(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１−１）で表される化合物。
【化２】
0005862889.tif 000016
【請求項２】
下記式（１−１）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を含有するＭＥＰ経路中の酵素ＤＸＳの阻害剤。
【化４】
0005862889.tif 000017
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＥＰ経路中の酵素ＤＸＳの阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物にとって必要不可欠なイソプレノイドはイソペンテニル２リン酸から生合成されている。イソペンテニル２リン酸合成経路は２種類知られている。真核生物が主に保有しているメバロン酸経路と、原核生物が主に保有している２−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  ４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＭＥＰ）経路である。また、植物は葉緑体内でＭＥＰ経路を使用し、細胞質内ではメバロン酸経路を使用していることも知られており、進化的にも非常に興味深い経路である。原核生物の中には結核菌やマラリア原虫などの病原菌が多く存在している。そして、ＭＥＰ経路は人には存在しないため、新規薬剤分子の有用なターゲットと考えられている。
【０００３】
ＭＥＰ経路を以下に示す。
【０００４】
【化１】
0005862889.tif 000002
【０００５】
ＭＥＰ経路では、まずピルビン酸（Ｐｙｒ）とグリセルアルデヒド３リン酸（Ｇ３Ｐ）が酵素ＤＸＳによってＤＸＰに縮合される。その後、酵素ＤＸＲによってＭＥＰが合成される。その後は５つの段階を経てイソペンテニル２リン酸が生合成される。
【０００６】
本発明は、ＭＥＰ経路の最初の反応に関わる酵素ＤＸＳに関する。現在、ＭＥＰ経路阻害剤としてフォスミドマイシンとケトクロマゾンが知られている。フォスミドマイシンは酵素ＤＸＲ（１−ｄｅｏｘｙ  Ｄ−ｘｙｌｕｌｏｓｅ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）を阻害し、ケトクロマゾンは酵素ＤＸＳ（１−ｄｅｏｘｙ  Ｄ−ｘｙｌｕｌｏｓｅ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）を阻害する。どちらもＭＥＰ経路の最初の反応に関係する酵素である。しかし、この２つの阻害物質は薬剤への応用としていくつかの問題があると言われている。フォスミドマイシンは体内で分解しやすいため、多量の摂取を必要とされる。ケトクロマゾンは元々除草剤として使用されていることから人体への影響が懸念されている。このような問題から、これらの化合物はＭＥＰ経路阻害剤としてはまだ改善の余地があり、新たな阻害剤が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−１９６４１号公報
【特許文献２】特開２０１１−１７８７４３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】浅見忠男、雄谷友美、葛山智久、笠原博幸、永田典子、山口信次郎、神谷勇治、吉田茂男、白化作用を有する除草剤クロマゾンはＭＥＰ経路中の１−ｄｅｏｘｙ−ｄ−ｘｙｌｕｌｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅが触媒する反応の阻害剤か？、植物化学調節学会研究発表記録集、３７巻、２，２００２
【非特許文献２】松江由紀子、浅見忠男、葛山智久、西山真  ２００７年度日本農芸化学会要旨集、ＭＥＰ経路阻害剤ｋｅｔｏｃｌｏｍａｚｏｎｅの阻害機構に関する研究、２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＭＥＰ経路中の酵素ＤＸＳの阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、コショウ科のヒハツモドキ（Ｐｉｐｅｒ  ｒｅｔｒｏｆｒａｃｔｕｍ）の抽出液から酵素ＤＸＳ阻害活性測定を行いスクリーニングした。その結果、強い酵素ＤＸＳ阻害活性を示すフラクションがあることを見い出した。この抽出液からＤＸＳ阻害活性物質を単離し、本発明を完成した。ヒハツモドキは、東南アジア原産であり沖縄でもよく栽培されている。現地では香辛料や民間伝承薬として使用されている。
【００１１】
本発明は、下記式（１−１）
【００１２】
【化２】
0005862889.tif 000003
【００１３】
で表わされる化合物である。
【００１４】
