(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
過冷却促進剤を水または用途に応じた添加物を含む水溶液に溶解させて調製される不凍性液体であって、前記不凍性液体中に前記過冷却促進剤が０．０１ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌであり、前記過冷却促進剤が、下記式（１）
【化１】
0006035371.tif 000012
で示される置換ベンゾイル基とエステル結合した部分構造を有する糖エステル型の加水分解型タンニンである２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−α，β−Ｄ−ハマメロース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、または下記式（２）
【化２】
0006035371.tif 000013
で示される置換ベンゾイル基とエステル結合した部分構造を有する糖エステル型の加水分解型タンニンであるタンニン酸である不凍性液体。
【請求項２】
さらに、凍害防止剤を１〜４０容積％含有する請求項１に記載の不凍性液体。
【請求項３】
凍害防止剤が、メタノール、エタノール、アセトアミド、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ホルムアルデヒド、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、プロリン、グルコース、ソルビトール、シュークロース、トレハロース、ポリエチレングリコール、デキストラン１０−１５０、ポリビニルピロリドン（PVP）、アルブミン、フイコール、及びヒドロキシエチルスターチ（HES）からなる群から選択される１種または２種以上である請求項２に記載の不凍性液体。
【請求項４】
植物または動物の細胞、組織、魚介類、野菜から選択される生物材料を含み、０〜−１５℃に冷却された請求項１に記載の不凍性液体。
【請求項５】
過冷却促進剤を０．０１〜３０ｇ／Ｌ含み、凍害防止剤を単独または組み合わせて２０〜９０容積％、残余（１０〜８０容積％）が水または用途に応じた添加物を含む水溶液であり、前記過冷却促進剤が、下記式（１）
【化３】
0006035371.tif 000014
で示される置換ベンゾイル基とエステル結合した部分構造を有する糖エステル型の加水分解型タンニンである２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−α，β−Ｄ−ハマメロース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、または下記式（２）
【化４】
0006035371.tif 000015
で示される置換ベンゾイル基とエステル結合した部分構造を有する糖エステル型の加水分解型タンニンであるタンニン酸であるガラス化液。
【請求項６】
前記水または用途に応じた添加物を含む水溶液を４０〜８０容積％含有する請求項５に記載のガラス化液。
【請求項７】
植物または動物の細胞、組織、魚介類、野菜から選択される生物材料を含み、０〜−１５℃に冷却された請求項６に記載のガラス化液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は過冷却促進剤に関する。さらに詳しく言えば、低濃度で氷核の形成を阻害して水を過冷却させる活性を有するタンニンからなる過冷却促進剤、前記タンニンを含有する不凍性液体、及びガラス化液に関する。
【背景技術】
【０００２】
水を氷点下で長期間に渡り安定的に凍らせない物質があれば様々な産業分野への応用が期待されるが、現在のところ産業的に応用が期待できるレベルで、低濃度の添加により水を少なくとも１０℃以上、１日以上過冷却させる物質は知られていない。
【０００３】
寒冷地に生育する樹木の細胞水は低温で液体状態を保つことが知られている。このような樹木は、木部柔細胞内の水が、外界から分離された水滴のため水の物理的特性により−４０℃まで過冷却すると考えられている（非特許文献１）。木部柔細胞を取り囲む細胞壁が、細胞からの脱水及び細胞外の氷が細胞内に浸入することを防ぐバリアーとして働くために、細胞外に氷ができても、細胞内の水は外界から孤立した水滴として振る舞い過冷却すると考えられている。また、越冬植物に含まれるフェノール化合物（フラボノイド）が過冷却活性を有するらしいことが知られ、凍結防御物質として機能することが示唆され（非特許文献２）、生殖細胞等を培養するための凍結培地にフラボノイドを用いること（特許文献１）、内燃機関等の冷却液として用いる不凍液の成分としてフラボノイドを用いること（特許文献２）が開示されている。なお、多種類のフラボノイド配糖体が、二次代謝物として樹木を含む植物や生物由来の物質に存在することが知られている（非特許文献３）。
【０００４】
本発明者は、寒冷地に生育する樹木の細胞水が低温で液体状態を保つメカニズム解明のための総合的研究を開始し、先ず−４０℃で木部柔細胞が数週間の期間に渡って安定的に示す過冷却能力（これを一時的な過冷却と区別して深過冷却能力という。）のうち、２０℃の過冷却能力は水が物理的に隔離されているという要因により起こるが、残りの２０℃の過冷却能力は細胞内に存在する何らかの物質により引き起こされることを明らかにした（非特許文献４)。
次いで、細胞の融解温度と細胞内の水分濃度から、モル凝固点降下による過冷却活性の増加を求めたところ、細胞内濃度の影響による過冷却活性の増加は２〜３℃程度であり、残りの１７〜１８℃の過冷却活性は、前述の物理的要因によらず、細胞内に存在する何らかの物質により引き起こされているとの結論に至った。木部柔細胞の過冷却限度温度の増加は、特徴的な遺伝子発現とそれに伴う蛋白質の発現を伴っていたが、この蛋白質には過冷却促進活性はなかった。また、木部柔細胞のみに特徴的に蓄積する糖質は認められず、細胞内に蓄積した個々の糖質にも過冷却促進活性は認められなかった。
【０００５】
一方、木部柔細胞から抽出した、蛋白質、糖質以外の２次代謝物は高い過冷却活性を示し、過冷却活性は木部柔細胞からメタノールで抽出した粗抽出物、これをさらに数段階にわたり精製した全ての画分に認められ、深過冷却する木部柔細胞には多種・多様な高い過冷却活性を示す物質が存在することが確認された。
本発明者は、これらの過冷却活性を示す画分の中から、３〜９℃の範囲で過冷却活性を示すフラボノール配糖体を同定し先に特許出願をしている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０００−５００３２７（WO97/14785）
