(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法が、
ａ）ＢＡＸポリペプチドのプロアポトーシス活性を活性化するのに適している条件下で、化合物を、当該ＢＡＸポリペプチドのα１螺旋；α２螺旋；α１−α２の間のループ；α６螺旋；並びにα４螺旋、α５螺旋、及びα８螺旋の選択残基；の１つ又はそれ以上の結合部位と接触させること；
ｂ）当該化合物が、配列番号１に記載のＢＡＸポリペプチドのアミノ酸配列のＧｌｕ１７、Ｇｌｎ１８、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３、Ａｒｇ３４、Ａｌａ３５、Ｇｌｙ３６、Ａｒｇ３７、Ｍｅｔ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｙ４０、Ｇｌｕ４１、Ａｌａ４２、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ａｌａ５４、Ｓｅｒ５５、Ｔｈｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ｌｙｓ５８、Ｌｅｕ５９、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｕ６１、Ｌｙｓ６４、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｌｅｕ１２２、Ｌｅｕ１２５、Ｔｈｒ１２７、Ｌｙｓ１２８、Ｖａｌ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｌｅｕ１３２、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６、Ａｒｇ１４７、Ｌｅｕ１４９、Ｇｌｙ１５０、Ｇｌｙ１５６、Ｇｌｙ１５７、Ｔｒｐ１５８、Ａｓｐ１５９、Ｌｅｕ１６１、Ｌｅｕ１６２に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基に結合することを確認すること；及び
ｃ）当該化合物による当該ＢＡＸポリペプチドの活性化を検出すること：
を含有してなり、
ここで、当該化合物とＢＡＸポリペプチドの結合部位との相互作用は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝；上部近傍ループ；下部近傍ループ；又はこれらの組み合わせ；の場所で起こる、
ＢＡＸポリペプチドのプロアポトーシス活性を活性化する化合物を同定する方法。
【請求項２】
化合物の結合が、ＢＡＸポリペプチドの１又はそれ以上の該アミノ酸残基のＮＭＲスペクトルのシフトを引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
方法が、前記ａ）、ｂ）及びｃ）の前に、さらに
ｄ）ＢＡＸポリペプチドの結合部位の三次元構造を提供すること（ここで、当該結合部位は、α１螺旋、α２螺旋、α１−α２の間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５、及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有している）；及び
ｅ）当該結合部位と化合物の間の結合相互作用をシミュレートすること（ここで、化合物とＢＡＸポリペプチドの結合部位との相互作用は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝、上部近傍ループ、下部近傍ループ、或いはこれらの組み合わせの場所で起こる）：
を含有してなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）の化合物が、表１の化合物、又は表１の化合物の結合親和性、活性、溶解性、又はその他の薬理学的特性を改善する誘導体から選択される化合物である、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）の検出が、
（Ａ）ＢＡＸポリペプチドのオリゴマー化；抗体によるＢＡＸポリペプチド配座異性体の検出；ミトコンドリアチトクロムｃ放出；リポソーム放出；細胞死；ミトコンドリア又は細胞の形態；ミトコンドリアのカルシウム流出；ミトコンドリアの膜貫通の定量；及びカスパーゼ３活性又はアネキシンＶ結合の定量；よりなる群から選ばれるアッセイを提供すること、並びに、
（Ｂ）最適化されたタンパク質発現及び精製条件、並びにモノマー、ダイマー又はオリゴマーの配座異性体及びそれらの種を安定化するポリペプチド変異体の作出により、ＢＡＸポリペプチドの収率及び安定性を最大化するように調製されたＢＡＸポリペプチドタンパク質をアッセイに使用すること、
を含有してなる、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
当該化合物が、ＢＡＸポリペプチドの結合部位における配列番号１に記載の配列のＬｙｓ２１に対応するアミノ酸残基と結合する、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
当該化合物が、ＢＡＸポリペプチドの結合部位における配列番号１に記載の配列のＭｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ａｌａ２４、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｎ３２、Ｇｌｕ１３１、Ａｒｇ１３４、Ｍｅｔ１３７、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基と結合する、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
当該化合物が、ＢＡＸポリペプチドの結合部位における配列番号１に記載の配列のＧｌｕ１７、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ｔｈｒ５６、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基と結合する、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００８年１０月１０日に出願された、米国仮特許出願第６１／１３６，９０６号の優先権を主張する。前記特許出願の開示はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。
【背景技術】
【０００２】
プログラム細胞死又はアポトーシスは、多細胞生物の正常な発育及びホメオスタシスに対する必須の生理的過程である（Thompson, C. B. (1995) Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease, Science 267, 1456-1462.; Jacobson, M. D., Weil, M., and Raff, M. C. (1997) Programmed cell death in animal development, Cell 88, 347-354）。アポトーシスは更に、細胞増殖を制御して、異常な、紛れ込んでいる、機能不全な、或いは有害な細胞を除去するための防御機構として機能する。アポトーシスの脱制御は、細胞増殖と細胞死の間のバランスを変えてしまい、癌（Adams, J. M., and Cory, S. (2007) The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy, Oncogene 26, 1324-1337）、自己免疫（Krammer, P. H. (2000) CD95's deadly mission in the immune system, Nature 407, 789-795）、神経変性疾患（Yuan, J., and Yankner, B. A. (2000) Apoptosis in the nervous system, Nature 407, 802-809）、及び心臓血管疾患（Kang, P. M., and Izumo, S. (2003) Apoptosis in heart: basic mechanisms and implications in cardiovascular diseases, Trends Mol Med 9, 177-182）などの多すぎる或いは少なすぎる細胞死を特徴とする多種の疾患の一因となる。過去２０年に渡るアポトーシスシグナル経路の集中的な研究は、その相互作用が細胞の生死の間の微妙なバランス保持する、プロアポトーシスとアンチアポトーシスのシグナル伝達ネットワークとして、ＢＣＬ−２タンパク質ファミリーを同定した（Danial, N. N., and Korsmeyer, S. J. (2004) Cell death: critical control points, Cell 116, 205-219; Youle, R. J., and Strasser, A. (2008) The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death, Nat Rev Mol Cell Biol 9, 47-59）。生化学及び遺伝子の研究は、ＢＣＬ−２タンパク質ファミリーのアポトーシス細胞死に関する「引き返し限界点」を調節する重要な役割を明らかにした。
【０００３】
ＢＣＬ−２ファミリーメンバーは、進化的に保存されていて、タンパク質相互作用を介してアポトーシスを調節するプロ及びアンチアポトーシスメンバーを含有している（Youle, R. J., and Strasser, A. (2008) The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death, Nat Rev Mol Cell Biol 9, 47-59）（図１）。ＢＣＬ−ＸＬ及びＢＣＬ−２などのアンチアポトーシスタンパク質は、プロアポトーシスタンパク質を阻害して細胞死を防ぎ、４つのＢＣＬ−２相同ドメイン（ＢＨ−１〜４）を共有している（図２）。ＢＡＸ及びＢＡＫなどのマルチドメインプロアポトーシスタンパク質は３つの保存ドメイン（ＢＨ１〜３）を共有して、活性化すると、ミトコンドリアに不可逆的な損傷を負わせる（Wei, M. C., Zong, W. X., Cheng, E. H., Lindsten, T., Panoutsakopoulou, V., Ross, A. J., Roth, K. A., MacGregor, G. R., Thompson, C. B., and Korsmeyer, S. J. (2001) Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death, Science (New York, N.Y 292, 727-730; Green, D. R. (2005) Apoptotic pathways: ten minutes to dead, Cell 121, 671-674）。プロアポトーシスタンパク質のサブグループは保存ＢＨ３ドメインのみを共有している。これらの「ＢＨ３−オンリー」プロアポトーシスタンパク質は、細胞全体に位置していて、生理的なストレス或いは細胞傷害の条件下でマルチドメインメンバーへ死のシグナルを送達する態勢にある、死のメッセンジャーとして機能する（Letai, A., Bassik, M. C., Walensky, L. D., Sorcinelli, M. D., Weiler, S., and Korsmeyer, S. J. (2002) Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics, Cancer Cell 2, 183-192; Chen, L., Willis, S. N., Wei, A., Smith, B. J., Fletcher, J. I., Hinds, M. G., Colman, P. M., Day, C. L., Adams, J. M., and Huang, D. C. (2005) Differential targeting of prosurvival Bcl-2 proteins by their BH3-only ligands allows complementary apoptotic function, Mol Cell 17, 393-403）。アポトーシス刺激及び細胞状況の特質に応じて、ＢＨ３−オンリータンパク質の死のシグナルは、アンチアポトーシスタンパク質によって中和されるか、或いはミトコンドリア致死因子ＢＡＸ及びＢＡＫへ直接送達されることになる。ＢＡＸ及びＢＡＫはミトコンドリア外膜の透過性上昇を誘発する細胞死への道を示す（Wei, M. C., Zong, W. X., Cheng, E. H., Lindsten, T., Panoutsakopoulou, V., Ross, A. J., Roth, K. A., MacGregor, G. R., Thompson, C. B., and Korsmeyer, S. J. (2001) Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death, Science 292, 727-730）。ミトコンドリア外膜が透過性になると、多数のミトコンドリア因子がサイトゾル内に放出される。これらアポトーシス因子の１つである、チトクロムＣは、アポトソームと呼ばれるサイトゾル複合体の重要な因子であり（Riedl, S. J., and Salvesen, G. S. (2007) The apoptosome: signalling platform of cell death, Nat Rev Mol Cell Biol 8, 405-413）、これはカスパーゼ−９を活性化して、死のプログラムの不可逆的執行をもたらす（Li, P., Nijhawan, D., Budihardjo, I., Srinivasula, S. M., Ahmad, M., Alnemri, E. S., and Wang, X. (1997) Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade, Cell 91, 479-489; Luo, X., Budihardjo, I., Zou, H., Slaughter, C., and Wang, X. (1998) Bid, a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors, Cell 94, 481-490）。
【０００４】
リンパ腫の染色体分断点ｔ（１４；１８）にあるタンパク質ＢＣＬ−２の発見は、癌細胞が細胞死に耐えるために利用していること、すなわち、ＢＣＬ−２活着タンパク質の過剰発現及び致死因子タンパク質ＢＡＸ／ＢＡＫの隔離という戦略を明らかにした。ＢＣＬ−２のファミリーメンバーは、細胞生存又は細胞死を決定する岐路で作動するので、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質活性を調節する標的薬剤の開発は、無秩序な細胞生存又は早期細胞死の疾患における細胞死を、それぞれ治療的に誘発又は阻害する可能性をもたらすだろう。我々は以前に、ＢＣＬ−２ファミリーの天然ペプチド断片を、細胞内のＢＣＬ−２ファミリーメンバーを選択的に同定して標的にできる、ＢＣＬ−２の安定化したα−螺旋ドメイン（Stabilized Alpha-Helices of BCL-2 domains ；ＳＡＨＢｓ）と呼ばれる、薬理学的構成要素に変換する、「炭化水素架橋」と呼ばれる新規な技術を開発して利用した（Walensky, L. D., Kung, A. L., Escher, I., Malia, T. J., Barbuto, S., Wright, R. D., Wagner, G., Verdine, G. L., and Korsmeyer, S. J. (2004) Activation of apoptosis in vivo by a hydrocarbon-stapled BH3 helix, Science (New York, N.Y 305, 1466-1470））。我々は、劇的に増強されたα−螺旋構造、タンパク分解安定性、細胞透過性、及び強力で選択的な標的結合親和性を含む、固有の生物物理学的特性を有するＳＡＨＢを開発した。この化合物の離散サブセットは、必須ミトコンドリア致死因子タンパク質ＢＡＸと結合する際立った能力を明らかにした（Walensky, L. D., Pitter, K., Morash, J., Oh, K. J., Barbuto, S., Fisher, J., Smith, E., Verdine, G. L., & Korsmeyer, S. J. (2006) Molecular Cell 24, 199-210）。
【０００５】
この発見が、ＮＭＲ分光法を用いて架橋ＢＩＭ ＢＨ３ペプチドとＢＡＸの間の相互作用に関する構造的基盤の検討を促進させた。この検討を進める中で、その直接活性化のためのＢＡＸの明白な結合部位を初めて同定した（Gavathiotis, E., Suzuki, M., Davis, M. L., Pitter, K., Bird, G. H., Katz, S. G., Tu, H.-C., Kim, H., Cheng, E. H.-Y., Tjandra, N., Walensky, L.D. (2008) Nature、印刷中）。ＢＡＸの活性化を誘発するメカニズムは細胞死分野の長年に渡る謎であって激しい議論の主題であった。ＢＡＸ上のこの相互作用部位の位置は予測できないものであった。そしてＢＣＬ−２ファミリータンパク質につぃての新規な相互作用メカニズム、及びＢＡＸが直接関与する細胞死を調節するための新規な治療標的の両方を明確にしている。新規部位の遮断がＢＡＸ誘発細胞死を効果的に抑制する一方で、リガンド関与はＢＡＸ介在アポトーシスを誘発できる。
【０００６】
従って、ＢＡＸ活性化部位の同定は、無秩序な細胞生存又は病的な細胞死によって特徴づけられるヒトの疾患におけるアポトーシスをそれぞれ活性化又は阻害する薬剤の開発に対して重要な意味を有している。ＢＡＸは３つの公知の同種プロアポトーシスマルチドメインＢＣＬ−２ファミリーメンバーのうちの１つにすぎないので、ＢＡＸの直接誘発部位の暗示するものをプロアポトーシスＢＡＫ及びＢＯＫへ同様に拡張できるだろう。
【発明の概要】
【０００７】
一態様では、本発明は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法を提供し、その方法は：
ａ）当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドを、当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性を調節するのに適している条件下で、化合物と接触させること；及び
ｂ）化合物による当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性の調節を検出すること：
を含有してなり、
ここで、化合物は、当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのα１螺旋、α２螺旋、α１−α２の間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５、及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有している結合部位と相互作用し；
ここで、化合物の結合部位との相互作用は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝、上部近傍ループ、下部近傍ループ、或いはこれらの組み合わせの場所で起こる。
【０００８】
別の態様では、本発明は、ＢＡＸポリペプチドのプロアポトーシス活性を活性化する化合物を同定する方法を提供し、その方法は：
ａ）当該ＢＡＸポリペプチドの結合部位（ここで結合部位は、α１螺旋、α２螺旋、α１−α２の間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５、及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有している）を、当該ＢＡＸポリペプチドのプロアポトーシス活性を活性化するのに適している条件下で、化合物と接触させること；及び
ｂ）当該化合物による当該ＢＡＸポリペプチドの活性化を検出すること：
を含有してなり、
ここで、当該化合物は、配列番号１に記載の配列のＧｌｕ１７、Ｇｌｎ１８、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３、Ａｒｇ３４、Ａｌａ３５、Ｇｌｙ３６、Ａｒｇ３７、Ｍｅｔ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｙ４０、Ｇｌｕ４１、Ａｌａ４２、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ａｌａ５４、Ｓｅｒ５５、Ｔｈｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ｌｙｓ５８、Ｌｅｕ５９、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｕ６１、Ｌｙｓ６４、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｌｅｕ１２２、Ｌｅｕ１２５、Ｔｈｒ１２７、Ｌｙｓ１２８、Ｖａｌ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｌｅｕ１３２、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６、Ａｒｇ１４７、Ｌｅｕ１４９、Ｇｌｙ１５０、Ｇｌｙ１５６、Ｇｌｙ１５７、Ｔｒｐ１５８、Ａｓｐ１５９、Ｌｅｕ１６１、又はＬｅｕ１６２に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基と結合し、そして
ここで、化合物の結合部位との相互作用は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝、上部近傍ループ、下部近傍ループ、或いはこれらの組み合わせの場所で起こる。
【０００９】
別の態様では、本発明は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの候補モジュレータを同定する方法を提供し、方法は：
ａ．当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの結合部位の三次元構造を用いて（ここで、当該結合部位は、α１螺旋、α２螺旋、α１−α２の間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５、及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有している）、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド相互作用テンプレートを形成すること；及び
ｂ．当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド相互作用テンプレートを用いて、当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド候補モジュレータを選択すること（ここで、当該候補モジュレータは当該結合部位に結合する）：
を含有してなり、
ここで、候補モジュレータの結合部位との相互作用は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝、上部近傍ループ、下部近傍ループ、或いはこれらの組み合わせの場所で起こる。
【００１０】
別の態様では、本発明は、ＢＡＸポリペプチドのプロアポトーシス活性を活性化する候補化合物を同定する方法を提供し、方法は：
ａ．ＢＡＸポリペプチドの結合部位の三次元構造を提供すること（ここで、当該結合部位は、α１螺旋、α２螺旋、α１−α２の間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５、及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有している）；
ｂ．当該結合部位と化合物の間の結合相互作用をシミュレートすること（ここで、化合物の結合部位との相互作用は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝、上部近傍ループ、下部近傍ループ、或いはこれらの組み合わせの場所で起こる）；及び
ｃ．当該化合物が、当該結合部位にある配列番号１に記載の配列のＧｌｕ１７、Ｇｌｎ１８、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３、Ａｒｇ３４、Ａｌａ３５、Ｇｌｙ３６、Ａｒｇ３７、Ｍｅｔ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｙ４０、Ｇｌｕ４１、Ａｌａ４２、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ａｌａ５４、Ｓｅｒ５５、Ｔｈｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ｌｙｓ５８、Ｌｅｕ５９、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｕ６１、Ｌｙｓ６４、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｌｅｕ１２２、Ｌｅｕ１２５、Ｔｈｒ１２７、Ｌｙｓ１２８、Ｖａｌ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｌｅｕ１３２、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６、Ａｒｇ１４７、Ｌｅｕ１４９、Ｇｌｙ１５０、Ｇｌｙ１５６、Ｇｌｙ１５７、Ｔｒｐ１５８、Ａｓｐ１５９、Ｌｅｕ１６１、又はＬｅｕ１６２よりなる群から選ばれるアミノ酸残基と結合するか否かを確認すること（ここで、結合部位の当該アミノ酸残基と結合する当該化合物は当該候補化合物である）：
を含有してなる。
【００１１】
一態様では、本発明は、対象における疾患を治療する方法を提供し、方法は、治療を必要とする当該対象に、上記方法の何れか１つによって同定された化合物の、当該対象が当該疾患を治療されるような、有効量を投与することを含有してなる。
【００１２】
別の態様では、本発明は、対象における疾患を治療する方法を提供し（ここで、対象は当該疾患の治療を必要としていると確認されている）、方法は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド又はＢＡＸの結合部位と結合する、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法によって同定された化合物（ここで、当該結合部位は、α１螺旋、α２螺旋、α１−α２の間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５、及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有していて、当該化合物はＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド又はＢＡＸを調節する）の、当該対象が当該疾患を治療されるような、有効量を投与することを含有してなる。
【００１３】
ある特定の態様では、本発明は、対象における癌又は腫瘍を治療する方法を提供し（ここで、対象は当該疾患の治療を必要としていると確認されている）、方法は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドと結合する化合物の有効量を当該対象に投与することを含有してなる（ここで、当該結合部位は、α１螺旋、α２螺旋、α１−α２の間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５、及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有していて、当該化合物はＢＡＸポリペプチドのプロアポトーシス活性を活性化し、当該化合物は配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基Ｇｌｕ１７、Ｇｌｎ１８、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３、Ａｒｇ３４、Ａｌａ３５、Ｇｌｙ３６、Ａｒｇ３７、Ｍｅｔ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｙ４０、Ｇｌｕ４１、Ａｌａ４２、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ａｌａ５４、Ｓｅｒ５５、Ｔｈｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ｌｙｓ５８、Ｌｅｕ５９、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｕ６１、Ｌｙｓ６４、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｌｅｕ１２２、Ｌｅｕ１２５、Ｔｈｒ１２７、Ｌｙｓ１２８、Ｖａｌ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｌｅｕ１３２、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６、Ａｒｇ１４７、Ｌｅｕ１４９、Ｇｌｙ１５０、Ｇｌｙ１５６、Ｇｌｙ１５７、Ｔｒｐ１５８、Ａｓｐ１５９、Ｌｅｕ１６１、又はＬｅｕ１６２の１つ又はそれ以上と結合し、結合部位は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝、上部近傍ループ、下部近傍ループ、或いはこれらの組み合わせの場所で起こる）。
【００１４】
一態様では、本発明は、ＢＣＬ−２関連疾患を治療するための組成物を提供し、ここで当該組成物は：
ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの結合部位と結合する化合物（ここで、当該結合部位は、α１螺旋、α２螺旋、α１−α２の間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５、及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有していて、当該化合物はＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性を調節し、化合物は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝、上部近傍ループ、下部近傍ループ、或いはこれらの組み合わせの場所で結合部位と相互作用する）；及び
有機化合物、ポリペプチド及び核酸又はそれらの組み合わせから選ばれる第２化合物：
を含有してなる（ここで、組成物はＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの結合部位と結合する）。
【００１５】
上記のような組成物及び使用説明書を含有してなるキットも本発明によって意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質の３つの異なった種類がどのようにしてアポトーシスを調節するために相互作用しているかを図示している。
【図２】図２は、選択したＢＣＬ−２ファミリーメンバーのリストを示し、それらの保存ＢＣＬ−２相同（ＢＨ）ドメインを強調している。
【図３】図３は、アンチアポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバーのＢＨ３結合ポケットを図示している。
【図４】図４は、ＢＡＸの直接活性化で始まり、ＢＡＸ介在ミトコンドリア損傷に終わる、一連の事象を説明している。
【図５】図５は、ＮＭＲ分析で確認した、ＢＡＸ上の新たに同定されたＢＨ３相互作用部位の位置を明示している。重要なことは、ＢＩＭ ＳＡＨＢが、アンチアポトーシスタンパク質に対して同定されて図３に示されている標準的なＢＨ３結合部位とは異なっている構造位置でＢＡＸを取り込むことである。
