(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液および／または血液製剤、あるいはワクチンおよび／またはワクチンの製造における中間体を、第１のウイルスの有無について試験するための方法であって：
（ａ）前記血液および／または前記血液製剤、あるいは前記ワクチンおよび／またはワクチンの製造における中間体の試料を採取する工程、
（ｂ）前記試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；ならびに
（ｃ）前記第１のウイルスおよび前記第２のウイルスの有無を検出するために、前記試料由来の核酸を分析する工程
を包含し、ここでは、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが同じ型のウイルスであり、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが、いずれもエンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスであり、かつ、いずれも糸状ウイルス、正二十面体ウイルスまたは複合ウイルスであり、そして、前記第１のウイルスが動物ウイルスであり、前記第２のウイルスが植物ウイルスである、方法。
【請求項２】
生物学的試料が第１のウイルスを実質的に含まないことを確かめる方法であって：
（ａ）生物学的試料由来の核酸またはウイルスポリペプチドを分析する前に、前記生物学的試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；
（ｂ）前記第１のウイルスおよび前記第２のウイルスを検出するために、前記生物学的試料由来の前記核酸またはウイルスポリペプチドを分析する工程；ならびに
（ｃ）前記第２のウイルスの存在を、前記第１のウイルスの検出の非存在下で検出する工程
を包含し、ここでは、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが同じ型のウイルスであり、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが、いずれもエンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスであり、かつ、いずれも糸状ウイルス、正二十面体ウイルスまたは複合ウイルスであり、そして、前記第１のウイルスが動物ウイルスであり、前記第２のウイルスが植物ウイルスである、方法。
【請求項３】
前記第１のウイルスおよび前記第２のウイルスがいずれも、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、＋ｓｓＲＮＡウイルス、−ｓｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡレトロウイルス、またはｄｓＲＮＡレトロウイルスである、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記第２のウイルスがＡｐＴＶである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のウイルスが正二十面体動物ウイルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記正二十面体動物ウイルスが哺乳動物レオウイルス（ＭＲＶ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ワクチンおよび／またはワクチンの産生における中間体を、第１のウイルスの有無について試験するための方法であって：
（ａ）前記ワクチンおよび／またはワクチンの産生における前記中間体の試料を採取する工程；
（ｂ）前記試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；
（ｃ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法を使用して、前記第２のウイルスの存在と前記第１のウイルスの有無を検出する工程
を包含し、ここでは、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが同じ型のウイルスであり、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが、いずれもエンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスであり、かつ、いずれも糸状ウイルス、正二十面体ウイルスまたは複合ウイルスであり、そして、前記第１のウイルスが動物ウイルスであり、前記第２のウイルスが植物ウイルスである、方法。
【請求項８】
第１のウイルスを含まないワクチンを製造する方法であって：
（ａ）外因性の第２のウイルスをワクチンの産生における中間体に対して添加する工程；（ｂ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を使用して、前記第２のウイルスが存在することと前記第１のウイルスが存在しないことを検出する工程；ならびに
（ｃ）前記第１のウイルスを含まないワクチンを処方する工程
を包含し、ここでは、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが同じ型のウイルスであり、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが、いずれもエンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスであり、かつ、いずれも糸状ウイルス、正二十面体ウイルスまたは複合ウイルスであり、そして、前記第１のウイルスが動物ウイルスであり、前記第２のウイルスが植物ウイルスである、方法。
【請求項９】
インフルエンザワクチンの細胞培養に基づく産生のための方法であって、以下：
（ａ）細胞を醗酵容器の中で増殖させる工程；
（ｂ）種インフルエンザウイルスを添加する工程；
（ｃ）前記インフルエンザウイルスの増殖を、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を使用して第１の混入しているウイルスの存在についてモニターする工程；
（ｄ）前記インフルエンザウイルスの懸濁液を遠心分離し、濾過する工程；
（ｅ）前記インフルエンザウイルスを、クロマトグラフィーおよび限外／透析濾過工程により精製し、不活化し、崩壊させて、ウイルス表面抗原ＨＡおよびＮＡを可溶化させる工程；
（ｆ）前記抗原を濾過して１価のバルクを得る工程
を行うことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
以下：
（ｇ）前記１価のバルクを多価のバルク（典型的には、３価のバルク）になるようにブレンドし、最終的な容器の中に充填する工程
をさらに行うことを特徴とする、請求項９に記載のインフルエンザワクチンの細胞培養に基づく産生のための方法。
【請求項１１】
組成物を分析するための方法であって、
（ａ）外因性の対照ウイルスを前記組成物の試料に対して添加する工程、その後、
（ｂ）前記試料を目的のウイルスの存在について試験する工程を包含し、ここで、前記対照ウイルスと前記目的のウイルスは互いに異なるが、同じ型のウイルスであり、前記目的のウイルスが第１のウイルスであり、前記対照ウイルスが第２のウイルスであり、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが、いずれもエンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスであり、かつ、いずれも糸状ウイルス、正二十面体ウイルスまたは複合ウイルスであり、そして、前記第１のウイルスが動物ウイルスであり、前記第２のウイルスが植物ウイルスである、方法。
【請求項１２】
第１のウイルスを検出するためのアッセイの信頼性を確認するための方法であって：
（ａ）生物学的試料由来の核酸またはポリペプチドを分析する前に、前記生物学的試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；ならびに
（ｂ）前記第１のウイルスおよび前記第２のウイルスを検出するために、前記生物学的試料由来の前記核酸またはポリペプチドを分析する工程
を包含し、ここでは、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが同じ型のウイルスであり、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが、いずれもエンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスであり、かつ、いずれも糸状ウイルス、正二十面体ウイルスまたは複合ウイルスであり、そして、前記第１のウイルスが動物ウイルスであり、前記第２のウイルスが植物ウイルスである、方法。
【請求項１３】
前記第１のウイルスと前記第２のウイルスが、請求項３〜５のいずれか１項において規定されるとおりである、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第１のウイルスを検出するためのアッセイの信頼性を確認するための方法、生物学的試料または薬学的試料中に第１のウイルスが存在しないことを保証する方法、および第１のウイルスを含まないワクチンを製造する方法における、外因性の内部陽性対照としての第２のウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的試料中のウイルスの混入は、輸血および臓器移植、ならびにワクチンおよび医薬品の産生を含む医学の多くの分野における問題である。ウイルスは、ウイルス抗原の存在、ウイルス抗原またはウイルス核酸に対する宿主抗体の存在を検出する多数の様々な試験を使用して生物学的試料中で検出され得る。
【０００３】
生物学的試料をウイルスの混入について試験するか、または生物学的試料がウイルスを含まないことを確かめる場合には、陰性の結果を解釈することに関する問題がある。適切な対照なしに、混入しているウイルスが検出されないことがアッセイの失敗の結果であるか、または生物学的試料中に混入しているウイルスが全くないことの結果であるかを決定することは不可能である。陰性の結果が前者の理由に原因があると考えられ得る場合は、アッセイの失敗がいずれかの段階で起こったと考えられる。例えば、核酸アッセイにおいては、失敗は、核酸の抽出、取り扱い、増幅、または検出工程の間に起こり得る。一般に、ウイルス核酸の検出のためのＰＣＲによる方法においては、４種類の対照が使用される。第１の対照は、核酸抽出工程についての内部陽性対照である。第２の対照は、ＰＣＲ産物の検出についてのものである。第３の対照は増幅工程についてのものである。最後に、第４の対照は、アッセイの間の混入を検出するための、鋳型ではない対照である。同様の対照が、ウイルスポリペプチドを検出するためのアッセイにおいて使用される。
【０００４】
本発明は、外因性の内部陽性としての第２のウイルスの使用に関する。
【０００５】
