(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む赤小豆抽出物又はその分画物を有効成分として含む、ＴＬＲ及びＩＬ−６媒介性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物であって、
前記ＴＬＲ及びＩＬ−６媒介性疾患は、アトピー性皮膚炎、関節炎、乾癬、喘息、移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症からなる群から選択される自己免疫疾患；
骨髄腫、乳がん、前立腺がん、脳腫瘍、頭頸部がん、黒色腫、白血病及びリンパ腫からなる群から選択されるがん疾患；
骨粗しょう症、動脈硬化症及び心筋梗塞からなる群から選択される代謝性疾患；又はｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡウイルス感染症である、薬学的組成物。
【化５】
0005932972.tif 000015
【請求項２】
前記赤小豆抽出物が、赤小豆の、水、炭素数１〜６のアルコール及びこれらの混合溶媒からなる群から選択される溶媒の抽出物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記分画物が、赤小豆抽出物の、ヘキサン、酢酸エチル、水及びこれらの混合溶媒からなる群から選択される溶媒の分画物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
下記化学式で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む赤小豆抽出物又はその分画物を有効成分として含む、ＴＬＲ及びＩＬ−６媒介性疾患の予防又は改善用の皮膚外用剤であって、
前記ＴＬＲ及びＩＬ−６媒介性疾患は、アトピー性皮膚炎、関節炎、乾癬、喘息、移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症からなる群から選択される自己免疫疾患；
骨髄腫、乳がん、前立腺がん、脳腫瘍、頭頸部がん、黒色腫、白血病及びリンパ腫からなる群から選択されるがん疾患；
骨粗しょう症、動脈硬化症及び心筋梗塞からなる群から選択される代謝性疾患；又はｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡウイルス感染症である、
皮膚外用剤。
【化６】
0005932972.tif 000016
【請求項５】
下記化学式で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む赤小豆抽出物又はその分画物を有効成分として含む、ＴＬＲ及びＩＬ−６媒介性疾患の予防又は改善用の個人衛生用品であって、
前記ＴＬＲ及びＩＬ−６媒介性疾患は、アトピー性皮膚炎、関節炎、乾癬、喘息、移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症からなる群から選択される自己免疫疾患；
骨髄腫、乳がん、前立腺がん、脳腫瘍、頭頸部がん、黒色腫、白血病及びリンパ腫からなる群から選択されるがん疾患；
骨粗しょう症、動脈硬化症及び心筋梗塞からなる群から選択される代謝性疾患；又はｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡウイルス感染症である、
個人衛生用品。
【化８】
0005932972.tif 000017
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オレアノール酸アセテートを有効成分として含むTLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物に関し、より具体的にはオレアノール酸アセテート(oleanolic  acid  acetate)、又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含むTLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物、前記化合物又は塩を含む赤小豆抽出物又はその分画物を有効成分として含むTLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物、及び前記組成物をTLR及びIL-6媒介性疾患の疑いのある個体にに投与する段階を含む、TLR及びIL-6媒介性疾患の治療方法に関する。また、本発明は、前記有効成分を含むTLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は改善用の皮膚外用剤、健康食品及び個人衛生用品に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応は、活性化された免疫細胞が外来性及び内因性物質(抗原)に対して起こす一連の反応である。細菌、ウイルスなどを含む微生物や生体の異物などが生体に流入すると、宿主細胞は、感染症を克服するために、炎症反応の原因となるサイトカインなどの因子を分泌して炎症反応を誘発させる。そして、これらの微生物や生体の異物が免疫細胞によって認識されると、免疫細胞が活性化され、活性化された免疫細胞でも炎症反応の原因となる多くの因子を分泌して炎症反応を誘発する(非特許文献１)。
【０００３】
分子生物学及び遺伝子工学の発展により、炎症に係る細胞内の分子標的が明らかになっており、特に感染初期の非特異的先天性免疫反応の段階で病原体の特定の部分を認識する遺伝子が明らかになり、これに伴い炎症の初期の発生過程についての新しい分子的機序の解析が行われている。最近炎症の初期の病原体を認知する遺伝子としてトール様受容体(Toll-like  recepor、TLR)が病原体の原形質膜の構成成分(lipopolysaccharide(LPS：endotoxin)、peptidoglycan)と核酸構成物(ds  RNA、single  strand  RNA、GpG  DNA  etc.)を認識することが知られることで、TLRの研究が活発に行われている(非特許文献２、非特許文献３)。
【０００４】
TLRは、1型膜貫通型シグナル伝達分子(type  I  transmembrane  signaling  molecule)として先天性免疫系(innate  immune  system)を担当する細胞で主に発現されている。この細胞においてTLRは、細胞外ドメイン(extracellular  domain)を介してPAMP(pathogen-associated  molecular  patterns)やMAMP(microorganism-associated  molecular  patterns)を認識し、その結果、先天性免疫細胞の炎症性細胞の活性化を誘導する。TLRsが明らかになって以来、TLRsに結合するPAMPを見出す努力が続けられてきており、これまでTLR10、TLR12、TLR13を除き、それぞれ１つ以上のリガンドが明らかになった(非特許文献４)。TLRsは互いに異なるが、シグナル伝達機序を共有する(非特許文献５)。
【０００５】
TLRによるシグナル伝達における共通点は、TIR(Toll/interleukin-1  receptor-like  domain)のドメインによるNF-κBの活性化である。TLRによるシグナル伝達過程は、TIRドメインを有するMyD88と相互に作用して複合体を形成する。MyD88のC末端に位置するTIRドメインはTLRとの複合体を形成し、N末端に位置するデスドメインは、リン酸化酵素(Ser/Thr  kinase)であるIRAK(IL-1R  associated  kinase)-1又はIRAK-2と複合体を形成するようになる。IRAK-1は再びTRAF6(tumor  necrosis  factor  receptor-associated  factor  6)との相互作用によってNIK(NF-κB-inducing  kinase)を活性化させ、NIKの活性化は、再びIKK(IκBkinase)をリン酸化し、リン酸化されたIKKは再びIκB(inhibitoryκB)をリン酸化させるされ、その結果、NF-κBの活性化を引き起こす。有効にされたNF-κBは核に移動し、転写因子として作用してサイトカイン及び細胞の結合分子に関連する遺伝子の発現を誘導する(非特許文献２、非特許文献３)。
【０００６】
特にTLR-7はssRNA(single-stranded  RNA)とssRNA類似体であるpolyI(polyinosinic  acid)を認識することで知られている。即ちTLR-7がssRNAを確認した後、アダプタータンパク質(adaptor  protein)であるMyD88と反応して転写因子であるNFkBとAP-1を活性化させ、炎症性サイトカインを生成するようになる。もう一つの機序として、TRIFに依存的機序はTRIF、TBK1(ANK-binding  kinase  1)、TRAF3と転写因子であるIRF3に連続的にシグナルを伝達し、I型インターフェロンの産生を誘導する。そして、TLR-3は、RNAウイルスの増殖中に生じるdsRNA(double-stranded  RNA)とdsRNA類似体であるpolyI：C(polyinosinic-polycytidylic  acid)を認知することが知られている。即ち、TLR-3のロイシンリッチ反復モチーフ(leucine-rich  repeat  motif)形態のエクトドメイン(ectodomain)であるdsRNAを認識した後、アダプタータンパク質であるTRIFと反応して転写因子であるIRF3とNFκBを活性化させ、1型IFNとIL-6及びIL-12などの炎症性サイトカインを生成させる(非特許文献６)。炎症媒介物質が過剰に生産されると、過剰な免疫反応を引き起こし、それにより大腸炎、膵炎、リウマチ性関節炎、喘息などの各種身体疾患を悪化させる原因となる。したがって、TNF-α、IL-1β及びIL-6、IL-10のよな炎症媒介物質を抑制する物質を開発することができれば、各種自己免疫疾患及び身体疾患の治療に役立つであろう。
【０００７】
STAT3(signal  transducers  and  activators  of  transcription)は、リウマチ性関節炎を含む自己免疫疾患において、NF-κBとは異なる別の重要な転写因子としての役割を果たすことが知られている。特に、STAT3は、炎症反応を媒介するサイトカインであるインターロイキン-6(interleukin-6、IL-6)によって活性化されることが知られており、上皮成長因子(EGF)によっても活性化されることが知らされている(非特許文献７)。
【０００８】
IL-6は、B-細胞刺激因子2又はインターフェロンβ2として知られているサイトカインであり、リンパ球系B細胞の活性化に関与する分化因子として発見され(非特許文献８)、その後T細胞の分化及び増殖、神経細胞の分化、破骨細胞の形成、肝細胞でのタンパク質の生産などに影響を及ぼす多機能性サイトカインであることが明らかになった(非特許文献９)。
【０００９】
