(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）マトリックスナノスフェアであって、前記マトリックスナノスフェアがマトリックスを含んでなるものであり、前記マトリックスが、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むものである、マトリックスナノスフェア；および
（ｂ）コア−シェル小胞性ナノカプセルであって、前記コア−シェル小胞性ナノカプセルがコアおよびシェルを含んでなるものであり、前記シェルが、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むものである、コア−シェル小胞性ナノカプセル
からなる群から選択される、ナノ粒子。
【請求項２】
（Ｃ１−Ｃ４）アルキルが、エチル、イソプロピルまたはｎ−ブチルである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記ナノ粒子の平均粒径が、５０〜３００ｎｍ、好ましくは１００〜２００ｎｍ、より好ましくは１２０〜１６０ｎｍ、さらにより好ましくは約１３０〜１４０ｎｍである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４】
対象生成物をさらに含んでなる、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項５】
少なくとも１つの請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子と、担体とを含んでなる組成物。
【請求項６】
前記担体が、農業、化粧品、食品または医薬品で許容される担体である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ナノ粒子が対象生成物を含んでなる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記対象生成物が、除草剤、殺虫剤、抗真菌剤、老化防止製品、抗ニキビ製品、フェイシャルケア製品、着色化粧品、化粧品、パーソナルケア製品、サンスクリーン／サンケア用製品、歯磨き用製品、練り歯磨き粉、またはリンス、シャンプー用製品、香水、毛髪用製品、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシンまたはビタミンＢ３、パントテン酸またはビタミンＢ５、チアミンモノホスフェート、チアミンピロホスフェート、チアミントリホスフェート、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋファミリーおよびこれらの誘導体、リン脂質、カロチノイド、脂肪酸、ω−３脂肪酸、アミノ酸、フィトスタノール、フィトステロール、ポリフェノール、鎮痛薬、抗脱毛剤、抗狭心症剤、抗細菌剤、抗鬱剤、抗真菌剤、抗高血圧剤、抗炎症剤、抗新生物剤、解熱剤、抗精神病剤、抗不安剤、気管支拡張剤、グルココルチコイド、免疫抑制剤、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
（ａ）下記からなる群から選択される成分：
ｉ．少なくとも１つの請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子；および
ｉｉ．ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルと対象生成物とを媒体中に含有してなる溶液または懸濁物であって、前記媒体が、水混和性の揮発性アルコールと水系媒体とを含み、水系媒体の量が、ナノ粒子を形成するのに必要な水系媒体の量より少ない量である、溶液または懸濁物；と、
（ｂ）担体とを含んでなる組成物であって、
前記対象生成物が、アセチルサリチル酸、アルファ−心房性ナトリウム利尿ペプチド、アルギニンバソプレシン、アトロピン、オーグメロセン、アトルバスタチン、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）、カルシトニン、絨毛性ゴナドトロピン、コルチコトロピン、デスモプレシン、エピバチジン、エルビタックス（登録商標）（セツキシマブ）、エクセナチド、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、ヒュミラ（登録商標）（アダリムマブ）、ヒューマリン（登録商標）、ケトコナゾール、ランレオチド、ルトロピンアルファ、メトプロロール、ミノキシジル、ネシリチド、オクトレオチド、パクリタキセル、パラセタモール、ペガプタニブ、組み換え卵胞刺激ホルモン、組み換え成長因子、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）、リツキサン（登録商標）（リツキシマブ）、セルモレリン、ソマトトロピン、タキサン誘導体、タキソール、酢酸テリパラチド、サイロトロピン、トリクロサン、ウロフォリトロピン、ゾーレア（登録商標）（オマリズマブ）、アクチノマイシンＤ、アルベンダゾール、アルドステロン、アルプラゾラム、アミオダロン、アミトリプチリン、アンプレナビル、アシマドリン、アトルバスタチン、ブニトロロール、ブスピロン、カンプトセシン、カルバマゼピン、カルベジロール、セリプロロール、シクロスポリンＡ、シメチジン、クロトリマゾール、コルヒチン、コルチゾン、ダウノルビシン、デブリソキン、デキサメタゾン、ジアゼパム、ジギトキシン、ジゴキシン、ジルチアゼム、ドセタキセル、ドンペリドン、ドキソルビシン、エファビレンツ、エピルビシン、エリスロマイシン、エルゴタミン、エストラジオール、エストラジオールグルクロニド、エルロチニブ、エトポシド、フェニトイン、フェンタニル、フェロジピン、フェノチアジン、フェキソフェナジン、フルオロキノロン、フルオロウラシル、ＦＫ−５０６、ゲンタマイシン、グリセオフルビン、ヒドロコルチゾン、イマチニブ、インジナビル、イトラコナゾール、イベルメクチン、ケトコナゾール、ケンペロール、レポフロキサシン、リドカイン、ロペラミド、ロサルタン、ロバスタチン、メベンダゾル、メチルプレドニゾロン、メトトレキサート、ミベフラジル、ミダゾラム、ニソルジピン、モルヒネ、ネルフィナビル、ニカルジピン、ニトレンジピン、ニフェジピン、オンダンセトロン、パクリタキセル、ペンタゾシン、プラジカンテル、プレドニゾロン、プレドニゾン、ケルセチン、キニジン、ラニチジン、ラパマイシン、リファブチン、リファンピシン、リトナビル、サキナビル、シロリムス、スルファメチゾール、タクロリムス、タモキシフェン、タリノロール、テニポシド、テルフェナジン、テトラサイクリン、トポテカン、トリアムシノロン、バルスポダール、ベラパミル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ゾピクロン、およびこれらの混合物からなる群から選択されるものである、組成物。
【請求項１０】
前記組成物が乾燥粉末の形態である、請求項５〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記担体が、頬、歯、鼻、目、口、非経口、直腸、局所または膣経路によって投与するための医薬的に許容される賦形剤、または局所経路によって投与するための美容的に許容される賦形剤を含んでなる、請求項５に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む食料品。
【請求項１３】
前記対象生成物が、脱毛の治療に用いられるミノキシジルである、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記対象生成物が、頬感染の治療に用いられるトリクロサンまたはケトコナゾールである、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記対象生成物が、脱毛を治療するための医薬の製造におけるミノキシジルである、請求項４に記載のナノ粒子の使用。
【請求項１６】
前記対象生成物は、頬感染を治療するための医薬の製造におけるトリクロサンまたはケトコナゾールである、請求項４に記載のナノ粒子の使用。
【請求項１７】
ミノキシジルを保持する請求項４に記載のナノ粒子を少なくとも含んでなることを特徴とする、被検体の脱毛を治療するための組成物。
【請求項１８】
トリクロサンまたはケトコナゾールを保持する請求項４に記載のナノ粒子を少なくとも含んでなることを特徴とする、被検体の頬感染を治療するための組成物。
【請求項１９】
マトリックスを含んでなるマトリックスナノスフェアを製造する方法であって、前記マトリックスが、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含んでなるものであり、前記方法が、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含有する有機溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させて、前記マトリックスナノスフェアを形成する工程を少なくとも含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項２０】
対象生成物を含んでなるマトリックスナノスフェアを製造する方法であって、前記マトリックスナノスフェアがマトリックスを含んでなるものであり、前記マトリックスが、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含んでなるものであり、前記方法が、
（ａ）前記対象生成物および前記ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系または含水アルコール溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させる工程；またはこれに代えて、
（ｂ）前記対象生成物および前記ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系の溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させる工程；またはこれに代えて、
（ｃ）前記対象生成物および前記ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む有機溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させる工程であって、前記有機溶液または懸濁物が不揮発性水混和性溶媒を含むものである、工程を少なくとも含んでなることを特徴とする方法。
【請求項２１】
対象生成物を含んでなるコア−シェル小胞性ナノカプセルを製造する方法であって、前記コア−シェル小胞性ナノカプセルがコアおよびシェルを含んでなるものであり、前記シェルが、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含んでなるものであり、前記方法が、前記対象生成物および前記ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む溶液または懸濁物と、水系溶媒とを接触させる工程を少なくとも含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項２２】
ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルおよび水混和性アルコールを含有してなる含水アルコール溶液または懸濁物中の溶媒を除去することによりナノ粒子を製造する方法であって、水の量が、ナノ粒子を形成するのに必要な水の量より少ない量であることを特徴とする、方法。
【請求項２３】
目的生成物をさらに含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルと、水混和性アルコールと、目的生成物とを含有してなる含水アルコール溶液または懸濁物中の溶媒を除去することにより皮膚表面でナノ粒子を製造するインサイチュ方法であって、水の量が、ナノ粒子を形成するのに必要な水の量より少ない量であることを特徴とする、方法。
【請求項２５】
前記目的生成物が化粧品である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘膜への生体接着能が高く、水系媒体中での長期間安定性が高いポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフエスエル由来のナノ粒子を含む生体適合性ナノ粒子送達系に関する。このナノ粒子は、農業、化粧品、食品および医薬品に、対象生成物を効率よく組み込むことができる。さらに、本発明は、このナノ粒子の製造方法、ならびにその使用および応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体接着性ポリマー系ナノ粒子またはミクロ粒子は、治療用分子を含む多くの化合物を送達するための有望な粒子系であると考えられてきた。これらの系の生体接着特性は、粘膜表面との強力な相互作用および長期間接触を生じる可能性を与え、薬物吸収の大幅な増加と、患者のコンプライアンスの向上をもたらす。様々な研究および調査で、頬、鼻、目、口、直腸および膣経路のための有益な適用性が報告されており、生体接着性製剤を用いるときにｉｎ  ｖｉｖｏで何が達成可能であるのかという例が提示されている。
【０００３】
頬用の生体接着性ミクロ粒子およびナノ粒子は、粘膜への局所的な薬物放出を達成することができる。口腔内での、歯痛、細菌感染および真菌感染、アフタ性潰瘍、扁平苔癬、炎症および歯科学的な口内炎の治療が報告されている。非常に多くの研究で、フェンタニル、デンブフィリン、硫酸亜鉛、クロルヘキシジンおよびテオフィリンのような薬物を制御放出するための頬送達系の使用が報告されている。例えば、キトサン、ヒアルロン酸および他のポリマーのような生体接着性ポリマーに由来する経鼻粘膜接着性ミクロスフェアは、デスモプレシンを含む薬物のバイオアベイラビリティを高める［１−３］。同様に、これらの系は、カルシトニンのような生物活性分子の経口バイオアベイラビリティを高める。さらに、生体接着性ミクロ担体およびナノ担体は、眼科の多くの薬物を局所的に適用するために応用されており、その局所での薬物放出を延長することができ、異物の感覚または視覚のぼやけを生じさせなかった。粘膜接着性のナノ粒子またはミクロ粒子は、さらに、皮膚送達目的を含む局所送達戦略に応用されるか、または毛包への局所的な送達戦略にも応用されてきた。粘膜接着性ミクロ粒子を調製する新しい手法は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓの治療において、硝酸エコナゾールのための革新的な膣送達系であると考えられてきた。生体接着性のミクロ粒子およびナノ粒子の分野での最も興味深い研究領域のひとつは、血清中の抗体応答の誘発、および局所的な末梢での粘膜分泌を促進するための粘膜ワクチンおよび免疫療法に注目するものである。このような手法を用いる大きな利点としては、投与が容易であること、および全身および粘膜での免疫生成が挙げられる。
【０００４】
生体接着性粒子系を得るために応用されることが記載されている多くの生体接着性ポリマーとしては、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、セルロース誘導体およびアルギン酸ナトリウムが挙げられる。アクリル酸の様々なコポリマー、例えば、アクリル酸／ポリエチレングリコールモノメチルエーテルコポリマーおよびアクリル酸−２  エチルヘキシルアクリレートコポリマーも研究されている。ＰＡＡ、キトサンおよびその誘導体、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ＰＶＡ、ゼラチン、カラギナン、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＮａＣＭＣ）およびヒアルロン酸は、頬粘膜と相互作用することがわかっている。
【０００５】
他の有望な生体接着性ポリマーは、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）という商標でＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＩＳＰ）によって市販されているポリマー、すなわち、ポリメチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーであり、口腔送達戦略、頬への接着戦略、経皮送達系および他の化粧品用途、例えば、ヘアスタイリング製品のための接着剤、バインダー、固定剤、粘膜接着剤として適用されてきた。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）コポリマーとしては、以下のものが挙げられる。
−Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮコポリマー、無水物形態であり、容易に加水分解し、水溶性遊離酸（Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）Ｓ）の透明溶液を生成することができる水不溶性白色粉末として供給される。
−Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）Ｓコポリマー、遊離酸形態であり、溶液または粉末の形態で供給される。
−Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＭＳコポリマー、ナトリウム／カルシウムＰＶＭ／ＭＡコポリマーの混合塩であり、粉末として供給され、水中でゆっくりと加水分解させることができる。
−Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳコポリマー、種々のアルキル鎖長および分子量のＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフエステル形態、すなわち、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５（モノエチルエステル）、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５（モノブチルエステル）およびＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ３３５Ｉ（イソプロピルエステル）であり、これらのコポリマーは、水不溶性であるが、水溶液中で塩基によって中和すると水溶性であり、アルコール溶液として供給される。
【０００６】
【化１】
0006001640.tif 000002
【０００７】
合成ＰＶＭ／ＭＡコポリマーは、非常に多様な用途を有している。具体例として、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮコポリマーは、増粘剤および凝集剤、歯科用接着剤、口腔タブレットの賦形剤、経皮パッチの賦形剤などに広く用いられている。それに加え、薬物を制御放出させるための、そして、マトリックス形態で、眼内で薬物を局所放出させるためのこれらのコポリマーの使用、更には薬物送達目的または粘膜ワクチンのための生体接着性のミクロ粒子またはナノ粒子の製作におけるこれらのコポリマーの使用が報告されている［４−５］。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）Ｓコポリマーは、主に、抗菌剤の送達を延長するための口腔衛生製品のための接着性ポリマーとして練り歯磨きおよびマウスウォッシュで使用されている。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＭＳコポリマーは、義歯接着剤、造瘻接着剤および粘膜用途のための局所用担体に使用されており、局所的な口腔送達目的のためのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＭＳコポリマーに由来するミクロ粒子およびナノ粒子が報告されている。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳコポリマーは、腸溶性膜コーティング剤および造瘻接着剤に使用されており、平均直径が１００〜１５０μｍのケトロラクトロメタミンを含有するＰＶＭ／ＭＡコポリマーのｎ−ヘキシルハーフエステルに由来するミクロ粒子が報告されている［６］が、このミクロ粒子は、通常はｉｎ  ｖｉｔｒｏで４〜５日間で分解してしまうため、最終的な用途は限定されている。
【０００８】
ミクロ粒子系またはナノ粒子系を得るために、多くの調査にＰＶＭ／ＭＡコポリマーが使用されている。
【０００９】
Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮコポリマーに由来するナノ系は、主に、溶媒置換法によって得られる。これに関し、含水アルコール相を含むアセトン中でＰＶＭ／ＭＡコポリマーを脱溶媒した後、架橋剤（例えば、ポリアミンまたはタンパク質）を用いて形成されたナノ粒子の架橋が報告されている。これらのナノ系の水系媒体での安定性は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮコポリマーが水溶性のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）Ｓコポリマーに加水分解するため、非常に短い。水系媒体中で、このナノ粒子は非常にすばやく溶解することができる。水系媒体中でのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ系の安定化には、架橋する薬剤（架橋剤）、例えば、ポリアミン化合物、例えば、スペルミジンまたはスペルミン（しかし、このカップリング反応には、特定の条件下で少なくとも２０時間が必要である）、ジアミン化合物、例えば、毒性のある１，３−ジアミノプロパン（ＤＰ）、または免疫原性分子、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いたＰＶＭ／ＭＡコポリマーの化学修飾および官能基化が必要である。ＤＰのみの添加では、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中でのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の安定性の向上は弱い［７］。架橋しているＰＶＭ／ＭＡナノ粒子の他の欠点としては、ナノ粒子の粒径が顕著に大きくなること、およびナノ系の生体接着能が著しく下げることが挙げられる。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の生体接着能を高めるために、このナノ粒子を水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって修飾することができる。しかし、この手法は、例えば、ヒドロキシル含有化合物を用いて無水マレイン酸コポリマーを修飾し、エステル誘導体を作成するには高温および激しい酸性条件が必要であり、親水性ＰＥＧ（低ＯＨ含有）を使用すると、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮコポリマーがより水に溶けやすい誘導体に変換される可能性があるため、得られるナノ粒子の水系媒体での安定性が低下することがあるといったいくつかの欠点を伴って行われる。
【００１０】
さらに、ポリマーの有機相（Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮのアセトン溶液）に水溶性薬物を組み込むというＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の能力に関連して、問題点がいくつか報告されている。知られているように、水溶性薬物は、アセトンには不溶性であり、含水アルコール溶液を加え、ナノ系の形態でＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮを沈殿させると、大きな結晶を形成し、ナノ粒子の形成を妨害することがある。この理由のために、水溶性薬物である５−フルオロウリジン（ＦＵＲＤ）を既に形成しておいたナノ粒子と単にインキュベートすることによって、この薬物がＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子に保持され、その結果、非常に低いカプセル化効率が得られた（約１３％）［８］。
【００１１】
Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子が水不溶性分子または水難溶性分子を組み込む能力に関し、この種の分子のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子への組み込みを高めるために、シクロデキストリン（ＣＤ）のような錯化剤、または、例えば、ＰＥＧおよびアミノ酸（例えば、グリシン）のような可溶化剤を使用することが必要である。実際に、錯化剤または可溶化剤を用いない場合、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子に組み込まれていない遊離薬物は、減圧下、有機溶媒を蒸発させた後に得られる最終的なナノ粒子水性懸濁物中に大きな結晶として析出するであろう。したがって、共溶媒を用いないと、水難溶性分子のカプセル化効率はきわめて低い。共溶媒であるＰＥＧおよびアミノ酸を用いると、水難溶性化合物（例えば、パクリタキセル）のカプセル化効率は高くなるが、ナノ粒子製造方法の収率が著しく下がる。
【００１２】
二重乳化技術によって調製されるＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＭＳミクロスフェアは、水不溶性分子のカプセル化効率が低いことが示されていた（トリクロサンの場合、おおよそ３０％）。それに加え、トリクロサンの迅速な放出が達成され（ＰＢＳ中、１時間以内に約１００％）、このことは、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＭＳミクロ系の低い安定性、迅速な薬物放出、および／またはミクロ系の分解を示していた［９］。さらに、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＭＳ由来の粒子系は、等張性リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中での迅速な膨潤化（半膨潤時間がおおよそ１０分）およびブタ食道粘膜での短い保持時間を示していた［１０］。
【００１３】
一方、ナノ粒子製造の非常に重要な態様は、工業的な製造の複雑性とスケールアップ法である。薬物を送達するためのナノ粒子を調製するために、毒性のある有機溶媒（例えば、ジクロロメタン、酢酸エチル、クロロホルム、アセトンなど）およびホモジナイザーのような特殊な複雑な装置の使用を含む乳化技術または溶媒蒸発技術など多くの技術が開発されてきた。高品質の製品を開発し、薬物濃度およびポリマー濃度、処理操作、粒径、薬物安定性または捕捉効率を含む製造工程のための合理的な手法を提供するために、方法の実現可能性、製剤の最適化、方法の最適化、スケールアップおよびバリデーションを含む所定の工程が必要であるため、大規模製造でのこの技術の実施にはまだ課題がある。
【００１４】
ＰＶＭ／ＭＡコポリマーの使用に基づく対象生成物の送達のための非常に多くのナノ粒子系が知られているが、未解決であり、かつ用途を限定する欠点がいくつか存在する。
【００１５】
したがって、ＰＶＭ／ＭＡコポリマー由来のナノ粒子系に関連する上述の欠点、例えば、水系媒体での長期間安定性が低いこと、水系媒体での安定性を高めるために架橋剤を使用すること、親水性化合物のカプセル化効率が低いこと、疎水性化合物をカプセル化する効率を高めるために共溶媒または錯化剤を使用すること、毒性のある有機溶媒または複雑な技術の使用を必要とする、費用が高く、複雑な製造方法をすべてまたは一部解決することができる、対象生成物を送達するためのナノ粒子系をさらに開発することが必要である。有利なことに、対象生成物を送達するためのさらなるナノ粒子系は、粘膜への生体接着能が高いことに加え、水系媒体中での長期安定性が高く、油および親水性または疎水性の低分子化合物または高分子化合物を含む対象生成物のカプセル化効率が高くあるべきであり、および／または、より簡便で環境に優しい方法によって製造されるべきである。これらの目的は、本発明により提供されるナノ粒子によって達成することができる。
【発明の概要】
【００１６】
驚くべきことに、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含有するエタノールまたはポリオール（例えば、プロピレングリコール）のような医薬的または美容的に許容される溶媒と、水系媒体とを、場合により賦形剤の存在下で混合することにより、非常に均質で粒径の小さい（約１３０ｎｍ）、さらに収率の高い（約９８％）ナノ粒子が自発的に形成され得ることが見出された。この方法によって、ナノ系を得るために通常適用される、さらなる有機溶媒（例えば、アセトン、ジクロロメタンまたは酢酸エチル）、共溶媒（例えば、ＣＤまたはＰＥＧ）または界面活性剤を必要とすることなく、親水性の大きな分子および小さな分子（ＢＳＡおよびＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ）ならびに疎水性の大きな分子および小さな分子分子（ケトコナゾール、ミノキシジルおよびトリクロサン）の双方のカプセル化効率が高いナノ粒子を得ることができる。それに加え、このナノ粒子製造方法によって、対象生成物（ＰＯＩ）を含有するコポリマーを体液と混合することにより、体液内でｉｎ  ｓｉｔｕで自己組織化ナノ粒子（ＳＡＮＰ）を形成することもでき、結果として、ＰＯＩを保持するナノ粒子を、体液（水系媒体）と接触させてｉｎ  ｓｉｔｕで自発的に形成することができる。
【００１７】
ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するナノ粒子の製造方法が簡便であることにより、特殊な装置を使用することなく、これらのナノ系を得ることが簡便であるために、工業的規模の費用が低減される。さらに、アセトンを溶媒として用いず、化学架橋および乾燥工程を用いないことは、他のＰＶＭ／ＭＡナノ粒子（例えば、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ由来のナノ粒子）と比較して、これらの系を製造するのに有利で重要な工程である。
【００１８】
ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来して得られるナノ粒子は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ由来のナノ粒子よりも高い長期安定性（分解速度が小さい）を示し、水系媒体中の種々の条件で３ヶ月平均粒径の変化がない。これにより、毒性のある架橋剤、凍結乾燥または他の乾燥技術を用いる必要がなく、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するナノ粒子の水系懸濁物の直接的な商業化が可能になる。それに加え、これらのナノ粒子を、化粧品業界および医薬品業界で広く用いられている溶液、懸濁物、ゲルおよび半固体または固体のような多くの投与形態に容易に組み込むことができる。
【００１９】
さらに、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するナノ粒子は、ブタの頬および舌の粘膜モデル表面に対し、他のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮコポリマーに由来するナノ粒子で観察されるよりも高い、対象生成物の制御放出を効果的に高めることを保証する接着親和性を示した。
【００２０】
驚くべきことに、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルと、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するナノ粒子は、水難溶性化合物の共溶媒効果を有し、これらの研究で使用する疎水性薬物（ケトコナゾール、ミノキシジルまたはトリクロサン）のカプセル化効率を高める。したがって、このＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するナノ粒子は、共溶媒または錯化剤の使用を必要とすることなく、親水性分子および特に疎水性分子双方をカプセル化する高い効率を保証する。
【００２１】
要約すると、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するナノ粒子は、とりわけ、以下の特性を示す。（ｉ）粘膜表面に対する高い接着親和性；（ｉｉ）水系媒体および含水アルコール系媒体双方での高い長期安定性（分解速度）；（ｉｉｉ）共溶媒または錯化剤を必要とすることなく、親水性分子および特に疎水性分子をカプセル化する高い有効性、（ｉｖ）例えば、液体、固体または半固体、例えば、懸濁物、ゲルなど多くの投与形態に組み込まれる高い利便性。それに加え、有利なことに、このナノ粒子は、毒性のある有機溶媒または複雑な技術を使用することなく、小規模および大規模で容易に製造することができる。上述の特性はすべて、農業、食品などの分野、特に、化粧品および医薬品の分野など種々の分野で、とりわけ、毛髪、皮膚などを含む様々な表面に対する制御放出送達系として、またはとりわけ、頬、鼻、口、直腸、膣の経路による投与に対する制御放出送達系として、上のナノ粒子を使用するのに有利に働く。
【００２２】
したがって、本発明の目的は、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するナノ粒子の製造および使用である。
【００２３】
したがって、一つの態様では、本発明は、下記からなる群から選択されるナノ粒子に関する：
（ａ）マトリックスナノスフェア（ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ、ナノ粒子）であって、前記マトリックスナノスフェアがマトリックスを含んでなるものであり、前記マトリックスが、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むものである、マトリックスナノスフェア；および
（ｂ）コア−シェル小胞性ナノカプセルであって、前記コア−シェル小胞性ナノカプセルがコアおよびシェルを含んでなるものであり、前記シェルが、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むものである、コア−シェル小胞性ナノカプセル。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明によって提供される前記ナノ粒子は、対象生成物、例えば、農業、化粧品、食品または医薬品の業界におけるでの対象生成物をさらに含む。
【００２５】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの本発明によって提供されるナノ粒子と、担体とを含む組成物に関する。特定の実施形態では、組成物は、頬、歯、鼻、目、口、非経口、直腸、局所、または膣経路による投与に適した化粧品組成物または医薬組成物である。
【００２６】
別の態様では、本発明は、
（ａ）下記からなる群から選択される成分：
ｉ．少なくとも１つの本発明のナノ粒子；および
ｉｉ．ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルと対象生成物とを媒体中に含有してなる溶液または懸濁物であって、前記媒体が、水混和性の揮発性アルコールと水系媒体とを含み、水系媒体の量が、ナノ粒子を形成するのに必要な水系媒体の量より少ない量である、溶液または懸濁物；と、
（ｂ）担体とを含んでなる組成物であって、
前記対象生成物が、アセチルサリチル酸、アルファ−心房性ナトリウム利尿ペプチド、アルギニンバソプレシン、アトロピン、オーグメロセン、アトルバスタチン、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）、カルシトニン、絨毛性ゴナドトロピン、コルチコトロピン、デスモプレシン、エピバチジン、エルビタックス（登録商標）（セツキシマブ）、エクセナチド、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、ヒュミラ（登録商標）（アダリムマブ）、ヒューマリン（登録商標）、ケトコナゾール、ランレオチド、ルトロピンアルファ、メトプロロール、ミノキシジル、ネシリチド、オクトレオチド、パクリタキセル、パラセタモール、ペガプタニブ、組み換え卵胞刺激ホルモン、組み換え成長因子、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）、リツキサン（登録商標）（リツキシマブ）、セルモレリン、ソマトトロピン、タキサン誘導体、タキソール、酢酸テリパラチド、サイロトロピン、トリクロサン、ウロフォリトロピン、ゾーレア（登録商標）（オマリズマブ）、アクチノマイシンＤ、アルベンダゾール、アルドステロン、アルプラゾラム、アミオダロン、アミトリプチリン、アンプレナビル、アシマドリン、アトルバスタチン、ブニトロロール、ブスピロン、カンプトセシン、カルバマゼピン、カルベジロール、セリプロロール、シクロスポリンＡ、シメチジン、クロトリマゾール、コルヒチン、コルチゾン、ダウノルビシン、デブリソキン、デキサメタゾン、ジアゼパム、ジギトキシン、ジゴキシン、ジルチアゼム、ドセタキセル、ドンペリドン、ドキソルビシン、エファビレンツ、エピルビシン、エリスロマイシン、エルゴタミン、エストラジオール、エストラジオールグルクロニド、エルロチニブ、エトポシド、フェニトイン、フェンタニル、フェロジピン、フェノチアジン、フェキソフェナジン、フルオロキノロン、フルオロウラシル、ＦＫ−５０６、ゲンタマイシン、グリセオフルビン、ヒドロコルチゾン、イマチニブ、インジナビル、イトラコナゾール、イベルメクチン、ケトコナゾール、ケンペロール、レポフロキサシン、リドカイン、ロペラミド、ロサルタン、ロバスタチン、メベンダゾル、メチルプレドニゾロン、メトトレキサート、ミベフラジル、ミダゾラム、ニソルジピン、モルヒネ、ネルフィナビル、ニカルジピン、ニトレンジピン、ニフェジピン、オンダンセトロン、パクリタキセル、ペンタゾシン、プラジカンテル、プレドニゾロン、プレドニゾン、ケルセチン、キニジン、ラニチジン、ラパマイシン、リファブチン、リファンピシン、リトナビル、サキナビル、シロリムス、スルファメチゾール、タクロリムス、タモキシフェン、タリノロール、テニポシド、テルフェナジン、テトラサイクリン、トポテカン、トリアムシノロン、バルスポダール、ベラパミル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ゾピクロン、およびこれらの混合物からなる群から選択されるものである、組成物に関する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、本発明によって提供されるナノ粒子を含む食料品に関する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、前記対象生成物が、脱毛の治療に用いられるミノキシジルであるか、または、前記対象生成物が、頬感染の治療に用いられるトリクロサンまたはケトコナゾールである、本発明によって提供されるナノ粒子に関する。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、対象生成物が、脱毛を治療するための医薬の製造におけるミノキシジルであるか、または、対象生成物が、頬感染を治療するための医薬の製造におけるトリクロサンまたはケトコナゾールである、本発明によって提供されるナノ粒子の使用に関する。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、ミノキシジルを保持する本発明によって提供されるナノ粒子を被検体に投与する工程を含む、被検体の脱毛を治療する方法、または、トリクロサンまたはケトコナゾールを保持する本発明によって提供されるナノ粒子を被検体に投与する工程を含む、被検体の頬感染を治療する方法に関する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、マトリックスを含むマトリックスナノスフェアを製造する方法であって、前記マトリックスが、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むものであり、この方法が、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含有する有機溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させて、前記マトリックスナノスフェアを形成する工程を少なくとも含むことを特徴とする方法に関する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、対象生成物を含むマトリックスナノスフェアを製造する方法であって、前記マトリックスナノスフェアがマトリックスを含むものであり、前記マトリックスが、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むものであり、前記方法が、
（ａ）対象生成物およびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系または含水アルコール溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させる工程；またはこれに代えて、
（ｂ）対象生成物およびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系の溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させる工程；またはこれに代えて、
（ｃ）対象生成物およびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む有機溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させる工程であって、前記有機溶液または懸濁物が不揮発性水混和性溶媒を含むものである、工程を少なくとも含んでなることを特徴とする方法に関する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、対象生成物を含むコア−シェル小胞性ナノカプセルを製造する方法であって、前記コア−シェル小胞性ナノカプセルがコアおよびシェルを含むものであり、前記シェルが、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むものであり、前記方法が、対象生成物およびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む溶液または懸濁物と、水系溶媒とを接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】（Ａ）走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）によって、および（Ｂ）透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）によって得られたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子の写真。
【図２】室温（２５℃）でのナノ粒子濃度と相関関係にある安定性試験および対応する走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）。（Ａ）および（Ｃ）は、それぞれ加水分解前および加水分解後に得られたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子のＳＥＭによる写真を示し、（Ｂ）は、２４時間目のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子のＳＥＭによる写真を示す。
【図３】室温（２５℃）での安定性試験中のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子およびＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の粒径のモニタリング。
【図４】分散媒体として再蒸留水を用い、異なる温度、すなわち、（Ａ）４℃、（Ｂ）室温（２５℃）および（Ｃ）３７℃でのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子（ＧＥＳ  ＮＰ）およびＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子（ＧＡＮ  ＮＰ）の安定性比較試験。この試験に使用したナノ粒子の濃度は、１０ｍｇ／ｍＬであった。
【図５】（Ａ）レモン精油コントロール製剤および（Ｂ）レモン精油を保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノカプセルの蛍光顕微鏡検査。
【図６】ＦＩＴＣ−ＢＳＡを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子の蛍光顕微鏡検査。
【図７】（Ａ）ケトコナゾールを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子（ＫＴＺ−Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子）および（Ｂ）ナノ粒子形成のために適用した同様の方法によって処理されたＫＴＺ結晶の走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）。
【図８】（Ａ）トリクロサン（ＴＲＩ）結晶、（Ｂ）トリクロサンを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子（ＴＲＩ−Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子）、（Ｃ）ＴＲＩ油の走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）、および（Ｄ）脂溶性蛍光プローブ  １，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニン過塩素酸塩で染色したＴＲＩエマルションの蛍光顕微鏡検査。
【図９】ミノキシジルを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子（ＭＸＤ−Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子）のナノ粒子径のモニタリング。調査した製剤は、２００ｍｇおよび２５０ｍｇのＭＸＤを含み、賦形剤を含まないか、あるいはプロピレングリコール（ＰＧ）、グリセロール（Ｇ）またはポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ）を含む、ＭＸＤを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子であった。
【図１０】乾燥前および乾燥後に、賦形剤を含まないか、あるいはプロピレングリコールを含む（ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ  ＰＧ）、グリセロールを含む（ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ  Ｇ）またはポリエチレングリコール４００を含む（ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ  ＰＥＧ）、ＭＸＤを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子製剤、および市販製品（Ｌａｃｏｖｉｎ（登録商標）およびＡｌｏｐｅｘｙ（登録商標））の巨視的および微視的な視覚化。すべての製剤を同様のＭＸＤ濃度（２％ｗ／ｖ）で使用した。
【図１１】賦形剤を含まない（ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ）か、または賦形剤であるグリセロールを含む（ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ  Ｇ）、プロピレングリコールを含む（ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ  ＰＧ）およびＰＥＧ４００を含む（ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ  ＰＥＧ）、ＭＸＤ  Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子、および市販製品（Ｌａｃｏｖｉｎ（登録商標）およびＡｌｏｐｅｘｙ（登録商標））の走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）。
【図１２】毛髪サンプルの微視的な特性評価。毛髪構造２０倍、（Ａ）蛍光標識されたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子を含まない通常の毛髪の蛍光顕微鏡検査；および（Ｂ）Ｍ１群（Ｃ）およびＭ２群（Ｄ）の通常の毛髪の蛍光顕微鏡検査。
【図１３】毛髪群Ｍ１（Ａ、Ｂ）および毛髪群Ｍ２（Ｃ、Ｄ）について、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子を用いてインキュベートした通常の毛髪の走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）。
【図１４】異なる時間でのブタの頬および舌の粘膜組織における累積的に接着したナノ粒子製剤の量のアッセイ。製剤は、Ｒｈｏｄｄａｍｉｎ  Ｂを含む、蛍光標識されたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子の水系懸濁物（ＮＰ  ＧＥＳＲ）；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを含む、蛍光標識されたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の水系懸濁物（ＮＰ  ＧＡＮＲ）；蛍光標識されたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５（ＧＥＬ  ＮＰＧＥＳＲ）；またはヒアルロン酸ナトリウムゲル（０．７５％ｗ／ｖ）に再懸濁させた蛍光標識されたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子（ＧＥＬ  ＮＰＧＡＮＲ）であった。それぞれの値は、平均値によってあらわされた（ｎ＝３；ＳＤは、平均値の２０％未満であった）。
【図１５】頬粘膜横断面の組織の視覚化。（Ａ）頬粘膜の光学顕微鏡検査；（Ｂ）ナノ粒子を含まない頬組織の蛍光顕微鏡検査；（Ｃ）投与から０．５時間後のＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子；（Ｄ）投与から０．５時間後のＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子；（Ｅ）投与から２．５時間後のＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子；および（Ｆ）投与から２．５時間後のＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子。
【図１６】「糸状乳頭」と呼ばれる小さな毛状突起を有するブタの舌背面横断面の組織の視覚化。（Ａ）舌背面の粘膜表面の光学顕微鏡検査；（Ｂ）投与から２．５時間後のＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子；（Ｃ、Ｄ）投与から２．５時間後のＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するナノ粒子、このナノ粒子を製造する方法、およびこのナノ粒子の用途を提供する。
【００３６】
定義
本発明の理解を促進するために、本発明に関して使用するいくつかの用語および表現の意味を以下に記載する。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「（Ｃ１−Ｃ４）アルキル」という用語は、１〜４個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖のアルカンから誘導される基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルなどに関する。
【００３８】
「平均粒径（ａｖｅｒａｇｅ  ｓｉｚｅ）」または「平均粒径（ｍｅａｎ  ｓｉｚｅ）」は、本明細書で使用する場合、水系媒体中で共に移動するナノ粒子の集団の平均直径に関する。これらの系の平均粒径は、当業者に既知の標準的な方法および以下に記載する実施例に添付する実験の部分で具体例として記載される方法によって測定することができる。粒子の平均粒径は、主に、コポリマーの量および分子量、本発明のナノ粒子中に存在する対象生成物（もしあれば）の性質および量（一般的に、この成分の量または分子量が大きくなるほど、ナノ粒子の平均粒径が大きくなる）、そしてナノ粒子を製造する方法のいくつかのパラメーター、例えば、攪拌速度などによって影響を受け得る。
【００３９】
ある製品は、ヒト用食品または動物用食品でのその使用が、国または組織（例えば、国連の食糧農業機関（ＦＡＯ）または世界保健機関（ＷＨＯ））の国際食品規格にしたがって安全である場合に、「食品グレード」であると言われ、その結果、「食品グレード」の製品は、「食品でのその使用に適した」毒性がない製品であり、したがって、この両表現は同義語であり、本明細書では明瞭に区別せずに使用される。
【００４０】
「ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、以下の式の構造に関する。
【化２】
0006001640.tif 000003
（式中、ＲはＣ１−Ｃ４アルキルであり、２個のカルボキシル基の１個だけがエステル化されている。）
【００４１】
本明細書で使用する場合、「ナノ粒子」との用語は、天然ポリマーまたは合成ポリマーによって形成される、平均粒径が１マイクロメートル（μｍ）未満、典型的には１０〜９００ナノメートル（ｎｍ）、好ましくは５０〜５００ｎｍ、さらに好ましくは１００〜４００ｎｍ、さらになお好ましくは１２０〜１６０ｎｍ、さらになお好ましくはおよそ１２０〜１６０ｎｍである固体ポリマー粒子のコロイド系を指す（この場合、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの重合によって形成される）。とりわけ、製造方法に依存して、ナノ粒子は、マトリックスナノスフェアとコア−シェル小胞性ナノカプセルとにさらに分けることができる［１１］。「マトリックスナノスフェア」は、ポリマーの三次元網目構造によって形成されるマトリックス形態であり、ナノスフェアが対象生成物、例えば、薬物を保持している場合、この対象生成物は、この三次元網目構造で物理的にかつ均一に分散することができる。本発明のマトリックスナノスフェアのマトリックス、すなわち三次元網目構造は、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む。「コア−シェル小胞性ナノカプセル」は、内部の空洞（「コア」として知られる）によって形成され、場合により、対象生成物を含有し、ポリマー壁または膜（「シェル」として知られる）によって囲まれた小胞系である。すなわち、コア−シェル小胞性ナノカプセルは、典型的なコア−シェル構造を示し、対象生成物が、リザーバに、またはポリマー壁または膜（「シェル」）によって囲まれた空洞（「コア」）の中に閉じ込められたナノ小胞系である。当業者は、コア−シェル小胞性ナノカプセルのコアが賦形剤のみを含んでいてもよく、以下に定義するような任意の対象生成物を含んでいてもよく、または、賦形剤および以下に定義するような対象生成物の両方を含んでいてもよいことを知っている。両方の場合において、これらの系の大きな比表面積に起因して、対象生成物の分子が、ナノ粒子表面に捕捉されるか、または吸着してもよい。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「対象生成物」または「ＰＯＩ」は、例えば、農業、化粧品、食品または医薬品の業界のような任意の種類の産業で使用することができる任意の化合物を指す。実際に、任意の種類の産業で使用することができる任意の化合物は、本発明ではＰＯＩと考えることができる。本発明のＰＯＩの具体的で非限定的な例としては、小さいかまたは大きい、水溶性または脂溶性の、親水性、疎水性または両親媒性の、有機化合物または無機化合物、例えば、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、油、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、低分子有機化学化合物などが挙げられる。ＰＯＩは、任意の形態または状態、例えば、液体、半固体または固体の状態であってもよく、すなわち、ＰＯＩは、水系媒体または有機媒体に溶解または分散していてもよく、そのため、水系または有機溶液または懸濁物（油系の溶液または懸濁物を含む）を形成してもよく、または、ＰＯＩは固体生成物として、溶解または分散していなくてもよい。
【００４３】
特定の実施形態では、ＰＯＩは、農業的な活性を有する化合物、すなわち、農業の産業で使用することができる化合物、例えば、疫病および病原体を制御するための植物検疫製品、植物成長促進剤、例えば、除草剤（例えば、グリホサートなど）、殺虫剤（例えば、ラムダ−シハロトリンなど）、抗真菌剤（例えば、マンコゼブ）などである。
【００４４】
別の特定の実施形態では、ＰＯＩは、化粧品の活性を有する化合物、すなわち、ヒトまたは動物の体の外観またはにおいを向上させるために用いられる物質である。化粧品としては、スキンケアクリーム、ローション、粉末、香水、リップスティック、指の爪および足の爪の研磨剤、目および顔のメイクアップ、ウェットティッシュ、パーマネントウェーブ、カラーコンタクトレンズ、ヘアカラー、ヘアスプレーおよびゲル、デオドラント、手の消毒剤、赤ちゃん用製品、バスオイル、バブルバス、バスソルト、バターおよび多くの他の種類の製品が挙げられる。化粧品の産業で使用されるＰＯＩの具体的で非限定的な例としては、老化防止製品（例えば、レチノイド）、抗ニキビ製品（例えば、エリスロマイシン、ベンゾイルペルオキシドなど）、フェイシャルケア製品（例えば、洗顔料中のＧＨＫ銅など）、着色化粧品（例えば、ルージュ、ファンデーション、上塗り、パウダーなどに用いられるカラー顔料）、化粧品（例えば、Ｃｏ−Ｑ１０など）、パーソナルケア製品（例えば、デオドラント中の香料の水分制御放出など）、サンスクリーン／サンケア用製品（例えば、ＵＶ遮蔽剤）、歯磨き、練り歯磨きまたはリンス用製品（例えば、トリクロサン／殺菌剤、香味剤、香り、口の渇きを防ぐ活性物質などの持続性放出）、シャンプー用製品（例えば、ふけ防止／保湿活性物質など）、香水（例えば、香り粒子など）、毛髪用製品（例えば、固定剤、毛髪のボリュームをアップさせるスタイリング製品など）が挙げられる。
【００４５】
