(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者由来の生物試料において乳癌と良性乳房疾患を識別するための方法であって、該方法は
ａ）生物試料由来の生物材料を、少なくとも４の試薬に接触させるステップであって、該少なくとも４の試薬は、配列番号１から４４に記載の核酸配列を含む２８の異なる標的遺伝子に各々特異的な２８の試薬から選択され、且つ（１）配列番号１、（２）配列番号２又は３、（３）配列番号４又は５、及び（４）配列番号６に記載の核酸配列をそれぞれ含む少なくとも４の異なる標的遺伝子に各々特異的な４の試薬はいつも含む、ステップ、
ｂ）前記少なくとも４の標的遺伝子各々の発現レベルを決定して、患者の発現プロファイルを得るステップ、及び
ｃ）以前に乳癌を有すると臨床的に分類された患者群由来の前記少なくとも４の標的遺伝子の発現プロファイル及び以前に良性乳房疾患を有すると臨床的に分類された患者群由来の前記少なくとも４の標的遺伝子の発現プロファイルと共に、患者の発現プロファイルの解析を行うステップを含み、
患者の発現プロファイルが、以前に乳癌を有すると臨床的に分類された患者群由来の発現プロファイルと群れを形成した場合に、患者が乳癌を有すると示唆され、
患者の発現プロファイルが、以前に良性乳房疾患として臨床的に分類された患者群由来の発現プロファイルと群れを形成した場合に、患者が良性乳房疾患を有すると示唆される、方法。
【請求項２】
患者由来の生物試料において乳癌と良性乳房疾患を識別するための方法であって、該方法は
ａ）生物試料由来の生物材料を、配列番号１から４４に記載の核酸配列を含む２８の異なる標的遺伝子に各々特異的な２８の試薬に接触させるステップ、
ｂ）前記２８の標的遺伝子各々の発現レベルを決定して、患者の発現プロファイルを得るステップ、及び
ｃ）以前に乳癌を有すると臨床的に分類された患者群由来の前記２８標的遺伝子の発現プロファイル及び以前に良性乳房疾患を有すると臨床的に分類された患者群由来の前記２８標的遺伝子の発現プロファイルと共に、患者の発現プロファイルの解析を行うステップを含み、
患者の発現プロファイルが、以前に乳癌を有すると臨床的に分類された患者群由来の発現プロファイルと群れを形成した場合に、患者が乳癌を有すると示唆され、
患者の発現プロファイルが、以前に良性乳房疾患として臨床的に分類された患者群由来の発現プロファイルと群れを形成した場合に、患者が良性乳房疾患を有すると示唆される、方法。
【請求項３】
生物試料が血液試料である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
生物材料が核酸を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）の標的遺伝子に特異的な試薬の各々が、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）の標的遺伝子に特異的な試薬の各々が、少なくとも１つのプライマーを更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップａ）の標的遺伝子に特異的な試薬の各々が、１つのハイブリダイゼーションプローブ及び２つのプライマーを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも４の試薬を含む、患者由来の生物試料において良性乳房疾患から乳癌を識別するためのキットであって、
前記少なくとも４の試薬は、配列番号１から４４に記載の核酸配列を含む２８の異なる標的遺伝子に各々特異的な２８の試薬から選択され、且つ（１）配列番号１、（２）配列番号２又は３、（３）配列番号４又は５、及び（４）配列番号６に記載の核酸配列をそれぞれ含む少なくとも４の異なる標的遺伝子に各々特異的な４の試薬がいつも含まれる、キット。
【請求項９】
２８の試薬を含む、患者由来の生物試料において良性乳房疾患から乳癌を識別するためのキットであって、該２８の試薬は配列番号１から４４に記載の核酸配列を含む２８の異なる標的遺伝子に各々特異的である、キット。
【請求項１０】
患者由来の生物試料において良性乳房疾患から乳癌を識別するための組成物の製造における、少なくとも４の異なる標的遺伝子に各々特異的な少なくとも４の試薬の使用であって、前記少なくとも４の試薬は、配列番号１から４４に記載の核酸配列を含む２８の異なる標的遺伝子に各々特異的な２８の試薬から選択され、且つ（１）配列番号１、（２）配列番号２又は３、（３）配列番号４又は５、及び（４）配列番号６に記載の核酸配列をそれぞれ含む少なくとも４の異なる標的遺伝子に各々特異的な４の試薬がいつも含まれる、使用。
【請求項１１】
患者由来の生物試料において良性乳房疾患から乳癌を識別するための組成物の製造における、配列番号１から４４に記載されている核酸配列を含む２８の異なる標的遺伝子にそれぞれ特異的な２８試薬の使用。
【請求項１２】
生物試料が血液試料である、請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
生物材料が核酸を含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
標的遺伝子に特異的な試薬の各々が、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
標的遺伝子に特異的な試薬の各々が少なくとも１つのプライマーを更に含む、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
標的遺伝子に特異的な試薬の各々が１つのハイブリダイゼーションプローブ及び２つのプライマーを含む、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌と良性乳房疾患の識別の分野に関する。特に、本発明は、乳癌と良性乳房疾患を識別するための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、世界中の女性に最も一般的な癌である。乳癌の病理発生は十分に理解されていないため、早期診断が非常に重要であると考えられる。現在、マンモグラム検査は、乳癌検出のために最も頻繁に行われている方法である。この方法を用いると、４０〜６９歳の女性における乳癌罹患率を２０〜４０パーセント低下させることができ、これは複数の大規模な無作為試験によって立証された。現在、マンモグラフィは、早期乳癌検出について最も信頼できる基準であるが、報告された全体的な感度は、特定のサブセットの女性、特にＸ線撮影で濃く写る（radiographically dense）乳房を有し、乳癌リスクが増加した女性において有意に低下する。非常に密度の高い乳房を有する女性におけるフィルムマンモグラフィ感度の見積りは、４８〜６３％の範囲に収まる。マンモグラフィは、特に若年群において感度及び特異性が低く、プロセスが行われる際に圧迫痛（compression pain）があるという不利益がある。その上、多くの症例は、体積が小さく密度が高い乳房が原因で検診においてそのマンモグラフィの明解な結果を得ることができず、それらの多くは、そのマンモグラフィ診断においてＢＩ−ＲＡＤＳ  ０（ＢＩ−ＲＡＤＳ：乳房画像診断に関する報告およびデータシステム（Breast Imaging Reporting and Data System））として分類された。
【０００３】
BI-RADSは、マンモグラフィの報告を標準化し、情報交換を改善し、マンモグラフィ所見に関する混乱を低下させ、研究を支援し、成績のモニタリングを容易にするために、米国放射線医学会（American College of Radiology）（ＡＣＲ）によって１９９３年に開発された。１９９７年のマンモグラフィ品質標準法（Mammography Quality Standards Act）（ＭＱＳＡ）［最終規則（Final Rule）６２（２０８）：５５９８８］によると、米国内のあらゆるマンモグラムは、これらの評価カテゴリーのうち１つを用いて報告する必要がある。各マンモグラフィ研究は、最も関連する所見に基づく単一の評価を割り当てられるべきである。分類は、不完全な評価（カテゴリー０）と、完全な評価（カテゴリー１、２、３、４、５、６）へと分けられる。ＢＩ−ＲＡＤＳカテゴリー０は、追加的な画像診断が必要であることを意味する、不完全な評価として定義される。通常、超音波検査又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、或いは更には生検に基づく、長期にわたり、費用がかかり、不安を生むプロセスを必要とする経過観察が推奨される。超音波検査は、マンモグラフィと組み合わせたとしても、不必要な侵襲的ステップへとつながる高偽陽性率の結果を伴う。長期のＭＲＩの留保は、患者にとって有害である。ＭＲＩもまた、高コストであると共に高偽陽性率の結果をもたらす。このような様々な要因のため、特にマンモグラフィが同定できない場合に、乳癌検出を改善し、患者のリスクを示し得る実行の容易な新規の検査の必要が非常に重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＣＥＡ、ＣＡ１５−３等、血清バイオマーカーは、癌検査において優れた成績を示さない［１］。