(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻を検出する方法であって、前記方法は：
前記方法に使用するためのサンプルを獲得すること；および
１つ以上の渦鞭毛藻サキシトキシンＡ触媒ドメインのポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドの存在に関してサンプルを分析することを含んでなり；
前記サキシトキシンＡ触媒ドメインが、サキシトキシンＡ４触媒ドメイン、またはサキシトキシンＡ４触媒ドメインの断片から選択され；
前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在が、前記サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻の存在を示す方法。
【請求項２】
サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻の非存在を判定する方法であって、前記方法が：
前記方法に使用するためのサンプルを獲得すること；および
１つ以上の渦鞭毛藻サキシトキシンＡ触媒ドメインのポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドの存在に関してサンプルを分析することを含んでなり；
前記サキシトキシンＡ触媒ドメインが、サキシトキシンＡ４触媒ドメイン、またはサキシトキシンＡ４触媒ドメインの断片から選択され；
前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの非存在が、前記サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻の非存在を示す方法。
【請求項３】
サキシトキシンＡ４触媒ドメイン配列またはその断片が、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３１１５〜４１２１、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３５９７〜３７２１、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体を含んでなる請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記分析が、ポリメラーゼ連鎖反応による前記サンプルからポリヌクレオチドの増幅を含んでなる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
配列番号１９８〜１９９のいずれか１つに示された配列、またはこれらの配列のいずれか１つの断片もしくは変異体を含んでなる１つ以上のプライマーを利用する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号４の残基９４７−１２８１に示されたサキシトキシンＡ４触媒ドメインのアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含んでなる請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記サキシトキシン産生渦鞭毛藻が、アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）、ピロジニウム（Ｐｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）またはギムノジニウム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）属に由来する請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記サキシトキシン産生渦鞭毛藻が、Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ、Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ、Ａ  ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｍ、Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ、Ａ．ｏｓｔｅｎｆｅｌｄｉｉ、Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）、Ｇ．ｃａｔｅｎａｔｕｍおよびＰ．ｂａｈａｍｅｎｓｅ  ｖａｒ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｍからなる群から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻の検出用キットであって、前記キットが、渦鞭毛藻サキシトキシンＡ触媒ドメインのポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドの存在を検出するために少なくとも１種の試剤を含んでなり、前記サキシトキシンＡ触媒ドメインが、サキシトキシンＡ４触媒ドメイン、またはサキシトキシンＡ４触媒ドメインの断片から選択されるキット。
【請求項１０】
サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻の非存在の判定用キットであって、前記キットが、渦鞭毛藻サキシトキシンＡ触媒ドメインのポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドの存在を検出するために少なくとも１種の試剤を含んでなり、前記サキシトキシンＡ触媒ドメインが、サキシトキシンＡ４触媒ドメイン、またはサキシトキシンＡ４触媒ドメインの断片から選択されるキット。
【請求項１１】
前記サキシトキシンＡ４触媒ドメイン配列またはその断片が、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３１１５〜４１２１、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３５９７〜３７２１、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体を含んでなる請求項９または請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記試剤が、プライマー、プローブまたは抗体である請求項９〜１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
前記試剤が、配列番号１９８〜１９９のいずれか１つに示された配列、またはこれらの配列のいずれか１つの断片もしくは変異体を含んでなるプライマーである請求項９〜１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
前記試剤が、配列番号４の残基９４７−１２８１に示されたサキシトキシンＡ４触媒ドメインのアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体に特異的に結合する請求項９または請求項１０に記載のキット。
【請求項１５】
サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻の検出用プライマー対であって、前記プライマー対が、配列番号１９８のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第一のプライマー、および配列番号１９９のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第二のプライマーを含んでなるプライマー対。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照による援用
本出願は、２０１１年５月１６日に出願された米国の米国仮特許出願第６１／４８６，６３３号明細書からの優先権を主張するものであり、その内容全体は、相互参照により本明細書に援用されている。
【０００２】
本発明は一般に、サキシトキシン類の分野、およびそれらを産生できる微生物の同定に関する。さらに具体的には、本発明は、渦鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）中のサキシトキシンをコードする遺伝子の同定、およびサキシトキシン類の産生源である渦鞭毛藻類の具体的な検出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
サキシトキシン（ＳＴＸ）は、世界中の水生環境中に存在し、重大な経済的、環境的および人の健康に影響を及ぼす強力な神経毒である。ベクター種の摂取により、麻痺および死に至り得る重篤なヒト疾患である麻痺性貝毒に至るおそれがある。１５％の死亡率で推定２０００件のヒトにおける麻痺性貝毒が毎年世界中で発生している。ＳＴＸのモニタリングおよび軽減のためにコストがかかるため、有害なプランクトン大増殖による経済的損失は年間８億９５００万米国ドルと算出されている。淡水環境において、ＳＴＸは、主として原核生物のラン藻類に産生される。しかし、海洋環境においては真核生物の渦鞭毛藻類がＳＴＸの存在と関連している。多くの渦鞭毛藻種がＳＴＸ産生と関連があるにもかかわらず、これらの微生物におけるＳＴＸ産生に関する遺伝学的根拠は曖昧のままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
海洋サンプルにおけるＳＴＸ産生渦鞭毛藻類の存在（または非存在）を検出する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
多くの試験において、酵素学的特性化、ＰＣＲ法、表現配列タグ（ＥＳＴ）ライブラリのインシリコ分析、または他の公的に利用可能なヌクレオチド配列の使用により渦鞭毛藻類中のＳＴＸ経路の遺伝子および／または酵素を同定する試みは不成功に終わっている。さらに、幾つかの以前の試験により、ＳＴＸが、実際は渦鞭毛藻類により産生されず、その代わりに共培養細菌により産生される可能性が示唆されている。
【０００６】
本発明により、渦鞭毛藻類が実際にＳＴＸ産生源であることが確認され、また、これらの微生物におけるＳＴＸ産生の原因となる遺伝子が同定された。ＳＴＸ産生の原因となる遺伝子の同定により、淡水環境ならびに海洋環境双方におけるＳＴＸ産生渦鞭毛藻類を検出するための多数の分子試験に関する基準が提供される。
【０００７】
第１の態様において、本発明は、サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻を検出する方法を提供し、この検出方法は：
この検出方法に使用するためのサンプルを得ること、および
１種以上の渦鞭毛藻サキシトキシンＡポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドの存在に関してサンプルを分析することを含んでなり、
前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在により、サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻の存在が示される。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻の非存在を判定する方法を提供し、この判定方法は：
この判定方法に使用するためのサンプルを得ること、および
１種以上の渦鞭毛藻サキシトキシンＡポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドの存在に関してサンプルを分析することを含んでなり、
前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの非存在により、サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻の非存在が示される。
【０００９】
第１または第２の態様の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号５〜１９７、２２４〜２２７、２３０〜２４２および２４７のいずれか１つに示されている配列、またはこれらの配列のいずれか１つの断片もしくは変異体から選択されるサキシトキシンＡヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１０】
第１または第２の態様の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、サキシトキシンＡ１触媒ドメイン配列、サキシトキシンＡ４触媒ドメイン配列、またはそれらの断片を含んでなる。
【００１１】
第１または第２の態様の一実施形態において、サキシトキシンＡ４触媒ドメイン配列またはその断片は、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３１１５〜４１２１、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３５９７〜３７２１、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体を含んでなる。
【００１２】
第１または第２の態様の一実施形態において、サキシトキシンＡ４触媒ドメイン配列またはその断片は、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３１１５〜４１２１、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３５９７〜３７２１、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体からなる。
【００１３】
第１または第２の態様の一実施形態において、サキシトキシンＡ１触媒ドメイン配列は、配列番号１に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド１６０〜１８２１、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド２７７〜２０２２、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体を含んでなる。
【００１４】
第１または第２の態様の一実施形態において、サキシトキシンＡ１触媒ドメイン配列は、配列番号１に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド１６０〜１８２１、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド２７７〜２０２２、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体からなる。
【００１５】
第１または第２の態様の一実施形態において、分析は、ポリメラーゼ連鎖反応によるサンプルからのポリヌクレオチドの増幅を含んでなる。
【００１６】
第１または第２の態様の一実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応は、配列番号１９８または配列番号１９９に示された配列、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体を含んでなる１種以上のプライマーを利用する。
【００１７】
第１または第２の態様の一実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応では、配列番号１９８または配列番号１９９に示された配列、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体からなる１種以上のプライマーが利用される。
【００１８】
第１または第２の態様の一実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応は、配列番号１９８〜１９９、２００〜２１１、２２０〜２２３、２２８〜２２９、および２４３〜２４４、またはこれらの配列のいずれか１つの断片もしくは変異体を含んでなるか、またはそれらからなる１種以上のプライマーを利用する。
【００１９】
第１または第２の態様の一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に示されたサキシトキシンＡのアミノ酸配列、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体を含んでなる。
【００２０】
第１または第２の態様の一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４に示されたサキシトキシンＡのアミノ酸配列、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体からなる。
【００２１】
第１または第２の態様の一実施形態において、サキシトキシン産生渦鞭毛藻は、アレキサンドリウム属（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）、ピロジニウム属（Ｐｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）またはギムノジニウム属（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）に由来する。
【００２２】
第１または第２の態様の一実施形態において、サキシトキシン産生渦鞭毛藻は、Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）、Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）、Ａ  ルシタニクム（Ａ  ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｍ）、Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）、Ａ．オステンフェルジー（Ａ．ｏｓｔｅｎｆｅｌｄｉｉ）、Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）、Ｇ．カテナツム（Ｇ．ｃａｔｅｎａｔｕｍ）、およびＰ．バハメンセバルコンプレッスム（Ｐ．ｂａｈａｍｅｎｓｅ  ｖａｒ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｍ）からなる群から選択される。
【００２３】
第１または第２の態様の一実施形態において、前記分析は、第１１または第１２の態様のプライマー対を用いて実施される。
【００２４】
第３の態様において、本発明は、サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻の検出用キットを提供し、このキットは、渦鞭毛藻のサキシトキシンＡポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドの存在を検出するための少なくとも１種の試剤を含んでなる。
【００２５】
第４の態様において、本発明は、サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻の非存在の判定用キットを提供し、このキットは、渦鞭毛藻のサキシトキシンＡポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドの存在を検出するための少なくとも１種の試剤を含んでなる。
【００２６】
第３または第４の態様の一実施形態において、試剤は、配列番号５〜１９７、２２４〜２２７、２３０〜２４２および２４７のいずれか１つに示された配列、またはこれらの配列のいずれか１つの断片もしくは変異体から選択されたサキシトキシンＡのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドに特異的に結合する。
【００２７】
第３または第４の態様の一実施形態において、試剤は、サキシトキシンＡ１触媒ドメイン配列、サキシトキシンＡ４触媒ドメイン配列、またはそれらの断片を含んでなるポリヌクレオチドに特異的に結合する。
【００２８】
第３または第４の態様の一実施形態において、サキシトキシンＡ４触媒ドメイン配列、またはその断片は、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３１１５〜４１２１、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３５９７〜３７２１、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体を含んでなる。
【００２９】
第３または第４の態様の一実施形態において、サキシトキシンＡ４触媒ドメイン配列、またはその断片は、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３１１５〜４１２１、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３５９７〜３７２１、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体からなる。
【００３０】
第３または第４の態様の一実施形態において、サキシトキシンＡ１触媒ドメイン配列は、配列番号１に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド１６０〜１８２１、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド２７７〜２０２２、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体を含んでなる。
【００３１】
第３または第４の態様の一実施形態において、サキシトキシンＡ１触媒ドメイン配列は、配列番号１に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド１６０〜１８２１、配列番号３に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド２７７〜２０２２、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体からなる。
【００３２】
第３または第４の態様の一実施形態において、試剤は、プライマー、プローブまたは抗体である。
【００３３】
第３または第４の態様の一実施形態において、試剤は、配列番号１９８または配列番号１９９に示された配列、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体を含んでなるプライマーである。
【００３４】
第３または第４の態様の一実施形態において、試剤は、配列番号１９８または配列番号１９９に示された配列、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体からなるプライマーである。
【００３５】
第３または第４の態様の一実施形態において、試剤は、配列番号１９８〜１９９、２００〜２１１、２２０〜２２３、２２８〜２２９、および２４３〜２４４のいずれか１つに示された配列、またはこれらの配列のいずれか１つの断片もしくは変異体を含んでなるか、またはそれらからなるプライマーである。
【００３６】
第３または第４の態様の一実施形態において、試剤は、配列番号２または配列番号４に示されたサキシトキシンＡのアミノ酸配列、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体に特異的に結合する。
【００３７】
第３または第４の態様の一実施形態において、キットは、２種の試剤を含んでなり、２種の試剤は、第１１または第１２の態様のプライマー対である。
【００３８】
第１、第２、第３または第４の態様の一実施形態において、サンプルは、環境サンプルである。
【００３９】
第１、第２、第３または第４の態様の一実施形態において、サンプルは、塩水サンプルである。
【００４０】
第１、第２、第３または第４の態様の一実施形態において、サンプルは、淡水サンプルである。
【００４１】
第１、第２、第３または第４の態様の一実施形態において、サンプルは、海洋サンプルである。
【００４２】
第５の態様において、本発明は、配列番号１に示された配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは断片を提供する。
【００４３】
第５の態様の一実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１に示された配列、またはその変異体もしくは断片からなる。
【００４４】
第６の態様において、本発明は、配列番号３に示された配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド、またはその変異体もしくは断片を提供する。
【００４５】
第６の態様の一実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号３に示された配列、またはその変異体もしくは断片からなる。
【００４６】
第７の態様において、本発明は、配列番号５〜１９７、２２４〜２２７、２３０〜２４２および２４７のいずれか１つに示された配列を含んでなる単離ポリヌクレオチドまたはこれらの配列のいずれか１つの変異体もしくは断片を提供する。
【００４７】
第７の態様の一実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号５〜１９７、２２４〜２２７、２３０〜２４２および２４７のいずれか１つに示された配列またはこれらの配列のいずれか１つの変異体もしくは断片からなる。
【００４８】
第８の態様において、本発明は、第５、第６または第７の態様に従ってポリヌクレオチドのいずれか１つによりコード化された単離ポリペプチドを提供する。
【００４９】
第９の態様において、本発明は、第５、第６または第７の態様に従ってポリヌクレオチドに特異的に結合するプライマーまたはプローブを提供する。
【００５０】
第１０の態様において、本発明は、第８の態様に従ってポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。
【００５１】
第１１の態様において、本発明は、サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻を検出するためのプライマー対を提供し、前記プライマー対は、配列番号１９８のポリヌクレオチド配列を含んでなる第１のプライマー、またはその断片もしくは変異体、および配列番号１９９のポリヌクレオチド配列を含んでなる第２のプライマー、またはその断片もしくは変異体を含んでなる。
【００５２】
第１１の態様の一実施形態において、プライマー対は、配列番号１９８のポリヌクレオチド配列からなる第１のプライマー、またはその断片もしくは変異体、および配列番号１９９のポリヌクレオチド配列からなる第２のプライマー、またはその断片もしくは変異体を含んでなる。
【００５３】
第１２の態様において、本発明は、サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻を検出するためのプライマー対を提供し、前記プライマー対は：
配列番号１９８のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第１のプライマー、および配列番号１９９のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第２のプライマー；または
配列番号２００のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第１のプライマー、および配列番号２０１のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第２のプライマー；または
配列番号２０２のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第１のプライマー、および配列番号２０３のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第２のプライマー；または
配列番号２０４のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第１のプライマー、および配列番号２０５のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第２のプライマー；または
配列番号２０６のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第１のプライマー、および配列番号２０７のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第２のプライマー；または
配列番号２０８のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第１のプライマー、および配列番号２０９のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第２のプライマー；または
配列番号２１０のポリヌクレオチド配列を含むか、もしくはそれからなる第１のプライマー、および配列番号２１１のポリヌクレオチド配列を含むか、もしくはそれからなる第２のプライマー；または
配列番号２２０のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第１のプライマー、および配列番号２２１のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第２のプライマー；または
配列番号２２２のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第１のプライマー、および配列番号２２３のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第２のプライマー；または
配列番号２２８のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第１のプライマー、および配列番号２２９のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第２のプライマー；または
配列番号２４３のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第１のプライマー、および配列番号２４４のポリヌクレオチド配列を含んでなるか、もしくはそれからなる第２のプライマー、を含んでなる。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態を、添付の図面を参照に例示みを目的としてここに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】渦鞭毛藻類とシアノバクテリアにおけるｓｘｔＡの構造をを示す図である。Ａ．  Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）  ＣＣＭＰ１７１９におけるｓｘｔＡ転写物の転写物の構造。Ｂ．  Ｃ．ラシボルスキー（Ｃ．ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ）  Ｔ３のゲノムｓｘｔＡ構造。Ｃ．太字で印されたｓｘｔＡにより導入された結合と分子を有するＳＴＸの構造。
【図２】Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）のｓｘｔＡ転写物とシアノバクテリアのｓｘｔＡ遺伝子のＧＣ含量を示すグラフである。ＧＣ含量は、１０００ｂｐのウインドウサイズで１０ｂｐ毎に算出された。
【図３】ＳｘｔＡ１の系統樹を示す図であり、縮尺で描かれた系統図が表示されており（完全系統樹に関しては図５を参照）、最尤法トポロジーを示している。分岐点上の数字は、最尤法およびベイジアン（Ｂａｙｅｓｉａｎ）解析それぞれのブートストラップ値を表している。
【図４Ａ】ＳｘｔＡ４の系統樹を示す図である。縮尺で描かれた系統図が表示されており（完全系統樹に関しては図６を参照）、最尤法トポロジーを示している。分岐点上の数字は、最尤法およびベイジアン解析それぞれのブートストラップ値を表している。
【図４Ｂ】増殖サイクルの間、３つの異なる時点でのＡ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）  ＡＣＳＨ０２におけるｓｘｔＡ４のゲノムコピー数を示すグラフである。
【図５】ＳｘｔＡ１系統樹を示す図であり、最尤法トポロギーが示されている。分岐点上の数字は、最尤法およびベイジアン解析それぞれのブートストラップ値を表している。太字の配列は、転写物由来の配列であり；ＲＡＣＥを用いて生じるか、または４５４の読取りアセンブリからの整列群である。
【図６】ＳｘｔＡ４系統樹を示す図であり、最尤法トポロギーを示している。分岐点上の数字は、それぞれ最尤法およびベイジアン解析のブートストラップ値を表している。太字の配列は、；ＲＡＣＥを用いて生じたか、または４５４の読取りアセンブリからの整列群である転写物由来の配列である。
【図７】実施例２に述べられている植物プランクトンとＳ．グロメラータ（Ｓ．ｇｌｏｍｅｒａｔａ）のサンプリング地点を示すマップである。Ａ．ニューサウスウェールズ、オーストラリア（Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の３ヵ所の河口域内でブルームを採取；Ｂ．ブリスベン・ウォーター（Ｂｒｉｓｂａｎｅ  Ｗａｔｅｒ）、Ｃ．ジョージズ・リバー（Ｇｅｏｒｇｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）およびＤ．ワゴンガ入り江（Ｗａｇｏｎｇａ  Ｉｎｌｅｔ）。Ｄ中のスケールバーは、差込マップＢ、ＣおよびＤ内において１ｋｍを表す。
【図８】３つのアレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）株の指数増殖の既知細胞数からのＤＮＡ希釈に基づいたｓｘｔＡ４プライマー対の標準曲線を示すグラフである。アッセイは、種々の株において３０〜２６００の細胞を表すＤＮＡ濃度を用いて試験した。
【図９】Ａ．ジョージズ・リバーおよびＢ．ワゴンガ入り江のサンプリング地点において２０１０年１１月の期間、顕微鏡的細胞同定カウントおよびＬＳＵ  ｒＤＮＡプライマー対を用いたｑＰＣＲに基づいてｓｘｔＡ４遺伝子コピー（一次ｙ軸）の存在量、およびアレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）細胞（二次ｙ軸）の推定量を示す２つのグラフである。
【図１０】サンプリング地点において毎週、光学顕微鏡下で手動カウントにより判定したｓｘｔＡ４Ｌ−１のコピー数またはアレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の細胞数を示すグラフである。
【図１１】アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の細胞存在量とｓｘｔＡ４のコピー数との間の回帰式を示すグラフである。
【図１２】アレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）ＡＴＮＷＢ０１のＳＥＭ画像を示す図である。Ａ）スケールバー＝５μｍでの一般的細胞サイズと形状を示す無傷の細胞膜を有する腹面図、Ｂ）スケールバー＝１０μｍでの細胞形状を示す無傷の細胞膜を有する背面図、Ｃ）スケールバー＝５μｍでの上錐体の頂端図、１インチプレート上のＡＰＣおよびポアを示す、Ｄ）スケールバー＝１０μｍでの下錐体の底面図、プレートパターンを示す、Ｅ）頂端ポア複合体、コンマ形状を示す、Ｆ）スケールバー＝２μｍでの後溝プレート、ポアを示す。
【図１３】アレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）のＡＴＣＪ３３株、ＡＴＥＢ０１株、およびＡＴＢＢ０１株のＳＥＭ画像（比較のため、Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ  １９９１からの引用）、Ａ〜ＤはＡＴＣＪ３３を示す図であり、Ａ）スケールバー＝１０μｍでの２個の細胞鎖および一般的な細胞サイズと形状を示すＡＴＣＪ３３、Ｂ）腹面ポアを示す第１の頂端プレート、Ｃ）コンマ形状を示すＡＰＣ、Ｄ）腹面ポアＥ，Ｆ，Ｈ  ＡＴＥＢ０１を示す第１の頂端プレート、Ｅ）スケールバー＝１０μｍでの細胞の一般的サイズと形状を示すＡＴＥＢ０１、Ｆ）ＡＴＥＢ０１、腹面ポアを示す第１の頂端プレート、Ｇ）腹面ポアとＡＰＣを示すＡＴＢＢ０１、Ｈ）ＡＰＣを示すＡＴＥＢ０１。
【図１４】Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）複合体（２８２１のキャラクタ）の１８Ｓ＋ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２＋２８Ｓ  ｒＤＮＡが連結された系統を示す図である。この系統樹はベイズの推論（Ｐｈｙｌｏｂａｙｅｓ）により再構築されている。内部分岐点上の数字は、ＰｈｙｌｏｂａｙｅｓとＲＡｘＭＬ（順序づけ；Ｐｈｙｌｏｂａｙｅｓ／ＲａｘＭＬ）に関する事後確率およびブートストラップ値（＞５０％）を表す。黒丸は、１．００の事後確率値および＞９０％のブートストラップを示す。１〜４群の分岐は折りたたまれている。系統の拡張版に関して参照。
【図１５】ＨＰＬＣを用いたＡＴＮＷＢ０１の毒性プロファイルを示す図であり、示されたピークは、ＰＳＰ毒性基準に対して決定された。
【図１６】Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）複合体（２８２１のキャラクタ）の１８Ｓ＋ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２＋２８Ｓ  ｒＤＮＡが連結された系統を示す図である。この系統樹はベイズの推論（Ｐｈｙｌｏｂａｙｅｓ）により再構築されている。内部分岐点上の数字は、ＰｈｙｌｏｂａｙｅｓとＲＡｘＭＬ（順序づけ；Ｐｈｙｌｏｂａｙｅｓ／ＲａｘＭＬ）に関する事後確率およびブートストラップ値（＞５０％）を表す。黒丸は、１．００の事後確率値および＞９０％のブートストラップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
定義
本出願に用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈において他に明確に指示されない限り、複数の記述を含む。例えば、用語「渦鞭毛藻類（ａ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ）」は複数の渦鞭毛藻類も含む。
【００５７】
本明細書に用いられる用語「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの語句「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」の変形は、対応して意味が変わる。したがって、例えば、タンパク質をコード化する配列を「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ポリヌクレオチドは、専らその配列からなる場合もあるし、１つ以上のさらなる配列を含む場合もある。
