(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｍ１（式中、Ｍ１は多価金属イオンを表す。）、及び
（ｂ）式Ｍ２Ｌｘ（式中、ｘは２又はそれ以上の整数を表し、Ｍ２は第２の金属イオンを表し、各Ｌは、金属イオン配位子を表し、少なくとも２つのＬはホスホネート基を有する。）で表される金属複合体を含むビスホスホネート、
から成るコアを有する金属−ビスホスホネートナノ粒子。
【請求項２】
前記Ｍ２が白金、ルテニウム、又はベータ放射性核種であり、ｘが５又は６である請求項１に記載の金属−ビスホスホネートナノ粒子。
【請求項３】
２つのＬが、独立して、式−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２（式中、各Ｒは、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、アリール基、置換アリール基又は負電荷を表す。）で表される請求項１に記載の金属−ビスホスホネートナノ粒子。
【請求項４】
各Ｒが、独立して、水素原子、アルキル基又は負電荷を表す請求項３に記載の金属−ビスホスホネートナノ粒子。
【請求項５】
更に、前記コアの外表面の少なくとも一部を取り囲む、一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層を含む請求項１に記載の金属−ビスホスホネートナノ粒子。
【請求項６】
少なくとも一つの脂質コーティング層又は脂質コーティング剤を含む請求項５に記載の金属−ビスホスホネートナノ粒子。
【請求項７】
更に、非ビスホスホネート治療薬若しくはそのプロドラッグ及び/又はイメージング剤を有する請求項１に記載の金属−ビスホスホネートナノ粒子。
【請求項８】
前記非ビスホスホネート治療薬が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である請求項７に記載の金属−ビスホスホネートナノ粒子。
【請求項９】
前記少なくとも一つのLが、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、ＮＨ３、アルキルアミノ基、水酸基、アルコキシ基、ジオール又はジアミンである請求項１に記載の金属−ビスホスホネートナノ粒子。
【請求項１０】
請求項１に記載の金属−ビスホスホネートナノ粒子及び薬学的に許容される担体から成る、癌又は骨関連疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項１１】
患者に請求項１に記載の金属−ビスホスホネートナノ粒子の有効量を投与することから成る、治療を必要とする患者の癌又は骨関連疾患を治療する方法、に使用するための請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１１年７月８日出願の米国仮特許出願61/505,806の優先権を主張するものであり、本明細書にはその全体が取り込まれている。
この発明は、米国国立癌研究所によって授与された助成金番号1-U01-CA151455-01の下で、国立科学財団によって授与助成金番号DMR-0906662の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、金属−ビスホスホネートナノ粒子、このナノ粒子を含む組成物、このナノ粒子を合成する方法、及びこれらの癌又は骨関連障害のための治療薬及び/又はイメージング剤としての使用に関する。このナノ粒子は、有機又は無機ポリマー、脂質単層、及び/又は脂質二重層で被覆され、及び/又はリポソームに組み込まれることができる。このナノ粒子は、さらに追加の治療薬、及び/又は疾患の診断、治療及び/又はイメージングに使用するための特異的部位へこのナノ粒子を向けるための標的化剤を含むことができる。
【背景技術】
【０００３】
現在、種々のタイプの癌を臨床で治療するために多くの抗癌剤が利用可能であるが、それらの治療有効性は、これらの薬物を選択的に腫瘍に送達することができないことにより制限されてきた。全てではないが、ほとんどのこれらの抗がん薬は、高度に細胞毒性であり、癌細胞と一緒に正常細胞を殺すことができる。これらの抗癌剤を腫瘍領域へ送達するための方法が欠如するため、これらの薬剤の高投与量がしばしば必要とされ、このことが望ましくない副作用を引き起こす可能性がある。その結果、現在使用されている抗癌剤のほとんどはかなり限られた治療指数しか有さない。このような投与量の制限は、患者の全ての癌細胞の完全な根絶を妨げ、多くの患者に癌の再発をもたらす可能性がある。この投与量の制限はまた、再発する癌を薬剤耐性になり易くし、そのため患者の予後を悪化させる可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そのため、選択的に腫瘍に送達され、優れた治療指数を提供することができる新規な抗癌組成物に対する大きな必要性がある。また、投与後に、抗癌剤が如何に効率的に腫瘍に局在化するかを監視するためのリアルタイム技術に対する必要性もある。
後記のスキーム１に示すようなビスホスホネートは、骨粗鬆症のような骨吸収に関連する疾患を治療するために使用されている。最近では、ビスホスホネート（特に、ゾレドロン酸及びパミドロネート）は、乳癌などのいくつかの癌の骨転移を治療するために使用されてきた。また、ビスホスホネートが、メタロプロテイナーゼや他の重要なタンパク質の経路を阻害することにより、効果的な抗腫瘍剤になりうることを示す証拠が増えつつある。しかし、抗癌治療薬としてのビスホスホネートの臨床応用は、注入されたホスホネートの大部分が、骨に結合するか又は腎臓ろ過により除去されるという望ましくない薬物動態によって制限されている。従って、このような癌や骨関連障害を治療するため等の治療剤としてのビスホスホネートを送達するための追加の方法の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
いくつかの実施態様において、本発明は、（ｉ）ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を用意する段階、（ii）このビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を、エージングされた溶液を提供するための期間エージングする段階、及び（iii）このエージングされた溶液から金属−ビスホスホネートナノ粒子を単離する段階、から成る金属−ビスホスホネートナノ粒子の製法を提供する。
いくつかの実施態様において、この記多価金属イオンは２価である。いくつかの実施態様において、この多価金属イオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施態様において、このビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液は、少なくとも２つの異なる多価金属イオンを含む、及び／又は該溶液が、少なくとも一つの常磁性多価金属イオンを含む。いくつかの実施態様において、このビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液は、常磁性金属イオン、ホスフェートイオン、及び／又は白金金属イオンを含まない。
【０００６】
いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは下式
【化１】
0006049712.tif 000002
（式中、ｎ及びｍはそれぞれ独立して０〜２の整数を表し、各Ｒは、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、アリール基、及び置換アリール基からなる群から選択され、Ｒ１は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルキル基、置換アルキル基、アミノ基、アルコキシ基及びアルキルチオ基から成る群から選択され、Ｒ２は、ハロゲン原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、置換アラルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基及びアリールアミノ基からなる群から選択される。）で表される構造を有する、又はその塩である。
いくつかの実施態様において、Ｒ２は、置換アルキル基及びアラルキル基から選択され、但し、該置換アルキル基は、ＮＨ２−置換アルキル基、アルキルアミノ置換アルキル基、及びジアルキルアミノ置換アルキル基から成る群から選択され、かつ該アラルキル基は、窒素含有ヘテロアリール部分を含むアラルキル基である。
いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、ゾレドロン酸、パミドロネート、リセドロン酸、アレンドロネート、ゼリドロン酸（zeridronic acid）、チルドロネート、エチドロネート、及びイバンドロネートからなる群から選択される。
【０００７】
いくつかの実施態様において、この（ｉ）ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を用意する段階は、
（ａ）溶媒に該ビスホスホネートと多価金属イオン前駆体を溶解する段階、但し、該多価金属イオン前駆体はＭＬｘ（式中、ｘは該金属イオンの原子価に相当する整数を表し、Ｍは多価金属イオンを表し、各Ｌは、独立して、ハロゲン原子、水酸基、スルフェート、及びアミノ基からなる群から選択される配位子を表す。）で表される化合物、又はその水和物若しくは他の溶媒和物である、及び
（ｂ）該ビスホスホネートの前駆体溶液と多価金属イオンを含む前駆体溶液を混合する段階、但し、該多価金属イオンを含む前駆体溶液が、ＭＬｘ（式中、ｘ、Ｍ、各Ｌは、上記と同様に定義される。）で表される化合物、又はその水和物若しくは他の溶媒和物を、溶媒に溶解することにより調整される、
のいずれかから成る。
いくつかの実施態様において、この（ｉ）ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を用意する段階は、更に、該ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液のｐＨを調整する段階、又はその前駆体溶液のｐＨを調整する段階を含む。
【０００８】
いくつかの実施態様において、この（ｉ）ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を用意する段階は、更に、該ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液又はその前駆体溶液に、一つ又はそれ以上の非ビスホスホネート治療薬若しくはそのプロドラッグ及び/又は一つ又はそれ以上のイメージング剤を添加する段階を含む。いくつかの実施態様において、この非ビスホスホネート治療薬若しくはそのプロドラッグ及び/又は一つ又はそれ以上のイメージング剤は、前記多価金属イオンに配位可能な官能基を含む。いくつかの実施態様において、この非ビスホスホネート治療薬若しくはそのプロドラッグ及び/又は一つ又はそれ以上のイメージング剤は、化学療法剤、光線力学療法剤、放射線増感剤、ベータ放出放射性核種、タンパク質、ペプチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び蛍光体から成る群から選択される。
【０００９】
いくつかの実施態様において、この方法は、（ii）エージング段階の前に、更に、前記（ｉ）ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液にマイクロ波を照射する段階を含む。
いくつかの実施態様において、この（ii）エージング段階は、前記（ｉ）ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を、室温より高い温度で一定時間加熱する段階から成る。いくつかの実施態様において、この室温より高い温度は、約８０℃と約１４０℃の間である。いくつかの実施態様において、この一定時間は、約２０分と約２４時間の間である。
いくつかの実施態様において、この（iii）金属−ビスホスホネートナノ粒子を単離する段階は、前記エージングされた溶液を遠心分離して、粗ナノ粒子を提供する段階、前記エージングされた溶液をろ過して、粗ナノ粒子を提供する段階、アルコールに粗ナノ粒子を再分散させる段階、粗ナノ粒子を水性溶液で洗浄する段階、粗ナノ粒子をアルコール溶液で洗浄する段階、及び粗ナノ粒子を乾燥させる段階、から成る群の一つ又はそれ以上から成る。いくつかの実施態様において、この（iii）金属−ビスホスホネートナノ粒子を単離する段階は、結晶性金属−ビスホスホネートナノ粒子を単離する段階から成る。
【００１０】
いくつかの実施態様において、この方法は、更に、単離された金属−ビスホスホネートナノ粒子を一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層に接触させ、それによりコーティングされた金属−ビスホスホネートナノ粒子を提供する段階を含む。いくつかの実施態様において、この一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、金属酸化物、ポリマー（例えば、シリカベースのポリマー（例えば、シリカ（SiO2）、ポリ（シロキサン）、又はポリ（シルセスキオキサン））又は有機ポリマー）、脂質単層、脂質二重層、及びこれらの組み合わせから選択される。
いくつかの実施態様において、この一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、有機ポリマーから成り、この有機ポリマーは親水性ポリマーである。いくつかの実施態様において、この一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、標的化部分及び／又は不動態化部分を含む。いくつかの実施態様において、この一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、ジオレオイルＬ−α−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＡ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＰＳＰＥ−ＰＥＧ−アニスアミド、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−葉酸塩、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、アニスアミド誘導体化ＤＯＰＥ、シリカ、ｃＲＧｆＫ誘導化シリカ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−誘導体化シリカ及びアニスアミド−ＰＥＧ−誘導体化シリカから成る群から選択される。
【００１１】
いくつかの実施態様において、本発明は、（ｉ）ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を用意する段階、（ii）このビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を、エージングされた溶液を提供するための期間エージングする段階、及び（iii）このエージングされた溶液から金属−ビスホスホネートナノ粒子を単離する段階、から成る金属−ビスホスホネートナノ粒子の製法により製造された金属−ビスホスホネートナノ粒子を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、（ｉ）ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を用意する段階、（ii）このビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を、エージングされた溶液を提供するための期間エージングする段階、及び（iii）このエージングされた溶液から金属−ビスホスホネートナノ粒子を単離する段階、から成る金属−ビスホスホネートナノ粒子の製法により製造された金属−ビスホスホネートナノ粒子及び薬学的に許容される担体から成る医薬組成物を提供する。
【００１２】
いくつかの実施態様において、本発明は、（ｉ）ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を用意する段階、（ii）このビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を、エージングされた溶液を提供するための期間エージングする段階、及び（iii）このエージングされた溶液から金属−ビスホスホネートナノ粒子を単離する段階、から成る金属−ビスホスホネートナノ粒子の製法により製造された金属−ビスホスホネートナノ粒子の有効量を投与することから成る、治療を必要とする患者の癌又は骨関連疾患を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様において、この癌は、肺癌、乳癌及び前立腺癌から成る群から選択される。
いくつかの実施態様において、この癌又は骨関連疾患を治療する方法は。この金属−ビスホスホネートナノ粒子の投与後、更に、細胞、組織、器官又は患者のいずれかの画像を描くことを含む。この画像を描くことは、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、光学イメージング、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）及び単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）から成る群のうちの一つを実施することから成る。
【００１３】
いくつかの実施態様において、本発明は、結晶性の多価金属イオン−ビスホスホネート複合体から成るコアを含む金属−ビスホスホネートナノ粒子を提供する。いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、更に、前記コアの外表面の少なくとも一部を取り囲む、一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層を含む。いくつかの実施態様において、この一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、金属酸化物、ポリマー（例えば、シリカ（SiO2）、ポリ（シロキサン）、又はポリ（シルセスキオキサン））又は有機ポリマー）、脂質単層、脂質二重層、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される。
いくつかの実施態様において、この一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、標的化剤及び／又は不動態化剤で誘導体化される。いくつかの実施態様において、この一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、ジオレオイルＬ−α−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＡ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＰＳＰＥ−ＰＥＧ−アニスアミド、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−葉酸塩、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、アニスアミド誘導体化ＤＯＰＥ、シリカ、ｃＲＧｆＫ誘導化シリカ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−誘導体化シリカ及びアニスアミド−ＰＥＧ−誘導体化シリカから成る群から選択される。
いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、更に、非ビスホスホネート治療薬若しくはそのプロドラッグ及び/又はイメージング剤を含む。
いくつかの実施態様において、この多価金属イオンが２価金属イオンである。いくつかの実施態様において、この多価金属イオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、及びこれらの組み合わせから選択される。
【００１４】
いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは下式
【化１】
0006049712.tif 000003
（式中、ｎ及びｍはそれぞれ独立して０〜２の整数を表し、各Ｒは、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、アリール基、及び置換アリール基からなる群から選択され、Ｒ１は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルキル基、置換アルキル基、アミノ基、アルコキシ基及びアルキルチオ基から成る群から選択され、Ｒ２は、ハロゲン原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、置換アラルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基及びアリールアミノ基からなる群から選択される。）で表される構造を有する、又はその塩である。いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、ゾレドロン酸、パミドロネート、リセドロン酸、アレンドロネート、ゼリドロン酸（zeridronic acid）、チルドロネート、エチドロネート、及びイバンドロネートからなる群から選択される。
【００１５】
いくつかの実施態様において、本発明は、結晶性の多価金属イオン−ビスホスホネート複合体から成るコアを含む金属−ビスホスホネートナノ粒子及び薬学的に許容される担体から成る医薬組成物を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、結晶性の多価金属イオン−ビスホスホネート複合体から成るコアを含む金属−ビスホスホネートナノ粒子の有効量を投与することから成る、治療を必要とする患者の癌又は骨関連疾患を治療する方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、（ａ）多価金属イオン−ビスホスホネート複合体から成るコア、及び（ｂ）このコアの外表面の少なくとも一部を取り囲むコーティング層、但し、該コーティング層は、金属酸化物、ポリマー（例えば、シリカ系ポリマー又は有機ポリマー）、脂質単層又は脂質二重層から成る、から成る金属−ビスホスホネートナノ粒子を提供する。いくつかの実施態様において、この記コアは、更に、非ビスホスホネート治療薬若しくはそのプロドラッグ及び/又はイメージング剤を含む。
【００１６】
いくつかの実施態様において、この多価金属イオンは２価金属イオンである。いくつかの実施態様において、この多価金属イオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは下式
【化１】
0006049712.tif 000004