また本発明は、上記式（１−１）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を含有するＭＥＰ経路中の酵素ＤＸＳの阻害剤である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の化合物または阻害剤は、ＭＥＰ（２−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  ４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）経路中の酵素ＤＸＳ（１−ｄｅｏｘｙ  Ｄ−ｘｙｌｕｌｏｓｅ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）を阻害する。本発明の化合物または阻害剤は、結核菌の類縁菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）に対する生育阻害活性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｆｒ．Ｂ−３−４の活性測定結果を示す図である。
【図２】Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに対する生育阻害活性試験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の化合物は、下記式（１−１）で表される。
【００１８】
【化３】
0005862889.tif 000004
【００１９】
式（１−１）の化合物の薬学的に許容される塩の例としては、塩基付加塩が挙げられる。
塩基付加塩としては無機塩基または有機塩基との塩が挙げられる。無機塩基との塩として、例えば、アンモニウム塩、アルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩等が挙げられる。
【００２０】
また有機塩基との塩として、例えば、第１級、第２級および第３級脂肪族および芳香族アミンとの塩が挙げられる。これらの例として、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、４種のブチルアミン異性体、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ジ−ｎ−ブチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、キヌクリジン、ピリジン、キノリンおよびイソキノリン、ベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、ヒドラバミンが挙げられる。またアルギニン、リシンなどのようなアミノ酸との塩が挙げられる。
式（１−１）の化合物またはその塩は、溶媒和物としても提供され得る。溶媒和物として、例えば、水和物、メタノール、エタノール等のアルコール和物等が挙げられる。
【００２１】
＜式（１−１）の化合物の製造方法＞
式（１−１）の化合物は、ヒハツモドキ（Ｐｉｐｅｒ  ｒｅｔｒｏｆｒａｃｔｕｍ）の葉を抽出および精製して製造することができる。
抽出は、メタノール、アセトニトリルなどの溶媒で行うことができる。
精製は、中圧クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等によって行うことができる。
得られたフラクションの酵素ＤＸＳの阻害活性は、ＭＥＰ経路の初期反応であるＰｙｒとＧ３ＰからＭＥＰが合成される過程での、酵素ＤＸＲの反応により生じるＮＡＤＰＨの吸収波長を測定することで間接的に測定することができる。
【実施例】
【００２２】
＜酵素ＤＸＳの阻害活性の測定＞
酵素ＤＸＳは、下記に示すように、ＰｙｒとＧ３Ｐを基質としてＤＸＰを生成する。その後、ＤＸＰは酵素ＤＸＲによってＭＥＰに変換される。酵素ＤＸＲが反応する過程で同時にＮＡＤＰＨを還元するためＮＡＤＰＨの特異的な吸収波長である３４０ｎｍの吸光度を測定することで酵素ＤＸＳの活性を間接的に測定した。
【００２３】
【化４】
0005862889.tif 000005
【００２４】
（基質、ｂｕｆｆｅｒ、タンパク質の濃度調整）
２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＴＰＰ、１Ｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１Ｍ  Ｇ３ＰをＳｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎとして作成した。
精製したＤＸＳおよびＤＸＲ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）の濃度をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌ、になるように調整した。
【００２５】
（フラクションとＤＸＳ  のプレヒート）
ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ  １００μｌとＤＸＳ  １０μｌサンプル（１ｍｇ／ｍｌ）４μｌをエッペンチューブに添加し、３７℃で１０ｍｉｎプレヒートを行った。
【００２６】
（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  の作成とＤＸＰの生成）
ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎより下記表１に示すようにｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを作成した。
【００２７】
【表１】
0005862889.tif 000006
【００２８】
ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを３７℃で１ｈインキュベートした。その後ｏｎ  ｉｃｅで酵素反応を停止させた。
【００２９】
（ＤＸＲの活性測定）
インキュベート後、エッペンチューブから３００μｌをセル（ＴＭ  Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）に取り３７℃で１ｍｉｎプレヒートを行った。その後、ＮＡＤＰＨ（１００ｍＭ）を６μｌ添加し波長３４０ｎｍの吸光値の測定を開始する。４０ｓｅｃ後ＤＸＲ（１ｍｇ／ｍｌ）を２μｌ添加し６ｍｉｎ測定した。
【００３０】
【化５】
0005862889.tif 000007
【００３１】
コントロールとしてサンプルの代わりにメタノールを添加した場合、ＤＸＲの酵素反応が進むことにより波長３４０ｎｍでの吸光値が時間とともに減少する。サンプルにＤＸＳに対する阻害活性がある場合には、コントロールと比較して、吸光値の減少が見られないか、あるいは緩やかになる。
【００３２】
実施例１
＜粗抽出＞
乾燥したヒハツモドキ（Ｐ．ｒｅｔｒｏｆｒａｃｔｕｍ）の葉２１．２ｇを、ミルミキサーを用いて破砕し、１Ｌメタノールにて一晩抽出した。その結果、合計１９７７ｍｇの抽出液を得られた。得られた抽出液は２００ｍｇ／ｍｌに濃度調整し粗抽出液とした。
【００３３】
＜中圧クロマトグラフィーによる精製＞
（精製１段階）
Ｐｕｒｉｆ  ｃｏｍｐａｃｔ（モリッテクス社）を用い以下の条件でサンプル２００ｍｇ／ｍｌを４ｍｌ添加した。
カラム：シリカゲルカラム（Ｓｉ６０μｌ  ＳＩＺＥ  １２０）
溶媒：  メタノール、クロロホルム
組成：  Ｆｌｏｗ  ２０ｍｌ／ｍｉｎ  ０ｍｉｎメタノール０％
→１２０  ｍｉｎメタノール１００％
その結果、試験管（一本１８ｍｌ）１３４本分分取し、下記表２に示すように分画した。
【００３４】
【表２】
0005862889.tif 000008
【００３５】
これらのフラクションについてＤＸＳ阻害活性を測定した。その結果Ｆｒ．Ｂに阻害活性が見られた。
【００３６】
（精製２段階）
得られたＦｒ．Ｂを下記条件でさらに精製した。
条件
カラム：ＯＤＳ−３  ２０×２５０  ｍｍ
流量：  ５  ｍｌ／ｍｉｎ
溶媒：  アセトニトリル：メタノール＝９：１
Ｆｒ．Ｂ−１〜３の３つのフラクションが得られ、活性測定にかけたところＦｒ．Ｂ−３（保持時間２９分〜３５分）に活性が見られた。以後Ｆｒ．Ｂ−３をさらに精製していった。
【００３７】
（精製３段階）
Ｆｒ．Ｂ−３を下記条件でさらに精製した。
条件
カラム：ＯＤＳ−３  ４．６×２５０  ｍｍ
流量：  ５  ｍｌ／ｍｉｎ
溶媒：  アセトニトリル：メタノール：水＝８：１：１
Ｆｒ．Ｂ−３−１〜５の５つのフラクションが得られた。活性測定にかけたところＦｒ．Ｂ−３−４（保持時間７．８分〜９．８分）および５に活性が見られた。Ｆｒ．Ｂ−３−４はピークを切り出しＦｒ．Ｂ−３−５はそのあとのベース部分を分取していることからＦｒ．Ｂ−３−４を解析していくこととした。
【００３８】
＜Ｆｒ．Ｂ−３−４の活性測定＞
Ｆｒ．Ｂ−３−４の活性測定結果を図１に示す。
【００３９】
＜Ｆｒ．Ｂ−３−４の構造解析＞
阻害活性測定の結果によりＦｒ．Ｂ−３−４に活性が見られたためＨＰＬＣにて分析を行った。
【００４０】
（ＨＰＬＣによる分析）
カラム：ＯＤＳ−３  ４．６×２５０  ｍｍ
流量：  ５  ｍｌ／ｍｉｎ
溶媒：  アセトニトリル：メタノール：水＝８：１：１
分析の結果Ｆｒ．Ｂ−３−４はシングルピークであることが示唆された。このフラクションの構造解析を行った。
【００４１】
（ＬＣ／ＭＳによる分子量推定）
精製の結果、単離したと考えられるＦｒ．Ｂ−３−４をＬＣ／ＭＳにかけたところ、分子量は３７６であり、組成式は、Ｃ２２Ｈ３２Ｏ５であると推定された。
【００４２】
（ＮＭＲ解析）
ＮＭＲのスペクトル解析の結果、下記式で表されるメチレンジオキシフェニル基を有していることが判明した。メチレンジオキシフェニル基の置換様式は１，２，４−置換であり、その化学シフト値から、下記式のＲの部分にアルキル側鎖が置換していることが明らかになった。
