(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）β−キシロシダーゼ活性を有する第１のポリペプチド又はその変異体であって、前記第１のポリペプチド又はその変異体が、配列番号２８に対して、又は、配列番号２８の（ｉ）２１−３４１、（ｉｉ）２１−３５０、（ｉｉｉ）１０７−３４１、若しくは、（ｉｖ）１０７−３５０の残基に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＦｖ４３Ｄポリペプチドである前記第１のポリペプチド又はその変異体と、
（ｂ）キシラナーゼ活性を有する第２のポリペプチド又はその変異体であって、前記第２のポリペプチド又はその変異体が、
（ｉ）トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチド、
ここで、前記トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチドは、配列番号４２に対して若しくは配列番号４２の１７−３４７の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドであるか、又は、前記トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチドは、配列番号４１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって若しくは配列番号４１の相補体に対して高厳格性条件下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド又はその成熟体である、
（ｉｉ）トリコデルマリーゼイＸｙｎ２ポリペプチド、
ここで、前記トリコデルマリーゼイＸｙｎ２ポリペプチドは、配列番号４３に対して又は配列番号４３の３３−２２２の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドである、
（ｉｉｉ）ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチド、
ここで、前記ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、配列番号２４に対して若しくは配列番号２４の１９−２２８の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドであるか、又は、前記ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、配列番号２３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって若しくは配列番号２３の相補体に対して高厳格性条件下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド又はその成熟体である、
又は
（ｉｖ）ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチド、
ここで、前記ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、配列番号２６に対して若しくは配列番号２６の２０−３１３の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドであるか、又は、前記ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって若しくは配列番号２５の相補体に対して厳格性条件でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド又はその成熟体である、
である前記第２のポリペプチド又はその変異体と、を含み、
バイオマスから得たヘミセルロースキシランの６０％以上をキシロースに変換することができることを特徴とする非天然組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、
前記組成物が、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する第３のポリペプチド又はその変異体をさらに含み、
前記第３のポリペプチド又はその変異体が、
(a) 配列番号３２に対して、又は、配列番号３２の（ｉ）２０−６６０、（ｉｉ）２０−６４５、（ｉｉｉ）４５０−６４５、若しくは、（ｉｖ）４５０−６６０の残基に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＦｖ５１Ａポリペプチド、
(b) 配列番号２０に対して、又は、配列番号２０の（ｉ）１５−５５８、若しくは、（ｉｉ）１５−２９５の残基に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＡｆ４３Ａポリペプチド、
(c) 配列番号１２に対して、又は、配列番号１２の（ｉ）１７−５７４、（ｉｉ）２７−５７４、（ｉｉｉ）１７−３０３、若しくは、（ｉｖ）２７−３０３に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＦｖ４３Ｂポリペプチド、
(d) 配列番号１４に対して、又は、配列番号１４の（ｉ）２１−６７６、（ｉｉ）２１−６５２、（ｉｉｉ）４６９−６５２、若しくは、（ｉｖ）４６９−６７６の残基に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＰａ５１Ａポリペプチド、又は
(e) 配列番号２２に対して、又は、配列番号２２の（ｉ）２１−６３２、（ｉｉ）４６１−６３２、（ｉｉｉ）２１−６４２、若しくは、（ｉｖ）４６１−６４２の残基に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＰｆ５１Ａポリペプチド
であることを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の組成物であって、
前記Ｆｖ４３Ｄポリペプチドが、配列番号２７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって、又は、配列番号２７の相補体に対して高厳格性条件下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド又はその成熟タンパクであることを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の組成物であって、
(a)前記Ｆｖ５１Ａポリペプチドが、配列番号３１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって、又は、配列番号３１の相補体に対して高厳格性条件下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド又はその成熟タンパクである、
(b)前記Ａｆ４３Ａポリペプチドが、配列番号１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって、又は、配列番号１９の相補体に対して高厳格性条件下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチドである、
(c)前記Ｆｖ４３Ｂポリペプチドが、配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって、又は、配列番号１１の相補体に対して高厳格性条件下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド又はその成熟タンパクである、
(d)前記Ｐａ５１Ａポリペプチドが、配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって、又は、配列番号１３の相補体に対して高厳格性条件下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド又はその成熟タンパクである、又は
(e)前記Ｐｆ５１Ａポリペプチドが、配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって、又は、配列番号２１の相補体に対して高厳格性条件下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド又はその成熟タンパクであることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、セルラーゼ活性を有する１つ又はそれ以上のポリペプチドをさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物であって、前記セルラーゼ活性を有する１つ又はそれ以上のポリペプチドが全セルラーゼの成分であり、
ここで、全セルラーゼは、少なくともエンドグルカナーゼ、セロビオヒドラーゼ、及びβ−グルコシダーゼを含む天然又は非天然のセルラーゼ含有組成物、又は、少なくともエンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドラーゼ活性、及びβ−グルコシダーゼ活性を含む天然又は非天然のセルラーゼ含有組成物であることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、前記全セルラーゼが、α−グルコシダーゼ・リッチであることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の組成物であって、前記全セルラーゼは、糸状菌の全セルラーゼであることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、前記糸状菌の全セルラーゼが、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillus)、エメリセラ(Emericella)、フザリウム(Fusarium)、フミコラ(Humicola)、ムコール(Mucor)、ミセリオフトラ(Myceliophthora)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、スキタリジウム(Scytalidium)、チエラビア(Thielavia)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、ファネロカエテ(Phanerochaete)、トリポクラディウム(Tolypocladium)又はトリコデルマ(Trichoderma)の種から調製されたものであることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項６に記載の組成物であって、前記全セルラーゼが、クリソスポリウム・ルクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、ファネロキーテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、トリコデル・マリーゼイ(Trichoderma reesei)、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンジブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)又はペニシリウム・フニクロスム(Pencillium funiculosum)の全セルラーゼであることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項５に記載の組成物であって、前記１つ又はそれ以上のセルラーゼ活性を有するポリペプチドが、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼから選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、前記β−グルコシダーゼが、トリコデルマリーゼイＢｇｌ１ポリペプチドであり、
前記トリコデルマリーゼイＢｇｌ１ポリペプチドが、配列番号４５に対して又は配列番号４５の２０−７４４の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、
前記β−グルコシダーゼポリペプチドが、前記組成物中のセルラーゼ酵素の全重量の最大５０重量％を構成することを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組成物であって、前記β−グルコシダーゼポリペプチドが、前記組成物中のタンパクの全重量の２重量％から５０重量％を構成することを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項６に記載の組成物であって、前記１つ又はそれ以上のセルラーゼ活性を有するポリペプチドが、前記組成物中のタンパクの全重量の３０重量％から８０重量％を構成することを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物であって、前記１つ又はそれ以上のセルラーゼ活性を有するポリペプチドが、カルコフロール分析によって決定したときに、リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）１ｇ当たり１ｍｇのタンパク量において、少なくとも０．００００５の生成率(fraction product)を達成することができることを特徴とする組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の組成物であって、１つ又はそれ以上のアクセサリタンパクをさらに含み、前記１つ又はそれ以上のアクセサリタンパクが、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナーゼ、リグニナーゼ、アミラーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、キシログルカナーゼ、グリコシドヒドロラーゼ・ファミリー６１ポリペプチド、ＣＩＰ１、ＣＩＰ１様タンパク、ＣＩＰ２、ＣＩＰ２様タンパク、スオレニン、エクスパンシン、セロビオースデヒドロゲナーゼ、及び、マンガンペルオキシダーゼからなる群より選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、前記１つ又はそれ以上のアクセサリタンパクが、前記組成物中のタンパクの全重量の１重量％から５０重量％を構成することを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の組成物であって、バイオマスから得たヘミセルロースキシランの７０％以上をキシロースに変換することができることを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物であって、バイオマスから得たヘミセルロースキシランの８０％以上をキシロースに変換することができることを特徴とする組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載の組成物であって、前記バイオマスが、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、コーンファイバ、スイッチグラス、モロコシ、紙、パルプ、又は、サトウキビバガスであることを特徴とする組成物。
【請求項２１】
請求項１に記載の組成物であって、前記バイオマスがススキであることを特徴とする組成物。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物であって、バイオマスをさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物であって、前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの総重量が、バイオマス中のヘミセルロース１ｋｇ当たり１ｇ〜４０ｇであることを特徴とする組成物。
【請求項２４】
請求項２２に記載の組成物であって、前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの総重量が、バイオマス中のヘミセルロース１ｋｇ当たり０．５ｇから４０ｇであることを特徴とする組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組成物であって、前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの総重量が、バイオマス中のヘミセルロース１ｋｇ当たり０．５ｇから２０ｇであることを特徴とする組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組成物であって、前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの総重量が、バイオマス中のヘミセルロース１ｋｇ当たり２ｇから２０ｇであることを特徴とする組成物。
【請求項２７】
請求項２２に記載の組成物であって、前記β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドの総重量が、バイオマス中のヘミセルロース１ｋｇ当たり１ｇから５０ｇであることを特徴とする組成物。
【請求項２８】
請求項２２に記載の組成物であって、前記β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドの総重量が、バイオマス中のヘミセルロース１ｋｇ当たり０．５ｇから５０ｇであることを特徴とする組成物。
【請求項２９】
請求項２８に記載の組成物であって、前記β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドの総重量が、バイオマス中のヘミセルロース１ｋｇ当たり０．５ｇから４０ｇであることを特徴とする組成物。
【請求項３０】
請求項２９に記載の組成物であって、前記β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドの総重量が、バイオマス中のヘミセルロース１ｋｇ当たり２ｇから４０ｇであることを特徴とする組成物。
【請求項３１】
請求項２２に記載の組成物であって、前記Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの総重量が、バイオマス中のヘミセルロース１ｋｇ当たり０．５ｇから２０ｇであることを特徴とする組成物。
【請求項３２】
請求項２２に記載の組成物であって、前記Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドの総重量が、バイオマス中のヘミセルロース１ｋｇ当たり０．２ｇから２０ｇであることを特徴とする組成物。
【請求項３３】
請求項２２に記載の組成物であって、前記セルラーゼ活性を有するポリペプチドの総重量が、バイオマス中のセルロース１ｋｇ当たり１ｇから１００ｇであることを特徴とする組成物。
【請求項３４】
請求項１に記載の組成物を含むことを特徴とする培養液。
【請求項３５】
請求項３４に記載の培養液であって、糸状菌の培養液であることを特徴とする培養液。
【請求項３６】
請求項３５に記載の培養液であって、前記糸状菌が、トリコデルマ(Trichoderma)、フミコラ(Humicola)、フザリウム(Fusarium)、アスペルギルス(Aspergillus)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、セファロスポリウム(Cephalosporium)、アクリャ(Achlya)、ポドスポラ(Podospora)、エンドチア(Endothia)、ムコール(Mucor)、コクリオボルス(cochliobolus)、ピリキュラリア(Pyricularia)、ファネロカエテ(Phanerochaete)、又は、クリソスポリウム(Chrysosporium)であることを特徴とする培養液。
【請求項３７】
請求項３５に記載の培養液であって、前記糸状菌が、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・フォエティダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、クリソスポリウム・ルクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム・バクトリディオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クロックウェレンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・カルモラム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミヌム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポルム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンジ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レティキュラツム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サンブシヌム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイデス(Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・スルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロスム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコセシオイデス(Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ヴェネナツム(Fusarium venenatum)、ブジェルカンデラ・アダスタ(Bjerkandera adusta)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・カレギエア(Ceriporiopsis caregiea)、セリポリオプシス・ギルベセンス(Ceriporiopsis gilvescens)、セリポリオプシス・パノシンタ(Ceriporiopsis pannocinta)、セリポリオプシス・リブロサ(Ceriporiopsis rivulosa)、セリポリオプシス・スブルファ(Ceriporiopsis subrufa)、セリポリオプシス・サバーミスポラ(Ceriporiopsis subvermispora)、コプリヌス・シネレウス(Coprinus cinereus)、コリオラス・ヒルスタス(Coriolus hirsutus)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、ミセリオフトラ・サーモフィリア(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ニューロスポラ・インターメディア(Neurospora intermedia)、ペニシリウム・パルロゼラム(Penicillium purpurogenum)、ペニシリウム・カネスセンス(Penicillium canescens)、ペニシリウム・ソリツム(Penicillium solitum)、ペニシリウム・フニクロスム(Penicillium funiculosum)、ファネロキーテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、フレビア・ラジアータ(Phlebia radiate)、プロレタス・エリンギ(Pleurotus eryngii)、タラロミセス・フラバス(Talaromyces flavus)、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)、トラメテス・ビローサ(Trametes villosa)、トラメテス・バーシカラー(Trametes versicolor)、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンジブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマリーゼイ(Trichoderma reesei)、又は、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)であることを特徴とする培養液。
【請求項３８】
請求項３４に記載の培養液であって、無細胞培養液であることを特徴とする培養液。
【請求項３９】
バイオマスを糖に変換する方法であって、
（ａ）β−キシロシダーゼ活性を有する第１のポリペプチド又はその変異体であって、前記第１のポリペプチド又はその変異体が、配列番号２８に対して、又は、配列番号２８の（ｉ）２１−３４１、（ｉｉ）２１−３５０、（ｉｉｉ）１０７−３４１、若しくは、（ｉｖ）１０７−３５０の残基に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＦｖ４３Ｄポリペプチドである前記第１のポリペプチド又はその変異体と、
（ｂ）キシラナーゼ活性を有する第２のポリペプチド又はその変異体であって、前記第２のポリペプチド又はその変異体が、
（ｉ）トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチド、
ここで、前記トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチドは、配列番号４２に対して若しくは配列番号４２の１７−３４７の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドであるか、又は、前記トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチドは、配列番号４１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって若しくは配列番号４１の相補体に対して高厳格性条件下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド又はその成熟体である、
（ｉｉ）トリコデルマリーゼイＸｙｎ２ポリペプチド、
ここで、前記トリコデルマリーゼイＸｙｎ２ポリペプチドは、配列番号４３に対して又は配列番号４３の３３−２２２の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドである、
（ｉｉｉ）ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチド、
ここで、前記ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、配列番号２４に対して若しくは配列番号２４の１９−２２８の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドであるか、又は、前記ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、配列番号２３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって若しくは配列番号２３の相補体に対して高厳格性条件下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド又はその成熟体である、
又は
（ｉｖ）ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチド、
ここで、前記ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、配列番号２６に対して若しくは配列番号２６の２０−３１３の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドであるか、又は、前記ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって若しくは配列番号２５の相補体に対して厳格性条件でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド又はその成熟体である、
である前記第２のポリペプチド又はその変異体とを含む非天然組成物にバイオマスを接触させるステップ、を含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
（ａ）β−キシロシダーゼ活性を有する第１のポリペプチド又はその変異体であって、前記第１のポリペプチド又はその変異体が、配列番号２８に対して、又は、配列番号２８の（ｉ）２１−３４１、（ｉｉ）２１−３５０、（ｉｉｉ）１０７−３４１、若しくは、（ｉｖ）１０７−３５０の残基に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＦｖ４３Ｄポリペプチドである前記第１のポリペプチド又はその変異体と、
（ｂ）キシラナーゼ活性を有する第２のポリペプチド又はその変異体であって、前記第２のポリペプチド又はその変異体が、
（ｉ）トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチド、
ここで、前記トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチドは、配列番号４２に対して若しくは配列番号４２の１７−３４７の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドであるか、又は、前記トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチドは、配列番号４１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって若しくは配列番号４１の相補体に対して高厳格性条件下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド又はその成熟体である、
（ｉｉ）トリコデルマリーゼイＸｙｎ２ポリペプチド、
ここで、前記トリコデルマリーゼイＸｙｎ２ポリペプチドは、配列番号４３に対して又は配列番号４３の３３−２２２の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドである、
（ｉｉｉ）ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチド、
ここで、前記ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、配列番号２４に対して若しくは配列番号２４の１９−２２８の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドであるか、又は、前記ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、配列番号２３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって若しくは配列番号２３の相補体に対して高厳格性条件下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド又はその成熟体である、
又は
（ｉｖ）ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチド、
ここで、前記ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、配列番号２６に対して若しくは配列番号２６の２０−３１３の残基に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドであるか、又は、前記ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、配列番号２５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によって若しくは配列番号２５の相補体に対して厳格性条件でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされるポリペプチド又はその成熟体である、
である前記第２のポリペプチド又はその変異体とを含む非天然組成物又は培養液を用いてヘミセルロース含有材料を処理するステップ、を含むことを特徴とする糖化プロセス。
【請求項４１】
請求項４０に記載のプロセスであって、前記ヘミセルロース含有材料が、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、コーンファイバ、スイッチグラス、モロコシ、紙、パルプ、ススキ又はサトウキビバガスであることを特徴とする糖化プロセス。
【請求項４２】
請求項４０に記載のプロセスであって、前記ヘミセルロース含有材料のヘミセルロースキシランから少なくとも６０％のキシロースを生成することを特徴とする糖化プロセス。
【請求項４３】
請求項４０に記載のプロセスであって、モノマー糖を回収するステップをさらに含むことを特徴とするプロセス。
【請求項４４】
β−キシロシダーゼ活性を有し、かつ、配列番号２８のアミノ酸配列に対して、又は、配列番号２８の（ｉ）２１−３４１、（ｉｉ）２１−３５０、（ｉｉｉ）１０７−３４１、若しくは、（ｉｖ）１０７−３５０の残基に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを発現するように組み換えた宿主細胞。
【請求項４５】
糸状菌の細胞であることを特徴とする請求項４４に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
請求項４５に記載の宿主細胞であって、トリコデルマ(Trichoderma)、フミコラ(Humicola)、フザリウム(Fusarium)、アスペルギルス(Aspergillus)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、セファロスポリウム(Cephalosporium)、アクリャ(Achlya)、ポドスポラ(Podospora)、エンドチア(Endothia)、ムコール(Mucor)、コクリオボルス(cochliobolus)、ピリキュラリア(Pyricularia)、ファネロカエテ(Phanerochaete)又はクリソスポリウム（Chrysosporium)の細胞であることを特徴とする宿主細胞。
【請求項４７】
請求項４５に記載の宿主細胞であって、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・フォエティダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、クリソスポリウム・ルクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム・バクトリディオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クロックウェレンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・カルモラム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミヌム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポルム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンジ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レティキュラツム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サンブシヌム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイデス(Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・スルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロスム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコセシオイデス(Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ヴェネナツム(Fusarium venenatum)、ブジェルカンデラ・アダスタ(Bjerkandera adusta)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・カレギエア(Ceriporiopsis caregiea)、セリポリオプシス・ギルベセンス(Ceriporiopsis gilvescens)、セリポリオプシス・パノシンタ(Ceriporiopsis pannocinta)、セリポリオプシス・リブロサ(Ceriporiopsis rivulosa)、セリポリオプシス・スブルファ(Ceriporiopsis subrufa)、セリポリオプシス・サバーミスポラ(Ceriporiopsis subvermispora)、コプリヌス・シネレウス(Coprinus cinereus)、コリオラス・ヒルスタス(Coriolus hirsutus)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、ミセリオフトラ・サーモフィリア(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ニューロスポラ・インターメディア(Neurospora intermedia)、ペニシリウム・パルロゼラム(Penicillium purpurogenum)、ペニシリウム・カネスセンス(Penicillium canescens)、ペニシリウム・ソリツム(Penicillium solitum)、ペニシリウム・フニクロスム(Penicillium funiculosum)、ファネロキーテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、フレビア・ラジアータ(Phlebia radiate)、プロレタス・エリンギ(Pleurotus eryngii)、タラロミセス・フラバス(Talaromyces flavus)、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)、トラメテス・ビローサ(Trametes villosa)、トラメテス・バーシカラー(Trametes versicolor)、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンジブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマリーゼイ(Trichoderma reesei)、又は、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)であることを特徴とする宿主細胞。
【請求項４８】
請求項４４に記載の宿主細胞であって、細菌の細胞であることを特徴とする宿主細胞。
【請求項４９】
請求項４８に記載の宿主細胞であって、前記細菌が、ストレプトミセス(Streptomyces)、サーモモノスポラ(Thermomonospora)、バチルス(Bacillus)、又は、セルロモナス(Cellulomonas)である宿主細胞。
【請求項５０】
請求項４０に記載のプロセスであって、前記ヘミセルロース含有材料がセルロースをさらに含むことを特徴とする糖化プロセス。
【請求項５１】
請求項４０に記載のプロセスであって、前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの量が、バイオマス材料中のヘミセルロース１ｋｇ当たり１ｇから４０ｇであることを特徴とする糖化プロセス。
【請求項５２】
請求項４０に記載のプロセスであって、前記キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの量が、前記材料中のヘミセルロース１ｋｇ当たり０．５ｇから４０ｇであることを特徴とする糖化プロセス。
【請求項５３】
請求項４０に記載のプロセスであって、前記β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドの量が、前記材料中のヘミセルロース１ｋｇ当たり１ｇから５０ｇであることを特徴とする糖化プロセス。
【請求項５４】
請求項４０に記載のプロセスであって、前記β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドの量が、前記材料中のヘミセルロース１ｋｇ当たり０．５ｇから５０ｇであることを特徴とする糖化プロセス。
【請求項５５】
請求項５０に記載のプロセスであって、前記セルラーゼ活性を有するポリペプチドの量が、前記ヘミセルロース含有材料中のセルロース１ｋｇ当たり１ｇから１００ｇであることを特徴とする糖化プロセス。
【請求項５６】
請求項５０に記載のプロセスであって、前記β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドの量が、セルラーゼ活性を有するポリペプチドの全重量の５０％以下であることを特徴とする糖化プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本出願は、２００９年９月２３日に提出した米国仮出願第６１／２４５２７３号、及び、２００９年１２月２３日に提出した米国仮出願第６１／２８９８８６号に対する優先権を主張する。これらの開示は本明細書に参照として組み込まれている。
【０００２】
２．技術分野
本開示は、一般に、グリコシルヒドロラーゼ酵素、そのような酵素を含む組成物、及び、その酵素及び組成物を、例えば、セルロース材料及びヘミセルロース材料を糖に糖化又は変換するために使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
３．バックグラウンド
１９７０年代以降、ＯＰＥＣが石油の生産を減らすことによって石油危機が生じた時に、液体燃料の代替として、再生可能なリグノセルロースバイオマスを、発酵させてアルコール（例えばエタノール）を得られる発酵性糖に生物学的に変換することに、研究者の強い注目が集まっていた(Bungay, H. R., "Energy: the biomass options". NY: Wiley; 1981; Olsson L, Hahn-Hagerdal B. Enzyme Microb Technol 1996,18:312-31; Zaldivar, J et al., Appl Microbiol Biotechnol 2001, 56: 17-34; Galbe, M et al., Appl Microbiol Biotechnol 2002, 59:618-28)。最近２０年間、エタノールは、米国においてはガソリンに対する１０％の混合物として、また、ブラジルにおいてはそのまま燃料として広く用いられている。燃料バイオエタノールの重要性は、原油価格の急騰及び原油の枯渇につれて増大するであろう。さらに、発酵性糖は、プラスチック、ポリマー及び他の生物ベース生成物を生産するためにより多く使用されるようになっており、その産業が今後数年間に相当に拡大することが予想される。したがって、石油をベースとした原料の代わりの原料として使用することができる大量の低価格な発酵性糖の需要は増大し続けている。
【０００４】
有用な再生可能供給原料における主要なものは、セルロース及びヘミセルロース（キシラン）であり、これらを発酵性糖に変換することができる。これらの多糖類を、可溶性の糖（例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、及び／又は、他のヘキソースやペントース）に、酵素によって変換することは、種々の酵素の複合作用により生じる。例えば、エンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＧ）及びエキソセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）は、不溶性セルロースからセロオリゴ糖（例えば、セロビオースが主産物である）への加水分解を触媒する。一方で、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）は、オリゴ糖からグルコースへの変換を触媒する。キシラナーゼは、他のアクセサリタンパク（以下に限定されないが、例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ、フェルロイルエステラーゼ及びアセチルキシランエステラーゼ、グルクロニダーゼ、並びに、β−キシロシダーゼと共になって、ヘミセルロースの加水分解を触媒する。
【０００５】
植物の細胞壁は、共有結合及び非共有結合の手段によって相互に作用する複数の複合多糖の不均質混合物からなる。高等植物細胞壁の複合多糖は、例えば、セルロース（β−１，４グルカン）を含む。セルロースは、一般に、細胞壁成分に見られる炭素の３５％〜５０％を構成する。セルロースポリマーは、水素結合、ファンデルワールス相互作用及び疎水的相互作用によって自己会合することによって、半結晶性セルロースミクロフィブリルを形成する。これらのミクロフィブリルは、非晶性セルロースとして一般に知られている非晶質の部位をも含む。セルロースミクロフィブリルは、ヘミセルロース（例えば、キシラン、アラビナン、及び、マンナンを含む）、ペクチン（例えば、ガラクツロナン及びガラクタン）、並びに、他の種々のβ−１，３及びβ−１，４グルカンからなるマトリクスに埋め込まれている。これらのマトリックスポリマーは、例えば、アラビノース残基、ガラクトース残基及び／又はキシロース残基によって頻繁に置換されることにより、高度に複合化したアラビノキシラン、アラビノガラクタン、ガラクトマンナン及びキシログルカンを与える。ヘミセルロースマトリクスは、同様にポリフェノール性のリグニンに囲まれている。
【０００６】
酵素がセルロースミクロフィブリルのコアに作用し得る前にリグニン成分及びヘミセルロース成分を分解しなければならないので、このマトリクスの複雑さは、微生物による分解を困難にする。通常、細胞壁ポリマーを分類して構成成分の単糖を放出させるためには、様々な酵素活性の共同が必要とされる。植物細胞壁を糖化するためには、セルロース分解酵素が植物細胞壁の基質に作用できるように、リグニンは透過性でなければならず、また、ヘミセルロースは分解されなければならない。セルロースの供給原料の種類に関わらず、酵素のコスト及び加水分解効率は、バイオマスの生物学的変換プロセスの商業化を限定する主要な要因である。微生物によって生成される酵素の生産コストは、酵素を生産する株の生産性及び培養液における最終活性収率に強く関係する。多酵素複合体の加水分解効率は、個々の酵素の特性、それらの酵素間の相乗作用、及び、多酵素混合物における酵素の比率のいずれにも依存する。
【０００７】
植物性材料並びに／又は他のセルロース材料若しくはヘミセルロース材料をより高い効率及び収率で発酵性糖に変換することができる酵素及び／又は酵素混合物／酵素組成物を同定する必要が当業界に存在する。
【０００８】
４．概略
本開示は、例えば、キシラナーゼ（例えば、エンドキシラナーゼ）、キシロシダーゼ（例えば、β−キシロシダーゼ）、アラビノフラノシダーゼ（例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ）を含むヘミセルロース分解活性を有する特定のグリコシルヒドロラーゼポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸、並びに／又は、これらの核酸及びこれらのポリペプチドを作成及び使用する方法を提供する。本開示は、キシラナーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性、及び／又は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する新規な酵素及び変異体の発見に部分的に基づいている。本開示は、セルロース材料及びヘミセルロース材料の加水分解を効率的に触媒する酵素混合物（又は組成物）の同定にも基づいている。本開示の目的のために、ある酵素は、特定の酵素活性を有するポリペプチド又はその酵素そのもののいずれかとして定義することができる。例えば、キシラナーゼは、キシラナーゼ活性を有するポリペプチド又はキシラナーゼ酵素と称することができる。また、β−キシロシダーゼは、β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド又はβ−キシロシダーゼ酵素のいずれかとして称することができる。
【０００９】
本開示の酵素及び／又は酵素混合物／酵素組成物は、バイオマスから糖を生産するために使用することができる。そのようにして生産される糖は、微生物によるエタノール生産に使用することもできるし、又は、様々な工業的用途における他のバイオ生成物を生産するために使用することもできる。したがって、本開示は、さらに、本明細書に記載されている酵素及び／又は酵素混合物／酵素組成物を使用した工業的応用（例えば、エタノール生産における糖化プロセス）を提供する。本開示の酵素及び／又は酵素混合物／酵素組成物は、バイオ燃料生産における酵素コストを減らすために使用することができる。
【００１０】
一態様において、本開示の発明は、リグノセルロース系バイオマスの主成分（例えば、セルロース、ヘミセルロース、及び、リグニンを含む）、又は、セルロース及び／若しくはヘミセルロースを含む任意の材料を加水分解するのに有用な酵素（その変異体を含む）、酵素混合物／酵素組成物に関する。そのようなリグノセルロース系バイオマス並びに／又はセルロース及び／若しくはヘミセルロースを含む材料には、例えば、種、穀類、塊茎、食品プロセス若しくは工業プロセスの植物廃棄物若しくは副産物（例えば茎）、トウモロコシ（例えば、トウモロコシ穂軸、及び、まぐさなどを含む）、草（例えば、ソルガストラムヌタンス(Sorghastrum nutans)等のインディアングラス（Indian grass）、又は、例えば、パニクム・ヴァーガタム(Panicum virgatum)等のパニクム種等のスイッチグラス(switchgrass)）、木材（例えば、木材チップ、加工廃棄物を含む）、紙、パルプ、再生紙（例えば新聞）が含まれる。
【００１１】
本発明の酵素混合物／酵素組成物は、植物によって変わる複合体構造の、β−１，４−結合した複数のグルコース部位の直鎖を含むセルロース又はヘミセルロースを加水分解するために使用することができる。
【００１２】
本発明の酵素混合物／酵素組成物は、例えば、セルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを含む多数の様々な酵素を含んでいてもよい。例えば、本発明の酵素混合物／酵素組成物は、バイオマス又は適切な供給原料を加水分解するために使用することができる。本発明の酵素混合物／酵素組成物は、好ましくは、例えば、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、及び／又は、ヘミセルロースをモノマー糖に消化することができる他の酵素から選択される酵素の混合物を含む。本発明の酵素混合物／酵素組成物は、１つ又はそれ以上のキシラナーゼ、１つ又はそれ以上のキシロシダーゼ、１つ又はそれ以上のセロビオヒドロラーゼ、１つ又はそれ以上のアラビノフラノシダーゼ、並びに、ヘミセルロースをモノマー糖に変換することができる１つ又はそれ以上の他の酵素から選択される２つ以上、３つ以上又は４つ以上の酵素の混合物を含んでいてもよい。ヘミセルロースをモノマー糖に消化することができる他の酵素は、限定されるものではなく、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、又は、セルラーゼ若しくはヘミセルラーゼを含む組成物を含む。本発明の酵素混合物／酵素組成物は、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、及び、ヘミセルロースをモノマー糖に変換することができる少なくとも１つの他の酵素から選択される２つ以上、３つ以上又は４つ以上の酵素の混合物を含んでいてもよい。本発明の酵素混合物／酵素組成物の非限定的な例には、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アラビノフラノシダーゼ及びα−グルコシダーゼの混合物が含まれる。本発明の酵素混合物／酵素組成物は天然に存在しないものであることが好ましい。
【００１３】
本明細書で用いられているように、「天然に存在する組成物」との用語は、１つ又はそれ以上の酵素成分又は酵素活性を含む天然に存在する源によって生産される組成物であって、それらの成分又は活性のそれぞれが、その源が天然に、手をつけられずに、かつ、人工的に変更されていないときに、その天然に存在する源によって生産される比率及び濃度においてみられる組成物を指す。従って、天然に存在する組成物は、例えば、その酵素成分の比率又は濃度がその天然環境における天然生物によって生産されるものから変化させないように、セルロース分解酵素又はヘミセルロース分解酵素について変更されていない生物によって生産されたものである。これに対して、「天然に存在しない組成物」は、（１）天然に存在する比率で又は天然に存在しない（すなわち、変化させた）比率でセルロース分解酵素又はヘミセルロース分解酵素を混ぜること、又は、（２）１つ又はそれ以上の内因性酵素又は外因性酵素を発現、過剰発現、又は、過小発現するように生物を修飾すること、又は、（３）少なくとも１つの内因性酵素を欠損させるように生物を修飾することによって生産された組成物を指す。「天然に存在しない組成物」は、変えられていない天然生物によって生産される組成物であるが、該組成物中の特定の酵素の量又は重量比がその天然環境において培養したその天然生物によって作られる組成物中に存在するものとは異なるように、その天然生物の天然環境とは異なる人工の媒体又は環境において培養した天然生物によって生産された組成物を表すこともある。
【００１４】
本明細書に記載されている本発明の酵素混合物／酵素組成物は、例えば培養液である。前記培養液は、例えば、トリコデルマ(Trichoderma)、フミコラ(Humicola)、フザリウム(Fusarium)、アスペルギルス(Aspergillus)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、セファロスポリウム(Cephalosporium)、アクリャ(Achlya)、ポドスポラ(Podospora)、エンドチア(Endothia)、ムコール(Mucor)、コクリオボルス(cochliobolus)、ピリキュラリア(Pyricularia)又はクリソスポリウム(Chrysosporium)を含む糸状菌の１つであってもよい。トリコデルマ種の例示的な菌はトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)である。ペニシリウム種の例示的な菌は、ペニシリウム・フニクロスム(Penicillium funiculosum)である。培養液は、例えば、無細胞培養液又は全細胞培養液であってもよい。
【００１５】
本明細書に記載されている本発明の酵素混合物／酵素組成物は、他の例においてはセルラーゼ組成物である。前記セルラーゼ組成物は、例えば、トリコデルマリーゼイ等のトリコデルマのセルラーゼ組成物を含む糸状菌セルラーゼ組成物である。前記セルラーゼ組成物は、糸状菌、例えば、トリコデルマリーゼイ等のトリコデルマによって生産することができる。
【００１６】
例えば、本発明の酵素混合物／酵素組成物は、（ａ）１つ又はそれ以上のキシラナーゼ酵素であって、前記１つ又はそれ以上のキシラナーゼ酵素の少なくとも１つがトリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２又はＡｆｕＸｙｎ５であるもの、（ｂ）１つ又はそれ以上のα−キシロシダーゼ酵素であって、前記１つ又はそれ以上のα−キシロシダーゼ酵素の少なくとも１つがグループ１のα−キシロシダーゼ又はグループ２のα−キシロシダーゼであり、前記グループ１のα−キシロシダーゼがＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであり、前記グループ２のα−キシロシダーゼは、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、又は、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１であるもの、（ｃ）１つ又はそれ以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼ酵素であって、前記１つ又はそれ以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼの少なくとも１つがＡｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ又はＦｖ５１Ａであるもの、（ｄ）１つ又はそれ以上のセルラーゼ酵素、及び、選択的に（ｅ）１つ又はそれ以上の他の成分を含んでいてもよい。
【００１７】
酵素混合物／酵素組成物は好ましくは天然に存在しないものである。前記（ｄ）の１つ又はそれ以上のセルラーゼ酵素は、カルコフロール分析によって決定したときに、リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）１グラム当たりにタンパク１ｍｇ当たりで、少なくとも０．００００５の生産率を達成できることが望ましい。非限的な例において、組成物中のキシラナーゼ酵素の混合重量は、前記組成物中の合計タンパク重量又は総タンパク重量の５重量％から４５重量％（例えば、５重量％〜２５重量％、５重量％から１５重量％、１０重量％から１５重量％）で存在し又はその重量に相当することができる。一方で、α−キシロシダーゼ酵素の合計重量は、組成物中の総タンパクの２重量％から５０重量％（例えば、２重量％〜３０重量％、５重量％から２５重量％、５重量％から１０重量％）で存在又はその重量に相当することができる。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ酵素の合計重量は、組成物中の合計タンパク重量又は総タンパク重量の２重量％から５０重量％（例えば、２重量％〜３０重量％、２重量％から２０重量％、５重量％から１５重量％、５重量％から１０重量％）で存在又はその重量に相当することができる。セルラーゼ酵素の合計重量は、組成物中の合計タンパク重量又は総タンパク重量の３０重量％から８０重量％（例えば、４０重量％から７０重量％、５０重量％から６０重量％）で存在又はその重量に相当することができる。
【００１８】
本明細書に記載されている酵素混合物／酵素組成物は、例えば、培養液組成物である。この培養液は、限定されるものではないが、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、アクリャ（Ａｃｈｌｙａ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、エンドチア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、コクリオボルス（ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）又はクリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）を含む糸状菌の１つである。トリコデルマ種の例示的菌はトリコデルマリーゼイである。ペニシリウム種の例示的菌はペニシリウム・フニクロスムである。培養液は、例えば、無細胞培養液又は全細胞培養液であってもよい。また、本明細書に記載されている酵素混合物／酵素組成物はセルラーゼ組成物（例えば、糸状菌セルラーゼ組成物）であってもよい。このセルラーゼ組成物は、例えば、トリコデルマ等の糸状菌によって生産することができる。
【００１９】
例えば、本発明の酵素混合物／酵素組成物は、（ａ）１つ又はそれ以上のキシラナーゼ酵素であって、前記１つ又はそれ以上のキシラナーゼ酵素の少なくとも１つがトリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２又はＡｆｕＸｙｎ５であるもの、（ｂ）グループ１のα−キシロシダーゼ酵素であるＦｖ３Ａ及びＦｖ４３Ａの１つ又は両方、（ｃ）Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、及び／又は、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１から選択されるグループ２のα−キシロシダーゼ酵素の１つ又はそれ以上、（ｄ）１つ又はそれ以上のセルラーゼ酵素、及び、選択的に（ｅ）１つ又はそれ以上の他の成分を含んでいてもよい。前記（ｅ）の１つ又はそれ以上のセルラーゼ酵素は、カルコフロール分析によって決定したときに、リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）１グラム当たりにタンパク１ｍｇ当たりで、少なくとも０．００００５の生産率を達成できることが望ましい。
【００２０】
