(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）疎水性基が結合されてなるゼラチン誘導体を含む第１剤であって、該ゼラチン誘導体は
（ａ）重量平均分子量が１０,０００〜５０,０００であり、
（ｂ）該疎水性基が炭素数６〜１８のアルキル基であり、
（ｃ）該ゼラチン誘導体中のイミノ基／アミノ基（モル比）が１／９９〜３０／７０であり、且つ
（ｄ）該ゼラチン誘導体は下式の構造によって該疎水性基と結合され、
〜ＮＨ−ＣＲ１Ｒ２
上式において〜はゼラチン残基であり、Ｒ１は疎水性基であり、Ｒ２は水素原子または疎水性基である
第１剤、及び
（２）該ゼラチン誘導体の架橋剤を含む第２剤
からなる、放射法による滅菌への耐性を有する外科用シーラント。
【請求項２】
該ゼラチンが、冷水魚由来のゼラチンである、請求項１記載の外科用シーラント。
【請求項３】
該冷水魚がタラである、請求項２記載の外科用シーラント。
【請求項４】
該架橋剤が、少なくとも２つの活性化されたエステル基を有する、ポリエチレングリコールエーテル多塩基酸エステルである、請求項１〜３のいずれか１項記載の外科用シーラント。
【請求項５】
（該架橋剤の官能基の当量／該ゼラチン誘導体のアミノ基の当量）が０．２〜２となる量で使用される、求項１〜４のいずれか１項記載の外科用シーラント。
【請求項６】
前記第１剤が吸収線量６０ｋＧｙ以下の放射法の滅菌に対して耐滅菌性を有する、請求項１〜５の何れかに記載の外科用シーラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外科用シーラントに関し、詳細には疎水性基を有するゼラチン誘導体を主剤とする外科用シーラントにする。
【背景技術】
【０００２】
外科用シーラント又は組織接着剤（以下まとめて「シーラント」という）は、生体組織間の吻合部や損傷部に適用されて膜を形成し、血液の漏出、気体のリーク等を防止する材料であり、呼吸器外科、消化器外科、心臓血管外科、口腔外科等、種々の外科手術において使用されている。現在、最も広く使用されているシーラントは、フィブリンシーラント（商品名ボルヒール：化学及び血清療法研究所製）である。該シーラントは生体親和性に優れるが、組織に対する接着性及び患部のシーリング強度が低いという問題もある。ここで、シーリング強度は膜の耐圧強度もしくは破裂強度で測定され、該強度にはシーラント膜自体の強度と該膜の生体組織への接着強度の双方が要求される。
【０００３】
本発明者は、上記問題を解決するシーラントとして、疎水性基を導入したゼラチン誘導体（以下「疎水化ゼラチン」という場合がある）を用いたシーラントの開発を進めてきた（例えば特許文献１、特許文献２）。該シーラントから得られる膜は、組織に対する接着強度及びシーリング強度が高く、体液による膨潤も少ない。
【０００４】
しかし、生体材料は上記のような各特性だけでなく、最終製品、即ち最終容器又は包装に収められた形態での耐滅菌性を備えることが重要である。最終滅菌法として日本薬局方には、加熱法、照射法、及びガス法の中から適当な方法を選択すると規定されている（第十四改正日本薬局方、第二部、参考情報、第1235頁）。上記フィブリンシーラントは加熱により最終滅菌されているが、疎水化ゼラチンは加水分解により分子量が低下するため加熱法は適切ではない。また、疎水化ゼラチンは通常、水溶液の形態で供されるのでガス法も適用できない。従って、照射法を用いることになるが、ゼラチンのようなタンパク質を主成分とする材料を変性することなく滅菌するのは大変困難である。
【０００５】
例えば、特許文献３はコラーゲンゲルの放射線滅菌に関するものであるが、放射線照射によりコラーゲンゲルの部分的な架橋反応や分解反応を生じさせ、コラーゲンゲルの特性を著しく損なうとし（特許文献３、段落０００５）、コラーゲンゲルに熱変性アテロコラーゲン等の放射線保護物質を添加することを提案している。また、ゼラチン等の高分子に多官能トリアジン化合物を配合して、放射線照射する方法が提案されている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ2012/046717号