近年、末梢血細胞における遺伝子発現パターンを用いた乳癌早期診断の可能性について記載する数報の文献がある［２］。これら予備研究の結果は、癌が血液の生化学的環境において特徴的な変化をもたらし得ること、その結果、同定された数種の遺伝子の発現パターンを用いて、癌及び対照群を高い精度で識別できることを示す。しかし、血液バイオマーカーに基づく代替法で、ＢＩ−ＲＡＤＳ０患者内における乳癌（ＢＣ）と良性乳房疾患（ＢＢＤ）の識別に成功したものはない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、患者由来の生物試料において乳癌と良性乳房疾患を識別するための方法であって、ａ）患者から生物材料を含む生物試料を得るステップと、ｂ）生物試料由来の生物材料を、配列番号１〜４４に記載されている核酸配列を含む、少なくとも１つの標的遺伝子のための少なくとも１つの特異的試薬且つ２８標的遺伝子のための２８以下の特異的試薬と接触させるステップであって、少なくとも１つの試薬が、少なくとも配列番号１、２又は３、４及び５又は６に記載されている核酸配列から選択される核酸配列を含む標的遺伝子に特異的であるステップと、ｃ）配列番号１、２又は３、４及び５又は６に記載されている核酸配列から選択される核酸配列を含む少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルを決定して、患者の発現プロファイルを得るステップと、ｄ）以前に乳癌として臨床的に分類された患者由来の標的遺伝子の発現プロファイル及び以前に良性乳房疾患として臨床的に分類された患者由来の標的遺伝子の発現プロファイルを用いて、患者の発現プロファイルの解析を行うステップであって、患者の発現プロファイルが、以前に乳癌として臨床的に分類された患者由来の発現プロファイルと群れを形成した場合、患者は乳癌であると予見され、患者の発現プロファイルが、以前に良性乳房疾患として臨床的に分類された患者由来の発現プロファイルと群れを形成した場合、患者は良性乳房疾患であると予見されるステップとを含む方法を提供する。
【０００６】
一実施形態において、ステップｂ）において、生物材料を、少なくとも４且つ２８以下の標的遺伝子の組み合わせに特異的な試薬と接触させ、試薬は、少なくともそれぞれ配列番号１、２又は３、４及び５又は６に記載されている核酸配列を含む標的遺伝子に特異的な試薬を包含し、少なくとも前記４遺伝子の発現レベルをステップｃ）において決定して、患者の発現プロファイルを得る。
【０００７】
別の一実施形態において、ステップｂ）において、生物材料を、２８遺伝子の組み合わせに特異的な試薬と接触させ、試薬は、それぞれ配列番号１〜４４に記載されている核酸配列を含む標的遺伝子に特異的な試薬を包含し、２８遺伝子の発現レベルをステップｃ）において決定して、患者の発現プロファイルを得る。
【０００８】
具体的には、患者から採取された生物試料は、血液試料である。より具体的には、生物材料は、核酸を含む。
【０００９】
一実施形態において、ステップｂ）の少なくとも１つの特異的試薬は、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む。別の一実施形態において、ステップｂ）の特異的試薬は、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ及び少なくとも１つのプライマーを含む。更に別の一実施形態において、ステップｂ）の特異的試薬は、１つのハイブリダイゼーションプローブ及び２つのプライマーを含む。
本発明はまた、患者由来の生物試料において良性乳房疾患から乳癌を識別するためのキットであって、配列番号１〜４４に記載されている核酸配列を含む少なくとも１つの標的遺伝子のための少なくとも１つの特異的試薬且つ２８標的遺伝子のための２８以下の特異的試薬を含み、少なくとも１つの試薬が、少なくとも配列番号１、２又は３、４及び５又は６に記載されている核酸配列から選択される核酸配列を含む標的遺伝子に特異的であるキットを提供する。
【００１０】
一実施形態において、本発明のキットは、少なくとも４且つ２８以下の標的遺伝子の組み合わせに特異的な試薬を含み、試薬は、少なくともそれぞれ配列番号１、２又は３、４及び５又は６に記載されている核酸配列を含む標的遺伝子に特異的な試薬を包含する。
【００１１】
別の一実施形態において、本発明のキットは、２８標的遺伝子の組み合わせに特異的な試薬を含み、試薬は、配列番号１〜４４に記載されている核酸配列を含む標的遺伝子に特異的な試薬を包含する。
【００１２】
本発明はまた、患者由来の生物試料において良性乳房疾患から乳癌を識別するための組成物の製造における、配列番号１〜４４に記載されている核酸配列を含む少なくとも１つの標的遺伝子のための少なくとも１つの特異的試薬且つ２８標的遺伝子のための２８以下の特異的試薬の使用であって、少なくとも１つの試薬が、少なくとも配列番号１、２又は３、４及び５又は６に記載されている核酸配列から選択される核酸配列を含む標的遺伝子に特異的である使用に関する。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、患者由来の生物試料において良性乳房疾患から乳癌を識別するための組成物の製造における少なくとも４つ且つ２８以下の標的遺伝子の組み合わせに特異的な試薬の使用であって、試薬が、少なくともそれぞれ配列番号１、２又は３、４及び５又は６に記載されている核酸配列を含む標的遺伝子に特異的な試薬を包含する使用に関する。
【００１４】
別の一実施形態において、本発明は、患者由来の生物試料において良性乳房疾患から乳癌を識別するための組成物の製造における２８標的遺伝子の組み合わせの使用であって、試薬が、配列番号１〜４４に記載されている核酸配列を含む標的遺伝子に特異的な試薬を包含する使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ０患者におけるＢＣとＢＢＤを識別するための診断ツールを提供することにより、先行技術のあらゆる問題点を解決することを提案する。そのマンモグラフィがＢＩ−ＲＡＤＳ  ０として分類される患者の大多数が乳房病変を有することを考慮し、本研究は、ＢＣをＢＢＤから識別することを目的とする。これは、乳癌患者及びこの疾患の徴候のない患者の発現パターンに焦点を合わせる初期の研究とは大きく異なる。これは、一部の炎症反応調節等、癌の検出に対する一部の非癌特異的因子を排除する。
【００１６】
驚くべきことに、本発明者らは、ＣＨＩ３、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＩＬＲＡ３及びＴＵＢＢ２Ａから選択される少なくとも１つの標的遺伝子の発現の解析が、ＢＤＤ患者をＢＣから区別するのに十分な情報をもたらすことを証明した。当然ながら、上述の標的遺伝子の組み合わせの発現解析は、ＣＨＩ３、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＩＬＲＡ３及びＴＵＢＢ２Ａを包含する下の表１に記載されている遺伝子等、２８標的遺伝子の発現プロファイルの解析と同様に、結果の感度及び特異性を改善する。
【００１７】
【表１】
0005932778.tif 000002
【００１８】
例えば、表１において明らかな通り、同一標的遺伝子に対し数種の変異体が存在することもある。本発明において、全変異体が関係しており、差別せずに解析した。これら遺伝子の種々のアイソフォームが存在する場合、全アイソフォームが本発明に関係することが明瞭に理解される。
【００１９】
本発明者らは、特に関心がある決定的なマンモグラフィが得られない患者について、乳癌を良性乳房疾患から判別するのに有用な末梢血ｍＲＮＡシグネチャーを同定した。
【００２０】
よって、本発明は、患者由来の生物試料において乳癌と良性乳房疾患を識別するための方法であって、
ａ）患者から生物材料を含む生物試料を得るステップと、
ｂ）生物試料由来の生物材料を、配列番号１〜４４に記載されている核酸配列を含む、少なくとも１つの標的遺伝子のための少なくとも１つの特異的試薬及び２８標的遺伝子のための２８以下の特異的試薬と接触させるステップであって、少なくとも１つの試薬が、少なくとも配列番号１、２又は３、４及び５又は６に記載されている核酸配列から選択される核酸配列を含む標的遺伝子に特異的であるステップと、
ｃ）配列番号１、２又は３、４及び５又は６に記載されている核酸配列から選択される核酸配列を含む少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルを決定して、患者の発現プロファイルを得るステップと、
ｄ）以前に乳癌として臨床的に分類された患者由来の標的遺伝子の発現プロファイル及び以前に良性乳房疾患として臨床的に分類された患者由来の標的遺伝子の発現プロファイルを用いて、患者の発現プロファイルの解析を行うステップであって、
患者の発現プロファイルが、以前に乳癌として臨床的に分類された患者由来の発現プロファイルと群れを形成した場合、患者は乳癌であると予見され、