酵素混合物／酵素組成物は天然に存在しないものであることが好ましい。非限的な例において、組成物中のキシラナーゼ酵素の合計重量は、組成物中の合計タンパク重量又は総タンパク重量の５重量％から４５重量％（例えば、５重量％〜２５重量％、５重量％から１５重量％、１０重量％から１５重量％）で存在し又はその重量に相当することができる。グループ１のα−キシロシダーゼ酵素の合計重量は、組成物中の総タンパク重量の２重量％から５０重量％（例えば、２重量％から３０重量％、５重量％から２５重量％、５重量％から１０重量％）に相当することができる。グループ２のα−キシロシダーゼ酵素は、組成物中の総タンパク重量の２重量％から５０重量％（例えば、２重量％から３０重量％、５重量％から２５重量％、５重量％から１０重量％）に相当することができる。また、セルラーゼ酵素の合計重量は、組成物中の合計タンパク重量又は総タンパク重量の３０重量％から８０重量％（例えば、４０重量％〜７０重量％、５０重量％から６０重量％）を構成し又はその重量に相当することができる。グループ２のα−キシロシダーゼ酵素の重量に対するグループ１のα−キシロシダーゼ酵素の重量の比率は、例えば、１：１０〜１０：１（例えば、１：８〜８：１、１：６〜６：１、１：４〜４：１、１：２〜２：１、又は、１：１）であってもよい。前記酵素混合物／酵素組成物はさらなる成分をさらに含むことができる。さらなる成分はアクセサリタンパク又は他のタンパク／非タンパク成分であってもよい。さらなる成分は、例えば、組成物中のタンパクの全重量の１重量％〜５０重量％、１重量％〜１０重量％、２重量％〜５重量％、５重量％〜１０重量％、又は、５重量％〜２０重量％に相当することができる。本明細書に記載されている酵素混合物／酵素組成物は、例えば培養液組成物である。この培養液は、限定されないが、例えば、トリコデルマ(Trichoderma)、フミコラ(Humicola)、フザリウム(Fusarium)、アスペルギルス(Aspergillus)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、セファロスポリウム(Cephalosporium)、アクリャ(Achlya)、ポドスポラ(Podospora)、エンドチア(Endothia)、ムコール(Mucor)、コクリオ
ボルス(cochliobolus)、ピリキュラリア(Pyricularia)又はクリソスポリウム(Chrysosporium)を含む糸状菌の１つである。トリコデルマ種の例示的菌はトリコデルマリーゼイである。ペニシリウム種の例示的菌はペニシリウム・フニクロスムである。培養液は例えば無細胞培養液又は全細胞培養液であってもよい。また、本明細書に記載されている酵素混合物／酵素組成物はセルラーゼ組成物（例えば、糸状菌セルラーゼ組成物）であってもよい。このセルラーゼ組成物は、例えば、トリコデルマ等の糸状菌によって生産することができる。
【００２１】
さらなる例において、本発明の酵素混合物／酵素組成物は、（ａ）１つ又はそれ以上のキシラナーゼ酵素であって、前記１つ又はそれ以上のキシラナーゼ酵素の少なくとも１つがトリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２又はＡｆｕＸｙｎ５であるもの、（ｂ）１つ又はそれ以上のα−キシロシダーゼ酵素であって、前記１つ又はそれ以上のα−キシロシダーゼ酵素の少なくとも１つがグループ１のαキシロシダーゼ酵素であるＦｖ３Ａ若しくはＦｖ４３Ａ、又は、グループ２のα−キシロシダーゼ酵素であるＰｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ及び／又はトリコデルマリーゼイＢｘｌ１であるもの、（ｃ）１つ又はそれ以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼ酵素であって、前記１つ又はそれ以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼ酵素の少なくとも１つがＡｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ又はＦｖ５１Ａであるもの、（ｄ）１つ又はそれ以上のα−グルコシダーゼ酵素、及び、選択的に（ｅ）１つ又はそれ以上の他の成分を含むことができる。酵素混合物／酵素組成物は天然に存在しないものであることが好ましい。非限定的な例において、組成物中のα−キシラナーゼ酵素の合計重量は、組成物中の合計タンパク重量又は総タンパク重量の５重量％から４５重量％（例えば、５重量％〜２５重量％、５重量％から１５重量％、１０重量％から１５重量％）で存在し又はその重量に相当することができる。キシロシダーゼ酵素の合計重量は、組成物中の総タンパク重量の２重量％から５０重量％（例えば、２重量％〜３０重量％、５重量％から２５重量％、５重量％から１０重量％）に相当することができる。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ酵素の合計重量は、組成物中の総タンパク重量の２重量％から５０重量％（例えば、２重量％〜３０重量％、５重量％から２５重量％、５重量％から１０重量％）に相当することができる。α−グルコシダーゼ酵素の合計重量は、組成物中の合計タンパク重量又は総タンパク重量の２重量％から５０重量％（例えば、最大５０重量％以内で、２重量％から１０重量％、３重量％から８重量％）に相当することができる。この酵素混合物／酵素組成物はさらなる成分をさらに含むことができる。さらなる成分はアクセサリタンパク又は他のタンパク／非タンパク成分であってもよい。さらなる成分は、例えば、組成物中のタンパクの全重量の１重量％から５０重量％、１重量％から１０重量％、２重量％から５重量％、５重量％から１０重量％、５重量％から２０重量％に相当することができる。本明細書に記載されている酵素混合物／酵素組成物は、例えば培養液組成物である。この培養液は、限定されるものではなく、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、アクリャ（Ａｃｈｌｙａ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、エンドチア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、コクリオボルス���ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）又はクリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）を含む糸状菌の１つである。トリコデルマ種の例示的菌はトリコデルマリーゼイである。ペニシリウム種の例示的菌はペニシリウム・フニクロスムである。培養液は、例えば、無細胞培養液又は全細胞培養液であってもよい。また、本明細書に記載されている酵素混合物／酵素組成物はセルラーゼ組成物（例えば、糸状菌セルラーゼ組成物）であってもよい。セルラーゼ組成物は、例えば、トリコデルマ等の糸状菌によって生産することができる。
【００２２】
本発明の酵素混合物／酵素組成物は、さらに、例えば、（ａ）１つ又はそれ以上のキシラナーゼ酵素であって、前記１つ又はそれ以上のキシラナーゼ酵素の少なくとも１つがトリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２又はＡｆｕＸｙｎ５であるもの、（ｂ）グループ１のα−キシロシダーゼ酵素であるＦｖ３Ａ及びＦｖ４３Ａの１つ又は両方、（ｃ）Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、及び／又は、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１から選択されるグループ２の１つ又はそれ以上のα−キシロシダーゼ酵素、（ｄ）１つ又はそれ以上のα−グルコシダーゼ酵素、及び、選択的に（ｅ）１つ又はそれ以上の他の成分を含むことができる。酵素混合物／酵素組成物は天然に存在しないものであることが好ましい。非限定的な例において、キシラナーゼ酵素の合計重量は、組成物中のタンパクの全重量の５重量％から４５重量％（例えば、５重量％〜２５重量％、５重量％から１５重量％、１０重量％から１５重量％）に相当する。グループ１のα−キシロシダーゼ酵素の合計重量は、組成物中のタンパクの全重量の２重量％から５０重量％（例えば、２重量％から３０重量％、５重量％から２５重量％、５重量％から１０重量％）に相当する。グループ２のα−キシロシダーゼ酵素の合計重量は、組成物中のタンパクの全重量の２重量％から５０重量％（例えば、２重量％から３０重量％、５重量％から２５重量％、５重量％から１０重量％）に相当する。α−グルコシダーゼ酵素の合計重量は、組成物中のタンパクの全重量の２重量％から５０重量％（例えば、２重量％から３０重量％、５重量％から２５重量％、５重量％から１０重量％）に相当する。グループ２のα−キシロシダーゼ酵素の重量に対するグループ１のα−キシロシダーゼ酵素の重量の比率は、例えば、１：１０〜１０：１、例えば、１：８〜８：１、１：６〜６：１、１：４〜４：１、１：２〜２：１、又は、１：１であってもよい。酵素混合物／酵素組成物はさらなる成分をさらに含むことができる。さらなる成分はアクセサリタンパク又は他のタンパク／非タンパク成分であってもよい。さらなる成分は、例えば、１重量％又は１重量％又は２重量％又は５重量％又は組成物におけるタンパクの全重量の５重量％から２０重量％から１０重量％から５重量％から１０重量％から５０重量％を構成することができる。本明細書に記載されている酵素混合物／酵素組成物は、例えば、培養液組成物である。培養液は、限定されるものではなく、例えば、トリコデルマ(Trichoderma)、フミコラ(Humicola)、フザリウム(Fusarium)、アスペルギルス(Aspergillus)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、セファロスポリウム(Cephalosporium)、アクリャ(Achlya)、ポドスポラ(Podospora)、エンドチア(Endothia)、ムコール(Mucor)、コクリオボルス(cochliobolus)、ピリキュラリア(Pyricularia)又はクリソスポリウム(Chrysosporium)を含む糸状菌の１つである。トリコデルマ種の例示的な菌はトリコデルマリーゼイである。ペニシリウム種の例示的な菌はペニシリウム・フニクロスムである。培養液は、例えば無細胞培養液又は全細胞培養液であってもよい。また、本明細書に記載されている酵素混合��／酵素組成物は、セルラーゼ組成物（例えば、糸状菌セルラーゼ組成物）であってもよい。セルラーゼ組成物は、例えば、トリコデルマ等の糸状菌によって生産することができる。
【００２３】
さらに、本発明の酵素混合物／酵素組成物は、例えば、（ａ）１つ又はそれ以上のキシラナーゼ酵素であって、前記１つ又はそれ以上のキシラナーゼ酵素の少なくとも１つがトリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２又はＡｆｕＸｙｎ５であるもの、（ｂ）１つ又はそれ以上のα−キシロシダーゼ酵素であって、前記１つ又はそれ以上のα−キシロシダーゼ酵素の少なくとも１つがグループ１のα−キシロシダーゼ又はグループ２のα−キシロシダーゼであり、前記グループ１のα−キシロシダーゼはＦｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａであってもよく、前記グループ２のα−キシロシダーゼがＰｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ及び／又はトリコデルマリーゼイＢｘｌ１であってもよいもの、（ｃ）１つ又はそれ以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼ酵素であって、前記１つ又はそれ以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼ酵素の少なくとも１つがＡｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ又はＦｖ５１Ａであるもの、及び、選択的に（ｄ）１つ又はそれ以上の他の成分を含むことができる。酵素混合物／酵素組成物は天然に存在しないものであることが好ましい。非限定的な例において、キシラナーゼ酵素の合計重量は、組成物中の総タンパク重量の５重量％から４５重量％（例えば、５重量％から２５重量％、５重量％から１５重量％、１０重量％から１５重量％）に相当する。α−キシロシダーゼ酵素の合計重量は、組成物中の総タンパク重量の２重量％から５０重量％（例えば、２重量％〜３０重量％、５重量％から２５重量％、５重量％から１０重量％）に相当する。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ酵素の合計重量は、組成物中の総タンパク重量の２重量％から５０重量％（例えば、２重量％から３０重量％、５重量％から２５重量％、５重量％〜１０重量％）に相当する。この酵素混合物／酵素組成物はさらなる成分をさらに含むことができる。さらなる成分はアクセサリタンパク又は他のタンパク／非タンパク成分であってもよい。さらなる成分は、例えば、組成物中のタンパクの全重量の１重量％から５０重量％、１重量％から１０重量％、２重量％から５重量％、５重量％から１０重量％、５重量％から２０重量％に相当することができる。本明細書に記載されている酵素混合物／酵素組成物は、例えば、培養液組成物である。この培養液は、限定されるものではなく、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、アクリャ（Ａｃｈｌｙａ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、エンドチア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、コクリオボルス（ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）又はクリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）を含む糸状菌の１つである。トリコデルマ種の例示的な菌はトリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）である。ペニシリウム種の例示��な菌はペニシリウムフニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）である。培養液は、例えば、無細胞培養液又は全細胞培養液であってもよい。また、本明細書に記載されている酵素混合物／酵素組成物は、セルラーゼ組成物（例えば、糸状菌セルラーゼ組成物）であってもよい。セルラーゼ組成物は、例えば、トリコデルマ等の糸状菌によって生産することができる。
【００２４】
本発明の酵素混合物／酵素組成物は、さらに、（ａ）１つ又はそれ以上のキシラナーゼ酵素であって、前記１つ又はそれ以上のキシラナーゼ酵素の少なくとも１つがトリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２又はＡｆｕＸｙｎ５であるもの、（ｂ）グループ１のα−キシロシダーゼ酵素であるＦｖ３Ａ及びＦｖ４３Ａの１つ又は両方、（ｃ）Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ及び／又はトリコデルマリーゼイＢｘｌ１から選択されるグループ２のα−キシロシダーゼ酵素の１つ又はそれ以上、及び、選択的に（ｄ）１つ又はそれ以上の他の成分を含むものであってもよい。酵素混合物／酵素組成物は天然に存在しないものであるのが好ましい。非限定的な例において、キシラナーゼ酵素の合計重量は、組成物中の総タンパク重量の５重量％から４５重量％（例えば、５重量％から２５重量％、５重量％から１５重量％、１０重量％から１５重量％）に相当することができる。グループ１のα−キシロシダーゼ酵素の合計重量は、組成物中の総タンパク重量の２重量％から５０重量％（例えば、２重量％〜３０重量％、５重量％から２５重量％、５重量％から１０重量％）に相当することができる。グループ２のα−キシロシダーゼ酵素の合計重量は、組成物中の総タンパク重量の２重量％から５０重量％（例えば、２重量％から３０重量％、５重量％から２５重量％、５重量％から１０重量％）に相当することができる。グループ２のα−キシロシダーゼ酵素の重量に対するグループ１のα−キシロシダーゼ酵素の重量の比率は、例えば、１：１０〜１０：１、例えば、１：８〜８：１、１：６〜６：１、１：４〜４：１、１：２〜２：１、又は、１：１であってもよい。酵素混合物／酵素組成物はさらなる成分をさらに含むことができる。さらなる成分はアクセサリタンパク又は他のタンパク／非タンパク成分であってもよい。さらなる成分は、例えば、組成物中のタンパクの全重量の１重量％から５０重量％、１重量％から１０重量％、２重量％から５重量％、５重量％から１０重量％、又は、５重量％から２０重量％に相当することができる。本明細書に記載されている酵素混合物／酵素組成物は、例えば、培養液組成物である。この培養液は、限定されるものではないが、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、アクリャ（Ａｃｈｌｙａ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、エンドチア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、コクリオボルス（ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、ピリキュラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）又はクリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）を含む糸状菌の１つである。トリコデルマ種の例示的な菌はトリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）である。ペニシリウム種の例示的な菌はペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）で��る。この培養液は、例えば、無細胞培養液又は全細胞培養液であってもよい。また、本明細書に記載されている酵素混合物／酵素組成物は、セルラーゼ組成物（例えば、糸状菌セルラーゼ組成物）であってもよい。セルラーゼ組成物は、例えば、トリコデルマ等の糸状菌によって生産することができる。
【００２５】
本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、食品産業において（例えば、パン製造に）、果実及び野菜の加工において、農業廃棄物の分解において、動物飼料の製造において、パルプ及び紙の生産において、織物業において、又は、家庭用及び工業用の清浄剤において使用することができる。例えば、本開示の酵素、及び、酵素混合物／酵素組成物中の酵素は、例えば、真菌又はバクテリア等の微生物によってそれぞれ独立して生産される。
【００２６】
本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、植物バイオマス（例えば、トウモロコシ、穀類、草（例えば、ソルガストラム・ヌタンス等のインディアングラス（Indian grass）、又は、例えば、パニクム・ヴァーガタム等のパニクム種等のスイッチグラス（switchgrass））、又は、木材若しくは木材加工副産物）等のすべての生物学的ソースを含むあらゆる適切なソースを消化してリグノセルロースにするための商業用の酵素又は組成物として、例えば、木材加工において、パルプ工業及び／又は製紙業において、織物業において、家庭用及び工業用の清浄剤において及び／又は、バイオマス廃棄物処理において使用することができる。
【００２７】
他の一態様において、本開示は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４６、４７、４８、４９又は５０の核酸配列に対して、少なくとも約１０残基（例えば、少なくともおおよそ、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、又は、２０００残基）の領域にわたって、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は完全な（１００％）の配列同一性を有する単離された核酸、合成核酸、又は、組み換え核酸を提供する。関連して、本開示は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４６、４７、４８、４９、若しくは、５０の核酸配列又はこれらの断片に対して９７％、９８％、９９％又は完全（１００％）の配列同一性の相補体に対して、高い厳格性条件下においてハイブリダイズすることができる単離された核酸、合成核酸、又は、組み換えの核酸を提供する。断片の長さは、例えば、少なくとも１５０個の連続した残基（例えば、少なくとも２００個、２５０個、又は、３００個の連続した残基）であってもよい。本開示は、ヘミセルロース分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸を提供する。例示的ヘミセルロース分解活性は、限定されるものではないが、キシラナーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性、及び／又は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を含む。ヘミセルロース分解活性を有する例示的ポリペプチドは、限定されるものではないが、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼを含む。
【００２８】
本開示は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３若しくは４４のアミノ酸配列、又は、これらの部分配列（例えば、触媒ドメイン（「ＣＤ」）、糖結合モジュール（「ＣＢＭ」）、又は、それらの適切な変異体）を含むポリペプチドを含む本開示の酵素をコードする単離された核酸、合成核酸、又は、組み換え核酸をさらに提供する。いくつかの実施形態において、本開示の核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３又は４４のアミノ酸配列のタンパクの成熟部分をコードする。その核酸は、選択的に、作用可能になるように異種起源のシグナル配列（例えば、トリコデルマリーゼイＣＢＨＩシグナル配列）に連結されている。この核酸は、望ましくは、ヘミセルロース分解活性（例えば、キシラナーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性、及び／又は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性）を有するポリペプチドをコードする。本開示の核酸は、ヘミセルラーゼ（例えば、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、及び／又は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ、又は、これらの適切な変異体）をコードする。本開示のさらなる核酸はセクション６．２において後述する。
【００２９】
本開示は、さらに、本開示の核酸又はその部分配列を含む発現カセットを提供する。例えば、核酸は、少なくとも約１０残基、例えば、少なくともおおよそ、１０、２０、３０、４０、５０、７５、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００又は５００の残基の領域にわたって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４６、４７、４８、４９若しくは５０の核酸配列に対して、少なくとも約７０％（例えば、少なくともおおよそ、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の配列同一性を有する。他の一例において、前記核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３又は４４のポリペプチドをコードするものであり、前記核酸は、選択的にプロモータに作用可能なように連結されている。前記プロモータは、例えば、真菌、ウイルス、細菌、哺乳動物又は植物のプロモータであってもよい。前記プロモータは、常時発現プロモータ又は誘導可能プロモータであり得る。適切な例示的プロモータは、糸状菌（例えば、トリコデルマリーゼイ）において発現させることが可能である。適切なプロモータは、糸状菌（例えば、トリコデルマリーゼイ）に由来するもの（例えば、トリコデルマリーゼイに由来するセロビオヒドロラーゼＩ（「ｃｂｈ１」）遺伝子プロモータ）であってもよい。
【００３０】
本開示は、さらに、本開示の核酸又は本開示の発現カセットを発現するように遺伝子操作された組み換え細胞を提供する。例えば、前記核酸は、少なくとも約１０個（例えば、少なくともおおよそ、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００又は５００個）のヌクレオチド残基の領域にわたって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４６、４７、４８、４９又は５０の核酸配列に対して、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の配列同一性を有する。前記核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３又は４４のポリペプチドをコードすることができ、前記核酸は、選択的にプロモータに作用可能なように連結されている。前記発現カセットは、少なくとも約１０個のヌクレオチド残基の領域にわたって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４６、４７、４８、４９又は５０に対して、少なくとも約７０％（例えば、少なくともおおよそ、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の配列同一性を有する核酸を含むことができる。例えば、前記発現カセットは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３又は４４のポリペプチドをコードする核酸を含むことができ、前記核酸は、選択的にプロモータに作用可能なように連結されている。前記組み換え細胞は、望ましくは、組み換え細菌細胞、組み換え哺乳動物細胞、組み換え真菌細胞、組み換え酵母菌、組み換え昆虫細胞、組み換え藻細胞、又は、組換え植物細胞である。例えば、前記組み換え細胞は、トリコデルマ(Trichoderma)、フミコラ(Humicola)、フザリウム(Fusarium)、アスペルギルス(Aspergillus)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、セファロスポリウム(Cephalosporium)、アクリャ(Achlya)、ポドスポラ(Podospora)、エンドチア(Endothia)、ムコール(Mucor)、コクリオボルス(cochliobolus)、ピリキュラリア(Pyricularia)又はクリソスポリウム(Chrysosporium)細胞等の組み換え糸状菌細胞である。
【００３１】
本開示は、本開示の核酸又は本開示の発現カセットを含む遺伝子導入植物を提供する。
【００３２】
本開示は、少なくとも約１０個（例えば、少なくともおおよそ、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００又は３５０個）の残基の領域にわたって、又は、完全長の未成熟ポリペプチド、完全長の成熟ポリペプチド、完全長の触媒性ドメイン、若しくは、完全長の糖結合モジュールにわたって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３又は４４のポリペプチドに対して、少なくとも約８０％（例えば、少なくともおおよそ、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は完全（１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド、合成ポリペプチド、又は、組み換えポリペプチドを提供する。例示的ポリペプチドの長さは、少なくとも約１０残基（例えば、少なくともおおよそ、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００残基）の断片を含む。特定の実施形態において、前記断片は触媒性ドメイン及び／又は糖結合モジュールを含む。前記断片が本開示の酵素の触媒性ドメイン及びの糖結合モジュールの両方を含む場合には、前記断片は、選択的に触媒性ドメイン及び糖結合モジュールを分離するリンカーを含む。リンカーは生来のリンカー又は異種起源のリンカーであってもよい。特定の実施形態において、本開示のポリペプチドは、１つ又はそれ以上のヘミセルラーゼ活性を有する。本開示のポリペプチド又はペプチド配列には、本開示の核酸によってコードされる配列が含まれる。例示的ポリペプチドはセクション６．１に記載されている。
【００３３】
本開示は、本開示のポリペプチドの少なくとも１つの領域（例えば、触媒性ドメイン、糖結合モジュール又はこれらの両方）を含むキメラタンパク又は融合タンパクをさらに提供する。少なくとも１つの領域は、第２のアミノ酸配列（例えば、シグナルペプチド配列）に作用可能なように連結されていてもよい。
【００３４】
反対に、本開示は、例えば、シグナル配列に自然には伴わない異種起源のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする第２の配列に作用可能なように連結された本開示のポリペプチドのシグナル配列を含むキメラタンパク又は融合タンパクを提供する。従って、本開示は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３又は４４のポリペプチドの１〜１３、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８、１〜１９、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜２６、１〜２７、１〜２８、１〜２８、１〜３０、１〜３１、１〜３２、１〜３３、１〜３４、１〜３５、１〜３６、１〜３７、１〜３８、又は、１〜４０の残基を含む組み換えポリペプチドを提供する。さらなる例示的なキメラポリペプチド又は融合ポリペプチドはセクション６．１．１に記載されている。
【００３５】
本開示は、さらに、組み換えポリペプチドを生産する方法であって、（ａ）本開示のポリペプチドを発現するするように遺伝子操作した宿主細胞を培養するステップと、（ｂ）ポリペプチドを回収するステップとを含む方法を提供する。ポリペプチドの回収は、例えば、ポリペプチドを含む培養液の回収を含む。特定の実施形態において、ポリペプチドの回収は、さらなる精製ステップを含むことができる。
【００３６】
本開示は、セロオリゴ糖組成物、アラビノキシランオリゴマー組成物、又は、グルカン含有若しくはセルロース含有組成物を加水分解、分解、又は、破壊するための方法であって、前記酵素又は前記酵素混合物／酵素組成物に前記組成物を適切な条件下で接触させるステップを含み、本開示の酵素混合物／酵素組成物は、セロオリゴ糖組成物、アラビノキシランオリゴマー組成物、又は、グルカン含有若しくはセルロース含有組成物を加水分解、分解、又は、破壊する方法を提供する。
【００３７】
本開示は、本開示のポリペプチド又は本開示の核酸によってコードされるポリペプチドを含む酵素「混合物」又は組成物（本明細書において、「酵素混合物／酵素組成物」とも呼ばれる）を提供する。いくつかの実施形態において、本開示のポリペプチドは、キシラナーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性、及び、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性から選択される１つ又はそれ以上の活性を有する。特定の実施形態において、前記酵素混合物／酵素組成物は、セルロースポリマー及びヘミセルロースポリマーを解重合して代謝可能な炭素成分にするために使用され、また、そのような使用に有用である。本開示の酵素混合物は、例えば、製造の生成物等として、組成物の形態であってもよい。前記組成物は、例えば、製剤形態であってもよく、例えば、液体又は固体の物理的形態をとることができる。例示的実施形態において、本開示の酵素混合物／酵素組成物は、（１）エンドグルカナーゼ、（２）セロビオヒドロラーゼ、及び、（３）β−グルコシダーゼから選択される少なくとも３つの異なる酵素種、又は、（１）セルロース材料又はヘミセルロース材料の内部のβ−１，４結合の開裂を触媒してより短いグルコオリゴ糖を生じさせるエンドグルカナーゼ活性、（２）「エキソ」の態様でのセロビオース単位（例えば、β−１，４−グルコース・グルコース二糖）の開裂及び放出を触媒するセロビオヒドロラーゼ活性、及び、（３）短いセロオリゴ糖（例えば、セロビオース）からのグルコースモノマーの放出を触媒するβ−グルコシダーゼ活性から選択される少なくとも３つの異なる酵素活性を含むセルラーゼを含む。本開示の例示的な酵素混合物／酵素組成物はセクション６．３．４に記載されている。
【００３８】
他の一態様において、本開示は、リグノセルロースを含むバイオマス材料を加工する方法であって、本開示のポリペプチド又は本開示の核酸によってコードされたポリペプチド又は本開示の酵素混合物／酵素組成物（例えば、製造の生成物）に、セルロース及び／又は発酵性糖を含む組成物を接触させるステップを含む方法を提供する。リグノセルロースを含む適切なバイオマス材料は、農作物、食物若しくは飼料の製品の副産物、リグノセルロース廃棄物、植物廃棄物、又は、廃紙若しくは廃紙生成物に由来するものであってもよい。本開示のポリペプチドは、セルラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性、キシラナーゼ活性、マンナナーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性、アラビノフラノシダーゼ活性、及び、他のヘミセルラーゼ活性から選択される１つ又はそれ以上の酵素活性を有していてもよい。適切な植物廃棄物には、穀物、種子、茎、葉、外皮、殻、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、わら、草、木材、木材チップ、木材パルプ及びおがくずが含まれ得る。草は、例えば、インディアングラス又はスイッチグラスであってもよい。また、草は、例えばススキであってもよい。紙廃棄物は、例えば、廃棄若しくは使用された写真複写紙、コンピュータプリンター紙、ノート、ノートパッド紙、タイプライター用紙、新聞、マガジン、厚紙、並びに、紙ベースの種々のパッケージング材であってもよい。また、紙廃棄物は例えばパルプであってもよい。
【００３９】
本開示は、ヘミセルロース加水分解酵素及びセルロース加水分解酵素の混合物と、少なくとも１つのバイオマス材料とを含む組成物（酵素及び酵素混合物／酵素組成物、例えば、本開示の製造の生成物を含む）を提供する。選択的に、前記バイオマス材料は、農作物由来のリグノセルロース材料を含む。又は、前記バイオマス材料は食物又は飼料の製品の副産物である。また、適切なバイオマス材料は、リグノセルロース廃棄物、植物残渣、廃紙若しくは廃紙生成物であってもよいし、又は、植物廃棄物を含んでいてもよい。植物廃棄物は、例えば、穀物、種子、茎、葉、外皮、殻、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、草、わら、木材、木材チップ、木材パルプ、又は、おがくずを含むものであり得る。限定されるものではないが、例示的な草には、インディアングラス又はスイッチグラスが含まれる。また、例示的な草はススキを含み得る。限定されるものではないが、例示的な紙廃棄物には、廃棄又は使用された写真複写紙、コンピュータ・プリンタ紙、ノート、ノートパッド紙、タイプライター用紙、新聞、雑誌、厚紙、及び、紙ベースのパッケージング材が含まれる。また、例示的紙廃棄物には、例えばパルプが含まれ得る。
【００４０】
例えば、刊行物、特許、特許出願、ＧｅｎＢａｎｋ配列、及び、本明細書中で引用されているＡＴＣＣ寄託を含む、出願日の時点で公に利用可能なすべての情報は、参照として明示的に組み込まれている。
5.図面の簡単な説明及び表の説明
【００４１】
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１−１】表１Ａは、本開示においてグリコシルヒドロラーゼ酵素に対して使用した配列識別子（sequence identifier）の概略を提供する。
【図１−２】表１Ａの続きである。
【図２】表１Ｂは、実施例で言及されるさらなるグリコシルヒドロラーゼ酵素の登録番号を提供する。
【図３】表２は、合成基質ｐＮＰＡ及び合成基質ｐＮＰＸ（以下のセクション７．１．６に定義されている）に対する発現されたタンパクの活性を、トリコデルマリーゼイ・クアッド欠損宿主のバックグラウンド活性に対して相対的に示している。グアッド欠損宿主バックグラウンド（又は「ＸＱｕａｄ」）は、クアッド欠損株において発現されたタンパクの活性を、発現されたタンパクを含まないクアッド欠損バックグラウンド株の活性で割ったものとして定義される。例えば、＞１の値は、発現されたタンパクがバックグラウンドより高い活性を有することを示している。
【図４】表３は、５０℃、ｐＨ５において樺材キシランと共にインキュベートしたときの精製されたエンドキシラナーゼ候補のキシラナーゼ活性を示している。
【図５】表４は、酸加水分解によって決定される利用可能な全糖に基づいた、トウモロコシ穂軸のアラビノキシランオリゴマーからモノマー生成物への変換率を示している。実施例４を参照されたい。
【図６】表５は、処理されたトウモロコシ穂軸をモノマー糖に加水分解するヘミセルラーゼ活性のレベルを決定する実験結果を示している（実施例７に記載されている）。「実行＃」と題された列はランダム化された実験の順序を示している。「トライアル＃」と題された列は、標準的実験設計の順番を示している。「グアッド（Quad）」と題された列は、グアッドを欠損させたトリコデルマ・リーゼイ株の増殖用の培養液上清から得た総タンパクの割合を示している。「Ｘｙｎ３」と題された列は、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３である総タンパクの割合を示している。「Ｆｖ４３Ｄ」と題された列は、Ｆｖ４３Ｄである総タンパクの割合を示している。「Ｆｖ５１Ａ」と題された列は、Ｆｖ５１Ａである総タンパクの割合を示している。「Ｆｖ４３Ａ」と題された列は、Ｆｖ４３Ａである総タンパクの割合を示している。「Ｆｖ４３Ｂ」と題された列は、Ｆｖ４３Ｂである総タンパクの割合を示している。「投入（μｇ／ｍｇ糖）」と題された列は、糖１ミリグラム当たりのタンパク１マイクログラムの単位において、糖化反応に投入したタンパクを示している。「Ｘｙｌ  ｍｇ／ｍＬ」、Ｇｌｕ  ｍｇ／ｍＬ、Ａｒａｂ  ｍｇ／ｍＬ、及び、Ｇ＋Ｘ＋Ａ  ｍｇ／ｍＬ」と題された列は、糖化反応の終了時に検知された、キシロース、グルコース、アラビノース、及び、それらの３つの糖産物の組み合わせの濃度を示している。「Ｘｙｌ理論％、Ｇｌｕ理論％、及び、Ａｒａｂ理論％」と題された列は、糖化反応の終了時に到達した、キシロース、グルコース、及び、アラビノースの理論収率のパーセントを示している。
【図７】表６は、トウモロコシ穂軸の加水分解から得られるグルコース、キシロース及びアラビノースの予測される最大収率のための７つの酵素成分の算出された比率を示している。「投入合計ｍｇ／ｇ  糖」と題した列は、前記予測を算出したときの合計酵素用量を示している。「合計  ｍｇ／ｍｌ  Ｇ＋Ｘ＋Ａ、グルコース収率％、キシロース収率％、アラビノース収率％」と題された列は、最適条件について算出した反応を示している。「モデルに適合させたｒ２データ（両方の投与を含む）」と題された列は、表５に示されているデータに適合させたモデルのためのｒ２乗の統計パラメータを示している。「アクセレラーゼ割合、クアッド・デル・サプ割合、精製したトリコデルマリーゼイＸｙｎ３割合、精製したＦｖ４３Ｄ割合、精製したＦｖ５１Ａ割合、精製したＦｖ４３Ａ割合、及び、精製したＦｖ４３Ｂ割合」と題された列は、表５のデータに適合させたモデルによって最適であると計算された成分の割合を示している。
【図８】表７は、１．０６ｇの１４％の固形分の前処理されたトウモロコシ穂軸の反応において、Ｆｖ３Ａ及びＦｖ４３Ｄの酵素を含む混合物を使用した場合における、トウモロコシ穂軸の加水分解変換を最大にするための酵素投与の改良を示している。糖化の条件は、実施例７に記載されているのと同様である。酵素名でマークした列は、使用したグルカン又はキシランのグラム当たりの一覧されている各酵素のｍｇを示している。
【図９】表８は、１．０６グラム、１４％の固形分の前処理されたトウモロコシ穂軸の反応において、唯一のＬ−α−アラビノフラノシダーゼとしてＦｖ５１Ａを含む混合物を使用した場合における、トウモロコシ穂軸を最大変換するための酵素投与の改良を示している。糖化に使用した条件は、実施例７に記載されているのと同様である。酵素名でマークした列は、使用したグルカン又はキシランのグラム当たりの一覧されている各酵素のｍｇを示している。糖でマークした列は、サイズ排除クロマトグラフィで行った測定に基づいて、生じた各糖生成物の１ｍＬ当たりにおける量（ｍｇ）を示している。＞ｄｐ２の列は、二糖より大きいオリゴマーのすべてを含む。
【図１０】表９は、１．０６ｇ、１４％固形分の前処理したトウモロコシ穂軸の反応において試験した精製されたヘミセルラーゼ混合物Ａ、混合物Ｂ、混合物Ｃから得た糖の収率を示している。糖化に使用した条件は実施例７に記載されているのと同様である。混合物Ａ：キシラン１グラム当たり、６ｍｇのトリコデルマリーゼイＸｙｎ３、４ｍｇのＦｖ３Ａ、１ｍｇのＦｖ５１Ａ混合物Ｂ：キシラン１グラム当たり、６ｍｇのトリコデルマリーゼイＸｙｎ３、１ｍｇのＦｖ４３Ｄ、３ｍｇのＦｖ４３Ａ、３ｍｇのＦｖ４３Ｂ混合物Ｃ：キシラン１グラム当たり、６ｍｇのトリコデルマリーゼイＸｙｎ３、３ｍｇのＦｖ３Ａ、１ｍｇのＦｖ４３Ｄ、１ｍｇのＦｖ５１Ａモノマー糖でマークした列は、一覧されている各モノマーの収率％を示している。
【図１１】表１０は、トウモロコシ穂軸、モロコシ、スイッチグラス及びサトウキビバガスから作成したヘミセルロース調製物をヘミセルラーゼ混合物Ａ、ヘミセルラーゼ混合物Ｂ、ヘミセルラーゼ混合物Ｃで処理した場合における糖の収率を示している。これらの反応は、実施例８に記載されているように、４８℃において、５０ｍＭ  ｐＨ５．０の酢酸ナトリウムバッファにおいて、６時間にわたって、１００μＬ規模で実施した。各モノマー糖の収率％が示されている。  表１１は、様々なトリコデルマリーゼイ組込発現株（Ｈ３Ａ、３９Ａ、６９Ａ、Ａ１０Ａ、Ｇ６Ａ、１０２、４４Ａ、１１Ａ、Ｇ９Ａと示されている）によって発現された多数の酵素の濃度を、ＨＰＬＣ積分面積のパーセントで決定して示している。  表１２は、スイッチグラスの前処理のパラメータの一覧、及び、様々な前処理を行った糖化の結果を示している。
【図１２】表１３は、異なる量の固形分、異なる酵素、及び、異なる培養時間による反応における、トリコデルマリーゼイ組込株（Ｈ３Ａ）によって生産された酵素組成物を用いた広葉樹パルプの糖化結果を示している。  表１４は、温度及びｐＨを変化させた場合における、組込株Ｈ３Ａによって生産された酵素組成物による広葉樹パルプの糖化の結果を示している。以下及び図面に一覧されているシグナル配列はすでに予想されている。その予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋにおいて利用可能）で作成された。領域予想は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ又はＮＣＢＩデータベースの１つ以上に基づいて行った。
【００４３】
【図１３】図１Ａは、Ｆｖ３Ａヌクレオチド配列（配列番号：１）である。
【図１４】図１Ｂは、Ｆｖ３Ａアミノ酸配列（配列番号：２）である。配列番号２は、未成熟なＦｖ３Ａの配列である。Ｆｖ３Ａは、配列番号２の位置１〜２３（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号２の位置２４〜７６６に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインを太字で示す。
【図１５】図２Ａは、Ｐｆ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号：３）である。図２Ｂは、Ｐｆ４３Ａアミノ酸配列（配列番号：４）である。配列番号４は、未成熟なＰｆ４３Ａの配列である。Ｐｆ４３Ａは、配列番号４の位置１〜２０（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号４の位置２１〜４４５に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインを太字で示す。予想される糖結合モジュール（「ＣＢＭ」）を大文字で示し、また、触媒性ドメイン及び糖結合モジュールを分離する予想されるリンカーをイタリック体で示す。
【図１６】図３Ａは、Ｆｖ４３Ｅヌクレオチド配列（配列番号：５）である。  図３Ｂは、Ｆｖ４３Ｅアミノ酸配列（配列番号：６）である。配列番号６は、未成熟なＦｖ４３Ｅの配列である。Ｆｖ４３Ｅは、配列番号６の位置１〜１８（下線されている）に対応する予想されるシグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号６の位置１９〜５３０に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインを太字で示す。
【図１７】図４Ａは、Ｆｖ３９Ａヌクレオチド配列（配列番号：７）である。  図４Ｂは、Ｆｖ３９Ａアミノ酸配列（配列番号：８）である。配列番号８は、未成熟なＦｖ３９Ａの配列である。Ｆｖ３９Ａは、配列番号８の位置１〜１９（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号８の位置２０〜４３９に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインを太字で示す。
【図１８】図５Ａは、Ｆｖ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号：９）である。  図５Ｂは、Ｆｖ４３Ａアミノ酸配列（配列番号：１０）である。配列番号：１０は、未成熟なＦｖ４３Ａの配列である。Ｆｖ４３Ａは、配列番号１０の位置１〜２２（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号１０の位置２３〜４４９に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインを太字で示す。予想される糖結合モジュールを大文字で示す。また、保存ドメイン及び糖結合モジュールを分離する予想されるリンカーをイタリック体で示す。
【図１９】図６Ａは、Ｆｖ４３Ｂヌクレオチド配列（配列番号：１１）である。  図６Ｂは、Ｆｖ４３Ｂアミノ酸配列（配列番号：１２）である。配列番号１２は、未成熟なＦｖ４３Ｂの配列である。Ｆｖ４３Ｂは、配列番号１２の位置１〜１６（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号１２の位置１７〜５７４に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインを太字で示す。
【図２０】図７Ａは、Ｐａ５１Ａヌクレオチド配列（配列番号：１３）である。  図７Ｂは、Ｐａ５１Ａアミノ酸配列（配列番号：１４）である。配列番号１４は、未成熟Ｐａ５１Ａの配列である。Ｐａ５１Ａは、配列番号１４の位置１〜２０（下線されている）に対応する予想されるシグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号１４の位置２１〜６７６に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想されるＬ−α−アラビノフラノシダーゼ保存ドメインを太字で示す。発現を目的として、そのゲノムＤＮＡは、トリコデルマリーゼイにおける発現のためにコドンが最適化されていた（図６０Ｂ参照）。
【図２１】図８Ａは、Ｇｚ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号：１５）である。  図８Ｂは、Ｇｚ４３Ａアミノ酸配列（配列番号：１６）である。配列番号１６は、未成熟なＧｚ４３Ａの配列である。Ｇｚ４３Ａは、配列番号１６の位置１〜１８（下線されている）に対応する予想されるシグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号１６の位置１９〜３４０に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインを太字で示す。発現を目的として、Ｇｚ４３Ａの予想シグナル配列を、トリコデルマ・リーゼイ中のトリコデルマ・リーゼイＣＢＨ１シグナル配列（ｍｙｒｋｌａｖｉｓａｆｌａｔａｒａ（配列番号５１））で置換した（図６１参照）。
【図２２】図９Ａは、Ｆｏ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号：１７）である。  図９Ｂは、Ｆｏ４３Ａアミノ酸配列（配列番号：１８）である。配列番号１８は、未成熟なＦｏ４３Ａの配列である。Ｆｏ４３Ａは、配列番号１８の位置１〜２０（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号１８の位置２１〜３４８に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインを太字で示す。発現を目的として、Ｆｏ４３Ａの予想シグナル配列を、トリコデルマ・リーゼイＣＢＨ１シグナル配列（ｍｙｒｋｌａｖｉｓａｆｌａｔａｒａ（配列番号：５１））で置換した（図６２参照）。
【図２３】図１０Ａは、Ａｆ４３Ａヌクレオチド配列（配列番号：１９）である。  図１０Ｂは、Ａｆ４３Ａアミノ酸配列（配列番号：２０）である。配列番号２０は、未成熟なＡｆ４３Ａの配列である。予想される保存ドメインを太字で示す。
【図２４】図１１Ａは、Ｐｆ５１Ａヌクレオチド配列（配列番号：２１）である。  図１１Ｂは、Ｐｆ５１Ａアミノ酸配列（配列番号：２２）である。配列番号２２は、未成熟なＰｆ５１Ａの配列である。Ｐｆ５１Ａは、配列番号２２の位置１〜２０（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号２２の位置２１〜６４２に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想されるＬ−α−アラビノフラノシダーゼ保存ドメインを太字で示す。発現を目的として、予想されるＰｆ５１Ａシグナル配列を、コドンを最適化したトリコデルマ・リーゼイＣＢＨ１のシグナル配列（ｍｙｒｋｌａｖｉｓａｆｌａｔａｒａ（配列番号：５１））で置換した（下線で示す）。また、Ｐｆ５１Ａヌクレオチド配列は、トリコデルマ・リーゼイにおける発現のためにコドンが最適化されていた（図６３参照）。
【図２５】図１２Ａは、ＡｆｕＸｙｎ２ヌクレオチド配列（配列番号：２３）である。  図１２Ｂは、ＡｆｕＸｙｎ２アミノ酸配列（配列番号：２４）である。配列番号２４は、未成熟なＡｆｕＸｙｎ２の配列である。ＡｆｕＸｙｎ２は、配列番号２４の位置１〜１８（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号２４の位置１９〜２２８に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想されるＧＨ１１保存ドメインを太字で示す。
【図２６】図１３Ａは、ＡｆｕＸｙｎ５ヌクレオチド配列（配列番号：２５）である。  図１３Ｂは、ＡｆｕＸｙｎ５アミノ酸配列（配列番号：２６）である。配列番号２６は、未成熟なＡｆｕＸｙｎ５の配列である。ＡｆｕＸｙｎ５は、配列番号２６の位置１〜１９（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号２６の位置２０〜３１３に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想されるＧＨ１１保存ドメインを太字で示す。
【図２７】図１４Ａは、Ｆｖ４３Ｄヌクレオチド配列（配列番号：２７）である。  図１４Ｂは、Ｆｖ４３Ｄアミノ酸配列（配列番号：２８）である。配列番号２８は、未成熟なＦｖ４３Ｄの配列である。Ｆｖ４３Ｄは、配列番号２８の位置１〜２０（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号２８の位置２１〜３５０に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインを太字で示す。
【図２８】図１５Ａは、Ｐｆ４３Ｂヌクレオチド配列（配列番号：２９）である。  図１５Ｂは、Ｐｆ４３Ｂアミノ酸配列（配列番号：３０）である。配列番号３０は、未成熟なＰｆ４３Ｂの配列である。Ｐｆ４３Ｂは、配列番号３０の位置１〜２０（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号３０の位置２１〜３２１に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインを太字で示す。
【図２９】図１６Ａは、Ｆｖ５１Ａヌクレオチド配列（配列番号：３１）である。  図１６Ｂは、Ｆｖ５１Ａアミノ酸配列（配列番号：３２）である。配列番号３２は、未成熟なＦｖ５１Ａの配列である。Ｆｖ５１Ａは、配列番号３２の位置１〜１９（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号３２の位置２０〜６６０に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想されるＬ−α−アラビノフラノシダーゼ保存ドメインを太字で示す。
【図３０】図１７Ａは、Ｃｇ５１Ｂヌクレオチド配列（配列番号：３３）である。
【図３１】図１７Ｂは、Ｃｇ５１Ｂアミノ酸配列（配列番号：３４）である。配列番号３４は、未成熟なＣｇ５１Ｂの配列である。Ｃｇ５１Ｂは、配列番号３４の位置１〜２０（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号３４の位置２１〜６７０に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインを太字で示す。
【図３２】図１８Ａは、Ｆｖ４３Ｃヌクレオチド配列（配列番号：３５）である。図１８Ｂは、Ｆｖ４３Ｃアミノ酸配列（配列番号：３６）である。配列番号３６は、未成熟なＦｖ４３Ｃの配列である。Ｆｖ４３Ｃは、配列番号３６の位置１〜２２（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号３６の位置２３〜３３３に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインを太字で示す。
【図３３】図１９Ａは、Ｆｖ３０Ａヌクレオチド配列（配列番号：３７）である。  図１９Ｂは、Ｆｖ３０Ａアミノ酸配列（配列番号：３８）である。配列番号３８は、未成熟なＦｖ３０Ａの配列である。Ｆｖ３０Ａは、配列番号３８の位置１〜１９（下線されている）に対応する予想されるシグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号３８の位置２０〜５３７に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。
【図３４】図２０Ａは、Ｆｖ４３Ｆヌクレオチド配列（配列番号：３９）である。  図２０Ｂは、Ｆｖ４３Ｆアミノ酸配列（配列番号：４０）である。配列番号４０は、未成熟なＦｖ４３Ｆの配列である。Ｆｖ４３Ｆは、配列番号４０の位置１〜２０（下線されている）に対応する予想されるシグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号４０の位置２１〜３１５に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。
【図３５】図２１Ａは、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ヌクレオチド配列（配列番号：４１）である。  図２１Ｂは、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３アミノ酸配列（配列番号：４２）である。配列番号４２は、未成熟なトリコデルマリーゼイＸｙｎ３の配列である。トリコデルマリーゼイＸｙｎ３は、配列番号４２の位置１〜１６（下線されている）に対応する予想されるシグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号４２の位置１７〜３４７に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインを太字で示す。
【図３６】図２２は、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２（配列番号：４３）のアミノ酸配列である。シグナル配列を下線で示す。予想される保存ドメインを太字で示す。そのコード配列は、Torronen et al. Biotechnology, 1992, 10:1461-65において見つけることができる。
【図３７】図２３は、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１（配列番号：４４）のアミノ酸配列である。シグナル配列を下線で示す。予想される保存ドメインを太字で示す。そのコード配列は、Margolles-Clark et al. Appl. Environ. Microbiol. 1996, 62(10):3840-46において見つけることができる。
【図３８】図２４は、トリコデルマリーゼイＢｇｌ１（配列番号：４５）のアミノ酸配列である。シグナル配列を下線で示す。予想される保存ドメインを太字で示す。そのコード配列は、Barnett et al. Bio-Technology, 1991, 9(6):562-567において見つけることができる。
【図３９】図２５は、カルコフロール検出(calcofluor detection)を用いたＰＡＳＣ加水分解を使用したセルラーゼ活性分析を示す。
【図４０】図２６は、キシラナーゼ溶出プロファイルを示す。
【図４１】図２７は、ＡｆｕＸｙｎ５の二工程分離のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動検出を示す。レーン１：天然のままのサンプルレーン２：フェニルカラムから溶出液レーン３：ＧＦカラムから溶出液
【図４２】図２８は、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯプラスミドを示す。
【図４３】図２９は、ｐＴｒｅｘ３ｇＭを示す。
【図４４】図３０Ａ−Ｂは、トウモロコシ穂軸基質に対する様々な酵素の性能を示している。エラーバーは、３回繰り返しのトウモロコシ穂軸分析に伴う実験誤差を表す。Ｘ軸に沿った括弧内の数は、セルロース１グラム当たりの酵素用量をタンパクのｍｇで表す。
【図４５】図３１は、トウモロコシ穂軸基質に対する様々な酵素混合物／酵素組成物の性能を示す。エラーバーは、３回繰り返しのトウモロコシ穂軸分析に伴う実験誤差を表す。Ｘ軸に沿った括弧内の数は、セルロース１グラム当たりの酵素用量をタンパクのｍｇで表す。
【図４６】図３２は、トウモロコシ穂軸基質に対する様々な酵素混合物／酵素組成物の性能を示している。エラーバーは、３回繰り返しのトウモロコシ穂軸分析に伴う実験誤差を表す。Ｘ軸に沿った括弧内の数は、セルロース１グラム当たりの酵素用量をタンパクのｍｇで表す。
【図４７】図３３は、トウモロコシ穂軸基質に対する様々な酵素混合物／酵素組成物の性能を示している。エラーバーは、３回繰り返しのトウモロコシ穂軸分析に伴う実験誤差を表す。Ｘ軸に沿った括弧内の数は、セルロース１グラム当たりの酵素用量をタンパクのｍｇで表す。
【図４８】図３４は、トウモロコシ穂軸基質に対する様々な酵素混合物／酵素組成物の性能を示している。エラーバーは、３回繰り返しのトウモロコシ穂軸分析に伴う実験誤差を表す。Ｘ軸に沿った括弧内の数は、セルロース１グラム当たりの酵素用量をタンパクのｍｇで表す。
【図４９−１】図３５Ａ−Ｃは、トウモロコシ穂軸基質に対する様々な酵素混合物／酵素組成物の性能を示している。エラーバーは、３回繰り返しのトウモロコシ穂軸分析に伴う実験誤差を表す。Ｘ軸に沿った括弧内の数は、セルロース１グラム当たりの酵素用量をタンパクのｍｇで表す。
【図４９−２】図３５の続きである。
【図５０】図３６は、短いアラビノキシランオリゴマーのアノマープロトンＮＭＲ領域は、Ｆｖ４３Ｂ及びＦｖ４３Ａによる開裂を示している。
【図５１】図３７は、短いアラビノキシランオリゴマーのアノマープロトンＮＭＲ領域は、Ｆｖ３Ａによるアラビノースからβ−１，２−結合キシロースへの開裂を示している。
【図５２】図３８は、トリコデルマリーゼイβ−キシロシダーゼのアミノ酸配列とＦｖ３Ａのアミノ酸配列との配列比較を示している。
【図５３】図３９は、ｐＥＮＴＲ−ＴＯＰＯ−Ｂｇｌ１（９４３／９４２）プラスミドを示す。
【図５４】図４０は、ｐＴｒｅｘ３ｇ  ９４３／９４２  Ｂｇｌ１発現ベクターを示す。
【図５５】図４１は、ｐＥＮＴＲ−トリコデルマリーゼイＸｙｎ３プラスミドを示す。
【図５６】図４２は、ｐＴｒｅｘ３ｇ／トリコデルマリーゼイＸｙｎ３発現ベクターを示す。
【図５７】図４３は、ｐＥＮＴＲ−Ｆｖ３Ａプラスミドを示す。
【図５８】図４４は、ｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３Ａ発現ベクターを示す。
【図５９】図４５は、ＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３Ｄプラスミドを示している。
【図６０】図４６は、ＴＯＰＯ  Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ５１Ａプラスミドを示している。
【図６１】図４７Ａは、トリコデルマリーゼイ組込発現株から分泌された酵素培養液によるグルカンのモノマー糖への変換を示している。  図４７Ｂは、トリコデルマリーゼイ組込発現株から分泌された酵素培養液によるキシランのモノマー糖への変換を示している。
【図６２】図４７Cは、グルカン及びキシランからモノマー及び可溶性オリゴマー生成物の両方への変換の程度について、３日目のサンプルを分析した。  図４７Ｄは、３つのトリコデルマリーゼイ組込発現株から得た酵素生成物のクロマトグラフィの比較を示している。実験条件は実施例１に記載されている。タンパク比率は、形質転換体によって異なり、全積分ピーク面積のパーセンテージとして定量することができる。「ＥＧＬ」は、エンドグルカナーゼのピークの合計面積を示している。ＨＰＬＣ分析用の試薬として少量のＥｎｄｏＨをタンパク試料に加えた。
