣ測定：カラム：ＹＭＣ  ＯＤＳ  ＡＱ、５μｍ（２５０×４．６ｍｍ）。移動相組成物：７０／３０アセトニトリル／０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）で定組成溶出。流量：１．２ｍｌ／分。カラム温度：６０℃。サンプル温度１０℃。注入体積：１０μｌ。サンプル溶液：アセトニトリルに溶かしたピメクロリムスの０．５ｍｇ／ｍｌ溶液を調製。検出器ＵＶ：２１０ｎｍ
【００６６】
タクロリムスのクロマトグラフィ純度のＨＰＬＣ測定：カラム：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８；３．５μｍ（１５０×２．１ｍｍ）。移動相組成物：定組成溶出
・成分Ａ：０．１％酢酸水溶液５８％
・成分Ｂ：アセトニトリル１５％
・成分Ｃ：テトラヒドロフラン２７％
・流量：０．３ｍｌ／分。カラム温度：５０℃。注入体積：１０μｌ。
サンプル溶液：タクロリムス２５ｍｇを計量し、アセトニトリル／水  １／１  ｖ／ｖ  ２５ｍｌ（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。検出器ＵＶ：２７８ｎｍ
利用した質量分光計は、陽イオン化におけるイオントラップＡｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄ．６３００である。
【００６７】
利用した噴霧乾燥装置は、Ａｄｖａｎｃｅ不活性ループＢ−２９５機器を備えたＢｕｃｈｉモデルＢ２９０である。
【００６８】
ＤＲＸスペクトル（粉末）を、５０００から６００００の開始角［１／２  ２θ］から、回折計（ＰＷ１７１０  Ｐｈｉｌｉｐｓ）を使用して記録した。回折ダイアグラムを、サンプルのいかなる処理も行わずにＣｕアノードを用いて得た（Ｋα＝１．５４０６０ÅおよびＫα＝１．５４４３９Å）。
【実施例１】
【００６９】
乾燥による再構成可能な固体ラパマイシン／シクロデキストリン複合体の調製（溶媒としてエタノール９５％）
エタノール（９６％）に溶かしたラパマイシンの０．４％ｗ／v溶液を、シクロデキストリン粉末に添加した。ラパマイシンとシクロデキストリンとの最終的な相対比を、表２および３に報告する。
【００７０】
この懸濁液を、３０分間撹拌しながら２０〜２５℃に維持し、次いで得られた混合物を、エタノールを除去するために１８時間真空乾燥した。乾燥固体粉末を、窒素雰囲気下で−２０℃で貯蔵した。
【００７１】
表２において、溶液状態（１／１  水／アセトニトリル混合物）にあるラパマイシン／ＣＤ複合体のアッセイデータ（ＨＰＬＣデータ）を、２０〜２５℃で、ｔ＝０および１９日後に報告する。
【００７２】
【表４】
0005856769.tif 000009
【００７３】
【表５】
0005856769.tif 000010
【００７４】
【表６】
0005856769.tif 000011
【００７５】
【表７】
0005856769.tif 000012
【実施例２】
【００７６】
乾燥による再構成可能な固体ラパマイシン／シクロデキストリン複合体の調製（溶媒としてアセトン）
アセトンにラパマイシンを溶かした０．４％ｗ／ｖ溶液を、γシクロデキストリンに添加した。ラパマイシンとシクロデキストリンとの最終的な相対比は、０．６％ｗ／ｗであった。得られた懸濁液を、撹拌しながら３０分間２０〜２５℃に維持した。得られた混合物を、アセトンを除去するために１８時間真空乾燥した。任意選択で、湿潤固体を、ｎ−ヘプタンを用いた懸濁液の希釈および濾過によって回収してもよく；次いで乾燥器内に移してもよい。
【００７７】
乾燥固体粉末を、窒素雰囲気下で−２０℃で貯蔵した。
【００７８】
６０℃での、得られたラパマイシン／γＣＤ複合体（粉末）の安定性データを、乾燥エタノールおよびエタノール９６％を溶媒として使用して得られたものと比較し；得られたデータを、図２および表６にまとめた。特に、図２では、６０℃で６９６時間、粉末に関して行われた安定性試験中、分解によって生じた関連ある副生成物の合計（ＨＰＬＣデータ）を報告する。
【００７９】
【表８】
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【実施例３】
【００８０】
噴霧乾燥器による再構成可能な固体ラパマイシン／シクロデキストリン複合体の調製（溶媒としてアセトン）
アセトンに溶かしたラパマイシンの０．１％ｗ／ｖ溶液を、γシクロデキストリンに添加した。
【００８１】
ラパマイシンとシクロデキストリンとの最終的な相対比は、０．６％ｗ／ｗであった。得られた懸濁液を、撹拌しながら３０分間２０〜２５℃に維持した。
【００８２】
得られた懸濁液を、下記の実験条件で噴霧乾燥器で処理した：
・不活性窒素温度＝７０℃
・供給速度＝１７ｍｌ／分
・出口窒素温度＝５４℃
・アスピレーター速度＝８０％
・ノズルクリーニングの頻度＝２ショット／秒
【００８３】
得られた固体粉末を３０℃で８時間乾燥し、次いで窒素雰囲気下で−２０℃で貯蔵した。この複合体の特徴は、実施例２で得られた生成物に関して記述したものと同じである。
【００８４】
