(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの赤血球のパラメータを決定するためのデジタルホログラフィーに基づく方法であって、
前記少なくとも一つの赤血球及び電磁放射線の相互作用から生じる前記少なくとも一つの赤血球を代表する波面を含む干渉縞を構成するステップと、
前記干渉縞から前記少なくとも一つの赤血球の波面を代表する一つの波長の振幅情報及び位相情報を再構成するステップと、
前記少なくとも一つの赤血球を代表する一つの波長の位相情報及び振幅情報を組み合わせることにより、前記少なくとも一つの赤血球の平均赤血球容積及び／又は平均赤血球ヘモグロビン濃度及び／又は平均赤血球ヘモグロビンを決定するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも一つの赤血球を代表する一つの波長の位相情報及び振幅情報を組み合わせることは、前記少なくとも一つの赤血球を含む試料の屈折率を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、前記少なくとも一つの赤血球を代表する一つの波長の位相情報及び振幅情報を組み合わせることにより、前記少なくとも一つの赤血球の平均赤血球容積及び／又は平均赤血球ヘモグロビン濃度及び／又は平均赤血球ヘモグロビンの決定のための一つの画像のみを生成することにより実行される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記平均赤血球容積は、
【数１】
0006001566.tif 000018
によって、算出され、ＭＣＶは、前記平均赤血球容積であり、λは、波長であり、αは、ヘモグロビンの屈折率の増分であり、εｈは、波長λでのヘモグロビンのモル吸光係数であり、φは、前記少なくとも一つの赤血球の全位相シフトであり、Ωは、前記少なくとも一つの赤血球の全吸収であり、ｎｍは、赤血球のない周りの流体の屈折率であり、Ｎｒｂｃは、前記少なくとも一つの赤血球の総数である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記平均赤血球ヘモグロビン濃度は、
【数２】
0006001566.tif 000019
によって、算出され、ＭＣＨＣは、前記平均赤血球ヘモグロビン濃度であり、ｉは、画素であり、Ｎｐは、前記少なくとも一つの赤血球を表す画素の総数であり、αは、ヘモグロビンの屈折率の増分であり、ｎ０はヘモグロビンがない場合の赤血球の屈折率であり、ｎｍは、赤血球のない周りの流体の屈折率であり、ｃｈｉ、画素ｉにおけるヘモグロビンの濃度であり、λは、波長であり、εｈは、波長λのヘモグロビンのモル吸光係数であり、φは、前記少なくとも一つの赤血球の全位相シフトであり、ｌｉは、画素ｉにおける吸収液と非吸収性の液体の混合物からの透過光強度であり、ｌ０は、前記混合物への入射光の強度である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記平均赤血球ヘモグロビンは、
【数３】
0006001566.tif 000020
によって、算出され、ＭＣＨは、前記平均赤血球ヘモグロビンであり、ＭＣＶは、前記平均赤血球容積であり、ＭＣＨＣは、前記平均赤血球ヘモグロビン濃度である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも二つの波長から少なくとも一つの赤血球を代表する再構成された振幅情報及び／又は位相情報は、酸素飽和度を決定するために使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記酸素飽和度は、
【数４】
0006001566.tif 000021
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酸素飽和度（S）は、
【数５】
0006001566.tif 000022
請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記電磁放射線は、可視光のスペクトルの波長を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
デジタルホログラフィーにより、少なくとも一つの赤血球を含む試料を分析するための装置であって、
光の少なくとも一つの物体光線及び少なくとも一つの参照光線を生成するために配置された少なくとも一つの光源であって、前記少なくとも一つの物体光線及び前記少なくとも一つの参照光線が相互にコヒーレントである光源と、
前記試料に前記少なくとも一つの物体光線を当てるための手段と、
前記試料を通過する前記少なくとも一つの物体光線と前記少なくとも一つの参照光線を重畳させることで、干渉縞を生成するための手段と、
前記干渉縞を検出するために配置されたセンサと、
前記干渉縞から前記少なくとも一つの赤血球を代表する一つの波長の物体波面の位相情報及び／又は振幅情報を再構成し、前記位相情報及び／又は前記振幅情報から平均赤血球容積及び／又は平均赤血球ヘモグロビン濃度及び／又は平均赤血球ヘモグロビンを決定するために配置された処理部とを含む装置。
【請求項１２】