【図６３】図４８Ａ及び図４８Ｂは、糖化において、組込株によって生産された酵素組成物に対して、アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸中のグルカン＋キシランの１グラム当たり合計７ｍｇのタンパク量でヘミセルラーゼを添加すると、その添加に応じてキシロースモノマーの収率が増加することを示している。図４８Ａは、組込株によって生産された酵素組成物中のフザリウム・バーティシリオイデス・ヘミセルラーゼ（Constituent Fusarium verticillioides）を示している。図４８Ｂは、他の真菌から得た複数のヘミセルラーゼを示している。
【図６４】図４９Ａ−４９Ｂは、糖化において、組込株によって生産された酵素組成物に、アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸中のグルカン＋キシランの１グラム当たり合計７ｍｇのタンパク量のヘミセルラーゼを添加すると、その添加に応じてグルコースモノマーの収率が増加することを示している。図４９Ａは、組込株によって生産された酵素組成物中の構成成分であるフザリウム・バーティシリオイデス・ヘミセルラーゼを示している。  図４９Ｂは、他の真菌から得たヘミセルラーゼを示している。
【図６５】図５０Ａ及び図５０Ｂは、糖化において、組込株によって生産された酵素組成物に、アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸中のグルカン＋キシランの１グラム当たり合計７ｍｇのタンパク量のヘミセルラーゼを添加すると、その添加に応じてアラビノースモノマーの収率が増加することを示している。図５０Ａは、組込株によって生産された酵素組成物中の構成成分であるフザリウム・バーティシリオイデス・ヘミセルラーゼを示している。  図５０Ｂは、他の真菌から得たヘミセルラーゼを示している。
【図６６】図５１は、それぞれの前処理条件における糖化性能のグラフ表示を示している。Ｘ軸は表１２に一覧されている実験結果に対応している。収率は、未加工のスイッチグラス中の利用可能なグルカン又はキシランの理論量に基づいて計算した。すべての収率は、酵素混合物による３日間の糖化の後に放出された単量体の糖に基づいている。
【図６７】図５２は、多数のＧＨ３９β−キシロシダーゼのアミノ酸配列の配列比較を示している。下線が付された太字の残基は、予想される触媒性の一般酸塩基残基（配列比較の上に「Ａ」で示されている）及び触媒性の求核分子残基（配列比較の上に「Ｎ」で示されている）である。下方の２つの配列中の下線が付された普通文字の残基は、それぞれの三次元構造の活性部位中の基質の４オングストローム以内である（それぞれｐｄｂ：１ｕｈｖ及び２ｂｓ９）。Ｆｖ３９Ａ配列中の下線が付されている残基は、活性部位中の４オングストローム以内のの結合基質であると予想される。
【図６８−１】図５３は、多数のＧＨ４３ファミリーのヒドロラーゼのアミノ酸配列の配列比較を示している。ファミリーのメンバー間で高度に保存されたアミノ酸残基は、下線及び太字で示されている。
【図６８−２】図５３の続きである。
【図６９】図５４は、多数のＧＨ５１ファミリーの酵素のアミノ酸配列の配列比較を示している。ファミリーのメンバー間で高度に保存されたアミノ酸残基は、下線及び太字で示されている。
【図７０−１】図５５Ａ及び図５５Ｂは、多数のＧＨ１０ファミリー及びＧＨ１１ファミリーのエンドキシラナーゼのアミノ酸配列の配列比較を示している。図５５Ａは、ＧＨ１０ファミリーのキシラナーゼの配列比較を示している。下線が付されている太字の残基は、触媒性の求核性残基（配列比較の上に「Ｎ」で示されている）。
【図７０−２】図５５Ｂは、ＧＨ１１ファミリーのキシラナーゼの配列比較を示している。下線が付された太字の残基は、触媒性の求核分子残基及び一般酸塩基残基（配列比較の上にそれぞれ「Ｎ」及び「Ａ」で示されている）。
【図７１−１】図５６Ａ及び図５６Ｂは、様々な酵素混合物／酵素組成物によって、希アンモニアで前処理したスイッチグラスを糖化した結果を示している。図５６Ａは、グルカン変換を示している。
【図７１−２】図５６Ｂは、キシランの変換を示している。実施例１３に記載されているように、図の下のＸ軸上の数字は、１ｇのグルカン又はキシラン当たりの所定の混合物／組成物中の各タンパクの合計ｍｇの量を示している。
【図７２】図５７Ａ及び図５７Ｂは、組込株Ｈ３Ａによって生産した酵素組成物による希アンモニアで前処理したスイッチグラスの糖化を示している。図５７Ａは、グルカンの変換を示している。  図５７Ｂは、キシランの変換を示している。実験条件は実施例１４に記載されている。
【図７３−１】図５８Ａ−図５８Ｃは、組込株Ｈ３Ａによって生産された酵素組成物による様々な酵素用量におけるスチーム膨張サトウキビバガスの糖化を示している。図５８Ａは、グルカン変換を示している。  図５８Ｂは、キシランの変換を示している。
【図７３−２】図５８Ｃは、３日目のグルカン及びキシランの変換を示している。実験条件は実施例１７に記載されている。
【図７４−１】図５９Ａ−図５９Ｃは、希酸で前処理したコーンファイバーを、様々な酵素又は酵素混合物によって糖化した結果を示している。図５９Ａは、グルカンの変換を示している。  図５９Ｂは、キシランの変換を示している。
【図７４−２】図５９Ｃは、５日目のグルカン及びキシランの変換を示している。調整された糖（グルコース又はキシロース）は、開始時の糖レベルを差し引いた、酵素工程によって生じた糖を示している。Ｘ軸に沿って示されている比率は、セルロース１グラム当たりの酵素用量を、総タンパクのｍｇで示している。実験条件は実施例１８に記載されている。
【図７５】図６０Ａは、Ｐａ５１Ａ（配列番号：４６）のための推定されるｃＤＮＡを示している。
【図７６】図６０Ｂは、Ｐａ５１Ａ（配列番号：４７）のためのコドン最適化ｃＤＮＡを示している。
【図７７】図６１は、成熟Ｇｚ４３Ａ（配列番号：４８）をコードするゲノムＤＮＡの上流にＣＢＨ１シグナル配列（下線部）を含む構築物のためのコード配列を示している。
【図７８】図６２は、成熟Ｆｏ４３Ａ（配列番号：４９）をコードするゲノムＤＮＡの上流にＣＢＨ１シグナル配列（下線部）を含む構築物のためのコード配列を示している。
【図７９】図６３は、成熟Ｐｆ５１Ａ（配列番号：５０）をコードするコドン最適化ＤＮＡの上流にＣＢＨ１シグナル配列（下線部）を含む構築物のためのコドン最適化コード配列を示している。
【図８０】図６４は、多数のＧＨ３ファミリーのヒドロラーゼのアミノ酸配列の配列比較を示している。ファミリーのメンバー間で高度に保存されているアミノ酸残基は太字に下線を付して示されている。ボックスマークは、基質結合に関与すると予想される隣接残基とともに、予想される触媒性残基を示している。
【図８１】図６５は、２つの代表的なフザリウムＧＨ３０ファミリーのヒドロラーゼのアミノ酸配列の配列比較を示している。ファミリーのメンバー間で保存されているアミノ酸残基は太字に下線を付して示されている。
【００４４】
６．詳細な説明
酵素は、伝統的に基質特異性及び反応生成物によって分類されてきた。ゲノム時代の以前には、機能は、酵素を比較するための最も受け入れられる（そして、おそらくは最も有用な）根拠であるとみなされており、様々な酵素活性の分析が長年にわたって高度に発展し、それによって周知のＥＣ分類体系が得られた。セルラーゼ及び他のグリコシルヒドロラーゼは、２つの糖成分（又は、ニトロフェノールグリコシド誘導体中に生じるような糖と非糖部位）の間のグリコシド結合に作用するものであり、この分類体系下ではＥＣ３．２．１．−と呼ばれ、その最後の数字が結合開裂の正確な種類を示している。例えば、この体系によれば、エンド作用型セルラーゼ（１，４−β−エンドグルカナーゼ）は、ＥＣ３．２．１．４と呼ばれる。
【００４５】
広く普及したゲノム配列決定プロジェクトの到来と共に、配列データによって、関連遺伝子及び関連タンパクの分析及び比較が容易になった。さらに、糖成分に作用できるますます多くの酵素（すなわち、カルボヒドラーゼ）が結晶化され、その三次元構造が決定されてきた。そのような分析は、アミノ酸配列に基づいて予想することができる保存された三次元的折りたたみ構造を含む関連配列によって、酵素の個々のファミリーを同定してきた。さらに、異なる反応を触媒する場合でさえ、同一又は同様の三次元的折りたたみ構造を有する酵素が、加水分解の同一又は同様の立体特異性を示すことが示されている(Henrissat et al., 1998, FEBS Lett 425(2): 352-4; Coutinho and Henrissat, 1999, in Genetics, biochemistry and ecology of cellulose degradation. T. Kimura. Tokyo, Uni Publishers Co: 15-23.)。
【００４６】
これらの発見は、カルボヒドラーゼモジュールの配列に基づいた分類の基礎を形成する。その分類は、インターネットデータベースの形態、the Carbohydrate-Active enZYme server（ＣＡＺｙ）（http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.htm（糖活性酵素：統合データベースアプローチ）において利用可能）で利用することができる。Cantarel et al., 2009, Nucleic Acids Res.37 (Database issue):D233-38)を参照されたい。
【００４７】
ＣＡＺｙは、触媒される反応の種類によって、グリコシルヒドロラーゼ（GH's）、グリコシルトランスフェラーゼ（GT's）、多糖類リアーゼ（PL's）及び糖エステラーゼ（CE's）の４つの区別可能な主要なクラスのカルボヒドラーゼを定義する。本開示の酵素はグリコシルヒドロラーゼである。GH'sは、２つ以上の糖の間のグリコシド結合、又は、糖と非糖成分との間のグリコシド結合を加水分解する酵素の一群である。配列類似性によってグループ分けされたグリコシルヒドロラーゼの分類系は、８５個以上の異なるファミリーの定義を与えている。この分類はＣＡＺｙウェブサイトにおいて利用することができる。
【００４８】
本開示の酵素は、特に、グリコシルヒドロラーゼファミリー３、１０、１１、３０、３９、４３及び／又は５１に属する。
【００４９】
グリコシドヒドロラーゼファミリー３（「ＧＨ３」）酵素には、例えば、β−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２１）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）；Ｎ−アセチルβ−グルコサミニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５２）；グルカンβ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５８）；セロデキストリナーゼ（ＥＣ：３．２．１．７４）；エキソ−１、３−１、４−グルカナーゼ（ＥＣ：３．２．１）；及び、β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２３）が含まれる。例えば、ＧＨ３酵素は、β−グルコシダーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性、Ｎ−アセチルβ−グルコサミニダーゼ活性、グルカンβ−１，３−グルコシダーゼ活性、セロデキストリナーゼ活性、エキソ−１，３−１，４−グルカナーゼ活性、及び／又は、β−ガラクトシダーゼ活性を有するものであってもよい。一般に、ＧＨ３酵素は、球状タンパクであり、２つ以上のサブドメインからなるものであり得る。触媒性残基は、β−グルコシダーゼにおいて、そのペプチドのＮ末端の３番目に位置するアスパラギン酸残基、及び、アミノ酸断片ＳＤＷの範囲内の部位であると判明している(Li et al. 2001, Biochem. J. 355:835-840)。トリコデルマリーゼイに由来するＢｇｌ１における対応配列は（開始位置のメチオニンから数えて）Ｔ２６６、Ｄ２６７及びＷ２６８であり、触媒性残基であるアスパラギン酸はＤ２６７である。ヒドロキシル／アスパラギン酸配列は、試験を行ったＧＨ３β−キシロシダーゼにおいても保存されている。例えば、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１における対応配列はＳ３１０及びＤ３１１である。また、Ｆｖ３Ａにおける対応配列はＳ２９０及びＤ２９１である。
【００５０】
グリコシドヒドロラーゼファミリー３９（「ＧＨ３９」）酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．７６）活性又はβ−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）活性を有する。サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Thermoanaerobacterium saccharolyticum）(Uniprot登録番号P36906)、及び、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）(Uniprot登録番号Q9ZFM2)から得られる２つのＧＨ３９β−キシロシダーゼの三次元構造が解明されている(Yang et al. J. Mol. Biol. 2004, 335(1):155-65、及び、Czjzek et al., J. Mol. Biol. 2005, 353(4):838-46を参照されたい)。これらの酵素における最も高度に保存された部位は、これらの酵素のＮ末端部位に位置しており、古典的（α／β）８ＴＩＭバレルフォールドを有し、β鎖４（酸／塩基）及びβ鎖７（求核分子）のＣ末端終端に２つの重要な活性部位であるグルタミン酸が位置している。サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム及びゲオバチルス・ステアロサーモフィルスから得られる上述のそれぞれのＧＨ３９β−キシロシダーゼと、Ｆｖ３９Ａとの配列比較に基づいて、Ｆｖ３９Ａの残基であるＥ１６８及びＥ２７２は、触媒性の酸−塩基及び求核分子として機能することが予想される。
【００５１】
グリコシドヒドロラーゼ・ファミリー４３（「ＧＨ４３」）酵素には、例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）、β−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）、エンド−アラビナナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９９）、又は、ガラクタン１，３−β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１４５）が含まれる。例えば、ＧＨ４３酵素は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性、エンド−アラビナナーゼ活性、及び／又は、ガラクタン１，３−β−ガラクトシダーゼ活性を有し得る。ＧＨ４３ファミリー酵素は、５つのブレードによるβ−プロペラ様構造を示す。このプロペラ様構造は、四本鎖のβ−シートからなるブレードの５重の繰り返しをベースとする。触媒性の一般的塩基であるアスパラギン酸、触媒性の一般的酸であるグルタミン酸塩、及び、その一般的塩基のｐＫａを調整するアスパラギン酸は、クロストリジウム・ジャポニカス（Cellvibrio japonicus）ＣｊＡｂｎ４３Ａの結晶構造を通じて同定されており、部位特異的変異誘発によって確認されている(Nurizzo et al. Nat. Struct. Biol. 2002, 9(9) 665-8を参照されたい)。これらの触媒性残基は、アミノ酸配列中に広く分布する３つの保存されたブロックに配置されている(Pons et al. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics, 2004, 54:424-432)。バイオマス加水分解における有用な活性について試験を行ったＧＨ４３ファミリー酵素において、予想される触媒性残基は、図５３の配列において下線を付した太字の残基として示されている。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス・キシロシダーゼの結晶構造(Brux et al. J. Mol. Bio., 2006, 359:97-109)は、この酵素に結合する基質にとって重要であり得るいくつかのさらなる残基を示唆している。バイオマス加水分解を目的として試験を行ったＧＨ４３ファミリー酵素が異なる基質選択性を有していたので、これらの残基は、図５３に比較されている配列中に完全には保存されていない。しかし、試験を行った複数のキシロシダーゼの間でも、疎水性相互作用又は水素結合を介して基質結合に寄与するいくつかの残基が保存されており、その残基は図５３において一重下線で示されている。
【００５２】
グリコシドヒドロラーゼ・ファミリー５１（「ＧＨ５１」）酵素は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）活性及び／又はエンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）活性を有している。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＴ−６に由来するＧＨ５１Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの高分解能の結晶構造は、この酵素が六量体であり、それぞれのモノマーは、ゼリーロール・トポロジー（jelly-roll topology）と共に、２つの領域：８バレル（β／α）及び１２鎖のβサンドイッチに組み立てられることを示す(Hovel et al. EMBO J. 2003, 22(19):4922-4932を参照されたい)。触媒性残基が、酸性であり、ファミリー中の複数の酵素配列間で保存されていることを予想することができる。Ｆｖ５１Ａ、Ｐｆ５１Ａ及びＰａ５１Ａのアミノ酸配列を、より多様な配列の複数のＧＨ５１酵素と配列比較すると、８個の酸性残基が保存されていた。それらの残基は図５４に下線及び太字で示されている。
【００５３】
グリコシドヒドロラーゼ・ファミリー１０（「ＧＨ１０」）酵素もまた８バレル（β／α）構造を有している。これらの酵素は、一般的な酸／塩基の触媒作用プロセスにおいて少なくとも１つの酸性の触媒性残基を使用するメカニズムを保持しながら、エンドの態様で加水分解を行う(Pell et al., J. Biol. Chem., 2004, 279(10): 9597-9605)。ペニシリウム・シムプリシシマム（Penicillium simplicissimum）（Uniprot P56588）、及び、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）（Uniprot P23360）のＧＨ１０キシラナーゼの結晶構造が、それらの活性部位が基質と複合化したものとして解明されている(Schmidt et al. Biochem., 1999, 38:2403-2412; and Lo Leggio et al. FEBS Lett. 2001, 509: 303-308を参照されたい)。トリコデルマリーゼイＸｙｎ３の基質結合及び触媒作用にとって重要な残基は、ペニシリウム・シムプリシシマム及びサーモアスカス・オーランティアカスに由来する上述のＧＨ１０キシラナーゼの配列との配列比較によって導き出すことができる（図５５Ａ）。トリコデルマリーゼイＸｙｎ３残基のＥ２８２は、触媒性の求核性残基であることが予想され、一方で、Ｅ９１、Ｎ９２、Ｋ９５、Ｑ９７、Ｓ９８、Ｈ１２８、Ｗ１３２、Ｑ１３５、Ｎ１７５、Ｅ１７６、Ｙ２１９、Ｑ２５２、Ｈ２５４、Ｗ３１２、及び／又は、Ｗ３２０の残基は、基質結合及び／又は触媒作用に関係していることが予想される。
【００５４】
グリコシドヒドロラーゼ・ファミリー１１（「ＧＨ１１」）酵素はα−ゼリーロール構造を有している。これらの酵素は、一般的な酸／塩基の触媒作用プロセスにおいて少なくとも１つの酸性の触媒性残基を使用するメカニズムを保持しながら、エンドの態様で加水分解を行う。これらの構造の全体に分布する他のいくつかの残基は、加水分解によって開裂されるキシロースモノマーのペアに隣接する基質中のキシロース単位を安定させることに寄与することができる。３つのＧＨ１１ファミリー・エンドキシラナーゼを試験した。また、これらの配列は図５５Ｂにおいて比較されている。Ｅ１１８（又は、成熟なトリコデルマ・リーゼイＸｙｎ２におけるＥ８６）及びＥ２０９（又は、成熟なトリコデルマ・リーゼイＸｙｎ２におけるＥ１７７）は、それぞれ、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２における触媒性求核残基及び一般的／酸塩基残基であることが確認されている(Havukainen et al. Biochem., 1996, 35:9617-24を参照されたい)。
【００５５】
グリコシドヒドロラーゼ・ファミリー３０（「ＧＨ３０」）酵素は、グルコシルセラミダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４５）活性、β−１，６−グルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７５）活性、β−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）活性、及び、β−グルコシダーゼ（３．２．１．２１）活性を有する酵素を有する。最初のＧＨ３０結晶構造は、Grabowski, Gatt and Horowitzによって解明されたゴーシェ病関連ヒトβ−グルコセレブロシダーゼである(Crit Rev Biochem Mol Biol 1990; 25(6) 385-414)。ＧＨ３０は、（α／β）８ＴＩＭバレルフォールドを有し、２つの重要な活性部位であるグルタミン酸がβ鎖４（酸／塩基）及びβ鎖７（求核分子）のＣ末端終端に位置している(Henrissat B, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 92(15):7090-4, 1995; Jordan et al., Applied Microbiol Biotechnol, 86:1647, 2010)。Ｆｖ３０Ａのグルタミン酸１６２は、配列比較されている１４個のＧＨ３０タンパク（１３個の細菌タンパク、及び、菌類バイオスポラ（Biospora）登録番号ＡＤＧ６２３６９に由来するエンド−β−キシラナーゼ）のうち、１４個において保存されている。また、Ｆｖ３０Ａのグルタミン酸２５０は、その１４個のうち１０個において保存されており、他の３個においてはアスパラギン酸であり、１個においては非酸性である。中適度に保存されている他の酸性残基が存在するが、他のものは広く保存されていない。
【００５６】
６．１  本開示のポリペプチド
本開示は、少なくともおおよそ１０個（例えば、少なくともおおよそ、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５の、２５０、２７５、３００、３２５若しくは３５０）の残基にわたる領域で、又は、未成熟ポリペプチドの完全長、完全長の成熟ポリペプチド、保存ドメインの全長、及び／若しくは、完全長の糖結合モジュールにわたって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、４４又は４５のポリペプチドに対して、少なくとも約８０％（例えば、少なくともおおよそ、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、完全な（１００％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、合成ポリペプチド又は組み換えポリペプチドを提供する。保存ドメインは予想される触媒ドメイン（「ＣＤ」）であり得る。例示的ポリペプチドは、少なくとも約１０個（例えば、少なくともおおよそ、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５）、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０又は６００個の長さの残基の断片を含む。この断片は保存ドメイン及び／又は糖結合モジュールを含んでいてもよい。この断片が酵素の保存ドメイン及び糖結合モジュールを含んでいる場合には、この断片はその２つを分離するリンカーを選択的に含む。このリンカーは、生来のリンカー又は異種起源のリンカーであり得る。本開示のポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９若しくは４１に対して少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％若しくは約９０％の配列同一性を有する核酸配列によって、又は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９若しくは４１、若しくはこれらの断片に対するの相補体に対して高い厳格性条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列によって、コードすることができるように意図されている。本開示の例示的核酸は、以下のセクション６．２に記載されている。
【００５７】
本開示のポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、４４又は４５のグリコシルヒドロラーゼ配列の少なくとも５０の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は、９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパクを含む。例えば、本開示のポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、４４又は４５のグリコシルヒドロラーゼ配列の少なくとも１０個（例えば、少なくとも、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００又は３５０個）の連続したアミノ酸残基に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。この連続したアミノ酸配列は、保存ドメイン、及び／又は、糖結合モジュール、及び／又は、シグナル配列に相当する。
【００５８】
本明細書に記載されているアミノ酸配列のあらゆるものは、特定のアミノ酸配列のＣ末端及び／又はＮ末端のそれぞれに隣接する少なくとも１個（例えば、少なくとも２、３、５、１０又は２０個）の異種起源のアミノ酸と共に若しくはつながって生産されてもよいし、又は、本開示の酵素のＣ末端及び／又はＮ末端から少なくとも１個（例えば、少なくとも２、３、５、１０又は２０個）のアミノ酸を欠損して生産されてもよい。
【００５９】
他の変異も本開示の範囲内である。例えば、酵素のｐＩを上昇又は低下させるように１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が修飾されていてもよい。ｐＩ値の変更は、グルタミン酸残基を除去するか又はグルタミン酸残基を他のアミノ酸残基で置換することによって達成することができる。本開示は、特に、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｆｖ５１Ａ、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１、及び／又は、トリコデルマリーゼイＢｇｌ１ポリペプチドを提供する。これらの酵素の１つ以上の組み合わせは、本発明の酵素混合物／酵素組成物（例えば、天然に存在しないもの）中に好ましくは存在する。
【００６０】
Ｆｖ３Ａ：Ｆｖ３Ａ（配列番号：２）のアミノ酸配列は、図１Ｂ、図３８及び図６４に示されている。配列番号：２は未成熟なＦｖ３Ａの配列である。Ｆｖ３Ａは、配列番号２の残基１〜２３（下線されている）に対応する予想シグナル配列を有しており、このシグナル配列の開裂によって、配列番号２の残基２４〜７６６に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインは図１Ｂに太字で示されている。Ｆｖ３Ａは、例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、混合直鎖キシロオリゴマー、ヘミセルロースから得た分岐アラビノキシランオリゴマー、又は、希アンモニアで前処理されたトウモロコシ穂軸を基質として使用した酵素分析において、β−キシロシダーゼ活性を有することが示されている。予想される触媒性残基はＤ２９１である。一方で、それに隣接する残基（Ｓ２９０及びＣ２９２）は、基質結合に関与することが予想される（図６４）。Ｅ１７５及びＥ２１３は、他のＧＨ３酵素においても保存されており、触媒性機能を有していると予想される。本明細書において用いられているように、「Ｆｖ３Ａポリペプチド」は、配列番号２の残基２４〜７６６における少なくとも５０個、（例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、又は、７００個）の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。Ｆｖ３Ａポリペプチドは、天然のＦｖ３Ａと比較して、Ｄ２９１、Ｓ２９０、Ｃ２９２、Ｅ１７５及びＥ２１３の残基が不変であることが好ましい。図６４の配列比較に示されているように、Ｆｖ３Ａポリペプチドは、Ｆｖ３Ａ、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１及び／又はトリコデルマリーゼイＢｇｌ１において保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。Ｆｖ３Ａポリペプチドは、好ましくは、図１Ｂに示されているような天然のＦｖ３Ａの予想される保存ドメインの全体を含む。本発明の例示的Ｆｖ３Ａポリペプチドは、図１Ｂに示されているような成熟なＦｖ３Ａ配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のＦｖ３Ａポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００６１】
従って、本発明のＦｖ３Ａポリペプチドは、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列に対して、又は、配列番号２の（ｉ）２４−７６６、（ｉｉ）７３−３２１、（ｉｉｉ）７３−３９４、（ｉｖ）３９５−６２２、（ｖ）２４−６２２、若しくは、（ｖｉ）７３−６２２の残基に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００６２】
Ｐｆ４３Ａ：Ｐｆ４３Ａ（配列番号：４）のアミノ酸配列が図２Ｂ及び図５３に示されている。配列番号：４は未成熟なＰｆ４３Ａの配列である。Ｐｆ４３Ａは、配列番号４の残基１〜２０に対応する予想シグナル配列を有しており（図２Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号４の残基２１〜４４５に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインが太字で示されている。予想される糖結合モジュールが大文字で示されている。また、触媒性ドメイン及び糖結合モジュールを分離する予想されるリンカーは、図２Ｂにイタリック体で示されている。Ｐｆ４３Ａは、例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、混合直鎖キシロオリゴマー、又は、アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を基質として使用した酵素分析において、β−キシロシダーゼ活性を有することが示されている。予想される触媒性残基は、Ｄ３２又はＤ６０と、Ｄ１４５と、Ｅ２０６とを含む。図５３において下線で示されているＣ末端領域が予想される糖結合モジュールである。本明細書において用いられているように、「Ｐｆ４３Ａポリペプチド」は、配列番号４の残基２１〜４４５における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０又は４００の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。Ｐｆ４３Ａポリペプチドは、天然のＰｆ４３Ａと比較して、Ｄ３２又はＤ６０と、Ｄ１４５と、Ｅ２０６との残基が不変であることが好ましい。Ｐｆ４３Ａは、Ｐｆ４３Ａ及び図５３の配列比較中の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個若しくは８個すべての他のアミノ酸配列を含むタンパクのファミリーにわたって保存されていることがわかっているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。本発明のＰｆ４３Ａポリペプチドは、好ましくは、（１）予想される糖結合モジュール、（２）予想される保存ドメイン、及び、（３）図２Ｂに示されているＰｆ４３Ａのリンカーの２つ以上又はすべての領域を含む。本発明の例示的Ｐｆ４３Ａポリペプチドは、図２Ｂに示されている成熟したＰｆ４３Ａ配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のＰｆ４３Ａポリペプチドは好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００６３】
従って、本発明のＰｆ４３Ａポリペプチドは、好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列に対して、又は、配列番号４の（ｉ）２１−４４５、（ｉｉ）２１−３０１、（ｉｉｉ）２１−３２３、（ｉｖ）２１−４４４、（ｖ）３０２−４４４、（ｖｉ）３０２−４４５、（ｖｉｉ）３２４−４４４、若しくは、（ｖｉｉｉ）３２４−４４５の残基に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００６４】
Ｆｖ４３Ｅ：Ｆｖ４３Ｅ（配列番号：６）のアミノ酸配列は図３Ｂ及び図５３に示されている。配列番号：６は未成熟なＦｖ４３Ｅの配列である。Ｆｖ４３Ｅは、配列番号６の残基１〜１８に対応する予想されるシグナル配列を有しており（図３Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号６の残基１９〜５３０に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインは図３Ｂに太字で示されている。Ｆｖ４３Ｅは、例えば、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド、キシロビオース、混合直鎖キシロオリゴマー、又は、アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を基質として使用した酵素分析において、β−キシロシダーゼ活性を有することが示されている。予想される触媒性残基は、Ｄ４０若しくはＤ７１と、Ｄ１５５と、Ｅ２４１とを含む。本明細書において用いられているように、「Ｆｖ４３Ｅポリペプチド」は、配列番号６の残基１９〜５３０における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００の連続したアミノ酸残基に対して、その少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。Ｆｖ４３Ｅポリペプチドは、天然のＦｖ４３Ｅと比較して、Ｄ４０若しくはＤ７１の残基と、Ｄ１５５の残基と、Ｅ２４１の残基とが不変であることが好ましい。Ｆｖ４３Ｅポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｅ並びに図５３の配列比較中の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個若しくは８個すべての他のアミノ酸配列を含む酵素のファミリーにわたって保存されていることがわかっているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。Ｆｖ４３Ｅポリペプチドは、好ましくは、図３Ｂに示されている天然のＦｖ４３Ｅの予想される保存ドメインの全体を含む。例示的Ｆｖ４３Ｅポリペプチドは、図３Ｂに示されている成熟Ｆｖ４３Ｅ配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のＦｖ４３Ｅポリペプチドは好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００６５】
従って、本発明のＦｖ４３Ｅポリペプチドは、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列に対して、又は、配列番号６の（ｉ）１９−５３０、（ｉｉ）２９−５３０、（ｉｉｉ）１９−３００、若しくは、（ｉｖ）２９−３００の残基に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００６６】
Ｆｖ３９Ａ：Ｆｖ３９Ａ（配列番号：８）のアミノ酸配列は図４Ｂ及び図５２に示されている。配列番号：８は未成熟なＦｖ３９Ａの配列である。Ｆｖ３９Ａは、配列番号８の残基１〜１９に対応する予想されるシグナル配列を有しており（図４Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号８の残基２０〜４３９に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインは、図４Ｂに太字で示されている。Ｆｖ３９Ａは、例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、混合直鎖キシロオリゴマー、又は、アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸を基質として使用した酵素分析において、β−キシロシダーゼ活性を有することが示されている。Ｆｖ３９Ａの残基であるＥ１６８及びＥ２７２は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Uniprot登録番号P36906）及びゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Uniprot登録番号Q9ZFM2）に由来する前述のＧＨ３９キシロシダーゼとＦｖ３９Ａとの配列比較に基づいて、触媒性酸塩基及び求核基としてそれぞれ機能することが予想される。本明細書において用いられているように、「Ｆｖ３９Ａポリペプチド」は、配列番号８の残基２０〜４３９における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０又は４００の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。Ｆｖ３９Ａポリペプチドは、天然のＦｖ３９Ａと比較して、Ｅ１６８及びＥ２７２の残基が不変であることが好ましい。Ｆｖ３９Ａポリペプチドは、Ｆｖ３９Ａとサーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム及びゲオバチルス・ステアロサーモフィルスに由来するキシロシダーゼとを含むファミリー又は複数の酵素の間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい（上記参照）。Ｆｖ３９Ａポリペプチドは、好ましくは、図４Ｂに示されている天然のＦｖ３９Ａの予想される保存ドメインの全体を含む。例示的Ｆｖ３９Ａポリペプチドは、図４Ｂに示されている成熟したＦｖ３９Ａ配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のＦｖ３９Ａポリペプチドは好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００６７】
従って、本発明のＦｖ３９Ａポリペプチドは、好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列に対して、又は、配列番号８の（ｉ）２０−４３９、（ｉｉ）２０−２９１、（ｉｉｉ）１４５−２９１、若しくは、（ｉｖ）１４５−４３９の残基に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００６８】
Ｆｖ４３Ａ：Ｆｖ４３Ａ（配列番号：１０）のアミノ酸配列は図５Ｂ及び図５３に提供されている。配列番号：１０は未成熟なＦｖ４３Ａの配列である。Ｆｖ４３Ａは、配列番号１０の残基１〜２２に対応する予想されるシグナル配列を有しており（図５Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号１０の残基２３〜４４９に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。図５Ｂにおいて、予想される保存ドメインは太字で示されている。予想される糖結合モジュールは大文字で示されている。また、触媒性ドメイン及び糖結合モジュールを分離する予想されるリンカーはイタリック体で示されている。Ｆｖ４３Ａは、例えば、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド、キシロビオース、混合直鎖キシロオリゴマー、ヘミセルロースから得た分岐したアラビノキシランオリゴマー、及び／又は、直鎖キシロオリゴマーを使用した酵素分析において、β−キシロシダーゼ活性を有することが示されている。予想される触媒性残基は、Ｄ３４若しくはＤ６２のいずれかと、Ｄ１４８と、Ｅ２０９とを含む。本明細書において用いられているように、「Ｆｖ４３Ａポリペプチド」は、配列番号１０の残基２３〜４４９における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０又は４００の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。Ｆｖ４３Ａポリペプチドは、天然のＦｖ４３Ａと比較して、Ｄ３４又はＤ６２の残基と、Ｄ１４８の残基と、Ｅ２０９の残基とが不変であることが好ましい。Ｆｖ４３Ａポリペプチドは、Ｆｖ４３Ａと図５３の配列比較中の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個すべての他のアミノ酸配列とを含む酵素のファミリーの間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。Ｆｖ４３Ａポリペプチドは、好ましくは、天然のＦｖ４３Ａの予想される糖結合モジュールの全体、及び／又は、天然のＦｖ４３Ａの予想される保存ドメインの全体、及び／又は、図５Ｂに示されているＦｖ４３Ａのリンカー全体を含む。例示的Ｆｖ４３Ａポリペプチドは、図５Ｂに示されている成熟したＦｖ４３Ａ配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のＦｖ４５Ａポリペプチドは好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００６９】
従って、本発明のＦｖ４３Ａポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列に対して、又は、配列番号１０の（ｉ）２３−４４９、（ｉｉ）２３−３０２、（ｉｉｉ）２３−３２０、（ｉｖ）２３−４４８、（ｖ）３０３−４４８、（ｖｉ）３０３−４４９、（ｖｉｉ）３２１−４４８、若しくは、（ｖｉｉｉ）３２１−４４９の残基に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を好ましくは含む。このポリペプチドは好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００７０】
Ｆｖ４３Ｂ：Ｆｖ４３Ｂ（配列番号：１２）のアミノ酸配列は図６Ｂ及び図５３に示されている。配列番号：１２は未成熟なＦｖ４３Ｂの配列である。Ｆｖ４３Ｂは配列番号：１２の残基１〜１６に対応する予想されるシグナル配列を有しており（図６Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号１２の残基１７〜５７４に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインは図６Ｂに太字で示されている。Ｆｖ４３Ｂは、例えば、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド及びｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを基質として使用した第１の酵素分析において、β−キシロシダーゼ活性及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性の両方を有することが示されている。この酵素は、第２の酵素分析において、分岐したアラビノ・キシロオリゴマーからのアラビノースの放出を触媒し、かつ、他のキシロシダーゼ酵素の存在下においてオリゴマー混合物からの増加したキシロース放出を触媒することが示された。予想される触媒性残基は、Ｄ３８又はＤ６８のいずれかと、Ｄ１５１と、Ｅ２３６とを含む。本明細書において用いられているように、「Ｆｖ４３Ｂポリペプチド」は、配列番号１２の残基１７〜５７４における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又は５５０の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、天然のＦｖ４３Ｂと比較して、Ｄ３８若しくはＤ６８のいずれかの残基と、Ｄ１５１の残基と、Ｅ２３６の残基とが不変であることが好ましい。Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｂと図５３の配列比較中の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個すべての他のアミノ酸配列とを含む酵素のファミリーの間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、好ましくは、図６Ｂ及び図５３に示されている天然のＦｖ４３Ｂの予想される保存ドメインの全体を含む。例示的Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、図６Ｂに示されている成熟したＦｖ４３Ｂ配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のＦｖ４３Ｂポリペプチドは、好ましくは、β−キシロシダーゼ活性、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性、又は、β−キシロシダーゼ活性とＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性との両方を有する。
【００７１】
従って、本発明のＦｖ４３Ｂポリペプチドは、好ましくは、配列番号１２のアミノ酸配列に対して、又は、配列番号１２の（ｉ）１７−５７４、（ｉｉ）２７−５７４、（ｉｉｉ）１７−３０３、若しくは、（ｉｖ）２７−３０３の残基に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは、好ましくは、β−キシロシダーゼ活性、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性、又は、β−キシロシダーゼ活性とＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性との両方を有する。
【００７２】
Ｐａ５１Ａ：Ｐａ５１Ａ（配列番号：１４）のアミノ酸配列は図７Ｂ及び図５４に示されている。配列番号１４は未成熟なＰａ５１Ａの配列である。Ｐａ５１Ａは、配列番号１４の残基１〜２０に対応する予想されるシグナル配列を有しており（図７Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号１４の残基２１〜６７６に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想されるＬ−α−アラビノフラノシダーゼ保存ドメインは図７Ｂに太字で示されている。Ｐａ５１Ａは、例えば、人工基質であるｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド及びｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを使用した酵素分析において、β−キシロシダーゼ活性とＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性との両方を有することが示されている。この酵素は、分岐したアラビノキシロオリゴマーからのアラビノースの放出を触媒し、かつ、他のキシロシダーゼ酵素の存在下においてオリゴマー混合物からの増加したキシロース放出を触媒することが示されている。保存されている酸性残基は、Ｅ４３、Ｄ５０、Ｅ２５７、Ｅ２９６、Ｅ３４０、Ｅ３７０、Ｅ４８５及びＥ４９３を含む。本明細書において用いられているように、「Ｐａ５１Ａポリペプチド」は、配列番号１４の残基２１〜６７６における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００又は６５０の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。Ｐａ５１Ａポリペプチドは、天然のＰａ５１Ａと比較して、Ｅ４３、Ｄ５０、Ｅ２５７、Ｅ２９６、Ｅ３４０、Ｅ３７０、Ｅ４８５及びＥ４９３の残基が不変であることが好ましい。Ｐａ５１Ａポリペプチドは、図５４の配列比較に示されているように、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ及びＰｆ５１Ａを含む酵素のグループの間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。Ｐａ５１Ａポリペプチドは、好ましくは、図７Ｂに示されている天然のＰａ５１Ａの予想される保存ドメインを含む。例示的Ｐａ５１Ａポリペプチドは、図７Ｂに示されている成熟したＰａ５１Ａ配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のＰａ５１Ａポリペプチドは、好ましくは、β−キシロシダーゼ活性、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性、又は、β−キシロシダーゼ活性とＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性との両方を有する。
【００７３】
従って、本発明のＰａ５１Ａポリペプチドは、好ましくは、配列番号１４のアミノ酸配列に対して、又は、配列番号１４の（ｉ）２１−６７６、（ｉｉ）２１−６５２、（ｉｉｉ）４６９−６５２、若しくは、（ｉｖ）４６９−６７６の残基に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは、好ましくは、β−キシロシダーゼ活性、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性、又は、β−キシロシダーゼ活性とＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性との両方を有する。
【００７４】
Ｇｚ４３Ａ：Ｇｚ４３Ａ（配列番号：１６）のアミノ酸配列は図８Ｂ及び図５３に示されている。配列番号１６は未成熟なＧｚ４３Ａの配列である。Ｇｚ４３Ａは配列番号１６の残基１〜１８に対応する予想されるシグナル配列を有しており（図８Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号１６の残基１９〜３４０に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインが図８Ｂに太字で示されている。Ｇｚ４３Ａは、例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は、混合及び／若しくは直鎖のキシロオリゴマーを基質として使用した酵素分析において、β−キシロシダーゼ活性を有することが示されている。予想される触媒性残基は、Ｄ３３又はＤ６８のいずれかと、Ｄ１５４と、Ｅ２４３とを含む。本明細書において用いられているように、「Ｇｚ４３Ａポリペプチド」は、配列番号１６の残基１９〜３４０における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０又は３００の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。Ｇｚ４３Ａポリペプチドは、天然のＧｚ４３Ａと比較して、Ｄ３３又はＤ６８のいずれかの残基と、Ｄ１５４の残基と、Ｅ２４３の残基とが不変であることが好ましい。Ｇｚ４３Ａポリペプチドは、Ｇｚ４３Ａと図５３の配列比較中の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個すべての他のアミノ酸配列とを含む酵素のグループの間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。Ｇｚ４３Ａポリペプチドは、好ましくは、図８Ｂに示されている天然のＧｚ４３Ａの予想される保存ドメインを含む。例示的Ｇｚ４３Ａポリペプチドは、図８Ｂに示されている成熟したＧｚ４３Ａ配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のＧｚ４３Ａポリペプチドは好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００７５】
従って、本発明のＧｚ４３Ａポリペプチドは、好ましくは、配列番号１６のアミノ酸配列に対して、又は、配列番号１６の（ｉ）１９−３４０、（ｉｉ）５３−３４０、（ｉｉｉ）１９−３８３、若しくは、（ｉｖ）５３−３８３の残基に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００７６】
Ｆｏ４３Ａ：Ｆｏ４３Ａ（配列番号：１８）のアミノ酸配列は図９Ｂ及び図５３に示されている。配列番号１８は未成熟なＦｏ４３Ａの配列である。Ｆｏ４３Ａは、配列番号１８の残基１〜２０に対応する予想されるシグナル配列を有しており（図９Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号１８の残基２１〜３４８に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインは、図９Ｂに太字で示されている。Ｆｏ４３Ａは、例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、及び／又は、混合直鎖キシロオリゴマーを基質として使用した酵素分析において、β−キシロシダーゼ活性を有することが示されている。予想される触媒性残基は、Ｄ３７又はＤ７２のいずれかと、Ｄ１５９と、Ｅ２５１とを含む。本明細書において用いられているように、「Ｆｏ４３Ａポリペプチド」は、配列番号１８の残基１８〜３４４における少なくとも５０、７５、１００、１２５の、１５０、１７５、２００、２５０又は３００の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。Ｆｏ４３Ａポリペプチドは、天然のＦｏ４３Ａと比較して、Ｄ３７又はＤ７２の残基と、Ｄ１５９の残基と、Ｅ２５１の残基とが不変であることが好ましい。Ｆｏ４３Ａポリペプチドは、Ｆｏ４３Ａと図５３の配列比較中の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個すべての他のアミノ酸配列とを含む酵素のグループの間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。Ｆｏ４３Ａポリペプチドは、好ましくは、図９Ｂに示されている天然のＦｏ４３Ａの予想される保存ドメインを含む。例示的Ｆｏ４３Ａポリペプチドは、図９Ｂに示されている成熟したＦｏ４３Ａ配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のＦｏ４３Ａポリペプチドは好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００７７】
従って、本発明のＦｏ４３Ａポリペプチドは、好ましくは、配列番号１８のアミノ酸配列に対して、又は、配列番号１８の（ｉ）２１−３４１、（ｉｉ）１０７−３４１、（ｉｉｉ）２１−３４８、若しくは、（ｉｖ）１０７−３４８の残基に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００７８】
Ａｆ４３Ａ：Ａｆ４３Ａ（配列番号：２０）のアミノ酸配列が図１０Ｂ及び図５３に示されている。配列番号２０は未成熟なＡｆ４３Ａの配列である。予想される保存ドメインが図１０Ｂに太字で示されている。Ａｆ４３Ａは、例えば、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを基質として使用した酵素分析において、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示されている。Ａｆ４３Ａは、エンドキシラナーゼの作用によってヘミセルロースから放出されるオリゴマーのセットからのアラビノースの放出を触媒することが示されている。予想される触媒性残基は、Ｄ２６又はＤ５８のいずれかと、Ｄ１３９と、Ｅ２２７とを含む。本明細書において用いられているように、「Ａｆ４３Ａポリペプチド」は、配列番号２０の少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０又は３００の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。Ａｆ４３Ａポリペプチドは、天然のＡｆ４３Ａと比較して、Ｄ２６又はＤ５８のいずれかの残基と、Ｄ１３９の残基と、Ｅ２２７の残基とが不変であることが好ましい。Ａｆ４３Ａポリペプチドは、Ａｆ４３Ａと図５３の配列比較中の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個すべての他のアミノ酸配列とを含む酵素のグループの間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。Ａｆ４３Ａポリペプチドは、好ましくは、図１０Ｂに示されている天然のＡｆ４３Ａの予想される保存ドメインを含む。例示的Ａｆ４３Ａポリペプチドは、配列番号２０に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。本発明のＡｆ４３Ａポリペプチドは、好ましくはＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【００７９】
従って、本発明のＡｆ４３Ａポリペプチドは、好ましくは、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、又は、配列番号２０の（ｉ）１５−５５８若しくは（ｉｉ）１５−２９５の残基に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは好ましくはＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【００８０】
Ｐｆ５１Ａ：Ｐｆ５１Ａ（配列番号：２２）のアミノ酸配列が図１１Ｂ及び図５４に示されている。配列番号２２は未成熟なＰｆ５１Ａの配列である。Ｐｆ５１Ａは配列番号２２の残基１〜２０に対応する予想されるシグナル配列を有しており（線は図１１Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号２２の残基２１〜６４２に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想されるＬ−α−アラビノフラノシダーゼ保存ドメインが図１１Ｂに太字で示されている。Ｐｆ５１Ａは、例えば、４−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを基質として使用した酵素分析において、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示されている。Ｐｆ５１Ａは、エンドキシラナーゼの作用によってヘミセルロースから放出されたオリゴマーのセットからのアラビノースの放出を触媒することが示されている。予想される保存された酸性残基は、Ｅ４３、Ｄ５０、Ｅ２４８、Ｅ２８７、Ｅ３３１、Ｅ３６０、Ｅ４７２及びＥ４８０を含む。本明細書において用いられているように、「Ｐｆ５１Ａポリペプチド」は、配列番号２２の残基２１〜６４２における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０又は６００の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。Ｐｆ５１Ａポリペプチドは、天然のＰｆ５１Ａと比較して、Ｅ４３、Ｄ５０、Ｅ２４８、Ｅ２８７、Ｅ３３１、Ｅ３６０、Ｅ４７２及びＥ４８０の残基が不変であることが好ましい。Ｐｆ５１Ａポリペプチドは、図５４の配列比較に示されているように、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ及びＦｖ５１Ａの間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。Ｐｆ５１Ａポリペプチドは、好ましくは図１１Ｂに示されている天然のＰｆ５１Ａの予想される保存ドメインを含む。例示的Ｐｆ５１Ａポリペプチドは、図１１Ｂに示されている成熟したＰｆ５１Ａ配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のＰｆ５１Ａポリペプチドは、好ましくはＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有している。
