(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記被検試料にイリジウム錯体を添加する工程、
ｂ）被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｃ）増幅産物を解析する工程。
【請求項２】
前記イリジウム錯体が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、NO2-、N2、N3-、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、およびR-（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）からなる群から選ばれる配位子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記配位子が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、およびR-からなる群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記イリジウム錯体が、ジ-μ-クロロビス[(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)イリジウム(I)]、及び、2-ヒドロキシ-N-ピリジン(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ジクロリドから選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記イリジウム錯体が、イリジウム化合物を、配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒、又は配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解することにより生成するイリジウム錯体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ターゲット領域の増幅が、細胞からの核酸の抽出を行わずに行われることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ターゲット領域の増幅が、微生物細胞内で行われることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲット領域の増幅が、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を前記被検試料に添加して行われることを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ターゲット領域の増幅が、界面活性剤の存在下で行われることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ターゲット領域が、５０〜５０００塩基のターゲット領域である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ターゲット領域が、被検試料のＤＮＡの５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及びｔＲＮＡ遺伝子から選択される遺伝子に対応するターゲット領域である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記被検試料が、食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料のいずれかである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物が、細菌又はウイルスである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌が、グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、又はマイクロアレイ法である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰＣＲ法が、リアルタイムＰＣＲ法により行われ、ＰＣＲと増幅産物の解析が同時に行われることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅産物の解析が、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行われることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
１）イリジウム錯体、又は、
配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒、もしくは配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解したときに、イリジウム錯体を生成するイリジウム化合物、
２）検出対象の微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー。
【請求項２０】
前記イリジウム錯体が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、NO2-、N2、N3-、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、およびR-（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）から選ばれる配位子を含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記配位子が、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、およびR-からなる群から選ばれる、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記イリジウム錯体が、ジ-μ-クロロビス[(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)イリジウム(I)]、及び、2-ヒドロキシ-N-ピリジン(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ジクロリドから選ばれる、請求項１９に記載のキット。
【請求項２３】
さらに、配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒を含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２４】
前記有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
さらに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
さらに界面活性剤を含む、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品や生体試料中に含まれる微生物、工業用水や市水等の環境中に含まれる微生物の検出法、及び微生物検出キットに関する。さらに詳しくは、食品や生体試料、拭き取り試料、工業用水や市水等の環境中に含まれる微生物の生細胞の選択的な検出が可能な検出法及び微生物検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
食品や生体試料、拭き取り試料、又は環境中の一般生菌数の測定には、従来、平板培養法が用いられてきた。しかし、平板培養法は結果が得られるまでに２日間から一ヶ月程度の時間を要し、細菌の同定も困難であるという問題があった。
【０００３】
近年では、被検試料をエチジウムモノアザイド（ＥＭＡ、ethidium monoazide）等のＤＮＡを架橋する架橋剤や、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理した後、試料中の微生物中の染色体ＤＮＡを選択的に核酸増幅反応により増幅することによって、試料中の生菌を検出する技術が提案され、成果を挙げている（特許文献１〜４）。
【０００４】
上記のような架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤は、細胞内に侵入すると、ＤＮＡに結合もしくはインターカレートしたりしてトポイソメラーゼやＤＮＡジャイレース（酵素）の働きを阻害したり、又はＤＮＡを架橋し、その結果、染色体ＤＮＡが破壊（断片化・切断）される。これらの薬剤は、生菌の細胞壁よりも死菌及び損傷菌の細胞壁の方が透過しやすいため、生菌よりも損傷菌や死菌の染色体ＤＮＡが優先的に断片化される。したがって、染色体ＤＮＡの特定の領域をターゲットとしたＰＣＲにより、生菌を損傷菌や死菌に比べて選択的に検出することができる。
【０００５】
尚、上記ＰＣＲの鋳型としては、従来、被検試料に含まれる微生物細胞から抽出した核酸が用いられていたが、細胞からの核酸の抽出を行わずに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤の存在下でＰＣＲを行うことで、迅速に生菌を検出する方法が開示されている（特許文献４）。
【０００６】
前記ＥＭＡは、ＤＮＡに水素結合した後、３５０〜７００ｎｍの波長の光照射を行うことによりＤＮＡの分子間を架橋する。したがって、試料への光照射が必須であるが、光源による試料への加熱を防ぐため、通常、氷水中に試料を浸漬して光照射が行われており、工程が煩雑となっている。また、光源にＬＥＤを用いる方法も提案されているが、光強度が不十分であり、また、経時的に架橋剤の架橋能の低下がみられる等の問題がある。さらに、ＥＭＡ等の薬剤やそれを含む試料は、薬剤の変性等を防ぐため、前記の試料への光照射を除いて、暗室中などの遮光下におく必要がある。
【０００７】
また、これまでの方法では、生菌を死菌及び損傷菌と区別するために、ＰＣＲのターゲット領域としては、一定以上の長さ、例えば９００塩基（ｂｐ）以上の長さを有する領域を用いるのが一般的である。しかしながら、現在一般的な定量ＰＣＲにて使用されている８０〜２００ｂｐ程度のターゲット領域に比べて、９００ｂｐ以上の領域をＰＣＲにより増幅するためには、各サイクルに数倍の時間を要し、また、定量性にも問題がないとはいえない。
【０００８】
一方、試料を架橋剤で処理した後、試料に培地を加えて加温し、再度架橋剤による処理を行うこと（特許文献３）、又は、ＥＭＡとトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレ
ース阻害剤とを併用すること（特許文献２）により、１００ｂｐ程度のターゲット領域であっても、生菌と死菌又は損傷菌との区別が可能なことが知られている。しかしながら、これらの方法は、工程または薬剤調製が煩雑である。
【０００９】
ところで、イリジウム錯体は、造影剤や発光材料、又はそれらの成分等として知られている。造影剤としては、例えば、非特許文献１には、ヒスチジンに結合して蛍光を発するイリジウム錯体が開示されている。また、発光材料としては、ＤＮＡと、主鎖又は側鎖にプロトン化可能なアミノ基を少なくとも１つ有し、ＤＮＡと絡み合う導電性高分子と、ＤＮＡのアニオン部に結合するカチオン性官能基を有する脂質化合物と、ＤＮＡのアニオン部に結合する蛍光発光性のイリジウム等の金属錯体とを含む発光材料が知られている（特許文献５）。この発光材料中では、金属錯体は導電性高分子や脂質化合物が結合していないＤＮＡのアニオン部に、静電相互作用により結合されている。
【００１０】
しかしながら、イリジウム錯体が微生物の生死判定に利用できることを示唆する従来技術は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第4340734号
【特許文献２】国際公開第2007/094077
【特許文献３】国際公開第2009/022558
【特許文献４】国際公開第2011/010740
【特許文献５】特開2012-036228
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Chemical & Engineering News, 89(28):31-32, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、簡便な工程で、かつ、好ましい形態ではターゲット領域が比較的短くても、微生物の生細胞の検出が可能な方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、被検試料を薬剤で処理し、試料中の微生物中の染色体ＤＮＡを選択的に核酸増幅反応により増幅することによって、試料中の生細胞を検出する技術において、使用する薬剤について検討した。そして、イリジウム錯体を用いると、試料への光照射、冷却、及び遮光環境を必要とせずに、微生物の生細胞の検出ができること、及び、ターゲット領域として比較的短鎖長の領域を設定した場合でも、高精度で微生物の生細胞を検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記被検試料にイリジウム錯体を添加する工程、