（式中、ｎ及びｍはそれぞれ独立して０〜２の整数を表し、各Ｒは、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、アリール基、及び置換アリール基からなる群から選択され、Ｒ１は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルキル基、置換アルキル基、アミノ基、アルコキシ基及びアルキルチオ基から成る群から選択され、Ｒ２は、ハロゲン原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、置換アラルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基及びアリールアミノ基からなる群から選択される。）で表される構造を有する、又はその塩である。いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、ゾレドロン酸、パミドロネート、リセドロン酸、アレンドロネート、ゼリドロン酸（zeridronic acid）、チルドロネート、エチドロネート、及びイバンドロネートからなる群から選択される。
【００１７】
いくつかの実施態様において、このコーティング層は、シリカ系ポリマーから成り、該シリカ系ポリマーが、標的化剤及び／又は不動態化剤で誘導体化される。いくつかの実施態様において、このコーティング層は、シリカ、ｃＲＧｆＫ誘導化シリカ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−誘導体化シリカ及び/又はアニスアミド−ＰＥＧ−誘導体化シリカから成る。
いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、前記金属酸化物、ポリマー、脂質単層又は脂質二重層から成るコーティング層に加えて、更に、一つ又はそれ以上の追加のコーティング層を含み、この一つ又はそれ以上の追加のコーティング層が、金属酸化物、ポリマー（例えば、シリカ系ポリマー又は有機ポリマー）、脂質単層、脂質二重層、及びこれらの組み合わせから選択される材料から成る。いくつかの実施態様において、本発明は、（ａ）多価金属イオン−ビスホスホネート複合体から成るコア、及び（ｂ）このコアの外表面の少なくとも一部を取り囲むコーティング層、但し、該コーティング層は、金属酸化物、ポリマー、脂質単層又は脂質二重層から成る、から成る金属−ビスホスホネートナノ粒子及び薬学的に許容される担体から成る医薬組成物を提供する。
【００１８】
いくつかの実施態様において、本発明は、（ａ）多価金属イオン−ビスホスホネート複合体から成るコア、及び（ｂ）このコアの外表面の少なくとも一部を取り囲むコーティング層、但し、該コーティング層は、金属酸化物、ポリマー、脂質単層又は脂質二重層から成る、から成る金属−ビスホスホネートナノ粒子の有効量を患者に投与することから成る、治療を必要とする患者の癌又は骨関連疾患を治療する方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、（ａ）Ｍ１（式中、Ｍ１は多価金属イオンを表す。）、及び（ｂ）ビスホスホネート、但し、該ビスホスホネートは、式Ｍ２Ｌｘ（式中、ｘは２又はそれ以上の整数を表し、Ｍ２は第２の金属イオンを表し、各Ｌは、金属イオン配位子を表し、少なくとも２つのＬはホスホネート基を有する。）で表される金属複合体を含む、から成るコアを有する金属−ビスホスホネートナノ粒子を提供する。いくつかの実施態様において、Ｍ１は２価金属イオンである。
【００１９】
いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、式Ｍ２Ｌｘ（式中、Ｍ２は白金であり、ｘは５又は６である。）で表される金属複合体である。いくつかの実施態様において、２つのＬは、式−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２（式中、各Ｒは、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、アリール基、置換アリール基又は負電荷を表す。）を有する。
いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、更に、このコアの外表面の少なくとも一部を取り囲む、一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層を含む。いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、少なくとも一つの脂質コーティング層及び脂質コーティング剤を含む。いくつかの実施態様において、この一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、標的化部分及び／又は不動態化部分を含む。
いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、更に、非ビスホスホネート治療薬若しくはそのプロドラッグ及び/又はイメージング剤を有する。
【００２０】
いくつかの実施態様において、本発明は、（ａ）Ｍ１（式中、Ｍ１は多価金属イオンを表す。）、及び（ｂ）ビスホスホネート、但し、該ビスホスホネートは、式Ｍ２Ｌｘ（式中、ｘは２又はそれ以上の整数を表し、Ｍ２は第２の金属イオンを表し、各Ｌは、金属イオン配位子を表し、少なくとも２つのＬはホスホネート基を有する。）で表される金属複合体を含む、から成るコアを有する金属−ビスホスホネートナノ粒子及び薬学的に許容される担体から成る医薬組成物を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、（ａ）Ｍ１（式中、Ｍ１は多価金属イオンを表す。）、及び（ｂ）ビスホスホネート、但し、該ビスホスホネートは、式Ｍ２Ｌｘ（式中、ｘは２又はそれ以上の整数を表し、Ｍ２は第２の金属イオンを表し、各Ｌは、金属イオン配位子を表し、少なくとも２つのＬはホスホネート基を有する。）で表される金属複合体を含む、から成るコアを有する金属−ビスホスホネートナノ粒子の有効量を投与することから成る、治療を必要とする患者の癌又は骨関連疾患を治療する方法を提供する。
【００２１】
以上のように、本発明の目的は、このようなナノ粒子から成る金属−ビスホスホネートナノ粒子及び組成物並びにこれを製造する及び使用する方法を提供することである。
本発明の目的は、以上の明細書に記載され、そしてこの目的は、ここに開示された事項により全体的に又は部分的に達成され、他の目的は、以下に最良に記載された添付図面を考量して記載が進むにつれて明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】配位高分子ナノ粒子を形成するための金属中心に配位可能な官能基を有する例示的な抗癌剤の化学構造を示す模式図である。
【図２】Aは、c軸から見下ろしたカルシウムパミドロネート結晶(Ca-Pam)のパッキングダイアグラムを示す模式図である。Bは、c軸から見下ろしたカルシウムゾレドロネート結晶(Ca-Zol)のパッキングダイアグラムを示す模式図である。Cは、c軸に沿ったカルシウムパミドロネート結晶(Ca-Pam)の一次元（1D）接続側面図を示す概略図である。Dは、c軸に沿ったのカルシウムゾレドロネート結晶(Ca-Zol)の一次元（1D）接続側面図を示す概略図である。
【図３】Aは、カルシウムパミドロネート結晶(Ca-Pam)ナノ粒子の動的光散乱（DLS）を示すグラフである。合成したままのCa-Pamナノ粒子のデータ（裸Ca-Pam粒子）は"ｘ"で示され、脂質コーティング後のCa-Pamナノ粒子のデータ（脂質被覆後）は"黒丸"で示され、アニスアミド（AA）標的化後のCa-PAMナノ粒子のデータ（AA標的化後）は、"白丸"で示されている。Bは、合成したままの（裸）、脂質コーティングされた（脂質被覆）、及びアニスアミド（AA）標的化された（AA標的化）Ca-PAMナノ粒子の熱重量分析（TGA）曲線を示すグラフである。
【図４】上の３図は、カルシウムパミドロネート結晶(Ca-Pam)ナノ粒子の走査電子顕微鏡（SEM）画像、下の３図は、透過型電子顕微鏡（TEM）画像を示す。各左の画像は、合成されたままの（裸の）Ca-Pamナノ粒子、各中央の画像は、脂質でコーティングされたCa-Pamナノ粒子、各右の画像はアニスアミド（AA）標的化Ca-Pamナノ粒子のものを示す。
【図５】Aは、カルシウムゾレドロネート結晶（Ca-Zol）ナノ粒子の動的光散乱（DLS）を示すグラフである。合成したままのCa-Zolナノ粒子のデータ（裸Ca-Zol粒子）は"ｘ"で示され、脂質コーティング後のCa-Zolナノ粒子のデータ（脂質被覆後）は"黒丸"で示され、アニスアミド（AA）標的化後のCa-Zolナノ粒子のデータ（AA標的化後）は、"白丸"で示されている。Bは、合成したままの（裸）、脂質コーティングされた（脂質被覆）、及びアニスアミド（AA）標的化された（AA標的化）Ca-Zolナノ粒子の熱重量分析（TGA）曲線を示すグラフである。
【図６】上の３図は、カルシウムゾレドロネート結晶（Ca-Zol）ナノ粒子の走査電子顕微鏡（SEM）画像、下の３図は、透過型電子顕微鏡（TEM）画像を示す。各左の画像は、合成されたままの（裸の）Ca-Zolナノ粒子、各中央の画像は、脂質でコーティングされたCa-Zolナノ粒子、各右の画像はアニスアミド（AA）標的化Ca-Zolナノ粒子のものを示す。
【図７】結晶性カルシウムパミドロネート（Ca-Pam）ナノ粒子で処理したNCI-H460大肺癌細胞の癌細胞増殖阻害アッセイの結果を示すグラフである。合成したままのCa-Pamナノ粒子のデータ（裸Ca-Pam粒子）は"白丸"で示され、脂質コーティング後のCa-Pamナノ粒子のデータ（脂質被覆後）は"三角"で示され、アニスアミド（AA）標的化後のCa-Pamナノ粒子のデータ（AA標的化後）は、"逆さまの三角"で示されている。比較のために、遊離パミドロネート（黒四角）のデータも示されている。50%阻害濃度（IC50）は、パミドロネート、合成したままのCa-Pam、脂質被覆Ca-Pam、及びAA-標的化Ca-Pamについて、それぞれ、65、62、4.2及び2.7μMと見積もられる。
【図８】被覆されていないアモルファスカルシウムゾレドロネート（A-Ca-Zol）ナノ粒子の走査電子顕微鏡（SEM）像を示す。
【図９】Aは、水に懸濁させた、アモルファスカルシウムゾレドロネート（A-Ca-Zol）ナノ粒子の、強度加重動的光散乱（DLS）曲線を示すグラフである。Bは、水に懸濁させた、アモルファスカルシウムゾレドロネート（A-Ca-Zol）ナノ粒子の、数加重動的光散乱（DLS）曲線を示すグラフである。
【図１０】遊離ゾレドロン酸（遊離ゾレドロネート）と比較した、被覆されていないアモルファスカルシウムゾレドロネート（A-Ca-Zol）ナノ粒子（即ち、カルシウムゾレドロネート-NP#1、カルシウムゾレドロネート-NP#2）の熱重量分析（TGA）曲線を示すグラフである。
【図１１】2時間シリカで被覆したアモルファスカルシウムゾレドロネート（A-Ca-Zol）ナノ粒子の走査電子顕微鏡(SEM)像を示す。
【図１２】Aは、被覆されていないナノ粒子（四角）、及び2時間シリカで被覆したアモルファスカルシウムゾレドロネート（A-Ca-Zol）ナノ粒子（丸）の強度加重動的光散乱(DLS)曲線を示す。Bは、被覆されていないナノ粒子（四角）、及び2時間シリカで被覆したアモルファスカルシウムゾレドロネート（A-Ca-Zol）ナノ粒子（丸）の数加重動的光散乱(DLS)曲線を示す。
【図１３】ナノ粒子表面にシリカ被覆反応を2時間行った後のシリカ被覆アモルファスカルシウムゾレドロネート（A-Ca-Zol）ナノ粒子のエネルギー分散型Ｘ線分光法(EDS)スペクトルを示す。
【図１４】2時間のシリカ被覆反応の前（被覆されていないナノ粒子）と後（2時間シリカ被覆）のアモルファスカルシウムゾレドロネート（A-Ca-Zol）ナノ粒子の熱重量分析(TGA)重量損失曲線を示す。遊離ゾレドロネートのTGA重量損失曲線も示す。
【図１５】5時間シリカ被覆反応を行ったアモルファスカルシウムゾレドロネート（A-Ca-Zol）ナノ粒子の走査電子顕微鏡(SEM)像を示す。
【図１６】Aは、被覆されていないナノ粒子（四角）、2時間シリカで被覆したA-Ca-Zolナノ粒子（丸）及び5時間シリカで被覆したA-Ca-Zolナノ粒子（三角）の強度加重動的光散乱(DLS)曲線を示す。Bは、被覆されていないナノ粒子（四角）、2時間シリカで被覆したA-Ca-Zolナノ粒子（丸）及び2時間シリカで被覆したA-Ca-Zolナノ粒子（三角）の数加重動的光散乱(DLS)曲線を示す。
【図１７】ナノ粒子表面にシリカ被覆反応を5時間行った後のシリカ被覆アモルファスカルシウムゾレドロネート（A-Ca-Zol）ナノ粒子のエネルギー分散型Ｘ線分光法(EDS)スペクトルを示す。
【図１８】被覆されていないアモルファスカルシウムゾレドロネート（A-Ca-Zol）ナノ粒子、シリカ被覆A-Ca-Zolナノ粒子（2時間被覆）及びシリカ被覆A-Ca-Zolナノ粒子（5時間被覆）の熱重量分析(TGA)重量損失曲線を示す。
【図１９】環状RGD（cRGD）を標的とするアモルファスカルシウムゾレドロネート（A-Ca-Zol）ナノ粒子の走査型電子顕微鏡(SEM)像を示す。
【図２０】PEG化(左)及びアニスアミド標的化(右)されたシリカ被覆アモルファスカルシウムゾレドロネート(A-Ca-Zol)ナノ粒子のSEM像を示す。
【図２１】Aは、非官能化（四角）、シリカ被覆（三角）、PEG化(ひし形)及びアニスアミド標的化(丸)されたシリカ被覆アモルファスカルシウムゾレドロネートナノ粒子の強度加重動的光散乱(DLS)曲線を示す。Bは、非官能化（四角）、シリカ被覆（三角）、PEG化(ひし形)及びアニスアミド標的化(丸)されたシリカ被覆アモルファスカルシウムゾレドロネートナノ粒子の数加重動的光散乱(DLS)曲線を示す。
【図２２】非官能化カルシウムゾレドロネートナノ粒子（三角形）、2時間シリカ被覆カルシウムゾレドロネートナノ粒子（丸）、及び5時間シリカ被覆カルシウムゾレドロネートナノ粒子（四角）の経時のゾレドロネート薬物放出を示すグラフである。比較のために透析バッグからの遊離薬物の時間依存拡散（菱形）を示す。
【図２３】アモルファスカルシウムゾレドロネート(A-Ca-Zol)ナノ粒子及び遊離ゾレドロネートで処理したH460ヒト肺癌細胞の細胞生存率曲線を示すグラフである。遊離ゾレドロネートのデータは白抜き四角で示し、合成したままのA-Ca-Zolナノ粒子のデータは白抜き丸で示し、アニスアミド標的化A-Ca-Zolナノ粒子のデータは黒四角で示し、、RGB標的化A-Ca-Zolナノ粒子のデータは黒丸で示す。ゾレドロネート、合成したままのA-Ca-Zol、アニスアミド標的化A-Ca-Zol、RGB標的化A-Ca-Zolの50%抑制濃度（IC50）は、それぞれ、>20、0.9、0.9及び2.5μMと見積もられた。
【図２４】合成したままの（被覆なしの）アモルファスカルシウムゾレドロネート(A-Ca-Zol)ナノ粒子で処理したヒトPC-3前立腺腺癌細胞の細胞生存率曲線を示すグラフである（丸）。比較のため、遊離ゾレドロネートで処理した細胞のデータも示す（四角）。ゾレドロネート及び合成したままのA-Ca-Zolナノ粒子の50%抑制濃度（IC50）は、それぞれ、3.1及び0.8μMと見積もられた。
【図２５】Aは、マンガンゾレドロネート（Mn-Zol）ナノ粒子の光散乱(DLS)流体力学直径を示すグラフである。白抜き四角：合成されたままの（裸の）ナノ粒子、白抜き丸：脂質被覆後のナノ粒子、黒丸：アニスアミド標的化後のナノ粒子のものを示す。Bは、Aに示すMn-Zolナノ粒子と同じ粒子のTGA減量曲線を示す。
【図２６】マンガンゾレドロネート（Mn-Zol）ナノ粒子の走査電子顕微鏡（SEM）像（上の３図）及び透過型電子顕微鏡(TEM）像（下の３図）を示す。
【図２７】Aは、アモルファスマンガンゾレドロネート（A-Mn-Zol）ナノ粒子の光散乱(DLS)流体力学直径を示すグラフである。白抜き四角：合成されたままの（裸の）ナノ粒子、白抜き丸：脂質被覆後のナノ粒子、黒丸：アニスアミド標的化後のナノ粒子のものを示す。Bは、Aに示すA-Mn-Zolナノ粒子と同じ粒子のTGA減量曲線を示す。
【図２８】アモルファスマンガンゾレドロネート（A-Mn-Zol）ナノ粒子の走査電子顕微鏡（SEM）像（上の３図）及び透過型電子顕微鏡(TEM）像（下の３図）を示す。各３図の左の画像は合成されたままの（裸の）ナノ粒子、中央の画像は、脂質被覆されたナノ粒子、右の画像はアニスアミド-標的化ナノ粒子に対応する。
【図２９】PEG化前（左）と後（右）のアモルファスマンガンゾレドロネートナノ粒子（A-Mn-Zol）のTEM顕微鏡写真を示す。
【図３０】37℃の5mMのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）における、裸のマンガンゾレドロネート(Mn-Zol)ナノ粒子(白抜き三角)と脂質被覆されたMn-Zolナノ粒子（黒三角）のゾレドロネート放出プロファイルを示す。
【図３１】裸の（三角）及びPEG化された（四角）アモルファスマンガンゾレドロネートナノ粒子の放出プロファイルを示すグラフである。
【図３２】ウシ血清アルブミン（BSA）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の、PEG化されたアモルファスマンガンゾレドロネート(PEG-A-Mn-Zol)ナノ粒子の安定性試験の結果を示すグラフである。このナノ粒子の多分散性指数（PDI）に関するデータは丸で示し、このナノ粒子のサイズに関するデータは四角で示し、計数率(%)に関するデータは三角で示す。
【図３３】マンガンゾレドロネート（Mn-Zol）ナノ粒子で処理されたH460大肺癌細胞の生存率曲線を示すグラフである。合成したままのMn-Zol(裸のMn-Zol)ナノ粒子のデータは三角、脂質被覆Mn-Zol(脂質被覆Mn-Zol)ナノ粒子のデータは逆三角で示す。比較のため、遊離ゾレドロネート（四角）と裸のリポソーム（丸）のデータも示す。ゾレドロネート、裸のリポソーム、合成したままの（裸の)Mn-Zol、及び脂質被覆Mn-ZolのIC50は、それぞれ、>20μM、>20μM、>20μM、及び0.98μMと見積もられた。
【図３４】アモルファスマンガンゾレドロネート（A-Mn-Zol）ナノ粒子で処理されたMCF-7癌細胞の生存率曲線を示すグラフである。合成したままのA-Mn-Zol(裸のA-Mn-Zol)ナノ粒子のデータは三角、脂質被覆A-Mn-Zol(脂質被覆A-Mn-Zol)ナノ粒子のデータは逆三角で示す。比較のため、遊離ゾレドロネート（四角）と裸のリポソーム（丸）のデータも示す。ゾレドロネート、裸のリポソーム、合成したままの（裸の)A-Mn-Zol、及び脂質被覆A-Mn-ZolのIC50は、それぞれ、9μM、>40μM、8μM、及び3μMと見積もられた。
【図３５】ASPC-1（図35A）及びMCF-7細胞（図35B）に対する、Mn-Zol＠DOPA(四角)、PEG-A-Zn-Zol(三角)、及びAA-PEG-A-Zn-Zol(ｘ)粒子の細胞毒性アッセイを示すグラフである。図35A及びBのいずれもにおいても、ゾレドロネート(Zol)は菱形で示す。
【図３６】Aは、肝臓、肺、脾臓、腎臓、膀胱及び血液中のPEG化アモルファスマンガンゾレドロネート(PEG-A-Zn-Zol)ナノ粒子の注射用量（ｘ軸に、注射用量に対する割合（D%）として示す）の分布を示すグラフである。注射後の異なる時点（即ち、左から右へ0.08、1、3、8、24及び36時間）におけるD%を提供する。Bは、マウスにおけるPEG化アモルファスマンガンゾレドロネート(PEG-A-Zn-Zol)の血液循環プロファイルを示すグラフである。
【図３７】Mn-Zol＠DOPA（A）、PEG-A-Zn-Zol（B）、及びAA-PEG-A-Zn-Zol（C）粒子の縦方向（ｒ1、四角）と横方向（ｒ2、菱形）のMR緩和を示すグラフである。
【図３８】１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェートを含むマイクロエマルジョン中で調整された、シス、シス、トランス−[Pt(NH3)2Cl2(OH)2]ビスホスホネート亜鉛ナノ粒子(cisPtBp-Zn-DOPA)の透過型電子顕微鏡（TEM）像である。
【図３９】図36のナノ粒子をPEG化したもの（cisPtBp-Zn-PEG）の透過型電子顕微鏡（TEM）像である。
【図４０】１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェートを含むマイクロエマルジョン中で調整された、ジクロロ-R,R-ジアミノシクロヘキサン白金ビスホスホネート複合体-亜鉛ナノ粒子(DACHPtBp-Zn-DOPA)の透過型電子顕微鏡（TEM）像である。
【図４１】図40のナノ粒子をPEG化したもの（DACHPtBp-Zn-PEG）の透過型電子顕微鏡（TEM）像である。
【図４２】ウシ血清アルブミン（BSA）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の、図39のPEG化ナノ粒子（cisPtBp-Zn-PEG）の安定性試験の結果を示すグラフである。ナノ粒子の多分散性指数（PDI）に関するデータは丸で示され、ナノ粒子サイズに関するデータは四角で示され、計数率(%)に関するデータは三角で示す。
【図４３】Aは、肝臓、肺、脾臓、腎臓、膀胱及び血液中の図39のPEG化ナノ粒子（即ち、cisPtBp-Zn-PEGナノ粒子）の注射用量（ｘ軸に、注射用量に対する割合（D%）として示す）の分布を示すグラフである。注射後の異なる時点（即ち、左から右へ0.08、1、3、8、24及び36時間）におけるD%を提供する。Bは、マウスにおける図39のPEG化ナノ粒子（即ち、cisPtBp-Zn-PEGナノ粒子）の血液循環プロファイルを示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明を、ここで、代表的な実施形態を示す添付の実施例を参照して、より完全に説明する。しかしながら、本発明は、異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載された実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が徹底的かつ完全となり、かつ当業者に実施態様の範囲を十分に伝えるように提供される。
他に定義しない限り、使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同等又は類似の如何なる方法、装置及び材料を、本発明を実施又は試験するために使用することができるが、ここには代表的な方法、装置及び材料のみを記載する。全ての刊行物、特許出願、特許及び本明細書で引用する他の参考文献は、その全体が参考として援用される。
明細書及び特許請求の範囲を通して、記載した化学式又は名称は、全ての光学異性体及び立体異性体、並びにこのような異性体や混合物が存在するラセミ混合物を包含する。
【００２４】
略語
℃：摂氏； ％：パーセント； μＭ：マイクロモル； ＡＡ：アニスアミド； ＢＰ：ビスホスホネート； Ｃａ：カルシウム； Ｃａ−ＰＡＭ：カルシウムパミドロネート；Ｃａ−Ｚｏｌ：カルシウムゾレドロネート； ｃｉｓＰｔ：シスプラチン； ＤＡＣＨ：Ｒ，Ｒ−ジアミノシクロヘキサン； ＤＬＳ：動的光散乱； ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド； ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド； ＤＯＰＡ：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸ナトリウム塩； ＤＯＰＣ：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン； ＤＯＰＥ：ジオレオイル  Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン； ＤＯＴＡＰ：１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン； ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）２０００］； ＥＤＳ：エネルギー分散型Ｘ線分光法； ＥｔＯＨ：エタノール； ｇ：グラム； ｈ：時間； ＩＣ５０：５０％阻止濃度； ＩＣＰ−ＭＳ：誘導結合プラズマ質量分析法； ｋｇ：キログラム； ｍｇ：ミリグラム； ｍｉｎ：分； ｍＬ：ミリリットル； ｍＭ：ミリモル； ｍｍｏｌ：ミリモル； Ｍｎ：マンガン； Ｍｎ−Ｚｏｌ：マンガンゾレドロネート； ＭＲＩ：磁気共鳴イメージング； ｎｍ：ナノメートル； ＮＭＲ：核磁気共鳴； ＭＷ：分子量； Ｐａｍ：パミドロネート； ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水； ＰＤＩ：多分散指数； ＰＥＧ：ポリエチレングリコール； ＰＥＴ：陽電子放出断層撮影； ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン；ｒ：半径； ＲＥＳ：細網内皮系； ＲＧＤ：アルギニン−グリシン−アスパラギン酸； ｒｐｍ：回転数毎分； ＳＥＭ：走査電子顕微鏡； ｓｉＲＮＡ：低分子干渉リボ核酸； ＳＰＥＣＴ：単光子放出コンピュータ断層撮影； ＴＥＭ：透過電子顕微鏡法； ＴＧＡ：熱重量分析； Ｗ：ワット； Ｚｎ：亜鉛； Ｚｏｌ：ゾレドロネート
