(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングする方法であって、
ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むグラム陰性細菌細胞を培養して、細胞の細胞質でポリペプチドを産生し、
ｂ）細菌細胞の細胞膜を透過化し、ポリペプチドおよびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、透過化された細菌細胞の細胞質内部に保持され、
ｃ）透過化された細菌細胞を標的分子と接触させて、該標的分子を透過化された細菌細胞の細胞質中に拡散させ、そして
ｄ）ポリペプチドを所望の活性に関してスクリーニングする
ことを含み、
細菌細胞は界面活性剤又は有機溶媒で透過化される、方法。
【請求項２】
標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングする方法であって、
ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むグラム陰性細菌細胞を培養して、ポリペプチドを産生し、細菌細胞壁に共有結合させ、
ｂ）細菌細胞の細胞膜を透過化し、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、透過化された細菌細胞内部に保持され、
ｃ）透過化された細菌細胞を標的分子と接触させ、そして
ｄ）ポリペプチドを所望の活性に関してスクリーニングする
ことを含み、
細菌細胞は界面活性剤又は有機溶媒で透過化される、方法。
【請求項３】
ステップｄ）が、
ｉ）ポリペプチドが標的分子と結合するかどうか、および／または標的分子と結合する程度を決定すること、および／または
ｉｉ）ポリペプチドが標的分子を酵素的に修飾するかどうか、および／または標的分子の酵素修飾率を決定すること
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドが、少なくとも第２ポリペプチドと結合して、透過化された細菌細胞の内部に保持され、および／または細菌細胞壁に結合するタンパク質複合体を形成する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドが第２ポリペプチド、またはそのサブユニットに融合している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第２ポリペプチドが：
ｉ）タンパク質複合体が透過化された細菌細胞壁内部に保持されるような分子サイズを有するポリペプチド；
ｉｉ）ＤＮＡ結合タンパク質；および／または
ｉｉｉ）細菌細胞壁結合タンパク質
から選択される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質複合体の分子量が少なくとも約１２０ｋＤａである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第２ポリペプチドが、透過化された細菌細胞の内部でマルチマーを形成する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
マルチマーがテトラマーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第２ポリペプチドが、ＲｈｎＡ、β−ガラクトシダーゼ、ＢｅｔＢ、Ｇ５Ｋ、ＧｓｈＢおよびＹｄｃＷから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ結合タンパク質がＣｏｍＥである、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
細菌細胞壁結合タンパク質が、ペプチドグリカン結合タンパク質、および細胞壁と結合できるリポタンパク質またはそのフラグメントから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
細菌細胞壁結合タンパク質が、ＫｚＰＧ、ＰＡＬ、ＯｍｐＡ、ＹｉａＤ、ＹｆｉＢおよびＭｏｔＢから選択されるペプチドグリカン結合タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞壁と結合できるリポタンパク質またはそのフラグメントが、外膜付着に必要な機能的Ｎ末端シグナル配列が欠如したリポタンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
リポタンパク質が大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＬＰＰである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
非イオン性界面活性剤が、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０）、ジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（８ＴＧＰ）、ならびにデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０）およびジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）の混合物から選択される、請求項４から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
細菌細胞の透過化が：
ｉ）Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）中約０．５％のｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（８ＴＧＰ）、ならびに
ｉｉ）Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）中約０．５％のデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０）および約０．５％のジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）
から選択される溶液中で実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップｂ）が細菌細胞を選択的に透過化することを含み、それにより、細菌細胞の外膜が細菌細胞の内膜よりもさらに透過化される、請求項１３から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
細菌細胞が、ジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）および／またはポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）から選択される界面活性剤で選択的に透過化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細菌細胞の選択的透過化を、ＥＤＴＡまたはＣａ２＋を含む溶液中で実施する、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ｅ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡを、透過化された細菌細胞から単離することを更に含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ＤＮＡがゲノムＤＮＡおよび／またはエピソームＤＮＡである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
エピソームＤＮＡがプラスミドまたはコスミドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドが外因性ポリヌクレオチドである、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
標的分子の分子量が約１２０ｋＤａ未満である、請求項１から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
所望の活性を有するポリペプチドを同定する方法であって、
ａ）請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法を用いてポリペプチドのライブラリーをスクリーニングし、そして
ｂ）所望の活性を有する１以上のポリペプチドを選択することを含む、方法。
【請求項２８】
ｃ）細菌細胞からポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡを単離することを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｄ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を決定することを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ポリペプチドのライブラリーが、細胞、組織、器官または生物から得られるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項２７から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ポリペプチドのライブラリーが、１以上の親ポリヌクレオチドを突然変異させることによって得られるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２７から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ポリペプチドが抗体または酵素である、請求項１から３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
抗体が単鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ポリペプチドが酵素であり、標的分子が透過化された細菌細胞に連結される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
標的分子が細菌細胞壁結合タンパク質に連結される、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドを標的分子に対する所望の活性に関してスクリーニングするための方法に関する。特に、本発明は、細菌細胞においてポリペプチドを発現し、前記細胞を透過化することにより、標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質ディスプレイの最も初期の方法は、ファージディスプレイ（非特許文献１）であり、この方法では、関心対象のタンパク質を、タンパク質の野生型コピーとともに存在し得るファージの外皮タンパク質の１つと融合させる。たとえば、ｐＩＩＩタンパク質に対する融合を使用したＭ１３繊維状ファージを基礎とするディスプレイプラットフォーム。
【０００３】
他のディスプレイ法には、「インビトロ」ディスプレイ法が含まれ、この方法では、タンパク質は細胞翻訳抽出物を用いて発現され、タンパク質とコーディング核酸との間のカップリングは、物理的結合（例えば、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ）によるか、または通常のスカフォールドへの付着への付着もしくは膜内への封入により、例えばインビトロ区画化（ＩＶＣ）で達成され、ＩＶＣでは、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡおよびタンパク質両方のマイクロビーズ（磁気またはセファロース）キャプチャシステムも含み得るミセル懸濁液内で翻訳される。
【０００４】
タンパク質ディスプレイの別の方法は微生物表面ディスプレイであり、これは、グラム陰性、グラム陽性真正細菌または酵母のいずれかの微生物細胞外側に対する発現されたタンパク質の標的配置を含む。タンパク質を、細胞表面にそれらを付着させるアンカードメインと融合させる。アンカードメインは、脂質化もしくは細胞壁への共有結合を要求するモチーフを有し得るか、または露出したループ領域内の内在性膜タンパク質に対する融合物であり得る。産生の拡張性のために、微生物表面ディスプレイは、多様なライブラリーから改善されたタンパク質変異体についてスクリーニングするために用いられるだけでなく、ワクチン接種用の抗原を提示するためもしくは工業バイオテクノロジーの酵素用細胞スカフォールドとして用いることもできる。
【０００５】
タンパク質ディスプレイ方法は、通常、抗体などの親和性タンパク質の進化に適用される。単一分子ディスプレイ法は歴史上最も普及しているが、高いバックグラウンドおよび親和性スケール間の低い分解能の問題を抱えている。周辺質収量が細胞質での発現に比べて非常に低いことが多い場合でも、酵母における表面ディスプレイによるかまたはファージ系により同定されるタンパク質は、通常、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）周辺質における発現のために再編成される。しかし、抗体が細胞質において高収率で発現される場合、ほぼすべての場合に、それらは不溶性封入体を形成し、これは難儀してリフォールディングし、活性に関して試験しなければならない。
【０００６】
このように、特に、親和性タンパク質ディスプレイライブラリおよび酵素ライブラリーをスクリーニングするためのタンパク質ディスプレイの方法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Smith (1985) Science, 228:1315-1317
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、透過化された細菌細胞において標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングすることを可能にするタンパク質ディスプレイの方法を開発した。ポリペプチドは、透過化された細菌細胞内に保持されているか、または透過化された細菌細胞に結合しているかのいずれかである。
【０００９】
したがって、本発明は、標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングする方法であって：
ａ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養して、ポリペプチドを産生し、
ｂ）細菌細胞を透過化し、ここで、ポリペプチドおよびポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは透過化された細菌細胞の内部に保持され、
ｃ）透過化された細菌細胞を標的分子と接触させて、該標的分子を透過化された細菌細胞中に拡散させ、そして
ｄ）ポリペプチドを所望の活性に関してスクリーニングする
ことを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングする方法であって：
ａ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養して、ポリペプチドを産生し、細菌細胞壁に付着させ、
ｂ）細菌細胞を透過化し、ここで、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、透過化された細菌細胞内部に保持される、
ｃ）透過化された細菌細胞を標的分子と接触させ、そして
ｄ）ポリペプチドを所望の活性に関してスクリーニングする
ことを含む方法を提供する。
【００１１】
１つの実施形態において、ステップｄ）は：
ｉ）ポリペプチドが標的分子に結合するかどうか、および／もしくは標的分子に結合する程度を決定すること、ならびに／または
ｉｉ）ポリペプチドが標的分子を酵素的に修飾するかどうか、および／もしくは標的分子の酵素修飾率を決定する
ことを含む。
【００１２】
細菌細胞は、細胞膜を可溶化するが細菌細胞壁の完全性を保持する任意の薬剤で透過化することができる。そのような薬剤としては、界面活性剤および有機溶媒が挙げられる。１つの実施形態において、細菌細胞を界面活性剤、たとえば非イオン性界面活性剤で透過化する。
【００１３】
本発明の方法は、任意の好適なグラム陰性またはグラム陽性細菌細胞において実施することができるが、好ましくは、細菌細胞はグラム陰性細菌細胞である。
したがって、本発明は、標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングする方法であって：
ａ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養して、ポリペプチドを産生し、
ｂ）細菌細胞を透過化し、ここで、ポリペプチドおよびポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは透過化された細菌細胞の内部に保持され、
ｃ）透過化された細菌細胞を標的分子と接触させて、該標的分子を透過化された細菌細胞中に拡散させ、そして
ｄ）ポリペプチドを所望の活性に関してスクリーニングする
ことを含む方法を提供する。
本発明はさらに、標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングする方法であって：
ａ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養して、ポリペプチドを産生し、細菌細胞壁に付着させ、