診断目的のために内部陽性対照として外因性のウイルスを使用する概念は当該分野で公知である。例えば、非特許文献１は、Ａ型インフルエンザに感染した被験体由来の生物学的試料中のＡ型インフルエンザウイルスの検出のためのアッセイにおける内部陽性対照としてのトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）の使用を記載している。しかし、このシステムにはいくつかの欠点がある。特に、ＴｏＭＶは、臨床検体からのノロウイルスＩの検出のための内部陽性対照としては機能せず、したがって内部陽性対照としてのその使用は限定される。
【０００６】
Ｍａｉｒｈｏｆｅｒらに記載されたシステムのさらなる欠点は、対照ウイルス（ＴｏＭＶ）と試験ウイルス（Ａ型インフルエンザ）が異なる型のウイルスである点である。ＴｏＭＶは、＋ｓｓＲＮＡゲノムをもつ非エンベロープウイルスである。一方、Ａ型インフルエンザは、−ｓｓＲＮＡゲノムをもつエンベロープウイルスである。このことは、陽性対照の信頼性を欠くことにつながる可能性が高い。例えば、陽性対照ウイルスについて抽出、増幅、および検出の工程が最適化されても、抽出、増幅、および検出の工程のいずれか１つの条件が混入しているウイルスに適さない可能性がある。したがって、アッセイが対照ウイルスの検出について陽性である場合の、混入しているウイルスの検出についての陰性の結果は、生物学的試料中に混入がないことではなく、混入しているウイルスに対して行う抽出、増幅、または検出の工程の失敗を示していることもあり得る。実際、Ｍａｉｒｈｏｆｆｅｒらは、２００７年のｑＰＣＲシンポジウムで、ＴｏＭＶとノロウイルスの核酸を、これらの核酸を同じ条件下で抽出した場合には、両方のウイルスを含むことがわかっている同じ試料中で両方を検出することができなかったことを報告した。
【０００７】
ＴｏＭＶの使用のなおさらなる欠点は、このウイルスが全てのナス科植物（例えば、タバコ、ジャガイモ、およびトマト）に一般的に見られる点である。したがって、核酸抽出後の陽性対照を用いるアッセイに、一般的に見られる植物材料が混入する可能性がある。核酸抽出工程後に試料に混入があった場合は、たとえ抽出工程が失敗してもなお、対照ウイルスＴｏＭＶの検出についての陽性の結果が起こり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍａｉｒｈｏｆｅｒら、ｑＰＣＲ  ２００７  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ＆  Ｅｘｈｉｂｉｔｉｏｎ  ＆  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ３ｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｑＰＣＲ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，２８頁，ＩＳＢＮ−１３  ９７８−３−００−０２０３８５−５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、核酸の抽出および検出アッセイのための適切な内部陽性対照が依然必要とされている。我々が知る限り、ワクチンの製造における内部陽性対照（ＩＰＣ）としての外因性ウイルスの使用は、これまでには記載されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
特定の実施形態において、本願は例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
第１のウイルスを検出するためのアッセイの信頼性を確認するための方法であって：
（ａ）生物学的試料由来の核酸を分析する前に、前記生物学的試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；ならびに
（ｂ）前記第１のウイルスおよび前記第２のウイルスを検出するために、前記生物学的試料由来の前記核酸を分析する工程
を包含し、ここでは、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが同じ型のウイルスである、方法。
（項目２）
血液および／または血液製剤、あるいはワクチンおよび／またはワクチンの製造における中間体を、第１のウイルスの有無について試験するための方法であって：
（ａ）前記血液および／または前記血液製剤、あるいは前記ワクチンおよび／またはワクチンの製造における中間体の試料を採取する工程、
（ｂ）前記試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；ならびに
（ｃ）前記第１のウイルスおよび前記第２のウイルスの有無を検出するために、前記試料由来の核酸を分析する工程
を包含し、ここでは、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが同じ型のウイルスである、方法。
（項目３）
生物学的試料が第１のウイルスを実質的に含まないことを確かめる方法であって：
（ａ）生物学的試料由来の核酸を分析する前に、前記生物学的試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；
（ｂ）前記第１のウイルスおよび前記第２のウイルスを検出するために、前記生物学的試料由来の前記核酸を分析する工程；ならびに
（ｃ）前記第２のウイルスの検出の非存在下の前記第１のウイルスの存在を検出する工程を包含し、ここでは、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが同じ型のウイルスである、方法。
（項目４）
前記生物学的試料に対して前記外因性の第２のウイルスを添加した後、前記生物学的試料から前記核酸を抽出する工程をさらに包含する、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
生物学的試料中の第１のウイルスを検出するためのアッセイにおける内部陽性対照としての第２のウイルスの使用であって、ここでは、前記第１のウイルスおよび前記第２のウイルスが同じ型のウイルスである、使用。
（項目６）
第１のウイルスを検出するためのアッセイの信頼性を確認するための方法であって：
（ａ）生物学的試料由来のウイルスポリペプチドを分析する前に、前記生物学的試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；ならびに
（ｂ）前記第１のウイルスおよび前記第２のウイルスを検出するために、前記生物学的試料由来の前記ウイルスポリペプチドを分析する工程
を包含し、ここでは、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが同じ型のウイルスである、方法。
（項目７）
生物学的試料が第１のウイルスを実質的に含まないことを確かめる方法であって：
（ａ）生物学的試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；
（ｂ）前記第１のウイルスおよび前記第２のウイルスを検出するために、前記生物学的試料由来のウイルスポリペプチドを分析する工程；ならびに
（ｃ）前記第２のウイルスが存在するが、前記第１のウイルスが存在しないことを検出する工程
を包含し、ここでは、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが同じ型のウイルスである、方法。
（項目８）
前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが重複しない宿主範囲を有する、項目１〜３、または項目６〜７のいずれか１項に記載の方法、あるいは項目５に記載の使用。
（項目９）
前記第１のウイルスが動物ウイルスであり、前記第２のウイルスが植物ウイルスである、上記項目のいずれかに記載の方法または使用。
（項目１０）
前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとがいずれもエンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスである、上記項目のいずれかに記載の方法または使用。
（項目１１）
前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとがいずれも、糸状ウイルス、正二十面体ウイルス、または複合ウイルスである、上記項目のいずれかに記載の方法または使用。
（項目１２）
前記第１のウイルスおよび前記第２のウイルスがいずれも、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、＋ｓｓＲＮＡウイルス、−ｓｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡレトロウイルス、またはｄｓＲＮＡレトロウイルスである、上記項目のいずれかに記載の方法または使用。
（項目１３）
前記第２のウイルスがＡｐＴＶである、上記項目のいずれかに記載の方法または使用。
（項目１４）
前記第１のウイルスが正二十面体動物ウイルスである、項目１３に記載の方法または使用。
（項目１５）
前記第１のウイルスが哺乳動物レオウイルス（ＭＲＶ）であり、前記第２のウイルスがＡｐＴＶである、項目１４に記載の方法または使用。
（項目１６）
前記検出工程に核酸アッセイが含まれる、項目１〜５または８〜１５のいずれか１項に記載の方法または使用。
（項目１７）
前記ウイルスがＲＮＡウイルスであり、前記核酸アッセイが逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）である、項目１６に記載の方法または使用。
（項目１８）
前記核酸アッセイが１工程のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲである、項目１７に記載の方法または使用。
（項目１９）
前記生物学的試料が、ワクチンまたはワクチンの産生における中間体；血清、血漿、赤血球、白血球、血小板を含む血液および血液製剤；骨髄、腎臓、肝臓、心臓、肺、または皮膚を含む組織試料である、項目１または３〜１８のいずれか１項に記載の方法または使用。
（項目２０）
前記生物学的試料が、インフルエンザワクチンまたはインフルエンザワクチンの産生における中間体である、項目１または３〜１９のいずれか１項に記載の方法または使用。
（項目２１）
前記インフルエンザワクチンが細胞培養物中で産生される、項目２０に記載の方法または使用。
（項目２２）
前記インフルエンザワクチンがＯｐｔａｆｌｕ（商標）ワクチンである、項目２１に記載の方法または使用。
（項目２３）
５０ｍＭの１価の陽イオンの存在下で、５０℃〜７５℃のＴｍで配列番号１またはその相補物にハイブリダイズする約１０〜３０塩基の長さの核酸配列を含む、上記項目のいずれかに記載の方法または使用における、ＡｐＴＶの検出用のプライマー。
（項目２４）
５０ｍＭの１価の陽イオンの存在下で、５０℃〜７５℃のＴｍで配列番号１またはその相補物にハイブリダイズする約２０〜６０塩基の長さの核酸配列を含む、上記項目のいずれかに記載の方法または使用における、ＡｐＴＶの検出用のプローブ。
（項目２５）
前記核酸配列が配列番号１またはその相補物の断片を含む、項目２３に記載のプライマー、または項目２４に記載のプローブ。
（項目２６）
検出可能な標識をさらに含む、項目２３〜２５のいずれか１項に記載のプライマーまたはプローブ。
（項目２７）