【００２５】
Ｉ．定義
以下の用語は、当業者により良く理解されると信ずるが、以下の定義は本発明の説明を円滑にするために示すものである。
長年の特許法の慣習に従って、用語「a（一つ）」、「an（一つ）」及び「the（その）」は、特許請求の範囲を含む本出願で使用される場合、「1つまたはそれ以上」を表す。従って、例えば、「金属イオン」という表現は、このような金属イオンの複数を含む。
特に断らない限り、サイズの大きさ、反応条件、及び明細書及び特許請求で用いられるすべての数値は、すべての場合「約」という用語によって修飾されると理解すべきである。従って、反対の指示がない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲において記載される数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。
値又はサイズの大きさ（例えば、半径又は直径）、重量、濃度若しくはパーセンテージを表す場合、本明細書で用いられる「約」という用語は、特定された量から、ある例においては±20％又は±10％、他の例においては±5％、他の例においては±1％、更に他の例においては±0.1％の変化を包含することを意味し、このような変化は開示された方法を実施するのに適切である。
本明細書で使用される用語「及び/又は」は、実体の一覧に関連して用いられ、その実体が単独で又は組み合わせて存在することを表す。従って、例えば、語句「A、B、C、及び/又はD」は、個々のA、B、C、及びDを含むだけでなく、A、B、C、及びDの任意及び全ての組み合わせ及び下位の組み合わせを含む。
【００２６】
用語「comprising（から成る）」は、「including（含む）」、「containing（含む）」又は「characterized by(により特徴付けられる)」と同様に、包含的又は制約が無く、付加的な、非列挙の要素又は方法段階を排除しない。「comprising（から成る）」は、名付けられた要素は存在するが、他の要素も加えることが可能であり、それでも特許請求の範囲の構成物や方法を形成することができることを意味する技術用語である。
用語「consisting of（のみから成る）」は、請求の範囲に明記してない全ての要素、段階又は内容物を除外する。成句「consist of（のみから成る）」が、プレアンブルに直ちに続かないで、請求の範囲の本体に現れる場合、示された要素のみに限定されるが、他の要素は、全体として請求の範囲から排除されない。
用語「consisting essentially of(本質的に、から成る)」は、請求範囲を、明記した材料又は段階に限定して、さらに請求範囲の発明事項の基本的及び新規の特徴に実質的に影響しない材料又は段階を限定する。
用語「comprising（から成る）"、「consisting of（のみから成る）」及び「consisting essentially of(本質的に、から成る)」に関して、これらの３種の用語の１種が本明細書で用いられた時、本発明は、他の２種の用語のいずれかの使用を含めることができる。
【００２７】
用語「ナノ材料」及び「ナノ粒子」は、約1,000nm未満の寸法（例えば、長さ、幅、直径など）を有する少なくとも一つの領域を有する構造を表す。いくつかの実施態様において、この寸法はより小さい（例えば、約500nm未満、約250nm未満、約200nm未満、約150nm未満、125nm未満、約100nm未満、約80nm未満、約70nm未満、約60nm未満、約50nm未満、約40nm未満、約30nm未満又はさらに約20nm未満）。いくつかの実施態様において、この寸法は約10nm未満である。
いくつかの実施態様において、このナノ材料又はナノ粒子はほぼ球形である。ナノ粒子がほぼ球形である場合には、その特徴的な寸法は、その球の半径又は直径に対応することができる。球形に加えて、このナノ材料は円盤状、楕円形、多面体、棒状、立方体、又は不規則な形状でありうる。
【００２８】
このナノ粒子は、コア領域（即ち、この粒子のより外側の要素の間の空間）と外表面（即ち、この粒子の外側の要素を規定する面）から成ることができる。いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、このナノ粒子のコアを取り囲む又は部分的に取り囲む１又はそれ以上のコーティング層を有することができる。従って、例えば、球状のナノ粒子は、一つまたはそれ以上の同心のコーティング層を有することができ、各連続層は、その粒子の中心により近くより小さな層の外表面上に分散される。ここに開示するナノ粒子は、典型的には、金属−ビスホスホネートナノ粒子から成る固体材料から成り、それは一つまたはそれ以上の孔又は中空内部領域を有することができる。この材料は、アモルファス又は結晶性であってもよい。いくつかの実施態様において、このナノ粒子のコアは、さらに、１又はそれ以上のイメージング剤及び/又は非ビスホスホネート治療薬（例えば、非ビスホスホネート抗癌剤）を含み、これらはこの金属−ビスホスホネートのコア材料中に物理的に捕捉され、この金属−ビスホスホネートのコア材料の金属イオンに配位し、又は共有結合又はイオン結合を介して（例えば、ビスホスホネート）に化学的に結合してもよい。いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、本質的にホスフェートイオン（即ち、PO43-、HPO42-、及びH2PO4-）を含まない。
【００２９】
このコアが非ビスホスホネート治療剤又はイメージング剤を含む場合、これらの薬剤は、このナノ粒子に「埋め込まれた」ということができる。この「埋め込まれた」とは、この治療剤又はイメージング剤が、この粒子（例えば、ビスホスホネート又は金属イオン）のコア内部に、共有結合した又は配位結合を介して結合した等、結合したことをいう。あるいは、この複合体又は薬剤は、そのコア中に細孔内に隔離され（即ち、非共有結合的に包含され）、又は水素結合、ロンドン分散力、又は任意の他の非共有相互作用を介して、そのコア材料と相互作用してもよい。
【００３０】
用語「ポリマー」及び「高分子」は、繰り返し単位（即ち、所定の化学下部構造の複数のコピー）を持つ化学構造を表す。ポリマーは、重合性モノマーから形成することができる。重合性モノマーは、重合性モノマーの他の分子上の反応性部分と結合（例えば、共有結合）を形成するように反応することができる１又はそれ以上の反応性部分を含む分子である。一般に、各重合性モノマー分子は、２つ又はそれ以上の他の分子と結合することができる。いくつかの場合において、重合性モノマーは、唯一つの他の分子と結合し、そのポリマー材料の末端を形成する。
ポリマーは、有機若しくは無機又はそれらの組み合わせであってもよい。本明細書で使用される用語「無機」は、炭素、水素、窒素、酸素、硫黄、リン、又はハロゲン以外の、少なくともいくつかの原子を有する化合物又は組成物のことを表す。従って、例えば、無機化合物又は組成物は、１又はそれ以上のケイ素原子及び/又は１又はそれ以上の金属原子を含んでもよい。
本明細書で使用される「有機ポリマー」は、その繰り返し単位中にシリカや金属原子を含まないものである。典型的な有機ポリマーとして、ポリビニルピロリドン（PVP）、ポリエステル、ポリアミド、ポリエーテル、ポリジエンなどが挙げられる。いくつかの有機ポリマーは、生物学的条件下で経時的に分解することができるように、例えば、エステルやアミドのような生分解性結合を含有する。
【００３１】
本明細書で使用する用語「親水性ポリマー」は、一般に、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメチルアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール（即ち、PEG）又は他の親水性ポリ（アルキレンオキシド）、ポリグリセリン、及びポリアスパルトアミド等の親水性有機ポリマーを表す。この「親水性」という用語は、水と相互作用する分子種又は化学種の能力を表す。従って、親水性ポリマーは、典型的には極性であるか、又は水に水素結合することができる基を有する。
【００３２】
用語「イメージング剤」は、その試料の可視化を助ける化学成分を表す。例えば、イメージング剤は、「コントラスト剤」であってもよく、また検査される生物学的組織又は構造のコントラストを増加させる部分（分子、マクロ分子、配位複合体、又はナノ粒子の特定部分又は全体）を表すことができる。
このコントラスト剤は、磁気共鳴イメージング（MRI）、光学イメージング、陽電子放出断層撮影（PET）イメージング、単一光子放出コンピュータ断層撮影（SPECT）イメージング、又はそれらの組み合わせ（即ち、このコントラスト剤はマルチモーダルであってもよい。）を用いて検査される構造のコントラストを高めることができる。
用語「MRIコントラスト剤」は、試料中の水プロトンの誘導緩和速度の変化に影響を与える部分のことを表す。
用語「光学イメージング剤」又は「光学コントラスト剤」は、光（例えば、紫外線、可視光、又は赤外光）を吸収し、反射し又は放射する能力に基づいて検出することができるグループのことを表す。光学イメージング剤は、吸光度、反射率若しくは蛍光の変化、又は吸光度ピーク若しくはそれらの最大波長数の変化の変化に基づいて検出されることができる。従って、光学イメージング剤は、有機色素や無機色素を含む、蛍光又はルミネッセンス（発光）に基づいて検出されうるものを含む。
【００３３】
本明細書で用いられる用語「リガンド（又は配位子）」は、別の種との何らかの方法で相互作用（例えば、結合又はキレート）する分子やイオンのような化学種のことを表す。用語「リガンド」は、溶液中の金属イオンと結合して「配位複合体」を形成する分子やイオンのことを表してもよい。Martell, A. E., and Hancock, R. D., Metal Complexes in Aqueous Solutions, Plenum: New York (1996)を参照されたい。この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。用語「リガンド」はまた、生物特異的認識事象（例えば、抗体-抗原結合、酵素-基質認識、受容体-受容体リガンド結合など）に関与する分子のことを表してもよい。
「配位複合体」は、金属イオンと電子対ドナー（即ち、キレート基又はリガンド）との間に配位結合が存在する化合物である。従って、キレート基は、一般に、金属イオンへ与えるために利用可能な非共有電子対を有する、電子対ドナー、分子または分子イオンである。キレート基又は金属イオンリガンドは、一座配位性又は多座配位性であってもよい。「多座配位性」は、金属イオンへ与えるための２，３，４又はそれ以上の電子対を有し、複数の配位部位で金属イオンに配位可能なキレート剤のことを表す。「一座配位性」は、唯一の配位部位で金属イオンに配位するキレート剤のことを表す。
【００３４】
用語「結合（bonding）」又は「結合した」及びこれらの変形は、共有結合又は非共有結合のいずれかを表すことができる。いくつかの場合において、用語「結合」は、配位結合を介した結合のことを表す。用語「抱合(conjunction)」は、共有結合又は配位結合の形成だけでない結合プロセスのことを表してもよい。
用語「配位」は、一つの多電子対ドナーが配位的結合する、即ち、一つの金属イオンに「配位」する、相互作用のことを表す。
用語「配位結合」は、結果的に電子対ドナーと金属イオンとの間に引力が発生させる、電子対ドナーと金属イオン上の配位部位との間の相互作用のことを表す。この用語の使用は、金属イオンと電子対ドナーの特性に応じて、多かれ少なかれ共有結合性（完全に共有結合性でないにしても）と分類できる特定の配位結合に限定することを意図していない。
【００３５】
本明細書において、用語「常磁性金属イオン」は、磁場の大きさに比例して、磁場に平行又は反平行に磁化される金属イオンのことを表す。一般に、常磁性金属イオンは、不対電子を有する金属イオンである。常磁性金属イオンは、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、コバルト、ニッケル、銅、モリブデン、ルテニウム、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム及びイッテルビウムを含む遷移及び内部遷移元素、からなる群から選択されうるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、この常磁性金属イオンは、ガドリニウムIII (即ち、Gd+3又はGd(III)); マンガンII (即ち、Mn+2又はMn(II)); 銅II (即ち、Cu+2又はCu(II)); クロムIII (即ち、Cr+3又はCr(III)); 鉄II (即ち、Fe+2又はFe(II)); 鉄III (即ち、Fe+3又はFe(III)); コバルトII (即ち、Co+2又はCo(II)); エルビウムII (即ち、Er+2又はEr(II)), ニッケルII (即ち、Ni+2又はNi(II)); ユーロピウムIII (即ち、Eu+3又はEu(III)); イットリウムIII (即ち、Yt+3又はYt(III)); 及びジスプロシウムIII (即ち、Dy+3又はDy(III))からなる群から選択することができる。いくつかの実施態様において、その高い磁気モーメント、対称な電子基底状態、及び現在ヒトでの診断の使用に承認されていることにより、この常磁性イオンはランタニド原子Gd（III）である。
【００３６】
「ルミネッセンス（発光）」は、電子的励起状態にある分子（又は他の化学種）が、光子を放出して、より低いエネルギー状態に緩和するときに、起こる。ある実施態様において、この発光剤は化学発光剤であってもよい。化学発光においては、この励起状態は、ルミノールやイソルミノールなどの化学反応の結果として生成される。蛍光や燐光などのフォトルミネッセンスでは、電子的励起状態は、外部光源により分子を照射することにより生成される。生物発光は、ルシフェラーゼなどの酵素による反応の結果として発生しうる。電気化学発光（ECL）では、電子的励起状態は、適切な周囲の化学的環境中で、分子（又は前駆体分子）を電気エネルギーに暴露することにより生成される。電気化学発光剤の例は、例えば、米国特許第5147806号、同第5641623号、及び米国特許出願公開2001/0018187に提供され、金属陽イオン−液体複合体、置換又は非置換の多環芳香族分子、及びイソベンゾフランやインドールのアリール誘導体などの混合系が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、電気化学発光の化学的部分は、金属含有有機化合物から成り、この金属は、ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、パラジウム、モリブデン、テクネチウム及びタングステンからなる群から選択される。
【００３７】
上述したように、用語「フルオロフォア（蛍光団）」は、可視光又は非可視光（例えば、紫外光）によって励起することができる種を表す。フルオロフォアの例としては、量子ドットとドープ量子ドット（例えば、半導体のCdSe量子ドット又はMnドープCdSe量子ドット）、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体及び類似体、インドシアニングリーン、ローダミン、トリフェニルメチン、ポリメチン、シアニン、フタロシアニン、ナフトシアニン、メロシアニン、ランタニド複合体又はクリプタート、フラーレン、オキサテルラゾール（oxatellurazole）、ラホヤブルー、ポルフィリン及びポルフィリン類似体、並びにクロロフィル、カロテノイド、フラボノイド、ビリン(bilins)、フィトクロム、フィコビリン、フィコエリトリン、フィコシアニン、レチノイン酸及びレチノイン(retinoins)やレチネート(retinates)などの類似体のような天然の発色団／蛍光団が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
用語「量子ドット」とは、ルミネセンス性の（即ち、励起時に電磁放射線を放射することが可能である）無機結晶材料から成る半導体ナノ粒子を表す。この量子ドットは、必要に応じて、第2の半導体材料から成るオーバーコーティング又は「シェル」の中に含まれる1つまたはそれ以上の第1の半導体材料から成る内部コアを含んでもよい。半導体シェルに囲まれた半導体ナノ結晶コアは、「コア/シェル」型半導体ナノ結晶と呼ばれる。周囲のシェル材料は、必要に応じて、コア材料のバンドギャップエネルギーより大きなバンドギャップエネルギーを有してもよく、またコア基板の原子間隔に近い原子間隔を有するように選択してもよい。
量子ドットのための適切な半導体材料として、元素の周期律表の第２族及び第１２族から選択される第一の要素及び第１６族から選択される第二の要素から成る材料が挙げられるが、これに限定されない。このような材料として、ZnS、ZnSe、ZnTe、CDs、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe等が挙げられるが、これらに限定されない。適切な半導体材料として、また、元素の周期律表の第１３族から選択される第一の要素及び第１５族から選択される第二の要素から成る材料が挙げられる。このような材料として、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InN、InP、InAs、InSbなどが挙げられるが、これらに限定されない。半導体材料として、更に、第１４族（ゲルマニウム、シリコン等）から成る材料が挙げられ、このような材料として、PbS、PbSeなどの材料、及びこれらの合金及び混合物が挙げられる。ここで使用される元素の周期律表や族は、それらの要素グループに番号を付けるための新しいIUPACシステムによるものであり、化学と物理のハンドブック第81版（Handbook of Chemistry and Physics, 81st Edition (CRC Press, 2000)）に記載されている。
【００３９】
「アルキル基」は、線型（即ち、直鎖）、分枝型、又は環状、飽和、又は少なくとも部分的に飽和、及び幾つかの場合完全に不飽和型（即ち、アルケニル基及びアルキニル基）炭化水素鎖を含むＣ１〜２０を表わし、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、オクテニル基、ブタジエニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、及びアレニル基が含まれる。「分枝型」は、メチル基、エチル基又はプロピル基のような低級アルキル基が線型アルキル鎖に付加したアルキル基を表す。「低級アルキル基」は、１から８炭素原子（即ち、Ｃ１〜８アルキル基）例えば、１，２，３，４，５，６，７又は８炭素原子、を有するアルキル基を表す。「高級アルキル基」は、約１０から約２０炭素原子、例えば、１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，又は２０炭素原子、を有するアルキル基を表す。ある態様において、「アルキル基」は特に、Ｃ１〜８直鎖アルキル基を表す。他の態様において、「アルキル基」は特に、Ｃ１〜８分枝鎖アルキル基を表す。
【００４０】
アルキル基を、任意に１個以上の、同一又は異なる、アルキル基置換基により置換することができる（「置換アルキル基」）。用語「アルキル基置換基」はアルキル基、置換アルキル基、ハロ基、アリールアミノ基、アシル基、ヒドロキシル基、アリールオキシル基、アルコキシル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルオキシル基、アラルキルチオ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、オキソ基及びシクロアルキル基を含むが、これらに制限されない。いくつかの実施態様において、アルキル鎖に沿って、任意に、１以上の酸素原子、イオウ原子又は置換窒素原子又は非置換窒素原子を挿入することができて、ここで、窒素置換基は、水素原子、低級アルキル基（本明細書ではまた、「アルキルアミノアルキル基」と表す）又はアリール基である。
【００４１】
従って、「置換アルキル基」は、本明細書で定義したように、アルキル基を含み、ここでアルキル基の１以上の原子又は官能基が他の原子又は官能基に置き換えられ、例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン原子、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、ヒドロキシル基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸基及びメルカプト基が含まれる。
【００４２】
「アリール基」は、単一芳香族環、又は互いに融合した、又は共有結合で連結した、又はメチレン基又はエチレン基部分のような、しかしこれらに制限されない、一般的な置換基に結合した芳香族部分を表す。一般的な連結基はまた、ベンゾフェノンにおける様なカルボニル基、又はジフェニルエーテルにおける様な酸素原子、又はジフェニルアミンにおける様な窒素原子であってもよい。用語「アリール基」は、とりわけ複素環式芳香族化合物を含む。この芳香族環（複数もあり）は、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基、ジフェニルエーテル基、ジフェニルアミン基及びベンゾフェノン基を含むことができる。特別の実施形態において、用語「アリール基」は、約５から約１０炭素原子、即ち５，６，７，８，９又は１０炭素原子を含む環状芳香族基を意味し、及び５−及び６−員環の炭化水素、及び複素環式芳香族環を含む。
【００４３】
アリール基は、任意に、１以上の同一又は異なる、アリール基置換基と置き換えることができて（「置換アリール基」）、ここで「アリール基置換基は」アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、アラルキル基、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アリールオキシル基、アラルキルオキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、アシル基、ハロ基、ニトロ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルコキシカルボニル基、アシルオキシル基、アシルアミノ基、アロイルアミノ基、カルバモイル基、アルキルカルバモイル基、ジアルキルカルバモイル基、アリールチオ基、アルキルチオ基、アルキレン基及びＮＲ'Ｒ''を含み、ここでＲ'及びＲ''は、夫々独立に、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基、置換アリール基、及びアラルキル基である。