ｂ）細菌細胞を透過化し、ここで、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、透過化された細菌細胞内部に保持される、
ｃ）透過化された細菌細胞を標的分子と接触させ、そして
ｄ）ポリペプチドを所望の活性に関してスクリーニングする
ことを含む方法を提供する。
【００１４】
１つの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも第２ポリペプチドと結合して、透過化された細菌細胞の内部に保持された、および／または細菌細胞壁に付着した、タンパク質複合体を形成する。ポリペプチドは、たとえば非共有もしくは共有結合によるなどで第２ポリペプチドと間接的に結合することができるか、またはポリペプチドは、第２ポリペプチドと直接的に結合することができ、たとえば融合タンパク質であり得る。
【００１５】
したがって、１つの実施形態において、ポリペプチドを、第２ポリペプチド、またはそのサブユニットと融合させる。
【００１６】
本発明の方法において、第２ポリペプチドは：
ｉ）タンパク質複合体が透過化された細菌細胞壁の内部に保持されるような分子サイズを有するポリペプチド；
ｉｉ）ＤＮＡ結合タンパク質；および／または
ｉｉｉ）細菌細胞壁結合タンパク質
から選択することができる。
【００１７】
１つの実施形態において、タンパク質複合体の分子量は、少なくとも約１２０ｋＤａである。
【００１８】
別の実施形態において、第２ポリペプチドは、透過化された細菌細胞の内部でマルチマーを形成する。マルチマーは、たとえば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマーまたはさらに高次のマルチマーであり得る。１つの実施形態において、マルチマーはテトラマーである。
【００１９】
特定の１つの実施形態において、第２ポリペプチドは、ＲｈｎＡ、β−ガラクトシダーゼ、ＢｅｔＢ、Ｇ５Ｋ、ＧｓｈＢ、およびＹｄｃＷから選択される。
【００２０】
所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドを細菌宿主細胞ＤＮＡと結合させるために、任意のＤＮＡ結合タンパク質を本発明の方法で用いることができる。１つの実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質はＣｏｍＥである。
【００２１】
代替的または付加的に、ポリペプチドを細菌細胞壁結合タンパク質と結合させることができ、この場合、細菌細胞壁結合タンパク質は、ペプチドグリカン結合タンパク質、および細胞壁と結合できるリポタンパク質またはそのフラグメントから選択される。
【００２２】
１つの実施形態において、細菌細胞壁結合タンパク質は、ＫｚＰＧ、ＰＡＬ、ＯｍｐＡ、ＹｉａＤ、ＹｆｉＢおよびＭｏｔＢから選択されるペプチドグリカン結合タンパク質である。
【００２３】
ポリペプチドは細菌細胞壁と非共有的または共有的のいずれかで結合し得るが、１つの実施形態では、ポリペプチドは細菌細胞壁と共有結合する。
【００２４】
別の実施形態において、細胞壁と結合できるリポタンパク質は、外膜付着に必要な機能的Ｎ末端シグナル配列が欠如したリポタンパク質である。
【００２５】
特定の１つの実施形態において、リポタンパク質は大腸菌ＬＰＰである。
【００２６】
本発明の方法の１つの実施形態において、非イオン性界面活性剤は、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０）、ジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（８ＴＧＰ）、ならびにデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０）およびジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）の混合物から選択される。
【００２７】
特定の１つの実施形態において、細菌細胞の透過化は：
ｉ）ＬＢ中約０．５％のｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（８ＴＧＰ）、および
ｉｉ）ＬＢ中約０．５％のデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０）および約０．５％のジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）
から選択される溶液中で実施される。
【００２８】
本発明の方法の別の実施形態において、ステップｂ）は、細菌細胞を選択的に透過化することを含み、それにより、細菌細胞の外膜は細菌細胞の内膜よりもさらに透過化される。
【００２９】
１つの実施形態において、細菌細胞は、ジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）および／またはポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）から選択される界面活性剤で選択的に透過化される。
【００３０】
１つの実施形態において、細菌細胞の選択的透過化は、界面活性剤を約０．２％で含む溶液中で実施される。
【００３１】
別の実施形態において、細菌細胞の選択的透過化は、ＥＤＴＡまたはＣａ２＋を含む溶液中で実施される。
【００３２】
別の実施形態において、方法は、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むＤＮＡを透過化された細菌細胞から単離することをさらに含む。
【００３３】
細菌細胞から単離されるＤＮＡは、ゲノムＤＮＡおよび／またはエピソームＤＮＡであり得る。エピソームＤＮＡは、たとえば、プラスミドまたはコスミドであり得る。
【００３４】
１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは外因性ポリヌクレオチドである。
【００３５】
別の実施形態において、標的分子の分子量は約１２０ｋＤａ未満である。
【００３６】
本発明はさらに、
所望の活性を有するポリペプチドを同定するための方法であって：
ａ）本発明の方法を用いてポリペプチドのライブラリーをスクリーニングすること；および
ｂ）所望の活性を有する１以上のポリペプチドを選択すること
を含む方法を提供する。
【００３７】
１つの実施形態において、方法はさらに、ｃ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むＤＮＡを細菌細胞から単離することを含む。
【００３８】
別の実施形態において、方法は、ｄ）ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの配列を決定することをさらに含む。
【００３９】
１つの実施形態において、ポリペプチドのライブラリーは、細胞、組織、器官または生物から得られるポリヌクレオチドによりコード化される。
【００４０】
別の実施形態において、ポリペプチドのライブラリーは、１以上の親ポリヌクレオチドを突然変異させることによって得られるポリヌクレオチドによりコード化される。
【００４１】
１つの実施形態において、ポリペプチドは抗体または酵素である。
【００４２】
特定の１つの実施形態において、抗体は単鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）である。
【００４３】
別の実施形態において、ポリペプチドは酵素であり、標的分子を透過化された細菌細胞に結合させる。標的分子を透過化された細菌細胞に結合させるために、標的分子を細菌細胞に直接的または間接的のいずれかで結合させることができる。標的分子を透過化された細菌細胞に直接的に結合させるために、標的分子をたとえば、細菌細胞壁結合タンパク質と結合させることができる。
【００４４】
別の実施形態において、ポリペプチドは、抗体以外の結合タンパク質である。たとえば、ポリペプチドは、これらに限定されるものではないが、リポカリン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）、ユビキチン、またはγ−Ｂ−クリスタリンをはじめとする結合タンパク質であり得る。
【００４５】
本発明の方法の１つの実施形態において、ポリペプチドは、Ｉ２７、ＲＬ６、ＫｚＰＧ、ＳＮＡＰ，および／またはＤＢＰのいずれか１つから選択されるドメインを含む。特定の１つの実施形態において、ポリペプチドは、ドメインＩ２７、ＲＬ６、ＫｚＰＧ、ＳＮＡＰ、およびＤＢＰを含む。
【００４６】
本発明の方法の別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１３と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【００４７】
本発明はさらに、第２ポリペプチドと結合して、透過化された細菌細胞の内部に保持されるタンパク質複合体を形成する外因性ポリペプチドを含む透過化された細菌細胞を提供する。
本発明はさらに、透過化された細胞膜を含むグラム陰性菌細胞を提供し、細菌細胞が、第２ポリペプチドと結合して、透過化された細菌細胞の内部に保持されるタンパク質複合体を形成する外因性ポリペプチドを含む。
【００４８】
本発明はさらに、細菌細胞壁に付着した外因性ポリペプチドを含む透過化された細菌細胞を提供する。
本発明はさらに、透過化された細胞膜を含むグラム陰性菌細胞を提供し、細菌細胞が、細菌細胞壁に付着した外因性ポリペプチドを含む。
【００４９】
本発明はさらに：
ａ）ｉ）第１ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをベクターに挿入するための部位、および
ｉｉ）第１ポリペプチドと結合して、透過化された細菌細胞の内部に保持されるタンパク質複合体を形成する、第２ポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレーム
を含むベクター、ならびに
ｂ）細菌細胞を透過化することができる薬剤
を含むキットを提供する。
【００５０】
本発明はさらに：
ａ）ｉ）第１ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをベクターに挿入するための部位、および
ｉｉ）第１ポリペプチドと結合して、細菌細胞壁に付着したタンパク質複合体を形成する第２ポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレーム
を含むベクター、ならびに
ｂ）細菌細胞を透過化することができる薬剤
を含むキットを提供する。
【００５１】
１つの実施形態において、部位およびオープンリーディングフレームは、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチド、またはそのサブユニットが融合タンパク質として発現されるような位置にある。
【００５２】
別の実施形態において、細菌細胞を透過化することができる薬剤は界面活性剤である。
【００５３】
さらに別の実施形態において、界面活性剤は、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０）、ジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（８ＴＧＰ）、ならびにデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ１０）およびジメチルオクチルホスフィンオキシド（Ａｐｏ８）の混合物から選択される非イオン性界面活性剤である。
【００５４】
１つの実施形態において、キットは細菌細胞をさらに含む。
【００５５】
好ましくは、細菌細胞はグラム陰性である。たとえば、細菌細胞は大腸菌であり得る。
本発明はさらに、
ａ）ｉ）ベクターに第１ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを挿入するための部位と、
ｉｉ）第１ポリペプチドと結合して、透過化された細胞壁を含むグラム陰性菌細胞の内部に保持されるタンパク質複合体を形成する第２ポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームと
を含むベクターと、
ｂ）グラム陰性菌細胞を透過化することができる薬剤と
を含むキットを提供する。
本発明はさらに、
ａ）ｉ）ベクターに第１ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを挿入するための部位と、
ｉｉ）第１ポリペプチドと結合して、グラム陰性菌細胞壁に付着したタンパク質複合体を形成する第２ポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームであって、グラム陰性菌細胞が、透過化された細胞膜を含むオープンリーディングフレームと
を含むベクターと、
ｂ）グラム陰性菌細胞を透過化することができる薬剤
を含むキットを提供する。
【００５６】
本発明はさらに、配列番号１３と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を提供する。
【００５７】
本発明はさらに、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは１００％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００５８】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【００５９】
本発明はさらに、配列番号６〜１２または１６のいずれか１つと少なくとも９０％、さらに好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドスペーサーを提供する。
【００６０】
明らかなように、本発明の１つの態様の好ましい特徴および特性は、本発明の多くの他の態様に適用可能である。
【００６１】
本明細書全体を通して、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という語、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、記載された要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を包含するが、任意の他の要素、整数若しくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を除外しないことを意味すると理解される。
【００６２】
本発明を、以下の非限定的例により、添付の図面を参照して後述する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】大腸菌細胞の界面活性剤透過化。ＧＦＰを発現する大腸菌細胞を界面活性剤で処理して、膜透過化の有効性を測定した。細胞を明視野（第１列）または蛍光顕微鏡法（第２列および第３列）のいずれかにより観察した。透過化は、膜不透過性ＤＮＡ結合色素Ｇｅｌ  Ｒｅｄ（第３列）の吸収と同時にＧＦＰ（緑色、第２列）が、細胞から放出される場合に有効であった。界面活性剤８ＴＧＰ（０．５％）および０．５％のＭｅｇａ１０／０．５％のＡｐｏ８（「Ａｇｅｎｔ８６」）は大腸菌細胞の透過化において最も有効であることが判明した。
【図２】界面活性剤上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。図１で示される大腸菌細胞の界面活性剤透過化の上清を、９％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にロードして、界面活性剤によるタンパク質放出を定性的に評価した（第１レーン）。界面活性剤透過化細胞における細胞壁カプセルによる細胞タンパク質のサブセットの保持を示すために、界面活性剤透過化細胞の試料をリゾチーム（２ｍｇ／ｍＬ）で処理して、細胞壁（第２レーン）を加水分解した。
【図３】テトラマー融合タンパク質発現。（Ａ）Ｈｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：テトラマー融合タンパク質の大腸菌における発現を、全細胞タンパク質に対してプローブされたαＨｉｓ抗体を用いてウェスタンブロットにより調べた。予想される分子量のバンドに加えて、＞２５０ｋＤの高分子量バンドがＲｈｎＡテトラマー融合物（レーン４）で観察され、これはテトラマーとして移動した複合体の推定されるＳＤＳ耐性形態である。（Ｂ）ＢｅｔＢテトラマー融合タンパク質抽出物を界面活性剤可溶性および界面活性剤不溶性（細胞カプセルペレット）抽出物に分離し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。
【図４】テトラマー融合タンパク質のＳＮＡＰ標識。例１で記載されているようにして、Ｈｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：テトラマー融合タンパク質を大腸菌において発現させ、細胞を８ＴＧＰで透過化した。例３で記載されているようにして、融合タンパク質の発現を、膜不透過性ＳＮＡＰリガンドＢＧ−５４７で標識された透過化細胞の蛍光顕微鏡検査（第２列）により検出した。細胞ＤＮＡを膜透過性色素、Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎで標識した（第１列）。ＳＮＡＰおよびＳｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎシグナルのオーバーレイを第３列に示す。
【図５】透過化細胞におけるＨｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：ＢｅｔＢテトラマーのαＨｉｓ抗体標識。例３で記載されるような、αＨｉｓ抗体でプローブされたＨｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：ＢｅｔＢテトラマーを発現する透過化細胞の蛍光顕微鏡検査（第１パネル）。細胞をＳＮＡＰリガンドＢＧ−５４７で標識した（第２パネル）。αＨｉｓおよびＳＮＡＰ両方の共存（第３パネル）は、αＨｉｓ抗体が透過化細胞の細胞壁を透過することを示す。
【図６】ＨＡＬＯおよびＳＮＡＰ発現レポーターとのＢｅｔＢ、ＲｈｎＡおよびＹｄｃＷテトラマー融合物。ＢｅｔＢ、ＲｈｎＡおよびＹｄｃＷテトラマーを別々に発現レポーターＨＡＬＯおよびＳＮＡＰと融合させた。融合タンパク質を発現する細胞を透過化し、宿主ＤＮＡをＧｅｌ  Ｒｅｄで標識し、ＨＡＬＯ（Ｇ１００１）およびＳＮＡＰ（ＢＧ−４８８）の蛍光リガンドを用いて融合タンパク質を検出した。
【図７】ＧＦＰ５：：ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）融合物の発現。淋菌（Ｎ．  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）由来の非特異的高親和性ＤＮＡ結合タンパク質であるＣｏｍＥをＧＦＰ５のＣ末端に融合させ、大腸菌で発現させた。細胞を透過化し、ＧＦＰ（第１パネル）およびＧｅｌ  Ｒｅｄ（第２パネル）に関して蛍光顕微鏡法により観察した。蛍光の共存（第３パネル）は、融合タンパク質および宿主ＤＮＡの両方が透過化細胞カプセル内に保持されたことを示す。
【図８】透過化細胞におけるＤＮＡの保持。ＧＦＰ５：：ＤＢＰ融合物、またはＨｉｓ６：：ｅＧＦＰ融合物を発現する大腸菌細胞を、未処理のまま放置するか（１および４行）または例１で記載されるように透過化させるか（２、３、５および６行）のいずれかであった。透過化細胞を４℃で一晩保存するか、またはＴＢＳ中に再懸濁させ、３７℃で一晩振盪した後、ＧＦＰ（第１列）またはＧｅｌ  Ｒｅｄ（第２列）に関して蛍光顕微鏡法により観察した。ＧＦＰおよびＧｅｌ  Ｒｅｄの共存を第３列に示す。
【図９】透過化細胞からのＤＮＡ抽出。（Ａ）ＧＦＰ５：：ＤＢＰ融合タンパク質または（Ｂ）Ｈｉｓ６：：ｅＧＦＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を例１で記載されるようにして透過化した。透過化細胞を一晩４℃で保存するか、またはＴＢＳ中に再懸濁させ、３７℃で一晩振盪した後、プラスミドＤＮＡを抽出し、エチジウムブロミド染色された１％アガロースゲル上、ＴＡＥ緩衝液で電気泳動させた。レーン１は未処理細胞中の全プラスミドＤＮＡである。レーン２および４は、それぞれ４℃で一晩保存し、３７℃で振盪した細胞カプセルの透過化ステップからの上清であり、レーン３および５は、それぞれ４℃で一晩保存し、３７℃で振盪した細胞カプセルからのプラスミド調製物である。
【図１０】ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質のＳＮＡＰ標識。ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を例１で記載されるようにして透過化した。融合タンパク質局在化を、例３で記載されるようにＳＮＡＰリガンドＢＧ−４８８での標識により検出した。標識された細胞を明視野顕微鏡検査（第１パネル）および蛍光顕微鏡検査（第２パネル）により観察した。第３パネルは明視野図および蛍光図両方のオーバーレイである。
【図１１】αＧＦＰ：：ＨＡＬＯ：：ＲｈｎＡ融合タンパク質によるｅＧＦＰの結合。αＧＦＰ：：ＨＡＬＯ：：ＲｈｎＡ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を例１で記載されるようにして透過化した。精製されたｅＧＦＰタンパク質を例８で記載されるように細胞カプセルと結合させ、ｅＧＦＰを蛍光顕微鏡検査により視覚化した。第１パネル、明視野図；第２パネル、ｅＧＦＰ蛍光；第３パネル、明視野および蛍光のオーバーレイ。
【図１２】αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質によるｅＧＦＰの結合。αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を例１で記載されるようにして透過化した。精製されたｅＧＦＰタンパク質を例８で記載されるようにして細胞カプセルと結合させ、例３で記載されているようにして、ｅＧＦＰを２つの方法、ウェットマウントおよびドライマウントによる蛍光顕微鏡法で視覚化した。（Ａ）ウェットマウント細胞カプセルに結合させたｅＧＦＰ。挿入パネル（ｉ）および（ｉｉ）は、αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質により結合したｅＧＦＰの細胞壁局在化を示す。（Ｂ）および挿入パネル（Ａｉｉｉ）は、ＤＡＢＣＯ／グリセロール中でドライマウントによる顕微鏡検査のために調製された同じ細胞を示す。
【図１３】ＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質によるｅＧＦＰの結合。ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰまたはＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を例１で記載されているようにして透過化した。精製されたｅＧＦＰタンパク質を例８で記載されているようにして細胞カプセルと結合させ、例３で記載されているようにして、ｅＧＦＰをドライマウントによる蛍光顕微鏡法によって視覚化した。（Ａ）ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質を発現する細胞は、ＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質を発現する細胞（第２パネル、下行）と異なり、ｅＧＦＰ蛍光がない（第２パネル、上行）。
【図１４】ＬＰＰ融合タンパク質による細胞壁に対する共有結合の証明。ＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞を例１で記載されているようにして透過化した。融合タンパク質局在化を例３で記載されているようにしてＳＮＡＰリガンドＢＧ−４８８で標識することにより検出し、ＤＮＡをＧｅｌ  Ｒｅｄで染色した。試料を５分間２２℃（Ａ）または９５℃（Ｂ）で加熱した後、ドライマウントし、蛍光顕微鏡検査により観察した。
【図１５】界面活性剤／Ｃａ２＋緩衝液を用いた外膜透過化。ＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質（外部αＧＦＰまたはαＧＦＰ：：ＨＡＬＯ：：ＦＬＡＧ：：ＲｈｎＡ融合タンパク質（内部αＧＦＰ）を発現する大腸菌細胞を例１０で記載されているようにして透過化した。大きなリガンドに対する外膜の透過化は、細胞壁に付着したαＧＦＰドメインにｅＧＦＰを結合させることにより評価した。内膜の透過化は、大きなリガンド（ｅＧＦＰ）および小さなリガンド（Ｇｅｌ  Ｒｅｄ）を用いて評価した。Ｃａ２＋緩衝液中の界面活性剤Ａｐｏ８（Ａ）およびＴｗｅｅｎ２０（Ｂ）はどちらも、大きなリガンドに対する外膜の選択的透過性を示した。
【図１６】界面活性剤／ＥＤＴＡ緩衝液を用いた外膜透過化。ＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質（外部αＧＦＰ）またはαＧＦＰ：：ＨＡＬＯ：：ＦＬＡＧ：：ＲｈｎＡ融合タンパク質（内部αＧＦＰ）を発現する大腸菌細胞を例１０で記載されるようにして透過化した。大きなリガンドに対する外膜の透過化を、ｅＧＦＰを細胞壁に付着したαＧＦＰドメインに結合させることにより評価した。内膜の透過化は、大きなリガンド（ｅＧＦＰ）および小さなリガンド（Ｇｅｌ  Ｒｅｄ）を用いて評価した。ＥＤＴＡ緩衝液中の界面活性剤Ａｐｏ８（Ａ）およびＴｗｅｅｎ２０（Ｂ）はどちらも大きなリガンドに対する外膜の選択的透過性を示した。
【図１７】混合ｅＧＦＰ、およびＳＮＡＰ標識された細胞のＦＡＣＳ分析。ｅＧＦＰ（＃１矢印）；ＳＮＡＰリガンドＢＧ−４８８で標識されたαＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質（＃２矢印）；およびＳＮＡＰリガンドＢＧ−５４７で標識されたＨｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：ＢｅｔＢ（＃３矢印）を発現する大腸菌細胞の３つの集団を、ＦＡＣＳにより分類した。分類された集団を初回分類の６０分後に純度および細胞完全性について再分析した。
【図１８】αＧＦＰおよびＫｚＰＧドメイン間のペプチドリンカーは、αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞のセファロース支持体に対する結合を可能にする。１２−ｍｅｒリンカー領域ＲＬ６をαＧＦＰおよびＫｚＰＧドメイン間に有するαＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する細胞を、Ｈｉｓ６：：ｅＧＦＰ中間体によりＣｏ２＋−セファロース支持体Ｃｏ２＋−セファロース支持体と結合させた。ＧＦＰ結合を左のパネルに示し（緑）；融合タンパク質のＳＮＡＰリガンド（赤）結合を中央のパネルに示し；それぞれのオーバーレイを右に示す。
【図１９】αＧＦＰ：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞のストレプトアビジン標識された磁気ビーズに対する結合。（Ａ）ビオチン標識されたｅＧＦＰ（中央および右パネル）を、αＧＦＰ：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する細胞と結合させ、これを次にストレプトアビジン標識された磁気粒子と結合させた。（Ｂ）最初にビオチニル化ｅＧＦＰで標識されたストレプトアビジン標識磁気粒子に対するαＧＦＰ：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する細胞の逆の結合。この例では、ビーズは緑色に標識され（ＧＦＰパネル）、細胞はＢＧ−５４７ＳＮＡＰリガンドで標識された（赤、ＳＮＡＰ  ｒｅｄパネル）。（Ｃ）ドメインリンカー（ヒトタイチンの２７番目のＩｇドメイン）も結合スペーサーとして有効であった。αＧＦＰ：：Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現する大腸菌細胞をまずビオチニル化ｅＧＦＰと結合させ（緑、ＧＦＰパネル）、ＢＧ−５４７ＳＮＡＰリガンドで標識（赤、ＳＮＡＰ  ｒｅｄパネル）した後、ストレプトアビジン標識磁気粒子と結合させる。
【図２０】大腸菌細胞質におけるｓｃＦｖ：：Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質としてのマウスｓｃＦｖ遺伝子の発現。マウスｓｃＦｖライブラリーを構築し、本発明の方法にしたがって大腸菌細胞質でディスプレイした。検出可能な発現を有するクローンをＳＮＡＰリガンド結合により検出し、ミスフォールド（左パネル）、わずかに発現されるが可溶性（中央のパネル）または高度に発現され可溶性（右パネル）に分類した。
【図２１】可溶性および不溶性ｓｃＦｖ発現の大腸菌細胞質における検出。マウスｓｃＦｖ発現ライブラリーからの限定されたスクリーンにおいて高度に発現され可溶性であることが判明した、選択されたクローンを、ｓｃＦｖ：：Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＦＬＡＧおよびｓｃＦｖ：：ＲＬ６：：ＦＬＡＧ融合タンパク質として発現構築物中にサブクローンした。タンパク質フラクションを可溶性または不溶性のいずれかとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードし、ニトロセルロース膜に移し、αＦＬＡＧ抗体を用いて検出した。可溶性（Ｓ）または不溶性（Ｐ）フラクションについて、試料、ならびに発現される各クローンをＩ２７：：ＲＬ６（Ｉ）またはＲＬ６（Ｒ）リンカーと対にする。ライブラリスクリーンから単離されるＩ２７：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰディスプレイ構築物におけるオリジナルのｓｃＦｖクローンの蛍光顕微鏡画像も下のパネルに示す。
【００６４】
配列表の凡例
配列番号１  ｐＡｒａ３：：Ｈｉｓ６：：ＳＮＡＰアラビノースベクターのヌクレオチド配列
配列番号２  ｐＡｒａ３：：Ｈｉｓ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰベクターのヌクレオチド配列
配列番号３  ｐＡｒａ３：：ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰベクターのヌクレオチド配列
配列番号４  ｐＡｒａ３：：αＧＦＰ（Ｒ３５）：：ＨＡＬＯ：：ＦＬＡＧ：：ＲｈｎＡベクターのヌクレオチド配列
配列番号５  ランダム化ペプチドスペーサードメイン
配列番号６〜１２  ペプチドリンカースペーサー
配列番号１３  Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ
配列番号１４  Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰコーディング配列
配列番号１５  ライブラリスカフォールドベクター
配列番号１６  Ｉ２７スペーサー
【発明を実施するための形態】
【００６５】
一般的技術および定義
別段の明確な規定がない限り、本明細書中で用いられる全ての専門用語および科学用語は、（たとえば、タンパク質化学、生化学，細胞培養、分子遺伝学、微生物学、および免疫学の）当業者により通常理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるべきである。
【００６６】
特に明記しない限り、本発明で利用される組換えタンパク質、細胞培養、および免疫手法は、当業者に周知の標準的手順である。そのような技術は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edn, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001)、R. Scopes, Protein Purification - Principals and Practice, 3rd edn, Springer (1994)、T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)、D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)、およびF.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)、およびJ.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (including all updates until present)などの出典で文献全体にわたって記載され、説明されている。
【００６７】
「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、本明細書中では一般的に交換可能に用いられる。本明細書中で用いられる場合、「外因性ポリペプチド」という用語は、外因性ポリヌクレオチドによりコード化されるポリペプチドを指す。「外因性ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で用いられる場合、それが導入される細胞と異なるポリヌクレオチド、またはポリペプチドが通常見いだされない宿主細胞核酸内の位置以外は導入される細胞における配列と配列が相同性であることを意味する。
【００６８】
「抗体」という用語は、本発明で用いられる場合、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、多特異性抗体、ヘテロ結合抗体、キメラ抗体、例えばインタクト分子ならびにそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖならびに他の抗体様分子が挙げられる。
【００６９】
「約」という用語は、本明細書中で用いられる場合、所定値の＋／−５％の範囲を指す。
【００７０】
透過化
本発明の方法では、細菌細胞を透過化し、かくして可溶性細胞成分の少なくとも一部を、細胞壁を通して拡散させる。所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドは、細菌細胞壁内に保持されるか、または細菌細胞壁に付着する。本明細書中で用いられる場合、「透過化された細菌細胞」とは、１以上細胞膜中に孔を生成させるか、または細胞膜を可溶化し、一方、ペプチドグリカン間の結合を加水分解せず、それにより細胞壁をインタクトのままで保持する透過化剤の使用を指す。細菌細胞を透過化する薬剤の非限定的例としては、界面活性剤および有機溶媒が挙げられる。透過化は、有利には、小〜中程度のサイズのタンパク質、たとえば１２０ｋＤａまで、または同等以下のサイズの他の分子がインタクトなままの細胞カプセル中に侵入させる。さらに、細菌細胞壁の完全性を維持することにより、透過化された細菌細胞は、従来法で、たとえば細菌細胞をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ−リゾチームで処理することにより産生されるスフェロプラストほど脆弱ではなく、スフェロプラストでは、細菌細胞壁が少なくとも部分的に加水分解されている。本発明の方法で産生される透過化された細菌細胞は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）などの技術によく適しており、一方、スフェロプラストは高剪断フローサイトメトリー環境により損なわれ、制御された浸透圧条件を必要とし、したがってそれらの潜在的使用が限定される。