2つの作用的に異なる膜受容体分子がIL-6の活性を誘導するのに必要であるが、これらのうち一方は、IL-6に特異的に結合する分子量が約80KDのインターロイキン-6受容体(IL-6R)であり、もう一方は、シグナル伝達に関与する分子量が約130KDのgp130である。IL-6とIL-6RはIL-6/IL-6R複合体を形成した後、もう一方の膜タンパク質であるgp130と結合することにより、IL-6による細胞内のシグナル伝達が誘導される(非特許文献１０)。また、IL-6の細胞内シグナル伝達を誘導する過程で、gp130及びJAK(Janus  kinase)のリン酸化がSTAT3の転写活性に必須であることが明らかになった(非特許文献１１)。IL-6と受容体の結合後、細胞内では、JAK2(Janus  Kinases  2)がリン酸化によって活性化され、活性化されたJAK2によって受容体の細胞質内ドメインの幾つかのチロシン残基がリン酸化され、これはSH2や他のリン酸化チロシン結合モチーフを有するSTAT3のような細胞内タンパク質の結合の役割を果たすようになる。受容体の細胞内ドメインに結合したSTAT3は、JAK2によってリン酸化された後、受容体から流れ出る。活性化されたSTAT3は、細胞質内に互いに結合して同型又は異型ニ量体を成した後、核内に入り、標的分子の転写活性領域に結合して転写を増加させる(非特許文献１２、非特許文献１３)。このようなIL-6の過剰産生は、リウマチ性関節炎、キャッスルマン症候群(Castleman  Syndrome)、クローン病、骨粗しょう症、がん性悪液質(Cancer  cachexia)、動脈硬化症、糖尿病などの各種疾患に関与することが明らかになっている(非特許文献９、非特許文献１４)。さらに、STAT3の構造的活性化及び過剰発現が骨髄腫、乳がん、前立腺がん、脳腫瘍、頭頸部がん、黒色腫、白血病並びにリンパ腫、特に慢性骨髄性白血病及び多発性骨髄腫を含む様々な形態のがんに関与すると思われる(非特許文献１５)。
【００１０】
これまでの報告においては、何らかの物質のiNOS活性抑制などのような抗酸化効果などを観察し、すぐにこのような物質が炎症性疾患にも治療効果があるだろうと報告されていたが、抗酸化剤がリウマチ性関節炎及びループス病などのような炎症性疾患に分類された疾患に効果がないという報告があるなど(非特許文献１6)、抗酸化効果がすぐに炎症性疾患の治療に適用できないという問題があった。
【００１１】
一方、自己免疫皮膚疾患の中で代表的に知られているのがアトピー性皮膚炎である。アトピー性皮膚炎は慢性的であり、再発性の高い皮膚疾患として皮膚のせつ(おでき)、湿疹、かゆみ、炎症反応を伴う。病理学的、遺伝学的作用機序は未だ正確に分かっていない。アトピーは敏感性の高い特定の遺伝子、環境、皮膚の外壁の損傷程度、免疫的な要因などが複合的な影響を及ぼす免疫反応である。アトピー性皮膚炎は、典型的なTh2型の免疫疾患と定義されるが(非特許文献１7)、これはアトピー性皮膚炎にかかり始める際に、Th2免疫反応が重要な機能を担っているからである。抗原のアレルゲンが皮膚を通して体内に流入すると皮膚に位置する抗原提示細胞が、これを認知し、それに反応するようになる。この時、アレルゲンは、特異的にTh2形態の免疫反応を誘導し、そのようにTh2表現型のAPCsはT細胞を自覚し、Th2細胞への分化を誘導する。Th2細胞は多量のTh2形態のサイトカインを発現させ、Th2型のサイトカインは肥満細胞(mast  cell)を活性化させ、ヒスタミンのような水溶性媒介因子の分泌を促進させ、B細胞を刺激しIgEの産生を促進させる。このような媒介因子は、再び免疫細胞を炎症部位に誘導することで、さらに強化されたTh2形態の免疫反応を誘導するようになり、最終的にアトピー性皮膚炎を誘発するに至る。このようなアトピー性皮膚炎の治療のための標的候補遺伝子としては、IgEに高い親和性を有するFceR1b、Th2型のサイトカインであるIL-4、IL-5、IL-13、ケモカインの一種であるエオタキシン(eotaxin)、RANTESなどがあり、アトピーを誘発するにあたって大きな役割を果たす(非特許文献１８、非特許文献1９)。したがって、Th2形態のサイトカインとケモカインの遺伝子の発現を調節する物質を発明するならば、アトピーをはじめとする様々な各種自己免疫疾患及び身体疾患の治療に役立つであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Chen  G.Y.,  Nat.Rev.Immunol.,10(12)：826-837,2010
【非特許文献２】Brown  J.,  et  al,  J.Dent.Res.,  2010,Epub  ahead  of  print
【非特許文献３】Palusinska-Szysz  M.,et  al.,  Folia  Microbiol.(Praha),  2010,  55(5),508-14
【非特許文献４】Kawai  T.et  al,  Ann.NY  Acad.Sci.,  2008,  1143,1-20
【非特許文献５】Liew  F.Y.,  et  al.,  Nat．Rev.Immunol.,  2005,  5(6),  446-458
【非特許文献６】Alexopoulou  L.,  et  al,  Nature,  2001,  413,  732-738
【非特許文献７】Darnell  Jr.JE,  et  al.,  Science,  1994,  264,  1415-1421
【非特許文献８】Hirano  T.,  et  al.,  Nature,  1986,  324,  73-76
【非特許文献９】Akira  S.,  et  al.,  Adv.In  Immunology,  1993,  54,  1-78
【非特許文献１０】Taga  T.,  et  al.,  J.  Exp.  Med.,  1987,  196,  967
【非特許文献１１】Heinrich  P.,  et  al.,  Biochem.J.,  2003,  374,  1-20
【非特許文献１２】Levy,  D.E、et  al.,  Nat.  Rev.  Mol.  Cell  Biol.,  2002,  3,  651-62
【非特許文献１３】Darnell,  J.E,  Science,  1997,  277,  1630-1635
【非特許文献１４】Kallen  K.,  et  al.,  Exp．Opin.Invest.  Drugs,1997,6,237-266
【非特許文献１５】Niu、et  al.、Cancer  Res.、1999、59、5059-5063
【非特許文献１６】Karen  H.  Costenbader,  et  al.,  American  Journal  of  Epidemiology,  172(2):205-216,  2010
【非特許文献１７】Mamessier,  E.,  et  al,  European  Journal  of  Dermatology,  2006,  16(2),  103
【非特許文献１８】Hoffjan,  S.,  et  al.,  Journal  of  Molecular  Medicine,  2005,  83(9),  682-692
【非特許文献１９】Cookson,  W.,  Nat.  Rev.Immunol.,  2004,  4(12),  978-988
【非特許文献２０】Harborne  J.B.  Phytochemical  methods：A  guide  to  modern  techniques  of  plant  analysis,  3rd  Ed．p6-7,  1998)
【非特許文献２１】Voutquenne  L.  et  al．Phytochemistry  2003,  64,  781-789
【非特許文献２２】Kongduang  D.et  al.Tetrahedron  letters  2008,  49,  4067-4072
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、TLR及びIL-6媒介性疾患の治療物質を見出すために鋭意努力した結果、天然資源の中で赤小豆(小豆及びしま蔓小豆)抽出物、分画物、そしてそれから精製された化合物を用いて、最初に、dsRNA及びssRNAの合成類似体であるPoly(I：C)とPoly(I)によって誘導されるTLR-3及びTLR-7の活性阻害及びNF-κBを含むシグナル伝達経路を遮断する活性を確認し、次に、IL-6によって活性化される炎症関連転写因子であるSTAT3の転写活性及びリン酸化を阻害することを確認し、最後にDNCBによるNC/Ngaマウスのアトピー性皮膚炎並びにコラーゲン誘導関節炎を抑制する効果を明らかにすることにより、TLR及びIL-6媒介性疾患の予防及び治療用の薬学的組成物の発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的は、オレアノール酸アセテート又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、TLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物を提供することにある。
【００１５】
また、本発明の他の目的は、前記化合物又はその薬学的に許容される塩を含む赤小豆抽出物又はその分画物を有効成分として含む、TLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物を提供することにある。
【００１６】
また、本発明の他の目的は、前記組成物をTLR及びIL-6媒介性疾患の疑いのある個体に投与する段階を含む、TLR及びIL-6媒介性疾患の治療方法を提供することにある。
【００１７】
また、本発明の他の目的は、前記オレアノール酸アセテート又はその薬学的に許容される塩、又は、前記化合物又はその薬学的に許容される塩を含む赤小豆抽出物又はその分画物を有効成分として含む、TLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は改善用の皮膚外用剤、健康食品、又は個人衛生用品を提供することにある。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の赤小豆抽出物又は化合物は、長年天然薬材として使用されてきた天然物に由来しており、副作用がない上、dsRNA及びssRNAの合成類似体であるPoly(I：C)とPoly(I)によって誘導されるTLR-3及びTLR-7の活性阻害並びにNF-κBを含むシグナル伝達経路を遮断し、IL-6によって活性化される炎症関連転写因子であるSTAT3の転写活性及びリン酸化を阻害することにより、TLR及びIL-6媒介性疾患、例えば、アトピー性皮膚炎もしくは関節炎などの予防又は治療剤の開発に広く活用されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１aは、小豆メタノール抽出物、ヘキサン分画物、酢酸エチル分画物及び水分画物のHPLC分析結果を示すクロマトグラムである。図1bは、しま蔓小豆メタノール抽出物、ヘキサン分画物、酢酸エチル分画物及び水分画物のHPLC分析結果を示すクロマトグラムである。