ｂ）被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｃ）増幅産物を解析する工程、
を提供する。
【００１６】
前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、細胞からの核酸の抽出を行わずに行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を前記被検試料に添加して行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、界面活性剤の存在下で行われることを好ましい態様としている。
【００１７】
また前記方法は、前記被検試料が、食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料のいずれかであることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記微生物が、細菌又はウイルスであることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記細菌が、グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域が、５０〜５０００塩基のターゲット領域であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ターゲット領域が、被検試料のＤＮＡの５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及びｔＲＮＡ遺伝子から選択される遺伝子に対応するターゲット領域であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、又はマイクロアレイ法であることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記ＰＣＲ法が、リアルタイムＰＣＲ法により行われ、ＰＣＲと増幅産物の解析が同時に行われることを好ましい態様としている。
また、前記方法は、前記増幅産物の解析が、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行われることを好ましい態様としている。
【００１８】
また、本発明は、核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
１）イリジウム錯体、又は、
配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒、もしくは配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解したときに、イリジウム錯体を生成するイリジウム化合物、
２）検出対象の微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー、
を提供する。
【００１９】
前記本発明のキットは、さらに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を含むことを好ましい形態としている。
また、前記キットは、さらに界面活性剤を含むことを好ましい形態としている。
【００２０】
本発明の方法及びキットは、前記イリジウム錯体が、NH3、RNH2、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート（-CO-O-）基、ピリジン基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、NO2-、N2、N3-、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、およびR-からなる群から選ばれる配位子を含むものであることを好ましい形態としている（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）。
また、前記方法及びキットは、前記配位子が、NH3、RNH2、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート（-CO-O-）基、ピリジン基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、およびR-からなる群から選ばれることを好ましい
形態としている。
【００２１】
また、前記方法及びキットは、前記イリジウム錯体が、ジ-μ-クロロビス[(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)イリジウム(I)]、及び、2-ヒドロキシ-N-ピリジン(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ジクロリドから選ばれることを好ましい形態としている。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の方法によれば、簡便な工程で、微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出することができる。本発明により、核酸増幅法による簡易かつ迅速な食品及び生体試料、拭き取り試料、工業用水、環境用水、排水等の環境中の微生物の生細胞・損傷細胞・死細胞の簡便な判別が可能となる。
【００２３】
また、本発明に用いるイリジウム錯体のうち、例えば、後述する化２に示される化合物は有機化学や有機合成化学の分野において金属触媒として使用されおり、ＥＭＡ等の薬剤に比べて危険性が低いと考えられる。さらに、好ましいイリジウム錯体は、ＥＭＡ等の薬剤に比べて安価であり、産業上有利である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００２５】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法である。
ａ）前記被検試料にイリジウム錯体を添加する工程、
ｂ）被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｃ）増幅産物を解析する工程。
【００２６】
本発明の方法においては、増幅の対象は核酸全般のいずれであってもよく、具体的には１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、及び２本鎖ＲＮＡを例示することができる。
【００２７】
本明細書において、「被検試料」とは、その中に存在する微生物の生細胞を検出する対象であり、核酸増幅法による染色体ＤＮＡ、又はＲＮＡの特定領域の増幅によって存在を検出することが可能なものであれば特に制限されないが、食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料等が挙げられる。
【００２８】
特に、食品としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の氷菓；殺菌ミルク、加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；経腸栄養食品、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；特定保健用食品、健康補助食品等の機能性食品等が好ましい。
【００２９】
また、生体試料としては、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料、胸水試料、喀痰試料、糞便試料、鼻腔粘液試料、喉頭粘液試料、胃洗浄液試料、膿汁試料、皮膚粘膜試料、口腔粘液試料、呼吸器粘膜試料、消化器粘膜試料、眼結膜試料、胎盤試料、生殖細胞試料、産道試料、母乳試料、唾液試料、嘔吐物、又は水疱内容物等が例示される。
さらに、環境用水としては、市水、地下水、河川水、又は雨水等が例示される。
【００３０】
本発明においては、被検試料は、前記のような食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料等そのものであってもよく、これらを希釈もしくは濃縮したもの、又は本発明の方法による処理以外の前処理をしたものであってもよい。前記前処理としては、加熱処理、濾過、遠心分離等が挙げられる。
【００３１】
また、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪及び糖質等の夾雑物は、これらを分解する活性を有する酵素による処理等によって除去又は低減させてもよい。前記被検試料中に存在する微生物以外の細胞としては、被検試料が乳、乳製品、乳又は乳製品を原料とする食品である場合には、ウシ白血球及び乳腺上皮細胞等が挙げられる。また、被検試料が血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料等の生体試料の場合には、赤血球、白血球（顆粒球、好中球、好塩基球、単球、リンパ球等）、及び血小板等が挙げられる。
【００３２】
前記酵素としては、前記夾雑物を分解することができ、かつ、検出対象の微生物の生細胞を損傷しないものであれば特に制限されないが、例えば、脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素が挙げられる。前記酵素は、１種類の酵素を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上の酵素を併用してもよいが、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素の両方、又は脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素の全てを用いることが好ましい。
脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等が、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ等が、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ等が挙げられる。
【００３３】
「微生物」は、本発明の方法により検出される対象であり、核酸増幅法により検出することが可能であって、かつ、ＤＮＡ又はＲＮＡに結合するイリジウム錯体の微生物に対する作用が生細胞と死細胞や損傷細胞とで異なるものであれば、特に制限されないが、好ましくは細菌、糸状菌、酵母、又はウイルス等が挙げられる。細菌としては、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれもが含まれる。
【００３４】
グラム陽性菌としては、黄色ブドウ球菌や表皮ブドウ球菌などのブドウ球菌属；ミクロコッカス属；Streptcoccus pyogenes、Streptococcus pneumoniae（肺炎球菌）等のストレプトコッカス属；Enterococcus faecalisなどエンテロコッカス属；エロコッカス属；Bacillus cereus（セレウス菌）、Bacillus subtilis（バチラス・ズブチリス）、Bacillus licheniformis（バチラス・リヘニフォルミス）等のバチラス属（栄養型細胞が望ましい）；ボツリヌス菌やウエルシュ菌などのクロストリジウム属；ヒト型結核菌やウシ型結核菌；マイコバクテリウム・イントラセルラー、マイコバクテリウム・アビウムなどのマイコバクテリウム属（抗酸菌及び非定型抗酸菌群）；ライ菌；アクチノミセス属；ノカルジア属；ノカルジオプシス属；アクチノマズラ属；ストレプトミセス属；デルマトフィルス属；ユーバクテリウム属；コリネバクテリウム属；プロピオニバクテリウム属等が挙げられる。
【００３５】
また、グラム陰性菌としては、レジオネラ属；サルモネラ属；O157、O26、O11、O145を始めとする腸管出血性大腸菌；カンピロバクター属；アルコバクター属；ヘリコバクター属；緑膿菌などのシュードモナス属；バークホルデリア属；アシネトバクター属；アルカリゲネス属；クリセオバクテリウム属；モラクセラ属；コクシェラ属；ブルセラ属；野兎病菌（Francisella tularensis）等のフランシセラ属；バルトネラ属；ボルデテラ属；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）等のヘモフィルス属；パスツレラ属；クロモ
バクテリウム属；ストレプトバシラス属；赤痢菌等のシゲラ属、エルシニア属、エシェリヒア・コリなどエシェリヒア属、クレブシェラ属、シトロバクター属、エドワージエラ属、エンテロバクター属、ハフニア属、プレジオモナス属、プロテウス属、プロビデンシア属、モルガネラ属、セラチア属等の腸内細菌科；ビブリオ属；エロモナス属；バクテロイデス属；プレボテラ属；ポルフィロオナス属；フソバクテリウム属；レプトトリキア属；ベイヨネラ属；ブラキスピラ属；レプトスピラ属；トレポネーマ属；ブタ赤痢スピロヘータ；ボレリア属；マイコプラズマ；リケッチア；クラミジア等が挙げられる。