【００７１】
好ましくは、透過化処理は、細胞タンパク質をそれらの自然な状態および相互関係で保存する。非イオン性界面活性剤は、タンパク質フォールディングおよびタンパク質複合体に対してイオン性界面活性剤ほど破壊的でない。したがって、好ましい実施形態では、非イオン性界面活性剤を用いて細菌細胞壁を透過化する。非イオン性界面活性剤の非限定的例としては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｂｒｉｊ  ３５、Ｂｒｉｊ  ５８、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ、Ｏｃｔｙｌ  β  Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、Ｍｅｇａ  ８、Ｍｅｇａ  ９、Ｍｅｇａ  １０、ＢｉｇＣＨＡＰ、Ｄｅｏｘｙ  ＢｉｇＣＨＡＰ、Ａｐｏ８、および８ＴＧＰが挙げられる。
【００７２】
界面活性剤の混合物を用いて細菌細胞を透過化することができる。たとえば、界面活性剤は、２以上の非イオン性界面活性剤の混合物であり得る。１つの実施形態において、界面活性剤はＭｅｇａ  １０およびＡｐｏ８の混合物である。
【００７３】
所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドが細菌細胞壁に付着しているか、または内側細胞膜と一体化しているかもしくは付着している場合、必ずしも細菌細胞の内膜を透過化する必要はない可能性があることを当業者は理解するであろう。したがって、１つの実施形態では、細菌細胞は選択的に透過化される。「選択的に透過化される」により、透過化された細菌細胞の外膜が内膜よりもさらに透過化され、それによって、内膜および外膜の両方が、０．５％のＭｅｇａ  １０および０．５％のＡｐｏ８を含む溶液を用いることによるなどで透過化された透過化細胞と比較した場合、膜不透過性物質、たとえば膜不透過性ＤＮＡ結合リガンドＧｅｌ  Ｒｅｄの５０％以下、もしくは更に好ましくは４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下が選択的に透過化された細胞の内膜を透過するか、または透過しないことを意味する。
【００７４】
当業者は、本発明の方法にしたがって細菌細胞を選択的に透過化するために好適な条件を決定することができるが、１つの実施形態では、細菌細胞は、非イオン性界面活性剤で選択的に透過化される。たとえば、非イオン性界面活性剤は、Ａｐｏ８およびＴｗｅｅｎ２０から選択することができる。１つの実施形態において、細菌細胞を選択的に透過化するための溶液は、界面活性剤を約０．２％〜約０．４％、または約０．２％〜約０．３％、または約０．２％の濃度で含む。好ましくは、細菌細胞を選択的に透過化するための溶液は、Ｃａ２＋またはＥＤＴＡを含む緩衝液中界面活性剤を含む。細菌細胞を選択的に透過化するために好適な例示的緩衝液としては、２５ｍＭのＴｒｉｓ中０．２〜０．４％のＡｐｏ８もしくはＴｗｅｅｎ２０、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、または２５ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＣａ２＋（ｐＨ８．０）が挙げられる。１つの実施形態において、細菌細胞の選択的透過は、細胞を好適な緩衝液中、約２５℃にて約１０分間インキュベートすることによって達成することができる。
【００７５】
ポリペプチド発現
所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドを、細菌細胞における発現の好適なベクター中にクローンすることができる。「ベクター」は本明細書中で用いられる場合、細菌細胞を形質転換するために好適であることが当該技術分野で知られている任意のベクターを指す。好ましくは、ベクターはまた、宿主のゲノムから独立して、細菌細胞内で複製することができる。ベクターとしては、プラスミド、ウイルスおよびコスミドならびに線状ＤＮＡエレメント、例えば大腸菌の線状ファージＮ１５、および／または細菌細胞ゲノムから独立して複製する染色体外ＤＮＡが挙げられる。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。
【００７６】
本明細書中で用いられる場合、「発現ベクター」は、細菌細胞において特定のポリヌクレオチド分子を発現させることができるベクターである。好ましくは、発現ベクターは、細菌細胞内で複製することもできる。好適な発現ベクターは、典型的には、調節配列、たとえば転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、および組換え細菌細胞と適合性であり、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド分子の発現を制御する他の調節配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長、および終止を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、転写開始を制御するもの、たとえば、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列である。好適な転写制御配列は、細菌細胞において機能することができる任意の転写制御配列を含む。種々のそのような転写制御配列は、当業者に公知である。
【００７７】
発現ベクターの細菌細胞への形質転換は、ポリヌクレオチド分子を細胞中に挿入できる任意の好適な方法により達成することができる。形質転換技術としては、これらに限定されるものではないが、エレクトロポレーションおよび化学変換が挙げられる。形質転換されたポリヌクレオチド分子は、染色体外にとどまる可能性があるか、またはそれらの発現される能力が保持されるような方法で形質転換された（すなわち、組換え）細胞の染色体内の１以上の部位に組み込まれる可能性がある。
【００７８】
組換えＤＮＡ技術を用いて、たとえば、宿主細胞内のポリヌクレオチド分子のコピー数、それらのポリヌクレオチド分子が転写される効率、結果として得られる転写物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操作することによって、形質転換されたポリヌクレオチド分子の発現を改善することができる。ポリヌクレオチド分子の発現を増大させるために有用な組換え技術としては、これらに限定されるものではないが、ポリヌクレオチド分子を高コピー数のプラスミドに機能的に連結すること、ベクター安定性配列のプラスミドへの添加、転写制御シグナル（たとえば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換もしくは修飾、翻訳制御シグナル（たとえば、リボソーム結合部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）の置換もしくは修飾、宿主細胞のコドン使用に対応させるためのポリヌクレオチド分子の修飾、および転写物を不安定化する配列の欠失が挙げられる。
【００７９】
当業者は、本発明の方法でポリペプチドを発現するために好適な細菌株を容易に決定することができるであろう。当業者は、本発明の方法での使用に好適なグラム陰性菌には、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、アクチノバチルス属（アクチンｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびヒストフィルス属（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ）が含まれることを理解するであろう。好ましい実施形態において、グラム陰性菌は大腸菌である。
【００８０】
タンパク質複合体
所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドを少なくとも第２ポリペプチドと結合させて、タンパク質複合体が透過化された細菌細胞の内部に保持されるような分子サイズを有するタンパク質複合体を形成することができる。ポリペプチドをたとえば、ジスルフィド架橋などの共有結合によるか、または非共有結合により、第２ポリペプチドと結合させることができる。「非共有結合」とは、原子間結合が関与しない分子相互作用を指す。たとえば、非共有相互作用は、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用、およびファンデルワールス力が関与する。非共有結合力を用いて、別個のポリペプチド鎖をタンパク質またはタンパク質複合体中に一緒に保持することができる。したがって、ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを同じかもしくは異なるベクターのいずれかから別のポリペプチドとして発現することができるか、またはポリペプチドの一方もしくは両方を、細菌細胞ゲノム中に組み入れられたポリペプチドをコード化するＤＮＡから発現することができる。
【００８１】
あるいは、タンパク質複合体と結合するポリペプチドおよび第２ポリペプチドは融合タンパク質であり得る。本明細書中で用いられる場合、「融合タンパク質」とは、２つのポリペプチドのそれぞれの少なくとも一部をコード化するポリヌクレオチドの発現から生じる２以上のポリペプチド、またはそれらのフラグメントからなるハイブリッドタンパク質を指す。
【００８２】
分子サイズにより透過化された細菌細胞中に保持されるタンパク質複合体
第２ポリペプチドは、所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドで形成された複合体の少なくともいくつかが、透過化された細菌細胞から拡散することができないような十分な分子サイズ、すなわち十分な分子量または分子半径を有する任意のポリペプチドであり得る。したがって、タンパク質複合体は、細胞の透過化後に細菌細胞内に保持される。当業者は、その分子量および球状または桿状（糸状）タンパク質であるかどうかをはじめとする第２ポリペプチドの性質が、細菌細胞壁を通るタンパク質複合体の拡散を防止または阻害するその能力を決定することを理解するであろう。１つの実施形態において、第２ポリペプチドの分子量は、少なくとも約３０ｋＤａ、または少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０ｋＤａもしくはそれ以上である。１つの実施形態において、第２ポリペプチドは少なくとも約１２０ｋＤａである。
【００８３】
１つの実施形態において、第２ポリペプチドは、透過化された細菌細胞の孔排除サイズよりも大きな分子サイズを有するマルチマーを形成する。本明細書中で用いられる場合、「マルチマー」という用語およびその文法的変異は、２以上の異なる分子間のマルチマー複合体の形成を指す。マルチマーは、たとえば、同じタンパク質の２以上の分子（すなわち、ホモマルチマー）または２以上の異なるか、もしくは非同一タンパク質（すなわち、ヘテロマルチマー）の混合物を含み得る。本発明の方法における使用に好適なマルチマーを形成するタンパク質としては、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、および７以上のサブユニットを含むさらに高次のマルチマーが挙げられる。
【００８４】
マルチマータンパク質には、ホモダイマー、たとえば、ＰＤＧＦ受容体α、およびβイソ型、エリスロポエチン受容体、ＭＰＬ、ならびに−ＣＳＦ受容体、それらのサブユニットがそれぞれリガンド結合およびエフェクタードメインを有するヘテロダイマー、たとえば、ＰＤＧＦ受容体αβイソ型、ならびに異なる機能を有する成分サブユニットを有するマルチマー、たとえば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、およびＧＭ−ＣＳＦ受容体が含まれる。本発明の方法で用いることができる他のマルチマータンパク質の非限定的例としては、ＤＮＡの合成または複製に関与する因子、例えばＴＦＩＩＤおよびＴＦＩＩＨなどのｍＲＮＡの産生に関与するＤＮＡポリメラーゼタンパク質；細胞、核および他の膜関連タンパク質、例えばホルモンおよび他のシグナル伝達受容体、能動輸送タンパク質およびイオンチャンネル、ヘモグロビン、フィブリノゲンおよびフォンウィルブランド因子をはじめとする血液中のマルチマータンパク質；細胞内の構造を形成するタンパク質、例えばアクチン、ミオシン、およびチューブリンならびに他の細胞骨格タンパク質；細胞外環境で構造を形成するタンパク質、例えばコラーゲン、エラスチンおよびフィブロネクチン；細胞内および細胞外輸送に関与するタンパク質、例えばキネシンおよびダイニン、タンパク質のＳＮＡＲＥファミリー（可溶性ＮＳＦ付着タンパク質受容体）およびクラスリン；クロマチン構造の調節に役立つタンパク質、例えばヒストンおよびプロタミン、Ｓｗｉ３ｐ、Ｒｓｃ８ｐおよびモイラ；マルチマー転写因子、例えばＦｏｓ、ＪｕｎおよびＣＢＴＦ（ＣＣＡＡＴボックス転写因子）；マルチマー酵素、例えばアセチルコリンエステラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ；シャペロンタンパク質、例えばＧｒｏＥ、ＧｒｏＥＬ（シャペロニン６０）およびＧｒｏＥＳ（シャペロニン１０）；抗毒素、たとえばヘビ毒、ボツリヌス毒素、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）超抗原；リシン（バクテリオファージおよびウイルス由来の酵素）；ならびにほとんどのアロステリックタンパク質が挙げられる。１つの実施形態において、マルチマータンパク質は大腸菌タンパク質である。マルチマーを形成する大腸菌タンパク質の非限定的例としては、Ｌ−ラムノースイソメラーゼ（ＲｈｎＡ；たとえばＮＣＢＩ受入ＣＡＡ４３００２）、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ；たとえばＮＣＢＩ受入ＹＰ００１４６１５２０）、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢｅｔＢ；たとえばＮＣＢＩ受入ＡＡＡ２３５０６）、グルタメート−５−キナーゼ（Ｇ５Ｋ；たとえばＮＣＢＩ受入ＡＡＢ０８６６２）、グルタチオンシンターゼ（ＧｓｈＢ；たとえばＮＣＢＩ受入ＡＰ＿００３５０４）、および中鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＹｄｃＷ；たとえばＮＣＢＩ受入ＡＰ＿００２０６７）が挙げられる。
【００８５】
１つの実施形態において、所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドは、細菌細胞壁内にポリペプチドを保持するために十分な分子サイズを有する。したがって、当業者は、透過化された細菌細胞内にポリペプチドを保持するために、そのようなポリペプチドを第２ポリペプチドと必ずしも結合させる必要はないことを理解するであろう。
【００８６】
ＤＮＡ結合タンパク質
本発明者は、透過化後の細菌細胞内にＤＮＡが保持されることを見出した。したがって、１つの実施形態において、ポリペプチドをＤＮＡ結合タンパク質と結合させて、タンパク質複合体を形成し、これはＤＮＡと結合し、細菌細胞の内部に保持される。本明細書中で用いられる場合、「ＤＮＡ結合タンパク質」とは、２本鎖または１本鎖ＤＮＡを認識する少なくとも１つのモチーフを含むＤＮＡ結合ドメインを含む任意のタンパク質を指す。当業者には知られているように、ＤＮＡ結合ドメインは、ヘリックス・ターン・ヘリックス、亜鉛フィンガー、ロイシンジッパー、翼状ヘリックス、翼状ヘリックス・ターン・ヘリックス、ヘリックス・ループ・ヘリックス、ＤＮＡを認識する免疫グロブリンフォールド、またはＢ３ドメインを含む。ポリペプチドをＤＮＡ結合タンパク質と結合することによって、有利には、本発明のスクリーニング法においてポリペプチドをコード化するプラスミドなどのＤＮＡの回収が増大する。
【００８７】
ＤＮＡ結合タンパク質の例としては、細菌コンピテンスタンパク質、例えばこれらに限定されるものではないが、大腸菌ＤＮＡ結合タンパク質、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｈｏｅａｅ）ＤＮＡ結合タンパク質、たとえばＣｏｍＥ、アデノウイルスＥ２タンパク質、ＡｒａＣ転写因子、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子、塩基性ロイシンジッパー転写因子、ブチラート反応因子、セントロメアタンパク質Ｂ、ＣＯＵＰ転写因子、初期増殖応答転写因子、Ｇボックス結合因子、ＧＡＴＡ転写因子、ＨＭＧＡタンパク質、ホメオドメインタンパク質、Ｉ−カッパＢタンパク質、組み込み宿主因子、インターフェロン調節因子、インターフェロン−刺激遺伝子因子３、Ｋｒｕｐｐｅｌ様転写因子、ロイシン応答調節タンパク質、マトリックス付着領域結合タンパク質、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質、ＭｕｔＳホモログ２タンパク質、骨髄性−リンパ性白血病タンパク質、ＮＦ−カッパＢ、ＮＦ１転写因子、核呼吸因子、ガン遺伝子タンパク質ｐ５５、起点認識複合体、対合ボックス転写因子、ＰＯＵドメイン因子、プロトオンコジーン因子、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、Ｒａｄ５２ＤＮＡ修復および組換えタンパク質、複製タンパク質Ａ、複製タンパク質Ｃ、網膜芽細胞種タンパク質、Ｓｍａｄタンパク質、ＳＯＸ転写因子、Ｔボックスドメインタンパク質、ＴＣＦ転写因子、テロメア結合タンパク質、Ｔｏｌｌ様受容体９、トランス活性化因子、および翼状ヘリックス転写因子が挙げられる。１つの実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質は大腸菌ＤＮＡ結合タンパク質である。別の実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質は淋菌タンパク質、たとえばＣｏｍＥである。