生物学的試料中の第１のウイルスの核酸および第２のウイルスの核酸の検出用のキットであって、ここで、前記第２のウイルスが内部陽性対照であり、前記キットは、前記第２のウイルスまたは前記第２のウイルスの核酸と、前記第２のウイルスの検出用のプライマーおよび／またはプローブを含む、キット。
（項目２８）
前記プライマーが配列番号２および３に示す配列を含み、前記プローブが配列番号４に示す配列を含む、項目１７〜２２のいずれか１項に記載の方法または使用、項目２３〜２６のいずれか１項に記載のプライマーまたはプローブ、あるいは、項目２７に記載のキット。
（項目２９）
ワクチンおよび／またはワクチンの産生における中間体を、第１のウイルスの有無について試験するための方法であって：
（ａ）前記ワクチンおよび／またはワクチンの産生における前記中間体の試料を採取する工程；
（ｂ）前記試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；
（ｃ）項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法または項目２７に記載のキットを使用して、前記第２のウイルスの存在と前記第１のウイルスの有無を検出する工程
を包含し、ここでは、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが同じ型のウイルスである、方法。
（項目３０）
第１のウイルスの検出のためのアッセイについて内部陽性対照（Ｅｘ−ＩＰＣ）を選択する方法であって：
（ａ）第１のウイルスを選択する工程；
（ｂ）前記第１のウイルスについてウイルス型を決定する工程；
（ｃ）宿主範囲が重複していない同じ型の第２のウイルスを選択する工程；ならびに
（ｄ）前記第１のウイルスの核酸と前記第２のウイルスの核酸の両方を同じ抽出手順を使用して生物学的試料から抽出できることを確かめる工程
を包含する、方法。
（項目３１）
前記第１のウイルスが動物ウイルスであり、前記第２のウイルスが植物ウイルスである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
第１のウイルスを含まないワクチンを製造する方法であって：
（ａ）外因性の第２のウイルスをワクチンの産生における中間体に対して添加する工程；（ｂ）項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法または項目２７に記載のキットを使用して、前記第２のウイルスが存在することと前記第１のウイルスが存在しないことを検出する工程；ならびに
（ｃ）前記第１のウイルスを含まないワクチンを処方する工程
を包含し、ここでは、前記第１のウイルスと前記第２のウイルスとが同じ型のウイルスである、方法。
（項目３３）
項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法が、細胞培養に基づく産生プロセスの醗酵工程に適用される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
インフルエンザワクチンの細胞培養に基づく産生のための方法であって、以下：
（ａ）細胞を醗酵容器の中で増殖させる工程；
（ｂ）種インフルエンザウイルスを添加する工程；
（ｃ）前記インフルエンザウイルスの増殖を、項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法を使用して第１の混入しているウイルスの存在についてモニターする工程；
（ｄ）前記インフルエンザウイルスの懸濁液を遠心分離し、濾過する工程；
（ｅ）前記インフルエンザウイルスを、クロマトグラフィーおよび限外／透析濾過工程により精製し、不活化し、崩壊させて、ウイルス表面抗原ＨＡおよびＮＡを可溶化させる工程；
（ｆ）前記抗原を濾過して１価のバルクを得る工程；ならびに
（ｇ）任意に、前記１価のバルクを多価のバルク（典型的には、３価のバルク）になるようにブレンドし、最終的な容器の中に充填する工程
を行うことを特徴とする、方法。
（項目３５）
項目３２〜３４のいずれか１項に記載の方法により産生されたインフルエンザワクチン。
（項目３６）
組成物を分析するための方法であって、
（ａ）外因性の対照ウイルスを前記組成物の試料に対して添加する工程、その後、
（ｂ）前記試料を目的のウイルスの存在について試験する工程を包含し、ここで、前記対照ウイルスと前記目的のウイルスは互いに異なるが、同じ型のウイルスである、方法。
本発明は、生物学的試料中の第１のウイルスを検出するためのアッセイにおける内部陽性対照としての第２のウイルスの使用に関する。第２のウイルスは、第１および第２のウイルスを検出するためのアッセイを実行する前に、生物学的試料に対して添加することができる。
【００１１】
特定の実施形態においては、本発明は、核酸抽出（Ｅｘ−ＩＰＣ）および核酸検出アッセイのための内部陽性対照に関する。本発明は、第１のウイルスの検出のための核酸抽出および核酸検出アッセイにおける、外因性の内部陽性対照としての第２のウイルスまたはウイルス核酸の使用に関する。ここでは、内部陽性対照として使用される第２のウイルスは、外部から添加される場合以外には生物学的試料中には存在し得ない。
【００１２】
本発明者らは、第１のウイルスと第２のウイルスとが同じ型である場合には、第２のウイルスが、第１のウイルスの生物学的試料への混入の有無を決定するためのアッセイにおいて核酸抽出工程についての内部陽性対照として機能し得ることを見出した。
【００１３】
したがって、本発明は以下を提供する：
・第１のウイルスを検出するためのアッセイの信頼性を確認するための方法
・生物学的試料が第１のウイルスを実質的に含まないことを確かめる方法
・第１のウイルスの有無について血液および／または血液製剤を試験するための方法
・第１のウイルスの有無についてワクチンまたはワクチンの製造における中間体を試験するための方法
・生物学的試料中の第１のウイルスを検出するためのアッセイにおける内部陽性対照としての第２のウイルスの使用
・生物学的試料中の第１および第２のウイルスの核酸またはポリペプチドの検出用キットであって、ここでは、第２のウイルスが内部陽性対照である、キット
・Ａｌｌｉａｒｉａ  ｐｅｔｉｏｌａｔａティモウイルスの検出用のプライマーおよびプローブ
・第１のウイルスが存在しないことが確かめられた、ワクチン、ワクチンの製造における中間体、血液、および／または血液製剤
・第１のウイルスを含まないワクチンの製造方法
・組成物中の目的のウイルスの有無を試験するための方法における、外因性の対照ウイルスを組成物に添加することからなる改良であって、ここでは、対照ウイルスと目的のウイルスが同じ型のウイルスである、改良
・生物学的生成物および／または医薬品の製造方法における、製品の試料に対して、ウイルスの混入についてそれを試験するために外因性の対照ウイルスを添加することからなる改良であって、ここでは、対照ウイルスと目的のウイルスは同じ型のウイルスである、改良。
【００１４】
本発明の方法
１つの実施形態において、本発明は、以下の工程を含む第１のウイルスを検出するためのアッセイの信頼性を確認するための方法を提供する：
（ａ）生物学的試料由来の核酸を分析する前に、生物学的試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；ならびに
（ｂ）第１および第２のウイルスを検出するために、生物学的試料由来の核酸を分析する工程；
ここでは、第１のウイルスと第２のウイルスは同じ型のウイルスである。
【００１５】
上記方法は、抽出した核酸を分析する前に、生物学的試料から核酸を抽出する工程をさらに含み得る。この実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、第１のウイルスを検出するためのアッセイの信頼性を確認するための方法を提供する：
（ａ）生物学的試料から核酸を抽出する前に、生物学的試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；
（ｂ）生物学的試料から核酸を抽出する工程；ならびに
（ｃ）第１および第２のウイルスを検出するために、工程（ｂ）に由来する核酸を分析する工程；
ここでは、第１のウイルスと第２のウイルスは同じ型のウイルスである。
【００１６】
分析工程には、核酸の増幅および検出の工程が含まれ得る。
【００１７】
アッセイの「信頼性を確認すること」により、第２のウイルスは、核酸の抽出工程および／または分析工程についての陽性対照として機能し得ることが意味される。分析工程における第２のウイルスの検出は、核酸の抽出工程（存在する場合）が成功したことを示す。第２のウイルスが検出されないことは、核酸の抽出工程（存在する場合）が失敗したこと、または分析工程が失敗したことを示す。
【００１８】
分析工程についてのさらなる陽性対照、例えば、核酸の増幅工程についての陽性対照、および核酸の検出工程についての陽性対照、ならびに検出可能な核酸を含まない陰性対照または鋳型ではない対照を含むさらなる対照もまた、本発明の方法において使用され得る。これらのさらなる対照は、分析工程において第２のウイルスが検出できなかったことの原因が、核酸の抽出工程（存在する場合）または分析工程の失敗であるかどうかを決定するために使用され得る。
【００１９】
さらなる実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、生物学的試料が第１のウイルスを実質的に含まないことを確かめる方法を提供する：
（ａ）生物学的試料由来の核酸を分析する前に、生物学的試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；
（ｂ）第１および第２のウイルスを検出するために、生物学的試料由来の核酸を分析する工程；ならびに
（ｃ）第２のウイルスが存在するが、第１のウイルスが存在しないことを検出する工程；
ここでは、第１のウイルスと第２のウイルスは同じ型のウイルスである。
【００２０】
上記方法は、抽出した核酸を分析する前に、生物学的試料から核酸を抽出するさらなる工程を含み得る。この実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、生物学的試料が第１のウイルスを実質的に含まないことを確かめる方法を提供する：
（ａ）生物学的試料から核酸を抽出する前に、生物学的試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；
（ｂ）生物学的試料から核酸を抽出する工程；
（ｃ）第１および第２のウイルスを検出するために、工程（ｂ）に由来する核酸を分析する工程；ならびに
（ｄ）第２のウイルスが存在するが、第１のウイルスが存在しないことを検出する工程；
ここでは、第１のウイルスと第２のウイルスは同じ型のウイルスである。
【００２１】
本発明はまた、生物学的試料中の第１のウイルスを検出するためのアッセイにおける内部陽性対照としての第２のウイルスの使用を提供する。ここでは、第１のウイルスと第２のウイルスは同じ型のウイルスである。
【００２２】