【００８１】
従って、本発明のＰｆ５１Ａポリペプチドは、好ましくは、配列番号２２のアミノ酸配列に対して、又は、配列番号２２の（ｉ）２１−６３２、（ｉｉ）４６１−６３２、（ｉｉｉ）２１−６４２、若しくは、（ｉｖ）４６１−６４２の残基に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このポリペプチドはＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有している。
【００８２】
ＡｆｕＸｙｎ２：ＡｆｕＸｙｎ２（配列番号：２４）のアミノ酸配列が図１２Ｂ及び図５５Ｂに示されている。配列番号２４は未成熟なＡｆｕＸｙｎ２の配列である。ＡｆｕＸｙｎ２は、配列番号２４の残基１〜１８に対応する予想されるシグナル配列を有しており（線は図１２Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号２４の残基１９〜２２８に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想されるＧＨ１１保存ドメインが図１２Ｂに太字で示されている。ＡｆｕＸｙｎ２は、前処理されたバイオマス又は単離されたヘミセルロースに作用するときに、キシロバイオシダーゼの存在下における増加したキシロースモノマー生成物を触媒する能力を観察することによって間接的に、エンドキシラナーゼ活性を有することが示されている。保存された触媒性残基は、Ｅ１２４、Ｅ１２９及びＥ２１５を含む。本明細書において用いられているように、「ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチド」は、配列番号２４の残基１９〜２２８における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、又は、２００の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、天然のＡｆｕＸｙｎ２と比較して、Ｅ１２４、Ｅ１２９及びＥ２１５の残基が不変であることが好ましい。図５５Ｂの配列比較に示されているように、ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５及びトリコデルマリーゼイＸｙｎ２の間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、好ましくは図１２Ｂに示されている天然のＡｆｕＸｙｎ２の予想される保存ドメインの全体を含む。例示的ＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは、図１２Ｂに示されている成熟したＡｆｕＸｙｎ２配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のＡｆｕＸｙｎ２ポリペプチドは好ましくはキシラナーゼ活性を有する。
【００８３】
ＡｆｕＸｙｎ５：ＡｆｕＸｙｎ５（配列番号：２６）のアミノ酸配列が図１３Ｂ及び図５５Ｂに示されている。配列番号２６は未成熟なＡｆｕＸｙｎ５の配列である。ＡｆｕＸｙｎ５は、配列番号２６の残基１〜１９に対応する予想されるシグナル配列を有しており（線は図１３Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号２６の残基２０〜３１３に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想されるＧＨ１１保存ドメインが図１３Ｂに太字で示されている。ＡｆｕＸｙｎ５は酵素は、前処理されたバイオマス又は単離されたヘミセルロースに作用するときに、キシロバイオシダーゼの存在下における増加したキシロース・モノマー生成物を触媒する能力を観察することによって間接的に、エンドキシラナーゼ活性を有することが示されている。保存された触媒性残基は、Ｅ１１９、Ｅ１２４及びＥ２１０を含む。予想される糖結合モジュールは、Ｃ末端の付近であり、多数の疎水性残基を特徴としており、セリン、トレオニンを多く含むアミノ酸の長い連続物に続いている。この領域が図５５Ｂに下線で示されている。本明細書において用いられているように、「ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチド」は、配列番号２６の残基２０〜３１３における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０又は２７５の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、天然のＡｆｕＸｙｎ５と比較して、Ｅ１１９、Ｅ１２０及びＥ２１０の残基が不変であることが好ましい。図５５Ｂの配列比較に示されているように、ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、ＡｆｕＸｙｎ５、ＡｆｕＸｙｎ２及びトリコデルマリーゼイＸｙｎ２の間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、好ましくは、天然のＡｆｕＸｙｎ５の予想される糖結合モジュールの全体、及び／又は、図１３Ｂに示されている天然のＡｆｕＸｙｎ５の予想される保存ドメインの全体（下線が付されている）を含む。例示的ＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、図１３Ｂに示されている成熟したＡｆｕＸｙｎ５配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、好ましくはキシラナーゼ活性を有する。
【００８４】
Ｆｖ４３Ｄ：Ｆｖ４３Ｄ（配列番号：２８）のアミノ酸配列は図１４Ｂ及び図５３に示されている。配列番号２８は未成熟なＦｖ４３Ｄの配列である。Ｆｖ４３Ｄは、配列番号２８の残基１〜２０に対応する予想されるシグナル配列を有しており（図１４Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号２８の残基２１〜３５０に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインは図１４Ｂに太字で示されている。Ｆｖ４３Ｄは、例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、及び／又は、混合された直鎖のキシロオリゴマーを基質として使用した酵素分析によって、β−キシロシダーゼ活性を有することが示されている。予想される触媒性残基は、Ｄ３７又はＤ７２のいずれかと、Ｄ１５９と、Ｅ２５１とを含む。本明細書において用いられているように、「Ｆｖ４３Ｄポリペプチド」は、配列番号２８の残基２１〜３５０における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００又は３２０の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、天然のＦｖ４３Ｄと比較して、Ｄ３７又はＤ７２のいずれかの残基と、Ｄ１５９の残基と、Ｅ２５１の残基とが不変であることが好ましい。Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、Ｆｖ４３Ｄと、図５３の配列比較中の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個すべての他のアミノ酸配列とを含む酵素のグループの間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、好ましくは図１４Ｂに示されている天然のＦｖ４３Ｄの予想される触媒性ドメインの全体を含む。例示的Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、少なくとも８５％有する配列、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は図１４Ｂに示される成熟したＦｖ４３Ｄ配列に対する１００％の同一性を含む。本発明のＦｖ４３Ｄポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００８５】
従って、本発明のＦｖ４３Ｄポリペプチドは、好ましくは、配列番号２８のアミノ酸配列に対して、又は、配列番号２８の（ｉ）２１−３４１、（ｉｉ）２１−３５０、（ｉｉｉ）１０７−３４１、若しくは、（ｉｖ）１０７−３５０の残基に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００８６】
Ｐｆ４３Ｂ：Ｐｆ４３Ｂ（配列番号：３０）のアミノ酸配列は図１５Ｂ及び図５３に示されている。配列番号３０は未成熟なＰｆ４３Ｂの配列である。Ｐｆ４３Ｂは、配列番号３０の残基１〜２０に対応する予想されるシグナル配列を有しており（線は図１５Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号３０の残基２１〜３２１に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインは図１５Ｂに太字で示されている。保存ドメイン中の保存された酸性残基はＤ３２、Ｄ６１、Ｄ１４８及びＥ２１２を含む。Ｐｆ４３Ｂは、例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、及び／又は、混合した直鎖のキシロオリゴマーを基質として使用した酵素分析において、β−キシロシダーゼ活性を有することが示されている。本明細書において用いられているように、「Ｐｆ４３Ｂポリペプチド」は、配列番号３０の残基２１〜３２１における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０又は２８０の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。Ｐｆ４３Ｂポリペプチドは、天然のＰｆ４３Ｂと比較して、Ｄ３２、Ｄ６１、Ｄ１４８及びＥ２１２の残基が不変であることが好ましい。Ｐｆ４３Ｂポリペプチドは、Ｐｆ４３Ｂと、図５３の配列比較中の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個すべての他のアミノ酸配列とを含む酵素のグループの間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。Ｐｆ４３Ｂポリペプチドは、好ましくは図１５Ｂに示されている天然のＰｆ４３Ｂの予想される保存ドメインを含む。例示的Ｐｆ４３Ｂポリペプチドは、図１５Ｂに示されている成熟したＰｆ４３Ｂ配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のＰｆ４３Ｂポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００８７】
従って、本発明のＰｆ４３Ｂポリペプチドは、好ましくは、配列番号３０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００８８】
Ｆｖ５１Ａ：Ｆｖ５１Ａ（配列番号：３２）のアミノ酸配列は図１６Ｂ及び図５４に示されている。配列番号：３２は未成熟なＦｖ５１Ａの配列である。Ｆｖ５１Ａは、配列番号３２の残基１〜１９に対応する予想されるシグナル配列を有しており（図１６Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号３２の残基２０〜６６０に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想されるＬ−α−アラビノフラノシダーゼ保存ドメインが図１６Ｂに太字で示されている。Ｆｖ５１Ａは、例えば、４−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを基質として使用した酵素分析において、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示されている。Ｆｖ５１Ａは、エンドキシラナーゼの作用によってヘミセルロースから放出されたオリゴマーのセットからのアラビノースの放出を触媒することが示されている。保存されている残基は、Ｅ４２、Ｄ４９、Ｅ２４７、Ｅ２８６、Ｅ３３０、Ｅ３５９、Ｅ４７９及びＥ４８７を含む。本明細書において用いられているように、「Ｆｖ５１Ａポリペプチド」は、配列番号３２の残基２０〜６６０における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００又は６２５の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。Ｆｖ５１Ａポリペプチドは、天然のＦｖ５１Ａと比較して、Ｅ４２の残基、Ｄ４９の残基、Ｅ２４７の残基、Ｅ２８６の残基、Ｅ３３０の残基、Ｅ３５９の残基、Ｅ４７９の残基及びＥ４８７の残基が不変であることが好ましい。図５４の配列比較に示されているように、Ｆｖ５１Ａポリペプチドは、Ｆｖ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ及びＰｆ５１Ａの間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。Ｆｖ５１Ａポリペプチドは、好ましくは図１６Ｂに示されている天然のＦｖ５１Ａの予想される保存ドメインを含む。例示的Ｆｖ５１Ａポリペプチドは、図１６Ｂに示されている成熟したＦｖ５１Ａ配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のＦｖ５１Ａポリペプチドは、好ましくはＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【００８９】
従って、本発明のＦｖ５１Ａポリペプチドは、好ましくは、配列番号３２のアミノ酸配列に対して、又は、配列番号３２の（ｉ）２０−６６０、（ｉｉ）２０−６４５、（ｉｉｉ）４５０−６４５、若しくは、（ｉｖ）４５０−６６０の残基に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは、好ましくはＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。
【００９０】
Ｘｙｎ３：トリコデルマリーゼイＸｙｎ３（配列番号：４２）のアミノ酸配列は、図２１Ｂに示されている。配列番号：４２は未成熟なトリコデルマリーゼイＸｙｎ３の配列である。トリコデルマリーゼイＸｙｎ３は、配列番号４２の残基１〜１６に対応する予想されるシグナル配列を有しており（図２１Ｂに下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号４２の残基１７〜３４７に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインが図２１Ｂに太字で示されている。トリコデルマリーゼイＸｙｎ３は、この酵素が前処理されたバイオマス又は単離されたヘミセルロースに作用するときに、キシロバイオシダーゼの存在下における増加したキシロースモノマー生成を触媒する能力を観察することによって間接的に、エンドキシラナーゼ活性を有することが示されている。保存されている触媒性残基は、他のＧＨ１０ファミリー酵素であるストレプトミセス・ハルステディイ（Streptomyces halstedii）から得たＸｙｓ１デルタとの配列比較によって決定されるように、Ｅ９１、Ｅ１７６、Ｅ１８０、Ｅ１９５及びＥ２８２を含む(Canals et al., 2003, Act Crystalogr. D Biol. 59:1447-53)。この酵素は、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３に対して３３％の配列同一性を有する。本明細書において用いられているように、「トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチド」は、配列番号４２の残基１７〜３４７における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０又は３００の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチドは、天然のトリコデルマリーゼイＸｙｎ３と比較して、Ｅ９１、Ｅ１７６、Ｅ１８０、Ｅ１９５及びＥ２８２の残基が不変であることが好ましい。トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチドは、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３及びＸｙｓ１デルタの間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変
であることが好ましい。トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチドは、好ましくは図２１Ｂに示されている天然のトリコデルマリーゼイＸｙｎ３の予想される保存ドメインの全体を含む。例示的トリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチドは、図２１Ｂに示されている成熟したトリコデルマリーゼイＸｙｎ３配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のトリコデルマリーゼイＸｙｎ３ポリペプチドは、好ましくはキシラナーゼ活性を有する。
【００９１】
Ｘｙｎ２：トリコデルマリーゼイＸｙｎ２（配列番号：４３）のアミノ酸配列は、図２２及び図５５Ｂに示されている。配列番号４３は未成熟なトリコデルマリーゼイＸｙｎ２の配列である。トリコデルマリーゼイＸｙｎ２は、配列番号４３の残基１〜３３に対応する予想されるプレプロペプチド配列を有しており（図２２に下線で示されている）、位置１６と位置１７との間の予想されるシグナル配列の開裂によって、プロペプチドが与えられると予想される。このプロペプチドは、位置３２と位置３３との間をケキシン様プロテアーゼで処理されることによって、配列番号４３の残基３３〜２２２に対応する配列を有する成熟タンパクを生成する。予想される保存ドメインが図２２に太字で示されている。トリコデルマリーゼイＸｙｎ２は、その酵素が前処理されたバイオマス又は単離されたヘミセルロースに作用するときに、キシロバイオシダーゼの存在下で増加したキシロース・モノマー製品を触媒するその能力を観察することによって間接的に、エンドキシラナーゼ活性を有することが示されている。保存されている酸性残基は、Ｅ１１８、Ｅ１２３及びＥ２０９を含む。本明細書において用いられているように、「トリコデルマリーゼイＸｙｎ２ポリペプチド」は、配列番号４３の残基３３〜２２２における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０又は１７５の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。トリコデルマリーゼイＸｙｎ２ポリペプチドは、天然のトリコデルマリーゼイＸｙｎ２と比較して、Ｅ１１８、Ｅ１２３及びＥ２０９の残基が不変であることが好ましい。図５５Ｂの配列比較において示されているように、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２ポリペプチドは、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２及びＡｆｕＸｙｎ５の間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。トリコデルマリーゼイＸｙｎ２ポリペプチドは、好ましくは図２２に示されている天然のトリコデルマリーゼイＸｙｎ２の予想される保存ドメインの全体を含む。例示的トリコデルマリーゼイＸｙｎ２ポリペプチドは、図２２に示されている成熟したトリコデルマリーゼイＸｙｎ２配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のトリコデルマリーゼイＸｙｎ２ポリペプチドは、好ましくはキシラナーゼ活性を有する。
【００９２】
Ｂｘｌ１：トリコデルマリーゼイＢｘｌ１（配列番号：４４）のアミノ酸配列は、図２３及び図６４に示されている。配列番号４４は未成熟なトリコデルマリーゼイＢｘｌ１の配列である。トリコデルマリーゼイＢｘｌ１は、配列番号４４の残基１〜１８に対応する予想されるシグナル配列を有しており（図２３に下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号４４の残基１９〜７９７に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインが図２３に太字で示されている。トリコデルマリーゼイＢｘｌ１は、例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、及び／又は、混合した直鎖のキシロオリゴマーを基質として使用した酵素分析において、βキシロシダーゼ活性を有することが示されている。保存された酸性残基はＥ１９３、Ｅ２３４及びＤ３１０を含む。本明細書において用いられているように、「トリコデルマリーゼイＢｘｌ１ポリペプチド」は、配列番号４４の残基１７〜７９７における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００又は７５０の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。トリコデルマリーゼイＢｘｌ１ポリペプチドは、天然のトリコデルマリーゼイＢｘｌ１と比較して、Ｅ１９３、Ｅ２３４及びＤ３１０の残基が不変であることが好ましい。図６４の配列比較において示されているように、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１ポリペプチドは、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１、Ｆｖ３Ａ及びトリコデルマリーゼイＢｇｌ１の間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。トリコデルマリーゼイＢｘｌ１ポリペプチドは、好ましくは図２３に示されている天然のトリコデルマリーゼイＢｘｌ１の予想される保存ドメインの全体を含む。例示的トリコデルマリーゼイＢｘｌ１ポリペプチドは、図２３に示されている成熟したトリコデルマリーゼイＢｘｌ１配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のトリコデルマリーゼイＢｘｌ１ポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００９３】
従って、本発明のトリコデルマリーゼイＢｘｌ１ポリペプチドは、好ましくは配列番号４４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。このポリペプチドは、好ましくはβ−キシロシダーゼ活性を有する。
【００９４】
Ｂｇｌ１：トリコデルマリーゼイＢｇｌ１（配列番号：４５）のアミノ酸配列は、図２４及び図６４に示されている。トリコデルマリーゼイＢｇｌ１は、配列番号４５の残基１〜１９に対応する予想されるシグナル配列を有しており（図２４に下線で示されている）、このシグナル配列の開裂によって、配列番号４５の残基２０〜７４４に対応する配列を有する成熟タンパクが与えられると予想される。予想される保存ドメインが図２４に太字で示されている。トリコデルマリーゼイＢｇｌ１は、パラ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドの加水分解を触媒してパラ−ニトロフェノールを生成する能力、及び、セロビオースの加水分解を触媒する能力を観察することによって、β−グルコシダーゼ活性を有することが示されている。保存された酸性残基はＤ１６４、Ｅ１９７及びＤ２６７を含む。本明細書において用いられているように、「トリコデルマリーゼイＢｇｌ１ポリペプチド」は、配列番号４５の残基２０〜７４４における少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０又は７８０の連続したアミノ酸残基に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を表す。トリコデルマリーゼイＢｇｌ１ポリペプチドは、天然のＢｇｌ１と比較して、Ｄ１６４、Ｅ１９７及びＤ２６７の残基が不変であることが好ましい。図６４の配列比較に示されているように、トリコデルマリーゼイＢｇｌ１ポリペプチドは、トリコデルマリーゼイＢｇｌ１、Ｆｖ３Ａ及びトリコデルマリーゼイＢｘｌ１の間で保存されているアミノ酸残基の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％が不変であることが好ましい。トリコデルマリーゼイＢｇｌ１ポリペプチドは、好ましくは図２４に示されている天然のトリコデルマリーゼイＢｇｌ１の予想される保存ドメインの全体を含む。例示的トリコデルマリーゼイＢｇｌ１ポリペプチドは、図２４に示されている成熟したトリコデルマリーゼイＢｇｌ１の配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。本発明のトリコデルマリーゼイＢｇｌ１ポリペプチドは、好ましくはβ−グルコシダーゼ活性を有する。
【００９５】
従って、本開示は、以下に記載されているように、単離された、合成された、又は、組み換えた多数のヘミセルロース分解性ポリペプチド又はその変異体を提供する。
（１）（ｉ）配列番号２の２４〜７６６の位置、（ｉｉ）配列番号２の７３〜３２１の位置、（ｉｉｉ）配列番号２の７３〜３９４の位置、（ｉｖ）配列番号２の３９５〜６２２の位置、（ｖ）配列番号２の２４〜６２２の位置、又は、（ｉｖ）配列番号２の７３〜６２２の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、好ましくはα−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド。
（２）（ｉ）配列番号４の２１〜４４５の位置、（ｉｉ）配列番号４の２１〜３０１の位置、（ｉｉｉ）配列番号４の２１〜３２３の位置、（ｉｖ）配列番号４の２１〜４４４の位置、（ｖ）配列番号４の３０２〜４４４の位置、（ｖｉ）配列番号４の３０２〜４４５の位置、（ｖｉｉ）配列番号４の３２４〜４４４の位置、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４の３２４〜４４５の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、好ましくはα−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド。
（３）（ｉ）配列番号６１９〜５３０の位置、（ｉｉ）配列番号６の２９〜５３０の位置、（ｉｉｉ）配列番号６の１９〜３００の位置、又は、（ｉｖ）配列番号６の２９〜３００の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、好ましくはα−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド。
（４）（ｉ）配列番号８の２０〜４３９の位置、（ｉｉ）配列番号８の２０〜２９１の位置、（ｉｉｉ）配列番号８の１４５〜２９１の位置、又は、（ｉｖ）配列番号８の１４５〜４３９の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、好ましくはα−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド。
（５）（ｉ）配列番号１０の位置２３〜４４９の位置、（ｉｉ）配列番号１０の２３〜３０２の位置、（ｉｉｉ）配列番号１０の２３〜３２０の位置、（ｉｖ）配列番号１０の２３〜４４８の位置、（ｖ）配列番号１０の３０３〜４４８の位置、（ｖｉ）配列番号１０の３０３〜４４９の位置、（ｖｉｉ）配列番号１０の３２１〜４４８の位置、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号１０の３２１〜４４９の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、好ましくはα−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド。
（６）（ｉ）配列番号１２の１７〜５７４の位置、（ｉｉ）配列番号１２の２７〜５７４の位置、（ｉｉｉ）配列番号１２の１７〜３０３の位置、又は、（ｉｖ）配列番号１２の２７〜３０３の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、好ましくは、α−キシロシダーゼ活性とＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性との両方を有するポリペプチド。
（７）（ｉ）配列番号１４の位置２１〜６７６の位置、（ｉｉ）配列番号１４の２１〜６５２の位置、（ｉｉｉ）配列番号１４の４６９〜６５２の位置、又は、（ｉｖ）配列番号１４の４６９〜６７６の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、好ましくは、α−キシロシダーゼ活性とＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性との両方を有するポリペプチド。
（８）（ｉ）配列番号１６の１９〜３４０の位置、（ｉｉ）配列番号１６の５３〜３４０の位置、（ｉｉｉ）配列番号１６の１９〜３８３の位置、又は、（ｉｖ）配列番号１６の５３〜３８３の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、好ましくはα−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド。
（９）（ｉ）配列番号１８の２１〜３４１の位置、（ｉｉ）配列番号１８の１０７〜３４１の位置、（ｉｉｉ）配列番号１８の２１〜３４８の位置、又は、（ｉｖ）配列番号１８の１０７〜３４８の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、好ましくはα−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド。
（１０）（ｉ）配列番号２０の１５〜５５８の位置又は（ｉｉ）配列番号２０の１５〜２９５の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、好ましくはＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド。
（１１）（ｉ）配列番号２２の位置２１〜６３２の位置、（ｉｉ）配列番号２２の４６１〜６３２の位置、（ｉｉｉ）配列番号２２の２１〜６４２の位置、又は、（ｉｖ）配列番号２２の４６１〜６４２の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、好ましくはＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド。
（１２）（ｉ）配列番号２８の２１〜３４１の位置、（ｉｉ）配列番号２８の２１〜３５０の位置、（ｉｉｉ）配列番号２８の１０７〜３４１の位置、又は、（ｉｖ）配列番号２８の１０７〜３５０の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、α−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド。
（１３）（ｉ）配列番号３２の２０〜６６０の位置、（ｉｉ）配列番号３２の２０〜６４５の位置、（ｉｉｉ）配列番号３２の４５０〜６４５の位置、又は、（ｉｖ）配列番号３２の４５０〜６６０の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、好ましくはＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド。
【００９６】
本開示は、上記ポリペプチドの１つ以上を多量に含む組成物（例えば、セルラーゼ組成物、又は、酵素混合物／酵素組成物）又は培養液をさらに提供する。したがって、酵素混合物／酵素組成物は天然に存在しない組成物である。セルラーゼ組成物は、例えば、トリコデルマ・セルラーゼ組成物のような糸状菌セルラーゼ組成物であり得る。上記培養液は、例えば、トリコデルマ（Trichoderma）、フミコラ(Humicola)、フザリウム(Fusarium)、アスペルギルス(Aspergillus)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、セファロスポリウム(Cephalosporium)、アクリャ(Achlya)、ポドスポラ(Podospora)、エンドチア(Endothia)、ムコール(Mucor)、コクリオボルス(cochliobolus)、ピリキュラリア(Pyricularia)又はクリソスポリウム(Chrysosporium)の培養液等のように、糸状菌の培養液であり得る。詳細には、上記培養液は、例えば、トリコデルマリーゼイ(Trichoderma reesei)等のトリコデルマ種の１つであってもよいし、又は、ペニシリウム・フニクロスム(Penicillium funiculosum)等のペニシリウム種の１つであってもよい。上記培養液は、好ましくは無細胞培養液であり得る。
【００９７】
さらに、以下の開示において、上記ポリペプチドを発現するように遺伝子を組み換えた宿主細胞を提供する。上記宿主細胞は、例えば、トリコデルマ(Trichoderma)細胞、フミコラ(Humicola)細胞、フザリウム(Fusarium)細胞、アスペルギルス(Aspergillus)細胞、ニューロスポラ(Neurospora)細胞、ペニシリウム(Penicillium)細胞、セファロスポリウム(Cephalosporium)細胞、アクリャ(Achlya)細胞、ポドスポラ(Podospora)細胞、エンドチア(Endothia)細胞、ムコール(Mucor)細胞、コクリオボルス(cochliobolus)細胞、ピリキュラリア(Pyricularia)細胞、又は、クリソスポリウム(Chrysosporium)細胞等の糸状菌宿主細胞であってもよい。詳細には、上記宿主細胞は、例えば、トリコデルマ種の細胞（トリコデルマリーゼイ細胞等）、ペニシリウム細胞（ペニシリウム・フニクロスム(Penicillium funiculosum)細胞等）、アスペルギルス細胞（アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)又はアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）等の細胞）、又は、フザリウム細胞（フザリウム・バーティシリオイデス(Fusarium verticillioides)、又は、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)の細胞等）であり得る。
【００９８】
６．１．１  融合タンパク
本開示は、さらに、１つ又はそれ以上の融合断片に結合させた本開示のタンパクのドメインを含む融合タンパクを提供する。この融合断片は、一般的には、そのタンパクとは起源が異なるものである（すなわち、本開示のタンパクとは異なる源に由来する）。限定されるものではないが、適切な融合断片には、タンパクの安定性を高めることができ、他の望ましい生物活性を提供することができ、及び／又は、タンパクの精製（例えば、親和性クロマトグラフィーによるもの）を促進することができる断片が含まれる。適切な融合断片は、所望の機能（例えば、安定性、溶解度、作用若しくは生物活性を増大させる機能、又は、タンパクの精製を簡単にする機能）を有するあらゆる大きさのドメインであり得る。融合断片は、本開示のタンパクのドメインのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に結合させることができる。この融合断片は開裂を受けやすい。開裂に対する感受性を有することによっていくつかのメリットがあり、例えば、対象タンパクの直接的な回収が可能になる。融合タンパクは、好ましくは、タンパク又はそのドメインのカルボキシル末端又はアミノ末端のいずれかに結合させた融合断片、又は、カルボキシル末端及びアミノ末端の両方に結合させた融合断片を含むタンパクをコードする融合核酸をトランスフェクトした組み換え細胞を培養することによって生産される。
【００９９】
従って、本開示のタンパクは、さらに、遺伝子融合（例えば、組み換えタンパクの過剰発現された、可溶性の、かつ、活性な形態）、変異させた遺伝子（例えば、遺伝子の転写及び翻訳を促進するコドン修飾を有する遺伝子）、及び、短縮された遺伝子（例えば、シグナル配列が除去された又は異種起源のシグナル配列で置換された遺伝子）の発現産物を含む。
【０１００】
不溶性基質を用いるグリコシルヒドロラーゼは、多くの場合、モジュラー酵素である。これらの酵素は、通常、１つ又はそれ以上の非触媒性の糖結合ドメイン（ＣＢＭ）に付加された触媒性モジュールを含む。実際に、糖結合モジュールは、グリコシルヒドロラーゼのそのターゲット基質である多糖類との相互作用を促進すると考えられる。したがって、本開示は、例えば、「挿入された」異種起源の糖結合モジュールの結果として複数の基質を有するキメラ酵素を含む、変化した基質特異性を有するキメラ酵素を提供する。本開示のキメラ酵素の異種起源の糖結合モジュールは、それらが、同様にグリコシルヒドロラーゼとは異なる種に由来するもの又は同種のものであり得る触媒性モジュール又は触媒性ドメイン（例えば、活性部位の「触媒性ドメイン」）に付加されるようにして、別々の部分からなるように設計されたものであってもよい。
【０１０１】
したがって、本開示は、糖結合モジュール／触媒性ドメインのモジュールからなる、又は、その糖結合モジュール／触媒性ドメインのモジュールを含むペプチド及びポリペプチドを提供する。この糖結合モジュール／触媒性ドメインのモジュールは、キメラ（異種起源）の糖結合モジュール／触媒性ドメインのペアを形成するように、一致するように組み合わされ又は連結されたものであり得る。したがって、キメラポリペプチド／キメラペプチドは、対象酵素の性能を向上又は変化させるために使用することができる。従って、本開示は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、４４又は４５の酵素の少なくとも１つの糖結合モジュールを含むキメラ酵素を提供する。本開示のポリペプチドは、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、４４又は４５のグリコシルヒドロラーゼ配列の触媒性ドメイン及び／又は糖結合モジュールを含むアミノ酸配列を含む。したがって、本開示のポリペプチドは、好ましくは、２つ以上の異なるタンパクから得た機能ドメインを含む融合タンパク（例えば、あるタンパクから得た糖結合モジュールを、他のタンパクから得た触媒性ドメインに連結したもの）であってもよい。
【０１０２】
本開示のポリペプチドは、好ましくは「実質的に純粋な」形態で調製され及び／又は使用することができる。例えば、本開示のポリペプチドは、バッファ又は溶液等の他の成分を含む所定の組成物中の総タンパクの少なくとも約８０重量％（例えば、少なくとも約８５重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％又は９９重量％）を構成する。また、本開示のポリペプチドは、好ましくは、組み換え培養液（例えば、糸状菌培養液）中で調製され及び／又は使用することができる。この組み換え培養液は、天然に存在しないものであってもよい。例えば、この培養液は、本開示の異種起源のポリペプチドを発現するように操作された組み換え宿主細胞によって、又は、内因性発現レベルよりも多い又は少ない量で（例えば、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍若しくはそれ以上の量で、又は、内因性発現レベルよりも低い量で）本開示の内因性ポリペプチドを発現するように操作された組み換え宿主細胞によって生産することができる。更に、本開示のポリペプチドは、好ましくは、所望の比率で本開示の複数のポリペプチドを発現するように操作された「合成」宿主細胞株によって生産される組み換え培養液として調製され及び／又は使用することができる。望ましい例示的比率は、例えば、セクション６．３．４に記載されている。
【０１０３】
６．２  核酸及び宿主細胞
本開示は、例えば、上記セクション６．１に記載されているもののような、本開示のポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【０１０４】
本開示は、少なくとも約１０個（例えば、少なくともおおよそ、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、又は、２０００）のヌクレオチドの領域にわたって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４６、４７、４８、４９又は５０の核酸に対して、少なくとも約７０％、例えば、少なくともおおよそ、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、完全（１００％）の配列同一性を有する核酸配列を含む単離された、合成された又は組み換えられた核酸を提供する。本開示は、さらに、ヘミセルロース分解活性（例えば、キシラナーゼ活性、β−キシロシダーゼ活性、及び／又は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性）を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【０１０５】
本開示の核酸は、さらに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、４４又は４５の配列やこれらの部分配列（例えば、保存ドメイン又は糖結合ドメイン（糖結合モジュール）及びそれらの変異体）を有する酵素をコードする単離された核酸、合成の核酸又は組み換えの核酸を含む。本開示の核酸は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４３、４４又は４５のタンパクの成熟部分をコードすることができる。
【０１０６】
本開示は、特に、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｆｖ５１Ａ、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１、又は、トリコデルマリーゼイＢｇｌ１のポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【０１０７】
例えば、本開示は、以下のペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
（１）（ｉ）配列番号２の２４〜７６６の位置、（ｉｉ）配列番号２の７３〜３２１の位置、（ｉｉｉ）配列番号２の７３〜３９４の位置、（ｉｖ）配列番号２の３９５〜６２２の位置、（ｖ）配列番号２の２４〜６２２の位置、又は、（ｉｖ）配列番号２の７３〜６２２の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（２）（ｉ）配列番号４の２１〜４４５の位置、（ｉｉ）配列番号４の２１〜３０１の位置、（ｉｉｉ）配列番号４の２１〜３２３の位置、（ｉｖ）配列番号４の２１〜４４４の位置、（ｖ）配列番号４の３０２〜４４４の位置、（ｖｉ）配列番号４の３０２〜４４５の位置、（ｖｉｉ）配列番号４の３２４〜４４４の位置、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号４の３２４〜４４５の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（３）（ｉ）配列番号６の１９〜５３０の位置、（ｉｉ）配列番号６の２９〜５３０の位置、（ｉｉｉ）配列番号６の１９〜３００の位置、又は、（ｉｖ）配列番号６の２９〜３００の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（４）（ｉ）配列番号８の２０〜４３９の位置、（ｉｉ）配列番号８の２０〜２９１の位置、（ｉｉｉ）配列番号８の１４５〜２９１の位置、又は、（ｉｖ）配列番号８の１４５〜４３９の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（５）（ｉ）配列番号１０の２３〜４４９の位置、（ｉｉ）配列番号１０の２３〜３０２の位置、（ｉｉｉ）配列番号１０の２３〜３２０の位置、（ｉｖ）配列番号１０の２３〜４４８の位置、（ｖ）配列番号１０の３０３〜４４８の位置、（ｖｉ）配列番号１０の３０３〜４４９の位置、（ｖｉｉ）配列番号１０の３２１〜４４８の位置、又は、（ｖｉｉｉ）配列番号１０の３２１〜４４９の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（６）（ｉ）配列番号１２の１７〜５７４の位置、（ｉｉ）配列番号１２の２７〜５７４の位置、（ｉｉｉ）配列番号１２の１７〜３０３の位置、又は、（ｉｖ）配列番号１２の２７〜３０３の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（７）（ｉ）配列番号１４の２１〜６７６の位置、（ｉｉ）配列番号１４の２１〜６５２の位置、（ｉｉｉ）配列番号１４の４６９〜６５２の位置、又は、（ｉｖ）配列番号１４の４６９〜６７６の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（８）（ｉ）配列番号１６の１９〜３４０の位置、（ｉｉ）配列番号１６の５３〜３４０の位置、（ｉｉｉ）配列番号１６の１９〜３８３の位置、又は、（ｉｖ）配列番号１６の５３〜３８３の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（９）（ｉ）配列番号１８の２１〜３４１の位置、（ｉｉ）配列番号１８の１０７〜３４１の位置、（ｉｉｉ）配列番号１８の２１〜３４８の位置、又は、（ｉｖ）配列番号１８の１０７〜３４８の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（１０）（ｉ）配列番号２０の１５〜５５８の位置又は（ｉｉ）配列番号２０の１５〜２９５の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（１１）（ｉ）配列番号２２の２１〜６３２の位置、（ｉｉ）配列番号２２の４６１〜６３２の位置、（ｉｉｉ）配列番号２２の２１〜６４２の位置、又は、（ｉｖ）配列番号２２の４６１〜６４２の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（１２）（ｉ）配列番号２８の２１〜３４１の位置、（ｉｉ）配列番号２８の２１〜３５０の位置、（ｉｉｉ）配列番号２８の１０７〜３４１の位置、又は、（ｉｖ）配列番号２８の１０７〜３５０の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（１３）（ｉ）配列番号３２の２０〜６６０の位置、（ｉｉ）配列番号３２の２０〜６４５の位置、（ｉｉｉ）配列番号３２の４５０〜６４５の位置、又は、（ｉｖ）配列番号３２の４５０〜６６０の位置に対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
【０１０８】
さらに下記を提供する。
（１）配列番号１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、それ以上）の配列同一性を有する核酸、又は、配列番号１の相補体若しくはその断片に対して高い厳格性条件下においてハイブリダイズすることができる核酸
（２）配列番号３に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、それ以上）の配列同一性を有する核酸、又は、配列番号３の相補体若しくはその断片に対して高い厳格性条件下においてハイブリダイズすることができる核酸
（３）配列番号５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、それ以上）の配列同一性を有する核酸、又は、配列番号５の相補体若しくはその断片に対して高い厳格性条件下においてハイブリダイズすることができる核酸
（４）配列番号７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、それ以上）の配列同一性を有する核酸、又は、配列番号７の相補体若しくはその断片に対して高い厳格性条件下においてハイブリダイズすることができる核酸
（５）配列番号９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、それ以上）の配列同一性を有する核酸、又は、配列番号９の相補体若しくはその断片に対して高い厳格性条件下においてハイブリダイズすることができる核酸
（６）配列番号１１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、それ以上）の配列同一性を有する核酸、又は、配列番号１１の相補体若しくはその断片に対して高い厳格性条件下においてハイブリダイズすることができる核酸
（７）配列番号１３に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、それ以上）の配列同一性を有する核酸、又は、配列番号１３の相補体若しくはその断片に対して高い厳格性条件下においてハイブリダイズすることができる核酸
（８）配列番号１５に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、それ以上）の配列同一性を有する核酸、又は、配列番号１５の相補体若しくはその断片に対して高い厳格性条件下においてハイブリダイズすることができる核酸
（９）配列番号１７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、それ以上）の配列同一性を有する核酸、又は、配列番号１７の相補体若しくはその断片に対して高い厳格性条件下においてハイブリダイズすることができる核酸
（１０）配列番号１９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、それ以上）の配列同一性を有する核酸、又は、配列番号１９の相補体若しくはその断片に対して高い厳格性条件下においてハイブリダイズすることができる核酸
（１１）配列番号２１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、それ以上）の配列同一性を有する核酸、又は、配列番号２１の相補体若しくはその断片に対して高い厳格性条件下においてハイブリダイズすることができる核酸
（１２）配列番号２７に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、それ以上）の配列同一性を有する核酸、又は、配列番号２７の相補体若しくはその断片に対して高い厳格性条件下においてハイブリダイズすることができる核酸
（１３）配列番号３１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は、それ以上）の配列同一性を有する核酸、又は、配列番号３１の相補体若しくはその断片に対して高い厳格性条件下においてハイブリダイズすることができる核酸
【０１０９】
本開示は、さらに、上記核酸を含む発現カセット及び／又はベクターを提供する。
【０１１０】
好ましくは、本開示の酵素をコードする核酸は、作用できるようにプロモータに連結される。特に、糸状菌宿主における組み換え発現が望まれる場合には、プロモータが糸状菌プロモータであり得る。上記核酸は、例えば、異種起源のプロモータによって制御されてもよい。上記核酸は、恒常的なプロモータ又は誘導可能なプロモータの制御下で発現させることができる。以下に限定されるものではないが、使用可能なプロモータの例には、セルラーゼプロモータ、キシラナーゼプロモータ、１８１８プロモータ（トリコデルマのＥＳＴマッピングによって高度に発現されるタンパクであることが以前から判明している）が含まれる。例えば、上記プロモータは、好ましくは、セロビオヒドロラーゼ・プロモータ、エンドグルカナーゼ・プロモータ、又は、β−グルコシダーゼ・プロモータであってもよい。特に好適なプロモータは、例えば、トリコデルマ・リーゼイ・セロビオヒドロラーゼ・プロモータ、エンドグルカナーゼ・プロモータ、又は、β−グルコシダーゼ・プロモータであり得る。例えば、上記プロモータは、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）プロモータである。上記プロモータの非限的的な例には、ｃｂｈ１プロモータ、ｃｂｈ２プロモータ、ｅｇｌ１プロモータ、ｅｇｌ２プロモータ、ｅｇｌ３プロモータ、ｅｇｌ４プロモータ、ｅｇｌ５プロモータ、ｐｋｉ１プロモータ、ｇｐｄ１プロモータ、ｘｙｎ１プロモータ、又は、ｘｙｎ２プロモータが含まれる。プロモータの非限定的なさらなる例には、トリコデルマ・リーゼイのｃｂｈ１プロモータ、ｃｂｈ２プロモータ、ｅｇｌ１プロモータ、ｅｇｌ２プロモータ、ｅｇｌ３プロモータ、ｅｇｌ４プロモータ、ｅｇｌ５プロモータ、ｐｋｉ１プロモータ、ｇｐｄ１プロモータ、ｘｙｎ１プロモータ、又は、ｘｙｎ２プロモータが含まれる。
【０１１１】
本開示は、本開示の１つ又はそれ以上の酵素を発現するように操作された宿主細胞を提供する。好適な宿主細胞には、あらゆる微生物の細胞（例えば、細菌、原生生物、藻類、真菌（例えば、酵母又は糸状菌）又は他の微生物の細胞）が含まれる。上記宿主細胞は、好ましくは細菌、酵母又は糸状菌の細胞である。
【０１１２】
以下に限定されるものではないが、細菌種の好適な宿主細胞には、エシェリキア(Escherichia)、バチルス(Bacillus)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、シュードモナス(Pseudomonas)、及び、ストレプトミセス（Streptomyces）の細胞が含まれる。
【０１１３】
以下に限定されるものではないが、細菌種の好適な細胞には、大腸菌、バチルス・サチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、ラクトバチラス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、シュードモナス・アエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、及び、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)の細胞が含まれる。
【０１１４】
以下に限定されるものではないが、酵母種の好適な宿主細胞には、サッカロミケス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、カンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)、ピチア(Pichia,)、クリベロミセス(Kluyveromyces)、及び、ファフィア(Phaffia)の細胞を含む。
【０１１５】
以下に限定されるものではないが、酵母種の好適な細胞には、サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、ハンセヌラ・ポリモーファ(Hansenula polymorpha)、ピキチア・パストリス(Pichia pastoris)、Ｐ．カナデンシス(P. canadensis)、クリベロミセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、及び、ファフィア・ロドジマ(Phaffia rhodozyma)の細胞が含まれる。
【０１１６】
糸状菌の好適な宿主細胞には、下位分類の真菌類のすべてのフィラメント形態が含まれる。以下に限定されるものではないが、糸状菌種の好適な細胞には、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillus)、アウレオバシジウム(Aureobasidium)、ブジェルカンデラ(Bjerkandera)、セリポリオプシス(Ceriporiopsis)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、コプリナス(Coprinus)、コリオラス(Coriolus)、コリナスクス(Corynascus)、ケトミウム(Chaetomium)、クリプトコックス(Cryptococcus)、フィロバシジウム(Filobasidium)、フザリウム(Fusarium)、ジベレラ(Gibberella)、フミコラ(Humicola)、ヒポクレア(Hypocrea)、マグナポルテ(Magnaporthe)、ムコール(Mucor)、ミセリオフトラ(Myceliophthora)、ムコール(Mucor)、ネオカリマスティクス(Neocallimastix)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペシロミセス(Paecilomyces)、ペニシリウム(Penicillium)、ファネロカエテ(Phanerochaete)、フレビア(Phlebia)、ピロミセス(Piromyces)、プルーロタス(Pleurotus)、スキタリジウム(Scytalidium)、シゾフィラム(Schizophyllum)、スポロトリクム(Sporotrichum)、タラロミセス(Talaromyces)、サーモアスカス(Thermoascus)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラディウム(Tolypocladium)、トラメテス(Trametes)、及び、トリコデルマ(Trichoderma)の細胞が含まれる。好適な細胞には、これらの糸状菌種の様々なアナモルフ形態及びテレオモルフ形態の細胞が含まれ得る。
【０１１７】
以下に限定されるものではないが、糸状菌種の好適な細胞には、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・フォエティダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Chrysosporium lucknowense)、フザリウム・バクトリディオイデス（Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis)、フザリウム・クロックウェレンス（Fusarium crookwellense)、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポルム（Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum)、フザリウム・レティキュラツム（Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum)、フザリウム・サンブシヌム（Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロスム（Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコセシオイデス（Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ヴェネナツム（Fusarium venenatum)、ブジェルカンデラ・アダスタ（Bjerkandera adusta)、セリポリオプシス・アネイニナ（Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・アネイニナ（ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea)、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens)、セリポリオプシス・パノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta)、セリポリオプシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa)、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa)、セリポリオプシス・サバーミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora)、コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus)、コリオラス・ヒルスタス(Coriolus hirsutus)、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei)、ミセリオフトラ・サーモフィリア(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa)、ニューロスポラ・インターメディア（Neurospora intermedia)、ペニシリウム・パルロゼラム（Penicillium purpurogenum)、ペニシリウム・カネスセンス（Penicillium canescens)、ペニシリウム・ソリツム（Penicillium solitum)、ペニシリウム・フニクロスム（Penicillium funiculosum)、ファネロキーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium)、フレビア・ラジアータ（Phlebia radiate)、プロレタス・エリンギ（Pleurotus eryngii)、タラロミセス・フラバス（Talaromyces flavus)、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris)、トラメテス・ビローサ（Trametes villosa)、トラメテス・バーシカラー（Trametes versicolor)、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ（Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンジブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、及び、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride)の細胞が含まれる。