前記処理部は、赤血球の分布の決定を含む、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記処理部は、再構成された少なくとも二つの波長の少なくとも一つの赤血球を代表する位相情報及び／又は振幅情報を使用することによる酸素飽和度の決定を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも二つの波長が使用される、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記少なくとも一つの光源と、前記光線を当てるための手段と、前記重畳させるための手段と、前記センサとが前記培養器内に設置された環境室をさらに含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
前記処理部は、前記環境室外に設置され、前記装置は、前記センサから前記処理部に前記干渉縞を送信するように構成された送信器をさらに含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１７】
前記環境室内の湿度、気温及び二酸化炭素割合の少なくとも一つを制御するためのコントローラをさらに含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球に関連付けられた物理パラメータを決定するためのデジタルホログラフィーに基づく方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
診断目的のために、一般的に使用されるツールは、全血球計算値（ＣＢＣ）である。ＣＢＣは、分析に使用された細胞の３つの重要なタイプに分類できる。この分類は、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）、及び血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅｓ）である。例えば、Ｍｅａｎ  Ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  Ｖｏｌｕｍｅ（ＭＣＶ）平均赤血球体積、Ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｗｉｄｅ（ＲＤＷ）赤血球集団の変動の尺度、Ｍｅａｎ  Ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＭＣＨ）赤血球当たりのヘモグロビンの平均量、Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ（ＳＯ２）酸素によって占められた、赤血球中のヘモグロビン結合部位の割合測定、Ｍｅａｎ  Ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＣＨＣ）赤血球中のヘモグロビンの平均濃度、等の赤血球の重要な特徴を決定することによって、種々の疾患を診断することが可能である。例えば、貧血は、ＭＣＶの値が正常範囲より上か下かに基づいて、小赤血球か大赤血球かに分類される。現在のところ、これらのパラメータは、フローサイトメーター及び共焦点レーザー走査顕微鏡等の複雑で高価なシステム、又は、インピーダンスボリュームアナライザー機器等の一つのパラメータしか測定できないシステムによって測定できる。
【０００３】
ラッパらによる「デジタルホログラフィック顕微鏡、共焦点顕微鏡、及び、インピーダンスボリュームアナライザーによるヒト赤血球の比較研究」（血球計算の進歩のための国際学会誌、７３Ａ：８９５−９０３、２００８）の記事では、屈折率及び無傷の個々の赤血球の体積の測定のために、デカップリング手順との組み合わせで、デジタルホログラフィー顕微鏡技術の適用可能性を実証する技術が記載されている。さらに、デカップリング手順は、「デカップリング手順」と呼ばれる実験プロトコルが生細胞の定量的位相画像とは別に積分屈折率及び細胞の厚さを測定する目的で開示される、ラッパらによる「デジタルホログラフィック顕微鏡で生きた細胞の積分屈折率と動的セル形態計測の測定」（ＯＰＴＩＣＳ  ＥＸＰＲＥＳＳ，  Ｖｏｌ．１３，  Ｎｏ．２３，  ９３６１−９３７３，  ２００５）の記事でより詳細に説明される。
【０００４】
したがって、例えば、ＭＣＶ及び／又はＭＣＨＣ及び／又はＲＤＷ及び／又はＳＯ２及び／又はＭＣＨ等の赤血球パラメータを計算するために、溶液中に赤血球を有し、屈折率が知られなければならない二つの溶液のうち前記溶液を第二の溶液に交換することが必要である。これは、例えば、赤血球を汚染することなしに、実行するには、かなりの実験室のスキルが必要となる面倒で時間のかかるアプローチである。さらに、溶液交換のプロセスは、ユーザ関与（ｕｓｅｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）による測定における事故のリスクを増大させる付加的な工程である。溶液を交換したときのさらなる欠点は、第一溶液の試料に存在する全ての赤血球が第一溶液を取り除き第二溶液に交換後に存在しないという事実であり、試料の損失又は汚染を意味する。この溶液交換プロセス中の赤血球の減少は、最初の測定を行う前に赤血球を観察容器に沈殿及び付着させる必要があることに起因する。