別の特定の実施形態では、ＰＯＩは、栄養活性を有する化合物、すなわち食品産業で使用することができる化合物であり、例えば、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシンすなわちビタミンＢ３、パントテン酸すなわちビタミンＢ５、チアミンモノホスフェート、チアミンピロホスフェート、チアミントリホスフェート、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋファミリーおよびこれらの誘導体、リン脂質、カロチノイド（例えば、カロテン、リコピン、ルテイン、カプサンシン、ゼアキサンチンなど）、脂肪酸、ω−３脂肪酸（例えば、ＤＨＡ、ＥＰＡなど）、アミノ酸（例えば、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリン）、フィトスタノールまたはフィトステロール（例えば、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなど）、ポリフェノール（ケルセチン、ルチン、レスベラトロル、ケンペロール、ミリセチン、イソラムネチンなど）などである。
【００４６】
別の特定の実施形態では、ＰＯＩは、治療活性を有する化合物（すなわち、被検体に投与したとき、作用部位で受容体と相互作用し、特定の効果を発揮する物質）であり、この種の生成物は、医薬品産業で使用することができる。治療活性を有するＰＯＩの具体的で非限定的な例としては、抗体またはそのフラグメント、細菌、真菌またはウイルスのタンパク質または抗原、細胞受容体、凝固因子、サイトカイン、酵素、エリスロポエチン、成長因子、ホルモン、インスリン、インターロイキン、インターフェロン、リガンド、核酸（例えば、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、シグナル伝達剤、低分子有機化学化合物、毒素などが挙げられる。特定の実施形態では、ＰＯＩとしては、鎮痛（麻酔）剤（例えば、コデイン、モルヒネなど）、鎮痛薬（非麻酔）剤（例えば、アセチルサリチル酸、フルフェナム酸など）、抗脱毛剤（例えば、フィナステライド、ミノキシジルなど）、抗狭心症剤（例えば、アテノロール、ニカルジピンなど）、抗細菌剤（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、アジスロマイシン（ａｚｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、セファクロル、シプロフロキサシン、ネオマイシン、テトラサイクリンなど）、抗鬱剤（例えば、フルオキセチン、パロキセチンなど）、抗真菌剤（例えば、イソコナゾール、ケトコナゾールなど）、抗高血圧剤（例えば、ベナゼプリル、カプトプリル、カルベジロール、エナラプリル、ロサルタン、ミノキシジルなど）、抗炎症剤（例えば、ニフルム酸、セレコキシブ、イブプロフェンなど）、抗新生物剤（例えば、アレムツズマブ、シスプラチン、ドセタキセル、トラスツズマブなど）、解熱剤（例えば、アセトアミノフェン、インドメタシンなど）、抗精神病剤（例えば、リスペリドンなど）、抗不安剤（例えば、アルプラゾラム、ロラゼパムなど）、気管支拡張剤（例えば、カルブテロール、エピネフリンなど）、グルココルチコイド（例えば、ブデソニド、プレドニゾロンなど）、免疫抑制剤（例えば、アレムツズマブ、タクロリムスなど）などが挙げられる。さらに特定の実施形態では、ＰＯＩは、アセチルサリチル酸、アルファ−心房性ナトリウム利尿ペプチド、アルギニンバソプレシン、アトロピン、オーグメロセン、アトルバスタチン、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）、カルシトニン、絨毛性ゴナドトロピン、コルチコトロピン、デスモプレシン、エピバチジン、エルビタックス（登録商標）（セツキシマブ）、エクセナチド、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、ヒュミラ（登録商標）（アダリムマブ）、ヒューマリン（登録商標）、ケトコナゾール、ランレオチド、ルトロピンアルファ、メトプロロール、ミノキシジル、ネシリチド、オクトレオチド、パクリタキセル、パラセタモール、ペガプタニブ、組み換え卵胞刺激ホルモン、組み換え成長因子、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）、リツキサン（登録商標）（リツキシマブ）、セルモレリン、ソマトトロピン、タキサン誘導体、タキソール、酢酸テリパラチド、サイロトロピン、トリクロサン、ウロフォリトロピン、ゾーレア（登録商標）（オマリズマブ）などからなる群から選択される。別の実施形態では、ＰＯＩは、アクチノマイシンＤ、アルベンダゾール、アルドステロン、アルプラゾラム、アミオダロン、アミトリプチリン、アンプレナビル、アシマドリン、アトルバスタチン、ブニトロロール、ブスピロン、カンプトセシン、カルバマゼピン、カルベジロール、セリプロロール、シクロスポリンＡ、シメチジン、クロトリマゾール、コルヒチン、コルチゾン、ダウノルビシン、デブリソキン、デキサメタゾン、ジアゼパム、ジギトキシン、ジゴキシン、ジルチアゼム、ドセタキセル、ドンペリドン、ドキソルビシン、エファビレンツ、エピルビシン、エリスロマイシン、エルゴタミン、エストラジオール、エストラジオールグルクロニド、エルロチニブ、エトポシド、フェニトイン、フェンタニル、フェロジピン、フェノチアジン、フェキソフェナジン、フルオロキノロン、フルオロウラシル、ＦＫ−５０６、ゲンタマイシン、グリセオフルビン、ヒドロコルチゾン、イマチニブ、インジナビル、イトラコナゾール、イベルメクチン、ケトコナゾール、ケンペロール、レポフロキサシン、リドカイン、ロペラミド、ロサルタン、ロバスタチン、メベンダゾル、メチルプレドニゾロン、メトトレキサート、ミベフラジル、ミダゾラム、ニソルジピン、モルヒネ、ネルフィナビル、ニカルジピン、ニトレンジピン、ニフェジピン、オンダンセトロン、パクリタキセル、ペンタゾシン、プラジカンテル、プレドニゾロン、プレドニゾン、ケルセチン、キニジン、ラニチジン、ラパマイシン、リファブチン、リファンピシン、リトナビル、サキナビル、シロリムス、スルファメチゾール、タクロリムス、タモキシフェン、タリノロール、テニポシド、テルフェナジン、テトラサイクリン、トポテカン、トリアムシノロン、バルスポダール、ベラパミル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ゾピクロン、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００４７】
別の特定の実施形態では、ＰＯＩは、賦形剤（すなわち、液体、固体または半固体であってもよく、組成物の活性成分のための媒体または担体として使用することができる不活性物質）である。賦形剤として作用するＰＯＩの具体的で非限定的な例としては、流動パラフィンまたは溶融した脂質、例えば、ワックス、綿油、トウモロコシ油、水素化植物油、キャノーラ油、ココナツ油などである。ＰＯＩは、コア−シェル小胞性ナノカプセルの製造に特に有用であり、ナノカプセルのコア中に見出されてもよい。
【００４８】
「揮発性溶媒」は、本明細書で使用する場合、室温で容易に気化／蒸発する液体であり、揮発性溶媒は、通常は、水と比較して、高い蒸気圧と低い沸点を有する。同様に、「不揮発性溶媒」は、本明細書で使用する場合、室温で容易に蒸発しないか、または非常に緩やかに蒸発する液体を指し（例えば、ＰＧ、ＰＥＧ４００、グリセロール）、不揮発性溶媒は、通常は、水よりも低い蒸気圧と高い沸点を有する。
【００４９】
「水混和性」溶媒または液体は、水に完全に溶解し、水、例えばアルコールなどと分離することが困難な溶媒または液体である。
【００５０】
本発明のナノ粒子
一つの態様では、本発明は、下記からなる群から選択されるナノ粒子（以下、「本発明のナノ粒子」という）に関する。
（ａ）マトリックスを含むものであり、前記マトリックスが、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むものである、マトリックスナノスフェア；および
（ｂ）コアおよびシェルを含むものであり、シェルが、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むものである、コア−シェル小胞性ナノカプセル
【００５１】
「ナノ粒子」との用語は、既に定義されており、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの重合によって形成されるこの特定の場合に、、平均粒径が１μｍ未満、典型的には１０〜９００ｎｍ、好ましくは１００〜４００ｎｍ、さらに好ましくは１２０〜１６０ｎｍ、さらになお好ましくはおよそ１３０〜１４０ｎｍである固体ポリマー粒子のコロイド系を指す。「ナノ粒子」との用語は、他の意味であると示されていない限り、マトリックスナノスフェアおよびコア−シェル小胞性ナノカプセルを含む。両方の場合において、これらの系の大きな比表面積に起因して、ＰＯＩの分子は、それが存在する場合、ナノ粒子表面に捕捉されるか、または吸着してもよい。
【００５２】
特定の実施形態では、本発明のナノ粒子は、マトリックスを含み、このマトリックスがＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むマトリックスナノスフェアである。この実施形態では、対象生成物がナノスフェアの内部に捕捉されるか、またはカプセル化されてもよく、または、対象生成物がナノスフェア表面に吸着してもよい。
【００５３】
別の特定の実施形態では、本発明のナノ粒子は、コアおよびシェルを含み、前記シェルが、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む、コア−シェルナノ小胞構造体（ナノカプセル）である。空洞（コアまたはリザーバ）は、液体、半固体または固体の形態中に、または分子状分散物としてＰＯＩを含有してもよく、このリザーバは、使用する調製方法および原材料にしたがって脂溶性または疎水性であってもよい。このことは、液体、半固体または固体状態の形態、例えば、油、水不混和性液体、有機溶液または懸濁物（ＰＯＩを含む油溶液または懸濁物を含む）、ＰＯＩを含む水系溶液または懸濁物などのでＰＯＩを保持するために特に有用である。この実施形態によれば、ＰＯＩは、ナノカプセルの中にあってもよく、または、ナノカプセル表面に吸着していてもよい。
【００５４】
別の特定の実施形態では、本発明は、マトリックスを含み、このマトリックスが、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む、少なくともマトリックスナノスフェアと、コアおよびシェルを含み、このシェルがＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む、少なくともコア−シェル小胞性ナノカプセルとの組み合わせを提供する。
【００５５】
ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルは既知の生成物であるか、または、適切なアルコール、例えば、１〜４個の炭素原子を含むアルコール中で、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーの無水物を開環することによって製造することができる。ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの具体的で非限定的な例としては、ＩＳＰによりＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳという共通の商標によって市販されるもの、例えば、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５（ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのモノエチルエステル）、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ３３５Ｉ（ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのイソプロピルエステル）、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５（ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのモノブチルエステル）が挙げられる。ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルは、水不溶性であり、アルコール系溶液、例えば、エタノール系溶液［５０％（ｗ／ｖ）］で供給することができる。
【００５６】
ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルは、長期間にわたって粘膜表面に接着する能力を有し、適用部位における長い滞留時間および長期間にわたる薬物放出を提供する。
【００５７】
ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルは、いくつかの短期間経口毒性試験（ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのモノエチルエステルまたはモノブチルエステルの場合、ＬＤ５０＞２５．６ｇ／ｋｇ）および亜慢性吸入試験の結果という観点で非毒性化合物であると考えられ、目または皮膚への刺激物質ではない。ヒト志願者で評価したとき、皮膚刺激物質、感作性物質または光感作性物質ではない。ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのモノブチルエステルは、遺伝毒性が陰性であった。ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのモノエチルエステルおよびモノブチルエステルは、本発明の用途の実施において、化粧品成分として中和形態で安全である。実際に、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルは、ＧＲＡＳに列挙された材料コポリマーであると考えられ、膜形成剤および毛髪固定剤として機能し（化粧品成分審査委員会）、欧州連合の化粧品規制の一般条項にしたがって欧州で上市されている化粧品およびパーソナルケア製品として使用されてもよい。ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのモノブチルエステルは、エアロゾルおよびポンプ式ヘアスプレー、スタイリングムースおよびセット用ローション、目、顔および皮膚のメイクアップ、クリームおよびローションで使用される。
【００５８】
特定の実施形態では、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルは、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのモノエチルエステルまたはＰＶＭ／ＭＡコポリマーのモノブチルエステルである。
【００５９】
ＰＶＭ／ＭＡのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの分子量は、広い範囲内でさまざまであってもよく、特定の実施形態では、ＰＶＭ／ＭＡのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの分子量は、１０〜３００ｋＤａ、好ましくは５０〜２５０ｋＤａ、さらに好ましくは９０〜１５０ｋＤａである。特定の実施形態では、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルは、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのモノエチルエステルであり、分子量が１００〜１５０ｋＤａである。別の特定の実施形態では、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルは、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのモノブチルエステルであり、分子量が９０〜１５０ｋＤａである。
【００６０】
本発明のナノ粒子の比表面積が大きいため、対象生成物の分子は、ナノ粒子表面に捕捉されてもよく、または吸着してもよい。したがって、本発明のナノ粒子は、対象生成物、例えば、種々の用途および有用性を有する、大きいまたは小さい、疎水性または親水性の化合物を効率よく組み込むことができ、したがって、種々の用途（例えば、医薬品、化粧品または農業用組成物、食品生産物など）に応用できる可能性がある。
【００６１】
したがって、特定の実施形態では、本発明のナノ粒子は、対象生成物（ＰＯＩ）をさらに含み、この場合には、本発明のナノ粒子は、本明細書において折に触れて、「本発明の保持するナノ粒子」と特定される。ＰＯＩに関連する情報は、上記項目（「定義」）の中に見出される。当業者は、本発明の保持するナノ粒子が、ＰＯＩが互いに不相溶性でない限り、同じナノ粒子中に目的の１つ又はそれ以上の目的生成物（ＰＯＩ）を組み込むことができることを理解するであろう。
【００６２】
特定の実施形態では、ＰＯＩは、ケトコナゾール、ミノキシジルまたはトリクロサンであり、本発明のナノ粒子は、ＰＯＩがナノスフェアの中に捕捉されているか、またはカプセル化されているか、または、ＰＯＩがナノスフェアの表面に吸着しているマトリックスナノスフェアである。
【００６３】
別の特定の実施形態では、ＰＯＩは、精油、例えばレモン精油であり、本発明のナノ粒子は、ＰＯＩがナノスフェアの中に捕捉されているか、またはカプセル化されているか、または、ＰＯＩがナノスフェアの表面に吸着しているコア−シェル小胞性ナノカプセルである。
【００６４】
本発明の保持するナノ粒子中の「コポリマー」：ＰＯＩの重量比（ここで、「コポリマー」は、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーの（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの重合によって形成されるコポリマーを意味する。）は、広範囲にわたってさまざまに変動してもよいが、特定の実施形態では、本発明の保持するナノ粒子中のコポリマー：ＰＯＩ重量比は、１：１０−６〜１：１０６、好ましくは１：１０−３〜１：１０３、さらに好ましくは１：０．０３〜１：０．５であってもよい。
【００６５】
ナノ粒子を製造する方法
別の態様では、本発明は、マトリックスを含むマトリックスナノスフェアを製造する方法であって、前記マトリックスが、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含んでなるものであり（すなわち、本発明のナノ粒子の特定の実施形態）（以下、これを「本発明の方法［１］という）、この方法が、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含有する有機溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させて、前記マトリックスナノスフェアを作成する工程を少なくとも含むことを特徴とする方法に関する。本発明のこの方法［１］は、本発明の「空の」ナノ粒子、すなわち、対象生成物（ＰＯＩ）を含まないナノ粒子、とりわけ、マトリックスがＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むマトリックスナノスフェアを提供する。
【００６６】
ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルは、既知の生成物であるか、または、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーの無水物（例えば、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ）をアルコール中で開環することによって製造することができる。特定の実施形態では、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルは、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのモノエチルエステル、またはモノイソプロピルエステル、またはブチルエステルである。
【００６７】
有機溶媒は、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを完全にまたは部分的に溶解することができる任意の適切な有機溶媒、好ましくは、医薬的または美容的に許容される有機溶媒であってもよい。本発明の方法［１］に関する範囲内で使用可能な有機溶媒の具体的で非限定的な例としては、アルコール、およびアルコール以外の不揮発性水混和性溶媒、およびこれらの混合物が挙げられる。
【００６８】
「アルコール」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒドロキシル官能基（−ＯＨ）が炭素原子に、通常は、他の炭素原子または水素原子に結合した任意の有機化合物を指し、１個のみのヒドロキシル基を含むアルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールなど、２個又はそれ以上（複数個）のヒドロキシル基を含むアルコール、例えば、プロピレングリコール（ＰＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含む。メタノール、エタノールおよびイソプロパノールは、揮発性アルコールであり、一方ＰＧおよびＰＥＧは、液体として存在してもよい（ＰＧ）か、またはＰＥＧの分子量（Ｍｗ）に依存して固体として存在してもよい不揮発性アルコールである（例えば、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ１００００）。例えば、薬物を投与するための固体医薬形態、例えば、坐剤（例えば、解熱性薬物などを含む直腸用坐剤、または抗真菌剤などを含む膣用坐剤（膣錠）を製造するために、固体溶媒（例えば、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ１００００など）を使用してもよく、とりわけポリマーを含む溶液または懸濁物が体液、例えば膣液と接触すると、ナノ粒子が形成されるであろう。
【００６９】
特定の実施形態では、有機溶媒は、揮発性アルコール、例えば、エタノールである。別の特定の実施形態では、有機溶媒は、不揮発性アルコール、例えばＰＧである。別の特定の実施形態では、有機溶媒は、２種又はそれ以上の揮発性アルコールの混合物を含む。別の特定の実施形態では、有機溶媒は、２種又はそれ以上の不揮発性アルコールの混合物を含む。別の特定の実施形態では、有機溶媒は、少なくとも１つの揮発性アルコールと少なくとも不揮発性アルコールとの混合物、例えば、エタノールとＰＧとの混合物を含む。
【００７０】
または、有機溶媒は、アルコール以外の不揮発性水混和性溶媒であってもよい。アルコール以外の不揮発性水混和性溶媒の具体的で非限定的な例としては、ポリオキシグリセリド、例えば、カプリルオカプロイルポリオキシグリセリド、脂肪酸誘導体、例えば、これらのＰＧまたはＰＥＧ誘導体などが挙げられる。「カプリルオカプロイルポリオキシグリセリド」との用語は、脂質系界面活性剤を指す。１つの例示的なカプリルオカプロイルポリオキシグリセリドは、Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）としてＧａｔｔｅｆｏｓｓｅによって上市されている、ＰＥＧ−８カプリル／カプリングリセリドである。カプリルオカプロイルポリオキシグリセリドは、「カプリルオカプロイルマクロゴールグリセリド」としても知られている。
【００７１】
コポリマー有機溶液または懸濁物中のＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの濃度は、広範囲にわたってさまざまに変化してもよいが、特定の実施形態では、コポリマー有機溶液または懸濁物中のＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの濃度は、０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％〜３０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは１％〜１５％（ｗ／ｖ）、さらになお好ましくは２％〜１０％（ｗ／ｖ）であり、特定の実施形態では、コポリマー有機溶液または懸濁物中のＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの濃度は、約５％（ｗ／ｖ）である。
【００７２】
ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含有する有機溶液または懸濁物は、有機溶媒中に前記生成物を溶解または分散させることによって調製することができる。特定の実施形態では、有機溶媒は、アルコール、例えば、単純なアルコール、例えば、揮発性の単純なアルコール、例えば、エタノールなどであり、またはポリオール、例えば、不揮発性ポリオール、例えば、ＰＧである。別の特定の実施形態では、有機溶媒は、アルコール以外の不揮発性水混和性溶媒、例えば、ポリオキシグリセリド、例えば、カプリルオカプロイルマクロゴール−グリセリド、または脂肪酸誘導体である。
【００７３】
特定の実施形態では、溶媒はアルコールであり、したがって、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルが既に濃縮されたアルコール溶液の形態であれば、所望の濃度を達成するために、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを所望の濃度で含む希釈したアルコール溶液を、この濃縮溶液に必要量のアルコールを単に加えることによって調製することができる。これは、例えば、市販品であるＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５（ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのモノエチルエステル）、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ３３５Ｉ（ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのイソプロピルエステル）およびＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５（ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのモノブチルエステル）の場合であり、通常は、濃度５０％（ｗ／ｖ）のこれらエステルのエタノール溶液として供給され、したがって、結果として、所望の濃度（例えば、５％（ｗ／ｖ））を達成するために、必要な量の無水エタノールを加えることによって市販溶液を希釈することができる。
【００７４】
本発明の方法［１］によれば、ナノ粒子を形成するために、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含有する有機溶液または懸濁物を、水混和性ポリマー非溶媒として作用する水系媒体と接触させる。特定の実施形態では、水系媒体は、水、好ましくは、蒸留水または再蒸留水を含む。この工程は、適切な温度で、典型的には、１℃〜１００℃、好ましくは１０℃〜４０℃、さらに好ましくは１５℃〜２５℃で行われる。その後、所望の場合は、得られるナノ粒子の懸濁物は、有機溶媒を除去するための適切な処理に付される。有機溶媒の除去は、取り除かれる溶媒の性質に依存して、例えば、エバポレーションなどの当業者が知っている任意の従来の方法によって行うことができる。特定の実施形態では、有機溶媒がエタノールである場合、好ましくは減圧下で、Ｒｏｔａｖａｐｏｒを用いてナノ粒子懸濁物を蒸発させて、アルコールを除去する。
【００７５】
また、ナノ粒子、とりわけマトリックスナノスフェアは、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルおよび水混和性アルコール、好ましくは、揮発性水混和性アルコールを含有する含水アルコール溶液または懸濁物中の溶媒を取り除くことによって製造することができ、水の量は、ナノ粒子を形成するために必要な水の量よりも少なく、この実施形態では、アルコールの一部を取り除くと、ナノ粒子の形成が起こる。本発明者らによって行われるアッセイでは、水の量がナノ粒子を形成するために必要な水の量よりも少ない量である、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルおよびエタノールを含有する含水アルコールをヒトの皮膚（約３７℃）へ局所適用すると、エタノールの一部がエバポレーションによって取り除かれた後、皮膚表面にナノ粒子が形成したという指標である、初期の透明溶液から不透明懸濁物への変化によって示されるように、表面にナノ粒子が形成されることが示された。
【００７６】
したがって、特定の実施形態では、本発明の方法［１］は、（ｉ）ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含有する有機溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させて、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含有する含水有機溶液または懸濁物を得る工程であって、前記有機溶液または懸濁物が揮発性水混和性溶媒、好ましくは揮発性水混和性アルコールを含むものであり、前記水系媒体の量が、ナノ粒子を形成するのに必要な水系媒体の量よりも少ない量であることを特徴とする工程と、（ｉｉ）前記溶媒の少なくとも一部を取り除いて、マトリックスを含むマトリックスナノスフェアを形成する工程であって、前記マトリックスが、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むものである工程とを含む。
【００７７】