【００３６】
ウイルスとしては、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、アストロウイルス科、コロナウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、ボルナウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、肝炎ウイルスが挙げられるなどが挙げられる。
【００３７】
後記実施例１、３に示されるように、イリジウム錯体による処理によりグラム陰性細菌であるエシェリヒア・コリの生細胞と死細胞の識別が可能であることが示された。また、実施例２、４に示されるように、イリジウム錯体によりスタフィロコッカス・アウレウスの生細胞と死細胞の識別が可能であることが示された。これらの結果から、イリジウム錯体は、微生物全般について生細胞と死細胞の識別に使用できると考えられる。
さらに、グラム陰性細菌の細胞壁外膜と同成分の最外殻エンベロープを有するウイルスについても、生細胞と死細胞の識別に使用できると考えられる。また、エンベロープを有しない所謂ヌクレオカプシド（タンパク質膜）のみ保有するウイルスは、外膜を有さず、直接ペプチドグリカン層が外界と接触するグラム陽性細菌に比較的類似しているため、イリジウム錯体による生細胞と死細胞の識別が可能であると考えられる。尚、後述するように、本発明においては、ウイルス粒子も、便宜的に「細胞」と呼ぶ。
【００３８】
エンベロープを有しない腸管系ウイルスの感染型（生細胞に相当）・非感染型（死細胞に相当）の識別に、PMA（プロピジウムモノアジド）という、物理的損傷のある非感染型にのみ透過して非感染型の核酸に共有結合し、核酸を鋳型として不活性化させる薬剤を用いて、腸管系ウイルスにて明瞭な感染型・非感染型の判定を可能にした技術も存在する（S. Parshionikar et al., Appl. Envrion. Microbiol. 76, 4318-4326, 2010）。
PMAは元来、細菌の生細胞と死細胞の明瞭な識別を可能とする薬剤であるが（A. Nocker
et al., J. Microbiol. Methods. 67, 310-320, 2006）、ヌクレオカプシドしか有しない腸管系ウイルスでも明瞭な前記識別を可能としているので、イリジウム錯体も、PMAと同様に、ヌクレオカプシドしか有しない腸管系ウイルスにおいて（エンベロープを有するウイルスはグラム陰性細菌に形態学的に酷似しているため勿論含まれる）、明瞭に感染型・非感染型を判定できる可能性が高い。
【００３９】
本発明において「生細胞」（Live cell）とは、一般に好適な培養条件によって培養した際に増殖が可能であって、その微生物が有する代謝活性を示す状態（Viable-and-Culturable state）であり、細胞壁の損傷がほとんど無い微生物をいう。なお、ここでいう代謝活性とはＡＴＰ活性やエステラーゼ活性を例示することができる。本発明においては、ウイルス粒子も、便宜的に「細胞」と呼ぶ。「生細胞」は、ウイルスに関しては、哺乳動物細胞に感染し、増殖できる状態をいう。
【００４０】
「死細胞」（Dead cell）とは、好適な培養条件によって培養した場合であっても増殖は不可能であって、代謝活性を示さない状態（Dead）の微生物である。また、細胞壁の構造は維持されているものの、細胞壁自体は高度に損傷を受けており、ヨウ化プロピジウムのような弱透過性の核染色剤等が細胞壁を透過する状態である。ウイルスに関する「死細
胞」とは、哺乳動物細胞に感染できない状態をいう。
【００４１】
「損傷細胞」（Injured cell又はViable-but-Non Culturable cell）とは、人為的ストレス又は環境的ストレスにより損傷を受けているために、一般に好適な培養条件によって培養した場合であっても、増殖は困難であるが、その微生物が有する代謝活性は、生細胞と比較すると低下しているものの死細胞と比較すると有意に活性を有する状態の微生物である。ウイルスに関しては、哺乳動物細胞に感染したとしても、細胞中で増殖できない状態をいう。
本明細書においては、特記しない限り、「生細胞」、「死細胞」及び「損傷細胞」は、微生物の生細胞、死細胞及び損傷細胞を意味する。
【００４２】
特に、食品衛生検査や臨床検査において、穏和な加熱処理や抗生物質投与により、損傷細胞の状態を呈した細菌の検出が注目されており、本発明は、生細胞の検出のみならず、生細胞と死細胞及び／又は損傷細胞との識別も可能な微生物の検出方法を提供するものである。
【００４３】
尚、生細胞、損傷細胞及び死細胞の細胞数単位は、通常、いずれも細胞数cells/ml で表される。
生細胞の細胞数は、好適な平板培地上で、好適な培養条件で培養したときのコロニー形成数（cfu/ml又はCFU/ml（colony forming units / ml））で近似させることができる。
【００４４】
損傷細胞の標準試料は、例えば、生細胞けん濁液を加熱処理、例えば沸騰水中で加熱処理することにより調製することができるが、その場合は、損傷細胞の細胞数は、加熱処理する前の生細胞けん濁液のｃｆｕ／ｍｌで近似させることができる。尚、損傷細胞を調製するための沸騰水中での加熱時間は、微生物の種類により異なるが、例えば実施例に記載された細菌では、５０秒程度で損傷細胞を調製することができる。
また、損傷細胞の標準試料は、抗生物質処理によっても調製することができるが、その場合は、損傷細胞の細胞数は、生細胞けん濁液を抗生物質で処理した後、抗生物質を除去し、可視光（波長600nm）の透過度、すなわち濁度を測定し、生細胞数濃度が予め判っている生細胞けん濁液の濁度と比較することにより、好適な平板培地上で好適な培養条件で培養したときのコロニー形成数（cfu/ml）で近似させることができる。
【００４５】
ウイルスでは、細胞数単位は、プラーク形成単位（pfu又はPFU（plaque-forming units））で表される。
【００４６】
尚、本発明の方法は、生細胞の検出が目的であり、生細胞と区別される微生物は、損傷細胞であっても死細胞であってもよい。
【００４７】
本発明において、「生細胞の検出」とは、被検試料中の生細胞の有無の判別及び生細胞の量の決定のいずれをも含む。また、生細胞の量とは、絶対的な量に限られず、対照試料に対する相対的な量であってもよい。また、「生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する」とは、生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞に比べて選択的に検出することを意味する。
【００４８】
以下、本発明の方法を工程毎に説明する。尚、前記したように、以下の工程の前に、任意の工程として、被検試料を、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪、又は糖質を分解する活性を有する酵素で処理する工程を含んでいてもよい。
【００４９】
（１）工程ａ）
被検試料に、イリジウム錯体（以下、「本発明の薬剤」、又は単に「薬剤」とも記載する。）を添加する。すなわち、被検試料中の微生物を、前記薬剤で処理する。
前記薬剤は、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に直接的に、又はタンパク質等を介して間接的に結合もしくは干渉して、ターゲット領域のＰＣＲ反応を阻害すると推定される。
【００５０】
前記薬剤は、生細胞と、損傷細胞又は死細胞及びウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等に対する作用が異なるものであることが好ましく、より具体的には、生細胞の細胞壁よりも損傷細胞もしくは死細胞の細胞壁、又はウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等の細胞膜に対して透過性が高いものであることが好ましい。
【００５１】
イリジウム錯体としては、生細胞と損傷細胞及び／又は死細胞との細胞壁に対する透過性が異なり、かつ、細胞内の核酸に結合してターゲット領域のＰＣＲ反応を阻害し得る限り、特に制限されないが、例えば、配位子として、少なくともNH3、RNH2、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート（-CO-O-）基、ピリジン基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、NO2-、N2、N3-、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、およびR-からなる群から選ばれる一つを含むイリジウム錯体が挙げられる（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）。イリジウム錯体は、上記のような配位子を一つ含んでいてもよく、同一又は異なる配位子を複数含んでいてもよい。また、上記以外の配位子を含んでいてもよい。
【００５２】
前記飽和有機基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、シクロブチル、ペンチル基、シクロペンチル、ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、シクロオクチル基等のアルキル基等が挙げられる。また、不飽和有機基としては、ベンジル基（ベンゼン環）、ナフチル基（ナフタレン環）、アリル基、シクロオクタジエニル基、シクロオクテン基、ペンタメチルシクロペンタジエニル基、インデニル基等が挙げられる。これらの飽和有機基及び不飽和有機基は置換基を有していてもよい。
【００５３】
上記配位子としては、NH3、RNH2、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート（-CO-O-）基、ピリジン基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、およびR-からなる群から選ばれる一つ又はそれ以上が好ましい（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）。これらの中では、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、ピリジン基、OH-、R-が特に好ましい。
【００５４】
イリジウム錯体として具体的には、下記の化合物が挙げられる。
ジ-μ-クロロビス[(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)イリジウム(I)]（Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]） C16H24Cl2Ir2
2-ヒドロキシ-N-ピリジン(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ジクロリド（2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride） C15H20Cl2IrNO
(アセチルアセトナト)ジカルボニルイリジウム(I)（Acetylacetonato)dicarbonyliridium(I)) C7H7IrO4
(アセチルアセトナト)(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I) C13H19IrO2
(アセチルアセトナト)(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I) C13H19IrO2
クロロビス(シクロオクテン)イリジウム(I)ダイマー（Chlorobis(cyclooctene)iridium(I)dimer） C32H56Cl2Ir2
クロロジヒドリド[ビス(2-ジイソプロピルホスフィノ)エチルアミン]イリジウム(III)（Chlorodihydrido[bis(2-diisopropylphosphino)ethylamine]iridium(III)） C16H39ClIrNP
2
クロロ(5-メトキシ-2-[1-[(4-メトキシフェニル)イミノ-N]エチル]フェニルl-C)(1,2,3,4,5-ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)（Chloro(5-methoxy-2-[1-[(4-methoxyphenyl)imino-N]ethyl]phenyl-C)(1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)） C26H31ClIrNO2
ジクロロテトラキス(2-(2-ピリジニル)フェニル)ジイリジウム(III)（Dichlorotetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)） C44H32Cl2Ir2N4