【００４４】
従って、「置換アリール基」は、本明細書で定義したように、アリール基を含み、ここでアリール基の１以上の原子又は官能基は、他の原子又は官能基と置き換えられ、官能基としては、例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン原子、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、ヒドロキシル基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸基及びメルカプト基が含まれる。
アリール基の特別な例としては、シクロペンタジエニル基、フェニル基、フラン基、チオフェン基、ピロール基、ピラン基、ピリジン基、イミダゾール基、ベンズイミダゾール基、イソチアゾール基、イソクサゾール基、ピラゾール基、ピラジン基、トリアジン基、ピリミジン基、キノリン基、イソキノリン基、インドール基、カルバゾール基等々が含まれるが、これらに制限されない。
【００４５】
本明細書で使用される「ヘテロアリール」は、環構造の骨格内の１つ以上の非炭素原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅなど）を含有するアリール基を表す。窒素含有ヘテロアリール部分としては、ピリジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、ピラゾール、ピラジン、トリアジン、ピリミジンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「ジアルキルアミノ」は、ＮＲＲ'基を表し、ここで各Ｒ及びＲ'は、夫々独立に、前述のアルキル基及び/又は置換アルキル基である。ジアルキルアミノ基としては、例えば、エチルメチルアミノ基、ジメチルアミノ基、及びジエチルアミノ基が挙げられる。「アルキルアミノ」は、ＮＲＲ'基を表し、ここでＲ及びＲ'のうちの一つは水素原子であり、他はアルキル基又は置換アルキル基である。
用語「アミノ」は、−ＮＨ２基を表す。「アミノ」はまた上記のジアルキルアミノ又はアルキルアミノを表す。
用語「アリールアミノ」は、アリール−Ｎ（Ｒ）−基を表し、このＲは水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基である。
ここで使用される用語「ハロ」、「ハロゲン化物」又は「ハロゲン」は、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基及びヨード基を表す。
用語「ヒドロキシル」は−ＯＨ基を表す。
用語「メルカプト」又は「チオール」は−ＳＨ基を表す。
「アルコキシル」は、アルキル−Ｏ−基を表し、このアルキルは前述のとおりである。ここで用いられる用語「アルコキシル」は、例えば、メトキシル、エトキシル、プロポキシル、イソプロポキシル、ブトキシル、t-ブトキシル、及びペントキシルを表す。用語「オキシアルキル」は、「アルコキシル」と互換的に使用することができる。
【００４６】
用語「アルキルチオ」は、アルキル−Ｓ−基を表す。
「アリールオキシ」は、アリール−Ｏ−基を表し、このＲは上記のとおりであるが、置換アリール基を含む。ここで使用する用語「アリールオキシ」は、フェニルオキシ基やアルキル基、置換アルキル基、ハロ基、又はアルコキシ置換フェニルオキシ基を表すことができる。
用語「アリールチオ」は、アリール−Ｓ−基を表す。
「アラルキル」は、アリール−アルキル基を表し、このアリール及びアルキルは前記のとおりであるが、置換アリール基や置換アルキル基を含む。アラルキル基としては、例えば、ベンジル基、フェニルエチル基、及びナフチルメチル基が挙げられる。
用語「ホスホネート」は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２基を表し、ここで各Ｒは独立して水素原子、アルキル基、アラルキル基、アリール基、又は負電荷（即ち、この酸素原子に結合するＲ基が存在せず、その結果この酸素原子上に未結合の電子ペアが存在する）である。従って、別の言い方をすれば、各Ｒは、存在しても又はしなくてもよく、存在する場合には、水素原子、アルキル基、アラルキル基又はアリール基を表す。
用語「シリル」は、ケイ素原子（Ｓｉ）を含む基を表す。
用語「シロキサン」は、−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ−結合を含む化合物を表す。ここで用いられる用語「ポリ（シロキサン）」は、式Ｒ２ＳｉＯので表されるポリマー基又は化合物を表し、Ｒは水素原子、アルキル基、アラルキル基、又はアリール基を表す。
用語「ポリ（シルセスキオキサン）」は、式ＲＳｉＯ１．５のポリマー基又は化合物を表し、Ｒは水素原子、アルキル基、アラルキル基、又はアリール基を表す。
【００４７】
用語「脂質」は、脂肪酸、リン脂質、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質(saccharolipid)、又はポリケチドのような、但しこれらに限定されない、疎水性又は両親媒性低分子を表してもよい。
用語「疎水性」は、水と相互作用する能力を欠く分子又は化学種を表す。用語「両親媒性」は、親水性と疎水性の両方の属性を有する分子又は化学種を表す。
ここで使用する用語「癌」は、制御されていない細胞分裂、及び細胞が転移する能力又は細胞が追加の部位で新たな成長を確立する能力、に起因する疾患を表す。用語「悪性」、「悪性腫瘍」、「新生物(neoplasm)」、「腫瘍」、「癌」及びその変異は、癌細胞又は癌細胞のグループを表す。
癌の特定の種類としては、皮膚癌（例えば、メラノーマ）、結合組織癌（例えば、肉腫）、脂肪癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌（例えば、中皮腫）、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、肛門性器癌（例えば、精巣癌）、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、中枢神経系（CNS）癌、網膜癌、血液、神経芽細胞腫、多発骨髄腫、及びリンパ系の癌（例えば、ホジキンリンパ腫や非ホジキンリンパ腫）が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「抗癌剤」及び「抗癌プロドラッグ」は、癌を治療する（即ち、癌細胞を死滅させる、癌細胞の増殖を防げる、又は癌に関連する症状を治療する）ことが知られている又はそう考えられている薬物又はプロドラッグを表す。
【００４８】
ＩＩ．一般的考察
いくつかの実施態様において、本発明は、金属ビスホスホネートナノ材料（例えば、ナノ粒子）に関し、これらのナノ材料の合成、これらの表面改質と機能化、及びこれらの抗癌剤及び/又は骨関連障害の治療薬又はこれらの治療剤及びイメージング剤の両方としての使用を含む。このナノ材料は、ビスホスホネートに金属イオンを配位すること基づいてもよい。
一般に、このナノ材料は、固体結晶又はアモルファスの金属イオン−ビスホスホネート材料から成ることができる。このナノ粒子の合成は、適切な合成条件（例えば、溶媒、濃度、温度及び/又はpH）を選択することによって、結晶性又はアモルファス材料のいずれかを達成するように調整することができる。いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、例えば、重量で、50％以上（例えば、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又はそれ以上）のビスホスホネートを含んでもよい。
【００４９】
いくつかの実施態様において、この金属ナノ粒子は、ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を用意する段階、このビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を、エージングされた溶液を提供するための期間エージングする段階、及びこのエージングされた溶液から金属−ビスホスホネートナノ粒子を単離する段階、から成る方法で作ることができる。いくつかの実施態様において、この多価金属イオンは２価である。適切な２価金属イオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、及びこれらの組み合わせであるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、このビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液は、少なくとも２つの異なる多価金属イオンを含む、及び／又は、少なくとも一つの常磁性多価金属イオンを含む。いくつかの実施態様において、この溶液は一種類の多価金属イオンから成る。いくつかの実施態様において、このビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液は、常磁性金属イオン、ホスフェートイオン、及び／又は白金金属イオンを含まない。
【００５０】
如何なる適切なビスホスホネート化合物又は複合体を使用してもよい。いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、両方とも同じ炭素原子又は同じ炭素原子鎖に結合する２個のホスホネート基を有する化合物である。いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは下式
【化１】
0006049712.tif 000005
（式中、ｎ及びｍはそれぞれ独立して０〜２の整数（即ち、それぞれ独立して０、１又は２である。）を表し、各Ｒは、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、アリール基、及び置換アリール基からなる群から選択され、Ｒ１は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルキル基、置換アルキル基、アミノ基、アルコキシ基及びアルキルチオ基から成る群から選択され、Ｒ２は、ハロゲン原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、置換アラルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基及びアリールアミノ基からなる群から選択される。）で表される構造を有する、又はその塩である。いくつかの実施態様において、ｎ及びｍの少なくとも一つは２である。いくつかの実施態様において、ｎ及びｍの少なくとも一つは１である。いくつかの実施態様において、各Ｒは水素原子である。いくつかの実施態様において、Ｒ１は水酸基又は水素原子である。
いくつかの実施態様において、Ｒ２は、置換アルキル基又はアラルキル基である。いくつかの実施態様において、この置換アルキル基は、ＮＨ２−置換アルキル基、アルキルアミノ置換アルキル基、又はジアルキルアミノ置換アルキル基である。いくつかの実施態様において、このアラルキル基は、窒素含有ヘテロアリール部分（例えば、イミダゾール又はピリジン）を含むアラルキル基である。
【００５１】
従って、適切なビスホスホネートとしては、ゾレドロン酸、パミドロネート、リセドロン酸、アレンドロネート、ゼリドロン酸（zeridronic acid）、チルドロネート、エチドロネート、及びイバンドロネートが挙げられるが、これらに限定されない。これらのビスホスホネートの構造を、以下スキーム1に示す。
【化２】
0006049712.tif 000006
【００５２】
いくつかの実施態様において、ビスホスホネートは、式（化１）で表される化合物ではない。いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは金属複合体であって、少なくとも２つの金属配位子は、この金属複合体の金属に配位していないホスホネート基から成る。例えば、いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、白金金属複合体（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン又は類似の化合物）であって、２つの白金配位子は、ホスホネート含有基で置換され、又はホスホネート含有基に結合している。従って、いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、式Ｍ２Ｌｘ（式中、ｘは２以上の整数であり、Ｍ２は金属イオン（例えば、Ｐｔ）であり、各Ｌは金属イオンの配位子であり、少なくとも２つのＬはホスホネート基を含む。）で表される金属複合体である。いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、式Ｍ２Ｌｘ−２［−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２］２（式中、各Ｒは、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、アリール基又は負電荷である。）で表される。
【００５３】
いくつかの実施態様において、ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液は、溶媒にビスホスホネート及び多価金属前駆体を溶解することによって用意することができる。いくつかの実施態様において、この溶媒は、水性溶媒又は水と水混和性溶媒の組み合わせであり、この水混和性溶媒は、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジメチルホルムアミド（DMF）、アセトニトリル、アセトン、又は水混和性アルコールである。いくつかの実施態様において、この溶媒は、水又は水とDMFの混合物である。
この多価金属前駆体は、ＭＬｘ（式中、ｘは該金属イオンの原子価に相当する整数を表し、Ｍは多価金属イオンを表し、各Ｌは配位子を表す。）で表される化合物であってもよい。適切な配位子として、ハロゲン原子、水酸基、スルフェート、及びアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、この多価金属前駆体は、式ＭＬｘで表される化合物の水和物又は溶媒和物である。いくつかの実施態様において、この多価金属前駆体は金属ハロゲン化物（例えば、CaCl2又はMnCl2）又はその水和物若しくは溶媒和物である。
【００５４】
いくつかの実施態様において、ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液は、このビスホスホネートの前駆体溶液と多価金属イオンを含む前駆体溶液を混合することによって用意することができる。この多価金属イオンを含む前駆体溶液は、適切な溶媒に多価金属前駆体（例えば、ＭＬｘで表される化合物又はその水和物若しくは溶媒和物）を溶解することによって用意することができる。ビスホスホネートの前駆体溶液は、適切な溶媒にビスホスホネートを溶解することによって用意することができる。
ビスホスホネート及び金属前駆体は、１つ又は複数のマイクロエマルジョン中で一緒に混合される。いくつかの実施態様において、このマイクロエマルションの１つ又はそれ以上は脂質を含むことができ、このナノ粒子は、このナノ粒子の外面の少なくとも一部に脂質層（例えば、脂質単層）を含むように形成される。いくつかの実施態様において、この脂質は、ＤＯＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ、オレイン酸、ステアリン酸、オクタデシルリン酸、又はオクタデシルホスホン酸である。
【００５５】
いくつかの実施態様において、ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を用意する段階は、更に、溶液又は前駆体溶液（即ち、ビスホスホネート及び／又は多価金属イオンを含む）のｐＨを調整する段階を含む。例えば、１つまたはそれ以上の溶液にｐＨ調整化学物質（即ち、アンモニア又はＨＣｌなどのｐＨを上昇させる又は低下させる化合物）を添加してもよい。
この金属−ビスホスホネートナノ粒子製剤に、ビスホスホネートに加えて、他の適切な治療剤又はそれらのプロドラッグを組み込むことができる。これらのナノ物質の治療効果は、ナノ粒子中に含まれている薬剤（貨物）の抗癌活性から誘導されるか、又は光線力学療法におけるレーザー光子活性化又は放射線感作における電離放射線（Ｘ線など）のような、外部トリガの結果であることができる。
いくつかの実施態様において、本発明のナノ粒子は、一つ又はそれ以上のイメージング剤を含むことができる。ナノ粒子中に含有させることができるイメージング剤は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）用の高度の常磁性中心（例えば、Ｍｎ２＋）から、光学イメージング用光学フルオロフォア、及び陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）又は単光子陽電子放出断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージング用の放射性金属中心（例えば、６４Ｃｕ、１１１Ｉｎ、及９９ｍＴｃ）に及んでいる。このナノ粒子のいくつかは、化学療法と放射線療法を組み合わせるために、従来の抗がん剤やプロドラッグとβ−放出放射性核種（例えば、９９Ｙ）の両方を含んでもよい。
【００５６】
いくつかの実施態様において、ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を用意する段階は、更に、このビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液又はその前駆体溶液に、一つ又はそれ以上の非ビスホスホネート治療薬若しくはそのプロドラッグ及び/又は一つ又はそれ以上のイメージング剤を添加する段階を含む。いくつかの実施態様において、これら非ビスホスホネート治療薬若しくはプロドラッグ及び/又はイメージング剤は、例えば、化学療法剤、光線力学療法剤、放射線増感剤、ベータ放出放射性核種、治療用タンパク質若しくはペプチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び蛍光体を含むことができる。いくつかの実施態様において、非ビスホスホネート治療薬、そのプロドラッグ及び/又はイメージング剤は、多価金属イオンに配位可能な単数又は複数の官能基（例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基など）を有する。いくつかの実施態様において、非ビスホスホネート治療剤、プロドラッグ又はイメージング剤は、共有結合でビスホスホネートに結合する。いくつかの実施態様において、この共有結合を生理学的条件下（例えば、一定のｐＨ、又は特定の酵素の存在下）で切断可能であるように設計することができる。
【００５７】
いくつかの実施態様において、ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を、エージング前にマイクロ波にかける。いくつかの実施態様において、このエージングは、ビスホスホネート及び多価金属イオンを含む溶液を、室温より高い温度（例えば、約20、21、22、23、24又は25℃以上）で一定時間加熱することから成る。いくつかの実施態様において、この室温より高い温度は、約80℃と約140℃の間（例えば、約80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135又は140℃）である。いくつかの実施態様において、この一定時間は、約20分と約24時間の間（例えば、約20、25、30、35、40、45、50、55若しくは60分、又は約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24時間）である。いくつかの実施態様において、この一定時間は、1日より長い。
【００５８】
この金属−ビスホスホネートナノ粒子を、適切な一つの技術又は複数の技術の組み合わせにより、単離することができる。適切な技術としては、遠心分離、濾過、デカンテーション、洗浄、凍結乾燥、透析、及び乾燥が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施態様において、この金属−ビスホスホネートナノ粒子を単離する段階は、エージングされた溶液を遠心分離して粗ナノ粒子を提供する段階、エージングされた溶液をろ過して粗ナノ粒子を提供する段階、溶液（例えば、エタノール又はメタノールなどのアルコール溶液）に粗ナノ粒子を再分散させる段階、粗ナノ粒子を水性溶液で洗浄する段階、粗ナノ粒子をアルコール溶液で洗浄する段階、及び粗ナノ粒子を乾燥させる段階の一つ又はそれ以上から成る。いくつかの実施態様において、結晶性金属−ビスホスホネートナノ粒子を単離する。
【００５９】
いくつかの実施態様において、ナノ粒子を、金属酸化物、ポリマー（例えば、シリカ（ＳｉＯ２）、ポリ（シロキサン）又はポリ（シルセスキオキサン）又は有機ポリマーのような、但しこれらに限定されない、シリカ系ポリマー）、脂質単層、脂質二重層、及びこれらの組み合わせのような、但しこれらに限定されない、一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層で被覆して、コーティングされたナノ粒子を提供することができる。従って、ナノ粒子のいくつかは、シリカ層若しくはシリカベースの層、別のポリマーコーティング（即ち、他の無機又は有機ポリマーコーティング）、又は安定化及び表面機能化のための脂質コーティングで被覆することができる。いくつかの実施態様において、このコーティング（被覆）は有機ポリマーから成る。いくつかの実施態様において、この有機ポリマーは、親水性ポリマー（例えば、PEG又はPVP）である。ナノ粒子のいくつかは、リポソーム内に直接封入することができる。このナノ材料は、さらに、標的特異的療法及びイメージングで使用するために、このナノ材料を特定サイトへ導くための標的化剤を含んでもよい。ナノ材料のいくつかは、不動態化部分で被覆されてもよい。
【００６０】
いくつかの実施態様において、本発明は、ビスホスホネートを選択的に癌細胞（例えば、肺癌細胞、乳癌細胞、又は前立腺癌細胞）へ送達するために、金属−ビスホスホネートナノ粒子中にビスホスホネートを封入する方法に関する。さらに、相乗的な抗腫瘍効果を可能にするために、この金属−ビスホスホネートナノ粒子中に、他の抗癌剤又はそのプロドラッグ、及び治療用放射性核種を封入してもよい。
いくつかの実施態様において、投与後、細胞、組織、器官又は患者の画像を描くために、本発明のナノ粒子を使用してもよい。この画像を描くことが、例えば、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、光学イメージング、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）又は単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を実施することから成ってもよい。いくつかの実施態様において、この画像を描くことは、患者の治療と一緒に行われる。
いくつかの実施態様において、本発明のナノ粒子を、早期溶解に対して安定化させ、及び/又は特徴的な環境要因（例えば、低ｐＨ及びより低い環境）を利用して貨物である治療剤及び/又はイメージング剤を癌細胞内で放出することができる。この安定化は、ナノ粒子を、例えば、シリカの薄層、ポリ（シロキサン）、別のポリマー（例えば、有機ポリマー）、脂質単層又は脂質二重層で被覆することによって達成することができる。
【００６１】