もし赤血球が正常に付着していない場合は、赤血球は、第一溶液に結合せずに第一溶液とともに洗い流され、及び／又は新しい位置に移動し観察容器に付着する。これは、アーチファクト（ａｒｔｉｆａｃｔｓ）を導入することにより、結果的に赤血球の再構成された波面の質に影響を与える。さらに、液体の交換及び存在は、赤血球の形態及び／又は好ましい振る舞いに不要な方法で影響を与えるかもしれない。観測容器は、溶液を希釈及び／又は混合することにより、屈折率が想定される既知の要素の代わりに、解明できない要素になることによって、測定の品質を落とさないように、一度のみ使用されなければならない。さらに、ナノメートル（ｎｍ）の範囲内の精度で使い捨ての消耗品として、特定の高さの観察容器を製造することは、非常に難しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、前記パラメータを決定する改良された方法は、有利であり、かつ、特に、簡単かつ迅速で、より信頼性の高い方法が望まれている。
【０００６】
したがって、本発明は、上述の短所の単独又は短所の任意の組み合わせの一つ以上を緩和、軽減又は排除することを目的とする。特に、溶液を交換及び／又は溶液の存在なしに、赤血球の平均赤血球容積、赤血球分布幅、平均赤血球ヘモグロビン、酸素飽和度、及び平均赤血球ヘモグロビン濃度を決定することを本発明の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第一の態様によれば、さらなる目的は、前記少なくとも一つの赤血球及び電磁放射線の相互作用から生じる前記少なくとも一つの赤血球を代表する波面を含む干渉縞を構成するステップと、前記干渉縞から前記少なくとも一つの赤血球の波面を代表する振幅情報及び位相情報を再構成するステップと、少なくとも一つの赤血球を代表する位相情報及び振幅情報を組み合わせることにより、少なくとも一つの赤血球の平均赤血球容積及び／又は平均赤血球ヘモグロビン濃度及び／又は酸素飽和度及び／又は平均赤血球ヘモグロビンを決定するステップとを含み、少なくとも一つの赤血球のパラメータを決定するためのデジタルホログラフィーに基づく方法によって、解決される。
【０００８】
「デジタルホログラフィック顕微鏡、共焦点顕微鏡、及び、インピーダンスボリュームアナライザーによるヒト赤血球の比較研究」の記事で、開示された方法の振幅情報は、本発明に係る方法に関係ない又は使用されていない。ラッパらの記事の提案方法は、異なる試料の液体が使用されるときに撮影された、二つの異なる画像を使用すること、かつ、平均赤血球容積及び平均赤血球ヘモグロビンを決定できる、これらの画像の違いを使用することに関連する。本発明は、しかしながら、例えば、異なる細胞液を使用せずに、振幅情報が一つの画像のみからパラメータを決定するための基礎を築く位相情報と組み合わされて使用される方法に関する。この本発明のさらなる利点は、以下に記載されている。
【０００９】
本発明に係る方法により、酸素飽和度は、二つ以上の波長で再構成された振幅情報及び/又は位相情報を用いて決定される。
【００１０】
本発明に係る方法は、溶液の交換又は／溶液の存在なしに、赤血球の平均赤血球容積、赤血球分布幅、平均赤血球ヘモグロビン、酸素飽和度、及び平均赤血球ヘモグロビン濃度の決定を可能にする。これは、ラッパらの方法にはない事例である。さらに、ユーザに必要な実験のスキルは、溶液交換のプロセス及びユーザの失敗による試料の汚染の危険を取り除くことによって、劇的に少なくなる。溶液交換が不要になると、本発明に係る方法が前記パラメータを決定するために、干渉縞の検出、及び、前記少なくとも一つの赤血球を代表する振幅情報及び位相情報の再構築のみを必要とするので、前記パラメータを決定するための時間が減少する。本発明に係る方法は、非常に早い割合で、現象を調査でき、その割合は、干渉縞を検出するデジタル検出器の取得率で主に決定される。
【００１１】
本発明によると、振幅情報及び位相情報の両方が使用される。一つの画像からそれぞれの画素の厚さ及び屈折率を直接的に決定できる可能性がある。屈折率は、ヘモグロビンのみに依存するから、本発明によると、赤血球の平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン濃度、酸素飽和度又は平均赤血球ヘモグロビン等の所望のパラメータを決定できる可能性がある。したがって、本発明の一つの実施形態によると、前記少なくとも一つの赤血球を代表する位相情報及び振幅情報の組み合わせは、少なくとも一つの赤血球を含む試料の屈折率を決定することを含む。もう一つの実施形態によると、方法は、前記パラメータの決定のための一つの画像のみの生成によって実行される。これは、以下にさらに説明される。
【００１２】
さらに、本発明に係る方法は、以前の観察容器の必要性、及び、前記観察容器に付着する赤血球の必要性をなくす。さらに溶液交換時の観察容器から赤血球の可能な動き、又は洗い落とされた赤血球により発生するアーチファクトは、たった一つの検出要件のおかげで、本発明に係る方法では、取り除かれる。明確に定義された高さの観察容器及び既知の屈折率の溶液の必要性は、本発明の振幅情報と位相情報の使用のおかげで、なくなる。方法は、さらに、少なくとも一つの赤血球とともに流動性を促進する能力のおかげで、少なくとも一つの赤血球に生体内のような環境を維持させる。
【００１３】