【図２】図２a及び図２bは、赤小豆のメタノール抽出物、ヘキサン分画物、酢酸エチル分画物及び水分画物の、THP-1-blue細胞でpoly(I)処理によって増加したSEAP活性阻害効果を示したグラフ及び表である。
【図３】図３は赤小豆メタノール抽出物の、THP-1-blue細胞でpoly(I：C)処理によって増加したSEAP活性阻害効果を示したグラフである。
【図４】図４a及び図４bは、赤小豆メタノール抽出物の、THP-1細胞でpoly(I)処理によって活性化されて核に移動するNFκBP50(図４a)及びAP-1のC-Jun(図４b)の活性を抑制する効果を示したウェスタンブロットの写真である。図４c乃至図４eは、赤小豆メタノール抽出物の、THP-1細胞でpoly(I)処理によってリン酸化されるIKKα/β(図４c)、IκB(図４d)、p38及びJNK(図４e)のリン酸化を抑制する効果を示したウェスタンブロットの写真である。
【図５】図５a及び図５bは、赤小豆メタノール抽出物の、THP-1細胞でpoly(I：C)処理によって活性化されて核に移動するNFκBP65/p50(図５a)及びAP-1のC-Jun(図５b)の活性を抑制する効果を示したウェスタンブロットの写真である。図５c乃至  図５e  は、赤小豆メタノール抽出物の、THP-1細胞でpoly(I：C)処理によってリン酸化されるIKKα/β(図５c)、IκB  (図５d  )、p38及びJNK(図５e  )のリン酸化を抑制する効果を示したウェスタンブロットの写真である。図５fは赤小豆メタノール抽出物の、THP-1細胞でpoly(I：C)処理によって活性化され、リン酸化されるIRF3のリン酸化を抑制する効果を示したウェスタンブロットの写真である。
【図６】図６a乃至図６eは、赤小豆メタノール抽出物の、THP-1細胞でpoly(I)処理によって誘導された炎症性サイトカインであるTNFα(図６a)、炎症性サイトカインであるIL-6(図６b)、ケモカインであるRANTES(図６c)、IFNβ(図６d)、ケモカインであるMCP-1(図６e)の  mRNA発現を抑制する効果を示したグラフである。
【図７】図７aは、赤小豆メタノール抽出物の、THP-1細胞でpoly(I：C)処理によって誘導される炎症性因子であるTNFα(図７a)、炎症性因子であるIL-6(図７b)、細胞接着因子であるICAM-1(図７c)、ケモカインであるMCP-1(図７d)のmRNA発現を抑制する効果を示したグラフである。
【図８】図８aは、赤小豆メタノール抽出物の、Hep3B細胞でIL-6処理によって誘導されるSTAT3リン酸化を阻害する効果を示す写真である。図８bは、赤小豆から分離精製された化学式１の化合物の、Hep3B細胞でIL-6処理によって誘導されるSTAT3リン酸化を阻害する効果を示した写真である。
【図９】図９は、赤小豆メタノール抽出物の、NC/NgaマウスでDNCBによって誘導されるアトピー性皮膚炎の症状が改善される効果をNC/Ngaマウスの背中の皮膚に示した写真である。
【図１０】図10は、赤小豆メタノール抽出物の、NC/NgaマウスでDNCBによって誘導されるアトピー性皮膚炎の症状が改善される効果を皮膚の重症度で示したグラフである。
【図１１】図11は、赤小豆メタノール抽出物の、NC/NgaマウスでDNCBによって誘導されるアトピー性皮膚炎に対する血液中の好酸球の変化を数値で示したグラフである。
【図１２】図12は、正常なDBA/1  OlaHsdとCIA誘発マウスモデルの前肢と後肢の状態を示した写真である。
【図１３】図13は、赤小豆メタノール抽出物の、DBA/1  OlaHsdマウスでCIAによって誘発させた関節炎の症状が改善される効果をCIA誘導の程度で示したグラフである。
【図１４】図14は、オレアノール酸又はオレアノール酸アセテートの濃度に応じたHep3B細胞でIL-6処理によって誘導されるSTAT3ルシフェラーゼ活性を阻害する効果を示したグラフである。
【図１５】図15は、赤小豆メタノール抽出物が、マウスの骨髄細胞から分離した骨髄マクロファージが破骨細胞に分化するのを阻害する効果を示した写真である。
【図１６】図16は、オレアノール酸アセテートが、マウス骨髄細胞から分離した骨髄マクロファージが破骨細胞に分化するのを阻害する効果を示した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
前記の目的を達成するための一つの様態として、本発明は下記化学式１で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、TLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。
【化１】
0005932972.tif 000002
【００２１】
本発明の一実施例によれば、本発明者らは赤小豆に属する小豆としま蔓小豆からそれぞれのメタノール抽出物を得て、前記メタノール抽出物を水、n-ヘキサン、酢酸エチルなどで分画し、それぞれの分画物を得た。前記の抽出物と分画物をHPLCで分析した結果、小豆としま蔓小豆は、相互に類似したHPLCのクロマトグラムを示し、前記n-ヘキサン分画物からの有効成分であるオレアノール酸アセテート(oleanolic  acid  acetate  、化学式１)とスチグマステロール(stigmasterol  、化学式２)をそれぞれ精製した。
【００２２】
下記化学式１又は２の化合物は、常用化された化合物又は公知の方法によって得ることができる。本発明に係る赤小豆から化合物１と２の抽出、分離及び精製方法は、具体的には次のとおりである。赤小豆のヘキサン可溶性分画物をヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離する。このうち分画物3と分画物4は、メタノールを用いて再結晶を行い、化学式１、２の純粋な化合物を分離する。
【００２３】
【化２】
0005932972.tif 000003
【００２４】
【化３】
0005932972.tif 000004
【００２５】
本発明に使用される用語、「TLR及びIL-6媒介性疾患」とは、トール様受容体(Toll-like  recepor、TLR)に属するTLR-3とTLR-7の活性化によって活性化されたNF-κBが核に移動し、核において各種サイトカイン及び細胞接合分子に関連する遺伝子が発現され、IL-6によるSTAT3の活性化が抑制されることによって発症する疾患の総称を意味する。前記TLR及びIL-6媒介性疾患は、特にこれに限定されないが、炎症性疾患、自己免疫疾患、がん疾患又は代謝性疾患に大別することができる。
【００２６】
本発明において、前記炎症性疾患は炎症を主病変とする疾患の総称を意味するものであり、本発明の目的上、前記TLR及びIL-6によって媒介される炎症性疾患であることが好ましい。前記炎症性疾患は、これらに限定されないが、好ましくはssRNA及びdsRNAウイルス感染症、敗血症、多発性軟骨炎、硬皮症、皮膚炎、湿疹、痛風、歯周疾患、ベーチェット症候群、浮腫、脈官炎、川崎病、糖尿病性網膜炎、自己免疫性膵炎、血管炎、糸球体腎炎、細菌及び真菌の急性及び慢性の感染症、急性及び慢性気管支炎、並びにインフルエンザ感染症などが含まれる。
【００２７】
本発明の一実施例では、化学式１のオレアノール酸アセテートが濃度依存的にSTAT3ルシフェラーゼ活性を阻害することを確認し(表7)、特に公知のオレアノール酸よりも顕著に優れた炎症性疾患の予防及び治療効果を示し得ることを確認することにより(図14)、前記化合物を有効成分として含む薬学的組成物がIL-6によるSTAT3の活性化に関連する炎症性疾患の予防又は治療に効果的であることを確認した。
【００２８】
本発明において、前記自己免疫疾患は病的固体の自己の抗原に対する免疫反応が直接的、間接的原因で現れる疾患の総称を意味するものであり、本発明の目的上、好ましくは前記TLR及びIL-6によって媒介される自己免疫疾患である。前記自己免疫疾患は、これらに限定されないが、好ましくはアトピー性皮膚炎、関節炎、乾癬、喘息、移植片対宿主病、免疫不全症、全身性エリテマトーデス、及び多発性硬化症が含まれ、より好ましくはアトピー性皮膚炎又は関節炎である。TLRは免疫反応を刺激し、自己免疫疾患の発達に関連しており、IL-6によって活性化されるSTAT3は、様々な自己免疫疾患において重要な転写因子として機能して、本発明において濃度依存的にSTAT3ルシフェラーゼ活性を阻害させることを確認した化学式１のオレアノール酸アセテートは、TLR及びIL-6によって媒介される自己免疫疾患に効果的であることを確認した。本発明の化学式１で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む薬学的組成物は、従来の抗酸化剤の作用機序によるものとは異なる作用機序によって治療効果を奏することができる。
【００２９】
本発明において、前記がん疾患は組織内において必要とされる状態を無視して無限増殖する未分化細胞によって構成された腫瘤又は腫瘍を形成する疾患を意味するものであり、本発明の目的上、TLR及びIL-6によって媒介されるがん疾患である。前記がん疾患は、これらに限定されないが、好ましくは、骨髄腫、乳がん、前立腺がん、脳腫瘍、頭頸部がん、黒色腫、白血病及びリンパ腫が含まれる。IL-6によって活性化されるSTAT3は、その構造的活性化及び過剰発現が慢性骨髄性白血病又は多発性骨髄腫を含む様々な形態のがんに関連しており、前記STAT3の活性を阻害させることにより、前記がん疾患の予防又は治療効果を示すことができる。
【００３０】
本発明において、前記代謝性疾患は生体内の物質代謝障害によって発生する疾患を総称する意味するものであり、本発明の目的上、好ましくはTLR及びIL-6によって媒介される代謝性疾患である。前記の代謝性疾患は、これらに限定されないが、好ましくは、骨粗しょう症、動脈硬化症、及び心筋梗塞を含むことができ、より好ましくは、骨粗しょう症である。IL-6の過剰産生は、特に骨粗しょう症に関与していることが様々な面で明らかになっており、これにより本発明の組成物はIL-6媒介性疾患を予防又は治療することができる。本発明の一実施例では、化学式１の化合物を処理する場合、濃度依存的に破骨細胞の大きさと数が減少することを確認することにより、前記化合物が破骨細胞の分化を抑制し、骨粗しょう症の予防及び治療に効果を示すことを確認した(図16)。
【００３１】
本発明において、前記TLR及びIL-6媒介性疾患は、前記の疾患に加えてTLR及びIL-6によって媒介される様々な疾患を全て含むことができ、その例として、アナフィラキシー又は過敏性反応、アルツハイマー病、悪液質、肥満、超免疫グロブリン血症、メニエール病、疼痛、過敏性肺疾患、内分泌性眼疾患などを含むことができる。
【００３２】