ジヨード(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ダイマー（Diiodo(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III) dimer） C20H30I4Ir2
イリジウム(III)ブロミド水和物（Iridium(III) bromide hydrate） Br3Ir・xH2O
イリジウム(IV)クロリド水和物（Iridium(IV) chloride hydrate） Cl4Ir・xH2O
ペンタアンミンクロロイリジウム(III)クロリド（Pentaamminechloroiridium(III) chloride） H15Cl3IrN5
テトライリジウムドデシルカルボニル（Tetrairidium dodecacarbonyl） C12Ir4O12
イリジウム(III)アセチルアセトナート（Iridium(III)acetylacetonate） C15H21IrO6
(1,5-シクロオクタジエン)-η5-インデニル)イリジウム(I)（(1,5-cyclooctadiene)-η5-indenyl)iridium(I)） C17H18Ir
(1,5-シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニルホスフィン)イリジウム(I)ヘキサフルオロホスファート（(1,5-cyclooctadiene)bis(methyldiphenylphosphine)iridium(I)hexafluorophospate） C34H38F6IrP3
(1,5-シクロオクタジエン)(ピリジン)(トリシクロヘキシルホスフィン)-イリジウム(I)ヘキサフルオロホスファート（(1,5-cyclooctadiene)(pyridine)(tricyclohexylphosphine)-iridium(I)hexafluorophosphate） C31H50F6IrNP2
(1,5-シクロオクタジエン)(ヘキサフルオロアセチルアセトナト)イリジウム(I)（(1,5-cyclooctadiene)(hexafluoroacetylacetonato)iridium） C13H13F6IrO2
(1,5-シクロオクタジエン)(メトキシ)イリジウム(I)ダイマー（(1,5-cyclooctadiene)(methoxy)iridium(I)dimer） C18H30Ir2O2
ビス(シクロオクタジエン)イリジウム(I)テトラキス(3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル)ボラート（bis(cyclooctadiene)iridium(I)tetrakis (3,5-bis(tryfluoromethyl)phenyl)borate） C48H36BF24Ir
ビス(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I)テトラフルオロボラート（bis(1,5-cyclooctadiene)iridium(I)tetrafluoroborate） C16H24BF4Ir
ビス[1,2-ビス(ジフェニスホスフィノ)エタン]カルボニルクロロイリジウム(I)（bis[1,2-bis(diphenylphosphino)ethane]carbonylchloroiridium(I)） C53H48ClIrOP4
ペンタメチルシクロペンタジエニルイリジウム(III)クロリドダイマー（pentamethylcyclopentadienyliridium(III)chloride dimer） C20H30Cl4Ir2
クロロトリカルボニルイリジウム（Chlorotricarbonyliridium(I)） C3ClIrO3
カルボニルクロロビス(トリフェニルホスフィン)イリジウム(I)（Carbonylchlorobis(triphenylphosphine)iridium(I)）C37H30ClIrOP2
【００５５】
好ましい錯体としては、下記の化合物が挙げられる。
Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]（別名：ビス(1,5-シクロオクタジエン)ジイリジウム(I)ジクロリド（bis(1,5-cyclooctadiene)diiridium(I)dichloride））（化１、分子量（M.W.）又は式量（F.W.）：671.70）
2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride（化２、分子量（M.W.）又は式量（F.W.）：493.45)
【００５６】
【化１】
0006035257.tif 000002
【００５７】
【化２】
0006035257.tif 000003
【００５８】
また、イリジウム錯体として、イリジウム化合物を、配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒、又は配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解することにより生成するイリジウム錯体が挙げられる。このようなイリジウム化合物としては、例えば、イリジウムと他の元素又は基との共有結合により、巨大分子を形成するイリジウム化合物が挙げられる。
前記元素又は基としては、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、OH-、NO3-、CH3COO-、PO43-、RO-、CO32-、ROPO32-、(RO)2PO2-、RS-、CN-、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、H-、R-（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）等が挙げられる。
【００５９】
前記イリジウム化合物として具体的には、塩化イリジウム、臭化イリジウム、フッ化イリジウム、ヨウ化イリジウム、水酸化イリジウム、硝酸イリジウム、炭酸イリジウム、酢酸イリジウム、ジメトキシイリジウム、メトキシリン酸イリジウム、リン酸イリジウム、塩化イリジウム酸、ジスルフメチルイリジウム、ジシアノイリジウム、ジチオシアネートイリジウム、二水素化イリジウム、メチルイリジウム、酸化イリジウム、五塩化イリジウム（IV）ジアンモニウム（ヘキサクロロイリジウム（IV）酸二アンモニウム）等が挙げられる。これらのうち、好ましい化合物としては塩化イリジウム、臭化イリジウム、フッ化イリジウム、及びヨウ化イリジウムが挙げられ、特に好ましい化合物として塩化イリジウムが挙げられる。塩化イリジウムとしては、塩化イリジウム（III）、塩化イリジウム（IV）が挙げられる。
【００６０】
有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ベンゾニトリル（benzonitrile）等が挙げられる。塩化イリジウムをDMSOに溶解して得られる錯体としては、ジクロロビス（ジメチルスルホキシド）イリジウム（III）が挙げられる。
【００６１】
また、配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液としては、ハルマリン（harmaline）溶液、例えばハルマリン塩酸塩の水溶液等、及び、ジフェロセニル・ホスフィ
ン（diferrocenyl-phosphine）溶液、例えばジフェロセニル・ホスフィンのDMSO溶液等、が挙げられる。前記のようなイリジウムを含む巨大分子をこれらの溶液に溶解すると、イリジウムはハルマリンやジフェロセニル・ホスフィンにこれらを配位子として結合し直し、イリジウム錯体として低分子化される。このようにして生成するイリジウム錯体も、本発明に使用することができる。
イリジウム錯体は、二量体（１錯体に２個のイリジウム元素を有するダイマー）等の多量体であってもよい。二量体としては、例えば、Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]が挙げられる。
【００６２】
イリジウム錯体、及び、イリジウムと他の元素又は基との共有結合により巨大分子を形成するイリジウム化合物は、各種市販されており（例えば、和光純薬工業、シグマ）、それらを使用することができる。また、Weiss R.B., Christian M.C. (1993) Drugs 46:360; Gordon M., Hollander S. (1993) 24: 209; Khokhar A.R., Lopez-Berestein G., Perez-Soler P., US Patent 5 117 022, 1992; Brown D.B., Kohkhar A.R., Hacker M.P., McCommack J.J., European Patent EP 0130 482 b1, 1988; Yanai J., Japanese Patent JP
09 132 583 A2, 1997; Lippert B., Cisplatin: Chemistry and Biochemistry of Leading Anti-cancer Drugs, 1st Ed., John Wiley and sons, ltd., 1999に記載の方法に準拠して合成することもできる。
【００６３】
本発明の方法において、薬剤は１種類を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上を併用してもよい。
【００６４】
薬剤による処理の条件は、適宜設定することが可能である。例えば、検出対象の微生物の生細胞及び死細胞もしくは損傷細胞のけん濁液に、種々の濃度の薬剤を加えて、種々の時間置いた後、遠心分離等によって菌体を分離し、核酸増幅法で分析することによって、生細胞と死細胞もしくは損傷細胞を区別しやすい条件を決定することができる。
さらに、検出対象の微生物の生細胞、及びウシ白血球等の体細胞又は血小板等のけん濁液に、種々の濃度の薬剤を加えて、所定時間放置した後、遠心分離等によって菌体及び前記各種細胞を分離し、核酸増幅法で分析することによって、生細胞と各種細胞を区別しやすい条件を決定することができる。
【００６５】
このような条件として、具体的には、Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]では終濃度２０〜３０００μＭ、好ましくは２５〜３００μＭ、４〜４３℃、５分〜２時間が例示される。2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichlorideでは終濃度２０〜３０００μＭ、好ましくは５０〜３００μＭ、４〜４３℃、５分〜２時間が例示される。
他のイリジウム錯体についても、これらのイリジウム錯体に準じて条件を設定することができる。また、細胞数が既知の試料を用いて、細胞を種々の条件でイリジウム錯体で処理して、試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅し、増幅産物を解析することによって、好適な条件を選択することができる。
【００６６】
被検試料への薬剤の添加は、上記のように被検試料のけん濁液に薬剤を添加することによって行ってもよいが、薬剤の溶液に被検試料を添加することによって行ってもよい。
【００６７】
尚、エチジウムモノアザイド等を用いる従来の方法では、それらの架橋剤をＤＮＡ又はＲＮＡと水素結合させた後に、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子間を架橋させるために３５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の光照射を必要としているが、本発明の薬剤を用いる本発明の方法では、光照射を必要としない。また、そのため、光照射による試料の加熱を防ぐための冷却、例えば氷水への試料の浸漬も必要としない。
また、ＥＭＡ等の薬剤では、露光による薬剤の変性を防ぐため、試料への光照射を除け
ば、暗室中などの遮光下におく必要があるが、本発明の薬剤を用いる場合は、遮光の必要もない。
【００６８】
本発明の薬剤は、生細胞の細胞壁よりも、死細胞及び損傷細胞の細胞壁の方が透過しやすい。したがって、前記に示す作用時間内であれば、微生物の生細胞の細胞壁・細胞膜は実質的に透過せず、微生物の損傷細胞もしくは死細胞または死細胞になっている体細胞の細胞膜は透過すると考えられる。
その結果、薬剤は、体細胞の死細胞及び微生物の死細胞並びに損傷細胞の細胞内に進入し、続いて、染色体ＤＮＡ、又はＲＮＡに直接的又は間接的に結合もしくは干渉し、その結果、薬剤が結合したＤＮＡ、又はＲＮＡは、核酸増幅反応の鋳型とはならなくなると推定される。
【００６９】
生細胞よりも損傷細胞や死細胞に優先的に薬剤が透過すると、生細胞では染色体ＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域が核酸増幅法により増幅されるのに対し、損傷細胞や死細胞では染色体ＤＮＡ又はＲＮＡに薬剤が直接的又は間接的に結合もしくは干渉し、核酸増幅反応が阻害される。そのために、生細胞は損傷細胞や死細胞に比べて選択的に検出することができる。
