(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター結合領域とその下流に位置する発光酵素の遺伝子とから成る領域を含む核酸を有する生体試料由来の被験試料から放射される、前記発光酵素に由来する発光を検出して、前記被験試料内部の結像面における前記プロモーターの活性の強度および分布を示す第１画像を取得すること、および
前記第１画像の取得と同時にまたは前記取得と連続して、前記被験試料に対して照射光を照射し、前記照射光に応じて前記被験試料から放射される光を検出して、前記被験試料の内部の結像面における内部構造および外観を示す第２画像を取得することを含む光学的結像手段を用いて生体試料由来の被験試料の画像を取得する方法であって、
前記第１画像と前記第２画像は被験試料内部における同一の結像面について取得されたものである方法。
【請求項２】
前記被験試料は、ショウジョウバエの受精卵、胚、幼虫、蛹または成虫である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２画像は、前記照射光が前記被験試料を透過して生じる光および／または前記照射光が前記被験試料に反射して生じる光を検出することにより得られる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸は蛍光タンパク質の遺伝子をさらに含み、前記照射光は前記蛍光タンパク質を励起することができる光であり、前記第２画像は、前記被験試料中で発現した前記蛍光タンパク質から放射される蛍光を検出することにより得られる請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光タンパク質は、前記蛍光タンパク質とは異なるタンパク質と融合した状態で前記被験試料中に存在する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸は、前記プロモーター結合領域とは異なる第２プロモーター結合領域と、その下流に位置し前記発光酵素とは異なる第２発光酵素の遺伝子とから成る少なくとも１つの領域をさらに含み、
前記被験試料から放射される、前記第２発光酵素に由来する発光を検出して、前記被験試料における前記第２プロモーターの活性の強度および分布を示す第３画像を取得することをさらに含む請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１画像および前記第２画像の取得は、経時的に複数回繰り返して行われる請求項１から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記被験試料の複数の異なる面の各々から前記第１画像および前記第２画像が取得される請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１画像および前記第２画像を取得する前および／または後において、前記被験試料に対して刺激を与えることをさらに含む請求項１から８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記刺激は、薬剤の投与、光の照射、電気刺激、ガスへの曝露および加熱から成る群から選択される少なくとも１つである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１画像および前記第２画像は、前記刺激を与える前および後にそれぞれ少なくとも１回ずつ取得され、
前記刺激を与える前に取得された少なくとも１つの前記第１画像と前記刺激を与えた後に取得された少なくとも１つの前記第１画像とを比較し、および／または前記刺激を与える前に取得された少なくとも１つの前記第２画像と前記刺激を与えた後に取得された少なくとも１つの前記第２画像とを比較することをさらに含む請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１画像および前記第２画像の対応する部分を抽出することをさらに含む請求項１から１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１画像と前記第２画像とを重ね合わせた画像を取得することをさらに含む請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記重ね合わせた画像を表示または記録することをさらに含む請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料由来の被験試料の画像を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の癌化にＷｎｔ／β−カテニン経路が関与することが報告されている。Ｗｎｔとは、広い生物種において保存されている分泌性糖タンパク質であり、発生や形態形成等に関与することが確認されている。β−カテニンは細胞内に発現するタンパク質であり、核内に移行した場合、転写因子と結合して、種々の遺伝子の発現を促進する。Ｗｎｔ／β−カテニン経路において、Ｗｎｔの刺激に応じてβ−カテニンの細胞内濃度が調節される。
【０００３】
Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、新規抗癌剤検索における有力なターゲットとして有力視されている。また、Ｗｎｔ／β−カテニン経路は癌以外にも様々な疾患との関連性が報告されている。新規で有効なＷｎｔ／β−カテニン経路の研究手段は、これらの研究の進展において重要である。
【０００４】
生体試料から情報を取得する方法として、ルミノメーターを用いて発光検出する方法や、免疫組織学的染色法を用いて遺伝子発現パターンを検出する方法が存在する。
【０００５】