第二の態様によれば、デジタルホログラフィーに基づく少なくとも一つの赤血球を含む試料を分析するための装置は、実現される。この装置は、光の少なくとも一つの物体光線（ｏｂｊｅｃｔ  ｂｅａｍ）及び少なくとも一つの参照光線（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｅａｍ）が相互にコヒーレントである、前記少なくとも一つの物体光線及び少なくとも一つの参照光線を生成するために配置された少なくとも一つの光源と、前記試料に前記少なくとも一つの物体光線を当てるための手段と、前記試料を通過する前記少なくとも一つの物体光線と前記少なくとも一つの参照光線を重畳させることで、干渉縞を生成するための手段と、前記干渉縞を検出するために配置されたセンサと、前記少なくとも一つの赤血球を代表する前記干渉縞から物体波面の位相情報及び／又は振幅情報を再構成し、前記位相情報及び／又は前記振幅情報から平均赤血球容積及び／又は平均赤血球ヘモグロビン濃度及び／又は酸素飽和度及び／又は平均赤血球ヘモグロビンを決定するために配置された処理部とを含む。
【００１４】
第一の態様の特徴及び効果は、第二の態様に通常、適用される。さらに、この発明の特徴及び効果は、以下により詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明に係る方法のフローチャートを示す。
【図２】透明な生物学的物体の通過前後の物体光線の波面の概略図を示す。
【図３】本発明に係る方法の赤血球モデルの実施の形態及び概念図を示す。
【図４】本発明の実施形態による装置の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図１のフローチャートで示すように、少なくとも一つの赤血球のパラメータを決定するためのデジタルホログラフィーに基づく方法は、実現され、前記方法は、前記少なくとも一つの赤血球及び電磁放射線の相互作用から生じる前記少なくとも一つの赤血球を代表する波面を含む干渉縞を構成するステップと、前記干渉縞から前記少なくとも一つの赤血球の波面を代表する振幅情報及び位相情報を再構成するステップと、少なくとも一つの赤血球を代表する位相情報及び振幅情報を組み合わせることにより、少なくとも一つの赤血球の平均赤血球容積及び／又は平均赤血球ヘモグロビン濃度及び／又は酸素飽和度及び／又は平均赤血球ヘモグロビンを決定するステップとを含む。
【００１７】
本発明に係る方法の特定の一実施形態によれば、電磁放射線は、可視光のスペクトルの波長を有する。本発明に係る方法の他の実施形態では、例えば、赤外線及び／又はＸ線及び／又は紫外線スペクトル等の電磁放射線を使用してもよい。電磁放射線は、少なくとも一つの波長を放射することが可能な発生源によって生成される。光のスペクトルの放射線を発生する電磁放射線発生源は、例えば、ダイオード又はヘリウムネオンレーザー等のレーザー光源の任意の種類であってもよい。ダイオードレーザーが使用されることが好ましい。
【００１８】
本発明に係る方法の一実施形態において、互いにコヒーレントな少なくとも一つの物体光線及び少なくとも一つの参照光線は、例えば、光線スプリッターによって、コヒーレント光源から発する光の光線を二つの光線に分割することによって作成される。物体光線及び参照光線は、同じ周波数を有し、時間経過の間、一定の位相関係を示すことを意味し、互いにコヒーレントである。
【００１９】
物体光線は、電磁放射線の放射線に、観察容器、及び、前記観察容器に含まれる及び／又は前記観察容器上の少なくとも一つの赤血球を通過させるように構成された、観察容器に含まれる及び／又は前記観察容器上の少なくとも一つの赤血球を通過する。観察容器は、電磁放射線に、放射線の影響がない、又は、最小限の影響で、若しくは、既知の放射妨害効果で観察容器を通過させることが好ましい。観測容器はさらに、例えば、形態学的変化及び／又は屈折率変化等の少なくとも一つの赤血球の所望の物理的特性を強調できる培地を含んでもよい。観察容器は、例えば、サプリメントあり又はなしのＲＰＭＩ  １６４０等のリン酸緩衝生理食塩水及び／又はトリス緩衝食塩水及び／又はハンクの緩衝生理食塩溶液及び／又は、細胞増殖培地等の溶液とともに、生及び／又は死及び／又は増大及び／又は縮小等の所望の状態の少なくとも一つの赤血球を維持する培地をさらに含んでいてもよい。
【００２０】
参照光線は、参照光線が物体光線と異なる、例えば、ミラー又は光ファイバを用いた光路に沿って導かれるので、観察容器に含まれる及び／又は観察容器上の少なくとも一つの赤血球により影響を受けないままにされる。
【００２１】
図２に示すように、物体光線５０は、観察容器５８に含まれる及び／又は観察容器上の少なくとも一つの赤血球５５を通過する前に、既知の波面５１を有する。物体光線５０は、少なくとも一つの赤血球５５を通過するときに、少なくとも一つの赤血球５５は、物体光線５０の強度の少なくとも一部を吸収する。物体光線５０は、少なくとも一つの赤血球５５を通過するため、周囲に比べて光路長差が変化する。既知の物体光線の波面５１と少なくとも一つの赤血球５５との間の相互作用から出現する物体波面５２は、位相がシフトされ、その振幅は、少なくとも一つの赤血球５５からの吸収の影響を受ける。同様に、参照光線（図示せず）はまた、少なくとも一つの赤血球に影響されない既知の波面を有する。光路は、屈折率と物理的／幾何学的厚さの乗算として定義される。吸収は、波動伝播から他のタイプのエネルギーの赤血球による、変換された電磁放射エネルギーとして定義される。