【特許文献２】国際公開第２００４／０７４３９７号パンフレット（US2006/0038159）
【特許文献３】国際公開第２００８／００７６８４号パンフレット（US2009/0302265）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】化学と生物 vol. 43, No. 5, 280-282 (2005)
【非特許文献２】化学と生物 vol. 37, No. 12, 778-780 (1999)
【非特許文献３】Flavonoids Chemistry, Biochemistry and Applications, CRC Press Taylor and Francis Group (2006)
【非特許文献４】Role of intracellular contents to facilitate supercooling capability in beech (Fagus crenata) xylem parenchyma cells. CryoLetters, 27 (5), 305-310 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、木部柔細胞から抽出した過冷却活性を示す画分の中から、前述のフラボノイド配糖体以外の、高い過冷却活性を示す成分（物質）を同定し、実用的な凍らない水を作製するための新たな過冷却促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、−４０℃まで深過冷却する木部柔細胞を持つカツラの木部柔細胞から過冷却活性を指標として抽出した画分について、さらに有効活性成分の同定を試みた。その結果、加水分解型タンニンである２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−α，β−Ｄ−ハマメロース（クリガリン）、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース及び１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースが水を３．５〜４．６℃過冷却させる活性を有することを確認した。この知見に基づき、他の加水分解型タンニン、及び縮合型タンニンの過冷却活性の有無についても検討し、その結果、加水分解型タンニンである五倍子由来のタンニン酸、縮合型のカテキン型タンニンであるライチフルーツ由来低分子化ポリフェノール（オリゴノール，ライチフルーツ由来低分子化ポリフェノールの商品名，（株）アミノアップ化学製）、ライチフルーツ由来ポリフェノール（LFP）、ブドウ種子由来ポリフェノール（GSP）、及び茶カテキン、カテキン（C）、エピカテキン（EC）、エピカテキンガレート（ECG）、エピガロカテキン（EGC）、ガロカテキンガレート（GCG）、エピガロカテキンガレート（EGCG）等のカテキン類に過冷却活性があることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記１〜８のタンニンからなる過冷却促進剤、９〜１３の不凍性液体及び１４〜１６のガラス化液に関する。
１．  タンニンからなる過冷却促進剤。
２．  タンニンが、炭素原子数６の糖の１つ以上の水酸基が下記式（１）〜（６）：
【化１】
0006035371.tif 000002
（式中、ｎは０または１である。）
で示される構造から選択される置換ベンゾイル基とエステル結合した部分構造を有する糖エステル型の加水分解型タンニンである前項１に記載の過冷却促進剤。
３．  加水分解型タンニンが、２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−α，β−Ｄ−ハマメロース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースまたは１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースである前項２に記載の過冷却促進剤。
４．  加水分解型タンニンが、五倍子由来のタンニン酸である前項２に記載の過冷却促進剤。
５．  タンニンが、一般式（Ｉ）
【化２】
0006035371.tif 000003
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、各々独立して水素原子または水酸基を表し、Ｒ4は水素原子またはガロイル（galloyl）基を表す。）
で示されるフラバン−３−オール骨格を部分構造として含むカテキン型タンニンである前項１に記載の過冷却促進剤。
６．  カテキン型タンニンが、ライチフルーツ由来低分子化ポリフェノール（オリゴノール，ライチフルーツ由来低分子化ポリフェノールの商品名，（株）アミノアップ化学製）、ライチフルーツ由来ポリフェノール（LFP）、及びブドウ種子由来ポリフェノール（GSP）からなる群より選択されるポリフェノールである前項５に記載の過冷却促進剤。
７．  ポリフェノールが、ライチフルーツ由来低分子化ポリフェノール（オリゴノール）またはライチフルーツ由来のポリフェノールであり、超純水に対し過冷却活性を有する前項６に記載の過冷却促進剤。
８．  カテキン型タンニンが、茶カテキン、カテキン（C）、エピカテキン（EC）、エピカテキンガレート（ECG）、エピガロカテキン（EGC）、ガロカテキンガレート（GCG）及びエピガロカテキンガレート（EGCG）からなるカテキン類より選択される前項５に記載の過冷却促進剤。
９．  前項１〜８のいずれかに記載の過冷却促進剤を水または用途に応じた添加物を含む水溶液に溶解させてなる不凍性液体であって、前記不凍性液体中に前記過冷却促進剤を０．０１〜３０ｇ／Ｌ含む不凍性液体。
１０．  添加物が、動植物細胞の培養培地の成分、または生物材料の保存液の成分である前項９に記載の不凍性液体。
１１．  さらに、凍害防止剤を１〜４０容積％含有する前項９に記載の不凍性液体。
１２．  凍害防止剤が、メタノール、エタノール、アセトアミド、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ホルムアルデヒド、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、プロリン、グルコース、ソルビトール、シュークロース、トレハロース、ポリエチレングリコール、デキストラン１０−１５０、ポリビニルピロリドン（PVP）、アルブミン、フイコール、及びヒドロキシエチルスターチ（HES）からなる群から選択される１種または２種以上である前項１１に記載の不凍性液体。
１３．  生物材料を含み、０〜−１５℃に冷却された前項９または１１に記載の不凍性液体。