いくつかの実施態様において、金属−ビスホスホネートナノ粒子を腫瘍に集積して、透過及び保持効果を増強することができる（ＥＰＲ効果）。このＥＰＲ効果は、超透過性血管系及び腫瘍の貧弱なリンパ排液によって引き起こされる、腫瘍微小環境におけるマクロ高分子及び小粒子の選択的濃縮である。このＥＰＲ効果を増強するために、いくつかの実施態様において、この粒子の外側を親水性ポリマーで被覆又は親水性ポリマーに接合して、粒子の循環半減期を増加させ、又はその表面を血漿タンパク質吸着に対して不動態化することができる。
いくつかの実施態様において、投与後にナノ粒子を癌細胞に向かわせるために、金属−ビスホスホネートナノ粒子は更に標的化剤を含んでもよい。標的疾患細胞（例えば、腫瘍細胞）の表面上に位置することが知られている任意の標的化部分を、本発明のナノ粒子に使用することができる。例えば、細胞表面の抗原に向かう抗体を使用してもよい。あるいは、この標的化部分は、細胞表面上に存在する受容体に向かう配位子、又はその逆、であってもよい。いくつかの実施態様において、本発明のナノ粒子を腫瘍へ向けるために、小分子、ペプチド及びタンパク質を含む標的化部分を使用してもよい。
【００６２】
最後に、それらの薬物動態増強の結果として、いくつかの実施態様において、金属−ビスホスホネートナノ粒子を、骨吸収の強力な阻害剤として使用することができる。それらはまた、骨吸収に関連する疾患、骨粗鬆症、パジェット病、及び骨転移を治療するために使用することができる。このビスホスホネートナノ粒子は、骨疾患（例えば、種々の癌の骨転移など）の単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）イメージングのための９９ｍＴｃ（但し、これに限定されない）を含むイメージング剤を送達するための新規なビヒクルを提供することができる。
従って、いくつかの実施態様において、本発明は、金属−ビスホスホネートナノ粒子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施態様において、金属−ビスホスホネートナノ粒子及び/又はそれを含む医薬組成物の有効量を、癌又は骨関連障害の治療に提供するために、患者に投与することができる。
【００６３】
ＩＩＩ．結晶性金属-ビスホスホネートナノ粒子
スキーム２（下記）に示すように、いくつかの実施態様において、金属イオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、及び周期律表の他のもの）をビスホスホネートと結合（例えば、配位結合を介して）して結晶性ナノ粒子を形成することができる。スキーム２中のＭｎ＋イオンは、２価、３価及び４価イオン、又はその他のより高い原子価の金属イオンであってもよい。これらのナノ粒子は、その結晶構造のために、非球形の形態を有し、癌細胞に入るという利点を有することができる。これらのナノ粒子の安定性は、異なる金属−ホスホネート結合強度の結果として調整することができる。これらの金属−ビスホスホネートナノ粒子のＸ線結晶構造を決定して、薬物内容量やそのナノ粒子の他の重要な特性の正確な分析を可能とすることができる。これらの金属−ビスホスホネートナノ粒子の結晶特性により、ナノ粒子の各単一バッチが正確に同じ組成を持っていることを示すことができ、これは既存のほとんどのナノ粒子の場合（アモルファスであって、比較的不十分に定義された組成を有する）ではありえないことです。いくつかの実施態様において、結晶性金属−ビスホスホネートナノ粒子は、腎臓で濾過されたり又は骨へ結合したりして容易に排除されることなく、選択的に癌細胞へ送達され、癌細胞を死滅させるという優れた効果を可能にすることができる。
【００６４】
【化３】
0006049712.tif 000007
【００６５】
従って、いくつかの実施態様において、本発明は、結晶性の多価金属イオン−ビスホスホネート複合体から成る金属-ビスホスホネートナノ粒子を提供する。いくつかの実施態様において、この結晶性の多価金属イオン−ビスホスホネートナノ粒子は、一つ又はそれ以上のコーティング剤又は層で被覆され、それはこのナノ粒子の外表面の少なくとも一部を囲むことができる。適切なコーティング剤又は層として、金属酸化物、ポリマー（例えば、シリカ、ポリ（シロキサン）若しくはポリ（シルセスキオキサン）などのシリカベースのポリマー、又は有機若しくは親水性有機ポリマー）、脂質単層、脂質二重層、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、コーティング剤又は層の1つ又は複数を、標的化剤及び/又は不動態化剤で誘導体化することができる。いくつかの実施態様において、一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、ジオレオイルＬ−α−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸ナトリウム塩（ＤＯＰＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、アニスアミド誘導体化ＤＯＰＥ、シリカ、ｃＲＧｆＫ誘導化シリカ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導化シリカ、及びアニスアミド−ＰＥＧ−誘導体化シリカから成る群から選択される。
【００６６】
いくつかの実施態様において、多価金属イオンは二価である。適切な二価イオンとしては、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、この複合体は、少なくとも２つの異なる多価金属イオン及び／又は少なくとも一つの常磁性金属イオンを含む。いくつかの実施態様において、この複合体は、一種の多価金属イオンを含む。いくつかの実施態様において、この複合体は、常磁性金属イオン、ホスフェートイオン、及び／又は白金イオンを含まない。
いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、式（化１）
【化１】
0006049712.tif 000008
（式中、ｎ及びｍはそれぞれ独立して０〜２の整数（即ち、それぞれ独立して０、１又は２である。）を表し、各Ｒは、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、アリール基、及び置換アリール基からなる群から選択され、Ｒ１は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルキル基、置換アルキル基、アミノ基、アルコキシ基及びアルキルチオ基から成る群から選択され、Ｒ２は、ハロゲン原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、置換アラルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基及びアリールアミノ基からなる群から選択される。）で表される構造を有する、又はそのアニオン若しくは塩である。いくつかの実施態様において、Ｒ２は、置換アルキル基又はアラルキル基である。いくつかの実施態様において、この置換アルキル基は、ＮＨ２−置換アルキル基、アルキルアミノ置換アルキル基、又はジアルキルアミノ置換アルキル基である。いくつかの実施態様において、このアラルキル基は、窒素含有ヘテロアリール部分を含むアラルキル基である。従って、適切なビスホスホネートとしては、ゾレドロン酸、パミドロネート、リセドロン酸、アレンドロネート、ゼリドロン酸（zeridronic acid）、チルドロネート、エチドロネート、及びイバンドロネートが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様において、結晶性金属-ビスホスホネートナノ粒子は、更に、非ビスホスホネート治療薬若しくはそのプロドラッグ及び/又はイメージング剤を含む。これらの追加の薬剤は、この結晶性金属-ビスホスホネートナノ粒子内に埋め込まれ、又は隔離されることができる。
【００６７】
ＩＶ．アモルファス金属-ビスホスホネートナノ粒子
スキーム３（下記）に示すように、いくつかの実施態様において、適切な条件下（例えば、温度、溶媒、ｐＨ）で、アモルファス金属−ビスホスホネートナノ粒子を得ることができる。これらのナノ粒子は、結晶性金属−ビスホスホネートナノ粒子の特性に相補的な特性を有することができる。
【化４】
0006049712.tif 000009
【００６８】
従って、いくつかの実施態様において、本発明は、アモルファス多価金属イオン−ビスホスホネート複合体から成る金属-ビスホスホネートナノ粒子を提供する。いくつかの実施態様において、このアモルファス多価金属イオン−ビスホスホネートナノ粒子は、一つ又はそれ以上のコーティング剤又は層で被覆され、それはコアである金属イオン−ビスホスホネート複合体の外表面の少なくとも一部を囲むことができる。適切なコーティング剤又は層として、金属酸化物、ポリマー（例えば、シリカ、ポリ（シロキサン）若しくはポリ（シルセスキオキサン）などのシリカベースのポリマー、又は有機若しくは親水性有機ポリマー）、脂質単層、脂質二重層、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、コーティング剤又は層の1つ又は複数を、標的化剤及び/又は不動態化剤で誘導体化することができる。いくつかの実施態様において、一つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＡ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ、ＤＯＴＡＰ、アニスアミド誘導体化ＤＯＰＥ、シリカ、ｃＲＧｆＫ誘導化シリカ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導化シリカ、及びアニスアミド−ＰＥＧ−誘導体化シリカから成る群から選択される。
【００６９】
いくつかの実施態様において、多価金属イオンは二価である。適切な二価イオンとしては、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、この複合体は、少なくとも２つの異なる多価金属イオン及び／又は少なくとも一つの常磁性金属イオンから成る多価金属イオンとビスホスホネートから成る。いくつかの実施態様において、この複合体は、一種の多価金属イオンを含む。いくつかの実施態様において、この複合体は、常磁性金属イオン、ホスフェートイオン、及び／又は白金イオンを含まない。
いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、式（化１）
【化１】
0006049712.tif 000010
（式中、ｎ及びｍはそれぞれ独立して０〜２の整数（即ち、それぞれ独立して０、１又は２である。）を表し、各Ｒは、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、アリール基、及び置換アリール基からなる群から選択され、Ｒ１は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルキル基、置換アルキル基、アミノ基、アルコキシ基及びアルキルチオ基から成る群から選択され、Ｒ２は、ハロゲン原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、置換アラルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基及びアリールアミノ基からなる群から選択される。）で表される構造を有する、又はその塩である。いくつかの実施態様において、Ｒ２は、置換アルキル基又はアラルキル基である。いくつかの実施態様において、この置換アルキル基は、ＮＨ２−置換アルキル基、アルキルアミノ置換アルキル基、又はジアルキルアミノ置換アルキル基である。いくつかの実施態様において、このアラルキル基は、窒素含有ヘテロアリール部分を含むアラルキル基である。従って、適切なビスホスホネートとしては、ゾレドロン酸、パミドロネート、リセドロン酸、アレンドロネート、ゼリドロン酸（zeridronic acid）、チルドロネート、エチドロネート、及びイバンドロネートが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様において、アモルファス金属-ビスホスホネートナノ粒子は、更に、非ビスホスホネート治療薬若しくはそのプロドラッグ及び/又はイメージング剤を含む。これらの追加の薬剤は、このアモルファス金属-ビスホスホネートナノ粒子内に埋め込まれ、又は隔離されることができる。
【００７０】
Ｖ．追加の治療薬を含む金属−ビスホスホネートナノ粒子
現在使用されている抗癌薬又はそれらのプロドラッグの多くは、官能基（例えば、カルボン酸、水酸基、エーテル、アミド、アミノ等のプロトン受容基又はドナー基）を含有しており、金属−ビスホスホネートナノ粒子に埋め込み可能である。例えば、この官能基は、金属-ビスホスホネートの金属中心に配位することができる。例示的抗癌剤及びプロドラッグとしては、シスプラチン又はオキサリプラチンのプロドラッグ、メトトレキサート、ロイコボリン、ペメトレキセド二ナトリウム、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、シタラビン、アザチオプリン、メルファラン、イマチニブ、アナストロゾール、及びレトロゾールが挙げられるが、これらに限定されない。図１を参照されたい。従って、いくつかの実施態様において、適切な金属中心、図１に示すがこれらに限定されない抗癌剤、及び/又はこれらの各プロドラッグを、本発明の金属−ビスホスホネートナノ粒子に組み込むことができる。これらは、アモルファス若しくは結晶性のいずれかのナノ粒子又は両者であってもよい。いくつかの実施態様において、追加の（例えば、非ビスホスホネート）治療薬は抗癌剤ではないが、抗炎症剤、抗感染剤、免疫調節剤、又は他のタイプの治療剤であってもよい。いくつかの実施態様において、金属−ビスホスホネートナノ粒子内に含まれる追加の治療薬は、化学療法薬、光線力学療法（ＰＤＴ）剤、放射線増感剤、ベータ放出放射性核種、又はタンパク質や低分子干渉ＲＮＡ分子などの生物学的薬剤から成る群から選択することができる。第２（又は第３若しくは第４の）治療薬を含むこれらの金属−ビスホスホネートナノ粒子薬物は、相乗的に癌細胞を死滅させることができる。従って、いくつかの実施態様において、それらは優れた治療指数を有することができる。
【００７１】
ＶＩ．外部刺激によってのみ細胞毒性になる抗癌剤／プロドラッグを含む配位高分子ナノ粒子
いくつかの実施態様において、前のセクションに記載した方法を、細胞毒性を生じるために強力なレーザー光やＸ線照射などの外部刺激を必要とする抗癌剤を組み込むために使用することができる。例えば、光線力学療法（ＰＤＴ）のための増感剤として、ポルフィマーナトリウム(PHOTOFRIN(R), Axcan Pharma PDT, Inc., Birmingham, Alabama, USA)が広く使用されてきた。またプロトタイプの放射線増感剤として、モテキサフィンガドリニウム(XCYTRIN(R), Pharmacyclic, Sunnyvale, California, USA)のような他の薬剤が使用されている。ＰＤＴ剤及び放射線増感剤の両方とも、金属−ビスホスホネートナノ粒子に組み込むことができる。例えば、ポルフィマー及びモテキサフィンガドリニウムの両方とも、金属−ビスホスホネートナノ粒子に組み込むことができる。その結果得られる多量のポルフィマー及びモテキサフィンガドリニウムを含有する粒子は、それぞれ大用量の光線力学療法（ＰＤＴ）及びＸ線放射療法のための増感剤を送達するために使用することができる。効率的な標的送達アプローチは、光線力学療法（ＰＤＴ）剤と放射線増感剤の臨床可能性の実現に影響を与える可能性がある。
【００７２】
ＶＩＩ．治療薬とイメージング剤を同時送達するための金属−ビスホスホネートナノ粒子
いくつかの実施態様において、本発明の金属−ビスホスホネートナノ粒子は、治療剤とイメージング剤の両方を（例えば、適切な割合で）運ぶ。これは、抗癌剤を投与した後で、抗癌剤が如何に効率的に癌細胞に局在化しているか、及びその治療に癌細胞が如何に応答しているかを、リアルタイムでモニターすることを可能にする。このような二重の治療薬／イメージング剤送達アプローチは、薬物製剤が患者にうまく機能しているかどうかを医師が決定することを可能にし、患者が治療に応答していない場合又は患者が治療に良好に応答していない場合には、時間を節約する。
本発明の金属−ビスホスホネートナノ粒子は、ＭＲＩ、光学イメージング、ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴなどの、但しこれらに限定されない、異なるイメージング物理療法のための多種のイメージング剤を含有することができる。例えば、ランタニド原子Ｇｄ３＋又はＭｎ２＋のような遷移金属は、容易に粒子に組み込むことができる。Ｇｄ３＋とＭｎ２＋は重要な磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）剤である。これらの金属は、金属−ビスホスホネートナノ粒子中の抗癌剤やプロドラッグと一緒に腫瘍部位へ送達された場合、粒子の腫瘍への取り込みの決定を可能とし、増強された磁気共鳴（ＭＲ）コントラストの結果、高解像度で腫瘍の描写を可能にすることができる。これに加えて又はこれに代えて、いくつかの実施態様において、光学イメージング剤として使用するために、金属中心との配位に利用可能な官能基を有する有機フルオロフォア（蛍光団）（例えば、近赤外染料）を金属−ビスホスホネートナノ粒子に組み込むことができる。いくつかの実施態様において、ＰＥＴ（６４Ｃｕなど）又はＳＰＥＣＴ（例えば、１１１Ｉｎや９９ｍＴｃ）イメージング用のイメージング剤として用いるために、放射性金属中心をこの金属−ビスホスホネートナノ粒子に組み込むことができる。ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴイメージングは、インビボで粒子の生体内分布をリアルタイムでモニタリングするために使用することができる。
【００７３】
ＶＩＩＩ．無機、有機及び生物学的部分による金属ビスホスホネートナノ粒子の後変性
いくつかの実施態様において、本発明のナノ粒子系を、金属酸化物のような無機化合物若しくはポリマー、ポリビニルピロリドンのような有機化合物若しくはポリマー、脂質単層、脂質二重層、及び/又はリポソーム製剤（但し、これらに限定されない）から成るシェル（即ち、コーティング層）で変性することができる。ナノ粒子の表面特性を変性することによって、そのナノ粒子を、生物学的条件下での溶解に対して安定化させること、生物学的安定性、多様性及び特異性を付与するために官能化すること、及び/又はリポソームのような送達ビヒクル中に組み込むことができる。この金属−ビスホスホネートナノ粒子の薬物動態は、これらのナノ粒子の抗癌治療指数を最大にするように容易に調整することができる。
従って、いくつかの実施態様において、本発明は、（ａ）多価金属イオン−ビスホスホネート複合体から成るコア、及び（ｂ）このコアの外表面の少なくとも一部を取り囲むコーティング層から成る金属−ビスホスホネートナノ粒子を提供する。このコーティング層は、例えば、金属酸化物、ポリマー（例えば、シリカベースのポリマー又は有機ポリマー）、脂質単層又は脂質二重層から成ってもよい。いくつかの実施態様において、このコアは、更に、非ビスホスホネート治療薬若しくはそのプロドラッグ及び/又はイメージング剤を含んでもよい。
【００７４】
いくつかの実施態様において、この多価金属イオン−ビスホスホネート複合体の多価金属イオンは二価である。適切な二価イオンとしては、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、この複合体は、少なくとも２つの異なる多価金属イオン及び／又は少なくとも一つの常磁性金属イオンを含む。いくつかの実施態様において、この複合体は、一種の多価金属イオンを含む。いくつかの実施態様において、この複合体は、常磁性金属イオン、ホスフェートイオン、及び／又は白金イオンを含まない。
いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、式（化１）
【化１】
0006049712.tif 000011
（式中、ｎ及びｍはそれぞれ独立して０〜２の整数（即ち、それぞれ独立して０、１又は２である。）を表し、各Ｒは、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、アリール基、及び置換アリール基からなる群から選択され、Ｒ１は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルキル基、置換アルキル基、アミノ基、アルコキシ基及びアルキルチオ基から成る群から選択され、Ｒ２は、ハロゲン原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、置換アラルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリールオキシ基、アリールチオ基及びアリールアミノ基からなる群から選択される。）で表される構造を有する、又はそのアニオン若しくは塩である。いくつかの実施態様において、Ｒ２は、置換アルキル基又はアラルキル基である。いくつかの実施態様において、この置換アルキル基は、ＮＨ２−置換アルキル基、アルキルアミノ置換アルキル基、又はジアルキルアミノ置換アルキル基である。いくつかの実施態様において、このアラルキル基は、窒素含有ヘテロアリール部分を含むアラルキル基である。従って、適切なビスホスホネートとしては、ゾレドロン酸、パミドロネート、リセドロン酸、アレンドロネート、ゼリドロン酸（zeridronic acid）、チルドロネート、エチドロネート、及びイバンドロネートが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様において、このコーティング層は、シリカ系ポリマーから成り、該シリカ系ポリマーが、標的化剤及び／又は不動態化剤で誘導体化される。例えば、このコーティング層は、シリカ、ｃＲＧｆＫ誘導化シリカ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−誘導体化シリカ及び/又はアニスアミド−ＰＥＧ−誘導体化シリカから成ってもよい。いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、金属酸化物、ポリマー、脂質単層、脂質二重層又はこれらの組み合わせのような、但し、これらに限定されない、一つ又はそれ以上の追加のコーティング層（例えば、（ｂ）のコーティング層に追加したコーティング層）を含んでもよい。
【００７５】
ＩＸ．不動態化及び/又は標的化のための金属-ビスホスホネートナノ粒子の機能化
いくつかの実施態様において、シェル／コーティング層で変性されたもの又は脂質単層若しくは脂質二重層内に封入されたもの（但し、これらに限定されない）などの本発明の金属−ビスホスホネートナノ粒子は、ポリエチレングリコールのような生体適合性の不動態化分子で機能化することができ、血漿タンパク質の吸着や細網内皮系（RES）のような生体防衛システムによる認識を阻止することにより機能することができる。いくつかの実施態様において、金属−ビスホスホネートナノ粒子は、疾患（例えば、癌）に伴って細胞の表面上で過剰発現する特定の抗原や受容体等に特異的な標的化部分で機能化することができる。この標的化部分としては、小分子、ペプチド、及びタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