本発明の一実施例によれば、本発明者らはオレアノール酸アセテートがpoly(I)及びpoly(I：C)によって誘導されたSEAPの活性を有意に阻害したが、スチグマステロールは、poly(I)及びpoly(I：C)によって誘導されたSEAPの活性に対する阻害活性を示さないことを確認した(表4)。したがって、前記化学式１の化合物は、ssRNAであるpoly(I)及びdsRNAであるpoly(I：C)によって誘導されるTLR7とTLR3シグナル伝達経路を抑制し、その分画物は、poly(I)によって誘導されるTLR7のシグナル伝達経路を抑制することができるので、TLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は治療に適していることが確認された。
【００３３】
また、本発明の他の一実施例によれば、本発明者らは化学式１及び化学式２の化合物が濃度依存的にSTAT3ルシフェラーゼ活性を阻害させ(表7)、化学式１の化合物は、公知のオレアノール酸よりも著しく優れた炎症性疾患の予防及び治療効果を示し得ることを確認した(図14)。したがって、本発明の化学式１の化合物又はその薬学的に許容される塩は、IL-6によるSTAT3の活性化に関連する疾患の予防又は治療に活用できることが確認された。
【００３４】
本発明の化学式１の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用される適切な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。ここで、前記組成物に含まれる前記オレアノール酸アセテート、その塩、抽出物又は分画物の含有量は特に限定されないが、組成物の総重量に対して0.0001〜10重量％で、好ましくは0.001〜1重量％を含むように製造することが好ましい。
【００３５】
本発明において使用される用語、「薬学的に許容される塩」とは、陽イオンと陰イオンが静電引力によって結合している物質である塩の中でも、薬剤学的に使用することのできる形態の塩を意味するが、通常、金属塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩などであってもよい。例えば、金属塩としては、アルカリ金属塩(ナトリウム塩、カリウム塩など)、アルカリ土類金属塩(カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など)、アルミニウム塩などであってもよく、有機塩基との塩としては、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6-ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N、N-ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩であってもよく、無機酸の塩としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩であってもよく、有機酸との塩としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸などとの塩であってもよく、塩基性アミノ酸との塩としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩であってもよく、  酸性アミノ酸との塩としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩であってもよい。
【００３６】
本発明の化学式１の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型の製剤、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤型化して使用してもよい。本発明において、赤小豆抽出物と分画物を含む組成物に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油が挙げられる。製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤には、前記赤小豆抽出物とその分画物に少なくとも1つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口用の液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、一般的に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。非経口投与用の製剤としては、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール(propylene  glycol)、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール(witepsol)、マクロゴール、  トゥイーン(tween)61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。
【００３７】
本発明の前記薬学的組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、病気の程度、薬物の形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者が適切に選択することができる。しかし、より効果的な予防又は治療のために、本発明の前記オレアノール酸アセテート、その塩、抽出物又は分画物は、1日0.0001〜100mg/kg、好ましくは0.001〜100mg/kg投与可能であり、投与は一日一回投与してもよく、数回に分け投与してもよい。
【００３８】
本発明の薬学的組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路を通じて投与できる。あらゆる投与方法が考えられるが、例えば、経口、直腸又は静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜又は脳室内(intracerebroventricular)注射によって投与することができる。
【００３９】
また、他の様態として、本発明は前記組成物をTLR及びIL-6媒介性疾患の疑いのある個体に投与する段階を含む、TLR及びIL-6媒介性疾患の治療方法を提供する。
【００４０】
本発明において、前記TLR及びIL-6媒介性疾患の疑いのある個体は、TLR及びIL-6媒介性疾患が発症していたり、発症し得るヒトを含む全ての動物を意味し、本発明の化学式１の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む薬学的組成物をTLR及びIL-6媒介性疾患の疑いのある個体に投与することにより、個体を効率的に治療することができる。TLR及びIL-6媒介性疾患及び投与に関しては、前述したとおりである。
【００４１】
また、他の様態として、本発明は前記化学式１の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む赤小豆抽出物又はその分画物を有効成分として含むTLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物を提供する。
【００４２】
本発明の前記薬学的組成物は、前記化合物又はその薬学的に許容される塩を含む赤小豆抽出物又はその分画物を有効成分として含むことにより、TLR及びIL-6媒介性疾患を予防又は治療することができる。TLR及びIL-6媒介性疾患については前述した通りであり、前記赤小豆抽出物又はその分画物を有効成分として含む場合、TLR及びIL-6媒介性疾患は、好ましくは、自己免疫疾患、がん疾患又は代謝性疾患である。
【００４３】
本発明の一実施例では、自己免疫疾患のうち代表的な疾患である関節症のモデルマウスにおいて、赤小豆抽出物がCIA誘発の程度を改善させることを確認し(図13)、代表的な自己免疫皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎の動物モデルにおいて、赤小豆抽出物が症状改善に効果があることを確認することで(図9及び10)、前記赤小豆抽出物が、自己免疫疾患を予防又は治療するのに効果的な有効成分であることを確認した。また、本発明の他の実施例では、赤小豆抽出物を処理する場合、濃度依存的に破骨細胞の大きさと数が減少することを確認することにより、前記抽出物が破骨細胞の分化を抑制し、骨粗しょう症の予防及び治療に効果を示すを確認した(図15)。
【００４４】
本発明において使用される用語、「赤小豆」とは、マメ科の小豆(Phaseolus  angularis  Wight)の種子を意味するが、形態的には円柱形で少し平らで、種皮は赤褐色でなめらかで光沢があり、薬理活性の面では、利尿、消炎、排膿、解熱、全身浮腫、肝硬変、黄疸、せつ(おでき)、化膿性疾患、水腫、脚気、消渇、赤痢性下痢などの治療のため民間療法で使用されてきた。しかし、本発明のTLR-3及びTLR-7活性化によって誘導される疾患の治療用途に対しては知られておらず、本発明者らによって初めて明らかにされた。本発明の目的上、前記赤小豆は小豆(Phaseoli  angularis  Wight)又はしま蔓小豆(又は蔓小豆、Phaseolus  calcaratus  Roxburgh)の種子を意味するものとして使用されるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明において使用される用語、「赤小豆抽出物」とは、赤小豆を抽出して得た抽出物を意味するが、本発明の目的上、赤小豆抽出物は赤小豆の粉砕物を水、炭素数1〜6のアルコール(メタノール、エタノール、ブタノールなど)、これらの混合溶媒などで抽出して得た結果物であり得るが、これらに限定されず、前記の結果物は、抽出液、抽出液の希釈液又は濃縮液、抽出液を乾燥して得られる乾燥物、あるいはこれら粗精製物又は精製物などを全て含む。
【００４６】
本発明の一実施例によれば、赤小豆の粉砕物を乾燥重量の約2〜20倍、好ましくは約3〜5に達する容積の水、メタノール、エタノール及びブタノールなどのような炭素数1(C1)〜6(C6)のアルコールの極性溶媒又はこれらの約1:0.1〜1:10の混合比を有する混合溶媒を溶出溶媒として使用し、抽出温度は20〜100℃、好ましくは室温で、抽出期間は約12時間〜4日間、好ましくは3日間熱水抽出、冷浸抽出、還流冷却抽出又は超音波抽出などの抽出方法を用いて抽出することができる。好ましくは冷浸抽出で1回〜5回連続抽出して減圧ろ過して、そのろ過抽出物を回転真空濃縮器で20〜100℃、好ましくは室温で減圧濃縮し、水、低級アルコール又はこれらの混合溶媒に可溶な赤小豆(小豆及びシマツルアズ)粗抽出物を得ることができる。
【００４７】
本発明で使用される用語、「分画物」とは、様々な構成成分を含む混合物から特定成分又は特定グループを分離する分画方法によって得られた結果物を意味する。本発明では、好ましくは、赤小豆の抽出物をn-ヘキサン、酢酸エチルなどの溶媒を用いた溶媒分画法で分画した結果物であってもよく、極性溶媒分画物と非極性溶媒分画物のいずれをも含み、具体的には、ヘキサン分画物、酢酸エチル分画物及び水分画物など全てを用いることができる。
【００４８】