１４．  凍害防止剤を単独または組み合わせて２０〜９０容積％含有し、残余が水または用途に応じた添加物を含む水溶液であるガラス化液に、前項１〜８のいずれかに記載の過冷却促進剤を０．０１〜３０ｇ／Ｌ含んでなるガラス化液。
１５．  前記水または用途に応じた添加物を含む水溶液を４０〜８０容積％含有する前項１４に記載のガラス化液。
１６．  生物材料を含み、液体窒素温度に冷却された前項１４または１５に記載のガラス化液。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の過冷却促進剤は、水や水を含む物質の凍結温度を、本来水が凍結する温度より１５℃前後低下させることができる。この過冷却促進剤は、バルクの水を低温で長期にわたって安定的に過冷却させることができる。また、本発明の過冷却促進剤は、水と混合することにより、約−１５℃程度で利用できる不凍性液体となり、この不凍性液体中で生物材料等を長期間低温保存することが可能である。本発明の過冷却促進剤は、水や用途に応じて添加物を含んだ水溶液、または水を含む物質に溶解させて凍結させて、氷晶の大きさをコントロールする凍結制御剤として使用することができる。過冷却促進剤の添加により、過冷却により凍結開始温度が低下するために形成される氷晶の大きさを小さくすることができる。このため過冷却促進剤を加えた水溶液を、冷却速度を変えたり、添加物の組成や濃度を変えたりして、凍結することにより、氷の大きさを様々に変える凍結制御剤として使用することができる。更に、凍害防止剤を高濃度で含むガラス化液に、本発明の過冷却促進剤を添加することにより、ガラス化液の濃度を下げることが可能であり、ガラス化液への浸せきによる毒性を軽減することができ、液体窒素温度などの超低温に於いて効率的にガラス体をもたらすことができ、超低温のガラス体中でこれまでガラス保存が困難であった生物材料等を保存することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】カツラ抽出物の酢酸エチル可溶画分のシリカゲルカラムクロマトグラフ画分の過冷却活性を示す図であり、横軸は、シリカゲルカラムクロマトグラフ画分（フラクション）Ａ〜Ｔを示し、縦軸は過冷却活性（INT50（℃））を示す。
【図２】画分Ｋ〜Ｓの高速液体クロマトグラフを示す。
【図３】画分Ｋ〜Ｓから単離した２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−α，β−Ｄ−ハマメロースの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（重アセトンacetone-d6中で測定）を示す。
【図４】画分Ｋ〜Ｓから単離した、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（重メタノールCD3OD中で測定）を示す。
【図５】画分Ｋ〜Ｓから単離した１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースの1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（重メタノールCD3OD中で測定）を示す。
【図６】Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれ上記画分Ｋ〜Ｓから単離した２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−α，β−Ｄ−ハマメロース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース及び１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースの過冷却活性を示す図であり、横軸は液滴を載せた銅板の温度、縦軸は凍結した液滴の割合を示す。
【図７】実施例２で調製した１，２，３，４，６−ペンタガロイル−α，β−Ｄ−グルコピラノース混合物（α：β＝１：３．８）の過冷却活性を示す図である。
【図８】各種氷核物質（Ａ：氷核活性細菌（Erwinia ananas），Ｂ：ヨウ化銀（ＡｇＩ），Ｃ：氷核活性細菌（Xanthomonas campestris），Ｄ：フロログルシノール（Phloroglucinol）)及び超純水（MilliQ Water）に対する０．１％タンニン酸（五倍子）の過冷却促進効果を示す。
【図９】各種氷核物質（Ａ：氷核活性細菌（Erwinia ananas），Ｂ：ヨウ化銀（ＡｇＩ），Ｃ：氷核活性細菌（Xanthomonas campestris），Ｄ：フロログルシノール（Phloroglucinol）)及び超純水（MilliQ Water）に対する０．１％ポリフェノール類の過冷却促進効果を示す。
【図１０】各種氷核物質（Ａ：氷核活性細菌（Erwinia ananas），Ｂ：ヨウ化銀（ＡｇＩ），Ｃ：氷核活性細菌（Xanthomonas campestris），Ｄ：フロログルシノール（Phloroglucinol）)及び超純水（MilliQ Water）に対する０．１％茶カテキンの過冷却促進効果を示す。
【図１１】各種氷核物質（Ａ：氷核活性細菌（Erwinia ananas），Ｂ：ヨウ化銀（ＡｇＩ），Ｃ：氷核活性細菌（Xanthomonas campestris），Ｄ：フロログルシノール（Phloroglucinol）)及び超純水（MilliQ Water）に対する０．１％カテキン類の過冷却促進効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係るタンニンからなる過冷却促進剤は、樹木などのすべての生物体に含まれるので、この生物体や生物由来の物質から抽出してもよいし、また化学合成してもよい。対象樹木としては、過冷却促進物質が多量に含有されている寒冷地に成育する樹木が適している。このような樹木は、針葉樹として、例えば、カラマツ、ニオイヒバ、イチイ、スギ、ウラジロモミ、トドマツ、エゾマツ、アカエゾマツ、キタゴヨウ、ストローブマツ、アカマツ、クロマツなど、広葉樹としてシラカンバ、ヤマナラシ、クリ、ナナカマド、バクウンボク、ミズナラ、ハルニレ、カツラなどが挙げられる。量の多少を問わなければ、寒冷地以外の地域に育成する樹木も利用可能である。これら樹木の過冷却促進物質は、生細胞（柔細胞）内にあるものと考えられるが、細胞外に存在している可能性もある。これら物質は安定であり、生木のみならず、枯死木や長期貯蔵された木材からも抽出することができる。タンニンは、これら樹種の辺材、心材を含む木部のみならず、樹皮、冬芽、葉などや他の植物体からも抽出される。
【００１４】
