(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光性人工塩基又は蛍光性分子の蛍光を消光する消光剤であって、式Ｉで示す２−ニトロピロール構造を有する消光剤
【化１】
0005874152.tif 000044
［式Ｉにおいて、Ｒ１及びＲ２は
リボース、デオキシリボース、
水素、水酸基、ＳＨ基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数２ないし１０のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、１又は複数の５員ヘテロ環、１又は複数の６員ヘテロ環、１又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子
からなる群から独立に選択される基である］。
【請求項２】
式Ｉにおいて、Ｒ１がリボースまたはデオキシリボースである、請求項１に記載の消光剤。
【請求項３】
人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、蛍光性人工塩基と式ＩＩ
【化２】
0005874152.tif 000045
［式ＩＩにおいて、Ｒ２は、
水素、水酸基、ＳＨ基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数２ないし１０のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、１又は複数の５員ヘテロ環、１又は複数の６員ヘテロ環、１又は複数の複素環ヘテロ環、1又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子、
からなる群から選択される基である］
で表される消光性人工塩基との塩基対形成により、蛍光性人工塩基の蛍光の低下を観察することにより、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
【請求項４】
蛍光性人工塩基の蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、以下の
（ｉ）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）；
（ｉｉ）７−（２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓｓ）；
（ｉｉｉ）２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓ）；
（ｉｖ）２−アミノ−６−（２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓｓ）；
（ｖ）４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｓ）；
（ｖｉ）４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｖ）；及び
（ｖｉｉ）４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｖａｓ）；
からなる群より選択される蛍光性人工塩基と、
以下の式ＩＩＩ，又は式ＩＶの消光性塩基
【化３】
0005874152.tif 000046
［式ＩＩＩにおいて、Ｒ３は、
−Ｈ、ヨード、−ＣＨ３、
【化４】
0005874152.tif 000047
から選択される］
【化５】
0005874152.tif 000048
［式ＩＶにおいて、Ｒ４は、
−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＮＨ２、及び
【化６】
0005874152.tif 000049
（ここにおいて、ｎは０ないし１２のいずれかの整数である）
から選択される］
との間で塩基対が形成されると、蛍光性人工塩基の蛍光が低下し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
【請求項５】
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー；並びに、
以下の式ＩＩＩ，又は式ＩＶの消光性塩基
【化７】
0005874152.tif 000050
［式ＩＩＩにおいて、Ｒ３は、
−Ｈ、ヨード、−ＣＨ３、
【化８】
0005874152.tif 000051
から選択される］
【化９】
0005874152.tif 000052
［式ＩＶにおいて、Ｒ４は、
−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＮＨ２、及び
【化１０】
0005874152.tif 000053
（ここにおいて、ｎは０ないし１２のいずれかの整数である）
から選択される］
を塩基として有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光性人工塩基であるＤｓｓの蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。
【請求項６】
人工塩基対が形成されたことを検出する方法であって、
式Ｖ
【化１１】
0005874152.tif 000054
［式Ｖにおいて、Ｒ５は、リンカーを介して結合した蛍光性分子である］
で表される消光性人工塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が、式Ｖの人工塩基が塩基対を形成することによって増加し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
【請求項７】
蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）と、以下の式ＶＩの塩基：
【化１２】
0005874152.tif 000055
［式ＶＩにおいて、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］との間で塩基対が形成されると、
式ＶＩの塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が増加し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
【請求項８】
蛍光性分子が、インドカルボシアニン（Ｃｙ３）、インドジカルボシアニン（Ｃｙ５）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなる群から選択される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）を塩基として有するポリヌクレオシドを含む、核酸プライマー、並びに、
式ＶＩの塩基：
【化１３】
0005874152.tif 000056
［式ＶＩにおいて、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］を塩基として有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。
【請求項１０】
人工塩基対の形成を検出する方法であって、
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）又は静的消光作用の供与体となりうる自己消光性を有する、ｓ、ｓｓ、Ｄｓｓ、若しくはＤｓｓｓを１以上結合した天然塩基である天然塩基修飾体、或いは、ｓ、ｓｓ、Ｄｓｓ、若しくはＤｓｓｓである人工塩基を有するポリヌクレオシドを含む核酸を利用し、当該核酸中の人工塩基（第一人工塩基）と蛍光性分子を有する人工塩基（第二人工塩基）との間で人工塩基対が形成されると、前記天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドから、第二人工塩基の有する蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じて、蛍光スペクトル変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
【請求項１１】
蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）と、以下の式ＶＩの塩基：
【化１４】
0005874152.tif 000057
［式ＶＩにおいて、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］との間で塩基対が形成されると、
２４０−４１０ｎｍの紫外線による励起により、Ｄｓｓから式ＶＩの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じて、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
【請求項１２】
蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）と、以下の式ＶＩの塩基：
【化１５】
0005874152.tif 000058
［式ＶＩにおいて、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］との間で塩基対が形成されると、
２４０−３９０ｎｍの紫外線による励起により、少なくとも１つの２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）から、式ＶＩの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じ、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Ｄｓを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）を塩基として有するポリヌクレオチドが少なくとも１つ存在する、
前記方法。
【請求項１３】
蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）と、以下の式ＶＩの塩基：
【化１６】
0005874152.tif 000059
［式ＶＩにおいて、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］との間で塩基対が形成されると、
３５０−３９０ｎｍの紫外線による励起により、少なくとも１つの２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）から、式ＶＩの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じて蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Ｄｓを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも１つの２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが少なくとも１つ存在する、
前記方法
【請求項１４】
蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）と、以下の式ＶＩの塩基：
【化１７】
0005874152.tif 000060
［式ＶＩにおいて、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］との間で塩基対が形成されると、
２４０−４１０ｎｍの紫外線による励起により、７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）から、式ＶＩの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用が生じて蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Ｄｓを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少
なくとも１つの７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが存在する、
前記方法。
【請求項１５】
蛍光性分子が、インドカルボシアニン（Ｃｙ３）、インドジカルボシアニン（Ｃｙ５）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなる群から選択される、請求項１０ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
式ＶＩの塩基中の置換基Ｒ６が以下の：
【化１８】
0005874152.tif 000061
の構造を有する、請求項１１−１４に記載の方法。
【請求項１７】
蛍光スペクトルの変化が、肉眼で判定できる、請求項１０ないし１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
核酸の塩基対が、転写、逆転写、複製又は翻訳の工程で形成される、請求項１０ないし１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
以下のｉ）−ｉｖ）からなる群から選択される、１つの核酸プライマー；
ｉ）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー；
ｉｉ）７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも１つの、２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｓ）を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー；
ｉｉｉ）７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも１つの、２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｓ）が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー；及び
ｉｖ）７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー、
並びに、式ＶＩの塩基：
【化１９】
0005874152.tif 000062
［式ＶＩにおいてここで、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］
を塩基として有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光共鳴エネルギー転移又は静的消光作用による蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年４月２１日に提出された日本国出願特願２０１０−０９８３１９に基づく優先権を主張し、その全内容は本明細書中に取り込まれる。
本発明は、消光性ならびに蛍光性の核酸塩基類似体とその応用に関する。
具体的には、本発明は、２−ニトロピロールとその１位と４位修飾体、ならびにそれらのヌクレオシド誘導体が消光性の分子あるいは核酸塩基類似体として機能することの発見とその利用に関するものであり、ＰＣＲ産物の可視化などの幅広い検出・診断に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
人工的に新たな塩基対を作り出しＤＮＡの遺伝情報を拡張する技術は、汎用性の高い２つの応用が考えられ、人工塩基対の開発研究が盛んに行われている。応用の１つは、複製・転写・翻訳で機能する人工塩基対を作り出し、新たな構成成分を組み込んだＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質を作り出すことである。もう１つの応用は、人工塩基対をＤＮＡやＲＮＡに組み込んだ二本鎖核酸を形成させることで、核酸断片のプローブの配列種を増やすことによりリアルタイムＰＣＲによるマルチプレックスやＤＮＡコンピュータへの応用、さらに翻訳でタンパク質中に人工のアミノ酸を導入する際の新たなコドンとアンチコドンに用いることができる。【０００３】
蛍光性を示す核酸塩基類似体は数多く報告されているが、核酸塩基の類似体自身が強い消光作用を示す物質はこれまで知られていない。従来、核酸塩基にリンカーを介してダブシル基などの消光性分子を結合させる方法が知られている。しかしながら、この場合には塩基対を形成する塩基が、近傍に位置する蛍光性分子とは完全に接していないので、消光作用が弱くなり、その検出は装置に頼らないと不可能であった。本発明前は、塩基の消光作用を利用した塩基対の簡便かつ効率的な検出方法はみいだされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００９／１２３２１６
【特許文献２】特願２００９−２３２７７６（２００９年１０月６日出願）