【特許文献２】ＷＯ2014/112208号
【特許文献３】特開平１１-１３７６６２号公報
【特許文献４】特開２００３−６９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、変性アテロコラーゲン等の添加は、シーラント膜の特性を低下させる。また、多官能トリアジン化合物は高分子鎖間に分子架橋を形成させて分子架橋を形成することによって劣化を防ぐものであり、シーラントを患部に適用するための流動性を著しく損なう。
【０００８】
そこで、本発明は、放射線保護物質等を添加することなく滅菌することができる外科用シーラントを提供することを目的とする。また、本発明は、簡易且つ安全に製造することができる外科用シーラントを提供することをさらなる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち、本発明は、下記のものである：
（１）イミノ基を介して、疎水性基が結合されてなるゼラチン誘導体を含む第１剤であって、該ゼラチン誘導体は
（ａ）重量平均分子量が１０，０００〜５０,０００であり、
（ｂ）該疎水性基が炭素数６〜１８のアルキル基であり、且つ
（ｃ）該ゼラチン誘導体中のイミノ基／アミノ基（モル比）が１／９９〜３０／７０である、
第１剤、及び
（２）該ゼラチン誘導体の架橋剤を含む第２剤
からなる外科用シーラント。
【発明の効果】
【００１０】
上記シーラントは、その主剤が所定の分子量及び疎水性基を備えることで、耐放射線滅菌性に優れる。該シーラントから得られる膜は、組織に対する接着強度及びシーリング強度が高く、体液による膨潤が少ない。さらに、該シーラントは水性溶媒中で作ることができ、製造環境及び体内において安全であるだけでなく、一段工程で簡易に且つ高い収率で合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、原料タラ由来ゼラチン、実施例１及び２のゼラチン誘導体のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図２】重量平均分子量（Ｍｗ）１３,０００〜９４,０００の原料タラ由来ゼラチンを２０ｗ／ｖ％で０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９）に溶解した溶液を、１０〜４０ｋＧｙの吸収線量で電子線滅菌した後の写真である。
【図３】原料タラ由来ゼラチン、実施例１及び２のシーラント膜の、３７℃の生理食塩水中での膨潤状態を経時的に示す図である。
【図４】原料タラ由来ゼラチン、実施例３〜５のシーラント膜の、３７℃の生理食塩水中での膨潤状態を経時的に示す図である。
【図５】原料タラ由来ゼラチン、実施例６及び７のシーラント膜の、３７℃の生理食塩水中での膨潤状態を経時的に示す図である。
【図６】図３〜５に示す膨潤挙動を数値化してプロットしたグラフである。
【図７】実施例４及び６の第１剤の０．１Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ９)溶液（タラ由来ゼラチン誘導体２０ｗ／ｖ％）に電子線を照射し、吸収線量を２０〜６０ｋＧｙで変化させたときの流動性の変化を示す写真である。
【図８】実施例４及び６の第１剤に電子線を照射した後の粘度変化を示す表である。
【図９】ＡＳＴＭ（Ｆ２３９２−０４）に従う外科用シーラントの破裂強度試験の方法の概要を示す図である。
【図１０】実施例４及び６のシーラント膜の破裂強度（ｍｍＨｇ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜第１剤＞
本発明の外科用シーラントにおいて、第１剤はゼラチン誘導体を含む。該ゼラチン誘導体はイミノ基、即ち、−ＮＨ−、を介して結合された疎水性基を有し、下記式（１）で示される構造を有する。
〜ＮＨ−ＣＲ１Ｒ２                （１）