他の植物体からタンニンまたはこれを含む植物抽出物を得るための原料としては、これらを含む植物の成熟または未成熟果実、果皮、種子、葉、茎、葉柄、枝、根、花の全体または部分が用いられる。これらの原料から得られる抽出物には、植物体自体の乾燥物、粉砕物、植物体自体を圧搾抽出して得られる搾汁、粗抽出物、精製物などが含まれる。タンニンを含む植物及び植物加工品の具体例としては、茶、柿、ミモザ、ケブラチョ、ガンビア、ケイヒ、緑茶、紅茶、ウーロン茶、柿渋、中国産五倍子、トルコ産没食子、タラ、アレポ、ミロボラン、スマック、ゲンノショウコ、ブドウ種子、松樹皮、ソバ、ライチ、ワイン、キマメ茶、ドングリ、クリ、リンゴ未熟果実、カカオ、ブルーベリー等が挙げられるが、タンニンを含むものである限り上記以外の植物も使用できる。
【００１５】
抽出物の調製方法は特に限定されない。樹木や他の植物体からのタンニンの分離、精製に用いる通常の手段を採用することができる。通常の手段としては、例えば、樹木の木部組織の小片化、凍結、粉砕、抽出、分離、濃縮、乾燥や、植物体の抽出、濃縮、ろ過、分液、分別沈殿、結晶化、乾燥、真空乾燥、凍結乾燥、あるいは必要に応じて採用される、任意の粗抽出物の水可溶部や有機溶剤可溶部の分配または吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、親水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどがある。これらの慣用手段から選ばれる方法で目的の抽出物を分画した画分を得ることができる。例えば、タンニンを含む樹木や他の植物体の粉砕物を水あるいは有機溶剤またはそれらの混合溶剤で抽出後、抽出物をさらに有機溶剤を用いて前記各種クロマトグラフィーにより分画を行ってもよい。得られた画分はタンニンを含有し、これに濃縮、精製、滅菌、乾燥等の必要な処理を施して使用に供する。用いる有機溶剤としては、酢酸エチル、メタノール、エタノール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、クロロホルム、ジクロロメタン等が挙げられる。抽出は、通常室温または１００℃以下の加熱下で行う。抽出液はそのまま濃縮、乾燥してもよいが、さらに上清を分離回収してからこれを濃縮、乾燥してもよい。このようにして、樹木や他の植物体の抽出物としてタンニンを得ることができる。樹木や他の植物及び植物加工品に含まれるタンニンを過冷却促進剤として用いる場合、タンニンは必ずしも精製されたものを用いる必要はなく、タンニンを含む抽出画分を用いてもよい。
【００１６】
タンニンは植物界に広く分布するポリフェノールの一種であり、生薬からの天然抽出物であるタンニンは、古くから漢方薬として下痢止め等、また、皮のなめしや金属イオン沈澱剤として用いられてきた。そして、一般にタンニンは、加水分解型タンニンと縮合型タンニンに大分類され、さらに前者はガロタンニン、エラジタンニン、後者は単純縮合型タンニン、複合縮合型タンニンに小分類される。ガロタンニンは、酸などにより多価フェノール酸と糖などの多価アルコールに加水分解されて主に没食子酸などの多価フェノール酸を与え、エラジタンニンは没食子酸２量体などの多価フェノールを与える。
【００１７】
本発明に係る加水分解型タンニンの典型例としては、炭素原子数６の糖の１つ以上の水酸基が、下記（１）〜（６）：
【化３】
0006035371.tif 000004
（式中、ｎは０または１である。）
で示される構造から選択される置換ベンゾイル基とエステル結合した部分構造を有する糖エステル型の加水分解型タンニンがある。
【００１８】
炭素原子数６の糖の例としては、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース等のケトヘキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース等のアルドヘキソース、フコース、フクロース、ラムノース等のデオキシ糖等のヘキソースが挙げられる。これらの加水分解型タンニンの代表的な例として、一般式（Ｉａ）
【化４】
0006035371.tif 000005
で示されるフラノース、及び一般式（Ｉｂ）
【化５】
0006035371.tif 000006
で示されるグルコース由来の１つ以上の水酸基が前記式（１）〜（６）で示される構造から選択される任意の置換ベンゾイル基とエステル結合した部分構造を有する糖エステル型の加水分解性タンニンが挙げられる。
加水分解型タンニンの好ましい具体例としては、カスタラギン、ゲラニイン、ゲラニイン酸類、クリガリン、サングイインＨ−１０、β-グルコガリン、アセリタンニン、オイゲニイン、コリラギン、トリガロイルリボフラノース、トリガロイルグルコース、トリガロイルハマメロース、トリガロイルグルコース、テトラガロイルグルコース、ペンタガロイルグルコース、オクタガロイルグルコースなどのガロイル化単糖が挙げられる。
【００１９】
ガロタンニンには、ガロイルグルコースのガロイル基がデプシド結合によってさらにガロイル基に結合したジガロイルグルコースが含まれ、その例としてタンニン酸がある。タンニン酸は、五倍子、没食子、芍薬、タラなどから得られ、局方品（五倍子タンニン）等が市販されている。エラジタンニンの例としては、フウロソウ科ゲンノショウコに含まれるゲラニイン、シクンシ科カシに含まれるケブリン酸、ミズキ科サンシュユに含まれるコルヌシインＡ、バラ科リュウガソウ（竜牙草）に含まれるアグリモニイン等が挙げられる。
【００２０】
縮合型タンニンとしてカテキン型タンニンがある。カテキン型タンニンには、一般式（II）
【化６】
0006035371.tif 000007
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、各々独立して水素原子または水酸基を表し、Ｒ4は水素原子またはガロイル（galloyl）基を表す。）で示されるフラバン−３−オール骨格を部分構造として含む化合物が含まれる。
【００２１】
一般式（II）で示されるフラバン−３−オール骨格を部分構造として含むカテキン型タンニンは、それがカテキン分子を示すときは４位と８位の置換基が各々水素原子で置換されており、それがポリカテキンを示すときは４位と８位で縮合している。その具体例としては、茶カテキン、カテキンガレート、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、ガロカテキンガレート等のカテキン分子、及びオリゴノール、フラバンジェノール、ラタンイン、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジン Ｂ−１、プロシアニジン−Ｂ−２，Ｃ−１、シンナムタンニン Ｂ１，Ｄ１、プロアントシアニジン類、テアフラビン類、テアシネンシン類、テアルビジン類等のポリカテキンが挙げられる。