ナノ粒子を形成するのに必要な水系媒体の量は、特に、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーを含有する含水有機溶液または懸濁物中のＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの濃度に依存するが、特定の実施形態では、水系媒体（水）：アルコール（エタノール）の比率は、０．０１：１（ｖ／ｖ）〜１０００：１（ｖ／ｖ）、好ましくは０．５：１（ｖ／ｖ）〜１０：１（ｖ／ｖ）、さらに好ましくはおおよそ２：１（ｖ／ｖ）である。特定の実施形態では、ナノ粒子は、エタノール中に５％（ｗ／ｗ）でＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール溶液に１０ｍＬの水を加えた後、形成される［対照的に、１０ｍＬの同様のアルコール系コポリマー溶液に５ｍＬの水を加えた場合、ナノ粒子は生成しないであろう］。
【００７８】
媒体中にＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含有する含水有機溶液または懸濁物であって、前記媒体が揮発性水混和性溶媒（好ましくは、揮発性水混和性アルコール）と水系媒体とを含むものであり、前記水系媒体の量が、ナノ粒子を形成するのに必要な水系媒体の量より少ない量であることを特徴とする含水有機溶液または懸濁物は、本発明のさらなる態様を構成する。この含水有機溶液または懸濁物を使用して、ナノ粒子、主に、溶媒を除去した後に、マトリックスがＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むマトリックスナノスフェアを製造することができる。特定の実施形態では、溶媒は揮発性水混和性アルコール、例えば、エタノールであり、水系媒体は水を含み、この実施形態では、得られる含水有機溶液または懸濁物は、被検体の皮膚または毛髪への局所適用に特に有用であり、ナノ粒子は、エタノールの一部が蒸発した後、皮膚または毛髪の表面に形成される。
【００７９】
また、前記ナノ粒子は、得られたナノ粒子の懸濁物を有機溶媒を除去するための処理に付す必要なく、ｉｎ  ｓｉｔｕで製造することができる。この目的のために、コポリマー有機溶液または懸濁物、好ましくは、コポリマー溶媒が不揮発性水混和性溶媒（例えば、不揮発性水混和性アルコール、例えば、ＰＧ、またはアルコール以外の不揮発性水混和性溶媒）であり、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含有する有機溶液または懸濁物は、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルと有機溶媒とを混合し、次いで、前記コポリマーを含有する有機溶液または懸濁物と、水系媒体、例えば、水を含む媒体（例えば、水、好ましくは、再蒸留水）または体液（例えば、胃腸液など）とを混合することによって調製され、結果として、ｉｎ  ｓｉｔｕで自己組織化するナノ粒子（ＳＡＮＰ）が直接形成される。この実施形態では、溶媒蒸発法と比較して、ＳＡＮＰ中の不揮発性水混和性溶媒の残存量が最少であるため、溶媒を除去する必要がない。具体例として、１０ｇの市販のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ（５０％ｗ／ｖ）のエタノール溶液を１００ｍｌのＰＧに溶解することによって、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステル、例えば、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ（ここで、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳは、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ３３５ＩまたはＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５を意味する。）の５％（ｗ／ｖ）ＰＧ溶液を調製することができる。このことは、５％のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳのＰＧ溶液が５％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有することを意味する。ナノ粒子が形成されるとき、５％のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳのＰＧ溶液１ｍＬを１０ｍｌの水と混合する。従って、エタノールの濃度は０．２２５％（ｖ／ｖ）であり、すなわち、既に開示されている溶媒除去方法にしたがって（例えば、エバポレーションによって）エタノールを除去する前に得られるナノ粒子懸濁物中のエタノール濃度（約６６．６６％（ｖ／ｖ）であり得る）と比較して、最少のエタノールの最終濃度である。製剤中のエタノール含有量が低いと、コポリマー溶液または懸濁物を得るために大量のエタノールを使用しなくてすむため、許容可能な濃度範囲のエタノールを用いて口腔経路（薬物の経口バイオアベイラビリティを高める）または頬粘膜経路によって投与することができる。
【００８０】
この実施形態によれば、コポリマーを含有する有機溶液または懸濁物が、溶媒が不揮発性水混和性ポリオール（例えば、ＰＧ）であり、そしてＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含有する不揮発性ポリオール溶液または懸濁物が、この溶液または懸濁物と体液とを接触させることができる適切な経路（例えば、口、非経口、直腸、膣などの経路）によって被検体（例えば、ヒトを含む動物）に投与される、溶液または懸濁物である場合、水系媒体を含む適切な体液と接触してなる、ＰＶＭ／ＭＡコポリマー鎖のハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの自己組織化によってナノ粒子がｉｎ  ｓｉｔｕで形成される。
【００８１】
ＰＶＭ／ＭＡコポリマーを含有する有機（不揮発性水混和性溶媒）溶液または懸濁物中のＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの濃度は、広範囲にわたってさまざまに変化してもよいが、特定の実施形態では、コポリマー有機溶液または懸濁物中で、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの共重合によって形成されるコポリマーの濃度は、０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％〜３０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは１％〜１５％（ｗ／ｖ）、さらになお好ましくは２％〜１０％（ｗ／ｖ）であり、特定の実施形態では、コポリマー有機溶液中のＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの濃度は、約５％（ｗ／ｖ）である。
【００８２】
別の態様では、本発明は、対象生成物（ＰＯＩ）を含むマトリックスナノスフェアを製造する方法であって、前記マトリックスナノスフェアがマトリックスを含むものであり、前記マトリックスが、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むものである、方法に関し（すなわち、本発明のナノ粒子の特定の実施形態）（以下、「本発明の方法［２］」という）この方法は、
［Ａ］ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系または含水アルコール溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させる工程；またはこれに代えて、
［Ｂ］ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系の溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させる工程を少なくとも含む。
【００８３】
本発明の方法［２］は、本発明の「保持する」ナノ粒子、すなわち、少なくとも対象生成物（ＰＯＩ）を保持するマトリックスナノスフェアを提供する。
【００８４】
本発明の方法［２］の選択肢［Ａ］によれば、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系または含水アルコール溶液または懸濁物を水系媒体と接触させる。この選択肢［Ａ］は、ＰＯＩが親水性化合物または両親媒性化合物であるときに特に有用である（この場合には、水の割合を調整すべきである）。簡潔に言うと、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系または含水アルコール溶液または懸濁物は、当業者に既知の従来の手段によって得ることができ、例えば、ＰＯＩのアルコール系溶液または懸濁物（ＰＯＩを適切なアルコールに溶解または懸濁させることによって得られる）、またはその代わりに、ＰＯＩの水系溶液または懸濁物（ＰＯＩを水系媒体、例えば、水を含む媒体、好ましくは、水に溶解または懸濁させることによって得られる）と、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのアルコール系溶液とを、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系または含水アルコール溶液または懸濁物を得るのに適切な条件下で混合させることによって得ることができる。この操作条件の具体的で非限定的な例としては、室温で適切な時間、例えば、１分から３０分間、典型的には１５分未満、好ましくは約５分間攪拌する工程が挙げられる。
【００８５】
ＰＯＩの詳細は、「定義」の項目で既に述べた。ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの詳細は、本発明の方法［１］およびＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのアルコール系溶液の詳細、例えば、アルコール、濃度などに関連して既に述べた。特定の実施形態では、アルコール溶液中に存在するアルコールは、エタノールまたはポリオール、例えばＰＧである。
【００８６】
本発明の方法［２］の選択肢［Ａ］によれば、ＰＯＩを保持するナノ粒子（「ＰＯＩを保持するナノ粒子」）を形成するために、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系または含水アルコール溶液または懸濁物を、水系媒体、すなわち水混和性ポリマー非溶媒として作用する、水を含む媒体と接触させる。コポリマー溶媒（アルコール、例えば、エタノール）と、非溶媒（例えば、水）の体積比［溶媒：非溶媒］は、広範囲にわたってさまざまに変化してもよく、典型的には、１：０．００１（ｖ／ｖ）〜１：５０００（ｖ／ｖ）、好ましくは１：０．５（ｖ／ｖ）〜１：１（ｖ／ｖ）であってもよい。しかし、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系または含水アルコール溶液または懸濁物を、「欠陥のある状態の（ｉｎ  ｄｅｆｅｃｔ）」水系媒体と接触させる。すなわち、水の量がナノ粒子を形成するのに必要な水の量よりも少ない場合には、本発明の方法［１］の特定の実施形態に関連して既に述べたように、少なくとも一部のアルコールを除去することによって、ＰＯＩを保持するナノ粒子を形成することもできる。この場合には、アルコールは、好ましくは、揮発性水混和性アルコール、例えば、エタノールでなければならない。この実施形態は、ＰＯＩを局所適用によって送達するための、例えば化粧品組成物または医薬組成物を調製するのに有用であろう。
【００８７】
したがって、特定の実施形態では、本発明の方法［２］は、（ｉ）ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系または含水アルコール溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させて、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含有する含水アルコール系溶液または懸濁物を得る工程であって、前記溶液または懸濁物が揮発性水混和性アルコールを含むものであり、前記水系媒体の量が、ナノ粒子を形成するのに必要な水系媒体の量より少ない量であることを特徴とする工程と、（ｉｉ）前記アルコールの少なくとも一部を除去して、マトリックスを含むマトリックスナノスフェアを形成する工程であって、前記マトリックスがＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むものである工程とを含む。
【００８８】
媒体中にＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルおよびＰＯＩを含有する含水アルコール溶液または懸濁物であって、前記媒体が揮発性水混和性アルコールおよび水系媒体を含み、前記水系媒体の量が、ナノ粒子を形成するのに必要な水系媒体量より少ない量であることを特徴とする含水アルコール溶液または懸濁物は、本発明のさらなる態様を構成する。この含水有機溶液または懸濁物を使用して、ＰＯＩを保持するナノ粒子、主に、アルコールを除去した後に、マトリックスがＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むマトリックスナノスフェアを製造することができる。特定の実施形態では、アルコールはエタノールであり、水系媒体は水を含み、この実施形態では、得られた含水アルコール溶液または懸濁物は、被検体の皮膚または毛髪への局所適用に特に有用であり、ナノ粒子は、エタノールの一部が蒸発した後、皮膚または毛髪の表面に形成される。
【００８９】
ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系または含水アルコール溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させる工程は、適切な温度で、典型的には、１℃〜１００℃、好ましくは、１０℃〜４０℃、さらに好ましくは、１５℃〜２５℃で行われる。その後、必要な場合には、そのようにして得られるＰＯＩを保持するナノ粒子の懸濁物を適切な処理に付し、ＰＯＩを保持するナノ粒子の水系懸濁物を得るために、アルコールを除去する。アルコールの除去は、例えば、エバポレーションなどの当業者が知っている従来の方法によって行うことができる。特定の実施形態では、ＰＯＩを保持するナノ粒子の懸濁物は、好ましくは減圧下で、Ｒｏｔａｖａｐｏｒを用いて蒸発させて、アルコールを除去する。
【００９０】
本発明の方法［２］の選択肢［Ｂ］によれば、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系の溶液または懸濁物を水系媒体と接触させる。この選択肢［Ｂ］は、ＰＯＩが疎水性化合物または両親媒性化合物であるときに特に有用である。簡潔に言うと、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系懸濁物は、ＰＯＩと、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのアルコール系溶液とを、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系懸濁物を得るのに適切な条件下で混合することによって得られる。この操作条件の具体的で非限定的な例としては、室温で適切な時間、例えば、１分〜３０分間攪拌することが挙げられる。
【００９１】
ＰＯＩの詳細は、「定義」の項目で既に述べた。ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの詳細は、本発明の方法［１］およびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのアルコール系溶液の詳細、例えば、アルコール、濃度などに関連して既に述べた。特定の実施形態では、アルコール溶液中に存在するアルコールは、エタノールまたはポリオール、例えば、プロピレングリコール（ＰＧ）である。
【００９２】
本発明の方法［２］の選択肢［Ｂ］によれば、ＰＯＩを保持するナノ粒子（「ＰＯＩを保持するナノ粒子」）を形成するために、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系懸濁物を、水系媒体、すなわち水混和性ポリマー非溶媒として作用する、水を含む媒体と接触させる。特定の実施形態では、水系媒体は、水、好ましくは、蒸留水または再蒸留水を含む。コポリマー溶媒（アルコール、例えば、エタノールまたはＰＧ）と、非溶媒（例えば、水）の体積比［溶媒：非溶媒］は、広範囲にわたってさまざまに変化してもよく、典型的には、１：０．００１（ｖ／ｖ）〜１：５０００（ｖ／ｖ）、好ましくは、１：０．５（ｖ／ｖ）〜１：１（ｖ／ｖ）であってもよい。ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むアルコール系の溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させる工程は、適切な温度で、典型的には、１℃〜１００℃、好ましくは、１０℃〜４０℃、さらに好ましくは、１５℃〜２５℃で行われる。その後、本発明の方法［２］の選択肢［Ａ］に関連して既に述べたように、必要な場合には、そのようにして得られるＰＯＩを保持するナノ粒子の懸濁物を適切な処理に付し、ＰＯＩを保持するナノ粒子の水系懸濁物を得るために、アルコールを除去する。溶媒がＰＧである場合、経口経路によってヒトに使用することができるため、溶媒を除去する必要はない。
【００９３】
また、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのｉｎ  ｓｉｔｕで自己組織化ナノ粒子（ＳＡＮＰ）を形成する能力に起因して、本発明は、目的生成物（ＰＯＩ）を含むマトリックスナノスフェアを製造するさらなる方法であって、前記マトリックスナノスフェアがマトリックスを含むものであり、前記マトリックスが、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含むものである、方法（すなわち、本発明のナノ粒子の特定の実施形態）（以下、「本発明の方法［３］」という）を提供し、この方法が、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む有機溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させる工程であって、前記有機溶液または懸濁物が不揮発性水混和性溶媒を含むものである工程を少なくとも含むことを特徴とする。
【００９４】
本発明の方法［３］は、本発明の「保持する」ナノ粒子、すなわち、少なくともＰＯＩを保持する自己組織化マトリックスナノスフェアを提供する。
【００９５】
本発明の方法［３］によれば、不揮発性水混和性溶媒中にＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む有機溶液または懸濁物を水系媒体と接触させる。この方法は、ＰＯＩが疎水性、親水性または両親媒性の化合物であるときに特に有用である。簡潔に言うと、不揮発性水混和性溶媒中にＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む有機溶液または懸濁物は、ＰＯＩの溶液または懸濁物（ＰＯＩを不揮発性水混和性溶媒に溶解または懸濁させることによって得られる）と、不揮発性水混和性溶媒中のＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの溶液または懸濁物とを、不揮発性水混和性溶媒中にＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む有機溶液または懸濁物を得るのに適切な条件下で混合することによって得られる。この操作条件の具体的で非限定的な例としては、室温で適切な時間、例えば、１分〜３０分間、典型的には１５分未満、好ましくは約５分間攪拌する工程が挙げられる。溶液または懸濁物の溶媒、ＰＯＩの溶液または懸濁物、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの溶液または懸濁物は異なっていてもよいが、実際には、溶液または懸濁物双方の溶媒が同一であることが好ましく、特定の実施形態では、溶媒は、ポリオール、例えばＰＧである。
【００９６】
ＰＯＩの詳細は、「定義」の項目で既に述べた。ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの詳細は、本発明の方法［１］に関連して既に述べた。
【００９７】
上述のように、溶媒は、任意の適切な溶媒、例えば、不揮発性水混和性溶媒であってよく、その中で、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルが、完全にまたは部分的に溶解され得るもの、好ましくは、医薬品または化粧品として許容される不揮発性水混和性溶媒であってよい。本発明の方法［３］に関する範囲内でで使用可能な不揮発性水混和性溶媒の具体的で非限定的な例としては、不揮発性水混和性アルコール、例えば、ＰＧ、ＰＥＧなど、アルコール以外の不揮発性水混和性溶媒、例えば、ポリオキシグリセリド、例えば、カプリルオカプロイルポリオキシ−グリセリド（Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標））、脂肪酸誘導体、例えば、これらのＰＧまたはＰＥＧ誘導体など、およびこれらの任意の混合物、例えば、２種又はそれ以上の不揮発性水混和性アルコールの混合物、２種又はそれ以上のアルコール以外の不揮発性水混和性溶媒の混合物、または少なくとも１つの不揮発性水混和性アルコールとアルコール以外の少なくとも１つの不揮発性水混和性溶媒の混合物が挙げられる。
【００９８】
ＰＯＩおよび不揮発性水混和性溶媒を含む溶液または懸濁物中のＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの濃度は、広範囲にわたってさまざまに変化してもよいが、特定の実施形態では、溶液または懸濁物中のＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの濃度は、０．０１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％〜３０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは１％〜１５％（ｗ／ｖ）、さらになお好ましくは２％〜１０％（ｗ／ｖ）であり、特定の実施形態では、コポリマー有機溶液または懸濁物中のＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの濃度は、約５％（ｗ／ｖ）である。
【００９９】
本発明の方法［３］によれば、不揮発性水混和性溶媒中にＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む溶液または懸濁物を、水系媒体、すなわち、水を含む媒体と接触させ、コポリマー鎖をｉｎ  ｓｉｔｕで自己組織化させることによって、ＰＯＩを保持するナノ粒子（「ＰＯＩを保持するナノ粒子」）を形成する。特定の実施形態では、水系媒体は、水、好ましくは、蒸留水または再蒸留水を含む。この工程は、適切な温度で、典型的には、１℃〜１００℃、好ましくは１０℃〜４０℃、さらに好ましくは１５℃〜２５℃で行われる。
【０１００】
別の態様では、本発明は、目的生成物（ＰＯＩ）を含むコア−シェル小胞性ナノカプセルを製造する方法であって、前記コア−シェル小胞性ナノカプセルが、コアおよびシェルを含み、前記シェルが、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む、方法に関し（すなわち、本発明のナノ粒子の特定の実施形態）（以下、本発明の方法［４］という）、この方法は、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む溶液または懸濁物と、水系媒体とを接触させる工程を少なくとも含む。特定の実施形態では、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む溶液または懸濁物を、界面活性剤の存在下で、水系媒体と接触させる。
【０１０１】
本発明の方法［４］は、本発明の「保持する」ナノ粒子、すなわち、少なくともＰＯＩを保持するコア−シェル小胞性ナノカプセルを提供する。ＰＯＩは、ナノカプセルの中にあってもよく、またはシェルナノカプセルの表面に吸着してもよい。ＰＯＩは、液体、半固体または固体の状態であってよい。特定の実施形態では、ＰＯＩは油である。別の特定の実施形態では、ＰＯＩを水不混和性溶媒に溶解させるか、または分散させる。別の特定の実施形態では、ＰＯＩは、油系溶液または懸濁物の形態、または水不混和性溶媒中の溶液または分散物の形態の薬物または化粧品生成物である。
【０１０２】
本発明の方法［４］によれば、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む溶液または懸濁物を、界面活性剤の存在下で、水系媒体と接触させる。この方法は、ＰＯＩが疎水性、親水性または両親媒性化合物であるときに特に有用である。
【０１０３】
簡潔に言うと、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む溶液または懸濁物は、（ｉ）ＰＯＩ、（ｉｉ）アルコール、および（ｉｉｉ）ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのアルコール系溶液を、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む溶液または懸濁物を得るのに適切な条件下で混合することによって得られる。
【０１０４】
ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのアルコール系溶液の両方と混合するアルコールは、特定の実施形態では、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのアルコール系溶液を形成するアルコールと同じであるか、または好ましくは、異なっていてもよい。アルコールの具体的で非限定的な例としては、実質上、任意のアルコール、好ましくは、医薬品または化粧品として許容されるアルコール、例えば、単純なアルコール、例えば、エタノールなど、またはポリオール、例えば、ＰＧ、ＰＥＧなど、または単純なアルコールの任意の混合物、ポリオール、または少なくとも１つの単純なアルコールと少なくとも１つのポリオールの混合物が挙げられる。アルコールの混合物の使用は、他の特徴の中でも特に、ＰＯＩを含む液相（例えば、油、水不混和性溶媒中のＰＯＩの溶液または懸濁物など）およびアルコール（またはその混合物）の混合物中のＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの溶解度に依存して、簡便な場合がある。特定の実施形態では、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのアルコール系溶液の両方と混合するアルコールは、エタノール、ＰＧなど、好ましくはＰＧ（ＰＯＩを含む液相がＰＧに非常に可溶性である場合）、またはエタノールとＰＧの混合物であり、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのアルコール系溶液を形成するアルコールは、単純なアルコール、例えば、エタノールなどである。
【０１０５】
ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む溶液または懸濁物を得るための操作条件の具体的で非限定的な例としては、室温で適切な時間、例えば、１分〜３０分間、典型的には１５分未満、好ましくは約５分間攪拌することが挙げられる。
【０１０６】
ＰＯＩ：コポリマーの重量比（ここで、「コポリマー」は、コポリマーのアルコール系溶液または懸濁物を指す）は、広範囲にわたってさまざまに変化してもよいが、特定の実施形態では、ＰＯＩ：コポリマーの重量比率は、０．００１：１〜１００：１、好ましくは、０．０１：１〜１：１、さらに好ましくは、０．０２：１〜０．０５：１である。
【０１０７】
ＰＯＩの詳細は、「定義」の項目で既に述べたが、この場合には、ＰＯＩは、水不混和性液体中の溶液または懸濁物の形態でなければならない。したがって、特定の実施形態では、ＰＯＩは、油、例えば、精油である。別の特定の実施形態では、ＰＯＩを水不混和性溶媒（例えば、油）に溶解または分散させ、従って、油系溶液または懸濁物などを形成する。したがって、実質上、水不混和性液体に溶解または分散させることが可能な任意のＰＯＩを、本発明の方法［４］に関する範囲内で使用することができる。特定の実施形態では、ＰＯＩは、油系溶液または懸濁物の形態または水不混和性溶媒の溶液または分散物の形態の薬物または化粧品生成物である。
【０１０８】
ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの詳細は、本発明の方法［１］およびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのアルコール系溶液の詳細、例えば、アルコール、濃度などに関連して既に述べた。特定の実施形態では、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのアルコール系溶液中に存在するアルコールは、エタノールであり、そしてＰＯＩと混合するアルコール、およびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのエタノール系溶液と混合するアルコールは、ポリオール、好ましくはＰＧである。