【００７０】
工程ａ）の薬剤による処理は、一回でもよく、又はそれ以上の回数を繰り返して行ってもよい。薬剤の濃度は、一回目の薬剤処理では、二回目以降よりも高くし、二回目以降の薬剤処理では、一回目よりも低くすることが好ましい。
また、一回目の薬剤処理では、二回目以降の薬剤処理よりも処理時間を短くすることが好ましい。
【００７１】
先の薬剤処理と、それ以降の薬剤処理との間で、未反応の薬剤を除去する工程を追加してもよい。薬剤を除去する方法としては、被検試料を遠心分離して、微生物を含む沈殿と薬剤を含む上清とを分離し、上清を除去する方法が挙げられる。この場合、薬剤を除去した後、適宜、洗浄剤で微生物を洗浄する工程を追加することも可能である。
また、薬剤処理した試料は、下記工程ｂ）の前に、未反応の薬剤を除去しておくことが好ましい。
【００７２】
（２）工程ｂ）
次に、薬剤処理後の被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を、核酸増幅法により増幅する。
【００７３】
核酸増幅の鋳型となるＤＮＡ又はＲＮＡは、微生物の細胞から抽出したものを用いてもよいし、細胞からの核酸の抽出を行わずに薬剤処理した試料をそのまま用いてもよいが、細胞からの核酸の抽出を行わないことが好ましい。
細胞からの核酸の抽出を行わずに核酸増幅を行う場合は、被検試料を含む核酸増幅反応液に、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤を添加して、核酸増幅反応を行うことが好ましい（特許第4825313号、WO2011/010740参照）。
【００７４】
また、被検試料を含む核酸増幅反応液に、さらにマグネシウム塩、及び有機酸塩又はリ
ン酸塩を添加することがより好ましい。また、被検試料を含む核酸増幅反応液に、さらに界面活性剤を添加することが特に好ましい。増幅反応液に、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤に追加して、界面活性剤、マグネシウム塩、又は有機酸塩又はリン酸塩を添加する場合は、これらのうち、いずれか一種を、又は任意の二種以上を組合わせて使用することができ、これらの全てを添加することが特に好ましい。
前記核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、界面活性剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩の添加の順序は問わず、また、同時に添加してもよい。必要に応じ、核酸伸長酵素も通常のＰＣＲ法で使用している濃度の２倍〜１０倍の濃度で添加してもよい。
【００７５】
核酸増幅阻害物質とは、核酸増幅反応又は核酸伸張反応を阻害する物質であって、例えば、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の鋳型に吸着する正電荷阻害物質、又は核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）に吸着する負電荷阻害物質等が挙げられる。前記正電荷阻害物質としては、カルシウムイオン、ポリアミン、ヘム（heme）等が挙げられる。また、負電荷阻害物質としては、フェノール、フェノール系化合物、ヘパリン、グラム陰性細菌細胞壁外膜等が挙げられる。食品や臨床検体中には、このような核酸増幅反応を阻害する物質が多く含まれているといわれている。
【００７６】
上記のような核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤としては、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、アセトアミド、ベタイン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、大豆トリプシンインヒビター、α２−マクログロブリン、テトラメチルアンモニウムクロライド、リゾチームから、ホスホリラーゼ、及び乳酸脱水素酵素から選択される１種又は複数種を例示することができる。
【００７７】
前記ポリエチレングリコールとしては、ポリエチレングリコール４００又はポリエチレングリコール４０００が例示される。ベタインとしては、トリメチルグリシンやその誘導体等が挙げられる。また、ホスホリラーゼ及び乳酸脱水素酵素としては、ウサギ筋肉由来のグリコーゲンホスホリラーゼ及び乳酸脱水素酵素が挙げられる。なお、グリコーゲンホスホリラーゼとしては、グリコーゲンホスホリラーゼｂが好ましい。
特に、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、又はリゾチームを使用することが好ましい。
【００７８】
血液、糞便、及び肉を検査材料として想定し、それら検査材料中に含まれる核酸増幅阻害物質の阻害作用を低減させる試みとして上記のような物質をＰＣＲ反応液に加えて、前記阻害作用の低減が評価されている（Abu Al-Soud, W. et al, Journal of Clinical Microbiology, 38:4463-4470, 2000）。
【００７９】
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に代表されるアルブミンは、ヘム（heme）のような核酸増幅阻害物質に結合することにより、核酸増幅阻害を低減させている可能性が示唆されている（前記Abu Al-Soudら）。また、Ｔ４ジーン３２プロテインは１本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質であり、核酸増幅過程で鋳型となっている１本鎖ＤＮＡに予め結合して鋳型が核酸分解酵素による分解から免れ、核酸増幅反応が阻害されず促進されるか、又は、ＢＳＡと同様の核酸増幅阻害物質に結合することにより、核酸増幅が阻害されず進行する、という二つの可能性が考えられている（前記Abu Al-Soudら）。
さらに、ＢＳＡ、Ｔ４ジーン３２プロテイン、及びタンパク質分解酵素阻害剤（proteinase inhibitor）はタンパク質分解酵素（proteinase）に結合することによりタンパク質分解活性を低減させ、核酸合成酵素の働きを最大限に引き出す可能性が示唆されている。事実、牛乳や血液にはタンパク質分解酵素が残存していることもあり、その際、ＢＳＡ又はタンパク質分解酵素阻害剤（大豆トリプシンインヒビターやα２-マクログリブリン）の添加により核酸合成酵素が分解を受けず、核酸増幅反応が良好に進行したケースも紹介されている（前記Abu Al-Soudら）。
【００８０】
また、デキストランは一般にグルコースを原料として乳酸菌が合成する多糖類である。ムチンという同様の多糖類−ペプチド複合体が腸管粘膜に接着することも報告されており（Ruas-Madiedo, P., Applied and Environmental Microbiology, 74:1936-1940, 2008）、デキストランが負電荷阻害物質（核酸合成酵素に吸着）、又は正電荷阻害物質（核酸に吸着）に予め吸着することにより、それら阻害物質に結合する可能性は十分あるものと推
察される。
また、リゾチームは、牛乳中に多数含まれていると考えられる核酸増幅阻害物質と吸着しているものと推察される（前記Abu Al-Soudら）。
【００８１】
以上のことから、アルブミン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、デキストラン、及びリゾチームに代表される上記物質は、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤であるといえる。
【００８２】
アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、乳アルブミン、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。これらの中ではウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。アルブミンは精製品でもよく、本発明の効果を損わない限りグロブリン等の他の成分を含んでいてもよい。また、分画物であってもよい。被検試料（核酸増幅反応液）中のアルブミンの濃度は、例えば、通常０．０００１〜１質量％、好ましくは０．０１〜１質量％、より好ましくは０．２〜０．６質量％である。
【００８３】
デキストランとしては、デキストラン４０やデキストラン５００等が挙げられる。これらの中ではデキストラン４０が好ましい。被検試料（核酸増幅反応液）中のデキストランの濃度は、例えば、通常１〜８％、好ましくは１〜６％、より好ましくは１〜４％である。
【００８４】
Ｔ４ジーン３２プロテイン（例えば、ロシュ社製：ｇｐ３２とも呼ばれる）の被検試料（核酸増幅反応液）中の濃度は、通常０．０１〜１％、好ましくは０．０１〜０．１％、より好ましくは０．０１〜０．０２％である。
【００８５】
リゾチームとしては、卵白由来のリゾチームが挙げられる。被検試料（核酸増幅反応液）中のリゾチームの濃度は、例えば、通常１〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは６〜１５μｇ／ｍｌ、より好ましくは９〜１３μｇ／ｍｌである。
【００８６】
界面活性剤としては、Triton（ユニオンカーバイド社の登録商標）、Nonidet（シェル社）、Tween（ICI社の登録商標）、Brij（ICI社の登録商標）等の非イオン系界面活性剤、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）等の陰イオン系界面活性剤、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム等の陽イオン系界面活性剤が挙げられる。
TritonとしてはTriton X-100（ポリエチレングリコール tert−オクチルフェニルエーテル）等が，NonidetとしてはNonidet P-40（オクチルフェニル−ポリエチレングリコール）等が、TweenとしてはTween 20（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウラート）、Tween 40（ポリエチレングリコールソルビタンモノパルミタート）、Tween 60（ポリエチレングリコールソルビタンモノステアラート）、Tween 80（ポリエチレングリコールソルビタンモノオレアート）等が、BrijとしてはBrij56（ポリオキシエチレン(10) セチルエーテル）、Brij58（ポリオキシエチレン(20) セチルエーテル）等が挙げられる。
【００８７】
核酸増幅反応液中の界面活性剤の種類及び濃度は、微生物の細胞内へのＰＣＲ試薬の透過を促進し、核酸増幅反応を実質的に阻害しない限り特に制限されない。例えば、陰イオン系界面活性剤が用いられる場合は０．０００５〜０．０１％の範囲が好ましく、陽イオン系界面活性剤が用いられる場合は０．０００５〜０．０１％の範囲が好ましい。
具体的には、SDSの場合は、例えば、通常０．０００５〜０．０１％、好ましくは０．００１〜０．０１％、より好ましくは０．００１〜０．００５％、より好ましくは０．００１〜０．００２％である。
【００８８】
他の界面活性剤の場合、例えば、非イオン系界面活性剤が用いられる場合は０．００１〜１．５％の範囲が好ましい。
具体的には、Nonidet P-40の場合は、通常、０．００１〜１．５％の範囲であれば良く
、好ましくは０．００２〜１．２％、より好ましくは０．９〜１．１％である。
Tween 20、Tween 40、Tween 60、又はTween 80の場合は、通常、０．００１〜１．５％の範囲であれば良く、好ましくは０．００２〜１．２％、より好ましくは０．９〜１．１％である。
Brij56又はBrij58の場合は、通常０．１〜１．５％の範囲であれば良く、好ましくは０．４〜１．２％、より好ましくは０．７〜１．１％である。
核酸増幅反応に用いる酵素溶液に界面活性剤が含まれている場合は、同酵素溶液由来の界面活性剤のみでもよいし、さらに同種又は異なる界面活性剤を追加してもよい。
【００８９】
マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム等が挙げられる。被検試料（核酸増幅反応液）中のマグネシウム塩の濃度は、例えば、通常１〜１０ｍＭ、好ましくは２〜６ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭである。
【００９０】
有機酸塩としては、クエン酸、酒石酸、プロピオン酸、酪酸等の塩が挙げられる。塩の種類としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。また、リン酸塩として、ピロリン酸塩等が挙げられる。これらは、１種でもよく、２種又は３種以上の混合物であってもよい。被検試料（核酸増幅反応液）中の有機酸塩又はリン酸塩の濃度は、例えば、通常合計量で０．１〜２０ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは１〜５ｍＭである（特許第4127847号、WO2007/094077参照）。