【図６】図６は、ＢＩＭ ＳＡＨＢ−ＢＡＸ相互作用のＮＭＲ分析によって確認した、ＢＡＸ上の新規なＢＨ３相互作用部位のトポグラフィー（Ａ）及びＢＡＸ結合部位におけるＢＩＭ ＢＨ３の位置付けのトポグラフィー（Ｂ）を明示している。
【図７】図７は、ＢＡＸ上の新規なＢＨ３結合部位の残基を強調した、ＢＡＸのアミノ酸配列を示す（Ａ）。ＢＡＸのリボン図（Ｂ）及び表面図（Ｃ）において、ＢＩＭ ＢＨ３相互作用に関与するＢＡＸ残基を強調している。
【図８】図８は、ＢＡＸ活性化因子ＢＨ３ペプチド、及び炭化水素架橋誘導体の配列を列挙している。
【図９】図９は、新規な相互作用部位の仮想スクリーンから同定した分子が、いかに水平な疎水性の溝（Ａ）、上部近傍ループ領域（Ｂ）、及び下部近傍ループ領域（Ｃ）を修飾するかを示している。
【図１０】図１０は、ＢＡＸ上の新規なＢＨ３結合部位又はその隣接部位におけるリガンド相互作用に関連している残基を強調してある、ＢＡＸのアミノ酸配列を示す（Ａ）。ＢＡＸのリボン図（Ｂ）及び表面図（Ｃ）において、リガンド相互作用に関与するＢＡＸ残基を強調している。
【図１１】図１１は、仮想スクリーンによって同定された化合物が新規な相互作用部位でのＢＡＸ結合に対して、効果的且つ用量依存的にＦＩＴＣ−ＳＡＨＢと競合することを明らかにしている、競合的蛍光偏光結合アッセイを示している。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＢＩＭ ＳＡＨＢなどの、直接ＢＡＸ活性化化合物を適用して、ＢＡＸのそのモノマーからオリゴマー状態への変換をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってモニタリングすることを含むＢＡＸオリゴマー形成アッセイを示している。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、仮想スクリーンにより同定された化合物が、如何にこのＢＡＸオリゴマー形成アッセイによって検出されるようなＢＡＸオリゴマー形成を誘発するかを示している。
【図１３】図１３は、仮想スクリーンにより同定された化合物が、如何に動的光散乱を用いるＢＡＸモノマーのそのオリゴマーへの変換よって検出されるような、ＢＡＸオリゴマー形成を誘発するかを示している。
【図１４】図１４は、仮想スクリーンにより同定された化合物が、如何にＥＬＩＳＡアッセイによって検出されるような、Ｂａｘ−１−Ｂａｋ−１−ミトコンドリアからの組み換えＢＡＸ介在チトクロムＣ放出を誘発するかを示している。
【図１５】図１５は、同定された化合物５２８５７３８（Ａ）及び５２５８０７９（Ｂ）が、如何にＤＫＯ ＭＥＦｓではなく、ＢＡＸが再構築したＢａｘ−１−Ｂａｋ−１−マウス胚線維芽細胞（ＤＫＯ ＭＥＦ）における用量依存性アポトーシスを選択的に誘発するかを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｉ．定義
本明細書で用いられる用語「ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド」は、わずか１つから４つもの数の保存性ＢＣＬ−２相同ドメイン（ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３及び／又はＢＨ４９を有しているタンパク質の進化的に保存されているファミリーを示す。ＢＨドメインはα螺旋断片であって、ＢＣＬ−２ファミリーのアンチアポトーシス及びプロアポトーシスポリペプチドの両方に存在している。ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドは、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗ、ＭＣＬ−１、ＢＣＬ−Ｂ、Ａ１／ＢＦＬ−１、ＢＯＯ／ＤＩＶＡ、Ｎｒ−１３、ＣＥＤ−９、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＯＫ／ＭＴＤ、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＩＫ／ＮＢＫ、ＢＬＫ、ＨＲＫ、ＢＩＭ／ＢＯＤ、ＢＮＩＰ３、ＮＩＸ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＥＧＬ−１、及び、これに限定されないが、ＭｌｌＬ及びＥｌＢ−１９Ｋを包含する、ウィルス性同族体を包含する。
【００１８】
用語「活性部位」は、その形状、アミノ酸含量、及び荷電電位の結果として、他の化学物質（これに限定されないが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、分子、核酸、化合物、抗生物質又は薬剤、又はこれらの組み合わせを包含する）と、多種の共有及び／又は非共有結合力によって有利に相互作用又は結合する、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの領域を示す。「活性部位」は、ヒト炭化水素架橋ＢＩＭ ＢＨ３（配列番号３）などの、ＢＣＬ−２ドメインの安定化α螺旋を結合できる荷電した親水性残基の周辺によって囲まれ、そしてＢＡＸのα螺旋１及び６の並列によって形成される疎水性の溝を包含する。一態様では、活性部位は、配列番号１に記載の配列のＧｌｕ１７、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ｔｈｒ５６、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６に対応する２つ又はそれ以上のアミノ酸を含有する。
【００１９】
用語「結合部位」は、その形状、アミノ酸含量、及び荷電電位の結果として、他の化学物質（これに限定されないが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、分子、核酸、化合物、抗生物質又は薬剤を包含する）と、多種の共有及び／又は非共有結合力によって有利に相互作用又は結合する、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの領域を示す。「結合部位」は、配列番号１に記載の配列のＧｌｕ１７、Ｇｌｎ１８、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３、Ａｒｇ３４、Ａｌａ３５、Ｇｌｙ３６、Ａｒｇ３７、Ｍｅｔ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｙ４０、Ｇｌｕ４１、Ａｌａ４２、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ａｌａ５４、Ｓｅｒ５５、Ｔｈｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ｌｙｓ５８、Ｌｅｕ５９、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｕ６１、Ｌｙｓ６４、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｌｅｕ１２２、Ｌｅｕ１２５、Ｔｈｒ１２７、Ｌｙｓ１２８、Ｖａｌ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｌｅｕ１３２、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６、Ａｒｇ１４７、Ｌｅｕ１４９、Ｇｌｙ１５０、Ｇｌｙ１５６、Ｇｌｙ１５７、Ｔｒｐ１５８、Ａｓｐ１５９、Ｌｅｕ１６１、Ｌｅｕ１６２に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸を含有する。
【００２０】
用語「ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失又は置換によって、参照ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドとは異なっているポリペプチドを示す。幾つかのアミノ酸を、本明細書の以下に記載されているように、ポリペプチドの活性の本質を変えずに、ほぼ同一の特性を有している別のものに変えることができる（同類置換）ということは当該技術分野でよく理解されている。従って、本明細書で用いられるＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド変異体は、プロ−又はアンチアポトーシス活性を有しているポリペプチドを包含する。
用語「変異体」は、タンパク質にある参照ＢＣＬ−２相同ドメイン又はそれらの別の何れかの機能的ドメインと少なくとも３０％アミノ酸配列同一性を有しているタンパク質を示す。より詳細には、用語「変異体」は、これに限定されないが、１）配列番号１に記載の配列のＧｌｕ１７、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ｔｈｒ５６、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６に対応する、少なくとも２つのＢＡＸアミノ酸残基の相対構造座標を含有している三次元構造によって特徴付けられる活性部位；又は２）配列番号１に記載の配列のＧｌｕ１７、Ｇｌｎ１８、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３、Ａｒｇ３４、Ａｌａ３５、Ｇｌｙ３６、Ａｒｇ３７、Ｍｅｔ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｙ４０、Ｇｌｕ４１、Ａｌａ４２、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ａｌａ５４、Ｓｅｒ５５、Ｔｈｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ｌｙｓ５８、Ｌｅｕ５９、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｕ６１、Ｌｙｓ６４、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｌｅｕ１２２、Ｌｅｕ１２５、Ｔｈｒ１２７、Ｌｙｓ１２８、Ｖａｌ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｌｅｕ１３２、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６、Ａｒｇ１４７、Ｌｅｕ１４９、Ｇｌｙ１５０、Ｇｌｙ１５６、Ｇｌｙ１５７、Ｔｒｐ１５８、Ａｓｐ１５９、Ｌｅｕ１６１、Ｌｅｕ１６２に対応する、少なくとも１つのＢＡＸアミノ酸残基の相対構造座標を含有している三次元構造によって特徴付けられる活性部位：の何れかを含有しているＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドを包含し、何れの場合も、これらの残基の保存骨格原子からの＋／−ａ標準偏差は、１．１オングストローム未満、より好ましくは１．０オングストローム未満、そして最も好ましくは０．５オングストローム未満である。
【００２１】
「ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド変異体」は更に、ＢＣＬ−２相同ドメイン（例えば、ＢＨ３ドメイン）のアミノ酸配列と少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上類似しているアミノ酸配列を含有している、それらのポリペプチド、又はそれらの生物学的に活性な断片を包含する。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝」は、図６及び１０Ａに示されているような、ＢＡＸ上のＢＩＭ ＢＨ３相互作用部位の全て又は一部を含む、ＢＡＸ上のリガンド相互作用の領域を示す。
【００２３】
本明細書で用いる用語「上部近傍ループ」は、図１０Ｂに示されているような、α１−α２ループに近接して位置して、水平な疎水性の溝の中間点から上に伸長している残基を包含しているリガンド相互作用部位の部分を示す。
【００２４】
本明細書で用いる用語「下部近傍ループ」は、図１０Ｂに示されているような、α１−α２ループに近接して位置して、水平な疎水性の溝の中間点から下に伸長している残基を包含しているリガンド相互作用部位の部分を示す。
【００２５】
本明細書で用いる用語「α１−α２の間のループ」は、ＢＡＸのα螺旋１とα螺旋２の間に位置している残基を示す。
【００２６】
用語「疎水性パッチ」は、疎水性部分を結合する活性部位の部分を示す。一態様では、疎水性パッチは、１、２、３個又はそれ以上の疎水性アミノ酸残基を含有している。ある特定の態様では、疎水性ポケットは、配列番号１に記載の配列のＭｅｔ２０、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｌｅｕ４７、Ｖａｌ５０、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ｐｈｅ１４３に対応するアミノ酸残基を含有している。
【００２７】
用語「荷電／親水性パッチ」は、荷電しているか或いは親水性の部分を結合する活性部位の部分を示す。一態様では、荷電／親水性パッチは、１、２、３個又はそれ以上の荷電しているか或いは親水性のアミノ酸残基を含有している。ある特定の態様では、荷電／親水性パッチは、配列番号１に記載の配列のＧｌｕ１７、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３。Ａｓｐ４８、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ｔｈｒ５６、Ａｒｇ８９、Ｇｌｕ１３１、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ａｓｐ１４２、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６、Ａｒｇ１４７に対応するアミノ酸残基を含有している。
【００２８】
用語「疎水性アミノ酸」は、相対的に水に不溶性である、非荷電で非極性の側鎖を有している天然又は非天然のアミノ酸又はそれらの類似物の何れかを意味する。天然の疎水性アミノ酸の例は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンである。
【００２９】
用語「親水性アミノ酸」は、相対的に水溶性である、非荷電で極性の側鎖を有している天然又は非天然のアミノ酸又はそれらの類似物の何れかを意味する。天然の親水性アミノ酸の例は、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、及びシステインである。
【００３０】
用語「負に荷電したアミノ酸」は、通常の生理学的条件下で負に荷電する側鎖を有している天然の又は非天然のアミノ酸又はそれらの類似物の何れかを包含する。負に荷電している天然のアミノ酸の例はアスパラギン酸及びグルタミン酸である。
【００３１】
用語「正に荷電したアミノ酸」は、通常の生理学的条件下で正に荷電する側鎖を有している天然の又は非天然のアミノ酸又はそれらの類似物の何れかを包含する。正に荷電している天然のアミノ酸の例はアルギニン、リジン及びヒスチジンである。
【００３２】
用語「アンチアポトーシスポリペプチド」は、１つ又はそれ以上のアミノ酸相同ドメイン、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、及び／又はＢＨ４を有することによって特徴付けられ、そしてアポトーシスを減弱若しくは阻害して細胞の生存を促進する、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドを示す。「アンチアポトーシスポリペプチド」は更に、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド内のアンチアポトーシスＢＣＬ−２相同ドメインとアミノ酸配列が少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上類似している、タンパク質、又はそれらの生物学的に活性な断片を包含する。好ましい実施態様では、ＢＣＬ−２相同ドメインは、Ｂｃｌ−２（配列番号８）のＬｅｕ９７、Ｇｌｙ１０１及びＡｓｐ１０２に対応するアミノ酸残基などの、１つ又はそれ以上の保存アミノ酸残基を含有し：アンチアポトーシスポリペプチドは、これに限定されないが、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗ、ＭＣＬ−１、Ａ１／ＢＦＬ−１、ＢＣＬ−Ｂ、ＢＯＯ／ＤＩＶＡ、Ｎｒ−１３又はＣＥＤ−９を包含する。
【００３３】
用語「プロアポトーシスポリペプチド」は、１つ又はそれ以上のアミノ酸相同ドメイン、ＢＨ１、ＢＨ２、及び／又はＢＨ３を有することによって特徴付けられ、そしてアポトーシスを活性化して細胞死を促進する、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドを示す。「プロアポトーシスポリペプチド」は更に、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド内のプロアポトーシスＢＣＬ−２相同ドメインとアミノ酸配列が少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上類似している、タンパク質、又はそれらの生物学的に活性な断片を包含する。好ましい実施態様では、ＢＣＬ−２相同ドメインは、ＢＡＸ（配列番号１）のＬｅｕ９２、Ｇｌｙ９６及びＡｓｐ９７に対応するアミノ酸残基などの、１つ又はそれ以上の保存アミノ酸残基を含有する。プロアポトーシスポリペプチドは、これに限定されないが、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＯＫ／ＭＴＤ、ＢＩＤ ＢＡＤ、ＢＩＫ／ＮＢＫ、ＢＬＫ、ＨＲＫ、ＢＩＭ／ＢＯＤ、ＢＮＩＰ３、ＮＩＸ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ及びＥＧＬ−１を包含する。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「アポトーシス」は、エンドヌクレアーゼ活性、染色体移動、細胞核内の辺縁趨向、アポトーシス小体の形成、ミトコンドリアの膨張、ミトコンドリア稜の拡大、ミトコンドリア透過性転移孔の開口及び／又はミトコンドリアプロトン勾配の消失に関連していても関連していなくてもよい、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の断片化、クロマチンの凝縮などの、容易に観察可能な形態学的及び生化学的な変化によって特徴づけられる細胞死の選択的形態を誘導する、生化学的事象の制御されたネットワークを示す。
【００３５】
用語「化合物」は、化学物質、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせ、又は化学化合物及び／又はポリペプチド及び／又は核酸（例えば、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ誘導体）の混合物又は合成的組み合わせ、それらの塩及び溶媒和物、等を示すように本明細書で用いられている。好ましくは、本発明の化合物は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性部位に結合する。「モジュレータ」はＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性を調節する化合物である。
【００３６】
用語「候補化合物」は、本発明の方法で試験されて、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性部位と結合することが見出され、それによりＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性を調節すると考えられる、化学物質、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせ、又は化学化合物及び／又はポリペプチド及び／又は核酸の混合物又は合成的組み合わせ、それらの塩及び溶媒和物、等を示すように本明細書で用いられている。
【００３７】
化合物に関連して本明細書で用いられている用語「調節する」は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのアンチアポトーシス又はプロアポトーシスの活性、又は生化学的経路を制御するＢＣＬ−２ファミリーメンバーが関連するタンパク質−タンパク質相互作用（例えば、小胞体ストレス応答、グルコース刺激性インスリン分泌）の活性化又は阻害を示す。アンチアポトーシス、プロアポトーシス及びその他の生化学的活性（例えば、小胞体ストレス応答、グルコース刺激性インスリン分泌）の両方をアッセイする方法は当該技術分野で周知であって、本明細書に記載されている。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「相互作用する」又は「結合する」は、化合物又はそれらの部分と、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド又はそれらの部分の活性部位との間の近接の状態を示す。相互作用は、化合物上の１つ又はそれ以上の部分と、活性部位領域のアミノ酸上の１つ又はそれ以上の部分との間にある。結合は、非共有（ここで、並置が、水素結合、又はファン・デル・ワールス若しくは静電的相互作用によってエネルギー的に有利である）であっても、共有であってもよい。
【００３９】
用語「活性化する」は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのアンチアポトーシス又はプロアポトーシスの活性、或いはタンパク質−タンパク質相互作用に基づくその他の定義された生化学的な活性の増大を示す。プロアポトーシス活性を活性化する化合物は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性部位と結合して、その化合物を欠如している対照と比較したときに、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのプロアポトーシス活性を１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍又はそれ以上増大するだろう。別の実施態様では、アンチアポトーシス活性を活性化する化合物は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性部位と結合して、その化合物を欠如している対照と比較したときに、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのアンチポトーシス（生存）活性を１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍又はそれ以上増大するだろう。アンチアポトーシス及びプロアポトーシスの活性の活性化を評価するアッセイは当該技術分野で公知であって、本明細書に記載されている。
【００４０】
用語「阻害する」は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのアンチアポトーシス又はプロアポトーシスの活性、又はタンパク質−タンパク質相互作用に基づく別に定義された生化学的活性を減少又は遮断することを示す。例えば、プロアポトーシス活性を阻害する化合物は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性部位に結合して、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性化を抑制するか或いは活性を減少するだろう。従って、この化合物はプロアポトーシス活性の効果を阻害又は減少するだろう。従って、プロアポトーシス活性、例えば、細胞死が、化合物が存在していない対照の細胞集団と比較すると、阻害剤が存在している細胞の集団において、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又はそれ未満に少なくなるだろう。
【００４１】
アンチアポトーシス活性を阻害する化合物は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性部位又は結合部位と結合して、アンチアポトーシス活性を抑制又は阻害するだろう。従って、アンチアポトーシス活性、例えば、細胞の生存が、化合物が存在していない対照の細胞集団と比較すると、阻害剤が存在している細胞の集団において、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又はそれ未満に少なくなるだろう。
【００４２】
本明細書で用いられている用語「ＢＨ３ ＳＡＨＢ」は、安定化したα螺旋を形成するために炭化水素架橋されているＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのＢＣＬ-２相同ドメイン３を示す。多くのＢＨ３ドメインのアミノ酸配列が本明細書に記載されている。ＢＨ３ ＳＡＨＢを作る方法は当該技術分野において公知であって、２００４年１１月５日に出願された、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０２５０６８０号（これはその全てが参照により本明細書に取り込まれている）に記載されている。
【００４３】
本明細書で用いられている用語「ＢＩＭ ＢＨ３ポリペプチド」は、ＢＩＭのＢＣＬ−２相同ドメイン３を有しているポリペプチドを示す。一実施態様では、ＢＩＭ ＢＨ３ポリペプチドは、配列番号３に記載の配列（図８）と３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号２に記載の配列のＬｅｕ１５２、Ｇｌｙ１５６、及びＡｓｐ１５７に対応するアミノ酸残基又はこれらの同類置換の１つ又はそれ以上を包含している。好ましい実施態様では、ＢＩＭ ＢＨ３ポリペプチドは配列番号３のアミノ酸配列又はそれらのＳＡＨＢ誘導体（図８）を有している。
【００４４】
本明細書で用いられている用語「ＢＩＤ ＢＨ３ポリペプチド」は、ＢＩＤのＢＣＬ−２相同ドメイン３を有しているポリペプチドを示す。一実施態様では、ＢＩＤ ＢＨ３ポリペプチドは、配列番号５に記載の配列（図８）と３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号４に記載の配列のＬｅｕ９０、Ｇｌｙ９４、及びＡｓｐ９５に対応するアミノ酸残基又はこれらの同類置換の１つ又はそれ以上を包含している。好ましい実施態様では、ＢＩＤ ＢＨ３ポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列又はそれらのＳＡＨＢ誘導体（図８）を有している。
【００４５】
本明細書で用いられている用語「ＰＵＭＡ ＢＨ３ポリペプチド」は、ＰＵＭＡのＢＣＬ−２相同ドメイン３を有しているポリペプチドを示す。一実施態様では、ＰＵＭＡ ＢＨ３ポリペプチドは、配列番号７に記載の配列（図８）と３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号６に記載の配列のＬｅｕ１４１、Ａｌａ１４５、及びＡｓｐ１４６に対応するアミノ酸残基又はこれらの同類置換の１つ又はそれ以上を包含している。好ましい実施態様では、ＰＵＭＡ ＢＨ３ポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列又はそれらのＳＡＨＢ誘導体（図８）を有している。
【００４６】
本明細書で用いられている用語「ＢＡＸ ＢＨ３ポリペプチド」は、ＢＡＸのＢＣＬ−２相同ドメイン３を有しているポリペプチドを示す。一実施態様では、ＢＡＸ ＢＨ３ポリペプチドは、配列番号８に記載の配列（図８）と３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号１に記載の配列のＬｅｕ６３、Ｇｌｙ６７、及びＡｓｐ６８に対応するアミノ酸残基又はこれらの同類置換の１つ又はそれ以上を包含している。好ましい実施態様では、ＢＡＸ ＢＨ３ポリペプチドは配列番号８のアミノ酸配列又はそれらのＳＡＨＢ誘導体（図８）を有している。
【００４７】
本明細書で用いられる用語「ＢＡＸ活性化ＢＨ３コンセンサスポリペプチド」は、新規な相互作用部位におけるＢＡＸ結合のためのコンセンサス配列を含有しているポリペプチドを示す。一実施態様では、ＢＡＸ活性化ＢＨ３コンセンサスポリペプチドは、配列番号９に記載の配列（図８）と３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列又はそれらのＳＡＨＢ誘導体を有している。
【００４８】
用語「薬理学的有効量」、「治療有効量」、「薬理学的有効用量」又は単に「有効量」は、意図する薬理学的、治療的又は予防的結果を生じるのに有効な薬剤の量を示す。薬理学的有効量は、疾患の１つ又はそれ以上の症状の改善をもたらし、又は疾患の進行を防ぎ、或いは疾患の退縮をもたらす。
例えば、無秩序又は過剰な細胞生存又は増殖の治療に関しては、治療有効量は、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％まで、腫瘍成長の速度を減少し、腫瘍の大きさを減少し、転移の数を減少し、腫瘍進行の時間を増大し、或いは生存時間を増大する治療薬物の量を示すことが好ましい。
例えば、増大する細胞死に関連する疾患、例えば、虚血の治療に関しては、治療有効量は、治療を行わなかった場合に起こるであろう組織及び／又は細胞の損傷を阻止又は制限する治療薬剤の量を示すことが好ましい。治療薬剤は、組織及び／又は細胞損傷を、本発明の治療薬剤の投与なしで起こる損傷と比較すると、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％まで減少する。
【００４９】
疾患（例えば、過剰増殖性疾患、過剰な細胞生存又は増殖）に関連して本明細書で用いられる用語「治療する」、及び「治療すること」は、動物における病的細胞（例えば、過剰増殖性又は腫瘍性細胞）の発生の減少を示す。阻止は完全、例えば対象における病的細胞の皆無、であってよい。阻止は、対象における病的細胞の発生を、本発明なしで発生するより少なくするような、部分的であってもよい。ある実施態様では、このような用語は、１つ又はそれ以上の治療薬の投与によって：（１）癌細胞集団の安定化、減少又は除去、（２）寛解期間の増大、（３）癌の再発率の減少、（４）癌の再発時間の増大、及び（６）患者の生存率の増大：の１つ、２つ、３つ又はそれ以上もたらすことを示す。
【００５０】
増大した細胞死に関連する疾患、例えば、虚血に関して本明細書で用いられる用語「治療する」、及び「治療すること」は、動物において組織及び／又は細胞損傷の発生を減少することを示す。阻止は完全、例えば、対象に組織損傷が皆無であってよい。阻止は、対象における組織損傷が、治療薬無しで発生するものよりも少ないように、部分的であってもよい。
【００５１】
本明細書で用いられる用語「ＢＣＬ−２関連疾患」は、無秩序なＢＣＬ−２ファミリーメンバーに関連している疾患を示す。ＢＣＬ−２関連疾患は、過剰な細胞生存及び／又は増殖、例えば癌、又は過剰な細胞死、例えばアルツハイマー病と関連している。ＢＣＬ−２関連疾患は本明細書に記載されているようなものを包含する。
【００５２】
本明細書で用いられる「過剰増殖性疾患」は、癌、腫瘍性成長、過形成性或いは増殖性成長、又は異常な細胞生育或いは生存の病的状態を意味して、固形癌、非固形癌、及び白血病で見られるような、異常な細胞増殖又は蓄積の何れかを包含する。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「抗癌剤」及び「抗癌薬」は、癌のような過剰増殖性疾患の治療で用いられている、何れかの治療薬（例えば、化学療法化合物及び／又は分子治療化合物）、アンチセンス治療薬、核酸治療薬（例えばＲＮＡｉ）、放射線治療薬を示す。一実施態様では、本発明は、抗癌剤と、本明細書に記載されているようにＢＣＬ−２ファミリーペプチドの活性部位に結合する化合物の有効用量を投与することを含有してなる、ＢＣＬ−２関連疾患を治療する方法を対象にしている。
【００５４】