【０１０９】
本発明の方法［４］によれば、ＰＯＩを保持するコア−シェル小胞性ナノカプセル（「ＰＯＩを保持するシェルコア−シェル小胞性ナノカプセル」）を形成するために、ＰＯＩおよびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む水不混和性溶液または懸濁物、例えば、油系溶液または懸濁物を、場合により界面活性剤の存在下で、水系媒体、すなわち、水を含む媒体、非溶媒と接触させる。特定の実施形態では、水系媒体は、水、好ましくは、蒸留水または再蒸留水を含む。（ＰＯＩおよびコポリマーを含むアルコール系溶液または懸濁物）：水相の体積比は、広範囲にわたってさまざまに変化してもよく、例えば、１：５００〜１：１０００（ｖ／ｖ）、好ましくは１：５〜１：１０である。
【０１１０】
本発明によって提供されるコアシェルナノカプセルを製造するために界面活性剤を使用することは必要ではないが、適切なＨＬＢを得るために、実際には、界面活性剤、例えば、親水性界面活性剤、疎水性界面活性剤またはこれらの混合物を使用することは価値が在る。本発明に関する範囲内で使用可能な界面活性剤の具体的で非限定的な例としては、非イオン系界面活性剤、例えば、ポリソルベート（すなわち、脂肪酸、例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸などでエステル化されたペグ化ソルビタンから誘導される油系液体が挙げられ、修飾していない（非ペグ化）ソルビタンと脂肪酸とのエステルは、通常は、「スパン」という名称で呼ばれる）；ソルビタンモノラウレートのポリオキシエチレン誘導体（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、ソルビタンオレエートのポリオキシエチレン誘導体（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）など、アニオン系界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）など、ＢＡＳＦによってＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）として市販されているエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドに由来するブロックコポリマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などが挙げられる。特定の実施形態では、界面活性剤は、ＴＰＧＳ（ＰＥＧ１０００でエステル化したα−トコフェリルサクシネート）である。界面活性剤の量は、広範囲にわたってさまざまに変化してよいが、特定の実施形態では、界面活性剤の濃度は、０．００１％〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは、０．０５％〜５％（ｗ／ｖ）である。
【０１１１】
さらに、（ＰＯＩおよびコポリマーを含むアルコール系溶液または懸濁物）：水相の体積比は、広範囲にわたってさまざまに変化してよく、例えば、１：５００〜１：１０００（ｖ／ｖ）、好ましくは、１：５〜１：１０であってよい。
【０１１２】
この工程は、適切な温度で、典型的には、１℃〜１００℃、好ましくは、１５℃〜５０℃で行われる。
【０１１３】
所望の場合には、本発明のナノ粒子は、ＰＯＩを保持するもの（ＰＯＩを保持するナノ粒子）および保持していないもの（「空の」ナノ粒子）双方が、温度および酸化に関する安定性を高める目的のために、それらの製剤において、酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸（ビタミンＣ）などを組み込んでもよい。この場合には、酸化防止剤は、ＰＯＩ（適切な場合）と一緒に、または本発明のナノ粒子のコーティング内に共カプセル化されていてよく、その目的のために、本発明の方法［１］〜［４］は、例えば、ナノ粒子を製造するために用いられる水系媒体に酸化防止剤を加えることによって、ナノ粒子の製剤に酸化防止剤を組み込むように適切に変えられる。
【０１１４】
さらに、所望の場合には、本発明の方法［１］、［２］、［３］および［４］は、粉末の形態の本発明のナノ粒子（すなわち、ＰＯＩを保持するナノ粒子および「空の」ナノ粒子の両方）を得るために、そのようにして形成されるナノ粒子を含有する懸濁物を乾燥させるための乾燥工程を含んでいてもよい。ナノ粒子のこの存在形態は、安定性に寄与し、さらに、固形食品（例えば、小麦粉、パン、ペーストリー製品、穀類、ミルク粉末など）および化粧品組成物および製品および／または医薬組成物および製品の最終的な用途に特に有用である。
【０１１５】
実質上、ナノ粒子を含有する懸濁物を乾燥するのに適切な任意の従来からある技術または方法を使用し、この乾燥工程を行うことができるが、特定の実施形態では、ナノ粒子を含有する懸濁物の乾燥は、スプレー乾燥によって、または凍結乾燥によって行われる。この処理は、一般的に、ナノ粒子の懸濁物に、ナノ粒子の適切な保護剤、例えば、糖類、例えば、ラクトース、トレハロース、マンニトール、スクロース、マルトデキストリン、グルコース、ソルビトール、マルトースなど、およびこれらの混合物を加えることによって行われる。この保護剤は、乾燥工程中に本発明のナノ粒子が熱分解しないように、また酸化しないように保護する。
【０１１６】
「ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステル：糖類」の重量比は、広範囲にわたってさまざまに変化してよいが、特定の実施形態では、「ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステル：糖類」の重量比は、１〜１０００、好ましくは約１：１〜５である。
【０１１７】
同様に、特定の実施形態では、糖類を含有する溶液は、酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸（ビタミンＣ）などをさらに含有してもよく、この場合には、「ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステル：糖類：酸化防止剤」の重量比は、１：０．０１〜１０００：０．００１〜１００、好ましくは、約１：５：０．２であってよい。
【０１１８】
上述のように、当業者は、本発明の保持するナノ粒子が、ＰＯＩが互いに非相溶性ではない限り、同じナノ粒子に１種又はそれ以上のＰＯＩを組み込むことができることを理解するであろう。そのために、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む同じアルコール系（または油系）溶媒に、または、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む同じ含水アルコール溶液または懸濁物に、または、異なる調製物にＰＯＩを組み込むために、方法［１］、［２］、［３］および［４］を適切に改良するであろう。
【０１１９】
本発明の方法［１］、［２］、［３］または［４］によって得られる本発明のナノ粒子は、本発明のさらなる態様を構成する。
【０１２０】
用途
本発明のナノ粒子は、対象生成物を様々な表面、例えば、頬、胃腸管、毛髪、鼻、口、直腸、皮膚、膣などに送達するためのシステムとして、多くの産業、例えば、医薬品、化粧品、農業または食品の産業で潜在的に有用性をもたらす多くの特性を有する。
【０１２１】
本発明のナノ粒子の特性の具体的で非限定的な例としては、粘膜への生体接着性が高いこと、水系媒体中での長期安定性が高いこと、対象生成物（例えば、小さいまたは大きい、親水性、疎水性または両親媒性の化合物）のカプセル化効率が高いこと、油のカプセル化効率が高いこと、および／または疎水性化合物の水への溶解度の増強剤であることが挙げられる。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明のナノ粒子は、ＰＯＩを農業用組成物、化粧品組成物、食品組成物または医薬品組成物に組み込むことができる。
【０１２３】
本発明のナノ粒子は、懸濁物、好ましくは水系媒体の形態で存在してもよく、またはその代わりに、ＰＯＩを安定な状態に維持し、長期間保存することができる（特に、固形食品調製物に組み込むための）乾燥粉末の形態で存在してもよい。
【０１２４】
したがって、別の態様では、本発明は、少なくとも１つの本発明のナノ粒子と、農業品、化粧品または医薬品として許容される担体または食品に適した担体とを含む組成物（以下、「本発明の組成物」）に関する。
【０１２５】
特定の実施形態では、本発明のナノ粒子は、本発明の「空の」ナノ粒子であり、すなわち、ＰＯＩを含まない本発明のナノ粒子、例えば、（ｉ）マトリックスを含み、このマトリックスがＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む、マトリックスナノスフェア、（ｉｉ）コアおよびシェルを含み、このシェルがＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む、コア−シェル小胞性ナノカプセル、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせである。
【０１２６】
別の特定の実施形態では、本発明のナノ粒子は、本発明の「保持する」ナノ粒子であり、すなわち、ＰＯＩを保持する本発明のナノ粒子、例えば、（ｉ）ＰＯＩおよびマトリックスを含み、このマトリックスがＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む、マトリックスナノスフェア、（ｉｉ）コアの中のＰＯＩおよびシェルを含み、このシェルがＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含む、コア−シェル小胞性ナノカプセル、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせである。特定の実施形態では、ＰＯＩは、農業品、化粧品、栄養品、および／または治療品としての活性を有するＰＯＩである。ＰＯＩの詳細は、「定義」の項目で既に述べた。
【０１２７】
別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、「農業用組成物」であり、そのために、この組成物は、最も広い意味で、農業分野で使用することができるＰＯＩ、例えば、疫病および病原体を制御するための衛生植物品、植物成長促進剤など、例えば、除草剤（グリホサートなど）、殺虫剤（例えば、λ−シハロトリンなど）、抗真菌剤（例えば、マンコゼブ）などと、その用途に適した１種又はそれ以上の賦形剤を含む農業的に許容される担体とを含む本発明の「保持する」ナノ粒子を含み、農業用組成物は、当業者に既知の担体を用いることによって、ゲル、懸濁物などの形態に製剤化することができる。
【０１２８】
別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、「化粧品組成物」であり、そのために、この組成物は、本発明の「空の」ナノ粒子、例えば、毛髪固定剤、スタイリング剤などのようなヘアスタイリング製品で使用するための空のナノ粒子、または化粧品としての活性を有するＰＯＩまたは化粧品としての目的で使用することができるＰＯＩを含む本発明の「保持する」ナノ粒子、またはこれらの混合物と、適切な経路によって（例えば、局所経路によって）投与するのに適した１種又はそれ以上の賦形剤を含む化粧品として許容される担体とを含み、化粧品組成物は、スキンケアクリーム、ローション、粉末、香水、リップスティック、指の爪および足の爪の研磨剤、目および顔のメイクアップ、ウェットティッシュ、パーマネントウェーブ、カラーコンタクトレンズ、ヘアカラー、ヘアスプレーおよびゲル、デオドラント、手の消毒剤、赤ちゃん用製品、バスオイル、バブルバス、バスソルト、懸濁物、バターおよび多くの他の種類の製品に製剤化することができる。化粧品組成物の製剤に適した賦形剤および化粧品組成物の製造に関する情報は、「Ｍａｎｕａｌ  ｄｅ  Ｃｏｓｍｅｔｏｌｏｇｉａ」、Ｏｃｔａｖｉｏ  Ｄｉｅｚ  Ｓａｌｅｓ、第１版、１９９８年、Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ  Ｖｉｄｅｏｃｉｎｃｏ、Ｓ．Ａ．という本の中に見いだすことができる。化粧品産業で使用するＰＯＩの具体的で非限定的な例としては、「定義」の項目に既に述べた製品が挙げられる。
【０１２９】
別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、「食品組成物」、例えば、固体、液体または半固体の食品調製物であり、そのために、この組成物は、栄養活性を有するＰＯＩを含む本発明の「保持する」ナノ粒子と、食品で使用する担体とを含む。また、本発明の組成物を食料品に組み込むことができ、したがって、別の態様では、本発明は、本発明の組成物、すなわち、栄養活性を有するＰＯＩを含む本発明の「保持する」ナノ粒子と、食品で使用する担体とを含む組成物を含む食料品に関する。食料品は、液体、半固体または固体の形態で見いだされてもよい。本発明の組成物を豊富に含んでもよく、または本発明の組成物で強化されてもよい食料品の具体例としては、乳および乳製品（ヨーグルト、チーズ、カードなど）、ジュース、ジャム、パンおよびペーストリー製品、発酵させた肉、ソースなどが挙げられる。同様に、本発明の組成物を、動物用食品、例えば、餌に組み込むことができる。
【０１３０】
別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、「医薬組成物」であり、そのために、この組成物は、治療活性を有するＰＯＩまたは治療目的で使用することができるＰＯＩを含む本発明の「保持する」ナノ粒子と、１種又はそれ以上の賦形剤またはビヒクルを含む医薬的に許容される担体とを含む。
【０１３１】
本発明の「保持する」ナノ粒子中に存在するＰＯＩは、ナノ粒子（すなわち、ナノスフェアまたはナノカプセル）の中に捕捉させるか、またはカプセル化することができ、またはその代わりに、対象生成物をナノ粒子の表面に吸着させることができる。
【０１３２】
医薬組成物の例は、液体、固体または半固体の組成物を含む。
【０１３３】
医薬組成物は、それぞれの製剤に適した賦形剤を含み、当業者に既知の方法によって従来どおり調製される。賦形剤は、選択される医薬投薬形態にしたがって選択される。薬物の種々の投薬形態およびその調製の説明は、「Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ」、Ｃ．Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ、第１０版、１９９３、Ｌｕｚａｎ  ５、Ｓ．Ａ．ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓという本の中に見いだすことができる。
【０１３４】
本発明の「保持する」ナノ粒子に組み込まれるＰＯＩの比率は、広範囲にわたってさまざまに変化してよいが、特定の実施形態では、コポリマー：ＰＯＩの重量／重量の比は、１：１０−６〜１：１０６、好ましくは１：１０−３〜１：１０３、さらに好ましくは１：０．０３〜１：０．５である。ただし、適切な比率は、組み込まれるＰＯＩのそれぞれの場合によって変わるであろう。
【０１３５】
ＰＯＩを用いた治療が必要な被検体に投与される本発明の「保持する」ナノ粒子の投薬量は、広範囲にわたってさまざまに変化してよく、他の特徴の中でも、ＰＯＩの性質、その活性または効能、ナノ粒子あたりのＰＯＩの量などによって変わり、単なる具体例を目的とすれば、被検体に投与される「保持する」ナノ粒子の投薬量は、例えば、体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは、体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜２ｍｇであってよい。
【０１３６】
特定の実施形態では、この医薬組成物は、任意の適切な経路によって、例えば、頬、歯、鼻、目、口、非経口、直腸、局所または膣経路によって投与するのに適した医薬投薬形態として製剤化される。医薬投薬形態の具体的で非限定的な例としては、固体（例えば、軟質または硬質のゼラチンおよび非ゼラチンカプセル、接着フィルム、歯科用接着パッチ、坐剤、錠剤、顆粒、微粒子など）、半固体（例えば、クリーム、ゲル、ローション、軟膏など）、液体（例えば、溶液、懸濁物など）が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子の生体接着特性に起因して、医薬組成物は、粘膜への接近経路によって投与するための組成物の形態で製剤化される。
【０１３７】
特定の実施形態では、医薬組成物は、直腸経路（坐剤）または膣経路（膣錠）によって投与するのに適した医薬形態として製剤化され、所望の場合には、この実施形態では、ポリマーを含む溶液または懸濁物が体液、例えば、膣液と接触するとき、ナノ粒子を形成することができる。
【０１３８】
別の特定の実施形態では、医薬組成物は、凍結防止剤とともに乾燥粉末の形態（例えば、凍結乾燥物）で調製され、使用前に再構築剤と混合することによって再構築される。
【０１３９】
特定の実施形態では、本発明は、下記を含む医薬組成物を提供する。
【表１】
0006001640.tif 000004
【０１４０】
本発明の「保持する」ナノ粒子、特に、薬物であるＰＯＩを保持するナノ粒子は、疾患の治療に使用することができる。薬物は、治療する疾患の機能において選択される。したがって、別の態様では、本発明は、疾患を治療するための医薬の製造における、薬物であるＰＯＩを保持する本発明のナノ粒子の使用に関するか、またはその代わりに、本発明は、医薬として使用するための、または疾患の治療における、薬物であるＰＯＩを保持する本発明のナノ粒子に関する。
【０１４１】
特定の実施形態では、薬物はミノキシジルであり、そのため、本発明は、脱毛（脱毛症）を治療するための医薬の製造における、ミノキシジルを保持する本発明のナノ粒子の使用に関するか、またはその代わりに、言い換えると、脱毛（脱毛症）の治療に用いられるミノキシジルを保持する本発明のナノ粒子に関する。
【０１４２】
特定の実施形態では、薬物は、トリクロサンまたはケトコナゾールであり、そのため、本発明は、頬感染を治療するための医薬の製造における、トリクロサンまたはケトコナゾールを保持する本発明のナノ粒子の使用に関するか、またはその代わりに、言い換えると、頬感染の治療に用いられるトリクロサンまたはケトコナゾールを保持する本発明のナノ粒子に関する。
【０１４３】
本発明のナノ粒子はｉｎ  ｓｉｔｕで形成されてもよいため、本発明の別の態様は、
ｉ．媒体中に、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルおよび対象生成物を含有する溶液または懸濁物であって、前記媒体が揮発性水混和性アルコールおよび水系媒体を含むものであり、前記水系媒体の量がナノ粒子を形成するのに必要な水系媒体の量より少ない量である、溶液または懸濁物と、
ｉｉ．担体とを含む組成物である。
【０１４４】
本発明をいくつかの実施例をによって以下に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではなく、単に説明するものである。
【実施例】
【０１４５】
以下の実施例は、対象生成物、例えば、油（例えば、レモン精油）、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、または薬物（例えば、ケトコナゾール、ミノキシジルまたはトリクロサン）を組み込むことができる、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するナノ粒子（マトリックスナノスフェアおよびシェルナノカプセル）の製造を説明する。この実施例は、ナノ粒子が、粘膜への生体接着性が高く、水系媒体での長期安定性が高く、対象生成物（例えば、小さいまたは大きい、親水性、疎水性または両親媒性の化合物）のカプセル化効率が高く、油のカプセル化効率が高く、そしてナノ粒子が、疎水性化合物の水への溶解度を増強することを示す。
【０１４６】
ナノ粒子を製造するために使用される材料を以下に記載する。
【０１４７】
材料
ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルとして、市販のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳエタノール系溶液を使用した。つまり、ポリメチルエーテル−コ−無水マレイン酸コポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）のモノエチルエステル（Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５）、およびモノブチルエステル（Ｇａｎｔｒｅｚ  ＥＳ（登録商標）４２５）のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳエタノール系溶液（５０％ｗ／ｖ）、およびＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ１１９［分子量（Ｍｗ）：２００，０００（ｇ／ｍｏｌ）］がＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＩＳＰ、スペイン）から供給された。
【０１４８】
超純水に可溶性のキトサン（ＰＲＯＴＡＳＡＮ  ＵＰ  ＣＬ  １１３、Ｍｗ：５０，０００〜１５０，０００ｇ／ｍｏｌ）がＮｏｖａｍａｔｒｉｘ（ノルウェー）から供給された。
【０１４９】
フルオレセインイソチオシアネートで標識されたウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）、脂溶性蛍光プローブ  １，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩、およびＴＰＧＳ（ポリエチレングリコール１０００［ＰＥＧ  １０００］でエステル化したα−トコフェリルサクシネート）がＳｉｇｍａ（スペイン）によって供給された。
【０１５０】
欧州薬局方グレードのトリクロサン、ミノキシジル、ケトコナゾールおよびレモン精油がＦａｇｒｏｎ（スペイン）から供給された。
【０１５１】
ヒアルロン酸ナトリウムおよび中鎖トリグリセリド（Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標）８１２）がＦａｇｒｏｎ（スペイン）によって供給された。
【０１５２】
賦形剤を含む他の化学試薬はすべて分析用グレードであり、Ｓｉｇｍａ（スペイン）によって供給された。
【０１５３】
実施例１
Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の調製および特性評価
１．１  ナノ沈殿法−溶媒置換法によるＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の調製
Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子を得るために、ポリメチルエーテル−コ−無水マレイン酸コポリマー（ＰＶＭ／ＭＡ）のモノエチルエステル（Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５）およびモノブチルエステル（Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５）のポリマーエタノール系溶液（５０％ｗ／ｖ）を無水エタノールで濃度が５％（ｗ／ｖ）になるまで希釈した。次いで、このポリマー溶液５ｍＬと、ポリマー混和性の非溶媒として１０ｍＬの再蒸留水とを混合することによって、ナノ粒子を形成した。得られたナノ粒子懸濁物を減圧下で、Ｒｏｔａｖａｐｏｒ（Ｂｕｅｃｈｉ  Ｒ−１４４、スイス）を用いて蒸発させて、エタノールを除去した。
【０１５４】
一方、最終的なエタノール含有量が少なく、エバポレーションの必要がないｉｎ  ｓｉｔｕで自己組織化したＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子（ＳＡＮＰ）を得た。この目的のために、１０ｇのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５アルコール系溶液（５０％ｗ／ｖ  エタノール溶液）を１００ｍＬのプロピレングリコールに溶解することによって、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５  ５％（ｗ／ｖ）を含有する不揮発性ポリオール（プロピレングリコール）ポリマー溶液を調製し、次いで、１ｍＬのプロピレングリコール−Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５（５％ｗ／ｖ）溶液を、１０ｍＬの再蒸留水と混合し、ナノ粒子を得た。最後に、さらに特性評価するために、空のアニオン系Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の水系懸濁物を集めた。
【０１５５】
カチオン系Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子を得るために、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の含水アルコール系懸濁物１５ｍＬ（５ｍＬのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５（またはＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５）アルコール系溶液（５％ｗ／ｖ）および１０ｍＬの再蒸留水の混合物）、または、ｉｎ  ｓｉｔｕ技術によって得られた１０ｍＬのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子を、超純水に可溶性のキトサン（ＰＲＯＴＡＳＡＮ  ＵＰ  ＣＬ  １１３）を異なるキトサン濃度（１．２５、２．５および５ｍｇ／ｍＬ）で含む水溶液１５ｍＬとともにインキュベートした。次いで、この混合物を室温で５分間、磁気攪拌下で放置した。得られたナノ粒子懸濁物を減圧下で蒸発させ、さらに特性評価するために、キトサンでコーティングされたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子を集めた。
【０１５６】
１．２  空のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の特性評価
１．２．１  ナノ粒子の粒径、ゼータ電位、収率および形態
ナノ粒子の粒径およびゼータ電位を、Ｚｅｔａｍａｓｔｅｒ分析システム（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を用い、それぞれ光子相関分光法および電気泳動によるレーザードップラー流速測定法によって測定した。サンプルを再蒸留水で希釈し、散乱角を９０°とし、２５°で測定した。
【０１５７】
ナノ粒子調製方法の収率は、ナノ粒子に変換されたポリマーの割合であり、既に記載されているように凍結乾燥したサンプルから重量測定法によって測定した［１２］。この目的のために、ナノ粒子水系懸濁物を２７，０００×ｇで２０分間、２回遠心分離して（Ｓｉｇｍａ  ｌａｂ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｒｏｔｏｒ  ３３３６、Ｂｉｏｆｕｇｅ  Ｈｅｒａｅｕｓ、ドイツ）、再び集め、Ｇｅｎｅｓｉｓ  １２ＥＬ装置（Ｖｉｒｔｉｓ、ＵＳＡ）中で凍結乾燥させた。凍結乾燥させた乾燥ナノ粒子サンプルと、製剤を調製するために使用されたポリマーの初期量との比率として、ナノ粒子の百分率での収率（ナノ粒子に変換されたポリマーの量）を計算した。
【０１５８】
ナノ粒子の形態の特徴を、Ｚｅｉｓｓ  ＤＳＭ  ９４０デジタル走査型電子顕微鏡（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）による走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）および電子顕微鏡Ｚｅｉｓｓ  Ｌｉｂｒａ（登録商標）１２０（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）での透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって視覚化した。
【０１５９】
１．２．２  結果
第１表は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の主な物理化学的特徴を示す。一般的に、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５（ＧＥＳ−ＮＰ１）およびＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５（ＧＥＳ−ＮＰ２）から調製した空のアニオン系Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子は、約１４０ｎｍの均一な粒径を示し（ＧＥＳ−ＮＰ１、ＧＥＳ−ＮＰ２および自己組織化ＧＥＳ−ＮＰ）、約−６０ｍＶの負の表面電荷を示した。ナノ粒子の百分率での収率は、すべての製剤について非常に高かった（約９８％）。一方、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子をキトサンでコーティングすると、コーティングしていないものと比較して、粒径がおおよそ２００ｎｍまで顕著に増加した（Ｐ＜０．０５）。キトサンでコーティングされたナノ粒子（ＧＥＳ−ＮＰ−Ｑ１．２５、ＧＥＳ−ＮＰ−Ｑ２．５およびＧＥＳ−ＮＰ−Ｑ５）は、均一な粒径を有し、正の表面電荷を有している。ナノ粒子表面に接着したキトサンの量を増やすことによって、粒子の粒径および正の表面電荷の双方が顕著に増加することが留意される（Ｐ＜０．０５）。