ルミノメーターを用いた発光検出では、ショウジョウバエといった生体試料の胚、幼虫、蛹、成虫について、その発生過程におけるプロモーター活性の変化を測定する方法が知られている。しかしながら、ルミノメーターのような分光測定で得られるデータは、プロモーター活性の数値データのみであり、画像データを得ることは出来ない。このため、胚、幼虫、蛹および成虫における遺伝子発現パターンを測定することは出来ない。
【０００６】
また、免疫組織学的染色法（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、βガラクトシダーゼおよびＸ−ｇａｌを用いたプロモーターアッセイ法等）は、古くから遺伝子発現パターンを検出する手法として使用されてきものの、染色に際してサンプルの固定が必要であるため、生きているショウジョウバエといった生体試料を連続的に観察することは出来ない。
【０００７】
特許文献１には、光透過性に乏しい厚みのある胚等の生体試料について、遺伝子発現に関する情報をルシフェラーゼによる発光を用いて異なる角度から画像取得することにより、異なる試料外面付近に分布する遺伝子発現を解析する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−０８９５２１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Cell (1992) Vol.26:1073-1087
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、生体試料由来の被験試料についての有用な情報を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る光学的結像手段を用いて生体試料由来の被験試料の画像を取得する方法は、プロモーター結合領域とその下流に位置する発光酵素の遺伝子とから成る領域を含む核酸を有する生体試料由来の被験試料から放射される、前記発光酵素に由来する発光を検出して、前記被験試料における前記プロモーターの活性の強度および分布を示す第１画像を取得すること、および前記第１画像の取得と同時にまたは前記取得と連続して、前記被験試料に対して照射光を照射し、前記照射光に応じて前記被験試料から放射される光を検出して、前記被験試料の内部構造および／または外観を示す第２画像を取得することを含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、生体試料由来の被験試料についての有用な情報が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、Ｗｎｔおよびβ−カテニンが関与するシグナル伝達経路を概略的に示す図である。
【図２】図２は、第１画像および第２画像の一例を示す図である。
【図３】図３は、胚の２つの異なる面の各々から画像を取得する様子を概略的に示す図である。
【図４】図４は、本発明に使用できるショウジョウバエを作製するための掛け合わせの例を示す図である。
【図５】図５は、経時的に取得された第１画像および第２画像の例を示す図である。
【図６】図６は、イオノマイシンを投与した場合の影響を示す図である。
【図７】図７は、６−ブロモインジルビン−３−オキシムを投与した場合の影響を示す図である。
【図８】図８は、ラパマイシンを投与した場合の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第１実施形態は、光学的結像手段を用いて生体試料由来の被験試料の画像を取得する方法に関する。
【００１５】
光学的結像手段とは、例えば、観察の対象を所定の結像面において光学的に検出して画像を取得する手段である。光学的結像手段は、結像面に生じている光信号を特異的に取得するための結像光学系を有していることが好ましい。また、光学的結像手段は、試料から照射される光のうち特定の波長を有した光を選択的に検出する手段を備えてよい。さらに、光学的結像手段は、試料に対して、特定の波長を有した光を選択的に照射する手段を備えてよい。これらの手段の例は、特定の波長を有した光を主に透過させることができるフィルターである。光学的結像手段は、検出した画像を電子データに変換するための撮像素子を備えてよい。光学的結像手段は、コンピューターに接続され、コンピューターによって、画像の電子データが表示または記録されてよい。光学的結像手段の一例は、光学顕微鏡である。光学的結像手段の具体的な例は、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社）である。
【００１６】
生体試料とは、ヒトを除いたあらゆる生物を意味する。生体試料として、例えば、発生学的に内部構造、外観の形状および／またはサイズ等が変化し、その変化の過程で遺伝学的な活性も変化するような生物を使用することができる。生体試料は、変態を行う生物であってよく、特に昆虫であってよい。生体試料は、生きた生物であってよい。生体試料の具体的な例はショウジョウバエである。
【００１７】
ショウジョウバエとは、ハエ目ショウジョウバエ科に属するハエを意味する。本発明で使用できるショウジョウバエとは、例えばキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）である。ショウジョウバエ由来の被験試料は、例えばショウジョウバエの個体である。個体は、受精卵から成虫まで成長する途中のいずれかの状態であってよい。被験試料は、例えば受精卵、胚、幼虫、蛹または成虫である。被験試料は生きた状態のまま使用することができる。
【００１８】
本発明に係る方法は、プロモーター結合領域とその下流に位置する発光酵素の遺伝子とから成る領域を含む核酸を有する生体試料由来の被験試料から放射される、前記発光酵素に由来する発光を検出して、前記被験試料における前記プロモーターの活性の強度および分布を示す第１画像を取得することを含む。