患者の発現プロファイルが、以前に良性乳房疾患として臨床的に分類された患者由来の発現プロファイルと群れを形成した場合、患者は良性乳房疾患であると予見されるステップと
を含む方法に関する。
【００２１】
１又は複数の実施形態において、ステップｂ）において、生物材料を、少なくとも２又は少なくとも３又は少なくとも４の標的遺伝子且つ２８以下の標的遺伝子の組み合わせに特異的な試薬と接触させることが可能であり、試薬は、少なくともそれぞれ配列番号１、２又は３、４及び５又は６のうちいずれか一配列に記載されている核酸配列を含む標的遺伝子に特異的な試薬を包含し、少なくとも２、３又は４種の遺伝子の発現レベルは、ステップｃ）において決定される。
【００２２】
標的遺伝子の組み合わせの例を下に記す。
配列番号１及び配列番号２又は３
配列番号１及び配列番号４
配列番号１及び配列番号５又は６
配列番号２又は３及び配列番号４
配列番号２又は３及び配列番号５又は６
配列番号４及び配列番号５又は６
配列番号１、配列番号２又は３及び配列番号４
配列番号１、配列番号２又は３及び配列番号５又は６
配列番号１、配列番号４及び配列番号５又は６
配列番号２又は３、配列番号４及び配列番号５又は６
配列番号４、配列番号５又は６及び配列番号２又は３、並びに
配列番号１、配列番号２又は３、配列番号４及び配列番号５又は６。
次の標的遺伝子の組み合わせ、即ち、配列番号１、配列番号２、配列番号４及び配列番号５並びに配列番号１、配列番号３、配列番号４及び配列番号６が好ましい。
【００２３】
その結果、本発明の方法の一実施形態において、ステップｂ）において、生物材料を、少なくとも４つ且つ２８以下の標的遺伝子の組み合わせに特異的な試薬と接触させ、試薬は、少なくともそれぞれ配列番号１、２又は３、４及び５又は６に記載されている核酸配列を含む標的遺伝子に特異的な試薬を包含し、少なくとも前記４遺伝子の発現レベルをステップｃ）において決定して、患者の発現プロファイルを得る。
【００２４】
本方法の別の一実施形態において、ステップｂ）において、生物材料を、２８遺伝子の組み合わせに特異的な試薬と接触させ、試薬は、それぞれ配列番号１〜４４に記載されている核酸配列を含む標的遺伝子に特異的な試薬を包含し、２８遺伝子の発現レベルをステップｃ）において決定して、患者の発現プロファイルを得る。
【００２５】
患者から採取された生物試料は、下文に定義する生物材料を含有する傾向のあるいずれかの試料であり、特に、血液、血漿、血清、組織、循環細胞試料、血液試料が好ましい。この生物試料は、当業者にとって公知のいずれかの種類のサンプリングによって供給される。
【００２６】
本発明の方法の一実施形態において、生物材料は、当業者によく知られた核酸抽出及び精製プロトコールのいずれかにより、生物試料から抽出することができる。本発明の別の一実施形態において、標的生物材料は、生物試料から抽出されず、その解析は、試料から直接的に行われる。
【００２７】
用語「生物材料」は、標的遺伝子発現の検出を可能にする任意の材料を意味する。生物材料は、特に、タンパク質又は核酸、特にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）若しくはリボ核酸（ＲＮＡ）等を含み得る。核酸は、特にＲＮＡ（リボ核酸）となり得る。
【００２８】
本発明の好ましい一実施形態によると、生物材料はステップで抽出され、核酸、好ましくはＲＮＡ、更により好ましくは全ＲＮＡを含む。全ＲＮＡは、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、標的遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と共にその他の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ等のｍＲＮＡ及びリボソームＲＮＡを含む。この生物材料は、特に、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又は該ｍＲＮＡに由来するタンパク質等、標的遺伝子に特異的な材料を含む。
【００２９】
目安として、核酸抽出は、患者の細胞内に含有されている核酸を遊離させるための、生物試料中に存在する細胞の溶解からなるステップにより実行することができる。例として、次の特許出願に記載されている溶解方法を用いることができる。磁気及び機械的溶解の混合に関する国際公開第００／０５３３８号パンフレット、電気的溶解に関する国際公開第９９／５３３０４号パンフレット、機械的溶解に関する国際公開第９９／１５３２１号パンフレット。当業者は、熱若しくは浸透圧ショック又はグアニジウム塩等のカオトロピック剤を用いた化学的溶解等、他のよく知られた溶解方法、溶解ステップにおいて遊離された他の細胞構成成分から核酸を分離するための精製ステップを用いてもよい（米国特許第５，２３４，８０９号明細書）。これは、一般に、核酸の濃縮を可能にし、ＤＮＡ又はＲＮＡの精製に適応させることができる。例として、必要に応じて吸着又は共有原子価によりオリゴヌクレオチドでコーティングした磁気粒子を用いることができ（この点において、米国特許第４，６７２，０４０号明細書及び米国特許第５，７５０，３３８号明細書を参照）、これにより、これら磁気粒子と結合した核酸を洗浄ステップによって精製することができる。この核酸精製ステップは、前記核酸をその後増幅することが望ましい場合特に有利である。これら磁気粒子の特に有利な一実施形態は、特許出願、国際公開第Ａ−９７／４５２０２号パンフレット及び国際公開第Ａ−９９／３５５００号パンフレットに記載されている。
【００３０】
用語「特異的な試薬」は、上に定義されている生物材料と接触させると、前記標的遺伝子に特異的な材料と結合する試薬を意味する。目安として、特異的な試薬及び生物材料が、核酸起源（nucleic origin）のものである場合、特異的な試薬を生物材料と接触させると、特異的な試薬は、標的遺伝子に特異的な材料とハイブリダイズする。用語「ハイブリダイゼーション」は、適切な条件下で、２本のヌクレオチド断片が、安定的且つ特異的な水素結合により結合して、二本鎖複合体を形成するプロセスを意味するよう企図されている。これらの水素結合は、相補的なアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））塩基の間（これをＡ−Ｔ結合と言う）、或いは相補的なグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）塩基の間（これをＧ−−Ｃ結合と言う）に形成される。２本のヌクレオチド断片のハイブリダイゼーションは、完全（相補的ヌクレオチド断片又は配列のことをいう）であってもよく、即ち、このハイブリダイゼーションにおいて得られる二本鎖複合体は、Ａ−Ｔ結合及びＣ−Ｇ結合のみを含む。このハイブリダイゼーションは、部分的（十分に相補的なヌクレオチド断片又は配列のことをいう）であってもよく、即ち、得られる二本鎖複合体は、二本鎖複合体を形成できるＡ−Ｔ結合及びＣ−Ｇ結合のみならず、相補塩基と結合していない塩基を含む。２本のヌクレオチド断片間のハイブリダイゼーションは、用いられている作業条件、特にストリンジェンシーに依存する。ストリンジェンシーは、特に、２本のヌクレオチド断片の塩基組成に応じると共に、２本のヌクレオチド断片間のミスマッチ形成の程度により定義される。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及び種類、変性剤の性質及び濃度、及び／又はハイブリダイゼーション温度等、反応パラメータにも依存し得る。これらデータの全てはよく知られており、当業者であれば、適切な条件を決定することができる。一般に、ハイブリダイズさせようとするヌクレオチド断片の長さに応じて、ハイブリダイゼーション温度は、およそ０．５〜１Ｍ濃度の生理食塩水溶液において、およそ２０〜７０℃、特に３５〜６５℃である。配列又はヌクレオチド断片又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、ヌクレオチド断片とハイブリダイズできる天然の核酸の情報的配列によって特徴づけられる、リン酸エステル結合によって一体的に集合した一連のヌクレオチドモチーフであり、この一連のモチーフは、異なる構造を有するモノマーを含有し、天然の核酸分子から及び／又は遺伝的組換えにより及び／又は化学合成により得ることができる。モチーフは、その構成要素が糖、リン酸基及び窒素性塩基である核酸の天然のヌクレオチドとなり得るモノマーの誘導体である。ＤＮＡにおける糖はデオキシ−２−リボースであり、ＲＮＡにおける糖はリボースである。ＤＮＡが関与するかＲＮＡが関与するかに応じて、窒素性塩基は、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン及びチミンから選択される。或いは、モノマーは、３種の構成要素のうち少なくとも１種が修飾されたヌクレオチドである。例として、修飾は、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリ���ン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジン等、修飾塩基又はハイブリダイゼーション可能なその他の修飾塩基を含む塩基のレベルか、糖のレベル、例えば少なくとも１個のデオキシリボースのポリアミドへの置換か（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４、１４９７〜１５００（１９９１）［３］）、或いはリン酸基のレベル、例えば、そのエステル、特に、二リン酸エステル、アルキル及びアリールホスホネート並びにホスホロチオエートから選択されるエステルへの置換のいずれかで生じ得る。