【特許文献３】特開２００７−０６１０８７
【特許文献４】特願２００９−２３２８５１（２００９年１０月６日出願）
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｉ．Ｈｉｒａｏ，Ｔ．Ｍｉｔｓｕｉ，Ｍ．Ｋｉｍｏｔｏ，Ｓ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９，１５５４９−１５５５５（２００７）．
【非特許文献２】Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｍ．Ｋｉｍｏｔｏ，Ｒ．Ｋａｗａｉ，Ｔ．Ｍｉｔｓｕｉ，Ｓ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｉ．Ｈｉｒａｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３７，ｅ１４（２００９）．
【非特許文献３】Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ，ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ．Ｔ．Ｍｉｔｓｕｉ，Ｍ．Ｋｉｍｏｔｏ，Ｒ．Ｋａｗａｉ，Ｓ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｉ．Ｈｉｒａｏ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６３，３５２８−３５３７（２００７）．
【非特許文献４】Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｉｎｇ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ−ｐａｉｒ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｍ．Ｋｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ｍｉｔｓｕｉ，Ｙ．Ｈａｒａｄａ，Ａ．Ｓａｔｏ，Ｓ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｉ．Ｈｉｒａｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３５，５３６０−５３６９（２００７）．
【非特許文献５】３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ  ａｎｄ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＰＣＲ．Ｄ．Ｌｏａｋｅｓ，Ｄ．Ｗ．Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｌｉｎｄｅ，ａｎｄ  Ｆ．Ｈｉｌｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，２３６１−２３６６（１９９５）．
【非特許文献６】Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｓｙｓｔｅｍ：ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｉｎｔｏ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ．Ｉ．Ｈｉｒａｏ，Ｍ．Ｋｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ｍｉｔｓｕｉ，Ｔ．Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｒ．Ｋａｗａｉ，Ｓａｔｏ，Ｙ．Ｈａｒａｄａ，Ｓ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３，７２９−７３５（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、消光性を示す塩基を見いだし、そして、蛍光性を示す塩基と消光性を示す塩基とが選択的に塩基対を形成すれば、ＤＮＡが二本鎖を形成すると蛍光性人工塩基を強く消光させることができる可能性があり、ＰＣＲにおけるＤＮＡ増幅やモレキュラービーコンなどで目視判定が可能な検出技術を作り出すことができると考え、本発明に想到した。【０００７】
２−ニトロピロール誘導体は、本発明者らがこれまで開発してきた人工塩基対のＰｎやＰｘで表される塩基である。ＰｎやＰｘは、第三の核酸塩基対（人工塩基対）として、その相補人工塩基（Ｄｓ：７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基）と塩基対（Ｄｓ−Ｐｎ、Ｄｓ−Ｐｘ塩基対）を形成し、複製や転写で核酸中の特定部位に導入できることが示されている。また、蛍光性の人工塩基としてＤｓの改良塩基であるＤｓｓ（７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン）とも２−ニトロピロールが塩基対を形成する。【０００８】
本発明者らは本発明において、２−ニトロピロールに消光性があることを初めて明らかにした。例えば、ＰｎやＰｘが二本鎖ＤＮＡ中でＤｓｓと塩基対を形成すると２−ニトロピロールの消光性によりＤｓｓの蛍光が消光されることを見いだした。なお、２−ニトロピロールに類似の３−ニトロピロールは、ユニバーサル塩基として知られているが、本発明の２−ニトロピロールと異なり消光作用は低い。【０００９】
ＤｓｓとＰｎ（あるいはＰｘ）の塩基対を含む二本鎖核酸は、蛍光性のＤｓｓに消光性のＰｎ（あるいはＰｘ）が塩基対として接しているので、Ｄｓｓの蛍光は効率よく消光される。しかし、二本鎖構造が一本鎖のＤＮＡに変性した場合は、Ｄｓｓを含むＤＮＡ鎖が発光する。このような人工塩基対はこれまでに例が無く、この性質を利用して、新たなモレキュラービーコンなどの検出・診断技術が可能になった。【００１０】
２−ニトロピロールの４位にリンカーを介して蛍光色素を結合させると、そのヌクレオシドやヌクレオチド誘導体（Ｐｘの誘導体）は２−ニトロピロールと色素が相互作用することによりその蛍光がある程度消光されることが分かった。しかしこのヌクレオチド誘導体がＤＮＡやＲＮＡ中に導入されると、２−ニトロピロールと相互作用していた色素部分がＤＮＡやＲＮＡ断片中の外側に飛び出すので、本来の蛍光強度が復活することも見出した。また、このＰｘの誘導体の基質（ヌクレオシド三リン酸）は、鋳型中の人工塩基Ｄｓに相補して、複製によりＤＮＡ中に導入できる。これらのＰｘ誘導体の蛍光変化の特性と複製におけるＤＮＡ中への部位特異的な取り込みを利用することにより、リアルタイムＰＣＲなどの検出・診断技術に本技術を利用することができる。【００１１】
また、発明者らが別途開発した蛍光性人工塩基（ｓ）と本Ｄｓ−Ｐｘ塩基対を組み合わせることにより、ＤＮＡのＰＣＲ増幅の可視化法を新たに開発した。この可視化ＰＣＲは、ＤＮＡ増幅を裸眼で識別できるため、従来のリアルタイムＰＣＲでは不可能であった臨床現場での迅速・簡便なＰＣＲ診断法として用いることができ、テーラーメイド医療を目指したコンパニオン診断薬としての道を開く。また、本技術による特定のＤＮＡ配列の検出は、医療に限らず、ビールなどの発酵食品の品質管理（酵母の遺伝子変異を検出）や輸入食材の流通管理（食品の遺伝子による真贋判定）などにも応用できる。【００１２】
以上より、限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
式Ｉで示す２−ニトロピロール構造を有する消光剤【００１３】
【化１】
0005874152.tif 000002
【００１４】
［式Ｉにおいて、Ｒ１及びＲ２は
リボース、デオキシリボース、
水素、水酸基、ＳＨ基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数２ないし１０のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、１又は複数の５員ヘテロ環、１又は複数の６員ヘテロ環、１又は複数の複素環ヘテロ環、１又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子
からなる群から独立に選択される基である］。
［態様２］
式Ｉにおいて、Ｒ１がリボースまたはデオキシリボースである、態様１に記載の消光剤。
［態様３］
人工塩基対の形成を検出する方法であって、
１）式ＩＩ【００１５】
【化２】
0005874152.tif 000003
【００１６】
［式ＩＩにおいて、Ｒ２は、
水素、水酸基、ＳＨ基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数２ないし１０のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、１又は複数の５員ヘテロ環、１又は複数の６員ヘテロ環、１又は複数の複素環ヘテロ環、１又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子、
からなる群から選択される基である］
で表される消光性人工塩基を有するヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいは、
２）蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオチド
のいずれか、あるいは双方を用いることを特徴とする、前記方法。
［態様４］
人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、蛍光性人工塩基と式ＩＩ【００１７】
【化３】
0005874152.tif 000004
【００１８】
［式ＩＩにおいて、Ｒ２は、
水素、水酸基、ＳＨ基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数２ないし１０のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、１又は複数の５員ヘテロ環、１又は複数の６員ヘテロ環、１又は複数の複素環ヘテロ環、１又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子、
からなる群から選択される基である］
で表される消光性人工塩基との塩基対形成により、蛍光性人工塩基の蛍光の低下を観察することにより、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
［態様５］
蛍光性人工塩基の蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、以下の、
（ｉ）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）；
（ｉｉ）７−（２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓｓ）；
（ｉｉｉ）２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓ）；
（ｉｖ）２−アミノ−６−（２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓｓ）；
（ｖ）４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｓ）；
（ｖｉ）４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｖ）；及び
（ｖｉｉ）４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｖａｓ）；
からなる群より選択される蛍光性人工塩基と、
以下の式ＩＩＩ，又は式ＩＶの消光性塩基【００１９】
【化４】
0005874152.tif 000005
【００２０】
［式ＩＩＩにおいて、Ｒ３は、
−Ｈ、ヨード、−ＣＨ３、【００２１】
【化５】
0005874152.tif 000006
【００２２】
から選択される］【００２３】
【化６】
0005874152.tif 000007
【００２４】
［式ＩＶにおいて、Ｒ４は、
−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＮＨ２、及び【００２５】
【化７】
0005874152.tif 000008
【００２６】
（ここにおいて、ｎは０ないし１２のいずれかの整数である）
から選択される］
との間で塩基対が形成されると、蛍光性人工塩基の蛍光が低下し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
［態様６］
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー；並びに、
以下の式ＩＩＩ、又は式ＩＶの消光性塩基【００２７】
【化８】
0005874152.tif 000009
【００２８】
［式ＩＩＩにおいて、Ｒ３は、
−Ｈ、ヨード、−ＣＨ３、【００２９】
【化９】
0005874152.tif 000010
から選択される］【００３０】
【００３１】
【化１０】
0005874152.tif 000011
【００３２】
［式ＩＶにおいて、Ｒ４は、
−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＮＨ２、及び【００３３】
【化１１】
0005874152.tif 000012
【００３４】
（ここにおいて、ｎは０ないし１２のいずれかの整数である）
から選択される］
を塩基として有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光性人工塩基の蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。
［態様７］
人工塩基対を検出する方法であって、
式Ｖ【００３５】
【化１２】
0005874152.tif 000013
【００３６】
［式Ｖにおいて、Ｒ５は、リンカーを介して結合した蛍光性分子である］
で表される消光性人工塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が、式Ｖの人工塩基が塩基対を形成することによって変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
［態様８］
蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）と、以下の式ＶＩの塩基：【００３７】
【化１３】
0005874152.tif 000014
【００３８】
［式ＶＩにおいて、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］との間で塩基対が形成されると、
式ＶＩの塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が増加し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
［態様９］
蛍光性分子が、インドカルボシアニン（Ｃｙ３）、インドジカルボシアニン（Ｃｙ５）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなる群から選択される、態様７又は８に記載の方法。
［態様１０］
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）を塩基として有するポリヌクレオシドを含む、核酸プライマー、並びに、
式ＶＩの塩基：【００３９】
【化１４】
0005874152.tif 000015
【００４０】
［式ＶＩにおいて、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］を塩基として有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。
［態様１１］
人工塩基対の形成を検出する方法であって、
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドを含む核酸を利用し、当該核酸中の人工塩基（第一人工塩基）と蛍光性分子を有する人工塩基（第二人工塩基）との間で人工塩基対が形成されると、前記天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドから、第二人工塩基の有する蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）により、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
［態様１２］
蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）と、以下の式ＶＩの塩基：【００４１】