「同じ型のウイルス」により、第１のウイルスと第２のウイルスが同じ構造および／またはゲノム型を有することが意味される。１つの実施形態においては、いずれのウイルスも同じ構造を有し得る。例えば、両方のウイルスがエンベロープウイルスであってよく、また非エンベロープウイルスであってもよい。あるいは、または加えて、上記ウイルスは同じキャプシド構造を有し得る。例えば、両方のウイルスが、糸状ウイルス（当該分野では螺旋状ウイルスとも呼ばれる）であってよく、正二十面体ウイルスであってよく、また、純粋な糸状ではなく純粋な正二十面体でもないキャプシドを持つ複合ウイルス（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）であってもよい。さらに、または代わりに、両方のウイルスが同じゲノム型を有し得る。例えば、両方のウイルスが、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、＋ｓｓＲＮＡウイルス、−ｓｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡレトロウイルス、またはｄｓＲＮＡレトロウイルスであり得る。両方のウイルスのウイルスゲノムが直鎖または環状であってよく、そしてセグメント化されていてもよく、また、単一の核酸であってもよい。セグメント化されたゲノムの場合には、各ビリオンは、１つ以上のゲノムセグメントを含み得る。
【００２３】
１つの特定の有利な実施形態においては、第１および第２のウイルスは、異なる重複しない宿主範囲を有する。一例として、第１の動物ウイルス（特に、第１の種に感染し得る動物ウイルス）を含み得る第１の動物種の被験体由来の生物学的試料は、第２のウイルスが第１の動物種に感染できない場合には、当然、対照である第２のウイルスを含まない。１つの特定の実施形態においては、第１のウイルスは動物ウイルス、例えば、哺乳動物ウイルスまたは鳥ウイルスであり、第２のウイルスは植物ウイルスである。特定の実施形態においては、哺乳動物はヒトである。さらなる特定の実施形態においては、鳥ウイルスは家禽、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、および／またはアヒルに感染するウイルスである。これらの実施形態においては、宿主範囲は重複し得ない。
【００２４】
植物ウイルスは、ワクチンに混入し得る第１のウイルスの検出について、ワクチンの製造における第２のウイルスＩＰＣとして特に有利である。ＩＰＣとしての植物ウイルスの使用の具体的な利点として、ウイルスの安全性（植物ウイルスは、ワクチンの製造にかかわる作業者にとって非病原性である）；アッセイの信頼性（特に、植物ウイルスが一般的にヒトと接触する植物種に感染しない場合には、第２のヒトまたは哺乳動物ウイルスとは異なり、ワクチンの製造にかかわる作業者が植物ウイルスに汚染される可能性がない）；および、コスト（大量の植物ウイルスを植物細胞培養物中で容易に、そして安価産生することができる）が挙げられる。
【００２５】
本発明はまた、以下の工程を含む、第１のウイルスの検出用のアッセイについてＩＰＣを選択する方法を提供する：
（ａ）第１のウイルスを選択する工程；
（ｂ）第１のウイルスについてウイルス型を決定する工程；
（ｃ）宿主範囲が重複していない同じ型の第２のウイルスを選択する工程；ならびに
（ｄ）第１のウイルスと第２のウイルスの両方の核酸を同じ抽出手順を使用して生物学的試料から抽出できること、および／または第１のウイルスと第２のウイルスに由来する核酸を同じ核酸分析工程を使用して検出できることを確かめる工程。
【００２６】
一般的用語においては、第１のウイルスは、その有無を試験する、確かめる、または確認する必要がある目的のウイルス（典型的には、ヒト病原体）であり、第２のウイルスは対照ウイルス（典型的には、ヒト病原体ではない）である。本発明での使用に適しているウイルスの対の具体的な例としては以下が挙げられる：
【００２７】
【表１】
0005999817.tif 000002
１つの実施形態において、植物ウイルスは、コムギ、トマト、タバコ、トウモロコシなどの作物に感染するウイルスのような一般的に存在している植物ウイルスではない。好ましい実施形態においては、第２のウイルスは、Ａｌｌｉａｒｉａ  ｐｅｔｉｏｌａｔａティモウイルス（ＡｐＴＶ）である。このウイルスは、Ａｒｔｕｒ  Ｐｆｉｔｚｎｅｒ博士によって１９９７年にシュツットガルトのメーリンゲン（ドイツ）で、典型的なウイルス感染の兆候（モザイク模様の葉）を示したＡｌｌｉａｒｉａ  ｐｅｔｉｏｌａｔａ植物から単離された。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｈｅｎｈｅｉｍ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙによる全ゲノムの配列決定によって、新たに単離されたウイルスがティモウイルス科、ティモウイルス属（＋ｓｓＲＮＡ、非エンベロープ、等軸の正二十面体ウイルス）に属することが明らかになった。ゲノム配列は（ＤＮＡの形態で）配列番号１に示す。ＡｐＴＶの存在は公知であった（Ｏｈｎｅｓｏｒｇｅ  Ｓ．ら（１９９８）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｕｎｄ  Ｃｈａｒａｋｔｅｒｉｓｉｅｒｕｎｇ  ｅｉｎｅｓ  ｎｅｕｅｎ  Ｔｙｍｏｖｉｒｕｓ  ａｕｓ  Ａｌｌｉａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  −  Ｊａｈｒｅｓｔａｇｕｎｇ  ｄｅｒ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｓｃｈｅｎ  Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ；Ｏｈｎｅｓｏｒｇｅ  Ｓ．（１９９９）Ｉｎｔｅｒａｋｔｉｏｎ  ｕｎｄ  ｓｕｂｚｅｌｌｕｌａｅｒｅ  Ｌｏｋａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｖｏｎ  Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｅｎ−Ｔｒａｎｓｋｒｉｐｔｉｏｎｓｆａｋｔｏｒｅｎ  ａｕｓ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  −  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ  ａｎ  ｄｅｒ  Ｆａｋｕｌｔａｅｔ  ｆｕｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ  Ｈｏｈｅｎｈｅｉｍ；Ｏｈｎｅｓｏｒｇｅ  Ｓ．，Ｐｆｉｔｚｎｅｒ  Ａ．Ｊ．Ｐ．（２００３）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  Ｔｙｍｏｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  Ａｌｌｉａｒｉａ  ｐｅｔｉｏｌａｔａ  −  Ｊａｈｒｅｓｔａｇｕｎｇ  ｄｅｒ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｓｃｈｅｎ  Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ）が、この配列はこれまでのところ公開されていない。
【００２８】
より一般には、第２のウイルスは、ティモウイルス属、マクラウイルス属、またはマラフィウイルス属の任意のそのようなウイルスを含む、ティモウイルス科の任意のウイルスであり得る。例えば、これは、カブ黄化モザイクウイルス（ｔｕｒｎｉｐ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、アンデスポテト潜在ウイルス（Ａｎｄｅａｎ  ｐｏｔａｔｏ  ｌａｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ）、ベラドンナ斑紋ウイルス（ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、カカオ黄化モザイクウイルス（ｃａｃａｏ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、チョウマメ葉脈黄化ウイルス（ｃｌｉｔｏｒｉａ  ｙｅｌｌｏｗ  ｖｅｉｎ  ｖｉｒｕｓ）、ヌスビトハギ黄化斑紋ウイルス（ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、ズルカマラ斑紋ウイルス（ｄｕｌｃａｍａｒａ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、ナスモザイクウイルス（ｅｇｇｐｌａｎｔ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、エゾスズシロ潜在ウイルス（ｅｒｙｓｉｍｕｍ  ｌａｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ）、ケネディア黄化モザイクウイルス（ｋｅｎｎｅｄｙａ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、メロン縮葉モザイクウイルス（ｍｅｌｏｎ  ｒｕｇｏｓｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、オクラモザイクウイルス（ｏｋｒａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、オノーニス黄化モザイクウイルス（ｏｎｏｎｉｓ  ｙｅｌｌｏｗ  ｖｉｒｕｓ）、パッションフルーツ黄化モザイクウイルス（ｐａｓｓｉｏｎｆｒｕｉｔ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、ホオズキ斑紋ウイルス（ｐｈｙｓａｌｉｓ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、オオバコ斑紋ウイルス（ｐｌａｎｔａｇｏ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、ゴマノハグサ斑紋ウイルス（ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、バンバラマメ壊死性モザイクウイルス（ｖｏａｎｄｚｅｉａ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、マラー・ファベケウスモザイクウイルス（ｗｉｌｄ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、またはベリア潜在ウイルス（ｂｅｌｉａ  ｌａｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ）であり得る。
【００２９】
ＡｐＴＶは、その宿主であるＡｌｌｉａｒｉａ  ｐｅｔｉｏｌａｔａが作物としては生長しないので、本発明により対照として使用される第２のウイルスとして特に有用である。したがって、ＡｐＴＶを含有しているＡｌｌｉａｒｉａ  ｐｅｔｉｏｌａｔａ組織の混入は、目的の生物学的試料においては極めて稀である。例えば、生物学的試料が得られる個体は、ＴｏＭＶが混入したトマト、ジャガイモ、またはタバコ植物あるいは植物性産物よりも、混入したＡｌｌｉａｒｉａ  ｐｅｔｉｏｌａｔａと接触する可能性がはるかに低い。このウイルスの制限された宿主範囲もまた、環境的混入の低いリスクにつながる。
【００３０】