【００８８】
細胞壁結合タンパク質
所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドを、細菌細胞壁結合タンパク質と結合させることができる。当業者は、細胞壁結合タンパク質の選択が宿主細胞種に依存することを理解するであろう。なぜなら、異なる細菌は異なる細胞壁組成を有するからである。細菌はペプチドグリカン（ＰＧ）から構成される細胞壁を有するが、種間の化学修飾は、異種間結合に影響を及ぼし得る。当業者は、特定の細菌種における使用に好適な細胞壁結合タンパク質を容易に決定することができるであろう。
【００８９】
細菌細胞壁結合タンパク質は、それによって天然の構造中のポリペプチド鎖が細菌細胞壁上の特定の分子または分子構造を認識でき、結合できるドメイン構造を有することが知られているタンパク質を含む。したがって、「細菌細胞壁結合タンパク質」という用語は、細菌細胞壁に特異的に結合するタンパク質の部分であるタンパク質ドメインを包含する。細菌細胞壁結合タンパク質の例としては、バクテリオファージによりコードされるような細胞壁ヒドロラーゼ、細菌の細胞壁ヒドロラーゼおよび異なる自己溶菌酵素が挙げられる。さらに含まれるのは、バクテリオファージおよび他のウイルスのＤＮＡによりコードされる受容体分子である。細菌細胞壁結合タンパク質が、細菌に特異的に結合できるバクテリオファージ起源の加水分解酵素由来である場合、細胞壁結合タンパク質はそれらの結合能力を保持するが、好ましくは著しい加水分解活性を有さない。
【００９０】
１つの実施形態において、細胞壁結合タンパク質は大腸菌の細胞壁に共有結合する。たとえば、大腸菌宿主細胞について、ＰＡＬ、ＯｍｐＡ、ＹｉａＤ、ＹｆｉＢ、およびＭｏｔＢに存在する、保存された約１００のアミノ酸ＰＧ結合ドメインを有する内因性ＰＧ結合タンパク質がある（Parsons et al., 2006）。しかし、たとえばシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）φＫＺファージ（ＫｚＰＧ）由来の約７０のアミノ酸ＰＧ結合ドメインなどの他の生物由来のタンパク質は、大腸菌で十分に発現され、高親和性で細胞壁に結合することが示されている（Briers et al., 2009）。したがって、ＰＧと結合するタンパク質由来のＰＧ結合ドメインを本発明の方法で細菌細胞壁結合タンパク質として用いることができる。
【００９１】
例示的実施形態において、所望の活性に関してスクリーニングされ、細菌細胞のサイトゾルで発現されるポリペプチドに、ＰＧ結合ドメインを融合させることができる。膜透過化により、ＰＧ結合ドメインは細胞壁と結合し、その結果、透過化細胞内で関心対象のポリペプチドが保持される。細胞内での関心対象のポリペプチドの保持を潜在的にさらに増強するために、当業者は、ポリペプチドが細菌細胞壁結合タンパク質に加えてＤＮＡ結合タンパク質と結合できることを理解するであろう。
【００９２】
あるいは、関心対象のポリペプチドは、細菌細胞壁に共有結合することができるタンパク質と結合することができる。好ましくは、タンパク質は周辺質を標的とするシグナルを含む。したがって、ポリペプチドは細菌細胞のサイトゾル中で発現されるが、周辺質を標的とし、ここで膜透過化前に細胞壁に結合する。
【００９３】
非限定的例として、細胞壁と共有結合する細菌細胞壁結合タンパク質は、細胞壁と結合することができ、外膜付着に必要な機能的Ｎ末端シグナル配列が欠如したリポタンパク質であり得る。たとえば、リポタンパク質は大腸菌ＬＰＰであり得る。ＬＰＰは、トリマーコイルドコイルを形成する多量の大腸菌タンパク質である。その天然の形態において、一端は脂質化により外膜に結合し、多端はＣ−末端リシンにより細胞壁に共有結合する。リポタンパク質は、リポタンパク質に周辺質を標的とさせる配列、たとえばＯｍｐＦ周辺質ターゲティング配列をさらに含み得る。１つの実施形態において、リポタンパク質は、外膜付着に必要な機能的Ｎ末端シグナル配列が欠如した大腸菌リポタンパク質である。
【００９４】
本明細書の教示を考慮して、当業者は、細菌細胞壁と共有結合し、本発明の方法での使用に好適なタンパク質を同定または設計できるであろう。
【００９５】
本発明の１つの実施形態において、所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドは、ＫｚＰＧドメインならびにスペーサー、ＳＮＡＰおよび／またはＤＢＰから選択される１以上の他のドメインを含む融合ポリペプチドである。特定の１つの実施形態において、融合ポリペプチドは、１以上スペーサーならびにＫｚＰＧ、ＳＮＡＰおよびＤＢＰドメインを含む。
【００９６】
スペーサー
１つの実施形態において、所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドを、１以上スペーサーを含む融合ポリペプチドとして発現することができる。「スペーサー」は、本明細書中で用いられる場合、融合ポリペプチド中に含まれて、細菌細胞におけるポリペプチドの発現を増強するか、または立体障害を減少させて、所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドがその所望の三次構造をとることができ、および／またはその標的分子と適切に相互作用することができるペプチドまたはポリペプチドを指す。したがって、融合タンパク質は、融合ポリペプチド中の１以上のポリペプチドドメインの前、後、または間に１以上スペーサーを含み得る。スペーサーおよび所望のスペーサーの同定方法については、たとえば、George, et al. (2003)を参照のこと。
【００９７】
１つの実施形態において、スペーサーは、１〜５０のアミノ酸残基の長さ、または約１〜２５残基、または約５〜１５残基の長さである１以上のアミノ酸配列を含む。たとえば、スペーサーは、Ｉ２７、ＲＬ１、ＲＬ２、ＲＬ３、ＲＬ４、ＲＬ５および／またはＲＬ６の１以上から選択することができる。当業者は、限定された数のアミノ酸置換、たとえば、１、２、３、４または５のアミノ酸置換を、スペーサーとして機能するその能力に影響を及ぼすことなくスペーサーに導入することができることを理解するであろう。特定の１つの実施形態において、１以上スペーサーは、配列番号６〜１２または１６のいずれか１つから選択される。したがって、１つの実施形態において、所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドは、Ｉ２７、ＲＬ６、ＫｚＰＧ、ＳＮＡＰおよびＤＢＰを含む融合ポリペプチドである。
【００９８】
スクリーニング法およびタンパク質進化
本発明は、標的分子に対する所望の活性に関してポリペプチドをスクリーニングするための方法を提供する。本明細書中で用いられる場合、「所望の活性」という用語は、ポリペプチドの任意の潜在的に有用な活性を指し、これらに限定されるものではないが、結合、酵素修飾、フォールディング安定性および／または熱安定性を包含する。
【００９９】
「標的分子」という用語は、ポリペプチドと結合し、および／またはポリペプチドにより修飾される分子を指し、たとえば抗体、受容体、抗原、酵素などであり得る。したがって、「標的分子」は、酵素基質または結合に関して評価される分子（たとえば、リガンド、エピトープ、抗原、マルチマー化パートナー、例えばホモもしくはヘテロダイマーパートナーなど、またはそれらの任意の組み合わせ）について言及する際に使用することができる。
【０１００】
ポリペプチド活性は、単一のポリペプチドを発現する単一種の細胞の関連で、またはそれぞれが異なるポリペプチドもしくはポリペプチド変異体を発現する細胞のライブラリーの関連で、スクリーニングあるいは選択することができると理解される。したがって、本発明の方法は、インビトロタンパク質進化について用いることができる。インビトロタンパク質進化により、多数のタンパク質機能および特性を調査することが可能になり、典型的には２つの主なステップ、すなわち多様化および選択を含む。多様化は、ポリペプチドをコードする核酸の多様なライブラリーを生成する能力に依存する。選択は、所望の活性に関してライブラリーをスクリーニングし、活性を遺伝子型と結びつけることにより、たとえば、観察された活性の原因となる遺伝子型を含むライブラリーの数を特定することにより達成することができる。
【０１０１】
ＤＮＡライブラリーは、ポリペプチドをコード化するＤＮＡ挿入物（ＤＮＡフラグメント）を含む組換えベクターのコレクションである。ＤＮＡ挿入物の起源は、ゲノム、ＤＮＡ、合成または半合成であり得る。ポリペプチドは、所望の活性を有し得、たとえば関心対象のポリペプチドは、結合タンパク質、たとえば抗体、または酵素、たとえば、ポリメラーゼ、リガーゼ、制限酵素、トポイソメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、代謝性酵素、触媒酵素、または成長因子ホルモン、抗菌ペプチド、抗原、受容体、レポータータンパク質、免疫調節タンパク質、神経伝達物質、構造タンパク質、転写因子またはトランスポーターであり得る。１つの実施形態において、ポリペプチドは抗体または酵素である。したがって、本発明の方法を、所望の活性を有するポリペプチドの変異体に関してスクリーニングするために用いることができる。
【０１０２】
たとえば、結合タンパク質または酵素のＤＮＡライブラリーのクローニングおよび構築は、当該技術分野で公知の方法を用いて実施することができる。たとえば、Lutz and Patrick (2004)は、ライブラリー多様性を生成させる方法およびタンパク質工学で使用するための遺伝子組換えの方策を概説している。ディスプレイされたポリペプチド変異体のスクリーニングのために、表面ディスプレイされたライブラリーに用いられる方策を、本発明の方法に採用し、適応させることができる（Becker et al., 2004; Kenrick et al., 2007; Miller et al., 2006; Daugherty et al., 2000）。
【０１０３】
核酸のライブラリーを複数の細菌細胞に導入し、その結果、細菌細胞のそれぞれにおいてライブラリーのメンバーが発現される。発現されることに加えて、ポリペプチドを、それらの機能または特性を評価するために、透過化された細菌細胞内で保持するか、または細胞壁に付着させる。ポリペプチド、たとえば抗体などの結合タンパク質の核酸ライブラリー、または酵素の核酸ライブラリーを、種々の方法により、例えば点突然変異などの突然変異、欠失、および挿入の導入によるか、または組換え事象により、生成させることができる。変異体のライブラリーを生成させる方法は、当該技術分野で公知であり、エラープローンＰＣＲ、ＤＮＡ修復不全細菌におけるＤＮＡの合成およびＤＮＡの化学修飾を含む。組換えによりライブラリーを生成させる方法は、当該技術分野で公知であり、遺伝子シャッフリング、高組換え誘導細菌におけるＤＮＡのアセンブリ、合成核酸ライブラリアセンブリなど、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。このように、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドのライブラリーを複数の細菌細胞に導入することができ、その結果、細菌細胞のそれぞれにおいてライブラリーの１つまたはメンバーが発現される。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、ライブラリーは、ポリペプチドの２以上の変異体を含み、この場合、それぞれの変異体は、アミノ酸配列において若干の変化を有する独特のポリペプチドを含む。他の実施形態において、ライブラリーは、２以上の無関係な配列を含む。たとえば、酵素を阻害できる候補ポリペプチドを同定するために、ランダム配列または所定の配列のライブラリーを調べることができる。ライブラリーは、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも１０７またはそれ以上のメンバーを有し得る。
【０１０５】
結合タンパク質ディスプレイ
１つの実施形態において、本発明の方法を、たとえば抗体などの結合タンパク質の発生に適用することができる。したがって、１つの実施形態において、所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドは結合タンパク質であり、標的分子は、結合タンパク質が結合することができる任意の分子であり、所望の活性は、標的分子に対する結合、および／または結合の程度である。本発明の方法は、たとえば、結合タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養して、細胞においてタンパク質を産生することを含み得る。細胞を続いて透過化し、透過化された細胞を標的分子と接触させる。当該技術分野における任意の好適な方法を、ポリペプチドが標的分子と結合するかどうか、および／または標的分子と結合する程度を決定するために用いることができる。
【０１０６】
本発明の方法は、結合タンパク質ディスプレイライブラリのスクリーニングに特に適している。タンパク質の細胞外空間に対するターゲティングを絶対的に必要とするインビボ表面ディスプレイの他の方法と異なり、細胞膜はディスプレイタンパク質に対して提示された標識された標的との相互作用を防止するので、本発明の方法は、宿主細胞の細胞質において親和性タンパク質を発現でき、フォールディングすることができる。したがって、スクリーニングパラメータは、細菌の細胞質における親和性変異体タンパク質の高収率および生産的フォールディングを含み得る。
【０１０７】
さらに、細胞質タンパク質発現およびフォールディングが還元環境にある場合、本発明の方法を適用して、抗体の変異体、またはそれらの自然の形態でジスルフィド結合を有し還元環境において生産的フォールディングが可能である他のタンパク質を選択することができる。選択された変異体は、フォールディング安定性に関してドメイン内またはドメイン間ジスルフィド結合に依存しないので、更に安定であることが予想される。このアプローチは、中和または標識のいずれかのために標的の細胞内結合に使用できる抗体を開発するために応用される。
【０１０８】
本発明の方法は、したがって、当該技術分野で公知のスカフォールド、例えば１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、Ｆａｂ、および非抗体スカフォールド、例えばリポカリン、ＦＮ３、ユビキチン、γ−Ｂ−クリスタリンなどをはじめとする種々の結合タンパク質のディスプレイおよび選択のためのプラットフォームとして用いることができる。
【０１０９】
酵素ディスプレイ
本発明の方法は、酵素および酵素ライブラリーのディスプレイのため、そして酵素特性の発生のために用いることができる。したがって、１つの実施形態において、所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドは酵素であり、標的分子は酵素の基質であり、所望の活性は標的分子に対する結合および／または標的分子の酵素修飾である。当業者は、他の表面ディスプレイ技術を用いる酵素活性に関してのアッセイを開発するための方法を、本発明の方法に対するアッセイと同等に適用することができることを理解するであろう。
【０１１０】
本発明の方法はまた、透過化され、次いで水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンとして懸濁された宿主細胞において発現された酵素ライブラリーの使用によく適している。Aharoni et al. (2005)は、パラキソナーゼの改善のためにＦＡＣＳによりｗ／ｏ／ｗエマルジョン中で表面ディスプレイされた酵素ライブラリをを使用することの有用性を示した。非透過性油膜中に封入することの利点は、拡散性基質および生成物を酵素活性およびコーディング核酸配列の近くに保持できることである。しかし、Aharoni et al. (2005)により記載されているスクリーンは、酵素が宿主細胞の外部でディスプレイされることを必要とする。本発明の方法を使用して、酵素ライブラリーの細胞内発現およびフォールディングを酵素機能における改善のために用いることができた。
【０１１１】
本発明の方法において、酵素を産生するために、酵素をコード化するポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養する。細菌細胞の透過化後に、細胞を酵素の基質と接触させ、公知方法を用いて、酵素が基質を修飾するかどうか、および／または基質の酵素修飾率を測定することができる。
【０１１２】
数例において、標的分子（たとえば酵素基質）を細菌細胞と結合させることが望ましい場合がある。当業者は、標的分子を透過化された細菌細胞の任意の成分に、直接的または間接的のいずれかで結合させることができることを理解するであろう。直接結合は、非限定的例として、標的分子を細菌細胞壁と結合させることにより達成することができる。標的分子の間接的結合は、標的分子を、所望の活性に関してスクリーニングされるポリペプチドと結合している第２ポリペプチドと結合してタンパク質複合体を形成することによって達成することができる。たとえば、標的分子を、透過化された細菌細胞の内部にタンパク質複合体を保持するために十分な分子サイズを有するポリペプチドと結合させることができるか、またはＤＮＡ結合タンパク質と、もしくは本発明の方法で用いられるような細菌細胞壁結合タンパク質と結合させることができる。標的分子を細菌細胞と結合させることにより、有利には、たとえばＦＡＣＳまたは磁気ビーズ選択によるなどの技術を使用して、活性酵素を提示する細菌細胞の単離が可能になる。