本明細書で用いる用語「構造座標」は、分子又は分子複合体中の別の原子に対する原子の空間関係に対応しているデカルト座標を示す。構造座標は、Ｘ線結晶学的技法又はＮＭＲ技法を用いて得ることができ、或いは分子置換分析又はホモロジーモデリングを用いて導くことができる。多種のソフトウェアプログラムが、分子又は分子複合体の三次元表示を得るための構造座標セットのグラフ表示を可能にしている。ＢＣＬ−２ファミリーメンバーについての構造座標は当該技術分野において公知であって、公的に入手できる。
【００５５】
用語「相互作用テンプレート」は、分子又は分子複合体中の別の原子に対する原子の空間関係に対応しているデカルト座標を用いて構築された三次元モデルを示す。構造座標は、Ｘ線結晶学的技法又はＮＭＲ技法を用いて得ることができ、或いは分子置換分析又はホモロジーモデリングを用いて導くことができる。多種のソフトウェアプログラムが、分子又は分子複合体の三次元表示を得るための構造座標セットのグラフ表示を可能にしている。ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの構造座標は、当該技術分野において公知であって、例えば、Protein Data Bank (“PDB”) (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics; http://www. rcsb.org)に見出すことができる。例えば、公知のＢＣＬ−２ファミリー構造座標は、ＢＡＸ（ＰＤＢ ＩＤ Ｎｏ．１ｆ１６）、ＢＡＫ（ＰＤＢ ＩＤ Ｎｏ．２ｉｍｓ）、ＢＣＬ−２（ＰＤＢ ＩＤ Ｎｏ．１ｇ５ｍ）、ＢＩＭ（ＰＤＢ ＩＤ Ｎｏ．２ｐｑｋ）及びＢＣＬ−ＸＬ（ＰＤＢ ＩＤ Ｎｏ．１ｌｘｌ）、本発明に関連するものに加えて：ＢＩＭ ＢＨ３−ＢＡＸ（ＰＤＢ ＩＤ Ｎｏ．２ｋ７ｗ）、更に当該技術分野で公知のその他のものを包含する。
【００５６】
相互作用テンプレートは、配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有しているＢＡＸポリペプチドのものが好ましく、ここで、ＢＡＸポリペプチドの活性部位は溶媒に感受性であって、モジュレータ、例えば活性因子との相互作用に使用可能である。ＢＡＸのこの三次元形態は、活性部位に結合する化合物の同定を促進するために用いられる。本明細書で用いられる「相互作用テンプレート」は、ＢＡＸの配列／構造アラインメントを別のＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドと比較して作成したテンプレートを包含する。保存及び非保存残基の同定は、当業者が別のＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの対応する活性部位を同定して、ポリペプチドのモジュレータを設計／スクリーニングすることを可能にする。
【００５７】
アミノ酸の位置、例えば、配列番号１に記載の配列のＡｌａ１４９に関して本明細書で用いられている、用語「に対応している」は、第１ポリペプチドと参照ポリペプチドの配列が相同性又は別のアルゴリズム（例えば、構造比較）によって整列しているときに、参照ポリペプチド配列、例えばＢＡＫの所定のアミノ酸と整列される第１ポリペプチド配列、例えばＢＡＸのアミノ酸を示す。アラインメントは、この目的のためにデザインされたソフトウェア、例えば、このバージョン用のデフォルトパラメータを有するＢＬＡＳＴＰバージョン２．２．２を用いて当業者によって実行される。対応するアミノ酸は、第１ポリペプチド配列及び第２ポリペプチド配列の構造比較によっても同定できる。このような構造比較は当該技術分野において公知であって、本明細書に記載されている。例えば、Petros et al. Biochimica et Biophysica Acta 1644; 83-94 (2004) and Suzuki et al., Cell. 103; 645-654 (2000) は、ＢＣＬ−２ファミリーメンバーのＢＣＬ−２相同ドメイン間の構造アラインメントを説明している。
【００５８】
用語アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基の両方を含有している分子を示す。適切なアミノ酸は、限定されないで、ペプチド中で見出される２０個の通常の天然アミノ酸（例えば、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ（１文字略号として知られている））、更に有機合成又はその他の代謝経路で製造される天然又は非天然のアミノ酸のＤ−及びＬ−異性体の両方を包含する。
【００５９】
「非−必須」アミノ酸残基は、そのＢＡＸ結合能力を無効或いは実質的に変えることなくポリペプチド（例えばＢＩＭ ＢＨ３）の野生型配列から変えることができる残基である。「必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から変えたときに、ＢＡＸ活性部位又は結合部位に対するポリペプチドの結合活性の無効又は実質的な減少をもたらす残基である。ＢＨ３ドメインの必須及び非−必須アミノ酸残基は、当該技術分野で公知であって本明細書に記載されている方法によって容易に確認できる。本明細書で用いる用語「必須」アミノ酸残基は必須アミノ酸の同類置換を包含する。一般に、「必須」アミノ酸残基はＢＨ３ポリペプチドの相互作用面（ＢＡＸと相互作用する残基）で見出される。
【００６０】
「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基又はその化学的に類似する残基で置換されるということである。例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を包含する。その他の同類アミノ酸置換は、ペプチドの電荷を修正するためにアスパラギンをアスパラギン酸に置換する場合のように、アミノ酸側鎖ファミリーを越えて生じることもある。従って、ＢＨ３ドメインポリペプチド中の予想される非必須アミノ酸残基を、例えば、同一側鎖ファミリー又はファミリーを越える同族体（例えば、アスパラギンをアスパラギン酸へ、グルタミンをグルタミン酸へ）由来の別のアミノ酸残基と置換することが好ましい。更に、コードされる配列における単一アミノ酸又はアミノ酸の数パーセントを変更、付加又は欠失する個々の置換、削除又は付加も同類置換」と考えられる。
【００６１】
２つ又はそれ以上の核酸又はポリペプチド配列に関連している用語「同一」又は「同一パーセント」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて測定して、又は目視検査によって、比較又は最大一致整列したときに、同一であるか或いは特定のパーセント同一であるヌクレオチド又はアミノ酸を有している２つ又はそれ以上の配列又は副配列を示す。
【００６２】
２つ又はそれ以上のポリペプチド配列に関連している用語「相同」又は「相同パーセント」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて測定して、又は目視検査によって、比較又は最大一致整列したときに同一であるか、又は特定のパーセント同一であるアミノ酸残基、或いはその同類置換を有している２つ又はそれ以上の配列又は副配列を示す。例としては、第１領域のアミノ酸配列が、第１領域中に含有されている数と等しい数のアミノ酸の何れかの配列と比較したとき、又は以下で検討するような、当該技術分野で公知のコンピューター相同プログラムによって整列されているアンチアポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバータンパク質のアラインメントと比較して、第２のアンチアポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバータンパク質の第２領域と、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、或いはさらに９５％も同一である場合に、第１タンパク質領域はアンチアポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバータンパク質の領域と相同であると考えられる。第１タンパク質及び第２タンパク質のポリペプチド領域が１つ又はそれ以上の保存アミノ酸残基を包含していることが好ましい。
【００６３】
ＩＩ．詳細な説明
一態様では、本発明は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性を調節する有機分子を同定する方法を提供し、方法は：
ａ）当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドを、当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性を調節するのに適している条件下で、化合物と接触させること；及び
ｂ）化合物による当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性の調節を検出すること：
を含有してなり、
ここで、化合物は、当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのα１螺旋、α２螺旋、α１−α２間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５、及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有している結合部位と相互作用し、
ここで、化合物の結合部位との相互作用は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝、上部近傍ループ、下部近傍ループ、或いはこれらの組み合わせの場所で起こる。
【００６４】
第２の態様では、本発明はＢＡＸポリペプチドのプロアポトーシス活性を活性化する有機分子化合物を同定する方法を提供し、その方法は：
ａ）当該ＢＡＸポリペプチドの結合部位（ここで、結合部位はα１螺旋、α２螺旋、α１−α２の間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５、及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有している）を、当該ＢＡＸポリペプチドのプロアポトーシス活性を活性化するのに適している条件下で、化合物と接触させること；及び
ｂ）当該化合物による当該ＢＡＸポリペプチドの活性化を検出すること：
を含有してなり、
ここで、当該化合物は、配列番号１に記載の配列のＧｌｕ１７、Ｇｌｎ１８、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３、Ａｒｇ３４、Ａｌａ３５、Ｇｌｙ３６、Ａｒｇ３７、Ｍｅｔ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｙ４０、Ｇｌｕ４１、Ａｌａ４２、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ａｌａ５４、Ｓｅｒ５５、Ｔｈｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ｌｙｓ５８、Ｌｅｕ５９、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｕ６１、Ｌｙｓ６４、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｌｅｕ１２２、Ｌｅｕ１２５、Ｔｈｒ１２７、Ｌｙｓ１２８、Ｖａｌ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｌｅｕ１３２、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６、Ａｒｇ１４７、Ｌｅｕ１４９、Ｇｌｙ１５０、Ｇｌｙ１５６、Ｇｌｙ１５７、Ｔｒｐ１５８、Ａｓｐ１５９、Ｌｅｕ１６１、Ｌｅｕ１６２に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基と結合し、そして
ここで、化合物の結合部位との相互作用は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝、上部近傍ループ、下部近傍ループ、或いはこれらの組み合わせの場所で起こる。
【００６５】
第３の態様では、本発明は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの候補有機分子モジュレータを同定する方法を提供し、方法は：
ａ）当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの結合部位の三次元構造を用いて（ここで、当該結合部位は、α１螺旋、α２螺旋、α１−α２の間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５、及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有している）、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド相互作用テンプレートを形成すること；及び
ｂ）当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド相互作用テンプレートをを用いて当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド候補モジュレータを選択すること（ここで、当該候補モジュレータは当該結合部位に結合する）：
を含有してなり、
ここで、候補モジュレータの結合部位との相互作用は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝、上部近傍ループ、下部近傍ループ、或いはこれらの組み合わせの場所で起こる。
【００６６】
第４の態様では、本発明はＢＡＸポリペプチドのプロアポトーシス活性を活性化する候補有機分子化合物を同定する方法を提供し、方法は：
ａ）ＢＡＸポリペプチドの結合部位の三次元構造を提供すること（ここで、当該結合部位はα１螺旋、α２螺旋、α１−α２の間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５、及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有している）；
ｂ）当該結合部位と化合物の間の結合相互作用をシミュレートすること（ここで、化合物の結合部位との相互作用は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝、上部近傍ループ、下部近傍ループ、或いはこれらの組み合わせの場所で起こる）；及び
ｃ）当該化合物が、当該結合部位の配列番号１に記載の配列のＧｌｕ１７、Ｇｌｎ１８、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３、Ａｒｇ３４、Ａｌａ３５、Ｇｌｙ３６、Ａｒｇ３７、Ｍｅｔ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｙ４０、Ｇｌｕ４１、Ａｌａ４２、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ａｌａ５４、Ｓｅｒ５５、Ｔｈｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ｌｙｓ５８、Ｌｅｕ５９、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｕ６１、Ｌｙｓ６４、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｌｅｕ１２２、Ｌｅｕ１２５、Ｔｈｒ１２７、Ｌｙｓ１２８、Ｖａｌ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｌｅｕ１３２、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６、Ａｒｇ１４７、Ｌｅｕ１４９、Ｇｌｙ１５０、Ｇｌｙ１５６、Ｇｌｙ１５７、Ｔｒｐ１５８、Ａｓｐ１５９、Ｌｅｕ１６１、Ｌｅｕ１６２よりなる群から選ばれるアミノ酸残基と結合するか否かを確認すること（ここで、結合部位の当該アミノ酸残基と結合する当該化合物は当該候補化合物である）：
を含有してなる。
【００６７】
ある特定の実施態様では、当該化合物は有機化合物である。別の実施態様では、当該化合物は表１から選ばれ、そして表１の化合物の誘導体を更に含有してもよく、ここで当該誘導体は結合親和性、活性、溶解度又はその他の薬理学的特性を改善する。
【００６８】
一実施態様では、当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドはプロアポトーシスポリペプチドである。
【００６９】
更なる実施態様では、当該プロアポトーシスポリペプチドはＢＡＸである。別の更なる実施態様では、当該プロアポトーシスポリペプチドはＢＯＫ又はＢＡＫである。
【００７０】
ある特定の実施態様では、当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドはアンチアポトーシスポリペプチドである。更なる実施態様では、当該アンチアポトーシスポリペプチドは、 ＢＣＬ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、ＢＣＬ−Ｂ、Ａ１／Ｂｆｌ−１、Ｂｏｏ／Ｄｉｖａ、Ｎｒ−１３、Ｃｅｄ−９、ウィルス性同族体、Ｍ１１Ｌ、及びＥ１Ｂ−１９Ｋよりなる群から選ばれる。
【００７１】
別の実施態様では、当該活性は、プロアポトーシス活性又はアンチアポトーシス活性である。別の実施態様では、当該調節は当該プロアポトーシス活性の活性化又は阻害である。別の実施態様では、調節は当該アンチアポトーシス活性の活性化又は阻害である。
【００７２】
一実施態様では、工程（ｂ）の検出は、
（Ａ）ＢＣＬ−２ポリペプチドのオリゴマー化、ＢＣＬ−２ポリペプチド配座異性体の抗体による検出、ミトコンドリアチトクロムＣの放出、リポソームの放出、細胞死、ミトコンドリア又は細胞の形態、ミトコンドリアカルシウムの流動、ミトコンドリア膜貫通の定量、及びカスパーゼ３活性又はアネキシンＶ結合の定量よりなる群から選ばれるアッセイ、及び
（Ｂ）収率及び最適化タンパク質発現及び精製条件に渡る安定性を最大にして、モノマー、ダイマー又はオリゴマー配座異性体を安定化するポリペプチド突然変異体及び種を生成するために特に製造されたＢＣＬ−２ポリペプチドタンパク質を使用すること、
を含有してなる。
【００７３】
ある特定の実施態様では、当該化合物は、結合部位において、配列番号１に記載の配列のＧｌｕ１７、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ｔｈｒ５６、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基と結合する。
【００７４】
別の実施態様では、当該化合物は、結合部位において、配列番号１に記載の配列のＭｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ａｌａ２４、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｎ３２、Ｇｌｕ１３１、Ａｒｇ１３４、Ｍｅｔ１３７、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基と結合する。
【００７５】
別の実施態様では、当該化合物は、結合部位において、配列番号１に記載の配列のＬｙｓ２１に対応するアミノ酸残基と結合する。
【００７６】
ある特定の実施態様では、当該化合物は、結合部位において、配列番号１に記載の配列の Ｇｌｕ１７、Ｇｌｎ１８、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３、Ａｒｇ３４、Ａｌａ３５、Ｇｌｙ３６、Ａｒｇ３７、Ｍｅｔ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｙ４０、Ｇｌｕ４１、Ａｌａ４２、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ａｌａ５４、Ｓｅｒ５５、Ｔｈｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ｌｙｓ５８、Ｌｅｕ５９、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｕ６１、Ｌｙｓ６４、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｌｅｕ１２２、Ｌｅｕ１２５、Ｔｈｒ１２７、Ｌｙｓ１２８、Ｖａｌ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｌｅｕ１３２、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６、Ａｒｇ１４７、Ｌｅｕ１４９、Ｇｌｙ１５０、Ｇｌｙ１５６、Ｇｌｙ１５７、Ｔｒｐ１５８、Ａｓｐ１５９、Ｌｅｕ１６１、Ｌｅｕ１６２に対応する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基と結合する。
【００７７】
一実施態様では、当該化合物は更に有機化合物、ポリペプチド、核酸又はそれらの組み合わせを含有する。
【００７８】
更なる実施態様では、当該化合物は、表１中の第２の化合物と結合している表１の化合物を含有するか、又は表1に列挙される化合物若しくはそれらの化学サブ成分の組み合わせ、及びそれらの誘導体を含有する。
【００７９】
別の実施態様では、当該第２の化合物は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝、上部近傍ループ、下部近傍ループ、或いはこれらの組み合わせの場所で結合部位と相互作用する。
【００８０】
ある特定の実施態様では、当該化合物は更にＢＩＭポリペプチドを含有する。
【００８１】
別の実施態様では、当該化合物は更にＢＩＭ ＢＨ３ペプチド（配列番号３）又はそれらのＳＡＨＢ誘導体を含有する。
【００８２】
別の実施態様では、当該化合物は更に、配列番号３に記載の配列と３０％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を含有して、そして配列番号２に記載の配列のＩｌｅ１４８、Ｌ１５２、Ａｒｇ１５３、Ａｒｇ１５４、Ｇｌｙ１５６、Ａｓｐ１５、Ｇｌｕ１５８、又はＡｓｎ１６０に対応するアミノ酸残基、又はそれらの同類天然又は非天然アミノ酸置換を含有する。
【００８３】
別の実施態様では、当該化合物は、更に配列番号２に記載の配列のＩｌｅ１４８、Ａｌａ１４９、Ｌ１５２、Ａｒｇ１５３、Ａｒｇ１５４、Ｉｌｅ１５５、Ｇｌｙ１５６、Ａｓｐ１５７、Ｇｌｕ１５８、Ａｓｎ１６０、Ａｌａ１６１、又はＴｙｒ１６３に対応するアミノ酸残基、又はそれらの同類天然又は非天然アミノ酸置換を含有する。
【００８４】
一実施態様では、当該化合物は更にＢＩＤポリペプチドを含有する。
【００８５】
別の実施態様では、当該化合物は更にＢＩＤ ＢＨ３ペプチド（配列番号５）又はそれらのＳＡＨＢ誘導体を含有する。
【００８６】
更に別の実施態様では、当該化合物は更にＰＵＭＡポリペプチドを含有する。
【００８７】
ある特定の実施態様では、当該化合物は更にＰＵＭＡ ＢＨ３ペプチド（配列番号７）又はそれらのＳＡＨＢ誘導体を含有する。
【００８８】
別の実施態様では、当該化合物は更にＢＡＸポリペプチドを含有する。
【００８９】
ある特定の実施態様では、当該化合物は更にＢＡＸ ＢＨ３ペプチド（配列番号８）又はそれらのＳＡＨＢ誘導体を含有する。
【００９０】
一実施態様では、当該化合物は更に、これに限定されないが、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＩＫ／ＮＢＫ、ＢＬＫ、ＨＲＫ、ＢＩＭ／ＢＯＤ、ＢＮＩＰ３、ＮＩＸ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ及びＥＧＬ−１又はこれらのＢＨ３領域を含有している、ＢＨ３−オンリータンパク質の群から選ばれるポリペプチドを含有する。
【００９１】
一実施態様では、当該化合物は更に、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗ、Ｂｃｌ−Ｂ、ＭＣＬ−１、Ａ１／ＢＦＬ−１、ＢＯＯ／ＤＩＶＡ、ＮＲ−１３、ＣＥＤ−９、ウィルス性同族体、Ｍ１１Ｌ、及びＥ１Ｂ−１９Ｋよりなる群から選ばれるポリペプチドを含有する。
【００９２】
別の実施態様では、当該化合物は更に、ＢＡＸ、ＢＡＫ及びＢＯＫよりなる群から選ばれるポリペプチドを含有する。
【００９３】
別の実施態様では、当該化合物は更に、配列番号３に記載の配列と３０％同一のＢＨ３領域ポリペプチドを含有していて、そして配列番号２に記載の配列のＬｅｕ１５２、Ｇｌｙ１５６、及びＡｓｐ１５７に対応するアミノ酸残基、又はそれらの同類置換を含有する。
【００９４】
ある特定の実施態様では、当該化合物は更に、配列番号５に記載の配列と３０％同一のＢＨ３領域ポリペプチドを含有していて、そして配列番号４に記載の配列のＬｅｕ９０、Ｇｌｙ９４及びＡｓｐ９５に対応するアミノ酸残基、又はそれらの同類置換を含有する。
【００９５】
別の実施態様では、当該化合物は更に、配列番号７に記載の配列と３０％同一のＢＨ３領域ポリペプチドを含有していて、そして配列番号６に記載の配列のＬｅｕ１４１、Ａｌａ１４５及びＡｓｐ１４６に対応するアミノ酸残基、又はそれらの同類置換を含有する。
【００９６】
ある特定の実施態様では、当該化合物は更に、配列番号８に記載の配列と３０％同一のＢＨ３領域ポリペプチドを含有していて、そして配列番号１に記載の配列のＬｅｕ６３、Ｇｌｙ６７及びＡｓｐ６８に対応するアミノ酸残基、又はそれらの同類置換を含有する。
【００９７】
一実施態様では、当該化合物は更に、配列番号９において同定されるようなＢＡＸ活性部位へ結合するＢＨ３のコンセンサス配列と３０％同一であるポリペプチド及びそれらの同類置換を含有する。
【００９８】
一実施態様では、当該化合物は＜１ｍＭの親和性で当該結合部位と結合する。
【００９９】
別の態様では、本発明は対象における疾患を治療する方法を提供し、方法は、当該対象が当該疾患を治療されるように、上記の方法によって同定された化合物の有効量を、それを必要としている当該対象に投与することを含有してなる。
【０１００】
別の態様では、本発明は対象における疾患を治療する方法を提供し、ここにおいて、対象は当該疾患を治療する必要があると確認されていて、
方法は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド又はＢＡＸの結合部位と結合する、特許請求の範囲第１〜４項の何れか一項に記載の方法によって同定された化合物（ここにおいて、当該結合部位は、α１螺旋、α２螺旋、α１−α２間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有していて、当該化合物はＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド又はＢＡＸを調節する）の有効量を、当該対象が当該疾患の治療を受けられるように、当該対象に投与することを含有してなる。
【０１０１】
一実施態様では、当該疾患は細胞増殖又はアポトーシス遮断の障害である。
【０１０２】
別の実施態様では、当該細胞増殖又はアポトーシス遮断の疾患は癌又は自己免疫疾患である。
【０１０３】
更なる実施態様では、当該癌は固形癌、白血病、及びリンパ腫よりなる群から選ばれる。更なる実施態様では、当該癌は化学療法耐性の癌である。更に別の実施態様では、当該化学療法耐性癌は、ＡＢＴ−７３７、ＡＢＴ−２６３、オバトクラックス（obatoclax）、又はその他のＢＣＬ−２生存タンパク質阻害因子に耐性である。
【０１０４】
一実施態様では、当該疾患は細胞消失の障害である。
【０１０５】
別の実施態様では、化合物はＢＡＸ活性を阻害する。
【０１０６】
ある特定の実施態様では、当該細胞消失障害は神経変性、心臓発作、又は脳卒中である。
【０１０７】
別の態様では、本発明は対象における癌又は腫瘍を治療する方法を提供し、ここにおいて、対象は当該疾患を治療する必要があると確認されていて、
方法は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの結合部位と結合する化合物の有効量を当該対象へ投与することを含有してなる（ここにおいて、当該結合部位は、α１螺旋、α２螺旋、α１−α２間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有していて、当該化合物はＢＡＸポリペプチドのプロアポトーシス活性を活性化し、ここにおいて当該化合物は配列番号１に記載の配列のＧｌｕ１７、Ｇｌｎ１８、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３、Ａｒｇ３４、Ａｌａ３５、Ｇｌｙ３６、Ａｒｇ３７、Ｍｅｔ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｙ４０、Ｇｌｕ４１、Ａｌａ４２、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ａｌａ５４、Ｓｅｒ５５、Ｔｈｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ｌｙｓ５８、Ｌｅｕ５９、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｕ６１、Ｌｙｓ６４、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｌｅｕ１２２、Ｌｅｕ１２５、Ｔｈｒ１２７、Ｌｙｓ１２８、Ｖａｌ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｌｅｕ１３２、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６、Ａｒｇ１４７、Ｌｅｕ１４９、Ｇｌｙ１５０、Ｇｌｙ１５６、Ｇｌｙ１５７、Ｔｒｐ１５８、Ａｓｐ１５９、Ｌｅｕ１６１、Ｌｅｕ１６２の１つ又はそれ以上と結合し、ここにおいて結合部位は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝、上部近傍ループ、下部近傍ループ、或いはこれらの組み合わせの場所に生じる）。
【０１０８】
別の態様では、本発明はＢＣＬ−２関連疾患を治療するための組成物を提供し、ここにおいて、当該組成物は：
ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの結合部位と結合する化合物（ここにおいて、当該結合部位は、α１螺旋、α２螺旋、α１−α２間のループ、α６螺旋、並びにα４、α５及びα８螺旋の選択残基の内の１つ又はそれ以上を含有していて、ここにおいて、当該化合物はＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性を調節し、ここにおいて、当該化合物は、荷電した親水性残基の周辺を有しているか、又は有していない水平な疎水性の溝、上部近傍ループ、下部近傍ループ、或いはこれらの組み合わせの場所で結合部位と相互作用する）；及び
有機化合物、ポリペプチド及び核酸又はそれらの組み合わせから選ばれる第２化合物：からなっていを含有している（ここにおいて、組成物は当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの結合部位と結合する）。
【０１０９】
一実施態様では、当該化合物は有機化合物である。
【０１１０】
別の実施態様では、当該化合物は表１中の化合物から選ばれる。
【０１１１】
ある特定の実施態様では、当該化合物は表１中の化合物から選ばれる化合物の組み合わせから誘導される。
【０１１２】
別の実施態様では、当該第２化合物は有機化合物である。
【０１１３】
ある特定の実施態様では、当該第２化合物はポリペプチドである。
【０１１４】
別の実施態様では、当該第２化合物は、ＢＩＭ、ＢＩＤ、ＢＡＸ、ＰＵＭＡ、ＢＡＫ及びＢＯＫよりなる群から選ばれる。
【０１１５】
一実施態様では、当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドはプロアポトーシスポリペプチドである。
【０１１６】
更なる実施態様では、当該プロアポトーシスポリペプチドはＢＡＸである。
【０１１７】
更なる実施態様では、当該プロアポトーシスポリペプチドはＢＯＫ又はＢＡＫである。
【０１１８】
別の実施態様では、当該ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドはアンチアポトーシスポリペプチドである。
【０１１９】
更なる実施態様では、当該アンチアポトーシスポリペプチドは、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ−Ｂ、ＭＣＬ−１、Ｂｆｌ−１／Ａ１、ＢＯＯ／ＤＩＶＡ、ＮＲ−１３、ＣＥＤ−９、又はウィルス性同族体（例えば、Ｍ１１Ｌ、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ等）よりなる群から選ばれる。
【０１２０】
別の実施態様では、当該調節はプロアポトーシス活性の活性化又は阻害である。
【０１２１】
別の実施態様では、当該調節はアンチアポトーシス活性の活性化又は阻害である。
【０１２２】
別の実施態様では、当該組成物は、結合部位において、配列番号１に記載の配列のＧｌｕ１７、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ｔｈｒ５６、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６から選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸残基と結合する。
【０１２３】
別の実施態様では、当該化合物は、結合部位において、配列番号１に記載の配列のＭｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ａｌａ２４、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｎ３２、Ｇｌｕ１３１、Ａｒｇ１３４、Ｍｅｔ１３７、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２から選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸残基と結合する。
【０１２４】
別の実施態様では、当該化合物は、結合部位において、配列番号１に記載の配列のＬｙｓ２１に対応するアミノ酸残基と結合する。
【０１２５】
一実施態様では、当該化合物は、結合部位において、配列番号１に記載の配列のＧｌｕ１７、Ｇｌｎ１８、Ｍｅｔ２０、Ｌｙｓ２１、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２４、Ｌｅｕ２５、Ｌｅｕ２７、Ｇｌｎ２８、Ｇｌｙ２９、Ｉｌｅ３１、Ｇｌｎ３２、Ａｓｐ３３、Ａｒｇ３４、Ａｌａ３５、Ｇｌｙ３６、Ａｒｇ３７、Ｍｅｔ３８、Ｇｌｙ３９、Ｇｌｙ４０、Ｇｌｕ４１、Ａｌａ４２、Ｌｅｕ４７、Ａｓｐ４８、Ｐｒｏ４９、Ｖａｌ５０、Ｐｒｏ５１、Ｇｌｎ５２、Ａｓｐ５３、Ａｌａ５４、Ｓｅｒ５５、Ｔｈｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ｌｙｓ５８、Ｌｅｕ５９、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｕ６１、Ｌｙｓ６４、Ａｒｇ８９、Ｐｈｅ９２、Ｐｈｅ９３、Ｌｅｕ１２２、Ｌｅｕ１２５、Ｔｈｒ１２７、Ｌｙｓ１２８、Ｖａｌ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ｇｌｕ１３１、Ｌｅｕ１３２、Ｉｌｅ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３５、Ｍｅｔ１３７、Ｇｌｙ１３８、Ｔｒｐ１３９、Ｌｅｕ１４１、Ａｓｐ１４２、Ｐｈｅ１４３、Ａｒｇ１４５、Ｇｌｕ１４６、Ａｒｇ１４７、Ｌｅｕ１４９、Ｇｌｙ１５０、Ｇｌｙ１５６、Ｇｌｙ１５７、Ｔｒｐ１５８、Ａｓｐ１５９、Ｌｅｕ１６１、Ｌｅｕ１６２から選ばれる１つ又はそれ以上のアミノ酸残基と結合する。
【０１２６】
ある特定の実施態様では、当該第２化合物はＢＩＭポリペプチドである。
【０１２７】
別の実施態様では、当該第２化合物はＢＩＭ ＢＨ３ポリペプチド又はそれらのＳＡＨＢ誘導体である。
【０１２８】
別の実施態様では、当該第２化合物は配列番号３に記載の配列と３０％又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を含有するアミノ酸であって、配列番号２に記載の配列のＩｌｅ１４８、Ｌ１５２、Ａｒｇ１５３、Ａｒｇ１５４、Ｇｌｙ１５６、Ａｓｐ１５７、Ｇｌｕ１５８、或いはＡｓｎ１６０に対応するアミノ酸残基、又はそれらの同類の天然又は非天然のアミノ酸置換を含有している。
【０１２９】
別の実施態様では、当該第２化合物は配列番号２のアミノ酸残基Ｉｌｅ１４８、Ａｌａ１４９、Ｌ１５２、Ａｒｇ１５３、Ａｒｇ１５４、Ｉｌｅ１５５、Ｇｌｙ１５６、Ａｓｐ１５７、Ｇｌｕ１５８、Ａｓｎ１６０、Ａｌａ１６１、又はＴｙｒ１６３を含有するアミノ酸である。
【０１３０】
別の実施態様では、当該第２化合物はＢＩＤポリペプチドである。
【０１３１】
ある特定の実施態様では、当該第２化合物はＢＩＤ ＢＨ３ペプチド又はそれらのＳＡＨＢ誘導体である。
【０１３２】
ある特定の実施態様では、当該第２化合物はＰＵＭＡポリペプチドである。
【０１３３】
更なる実施態様では、当該第２化合物はＰＵＭＡ ＢＨ３ペプチド又はそれらのＳＡＨＢ誘導体である。
【０１３４】
別の実施態様では、当該第２化合物はＢＡＸポリペプチドである。
【０１３５】
更なる実施態様では、当該第２化合物はＢＡＸ ＢＨ３ペプチド又はそれらのＳＡＨＢ誘導体である。
【０１３６】
一実施態様では、当該第２化合物は、これに限定されないが、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＩＫ／ＮＢＫ、ＢＬＫ、ＨＲＫ、ＢＩＭ／ＢＯＤ、ＢＮＩＰ３、ＮＩＸ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ及びＥＧＬ−１又はこれらのＢＨ３領域を含有している、ＢＨ３−オンリータンパク質の群から選ばれる。
【０１３７】
別の実施態様では、当該第２化合物は、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−ｗ、ＢｃＬ−Ｂ、ＭＣＬ−１、Ｂｆｌ−１／Ａ１、ＢＯＯ／ＤＩＶＡ、ＮＲ−１３、ＣＥＤ−９、又はウィルス性同族体（例えば、Ｍ１１Ｌ、及びＥ１Ｂ−１９Ｋ等）よりなる群から選ばれるポリペプチドを含有している。
【０１３８】
別の実施態様では、当該第２化合物は、ＢＡＸ、ＢＡＫ及びＢＯＫよりなる群から選ばれるポリペプチドを含有している。
【０１３９】
一態様では、本発明は、請求項５６に記載の組成物及び使用説明書を含有してなるキットを提供する。
【０１４０】
ＩＩＩ．ＢＣＬ−２ファミリー機能の構造洞察
タンパク質のＢＣＬ−２ファミリーは、細胞死に対する感受性を制御するチェック及びバランスをもたらすプロ及びアンチのアポトーシスポリペプチドの両方を包含している。この経路の脱制御を、多くの癌を含む、広範囲のヒトの疾患の発症機序において確認している。
【０１４１】
進化的に保存されたＢＣＬ−２ファミリーのメンバーは、アポトーシス細胞死及び生存の重要な制御因子である。タンパク質ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ、Ｂｃｌ−ｗ、ＢＦＬ１／Ａ１及びＭＣＬ−１は死の拮抗薬であり、一方 ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＡＤ、ＢＣＬ−ＸＳ、ＢＩＤ、ＢＩＭ、及びＢＩＫは死の作動薬の例である（Kroemer et al., Nature Med. 6:614 20 (1997)）。
【０１４２】
ＢＣＬ−２ファミリーは、全てがα螺旋断片を含んでいる、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、及びＢＨ４と呼ばれる保存「ＢＣＬ−２同族体」（ＢＨ）が最大４つまで存在していることによって定義される（Chittenden et al. 1995 EMBO 14:5589; Wang et al. 1996 Genes Dev. 10:2859）。ＢＣＬ−２及びＢＣＬ−ＸＬなどの、アンチアポトーシスタンパク質は、全てのＢＨドメインにおいて配列保存を表示する。プロアポトーシスタンパク質は、ＢＨ１、ＢＨ２、及びＢＨ３ドメイン中に相同性を有している、「マルチドメイン」メンバー（例えば、ＢＡＫ，ＢＡＸ、ＢＯＫ）、及びＢＨ３両親媒性α螺旋断片のみに配列相同性を含有している、「ＢＨ３ドメインオンリー」メンバー（例えば、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＩＭ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ）に分けられる。ＢＣＬ−２ファミリーメンバーは、ホモ及びヘテロダイマーを形成する能力を有していて、これは競合的結合及びプロ及びアンチアポトーシスタンパク質レベルの間の比率が死亡刺激への感受性に影響しているということを示唆している。アンチアポトーシスタンパク質は、プロアポトーシス過剰、すなわち、過剰なプログラム細胞死から細胞を保護するように機能する。ある特定の細胞型では、細胞膜で受け取った死亡シグナルはミトコンドリア経路を介してアポトーシスを誘発する。ミトコンドリアのアポトーシス経路は、内因性細胞ストレス及びシグナル経路によっても活性化される。ミトコンドリアは、カスパーゼ９を活性化する細胞質複合体の重要な成分である、シトクロムｃを隔離することによって細胞死の管理者として働くことができ、重大な下流のタンパク分解事象をもたらす。ＢＣＬ−２／ＢＣＬ−ＸＬ及びＢＡＫ／ＢＡＸなどのマルチドメインタンパク質は、ＢＣＬ−２ファミリーの上流ＢＨ３オンリーメンバーによって更に制御されたそれらの活性によって、ミトコンドリア膜で保護者及び死刑執行人の２つの役割をはたす。例えば、ＢＩＤは、プロアポトーシスタンパク質の「ＢＨ３ドメインオンリー」サブセットのメンバーであって、細胞膜で受け取った死のシグナルを、ミトコンドリア膜のエフェクタープロアポトーシスタンパク質へ送達する。ＢＩＤ及びＢＩＭなどの、選択ＢＨ３オンリーメンバーは「活性化因子」と呼ばれ（Letai, A., et al.  Cancer Cell  2, 183-192 (2002)）、プロ及びアンチアポトーシスタンパク質の両方と相互作用する固有の能力を有している（Walensky Mol Cell 2006）。カスパーゼ８の活性化により、ＢＩＤが開裂して、切断された付加体、ｔＢＩＤがチトクロムｃの放出及びＢＣＬ−２ファミリータンパク質の関与を介するミトコンドリアアポトーシスを誘発する。
【０１４３】
欠失及び突然変異誘発試験は、プロアポトーシスファミリーメンバーの両親媒性α螺旋ＢＨ３断片が死のドメインとして機能して、それによって、マルチドメインのアポトーシスタンパク質と相互作用する重要な構造モチーフを示すことを確認した。構造検討は、ＢＨ３螺旋がＢＨ１、２及び３ドメインの界面によって形成される疎水性の溝に挿入することにより、アンチアポトーシスタンパク質と相互作用することを明らかにしている。ｔＢＩＤ及びＢＩＭは、結合して、アンチアポトーシスタンパク質（例えば、ＢＣＬ−２及びＢＣＬ−ＸＬ）によって隔離することができ、そして直接又は間接的にプロアポトーシスタンパク質ＢＡＸ及びＢＡＫの活性化を誘発して、シトクロムｃ放出及びミトコンドリアのアポトーシスプログラムを誘導することができる。
【０１４４】
ＢＣＬ−２関連卵巣キラー（ＢＯＫ）は、プロアポトーシスマルチドメインサブグループの第３番目のメンバーで、ＢＩＤ及びＢＩＭ ＳＡＨＢなどの、活性化因子ＳＡＨＢリガンドによっても拘束される。ＢＯＫは、卵巣ｃＤＮＡライブラリーからクローン化されて、卵巣、子宮、及び睾丸に高度に発現することが見出された。その後、ＢＯＫ ｍＲＮＡ種は、心臓、腎臓、肝臓、結腸、肺、腸、甲状腺、副腎、膵臓、及び骨髄を包含する、組織の広範分布、及び選択癌細胞株において同定されている。
【０１４５】
ＢＣＬ−２生物学の大躍進は、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質の最初のＸ線及びＮＭＲ構造が報告された１０年前に、Abbott Laboratories のFesik と共同研究者によって達成された（Muchmore, S. W., Sattler, M., Liang, H., Meadows, R. P., Harlan, J. E., Yoon, H. S., Nettesheim, D., Chang, B. S., Thompson, C. B., Wong, S. L., Ng, S. L., and Fesik, S. W. (1996) X-ray and NMR structure of human Bcl-xL, an inhibitor of programmed cell death, Nature 381, 335-341）。ＢＣＬ−ＸＬの構造は、８つのα螺旋からなり、その内の２つ（螺旋５及び６）は、ジフテリア及びコリシンの細孔形成毒素の膜内挿入ドメインの中央疎水性核レミネセント（reminescent）を形成する（Muchmore, S. W., Sattler, M., Liang, H., Meadows, R. P., Harlan, J. E., Yoon, H. S., Nettesheim, D., Chang, B. S., Thompson, C. B., Wong, S. L., Ng, S. L., and Fesik, S. W. (1996) X-ray and NMR structure of human Bcl-xL, an inhibitor of programmed cell death, Nature 381, 335-341）。この構造相同性は、ＢＣＬ−２ファミリーメンバーのリポソーム及びミトコンドリア系における細孔形成の能力を明らかにする研究の基礎をもたらした（Nouraini, S., Six, E., Matsuyama, S., Krajewski, S., and Reed, J. C. (2000) The putative pore-forming domain of Bax regulates mitochondrial localization and interaction with Bcl-X(L), Mol Cell Biol 20, 1604-1615; Narita, M., Shimizu, S., Ito, T., Chittenden, T., Lutz, R. J., Matsuda, H., and Tsujimoto, Y. (1998) Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome c release in isolated mitochondria, Proc Natl Acad Sci U S A 95, 14681-14686）。続いて、ＢＣＬ−ＸＬと複合したＢＡＫ ＢＨ３ペプチドの構造が、プロ及びアンチアポトーシスＢＣＬ−２ファミリーメンバー間のタンパク質−タンパク質相互作用のパラダイム（プロアポトーシスα螺旋ＢＨ３ドメインが、アンチアポトーシスタンパク質のＢＨ１〜３ドメイン（ＢＨ１：α４−α５螺旋の部分；ＢＨ２：α７−α８の部分；ＢＨ３：α２の部分）の並置によって形成された疎水性の溝に挿入する）を明らかにした（図３）。
【０１４６】
この構造パラダイムは、ＢＨ３オンリーペプチドと複合した、ＢＣＬ−２（Petros, A. M., Nettesheim, D. G., Wang, Y., Olejniczak, E. T., Meadows, R. P., Mack, J., Swift, K., Matayoshi, E. D., Zhang, H., Thompson, C. B., and Fesik, S. W. (2000) Rationale for Bcl-xL/Bad peptide complex formation from structure, mutagenesis, and biophysical studies, Protein Sci 9, 2528-2534）、ＢＣＬ−ｗ（Denisov, A. Y., Chen, G., Sprules, T., Moldoveanu, T., Beauparlant, P., and Gehring, K. (2006) Structural model of the BCL-w-BID peptide complex and its interactions with phospholipid micelles, Biochemistry 45, 2250-2256）、ＭＣＬ−１（Day, C. L., Chen, L., Richardson, S. J., Harrison, P. J., Huang, D. C., and Hinds, M. G. (2005) Solution structure of prosurvival Mcl-1 and characterization of its binding by proapoptotic BH3-only ligands, J Biol Chem 280, 4738-4744）及びＢＦＬ−１／Ａ１（Smits, C., Czabotar, P. E., Hinds, M. G., and Day, C. L. (2008) Structural plasticity underpins promiscuous binding of the prosurvival protein A1, Structure 16, 818-829）の引き続くＮＭＲ構造において確認されて、ＢＣＬ−２タンパク質間の伝達が疎水性の溝とＢＨ３死の螺旋間に形成されたホモ及びヘテロ複合体のネットワークを介していることを示唆した。ヘテロ結合への優先性は、アンチアポトーシス溝と結合パートナーのＢＨ３ペプチドのアミノ酸組成の個々の相違によって決まる。
【０１４７】
ＢＨ３ペプチドとのアンチアポトーシス複合体の構造決定は、ＢＣＬ−２ファミリーメンバーの機能へ重要な機構的洞察をもたらして、ＢＣＬ−２が制御するアポトーシス経路の有望な薬理学的モジュレータの開発を誘導した（Walensky, L. D., et al. (2004) Activation of apoptosis in vivo by a hydrocarbon-stapled BH3 helix, Science (New York, N.Y 305, 1466-1470; Oltersdorf, T., et al. (2005) An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumours, Nature 435, 677-681; Nguyen, M., et al. (2007) Small molecule obatoclax (GX15-070) antagonizes MCL-1 and overcomes MCL-1-mediated resistance to apoptosis, Proc Natl Acad Sci U S A 104, 19512-195）。例えば、小分子ＡＢＴ−７３７のような選択的なＢＣＬ−２阻害剤はアンチアポトーシスＢＣＬ−２／ＢＣＬ−ＸＬの疎水性の溝を標的として、選択腫瘍内のアポトーシスを再活性化する（Oltersdorf, T., et al. (2005) An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumours, Nature 435, 677-681）。
【０１４８】
際立って、プロアポトーシスＢＡＸ（Suzuki, M., Youle, R. J., and Tjandra, N. (2000) Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization, Cell 103, 645-654）及びＢＨ３オンリーＢＩＤ（McDonnell, J. M., et al.(1999) Solution structure of the proapoptotic molecule BID: a structural basis for apoptotic agonists and antagonists, Cell 96, 625-634; Chou, J. J., et al. (1999) Solution structure of BID, an intracellular amplifier of apoptotic signaling, Cell 96, 615-624）のＮＭＲ構造が、アンチアポトーシスタンパク質との構造類似性を明らかにした。ＢＡＸ及びＢＩＤは、同様に、それぞれ、６又は７の両親媒性螺旋に囲まれている２つの中央核螺旋を有している。ＢＡＸ及びＢＩＤのＮ末端に、別の重要な構造類似性が明らかになった。α１とα２の間の非構造ループ（ＢＨ３）も、ＢＣＬ−２（Petros, A. M., et al. (2001) Solution structure of the antiapoptotic protein Bcl-2, Proc Natl Acad Sci U S A 98, 3012-3017）及びＢＣＬ−ＸＬ（Muchmore, S. W., et al. (1996) X-ray and NMR structure of human Bcl-xL, an inhibitor of programmed cell death, Nature 381, 335-341）などの選択アンチアポトーシスタンパク質に存在している。
【０１４９】
これらのタンパク質のループ領域は、一次配列及び長さの点で異なっていて、それらのアポトーシス機能を調整すると仮定される。実際に、ＢＣＬ−ＸＬ／ＢＣＬ−２ループのリン酸化（Ito, T., Deng, X., Carr, B., and May, W. S. (1997) Bcl-2 phosphorylation required for anti-apoptosis function, The Journal of biological chemistry 272, 11671-11673）は、細胞状況に応じてアンチアポトーシス機能を阻害して、カスパーゼ８が介在するＢＣＬ−２ループの開裂が、恐らくそのＢＨ３死のドメインを曝露することにより、タンパク質を強力なプロアポトーシスタンパク質に変換する（Cheng, E. H., Kirsch, et al. (1997) Conversion of Bcl-2 to a Bax-like death effector by caspases, Science 278, 1966-1968）。細胞質性ＢＡＸ及びＢＩＤのプロアポトーシスループ領域は、それぞれカルパイン及びカスパーゼ８によって酵素開裂を受けて、増大したミトコンドリア標的化及びプロアポトーシス活性を示す切断型形態を生じる（Li, H., et al. (1998) Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis, Cell 94, 491-501; Cartron, P. F., et al. (2004) The p18 truncated form of Bax behaves like a Bcl-2 homology domain 3-only protein, J Biol Chem 279, 11503-11512; Wood, D. E., et al.(1998) Bax cleavage is mediated by calpain during drug-induced apoptosis, Oncogene 17, 1069-1078）。
【０１５０】
マルチドメインのプロ及びアンチアポトーシスタンパク質は、疎水性残基が豊富で、ミトコンドリア外膜標的化及び挿入のアンカーとして機能するＣ−末端膜貫通領域を含有している（Suzuki, M., Youle, R. J., and Tjandra, N. (2000) Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization, Cell 103, 645-654）。プロアポトーシスＢＡＸは、ＢＡＸがミトコンドリアに配置されると膜貫通領域として機能すると推測されている、Ｃ−末端α９螺旋を含有している。モノマーＢＡＸにおいて、α９は相補的疎水性相互作用を介してＢＡＸの疎水性溝を取り込んで、疎水性溝への接近とそのＢＨ３ドメインの露出の両方を不可能にする（Sattler, M., et al. (1997) Structure of Bcl-xL-Bak peptide complex: recognition between regulators of apoptosis, Science 275, 983-986）。正常細胞において、ＢＡＫはミトコンドリア外膜に構造的に限局しているが、ＢＡＸはサイトゾル中に不活性モノマーとして存在している（Suzuki, M., Youle, R. J., and Tjandra, N. (2000) Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization, Cell 103, 645-654; Hsu, Y. T., and Youle, R. J. (1998) Bax in murine thymus is a soluble monomeric protein that displays differential detergent-induced conformations, J Biol Chem 273, 10777-1078）。
【０１５１】
アポトーシス刺激を受け取って、ＢＡＸは、そのミトコンドリアへの転移、ホモオリゴマー化、及びミトコンドリア外膜内での孔形成をもたらす、構造変化を受けると考えられている（Hsu, Y. T., and Youle, R. J. (1998) Bax in murine thymus is a soluble monomeric protein that displays differential detergent-induced conformations, J Biol Chem 273, 10777-1078; Soane, L., and Fiskum, G. (2005) Inhibition of mitochondrial neural cell death pathways by protein transduction of Bcl-2 family proteins, J Bioenerg Biomembr 37, 179-190; Tan, Y. J., Beerheide, W., and Ting, A. E. (1999) Biophysical characterization of the oligomeric state of Bax and its complex formation with Bcl-XL, Biochem Biophys Res Commun 255, 334-339）。
過去の研究は、その溝からのＣ−末端膜貫通領域の放出が転移及び膜固定に必要であろうということを示唆している（Schinzel, A., Kaufmann, T., Schuler, M., Martinalbo, J., Grubb, D., and Borner, C. (2004) Conformational control of Bax localization and apoptotic activity by Pro168, J Cell Biol 164, 1021-1032）。
更に、モノクローナル抗体６Ａ７によって検出されるような、Ｎ−末端領域での構造変化がＢＡＸの構造的に活性化された形態を選択的に検出する（Hsu, Y. T., and Youle, R. J. (1998) Bax in murine thymus is a soluble monomeric protein that displays differential detergent-induced conformations, J Biol Chem 273, 10777-10783; Yethon, J. A., Epand, R. F., Leber, B., Epand, R. M., and Andrews, D. W. (2003) Interaction with a membrane surface triggers a reversible conformational change in Bax normally associated with induction of apoptosis, J Biol Chem 278, 48935-48941）。
【０１５２】
このＮ−末端エピトープの露出が、ミトコンドリア標的化及びα９放出の要件であると考えられている（Schinzel, A., Kaufmann, T., Schuler, M., Martinalbo, J., Grubb, D., and Borner, C. (2004) Conformational control of Bax localization and apoptotic activity by Pro168, J Cell Biol 164, 1021-1032）。
ＢＡＸ／ＢＡＫが介在するアポトーシス誘導について多くのモデルが提案されているが、ＢＡＸ／ＢＡＫ活性化についての明白な分子の誘引メカニズムはまだ分かっていない。Walensky 及び共同研究者らは現在、その活性化を誘発するプロアポトーシスＢＡＸ上の新規なＢＨ３相互作用部位を同定している（Gavathiotis, E., Suzuki, M., Davis, M.L., Pitter, K., Bird, G.H., Katz, S.G., Tu, H.-C., Kim, H., Cheng, E. H.-Y. Tjandra, N. and Walensky, L.D.  BAX activation is initiated at a novel interaction site.  Nature, in press, 2008）。注目すべきは、この新規な相互作用部位が、アンチアポトーシスタンパク質について同定されたＢＨ３相互作用部位と比べると、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質の異なった地理的領域に位置していることである（図５）。
ＢＨ３螺旋との複合体におけるアンチアポトーシス溝の構造を解明することが、癌治療のための生存タンパク質の標的阻害剤をもたらすのとまさに同様に、ＢＡＸ上のＢＨ３相互作用部位の解明及びそれらの活性化連続体に従ってＢＡＸ／ＢＡＫ構造を定義付けることが、ヒトの疾患においてアポトーシスを調節する新規な薬理学的好機をもたらすだろう。
【０１５３】
ＩＶ．その活性化を誘発するＢＡＸ上の新規な相互作用部位
ＢＡＸ活性化の起因現象を調べるために、ＢＡＸのＢＨ３リガンドＢＩＭ ＳＡＨＢとの相互作用を検討した。ＢＩＭ ＳＡＨＢは、天然の死ドメインのα螺旋特性を反復してＢＡＸに直接結合することが先に明らかにされている（Walensky, L. D., et al. (2006) A stapled BID BH3 helix directly binds and activates BAX, Mol Cell 24, 199-210）。ＢＡＸと結合しているＢＩＭ ＳＡＨＢを、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を用いて観察した。ＢＡＸの１Ｈ−１５Ｎ相関スペクトルと比較して、ＢＩＭ ＳＡＨＢの付加は、選択ＮＭＲの交差ピークを拡大及びシフトして、ＢＡＸの結合及び非結合の構造間の速い移行を示唆した。ＮＭＲスペクトルの全般的な特徴は、ＢＩＭ ＳＡＨＢ結合上のα１とα２間のループ残基における有意な変化を除いて、かなり似ていた。ＢＩＭ  ＳＡＨＢ滴定したＢＡＸの化学シフト摂動解読は、ＢＡＸ残基の離れたサブセットにおける相互作用を明らかにした。α１及びα６螺旋に局在している残基に、更にα１α２間の可変ループの残基にも、最も大きい変化が観察された。有意な変化は、Ｑ２８、Ｑ３２及びＱ５２の側鎖ＮＨ２についても観察された。
【０１５４】
ＢＡＸ構造（Suzuki, M., Youle, R. J., and Tjandra, N. (2000) Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization, Cell 103, 645-654）においては、α１及びα６螺旋は互いに近接して位置していて、ＢＩＭ ＳＡＨＢ結合によって影響を受ける残基は、タンパク質構造の片側にあるこれらの螺旋の並置にある異なった位置に局在していた。注目すべきは、タンパク質のカルボキシ末端側の残基はこれらの条件下でＢＩＭ ＳＡＢ滴定によって影響を受けなかったので、新規結合部位を、アンチアポトーシスタンパク質の標準的なＢＨ３結合部位から正反対の面に置いた（図５）。従って、ＢＡＸ上のＢＩＭ ＳＡＨＢの結合部位を、親水性及び荷電した残基の縁で囲まれた疎水性割れ目を螺旋間分岐形成して、２つの螺旋α１及びα６によって定義した（図６）。