【００１９】
この核酸は、生体試料のゲノム中に含まれる核酸であってよく、あるいは生体試料の細胞中に含まれるベクターに含まれる核酸であってよい。
【００２０】
プロモーター結合領域とは、特定の塩基配列を有した核酸の領域である。一般に、プロモーター結合領域の下流には、特定の遺伝子が存在しており、プロモーター結合領域にプロモータータンパク質が結合した場合、この遺伝子の発現が促進される。プロモーター結合領域は、例えば、生体試料が本来有している内在性のものであってよい。例えば、プロモーター結合領域は、種々の生物種において保存されているタンパク質についてのプロモーター結合領域である。あるいは、プロモーター結合領域は、特定の薬剤に対して応答性を有するプロモーターに対応したものである。また、プロモーター結合領域は、特定のシグナル伝達に関連するタンパク質についてのプロモーター結合領域である。また、プロモーター結合領域は、研究の目的に応じて選択することができる。例えば、生体試料の発生を研究する場合、発生の進行に応じて活性が変動するタンパク質についてのプロモーター結合領域を使用することができる。さらに、プロモーター結合領域は、生体試料が本来有していない外在性のものであってよい。
【００２１】
プロモーター結合領域の一例は、Ａｒｍａｄｉｌｌｏ遺伝子についてのプロモーター結合領域である。ショウジョウバエの有するＡｒｍａｄｉｌｌｏは、哺乳類の有するβ−カテニンと高い相同性を有する。
【００２２】
図１には、Ｗｎｔおよびβ−カテニンが関与するシグナル伝達経路が概略的に示されている。
【００２３】
図１（ａ）は、細胞に対してＷｎｔによる刺激がない状態を示している。Ｗｎｔ２が存在しない場合、細胞膜１００上に存在するＷｎｔ２に対する受容体／細胞膜タンパク質１１は、Ｗｎｔ２と結合することができず、活性化されない。この場合、細胞内では、β−カテニン１に対して、カゼインキナーゼ１α（ＣＫ１α）１２、Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ Ｃｏｌｉ（ＡＰＣ）１３、Ａｘｉｎ１４およびグリコーゲン合成酵素リン酸化酵素−３β（ＧＳＫ−３β）１５等が結合する。β−カテニン１に結合したこれらのタンパク質の作用により、β−カテニン１はユビキチン化され、複数のユビキチン１６が結合する。このユビキチン１６のシグナルに起因して、β−カテニン１はプロテアソームに運ばれ分解される。図１（ａ）には、分解されたβ−カテニン１’が比喩的に示される。
【００２４】
一方、図１（ｂ）は、細胞がＷｎｔ２による刺激を受けた状態を示している。Ｗｎｔ２は受容体／細胞膜タンパク質１１に結合し、これらを活性化する。活性化された受容体／細胞膜タンパク質１１は、その後、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質（Ｄｖｌ）１７を活性化し、活性化されたＤｖｌ１７は、Ａｘｉｎ１４等と結合して、Ａｘｉｎ１４等とβ−カテニン１との結合を抑制する。これにより、β−カテニン１はプロテアソームによる分解を逃れ、その結果、β−カテニン１の細胞内濃度が上昇する。次にβ−カテニン１は核１０１の内部に移行し、転写因子であるＴ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ／Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（Ｔｃｆ／Ｌｅｆ）１８と結合して複合体を形成し、この複合体は核酸１０２の転写調節領域に結合して、遺伝子発現を促進する。なお、Ｗｎｔシグナル経路についての詳細は、例えば、生化学第８０巻第１２号，ｐｐ．１０７９−１０９３，２００８が参照される。
【００２５】
Ｗｎｔ／β−カテニン経路により発現の調節を受ける遺伝子には、細胞の増殖、分化、体軸形成および器官形成に関与する遺伝子が含まれている。そのため、β−カテニンは、これらの現象において重要な働きを有する。
【００２６】
発光酵素は、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を意味する。発光酵素の例は、ルシフェラーゼである。ルシフェラーゼに対する発光基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光が生じる。ルシフェラーゼは、ホタルに由来するもの、バクテリアに由来するもの、コメツキムシ（クリックビートル）に由来するもの等を使用することができる。ルシフェラーゼの具体的な例は、東洋紡績株式会社から市販されているｐＥＬｕｃベクターに含まれるＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃである。被験試料の細胞内にて発現した発光酵素は、細胞に対して別途供給された発光基質の発光反応を促進し、その結果、発光を生じさせる。
【００２７】
発光酵素の遺伝子とプロモーター結合領域との位置関係は、プロモーター結合領域に対してプロモーターが結合した場合に、発光酵素の遺伝子の発現が促進されるような位置関係となっている。プロモーターは、例えば、被験試料の本来の生命活動に伴って、または被験試料に対する外部からの刺激等に起因してプロモーター結合領域に結合する。プロモーターのプロモーター結合領域への結合を受けて、その下流に位置する発光酵素の遺伝子の発現が促進される。
【００２８】