【化１５】
0005874152.tif 000016
【００４２】
［式ＶＩにおいて、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］との間で塩基対が形成されると、
２４０−４１０ｎｍの紫外線による励起により、Ｄｓｓから式ＶＩの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などが生じて、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法。
［態様１３］
蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）と、以下の式ＶＩの塩基：【００４３】
【化１６】
0005874152.tif 000017
【００４４】
［式ＶＩにおいて、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］との間で塩基対が形成されると、
２４０−３９０ｎｍの紫外線による励起により、少なくとも１つの２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）から、式ＶＩの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などにより、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Ｄｓを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）を塩基として有するポリヌクレオチドが少なくとも１つ存在する、前記方法。
［態様１４］
蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）と、以下の式ＶＩの塩基：【００４５】
【化１７】
0005874152.tif 000018
【００４６】
［式ＶＩにおいて、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］との間で塩基対が形成されると、
３５０−３９０ｎｍの紫外線による励起により、少なくとも１つの２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）から、式ＶＩの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などにより蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Ｄｓを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも１つの２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが少なくとも１つ存在する、
前記方法。
［態様１５］
蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法であって、
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）と、以下の式ＶＩの塩基：【００４７】
【化１８】
0005874152.tif 000019
【００４８】
［式ＶＩにおいて、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］との間で塩基対が形成されると、
２４０−４１０ｎｍの紫外線による励起により、７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）から、式ＶＩの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（static quenching）などにより蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Ｄｓを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも１つの７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが存在する、
前記方法。
［態様１６］
蛍光性分子が、インドカルボシアニン（Ｃｙ３）、インドジカルボシアニン（Ｃｙ５）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなる群から選択される、態様１１ないし１５のいずれか１項に記載の方法。
［態様１７］
式ＶＩの塩基中の置換基Ｒ６が以下の：
【００４９】
【化１９】
0005874152.tif 000020
【００５０】
の構造を有する、態様１２−１５に記載の方法。
［態様１８］
蛍光スペクトルの変化が、肉眼で判定できる、態様１１ないし１７のいずれか１項に記載の方法。
［態様１９］
核酸の塩基対が、転写、逆転写、複製又は翻訳の工程で形成される、態様１１ないし１８のいずれか１項に記載の方法。
［態様２０］
以下のｉ）−ｉｖ）からなる群から選択される、１つの核酸プライマー；
ｉ）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー；
ｉｉ）７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも１つの、２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｓ）を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー；
ｉｉｉ）７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも１つの、２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｓ）が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー；及び
ｉｖ）７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）を塩基として有するポリヌクレオシド、及び、７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー、
並びに、式ＶＩの塩基：
【００５１】
【化２０】
0005874152.tif 000021
【００５２】
［式ＶＩにおいてここで、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］
を塩基として有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキット。
【課題を解決するための手段】
【００５３】
Ｉ．消光剤
１．  消光剤の構造
本発明は、新規な消光剤を提供する。本発明の消光剤は、式Ｉで示す２−ニトロピロール構造を有する【００５４】
【化２１】
0005874152.tif 000022
【００５５】
［式Ｉにおいて、Ｒ１及びＲ２は
リボース、デオキシリボース、
水素、水酸基、ＳＨ基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数２ないし１０のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、１又は複数の５員ヘテロ環、１又は複数の６員ヘテロ環、１又は複数の複素環ヘテロ環、１又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子
からなる群から独立に選択される基である］
ことを特徴とする。【００５６】
本発明は、２−ニトロピロール構造が消光効果を有する、という発見に基づく。よって、Ｒ１及びＲ２は特に限定されず、任意の基を選択することが可能である。Ｒ１及びＲ２は任意に独立に選択される。【００５７】
ｉ）リボース、デオキシリボース
Ｒ１及び／又はＲ２は、好ましくは、リボース、デオキシリボースである。好ましくは、Ｒ１はリボース、デオキシリボースである。【００５８】
「リボース」とは、五炭糖の単糖の１種で、ＩＵＰＡＣ名は「（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，３，４−トリオール」である。
「デオキシリボース」とは、アルデヒド基を含む五炭糖の単糖の１種で、ＩＵＰＡＣ名は「（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２，４−ジオール」である。【００５９】
本発明の消光剤は、好ましくは、ポリヌクレオシド又はポリヌクレオチド中の塩基として、人工塩基対を形成した場合に、塩基対を形成する相手方、あるいは、近傍に存在する塩基が蛍光性の塩基である場合に、その蛍光を消す消光効果を奏する。あるいは、塩基対を形成する相補性の人工塩基、あるいは、近傍に存在する塩基に結合した蛍光物質の蛍光を消光する。【００６０】
ｉｉ）水素、水酸基、ＳＨ基、ハロゲン
ハロゲンの種類は特に限定されない。好ましくは、フッ素、臭素、ヨウ素等からなる群から選択される。【００６１】
ｉｉｉ）置換又は未置換の、炭素数２ないし１０のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基
炭素数２ないし１０のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基は、直鎖状でも枝分かれしていてもよく、特に限定されない。好ましくは、メチル基、エチル基、プロピニル基、エチレン基、  エチニル基などが含まれる。これらの基は、置換されていてもよい。置換基は、特に限定されないが、好ましくは、アミノ基、水酸基、ＳＨ基、ハロゲン、カルボキシル基、ニトロ基等からなる群から選択される。【００６２】
ｉｖ）窒素原子または硫黄原子を含む、１又は複数の５員ヘテロ環、１又は複数の６員ヘテロ環、１又は複数の複素環ヘテロ環、１又は複数の芳香族環
Ｒ１及び／又はＲ２は、１又は複数のヘテロ環であってもよい。ヘテロ環は、チエニル基、チアゾリル基、イミダゾリル基、フラニル基、あるいはこれらの誘導体等から選択される、５員のヘテロ環である。好ましくは、２−チエニル基、２−チアゾリル基、２−イミダゾリル基、２，２’−ビチエン−５−イル基、２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル基、５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル基、及び２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル基からなる群より選択される基である。【００６３】
６員ヘテロ環の例としては、ピラニル基、ピリジル基、ピリミジル基、等が挙げられる。複素環ヘテロ環の例としては、プリン、１−デアザプリン、キノリン等が挙げられる。
芳香族環の例としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。【００６４】
ヘテロ環、複素環ヘテロ環や芳香族環の数は、特に限定されないが、好ましくは１ないし３である。より好ましくは１又は２である。
ｖ）糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド
糖は、特に限定されない。例えば、グルコース、アラビノース、フラノース等が含まれる。リボースまたはデオキシリボースも糖の一種である。【００６５】
糖鎖は、特に限定されない、例えば、スクロース、ラクトース等が含まれる。
アミノ酸も、特に限定されない。例えば、グリシン、アラニン、フェニルアラニン等が含まれる。【００６６】
ペプチドの種類は、特に限定されない。好ましくは、ポリペプチドは、約２ないし１０個のアミノ酸残基からなる。好ましいペプチドは例えば、フェニルアラニル−グリシンなどである。また、ペプチド核酸等の非天然型ペプチドも含まれる。【００６７】
ｖｉ）リンカーを介して結合した蛍光性分子
リンカーの種類は特に限定されず、当業者は適宜採用可能である。リンカーは限定されるわけではないが、好ましくは、下記の化学式ＶＩＩおよびＶＩＩＩ：【００６８】
【化２２】
0005874152.tif 000023
【００６９】
［式ＶＩＩ中、ｎは１ないし１２の整数から選択される］
及び【００７０】
【化２３】
0005874152.tif 000024
【００７１】
［式ＶＩＩＩ中、ｍ及びｌは、１ないし１２の整数から各々独立に選択される］
からなる群より選択される。
式ＶＩＩ及びＶＩＩＩにおいて、ｎ、ｍ、ｌは各々好ましくは１−７、より好ましくは５である。【００７２】
蛍光性分子の種類は特に限定されない。好ましくは、インドカルボシアニン（Ｃｙ３）、インドジカルボシアニン（Ｃｙ５）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなる群から選択される。より好ましくは、インドカルボシアニン（Ｃｙ３）である。【００７３】
２．消光される蛍光を有する物質
本発明の式Ｉで示す２−ニトロピロール構造を有する消光剤の消光作用によって消光される蛍光を有する物質の種類は特に限定されない。【００７４】
蛍光を有する物質は、例えば、蛍光性人工塩基、蛍光色素などの蛍光性分子等任意の物質が含まれる。
式Ｉで示す２−ニトロピロール構造は、好ましくは以下の塩基と対合を形成する（特願２００９−２３２８５１）。【００７５】
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓ）；
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）；
７−（２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓｓ）；
２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）；
２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓ）；
２−アミノ−６−（２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓｓ）；
４−（２−チエニル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（ｄＤｓａ）；
４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｓ）；
４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｖ）；
４−（２−チアゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（ｄＤｖａ）；
４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｖａｓ）；及び
４−（２−イミダゾリル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（ｄＤｉａ）。【００７６】
上記のうち、Ｄｓｓ、Ｄｓｓｓ、ｓｓ、ｓｓｓ、Ｄｓａｓ、Ｄｓａｖ及びＤｖａｓは蛍光性塩基である。これらは本発明の式Ｉの消光剤と塩基対を形成すると、蛍光強度が低下するか、あるいは消光する。【００７７】
式Ｉの消光剤と直接塩基対を形成しない蛍光を有する物質であっても、式Ｉの消光剤と塩基対を形成する上記人工塩基の近くに存在する場合には、本願発明の消光剤の影響を受けうる。例えば、蛍光を有する人工塩基が上記人工塩基（例えば、ｓ）と同一の一本鎖あるいは二本鎖、あるいは三本鎖核酸上で近接して存在する（例えばとなり同士で隣接する）場合、あるいは、上記人工塩基に結合している蛍光性分子の場合などは、式Ｉの消光剤と塩基対を形成する上記人工塩基の塩基対の形成により、蛍光を有する物質が本発明の消光剤の近傍に存在することとなり、消光の影響を受けうる。【００７８】
上述した式Ｉと塩基対を形成する人工塩基以外にも、蛍光性の核酸塩基類自体として、２−アミノプリン、エテノアデノシンなどが知られている。
ＩＩ．人工塩基対の形成を検出する方法
本発明はまた、人工塩基対を検出する方法を提供する。本発明の方法は、
１．                式ＩＩ【００７９】
【化２４】
0005874152.tif 000025
【００８０】
［式ＩＩにおいて、Ｒ２は、
水素、水酸基、ＳＨ基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数２ないし１０のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、１又は複数の５員ヘテロ環、１又は複数の６員ヘテロ環、１又は複数の複素環ヘテロ環、１又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子、
からなる群から選択される基である］