【０１５５】
ＢＡＸ上の新規相互作用部位の構造的に定義されたトポグラフィーを用い、コンピューターによるスクリーニングを実施して、ＢＡＸ上の新規な結合溝を組み込むと予測される一連の小分子を同定した。次いで同定された分子を、競合的蛍光偏光、ＢＡＸオリゴマー化、チトクロムｃ放出、及び細胞に基づくアポトーシス誘導アッセイを含む、一連の生化学アッセイに付してそれらの機能的活性を立証した。
【０１５６】
Ｖ．コンピュータによる薬物設計
結合部位の同定は、ＢＡＸ及び対応する結合部位を有するその他のＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドを調節することが可能な化合物の開発及び同定を支援する。例えば、この情報を用いて、ＢＡＸの三次元コンピュータ処理相互作用テンプレートを当業者が作成できて、ＢＡＸ活性部位に特異的な活性因子及び阻害因子を設計するために用いることができる。別の実施態様では、当業者は、ＢＡＸ結合部位を、別のＢＣＬ−２ファミリーメンバーの対応する活性部位を同定するために利用することができる。次いでこの情報を、別のＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドを調節できる化合物を同定／開発するために用いることができる。
【０１５７】
ＢＣＬ−２ポリペプチドの三次元構造及び特異的に結合する部位の確認は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド活性のモジュレータとして作用できる薬剤の合理的な同定及び／又は設計に不可欠である。これは、標的化合物への所望の阻害効果を有する薬剤が同定されるまで数千の試験化合物をスクリーニングすることがそのような薬剤を同定する唯一の方法である、従来の薬剤アッセイ技術より有利である。必然的に、このような従来のスクリーニング方法は、費用がかかり、時間がかかり、そして同定された薬物の標的タンパク質に対する作用機序を明確にしない。このような三次元構造を用いて、研究者は想定される結合部位を同定し、次いでこれらの結合部位と相互作用する薬剤を同定或いは設計する。次いでこれらの薬剤を、標的分子に対する調節効果についてスクリーニングする。この方法では、所望の活性についてスクリーニングすべき薬剤の数を大幅に減少させるばかりでなく、標的化合物に対する作用の機序もよりよく理解される。
【０１５８】
ＢＡＸ結合部位の同定を、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの結合部位の１つ又はそれ以上の領域全部又は一部分と結合できる化合物についての小分子をコンピュータでスクリーニングするデータベースに用いることができるということが目論まれている。この方法の一実施態様では、同定された化合物の結合部位の領域に対する質又は適合を、形状相補性によるか或いは推定相互作用エネルギーによるかの何れかで評価することができる（Meng et al., J. Comp. Chem. 13:505-524, 1992）。
【０１５９】
更なる実施態様では、本発明の方法に従って分析できる可能性のあるモジュレータを、当該技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー方法における多数の方法の何れかを用いて得ることができる。一実施態様では、可能性のあるモジュレータは最初に、本明細書に記載されているか或いは当該技術分野で公知のインビトロアッセイを用いてプロアポトーシス又はアンチアポトーシス活性について同定する。可能性のあるモジュレータが同定されて、それらの構造が確認されると、本明細書に記載されているＢＡＸ結合部位の構造情報を用いるコンピューター分析によって更なる最適化を実施することができる。別の実施態様では、可能性のあるモジュレータは最初に、ＢＣＬ−２ファミリー結合部位の構造座標から作成された相互作用テンプレートを用いるスクリーニングで同定されて、更に付加的なコンピュータ分析によって最適化される。あるいは、更なる最適化を、本明細書に記載の方法を用いて、可能性のあるモジュレータとＢＣＬ−２ファミリー結合部位の共−複合体のＮＭＲ構造座標を確認することによって実施することができる。
【０１６０】
本発明の方法で用いることができる多種のコンビナトリアルライブラリーは、これに限定されないが、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相又は液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー方法；１ビーズ１化合物ライブラリー法及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いるライブラリー方法を包含する。生物学的ライブラリー方法は、ペプチドライブラリーに限定されているのに対して、その他の４つの方法は、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー又は小分子ライブラリーに適用可能である（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145）。
【０１６１】
好ましい実施態様では、化合物のライブラリーはデジタルライブラリーである。結合部位にフィットする候補について公知三次元構造の小分子のデータベースをスキャンできるデータベース検索プログラムを用いて結合相互作用を実行する。適切なプログラムは、ＣＡＴＡＬＹＳＴ（Molecular Simulations Inc., San Diego, CA）、ＵＮＩＴＹ（Tripos Inc., St Louis, MO）、ＦＬＥＸＸ（Rarey et al., J. Mol. Biol. 261: 470- 489 (1996)）、  ＣＨＥＭ−３−ＤＢＳ（Oxford Molecular Group, Oxford, UK）、ＤＯＣＫ（Kuntz et al., J. Mol. Biol 161: 269-288 (1982)）、及びＭＡＣＣＳ−３−Ｄ（MDL Information Systems Inc., San Leandro, CA）及びＬＵＤＩ（Boehm, J. Comp. Aid. Mol. Des. 6:61-78 (1992)）、ＣＡＶＥＡＴ（Bartlett et al. in “Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems”, special publication of The Royal Chem. Soc., 78:182-196 (1989)）及びＭＣＳＳ（Miranker et al. Proteins 11: 29-34 (1991）、ＧＬＩＤＥ（Schrodinger LLC, New York, NY）、及びＰＨＡＳＥ（Schrodinger LLC, New York, NY)を包含する。
【０１６２】
更に、分子ライブラリーの合成方法の例は当該技術分野、例えば、DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; 及びGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233に見出すことができる。
【０１６３】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421）、又はビーズ（Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップ(Fodor (1993) Nature 364:555-556）、バクテリア（Ladner 米国特許第５，２２３，４０９号)、胞子（Ladner 米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869）又はファージ上（Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner 上記）に存在していてよい。
【０１６４】
その実際の合成の前に、化合物の可能性のあるモジュレータの効果を更に分析して、ＢＡＸ活性部位の構造座標を用いるコンピュータモデリング技術によって試験することができる。コンピュータモデリングが相互作用を示したら次に、この分子を化学技術分野の当業者に公知の標準的な方法を用いて合成し、次いで本明細書に記載されているアッセイを用いて、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性を調節するその能力を試験することができる。
【０１６５】
ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのモジュレータ又はその他の結合化合物は、化学物質又は断片を個々の結合部位と結合するそれらの能力についてスクリーニングして選択する一連の工程の手段によって、コンピュータ的に評価して設計することができる。本発明の方法の別の実施態様では、可能性のあるモジュレータ化合物をＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの結合部位と、より特定的にはＡＸ結合部位と、結合するそれらの能力について試験することができる。このプロセスは、例えば、ＢＡＸ結合部位の構造座標に基づくコンピューター画面上の結合部位の、目視検査を包含できる。次いで、選択された化合物又は化学部分を、本明細書で定義したような結合部位の個々の領域内に、多種の方向に並べるか、又はドッキングさせることができる。ドッキングは、Quanta and SYBYLなどのソフトウェアを用い、続いてCHARMM and AMBER などの、標準分子力学力場によるエネルギー最小化及び分子力学によって行うことができる。
【０１６６】
ある実施態様では、本発明は、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの構造座標を電子記憶媒体に入力して、ポリペプチドの三次元コンピューターモデルを作り出すことを包含している。一実施態様では、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの完全構造座標を入力する。それに替わる実施態様では、断片、又は完全構造座標未満であるが、結合部位をを包含している断片を入力する。構造座標は当該技術分野で公知であるようなものか或いは相同性モデリングに基づいていてよい。例えば、公知のＢＣＬ−２ファミリー構造座標は、ＢＡＸ（PDB ID No. 1f16）、ＢＡＫ（PDB ID No. 2ims）、ＢＣＬ−２（PDB ID No. 1g5m）、ＢＣＬ−ＸＬ（PDB ID No. 1lxl）、本発明に関連するものに加えて：ＢＩＭ ＢＨ３−ＢＡＸ（PDB ID NO.2k7w）を、更に当該技術分野で公知の別のものも包含する。多くの公知のＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドについての構造座標は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（“ＰＤＢ”）（Research Collaboratory for Structural Bioinformatics; http://www. rcsb.org）から入手できる。
【０１６７】
本発明は更に、分子又は分子複合体の未知三次元構造を確認するために、本発明の構造座標を標準的な相同性モデリング技術と共に使用できるということを提供する。相同性モデリングは、１つ又はそれ以上の関連タンパク質分子、分子複合体又はそれらの部分（すなわち、結合部位）の構造座標を用いる未知構造のモデルを構築することを包含する。相同性モデリングは、その三次元構造を解明するタンパク質の共通又は相同部分を、公知分子中の相同構造成分の三次元構造に、特に関連（すなわち、相同性）構造座標を用いて、一致させることによって実施できる。相同性は、アミノ酸配列同一、相同第２構造成分、及び／又は相同３次折畳みを用いて確認できる。相同性モデリングは、三次元構造の部分又は全てを、アミノ酸残基（又は別の成分）を解明すべき関連構造のそれと置き換えて、再構築することを包含できる。
【０１６８】
同様な方法が当業者に公知である（Greer, 1985, Science 228, 1055; Bundell et al 1988, Eur. J. Biochem. 172, 513; Knighton et al., 1992, Science 258:130-135, http://biochem.vt.edu/courses/modeling/homology.htm）。相同性モデリングに用いることができるコンピュータープログラムは、Quanta and the homology module in the Insight II modeling package (Accelrys, Inc., San Diego, CA) 又は ＭＯＤＥＬＬＥＲ (Rockefeller University, www.iucr.ac:uk/sinris- top/logical/prg-modeller.html, Sali’s Modeller also from Accelrys, Inc., San Diego, CA)を包含する。
【０１６９】
相互作用テンプレートが作成されると、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの結合部位に結合する化合物を同定することができる。化合物又は化学物質を選択する過程でも用いることができるように特定化したコンピュータープログラムは：
１．Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Mo., 63144, USAから入手できるＳＹＢＹＬ、
２．Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Mo., 63144, USAから入手できるＵＮＩＴＹ、
３．Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Mo., 63144, USAから入手できるＦｌｅｘＸ、
４．ＧＲＩＤ (Goodford, P. J., "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules", J. Med. Chem., 28, pp. 849-857 (1985)、ＧＲＩＤは Oxford University, Oxford, UK. から入手できる）、
５．ＭＣＳＳ (Miranker, A. and M. Karplus, "Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method." Proteins: Structure. Function and Genetics, 11, pp. 29-34 (1991)、ＭＣＳＳは Molecular Simulations, Burlington, Mass. から入手できる）、
６．ＡＵＴＯＤＯＣＫ (Goodsell, D. S. and A. J. Olsen, "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing", Proteins: Structure. Function, and Genetics, 8, pp. 195-202 (1990)、ＡＵＴＯＤＯＣＫは Scripps Research Institute, La Jolla, Calif. から入手できる）、
７．ＤＯＣＫ (Kuntz, I. D. et al., "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions", J. Mol. Biol., 161, pp. 269-288 (1982)、ＤＯＣＫはUniversity of California, San Francisco, Calif. から入手できる）：
を包含する。
【０１７０】
適切な化合物又は化学部分が選択されると、これらを単一の化合物又は阻害剤に組み立てることができる。組み立ては、ＢＡＸ／ＢＩＭ−ＢＨ３のＮＭＲ結合検討の構造座標と関連してコンピューター画面上に表示された三次元画像上で化合物又は部分の互いとの関連性の目視検査によって進行できる。次いでこれに続いてＱｕａｎｔａ又はＳＹＢＹＬなどのソフトウェアを用いて手動モデル構築を行うことができる。
【０１７１】
当業者が個々の化合物又は化学物質を関連付けるのに役立つその他の有用なプログラムは：
１．ＣＡＶＥＡＴ (Bartlett, P. A. et al, "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules". In "Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems", Special Pub., Royal Chem. Soc., 78, pp. 182-196 (1989)、ＣＡＶＥＡＴは the University of California, Berkeley, Calif. から入手できる）、
２．ＭＡＣＣＳ−３Ｄ(MDL Information Systems, San Leandro, Calif.)のような３Ｄデータベース（この分野は Martin, Y. C., "3D Database Searching in Drug Design", J. Med. Chem., 35, pp. 2145-2154 (1992)で概説されている）、
３．ＨＯＯＫ ( Molecular Simulations, Burlington, Mass.から入手できる）：
を包含する。
【０１７２】
別の実施態様では、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのモジュレータは、空の活性部位又は随意に公知モジュレータ（複数も）のある部分（複数も）を含有しているものの何れかを用いて、全体的に又は「デノボ」で設計することができる。これらの方法で役立つプログラムは：
１．ＬＵＤＩ（Bohm, H.-J., "The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors", J. Comp. Aid. Molec. Design, 6, pp. 61-78 (1992)、ＬＵＤＩはBiosym Technologies, San Diego, Calif. から入手できる）、
２．ＬＥＧＥＮＤ（Nishibata, Y. and A. Itai, Tetrahedron, 47, p. 8985 (1991)、ＬＥＧＥＮＤはMolecular Simulations, Burlington, Mass. から入手できる）、
３．ＬｅａｐＦｒｏｇ（Tripos Associates, St. Louis, Mo.から入手できる）：
を包含する。
【０１７３】
その他の分子モデリング技術も本発明に従って利用することができる。例えば、Cohen, N. C. et al., "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry", J. Med. Chem., 33, pp. 883-894 (1990)を参照されたい。Navia, M. A. and M. A. Murcko, "The Use of Structural Information in Drug Design", Current Opinions in Structural Biology, 2, pp. 202-210 (1992)も参照されたい。
【０１７４】
上記の方法によって化合物が設計又は選択されると、化合物がＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドを調節する効率をコンピュータによる評価によって試験及び最適化することができる。効果的なＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのモジュレータは、その結合状態及び遊離状態の間のエネルギーにおける相対的に小さな相違（結合の小さい変形エネルギー）を好ましくは示すべきである。
【０１７５】
ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドのモジュレータとして設計された或いは選択された化合物を更に、その結合状態において標的タンパク質との反発静電気的相互作用を好ましくは欠如させるように、コンピュータによって最適化できる。このような非相補的（例えば、静電気的）相互作用は、反発電荷−電荷、双極子−双極子及び電荷−双極子相互作用を包含する。特に、モジュレータと酵素間の静電的相互作用の合計が、モジュレータがＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドに結合したとき、結合のエンタルピーに対して中性の或いは有利な寄与をもたらすことが好ましい。
【０１７６】
化合物変形エネルギー及び静電気的相互作用を評価する特異的なコンピュータソフトウェアは当該技術分野において入手可能である。このような用途のために設計されたプログラムの例は：Ｇａｕｓｓｉａｎ ９２ revision C,（ M. J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, Pa.）；ＡＭＢＥＲ version 4.0,（ P. A. Kollman, University of California at San Francisco）；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Molecular Simulations, Inc., Burlington, Mass.）；及びＩｎｓｉｇｈｔ ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Biosysm Technologies Inc., San Diego, Calif.）：を包含する。これらのプログラムは、例えば、シリコングラフィックス（Silicon Graphics）ワークステーション、ＩＲＩＳ ４Ｄ／３５又はＩＢＭ ＲＩＳＣ／６０００ワークステーション モデル５５０を用いて実行できる。その他のハードウェアシステム及びソフトウェアパッケージは当業者に公知であろう。
【０１７７】
ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドモジュレータが、本明細書に記載のようにして、最適に選択又は設計されると、その次に、その結合特性を改善又は修正するために、相互作用によってもたらされる情報及び修飾しやすい領域を同定する特異的テンプレートを再び用いて、その原子又は側鎖基の幾つかに置換を行うことができる。一般に、最初の置換は同類置換である。すなわち、置換基は、元の基と殆ど同じ大きさ、形、疎水性及び電荷を有しているであろう。もちろん、構造を変化させることが当該技術分野で知られている成分を避けなければならないことは当然である。このように置換した化合物は、次いで、上で詳述されているのと同様なコンピュータ方法によって、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドに適合する能力について分析してもよい。
【０１７８】
ある特定の実施態様では、モジュレータは、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ未満、７５０μＭ未満、５００μＭ未満、２５０μＭ未満、１００μＭ未満、５０μＭ未満、５００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、１ｎＭ未満、又は０．５ｎＭ未満の、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドに対するＫｄを有している。
【０１７９】
設計されたモジュレータは更に、当該技術分野で公知で本明細書に記載されているインビトロ又はインビボアッセイを用いて評価することができる。
【０１８０】
ＶＩ．断片型薬剤の設計
断片型薬剤の発見（創薬）も、ＢＡＸの新規活性部位又はその他のＢＣＬ−２ポリペプチド上の対応部位と相互作用する化合物を同定するために用いることができる。これらの構造手法は公知であって、これらの用途のためのコンピュータツール、例えば、「ＳＡＲ ｂｙ ＮＭＲ」(Shukers, S. B., et al., Science, 1996, 274, 1531-1534)、「ＳＨＡＰＥＳ ＮＭＲ」(Fejzo J, Lepre CA, Peng JW, Bemis GW, Ajay , Murcko MA, Moore JM., Chem Biol. 1999 Oct;6(10):755-69)、「Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」(www.stromix.com; Nienaber, V. L., et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18, 1105-1108)、及び「 Ｄｙｎａｍｉｃ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｘ−ｒａｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」(例えば、自己集合性断片のタンパク質分子により自己選択を許容する; Congreve, M. S., et al., Angew. Chem., Int. Ed., 2003, 42, 4479-4482)、及びその他の断片型ＮＭＲ及びＸ線結晶学的方法（例えば、Congreve et al., J. Med. Chem., 2008, 51 (13), 3661-3680;  Klagesa, J., Colesb, M., Kesslera, H. NMR-based screening: a powerful tool in fragment-based drug discovery in Exploiting Chemical Diversity for Drug Discovery, 2006, ed. Bartlett, P.A. and Entzeroth, M. RSC Publishing, Cambridge, UK; Erlanson, D.A., Wells, J.A., and Braisted, A.C. TETHERING: Fragment-Based Drug Discovery, Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 2004, 33, 199-223; Zartler ER and Shapiro MJ, Fragonomics: fragment-based drug discovery, Curr Opin Chem Biol, 2005, 9(4):366-70）は市販されている。
【０１８１】
ＶＩＩ．ＢＣＬ−２ファミリーペプチドの調節及び化合物の結合を評価するインビトロアッセイ
コンピュータモデリングに基づいてＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの結合部位に結合することが見出された、化合物の能力確認は、直接結合を試験することによって、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド相互作用について更に評価することができる。ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドと結合する試験化合物の能力の確認は、例えば、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの、可能性のあるモジュレータへの結合を複合体中の標識化されたＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドを検出することにより確認できるように、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド又は化合物を放射性同位体又は酵素標識と結合させることによって実施することができる。例えば、化合物を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３Ｈで、直接又は間接的の何れかに標識して、そして放射放出の直接カウントによって又はシンチレーションカウントによって放射性同位体を検出することができる。あるいは、化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼで酵素標識して、そして適切な基質から生成物への変換を確認することによって、酵素標識を検出することができる。更なる例として、化合物を、フルオレセインなどの蛍光標識で標識化して、そしてリガンドとＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの間の相互作用を蛍光偏光アッセイを用いて定量することができる。また、標的ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドに結合している化合物を、ＳＡＲ ｂｙ ＮＭＲ (Shukers, S. B., et al., Science, 1996, 274, 1531-1534)を含む、当該技術分野で公知の各種の確立された手法を用いて、複合体のＮＭＲ又はＸ線結晶学によって分析することができる。
【０１８２】
別の実施態様では、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドへ結合するモジュレータの能力の確認は、下流事象（例えば、ポリペプチドの構造変化、アポトーシス、ミトコンドリアチトクロムｃの放出、等）の誘発を検出することによって、或いはその他のＢＣＬ−２ファミリーが調節する細胞応答を検出することによって確認することができる。
【０１８３】
別の実施態様では、アッセイは、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質又は結合部位を含有しているそれらの生物学的活性部分を試験化合物と接触させて、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質又はその生物学的活性部分の活性を調節する、試験化合物の能力を確認する、無細胞アッセイである。ＢＣＬ−２ファミリータンパク質の活性を調節する試験化合物の能力の確認は、例えば、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質が、別のＢＣＬ−２ファミリー標的分子と結合する能力を確認（例えば、炭化水素架橋ＢＩＭ ＢＨ３ポリペプチドに結合しているＢＡＸをモニターする競合結合アッセイ）することによって達成できる。
【０１８４】
ＢＣＬ−２ファミリータンパク質の標的分子と結合する能力の確認は、リアルタイム生体分子相互作用分析（real-time Biomolecular interaction Analysis (BIA)）などの技術を用いても達成できる。Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705。本明細書で用いられる「ＢＩＡ］は、何れの反応体（例えば、ＢＬＡ核）も標識化することなく、リアルタイムに生体特異相互作用を検討する技術である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象の変化を生体分子間のリアルタイム反応の指標として用いることができる。
【０１８５】
代わりの実施態様では、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質の活性を調節する試験化合物の能力の確認は、下流ＢＣＬ−２ファミリー標的分子の活性を調節するＢＣＬ−２ファミリータンパク質の能力を確認することによって達成できる。例えば、適切な標的に対するエフェクター分子の活性を確認することができて、或いはエフェクターの適切な標的への結合を前記のようにして確認できる。
【０１８６】