【００２２】
ガロタンニンやエラジタンニンの酸加水分解によって得られる没食子酸（Gallic acid：ＧＡ）及びそのメチルエステル（Methyl gallate：ＭＧ）やエラジ酸（Ellagic acid：ＥＡ）、コーヒー豆から単離されるクロロゲン酸（Chlorogenic acid：ＣｈＡ）やコーヒー酸（Caffeic acid：ＣａＡ）などのポリフェノール分子にも過冷却活性が認められる。例えば、氷核物質ＡｇＩに対し、ＧＡは−１．２℃、ＭＧは−３．３℃、ＥＡは−０．３℃、ＣｈＡは−０．６℃、ＣａＡは−１．９℃の過冷却活性を示す。
【００２３】
加水分解型タンニンは、由来する原料によってガロイルグルコース１モル当りのペンタガロイル基の数を示すガロイル化度が異なり、さらに分子量にも差がある。原料の具体例としては、五倍子（例えば中国産五倍子）、没食子（例えばトルコ産没食子）、タラ、アレポ、ミロボラン、スマック等を好ましく利用することができる。
【００２４】
縮合型タンニンは、複数分子のカテキンが通常その４位と８位で炭素−炭素結合することにより縮合している。縮合型タンニンの原料としては、茶、柿、ミモザ、ケブラチョ、ガンビア、ケイヒ、ブドウ種子、松樹皮、ライチ等を好ましく利用することができる。さらに、高分子タンニンの場合、それらを原料として低分子量に調整したオリゴマーも利用できる。
【００２５】
本発明に係るタンニンからなる過冷却促進物質は、従来用いられているエチレングリコールなどの不凍液が濃度依存のモル凝固点降下によるのに対し、凝固点降下によらず低濃度で氷核形成を阻害する。すなわち、本発明に係る過冷却促進剤は、一般に１容積％以下または１質量％以下の低濃度で水に添加することにより、添加濃度に依存した凝固点降下を遥かに越える過冷却活性を示す。塩、糖、糖アルコールなどの一般的な物質では、凝固点降下温度の２倍程度の過冷却活性の増進を示すが、本発明に係る過冷却促進物質は１０倍以上、時には１００倍以上の過冷却活性を示す。また、従来の不凍蛋白質などは氷核が形成されて作られた氷晶の成長を阻害するものであり、氷核形成そのものを阻害するものではない。これに対し本発明に係る過冷却促進物質は氷核形成そのものを阻害する。
【００２６】
一般的に水の凍結には、氷核形成物質として氷核形成細菌及びその残渣が関与していると考えられている。本発明では氷核形成物質として有機生物由来の２種類のバクテリア（氷核活性細菌（Erwinia ananas及びXanthomonas campestris））の死菌体及び無生物由来の２種類の物質（ヨウ化銀（ＡｇＩ）及びフロログルシノール（Phloroglucinol））を用いてタンニンの過冷却活性を測定し評価した。
【００２７】
本発明のタンニンからなる過冷却促進剤は、氷核形成物質との相互作用において氷核形成物質に対し−０．１〜−６．８℃の過冷却活性を示し、超純水（MilliQ Water）に対し−０．３〜−４．５℃の過冷却活性を示す。特に、タンニン酸、オリゴノール（Oligonol）、ＬＦＰ（ライチ果実由来ポリフェノール）、ＥＧＣＧ（エピガロカテキンガレート）及びＥＣＧ（エピカテキンガレート）は、氷核物質及び純水の全てに対して良好な過冷却活性を示し、過冷却促進剤として実用的に優れている。水の凍結は水中の様々な異物が氷核となって起こる。これらの異物は非常に多種多様である。さらに、実用的には、同定できない様々な氷核形成物質が含まれる普通の水（純水含む）に対する過冷却活性を持つことも必要である。タンニン酸、オリゴノール（Oligonol；ライチフルーツ由来低分子化ポリフェノールの商品名，（株）アミノアップ化学製）、ＬＦＰ、ＥＧＣＧ、ＧＣＧ及びＥＣＧから選ばれるいずれのタンニンも水を過冷却させることができ、過冷却させる水の種類により過冷却活性が異なるフラボノイド配糖体より優れている。さらにタンニンを添加した水は気泡が多量に発生するような水をも−１０℃で数日間過冷却させる。
【００２８】
また、本発明に係るタンニンの超純水に対する過冷却促進効果は、フラボノイド配糖体よりも優れている。すなわち、タンニン酸は超純水（MilliQ Water）に対して−３．７℃の過冷却活性を示し、オリゴノール（Oligonol）、ＥＧＣＧ及びＥＣＧは超純水（MilliQ Water）に対して−３．２〜−４．５℃の優れた過冷却活性を示すのに対し、フラボノイド配糖体ではほとんど過冷却活性が認められない。従って、タンニンは純水の過冷却においてフラボノイド配糖体よりも有効であり、大容量の水（石油備蓄設備での消火用水など）を凍らせないでおくことが過冷却促進剤として使用できる。タンニンは、フラボノイド配糖体に比べて遙かに安価で大量調製が可能であり、フラボノイド配糖体に比べ水に溶けやすいため、−１０℃で飲める多くの飲料水、薬品などが作成できる。
【００２９】
また、本発明に係る過冷却促進剤は、ＡｇＩに対して−２．６〜−６．８℃の優れた過冷却促進効果を有するばかりでなく、比較的高温（例えば−６〜０℃）で氷核機能を有する氷核活性細菌として知られているエルウィニア・アナナス（Erwinia ananas）（例えば、特開２０００−１０６８６８号公報参照）に対しても−０．８〜−３．５℃の良好な過冷却促進効果を有する。特に、タンニン酸（Tannic acid）、オリゴノール（01igonol）、ＬＦＰ、及び茶カテキンはエルウィニア・アナナス（Erwinia ananas）に対しても−２．２〜−２．７℃の良好な過冷却活性を示し、カテキン類のうちＥＧＣＧ及びＥＣＧはエルウィニア・アナナス（Erwinia ananas）に対しても−３．４〜−３．５℃の優れた過冷却活性を示す。
【００３０】
また、本発明に係るタンニンの過冷却活性は、以下のような他の過冷却促進物質といわれるものの過冷却活性に比べて優れている。
１）種々植物（桃など）の種子から抽出した未同定の粗抽出物は−２．６〜−８．１℃の水の過冷却活性を示す（Cap1e et al.,（1983）Cryoletters, 4, 59-64．）。しかし、この値は、氷核形成物質としては能力の低いヨウ化銀のみを用い、用いた冷却速度も１℃／ｍｉｎと本発明の過冷却促進剤の冷却速度０．２℃／ｍｉｎより遥かに速く、一時的な過冷却をし易い条件である。
２）丁子から抽出したオイゲノールとその類似物質が−０．２〜−２．５℃の水の過冷却活性を示す（Kawahara and Obata（1996）J. Antibact. Antifung. Agents, 24, 95-100.）。添加濃度は１ｍｇ／ｍＬであり、冷却速度も１℃／ｍｉｎと本発明の過冷却促進剤の冷却速度より遥かに速く、一時的な過冷却をし易い条件である。