【０１１３】
当業者は、標的分子を細菌細胞と結合させるために好適なカップリング化学を容易に決定することができるであろう。好適なカップリング化学としては、アクリダイトおよびマレイミドなどのチオールカップリング試薬でのシステイン標識、アミン標識、ならびにカルボキシル標識が挙げられ、これらはＰｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰｒｏｄｕｃｔｓおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎをはじめとする供給元から市販されている。
【０１１４】
フローサイトメトリー分析
本発明の細胞ディスプレイ技術は、関心対象のポリペプチドの数千もの分子を一度に提示することができ、リボソーム／ｍＲＮＡディスプレイまたはファージディスプレイなどの分子ディスプレイ技術と異なり、フローサイトメトリー技術を用いて、たとえば蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）機械を用いてスクリーニングすることができる。ライブラリーにおける陽性事象をとらえることができるだけでなく、酵素活性または親和性などのパラメーターを各陽性メンバーについて同時に定義することができ、これによりスクリーンのアウトプットを改善することができる。フローサイトメトリーを実施するための機器は当該技術分野で公知であり、ＦＡＣＳ  Ｓｔａｒ  Ｐｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎおよびＦＡＣＳｏｒｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｅｐｉｃｓ  Ｃ、ならびにＭｏＦｌｏが挙げられる。フローサイトメトリー技術は、一般的に、液体試料中の細胞の分離を含む。典型的には、ＦＡＣＳの目的は、１以上の特性、たとえば、標的分子の存在について細胞を分析することである。フローサイトメトリー分析を実施するための方法は、当該技術分野で周知である。たとえば、酵素活性を分析するためのＦＡＣＳの使用法の概説は、Farinas(2006)により記載されている。
【０１１５】
本発明に関して、フローサイトメトリーは、連続して実施できる複数回のスクリーニングに有用である。細胞を初回の分類から単離することができ、直ちにフローサイトメーターに再導入し、再度スクリーニングして、スクリーンのストリンジェンシーを改善することができる。フローサイトメトリーは本質的に粒子分類技術であるので、細胞を培養する能力は必要ではない。無生育性細胞から核酸を回収するための技術は当該技術分野で周知であり、たとえば、ＰＣＲをはじめとするテンプレート依存性増幅技術を挙げることができる。
【０１１６】
所望の活性を有するポリペプチドを生成する細菌細胞が同定された後、ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むＤＮＡを、任意の好適な既知技術を用いて細菌細胞から単離することができる。したがって、通常の手順を使用して、ポリペプチドをコード化するＤＮＡを単離し、配列決定することができる。必要に応じて、ポリヌクレオチドは、所望の活性に関してスクリーニングされる変異体の別のライブラリーを生成させるために、もう１ラウンドの多様化をおこなうことができる。このようにして、反復プロセスを使用して、ポリペプチドの所望の活性を最適化することが可能である。
【０１１７】
キット
本発明の方法の実施に必要な成分は、キットの形態で都合良く提供することができる。当業者には理解されるように、キット中の種々の成分は、個々の容器中もしくはアリコートで供給することができるか、または溶液成分を異なる組み合わせ、異なる濃度で組み合わせて、本発明の方法の最適な実施を達成することができる。使用するまで成分が安定な形態で維持されるように、キットのどの成分を組み合わせることができるかを決定することは、当業者の知識の範囲内である。
【０１１８】
本発明のキットは、典型的には、最低でも、第１ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドをベクター中に挿入するための部位、および第１ポリペプチドと結合して、透過化された細菌細胞の細胞壁の内部に保持されるかまたは細胞壁に付着したタンパク質複合体を形成する第２ポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームを含むベクターを含むであろう。好ましくは、キットはまた、細菌細胞を透過化するための薬剤も含む。１つの実施形態において、キットは、細菌細胞、好ましくはグラム陰性細菌細胞をさらに含む。他のさらなる成分がキットとともに含まれていてもよいか、または所望により他の成分を最終使用者が提供してもよい。
【実施例】
【０１１９】
実施例１  大腸菌を透過性にする界面活性剤のスクリーニング
大腸菌細胞を透過性にするであろう、界面活性剤を同定するため、イオン性（ｎ−ドデシル−β−イミノジプロピオン酸；デシルトリメチルアンモニウムクロライド；ドデカノイルサルコシンナトリウム；アンゼルゲント３−１０）、および非イオン性（ジメチルオクチルホスフィンオキシド［Ａｐｏ８］；ジメチルデシルホスフィンオキシド；ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド［８ＴＧＰ］；スクロースモノドデカノアート；メガ（Ｍｅｇａ）１０；トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０；トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ１００；トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ１１４）の両方の多くの界面活性剤を、膜−不透過性色素、ゲルレッド（Ｇｅｌ  Ｒｅｄ）（Ｂｉｏｔｉｕｍ社、カタログ番号４１００２）の取り込み、およびＧＦＰの遊離の両方によってスクリーニングした。透過処理のテストを行った界面活性剤は、Ａｎａｔｒａｃｅから購入した。
ここに述べる実験に用いた大腸菌宿主株は、全てＫ１２由来のＡｒｇｅｎｔｕｍ細胞株（ΔｍｃｒＡΔ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）ΔｅｎｄＡ  ｌａｃＺΔＭ１５）（Ａｌｃｈｅｍｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）であった。しかしながら、本発明の方法は、Ｂ株由来のＢＬ２１（Ｆ−ｄｃｍ  ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ）、およびＫ１２クローン株ＤＨ５α（Ｆ−ｅｎｄＡ１  ｇｌｎＶ４４  ｔｈｉ−１  ｒｅｃＡ１  ｒｅｌＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｄｅｏＲ  ｎｕｐＧ  Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９，ｈｓｄＲ１７（ｒＫ−ｍＫ＋），λ−）を用いてもテストを行い、同様な結果を得た。
ＧＦＰを、アラビノース誘導性の高コピー数ベクター（ｐＡｒａ１：：ＧＦＰ５）にクローン化した。発現は、新たに画線したコロニーを含むシャーレから重度に播種した培養液より行った。培養液は、３７°Ｃで、アラビノースを最終濃度０．２％になるまで添加して発現を誘導するときに、ＯＤ６００が約０．３となるまで培養した。誘導された培養液は、収穫まで２５°Ｃで２時間振盪した。
１ｍＬの誘導培養液を遠心分離して細胞を沈殿させ、３００μＬの０．５％界面活性剤含有ＬＢ中に懸濁して透過性にした後、２５°Ｃで１０分間培養した。透過性にした細胞は、沈澱させ、再懸濁し１ｘゲルレッド（Ｇｅｌ  Ｒｅｄ）を含む水に再懸濁し２分間置き、その後沈澱させ３００μＬのＴＢＳで１度洗浄した。細胞は、３００μＬのＴＢＳに懸濁し、蛍光顕微鏡検査のために、ＤＡＢＣＯ／グリセリン（０．０３２５ｇのＤＡＢＣＯを９００μＬのグリセリン＋１００μＬのＰＢＳ中に溶解）を加えて処理した。
サンプルは、スライド式カメラ（ＳＰＯＴ  ＲＴ  ２．３．０ソフトウェアｖ４．６）を用いたオリンパスＰｒｏｖｉｓ  ＡＸ７０光学顕微鏡、またはＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２共焦点レーザ走査顕微鏡／Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＲＥ２倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ共焦点ソフトウェアｖ２．０）のいずれかにより可視化した。
図１は、界面活性剤によるＧＦＰ発現大腸菌の透過処理の結果を示す。未処理細胞は緑色（ＧＦＰ）であるが、透過性にされた細胞は、内部のＧＦＰを失い、ＤＮＡ結合性ゲルレッド（Ｇｅｌ  Ｒｅｄ）色素を取り込み赤色に染色される。また、ノニデット−４０もいくらか透過性化を示すが、Ａｐｏ８とＭｅｇａ１０は、より高い割合の透過化された細胞を示す。これら２種の界面活性剤の０．５％ずつの混合物は、剤８６と呼ばれ、別の界面活性剤ｎ-オクチル−β−Ｄ-チオグルコピラノシド（８ＴＧＰ）と同様に、ほとんど完全に透過処理することを示した。Ｍｅｇａ１０、Ａｐｏ８および８ＴＧＰは、すべて非イオン性界面活性剤で、イオン性界面活性剤と比べ、タンパク質の折りたたみや機能に対して、破壊の程度が低い。
細胞壁は、透過処理によっても無傷であったので、上述した界面活性剤での透過処理による上澄みの可溶性タンパク質の抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。透過処理した細胞に、ニワトリ卵白リゾチーム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社；８３７  ０５９）を最終濃度２ｍｇ／ｍＬまで、透過処理している細胞のサンプルに加え、細胞壁を除去し、全細胞タンパク質を遊離させた。β−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング色素を、９５°Ｃで２分間変性したサンプルに加えた。２０μＬのサンプルを９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、クーマシー・ブリリアント・ブルー／メタノール／酢酸で染色／固定した。
図２は、可溶性タンパク質の遊離は、顕微鏡検査で見られたＧＦＰの遊離およびＧｅｌ  Ｒｅｄの取り込みと直接的に関連していることを示す。無傷な細胞壁を有する細胞からのタンパク質の遊離と、リゾチームを用いて細胞壁を除去した細胞からのそれとの間には、明白に差があったが、細胞壁に被包された細胞が遊離する可溶性タンパク質は、大きさが約１２０ｋＤまでであった。これは、球状タンパク質が、グラム陰性真正細菌の細胞壁を構成するペプチドグリカン格子の細孔を通って、細胞から出ることができなくなる限界寸法であると思われる。
【０１２０】
実施例２．  宿主ＤＮＡを保持する透過処理溶液のスクリーニング
本発明の方法を、改良された特性のタンパク質変異体を求めて遺伝子ライブラリーをスクリーニングするのに使用するなら、発現されるタンパク質と、それをコードする核酸との間に関連がなければならない。膜の透過処理工程で、ＤＮＡが、細胞壁を通って失われるのを防ぐ障壁が除去されるので、宿主ＤＮＡの損失を減少し、あるいは防止しうる、透過処理の条件を調べた。
細胞の透過処理を、０．５％８ＴＧＰを用い異なる培地中で行い、ＤＮＡの損失を、ＤＮＡ結合色素、Ｇｅｌ  Ｒｅｄを用い、蛍光顕微鏡検査法により調べた。
【０１２１】
テストした透過処理培地（全培地に０．５％８ＴＧＰを含む）の組成
ＬＢ培地（１０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）
ＬＢ（塩）培地（１０ｇトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物）
５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５
５０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０
１７０ｍＭ−ＮａＣｌ
２５０ｍＭ−ＮａＣｌ
２５ｍＭ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５＋１．５％ＰＥＧ６０００（ｗ／ｖ）
５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５＋３％ＰＥＧ６０００（ｗ／ｖ）
５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５＋１７０ｍＭ−ＮａＣｌ
５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５＋２５０ｍＭ−ＮａＣｌ
好適な透過処理培地は、ＬＢ細菌培地と確認された。したがって、以降、透過処理は、０．５％８ＴＧＰを含むＬＢまたは剤８６を含むＬＢ（０．５％Ｍｅｇａ１０および０．５％Ａｐｏ８を含むＬＢ）のいずれかを用いて行った。
【０１２２】
実施例３．  タンパク質のテトラマー骨格への融合
例１に記述した実験で見られたとおり、大きさが約１２０ｋＤより大きいタンパク質は、細胞壁により、透過性にした大腸菌細胞の内部に保持された。したがって、１２０ｋＤより小さい目的タンパク質も、タンパク質パ−トナーと融合することで合計寸法が１２０ｋＤを超えるようにできれば、細胞壁カプセル中に保持されるだろうと考えられた。
このため、融合パートナーとして用いるため、大腸菌から６種の異なる四量体タンパク質をクローン化した。すなわち、β−ｇａｌ、ＢｅｔＢ、Ｇ５Ｋ、ＧｓｈＢ、ＲｈｎＡ、およびＹｄｃＷで、それぞれのモノマー寸法は１１６ｋＤ、５２ｋＤ、３９ｋＤ、３５ｋＤ、４７ｋＤおよび５０ｋＤであった。
アラビノース誘導性高コピー数ベクターを、四量体発現のために構築した。蛍光性基質と共有結合で結合する２０ｋＤ領域であるＳＮＡＰタグ（ＮＥＢ社／Ｃｏｖａｌｙｓ）が、テトラマー遺伝子の上流にクローン化され、発現レポーターとして使用された。精製と検知を容易にするため、６ｘＨｉｓエピトープも、融合タンパク質のＮ末端に挿入された。
前記アラビノースベクターｐＡｒａ３：：Ｈｉｓ６：：ＳＮＡＰの配列が、SEQ ID NO:1（配列番号）として示される。
融合タンパク質の発現は、０．２％アラビノースを加えて誘導し、培養液を２５°Ｃで２時間培養した。
本発明の方法により、蛋白質ディスプレイのために細胞を透過性にするプロトコルは、以下のとおりであった：
１．  遠心分離により細胞１ｍＬを沈澱させる。
２．  ３００μＬの０．５％８ＴＧＰ／ＬＢに細胞を再懸濁する。
３．  ２５°Ｃで１０分間培養する。
４．  遠心分離により細胞を沈澱させる。
５．  ２００μＬのＴＢＳまたはＬＢに細胞を再懸濁する。
【０１２３】
ＳＮＡＰ発現レポーター領域を、膜不透過性ＳＮＡＰ色素（Ｃｏｖａｌｙｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で標識付けするプロトコルは、以下のとおりであった：
１．  ２０ｎｍｏｌのＢＧ−４８８（緑色色素）またはＢＧ−５４７（赤色色素）を、３００μＬのＤＭＳＯに２００ｘ原液として溶解する。
２．  １μＬの２００ｘ原液を２００μＬの透過性にした細胞を懸濁したＴＢＳまたはＬＢに加える。
３．  ２５°Ｃで１５分間培養する。
４．  遠心分離により沈澱させ、また３００μＬのＴＢＳに再懸濁させて、細胞を２度洗浄する。
【０１２４】
四量体融合タンパク質が、透過性にした細胞カプセル中に保持されるのを蛍光顕微鏡検査法により観察するためのプロトコルは、以下のとおりであった：
１．  ２０μＬの細胞懸濁液を顕微鏡用スライドガラス上に滴下し、カバーガラスで覆い、端部をマニキュア液でシールする（湿式プレパラート）；あるいは細胞の液滴をほぼ乾燥させて、その上に２０μＬのＤＡＢＣＯ／グリセリンを滴下し、カバーガラスで覆い、端部をマニキュア液でシールする（乾式プレパラート）。
２．  オリンパスまたはＬｅｉｃａ蛍光顕微鏡のいずれかを用いて可視化する。
【０１２５】
完全長融合タンパク質の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに掛けてから、タンパク質抽出物のウェスタンブロット法でα−Ｈｉｓ６抗体をプローブに用い確認した。全ての四量体コンストラクトは、大腸菌中で検知可能なレベルで発現した（図３Ａ）。
大腸菌内で発現した四量体融合タンパク質の蛍光顕微鏡検査によれば、β−ｇａｌおよびＧ５Ｋは、顕著な封入体を含み、恐らく前記融合タンパク質の折りたたみが困難であるために、蛍光レベルが低いことが分かった。しかしながら、図４によれば、ＳＮＡＰ蛍光により判定されるとおり、前記融合タンパク質の発現は、ＧｓｈＢでは良好、ＲｈｎＡ、ＢｅｔＢおよびＹｄｃＷでは、極めて良好であった。透過性にした宿主細胞中の融合タンパク質の分布は、明視野顕微鏡検査および蛍光の両方から明らかなように複数のフォーカスを有し、均一でないことが注目された。しかし、蛍光性ＳＮＡＰ基質は、ミスフォールドされた領域には結合されていないであろうから、かつ信号が非常に強いことから、これらの物体は恐らく折り畳まれたタンパク質の凝集体であって、大腸菌中で過剰発現しているタンパク質においてしばしばみられる、折り畳まれていないタンパク質の封入体ではないと考えられる。