で表される消光性人工塩基を有するヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいは、
２）蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオチド
のいずれか、あるいは双方を用いることを特徴とする。【００８１】
式ＩＩの人工塩基の利用
本発明の式ＩＩの消光性人工塩基のピロール環の窒素原子は、リボースまたはデオキシリボースに結合して、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを構成する。本発明の式ＩＩの人工塩基は、Ｄｓ、Ｄｓｓ、Ｄｓｓｓ、ｓ、ｓｓ、ｓｓｓ、ｄＤｓａ、Ｄｓａｓ、Ｄｓａｖ、ｄＤｖａ、Ｄｖａｓ、及び、ｄＤｉａ等の人工塩基と人工塩基対を形成する（特願２００９−２３２８５１）。式ＩＩの消光性人工塩基とこれらの人工塩基との塩基対の形成により、塩基対を形成した蛍光性人工塩基、あるいは、付近に存在する蛍光性塩基若しくは蛍光性分子の蛍光強度が変化、あるいは消光する。本発明の方法はその変化を利用して人工塩基対の形成を検出する。【００８２】
特に、上記のうち、Ｄｓｓ、Ｄｓｓｓ、ｓｓ、ｓｓｓ、Ｄｓａｓ、Ｄｓａｖ及びＤｖａｓは蛍光性塩基であり、式ＩＩの化合物と塩基対を形成することにより、人工塩基の蛍光が低下する、あるいは消光する。【００８３】
あるいは、本発明の消光性人工塩基に蛍光性分子を結合すると、本発明の消光性人工塩基の消光性により蛍光性分子の蛍光強度が低下する。これは蛍光性分子が消光性人工塩基と溶液中でスタッキングすることにより効率よく消光されるためと考えられる。そして、この蛍光性分子を結合した消光性人工塩基が、上記人工塩基との間で人工塩基対が形成し、核酸中に取り込まれると、蛍光性分子と消光性人工塩基との間のスタッキングが解消されるので、蛍光色素の蛍光強度が増す。この性質を利用して、人工塩基対の形成を検出することが可能である。【００８４】
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などの利用
本発明は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオチドを利用して、人工塩基対を検出する方法も含む。【００８５】
「蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）」は、ある蛍光分子から他の分子へ、共鳴により励起エネルギーが移動する現象を意味する。エネルギーを与える分子はドナー（供与体）、受け取る分子はアクセプター（受容体）と呼ばれる。ＦＲＥＴが生じると、エネルギーを失ったドナーは基底状態に戻り、同時にエネルギーを受け取ったアクセプターは励起状態となる。従って、ドナーの蛍光は弱まり、アクセプターが蛍光分子であればその蛍光が観察される。アクセプターが消光分子であれば、ドナーが単独の場合には観察されていた蛍光がＦＲＥＴにより観察されなくなる。ＦＲＥＴによるタンパク質の検出、核酸の検出の一般的な方法は公知である。【００８６】
ＦＲＥＴが生じるためには、以下の３条件を満たす必要がある。ｉ）ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルに重なりがあること。スペクトルの重なり範囲は大きい方が望ましいが、必ずしも完全に重なっている必要はない。ｉｉ）ドナーとアクセプターが物理的に近距離に存在すること。ＦＲＥＴが５０％の確率で生じる距離は３ｎｍないし６ｎｍと考えられており、ＦＲＥＴの効率はこの距離の変化に対して敏感に変化する。ｉｉｉ）ドナーとアクセプターの相対的な向きが適切であること。【００８７】
本発明の方法は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を利用するものである。また、消光の過程には、ＦＲＥＴ以外にエキシマーなどの励起二量体の形成による静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）も含まれる。人工塩基対の形成により、これらの自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体がアクセプターの近傍に存在した場合、これらの供与体に特有の波長のエネルギーを与えて励起することにより、これらの供与体からアクセプターにエネルギーが供与され、アクセプターが本来は蛍光を発しないはずの波長のエネルギーで蛍光を発する。【００８８】
限定するわけではないが、「自己消光性を有する人工塩基」としては、１以上の隣接するｓ、例えば、同一核酸上で隣接する２以上のｓ、ｓｓ、Ｄｓｓ、Ｄｓｓｓなどが含まれる。【００８９】
好ましくは、同一核酸上で隣接する２以上のｓである。「自己消光性を有する天然塩基修飾体」とは、非限定的に、上記自己消光性を有する人工塩基（例えばｓ）を１以上結合した天然塩基（例えば、ｓを結合したウラシル、ｓを２個結合したシトシン、Ｄｓｓを結合したウラシル）、などが含まれる。「自己消光性を有する塩基類似体」とは、例えば、サイズエキスパンデッド塩基類似体（ｓｉｚｅ−ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇｓ）二量体、２−アミノプリン二量体などが含まれる。【００９０】
ここで検出される人工塩基対は、好ましくは上記式ＩＩで表される消光性人工塩基とその相補的な人工塩基との間の塩基対である。しかしながら必ずしもそれに限定されない。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）の供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオチドを利用する方法であれば、その他の公知の人工塩基対であっても本発明の範囲に含まれる。例えば、ｓ−ｙ塩基対（ｓ：２−アミノ−６−チエニルプリン、ｙ：ピリジン−２−オン）、ｖ−ｙ塩基対（ｖ：２−アミノ−６−チアゾリルプリン）、ｓ−Ｐａ塩基対（Ｐａ：ピロール−２−カルバルデヒド）、Ｄｓ−Ｐａ塩基対（Ｄｓ：７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン）、Ｐａ−Ｑ塩基対（Ｑ：９−メチルイミダゾ［（４，５）−ｂ］ピリジン）、ｉｓｏＧ−ｉｓｏＣ、５ＳＩＣＳ−ＭＭＯ２、５ＮａＭなどの人工塩基対も、本発明のＦＲＥＴを利用した方法により検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
［図１］図１は、消光性塩基（Ｐｎ、Ｐｘ）とその相補性塩基（ＤｓやＤｓｓ）との人工塩基対の例を示す。例は、Ｐｎと蛍光性人工塩基（Ｄｓｓ）、ならびにＰｘとＤｓからなる人工塩基対である。
［図２］図２は、本発明の実施例に使用した、消光性人工塩基Ｐｎとその４’誘導体の構造を示す。
［図３］図３は、本発明の実施例に使用した、消光性人工塩基Ｐｘとその誘導体の構造を示す。
［図４］図４は、本発明の方法に使用する、Ｐｎ又はＰｘと相補性を有する人工塩基の例として、Ｄｓ、並びに、蛍光性人工塩基Ｄｓｓ、Ｄｓｓｓ、Ｄｓａｖの構造を示す。
［図５］図５は、ＮＨ２−ｈｘ−ｄＰｘＴＰからＣｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰの合成を示す。反応条件は、以下の通りである。１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３中、ＮＨ２−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ（８．４μｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．５）（５００μｌ）、ＤＭＦ（３００μｌ）中、Ｃｙ３（７．６３μｍｏｌ）  Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、室温１２時間
［図６］図６は、蛍光性人工塩基Ｄｓｓまたはｓを結合した天然型塩基のアミダイト試薬の構造を示す。
図６中の化合物は、左からＤｓｓ−ｈｘ−ｄＵアミダイト、ｓ−ｈｘ−ｄＵアミダイト、そして、ｓ２−ｈｘ−ｄＣアミダイトである。
［図７］図７は、人工塩基Ｐｎによる相補鎖中の蛍光性人工塩基Ｄｓｓの消光を示す。１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＡＴ中の各ＤＮＡ溶液（５μＭ）を３６５ｎｍの照射により撮影した。蛍光性人工塩基（Ｄｓｓ）を含む一本鎖のオリゴヌクレオチド（１２−ｍｅｒ）を消光性人工塩基（Ｐｎ）を含む相補鎖のオリゴヌクレオチド（１２−ｍｅｒ）と二本鎖を形成させると、Ｄｓｓの蛍光がＰｎにより消光される（図７、左から２番目）。天然型塩基（Ｔなど）や人工塩基（ＤｓｓやＤｓ）と塩基対を形成してもＤｓｓの蛍光は消光されない（図７、左から３番目−５番目）。
［図８］図８は、図７の実験の各ＤＮＡ断片の蛍光スペクトルを示す。Ｄｓｓを含む一本鎖ＤＮＡ（５’−ＧＧＴＡＡＣＤｓｓＡＴＧＣＧ−３’）、Ｄｓｓ−Ｐｎ，Ｄｓｓ−Ｄｓｓ，Ｄｓｓ−Ｄｓ，Ｄｓｓ−Ｔ塩基対のそれぞれを含む二本鎖ＤＮＡ（５’−ＧＧＴＡＡＣＮＡＴＧＣＧ−３’（Ｎ＝Ｄｓｓ）及び５’−ＣＧＣＡＴＮ’ＧＴＴＡＣＣ−３’（Ｎ’＝Ｄｓｓ，Ｄｓ，Ｐｎ又はＴ）の５μＭ  ＤＮＡ溶液の蛍光スペクトル（励起波長：３８５ｎｍ、２５℃）の結果である。図８に示されるようにＤｓｓの蛍光はＰｎにより５分の１程度に消光された。
［図９］図９は、Ｐｎの消光作用を調べた結果を示す。具体的には、蛍光性人工塩基Ｄｓｓの２’−デオキシリボヌクレオシド  ５’‐三リン酸誘導体（ｄＤｓｓＴＰ）の水溶液での消光をｄＰｎＴＰの濃度依存性として調べた。Ａ：  Ｐｎのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＰｎＴＰ）の濃度依存による蛍光性人工塩基Ｄｓｓのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＤｓｓＴＰ，５μＭ）の蛍光強度の変化。Ｂ：  ｄＰｎＴＰと天然型塩基の三リン酸とのＤｓｓに対する消光性を比較した結果を示す。Ｐｎならびに天然型塩基のデオキシリボヌクレオシド三リン酸による、蛍光性塩基ｄＤｓｓＴＰ（５μＭ）の消光のＳｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ  Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ  ｐｌｏｔ。１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液中、２０℃で、３７０ｎｍの励起による蛍光を測定し、以下の式よりＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ定数（Ｋｓｖ）を算出した。
Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ  ｅｑｕａｔｉｏｎ  ：  Ｆ０／Ｆ１＝１＋ＫＳＶ［Ｑ］
［Ｆ０及びＦ１、：  各々消光剤を伴う（Ｆ１）又は伴わない（Ｆ０）場合の蛍光強度  ［Ｑ］：  消光剤の濃度］グアニン塩基は消光性を有することが知られているが、Ｐｎはさらに強い消光性を示す（図９Ｂ）。
［図１０］図１０は、Ｐｎとその各種誘導体（図２、図３）、ならびにＰｘによるＤｓｓの蛍光の消光特性を示す。具体的には、エタノール、２５℃で、３８５ｎｍの励起による蛍光を測定し、Ｐｎの各種誘導体とＰｘのデオキシリボヌクレオシド（Ａ：２．５ｍＭ、Ｂ：５ｍＭ）共存下での、ｄＤｓｓ（５μＭ）の蛍光強度の変化を調べた。いずれの誘導体もＰｎよりもさらに強い消光特性を示した。
［図１１］図１１は、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片による、Ｐｎを含む鋳型ＤＮＡとｄＤｓｓＴＰを用いたプライマー伸長反応を調べた結果を示す。２００ｎＭの鋳型ＤＮＡ、１０μＭのｄＣＴＰとｄＴＴＰ、０．１Ｕ／μｌのクレノウ断片に、各濃度のｄＤｓｓＴＰを加えて、３７℃、３分反応を行い、変性ゲル電気泳動で解析した。ｄＡＴＰとｄＧＴＰを加えていないので、伸長反応が進んだ際の生成物は鋳型のＣの手前で止まった３３−ｍｅｒになる。図１１は、ｄＤｓｓＴＰが鋳型中のＰｎに相補して、相補鎖ＤＮＡに取り込まれることを示している。既にｄＤｓｓＴＰは鋳型中のＰａに対しても取り込まれることを明らかにしているが（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３２：４９８８−４９８９，２０１０）、Ｐｎの方がＤｓｓの取り込み効率が高くなることが分かった。また、ｄＤｓｓＴＰの濃度を高くするとＰｎやＰａに対してＤｓｓが取り込まれた後の伸長反応が阻害されるが、ｄＤｓｓＴＰの濃度を下げることにより、プライマー伸長反応が効率よく進行した。
［図１２］図１２は、Ｄｓｓ−Ｐｘ塩基対を用いたＤｓを含むＤＮＡのＰＣＲ増幅を調べた結果を示す。Ｄｓを含むＤＮＡ（５５−ｍｅｒ）をｄＤｓｓＴＰとＮＨ２−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ、ならびに天然型塩基の基質を用いて２０サイクルのＰＣＲ増幅を行い、変性ゲル電気泳動後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩで染色後に生成物を解析した。Ｄｓを含む鋳型ＤＮＡ（５５−ｍｅｒ、Ｓ２）を用いて、天然型塩基の基質（ｄＮＴＰｓ）にｄＤｓｓＴＰとＮＨ２−ｈｘ−ｄＰｘＴＰを加えて、ＰＣＲを行った結果である。天然型塩基のみの鋳型ＤＮＡと同様に人工塩基を含む鋳型ＤＮＡ−Ｓ２も増幅されることが分かった。Ｄｓｓ−ＰｎならびにＤｓｓ−Ｐｘ塩基対は、ＰＣＲにおいても効率よく機能する。
［図１３］図１３は、Ｄｓｓ−Ｐｘ塩基対を用いたＰＣＲ増幅後のＤＮＡの配列決定を行った結果を示す。Ｄｓを含むＤＮＡ（５５−ｍｅｒ）をｄＤｓｓＴＰとＮＨ２−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ、ならびに天然型塩基の基質を用いて１５サイクルのＰＣＲ増幅を行い、従来法で増幅産物の配列決定を行った。増幅されたＤＮＡ中にはＤｓｓとＮＨ２−ｈｘ−Ｐｘが９９％以上保持されていることが分かった。本配列決定はこれまでに本願発明者らが開発した方法を用いている（Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｓｙｓｔｅｍ：ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｉｎｔｏ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ．Ｉ．Ｈｉｒａｏ，Ｍ．Ｋｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ｍｉｔｓｕｉ，Ｔ．Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｒ．Ｋａｗａｉ，Ａ．Ｓａｔｏ，Ｙ．Ｈａｒａｄａ，Ｓ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３，７２９−７３５（２００６）；Ａｎ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｍ．Ｋｉｍｏｔｏ，Ｒ．Ｋａｗａｉ，Ｔ．Ｍｉｔｓｕｉ，Ｓ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，ａｎｄ  Ｉ．Ｈｉｒａｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３７，ｅ１４（２００９））
［図１４］図１４は、Ｄｓｓ−Ｐｘ塩基対を用いたリアルタイムＰＣＲの原理を示した模式図である。ＤｓｓをＰＣＲのプライマー中に導入し、ｄＰｎＴＰあるいはｄＰｘＴＰを用いてＰＣＲを行うと、Ｄｓｓに相補してＰｎやＰｘが相補鎖中に取り込まれ、Ｄｓｓの蛍光が消光される。これを検出することによりリアルタイムＰＣＲが可能になる。
［図１５］図１５は、Ｄｓｓ−Ｐｘ塩基対を用いたリアルタイムＰＣＲを行った結果を示す。図１４で示したＤｓｓを含むプライマーを用いると、その相補鎖にｄＰｘＴＰが取り込まれ、Ｄｓｓの蛍光が消光される。これはＰＣＲの際にＤｓｓ−Ｐｘ塩基対が形成されて、Ｄｓｓの蛍光が消光され、リアルタイムＰＣＲへの応用が可能になる。
反応混合液（２５μＬスケール）
１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ
１μＭ  ０８０７３１−５’プライマー３  （配列番号１５）
１μＭ  ０９０９１４ａ−Ｐｌｅｘｏｒ−Ｄｓｓ１  （配列番号１６）
２μＭ  ｄＰｘＴＰ
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ＴａｑＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
２ａＭ（３コピー）−２ｆＭ（３００００コピー）  鋳型ＤＮＡ適用
滅菌水で全量２５μＬとした。