本発明の一実施例によれば、前記得られた赤小豆粗抽出物を蒸留水に懸濁した後、懸濁液の約1〜100倍、好ましくは約1〜5倍の容積のヘキサン、酢酸エチルのような非極性溶媒を加えて1回〜10回、好ましくは2回〜5回にわたって非極性溶媒の可溶層を抽出、分離して得ることができる。また、さらに通常の分画工程を実行することもできる(非特許文献２０)。具体的には、前記赤小豆粗抽出物を水に懸濁した後、同量のn-ヘキサン及び酢酸エチル溶媒を用いて、連続抽出により赤小豆の各溶媒可溶抽出物を得ることができ、より具体的には、赤小豆粗抽出物を水に懸濁した後、同量のn-ヘキサンを混合した後、分画してn-ヘキサン可溶性分画物及び水可溶性分画物を得ることができ、その水可溶性分画物に酢酸エチルを加え、酢酸エチル可溶性分画物及び水可溶性分画物を得ることができる。
【００４９】
本発明の一実施例によれば、本発明者らは赤小豆のメタノール抽出物、ヘキサン分画物、酢酸エチル分画物及び水分画物がpoly(I)によって誘導されたSEAPの活性を有意的に阻害し(図2)、poly(I：C)によって誘導されたSEAPの活性を赤小豆のメタノール抽出物が有意に阻害し(図3)、赤小豆の95％メタノール抽出物は、poly(I)及びpoly(I：C)によって誘導されたSEAPの活性を有意に阻害したが、50％エタノール抽出物においては、低い阻害活性を示すことが確認され(表2及び表3)、赤小豆抽出物は、poly(I)又はpoly(I：C)によって誘導される炎症性因子の発現を抑制させることが確認された(図6及び図7)。したがって、本発明の赤小豆抽出物は、ssRNAであるpoly(I)とdsRNAであるpoly(I：C)によって誘導されるTLR7とTLR3シグナル伝達経路を抑制し、その分画物はpoly(I)によって誘導されるTLR7のシグナル伝達経路を抑制することができるので、TLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は治療に適していることが確認された。
【００５０】
本発明の他の一実施例によれば、本発明者らは赤小豆抽出物がpoly(I)及びpoly(I：C)によって活性化される転写因子であるNF-κB(p65、p50)とAP-1(p-c-Jun)の核内移動を濃度依存的に減少させ(図4a、4b、5a及び5b)、NF-κBの上流段階であるIKK、IκBの活性化を濃度依存的に減少させ(図4c、4d、5c及び5d)、MAPキナーゼシグナル伝達系であるJNK、p-38のリン酸化活性を濃度依存的に減少させることを確認した(図4e及び5e)。また、poly(I：C)によって誘導されるTLR3のシグナル伝達過程の一つであるIRF3のリン酸化活性化にも赤小豆抽出物が、濃度依存的な抑制活性を示すことを確認した(図5f)。以上の結果から、本発明において赤小豆抽出物は、TLR及びIL-6媒介性疾患を予防又は治療するのに適していることが分かる。
【００５１】
また、本発明の他の一実施例によれば、本発明者らは赤小豆の抽出物、ヘキサン分画物、酢酸エチル分画物及び水分画物は、濃度依存的にSTAT3ルシフェラーゼ活性を阻害させ、(表5及び表6)、アトピー性皮膚炎の動物モデルに赤小豆抽出物を摂取させた結果、アトピー性皮膚炎の症状が改善され(図9及び図10)、好酸球の数値がアトピー性皮膚炎誘発及び非投与対照群に比べて減少したことを確認した(図11)。また、赤小豆抽出物は関節炎(collagen-induced  arthritis、CIA)モデルマウスにおいてCIA発生程度を改善させた(図13)。したがって、本発明の化学式１の化合物又はその薬学的に許容される塩を含む赤小豆抽出物又はその分画物は、IL-6によるSTAT3の活性化に関連する疾患、例えばアトピー性皮膚炎、関節炎などの予防又は治療に活用できることが分かる。
【００５２】
本発明の前記赤小豆抽出物又はその分画物を含む薬学的組成物もまた、薬学的組成物の製造に通常使用される適切な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。これについては、前述したとおりである。
【００５３】
もう一つの様態として、本発明は、前記組成物をTLR及びIL-6媒介性疾患の疑いのある個体に投与する段階を含む、TLR及びIL-6媒介性疾患の治療方法を提供する。前記組成物は、化学式１で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む赤小豆抽出物又はその分画物を有効成分として含む薬学的組成物であり、前記TLR及びIL-6媒介性疾患の疑いのある個体及び投与に関しては、前述したとおりである。
【００５４】
もう一つの様態として、本発明は前記化学式１で表される化合物又はその薬学的に許容される塩、又は、前記化学式１で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む赤小豆抽出物又はその分画物を有効成分として含む、TLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は改善用の皮膚外用剤を提供する。
【００５５】
前記化学式１の化合物、赤小豆抽出物又はその分画物については、前述した通りであり、前記有効成分は、TLR及びIL-6媒介性疾患を予防又は改善することができる皮膚外用剤に含まれ得る。前記の皮膚外用剤は、特にこれに限定されないが、好ましくは、軟膏剤、ローション剤、スプレー剤、パッチ剤、クリーム剤、散剤、懸濁剤、ゲル剤又はゲルの形態で製造され使用できる。
【００５６】
もう一つの様態として、本発明は、前記化学式１で表される化合物又はその薬学的に許容される塩、又は、前記化学式１で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む赤小豆抽出物又はその分画物を有効成分として含む、TLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は改善用の健康機能食品を提供する。
【００５７】
前記化学式１の化合物、赤小豆抽出物又はその分画物については、前述した通りであり、前記有効成分は、TLR及びIL-6媒介性疾患を予防又は改善することができる健康機能食品に含むことができる。
【００５８】
本発明の化学式１の化合物は、従来から薬剤として使用されてきた赤小豆の抽出物に由来しており、その安全性が立証されているので、食品組成物として用いることができる。前記化学式１の化合物、その薬学的に許容される塩、それらを含む赤小豆抽出物又はその分画物は、食品組成物の総重量に対して0.01〜100重量％、より好ましくは1〜80重量％含まれる。食品が飲料である場合には、100mlを基準に1〜30g、好ましくは3〜20gの割合で含むことができる。また、前記組成物は、食品組成物に通常使用されており、臭い、味、視覚などを向上させ得る追加成分を含むことができる。例えば、ビタミンA、C、D、E、B1、B2、B6、B12、ナイアシン(niacin)、ビオチン(biotin)、葉酸(folate)、パントテン酸(panthotenic  acid)などを含むことができる。また、亜鉛(Zn)、鉄(Fe)、カルシウム(Ca)、クロム(Cr)、マグネシウム(Mg)、マンガン(Mn)、銅(Cu)などのミネラルを含むことができる。また、リジン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含むことができる。また、防腐剤(ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど)、殺菌剤(さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウムなど)、酸化防止剤(ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)など)、着色剤(タール色素など)、発色剤(亜硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウムなど)、漂白剤(亜硫酸ナトリウム)、調味料(MSG  グルタミン酸ナトリウムなど)、甘味料(ズルチン、サイクラミン酸、サッカリン、ナトリウムなど)、香料(バニリン、ラクトンなど)、膨張剤(ミョウバン、D-酒石酸水素カリウムなど)、強化剤、乳化剤、増粘剤(糊料)、皮膜剤、ガム基礎剤、泡抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物(food  additives)を添加することができる。前記の添加物は、食品の種類に応じて選別され、適切な量で使用される。
【００５９】
前記化学式１の化合物、その薬学的に許容される塩、これらを含む赤小豆抽出物又はその分画物を含む食品組成物を用いて、様々な機能性食品を製造することができる。
【００６０】
本発明において使用される用語、「機能性食品(functional  food)」とは、特定保健用食品(food  for  special  health  use、FoSHU)と同様の用語として、栄養補給に加えて生体調節機能が効率的に表れるように加工された医学、医療効果が高い食品を意味する。本発明において使用される用語、「健康食品(health  food)」とは、一般的な食品に比べて積極的な健康の維持や増進効果を有する食品を意味し、「健康補助食品(health  supplement  food)」は、健康補助を目的とする食品を意味する。場合によっては、機能性食品、健康食品、健康補助食品の用語は混用される。前記食品は、TLR及びIL-6媒介性疾患の改善及び回復に有用な効果を得るために、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液体、丸薬などの様々な形態で製造できる。
【００６１】
このような機能性食品の具体的な例として、前記の組成物を用いて、農産物、畜産物又は水産物の特性を生かして変形させると同時に、貯蔵性をよくした加工食品を製造することができる。前記の組成物を含む健康機能食品は、特にこれに限定されないが、好ましくは、マーガリン、脂肪持続性(fat  continuous)又は水持続性(water  continuous)又は両方の持続性(bicontinuous)スプレッド、脂肪の減少したスプレッド、チョコレートやチョコレートのコーティング又はチョコレートの中身(fillings)、あるいは製菓の中身のような菓子類、アイスクリーム、アイスクリームコーティング、アイスクリーム含有物、ドレッシング、マヨネーズ、チーズ、クリーム代替物、乾燥スープ、ドリンク、シリアルバー、ソース、スナックバー、乳製品、臨床栄養食品、小児用食品などの形態で製造されたものを使用することができる。
【００６２】
もう一つの様態として、本発明は、前記化学式１で表される化合物又はその薬学的に許容される塩、又は、前記化学式１で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を含む赤小豆抽出物又はその分画物を有効成分として含む、TLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は改善用の個人衛生用品を提供する。
【００６３】