上式において、「〜」はゼラチン残基であり、Ｒ１は疎水性基であり、Ｒ２は水素原子又は疎水性基である。Ｎは、ゼラチン中の主としてリジン（Ｌｙｓ）のε−アミノ基由来である。好ましくは、Ｒ２が水素原子である。該式（１）のＮＨ構造は、例えばＦＴ‐ＩＲスペクトルにおいて３３００ｃｍ−１付近のバンドにより検出することができる。図１は、後述する実施例１及び２のゼラチン誘導体のＦＴ−ＩＲスペクトルを、原料ゼラチンのそれと比較して示すものである。疎水性基の量が増えるにつれ、３３００ｃｍ−１付近のＮ−Ｈの振動及び２９００ｃｍ−１付近のＣ−Ｈの振動が強くなっていることが分かる。
【００１３】
Ｒ２が疎水性基である場合、Ｒ１と同じでも互いに異なっていてもよい。該疎水性基は、炭素数６〜１８のアルキル基であり、分岐を含んでいてもよい。該アルキル基の例としては、ヘキシル基、オクチル基（又はカプリル基）、ノニル基（又はペラルゴルニル基）、ドデジシル基（又はラウリル基）、テトラデシル基（又はミリスチル基）等が挙げられる。好ましくは、Ｒ１が炭素数８〜１４の直鎖アルキル基であり、Ｒ２が水素原子である。
【００１４】
該ゼラチン誘導体中の誘導化率は、疎水性基が結合されたイミノ基の、原料ゼラチン中のアミノ基量に対するモル％で、１〜２０モル％、好ましくは５〜１０モル％である。言い換えれば、得られたゼラチン誘導体におけるイミノ基／アミノ基（モル比）は、1／９９〜２０／８０、より好ましくは５／９５〜１０／９０である。該誘導化率は、原料ゼラチン中のアミノ基と、疎水性基を結合した後のアミノ基量を、塩酸等で滴定によって定量することで、或いは、ＮＭＲ等により疎水性基の同定及び定量を行うことによって求めることができる。
【００１５】
該ゼラチン誘導体は、重量平均分子量（Ｍｗ）が１０,０００〜５０,０００、好ましくは１０,０００〜４０,０００である。前記範囲内において、優れた耐電子線滅菌性を示す。該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により定法に従い測定することができる。
【００１６】
原料ゼラチンは、天然由来、化学合成、発酵法、又は遺伝子組換えにより得られるゼラチンのいずれであってもよい。好ましくは、天然由来、例えばウシ、ブタ、魚由来のゼラチンであり、より好ましくは冷水魚由来、例えばタイ及びタラ、最も好ましくはタラのゼラチンが使用される。冷水魚由来のゼラチンはブタ等のゼラチンに比べて、イミノ酸の含有量が少なく、高濃度でも常温流動性に優れたシーラントを与えることができる。
【００１７】
該原料ゼラチンは酸処理ゼラチン、アルカリ処理ゼラチンのいずれであってもよい。好ましくはアルカリ処理ゼラチンである。また、該ゼラチンの分子量の範囲は、ゼラチン誘導体が上述の平均分子量（Ｍｗ）の範囲となるような範囲であればよい。
【００１８】
第１剤は、上記ゼラチン誘導体に加えて、誘導体化されていないゼラチンを含んでもよい。該ゼラチンとしては、上述の各種ゼラチンを用いることができる。誘導体化されていないゼラチンの量は、ゼラチン誘導体との合計重量の０〜９９ｗｔ％であり、好ましくは、０〜５０ｗｔ％である。
【００１９】
第１剤は、水性溶媒をさらに含み、該ゼラチン誘導体を該水性溶媒に溶解又は分散して水性溶液（以下、単に「水溶液」という場合がある）として供されることが利便性の点で好ましい。該水性溶媒としては、超純水、生理食塩水、ホウ酸、リン酸、炭酸等各種無機塩緩衝液又はこれらの混合物を用いることができる。好ましくはｐＨ８〜１１、より好ましくはｐＨ９〜１０のホウ酸緩衝液が使用される。該水性溶媒は、ゼラチン誘導体が１０〜８０ｗｔ／ｖ％、好ましくは１５〜３０ｗｔ／ｖ％となるような量で使用される。誘導体化されていないゼラチンを含む場合には、ゼラチン誘導体との合計重量が上記濃度となる量である。
【００２０】
＜第２剤＞
本発明において、第２剤はゼラチン誘導体の架橋剤であり、水、血液等の体液に不溶性の構造体を形成する。該架橋剤としては、ゼラチン中のアミノ基、主として側鎖の第一級アミノ基、と反応性の官能基を分子中に少なくとも２つ以上有するものの少なくとも一種が使用される。架橋剤の例としては、ゲニピン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドもしくはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドで活性化された多塩基酸、アルデヒド化合物、酸無水物、及びジイソチオシアンネートが挙げられる。