更に別の実施態様では、無細胞アッセイは、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質（例えば、ＢＡＸ）又は結合部位を含有しているそれらの生物活性部分を、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質（例えば、炭化水素架橋ＢＩＭ ＢＨ３ポリペプチド）と結合する公知化合物と接触させてアッセイ試料を形成し、そしてＢＣＬ−２ファミリータンパク質と相互作用する試験化合物の能力を確認する、ここで、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質と相互作用する試験化合物の能力の確認は、優先的にＢＣＬ−２ファミリータンパク質と結合するか又はその活性を調節して、公知化合物を置き換える、試験化合物の能力を確認することを含有している。
【０１８７】
本発明の上記アッセイ方法の２つ以上の実施態様では、一方の或いは両方のタンパク質の非複合体形態からの複合体形態の分離を促進するために、更にはアッセイの自動化に適合するためにも、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド又はその標的分子の何れかを固定化することが望ましい。試験化合物のＢＣＬ−２ファミリータンパク質への結合、又は候補化合物の存在下又は非存在下でのＢＣＬ−２ファミリータンパク質の標的分子との相互作用は、反応体を含有するのに適している何れかの容器中で実施することができる。そのような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、及び微小遠心管を包含する。一実施態様では、一方又は両方のタンパク質がマトリックスと結合できるようにするドメインを付加する融合タンパク質が提供される。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＢＣＬ−２ファミリー融合タンパク質又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, Mo.）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次いでこれを試験化合物と、或いは試験化合物及び非吸着標的タンパク質又はＢＣＬ−２ファミリータンパク質の何れか一方と、組合わせて、混合物を複合体形成を誘導する条件下で（例えば、塩及びｐＨに対する生理学的条件で）培養する。培養に続いて、ビーズ又はマイクロタイタープレートのウェルを洗浄して非結合成分の何れも除去し、ビーズの場合は、マトリックスを固定化して、複合体を直接又は間接的に、例えば、上記のようにして、確認する。あるいは、複合体をマトリックスから解離して、ＢＣＬ−２ファミリーの結合又は活性のレベルを標準的な技術を用いて確認することができる。
【０１８８】
タンパク質をマトリックス上に固定化するその他の技術も本発明のアッセイで使用することができる。例えば、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質又はＢＣＬ−２ファミリー標的分子の何れかを、ビオチンとストレプトアビジンの抱合体を用いて固定化することができる。ビオチン化ＢＣＬ−２ファミリータンパク質又は標的分子を、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から、当該技術分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.）を用いて製造して、ストレプトアビジンをコーティングした９６ウェルプレート（Pierce Chemicals）のウェルに固定化することができる。あるいは、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質又は標的分子と反応するが、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質のその標的分子との結合を妨げない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができ、非結合標的又はＢＣＬ−２ファミリータンパク質を抗体抱合によってウェル中に捕捉することができる。このような複合体を検出する方法は、ＧＳＴ−固定化複合体について上で述べたものに加えて、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質又は標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、さらにＢＣＬ−２ファミリータンパク質又は標的分子に関連している酵素活性の検出に依存している酵素結合アッセイを包含する。例えば、マイクロタイタープレートアッセイ設計を用いて、標的ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性化した又は阻害された配座異性体を認識する特定化された抗体を、マイクロタイタープレート上にコーティングして、化合物が誘導した標的ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの変化を捕捉し、次いで、迅速で精度の高い検出のために、蛍光色素分子又は酵素の何れかと共役している第２ＢＣＬ−２ファミリー抗体を適用して検出するか、あるいは蛍光色素分子又は酵素と共役している第２抗体によって認識することができる（すなわち、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡアッセイ」）。
【０１８９】
当該技術分野で公知であるか、或いは本明細書に記載されている多種のアッセイを用いて、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの結合部位に結合する化合物が、インビトロ又はインビボで腫瘍細胞数を阻害することを明らかにできる。このようなアッセイでは、癌細胞株の細胞又は患者由来の細胞を、目的の化合物の存在下及び非存在下で用いることができる。細胞が無秩序なＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド経路を有していることが好ましい。本発明の化合物又はレジメンの、癌細胞の数を減少する或いはそれらの増殖を阻害する能力は、当該技術分野で公知であって本明細書に記載されている方法によって評価することができる。
【０１９０】
本発明は、１つ又はそれ以上のＢＣＬ−２ファミリータンパク質の結合部位に結合してその活性を調節する化合物を同定する方法（本明細書で「スクリーニングアッセイとも称する）を提供する。重要なことは、これらのアッセイは、コンピュータを利用したスクリーニングによって同定された化合物を試験及び検証するために用いられるばかりでなく、網羅的なライブラリーからコンピュータを用いない、経験的な化合物をスクリーニングすることにも用いることができる。
【０１９１】
本明細書に記載されているポリペプチドの結合親和性は、例えば、滴定結合アッセイを用いて確認することができる。ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド又はＢＨドメインを含有しているポリペプチド（例えば、ＢＡＸ、等）は、蛍光標識されたＢＨ３含有ポリペプチド又はそれらの断片（例えば、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＡＫ、ＢＡＸ、等）などの基質、又はそれらの炭化水素架橋誘導体の存在下に、種々の濃度（例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ、及び１０ｍＭ）の候補化合物に曝露できる。次いで、候補化合物のそれぞれの濃度の効果を分析して、種々の濃度における候補化合物のＢＣＬ−２ファミリーポリペプチド結合活性に対する効果を確認し、これを候補化合物のＫｉを算定するために用いることができる。候補化合物は競合様式又は非競合様式において、ＢＣＬ−２タイプの活性を調節することができる。ＢＣＬ−２ファミリータンパク質と蛍光標識された候補化合物の間で直接結合アッセイを実施して、結合相互作用についてのＫｄを決定することもできる。候補化合物は、例えば、構造特異的抗体又はＨＳＱＣ ＮＭＲ分析によって測定されるようなＢＣＬ−２ファミリータンパク質の構造変化、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析で観察されるようなＢＣＬ−２ファミリータンパク質（例えばＢＡＸ）オリゴマー化状態の変化、リポソームからの蛍光色素又はタンパク質共役蛍光色素が誘発する放出、及び／又は精製ミトコンドリアからのチトクロムｃ放出を誘発する用量反応性の効果を測定することによって、インビトロでの生物学的活性についてスクリーニングすることもできる。細胞透過性スクリーニングアッセイも想定されて、そこでは蛍光的に又はその他で標識された候補化合物を、無傷細胞に適用し、次いでこれを、顕微鏡又は（Walensky et al Science 2004, Walensky et al Mol Cell 2006）に記載されているようなＦＡＣＳ分析によって、或いはハイスループット細胞蛍光性検出によって、細胞蛍光性についてアッセイする。
【０１９２】
本発明の化合物、医薬組成物、又はレジメンは、ヒトで使用する前に、所望の治療又は予防の活性についてインビトロで、次いでインビボで試験することが好ましい。例えば、特定の化合物の投与が有効か否かを確認するために用いることができるアッセイは、細胞培養アッセイを包含し、そこでは患者の組織試料（例えば、癌細胞）を培養液中で生育させ、そして本発明の化合物に曝露させるか、それともこれに接触させて、組織試料上のそのような化合物の効果を観察する。組織試料は、生検又は患者から血液／骨髄を採取することによって得られる。この試験は一人一人の患者にとって治療的に最も効果がある治療法（例えば、予防又は治療剤）の同定を可能にする。
【０１９３】
本明細書に記載されているアッセイは、個々の候補化合物を用いて実施でき、或いは複数の候補化合物を用いて実施できる。複数の候補化合物を用いてアッセイを実施する場合は、候補化合物の混合物を用いて実施できるか、或いは単一の候補化合物を有するそれぞれの反応を用いて平行反応を実行できる。試験化合物又は薬剤は、当該技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法の多数の手段の何れかを用いて得ることができる。
【０１９４】
好ましい実施態様では、細胞に基づいたアッセイは、化合物がＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの活性も調節するか否かを確認するために、ＢＣＬ−２ファミリーポリペプチドの結合部位に結合することが知られている（例えば、コンピュータモデリング、直接結合アッセイ、ＮＭＲ、又はその他の方法を用いて同定された）化合物に対して実施する。
【０１９５】
一実施態様では、アッセイは、ＢＣＬ−２ファミリータンパク質又はそれらの生物学的活性部分を発現する細胞を候補化合物と接触させて、結合部位に結合してＢＣＬ−２タイプの活性を調節する候補化合物の能力を確認する（例えば、内因性又は外因性の細胞死経路を介して、ある場合はアポトーシスを増大し、そして別の場合はアポトーシスを減少する）細胞に基づくアッセイである。試験化合物の細胞内のＢＣＬ−２タイプの活性を調節する能力を確認することは、例えば、ミトコンドリアからのチトクロムｃの放出又はその他の関連する生理学的情報（例えば、アネキシンＶ結合、ＭＴＴアッセイ、カスパーゼ活性アッセイ、ＴＵＮＥＬアッセイ）をモニタリングすることによって達成できる。例えば、特異的且つ直接的なＢＡＸ介在アポトーシスについての化合物の誘導をアッセイするために、報告され本明細書に記載されているようにして（参考、Gavathiotis et al. 2008, Nature、印刷中）、遺伝子的にＢＡＸ／ＢＡＫが欠失している細胞（陰性対照細胞）の化合物への応答を、トランスフェクション又はレトロウィルス感染によってＢＡＸが置き換わっている同じ細胞（試験細胞）と比較する。
【０１９６】
ＢＣＬ−２ポリペプチドの結合部位に結合することが見出されている化合物のインビトロ抗腫瘍活性は、腫瘍細胞を殺す化合物の能力を測定することによってアッセイできる。細胞株の例は：ヒト肺（Ａ５４９）；低トポII活性を有する耐性ヒト肺（Ａ５４９−ＶＰ）；ネズミメラノーマ（Ｂ１６）；ヒト結腸腫瘍（ＨＣＴ１１６）；ｐ１７０レベルが上昇しているヒト結腸腫瘍（ＨＣＴＶＭ）；低トポII活性を有するヒト結腸腫瘍（ＨＣＴＶＰ）；Ｐ３８８ネズミリンパ白血病細胞；及びヒト結腸癌細胞株（Ｍｏｓｅｒ）、及び当該技術分野で公知の他多くのもの：を包含する。
【０１９７】
腫瘍阻害アッセイは、例えば、Kelly, et al., U.S. Pat. No. No. 5,166,208,及びPandley, et al., J. Antibiot. 3(11):1389-401（1981）に記載されている。あるアッセイでは、細胞を標準的な条件下で２４時間生育させることができる。細胞をプレート（例えば９６ウェル平底プレート）に２４時間付着させた後、細胞を連続希釈濃度のＢＣＬ−２ファミリーモジュレータ化合物と７２時間培養することができる。これらのデータから細胞の５０％が殺生されか生育が阻害された化合物の濃度（ＩＣ５０）を確認する。
【０１９８】
ＶＩＩＩ．化合物のインビボ試験
本発明の化合物がインビボで腫瘍の形成を阻害することも明らかにすることができる。本発明の化合物、組成物、及びレジメンを、ヒトで用いる前に、適切な動物モデル系で試験することができる。このような動物モデル系は、これに限定されないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、等を包含する。当該技術分野で周知の動物系はどれでも用いることができる。手順の幾つかの態様を変えることができ、当該態様は、これに限定されないが、治療モダリティ（例えば、予防及び／又は治療薬剤）投与についての一時的な治療計画（ここではこのような治療モダリティが別々に又は混合剤として投与される）、及び治療モダリティの投与頻度を包含する。
【０１９９】
本発明のＢＣＬ−２ファミリーモジュレータ化合物のインビボ抗腫瘍活性を、非処置担癌動物と比較した、哺乳動物（例えば、マウス）中の腫瘍細胞の減少及び結果として生じる生存時間の増大によってアッセイできる。例えば、ＣＤＦ１マウスにＰ３８８ネズミリンパ性白血病細胞、エールリッヒ腫瘍細胞、Ｂ１６メラノーマ細胞、又はＭｅｔｈ−Ａ線維肉腫細胞の懸濁液を腹腔内投与する。次いで、投与されたマウスの幾つかを本発明のＢＣＬ−２ファミリーモジュレータ化合物で腹腔内処理して、別のマウスを食塩水又は対照化合物（例えば、小分子のエナンチオマー、ペプチドのアミノ酸突然変異体）で処理する。次いで化合物のインビボ活性を、食塩処置群の平均生存時間に対する処置群の平均生存時間の比×１００である、％Ｔ／Ｃの観点から確認する。Yokoi, et al.,米国特許第４，５８４，３７７号; Kelly, et al.,米国特許第５，１５５，２０８号; Warnick-Pickle, et al., J. Antibiot. 34(11):1402-7 (1981);及びPandley et al., 前記。
【０２００】
腫瘍形成及び転移拡散を含む、過剰増殖性疾患の膨大な数の動物モデルが当該技術分野で公知であって本明細書に記載されている（Chapter 317, “Principals of Neoplasia,” in Harrison’s: Principals of Internal Medicine, 13th Edition, Isselbacher et al., eds., McGraw-Hill, New York, p. 1814のChapter 317,“Principals of Neoplasia,”及びLovejoy et al., 1997, J. Pathol. 181:130-135を参照されたい）。過剰増殖性疾患は、癌及び自己免疫疾患などの細胞増殖又はアポトーシス遮断疾患を包含する。ＢＣＬ−２関連癌の例は、これに限定されないが、固形癌、白血病、及びリンパ腫を包含する。一実施態様では、疾患は化学療法耐性の癌である。より好ましい実施態様では、化学療法耐性の癌は、ＡＢＴ−７３７又はＡＢＴ−２６３（Abbott、Abbott Park, Illinois から入手できる）或いはオバトクラックス（obatoclax、Gemin X から入手できる）に耐性である。特定の例は、肺癌については、腫瘍小結節のラットへの移植（Wang et al., 1997, Ann. Thorac. Surg. 64:216-219）又はＮＫ細胞枯渇ＳＣＩＤマウスにおける肺癌転移の確立（Yono and Sone, 1997, Gan To Kagaku Ryoho 24:489-494）；結腸癌については、ヒト結腸癌細胞のヌードマウスへの結腸癌移植（Gutman and Fidler, 1995, World J. Surg. 19:226-234）、ヒト潰瘍性結腸炎のワタボウシタマリンモデル（Warren, 1996, Aliment. Pharmacol. Ther. Supp 12:45-47）及び腺腫様ポリープ性腫瘍抑制因子の突然変異を有するマウスモデル（Polakis, 1997, Biochim. Biophys. Acta 1332:F127-F147）；乳癌については、乳癌のｋａｎ遺伝子（kansgenic)モデル（Dankort and Muller, 1996, Cancer Treat. Res. 83:71-88; Amundadittir et al., 1996, Breast Cancer Res. Treat. 39:119-135）及びラットにおける腫瘍の化学作用による誘発（Russo and Russo, 5 1996, Breast Cancer Res. Treat. 39:7-20）；前立腺癌については、化学的に誘導したトランスジェニック齧歯モデル、及びヒト異種移植片モデル（Royal et al., 1996, Semin. Oncol. 23:35-40）；泌尿生殖器癌については、ラット及びマウスにおける誘発膀胱腫瘍（Oyasu, 1995, Food Chem.  Toxicol 33:747-755）及びヒト移行上皮癌のヌードラットへの異種移植（Jarrett et al., 1995, J. Endourol. 9:1-7）；そして造血器腫瘍については、動物における移植された同種骨髄（Appelbaum, 1997, Leukemia 11 (Suppl. 4):S15- S17）を包含する。更に、これに限定されないが、ｐ５３欠失マウスモデル（Donehower, 1996, Semin. Cancer Biol. 7:269-278）、Ｍｉｎマウス（Shoemaker et al., 1997, Biochem. Biophys. Acta, 1332:F25-F48）、及びラット１５における腫瘍に対する免疫応答（Frey, 1997, Methods, 12:173-188）を含む、多くの型の癌に適用できる一般的な動物モデルが記載されている。
【０２０１】
例えば、本発明の化合物を試験動物に投与でき、一態様では、試験動物がある種の癌を発症しやすく、その試験動物は続いて、腫瘍形成の発生率の減少について、化合物を投与していない動物と比較して試験される。あるいは、癌を有している試験動物（例えば、悪性の、腫瘍性の、又は形質転換された細胞を導入して、或いは発癌性物質を投与して腫瘍が誘発されている動物）に化合物を投与し、続いて化合物を投与していない動物と比較して、腫瘍退縮について試験動物の腫瘍を検査することができる。本発明の化合物は、治療有効量を投与したときに、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％まで、腫瘍の進行時間を延ばすか或いは生存時間を増大する場合に、過剰増殖性疾患の治療に有効であると考えられる。同様に、治療有効量の投与が、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％まで、腫瘍生育速度を減少し、腫瘍量を減少し、転移の数を減少する場合に、本発明の化合物は、過剰増殖性疾患の治療に有効であると考えられる。このような結果を、当業者、例えば、腫瘍学者、癌生物学者は確認することができる。
【０２０２】
更に、当業者に公知の何れのアッセイも、本明細書に開示されている化合物又は医薬組成物の、過剰な細胞増殖又は細胞死に関連する疾患、或いはそれらの１つ又はそれ以上の症状に対する予防的及び／又は治療的有用性を評価するために用いることができる。
【０２０３】
ＩＸ．本明細書に記載されているコンピュータによるスクリーニングで同定された化合物
以下の表１の化合物は、本明細書に記載されているように、ＢＡＸ上の新規なＢＨ３相互作用部位の構造座標を用いるコンピュータスクリーニングで同定された。
【０２０４】
0006049260.tif 000002
【０２０５】
0006049260.tif 000003
【０２０６】
0006049260.tif 000004
【０２０７】
0006049260.tif 000005
【０２０８】
0006049260.tif 000006
【０２０９】
0006049260.tif 000007
【０２１０】
0006049260.tif 000008
【０２１１】
0006049260.tif 000009
【０２１２】
0006049260.tif 000010
【０２１３】
0006049260.tif 000011
【０２１４】
0006049260.tif 000012
【０２１５】
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【０２１６】
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【０２１７】
0006049260.tif 000015
【０２１８】
0006049260.tif 000016
【０２１９】
0006049260.tif 000017
【０２２０】
0006049260.tif 000018
【０２２１】
Ｘ．治療方法
本発明の薬剤は、細胞死シグナルが下方制御されていて、病的細胞が細胞死の傾向を不適切に軽減している（これを本明細書では「減少したアポトーシス状態」と言う）細胞を治療するのに有用である。本発明は更に、薬剤の治療有効量を対象に投与して、ウィルスに感染しているか或いは自己抗体を発現している細胞などのある特定のタイプの細胞にアポトーシスを導入することが望ましい、アポトーシス関連疾患を治療する方法を提供する。通常は、薬剤は投与前に実質的に精製されている。対象は、これに限定されないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、等を含む動物でであってよく、典型的には哺乳動物であって、特定の実施態様ではヒトである。別の特定の実施態様では、非−ヒト哺乳動物が対象である。
【０２２２】
本発明は、異常な（例えば、不十分な又は過剰な）ＢＣＬ−２ファミリーメンバー発現又は活性（例えば、外因性又は内因性アポトーシス経路の異常）に関連する疾患に罹る危険性がある（又は罹りやすい）か或いは疾患を有している対象を治療する、予防的及び治療的な両方法を提供する。本明細書で用いられる用語「治療」は、疾患、疾患の症状又は疾患になりやすい傾向を、治す、癒す、軽減する、和らげる、変える、改善する、改良する、改める又はこれに影響を及ぼす目的で、疾患、疾患の症状又は疾患になりやすい傾向を有する患者に治療薬剤を適用若しくは投与する、又は疾患、疾患の症状又は疾患になりやすい傾向を有する患者由来の単離組織若しくは細胞株に治療薬剤を適用又は投与することであると定義される。治療薬剤は、これに限定されないが、小分子、ペプチド、抗体、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、その他の核酸組成物、及びこれらの組み合わせを包含する。
【０２２３】
ＢＣＬ−２タイプの疾患は、少なくともその一部が、１つ又はそれ以上のＢＣＬ−２ファミリーメンバーの異常なレベル（例えば、ＢＣＬ−２の過度な又は少ない発現）によって、又は異常な活性を示す１つ又はそれ以上のＢＣＬ−２ファミリーメンバーの存在によって引き起こされうる。そのため、本発明は、疾患症状の改善をもたらすであろう、ＢＣＬ−２ファミリーメンバーのレベル及び／又は活性を減少させること、又はＢＣＬ−２ファミリーメンバーのレベル及び／又は活性を増大させることに関している。例えば、ＢＣＬ−２などの抗アポトーシスタンパク質の過剰レベルによって維持されている腫瘍を、アポトーシス遮断を回避してＢＡＸ介在アポトーシスを直接誘発するために、ＢＡＸ活性化モジュレータ化合物を用いて治療することができる。
【０２２４】
本発明の化合物を、癌及び腫瘍性疾患を治療及び予防するために用いることができる。本明細書で用いる用語「癌」、「過剰増殖性」及び「腫瘍性」は、自律的増殖能及び細胞死欠損を有している細胞、すなわち、急速増殖型の細胞生育及び／又はアポトーシス遮断によって特徴付けられる異常な状態又は疾患を示す。過剰増殖性及び腫瘍性疾患状態を病的状態（すなわち、疾患状態を特徴としているか或いは疾患状態に相当している）に分類でき、あるいは非病的状態（すなわち、正常から逸脱しているが疾患状態に結びつかない）に分類できる。この用語は、病理組織学的タイプ又は侵襲性の段階に関わりなく、全てのタイプの、癌性生育又は腫瘍形成過程、転移組織又は悪性に形質転換した細胞、組織或いは器官を包含するように意図されている。「病的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍の生育によって特徴付けられる病期に生じる。非病的過剰増殖性細胞の例は、創傷修復に関連している細胞の増殖を包含する。
【０２２５】
細胞の増殖及び／又は分化の障害の例は、癌、例えば、上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、又は転移性疾患を包含する。化合物は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、このような癌の転移などを制御する新規な治療薬剤として作用できる。転移性腫瘍は、胸部、肺、肝臓、結腸及び卵巣に由来するものを包含するが、これに限定されない、複数の原発腫瘍タイプに起因している。
【０２２６】
癌又は腫瘍性疾患の例は、これに限定されないが、線維肉腫、筋肉種、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液肉腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃癌、食道癌、直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、頭頸部の癌、皮膚癌、脳腫瘍、扁平上皮癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、繊毛腫、精上皮癌、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、又はカポシ肉腫を包含する。
【０２２７】
増殖障害の例は、造血器腫瘍性疾患を包含する。本明細書で用いる用語「造血腫瘍性疾患」は、造血器由来の、例えば、骨髄、リンパ又は赤血球系由来の、過形成性／腫瘍性細胞、又はこれらの前駆細胞に関連する疾患を包含する。好ましくはこの疾患は、低分化急性白血病、例えば、赤芽球性白血病及び急性巨核球性白血病から生ずる。骨髄疾患の更なる例は、これに限定されないが、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Vaickus, L. (1991) Crit Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-97に概説されている）を包含し；リンパ性悪性腫瘍は、これに限定されないが、Ｂ−系ＡＬＬ及びＴ−系ＡＬＬを包含している急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）を包含する。悪性リンパ腫の更なる形態は、これに限定されないが、非ホジキンリンパ腫及びその変腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人性Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大型顆粒リンパ球白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病及びリード・シュテルンベルク病を包含する。
【０２２８】
胸部の細胞増殖及び／又は分化障害の例は、これに限定されないが、例えば、上皮過形成、硬化性腺症、小管乳頭腫を包含する増殖性胸部疾患；腫瘍、例えば、線維腺腫、葉状腫瘍、肉腫などの間質性腫瘍、及び大管乳頭腫などの上皮腫瘍；非浸潤性乳管癌（ぺージェット病を包含する）及び上皮内小葉癌を包含する上皮内（非侵襲性）癌、及びこれに限定されないが、浸潤性腺管癌、浸潤性小葉癌、髄様癌、膠様（粘液性）癌、管状腺癌、及び侵襲性乳頭癌を包含する侵襲性（浸潤性）癌、及び混合型悪性腫瘍を包含する。男性胸部の疾患は、これに限定されないが、女性化乳房及び癌を包含する。
【０２２９】
肺の細胞増殖及び／又は分化障害の例は、これに限定されないが、気管支カルチノイド、混合型腫瘍、及び転移型腫瘍などの、腫瘍随伴症候群、細気管支肺胞腫瘍、神経内分泌腫瘍を包含する気管支癌；単発性線維性腫瘍（胸膜線維腫）及び悪性中皮腫を包含する、炎症性胸水浸出、非炎症性胸水浸出、気胸、及び胸膜腫瘍を包含する、胸膜の病変を含んでいる。
【０２３０】
結腸の細胞増殖及び／又は分化障害の例は、これに限定されないが、非腫瘍性ポリープ、腺腫、家族性症候群、結腸直腸発癌、結腸直腸癌、及びカルチノイド腫瘍を包含する。
【０２３１】
肝臓の細胞増殖及び／又は分化障害の例は、これに限定されないが、結節性過形成、腺腫、及び肝臓の原発性癌及び転移性腫瘍を包含する、悪性腫瘍を包含する。
【０２３２】
卵巣の細胞増殖及び／又は分化障害の例は、これに限定されないが、体腔上皮の腫瘍、漿液腫瘍、粘液腫瘍、子宮内膜性腫瘍、透明細胞腺癌、嚢胞腺線維腫、ブレンナー腫瘍、表面上皮腫瘍などの卵巣腫瘍；成熟（良性）奇形腫、単胚葉性奇形種、未熟悪性奇形種、未分化胚細胞腫、卵黄嚢腫瘍、絨毛腫などの胚細胞腫瘍；顆粒膜−卵胞膜細胞腫瘍、卵胞膜線維腫、セルトリ間質細胞腫瘍、門（ｈｉｌｌ）細胞腫瘍、及び性腺芽腫などの、性索間質腫瘍；及びクルケンベルグ腫瘍などの転移性腫瘍を包含する。
【０２３３】
本明細書に記載されている化合物は、過剰活性な細胞死又は病理学的損傷による細胞死によって特徴付けられる疾患を治療又は予防するために用いることもできる。早期又は不要な細胞死、及び/又は不要又は過剰な細胞増殖によって特徴付けられる疾患のいくつかの例は、これに限定されないが、虚血性、低細胞性／形成不全、無細胞性／再生不良性、又は富細胞性／過形成性の疾患を包含する。いくつかの例は、これに限定されないが、ファンコニー貧血、再生不良性貧血、サラセミア、先天性好中球減少症、骨髄異形成を包含する血液疾患を包含する。
【０２３４】
アポトーシスを減少するように作用する本発明の化合物は、望ましくないレベルの細胞死に関連している疾患を治療するために用いることができる。従って、本発明のアンチアポトーシス化合物は、ウィルス感染、例えば、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）による感染に関連している感染、と関連している細胞死を引き起こすような疾患を治療するために用いることができる。各種の神経障害は、神経細胞の特定の集合が徐々に失われることを特徴としているので、感染症のアンチアポトーシスペプチドをこれらの疾患の治療に用いることができる。このような疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症、及び小脳変性症の各種形態を包含する。これらの疾患における細胞消失は炎症性の応答を誘発しないので、アポトーシスが細胞死のメカニズムであると見られる。更に、多くの血液疾患は、血液細胞の減少した産生に関連している。これらの疾患は、慢性疾患に関連している貧血、再生不良性貧血、慢性好中球減少症、及び骨髄異形成症候群を包含する。骨髄異形成症候群及び再生不良性貧血のいくつかの形態などの、血液細胞産生の障害は、骨髄内での増大したアポトーシス細胞死に関連している。これらの疾患は、アポトーシスを促進する遺伝子の活性化、間質細胞或いは造血生存因子の後天的欠乏、又は毒素及び免疫応答のメディエータの直接的作用に起因しているだろう。細胞死に関連している２つの一般的な疾患は心筋梗塞及び脳卒中である。両疾患において、血流の急速な損失事象で引き起こされた虚血の中央領域内の細胞が、壊死の結果として急速に死亡すると考えられる。しかしながら、虚血中央帯の外側に存在している細胞はより長期に渡って死亡して、形態学的にアポトーシスによって死亡すると見られる。本発明のアンチアポトーシス化合物は、好ましくない細胞死に関連しているこのような疾患の全てを治療するために用いることができる。