特異的な標的化部分又は他の追加部分を用いる実施形態において、この追加部分は、必要に応じて、粒子の外部（即ち、外表面）に関連付けることができる。この外表面上の有効な反応基を介して、この標的化部分をこの外表面に直接結合させることができる。この反応基として、アミン、アルコール、シリルエーテル、カルボキシレート、イソシアネート、ホスフェート、チオール、ハロゲン化物、又はエポキシドなどが挙げられる。例えば、標的細胞又は組織の認識に必要ではないアミンを含有する又はそのように誘導体化された、標的化部分を、カルボジイミド化学を利用して、粒子外面上に存在する反応基（例えば、カルボン酸）に直接結合することができる。同様に、標的化部分をナノ粒子表面に結合するために、合成リンカーを使用してもよい。例えば、カルボキシレート又は他の適切な反応性基を含む合成リンカーを、追加部分に結合する前に、このナノ粒子表面上にグラフト（移植）することができる。従って、ポリマーマトリックス材料の化学構造によって提供されていない場合、ナノ粒子表面に、標的化部分又は他の部分と結合するための適切な反応基を提供するためにリンカーを使用することができる。
【００７６】
いくつかの実施態様において、イメージング剤を特定の組織又は細胞へ導くように機能する標的化基は、イメージング剤を結合させることができる。従って、この標的化基は、イメージング剤が、一旦患者に導入されたら、特定の癌細胞など特定の分子シグナルを発現する特定の器官又は細胞に局在化し又はそこで濃縮することを引き起こす。好適な標的化基としては、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）のような抗体や抗体フラグメントを含む、小分子、ポリヌクレオチド、ペプチド、及びタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、この標的化剤は、炎症の部位を標的とすることができる抗主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）−ＩＩ抗体である。
いくつかの実施態様において、この標的化剤は腫瘍を標的とする。このような腫瘍−関連標的化剤は、種々の公知の腫瘍マーカー又は特定タイプの腫瘍に関連する酵素に関連することができる。従って、腫瘍標的化剤には、抗体、抗体フラグメント、細胞表面受容体リガンドなどが含まれる。以下、さらに標的化剤を説明する。
標的癌細胞に標的化するために使用する標的化部分は、腫瘍特異的抗原を中心に設計することができ、この抗原として、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、チロシナーゼ、ras HER2、erb、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、MN、gp100、gp75、p97、プロテイナーゼ3、ムチン、CD81、CID9、CD63、CD53、CD38、CO-029、CA125、GD2、GM2、及びO-アセチルGD3、M-TAA、M-fetal又はM-urinaryが挙げられ、これらは本発明に使用できるが、これらに限定されない。あるいは、この標的化部分は、腫瘍抑制因子の周囲に設計することができ、この因子として、サイトカイン、ケモカイン、腫瘍特異的受容体リガンド、受容体、アポトーシス誘導因子、又は分化剤が挙げられる。さらに、いくつかの実施態様において、更に、腫瘍の増殖に対する血管新生のプロセスの重要性を考えると、この標的化部分は、血管新生に関連する因子を標的とするように開発してもよい。従って、この標的化部分は、血管内皮増殖因子（VEGF）のような既知の血管新生因子と相互作用するように設計してもよい。Brannon- Peppas, L. and Blanchette, J. O., Advanced Drug Delivery Reviews, 56, 1649-1659 (2004)を参照されたい。
【００７７】
標的化のために提供される腫瘍抑制タンパク質としては、p16、p21、p27、p53、p73、Rb、ウィルムス腫瘍（WT-1）、DCC、神経線維腫症1型（NF-1）、フォンヒッペル・リンダウ（VHL）病腫瘍抑制、マスピン、Brush-1、BRCA-1、BRCA-2、複数の腫瘍抑制剤（MTS）、ヒトメラノーマのgp95/p97抗原、腎細胞癌関連G250抗原、KS 1/4汎癌抗原、卵巣癌抗原（CA125）、前立腺特異抗原、メラノーマ抗原gp75、CD9、CD63、CD53、CD37、R2、CD81、CO029、TI-1、L6及びSASが挙げられるが、これらに限定されない。もちろん、これらは単に例示的な腫瘍抑制因子であり、本発明は、腫瘍抑制因子として当業者に公知であるか、将来公知になる如何なる他の薬剤と併せて使用することができると想定される。
いくつかの実施態様において、標的化は、癌遺伝子により発現する因子に向けられる。これらとして、チロシンキナーゼ、Srcファミリーのメンバーのような膜結合及び細胞質顆粒の両方、Mosのようなセリン/スレオニンキナーゼ、、血小板由来増殖因子（PDDG）のような成長因子及び受容体、rasファミリーを含むSMALL GTPアーゼ（Gタンパク質）、サイクリン依存性プロテインキナーゼ（cdk）、c-myc、N-myc及びL-mycを含むmycファミリーのメンバー、並びにBcl-2及びファミリーメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の粒子により標的化され得るサイトカインとしては、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、ILA 1、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、TNF、GM-CSF、β-インターフェロン及びγ-インターフェロンが挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るケモカインとしては、M1P1α、M1P1β、及びRANTESが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
標的とされうる酵素としては、シトシンデアミナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、α-L-イズロニダーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、HSVチミジンキナーゼ、及びヒトチミジンキナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明で使用できる受容体及びその関連リガンドとしては、葉酸受容体、アドレナリン受容体、成長ホルモン受容体、黄体ホルモン受容体、エストロゲン受容体、上皮増殖因子（EGF）受容体、線維芽細胞増殖因子受容体（FGFR）などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、EGFは、脳腫瘍細胞、並びに乳癌及び結腸癌細胞において過剰発現する。いくつかの実施態様において、この標的化部分は、葉酸、グアニジン、トランスフェリン、炭水化物及び糖からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、この標的化部分は、アミノ酸配列RGD及びTATペプチドからなる群から選択されるペプチドである。
【００７９】
ホルモン及びその受容体としては、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、レプチン、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、アンジオテンシンI、アンジオテンシンII、β-エンドルフィン、β-メラニン細胞刺激ホルモン（β-MSH）、コレシストキニン、エンドセリンI、ガラニン、胃抑制ペプチド（GIP）、グルカゴン、インスリン、アミリン、リポトロピン、GLP-1（7-37）ニューロフィシン、及びソマトスタチンが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、ナノ材料の標的化成分に配置されたビタミン（脂溶性と非脂溶性ビタミンの両方）が、これらのビタミンの受容体を有する細胞を標的とするか、そうでなければ、これらのビタミンを取るために使用することができることを提供する。特に、ビタミンD及びその類似体、ビタミンE、ビタミンA等のような脂溶性ビタミン、又はビタミンC等のような水溶性ビタミンがこの態様のために好ましい。
種々の生物学的標的（例えば、病原体、腫瘍細胞、正常組織）上の抗原又は免疫原（例えば、腫瘍、組織又は病原体特異的抗原）の標的化を可能とする抗体が生成しうる。本発明のいくつかの実施態様において、この標的化部分は、抗体、又は抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Fab、F(ab')2又はscFv単位）である。従って、「抗体」として、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
このナノ粒子の他の特性を、標的化のために使用することができる。従って、いくつかの実施態様において、強化された浸透及び保持（EPR）効果が、標的化に使用される。このＥＰＲ効果は、超透過性血管系及び腫瘍の貧弱なリンパ排液によって引き起こされる、腫瘍微小環境におけるマクロ高分子及び小粒子の選択的濃縮である。このＥＰＲ効果を増強するために、いくつかの実施態様において、この粒子の外側を親水性ポリマーで被覆又は親水性ポリマーに接合して、粒子の循環半減期を増加させ、血漿タンパク質がこの粒子に結合することを阻止することができる。
標的化された薬物送達のための追加の例示的な戦略、特に、癌治療のために標的化されたシステムについては、Brannon- Peppas, L. and Blanchette, J. O., Advanced Drug Delivery Reviews, 56, 1649-1659 (2004)を参照されたい。この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
Ｘ．骨吸収関連疾患の治療及びイメージングのための金属−ビスホスホネートナノ粒子
いくつかの実施態様において、その強化された薬物動態の結果、本発明の金属−ビスホスホネートナノ粒子は、骨吸収の阻害剤として使用することができる。これらは、骨吸収に関連する疾患、骨粗鬆症、パジェット病、及び骨転移を治療するために使用することができる。このビスホスホネートナノ粒子は、また、骨疾患（種々の癌の骨転移など）のＳＰＥＣＴイメージング用の９９ｍＴｃなどの、但しこれに限定されない、イメージング剤を送達するための新規ビヒクルを提供することができる。
【００８２】
ＸＩ．金属-金属ビスホス複合体ナノ粒子
いくつかの実施態様において、本発明は、このビスホスホネート自体が金属複合体である金属−ビスホスホネートナノ粒子を提供する。従って、いくつかの実施態様において、このナノ粒子コアは、多価金属イオンとビスホスホネートとの間に形成される材料（例えば、配位複合体）から成る。この材料において、このビスホスホネートは、金属ビスホスホネート複合体である。そのため、いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、２つの金属リガンドがホスホネート含有基であり、その複数のホスホネート基が多価金属イオンに配位結合することに利用可能である、金属ビスホスホネート複合体である。例えば、ビスホスホネートは、２つのヒドロキシル配位子を有する金属複合体のような適切な金属複合体を提供し、この金属複合体をジエトキシホスフィニルイソシアネート、ジエトキシホスフィニルイソチオシアネート、ジエトキシホスフィニル含有カルボン酸無水物、又はエトキシホスフィニル含有アシルクロライドと接触させることによって調製することができ、更なる配位結合に利用可能なホスホネート基を提供することができる金属配位子を形成することができる。いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、２つの白金配位子が、白金配位に関与しないホスホネート含有基で置換され、又はこれに結合されている、白金金属複合体（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン又は類似の複合体）である。
【００８３】
いくつかの実施態様において、金属-金属ビスホスホネート複合体ナノ粒子は、一つまたはそれ以上のマイクロエマルジョン中で、多価金属イオン前駆体を金属ビスホスホネート複合体と混合することによって提供することができる。マイクロエマルジョン、特に、油中水型（又はその逆の）マイクロエマルジョンは、有機ポリマー、半導体ナノ粒子（Xu and Akins, Material. Letters, 58, 2623 (2004)を参照）、金属酸化物、及びシアン化物-架橋遷移金属イオンから成るナノ結晶のような種々のナノ相材料の合成に使用されてきた。Vaucher et al. Angew. Chem. Int. Ed., 39, 1793 (2000); Vaucher et al., Nano Lett., 2, 225 (2002); Uemura and Kitagawa, J. Am. Chem. Soc., 125, 7814 (2003); Catala et al., Adv. Mater., 15, 826 (2003); 及びYamada et al., J. Am. Chem. Soc., 126, 9482 (2004)を参照されたい。逆のマイクロエマルジョンは、界面活性剤によって有機相中で安定化されたナノメートルスケールの水滴から成る。この界面活性剤は、電荷がアニオン性、カチオン性、又は中性であってもよい。マイクロエマルジョンシステムの物理的性質に関する多くのレポートは、界面活性剤に対する水の比率、即ちＷ値（即ち、[H2O]/[界面活性剤]）が、マイクロエマルジョンが提供する多くの調整パラメータの一つにすぎない、逆ミセルのサイズをほとんど決定することを示している。Wong et al., J. Am. Chem. Soc., 98, 2391 (1976); White et al., Langmuir, 21, 2721 (2005); Giustini et al., J. Phys. Chem., 100, 3190 (1996); 及びKumar and Mittal, eds., Handbook of Microemulsion Science and Technology; New York:  Marcel Decker, 1999.を参照されたい。シリカ被覆ナノ粒子の調製におけるマイクロエマルションの使用については、米国特許出願公開US2006/0228554を参照されたい。これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
マイクロエマルジョンを作製するために使用することができる不混和性液体には、典型的には、比較的極性（即ち、疎水性）の液体と比較的非極性（即ち、親水性）の液体が含まれる。本発明において有用なマイクロエマルジョンを形成するために多くの種類の極性/非極性液体混合物を使用することができるが、利用される特定の液体の選択は、作られるナノ粒子の種類に依存する。本開示を検討すれば、当業者は、本発明の方法において使用するためのマイクロエマルジョンを製造する公知の方法を採用することにより、特定の用途のために特定の液体を選択することができる。多くの実施態様において、他の極性液体も有用かもしれないが、この比較的極性の液体は水である。水は、安価、容易に入手可能、非毒性、取り扱い及保存が容易、多くの異なる沈降反応で互換性があり、多くの非極性溶媒と非混和性である、などの理由で、有用である。好適な非極性液体の例としては、アルカン（例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカン等の任意の液体形態）、シクロアルカン（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサンなど）、芳香族炭化水素類（例えば、ベンゼン、トルエンなど）、及びこれらの混合物（例えば、石油及び石油誘導体）が挙げられる。一般に、それがマイクロエマルジョンを形成するために使われる他の成分と相溶性であって、それらを準備した後に粒子を単離するために使用される沈殿反応のいずれをも妨げない限り、このような非極性液体はいずれも使用可能である。
【００８５】
一般に、マイクロエマルジョンを形成するためには少なくとも1つの界面活性剤が必要である。界面活性剤は、マイクロエマルジョン中で、非常に小さな分散したミセル又は逆ミセルを、熱力学的に安定化させる表面活性剤である。典型的には、界面活性剤は、両親媒性構造を有し、それらを油性相と水性相との間に非常に低い界面張力を有するフィルムを形成することを可能にする。従って、比較的極性の液体と比較的非極性の液体との界面で表面張力を低下させ、本発明の他の態様と適合性である任意の物質は、ナノ粒子を作製するために使用されるマイクロエマルションを形成するために使用することができる。界面活性剤の選択は、使用される特定の液体や作ろうとしているナノ粒子の種類に依存する。特定の用途に適した具体的な界面活性剤は、公知のマイクロエマルジョンの製法や界面活性剤の公知の特性から選択することができる。例えば、マイクロエマルションプロセスでイオン性反応物が使用される場合には、一般に非イオン性界面活性剤が好ましく、イオン性界面活性剤はこのイオン性反応物と結合するか又はこれを妨害するであろう。
【００８６】
多数の適切な界面活性剤が知られている。非網羅的なリストには、例えば、オレイン酸カリウムやオレイン酸ナトリウム等の石鹸；コール酸ナトリウムやカプリル酸ナトリウム等のアニオン性界面活性剤；セチルピリジニウムクロライド、アルキルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ベンザルコニウム、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド等のカチオン性界面活性剤；N-アルキル-N,N-ジメチル-1-プロパンスルホン酸塩及びCHAPS等の両性イオン性洗剤；並びにポリオキシエチレンエステル及び種々のトリトン（例えば、TRITON(R)-X100、TRITON(R)-X114）等の非イオン性界面活性剤などが含まれる。
使用される界面活性剤の濃度は、選択された特定の界面活性剤、使用される液体、及び作られるべきナノ粒子の種類を含む多くの要因に依存する。適切な濃度は、経験的に決定することができる。例えば、特定用途で最も良く機能する濃度が見つかるまで、界面活性剤の異なる濃度を試みることによって。適切な濃度の範囲はまた、既知の臨界ミセル濃度から決定することができる。
【００８７】
いくつかの実施態様において、１又は複数のマイクロエマルジョンは、このナノ粒子が更に、このナノ粒子の外表面の少なくとも一部の上に、脂質コーティング層（例えば、脂質単層）を有するすることができるように、ＤＯＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＣ又はＤＯＰＥのような、ただしこれらに限定されない、脂質化合物を含有してもよい。
いくつかの実施態様において、金属−金属ビスホスホネート複合体を１以上のコーティング層又はコーティング剤で被覆してもよい（例えば、このナノ粒子の合成の間に設けられた任意の脂質コーティングに加えて）。このような追加のコーティング層としては、金属酸化物、ポリマー（例えば、シリカベースのポリマー又は有機ポリマー）、脂質単層、又は脂質二重層が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、１又はそれ以上のコーティング層又はコーティング剤は、標的化剤又は不動態化剤を含有してもよい。いくつかの実施態様において、この金属-金属ビスホスホネート複合体は、さらに、１つ又はそれ以上の追加の治療剤、プロドラッグ及び／又はイメージング剤を含有してもよい（例えば、ビスホスホネート複合体に加えて）。
【００８８】
従って、いくつかの実施態様において、本発明は、（ａ）Ｍ１（式中、Ｍ１は多価金属イオンを表す。）、及び（ｂ）式Ｍ２Ｌｘ（式中、ｘは２又はそれ以上の整数を表し、Ｍ２は第２の金属イオンを表し、各Ｌは、金属イオン配位子を表し、少なくとも２つのＬはホスホネート基を有する。）で表される金属複合体を含むビスホスホネート、から成るコアを有する金属−ビスホスホネートナノ粒子を提供する。いくつかの実施態様において、Ｍ１は、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、又はこれらの組み合わせのような、２価金属イオンである。いくつかの実施態様において、Ｍ１は、Ｚｎ２＋である。
いくつかの実施態様において、Ｍ２は、白金イオン、ルテニウムイオン、又は、例えば、９９Ｙのようなベータ放射性核種である。いくつかの実施態様において、ｘは５又は６である。この２つのＬ配位子は、ホスホネート基を有し、式−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２（式中、各Ｒは、独立して、水素原子、アルキル基、置換アルキル基、アラルキル基、アリール基、置換アリール基又は負電荷を表す。）で表されてもよい。いくつかの実施態様において、各Ｒは、水素原子、アルキル基又は負電荷である。いくつかの実施態様において、各Ｒは、水素原子又は負電荷である。他のＬ配位子（即ち、ホスホネート基を含有しないもの）として、ハロゲン原子（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ又はＩ）、ＮＨ３、アルキルアミノ基、水酸基、アルコキシ基、ジオール及びジアミン（例えば、ジアミノシクロヘキサン）等の、但しこれらに限定されない、単座−金属配位子及び二座金属配位子が挙げられる。いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、式Ｍ２Ｌｘ−２［−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２］２で表されることができる。いくつかの実施態様において、ナノ粒子コアは、Ｍ１と式Ｍ２Ｌｘ−２［−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２］２で表される複合体との間に形成された配位複合体から成ってもよい。
【００８９】
いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、更に、コアの外表面の少なくとも一部を取り囲む、１つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層を有してもよい。このコーティング剤又はコーティング層として、金属酸化物、ポリマー（例えば、シリカベースのポリマー又は有機ポリマー）、脂質単層、脂質二重層又はこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、少なくとも一つの脂質コーティング層又はコーティング剤（例えば、脂質単層）を有してもよい。いくつかの実施態様において、この１つ又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、標的化部分又は不動態化部分を有してもよい。いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、さらに、非ビスホスホネート治療剤、そのプロドラッグ及び／又はイメージング剤を含有してもよい。
【００９０】
ＸＩＩ．製剤
本発明の組成物は、いくつかの実施態様において、薬学的に許容される担体を含む組成物から成る。任意の適切な医薬製剤を、被験者へ投与するための組成物を調製するために使用することができる。いくつかの実施態様において、この組成物及び/又は担体は、薬学的にヒトに受容可能である。