【００５８】
本明細書に用いられる用語「サキシトキシン」は、純粋なサキシトキシンおよびその類縁体を包含しており、それらの非限定例としては、ネオサキシトキシン（ｎｅｏＳＴＸ）、ゴニオトキシン（ＧＴＸ）、デカルバモイルサキシトキシン（ｄｃＳＴＸ）、非硫酸化類縁体、一硫酸化類縁体、二硫酸化類縁体、デカルバモイル化類縁体および疎水性類縁体が挙げられる。
【００５９】
本明細書において、先行技術文献の説明、またはこれらの文献に由来する記述か、またはこれらの文献に基づく記述をいずれも、それらの文献または由来する記述が関連技術の通常の一般的知識の一部であるとして認めるものではない。
【００６０】
説明を目的として、本明細書に引用される全ての文献およびジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）配列は、それらの全体が参照として本明細書に援用されている。
【００６１】
詳細な説明
本発明者らは、渦鞭毛藻類がサキシトキシン（ＳＴＸ）の産生源であると判定し、これらの微生物においてＳＴＸ産生の原因となる遺伝子を同定した。この発見に基づいて、本発明者らは、ＳＴＸ−産生渦鞭毛藻種とＳＴＸを産生しない渦鞭毛藻種とを識別できるアッセイを開発した。
【００６２】
したがって、本発明の一定の態様は、渦鞭毛藻類に存在するＳＴＸポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の提供に関する。
【００６３】
サンプル中に本発明の１つ以上の配列の存在（または非存在）の検出に基づいて、所与のサンプル中のＳＴＸ−産生渦鞭毛藻類を検出する方法もまた提供される。
【００６４】
サンプル中に本発明の１つ以上の配列の存在（または非存在）を検出するために、試剤を含んでなる所与のサンプル中のＳＴＸ−産生渦鞭毛藻類の検出用キットもまた提供される。
【００６５】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
渦鞭毛藻サキシトキシンのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列（それぞれ「本発明のポリヌクレオチド」および「本発明のポリペプチド」）が本明細書に開示される。本発明のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）または相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）であり得る。
【００６６】
一定の実施形態において、配列は、サキシトキシンＡ遺伝子（ｓｘｔＡ）ポリヌクレオチド配列またはサキシトキシンＡポリペプチド（ＳＴＸＡ）配列である。
【００６７】
ｓｘｔＡポリヌクレオチド配列は、１つ以上のｓｘｔＡ遺伝子触媒ドメイン（すなわち、ｓｘｔＡ１、ｓｘｔＡ２、ｓｘｔＡ３、またはｓｘｔＡ４触媒ドメイン）、またはそれらの断片のいずれかを含むことができる。非限定例としてのみ、ｓｘｔＡ１配列は、ジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３８（配列番号１）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド１６０〜１８２１またはジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号３）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド２７７〜２０２２によって定義できる。ｓｘｔＡ２配列は、ジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３８（配列番号１）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド１８３７〜２４１５またはジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号３）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド２０３８〜２６０４により定義できる。ｓｘｔＡ３配列は、ジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３８（配列番号１）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド２４７９〜２６９４またはジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号３）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド２７２２〜２９４９により定義できる。ｓｘｔＡ４配列は、ジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号３）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３１１５〜４１２１またはジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号３）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３５９７〜３７２１により定義できる。
【００６８】
本発明のｓｘｔＡ遺伝子ポリヌクレオチド配列の他の非限定例としては、ジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３８およびＪＦ３４３２３９（配列番号１および配列番号３）に提供されたものが挙げられる。
【００６９】
ＳＴＸＡポリペプチド配列は、１つ以上のＳＴＸタンパク質触媒ドメイン（すなわち、ＳＴＸＡ１、ＳＴＸＡ２、ＳＴＸＡ３、またはＳＴＸＡ４触媒ドメイン）、またはそれらの断片のいずれかを含み得る。非限定例としてのみ、ＳＴＸＡ１配列は、ジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３８（配列番号２）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基１〜５５４またはジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号４）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基１〜５８２によって定義できる。ＳＸＴＡ２配列は、ジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３８（配列番号２）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基５６０〜７５２またはジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号４）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基５８８〜７７６により定義することができる。ＳＴＸＡ３配列は、ジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３８（配列番号２）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基７７４〜８４５またはジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号４）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基８１６〜８９１により定義することができる。ＳＸＴＡ４配列は、ジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号４）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基９４７〜１２８１により定義することができる。
【００７０】
本発明のＳＴＸポリペプチド配列の他の非限定例としては、ジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２３８およびＪＦ３４３２３９（配列番号２および配列番号４）に提供されたものが挙げられる。
【００７１】
ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、サキシトキシン産生渦鞭毛藻類に由来することが好ましい。例えば、ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、ゴニオウラクス目（Ｇｏｎｙａｕｌａｃａｌｅｓ）またはギムノジニウム目（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉａｌｅｓ）の渦鞭毛藻類に由来し得る。渦鞭毛藻類は、アレキサンドリウム属（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）（以前はゴニオウラクス属（Ｇｏｎｙａｕｌａｘ））、ピロジニウム属（Ｐｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）またはギムノジニウム属（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）であることが好ましい。
【００７２】
好ましいアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種の非限定例としては、Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）（例えば、株ＡＣＣＣ０１、ＡＣＳＨ０２、ＡＣＴＲＡ０２およびＣＣＭＰ１４９３），Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）（例えば、株ＣＣＭＰ１７１９およびＣＣＭＰ１９７９）、Ａ．ルシタニクム（Ａ．ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｍ）、Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）（例えば、株ＣＣＭＰ１８８８、ＣＣＭＰ１１３、ＡＬＳＰ０１、ＡＬＳＰ０２およびＡＭＤ１６／ＡＭＡＤ１６）、Ａ．オステンフェルジー（Ａ．ｏｓｔｅｎｆｅｌｄｉｉ）、およびＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）（例えば、株ＣＣＭＰ１７７１、ＡＴＢＢ０１、ＡＴＥＢ０１、ＡＴＣＪ３３およびＡＴＮＷＢ０１）が挙げられる。好ましいギムノジニウム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）種の非限定例としては、Ｇ．カテナツム（Ｇ．ｃａｔｅｎａｔｕｍ）（例えば、株ＧＣＴＲＡ０１およびＣＳ−３９５）が挙げられる。好ましいピロジニウム（Ｐｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）種の非限定例としては、Ｐ．バハメンセバルコンプレッスム（Ｐ．ｂａｈａｍｅｎｓｅ  ｖａｒ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｍ）が挙げられる。
【００７３】
本発明のポリヌクレオチドと本発明のポリペプチド双方の断片もまた、本明細書に提供される。
【００７４】
本明細書で考慮されているポリヌクレオチドの「断片」は、本発明のポリヌクレオチドの構成成分またはその変形であるポリヌクレオチド分子である。ポリヌクレオチドの断片は、必ずしも生物学的活性を保持するポリペプチドをコード化する必要はないがその事例であることから除外されない。一定の実施形態において、断片は、ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして有用であり得る。断片は、本発明のポリヌクレオチドを開裂させることによって誘導できるか、またあるいは、幾つかの他の手段、例えば、化学合成により合成することができる。本明細書で考慮されるポリヌクレオチドの断片は、長さが約５０００未満のヌクレオチド、長さが約４５００未満のヌクレオチド、または長さが約４０００未満、３５００未満、３０００未満、２５００未満、２０００未満、１５００未満、１０００未満、７５０未満、５００未満、４００未満、３００未満、２５０未満、２００未満、１５０未満、１００未満、７５未満、５０未満、２５未満または１５未満のヌクレオチドであり得る。さらに、またあるいは、本明細書で考慮されるポリヌクレオチドの断片は、長さが約１５超のヌクレオチド、長さが約２５超のヌクレオチド、または長さが約５０超ヌクレオチド、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、３００超、４００超、５００超、７５０超、１０００超、１５００超、２０００超、２５００超、３０００超、３５００超または４０００超のヌクレオチドであり得る。さらに、またあるいは、本明細書で考慮されるポリヌクレオチドの断片は、長さが約２５〜約５０の間のヌクレオチド、長さが約２５〜約７５の間のヌクレオチド、または長さが約２５〜約１００の間のヌクレオチド、１００〜２５０の間、１００〜５００の間、２５０〜５００の間、１００〜１０００の間、５００〜２０００の間、１０００〜２０００の間のヌクレオチドであり得る。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチドの断片は、ｓｘｔＡ遺伝子の断片を含んでなる。例えば、本発明のポリヌクレオチドの断片は、ｓｘｔＡ１、ｓｘｔＡ２、ｓｘｔＡ３、またはｓｘｔＡ４触媒ドメイン、またはそれらの断片のいずれか１つ以上を含むことができる。本発明のポリペプチド断片は、ＳＴＸタンパク質の断片含んでなる。例えば、本発明のポリヌクレオチドの断片は、ＳＴＸＡ１、ＳＴＸＡ２、ＳＴＸＡ３、またはＳＴＸＡ４触媒ドメイン、またはそれらの断片のいずれか１つ以上を含むことができる。
【００７６】
本発明のｓｘｔＡ遺伝子のポリヌクレオチド配列断片の具体的かつ非限定的な例としては、ジェンバンクの登録番号ＪＦ３４３２４０〜ＪＦ３４３４３２（配列番号５〜配列番号１９７）に提供されたもの、および配列番号２２４〜２２７、２３０〜２４２および２４７に示されたものが挙げられる。
【００７７】
本発明のｓｘｔＡ遺伝子のポリヌクレオチド配列断片のさらなる具体的かつ非限定的な例としては、ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３８（配列番号３）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３１１５〜４１２１およびヌクレオチド３５９７〜３７２１により定義されたもの、およびそれらの断片および変異体が挙げられる。
【００７８】
ｓｘｔＡ１触媒ドメイン配列の具体的かつ非限定的な例としては、配列番号２２４〜２２７および２４７に示されたものが挙げられる。
【００７９】
ｓｘｔＡ４触媒ドメイン配列の具体的かつ非限定的な例としては、配列番号２３０〜２４２に示されたものが挙げられる。
【００８０】
本明細書で考慮されているポリペプチドの「断片」は、本発明のポリペプチドの構成成分またはその断片であるポリペプチド分子である。断片は一般に、構成成分であるポリペプチドに共通の定性的な生物活性を有するが、このことは必ずしも必要ではない。本明細書で考慮されているポリペプチドの断片は、長さが約１５００未満のアミノ酸残基、長さが約１４００未満のアミノ酸残基、または長さが約１３００未満、１２００未満、１１００未満、１０００未満、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満、３００未満、２５０未満、２００未満、１５０未満、１００未満、７５未満、５０未満、２５未満または１５未満のアミノ酸残基であり得る。さらに、またあるいは、本明細書で考慮されているポリペプチドの断片は、長さが約１５超のアミノ酸残基、長さが約２５超のアミノ酸残基、または長さが約５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、３００超、４００超、５００超、６００超、７００超、８００超、９００超、１０００超、１１００超、１２００超、または１３００超のアミノ酸残基であり得る。さらに、またあるいは、本明細書で考慮されているポリペプチドの断片は、長さが約１５〜約２５の間のアミノ酸残基、長さが約１５〜約５０の間のアミノ酸残基、または長さが約１５〜７５の間、１５〜１００の間、１５〜１５０の間、２５〜５０の間、２５〜１００の間、５０〜１００の間、５０〜１５０の間、１００〜２００の間、１００〜２５０の間、１００〜３００の間、１００〜５００の間、５００〜７５０の間、５００〜１０００の間、または１０００〜１３００の間のアミノ酸残基であり得る。
【００８１】
本発明のＳＴＸＡのポリペプチド配列断片の具体的かつ非限定的な例としては、ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２４８（配列番号３）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基Ｘ−Ｙにより定義されたもの、ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号４）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基９４７〜１２８１により定義されたもの、およびそれらの断片および変異体が挙げられる。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドの変異体と本発明のポリペプチドの変異体、およびそれらの断片もまた、本明細書に提供される。
【００８３】
本明細書に考慮されている「変異体」とは、実質的に類似の配列のことである。一般に、２つの配列が、特定された領域上で、または特定されない場合は全体の配列上で同一（「配列同一性」のパーセンテージ）である特定されたパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドのを有するならば、２つの配列は「実質的に類似」している。したがって、本明細書に開示されたポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の「変異体」は、参照配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有することができる。
【００８４】
一般に、ポリペプチド配列の変異体は、定性的な生物活性を共通に有する。ポリヌクレオチド配列の変異体は、一般に定性的な生物活性を共通に有するポリペプチドをコード化する。用語「変異体」の意味の中に、本発明のポリヌクレオチドおよび本発明のポリペプチドの相同体も含まれる。ポリヌクレオチド相同体は、一般に種々の渦鞭毛藻種から由来するが、本明細書に開示された対応するポリヌクレオチドと同一の生物学的機能または活性を実質的に共有する。ポリペプチド相同体は、一般に種々の渦鞭毛藻種から由来するが、本明細書に開示された対応するポリペプチドと同一の生物学的機能または活性を実質的に共有する。用語「変異体」には、本発明のポリペプチドの類縁体もまた含まれる。ポリペプチド「類縁体」は、本発明のポリペプチドの誘導体であるポリペプチドであり、その誘導体は、ポリペプチドが実質的に同じ機能を保持するように１つ以上のアミノ酸の付加、削除、置換を含んでなる。用語「保存的アミノ酸置換」とは、ポリペプチド鎖（タンパク質の一次配列）内の１つのアミノ酸を、同様の性質を有する別のアミノ酸へ置換することまたは交換することである。例えば、荷電アミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）を、同様に荷電アミノ酸であるアスパラギン酸（Ａｓｐ）へ置換することは、保存的アミノ酸置換であるといえる。
【００８５】
一般に、本発明のポリヌクレオチドおよび本発明のポリペプチドは「単離」される。本文脈における「単離」とは、当然のことながら、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、その天然状態で見出されると思われる幾つかまたは全ての他の成分から取り出されたか、または他の成分に結合していないことを意味する。例えば、「単離」ポリヌクレオチドは、より大きなポリヌクレオチド配列を有する他のポリヌクレオチドから取り出すことができるか、または無関係のポリヌクレオチドなどの天然成分から取り出すことができる。同様に、「単離」ポリペプチドは、より大きなポリペプチド配列を有する他のポリペプチドから取り出すことができるか、または無関係のポリペプチドなどの天然成分から取り出すことができる。明確に述べると、ポリペプチドの「単離」ポリヌクレオチドには、天然から取り出されずに、化学的合成および／または組換え法による調製など、新規に調製されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドも含まれる。本明細書に記載されるように、本発明の単離ポリペプチドは、より長いポリペプチドまたは融合タンパク質の構成部分として含まれ得る。
【００８６】
一定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ベクター内にクローン化することができる。ベクターは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含むことができる。ベクターは、プラスミドベクター、ウィルスベクター、または外来配列の挿入、細胞内への導入および導入された配列の発現のために適合させた他の好適な媒体であり得る。一般にベクターは、発現ベクターであり、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合部位、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列などの発現制御配列およびプロセシング配列を含むことができる。本発明は、このようなベクターにより形質変換された宿主細胞も考慮されている。例えば、本発明のポリヌクレオチドを、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌宿主細胞に形質変換されるベクター内にクローン化することができる。ベクターの構築法および宿主細胞への形質変換法は、一般に当該技術分野において知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃなどの標準的テキストに記載されている。
【００８７】
プローブ、プライマーおよび抗体
本発明のポリヌクレオチドには、プライマーおよびプローブとして使用するためのポリヌクレオチドの誘導体および断片含まれる。
【００８８】
誘導体および断片は、オリゴヌクレオチドの形態であり得る。オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲなどの核酸増幅反応への使用に好適なヌクレオチド残基の短い伸長であり、一般に長さが少なくとも約５から約８０のヌクレオチド、より一般的には、長さが少なくとも約１０から約５０のヌクレオチド、さらにより一般的には、長さが少なくとも約１５から約３０のヌクレオチドである。
【００８９】
一実施形態において、プローブは、配列番号２４５または配列番号２４６に示された配列を含んでなるか、またはそれらからなる。
【００９０】
一般に、ハイブリダイゼーションによる相同的配列の検出に使用するため、プローブは、変えられる長さのヌクレオチド配列であり、例えば、約１０のヌクレオチドと数千のヌクレオチドとの間のヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、または他のオリゴヌクレオチドであり得る。
【００９１】
ヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーのデザイン法および／または製造法は、当該技術分野において知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋなどの標準的テキスト；およびＩｔａｋｕｒａ    ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，（Ｅｄｓ）（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＩｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，（Ｅｄｓ）（１９９９）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋなどの出版物に記載されている。
【００９２】
ポリヌクレオチドのプライマーおよびプローブは、例えば、ホスホジエステル法およびホスホトリエステル法などの化学合成法（例えば、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；米国特許第４３５６２７０号明細書）、およびジエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９−１８６２を参照）により調製することができる。
【００９３】
前述のプローブおよびプライマーなど、本発明のポリヌクレオチドは、マーカーの組込みにより標識してそれらの検出を容易にすることができる。核酸の標識法および検出法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．などの標準的テキストに記載されている。好適なマーカーの非限定例としては、蛍光分子（例えば、アセチルアミノフルオレン、５−ブロモデオキシウリジン、ジゴキシゲニン、およびフルオレセイン）および放射性同位元素（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、３３Ｐ）が挙げられる。マーカーの検出は、例えば、化学的、光化学的、免疫化学的、生化学的または分光学的技法により達成することができる。
【００９４】
プローブおよびプライマーを用いて、例えば、関心対象であるサンプル中の渦鞭毛藻類を検出または単離することができる。一定の実施形態において、プローブおよびプライマーを用いて、関心対象であるサンプル中のＳＴＸ産生渦鞭毛藻類を検出することができる。さらに、またあるいは、プローブまたはプライマーを用いて、他の生物、例えば、他の渦鞭毛藻種などの対応する配列を単離することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ハイブリダイゼーションなどの方法を用いて、本明細書に示された配列に対するそれらの配列の相同性に基づきこのような配列を同定することができる。本明細書に示された全体配列に対する、またはそれらの断片に対する配列相同性に基づき選択される配列は、実施形態により包含されている。このような配列としては、開示された配列の相同分子種である配列が挙げられる。用語「相同分子種」とは、共通の祖先遺伝子に由来する遺伝子のことであり、種分化の結果、種々の種に見られる。遺伝子のヌクレオチド配列および／またはコード化されたタンパク質配列が、本明細書の他所で定義されるような実質的な同一性を共有する場合、種々の種に見られる遺伝子は相同分子種として考慮される。相同分子種の機能は、種間で保存性が高いことが多い。
【００９５】
ハイブリダイゼーション技法において、既知のヌクレオチド配列の全部または一部を用いて、所与のサンプル中に存在する他の対応する核酸配列に対し選択的にハイブリダイズするプローブを生成する。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、または他のオリゴヌクレオチドであり得、検出可能なマーカーにより標識することができる。したがって、例えば、ハイブリダイゼーション用プローブは、本発明の配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識することによって作製することができる。プローブと標的配列との間の相同性（配列同一性）のレベルは、主としてハイブリダイゼーション条件の厳密性により大いに決定されるであろう。特に、プローブとして使用されるヌクレオチド配列は、低厳密性、中程度厳密性または高厳密性の条件下、本明細書に開示されたポリヌクレオチドの相同体または他の変異体に対してハイブリダイズすることができる。当業者によく知られている多くの条件および要素があり、これらは、例えば、特定の核酸にハイブリダイズするために核酸の長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）；塩類の濃度およびホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールなどの存在または非存在などの他の成分；ならびにハイブリダイゼーションの温度および／または洗浄ステップを変えることなど、ハイブリダイゼーションの厳密性を変えるために使用することができる。
【００９６】
ＰＣＲアプローチ下、ＰＣＲ反応に使用するために、オリゴヌクレオチドプライマーをデザインして、任意の関心のある生物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡからの対応するＤＮＡ配列を増幅させることができる。ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲクローニングをデザインする方法は、一般に当該技術分野において知られている。ＰＣＲの知られた方法としては、限定はしないが、ペアードプライマー、ネスト状プライマー、単一特異的プライマー、縮退プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチドプライマーなどを用いる方法が挙げられる。
【００９７】
ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに使用するため本明細書に記載されたプライマーが、渦鞭毛藻ｓｘｔ遺伝子配列の検出用プローブとして使用できることも、当業者は認識するであろう。
【００９８】
本発明は、抗体が本発明のポリペプチドに特異的に結合できることも考慮されている。抗体を使用して、所与サンプル中の１種以上のＳＴＸポリペプチドを定性的または定量的に検出でき、かつ分析できる。「特異的結合」によって、当然のことながら抗体は、無関係のタンパク質に対する結合よりも高親和性で標的ポリペプチドまたはその断片に結合できる。例えば、抗体は、少なくとも約１０−４Ｍから約１０−１０Ｍの範囲の結合定数でポリペプチドまたはその断片に結合できる。結合定数は、少なくとも約１０−５Ｍまたは少なくとも約１０−６Ｍであることが好ましい。結合定数は、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍまたは少なくとも約１０−９Ｍ以上であることがより好ましい。本発明の文脈において、本発明のＳＴＸポリペプチドに特異的な抗体に関しては、ポリペプチドの断片に特異的である抗体を含む。
【００９９】
本発明の抗体は、例えば、全抗体として、または抗体断片として、または相補的決定領域など、他のそれらの免疫学的活性断片としてなど、種々の形態で存在し得る。同様に、抗体は、機能的抗原結合ドメイン、すなわち、重鎖および軽鎖可変ドメインを有する抗体断片として存在し得る。また、抗体断片は、限定はしないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、ｄＡｂ（単一ドメイン抗体）、キメラ抗体、二重特異的抗体、ジアボディーおよびトリアボディーからなる群から選択される形態で存在し得る。
【０１００】
抗体「断片」は、全抗体の修飾または所望の抗体断片の合成により製造することができる。抗体断片を含む抗体生成法は、当該技術分野において知られており、例えば、組換えＤＮＡ技法による合成が挙げられる。当業者は、例えば、米国特許第５２９６３４８号明細書およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．などの標準的テキストに記載されているものなど、抗体を合成する方法を認識するであろう。
【０１０１】
抗体は、関心のあるＳＴＸポリペプチドの個別の領域または断片から調製するのが好ましい。関心のあるポリペプチドの抗原部分は、約５から約１５のアミノ酸からなど、適切な長さであり得る。抗原部分は、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４のアミノ酸残基を含有することが好ましい。
【０１０２】
本発明のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体は、例えば、本発明の精製ＳＴＸポリペプチドを用いるか、または当該技術分野において知られた任意の方法を用いて本発明のＳＴＸポリペプチドをコード化する本発明の精製ＳＴＸポリヌクレオチド配列を用いて調製することができる。例えば、一般にＦａｂ部分を含有するモノクローナル抗体は、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｅｄｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８６）２ｎｄ  ｅｄ；およびＫｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７に記載されたハイブリドーマ技法を用いて調製することができる。このような技法としては、限定はしないが、ファージまたは同様のベクターにおける組換え抗体のライブラリからの抗体選択による抗体調製、ならびにウサギまたはマウスを免疫化することによりポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６を参照）が挙げられる。
【０１０３】
また、当然のことながら、本発明の抗体としては、ヒト化抗体、キメラ抗体、および完全ヒト抗体が挙げられる。本発明の抗体は、２つ以上の抗原またはエピトープに対して結合特異性を有する二重特異性抗体であり得る。例えば、抗体は、１つ以上のＳＴＸポリペプチドまたはその断片への特異性を有することができ、さらに別の抗原への結合特異性を有することができる。ヒト化抗体、キメラ抗体、完全ヒト抗体、および二重特異的抗体の調製法は、当該技術分野において知られており、例えば、米国特許第６９９５２４３号明細書に記載されたものが挙げられる。
【０１０４】
一般に、本発明のＳＴＸポリペプチドを潜在的に含んでなるサンプルは、ＳＴＸポリペプチドまたはその断片を特異的に結合する抗体と接触することができる。場合によっては、抗体を固体支持体に固定して、抗体をサンプルと接触させる前に複合体の洗浄とその後の単離を促進させることができる。固体支持体の例としては、例えば、マイクロタイタープレート、ビーズ、チック、またはミクロビーズが挙げられる。上記のとおり、抗体は、プロテインチップアレイまたはプローブ基質に結合させることもできる。
【０１０５】
本発明のポリペプチドに結合された抗体の同定のための検出可能な標識としては、限定はしないが、フルオロクローム、蛍光色素、蛍光染料、放射標識、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、当該技術分野において一般に用いられる他のものなどの酵素、およびコロイド状金または色ガラスまたはプラスチックビーズを含む比色分析ラベルが挙げられる。あるいは抗体を、間接アッセイを用いて検出することができ、例えば、第２の標識抗体を用いてポリペプチド−特異的抗体結合を検出する。
【０１０６】
抗体−マーカー複合体の存在の測定法、または複合体量の測定法としては、例えば、蛍光、化学発光、発光、吸光度、複屈折、透過率、反射率の検出、または表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、共振ミラー法、回折格子結合器導波管法、または干渉分光法などの屈折率の検出が挙げられる。高周波法としては、多極性共鳴分光法が挙げられる。電気化学的方法としては、電流測定法およびボルタメトリー法が挙げられる。光学的方法としては、画像法ならびに非画像法および顕微鏡法が挙げられる。
【０１０７】
抗体−マーカー複合体の存在の検出、または複合体量の測定のための有用なアッセイとしては、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロットアッセイが挙げられる。このような方法は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ，（Ｅｄｓ）（１９９１）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７ｔｈ  ｅｄ；  ａｎｄ  Ａｓａｉ，（Ｅｄ）（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ３７に記載されている。
【０１０８】
渦鞭毛藻類の検出法
本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明のポリペプチドの検出法および／または単離法（「本発明の方法」）を提供する。
【０１０９】
一実施形態において、本発明は、サンプル中の渦鞭毛藻を検出する方法を提供する。この方法は、方法に使用するためのサンプルを獲得すること、およびサンプル中の本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明のポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体の存在を検出することを含んでなる。サンプル中のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体の存在により、サンプル中の渦鞭毛藻類を示している。
【０１１０】
ｓｘｔＡ遺伝子が、サキシトキシン産生渦鞭毛藻類に存在するが、サキシトキシンを産生しない渦鞭毛藻類には存在しないことを、本発明者は判定した。特に、ｓｘｔＡ遺伝子のｓｘｔＡ１および／またはｓｘｔＡ４触媒ドメインの検出により、サキシトキシン産生渦鞭毛藻類を示していることが確認されている。
【０１１１】
したがって、別の実施形態において、本発明は、サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻を検出する方法を提供する。この方法は、方法に使用するためのサンプルを獲得すること、およびサンプル中の本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明のポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体の存在を検出することを含んでなる。サンプル中のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体の存在により、サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻類を示している。
【０１１２】