ＰＣＲ条件
９４℃、２分→［９４℃、５秒−６８℃、４０秒］×５５サイクル
［図１６］図１６は、Ｄｓｓ−Ｐｎ塩基対を含むＤＮＡヘアピンの蛍光特性を調べた結果を示す。Ｄｓｓ−Ｐｎ塩基対を含むＤＮＡヘアピン（３４−ｍｅｒ）とＤｓｓを含む一本鎖ＤＮＡ（１２−ｍｅｒ）のそれぞれのＤｓｓの蛍光強度の温度依存性を測定した。それぞれのＤＮＡを１μＭ、２ｍＭ塩化マグネシウムを含む緩衝溶液中で測定した。ＤｓｓとＰｎを塩基対としてヘアピン核酸のステム領域に導入することにより、ヘアピン構造を形成しているとＤｓｓの蛍光がＰｎにより消光され、このヘアピンＤＮＡを熱変性させると、その過程でＤｓｓの蛍光強度が増加した。このＤｓｓ−Ｐｎ（あるいはＤｓｓ−Ｐｘ）塩基対の性質は、モレキュラービーコンに応用することが出来る。
［図１７］図１７は、Ｄｓｓ−Ｐｎ塩基対を含むモレキュラービーコンの可視化が可能になったことを示す。Ｄｓｓ−Ｐｎ塩基対を含むヘアピン型ビーコン（２６−ｍｅｒ）の蛍光をターゲットの一本鎖ＤＮＡ（７１−ｍｅｒ）の存在下、非存在下で観測した。それぞれのＤＮＡを１μＭ、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）・１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ・０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で測定した。その結果、Ｄｓｓ−Ｐｎ塩基対を含むモレキュラービーコンのループ部分に相補するＤＮＡを認識して二本鎖を形成するとＰｎによるＤｓｓの蛍光消光が解消され、紫外線を照射することにより、Ｄｓｓの蛍光を裸眼で確認することが出来た。
［図１８］図１８は、Ｄｓｓ−Ｐｎ塩基対を含むモレキュラービーコンによる一塩基変異を検出した結果を示す。Ｄｓｓ−Ｐｎ塩基対を含む２種類のヘアピン型ビーコン（２６−ｍｅｒ）のそれぞれの蛍光を１塩基変異の２種類の標的配列のそれぞれの一本鎖ＤＮＡ（７１−ｍｅｒ）に加えて観測した。それぞれのＤＮＡを１μＭ、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）・１００ｍＭ  ＮａＣｌ・０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で測定した。２種類の標的配列について各標的ＤＮＡに相補する配列をループ部分に有するモレキュラービーコンを作成することにより、１塩基の違いを、ハイブリダイゼーションによりＤｓｓの発光強度の違いとして、識別することが出来た。
［図１９］図１９は、蛍光色素Ｃｙ３をＰｘに結合させた基質として、Ｃｙ３−Ｐｘ／Ｄｓｓ塩基対を用いた可視化ＰＣＲの原理を示す。
［図２０］図２０は、図１９に記載の原理に基づき、Ｃｙ３−Ｐｘ／Ｄｓｓ塩基対を用いた可視化リアルタイムＰＣＲを行った例を示す。
反応混合液（２５μＬスケール）
１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ
１μＭ  ０８０７３１−５’プライマー３  （配列番号１５）
１μＭ  ０９０９１４ａ−Ｐｌｅｘｏｒ−Ｄｓｓ１  （配列番号１６）
２μＭ  Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ＴａｑＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
２ａＭ（３コピー）−２００ｆＭ（３００００００コピー）  鋳型ＤＮＡ適用
滅菌水で全量２５μＬとした。
ＰＣＲ条件
９４℃、２分→［９４℃、５秒−６８℃、４０秒］×５５サイクル
Ｃｙ３は３５０ｎｍ近辺の励起波長では発光しないので、Ｃｙ３を結合したＰｘの基質（Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ）は３５０ｎｍのＵＶ照射では発光しない。Ｄｓｓ−Ｐｘの塩基対形成によりＣｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰがＤｓｓの相補鎖に取り込まれると、３５０−３９０ｎｍのＵＶ照射によりＤｓｓからＣｙ３への蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が生じ発光する。これにより、Ｃｙ３の発光をオレンジフィルターを通して観察することにより、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡを裸眼で検出することが出来る。
［図２１］図２１は、蛍光性分子（Ｃｙ３）を結合した消光性Ｐｘ塩基によるリアルタイムＰＣＲ法の原理を示した模式図である。蛍光性分子（例えばＣｙ３など）を消光性のＰｘ塩基に結合させると、蛍光性分子の蛍光が３０％程度消光する。これを基質（Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ）にして、Ｄｓ塩基を導入したプライマーを用いてＰＣＲを行うとＣｙ３−ｈｘ−ｄＰｘがＤＮＡ中に取り込まれることで、Ｃｙ３の蛍光強度が増大する。この方法はリアルタイムＰＣＲに用いることができる（図２２）。
［図２２］図２２は、蛍光性分子（Ｃｙ３）を結合した消光性のＰｘ塩基を用いてリアルタイムＰＣＲを行った結果を示す。リアルタイムＰＣＲ装置（ストラタジーン、Ｍｘ３００５Ｐ）を用いて、Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰを基質として用いたリアルタイムＰＣＲ検出を行った。ＰＣＲ反応は、プライマー：各１μＭ、天然型塩基基質ｄＮＴＰ：各０．２ｍＭ、人工塩基基質Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ：２μＭで実施し、励起波長５４５ｎｍで５６８ｎｍの蛍光変化を検出した。５４５ｎｍの照射で直接、Ｃｙ３を励起するため図１９と図２０の応用例と異なり、この場合には遊離の基質のＣｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰも発光する。よってこの方法の場合は、図２０のように裸眼では識別できない。そこで、ＤＮＡ中にＣｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰが取り込まれた際の蛍光強度の増加の測定に、リアルタイムＰＣＲ装置を用いた。
［図２３］図２３は、蛍光性分子（Ｃｙ３）を結合した消光性のＰｘ塩基によるリアルタイムＰＣＲ産物をゲル電気泳動により検出した結果を示す。図２２で示したＰＣＲ産物は、Ｃｙ３が取り込まれているので、この産物をアガロースゲルで電気泳動すると、従来のＥｔＢｒやＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎなどのＤＮＡ染色用の色素を用いることなく、ゲル上でＰＣＲ産物をＣｙ３の蛍光で検出することができる。
検出条件
ＦＬＡ７０００バイオイメージングアナライザー
（Ｃｙ３  ｍｏｄｅ）
５３２ｎｍ  レーザー／Ｏ５８０  蛍光フィルター
ＰＭＴ：  ５００Ｖ
［図２４］図２４は、蛍光性分子（Ｃｙ３）ならびに蛍光性人工塩基ｓを含むＤＮＡの蛍光特性を調べた結果である。測定条件：１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に、各種ＤＮＡ断片が５μＭとなるように調製し、２５４−３６５ｎｍの照射で発光を観察した。  レーン２は蛍光性人工塩基ｓを１つ含むＤＮＡ断の場合であり、ｓのみをＤＮＡ中に導入すると２５４‐３６５ｎｍの照射でｓの発光が起こる。しかし、ｓを２つ隣接してＤＮＡ中に導入するとその蛍光が消光する（レーン３）。天然型塩基だけからなるＤＮＡ断片にＣｙ３を結合させた場合、３６５ｎｍの照射では発光しない（レーン４）。しかしながら、ＤＮＡ中のＣｙ３近傍にｓを１つあるいは２つを導入すると、ｓとＣｙ３間でＦＲＥＴが起こり、Ｃｙ３の蛍光が観測されるようになる（レーン５−７）。具体的には、３６５ｎｍでｓを励起するとＣｙ３のオレンジ色の発光が観測される（レーン５，６）。さらに２つのｓを隣接してＤＮＡ断片中に導入すると、ｓ同士の消光により２５４‐３６５ｎｍで励起してもｓの発光はほとんど観測されないが（レーン３）、このＤＮＡ断片にＣｙ３を結合させるとＦＲＥＴが起こり、Ｃｙ３の発光が観測される（レーン７）。この現象を利用して、複製や転写によるＤＮＡの増幅の検出を裸眼で行うことができる。
［図２５］図２５は、蛍光性分子（Ｃｙ３）を結合した消光性のＰｘ塩基と蛍光性人工塩基ｓを組み合わせた可視化ＰＣＲ法の原理を示す。蛍光性人工塩基ｓを隣接して２つ導入するとｓの蛍光は完全に消光し、３５０ｎｍの照射で発光しない。それに近接するＤｓも３５０ｎｍで発光しない。２つの隣接するｓ及びその近傍にＤｓを含むプライマーとＣｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰを用いてＰＣＲを行うと、その相補鎖にＣｙ３−ｈｘ−Ｐｘが取り込まれる。２つのｓとＤｓが近い位置にあるため、ｓの励起波長である３６５ｎｍの照射でＦＲＥＴが起こり、近傍のＣｙ３などの蛍光色素が蛍光発光する（図２６）。これを用いてＰＣＲで増幅されたＤＮＡを裸眼で検出することができる（図２６、２７）。
［図２６］図２６は、蛍光性分子（Ｃｙ３）を結合した消光性のＰｘ塩基と蛍光性人工塩基ｓを組み合わせた可視化ＰＣＲ法の結果を示す。図２６にはＰＣＲを行い、ＰＣＲチューブを３５０ｎｍで照射し、裸眼であるいはオレンジ色のフィルターを通してＣｙ３の発光を調べた結果を示す。従来法では、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅を裸眼で確認することは難しかった。即ち、従来の例えばＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いる方法は、リアルタイムＰＣＲで最も用いられる検出法であるが、図中右側のように裸眼での検出は難しい。これに対し、本発明の方法は、リアルタイムＰＣＲのみならず裸眼でもＰＣＲの検出が可能であった（図２６左側）。
［図２７ａ］図２７ａは、蛍光性分子（Ｃｙ３）を結合した消光性のＰｘ塩基と蛍光性人工塩基ｓを組み合わせた可視化ＰＣＲ法を行った結果を示す。標的ＤＮＡを３コピーから３００万コピー用いて、５５サイクルのＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動により解析した結果は図２８に示している。本検出系では、電気泳動することなく、３６５ｎｍのＵＶ励起によるＣｙ３の蛍光の有無を反応チューブレベルで観察するだけで、３コピーのＤＮＡでも５５サイクルのＰＣＲ後、その増幅産物を裸眼で検出が可能であることを示している。
［図２７ｂ］図２７ｂは、蛍光性分子（Ｃｙ３）を結合した消光性Ｐｘ塩基と蛍光性人工塩基ｓを組み合わせた可視化ＰＣＲをリアルタイム定量ＰＣＲ装置により検出した結果を示す。
反応混合物（２５μスケール）
１μＭ  ０８０７３１  ５’ｐｒｉｍｅｒ  ３
１μＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  ２ｄ−Ｄｓ−ｓｓ３  ３’ｐｒｉｍｅｒ
２μＭ  Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ
２００μＭ  ｄＮＴＰｓ
１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ
１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ
２ａＭ（３ｃｏｐｉｅｓ）〜２００ｆＭ（３００００００ｃｏｐｉｅｓ）９８Ｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ
ＰＣＲ条件：  ９４℃−２分  →  ［９４℃−５秒→６８℃−４０秒］×３０−５５サイクル
本法はＤＮＡ中に取り込まれたＣｙ３‐ｈｘ−ＰｘのＣｙ３の蛍光強度の増加によりリアルタイムＰＣＲも可能である。
［図２７ｃ］図２７ｃは、図２７ｂの各ＰＣＲサイクルのＤＮＡ増幅産物を可視化した結果を示す。
［図２７ｄ］図２７ｄは、図２７ｃの各ＰＣＲチューブの蛍光強度を定量化した結果を示す。図２７ｄ１は、０、３−３００００コピーのそれぞれのＤＮＡをＰＣＲで増幅した時の各ＰＣＲサイクルにおける蛍光強度をプロットしたものである。図２７ｄ２は、３−３００００００コピーのそれぞれのＤＮＡを各ＰＣＲサイクルで増幅した時の蛍光強度をプロットした図である。
［図２８］図２８は、蛍光性分子（Ｃｙ３）を結合した消光性のＰｘ塩基と蛍光性人工塩基ｓを組み合わせたプライマーを用いたＰＣＲ（５５サイクル）による産物のゲル電気泳動上での検出を行った結果を示す。本発明の方法により図２７ａの可視化ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動することにより、３１２ｎｍあるいは５３２ｎｍの照射でＰＣＲ産物を検出することができた。３１２ｎｍの照射の場合にはｓからＣｙ３へのＦＲＥＴを検出しており、５３２ｎｍの照射の場合には、ＤＮＡ中に取り込まれたＣｙ３を直接励起した結果を示している。ＰＣＲ産物はＣｙ３で標識されているため、３１２ｎｍでｓを励起してＦＲＥＴにより、あるいは、５３２ｎｍで直接Ｃｙ３を励起することにより、ＰＣＲ産物をゲル上で観察することが出来た。
［図２９ａ］図２９ａは、蛍光性分子（ｓ塩基）を天然型塩基にリンカーを介して結合したヌクレオシド誘導体（図６、ｓ−ｈｘ−ｄＵ、（Ｕｓ））とＤｓ−Ｐｘ塩基対を用いたＰＣＲ産物の検出法を示した模式図である。図２５の可視化ＰＣＲ法では、隣接する２つの蛍光性人工塩基ｓを用いているが、代わりにこの蛍光性のｓを天然型塩基にリンカーを介して結合し、ＰＣＲ用のプライマー中にこの塩基を２つ隣接させたものが、図２９ａの態様である。
［図２９ｂ］図２９ｂは、蛍光性分子（ｓ塩基）を天然型塩基にリンカーを介して結合したヌクレオシド誘導体（図６、ｓ−ｈｘ−ｄＵ、（Ｕｓ））とＤｓ−Ｐｘ塩基対を用いたＰＣＲについて、使用する各プライマー、鋳型の配列、並びにＰＣＲの条件を示した図である。
［図２９ｃ］図２９ｃは、蛍光性分子（Ｃｙ３）を結合した消光性のＰｘ塩基と蛍光性人工塩基ｓ−ｈｘ−ｄＵを組み合わせた可視化ＰＣＲを行った結果を示す。ＤＮＡ中に取り込まれたＣｙ−ｈｘ−ＰｘのＣｙ３の蛍光強度の増加によりリアルタイムＰＣＲも可能となった。
［図２９ｄ］図２９ｄは、図２９ｃの各ＰＣＲサイクルのＤＮＡ増幅産物を可視化したものである。
［図３０］図３０は、ｓ−ｈｘ−ｄＵアミダイト試薬の化学合成である。
条件：（ａ）ＣＢｒ４，ＰＰｈ３，ＣＨ２Ｃｌ２；
１．    （ｂ）Ｋ２ＣＯ３，ＤＭＦ；
２．    （ｃ）Ｐａｃ−Ｃｌ，ＨＯＢＴ，ピリジン，ＣＨ３ＣＮ；
３．    （ｄ）ＤＭＴｒ−デオキシ−５−ヨードウリジン，Ｐｄ（ＰＰｈ３）４，ＣｕＩ，ＴＥＡ，ＤＭＦ；
４．    （ｅ）ＮＣ（ＣＨ２）２Ｏ−Ｐ（Ｃｌ）Ｎ（ｉＰｒ）２，ＤＩＥＡ，ＴＨＦ
［図３１］図３１は、２分子の蛍光性塩基（ｓ）を天然型塩基にリンカーを介して結合したヌクレオシド誘導体（図６、ｓ２−ｈｘ−ｄＣ、（Ｃｓｓ））とＤｓ−Ｐｘ塩基対を用いたＰＣＲ産物の検出方法を示した模式図である。
［図３２］図３２は、蛍光性分子（Ｄｓｓ塩基）を天然型塩基にリンカーを介して結合したヌクレオチド誘導体（図６、Ｄｓｓ−ｈｘ−ｄＵ（ＵＤｓｓ））とＤｓ−Ｐｘ塩基対を用いたＰＣＲ産物の検出方法を示した模式図である。
［図３３］図３３は、Ｄｓｓ−ｈｘ−ｄＵアミダイト試薬の化学合成を示した結果である。
条件：（ａ）Ｋ２ＣＯ３，ＤＭＦ；
５．    （ｂ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４，ＣｕＩ，ＴＥＡ，ＤＭＦ；
６．    （ｃ）  ＤＭＴｒＣｌ，ピリジン；
７．    （ｄ）ＮＣ（ＣＨ２）２Ｏ−Ｐ（Ｃｌ）Ｎ（ｉＰｒ）２，ＤＩＥＡ，ＴＨＦ
【発明を実施するための形態】
【００９２】
本発明は、好ましくは以下の態様を含む。
Ａ．蛍光性人工塩基と本発明の消光性人工性塩基の塩基対形成による蛍光の低下を利用する方法
本発明の方法は、一態様において、蛍光性人工塩基と式ＩＩ
【００９３】
【化２５】
0005874152.tif 000026
【００９４】
［式ＩＩにおいて、Ｒ２は、
水素、水酸基、ＳＨ基、ハロゲン、
置換又は未置換の、炭素数２ないし１０のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基、
窒素原子または硫黄原子を含む、１又は複数の５員ヘテロ環、１又は複数の６員ヘテロ環、１又は複数の複素環ヘテロ環、１又は複数の芳香族環、
糖、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、
リンカーを介して結合した蛍光性分子、
からなる群から選択される基である］
で表される消光性人工塩基との塩基対形成により、蛍光性人工塩基の蛍光の低下を観察することにより、人工塩基対が形成されたことを検出する。
【００９５】
好ましくは、蛍光性人工塩基は式ＩＩと塩基対を形成することが知られている以下の、