【００２１】
多塩基酸としては、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、グルタル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、オキサロ酢酸、cis−アコニット酸、２−ケトグルタル酸、ポリ酒石酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等が例示され、これらのカルボキシル基が活性エステル化されたもの、例えばジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ジスクシンイミジルタートレート（ＤＳＴ）等を使用することができる。
【００２２】
また、ポリエチレングリコールもしくはポリエチレングリコールエーテルの、多塩基酸エステルで、該多塩基酸の、ポリエチレングリコールと反応していないカルボキシル基の少なくとも１つが活性エステル化されたもの、例えば4,7,10,13,16-ペンタオキサノナデカン二酸ジ(N-スクシンイミジル)、及び下記式で表されるポリエチレングリコール  ジ（スクシンイミジル  スクシネート）（ＳＳ−ＰＥＧ−ＳＳ）:
【化１】
0005995128.tif 000002
（ｎはＭｎが約２０,０００となる数）；
さらに、下記式で表されるペンタエリスリトール‐ポリエチレングリコールエーテル  テトラスクシンイミジル  グルタレート（４Ｓ−ＰＥＧ）：
【化２】
0005995128.tif 000003
（ｎはＭｎが約１０,０００となる数）；
が挙げられる。
【００２３】
アルデヒド化合物としては、１分子中に２つ以上のアルデヒド基が導入された、アルデヒド基導入多糖類、例えばアルデヒド基導入デンプン、アルデヒド基導入デキストラン、及びアルデヒド基導入ヒアルロン酸が、酸無水物としては、無水グルタル酸、無水マレイン酸、及び無水コハク酸が、ジイソチオシアンネートとしてはヘキサメチレンジイソチオシアネート等が例示される。これらのうち、上記活性化ポリエチレングリコール多塩基酸エステル、及びアルデヒド基導入多糖類が好ましく使用される。
【００２４】
これらの架橋剤は、ゼラチン誘導体のアミノ基１当量に対して、該架橋剤中の官能基、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたエステル基、が０．２〜３当量、好ましくは０．３〜２当量、より好ましくは０．４〜１．２当量となる量で使用される。２種以上の架橋剤の混合物を用いてもよく、その場合はそれらの合計当量が上記範囲となる量とする。
【００２５】
第２剤も、該架橋剤を溶解するための水性溶媒をさらに含むことが好ましい。但し、該架橋剤と該水性溶媒とを別々の容器で供し、使用に際して、使用の約２時間前以後に、両者を適量混合して水性溶液（以下、単に「水溶液」という場合がある）として使用することが好ましい。該水性溶媒については、第１剤について上記したものを使用することができる。好ましくは、ｐＨ３〜８、より好ましくはｐＨ４〜６のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が使用される。最も好ましくは、第１剤の水溶液と第２剤の水溶液を同体積で混合した際に、ｐＨが８〜９となるように双方の水性溶媒のイオン強度が調整される。例えば、第１剤水溶液をｐＨ９、イオン強度０．０５〜０．１のホウ酸緩衝溶液とし、第２剤水溶液をｐＨ４、イオン強度０．０１〜０．０３のリン酸緩衝溶液とすることで、同体積で混合した際に８〜９のｐＨとすることができる。又は、第１剤水溶液をｐＨ１０、イオン強度０．０５〜０．１のホウ酸緩衝溶液として、第２剤水溶液をｐＨ４、イオン強度０．０１〜０．０７のリン酸緩衝溶液としてもよい。
【００２６】
第２剤は、第１剤中のアミノ基の当量に対する第２剤中の官能基の当量、即ち（第２剤中の官能基当量／第１剤中のアミノ基当量）が、上記範囲になるように調整される。２種以上の架橋剤の混合物を用いてもよく、その場合はそれらの合計が上記範囲となる量とする。