別の実施形態において、本発明は、サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻類の非存在を判定する方法を提供する。この方法は、方法に使用するためのサンプルを獲得すること、およびサンプル中の本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明のポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体の非存在を判定することを含んでなる。サンプル中のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体の非存在により、サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻類が存在しないことを示している。
【０１１３】
本発明の方法の文脈（即上部の段落に記載されたものを含む）において、ポリヌクレオチド配列は、サキシトキシンＡ遺伝子（ｓｘｔＡ）配列であり得る。ｓｘｔＡポリヌクレオチド配列は、１つ以上のｓｘｔＡ遺伝子触媒ドメイン（すなわち、ｓｘｔＡ１、ｓｘｔＡ２、ｓｘｔＡ３、またはｓｘｔＡ４触媒ドメイン）のいずれか、またはそれらの断片を含むことができる。ｓｘｔＡポリヌクレオチド配列は、ｓｘｔＡ１および／またはｓｘｔＡ４ドメイン、またはその断片を含んでなることが好ましい。ｓｘｔＡポリヌクレオチド配列は、ｓｘｔＡ４ドメイン、またはその断片を含んでなることがより好ましい。ポリヌクレオチド配列は、サキシトキシンＡポリペプチド（ＳＴＸＡ）配列であり得る。
【０１１４】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３８およびＪＦ３４３２３９（配列番号１および配列番号３）のいずれか１つに提供された配列、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体に相当する。
【０１１５】
他の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２４０〜ＪＦ３４３４３２（配列番号５〜配列番号１９７）のいずれか１つに提供された配列、またはその配列のいずれか１つの断片もしくは変異体のに相当する。
【０１１６】
他の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２２４〜２２７および２４７のいずれか１つに提供されたｓｘｔＡ１触媒ドメイン配列、またはその配列のいずれか１つの断片もしくは変異体を含んでなる。
【０１１７】
他の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２３０〜２４２のいずれか１つに提供されたｓｘｔＡ４触媒ドメイン配列、またはその配列のいずれか１つの断片もしくは変異体を含んでなる。
【０１１８】
他の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３８（配列番号１）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド１６０〜１８２１；ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号３）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド２７７〜２０２２；ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３８（配列番号１）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド１８３７〜２４１５；ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号３）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド２０３８〜２６０４；ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３８（配列番号１）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド２４７９〜２６９４；ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号３）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド２７２２〜２９４９；ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号３）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３１１５〜４１２１；ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号３）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３５９７〜３７２１；またはそれらの配列のいずれか１つの断片もしくは変異体を含むことができる。
【０１１９】
本発明の方法の文脈（即上部の段落に記載されたものを含む）において、ポリペプチド配列は、サキシトキシンＡタンパク質（ＳＴＸＡ）配列であり得る。ＳＴＸＡポリペプチド配列は、１つ以上のＳＴＸＡタンパク質触媒ドメイン（すなわち、ＳＴＸＡ１、ＳＴＸＡ２、ＳＴＸＡ３、またはＳＴＸＡ４触媒ドメイン）のいずれか、またはそれらの断片を含むことができる。ＳＴＸＡポリペプチド配列は、ＳＴＸＡ１またはＳＴＸＡ４ドメイン、またはその断片を含んでなることが好ましい。ＳＴＸＡポリペプチド配列は、ＳＴＸＡ４ドメイン、またはその断片を含んでなることがより好ましい。
【０１２０】
幾つかの実施形態において、ポリペプチド配列は、ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３８またはＪＦ３４３２３９（配列番号２および配列番号４）に提供された配列、またはいずれかの配列の断片もしくは変異体に相当する。
【０１２１】
他の実施形態において、ポリペプチド配列は、ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３８（配列番号２）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基１〜５５４；ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号４）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基１〜５８２；ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３８（配列番号２）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基５６０〜７５２；ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号４）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基５８８〜７７６；ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３８（配列番号２）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基７７４〜８４５；ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号４）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基８１６〜８９１；ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号４）に示されたポリペプチド配列のアミノ酸残基９４７〜１２８１；またはこれらの配列のいずれか１つの断片もしくは変異体を含むことができる。
【０１２２】
本発明の方法を用いて、サンプル中に検出された渦鞭毛藻類またはサンプルから非存在であると判定された渦鞭毛藻類は、サキシトキシン産生渦鞭毛藻類であり得る。特に限定はしないが、渦鞭毛藻類は、ゴニオウラクス目（Ｇｏｎｙａｕｌａｃａｌｅｓ）またはギムノジニウム目（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉａｌｅｓ）から由来し得る。渦鞭毛藻類は、アレキサンドリウム属（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）（以前は、ゴニオウラクス属（Ｇｏｎｙａｕｌａｘ））、ピロジニウム属（Ｐｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）またはギムノジニウム属（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）から由来し得る。アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種の好適な例としては、Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）（例えば、株ＡＣＣＣ０１、ＡＣＳＨ０２、ＡＣＴＲＡ０２およびＣＣＭＰ１４９３）、Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）（例えば、株ＣＣＭＰ１７１９およびＣＣＭＰ１９７９）、Ａ．ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｍ、Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）（例えば、株ＣＣＭＰ１８８８、ＣＣＭＰ１１３、ＡＬＳＰ０１、ＡＬＳＰ０２およびＡＭＤ１６／ＡＭＡＤ１６）、Ａ．オステンフェルジー（Ａ．ｏｓｔｅｎｆｅｌｄｉｉ）およびＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）（例えば、株ＣＣＭＰ１７７１、ＡＴＢＢ０１、ＡＴＥＢ０１、ＡＴＣＪ３３およびＡＴＮＷＢ０１）が挙げられる。ギムノジニウム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）種の好適な例としては、Ｇ．カテナツム（Ｇ．ｃａｔｅｎａｔｕｍ）（例えば、株ＧＣＴＲＡ０１およびＣＳ〜３９５）が挙げられる。ピロジニウム（Ｐｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）種の好適な例としては、Ｐ．バハメンセバルコンプレッスム（Ｐ．ｂａｈａｍｅｎｓｅ  ｖａｒ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｍ）が挙げられる。
【０１２３】
本発明の方法に使用のサンプルは、任意の手段により「獲得する」ことができる。例えば、サンプルは、天然状態からのサンプル（例えば、湖、海、河川からのサンプル）から取り出すことにより、または「非天然」状態（例えば、実験室設定の培養、ダム、貯水槽、タンクなど）から取り出すことにより獲得できる。
【０１２４】
本発明の方法に使用のサンプルは、１種以上の渦鞭毛藻類、または１種以上のサキシトキシン産生渦鞭毛藻類をを含む疑いがあり得る。サンプルは、比較サンプルまたは対照サンプル、例えば、渦鞭毛藻類またはサキシトキシン産生渦鞭毛藻類の既知の濃度または密度を含んでなるサンプル、または渦鞭毛藻類またはサキシトキシン産生渦鞭毛藻類の１種以上の既知の種または株を含んでなるサンプルであり得る。サンプルは、任意の供給源に由来し得る。例えば、サンプルは、環境サンプルであり得る。環境サンプルは、例えば、塩水、淡水、河川水、湖水、海水、または沿岸水に由来し得る。環境サンプルは、渦鞭毛藻ブルームに由来し得る。あるいは、サンプルは、培養などの実験室源または市販源に由来し得る。あるいは、サンプルは、例えば、組織または生体液などの生物学的源に由来し得る。サンプルは、原物質状態から、例えば、精製、希釈または任意の他の成分または成分の付加により修飾することができる。
【０１２５】
一定の実施形態において、本発明の方法を用いて試験されたサンプルは、サンプル源を取り込む動物においてサキシトキシンの存在または非存在に関して情報を提供することができる。例えば、サンプルを試験して、例えば、魚類（例えば、フグ）および特に貝類（例えば、ゴカイ、クラム、カキ、ホタテガイなど）など、動物水産物においてサキシトキシンの存在または非存在を判定できる。
【０１２６】
本発明の方法に使用するためのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、混合培養または個々の種または属単離体としてのいずれかの微生物から単離（すなわち、抽出）することができる。したがって、サンプルの微生物は、抽出前に培養でるか、または抽出は、供与サンプル上で直接実施することができる。本発明の方法を用いる分析用のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの単離（すなわち、抽出）と精製に好適な方法は、一般に、当該技術分野において知られており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（Ｅｄｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；Ｗａｌｋｅｒ，（Ｅｄ）（１９８８）Ｎｅｗ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ；およびＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ．Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．などの標準的テキストに記載されている。さらなる方法としては、Ｎｅｉｌａｎ（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：２２８６−２２９１に記載されている。本発明の方法の使用に好適なポリペプチド精製法としては、限定はしないが、逆相カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、遠心分離、ゲルろ過、硫酸アンモニウム沈殿、およびイオン交換が挙げられる。
【０１２７】
代わりの実施形態において、本発明の方法は、サンプルから核酸および／またはポリペプチドを単離することなく実施することができる。
【０１２８】
供与サンプル中の本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明のポリペプチドの存在の検出（または不在の判定）は、任意の好適な技法を用いて実施することができる。好適な技法は、一般に本発明の１つ以上のポリヌクレオチドのいずれか、または本発明の１つ以上のポリペプチドのいずれかに特異的なプライマー、プローブまたは抗体の使用を含み得る。好適な技法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびこの技法の関連する変型（例えば、定量的ＰＣＲ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、流動細胞計測法、蛍光顕微鏡法などの抗体ベースのアッセイが挙げられる。これらおよび他の好適な技法は、一般に当該技術分野において知られており、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；Ｗａｌｋｅｒ，（Ｅｄ）（１９８８）Ｎｅｗ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ；およびＳｃｏｐｅｓ（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ．Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．などの標準的テキストに記載されている。
【０１２９】
好ましい実施形態において、供与サンプル中の本発明のポリヌクレオチドの存在（または非存在の判定）の検出は、ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により、関心のあるサンプルから抽出された核酸の増幅により、および増幅配列の検出により達成される。ＰＣＲアプローチ下、オリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲ反応に使用のためにデザインして、例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡポリヌクレオチドなどの本発明のポリヌクレオチドを増幅させることができる。ＰＣＲの好適な方法は、限定はしないが、ペアードプライマー、ネスト状プライマー、単一特異的プライマー、縮退プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチドプライマーなどを用いるものが挙げられる。ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲプライマーの検出法は、一般に当該技術分野において知られており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２），２８０−２８１；Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，（Ｅｄｓ）（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，（Ｅｄｓ）（１９９９）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋなどの標準的テキストに開示されている。
【０１３０】
ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ手法の種々のパラメータが、能力に影響を及ぼすことなく変えて所望の産物を得ることができることを、当業者は容易に認識するであろう。例えば、塩濃度を変えることができるか、または１つ以上の変性ステップ、アニーリングステップおよび伸長ステップの時間および／または温度を変えることができる。同様に、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡテンプレートの量もまた、利用できる核酸量または効率的な増幅に必要な最適なテンプレート量に依って変えることができる。本発明の方法およびキットに使用するためのプライマーは、一般的にヌクレオチドの長さが少なくとも約５から約８０、より一般的には、ヌクレオチドの長さが約１０から約５０、さらにより一般的には、ヌクレオチドの長さが約１５から約３０のオリゴヌクレオチドである。
【０１３１】
本発明のプライマーが、限定はしないが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなど、および本発明のポリヌクレオチドの検出のためのプローブとして多くの異なる適用に有用となり得ることを当業者は認識するであろう。このようなプライマーは、例えば、直接的な化学合成またはクローニングおよび適切な配列の制限など、任意の好適な方法により調製することができる。プライマーがハイブリダイズするテンプレート分子の配列に反映させるのに、プライマーにおける全ての塩基を必要としない。プライマーがテンプレートにハイブリダイズできるように、プライマーは、十分な相補的塩基を含有させるだけのプライマーを必要とする。プライマーは、１つ以上の位置にミスマッチ塩基を含むこともでき、それらの塩基は、テンプレート中の塩基に相補的ではないが、むしろ、塩基の伸長または増幅の際、ＤＮＡ内に変化をもたらすようにデザインされる。例えば、増幅ＤＮＡのクローニングを促進させるために、５’末端に制限酵素の認識配列の形態で、プライマーは、追加の塩基を含むことができる。
【０１３２】
本発明の方法は、供与サンプル中の本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明のポリペプチドの存在の検出（または非存在の判定）を含む。上述のとおり、配列は、１つ以上のサキシトキシンＡ１、Ａ２、Ａ３、またはＡ４触媒ドメインの配列（またはそれらの断片）のいずれかなど、サキシトキシンＡ配列を含むことができる。配列は、サキシトキシンＡ１ドメインおよび／またはサキシトキシンＡ４ドメインを含んでなることが好ましい。配列は、サキシトキシンＡ４ドメイン（またはそれらの断片）を含んでなることがより好ましい。
【０１３３】
本発明の方法を実施する際、本発明のポリヌクレオチドを増幅できる任意のプライマー、本発明のポリヌクレオチドを検出できる任意のプローブ、または本発明のポリペプチドを検出できる任意の抗体を用いることができることを、当業者は認識するであろう。好ましい実施形態において、プライマー、プローブおよび抗体は、先の段落（すなわち、直ぐ上の段落）に記述されたサキシトキシンＡ配列のいずれか１つ以上に特異的に結合する。
【０１３４】
「特異的に結合すること」によって、当然のことながら、プライマー、プローブまたは抗体は、無関係の配列への結合よりも高い親和性で標的配列に結合できる。したがって、潜在的結合パートナーとして異なるが、等しく接触可能な複数の配列に曝露されると、標的配列に特異的なプライマー、プローブまたは抗体は、標的配列に選択的に結合し、他の代わりとなる潜在的結合パートナーは、プライマー、プローブまたは抗体により実質的に結合されないままとなる。一般に、標的配列に特異的なプライマー、プローブまたは抗体は、標的配列ではない他の潜在的配列よりも少なくとも１０倍、好ましくは５０倍、より好ましくは１００倍、最も好ましくは１００倍以上の頻度で標的配列に優先的に結合する。標的配列に特異的なプライマー、プローブまたは抗体は、弱いがまだ検出可能なレベルで非標的配列に結合でき得る。このことは、バックグラウンド結合として一般に知られており、例えば、適切な対照の使用により特異的な結合と容易に識別可能である。
【０１３５】
好ましい実施形態において、プライマー、プローブまたは抗体は、サキシトキシンＡ１またはＡ４触媒ドメインのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列、またはそれらの断片に特異的に結合する。プライマー、プローブまたは抗体は、サキシトキシンＡ４触媒ドメインのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列、またはそれらの断片に特異的に結合することがより好ましい。
【０１３６】
好適なプライマーおよびプローブは、サキシトキシンＡ１触媒ドメインのポリヌクレオチド配列の任意の断片に特異的に結合できる。好適な抗体は、このようなポリヌクレオチド配列によりコード化されたサキシトキシンＡ１触媒ドメインのポリペプチド配列の断片に特異的に結合できる。
【０１３７】
好適なプライマーおよびプローブは、サキシトキシンＡ４触媒ドメインのポリヌクレオチド配列の任意の断片に特異的に結合できる。非限定例のみの目的で、好適なプライマーおよびプローブは、ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３９（配列番号３）に示されたポリヌクレオチド配列のヌクレオチド３１１５〜４１２１により定義されたサキシトキシンＡ４触媒ドメインのポリヌクレオチド配列の断片に特異的に結合できる。好適な抗体は、このようなポリヌクレオチド配列によりコード化されたサキシトキシンＡ４触媒ドメインのポリペプチド配列の断片に特異的に結合できる。
【０１３８】
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、ＰＣＲ増幅を用いてサンプル中の本発明のポリヌクレオチドの存在の検出（または非存在の判定）を含むことができる。サキシトキシンＡのＰＣＲ増幅に好適なオリゴヌクレオチドプライマーは対である。ポリヌクレオチド配列は、ｓｘｔ遺伝子の１つ以上の触媒ドメインのいずれか、またはそれらの断片を増幅することができる。プライマーは、サキシトキシンＡ４触媒ドメインのポリヌクレオチド配列を含んでなる配列、またはその断片を増幅させることが好ましい。非限定例のみの目的で、この目的にとって好適なプライマー対は、配列番号１９８のポリヌクレオチド配列を含んでなる第１のプライマー、またはその断片もしくは変異体、および／または配列番号１９９のポリヌクレオチド配列を含んでなる第２のプライマー、またはその断片もしくは変異体を含むことができる。好適なプライマー対の他の非限定例としては、配列番号２００〜２１１、２２０〜２２３、２２８〜２２９、および２４３〜２４４に示されたもの（これらのプライマー対配列の断片および変異体など）が挙げられる。
【０１３９】
例示されたプライマーが、一般に増幅されたサキシトキシンＡ遺伝子の領域または本発明の方法を限定する意図はないことを、当業者は認識するであろう。本発明が、例示された特異的なプライマーの使用に限定されず、プライマーが適切にデザインされるという条件で代替のプライマー配列もまた使用でき、サキシトキシポリヌクレオチド配列、好ましくはサキシトキシンＡポリヌクレオチド配列、より好ましくはサキシトキシンＡ１および／またはＡ４ドメインポリヌクレオチド配列の増幅が可能であることもまた当業者は認識するであろう。
【０１４０】
他の実施形態において、好適なプローブの使用によって、本発明の方法は、サンプル中の本発明のポリヌクレオチドの存在の検出（または非存在の判定）を含むことができる。本発明のプローブは、本発明のｓｘｔポリヌクレオチド配列に基づいている。一般的にハイブリダイゼーションにより相同的配列の検出に使用するため、プローブは、例えば、約１０のヌクレオチドと数千のヌクレオチドとの間の可変長ヌクレオチド配列である。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ｍＲＮＡ断片、または他のオリゴヌクレオチドであり得る。本発明のプローブは、マーカーの取込みにより標識してそれらの検出を促進させることができる。好適なマーカーの例としては、蛍光分子（例えば、アセチルアミノフルオレン、５−ブロモデオキシウリジン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン）および放射性同位元素（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、３３Ｐ）が挙げられる。マーカーの検出は、例えば、化学的、光化学的、免疫化学的、生化学的、または顕微鏡的技法により達成することができる。ヌクレオチドプローブのデザイン方法および／または製造方法は、一般に当該技術分野において知られており、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（２００７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２８０−２８１などの標準的なテキストに記載されている。
【０１４１】
他の実施形態において、本発明の方法は、抗体を用いてサンプル中の本発明のポリペプチドの存在の検出（または非存在の判定）を含むことができる。抗体を用いて、供与サンプル中の本発明の１つ以上のＳＴＸポリペプチドを定性的または定量的に検出および分析することができる。抗体は、例えば、流動細胞計測法、免疫組織化学または当該技術分野において知られた他の手段により検出を可能にする蛍光色素に結合させることができる。あるいは、抗体は、比色検出または化学発光検出を可能にする基質に結合させることができる。本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合できる１種以上の抗体に結合できる二次抗体の使用も考慮されている。
【０１４２】
渦鞭毛藻の検出用キット
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明のポリペプチドの検出および／または単離用キット（「本発明のキット」）を提供する。
【０１４３】
一定の実施形態において、キットは、サンプル中の渦鞭毛藻を検出するために用いられる。
【０１４４】
他の実施形態において、キットは、サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻を検出するために用いられる。
【０１４５】
他の実施形態において、キットは、サンプル中のサキシトキシン産生渦鞭毛藻類の非存在を判定するために使用される。
【０１４６】
一般に、本発明のキットは、本発明の１つ以上のポリヌクレオチド、および／または本発明の１つ以上のポリペプチド、および／またはそれらの断片もしくは変異体の存在を検出するために少なくとも１種の試剤を含んでなる（上記のタイトル「ポリヌクレオチドおよびポリペプチド」の節参照）。この目的に好適な任意の試剤を、キットに含有させることができる。好適な試剤の非限定例としては、上記のタイトル「プローブ、プライマーおよび抗体」の節および「渦鞭毛藻類の検出法」の節に記載されたものなどのプライマー、プローブおよび抗体が挙げられる。
【０１４７】
好ましい実施形態において、キットは、本発明の方法に使用される（上記のタイトル「渦鞭毛藻類の検出方法」の節参照）。
【０１４８】
幾つかの実施形態において、本発明は、サンプル中の渦鞭毛藻の検出用キット、サンプル中、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドの存在、および／または本発明の１つ以上のポリペプチドの存在、および／またはいずれかの変異体もしくは断片の存在を検出するために少なくとも１種の試剤を含んでなるキットを提供する。渦鞭毛藻は、サキシトキシン産生渦鞭毛藻であることが好ましい。
【０１４９】
他の実施形態において、本発明は、サンプル中の渦鞭毛藻の非存在の判定用キット、サンプル中、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドの非存在、および／または本発明の１つ以上のポリペプチドの非存在、および／またはいずれかの変異体もしくは断片の非存在を判定するために少なくとも１種の試剤を含んでなるキットを提供する。渦鞭毛藻は、サキシトキシン産生渦鞭毛藻であることが好ましい。
【０１５０】
一般に、本発明のキットは、任意の数の追加成分を含むことができる。非限定例での追加構成要素としては、サンプルの収集および／または保存用成分、細胞培養用試薬、参照サンプル、緩衝剤、ラベル、および／または本発明の方法を実施するための取扱い説明書を挙げることができる。
【０１５１】
本発明のキットを用いてサンプル中に検出されるか、またはサンプルから非存在と判定された渦鞭毛藻類は、サキシトキシン産生渦鞭毛藻類であり得る。特定されたいかなる限定を課することなく、渦鞭毛藻類は、ゴニオウラクス目（Ｇｏｎｙａｕｌａｃａｌｅｓ）またはギムノジニウム目（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉａｌｅｓ）に由来し得る。渦鞭毛藻類は、アレキサンドリウム属（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）（以前はゴニオウラクス属（Ｇｏｎｙａｕｌａｘ））、，ピロジニウム属（Ｐｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）またはギムノジニウム属（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）に由来し得る。アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種の好適な例としては、Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）（例えば、株ＡＣＣＣ０１、ＡＣＳＨ０２、ＡＣＴＲＡ０２およびＣＣＭＰ１４９３）、Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）（例えば、株ＣＣＭＰ１７１９およびＣＣＭＰ１９７９）、Ａ  ルシタニクム（Ａ  ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｍ）、Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）（例えば、株ＣＣＭＰ１８８８、ＣＣＭＰ１１３、ＡＬＳＰ０１、ＡＬＳＰ０２およびＡＭＤ１６／ＡＭＡＤ１６）、Ａ．オステンフェルジー（Ａ．ｏｓｔｅｎｆｅｌｄｉｉ）およびＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）（例えば、株ＣＣＭＰ１７７１、ＡＴＢＢ０１、ＡＴＥＢ０１、ＡＴＣＪ３３およびＡＴＮＷＢ０１）が挙げられる。ギムノジニウム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）種の好適な例としては、Ｇ．カテナツム（Ｇ．ｃａｔｅｎａｔｕｍ）（例えば、株ＧＣＴＲＡ０１およびＣＳ−３９５）が挙げられる。ピロジニウム（Ｐｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）種の好適な例としては、Ｐ．バハメンセバルコンプレッスム（Ｐ．ｂａｈａｍｅｎｓｅ  ｖａｒ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｕｍ）が挙げられる。
【０１５２】
幅広く説明された本発明の意図または範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態に記載されるとおり、多くの変型および／または修飾が、本発明になすことができることは、当業者により認識されるであろう。したがって、本実施形態は、全ての態様において例示的でありかつ限定的ではないと考慮されるべきである。
【実施例】
【０１５３】
本発明は、具体的な実施例を参照として本明細書に記載されるが、これらは、限定されるものとして決して解釈してはならない。
【０１５４】
実施例１：渦鞭毛藻類の神経毒サキシトキシンに関して核−コード化遺伝子の同定
材料および方法
−培養および毒素測定
サキシトキシン産生および非産生渦鞭毛藻の培養は、種々の培養物収集から得られた（表１）。
【０１５５】
【表１】
0006001648.tif 000002
【０１５６】
培養物は、Ｇｓｅ中、１６〜２０℃で、１２／１２光サイクル下、およびフォトンｍ−２ｓ−１の約１００マイクロモルのフォトン照射で維持された（Ｄｏｂｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）における方法を参照、溶解された有機物質により毒性の渦鞭毛藻ギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）（Ｇｒａｈａｍ）の増殖および生物量の刺激、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍａｒ  Ｂｉｏｌ  Ｅｃｏｌ２３６：３３−４７を参照）またはＬ１培地（Ｇｕｉｌｌａｒｄ  ａｎｄ  Ｈａｒｇｒａｖｅｓ（１９９３）における方法を参照、Ｓｔｉｃｈｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｓは、黄藻植物ではなく珪藻である、Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ３２，２３４−２３６）。株の毒性は、ＨＰＬＣまたはＬＣＭＳを用いて測定された。ＨＰＬＣ法の検出限界は、Ｃ１およびＣ３に関しては約０．０７μｇＳＴＸｅｑ／１００ｇからＧＴＸ１に関しては４．１μｇＳＴＸｅｑ／１００ｇまでの範囲であった。ＬＣＭＳ法に関する検出限界は、ＮＥＯおよびＳＴＸに関しては約０．１ｐｇ／細胞からＣ１およびＣ２に関しては０．５ｐｇ／細胞までの範囲であった。
【０１５７】
−ＲＮＡおよびＤＮＡの抽出
４５４−ライブラリ構築物（下記参照）に関する全ＲＮＡを単離するために、アレキサンドリウム・フンジエンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）  Ｂａｌｅｃｈ  ＣＣＭＰ１７１９およびアレキサンドリウム・ミヌツム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ）  Ｈａｌｉｍ  ＣＣＭＰ１１３の培養物を、遠心分離（１分、１０００ｘｇ、１２℃）により指数相中で収穫した。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１．４ｍｍのビーズ（Ｍｅｄｉｎｏｒ）を用いて、Ｍｅｄｉｎｏｒ（２０秒のスピード４）からのＦａｓｔ  Ｐｒｅｐビード−ビーターによりドライアイス上でビードビーティングするために曝露し、製造元のプロトコルに従って全ＲＮＡを、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｃｅｌｌ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出した。
【０１５８】
ＲＡＣＥ分析に関して、ポリＡ濃縮ｍＲＮＡを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＤＩＲＥＣＴ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。細胞を、遠心分離（２分、４℃、１６０００ｘｇ）により収穫し、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞溶解／結合緩衝液を加え、これをビード−ビーター（２０秒、ステップ４）を用いて均質化した。遠心分離（１分、４℃、１６０００ｘｇ）後、透明なホモジネートを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ混合物に移し、プロトコルに従ってｍＲＮＡを単離した。最後に、提供されたプロトコルに従って、ｍＲＮＡをＴＵＲＢＯ（商標）ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した。
【０１５９】
製造元のプロトコルに従って、ゲノムＤＮＡプラントＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるか、またはＣＴＡＢ法用いることにより、表１に掲げた全ての渦鞭毛藻株からゲノムＤＮＡを単離した。
【０１６０】
ＲＮＡおよびＤＮＡの性質と含量は、対照渦鞭毛藻遺伝子（チトクロームｂ、アクチン）を増幅することにより、および／または臭化エチジウム染色寒天ゲル上でそれらを可視化することにより、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。
【０１６１】
−ｃＤＮＡライブラリの構築、４５４の配列決定、アセンブリおよび分析
各末端に取付けた４５４アダプタを用いて正常化ポリＡ濃縮ｃＤＮＡライブラリを、市販のＶｅｒｔｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＡＧ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｒｔｉｓ−ｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）より構築した。Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）  ＣＣＭＰ  １７１９およびＡ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）  ＣＣＭＰ１１３ライブラリの各プレートの半分は、Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ｕｉｏ．ｎｏ／）におけるＲｏｃｈｅ  ４５４配列決定ＴＩＴＡＮ技法を用いて配列決定された。少なくとも１つのｃＤＮＡアダプタを有した４５４読取りのみを、更に考慮した。アダプタおよび、存在する場合の完全および部分的渦鞭毛藻のスプライスされたリーダー（ＳＬ）配列は、現在、生命情報科学のツールＣＬＯＴＵに組み込まれている社内ＰＥＲＬスクリプトを用いるアセンブリの前に除去された。読取りは、主スイッチ「ｄｅｎｏｖｏ」、「ｅｓｔ」、「ａｃｃｕｒａｔｅ」および「４５４」によりソフトウェアプログラムＭｉｒａ  ｖ３．０．５を用いて集めた。