（ｉ）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）；
（ｉｉ）７−（２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓｓ）；
（ｉｉｉ）２−アミノ−６−（２，２’−ビチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓ）；
（ｉｖ）２−アミノ−６−（２，２’，５’，２’’−ターチエン−５−イル）プリン−９−イル基（ｓｓｓ）；
（ｖ）４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｓ）；
（ｖｉ）４−［２−（２−チアゾリル）チエン−５−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｓａｖ）；及び
（ｖｉｉ）４−［５−（２−チエニル）チアゾール−２−イル］ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル基（Ｄｖａｓ）；
からなる群より選択される。
【００９６】
その他にも蛍光性人工塩基として、２−アミノプリン、エテノアデノシンなどが利用されうる。
好ましくは、本発明の消光性塩基は以下の式ＩＩ１又は式ＩＶである。
【００９７】
【化２６】
0005874152.tif 000027
【００９８】
［式ＩＩＩにおいて、Ｒ３は、
−Ｈ、ヨード、−ＣＨ３、
【００９９】
【化２７】
0005874152.tif 000028
【０１００】
から選択される］
【０１０１】
【化２８】
0005874152.tif 000029
【０１０２】
［式ＩＶにおいて、Ｒ４は、
−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＮＨ２、及び
【０１０３】
【化２９】
0005874152.tif 000030
【０１０４】
（ここにおいて、ｎは０ないし１２のいずれかの整数である）
から選択される］
式ＩＶにおいて、ｎは好ましくは３−７、より好ましくは５である。
【０１０５】
本発明はまた、
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー；並びに、
式ＩＩＩ又は式ＩＶの消光性塩基を塩基として有するポリヌクレオチドを含む、蛍光性人工塩基の蛍光の低下により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキットを提供する。
【０１０６】
Ｂ．本発明の消光性人工性塩基に結合した蛍光性分子の蛍光強度が人工塩基対の形成により変化することを利用する方法
本発明は、一態様において、人工塩基対の形成を検出する方法であって、
式Ｖ
【０１０７】
【化３０】
0005874152.tif 000031
【０１０８】
［式Ｖにおいて、Ｒ５は、リンカーを介して結合した蛍光性分子である］
で表される消光性人工塩基中の蛍光性分子の蛍光強度が、式Ｖの人工塩基が塩基対を形成することによって変化し、人工塩基対が形成されたことを検出する、前記方法を提供する。
【０１０９】
式Ｖの人工塩基が塩基対を形成する相補性の塩基対は、上述したＤｓ、Ｄｓｓ、Ｄｓｓｓ、ｓ、ｓｓ、ｓｓｓ、ｄＤｓａ、Ｄｓａｓ、Ｄｓａｖ、ｄＤｖａ、Ｄｖａｓ、及び、ｄＤｉａなど任意のものが可能である。好ましくは、Ｄｓ、ｓ、ｓｓ、ｓｓｓ、ｄＤｓａ、ｄＤｖａ、及び、ｄＤｉａ、より好ましくは７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）である。
【０１１０】
消光性人工塩基は、好ましくは、以下の式ＶＩの塩基：
【０１１１】
【化３１】
0005874152.tif 000032
【０１１２】
［式ＶＩにおいて、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］である。
リンカーは、式Ｉの消光剤について上述したものと同様のものを使用可能である。
【０１１３】
蛍光性分子は、式Ｉの消光剤について上述したものと同様のものを使用可能である。
本発明はまた、Ｄｓ
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）を塩基とし
て有するポリヌクレオシドを含む、核酸プライマー、並びに、
式ＶＩの塩基を有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光強度の変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキットを提供する。
【０１１４】
Ｃ  蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ならびに静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドを含む核酸を利用して核酸を検出する方法
本発明は、一態様において、
人工塩基対の形成を検出する方法であって、
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ならびに静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドを含む核酸を利用し、当該核酸中の人工塩基（第一人工塩基）と蛍光性分子を有する人工塩基（第二人工塩基）との間で人工塩基対が形成されると、前記天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドから、第二人工塩基の有する蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などが生じて、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法、を提供する。
【０１１５】
核酸中の人工塩基（第一人工塩基）と蛍光性分子を有する人工塩基（第二人工塩基）との間で人工塩基対は、好ましくは、本発明の式ＩＩで表される消光性人工塩基を第二人工塩基として含む。しかしながら、必ずしもこれに限定されず、公知の人工塩基対について、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）及び／又は静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などの供与体となりうる自己消光性を有する天然塩基修飾体、人工塩基、或いは塩基類似体を有するポリヌクレオシドを含む核酸を利用することが可能である。
【０１１６】
Ｃ−１
本発明は、Ｃの方法の一態様として以下の態様を提供する。
本発明の蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法は、７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）と、以下の式ＶＩの塩基：
【０１１７】
【化３２】
0005874152.tif 000033
【０１１８】
［式ＶＩにおいて、Ｒ６は、リンカーを介して又は介さずに結合した蛍光性分子である］との間で塩基対が形成されると、
２４０−４１０ｎｍの紫外線による励起により、Ｄｓｓから式ＶＩの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などが生じて、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、前記方法である。
【０１１９】
本態様の模式図を図１９に示す。
２４０−４１０ｎｍの紫外線はＤｓｓが励起される波長である。式ＶＩの塩基中の蛍光性分子は通常、この波長では蛍光を生じずＦＲＥＴは生じて始めて蛍光が観察されることが望ましい。
【０１２０】
以下のＣ−２ないしＣ−４の態様はいずれも７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）と、式ＶＩの塩基との間で人工塩基対の形成を検出するものである。
【０１２１】
Ｃ−２
本発明は、Ｃの方法の一態様として以下の態様を提供する。
本発明の蛍光共鳴エネルギー転移ならびに静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法は、
７−（２−チエニル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン３−イル基（Ｄｓ）と、式ＶＩの塩基との間で塩基対が形成されると、
２４０−３９０ｎｍの紫外線による励起により、少なくとも１つの２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）から、式ＶＩの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などが生じ、蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Ｄｓを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）を塩基として有するポリヌクレオチドが少なくとも１つ存在する、前記方法である。
【０１２２】
本態様の模式図を図２５に示す。
ここにおいて、Ｄｓを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上存在するｓの数は限定されないが、好ましくは１−３、より好ましくは１又は２である。最も好ましくは２である。図２４、レーン３で示したようにｓが２個の場合には、ｓの自己消光性によりｓの蛍光強度が低下あるいは消光されており（自家消光）、ＦＲＥＴによる蛍光スペクトルの変化がよりはっきりと観察される（図２４、レーン７）。ｓが１個の場合はｓの蛍光が観察される（図２４、レーン２）。この場合も、ＦＲＥＴによりｓの蛍光から蛍光性分子の蛍光が観察されるようになる（図２４、レーン５、６）。
【０１２３】
ｓが２つ並んだ場合のように２以上の人工塩基が同一核酸上に２つ以上存在している態様だけでなく、天然塩基に自己消光性塩基が結合している場合、Ｄｓｓのように１つの人工塩基中に２以上の消光性塩基部分（ｓ）が存在するような場合も本発明のＦＲＥＴ及び又は静的消光作用を利用した方法が適用可能である。
【０１２４】
Ｃ−３
本発明は、Ｃの方法の一態様として以下の態様を提供する。
本発明の蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法は、
Ｄｓと、式ＶＩ塩基との間で塩基対が形成されると、
３５０−３９０ｎｍの紫外線による励起により、少なくとも１つの２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）から、式ＶＩの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などが生じて蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Ｄｓを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも１つの２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）が天然型塩基に結合した少なくとも１の塩基を有するポリヌクレオチドが少なくとも１つ存在する、前記方法である。
【０１２５】
本態様の模式図を図２９ａ及び図３１に示す。
ｓが結合する天然塩基の種類は限定されず、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕのいずれでも可能である。また、ｓが結合する天然塩基が２以上隣接して存在する場合、隣接天然塩基は同じであっても、異なっていてもよい。好ましくは同じものが２以上隣接する。ｓが結合する天然塩基が同一核酸中に隣接する数も、ｓが核酸中に存在するＣ−２の態様と同様に、特に限定されないが、好ましくは１−３、より好ましくは１又は２である。最も好ましくは２である。
【０１２６】
また、Ｃ−３の態様には、１つの天然塩基に２以上のｓが結合する態様も含む（図３１）。結合するｓの数は、特に限定されないが好ましくは２又は３，より好ましくは２である。
【０１２７】
Ｃ−４
本発明は、Ｃの方法の一態様として以下の態様を提供する。
本発明の蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法は、
Ｄｓと、式ＶＩの塩基との間で塩基対が形成されると、
２４０−４１０ｎｍの紫外線による励起により、７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）から、式ＶＩの塩基中の蛍光性分子への蛍光共鳴エネルギー転移や静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などが生じて蛍光スペクトルが変化し、人工塩基対が形成されたことが検出される、
ここにおいて、Ｄｓを塩基として有するポリヌクレオシドを含む核酸と同一鎖上に、少なくとも１つの７−（２，２’−ビチエン−５−イル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−３−イル基（Ｄｓｓ）が天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドが存在する、
前記方法、である。
【０１２８】
本態様の模式図を図３２に示す。
本発明のＣ−１ないしＣ−４を含むＣの態様において、蛍光性分子は特に限定されない。好ましくは、式Ｉの消光剤について上述したのと同様である。より好ましくはインドカルボシアニン（Ｃｙ３）である。
【０１２９】
式ＶＩの塩基中の置換基Ｒ６は好ましくは以下の：
【０１３０】
【化３３】
0005874152.tif 000034
【０１３１】
の構造を有する。
本発明はまた、
以下のｉ）−ｉｖ）からなる群から選択される、１つの核酸プライマー；
ｉ）Ｄｓｓを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー；
ｉｉ）Ｄｓを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも１つのｓを塩基として有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー；
ｉｉｉ）Ｄｓを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、少なくとも１つのｓが天然型塩基に結合した少なくとも１の塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー；及び
ｉｖ）Ｄｓを塩基として有するポリヌクレオシド、及び、Ｄｓｓが天然型塩基に結合した塩基を有するポリヌクレオチドを含む、核酸プライマー、
並びに、式ＶＩの塩基
を塩基として有するポリヌクレオチド
を含む、蛍光共鳴エネルギー転移ならびに静的消光作用（ｓｔａｔｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）などによる蛍光スペクトルの変化により、人工塩基の塩基対の形成を検出する方法に使用するためのキットを提供する。
【０１３２】
Ｄｓｓ−ＰｎならびにＤｓｓ−Ｐｘ塩基対は、ＰＣＲにおいても効率よく機能する。本発明においては、核酸の塩基対は、転写、逆転写、複製又は翻訳のいずれの工程で形成されるものであってもよい。
【０１３３】
本発明のＦＲＥＴ及び／又は静的消光作用を利用した検出方法において（態様Ｃ）、検出スペクトルの変化は、肉眼で判定できる、ことを特徴とする。本発明前は、可視で簡便に人工塩基対の形成、標的核酸の検出を行うことのできる方法は存在しなかった。本発明の検出方法を利用すると、リアルタイムＰＣＲも可視化できる。よって、複雑かつ高価なＰＣＲ装置が不要となった
また、本発明の人工塩基対の検出方法を利用して核酸の増幅を行った場合、増幅された核酸をそのまま電気泳動し、簡便に検出することが可能である（図２３等）。さらに、電気泳動のバンドの濃さにより定量化も可能である。
【実施例】
【０１３４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【０１３５】
実施例１  Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰの化学合成（図５）
１）試薬、溶媒等
試薬及び溶媒は、標準的な供給業者から購入し、さらに精製することなく使用した。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ）および３１Ｐ−ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ）スペクトルは、ＢＲＵＫＥＲ  ＡＶ３００核磁気共鳴スペクトロメーター上に記録した。合成したヌクレオシド５’−三リン酸は、Ｇｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステムで最終精製を行った。エレクトロスプレイ−イオン化マススペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）  は、Ｗａｔｅｒｓ  ２６９０  ＬＣシステムを伴ったＷａｔｅｒｓ  ＺＭＤ  ４０００マスシステム上に記録した。【０１３６】