【００２７】
＜添加剤＞
上記第１剤及び／又は第２剤は、各種添加剤を本発明の目的を阻害しない量でさらに含んでよい。該添加剤としては、着色料、ｐＨ調整剤、粘度調整剤、保存剤等が挙げられる。好ましくは、シーラントの適用箇所が分かり易いように、第１剤あるいは２剤水溶液中に着色料、例えばブリリアントブルーを添加する。添加量は、例えば１０〜１００μg／ｍＬであってよい。
【００２８】
＜製造方法＞
本発明のシーラントは、第１剤と第２剤を個別に調製することによって得ることができる。
［第１剤の調製法］
（１）原料ゼラチン水性溶液の調製
出発材料のゼラチンを５〜５０ｗｔ／ｖ％となる量で、４０〜９０℃で加熱して水性溶媒に溶解する。該水性溶媒としては、水と水溶性有機溶媒との混合物を用いる。該水溶性有機溶媒としては、炭素数１〜３のアルコール、エステル等を用いることができ、好ましくはエタノールが使用される。
【００２９】
（２）誘導体化
工程（１）で得られたゼラチン水溶液に、導入する疎水性基を有する誘導体化薬剤を添加し、所定時間撹拌して反応させる。該誘導体化薬剤としては、上記疎水基を有するアルデヒドもしくはケトン、例えばドデカナール、テトラデカナール、デシルエチルケトンが使用される。反応温度は３０〜８０℃、反応時間は０．５〜１２時間であり、通常、撹拌するだけでゼラチンのアミノ基にシッフ塩基（〜Ｎ＝ＣＲ１Ｒ２）を介してアルキル基が結合されたゼラチンを得ることができる。アルデヒドの使用量は、所望の誘導化率に相当する化学量論量に対して１〜４倍とする。より好ましくは、１〜２倍とする。
【００３０】
次いで、該シッフ塩基を還元して上記式（１）の構造とする。還元剤としてはシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）、２−ピコリンボラン、ピリジンボラン等の、公知の還元剤を使用することができる。これらのうち、２−ピコリンボランが好ましい。ピコリンボランは安定性であり、水性溶媒中でアルデヒドもしくはケトンの還元アミノ化反応を一段（ワンポット）で行うことが可能である。また、８０〜９０％の収率を達成することができ、これはシアノ水素化ホウ素ナトリウムが７０〜７５％であるのに比べて顕著に高い。２−ピコリンボランの使用量は、誘導体化薬剤の当量に対して１〜３当量であることが好ましい。
【００３１】
（３）精製
工程（２）で得られた反応溶液に、大過剰の貧溶媒、例えば冷エタノールを加えて、ゼラチン誘導体を沈殿させる。該沈殿を濾別した後、エタノール等で洗浄して、最終生成物を得る。
【００３２】
（４）第１剤の調製
工程（３）で得られたゼラチン誘導体を、ホウ酸緩衝液等の水性溶媒に上述の範囲となる量で溶解することが好ましい。所望により、誘導体化されていないゼラチン、その他添加剤を添加してよい。得られた第１剤を、例えばポリプロピレン等のプラスチック製ディスペンサ等の所定の容器に充填する。好ましくは、外科用シーラントを患部に適用する際に使用する、先端部で両剤を混合することができるダブルシリンジ型ディスペンサ等の一方に第１剤の水溶液を充填する。
【００３３】
［第２剤の調製法］
第２剤として例示した上記各架橋剤は、公知の方法で合成してもよいし、市販されているものを使用してもよい。該架橋剤と、それを溶解するための、例えばＰＢＳ等の水性溶媒を別々の容器、例えば架橋剤をガラス製のバイアルに、水性溶媒をプラスチックボトルに入れて供する。
【００３４】
＜放射線滅菌＞
次いで、ディスペンサに充填された水溶液の形態の第１剤、バイアルに充填された粉末形態の架橋剤、及びボトルに充填された該架橋剤を溶解するための水性溶媒を夫々放射線滅菌する。該放射線としては、電子線、ガンマ線、制動放射線が挙げられ、電子線滅菌が好ましい。吸収線量としては、従来広く用いられている（第十四改正日本薬局方、第二部、参考情報、第1235頁、右欄、2.2  放射線法）２５ｋＧｙか、それ以上であればよく、好ましくは２５ｋＧｙ〜４５ｋＧｙである。
【００３５】
＜組織への適用方法＞