【０１６２】
２つの４５４ライブラリ内の推定上のｓｘｔ遺伝子配列を同定するために、カスタムＢＬＡＳＴ検索を、自由に入手できるオンラインデータポータル「Ｂｉｏｐｏｒｔａｌ」（ｗｗｗ．ｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｎｏ）で実施した。２つの戦略を用いた：シアノバクテリアルｓｘｔ遺伝子を、組立てアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）のデータセットまたは未組立て４５４の読取りデータセットに対して照会した。ｅ値＜０．１での全てのヒットを抽出し、各遺伝子に関する最低ｅ値を有する配列を、ＮＣＢＩにおける非冗長タンパク質データベースに対してブラストした。
【０１６３】
ｓｘｔＡに関して、全て検索された配列は、１０ｂｐの最少重なりおよび低厳密性または高厳密性を用いて、ソフトウェアプログラムＣＬＣ  Ｂｉｏ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈにおいて再組立てを行った。生じたコンティグ配列を、アリゴリズムのｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘおよびｔｂｌａｓｔｘを用いて非冗長およびＮＣＢＩにおけるＥＳＴデータベースに対してブラストした。ｓｘｔＡ転写物の構造は、シアノバクテリアからｓｘｔＡに対してそれらの翻訳された配列の位置合わせにより、ならびに保存ドメインサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ）により決定された。シアノバクテリア由来のｓｘｔＡの触媒的かつ基質結合残基は、以前に決定されていた。転写物は、シグナルＰ３．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）およびシグナル−３Ｌの３層アプローチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｂｉｏ．ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｂｉｏｉｎｆ／Ｓｉｇｎａｌ−３Ｌ／）において実施された神経回路網および隠れマルコフ（Ｍａｒｋｏｖ）モデルを用いて、可能なシグナルペプチドおよび対応する開裂部位の存在に関して検索した。ＴＭＨＭＭサーバー２．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）およびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットによる疎水性プロファイルを用いて、膜間らせん体を探索した。
【０１６４】
−ＲＡＣＥ分析
プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｒｉｍｅｒ３／；表２）を用いてｓｘｔＡに対し高相似性を有するコンティグの保存領域においてデザインした。
【０１６５】
【表２】
0006001648.tif 000003
【０１６６】
第１鎖ｃＤＮＡは、ＧＣ高含量の転写体に関する製造元（３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の説明書に従って、アダプタープライマーＡＰを用い、ポリＡを豊富に含んだ約９５ｎｇのｍＲＮＡにより合成した。ＲＮａｓｅ  Ｈ処理後、ＲＡＣＥ産物を１：１０に希釈し、ＰＣＲのテンプレートとして用いた。転写体の５’端を増幅するために、３つの異なるプロトコルを用いた。第１に、渦鞭毛藻類におけるＺｈａｎｇ（Ｚｈａｎｇら（２００７）スプライスリーダーＲＮＡトランススプライシング（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０４：４６１８−４６２３））の方法をわずかに改変して用いた。完全転写体を濃縮するために、上記の３’ＲＡＣＥライブラリを、プライマーＡＵＡＰ（キットで提供されるアダプタープライマー）およびｄｉｎｏＳＬにより増幅させた（ＰＣＲプログラム：９４℃−６０秒；３０×（９４℃−３０秒、６８℃−５分）；６８℃−１０分；８℃保持；下記のＰＣＲ化学を参照）。ＰＣＲ産物を１：１０に希釈してネステッドＰＣＲにおけるテンプレートとして用い、フォワードプライマーとしてｄｉｎｏＳＬ、およびいくつかの異なる内部リバースプライマー（表２）を用いて増幅させた。さらに、これらの実験では、提供された５’アダプタープライマーおよびいくつかの異なる内部リバースプライマーを用い、２つのキット、５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。全ての産物をクローン化し、下記の通り配列決定した。
【０１６７】
−ＰＣＲおよび配列決定
全てのＰＣＲ反応は、テンプレート、１単位の１０Ｘ  ＢＤ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、各０．５μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー（表２）、ＤＭＳＯ（１０％の最終濃度）および０．２５単位の５０Ｘ  ＢＤ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する２５μｌ容量中で実施した。別に明記しない限り、ＰＣＲは以下の通り増幅させた：９４℃−２．５分；５×（９４℃−３０秒；６８℃−変動）；５×（９４℃−３０秒；６６℃−３０秒；６８℃−変動）；２５×（９４℃−３０秒；６４℃−３０秒；６８℃−変動）；６８℃−１０分；８℃−保持。ＰＣＲ産物は、１％臭化エチジウム染色アガロースゲル上で可視化し、切り出し、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）により洗浄し、ＴＯＰＯ  ＴＡ（登録商標）クローニングキットにより、製造元の説明書に従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター；Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｍａｃｈ１（商標）Ｔ１Ｐｈａｇｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞）クローン化した。１単位の１０×標準ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）、０．４μＭのプライマーＴｏｐｏＦおよびＴｏｐｏＲ（表２）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、および１単位のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（Ｑｉａｇｅｎ）を含有する２５μｌのＰＣＲ反応液に、個々のコロニーを直接加えた。環化条件は、９５℃−１５分、３０×（９４℃−３０秒；６０℃−３０秒；７２℃−９０秒）、７２℃−５分、８℃−保持であった。ＰＣＲ産物を希釈し、クローニングキットと共に供給されたプライマーＭ１３ＦおよびＭ１３Ｒを用いて両側から直接Ｓａｎｇｅｒ配列決定した。
【０１６８】
−ｓｘｔＡｌおよびｓｘｔＡ４ゲノム増幅
全ての渦鞭毛藻類株（表１）を推定上のｓｘｔＡｌ遺伝子およびｓｘｔＡ４遺伝子の存在に関して試験した。ｇＤＮＡを用い、上記のプロトコルに従ってＰＣＲを実施した。ｓｘｔＡｌ断片は、プライマーｓｘｔ００１  ＆  ｓｘｔ００２（約５５０ｂｐ）により、ｓｘｔＡ４断片は、プライマーｓｘｔ００７  ＆  ｓｘｔ００８（約７５０ｂｐ）により増幅した（表２）。
【０１６９】
−系統分析
渦鞭毛藻類のヌクレオチド配列は、対応するアミノ酸配列に翻訳する前に、正確なリーディングフレームにおけるコード化配列を考慮して、ＭａｃＣｌａｄｅ  ｖ４．０７（Ｍａｄｄｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｉｓｏｎ（１９９２）ＭａｃＣｌａｄｅ．３ｅｄ：Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓを参照）を用いて手動でアライメントした。引き続き、外集団を構成しており近縁性のＮＣＢＩ  ｎｒ  Ｂｌａｓｔｐヒットの選択に加え、シアノバクテリアに関してオルソロガスなｓｘｔ配列に対してＭＡＦＦＴｖ６  Ｌ−ＩＮＳ−Ｉモデルを用いて渦鞭毛藻類のアミノ酸をアライメントした。得られたアライメントを手動でチェックし、アライメント不良な箇所は、ＭａｃＣｌａｄｅ  ｖ４．０７を用いて除去した（上記のＭａｄｄｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｉｓｏｎ（１９９２）を参照）。
【０１７０】
ＰｒｏｔＴｅｓｔ  ｖ２．４（Ａｂａｓｃａｌら（２００５）ＰｒｏｔＴｅｓｔ：ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｓｔ−ｆｉｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１：２１０４−２１０５を参照）により、全ての推定されたアライメントに関して、最適な進化モデルとしてＷＡＧが決定された。最尤度（ＭＬ）分析を、２５のレートカテゴリで、ＲＡｘＭＬ−ＶＩ−ＨＰＣｖ７．２．６、ＰＲＯＴＣＡＴＷＡＧモデルによって実施した（Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ（２００６）ＲＡｘＭＬ−ＶＩ−ＨＰＣ：Ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ−ｂａｓｅｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｏｕｓａｎｄｓ  ｏｆ  ｔａｘａ  ａｎｄ  ｍｉｘｅｄ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２２：２６８８−２６９０を参照）。最可能トポロジーを１００の個別の探索から確立し、１００の偽反復試験によりブートストラップ分析を実施した。自由数の混合カテゴリによる同一置換モデルおよび４つのカテゴリ下の離散的部位交差変異の下、Ｐｈｙｌｏｂａｙｅｓ  ｖ３．２ｅを用いてベイズ推論を実施した（Ｌａｒｔｉｌｌｏｔ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ（２００４）Ａ  Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ａｃｒｏｓｓ−ｓｉｔｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２１：１０９５−１１０９；およびＬａｒｔｉｌｌｏｔ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ（２００６）Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｂａｙｅｓ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ．Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ５５：１９５−２０７を参照）。二分裂（鎖）間の最大差が＜０．１の場合に系図を推定した。全てのモデル推定及び系統分析は、無料公開の「Ｂｉｏｐｏｒｔａｌ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｕｉｏ．ｎｏ／）上で行った。
【０１７１】
−コピー数の決定
アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）株ＡＣＳＨ０２の２００ｍｌバッチ培養物を三通り、上記の通り増殖させ、Ｓｅｄｇｅｗｉｃｋ−Ｒａｆｔｅｒチャンバおよび倒立光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、存在量を３日おきにカウントした。ｇＤＮＡ抽出用の１０ｍｌサンプルを、初期指数増殖期、後期指数増殖期および定常期に採取した。
【０１７２】
１６１ｂｐ産物を増幅させるプライマー３ソフトウェアを用い、ｓｘｔ４領域を含むＡ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）およびＡ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）４５４のアライメント読取りにおける保存領域に基づいて、ｑＰＣＲに好適なプライマーをデザインした。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、Ｒｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）上でｑＰＣＲサイクルを実施した。１２．５μｌのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスター混合物、１μｌのテンプレートＤＮＡ、１μｌの各プライマー対、１μｌのＢＳＡおよび８．５μｌのＭｉｌｌｉＱ水から構成される２５μｌの最終容量中、ｑＰＣＲアッセイを実施した。ｑＰＣＲアッセイは、以下のプロトコルで３通り実施した：９５℃で１０秒、９５℃で１５秒および６０℃で３０秒を３５サイクル。各プログラムの最後に融解曲線分析を実施して増幅特異性を確認し、選択ＰＣＲ産物の配列決定を行った。新鮮なＰＣＲ産物の２〜２×１０５ｎｇ範囲の既知濃度１０倍希釈系から標準曲線を構築した。ＰＣＲ産物の分子を決定した：Ａによる（Ａ×６．０２２×１０２３）×（６６０×Ｂ）−１：ＰＣＲ産物の濃度、６．０２２×１０２３：アボガドロ数、６６０：１塩基対当たりの平均分子量およびＢ：ＰＣＲ産物の長さ。未知サンプル中の分子数を決定し、ｑＰＣＲテンプレート中の既知細胞数で割って、細胞１個当たりのコピー数を得た。検出限界は、およそ５０００コピーの遺伝子配列であった（すなわち、１アッセイ当たり約２０〜３０個の細胞、各々が配列の約２００コピーを有する）。しかし、分析は、この細胞数の１０〜１００倍で実施し、したがって検出限界またはその近くで実施したのではない。
【０１７３】
結果
−Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）およびＡ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）のトランスクリプトームにおけるｓｘｔ配列の同定
４５４の配列決定により、Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）では、５８９，４１０の生読取り、Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）では、７０１，８７０の生読取りが得られた（ＳＲＡ０２８４２７．１：各々ＳＲＳ１５１１５０．１サンプルおよびＳＲＳ１５１１４８．１サンプル）。品質管理後、読取りを、Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）に関しては、４４，６９７のコンティグと５３９のシングルトンに、Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）に関しては、５１，８６１のコンティグと１６３のシングルトンにアセンブリした。コンティグ長とＧＣ含量は双方のライブラリに関して同様であった：Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）とＡ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）に関して、それぞれ、６６９ｂｐ（±３６０）と６７８ｂｐ（±３６１）の平均配列長（±ＳＤ）、５９％と５８％のＧＣ含量が算出された。
【０１７４】
シアノバクテリアのｓｘｔＡ遺伝子によるアセンブリしていない４５４ｃＤＮＡライブラリ読取りの検索では、Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）に関して９４のヒット、Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）に関して８８のヒットがそれぞれ得られた。アセンブリしたデータセットでの同様の検索で、Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）ライブラリから１０のコンティグ、Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）ライブラリから９のコンティグが復帰した。全配列のプーリングと再アセンブリの後、２つのコンティグがシアノバクテリアからのｓｘｔＡに対して高い類似性を示した：一つは、ドメインｓｘｔＡ１（コンティグ長＝１４５０ｂｐ、ＧＣ＝６０．１％、ビットスコア＝２１３、ｅ値＝５ｅ−６１）に対して、他方は、ｓｘｔＡ４（コンティグ長＝１０５９ｂｐ、ＧＣ＝６５％、ビットスコア＝１９５、ｅ値＝１ｅ−４７）に対して。双方のコンティグが双方のアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）ライブラリからの配列を含有したが、どちらも、完全ＯＲＦ、渦鞭毛藻類スプライスリーダー配列またはポリＡテールを含有しなかった。これら２つのコンティグを、ゲノム増幅、ＲＡＣＥ分析および配列決定に関して、ｓｘｔＡ１およびｓｘｔＡ４のデザインに使用した。
【０１７５】
残りのコアｓｘｔ遺伝子に関するインシリコ検索の結果は、表３にまとめてある。
【０１７６】
【表３】
0006001648.tif 000004
【０１７７】
【表４】
0006001648.tif 000005
【０１７８】
ｓｘｔＡとは別に、良好なアライメントスコア（ビットスコア＞５５）および高有意性のｅ値（＜ｅ−２０）を有するコンティグを、双方のライブラリのアミジノトランスフェラーゼ遺伝子ｓｘｔＧに関して復元した。ＮＣＢＩ  ｎｒ  タンパク質データベースに対して最低のｅ値を有するコンティグの再ブラスチングにより、最も類似した遺伝子は、アクチノバクテリアグリシンアミノトランスフェラーゼであり、一方、シアノバクテリアからのｓｘｔＧに対する類似性はより小さいが、それでも高有意性であった（表３）。コア生合成遺伝子、ｓｘｔＢ、ｓｘｔＦ／Ｔ、ｓｘｔＩ、ｓｘｔＲおよびｓｘｔＵに関しては、ｅ値≦０．１を有するコンティグを双方のアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）ライブラリから復元し、一方、ｓｘｔＳだけはＡ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）ライブラリにヒットを有した（表３）。ｓｘｔＣ、ｓｘｔＤおよびｓｘｔＥに関しては、いずれのライブラリにおいてもマッチの復元はされなかった。ｓｘｔＣとｓｘｔＥは未知のタンパク質であり、ｓｘｔＤは、ステロールデサチュラーゼ様タンパク質である。シアノバクテリア遺伝子に対して類似性のない渦鞭毛藻タンパク質がそれらの機能を果たしている可能性がある。あるいは、これらの遺伝子は作成されたデータセットに存在しなかった。データセットは包括的ではあるが完全ではない。例えば、ｓｘｔＡ転写物のいくつかの領域もまた４５４データセットにおいては復元されなかったが、ＲＡＣＥ分析によってのみ獲得された（上記参照）。ＮＣＢＩ  ｎｒ  タンパク質データベースに対する再ブラスチングにより、対応するシアノバクテリアｓｘｔ遺伝子においてコード化されたものと類似しているｓｘｔＢ（Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）のみ）、ｓｘｔＦ／Ｍ、ｓｘｔＨ／Ｔ、ｓｘｔＩおよびｓｘｔＵに関するタンパク質に対するヒットが検索された。実際の配列類似性は保存性が低く、アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）のコンティグとシアノバクテリアｓｘｔ遺伝子との間の有意なヒットは見られなかった。
【０１７９】
−Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）におけるｓｘｔＡの転写物の構造
ＲＡＣＥ実験の結果、２つの異なるｓｘｔＡ様転写物ファミリーが得られた。双方とも５’端に渦鞭毛藻のスプライスされたリーダー配列を、３’端にポリＡテールを有したが、配列、長さ、およびそれらのコード化しているｓｘｔドメインの数が異なっていた。短い方の転写物は、ドメインｓｘｔＡ１、ｓｘｔＡ２およびｓｘｔＡ３をコード化し、一方、長い方の転写物は、シアノバクテリアｓｘｔＡ遺伝子によってもコード化されている４つのｓｘｔＡドメインの全てをコード化する（図１）。
【０１８０】
短い方の転写物のコンセンサス配列は、ポリＡテールを除いて、３１３６ｂｐであった。ＳＬ−リーダーを有する８つのクローンが配列決定され、３つの異なる５’ＵＴＲが明らかになった。これらの配列はほとんど同一である；ただし、１つのクローンは１５ｂｐを有し、別の１つはＳＬ−リーダーの直後に１９ｂｐの挿入体を有した。２つの配列挿入体は、長さを別にして同一であった。配列決定された９つの３’ＵＴＲはほとんど同一であり、ポリＡテールは、各クローンの同位置で開始した。この短い方のｓｘｔＡ転写物のドメイン構造は以下の通りである：アミノ酸残基１〜２７はシグナルペプチドをコード化する。残基２８〜５３１はｓｘｔＡ１に対応し、これは３つの保存モチーフ（Ｉ：ＶＤＴＧＣＧＤＧＳＬ（配列番号２１４）、ＩＩ：ＶＤＡＳＲＴＬＨＶＲ（配列番号２１５）、ＩＩＩ：ＬＥＶＳＦＧＬＣＶＬ（配列番号２１６）を含有する。残基５３５〜７２９は触媒ドメイン５５７−Ｗ、６４８−Ｔ、６６３−Ｈ、７１１−Ｒを有するｓｘｔＡ２に対応し；一方、短い転写物の最終ドメインであるｓｘｔＡ３は、ホスホパンテテイニル付加部位７８３−ＤＳＬ−７８５を有する残基７５０〜８２２に対応する。
【０１８１】
長い方のｓｘｔＡ転写物のコンセンサス配列は４６１３ｂｐであった（多数決ルール、最長３’ＵＴＲ、ポリＡテールなし、図１）。ＳＬ−配列を有する５つのクローンが特性化された。それらのうちの１つは、１５位に通常のＧではなくＡを有するやや分岐したＳＬ−配列を有した。全ての５’ＵＴＲは、９７ｂｐの長さ（ＳＬ配列を除いて）であり、配列はほぼ同一であった。配列決定された４つの３’クローンの各々は、異なった長さを有した（３４２ｂｐ、４０７ｂｐ、４４６ｂｐおよび４９２ｂｐ）。長い方のｓｘｔＡ転写物のドメイン構造は以下の通りであった：アミノ酸残基１〜２５はシグナルペプチドをコード化する。残基２６〜５３０は、３つの保存モチーフ（Ｉ：ＶＶＤＴＧＣＧＤＧ（配列番号２１７）、ＩＩ：ＶＤＰＳＲＳＬＨＶ（配列番号２１８）およびＩＩＩ：ＬＱＧＳＦＧＬＣＭＬ（配列番号２１９）を有するドメインｓｘｔＡ１に対応し；残基５３５〜７２４は、触媒残基５５６−Ｗ、６６１−Ｔ、６９３−Ｈ、７０８−Ｒを有するドメインｓｘｔＡ２に対応する。ｓｘｔＡ３は、残基７６３〜５３９に対応し、ここで７９９−ＤＳＬ−８０１はホスホパンテテイニル付加部位であり；最後に、ドメインｓｘｔＡ４は残基８９４〜１２７２に対応する。
【０１８２】
２つのアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）ｓｘｔＡ転写物のＧＣ含量は、シアノバクテリアｓｘｔＡ遺伝子よりも一貫して高かった（図２）。ＧＣ含量は、６９％（長転写物）、６２％（短転写物）および４３％（全てのシアノバクテリアｓｘｔＡ遺伝子）。
【０１８３】
全てのアルゴリズムが、双方の転写物に関し、シグナルペプチド（ＳＰ）と対応する開裂部位の存在を予測した。しかし、渦鞭毛藻におけるクラスＩのトランジットペプチドを示していると思われる膜貫通ヘリックスは予測されなかった。転写物はいずれもクラスＩＩおよびクラスＩＩＩのトランジットペプチドに関する基準に合わなかった。
【０１８４】
ジェンバンク登録番号は、短ｓｘｔＡ４転写物ではＪＦ３４３２３８、長ｓｘｔＡ４転写物ではＪＦ３４３２３９であり（多数決ルールのコンセンサス配列）、Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）ＣＣＭＰ１７１９の残りのクローン化ＲＡＣＥ配列では、ＪＦ３４３３５７〜ＪＦ３４３４３２である。
【０１８５】
−渦鞭毛藻のｓｘｔＡ１配列およびｓｘｔＡ４配列の系統
本試験においてデザインされたｓｘｔＡ１プライマーおよびｓｘｔＡ４プライマー（表２）は、毒性領域を有する（表１）５つの種と２つのギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）株を含んでなる１８のアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）株において、約５５０ｂｐ（ｓｘｔＡ１）長と約７５０ｂｐ（ｓｘｔＡ４）長の単一バンドを増幅した。５つの非ＳＴＸ産生アレキサンドリウム・アフィネ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ａｆｆｉｎｅ）およびアレキサンドリウム・アンデルソニー（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）の株に関しても、またガンビエルディカス属（Ｇａｍｂｉｅｒｄｉｃｕｓ）、オストレオプシス属（Ｏｓｔｒｅｏｐｓｉｓ）、プロロセントラム属（Ｐｒｏｒｏｃｅｎｔｒｕｍ）、アンフィジニウム属（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ）の非ＳＴＸ産生渦鞭毛藻株に関しても、ｓｘｔＡ１またはｓｘｔＡ４のＰＣＲ産物は増幅されなかった（表１）。これらのＰＣＲベースの結果は、一般的に、毒素測定値に合致した。しかし、ＳＴＸが検出されなかった４つのＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）株（ＡＴＣＪ３３、ＡＴＥＢ０１、ＣＣＭＰ１７７１、ＡＴＢＢ０１）のゲノムＤＮＡからｓｘｔＡ１断片およびｓｘｔＡ４断片が増幅された（表１）。
【０１８６】
ｓｘｔＡ１の系統分析（図３；図５）は、全てのｓｘｔＡ１配列が、２つのサブクラスターに分けられる十分に支持された１つのクラスターを形成したことを示している。同じ株のいくつかのクローンは同一であったが、わずかに異なるクローンがほとんどの株で見られた。これらの異なるクローンは、一般に、種または株に関連したパターンなしに、系統を通して分散していた。Ｇ．カテナツム（Ｇ．ｃａｔｅｎａｔｕｍ）からの配列のみが、サブクラスターのうちの１つの中に密な分枝を形成した。渦鞭毛藻クラスターに最も近縁なものは、シアノバクテリアのｓｘｔＡ遺伝子およびプロテオバクテリアのポリケチドシンターゼ類であった（図３；図５）。
【０１８７】
全てのｓｘｔＡ４配列は、至るところに分散した同一株からのクローンにより、十分に支持された１つのクラスターを形成した（図４Ａ；図６）。シアノバクテリアのｓｘｔＡ遺伝子およびアクチノバクテリアのアミノトランスフェラーゼは、最も近い姉妹分岐群を形成した。
【０１８８】
ゲノムのｓｘｔＡ１断片およびｓｘｔＡ４断片に対するジェンバンク登録番号は、ＪＦ３４３２４０〜ＪＦ３４３３５６である。
【０１８９】
−ｓｘｔＡ４のコピー数および多型
Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）におけるｓｘｔＡ４の１００から２４０の間のゲノムコピーが、ｑＰＣＲアッセイに基づいて、種々の増殖速度で３つの時点で採集されたＡＣＳＨ０２の三通りのバッチ培養物に見られた（図４Ｂ）。
【０１９０】
ｓｘｔＡ４ドメインをカバーし、Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）  ４５４読取りに基づいた９８７ｂｐのコンティグの分析により、少なくとも２０の一塩基多型（ＳＮＰ）が明らかになり、そのうち１５はサイレントであった。ＳＮＰは、読取りの中で少なくとも２つに生じた１つの塩基対変化として定義された。ホモポリマーのストレッチおよびインデルは無視した。
【０１９１】
考察
−ｓｘｔ遺伝子は、渦鞭毛藻のゲノムにコード化されている
渦鞭毛藻のゲノムは通常、大型（１．５〜２００ｐｇのＤＮＡ細胞−１；５２）で、分岐性が高い。最近の予測によると、渦鞭毛藻のゲノムは、３８，０００〜ほぼ９０，０００の間のタンパク質コード化遺伝子を含有し、これらは、ヒトゲノムにおいてコード化された遺伝子の数の１．５〜４．５倍に相当するとのことである。本試験における＞１２０万のＥＳＴの配列決定の結果は、シアノバクテリアにおけるＳＴＸ生合成に関係する遺伝子の密接な相同体が、ＳＴＸ産生渦鞭毛藻にも存在していることを示している（表３）。渦鞭毛藻の起源をさらに確認するために、生合成経路におけるユニークな出発遺伝子であるｓｘｔＡを調べた。Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）  ＣＣＭＰ  １７１９のトランスクリプトームは、シアノバクテリアにおいてｓｘｔＡとして同一のドメイン構造を有する２つの異なる転写物ファミリーを含有した。これら２つの転写物ファミリーは、長さ、配列、およびそれらがコードする触媒ドメインの数が異なっていた。長い方の転写物は、既知のシアノバクテリアｓｘｔＡ遺伝子に存在する４つのドメイン全てを含有したが、短い方の転写物は、末端のアミノトランスフェラーゼドメインを欠いていた（図１）。バクテリアの転写物とは対照的に、双方の転写物ファミリーとも、３’端に真核生物のポリＡテール、５’端に渦鞭毛藻のスプライスされたリーダー配列を有していた。したがって、これらの結果は、少なくともｓｘｔＡ遺伝子は、そしてことによると他のｓｘｔ遺伝子も、渦鞭毛藻の核ゲノム内にコード化されていること、また、渦鞭毛藻におけるＳＴＸ合成は共培養されたバクテリアから生じるのではないことを明らかに示している。しかしながら、これらのバクテリアはなお、渦鞭毛藻におけるＳＴＸ生合成の調節に重要な役割を果たしていると考えられる。
【０１９２】
双方の転写物において同定されたシグナルペプチドは、双方のＳｘｔ産物の特異的ターゲティングを示す。渦鞭毛藻の核ゲノム内の多くの遺伝子は、プラスチド由来であり、それらの産物はプラスチドをターゲティングしている。これらのタンパク質は、細胞基質内で翻訳されてから、プラスチド膜を通ってプラスチドへと輸送される。ペリジニン含有渦鞭毛藻様のアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）において、この過程にはシグナルペプチドモチーフとトランスファーペプチドモチーフが必要である。双方のｓｘｔＡ転写物はシグナルペプチドを含有をすることが予測されたが、トランスファーペプチドの構造は同定されなかった。したがって、双方のｓｘｔＡタンパク質は細胞基質外でターゲティングされているようであるが、ターゲットの領域は実験的に調べる必要がある。
【０１９３】
渦鞭毛藻ｓｘｔＡ転写物は、相対するシアノバクテリアと、シグナルペプチド、ＳＬ配列およびポリＡテールの存在によって異なっていただけでなく、それらのＧＣ含量においても異なっていた。Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）  ＥＳＴはかなり高いＧＣ含量を有した（図２）。アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種からの転写された遺伝子は、＞５６％の平均ＧＣ含量を有し、一方、ＳＴＸ産生属であるシリンドロスペルモプシス（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、アファニゾメノン（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）、およびリングビア（Ｌｙｎｇｂｙａ）などの繊維状シアノバクテリアは、約４０％のゲノムＧＣ含量を有すると報告されている。このことは、ｓｘｔＡのＧＣ含量がｓｘｔＡを有する祖先から著しく分岐し、これらの微生物におけるゲノムの残りと一致していることを示している。
【０１９４】
２つの異なるｓｘｔＡ転写物の関与とＳＴＸ合成におけるそれらの役割は、今のところ明らかではないが、ＧＣ含量の違い（図２）は、それらが異なる選択圧の下にあることを示している。
【０１９５】
−ｓｘｔＡの非同一コピー：ゲノムとトランスクリプトームレベルにおける変化
渦鞭毛藻ゲノムの１つの典型的な特徴は、同一の場合もあるし同一でない場合もある複数のコピーにおいて遺伝子が生じ得ることである。これは、リサイクリングまたはｃＤＮＡの所有などのきわめて異常な機構に関連している可能性もある。ｓｘｔＡはまた、渦鞭毛藻のゲノム内に複数のコピーで生じるらしい。Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）  ＡＣＳＨ０２（温帯アジアのリボタイプ）のゲノムＤＮＡには、ｓｘｔＡ４ドメインの１００〜２４０のコピーが存在すると予測された。細胞周期を通して検出されたコピー数の違いは、おそらく、バッチ培養中の増殖速度および種々の細胞周期の段階における細胞の割合に関連しているであろう。１５の異なるアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）株および１つのＧ．カテナツム（Ｇ．ｃａｔｅｎａｔｕｍ）株からの全てのゲノムｓｘｔＡ４配列が、１つの十分に支持された系統クラスターを形成し、系統樹中に分散した同一株のわずかに異なったいくつかのクローン配列を有した。ｓｘｔＡ１もまた、分析した全ての株に複数の非同一コピーで生じたのが見られた（図５）。さらに、渦鞭毛藻ｓｘｔＡ１クラスターを２つの亜分岐群に分けることで、ｓｘｔＡ１が２つの別個の遺伝子クラスによってコード化されている可能性が、少なくともいくつかの株において示される。
【０１９６】
ｓｘｔＡのゲノム変化は、アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）のトランスクリプトームにおいても存在する。ｓｘｔＡ１の系統樹にトランスクリプトームのデータを加えることにより、上位の系統群は長い方のｓｘｔＡ転写物に対応するが、一方、下位の系統群は短い方の転写物に対応することが示された（図３、図５）。Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）のトランスクリプトームにおけるｓｘｔＡ４領域のヌクレオチドレベルの分析により、ＳＮＰ部位の多く、その三分の二がサイレントであることが明らかになった。
【０１９７】
−ｓｘｔＡ１、ｓｘｔＡ４およびサキシトキシン産生の間の関係
本試験の間に同定されたｓｘｔＡ１およびｓｘｔＡ４ゲノム配列は、２つのＧ．カテナツム（Ｇ．ｃａｔｅｎａｔｕｍ）株、ならびにＡ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）種、Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）種、Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）種およびＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）種などの１４のアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）株を含む分析されたすべてのＳＴＸ産生渦鞭毛藻株に存在した。２つのＡ．アンデルソニ（Ａ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）株および３つのＡ．アフィネ（Ａ．ａｆｆｉｎｅ）株からは、２つのｓｘｔ断片のどちらも増幅されなかった。ガンビエルディスカス・オーストラレス（Ｇａｍｂｉｅｒｄｉｓｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｅｓ）、アンフィジニウム・マサルティー（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｍａｓｓａｒｔｉｉ）、プロロセントラム・リマ（Ｐｒｏｒｏｃｅｎｔｒｕｍ  ｌｉｍａ）、オストレオプシス・シアメンシス（Ｏｓｔｒｅｏｐｓｉｓ  ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）およびオストレオプシス・オバタ（Ｏｓｔｒｅｏｐｓｉｓ  ｏｖａｔａ）において、相同体もまた検出されなかったが、これらは全てＳＴＸを産生しないことが知られている（表１）。
【０１９８】
分析されたほとんどの株に関して、ｓｘｔＡ１およびｓｘｔＡ４の存在とＳＴＸ含量との間にきわめて良好な関連があったにもかかわらず、ＳＴＸ産生が検出されなかったＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）株からも双方の断片が増幅された（表１）。Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）株ＣＣＭＰ１７７１のＲＡＣＥ分析により、この株において、ｓｘｔＡ１とｓｘｔＡ４が転写されることが明らかになった（データは示していない）。Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）によって産生されるＳＴＸの量が、用いられたＨＰＬＣ／ＭＳ毒素測定法の検出限界以下であることが推測される。Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）株ＡＴＢＢ０１を調べるために用いられたきわめて高感度のサキシフィリンアッセイでは、それが毒性であることが見出されているからである。転写物の存在量は渦鞭毛藻ゲノムに存在する遺伝子のコピー数に確かに関連していることが示唆されている。したがって、低濃度のＳＴＸを有する株は、より多くＳＴＸを産生する株に比べてｓｘｔ遺伝子のコピー数が少ない可能性がある。もしこれが真実なら、ｓｘｔＡ１およびｓｘｔＡ４の存在は、毒性を示すと考えられ、環境中のＳＴＸ産生細胞を検出するための分子法が開発できるであろう。
【０１９９】
−真核生物におけるＳＴＸ合成の進化およびアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）の多様化におけるその役割