【０１１８】
本開示は、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、及び、Ｆｖ５１Ａの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は、５つ以上のポリペプチドを発現するように操作された組み換え宿主細胞をさらに提供する。上記組み換え宿主細胞は、例えば、組み換えトリコデルマリーゼイ宿主細胞である。特定の例において、本開示は、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、及び、Ｆｖ５１Ａの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上又は５つ以上のポリペプチドを発現するように操作された、組み換えトリコデルマリーゼイ等の、組み換え真菌を提供する。本開示は、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ及びＦｖ５１Ａの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上のポリペプチドを発現するように操作された組み換えトリコデルマリーゼイ宿主細胞を提供する。
【０１１９】
本開示は、少なくとも１つのキシラナーゼ、少なくとも１つのβ−キシロシダーゼ、及び、１つのＬ−α−アラビノフラノシダーゼを発現するように組み換えた宿主細胞（例えば、組み換え真菌宿主細胞又は組み換え糸状菌）を提供する。本開示は、さらに、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１、及び／又は、トリコデルマリーゼイＢｇｌ１の１つ又はそれ以上に加えて、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、及び、Ｆｖ５１Ａの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上のポリペプチドを発現するように操作された組み換え宿主細胞（例えば、組み換えトリコデルマリーゼイ等のような組み換え真菌宿主細胞又は組み換えの糸状菌）を提供する。前記組み換え宿主細胞は、例えば、トリコデルマリーゼイ宿主細胞である。前記組み換え真菌は、例えば、組み換えたトリコデルマリーゼイである。
【０１２０】
本開示は、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１、及び／又は、トリコデルマリーゼイＢｇｌ１の１つ又はそれ以上に加えて、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ｂ、及び、Ｆｖ５１Ａの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上のポリペプチドを発現するように操作されたトリコデルマリーゼイ宿主細胞又は組み換えトリコデルマリーゼイ真菌を提供する。
【０１２１】
本開示は、さらに、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、トリコデルマリーゼイＢｇｌ１、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、及び、Ｆｖ５１Ａのポリペプチドを発現するように組み換えられた組み換え宿主細胞（例えば、組み換え真菌宿主細胞又は組み換え微生物（例えば、組み換えトリコデルマリーゼイ等の糸状菌））を提供する。例えば、前記組み換え宿主細胞は、好ましくはトリコデルマリーゼイ宿主細胞である。前記組み換え真菌は、好ましくは組み換えトリコデルマリーゼイである。本開示は、例えば、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、トリコデルマリーゼイＢｇｌ１、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ及びＦｖ５１Ａのポリペプチドを発現するように組み替えられたトリコデルマリーゼイ宿主細胞を提供する。
【０１２２】
さらに、本開示は、糖化に好適な比率で好適な酵素を含む酵素混合物を発現するように操作された組み換え宿主細胞又は組み換え真菌を提供する。前記組み換え宿主細胞は、例えば、真菌宿主細胞である。前記組み換え真菌は、例えば、組み換えトリコデルマリーゼイである。好適な酵素混合物中に存在する例示的な酵素比率／量は、以下のセクション６．３．４に記載されている。
【０１２３】
本開示は、本開示の核酸又は本開示の発現カセットを含む遺伝子導入植物をさらに提供する。遺伝子導入植物は、例えば、穀物、トウモロコシ、ポテト、トマト、コムギ、脂肪種子、菜種、ダイズ、コメ、オオムギ又はタバコであってもよい。
【０１２４】
６．３  糖化用酵素混合物
本開示は、リグノセルロース材料を分解することができる酵素混合物／酵素組成物を含む組成物を提供する。そのような複数酵素の混合物／組成物は、本開示の１つ又はそれ以上のさらなるポリペプチドと組み合わせて、又は、他の微生物、植物又は生物から得た１つ又はそれ以上の酵素と組み合わせて、本開示の少なくとも１つのポリペプチドを含む。相乗的な酵素の組み合わせ及び関連した方法が意図されている。本開示は、特定のリグノセルロース材料を分解するための混合物／組成物中に含まれる酵素の最適な比率を同定する方法を含む。これらの方法は、例えば、所定のリグノセルロース基質をその構成糖に効率的に変換するための最適な酵素混合物／酵素組成物及び比率を同定する試験が含まれる。下記の例には、リグノセルロース材料を分解するための酵素の最適な比率及び混合物／組成物を同定するために使用可能な分析が含まれる。
【０１２５】
６．３．１  バックグラウンド
高等植物の細胞壁は、多様な糖ポリマー（ＣＰ）成分で構成されている。これらの糖ポリマーは、共有結合手段及び非共有結合手段を通じて相互に作用して、固い細胞壁を形成し、植物における膨圧に耐えるのに必要な構造の統合性を提供する。植物にみられる主要な糖ポリマーはセルロースであり、細胞壁の構造骨格を形成する。セルロース生合成中に、ポリ−β−１，４−Ｄ−グルコースの鎖は、水素結合及び疎水的相互作用を通じて自己会合し、セルロースミクロフィブリルを形成する。セルロースミクロフィブリルは、さらに自己会合することによってさらに大きいフィブリルを形成する。セルロースミクロフィブリルは、多くの場合は構造的に不規則であり、結晶度を変化させる部位を含んでいる。セルロースフィブリルの結晶度は、水素結合がその成分セルロース鎖の間でどのくらい隙間なく並んでいるかに応じて変化する。より少なく並んだ結合を有する領域、したがって、より近接容易なグルコース鎖はアモルファス領域と呼ばれる。
【０１２６】
セルロースからグルコースへの解重合の一般的モデルには、最低３つの異なる酵素活性が含まれる。エンドグルカナーゼは、そのままのセルロース鎖よりエキソグルカナーゼ活性の作用を受けやすい近接可能な末端の数を増加させるプロセスにおいて、セルロース鎖をより短い鎖に内部で開裂する。これらのエキソグルカナーゼ（例えば、セロビオヒドロラーゼ）は、還元末端又は非還元末端のいずれかに対して特異的であり、ほとんどの場合はグルコースの二量体であるセロビオースを放出させる。次に、蓄積したセロビオースは、セロビアーゼ（例えば、β−１，４−グルコシダーゼ）による開裂を受けてグルコースになる。
【０１２７】
セルロースは、アンヒドログルコースのみを含む。対照的に、ヘミセルロースは、多数の異なる糖モノマーを含んでいる。ヘミセルロース中の糖モノマーは、グルコースに加えて、例えば、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース及びアラビノースを含んでいることがある。ヘミセルロースは、大部分のＤ−ペントース糖と、場合によっては少量のＬ−糖を含んでいる。キシロースが一般的に最大量で存在しているが、マンヌロン酸及びガラクツロン酸も存在する傾向がある。ヘミセルロースは、キシラン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、グルコマンナン及びキシログルカンを含む。
【０１２８】
本開示の酵素及び複数酵素組成物は、例えば、キシラン、アラビノキシラン、及び、キシラン含有基質若しくはアラビノキシラン含有基質を含むヘミセルロース材料の糖化に有用である。アラビノキシランは、キシロースとアラビノースとからなる多糖であって、Ｌ−α−アラビノフラノース残基が、β−１，４−結合キシロースポリマー骨格に対して分岐点として結合した多糖である。大部分のバイオマス源は、かなり複雑であり、他の成分の中でも特に、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、リグニン、タンパク及び灰分を含んでいる。
【０１２９】
従って、ある態様において、本開示は、最も効率的な態様でバイオマスを発酵性糖に分解するために、共同して作用するときに広範な又は多様な基質特異性与える酵素を含む酵素混合物／酵素組成物を提供する。本発明の複数酵素の混合物／組成物の一例は、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、及び、選択的に、アクセサリタンパクの混合物である。この酵素の混合物／酵素組成物は、好ましくは天然に存在しない組成物である。
【０１３０】
従って、本開示は、キシラン加水分解酵素、ヘミセルロース加水分解酵素、及び／又は、セルロース加水分解酵素の混合物を含む酵素混合物／酵素組成物（製造の産物を含む）であって、グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ、キシラナーゼ、β−グルコシダーゼ、及び、β−キシロシダーゼを含むセルラーゼの少なくとも１つ、これらのいくつか、又は、これらのすべてを含むものを提供する。好ましくは、本開示の酵素混合物／酵素組成物のそれぞれは、本開示の少なくとも１つの酵素を含む。本開示は、さらに、天然に存在しない組成物である酵素混合物／酵素組成物を提供する。本明細書において用いられているように、「酵素混合物／酵素組成物」という用語は以下のものを表す。
（１）成分酵素を組み合わせることによって作成した組成物であって、培養液の形態、又は、部分的若しくは完全に単離若しくは精製された組成物
（２）１つ以上の成分酵素を発現するように修飾された生物によって生産された組成物であって、ある実施形態において、１つ又はそれ以上の成分酵素を発現させるために使用される生物は、１つ又はそれ以上の遺伝子を欠損するように修飾されたものであってもよく、ある他の実施形態において、１つ又はそれ以上の成分酵素を発現させるために使用される生物は、キシラン加水分解、ヘミセルロース加水分解及び／又はセルロース加水分解に影響を与えるタンパクをさらに含んでいてもよい組成物
（３）糖化反応又は醗酵反応中に成分酵素を同時に、別々に又は連続的に混合することによって作成した組成物
（４）例えば、糖化反応又は醗酵反応において、その場で生産した酵素混合物
（５）上記（１）〜（４）のいずれか又はすべてに従って生産した組成物
【０１３１】
本明細書で使用されている「培養液」という用語は、回収及び／又は精製をまったく行っていないか又は回収及び／又は精製を最小限で行った発酵によって生産された酵素調製物を表す。例えば、微生物培養は、タンパク合成（例えば、酵素の発現）を可能にするために炭素制限条件下でインキュベートされて、飽和に達するまで増殖させる。その後、酵素が細胞培養培地中に分泌されると、その培養液を使用することができる。本開示の培養液は、発酵の終了時に得られる発酵材料の分画されていない成分又は分画された成分を含み得る。例えば、本発明の培養液は、分画されておらず、微生物細胞（例えば、糸状菌細胞）が発酵プロセスを受けた後に与えられる使用済みの培地及び細胞破片を含む。この培養液は、好ましくは、使用済みの細胞培養溶剤と、細胞外酵素と、生存した又は死滅した微生物細胞とを含む。あるいは、微生物細胞を除去するために、この培養液を分画することができる。それらの場合において、その培養液は、例えば、使用済みの細胞培養溶剤と細胞外酵素とを含んでいる可能性がある。
【０１３２】
好適な複数酵素の混合物／組成物を生産するために、本明細書に明記されている酵素のいずれもは、本明細書に記載されている酵素と、又は、他の利用可能な好適な酵素の１つ又はそれ以上と組み合わされてもよい。本開示は、以下に一覧されている特定の例示的な組み合わせに限定又は制限されない。
【０１３３】
６．３．２  バイオマス
本開示は、本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物を使用して、バイオマスを糖化する方法及びプロセスを提供する。「バイオマス」という用語は、本明細書において使用されているように、セルロース及び／又はヘミセルロース（選択的に、さらにリグノセルロースバイオマス材料中のリグニン）を含むあらゆる組成物を表す。限定されるものではないが、本明細書において用いられているように、バイオマスには、種、穀類、塊茎、食品プロセス又は工業プロセスの植物廃棄物若しくは植物副産物（例えば茎）、トウモロコシ（例えば、トウモロコシ穂軸、まぐさ等を含む）、草（例えば、ソルガストラムヌタンス(Sorghastrum nutans)等のインディアングラス（Indian grass）、木材（例えば、木材チップ、加工廃棄物を含む）、紙、パルプ、再生紙（例えば、新聞、印刷紙等）が含まれる。限定されないが、他のバイオマス材料には、ポテト、ダイズ（例えば、ナタネ）、オオムギ、ライムギ、オートムギ、コムギ、ビート及び、サトウキビバガスが含まれる。
【０１３４】
本開示は、バイオマス材料（例えば、キシラン、ヘミセルロース、セルロース及び／又は発酵性糖を含む材料）を含む組成物を、本開示のポリペプチドに、又は、本開示の核酸によってコードされたポリペプチドに、又は、酵素混合物／酵素組成物のいずれか１つに、又は、本開示の製造の生成物に接触させるステップを含む糖化の方法を提供する。糖化されたバイオマス（例えば、本開示の酵素によって処理されたリグノセルロース材料）は、例えば、微生物発酵及び／又は化学合成等のプロセスによって、多数のバイオ生成物にすることができる。本明細書において用いられているように、「微生物発酵」は、好適な条件下で発酵微生物を増殖させてそれを回収するプロセスを表す。発酵微生物は、バイオ生成物の生産のための望ましい発酵プロセスにおいて使用するのに好適なあらゆる微生物であり得る。限定されるものではないが、好適な発酵微生物には、糸状菌、酵母及びバクテリアが含まれる。糖化されたバイオマスは、例えば、発酵及び／又は化学合成によって、燃料（例えば、バイオエタノール、バイオブタノール、バイオメタノール、バイオプロパノール、バイオディーゼル、ジェット燃料のようなバイオ燃料等）にすることができる。糖化されたバイオマスは、例えば、発酵及び／又は化学合成によって、汎用化学製品（例えば、アスコルビン酸、イソプレン、１，３−プロパンジオール）、脂質、アミノ酸、タンパク及び酵素にすることができる。
【０１３５】
６．３．３．  前処理
糖化を行う前に、バイオマス（例えばリグノセルロース材料）は、キシラン材料、ヘミセルロース材料、セルロース材料、及び／又は、リグニン材料が酵素に近接できるように又は酵素の作用を受けやすくし、したがって、本開示の酵素及び／又は酵素混合物／酵素組成物による加水分解を受けやすくするために、１つ又はそれ以上の前処理ステップに供されることが好ましい。
【０１３６】
例示的実施形態において、前処理は、反応容器内で強酸及び金属塩の希い溶液を含む触媒にバイオマス材料を暴露させるステップを必要とする。バイオマス材料は、例えば、生の材料であってもよいし、又は、乾燥した材料であってもよい。この前処理は、セルロース加水分解の活性化エネルギ又は温度を低下させ、結果的に発酵性糖の収率を高くすることができる。例えば、米国特許第６６６０５０６号及び第６４２３１４５号を参照されたい。
【０１３７】
他の例示的な前処理方法は、セルロースからグルコースへの著しい解重合を達成せずに、主としてヘミセルロースの解重合を達成するように選択した温度及び圧力において、水性媒体における第１の加水分解ステップにバイオマス材料を供することによって、バイオマスを加水分解するステップを必要とする。このステップによって、液体の水相がヘミセルロースの解重合から得られた溶解した単糖を含み、固体相がセルロース及びリグニンを含むスラリーが与えられる。次に、このスラリーは、セルロースの大部分が解重合されて、溶解した又は可溶性のセルロース解重合生成物を含む液体の水相を与えることができる条件下における第２の加水分解ステップに供される。例えば、米国特許第５５３６３２５号を参照されたい。
【０１３８】
さらなる例示的方法は、約０．４％〜約２％の強酸を使用した希酸加水分解の１つ又はそれ以上の段階によってバイオマス材料を処理し、その後で、酸加水分解された材料の未反応固体リグノセルロース成分をアルカリ脱リグニン処理するステップを含む。例えば、米国特許第６４０９８４１号を参照されたい。
【０１３９】
他の例示的な前処理方法は、予備加水分解反応装置においてバイオマス（例えば、リグノセルロース材料）を予備加水分解するステップと、固体のリグノセルロース材料に酸性の液体を加えることによって混合物を作成するステップと、前記混合物を反応温度に加熱するステップと、リグノセルロース材料を、リグノセルロース材料に由来するリグニンの少なくとも約２０％を含む可溶性部分と、セルロースを含む固体画分とに分画するのに充分な時間にわたって反応温度を維持するステップと、反応温度又はその近傍において固体画分から可溶性部分を分離して前記可溶性部分を除去するステップと、前記可溶性部分を回収するステップとを含む。固体画分中のセルロースを、酵素消化をより受けやすい状態にする。例えば、米国特許第５７０５３６９号を参照されたい。
【０１４０】
さらなる前処理方法は、過酸化水素Ｈ２Ｏ２の使用を含んでいてもよい。Gould, 1984, Biotech, and Bioengr.26:46-52を参照されたい。
【０１４１】
前処理は、バイオマス材料を、理論量の水酸化ナトリウム及び理論量の水酸化アンモニウムに非常に低い濃度において接触させるステップを含んでいてもよい。Teixeira et al.,1999, Appl.Biochem.and Biotech.77-79:19-34を参照されたい。
【０１４２】
前処理は、穏やかな温度、圧力及びｐＨにおいて、ｐＨが約９〜約１４の化学物質（例えば、炭酸ナトリウム又は水酸化カリウム等の塩基）に、リグノセルロースを接触させるステップを含んでいてもよい。ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００４／０８１１８５を参照されたい。好ましい前処理方法においては、例えば、アンモニアを使用する。そのような前処理方法は、バイオマス材料を、高固形分の条件下で低濃度のアンモニアに暴露させるステップを含む。例えば、米国特許公開公報第２００７００３１９１８号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０６１１０９０１号を参照されたい。
【０１４３】
６．３．４  例示的な酵素混合物
本開示は、本開示の１つ又はそれ以上の酵素を含む酵素混合物／酵素組成物を提供する。酵素混合物／酵素組成物の１つ又はそれ以上の酵素は、組み換え宿主細胞又は組み換え生物によって生産することができる。酵素混合物／酵素組成物は、天然に存在しない組成物であることが好ましい。
【０１４４】
本開示の酵素混合物／酵素組成物は、好ましくは、β−キシロシダーゼ活性を有する第１のポリペプチドを含んでいてもよく、さらに、β−キシロシダーゼ活性を有する１つ、２つ、３つ又は４つ以上の第２のポリペプチド、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する１つ又はそれ以上のポリペプチド、キシラナーゼ活性を有する１つ又はそれ以上のポリペプチド、及び、セルラーゼ活性を有する１つ又はそれ以上のポリペプチドを含む。β−キシロシダーゼ活性を有する前記第１のポリペプチドは、例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、又は、Ｆｖ３９Ａのポリペプチドである。β−キシロシダーゼ活性を有する前記第２のポリペプチドは、存在する場合には、例えば、β−キシロシダーゼ活性を有する前記第１のポリペプチドとは異なるものであり、好ましくは、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ３９Ａ、又は、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１のポリペプチドである。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する前記１つ又はそれ以上のポリペプチドのそれぞれは、存在する場合には、例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ４３Ｂ又はＦｖ５１Ａのポリペプチドである。キシラナーゼ活性を有する前記１つ又はそれ以上のポリペプチドのそれぞれは、例えば、トリコデルマリーゼイＸｙｎ、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２又はＡｆｕＸｙｎ５である。セルラーゼ活性を有する前記１つ又はそれ以上のポリペプチドのそれぞれは、存在する場合には、例えば、エンドグルカナーゼ（例えば、トリコデルマリーゼイＥＧ１又はＥＧ２）、セロビオヒドロラーゼ（例えば、トリコデルマリーゼイＣＢＨ１又はＣＢＨ２）、β−グルコシダーゼ（例えば、トリコデルマリーゼイＢｇｌ１）である。
【０１４５】
本開示の他の酵素混合物／酵素組成物は、好ましくは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する第１のポリペプチドを含んでいてもよく、さらに、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有する１つ、２つ、３つ又は４つの第２ポリペプチド、β−キシロシダーゼ活性を有する１つ又はそれ以上のポリペプチド、キシラナーゼ活性を有する１つ又はそれ以上のポリペプチド、又は、セルラーゼ活性を有する１つ又はそれ以上のポリペプチドを含む。第１のＬ−α−アラビノフラノシダーゼは、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ又はＦｖ５１Ａのポリペプチドである。第２のＬ−α−アラビノフラノシダーゼは、第１のＬ−α−アラビノフラノシダーゼとは異なるものであり、例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ４３Ｂ又はＦｖ５１Ａポリペプチドである。前記１つ又はそれ以上のβ−キシロシダーゼのそれぞれは、例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ３９Ａ、又は、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１のポリペプチドである。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上のキシラナーゼのそれぞれは、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ２又はＡｆｕＸｙｎ５のポリペプチドである。特定の実施形態において、１つ又はそれ以上のセルラーゼのそれぞれは、独立して、エンドグルカナーゼ（例えば、トリコデルマリーゼイＥＧ１又はＥＧ２のポリペプチド）、セロビオヒドロラーゼ（例えば、トリコデルマリーゼイＣＢＨ１又はＣＢＨ２ポリペプチド）、β−グルコシダーゼ（例えば、トリコデルマリーゼイＢｇｌ１ポリペプチド）である。
【０１４６】
キシラナーゼ：キシラナーゼは、好ましくは、本開示の酵素混合物／酵素組成物中の酵素の約０．０５重量％から約７５重量％（すなわち、このキシラナーゼのパーセンテージは、組成物中のすべてのタンパクの重量に対する重量パーセントである）を構成するか、又は、相対重量基準の約０．０５重量％から約７５重量％（すなわち、このキシラナーゼのパーセンテージは、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セルラーゼ、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ及びアクセサリタンパクの合計重量に対する重量パーセントである）を構成する。任意のペアのタンパクの互いに対する比率は、本開示の酵素混合物／酵素組成物において容易に算出することができる。本明細書に開示されている重量パーセントから導き出すことができる任意の重量比で酵素を含む混合物／組成物が意図されている。キシラナーゼの含有量は、下限が酵素混合物／酵素組成物中の酵素の全重量の０．０５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％又は５０重量％であり、また、上限が、酵素混合物／酵素組成物中の酵素の全重量の１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％又は７５重量％である範囲内であってもよい。酵素混合物又は酵素組成物中の１つ又はそれ以上のキシラナーゼは、例えば、酵素混合物／酵素組成物中の全酵素の５重量％〜２０重量％、１０重量％〜１５重量％、又は、１５重量％〜２５重量％に相当することができる。本開示の例示的な酵素混合物／酵素組成物に含ませるのに好適なキシラナーゼは以下のセクション６．３．６に記載されている。
【０１４７】
Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ：Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは、好ましくは、所定の酵素混合物／酵素組成物中の全酵素の全重量の約０．０５重量％から約７５重量％（すなわち、このＬ−α−アラビノフラノシダーゼのパーセンテージは、混合物／組成物中のすべてのタンパクの重量に対する重量パーセントである）、又は、相対重量基準の約０．０５重量％から約７５重量％（すなわち、このＬ−α−アラビノフラノシダーゼの前記パーセンテージは、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セルラーゼ、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ及びアクセサリタンパクの合計重量に対する重量パーセントである）を構成する。任意のペアのタンパクの互いに対する比率は、本開示の酵素混合物／酵素組成物において容易に算出することができる。本明細書に開示されている重量パーセントから導き出すことができる任意の重量比で酵素を含む混合物／組成物が意図されている。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼの含有量は、下限が、混合物／組成物中の酵素の全重量の０．０５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％又は５０重量％であり、また、上限が、混合物／組成物中の酵素の全重量の１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％又は７５重量％である範囲内であってもよい。例えば、１つ又はそれ以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼは、好ましくは、前記混合物／組成物中の酵素の全重量の２重量％〜２５重量％、５重量％〜２０重量％、又は、５重量％〜１０重量％に相当することができる。本開示の酵素混合物／酵素組成物に含ませるのに適した例示的なＬ−α−アラビノフラノシダーゼは、以下のセクション６．３．８に記載されている。
【０１４８】
β−キシロシダーゼ：β−キシロシダーゼは、好ましくは、酵素混合物／酵素組成物中の酵素の全重量の約０．０５重量％から約７５重量％を構成する。任意のペアのタンパクの互いに対する比率は、本開示の酵素混合物／酵素組成物において容易に算出することができる。本明細書に開示されている重量パーセントから導き出すことができる任意の重量比で酵素を含む混合物／組成物が意図されている。β−キシロシダーゼの含有量は、下限が、混合物／組成物中の酵素の全重量の約０．０５重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％又は５０重量％であり、また、上限が、混合物／組成物中の酵素の全重量の約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％又は７５重量％である範囲内であってもよい。例えば、β−キシロシダーゼは、混合物／組成物中の酵素の全重量の約０．０５重量％から約７５重量％に相当することができる。また、β−キシロシダーゼは、混合物／組成物中の酵素の全重量の０．０５重量％〜約７０重量％、約１重量％〜約６５重量％、約１重量％〜約６０重量％、約２重量％〜約５５重量％、約３重量％〜約５０重量％、約４重量％〜約４５重量％、又は、約５重量％〜約４０重量％に相当することができる。さらに別の例において、β−キシロシダーゼは、好ましくは、混合物／組成物中の酵素の全重量の２重量％〜３０重量％、１０重量％〜２０重量％、又は、５重量％〜１０重量％に相当する。好適な例示的β−キシロシダーゼは以下のセクション６．３．７に記載されている。
【０１４９】
セルラーゼ：セルラーゼは、好ましくは、酵素混合物／酵素組成物中の酵素の全重量の約０．０５重量％から約９０重量％を構成する。任意のペアのタンパクの互いに対する比率は、本開示の酵素混合物／酵素組成物において容易に算出することができる。本明細書に開示されている重量パーセントから導き出すことができる任意の重量比で酵素を含む混合物／組成物が意図されている。セルラーゼの含有量は、下限が、混合物／組成物中の酵素の全重量の０．０５重量％、５重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、混合物／組成物における酵素の全重量の７０重量％及び上限は、約２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％又は９０重量％である範囲内であってもよい。例えば、セルラーゼは、好ましくは、混合物／組成物中の酵素の全重量の３０重量％〜８０重量％、５０重量％〜７０重量％、又は、４０重量％〜６０重量％に相当する。好適な例示的セルラーゼは以下のセクション６．３．５に記載されている。本開示の酵素混合物／酵素組成物におけるセルラーゼ成分は、カルコフロール分析によって決定したときに、リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）１グラム当たりにタンパク１ｍｇ当たりで、少なくとも０．００５の生産率を達成できることが望ましい。例えば、本開示の混合物／組成物におけるセルラーゼ成分は、ＰＡＳＣ１グラム当たりタンパク１ｍｇ当たりで一定の生成率を達成することができ、その範囲の下限は、おおよそ、０．００５、０．０１、０．０１５、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７５又は０．１であり、また、その範囲の上限は、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６又は０．７である。本開示の混合物／組成物におけるセルラーゼ成分は、カルコフロール分析によって決定したときに、ＰＡＳＣ１グラム当たりタンパク１ｍｇ当たりで、例えば、０．００００５−０．０００１、０．０００５−０．００１、０．００１−０．００５、０．００５−０．０３、０．０１−０．０６、０．０２−０．０４、０．０１−０．０３、０．０２−０．０５、０．０２−０．０４、０．０１−０．０５、０．０１５−０．０３５又は０．０１５−０．０７５の生産率を達成することができる。セルラーゼは、例えば、全セルラーゼであってもよい。セルラーゼは、例えば、好ましくは、β−グルコシダーゼを多量に含むものであってもよい。
【０１５０】
アクセサリタンパク：前記酵素混合物／酵素組成物は、好ましくは、１つ又はそれ以上のアクセサリタンパクをさらに含んでいてもよい。酵素混合物／酵素組成物のアクセサリタンパクの含有量は、酵素混合物／酵素組成物中のタンパクの全重量の約０重量％〜約６０重量％であってもよい。任意のペアのタンパクの互いに対する比率は、本開示の酵素混合物／酵素組成物において容易に算出することができる。本明細書に開示されている重量パーセントから導き出すことができる任意の重量比で酵素を含む混合物／組成物が意図されている。アクセサリタンパクの含有量は、下限が、酵素混合物／酵素組成物中のタンパクの全重量の０重量％、１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、１０重量％、１２重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％又は３５重量％であり、また、上限が、酵素混合物／酵素組成物中のタンパクの全重量の２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１３重量％、１４重量％、１５重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％又は６０重量％である範囲内であってもよい。例えば、アクセサリタンパクは、好ましくは、酵素混合物／酵素組成物において、０重量％〜２重量％、５重量％〜１０重量％、２０重量％〜５０重量％、又は、２重量％〜５重量％に相当することができる。本開示の酵素混合物／酵素組成物に含ませるのに適したアクセサリタンパクは、以下のセクション６．３．９に記載されている。
【０１５１】
本開示は、下記（１）〜（５）を含むリグノセルロース糖化用の第１の酵素混合物／酵素組成物を提供する。
（１）約３０重量％〜約８０重量％（例えば、３０重量％〜８０重量％、３５重量％〜７５重量％、４０重量％〜７０重量％、４０重量％〜６０重量％、５０重量％〜７０重量％等）のセルラーゼ、例えば、全セルラーゼ、又は、β−グルコシダーゼを多量に含む全セルラーゼ
（２）約３重量％〜約５０重量％（例えば、５重量％〜４０重量％、１０重量％〜３０重量％、５重量％〜２０重量％、１０重量％〜１５重量％、１５重量％〜２５重量％等）のキシラナーゼ（例えば、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物）
（３）約２重量％〜約４０重量％（例えば、２重量％〜３５重量％、５重量％〜３０重量％、１０重量％〜２５重量％、２重量％〜３０重量％、１０重量％〜２０重量％、５重量％〜１０重量％等）のβ−キシロシダーゼ（例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物）
（４）約２重量％〜約４０重量％（例えば、２重量％〜３５重量％、５重量％〜３０重量％、１０重量％〜２５重量％、２重量％〜２５重量％、５重量％〜２０重量％、５重量％〜１０重量％等）のＬ−α−アラビノフラノシダーゼ（例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｐｆ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物）
（５）約０重量％〜約５０重量％（２重量％〜４０重量％、５重量％〜３０重量％、１０重量％〜２５重量％、０重量％〜２重量％、５重量％〜１０重量％、２０重量％〜５０重量％、２重量％〜５重量％など）のアクセサリタンパク。
【０１５２】
本開示は、下記（１）〜（５）を含むリグノセルロース糖化用の第２の酵素混合物／酵素組成物を提供する。
（１）約３０重量％〜約８０重量％（例えば、３０重量％〜８０重量％、３５重量％〜７５重量％、４０重量％〜７０重量％、４０重量％〜６０重量％、５０重量％〜７０重量％等）のセルラーゼ（例えば、全セルラーゼ、又は、β−グルコシダーゼを多量に含む全セルラーゼ）、又は、約２重量％〜約１０重量％（例えば、２重量％〜８重量％、４重量％〜６重量％、２重量％〜４重量％、６重量％〜８重量％、８重量％〜１０重量％、２重量％〜１０重量％等）のβ−グルコシダーゼ（例えば、トリコデルマリーゼイＢｇｌ１）
（２）約３重量％〜約５０重量％（例えば、５重量％〜４０重量％、１０重量％〜３０重量％、５重量％〜２０重量％、１０重量％〜１５重量％、１５重量％〜２５重量％等）のキシラナーゼ（例えば、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物）
（３）約２重量％〜約４０重量％（例えば、２重量％〜３５重量％、５重量％〜３０重量％、１０重量％〜２５重量％、２重量％〜３０重量％、１０重量％〜２０重量％、５重量％〜１０重量％等）の少なくとも２つのβ−キシロシダーゼであって、その少なくとも１つのβ−キシロシダーゼがグループ１から選択され、その少なくとも１つのβ−キシロシダーゼがグループ２から選択され、前記グループ１が、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ又はこれらの混合物であり、前記グループ２が、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物であるもの
（４）約２重量％〜約２５重量％（例えば、２重量％〜２５重量％、５重量％〜２０重量％、５重量％〜１０重量％等）のＬ−α−アラビノフラノシダーゼ（例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｐｆ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物）
（５）約０重量％〜約５０重量％（２重量％〜４０重量％、５重量％〜３０重量％、１０重量％〜２５重量％、０重量％〜２重量％、５重量％〜１０重量％、２０重量％〜５０重量％、２重量％〜５重量％など）のアクセサリタンパク
【０１５３】
本開示は、下記（１）及び（２）を含むリグノセルロース糖化用の第３の酵素混合物／酵素組成物を提供する。
（１）約３重量％〜約５０重量％（例えば、５重量％〜４０重量％、１０重量％〜３０重量％、５重量％〜２０重量％、１０重量％〜１５重量％、１５重量％〜２５重量％など）のキシラナーゼ（例えば、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物）
（２）約２重量％〜４０重量％（例えば、２重量％〜３５重量％、５重量％〜３０重量％、１０重量％〜２５重量％、２重量％〜３０重量％、１０重量％〜２０重量％、５重量％〜１０重量％など）の少なくとも２つのβ−キシロシダーゼであって、その少なくとも１つのβ−キシロシダーゼがグループ１から選択され、その少なくとも１つのβ−キシロシダーゼがグループ２から選択され、前記グループ１が、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、又は、これらの混合物であり、前記グループ２が、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物であるもの
【０１５４】
本開示は、下記（１）〜（３）を含むリグノセルロース糖化用の第４の酵素混合物／酵素組成物を提供する。
（１）約５重量％〜約２５重量％（例えば、２重量％〜２５重量％、５重量％〜２０重量％、５重量％〜１０重量％など）のキシラナーゼ（例えば、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物）
（２）約２重量％〜約３０重量％（例えば、２重量％〜３０重量％、１０重量％〜２０重量％、５重量％〜１０重量％など）のβ−キシロシダーゼ（例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物
（３）約２重量％〜約５０重量％（例えば、２重量％〜５重量％、５重量％〜４５重量％、１０重量％〜４０重量％、１５重量％〜３０重量％、１０重量％〜２５重量％、５重量％〜２０重量％、１５重量％〜４０重量％など）のβ−グルコシダーゼ（例えば、トリコデルマリーゼイＢｇｌ１）
【０１５５】
本開示は、下記（１）及び（２）を含むリグノセルロース糖化用の第５の酵素混合物／酵素組成物を提供する。
（１）約５重量％〜約２５重量％（例えば、２重量％〜２５重量％、５重量％〜２０重量％、５重量％〜１０重量％など）のキシラナーゼ（例えば、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物）
（２）約２重量％〜約３０重量％（例えば、２重量％〜３０重量％、１０重量％〜２０重量％、５重量％〜１０重量％など）のβ−キシロシダーゼ（例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物
【０１５６】
本開示は、下記（１）〜（４）を含むリグノセルロース糖化用の第６の酵素混合物／酵素組成物を提供する。
（１）約２重量％〜約５０重量％（例えば、２重量％〜５重量％、５重量％〜４５重量％、１０重量％〜４０重量％、１５重量％〜３０重量％、１０重量％〜２５重量％、５重量％〜２０重量％、１５重量％〜４０重量％など）のβ−グルコシダーゼ（例えば、Ｂｇｌ１）
（２）約３重量％〜約５０重量％（例えば、５重量％〜４０重量％、１０重量％〜３０重量％、５重量％〜２０重量％、１０重量％〜１５重量％、１５重量％〜２５重量％など）のキシラナーゼ（例えば、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物）
（３）約２重量％〜４０重量％（例えば、２重量％〜３５重量％、５重量％〜３０重量％、１０重量％〜２５重量％、２重量％〜３０重量％、１０重量％〜２０重量％、５重量％〜１０重量％など）のβ−キシロシダーゼ（例えば、Ｆｖ３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物
（４）約２重量％〜約２５重量％（例えば、２重量％〜２５重量％、５重量％〜２０重量％、５重量％〜１０重量％など）のＬ−α−アラビノフラノシダーゼ（例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｐｆ５１Ａ、Ｆｖ５１Ａ、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物
【０１５７】
このリグノセルロース糖化用の第６の酵素混合物／酵素組成物は、例えば、約２重量％〜約４０重量％の少なくとも２つのβ−キシロシダーゼを含んでいてもよく、その少なくとも１つのβ−キシロシダーゼがグループ１から選択され、その少なくとも１つのβ−キシロシダーゼがグループ２から選択され、前記グループ１が、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ又はこれらの混合物であり、前記グループ２が、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ、トリコデルマリーゼイＢｘｌ１、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、又は、これらの酵素の２つ以上の混合物であってもよい。
【０１５８】
本開示の酵素混合物／酵素組成物がグループ１及びグループ２の両方を含む場合には、グループ２のβ−キシロシダーゼに対するグループ１のβ−キシロシダーゼの比率は、好ましくは、１０：１〜１：１０である。例えば、この比率は、好ましくは、１：２〜２：１、２：５〜５：２、３：８〜８：３、１：４〜４：１、１：５〜５：１、１：７〜７：１、又は、これらの端点のあらゆる組み合わせの間の範囲（例えば、１：１０〜２：１、４：１〜２：５、３：８〜５：１など）である。好ましい比率の特別な例はおよそ１：１である。
【０１５９】
本開示の酵素混合物／酵素組成物がβ−キシロシダーゼとしてＦｖ４３Ａを含む場合には、前記混合物／組成物は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼとしてＦｖ４３Ｂをさらに含んでいてもよい。
【０１６０】
本開示の酵素混合物／酵素組成物は、例えば、酵素混合物／酵素組成物の成分に加えてバイオマスを含む糖化反応液の一部であることが好ましい。この糖化反応液は、例えば、以下の１つ、２つ、３つ又は４つすべてを特徴とする。
（ｉ）前記糖化反応液においてヘミセルラーゼ１ｋｇ当たりのキシラナーゼの全重量は、下限が、おおよそ、０．５ｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、７ｇ又は１０ｇであり、また、上限が、独立しておおよそ、５ｇ、７ｇ、１０ｇ、１５ｇ、２０ｇ、３０ｇ又は４０ｇである範囲内である。例えば、前記反応液中のヘミセルラーゼ１ｋｇ当たりのキシラナーゼの全重量は、０．５ｇ〜４０ｇ、０．５ｇ〜３０ｇ、０．５ｇ〜２０ｇ、０．５〜１０ｇ、０．５〜５ｇ、１ｇ〜４０ｇ、２ｇ〜４０ｇ、３ｇ〜４０ｇ、５ｇ〜４０ｇ、７ｇ〜３０ｇ、１０ｇ〜３０ｇ、５ｇ〜２０ｇ、又は、５ｇ〜３０ｇである。
（ｉｉ）前記糖化反応液におけるヘミセルラーゼ１ｋｇ当たりのβ−キシロシダーゼの全重量は、下限が、おおよそ、０．５ｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、７ｇ又は１０ｇであり、上限が、独立しておおよそ、５ｇ、７ｇ、１０ｇ、１５ｇ、２０ｇ、３０ｇ、４０ｇ又は５０ｇである範囲内である。例えば、前記反応液におけるヘミセルラーゼ１ｋｇ当たりのβ−キシロシダーゼの全重量は、０．５〜４０ｇ、０．５ｇ〜５０ｇ、０．５ｇ〜３０ｇ、０．５ｇ〜２０ｇ、０．５ｇ〜１０ｇ、０．５ｇ〜５ｇ、１ｇ〜４０ｇ、２ｇ〜４０ｇ、３ｇ〜４０ｇ、５ｇ〜４０ｇ、７ｇ〜３０ｇ、１０ｇ〜３０ｇ、５ｇ〜３０ｇ、５ｇ〜２０ｇである。
（ｉｉｉ）前記糖化反応液におけるヘミセルラーゼ１ｋｇ当たりのＬ−α−アラビノフラノシダーゼの全重量は、下限が、おおよそ、０．２ｇ、０．５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５ｇ、３ｇ、４ｇ又は５ｇであり、上限が、独立しておおよそ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、７ｇ、１０ｇ、１５ｇ又は２０ｇである範囲内である。例えば、前記反応液におけるヘミセルラーゼ１ｋｇ当たりのＬ−α−アラビノフラノシダーゼの全重量は、０．２ｇ〜２０ｇ、０．５ｇ〜２０ｇ、１ｇ〜２０ｇ、２ｇ〜２０ｇ、２．５ｇ〜２０ｇ、３ｇ〜１５ｇ、４ｇ〜２０ｇ、５ｇ〜１５ｇ、５ｇ〜１０ｇ、５ｇ〜２０ｇ、又は、２．５ｇ〜１５ｇである。
（ｉｖ）前記糖化反応液におけるセルラーゼ１ｋｇ当たりのセルラーゼの全重量は、下限が、おおよそ、１ｇ、３ｇ、５ｇ、７ｇ、１０ｇ、１２ｇ、１５ｇ、１８ｇ又は２０ｇであり、また、上限が、独立しておおよそ、１０ｇ、１５ｇ、１８ｇ、２０ｇ、２５ｇ、３０ｇ、５０ｇ、７５ｇ又は１００ｇである範囲内である。例えば、前記反応液におけるセルラーゼ１ｋｇ当たりのセルラーゼの全重量は、１ｇ〜１００ｇ、３ｇ〜１００ｇ、５ｇ〜１００ｇ、７ｇ〜１００ｇ、１２ｇ〜１００ｇ、１５ｇ〜１００ｇ、１８ｇ
〜１００ｇ、３ｇ〜７５ｇ、５ｇ〜５０ｇ、７ｇ〜７５ｇ、１０ｇ〜７５ｇ、１０ｇ〜５０ｇ、１２ｇ〜７５ｇ、１２ｇ〜５０ｇ、１５ｇ〜７５ｇ、１５ｇ〜５０ｇ、１８ｇ〜３０ｇ、１８ｇ〜７５ｇである。
【０１６１】
６．３．５．  セルラーゼ
本開示の酵素混合物／酵素組成物は、１つ又はそれ以上のセルラーゼを含んでいてもよい。セルラーゼは、セルロース（β−１，４−グルカン又はβ−Ｄ−グルコシド結合）を加水分解して、グルコース、セロビオース、セロオリゴ糖などを生成する酵素である。セルラーゼは、伝統的に、エンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）、及び、β−グルコシダーゼ（β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ）（ＥＣ  ３．２．１．２１（「ＢＧ」）からなる３つの主要なクラスに分類されている(Knowles et al., 1987, Trends in Biotechnology 5(9):255-261;Shulein, 1988, Methods in Enzymology, 160:234-242)。エンドグルカナーゼは、主としてセルロース繊維のアモルファス部分に作用する。一方で、セロビオヒドロラーゼは、結晶セルロースを分解することができる。
【０１６２】
特に、本開示の方法及び組成物に従って使用するためのセルラーゼは、クリニペリス・スカペラ(Crinipellis scapella)、マクロフォミナ・ファセオリナ(Macrophomina phaseolina)、ミセリオフトラ・サーモフィリア(Myceliophthora thermophila)、ソルダリア・フィミコーラ(Sordaria fimicola)、ボルテラ・コレトトリコイデス
(Volutella colletotrichoides)、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)、アクレモニウム種(Acremonium sp.)、エキシディア・グランデュロサ(Exidia glandulosa)、フォメス・フォメンタリウス(Fomes fomentarius)、スポンジペリス種(Spongipellis sp.)、リゾフリクティス・ロセア(Rhizophlyctis rosea)、リソムコル・プシラス(Rhizomucor pusillus)、フィコミセス・ニテウス(Phycomyces niteus)、カエトスチルム・フレセニイ(Chaetostylum fresenii)、ディプロディア・ゴスシピナ(Diplodia gossypina)、ウロスポラ・ビルグラミイ(Ulospora bilgramii)、サッコボルス・ジルテルス(Saccobolus dilutellus)、ペニシリウム・ベルクロスム(Penicillium verruculosum)、ペニシリウム・クリソゲヌム(Penicillium chrysogenum)、サーモミセス・バールコスス(Thermomyces verrucosus)、ジアポルテ・シンゲネシア(Diaporthe syngenesia)、コレトトリケム・ラゲナリウム(Colletotrichum lagenarium)、ニグロスポラ種(Nigrospora sp.)、キシラリア・ヒポキシロン(Xylaria hypoxylon)、ネクトリア・ピネア(Nectria pinea)、ソルダリア・マクロスポラ(Sordaria macrospora)、チエラビア・サーモフィリア(Thielavia thermophila)、カエトミウム・モロルム(Chaetomium mororum)、カエトミウム・ビルセンス(Chaetomium virscens)、カエトミウム・ブラシリエンシス(Chaetomium brasiliensis)、カエトミウム・クニコロルム(Chaetomium cunicolorum)、シスパストスポラ・ボニネンシス(Syspastospora boninensis)、クラドリヌム・フォエクンディスシマム(Cladorrhinum foecundissimum)、スキタリジウム・サーモフィリア(Scytalidium thermophila)、グリオクラディウム・カテヌラタム(Gliocladium catenulatum)、フザリウム・オキシスポルム種リコペルシチ(Fusarium oxysporum ssp. lycopersici）、フザリウム・オキシスポルム・パシフロラ(Fusarium oxysporum ssp.passiflora)、フザリウム・ソラニ(Fusarium solani)、フザリウム・アングイオイデス(Fusarium anguioides)、フザリウム・ポアエ(Fusarium poae)、フミコラ・ニグレセンス(Humicola nigrescens)、フミコラ・グリセア(Humicola grisea)、パナエオルス・レチルギス(Panaeolus retirugis)、トラメテス・サングイネア(Trametes sanguinea)、シゾフィラム・コミューン(Schizophyllum commune)、トリコテチウム・ロセウム(Trichothecium roseum)、ミクロスファエロプシス種(Microsphaeropsis sp.)、アソボルス・スチクトイデウス種（Acsobolus stictoideus sp.）、ポロニア・プンクタタ(Poronia punctata)、ノデュリスポルム種(Nodulisporum sp.)、トリコデルマ種(例えば、トリコデルマリーゼイ)、及び、シリンドロカルポン種(Cylindrocarpon sp.)の１つ又はそれ以上の生物から得ることができ又はその生物から組み替え技術によって生産することができる。
【０１６３】
例えば、本開示の方法及び／又は組成物において使用されるセルラーゼは、全セルラーゼであり、及び／又は、以下のセクション７．１．１０に記載されているカルコフロール分析によって決定したときに少なくとも０．１（例えば、０．１〜０．４）の生産率を達成することができる。
【０１６４】
６．３．５．１  β−グルコシダーゼ
本開示の酵素混合物／酵素組成物は、選択的に１つ又はそれ以上のβ−グルコシダーゼを含んでいてもよい。「β−グルコシダーゼ」という用語は、本明細書において使用されているように、ＥＣ３．２．１．２１に分類されるβ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ、及び／又は、限定されるものではないが、ＧＨファミリー１、３、９又は４８のメンバーを含む特定のＧＨファミリーのメンバーであって、セロビオースの加水分解を触媒してβ−Ｄ−グルコースを放出するものを表す。
【０１６５】
好適なβ−グルコシダーゼは、多数の微生物から組み換え手段によって得ることもできるし又は購入することもできる。限定されるものではないが、微生物に由来するβ−グルコシダーゼの例には、バクテリア及び真菌から得たものが含まれる。例えば、本開示のβ−グルコシダーゼは、糸状菌から好適に得ることができる。
【０１６６】
β−グルコシダーゼは、特に、アスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)(Kawaguchi et al. Gene 1996, 173:287-288)、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachi)(Iwashita et al. Appl.Environ.Microbiol.1999, 65:5546-5553))、アスペルギルス・オリゼー(WO2002/095014)、セルロモナス・ビアゾテア(Cellulomonas biazotea)(Wong et al. Gene, 1998, 207:79-86)、ペニシリウム・フニクロスム(Penicillium funiculosum)(WO 2004/078919)、サッカロミコプシス・フィブリゲラ(Saccharomycopsis fibuligera)(Machida et al. Appl.Environ.Microbiol.1988, 54:3147-3155)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)(Wood et al. Nature 2002, 415: 871-880)、又は、トリコデルマリーゼイ((例えば、β−グルコシダーゼ１（米国特許第６０２２７２５号）、β−グルコシダーゼ３（米国特許第６９８２１５９号）、β−グルコシダーゼ４（米国特許第７０４５３３２号）、β−グルコシダーゼ５（米国特許第７００５２８９号）、β−グルコシダーゼ６（米国公開公報第２００６０２５８５５４号）、β−グルコシダーゼ７（米国公開公報第２００６０２５８５５４号))から得ることもできるし又はこれらから組み換え技術によって生産することができる。
【０１６７】
β−グルコシダーゼは、β−グルコシダーゼをコードする内因性又は外因性の遺伝子を発現させることによって生産することができる。例えば、β−グルコシダーゼは、例えば、グラム陽性の微生物（例えば、バチルス又は放線菌）、又は、真核生物の宿主（例えば、トリコデルマ、アスペルギルス、サッカロミケス又はピチア）によって細胞外空間に分泌され得る。β−グルコシダーゼは、いくつかの状況においては、過剰発現又は過小発現させることができる。
【０１６８】
β−グルコシダーゼは商業的供給源から得ることもできる。本開示において使用するに適したβ−グルコシダーゼの商業的調製物の例には、例えば、アクセレラーゼ（商標）ＢＧ(Danisco US社、Genencor)中のトリコデルマリーゼイβ−グルコシダーゼ、ＮＯＶＯＺＹＭ（商標）１８８（β−アスペルギルスニガーから得たグルコシダーゼ）、アグロバクテリウム種(Agrobacterium sp.)β−グルコシダーゼ、及び、メガザイム(Megazyme International Ireland社、アイルランド)から得たサーモトガ・マリティマ(Thermatoga maritima)β−グルコシダーゼが含まれる。
【０１６９】
さらに、以下のセクション６．３．５．４に記載されているように、β−グルコシダーゼは、全セルラーゼの成分であってもよい。
【０１７０】
β−グルコシダーゼ活性は、Chen et al., in Biochimica et Biophysica Acta 1992, 121:54-60によって記載されている分析などのように、当業界で知られた数多くの適切な手段によって決定することができる。その分析において、１ｐＮＰＧは、１０分間、５０℃（１２２°Ｆ）及びｐＨ４．８において、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシドから放出されたニトロフェノール１μｍｏｌを表す。
【０１７１】
６．３．５．２  エンドグルカナーゼ
本開示の酵素混合物／酵素組成物は、選択的に１つ又はそれ以上のエンドグルカナーゼを含む。あらゆるエンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）を本開示の方法及び組成物においてで使用することができる。エンドグルカナーゼは、内因性又は外因性のエンドグルカナーゼ遺伝子を発現させることによって生産することができる。エンドグルカナーゼは、いくつかの状況において、過剰発現又は過小発現させることができる。
【０１７２】
例えば、トリコデルマリーゼイＥＧ１(Shoemaker et al. Bio/Technology 1983, 1:691-696)、及び／又は、トリコデルマリーゼイＥＧ２(Teeri et al. Bio/Technology 1983, 1:696-699)は、本開示の方法及び組成物において好適に使用される。
【０１７３】
熱安定性のチエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)エンドグルカナーゼ(Kvesitadaze et al., Applied Biochem. Biotech. 1995, 50:137-143)は、他の例において、本開示の方法及び組成物において使用される。さらに、トリコデルマリーゼイＥＧ３(Okada et al. Appl. Environ. Microbiol. 1988, 64:555-563)、ＥＧ４(Saloheimo et al. Eur. J. Biochem. 1997, 249:584-591)、ＥＧ５(Saloheimo et al. Molecular Microbiology 1994, 13:219-228)、ＥＧ６（米国特許公開公報第２００７０２１３２４９号）、又は、ＥＧ７（米国特許公開公報第２００９０１７０１８１号）、アシドサーマス・セルロリティカス(Acidothermus cellulolyticus)ＥＩエンドグルカナーゼ（米国特許第５５３６６５５号）、フミコラ・インソレンス・エンドグルカナーゼＶ(Humicola insolens endoglucanase V)（ＥＧＶ）（Protein Data Bankエントリ4ENG）、スタフィロトリチュム・コッコスポルム(Staphylotrichum coccosporum)エンドグルカナーゼ（米国特許公開公報第２００７０１１１２７８号）、アスペルギルス・アクレアタス・エンドグルカナーゼ(Aspergillus aculeatus endoglucanase)Ｆ１−ＣＭＣ(Ooi et al. Nucleic Acid Res. 1990, 18:5884)、アスペルギルス・カワチイ(Aspergillus kawachii)ＩＦＯ４３０８エンドグルカナーゼＣＭＣａｓｅ−１(Sakamoto et al. Curr. Genet. 1995, 27:435-439)、エルウイニア・カロトバラ(Saarilahti et al. Gene 1990, 90:9-14)；又は、アクレモニウムサーモフィルム(Acremonium thermophilum)ＡＬＫＯ４２４５エンドグルカナーゼ（米国特許公開公報第２００７０１４８７３２号）を使用することもできる。
【０１７４】
好適なエンドグルカナーゼのさらに他のものは、例えば、ＷＯ９１／１７２４３、ＷＯ９１／１７２４４、ＷＯ９１／１０７３２、及び、米国特許第６００１６３９号に記載されている。
【０１７５】
６．３．５．３  セロビオヒドロラーゼ
あらゆるセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）を選択的に本開示の方法及び混合物／組成物において使用することができる。セロビオヒドロラーゼは、内因性又は外因性のセロビオヒドロラーゼ遺伝子を発現させることによって生産することができる。セロビオヒドロラーゼは、いくつかの状況においては、過剰発現又は過少発現させることができる。
【０１７６】
例えば、トリコデルマリーゼイＣＢＨ１(Shoemaker et al. Bio/Technology 1983, 1:691-696)、及び／又は、ＣＢＨ２(Teeri et al. Bio/Technology 1983, 1:696-699)は、本開示の方法及び混合物／組成物において好適に使用することができる。
【０１７７】
（米国特許公開公報２００７０１４８７３０番）