特定の実施形態では、ＡｐＴＶが、第１の非エンベロープおよび／または正二十面体および／または＋ｓｓＲＮＡウイルスの検出方法についての内部陽性対照として有用である。好ましい実施形態において、ＡｐＴＶは、非エンベロープの、正二十面体の、ｄｓＲＮＡウイルスである第１の哺乳動物または鳥レオウイルスの存在を検出するためのアッセイにおいて第２の対照ウイルスとして使用される。哺乳動物レオウイルス（ＭＲＶ）は任意の型のＭＲＶ株、例えば、ＭＲＶ−１、ＭＲＶ−２、および／またはＭＲＶ−３であり得る。
【００３１】
外因性の第２のウイルスは、約５０〜３００ｐｇ／ｍｌの濃度で生物学的試料に添加され得る。例えば、生物学的試料に添加される第２のウイルスの濃度は、約５０、１００、１５０、２００、２５０、または３００ｐｇ／ｍｌであり得る。
【００３２】
本発明のさらなる態様では、上記方法は、ウイルス核酸ではなくウイルスポリペプチドの検出による。この態様では、本発明の１つの実施形態は、以下の工程を含む、第１のウイルスを検出するためのアッセイの信頼性を確認するための方法である：
（ａ）生物学的試料由来のウイルスのポリペプチドを分析する前に、生物学的試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；ならびに
（ｂ）第１および第２のウイルスを検出するために、生物学的試料由来のウイルスのポリペプチドを分析する工程；
ここでは、第１のウイルスと第２のウイルスは同じ型のウイルスである。
【００３３】
本発明のこの態様のさらなる実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、生物学的試料が第１のウイルスを実質的に含まないことを確かめる方法を提供する：
（ａ）生物学的試料由来のウイルスのポリペプチドを分析する前に，生物学的試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；
（ｂ）第１および第２のウイルスを検出するために，生物学的試料由来のウイルスのポリペプチドを分析する工程；ならびに
（ｃ）第２のウイルスが存在するが、第１のウイルスが存在しないことを検出する工程；
ここでは、第１のウイルスと第２のウイルスは同じ型のウイルスである。
【００３４】
本発明はまた、（ａ）組成物の試料に対して対照ウイルスを添加する工程、その後、（ｂ）目的のウイルスの存在について試料を試験する工程を含む、組成物を分析するための方法を提供する。ここでは、対照ウイルスと目的のウイルスは互いに異なるが、同じ型のウイルスである。工程（ｂ）を実施することに加えて、上記方法には典型的に、対照ウイルスの存在について試料を試験する工程が含まれる。したがって、上記方法は、目的のウイルスについての試験を確認するために有用な陽性対照を提供する。
【００３５】
ウイルス核酸の分析
本発明の方法の分析工程は、第１および／または第２のウイルスを起源とする核酸の有無を同定するために使用することができる。陽性の結果は、核酸の存在の検出である。陰性の結果は核酸が検出されないことである。本発明が一部、生物学的試料にウイルスが混入していないことを保証することに関することを考えると、本発明のアッセイが、ウイルス核酸が存在しないことを検出するまたは確かめるために主に使用されることが予測される。
【００３６】
核酸は、生物学的試料から、特に、生物学的試料に含まれるウイルス粒子から、当該分野で公知の任意の方法により抽出され得る。１つの実施形態において、核酸は、市販されている自動ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｓｙｓｔｅｍ  ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）をＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）とともに使用してウイルス粒子から単離される。あるいは、ＲＮＡ／ＤＮＡは、市販されているＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｍｉｄｉ  Ｖｉｒｕｓ／Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｋｉｔを使用してウイルス粒子から単離することができる。ウイルス粒子は、試料をプロテイナーゼＫを含有している溶解緩衝液とともにインキュベーションすることにより溶解させられ得る。
【００３７】
好ましくは、核酸抽出手順では、第１のウイルスと第２のウイルスに由来する核酸を同等の効率で抽出すべきである。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態では、核酸の抽出工程は必要ない。生物学的試料中の核酸は、例えば、Ｐａｎｎａｃｉｏら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９３年９月２５日；２１（１９）：４６５６）およびＰａｎｄｏｒｉら（ＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ２００６年６月２４日；６：１０４）に記載されているように、先に抽出工程を全く行わずに直接分析される場合がある。
【００３９】
分析のために、核酸アッセイが行われる。本発明の方法の分析工程には、核酸増幅および核酸検出の工程が含まれ得る。
【００４０】
ＲＮＡウイルスの検出のための好ましいアッセイは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）である。しかし、当業者に公知であるように、同等のＲＮＡ増幅方法もまた、適用可能である（ＵＳ−５４０９８１８に記載されているような、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、すなわちＮＡＳＢＡ（商標）；３ＳＲ（商標）；ＵＳ−５３９９４９１に記載されているようなＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、すなわちＴＭＡ（商標）など）。本発明において、逆転写反応または同等のＲＮＡ増幅方法は、１本鎖ウイルスについて、あるいは２本鎖ウイルスにおいてはプラス鎖について、マイナス鎖について、または両方の鎖について行うことができる。したがって、本発明の方法は、第１および第２のウイルスゲノムのプラス鎖および／またはマイナス鎖を検出するために使用することができる。
【００４１】
特定の実施形態において、１工程のＲＴ−リアルタイムＰＣＲアッセイが使用される（「１工程のＲＴ−ｑＰＣＲ」）。当業者は、そのような「１工程のＲＴ  ｑＰＣＲ」アッセイの実行を熟知している。当業者はそのような増幅についての詳細な反応条件を見出す方法も知っている。逆転写反応（ＲＴ）および増幅反応（ｑＰＣＲ）は、いくつかの容器の中で行われるのではなく、同じ容器の中で（例えば、単一のチューブまたはバイアルの中で）行われ得る。
【００４２】
市販されているＲＴ−ＰＣＲキット（例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（商標）ＶｉｒｕｓキットまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）キット）が使用され得る。生じた蛍光シグナルが、当該分野で公知であるように、それぞれのリアルタイムサイクラーソフトウェアを使用して分析され得る。
【００４３】
ＤＮＡウイルスの検出のための好ましいアッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。しかし、当業者に公知であるように、任意の核酸増幅方法もまた適用可能である。核酸アッセイは、好ましくは、リアルタイムアッセイとして行われる（例えば、「ｑＰＣＲ」；Ｔａｑｍａｎ（商標）、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標）；Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）など）。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明は、本発明の方法およびキットにおけるＡｐＴＶの検出のためのプライマーおよびプローブ配列を提供する。第２のウイルスが本発明の核酸アッセイのためのＡｐＴＶプライマーである場合は、これは、約１０〜６０塩基の長さ、例えば、１０〜３０塩基の長さ、より具体的には、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基の長さの任意の核酸配列であり得、これは、５０ｍＭの１価の陽イオンの存在下で、≧５０℃、好ましくは、５０℃〜７５℃、または５５℃〜６５℃のＴｍでＡｐＴＶゲノム（配列番号１）またはその相補物にハイブリダイズする。特定の実施形態においては、プライマーに、配列番号１またはその相補物の断片である核酸配列が含まれる。ここでは、上記断片は、約１０〜３０塩基の長さ、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基の長さである。
【００４５】
任意の特定のプライマー対においては、正方向プライマーと呼ばれる第１のプライマーがＡｐＴＶゲノムとハイブリダイズし、逆方向プライマーと呼ばれる第２のプライマーがウイルスゲノムの相補物とハイブリダイズする。１つの実施形態においては、１つの正方向プライマーと１つの逆方向プライマーを含有している任意の特定のプライマー対のΔＴｍは、≦約５℃、例えば、約５℃、４℃、３℃、２℃、１℃、またはそれ未満である。
【００４６】
１つの実施形態において、本発明の方法およびキットで使用されるプライマーは、特定のプライマー対により増幅される断片が、≦約１５０塩基の長さ、例えば、プライマー配列を含め約１５０〜約５０ヌクレオチド長となるように設計される。特定の実施形態では、増幅される断片は、プライマー配列を含め約１４０塩基、１３０塩基、１２０塩基、１１０塩基、１００塩基、９０塩基、８０塩基、７０塩基、または６０塩基長であり得る。
【００４７】
本発明はまた、本発明の方法およびキットにおいて使用される、増幅されたＰＣＲ産物の検出のためのプローブ配列を提供する。プローブ配列は、約１０〜６０塩基の長さ、例えば、２０〜４０塩基の長さ、より具体的には、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基の長さであり、５０ｍＭの１価の陽イオンの存在下で、≧５０℃、好ましくは、５０℃〜７５℃、または５５℃〜６５℃のＴｍでＡｐＴＶゲノム（配列番号１）またはその相補物とハイブリダイズする。
【００４８】
特定の実施形態において、プローブは、配列番号１またはその相補物の断片である核酸配列を含む。断片は１０〜６０塩基の長さ、例えば、２０〜４０塩基の長さ、より具体的には、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基の長さであり得る。
【００４９】
プライマーおよび／またはプローブ（例えば、配列番号２〜４）は、例えば、放射標識、５’６−カルボキシフルオレセイン（６ＦＡＭ）標識および／または３’「ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ」（ＢＢＱ）標識のような蛍光標識、あるいは当該分野で公知の任意の他の標識で標識され得る。プローブは、高いハイブリダイゼーション能力をもたらすそのリボース中の２’−Ｏ、４’−Ｃメチレン架橋で修飾されたシトシンを含む、ロックト核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドであり得る。