【０１６０】
【表２】
0006001640.tif 000005
【０１６１】
Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子は、ＳＥＭおよびＴＥＭによって試験すると、球状であり、均一であることがわかった［図１Ａおよび１Ｂ（ＧＥＳ−ＮＰ１）］。
【０１６２】
１．３  ナノ粒子の安定性試験
１．３．１  短期および長期の安定性試験
異なる条件でのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の分解速度を調べるために、既に公開されている試験にしたがって、４０５ｎｍでの比濁アッセイによって安定性をモニタリングした［１３］。この目的のために、異なる濃度のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子水系懸濁物（１０ｍｇおよび２０ｍｇのナノ粒子／ｍＬ）と、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ１１９ナノ粒子水系懸濁物とによる短期安定性比較試験を室温で行った。この試験では、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ１１９（ＩＳＰ、スペイン）は、水不溶性ポリマーと考えられるため、架橋していないＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ１１９ナノ粒子［８］をリファレンスとして使用した。
【０１６３】
一方、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５およびＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子（１０ｍｇ／ｍＬ）の水系懸濁物の長期安定性試験（約３ヶ月間）を異なる温度（４℃、室温（１８−２２℃）および３７℃）で行った。
【０１６４】
全サンプルをトリプリケートでアッセイし、データを平均プラスＳＤであらわした。この試験中、ナノ粒子の粒径をモニタリングし、最後に、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を行い、短期安定性試験でのナノ粒子製剤の形態変化を観察した。
【０１６５】
１．３．２  結果
図２は、２種類の異なる濃度（１０ｍｇ／ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬ）で、室温（２５℃）で２４時間以内のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５およびＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の分解速度、およびナノ粒子の形態変化を観察するための対応する走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）を示す。一般的に、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子と比較したとき、ポリマー濃度とは独立して、水系媒体中で高い安定性と、低い分解性を示した。最初の５時間の間には、両方の種類のナノ粒子が同様の安定性を示した。しかし、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子は、５時間後には顕著な分解速度プロファイルを示し始め、インキュベーションしてから６〜８時間の間に完全に分解した。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の遅滞時間（すなわち、濁度が減少し始める時間）は、約５時間であると計算された。図２のＳＥＭ画像は、画像ＣではＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子が完全に分解し、ポリマー膜のみが観察されたことを示していた。一方、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の粒径は、インキュベーションの最初の５時間に２００ｎｍ〜４００ｎｍまで顕著に増加した（図３）。その後、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子が加水分解し、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）Ｓの遊離ポリマー溶液（Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮの水溶性形態）を形成したため、ナノ粒子の粒径は検出されなかった。
【０１６６】
長期安定性試験（図４）の場合、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子と比較して、異なる温度で高い安定性を示すことが観察されている。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の分解速度は、温度が上がるにつれて増大し、分解遅滞時間は、インキュベーション後２〜２４時間の範囲であった。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の場合、４℃または室温で分解は観察されなかった。しかし、３７℃で、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の分解遅滞時間によってあらわされる安定性は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子よりも約３５０〜４００倍長かった。
【０１６７】
実施例２
油を含有するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノカプセルの調製および特性評価
２．１  油を含有するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノカプセルの調製
液体油を保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノカプセルを調製するために、溶媒置換法によってレモン精油をＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳポリマーシェルに組み込んだ。この目的のために、０．５ｍＬのレモン精油（脂溶性蛍光プローブである１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩で蛍光標識された）、および０．５ｍＬのプロピレングリコールを、ポリマー濃度が２５ｍｇ／ｍＬのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５エタノール系溶液１０ｍＬと混合した。その後、油系ポリマー溶液を、界面活性剤、つまり、１％（ｗ／ｖ）のＴＰＧＳ（ｄ−αトコフェリルポリエチレングリコール１０００サクシネート）を含む３０ｍＬの水相（媒体）に注いだ。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ポリマーを含まないレモン精油エタノール系溶液を加えることによって、コントロール製剤を調製した。次いで、得られたナノカプセル懸濁物を、減圧下でＲｏｔａｖａｐｏｒ（Ｂｕｉｃｈｉ  Ｒ−１４４、スイス）を用いて蒸発させて、エタノールを除去した。さらに特性評価するために、レモン精油を保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノカプセルの最終的な水系懸濁物を回収した。
【０１６８】
２．２  Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノカプセルの特性評価
粒径、ゼータ電位およびナノ粒子調製方法の収率を実施例１に記載したように測定した。蛍光標識されたレモン精油のカプセル化効率を計算するために、２ｍＬの水不混和性油（Ｍｙｇｌｉｏｌ（登録商標）８１２）を、０．５ｍＬのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノカプセルに加え、室温で１０分間振とうさせることによって遊離油を抽出した。励起波長５４０ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍの分光蛍光法（ＧＥＮｉｏｓ、ＴＥＣＡＮ、Ｇｒｏｅｄｉｇ、オーストリア）によって、遊離油の量をアッセイした。この目的のために、脂溶性蛍光プローブである１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩標準溶液を保持したレモン製油を用い、０．０５〜２．５μｇ／ｍＬの濃度範囲で較正曲線を作成した（ｒ＝０．９９６）。最後に、蛍光顕微鏡検査法（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＨ４０  Ｍｏｄｅｌ、Ｏｌｙｍｐｕｓ、スペイン）によって製剤を視覚化した。
【０１６９】
２．３  結果
第２表は、液体油（レモン油）を保持したＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノカプセルの主な物理化学的特徴を記載する。揮発性レモン精油は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノカプセルの中に効率的にカプセル化され、カプセル化された油の割合は約８２％であると観察された。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノカプセルの粒径は均一であり（約２１２ｎｍ）、負の電荷のゼータ電位を有していた。一方、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳポリマーを用いずに調製したコントロール製剤は、低い安定性を示し、したがって、油の相分離を示し、このコントロール製剤中の油滴の粒径は、５〜１５μｍの範囲で不均一であった。この特徴は、両製剤の蛍光顕微鏡検査法によって観察された（図５）。
【０１７０】
【表３】
0006001640.tif 000006
【０１７１】
実施例３
スプレー乾燥によるＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の調製および特性評価
この目的のために、５０ｍＬのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５エタノール系溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）を１００ｍＬの蒸留水と混合して、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子を形成した。異なる界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（１００ｍｇ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマー］（１００ｍｇ）、またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０［ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート］（７．５ｍｇ）をナノ粒子含水アルコール懸濁物に加えた。最後に、７．５ｇのマンニトールを賦形剤として加えた。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の乾燥粉末を得るために、懸濁物をＭｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ−ｄｒｙｅｒ  Ｂｕｅｃｈｉ  Ｂ１９１（Ｂｕｅｃｈｉ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ  ＡＧ、スイス）中で、以下の条件で乾燥させた。
注入口温度：９０℃、
排出口温度：６０℃、
スプレー流量：６００Ｌ／ｈ、
最大能力の９０％のアスピレーター。
【０１７２】
この方法の間、ナノ粒子懸濁物を緩やかな攪拌下に維持した。実施例１に示すようなさらなる特性評価のために、回収した粉末を密閉したガラス容器中に室温で保存した。
【０１７３】
第３表は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子懸濁物を異なる賦形剤を用いてスプレー乾燥した後に得られたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子の主な物理化学的特徴を記載する。スプレー乾燥方法の収率は、スプレー乾燥機から得られた乾燥粉末の重量と、加えた成分の初期理論重量との差として計算した。スプレー乾燥機から得られたナノ粒子の乾燥粉末は、容易に水に分散し、得られた粒径は、許容される多分散指数（０．２−０．３）を有し、均一であった。サンプルを再蒸留水に懸濁した後に得られたナノ粒子の粒径は、おおよそ２３０ｎｍであり、表面に負電荷を有していた。スプレー乾燥方法の収率は、使用した初期の理論乾燥固体の約８０％であった。
【０１７４】
【表４】
0006001640.tif 000007
【０１７５】
実施例４
Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子への大きい分子モデルとしてのウシ血清アルブミンのカプセル化
４．１  Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子へのＢＳＡのカプセル化
Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子に組み込まれる大きな分子の薬物モデルとして、蛍光標識されたタンパク質を使用した。この目的のために、異なる量のフルオレセインイソチオシアネートで標識されたウシ血清アルブミン（ＦＩＴＣ−ＢＳＡ）を使用した（０．５、１および２．５ｍｇ／２５０ｍｇのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５）。このタンパク質を１ｍＬの蒸留水に溶解し、次いで、５ｍＬのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５エタノール系溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）に加えた。この溶液を室温で５分間、磁気攪拌下で放置し、次いで９ｍＬの蒸留水を加え、ナノ粒子を形成した。得られたナノ粒子懸濁物を減圧下で、Ｒｏｔａｖａｐｏｒ（Ｂｕｅｃｈｉ  Ｒ−１４４、スイス）を用いて蒸発させて、エタノールを除去した。さらに特性評価するために、ＦＩＴＣ−ＢＳＡを保持したＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の最終的な水系懸濁物を集めた。
【０１７６】
４．２  ＦＩＴＣ−ＢＳＡを保持したＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の特性評価
粒径、ゼータ電位およびナノ粒子調製方法の収率を実施例１に記載したように測定した。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子へのＦＩＴＣ−ＢＳＡのカプセル化効率を計算するために、ナノ粒子懸濁物を２７，０００×ｇで２０分間遠心分離した。次いで、遊離ＦＩＴＣ−ＢＳＡの量を上澄み中でアッセイし、カプセル化されたタンパク質の量を、使用したタンパク質の初期量から概算した。この目的のために、ＦＩＴＣ−ＢＳＡ標準溶液を１〜５０μｇ／ｍＬの濃度範囲で用いて較正曲線を作成した（ｒ＝０．９９６）。４８５ｎｍ（励起波長）および５３５ｎｍ（発光波長）で分光蛍光法によってアッセイを行った（ＧＥＮｉｏｓ、ＴＥＣＡＮ、オーストリア）。ＦＩＴＣ−ＢＳＡを含有する新しく調製したナノ粒子を、ポリ−Ｌ−リジンでプレコーティングしたスライド（Ｓｉｇｍａ、スペイン）上にデポジットさせ、蛍光顕微鏡検査法（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＨ４０  Ｍｏｄｅｌ、Ｏｌｙｍｐｕｓ、スペイン）によって視覚化した。
【０１７７】
４．３  結果
第４表は、ＦＩＴＣ−ＢＳＡを保持したＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の主な物理化学的特徴を示す。Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子中にＦＩＴＣ−ＢＳＡをカプセル化すると、ナノ粒子の粒径は顕著に増大したが、ナノ粒子の表面電荷には影響を与えないことが観察された。カプセル化効率は約９６％であり、このことは、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子が、タンパク質のような大きな分子を組み込む能力が高いことを示していた。ＦＩＴＣ−ＢＳＡ  Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の蛍光顕微鏡検査法により、ナノ粒子ポリマーマトリックスへのＦＩＴＣ−ＢＳＡの高い組み込み（図６）が確認された。
【０１７８】
【表５】
0006001640.tif 000008
【０１７９】
この実施例は、大きな親水性化合物（ＢＳＡ）の高いカプセル化効率が達成されたことを示す（約９７％）。
【０１８０】
実施例５
Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子への小さな親水性薬物モデルとしてのＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂのカプセル化
１ｍＬの再蒸留水にあらかじめ溶解しておいた蛍光親水性分子（１ｍｇ）を５ｍＬのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５エタノール系溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）に加えることによって、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子を調製した。この溶液を室温で５分間、磁気攪拌下で放置し、次いで、９ｍＬの蒸留水を加え、ナノ粒子を形成した。得られたナノ粒子懸濁物を減圧下で、Ｒｏｔａｖａｐｏｒ（Ｂｕｅｃｈｉ  Ｒ−１４４、スイス）を用いて蒸発させて、エタノールを除去した。ナノ粒子に保持されたＲＢＩＴＣ［Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂイソチオシアネート］の量を５４０ｎｍで吸光光度法によって測定した（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  ｉＥＭＳ  Ｒｅａｄｅｒ  ＭＦ、フィンランド）。保持したＲＢＩＴＣの量は、加えた初期濃度と遠心分離工程の後に上澄みで測定した濃度との差から概算した。他で記載されている改変プロトコルにしたがって、ナノ粒子からのＲＢＩＴＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出を試験した［１８］。この目的のために、１ｍＬのナノ粒子懸濁物を３ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４と混合し、３７±１℃で攪拌下で放置した。異なる時間間隔で、ナノ粒子を透析管Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）１００，０００  ＭＷＣＯ（ＶＩＶＡＳＰＩＮ、ドイツ）によって集めた。５４０ｎｍでの吸光光度法によって透析物をアッセイし、放出したＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂの量を定量した。
【０１８１】
Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子は、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂのような小さな親水性分子を会合する高い能力を示した（第５表）。カプセル化効率は、加えたＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂの初期量の９９％であった。一方、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂのカプセル化によって、ナノ粒子の粒径が顕著に増加し（第５表）、ナノ粒子の表面電荷には影響を与えなかった。
【０１８２】
【表６】
0006001640.tif 000009
【０１８３】
実施例６
粘膜および局所への送達用途のための、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子への疎水性抗真菌薬物モデルとしてケトコナゾールのカプセル化
６．１  ケトコナゾール（ＫＴＺ）を保持したＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の製造
Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の疎水性分子を捕捉する能力を調べるために、ケトコナゾールを水不溶性疎水性分子として選んだ。ケトコナゾールは、イミダゾール抗真菌剤であり、水およびアルコールのような一般的な溶媒への溶解度がきわめて低いという特徴を有する。薬物結晶を溶解し、薬物結晶を含まない均一なナノ粒子を得るのに必要とされる、適切なケトコナゾール：ポリマー比（ｗ／ｗ）の選択を最初に最適化した。この目的のために、２００ｍｇのＫＴＺを異なる容積のコントロール溶液としての無水エタノール（１０、１５および２０ｍＬ）または同じ容積のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５エタノール系溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）に再懸濁させた。対応する容積の再蒸留水（２：１（ｖ／ｖ）水／ポリマー溶液）をＫＴＺを含有するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳアルコール系溶液に加えることによって、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子を製造した。並行して、同様の容積の再蒸留水をＫＴＺエタノール系溶液（Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳの可溶化効果を調べるための、ポリマーを含まないネガティブコントロール）に加えた。得られたＫＴＺを含有するナノ粒子懸濁物または含水アルコール溶液を減圧下で、Ｒｏｔａｖａｐｏｒ（Ｂｕｅｃｈｉ  Ｒ−１４４、スイス）を用いて蒸発させて、エタノールを除去した。最後に、さらなる特性評価および薬物含有量を定量するために、ＫＴＺを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の水系懸濁物およびポリマーを含まないＫＴＺ水系懸濁物を集めた。
【０１８４】
６．２  ＫＴＺナノ粒子の特性評価
粒径、ゼータ電位およびナノ粒子調製方法の収率を実施例１に記載したように測定した。蛍光および光学顕微鏡を用い、得られたＫＴＺを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子懸濁物中の結晶の存在を観察した。この目的のために、ＫＴＺを保持するナノ粒子および同じ方法によって処理された遊離薬物を走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって視覚化した。それに加え、ＫＴＺを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子を室温で２ヶ月間放置し、次いで、ナノ粒子の形態をＳＥＭによって観察した。ナノ粒子中のカプセル化された薬物の量を、２５７ｎｍでＵＶ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  １２０３  ＵＶ−ＶＩＳ）によってアッセイした。ナノ粒子懸濁物中のＫＴＺの量またはポリマーＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳを含まない遊離ＫＴＺ懸濁物の量を定量するために、新しく調製した製剤の全サンプルを減圧下で蒸発させて、エタノールを除去し、次いで、１ｍＬのトリプリケートのサンプルを２０，０００ｒｐｍで２５分間遠心分離した。その後、０．５ｍＬの上澄みをメタノールで希釈し、２５７ｎｍで分光光度計によってアッセイした［１４］。並行して、ナノ粒子沈殿物を３７℃で２日間放置し、残留水を蒸発させ、次いで、ＫＴＺを含有する製剤を１ｍＬのメタノールに溶解し、２５７ｎｍでアッセイした。２５ｍｇのＫＴＺを１００ｍＬのメタノールに溶解することによって較正曲線を作成した。較正曲線の各点（５〜３０μｇ／ｍＬ）をこの標準溶液から作成した。
【０１８５】
６．３  結果
第６表に示した結果から、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子が、ケトコナゾールのような水不溶性薬物分子をカプセル化する能力を示すことが結論づけられる。カプセル化効率は、加えたＫＴＺの初期量の約９７％であった。アルコール系溶液からＫＴＺを沈殿させた後に得られた結晶性沈殿物を含有する水系懸濁物について得られた定量結果は、ＫＴＺの水溶解度がおおよそ１１μｇ／ｍＬであり、既に公表されているデータと同様であることを示していた［１５］。このネガティブコントロールサンプル中の沈殿物の態様は、完全に結晶性であった。
【０１８６】
一方、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子（ＮＰＧＥＳ−ＫＴＺ１、ＮＰＧＥＳ−ＫＴＺ２およびＮＰＧＥＳ−ＫＴＺ３）に対するＫＴＺの会合は、コントロール（ＧＥＳ−ＮＰ）と比較して、表面の負電荷を減少させた。異なるポリマー濃度でＫＴＺを含有するナノ粒子の粒径は、均一であり（約２００ｎｍ）、おおよそ２〜１０μｍの薬物結晶が存在しないことを示していた。これらの薬物結晶は、ナノ粒子を形成するために用いられるＫＴＺを含有するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳアルコール系溶液と同じ方法でＫＴＺアルコール系溶液を処理した後にのみ観察された。この事実は、ＫＴＺ結晶およびＫＴＺを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の両方をＳＥＭによって視覚化した後観察された（図７）。室温で少なくとも２ヶ月間放置したナノ粒子について、ＳＥＭから同様の結果が得られ、結晶の成長および形成は観察されなかった（図７Ｃ）。これらの結果は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子が、ＫＴＺのような疎水性薬物の水への溶解度を高めることを示している。
【０１８７】
【表７】
0006001640.tif 000010
【０１８８】
実施例７
粘膜および局所への送達用途のためのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子への疎水性抗菌薬物モデルとしてのトリクロサン（ＴＲＩ）のカプセル化
７．１  トリクロサンを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の製造
トリクロサン（ＴＲＩ）を保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子を得るために、異なる量のトリクロサン（ＴＲＩ）を使用した。この目的のために、１２ｍｇおよび２０ｍｇのＴＲＩを５ｍＬのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５エタノール系溶液に４０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。１０ｍＬの再蒸留水を加えることによって、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子を製造した。その後、有機溶媒（エタノール）を減圧下でＲｏｔａｖａｐｏｒ（Ｂｕｅｃｈｉ  Ｒ−１４４、スイス）を用いて蒸発させて、エタノールを除去し、ナノ粒子中のＴＲＩの最終的な合計濃度は０．１２％または２％（ｗ／ｖ）であった。さらなる特性評価および薬物含有量を定量するために、ＴＲＩを含有するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子の水系懸濁物を集めた。
【０１８９】
一方、エタノールの蒸発工程を避け、低エタノール含有量の最終的なナノ粒子懸濁物を得るために、ｉｎ  ｓｉｔｕで自己組織化する技術を適用し、ＴＲＩを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子を得た。この目的のために、ポリマー（Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５）のプロピレングリコール（ＰＧ）（ＧＥＳ−ＰＧ溶液）溶液を濃度５％（ｗ／ｖ）で調製した。次いで、対応する量のＴＲＩをプロピレングリコールポリマー溶液（ＴＲＩ−ＰＧ溶液）に溶解することによって、ＴＲＩ溶液を調製した。ＧＥＳ−ＰＧ溶液およびＴＲＩ−ＰＧ溶液を一緒に混合した（ＧＥＳ−ＴＲＩ−ＰＧ溶液）。その後、ＧＥＳ−ＴＲＩ−ＰＧ溶液を水（１０ｍＬ）に加えることによって、ＴＲＩを含有するナノ粒子を形成した。
【０１９０】