３）ヒノキチオールとその類似物質は−０．４〜−２．１℃の水の過冷却活性を示す（Kawahara et al.,（2000）Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2651-2656.)。添加濃度は１０ｍＭであり、冷却速度も１℃／ｍｉｎと本発明の過冷却促進剤の冷却速度より遥かに速く、一時的な過冷却をし易い条件である。
４）細菌から抽出した１３０ｋＤａのキチン多糖は０〜−４．２℃の水の過冷却活性を示す（Yamashita et al.,（2002）Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 948-954）。添加濃度は５０μｇ／ｍＬであるが、用いた冷却速度は１℃／ｍｉｎと本発明の過冷却促進剤の冷却速度より遥かに速く、一時的な過冷却をし易い条件である。
５）様々な不凍蛋白質が最大−７．８℃の水の過冷却活性を示す（Duman(2002) J. Comp. Physio1., 172, 163-168.)。しかしこの最大の値が得られる添加不凍蛋白質濃度が不明であるとともに、０．５Ｍという高濃度のクエン酸を添加した時に得られた値である。不凍蛋白質のみでは−１．２℃、過冷却を促進するのみである。
【００３１】
本発明のタンニンからなる過冷却促進剤は、通常、水に０．０１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．０１〜３０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１〜１０ｇ／Ｌ、更に好ましくは０．１〜１．０ｇ／Ｌ溶解させて不凍性液体として用いることができる。この不凍性液体は、通常はこのタンニンを水に溶解させて得られるが、水の代わりに、用途に応じた添加物を含む水溶液を用いてもよい。このような添加物として、例えば、動植物細胞の培養培地の成分、生物材料の保存液の成分などが挙げられる。水溶液中の添加物の濃度は用途に応じて適宜定めればよい。
【００３２】
また、この不凍性液体は、この他の過冷却促進剤や凍害防止剤を含んでもよい。凍害防止剤を含む場合、凍害防止剤を単独または組み合わせて１〜４０容積％、好ましくは１〜２０容積％含有してもよい。凍害防止剤とは、生物材料やこれらを浸漬させた水溶液に添加することにより、凍結による傷害を軽減する物質をいう。凍害防止剤といわれる物質はいずれも、濃度依存の凝固点降下をもたらす、氷晶の形成量を軽減する、凍結材料の塩濃度の上昇を軽減する、ガラス化を容易にする、などのうち、一つあるいは複合的な効果を有する。このような凍害防止剤としては、例えば、メタノール、エタノール、アセトアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアルデヒド、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、プロリン、グルコース、ソルビトール、シュークロース、トレハロース、ポリエチレングリコール、デキストラン１０−１５０、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アルブミン、フイコール、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）などが挙げられる。
【００３３】
このような不凍性液体は、凍害防止剤を全く加えない場合、あるいは凝固点降下には殆ど影響を与えない濃度（１質量％程度以下）で凍害防止剤などの添加物を加えた場合には、長期間（１〜２週間）−１５℃付近まで液体状態を保たせることができる。この不凍性液体中に生物材料（植物や動物の細胞や組織、食用や観賞用等の魚介類、野菜などの植物そのものなど、またはその一部をいう。）を入れて冷却することにより、通常約５℃以下の低温で用いられるが、０℃以下、特に約０〜−１５℃の温度範囲で凍結を起こさずに、長期低温保存が可能になる。この不凍性液体は、過冷却により凍結開始温度が下がることにより氷晶の大きさを小さくすることができ、また単独または凍害防止剤などとの併用により、凍結乾燥により調製をする医薬品や食品などの凍結制御剤として使用できる。上記物質を含む樹木などの生物材料からの抽出物（粗抽出液等）においても同様の応用が可能である。
【００３４】
一方、上記の凍害防止剤を高濃度で含む水溶液は「ガラス化液」と呼ばれ、超低温（例えば、液体窒素温度）においても水は結晶を形成せず、ガラス体（非晶質の氷）になる（新野孝男ら編「植物超低温保存マニュアル」農業生物資源研究所発行2006年）。ガラス化液とは上記凍害防止剤を単独または幾つか組み合わせて２０〜９０容積％、好ましくは４０〜９０容積％含有し、残余が水である溶液をいう。この水として動植物培養液などの溶媒を用いてもよい。動植物の培養や保存に用いる場合には、水や動植物培養液を３０容積％以上、特に４０容積％以上混合することが好ましい。現在、最も多く用いられているガラス化液ＰＶＳ２は、３０容積％グリセリン、１５容積％エチレングリコール、１５容積％ＤＭＳＯ、０．４Ｍシュークロースを、培地溶液に加えたものである。培地溶液の種類や濃度は培養や保存する材料によって適宜変更する。本発明においては、このガラス化液に本発明の過冷却促進剤（上記タンニン）を通常０．０１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．０１〜３０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１〜１０ｇ／Ｌ、更に好ましくは０．１〜１.０ｇ／Ｌ添加する。このようなガラス体は、ガラス化液の凍結温度以下、例えば−１５℃以下、特に−６０〜−２７３℃の温度範囲、例えば液体窒素温度（７７Ｋ）で非晶質状態を保たせることができる。
【００３５】
ガラス化による凍結保存では、通常予め保存したい材料を室温あるいは０℃以上の温度で、短時間浸潰処理する。この凍結前処理により、材料中の水は高濃度のガラス化液で脱水されると共に、ガラス化液が材料内水分と置換される。このため、これら材料を液体窒素に投入すると材料内外の水は氷晶を形成せずにガラス化する。植物などの生物材料をガラス化液に入れて液体窒素に投入すると、生物材料内外の水はガラス体（非晶質の氷）になり、ガラス状態では凍結による傷害が起こらないため、生物材料を超低温のガラス化液中で凍結保存することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの例は本発明を限定することを意図するものではない。