第１画像は、発光酵素が触媒する化学反応により生じた発光を、光学的結像手段を用いて検出することにより取得される。このとき、被験試料に対して任意の方法で発光基質を提供することができる。被験試料がショウジョウバエといった変態を行う昆虫の胚である場合には、例えば、発光基質を含む溶液中に胚を浸漬し、胚の内部に発光基質を浸入させることができる。あるいは、親となる成虫に対して発光基質を含む餌を与えて、その親から産まれる胚の内部に発光基質を提供することができる。被験試料が幼虫または成虫である場合には、例えば、発光基質を混入した餌を与えることで、被験試料の体内に発光基質を提供することができる。被験試料が蛹である場合には、幼虫の段階において発光基質を混入した餌を与え、変態後の蛹の体内に発光基質を提供することができる。マイクロインジェクション法を使用することで、個体の体内に直接発光基質を提供することもできる。被験試料として胚を使用し、発光基質を含む溶液中に浸漬して発光基質を提供する場合、発光基質の濃度は好ましくは５ｍＭ以下であり、さらに好ましくは３ｍＭ以下である。発光基質の濃度が高すぎる場合、被験試料の生育に異常が生じる可能性がある。発光酵素および発光基質は、目的に応じて、種々の由来または組成物からなる溶液から任意に選ぶことができる。
【００２９】
図２には、第１画像および第２画像の一例が示される。図２（ａ）は、第２画像の例であり後述する。図２（ｂ）および（ｃ）は、第１画像の例である。この例では、被験試料としてショウジョウバエの胚を使用し、プロモーター結合領域としてＡｒｍａｄｉｌｌｏ遺伝子についてのプロモーター結合領域を使用し、発光酵素の遺伝子としてＥＬｕｃの遺伝子を使用している。ショウジョウバエのように比較的光透過性の高い生体試料の胚、蛹、成虫においては、発光酵素、発光基質および画像取得時の露光時間を適宜組み合わせることで、生体内部の情報を、発光画像として画像取得できることが分かった。発光基質と被験試料の生体組織等の関係については、出願人による特開２００７−２４８０５０号を参照してもよい。図２（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ開始から１時間２０分後および１０時間後に取得した第１画像である。図２（ｂ）では、被験試料の一部が発光していることがわかり、図２（ｃ）では、被験試料の全体が発光していることがわかる。
【００３０】
被験試料中のプロモーターの活性の強度は、例えば、第１画像中の発光量から特定することができる。また、被験試料中のプロモーターの活性の分布は、例えば、第１画像中の発光の位置から特定することができる。
【００３１】
本発明に係る方法は、前記被験試料に対して照射光を照射し、前記照射光に応じて前記被験試料から放射される光を検出して、前記被験試料の内部構造および／または外観を示す第２画像を取得することを含む。とくに、本発明では、照明光を用いて画像取得するか励起光を照明して蛍光画像を取得するのが好ましい。しかも、被験試料の生体内部における同一の結像面について第１画像と第２画像の両方を取得し、それぞれの画像から第１画像由来および第２画像由来の内部構造を照合することにより、外表面またはその表皮近傍付近からは把握できない生体内部における形状および／またはプロモーター活性を知ることができる。さらに、生体内部における形状および／またはプロモーター活性を時系列な第１画像および第２画像を用いて解析することにより、生体内部で実際に起こっている変化を正確に把握することができる。
【００３２】
第１画像の取得と第２画像の取得とは、ほぼ同時に行うことができる。すなわち、第１画像の取得と第２画像の取得とを同時に行うことができ、あるいは、第１画像の取得と第２画像の取得とを短時間のうちに連続して行うことができる。連続して行う場合、例えば、第１画像の取得が完了した直後に、第２画像の取得を開始することができ、またはその逆の順序で画像を取得することができる。
【００３３】
照射光は、例えば、様々な波長の光が混ざったものであってよい。例えば、照射光は、タングステンランプや、ハロゲンランプといった一般的な光源から照射される光であってよい。この場合、第２画像として明視野画像が取得される。すなわち、第２画像の取得のために、照射光が被験試料を透過して生じる光および／または照射光が被験試料に反射して生じる光が検出される。照明光は、例えば可視光であり、例えば光学的結像手段に備わった光源から被験試料に対して照射される。
【００３４】
図２には、第１画像および第２画像の一例が示される。図２（ａ）は、第２画像を明視野画像として取得した場合の例である。この例では、被験試料としてショウジョウバエの胚を使用し、プロモーター結合領域としてＡｒｍａｄｉｌｌｏ遺伝子についてのプロモーター結合領域を使用し、発光酵素の遺伝子としてＥＬｕｃの遺伝子を使用している。同一の結像面における第１画像と第２画像とを照合した結果、確認できる内部構造はまだ形成されていないことがわかる。
【００３５】
照射光が被験試料を透過して生じる光を検出する場合、被験試料の透明度を上げる処理を行ってもよい。例えば、ガラス板上に被験試料を置き、被験試料にシリコンオイル、グリシンまたはミネラルオイル等を滴下した状態で、光学的結像手段により画像を取得することができる。
【００３６】
あるいは、照明光は、特定の波長の光を主に含むものであってよい。例えば、照明光は、特定の蛍光タンパク質を励起することが可能な光であってよい。この場合、被験試料としてこの特定の蛍光タンパク質を発現したもの使用し、この照明光によって蛍光タンパク質を励起させて、蛍光を生じさせることができる。この場合、この蛍光を検出することで第２画像として蛍光画像を取得することができる。
【００３７】
蛍光タンパク質の発現は、被験試料が有する核酸中に蛍光タンパク質の遺伝子を導入することで行うことができる。蛍光タンパク質としては、既知のものを使用できる。蛍光タンパク質の例は、例えばＧＦＰである。
【００３８】
蛍光タンパク質は、単独で被験試料の細胞中に発現させることができる。あるいは、蛍光タンパク質は、蛍光タンパク質とは異なるタンパク質と融合した状態で被験試料の細胞中に発現させることができる。すなわち、蛍光タンパク質を異なるタンパク質の蛍光タグとして使用することができる。ここにおいて、異なるタンパク質は、目的に応じて選択することが可能であり、例えば特定のタイミングにおいて特定の細胞にのみ発現するものを選択することができる。