２）１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル−４−［３−（Ｃｙ３−カルボキサミドヘキサナミド）−１−プロピニル］−２−ニトロピロール  ５’−三リン酸  （Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ）  の合成
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−［３−（６−アミノヘキサナミド）−１−プロピニル］−２−ニトロピロール  ５’−三リン酸（ＮＨ２−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ）（８．４μｍｏｌ）の１００ｍＭＭ  ＮａＨＣＯ３−Ｎａ２ＣＯ３バッファー溶液（ｐＨ８．６，５００μｌ）にＣｙ３  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（Ｃｙ３−ＳＥ，６．０ｍｇ，７．６３μｍｏｌ）のＤＭＦ（３００μｌ）溶液を加えて室温で１２時間静置した。５０ｍＭ  ＴＥＡＡ（３．０ｍｌ）を反応溶液に加えてＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５ならびにＨＰＬＣで精製してＣｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ（２．７μｍｏｌ，３５％）を得た。【０１３７】
３）  Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ  ８．５５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ），７．９０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝１．７Ｈｚ），７．８５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．２，８．４Ｈｚ），７．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），７．３９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１．９，８．５Ｈｚ），７．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），６．６４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），６．３９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．８，１３．５Ｈｚ），４．５９（ｍ，１Ｈ），４．２２−４．０８（ｍ，９Ｈ），３．２０（ｑ，３２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．０７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．５９（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．１，１３．３Ｈｚ），２．３８（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．２，１３．８Ｈｚ），２．２７−２．１７（ｍ，２Ｈ），１．８６（ｍ，２Ｈ），１．７７（ｓ，１２Ｈ），１．６７−１．５４（ｍ，４Ｈ），１．４２−１．２５（ｍ，５６Ｈ）．
３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ  −８．６５（ｂｓ，１Ｐ），−１０．７２（ｄ，１Ｐ，Ｊ＝１９．７Ｈｚ），−２２．３２（ｔ，１Ｐ，Ｊ＝２０．４Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｆｏｒ  Ｃ４９Ｈ６５Ｎ６Ｏ２２Ｐ３Ｓ２  計算値：１２４７．２８（Ｍ＋Ｈ）＋，  実測値：１２４７．４３（Ｍ＋Ｈ）＋，  計算値：  １２４５．２８（Ｍ−Ｈ）−，  実測値：１２４４．９１（Ｍ−Ｈ）−．
実施例２  人工塩基Ｐｎによる相補鎖中の蛍光性人工塩基Ｄｓｓの消光（図７）
蛍光性人工塩基Ｄｓｓを含むＤＮＡ断片  （１２−ｍｅｒ、５’−ＧＧＴＡＡＣＮ１ＡＴＧＣＧ−３’、Ｎ１＝Ｄｓｓ）（配列番号１）のみ、もしくは相補鎖のＤＮＡ断片（１２−ｍｅｒ、５’−ＣＧＣＡＴＮ２ＧＴＴＡＣＣ−３’、Ｎ２＝Ｐｎ、Ｄｓｓ、Ｄｓ、もしくはＴ）（配列番号２）と二本鎖を形成させた場合の蛍光変化を調べるために、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液中で一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が５μＭとなるように溶液を調製し、アニーリング後、３６５ｎｍでのＵＶトランスイルミネーター照射により蛍光を撮影した結果を図７に示した。【０１３８】
実施例３  各ＤＮＡ断片の蛍光スペクトル（図８）
図８に、ＥＴＣ−２７３Ｔ温度コントローラーを装備したＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００スペクトロメーターを用いて測定した各ＤＮＡ断片の蛍光スペクトルを示した。Ｄｓｓを含む一本鎖ＤＮＡ断片（１２−ｍｅｒ、５’−ＧＧＴＡＡＣＮ１ＡＴＧＣＧ−３’、Ｎ１＝Ｄｓｓ）（配列番号１）及びその相補鎖（１２−ｍｅｒ、５’−ＣＧＣＡＴＮ２ＧＴＴＡＣＣ−３’、Ｎ２＝Ｐｎ、Ｄｓｓ、Ｄｓ、もしくはＴ）（配列番号２）を含む二本鎖ＤＮＡを、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液中で５μＭとなるように調製し、アニーリング後、３８５ｎｍでの励起による発光スペクトルを２５℃で測定した。【０１３９】
比較として、Ｄｓを含む一本鎖ＤＮＡ断片（１２−ｍｅｒ、５’−ＧＧＴＡＡＣＮ１ＡＴＧＣＧ−３’、Ｎ１＝Ｄｓ、５μＭ）（配列番号３）を用いて、３１０ｎｍでの励起による発光スペクトルを２５℃で測定した。【０１４０】
実施例４  Ｐｎの消光作用（図９）
Ａ．Ｐｎのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＰｎＴＰ）の濃度依存による蛍光性人工塩基Ｄｓｓのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＤｓｓＴＰ，５μＭ）の蛍光強度の変化
ＥＴＣ−２７３Ｔ温度コントローラーを装備したＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００スペクトロメーターを用いて、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０５ｍＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＰｎＴＰ）を含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液（１００μｌ）に、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＤｓｓＴＰ、１０５μＭ）を５μｌ加えて、３７０ｎｍでの励起によるｄＤｓｓＴＰの発光スペクトルを２０℃で測定した。【０１４１】
同様に天然型塩基のデオキシリボヌクレオシド三リン酸存在下のｄＤｓｓＴＰの蛍光消光効果を調べるために、１５ｍＭ、１２ｍＭ、９ｍＭ、６ｍＭ、３ｍＭ、１ｍＭのデオキシリボアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシリボチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシリボシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）を含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液（１００μｌ）に、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＤｓｓＴＰ、１０５μＭ）を５μｌ加えて、３７０ｎｍでの励起によるｄＤｓｓＴＰの発光スペクトルを２０℃で測定した。【０１４２】
Ｂ．ｄＰｎＴＰと天然型塩基の三リン酸とのＤｓｓに対する消光性の比較
Ｐｎならびに天然型塩基のデオキシリボヌクレオシド三リン酸による、蛍光性人工塩基のヌクレオシド三リン酸、ｄＤｓｓＴＰ（５μＭ）の消光性をＳｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ  Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ  ｐｌｏｔにより解析した。【０１４３】
具体的には、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液中、２０℃で測定した発光スペクトル  （３７０ｎｍ  励起）を用いて、系中に存在するクエンチャー（ｄＰｎＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）の濃度に対する蛍光強度の減少を以下のＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ式に代入することにより、Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ定数（ＫＳＶ）を算出した。【０１４４】
Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ式：  Ｆ０／Ｆ１＝１＋ＫＳＶ［Ｑ］
ここで、Ｆ０は、クエンチャーの存在しない場合の蛍光強度、Ｆ１はクエンチャーの存在する場合の蛍光強度を示し、［Ｑ］はクエンチャーの濃度である。具体的には、クエンチャーの濃度［Ｑ］を横軸に、そのクエンチャー濃度に対するＦ０／Ｆ１を縦軸にプロットし、最小二乗法により得られた直線からＫＳＶを求めた。ここで、ＫＳＶの値が大きいほど消光能が強いクエンチャーであることを示す。グアニン塩基は消光性を有することが知られているが、Ｐｎはさらに強い消光性を示すことがわかった。【０１４５】
実施例５  ｄＰｎとその各種誘導体によるｄＤｓｓの蛍光の消光（図１０）
５ｍＭまたは５ｍＭ  ｄＰｎまたはその各種誘導体存在下での終濃度５μＭ  ｄＤｓｓの蛍光を、励起波長３８５ｎｍ、測定温度２５℃で測定した結果を図１０に示した。具体的には、各ヌクレオシド溶液（２０μＭ  ｄＤｓｓ、２０ｍＭ  ｄＰｎおよびその各種誘導体）を以下の手順で調製した。【０１４６】
ｄＤｓｓ、ｄＰｎまたはその各種誘導体をそれぞれ約５ｍｇとり、５５−６０℃で６時間乾燥後、秤量し、ｄＤｓｓは２ｍＭ、ｄＰｎまたはその各種誘導体はそれぞれ２０ｍＭになるように２０％  アセトニトリル水溶液を加えた。ｄＤｓｓはさらに希釈し、２０μＭとした。蛍光スペクトル測定用のサンプルに関しては、ｄＰｎまたはその各種誘導体の終濃度２．５ｍＭの場合（図１０Ａ）、５０μｌの２０μＭ  ｄＤｓｓ溶液、２５μｌの２０ｍＭ  ｄＰｎまたはその各種誘導体溶液、２５μｌの２０％アセトニトリル溶液、１００μｌのエタノールを混合して、全量を２００μｌとした。ｄＰｎまたはその各種誘導体の終濃度５ｍＭの場合（図１０Ｂ）には、５０μｌの２０μＭ  ｄＤｓｓ溶液、５０μｌの２０ｍＭ  ｄＰｎまたはその各種誘導体溶液、１００μｌのエタノールを混合して、全量を２００μｌとした。【０１４７】
実施例６  クレノウ断片によるＤｓｓ−Ｐｎ塩基対のＤＮＡ中への一塩基取り込み実験（表１）
クレノウ断片による一塩基取り込み実験を、文献に従っておこなった（Ｋｉｍｏｔｏ，Ｍ．；Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｓ．；Ｈｉｒａｏ，Ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２００４，２６，９９９−１００５、Ｐｅｔｒｕｓｋａ，Ｊ．；Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．；Ｂｏｏｓａｌｉｓ，Ｍ．Ｓ．；Ｓｏｗｅｒｓ，Ｌ．Ｃ．；Ｃｈｅｏｎｇ，Ｃ．；Ｔｉｎｏｃｏ，Ｉ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８，８５，６２５２−６２５６、Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｓ．；Ｂｌｏｏｍ，Ｌ．Ｂ．；Ｐｅｔｒｕｓｋａ，Ｊ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３，２８，８３−１２６、Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９８，５，９５０−９５４）。【０１４８】
具体的には、５’末端が６−カルボキシフルオレセインで標識されたプライマー（２０−ｍｅｒ、５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡ−３’（配列番号４）または、５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＣＴＴＣＴ−３’（配列番号５））と鋳型ＤＮＡ（３５−ｍｅｒ、５’−ＡＧＣＴＣＴＤｓｓＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴ−３’（配列番号６））または、５’−ＴＣＧＡＧＡＮＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴ−３’（Ｎ＝Ｐｎ、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）（配列番号７））を、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、および１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）  緩衝液中で、９５℃で加温した後に、４℃へ緩やかに冷却することによりアニーリングし、鋳型鎖とプライマーの二本鎖を形成させた。【０１４９】
このプライマー―鋳型二本鎖ＤＮＡ溶液（１０μＭ）を５μｌずつ分注した後，エキソヌクレアーゼ活性を持たないクレノウ断片（ＫＦｅｘｏ−、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＵＳＢ）の酵素溶液（２μｌ）を加えて、３７℃で２分間インキュベートし、ＤＮＡ・酵素複合体を形成させた。その溶液に３μｌの各基質、即ちヌクレオシド三リン酸溶液（Ｄｓｓ、ＰｎまたはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのうち１種、１μＭ−５ｍＭ）を加えて、３７℃で酵素反応（１−３５分間）を行った。反応の終了は、１０μｌの２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む９５％ホルムアミド溶液（停止溶液）を加えて７５℃で３分加温することで行った。【０１５０】
反応条件をまとめると以下の通りである。溶液（１０μｌ）中、５μＭプライマー−鋳型二本鎖、５−５０ｎＭ酵素及び０．３−１５００μＭ基質を使用。溶液（１０μｌ）は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ及び０．０５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む。反応は、３７℃で１−３５分間。【０１５１】
反応溶液の一部を停止溶液で希釈した後、その希釈反応液０．５μｌをローディング溶液（脱イオンホルムアミド：２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍｇ／ｍｌブルーデキストラン溶液＝５：１）３μｌと混合し、９０℃で２分加熱し、氷上に置いて急冷した。そのうちの約０．５μｌを１レーンおきにシークエンスゲルにロードし電気泳動を行った。シークエンスゲル（３６ｃｍ  ＷＴＲ）の組成は、６Ｍ  尿素、１０％ポリアクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１９：１）、０．５×ＴＢＥである。泳動用緩衝液は，０．５×ＴＢＥを用いた。Ｒｕｎ  Ｍｏｄｕｌｅは、ＧＳ  Ｒｕｎ  ３６Ｃ−２４００である。泳動時間は約１時間とし、反応産物のピークパターンの解析及び定量は、ＧｅｎｅＳｃａｎソフトウエア  （バージョン３．０）装備した自動ＡＢＩ３７７ＤＮＡシークエンサーで解析した。【０１５２】