【００５０】
本発明はまた、本発明の方法およびキットにおいて使用される、配列番号２、３、および４より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。これらの核酸は、８０ヌクレオチド未満、例えば、５０ヌクレオチド未満、または３０ヌクレオチド未満の長さの１本鎖であるべきである。これらは、ＭＲＶを検出するためのプライマーおよび／またはプローブとして有用であり得る。核酸は、関連する配列番号と同じ３’残基を有し得る。すなわち、配列５’−Ｘ−Ｙ−３’（式中、Ｙは、配列番号２、３、および４より選択される配列であり；Ｘは、１つ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列である）を含み得る。配列５’−Ｘ−Ｙ−３’を持つ核酸はＡｐＴＶ核酸にハイブリダイズし得る。
【００５１】
ウイルスポリペプチドの分析
本発明の方法の分析工程は、第１および／または第２のウイルスを起源とするポリペプチドの有無を同定するために使用され得る。陽性の結果は、ウイルスポリペプチドの存在の検出である。陰性の結果は、ウイルスポリペプチドが検出されないことである。本発明は一部、生物学的試料にウイルスが混入していないことを保証することに関するので、本発明のアッセイは、ウイルスポリペプチドが存在しないことを検出するまたは確かめるために主に使用されると予測される。
【００５２】
免疫ブロット法（例えば、ウェスタンブロッティング）、免疫沈降法、免疫電気泳動法、質量分析法、免疫拡散法（例えば、ＳＲＩＤ）、免疫化学的方法、バインダー・リガンド・アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学的技術、凝集アッセイなどを含むがこれらに限定されない様々な技術を、タンパク質の検出に利用できる。
【００５３】
タンパク質が１種類以上の抗体を使用することにより検出されるイムノアッセイが好ましい。これらの方法において有用な抗体は、ウイルスタンパク質（典型的には、構造タンパク質）の任意の部分に特異的であり得るが、様々な単離物の間で十分に保存されている配列に特異的であることが理想的である。様々なイムノアッセイの形式を当業者は利用でき、これらは多くの場合、例えば、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、または色素標識で標識された抗体の使用を含む。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイ（例えば、ビオチンとアビジンを利用するもの、およびＥＬＩＳＡのような、酵素で標識され、酵素に媒介されるイムノアッセイ）もまた公知である。
【００５４】
これらの方法で使用される「抗体」は様々な形態をとり得る。したがって、抗体はポリクローナル調製物であっても、モノクローナル調製物であってもよい。特異性と再現性の理由から、モノクローナル抗体を使用することが好ましい。抗体は、哺乳動物の中で自然界において見られるような天然の抗体であっても、また人工のものであってもよい。したがって、抗体は、例えば、抗原結合活性を保持している天然の抗体の断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片）、単一のポリペプチド鎖としてＶＨドメインとＶＬドメインを含む「単鎖Ｆｖ」、「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」、「トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）」、単一の可変ドメインまたはＶＨＨ抗体、「ドメイン抗体」（ｄＡｂ）、１つの生物に由来する定常ドメインを有しているが異なる生物に由来する可変ドメインを有しているキメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体などであり得る。抗体には、単一の抗原結合部位が（例えば、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ中のように）含まれてよく、また、複数の抗原結合部位が（例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片またはダイアボディまたは天然の抗体中のように）含まれてもよい。抗体が２つ以上の抗原結合部位を有する場合は、それが、単一特異性抗体であること、すなわち、全ての抗原結合部位が同じ抗原を認識することが好ましい。
【００５５】
抗体は、例えば、共有結合性の結合体化を介して非タンパク質物質を含み得る。例えば、抗体は検出可能な標識を含み得る。
【００５６】
用語「モノクローナル」は、抗体に関してもともと使用されてきたように、全てが同じ標的タンパク質を認識するが、異なるＢ細胞によって産生され、かつそのタンパク質上の異なるエピトープに特異的である「ポリクローナル」抗体とは対照的に、免疫細胞の単一のクローン株により産生された抗体をいう。本明細書中で使用される場合は、語「モノクローナル」は、任意の特定の細胞起源を含意するのではなく、全てが同じアミノ酸配列を有し、かつ同じ標的タンパク質（単数または複数）中の同じエピトープ（単数または複数）を認識する抗体の任意の集団をいう。したがって、モノクローナル抗体は、免疫細胞、非免疫細胞、無細胞系などを含む任意の適切なタンパク質合成系を使用して産生され得る。この利用は、この分野で日常的に見られ、例えば、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞株の中で発現させられたＣＤＲ移植ヒト化抗体Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）、ＣＨＯ細胞株の中で発現させられたヒト化抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、およびＣＨＯ細胞株中で発現させられたファージディスプレイ抗体Ｈｕｍｉｒａ（商標）についての製品データシートは全て、モノクローナル抗体としての産物を意味している。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、抗体の種または供給源に関しても、それが作られる様式によっても限定されない。
【００５７】
本発明で使用される抗体は、理想的には、配列番号１の中でコードされるポリペプチドの内側のエピトープに結合する。適切なエピトープは、従来のエピトープ予測およびマッピング技術を使用してインビトロまたはインシリコで同定され得る。一旦同定されれば、エピトープを、別の目的のウイルスと非交差反応性であると確かめることができる。
【００５８】
イムノアッセイは、不均質な形式であっても、均質な形式であっても、また、標準的な型であっても、競合型であってもよく、これらに限定されない。
【００５９】
本発明は、本発明の方法で使用されるＡｐＴＶポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。１つの実施形態において、本発明は、配列番号１によりコードされるポリペプチドのうちの１つ以上に特異的に結合する抗体を提供する。「特異的に結合する」により、抗体がＢＳＡよりも実質的に高い親和性で、配列番号１によりコードされるポリペプチドに結合することが意味される。好ましくは、親和性は、ＢＳＡに対してよりも、本発明のポリペプチドに対して、少なくとも１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍高いなどである。
【００６０】
１つの実施形態においては、抗体は、配列番号１によりコードされるポリペプチドに対して、任意のウイルスポリペプチドに対するその結合親和性よりも少なくとも１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍高いなどの親和性で結合する。
【００６１】
本発明の抗体に特異的に結合する、配列番号１によりコードされるポリペプチドは抗原と呼ばれる。
【００６２】
生物学的試料
本発明は、任意の生物学的試料とともに使用するために適している。例えば、臨床試料が特定のウイルスの存在について頻繁に試験される。したがって、生物学的試料は、血液または血液製剤、例えば、全血；血液画分；血清、血漿、赤血球、白血球、および／もしくは血小板のような血液成分；凝固因子濃縮物、血清アルブミン、または免疫グロブリン調製物であり得る。１つの特定の実施形態において、血液または血液製剤は、血液バンクに由来し得るもしくは血液バンクに送られ得る、および／または輸血に使用され得る。
【００６３】
本発明はまた、ウイルスが混入している可能性がある非生物学的試料についても使用され得る。例えば、試料は医薬品であり得る。
【００６４】
試料は、熱不活化された試料であってよく、また、熱不活化産物由来の試料であってもよい。
【００６５】
生物学的試料はまた、骨髄、腎臓、肝臓、心臓、肺、および／または皮膚を含むがこれらに限定されるわけではない、任意の組織試料あるいは生検材料であってもよい。生物学的試料はまた、尿、糞便、痰、唾液、吸引液、咽頭洗浄液、細気管支洗浄液、羊水、滑液、濾胞液、腹水、および／または脳脊髄液であってもよい。
【００６６】
この実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、第１のウイルスの有無について血液および／または血液製剤を試験するための方法を提供する：
（ａ）血液および／または血液製剤の試料を採取する工程
（ｂ）試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；ならびに
（ｃ）本発明の方法またはキットを使用して、第２のウイルスの存在と第１のウイルスの有無を検出する工程；
ここでは、第１のウイルスと第２のウイルスは同じ型のウイルスである。
【００６７】
本発明はまた、本発明の方法またはキットを使用して第１のウイルスを含まないことが確かめられた血液または血液製剤を提供する。
【００６８】
本発明を使用して試験され得る血液製剤として、全血；血漿（例えば、アフェレーシス血漿または回収された血漿）；血清；血小板；血漿製剤；凝固因子濃縮物；第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、または第ＶＩＩＩ／ｖＷＦ因子のような凝固因子；活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ＡＰＣＣ）、ヒト血清アルブミンを含む血清アルブミン；あるいは、免疫グロブリン調製物が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。上記生成物は、熱不活化生成物であり得る。
【００６９】
任意の適切な第１のウイルスと第２のウイルスの対が、本発明のこの実施態様において使用され得る。特に、第１のウイルスがＭＲＶである場合は、第２のウイルスはＡｐＴＶであり得る。
【００７０】