【００３９】
第２画像として、上記のような明視野画像および上記のような蛍光画像を併せて取得することもできる。
【００４０】
被験試料の内部構造は、明視野画像を取得する場合には、被験試料を透過した光に基づいて特定することができる。一方、蛍光画像を取得する場合には、被験試料中の特定の組織や器官に特異的に発現することが既知であるタンパク質に融合した蛍光タンパク質を発現させることで、その蛍光タンパク質から発せられる蛍光に基づいてその組織や器官を特定することができる。
【００４１】
また、被験試料の外観は、明視野画像を取得する場合には、被験試料に反射して生じた光に基づいて特定することができる。一方、蛍光画像を取得する場合には、被験試料の外表面に蛍光タンパク質を発現させて、その蛍光に基づいて外観を特定することができる。被験試料の外表面に蛍光タンパク質を発現させるには、被験試料中に蛍光タンパク質を単独で発現させてもよく、被験試料の少なくとも外表面に特異的に発現することが既知のタンパク質に融合させた状態で蛍光タンパク質を発現させてもよい。
【００４２】
本発明の第２実施形態では、核酸は、上述のプロモーター結合領域とは異なる第２プロモーター結合領域と、その下流に位置し上述の発光酵素とは異なる第２発光酵素の遺伝子とから成る少なくとも１つの領域をさらに含む。そして、第２実施形態は、被験試料から放射される、第２発光酵素に由来する発光を検出して、被験試料における第２プロモーターの活性の強度および分布を示す第３画像を取得することをさらに含む。
【００４３】
第２プロモーター結合領域は、第１画像を取得するためのプロモーター結合領域と同様に選択することができる。ただし、これらのプロモーター結合領域は、互いに異なる遺伝子の上流に位置するものである。
【００４４】
第２発光酵素は、第１画像を取得するための発光酵素と同様に選択することができる。ただし、第１画像を取得するための発光酵素に起因して生じる蛍光の波長と、第２発光酵素に起因して生じる蛍光の波長とは異なる。特に、これらの波長は、光学的結像手段によって区別可能な程度に異なることが好ましい。
【００４５】
本発明の第３実施形態では、第１画像および前記第２画像の取得は、複数回繰り返して行われる。
【００４６】
取得のタイミングは任意に設定することができる。例えば、一定の間隔で取得することができる。すなわち、この場合、第１画像と第２画像とがほぼ同時に取得され、一定時間をおいて再び第１画像と第２画像とがほぼ同時に取得され、その後、必要に応じてこのような取得を繰り返すことができる。あるいは、画像の取得は、被験試料の特定の段階において選択的に行うことができる。すなわち、例えば、本発明の開始段階において第１画像と第２画像とをほぼ同時に取得し、被験試料に変化が生じた段階において再び第１画像と第２画像とをほぼ同時に取得し、その後も何らかの変化が生じる度に取得を行うことができる。
【００４７】
本発明の第４実施形態では、被験試料の複数の異なる面の各々から第１画像および第２画像が取得される。
【００４８】
この実施形態の例を図２に示す。図３には、ショウジョウバエの胚の２つの異なる面からそれぞれ画像を取得する様子が示されている。図３（ａ）には、ショウジョウバエの胚２００を側面から対物レンズ２０１で観察する様子が示されている。観察される観察面２０２ａは、対物レンズ２０１の光軸に対して垂直となっている。図３（ｂ）には、胚２００を上面から対物レンズ２０１で観察する様子が示されている。観察される観察面２０２ｂは、対物レンズ２０１の光軸に対して垂直となっている。
【００４９】
この実施形態では、例えば、被験試料のある面から第１画像および第２画像を取得し、それとほぼ同時に別の面から第１画像および第２画像を取得することができる。あるいは、ある面から取得した後、時間をおいて別の面から取得してもよい。複数の面についての画像を同一の被験試料から取得してもよく、あるいは、取得しようとする面の数に応じて被験試料を用意し、それぞれ異なる面についての画像を取得してもよい。
【００５０】
本発明の第５実施形態は、第１画像および第２画像を取得する前および／または後において、被験試料に対して刺激を与えることをさらに含む。
【００５１】
被験試料への刺激と画像の取得との間の時間は任意に設定される。また、刺激の前後で画像を取得することができる。
【００５２】
刺激は、薬剤の投与、光の照射、電気刺激、ガスへの曝露および加熱から成る群から選択される少なくとも１つとすることができる。
【００５３】
刺激として薬剤を投与する場合、例えば、被験試料に対する影響が既知である薬剤を使用することができる。プロモーター結合領域として、β−カテニン（Ａｒｍａｄｉｌｌｏ）といったＷｎｔ／β−カテニン経路に関与するタンパク質に対する領域を使用する場合、そのような経路に関与するタンパク質の阻害剤を使用することができる。例えば、β−カテニンとＴｃｆとの複合体形成を阻害するイオノマイシン、ＧＳＫ−３β阻害剤である６−ブロモインジルビン−３−オキシム（ＢＩＯ）等を使用することができる。あるいは、薬剤として、被験試料に対する影響が未知または不確定のものを使用することができる。例えば、抗癌剤といった薬剤の候補となる物質を投与することができる。
【００５４】
刺激として光を照射する場合、光は可視光でも可視光以外の光でもよい。光は、一定時間照射し続けてもよく、短時間の一度の照射でもよく、またはパルス状に照射してもよい。
【００５５】
電気的な刺激を行う場合、例えば被験試料に電極を挿して刺激することができる。被験試料としてショウジョウバエといった昆虫の成虫を使用する場合、神経細胞に対する応答を確認するために、成虫の神経系またはその付近に電極を挿すこともできる。
【００５６】