ＳＮＡＰ：：テトラマー融合体は、Ｈｉｓ６-Ｎ末端エピトープをまた有していた。抗体といった大きな分子が、大腸菌細胞壁の格子構造を通り抜けられるかを調べるため、透過性にした細胞にＳＮＡＰ：：テトラマー融合体を検出するαＨｉｓ抗体をプローブとして設けた。
１．  前記Ｈｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：ＢｅｔＢ骨格融合体の発現および透過処理を上述のように実施した。
２．  ＢＧ−５４７  ＳＮＡＰリガンドによる標識化を上述のように実施した。
３．  ２００μＬの透過性にしたＳＮＡＰ−標識化細胞をＬＢ中で３回洗浄し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）コートしたカバーガラス上に沈降させた。過剰な細胞培地を、吸引して除去し、前記スライドガラスを風乾させた。
４．  細胞を、ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、１％冷水魚ゼラチン（Ｓｉｇｍａ社、Ｇ７７６５）、アジドの０．０２％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液）中で、１時間ブロックした。
５．  細胞を、ブロッキング緩衝液で１：１０に希釈したαＨｉｓ一次抗体（Ａｂｃａｍ社、ＡＢ９１３６−１００）中で、一晩２５°Ｃで培養した。
６．  細胞を３回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中で洗浄した（各回１０分間）。
７．  細胞を、ブロッキング緩衝液で１：２，０００に希釈した二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ａ１１０１５）中、室温１時間培養した。
８．  細胞を３回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中で洗浄した。
９．  ＤＡＢＣＯ／グリセリンを封入剤に用い、共焦点オリンパス顕微鏡で観察した。
【０１２６】
図５は、αＨｉｓ抗体が細胞壁カプセルの内部でＳＮＡＰ蛍光性リガンドと共存しており、細胞壁の細孔が、比較的大きなタンパク質が、カプセル内部空間中に拡散を許すのに十分な大きさであることを表わしている。このように、非常に大きなタンパク質リガンドも、本発明の方法により、細胞質中で発現する親和性タンパク質のための親和性基質として使用できる。
細胞下物体の生成が変化するか否かを見るためにＳＮＡＰ融合パートナーおよび発現レポーターをＨＡＬＯタンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ社）と比較した。前記ＨＡＬＯタンパク質は、ＳＮＡＰと同様に膜不透過性蛍光性基質（Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８；Ｇ１００１、Ｐｒｏｍｅｇａ社）と共有結合で結合する。ＨＡＬＯレポーター遺伝子は、四量体発現コンストラクト中のＳＮＡＰ遺伝子の位置にインフレームに直接クローン化した。ＨＡＬＯ：：四量体骨格タンパク質の発現を、ＳＮＡＰ変異体と比較した。透過性にしたＨＡＬＯ細胞の標識付けは、実質的にＳＮＡＰに対して記述したように、またメーカーの説明書に従い実施した。図６は、ＨＡＬＯ：：テトラマーおよびＳＮＡＰ：：テトラマーの発現パターンは、同様であったが、例外的にＨＡＬＯ：：ＲｈｎＡ融合タンパク質は、部分的にＳＮＡＰ：：ＲｈｎＡ融合体より溶解性で、複数の蛍光フォーカスを有する細胞がより少数であったことを示す。
したがって、タンパク質を四量体骨格（ここでは、ＳＮＡＰまたはＨＡＬＯ）への融合体として発現させ、つづいて大腸菌宿主細胞を適当な界面活性剤で透過性にすると、目的のタンパク質が、細胞壁の内側に保持できる。
【０１２７】
実施例４．  細胞骨格としてのＤＮＡ結合タンパク質
表現型を遺伝子型に結合するには、宿主細胞は、透過処理の後、また機能スクリーニングを通して、少なくともいくらかのエピソームＤＮＡを保持しなければならない。宿主ゲノムのＤＮＡならびにプラスミドＤＮＡを保持する透過処理条件を見出したことで、発現した目的のタンパク質の保持骨格としてＤＮＡが使用できると結論付けた。
このため、小型（８０ａａ）の高親和性らせん−ヘアピン−らせんＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）を、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  ＣｏｍＥ遺伝子（ＣｈｅｎおよびＧｏｔｓｃｈｌｉｃｈ、２００１）からクローン化し、これをアラビノース誘導性コンストラクト（ｐＡｒａ３：：ＧＦＰ：：ＤＢＰ；ｓｅｑ２）中で、ＧＦＰのＣ末端に融合した。
アラビノース誘導による発現を例１に記述したように実施した。細胞を透過性にし、例１および３に記述したように蛍光顕微鏡検査のために調製した。
図７は、ＧＦＰ：：ＤＢＰ融合体（緑色）が透過性にした細胞中に保持され、ＤＮＡ結合色素、Ｇｅｌ  Ｒｅｄ（赤色）と共存したことを示す。
したがって、タンパク質を、高親和性、非特異的ＤＮＡ結合タンパク質への融合体として発現させ、つづいて大腸菌宿主細胞を適当な界面活性剤で透過性にすると、目的のタンパク質が、細胞カプセルの内側に保持できる。
【０１２８】
実施例５．  透過性にした細胞中へのＤＮＡ保持
ＤＮＡ、ゲノムおよびエピソーム両方のプラスミドの、透過性にした細胞カプセル中への保持を実証するため、蛍光顕微鏡検査およびプラスミドＤＮＡ抽出のためにＧＦＰ５：：ＤＢＰおよびＨｉｓ６：：ｅＧＦＰを発現する細胞を調製した。
誘導後、細胞を透過性にし、つづいて凍結するか、ＴＢＳ中で３７°Ｃにおいて一晩振盪した。次の日、全サンプルを、蛍光顕微鏡検査でＧＦＰ、およびＤＮＡ結合色素Ｇｅｌ  ＲｅｄでカプセルＤＮＡ含量を見るために、または、プラスミドＤＮＡ調製のために処理した。
蛍光顕微鏡検査を例３に対して記述したように実施した。図８は、宿主細胞ＤＮＡ（赤色）およびＧＦＰ５：：ＤＢＰ（緑色）双方とも、細胞カプセル中に、透過処理直後も、一晩３７°Ｃで培養しても目立った減少もなく、保持されたことを示す。Ｈｉｓ６：：ＧＦＰ  タンパク質は、透過処理直後に失われたが、宿主細胞ＤＮＡ（赤色）は、透過処理直後も、一晩後も、同じく目立った減少もなく、保持された。
宿主ゲノムだけでなくプラスミドＤＮＡも透過性にした細胞内に保持されることを確認するため、同じように調製されたサンプルに対してプラスミド少量調製を行った。
１ｍＬの界面活性剤処理または無処理細胞から、プラスミド少量調製アルカリ溶解プロトコルによりプラスミドＤＮＡを調製した。界面活性剤抽出による上澄み中に遊離されたプラスミドＤＮＡを、Ｐｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐ  Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎｕｐ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、９５５１５２０５１）コレムおよび溶液を、メーカーのプロトコルに従って用いて、抽出した。
各サンプルの全量を１％アガロースゲルにロードし、富士フィルム社ＬＡＳ−３０００インテリジェントダークボックス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｄａｒｋｂｏｘ）でイメージリーダー（Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ）ＬＡＳ−３０００ソフトウェアおよびＭｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ  ｖ３．０ソフトウェアを使用して画像化した。
図９は、両細胞株からのプラスミドＤＮＡをサンプルとした、ＴＡＥ緩衝液を用いた臭化エチジウム染色１％アガロースゲルを示す。
図９のレーン１は、無処理細胞中の全プラスミドＤＮＡである。レーン２は、透過処理工程の上澄み、レーン３は、透過処理後に細胞カプセル中に保持されたプラスミドである。図８で観察された可溶性Ｈｉｓ６：：ＧＦＰ  タンパク質の完全な消失に拘わらず、透過処理による上澄み中へのプラスミド遊離が殆どないことが観測された。したがって、プラスミドＤＮＡは、ほとんど完全に細胞壁により保持され、本発明の方法において改良されたタンパク質変異体の選別のために、遺伝子型を表現型に結合するために使用できる。
顕微鏡検査のデータを確認するように、ＴＢＳに懸濁した透過性にした細胞の３７°Ｃでの一晩の培養後も、この培養でのプラスミドＤＮＡの消失は全く見られなかった（レーン５）。
【０１２９】
実施例６．  ペプチドグリカン結合骨格
膜透過処理後も保持されるいま一つの細胞構造は、ペプチドグリカン（ＰＧ）の格子状ポリマーでなる細胞壁である。
ＰＧを非共有結合で結合するために、大腸菌内で良好に発現し、細胞壁に高親和性（Ｋ＝３ｘ１０７Ｍ−１）をもって結合することが既に知られている（Ｂｒｉｅｒｓら、２００９）、シュードモナスφＫＺファージ（ＫｚＰＧ）からの７０ａａＰＧ結合領域をクローン化した。親和性タンパク質の選別用に、ＰＧに対するＫｚＰＧ−結合領域の親和性より、より高い親和性を標的に対して有する変異体を見つけるため、骨格結合タンパク質の親和性を増す必要がある。骨格結合部分の親和性を増すため、ＣｏｍＥ  ＤＮＡ結合領域（ＤＢＤ）およびＰＧ結合領域の両方を同一の融合タンパク質内で結合した。したがって、両骨格（ＰＧまたはＤＮＡ）からの融合タンパク質の最終解離定数は、それぞれの速度定数の倍数の近似値となる。
このため、発現ベクターｐＡｒａ３：：Ｈｉｓ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ（SEQ ID NO:2（配列番号））を構築した。例１に記述したように発現を誘導し、細胞を例３に記述したように蛍光顕微鏡検査のために調製した。融合タンパク質の発現および分布は、例３に記述したようにＳＮＡＰ標識化により観察した。
蛍光は、細胞の辺縁で、細胞壁の領域において認められ、より軽度には、カプセルの細胞壁で囲まれる空間内の広汎な領域において認められた。
本発明のさらなる態様では、目的のタンパク質を共有結合で、透過処理前の細胞骨格に付着させる。これを実現するため、周辺質内にコイルドコイル三量体を形成する、大腸菌に豊富なタンパク質ＬＰＰへのタンパク質融合体を用いた。その天然型においては、１端が脂質化により外膜と連結し、他端はＣ末端リジンにより共有結合で細胞壁に結合している。
ＯｍｐＦ周辺質標的シグナル配列をＳＮＡＰ発現レポーターに融合し、さらにＮ末端シグナル配列を欠く５７ａａ大腸菌ＬＰＰ配列、外膜付着に必要なシステインが続く発現コンストラクトを構築した。発現ベクター、ｐＡｒａ３：：ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ（SEQ ID NO:3（配列番号））は、例１に記述されるようにアラビノースで誘導され、細胞を蛍光顕微鏡検査のため、例３に記述されるように、調製した。融合タンパク質の発現および分布は、例３に記述したようにＳＮＡＰ標識化により観察した。
図１０が示すように、ＬＰＰ融合タンパク質の分布は、細胞壁の表面にわたって不均一で、強い蛍光の場所と、蛍光のない場所があった。しかし、ほとんどのケースで細胞の極が、標識化された。
【０１３０】
実施例７．  四量体タンパク質骨格を用いたαＧＦＰ親和性タンパク質のディスプレイ
親和性タンパク質に適用する本発明の方法を実証するため、ｅＧＦＰに対して免疫したラマから生成した単一領域抗体を細胞骨格ベクター中にクローン化した。ここに、αＧＦＰ抗体に対する特許出願に（ＷＯ２００７／０６８３１３）挙げられている２配列の内、Ｒ３５変異体のみが機能することを指摘したい（αＧＦＰ−Ｒ３５；タンパク質データベースＩＤ  ３Ｋ１Ｋ）。したがって、この配列を全実験において使用した。
前記αＧＦＰ−Ｒ３５遺伝子を、ｐＡｒａ３：：ＨＡＬＯ：：ＦＬＡＧ：：ＲｈｎＡ四量体骨格のＮ末端融合体として、ｐＡｒａ３：：αＧＦＰ（Ｒ３５）：：ＨＡＬＯ：：ＦＬＡＧ：：ＲｈｎＡベクター（SEQ ID NO:4（配列番号））を製作するためクローン化した。
前記抗体の標的基質としてＨｉｓ６：：ｅＧＦＰ融合タンパク質を製造するため、ｐＡｒａ３：：Ｈｉｓ６：：ｅＧＦＰベクターも、構築した。例１に記述されるように、Ｈｉｓ６：：ｅＧＦＰタンパク質を誘導した。可溶性タンパク質が、０．５％８ＴＧＰを用いて細胞から遊離され、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ社；３０２３０）を用いてＩＭＡＣにより精製された。Ｈｉｓ６：：ｅＧＦＰは、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂からＮＴＴＷ緩衝液＋イミダゾール（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋２００ｍＭイミダゾール）に溶出された。
抗体::四量体融合タンパク質の発現および宿主細胞の透過処理は、例１および３に記述されるように実施した。
透過性にした細胞カプセル内で、αＧＦＰをｅＧＦＰに結合するため、カプセル沈殿物を３００μＬのｅＧＦＰ中に懸濁し、２５°Ｃで２０分間平衡化させてから、カプセルを遠心分離で沈澱させ、３００μＬのＴＢＳ中で１度洗浄した後、ＴＢＳ中に再懸濁させた。αＧＦＰ／ｅＧＦＰカプセルに対する蛍光顕微鏡検査を、例３に記述されるように、実施した。
図１１は、ＨＡＬＯリガンド標識化した図５で観察されるフォーカスと関係があるかもしれない、より強く染色された複数のフォーカスが生じているが、透過性にしたαＧＦＰ：：ＨＡＬＯ：：ＲｈｎＡ融合タンパク質を発現しているカプセルが、細胞の全域でｅＧＦＰに結合したのを示している。
したがって、ラマαＧＦＰ抗体の機能は細胞質内で発現し、さらに界面活性剤透過処理後も、カプセル内に保持される。
例３で記述され、また図５で観察されたαＨｉｓ抗体の標識化は、すでに約１５０ｋＤと大きめなタンパク質が、透過性にした細胞壁を拡散して通り、カプセルの内部に入ることができることを実証した。しかし、未変性の抗体は、柔軟なヒンジ領域で分けられた、３つのほぼ同じ大きさの領域を有する変則的な形状のタンパク質である。したがって、これらのタンパク質の示す有効半径は、はるかに小さな球状タンパク質に相応すると思われる。しかし、βバレル構造と約２７ｋＤの分子の大きさを有するＧＦＰは、半径がその大きさに比例する、対称性のタンパク質であり、内部のαＧＦＰ抗体と結合するために、透過性にしたカプセルの細胞壁を通過することができた。
したがって、本発明の方法は、大腸菌細胞質中で親和性タンパク質を発現して、少なくとも３０ｋＤの対称性の標的に結合する親和性ライブラリーのディスプレイに使用できる。
【０１３１】
実施例８．  ＰＧ−およびＤＮＡ結合タンパク質骨格を用いるαＧＦＰ親和性タンパク質のディスプレイ
本発明の方法は、ＰＧ−およびＤＮＡ結合領域と融合したαＧＦＰラクダ抗体を用いてさらに実証された。
抗体：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質の発現、宿主細胞の透過処理、およびＨｉｓ６：：ｅＧＦＰによる標識付けは、例６に記述されるように実施した。
αＧＦＰ融合タンパク質によるｅＧＦＰの結合の画像化には、湿式および乾式プレパラートの両方が用いられた。図１２は、ＧＦＰ蛍光において、両方の画像化法で有意な差があったことを示している。乾式プレーパラート（ＤＡＢＣＯ／グリセリン）にされた細胞は、ほとんどが内部蛍光で、明視野とｅＧＦＰ標識の間の混合があり、細胞壁の周囲の領域は内部空間より光が強くない（図１２Ｂ）。しかしながら、ＴＢＳ中で直接プレパラートにされた細胞は、細胞壁に結合したｅＧＦＰと思われる強い蛍光の外部境界のはっきりした形状と、より弱い内部信号を有していた（図１２Ａ）。理論に縛られることなく、推測するならば、ＤＡＢＣＯ／グリセリン溶媒環境は、粘度が高くまた水性でないので、ＫｚＰＧ領域とペプチドグリカン細胞壁の間の相互作用を抑止したが、αＧＦＰのｅＧＦＰとの、あるいはＤＢＰのＤＮＡとの結合は抑止しなかった。
しかしながら、親和性タンパク質または酵素のスクリーニング操作は、通常は水系環境で行われるので、親和性融合タンパク質の分布は、図１２Ａに観測された細胞壁結合湿式プレパラートに近いであろう。
【０１３２】
実施例９．  細胞壁への共有結合性付着によるαＧＦＰ親和性タンパク質のディスプレイ
本発明の方法は、αＧＦＰ抗体の共有結合による細胞壁への結合によりさらに実証された。
αＧＦＰ抗体は、アラビノース誘導性融合体として、ＯｍｐＦシグナル配列の下流、かつＳＮＡＰおよびＬＰＰ配列の上流にクローン化された。
アラビノースで発現を誘導した後、ＯｍｐＦシグナル配列は、新生タンパク質を、内部細胞膜を通して周辺質に送り、これが膜細孔を通るときに分裂される。
周辺質において、ＬＰＰ領域は、２つの別のパートナー、野生型ＬＰＰまたは他のαＧＦＰ融合タンパク質とともに、三量体コイルドコイルを形成すると思われる。ＬＰＰ領域のＣ末端の残基はリジンで、共有結合により、εアミン基を介して、恐らくはＹｂｉＳ  Ｌ，Ｄ−トランスペプチダーゼにより（Ｍａｇｎｅｔら、２００７）、大腸菌細胞壁に結合する。
ＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合タンパク質の発現、細胞透過処理、およびｅＧＦＰ標識付けは、例８に記述のように実施した。
図１３は、ｅＧＦＰは、細胞壁の周りに不均一に、しかし強力に結合したことを示す（図１３Ｂ）。ｅＧＦＰは、ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合体をαＧＦＰ領域無しに発現している細胞に結合されなかった（図１３Ａ）。