本発明の外科用シーラントは、皮膚、血管、腱、神経、腸、及びリンパ管等の管状組織、肝臓、膵臓、及び心臓などの臓器の断裂部分に適用することができる。なかでも、湿潤組織、例えば、血管、肺等に好適に適用される。外科用シーラントの適用方法としては、上述のとおり第２剤を、好ましくは使用直前に水溶液とする。その際の架橋剤の濃度は、既に述べたとおりである。得られた第２剤水溶液を、既に第１剤水溶液が充填されているダブルシリンジ型ディスペンサの空いている方のシリンジに充填して適用し、又は、ダブルシリンジを備えるエアアシストスプレーで噴霧して患部に施与する。
【００３６】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［基礎実験１：ゼラチン分子量の耐電子線滅菌性への影響］
原料ゼラチンの分子量の違いによる耐電子線滅菌性の違いを、種々の重量平均分子量（Ｍｗ）のタラ由来のゼラチン（新田ゼラチン（株）製）を用いて調べた。タラ由来のゼラチンを２０ｗ／ｖ％となる量で０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９）に、８０℃で２０分間加熱して溶解した。得られた溶液を、１０〜４０ｋＧｙの吸収線量で電子線滅菌した。結果を図２に示す。同図から、Ｍｗ６０,０００未満であれば電子線による変性がなく、Ｍｗ３８,０００以下であれば十分な耐電子線滅菌性があることが分かった。
【００３７】
［実施例１〜７］
＜第１剤の調製＞
タラ由来のゼラチン（Ｍｗ１３,０００、新田ゼラチン（株）製）を水３５０ｍＬに溶解し、得られた水溶液にエタノール １４０ｍＬを加えて５０℃にて撹拌した。ゼラチンのアミノ基に対して、表１に記載の誘導化率に相当する化学量論量の１.５当量のドデカナールを５ｍＬエタノールに溶解して、ゼラチン溶液に混合し、次いでドデカナールの約１.５当量の２-ピコリンボランを加えて、１８時間撹拌した。反応溶液の１０倍体積量の冷エタノール中に該反応溶液を滴下して、生成されたゼラチン誘導体を再沈殿させ、吸引ろ過を行った。得られた沈殿物の約５倍体積量の冷エタノール中に該沈殿物を入れ、1時間撹拌しながら洗浄後吸引ろ過を行った。この洗浄を3回行った後、２日間真空乾燥して、ドデシル基が導入された白色のゼラチン誘導体１を、収率は約８２％で得た。誘導化率は、塩酸による滴定法により確認した。
【００３８】
タラ由来のゼラチンの分子量（Ｍｗ）を２４,０００又は３８,０００に変え、又はドデカナールをテトラデカナールに変えたことを除き上記ゼラチン誘導体の調製方法と同様の方法で、表１に示すゼラチン誘導体を調製した。
【表１】
0005995128.tif 000004
【００３９】
上記各ゼラチン誘導体を、ｐＨ９の０．１Ｍホウ酸緩衝液に、実施例１及び２は２０ｗ／ｖ％で、実施例３〜７は１５ｗ／ｖ％で溶解し、得られた溶液を、２.５ｍＬのポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填し、各第１剤とした。
【００４０】
＜第２剤の調製＞
第２剤として、ペンタエリスリトール‐ポリエチレングリコールエーテル  テトラスクシンイミジル  グルタレート（４Ｓ−ＰＥＧ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いた。下記各評価の直前に、ブリリアントブルーを１００μg/ｍＬ含むｐＨ４のリン酸緩衝液に、実施例１及び２では第１剤の残存アミノ基に対して4S-PEGのスクシンイミドエステル基の当量比（モル比）が０．７５となるように、他の実施例では０．５となるように調製した量を溶解し、得られた水溶液を第１剤と同様のシリンジに収納して第２剤とした。
【００４１】
［評価］
＜膨潤性＞
第１剤と第２剤を夫々２００μｌずつ、厚さ１ｍｍのシリコーンゴムをスペーサーとする２枚のガラス板間に流し込み、板状のシーラント硬化物を作成した。得られたシーラント硬化物を直径１５ｍｍのポンチでくりぬくことにより、厚さ１．０ｍｍ、直径１５ｍｍの円形シーラント膜を調製した。シーラント膜を３７℃の生理食塩水中に浸漬し、経過時間によるシーラント膜の重量の変化から膨潤性を調べた。なお、本評価においては上記試験片を作成するために第１剤はｐＨ８の０．１ＭＰＢＳ溶液とし、及び（架橋剤中のスクシンイミドエステル基の当量／ゼラチン誘導体中のアミノ基の当量）比は、実施例１，２において０．７５、実施例３〜５において０．５及び実施例６、７において０．５とした。また、比較例として、誘導体化していないゼラチンを用いた。