刺激として被験試料をガスに曝露する場合、例えば、ガスで満たした容器に被験試料を入れることでガスに曝露することができる。ガスとして、ジエチルエーテルといった麻酔効果を有するガス等を使用することができる。あるいは、ガスとして、被験試料に対する影響を研究しようとするガスを選択することができる。例えば、アルコール依存症の研究のためにエタノールガスを使用することができる。
【００５７】
刺激として被験試料を加熱する場合、被験試料を直接加熱してよく、または被験試料を高温の環境に移すことでその温度まで加熱してよい。
【００５８】
第１画像および第２画像を、刺激を与える前および後にそれぞれ少なくとも１回ずつ取得する場合、この実施形態は、刺激を与える前に取得された少なくとも１つの第１画像と刺激を与えた後に取得された少なくとも１つの第１画像とを比較し、および／または刺激を与える前に取得された少なくとも１つの第２画像と刺激を与えた後に取得された少なくとも１つの第２画像とを比較することをさらに含むことができる。
【００５９】
例えば、刺激を与えた後に複数回画像を取得する場合、取得した全ての画像を時間の進行に沿って並べることで、被験試料の状態の変動をみることができる。また、一定間隔で画像を取得し、特定のタイミングで刺激を複数回与えることもできる。
【００６０】
本発明の第６実施形態は、第１画像および前記第２画像の対応する部分を抽出することをさらに含む。
【００６１】
抽出は、その部分を四角で囲むことで、またはフリーハンドで囲むことで行うことができる。１つの画像から複数の部分を抽出することができる。この部分は、例えば、いわゆる関心領域（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ：ＲＯＩ）として抽出することもできる。第１画像から抽出した部分について、発光量を数値化することができる。抽出および発光量の数値化は、コンピューターを用いて行うことができる。
【００６２】
部分の抽出の際、第２画像に含まれる内部構造および外観の情報を利用することができる。例えば、被験試料内の特定の組織や器官に対応する部分を抽出することができる。
【００６３】
複数の画像を取得する場合、すべての画像から部分を抽出する必要はなく、特定の画像のみから必要に応じた部分を抽出することができる。例えば、第２画像から得られる情報に基づいて、特定の内部構造が確認される画像についてのみ、その構造を部分として取得することができる。
【００６４】
本発明の第７実施形態は、第１画像と第２画像とを重ね合わせた画像を取得することをさらに含む。
【００６５】
例えば、ほぼ同時に取得した第１画像と第２画像とを重ね合わせることができる。また、被験試料の同一の面を撮影した第１画像と第２画像とを重ね合わせることができる。重ね合わせはコンピューターを用いて行うことができる。
【００６６】
この実施形態は、重ね合わせた画像を表示または記録することをさらに含んでよい。表示および記録は、コンピューターを用いて行うことができる。
【００６７】
第１の実施形態によれば、生体試料由来の被験試料についての有用な情報を得ることができる。第１画像からはプロモーターの活性の強度および分布の情報が、第２画像からは被験試料の内部構造および／または外観の情報が得られるため、これらの２種類の情報から、プロモーター活性と内部構造や外観との関係等を知ることができる。
【００６８】
また、被験試料として、ショウジョウバエの受精卵、胚、幼虫、蛹または成虫を使用することができ、ショウジョウバエの成長の様々な段階について情報を取得することができる。
【００６９】
第２画像として明視野画像を取得する場合、被験試料の内部構造や外観の情報を容易に取得することができる。
【００７０】
一方、被験試料中に蛍光タンパク質を発現させて、第２画像として蛍光画像を取得する場合、特定の内部構造や外観を蛍光で標識することが可能となり、その構造や外観をより明確に特定することが可能となる。被験試料として蛹や成虫を使用する場合、その内部構造を明視野画像により捉えることは困難となるものの、蛍光画像を取得することでこのような被験試料においても内部構造を特定することが容易となる。
【００７１】
さらに、被験試料中において特定のタンパク質と融合させた状態で蛍光タンパク質を発現させる場合、その特定のタンパク質が特異的に発現する細胞のみ、またはその特定のタンパク質が局在する細胞中の部位のみを蛍光標識することができる。これにより、被験試料中の特定の構造の位置や形状を第２画像から知ることができる。
【００７２】
第２実施形態のように、第２プロモーター結合領域と第２発光酵素の遺伝子とをさらに含んだ核酸を有する被験試料を使用して、第２発光酵素に基づく第３画像を取得することで、１つの第１画像から複数のプロモーターの活性についての情報を得ることができる。そのような第１画像から、各プロモーター活性の強度の違いや分布の違いを知ることができる。
【００７３】
第３実施形態のように、第１画像および前記第２画像の取得を複数回繰り返して行うことで、プロモーター活性の情報および被験試料の内部構造や外観といった情報の変化を知ることができる。特に、生体試料の胚発生や成長に伴う、プロモーター活性の変動や、内部構造等の変動を知ることができる。
【００７４】
第４実施形態のように、被験試料の複数の異なる面の各々から第１画像および第２画像を取得する場合、単一の面から画像を取得する場合と比較してより多くの情報を得ることができる。すなわち、プロモーター活性が上昇している位置や内部構造を立体的に把握することができる。これにより、そのような位置や構造をより正確に特定することができる。
【００７５】
第５実施形態のように、被験試料に対して刺激を与えることにより、そのような刺激を受けた状態の被験試料について、第１画像および第２画像を取得することができる。
【００７６】