シアノバクテリアのｓｘｔ遺伝子はシアノバクテリア間での保存性が高く遺伝子クラスターは、少なくとも２１億年前に生じたと考えられる。本明細書における結果は、シアノバクテリアｓｘｔＡ配列の系統群に系統的に密に近縁性である渦鞭毛藻ｓｘｔＡ転写物および他のバクテリアの推定的な毒素関連遺伝子（図３および図４）も、シアノバクテリアのｓｘｔＡ遺伝子と同じドメイン構造を有することを示している（図１）。この著しい類似性は、おそらく、祖先のＳＴＸ産生バクテリアと渦鞭毛藻類との間の水平的な遺伝子移行（ＨＧＴ）によるという提案がなされている。渦鞭毛藻類の中で、ＳＴＸは、ゴニオウラクス目（Ｇｏｎｙａｕｌａｃａｌｅｓ）の中のゴニオラクス科（Ｇｏｎｙａｕｌａｃａｃｅａｅ）に属するアレキサンドリウム属（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）およびピロジニウム属（Ｐｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）の種により、また、ギムノジニウム目（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉａｌｅｓ）の中のギムノジニウム科（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉａｃｅａｅ）に属するギムノジニウム属（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）の１つの種により産生される。したがって、これらの毒素は、１つの科の中の２つの属によって、また遠隔の渦鞭毛藻目からの１つの種によって産生される。渦鞭毛藻類の中でのＳＴＸ合成のこの分散、ならびにアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）とギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）のｓｘｔＡ配列間の密な関連性（図３、図４、図５および図６）は、バクテリアから渦鞭毛藻へのＨＧＴが、おそらく、アレキサンドリウム属（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）およびピロジニウム属（Ｐｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）の起源の前に生じ、その後に、渦鞭毛藻から渦鞭毛藻への移行がギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）へ生じたことを示唆している。真核生物から真核生物のＨＧＴの範囲は、このような事象を検出する困難さにより過小評価されることが多いが、最近の研究では、このような遺伝子移行の重要性と広がりが強調されている。
【０２００】
本試験における渦鞭毛藻のｓｘｔＡ配列の中の関連性は、内部の分岐の多くが統計的に裏づけされていないため、本試験では解明されなかった（図５および図６）。したがって、ｓｘｔＡ遺伝子の進化がアレキサンドリウム属（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）のｓｘｔＡ遺伝子の進化を反映しているかどうかを確実に判定すること、または、アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）からＧ．カテナツム（Ｇ．ｃａｔｅｎａｔｕｍ）への推定されるＨＧＴの起源を判定することは不可能であった。しかしながら、Ｇ．カテナツム（Ｇ．ｃａｔｅｎａｔｕｍ）、Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）、およびＡ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の複数の株からのｓｘｔＡ１遺伝子およびｓｘｔＡ４遺伝子のコピーが種によってクラスター化される傾向があることは、それらの歴史がこれらの種の進化を反映していることを示している。非ＳＴＸ産生種のＡ．アフィネ（Ａ．ａｆｆｉｎｅ）およびＡ．アンデルソニ（Ａ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）からｓｘｔＡ１およびｓｘｔＡ４が増幅されなかったことは、ｓｘｔＡ遺伝子が、これらの系統から失われたか、または変異し過ぎていて、本明細書で開発されたプライマーがそれらを増幅できなかったことを示している可能性が考えられる。
【０２０１】
２つのアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）ＥＳＴのデータセットは、シアノバクテリアから同定されたコアｓｘｔ遺伝子の大多数に対する相同体をコード化する転写物を含有した（表３）。シアノバクテリアｓｘｔ遺伝子に対する類似性は、しばしばかなり大きかったとしても、それはｓｘｔＡで見られたものよりはるかに小さかった。最も近接したヒットは、データベースに存在する他のバクテリア遺伝子または真核生物遺伝子に対するものであった。このことは、渦鞭毛藻類において、ｓｘｔ経路の種々の遺伝子が別個の起源を有する可能性を示している。この遺伝子クラスターの複雑な起源を解明するためにはさらなる研究が必要であり、その研究によって、これらの太古からの重要な微生物のゲノムおよび分子生物学に関するさらなる進歩が導かれるであろう。
【０２０２】
実施例２：渦鞭毛藻類におけるＳＴＸ産生の検出および定量化のための定量的方法
材料および方法
−培養物の維持
渦鞭毛藻の培養物（表４）は、１６〜２０℃において、ＧＳｅ培地（Ｄｏｂｌｉｎら、１９９９、上記）またはＬ１培地（Ｇｕｉｌｌａｒｄ  ＆  Ｈａｒｇｒａｖｅｓ，１９９３、上記）において維持された。光は、白色蛍光電球（Ｃｒｏｍｐｔｏｎ  Ｌｉｇｈｔ）により、１２／１２時間の暗／明サイクルで、６０〜１００μｍｏｌフォトンｍ−２秒―１を用いて提供された。用いられた株は、タスマニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔａｓｍａｎｉａ）（Ｍ．ｄｅ  Ｓａｌａｓにより単離）、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ、Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ−Ｇｕｉｌｌａｒｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＭＰ）およびＣａｗｔｈｒｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにより提供された。
【０２０３】
【表５】
0006001648.tif 000006
【０２０４】
−ＤＮＡの抽出およびＰＣＲ
培養物の濃度は、Ｓｅｄｇｅｗｉｃｋ  Ｒａｆｔｅｒ細胞（Ｐｒｏｓｃｉｔｅｃｈ）および倒立光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、定期的に測定した。指数増殖期に既知の培養細胞数を採集した。ＤＮＡは、ＣＴＡＢ法（Ｄｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｄｏｙｌｅ，１９８７  Ａ  ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｆｒｅｓｈ  ｌｅａｆ  ｔｉｓｓｕｅ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ  Ｂｕｌｌ  １９：１−５を参照）を用いて、細胞ペレットから抽出し、−２０℃でさらに一晩、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡの品質および量は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、４４０ｂｐ断片を増幅するプライマー対４ｆおよび６ｒ、または約１７８０ｂｐを増幅する１８ＳｒＤＮＡプライマー１８ＳＦ０８（５’−ＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧ−３’（配列番号２２０））およびＲ０ＩＴＳ（５’−ＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣ−３’（配列番号２２１））を用い、Ｌｉｎら（２００９）のプロトコルに従って、対照の渦鞭毛藻遺伝子（ｃｙｔｂまたはＳＳＵ  ｒＲＮＡ）を増幅することにより判定した。
【０２０５】
−ｓｘｔｑＰＣＲアッセイの開発およびコピー数測定
アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）種、Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）種、Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）種、Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）種およびギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）種（ジェンバンク登録番号ＪＦ３４３２３８〜ＪＦ３４３２３９、ＪＦ３４３２５９〜ＪＦ３４３２６５）の９株からのｓｘｔＡ４ゲノムおよび配列のアライメントを構築した。遺伝子配列の保存性の程度をｓｘｔＡ４ドメインの４４０ｂｐフラクションについてチェックし、アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種間では９４〜９８％、ギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）種とアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種間では８９％であることが分かった。ｓｘｔＡ４に特異的なプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアおよびコンセンサス配列を用いてデザインした。次いで、プライマー配列の特異性を、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）上で、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用いて確認した。プライマーの配列は、ｓｘｔＡ４Ｆ  ５’  ＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＧＴＴＣＡＡＴＴＣ  ３’（配列番号１９８）およびｓｘｔＡ４Ｒ  ５’  ＴＡＣＡＧＡＴＭＧＧＣＣＣＴＧＴＧＡＲＣ  ３’（配列番号１９９）であり、１２５ｂｐの産物が得られた。
【０２０６】
ＳＴＸ産生株または潜在的ＳＴＸ産生株に対するそれらの特異性を判定するために、アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）、ギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）の６つの種、ゴニオウラクス目（Ｇｏｎｙａｕｌａｃａｌｅｓ）の他の３つの毒素産生種：オストレオプシス・オバタ（Ｏｓｔｒｅｏｐｓｉｓ  ｏｖａｔａ）、ガンビエルディスカス・オーストラレス（Ｇａｍｂｉｅｒｄｉｓｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｅｓ）、オストレオプシス・シアメンシス（Ｏｓｔｒｅｏｐｓｉｓ  ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）、さらなる渦鞭毛藻、アンフィジニウム・マサルティー（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｍａｓｓａｒｔｉｉ）、および６つの同定された渦鞭毛藻種を含む混合植物プランクトン群集を含有する環境サンプルからｓｘｔＡ４プライマー対を増幅した（表４）。ＰＣＲ増幅は、テンプレート、０．５μＭの各プライマー、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１μｌのＢＳＡ（ＮＥＢ）、および１０μＬのＩｍｍｏｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を含有する２０μｌの反応液、ｄＮＴＰｓ、Ｉｍｍｏｌａｓｅ  Ｔａｑポリメラーゼおよび反応緩衝液含有する２０μｌの反応液、またはテンプレート、０．２μＭの各プライマー、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１μｌのＢＳＡ、ｄＮＴＰｓ、０．２μｌのＭｙＴａｑ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）ホットスタートポリメラーゼおよびＨ２Ｏを含有する２μｌのＭｙＴａｑ反応緩衝液を含有する２０μｌの反応液中で実施した。ホットスタートＰＣＲは、９５℃で５〜１０分、それから９５℃で３０秒、５５℃または６０℃で３０秒（ｃｙｔｂプライマーおよびｓｘｔＡ４プライマーそれぞれについて）、７２℃で３０秒を３５サイクル、引き続き、７２℃で７分の最終伸長ステップによって実施した。１８Ｓ断片は、テンプレート、１単位の１０×ＢＤ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、５ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．２μＭの各プライマー、ＤＭＳＯ（１０％の最終濃度）および０．２５単位の５０×ＢＤ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  Ｐｏｌｉｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する２５μＬの反応液中で増幅した。ＰＣＲは、以下の通り増幅した：９４℃で１分；３０×（９４℃で３０秒；５７℃で３０秒；６８℃で１２０秒）６８℃で１０分；８℃で保持。産物は、３％アガロースゲル電気泳動法を用いて分析し、臭化エチジウムで染色し、可視化した。
【０２０７】
また、ｑＰＣＲも、大型サブユニット（ＬＳＵ）リボゾームＲＮＡ領域（Ｈｏｓｏｉ  ＴａｎａｂｅおよびＳａｋｏ，２００５）の領域に基づき、オーストラリアの温帯水域に見られるアレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の温帯アジアのリボタイプに特異的なプライマー対を用い、１６０ｂｐの断片、ｃａｔＦ（５’−ＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＴＡＧＴＧＣ−３’）（配列番号２２２））およびｃａｔＲ（５’−ＧＴＧＣＡＡＡＧＧＴＡＡＴＣＡＡＡＴＧＴＣＣ−３’）（配列番号２２３））を増幅して実施した。環境サンプルに対してアッセイを実施し、Ｍ．ｄｅ  Ｓａｌａｓ（ＵＴＡＳ）によりオーストラリアの水域から単離された株：ＡＣＣＣ０１、ブリスベン・ウォーター地点からおよそ２０ｋｍ、ジョージズ・リバー地点から５０ｋｍのコーワン・クリーク、ニューサウスウェールズ（Ｃｏｗａｎ  Ｃｒｅｅｋ，ＮＳＷ）から単離、ＡＣＳＨ０２、ジョージズ・リバー地点の北方およそ３５ｋｍのシドニー・ハーバー（Ｓｙｄｎｅｙ  Ｈａｒｂｏｕｒ）から単離、およびＡＣＴＲＡ０２、タスマニア、オーストラリア（Ｔａｓｍａｎｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から単離、に基づき、このＬＳＵ  ｒＲＮＡプライマー対の新規標準曲線を構築した。
【０２０８】
ｑＰＣＲサイクリングは、ＳＳＯＦａｓｔ  Ｅｖａｇｒｅｅｎ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ）を用い、Ｒｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に対して実施した。ｑＰＣＲアッセイは、１０μｌのＥｖａｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＤＮＡ挿入色素、緩衝液およびＴａｑポリメラーゼを含有）、１μｌのテンプレートＤＮＡ、０．５μＭの各プライマー、および１μｌのＢＳＡからなる２０μｌの最終容量で実施した。ｑＰＣＲアッセイは以下のサイクルにより三通り実施した：９５℃で１０秒、９５℃で１５秒と６０℃で３０秒を３５回反復。各サイクルの最後に融解曲線分析を実施して、増幅の特異性を確認し、選択されたＰＣＲ産物の配列決定を行った。
【０２０９】
ｓｘｔＡ４とＬＳＵ  ｒＲＮＡ双方に関する標準曲線を２つの方法で構築した：（１）５．７〜５．７×１０−５ｎｇ（ｎ＝６）の範囲で、既知濃度の新鮮ＰＣＲ産物の希釈系を用いて。ＰＣＲ産物を用いる標準曲線は、アッセイの有効性を判定するために（Ｐｆａｆｆｌ，（２００１）Ａ  ｎｅｗ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１  Ｍａｙ１；２９（９）：ｅ４５における方法を参照）、ならびにコピー数を判定するために用いられた。ＰＣＲ産物の分子を判定した：（Ａｘ６．０２２×１０２３）×（６６０ｘＢ）−１、ここでＡ：ＰＣＲ産物の濃度、６．０２２×１０２３：アボガドロ数、６６０：塩基対１つ当たりの平均分子量、Ｂ：ＰＣＲ産物の長さ。未知サンプル中の分子数を判定し、ＤＮＡ  ｑＰＣＲテンプレートにおける既知の細胞数で割って、細胞１個当たりのコピー数を得る。（２）指数増殖期に採取したアレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の株（ＡＣＣＣ０１、ＡＣＳＨ０２、ＡＣＴＲＡ０２）の既知細胞数の二通りのサンプルからＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを３桁超、５０％で希釈する（ｎ＝６）。
【０２１０】
ＬＳＵ  ｒＲＮＡアッセイに基づいて、サンプル中のＡ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の環境存在量を予測するために、（２）からの等式を外挿してこれらのサンプルに関して測定したＣＴ値に適用した。いくつかのアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種の株におけるｒＲＮＡ遺伝子のコピー数にばらつきが見られたこと、ならびに細胞の増殖条件および細胞周期条件におけるばらつきによる２のファクターまでのばらつきが予想されたため、３つの株各々の二通りのサンプルにおいて、ＬＳＵ  ｒＲＮＡ遺伝子領域のコピー数を測定した。環境サンプル中の最終的なＡ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）存在量を、６つの独立した予測値の平均および標準偏差として測定した。
【０２１１】
−植物プランクトンおよびカキサンプルの採集
植物プランクトン群集は、ナルーマ（Ｎａｒｏｏｍａ）、ワゴンガ入り江、ＮＳＷ、東経３６度１３分、南緯１５０度６分、ならびにジョージズ・リバー、ＮＳＷ、東経３４度１分、南緯１５１度８分におけるシドニーイワガキ（Ｓａｃｃｏｓｔｒｅａ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ）の養殖場近くの基準モニタリング地点で、２０１０年１１月１５〜２０日の間、毎日、中潮位の時点で採取した（図７）。サンプルは、ブリスベン・ウォーター、ＮＳＷ、東経３３度２８分、南緯１５１度１８分にても、２０１０年７月２２日に採取した（図７）。
【０２１２】
分子分析用に、三通りの４Ｌボトルサンプルを毎日採取した。さらに５００ｍｌのボトルを取り、顕微鏡同定および計数のために、直ちにルゴールヨウ素で固定した。３μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを用いてサンプルを濾過し、ＤＮＡの抽出まで−２０℃で凍結した。２０１０年１１月１７日および２０１０年１１月１９日に、植物プランクトン採集地点のすぐ近くにある養殖場から１０の個々のＳ．グロメラータ（Ｓ．ｇｌｏｍｅｒａｔａ）のサンプルを採取した。Ｓ．グロメラータ（Ｓ．ｇｌｏｍｅｒａｔａ）のサンプルは、毒素試験用にプールした。
【０２１３】
混合環境サンプル中のプライマー対の特異性を判定するために、既知のＳＴＸ産生種が存在しない植物プランクトン群集をサンプル採取した。２０１１年、１月１９日、ジャービス・ベイ（Ｊｅｒｖｉｓ  Ｂａｙ）において、１Ｌの表層群集を、上記の通り、サンプル採取し、保存し、濃縮し、同定し、５００ｍｌからの存在種をカウントした。存在する渦鞭毛藻は、プロトセラチウム・レチクラタム（Ｐｒｏｔｏｃｅｒａｔｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、カルロドジニウム・ｃｆ・ベネフィクム（Ｋａｒｌｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｆ  ｖｅｎｅｆｉｃｕｍ）、カレニア（Ｋａｒｅｎｉａ）種、プロロセントルム・ミカンス（Ｐｒｏｒｏｃｅｎｔｒｕｍ  ｍｉｃａｎｓ）、ポラレラ・グラシアリス（Ｐｏｌａｒｅｌｌａ  ｇｌａｃｉａｌｉｓ）、フィステリア・シュムワヤエ（Ｐｆｉｅｓｔｅｒｉａ  ｓｈｕｍｗａｙａｅ）、およびシンビオジニウム（Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ）種として同定された。残りの５００ｍｌのサンプルを上記の通り、濾過し、ＤＮＡ抽出しＰＣＲを行った。
【０２１４】
−顕微鏡を用いたアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）細胞のカウント
ルゴール保存したサンプルの約３００ｍｌ中の植物プランクトン細胞を、洗浄前に、５μｍセルロースエステルフィルター（Ａｄｖａｎｔｅｃ）上で４ｍｌへと重力補助膜濾過により濃縮し、カウントした。Ｓｅｄｇｅ  Ｒａｆｔｅｒ細胞とＺｅｉｓ  Ａｘｉｏｌａｂ位相差光学素子を備えた顕微鏡を用いて、アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種を同定しカウントした。カウントされた細胞数は、サンプルの間でアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）の存在量に依って変動し、標準誤り率は、以下の等式を用いて算出した：誤り＝２／√ｎ、式中、ｎはサンプル中に見られた細胞数。
【０２１５】
−カキおよび培養物における毒素の測定
ニュージーランドのＣａｗｔｈｒｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおける貝における麻痺性貝中毒性毒素に関するＡＯＡＣ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ２００５．０６に従い、ＨＰＬＣを用いて、貝のサンプルおよび渦鞭毛藻細胞ペレットを試験した。元のプロトコルに記載されたマトリクス変更因子を用いずに、代わりに、個別の各化合物に対して平均スパイクリカバリーを用いた。Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＦＬＲ検出器に結合させたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）上でＨＰＬＣ分析を実施した。３０℃で、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｃ１８  ＢＥＨ  １．７μｍ  ２．１×５０ｍｍカラムにより分離を達成し、１分当たり０．２ｍＬで溶出させた。移動相は、０．１Ｍのギ酸アンモニウム（Ａ）および５％アセトニトリル中０．１Ｍのギ酸アンモニウム（Ｂ）で、双方ともｐＨ６に調整した。勾配の構成は、１００％Ａを０．５分、３．５分かけて８０％Ｂへ直線勾配、次いで、０．１分かけて開始条件へ戻し、１．９分保持であった。蛍光検出器は、励起を３４０ｎｍ、発光を３９５ｎｍに設定した。ＳＴＸ類縁体に関する分析用標品は、カナダ国立研究評議会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ、Ｃａｎａｄａ）から得た。細胞培養物ＨＰＬＣの検出限界は、ＮＥＯとＳＴＸに関しては、細胞１個当たり、０．１  ｐｇ、ＧＴＸ１／４、ＧＴＸ６（Ｂ２）およびＧＴＸ５（Ｂ１）に関しては、細胞１個当たり、０．２  ｐｇ、Ｃ１，２に関しては、細胞１個当たり、０．５  ｐｇ、類縁体Ｃ３，４に関しては、細胞１個当たり、＜０．３  ｐｇと考えられた。
【０２１６】
結果
−プライマー対の特異性、感受性および効率性
本試験においてデザインされたプライマーは、全ての被験ＳＴＸ産生渦鞭毛藻の種：アレキサンドリウム・ミヌツム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ）、Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）、Ａ  ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ、Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）およびギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）において、正確なサイズの断片を増幅することが分かった（表４）。また、利用したＨＰＬＣ法の検出限界以上のレベルでＳＴＸ類の産生が見られなかったＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）種、ＡＴＣＪ３３株、タスマニアのリボタイプから、正確なサイズの断片を増幅した。産物の配列決定により、これはｓｘｔＡ４の相同体であることが確認された。
【０２１７】
ｓｘｔＡ４プライマー対は、非ＳＴＸ産生の近縁ゴニオウラクス（Ｇｏｎｙａｕｌａｃａｌｅａｎ）の種であるアレキサンドリウム・アンデルソニー（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）種、アレキサンドリウム・アフィネ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ａｆｆｉｎｅ）種、ガンビエルディカス・オーストラレス（Ｇａｍｂｉｅｒｄｉｓｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｅｓ）種、オストレオプシス・オバタ（Ｏｓｔｒｅｏｐｓｉｓ  ｏｖａｔａ）種またはオストレオプシス・シアメンシス（Ｏｓｔｒｅｏｐｓｉｓ  ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）種由来のＤＮＡを増幅しなかったし、また、より遠縁の渦鞭毛藻種であるアンフィジニウム・マサルティー（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｍａｓｓａｒｔｉｉ）種由来のＤＮＡも増幅しなかった。また、ｓｘｔＡ４プライマー対は、バクテリア、珪藻、ピコプランクトンおよび渦鞭毛藻のプロトセラチウム・レチクラタム（Ｐｒｏｔｏｃｅｒａｔｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、カルロドジニウム・ｃｆ・ベネフィクム（Ｋａｒｌｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｆ  ｖｅｎｅｆｉｃｕｍ）、カレニア（Ｋａｒｅｎｉａ）種、プロロセントルム・ミカンス（Ｐｒｏｒｏｃｅｎｔｒｕｍ  ｍｉｃａｎｓ）、ポラレラ・グラシアリス（Ｐｏｌａｒｅｌｌａ  ｇｌａｃｉａｌｉｓ）、フィステリア・シュムワヤエ（Ｐｆｉｅｓｔｅｒｉａ  ｓｈｕｍｗａｙａｅ）、およびシンビオジニウム（Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ）種などの混合プランクトン群集を含有する植物プランクトンサンプルからのＤＮＡを増幅しなかった（表４）。対照的に、全てのサンプルからのＤＮＡは、陽性対照プライマー対を用いて増幅され、反応テンプレートが完全であって阻害物が無いことが確認された。
【０２１８】
このプライマー対に基づいたｓｘｔＡ４アッセイの効率は、新鮮ＰＣＲ産物の６桁超の希釈系列を用いて算出すると９７％であった。このアッセイを、Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の３つの株からのｇＤＮＡの２通りの５０％希釈系列を用いて算出すると９３〜１０７％の効率であった（図８）。双方のＰＣＲ産物に基づき、ｇＤＮＡ、回帰方程式のｒ２値に基づいた標準曲線は０．９５以上であった（図８）。アッセイがＤＮＡの量に感受性があったことは、Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の３つの株の約３０個から２０００個の細胞を表している。したがって、利用したプロトコルと同様のプロトコルに従ってサンプル採集を実施し、４Ｌの海水を採集し、抽出し、１５μＬに溶出し、そのうちの１μＬをアッセイした場合は、このアッセイにより、およそ１Ｌ当たり１１０個の細胞の検出限界で、Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の環境濃度が検出されると考えられる。
【０２１９】
−ｓｘｔＡ４遺伝子のコピー数
アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の３つの培養株におけるｓｘｔＡ４のコピー数は、細胞１個当たり、平均１７８〜２８０であった（表５）。これらの株の毒性は、細胞１個当たり、ＳＴＸ当量で３．１〜６．６ｐｇであった（表５）。環境サンプルにおいて、ｓｘｔＡ４のコピー数は、ジョージズ・リバーとワゴンガ入り江のサンプルで、細胞１個当たり、それぞれ２２６と３７６であり、予想値中のほとんどの変数は、ワゴンガ入り江のサンプルに基づいた。
【０２２０】
【表６】
0006001648.tif 000007
【０２２１】
環境サンプル
ｓｘｔＡ４は、１つのブリスベン・ウォーターのサンプルで、ならびにジョージズ・リバーとワゴンガ入り江サンプルのセットで検出された（図９）。配列決定および融解曲線分析により、これがｓｘｔＡ４であり、アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）株由来の対応する遺伝子に対して９９％以上の平均同一性を有することが確認された。顕微鏡から予想された細胞数、ＬＳＵ  ｒＤＮＡから予想された細胞数、およびｓｘｔＡ４のコピー数との間の正の関連性が、双方の環境サンプルセットに見られた。ＬＳＵ  ｒＤＮＡ遺伝子のｑＰＣＲから予想された細胞数とｓｘｔＡ４のコピー数との間の相関性は、ジョージズ・リバーのサンプルではきわめて高く（ｒ２＝０．９７、勾配＝０．００５９、ｐ＜０．００１）、ワゴンガ入り江のサンプルではそれより低かった（ｒ２＝０．７０、勾配＝０．００１、ｐ＜０．０７）（図９）。
【０２２２】
プールされたＳ．グロメラータ（Ｓ．ｇｌｏｍｅｒａｔａ）のサンプルにおけるＳＴＸはこれら３つの地点の各々から検出され、ジョージズ・リバー地点では高濃度（貝１ｋｇ当たり、ＳＴＸ等価で２００μｇ）が報告され、ワゴンガ入り江とブリスベン・ウォーター双方ではより低濃度（貝１ｋｇ当たり、ＳＴＸ等価でそれぞれ、４８μｇと１４５μｇ、表５）が記録された。
【０２２３】
考察
本明細書において、海洋環境サンプル中のＳＴＸ産生の可能性を検出および定量化する新規な方法が提供されている。アッセイは、ｓｘｔ経路に関与すると推測されるユニークな酵素をコードする遺伝子ｓｘｔＡの検出に基づいている。記載された方法では、全てのＳＴＸ産生培養物中にｓｘｔＡ遺伝子を検出し、非ＳＴＸ産生培養物、または既知のＳＴＸ産生種を含有しなかった環境サンプル中には検出しなかった。しかし、ｓｘｔＡ遺伝子は、非産生株であるアレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）、タスマニアのリボタイプ、ＡＴＣＪ３３にも検出された。この種のタスマニアのリボタイプのきわめて近縁の株がＳＴＸを産生することが分かっているので（未発表データ）、ＡＴＣＪ３３株が一定の状況下でＳＴＸ産生の潜在性を有する可能性がある。本試験におけるアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）およびギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）の種および株に由来するｓｘｔＡ４の増幅は、上記の実施例１の所見、すなわち、ｓｘｔＡ１およびｓｘｔＡ４のおよそ５５０ｂｐおよび７５０ｂｐの断片が試験した同一株から増幅され、アレキサンドリウム・アフィネ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ａｆｆｉｎｅ）種およびＡ．アンデルソニー（Ａ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）種由来のこれら断片の増幅は検出されなかったという所見に一致する。
【０２２４】
−ｓｘｔＡ４のコピー数とＳＴＸ含量
ｓｘｔＡ４の存在量は、試験した株および環境サンプルの中で比較的同様であり、細胞１個当たり、１７８〜３７６コピーの範囲であることが分かった（表５）。これは、上記の実施例１の結果、すなわち、ｑＰＣＲを用いたアレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）株、ＡＣＳＨ０２の増殖を通して、細胞１個当たり、１００〜２４０コピーが見られたことを裏づける。アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の３つの株のＳＴＸ当量の総毒性は、細胞１個当たり、ＳＴＸ当量で３．１〜６．６ｐｇであった（表５）。これは、Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）、Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）およびＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）などの他のＳＴＸ産生種の毒性（細胞１個当たり、ＳＴＸ当量で０．６６〜９．８ｐｇ）以内にあるが、ギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）（細胞１個当たり、ＳＴＸ当量で２６〜２８ｐｇおよびアレクサンドリウム・オステンフェルジー（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｏｓｔｅｎｆｅｌｄｉｉ）（細胞１個当たり、ＳＴＸ当量で２１７ｐｇまで）よりも低い。
【０２２５】
−南東オーストラリアにおけるｓｘｔＡ４、Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）およびＳＴＸ
本試験期間中、南東オーストラリア河口の３つの機会でサンプルを採取し、各々の場合、ｓｘｔＡ４が検出された（表４）。ジョージズ・リバーのサンプル設定に関して、ＬＳＵ  ｒＤＮＡにより判定されたとおり、１Ｌ当たりのｓｘｔＡ４コピー数と１Ｌ当たりの細胞存在量との間の相関関係が、大いに重要であった（図９）。ジョージズ・リバーのサンプリング地点において、ＬＳＵ  ｒＤＮＡアッセイの推定量に基づいて５日に亘るサンプリング期間を通して、平均的存在量が１Ｌ当たり３１５０〜２６４５０個の細胞が記録され、顕微鏡敵細胞数に基づいて選択された日から７９００〜３８０００個が記録された。最終日のサンプリングにおいて、三重に採取されたサンプル間で細胞数のばらつきが、Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の分布の不均一性を反映した地点で見られた。これにもかかわらず、ｒＲＮＡ  ｑＰＣＲに基づく１Ｌ当たりのｓｘｔＡ４コピー数とアレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の細胞数との間の相関関係が、非常に強く（ｒ２＝０．９７、勾配＝０．００５９、ｐ＜０．００１）、この週の期間に採取されたカキサンプル中の全ＳＴＸ量が、貝１ｋｇ当たり２００μｇのＳＴＸ等価体であり、環境衛生モニタリングに関する規制レベル（貝１ｋｇ当たり８００μｇのＳＴＸ等価体）以下であったが、本試験期間に採取された３つのサンプルの中で最高であった。
【０２２６】
ワゴンガ入り江におけるサンプリング期間を通して、平均存在量が１Ｌ当たり３０〜２８８個の細胞が、ＬＳＵ  ｒＤＮＡ  ｑＰＣＲアッセイの推定量に基づき見られ、また顕微鏡的細胞数に基づき１Ｌ当たり８０〜５４０個の細胞が見られた（図９）。ＬＳＵ  ｒＤＮＡ  ｑＰＣＲアッセイから算出されたように、１Ｌ当たりのｓｘｔＡ４コピー数と細胞数との間の相関関係は、ジョージズ・リバーのサンプル（ｒ２＝０．７０、勾配＝０．００１、ｐ＝０．０７）よりも低かった。このことは、これら２つのサンプルが１Ｌ当たり１１０個の細胞よりも少なく含有し、したがって、このアッセイの信頼できる検出限界が、より低かったという事実を反映し得る。あるいは、このサンプリングセットのより低い相関係数は、ｓｘｔＡのコピー数が異なるアレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の種々の株の存在に起因すると考えられる。
【０２２７】
−ＳＴＸおよびアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種に関する検出方法
一般に、ＨＡＢ−形成植物プランクトン、産業ならびに生物学的海洋調査に関するそれらの毒素の数え上げは、種の顕微鏡ベースの集計および直接的毒素の検出法に依る。ＳＴＸの定量化は、一般にマウスのバイオアッセイ、ＨＰＬＣ機器、ＬＣ−ＭＳ機器または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの抗体ベースの免疫アッセイにより実施される。ＨＰＬＣは、時間のかかる高価な方法であり、十分に装備された分析実験室およびＳＴＸの純粋な標品とその多数の類縁体を必要とする。新たに開発されたＥＬＩＳＡ法は、これら幾つかのの欠点が克服されているが、それらは、数種の通常のＳＴＸ誘導体に関して入手できず、毒素プロファイルが、かなり複雑なことが多いので交差反応性の問題がある。
【０２２８】
海洋植物プランクトン種の同定および数え上げに関する分子遺伝子的方法および抗体ベース法は、顕微鏡ベースの集計および直接的毒素検出法と比較した場合、多くの利点がある：顕微鏡ベースの分類学的同定に比較して、トレーニングと経験の必要性が非常に少ない簡便性、費用効果（ｑＰＣＲ試薬は一般に、１サンプル当たり約１米国ドルよりも安い費用）、スピードおよび自動化の可能性（３０サンプルまで、９６ウェルプレートを用いて標準的なｑＰＣＲ機器上で２時間の三重反復試験で操作できる）。リアルタイムのｑＰＣＲ機器は、近年、実質的に費用が減少しており、分子生物学的技法における基本トレーニングにより操作することができる。
【０２２９】
アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）  １Ｌ当たり約１１０個の細胞の信頼できる検出限界は、本明細書に報告されたｑＰＣＲ法を用いて達成できる。アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）の検出に関して、ｑＰＣＲに基づくアッセイは、存在量の低い細胞において顕微鏡ベース法よりも鋭敏である可能性があり、そこには、関心のある種が植物プランクトンの少量成分である可能性がある。多数の植物プランクトンのモニタリングプログラムに適用されるＳｅｄｇｅｗｉｃｋ−Ｒａｆｔｅｒ集計チャンバ法は、１Ｌ当たり１０００個の細胞の信頼できる検出限界を有するように考慮されている。しかしながら、これは、観察されたサンプルの容量に依存する。本試験において、１Ｌ当たり２０個を下回る細胞に対する検出レベルは、より大きな容量のサンプルが観察されるように、サンプルをろ過することによりＳｅｄｇｅｗｉｃｋ−Ｒａｆｔｅｒ集計チャンバ法を用いて達成された。顕微鏡ベースのカウントにおける標準的な誤差は、観察された細胞数に依り、細胞数の減少が増すことである。分子遺伝子的方法に関して、細胞カウントに関連する標準的誤差は、アッセイの検出閾値よりも細胞存在量が大きなため細胞の存在量に依らない。分子遺伝子的同定および数え上げ方法は、これらの方法を用いてサンプル採取された水の容量（一般に１〜８Ｌ）に依って、ｑＰＣＲおよびＦＩＳＨプローブを用いたアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種１Ｌ当たり１０〜１００個の細胞のオーダーで検出閾値を報告している。アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種１Ｌ当たり２００個の細胞と低い濃度は、貝へのＳＴＸ取込みに関連しており、多数の植物プランクトンのモニタリングプログラムで現在実施されているとおり、低い細胞存在量での種の信頼できる検出は、顕微鏡カウントよりもｑＰＣＲベースの数え上げ方法の重要な利点である。