例えば、適切な製剤は、水性及び非水性の滅菌注射溶液並びに水性及び非水性の滅菌懸濁液を含んでもよく、この滅菌注射溶液は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質及びこの製剤を被験者の体液と等張にする溶質を含んでもよく、この滅菌懸濁液は、懸濁化剤及び増粘剤を含んでもよい。この製剤は、例えば、密封されたアンプル及びバイアルのような、単位用量又は複数用量の容器で提供することができ、使用直前に、注射のための水のような、殺菌液状担体の添加のみを必要とする、凍結又は凍結乾燥状態で保存することができる。いくつかの例示的な成分は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（一例では0.1〜10 mg/mlの範囲、別の例では約2.0 mg/ml）、及び/又はマンニトール若しくはその他の糖（一例では10〜100 mg/mlの範囲、別の例では約30 mg/ml）及び/又はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）である。
本発明の製剤が、上記の成分に加えて、当該タイプの製剤に関連する技術分野で慣用される他の薬剤を含むことができることは理解されるべきである。例えば、無菌発熱物質を含まない水性及び非水性の溶液を使用することができる。
【００９１】
ＸＩＩＩ．被験者
本発明の方法及び組成物は、インビトロ（例えば、単離された細胞又は組織に）又はインビボ（即ち、患者などの生体）で被験者の試料に用いることができる。本発明の原理は、用語「被験者」及び「患者」に含まれることが意図される哺乳動物を含む、すべての脊椎動物種に対して有効であることを示していることが理解されるべきであるが、いくつかの実施態様において、被験者はヒト被験者である。さらに、哺乳動物は、本明細書に開示された組成物及び方法を用いることが望ましい如何なる哺乳類種、特に農業用の及び家畜の哺乳動物種を含むと理解される。
このように、本発明の方法は、温血脊椎動物において特に有用である。従って、本発明は、哺乳類や鳥類に関する。より詳細には、ヒト及び、絶滅の危機にある重要な哺乳類（例えば、シベリアトラ）、ヒトにとって経済的に重要な哺乳類（ヒトにより消費されるために農場で飼育されている動物）及び／又は、例えば、ヒト以外の肉食動物（例えば、ネコ及びイヌ、）ブタ類（ブタ、去勢ブタ、及びヨーロッパイノシシ）、反芻動物（畜牛、去勢ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダのような）及びウマのように、ヒトに対し社会的に重要な哺乳類（ペットとして、又は動物園で飼われている動物）のような哺乳類に対するイメージング方法及び組成物が提供される。また、絶滅の危機に瀕している鳥、動物園で飼われている又はペットとして飼われている鳥（例えば、オウム）、家禽(fowl)、特に家畜化された家禽(fowl)、例えば、七面鳥、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなどの家禽(poultry)（これらもヒトとって経済的に重要である）を含む鳥のイメージングが提供される。従って、また家畜性ブタ類（ブタ及び去勢ブタ）、反芻動物、馬、家禽類等々のイメージングが提供されるが、これらに制限されない。
【００９２】
ＸＩＶ．投与
本発明の組成物の投与に適した方法としては、静脈内及び腫瘍内注射、経口投与、皮下投与又は腹腔内投与が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、組成物を、例えば、肺経路内で組成物を噴霧するような、その他の方法でイメージングが必要な部位に付着させることができる。本発明の組成物を投与する特定のモードは、イメージング及び/又は治療の対象である細胞の分布や量、及び代謝又は投与部位からその組成物を除去するためのメカニズムを含む様々な要因に依存する。例えば、比較的表在性の腫瘍については、腫瘍内に注射することができる。対照的に、内部腫瘍については、静脈内注射後にイメージング及び/又は治療を行うことができる。
いくつかの実施態様において、投与方法は、イメージング及び/又は治療されるべき部位における、地域化された送達又は蓄積の特徴を包含する。いくつかの実施態様において、組成物は腫瘍内に送達される。いくつかの実施態様において、標的の温熱治療に続いて、組成物を静脈内注射することによって、組成物を標的へ選択的に送達することができる。
組成物を肺経路へ送達するために、本発明の組成物をエアロゾル又は粗スプレーとして調整してもよい。エアゾール又はスプレー製剤を調整又は投与する方法は、米国特許第5,858,784号、同第6,013,638号、同第6,022,737号及び同第6,136,295号に見ることができる。
【００９３】
ＸＶ．用量
本発明の組成物の有効用量が、被験者に投与される。「有効量」とは、結果が検知可能な治療又は適切なイメージングを行うのに十分な組成物の量のことをいう。本発明の組成物の構成成分の実際の用量レベルは、特定の被験者及び/又は標的に対する所望の効果を達成するのに有効である組成物の量を投与するように、変化させることができる。選択された用量レベルは、組成物の活性（例えば、MRIの緩和度又はビスホスホネート薬物の量）及び投与経路に依存する。
本発明の開示の検討後、当業者は、特定の処方、その組成物に用いられる投与方法、及び治療及び/又はイメージングを行う標的の性質を考慮して、個々の被験者に投与する量を調整することができる。このような調整又は変更、並びにいつ及びどのようにこのような調整又は変更を行うかの評価は、当業者にとって公知である。
【実施例】
【００９４】
以下の実施例は、当業者に本発明の代表的な実施形態を実施するための指針を提供するためのものである。本開示と当業者の一般的レベルに照らして、当業者は以下の実施例は単に例示にすぎず、本発明の範囲から逸脱することなく、多くの変更、修正、及び改変が可能であることを理解するであろう。
【００９５】
材料と方法
全ての出発物質は、特に断りのない限り、シグマ・アルドリッチ社(Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)又はフィッシャー社(Fisher, Thermo Fisher Scientific, Hampton, New Hampshire, USA)から購入し、さらに精製することなく使用した。1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパンクロリド塩（DOTAP）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸ナトリウム（DOPA）、及び1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ（ポリエチレングリコール）2000]（DSPE-PEG2K）はアバンチ・ポラー・リピッズ社(Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)から購入した。ジオレオイルL-α-ホスファチジルエタノールアミン（DOPE）はシグマ・アルドリッチ社から寄贈された。細胞培養液は下記から入手した：ウシ胎児血清(FBS, Sigma, St. Louis, Missouri, USA)、GIBCO(R)RPMI-1640増殖培地(Invitrogen Corporation, Carlsbad, California)、ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma, St. Louis, Missouri, USA)、及びリン酸緩衝生理食塩水(PDS, GIBCO(R), Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, USA)。マイクロ波反応は、CEMディスカバリーマイクロ社（CEM Discovery microwave, Matthews, North Carolina, USA)で行った。1H NMRスペクトルは、400MHzでブルカー社のNMR 400 DRX分光計(Bruker Corporation, Billerica, Massachusetts, USA)で記録し、重クロロホルム又はDMSOの不完全な重水素化から生じるプロトン共鳴を基準とした。単結晶X線回折及び粉末X線回折（PXRD）パターンは、ブルカー社のSMART APEX II回折計(Bruker AXS, Inc., Madison, Wisconsin, USA)で収集した。このPXRDパターンはPILOTプラグインを使用してAPEX IIプログラムパッケージで処理した。UV-Vis吸収スペクトルは、UV-2401PC 紫外-可視分光光度計（島津製作所、京都、日本）を用いて得た。熱重量分析（TGA）は、白金皿を備えたTGA-50（島津製作所、京都、日本）を用いて行った。粒子サイズ及び形態を決定するために、4700電界放射型走査電子顕微鏡（SEM、日立インストゥルメント社製、東京、日本）及びJEM 100CX-II透過型電子顕微鏡（JEOL製、東京、日本）を使用した。ナノ粒子のSEM画像は、ガラス基板上で撮った。SEM像を撮る前に、サンプルに約5nmの導電層を塗布するために、金/パラジウム（80/20）ターゲットとMTM-10、厚さのモニターを搭載したクレシントン社108自動スパッタコーター(Cressington Scientific Instruments, Ltd., Watford, UK)を使用した。サイズとゼータ電位のデータは、マルベン社ゼータサイザーナノZs (Malvern Instruments, Malvern, UK)で収集した。Mn及びPtの濃度を決定するために、バリアン社820-MS誘導結合したプラズマ質量分析計(Varian, Inc., Palo Alto, California, USA)を使用した。サンプルは、0.4 mL/分の自由吸引速度で、ペルチェ冷却型ダブルパスガラススプレーチャンバー及び石英トーチを備えた同心ガラス噴霧器を介して導入した。サンプルは、蠕動ポンプで、SPS3オートサンプラー（バリアン社）から噴霧器へ運んだ。全ての標準品及びサンプルは、2％HNO3でミリQ水を用いて調製した。
【００９６】
実施例１
カルシウムパミドロネート結晶（Ca-Pam）及びカルシウムゾレドロネート（Ca-Zol）ナノ粒子
１．１  Ca-Pamナノ粒子の合成
パミドロン酸（0.1g、0.42mmol）と塩化カルシウム2H2O（0.2g、1.4mmol）を14 mLの水に溶解し、それぞれ、pH8.2に調整した。合わせた溶液をさらに80℃で24時間撹拌した。13000rpmで15分間の遠心分離により、Ca-Pamを単離した。これを水で1回、エタノールで3回洗浄し、その後エタノールに再分散した。このプロセスから約81mg（70％）のCa-Pam粒子を単離した。
１．２  Ca-Zol ナノ粒子の合成
ゾレドロン酸（5mg、0.019 mmol）及び塩化カルシウム2H2O（10mg、0.07mmol）をDMF/水（5mL/2mL）の混合溶媒に溶解した。得られた溶液を、マイクロ波容器中に密封し、400 Wに設定されたマイクロ波オーブンに5分間入れた。撹拌しながら100℃で20分間加熱した後、13000rpmで15分間の遠心分離により、Ca-Zol結晶粒子を単離した。これを水で1回、エタノールで3回洗浄し、その後エタノールに再分散した。このプロセスから約4mg（67.5％）のCa-Zol粒子を単離した。
【００９７】
１．３  Ca-Pam及びCa-Zol単結晶X線構造
Ca-Pam及びCa-Zolの単結晶を、X線回折測定のため成長させた。全ての結晶学的測定は、銅ターゲットX線管を備え、1600ワットで作動するブルカー社のSMART APEX II CCDベースX線回折装置(Bruker AXS, Inc., Madison, Wisconsin, USA)で行なった。フレームは、ナノフレーム積分アルゴリズムを使用したAPEX IIソフトウェアパッケージを組み込んだブルカー社のSAINT(R)を用いて、ローレンツ及び偏光効果について補正して、統合した。ブルカー社のSADABSを使用して、吸収補正を適用した。全ての構造体は、直接法によって解明し、ブルカー社のSHELXTLソフトスーツを使用して、F2上の最小二乗法を用いて収束するように解析した。全ての非水素原子は異方的に解析した。Ca-Pam及びCa-Zolのデータは、それぞれ2θ=138.6度と108.1度において、>98％の完全度で、収集した。Ca-Pam及びCa-Zolナノ粒子のX線結晶学的データを表１に示す。このナノ粒子のパッキングダイアグラムを図2A-Dに示す。
【００９８】
【表１】
0006049712.tif 000012
【００９９】
１．４  DOPE-アニスアミドの合成手順
ジオレオイルL-α-ホスファチジルエタノールアミン（DOPE）（50mg、0.067mmol）を、N、N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド及び4-ジメチルアミノピリジン（16.42mg、0.134mmol）の存在下、窒素保護下で、ジクロロメタン（10mL、無水）中で、4-メトキシ安息香酸（103.5mg、0.672mmol）と反応させた。この反応は、暗所で室温で24時間撹拌して行った。回転蒸発法によりジクロロメタンを除去した後、粗生成物をクロロホルムに再溶解し、この溶液を4％Na2CO3、0.2M塩酸水溶液で洗浄し、次いでMgSO4で乾燥させた。得られた粗生成物を、シリカゲル及びクロロホルム/メタノール(5/1)を溶離剤として用いて、カラムクロマトグラフィーにより精製した。溶媒を除去した後に、生成物を得た（30mg、収率51％）。1H NMR (CDCl3): δ 7.82 (d, J =7.6 Hz, 2H); 6.78 (s, 2H); 5.31 (m, 4H); 3.76 (s, 3H); 2.15 (s, 4); 1.97 (s, 6H); 1.62 (s, 10H); 1.46 (s, 4H); 1.21 (t, J= 14 Hz, 30H); 0.85 (t, J = 6 Hz, 6H).
【０１００】
１．５  リポソーム及びアニスアミド標的化リポソームの一般的作成手順
20mLのバイアルに、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパンクロリド塩（DOTAP）5mg（クロロホルム溶液）及びDOPE5.295mg（クロロホルム溶液）又はDOPE-AA1.03mg及びDOPE4.3mgを加えた後、溶媒を回転エバポレーターで除去した。この脂質フィルムを、更に3時間真空乾燥した。リポソームを調製するために、水2.85 mLを加えて、1時間水和させ、濁った脂質懸濁液を形成させた。この懸濁液を押出機で押出した。孔径が600 nm及び100nmの膜を使用して、少なくとも10の押出サイクルを行った。得られたリポソームは、4℃で保存した。
【０１０１】
１．６  脂質コーティングの一般的手順
粒子の水性懸濁液と調製されたリポソームを重量比8:1で混合することにより、脂質被覆粒子を得た。この混合物は、時々振盪しながら1時間室温で放置した。この混合物を6000rpmで8分間遠心分離することにより余分な脂質を除去した。
Ca-Pam及びCa-Zol粒子の動的光散乱（DLS）データを表2及び3に示す。図3A及び図5Aは、それぞれ、脂質裸の、脂質でコーティング（被覆）された、及びアニスアミド（AA）標的化Ca-Pam及びCa-Zol粒子のDLS流体力学的直径を示す。図4及び図6は、種々のCa-Pam及びCa-Zol粒子のSEM及びTEM画像を示す。
【０１０２】
【表２】
0006049712.tif 000013
【０１０３】
【表３】
0006049712.tif 000014
【０１０４】
１．７  Ca-Pamの薬物積み込み(loading)と放出(release)プロファイルの決定
新鮮な塩化鉄（III）溶液(5mM)を用意した。100 mLのメスフラスコ中で、過塩素酸（11.7 M）17.2 mLを水50mLで希釈した。次に、0.135グラムの塩化第二鉄六水和物を加えて、この溶液を水で100mLに希釈した。また、新鮮な過塩素酸(2M)を用意した。過塩素酸（11.7 M）17.2 mLを水で100mLに希釈した。過塩素酸溶液(2M)中に新鮮なパミドロネート(5mM)を用意した。パミドロネート13.95mgを、10mLのHClO4（2M）に溶解した。上記溶液を用いて、標準溶液を調製した。基準スペクトルを、過塩素酸溶液(2M)(PBS 2.5mMを加えた)中の2.5 mMのFe3+を溶解したものを用いて記録した。280nmにおける吸光度を記録した。2 M過塩素酸を用いて粒子を一晩消化した。この溶液中の薬物の濃度を、280nmにおける吸光度によって決定し、記録した。裸粒子の薬物積み込みは75.5％であり、脂質コーティング後の薬物積み込みは70.1％である。
【０１０５】
１．８  Ca-Zolの薬物積み込みと放出プロファイル
0.1M HCl及び5mMのPBSを加えた5つの異なる濃度のゾレドロン酸の、215nmにおける吸光度を測定することにより、対応する２つの標準曲線を作製した。0.1M塩化水素中で粒子を一晩消化した。この溶液中の薬物の濃度を、215nmにおける吸光度によって決定し、記録した。裸粒子の薬物積み込みは75.7％であり、脂質コーティング後の薬物積み込みは67.0％である。
【０１０６】
１．９  インビトロアッセイ
ノースカロライナ大学チャペルヒル校のラインバーガー総合癌センターの組織培養施設(The Tissue Culture Facility of Lineberger Comprehensive Cancer Center at the University of North Carolina at Chapel Hill)から、NCI-H460大肺癌細胞(American Type Culture Collection (ATCC)# HTB-177))を購入した。この細胞株を、10 ％ウシ胎児血清(Sigma, St. Louis, Missouri, USA)及び2％ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma, St. Louis, Missouri, USA)を補充したRPMI-1640増殖培地(Cellgro(R), Mediatech, Inc., Manassas, Virginia, USA)中で懸濁液として保持した。
コンフルエントなH460細胞を、血球計数器を用いて培養フラスコから計数した。細胞を、3 mLのRPMI-1640完全増殖培地中で6ウェルプレートに5x104細胞/ウェルの細胞密度で播種した。この細胞を、37℃、5％ CO2で一晩インキュベートした。パミドロネートの濃度（μM）が、0、5、10、20、40、及び80となるように、RPMI-1640培地中のパミドロネート、及びCa-Pam、脂質被覆Ca-Pam、及びAA-脂質被覆Ca-Pamの粒子分散液（80μM）並びに追加の培地をウェルに追加した。パミドロネート又は粒子無しの細胞を、48時間インキュベートした（37℃、5％ CO2）。生存率をトリパンブルー排除アッセイにより決定した。このアッセイの結果を図7に示す。AA-標的化Ca-Pamと脂質被覆Ca-PamのIC50は、それぞれ、2.7μM及び4.2μMと決定された。比較として、パミドロネート無しと合成したままのCa-Pamナノ粒子のIC50は、それぞれ、65μMと62μMであった。
【０１０７】
実施例２
アモルファスCa-Zolナノ粒子
２．１  アモルファスカルシウムゾレドロネート（A-Ca-Zol）ナノ粒子の合成
50mMのゾレドロン酸溶液を、アンモニア水（18 mL、0.9 mmol）を用いて、pH=9に調整した。この溶液を激しく撹拌しながら80℃に加熱した。同容量の100mMの塩化カルシウム液（pH=9）（1.8mmol）を、急速に加えたところ、直後に白色沈殿物を形成した。このナノ粒子懸濁液を、80℃で一晩熟成させた。ナノ粒子を遠心分離によって単離し、水で一度、及びNH3の2%エタノール溶液で一度洗浄した。この粒子を、エタノール懸濁液として保存した。A-Ca-Zolナノ粒子のSEM像を図8に示す。図9A及びBは、A-Ca-Zolナノ粒子の強度及び数加重動的光散乱(DLS)曲線を示す。
【０１０８】
２．２  A-Ca-Zolナノ粒子のシリカコーティング
ゾレドロネートカルシウムナノ粒子を、改変されたゾル-ゲル法によってシリカで被覆した。簡潔には、カルシウムゾレドロネートナノ粒子30mgを0.5mg/mLでエタノール中に懸濁した。次にテトラエチルオルトシリケート（180μL、0.8 mmol）及び33％水酸化アンモニウム溶液（全体積の3％）を添加した。この懸濁液を室温で2又は5時間激しく撹拌した。ナノ粒子を遠心分離によって単離し、エタノールで2回洗浄した。このナノ粒子をエタノール中で保存した。
2時間シリカで被覆したA-Ca-Zolナノ粒子の走査電子顕微鏡(SEM)像を図11に示す。図12A及びBは、シリカ被覆反応を2時間行ったシリカ被覆A-Ca-Zolナノ粒子の強度及び数加重動的光散乱(DLS)曲線を示す。比較のために、被覆されていないナノ粒子のDLS曲線も示す。図13は、2時間シリカで被覆した粒子のエネルギー分散型Ｘ線分光法(EDS)スペクトルであり、これはシリカの存在を示す。遊離ゾレドロネートの熱重量分析(TGA)重量損失曲線も示す。
5時間シリカで被覆したA-Ca-Zolナノ粒子の走査電子顕微鏡(SEM)像を図15に示す。図16A及びBは、被覆されていないナノ粒子、シリカ被覆反応を2時間及び5時間行ったシリカ被覆A-Ca-Zolナノ粒子の強度及び数加重動的光散乱(DLS)曲線を示す。図17は、5時間シリカで被覆した粒子のエネルギー分散型Ｘ線分光法(EDS)スペクトルである。図18は、被覆されていないナノ粒子、シリカ被覆反応を2時間及び5時間行ったシリカ被覆A-Ca-Zolナノ粒子の熱重量分析(TGA)重量損失曲線を示す。
【０１０９】
２．３  シリカ被覆されたA-Ca-Zolナノ粒子の表面官能化
RGD標的化：
シリカ被覆（5時間）カルシウムゾレドロネートナノ粒子4mgを2 mg/mLでエタノールに再分散した。このナノ粒子懸濁液にシリル誘導化cRGfK（DMSO 50μL中に0.2 mg）を加えた。水酸化アンモニウム水溶液（33％）を、エタノール溶液体積の3％となるように添加した。この懸濁液を室温で24時間撹拌した。ナノ粒子を遠心分離によって単離し、エタノールで3回洗浄した。このナノ粒子をエタノール懸濁液として保存した。図19は、RGD標的化、シリカ被覆A-Ca-Zolナノ粒子のSEM像を示す。
シリカ被覆A-Ca-Zolナノ粒子のPEG化及びアニスアミド標的化：
シリカ被覆（5時間）カルシウムゾレドロネートナノ粒子13mgを6.5 mg/mLでエタノールに再分散した。この懸濁液に、シリル誘導化ポリエチレングリコール（MW：2000）モノメチルエーテル（2.5 mg）を溶解させ、NH4OH総濃度が3%となるように、水酸化アンモニウム水溶液を加えた。この懸濁液を室温で24時間撹拌し、次に、ナノ粒子を遠心分離によって単離し、エタノールで2回洗浄した。この粒子をエタノール懸濁液として保存した。シリル誘導化アニスアミドPEG（MW=2000）の一部（10重量％）をこの反応液に加えた以外は、同じ手順で、アニスアミド標的化ナノ粒子を調整した。図20は、PEG化及びアニスアミド標的化されたシリカ被覆A-Ca-Zolナノ粒子のSEM像を示す。図21AとBは、非官能化(即ち、被覆されていない又は裸の)A-Ca-Zolナノ粒子、5時間シリカ被覆したA-Ca-Zolナノ粒子、PEG-標的化A-Ca-Zolナノ粒子及びAA-標的化A-Ca-Zolナノ粒子の強度加重及び数加重動的光散乱(DLS)曲線を示す。
２．４  ゾレドロネートの放出