さらに、刺激として、薬剤の投与、光の照射、電気刺激、ガスへの曝露または加熱を行った場合、それらの刺激に対する被験試料の応答を調べることができる。特に、刺激として特定の効果を与えることが既知の薬剤を投与した場合、その効果を受けた状態における被験試料の様子を調べることができる。また、投与した薬剤がどのような効果を与えるかを調べることで、薬剤のスクリーニングを行うことができる。刺激として電気を使用する場合、例えば被験試料の神経細胞への影響を調べることができる。
【００７７】
さらに、刺激の前後に画像を取得することにより、刺激を受けることによる被験試料の変化を調べることができる。刺激後に複数回画像を取得する場合には、刺激を受けた時からの経過時間に応じた被験試料の状態を調べることができる。
【００７８】
第６実施形態のように、第１画像および前記第２画像の対応する部分を抽出する場合、そのような部分に着目して情報を取得することができる。また、そのような部分のみのプロモーター活性の量を数値化することができる。
【００７９】
第７実施形態のように、第１画像と第２画像とを重ね合わせた画像を取得する場合、第１画像に由来する発光の情報と、第２画像に由来する内部構造や外観の情報とを、重ね合わせた画像において直接照らし合わせることができる。
【００８０】
さらに、そのように重ね合わせた画像を表示または記録することにより、取得した画像の利用性を向上させることができる。
【実施例】
【００８１】
［例１：被験試料の作製および観察］
この例では、被験試料としてショウジョウバエの胚を作製し、第１画像および第２画像を経時的に取得した。プロモーター結合領域としてはａｒｍａｄｉｌｌｏ遺伝子についてのプロモーター結合領域を使用し、発光酵素の遺伝子としてクリックビートルに由来するルシフェラーゼの遺伝子を使用した。
【００８２】
ａｒｍａｄｉｌｌｏプロモーター領域およびクリックビートルルシフェラーゼ遺伝子Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｌｕｃ（東洋紡績株式会社）をＫＰ１２４ベクターに導入し、ａｒｍ：：ＥＬｕｃベクターを作成した。
【００８３】
このａｒｍ：：ＥＬｕｃベクターを、８６Ｆｂ系統のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの受精卵にマイクロインジェクション法により導入した。インジェクション液の組成は、２００ｎｇ／ｕｌのａｒｍ：：ＥＬｕｃベクターおよび０．５％のＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  ＦＣＦとした。受精卵を発生させ、成虫を得た。
【００８４】
この成虫について、図４に示される掛け合わせを行い、発光ショウジョウバエ系統であるａｒｍ：：ＥＬｕｃ系統を作製した。
【００８５】
このａｒｍ：：ＥＬｕｃ系統の胚について発光イメージングを行った。胚を、３ｍＭの濃度のルシフェリン溶液中に入れた。胚は２つ用意し、一方については胚の側面からイメージングし、他方については胚の上面からイメージングした。発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社）を使用し、Ａｎｄｏｒ、ＥＭ−ｇａｉｎ  ２５５、ｂｉｎｎｉｎｇ  １ｘ１、６０ｘ対物と設定した。明視野画像の取得のための露光時間は１００ｍ秒とし、発光画像の取得のための露光時間は４．５分とした。５分間隔で２２時間撮像を続けた。
【００８６】
取得した第１画像および第２画像の内、代表的な４つの段階の画像を図５に示す。図５（ａ）は、開始から１時間５５分の時点で取得された画像であり、左上には側面から見た第２画像（明視野）、左下には側面から見た第１画像（発光）、右上には上面から見た第２画像（明視野）および右下には側面から見た第２画像（発光）がそれぞれ示されている。図５（ｂ）から（ｄ）は、それぞれ６時間４５分、９時間および１０時間５分の時点で取得された画像であり、各時点での４つの画像の配置は図５（ａ）と同じである。なお、第１画像は、発光強度に応じて色を付した疑似カラー画像として取得したが、図５はそれをモノクロで表現したものである。
【００８７】
第２画像（明視野）から、胚の外観および内部構造の様子がわかる。特に、時間の経過とともに、胚の内部に構造が形成されていくことがわかる。また、側面および上面の画像から、その構造を立体的に把握することができる。
【００８８】
第１画像（蛍光）から、プロモーター活性が上昇する時期および部位がわかる。プロモーター活性の様子から、ａｒｍａｄｉｌｌｏタンパク質（β−カテニンのホモログ）の発現の状態を推定できる。図５（ａ）から（ｂ）に示されるように、初期の段階ではａｒｍａｄｉｌｌｏタンパク質はほとんど発現していないのに対し、図５（ｃ）に示されるように、９時間後の時点では、特定の位置において発現が上昇しており、さらに図５（ｄ）に示されるように１０時間を過ぎた段階では、発現する位置が広がり、さらにその量も上昇していることがわかる。また、図５（ｄ）において、側面から見た場合、胚の１か所が強く発現していることがわかるものの、上面から見た場合、その強い発現を示す部分は胚の左右にそれぞれ存在することがわかる。
【００８９】
［例２：薬剤（イオノマイシン）投与に対する応答の観察］
上記例１のように作製した胚に対して薬剤（イオノマイシン）を投与し、投与後の胚の様子を観察した。
【００９０】
イオノマイシンの構造式は、図６（ｃ）に示される。イオノマイシンはβ−カテニンとＴＣＦの結合を阻害する。この結合が阻害される結果、図１（ｂ）に示されるような、核１０１の内部におけるβ−カテニン／ＴＣＦ複合体の核酸１０２への結合が生じない。その結果、Ｗｎｔ／β−カテニン経路によって発現が誘導される遺伝子の転写活性が低下すると考えられる。
【００９１】
上記例１にて作製した胚を１０μＭのイオノマイシンを含む溶液に浸漬した。コントロールとして、別の胚を、イオノマイシンを含まない溶液に浸漬した。これらの胚を、上記例１と同様な条件下で経時的に観察した。ただし、この例では、側面からのみ画像を取得した。