適切なＣＢＨは、アガリクス・ビスポルス(Agaricus bisporus)ＣＢＨ１(Swiss Prot Accession No.Q92400)、アスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)ＣＢＨ１(Swiss Prot Accession No.O59843)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)ＣＢＨＡ(GenBank Accession No.AF420019)若しくはＣＢＨＢ(GenBank Accession No. AF420020)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)ＣＢＨＡ(GenBank Accession No. AF156268)若しくはＣＢＨＢ(GenBank Accession No. AF156269)、クラビセプス・プルプレア(Claviceps purpurea)ＣＢＨ１(Swiss Prot Accession No. O00082)、コクリオボルス・カルボナルム(Cochliobolus carbonarum)ＣＢＨ１(Swiss Prot Accession No. Q00328)、クリフォネクトリア・パラシティカ(Cryphonectria parasitica)ＣＢＨ１(Swiss Prot Accession No. Q00548)、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)ＣＢＨ１(Cel7A)(Swiss Prot Accession No. P46238)、フミコラ・グリセア(Humicola grisea)ＣＢＨ１．２(GenBank Accession No. U50594)、フミコラ・グリセア・バー・サーモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)ＣＢＨ１(GenBank Accession No.D63515)、ＣＢＨ１．２(GenBank Accession No.AF123441)若しくはｅｘｏ１(GenBank Accession No.AB003105)、メラノカルパス・アルボミセス(Melanocarpus albomyces)Ｃｅｌ７Ｂ(GenBank Accession No.AJ515705)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora c
rassa)ＣＢＨ１(GenBank Accession No.X77778)、ペニシリウム・フニクロスム(Penicillium funiculosum CBHI)ＣＢＨＩ（Ｃｅｌ７Ａ）(米国特許公報第20070148730号)、ペニシリウム・ジャンチネルム(Penicillium janthinellum)ＣＢＨＩ(GenBank Accession No. S56178)、ファネロキーテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)ＣＢＨ(GenBank Accession No. M22220)若しくはＣＢＨＩ−２（Ｃｅｌ７Ｄ）(GenBank Accession No. L22656)、タラロミセス・エマーソニイ(Talaromyces emersonii)ＣＢＨ１Ａ(GenBank Accession No. AF439935)、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)ＣＢＨ１(GenBank Accession No. X53931)、又は、ボルバリエラ・ボルバセア(Volvariella volvacea)Ｖ１４  ＣＢＨ１(GenBank Accession No. AF156693)から選択することができる。
【０１７８】
６．３．５．４  全セルラーゼ
本開示の酵素混合物／酵素組成物は、全セルラーゼをさらに含んでいてもよい。本明細書において用いられているように、「全セルラーゼ」は、少なくとも３つの異なる酵素種：（１）エンドグルカナーゼ、（２）セロビオヒドロラーゼ、及び、（３）β−グルコシダーゼを含むか、又は、少なくとも３つの異なる酵素活性：（１）内部のβ−１，４−結合の開裂を触媒してより短いグルコオリゴ糖を生じさせるエンドグルカナーゼ活性、（２）セロビオース単位（β−１，４−グルコースグルコース二糖）のエキソ型放出を触媒するセロビオヒドロラーゼ活性、及び、（３）短いセロオリゴ糖（例えばセロビオース）からのグルコースモノマーの放出を触媒するβ−グルコシダーゼ活性を含む天然又は非天然のセルラーゼ含有組成物を表す。
【０１７９】
「天然に存在するセルラーゼ含有」組成物は、天然に存在する源によって生産された組成物であり、１つ又はそれ以上のセロビオヒドロラーゼ種の成分又は活性と、１つ又はそれ以上のエンドグルカナーゼ種の成分又は活性と、１つ又はそれ以上のβ−グルコシダーゼ種の成分又は活性とを含み、これらの成分又は活性のそれぞれが、人工的に変更されていない天然の比率及びレベルでみられる組成物である。従って、天然に存在するセルラーゼ含有組成物は、例えば、成分酵素の比率又はレベルが天然の生物によって天然に生産されるものと変わらないように、セルロース分解酵素に関して変化させていない生物によって生産されたものである。「天然に存在しないセルラーゼ含有組成物」は、（１）天然に存在する比率で、又は、天然に存在しない比率、つまり、変化させた比率で成分セルロース分解酵素を混合することによって、（２）１つ又はそれ以上のセルロース分解酵素を過剰発現又は過小発現するように生物を修飾することによって、又は、（３）少なくとも１つのセルロース分解酵素を欠損するように生物を修飾することによって、生産された組成物を表す。「天然に存在しないセルラーゼ含有」組成物は、天然生物が非天然条件下で増殖して酵素を変化したレベル又は比率で生産するように、天然生物の培養条件を調節することによって得られた組成物も表すことができる。従って、いくつかの実施形態において、本開示の全セルラーゼ調製物は、１つ又はそれ以上のＥＧ、１つ又はそれ以上のＣＢＨ、及び／又は、１つ又はそれ以上のβ−グルコシダーゼを欠損及び／又は過剰発現させたものであってもよい。
【０１８０】
本開示において、全セルラーゼ調製物は、セルロース材料を加水分解することができるあらゆる微生物から得ることができる。いくつかの実施形態において、全セルラーゼ調製物は、糸状菌の全セルラーゼである。例えば、全セルラーゼ調製物は、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillus)、エメリセラ(Emericella)、フザリウム(Fusarium)、フミコラ(Humicola)、ムコール(Mucor)、ミセリオフトラ(Myceliophthora)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、スキタリジウム(Scytalidium)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラディウム(Tolypocladium)、又は、トリコデルマ種(Trichoderma species)から得ることができる。全セルラーゼ調製物は、例えば、アスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フォエティダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、又は、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)の全セルラーゼである。さらに、全セルラーゼ調製物は、フザリウム・バクトリディオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クロックウェレンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・カルモラム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミヌム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポルム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンジ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レティキュラツム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サンブシヌム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイデス(Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・スルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロスム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコセシオイデス(Fusarium trichothecioides)又はフザリウム・ヴェネナツム(Fusarium venenatum)の全セルラーゼ調製物であってもよい。全セルラーゼ調製物は、さらに、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、ミセリオフトラ・サーモフィリア(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ペニシリウム・パルロゼラム(Penicillium purpurogenum)、ペニシリウム・フニクロスム(Penicillium funiculosum)、スキタリジウム・サーモフィルム(Scytalidium thermophilum)、又は、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)の全セルラーゼ調製物であってもよい。さらに、全セルラーゼ調製物は、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンジブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマリーゼイ(Trichoderma reesei)（例えば、ＲＬ−Ｐ３７(Sheir-Neiss G et al. Appl. Microbiol. Biotechnology, 1984, 20, pp.46-53)、又は、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)(例えば、ATCC 32098及び32086)の全セルラーゼ調製物であってもよい。
【０１８１】
全セルラーゼ調製物は、特に、トリコデルマリーゼイＲｕｔＣ３０の全セルラーゼ調製物であることが好ましい。このセルラーゼは、トリコデルマリーゼイＡＴＣＣ５６７６５として米国培養菌保存施設(American Type Culture Collection)から入手することができる。例えば、全セルラーゼ調製物は、さらに、ペニシリウム・フニクロスム(Penicillium funiculosum)の全セルラーゼであることも好ましい。このセルラーゼは、ペニシリウム・フニクロスム(Penicillium funiculosum)ＡＴＣＣ１０４４６として米国培養菌保存施設(American Type Culture Collection)から入手することができる。
【０１８２】
全セルラーゼ調製物は商業的供給源から得ることもできる。本開示の方法及び組成物において使用するに適した商品のセルラーゼ調製物の例には、例えば、ＣＥＬＬＵＣＬＡＳＴ（商標）及びＣｅｌｌｉｃ（商標）及びＬＡＭＩＮＥＸ（商標）ＢＧ（Novozymes A/S)、ＩｎｄｉＡｇｅ（商標）４４Ｌ、Ｐｒｉｍａｆａｓｔ（商標）１００、Ｐｒｉｍａｆａｓｔ（商標）２００、Ｓｐｅｚｙｍｅ（商標）ＣＰ、アクセレラーゼ（商標）１０００、及び、アクセレラーゼ（商標）１５００(Danisco US. 社、Genencor)が含まれる。
【０１８３】
好適な全セルラーゼ調製物は、当業界で知られているあらゆる微生物培養方法（特に、セルロース材料を加水分解することができる酵素の発現を生じさせる発酵）を使用して作成することができる。本明細書において用いられているように、「発酵」は、セルラーゼ又は対象酵素を発現させ及び／又は単離することができる条件下において、適切な培地中で、実験用又は工業用の発酵槽中で行われる振盪フラスコ培養、小規模又は大規模の発酵（連続発酵、バッチ発酵、供給回分発酵又は固形発酵等）を表す。
【０１８４】
一般に、微生物は、セルロース材料を加水分解することができる酵素の生産に適した細胞培養培地において培養される。培養は、当業界で知られた手順及びバリエーションを使用して、炭素と窒素源と無機塩とを含む適切な培養液中で実行される。培養及びセルラーゼ生産のための適切な培地、温度範囲、及び、他の条件は、当業界で知られている。非限定的な例として、トリコデルマリーゼイによってセルラーゼを生産するための典型的な温度範囲は、２４℃〜２８℃である。
【０１８５】
全セルラーゼ調製物は、回収及び／又は精製をまったく行っていない又は最小限で行った発酵によって生産されたままのものとして、使用することができる。例えば、セルラーゼが細胞培養培地中に分泌されれば、セルラーゼを含む細胞培養培地をそのまま使用することができる。全セルラーゼ調製物は、使用済み細胞培養培地、細胞外酵素及び細胞を含む発酵材料の分画されていない成分を含んでいてもよい。一方で、全セルラーゼ調製物は、多数のルーティンステップ（例えば、沈殿、遠心分離、親和性クロマトグラフィ、濾過など）においてさらなる処理に供することもできる。例えば、全セルラーゼ調製物は、濃縮されていてもよく、次にさらなる精製を行わずに使用されるものであってもよい。全セルラーゼ調製物は、例えば、発酵後に細胞生存率を低下させ又は細胞を死滅させる特定の薬剤を含むように製剤されたものであってもよい。例えば、細胞は、当業界で知られた方法を使用して、溶解させてもよいし又は透過性にしてもよい。
【０１８６】
全セルラーゼ調製物のエンドグルカナーゼ活性は、基質としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を使用して決定することができる。好適な分析は、ＣＭＣに作用する酵素混合物によって生成された還元末端の生成を測定するものであり、該分析において、１ユニットは、１分当たりに１μｍｏｌの生成物を放出させる酵素の量である(Ghose, T. K., Pure & Appl. Chem. 1987, 59, pp. 257-268)。
【０１８７】
全セルラーゼは、β−グルコシダーゼを多量に含むセルラーゼであってもよい。β−グルコシダーゼを多量に含む全セルラーゼは、一般に、β−グルコシダーゼと全セルラーゼ調製物とで構成される。β−グルコシダーゼを多量に含む全セルラーゼ組成物は、組み換え技術によって生産することができる。例えば、そのような全セルラーゼ調製物は、全セルラーゼを生産することができる微生物においてβ−グルコシダーゼを発現させることによって得ることができる。β−グルコシダーゼを多量に含む全セルラーゼ組成物は、例えば、全セルラーゼ調製物と、β−グルコシダーゼとを含んでいてもよい。例えば、β−グルコシダーゼを多量に含む全セルラーゼ組成物は、好ましくは、混合物／組成物中のタンパクの全重量に基づいて、少なくとも５重量％、少なくとも７重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、又は、少なくとも２０重量％、また、２５重量％以下、３０重量％以下、３５重量％以下、４０重量％以下、又は、５０重量％以下のβ−グルコシダーゼを含み得る。
【０１８８】
６．３．６  キシナラーゼ
本開示の酵素混合物／酵素組成物は、例えば、１つ又はそれ以上のグループＡのキシラナーゼを含む。このキシラナーゼは、トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、ＡｆｕＸｙｎ２、又は、ＡｆｕＸｙｎ５であり得る。好適なトリコデルマリーゼイＸｙｎ２、好適なトリコデルマリーゼイＸｙｎ３、好適なＡｆｕＸｙｎ２、又は、好適なＡｆｕＸｙｎ５ポリペプチドは、上記セクション６．１に記載されている。
【０１８９】
本開示の酵素混合物／酵素組成物は、選択的に１つ又はそれ以上のグループＡのキシラナーゼに加えて又はそのキシラナーゼに代えて、１つ又はそれ以上のキシラナーゼを含む。あらゆるキシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）をさらなる１つ又はそれ以上のキシラナーゼとして使用することができる。適切なキシラナーゼには、例えば、カルドセルム・サッカロリティカム(Caldocellum saccharolyticum)・キシナラーゼ(Luthi et al. 1990, Appl. Environ. Microbiol.56(9):2677-2683)、サーモトガ・マリティマ(Thermatoga maritima)・キシラナーゼ(Winterhalter & Liebel, 1995, Appl. Environ. Microbiol.61(5):1810-1815)、サーマトガ種株(Thermatoga Sp. Strain)ＦＪＳＳ−Ｂ．１キシナラーゼ(Simpson et al. 1991, Biochem. J. 277, 413-417)、バチルス・シルクランス・キシラナーゼ(Bacillus circulans xylanase)（ＢｃＸ）（米国特許第５４０５７６９号）、アスペルギルス・ニガー・キシラナーゼ(Aspergillus niger xylanase)(Kinoshita et al. 1995, Journal of Fermentation and Bioengineering 79(5):422-428)、ストレプトミセス・リビダンス・キシラナーゼ(Streptomyces lividans xylanase)(Shareck et al. 1991, Gene 107:75-82; Morosoli et al. 1986 Biochem. J. 239:587-592; Kluepfel et al. 1990, Biochem. J. 287:45-50)、バチルス・サチリス・キシラナーゼ(Bacillus subtilis xylanase)(Bernier et al. 1983, Gene 26(1):59-65)、シュードモナス−フルオレッセンス・キシラナーゼ(Pseudomonas fluorescens xylanase)(Gilbert et al. 1988, Journal of General Microbiology 134:3239-3247)、クロストリジウム・テルモセルム・キシラナーゼ(Clostridium thermocellum xylanase)(Dominguez et al., 1995, Nature Structural Biology 2:569-576)、バチルス・プミルス・キシラナーゼ(Bacillus pumilus xylanase)(Nuyens et al. Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 56:431-434; Yang et al. 1998, Nucleic Acids Res. 16(14B):7187)、クロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)Ｐ２６２キシラナーゼ(Zappe et al. 1990, Nucleic Acids Res. 18(8):2179)、又は、トリコデルマ・ハルジアナム・キシラナーゼ(Trichoderma harzianum xylanase)(Rose et al. 1987, J. Mol. Biol.194(4):755-756)が含まれる。キシラナーゼは、キシラナーゼをコードする内因性又は外因性の遺伝子を発現させることによって生産することができる。キシラナーゼは、いくつかの状況において、過剰発現又は過小発現させることができる。
【０１９０】
６．３．７  β−キシロシダーゼ
本開示の酵素混合物／酵素組成物は、好ましくは、例えば、１つ又はそれ以上のβ−キシロシダーゼを含む。例えば、β−キシロシダーゼは、グループ１のβ−キシロシダーゼ酵素（例えば、Ｆｖ３Ａ又はＦｖ４３Ａ）、又は、グループ２のβ−キシロシダーゼ酵素（例えば、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｏ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐａ５１Ａ、Ｇｚ４３Ａ又はトリコデルマリーゼイＢｘｌ１）である。これらのポリペプチドは上記セクション０に記載されている。例えば、本開示の酵素混合物／酵素組成物は、好ましくは、グループ１の１つ又はそれ以上のβ−キシロシダーゼとグループ２の１つ又はそれ以上のβ−キシロシダーゼとを含んでいてもよい。
【０１９１】
本開示の酵素混合物／酵素組成物は、選択的に、上述したグループ１及び／又はグループ２のβ−キシロシダーゼに加えて又は代えて、１つ又はそれ以上のβ−キシロシダーゼを含んでいてもよい。あらゆるβ−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）をさらなるβ−キシロシダーゼとして使用することができる。好適なβ−キシロシダーゼには、例えば、タラロミセス・エマーソニイＢｘｌ１(Talaromyces emersonii Bxl1)(Reen et al. 2003, Biochem Biophys Res Commun. 305(3):579-85)、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)β−キシロシダーゼ(Shallom et al. 2005, Biochemistry 44:387-397)、スキタリジウム・サーモフィルム(Scytalidium thermophilum)β−キシロシダーゼ(Zanoelo et al. 2004, J. Ind. Microbiol. Biotechnol.31:170-176)、トリコデルマ・リグノルム(Trichoderma lignorum)β−キシロシダーゼ(Schmidt, 1998, Methods Enzymol. 160:662-671)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)β−キシロシダーゼ(Kurakake et al. 2005, Biochim. Biophys. Acta 1726:272-279)、アスペルギルス・バーシカラー(Aspergillus versicolor)β−キシロシダーゼ(Andrade et al. 2004, Process Biochem. 39:1931-1938)、ストレプトミセス種(Streptomyces sp.)β−キシロシダーゼ(Pinphanichakarn et al. 2004, World J. Microbiol. Biotechnol. 20:727-733)、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)β−キシロシダーゼ(Xue and Shao, 2004, Biotechnol. Lett. 26:1511-1515)、トリコデルマ種(Trichoderma sp.) ＳＹ β−キシロシダーゼ (Kim et al. 2004, J. Microbiol. Biotechnol. 14:643-645)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)β−キシロシダーゼ(Oguntimein and Reilly, 1980, Biotechnol. Bioeng. 22:1143-1154)、又は、ペニシリウム・ウォルトマンニン(Penicillium wortmanni)β−キシロシダーゼ(Matsuo et al. 1987, Agric. Biol. Chem. 51:2367-2379)が含まれる。β−キシロシダーゼは、β−キシロシダーゼをコードする内因性又は外因性の遺伝子を発現させることによって生産することができる。β−キシロシダーゼは、いくつかの状況において、過剰発現又は過小発現させることができる。
【０１９２】
６．３．８  Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ
本開示の酵素混合物／酵素組成物は、好ましくは、例えば、１つ又はそれ以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼを含み得る。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは、例えば、Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ又はＦｖ５１Ａである。Ａｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ５１Ａ、Ｐａ５１Ａ及びＦｖ５１Ａのポリペプチドは、上記セクション６．１に記載されている。
【０１９３】
本開示の酵素混合物／酵素組成物は、選択的に、上記Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼに加えて又は代えて、１つ又はそれ以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼを含む。あらゆる適切な生物から得たＬ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）をさらなるＬ−α−アラビノフラノシダーゼとして使用することができる。適切なＬ−α−アラビノフラノシダーゼには、例えば、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)(Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260)、アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)(Oshima et al. J. Appl. Glycosci. 2005, 52:261-265)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)(Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260)、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)(Kim et al., J. Microbiol. Biotechnol. 2004,14:474-482)、ビフィドバクテリウム・ブレヴェ(Bifidobacterium breve)(Shin et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69:7116-7123)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum )(Margolles et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69:5096-5103)、クロストリジウム・テルモセルム(Clostridium thermocellum)(Taylor et al., Biochem. J. 2006, 395:31-37)、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)(Panagiotou et al., Can. J. Microbiol. 2003, 49:639-644)、フザリウム・オキシスポルム・ｆ．ｓｐ．・ディアンティ(Fusarium oxysporum f. sp. dianthi)(Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260)、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)Ｔ−６(Shallom et al., J. Biol. Chem. 2002, 277:43667-43673)、ホルデウム・ウルガレ(Hordeum vulgare)(Lee et al., J. Biol. Chem. 2003, 278:5377-5387)、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)(Sakamoto et al., Biophys. Acta 2003, 1621:204-210)、ペニシリウム種(Penicillium sp.)(Rahman et al., Can. J. Microbiol. 2003, 49:58-64)、シュードモナス・セルロサ(Pseudomonas cellulosa)(Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260)、リゾムコール・プシルス(Rhizomucor pusillus)(Rahman et al., Carbohydr. Res. 2003, 338:1469-1476)、ストレプトミセス・チャートレウシス(Streptomyces chartreusis)、ストレプトミセス・サーモビオラクス(Streptomyces thermoviolacus)、サーモアナエロバクタ・エタノリクス(Thermoanaerobacter ethanolicus)、サーモバチルス・キシラニリティクス(Thermobacillus xylanilyticus)(Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260)、サーモモノスポラ・フスカ(Thermomonospora fusca)(Tuncer and Ball, Folia Microbiol. 2003, (Praha) 48:168-172)、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)(Miyazaki, Extremophiles 2005, 9:399-406)、トリコデルマ種(Trichoderma sp.)ＳＹ(Jung et al. Agric. Chem. Biotechnol. 2005, 48:7-10)、アスペルギルス・カワチイ(Aspergillus kawachii)(Koseki et al., Biochim. Biophys. Acta 2006, 1760:1458-1464)、フザリウム・オキシスポルム・ｆ．ｓｐ．・ディアンティ(Fusarium oxysporum f. sp. dianthi)(Chacon-Martinez et al., Physiol.Mol. Plant Pathol. 2004,64:201-208)、サーモバチルス・キシラニリティクス(Thermobacillus xylanilyticus)(Debeche et al., Protein Eng. 2002, 15:21-28)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、メリピルス・ギガンテウス(Meripilus giganteus)(Sorensen et al., Biotechnol. Prog. 2007, 23:100-107) 、又は、ラファナス・サチヴィウス(Raphanus sativus)(Kotake et al. J. Exp. Bot. 2006, 57:2353-2362)のＬ−α−アラビノフラノシダーゼが含まれる。
【０１９４】
Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼをコードする内因性又は外因性の遺伝子を発現させることによって生産することができる。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは、いくつかの状況において、過剰発現又は過小発現させることができる。
【０１９５】
６．３．９  アクセサリタンパク
本開示の酵素混合物／酵素組成物は、好ましくは、例えば、１つ又はそれ以上のアクセサリタンパクをさらに含んでいてもよい。限定されるものではないが、アクセサリタンパクの例には、マンナナーゼ（例えば、エンドマンナナーゼ、エキソマンナナーゼ、及び、β−マンノシダーゼ）、ガラクタナーゼ（例えば、エンドガラクタナーゼ及びエキソガラクタナーゼ）、アラビナーゼ（例えば、エンドアラビナーゼ及びエキソアラビナーゼ）、リグニナーゼ、アミラーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ（例えば、フェルラ酸エステラーゼ、アセチル・キシラン・エステラーゼ、クマル酸エステラーゼ、又は、ペクチン・メチル・エステラーゼ）、リパーゼ、グリコシドヒドロラーゼファミリー６１ポリペプチド、キシログルカナーゼ、ＣＩＰ１、ＣＩＰ２、スオレニン、エクスパンシン、及び、タンパクを分裂させるセルロースが含まれる。アクセサリタンパクの例には、さらに、ＣＩＰ１様タンパク、ＣＩＰ２様タンパク、セロビオースデヒドロゲナーゼ、及び、マンガンペルオキシダーゼが含まれ得る。特定の実施形態において、セルロース攪乱タンパクは、セルロース結合モジュールである。
【０１９６】
６．４  さらなる応用
バイオマスの糖化に加えて、本開示の酵素及び／又は酵素混合物／酵素組成物は、工業、農業、食品及び飼料のみならず、食料及び飼料サプリメントの加工プロセスにおいて使用することができる。例示的な応用が以下に記載されている。
【０１９７】
６．４．１  木材、紙及びパルプの処理
本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物及び方法は、木材、木材製品、木材廃棄物若しくは木材副産物、紙、紙製品、紙パルプ若しくは木材パルプ、クラフトパルプ、又は、木材若しくは紙のリサイクル処理又は工業的プロセスにおいて使用することができる。これらのプロセスには、例えば、木材、木材パルプ、廃紙、紙若しくはパルプの処理、又は、木材若しくは紙の脱インクが含まれる。本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、例えば、紙パルプ、又は、リサイクルした紙若しくは紙パルプを処理又は前処理するために使用することができる。本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、紙、パルプ、リサイクルした紙若しくは紙パルプの処理又は前処理に含まれている場合には、紙の「白色度」を高めるために使用することができる。紙のグレードがより高いほど好ましく、白色度がより高いほど好ましい。この白色度は、光学走査装置のスキャン性能に影響を与える可能性がある。そのため、本発明の酵素、酵素混合物／酵素組成物及び方法／プロセスは、インクジェット、レーザー及び写真プリント品質の紙を含む高いグレードの「白色」の紙を作るために使用することができる。
【０１９８】
本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は含めて、多数の他のセルロース材料を処理するか処理するために使用することができる、例えば木材、木綿、麻、アマ又はリネンから線維。
【０１９９】
従って、本開示は、本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物を使用した、木材、木材パルプ、紙、紙パルプ、廃紙、又は、木材若しくは紙リサイクルの処理プロセスを提供する。
【０２００】
本開示の酵素混合物／酵素組成物は、米国特許第６７６７７２８号又は第６４２６２００号、Neo, J. Wood Chem. Tech.1986, 6(2):147に記載されているように、新聞等の印刷された廃紙のインクを抜くために、又は、非接触印刷された廃紙（例えば、コピー用紙及びレーザープリントされた用紙）や、接触に印刷された廃紙と非接触に印刷された廃紙との混合物のインキを抜くために使用することができる。
また、それらは液相の中へのパルプにおいて含まれており、キシロースに対するキシランを加水分解するのに充分な条件に対する得られた液相において含まれていたキシランを供し、キシロースを回収するキシランの抽出に関するプロセスにおける紙グレード広葉樹パルプからキシロースを生産するために使用することができる。
抽出する工程は、例えば、酵素又は酵素混合物／酵素組成物（参照、米国特許６，５１２，１１０番）によってパルプの水性懸濁液又はアルカリ可溶の材料の少なくとも１つの処理を含むことができる。
酵素、開示の酵素混合物／酵素組成物は広葉樹線維から作られた再生紙生成物、広葉樹線維の混合物及び軟材線維のようなセルロース系繊維からパルプを溶かすために使用することができる、廃紙、例えば、中へ記載されるとき、印刷されていない囲い、脱インクされた囲い、印刷されていない帳簿用紙、脱インクされた帳簿用紙などから、例えば米国特許６，２５４，７２２番。
【０２０１】
６．４．２  繊維及び生地の処理
本開示は、本開示の１つ又はそれ以上の酵素、酵素混合物／酵素組成物を使用して線維及び生地を処理する方法を提供する。本発明の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、当業界で知られている任意の線維処理方法又は生地処理方法において使用することができる。例えば、米国特許第６２６１８２８号、第６０７７３１６号、第６０２４７６６号、第６０２１５３６号、第６０１７７５１号、第５９８０５８１号、米国特許公開公報２００２０１４２４３８Ａ１を参照されたい。本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、例えば、線維及び／又は生地の糊抜きにおいて使用することができる。生地の感触及び外観は、例えば、溶液中で本開示の酵素又は酵素の混合物／組成物に生地を接触させるステップを含む方法によって改善することができる。選択的に、生地は、加圧した溶液中で処理される。本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、染みを除去するために使用することができる。
【０２０２】
本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、線維（例えば、コットン、アサ、アマ又はリネンに由来する線維）、縫った生地及び縫っていない生地（例えば、コットン、コットン混合物、又は、天然若しくは人工のセルロース材料若しくはそれらの混合物から作られた編物、織物、デニム、毛糸、及び、タオル生地）を含む他の多くのセルロース材料を処理するために使用することができる。この繊維処理プロセスは、例えば、研磨及び／又は漂白といった他の繊維処理と共に使用することができる。研磨は、例えば、コットン繊維、例えば、クチクラ（主としてワックスからなるもの）、及び、一次細胞壁（主としてペクチン、タンパク及びキシログルカンからなるもの）から非セルロース材料を除去することである。
【０２０３】
６．４．３  食品処理及び食品加工
本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、食品処理工業において多数の用途がある。例えば、油を多量に含む植物性材料（例えば、油を多量に含む種子）からの油の抽出を改良するためにこれらを使用することができる。本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、大豆から大豆油を、オリーブからオリーブオイルを、菜種から菜種油を又はヒマワリの種からヒマワリ油を抽出するために使用することができる。
【０２０４】
本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、植物細胞材料の成分を分離するために使用することができる。例えば、これらは、植物細胞成分を分離するために使用することができる。さらに、本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、作物を、タンパク画分と、油画分と、外皮画分とに分離するために使用することもできる。
【０２０５】
その分離プロセスは、既知の方法を使用して実行することができる。本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、上記用途に加えて、果物ジュース若しくは野菜ジュース、シロップ、並びに、抽出物などの調製における収率を増加させるために使用することができる。さらに、これらは、例えば、シリアル、穀物、ワイン若しくはジュースの生産に由来する様々な植物細胞壁由来の材料若しくは廃棄物、又は、例えば、野菜の外皮、マメの外皮、テンサイパルプ、オリーブパルプ、ポテトパルプなどの農業廃棄物の酵素処理において使用することもできる。さらに、これらは、加工された果実又は植物の堅さ及び／又は外観を変化させるために使用することができる。さらに、これらは、植物成分（食料を含む）の処理、植物性材料の精製又は抽出を容易にするように植物性材料を処理するために使用することもできる。本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、飼料価値を向上させること、水結合力を低下させること、廃棄された水生植物における分解性を向上させること、及び／又は、植物性材料からエンシレージへの変換を向上させることなどに使用することができる。
【０２０６】
本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、製パン用途に使用することができる。いくつかの実施形態において、これらは、機器にとって困難ではない非粘着性のパン生地を生成するために、及び、パンを小さくするために使用される。また、これらは、新鮮さの喪失及び保存期間の短縮を生じさせるパン生地製品の急速な再水和を防止することを目的として、アラビノキシランを加水分解するために使用することもできる。これらは、例えば、パン生地の加工において添加物として使用される。
【０２０７】
６．４．４  動物飼料及び食料、又は、飼料添加剤及び食料添加剤
本開示は、本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物を使用して、動物の飼料及び食料、並びに、食料又は飼料の添加剤（サプリメント）を処理する方法を提供する。前記動物には、哺乳動物（例えば、ヒト）、鳥、魚などが含まれる。本開示は、本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物を含む動物飼料、食料及び添加物（サプリメント）を提供する。本開示の酵素を、動物飼料、食料及び添加物の処理において使用することによって、動物飼料又は添加物（サプリメント）に含まれる栄養素（例えば、デンプン、タンパクなど）の利用を促進することができる。本発明の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、分解困難なタンパクを分解することによって、又は、間接的に若しくは直接的にデンプン（若しくは他の栄養素）を暴露させることによって、栄養素を他の内因性又は外因性酵素により近接可能にすることができる。これらは、簡単に消化されかつ容易に吸収される栄養素及び糖の放出を単に生じさせることもできる。
【０２０８】
動物飼料に加える場合には、本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、腸内粘度を低下させることによって部分的に、インビボにおける植物細胞壁材料の分解を改善する(例えば、Bedford et al., Proceedings of the 1st Symposium on Enzymes in Animal Nutrition, 1993, pp. 73-77を参照されたい)。これによって、動物による植物栄養素の利用性がより向上する。したがって、飼料中に本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物を使用することによって、動物の成長速度及び／又は飼料変換率（すなわち、体重増加に対する吸収された飼料の重量）を向上させることができる。
【０２０９】
本開示の動物飼料添加物は、飼料成分と容易に混合され得る顆粒状の酵素製品であってもよい。あるいは、本開示の飼料添加剤は、プレミックスの１つの成分を構成することができる。本開示の顆粒状の酵素製品は、コーティングされたものであってもよいし又はコーティングされていないものであってもよい。酵素顆粒の粒径は、飼料及び／又はあらかじめ混合する成分の粒径と混合可能なものである。これは、飼料中に酵素を組み込む安全かつ簡便な方法を提供する。あるいは、本開示の動物飼料添加物は、安定した液体組成物であってもよい。これは、水性スラリー又はオイルベーススラリーであり得る。例えば、米国特許第６２４５５４６号を参照されたい。
【０２１０】
本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、穀物、シリアル、トウモロコシ、ダイズ、菜種及びルーピンなどの遺伝子導入飼料穀物（例えば、遺伝子導入した植物、種子など）おいて酵素を直接的に発現させることによって供給することができる。上で論じられているように、本開示は、本開示のポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子導入植物、植物部品及び植物細胞を提供する。本開示の酵素は、回収可能な量で生産されるように、その核酸が発現される。キシラナーゼは、あらゆる植物又は植物部位から回収することができる。あるいは、組み換えポリペプチドを含む植物又は植物部位は、食品又は飼料等の品質を向上させる（例えば、栄養価、嗜好性、流動学的特性を向上させる）ために、又は、抗栄養因子を破壊するために、使用することができる。
【０２１１】
本開示は、対象動物によって消費される前に、本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物を使用して飼料からオリゴ糖を除去する方法を提供する。このプロセスにおいて、飼料は、代謝エネルギー値が増大するように構成される。酵素に加えて、ガラクトシダーゼ、セルラーゼ及びこれらの組み合わせの本開示の酵素混合物／酵素組成物を使用することができる。
【０２１２】
本開示は、本開示の組み換え酵素を含む栄養サプリメントを調製すること、及び、動物によって吸収される食品中に含まれるヘミセルラーゼの利用性を高めるためにその栄養サプリメントをその動物に投与することによって、動物の飼料中の栄養補助として本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物を使用する方法を提供する。
【０２１３】
６．４．５  廃棄物処理
本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、様々な他の工業的用途において（例えば、廃棄物処理において）使用することができる。例えば、１つの態様において、本開示は、本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物を使用した廃棄物分解方法を提供する。この方法は、実質的に処理されていない固体廃棄物の質量及び体積を低下させるステップを含んでいてもよい。固体廃棄物を、管理された温度において、酵素溶液（本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物を含む）の存在下で、酵素による消化作用によって処理することができる。これによって、加えた微生物に起因した感知可能な細菌発酵を伴わない反応が生じる。固体廃棄物は、液体化された廃棄物と任意の残留固形物廃棄物とに変換される。その生じた液化廃棄物をその任意の残留廃棄物固化体から分離することができる。例えば、米国特許第５７０９７９６号を参照されたい。
【０２１４】
６．４．６  洗浄剤、消毒薬及び洗浄組成物
本開示は、本開示の１つ又はそれ以上の酵素、酵素混合物／酵素組成物を含む洗浄剤組成物、消毒薬組成物又はクレンザー（掃除又は洗浄）組成物、これらの組成物の製造方法及び使用方法を提供する。本開示は、洗浄剤、消毒薬又はクレンザー組成物の既知のすべての使用方法を組み込む。例えば、米国特許第６４１３９２８号、第６３９９５６１号、第６３６５５６１号、第６３８０１４７号を参照されたい。
【０２１５】
特定の実施形態において、本発明の洗浄剤組成物、消毒薬組成物又はクレンザー組成物は、一要素水性組成物及び二要素水性組成物、非水性液体組成物、鋳造固体(cast solid)、顆粒形態、微粒子形態、圧縮錠剤、ゲル形態及び／又はペースト形態及び／又はスラリー形態であってもよい。本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物は、固体又は液体の形態において、洗浄剤、消毒薬又はクレンザーの添加物製品として使用することができる。そのような添加物製品は、従来の洗剤組成物の性能を補い又は高めるように意図されており、洗浄工程のあらゆる段階において加えることができる。
【０２１６】
本開示は、硬表面を洗浄するための洗剤組成物、生地を洗浄するための洗剤組成物、食器洗浄組成物、口内クリーニング組成物、義歯クリーニング組成物、及び、コンタクトレンズ清浄液を含む洗浄組成物を提供する。
【０２１７】
本開示の酵素が洗濯機洗浄方法において使用するに適した組成物の成分である場合には、その組成物は、本開示の酵素、酵素混合物／酵素組成物に加えて、界面活性剤及びビルダー化合物の両方を含んでいてもよい。これらは、１つ又はそれ以上の洗浄剤成分（例えば、有機ポリマ化合物、漂白剤、さらなる酵素、泡抑制剤、分散剤、石灰石鹸分散剤、土懸濁及び再沈着阻害剤、及び、腐食阻害剤）をさらに含んでいてもよい。
【０２１８】
本開示の洗濯組成物は、さらなる洗浄剤成分として、柔軟剤をさらに含んでいてもよい。カルボヒドラーゼを含むそのような組成物は、洗濯用洗剤組成物として製剤された場合には、生地清浄、染み抜き、白色度保持、柔軟化、色外観、染料移動阻害、及び、消毒を提供することができる。
【０２１９】
上に述べたように、本開示は、ヘミセルロースを含むバイオマス材料を糖化するプロセスにさらに提供する。そのようなバイオマス材料は、選択的にセルロースを含むものであってもよい。限定されるものではないが、例示的バイオマス材料には、トウモロコシ穂軸、スイッチグラス、モロコシ、及び／又は、バガスが含まれる。従って、本開示は、本明細書に記載されている酵素混合物／酵素組成物によって、ヘミセルロース及び選択的にセロースを含むバイオマス材料を処理するステップを含む糖化方法を提供する。本発明のそのような方法において使用される酵素混合物／酵素組成物は、バイオマス材料中のヘミセルロース１ｋｇ当たりに、０．５ｇ〜４０ｇ（例えば、０．５ｇ〜２０ｇ、０．５ｇ〜３０ｇ、０．５ｇ〜４０ｇ、０．５ｇ〜１５ｇ、０．５ｇ〜１０ｇ、０．５ｇ〜５ｇ、０．５ｇ〜７ｇなど）のキシラナーゼ活性を有するポリペプチドを含む。本発明のそのようなプロセスにおいて使用される酵素混合物／酵素組成物は、バイオマス材料中のヘミセルロース１ｋｇ当たり、１ｇ〜４０ｇ（例えば、２ｇ〜２０ｇ、３ｇ〜７ｇ、１ｇ〜５ｇ、又は、２ｇ〜５ｇなど）のキシラナーゼ活性を有するポリペプチドをさらに含んでいてもよい。そのようなプロセスにおいて使用される酵素混合物／酵素組成物は、バイオマス材料中のヘミセルロース１ｋｇ当たり、０．５ｇ〜５０ｇ（例えば、０．５ｇ〜５０ｇ、０．５ｇ〜４５ｇ、０．５ｇ〜４０ｇ、０．５ｇ〜３０ｇ、０．５ｇ〜２５ｇ、０．５ｇ〜２０ｇ、０．５ｇ〜１５ｇ、０．５ｇ〜１０ｇなど）のα−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドを含んでいてもよい。そのようなプロセスにおいて使用される酵素混合物／酵素組成物は、バイオマス材料中のヘミセルロース１ｋｇ当たり、１ｇ〜５０ｇ（例えば、２ｇ〜４０ｇ、４ｇ〜２０ｇ、４ｇ〜１０ｇ、２ｇ〜１０ｇ、又は、３ｇ〜７ｇなど）のα−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチドをさらに含んでいてもよい。本発明のそのようなプロセスにおいて使用される酵素混合物／酵素組成物は、バイオマス材料中のヘミセルロース１ｋｇ当たり、０．２ｇ〜２０ｇ（例えば、０．２ｇ〜１８ｇ、０．２ｇ〜１５ｇ、０．３ｇ〜１０ｇ、０．２ｇ〜８ｇ、又は、０．２ｇ〜５ｇなど）のＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを含んでいてもよい。本発明のそのようなプロセスにおいて使用される酵素混合物／酵素組成物は、バイオマス材料中のヘミセルロース１ｋｇ当たり、０．５ｇ〜２０ｇ（例えば、１ｇ〜１０ｇ、１ｇ〜５ｇ、２ｇ〜６ｇ、０．５ｇ〜４ｇ、又は、１ｇ〜３ｇなど）のＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチドを含んでいてもよい。酵素混合物／酵素組成物は、バイオマス材料中のセルロース１ｋｇ当たり、１ｇ〜１００ｇ（例えば、１ｇ〜１００ｇ、２ｇ〜８０ｇ、３ｇ〜５０ｇ、５ｇ〜４０ｇ、２ｇ〜２０ｇ、１０ｇ〜３０ｇ、又は、１２ｇ〜１８ｇなど）のセルラーゼ活性を有するポリペプチドをさらに含んでいてもよい。選択的に、α−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドの量は、セルラーゼ活性を有するポリペプチドの全重量の５０％以内を構成することができる。
【０２２０】
本発明の好適な方法は、好ましくは、処理されたバイオマス材料のヘミセルロースキシランから６０％〜９０％のキシロースを生じさせる。好適なバイオマス材料には、例えば、トウモロコシ穂軸、スイッチグラス、モロコシ、及び／又は、バガスの１つ以上が含まれる。同様に、本発明の方法は、好ましくは、これらのバイオマス材料の１つ又はそれ以上に由来するヘミセルロースキシランから少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％）のキシロースを産出する。限定されるものではないが、例えば、この方法によって、トウモロコシ穂軸、スイッチグラス、モロコシ及び／又はバガスを含むヘミセルロース含有バイオマス材料のヘミセルロースキシランから６０％〜９０％のキシロースが生じる。本発明のプロセスは、さらに、単糖を回収するステップを選択的に含む。
【０２２１】
本発明を以下の実施例によってさらに説明する。以下の実施例は説明のみを目的として提供する。以下の実施例は、いかなる態様においても、本発明の範囲又は内容を限定するものとして解釈してはならない。
【０２２２】
７．実施例１：代表的実験的方法
７．１  材料及び方法
以下の分析／方法を実施例１及びその後の実施例において使用した。以下に提供するプロトコルからのあらゆる逸脱が示されている。
７．１．１  植物組織からのヘミセルロースの調製
ヘミセルロース調製物は、Erbringerova et al. (Carbohydrate Polymers 1998, 37:231)によって記載されているＮａＯＨ／音波処理の変形を使用して調製した。乾燥した植物性材料を１ｍｍのふるいを通るように粉砕し、この材料１０ｇを５％(wt/v)の２５０ｍＬのＮａＯＨに懸濁した。この懸濁液を撹拌せずに８０℃で３０分間加熱し、次に、それをハイのセッティングでプローブソニケータ(probe sonicator)を使用して環境温度で１５分間にわたって超音波処理した。この懸濁をさらに３０分間８０℃に戻し、次に、室温に冷ました。
【０２２３】
固形分を３０００Ｇにおける１５分間の遠心分離によって懸濁液から除去した。得られた上澄みを氷上で冷却した１Ｌのエタノールの中に移した。３０分後に、最初に沈殿物の上の透明な液体を移し、その沈殿物を完全に空気乾燥させずに濾過することによって沈殿物を回収した。濾過ケーキを冷たい２００ｍＬの８０％エタノールで洗浄し、その後、それを空気乾燥させずにろ過機から除去した。その濾過ケーキを２００ｍＬの水に再溶解し、その溶液のｐＨを酢酸を用いて５．５に調節した。抽出した糖を氷上の１Ｌのエタノールに加え、上述した濾過によって再び回収した。その濾過ケーキを冷凍し、残存する溶媒及び水を凍結乾燥によって除去した。回収した糖の収率は、組織及び調製物に応じて変化し、出発植物材料の６％〜２３％の範囲であった。
【０２２４】
７．１．２  バイオマス基質の希アンモニア前処理
ＷＯ０６１１０９０１Ａ（明示的に別段の定めがない限り）に記載されている方法及び処理範囲に従った酵素による加水分解の前に、トウモロコシ穂軸及びスイッチグラスを前処理した。
【０２２５】
７．１．３  バイオマスの構成の分析
「Determination of structural carbohydrates and lignin in the biomass」 (http://www.nrel.gov/biomass/pdfs/42618.pdfにおいて利用可能なNational Renewable Energy Laboratory, Golden, CO 2008)に記載されている２ステップの酸加水分解方法を使用してバイオマス基質の組成を測定した。開始時の基質のグルカン及びキシランの含有量から得た理論収率に対する反応率によって酵素による加水分解の結果を報告する。
【０２２６】
７．１．４  アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸からの未処理オリゴマーの調製
ヘミセルラーゼを選別するための未処理オリゴマーを以下の処理によってトウモロコシ穂軸から調製した。ハンマーで粉砕したトウモロコシ穂軸（平均径が〜１／４）に６％アンモニア(wt/wt)を加えたものを、撹拌圧力反応装置中に蒸気を直接噴射することによって１４５℃に加熱した。２０分後に、〜０．１バールの最終真空において反応装置から過剰なアンモニアを流出させた。その後、酵素による糖化のために、アンモニアに前処理されたトウモロコシ穂軸を無菌撹拌反応器内に置いた。すべての添加を行った後に、充分な水を加えることによって２５％(w/w)の最終全固形分投与量を得た。４Ｎ硫酸を用いて反応装置のｐＨをｐＨ５．３で維持し、温度を４７℃に制御した。スペザイム(Spezyme)（商標）ＣＰ、マルチフェクト(Multifect)（商標）キシラナーゼ(Danisco US社、Genencor)、及び、ノボ１８８(Novo 188)(Novozymes、デンマーク)を、セルロース１ｇ当たりそれぞれ２０ｍｇ、１０ｍｇ及び５ｍｇの投与量で加え、前処理されたトウモロコシ穂軸を１１６時間にわたって糖化して糖及びオリゴマーにした。次に、その材料を３３℃に冷まし、４Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨ５．８に調節した。次に、米国特許第７３５４７５５号に記載されているように、組み換えジモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)株の種培養物（１０％の全容積、ＡＴＣＣ登録番号No. PTA-1798）を加えることによってグルコース及びキシロースを発酵させてエタノールにした。グルコースのすべて及び〜９５％のキシロースが消費されるまで発酵が進行した。培養液の分割単位０．５Ｌを２０分間の遠心分離（２１０００Ｇ）によって浄化し、その後に、０．２ミクロンのフィルタ濾過ユニット(Nalgene)によって上澄みを濾過した。そのろ過した培養液から、３５℃で維持された回転蒸散装置上で家庭用掃除機により、エタノールを除去した。後者の処理によって最終液の全体積を１／４に減らした。
【０２２７】
７．１．５  総タンパク分析
タンパクサンプルの特性（すなわち、精製された発酵培養液、商品等）に応じて、異なる総タンパク定量法を使用した。ＢＣＡタンパクアッセイは、分光光度計を用いてタンパク濃度を測定する比色測定法の一例である。
【０２２８】
試薬：ＢＣＡタンパクアッセイキット(Pierce Chemical、プロダクトＮｏ．23227)、５０ｍＭ  酢酸ナトリウムバッファｐＨ５．０、１５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、０．１Ｎ  ＮａＯＨ、ＢＳＡストック液、（タンパクアッセイキットの）試薬Ａ及び試薬Ｂ
【０２２９】
手順：５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファを使用して試験管内で酵素希釈液を調製した。希釈した酵素溶液（０．１ｍＬ）を、１ｍＬの１５％ＴＣＡを含む２ｍＬのエッペンドルフ遠心分離チューブに加えた。それらのチューブを攪拌し、氷浴中に１０分間置いた。その後、サンプルを１４０００ｒｐｍで６分間遠心分離した。その上澄みを注ぎ出し、ペレットを１ｍＬの０．１Ｎ  ＮａＯＨに再懸濁し、ペレットが溶解するまでチューブを攪拌した。２ｍｇ／ｍＬのストック液からＢＳＡ標準溶液を調製した。２５ｍＬの試薬Ａに０．５ｍＬの試薬Ｂを混合することによって、ＢＣＡ希釈標準溶液を調製した。再懸濁したタンパク（各０．１ｍＬ）を３つのエッペンドルフ遠心分離チューブに加えた。２ｍＬのピアスＢＣＡ希釈標準溶液(Pierce BCA working solution)を、サンプル及び段階希釈したＢＳＡ標準溶液の各エッペンドルフチューブに加えた。すべてのチューブを３７℃の水槽中で３０分間インキュベートした。その後、サンプルを室温（１５分）に冷まし、分光光度計において５６２ｎｍの吸収度を測定した。
【０２３０】
計算：それぞれのＢＳＡタンパク標準吸光度の平均値を算出し、その平均値を、Ｘ軸を吸収度とし、Ｙ軸を濃度（ｍｇ／ｍＬ）としてプロットした。線形曲線当てはめを適用し、式：ｙ＝ｍｘ＋ｂを用いて線の方程式を計算した。
【０２３１】
酵素サンプルの生の濃度を、ｘの値を吸収度に置き換えることによって計算した。希釈係数を乗算することによって総タンパク濃度を算出した。
【０２３２】
精製したサンプルの総タンパクを、Ａ２８０(例えば、Pace et al., Protein Science, 1995, 4:2411参照)によって決定した。
【０２３３】
いくつかのタンパクサンプルを、Weichselbaum及びGornallによってウシ血清アルブミンを標準物質として用いて変更されたビウレット法（変更されたビウレット）を使用して測定した(Weichselbaum, Amer. J. Clin. Path. 1960, 16:40; Gornall et al., J. Biol. Chem. 1949, 177:752)。
【０２３４】