本発明において、過冷却活性（氷核形成阻害活性ともいう。）は、以下の方法で測定した。すなわち、氷核物質を含む緩衝液に被測定物０．５ｍｇ／ｍＬを混合した溶液を用意し、温度コントロールができる銅板上に、この溶液の２μＬの液滴を多数載せ、銅板を０．２℃／ｍｉｎで冷却して凍結する液滴数を肉眼的に観察し、５０％の液滴が凍結した温度を凍結温度とし、被測定物と氷核物質を含む溶液の凍結温度と、氷核物質と緩衝液のみからなる溶液（Control）の凍結温度の差（INT50（℃））を過冷却活性とした。緩衝液は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。
【００３７】
実施例１：
北海道札幌地区に自生するカツラから枝を採集した。このカツラの枝の木部組織を鉛筆削りで小片化した後、液体窒素で凍結し、乳鉢と乳棒で可能な限り小片に粉砕した。得られた木部組織の粉砕物３．７Ｋｇをメタノール２０Ｌに２週間浸漬した。得られた抽出液を14,000Ｇで遠心分離し（Hitachi：HIMC CF15R）、上清を回収した。これを乾燥して、乾燥物９３．８ｇを３００ｍＬの水に溶かした。
この粗抽出物の水懸濁液を２０℃で14,000Ｇで遠心分離し、上清を回収した。この上清３００ｍＬと酢酸エチル６００ｍＬを混合し、分液ロートにて、水可溶部と酢酸エチル可溶部に分け乾燥した。これらの過冷却活性を前記方法で測定した。氷核物質として氷核活性細菌（Erwinia ananas）の死滅菌体（和光純薬工業（株）製）を用いた。水可溶部では−２℃程度の、酢酸エチル可溶部では−４℃程度の過冷却活性が得られた。
【００３８】
より高い過冷却活性を示した乾燥した酢酸エチル可溶画分を「ヘキサン・２−プロパノール・水」、「クロロホルム・メタノール・水」を用いて自作のシリカゲルカラムクロマトグラフィーでＡ〜Ｔの２０のフラクションに分けた。次に、Ａ〜Ｔの各画分について、過冷却活性（INT50（℃））を上記の方法で測定した。その結果を図１に示す。
【００３９】
上記で得られた画分Ｋ〜Ｓを、高速液体クロマトグラフィー（カラム：PC HILIC column(Hydrophilic Interaction Chromatography)、溶媒：アセトニトリル：水＝９：１、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、ディテクター：ＵＶ２８０ｎｍ）で分析した。結果を図２に示す。図２に示される２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−α，β−Ｄ−ハマメロース(2,3,6-tri-O-galloyl-α,β-D-hamamelose)、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース(1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose)及び１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース(1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose)を各々単離し、これらが過冷却活性を示すことを確認した。これらの３物質は既知の物質であるが、1Ｈ−ＮＭＲで構造を確認した。これらの1Ｈ−ＮＭＲチャートを図３〜５に示す。図６には、氷核形成物質としてErwinia ananasを２ｍｇ／ｍＬ用い、前記３物質を含む水の過冷却活性を、３物質を含まない対照のデータと共に示す。図６（Ａ）及び（Ｃ）には２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−α，β−Ｄ−ハマメロース及び１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースを０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ及び３ｍｇ／ｍＬを含むデータを示し、図６（Ｂ）には１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースを０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬを含むデータを示す。この結果、加水分解型タンニンの１種であるクリガリン（２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−α，β−Ｄ−ハマメロース）、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース及びガロイルグルコース（１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース）が、−４０℃まで深過冷却する木部柔細胞を持つカツラの木部からのメタノール抽出物中に同定され、各々水を約５℃過冷却させる活性を有することが確認された。なお、クリガリン（２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−α，β−Ｄ−ハマメロース）は主に画分Ｋ〜Ｎに含まれ、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースは主に画分Ｎ〜Ｏに含まれ、ガロイルグルコース（１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース）は主に画分Ｐ〜Ｑに含まれる。
【００４０】
実施例２：
Tetrahedron, 53, 10725-10732 (1997)に従って１，２，３，４，６−ペンタガロイル−α，β−Ｄ−グルコピラノース混合物（α：β＝１：３．８）を調製し、過冷却活性を前記方法で測定した。その結果を図７に示す。
【００４１】
実施例３：
氷核形成物質を加えない蒸留水、または水道水１ｍＬを試験管に入れ、−１０℃で、常に空気と混在して水中に絶えず気泡ができる振動下に置いた。これらの水は瞬時に凍結したが、これらの水に０．００１％（Ｗ／Ｗ）濃度以上で、０．１％タンニン酸（五倍子由来）、０．１％各種ポリフェノール（オリゴノール（商品名，（株）アミノアップ化学製）、ＧＳＰ（ブドウ種子由来ポリフェノール，（株）アミノアップ化学製）、ＬＦＰ（ライチ果実由来ポリフェノール，（株）アミノアップ化学製）、０．１％茶カテキン、０．１％各種カテキン類（ＥＧＣ（エピガロカテキン）、Ｃ（カテキン）、ＥＧＣＧ（エピガロカテキンガレート）、ＥＣＧ（エピカテキンガレート））を加えたところ３日間以上過冷却を続けた。
【００４２】
実施例４〜８