【００３１】
本発明の特定の一実施形態によると、特異的試薬は、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ、或いは少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ及び標的遺伝子に特異的な少なくとも１つのプライマー、或いは少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブ及び標的遺伝子に特異的な２つのプライマーを含む。
【００３２】
本発明の目的で、用語「増幅プライマー」は、酵素による重合、例えば酵素増幅反応を開始させる、５〜１００ヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドを含むヌクレオチド断片を意味する。用語「酵素増幅反応」は、少なくとも１つの酵素の作用によりヌクレオチド断片の複数コピーを生成するプロセスを意味する。このような増幅反応は当業者によく知られており、特に次の技法について言及することができる。米国特許第４，６８３，１９５号明細書、米国特許第４，６８３，２０２号明細書及び米国特許第４，８００，１５９号明細書に記載されているＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、例えば特許出願、欧州特許第０２０１１８４号明細書に開示されているＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、特許出願、国際公開第９０／０１０６９号パンフレットに記載されているＲＣＲ（修復連鎖反応（repair chain reaction））、特許出願、国際公開第９０／０６９９５号パンフレットによる３ＳＲ（自家持続配列複製法）、特許出願、国際公開第９１／０２８１８号パンフレットによるＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）、米国特許第５，３９９，４９１号明細書によるＴＭＡ（転写増幅法）並びにＲＴ−ＰＣＲ。
酵素増幅がＰＣＲである場合、特異的な試薬は、標的遺伝子に特異的な材料の増幅を可能にする、標的遺伝子に特異的な少なくとも２種の増幅プライマーを含む。そこで、標的遺伝子に特異的な材料は、好ましくは、標的遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られる相補的ＤＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡのことをいう）、又は標的遺伝子に特異的なｃＤＮＡの転写によって得られる相補的ＲＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＲＮＡのことをいう）を含む。酵素増幅が逆転写反応後に行われるＰＣＲである場合、ＲＴ−ＰＣＲのことをいう。
【００３３】
用語「ハイブリダイゼーションプローブ」は、所定の条件下におけるハイブリダイゼーション特異性を有し、標的遺伝子に特異的な材料とハイブリダイゼーション複合体を形成する、５〜１００ヌクレオチド、特に、１５〜３５ヌクレオチド及び６０〜７０ヌクレオチド等の１０〜７５ヌクレオチド等、少なくとも５ヌクレオチドを含むヌクレオチド断片を意味する。本発明において、標的遺伝子に特異的な材料は、標的遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮＡに包含されるヌクレオチド配列（標的遺伝子特異的ｍＲＮＡのことをいう）、前記メッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られる相補的ＤＮＡに包含されるヌクレオチド配列（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡのことをいう）、或いは、上述の前記ｃＤＮＡの転写によって得られる相補的ＲＮＡに包含されるヌクレオチド配列（標的遺伝子特異的ｃＲＮＡのことをいう）となることができる。ハイブリダイゼーションプローブは、その検出のための標識を包含し得る。用語「検出」は、計数方法等、直接検出か、標識を用いた検出方法による間接検出のいずれかを意味するよう企図されている。核酸を検出するための多くの検出方法が存在する（例えば、Ｋｒｉｃｋａら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９年、４５（４）巻、４５３〜４５８頁［４］又はＫｅｌｌｅｒ  Ｇ．Ｈ．ら、ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ、第２版、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年、第５及び６節、１７３〜２４９頁［５］を参照）。用語「標識」は、検出可能なシグナルを発生させることのできるトレーサーを意味するよう企図されている。これらトレーサーの非限定的な一覧として、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等、例えば比色分析、蛍光又は発光によって検出できるシグナルを生じる酵素；蛍光、発光又は色素化合物等、発色団；電子顕微鏡によって、伝導率等、その電気的特性のため、電流測定若しくはボルタメトリー（voltametry）の方法によって又はインピーダンス測定によって検出可能な電子密度の高い化学基；回折、表面プラズモン共鳴法若しくは接触角変動等、光学的方法又は原子間力分光測定、トンネル効果その他等、物理的方法によって検出できる化学基；３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等、放射性分子が挙げられる。
【００３４】
本発明の目的で、ハイブリダイゼーションプローブは、「検出」プローブとなることができる。この場合、「検出」プローブは、標識によって標識される。検出プローブは、特にＴｙａｇｉ＆Ｋｒａｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈ、１９９６、１４：３０３〜３０８［６］）によって記載されている「分子ビーコン」検出プローブとなることができる。これら「分子ビーコン」は、ハイブリダイゼーションの際に蛍光となる。これらは、ステムループ型の構造を有し、フルオロフォア及び「クエンチャー」基を含有する。特異的ループ配列とその相補的標的核酸配列との結合により、ステムがほどけ、適切な波長の励起により蛍光シグナルが放出される。検出プローブは、特に、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇＴＭの技術に従った「色分けバーコード（color-coded barcode）」を含む「レポータープローブ」となることができる。
【００３５】
ハイブリダイゼーション反応の検出のため、直接的に（特に、標識を標的配列中へと取り込むことにより）、或いは間接的に（特に、上に定義されている検出プローブを用いて）標識された標的配列を用いることができる。特に、ハイブリダイゼーションステップの前に、例えば、酵素増幅反応の際に標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸を用いた標的配列の標識及び／又は開裂に存するステップを行うことができる。開裂は、特に、イミダゾール又は塩化マンガンの作用によって行うことができる。標的配列は、例えば、文書、国際公開第９１／１９８１２号パンフレットに記載されているサンドイッチハイブリダイゼーション技法に従った検出プローブのハイブリダイズによって、増幅ステップの後に標識してもよい。別の特定の好ましい核酸標識方法は、出願、仏国特許出願公開第２７８００５９号明細書に記載されている。
【００３６】
本発明の好ましい一実施形態によると、検出プローブは、フルオロフォア及び消光剤を含む。本発明の更により好ましい一実施形態によると、ハイブリダイゼーションプローブは、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレセイン）又はＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）フルオロフォアをその５’末端に、消光剤（ダブシル）をその３’末端に含む。
【００３７】