クジェルダール(Kjeldahl)(rtech laboratories, www.rtechlabs.com)によって、又は、社内におけるデュマスメソッド(the DUMAS method)(TruSpec CN, www.leco.com)(SADER, et al. Archives of Veterinary Science, 9(2):73-79, 2004)によって、放出された窒素の燃焼、捕捉及び測定によって、総窒素として、発酵産物の総タンパク含有量を時々測定した。複雑なタンパク含有サンプル（例えば、培養液）については、平均１６％の窒素含有量、及び、タンパクに対する窒素の換算係数６．２５を使用した。いくつかの場合においては、緩衝する非タンパク窒素を除去するために、総沈殿タンパクを測定した。１２．５％の最終ＴＣＡ濃度を使用し、タンパク含有ＴＣＡペレットを０．１Ｍ  ＮａＯＨに再懸濁した。
【０２３５】
他の場合においては、クマシィプラス・ベターブラッドフォードアッセイ(Coomassie Plus- the Better Bradford Assay)(Thermo Scientific, Rockford, IL プロダクトＮｏ．23238)を、供給業者の推奨に従って使用した。
【０２３６】
７．１．６  合成基質（パラニトロフェニル基質）活性アッセイ
クローンした遺伝子のトリコデルマリーゼイ発現から得た活性タンパクを、モデル基質アッセイを用いて確認した。４−ニトロフェニルα−Ｌ−アラビノフラノシド（ｐＮＰＡ、Sigma N3641）及び４−ニトロフェニルβ−Ｄグルコピラノシド（ｐＮＰＧ、Sigma N7006）及び４−ニトロフェニルβ−Ｄキシロピラノシド（ｐＮＰＸ、Sigma N2132）等の合成基質に対するセルラーゼ活性及びヘミセルラーゼの活性を以下のように測定した。１００ｍＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．８）に３０ｍｇの合成基質を溶解させることによって、基質溶液を調製した。反応を停止させるための炭酸ナトリウム（１Ｍ）を調製した。基質溶液（１００μＬ）をコースタ(Costar)９６ウェルプレート（カタログＮｏ．９０１７）に分注した。２０μＬの酵素サンプルを、マイクロタイタープレートウェルに分注した。そのマイクロタイタープレートを、サーモミキサＲ加熱及び冷却用振盪機(Thermomixer R heating and cooling shaker)（エッペンドルフ）を使用して、５０℃で１０分間インキュベートした。反応を停止させるために、５０μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムを各ウェルに加えた。スペクトラマックス３４０Ｃ３８４マイクロプレート分光光度計(Molecular Devices)を用いて、４００ｎｍの波長における吸収度を測定した。ｐ−ニトロフェノール標準曲線を使用することによって、１ｍＬ当たりの単位を決定した。クアッド欠損トリコデルマ宿主（ｃｂｈ１遺伝子、ｃｂｈ２遺伝子、ｅｇｌ１遺伝子及びｅｇｌ２遺伝子を欠損させたもの、ＷＯ０５／００１０３６参照）を、このバックグラウンドにおいて発現された酵素の活性のためのコントロールとして、酵素サンプルと共に分析した。
【０２３７】
７．１．７  トウモロコシ穂軸糖化分析
通常は、マイクロタイタープレート形式におけるトウモロコシ穂軸の糖化を以下の手順に従って実行した。バイオマス基質である希アンモニア前処理トウモロコシ穂軸を水で希釈し、硫酸でｐＨ調節することによって、ｐＨ５、７％セルローススラリーを生成した。それを分析においてそのまま使用した。試験した酵素は、市販のセルラーゼ製品（例えば、アクセレラーゼ（商標）１０００、アクセレラーゼ（商標）１５００）(Danisco US社、Genencor）と、トリコデルマリーゼイ培養液と、精製した酵素とを含んでいた。トウモロコシ穂軸基質中のセルロース１グラム当たりの総ｍｇタンパク（組成分析によって決定される）に基づいて、酵素を投与した。必要とされる体積で所望の投与濃度を得るために、これらの酵素を５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で希釈した。１ウェル当たり、４０マイクロリットルの酵素溶液を、７％セルロースの７０ｍｇの希アンモニア前処理トウモロコシ穂軸に加えた（最終的に４．５％セルロースに相当する）。その分析プレートを室温で１０分間インキュベートした。それらの分析プレートをアルミプレートシーラーで覆い、それらのプレートを５０℃において２００ｒｐｍで３日間インキュベートした。インキュベートの終了時に、１ウェル当たり１００μＬの１００ｍＭグリシンバッファ（ｐＨ１０．０）を加え、そのプレートを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、糖化反応を停止させた。９６ウェルＨＰＬＣプレート中の２００μＬのミリＱ水に１０マイクロリットルの上澄みを加え、可溶性の糖をＨＰＬＣによって測定した。これは、本明細書の複数の実施例において使用した典型的な方法について説明している。特定の実施例においては、変更したプロトコルを用いてトウモロコシ穂軸の糖化を測定した。その変更は個々の実施例に記載されている。
【０２３８】
７．１．８  ＨＰＬＣによる糖分析
通常は、遠心分離による不溶性材料の除去、０．２２μｍのナイロンフィルタ(Spin-X centrifuge tube filter, Corning Incorporated, Corning, NY)による濾過、及び、可溶性糖を適正濃度にするための蒸留水による希釈によって、トウモロコシ穂軸の糖化加水分解からサンプルを調製した。６×５０ｍｍのＳＨ−１０１１Ｐガードカラム(www.shodex.net)を用いて、ショデックス・シュガー(Shodex Sugar)SH-G SH1011, ８×３００ｍｍによってモノマー糖を測定した。溶媒は、０．６ｍＬ／分で流した０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４であった。カラム温度は５０℃であった。また、屈折率検出器を使用して検出を実行した。グルコース、キシロース及びアラビノースの外部標準を各サンプルセットと共に流した。本明細書の特定の実施例は、プロトコルをやや変更したセットと同じ結果を得るためのプロトコルを使用している。プロトコルに対する具体的な変更は個々の実施例に記載されている。
【０２３９】
トソー・バイオセップ(Tosoh Biosep)Ｇ２０００ＰＷカラム７．５ｍｍ×６０ｃｍ(www.tosohbioscience.de)を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって、オリゴマー糖を分離した。溶媒は０．６ｍＬ／分の蒸留水であり、そのカラムを室温において用いた。サイズキャリブレーションに使用した六炭糖標準は、スタキオース、ラフィノース、セロビオース及びグルコースであった。五炭素糖は、キシロヘキソース、キシロペントース、キシロテトロース、キシロトリオース、キシロビオース及びキシロースであった。キシロオリゴマーをメガザイム(www.megazyme.com)から得た。検出は屈折率によるものであり、定量的に報告されている場合には、結果は、ピーク面積単位、又は、パーセントによる相対ピーク面積のいずれかである。
【０２４０】
遠心分離及びろ過によって浄化した上記サンプルの酸加水分解によって、可溶性糖の総量を測定した。０．８Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いて浄化したサンプルを１：１で希釈し、その溶液を、１２１℃で１時間の全サイクル時間にわたって、キャップをしたバイアル内で滅菌した。結果は、加水分解中のモノマー糖の損失を補正することなく報告されている。
【０２４１】
７．１．９  ＨＰＬＣによるタンパク分析
組込発現株の１４Ｌの発酵から培養液に含まれていた酵素を分離及び定量するために、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及び質量分析（ＭＳ）を実行した。ストレプトミセス・プリカタス(S. plicatus)（例えば、NEB P0702L）から組み換え技術によって発現させたエンドＨグリコシダーゼを用いて酵素サンプルを最初に処理した。エンドＨは、サンプル総タンパクの１μｇ当たり０．０１μｇ〜０．０３μｇのエンドＨタンパクの比率で使用し、ＨＰＬＣ分析の前にＮ結合した糖鎖結合を酵素によって除去するために３７℃においてｐＨ４．５〜６．０で３時間インキュベートした。その後、約５０μｇのタンパクを、ＨＩＣフェニルカラムを備えたアジレント(Agilent)１１００ＨＰＬＣシステムを使用した疎水性相互作用クロマトグラフィに注入し、濃縮培養液のサンプルに対して高から低の塩勾配を３５分以上実行した。この勾配は、高塩バッファＡ（４Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．７５）と、低塩バッファＢ（２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．７５）とを使用して達成した。２２２ｎｍの紫外線を用いてピークを検知し、画分を回収し、質量分析によって同定した。
【０２４２】
７．１．１０  カルコフロールホワイトを使用したセルラーゼ活性分析
カルコフロールホワイト検出方法(Appl. Biochem. Biotechnol. 161:313-317)を使用して、ＰＡＳＣに対するセルラーゼ活性を測定した。使用したすべての化学物質は分析用グレードであった。アビセル(Avicel)ＰＨ−１０１は、ＦＭＣバイオポリマ(フィラデルフィア、ペンシルベニア州)から購入した。カルコフロールホワイトはシグマ(セントルイス、ミズーリ州)から購入した。「Walseth, TAPPI 1971, 35:228 and Wood, Biochem. J. 1971, 121:353-362」の適合したプロトコルを使用して、アビセルＰＨ−１０１からリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）を調製した。簡潔に、アビセルを濃縮リン酸中に溶解させ、次に、冷却した脱イオン水を使用して沈殿させた。セルロースを回収し、ｐＨを中性にするためにさらなる水で洗浄した後に、それを、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）中で１％固形分となるように希釈した。
【０２４３】
すべての酵素希釈液を５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）に入れた。直線検量線を作成するために、ＧＣ２２０セルラーゼ（Danisco US社、Genencor)を、ＰＡＳＣ１ｇに対して、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ及び１５ｍｇのタンパクとなるように希釈した。検量線の範囲内となるように、すなわち、０．１〜０．４の生成率の反応を得るように、試験するサンプルを希釈した。９６ウェルマイクロタイタープレート中の２０μＬの酵素溶液に対して、１５０μＬの冷たい１％ＰＡＳＣを加えた。そのプレートを覆ってイノーバ(Innova)インキュベータ／振盪機において２００ｒｐｍで５０℃で２時間インキュベートした。５０μｇ／ｍＬのカルコフロールを含む１００ｍＭグリシン１００μＬ(ｐＨ１０)を用いてこの反応を停止した。蛍光マイクロプレートリーダ(SpectraMax M5 by Molecular Devices)で励起波長Ｅｘ＝３６５ｎｍ及び放射波長Ｅｍ＝４３５ｎｍにおいて蛍光を測定した。その結果（図２５に示す）は、下記式：ＦＰ＝１−（Ｆｌサンプル−Ｆｌバッファ）／（Ｆｌゼロ酵素−Ｆｌバッファ)による生成率として表されている。ここで、ＦＰは生成率(fraction product)であり、Ｆｌは螢光単位である。
【０２４４】
７．１．１１  フザリウム・バーティシリオイデスの培養、及び、細胞外タンパクにおいて検出される主要なヘミセルラーゼ活性の精製
野性型フザリウム・バーティシリオイデスの供給源は、Fuchs et al., Fungal Genetics and Biology 2004, 41:852-863のTable 1に記載されている通りである。真菌は、「Li et al., Applied Biochemistry and Biotechnology 2005, (121-124):321-334」に記載されている方法の変形を使用してデンプンを除去したトウモロコシ穀粒繊維を使用して培養した。
【０２４５】
２００ｇのトウモロコシ果皮を３Ｌの水道水中にスラリーにし、それを５ｍＬ（５００ｍｇ）の高温のアミラーゼ・リコザイムＳＣ ＤＳ(Novozymes, Denmark)と共に８０℃に加熱することによって、トウモロコシ乾燥粉砕分別から得た乾燥トウモロコシ果皮部分からデンプンを除去した。この混合物を、ヘラで時々撹拌し、３０分間にわたって８０℃に保持し、次に、約２時間にわたって室温に冷ました。部分的に脱水するために、得られたスラリーを２０メッシュのふるいの上に移した。ふるいの上の固形分を、４Ｌの水道水でさらに洗浄し、６０℃のオーブンで最終乾燥させる前に、一昼夜にわたって空気乾燥した。１ｍｍのふるいを通るように、使用前に、この乾燥した材料をナイフ粉砕機において粉砕した。
【０２４６】
フザリウム・バーティシリオイデス培養液をポテトデキストロース寒天培地（Sigma P6685）の上に保持し、そのプレートから得た菌糸を２４ｇ／Ｌのポテトデキストロースのリッチ増殖培地に植菌した。この増殖培養液を１３０ｒｐｍで攪拌しながら３０℃で３日間培養した。３日間の増殖の後に、トウモロコシ果皮誘導培地に植菌するために、その得られた１５０ｍＬの細胞塊及び使用済み培地を使用した。この誘導培地は、８０ｇのデンプン除去トウモロコシ果皮を含む１Ｌの基本培地（１５ｇのＫＨ２ＰＯ４、５ｇの硫酸アンモニウム、２０ｇの酵母抽出物、０．５ｇの硫酸マグネシウム、及び、１ｇのトウィーン８０、ｐＨ４．８）であった。その培養液を、１３０ｒｐｍで７日間攪拌しながら３０℃に保持した。２０分間の２０００Ｇの遠心分離によって、使用済みの穀粒及び真菌細胞塊から細胞外タンパクを分離した。その部分的に浄化された上澄みを、０．４５μｍのフィルタに通し、次に、０．２２μｍのフィルタに通した。その浄化した濾液は、使用するまで４℃で保存した。３０ｋＤ遮断機能を備えたアミコン(Amicon)ウルトラ４遠心分離フィルタ(Millipore)を用いて、この濾液を約１４倍に濃縮した。最初にタンパクを５０ｍＭ  ｐＨ６．３（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸・ＮａＯＨ（ＭＥＳ）バッファにバッファ交換し、次に、ＧＥヘルス・サイエンス・Ｑ−セファロース・ファスト・フロー・第４級アミン陰イオン交換カラム（ＭＥＳバッファを用いて平衡化した２０ｍＬのカラム体積）にタンパクを適用することによって、真菌上澄みから、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＬＡＲＦ）活性体及びβ−キシロシダーゼ（ＢＸＬ）活性体を精製した。使用したタンパク浄化システムは、ユニコーン・ソフトウェア(Unicorn software)を用いたＧＨヘルス・サイエンス・アクタ・システム(GH Health Sciences Akta system)であった。ＭＥＳバッファ中の０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配によってタンパクを溶出させた。カラム画分における活性は、（ＢＸＬ活性のために）４−ニトロフェニルα−Ｄ−キシロピラノシドを使用して、又は、（ＬＡＲＦ活性のために）４−ニトロフェニルα−Ｌ−アラビノフラノシドを使用して、モニターした。いずれの場合においても、２μＬのカラム画分を、９
５μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）及び５μＬのｐ−ニトロフェニル基質に対して加え、混合し、２３℃で２分間インキュベートした。１００μＬの１Ｎ炭酸ナトリウム停止液を加え、４０５ｎｍの吸収度を測定した。
【０２４７】
陰イオン交換システムから活性酵素画分を回収し、アミコン・セントリプレップ濾過(Amicon Centriprep)によって濃縮し、上述した同じタンパク浄化システムを使用して、ＧＥヘルス・サイエンス・ＳＰ−セファロース・ファスト・フロー・スルホプロピル・陽イオン交換カラム（酢酸ナトリウムバッファを用いて平衡化された２０ｍＬのカラム体積）に適用した。酢酸ナトリウムバッファ中の０〜１Ｍ  ＮａＣｌ勾配を用いてタンパクを溶出させ、画分中の活性を上述したようにモニターした。その後、活性画分を、回収及び保存し、必要に応じて濃縮した。活性画分中のタンパクをＭＳ−ＭＳによって同定した。
【０２４８】
７．１．１２  ＭＳ−ＭＳによるタンパク分析
フザリウム・バーティシリオイデス・ファミリーＧＨ５４  Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＬＡＲＦ）、ファミリーＧＨ５１  ＬＡＲＦ、２つのファミリーＧＨ３  β−キシロシダーゼ、ファミリーＧＨ３０  β−キシロシダーゼ（ＢＸＬ）の代表的な集合の同定を以下に記載する。
【０２４９】
ＧＨ５４  ＬＡＲＦを同定するために、上記精製処理から得た２５０μＬの「画分Ｂ３」（０．３５ｍｇタンパク）に、２００μＬの１Ｎ  ＨＣｌ(EM Industries、Hawthorne、ニューヨーク州)を加え、そのサンプルを１０分間で氷で冷却した。次に、２００μＬの５０％ＴＣＡ(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)を加え、タンパクを沈殿させるためにそのサンプルを氷で１０分間冷やした。サンプルを１６０００ｒｃｆで２分間遠心分離し、上澄みを破棄した。ペレット化したタンパクを９０％の冷たいアセトン(J.T. Baker、Phillipsburg、ニュージャージー州)で洗浄し、次に、それを１６０００ｒｃｆで１分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレットを空気乾燥するために放置した。最初に３０μＬの８Ｍ尿素(MP Biomedicals、Solon、オハイオ州)をペレットに加え、次に、４μＬの０．２Ｍ  ＤＴＴ(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)を加えた。サンプルを５２℃で３０分間インキュベートし、次に、４μＬの０．４４Ｍヨードアセトアミド(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)を加え、その溶液を暗闇で室温において３０分間インキュベートした。次に、１２０μＬの０．１％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド水(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)をゆっくり加え、次に、サンプルを二等分した。サンプルの半分に、７．５μｇのトリプシン(Promega社、Madison、ウィスコンシン州）を加え、他の半分に、４μｇのＡｓｐＮ(Roche Applied Science社、Indianapolis、インディアナ州)を加えた。両方のサンプルを３７℃で１時間インキュベートした。ＴＦＡの最終体積が０．１％となるように、１０％トリフルオロ酢酸(Thermoscientific社、Waltham、マサチューセッツ州)を用いてサンプルの反応を停止させた。両方のサンプルを、サーモフィンガン(Thermofinnigan)（サンノゼ、カリフォルニア州）ＬＣＱデカ・エレクトロスプレイ・イオン化（ＥＳＩ）イオントラップ質量分析装置に流した。バイダックＣ１８(Vydac C18)カラム（５μ、３００Ａ、０．２×１５０ｍｍ、Michrom Bioresources社、Auburn、カリフォルニア州）は、２００μＬ／分の流速で実行した。注入体積は、５０μＬであり、カラムに投与する前にオンライント・ラッピング・カートリッジ(on-line trapping cartridge)(Peptide CapTrap、Michrom Bioresources、Auburn、カリフォルニア州)によってろ過した。分解物の分離は、勾配(溶媒Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液(J.T. Baker、Phillipsburg、ニュージャージー州)、溶媒Ｂ：０．０８％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル(J.T. Baker, Phillipsburg、ニュージャージー州)）を用いて実行した。ＧＨ５１  ＬＡＲＦ、２つのＧＨ３β−キシロシダーゼ、及び、ＧＨ３０β−キシロシダーゼを同定するために、トリプシン及びＡｓｐＮに加えてキモトリプシン(7.5μｇ、Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州)を用いてサンプルを消化した以外は、上記方法を使用した。バイオワークス(Bioworks)３．３１(Thermo、サンノゼ）のターボシークエスト(TurboSequest)サーチエンジンは、フザリウム・バーティシリオイデス・タンパクデータベースからタンパクを同定するために使用した。タンパクデータベースは、http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_verticillioides/MultiDownloads.htmlからダウンロードした。
【０２５０】
７．１．１３  希アンモニア水で前処理したスイッチグラスによるフザリウム・バーティシリオイデス酵素の誘導
希アンモニア水で前処理したスイッチグラスに対してフザリウム・バーティシリオイデス酵素を誘導するために、スイッチグラスを直径１ｍｍ未満に粉砕し、次に、それを６％アンモニアによって、乾燥重量に基づいて５０％の初期乾燥物質において、１６０℃の最高温度で９０分間にわたって前処理した。得られた材料は、固形分が４３．３％であり、０．３３６％の残留アンモニアを含んでいた。野性型フザリウムバーティシリオイデスの培養液をポテトデキストロース寒天培地(SigmaP6685)の上に保持し、２４ｇ／Ｌポテトデキストロースのリッチ増殖培地をプレートから得た菌糸で植菌した。この増殖培養液を１４０ｒｐｍで攪拌しながら２４℃で３日間インキュベートした。その間に培養液はフザリウム細胞で不透明になった。３日間の培養の後に、１００ｍＬのベース・クリストポロス培地(base Christakapoulos media)（０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．０３％ＣａＣｌ２、０．０３％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．６１％Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１３４％ＮａＨ２ＰＯ４・１Ｈ２Ｏ、１．０％無水リン酸アンモニウム）をそれぞれ含む４つのフラスコを、得られた細胞懸濁液４ｍＬで植菌した。その懸濁液に、希アンモニア水で前処理したスイッチグラスの２グラムの乾燥物質を唯一の炭素源として加えた。その前処理スイッチグラスを添加した後に、ｐＨを６．５に調節し、フラスコを２３℃で１８０ｒｐｍで１６８時間にわたって回転させた。サイズ排除クロマトグラフィを行う前に、ｐ−ニトロフェニルアラビノフラノシダーゼ活性、ｐ−ニトロフェニルキシロシダーゼ活性及びｐ−ニトロフェニルグルコシダーゼ活性のタンパクを対象とするブラッドフォードアッセイによって、及び、酵素の誘導を対象とするＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、サンプルを異なる時点において分析した。前処理されていないそのままのスイッチグラス、２％グルコース及び無炭素源のものが対応するコントロールとして含まれていた。そのコントロールは、希アンモニア水で前処理したスイッチグラス炭素源を用いた場合よりも酵素誘導のレベルがはるかに低いことがわかった。
【０２５１】
７．１．１４  サイズ排除クロマトグラフィによるフザリウムバーティシリオイデス培養液の分画
上述した１６８時間の誘導によって発現された酵素を含むフザリウムバーティシリオイデス培地を、破片及び細胞を除去するために３５００Ｇで遠心分離した。上澄みを０．４μｍのフィルタを通して濾過することによって、透明な濃い黄色の液体を得た。この液体を、大型のアミコンウルトラ(Amicon ultra)１０Ｋ  ＭＷ分画濃縮装置（ＵＦＣ９０１０２４）において２回濃縮した（４倍）。１．７ｍＬの濃縮サンプルをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）用に保存し、前述のＢＣＡ分析によってタンパク成分を分析した。濃縮したタンパクサンプルを、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）によって平衡化したスーパーデックス(Superdex)１６／６０  ＳＥＣカラムに投与した。そのカラムを４℃において１ｍＬ／分で溶出させた。２１４ｎｍ及び２８０ｎｍにおいてサンプルの吸収度をモニターした。空隙容量を溶出させた後に、深いウェルのポリプロピレンマイクロタイタープレートに１ｍＬの画分を回収した。タンパクを含む画分を別々の深いウェルのプレートに集め、すべての画分について、ＢＣＡ分析によって総タンパク濃度を測定し、また、実施例１（合成基質活性分析）に記載されているように、ｐ−ニトロフェニルアラビノシダーゼ活性、ｐ−ニトロフェニルキシロシダーゼ活性及びｐ−ニトロフェニルグルコシダーゼ活性を測定した。
【０２５２】
７．１．１５  陽イオン交換クロマトグラフィによるトリコデルマリーゼイ発酵液からの多くのＧＨ４３、ＧＨ５１及びＧＨ３ホモログ（以下のセクション８．１）の精製
ＷＯ２００５／００１０３６に記載されているように、野性型トリコデルマリーゼイ培養液から振盪フラスコ規模で酵素を生産した。その細胞外酵素調製物を必要に応じてアミコン・セントリプレップ(Amicon Centriprep)濾過によって濃縮し、それを、ユニコーンソフトウェアを用いたＧＥヘルス・サイエンス・アクタ・システム・タンパク精製システムを使用して、ＧＥヘルス・サイエンス・ＳＰ−セファロース・ファスト・フロー・スルホプロピル・陽イオン交換カラム（酢酸ナトリウムバッファを用いて平衡化された２０ｍＬのカラム体積）に適用した。酢酸ナトリウムバッファ中の０〜１ＭのＮａＣｌ勾配によってタンパクを溶出させ、上述したように画分中の活性をモニターした。その後、活性画分を回収及び保存し、必要に応じて濃縮した。４−ニトロフェニルα−Ｄ−キシロピラノシド（ＢＸＬ活性用）又は４−ニトロフェニルα−Ｌ−アラビノフラノシド（ＬＡＲＦ活性用）を使用して、カラム画分中の活性をモニターした。いずれの場合においても、９５μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）及び５μＬのｐ−ニトロフェニル基質に対して２μＬのカラム画分を加え、それを混合し、２３℃で２分間インキュベートした。１００マイクロリットルの１Ｎ炭酸ナトリウム停止液を加え、４０５ｎｍにおいて吸収度を測定した。いくつかの場合においては、陽イオン交換の前の陰イオン交換タンパク精製工程が有用であった。この場合、酵素画分を、５０ｍＭ（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸・ＮａＯＨ（ＭＥＳ）バッファ（ｐＨ６．３）にバッファ交換した。次に、そのタンパクサンプルを、ＧＥヘルス・サイエンスＱ−セファロース・ファスト・フロー・第四級アミン陰イオン交換カラム（ＭＥＳバッファによって平衡化した２０ｍＬのカラム体積）に投与した。陽イオン交換工程に記載されているようにアクタ・タンパク精製システムを使用した。ＭＥＳバッファ中の０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配によってタンパクを溶出させた。その後、活性酵素を、陽イオン交換クロマトグラフィの前に５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）にバッファ交換した。
【０２５３】
７．１．１６  キシラナーゼの精製
２つの段階でキシラナーゼの精製を実施した。
段階１：疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
発酵液上澄みに１Ｍの最終濃度を達成するように（ＮＨ４）２ＳＯ４を加えた。使用した分離カラムは、ハイプレップ・フェニル(highsub)、１６／１０、２０ｍＬであった。
バッファＡ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０
バッファＢ：バッファＡ  ＋  １Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４
段階的溶出：４５％Ｂ；０％Ｂ；水＋１０％グリセロール
【０２５４】
段階２：ゲルろ過（ＧＦ）
ＨＩＣカラムから０％Ｂの溶出液を回収し、その溶出液をハイロード２６／６０スーパーデックス７５プレップグレード（３２０ｍＬ、GE Healthcare）カラムに投与した。移動相は、０．１５ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）であった。溶出プロファイルを図２６に示す。図２７は、ＡｆｕＸｙｎ５の２ステップ分離のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動検出を示している。
【０２５５】
トリコデルマリーゼイＸＹＮ３のタンパクを精製するために、アプライド・バイオシステムズ・ＢＩＯＣＡＤ（商標）ビジョン及びアマーシャム・ファーマシア・バイオテックＡＫＴＡエクスプローラを使用した。限外濾過濃縮物から得た約１５０ｍＬのキシラナーゼ３を、１０ｍＭのＴＥＳバッファ（ｐＨ６．８）において平衡化されたセファデックスＧ−２５Ｍ脱塩カラム（全体積５２５ｍＬ）に投与した。その後、この脱塩したサンプルの３００ｍＬ〜４００ｍＬを陰イオン交換カラム(高密度第四級アミン樹脂、Applied Biosystems社)に投与した。その後、２５ｍＭのＴＥＳバッファの８カラム体積を用いた０〜１Ｍの塩化ナトリウムの間の塩勾配を使用して、結合したタンパクを溶出させた。タンパクの溶出が０−２５０のｍＭ塩化ナトリウム間に生じた。１０％ビストリスＮＵＰＡＧＥ（商標）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動(Novex)を使用してその溶出を検出した。ビバスピン５０００ＭＷＣＯ（分子量遮断）膜濃縮装置(Vivascience、GE Healthcare)を用いて、溶出したキシラナーゼ３を含むサンプルを１０ｍＬに濃縮した。その後、この濃縮物を、ハイロード２６／６０スーパーデックス２００(ID no 17-1071-01、GE Healthcare)に投与した。１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭのＴＥＳバッファ(ｐＨ６．８)を用いてこのカラムを平衡化し、塩化ナトリウムを含むＴＥＳバッファの８カラム体積にわたって結合したタンパクを溶出させた。１０％ビストリスＮＵＰＡＧＥ（商標）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動(Novex)を使用して、溶出したタンパクの純度が９５％より高いことを測定した。
【０２５６】
７．１．１７  Ｆｖ４３Ｄの精製
フザリウムバーティシリオイデス４３Ｄの限外濾過濃縮物（ＵＦＣ）をバッファ交換し、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．０）に対して一昼夜にわたって透析した。スルホプロピル・セファロース・ファスト・フロー樹脂（ＧＥヘルスケア）が予め充填され、かつ、シリンジと共に使用されるように設計されたハイトラップ(HiTrap)１ｍＬカラムに、この透析した材料を通した。この精製したＦｖ４３Ｄを、２５０ｍＭ塩化ナトリウムと共に５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．０）を用いて溶出させた。ＧＥヘルスケアコネクタが装着された５ｍＬのシリンジを使用して、この限外濾過濃縮物及び酢酸ナトリウムバッファをカラムを通して押し出した。この精製したＦｖ４３Ｄを、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ４．０）に対して一昼夜にわたって透析した。均一性を示するために、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ及び質量分析によって、この精製したタンパクを分析した。
【０２５７】
７．１．１８  Ｆｖ５１Ａの精製
フザリウムバーティシリオイデス５１Ａの限外濾過濃縮物（ＵＦＣ）を、バッファ交換し、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）に対して一昼夜にわたって透析した。その透析した材料を、メチルスルフォナート培地が予め充填されたＲＥＳＯＵＲＣＥ１５（ＧＥヘルスケア社）６ｍＬカラムに通した。この限外濾過濃縮物を、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）に対して１ｍＬ／分で投与し、０〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム勾配を用いた５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）に対して５ｍＬ／分で溶出させた。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、その溶出した画分を回収及び分析した。精製されたＦｖ５１Ａを含む画分を、Sartorius Stemdim Biotech社の１００００ＭＷＣＯビバスピン濃縮装置を使用して濃縮した。この精製したＦｖ５１Ａを、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）に対して一昼夜透析した。均一性を実証するために、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ及び質量分析によって、この精製したタンパクを分析した。ＧＥヘルスケアから得たＡＫＴＡエクスプローラ１００システムをＦｖ５１Ａの精製に使用した。
【０２５８】
８．実施例２：トリコデルマリーゼイにおける様々な種からの個々のヘミセルラーゼ遺伝子の発現
８．１  フザリウムバーティシリオイデス遺伝子
Ｆｖ５１Ａの配列は、ＧＨ５１アラビノフラノシダーゼホモログを求めてブロード・インスティチュート・データベース（http://www.broadinstitute.org/）のフザリウムバーティシリオイデスのゲノムを検索することによって取得した。フザリウムバーティシリオイデスから得られた以下の遺伝子：Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ５１Ａ、Ｆｖ３Ｂ、Ｆｖ４３Ｃ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ３０Ａ、Ｆｖ３０Ｂ及びＦｖ４３Ｆがトリコデルマリーゼイにおいて発現されていた。Ｆｖ３Ａの配列は、フザリウムバーティシリオイデスのゲノム中のＧＨ３β−キシロシダーゼホモログを探すことによって取得した。注釈付きの配列は、シグナル配列を欠損していた。シグナル配列を含む上流配列を同定するために、遺伝子予測プログラムAugustus(http://augustus.gobics.de/)を使用した。Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｖ４３Ｅ及びＦｖ３０Ａの配列は、ＧＨ３９β−キシロシダーゼ、ＧＨ３０β−キシロシダーゼ及びＧＨ４３β−キシロシダーゼのホモログを求めてフザリウムバーティシリオイデスのゲノムを検索することによって取得した。テンプレートとしてフザリウムバーティシリオイデスから得た精製又は抽出したゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲによって、対象のヘミセルラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームを増幅した。使用したＰＣＲサーモサイクラは、DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler(BioRad Laboratories)であった。使用したＤＮＡポリメラーゼは、PfuUltra II Fusion HS ＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene社)であった。
【０２５９】
オープンリーディングフレームを増幅するために使用したプライマーは以下の通りである。
Ｆｖ３Ａ：
順方向プライマＭＨ１２４(5'-CACCATGTGGCTGACCTCCCCATT-3')（配列番号：５２）
逆方向プライマＭＨ１２５(5'-TTAGCTAAACTGCCACCAGTTGAAGTTG -3')（配列番号：５３）
Ｆｖ４３Ａ：
順方向プライマＭＨ０７５(5'-CACCATGCGCTTCTCTTGGCTATTGT-3')（配列番号：５４）
逆方向プライマＭＨ０７６(5'-CTACAATTCTGATTTCACAAAAACACC-3')（配列番号：５５）
Ｆｖ４３Ｂ：
順方向プライマＭＨ０７７(5'-CACCATGCGCTTCTCTTGGCTATTGT-3')（配列番号：５６）
逆方向プライマＭＨ０７８(5'-CTACAATTCTGATTTCACAAAAACACC-3')（配列番号：５７）
Ｆｖ４３Ｄ：
順方向プライマＭＨ０８１(5'-CACCATGCAGCTCAAGTTTCTG-3')（配列番号：５８）
逆方向プライマＭＨ０８２(5'-CTAAATCTTAGGACGAGTAAGC-3')（配列番号：５９）
Ｆｖ５１Ａ：
順方向プライマＳＫ１１５９(5'-CACCATGGTTCGCTTCAGTTCAATCCTAG-3')（配列番号：６０）
逆方向プライマＳＫ１１６０(5'-CTAGCTAGAGTAAGGCTTTCC-3')（配列番号：６１）
Ｆｖ３９Ａ：
順方向プライマＭＨ１１６(5'-CACCATGCACTACGCTACCCTCACCAC-3')（配列番号：６２）
逆方向プライマＭＨ１１７(5'-TCAAGTAGAGGGGCTGCTCACC-3')（配列番号：６３）
Ｆｖ３Ｂ：
順方向プライマＭＨ１２６(5'- CAC CAT GAA ACT CTC TAG CTA CCT CTG -3')（配列番号：６４）
逆方向プライマＭＨ１２７(5'- CTA CGA AAC TGT GAC AGT CAC GTT G -3')（配列番号：６５）
Ｆｖ３０Ａ：
順方向プライマＭＨ１１２(5'-CAC CAT GCT CTT CTC GCT CGT TCT TCC TAC-3')（配列番号：６６）
逆方向プライマＭＨ１１３(5'-TTA GTT GGT GCA GTG GCC ACG-3')（配列番号：６７）
Ｆｖ３０Ｂ：
順方向プライマＭＨ１１４(5'-CAC CAT GAA TCC TTT ATC TCT CGG CCT TG-3')（配列番号：６８）
逆方向プライマＭＨ１１５(5'-CAG CCC TCA TAG TCG TCT TCT TC-3')（配列番号：６９）
Ｆｖ４３Ｃ：
順方向プライマＭＨ０７９(5'- CAC CAT GCG TCT TCT ATC GTT TCC -3')（配列番号：７０）
逆方向プライマＭＨ０８０(5'- CTA CAA AGG CCT AGG ATC AA -3')（配列番号：７１）
Ｆｖ３９Ａ：
順方向プライマＭＨ１１６(5'-CAC CAT GCA CTA CGC TAC CCT CAC CAC-3')（配列番号：７２）
逆方向プライマＭＨ１１７ (5'-TCA AGT AGA GGG GCT GCT CAC C-3')（配列番号：７３）
Ｆｖ４３Ｅ：
順方向プライマＭＨ１４７(5'-CAC CAT GAA GGT ATA CTG GCT CGT GG-3')（配列番号：７４）
逆方向プライマＭＨ１４８(5'-CTA TGC AGC TGT GAA AGA CTC AAC C-3')（配列番号：７５）
Ｆｖ４３Ｆ：
順方向プライマＭＨ１４９(5'-CACCATGTGGAAACTCCTCGTCAGC-3')（配列番号：７６）
逆方向プライマＭＨ１５０(5'-CTA ATA AGC AAC AGG CCA GCC ATT G-3')（配列番号：７７）
pENTR/D-TOPO(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州）に直接クローニングするのを容易にするために、これらの順方向プライマは、５’末端に４つのさらなるヌクレオチド（配列ＣＡＣＣ）を含んでいた（図２８）。
【０２６０】
オープンリーディングフレームを増幅するためのＰＣＲ条件は、（Ｆｖ５１Ａを除いて）ステップ１：９４℃で２分、ステップ２：９４℃で３０秒、ステップ３：５７℃で３０秒、ステップ４：７２℃で３０秒〜４５秒であった。ステップ２、ステップ３及びステップ４をさらに２９サイクル繰り返した。ステップ５：７２℃で２分。Ｆｖ５１Ａには、ステップ１：９４℃で２分、ステップ２：９４℃で３０秒、ステップ３：５６℃で３０秒、ステップ４：７２℃で４５秒の条件を使用した。ステップ２、ステップ３、ステップ４をさらに２５サイクル繰り返した。ステップ５：４℃で維持。
【０２６１】
Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット(Qiagen社、ヴァレンシア、カリフォルニア州）を使用して、一致するヘミセルラーゼ・オープンリーディングフレームのＰＣＲ生成物を精製した。精製したＰＣＲ生成物をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにクローンし、それをＴＯＰ１０の化学的形質転換受容性の大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア州）に導入し、それを５０ｐｐｍのカナマイシンを含むＬＡプレートに蒔いた。ＱＩＡｓｐｉｎプラスミド調製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して、大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを得た。ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入されたＤＮＡの配列データは、Ｍ１３順方向プライマ及び逆方向プライマ(Sequetech社、Mountain View、カリフォルニア州）を使用して取得した。一致するヘミセルラーゼのオープンリーディングフレームの正確なＤＮＡ配列を含むｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターを、供給業者の指示に従ってＬＲクロナーゼ反応液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ）を使用して、ｐＴｒｅｘ３ｇＭデスティネーションベクター（ＷＯ０５／００１０３６、図２９）に結合し直した。次に、このＬＲクロナーゼ反応の生成物をＴＯＰ１０の化学的に形質転換受容性の大腸菌細胞に導入し、その後、それを５０ｐｐｍのカルベニシリンを含むＬＡに蒔いた。得られた発現ベクターは、ｐＴｒｅｘ３ｇＭのａｔｔＲ１部位及びａｔｔＲ２の部位と、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯのａｔｔＬ１部位及びａｔｔＬ２部位との間の組み換え現象、及び、アスペルギルスニデュランスアセタミダーゼ選択マーカ（ａｍｄＳ）によって生じた一致するヘミセルラーゼ・オープンリーディングフレームを含むｐＴｒｅｘ３ｇＭプラスミドであった。キアゲンミニプレップキット(Qiagen miniprep kit)を使用して、一致するヘミセルラーゼオープンリーディングフレームを含む発現ベクターのＤＮＡを単離した。それをトリコデルマリーゼイ胞子の遺伝子銃導入に使用した。
【０２６２】
一致するヘミセルラーゼオープンリーディングフレームを含むｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクターを有するトリコデルマリーゼイの遺伝子銃導入は、以下のプロトコルを使用して実行した。ヘリウム照射によるトリコデルマリーゼイ・セルラーゼ・クアッド欠損（Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｅｇ１、Δｅｇ２）株の形質転換は、バイオラッド(Hercules、カリフォルニア州)から得た遺伝子銃(Biolistic)（商標）ＰＤＳ−１０００／粒子デリバリシステムを供給業者の指示に従って使用して実行した（ＷＯ０５／００１０３６及びＵＳ２００６／０００３４０８参照）。形質転換体を未使用のアセトアミド選択プレートに移した（ＷＯ２００９１１４３８０参照）。炭素源としての〜２％のグルコース／ソホロース混合物（ＵＳ７７１３７２５）、１０ｍＬ／Ｌの１００ｇ／ＬのＣａＣｌ２、２．５ｍＬ／Ｌのトリコデルマリーゼイ追跡成分（４００Ｘ）：１７５ｇ／Ｌのクエン酸無水物；２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３．２のｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３の殺菌後添加を含む、２００μＬ／ウェルのグリシン最少培地（６．０ｇ／Ｌのグリシン；４．７ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；５．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４；１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；３３．０ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ；ｐＨ５．５）を含むフィルタマイクロタイタープレート(Corning社)に、安定な形質転換体を植菌した。２８℃のインキュベータに入れたＯ２リッチチャンバにおいて、液体培養液中で形質転換体を５日間培養した。フィルタマイクロタイタープレートから上澄みサンプルを真空多岐管に回収した。発現を確認するために、上澄みサンプルを、供給業者の指示に従って４％〜１２％のＮｕＰＡＧＥゲル(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州）に流した。このゲルをシンプリーブルー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、ＣＡ）を用いて染色した。トリコデルマリーゼイ発酵液からのＧＨ４３酵素、ＧＨ５１酵素及びＧＨ３酵素の精製は、実施例１に記載されている陽イオン交換クロマトグラフィによって実行した。
【０２６３】
８．２  他の種から得た遺伝子
Ｐｆ４３Ａ及びＰｆ５１Ａの配列は、ペニシリウム・フニクロスムのゲノムの配列を決定することによって取得した。ペニシリウム・フニクロスムのゲノム検索のために、公知のゲノムから入手可能な他の真菌のＧＨ４３及びＧＨ５１のホモログを使用した。イントロン配列及び開始コドンを確認するために、Ａｕｇｕｓｔｕｓ(http://augustus.gobics.de/)という名前の遺伝子予測プログラムを使用した。ブロード・インスティチュート・データベースにおいて入手可能なジベレラ・ゼアエ(Gibberella zeae)（フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)）及びフザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)のゲノムを照会して、Ｇｚ４３Ａ及びＦｏ４３Ａの配列をそれぞれ取り出すために、Ｆｖ４３Ｄ配列を使用した。天然のシグナル配列に代えてＣＢＨ１シグナル配列を用いて、GeneArt(Geneart GmbH、Regensburg、ドイツ)によって、Ｇｚ４３Ａ及びＦｏ４３Ａの遺伝子を合成した。どちらの遺伝子もイントロンを含んでいなかった。このＰｆ５１Ａ遺伝子は、コドンが最適化されたものであり、天然のシグナル配列に代えてＣＢＨ１シグナル配列を用いてＧｅｎｅＡｒｔによって合成した。
【０２６４】
下記プライマを使用してトリコデルマリーゼイにＰｆ４３Ａ及びＰｆ５１Ａをクローンし、発現させた。
Ｐｆ４３Ａ：
ＭＨ１５１(5'-CACCATGCTTCAGCGATTTGCTTATATTTTACC-3')（配列番号：７８）
Ｐｆ４３Ａ：
ＭＨ１５２(5'-TTATGCGAACTGCCAATAATCAAAGTTG-3')（配列番号：７９）
Ｐｆ５１Ａ：
ＳＫ１１６８(5'-CACCATGTACCGGAAGCTCGCCGTG-3’)（配列番号：８０）
Ｐｆ５１Ａ：
ＳＫ１１６９(5'-CTACTCCGTCTTCAGCACAGCCAC-3’)：（配列番号：８１）
【０２６５】
トリコデルマリーゼイにおいて発現させるために、アスペルギルスフミガーツスから３つの遺伝子：ＧＨ１１キシラナーゼ２（ＡｆｕＸｙｎ２）、ＧＨ１１キシラナーゼ５（ＡｆｕＸｙｎ５）及びＧＨ４３  Ａｆ４３Ａをクローンした。
【０２６６】
ＡｆｕＸｙｎ２、ＡｆｕＸｙｎ５及びＡｆ４３Ａのクローニングプライマ用のプライマを以下に示す。
ＡｆｕＸｙｎ２：
Ａ．ｆｕｍｉ−Ｑ４ＷＧ１１−Ｆ：(5'-CCGCGGCCGCACCATGGTTTCTTTCTCCTACCTGCTGCTG-3')（配列番号：８２）
Ａ．ｆｕｍｉ−Ｑ４ＷＧ１１−Ｒ：
(5'-CCGGCGCGCCCTTACTAGTAGACAGTGATGGAAGCAGATCCG-3')（配列番号：８３）
ＡｆｕＸｙｎ５：
Ａ．ｆｕｍｉ−Ｑ４ＷＦＺ８−Ｆ：(5'-CCGCGGCCGCACCATGATCTCCATTTCCTCGCTCAGCT-3')（配列番号：８４）
Ａ．ｆｕｍｉ−Ｑ４ＷＦＺ８−Ｒ：
(5'-CCGGCGCGCCCTTATCACTTGGATATAACCCTGCAAGAAGGTA-3')（配列番号：８５）
Ａｆ４３Ａ：
ＳＫ１２０３：(5'-CACCATGGCAGCTCCAAGTTTATCC-3')（配列番号:８６）
ＳＫ１２０４：(5' TCAGTAGCTCGGGACCACTC-3')（配列番号:８７）
【０２６７】
これらすべての遺伝子のクローニング及び発現に使用した方法は、フザリウム遺伝子のクローニングのために説明した手順と同様である。表１Ｂに一覧されている遺伝子を含むさらなる遺伝子を同様の方法でクローンした。
【０２６８】
９．実施例３：合成基質に対する新規なヘミセルラーゼの活性に関する試験
例えば、表２における、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ｆｖ４３Ｄ及び他の多数のタンパクの活性は、実施例１の合成基質活性分析において記載されているように、合成基質のｐＮＰＸ及びｐＮＰＡに対して試験を行った。トリコデルマリーゼイＢｘｌ１を０．７ｇ／Ｌで使用した。増殖培養液から得た体積（マイクロタイタープレート又は振盪フラスコの規模）で、他の酵素サンプル及びクアッド欠損宿主のコントロールを加えた。したがって、その絶対活量は、サンプル間で比較することはできないが、表２に示されている相対的なｐＮＰＸ活性及びｐＮＰＡ活性と共に、発現された活性タンパクの指標の１つである。パラニトロフェニル基質に対する活性は、バイオマス糖化における性能の予測因子として使用していない。
【０２６９】
１０．実施例４：前処理してトウモロコシ穂軸のセルラーゼ調製物及びヘミセルラーゼ調製物による加水分解
１０．１  発現されたタンパクの糖化性能
Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼを欠失した酵素混合物に対する添加物として、発現されたタンパクの糖化性能を評価した。アクセレラーゼ（商標）１５００／トリコデルマリーゼイＸｙｎ３／Ｆｖ３Ａの酵素混合物に対して加えることによる４日間のトウモロコシ穂軸糖化分析において、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ候補を評価した。下記の酵素及び量／濃度を用いて、トウモロコシ穂軸糖化分析（実施例１）に記載されているように、スクリーニングを実施した。
＊アクセレラーゼ（商標）１５００、総タンパク（総窒素）５４．２ｍｇ／ｍＬ
＊トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、の総タンパク２．９ｍｇ／ｍＬ（精製済）
＊Ｆｖ３Ａ、総タンパク３．２ｍｇ／ｍＬ（精製済）
＊Ｆｖ５１Ａ、総タンパク７．８ｍｇ／ｍＬ（精製済）
＊Ｍｇ５１Ａ、総タンパク６．８ｍｇ／ｍＬ（ＴＣＡ／ＢＣＡ）
＊Ａｔ５１Ａ、総タンパク６．７ｍｇ／ｍＬ（ＴＣＡ／ＢＣＡ）
＊Ｐｔ５１Ａ、総タンパク３．３ｍｇ／ｍＬ（ＴＣＡ／ＢＣＡ）
＊Ｓｓ５１Ａ、総タンパク３．０ｍｇ／ｍＬ（ＴＣＡ／ＢＣＡ）
＊Ｖｄ５１Ａ、総タンパク６．８ｍｇ／ｍＬ（ＴＣＡ／ＢＣＡ）
＊Ｃｇ５１Ｂ、総タンパク３．６ｍｇ／ｍＬ（ＴＣＡ／ＢＣＡ）
＊Ａｆ４３Ａ、総タンパク２．６ｍｇ／ｍＬ（ＴＣＡ／ＢＣＡ）
＊Ｐｆ４３Ａ、総タンパク２ｍｇ／ｍＬ（ＴＣＡ／ＢＣＡ）
＊Ｆｖ４３Ｅ、総タンパク１．３７ｍｇ／ｍＬ（ＴＣＡ／ＢＣＡ）
【０２７０】
明示的に別段の定めがない限り、精製したサンプルの総タンパク（ＴＰ）は、Ａ２８０によって決定した。明示的に別段の定めがない限り、精製されていないサンプルの総タンパクは、供給業者の指示に従ったＢＣＡによって決定した。アクセレラーゼ（商標）１５００は、セルロース１ｇ当たり２０ｍｇのタンパク量で加え、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３は、セルロース１ｇ当たり５ｍｇのタンパク量で加え、Ｆｖ３Ａは、セルロース１ｇ当たり５ｍｇのタンパク量で加えた。Ｆｖ５１Ａ、Ｍｇ５１Ａ、Ａｔ５１Ａ、Ｐｔ５１Ａ、Ｓｓ５１Ａ、Ｖｄ５１Ａ、Ｃｇ５１Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ又はＦｖ４３Ｅは、セルロース１ｇ当たり１ｍｇ、３ｍｇ及び５ｍｇのタンパク量で加えた。５０℃及び２００ｒｐｍで４日間培養した後に、分析プレートを冷やし、ＨＰＬＣによって可溶性糖について分析を行った。
【０２７１】
酵素は、この酵素混合物において、グルコース収率やキシロース収率やアラビノース収率を高めるか、又は、セロビオース濃度やキシロビオース濃度を下げることがわかった。結果を図３０Ａ及び図３０Ｂに示す。
【０２７２】
さらに、これらの発現されたタンパクの糖化性能は、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ及びβ−キシロシダーゼを欠損する酵素混合物に対する添加物としても評価した。アクセレラーゼ（登録商標）１５００／トリコデルマリーゼイＸｙｎ３の酵素混合物に対する添加による３日間のトウモロコシ穂軸糖化分析において、β−キシロシダーゼ候補を評価した。下記の酵素及び量／濃度を用いて、トウモロコシ穂軸糖化分析（実施例１）に記載されているように、スクリーニングを実施した。
＊アクセレラーゼ（登録商標）１５００、総タンパク（全窒素）５４．２ｍｇ／ｍＬ
＊トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、２．９ｍｇ／ｍＬ（精製済）
＊Ｆｖ３Ａ、３．２ｍｇ／ｍＬ（精製済）
＊Ｆｖ４３Ｄ、６．８ｍｇ／ｍＬ（精製済）
＊Ｐｆ４３Ａ、総タンパク２ｍｇ／ｍＬ（ＢＣＡ）
＊Ｐｆ４３Ｂ、総タンパク２．７ｍｇ／ｍＬ（ＢＣＡ）
＊Ｆｖ４３Ｅ、総タンパク１．３７ｍｇ／ｍＬ（ＢＣＡ）
＊Ｆｖ４３Ｆ、総タンパク２．８ｍｇ／ｍＬ（ＢＣＡ）
＊Ｆｖ３０Ａ、総タンパク２．７ｍｇ／ｍＬ（ＢＣＡ）
アクセレラーゼ（登録商標）１５００は、セルロース１ｇ当たり１７．９ｍｇのタンパク量で加えた。トリコデルマリーゼイＸｙｎ３は、セルロース１ｇ当たり５ｍｇのタンパク量で加えた。Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ａ、Ｐｆ４３Ｂ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ｆ又はＦｖ３０Ａは、セルロース１ｇ当たり、１ｍｇ、３ｍｇ及び５ｍｇのタンパク量で加えた（Ｆｖ４３Ｅは、セルロース１ｇ当たり１ｍｇ及び３ｍｇで加えた）。５０℃及び２００ｒｐｍで３日間培養した後に、分析プレートを冷やし、ＨＰＬＣによって可溶性糖について分析した。結果を図３１に示す。酵素は、この酵素混合物において、グルコース収率やキシロース収率やアラビノース収率を高めるか、又は、セロビオース濃度やキシロビオース濃度を下げることがわかった
【０２７３】
さらに、発現されたタンパクの糖化性能は、キシラナーゼを欠損する酵素混合物に対する添加物としても評価した。トリコデルマリーゼイ組込発現株の構築中（実施例９に記載されている）に、Ｂｇｌ１、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、Ｆｖ４３Ｄのタンパクを過剰発現するが、エンドキシラナーゼを過剰発現しない１つのトリコデルマリーゼイ株（株＃４４）を単離した。キシラナーゼ候補を添加する性能スクリーニングを行うためのバックグラウンドとして、この株を使用した。株＃４４から得た酵素産物に対して添加することによる３日間のトウモロコシ穂軸糖化分析において、エンドキシラナーゼ候補を評価した。下記の酵素及び量／濃度を用いて、トウモロコシ穂軸糖化分析（実施例１）に記載されているように、スクリーニングを実施した。
＊株＃４４酵素産物  総タンパク７８．６ｍｇ／ｍＬ（変更したビウレット）
＊トリコデルマリーゼイＸｙｎ３  総タンパク２．９ｍｇ／ｍＬ（精製済）
＊ＡｆｕＸｙｎ２  総タンパク３．３ｍｇ／ｍＬ（精製済）
＊ＡｆｕＸｙｎ３  総タンパク５．８ｍｇ／ｍＬ（精製済）
＊ＡｆｕＸｙｎ５  総タンパク１４．８ｍｇ／ｍＬ（精製済）
＊ＰｆｕＸｙｎ１  総タンパク１．９ｍｇ／ｍＬ（精製済）
＊ＳｓｐＸｙｎ１  総タンパク１．２ｍｇ／ｍＬ（精製済）
【０２７４】
株＃４４によって生成された酵素組成物は、セルロース１ｇ当たり２０ｍｇのタンパク量で加えた。キシラナーゼ酵素候補は、セルロース１ｇ当たり３ｍｇ及び７ｍｇのタンパク量で加えた。５０℃及び２００ｒｐｍで３日間の培養した後に、分析プレートを冷やし、ＨＰＬＣによって可溶性糖について分析を行った。酵素は、この酵素混合物において、グルコース収率やキシロース収率やアラビノース収率を高めるか、又は、セロビオース濃度やキシロビオース濃度を下げることがわかった。結果を図３２に示す。
【０２７５】
Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼを欠損した酵素混合物における発現されたＦｖ５１Ａ及びＰａ５１Ａタンパクの糖化性能を評価及び比較した。アクセレラーゼ（登録商標）１０００／トリコデルマリーゼイＸｙｎ２／Ｂｘｌ１又はＦｖ３Ａの酵素混合物に対して添加することによる３日間のトウモロコシ穂軸糖化分析において、Ｆｖ５１Ａ及びＰａ５１Ａを評価した。下記の酵素及び量／濃度を用いて、トウモロコシ穂軸糖化分析（実施例１）に記載されているように、スクリーニングを実施した。
＊アクセレラーゼ（登録商標）１０００、総タンパク（全窒素）６０．６ｍｇ／ｍＬ
＊トリコデルマリーゼイＸｙｎ２  総タンパク４．１ｍｇ／ｍＬ（精製済）
＊トリコデルマリーゼイＢｘｌ１  総タンパク（ＴＣＡ／全窒素）６９ｍｇ／ｍＬ
＊Ｆｖ３Ａ  総タンパク（ＴＣＡ／全窒素）６５ｍｇ／ｍＬ
＊Ｆｖ５１Ａ  総タンパク（ＴＣＡ／ＢＣＡ）４３ｍｇ／ｍＬ
＊Ｐａ５１Ａ  総タンパク（ＴＣＡ／全窒素）８５．４ｍｇ／ｍＬ
アクセレラーゼ（商標）１０００は、セルロース１ｇ当たり２０ｍｇのタンパク量で加えた。トリコデルマリーゼイＸｙｎ２は、セルロース１ｇ当たり５ｍｇのタンパク量で加えた。トリコデルマリーゼイＢｘｌ１又はＦｖ３Ａは、セルロース１ｇ当たり５ｍｇのタンパク量で加えた。Ｆｖ５１Ａは、セルロース１ｇ当たり５ｍｇのタンパク量で加えた。Ｐａ５１Ａは、セルロース１ｇ当たり１ｍｇ、２ｍｇ又は５ｍｇのタンパク量で加えた。５０℃及び２００ｒｐｍで３日間培養した後に、分析プレートを冷やし、ＨＰＬＣによって可溶性糖について分析した。酵素の組み合わせは、この酵素混合物において、グルコース収率やキシロース収率やアラビノース収率を高めるか、又は、セロビオース濃度やキシロビオース濃度を下げることがわかった。結果を図３３に示す。
【０２７６】
さらに、アクセレラーゼ（登録商標）１０００／トリコデルマリーゼイＸｙｎ２の酵素混合物に対する添加による３日間のトウモロコシ穂軸糖化分析において、Ｆｖ５１Ａ及びＰａ５１Ａを評価した。精製したＦｖ５１Ａ（総タンパク２９ｍｇ／ｍＬ）及びＰａ５１Ａ（２９ｍｇ／ｍＬ）を試験の一部において使用した。アクセレラーゼ（商標）１０００は、セルロース１ｇ当たり１７．５ｍｇのタンパク量で加えた。トリコデルマリーゼイＸｙｎ２は、セルロース１ｇ当たり４．４ｍｇのタンパク量で加えた。Ｆｖ５１Ａは、セルロース１ｇ当たり４．４ｍｇのタンパク量で加えた。Ｐａ５１Ａは、セルロース１ｇ当たり０．９ｍｇ、１．８ｍｇ及び４．４ｍｇのタンパク量で加えた。５０℃及び２００ｒｐｍで３日間培養した後に、分析プレートを冷やし、ＨＰＬＣによって可溶性糖について分析した。酵素の組み合わせは、この酵素混合物において、グルコース収率やキシロース収率やアラビノース収率を高めることがわかった。結果を図３４に示す。
【０２７７】
さらに、発現されたタンパクの糖化性能を、β−キシロシダーゼを欠損する酵素混合物に対する添加物としても評価した。アクセレラーゼ（登録商標）１０００／トリコデルマリーゼイＸｙｎ２／Ｆｖ５１Ａの酵素混合物に対する添加による３日間のトウモロコシ穂軸糖化分析において、β−キシロシダーゼ候補を評価した。下記の酵素及び量／濃度を用いて、トウモロコシ穂軸糖化分析（実施例１）に記載されているように、スクリーニングを実施した。
＊アクセレラーゼ（登録商標）１０００、総タンパク（ＴＣＡ／全窒素）６０．６ｍｇ／ｍＬ
＊トリコデルマリーゼイＸｙｎ２、総タンパク４．１ｍｇ／ｍＬ（精製済）
＊Ｆｖ３Ａ、総タンパク（ＴＣＡ／全窒素）６５ｍｇ／ｍＬ
＊Ｆｖ３Ｂ、総タンパク（ＴＣＡ／全窒素）６２．９ｍｇ／ｍＬ
＊Ｆｖ３９Ａ、総タンパク（ＴＣＡ／全窒素）４７．５ｍｇ／ｍＬ
＊Ｆｖ３０Ｂ、総タンパク（ＴＣＡ／全窒素）６２．９ｍｇ／ｍＬ
＊Ｆｖ５１Ａ、総タンパク（ＴＣＡ／ＢＣＡ）４３ｍｇ／ｍＬ