前記化学式１の化合物、赤小豆抽出物又はその分画物については、前述した通りであり、前記の有効成分は、TLR及びIL-6媒介性疾患を予防又は改善し得る個人衛生用品に含まれてもよい。この時、前記個人衛生用品は、特にこれに限定されないが、好ましくは、石鹸、化粧品、ウェットティッシュ、トイレットペーパー、シャンプー、スキンクリーム、フェイスクリーム、歯磨き粉、口紅、香水、メイク-アップ、ファンデーション、チーク、マスカラ、アイシャドウ、日焼け止めローション、ヘアケア製品、エアフレッシュナージェル、洗浄ジェルなどが挙げられる。
【００６４】
以下、本発明を実施例によって、より詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６５】
赤小豆抽出及び分画物の製造、並びに化学式１及び2の化合物の分離精製
実施例1-1  ：赤小豆抽出物の製造
赤小豆(小豆又はしま蔓小豆)は、水で十分に洗浄し、日陰で乾燥した後、ワーリングブレンダーで粉末化させた。粉末化された赤小豆20kgをメタノール100lに入れ、室温で3日間冷浸抽出した後、ろ紙(ワットマン社、米国)で減圧ろ過し、その後、ろ過抽出物は回転真空濃縮器で室温でメタノール溶媒を除去した後、抽出された残渣として赤小豆抽出物450gを製造した。
【００６６】
実施例1-2  ：分画物の製造
前記製造された赤小豆抽出物から活性分画物を分離するために、赤小豆抽出物を水1lに懸濁させ、同量のn-ヘキサンを加えて混合して分画し、この過程を4回繰り返して、水可溶性分画物1lとn-ヘキサン可溶性分画物4lを得た。
【００６７】
次いで、前記n-ヘキサン可溶性分画物を減圧濃縮し、n-ヘキサン可溶抽出物50gを得た。
【００６８】
また、前記水可溶分画物1lに同量の酢酸エチルを加え、混合して分画し、その過程を3回繰り返して、水可溶性分画物1lと酢酸エチル可溶性分画物3lを再び得た。
【００６９】
前記得られた酢酸エチル可溶性分画物を減圧濃縮し、酢酸エチル可溶抽出物35gを得て、残りの水可溶性分画を減圧濃縮し、35gを得てそれを水分画物として用いた。
【００７０】
実施例1-3  ：赤小豆抽出と分画物のHPLC分析
前記実施例1-1及び1-2で得たそれぞれの赤小豆抽出並びに分画物を個体とし、HPLC分析を行った。
【００７１】
ここで、HPLCにはアジレント・テクノロジー1200シリーズ(Agilent  Technologies  1200  series)を用い、分析用カラムはYMC社J'sphere  ODS-H80(YMC、4μm、4.6mm  IDx150mm)カラムを使用した(図1a及び1b)。この際、分析溶媒は5％〜90％  CH3CNを1ml/min流しながら、210nmで分析し、試料は10mlを注入した(表1)。
【００７２】
【表１】
0005932972.tif 000005
【００７３】
図1aは、小豆のメタノール抽出物、ヘキサン分画物、酢酸エチル分画物及び水分画物のHPLC実施結果を示すクロマトグラムであり、図1bは、しま蔓小豆のメタノール抽出物、ヘキサン分画物、酢酸エチル分画物及び水分画物のHPLC実施結果を示すクロマトグラムである。
【００７４】
前記図1a及び1bに示されるように、カテキン-7-グルコピラノシド(catechin-7-glu)、ルーチン(rutin)、オレアノール酸アセテート(oleanolic  acid  acetate、OAA)とスチグマステロール(stigmasterol)のピークはそれぞれ5.5、24.5、35.5、35.5分代に観察されており、小豆としま蔓小豆のHPLCのクロマトグラムは、相互に類似したパターンを示すことが確認できた。
【００７５】
実施例1-4  ：有効成分の精製
前記実施例1-2で得たn-ヘキサン分画物80gをヘキサン：酢酸エチル(100:1  →  1:1)で構成された段階濃度の勾配(step  gradient)溶媒システムを用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行って、5つの活性分画(分画1-5)を得た。前記の活性分画のうち3番と4番の分画にメタノールを加えて再結晶過程を行うことにより、白い粉末状を示す2種の化合物を精製した。
【００７６】
前記精製した2種の化合物を機器分析(1H-、13C-NMR、MS)及び文献の値(非特許文献２１、非特許文献２２)に適用することにより、それぞれオレアノール酸アセテート(化学式１)及びスチグマステロール(化学式２)であることが確認できた。
【００７７】
化学式１：オレアノール酸アセテート
0005932972.tif 000006
4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10S,12aR,14bS)-10-ヒドロキシ-2,2,6a,6b,9,9,12a-へプタメチル  -1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-テトラデカヒドロピセン  -4a-カルボキシル酸アセテート
【００７８】
化学式２：スチグマステロール
0005932972.tif 000007
【実施例２】
【００７９】
赤小豆抽出物、分画物及び化合物のpoly(I)又はpoly(I：C)処理によるNFkB/AP-1依存的SEAP活性阻害効果
THP1-Blue-CD14細胞を2×105cells/100mlの濃度で96ウェルプレートに接種し、37℃で3時間培養した。
【００８０】
試料として、実施例1-1〜1-2で得た赤小豆抽出物及び各分画物を細胞培養液に1時間前処理し、50mg/mlのPoly(I)又は100mg/mlのpoly(I：C)を処理することによって、NFkB/AP-1依存的SEAP活性阻害効果を測定した(図2及び図3)。
【００８１】
図2は、赤小豆のメタノール抽出物、ヘキサン分画物、酢酸エチル分画物及び水分画物のTHP-1-blue細胞でpoly(I)処理によって増加したSEAP活性阻害効果を示したグラフであり、図3は、赤小豆メタノール抽出物の、THP-1-blue細胞でpoly(I：C)処理によって増加したSEAP活性阻害効果を示したグラフである。
【００８２】
図2に示されるように、赤小豆のメタノール抽出物、ヘキサン分画物、酢酸エチル分画物及び水分画物がpoly(I)によって誘導されたSEAPの活性を有意に阻害することが確認され、図3に示されるように、poly(I：C)によって誘導されたSEAPの活性を赤小豆のメタノール抽出物が有意に阻害することが確認された。
【００８３】
また、赤小豆抽出物の起源によって違いを示すかどうかを確認するために、小豆に由来する抽出物としま蔓小豆に由来する95％及び50％メタノール抽出物を個体に、poly(I)及びpoly(I：C)によって誘導されたSEAPの阻害活性を測定した(表2及び3)。
【００８４】
【表２】
0005932972.tif 000008
【００８５】
【表３】
0005932972.tif 000009
【００８６】
前記表2及び表3に示されるように、赤小豆の種類(小豆やしま蔓小豆)に関係なく、95％メタノール抽出物は、poly(I)及びpoly(I：C)によって誘導されたSEAPの活性を有意に阻害したが、50％エタノール抽出物は、低い阻害活性を示すことが確認された。
【００８７】
一方、ヘキサン分画物から精製した化学式１のオレアノール酸アセテート又は化学式２のスチグマステロールのpoly(I)及びpoly(I：C)によって誘導されたSEAPの活性に及ぼす影響を調べた(表4)。
【００８８】
【表４】
0005932972.tif 000010
【００８９】
前記表4に示されるように、オレアノール酸アセテートは、poly(I)及びpoly(I：C)によって誘導されたSEAPの活性を有意に阻害したが、スチグマステロールはpoly(I)及びpoly(I：C)によって誘導されたSEAPの活性に対する阻害活性を示さなかっただけでなく、赤小豆の主要化合物として知られているカテキン-7-グルコピラノシド及びルーチンに対する阻害活性を検証した結果、poly(I)及びpoly(I：C)によって誘導されたSEAPの活性には影響を及ぼさないことが確認された。
【実施例３】
【００９０】
poly(I)又はpoly(I：C)によって誘導される炎症性因子発現に対する赤小豆メタノール抽出物の効果
赤小豆メタノール抽出物の、poly(I)及びpoly(I：C)によって誘導される炎症性因子発現の抑制効果を測定するために、ヒト末梢血単核球細胞株(Human  peripheral  blood  monocytic  cell  line)であるTHP-1を用いて、次のような実験を行った。
【００９１】
まず、poly(I)若しくはpoly(I：C)によって誘導される炎症性因子の抑制効果を測定するために、THP-1細胞を12ウェルプレートに各ウェル当り5×105細胞数となるよう分注し、FBSを添加していないRPMI  1640(ペニシリン100  ユニット、ストレプトマイシン100mg)培地で培養した。12時間後、赤小豆メタノール抽出物の、最終濃度が60mg/mlになるようにジメチルスルホキシド(DMSO)で希釈し、1時間前処理し、50mg/mlのpoly(I)又は100mg/mlのpoly(I：C)を処理し、37℃で6時間培養した。培養終了後、細胞をチューブに集め、遠心分離して培地を除去し、PBSで1回洗浄した後、RNeasy  Mini  Elute  Cleanup  kitを使用してRNAを抽出した。RNAの濃度と純度は、2100  Bioanalyzer  system(Agilent  Technologies)で測定し、Taqman  reverse  transcription  reagents  kit(Applied  Biosystems)を使用してcDNAを合成した。炎症性因子の発現程度は、SYBR  Green  PCR  master  mix  kit(Applied  Biosystem)を使用してリアルタイムPCRにより測定した(図6及び図7)。
【００９２】
図6は、赤小豆メタノール抽出物の、THP-1細胞でpoly(I)処理によって誘導された炎症性サイトカインの発現抑制効果を示すグラフであり、図7は、赤小豆メタノール抽出物の、THP-1細胞でpoly(I：C)処理によって誘導された炎症性サイトカインの発現抑制効果を示すグラフである。図6及び図7に示されるように、対照群に比べ、50mg/mlのpoly(I)を処理した群では炎症性因子であるTNFα、IL-6、MCP-1、RANTES、IFNβの発現が有意に増加し、100mg/mlのpoly(I：C)を処理した群で対照群と比較した時、炎症性因子であるTNF-α、IL-6、ICAM-1、MCP-1の発現が有意に増加することが確認できた。
【００９３】
これに反して、赤小豆メタノール抽出物(60mg/ml)を1時間前処理した群では、それぞれの炎症性因子のいずれにおいても、その数値が有意に抑制されることが示され、赤小豆メタノール抽出物が、poly(I)又はpoly(I：C)によって誘導された炎症性因子の発現を抑制するという事実を確認することができた。
【実施例４】
【００９４】
赤小豆メタノール抽出物によって調節されるTLR-7及びTLR-3シグナル伝達経路