ハイブリダイゼーションプローブは、「捕捉（capture）」プローブであってもよい。この場合、「捕捉」プローブは、任意の適切な手段、即ち、直接的又は間接的に、例えば共有原子価又は吸着により、固体基板（solid substrate）上に固定化される、或いは固定化することができる。固体基板として、必要に応じて化学修飾された合成材料又は天然材料、特に、セルロースベースの材料、例えば紙、酢酸セルロース及びニトロセルロース等のセルロース誘導体又はデキストラン等、多糖類、特にスチレン型モノマーに基づくポリマー、コポリマー、綿等、天然繊維並びにナイロン等、合成繊維；シリカ、石英、ガラス又はセラミクス等、無機材料；ラテックス；磁気粒子；金属誘導体、ゲル等を用いることができる。固体基板は、マイクロタイタープレート（microtitration plate）、出願、国際公開第Ａ−９４／１２６７０号パンフレットに記載されているメンブレン又は粒子の形態となることができる。それぞれ、標的遺伝子に特異的な数種の異なる捕捉プローブを基板上に固定化することも可能である。特に、多数のプローブを固定化できるバイオチップを基板として用いることができる。用語「バイオチップ」は、小サイズの、数多くの捕捉プローブをその所定の位置に付着させる固体基板を意味するよう企図されている。バイオチップ又はＤＮＡチップの概念は、１９９０年代初頭を端緒とする。これは、マイクロエレクトロニクス、核酸化学、画像解析及び情報技術を統合した集学的技術に基づく。その動作原理は、分子生物学的基盤、ハイブリダイゼーション現象、即ち、２種のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列の塩基の相補性による対形成に基づく。バイオチップ方法は、固体基板に付着した捕捉プローブの使用に基づき、プローブにおいて、蛍光色素で直接的又は間接的に標識された標的ヌクレオチド断片の試料が作用する。捕捉プローブは、基板又はチップ上に特異的に配置され、各ハイブリダイゼーションは、標的ヌクレオチド断片に関し特異的な情報を提供する。得られた情報は累積的であり、例えば、１又は複数の標的遺伝子の発現レベルの定量化を可能にする。標的遺伝子の発現を解析するため、次に、ｍＲＮＡへと転写される標的遺伝子の全部又は一部に対応する数多くのプローブを含む基板を調製することができる。本発明の目的で、用語「低密度基板」は、５０未満のプローブを含む基板を意味するよう企図されている。本発明の目的で、用語「中密度基板」は、５０のプローブから１００００のプローブを含む基板を意味するよう企図されている。本発明の目的で、用語「高密度の基板」は、１００００を超えるプローブを含む基板を意味するよう企図されている。
【００３８】
次に、解析が望まれる標的遺伝子に特異的なｃＤＮＡ又はｃＲＮＡは、例えば、特異的捕捉プローブとハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション後、基板又はチップは洗浄され、標識ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ／捕捉プローブ複合体は、例えば、蛍光色素型標識との高親和性リガンド結合によって明らかになる。蛍光は、例えばスキャナにより読み取られ、蛍光の解析は、情報技術により処理される。目安として、分子診断のためＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社（「高密度のＤＮＡアレイによる遺伝情報アクセス（Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays）」、Ｍ．Ｃｈｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６、２７４、６１０〜６１４［７］、「迅速なＤＮＡ配列解析のための発光オリゴヌクレオチドアレイ（Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis）」、Ａ．Ｃａｖｉａｎｉ  Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９４、９１、５０２２〜５０２６［８］）によって開発されたＤＮＡチップについて言及することができる。本技術において、捕捉プローブは、一般にサイズが小さく、ほぼ２５ヌクレオチドである。バイオチップの他の例は、Ｇ．Ｒａｍｓａｙ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９８、１６巻、４０〜４４頁［９］；Ｆ．Ｇｉｎｏｔ、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ、１９９７、１０巻、１〜１０頁［１０］；Ｊ．Ｃｈｅｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、１９９６、１（３）巻、１８３〜２００頁［１１］；Ｔ．Ｌｉｖａｃｈｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、２２（１５）巻、２９１５〜２９２１頁［１２］；Ｊ．Ｃｈｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９８、１６巻、５４１〜５４６頁［１３］による刊行物又は米国特許第４，９８１，７８３号明細書、米国特許第５，７００，６３７号明細書、米国特許第５，４４５，９３４号明細書、米国特許第５，７４４，３０５号明細書及び米国特許第５，８０７，５２２号明細書に記されている。固体基板の主な特徴は、標的ヌクレオチド断片における捕捉プローブのハイブリダイゼーション特徴を保存するが、同時に、検出方法に対し最小バックグラウンドノイズを生じることであるべきである。プローブを基板上に固定化するための製作法（fabrication）の主要な型を３通りに区別することができる。
【００３９】
まず第一に、予め合成（pre-synthesized）されたプローブを置くことに存する第一の技法が存在する。プローブの付着は、マイクロピペット若しくはマイクロドットによって又はインクジェット装置によって直接移植することによって行われる。この技法は、数塩基（５〜１０）から最大で比較的大サイズの６０塩基（プリント）から数百塩基（マイクロデポジション（microdeposition））の範囲のサイズを有するプローブを付着させる。
【００４０】
プリントは、インクジェットプリンターにより用いられる方法の適応である。これは、４０００滴／秒に到達し得る速度の液体の微小球体（容量＜１ｎｌ）の推進力に基づく。プリントは、液体を放出するシステムと、それが置かれる表面とのいかなる接触にも関与しない。
【００４１】
マイクロデポジションは、数十〜数百塩基の長いプローブをスライドグラス表面に付着させることに存する。これらのプローブは、一般に、データベースから抽出され、増幅及び精製された産物の形態である。本技法は、４ｃｍ２弱の表面積におけるＤＮＡの認識ゾーン（recognition zone）と称する、およそ一万スポットを有するマイクロアレイと称するチップの作製を可能にする。尚、直径０．５〜１ｍｍ、最大密度２５スポット／ｃｍ２の、一般にＰＣＲにより増幅された産物を有する「マクロアレイ（macroarray）」と呼ばれるナイロンメンブレンの使用も忘れてはいけない。この非常に柔軟な技法は、多くの研究室で用いられている。本発明において、後者の技法は、バイオチップに包含されると考慮される。しかし、特許出願、国際公開第Ａ−００／７１７５０号パンフレット及び仏国特許出願公開第００／１４８９６号明細書の場合のように、マイクロタイタープレートの各ウェルの底に一定容量の試料を置いても、或いは、別の特許出願、仏国特許出願公開第００／１４６９１号明細書に従って、同じペトリ皿の底に明確に形成された滴を一定数置いてもよい。
【００４２】
プローブを基板又はチップに付着させるための第二の技法は、ｉｎ  ｓｉｔｕ合成と称する。本技法は、直接チップ表面における短いプローブの作製を可能にする。これは、ｉｎ  ｓｉｔｕオリゴヌクレオチド合成（特に、特許出願、国際公開第８９／１０９７７号パンフレット及び国際公開第９０／０３３８２号パンフレットを参照）に基づき、また、オリゴヌクレオチド合成機プロセスに基づく。この技法は、オリゴヌクレオチド伸長反応が行われている反応チャンバーをガラス表面に沿って動かすことに存する。
【００４３】