【００２２】
本発明に係る方法の一実施形態では、観察容器に含まれる及び／又は観察容器上の少なくとも一つの赤血球を通過する少なくとも一つの物体光線と少なくとも一つの参照光線の重畳は、例えば、他の光線スプリッターを用いて二つの光線を一緒にすることによって、達成される。少なくとも一つの赤血球と電磁放射線との相互作用、重畳は、干渉縞を生じさせ、これは、少なくとも一つの赤血球を代表する物体波面に関する情報を含む。
【００２３】
本発明に係る方法の一実施形態では、干渉縞が、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）又は相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）等のデジタルセンサにより検出される。検出された干渉縞は、ホログラムと呼ばれる。
【００２４】
少なくとも一つの赤血球を通過した少なくとも一つの物体光線と少なくとも一つの参照光線を重畳し、干渉縞を生成すること、及び、例えば、フラウンホーファー、フーリエ又はフレネルの設定等の干渉縞を検出することは、使用されてもよい。フレネルの設定を使用することが好ましい。前記三つの設定の違いは、光学的配置が前記少なくとも１つの赤血球を代表する波面の再構成の近似を可能にする一定の条件内にある。再構成された波面の近似を可能にする、フレネル設定で満たすべき条件は、センサ及び少なくとも一つの赤血球との間の距離が少なくとも一つの赤血球のサイズ及びセンサのサイズと比較して大きいことである。これは、少なくとも一つの赤血球からの散乱光を集光して略平行光でデジタルセンサに導く顕微鏡対物レンズを使用することによって達成され、光学的配置、少なくとも一つの赤血球とデジタルセンサとの間の距離は、少なくとも一つの赤血球のサイズ及びセンサのサイズと比較して、大きい。
【００２５】
検出された干渉縞から物体波面の振幅情報及び位相情報が再構成される。再構成は、例えば、フーリエ変換再構成及び／又はフレネル変換再構成及び／又は角度スペクトラム再構成及び／又はコンボリューション再構成及び／又はウェーブレット再構成等の任意の一般的な数値再構成手段によって行われる。少なくとも一つの赤血球の再構成された、典型的な振幅情報及び位相情報は、例えば、少なくとも一つの赤血球情報の二次元及び／又は三次元表現の画像及び／又はマップとして各ドメイン、位相、又は振幅に表されてもよい。再構成された情報を画像として表現されることが好ましい。
【００２６】
再構成された情報は、少なくとも一つの赤血球についての、例えば、平均赤血球容積、赤血球分布幅、平均赤血球ヘモグロビン、酸素飽和度及び、平均赤血球ヘモグロビン濃度等のパラメータを決定するためにコンピュータによって実行された画像処理でさらに使用される。複数の取得された画像は、調査された少なくとも一つの赤血球についてのさらなる有益な情報を決定するために、画像処理でさらに使用されてもよい。前記複数の画像は、異なる時点で取得され、それ以降の画像処理又は再構成のために格納されてもよく、本発明に係る方法が時間に依存しないことを意味する。このような画像処理は、少なくとも一つの赤血球が配置されたセグメンテーションアルゴリズムを含んでもよい。これらの配置された少なくとも１つの赤血球を幅、形状等の形態に関してさらに分析できる。使用されてもよいセグメンテーションアルゴリズムは、流域セグメンテーション及び／又は勾配分析であり、しかしながら、画像内の少なくとも一つの赤血球を検出及び／又は概説するためのアルゴリズムの任意のタイプを使用してもよい。流域セグメンテーションが使用されることが好ましい。
【００２７】
別の方法として、例えば、一つの光線の生成及び使用が使用されているインラインのディジタルホログラフィー等のデジタルホログラフィー設定の参照光線及び他のタイプの一つの物体光線を生成することは、干渉縞の生成のために、使用されてもよい。当業者が本明細書を調査したとき、例えば、インラインのデジタルホログラフィーにおいて本発明を使用するために、本発明の方法をいかに修正するかということは、明らかである。
【００２８】
例えば、平均赤血球容積及び／又は、赤血球分布幅、及び／又は、平均赤血球ヘモグロビン、及び／又は、酸素飽和度、及び／又は、平均赤血球ヘモグロビン濃度赤血球等のパラメータを決定するとき、赤血球は、無視できる程度の厚さの透明な細胞膜に含まれている、ヘモグロビン、塩及び他の有機化合物の均質な水溶液を主に含むものとして光学的視点から一般的にモデル化される。水及びヘモグロビン分子は赤血球容積の９５％以上を占める。したがって、例えば、フローサイトメーター、位相差顕微鏡法、及びデジタルホログラフィー等の前方散乱光を使用する技術に対して、赤血球は、体積Ｖ及び複素屈折率ｎｃ＝ｎｒ−ｎｉによって特徴づけできる。赤血球の内部はほぼ完全に水及びヘモグロビンによって占有されるので、赤血球から赤血球に対する屈折率ｎｃの変化は、単にヘモグロビン濃度の変化に起因し得る。
【００２９】