【００４３】
【化６】
0005862889.tif 000009
【００４４】
また下記式で表されるテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）環が存在していることが判明した。ＴＨＦ環の一方はカルボキシメチル基(‘-ＣＨ２-ＣＯＯＨ)、もう一方はアルキル鎖が置換していることが分かった。
【００４５】
【化７】
0005862889.tif 000010
【００４６】
なお、１3Ｃ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト値は以下のとおりであった。
１3Ｃ−ＮＭＲ(１００ＭＨｚ，  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４)  １７６．６,  １４８．９，  １４６．９,  １３７．９，  １２２．１,  １０９．７,  １０８．９,  １０１．９,  ８１．１,  ８０．４,  ７７．３,  ７６．９,  ４３．０,  ３７，２,  ３６．９,  ３６．６,  ３３．０,  ３２．８,  ３１．９,  ３１．８,  ３０．８,  ３０．７,  ３０．６,  ３０．２,  ２７．２  ｐｐｍ
以上よりＦｒ．Ｂ−３−４フラクション中の化合物は、下記式（１−１）で表される構造を有することが明らかになった。
【００４７】
【化８】
0005862889.tif 000011
【００４８】
＜式（１−１）で表される化合物のＤＸＳ阻害活性の評価＞
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓを対象として、式（１−１）で表される化合物のＤＸＳ阻害活性を評価した。
【００４９】
（前培養）
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ(Ｔｒｅｖｉｓａｎ  １８８９)  Ｌｅｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｎｅｕｍａｎｎ  １８９９のグリセロールストックから下記に示す２６Ｒ培地４ｍｌに植菌し３７℃で２４時間、しんとう培養した。
【００５０】
【表３】
0005862889.tif 000012
【００５１】
（本培養）
前培養の培地４ｍｌから４μｌ取り出し新しい２６Ｒの培地４ｍｌに添加する。本培養の培地には阻害剤を各種濃度で添加してある。阻害剤の濃度は１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌで行った。本培養は３７℃でしんとう培養し、３時間ごとにＯ．Ｄ．６６０を測定した。
【００５２】
（プレートリーダーによる阻害活性試験）
上の前培養により培養した培地から１００μｌ取り出し新しい２６Ｒの培地２ｍｌに添加する。本培養の培地には阻害剤を各種濃度で添加してある。阻害剤の濃度は上記と同じく、１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌである。よく振って混ぜた後、９６穴プレートリーダーに２００μｌずつ添加した。プレートは３７℃で静置培養し６０ｈ後にＯ．Ｄ．６６０を測定した。
【００５３】
（実験結果）
プレートリーダーによる生育阻害活性試験結果を図２に示す。図２から明らかなように２５μｇ／ｍｌ以上においてコントロールと顕著なＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに対する生育阻害を示すことがわかった。このことから式（１−１）で表される化合物は、真正細菌一般にも生育阻害を示すことが考えられ、抗真正細菌剤の候補物質としての有用である。
【００５４】
比較例１
下記式で表される化合物を合成し、実施例１と同じ方法で、ＤＸＳ酵素阻害活性を評価した。
【００５５】
【化９】
0005862889.tif 000013
【００５６】
この化合物は、ＤＸＳ酵素阻害活性を示さなかった。
【００５７】
比較例２
下記式で表される化合物（東京化成工業株式会社製）について実施例１と同じ方法で、ＤＸＳ酵素阻害活性を評価した。
【００５８】
【化１０】
0005862889.tif 000014
【００５９】
この化合物は、ＤＸＳ酵素阻害活性を示さなかった。
【００６０】
比較例３
下記式で表される化合物（和光純薬工業株式会社製）について実施例１と同じ方法で、ＤＸＳ酵素阻害活性を評価した。
【００６１】
【化１１】
0005862889.tif 000015
【００６２】
この化合物は、ＤＸＳ酵素阻害活性を示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の阻害剤は、結核菌などの真菌に対する抗菌剤および抗マラリア原虫薬としての利用が期待される。
【図１】
0005862889.tif 000018
【図２】
0005862889.tif 000019