【０２３０】
分子遺伝子ベースのモニタリング法には多くの利点が注目されたが、現行の方法は、幾つかの欠点を有しており、マーカー遺伝子を用いる種の数え上げのためのｑＰＣＲは、棲息地において多数のプローブを必要とし、数種のアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）、ピロジニウム・バハメンセ（Ｐｙｒｏｄｉｎｉｕｍ  ｂａｈａｍｅｎｓｅ）およびギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）は、ＳＴＸを発生し、産生する。特定の棲息地において以前に文書化されなかった種は、時には同定されており、それらの同定のために好適なプローブが入手できない場合、それらを認識することができない。さらに、一定の標的種の数え上げは、培養に対する調査、およびこれが地域間で変わり得るように、地域のＳＴＸ産生種の毒素の判定を必要とする。地域におけるアレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の高い存在量において、一般的にＳＴＸを産生するこの種は、必ずしも貝の中のＳＴＸと相関するとは限らず、ＳＴＸ産物中の個体群レベルの相違が生じ得ることが示唆される。
【０２３１】
たいていのｑＰＣＲベースの最終的な集計方法の欠点は、相対的に高速拡散速度が種特異的マーカーのデザインを可能にするので、通常、検出に用いられるリボソームＲＮＡ遺伝子は、アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）の幾つかの種の株間のコピー数において，および幾つかの場合、種の増殖期間中、有意に変わり得ることである。このことは、幾つかのアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種における不安定なｒＤＮＡ擬似遺伝子の存在、および染色体外ｒＤＮＡ分子の存在の可能性によると思われる。この変化の効果により、推定遺伝子数と細胞数との間に不均衡が生じ、その結果、顕微鏡に基づいた存在量の推定値とｑＰＣＲに基づいたものとの間に不整合が生じ得る。この理由のため、本試験において、ＬＳＵ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を、地域の水から単離されたＡ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の３種の株の複製で測定し、ＬＳＵ  ｒＤＮＡコピー数に基づいた細胞数の信頼できる推定値を得た。
【０２３２】
本明細書に提供された新規な方法は、ＳＴＸの合成に関係する遺伝子（ｓｘｔＡ）の直接的検出に依る。したがって、任意の特定種の存在量よりもＳＴＸ産生と緊密に相関し得る。さらに、分析器を用いて実際の毒素よりもｓｘｔＡを検出するために、この方法は、かなり速くかつ安価である。開示されたプライマー対を用いて、ｓｘｔＡ４は、試験された２種の非−ＳＴＸ産生アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種から増幅されなかったが、相対的に隔たった関系のＳＴＸ−産生種のギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）からは増幅された。このことは、特定の地点から以前に知られていなかったＳＴＸ産生の可能性のある種など、幾つかの異なるＳＴＸ産生属を同時に検出するために、単一アッセイの使用を可能にする。しかしながら、このアッセイはまた、ＳＴＸを産生することが見られなかったアレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）のＡＴＣＪ３３株からの産物を増幅し、この株がｓｘｔＡ１およびｓｘｔＡ４を有した上記実施例の１つの知見をミラー化し、そしてこのアッセイが、小さなパーセンテージでＳＴＸの存在を示し得ることを示した。
【０２３３】
上方制御されている遺伝子は、標準的増殖時のレベルと比較して約５倍以下で転写発生量を増加することが報告されているように、他の生物における制御と比較して、転写レベルの調節は、多くの渦鞭毛藻遺伝子の発現において比較的少ない役割を演じ得る。このことは、渦鞭毛藻類における高発現遺伝子のゲノムコピーの複製が、それらの転写を増加させる手段として機能し得るという理論に至った。もしこれが真であるならば、１細胞当たりのｓｘｔＡのコピー数と特定の株により産生したＳＴＸ量との間の関系があり得る。本試験において、被験種は、比較的同様のＳＴＸ細胞の割り当てを有し、１細胞当たりのｓｘｔＡにおいて有意差は無かった。
【０２３４】
実施例３：サキシトキシン産生および非産生渦鞭毛藻類種におけるｓｘｔＡ配列の調査
目的
サキシトキシンを産生することが知られている渦鞭毛藻類およびＳＴＸを産生することが知られていないものにおいて、サキシトキシン（ＳＴＸ）の合成に関与する遺伝子を増幅させ、配列決定すること。
【０２３５】
材料および方法
渦鞭毛藻類株を、ＧＳｅ培地中で増殖させ、１８°、および１２／１２光サイクルで培養室内に維持した。収穫し、３０００ｇで５分間の遠心分離により、次いでＣＴＡＢ法を用いて２０ｍｌの指数増殖培養液からＤＮＡを抽出した。
【０２３６】
サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｙｃｌｅｒ）内で１０％のＢＳＡを含有するＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＧＣ豊富なＰＣＲポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、以下のＰＣＲ条件で、ＤＮＡテンプレートをＰＣＲ増幅させた：初発に９５℃で５分の変性後、（１）９４ｏＣで３０秒の変性、（２）３０秒のアニーリング（可変温度）、および（３）７２ｏＣで１〜２分の伸長、最終的に同じ温度で１０分の伸長、の３５サイクル。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＰＣＲ産物をゲル切除してから、下記のようなプライマーを用いてＡＢＩ３７３０  ＤＮＡアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により直接的な配列決定をした。
【０２３７】
【表７】
0006001648.tif 000008
【０２３８】
本試験のために新たに調査された種は、以下のＳＴＸ産生種であった：アレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）、株ＣＡＷＤ１２１、および非産生種はアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種、株ＡＡＫＴ０１、アンフィジニウム・マサルティー（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｍａｓｓａｒｔｉｉ）  ＣＳ−２５９、アンフィジニウム・モオトノルム（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｍｏｏｔｏｎｏｒｕｍ）  ＣＡＷＤ１６１、コオリア・モノティス）Ｃｏｏｌｉａ  ｍｏｎｏｔｉｓ  ＣＡＷＤ９８、ガンビエルディスカス・オーストラレス（Ｇａｍｂｉｅｒｄｉｓｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｅｓ）  ＣＡＷＤ１４８、プロロセントルム・リマ（Ｐｒｏｒｏｃｅｎｔｒｕｍ  ｌｉｍａ）  ＣＡＷＤ、プロトセラチウム・レチクラタム（Ｐｒｏｔｏｃｅｒａｔｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）  ＣＡＷＤ、ゴニオウラクス・スピニフェラ（Ｇｏｎｙａｕｌａｘ  ｓｐｉｎｉｆｅｒａ）  ＣＡＷＤ。
【０２３９】
結果
正しいサイズのｓｘｔＡ１ドメイン遺伝子は、サキシトキシン産生種アレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）の株ＣＡＷＤ１２１（配列番号２２４）、および推定サキシトキシン産生種アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）、株ＡＣＮＣ５０（配列番号２２５〜２２６は、株ＡＣＮＣ５０の２種のクローンからｓｘｔＡ１ドメイン配列を示す）から同定された。これは、アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の株ＡＣＳＨ０２由来の対応する遺伝子に対し９９％相似であることが分かった。
【０２４０】
ｓｘｔＡ１（配列番号２２７）に関する遺伝子もまた、サキシトキシンを産生することが以前に報告されていなかったアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）株ＡＡＫＴ０１から増幅された。
【０２４１】
渦鞭毛藻類の残りの非産生種のいずれからも、遺伝子を増幅させることができなかった。
【０２４２】
結論
渦鞭毛藻類中のサキシトキシンの合成に関与する推定上の遺伝子の存在は、サキシトキシンを産生する全種で確認された。本試験において、それらは、ＣＡＷＤ１２１として単離されたニュージーランドでサキシトキシンを含有する有害な藻類ブルームを生じているさらなる産生株に見出された。さらに、サキシトキシンを産生する種に密接に関連するアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）の１種、株ＡＡＫＴ０１は、遺伝子ｓｘｔＡ１を有することが分かった。この種は、以前にサキシトキシンを産生することが報告されていなかったが、現在、一定の環境下でサキシトキシンを産生する可能性を有することが示唆された。より鋭敏な検出技法を用いた毒素分析は、この仮説を証明するために必要となり得る。例えば、Ｎｅｇｒｉら（２００３）は、Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）株、ＡＴＢＢ０１が、サキシフィリンアッセイで試験した場合、ＳＴＸ活性を示したが、ＨＰＬＣ法で試験した場合、毒素を検出できなかったことを報告した（Ｎｅｇｒｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．「Ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｔｏｘｉｎｓ  ａｒｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｔｏ  ｆｅｗ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｍｏｎｇ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ’ｓ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ」、Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３９（４），６６３−６６７を参照）。
【０２４３】
サキシトキシンを産生することが知られておらず、サキシトキシン産生種に密接に関連していない他の渦鞭毛藻目の種は、本試験で調査しなかったが、遺伝子ｓｘｔＡ１を有することが分かった。
【０２４４】
実施例４：ｓｘｔＡに基づくｑＰＣＲアッセイによりモニターされた、オプア・ベイ、ニュージーランド（Ｏｐｕａ  Ｂａｙ，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）からのアレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）
目的
海洋渦鞭毛藻類中のサキシトキシン合成に関与する遺伝子ｓｘｔＡのコピー数が、手動カウントされた海洋環境サンプル中のアレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）の細胞数と相関するか否かを判定すること。
【０２４５】
方法
サンプルは、クィーン・シャーロット・サウンド、サウスアイランド、ニュージーランド（Ｑｕｅｅｎ  Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ  Ｓｏｕｎｄ，Ｓｏｕｔｈ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）における、オナプア・ベイ（Ｏｎａｐｕａ  Ｂａｙ）の南東地域のオプア・ベイ（Ｏｐｕａ  Ｂａｙ）で採取した。週に一度４週間に亘って（２２／２／１２〜１３／３／１２）、水カラムにより０〜１５ｍの深さからの集積サンプルのうち、三重反復試験用の５００ｍｌサンプルを採取し、−８０℃で保存した。解凍後、各サンプル２００ｍｌを、０．４５ｕｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを通してろ過した。フィルターを、エッペンドルフ管に約５０ｕｌの海水中でリンスし、ボルテックスし、遠心分離した。製造元の取扱い説明書に従って、ペレットを、Ｍｏｂｉｏ  ＤＮＡソイルキットを用いて抽出した。ＤＮＡを、１００μｌ中で２回溶出した（同じ溶出液を、フィルターを通して２回リンスした）。高塩／エタノール沈殿を用いて、ＤＮＡを２０μｌのサンプルに濃縮した。
【０２４６】
プライマーの配列は、ｓｘｔＡ４Ｆ  ５’−ＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＧＴＴＣＡＡＴＴＣ−３’（配列番号１９８）およびｓｘｔＡ４Ｒ  ５’−ＴＡＣＡＧＡＴＭＧＧＣＣＣＴＧＴＧＡＲＣ−３’（配列番号１９９）であり、１２５ｂｐ産物を生成した。
【０２４７】
新鮮なＰＣＲ産物の知られた濃度の希釈シリーズを用いて、５．７−５．７×１０−５ｎｇ（ｎ＝６）からの範囲でｓｘｔＡ４の標準曲線を作成した。ＰＣＲ産物を用いる標準曲線を用いて、アッセイの効率を測定し、ならびにコピー数を測定した。ＰＣＲ産物の分子は：（Ａ×６．０２２×１０２３）×（６６０×Ｂ）−１で決定した、ここでＡ：ＰＣＲ産物の濃度、６．０２２×１０２３：アボガドロ数、６６０：１塩基対当たりの平均分子量、およびＢ：ＰＣＲ産物の長さ。
【０２４８】
ｑＰＣＲサイクリングは、ＳＳＯ  Ｆａｓｔ  Ｅｖａｇｒｅｅｎ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてＲｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）上で実施した。ｑＰＣＲアッセイは、１０μｌのＥｖａｇｒｅｅｎマスターミックス（ＤＮＡインターカレーティング色素、緩衝剤およびＴａｑポリメラーゼを含有）、１μｌのテンプレートＤＮＡ、０．５μＭの各プライマー、および１μｌのＢＳＡからなる２０μｌの最終容量中で実施した。ｑＰＣＲアッセイは、三重反復試験の以下のサイクルで実施した：９５℃で１０秒間、および９５℃で１５秒間および６０℃で３０秒間の３５の複製。融点曲線分析は、各サイクルの終末に実施して、増幅特異性を確認し、選択されたＰＣＲ産物を配列決定した。
【０２４９】
結果
検出された１Ｌ当たりのｓｘｔＡ４のコピー数は、アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）細胞の存在量の変化と同様に、サンプリングの第３週にピークに達し、その後に急降下することが分かった（図１０）。三重反復試験用の水サンプルにおいてｓｘｔＡ４１Ｌ当たりのコピー数は、１Ｌ当たりのアレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）細胞の平均存在量と有意に相関することが分かった（図１１、Ｒ２＝０．８６）。
【０２５０】
結論
遺伝子ｓｘｔＡに基づく定量的ｑＰＣＲアッセイは、アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）を含有する海水環境サンプル中にサキシトキシン存在の可能性を判定するための信頼できる方法であることが判明した。遺伝子ｓｘｔＡのコピーの存在量は、アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）種の存在量と有意に相関することが判明した。
【０２５１】
実施例５：「非毒性」のアレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）の系統群ＶにおけるｓｘｔＡ１配列とｓｘｔＡ４配列の増幅およびサキシトキシン産生ならびにｓｘｔＡの調査要約
３種のアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種、Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）、Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）およびＡ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）は、神経毒サキシトキシン（ＳＴＸ）の強力な産生株およびその類縁体、麻痺性貝毒（ＰＳＰ）の原因物質であり得る株を含む。これら３種は、形態学的に非常に類似しているが、互いに腹面ポアまたは鎖を形成する能力のみ異なる。種の分界のためのこれらの形態学的特性の妥当性は、広範囲にわたって論争されている。この種の複合体、Ｖ群、タスマニアン分岐群の特有の分岐群は、オーストラリア南東部に見られ、時折ブルーム比で発生する。この分岐群は、非毒性であると考えられており、ＰＳＰ毒素は、この種のブルーム後の貝には見られなかった。本試験において、アレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）であるＶ群のタスマニアン株は、ＳＴＸを産生し、ＳＴＸ産生に推定上関与する遺伝子ｓｘｔＡを有することが確認された。毒素プロファイルが決定され、高比率のＧＴＸ５および少量のＳＴＸなどまれであり、共発生するＡ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）（ＩＶ群）とは異なる。２０１０年１０月に発生したＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）の推定上のブルーム、およびシドニーイワガキ（Ｓａｃｃｏｓｔｒｅａ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ）におけるＳＴＸのその後の知見により、この種の幾つかの天然株がＳＴＸを産生し得ることが示唆され得る。
【０２５２】
序論
通常かつ広く行きわたった３種の渦鞭毛藻、アレキサンドリウム属（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）であるＡ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）、Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）およびＡ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）は、類似性が高く、時には、重なりのある形態学的特徴を有する（Ｂａｌｅｃｈ，１９９５；Ｆｕｋｕｙｏ，１９８５；Ｓｔｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９９０）。この分岐群は、５つの遺伝子的に異なる群からなるように、「種の複合体」を含んでなることが考慮されている（Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｓｃｈｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｌｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。これらの種の同定に使用される特徴としては、細胞の形状、頂端ポア複合体（ＡＰＣ）の形状、第１の頂板上の腹面ポアの存在（Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ））または非存在（Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）／Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ））、および細胞が、鎖形成（Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ））の傾向を示すか否かが挙げられる（Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）／Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ））（Ｂａｌｅｃｈ，１９９５）。これら３種間の形態学中間体を有する幾つかの形態もまた、観察されている（Ｃｅｍｂｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｇａｙｏｓｏ  ａｎｄ  Ｆｕｌｃｏ，２００６；Ｏｒｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｓａｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０２５３】
形態学に基づいた情報と対照的に、ＳＳＵ、ＴＳ／５．８ｓ、およびＬＳＵ遺伝子など、ｒＲＮＡオペロンの領域に基づいたアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種の多くの系統学的研究では、互いに明確に区別された分岐群（Ｉ−Ｖ群）を有する（Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｓｃｈｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）；（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｓａｋｏ，２００５；Ｌｅａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｌｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｍｏｎｔｒｅｓｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。渦鞭毛藻の多様性およびｒＤＮＡ配列に対するその関系の調査に基づいて、Ｌｉｔａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）により、渦鞭毛藻類中の保存的「種レベル」のマーカーが、ＩＴＳ１／５．８Ｓ／ＩＴＳ２  ｒＤＮＡの整列された領域内で４％（＝０．０４の修正されていない遺伝子距離）の相違を考慮され得ることが示唆された。アレキサンドリウム・タマレンセ／カテネラ／フンジエンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ／ｃａｔｅｎｅｌｌａ／ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）のこれらの分岐群は、ＩＴＳ１／５．８Ｓ／ＩＴＳ２の整列された配列において１３〜１８％、したがって幾つかの他の渦鞭毛藻種において３〜４倍のレベルで互いに相違する（Ｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０２５４】
特定の遺伝子分岐群（Ｉ−Ｖ群）に対するアレキサンドリウム・タマレンセ／カテネラ／フンジエンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ／ｃａｔｅｎｅｌｌａ／ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）株の同定は、形態学に基づく種の同定よりもＳＴＸ産生に関するそれらの予測的性向を考慮している（Ｓｃｈｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｓａｋｏ，２００５；Ｌｅａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｍｏｎｔｒｅｓｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｌｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。最新のＩ群およびＩＶ群の全株を、多様性の毒素プロファイルによりＳＴＸの産生可変量を分析したが（表７、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、一方、ＩＩ群株は、ＳＴＸの産生について報告されていない（Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＩＩＩ群株およびＶ群株の毒性は不明瞭である。それらは、一般に非毒性であると想定された（Ｌｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｓｃｈｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；  Ｇｅｎｏｖｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｂｏｌｃｈ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｓａｌａｓ，２００７；Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。ＩＩＩ群内に配置する遺伝子配列を有する単一株、ＣＣＭＰ１１６は、毒性があると報告されている（Ｐｅｎｎａ  ａｎｄ  Ｍａｇｎａｎｉ，１９９９）。一方、Ｖ群株は、一般に非毒性であると想定されているが（Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｂｏｌｃｈ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｓａｌａｓ，  ２００７）、極めて低レベルのＳＴＸは、タスマニアのベル・ベイ（Ｂｅｌｌ  Ｂａｙ）からの株ＡＴＢＢ０１／ＣＳ２９８により産生され得ることが示唆されている（Ｓｃｈｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；  Ｎｅｇｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。毒素プロファイルは測定されなかった。
【０２５５】
オーストラリアの海洋水において、アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種であるＡ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）およびＡ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）は、ＳＴＸを産生し、ブルーム比で発生し、貝中へのＳＴＸ取込みを生じた（Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｂｏｌｃｈ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｓａｌａｓ，２００７）。Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）の複合体種の中で、２つの群：Ｖ群のＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）およびＩＶ群のＡ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）は、地域に一貫して見いだされている（Ｂｏｌｃｈ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｓａｌａｓ，２００７）。この種の複合体の他の群は、過去２０年に亘る調査期間中見出されなかった（Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｂｏｌｃｈ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｓａｌａｓ，２００７）。バラスト水による導入（ＩＶ群）、または地域におけるそれらの長期存在（Ｖ群）を用いるなど、オーストラリアの海洋水中のＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）「種の複合体」株の起源について幾つか理論が提唱されている（Ｂｏｌｃｈ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｓａｌａｓ，２００７）。
【０２５６】
Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）（ＩＶ群）のブルーム、Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）およびギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）種のブルームは、ニューサウスウェールズ、サウスオーストラリア（Ｓｏｕｔｈ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ビクトリア（Ｖｉｃｔｒｉａ）およびタスマニア、オーストラリアにおける地点で、多数の理由で貝ベクター中のＳＴＸの取込みと関連している（Ｂｏｌｃｈ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｓａｌａｓ，２００７にレビュー）。オーストラリアの水での実験的にまたはモニタリングの過程でＳＴＸの存在に関して調査された潜在的貝ベクターは、シドニーイワガキ（Ｓａｃｃｏｓｔｒｅａ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ）、マガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ）、およびアコヤガイ（Ｐｅａｒｌ  Ｏｙｓｔｅｒｓ  Ｐｉｎｃｔａｄａ  ｉｍｂｒｉｃａｔａ）である（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）Ｖ群のブルームは、その地域をとおして間歇的に生じるが、貝へのＳＴＸ取込みを引き起こすことは報告されていない（Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
【０２５７】
ＳＴＸ産生の遺伝子ベースを調査する過程で、推定上のｓｘｔＡドメイン、ｓｘｔＡ１およびｓｘｔＡ４に関する遺伝子は、Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）Ｖ群の３種の株中に発見された（Ｓｔｕｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。これらの株を再調査して、それらの遺伝子親和性およびＳＴＸ産生に関する可能性を判定した。
【０２５８】
本試験では、ＳＴＸを産生することが判明したＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）株の毒素プロファイル、形態学および分子系統学を記載する。さらに、２０１０年にニューサウスウェールズ由来のＳ．グロメラータ（Ｓ．ｇｌｏｍｅｒａｔａ）のサンプル中のＳＴＸ存在の知見を報告する。
【０２５９】
材料および方法
培養液維持
渦鞭毛藻の培養液を、１８℃でＧＳｅ培地中に維持した。光は、１２／１２時間の暗／明サイクルで、６０〜１００μｍｏｌのフォトンｍ−２秒−１のフォトンフラックスにより、白色蛍光バルブ（Ｃｒｏｍｐｔｏｎ  Ｌｉｇｈｔ）により提供された。使用された株は、Ｍ  ｄｅ  Ｓａｌａｓにより、ケープ・ジャファ、南オーストラリア、オーストラリア（Ｃａｐｅ  Ｊａｆｆａ，Ｓｏｕｔｈ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（−３６．９４，１３９．７０）から単離されたＡＴＣＪ３３；ノース・ウエスト・ベイ、タスマニア、オーストラリア（Ｎｏｒｔｈ  Ｗｅｓｔ  Ｂａｙ，Ｔａｓｍａｎｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（−４３．０８，１４７．３１）から単離されたＡＴＮＷＢ０１；およびエミュ・ベイ、バーニー、タスマニア、オーストラリア（Ｅｍｕ  Ｂａｙ，Ｂｕｒｎｉｅ、Ｔａｓｍａｎｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（−４１．０５，１４５．９１）から単離されたＡＴＥＢ０１であった。
毒素判定のためのバルク培養液を、同じ日に２Ｌのエレンマイヤーフラスコに播種し、後期対数期または初期定常期中に、毒素の抽出のため一緒に収穫した。Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩＬの倒立光学顕微鏡下、Ｓｅｄｇｅｗｉｃｋ  Ｒａｆｔｅｒのカウンティングチャンバを用いて、１ｍｌのサブサンプルをカウントすることによって細胞の存在量を測定した。培養液を遠心分離し、直ちに−２０℃で凍結させてから、ＨＰＬＣ分析またはＤＮＡ抽出にかけた。ＨＰＬＣ分析用の細胞ペレットは、１．２５−２．２５×１０６個の細胞を含有した。
【０２６０】
ＬＭおよびＳＥＭ
細胞サイズと形状は、４０倍率または１００倍率でＬｅｉｃａ  ＤＭＩＬの倒立光学顕微鏡を用いて判定した。走査電子顕微鏡に関しては、２つの方法を用いてインタクトな細胞膜を維持するか、またはそれを曝露させた。培養液を、２％の四酸化オスミウム中で１０分間、または４％のグルタルアルデヒド中で１〜２時間固定した。それらを、ポリリシンコーティングカバースリップ上または５μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター上に置き、蒸留水でリンスし、一連のエタノール濃度を増しながら（３０、５０、７０、９０、１００％）脱水し、次いで臨界点で乾燥（Ｂａｌｔｅｃ）した。完全に乾燥したら、それらを、スタッブおよび金でコーティングしたスパッターに載せた。それらをシドニー大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｙｄｎｅｙ）（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ）で５−１５ｋＶのＺｅｉｓｓ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ  Ｆｉｅｌｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＦＥＳＥＭ）を用いて観察した。
【０２６１】
ＤＮＡ抽出およびＰＣＲ
さらに一晩、−２０℃でのＤＮＡ沈殿によりＣＴＡＢ法を用いて細胞ペレットからＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの性質と量は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）のプロトコルに従い、４４０ｂｐの断片を増幅させるプライマー対４ｆおよび６ｒを用いて、対照渦鞭毛藻遺伝子（ｃｙｔｂ）を増幅させることによって測定した。
【０２６２】
ｒＲＮＡ遺伝子ＬＳＵとＳＳＵならびに完全５．８ｓ／ＩＴＳ遺伝子の部分配列を、以前に公表されたプライマー：ＳＳ３、ＳＳ５（Ｍｅｄｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、Ｄ１Ｒ、Ｄ３ｂ（Ｓｃｈｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）およびＡｌｅｘ５．８ｓ（Ｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を用いて増幅した。ＰＣＲｓに関する一般的なサクリング条件は、９４℃で２分間の初発の変性ステップからなり、次いで９４℃で２０秒間、５６℃で３０秒間、および７２℃で１分間、次いで７分の最終伸長ステップの３５サイクルからなった。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動法により分離し、臭化エチジウムにより染色し、ＵＶ透視法により可視化した。配列決定される断片は、ゲルから切除し、ＤＮＡは、Ｂｉｏｌｉｎｅゲル精製キット（Ｂｉｏｌｉｎｅ，米国）を用いて精製し、２×１０μｌの溶出緩衝液中で溶出し、Ｎａｎｏｄｒｏｐの使用により濃度をチェックした。次に、凡そ４０ｎｇのＰＣＲ産物を、産物の初発増幅に用いられた同じプライマーで直接的な配列決定に使用した。
【０２６３】
毒素判定
渦鞭毛藻の細胞ペレットは、貝中の麻痺性貝毒素に関して、ニュージーランドのＣａｗｔｈｒｏｎ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅでＡＯＡＣ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ２００５．０６に従ってＨＰＬＣを用いて試験した。元のプロトコルに記載されたマトリックスモディファイヤーは使用されなかった；代わりに平均スパイク回収物を、各々分離化合物に用いた。ＨＰＬＣ分析は、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＦＬＲ検出器に連結されたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）上で実施された。分離は、３０℃でＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｃ１８  ＢＥＨ  １．７μｍ  ２．１×５０ｍｍカラムで達成され、１分当たり０．２ｍＬで溶出させた。移動相は、０．１Ｍのギ酸アンモニウム（Ａ）および５％のアセトニトリル中０．１Ｍのギ酸アンモニウム（Ｂ）であり、双方ともｐＨ６に調整した。勾配は、０．５分間１００％のＡ、３．５分間かけて８０％のＢへの直線的勾配からなり，次いで０．１分かけて開始条件への戻り、１．９分間保持した。蛍光検出器は、３４０ｎｍへの励起設定と３９５ｎｍへの発光設定とを有した。ＳＴＸ類縁体用の分析標品は、カナダ国立研究評議会から入手した。細胞培養液のＨＰＬＣの検出限界は、ＮＥＯとＳＴＸに関して１細胞当たり０．１ｐｇ、ＧＴＸ１／４、ＧＴＸ６（Ｂ２）およびＧＴＸ５（Ｂ１）に関して１細胞当たり０．２ｐｇ、Ｃ１、２に関して１細胞当たり０．５ｐｇ、および類縁体Ｃ３、４に関して１細胞当たり＜０．３ｐｇであると考慮された。