75mLのビーカーに5 mMのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を入れて、37℃に温めた。ゾレドロネート、非官能化カルシウムゾレドロネートナノ粒子、又はシリカ被覆カルシウムゾレドロネートナノ粒子のいずれか（全体でゾレドロネート5mgの存在）を、1 mLの水に再分散し、3500 MWカットオフの透析バッグに入れた。この透析バッグを、PBS溶液内に入れ、37 ℃でインキュベートした。定期的にこの透析液の一部を取り出して、ゾレドロネートの濃度を紫外/可視分光法により測定した。経時のゾレドロネート薬物放出のグラフを図22に示す。
【０１１０】
２．５  細胞生存率アッセイ
細胞生存率アッセイのために4つの細胞培養プレートを用意した。各ウェルに100,000のH460ヒト肺癌細胞を入れ、各ウェルにRPMI培地（10％FBS及び2％PenStrepを補充）3mLを入れ、そして37℃、5％CO2の条件下で一晩インキュベートした。
ゾレドロネート、裸の粒子（即ち、合成したままのA-Ca-Zol）、RGB標的化粒子、及びアニスアミド標的化粒子の20μMの保存溶液を、RPMI培地中の0μM、1μM、5μM、10μM、20μM、30μMの治療曲線が設立されるように、用意した。個々の処理後、プレートを48時間インキュベーターに戻した。
インキュベーション後、培地及び処理物を各ウェルから除去し、細胞をPBS 1mLで2回洗浄した。トリプシン1mLを各ウェルに添加し、3分間インキュベーターに戻した。次に、細胞及びトリプシンを、遠心管に移し、3分間遠心分離し、細胞ペレットを培地1mLに再分配した。血球計数器に細胞20μLと20μLのトリパンブルーを用いて、細胞数を数えた。結果を図23に示す。ゾレドロネート、合成したままのA-Ca-Zol、アニスアミド標的化粒子及びRGB標的化粒子の50%抑制濃度（IC50）は、それぞれ、>20、0.9、0.9及び2.5μMと見積もられた。
また、細胞生存率アッセイも同様に行われたが、ヒトPC-3前立腺腺癌細胞を用いた。ゾレドロネート又は合成したままのA-Ca-Zolで処理したPC-3細胞の細胞生存率の結果を図24に示す。ゾレドロネート又は合成したままのA-Ca-Zolの50%抑制濃度（IC50）は、それぞれ、3.1及び0.8μMと見積もられた。
【０１１１】
実施例３
治療とイメージング用のマンガンゾレドロネート（Mn-Zol）ナノ粒子
３．１  結晶性マンガンゾレドロネートナノ粒子（Mn-Zol）の合成
ゾレドロン酸（5mg、0.019mmol）とMnCl2 4H2O（10mg、0.05mmol）を、DMF/H2O（5mL/2mL）の混合溶媒に溶解した。3M HCl 0.15mLを添加した後、得られた溶液を、マイクロ波容器中に密閉し、設定400 W及び実行時間5分に設定された電力を有するマイクロ波オーブンに入れた。撹拌しながら100℃で20分間加熱した後、13000rpmで15分間の遠心分離により結晶粒子（Mn-Zol）を単離した。それらを水で1回、エタノールで3回洗浄した後、エタノール中に再分散した。この手順から約4.6mg（70％）の結晶粒子（Mn-Zol）を単離した。官能化された（即ち、脂質被覆された、及びAA-標的化された）Mn-Zolナノ粒子を、実施例1で記載した方法に従って調製した。
結晶性Mn-Zolナノ粒子の光散乱(DLS)データを表４に示す。図25Aは、裸の（即ち、合成されたままの）、脂質被覆、及びアニスアミド標的化Mn-Zolナノ粒子の光散乱(DLS)流体力学直径を示す。また図25Bは、同じ粒子についてTGA減量曲線を示す。図26は、Mn-Zolナノ粒子（即ち、合成されたままの粒子、脂質被覆粒子、及びアニスアミド標的化粒子）のSEM像及びTEM像を示す。
【０１１２】
【表４】
0006049712.tif 000015
【０１１３】
３．２  アモルファスマンガンゾレドロネートナノ粒子（A-Mn-Zol）の合成
ゾレドロン酸（5mg、0.019mmol）とMnCl2 4H2O（10mg、0.05mmol）を、DMF/H2O（10mL/7mL）の混合溶媒に溶解した。3M HCl約0.3mLを添加した後、得られた溶液を、マイクロ波容器中に密閉し、設定400 W及び実行時間5分に設定された電力を有するマイクロ波オーブンに入れた。撹拌しながら140℃で20分間加熱した後、13000rpmで15分間の遠心分離によりA-Mn-Zol粒子を単離した。それらをエタノールで3回洗浄した後、エタノール中に再分散した。この手順から約3.1mg（50％）の粒子（A-Mn-Zol）を単離した。官能化された（即ち、脂質被覆された、及びAA-標的化された）Mn-Zolナノ粒子を、実施例1で記載した方法に従って調製した。
A-Mn-Zolナノ粒子の光散乱(DLS)データを表５に示す。図27Aは、裸の（即ち、合成されたままの）、脂質被覆、及びアニスアミド標的化A-Mn-Zolナノ粒子の光散乱(DLS)流体力学直径を示す。また図27Bは、同じ粒子についてTGA減量曲線を示す。図28は、A-Mn-Zolナノ粒子（即ち、合成されたままの粒子、脂質被覆粒子、及びアニスアミド標的化粒子）のSEM像及びTEM像を示す。
【０１１４】
【表５】
0006049712.tif 000016
【０１１５】
３．３  PEG化アモルファスマンガンゾレドロネートナノ粒子（PEG-A-Mn-Zol）の合成
ゾレドロン酸（5mg、0.019mmol）とMnCl2 4H2O（10mg、0.05mmol）及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸ナトリウム塩(DOPA) 5mgを、DMF/H2O（16mL/3mL）の混合溶媒に溶解した。得られた溶液を、マイクロ波容器中に密閉し、設定800 W及び実行時間2分に設定された電力を有するマイクロ波オーブンに入れた。撹拌しながら140℃で10分間加熱した後、13000rpmで15分間の遠心分離によりアモルファス粒子を単離した。それらをシクロヘキサンで1回、エタノールで3回洗浄した後、THF中に再分散した。この手順から約2.3mg（28％）の粒子を単離した。50℃のEtOH/H2O30％（v/v）500μL中で、このナノ粒子にDOPC、コレステロール（モル比1:1）、DSPE-PEG2K（20モル％）のTHF溶液を加えることによって、得られた粒子を脂質及び脂質-PEGで被覆した。THFを蒸発させ、この溶液を室温まで冷却した結果、PEG-A-Mn-Zolを得た。図29の右側の画像は、PEG-A-Mn-Zolナノ粒子のTEM顕微鏡写真を示す。図29の左側の画像は、PEG化前のA-Mn-Zolナノ粒子の画像を示す。
３．４  薬物積み込み(loading)と放出(release)プロファイルの決定
0.1M HCl中の5つの異なる濃度におけるゾレドロン酸の207.5 nmの吸光度を測定することにより、対応する標準曲線を作成した。粒子を、0.1M HCl中で一晩消化した。この溶液中の薬物の濃度を、207.5 nmの吸光度によって決定し、記録した。Mn-Zol裸粒子の薬物積み込みは76.8％であり、脂質コーティング後の薬物積み込みは69.9％である。A-Mn-Zol裸粒子の薬物積み込みは82.7％であり、脂質コーティング後の薬物積み込みは71.2％である。
【０１１６】
３．５  Mn-Zol及びA-Mn-Zolナノ粒子の放出プロファイル
5mM リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の5つの異なる濃度におけるゾレドロン酸の215 nmの吸光度を測定することにより、対応する標準曲線を作成した。3500 MWカットオフの透析バッグから放出される薬剤を、37 ℃で5mM PBS中の紫外/可視分光法によりモニターした。裸の及び脂質被覆されたMn-Zolナノ粒子の放出プロファイルを図30に示す。PEG-A-Mn-Zolナノ粒子の放出プロファイルを図31に示す。挿入図は、ナノ粒子からの薬物放出のズームアップ図を示す。図32は、ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS中のPEG-A-Mn-Zolナノ粒子の安定性試験の結果を示す。血漿タンパク質の循環を模倣するために、この安定性試験を、高濃度のBSAを含有するPBS緩衝液中で行った。このような試験は、このナノ粒子が循環中で如何に安定であり、かつそれらが血漿タンパク質の吸収に如何に耐性であるかについて、ガイダンスを提供し、これは細網内皮系(RES)システムによるナノ粒子の認識に至るカスケードの最初のステップである、ことが理解された。
【０１１７】
３．６  インビトロアッセイ
ノースカロライナ大学チャペルヒル校のラインバーガー総合癌センターの組織培養施設(The Tissue Culture Facility of Lineberger Comprehensive Cancer Center at the University of North Carolina at Chapel Hill)から、NCI-H460大肺癌細胞（ATCC# HTB-177）及びMCF-7ヒト乳癌細胞（ATCC# HTB-22）を購入した。この細胞株を、10 ％ウシ胎児血清(Sigma, St. Louis, Missouri, USA)及び2％ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma, St. Louis, Missouri, USA)を補充したRPMI-1640増殖培地(Cellgro(R), Mediatech, Inc., Manassas, Virginia, USA)中で懸濁液として保持した。
コンフルエントなH460細胞を、血球計数器を用いて培養フラスコから計数した。細胞を、3 mLのRPMI-1640完全増殖培地中で6ウェルプレートに5x104細胞/ウェルの細胞密度で播種した。この細胞を、37℃、5％ CO2で一晩インキュベートした。ゾレドロネートの濃度（μM）が、0、1.0、2.5、5、10及び20となるように、RPMI-1640培地中のゾレドロネート、裸のリポソーム及びMn-Zol及び脂質被覆Mn-Zolの粒子分散液（80μM）並びに追加の培地をウェルに追加した。ゾレドロネート、リポソーム又は粒子無しの細胞を、48時間インキュベートした（37℃、5％ CO2）。生存率をトリパンブルー排除アッセイにより決定した。この結果を図33に示す。ゾレドロネート、裸のリポソーム、合成したままの（裸の)Mn-Zol、及び脂質被覆Mn-ZolのIC50は、それぞれ、>20μM、>20μM、>20μM、及び0.98μMと見積もられた。
【０１１８】
コンフルエントなMCF-7細胞をトリプシン処理し(trypsin-EDTA, Sigma, St. Louis, Missouri, USA)、血球計を用いて細胞密度を得た。6ウェルプレートに5.0x104細胞/ウェル及び合計で3mLの培地を播種した。このプレートを37℃、5％ CO2で一晩インキュベートした。ゾレドロネート濃度が0、2.5、5、10、20、及び40μMとなるように、ウェルにRPMI-1640培地及び追加の媒体（5％リン酸緩衝生理食塩水、Cellgro(R), Mediatech, Inc., Manassas, Virginia, USA)中でゾレドロネート、リポソーム、及び粒子分散液を加えた。このプレートを37℃ 5％ CO2の条件で48時間インキュベートし、トリパンブルー排除アッセイによって生存率を決定した。結果を図34に示す。ゾレドロネート、裸のリポソーム、合成したままの（裸の)A-Mn-Zol、及び脂質被覆A-Mn-ZolのIC50は、それぞれ、9μM、>40μM、8μM、及び3μMと見積もられた。
図35は、ASPC-1（図35A）及びMCF-7細胞（図35B）に対する、Mn-Zol＠DOPA、PEG-A-Zn-Zol、及びAA-PEG-A-Zn-Zol粒子の細胞毒性アッセイのデータを示す。図35のグラフは、ASPC-1（図35A）及びMCF-7細胞（図35B）に対する、Mn-Zol＠DOPA(四角：IC50は60μM（図35A）、15μM（図35B）)、PEG-A-Zn-Zol(三角：IC50は33μM（図35A）、6μM（図35B）)、及びAA-PEG-A-Zn-Zol(ｘ：IC50は20μM（図35A）、4μM（図35B）)粒子の細胞毒性アッセイを示す。図35A及びBのいずれもにおいても、ゾレドロネート(Zol、菱形)のIC50は>60μMである。
【０１１９】
３．７  PEG-A-Zn-Zol粒子の血液循環及び臓器分布
複数の正常なマウスに、尾静脈を介してゾレドロネート(Zol)10mg/kgに相当するPEG-A-Zn-Zol粒子を注射した。これらのマウスを異なる時点で屠殺し、それらの血液、肝臓、肺、脾臓、腎臓、及び膀胱を回収した。これらの臓器（及び血液サンプル）を濃硝酸を用いて消化し、ICP-MSを用いてMnの含有量を分析した。図36Aを参照。血液中を循環することが期待される唯一無傷の粒子として、Mnの分布は、ゾレドロネート(Zol)の分布の代替として機能する。図36Bは、最適化されていないPEG-A-Zn-Zol粒子が約8時間の半減期で血液中を循環することができることを示している。このようにPEG-A-Zn-Zol粒子は、細網内皮系(RES)システムを回避するために必要なステルス性を有し、腫瘍に効果的に蓄積することが示された。
図37A-Cは、Mn-Zol＠DOPA（図37A）、PEG-A-Zn-Zol（図37B）、及びAA-PEG-A-Zn-Zol（図37C）粒子の縦方向（ｒ1、四角）と横方向（ｒ2、菱形）のMR緩和を示す。図37Aの縦方向プロットは、y=11.405x + 0.6158, R2=0.981、図37Aの横方向プロットは、y=7.2919x + 0.215, R2=0.9833である。図37Bの縦方向プロットは、y=19.664x + 0.741, R2=0.9994、図37Bの横方向プロットは、y=11.564x + 0.2517, R2=0.9977である。図37Cの縦方向プロットは、y=18.382x + 0.3241, R2=0.9858、図37Cの横方向プロットは、y=3.8345x + 0.2453, R2=0.9941である。
【０１２０】
実施例４ シスプラチンビスフォスフォネート-亜鉛（cis-PtBp-Zn）ナノ粒子
【化５】
0006049712.tif 000017
【０１２１】
４．１  シスプラチンビスフォスフォネート（cisPtBP）複合体の合成
スキーム４に示すように、DMF 2mL中のシス、シス、トランス−[Pt(NH3)2Cl2(OH)2]（0.5g、1.5mmol）の懸濁液に、4モル当量のジエトキシホスフィニルイソシアネート（0.92 mL、6.0mmol）を含有するDMF溶液1mLを添加した。得られた混合物を暗所室温で12時間撹拌した。この溶液を濾過し、ジエチルエーテルの添加により、中間体であるcisPtBPエチルエステルを沈殿させ、ジエチルエーテルで少なくとも二回洗浄して、残留DMFを除去した。DMSO-d6中の1H NMRは、cisPtBP-エステル構造のプロトンシグナルを示す。収率：80％。
さらなる反応の前に、中間体エステル複合体をさらに4時間真空乾燥した。乾燥DMF中のエチルエステル複合体の溶液（250mg、0.36mmol）に、0℃で475μLのトリメチルシリルブロミド（3.6mmol）を加え、この混合物を暗所室温で18時間反応させた。この反応混合物を濃縮した後、ジクロロメタンの添加によって所望の生成物を沈殿させ、さらに、ジクロロメタンで少なくともさらに2回洗浄した。得られた固体をメタノール（MeOH）に溶解し、室温で8時間撹拌し、このシリルエステルを加水分解させた。この反応混合物を濃縮した後、この反応混合物にジクロロメタンを注ぎ、所望の生成物cisPtBPを沈殿させ、得られた固体をジクロロメタンで2回以上洗浄した。D2O中の1H NMRはcisPtBP構造のプロトンシグナルを示す。収率：60％。
【０１２２】
下記のスキーム５に示すように、同様の手順で、ジクロロ-R,R-ジアミノシクロヘキサン白金ビスホスホネート複合体（DACHPtBp）を調製した。
【化６】
0006049712.tif 000018
【０１２３】
４．２  ナノ粒子の合成手順：cisPtBp-Zn-DOPAナノ粒子の合成
下記のスキーム６（a）に示すように、cisPtBpナトリウム塩水溶液(25mg/mL)0.2mL又はZn（NO3）水溶液(100mg/mL)0.2mLを、0.3MトリトンX-100／1-ヘキサノールのシクロヘキサン溶液(1.5M)の2つの別個の5mLのアリコートに加え、室温で激しく攪拌して、W=7.4の2つの別個のマイクロエマルジョンを形成した。このcisPtBpマイクロエマルジョンに１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸ナトリウム塩(DOPA)（CHCl3中200mg/mL）20μLを添加し、透明な溶液が形成されるまでこの混合物を15分間攪拌した。これら２つのマイクロエマルジョンを合わせ、得られたw=7.4のマイクロエマルジョン10mLをさらに30分間攪拌した。20mLのエタノールを添加した後、cisPtBp-Zn-DOPAナノ粒子を単離し、エタノールで１回、50％EtOH/THFで２回洗浄した。次に、このcisPtBp-Zn-DOPAナノ粒子をTHF中に再分散し、さらに表面改質するまで保存した。
【０１２４】
【化７】
0006049712.tif 000019
【０１２５】
４．３  ナノ粒子の合成手順：DACHPtBp-Zn-DOPA粒子の合成
上記スキーム６（b）に示すように、DACHPtBpナトリウム塩の水溶液(25mg/mL)0.2mL又はZn（NO3）水溶液(100mg/mL)0.2mLを、0.3MトリトンX-100／1-ヘキサノールのシクロヘキサン溶液(1.5M)の2つの別個の5mLのアリコートに加え、室温で激しく攪拌して、W=7.4の2つの別個のマイクロエマルジョンを形成した。このDACHPtBpマイクロエマルジョンに１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸ナトリウム塩(DOPA)（CHCl3中200mg/mL）20μLを添加し、透明な溶液が形成されるまでこの混合物を15分間攪拌した。これら２つのマイクロエマルジョンを合わせ、得られたw=7.4のマイクロエマルジョン10mLをさらに30分間攪拌した。20mLのエタノールを添加した後、DACHPtBp-Zn-DOPAナノ粒子を単離し、エタノールで１回、50％EtOH/THFで２回洗浄した。次に、このDACHPtBp-Zn-DOPA粒子ナノ粒子をTHF中に再分散し、さらに表面改質するまで保存した。
【０１２６】
４．４  脂質コーティング及びPEG化の一般的手順
50℃で30％（v/v）のEtOH/H2O 500μLに、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(DOPC)、コレステロール（モル比1:1）、DSPE-PEG2K（20モル％）、及びcisPtBp-Zn-DOPA又はDACHPtBp-Zn-DOPAナノ粒子のTHF溶液を添加することにより、脂質被覆及びPEG化ナノ粒子、cisPtBp-Zn-PEG又はDACHPtBp-Zn-PEGを得た。N2を吹き込むことによりTHFを蒸発させ、得られた溶液を室温まで放冷した。得られたcisPtBp-Zn-PEG又はDACHPtBp-Zn-PEGナノ粒子は、使用するまで室温で保存した。cisPtBp-Zn-DOPA及びcisPtBp-Zn-PEGナノ粒子の粒子サイズ、サイズ分布、及び表面電位データを表６に示す。これらのナノ粒子のTEM像を図38及び39に示す。DACHPtBp-Zn-DOPA及びDACHPtBp-Zn-PEGナノ粒子の粒子サイズ、サイズ分布、及び表面電位データを表７に示す。これらのナノ粒子のTEM像を図40及び41に示す。
【０１２７】
【表６】
0006049712.tif 000020
【０１２８】
【表７】
0006049712.tif 000021
【０１２９】
４．５  cisPtBp-Zn-PEG及びDACHPtBp-Zn-PEGの薬物積み込み(loading)と放出(release)プロファイルの決定
予め秤量した乾燥ナノ粒子を一晩濃硝酸中で消化した後、ICP-MS測定のために水で希釈した。cisPtBp-Zn-PEGのシスプラチンの積み込みは20±5重量％であり、DACHPtBp-Zn-PEGのオキサリプラチン積み込みは18±3重量％であった。ウシ血清アルブミン（BSA）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の、cisPtBp-Zn-PEGナノ粒子の安定性試験の結果を図42に示す。
４．５  cisPtBp-Zn-PEGナノ粒子の血液循環及び臓器分布
複数の正常なマウスに、尾静脈を介してシスプラチン3mg/kgに相当するcisPtBp-Zn-PEG粒子を注射した。これらのマウスを異なる時点で屠殺し、それらの血液、肝臓、肺、脾臓、腎臓、及び膀胱を回収した。これらの臓器（及び血液サンプル）を濃硝酸を用いて消化し、ICP-MSを用いてPtの含有量を分析した。血液中を循環する無傷の粒子として、Ptの分布は、シスプラチンの分布を示す。結果を図43A及びBに示す。注射投与量の50％より多くが、少なくとも15時間の循環系に留まる。
なお、本明細書に開示した発明の様々な詳細点は、本発明の範囲から逸脱することなく変更することができることが理解されるであろう。さらに、上記の記載は、単に例示の目的のためであり、本発明を限定するものではない。
【図１】
0006049712.tif 000022
【図２】
0006049712.tif 000023
【図３】
0006049712.tif 000024
【図４】
0006049712.tif 000025
【図５】
0006049712.tif 000026
【図６】
0006049712.tif 000027
【図７】
0006049712.tif 000028
【図８】
0006049712.tif 000029
【図９】
0006049712.tif 000030
【図１０】
0006049712.tif 000031
【図１１】
0006049712.tif 000032
【図１２】
0006049712.tif 000033
【図１３】
0006049712.tif 000034
【図１４】
0006049712.tif 000035
【図１５】
0006049712.tif 000036
【図１６】
0006049712.tif 000037
【図１７】
0006049712.tif 000038
【図１８】
0006049712.tif 000039
【図１９】
0006049712.tif 000040
【図２０】
0006049712.tif 000041
【図２１】
0006049712.tif 000042
【図２２】
0006049712.tif 000043
【図２３】
0006049712.tif 000044
【図２４】
0006049712.tif 000045
【図２５】
0006049712.tif 000046
【図２６】
0006049712.tif 000047
【図２７】
0006049712.tif 000048
【図２８】
0006049712.tif 000049
【図２９】
0006049712.tif 000050
【図３０】
0006049712.tif 000051
【図３１】
0006049712.tif 000052
【図３２】
0006049712.tif 000053
【図３３】
0006049712.tif 000054
【図３４】
0006049712.tif 000055
【図３５】
0006049712.tif 000056
【図３６】
0006049712.tif 000057
【図３７】
0006049712.tif 000058
【図３８】
0006049712.tif 000059
【図３９】
0006049712.tif 000060
【図４０】
0006049712.tif 000061
【図４１】
0006049712.tif 000062
【図４２】
0006049712.tif 000063
【図４３】
0006049712.tif 000064