TLRs(Toll-like  receptors)にそれぞれのリガンドが結合すると、MyD88又はTRIFアダプターがTLRsに移動するようになるが、リガンドとしてTLR7にはssRNAが、TLR3にはdsRNAが結合するようになると、細胞内にシグナル伝達が開始され、NFkBとMAPK/AP-1を共通して活性化させ、TLR3はIRF-3経路をさらに活性化させ、炎症性サイトカインを生成する。したがって、本発明の赤小豆抽出物がTLR7、TLR3のシグナル伝達経路に及ぼす影響を、次のような実験により確認した。
【００９５】
まず、THP-1細胞を各ウェル当り1.5×106細胞数となるように分注し、FBSを添加していないRPMI  1640培地に12時間培養した。その後、抽出物を30、60、又は100mg/mlの濃度で1時間前処理し、50mg/mlのpoly(I)又は100mg/mlのpoly(I：C)をそれぞれ3時間処理した。3時間後、細胞をチューブに移し、遠心分離によって培地を除去し、PBSで1回洗浄した後、NE-PER核抽出試薬(Thermo  scientific)と細胞溶解バッファー(Cell  lysis  buffer)を使用して核抽出物と総タンパク質を抽出し、ウエスタンブルロット分析を行った。前記の核抽出物では、NFkB  p65/p50及びp-c-Junを確認し、総タンパク質ではMAPKs、IKB、IKK  isoforms、IRF3を測定した(図4及び図5)。
【００９６】
図4aは、赤小豆メタノール抽出物の、THP-1細胞でpoly(I)処理によって活性化されて核に移動するNFκB  P50の活性を抑制する効果を示すウェスタンブロットの写真であり、図4bは、AP-1、C-Jun活性を抑制する効果を示すウェスタンブロットの写真であり、図4cは、IKKα/βのリン酸化抑制効果を示すウェスタンブロットの写真であり、図4dは、IκBのリン酸化抑制効果を示すウェスタンブロットの写真であり、図4eは、p38及びJNKのリン酸化抑制効果を示すウェスタンブロットの写真である。
【００９７】
また、図5aは赤小豆メタノール抽出物の、THP-1細胞でpoly(I：C)処理によって活性化されて核に移動するNFκBP65/p50の活性を抑制する効果を示すウェスタンブロットの写真であり、図5bは、AP-1のC-Jun活性を抑制する効果を示すウェスタンブロットの写真であり、図5cは、IKKα/βのリン酸化抑制効果を示すウェスタンブロットの写真であり、図5dは、IκBのリン酸化抑制効果を示すウェスタンブロットの写真であり、図5eは赤小豆メタノール抽出物の、THP-1細胞でpoly(I)処理によってリン酸化されるp38及びJNKのリン酸化抑制効果を示すウェスタンブロットの写真であり、図5fは、IRF3のリン酸化抑制効果を示すウェスタンブロットの写真である。
【００９８】
前記図4及び図5に示されるように、赤小豆抽出物がpoly(I)とpoly(I：C)によるNFkBとp-c-Junの核内移動を濃度依存的に減少させることを確認し(図4a、4b、5a及び5b)、NFkBの上流段階であるIKK、IkBの活性化も濃度依存的に減少させることを確認し(図4c、4d、5c及び5d)、AP-1の活性化の上流段階であるMAPKs、即ちJNK、p-38の活性化もまた、抽出物によって濃度依存的に減少していることを確認し(図4e及び5e)、TLR3のシグナル伝達で示されるP-IRF3の活性化にも赤小豆抽出物が濃度依存的な抑制活性を示すことを確認することができた(図5f)。
【００９９】
以上の結果を総合すると、赤小豆抽出物は、TLR-7とTLR-3のシグナル伝達経路でNFkBとMAPKs/AP-1の活性化を抑制させることにより、炎症性因子の発現を抑制するという事実を確認することができた。
【実施例５】
【０１００】
赤小豆抽出物、分画物及び化合物のIL-6によって誘導されるSTAT3の転写活性抑制効果
赤小豆抽出物、分画物及びこれから精製された各化合物のIL-6によって誘導されるSTAT3の発現抑制効果を確認した。
【０１０１】
実施例5-1  ：形質転換体の製造
Hep3B細胞(ATCC  HB-8064)にpStat3-LucとpcDNA3.1(+)(Clontech  laboratories、Palo  Alto、CA)をリポフェクタミンプラス(lipofectamin  plus、Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)で共に形質感染させた。２日後からハイグロマイシンを処理(100mg/ml)して、ルシフェラーゼが安定して発現されるクローンを得た。前記クローンからルシフェラーゼの安定して発現されるか否かはルシフェラーゼ分析法により確認した。
【０１０２】
実施例5-2：IL-6反応性STAT3レポーター遺伝子検査
前記実施例5-1で得たクローンに含まれる形質感染した細胞をDMEM(GIBCO  119950965)で無血清培養(serum  starvation)して試料を下記のように1時間処理した後、10ng/ml  IL  -6(R&D  system、USA)を添加して12時間培養した。
【０１０３】
1．陰性対照群(非処理群)
2．陽性対照群(IL-6  10ng/ml)、並びに
3．分画物(10、30、60mg/ml)及び混合物。
【０１０４】
前記培養された細胞をPBSで洗浄し、50ml溶解緩衝液(luciferase  assay  system、promega、USA)を入れて20分間攪拌した後、30〜100mlのルシフェラーゼ基質(luciferase  assay  system、promega、USA)を入れ、発色程度をルミノメーター(luminometer、EG  &  G  BERTHOLD  、USA)で5分以内で測定した(表5及び表6)。
【０１０５】
【表５】
0005932972.tif 000011
【０１０６】
前記表5に示されるように、赤小豆のメタノール抽出物、ヘキサン分画物、酢酸エチル分画物及び水分画物は、濃度依存的にSTAT3ルシフェラーゼ活性を阻害することが分かる。
【０１０７】
【表６】
0005932972.tif 000012
【０１０８】
上記表６に示されるように、小豆及びしま蔓小豆の、９５％及び50％エタノール抽出物は、濃度依存的にSTAT3ルシフェラーゼ活性を阻害することが分かる。
【０１０９】
一方、ヘキサン分画物から精製されたオレアノール酸アセテートとスチグマステロールによるSTAT3ルシフェラーゼ活性抑制の効果を測定した(表7)。
【０１１０】
【表７】
0005932972.tif 000013
【０１１１】
前記表7に示されるように、オレアノール酸アセテートとスチグマステロールは、濃度依存的にSTAT3ルシフェラーゼ活性を阻害し、IC50値はそれぞれ<1μMと90μMとに測定された。しかし、赤小豆の主要化合物として知られているカテキン-7-グルコピラノシドとルーチンは、STAT3ルシフェラーゼ阻害活性を示さないことが確認された。
【０１１２】
実施例5-3：IL-6誘導STAT3のリン酸化阻害活性の測定
6ウェルプレートに各ウェル当り5×105細胞数となるようHep3B細胞を分注し、培養皿に80％程度に培養した後、無血清培地に交換し、さらに12時間培養し、下記のとおり試料を60分間処理した。
1．陽性対照群(非処理群)
2．陽性対照群(IL-16  10ng/ml)
3．分画物(10、30  、又は60mg/ml)及び化合物1(3、6、10、又は30μM)
4．ゲニステイン処理群(100μM)。
【０１１３】
次に、20ng/mlIL-6を処理して20分間反応させた後、40mlml溶解緩衝液(pH8、20mM  トリス-HCl、137mM  NaCl、10％グリセリン、1％トリトンX-100、1mM  Na3VO4、2mM  EDTA、1mM  APMSF、20μMロイペプチン(leupeptin)、20mg/mlアプロトニン(aprotonin)、Sigma、USA)を用いて細胞を溶解した後、遠心分離(13000g、15分)し、タンパク質が含まれた上澄液を得た。タンパク質の濃度は、DCタンパク質検査キット(Bio-Rad  、USA)を用いて定量し、4〜12％  SDSポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)にタンパク質をロードして175mAで2時間電気泳動した。電気泳動終了後、ゲルのタンパク質をPVDFメンブレン(Westran  S、孔径  0.2mm、Whatman、USA)に35Vで90分間転写した。転写されたメンブレンをトリス緩衝液(T-TBS：50mM  トリス-HCl、pH7.6、150mM  NaCl、0.2％  Tween-20、5％脱脂乳、Sigma、USA)で室温にて1時間遮断し、T-TBSで5回洗浄した。前記メンブレンに一次抗体としてphospho-STAT3(1:1000希釈)のポリクローナル抗体を4℃で12時間処理した。T-TBSで5回洗浄した後、二次抗体としてHRP結合した抗マウス抗体(1:5000希釈)を1時間反応させた。T-TBSで洗浄した後、暗室でECLキット(Amersham、USA)を用いて、フィルムを現像した(図8a及び8b)。
【０１１４】
図8aは赤小豆メタノール抽出物のHep3B細胞でIL-6処理によって誘導されるSTAT3リン酸化を阻害する効果を示す写真であり、図8bは、赤小豆から分離精製された化合物1のHep3B細胞でIL-6処理によって誘導されるSTAT3リン酸化を阻害する効果を示す写真である。
【０１１５】
図8a及び8bに示されるように、赤小豆抽出物及び化学式１の化合物は、IL-6誘導STAT3のリン酸化阻害活性を示すことが確認された。
【実施例６】
【０１１６】
赤小豆メタノール抽出物のアトピー性皮膚炎に対する症状改善効果
実験動物モデルに使用される特定病原体除去(Specific  Pathogen  Free、SPF)NC/NgaマウスはSLC,  Inc.(Japan)から購入し、実験を行うために、これらのマウスを一定の温度(23±3℃)、湿度(55±15％)及び照射量(7:00時から19:00時まで)の下で飼育した。購入後、生後8週齢の雌NC/NgaマウスをSPF動物飼育室で1週間安静にさせた後、実験に使用した。
【０１１７】
NC/Ngaマウスは、大きく3つの実験群に分けた。具体的には、[1]アトピー性皮膚炎を誘発していない陰性対照群、[2]アトピー性皮膚炎誘発及び非投与対照群、及び[3]アトピー性皮膚炎誘発及び投与群とした。
【０１１８】
活性評価用試料である赤小豆メタノール抽出物は、100％エタノールを用いて溶かした後、飼料に添加して2週間個体に容量別に摂取するようにした。2週間後にアトピー性皮膚炎を誘発するために、1％濃度のDNCB(2,4-ジニトロクロロベンゼン)を0.2％に希釈し、100mlを4日間隔で全実験期間中にわたりNC/Ngaマウスの背中の皮膚全体に塗布し、感作させた。DNCBを塗布した後、アトピー性皮膚炎誘発及び非投与対照群並びに投与群のNC/Ngaマウスと比較して、皮膚の重症度(skin  severity)を調べた。
【０１１９】