ＯｍｐＦ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ融合体の細胞壁への共有結合性付着は、最初に、前記融合タンパク質を発現している透過性にした細胞をＳＮＡＰリガンドで標識化し、その後標識化細胞カプセルのサンプルを９５°Ｃで５分間加熱して実証した。図１４は、細胞壁を標識化するＳＮＡＰリガンドからの蛍光は、加熱処理されたサンプルと、加熱されていないコントロールとの間で差が生じなかったことを示す。Ｇｅｌ  Ｒｅｄ染色でも、加熱処理されたサンプルにおいても、ゲノムＤＮＡは、細胞中に保持され続けることを実証した。
【０１３３】
実施例１０．  外膜透過処理実験
本発明のさらなる態様においては、外膜は、リガンド標的、例えば酵素基質、あるいはポリペプチド等に対して選択的に透過性にしてもよいが、このとき、スクリーンされた前記ポリペプチドは、細胞壁の内部に、あるいはこれに付着して保持される。
外膜を選択的に透過性にする条件を見出すため、一連の界面活性剤および緩衝液を選別した。大型リガンド（ｅＧＦＰ）および小型リガンド（Ｇｅｌ  Ｒｅｄ）の両方を用いて、外／内膜の透過処理で大きな、または小さな膜細孔が生成したかを調べた。
アラビノース誘導性ＯｍｐＦ：：αＧＦＰ：：ＳＮＡＰ：：ＬＰＰ（細胞壁に付着）またはαＧＦＰ：：ＨＡＬＯ：：ＦＬＡＧ：：ＲｈｎＡ（細胞質内性）を発現する大腸菌株を培養し、例１に記述されるように誘導した。
誘導された培養液１ｍＬを、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）で１回洗浄し、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）または２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋２ｍＭ  Ｃａ２＋（ｐＨ８）のいずれかの中に０．２〜０．４％の界面活性剤をいれた透過処理緩衝液変種中に懸濁し、２５℃で１０分間培養した。
透過性にした細胞は、適当な緩衝液で１回洗浄してから、Ｇｅｌ  Ｒｅｄ（１ｘ水中）で染色し、ＴＢＳで洗浄した。これを、精製したＨｉｓ６：：ｅＧＦＰとともに２５℃で１時間培養し、遠心分離で沈殿させ、ＴＢＳ中に再懸濁させ、湿式プレパラートとして蛍光顕微鏡検査法により観察した。
図１５及び１６は、Ｔｒｉｓ／Ｃａ２＋またはＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中の０．２％のＡｐｏ８（Ａ）またはＴｗｅｅｎ２０（Ｂ）が、外膜を選択的に透過性にし、大きなリガンド（ｅＧＦＰ）に、外膜を通させるが、内膜は通させないことを実証している。より小さな、膜不透過性のＤＮＡ結合リガンドＧｅｌ  Ｒｅｄは、大部分のサンプルで、細胞質まで部分的に透過性であって、いくつかの細胞において内膜にある程度の細孔形成が起きたことを示している。しかしながら、０．５％の８ＴＧＰまたは剤８６である界面活性剤で処理され、外膜、内膜ともにｅＧＦＰに対して完全に透過性であるサンプルに比べて、Ｇｅｌ  Ｒｅｄ結合の程度は著しく減少した。
【０１３４】
実施例１１．  蛍光選別および被包性ディスプレイの解析
細胞ディスプレイプラットフォームとして、リガンド結合クローンを識別するのに、本発明の方法は、蛍光標示式細胞選別（ＦＡＣＳ）に非常に向いている。透過性にした大腸菌細胞のＦＡＣＳによる選別での安定性を試験するため、３集団：ｉ）ｅＧＦＰ、ｉｉ）αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ、およびｉｉｉ）Ｈｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：ＢｅｔＢを誘導して発現させた。
ｅＧＦＰ発現細胞は、透過性にせず、無傷の大腸菌細胞での蛍光のポジティブコントロールとした。αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ発現細胞は、本発明の方法により透過性にし、ＳＮＡＰ  ＢＧ−４８８リガンド（緑色）で標識付けした。Ｈｉｓ６：：ＳＮＡＰ：：ＢｅｔＢ発現細胞は、本発明の方法により透過性にし、ＳＮＡＰ  ＢＧ−５４７リガンド（赤色）で標識付けした。
細胞はＰＢＳ中に懸濁し、混合集団の選別のために、ほぼ同数を混合し、あるいは信号の較正のため、別々に選別した。細胞選別は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ  Ｉｎｆｌｕｘ  ＦＡＣＳにより実施した。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより実施した。大腸菌選別のためのパラメーターは、操作者が決定した。
図１７は、蛍光により３集団が識別できたことを示している。選別された集団の再分析は、前記選別がそれぞれの比較的純粋な集団をもたらすことを示した。グラフの低蛍光領域にある信号は、信号の内部雑音であることが後で判明したので、後に操作者により装置の修正により除去した。
【０１３５】
実施例１２．  固体サポート結合のためのスペーサー領域選定
αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現している細胞を、８ＴＧＰ培地を用いて透過性にし、中間体Ｈｉｓ６−タグ化ｅＧＦＰを経由してＨｉｓＰｕｒ  Ｃｏ２＋セファロース・ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に結合した。細胞またはビーズは、最初に過剰のＨｉｓ６−ｅＧＦＰとともに培養し、ＴＢＳ中で洗浄し、一緒に２５℃で３０分間培養した。結合しなかった細胞は、ビーズから洗い流し、つぎに蛍光顕微鏡検査法でビーズの結合の程度を評価した。
最初は、αＧＦＰ：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質のセファロース・ビーズへの結合は検知されなかった。αＧＦＰ結合領域が、細胞壁に近すぎて、セファロース樹脂上のコバルト錯化ｅＧＦＰに到達できないためと理論を立てた。このため、ランダムコドンによる１２残基ペプチド・スペーサー領域を、αＧＦＰ結合領域およびｋｚＰＧペプチドグリカン結合領域の間にクローン化した（GGT ACC gcy gcy gkk wtb gck wtb gkk gkk gck gkk gcy gcy GGT CTG（SEQ ID NO:5（配列番号）））。
スペーサー変異体の小型ライブラリー（約２，０００要素）を発現し、上述のようにＣｏ２＋セファロースに結合した。前記ライブラリーの一部は、ビーズに結合することが観測された。これらのクローンはＰＣＲで増幅し、再クローン化し、十余のクローンの個別の結合性を試験し、配列を調べた。種々のペプチド・スペーサーが、タンパク分解に耐性があり（αＧＦＰを高度に融合タンパク質中に保持する）、また、図１８に示されているように、界面活性剤処理細胞をセファロース・ビーズに結合できることが判明した。サポート結合に機能することが判明したスペーサー配列を表１に挙げる。
【表１】
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スペーサー配列の一つＲＬ６を選んで、後の結合の検討に用いた。固体サポート・マトリックスへの強い結合に寄与する他の要素を調べた。細胞のマトリックスとの培養時間、および結合溶液の塩（ＮａＣｌ）の濃度は、両方とも結合に対してポジティブな効果を有することが分かった。培養時間３０分と、ＮａＣｌ濃度の範囲約２００ｍＭ〜５００ｍＭが、効果的であることが判明したが、３００ｍＭが最適と考えられる。結合は、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、ＭＯＰＳの３００ｍＭの塩含有緩衝溶液を含む一連の緩衝液中で効率的である。
αＧＦＰ：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰ融合タンパク質を発現している細胞を、ビオチン化ｅＧＦＰを介してストレプトアビジン磁性ナノ粒子（ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）に結合する条件は、図１９に明示されるセファロース・ビーズ結合に対して求められた範囲内にあることも判明した。
１２残基スペーサーに加えて、タンパク質領域をも、スペーサー領域として用いることが考えられた。ヒトのタイチン遺伝子（Ｉ２７）からの小型で安定な高度に発現した２７番目のイムノグロブリン領域をＲＬ６スペーサーの上流にクローン化した。この領域も、Ｎ末端のαＧＦＰ領域の高度かつ安定的な発現と、同時に非常に良好な固定マトリックス結合をも可能にすることが分かった（図１９）。
【０１３６】
実施例１３．  被包性ディスプレイ用のマウスｓｃＦｖライブラリーの構築
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）ライブラリーの細胞内ディスプレイ用の最後の領域構造は、ｓｃＦｖ：：Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＫｚＰＧ：：ＳＮＡＰ：：ＤＢＰであった。ｓｃＦｖ領域を除いた、融合タンパク質のタンパク質およびＤＮＡの配列は、SEQ ID NO:13（配列番号）およびSEQ ID NO:14（配列番号）に与えられている。このタンパク質融合体は、Ｎ末端にｓｃＦｖ、つづいて２つのスペーサー領域であるＩ２７およびＲＬ６、つぎにペプチドグリカン結合領域のＫｚＰＧ、ＳＮＡＰレポーター領域、最後にＤＮＡ結合領域（ＤＢＰ）を有する。
ランダムプライマーを用いたｃＤＮＡを、酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、マウス脾臓全ＲＮＡから製造した。このｃＤＮＡから、シェーファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）ら（２０１０）が記述したように、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、およびマウス抗体ファミリー配列用変性オリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、ｓｃＦｖ軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）可変領域を増幅した。ライブラリー・クローン化に用いたオリゴヌクレオチド・プライマーは、Ｓｃｈａｅｆｅｒらの記述したものと、Ｂｓｍ  ＢＩを介して我々のライブラリー骨格ベクター（SEQ ID NO:15（配列番号））内にクローン化するのに適当な末端を有する点で相違している。ＶＬおよびＶＨ領域は、オーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて加えられる。最終的ｓｃＦｖバンドは、合計６０回のＰＣＲ増幅サイクル（１回目３０回、２回目３０回）にかけられた。
ライブラリー・クローン化のために、ディスプレイ・コンストラクト９００ｎｇを、ＢｓｍＢＩで切断し、メーカーの説明書にしたがいＳｕｒｅｃｌｅａｎ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社）を用い沈澱させ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用い、同様に処理されたｓｃＦｖ生成物４００ｎｇに連結した。リガーゼを６５°Ｃ、１０分間の培養で失活させ、連結体をＥ．  Ｃｏｌｉ  Ａｒｇｅｎｔｕｍ株（Ａｌｃｈｅｍｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中に電気穿孔で入れた。電気穿孔された細胞は、ＳＯＣ培地中に回収し、３７°Ｃで１時間培養し、プール後、７５μｇ／ｍＬアンピシリンを含む２０ｘ１５０ｍｍＬＢ寒天シャーレに拡げた。このシャーレを一晩３０°Ｃで培養した。ライブラリーの大きさは４×１０５独立クローン程度と推定された。２０クローンの内、２０クローンに予想された大きさの挿入断片が含まれていることが判明した。
【０１３７】
実施例１４．  被包性ディスプレイ・マウスｓｃＦｖライブラリーのスクリーニング
ファージディスプレイ・ライブラリーから単離される一本鎖抗体は、多くの場合大腸菌中での発現が困難で、周辺質での発現レベルが低く、あるいはβシートとＩｇ群の間にジスルフィド結合形成を欠くために、細胞質中で完全に不溶性である。大腸菌細胞質中で可溶性のマウスｓｃＦｖ骨格を選別するのに被包性ディスプレイを用いることができるか否かを決定するには、ｓｃＦｖの溶解性が融合タンパク質の性質と相関しているか否かを決定する必要があった。
有用な可溶性ｓｃＦｖは、凝集のレベルが低く、発現レベルが少なくとも中程度であることが予想された。これは、透過性にした細胞中のＫｚＰＧ領域を、細胞壁に結合させる（したがって、細胞中の封入体に局在しない）、かつＳＮＡＰレポーター領域の少なくとも中程度の発現を示すクローンとして、視覚的に判断できた。
これらのパラメーターを選別するため、単一のコロニーを採取し、すでに例１に記述したようにアラビノースを用いて融合タンパク質の発現を誘導した。透過処理後、これらをＳＮＡＰリガンドで標識付けし蛍光顕微鏡検査法をもちいて観察した。前記ライブラリー・クローンを、発現、および、図２０に例が示されるような、ＳＮＡＰレポーターの細胞での分布に基づき、４類に分類した。
１．  ＳＮＡＰの発現なし。
２．  凝集した封入体中でのＳＮＡＰの中〜高程度の発現（図２０、左図）
３．  細胞壁に局在してのＳＮＡＰの弱程度の発現（図２０、中央図）
４．  細胞壁に局在してのＳＮＡＰの高程度の発現（図２０、右図）
【０１３８】
発現と溶解性の両方が高いクローンのみを、さらに分析した。しかし前記ＳＮＡＰレポーターの発現の弱かったのは、大腸菌発現に最適化されなかったタンパク質の非効率な発現のためでありうるので、こうしたクローンのうちのある部分は、コドンの使用が適性化されたならば、可溶性細胞質ライブラリー・ディスプレイに対して非常に適していると判明することがあり得る。
ＳＮＡＰレポーターの発現レベルが高く、透過性にした細胞の細胞壁の周りに均一に分布したクローンの配列を調べ、残りの融合タンパク質に対して正しい翻訳枠にあるｓｃＦｖ挿入断片の存在を確認した。分析した２１クローンの全てで、ｓｃＦｖ挿入断片は、全長で、正しい長さのグリシン／セリン・リンカー領域を有し、全融合タンパク質の翻訳のために正しい読み枠中にあることが判明した。このことは、本発明のスクリーニング方法は、大腸菌細胞の細胞質中で、溶解状態で発現したマウスｓｃＦｖ遺伝子を正しく識別していることを示唆した。前記ライブラリーから単離されたｓｃＦｖタンパク質が、大腸菌細胞質中で可溶であることを確認するため、これを、ライブラリー・コンストラクトから、介在性のスペーサー領域Ｉ２７−ＲＬ６またはＲＬ６のいずれかを含むＣ末端のＦＬＡＧエピトープを有するアラビノース誘導性発現ベクターにシャトルした。
アラビノースによるタンパク質発現の誘導後、可溶性のｓｃＦｖ：：Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＦＬＡＧまたはｓｃＦｖ：：ＲＬ６：：ＦＬＡＧ融合タンパク質を、０．５％８ＴＧＰで抽出した。不溶性の細胞物質は沈澱させ、β-メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中に、サンプルに超音波をかけ９５℃で５分間加熱して、再懸濁した。各画分の等量ずつを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、電気泳動した。分離されたタンパク質は、ニトロセルロース膜に移し、５％脱脂粉乳でブロックした。組換えタンパク質発現体に、１：１０００に希釈したヒツジαＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社）、つづいて、抗マウスＨＲＰ抱合二次抗体でプローブ付けを行った。化学発光を用いて検出した。
図２１は、本発明の方法は、ほとんどが溶解した状態で、細菌細胞質内で発現するｓｃＦｖ遺伝子を識別することができることを明らかにしている。ウェスタンブロット法による発現プロフィールは、各サンプルで、ｓｃＦｖ：：Ｉ２７：：ＲＬ６：：ＦＬＡＧコンストラクトについてＳＮＡＰリガンドで検知した蛍光顕微鏡検査法と一致している。
【０１３９】
広く記述された本発明の範囲を逸脱することなく、特定の態様において示したように、多くの変化形および／または改良が可能であることを当業者は理解するであろう。本実施態様は、したがって、いかなる点においても説明のためであって、制限を課すものと考えてはならない。
本明細書において、議論され、および／または参照された公刊物は、その全体を参照のため本明細書に組み入れる。
本出願は、ＡＵ２００９９０６３１０による優先権を主張するものであり、その開示全体は、参照により本願に組み込まれている。
本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品等々に関するいかなる議論もひとえに本発明の状況を提供することを目的としている。これらの事項のいずれか、または全てが、当出願の各請求項の優先日より以前に存在していたことを理由として、それが先行技術の基盤の一部を形成すること、あるいは本発明に関連する分野において普通の一般的な知識であったことを是認するとして取られるべきでない。
【０１４０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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