最後に、第三の技法は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって開発されたバイオチップに関与するプロセスであるフォトリソグラフィーと称する。この技法もｉｎ  ｓｉｔｕ合成である。フォトリソグラフィーは、マイクロプロセッサ技法に由来する。チップの表面は、光活性化され得る感光性化学基の付着によって修飾される。照射されると、この化学基は、オリゴヌクレオチドの３’末端と反応することができる。この表面を定義された形状のマスクによって保護することにより、選択的な照射と、従って、４種のヌクレオチドのいずれか１種の付着が望ましいチップの領域の活性化が可能になる。異なるマスクの逐次的な使用により、保護／反応の交互のサイクルと、従って、およそ数十平方マイクロメートル（μｍ２）のスポット上におけるオリゴヌクレオチドプローブの作製が可能になる。この解像度は、数平方センチメートル（ｃｍ２）の表面積に最大数十万個のスポットの作製を可能にする。フォトリソグラフィーは、次の利点を有する。大量に（in bulk）並行して、Ｎ塩基長（mer）のチップの作製をほんの４×Ｎサイクルで可能にする。これら技法は全て、本発明により用いることができる。本発明の好ましい一実施形態によると、上に定義されているステップｂ）の少なくとも１種の特異的試薬は、好ましくは、基板上に固定化された少なくとも１種のハイブリダイゼーションプローブを含む。この基板は、好ましくは、上に定義されている低、高又は中密度の基板である。
【００４４】
数多くのプローブを含む基板におけるこれらハイブリダイゼーションステップに先行して、標的遺伝材料の量を増加させるための、上に定義されている酵素増幅反応ステップが行われ得る。ステップｃ）において、標的遺伝子の発現レベルの決定は、当業者にとって公知のプロトコールのいずれかにより行うことができる。一般に、標的遺伝子の発現は、所定の期間で標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）を検出することにより、或いは、これらｍＲＮＡに由来するタンパク質を検出することにより解析することができる。
【００４５】
本発明は、好ましくは、当業者によく知られたプロトコールのいずれかに従った、標的遺伝子の発現レベルの、該標的遺伝子に由来するｍＲＮＡの検出による決定に関する。本発明の特定の一実施形態によると、各ｍＲＮＡが標的遺伝子に由来する数種の異なるｍＲＮＡの検出により、数種の標的遺伝子の発現レベルが同時に決定される。
【００４６】
特異的な試薬が、少なくとも１種の増幅プライマーを含む場合、次の仕方による標的遺伝子の発現レベルの決定が可能となる。１）生物材料として、上に提示されている通り生物試料から全ＲＮＡ（転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む）を抽出した後、前記ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）を得るために逆転写ステップを行う。目安として、この逆転写反応は、ＲＮＡ断片から相補的ＤＮＡ断片の獲得を可能にする逆転写酵素を用いて行うことができる。ＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス（Avian Myoblastosis Virus））又はＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）由来の逆転写酵素を特に用いることができる。より具体的には、ｍＲＮＡのｃＤＮＡのみを得ることが望ましい場合、この逆転写ステップは、相補性によりｍＲＮＡのポリＡ配列とハイブリダイズして、逆転写酵素の行う逆転写反応の開始点として機能するポリＴ−ポリＡ複合体を形成するチミン塩基（ポリＴ）のみを含むヌクレオチド断片の存在下で行うことができる。続いて、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ）及び標的遺伝子以外の遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子特異的ではないｃＤＮＡ）が得られる。２）標的遺伝子に特異的な増幅プライマー（複数可）を、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ及び標的遺伝子特異的ではないｃＤＮＡと接触させる。標的遺伝子に特異的な増幅プライマー（複数可）は、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡとハイブリダイズし、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡから生じるｃＤＮＡの公知の長さの所定の領域が特異的に増幅される。標的遺伝子特異的ではないｃＤＮＡは増幅されず、その一方で、大量の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが得られる。本発明の目的では、「標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ」又は「標的遺伝子に由来するｍＲＮＡから生じるｃＤＮＡ」と区別なくいう。このステップは、特にＰＣＲ型増幅反応により、或いは上に定義されているその他の増幅技法により行うことができる。ＰＣＲにより、それぞれ標的遺伝子に特異的な数組の異なる増幅プライマーを用いることにより、それぞれ異なる標的遺伝子に特異的な数種の異なるｃＤＮＡを同時に増幅することも可能となる：マルチプレックス増幅のことをいう。３）標的遺伝子の発現は、上述のステップ２）において得られた標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを検出及び定量化することにより決定される。この検出は、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡをそのサイズに応じて泳動する電気泳動の後に行うことができる。所定の泳動時間の後に、ＵＶ（紫外）光のライトテーブル上にゲルを置いたときに、光シグナルの放出によって標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの直接検出できるよう、泳動用のゲル及び培地は、エチジウムブロマイドを包含し得る。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの量が多い程、この光シグナルは明るくなる。このような電気泳動技法は、当業者によく知られている。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡは、飽和するまで行われた増幅反応によって得られた定量化範囲を用いて検出及び定量化してもよい。種々のステップ（逆転写、ＰＣＲ等）において観察され得る酵素効率の可変性を考慮に入れるため、種々の患者群の標的遺伝子の発現は、その発現が種々の患者群において類似する「ハウスキーピング」遺伝子の発現を同時に決定することにより正規化することができる。ハウスキーピング遺伝子の発現に対する標的遺伝子の発現の比率を理解することにより、即ち、ハウスキーピング遺伝子特異的ｃＤＮＡの量に対する標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの量の比率を理解することにより、種々の実験間のいかなる可変性も補正される。当業者は、特に、次の刊行物を参照することができる。Ｂｕｓｔｉｎ  Ｓ  Ａ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２００２、２９：２３〜３９；Ｇｉｕｌｉｅｔｔｉ  Ａ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００１、２５：３８６〜４０１。
【００４７】
特異的試薬が、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む場合、標的遺伝子の発現は、次の仕方で決定することができる。１）生物材料として、上に提示されている生物試料から全ＲＮＡを抽出した後、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ）及び標的遺伝子以外の遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子特異的でないｃＤＮＡ）を得るため、上述の通り逆転写ステップを行う。２）標的遺伝子特異的ｃＤＮＡと捕捉プローブのハイブリダイゼーション反応を行うため、その発現の解析が望まれる標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが固定化された基板と全ｃＤＮＡを接触させ、ここで標的遺伝子特異的でないｃＤＮＡは捕捉プローブとハイブリダイズしない。ハイブリダイゼーション反応は、上に示されているあらゆる材料を包含する固体基板上で行うことができる。好ましい一実施形態によると、ハイブリダイゼーションプローブは、基板上に固定化される。好ましくは、基板は、上に定義されている低、高又は中密度の基板である。ハイブリダイゼーション反応に先行して、上述の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの酵素増幅からなるステップを行って、大量の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを得て、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが標的遺伝子に特異的な捕捉プローブとハイブリダイズする確率を増加させることができる。