【００９１】
被検試料から核酸を抽出する場合は、抽出方法は、抽出されたＤＮＡが核酸増幅における鋳型として機能し得る限り特に制限されず、一般的に用いられている微生物のＤＮＡの抽出法にしたがって行うことができる。
【００９２】
ＤＮＡの抽出法は、例えば、Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 2001に記載されている。
【００９３】
被検試料からの核酸の抽出を行わない場合は、上記核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、及び必要に応じて他の各成分の存在下で、細胞内に存在していたＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する。核酸増幅の鋳型には、微生物細胞けん濁液、又はタンパク質分解酵素、脂質分解酵素、又は糖分解酵素等で処理した微生物細胞のけん濁液を用い、鋳型調製のための核酸の抽出は行わないことが好ましい。
【００９４】
被検試料から核酸の抽出を行う場合は、抽出したＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型として、通常の方法によりターゲット領域を核酸増幅法により増幅する。
【００９５】
核酸増幅法は、高温、例えば９０〜９５℃、好ましくは９３〜９５℃、より好ましくは９４〜９５℃における核酸の熱変性のステップを含むことが好ましい。
【００９６】
核酸増幅法としては、ＰＣＲ法（Polymerase chain reaction：White,T.J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)）、ＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification：新規遺伝子増幅法（LAMP法）の原理と応用 、納富継宣、長谷哲、BIO INDUSTRY, Vol.18, No.2, 15-23, 2001）、ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids：嶌田雅光ら、ベッドサイドICAN 法によるクラミジア／リン菌遺伝子検出試薬の開発、2002年、第51回日本医学検査学会抄録集、121、向井博之、ICAN 法の開発と応用、2002年、第14回北海道輸血シンポジウム、20）、ＳＤＡ法（Strand
Displacement Amplification：Edward L. Chan, et al.,Arch. Pathol. Lab. Med., 124:1649-1652, 2000）、ＬＣＲ法（Ligase Chain Reaction：Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.88, p.189-193, 1991）、ＴＭＡ法（Transcription-Mediated-Amplifi
cation：Sarrazin C. et al., J. Clin. Microbiol., vol.39: p.2850-2855 (2001)）、ＴＲＣ法（Transcription-Reverse Transcription-Concerted method：Nakaguchi Y. et al., J. Clin. Microbiol., vol.42: p.4284-4292 (2004)）、ＨＣ法（Hybrid Capture：Nazarenko I., Kobayashi L. et al., J. Virol. Methods, vol.154: p.76-81, 2008）、ＳＭＡＰ法（Smart Amplification Process、Smart Amp法；Mitani Y., et al., Nature Methods, vol.4, No.3, p.257-262 (2007)）、マイクロアレイ法（Richard P. Spence, et al., J. Clin. Microbiol., Vol.46, No.5, p.1620-1627, 2008）等がそれぞれ例示される。
【００９７】
なお、本発明においては、ＰＣＲ法を利用することが特に好ましいが、これに制限されない。ＰＣＲ法には、定量ＰＣＲ法（Quantitative PCR 又は Real-Time PCR：VanGuilder HD, et al., Biotechniques, 2008, Apr;44(5), 619-26、Spackman E., et al., Methods Mol Biol., 2008, Vol.436, p.19-26）、ＲＴ−ＰＣＲ法（Reverse Transcription PCR：Freeman WM, et al., Biotechniques, 1999, Jan;26(1), 112-22, 124-5）、リアルタイムＰＣＲ法（Nogva et al., Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4266-4271、 Nogva et al., Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4029-4036）等の改変法が含まれるが、それらに制限されない。
【００９８】
本発明において「ターゲット領域」とは、染色体ＤＮＡ、又はＲＮＡのうち、本発明に用いるプライマーを用いた核酸増幅法により増幅され得る領域であり、検出対象の微生物を検出することができるものであれば特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、被検試料に検出対象の微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット領域は、検出対象の微生物に特異的な配列を有することが好ましい。また、目的によっては、複数種の微生物に共通する配列を有するものであってもよい。さらに、ターゲット領域は単一であっても、複数であってもよい。
【００９９】
検出対象の微生物に特異的なターゲット領域に対応するプライマーセットと、広汎な微生物の核酸に対応するプライマーセットを用いると、検出対象の微生物の生細胞量と、多数種の微生物の生細胞量を、同時に測定することができる。ターゲット領域の長さとして
は、通常５０〜５０００塩基、又は５０〜３０００塩基が挙げられる。
本発明の方法では、ターゲット領域が従来法よりも短い、例えば４００塩基程度の長さであっても、生細胞と死細胞及び／又は損傷細胞との識別が可能である。
【０１００】
核酸の増幅に用いるプライマーは、各種核酸増幅法の原理に基づいて、適宜設定することが可能であって、上記ターゲット領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。
【０１０１】
好ましいターゲット領域の例は、５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、ｔＲＮＡ遺伝子、及び病原遺伝子等の各種特異遺伝子である。これらの遺伝子の一つ又はその一部をターゲットとしてもよく、２又はそれ以上の遺伝子にまたがる領域をターゲットとしてもよい。例えば、配列番号１及び２に示すプライマーセットを用いることにより、クロノバクター・サカザキ特異的な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部を増幅することができる。また、市販されている１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用プライマーを用いてもよい。
【０１０２】
また、検出対象の微生物が病原性細菌である場合には、ターゲット領域としては病原遺伝子が挙げられる。病原遺伝子としては、リステリア属細菌のリステリオリシンＯ（ｈｌｙＡ）遺伝子、サルモネラ属細菌のenterotoxin（エンテロトキシン）遺伝子やinvasion（ｉｎｖＡ）遺伝子、病原性大腸菌Ｏ−１５７、Ｏ−２６、Ｏ−１１１等のベロ毒素遺伝子、エンテロバクター属又はクロノバクター属細菌のouter-membrane-protein A（ｏｍｐＡ）遺伝子（クロノバクター・サカザキ菌）及びmacromolecular synthesis（ＭＭＳ）オペロン（クロノバクター・サカザキ菌）、レジオネラ属細菌のmacrophage-invasion protein（ｍｉｐ）遺伝子、腸炎ビブリオ細菌の耐熱性溶血毒遺伝子、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子、赤痢菌及び腸管侵入性大腸菌のｉｐａ遺伝子（invasion plasmid antigen gene）や、ｉｎｖＥ遺伝子（invasion gene）、黄色ブドウ球菌エンテロトキシン遺伝子、バチルス・セレウス菌のセレウリド（嘔吐毒素）遺伝子やエンテロトキシン遺伝子、ボツリヌス菌の各種毒素遺伝子等が挙げられる。
【０１０３】
また、エンベロープを有するインフルエンザウイルスの場合、ヘマグルチニン（Ｈタンパク質）遺伝子やノイラミニダーゼ（Ｎタンパク質）遺伝子、ノロウイルスに代表されるカリシウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、各種カプシドタンパクをコードしている遺伝子領域等が挙げられる。食中毒ウイルスとしてノロウイルスの他、ロタウイルス、アデノウイルスもあり、対象遺伝子はノロウイルス同様、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、カプシドタンパクをコードしている遺伝子領域が標的領域となる。
【０１０４】
複数種の微生物に共通するプライマーを用いると、被検試料中の複数種の微生物の生細胞を検出することができる。また、特定の細菌に特異的なプライマーを用いると、被検試料中の特定の菌種の生細胞を検出することができる。
【０１０５】
核酸増幅反応の条件は、各核酸増幅法（ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、及びマイクロアレイ法等）の原理に則った特異的な増幅が起る限り特に制限されず、適宜設定することができる。
【０１０６】
（３）工程ｃ）
核酸増幅法により増幅した増幅産物を解析する。増幅産物の解析は、工程ｂ）で採用する核酸増幅法に応じて、工程ｂ）に続いて行われるか、又は、工程ｂ）と同時に行われる。例えば、リアルタイムＰＣＲの場合は、工程ｃ）は工程ｂ）と同時に行われ得る。
解析法は、核酸増幅産物の検出又は定量が可能なものであれば特に制限されず、電気泳動法等が例示される。
【０１０７】
電気泳動法によれば、核酸増幅産物の量、及びその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行うことができる。
リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出し、そのＳＤ値に１０を乗じた値をスレッショールド値とし、そのスレッショールド値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレッショールド値（Ｃｔ値）という。従って、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲのターゲット領域に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。
【０１０８】
また、増幅産物の有無は、増幅産物の融解温度（ＴＭ）パターンを解析することによっても行うことができる。
上記の各方法は、本発明の方法における諸条件の最適化に際しても使用することができる。
【０１０９】
本発明の方法によって生細胞を検出する場合、核酸増幅産物の解析は、同定されている微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いると、生細胞の有無又は定量の精度を高めることができる。標準曲線は予め作成しておいたものを用いることができるが、被検試料と同時に標準試料について本発明の各工程を
行って作成した標準曲線を用いることが好ましい。また、予め微生物量とＤＮＡ量又はＲＮＡ量との相関を調べておけば、その微生物から単離されたＤＮＡ又はＲＮＡを標準試料として用いることもできる。
【０１１０】
＜２＞本発明のキット
本発明のキットは、核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、イリジウム錯体を含む。
【０１１１】
本発明のキットは、さらに、検出対象の微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマーを含んでいてもよい。
【０１１２】
本発明のキットは、好ましい態様では、さらに核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩のいずれか、又はこれらの２種以上を含んでいてもよい。より好ましい態様では、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩のすべてを含んでいてもよい。更に、核酸伸長酵素を、通常のＰＣＲもしくは通常のリアルタイムＰＣＲ時に使用する濃度の２倍〜１０倍濃度を含んだ方が、より好ましい。また、本発明のキットは、さらに界面活性剤を含んでいてもよい。