上述したモデルを適用することにより、ミー散乱理論は適用可能であり、電磁放射線と少なくとも一つの赤血球との相互作用から、発生した干渉縞に含まれる物体波面は、デジタルセンサで検出できる。これは、少なくとも一つの赤血球を代表する前記物体波面を再構成するとき、赤血球に関連する前記パラメータを決定する可能性をもたらす。一般的に使用される赤血球のモデル及びミー散乱理論の使用の問題点は、再構成された波面が二つの未知パラメータ、体積Ｖ及び複素屈折率ＮＣ及び追加の既知のパラメータに依存することであり、一つの再構成された波面は、当たり前でない方法で合わされた未知の二つのパラメータを含むことを意味する。
【００３０】
図３に、本発明に係る方法の概念的概略が示されている。それは、簡略化のため、一つの赤血球との関連で説明される。本発明に係る方法は、一つの赤血球に限定されないが、少なくとも一つの赤血球であることが好ましい。波面４０は、物体光線が少なくとも一つの赤血球４５を通過する前に、図２（５１，５５）に示したように、既知である。既知の波面４１、物体波面の少なくとも一部が少なくとも一つの赤血球４５を通過した後、それは、少なくとも一つの赤血球４５，ｎｍ・ｌを通過しない波面４０の少なくとも一部と比較して、その光路ｎｅｒｙ・ｌの差が原因で、位相シフト（φ）される。物体波面４１は、既知の波面４０，ｌと比較して、少なくとも一つの赤血球からの吸収ｌ０によっても影響される。
【００３１】
以下、本発明のために関心のあるパラメータを決定するための一つの可能なルートについて説明する。
【００３２】
本発明の方法に係る実施形態では、赤血球の屈折率は次のようにモデル化される。
【数１】
0006001566.tif 000002
ｎ０はヘモグロビンがない場合の赤血球の屈折率であり、αは特定の波長におけるヘモグロビンの屈折率の増分であり、Ｃｈは、ヘモグロビン濃度である。吸収液と非吸収性の液体の混合物の電磁放射線透過（Ａ）が吸収液の濃度（Ｃ）と電磁放射線が吸収液を移動した距離（ｌ）とに比例するというランベルトベールの法則は、さらに以下のように記述される。
【数２】
0006001566.tif 000003
εは、吸収液のモル吸光係数であり、ｌは、前記混合物からの透過光強度であり、ｌ０は、前記混合物への入射光の強度である。
【００３３】
ヘモグロビン濃度は赤血球内で一定であり、及び／又は、少なくとも一つの赤血球を代表する波面からなる干渉縞のデジタルセンサによる検出の間、少なくとも定数であり、かつ、吸収はヘモグロビンによってのみ引き起こされると仮定すると、干渉縞に含まれる赤血球を代表する波面に含まれ、デジタルセンサによって検出され、例えば、振幅画像として表現された振幅情報に再構成された赤血球の全吸収（Ω）は、以下のように記述される。
【数３】
0006001566.tif 000004
Npは、前記再構成された振幅画像における前記赤血球を表す画素の総数であり、εｈは、波長λにおけるヘモグロビンのモル吸光係数であり、Ｃｈは、へモグロビン濃度であり、ｌｉは、画素ｉにおける赤血球の厚さ（ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）である。
【００３４】
【数４】
0006001566.tif 000005
【００３５】
式（１）を使用することにより、干渉縞に含まれ、デジタルセンサによって検出され、位相画像として表現される位相情報に再構成された、画素ｉの相対位相シフト（φｉ）は、以下の式で表される。
【数５】
0006001566.tif 000006
ｎｍは、画素ｉの赤血球のない周りの流体の屈折率である。
【００３６】
【数６】
0006001566.tif 000007
【００３７】
式（３）によるヘモグロビンの全吸収、及び、式（５）による全位相シフトを使用することによって、少なくとも一つの赤血球の全位相シフトは、代わりに以下のように記載される。
【数７】
0006001566.tif 000008
項を置き換えることによって、少なくとも一つの赤血球の容積は、以下のように表される。
【数８】
0006001566.tif 000009
位相シフト及び少なくとも一つの赤血球の吸収の組み合わせである本発明による上記方法で、平均赤血球容積、ＭＣＶは、
【数９】
0006001566.tif 000010
により、算出でき、Nrbcは、赤血球の総数である。
【００３８】
さらに、画素の位相シフトは、式（２）と（５）の組み合わせで以下のように表せる。
【数１０】
0006001566.tif 000011
画素の厚さについて、これを解くと、
【数１１】
0006001566.tif 000012
になる。これを式（２）に再挿入し、画素のヘモグロビンの濃度について解くと、
【数１２】
0006001566.tif 000013
になる。
【００３９】
平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）は、以下のように計算される。
【数１３】
0006001566.tif 000014
Npは、赤血球の画素の総数である。
【００４０】
さらに、式（３）及び（４）の全吸収並びに式（６）の赤血球の容積の定義の使用によって、赤血球の酸素飽和度は、以下のように表される。
【数１４】
0006001566.tif 000015
λｉは、等吸収の波長である。これは、酸素飽和度が二つの波長の振幅情報及び／又は位相情報、すなわち等吸収波長及び非等吸収波長を再構成することによって、算出できることを示唆する。