ハイブリダイゼーション反応に先行して、例えば、増幅反応のために標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸を用いた、上述の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの標識及び／又は開裂に存するステップを行うこともできる。開裂は、特に、イミダゾール及び塩化マンガンの作用によって行うことができる。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡは、例えば、文書、国際公開第Ａ−９１／１９８１２号パンフレットに記載されているサンドイッチハイブリダイゼーション技法に従って標識プローブをハイブリダイズさせることにより、増幅ステップの後に標識してもよい。核酸を標識及び／又は開裂させるための他の好ましい特定の方法は、出願、国際公開第９９／６５９２６号パンフレット、国際公開第０１／４４５０７号パンフレット、国際公開第０１／４４５０６号パンフレット、国際公開第０２／０９０５８４号パンフレット、国際公開第０２／０９０３１９号パンフレットに記載されている。３）その後、ハイブリダイゼーション反応の検出からなるステップが行われる。検出は、標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが標的遺伝子特異的ｃＤＮＡとハイブリダイズする基板を、標識で標識された「検出」プローブと接触させ、標識により放射されたシグナルを検出することにより行うことができる。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが、標識で前もって標識された場合、標識によって放射されたシグナルは直接的に検出される。
【００４８】
ステップｂ）において接触させる少なくとも１つの特異的試薬が、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む場合、標的遺伝子の発現は、次の仕方で決定することもできる。１）生物材料として、上に提示されている生物試料から全ＲＮＡを抽出した後、生物材料のｍＲＮＡのｃＤＮＡを得るため、逆転写ステップが上述の通りに行われる。その後、プロモーターの制御下において機能し、ＤＮＡテンプレートから相補的ＲＮＡを得ることを可能にするＴ７ポリメラーゼ酵素を用いて、ｃＤＮＡの相補的ＲＮＡの重合が行われる。次に、標的遺伝子に特異的なｍＲＮＡのｃＤＮＡのｃＲＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＲＮＡのことをいう）及び標的遺伝子に特異的でないｍＲＮＡのｃＤＮＡのｃＲＮＡが得られる。２）標的遺伝子特異的ｃＲＮＡと捕捉プローブのハイブリダイゼーション反応を行うため、その発現の解析が望ましい標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが固定化された基板と全ｃＲＮＡを接触させ、ここで標的遺伝子特異的でないｃＲＮＡは、捕捉プローブとハイブリダイズしない。数種の標的遺伝子の発現を同時に解析することが望ましい場合、それぞれ標的遺伝子に特異的な数種の異なる捕捉プローブを基板上に固定化することができる。ハイブリダイゼーション反応に先行して、上述の標的遺伝子特異的ｃＲＮＡの標識及び／又は開裂に存するステップを行うことができる。３）その後、ハイブリダイゼーション反応の検出からなるステップが行われる。検出は、標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが、標的遺伝子特異的ｃＲＮＡとハイブリダイズする基板を、標識で標識された「検出」プローブと接触させ、標識により放射されたシグナルを検出することにより行うことができる。標的遺伝子特異的ｃＲＮＡが標識で前もって標識される場合、標識により放射されたシグナルは、直接的に検出される。多数のプローブがハイブリダイズされるバイオチップ型の基板が用いられる場合、ｃＲＮＡの使用は特に有利である。
【００４９】
本発明はまた、配列番号１〜４４のうちいずれか１配列を有する核酸配列を備える標的遺伝子に特異的なプローブから選択される少なくとも４種のハイブリダイゼーションプローブ、特に、配列番号１、２又は３、４及び５又は６のうちいずれか１配列を有する核酸配列を備える標的遺伝子に特異的な４種のハイブリダイゼーションプローブを含む基板に関する。
【００５０】
本発明は、更に、ＢＣをＢＢＤから識別するための、上に定義されている基板の使用に関する。
【００５１】
本発明はまた、患者由来の生物試料において良性乳房疾患から乳癌を識別するためのキットであって、配列番号１〜４４に記載されている核酸配列を含む少なくとも１つの標的遺伝子のための少なくとも１つの特異的試薬且つ２８標的遺伝子のための２８以下の特異的試薬を含み、少なくとも１つの試薬が、少なくとも配列番号１、２又は３、４及び５又は６に記載されている核酸配列から選択される核酸配列を含む標的遺伝子に特異的であるキットに関係する。
【００５２】
特異的試薬は、より詳細には上述の少なくとも２、３又は４の遺伝子であるが２８以下の遺伝子の組み合わせを標的とすることができ、一実施形態において、キットは、少なくとも４且つ２８以下の標的遺伝子の組み合わせに特異的な試薬を含み、該試薬は、少なくともそれぞれ配列番号１、２又は３、４及び５又は６に記載されている核酸配列を含む標的遺伝子に特異的な試薬を包含する。別の一実施形態において、キットは、２８標的遺伝子の組み合わせに特異的な試薬であって、配列番号１〜２８に記載されている核酸配列を含む標的遺伝子に特異的な試薬を包含する試薬を含む。
【実施例】
【００５３】
Ｉ）材料と方法
１．患者及び試料の特徴
本研究において、８４名の乳癌患者及び９４名の乳房良性疾患患者から血液試料を収集した。全患者は、２００７年７月から２００８年１２月にかけて復旦大学癌病院乳房手術部門（Breast Surgery Department of Cancer Hospital, Fudan University）（中国、上海）の乳癌の疑いのある患者を参照した。病院において各患者のマンモグラフィ検査を行い、一方、３名の専門的な放射線科医によって患者の全ＢＩ−ＲＡＤＳカテゴリーを決定した。ＲＮＡ安定化溶液を含有するＰａｘｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）に、８４名のＢＣ女性及び９４名のＢＢＤ女性それぞれから約２．５ｍｌの末梢血を収集した。疑いのある乳房病変における細針吸引術又は細胞学的検査により示されるいずれかの侵襲段階の前に、全血液試料を収集した。乳癌の診断は、針生検における癌細胞の同定に基づき、或いは良性疾患の外科的検体診断は、切開生検における癌細胞の欠如に基づいた。プロトコルは、臨床研究のための地方倫理委員会（local Ethical Committee for Clinical Research）により承認され、試験に採用した全患者から書面によるインフォームド・コンセントを得た。ＴＮＭステージ分類体系及びノッティンガム（Nottingham）システムを用いたグレード分類により、最終的な病理学的腫瘍ステージを決定した。その上、各腫瘍における腫瘍型及び腫瘍グレード、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）及びヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）状態並びにリンパ節状態を評価した。
【００５４】
２．ＲＮＡ抽出及びマイクロアレイ解析
ＰＡＸＧｅｎｅ血液ＲＮＡ（登録商標）キット（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ）によりメーカーの説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。光学密度（ＯＤ）２６０ｎｍの分光光度計により全ＲＮＡの量を測定し、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてＲＮＡ６０００Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐを用いて品質を評価した。ＲＮＡ品質数値（RNA Integrity Number）（ＲＩＮ）が７〜１０である試料のみ解析した。次に、５０ｎｇの全ＲＮＡを逆転写し、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡ  Ｏｖａｔｉｏｎ技術を用いてＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ増幅システム（ＮｕＧｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、メーカーの標準プロトコールに従って一本鎖ｃＤＮＡへと直線的に増幅させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）により産物を精製した。