アクセレラーゼ（登録商標）１０００は、セルロース１ｇ当たり２０ｍｇのタンパク量で加えた。トリコデルマリーゼイＸｙｎ２は、セルロース１ｇ当たり５ｍｇのタンパク量で加えた。Ｆｖ５１Ａは、セルロース１ｇ当たり５ｍｇ量で加えた。Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ３０Ｂ、Ｆｖ３Ａ又はＦｖ３Ｂは、セルロース１ｇ当たり１ｍｇ、２ｍｇ又は５ｍｇのタンパク量で加えた。５０℃及び２００ｒｐｍで３日間培養した後に、分析プレートを冷まし、ＨＰＬＣによって可溶性糖について分析した。酵素の組み合わせは、この酵素混合物において、β−キシロシダーゼ（トリコデルマリーゼイＢｘｌ１）の有無にかかわらず、グルコース収率やキシロース収率やアラビノース収率を高めるか、又は、セロビオース濃度やキシロビオース濃度を下げることがわかった。結果を図３５Ａ〜図３５Ｃに示す。
【０２７８】
１０．２  樺材キシランを用いたエンドキシラナーゼ候補の活性分析
下記分析により基質として樺材キシランを使用して、エンドキシラナーゼ候補の活性を評価した。９０マイクロリットルの１％（重量／体積）樺材キシラン(Sigma X0502)ストック液を、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え、５０℃で１０分間予備培養した。酵素希釈物及びキシロース標準をマイクロタイタープレートに（１０μＬ）加え、それらのプレートを５０℃で１０分間インキュベートした。一方で、１００μＬのＤＮＳ溶液をＰＣＲチューブに加えた。１０分間培養した後に、ＤＮＳ溶液を含むＰＣＲ試験管に、その６０μＬの酵素反応液を移した。そのチューブをサーモサイクラにおいて９５℃で５分間インキュベートし、次に、４℃に冷やした。１００マイクロリットルの反応液を９６ウェルプレートに移し、５４０ｎｍにおける吸収度を測定した。キシロース標準曲線を作成し、活性を算出するために使用した。１キシラナーゼ単位は、この分析条件下において、１分当たり１μモルのキシロース還元糖等量を生成するのに必要な酵素量として定義される。結果を表３に示す。
【０２７９】
１０．３  糖化したトウモロコシ穂軸から得たアラビノキシランオリゴマーの酵素加水分解
この試験においては、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸をセルラーゼ調製物及びヘミセルラーゼ調製物を用いて消化した後に残存するアラビノキシランオリゴマーの酵素による加水分解をモニターした。未加工のオリゴマーの調製は実施例１に記載されている。オリゴマー糖の総量は、密封したバイアルにおいて２％(v/v)硫酸を用いて１２１℃において３０分間にわたって未加工のオリゴマーを酸加水分解した後に、ＨＰＬＣによって測定した（実施例１参照）。糖濃度は、同一の手順で処理した既知の糖混合物のコントロールサンプルによって決定される少量の糖分解に対して補正した。この方法によって測定した未加工のオリゴマー調製物中の全糖の濃度は、４５ｇ／Ｌのグルコース、１６８ｇ／Ｌのキシロース及び４６ｇ／Ｌのアラビノースであった。酸加水分解される前の未加工のオリゴマー中に存在するモノマー糖を説明すると、８６％のグルコース、９０％のキシロース、及び、４３％のアラビノースがオリゴマー形態であった。未加工のオリゴマー調製物からアラビノースモノマーへの変換率の上昇について、様々なβ−キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ及びこれらの混合物を試験した。未加工のオリゴマー調製物を、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）によって２０倍に希釈して１２ｇ／Ｌのオリゴマーとし、５０℃の加熱ブロックにおいて１．５ｍＬのキャップされたエッペンドルフチューブ中に保持した。酵素は、０．０６〜０．０９ｇ／Ｌの最終濃度で加え、完了するまで２４時間にわたってインキュベートした。その後、実施例１に記載されているモノマー糖のＨＰＬＣ分析のために、サンプルを移した。結果は、酸加水分解によって決定したときの総糖に基づいたモノマー糖への変換率％として表４に一覧されている。
【０２８０】
未加工のオリゴマー混合物中に残存するアラビノキシランオリゴマーからアラビノースの最も高い収率（４４％〜７１％）を得るためには、Ｆｖ３Ａ＋Ｆｖ５１Ａ、Ｆｖ３Ａ＋Ｆｖ４３Ｂ、及び、Ｆｖ４３Ａ＋Ｆｖ４３Ｂの組み合わせが最良の結果を与えることが表４のデータによって示されている。配列ファミリー及び人工基質に対する活性から、Ｆｖ３Ａがβ−キシロシダーゼであり、Ｆｖ５１ＡがＬ−α−アラビノフラノシダーゼであることが推測される。
【０２８１】
トウモロコシ穂軸から得たアラビノキシラン中のアラビノース糖は、そのアラビノース糖の２位炭素及び３位炭素の両方において、キシロースに対して頻繁に結合することがわかっている。したがって、Ｆｖ３Ａの活性によっておそらくキシロース（１−２）アラビノース結合が加水分解され、それによって、アラビノース（１−３）キシロース結合がＬ−α−アラビノフラノシダーゼによって加水分解できるようになると考えられる。試験を行ったβ−キシロシダーゼのうち、Ｆｖ３Ａ及びＦｖ４３Ａだけこの活性を有すると考えられた。このスクリーニングにおいても、フザリウムバーティシリオイデスから得たファミリーの４３個のうちで、Ｆｖ４３ＢのみがＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有すると考えられた。結果を表４に示す。
【０２８２】
１１．実施例５：トウモロコシ穂軸を有効に加水分解するためのβ−キシロシダーゼの基質範囲
この実施例においては、３つのβ−キシロシダーゼの基質範囲、及び、トウモロコシ穂軸キシロオリゴマーからモノマー糖への有効な変換とのそれらの関係を評価した。実施例１に記載されているように、オリゴマー糖を含むトウモロコシ穂軸の加水分解産物を調製し、また、モノマー糖の分析を実行した。バイオゲルＰ２によるサイズ排除クロマトグラフィによって分離したときに２よりも大きい重合度（ＤＰ）を有するオリゴマー糖の陽子ＮＭＲスペクトルを決定した（図３６及び図３７）。酵素処理前のオリゴマーのスペクトルは、図３６の底部のパネルに「ＭＤ０７オリゴマー」とラベルされている。酵素処理後の画分を含む同じオリゴのスペクトルは、図３６及び図３７の処理酵素でラベルされた残りのパネルに示されている。
【０２８３】
２より大きい重合度のオリゴマーを含むバイオゲルＰ２画分（５ｍｇ〜１０ｍｇ）を、凍結乾燥し、次に、０．５ｍＭの２，２−ジメチル−２−シラペンタン−５−スルフォナート（ＤＳＳ）を内部標準として含むＤ２Ｏ溶液０．７ｍＬに溶解させた。残留水ピークの抑制を最適化するために、ＮＭＲサンプルとして０．５５ｍＬの分割単位を使用した。異核試験として１３Ｃスペクトル幅の最適化を用いて、バリアン二次元相関パルスシークエンスの標準バージョンを使用した。スペクトルは、５００ＭＨｚで作動する高感度クリオプローブを使用して、バリアン・ユニティ・イノーバ(Varian Unity Inova)において得た。構造解析は、個々の糖残基についてスピン系を特徴付ける相関関係を特定すること、及び、相互グリコシド相関関係を特定することによって実行した。
【０２８４】
ＮＭＲによって決定したアラビノース含有オリゴマーは、ポリマー断片中のキシロース残基に対してアラビノースがβ１→３結合した１つ又はそれ以上の分岐構造が大半を占める。その分岐におけるアラビノース残基は、アラビノースに対してβ１→２結合したキシロース残基によってさらに置換される。この第２置換を含まないアラビノースは、残留するキシロオリゴマー中にほとんど存在しない。トリコデルマリーゼイＢｘｌ１は、スペクトルにおける５．５ｐｐｍ〜５．５５ｐｐｍの残留シグナルによって証明されるように、最も外側のキシロース１→２アラビノース結合を開裂させることにおいてあまり有効ではない。より長い鎖のキシロースオリゴマーに対して有効なＦｖ４３ＡとＦｖ４３Ｂ・Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼとの組み合わせは、５．５ｐｐｍ域にシグナルを有する分岐した種のすべてではないが大部分を除去し、また、トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１を用いた処理とは異なって、キシロースオリゴマーに対して分岐した残留アラビノースに起因する５．３５のシグナルを残さない。
【０２８５】
Ｆｖ５１Ａのみによる処理又はＦｖ５１ＡとＦｖ３Ａとの組み合わせによる処理の後の残留キシロオリゴマーのスペクトルのアノマー陽子領域は、異なる結果を示している。Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼのみは、その領域中シグナルの複雑さを低減するのには有効ではない。Ｆｖ３Ａ・α−キシロシダーゼは、単純に結合したアラビノース１→３キシロースのオリゴマー構造の大部分をそのままにしながら、アラビノース分岐に内在するキシロースの実質的にすべてを除去する。α−キシロシダーゼに対するＬ−α−アラビノフラノシダーゼの添加は、還元糖のα及びβアノマー陽子に由来するシグナルの増加によって証明されるように、モノマー糖へのほとんど完全な変換を生じさせる。
【０２８６】
したがって、あるβ−キシロシダーゼが他のものに対してより有効であることは、おそらく、基質として許容可能な非糖部分の複雑さの観点における基質範囲に起因すると結論することができる。
【０２８７】
１２．実施例６：ＧＨ３β−キシロシダーゼにおける基質範囲の決定における配列比較及び重要残基
トリコデルマリーゼイβ−キシロシダーゼ（Ｂｘｌ１）は、フザリウムバーティシリオイデスオルソログ（Ｆｖ３Ａ）に対して６１％類似しており、図３８の配列比較に示されているように４２％の配列同一性を有する。Ｆｖ３Ａは、Ｂｘｌ１よりはるかに広い基質範囲を有している。この広い基質範囲は、２つのタンパク間で保存されていないアミノ酸に起因すると考えられる。
【０２８８】
１３．実施例７：トウモロコシ穂軸のモノマー糖への加水分解として定義されたヘミセルラーゼ活性の決定
全スラリー１００ｇ当たり１８．６ｇの乾燥トウモロコシ穂軸固形分を含み、Ｈ２ＳＯ４水溶液を用いてｐＨを約５に調節した水スラリーとして、実施例１に記載されているように前処理したトウモロコシ穂軸を使用した。このスラリー０．７８ｇを４ｍＬガラスバイアルに加え、所望の酵素の添加後に全反応重量が１．０６ｇとなるように充分な量の５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ(ｐＨ５．０)を加えた。実施例１に記載されている精製された調製物としてこのヘミセルラーゼを加えた。クアッド欠損トリコデルマリーゼイ株から得た上澄み（表５及び表６におけるクアッド）は、４つの主要なセルラーゼ活性を欠損させたトリコデルマリーゼイ株（ＷＯ０５／００１０３６に記載されている）によって発現されたバックグラウンドタンパクの濃縮物である。アクセレラーゼ（登録商標）１０００は、高いβ−グルコシダーゼ活性を有する全セルラーゼ混合物である。上記バイアルをオービタルシェイカにおいて４８℃において２３０ｒｐｍで７２時間にわたってインキュベートし、次に、２ｍＬの水を加えた。サンプルの一部を回収してさらに希釈し、実施例１に記載されているモノマー糖についてのＨＰＬＣ分析をするために遠心分離及び濾過を行った。前処理されたトウモロコシ穂軸からモノマー糖への加水分解に対する定義されたヘミセルラーゼ活性の有用量を明らかにする試験結果を表５に示す。
【０２８９】
実験計画法（ＤｏＥ）から得た結果をサーフェスモデルに適合させ、それを、試験した２つの総タンパク濃度におけるグルコース、キシロース及びアラビノースの最良の収率を得るための７つの酵素成分の最良の比率を決定するために使用した。７つの酵素成分の比率についての結果を表６に示す。Ｆｖ３Ａを含み、再度Ｆｖ４３Ｄを含むようにして、低レベルの活性定量に保持しながら、比率の他の調査（表７）を実施した。設定した反応及び反応条件は、完全なＤｏＥ実験のために記載されたものと同一であった。
【０２９０】
反応（実行番号）２０、２１及び２２は、全セルラーゼ酵素混合物のみを含んでおり、２１ｍｇ／ｇのグルカンを投与したときに、トウモロコシ穂軸中に存在するグルコースの約４８％及びキシロースの２４％をモノマーにした。エンドキシラナーゼであるトリコデルマリーゼイＸｙｎ３の添加は、ほぼ同じグルコースモノマー収率を保持し、かつ、キシロースモノマー収率を約４０％に増加させながら、全セルラーゼタンパク投与量を減らすことを可能にした（実行＃１）。上記した４０％のアラビノース収率を与えるすべての組み合わせは、Ｆｖ４３Ｄと、Ｆｖ４３Ａと、Ｆｖ４３Ｂ又はＦｖ５１Ａとの組み合わせ、又は、Ｆｖ３ＡとＦｖ５１Ａ又はＦｖ４３Ｂとの組み合わせが必要であった。これらの組み合わせによっても、キシロースからモノマー糖が最も多く放出される傾向があった。
【０２９１】
全セルラーゼ定量の投与及びエンドキシラナーゼ定量の投与の両方を保持するようにして、必要とされるヘミセルラーゼの混合物を最適することを目的とした反応の他の集合を実行した。アクセレラーゼ（登録商標）１０００全セルラーゼ調製物を１２ｍｇ／ｇのグルカン定量に保持し、精製済トリコデルマリーゼイＸｙｎ３エンドキシラナーゼを６ｍｇ／ｇのキシランに保持した。Ｆｖ５１Ａは、混合物中の唯一のＬ−α−アラビノフラノシダーゼであり、様々な用量で存在していた。他の反応条件は同様であったが、実施例１に記載されているようにサイズ排除クロマトグラフィによって加水分解産物を分析した。ピーク面積のみによって個々の糖の定量を実施し、その結果を表８に示した。
【０２９２】
すべて組み合わせにおいて、近似した量のグルコースが放出され、また、ほぼ同じ総量の可溶性キシロースが放出された。モノマーキシロースに減少させた程度は、処理によって異なっていた。オリゴマーをモノマーに変換する活性がない場合に、少なくともβ−キシロシダーゼを加えなければ、可溶化されたキシロースの約５０％がオリゴマーのままであった。キシラン１ｇ当たり２ｍｇのＦｖ３Ａタンパクは、重合度が２より大きいオリゴマーを３．６ｍｇ／ｍＬに減少させた。キシラン１ｇ当たり２ｍｇのＦｖ５１Ａタンパクに対してキシラン１ｇ当たり２ｍｇのＦｖ３Ａタンパクを加えたものは、重合度が２より大きいオリゴマーを１．５ｍｇ／ｍＬにさらに減少させた。キシラン１ｇ当たり約２ｍｇのＦｖ５１Ａは、必要とされる２ｍｇ／ｇのＦｖ３Ａが存在する場合には、重合度が２より大きいオリゴマーを最小化するのに充分であるように考えられる（表８）。
【０２９３】
６ｍｇ／ｇのキシラントリコデルマリーゼイＸｙｎ３と、２ｍｇ／ｇのＦｖ３Ａと、１ｍｇ又は２ｍｇ／ｇのＦｖ５１Ａとの混合物は、トウモロコシ穂軸アラビノキシラン全体をモノマー糖にするための１つの好適な投与である。混合物にＦｖ４３Ｄを加えることは、キシロビオース又は他の重合度が２より大きいオリゴマーをモノマーにするのを助ける。アラビノースからモノマーへの加水分解はこの実験では測定しなかった。
【０２９４】
１４．実施例８：トウモロコシ穂軸からモノマー糖を生産することにおけるヘミセルラーゼの有効性
この実施例においては、希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸に対して単独で作用させた場合のモノマーのキシロース糖及びアラビノース糖を生産することにおける精製済ヘミセルラーゼ活性の組み合わせの有効性を実証する。精製済ヘミセルラーゼの３つの混合物（混合物Ａ、混合物Ｂ、及び、混合物Ｃ）を調製し、実施例１のように調製して実施例１に記載されている条件で電気泳動した合計１ｇの１４％固形反応物中の前処理したトウモロコシ穂軸中のヘミセルロースを加水分解するために使用した。反応の７２時間後に実施例１に記載されているようにＨＰＬＣによってモノマー糖を分析し、得られた量を表９に示す。
・混合物Ａ：キシラン１ｇ当たり、６ｍｇのトリコデルマリーゼイＸｙｎ３、４ｍｇのＦｖ３Ａ、１ｍｇのＦｖ５１Ａ
・混合物Ｂ：キシラン１ｇ当たり、６ｍｇのトリコデルマリーゼイＸｙｎ３、１ｍｇのＦｖ４３Ｄ、３ｍｇのＦｖ４３Ａ、３ｍｇのＦｖ４３Ｂ
・混合物Ｃ：キシラン１ｇ当たり、６ｍｇのトリコデルマリーゼイＸｙｎ３、３ｍｇのＦｖ３Ａ、１ｍｇのＦｖ４３Ｄ、１ｍｇのＦｖ５１Ａ
この実験においては、定めたヘミセルラーゼの組み合わせによって、セルロースを可溶化する活性を含む先の実験においてみられたよりもわずかに少ないモノマー糖が生成された。この試験における収率は、全セルラーゼ調製物にエンドキシラナーゼのみを加えたものにおいてみられた収率より高かった。ヘミセルラーゼ活性は、キシランをモノマーにするのに有効である。
【０２９５】
実施例１に従った一般的方法における手順を用いて、トウモロコシ穂軸、穀実用モロコシから得たストーバの全体、スイッチグラス及びサトウキビバガスから作成したヘミセルロース調製物に対して、混合物の同じ組み合わせを使用した。５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）中に１００ｍｇ／ｍＬのヘミセルロース調製物を含むストック懸濁液を作成し、ｐＨをチェックした。これらのそれぞれを、５０ｍＭ緩衝酢酸溶液をさらに用いて、１ｍＬ当たり１０ｍｇの調製物を含むように希釈した。１０ｍｇ／ｍＬの懸濁液１００μＬに対して各酵素混合物の分割量を加え、その反応物を重複して電気泳動し、攪拌しながら４８℃で６時間インキュベートした。この反応物を、１００μＬの水で希釈し、実施例１に記載されているようにモノマー糖についてＨＰＬＣ分析をする前に遠心分離及び濾過を行った。各ヘミセルロース懸濁液の２００μＬを、０．８ＮのＨ２ＳＯ４２００μＬで希釈し、液体循環によって１２１℃において３０分間滅菌し、次いでろ過し、実施例１に記載されているように糖についてＨＰＬＣ分析を行った。表１０に示されている結果は、反応中に存在する酸加水分解可能な糖のパーセンテージとして、酵素混合物によって放出された平均モノマー糖として報告されている。
【０２９６】
混合物Ａ及び混合物Ｃは、トウモロコシ穂軸から得たヘミセルロースに対して良好に作用し、また、他の実験においてみられたように前処理した全トウモロコシ穂軸に対しても良好に作用した。Ｆｖ３Ａを含む混合物は、アラビノースからモノマーへの変換を増大させ、キシロースからモノマーへの変換において若干の優位性を与える。３つのすべての混合物は、他の単子葉植物から得た精製済ヘミセルロースに対して良好に作用した。１つのエンドキシラナーゼと、１つ又は２つのβ−キシロシダーゼであって、それらの１つが、２個又は３個のβ１→４結合したキシロース単位を超えた基質特異性を有するβ−キシロシダーゼと、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼとの混合は、単子葉植物のヘミセルロースに対する有効なヘミセルラーゼ混合物を与える。
【０２９７】
１５．実施例９：トリコデルマリーゼイの組込発現株の構築
５つの遺伝子：トリコデルマリーゼイ・β−グルコシダーゼ遺伝子ｂｇｌ１と、トリコデルマリーゼイ・エンドキシラナーゼ遺伝子ｘｙｎ３と、フザリウムバーティシリオイデス・β−キシロシダーゼ遺伝子ｆｖ３Ａと、フザリウムバーティシリオイデス・β−キシロシダーゼ遺伝子ｆｖ４３Ｄと、フザリウムバーティシリオイデス・α−アラビノフラノシダーゼ遺伝子ｆｖ５１Ａとを共発現するトリコデルマリーゼイの組込発現株を構築した。これらの異なる遺伝子のための発現カセットの構築及びトリコデルマリーゼイ株の形質転換を以下に記載する。
【０２９８】
１５．１  α−グルコシダーゼ発現カセットの構築
天然のトリコデルマリーゼイ・β−グルコシダーゼ遺伝子ｂｇｌ１のＮ末端部分は、ＤＮＡ２．０(Menlo Park、米国)によってコドン最適化を行った。この合成された部分は、コード領域の最初の４４７塩基から構成されていた。プライマーＳＫ９４３及びプライマーＳＫ９４１を使用してこの断片をＰＣＲ増幅した。プライマーＳＫ９４０及びプライマーＳＫ９４２を使用して、トリコデルマリーゼイ株ＲＬ−Ｐ３７から抽出したゲノムＤＮＡサンプルから、天然のｂｇｌ１遺伝子の残りの領域をＰＣＲ増幅した。プライマーＳＫ９４３及びプライマーＳＫ９４２を使用して、融合ＰＣＲ反応において、ｂｇｌ１遺伝子のこれらの２つのＰＣＲ断片を融合した。
順方向プライマＳＫ９４３：(5'- CACCATGAGATATAGAACAGCTGCCGCT-3')（配列番号：８８）
逆方向プライマＳＫ９４１：(5'-CGACCGCCCTGCGGAGTCTTGCCCAGTGGTCCCGCGACAG-3')（配列番号：８９）
順方向プライマＳＫ９４０：(5'-CTGTCGCGGGACCACTGGGCAAGACTCCGCAGGGCGGTCG-3')（配列番号：９０）
逆方向プライマＳＫ９４２：(5'- CCTACGCTACCGACAGAGTG-3')（配列番号：９１）
得られた融合ＰＣＲ断片をゲートウェイ（商標）エントリ・ベクター・ｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（商標）にクローンし、それを大腸菌ワンショット（商標）ＴＯＰ１０化学的形質転換受容細胞(Invitrogen社）に導入した。その結果、中間体ベクター、ｐＥＮＴＲＹ−９４３／９４２（図３９）が得られた。挿入されたＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって概説されているＬＲクロナーゼ（商標）反応プロトコルを使用して、正しいｂｇｌ１配列を有するｐＥＮＴＲＹ−９４３／９４２ベクターをｐＴｒｅｘ３ｇと結合し直した。そのＬＲクロナーゼ反応混合液を大腸菌ワンショット（商標）ＴＯＰ１０化学的形質転換受容受容細胞(Invitrogen社)に導入して、最終発現ベクターであるｐＴｒｅｘ３ｇ ９４３／９４２（図４０）を得た。このベクターは、トリコデルマリーゼイの形質転換用の選択可能なマーカとして、アセタミダーゼをコードするアスペルギルスニデュランスａｍｄＳ遺伝子をさらに含んでいる。その株を形質転換するための生成物を作成するために、ＷＯ０８１５３７１２に記載されているエレクトロポレーション法を使用して、プライマーＳＫ７４５及びプライマーＳＫ７７１を用いて、発現カセットをＰＣＲ増幅した。
順方向プライマＳＫ７７１：(5’-GTCTAGACTGGAAACGCAAC-3’)（配列番号：９４）
逆方向プライマＳＫ７４５：(5’-GAGTTGTGAAGTCGGTAATCC-3’)（配列番号：９５）
【０２９９】
１５．２  エンドキシラナーゼ発現カセットの構築
トリコデルマリーゼイから抽出したゲノムＤＮＡサンプルから、プライマーｘｙｎ３Ｆ−２及びプライマーｘｙｎ３Ｒ−２を使用して、天然のトリコデルマリーゼイ・エンドキシラナーゼ遺伝子ｘｙｎ３をＰＣＲ増幅した。
順方向プライマｘｙｎ３Ｆ−２：(5'-CACCATGAAAGCAAACGTCATCTTGTGCCTCCTGG-3')（配列番号：９４）
逆方向プライマ（ｘｙｎ３Ｒ−２）：(5'-CTATTGTAAGATGCCAACAATGCTGTTATATGCCGGCTTGGGG-3')（配列番号：９５）
得られたＰＣＲ断片をゲートウェイ（商標）エントリー・ベクター・ｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（商標）にクローンし、それを大腸菌ワンショット（商標）ＴＯＰ１０化学的形質転換受容細胞(Invitrogen社)に導入し、中間体ベクターであるｐＥＮＴＲ／Ｘｙｎ３（図４１）を得た。挿入されたＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。Invitrogen社によって概説されているＬＲクロナーゼ（商標）反応プロトコルを使用して、正しいｘｙｎ３配列を有するｐＥＮＴＲ／Ｘｙｎ３ベクターをｐＴｒｅｘ３ｇと結合し直した。このＬＲクロナーゼ反応液を大腸菌ワンショット（商標）ＴＯＰ１０化学的形質転換受容細胞(Invitrogen社)に導入し、最終発現ベクターであるｐＴｒｅｘ３ｇ／Ｘｙｎ３（図４２）を得た。このベクターは、トリコデルマリーゼイの形質転換用の選択可能なマーカとして、アセタミダーゼをコードするアスペルギルスニデュランスａｍｄＳ遺伝子を含んでいる。その株を形質転換するための生成物を作成するために、エレクトロポレーション方法を使用して、プライマーＳＫ７４５及びプライマーＳＫ８２２を用いて、発現カセットをＰＣＲ増幅した。
順方向プライマＳＫ７４５：(5' - GAGTTGTGAAGTCGGTAATCC-3')（配列番号：９６）
逆方向プライマＳＫ８２２：(5' - CACGAAGAGCGGCGATTC-3')（配列番号：９７）
【０３００】
１５．３  β−キシロシダーゼＦｖ３Ａ発現カセットの構築
フザリウムバーティシリオイデスのゲノムＤＮＡサンプルから、プライマーＭＨ１２４及びプライマーＭＨ１２５を使用して、フザリウムバーティシリオイデス・β−キシロシダーゼｆｖ３Ａ遺伝子を増幅した。
順方向プライマＭＨ１２４：(5'-CAC CCA TGC TGC TCA ATC TTC AG-3')（配列番号：９８）
逆方向プライマＭＨ１２５：(5'-TTA CGC AGA CTT GGG GTC TTG AG-3')（配列番号：９９）
このＰＣＲ断片をゲートウェイ（商標）エントリ・ベクター・ｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（商標）にクローンし、それを大腸菌ワンショット（商標）ＴＯＰ１０化学的形質転換受容細胞(Invitrogen社)に導入して、中間体ベクターであるｐＥＮＴＲ−Ｆｖ３Ａ（図４３）を得た。挿入されたＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。Invitrogen社によって概説されているＬＲクロナーゼ（商標）反応プロトコルを使用して、正しいｆｖ３Ａ配列を有するｐＥＮＴＲＹ−Ｆｖ３ＡベクターをｐＴｒｅｘ６ｇと結合し直した。このＬＲクロナーゼ反応液を大腸菌ワンショット（商標）ＴＯＰ１０化学的形質転換受容細胞(Invitrogen社)に導入し、最終発現ベクターであるｐＴｒｅｘ６ｇ／Ｆｖ３Ａ（図４４）を得た。このベクターは、天然のトリコデルマ・アセトラクターゼ・合成酵素(als)遺伝子のクロリムロンエチル耐性変異体（ａｌｓＲと示される）をさらに含んでいる。この変異体は、トリコデルマリーゼイの形質転換用の選択可能なマーカとしてその天然プロモータ及び天然ターミネータと共に使用される(WO2008/039370A1)。トリコデルマリーゼイを形質転換するための生成物を作成するために、エレクトロポレーション法（例えば、ＷＯ２００８１５３７１２Ａ２参照）を使用して、プライマーＳＫ１３３４、プライマーＳＫ１３３５及びプライマーＳＫ１２９９を用いて、発現カセットをＰＣＲ増幅した。
順方向プライマＳＫ１３３４：(5'-GCTTGAGTGTATCGTGTAAG-3')配列番号：１００）
順方向プライマＳＫ１３３５：(5'-GCAACGGCAAAGCCCCACTTC-3')（配列番号：１０１）
逆方向プライマＳＫ１２９９：(5'-GTAGCGGCCGCCTCATCTCATCTCATCCATCC-3')（配列番号：１０２）
【０３０１】
１５．４  β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ発現カセットの構築
フザリウムバーティシリオイデス・β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ発現カセットを構築するために、フザリウムバーティシリオイデスのゲノムＤＮＡから、プライマーＳＫ１３２２及びプライマーＳＫ１２９７を使用して、ｆｖ４３Ｄ遺伝子産物を増幅した。ＲＬ−Ｐ３７株から抽出したトリコデルマリーゼイゲノムＤＮＡから、プライマーＳＫ１２３６及びプライマーＳＫ１３２１を使用して、エンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇｌ１のプロモータの領域をＰＣＲ増幅した。次に、プライマーＳＫ１２３６及びプライマーＳＫ１２９７を使用して、融合ＰＣＲ反応において、これらの２つのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を融合した。得られた融合ＰＣＲ断片をpCR-Blunt II-TOPOベクター(Invitrogen社)にクローンすることによってプラスミドTOPO Blunt/Pegl1-Fv43D（図４５）を得た。このプラスミドを使用して大腸菌ワンショット（商標）ＴＯＰ１０化学的形質転換受容細胞(Invitrogen社)を形質転換した。いくつかの大腸菌クローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限消化によって確認した。
順方向プライマＳＫ１３２２：(5'-CACCATGCAGCTCAAGTTTCTGTC-3')（配列番号：１０３）
逆方向プライマＳＫ１２９７：(5'-GGTTACTAGTCAACTGCCCGTTCTGTAGCGAG-3')（配列番号：１０４）
順方向プライマＳＫ１２３６：(5'-CATGCGATCGCGACGTTTTGGTCAGGTCG-3')（配列番号：１０５）
逆方向プライマＳＫ１３２１：(5'-GACAGAAACTTGAGCTGCATGGTGTGGGACAACAAGAAGG-3')（配列番号：１０６）
トリコデルマリーゼイを形質転換するための生成物を作成するために、WO2008153712A2に記載されているエレクトロポレーション法を使用して、プライマーＳＫ１２３６及びプライマーＳＫ１２９７用いて、TOPO Blunt/Pegl1-Fv43Dから発現カセットをＰＣＲ増幅した。
【０３０２】
１５．５  α−アラビノフラノシダーゼ発現カセットの構築
フザリウムバーティシリオイデス・α−アラビノフラノシダーゼ遺伝子ｆｖ５１Ａ発現カセットを構築するために、フザリウムバーティシリオイデスのゲノムＤＮＡから、プライマーＳＫ１１５９及びプライマーＳＫ１２８９を使用して、ｆｖ５１Ａ遺伝子産物を増幅した。ＲＬ−Ｐ３７株から抽出したトリコデルマリーゼイのゲノムＤＮＡサンプルから、プライマーＳＫ１２３６及びプライマーＳＫ１２６２を使用して、エンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇｌ１のプロモータの領域をＰＣＲ増幅した。融合ＰＣＲ反応において、プライマーＳＫ１２３６及びプライマーＳＫ１２８９を使用して、これらの２つのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を融合した。得られた融合ＰＣＲ断片をpCR-Blunt II-TOPOベクター(Invitrogen社)にクローンすることによって、プラスミドTOPO Blunt/Pegl1-Fv51A（図４６）を得た。このプラスミドを使用して、大腸菌ワンショット（商標）ＴＯＰ１０化学的形質転換受容細胞(Invitrogen社)を形質転換した。
順方向プライマＳＫ１１５９：(5'-CACCATGGTTCGCTTCAGTTCAATCCTAG-3')（配列番号：１０７）
逆方向プライマＳＫ１２８９：(5'-GTGGCTAGAAGATATCCAACAC-3')（配列番号：１０８）
順方向プライマＳＫ１２３６：(5'-CATGCGATCGCGACGTTTTGGTCAGGTCG-3')（配列番号：１０９）
逆方向プライマＳＫ１２６２：(5'-GAACTGAAGCGAACCATGGTGTGGGACAACAAGAAGGAC-3')（配列番号：１１０）
トリコデルマリーゼイを形質転換するための生成物を作成するために、エレクトロポレーション法を使用して、プライマーＳＫ１２９８及びプライマーＳＫ１２８９を用いて、発現カセットをＰＣＲ増幅した。
順方向プライマSK1298：(5'-GTAGTTATGCGCATGCTAGAC-3')(配列番号：111)
逆方向プライマSK1289：(5'-GTGGCTAGAAGATATCCAACAC-3')(配列番号：112)
【０３０３】
１５．６  α−グルコシダーゼ発現カセット及びエンドキシラナーゼ発現カセットを用いたトリコデルマリーゼイの共形質転換
ＲＬ−Ｐ３７(Sheir-Neiss, G et al. Appl.Microbiol. Biotechnol.1984, 20:46-53)に由来し、かつ、高いセルラーゼ生成量によって選択したトリコデルマリーゼイ突然変異株を、ＰＥＧ媒介形質転換(Penttila, M et al. Gene 1987, 61(2):155-64)によって、α−グルコシダーゼ発現カセット（ｃｂｈ１プロモータ、トリコデルマリーゼイα−グルコシダーゼ１遺伝子、ｃｂｈ１ターミネータ、及び、ａｍｄＳマーカ）及びエンドキシラナーゼ発現カセット（ｃｂｈ１プロモータ、トリコデルマリーゼイｘｙｎ３及びｃｂｈ１ターミネータ）を用いて共形質転換した。多数の形質転換体を単離し、α−グルコシダーゼ生産及びエンドキシラナーゼ生産について試験した。他の発現カセットを用いた形質転換のために、トリコデルマリーゼイ株＃２２９と呼ばれる１つの形質転換体を使用した。
【０３０４】
１５．７  ２つのα−キシロシダーゼ発現カセットとα−アラビノフラノシダーゼ発現カセットを用いたトリコデルマリーゼイ株＃２２９の共形質転換
エレクトロポレーションを使用して、β−キシロシダーゼｆｖ３Ａ発現カセット（ｃｂｈ１プロモータ、ｆｖ３Ａ遺伝子、ｃｂｈ１ターミネータ、及び、ａｌｓＲマーカ）と、β−キシロシダーゼｆｖ４３Ｄ発現カセット（ｅｇｌ１プロモータ、ｆｖ４３Ｄ遺伝子、天然ｆｖ４３Ｄターミネータ）と、ｆｖ５１Ａ・α−アラビノフラノシダーゼ発現カセット(ｅｇｌ１プロモータ、ｆｖ５１Ａ遺伝子、ｆｖ５１Ａ天然ターミネータ）を用いて、トリコデルマリーゼイ株＃２２９を共形質転換した。クロリムロンエチル（８０ｐｐｍ）を含むボゲルス(Vogels)寒天プレートの上で形質転換体を選択した。
ボゲルス寒天（１リットル当たり）は、
５０倍ボゲルスストック液（後述）            ２０ｍＬと
ＢＢＬ寒天                                  ２０ｇとに、
脱イオン化されたＨ２Ｏを殺菌後に添加して   ９８０ｍＬにし、
５０％グルコース                            ２０ｍＬ
を加えて調製した。
５０倍のボゲルスストック液（１リットル当たり）（ＷＯ２００５／００１０３６）は、
７５０ｍＬの脱イオン化したＨ２Ｏに下記：
Ｎａ３クエン酸・２Ｈ２Ｏ                      １２５．００ｇ；
ＫＨ２ＰＯ４（無水）                          ２５０．００ｇ；
ＮＨ４ＮＯ３（無水）                          １００ｇ；
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                          １０．００ｇ；
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                          ５．００ｇ；
ボゲルストレースエレメント溶液              ５．０ｍＬ；
ボゲルスビオチン溶液                        ２．５ｍＬ；
を連続して溶解させ、脱イオン化されたＨ２Ｏを用いて１Ｌにした。
多数の形質転換体を単離してβ−キシロシダーゼ生成及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ生成を試験した。実施例１に記載されているようにトウモロコシ穂軸糖化分析に従ってバイオマス変換性能を求めて形質転換体をスクリーニングした。本明細書に記載されているトリコデルマリーゼイ組込発現株の例は、Ｈ３Ａ、３９Ａ、Ａ１０Ａ、１１Ａ及びＧ９Ａであり、これらは、トリコデルマリーゼイβ−グルコシダーゼ１、トリコデルマリーゼイＸｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ及びＦｖ４３Ｄの遺伝子のすべてを異なる比率（表１１）で発現する。さらに、本明細書に記載されているトリコデルマリーゼイ組込発現株の例には４４Ａ、６９Ａ、Ｇ６Ａ及び１０２が含まれ、これらのそれぞれがトリコデルマリーゼイβ−グルコシダーゼ１、トリコデルマリーゼイＸＹＮ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ及びＦｖ４３Ｄの遺伝子のほとんどを含んでおり、これらは異なる比率で発現される。４４Ａ株は、過剰発現されるトリコデルマリーゼイＸＹＮ３を欠損している。６９Ａ株は、Ｆｖ５１Ａ（ウェスタンブロットによって確認したが、示さない）を欠損している。Ｇ６Ａ株及び１０２株は、ＨＰＬＣタンパク分析（実施例１）によって測定されるように、Ｆｖ３Ａを欠損している（表１１）。
【０３０５】
１６．実施例１０：アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸に対するトリコデルマリーゼイ組込発現株の糖化性能
希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸に対するトリコデルマリーゼイ組込発現株によって生産された酵素組成物の糖化性能を評価した。限外濾過濃縮物（ＵＦＣ）又は遠心分離液のいずれかとしてトリコデルマリーゼイ酵素サンプルを生成した。限外濾過濃縮物を生成するために、遠心分離による細胞分離後にトリコデルマリーゼイ培養液（１４Ｌ規模）を得て、Millipore１０ｋＤ分子量遮断膜を通した細胞膜限外濾過を使用することによってその培養液を濃縮した。その後、ｐＨを４．８に調節した。その後、細胞を分離したその培養液を、ＦＷ６ブーフナー濾過を使用した濾過によって仕上げた。変更したビウレット法を使用して、総タンパク濃度について各酵素サンプルを分析した。
【０３０６】
バイアル又は振盪フラスコにおいて糖化性能を評価した。希アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸の２０％固形分（ＤＳ）投与に対する糖化性能について、各酵素調製物を分析した（ＷＯ２００６／１１０９０１参照）。その後、すべての糖化反応物を硫酸を用いて滴定してｐＨ５．０にし、微生物汚染を抑制するために０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度でアジ化ナトリウムを加えた。その後、各糖化反応において、グルカン基質又はキシラン基質１ｇ当たり２０ｍｇの総タンパク（ＴＰ）量で酵素調製物を適切に投与した。グルカン１ｇ当たり２０ｍｇの総タンパク量でアクセレラーゼ（商標）１５００（Ａｃ１５００）及び組込株限外濾過濃縮物を投与した。２５：９：４：３：１＝アクセレラーゼ（商標）１５００：Ｘｙｎ３：Ｆｖ３Ａ：Ｆｖ５１Ａ：ＦＶ４３Ｄの比率で酵素混合物を調製した。この混合物において、アクセレラーゼ（商標）１５００は、グルカン１ｇ当たり２０ｍｇの総タンパク量で投与した。ヘミセルラーゼは、キシラン１ｇ当たりで投与した（４．３ｍｇ  Ｘｙｎ３／ｇキシラン、１．７ｍｇ  Ｆｖ３Ａ／ｇキシラン、１．４ｍｇ  Ｆｖ５１Ａ／ｇキシラン、０．５ｍｇ  Ｆｖ４３Ｄ／ｇキシラン）。各糖化反応を、２００ｒｐｍに設定した回転振盪機において５０℃でインキュベートし、その後、１日間、２日間、３日間及び７日間の糖化（図４７Ａ、図４７Ｂ）の後に、ＨＰＬＣ分析（以下のセクション１６．１において「モノマーＨＰＬＣ分析」のセクションに後述されている）を使用してモノマー糖の濃度を決定する前に、サンプリングして１０倍に（v/v）希釈した。糖化の３日目に、各反応を、ＨＰＬＣ分析によってオリゴマー糖の濃度を分析するために、重量（w/w）によってサンプリングした（セクション１６．１及び図４７Ｃ）。これらの結果は、組込株Ｈ３Ａによって生成された酵素組成物及び組込株Ｇ９Ａによって生成された酵素組成物が、個々に発現された酵素から生成したアクセレラーゼ（登録商標）１５００又は酵素混合物よりも、さらに高いグルコース収率及びキシロース収率を提供することを示している。３つの異なる組込株によって生成された酵素組成物のクロマトグラフィの比較を図４７Ｄに示した。
【０３０７】
１６．１  ＨＰＬＣ分析
モノマー糖のＨＰＬＣ分析：BioRad Aminex HPX-87Hイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）を使用して、ＨＰＬＣによって各サンプルを分析した。１日、２日、３日及び７日のすべてのサンプルを、５ｍＭ硫酸を用いて体積によって１０倍に希釈し、ＨＰＬＣに注入する前に０．２μｍのフィルターを通してろ過し、供給業者の説明書に従って流した。オリゴマー糖のＨＰＬＣ分析（酸加水分解）：３日目の糖化サンプルを、ミリＱ水を用いて重量で１０倍に希釈し、次に、４％（w/w）の最終濃度で硫酸を加えた。上述のモノマー糖ＨＰＬＣ分析及びオリゴマー糖ＨＰＬＣ分析を行うために、既知濃度のキシロース及びグルコースの標準（糖回収標準「ＳＲＳ」）を調製して測定した。その後、オリゴマーＨＰＬＣサンプルを、１２１℃で１５分間滅菌し、ＨＰＬＣ BioRad Aminex HPX-87Hイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）に注入する前に０．２μｍのフィルタを通して濾過し、それを供給業者の説明書に従ってカラムに流した。オリゴマー糖の濃度は、各サンプルの酸加水分解後のＨＰＬＣ糖濃度によって、酸加水分解後に保持された糖回収標準（ＳＲＳ）のキシロース及びグルコースの濃度パーセントを乗算し、次に、上記「モノマー糖ＨＰＬＣ分析」のセクションにおいて決定した単量体の糖濃度を引くことによって決定した。
【０３０８】
１７．実施例１１：トリコデルマリーゼイ組込発現株の糖化性能を向上させることができる系統発生的に広範な酵素クラスの同定
この実施例においては、トリコデルマリーゼイ組込発現株によって生成された酵素組成物の有効性を限定する酵素活性を特定し、また、それらの限定的活性を補うことができる又は組込株成分を置換することができる様々な種から得た酵素を例示する。実施例１に記載されているような０．９５ｇの前処理したトウモロコシ穂軸を２０ｍＬのガラスバイアルに加えた。酵素添加後の全スラリー（ｐＨ５．０）１００ｇ当たり２２ｇの割合で乾燥トウモロコシ穂軸固形分が含まれる３．００ｇの全反応重量となるように、充分な５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）及び１ＮのＨ２ＳＯ４を加えた。組込株Ｈ３Ａによって生成されたトリコデルマリーゼイ酵素組成物（図４８Ａ、図４９Ａ及び図５０Ａ）を、すべてのバイアルに対して、供給原料中のグルカンとキシランとの合計１ｇ当たりに７ｍｇの総タンパク量で、限外濾過（すなわち無細胞）濃縮物として加えた。さらに、トリコデルマリーゼイ・クアッド欠損株（ＷＯ０５／００１０３６に記載されている）によって発現された１４Ｌの発酵培養液から得た限外濾過調製物をヘミセルラーゼ候補として加えた。このヘミセルラーゼ候補を、グルカン１ｇ当たり０ｍｇ、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ又は３．０ｍｇのタンパク量で加え、キシランを組み合わせた。
これらのヘミセルラーゼには、
フザリウム・バーティシリオイデス・Ｆｖ３Ａ
フザリウム・バーティシリオイデス・Ｆｖ５１Ａ
フザリウム・バーティシリオイデス・Ｆｖ４３Ｄ
を含む組込株自体によって生成された酵素組成物の成分と、
異なる真菌から得た下記酵素
フザリウム・オキシスポルム・Ｆｏ４３Ａ
ジベレラ・ゼアエ・Ｇｚ４３Ａ
ペニシリウム・フニクロスム・Ｐｆ４３Ａ
アスペルギルスフミガーツス・Ａｆ４３Ａ
ポドスポラ・アンセリナ・Ｐａ５１Ａ
ペニシリウム・フニクロスム・Ｐｆ５１Ａ
が含まれていた。
【０３０９】
バイアルは、オービタルシェイカにおいて４８℃、１８０ｒｐｍで７２時間インキュベートした。その後に１２ｍＬの水を加えた。部分サンプルを取得し、さらに希釈し、実施例１に記載されているようなモノマー糖についてのＨＰＬＣ分析に用いるために遠心分離及びろ過を行った。図４８Ａ及び図４８Ｂに示した結果は、フザリウムバーティシリオイデスＦｖ４３Ｄ及びフザリウムオキシスポルムＦｏ４３Ａ等のβ−キシロシダーゼ活性の添加が、グルカンとキシランとの合計１ｇ当たり７ｍｇのトリコデルマリーゼイ組込株の全タンパクを用いた場合と比較して、モノマーキシロースの放出が著しく向上させることを示している。０．５ｍｇ／ｇ及び１．０ｍｇ／ｇの少ない添加量でさえも顕著な改善がみられた。図４９Ａ及び図４９Ｂに示されている結果は、すべてのヘミセルラーゼ添加においてモノマーグルコースが顕著に増加しており、グルカンとキシランとの合計１ｇに対して１ｍｇ〜３ｍｇのヘミセルラーゼを投与した場合にも１０％より大きくモノマーグルコースが増加したことを示している。図５０Ａ及び図５０Ｂに示されている結果は、フザリウムバーティシリオイデスＦｖ５１Ａ、並びに、特にポスポドラ・アンセリン(Podospora anserine)Ｐａ５１Ａ及びペニシリウム・フニクロスムＰｆｕ５１Ａ等のＧＨ５１酵素の添加によって、モノマーアラビノース濃度が高まったことを示している。
【０３１０】
１８．実施例１２：様々に前処理したスイッチグラスのセルラーゼ調製物及びヘミセルラーゼ調製物による糖化
発現されたセルラーゼ及びヘミセルラーゼによる前処理未加工スイッチグラスに対する糖化性能を評価した。本明細書に記載されている酵素からなる酵素混合物による糖化性能について、スイッチグラスを希アンモニアで前処理するための様々な条件を評価した。前処理条件を変更し、前処理の有効性が酵素加水分解性能に影響する。未加工のスイッチグラスの前処理は、加熱した砂浴に沈めた密閉された６インチ×１／２インチのステンレススチールチューブにおいて実行した。未加工のスイッチグラスのスラリーと水と水酸化アンモニウム（２８％溶液）とを所望の固形分パーセント及びアンモニアパーセントになるように混合し、その後、前処理チューブに入れた。その後、チューブを所望の温度（±２℃）において所望の時間にわたって保持し、次に、室温にする前に約１分間にわたって氷水中で冷却した。その前処理済スラリーをチューブから回収し、フードの中で一昼夜にわたって（固形分が９０％より高くなるように）乾燥した。
【０３１１】
その後、乾燥した前処理済固形分を、アクセレラーゼ（登録商標）１５００、Ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ及びＦｖ４３Ｄ（それぞれ、グルカン又はキシラン１ｇに対して、２５ｍｇ、９ｍｇ、７ｍｇ、３ｍｇ、１ｍｇの総タンパク量）を使用して、固形分１０％、ｐＨ５、５０℃、２００ｒｐｍにおいて糖化した。
【０３１２】
２０ｍＬのシンチレーションバイアル中の全５ｍＬ体積の加水分解産物を使用した。グルカン及びキシランの収率は、未加工のバイオマスから利用可能なグルカン又はキシランと比較した、放出されたモノマーのグルコース及びキシロースに基づいている。ＨＰＬＣ(BioRad Aminex HPX 87-H column)によってモノマー糖の濃度を測定した。
【０３１３】
糖化の結果を最適化するために、前処理時間、温度、固形分パーセント、及び、ＮＨ３パーセントを広い範囲で変化させた。グルカンの収率及びキシランの収率の両方が５０％を超えた各前処理条件を強力な性能と考えた。強力な性能を発揮した前処理パラメータを、それぞれのグルカン収率、キシラン収率及び合計収率と共に表１２に一覧した。グルカン及びキシランの変換は、未加工のスイッチグラスにおいて理論的に利用可能なグルカン又はキシランと比較した糖化中に放出されたモノマー糖に基づいている。合計変換率はグルコース及びキシロースのみである（図５１）。
【０３１４】
１９．実施例１３：セルラーゼ調製物及びヘミセルラーゼ調製物による前処理スイッチグラスの糖化
上述した実施例に加えて、いくつかの基質、いくつかの前処理及びいくつかの条件に対して、組込株によって生成された酵素混合物及び酵素組成物の糖化性能を試験した。これらの試験は、酵素混合物又は組込株生成物を使用して性能の範囲を示している。それらの試験は、様々な基質及び前処理、ｐＨ及び温度にわたって優れた性能を実証する。
【０３１５】
希アンモニアで前処理したスイッチグラスを、ＷＯ０６１１０９０１Ａにおける方法及びプロセス範囲に従って調製した。スイッチグラス（３８．７％グルカン、２２．２％キシラン、２．５％アラビナン、２３．２％リグニン）をハンマーで粉砕して１ｍｍのふるいを通し、次に、６％ＮＨ３（重量／乾燥材料重量、ＮＨ４ＯＨとして加えた）を用いて１６０℃で９０分間前処理した。アクセレラーゼ（商標）１５００、マルチフェクト（商標）キシラナーゼ(いずれもがDanisco A/S、Genencor Division、Palo Alto、カリフォルニア州の市販品)、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ及びＦｖ４３Ｄを含む酵素混合物を用いて、１５％固形分を含む５０ｇの全反応質量として、その前処理済基質を処理した。市販製品の総タンパク（ＴＰ）をビウレット分析によって決定した。他の酵素は、トリコデルマリーゼイのセルラーゼクアッド欠損株における発現後の限外濾過濃縮物（ＵＦＣ）であった。ＴＣＡ沈殿可能タンパクの全窒素分析によってその濃縮物の総タンパクを決定した。すべての反応に、キシラン１ｇ当たり２５ｍｇの総タンパクのアクセレラーゼ（商標）１５００とグルカン１ｇ当たり９ｍｇの総タンパクのマルチフェクト（商標）キシラナーゼ（ＭＦ Ｘｙｌ）とを投与し、また、図５６Ａ〜図５６Ｂにそれぞれ示されているように、それぞれ、キシラン１ｇ当たり３．６ｍｇの総タンパクで、キシラン１ｇ当たり３．０ｍｇの総タンパクで、キシラン１ｇ当たり１．０ｍｇの総タンパクで、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ及びＦｖ４３Ｄを加えた。すべての酵素は、前処理をする前のスイッチグラスの初期糖含有量に比例して投与した。ｐＨ５．３、４７℃、３３℃で３日間にわたって糖化反応を実行した。
【０３１６】
３３℃における結果は、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ及びＦｖ４３Ｄの添加によって、グルカン変換率が高まり（図５６Ａ）、キシラン変換率が２倍以上に高まった（図５６Ｂ）ことを示している。４７℃における結果は、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ及びＦｖ４３Ｄの添加によって、グルカン変換率が若干高まり（図５６Ａ）、キシラン変換が２倍以上に高まった（図５６Ｂ）ことを示している。Ｆｖ５１Ａの添加又はＦｖ４３Ｄの添加は、単独で、キシラン変換率を大幅に高め、特にキシロオリゴマー又はキシロースモノマーへの変換が高まった。Ｆｖ３Ａのみの添加によってもキシロース収率は高まったが、Ｆｖ５１Ａと組み合わせることによってモノマーへのキシラン変換が大幅に高まった。
【０３１７】
２０．実施例１４：トリコデルマリーゼイ組込株による前処理済スイッチグラスの糖化
トリコデルマリーゼイ組込株（Ｈ３Ａ）によって生成された酵素組成物による、ＷＯ０６１１０９０１Ａにおける方法及びプロセス範囲に従って調製した希アンモニア前処理済スイッチグラスに対する糖化性能を評価した。スイッチグラス（３７％グルカン、２１％キシラン、５％アラビナン、１８％リグニン）をハンマーで粉砕して１ｍｍのふるいを通し、次に、１０．０％ＮＨ３（重量／乾燥材料重量、ＮＨ４ＯＨとして加えた）を用いて１６０℃で９０分間前処理した。デュプリケートした２つの５００ｍＬガラスエルレンマイヤーフラスコにおいて、２５％固形分の前処理済スラリー５０ｇを、糖（キシランとグルカン）１ｇ当たり１４ｍｇの総タンパク量で上記組込株から得た上澄みを用いて、４８℃、ｐＨ５．３で７日間糖化した。ＴＣＡ沈殿可能タンパクの全窒素分析によってＨ３Ａの総タンパクを決定した。酵素は、前処理を行う前のスイッチグラスの初期糖含有量に比例して投与した。
【０３１８】
７日目の終わりに、ＨＰＬＣによって、高いレベルのグルカン変換率（５２〜５５％、図５７Ａ）及びキシラン変換率（５１％−５３％、図５７Ｂ）を測定した。これらの結果は、上記組込株によって生成された酵素組成物が、高固形分（２５％乾燥材料）において、希アンモニア前処理済スイッチグラスを糖化することができることを示している。
【０３１９】
２１．実施例１５：トリコデルマリーゼイ統合株による広葉樹パルプの糖化
組成物（グルカン７５．１％。キシラン１９．１％、酸溶解性リグニン２．２％）を用いて、工業用の広葉樹未漂白パルプ(Kraft process and oxygen社, delignification, Smurfit Kappa Cellulose Du Pin, Biganos, Franceから得たもの)に対する、トリコデルマリーゼイ組込株Ｈ３Ａによって生成された酵素組成物の糖化性能を評価した。この酵素糖化試験究は、セルロース投与が異なる（９．３％〜２０％から変更した）こと及び１００ｇの全質量を用いたこと以外は、ＮＲＥＬスタンダードアッセイ法ＬＡＰ−００９「Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass」(http://www.nrel.gov/biomass/pdfs/42629.pdf)を用いて実行した。実験条件は２００ｒｐｍ、ｐＨ５．０、５０℃であった。酵素は、試験の開始時に、グルカン１ｇ当たり（最終乾燥物質に基づいて）２０ｍｇの総タンパク量で投与した。サンプルが液化されている場合には、時間間隔ごとにサンプルを取得し、次に、糖濃度についてＨＰＬＣによって分析した。ウォーターズＨＰＬＣシステム(Alliance system, Waters Corp., Milford,マサチューセッツ州)を使用して、グルコース、キシロース及びセロビオースの濃度を測定した。糖分析に使用したＨＰＬＣカラムは、バイオラッド(Aminex HPX-87Hイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）、BioRad 社、Hercules、カリフォルニア州)から得た。すべてのサンプルを、５ｍＭ硫酸を用いて１０倍に希釈し、ＨＰＬＣに注入する前に０．２μｍのフィルタを通して濾過した。示されているように（表１３）、「供給回分」形態において２つの試験を実行した。タイム０において７．０％初期乾燥材料含有量の前処理済広葉樹パルプを加え、最初の２４時間に残りの基質を４等分して異なる時点において加えて、最終固形分投与量を２０％とした。
【０３２０】
結果は、組込株Ｈ３Ａによって生成された酵素組成物を用いたグルカン及びキシランからモノマーへの高レベルの変換率（それぞれ最大で８９％及び９０％）を示している。変換率は、酵素投与量が多くなるほど、また、糖化時間長いほど上昇した。変換率は、固形分が１５％であるときよりも２０％であるときのほうが低かったが、２０％におけるその低い変換率は、供給回分プロセスを使用することによって部分的に改善することができる。
【０３２１】
２２．実施例１６：様々な温度及びＰＨにおけるトリコデルマリーゼイ組込株による広葉樹パルプの糖化
７％セルロース投与とグルカン１ｇ当たり２０ｍｇの総タンパク量（前処理済基質の最終乾燥材料及び組成に基づく）の組込株上澄みとにより、４５℃〜６０℃の温度及び（０．１Ｍクエン酸ナトリウムで緩衝した）ｐＨ４．６５〜５．４において、工業用広葉樹未漂白パルプ（前述の実施例において使用したものと同様）に対するトリコデルマリーゼイ組込株（Ｈ３Ａ）によって生成された酵素組成物の糖化性能を試験した。２日間の糖化の後の結果は、表１４に示されており、試験を行った条件の全範囲におけるグルカン及びキシランの優れた変換率を示している。これらの結果は、ｐＨ４．９及び５０℃がこの基質の糖化の最適条件であることを示唆しているが、ｐＨ５．０及び６０℃においても優れた変換率が認められる。より低いｐＨを含む５０℃における（他には実験条件を変更していない）再試験において、ｐＨ３．８、ｐＨ４．０及びｐＨ４．２５において優れた糖化がみとめられ、グルコース滴定濃度及びキシロース滴定濃度は、それぞれ、４５．１ｇ／Ｌ及び９．７ｇ／Ｌ、５０．０ｇ／Ｌ及び１１．４ｇ／Ｌ、５７．２ｇ／Ｌ及び１３．２ｇ／Ｌであった。
【０３２２】
２３．実施例１７：組込株によって生成された酵素組成物を様々な酵素用量で用いた蒸気膨張サトウキビバガスの糖化
蒸気で膨張させたサトウキビバガスに対するトリコデルマリーゼイ組込株（Ｈ３Ａ）によって生成された酵素組成物の糖化性能を、７％セルロース投与において評価した。ステイクテック(StakeTech)反応装置における２００℃、２１０psigの蒸気噴射によって４分の滞留時間でバガスを前処理した。その前処理済材料は、グルカン４０．９％。キシラン２０．８％、リグニン２７％の組成を有していた。この組込株上澄みを、（前処理済基質の最終乾燥物質及び組成に基づいて）グルカン１ｇ当たり１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、５０ｍｇ又は８０ｍｇの総タンパク量で投与した。５ｍＬの反応体積において、５０℃及びｐＨ５において３日間にわたって糖化を実行した。
【０３２３】
その結果（図５８Ａ−図５８Ｃ）は、組込株の生成物が、グルカンからグルコースへの変換（図５８Ａ及び図５８Ｃ）において、及び、特にキシランからキシロースへの変換（図５８Ｂ及び図５８Ｃ）において、アクセレラーゼ（商標）１５００の投与量の半分である場合にさえも、アクセレラーゼ（商標）１５００（グルカン１ｇ当たり２０ｍｇのタンパク量）よりも性能が優れていることを示した。グルカンの変換は、特に１日目に、Ｈ３Ａの総タンパク用量が増えるにつれてに顕著に上昇した（図５８Ａ及び図５８Ｃ）。一方で、キシランの変換は、さらに急速であり、１日〜３日にはほとんど上昇せず、Ｈ３Ａ総タンパクの用量が最も少ない場合でさえも非常に高かった（図５８Ｂ及び図５８Ｃ）。
【０３２４】
２４．実施例１８：様々な酵素を用いた希酸前処理コーンファイバの糖化
希硫酸で前処理したコーンファイバに対する酵素混合物の糖化性能を２５０ｍＬの振盪フラスコにおいて評価した。標準的試験においては、コーンファイバ（六炭糖３８％、五炭糖２７％の初期組成）を１５％固形分に調節し、それに０．３６％（ｗ／ｗ％）の硫酸を加えた。その後、コーンファイバスラリーを１２１℃において６０分間滅菌した。その後、６ＮのＮａＯＨを使用して、そのスラリーのｐＨを５．０に調節した。前処理済サンプルの糖濃度は、グルコース２１ｇ／Ｌ及びキシロース１２ｇ／Ｌであった。前処理済基質に対して以下のように（図５９Ａ、図５９Ｂ、図５９Ｃに示されているように）酵素を加えた。
アクセレラーゼ（商標）１５００（ＡＣ１５００）：（グルカン１ｇ当たり２０ｍｇの総タンパク）、及び、（グルカン１ｇ当たり４５ｍｇの総タンパク）
アクセレラーゼ（商標）１５００＋マルチフェクト（商標）キシラナーゼ（ＭＦ）：（グルカン１ｇ当たり２５ｍｇの総タンパク＋キシラン１ｇ当たり９ｍｇの総タンパク）、及び、（グルカン１ｇ当たり２５ｍｇの総タンパク＋キシラン１ｇ当たり２０ｍｇの総タンパク）
アクセレラーゼ（商標）１５００＋Ｘｙｎ３＋Ｆｖ３Ａ＋Ｆｖ５１Ａ＋Ｆｖ４３Ｄ：（グルカン１ｇ当たり２５ｍｇの総タンパク＋キシラン１ｇ当たり９ｍｇの総タンパク＋キシラン１ｇ当たり７ｍｇの総タンパク＋キシラン１ｇ当たり３ｍｇの総タンパク＋キシラン１ｇ当たり１ｍｇの総タンパク）（完全な酵素混合物）
２つの市販製品（アクセレラーゼ（商標）１５００及びマルチフェクト（登録商標）キシラナーゼ：Danisco US Inc., Genencor）の総タンパク（ＴＰ）をビウレット分析によって決定した。他の酵素は、トリコデルマリーゼイのセルラーゼクアッド欠損株（前述と同じもの）における発現後の限外濾過濃縮物（ＵＦＣ）であった。それらの酵素の総タンパク量をＴＣＡ沈殿可能タンパクの全窒素分析によって決定した。すべての酵素は、前処理をする前のコーンファイバの初期糖含有量に比例して投与した。酵素による糖化は、２００ｒｐｍ、５０℃において、２４時間、４８時間又は１２０時間にわたって実施した。サンプルを異なる時間間隔をおいて回収し、回収したサンプルをグルコース及びキシロースの糖の生成についてＨＰＬＣによって分析した。補正された糖（グルコース又はキシロース）は、酵素ステップによって生じた糖を反映するものであり、開始時の糖が差し引かれている。
【０３２５】
これらの結果は、上記完全な酵素混合物が、グルカン変換及びキシラン変換において、（アクセレラーゼ（商標）１５００＋マルチフェクト（商標）キシラナーゼ）（「ＡＣ１５００＋ＭＦ」）よりも、両方を同じ総タンパク量で投与しても、性能が優れていることを示している。上記完全な酵素混合物によってこの基質のグルカンが５日間の糖化の後にほとんど完全に変換された。
【０３２６】
２５．特定の実施形態及び参照による組込
本出願において引用されている刊行物、特許、特許出願及び他の文書のすべては、個々の刊行物、特許、特許出願又は他の文書のすべてが個別に指示されて言及されことによってすべての目的のために組み込まれているかのように、本明細書で言及されることによってすべての目的のために同じ範囲でそっくりそのまま組み込まれている。様々な具体的実施形態が説明及び記載されているが、本開示の精神及び範囲から外れずに様々な変形を行うことができることは当然に理解されるであろう。
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９−１】
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【図４９−２】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８−１】
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【図６８−２】
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【図６９】
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【図７０−１】
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【図７０−２】
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【図７１−１】
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【図７１−２】
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【図７２】
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【図７３−１】
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【図７３−２】
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【図７４−１】
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【図７４−２】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【配列表】
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