【０２３５】
本明細書に記載されている化合物で治療できる免疫疾患のいくつかの例は、これに限定されないが、臓器移植拒絶、関節炎、狼瘡、ＩＢＤ、クローン病、喘息、多発性硬化症、糖尿病等を包含する。
【０２３６】
本明細書に記載されているポリペプチドで治療できる神経疾患のいくつかの例は、これに限定されないが、アルツハイマー病、ダウン症候群、オランダ型遺伝性脳出血アミロイドーシス、反応性アミロイドーシス、蕁麻疹及び難聴を伴う家族性アミロイド腎症、マックル・ウェルズ症候群、特発性骨髄腫；マクログロブリン血症関連骨髄腫、家族性アミロイド多発性神経障害、家族性アミロイド心筋症、単独心アミロイド、全身性老人性アミロイドーシス、成人発症型糖尿病、インスリノーマ、単独心房性アミロイド、甲状腺の髄様癌、家族性アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、家族性アミロイド性多発性神経障害、スクレピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群、ウシ海綿状脳炎、プリオン媒介疾患、及びハンチントン病を包含する。
【０２３７】
本明細書に記載されているポリペプチドによって治療できる内分泌疾患のいくつかの例は、これに限定されないが、糖尿病、甲状腺機能亢進症、下垂体機能低下症、副甲状腺機能低下症、性腺機能低下症等を包含する。
【０２３８】
本発明の化合物及び方法で治療又は予防できる心血管疾患（例えば、炎症性疾患）は、これに限定されないが、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中、血栓症、動脈瘤、心不全、虚血性心疾患、狭心症、突然心臓死、高血圧性心疾患；動脈硬化症、小血管疾患、腎症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、高脂血症、黄色腫症、喘息、高血圧、肺気腫及び慢性肺疾患などの、非冠状血管疾患；又は血管形成後の再狭窄、シャント、ステント、合成又は天然切除の移植片、留置カテーテル、弁又は他の移植可能デバイスの留置などの、介入手順（「手術による血管外傷」）に関連する心血管疾患を包含する。好ましい心血管疾患はアテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、動脈瘤、及び卒中を包含する。
【０２３９】
ＸＩ．モジュレータの投与
一実施態様では、本発明の化合物は、本明細書に開示されている疾患の予防、治療、及び／又は管理のための単独療法として投与される。
【０２４０】
本発明の一態様は、患者（例えば、ヒト患者）の癌を予防、治療、及び／又は管理する方法に関し、その方法は、予防的に有効なレジメン又は治療的に有効なレジメンを患者に投与することを含有してなり、レジメンは本発明の化合物又は本発明の組成物を患者に投与することを含有していて、ここで、患者は癌であると診断されている。癌の予防、治療、及び／又は管理に有効であろう、予防及び／又は治療のレジメンで用いられる本発明の化合物の量は、化合物の現在処方されている用量に、さらに本明細書に開示されている方法で評価されているものに基づくことができる。
【０２４１】
この態様の一実施態様では、患者は別の治療を受けたか或いは受けている。この態様の別の実施態様では、患者は、癌の予防、治療、及び／又は管理のための治療を未だ受けていない。
【０２４２】
医師は、これに限定されないが、身体検査（例えば、前立腺検査、乳房検査、リンパ節検査、腹部診察、皮膚観察）、視覚法（例えば、大腸内視鏡検査、気管支鏡検査、内視鏡検査）、パップスメア分析（子宮頸癌）、便グアヤク分析、血液検査（例えば、全血球計算（ＣＢＣ）試験）、肝機能検査を包含する血液化学試験、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）試験、癌胎児抗原（ＣＥＡ）試験、癌抗原（ＣＡ）−１２５試験、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、染色体分析、骨髄分析（例えば、血液系悪性腫瘍の場合）、組織学、細胞学、唾液分析及び画像検査法（例えば、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、超音波、Ｘ腺画像、乳房撮影画像、骨のスキャン）を包含する、通常の癌スクリーニング方法の何れかを用いて患者を診断することができる。
【０２４３】
本発明の別の態様は、患者（例えば、ヒト患者）の固形癌を予防、治療、及び／又は管理する方法に関し、その方法はそれを必要としている患者に予防的に有効なレジメン又は治療的に有効なレジメンを投与することを含有してなり、レジメンは本発明の化合物又は組成物を患者に投与することを含有していて、ここで患者は固形癌を有していると診断されていて、患者は癌の嵩を縮小する初期の治療を受けている。
【０２４４】
本発明の別の態様は、癌を予防、治療、及び／又は管理する方法に関し、その方法はそれを必要としている患者に予防的に有効なレジメン又は治療的に有効なレジメンを投与することを含有し、レジメンは本発明の化合物（上記のような）、又はそれらの薬学的に許容される塩を投与することを含有していて、ここで患者は別の治療を受けている。ある実施態様では、以前の治療は、例えば、化学療法、放射免疫治療、毒素療法、プロドラッグ活性化酵素療法、抗体療法、手術療法、免疫療法、放射線療法、標的療法又はこれらの何れかの組み合わせである。
【０２４５】
ある実施態様では、患者における以前の治療が失敗している。ある実施態様では、本発明の化合物を投与することを含有している治療的に有効なレジメンを、患者が以前の治療を受けた直後に患者に投与する。例えば、ある特定の実施態様では、以前の治療の結果は、患者に本発明の化合物を投与する前には不明であってもよい。
【０２４６】
本発明の別の態様は、患者（例えば、ヒト患者）の癌を予防、治療、及び／又は管理する方法に関し、その方法はそれを必要としている患者に予防的に有効なレジメン又は治療的に有効なレジメンを投与することを含有してなり、そのレジメンは本発明の化合物又は組成物を患者に投与することを含有していて、そこで、本発明の化合物又は組成物は、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年又はそれ以上の期間に渡る無毒性量（ＮＯＡＥＬ）のヒト等価用量（ＨＥＤ）より低い用量で投与される。動物実験で確認されるようなＮＯＡＥＬは、ヒト臨床試験に対する最大推奨開始用量の決定に有用である。例えば、ＮＯＡＥＬはヒト等価用量を決定するために外挿することができる。一般に、このような種の間の外挿は、体表面積で正規化した用量（すなわち、ｍｇ／ｍ２）に基づいて実行される。ある特定の実施態様では、ＮＯＡＥＬは、マウス、ハムスター、ラット、フェレット、モルモット、ウサギ、イヌ、霊長類、霊長類（サル、マーモセット、リスザル、ヒヒ）、マイクロブタ又はミニブタで確認される。ＮＯＡＥＬの使用及びヒト等価用量を決定するためのそれらの外挿についての検討は、Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Pharmacology and Toxicology, July 2005を参照されたい。
【０２４７】
ある特定の実施態様では、レジメンは、予防的に有効なレジメン又は治療的に有効なレジメンを投与することを含有してなり、ここではレジメンが患者における癌細胞集団の減少をもたらす。一実施態様では、このレジメンを受けている患者を、このレジメンが患者における癌細胞集団の減少をもたらしているか否かを確認するためにモニタリングする。
【０２４８】
一般に、癌細胞集団のモニタリングは、患者から抽出した試料中の癌細胞の数又は量を検出することにより実施できる。試料中の癌細胞の数又は量を検出する方法は当該技術分野で公知である。このモニタリングステップは一般に、患者がレジメンを受けた少なくと１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、又は３０日後に実施される。
【０２４９】
ある実施態様では、試料は血液試料であってよく、ここでは単位容量（例えば、１ｍＬ）当たり又はその他の測定単位（例えば、組織学的分析の場合は単位区域当たり）の癌細胞の数又は量を定量する。ある特定の実施態様では、癌細胞集団を全血液細胞に対するパーセンテージとして決定することができる。
【０２５０】
別の実施態様では、患者から抽出される試料は組織試料（例えば、疑わしい癌性組織から抽出する生検）であって、ここでは癌細胞の数又は量は、例えば、組織の単位重量当たりの癌細胞の数又は量に基づいて測定される
【０２５１】
抽出された試料中の癌細胞の数又は量を、参照サンプル中で測定した癌細胞の数又は量と比較して、レジメンの有効性及び治療を受けている癌の改善を評価することができる。一実施態様では、参照サンプルは治療を受けている患者から抽出した試料であり、そこでは、患者由来の試料はより早い時点（例えば、基準参照サンプルとして、レジメンを受ける前、又はレジメンを受けている間の早期時点で）に抽出される。別の実施態様では、参照サンプルは健常、非癌患者から抽出される。
【０２５２】
別の実施態様では、抽出試料中の癌細胞集団を所定の参照範囲と比較することができる。特定の実施態様では、所定の参照範囲は、治療を受けている患者と同じタイプの癌を患っている患者の集団(複数も)から得られた癌細胞の数又は量に基づいている。
【０２５３】
治療を受けている患者から抽出した試料中の癌細胞の数、量、又はパーセンテージが参照サンプルと比較して、癌細胞集団の減少が非常に小さいと判断される場合には、次いで、医師は、治療レジメンを調節する多くの選択肢を有する。例えば、次いで、医師は、投与する本発明の化合物又は組成物の用量、投与の頻度、投与期間、又はこれらのあらゆる組み合わせ、の何れかを増やすことができる。特定の実施態様では、この決定がなされた後に、本発明の化合物又は組成物の第２有効量を患者に投与することができる。
【０２５４】
別の実施態様では、レジメンは、本発明の化合物又は組成物を投与することを含有してなり、ここでレジメンは癌細胞の数、量、又はパーセンテージの減少、及び患者における癌細胞の数、量、又はパーセンテージの減少をもたらす。
【０２５５】
癌の予防、治療、及び／又は管理に有効であろう予防及び／又は治療レジメンに用いられる本発明の化合物の量は、化合物の現在処方されている用量に、更に本明細書に開示されていて当該技術分野で公知の方法で評価されている用量に基づいて用いることができる。頻度及び用量は、投与される特定の化合物、癌疾患の重症度、投与経路、更に患者の年齢、身体、体重、応答及び過去の病歴に基づく、各患者に対する特異的な因子に従っても変化する。例えば、癌の治療、予防及び／又は管理に有効であろう本発明の化合物の用量は、例えば本明細書に開示されているか或いは当業者に公知の動物モデルなどの、動物モデルに化合物を投与することによって決定することができる。更に、インビトロアッセイを、最適な用量範囲の確認を支援するために随意に利用することができる。
【０２５６】
ある実施態様では、予防及び／又は治療レジメンは、ある特定程度の治療効果を達成できるように、患者に投与する用量を滴定することを含有してなる。このような程度は患者における癌細胞集団の減少を包含する。
【０２５７】
ある特定の実施態様では、予防及び／又は治療レジメンにおける本発明の化合物の用量は、参照サンプルと比較して、予防及び／又は治療レジメンを受けた後の患者から抽出した試験試料中に見出された癌細胞の数又は量の減少を達成するように調節される。ここで、参照サンプルは治療を受けている患者から抽出された試料であり、そこでは試料はより早い時点で患者から抽出される。一実施態様では、参照サンプルは予防及び／又は治療レジメンを受ける前に、同じ患者から抽出された試料である。特定の実施態様では、試験試料中の癌細胞の数又は量は、参照サンプル中よりも、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％少ない。
【０２５８】
ある実施態様では、予防及び／又は治療レジメンにおける本発明の化合物の用量は、所定の参照範囲内に入っている癌細胞の数又は量に達するように調節される。これらの実施態様では、試験試料中の癌細胞の数又は量を所定の参照範囲と比較する。
【０２５９】
別の実施態様では、予防及び／又は治療レジメンにおける化合物の用量は、参照サンプル（ここで、参照サンプルは健常で、癌に冒されていない患者から抽出された試料である）と比較して、予防及び／又は治療レジメンを受けた後の患者から抽出した試験試料に見出される癌細胞の数又は量の減少をもたらすように調節される。特定の実施態様では、試験試料中の癌細胞の数又は量は、参照サンプル中の癌細胞の数又は量の、少なくとも６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、又は２％以内である。
【０２６０】
固形癌を有しているある特定のヒト患者の治療では、腫瘍の疑いのある部位から複数の組織試料を抽出することは実施不可能であるかもしれない。このような実施態様では、ヒト患者用の予防及び／又は治療レジメンにおける本発明の化合物の用量は、動物モデルにおいて癌集団の減少に有効であるそれらの動物モデルでの用量から外挿される。その動物モデルでは、予防及び／又は治療レジメンは、参照サンプルと比較したときに、予防及び／又は治療レジメンを受けた後の動物から抽出した試験試料に見出される癌細胞の数又は量の減少をもたらすように調節される。参照サンプルは、予防及び／又は治療レジメンを受ける前の、同じ動物から抽出した試料であってよい。特定の実施態様では、試験試料中の癌細胞の数又は量は、参照サンプル中よりも、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％又は６０％少ない。動物における癌細胞の数又は量を減少するのに有効な用量を、体表面積について正規化して（例えば、ｍｇ／ｍ２）、等価ヒト用量をもたらすことができる。
【０２６１】
本明細書に開示されている予防及び／又は治療レジメンは、本発明の化合物又はそれらの医薬組成物の患者への単回投与又は複数回投与（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０回、又はそれ以上の投与）を含有してなる。
【０２６２】
一実施態様では、予防及び／又は治療レジメンは、本発明の化合物又はそれらの医薬組成物の複数回投与による投与を含有してなる。複数回投与によって投与する場合は、化合物又は医薬組成物を、症状を予防、治療、及び／又は管理するのに十分なある頻度で及びある量で投与する。一実施態様では、投与の頻度は、１日１回からおよそ８週間に１回までに及ぶ。別の実施態様では、投与の頻度は、およそ１週間に１回からおよそ６週間に１回までに及ぶ。別の実施態様では、投与の頻度は、およそ３週間に１回からおよそ４週間に１回までに及ぶ。
【０２６３】
一般に、癌を予防、治療、及び／又は管理するために対象に投与される本発明の化合物の用量は、対象の体重に対して、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲、より一般的には、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。一実施態様では、対象に投与される用量は、対象の体重に対して、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、又は１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で、より好ましくは、患者の体重に対して、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、又は１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０２６４】
特定の実施態様では、患者における癌を予防、治療、及び／又は管理するために対象に投与される本発明の化合物の用量は、患者の体重に対して５００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、好ましくは、２５０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、９５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、９０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、８５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、８０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、７５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、７０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、６５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、６０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、５５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、５０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、４５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、４０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、３５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、３０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、２５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、２０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、１５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、１０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、２．５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、２ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、１．５ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下、又は１ｍｇ／ｋｇ又はそれ以下である。
【０２６５】
別の特定の実施態様では、患者における癌を予防、治療、及び／又は管理するために対象に投与される本発明の化合物の用量は、０．１〜５０ｍｇ、０．１ｍｇ〜２０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１５ｍｇ、０．１ｍｇ〜１２ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．１ｍｇ〜８ｍｇ、０．１ｍｇ〜７ｍｇ、０．１ｍｇ〜５ｍｇ、０．１ｍｇ〜２．５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜２０ｍｇ、０．２５ｍｇ〜１５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜１２ｍｇ、０．２５ｍｇ〜１０ｍｇ、０．２５ｍｇ〜８ｍｇ、０．２５ｍｇ〜７ｍｇ、０．２５ｍｇ〜５ｍｇ、０．５ｍｇ〜２．５ｍｇ、１ｍｇ〜２０ｍｇ、１ｍｇ〜１５ｍｇ、１ｍｇ〜１２ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、１ｍｇ〜８ｍｇ、１ｍｇ〜７ｍｇ、１ｍｇ〜５ｍｇ、又は１ｍｇ〜２．５ｍｇの単位用量である。
【０２６６】
特定の実施態様では、患者における癌を予防、治療、及び／又は管理するために対象に投与される本発明の化合物の用量は、対象の体重に対して、０．０１〜１０ｇ／ｍ２の範囲、そしてより一般的には、０．１ｇ／ｍ２〜７．５ｇ／ｍ２の範囲である。一実施態様では、対象に投与される用量は、対象の体表面積に対して、０．５ｇ／ｍ２〜５ｇ／ｍ２、又は１ｇ／ｍ２〜５ｇ／ｍ２の範囲である。
【０２６７】
別の実施態様では、予防及び／又は治療レジメンは、本発明の化合物の有効量の１つ又はそれ以上の用量を患者に投与することを含有してなり、そこでは有効量の用量が、本発明の化合物の、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌ、又は少なくとも４００μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成する。
【０２６８】
別の実施態様では、予防及び／又は治療レジメンは、本発明の化合物の有効量の複数用量を患者に投与することを含有してなり、そこでは複数の用量が、少なくとも１日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月又は３６ヶ月に渡り、本発明の化合物の、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌ、又は少なくとも４００μｇ／ｍｌの血漿濃度を保持する。
【０２６９】
ある実施態様では、予防及び／又は治療レジメンは、本発明の化合物を１つ又はそれ以上の追加の抗癌治療法と組み合わせて投与することを含有してなる。併用療法で用いられる１つ又はそれ以上の追加抗癌治療法の用量が、癌を予防、治療、及び／又は管理するために用いられてきた、或いは現在用いられているそれよりも低いことが好ましい。癌を予防、治療、及び／又は管理するために現在用いられている１つ又はそれ以上の追加抗癌治療法の推奨用量は、これに限定されないが、Hardman et al., eds., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics, 10th ed., Mc-Graw-Hill, New York, 2001; Physician’s Desk Reference (60th ed., 2006)（これはその全てが、参照により本明細書に取り込まれている）を包含する、当該技術分野の何れかの参考文献から入手することができる。
【０２７０】
本発明の化合物及び１つ又はそれ以上の追加抗癌治療法は、別々に、同時に、又は連続して投与することができる。多くの実施態様では、本発明の化合物と追加の抗癌治療法は、少なくとも５分おいて、少なくとも３０分おいて、少なくとも１時間おいて、約１時間おいて、約１〜約２時間おいて、約２時間〜約３時間おいて、約３時間〜約４時間おいて、約４時間〜約５時間おいて、約５時間〜約６時間おいて、約６時間〜約７時間おいて、約７時間〜約８時間おいて、約８時間〜約９時間おいて、約９時間〜約１０時間おいて、約１０時間〜約１１時間おいて、約１１時間〜約１２時間おいて、約１２時間〜１８時間おいて、１８時間〜２４時間おいて、２４時間〜３６時間おいて、３６時間〜４８時間おいて、４８時間〜５２時間おいて、５２時間〜６０時間おいて、６０時間〜７２時間おいて、７２時間〜８４時間おいて、８４時間〜９６時間おいて、又は９６時間〜１２０時間おいて投与する。好ましい実施態様では、２つ又はそれ以上の抗癌治療法を同じ診察時の内に投与する。
【０２７１】
ある特定の実施態様では、本発明の化合物及び追加の抗癌治療法を周期的に投与する。周期治療は、１つの抗癌治療法をある期間投与して、続いて第２の抗癌治療法をある期間投与して、この順次投与を繰り返すこと、すなわち、一方又は両方の抗癌治療法に対する耐性の進展を減少するため、一方又は両方の抗癌治療法の副作用を無効に又は減少するため、そして／又は治療薬の有効性を改善するための周期を包含する。
【０２７２】
好ましい実施態様では、抗癌治療法を別の組成物で対象に同時に投与する。本発明の併用抗癌治療法は同一又は異なった投与経路で対象に投与されてもよい。
【０２７３】
特定の実施態様では、周期治療は、ある期間第１抗癌治療法を投与して、それに続いてある期間第２の抗癌治療法を投与して、随意に、それに続いて第３の抗癌治療法を投与してなど、そしてこの連続投与を繰り返して、すなわち、１つの抗癌治療法の耐性の進展を減少するため、１つの抗癌治療法の副作用を無効に又は減少するため、そして／又は抗癌治療法の効果を改善するための周期を包含する。
【０２７４】
本発明の化合物と追加の抗癌治療法を対象に同時に投与する場合の、用語「同時に」は、全く同時点での抗癌治療法の投与に限定されるのではなく、むしろ、これらが共に作用できるように（例えば、これらを別の方法で投与した場合より増大した利益を相乗的にもたらすように）これらを順に及びある時間間隔以内に対象に投与することを意味している。例えば、抗癌治療法を同時に又は異なった時点で何れかの順序で順次投与できるが、しかし、同時点に投与しない場合は、望ましい治療効果（好ましくは相乗的な様式に）をもたらすように、十分に近い時点に投与すべきである。本発明の併用抗癌治療法は、あらゆる適切な経路によってあらゆる適切な形態で、別々に投与することができる。併用抗癌治療法の構成成分を同じ医薬組成物中で投与しない場合は、これらを、それを必要としている対象に何れかの順序で投与できると理解できる。
【０２７５】
例えば、本発明の化合物を、それを必要としている対象に、追加の抗癌治療法の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間又は１２週間前）に、それと同時に、又はそれに続いて（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間又は１２週間後）に投与することができる。
【０２７６】
多様な実施態様では、抗癌治療法を、１分離して、１０分離して、３０分離して、１時間未満離して、１時間離して、１時間〜２時間離して、２時間〜３時間離して、３時間〜４時間離して、４時間〜５時間離して、５時間〜６時間離して、６時間〜７時間離して、７時間〜８時間離して、８時間〜９時間離して、９時間〜１０時間離して、１０時間〜１１時間離して、１１時間〜１２時間離して、２４時間まで離して、又は４８時間まで離して投与する。一実施態様では、抗癌治療法を同じ外来診察時に投与する。別の実施態様では、本発明の併用抗癌治療法を１分〜２４時間離して投与する。
【０２７７】
ＸＩＩ．製剤
本発明は、家畜及び／又はヒトへの投与に適している組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。本発明の医薬組成物は、組成物を対象に投与することを可能にする何れの形態であってもよく、当該対象は、これに限定されないが、ヒト、哺乳動物、又はウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどの、非ヒト動物を包含する動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましく、ヒトが最も好ましい。
【０２７８】
癌の予防、治療、及び／又は管理に有効であろう予防及び／又は治療のレジメンに用いられる本発明の化合物の製剤は、現在入手可能な製剤を基にすることができる。あるいは、化合物を当該技術分野の知見及び本明細書の教示に基づき再製剤化することができる。例えば、化合物を固体、液体又は気体（エアゾル）の形態にすることができる。投与の一般的な経路は、これに限定されないが、経口、局所、非経口、舌下、直腸内、膣内、眼内、皮内、腫瘍内、脳内、髄腔内、及び鼻腔内を包含できる。非経口投与は、皮下注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸膜内、胸骨内注射又は輸液手法を包含する。特定の実施態様では、組成物を非経口で投与する。より特定の実施態様では、組成物を静脈内に投与する。本発明の医薬組成物は、対象へ組成物を投与すると本発明の化合物が生体に吸収され利用されるように製剤化できる。組成物は１つ又はそれ以上の用量単位の形態を取ることができ、そこで、例えば、錠剤は単一用量単位であってよく、エアゾル形態の本発明の化合物の容器は複数の用量単位を保持することができる。
【０２７９】
医薬組成物の調製で用いられる物質は、用いられる量において毒性を示さないものでよい。医薬組成物中の有効成分（複数も）の最適な用量は多くの因子によって決まるということは当業者にとって明白なことであろう。関連のある因子は、これに限定されないが、対象の種類（例えば、ヒト）、対象の健康全般、対象が治療を必要としている癌の種類、多剤レジメンの１部としての組成物の使用、本発明の化合物の特定の形態、投与方法、及び用いられる組成物を包含する。
【０２８０】
薬学的に許容される担体又は賦形剤は、組成物を、例えば、錠剤又は粉末の形態にするために、微粒子でもよい。組成物を、例えば、経口用シロップ又は注射液とするために、担体（複数も）は液体でもよい。また、担体（複数も）は、例えば、吸入投与に有用なエアゾル組成物を提供するために、気体でもよい。
【０２８１】
用語「担体」は、これと共に本発明の化合物を投与する、希釈剤、補助剤又は賦形剤を示す。このような製薬用の担体は、水及び、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成由来のものを包含する、油などの、液体でよい。担体は、生理食塩水、アラビア・ゴム、ゼラチン、澱粉糊、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素等でよい。更に、助剤、安定化剤、増粘剤、滑沢剤及び着色剤を用いることができる。一実施態様では、対象に投与するとき、本発明の化合物及び薬学的に許容される担体は、殺菌されている。本発明の化合物を静脈内に投与するとき、水は好ましい担体である。生理食塩溶液並びに水性ブドウ糖及びグリセロール溶液も、特に注射溶液のための、液体担体として利用できる。適切な製薬用の担体は、澱粉、ブドウ糖、乳糖、蔗糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等も包含する。この組成物は、所望により、少量の湿潤或いは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含有することができる。
【０２８２】
組成物は、経口投与を意図としてよく、そしてそのような場合、組成物は固体又は液体の形態が好ましく、ここで、半固体状、半液体状、懸濁液及びゲル形態は、本明細書で液体又は固体の何れかと考えられている形態内に包含される。
【０２８３】
経口投与のための固形組成物として、組成物を粉末剤、顆粒剤、圧縮錠剤、丸剤、カプセル、チューインガム、ウエハース又は同様の形態に製剤化することができる。このような固形組成物は一般に、１つ又はそれ以上の不活性希釈剤を含有している。さらに、以下のものの１つ又はそれ以上が存在していてもよい：エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、微結晶性セルロース、又はゼラチンなどの結合剤；澱粉、乳糖又はデキストリンなどの賦形剤；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル（Primogel）、コーンスターチ等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はステロテックス（Sterotex）などの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；蔗糖又はサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジエッセンスなどの着香料；及び着色剤。
【０２８４】
医薬組成物が、カプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態である場合は、上記種類の物質に加えて、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン又は脂肪油などの液体の担体を含有できる。
【０２８５】