【００４１】
【数１５】
0006001566.tif 000016
【００４２】
さらに、又は、代わりに、平均赤血球ヘモグロビン、ＭＣＨは、
【数１６】
0006001566.tif 000017
によって算出される。
【００４３】
さらに、又は、代わりに、赤血球分布幅、ＲＤＷは、赤血球の幅を決定し、赤血球幅の変化を決定するために、再構成される振幅画像及び／又は位相画像に適用される、共通のエッジ検出アルゴリズムによって決定できる。
【００４４】
本発明に関連して、例えば、ＭＣＨ及び／又はＭＣＨＣを決定するために上記に説明されたルートは、本発明に係る一つの実施例を構成することに注目すべきである。本発明に係る興味のあるパラメータを取得するために実行することが可能な代替導出が存在する。例えば、ＭＣＨＣは、各赤血球の平均濃度を最初に計算することによって取得され、次に、取得された平均濃度の全ての平均値を使用してもよい。また、これは、本発明に係る可能な実施例の一つであるが、他のルート、導出及び／又は式は、本発明に関して使用されてもよい。
【００４５】
本発明の一実施形態に係る装置について図４を参照して説明する。図４は、試料１０を分析するための装置１００の概略図である。装置１００は、少なくとも一つの光源３００、センサ５００、光線スプリッター７ａ、７ｂは、図９ａ、９ｂの反射面、及び処理部１３を含む。９ａ及び９ｂの反射面とともに光線スプリッター７ａ、７ｂは、少なくとも一つの物体光線２１を試料に当てるための装置として、及び、少なくとも一つの物体光線２１と少なくとも一つの参照光線２３とを重畳するための装置として作動する。
【００４６】
光源３００は、コヒーレント光の少なくとも一つの光線１９を生成するように構成される。コヒーレント光の光線１９は、６３５ｎｍの波長の光を除外したダイオードレーザーのようなどのレーザー源から生じたレーザー光線であってもよい。ここに、一つの光源だけが図示された。一般的には、しかしながら、装置１００は、同時に使用されてもよい複数の光源３００を含んでもよい。もし、複数の光源３００が使用されると、これらの光源は、異なる波長の光を生成することが好ましい。これは、試料１０が異なる波長の光に異なって反応するから、有利である。したがって、試料に関するより多くの情報は、異なる波長を持つ複数の光源３００を使用することによって取得されてもよい。光源３００から生じるコヒーレント光である光線１９は、光線スプリッター９ａに直接導かれる。光線スプリッター７ａは、コヒーレント光の少なくとも一つの光線１９を少なくとも一つの物体光線２１及び少なくとも一つの参照光線２３に分割する。
【００４７】
この構成で、少なくとも一つの物体光線２１及び少なくとも一つの参照光線２３は、相互にコヒーレントな関係になり、それらが同じ周波数を持ち、時間経過中に普遍の位相関係を示す。一つより多い光源３００がある場合、光線スプリッター７ａは、光源３００から生じるそれぞれの光線１９を相互にコヒーレントな物体光線２１及び参照光線２３に分割してもよい。装置１００が使用されるとき、少なくとも一つの赤血球１１を含む試料１０は、少なくとも一つの物体光線２１の光路に配置される。例えば、反射面９ａは、試料１０に少なくとも一つの物体光線２１を当てるように少なくとも一つの物体光線２１の進路を曲げるために使用されてもよい。
【００４８】
物体光線２１は、試料１０の内部に進入するときに、物体光線２１は、試料１０、特に、少なくとも一つの赤血球１１を通過する。物体光線２１は、試料１０を通過するから、例えば、屈折率及び吸収の差が原因で、試料を通過しない参照光線２３等の光線と比べて、光路及び強度に差がある。これは、物体光線２１と参照光線２３との間の位相シフト及び振幅の差をもたらす結果となる。光路長は、屈折率と物理的／幾何学的厚さとの乗算として定義され、吸収は、波動伝搬から他のタイプのエネルギーに変換された電磁放射線エネルギーとして定義される。反射面９ｂは、反射することにより、少なくとも一つの参照光線２３の進路を曲げるように配置されてもよい。特に、反射面９ａ及び９ｂは、少なくとも一つの物体光線２１及び少なくとも一つの参照光線２３が、ここでは光線スプリッター７ｂの形である重畳するための装置に導かれるように配置されてもよい。
【００４９】
光線スプリッター７ｂは、少なくとも一つの物体光線２１及び少なくとも一つの参照光線２３を重畳させ、重畳させた光線２５をセンサ５００へ導く。センサ５００は、物体光線２１及び参照光線２３から生じる干渉縞を検出するように配置される。物体光線２１及び参照光線２３は、相互にコヒーレントであるから、これらは、センサ５００で干渉縞を生成する。特に、少なくとも一つの物体光線２１及び少なくとも一つの参照光線２３は、異なる光路長を移動し、異なる強度を持つから、試料１０を少なくとも一つの物体光線２１が通過することが原因で、干渉縞は、物体光線２１と参照光線２３との間の位相シフトと強度を示す。
【００５０】