下記の実施例４〜８では、氷核物質として、１０ｍＭのヨウ化銀（ＡｇＩ）（ナカライ製）、２ｍｇ／ｍＬの氷核活性細菌エルウィニア・アナナス（Erwinia ananas）の死菌体（和光純薬工業（株）製）、２ｍｇ／ｍＬの氷核活性細菌キサントモナス・カムペストリス（Xanthomonas campestris）の死菌体（和光純薬工業（株）製）、及び１２０ｍＭのフロログルシノール（Phloroglucinol）（東京化成工業（株）製）を、超純水（ミリＱ水（MilliQ Water））はミリポア社製超純水装置を通したものを用いた。これら氷核物質のいずれかを含む緩衝液、及び超純水（MilliQ Water）に被測定物質（１ｍｇ／ｍＬ）を混合し、前記方法で過冷却活性を測定した。被測定物質と氷核物質を含む溶液の凍結温度と氷核物質のみからなる溶液の凍結温度の差、ならびに被測定物質を溶解した純水の凍結温度と純水のみの凍結温度の差を過冷却活性（氷核形成阻害活性）とした（図８〜１１、表１〜４参照）。
【００４３】
実施例４：
上記４種の氷核物質を上記表示濃度で用い、加水分解型タンニンとして和光純薬工業（株）から入手したヌルデの虫瘤（五倍子）由来のタンニン酸を０．１質量％の濃度で用いたときの過冷却促進効果を測定した。その結果を図８（Ａ）〜（Ｅ）に示し、表１に凍結温度（INT50（℃））及び過冷却活性（℃））を示す。前記五倍子由来のタンニン酸は、氷核物質（E. ananas、X. campestris、ＡｇＩ、Phloroglucinol）及び超純水（MilliQ Water）に対して−０．６〜−４．７℃の過冷却活性を示し、超純水に対し−１．０℃の過冷却活性を示した。
【００４４】
【表１】
0006035371.tif 000008
【００４５】
実施例５：
上記と同様４種の氷核物質（E. ananas、X. campestris、ＡｇＩ、Phloroglucinol）を上記表示濃度で添加した水、及び超純水（MilliQ Water）に、縮合型タンニンとして各種ポリフェノール類：ＧＳＰ（Grape Seed Polyphenol：ブドウ種子由来ポリフェノール，中国ライン（Layn）社製）、ＬＦＰ（Lychee Fruit Polyphenol：ライチ果実由来ポリフェノール，中国ライン（Layn）社製）、及び01igonol（オリゴノール：ライチ果実由来低分子化ポリフェノールの商品名，（株）アミノアップ化学製）を０．１質量％の濃度で添加し過冷却促進効果を測定した。その結果を図９（Ａ）〜（Ｅ）に示す。図９から、01igonol及びＬＦＰは、氷核物質及び超純水の全てに対し過冷却活性を示し、特に超純水に対して優れた過冷却促進効果を有することが判る。
表２に凍結温度（INT50（℃））及び過冷却活性（℃））を示す。
【００４６】
【表２】
0006035371.tif 000009
本発明に係るタンニン（ポリフェノール類）は４種の氷核物質に対し−０．８〜−６．２℃の過冷却活性を示し、特に、Oligonol及びＬＦＰは、各種氷核物質及び超純水に対し−０．８〜−６．２℃の過冷却活性を示し、超純水に対し−１．６〜−３．２℃の優れた過冷却活性を示した。
【００４７】
実施例６：
４種の氷核物質（E. ananas、X. campestris、ＡｇＩ、Phloroglucinol）を添加した水、及び超純水（MilliQ Water）に、カテキンとして茶カテキン（（株）原料屋ドットコムＣＣで健康補助食品として販売されているものを入手）を０．１質量％濃度で添加し過冷却促進効果を測定した結果を図１０（Ａ）〜（Ｅ）示す。図１０から、茶カテキンは、氷核物質（E. ananas、X. campestris、ＡｇＩ、Phloroglucinol）の全てに対して過冷却促進効果を有することが判る。また、表３に凍結温度（INT50（℃））及び過冷却活性（℃））を示す。
【００４８】
【表３】
0006035371.tif 000010
表３に示される通り、本発明に係るカテキン（茶カテキン）は４種の氷核物質に対し−０．７〜−６．８℃の過冷却活性を示した。
【００４９】
実施例７：
４種の氷核物質（E. ananas、X. campestris、ＡｇＩ、Phloroglucinol）を添加した水、及び超純水（MilliQ Water）に、カテキン類として、ＥＧＣ（エピガロカテキン）、Ｃ（カテキン）、ＥＣ（エピカテキン）、ＥＧＣＧ（エピガロカテキンガレート）、ＧＣＧ（ガロカテキンガレート）及びＥＣＧ（エピカテキンガレート）を０．１質量％濃度に添加し、過冷却促進効果を測定した結果を図１１（Ａ）〜（Ｅ）に示す。なお、前記カテキン類はいずれも和光純薬工業（株）から入手した。図１１から、ＥＧＣＧ及びＥＣＧは、氷核物質（E. ananas、X. campestris、ＡｇＩ、Phloroglucinol）及び超純水（MilliQ Water）の全てに対して過冷却促進効果を有し、特に超純水（MilliQ Water）に対して優れた過冷却促進効果を有していることが分かる。
また、表４に凍結温度（INT50（℃））及び過冷却活性（℃）を示す。
【００５０】
【表４】
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表４に示される通り、本発明に係るカテキン類は、４種の氷核物質に対し−０．１〜−５．７℃の過冷却活性を示し、特に、ＥＣＧ及びＥＧＣＧは、４種の氷核物質及び超純水に対し−０．４〜−５．７℃の過冷却活性を示し、超純水（MilliQ Water）に対し−３．２〜−４．５℃の優れた過冷却活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の過冷却促進剤は、溶液に添加し、不凍性液体やガラス化液として使用することが可能である。この不凍性液体中に、植物や動物の細胞や組織、食用の魚介類や野菜等の生物材料を入れて冷却することにより、０℃以下、特に０〜−１５℃の温度範囲内で凍結を起こさずに、長期低温保存が可能となる。また、過冷却飲料としての応用が可能である。例えば、魚や肉などの生鮮食品の保存、ジュースなどの食品原料の輸入（凍結しないと８０ｃａｌ／ｇのエネルギー削減となる。）などを凍結保存から過冷却保存へと転換することができる。また、臓器移植時の臓器保存液としての利用等、臓器保存への適用も可能である。大型コンピューター、車のエンジン冷却剤など、石油系に代わる冷却剤としての応用も可能である。冷凍庫着霜防止、車窓ガラス曇り防止、トンネル結露防止などの目的で材料表面を塗装して結氷を防止することもできる。植物への低温耐性の付与により氷点下温度で凍結しないで生長する植物の作出を可能とする。雲への散布により氷晶化を抑制することで降雪量を調節することもできる。そのほか、凍結制御剤として凍結保存への応用が可能である。氷蓄熱・輸送システムによる電力利用の平準化もできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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