医薬組成物は、液体の形態、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁液であってよい。液体は経口投与に、或いは注射による送達に有用である。経口投与を意図としたときは、組成物は1つ又はそれ以上の甘味剤、保存剤、染料／着色料、及び香味料を含有できる。注射によって投与するための組成物では、1つ又はそれ以上の界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤及び等張剤も包含できる。
【０２８６】
本発明の液体組成物は、それらが溶液、懸濁液又はその他の類似形態であろうとなかろうと、1つ又はそれ以上の以下のものも包含できる：注射用蒸留水、食塩溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル溶液、等張食塩水、溶媒又は懸濁媒体として働く合成モノ−又はジ−グリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、シクロデキストリン、プロピレングリコール又はその他の溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤；及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張力を調節する試薬。非経口組成物は、ガラス、プラスチック又はその他の素材で作られたアンプル、使い捨て注射筒、又は複数回投与用バイアルに封入できる。生理食塩水は好ましい補助剤である。注射用組成物は滅菌されていることが好ましい。
【０２８７】
医薬組成物は、適切な用量が得られるように、本発明の化合物の有効量を含有している。医薬組成物は、それらの個々の疾患に対して現在処方されているように化合物の公知有効量を含有できる。
【０２８８】
一般に有効量は、組成物の重量に対して本発明の化合物が、少なくとも０．０１％である。経口投与を意図する場合は、この量は組成物の０．１重量％と８０重量％の間で変化してよい。好ましい経口組成物は、組成物の４重量％と５０重量％の間の本発明化合物を含有できる。本発明の好ましい組成物は、非経口用量単位が０．０１重量％と２重量％の間の本発明化合物を含有できるように調製される。
【０２８９】
本発明の組成物は適当な何れの経路によっても、例えば、点滴又はボーラス注射によって、上皮層又は皮膚粘膜層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜等）を介する吸収によって、投与できる。投与は全身的又は局所的であってよい。多様な送達システム、例えば、微小粒子、マイクロカプセル、カプセル等は公知であって、本発明の化合物を投与するために有用である。ある特定の実施態様では、本発明の１つ以上の化合物を対象に投与する。投与方法は、これに限定されないが、経口投与及び非経口投与；これに限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下を包含する非経口投与；鼻腔内、硬膜外、舌下、鼻腔内、脳内、心室内、髄腔内、膣内、経皮、直腸内；耳、鼻、眼、又は皮膚へ吸入、又は局所的によって、を包含できる。投与の好ましい方法は、医師の裁量に委ねられ、一部は疾患の部位（癌、癌性腫瘍又は前癌疾患の部位など）によって決まる。
【０２９０】
一実施態様では、本発明の化合物を非経口投与する。特定の実施態様では本発明の化合物を静脈内投与する。
【０２９１】
特定の実施態様では、１つ又はそれ以上の本発明の化合物を治療を必要とする領域（例えば、腫瘍又は虚血疾患の場所）に局所的に投与することが望ましい。これは、例えば、限定するのではないが、手術中の局所注入；局所塗布、例えば、手術後に創傷包帯と併用して、；注射によって；カテーテルの手段によって；坐薬の手段によって；又は移植の手段によって、実施でき。移植片は、シラスティック（silastic）膜などの膜又は繊維を包含している、多孔質の、無孔の、又はゲル状の材質である。一実施態様では、癌、癌性腫瘍、又は前癌組織の部位（又は以前の部位）に直接注射することによって投与できる。
【０２９２】
肺内投与も、例えば、吸入器又はネブライザー、及びエアロゾル化剤による製剤を用いて、又はフッ化炭素又は合成肺表面活性剤中でのかん流を介して、利用できる。ある特定の実施態様では、本発明の化合物を、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体を用いて、坐薬として製剤化できる。
【０２９３】
更に別の実施態様では、本発明の化合物を放出制御システムで送達できる。一実施態様では、ポンプを用いることができる（Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 1987, 14, 201; Buchwald et al., Surgery 1980, 88: 507; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 1989, 321: 574を参照されたい）。別の実施態様では、ポリマー物質を用いることができる（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FL, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 1983, 23, 61を参照されたい；Levy et al., Science 1985, 228, 190; During et al., Ann. Neurol., 1989, 25, 351; Howard et al., J. Neurosurg., 1989, 71, 105も参照されたい）。更に別の実施態様では、放出制御システムを本発明化合物の標的、例えば、脳に近接して設置し、それによって全身投与用量のごく一部のみを必要とすることができる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, 1984, pp. 115-138を参照されたい）。Langer (Science 1990, 249, 1527-1533) による総説で説明されているその他の放出制御システムを用いることができる。
【０２９４】
別の実施態様では、本発明化合物の制御放出又は持続放出を達成するために、ポリマー物質を用いることができる（例えば、米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１５１５４号；及びＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２０２５３号を参照されたい）。持続放出性製剤で用いられるポリマーの例は、これに限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシメタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリアクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及びポリオルトエステルを包含する。好ましい実施態様では、持続放出性製剤で用いられるポリマーは、不活性で、滲出性不純物がなく、保存上安定で、無菌で、そして生物分解性である。
【０２９５】
固形、液体又は気体形態であろうとなかろうと、本発明の組成物は、これに限定されないが、追加の予防剤、追加の治療剤、制吐剤、造血コロニー刺激因子、補助治療剤、ワクチン又はその他の免疫刺激剤、抗体／抗体断片からなる薬剤、抗鬱剤及び鎮痛剤を包含するものから選ばれる、追加の活性薬を包含できる。例えば、特定の実施態様では、医薬組成物は、本発明の化合物、追加の抗癌薬、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含有している。
【０２９６】
本発明は、本発明の医薬組成物の１つ又はそれ以上の成分を充填した１つ又はそれ以上の容器を含有している医薬パック又はキットも提供する。このような容器は、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する行政機関によって規定された形式の通知書をこのような容器に随意に添付することができ、この通知書は、ヒトへの投与についての製造、使用又は販売に対する当局の認可を表示している。
以下の実施例は、本発明の多くの態様の説明として提供されていて、決して本発明を限定することを意図していない。
【実施例】
【０２９７】
実施例１：コンピュータによるスクリーニング（In silico screen）
以下の市販ライブラリーから多種のコンピュータ内（In silico） ライブラリーを作成した：ACB Blocks、Asinex、Chembridge、Maybridge、Microsource、NCI、Peakdale、Zinc データベースから取り出したＦＤＡ承認薬（zinc.docking.org）。このIn silico ライブラリーをｍｏｌ２フォーマットに変換して、Qikprop を用いて薬様特性、ＡＭＤＥ特性、及び適切な官能基についての検索条件を追加した。分子は、３Ｄの全原子構造に変換して、最大４種の立体異性体、ｐＨ７．０及びｐＨ２．０に対するイオン化状態、異なった互変異体及び対掌体を作成して、Ligprep及びMacromodelを用いてそれらの配置を最適化した。In silicoでの３Ｄ分子のデータベースは合計およそ７５０，０００化合物となった。平均ＢＡＸ閉ループ構造及び平均ＢＡＸ開ループ構造を用い GROMACS ソフトウェアによってドッキング用のＢＡＸ構造を作成した。この２つの構造を、Maestro を用いてドッキングに適したフォーマットに作成して、それらのイオン化状態及び水素結合衝突を荷電した残基で確認した。ＢＩＭ ＳＡＨＢ結合部位の中心、２０Å以内にドッキングするリガンド、及び供給された座標から１２Åに拘束されるそれらの直径中央点を示す座標からＢＡＸ構造に対する受容体グリッドを作成した。更なる位置的、水素結合或いは疎水性拘束は含めていない。それぞれのＢＡＸ構造についての小分子データベースを伴う標準精度モード（ＳＰＶＳ）のGride を用いてドッキングを実施した。５員及び６員環の反転、各リガンドに対してエネルギーを最小にする最適４００ポーズの保持、そして倍率０．９までリガンドの非極性原子のファンデルワルス半径の拡張を可能にする、柔軟なドッキングを実行した。それぞれのＢＡＸ構造モデルに対するGlidescore関数に基づいてランク付けした上位２０，０００ヒットを選択して、特別精度ドッキングモード（ＸＰＶＳ）を用いてＢＡＸ構造に対して再度ドッキングさせた。それぞれのドッキング算出からの上位１０００ヒットをＢＡＸ構造に対してGlideポーズビュアーで可視化し、主要なＢＡＸ結合部位残基とのそれらの相互作用について分析して、それらの好ましい水素結合、疎水接触及び分子特性に基づいて選択して、表１に列挙して図９に描写している同定化合物を誘導した。Quickprop、Ligprep、Macromodel、Maesto、Glide は Schrodinger Suite 2006の部分である。
【０２９８】
実施例２：ＢＡＸと直接結合して活性化するＳＡＨＢの合成
既述の手法を用いて、ＢＩＭ、ＢＩＤ、ＰＵＭＡ、及びＢＡＸのＢＨ３ドメインに対応する炭化水素架橋ペプチド及びにそれらの突然変異体並びにＦＩＴＣ−βＡｌａ誘導体を合成し、精製して、特性を明らかにした。そのようなＳＡＨＢの組成物の例は図８に列挙されている（Walensky, L. D., et al. (2004) Activation of apoptosis in vivo by a hydrocarbon-stapled BH3 helix, Science (New York, N.Y 305, 1466-1470; Walensky, L. D., et al. (2006) A stapled BID BH3 helix directly binds and activates BAX, Mol Cell 24, 199-210; Bird, G.H., Bernal, F., Pitter, K., and Walensky, L.D.  Synthesis and biophysical characterization of stabilized alpha-helices of BCL-2 domains. Methods in Enzymology, 446: 369-386, 2008）。
【０２９９】
実施例３：ＮＭＲ分析及び生物学的試験に適しているＢＡＸの製造
ＢＡＸモジュレータを同定して試験するための本明細書に記載のＮＭＲ分析及び生物学的アッセイについて、十分に安定で純粋なＢＡＸのモノマー及びその他の配座異性体種のタンパク質発現及び精製を最適化するために必要に応じて、ＢＡＸの組成物及び産生方法を、先行報告（Walensky, L. D., et al. (2006) A stapled BID BH3 helix directly binds and activates BAX, Mol Cell 24, 199-210; Suzuki, M., Youle, R. J., and Tjandra, N. (2000) Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization, Cell 103, 645-654）から変更した。ヒトＢＡＸをコードする全長のｃＤＮＡ（ａａ１〜１９２）をｐＴＹＢ１プラスミド（New England Biolabs）内にクローン化して、制限酵素認識部位ＮｄｅＩ及びＳａｐＩを用いてキチンタンパク質のＮ−末端で融合した。Ｐ１６８Ｇ、Ｋ２１Ｅ、Ｅ６９Ｋ、Ｌ４５Ｃ、Ｍ１３７Ｃ、及びこれらの組み合わせを包含する、ＢＡＸｃＤＮＡの点突然変異をQuikChange II部位特異的突然変異キット（Stratagene, CA）を利用して引き起こした。突然変異及びそれらの関連オープンリーディングフレームをＤＮＡ配列分析によって確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中の新鮮な形質転換体を、製造会社（New Brunswick, NJ）のプロトコールに従って、ＯＤ：０．８〜１．０のフラスコを用いてＬ培地（Luria Broth（ＬＢ）培地）中で、又はＯＤ：１４の５Ｌ発酵槽を用いて富栄養ＬＢ培地（３．５ｇのＫＨ２ＰＯ４、５．０ｇのＫ２ＨＰＯ４、３．５ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ、３０ｇのグルコース、３．５ｇのトリプトファン、５．０ｇの酵母エキス）中で生育させる。細胞を３７℃で生育させて、１ｍＭにＩＰＴＧで４時間３０℃で発現の誘導を実行した。４℃で２５分間５０００ｒｐｍで遠心分離して細胞を採取し、次いで２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及びロッシュ（Roche）プロテアーゼ阻害カクテル（５０ｍＬ緩衝液／ペレット２５ｇ）を含有している冷却した溶解緩衝液中に再懸濁した。細胞をファルコン（Falcon）試験管中に分注して−８０℃に冷凍する。
【０３００】
解凍した時点で、細胞を超音波で破壊して、４℃で１時間４５，０００ｒｐｍで超遠心分離してペレットから分離した。上澄液を、キチンビーズ（New England Biolabs）を含有していて、４℃で溶解緩衝液中であらかじめ平衡化した、使い捨てグラビティカラム（Bio-Rad）上に取り込んだ。ビーズを溶解緩衝液の２０総容積で、次いで５０ｍＭのＤＴＴを含有している溶解緩衝液の追加の３総容積で洗浄した。カラムは上部と底に蓋をし、次いでキチンビーズを４℃で１晩放置して、キチン融合タンパク質を開裂させた。溶解緩衝液の少なくとも１０総容積でカラムからＢＡＸを溶出した。ＢＡＸタンパク質を、１０−ｋＤａカットオフセントリコン（Centricon）スピン濃縮器（Millipore）を用いて、０．５ｍＬまで濃縮し、次いでゲルろ過緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０）にて４℃であらかじめ平衡化したゲルろ過カラム（Superdex 75、10/300 GL、GE Healthcare Life Sciences）に付した。流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎで０．５ｍＬ間隔に分画して、注入試料容量＜０．２５ｍＬの分離は最大のＢＡＸモノマーを得た。ＢＡＸモノマーを含有している分画を〜１２ｍＬ容量の緩衝液で溶出し、プールし、次いで１０−ｋＤａカットオフセントリコンスピン濃縮器（Millipore）を用いて濃縮して、直ちに機能アッセイに用いた。
【０３０１】
実施例４：ＮＭＲ分光法及びその他の構造手法によるＢＡＸのモジュレータ同定
ＮＭＲによるスクリーニングは、５０〜１００μＭ濃度の化合物の非存在下及び存在下で、２５〜５０μＭ濃度の均一に１３Ｃで標識化ＢＡＸの１Ｈ−１３Ｃでフィルター処理した１Ｄ実験を記録して実行した。１．０〜０．２ｐ．ｐ．ｍ．の間の領域におけるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＴｈｒのメチル基の化学共鳴の変化から、結合を確認した。試験化合物の結合モードを、分子の滴定を実施し、化合物の非存在下又は存在下におけるＢＡＸの１Ｈ、１５Ｎ−ＨＳＱＣ又は１Ｈ、１３Ｃ ＨＳＱＣ実験を記録することにより、そしてそれぞれにＢＡＸ骨格アミド又は側鎖メチル基の化学シフトを、モニタリングすることによって特定化する。加重平均化学シフト差Δは、
【０３０２】
【数１】
0006049260.tif 000019
【０３０３】
としてｐ．ｐ．ｍ．で計算して、ＢＡＸの残基数の関数としてプロットする。誘導したΔが０．１ｐ．ｐ．ｐｍ．より大きいときに、リガンド滴定による有意な化学シフト変化が考慮される。均一に標識した１５Ｎ又は１５Ｎ／１３Ｃ標識化ＢＡＸサンプルは、同位体標識を実現するためのその後の修正を除いて、上記のように製造及び精製する。形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、３７℃で生育して、ＬＢ培地（非標識タンパク質用に）、又はそれぞれに均一な１５Ｎ−標識タンパク質又は１５Ｎ、１３Ｃ標識タンパク質を得るための１３Ｃグルコース（２ｇ／ｌ）を有するか有していない１５Ｎ−ＮＨ４Ｃｌ（１ｇ／ｌ）で置換したＭ９最小培地の何れか中に１ｍＭのＩＰＴＧで誘導する。ＢＡＸのＮＭＲサンプルは、Ｈ２Ｏ／Ｄ２Ｏ（９：１）中の２０ｍＭの酢酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）中で調製する。試験化合物のストックは、例えば、１０ｍＭ濃度にＤＭＳＯ中で調製する。ＮＭＲ実験は、NMR Pipe スペクトル分析パッケージで処理して、及び化学シフト変化は、NMR View ソフトウェアで測定する。ＮＭＲスペクトルは、例えば、ｚ−遮蔽勾配、三重共鳴凍結プローブを搭載したBruker Avance 600MHz で３０℃で記録する。
【０３０４】
ＢＡＸ相互作用化合物の結合特性を同定及び特徴付けする更なる構造アプローチは、上に記載及び参照されるように、ＮＭＲによるＳＡＲ、ＳＨＡＰＥＳ ＮＭＲ、及びＮＭＲ及びＸ線結晶学を用いるその他の断片に基づく薬剤発見手段を包含する。
【０３０５】
実施例５：競合的蛍光偏光結合アッセイ
蛍光化したＢＩＭ ＳＡＨＢ（２５ｎＭ）を結合緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４））中、室温で、ＢＩＭ ＳＡＨＢ（１μＭ）の存在下又は非存在下で、組み換え野生型ＢＡＸ又はその突然変異誘導体（１００ｎＭ）と共に培養して、ＦＩＴＣ−ＢＩＭ ＳＡＨＢのＢＡＸとの結合及び競合的阻害に関する基準ＦＰＡ値を確立した（図１１）。試験化合物のＢＡＸ結合能力を評価するために、５０μＭから始める連続希釈液をＦＩＴＣ−ＢＩＭ ＳＡＨＢ（２５ｎＭ）及びＢＡＸ（１００ｎＭ）に加えて、POLARstar OPTIMAマイクロプレートリーダー（BMG Labtech）を用いて経時的に蛍光偏光を測定して、ＦＩＴＣ−ＢＩＭ ＳＡＨＢ／ＢＡＸ結合の競合的阻害剤を同定した。Prismソフトウェア4.0(Graphpad)を用いる非線形回帰分析によってＩＣ５０値を確定した。ＢＡＸ結合活性を有する化合物を同定するためのライブラリーの実験的スクリーニングにもこのアッセイを利用することができる。
【０３０６】
実施例６：オリゴマー化アッセイ
ＢＩＭ ＳＡＨＢをＢＡＸモノマー（３８μＭ）を含有している２００μＬの溶液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ、ｐＨ７．２〜７．４、１５０ｍＭのＫＣｌ）にＢＩＭ ＳＡＨＢとＢＡＸの比を０．５：１、１：１、２：１及び４：１にして加えた。混合物及びＢＡＸモノマー単独のサンプルを、２２℃で１５分間培養し、次いでＳＤ７５カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析に付した（図１２Ａ）。クロマトグラムは、モノマーとオリゴマーのピークをそれぞれ、〜１１．５分及び〜６．５分に示す。ゲルろ過ピークの分子量を調整するために、タンパク質標準品（GE Healthcare）を用いた。時間依存分析のために、ＢＩＭ ＳＡＨＢをＢＡＸモノマーに１：１の比で加えて、２２℃で３０、６０、９０分間培養した後、混合物をＳＥＣで分析した。比較のための基準として、ＢＡＸモノマー単独を０時点及び上記の時点で分析した。in silicoスクリーニングにより同定した試験化合物をこのＢＡＸオリゴマー化アッセイで評価して、選択した化合物について示されているように、そのモノマーからそのオリゴマー形態へのＢＡＸの分子が誘発する変換を観察した（図１２Ｂ）。ＢＡＸオリゴマー化のハイスループット検出に用いた別法は、動的光散乱（ＤＬＳ）分析（Wyatt Technology）を含んでいる（図１３）。ＳＥＣ又はＤＬＳ読み出しを用いるオリゴマー化アッセイを、ＢＡＸのオリゴマー化を直接調節する（すなわち、活性化又は阻害する）化合物を同定するためのライブラリーの実験的スクリーニングにも用いることができる。
【０３０７】
実施例７：構造変化アッセイ
ＢＡＸモノマー（９μＭ）を含有している２０μＬのＰＢＳ溶液に、ＢＩＭ ＳＡＨＢ：ＢＡＸの比が０．５：１、１：１及び４：１にて、ＢＩＭ ＳＡＨＢを加えた。混合物（１０μＬ）及びＢＡＸモノマーサンプル（１０μＬ）を２２℃で１５分間培養して、次いで１５μＬの６Ａ７抗ＢＡＸ抗体を含有しているＢＳＡの３％ＰＢＳ溶液（２５０μＬ）に加えて、４℃で１時間培養した。加えて、各注入サンプル（１０％）の１μＬを５０μＬのＳＤＳ−サンプル緩衝液と混合して、試料にわたるＢＡＸレベルの基準値を測定した。あらかじめ浄化してあるセファロースビーズ（５０μＬ）をＢＩＭ ＳＡＨＢ：ＢＡＸ及びＢＡＸモノマー溶液に加えて４℃で更に２時間培養した。セファロースビーズを遠沈し、ＢＳＡの３％ＰＢＳ溶液１ｍＬで３回洗浄し、５０μＬのＳＤＳ−サンプル緩衝液に再懸濁して、９５℃で２分間煮沸した。それぞれの注入及び免疫沈降サンプルの１０μＬを分析に用いた。サンプルを１２％のＳＤＳ−ＰＳＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜上にブロットして、ウサギポリクローナルＮ２０抗ＢＡＸ抗体（Santa Cruz Biotechnology）及び化学発光による検出（PerkinElmer）を用いてウェスタン分析を実施した。試験化合物のＢＡＸ構造変化を誘発する能力を、このアッセイを用いて評価する。また、このアプローチを、ＢＡＸ構造変化を直接調節する（すなわち、活性化又は阻害する）化合物を同定するためのライブラリーの実験的スクリーニングに用いることができる。
【０３０８】
実施例８：架橋結合アッセイ
ＢＡＸ（１０ｎＭ）を、１０μＭから始める試験化合物の連続希釈液に加えて、１００ｎＭのＢＩＭ ＳＡＨＢの存在下又は非存在下で、室温で１時間培養した。続いて、１ｍＭのＢＭＨ（Pierce）を加えて、更に３０分間培養した。ゲル負荷緩衝液で反応を停止させて、サンプルを電気泳動及びＮ２０抗ＢＡＸ抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）を用いるウェスタン分析で分析して、ＢＡＸオリゴマー形態の存在又は非存在を確認した。ＢＩＭ ＳＡＨＢの非存在では、アッセイは、ＢＡＸのオリゴマー化を誘導する化合物を同定する。ＢＩＭ ＳＡＨＢの存在下で実施した場合は、ＢＩＭ ＳＡＨＢ誘導ＢＡＸオリゴマー化と相乗作用するか或いは阻止する化合物を同定することができる。
【０３０９】
実施例８：リポソーム放出アッセイ
ＢＡＸ、試験リガンド、及び脂質ベシクル以外の因子の非存在下で、プロアポトーシスＢＡＸの機能的放出活性を直接活性化する試験リガンドの能力を測定するために、リポソーム放出アッセイを用いる。ミトコンドリア外膜接触部位（ＯＭＣＴベシクル）（Ardail et al., 1990; Lutter et al., 2000）と類似している脂質組成を有する大きい単層ベシクル（ＬＵＶｓ）を作出して、既述（Oh et al., 2005; Oh et al., 2006, Pitter et al., 2008）の様にしてＦＩＴＣ標識化デキストランに封入した。蛍光発光アッセイを行って、報告されている（Oh et al., 2005; Pitter et al., 2008）様にして、ＦＩＴＣの放出を定量した。実験は、１０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度、１５〜５０ｎＭのＢＡＸ、及びＢＡＸ活性化ペプチド又は試験化合物の連続希釈液を用いて実施した。陰性対照検討は、ＢＡＸ単独、化合物単独、対照化合物（例えば、小分子のエナンチオマー、ペプチドのアミノ酸変異体）、及び既述（Walensky et al, 2006, Gavathiotis et al, 2008）の様な、アンチアポトーシスＢＣＬ−ＸＬがリガンド誘発ＢＡＸ活性を阻止する能力を試験することを包含する。このようなリポソーム放出アッセイは、ＢＡＸ介在放出を誘発する化合物を同定して、且つハイスループットで実施できる。ＢＩＭ ＳＡＨＢの存在下で実施する場合は、ＢＩＭ ＳＡＨＢ誘発、ＢＡＸ介在リポソーム放出と相乗作用するか或いはこれを阻止する化合物を同定できる。このアッセイは、ＢＡＸ介在リポソーム放出を直接調節する（活性化又は阻害する）化合物を同定するためのライブラリーの実験的スクリーニングにも用いることができる。
【０３１０】
実施例９：チトクロムｃ放出アッセイ
ミトコンドリアのチトクロムｃ放出アッセイを、オルガネラに関連するプロアポトーシスＢＡＸの機能的放出活性を直接活性化する試験リガンドの能力を測定するために用いる（図１４）。Ｂａｘ−／−／Ｂａｋ−／−ミトコンドリア（０．５ｍｇ／ｍＬ）を単離して、記載（Pitter, K., Bernal, F., LaBelle, J.L., and Walensky, L.D.  Dissection of the BCL-2 family signaling network using stabilized alpha-helices of BCL-2 domains.  Methods in Enzymology, 446: 387-408, 2008）の様にして放出アッセイを実施した。ミトコンドリアをＢＡＸ単独（５０ｎＭ）、試験化合物単独（例えば、２５μＭからの連続希釈液）、及び組み合わせ（５０ｎＭＢＡＸ＋試験化合物の連続希釈液）と共に、ＢＩＭ ＳＡＨＢ（２５０ｎＭ）の存在下又は非存在下で、培養した。４０分後に、ペレット及び上澄画分を単離して、比色ＥＬＩＳＡアッセイ（R & D Systems）を用いてチトクロムｃを定量した。放出可能なミトコンドリアプールから、上澄液中へ放出されたチトクロムｃのパーセント（％ｃｙｔｏｃｓｕｐ）を以下の式に従って計算した：％ｃｙｔｏｃ＝［ｃｙｔｏｃｓｕｐ−ｃｙｔｏｃｂａｃｋｇｒ）／（ｃｙｔｏｃｔｏｔａｌ−ｃｙｔｏｃｂａｃｋｇｒ）］＊１００（式中のbackgroud releaseはベシクル処理（１％ＤＭＳＯ）サンプルの上澄液中で検出されたチトクロムｃを示し、そしてtotal releaseは１％トリトン−Ｘ１００で処理したサンプル中で測定されたチトクロムｃを示す。ＢＩＭ ＳＡＨＢの非存在下で、アッセイは、ＢＡＸが介在するチトクロムｃ放出を誘発する化合物を同定する。ＢＩＭ ＳＡＨＢの存在下で実施する場合、ＢＩＭ ＳＡＨＢ誘発、ＢＡＸ介在チトクロムｃ放出と相乗作用するか或いはこれを阻止する化合物を同定できる。このアッセイは、ＢＡＸ介在チトクロムｃ放出を直接調節する（活性化又は阻害する）化合物を同定するためのライブラリーの実験的スクリーニングにも用いることができる。
【０３１１】
実施例１０：試験リガンドによるＢＡＸ介在アポトーシスの誘発を検出する細胞アッセイ
Ｂａｘ−／−Ｂａｋ−／−ＤＫＯ ＭＥＦをＳＶ４０で形質転換して、１０％ウシ胎仔血清を補完したダルベコ改変イーグル培地中で、標準的な培養条件及び手法に従って、保持した。ＢＡＸ及びその突然変異体のＤＫＯ細胞内への再構築を、既述（Cheng, E. H., et al. BCL-2, BCL-X(L) sequester BH3 domain-only molecules preventing BAX- and BAK-mediated mitochondrial apoptosis. Mol Cell 8, 705-711 (2001); Kim, H., et al. Hierarchical regulation of mitochondrion-dependent apoptosis by BCL-2 subfamilies. Nat Cell Biol 8, 1348-1358 (2006)）の様に、ＢＡＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのレトロウィルス形質導入によって達成し、次いでＧＦＰ感受性細胞に対してＭｏＦｌｏソートを行った。ＢＡＸタンパク質の発現を抗ＢＡＸウェスタン分析で確認した。ＢＡＸ再構築ＭＥＦ及び対照Ｂａｘ−／−Ｂａｋ−／−ＤＫＯ ＭＥＦを一連の濃度の試験化合物に曝露して、製造会社のプロトコールに従ってアネキシン−Ｖ−Ｃｙ３（BioVision, Mountain View, CA）染色により、次いで、FACS Caliber（BD Bioscience, San Jose, CA）及びCellQuester又はFlowJoソフトウェアを用いるフローサイトメリ分析によって、細胞死を定量した（図１５）。試験化合物によるＢＡＸ介在細胞死の阻害をモニターするために、スタウロスポリン（例えば、１μＭ）又はＢＩＭ ＳＡＨＢ（例えば、１０μＭ）の存在下で同一の実験を、次いで上記のようにアネキシン−Ｖ分析を実施した。このアッセイは、細胞状況におけるＢＡＸ介在アポトーシス誘発を直接調節する（すなわち、活性化又は阻害する）化合物を同定するためのライブラリーの実験的スクリーニングに用いることもできる。
【０３１２】
本願を通して引用されている全ての参照文献（文献参照、登録特許、公開特許出願、及び同時係属特許出願を含む）は参照により、それらの全てが本明細書に明確に取り込まれている。別段に特定しない限り、全ての本明細書で用いられている技術及び科学用語は、当業者に一般に知られている意味に従っている。
【０３１３】
当業者は、本明細書に記載されている本発明の特定の実施態様の多数の均等物を、認識されるだろう、或いは通常の実験以上のものを用いずに確認できるだろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0006049260.tif 000026
【図７Ａ】
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【図７ＢＣ】
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【図８−１】
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【図８−２】
0006049260.tif 000030
【図８−３】
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【図８−４】
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【図９ＡＢ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０ＢＣ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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