【００４２】
図３〜５に時系列のシーラント膜の写真を、及び図６に数値化した膨潤度（（含水重量-乾燥重量）／乾燥重量）をプロットしたものを示す。なお、これらの図において、例えば「４.２Ｃ１２」は誘導化率４.２モル％で、ドデシル基で誘導化されていることを示す。これらの結果から、アルキル基による誘導化により、シーラント膜の膨潤性が改良され、特に原料ゼラチンのＭｗが１３,０００、２４,０００では、改良の程度が顕著であることが分かる。
【００４３】
＜第１剤の電子線滅菌＞
実施例４及び実施例６で調製したゼラチン誘導体を夫々１５ｗｔ／ｖ（％）でｐＨ９の０．１Ｍホウ酸緩衝液に溶解して、２.５ｍＬのポリプロピレン製ディスポーザブルシリンジに充填した。これらに電子線を照射し、吸収線量を２０〜６０ｋＧｙで変化させたときのゲル化による流動性の変化によって劣化の程度を調べた。図７に電子線照射後の試料の写真を、図８に各吸収線量での照射後の試料の粘度を示す。図８において、「ＥＢ−」は電子線照射前を、「ＥＢ＋」は電子線照射後を示す。
【００４４】
図７に示すように、いずれの実施例も６０ｋＧｙまで流動性を維持した。また、粘度も最高値で80ｍＰａ・Ｓ以下であり、いずれも問題なく患部に適用できることが確認された。原料ゼラチンでは、低分子量の方が電子線照射による劣化が少なかったが（図２）、ゼラチン誘導体ではゼラチンの３８,０００のものがより優れた耐滅菌性を示した（図８）。
【００４５】
＜シーリング強度測定＞
実施例４及び６の、初期及び吸収線量４０ｋＧｙでの電子線滅菌後の双方について、ＡＳＴＭ（Ｆ２３９２−０４）に従い、図９に示す装置を用いて、ブタ大動脈（φ３０ｍｍ）を基材として用いた破裂強度測定を行うことによって、シーリング強度（耐圧強度）を測定した。第１剤と第２剤をそれぞれ２００μｌずつ混合し（架橋剤中のスクシンイミドエステル基の当量／ゼラチン誘導体中のアミノ基の当量＝０．５）、前記ブタ大動脈に塗布することで、厚さ１．０ｍｍ、直径１５ｍｍのシーラントを調製した。塗布後、５．０ｇ／ｍｍ２の荷重により１０分間の圧着を行った後、３７℃の生理食塩水を２ｍｌ／分で流し、破裂したときの圧力の測定を行った。
比較例として、市販のフィブリンシーラント（ボルヒール：化学及び血清療法研究所製）を用いた。結果を図１０に示す。
【００４６】
図１０に示すとおり、本発明のシーラントは、電子線滅菌後であってもフィブリンシーラント（約２０ｍｍＨｇ）に比べて顕著に高いシーリング強度を示した。該フィブリンシーラントは、該シーラントとブタ大動脈基材との界面で剥離したが、本発明のシーラントは、シーラント膜自体が破壊された。ここから、本発明のシーラントは接着強度にも優れることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の外科用シーラントは水性溶媒中、一段工程で高い収率で合成することができ、耐電子線滅菌性に優れる。該シーラントから得られる膜は、組織に対する接着強度及びシーリング強度が高い上に体液による膨潤が少なく、臨床での使用に大変適する。
【要約】
【課題】放射線保護物質等を添加することなく滅菌することができ、且つ、簡易且つ安全に製造することができる外科用シーラントを提供する。
【解決手段】
（１）イミノ基を介して、疎水性基が結合されてなるゼラチン誘導体を含む第１剤であって、該ゼラチン誘導体は
（ａ）重量平均分子量が１０,０００〜５０,０００であり、
（ｂ）該疎水性基が炭素数６〜１８のアルキル基であり、且つ
（ｃ）該ゼラチン誘導体中のイミノ基／アミノ基（モル比）が１／９９〜３０／７０である、
第１剤、及び
（２）該ゼラチン誘導体の架橋剤を含む第２剤
からなる外科用シーラント。
【選択図】なし【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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