【０１１３】
本発明のキットは、前記本発明の方法を実施するために用いることができる。
また、本発明のキットには、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪、又は糖質を分解する活性を有する酵素を追加することが可能である。
【０１１４】
酵素、イリジウム錯体、及び必要に応じて、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、並びにマグネシウム塩、有機酸塩又はリン酸塩、及び界面活性剤は、これらの成分を全て含む単一の組成物であってもよいし、各成分を任意の組合わせで含む複数の溶液又は組成物であってもよい。
【０１１５】
前記核酸増幅反応は、ＰＣＲ法（定量ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法を含む）、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、又はマイクロアレイ法であることが好ましい。なお、上記キットにおいて、架橋剤や培地は、本発明の方法で説明したものと同様である。
【０１１６】
本発明のキットに含まれるイリジウム錯体として好ましいものは、前記本発明の方法について記載した化合物と同様である。
【０１１７】
また、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤としては、アルブミン、デキストラン、及びＴ４ジーン３２プロテイン、アセトアミド、ベタイン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、大豆トリプシンインヒビター、α２−マクログロブリン、テトラメチルアンモニウムクロライド、リゾチーム、ホスホリラーゼ、及び乳酸脱水素酵素から選択されるいずれか一種又は複数種を例示することができる。
【０１１８】
また、マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム等が挙げられる。
【０１１９】
また、有機酸塩としては、クエン酸、酒石酸、プロピオン酸、酪酸等の塩が挙げられる。塩の種類としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。また、リン酸塩として、ピロリン酸塩等が挙げられる。これらは、１種でもよく、２種又は３種以上の混合物であってもよい。
【０１２０】
また、酵素としては、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪及び糖質等の夾雑物を分解することができ、かつ、検出対象の微生物の生細胞を損傷しないものであれば特に制限されないが、例えば、脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素が挙げられる。前記酵素は、１種類の酵素を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上の酵素を併用してもよいが、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素の両方、又は脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素の全てを用いることが好ましい。
脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等が、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ等が、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ等が挙げられる。
【０１２１】
本発明のキットは、さらに、希釈液、イリジウム錯体による反応用の反応液、核酸増幅用の酵素及び反応液、本発明の方法を記載した説明書等を含めることもできる。
【実施例】
【０１２２】
以下に、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１２３】
〔実施例１〕Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]による大腸菌（Escherichia coli）の生細胞・死細胞の識別
本実施例では、イリジウム錯体を用いたE. coliの生細胞及び死細胞の識別を行った。イリジウム錯体としては、イリジウム錯体二量体（１錯体に２個のイリジウム元素を有するダイマー）であるDi-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]を用いた。
【０１２４】
１．試験材料及び方法
１−１）滅菌水を用いてE. coli JCM1649株の生細胞けん濁液（1.2 × 107 cfu/ml）を調製した。この生細胞けん濁液の一部を沸騰水中に3分浸漬し、損傷細胞／死細胞けん濁液（1.2×107 cells/ml。以下、損傷細胞と死細胞を包括して死細胞と表記する）を調製した。これらの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ90 μlを下記試験に供した。
【０１２５】
１−２）イリジウム錯体溶液の調製
Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]（Wako）3.92 mg（5.84 μmol）を精確に秤量し、116.7 μlのジメチルスルフォキシド（DMSO、D8418-50ML, Sigma）に溶解して50 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して100μM、250μM、1000μMのイリジウム錯体溶液を準備した。
【０１２６】
１−３）イリジウム錯体による被検試料の処理
前記の各イリジウム錯体溶液10μlを、上記生細胞けん濁液90μl又は死細胞けん濁液90μlに添加し、恒温水槽にて37℃で30分間保持した。その後、冷却遠心処理（4℃、15,000×G、5分）し、上清を除去した。沈殿物（ペレット）を1mlの滅菌水にて洗浄した。洗浄後のペレット（細胞けん濁液5μlに相当）をPCR増幅用試料とした。
【０１２７】
１−４）PCR増幅
細胞からの核酸の抽出を行わずにＰＣＲを効率よく行うために必要な核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤の混合物の濃縮液（この溶液を、濃縮ダイレクトコンポーネント、cDBCと記載する）を調製した。
具体的には、ウシ血清アルブミン（BSA; Sigma A7906）、クエン酸三ナトリウム2水和
物（TSC: Tri-Sodium Citrate Dihydrate; 関東化学、東京）、塩化マグネシウム6水和物（31404-15 ナカライテスク、京都）、卵白リゾチーム（126-02671 Lysozyme from egg white; 和光純薬、大阪）、Brij58（P5884-100G; Sigma）の各ストック溶液を、表１に示す濃度となるように混合し、cDBCを調製した。
例えば、ＰＣＲ 200検体用として16.6% Brij58、4.8% BSA、333 mM TSC、1 M MgCl2、2.5 mg/ml lysozymeの各ストック溶液を、それぞれ250μl、200μl、15μl、15μl、20μlの容量にて混和すれば、表１に示す500μlのcDBC（10×DBC）を調製することができる。尚、後述するTaq DNA Polymerase with Standard Taq Buffer (New England Biolabs Japan Inc.; M0273S)を用いて、メーカーマニュアルに従ってリアルタイムPCRマスターミックス（qPCR）を調製すると、終濃度として2 mM相当のMgCl2が含まれていると推察されるため、合計のMgCl2は5 mM相当と推測された。
【０１２８】
Brij 58、 MgCl2、及びTSCは滅菌水にて溶解後、オートクレーブ（121℃、20分）し、水冷後室温に戻し、ストック溶液として使用した。BSA、Lysozymeは滅菌水にてストック溶液を調製し、0.22μmフィルターにて濾過滅菌し、ストック溶液とした。
【０１２９】
【表１】
0006035257.tif 000004
【０１３０】
次に、表２に示される、細胞からの核酸の抽出を行わずにリアルタイムＰＣＲ（細胞からの核酸の抽出せずに行うリアルタイムＰＣＲを、以降「ダイレクト・リアルタイムＰＣＲ」と記載する。）を行うためのマスターミックス（ダイレクト・リアルタイムＰＣＲ用マスターミックス）を調製した。具体的には、前記Taq DNA Polymerase with Standard Taq BufferをqPCRバッファーとして用い、これにTaqを通常使用の×4倍量加え、同バッファーにcDBC（10 × DBC）を所定量添加したダイレクト・リアルタイムＰＣＲ（DqPCR）マスターミックスを調製した。
先に調製したＰＣＲ増幅用試料にダイレクト・リアルタイムＰＣＲ用マスターミックスを添加して、リアルタイムPCR増幅(40 cycles)を２回実施した。尚、以下、New England Biolabs製品はNEBと記載する。
【０１３１】
【表２】
0006035257.tif 000005
【０１３２】
PCR増幅には、Primer ENT-16S forward: 腸内細菌科菌群（Enterobacteriaceae）特異的16S rRNA遺伝子検出用フォワードプライマー（5'-GTTGTAAAGCACTTTCAGTGGTGAGGAAGG -3'：配列番号１）、Primer ENT-16S reverse: 腸内細菌科菌群（Enterobacteriaceae）特異的16S rRNA遺伝子検出用リバースプライマー（5'-GCCTCAAGGGCACAACCTCCAAG-3'：配列番号２）をＰＣＲプライマーとして使用した（両プライマーはニッポンジーンに製造委託した）。増幅されるrRNA遺伝子の断片長は424 bpである。腸内細菌科菌群（Enterobacteriaceae）ENT-16S TaqMan probeとしては、配列番号３（5'-/56-FAM/AACTGCATC/ZEN/TGATACTGGCAGGCT/3lABkFQ/ -3'）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。このブローブは、オリゴヌクレオチドの５’末端に蛍光物質56-FAM、中央部にZEN、３’末端に31ABkFQという消光色素（クエンチャー）を配置した仕様で、Integrated DNA Technologies社にて委託製造した。
【０１３３】
尚、配列番号１及び２のプライマーに関する塩基配列情報は、Nakano, S. et al., J. Food Prot. 66:1798-1804, 2003から入手し、配列番号３のENA-16S TaqMan probeに関する塩基配列情報はGenBank database（http://www.ebi.ac.uk/genbank/）より腸内細菌科菌群内の16S rRNA遺伝子の相補的領域を選択することにより得た。
【０１３４】
リアルタイムＰＣＲ装置（StepOnePlus Real-Time PCR System; Applied Biosystems）を用いて、下記のＰＣＲサーマルサイクル条件により、リアルタイムＰＣＲを２回実施した。
1) 95℃, 20秒（1サイクル）
2) 95℃, 5秒; 60℃, 1分（40サイクル）
尚、陰性コントロールとして、滅菌水5μlを鋳型として使用した。
【０１３５】
２．結果及び考察
リアルタイムPCRの結果を表３に示す。表３中、「No Agent」は陰性コントロールを示す。
【０１３６】
【表３】
0006035257.tif 000006
【０１３７】
表３によれば、Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]をE. coliの生細胞及び死細胞に作用させたとき、死細胞のCt値は薬剤濃度依存的に大きくなり、当該イリジウム錯体100 μMの濃度にて死細胞由来のPCR増幅が完全に抑制された。一方、生細胞に関しては、濃度が高くなるにつれ若干薬剤の透過現象が観察されるが、前記死細胞由来
のPCRを完全に抑制した薬剤濃度では、未処理生細胞のCt値と比較して3.6程度の上昇（増幅の遅れ）に留まり、当該イリジウム錯体100 μMにて明瞭な生細胞と死細胞の識別が可能であった。
【０１３８】
〔実施例２〕Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]によるスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）の生細胞・死細胞の識別
実施例１では、イリジウム錯体二量体を用いて、グラム陰性細菌の代表的菌種であるE.