並行して、ＴＲＩを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子の溶解度に対するアジュバント効果を調べるためのコントロールとして使用するためにＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５を用いずに、同じ濃度のＴＲＩを両方の技術（溶媒置換技術およびｉｎ  ｓｉｔｕでの自己組織化技術）に用いた。
【０１９１】
７．２  トリクロサンを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ  ナノ粒子の特性評価
粒径、ゼータ電位およびナノ粒子調製方法の収率を実施例１に記載したように測定した。走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）および蛍光顕微鏡検査法を用い、得られたＴＲＩを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子の懸濁物およびネガティブコントロール製剤（すなわち、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５を含まない）における結晶の存在を観察した。ナノ粒子中でカプセル化された薬物の量を、２８０ｎｍでＵＶ分光光度計によって評価した［９］（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  １２０３  ＵＶ−ＶＩＳ）。ナノ粒子懸濁物中のＴＲＩの量を定量するために、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子の全サンプルを減圧下で蒸発させて、エタノールを除去するか、または、ＴＲＩ−ＰＧ製剤の場合には直接評価した。この目的のために、１ｍＬのサンプル（トリプリケートで）を２００００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。その後、０．５ｍＬの上澄みをメタノールで希釈し、２８０ｎｍで分光光度計によってアッセイした。較正曲線の各点（１０〜４０μｇ／ｍＬ）をこの標準溶液から作成した。
【０１９２】
７．３  結果
結果を第７表に示す。この結果を考慮すると、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子は、トリクロサン（ＴＲＩ）のような水不溶性薬物分子をカプセル化する高い能力を示すと結論づけることができる。溶媒置換法により得られるナノ粒子の場合、カプセル化効率は、加えたＴＲＩの初期量の約９７％であった。しかし、自己組織化技術によって得られたナノ粒子の場合、カプセル化効率は顕著に低下した（８２％）。異なる濃度でＴＲＩを含有するナノ粒子の粒径は、均一であり（約１４０ｎｍ）、このことは、おおよそ５０〜２００μｍの薬物結晶が存在しないことを示していた（図８Ａ）。この特徴は、ＴＲＩ結晶（ネガティブコントロール製剤）およびＴＲＩを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子のＳＥＭによる視覚化によって観察された（図８Ｂ）。これらの結果は、ナノ粒子製剤中に薬物結晶が存在しないため、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子が、ＴＲＩのような疎水性薬物の水溶解度を高めることを示している。驚くべきことに、所定量の水（ナノ粒子を得るのに必要な量よりも多かった）を、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５を含まないＴＲＩのアルコール系溶液に加えた後、ＴＲＩは、非結晶性油相として沈殿し、粒径の大きな油系粒子を有するエマルションを形成した。この油は、脂溶性蛍光プローブである１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩で染色したＴＲＩエマルションについて、ＳＥＭ（図８Ｃ）および蛍光顕微鏡検査法によって視覚化することができた（図８Ｄ）。ＴＲＩの油相は、水中で大きな密度を有し、油滴が融合した後、油層として沈殿した。
【０１９３】
【表８】
0006001640.tif 000011
【０１９４】
実施例８
脱毛用途のためのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子への疎水性薬物モデルとしてのミノキシジル（ＭＸＤ）のカプセル化
８．１  ＭＸＤを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の製造
ＫＴＺを保持するＧａｎｔｒｅｚ  ＥＳ（登録商標）ナノ粒子について既に記載したように（実施例６）、ＭＸＤを保持するＧａｎｔｒｅｚ  ＥＳ（登録商標）ナノ粒子を調製した。この目的のために、２００ｍｇおよび２５０ｍｇのＭＸＤを５ｍＬのエタノール系溶液または５ｍＬのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５エタノール系溶液に溶解した（５０ｍｇ／ｍＬ）。次いで、磁気攪拌下で、１０ｍＬの再蒸留水を５ｍＬのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５アルコール系溶液に加えることによって、ＭＸＤを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子を製造した。得られたナノ粒子の懸濁物またはＭＸＤを含有する得られた含水アルコール溶液を、減圧下でＲｏｔａｖａｐｏｒ（Ｂｕｅｃｈｉ  Ｒ−１４４、スイス）を用いて蒸発させて、エタノールを除去した。最後に、さらなる特性評価および薬物含有量を定量するために、ＭＸＤを含有するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子の水系懸濁物を集めた。最後に、プロピレングリコール、ＰＥＧ４００（分子量（Ｍｗ）４００Ｄａのポリエチレングリコール）、およびグリセロール（１０％（ｖ／ｖ））など、ポリマー（Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ）と適合性のある可塑剤として使用する異なる賦形剤を加えた。
【０１９５】
８．２  ＭＸＤナノ粒子の特性評価
粒径、ゼータ電位およびナノ粒子調製方法の収率を実施例１に記載したように測定した。製剤の物理的安定性を調べるために、ＭＸＤを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子を厳しく高温な条件で放置し（３７℃で１ヶ月）、ポリプロピレンまたはガラス容器の両方で結晶の成長または沈殿現象をモニタリングした。製剤の粒径および全体的な態様を１日に１回確認した。それに加え、巨視的および微視的な特性評価（光学顕微鏡法および走査型電子顕微鏡法）を用い、ＭＸＤを含有するナノ粒子ポリマー乾燥膜または市販の製剤の外観および物理特性を観察した。この目的のために、２００μＬのサンプル［２％（ｗ／ｖ）のＭＸＤ］をプラスチック表面に適用し、次いで、頭皮に適用した後に起こる現象をシミュレーションするために、サンプルを３７℃で乾燥させた。使用した製剤は、ＭＸＤと異なる賦形剤（プロピレングリコール、ＰＥＧ４００およびグリセロール）とを含むＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子、エタノール、プロピレングリコール、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）および水を含有するＭＤＸの市販製剤（Ｌａｃｏｖｉｎ（登録商標）２％）、γ−シクロデキストリン、プロピレングリコール、エタノールおよび水を含有する市販製剤（Ａｌｏｐｅｘｙ（登録商標）２％）であった。これらの製剤を乾燥表面に適用し、その態様を巨視的および微視的にモニタリングした。最後に、ナノ粒子中のカプセル化された薬物の量を２８６ｎｍでＵＶ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  １２０３  ＵＶ−ＶＩＳ）によってアッセイした。この目的のために、１ｍＬのサンプル（トリプリケートで）のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子を２００００ｒｐｍで２５分間遠心分離した。その後、０．５ｍＬの上澄みをエタノールで希釈し、２８６ｎｍでＵＶ分光光度計によってアッセイした［１６］。
【０１９６】
８．３  結果
一般的に、ＭＸＤを保持し、賦形剤を含むか、または含まないＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子は、約１３０ｎｍの均一な小さな粒径を示し（ＰＤＩ  ０．１）、負電荷のゼータ電位を示した（−５４ｍＶ）。両製剤において、カプセル化効率はかなり高く、一方は２００ｍｇのＭＸＤを保持し、他方は２５０ｍｇのＭＸＤを保持し、加えたＭＸＤの初期量の約７０％であった（第８表）。厳しい物理的条件下での、製剤の物理的安定性試験、３０日間にわたる毎日の粒径モニタリング、および巨視的な視覚化において、粒径の変化（図９）、またはポリプロピレンまたはガラス容器中での沈殿は示されなかった。これらの結果から、カプセル化されていないＭＸＤは、ナノ粒子の水系懸濁物中に溶解したままであることが確認された。
【０１９７】
【表９】
0006001640.tif 000012
【０１９８】
一方、ＭＸＤ（２％）を含有し、異なる賦形剤を含むＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子、エタノール、プロピレングリコールおよび水を含有するＭＤＸの市販製剤（Ｌａｃｏｖｉｎ（登録商標）２％）、およびγ−シクロデキストリン、プロピレングリコール、エタノールおよび水を含有する市販製剤（Ａｌｏｐｅｘｙ（登録商標）２％）について、巨視的および微視的な視覚化アッセイを行った。図１０は、適用した製剤の巨視的および微視的な態様を記載する。この図において、乾燥前のサンプルの態様は、ナノ粒子製剤の場合は乳白状であり、市販製品の場合は透明であった。しかし、乾燥させて２時間後、市販製品の結晶性膜は、目で見てわかる大きな白色の結晶層を有していることが観察された。一方、ＰＥＧ４００またはプロピレングリコールを含有するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子サンプルは、大きな結晶性の沈殿は観察されず、透明な接着性膜を示した。グリセロールを含むＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子を含有するサンプルは、わずかな乳白色のきれいな外観を有しており、結晶性の沈殿はみられなかった。それに加え、賦形剤を含んでいない、ＭＸＤを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子は、乾燥した割れ目の多い薄膜の外観を示したが、目に見える結晶はなかった（図１０）。さらに、異なる賦形剤（ＮＰＧＥＳ−ＭＸＤ  Ｇ、ＮＰＧＥＳ−ＭＸＤ  ＰＥＧおよびＮＰＧＥＳ−ＭＸＤ  ＰＧ）を含んでいる、ＭＸＤを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子は、１２時間後に乾燥膜を形成しなかった。しかし、市販製品では２時間以内に、そして、賦形剤を含んでいない、ＭＸＤを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５では４時間以内に乾燥沈殿が観察された。微視的な試験は、巨視的な結果を確認するものであり、すなわち、市販製品であるＬａｃｏｖｉｎ（登録商標）およびＡｌｏｐｅｘｙ（登録商標）では最初の２時間以内に大きな結晶が観察された。ＭＸＤナノ粒子製剤は、残留膜の態様に顕著な差異があった。これに関し、賦形剤を含んでいない、ＭＸＤを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子は、筋のついた容易に壊れる膜を示した（ＮＰＧＥＳ−ＭＸＤ）。この現象は、プロピレングリコール、グリセロールまたはＰＥＧのような賦形剤を含有するＭＸＤナノ粒子の乾燥膜では観察されなかった。それに加え、ＭＸＤナノ粒子製剤を含有する任意の乾燥膜では、大きな結晶は観察されなかった。
【０１９９】
図１１は、ＭＸＤを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子製剤およびＭＸＤの市販製剤について実施したＳＥＭを示す。この図から得られたデータは、実際に、図１０に示した結果と相関関係にあり、図１０に示した結果を確認するものであった。市販製品（Ｌａｃｏｖｉｎ（登録商標）およびＡｌｏｐｅｘｙ（登録商標））の場合、大きな結晶の沈殿物が観察された。一方、ＭＸＤナノ粒子製剤（ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ、ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ  Ｇ、ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ  ＰＧおよびＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ  ＰＥＧ）の場合、大きな結晶は観察されなかった。賦形剤を含まないＭＸＤナノ粒子製剤（ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ）およびグリセロールを含むＭＸＤナノ粒子（ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ  Ｇ）は、両方とも、均一な平均粒径分布を有するナノ粒子を含有する均一な膜の存在を示した。驚くべきことに、ＰＧまたはＰＥＧを含み、ＭＸＤを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子を含有する乾燥膜では、ナノ粒子が検出されなかったが、これは、水を蒸発させた後、これらの賦形剤へのポリマーの溶解度に起因するものであろう。ＰＥＧ４００を含有する製剤では、いくつかの大きな沈殿物（ポリマー膜層）が観察されたことに留意することが重要であり、このことは、ポリマーのいくつかのカルボキシル基とＰＥＧとの相互作用に関係があるであろう。この沈殿物の種類および性質を特定するために、さらなる観察が必要である。最後に、すべての膜はきれいな外観を有しており、光接着性の粘着性のテクスチャーを有していた。
【０２００】
実施例９
毛髪に対するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の生体接着親和性
この試験の目的は、毛髪に対するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の接着能を調べることであった。この目的のために、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを含む、蛍光標識されたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子を使用した。蛍光親水性分子（２００μｇ）をあらかじめ２００μＬの再蒸留水に溶解しておき、これを５ｍＬのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５エタノール系溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）に加えることによって、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子を調製した。この溶液を磁気攪拌下室温で５分間放置し、次いで、９．３ｍＬの蒸留水を加え、ナノ粒子を形成した。得られたナノ粒子懸濁物を減圧下で、Ｒｏｔａｖａｐｏｒ（Ｂｕｅｃｈｉ  Ｒ−１４４、スイス）を用いて蒸発させて、エタノールを除去し、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子中にカプセル化されたＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂの量を実施例５に記載したようにアッセイした。その後、ナノ粒子の水系懸濁物に５００μＬのグリセロールを加え、最終容積が１０ｍＬであり、グリセロール濃度が５％（ｖ／ｖ）のナノ粒子懸濁物を得た。接着性アッセイの場合、通常の黒い女性の毛髪（１００ｃｍ長さ）を石鹸および温水（７０℃）で５分間洗浄した。次いで、この毛髪を５ｃｍの長さに切り分け、２群（Ｍ１およびＭ２）に分けた。毛髪サンプルをヘアドライヤーから誘導した温風で５分間乾燥させた。その後、乾燥した毛髪を、蛍光標識されたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子に３０秒間浸し、次いで、放置して室温で乾燥させた。乾燥させた後、Ｍ１群の毛髪を蛍光顕微鏡法および走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって視覚化した。Ｍ２群の毛髪サンプルを再び石鹸および温水（７０℃）で５分間洗浄し、次いで、Ｍ１群について記載したように蛍光顕微鏡法およびＳＥＭによって視覚化した。両群（Ｍ１およびＭ２）の毛髪に接着したナノ粒子の量を定量するために、毛髪を３ＭのＮａＯＨで消化し、毛髪に接着したポリマー系ナノ粒子を溶解し、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを抽出した。毛髪に接着したナノ粒子のフラクションを評価するために、毛髪に接着したナノ粒子のフラクションの量を、５４０ｎｍ（励起波長）および５８０ｎｍ（発光波長）で分光蛍光法によってアッセイした（ＧＥＮｉｏｓ、ＴＥＣＡＮ、Ｇｒｏｅｄｉｇ、オーストリア）。データは、毛髪１ｍｇあたりまたは毛髪の表面積１ｃｍ２あたりに接着したフラクションによってあらわされた。
【０２０１】
毛髪サンプルに接着したフラクションの量は、Ｍ１群では、約９．５μｇ（ナノ粒子）／ｃｍ２（毛髪表面積）であることが確認された。他の毛髪サンプル群（Ｍ２）では、ナノ粒子が接着したフラクションの量は、毛髪の洗浄によって減少したが、ナノ粒子は、依然として毛髪表面に接着していることが確認された（３．５μｇ（ナノ粒子）／ｃｍ２（毛髪表面積））。蛍光顕微鏡法およびＳＥＭ（図１２および図１３）により、毛髪表面に対するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ４２５ナノ粒子の接着親和性が初期に高いことが確認された。それに加え、Ｍ１群において毛髪表面に接着したナノ粒子の乾燥膜は、洗浄および高温条件に耐え、Ｍ２群でみられるように、ナノ粒子は、毛髪表面に接着したままであった。さらに、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の膜を含有する毛髪の態様はきれいであり、透明であり、輝いており、乾燥後に黒い残留物は示されなかった。
【０２０２】
実施例１０
ブタの頬粘膜におけるＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子のｅｘ  ｖｉｖｏでの粘膜親和性試験
１０．１  定量的生体接着性アッセイ
Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の生体接着能（生体接着性）および粘膜親和性を調べるために、新しく得たブタの頬粘膜および舌背面を使用した。この目的のために、地方の屠殺場からブタの頭部を得て、頬粘膜または舌背面の粘膜を手術によって単離した。手術用ハサミを用い、下側にある結合組織から上皮を取り除き、２ｃｍ２の円形領域を切断した。次いで、組織サンプルを４℃でＰＢＳ中に保存し、２時間以内に使用した。フランツセルコンパートメントの引っ張り用フラットフランジの間に組織を固定し、ナノ粒子製剤の異なるサンプルをドナーコンパートメントにデポジットした。この場合、ナノ粒子製剤は、下記の５００μＬであった。
（ｉ）実施例９に開示されるように調製した、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを含み、グリセロールを用いない、蛍光標識されたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子の水系懸濁物、
（ｉｉ）Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを含む、蛍光標識されたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の水系懸濁物、
（ｉｉｉ）ヒアルロン酸ナトリウムゲルに再懸濁させた、蛍光標識されたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子（０．７５％ｗ／ｖ）、および
（ｉｖ）ヒアルロン酸ナトリウムゲルに再懸濁させた、蛍光標識されたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒（０．７５％ｗ／ｖ）。
【０２０３】
粘膜表面へサンプルを適用するために、ドナーコンパートメントの片側（組織１ｃｍ２）を、乱流攪拌下で５００μＬの水系ナノ粒子懸濁物のみに３０秒間さらし、口腔洗浄条件をシミュレーションした。次いで、このコンパートメントからサンプルを取り出し、製剤を７５ｍＬの疑似唾液［１９］〜［２０］に３７℃で６時間さらした。ヒアルロン酸ナトリウムゲルを適用する場合、ヒアルロン酸ゲルに組み込まれた等量のナノ粒子がコンパートメント内に残った。異なる時間間隔で組織サンプルを取り出し、、実験中にサンプルにさらした１ｃｍ２領域を切断し、単離した。接着したナノ粒子の量を既に記載したようにアッセイした［１２］。簡潔に言うと、各粘膜片を３ＭのＮａＯＨ２ｍＬで２４時間消化した。３ＭのＮａＯＨを加えることによってサンプルを３ｍＬに希釈し、１０分間ボルテックスし、２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。最後に、粘膜に接着したナノ粒子のフラクションを評価するために、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂの量を、５４０ｎｍ（励起波長）および５８０ｎｍ（発光波長）で分光蛍光法によってアッセイした（ＧＥＮｉｏｓ、ＴＥＣＡＮ、Ｇｒｏｅｄｉｇ、オーストリア）。コントロール組織を含むＲｈｏｄａｍｉｎｅ  ＢのＮａＯＨ（３Ｍ）溶液（０．０５〜１μｇ／ｍＬ）を加えることによって、生体接着性試験の標準曲線を作成した（ｒ＞０．９９６）。
【０２０４】
１０．２  蛍光顕微鏡検査法による組織の視覚化
頬および舌の粘膜におけるＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子製剤の分布を蛍光顕微鏡検査法によって視覚化した。この目的のために、異なる製剤にさらされた粘膜表面サンプルを取り出し、曝露してから２．５時間後にＰＢＳを用いて洗浄した。次いで、手術用ハサミを用いて粘膜を小片に切断し、組織処理媒体ＯＣＴ（最適切断温度）（Ｓａｋｕｒａ、オランダ）で処理し、液体窒素で凍結させた。組織サンプルをクライオスタット（２８００  Ｆｒｉｇｏｃｕｔ  Ｅ、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ、ドイツ）中で長手方向に５μｍの片に切断し、ポリ−Ｌ−リジンであらかじめコーティングしておいたスライド（Ｓｉｇｍａ、スペイン）に付着させ、蛍光顕微鏡による視覚化の前に−２０℃で保存した。
【０２０５】
１０．３  結果
図１４は、ブタの頬および舌背面双方の粘膜における、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５およびＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮコポリマーについて、組織１ｃｍ２あたり、ナノ粒子（ＮＰ）製剤の接着した部分の累積量をあらわす（μｇ（ＮＰ）／ｃｍ２（組織））。一般的に、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子（ＮＰ  ＧＥＳＲ）は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子（ＮＰ  ＧＡＮＲ）よりも高い接着能を示す。しかし、両方の種類のナノ粒子は、時間０（０時間）で同様の初期接着力を示した。１時間目、２．５時間目、４時間目および６時間目に、両方の種類のブタ粘膜において、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子の累積的な接着部分は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の累積的な接着部分の約２〜３倍であった（Ｐ＜０．０５）。ナノ粒子を含有するゲル製剤の場合、ヒアルロン酸ゲルが、時間０で、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子懸濁物と比較して、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子（ＧＥＬ  ＮＰＧＥＳＲ）の初期接着能を約２倍高めていることが観察された。それに加え、１時間目、２．５時間目、４時間目および６時間目に、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子を含有するゲルについて、生体接着能の顕著な向上が観察された。驚くべきことに、この現象は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮゲル製剤（ＧＥＬ  ＮＰＧＡＮＲ）の場合には観察されず、水系懸濁物（ＮＰ  ＧＡＮＲ）と、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子を含有するゲル（ＧＥＬ  ＮＰＧＡＮＲ）との間に顕著な差は観察されなかった。
【０２０６】
図１５は、蛍光標識されたナノ粒子製剤を投与してから０．５時間後および２．５時間後に、両方の頬粘膜組織の蛍光顕微鏡画像を示す。コントロール組織（ナノ粒子製剤を含まない）は、組織において低い蛍光強度を示す（図１５Ｂ）。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子は、唾液とともに組織をインキュベーションしてから０．５時間後に、頬粘膜の粘膜層で高い蛍光強度を示し（図１５Ｃ）、２．５時間目も同様であった（図１５Ｅ）。一方、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の組織蛍光強度は、インキュベーションしてから０．５〜２．５時間後に、投与してから２．５時間後のコントロールとほぼ同じ程度まで低下した（図１５Ｄおよび図１５Ｆ）。これらのデータにより、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５は、頬粘膜において、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子よりも高い親和性と、長い滞留時間を有することが確認された。それに加え、すべての場合において、ナノ粒子が粘膜下組織に浸透していないことが観察された。
【０２０７】
図１６は、蛍光標識されたナノ粒子製剤を投与して２．５時間目の舌の背面粘膜表面の蛍光顕微鏡画像を示す。頬粘膜組織と類似の組織（ブタの舌の背面粘膜）において、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ２２５ナノ粒子（図１６Ｃおよび図１６Ｄ）は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子よりも高い親和性と、長い滞留時間を有することを示している（図１６Ｂ）。
【０２０８】
実施例１〜１０の全体的な考察
本発明者らは、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを用いて製造される生体接着性ナノ粒子（マトリックスナノスフェアまたはシェルナノカプセル）の製造について、溶媒蒸発法およびｉｎ  ｓｉｔｕでの自己組織化技術を最適化した。
【０２０９】
このことに関し、驚くべきことに、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルを含有する、医薬品または化粧品として許容される溶媒、例えば、エタノールまたはポリオール（例えば、プロピレングリコール）と、水系溶液（場合により、１種又はそれ以上の賦形剤を含有してもよい）を混合すると、非常に均一な小さな粒径を有するナノ粒子が自発的に形成され得ることを見出した。溶媒蒸発法の場合には、そのようにして得られるナノ粒子の平均粒径は、約１２５〜１４５ｎｍ、典型的には、約１３０〜１３５ｎｍであり、高い製造収率を有していた（おおよそ９８％）。
【０２１０】
それに加え、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するｉｎ  ｓｉｔｕで自己組織化するナノ粒子（ＳＡＮＰ）を得ることが可能であった。このｉｎ  ｓｉｔｕ自己組織化技術によって、ナノ粒子をｉｎ  ｓｉｔｕで形成することができ、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルが水系媒体（例えば、水）または体液（例えば、胃腸管液）と接触したときに、ナノ粒子中に対象生成物（ＰＯＩ）をカプセル化することができる。
【０２１１】
（ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルの使用に基づく）本発明のナノ粒子を製造するための方法が簡便であることは、他のＰＶＭ／ＭＡ誘導体、例えば、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−無水マレイン酸）（ＰＶＭ／ＭＡ）コポリマー（Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ）に由来するナノ系について報告されている任意の特殊な装置を使用することなく本発明のナノ系を得ることが簡便となるために、工業スケールでの費用を低減させる。