【０２６４】
系統学的分析
本試験において新たに産生したＶ群のアレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）配列；（１）１８Ｓ（小さなサブユニット）ｒＤＮＡ、（２）Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＩＴＳ）１および２プラス５．８Ｓ  ｒＤＮＡ、および（３）２８Ｓ（大きなサブユニット）ｒＤＮＡは、株ＡＴＮＷＢ０１（ジェンバンク登録番号ＪＱ９９１０１５、Ｑ９９１０１６、Ｑ９９１０１７）に関するｒＤＮＡオペロンの２，８２１キャラクタ領域を構築するために連結された。さらに、新しいＬＳＵ  ｒＤＮＡは、株ＡＴＣＪ３３（８７４ｂｐ）およびＡＴＥＢ０１（６７８ｂｐの長さ、ジェンバンク登録番号ＪＱ９９１０１８およびＪＱ９９１０１９）から産生した。これは、ＮＣＢＩｎｒヌクレオチドデータベースデータｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／（２０１０年１０月現在）におけるＶ群配列、およびＡ．アフィネ（Ａ．ａｆｆｉｎｅ）外群からの全ての相同分子種と一緒に位置合わせをした。二次ＲＮＡ構造を考慮するＭＡＦＦＴｖ６  Ｑ−ＩＮＳ−Ｉモデル（Ｈｏｆａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｔｏｈ，２００８；Ｋｉｒｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を用いて、データセット（使用されるデフォルトパラメータ）およびＭａｃＣｌａｄｅ  ｖ４．０７（Ｍａｄｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｄｉｓｏｎ，１９９２）を手動で用いてチェックされた生成アラインメントの位置合わせをした。次いで最低の厳密性パラメータ下、アラインメントをＧｂｌｏｃｋｓ  ｖ０．９１ｂ（Ｃａｓｔｒｅｓａｎａ，２０００）と推論して、不十分に位置合わせをした位置および系統学的推定からの分岐領域を除外した。ＭＯＤＥＬＴＥＳＴ（Ｐｏｓａｄａ  ａｎｄ  Ｃｒａｎｄａｌｌ，１９９８）は、ヌクレオチド進展の最適モデルを確立した；全てのアラインメントに関してＧＴＲは、赤池情報量基準およびベイズ情報量基準（ＡｉＣおよびＢｉＣ）の双方にとって好ましかった。最尤（ＭＬ）分析は、２５のレートカテゴリを有するＲＡｘＭＬ−ＶＩ−ＨＰＣ  ｖ７．２．６，ＧＴＲＣＡＴモデルにより実施した（Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ，２００６）。最尤トポロジーは、１００の別個のサーチから確立され、ブートストラップ分析は、１００の擬似複製により実施された。ベイズの推論（Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅｓ）は、混合カテゴリの自由な数および４つのカテゴリ下での別個のアクロスサイトの変化を有するＰｈｙｌｏｂａｙｅｓ  ｖ３．２ｅ（Ｌａｒｔｉｌｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｌａｒｔｉｌｌｏｔ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ，２００４）を用いてＧＴＲＣＡＴ置換モデル下で実施された。二分裂（鎖）間の最高最大の相違が、＜０．１である場合、分岐樹は推定された。全てのモデル推定および系統学的分析は、オスロ大学において自由に利用できるＢｉｏｐｏｒｔａｌ（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）上で実施された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｕｉｏ．ｎｏ／）。
【０２６５】
植物性プランクトンおよび貝類のサンプル採取、集計および識別
２０１０年１０月および１１月、２０１０年１０月２５日および２０１０年１１月９日において連続２週に亘り、ヘイスティングズ・リバー（Ｈａｓｔｉｎｇｓ  Ｒｉｖｅｒ）、ニューサウスウェールズ、オーストラリア（−３１．４２Ｅ，１５２．８７Ｓ）で、ＮＳＷ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｐｒｏｇｒａｍの一部として、植物プランクトンを集めた。第２週において、シドニーイワガキ（Ｓａｃｃｏｓｔｒｅａ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ）を養殖場から集め、製造元の取扱い説明書に従ってＪｅｌｌｅｔｔ  ＰＳＰ試験（Ｊｅｌｌｅｔｔ  Ｒａｐｉｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｌｔｄ，Ｃａｎａｄａ）を用いて試験した。
【０２６６】
ボトルサンプルの集計のため、５００ｍｌのＬｕｇｏｌの保存サンプル中の植物プランクトン細胞を、５μｍのセルロースエステルフィルター（Ａｄｖａｎｔｅｃ）上で重力アシスト膜ろ過により濃縮してから、４ｍｌに洗浄し、カウントした。アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種を同定し、Ｓｅｄｇｅｗｉｃｋ  Ｒａｆｔｅｒセルおよび位相差光学を具備したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｌａｂ顕微鏡を用いてカウントした。種は、２００３年以来、ＮＳＷ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｐｒｏｇｒａｍの一部として有害な植物プランクトンを同定したＳ．Ｂｒｅｔｔ博士により同定された。アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種は、通常、ＮＳＷの水域に生じ、最もよく同定された種は、Ａ．カテネラ（Ａ．ｃａｔｅｎｅｌｌａ）およびＡ．ジュードゴニオラックス（Ａ．ｐｓｅｕｄｏｇｏｎｙａｕｌａｘ）である。カウントされた細胞数は、アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）の存在量に依ってサンプル間で変わり、標準誤差率は、式：誤差＝２／√ｎを用いて算出され、式中ｎは、サンプル中に観察された細胞数である。
【０２６７】
結果
光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡
ＡＴＮＷＢ０１の細胞は、円形であり、長さが２５〜４５μｍ（μ＝３４．２、ｎ＝２０）、幅が７〜４０μｍ（μ＝３３．６、ｎ＝２０）であった（図１２Ａ〜Ｂ）。細胞は、殆ど常に単一であった。２個の細胞の鎖は、稀に観察された。第１の頂端プレートは、頂端ポア複合体まで伸長し、小さなポア、腹面ポアを含んだ（図１２Ｃ）。頂端ポアプレート（Ｐｏ）は、小さな縁ポアにより囲まれた特徴的なコンマ形状を有した（図１２Ｅ）。時には、後部溝プレートにポアを有する細胞が観察された（図１２Ｆ）。たいての細胞は、後部溝プレートを欠いた。
【０２６８】
培養液の細胞ＡＴＣＪ３３（図１３  Ａ〜Ｄ）、ＡＴＥＢ０１（図１３Ｅ、Ｆ、Ｈ）およびＡＴＢＢ０１（図１３Ｇ）は、円形細胞を有した。細胞は、大部分は単一であり、時には２個の細胞鎖があった（図１３Ａ）。ＡＴＣＪ３３の細胞は、２３〜−３８μｍ長（μ＝３０．６、ｎ＝２０）、２３〜３８μｍ幅（μ＝２９．５、ｎ＝２０）があり、ＡＴＥＢ０１の細胞は、２５〜４０μｍ長（μ＝３３．５、ｎ＝２０）、２３〜３５μｍ幅（μ＝３１．６、ｎ＝２０）があった。第１の頂端プレートは、頂端ポアまで伸長し、腹面ポアを含んだ（図１３Ｂ、Ｄ、Ｈ）頂端ポアプレートは、特徴的なコンマ形状を示した（図１３Ｃ、Ｇ、Ｈ）。
【０２６９】
系統学的分析
新たなｒＤＮＡ配列（図１４、図１６）、ＳＳＵ  ｒＤＮＡ、ＩＴＳ／５．８ｓおよび毒素産生株ＡＴＮＷＢ０１の部分的ＬＳＵ  ｒＤＮＡ配列および２種の非毒性株ＡＴＣＪ３３およびＡＴＥＢ０１のＬＳＵ配列を含む系統学的分析により、これら全てが、Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）Ｖ群の他の株と一緒になって十分に支持された分岐群（ＰＰ／ＢＳ支持体に関して１．００／１００）を形成することを示す。最も可変性のあるＩＴＳ領域など、完全長ｒＤＮＡに基づくこの分岐群に相違は観測されなかった。
【０２７０】
株におけるｓｘｔＡ遺伝子のｓｘｔＡ１ドメインとｓｘｔＡ４ドメインとの比較
Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）５群の株におけるｓｘｔＡの２つのドメインに関する配列のヌクレオチド含量が、比較され、以前に配列決定された（Ｓｔｕｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ドメインｓｘｔＡ４の４４０ｂｐ配列は、株ＡＴＮＷＢ０１が、２つのヌクレオチド（９９．５％の配列同一性）のみにおいて、分析された５群Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）の２種の他の株、ＡＴＥＢ０１およびＡＴＣＪ３３とは異なっていることが示された。対照的に、これら３種の株は、アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）の他の種およびギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）に由来のこれらの遺伝子と８９〜９８％の配列同一性を示した。ドメインｓｘｔＡ１の４５０ｂｐ領域の比較で、株ＡＴＮＷＢ０１は、ｓｘｔＡ１ドメインの他のアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）配列およびギムノジニウム・カテナツム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ）配列に関して７０〜９３％の配列同一性と比較すると、２〜２．５％（９７．５〜９８％の配列同一性）５群の他の２種の株とは異なった。
【０２７１】
毒素
Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）の３つの株の中で、Ｖ群、凡そ１．５−２．２×１０６個の細胞を、ＨＰＬＣを用いて毒性に関する試験を行った。２つの株、ＡＴＣＪ３３とＡＴＥＢ０１は、検出可能な毒素が無いので陰性プロファイルを有した。１つの株、ＡＴＮＷＢ０１は、幾つかのＳＴＸ、Ｃ１、２およびｄｅＳＴＸと共に大部分はＧＴＸ５からなるプロファイル（図１５、表７）、および１細胞当たり１５．３ｆｍｏｌの細胞割り当で陽性結果を示した。
【０２７２】
環境サンプル
２０１０年１０月２５日にヘイスティングズ・リバーから集めたルーチンモニタリングサンプル中のアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）細胞は、１Ｌ当たり３５０個の細胞レベルで検出された（表６）。引き続き、２０１０年１１月９日に集めた同じ地点からのカキサンプルに対するＪｅｌｌｅｔ試験は、ＰＳＰ毒素に関して陽性であった。このサンプル中のアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）細胞は、単一細胞であり、一般に円形形状を有した。細胞は、長さが３５μｍ、および幅が３２〜３５μｍであった。アレキサンドリウム・セカ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔｈｅｃａ）の試験により、１インチプレート中で腹面ポアを示し、１インチプレート中のＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）のサイズおよび形状を示し、ＡＰＣ中の結合ポアが存在しないことを示した。
【０２７３】
オーストラリアの水域で観測されたアレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種の細胞のサイズと形状について、１インチプレートの形状、１インチプレート上の腹面ポアの存在、およびＡＰＣの形状は、アレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）と殆ど一致しているように思われる。しかしながら、このブルーム事象からの培養は確立されず、したがって分子配列や毒素プロファイルも確認することができなかった。
【０２７４】
【表８】
0006001648.tif 000009
【０２７５】
【表９】
0006001648.tif 000010
【０２７６】
【表１０】
0006001648.tif 000011
【０２７７】
【表１１】
0006001648.tif 000012
【０２７８】
【表１２】
0006001648.tif 000013
【０２７９】
考察
一般に、アレキサンドリウム属（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）の毒性種の間で、極度の栄養欠乏の状況（Ｂｏｃｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）とは別に、毒素プロファイルは、主として経時的に一定のままであるように思われる（Ｃｅｍｂｅｌｌａ  ａｎｄ  Ｄｅｓｔｏｍｂｅ，１９９６）。対照的に、産生された毒素量（細胞割当）は、経時的に変化することが分かっている。毒素プロファイルは、株内で安定であるように思われるが、特定の毒素プロファイルとこの種の複合体の特定の遺伝子群（Ｉ〜Ｖ）に対する株の同定との間の関係は不明瞭である。毒素プロファイルにおけるかなりのばらつきが、調べられた各群の株間で見出されいる（表７）。
【０２８０】
本試験は、アレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）、Ｖ群の株の毒素プロファイルの最初の報告である。本試験は、可変ＩＴＳ１／５．８ｓ／ＩＴＳ２領域など、腹面ポアの存在およびｒＤＮＡ遺伝子の長い配列などの形態学的特徴に基づいて、株ＡＴＮＷＢ０１は、Ｖ群のメンバーであることを示している。以前に、この群の株は、毒性に関してＨＰＬＣにより試験されており、非毒性であることが分かっている（Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｓａｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｂｏｌｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅ  Ｓａｌａｓ，２００７）。Ｎｅｇｒｉら（２００３）は、サキシフィリンアッセイにより試験された場合、Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）、ＴＢＢ０１の株は、ＳＴＸ活性を示したが、ＨＰＬＣ法で試験した場合、毒素を検出できなかったことを報告した。同じ試験において、オーストラリアの水域からのＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）（株ＡＴＴＲＡ０３）と同定された培養液は、ＳＴＸを産生することが分かった（Ｎｅｇｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。その後株ＡＴＴＲＡ０３は、その識別を検証することなく死亡したので、したがって、この種または群の株が表したことが不明瞭である。それが、輸出用に用いられた積出し港からの嚢胞として単離されたので、導入された嚢胞に由来した可能性がある（Ｂｏｌｃｈ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｓａｌａｓ，２００７）。
【０２８１】
日本の三河湾から単離されたＡｔ３０４など、日本からの３種の株は、系統学的分析においてＶ群の分岐群のメンバーであることが判明した（図１４）。それは、以前に南オーストラリアに限ると考えられていたので、このことは、北西太平洋領域に存在するＶ群の株の最初の報告である（Ｂｏｌｃｈ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｓａｌａｓ  ２００７）。日本からの株の毒性は測定されておらず、調べる必要がある。
【０２８２】
株ＡＴＮＷＢ０１は、標準的なＨＰＬＣ法を用いて検出可能な範囲内で十分なＳＴＸ細胞割当を有した（１細胞当たり１５．３ｆｍｏｌ、表７）。これは、この種の複合体の多くの通常のＳＴＸ産生株に報告された毒素割当と類似している（表７、１細胞当たり３．５〜３２８ｆｍｏｌ、１細胞当たり０．６６〜９．８ｐｇのＳＴＸ等価体）。ＧＴＸ５は、一般に、アレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）種複合体の株の毒素プロファイルの主要部分であることが報告されていなかったので、この株の毒素プロファイルは、比較的異常である（表７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。一般に、アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）株（ＩＶ群）である、ニューサウスウェールズにおける最も一般的な供給源の貝中のＰＳＴを、主要成分としてＣ１／２およびＧＴＸ１／４の高比率で含有している（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｎｅｇｒｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００３；Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。ＧＴＸ５は、チリからのアレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）Ｉ群株、および（３３．７％，Ａｇｕｉｌｅｒａ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、フランスからのアレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）（ＩＶ群）の２種の株（４４〜４６％，Ｌｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）の主要成分であることが分かっている。
【０２８３】
ヘイスティングズ・リバーのサンプルから同定されたＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）株から作製された培養物はなく、分子配列は決定されなかった。したがって、それをＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）のＶ群として明確に同定することは不可能である。ここ７年間、ニューサウスウェールズにおける河口域の６９地点で隔週の植物プランクトンモニタリングが行われた。２０１０年と２０１１年の８回のサンプル採集で、アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）が同定された。これらのうちの７回で、Ｊｅｌｌｅｔ  ＰＳＰ試験（ＮＳＷ  Ｆｏｏｄ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ、未公表データ）を用いて、ＰＳＰ毒素が近隣のカキ収穫域からのカキサンプル中に引き続き見い出された。アレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）は、２０１０年と２０１１年、４つのサンプルから同定された。ヘイスティングズ・リバーからのサンプルは、オーストラリアのカキにおいて、それがＰＳＰ毒性に関連しているという最初の報告であった。アレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）Ｖ群により産生された類縁体、特に高比率のＧＴＸ５は、ＳＴＸなどの最も毒性の高い類縁体に比べて、低当量の毒性を有し、ＳＴＸの約１０％の毒性であると予想される（Ｏｓｈｉｍａ、１９９５）。この種のブルームに関連していると推定されているこの領域の貝毒発生の最初の報告である理由がこの低ＳＴＸ当量毒性により説明できる。局所の集団が実際に毒素を産生し得るかどうかを検証するために、ＮＳＷ沿岸水域におけるアレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）群集団のさらなるサンプル採集が必要である。
【０２８４】
Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）の３つの株は全て遺伝子ｓｘｔＡを有することが見い出されている（Ｓｔｕｅｋｅｎら、２０１１）。ｓｘｔＡ遺伝子は、全てのＶ群株において、互いに密に近縁であることが分かっている（ｓｘｔＡ１ドメインおよびｓｘｔＡ４ドメインに関してアライメントさせた配列において、０．５〜２．５％の差異）。したがって、これらの株におけるこれらの遺伝子の存在または非存在は、毒素産生には関連していないと思われる。
【０２８５】
アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）種、アレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）種およびアレキサンドリウム・ミヌツム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ）種における増殖および毒素産生の差異は、塩分濃度、光および栄養物、ならびに培養物の増殖段階など、培養の環境条件に関連しているとの報告が以前なされている（Ｈａｍａｓａｋｉら、２００１；Ｈｕら、２００６；Ｌｉｐｐｅｍｅｉｅｒら、２００３；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９０；Ｇｒｚｅｂｙｋら、２００３）。本試験において、３つのＡ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）株各々を、同一の光条件下、同一の培地および海水中で培養し、接種し、次いで同一日に収穫した。したがって、他の２つのアレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）Ｖ群の株に見られた毒性の欠如が、ＳＴＸ産生の差異のある発現を促進する環境条件における差異の結果であるとは考えにくい。
【０２８６】
アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）のいくつかの培養株は、時とともに毒性を失うことがある。例えば、アレキサンドリウム・ミヌツム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ）がそうである（Ｍａｒｔｉｎｓら、がＡ．ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｍ、２００４に報告しているように）。これは最初、抗生物質性の曝露に関連していると考えられた。共培養されたバクテリアおよび共生バクテリアが、アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）種において、毒素産生の媒介にある役割を果たすことが示されていたからである（Ｈｏら、２００６）。本試験において、調べたＶ群の培養物は、おそらく、単離地点での海水のバクテリア群集に一致する混合バクテリア群集を含有していると考えられるが、抗生物質に曝露されたものはなかった。
【０２８７】
組み合わせ実験により、アレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ）（ＩＶ群）の毒性クローン株のサブクローンは、非毒性である可能性が見つかった（Ｃｈｏら、２００８）。Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）の１つの株の非毒性の特徴、毒性株の無菌性非毒性サブクローンが、細胞レベル当たりアトモルで確認された。この同じ株の９つの毒性サブクローンのうち３つが、比較的短い期間（４〜６年）で非毒性になった一方、他の毒性サブクローンはそれらの毒性を保持し、非毒性サブクローンは、非毒性のままであった（Ｃｈｏら、２００８）。
【０２８８】
マイクロサテライトマーカーを用い、アレキサンドリウム・カテネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ）ＩＶ群（Ｍａｓｓｅｒｅｔら、２００９）、アレキサンドリウム・タマレンセ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅＩ）群（Ｎａｇａｉら、２００７）（Ａｌｐｅｒｍａｎｎら、２００９）、Ａ．フンジエンセ（Ａ．ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ）Ｉ群（Ｅｒｄｎｅｒら、２０１１）およびＡ  ミヌツム（Ａ  ｍｉｎｕｔｕｍ）（ＭｃＣａｕｌｅｙら、２００９）の種間で、高レベルの集団遺伝子差異が見られた。このことは、種内組み合わせ実験後に毒素産生の差異を有した株の結果（Ｃｈｏら、２００８）と合わせて、Ａ．タマレンセ（Ａ．ｔａｍａｒｅｎｓｅ）（Ｖ群）内には、毒素産生において、集団レベルの有意な差異もまた存在し得ることを示唆している。毒素産生がこの種の１つの特定の集団に限定されるかどうかを判定するために、この株の複数のクローン培養物に対してマイクロサテライトマーカーを用いたさらなる試験が助けになると思われ、これによって、この集団の同定に関する予測的な遺伝子的手段をデザインすることが可能になると考えられる。
【０２８９】
引用文献
Ａｇｕｉｌｅｒａ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，  Ａ．，  Ｉｎｏｓｔｒｏｚａ，  Ｉ．，  Ｆｒａｎｃｏ，  Ｊ．Ｍ．，  ＲｉｏｂＡ，  Ｐ．，  Ｇｏｍｅｚ，  Ｐ．Ｉ．，  ２０１１．  Ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ，  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ  （Ｗｈｅｄｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｆｏｉｄ）  Ｂａｌｅｃｈ  １９８５  （Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ２００９  ｓｕｍｍｅｒ  ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｉｎ  ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃｈｉｌｅ．  Ｈａｒｍｆｕｌ  Ａｌｇａｅ．  Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ．
Ａｌｐｅｒｍａｎｎ，  Ｔ．Ｊ．，  Ｂｅｓｚｔｅｒｉ，  Ｂ．，  Ｊｏｈｎ，  Ｕ．，  Ｔｉｌｌｍａｎｎ，  Ｕ．，  Ｃｅｍｂｅｌｌａ，  Ａ．Ｄ．，  ２００９．  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌｉｆｅ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  ｍａｒｉｎｅ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ．  Ｍｏｌ．  Ｅｃｏｌ．  １８（１０），  ２１２２−２１３３．
Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．，  Ｋｕｌｉｓ，  Ｄ．，  Ｄｏｕｃｅｔｔｅ，  Ｇ．，  Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，  Ｊ．，  Ｂａｌｅｃｈ，  Ｅ．，  １９９４．  Ｂｉｏｇｅｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｔｏｘｉｃ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎａｄａ．  Ｍａｒ．  Ｂｉｏｌ．  １２０（３），  ４６７−４７８．
Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．，  Ｋｕｌｉｓ，  Ｄ．，  Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  Ｊ．，  Ｈａｌｌ，  Ｓ．，  １９９０．  Ｔｏｘｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｎｅ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ．  Ｔｏｘｉｃｏｎ  ２８（８），  ８８５−８９３．
Ｂａｌｅｃｈ，  Ｅ．  １９９５．  Ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  Ｈａｌｉｍ  （Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）．  Ｓｈｅｎｋｉｎ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ．
Ｂｏｃｚａｒ，  Ｂ．Ａ．，  Ｂｅｉｔｌｅｒ，  Ｍ．Ｋ．，  Ｌｉｓｔｏｎ，  Ｊ．，  Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｃａｔｔｏｌｉｃｏ，  Ｒ．Ａ．，  １９８８．  Ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｇｏｎｙａｕｌａｘ  ｔａｍａｒｅｎｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｇｏｎｙａｕｌａｘ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ  ｉｎ  ａｘｅｎｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ８８（４），  １２８５．
Ｂｏｌｃｈ，  Ｃ．Ｊ．Ｓ．，  ｄｅ  Ｓａｌａｓ，  Ｍ．Ｆ．，  ２００７．  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｂａｌｌａｓｔ  ｗａｔｅｒ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ  Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ．  Ｈａｒｍｆｕｌ  Ａｌｇａｅ  ６（４），  ４６５−４８５．
Ｃａｓｔｒｅｓａｎａ，  Ｊ．，  ２０００．  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｂｌｏｃｋｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １７（４），  ５４０−５５２．
Ｃｅｍｂｅｌｌａ，  Ａ．，  Ｄｅｓｔｏｍｂｅ，  Ｃ．，  １９９６．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃａｎａｄａ．  Ｉｎ：  Ｈａｒｍｆｕｌ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃ  Ａｌｇａｌ  Ｂｌｏｏｍｓ．  Ｉｎｔｅｒｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔａｌ  Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ，  ＵＮＥＳＣＯ，  Ｐａｒｉｓ，  ４４７−４５０．
Ｃｅｍｂｅｌｌａ，  Ａ．，  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｆ．，  Ｔｈｅｒｒｉａｕｌｔ，  Ｊ．Ｃ．，  １９８８．  Ｃｌａｄｉｓｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｐｒｏｔｏｇｏｎｙａｕｌａｘ．  Ｂｏｔ．  Ｍａｒ．  ３１（１），  ３９−５２．
Ｃｈｏ，  Ｙ．，  Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，  Ｋ．，  Ｏｇａｗａ，  Ｍ．，  Ｏｍｕｒａ，  Ｔ．，  Ｉｓｈｉｍａｒｕ，  Ｔ．，  Ｏｓｈｉｍａ，  Ｙ．，  ２００８．  Ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃ  ｓｕｂｃｌｏｎｅｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｔｏｘｉｃ  ｃｌｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ  （Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）：  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅ．  Ｈａｒｍｆｕｌ  Ａｌｇａｅ  ７（６），  ７４０−７５１．
ｄｅ  Ｓａｌａｓ，  Ｍ．Ｆ．，  Ｅｍｍｅｒｉｋ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ，  Ｇ．，  Ｎｅｇｒｉ，  Ａ．，  Ｖａｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ，  Ｒ．，  Ｂｏｌｃｈ，  Ｃ．，  ２００１．  Ｔｏｘｉｃ  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ：  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｏｒ  ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ？  Ｉｎ：  Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ，  Ｇ．Ｍ．，  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，  Ｓ．Ｉ．，  Ｂｏｌｃｈ，Ｃ．Ｊ．，  Ｌｅｗｉｓ，  Ｒ．Ｊ．  （Ｅｄｓ．），  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｉｎｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｆｕｌ  Ａｌｇａｌ  Ｂｌｏｏｍｓ．  Ｉｎｔｅｒｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔａｌ  Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＵＮＥＳＣＯ，  Ｈｏｂａｒｔ，  Ｔａｓｍａｎｉａ，Ｈａｒｍｆｕｌ  Ａｌｇａｌ  Ｂｌｏｏｍｓ  ２０００．，  ｐｐ  ４７７−４８０．
Ｅｒｄｎｅｒ，  Ｄ．Ｌ．，  Ｒｉｃｈｌｅｎ，  Ｍ．，  ＭｃＣａｕｌｅｙ，  Ｌ．Ａ  ．Ｒ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．Ｍ．，  ２０１１．  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｂｌｏｏｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｆｕｎｄｙｅｎｓｅ．  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ６（７），  ｅ２２９６５．
Ｆｕｋｕｙｏ，  Ｙ．，  １９８５．  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｏｇｏｎｙａｕｌａｘ  ｔａｍａｒｅｎｓｉｓ  （Ｌｅｂｏｕｒ）  Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｇｏｎｙａｕｌａｘ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ  （Ｗｈｅｄｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｆｏｉｄ）  Ｔａｙｌｏｒ  ｆｒｏｍ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｃｏａｓｔａｌ  ｗａｔｅｒｓ．  Ｂｕｌｌ．  Ｍａｒ．  Ｓｃｉ．  ３７（２），  ５２９−５３７．
Ｇａｙｏｓｏ，  Ａ．Ｍ．，  Ｆｕｌｃｏ，  Ｖ．Ｋ．，  ２００６．  Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ  （Ｌｅｂｏｕｒ）  Ｂａｌｅｃｈ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｇｏｌｆｏ  Ｎｕｅｖｏ  （Ｐａｔａｇｏｎｉａ，  Ａｒｇｅｎｔｉｎａ），  ｗｉｔｈ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｖｅｎｔｒａｌ  ｐｏｒｅ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｈａｒｍｆｕｌ  Ａｌｇａｅ  ５（３），  ２３３−２４１．
Ｇｅｎｏｖｅｓｉ，  Ｂ．，  Ｓｈｉｎ−Ｇｒｚｅｂｙｋ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｇｒｚｅｂｙｋ，  Ｄ．，  Ｌａａｂｉｒ，  Ｍ．，  Ｇａｇｎａｉｒｅ，  Ｐ．Ａ．，  Ｖａｑｕｅｒ，  Ａ．，  Ｐａｓｔｏｕｒｅａｕｄ，  Ａ．，  Ｌａｓｓｅｒｒｅ，  Ｂ．，  Ｃｏｌｌｏｓ，  Ｙ．，  Ｂｅｒｒｅｂｉ，  Ｐ．，  ２０１１．  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｒｙｐｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｗｉｔｈｉｎ  ｂｌｏｏｍｓ  ａｎｄ  ｃｙｓｔ  ｂａｎｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  （Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）  ｉｎ  ａ  Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ  ｌａｇｏｏｎ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅｍｉ−ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ．  Ｊ．  Ｐｌａｎｋｔ．  Ｒｅｓ．  ３３（３），  ４０５．