【００９２】
図６（ａ）および（ｂ）には、このようにして取得された画像が示される。図６（ａ）は、イオノマイシンを投与していないコントロールの胚から取得した画像である。左は開始から７時間１５分の時点に取得した画像であり、右は開始から１６時間２０分の時点に取得した画像である。それぞれにおいて、上は第２画像（明視野）であり、下は第１画像（発光）である。図６（ｂ）は、イオノマイシンを投与した胚から取得した画像であり、それぞれの画像の配置は図６（ａ）と同様である。
【００９３】
図６（ａ）と（ｂ）との比較から、７時間１５分の時点において、コントロールの胚では、頭部側（胚の左側）においてわずかに発現していることがわかるものの、イオノマイシンを投与した胚ではそのような発現が観察できない程度に抑制されていることがわかる。さらに、１６時間２０分の時点では、コントロールの胚では、全体的に発現しており、特に腹部の発現が強くなっているのに対し、投与した胚では頭部および前胸部の発現は観察できない程度に抑制されており、さらに腹部の発現量はコントロールと比較して低下しており、その分布にも違いがあることがわかる。
【００９４】
なお、観察を続けた結果、イオノマイシンを投与した胚は、コントロールの胚と同様に孵化した。
【００９５】
［例３：薬剤（ＢＩＯ）投与に対する応答の観察］
上記例１のように作製した胚に対して薬剤（６−ブロモインジルビン−３−オキシム）を投与し、投与後の胚の様子を観察した。
【００９６】
６−ブロモインジルビン−３−オキシム（ＢＩＯ）の構造式は、図７（ｃ）に示される。ＢＩＯはＧＳＫ−３βの機能を阻害する、図１（ａ）に示されるように、Ｗｎｔ２による刺激がない場合に、ＧＳＫ−３β１５はβ−カテニン１と結合し、β−カテニン１の分解を促進する。ＢＩＯによって、ＧＳＫ−３β１５の機能が阻害されると、β−カテニン１の分解が抑制されることが予想される。
【００９７】
上記例１にて作製した胚を２μＭのＢＩＯを含む溶液に浸漬した。コントロールとして、別の胚を、ＢＩＯを含まない溶液に浸漬した。これらの胚を、上記例１と同様な条件下で経時的に観察した。ただし、この例では、側面からのみ画像を取得した。
【００９８】
図７（ａ）および（ｂ）には、このようにして取得された画像が示される。図７（ａ）は、ＢＩＯを投与していないコントロールの胚から取得した画像である。左は開始から１時間２０分の時点に取得した画像であり、右は開始から１０時間の時点に取得した画像である。それぞれにおいて、上は第２画像（明視野）であり、下は第１画像（発光）である。図７（ｂ）は、ＢＩＯを投与した胚から取得した画像であり、それぞれの画像の配置は図７（ａ）と同様である。
【００９９】
図７（ａ）および（ｂ）から、ＢＩＯを投与した胚では、１時間２０分という発生初期の段階から、頭部に非常に強い発現が生じることがわかる。さらに、時間が進行するにつれて、ＢＩＯを投与した胚では、胚全体において発現が上昇していることがわかる。
【０１００】
なお、３０時間を経過しても、ＢＩＯを投与した胚では、発生が進行せず、孵化に至ることはなかった。
【０１０１】
［例４：薬剤（ラパマイシン）投与に対する応答の観察］
上記例１のように作製した胚に対して薬剤（ラパマイシン）を投与し、投与後の胚の様子を観察した。
【０１０２】
ラパマイシンの構造式は、図８（ｃ）に示される。ラパマイシンは、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）を特異的に阻害する。免疫抑制剤として使用され、癌治療の作用があることや寿命延長効果（酵母、線虫、ショウジョウバエ、マウス）を有することなどが知られている。
【０１０３】
上記例１にて作製した胚を１μＭのラパマイシンを含む溶液に浸漬した。コントロールとして、別の胚を、ラパマイシンを含まない溶液に浸漬した。これらの胚を、上記例１と同様な条件下で経時的に観察した。ただし、この例では、側面からのみ画像を取得した。
【０１０４】
図８（ａ）および（ｂ）には、このようにして取得された画像が示される。図８（ａ）は、ラパマイシンを投与していないコントロールの胚から取得した画像である。左は開始から１時間２０分の時点に取得した画像であり、右は開始から１７時間５分の時点に取得した画像である。それぞれにおいて、上は第２画像（明視野）であり、下は第１画像（発光）である。図８（ｂ）は、ラパマイシンを投与した胚から取得した画像であり、それぞれの画像の配置は図８（ａ）と同様である。
【０１０５】
図８（ａ）および（ｂ）から、１時間２０分の段階では、ラパマイシンを投与した胚は、コントロールと同様に発生し、発現パターンもほぼ同じであるものの、コントロールと比較して発現は高いことがわかる。さらに、１７時間２０分において、コントロールの胚では陥入が生じているものの（明視野画像）、投与した胚では、正常な発生が生じていないことがわかり、また、発現パターンもコントロールとは異なることがわかる。
【０１０６】
なお、５０時間を経過しても、ラパマイシンを投与した胚では、孵化に至ることはなかった。
【符号の説明】
【０１０７】
１…β−カテニン、１’…分解されたβ−カテニン、２…Ｗｎｔ、１１…受容体／細胞膜タンパク質、１２…ＣＫ１α、１３…ＡＰＣ、１４…Ａｘｉｎ、１５…ＧＳＫ−３β、１６…ユビキチン、１７…Ｄｖｌ、１８…Ｔｃｆ／Ｌｅｆ、１００…細胞膜、１０１…核、１０２…核酸、２００…胚、２０１…対物レンズ、２０２ａ、２０２ｂ…観察面。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0006049305.tif 000006
【図６】
0006049305.tif 000007
【図７】
0006049305.tif 000008
【図８】
0006049305.tif 000009