【０２１２】
本発明のナノ粒子の重要な利点は、水系媒体中での本発明のナノ粒子の長期安定性（分解速度）が、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ系のそれよりも高いことであり（図２）、すなわち、本発明のナノ粒子は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ系よりも、水系媒体中の長期安定性試験において、低い分解速度を示す。
【０２１３】
乳化技術を適用し、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮからＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）Ｓへの加水分解に起因して、水系媒体中のナノ系について短期安定性試験で安定性を示すＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ系を得た。同様に、水系媒体中で、これらのナノ粒子を非常に迅速に溶解させることができる。水系媒体中でのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ系の安定化には、ポリアミン化合物、毒性のある架橋剤、例えば、１，３−ジアミノプロパン（ＤＰ）、または免疫原性分子、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた化学修飾が必要である。ＤＰのみの添加では、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でのＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の安定性の向上は弱く、架橋していないＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の場合に４０％であるのに対し、２時間以内に２０％の加水分解速度を達成した。架橋しているＰＶＭ／ＭＡナノ粒子の他の欠点としては、ナノ粒子の平均粒径が顕著に大きくなること、およびナノ系の生体接着能が著しく低下することが挙げられる。しかし、本発明のナノ粒子は、架橋する必要がなく、その結果、このナノ粒子を、毒性のある架橋剤分子、凍結乾燥または他の乾燥技術を使用する必要なく、水系懸濁物の形態で市販化することができる。それに加え、化粧品業界および医薬品業界で広く使用される多くの投与形態（例えば、液体、半固体または固体の形態）に容易に組み込むことができる。
【０２１４】
本発明のナノ粒子は、様々な種類の分子、例えば、大きな親水性化合物、例えば、ＢＳＡ（実施例４）、および小さな親水性化合物、例えば、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ（実施例５）をカプセル化する高い能力を示す。しかし、ポリマーの有機相（Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮのアセトン溶液）に水溶性薬物を組み込むというＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の能力に関連して、問題点がいくつか報告されている。知られているように、水溶性薬物は、アセトンには不溶性であり、含水アルコール溶液を加え、ナノ系の形態でＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮを沈殿させると、大きなサイズの結晶を形成し、ナノ粒子の形成を妨害することがある。この理由のために、水溶性薬物である５−フルオロウリジン（ＦＵＲＤ）を既に形成しておいたナノ粒子と単にインキュベートすることによって、この薬物がＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子に保持され、その結果、非常に低いカプセル化効率が得られた（約１３％）。
【０２１５】
一方、油を含有するコア−シェル小胞性ナノカプセルの製造は、本発明によって最適化されている。レモン精油は、本発明のナノ粒子に効率よくカプセル化され（約８２％のカプセル化効率）、本発明によって提供されるＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するナノカプセルの平均粒径は、均一であった（約２１２ｎｍ）［実施例２］。
【０２１６】
水に難溶性の化合物と組み合わせて、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ由来のナノ粒子中にパクリタキセルのような疎水性薬物をカプセル化するために、シクロデキストリン（ＣＤ）のような錯化剤、またはポリエチレングリコールおよびアミノ酸（グリシン）を含む可溶化剤が必要である。実際に、錯化剤または可溶化剤を用いない場合、疎水性（脂溶性）化合物のカプセル化効率は、加えられた初期量の１％未満であった。他の種類のＰＶＭ／ＭＡ誘導体コポリマー、例えば、二重乳化技術によって調製されたＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＭＳ由来のミクロスフェアは、疎水性化合物のカプセル化効率が低いことが示される（トリクロサンの場合、約３０％）。
【０２１７】
しかし、本発明によれば、高いカプセル化効率を保ちつつ、水に難溶性またはほとんど溶解しない化合物（例えば、疎水性化合物または脂溶性化合物）をＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来のナノ粒子（本発明）中でカプセル化することが可能である。実施例６、７および８は、疎水性薬物、例えば、ケトコナゾール（ＫＴＺ）、トリクロサン（ＴＲＩ）およびミノキシジル（ＭＸＤ）のＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するナノ粒子（本発明）への組み込みを示す。実施例６〜８に示されているように、ナノ粒子中のＫＴＺのカプセル化効率は、加えられた初期量の約９７％であり（第６表）、ＴＲＩのカプセル化効率は約９７％であり（第７表）、そしてＭＸＤのカプセル化効率は約７２％であった（第８表）。さらに、ｉｎ  ｓｉｔｕで自己組織化するナノ粒子（ＳＡＮＰ）を製造するためのｉｎ  ｓｉｔｕ自己組織化技術を適用し、トリクロサンをカプセル化し、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来のＳＡＮＰ（本発明）中のトリクロサンの高いカプセル効率が得られた（おおよそ８２％−第７表）。ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来のナノ粒子（本発明）に対する薬物（ＫＴＺ、ＴＲＩおよびＭＸＤ）の会合は、使用したコポリマーの初期量から形成されたナノ粒子の割合に影響を及ぼさず、９５％以上の範囲で維持された（第６〜８表）。一方、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来のナノ粒子（本発明）に由来するナノ粒子の使用によって、ほとんど水に溶解しない化合物または水難溶性化合物の溶解度を高め、その結果、水系媒体中の対応する薬物の結晶形成を有効に抑制することが観察された。
【０２１８】
実施例６は、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステル（本発明）に由来するケトコナゾールを保持するナノ粒子の製造を開示しており、ほとんど水に溶解しない抗真菌剤または水難溶性抗真菌剤の制御放出のために、このナノ系を薬物送達系として適用してもよいことを開示する。高温高圧均質化技術によって、ケトコナゾール（ＫＴＺ）を保有する固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）およびナノ構造化脂質担体（ＮＬＣ）を得たが、ＫＴＺの脂質製剤は、ある程度の物理的および化学的な不安定性を示した。しかし、本発明によって提供され、異なるポリマー濃度でＫＴＺを含有する、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＫＴＺを保持するナノ粒子は、均質であり（平均粒径が約２００〜２３５ｎｍ）、粒径がおおよそ２〜１０μｍの薬物結晶が存在しないことを示していた。これらの薬物結晶は、ナノ粒子を形成するために用いられるＫＴＺを含有するＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのアルコール系溶液と同じ方法によってＫＴＺアルコール系溶液を処理した後にのみ観察された。この事実は、ＫＴＺ結晶およびＫＴＺを保持するＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳナノ粒子の両方を走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって視覚化した後観察された（図７）。室温で少なくとも２ヶ月間放置したナノ粒子について、ＳＥＭから同様の結果が得られ、結晶の成長または形成は観察されなかった（図７Ｃ）。これらの結果は、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＫＴＺを保持するナノ粒子が、ＫＴＺのような疎水性薬物の水への溶解度を高め、ナノ粒子の最終的な水系懸濁物中でＫＴＺの結晶化または沈殿を阻害することを示す。
【０２１９】
同様に、トリクロサン（ＴＲＩ）のカプセル化効率は、溶媒置換法により得られた、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＴＲＩを保持するナノ粒子（本発明）中に加えられた初期量の約９７％であり、ｉｎ  ｓｉｔｕ自己組織化技術によって得られた本発明のＴＲＩを保持するナノ粒子では約８０％であった。ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＴＲＩを保持するナノ粒子の水系懸濁物中に異なる濃度（０．１２％および０．２％（ｗ／ｖ））でＴＲＩを含有する本発明によって提供されるＴＲＩを保持するナノ粒子の粒径は、均一であり（約１４０ｎｍ）、粒径がおおよそ５０〜２００μｍの薬物結晶が存在しないことを示していた（図８Ａ）。これらの薬物結晶は、ナノ粒子を形成するために用いられるＴＲＩを含有するＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルのアルコール系溶液と同じ方法によってＴＲＩアルコール系溶液を処理した後にのみ観察された。この事実は、ＴＲＩ結晶およびＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＴＲＩを保持するナノ粒子の両方を走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって視覚化した後観察された（図８Ｂ）。これらの結果は、ナノ粒子製剤中に薬物結晶が存在しないため、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＴＲＩを保持するナノ粒子が、ＴＲＩのような疎水性薬物の水への溶解度を高めることを示す。さらに、本発明によって提供されるナノ粒子中にＴＲＩを含ませることによって、ナノ粒子の最終的な水系懸濁物中でＴＲＩの結晶の形成（結晶化）および沈殿を抑制すると考えられる。
【０２２０】
異なる試験は、複雑な乳化技術および毒性のある有機溶媒を使用することによってポリマーミクロ粒子およびナノ粒子がＴＲＩを含むことを記載する。これに関し、溶媒置換法による乳化−拡散によって、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｅ１００をポリマーとして用い、にきびを治療するためのＴＲＩを保持するＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ナノ粒子を調製した。高いカプセル化効率が得られたが（９５．５％）、ナノ粒子の製造は、毒性のある有機溶媒（メチルエチルケトン）を用いる乳化方法を含む、複雑な技術を必要とする［１７］。同様に、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＬＡ）およびセルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）およびポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）を安定化剤として用い、ＴＲＩを保持するナノ粒子を調製した。これらのＴＲＩを保持するナノ粒子は、ＰＬＧＡのような非生体接着性ポリマーに基づく歯周の治療のために設計された。カプセル化効率は、約６３％であり、複雑な乳化−拡散方法を適用し、ナノ粒子を得た。さらに、ＴＲＩを含有するキトサン／ゼラチンマイクロカプセルをスプレー乾燥法によって調製した。二重乳化溶媒蒸発技術によって、口腔に適用するための粘膜接着性の、ＴＲＩを保持するポリマーミクロスフェアを調製し、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＭＳ−９５５、カルボポール（登録商標）９７４Ｐ、ポリカルボフィルまたはキトサンから調製したミクロスフェアにＴＲＩを組み込んだ。一般的に、ＴＲＩの薬物保持効率は、キトサンの場合（約７０％）を除き、使用したすべてのポリマーについて約３０％であった。しかし、脂溶性ＴＲＩは、外側の油相に移動する傾向があるため、この技術を用いてＴＲＩをカプセル化するためのいくつかの困難が報告された。
【０２２１】
ミノキシジル（ＭＸＤ）は、男性型脱毛症を治療する際に局所的に使用される。ミノキシジルは、一般に、溶媒混合物、主に、プロピレングリコール：エタノール：水に組み込まれる。この局所治療の典型的な副作用としては、特に治療の開始時に起こる掻痒、紅斑、落屑性紅斑および乾燥を伴う刺激性皮膚炎が挙げられる。ある場合に、アレルギー性接触皮膚炎または脂漏性皮膚炎の悪化が報告されている。プロピレングリコール（ＰＧ）は、ある患者に掻痒および頭皮の落屑性紅斑を生じさせる場合があり、刺激性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、または脂漏性皮膚炎の悪化を含む症状の主な原因となる場合がある。
【０２２２】
一方、公開されている研究は、ＰＧ：エタノール：水（２０：６０：２０、ｖ／ｖ）混合物からの溶媒の蒸発に関する実験を記載している。この溶媒混合物を含有する製剤の主な問題のひとつは、頭皮に適用した後の蒸発である。適用後のエタノールの蒸発によって、濃縮したＰＧが生じるため、薬物沈殿をもたらす過飽和に達することがある。適用した製剤の量は、濃縮速度に影響を及ぼし、そのため、ＭＸＤが沈殿する時間に影響を及ぼす。沈殿は、吸収され得るＭＸＤの量を制限し、薬物の経皮吸収を悪くする。同様に、他の研究は、蒸発時間およびそのＭＸＤ濃度との関係について記載しており、エタノールは、最初の３０分後および２時間後に蒸発していてもよく、残留する唯一のビヒクル成分はＰＧであった。３％のＭＸＤ溶液の場合、ＭＸＤは、全体で２時間の観察期間にビヒクル中に留まっているが、播種すると直ちに大量の沈殿が生じ、過飽和溶液の存在が確認された。ある程度まで、頭皮上のＭＸＤの結晶生成によって、毛髪の外観がきれいではない態様のようなふけの形成を生じる場合がある。
【０２２３】
これらの結果は、本発明で得られる結果にしたがうものであるが、（ｉ）ＭＸＤ（２％）を含有し、異なる賦形剤を含む、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＭＸＤを保持するナノ粒子（本発明）、（ｉｉ）エタノール、ＰＧおよび水を含有するＭＤＸの市販製剤（Ｌａｃｏｖｉｎ（登録商標）２％）、および（ｉｉｉ）γ−シクロデキストリン、ＰＧ、エタノールおよび水を含有する市販製剤（Ａｌｏｐｅｘ（登録商標）２％）について、巨視的および微視的な肉眼的なアッセイを行った。これに関し、図１０から得られたデータは、乾燥前のサンプルの態様は、ナノ粒子製剤（ｉ）の場合乳白状であり、市販製品（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の場合透明であることを示す。しかし、乾燥して２時間後、市販製品について、目に見えて大きな白色結晶層を含む結晶性膜が観察され始めた。グリセロールを含む本発明によって提供されるＭＸＤを保持するナノ粒子を含有するサンプルは、結晶性沈殿を含まず、わずかに乳白状のきれいな外観を有していた。さらに、異なる賦形剤を含む本発明によって提供されるＭＸＤを保持するナノ粒子（ＮＰＧＥＳ−ＭＸＤＧ、ＮＰＧＥＳ−ＭＸＤ  ＰＥＧおよびＮＰＧＥＳ−ＭＸＤ  ＰＧ）は、１２時間後に乾燥膜を形成しなかった。しかし、市販製品では２時間以内に、そして賦形剤を含まない本発明のＭＸＤを保持するナノ粒子では４時間以内に、乾燥沈殿が観察された。微視的な試験は、巨視的な結果を裏付けており、市販製品Ｌａｃｏｖｉｎ（登録商標）２％およびＡｌｏｐｅｘ（登録商標）２％の場合、最初の２時間以内に大きな結晶が観察された。ＭＸＤを保持するナノ粒子製剤の場合、残留膜の態様に顕著な差異があった。これに関し、賦形剤を含まない本発明のＭＸＤを保持するナノ粒子は、筋のついた容易に壊れる膜を示した（ＮＰＧＥＳ−ＭＸＤ）。この現象は、プロピレングリコール（ＰＧ）、グリセロール（Ｇ）またはポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ）のような賦形剤を含有す本発明のＭＸＤナノ粒子の乾燥膜では観察されなかった。それに加え、本発明のＭＸＤナノ粒子製剤を含有する任意の乾燥膜では、大きな結晶は観察されなかった。同様の方法で、図１１は、本発明のＭＸＤを保持するナノ粒子の製剤および市販製品について実施したＳＥＭを示す。図１１から得られたデータは、図１０で得られた結果と実際に相関関係にあり、それを裏付けている。市販製品（Ｌａｃｏｖｉｎ（登録商標）２％およびＡｌｏｐｅｘ（登録商標）２％）の場合、大きな結晶の沈殿が観察された。一方、本発明のＭＸＤを保持するナノ粒子の製剤（ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ、ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ  Ｇ、ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ  ＰＧおよびＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ  ＰＥＧ）について、大きな結晶は観察されなかった［実施例８］。賦形剤を含まない本発明のＭＸＤを保持するナノ粒子（ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ）およびグリセロールを含む本発明のＭＸＤを保持するナノ粒子（ＮＰＧＥＳ／ＭＸＤ  Ｇ）は、均一な平均粒径分布を有するナノ粒子を含有する均一な膜の存在を示した。驚くべきことに、ＰＧまたはＰＥＧを含む本発明のＭＸＤを保持するナノ粒子を含有する乾燥膜では、ナノ粒子は検出されなかったが、これは、水が蒸発した後、賦���剤へのポリマーの溶解度に起因するものであろう。ＰＥＧ４００を含有する製剤について、ある大きな沈殿物（ポリマー膜層）が観察されたことに留意することが重要であり、このことは、ポリマーのいくつかのカルボキシル基とＰＥＧとの相互作用に関係があるであろう。すべての膜はきれいな外観を有しており、光接着性の粘着性のテクスチャーを有していた。
【０２２４】
一方、ＭＸＤの溶解度および皮膚透過性を調べるために、シクロデキストリン（ＣＤ）を使用し、ＭＸＤを含む包接錯体を調製した［２１］。溶融したモノオレイン（ＭＯ）を錯体溶液で水和することによって、ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン（ＨＰｂｅｔａＣＤ）／ミノキシジル（ＭＸＤ）錯体を捕捉したモノオレイン（ＭＯ）立方相を調製した。分散剤としてＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７を用いた浴型超音波処理によって立方相のナノ粒子を調製した。立方相に保持されたＭＸＤのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの皮膚透過性は、ＰＧ／水／エタノール（２０／３０／５０、ｖ／ｖ／ｖ）に溶解したＭＸＤのそれよりも大きかったが、皮膚の中に残留したＭＸＤの量は、ＭＸＤを保持するナノ粒子を含むものよりも、ＭＸＤ溶液を用いたときの方が多かった。これらのデータは、ＣＤ−ＭＸＤ錯体を適用したが、結晶性の態様を含む頭皮に残った残留物が、ＭＸＤ溶液よりも少ない程度で損なわれていることを示した。
【０２２５】
まとめると、本発明によれば、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＭＸＤを保持するナノ粒子は、男性型脱毛症を治療する薬物送達系を開発する目的で設計されている。薬物送達系としてのＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＭＸＤを保持するナノ粒子（本発明）の最も重要な利点は、評価した一般的な市販製剤と比較して、製造の利便性、アレルギー性ビヒクルとしてのＰＧの回避、そして頭皮での結晶形成現象がないことである。
【０２２６】
本発明のさらなる目的は、異なる条件で長期間にわたって毛髪への接着性を維持することができる、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来する生体接着性ナノ粒子の開発に関する。化粧用製品でのナノ系の適用は、毛幹に分子を送達するか、または外部攻撃因子から保護するために有益であり、毛髪の容積を大きくすることができる。結果は、毛髪サンプルに接着したフラクションの量は、１群（Ｍ１）では、毛髪の表面積１ｃｍ２あたり、約９．５μｇのナノ粒子であった。他の毛髪サンプル群（Ｍ２）では、ナノ粒子が接着したフラクションの量は毛髪を洗浄することによって減少したが、ナノ粒子は、依然として毛髪表面に接着していることが確認された（３．５μｇ（ナノ粒子）／ｃｍ２（毛髪表面積））。蛍光顕微鏡法およびＳＥＭ（図１２および図１３）により、毛髪表面に対する、本発明によって提供されるＭＸＤを保持するナノ粒子の懸濁物の初期の高い接着親和性が確認された。それに加え、１群において、毛髪表面に接着したナノ粒子の乾燥膜は、洗浄および高温条件に耐え、２群（Ｍ２）でみられるように、ナノ粒子は、毛髪表面に接着したままであった。それに加え、本発明のＭＸＤを保持するナノ粒子の膜を含有する毛髪の態様はきれいであり、透明であり、輝いており、乾燥後に黒い残留物を示さなかった（実施例９）。
【０２２７】
最後に、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＭＸＤを保持するナノ粒子（本発明）のｅｘ  ｖｉｖｏでの生体接着性試験を、ブタの動物モデルの頬および舌の粘膜で実施した（実施例１０）。この研究の目的は、リファレンスであるＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子と比較して、粘膜表面に対するナノ粒子の接着フラクションおよびこれらの接着系の耐久時間を測定することに注目した。図１４は、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステル（本発明）およびＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮコポリマーについて、ブタの頬および舌の背面の粘膜中でのナノ粒子製剤の接着フラクションの累積的な量（μｇ  ＮＰ／ｃｍ２（組織））をあらわす。一般的に、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＭＸＤを保持するナノ粒子（本発明）（ＮＰ  ＧＥＳＲ）は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮに由来するＭＸＤを保持するナノ粒子（ＮＰ  ＧＡＮＲ）よりも高い接着能力を示す。しかし、両方の種類のナノ粒子は、時間０で同様の初期接着力を示した。それにもかかわらず、１時間目、２．５時間目、４時間目および６時間目に、両方の種類のブタ粘膜において、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＭＸＤを保持するナノ粒子（本発明）の累積的な接着フラクションは、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮに由来するＭＸＤを保持するナノ粒子のそれよりも約２〜３倍大きかった。ナノ粒子を含有するゲル製剤の場合、ヒアルロン酸ゲルが、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＭＸＤを保持するナノ粒子（ＧＥＬＮＰ  ＧＥＳ）の初期の接着能を高め、ナノ粒子懸濁物よりも２倍大きいことが観察された。それに加え、１時間目、２．５時間目、４時間目および６時間目に、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＭＸＤを保持するナノ粒子を含有するゲルについて、生体接着能の顕著な向上が観察された。驚くべきことに、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ由来のナノ粒子ゲル製剤を用いてこの現象は観察されず、水系懸濁物（ＮＰ  ＧＡＮＲ）およびＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子を含有するゲル（ＧＥＬ  ＮＰ  ＧＡＮ）に顕著な差は観察されなかった。
【０２２８】
図１５は、ある蛍光標識されたナノ粒子製剤を投与して０．５時間後および２．５時間後の頬粘膜組織の蛍光顕微鏡画像を示す。コントロール組織（ナノ粒子製剤を含まない）は、組織中で低い蛍光強度を示す（図１５Ｂ）。ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂを保持するナノ粒子は、唾液とともに組織をインキュベーションして０．５時間後に頬粘膜の粘膜層で高い蛍光強度を示し（図１５Ｃ）、２．５時間目に同様であった（図１５Ｅ）。一方、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮナノ粒子の組織蛍光強度は、インキュベーションから０．５〜２．５時間後に、投与してから２．５時間後のコントロールとほぼ同じ程度まで低下した（図１５Ｄおよび図１５Ｆ）。これらのデータにより、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来する本発明のナノ粒子が、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ由来のナノ粒子よりも頬粘膜で高い親和性と長い滞留時間を有することが確認された。それに加え、すべての場合において、ナノ粒子が粘膜下組織に浸透しないことが観察された。
【０２２９】
図１６は、蛍光標識されたナノ粒子製剤を投与して２．５時間後に、舌背面粘膜表面での蛍光顕微鏡画像を示す。頬粘膜組織と類似の組織では、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステル由来の本発明のナノ粒子は、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＡＮ由来のナノ粒子（図１６Ｂ）よりも、ブタの舌の背面粘膜では高い親和性および長い滞留時間を示す（図１６Ｃおよび図１６Ｄ）。
【０２３０】
ポリマーの特性評価によれば、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するナノ粒子（例えば、Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）ＥＳ）は、ブタの頬および舌の粘膜モデル表面に対し、他のＧａｎｔｒｅｚ（登録商標）ポリマーに由来するナノ粒子と比べて高い接着剤親和性を示し、多くの化合物の制御放出の有効な向上を保証する。驚くべきことに、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルおよびこのコポリマーに由来するナノ粒子は、水にほとんど溶解しない化合物または水難溶性化合物に対して共溶媒効果を有し、疎水性薬物、例えば、ＫＴＺ、ＴＲＩまたはＭＸＤのカプセル化効率の向上をもたらす。したがって、ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルは、共溶媒または錯化剤を用いる必要なく、親水性、および特に疎水性化合物を組み込むための高いカプセル化効率を保証すると考えられる。ＰＶＭ／ＭＡコポリマーのハーフ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルエステルに由来するナノ粒子の接着特性および水への溶解度は、他の特性の中でも特に、このナノ粒子が、対象生成物を異なる表面、例えば、毛髪、皮膚、頬、口、鼻、膣、直腸などに制御放出として送達するためのシステムとして、多くの産業、例えば、医薬品、化粧品、農業または食品産業で適用されることを可能とする。
【０２３１】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図２】
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【図１０】
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【図１５】
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【図１６】
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