γＣＤエベロリムス複合体、γＣＤテムシロリムス複合体、γＣＤタクロリムス複合体、およびγＣＤピメクロリムス複合体の調製
これらの複合体を、実施例２および３のそれぞれに従い調製した。
【００８５】
γＣＤラパマイシン複合体、γＣＤエベロリムス複合体、γＣＤテムシロリムス複合体、γＣＤピメクロリムス複合体、γＣＤタクロリムス複合体、および出発材料として利用される、対応するマクロライドのＨＰＬＣ  ＵＶおよびＭＳデータ
全ての複合体のＨＰＬＣプロファイル（ＨＰＬＣおよびＵＶ検出器）を、図４〜８で収集した。各複合体ごとに、本発明者らは、実験セクションで記述された特定のＨＰＬＣクロマトグラフィ条件を利用した。
・図４．ラパマイシンγＣＤ複合体＝全イオン電流（ＴＩＣ）、ｍ／ｚ＝９５２での単イオン（カリウムとのラパマイシンの分子イオンの付加体；ｍ／ｚ＝９５２）、ｍ／ｚ＝１３１９での単イオン（ナトリウムとのγシクロデキストリンの付加体；ｍ／ｚ＝１３１９）
・図５．エベロリムスγＣＤ複合体＝全イオン電流（ＴＩＣ）、スペクトルＵＶ（２７８ｎｍ）、ｍ／ｚ＝１０２６での単イオン（カリウムとのエベロリムスの分子イオンの付加体）、ｍ／ｚ＝１２９７での単イオン（γシクロデキストリンの分子イオン）
・図６．テムシロリムスγＣＤ複合体＝全イオン電流（ＴＩＣ）、スペクトルＵＶ（２７８ｎｍ）、ｍ／ｚ＝１０４８での単イオン（アンモニアとのテムシロリムスの分子イオンの付加体）、ｍ／ｚ＝１２９７での単イオン（γシクロデキストリンの分子イオン）
・図７．ピメクロリムスγＣＤ複合体＝全イオン電流（ＴＩＣ）、スペクトルＵＶ（２１０ｎｍ）、ｍ／ｚ＝８４８での単イオン（カリウムとのピメクロリムスの分子イオンの付加体）、ｍ／ｚ＝１２９７での単イオン（γシクロデキストリンの分子イオン）
・図８．タクロリムスγＣＤ複合体＝全イオン電流（ＴＩＣ）、スペクトルＵＶ（２２０ｎｍ）、ｍ／ｚ＝１２９７での単イオン（γシクロデキストリンの分子イオン）、ｍ／ｚ＝８２２での単イオン（水とのタクロリムスの分子イオンの付加体）
【００８６】
ｔ＝０での、これらマクロライド複合体のＨＰＬＣ  ＵＶおよびＭＳクロマトグラフィプロファイルは、出発材料として利用された対応するマクロライドとは変わらないことがわかった。
【００８７】
ＣＤ複合体の調製で出発材料として利用された各マクロライドのＨＰＬＣ／ＭＳおよびＨＰＬＣ／ＵＶ分析を、本明細書に報告する。
・図９．ラパマイシン＝２３分で溶出された主なラパマイシン異性体の、全イオン電流（ＴＩＣ）、ＨＰＬＣ／ＵＶプロファイル、および質量スペクトル。
・図１０．エベロリムス＝２１分で溶出された主なエベロリムス異性体の、全イオン電流（ＴＩＣ）、ＨＰＬＣ／ＵＶプロファイル、および質量スペクトル。
・図１１．テムシロリムス＝２０分で溶出された主なテムシロリムス異性体の、全イオン電流（ＴＩＣ）、ＨＰＬＣ／ＵＶプロファイル、および質量スペクトル。
・図１２．ピメクロリムス＝２７分で溶出された主なピメクロリムス異性体の、全イオン電流（ＴＩＣ）、ＨＰＬＣ／ＵＶプロファイル、および質量スペクトル。
・図１３．タクロリムス＝１１分０秒で溶出された主なタクロリムス異性体の、全イオン電流（ＴＩＣ）、ＨＰＬＣ／ＵＶプロファイル、および質量スペクトル（同じく掲載のスペクトルにおいてｍ／ｚ＝８２２で水付加体およびｍ／ｚ＝８２６でナトリウムとの付加体が確認できる）。
【００８８】
γＣＤとのエベロリムス複合体の安定性
実施例２および３のそれぞれにより調製されたＣＤとのエベロリムス複合体に関する安定性データを、図３および表７に報告する。
【００８９】
特に、図３には、６０℃で９６時間、粉末で行われた安定性試験中の、分解によって生じた関連副生成物の合計（面積％を単位とするＨＰＬＣデータ）が報告されている。
【００９０】
【表９】
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【００９１】
γラパマイシン複合体、γＣＤエベロリムス複合体、γＣＤテムシロリムス複合体、γＣＤタクロリムス複合体、およびγＣＤピメクロリムス複合体の固体状態
ラパマイシン結晶質を噴霧乾燥器で処理した後（またはエタノールもしくはアセトン溶液から蒸発させた後）の、またγＣＤ（出発材料）、ラパマイシンγＣＤ複合体、結晶質ラパマイシン（出発材料）と、ピメクロリムス、テムシロリムス、タクロリムス、およびエベロリムスを噴霧乾燥器で処理した後（またはエタノールもしくはアセトン溶液から蒸発させた後）の固体状態を、図１４〜２３に報告する。これらの分析は、エタノールもしくはアセトン溶液からの蒸発後、これらマクロライドが非晶質形態にあることを裏付けている。γＣＤとの複合体のＤＲＸスペクトルは、図２２および下記の表９の両方で明示されるように、γＣＤの結晶質相が変化していないことを裏付けており、用いられた技法の分解能によれば、結晶質形態には微量のマクロライドも存在しない。
【００９２】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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