さらなる実施形態においては、生物学的試料は、ワクチンまたはワクチンの産生における中間体（あるいはその試料）である。特定の実施形態においては、生物学的試料は、インフルエンザワクチンの産生に由来する中間体またはインフルエンザワクチンである。インフルエンザワクチンは、孵化鶏卵中または細胞培養物中で産生され得る。
【００７１】
特に、細胞培養に基づくインフルエンザワクチンの産生またはインフルエンザワクチンは、例えば、ＷＯ２００８／０６８６３１に記載されているＯｐｔａｆｌｕ（商標）プロセスとワクチンであり得る。インフルエンザウイルスを増殖させるための最も好ましい細胞株はＭＤＣＫ細胞株である。元のＭＤＣＫ細胞株はＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手できるが、この細胞株の誘導体および他のＭＤＣＫ細胞株もまた使用され得る。例えば、ＷＯ９７／３７０００では、懸濁培養液中での増殖に適合させられたＭＤＣＫ細胞株（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ  ３３０１６」）が開示されている。同様に、ＷＯ０１／６４８４６では、無血清培養物での懸濁液中で増殖するＭＤＣＫ由来細胞株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）が開示されている。ＷＯ２００６／０７１５６３では、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）、および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む、非腫瘍原性ＭＤＣＫ細胞が開示されている。ＷＯ２００５／１１３７５８では、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２）を含む、感染に対する感受性が高いＭＤＣＫ細胞株が開示されている。
【００７２】
細胞培養に基づくワクチン産生プロセスは、通常、以下の工程を含む：それぞれ１価のバルクのための出発材料が、ＭＤＣＫ作業用細胞バンク（ＭＤＣＫ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ（ＷＣＢ））の単一のバイアルである。細胞を、産生の間の細胞増殖を最適化するために、化学的に定義された培地中で増殖させる。ＷＣＢをスピナーフラスコ中での逐次的な継代により増殖させ、続いて、より大きな醗酵容器にスケールアップする。種ウイルスを添加し、発酵槽中でのウイルスの増殖を２日〜４日間にわたり行う。感染サイクルの最後にウイルス懸濁液を遠心分離し、濾過して培養収集物から残余のインタクトな細胞を取り除く。清澄化したウイルス収集物と呼ぶ遠心分離し、濾過したバルクが、醗酵プロセスの最後である。清澄化したウイルス収集物は、ステンレス鋼製の保存容器中、室温（１６〜２５℃）で２４時間まで保存することができる。インフルエンザウイルスをクロマトグラフィーおよび限外／透析濾過工程により精製し、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）により不活化し、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）によって崩壊させて、ウイルス表面抗原ＨＡとＮＡを可溶化させる。薬物物質の産生プロセスは、１価のバルクが得られるように最終のバルク容器に濃縮物を濾過することで終わる。最後に、１価のバルクを多価のバルク（典型的には、３価のバルク）になるようにブレンドし、それらの最終的な容器、例えば、注射器に充填することができる。ＤＮＡのあらゆる腫瘍形成活性を最少にするためには、最終的なワクチン中の残留している細胞株ＤＮＡの量を最小限にすることが標準的な実施である（詳細はＷＯ２００８／０６８６３１を参照のこと）。
【００７３】
本発明の方法は、種ウイルスおよび／または細胞基材および／または培養培地から始まり、ウイルス感染および増殖の段階を経て、ウイルスの回収を経て、ウイルスの任意の処理（例えば、分割および／または表面タンパク質の抽出）を経て、ワクチンの処方を経て、その後、ワクチンをパッケージングする、ワクチンの製造の任意の段階（単数または複数）で行われ得る。したがって、本発明の方法にしたがって使用されるアッセイは、ウイルス培養物を作製するために使用される材料について、ウイルス培養物自体について、およびウイルス培養物から抽出し、そしてそれに由来する材料について行うことができる。アッセイは、個々の全てのワクチンまたは培養物について行われる必要はないが、通常の品質管理の一部として適切な間隔で使用され得る。これは、ワクチンの産生が、規制当局により推奨される、毎年の新しい株について変更される場合には特に有用であり、その段階で新しい培養物が確立され、新しい品質管理に供されなければならない。本発明の方法は、ワクチンの製造に使用される種ウイルスについてアッセイを行う場合に有利に使用される。
【００７４】
ワクチン産生の品質管理において使用される任意のアッセイがロバストであり、偽陽性、偽陰性、または変動性の結果を生じにくいことが特に重要である。本発明の方法は、生物学的試料、特に、ワクチンまたはワクチンの産生における中間体中の混入しているウイルスを検出するためのアッセイの信頼性を確実にするロバストな手段を提供する。
【００７５】
この実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、ワクチンおよび／またはワクチンの産生における中間体を、第１のウイルスの有無について試験するための方法を提供する：
（ａ）ワクチンおよび／またはワクチンの産生における中間体の試料を採取する工程；
（ｂ）試料に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；
（ｃ）本発明の方法またはキットを使用して、第２のウイルスの存在と、第１のウイルスの有無を検出する工程；
ここでは、第１のウイルスと第２のウイルスは同じ型のウイルスである。
【００７６】
本発明はまた、本発明の方法またはキットを使用して第１のウイルスを含まないことが確かめられた、ワクチンまたはワクチンの産生における中間体を提供する。
【００７７】
本発明はまた、以下の工程を含む、第１のウイルスを含まないワクチンを製造する方法を提供する：
（ａ）ワクチンの産生における中間体（またはその試料）に対して、またはバルクのワクチン（またはその試料）に対して外因性の第２のウイルスを添加する工程；
（ｂ）本発明の方法またはキットを使用して、その中の第２のウイルスの存在と第１のウイルスの有無を検出する工程；ならびに
（ｃ）第１のウイルスを含まないワクチンを処方する工程、
ここでは、第１のウイルスと第２のウイルスは同じ型のウイルスである。
【００７８】
ワクチンおよびワクチン処方物、例えば、インフルエンザワクチンを製造する好ましい方法は、ＷＯ２００６／０２７６９８、ＷＯ２００７／０５２１６３、ＷＯ２００８／０３２２１９、ＷＯ２０１０／０９２４７７、およびＷＯ２０１０／０９２４７６に記載されている。
【００７９】
本発明の方法は、必ずしも完成した試料について行われる必要はない。したがって、試料を得ることができ、上記方法を、試料の一部について、例えば、生検材料の一部について、または細胞培養物試料のアリコートについて行うことができる。
【００８０】
キット
本発明はまた、第２のウイルスと、第２のウイルスの検出用のプライマーおよび／またはプローブを含む、生物学的試料中の第１および第２のウイルスの有無の検出用のキットも提供する。ここでは、第２のウイルスは内部陽性対照である。任意に、キットはさらに、第１のウイルスの検出用のプライマーおよび／またはプローブを含み得る。
【００８１】
特定の実施形態において、キットは、ＡｐＴＶウイルス粒子とＡｐＴＶの検出用のプライマーおよび／またはプローブを含む。特異的な実施形態では、プライマーは、配列番号２および３に示す配列を有し（ＡＶ  Ｆプライマー：５’ＣＣＣ  ＴＧＣ  ＴＣＣ  ＴＡＣ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＴＣＴ  ＣＣ  ３’−  配列番号２、およびＡＶ  Ｒプライマー：５’ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＣＡ  ３’−  配列番号３）、そしてプローブは配列番号４に示す配列を有する
【００８２】
【化１】
0005999817.tif 000003
本発明のキットはさらに、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ、ポリメラーゼ緩衝液、ｄＮＴＰ、ＲＮａｓｅ不含水、およびランダムプライマーを含むがこれらに限定されない、核酸アッセイを実行するための試薬を含み得る。
【００８３】
本発明はさらに、（ｉ）ＡｐＴＶウイルス粒子と（ｉｉ）ＡｐＴＶの検出用の抗体を含む、生物学的試料中のＡｐＴＶ以外のウイルスの有無を検出する間に有用なキットを提供する。
【００８４】
一般
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」には、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」が含まれる。例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなってよく、また、さらなるものを含んでもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００８５】
数値ｘに関する用語「約」は任意のものであり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００８６】
語「実質的に」は、「完全に」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含まなくてもよい。必要に応じて、語「実質的に」は本発明の定義から省略され得る。
【００８７】
プライマーおよびプローブについてのＴｍは以下の式を使用して計算される：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６℃×（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］＋［Ｋ＋］）＋０．４１℃×（％ＧＣ）−６７５／Ｎ
株、増殖のための細胞株、用量、組み合わせ、処方などを含む、インフルエンザワクチンについてのさらなる一般的情報は、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｐｌｏｔｋｉｎ  ＆  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ編）、第４版、２００４年、ＩＳＢＮ  ０−７２１６−９６８８−０の第１７章と第１８章の中に見ることができる。ウイルスの構造およびゲノム型、ならびにウイルス増殖の間の生活環などの詳細を含む、ウイルスについてのさらなる詳細は、Ｋｎｉｐｅ  ＆  Ｈｏｗｌｅｙ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第４版、２００１年）、ＩＳＢＮ  ０−７８１７−１８３２−５の中に見ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
生物学的試料