Ｇｒｚｅｂｙｋ，  Ｄ．，  Ｂｅｃｈｅｍｉｎ，  Ｃ．，  Ｗａｒｄ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｖｅｒｉｔｅ，  Ｃ．，  Ｃｏｄｄ，  Ｇ．Ａ．，  Ｍａｅｓｔｒｉｎｉ，  Ｓ．Ｙ．，  ２００３．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓａｌｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｗｏ  ｃｏａｓｔａｌ  ｗａｔｅｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ．  Ｊ．  Ｐｌａｎｋｔ．  Ｒｅｓ．  ２５（１０），  １１８５．
Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ，  Ｇ．，  Ｂｏｌｃｈ，  Ｃ．，  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，  Ｓ．，  Ｏｓｈｉｍａ，  Ｙ．，  １９９１．  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  ｇｅｎｕｓ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｉｎ  ｓｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｗａｔｅｒｓ．  Ｂｏｔ．  Ｍａｒ．  ３４（６），  ５７５−５８８．
Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ，  Ｇ．，  Ｓｔｅｆｆｅｎｓｅｎ，  Ｄ．，  Ｗｅｔｈｅｒｂｅｅ，  Ｒ．，  １９８８．  Ｔｈｒｅｅ  ｅｓｔｕａｒｉｎｅ  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｔｏｘｉｎｓ．  Ｊ．  Ｐｌａｎｋｔ．  Ｒｅｓ．  １０（３），  ５３３．
Ｈａｍａｓａｋｉ，  Ｋ．，  Ｈｏｒｉｅ，  Ｍ．，  Ｔｏｋｉｍｉｔｓｕ，  Ｓ．，  Ｔｏｄａ，  Ｔ．，  Ｔａｇｕｃｈｉ，  Ｓ．，  ２００１．  Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ  Ｂａｙ，  ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｊａｐａｎ，  ａｓ  ａ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｊ．  Ｐｌａｎｋｔ．  Ｒｅｓ．  ２３（３），  ２７１．
Ｈｉｇｍａｎ，  Ｗ．Ａ．，  Ｓｔｏｎｅ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｌｅｗｉｓ，  Ｊ．Ｍ．，  ２００１．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｏｆ  ｔｏｘｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ  （Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ＵＫ  ｗａｔｅｒｓ．  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ  ４０  （３），  ２５６−２６２．
Ｈｏ，  Ａ．Ｙ．Ｔ．，  Ｈｓｉｅｈ，  Ｄ．Ｐ．Ｈ．，  Ｑｉａｎ，  Ｐ．Ｙ．，  ２００６．  Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ  ａｆｔｅｒ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．  Ａｑｕａｔ．  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｅｃｏｌ．  ４２（１），  ４１−５３．
Ｈｏｆａｃｋｅｒ，  Ｉ．Ｌ．，  Ｆｅｋｅｔｅ，  Ｍ．，  Ｓｔａｄｌｅｒ，  Ｐ．Ｆ．，  ２００２．  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｌｉｇｎｅｄ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３１９（５），  １０５９−１０６６．
Ｈｕ，  Ｈ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｗ．，  Ｓｈｉ，  Ｙ．，  Ｃｏｎｇ，  Ｗ．，  ２００６．  Ｎｉｔｒａｔｅ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｏｘｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍａｒｉｎｅ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ．  Ｍａｒ．  Ｐｏｌｌ．  Ｂｕｌｌ．  ５２（７），  ７５６−  ７６０．
Ｊｏｈｎ，  Ｕ．，  Ｆｅｎｓｏｍｅ，  Ｒ．Ａ．，  Ｍｅｄｌｉｎ，  Ｌ．Ｋ．，  ２００３．  Ｔｈｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｃｋ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｏｓｓｉｌ  ｒｅｃｏｒｄ  ｔｏ  ｅｘｐｌａｉｎ  ｂｉｏｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  （Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ２０（７），  １０１５−１０２７．
Ｋａｔｏｈ，  Ｋ．，  Ｔｏｈ，  Ｈ．，  ２００８．  Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＡＦＦＴ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ．  Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  Ｂｉｏｉｎｆ．  ９（４），  ２８６−２９８．
Ｋｉｍ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｓａｋｏ，  Ｙ．，  ２００５．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｘｉｃ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍｉｙａｖａｎｉｃｈｉｉ  （Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ．  Ｈａｒｍｆｕｌ  Ａｌｇａｅ  ４（６），  ９８４−９９１．
Ｋｉｒｙｕ，  Ｈ．，  Ｔａｂｅｉ，  Ｙ．，  Ｋｉｎ，  Ｔ．，  Ａｓａｉ，  Ｋ．，  ２００７．  Ｍｕｒｌｅｔ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３（１３），  １５８８−１５９８．
Ｋｕｍａｒ，  Ｓ．，  ＳｋｊＡ  ｖｅｌａｎｄ，  Ａ．，  Ｏｒｒ，  Ｒ．，  Ｅｎｇｅｒ，  Ｐ．，  Ｒｕｄｅｎ，  Ｔ．，  Ｍｅｖｉｋ，  Ｂ．Ｈ．，  Ｂｕｒｋｉ，  Ｆ．，  Ｂｏｔｎｅｎ，  Ａ．，  Ｓｈａｌｃｈｉａｎ−Ｔａｂｒｉｚｉ，  Ｋ．，  ２００９．  ＡＩＲ：  Ａ  ｂａｔｃｈ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｗｅｂ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｍａｔｒｉｃｅｓ  ｒｅａｄｙ  ｆｏｒ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １０（１），  ３５７．
Ｌａｒｔｉｌｌｏｔ，  Ｎ．，  Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，  Ｈ．，  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ，  Ｈ．，  ２００７．  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｂｒａｎｃｈ  ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｒｔｅｆａｃｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｉｍａｌ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｔｅ−ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｍｏｄｅｌ．  ＢＭＣ  Ｅｖｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７（Ｓｕｐｐｌ  １），  Ｓ４．
Ｌａｒｔｉｌｌｏｔ，  Ｎ．，  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ，  Ｈ．，  ２００４．  Ａ  Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ａｃｒｏｓｓ−ｓｉｔｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ２１（６），  １０９５−１１０９．
Ｌｅａｗ，  Ｃ．Ｐ．，  Ｌｉｍ，  Ｐ．Ｔ．，  Ｎｇ，  Ｂ．Ｋ．，  Ｃｈｅａｈ，  Ｍ．Ｙ．，  Ａｈｍａｄ，  Ａ．，  Ｕｓｕｐ，  Ｇ．，  ２００５．  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｙｒｏｄｉｎｉｕｍ  ｂａｈａｍｅｎｓｅ  （Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅｃａ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．  Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．  ４４（５）．
Ｌｉｌｌｙ，  Ｅ．，  Ｋｕｌｉｓ，  Ｄ．，  Ｇｅｎｔｉｅｎ，  Ｐ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．，  ２００２．  Ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  ｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｆｒａｎｃｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ａ  ｈｕｍａｎ−ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐａｃｉｆｉｃ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ＤＮＡａｎｄ  ｔｏｘｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｊ．  Ｐｌａｎｋｔ．  Ｒｅｓ．  ２４（５），  ４４３．
Ｌｉｌｌｙ，  Ｅ．Ｌ．，  Ｈａｌａｎｙｃｈ，  Ｋ．Ｍ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．Ｍ．，  ２００７．  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｇｌｏｂａｌ  ｂｉｏｇｅｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  （Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）  １．  Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．  ４３（６），  １３２９−１３３８．
Ｌｉｎ，  Ｓ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｈ．，  Ｈｏｕ，  Ｙ．，  Ｚｈｕａｎｇ，  Ｙ．，  Ｍｉｒａｎｄａ，  Ｌ．，  ２００９．  Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｃｏｘ１  ａｎｄ  ｃｏｂ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  ＤＮＡ  ｂａｒｃｏｄｉｎｇ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７５（５），  １２７９．
Ｌｉｐｐｅｍｅｉｅｒ，  Ｓ．，  Ｆｒａｍｐｔｏｎ，  Ｄ．Ｍ．Ｆ．，  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，  Ｓ．Ｉ．，  Ｇｅｉｅｒ，  Ｓ．Ｃ．，  Ｎｅｇｒｉ，  Ａ．Ｐ．，  ２００３．  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ  （Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）  ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ  ｂｙ  ｏｎｌｉｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｃｈｏｒｌｏｐｈｙｌｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．  Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．  ３９（２），  ３２０−３３１．
Ｌｉｔａｋｅｒ，  Ｒ．Ｗ，  Ｖａｎｄｅｒｓｅａ，  Ｍ．Ｗ．，  Ｋｉｂｌｅｒ，  Ｓ．Ｒ．，  Ｒｅｅｃｅ，  Ｋ．Ｓ．，  Ｓｔｏｋｅｓ，  Ｎ．Ａ．，  Ｌｕｔｚｏｎｉ，  Ｆ．Ｍ．，  Ｙｏｎｉｓｈ，  Ｂ．Ａ．，  Ｗｅｓｔ，  Ｍ．Ａ．，  Ｂｌａｃｋ，  Ｍ．Ｎ．Ｄ．，  Ｔｅｓｔｅｒ，  Ｐ．Ａ．，  ２００７．  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＩＴＳ  ｒＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．  ４３（２），  ３４４−３５５．
Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｄ．，  １９９２．  ＭａｃＣｌａｄｅ：  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ：  Ｓｉｎｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ．
Ｍａｒｔｉｎｓ，  Ｃ．Ａ．，  Ｋｕｌｉｓ，  Ｄ．，  Ｆｒａｎｃａ，  Ｓ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．Ｍ．，  ２００４．  Ｔｈｅ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＰＳＰ  ｔｏｘｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ｔｏｘｉｃ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｍ  ｃｌｏｎｅ．  Ｔｏｘｉｃｏｎ  ４３（２），  １９５−２０５．
Ｍａｓｓｅｒｅｔ，  Ｅ．，  Ｇｒｚｅｂｙｋ，  Ｄ．，  Ｎａｇａｉ，  Ｓ．，  Ｇｅｎｏｖｅｓｉ，  Ｂ  ．，  Ｌａｓｓｅｒｒｅ，  Ｂ．，  Ｌａａｂｉｒ，  Ｍ．，  Ｃｏｌｌｏｓ，  Ｙ．，  Ｖａｑｕｅｒ，  Ａ．，  Ｂｅｒｒｅｂｉ，  Ｐ．，  ２００９．  Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｍｏｎｇ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ  ａｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｍａｒｋｅｒｓ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７５（７），  ２０３７−２０４５．
ＭｃＣａｕｌｅｙ，  Ｌ．Ａ．Ｒ．，  Ｅｒｄｎｅｒ，  Ｄ．Ｌ．，  Ｎａｇａｉ，  Ｓ．，  Ｒｉｃｈｌｅｎ，  Ｍ．Ｌ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．Ｍ．，  ２００９．  Ｂｉｏｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌｌｙ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｈａｒｍｆｕｌ  ａｌｇａｌ  ｂｌｏｏｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ  （Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｓｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｍａｒｋｅｒｓ．  Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．  ４５（２），  ４５４−４６３．
Ｍｅｄｌｉｎ，  Ｌ．，  Ｅｌｗｏｏｄ，  Ｈ．Ｊ．，  Ｓｔｉｃｋｅｌ，  Ｓ．，  Ｓｏｇｉｎ，  Ｍ．Ｌ．，  １９８８．  Ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  １６Ｓ−ｌｉｋｅ  ｒＲＮＡ−ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ．  Ｇｅｎｅ  ７１（２），  ４９１−４９９．
Ｍｏｎｔｒｅｓｏｒ，  Ｍ．，  Ｊｏｈｎ，  Ｕ．，  Ｂｅｒａｎ，  Ａ．，  Ｍｅｄｌｉｎ，  Ｌ．Ｋ．，  ２００４．  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｔｕｍ  ｓｐ．  ｎｏｖ．  （ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）：  Ａ  ｎｅｗ  ｎｏｎｔｏｘｉｃ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．  ４０（２），  ３９８−４１１．
Ｍｕｒｒａｙ，  Ｓ．Ａ．，  Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，  Ｗ．Ａ．，  Ａｌｖｉｎ，  Ａ．，  Ｍｉｈａｌｉ，  Ｔ．Ｋ．，  Ｋａｌａｉｔｚｉｓ，  Ｊ．，  Ｎｅｉｌａｎ，  Ｂ．Ａ．，  ２００９．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｔｏｘｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅａｒｌ  ｏｙｓｔｅｒ，  Ｐｉｎｃｔａｄａ  ｉｍｂｒｉｃａｔａ．  Ｔｏｘｉｃｏｎ  ５４（３），  ２１７−２２３．
Ｍｕｒｒａｙ，  Ｓ．Ａ．，  Ｗｉｅｓｅ  Ｍ．，  Ｓｔｕｅｋｅｎ，  Ａ．，  Ｂｒｅｔｔ，  Ｓ．  Ｋｅｌｌｍａｎｎ，  Ｒ．，  Ｈａｌｌｅｇｒａｅｆｆ，  Ｇ．Ｍ．，  Ｎｅｉｌａｎ，  Ｂ．Ａ，  ２０１１．  ｓｘｔＡ−ｂａｓｅｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｈａｒｍｆｕｌ  ａｌｇａｌ  ｂｌｏｏｍｓ  ｉｎ  ｍａｒｉｎｅ  ｗａｔｅｒｓ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７７：７０５０−７０５７．
Ｎａｇａｉ，  Ｓ．，  Ｌｉａｎ，  Ｃ．，  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｓ．，  Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｍ．，  Ｍａｔｓｕｙａｍａ，  Ｙ．，  Ｉｔａｋｕｒａ，  Ｓ．，  Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｈ．，  Ｋａｇａ，  Ｓ．，  Ｙａｍａｕｃｈｉ，  Ｈ．，  Ｓｏｎｄａ，  Ｙ．，  ２００７．  Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ  （ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｃｏａｓｔａｌ  ｗａｔｅｒｓ．  Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．  ４３（１），  ４３−５４．
Ｎｅｇｒｉ，  Ａ．，  Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ，  Ｌ．，  Ｄｏｙｌｅ，  Ｊ．，  Ｗｅｂｓｔｅｒ，  Ｎ．，  Ｆｒａｍｐｔｏｎ，  Ｄ．，  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，  Ｓ．，  ２００３．  Ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｔｏｘｉｎｓ  ａｒｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｔｏ  ｆｅｗ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｍｏｎｇ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ’ｓ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ．  Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．  ３９（４），  ６６３−６６７．
Ｏｒｌｏｖａ，  Ｔ．Ｙ．，  Ｓｅｌｉｎａ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｌｉｌｌｙ，  Ｅ．Ｌ．，  Ｋｕｌｉｓ，  Ｄ．Ｍ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．Ｍ．，  ２００７．  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ  （Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｅａｓｔ  ｃｏａｓｔ  ｏｆ  Ｒｕｓｓｉａ．  Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．  ４６（５）．
Ｏｒｒ，  Ｒ．Ｊ．Ｓ．，  Ｓｔｕｅｋｅｎ，  Ａ．，  Ｒｕｎｄｂｅｒｇｅｔ，  Ｔ．，  Ｅｉｋｒｅｍ，  Ｗ．，  Ｊａｋｏｂｓｅｎ，  Ｋ．Ｓ．，  ２０１１．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｘｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ  ｒＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｈａｒｍｆｕｌ  Ａｌｇａｅ  １０（６），  ６７６−６８８．
Ｏｓｈｉｍａ，  Ｙ．，  １９９５．  Ｐｏｓｔｃｏｌｕｍｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｔｏｘｉｎｓ．  Ｊ．  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ７８（２），  ５２８−５３２．
Ｐａｒｋｈｉｌｌ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｃｅｍｂｅｌｌａ，  Ａ．Ｄ．，  １９９９．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓａｌｉｎｉｔｙ，  ｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｒｉｎｅ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎ  Ｃａｎａｄａ．  Ｊ  Ｐｌａｎｋｔ．  Ｒｅｓ．  ２１（５），  ９３９−９５５．
Ｐｅｎｎａ，  Ａ．，  Ｍａｇｎａｎｉ，  Ｍ．，  １９９９．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  （Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｒＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ．  Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．  ３５（３），  ６１５−６２１．
Ｐｅｒｓｉｃｈ，  Ｇ．，  Ｋｕｌｉｓ，  Ｄ．，  Ｌｉｌｌｙ，  Ｅ，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｄ．  Ｍ．，  Ｇａｒｃｉａ  Ｖ．Ｍ．Ｔ．  ２００６．  Ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ  （Ｌｅｂｏｕｒ）  Ｂａｌｅｃｈ  ｆｒｏｍ  ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｒａｚｉｌ．  Ｈａｒｍｆｕｌ  Ａｌｇａｅ  ５，  ３６−４４．
Ｐｏｓａｄａ，  Ｄ．，  Ｃｒａｎｄａｌｌ，  Ｋ．Ａ．，  １９９８．  Ｍｏｄｅｌｔｅｓｔ：  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４（９），  ８１７−８１８．
Ｒｏｇｅｒｓ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｌｅｂｌｏｎｄ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｍｏｎｃｒｅｉｆｆ，  Ｃ．Ａ．，  ２００６．  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌａｔｕｍ  （Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）  ｔｏ  ｏｔｈｅｒ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  １８Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｈａｒｍｆｕｌ  Ａｌｇａｅ  ５（３），  ２７５−２８０．
Ｓａｋｏ，  Ｙ．，  Ｋｉｍ，  Ｃ．Ｈ．，  Ｎｉｎｏｍｉｙａ，  Ｈ．，  Ａｄａｃｈｉ，  Ｍ．，  Ｉｓｈｉｄａ，  Ｙ．，  １９９０．  Ｉｓｏｚｙｍｅ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍａｔｉｎｇ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｅｌｌａ／ｔａｍａｒｅｎｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｉｎ：  Ｔｏｘｉｃ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ３２０−３２３．
Ｓｃｈｏｌｉｎ，  Ｃ．Ａ．，  Ｈｅｒｚｏｇ，  Ｍ．，  Ｓｏｇｉｎ，  Ｍ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．Ｍ．，  １９９４．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｕｐ  ａｎｄ  ｓｔｒａｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｇｌｏｂａｌｌｙ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  （ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）．  ＩＩ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＬＳＵ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ．  Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．  ３０（６），  ９９９−１０１１．
Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ，  Ａ．，  ２００６．  ＲＡｘＭＬ−ＶＩ−ＨＰＣ：  ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ−ｂａｓｅｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｏｕｓａｎｄｓ  ｏｆ  ｔａｘａ  ａｎｄ  ｍｉｘｅｄ  ｍｏｄｅｌｓ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２２（２１），  ２６８８．
Ｓｔｅｉｄｉｎｇｅｒ，  Ｋ．Ａ．，  １９９０．  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｍａｒｅｎｓｉｓ／ｃａｔｅｎｅｌｌａ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ｇｏｎｙａｕｌａｘ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｏｄｓ．  Ｉｎ：  Ｇｒａｎｅｌｉ，  Ｅ．，  Ｓｕｎｄｓｓｔｒｏｍ，  Ｂ．，  Ｅｄｌｅｒ，  Ｌ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄ．Ｍ．  （Ｅｄｓ．），  Ｔｏｘｉｃ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，，  ｐｐ．  １１−１６．
Ｓｔｕｅｋｅｎ，  Ａ．，  Ｏｒｒ，  Ｒ．Ｊ．Ｓ．，  Ｋｅｌｌｍａｎｎ，  Ｒ．，  Ｍｕｒｒａｙ，  Ｓ．Ａ．，  Ｎｅｉｌａｎ，  Ｂ．Ａ．，  Ｊａｋｏｂｓｅｎ，  Ｋ．Ｓ．，  ２０１１．  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｓａｘｉｔｏｘｉｎ  ｉｎ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ．  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ６（５），  ｅ２００９６．
Ｗｏｈｌｒａｂ，  Ｓ．，  Ｍ．  Ｈ．  Ｉｖｅｒｓｅｎ，  ａｎｄ  Ｕ．  Ｊｏｈｎ．  ２０１０．  Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｏ−ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｆｏｒ  ｇｒａｚｅｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｏｘｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓｅ．  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ５：ｅ１５０３９．
Ｙａｎｇ，  Ｉ．，  Ｕ．  Ｊｏｈｎ，  Ｓ．  Ｂｅｓｚｔｅｒｉ，  Ｇ．  Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒ，  Ｂ．  Ｋｒｏｃｋ，  Ａ．  Ｇｏｅｓｍａｎｎ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｄ．  Ｃｅｍｂｅｌｌａ．  ２０１０．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃ  ｖｅｒｓｕｓ  ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｒｉｎｅ  ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ．  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１：２４８．
【０２９０】
実施例６：ｓｘｔＡ４の検出およびアレキサンドリウム・ミヌツム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ）の毒性株と非毒性株との識別のためのｑＰＣＲ反応
材料および方法
白色９６ウェルプレートにおいて、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステム（登録商標）４８０上で１０μｌまたは２０μｌのｑＰＣＲ反応を実施した。各反応は、５μｌまたは１０μｌのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ、１２５ｎＭの各プライマー（ｓｘｔ０７２とｓｘｔ０７３）およびテンプレート（アレキサンドリウム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ）  ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ）を含有した。反応は２通り実施した。各プレートに関して標準曲線および非テンプレート対照を含めた。標準曲線は、プライマーｓｘｔ００７およびｓｘｔ００８によりＣＣＭＰ１１３株から作出されたゲル精製ＰＣＲアンプリコンの１０×連続希釈によって作成した（Ｓｔｕｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，ＰｌｏｓＯｎｅ）に記載されている通りのアンプリコンを得るためのＰＣＲ）。ｑＰＣＲサイクリングパラメータは：ホットスタート：１×（９５℃、１０分）；増幅：４５×（９４℃、１０秒；６４℃、２０秒；７２℃、１０秒、単一獲得；融解曲線：１×（９５℃、５秒；６５℃、１分；９７℃まで連続測定）；冷却：１×（４０℃、１０秒）であった。Ｒｏｃｈｅにより供給されたソフトウェアを用いて、交差点分析および融解曲線分析を実施した。
【０２９１】
これらの実験におけるｓｘｔＡの検出に用いられるｑＰＣＲプライマーは、以下の通りであった：
ｓｘｔ０７２  ＣＴＴＧＣＣＣＧＣＣＡＴＡＴＧＴＧＣＴＴ（配列番号２２８）
ｓｘｔ０７３  ＧＣＣＣＧＧＣＧＴＡＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧ（配列番号２２９）
【０２９２】
結果
上記に概説したｑＰＣＲによって以下の株を試験した。
【０２９３】
【表１３】
0006001648.tif 000014
【０２９４】
サキシトキシン産生株に関する配列を以下の通り作出した：
【０２９５】
【表１４】
0006001648.tif 000015
【０２９６】
利用したプライマーは、ＳＴＸ産生種においてｓｘｔＡを検出し、またアレキサンドリウム・ミヌツム（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ）の毒性株と非毒性株とを識別することができた。非毒性Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）は、それらのゲノムに２つの異なるｓｘｔＡコピーを有し、そのためＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎアッセイを用いた場合に、二頂融解曲線が得られる（図１７を参照：毒性のＡ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）  ＡＬ１Ｖ、２本の曲線；非−ＳＴＸ  Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）  ＶＧＯ６５１、１本の曲線）。他の種もまた、特徴的な融解曲線を有するが、融解曲線に基づいた毒性種と非毒性種との識別は、Ａ．ミヌツム（Ａ．ｍｉｎｕｔｕｍ）だけになされる。
【０２９７】
Ｒｏｃｈｅ，＃１４２からのプライマーｓｘｔ０７２およびｓｘｔ０７３もまた、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙのプローブにより良好に働くことが示された（データは示していない）。このアッセイは、環境サンプル中のｓｘｔＡの検出に極めて特異的であり、有用である。
【０２９８】
実施例７：サキシトキシン類を産生しない渦鞭毛藻株には、ｓｘｔＡ１とｓｘｔＡ４は存在しない
材料および方法
上記実施例１に記載した通り、ｓｘｔＡ１およびｓｘｔＡ４のＰＣＲｓを実施した。
【０２９９】
結果
下記の渦鞭毛藻株のいずれにもｓｘｔＡ（１／４）は、検出されなかった。
【０３００】
【表１５】
0006001648.tif 000016
【図１】
0006001648.tif 000017
【図２】
0006001648.tif 000018
【図３】
0006001648.tif 000019
【図４Ａ】
0006001648.tif 000020
【図４Ｂ】
0006001648.tif 000021
【図５】
0006001648.tif 000022
【図６】
0006001648.tif 000023
【図７】
0006001648.tif 000024
【図８】
0006001648.tif 000025
【図９】
0006001648.tif 000026
【図１０】
0006001648.tif 000027
【図１１】
0006001648.tif 000028
【図１２】
0006001648.tif 000029
【図１３】
0006001648.tif 000030
【図１４】
0006001648.tif 000031
【図１５】
0006001648.tif 000032
【図１６】
0006001648.tif 000033
【図１７】
0006001648.tif 000034
【配列表】
0006001648000001.app