coliの生細胞及び死細胞の明瞭な識別が可能であることが示された。本実施例では、同じイリジウム錯体二量体により、グラム陽性細菌であるS. aureusの生細胞と死細胞を明瞭に識別できるかを検討した。
【０１３９】
１．試験材料及び方法
１−１）滅菌水を用いてS. aureus ATCC 6538P株の生細胞けん濁液（4.5 × 107 cfu/ml）を調製した。この生細胞けん濁液の一部を沸騰水に3分浸漬し、死細胞懸濁液（4.5 × 107 cells/ml）を調製した。これらの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ90
μlを下記試験に供した。
【０１４０】
１−２）イリジウム錯体溶液の調製
Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)] 4.45 mg（6.63 μmol）を精確に秤量し、132.5 μlのジメチルスルフォキシドに溶解して50 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して100 μM、250 μM、1000μMのイリジウム錯体溶液を準備した。
【０１４１】
１−３）イリジウム錯体による被検試料の処理
前記の各イリジウム錯体溶液10 μlを、上記生細胞けん濁液90 μl又は死細胞けん濁液90 μlに添加し、恒温水槽にて37℃で15分間保持した。その後、冷却遠心処理（4℃、15,
000 × G、5分）し、上清を除去した。ペレットを1 mlの滅菌水にて洗浄した。洗浄後のペレット（細胞けん濁液5 μlに相当）をPCR増幅用試料とした。
【０１４２】
１−４）PCR増幅
下記表４に示される組成にて、ダイレクト・リアルタイムＰＣＲ（DqPCR）マスターミックスを調製した。具体的には、SYBRPremix Ex TaqTM PCR Master Mix (2×)（Takara-Bio Co., Ltd, Otsu, Japan）をリアルタイムPCR用バッファーとして用い、ＰＣＲ増幅用forward primer及びreverse primerとしてBacteria Screening PCR Kit (Takara-Bio)添付Primer Mix BS (5μM each)を使用した。尚、本プライマーミックスはスタフィロコッカス属及びバチラス属を共に検出可能とするプライマーであり、増幅遺伝子長は約380 bpである。リアルタイムＰＣＲは２回実施した。
【０１４３】
【表４】
0006035257.tif 000007
【０１４４】
リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、下記のＰＣＲサーマルサイクル条件により、リアルタイムＰＣＲを実施した。
1) 95℃, 1分（1サイクル）
2) 95℃, 10秒; 59℃, 30秒; 72℃, 30秒（40サイクル）
尚、陰性コントロールとして、滅菌水5μlを鋳型として使用した。
【０１４５】
２． 結果及び考察
リアルタイムＰＣＲの結果を表５に示す。
【０１４６】
【表５】
0006035257.tif 000008
【０１４７】
表５によれば、グラム陽性細菌であるS. aureusについても、イリジウム錯体（二量体）処理により生細胞と死細胞の識別が可能であることが示された。これにより、イリジウム錯体によりグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に関して、明瞭な生細胞と死細胞の識別が可能であることが示された。
【０１４８】
〔実施例３〕2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichlorideによるE. coliの生細胞・死細胞の識別
実施例１及び２にて、イリジウム錯体二量体を用いて、E. coli及びS. aureusというグラム陰性細菌、グラム陽性細菌の生細胞及び死細胞の明瞭な識別ができることが示された。本実施例では、イリジウム錯体単量体を用いてE. coliの生細胞と死細胞が識別できるかを検討した。
【０１４９】
１．試験材料及び方法
１−１）滅菌水を用いてE. coli JCM1649株の生細胞けん濁液（2.1 × 107 cfu/ml）を調製した。この生細胞懸濁液の一部を沸騰水中に3分浸漬し、死細胞懸濁液（2.1 × 107 cells/ml）を調製した。これらの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ90 μlを下記試験に供した。
【０１５０】
１−２）イリジウム錯体溶液の調製
2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride（関東化学（株）、東京）4.22 mg (8.55 μmol)を精確に秤量し、855.3 μlのジメチルスルフォキシド（Sigma）に溶解して10 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して250 μM、500 μM、2000μMのイリジウム錯体溶液を準備した。
【０１５１】
１−３）イリジウム錯体による被検試料の処理
前記の各イリジウム錯体溶液10 μlを、上記生細胞けん濁液90 μl又は死細胞けん濁液90 μlに添加し、恒温水槽にて37℃で30分間保持した。その後、冷却遠心処理（4℃、15,000 × G、5分）し、上清を除去した。ペレットを1 mlの滅菌水にて洗浄した。洗浄後のペレット（細胞けん濁液5 μlに相当）をPCR増幅用試料とした。
【０１５２】
１−４）PCR増幅
実施例１と全く同じ条件（すなわち、表２に示すダイレクト・リアルタイムPCRマスターミックス使用）にて、ダイレクト・リアルタイムPCR（DqPCR）を実施した。
【０１５３】
２．結果及び考察
リアルタイムPCRの結果を表６に示す。
【０１５４】
【表６】
0006035257.tif 000009
【０１５５】
表６によれば、2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichlorideをE. coliの生細胞及び死細胞に作用させたとき、死細胞のCt値は薬剤濃度依存的に大きくなり、当該イリジウム錯体200 μMの濃度にて死細胞由来のPCR増幅が完全に抑制された。一方、生細胞に関しては、濃度が高くなるにつれ若干薬剤の透過現象が観察されるが、前記死細胞由来のPCRを完全に抑制した薬剤濃度では、未処理生細胞のCt値と比較して4.3程度の上昇（増幅の遅れ）に留まり、当該イリジウム錯体200 μMにて明瞭な生細
胞と死細胞の識別が可能であった。
これにより、イリジウム錯体は二量体のみならず単量体においてもE. coliの明瞭な生細胞と死細胞の識別が可能であることが示された。
【０１５６】
〔実施例４〕2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichlorideによるS. aureusの生細胞・死細胞の識別
実施例３においては、イリジウム錯体単量体によりE. coliの生細胞と死細胞の明瞭な識別が可能であることが示された。本実施例では、同じイリジウム錯体単量体によりS. aureusの生細胞と死細胞を明瞭に識別できるかを検討した。
【０１５７】
１．試験材料及び方法
１−１）滅菌水を用いてS. aureus ATCC 6538P株の生細胞けん濁液（6.6 × 107 cfu/ml）を調製した。この生細胞けん濁液の一部を沸騰水中に3分浸漬し、死細胞懸濁液を調製したこれらの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ90 μlを下記試験に供した。
【０１５８】
１−２）イリジウム錯体溶液の調製
2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride(関東化学（株）、東京) 3.89 mg (7.88 μmol)を精確に秤量し、788.1 μlのジメチルスルフォキシド（Sigma）に溶解して10 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して250 μM、500 μM、2000μMのイリジウム錯体溶液を準備した。
【０１５９】
１−３）イリジウム錯体による被検試料の処理
前記の各イリジウム錯体溶液10 μlを、上記生細胞けん濁液90 μl又は死細胞けん濁液90 μlに添加し、恒温水槽にて37℃で15分間保持した。その後、冷却遠心処理（4℃、15,000 × G、5分）し、上清を除去した。ペレットを1 mlの滅菌水にて洗浄した。洗浄後のペレット（細胞けん濁液5 μlに相当）をPCR増幅用試料とした。
【０１６０】
１−４）PCR増幅
実施例２と同様にして、リアルタイムＰＣＲを２回実施した。
【０１６１】
２． 結果及び考察
リアルタイムＰＣＲの結果を表７に示す。
【０１６２】
【表７】
0006035257.tif 000010
【０１６３】
表７によれば、グラム陽性細菌であるS. aureusについても、当該イリジウム錯体（単量体）処理により生細胞と死細胞の識別が可能であることが示された。これにより、二量体や単量体に関わらず、イリジウム錯体により広くグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に関して、明瞭な生細胞と死細胞の識別が可能となった。
【配列表】
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