その後、２μｇの増幅・精製されたｃＤＮＡをＲＱ１  ＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により断片化し、末端転移酵素（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）及びＤＮＡ標識試薬（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によりビオチン化デオキシヌクレオシド三リン酸で標識した。ハイブリダイゼーションオーブン６４０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）内で、６０ｒｐｍ、５０℃で１８時間、ＨＧ  Ｕ１３３  ｐｌｕｓ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）において標識ｃＤＮＡをハイブリダイズさせた。ＨＧ  Ｕ１３３  ｐｌｕｓ２．０アレイは、およそ３９，０００の最もよく特徴づけられたヒト遺伝子を代表する５４，６７５プローブセットを含有する。ハイブリダイゼーション後、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルＥｕｋＧＥ−ＷＳ２ｖ４に従い、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ流体ステーション（fluidic station）ＦＳ４５０を用いてアレイを洗浄、染色した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘスキャナ３０００によりアレイをスキャンした。
【００５５】
３．マイクロアレイデータ解析
品質管理及び前処理。標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ品質管理パラメータの推奨に従って品質管理解析を行った。評価判断基準に基づくと、あらゆる血液試料測定値は、最小品質要求事項を満たした。バックグラウンド補正、分位正規化及び中央値分散分析要約（median polish summarization）を用いたＲＭＡ（ロバストマルチチップアベレージ（Robust Multi-chip Average））［１０］により、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現アレイを前処理した。極端なシグナル強度（５０より低い、或いは２１４より高い）を有するプローブセットを除去した。次に、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅデータベース情報に従い、配列情報に基づくフィルタリングを行った。Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤアノテーションなしのプローブセットを除去した。同一Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤに対する複数のプローブセットマッピングのために、最大値の四分位範囲のプローブセットのみを保持し、それ以外は除去した。結論として、バッチの尤度を低下させるため、正規化アルゴリズム、ＣｏｍＢａｔ［１１］を適用した。ＣｏｍＢａｔ方法（ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ｂｙｕ．ｅｄｕ／ｊｏｈｎｓｏｎ／ＣｏｍＢａｔ／）は、所定のデータセットにおけるバッチ効果を調整するために、パラメトリック又はノンパラメトリックいずれかの経験的ベイズフレームワークを適用する。
【００５６】
４．分子シグネチャー同定
発現データにおける重複性プローブセット及びバッチ変動を低下させるための適切な前処理の後、前処理した発現データに基づき分子シグネチャー同定を行った。マンモグラフィの結果及び確認された病理学的情報による８４のＢＣ及び９４のＢＢＤ試料を２群、即ちＢＩ−ＲＡＤＳ１〜５である７９のＢＣ＋７３のＢＢＤと、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ０である５のＢＣ＋２１のＢＢＤに分別した。ＢＩ−ＲＡＤＳ１〜５である７９のＢＣ＋７３のＢＢＤを訓練セット（train set）として用いて、再帰的特色排除（Recursive Feature Elimination）（ＲＦＥ）手順により関心のある遺伝子を同定し、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）［１２〜１３］により分類モデルを構築した。訓練セット内において、５倍の交差検定プロセスを行って、最適な遺伝子セットを決定した。第５の訓練セットのうち４つに基づくＲＦＥにより上位１００遺伝子のリストを同定した。上位１００遺伝子に基づき分類モデルを作成し、第５の訓練セットのうち別の１種を用いてモデルを検査した。本プロセスを１０００回反復して実施し、これにより、千個の上位１００遺伝子セットを作製した。最終的に、千個の上位１００遺伝子リスト全体に現れる遺伝子を最も強い遺伝子として同定して、全訓練セットを用いて最終モデルを作製した。その後、完全に不可視の（unseen）試料、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ０である５のＢＣ＋２１のＢＢＤへとモデルを適用した。
【００５７】
Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒライブラリー［１４〜１８］によるＲ環境を用いて、前処理及び統計的ステップを実行した。
【００５８】
ＩＩ）結果
１．患者の特徴
マンモグラフィの結果及び確認された病理学的情報による８４名のＢＣ及び９４名のＢＢＤ患者由来の１７８試料において本研究を行い、次に、これを２群、即ちＢＩ−ＲＡＤＳ１〜５である７９のＢＣ＋７３のＢＢＤと、ＢＩ−ＲＡＤＳ  ０である５のＢＣ＋２１のＢＢＤに分別した。表２は、これらＢＣ及びＢＢＤ患者集団の臨床的特徴の概要を述べる。即ち、９２％の癌患者はＴ０〜Ｔ２腫瘍を表し、７０％及び３２％の腫瘍は、それぞれホルモン受容体陽性及びＨｅｒ２陽性であった。良性所見は、それぞれ５１．１％の乳房疾患、２７．７％の乳腺線維腺腫及び２１．２％の毛細胆管内乳頭腫を包含した。
【００５９】
【表２】
0005932778.tif 000003
0005932778.tif 000004
【００６０】
２．モデルの構築及び実行
再帰的特色排除（ＲＦＥ）手順及びサポートベクターマシン（ＳＶＭ）分類を用いることにより、ＢＩ−ＲＡＤＳ１〜５であるＢＣ及びＢＢＤ患者を識別するための２８遺伝子パネルのセット（表１）を開発した。次に、ＢＩ−ＲＡＤＳ０群においてこの２８遺伝子パネルを検査した。
【００６１】
表３に概要が述べられている通り、２８予測遺伝子の中で、そのうち１５の発現は、ＢＢＤと比較してＢＣにおいて下方に発現され、１３は、ＢＣ対ＢＢＤにおいて上方に発現される。
【００６２】
【表３】
0005932778.tif 000005
【００６３】
４遺伝子シグネチャー
第一の訓練セットにおいて、４遺伝子パネルＣＨＩ３Ｌ１、ＣＬＥＣ４Ｃ、ＬＩＬＲＡ３及びＴＵＢＢ２Ａは、推定精度７１％（７６％の感度及び６６％の特異性）で悪性及び良性に分類した。
７９の乳癌試料のうち、６０を正確に分類し、一方、７３の良性試料のうち４８を正確なクラスに割り当てた（表４ａ）。
【００６４】
【表４】
0005932778.tif 000006
【００６５】
独立的ＢＩ−ＲＡＤＳ０検査セットにおけるモデルの性能測定基準を表４ｂに報告した。それぞれ感度６０％、特異性３８％で５種の癌試料のうち３つを正確に分類し、一方、２１名の良性患者のうち８名を的確に分類した。ＢＩ−ＲＡＤＳ０の検査セットにおけるモデルの精度は４２％である。
【００６６】
【表５】
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【００６７】
２８遺伝子シグネチャー
訓練セットにおいて、２８遺伝子パネルは、推定精度８８％（９４％の感度及び８４％の特異性）で悪性及び良性に分類した。
７９の乳癌試料のうち７４を正確に分類し、一方、７３の良性試料のうち６１を正確なクラスに割り当てた（表５ａ）。
【００６８】
【表６】
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【００６９】
独立的ＢＩ−ＲＡＤＳ０検査セットにおけるモデルの性能測定基準を表５ｂに報告する。それぞれ感度８０％、特異性７１％で５種の癌試料のうち４つを正確に分類し、一方、２１名の良性患者のうち１５名を的確に分類した。ＢＩ−ＲＡＤＳ  ０の検査セットにおけるモデルの精度は７３％である。
【００７０】
【表７】
0005932778.tif 000009
【００７１】
本発明者らはまた、不正確に予見された対象において、臨床的特徴のうちいずれが有意に大きな比率を占めるかについて解析した。本発明者らは、検査セットにおける唯一の偽陰性症例が、パジェット病及びＤＣＩＳの４６歳女性であったことを見出した。
【００７２】
書誌参照
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