センサ５００は、例えば、ＣＣＤ（電荷結合素子）又はＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）画像センサのようなデジタルセンサでもよい。センサ５００は、再構成処理を実行するためのソフトウエア及び／又はハードウエアを含んでよい処理部１３にさらに動作可能に接続されてもよい。再構成処理は、センサ５００で検出された干渉縞から位相情報及び／又は振幅情報を再構成してもよい。再構成された情報は、例えば、調査された、少なくとも一つの赤血球１１の少なくとも一つの画像を取得するために使用されてもよい。特に、処理部１３は、位相及び／又は振幅情報からＭＣＨ、ＭＣＶ、ＳＯ２、ＭＣＨＣ及びＲＤＷのようなパラメータを決定するために構成される。言い換えれば、処理部１３は、本発明の実施形態による方法の任意のデータ処理ステップを実行するように構成されてもよい。
【００５１】
さらに、装置１００は、記憶媒体又はメモリ（図示せず）を含んでもよい。記憶媒体又はメモリは、処理ユニット１３に動作可能に接続されてもよい。特に、記憶媒体又はメモリは、分析画像、及び、分析画像内で検出された変化の時点に関する時間データを格納するように構成されてもよい。装置１００は、環境室１５内で動作するように構成されてもよい。このような配置で、試料１０は、分析されるために維持される環境室から試料を取り出す必要がない。図４に図示されるように、光源３００、センサ５００、及び、光線スプリッター７ａ及び７ｂ、反射面９ａ及び９ｂ等の光学的構成要素は、環境室１５の中に含まれる。
【００５２】
処理部１３は、環境室１５内又は環境室１５外に配置されてもよい。処理部が環境室１５の外に配置されている場合、処理部は、センサ５００とワイヤレスで通信することが好ましい。例えば、装置は、処理部１３に動作可能に接続された受信器へセンサ５００から干渉縞に関連する情報を送信するように配置された送信器（図示せず）を含んでもよい。送信器は、信号を送信するのと同じように処理部１３からの信号を受信するように配置される送受信器の一部を構成してもよい。代わりに、装置１００は、環境室１５を含んでもよい。この場合、環境室１５は、装置１００と一体化して構成されることが好ましい。このような配置は、非常にコンパクトで柔軟なソリューションを提供する。例えば、一体化して構成された環境室を含む装置１００は、作業机の上に置いても、必要であれば、別の場所に便利に移動してもよい。有利なことに、装置１００が一体的に形成された環境室１５を有することにより、装置の全ての構成要素は、環境室内に配置されなければならないわけではない。例えば、環境室内の状態に敏感である、光線スプリッター７ａ及び７ｂ及び反射面９ａ及び９ｂ等の複数の光学的構成要素は、環境室の外に配置されてもよい。
【００５３】
一実施形態では、試料１０を保持する唯一の試料ホルダは、環境室１５の内側に配置される。装置１００は、環境室１５内の湿度、温度及び二酸化炭素の割合の少なくとも一方を制御する制御部（図示せず）をさらに含んでもよい。この方法で、少なくとも一つの赤血球のための最適な条件を達成されてもよい。赤血球は、特定の厳密に調整されたパラメータが必要である。まず、培地は７．４ｐＨを維持する必要がある。培地は、ほとんどの場合、炭酸で中和されているので、例えば、ＨＥＰＥＳ等の有機バッファが代わりに使用することもできるが、これは、５％−１０％の二酸化炭素を空気中に供給することによって、ほとんどの場合、達成される。培地の蒸発を妨げるために、空気は、水飽和すべきである。例えば、湿度は、約９０％−９５％又は９０％−９５％より上でもよい。赤血球は、例えば、３７℃に維持されることが好ましいが、これは、細胞の種類に依存する。例えば、ほとんどの哺乳類の細胞は、３７℃を好み、昆虫の細胞は、２０℃を好む一方で、鳥の細胞は、４０−４２℃を好む。さらに、異なる戦略は、装置１００及び、特に、例えば光線スプリッター７ａ及び７ｂ及び反射面９ａ及び９ｂ等の装置１００の光学的な構成要素が環境室１５内の状態に対応するために使用されてもよい。
【００５４】
一つの戦略によれば、装置１００は、培養器内の温度が室温と基本的に等しい間、環境室１５内に配置される。それから、環境室内の気温は、低い割合で増加する。この方法で、装置１００の光学的構成要素における結露は、光学的構成要素及び環境室１５の内部の空気の間には温度差がないから、回避されてもよい。他の戦略によると、光線スプリッター７ａ及び７ｂ及び反射面９ａ及び９ｂ等の光学的構成要素は、環境室１５内の状態に耐えられるように配置され、及び／又は取り扱われてもよい。特に、光学的構成要素は、結露をさせるように取り扱われてもよい。この方法で、装置１００は、環境室１５内の気温が室温と基本的に等しくないとき、環境室１５内に配置されてもよい。したがって、気温を増加させる上記手順は、避けてもよい。
【００５５】
本発明は特定の実施例に関連して説明してきたが、それは本明細書に記載された特定の形態に限定されるものではない。むしろ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。請求項において、用語「含む」は、他の要素又はステップの存在を排除するものではない。個々の特徴が異なる請求項に含まれてもよいが、さらに、特徴の組み合わせが実現可能及び／又は有利ではないことを意味するものではない。また、単数形の参照は複数を排除するものではない。したがって、「第一」、「第二」等への言及は複数を排除するものではない。
【図１】
0006001566.tif 000023
【図２】
0006001566.tif 000024
【図３】
0006001566.tif 000025
【図４】
0006001566.tif 000026