様々な生物学的試料を、ＭＲＶ  ＲＴＤ−ＰＣＲの開発段階で使用した（表２）。さらに、内部陽性対照を妨害する可能性があり得る３種類の可能性がある阻害物質を調べた。
【００８９】
【表２】
0005999817.tif 000004
ＲＴＤ−ＰＣＲ法の性能に対する阻害物質の影響を調べるために、３種類の成分を使用した。ＭＤＣＫ宿主細胞ＤＮＡ、Ｂ１上清の可溶性ＭＤＣＫ宿主細胞タンパク質、および濃縮したインフルエンザウイルス溶液を、可能性がある阻害物質として選択した。ＭＤＣＫ宿主細胞ＤＮＡを、バッチ２２．０９．０５（０．６×１０７ＭＤＣＫ細胞／ｍｌ；Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＴＤＭ）の研究室で製造された）から単離した。
【００９０】
濃縮したインフルエンザウイルスの溶液および可溶性ＭＤＣＫ宿主細胞タンパク質を生成するために、Ｆ１１０８２９＿Ｂ１試料を５５，０００ｇで２時間遠心分離した。ペレットを５ｍｌのＰＦ／ＣＤＭ培地中に再懸濁した。
【００９１】
阻害物質と全ての調べた生物学的試料を、ＤＮＡ、全タンパク質含有量、およびインフルエンザウイルス濃度により特徴付けした。分析データを表３にまとめる。
【００９２】
【表３】
0005999817.tif 000005
Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎアッセイを使用して、阻害物質のＤＮＡ含有量、Ｂ１、および種ウイルス試料を定量化した。
【００９３】
使用した阻害物質とマトリックスの全タンパク質含有量をマイクロブラッドフォード法により決定した。試験原理は通常のブラッドフォード法と同様であるが、低いタンパク質濃度を用いる。試料をＰＢＳ緩衝液で予め希釈し、５９５ｎｍの吸収でＢＳＡの検量線に対して測定した。色素試薬はＢｉｏＲａｄによるｑｕｉｃｋ  ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ色素試薬（１５０μｌ）であり、これを測定前に試料（１５０μｌ）とともに１５分間インキュベートした。
【００９４】
試料中のインフルエンザウイルスのコピー数を定量化するために、定量的１工程ＲＴ−ＰＣＲを使用した。試料を、試料中の遊離のｓｓＲＮＡを消化するために、室温（約２２℃）で６０分間、１．５μｌのＲＮａｓｅ  Ａ／Ｔ１（３μｇのＲＮａｓｅ  Ａおよび７．５ＵのＲＮａｓｅ  Ｔ１）で予め処理して、ウイルス粒子により保護されていたインフルエンザＲＮＡだけを定量化した。その後、ＲＮＡをＲＮＡ特異的核酸キット（ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ  −  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ）を用いて抽出した。
【００９５】
定量的ＲＴ−ＰＣＲのために、５μｌの試料を使用した。インフルエンザウイルスＲＮＡを逆転写（ＲＴ）させ、増幅させ（５０℃で１５分間のＲＴ、９５℃で２分間のＴａｑ活性化）、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ  Ｃｅｐｈｅｉｄ中でＡ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザ特異的プライマーおよびプローブを使用して、ＰＣＲにより検出した（４５サイクルについて、９４℃で１５秒間の変性；４５サイクルについて４５℃で４５秒間のアニーリング／伸長）。試料を、インフルエンザウイルスのコピー数を定量化するために標準物に対して測定した。標準物は、合成し、Ｔ３／Ｔ７転写ベクター（ｐＧＡ４−ａｍｐＲ）のＫｐｎＩ部位とＳａｃＩ部位にクローニングしたｓｓＲＮＡ断片である。これを、１０ｎｇ／ｍｌのｓｓＲＮＡの最終ｓｓＲＮＡ溶液（アリコートあたり１ｍｌ）として調製した。チューブへの低濃度のｓｓＲＮＡの非特異的吸着を防ぐために、１×ＴＥ（ｐＨ８．０）中の１００ｎｇ／μｌの酵母ｔＲＮＡを添加した。
【００９６】
反復アッセイの可変性に対する生物学的試料の選択の影響を評価した。３種類の異なるＢ１試料中のＭＲＶ−１の２連での決定は、決定値の間にごくわずかな差異しか示さず、それぞれ、６−ＦＡＭプローブについては０．７２のＣｔ値の標準偏差、そしてＣｙ５プローブについては０．１７のＣｔ値の標準偏差であった（表４）。
【００９７】
【表４】
0005999817.tif 000006
プライマー、プローブ、および試薬
プライマーおよびプローブの濃度のロバスト性を示すために、所定の濃度のわずかな差異を使用した。調べた濃度は、ＭＲＶプライマーとＡｐＴＶプライマー（ＡＶ  Ｆプライマー：５’ＣＣＣ  ＴＧＣ  ＴＣＣ  ＴＡＣ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＴＣＴ  ＣＣ  ３’−  配列番号２およびＡＶ  Ｒプライマー：５’ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＣＡ  ３’−  配列番号３）については０．５、０．６、および０．７μＭ、ＭＲＶプローブについては、０．１８、０．２０、および０．２２μΜ、そしてＡｐＴＶプローブについては、０．０８、０．１０、および０．１２μΜであった。調べた濃度の全ての組み合わせを２連で測定した。
【００９８】
プライマーおよびプローブの濃度のわずかな差異の研究は、０．７未満のＣｔ値の標準偏差を示した（表５）。さらに、平均Ｃｔ値からの最大偏差は、１．５未満のＣｔ値であった。
【００９９】
【表５】
0005999817.tif 000007
上記方法のロバスト性を示すために、３人の異なるオペレーター、３日、各プライマーおよびプローブの３つのバッチ、３種類の抽出キットおよびＰＣＲキットを、２つのＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  ｅｘｔｒａｃｔｏｒと２つのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＰＣＲ機器を用いて試験した。ＭＲＶ検出（試料あたり８回の単回決定）の平均Ｃｔ値を調べ、ウイルスのロバストな検出を示した。
【０１００】
ＭＲＶは、様々な試薬ロットの研究における２４回の決定（８回の反復の平均）において、１．００のＣｔ値の標準偏差で検出することができた（表６）。３つの場合において、試料あたり８回の反復のうちの１または２は失敗した。しかし、全体として、試料は陽性と呼べる。
【０１０１】
【表６】
0005999817.tif 000008
核酸抽出についての内部陽性対照
各抽出の効率を制御するために、ＡｐＴＶ抽出−内部陽性対照（ＥＸ−ＩＰＣ）を各試料にスパイクした。ＥＸ−ＩＰＣおよびＭＲＶの核酸を増幅させ、１工程のＲＴ−ＰＣＲにおいて異なるプライマーおよびプローブのセットによって検出した。したがって、２種類の標的のうちの一方の濃度が高すぎる場合には、２つの標的のうちの一方の競合阻害が起こり得る。したがって、ＥＸ−ＩＰＣの濃度を、ＥＸ−ＩＰＣのロバストな検出と、ＭＲＶの高感度の検出もまた保証する濃度に調整しなければならない。
【０１０２】
ＥＸ−ＩＰＣのロバスト性を示すために、１００、２００、および３００ｐｇ／ｍｌのＡｐＴＶを、１０２および１０３ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＭＲＶ濃度とともに使用した。さらに、ＭＲＶを含まない１つの試料を使用した。ＭＲＶおよびＡｐＴＶの濃度あたり１回の決定を行い、合計９回決定した（ＭＲＶを用いて６回、ＭＲＶを含めずに３回）。ＭＲＶフリーＢ１試料（ＮＧＫ−ＥＸ−ＩＰＣ）中でのＥＸ−ＩＰＣの決定に対する影響を調べた。
【０１０３】
ＭＲＶの決定においてはごくわずかな差異が観察され、１００〜３００ｐｇ／ｍＬの範囲のＥＸ−ＩＰＣ濃度を用いた場合は、０．５６のＣｔ値の最大標準偏差であった。ＭＲＶを含まない試料（ＮＧＫ−ＥＸ−ＩＰＣ）中でのＥＸ−ＩＰＣの決定は、同等に低い標準偏差（０．４６のＣｔ値；表７）を有していた。２５個のＮＧＫ−ＥＸ−ＩＰＣ対照の評価は、２８．３９の平均Ｃｔ値を示した（標準偏差１．３７）。
【０１０４】
【表７】
0005999817.tif 000009
他の対照
第２の対照（ＭＲＶ−ＰＣ）により、ＭＲＶの検出についての６−ＦＡＭ標識プローブの機能を管理する。ＭＲＶ−１株は、ＭＲＶフリーＢ１試料中で、１０２  ＴＣＩＤ５０／ｍＬの濃度で使用されるであろう。
【０１０５】
ＭＲＶ−ＰＣは、あらゆるアッセイに使用されるであろう。ＡｐＴＶはＭＲＶ−ＰＣ試料中にスパイクされないであろう。ＭＲＶ−ＰＣについてのＣｔ値が、アッセイの性能について、時間の間のわずかな差異を見るために対照チャートにおいてモニターされるであろう。ＭＲＶＰＣは、ＭＲＶフリーＢ１試料（ＮＧＫ）中にスパイクされるであろう。対照はＮＧＫ−ＭＲＶ−ＰＣと呼ばれる。
【０１０６】
第３のＲＴＤ−ＰＣＲ対照（ＭＲＶ−ＩＰＣ）が、ＲＴＤ−ＰＣＲの間の増幅および検出の正確な性能を調べるために必要である。ＭＲＶ−ＩＰＣは、２５６塩基対長のｓｓＲＮＡ構築物である。この構築物は、Ｐａｎｏｍｉｃｓ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により産生された。断片を合成し、Ｔ３／Ｔ７転写ベクター（ｐＧＡ４−ａｍｐＲ）のＫｐｎＩ部位とＳａｃＩ部位にクローニングした。これを、１０ｎｇ／ｍＬのｓｓＲＮＡの最終ｓｓＲＮＡ溶液として調製した。チューブへの低濃度のｓｓＲＮＡの非特異的吸着を防ぐために、１×ＴＥ（ｐＨ８．０）中の１００ｎｇ／μＬの酵母ｔＲＮＡを添加した。ＭＲＶ−ＩＰＣが増幅され、ＡｐＴＶ特異的プライマーおよびプローブにより検出されるであろう。対照は、それぞれのアッセイにおけるＲＴＤ−ＰＣＲの機能性を明らかにする。この対照は、抽出誤差とＰＣＲ誤差を区別することができる。
【０１０７】
第４の対照はＮＴＣ（鋳型ではない対照）である。ここでは、ＰＣＲ水だけがＲＴＤ−ＰＣＲにおいて鋳型として使用される。この対照はアッセイについての陰性対照であり、アッセイの実行の間のあらゆる混入を示すために使用される。
【０１０８】
ＭＲＶおよびＥＸ−ＩＰＣの検出
核酸抽出の間の交差汚染により生じる偽陽性の結果が存在しないことを示すために、１０５  ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＭＲＶ試料とＭＲＶフリー試料を交差して抽出した。ＭＲＶでスパイクした試料だけがＭＲＶの陽性検出を示すはずである。
【０１０９】
ＭＲＶは、ＭＲＶを添加した全ての試料中で検出された。ＭＲＶを含まない試料は全て、ＭＲＶについて陰性と分析された。ＥＸ−ＩＰＣは全ての場合において検出された。
【０１１０】
結論
ＥＸ−ＩＰＣの評価はロバストな性能を示した。プライマーおよびプローブ濃度のわずかな差異の調査は有意な影響を示さなかった。さらに、試薬の異なるバッチの使用もまた、ＲＴＤ−ＰＣＲの性能に対する影響を示さなかった。
【０１１１】
偽陽性または偽陰性の結果は存在せず、１０５  ＴＣＩＤ５０／ｍｌでスパイクした試料とＭＲＶをスパイクしなかった試料との間で、核酸抽出の際に交差汚染がないことも観察された。
【０１１２】
本発明がほんの一例として記載されており、本発明の範囲および精神に留まったまま改変が行われ得ることが理解されるものとする。
【配列表】
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