アトピー性皮膚炎の皮膚の重症度(skin  severity)は、紅斑(erythema)、浮腫(edema)、乾燥度(dryness)、表皮剥離症(excoriation)の程度を臨床的指標にして、それぞれの症状について数値化した後、これらの値を実験群の平均値で示した。それぞれの症状についての値は肉眼での観察により、症状に応じて軽(点数1)、通常(点数2)、重い(点数3)で表記しており、皮膚重症度は以下の式を計算した値を示した(図9及び10)。
【０１２０】
皮膚の重症度=  Σ個体の(紅斑+浮腫+乾燥度+表皮剥離症)/個体数
図9は、赤小豆メタノール抽出物の、NC/NgaマウスでDNCBによって誘導されるアトピー性皮膚炎の症状が改善される効果をNC/Ngaマウスの背中の皮膚で表した写真であり、図10は、赤小豆メタノール抽出物の、NC/NgaマウスでDNCBによって誘導されるアトピー性皮膚炎の症状が改善される効果を皮膚の重症度で表したグラフである。
【０１２１】
図9及び10に示されるように、アトピー性皮膚炎を誘発していない陰性対照群は、アトピー性皮膚炎を含むいかなる臨床症状も観察されなかったが、アトピー性皮膚炎誘発及び非投与対照群では、DNCBを塗布した後、7日齢から紅斑及び浮腫などの症状を含むアトピー性皮膚炎の症状が発生することが確認された。
【０１２２】
一方、アトピー性皮膚炎誘発及び投与群は、赤小豆メタノール抽出物を、１日間50mg/kg、250mg/kg、500mg/kgの濃度で摂取するようにした結果、それぞれの投与群の全てにおいてアトピー性皮膚炎誘発及び非投与対照群に比べて、紅斑、浮腫などのアトピー性皮膚炎の症状が改善される効果を確認することができた。
【実施例７】
【０１２３】
赤小豆メタノール抽出物の血液中の好酸球(eosinophil)数値の減少効果
実施例6のアトピー性皮膚炎を誘発していない陰性対照群、アトピー性皮膚炎誘発及び非投与対照群、そしてアトピー性皮膚炎誘発及び投与群に対する好酸球数値の変化について調べた。
【０１２４】
具体的には、DNCBを塗布し始めた最初の日から22日後、それぞれの実験群のNC/Ngaマウスを犠牲にして血液中の好酸球数値を自動血液分析装置(Automated  Hematology  Analyzer)を用いて測定した(図11)。
【０１２５】
図11は、赤小豆メタノール抽出物の、NC/NgaマウスでDNCBによって誘導されるアトピー性皮膚炎に対する血液中の好酸球の変化を数値で示すグラフである。図11に示されるように、アトピー性皮膚炎を誘発していない陰性対照群に比べてアトピー性皮膚炎誘発及び非投与対照群では好酸球(eosinophil)の数値が増加しており、アトピー性皮膚炎誘発及び投与群は赤小豆メタノール抽出物を、１日間50mg/kg、250mg/kg、500mg/kgの濃度で摂取するようにした結果、それぞれの投与群のいずれにおいても好酸球(eosinophil)の数値がアトピー性皮膚炎誘発及び非投与対照群に比べて減少していることが確認できた。
【実施例８】
【０１２６】
赤小豆メタノール抽出物の、コラーゲン誘導によるCIA関節炎マウスの症状改善効果
まず、雌6週齢のDBA/1  OlaHsdマウス(15〜20g)がHArlan(San  Jese  、CA、USA)社から供給され、マウスは実験当日まで固形飼料(抗生物質無添加、サムヤン飼料Co.)と水を十分に供給し、温度22±2℃、湿度55±15％、12時間(明暗周期)の環境で1週間適応させた後、それ以降の実験に使用した。
【０１２７】
次に、前記適応されたDBA/1  OlaHsdマウスを用いて、リウマチ性関節炎マウス(CIA)モデルを製造した。
【０１２８】
具体的には、DBA/1  OlaHsdマウス6匹を一つの群として、関節炎を誘発させていない通常群とCIAで誘発させ、薬物を処理していない対照群及びメトトレキサート(2mg/kg)処理群、赤小豆メタノール抽出物処理群(100mg/kg)に分けた。CIA誘発は、8週齢のDBA/1  OlaHsdマウスに100mgのウシ２型コラーゲンと0.1mlアジュバント(Complete  Freund's  Adjuvants)を混合して、マウスの尾の上側の部位に皮下注射し、21日後に同量をブースト(boost)し、CIAモデルを製造した。
【０１２９】
最後に、前記製造されたCIAモデルに赤小豆メタノール抽出物を投与して関節炎指標(Arthritis  index、AI)及び罹患率の分析を行った。
【０１３０】
具体的には、正常群と対照群には生理食塩水を毎日1回、それぞれ0.1mlずつ経口の注射し、MXT処理群はMXTを2mg/kgの濃度で投与し、赤小豆メタノール抽出物(100mg/kg)処理群は、赤小豆メタノールを毎日午前11時に経口投与した。続いて、2型コラーゲンでブーストし、DBA/1  OlaHsdマウスの各4つの足(paw)において関節炎の兆候について、以下の基準で罹患率(incidence、％)を決定し、下記の表8に図示されたCIA誘発の程度の指標に基づいてマウスの症状を1週間に1回ずつ記録した(図12及び図13)。
【０１３１】
【表８】
0005932972.tif 000014
【０１３２】
図12は、通常のDBA/1  OlaHsdとCIA発生マウスモデルの前肢と後肢の状態を示す写真であり、図13は、赤小豆メタノール抽出物の、DBA/1  OlaHsdマウスでCIAで誘発させた関節炎に対する症状の改善効果をCIA誘発の程度で示したグラフである。
【０１３３】
前記図13に示されるように、赤小豆メタノール抽出物は、DBA/1  OlaHsdマウスにCIAで関節炎を誘発させたモデルにおいて、対照群と比較してCIA発生程度を改善させる効果を示すことが確認できた。
【実施例９】
【０１３４】
IL-6誘導STAT3リン酸化阻害活性の測定によるオレアノール酸とオレアノール酸アセテートの活性の比較
上述した実施例により、赤小豆に由来する本発明のオレアノール酸アセテートがTLR及びIL-6媒介性疾患の予防又は治療に効果を示し得ることが確認された。このような本発明のオレアノール酸アセテートが、既存のオレアノール酸に比べて顕著な効果を有する特異的誘導体であることを確認するために、本発明のオレアノール酸アセテートが公知オレアノール酸に比べて活性面において如何なる違いを示すかについて、前記実施例5-2の方法を用いて確認を試みた。
【０１３５】
具体的には、試料としてオレアノール酸又はオレアノール酸アセテートをそれぞれ0.1、1、3、6、又は10μMで処理することを除いては、実施例5-2と同様の方法を行い、STAT3ルシフェラーゼ活性に対するオレアノール酸又はオレアノール酸アセテートの阻害効果を測定し、相互に比較した(図14)。
【０１３６】
図14は、オレアノール酸又はオレアノール酸アセテートの濃度に応じた、Hep3B細胞でIL-6処理によって誘導されるSTAT3ルシフェラーゼ活性を阻害する効果を示したグラフである。図14に示されるように、本発明のオレアノール酸アセテートは、IC50  =  0.9μMの阻害活性を示す反面、公知のオルレアノール酸10μMでも約14％の阻害活性を示したに過ぎないことが分かる。
【０１３７】
したがって、本発明のオレアノール酸アセテートは、公知のオレアノール酸よりも著しく優れた炎症性疾患の予防及び治療効果を示し得ることが確認された。
【実施例１０】
【０１３８】
RNAKLによって誘導される破骨細胞の分化に及ぼす赤小豆抽出物及びオレアノール酸アセテートの効果
5週齢のマウスの大腿骨と脛骨を分離し、髄腔を1  cc注射器で水洗いして骨髄細胞を得た。分離された骨髄細胞は10％  FBS、抗生物質、M-CSF(30ng/ml)を含むα-MEM(α-minimum  essential  medium)培地で3日間培養した。3日後、付着した細胞を骨髄マクロファージ（bone  marrow  macrophage、BMM)として用いた。骨髄マクロファージはM-CSF(30  ng/ml)と破骨細胞分化因子であるRNAKL(Receptor  activator  of  nuclear  factor  kappa-B  ligand)(50  ng/ml)を添加して培養し、赤小豆抽出物及びオレアノール酸アセテートを濃度別に処理した。4日後、培養した細胞は、TRAP溶液(Sigma  Aldrich、USA)で染色し、赤色に染色された細胞を分化した破骨細胞であると判断した。
【０１３９】
その結果、赤小豆抽出物及びオレアノール酸アセテートを処理した実験群では破骨細胞の分化を抑制することを確認した。図15及び16は、それぞれ赤小豆メタノール抽出物及びオレアノール酸アセテートがマウス骨髄細胞から分離した骨髄マクロファージが破骨細胞に分化するのを阻害する効果を示す写真である。前記図15に示されるように、赤小豆抽出物を処理していない対照群の細胞では、TRAP陽性多核破骨細胞が良く形成されていることが確認できたが、赤小豆抽出物を処理した実験群では、濃度依存的に破骨細胞の大きさと数が減少することが確認できた。特に、50mg/mlの濃度では著しく破骨細胞の分化が減少することが確認できた。また、図16に示されるように、オレアノール酸アセテートを処理した群でも、破骨細胞の分化を著しく抑制することが確認されており、特に10μMの低い濃度でも顕著な効果を示すことが確認された。
【０１４０】
したがって、本発明の赤小豆抽出物及びオレアノール酸アセテートは、破骨細胞の分化を抑制することにより、骨粗しょう症の予防及び治療に顕著な効果があることが分かる。
【０１４１】
製剤例1  ：散剤の製造
オレアノール酸アセテート、それを含む赤小豆抽出物又は前記抽出物の分画物0.1g、ラクトース1.5g及びタルク0.5gを混合し、気密布に充填して散剤を製造した。
【０１４２】
製剤例2  ：錠剤の製造
オレアノール酸アセテート、それを含む赤小豆抽出物又は前記抽出物の分画物0.1g、ラクトース7.9g、結晶性セルロース1.5g及びステアリン酸マグネシウム0.5gを混合し、直打法(direct  tableting  method)によって有効成分を50mg含む500mgの錠剤を製造した。
【０１４３】
製剤例3  ：粉末製剤の製造
オレアノール酸アセテート、それを含む赤小豆抽出物又は前記抽出物の分画物0.1g、コーンスターチ5gとカルボキシセルロース4.9gをよく混合して粉末を製造し、硬質カプセルに前記粉末500mgを入れてカプセル剤を製造した。
【０１４４】
製剤例4  ：注射剤の製造
通常の注射剤の製造方法に従って、オレアノール酸アセテート、それを含む赤小豆抽出物又は前記抽出物の分画物0.1gと適量の注射用滅菌蒸留水及びpH調整剤を含む2ml容量の注射アンプルを製造した。
【０１４５】
製剤例5  ：液剤の製造
通常の液剤の製造方法に従って、精製水にオレアノール酸アセテート、それを含む赤小豆抽出物又は前記抽出物の分画物0.1g、異性化糖10g及びマンニトール5gを加えて溶解し、レモンの香りを適量加えた後、前記成分を混合し、その後精製水を加えて全体の体積を100mlに調節した後、褐色瓶に充填し滅菌して液剤を製造した。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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