未反応のプライマー断片，および一塩基とりこまれて伸長したＤＮＡ断片のピークの面積を用いて、一ヌクレオチド伸長されたプライマーの割合を定量し、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆ  ｐｌｏｔ（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｆ．；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｓ．；Ｂｌｏｏｍ，Ｌ．Ｂ．；Ｐｅｔｒｕｓｋａ，Ｊ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３，２８，８３−１２６）により酵素学的パラメーターＶｍａｘ、ＫＭを算出した。なお、Ｖｍａｘの値は、使用された種々の酵素および二本鎖濃度に対して酵素濃度２０ｎＭ、二本鎖濃度５μＭに標準化された。【０１５３】
結果を表１に示す【０１５４】
【表１】
0005874152.tif 000035
【０１５５】
実施例７  大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼ  Ｉ  のクレノウ断片を用いたＰｎを含む鋳型ＤＮＡとｄＤｓｓＴＰによるプライマー伸長反応（図１１）
５’末端を３２Ｐで標識したプライマー（２３−ｍｅｒ）（配列番号８）とＰｎもしくはＰａを含む鋳型ＤＮＡ（３５−ｍｅｒ）（配列番号９）を、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ＤＴＴを含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中で、９５℃で加温後、４℃へ緩やかに冷却することによりアニーリングし、鋳型鎖とプライマーの二本鎖を形成させた。このプライマー―鋳型二本鎖ＤＮＡ溶液（４００ｎＭ）を５μｌずつ分注した後、２．５μｌの各基質、即ちヌクレオシド三リン酸溶液（４０μＭ  ｄＣＴＰ、４０μＭ  ｄＴＴＰ、０−４０μＭ  ｄＤｓｓＴＰ）を氷上で加えた。この溶液に、エキソヌクレアーゼ活性をもつクレノウ断片（ＫＦ  ｅｘｏ＋、ＴａＫａＲａ）を滅菌水で希釈した酵素溶液（２．５μｌ、１ユニット）を加えることで反応を開始し、３７℃で３分間保温後、１０μｌの１０Ｍ尿素を含む１×ＴＢＥ溶液（停止溶液）を加えて７５℃で３分加温することで反応を止めた。反応産物を１５％ポリアクリルアミド―７  Ｍ  尿素ゲルで電気泳動し、バンドパターンをバイオイメージングアナライザー（ＦＬＡ７０００、富士フィルム）によるオートラジグラフィーにより解析した。【０１５６】
実施例８  Ｄｓｓ−Ｐｘ塩基対を用いたＤｓを含むＤＮＡのＰＣＲ増幅（図１２）
所定濃度の人工塩基基質、ＮＨ２−ｈｘ−ｄＰｘＴＰおよびｄＤｓｓＴＰ、の存在下で、Ｄｓを含む鋳型ＤＮＡ（Ｓ２、５５−ｍｅｒ）もしくは天然型塩基だけからなるＤＮＡ（対照、５５−ｍｅｒ）を用いてＰＣＲを行い、その産物を電気泳動により解析した結果を図１２に示した。【０１５７】
使用した鋳型ＤＮＡおよびプライマーの配列は以下のとおりである。
ＤＮＡ  Ｓ２  （５５−ｍｅｒ、下線部はプライマーのアニーリング部位）
５’−ＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＧＧＣＣＣＤｓＴＴＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１０）
ＤＮＡ  対照  （５５−ｍｅｒ、下線部はプライマーのアニーリング部位）
５’−ＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１１）
５’側プライマー：
５’−ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’（配列番号１２）
３’側プライマー：
５’−ＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１３）
ＰＣＲ（反応スケール：４０μｌ）は鋳型として最終濃度０．４ｎＭのＤＮＡ断片を用いて実施し、９４℃−３０秒、４５℃−３０秒、６５℃−４分を１サイクルとして２０サイクル行った。反応液の最終組成は２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．０２ユニット／μｌ、ＮＥＢ）、１μＭ  ５’側プライマー、１μＭ  ３’側プライマー、０．３ｍＭ  各天然型塩基基質ｄＮＴＰ、１０−２５μＭ  ｄＤｓｓＴＰ、および２５μＭ  ＮＨ２−ｈｘ−ｄＰｘＴＰである。２０サイクル後のＰＣＲ産物を１５％ポリアクリルアミド―７Ｍ  尿素ゲルで電気泳動した。【０１５８】
増幅されたＤＮＡのバンドは、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ  （Ｌｏｎｚａ）で染色した後、バイオイメージャーＬＡＳ４０００（富士フィルム）  のＳＹＢＲモードで検出した。【０１５９】
実施例９  Ｄｓｓ−Ｐｘ塩基対を用いたＰＣＲ増幅後のＤＮＡのシーケンシング（図１３）
所定濃度の人工塩基基質、ＮＨ２−ｈｘ−ｄＰｘＴＰおよびｄＤｓｓＴＰ、の存在下で、Ｄｓを含む鋳型ＤＮＡ（Ｓ２、５５−ｍｅｒ）を用いてＰＣＲを行い、その産物中に人工塩基Ｄｓｓが保持されているかを、人工塩基基質ｄＰａ’ＴＰもしくはｄｄＰａ’ＴＰを利用したＤＮＡシーケンシングにより解析した結果を図１３に示した。【０１６０】
使用した鋳型ＤＮＡおよびプライマーの配列は以下のとおりである。
ＤＮＡ  Ｓ２  （５５−ｍｅｒ、下線部はプライマーのアニーリング部位）
５’−ＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＧＧＣＣＣＤｓＴＴＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＣ−３’（配列番号１０）
ＰＣＲ用プライマー
５’側プライマー：５’−ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’（配列番号１２）
３’側プライマー：５’−ＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１３）
シーケンシング用プライマー：
５’−ＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’（配列番号１４）
ＰＣＲ（反応スケール：２５μｌ）は鋳型として最終濃度０．６ｎＭのＤＮＡ断片を用いて実施し、９４℃−３０秒、４５℃−３０秒、６５℃−４分を１サイクルとして１５サイクル行った。反応液の最終組成は２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．０２ユニット／μｌ、ＮＥＢ）、１μＭ  ５’側プライマー、１μＭ  ３’側プライマー、０．３ｍＭ  各天然型塩基基質ｄＮＴＰ、２−１０μＭ  ｄＤｓｓＴＰ、および２−５０μＭ  ＮＨ２−ｈｘ−ｄＰｘＴＰである。１５サイクル後のＰＣＲ産物全長を変性ゲルで精製した後、ＤＮＡシーケンスの鋳型とし、シーケンシング解析をおこなった。【０１６１】
ＤＮＡのシーケンシング反応は、全量２０μｌスケールにて、市販のＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）のＣｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｍｉｘ  ８μｌとプライマー（４ｐｍｏｌ）とＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片（およそ０．３ｐｍｏｌ程度）を混合し、４０ｐｍｏｌのｄＰａ’ＴＰもしくは１ｎｍｏｌのｄｄＰａ’ＴＰの存在下、２５サイクルのＰＣＲ（９６℃−１０秒、５０℃−５秒、６０℃−４分）を行った。未反応のダイダーミネーターをＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）で反応溶液からとり除き、残りの溶液を減圧吸引により乾燥した。残存物にＢｌｕｅ−Ｄｅｘｔｒａｎを希釈したホルムアミド溶液を４μｌ加えて懸濁し、その一部をＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサーにより解析した。解析に用いたゲル組成は、７％ポリアクリルアミド―６Ｍ  尿素ゲルであり、配列のピークパターンは、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  ＰＲＩＳＭシークエンシング解析ｖ３．２ソフトウエアを用いて解析した。【０１６２】
実施例１０  Ｄｓｓ−Ｐｘ塩基対を用いたリアルタイムＰＣＲ（図１５）
人工塩基Ｄｓｓを含むプライマーを用いて、ｄＰｘＴＰの基質存在下でＰＣＲを行った場合のリアルタイムＰＣＲの原理を図１４に示した。【０１６３】
Ｄｓｓに対してＰｘが相補鎖に取り込まれると、ＰｘがＤｓｓのクエンチャー（消光剤）として作用するため、ＰＣＲ増幅された二本鎖ＤＮＡをＤｓｓの蛍光強度の減少から検出することができる。図１５は、実際に下記のＤＮＡ断片を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した結果であり、定量的な増幅プロットが得られ、反応液中（２５μｌ）に３コピーのＤＮＡでも検出可能であることがわかった。【０１６４】
実験に使用した配列（下線部はプライマーアニーリング部位に相当）
５’−プライマー配列：５’−ＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣ−３’（配列番号１５）
３’−プライマー配列：５’−ＡＡＴＡＡＴＧＣＤｓｓＴＣＣＴＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１６）
二本鎖鋳型ＤＮＡ（９８ｂｐ；片方の鎖のみ記載）：
５’−ＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＡＧＡＣＧＴＡＧＡＡＧＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＧＡＧＧＡ−３’（配列番号１７）
具体的には、リアルタイムＰＣＲ装置（ストラタジーン、Ｍｘ３００５Ｐ）を用いて、プライマー各１μＭ、天然型塩基基質ｄＮＴＰ  各０．２ｍＭ、人工塩基基質ｄＰｘＴＰ  ２μＭの存在下、９４℃−２分の後に、９４℃−５秒、６８℃−４０秒を１サイクルとする２ステップＰＣＲの条件で５５サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応スケールは２５μｌで、反応液の組成は４０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１６ｍＭ  ＫＣｌ、３．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１×ＴｉｔａｎｉｕｍＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。鋳型に用いたＤＮＡ断片は、反応液中にそれぞれ、０、３、１５、３０、１５０、３００、１５００、３０００、１５０００、３００００コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、ＰＣＲを実施した。【０１６５】
検出に用いたフィルターセットは、励起３５０ｎｍ−蛍光４４０ｎｍ（ＡＬＥＸＡ用）である。データ解析には、Ｐｌｅｘｏｒ（登録商標）  ＡｎａｌｙＳｉＳ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ｖ１．５．４．１８，Ｐｒｏｍｅｇａ  ＆  Ｅｒａｇｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。結果を図１５に示した。【０１６６】
実施例１１  Ｄｓｓ−Ｐｎ塩基対を含むＤＮＡヘアピンの蛍光特性（図１６）
Ｄｓｓを含む２種類のＤＮＡ、ｈａｉｒｐｉｎ  ｓｓＤＮＡ（３４−ｍｅｒ）（配列番号１８）とｓｓＤＮＡ（１２−ｍｅｒ）（配列番号１９）を１×ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有）中で１μＭとなるように調製し、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＤｙｅあるＲＯＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）存在下（最終濃度１０００倍希釈）、温度変化による蛍光強度の変化をＭｘ３００５Ｐのｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎモードで検出した。ＲＯＸのシグナル強度で補正したのち、３５℃での値を基準として規格化したときのグラフを図１６に示した。【０１６７】
構造をもたない直鎖上のｓｓＤＮＡ（１２−ｍｅｒ）は、ＤＮＡを含まないＢｕｆｆｅｒのみ（バックグラウンド）と同様、少しずつ蛍光が現象するプロファイルであったのに対し、Ｄｓｓ−Ｐｎ塩基対を含むヘアピン構造を形成するｈａｉｒｐｉｎ  ｓｓＤＮＡ（３４−ｍｅｒ）は、温度上昇とともに蛍光が上昇するプロファイルが得られた。これは、低温状態ではヘアピン構造をとっているために消光作用のあるＰｎがＤｓｓと塩基対を形成し、Ｄｓｓの蛍光がＰｎで消光して蛍光強度が低くなっている一方で、温度を上げた場合にはヘアピン構造が壊れて消光作用がなくなり、Ｄｓｓの蛍光が検出されるようになったため、と考えられる。【０１６８】
実施例１２  Ｄｓｓ−Ｐｎ塩基対を用いたモレキュラービーコンの可視化（図１７）
各種ＤＮＡ断片、モレキュラービーコン（ＭＢ−Ｃ、２６−ｍｅｒ）（配列番号２０）とＴａｒｇｅｔ  ＤＮＡ（７１Ｇ、７１−ｍｅｒ）（配列番号２１）をそれぞれ２μＭとなるように調製し、等量（５０μｌずつ）混合した。ネガティブコントロールとして、Ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡを含まない溶液を、ＭＢ−Ｃ溶液と混合した。最終的な溶液組成はＤＮＡ濃度各１μＭ、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡである。この溶液をＰＣＲマシンにて９０℃で１０秒間加熱後、２５℃まで徐冷した。励起波長３７５ｎｍのＵＶ−ＬＥＤランプによる照射下もしくは自然光下にて、デジタルカメラにより撮影した写真を図１７の右に示した。【０１６９】
ターゲットＤＮＡ非存在下では、モレキュラービーコンはループ―ステム構造を形成して、Ｄｓｓ−Ｐｎ塩基対形成により、Ｄｓｓの蛍光が消光されるが、ターゲットＤＮＡ存在下では、モレキュラービーコンのループ部分がハイブリダイゼーションによりターゲットＤＮＡと二本鎖を形成し、ステム構造が壊れてＤｓｓ−Ｐｎ塩基対が形成なくなり、Ｄｓｓの蛍光が検出されることが目視にて確認できた。【０１７０】
実施例１３  Ｄｓｓ−Ｐｎ塩基対を用いたモレキュラービーコンによる一塩基変異の検出（図１８）
５００ｎＭに希釈したモレキュラービーコン（２６−ｍｅｒ、ＭＢ−Ｃ（配列番号２０）またはＭＢ−Ｔ（配列番号２３））の溶液を５０μｌずつ分注し、最終溶液の５倍濃度のＴａｒｇｅｔ  ＤＮＡ断片（７１−ｍｅｒ、７１Ｇ（配列番号２１）または７１Ａ（配列番号２２）、１２．５μｌ）と混合したサンプルをインキュベーターにて４５℃で５分以上保温して平衡状態とした。蛍光測定はＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００  スペクトロメーターを用いて行い、セルに溶液を移したのち装置中（４５℃設定）で２分放置後に、自動シャッター制御を使用して３９０ｎｍで励起し４３０−４７０ｎｍの蛍光スペクトルを測定した。最終溶液中の組成は、モレキュラービーコン  ４００ｎＭ、Ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ  ０−３２００ｎＭ、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡである。【０１７１】
図１８に示したグラフは、４５４ｎｍの蛍光強度について、Ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ断片非存在下での蛍光強度でそれぞれ規格化してからプロットしたものである。一塩基のミスマッチがある場合には完全にマッチした場合よりも蛍光強度が有意に低くなることを利用して、一塩基変異をＤｓｓ−Ｐｎ塩基対を利用したモレキュラービーコンにより検出できることがわかった。【０１７２】
実施例１４  Ｃｙ３−Ｐｘ／Ｄｓｓ塩基対を用いた可視化ＰＣＲ（図２０）
人工塩基Ｄｓｓを含むプライマーを用いて、Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰの基質存在下でＰＣＲを行った場合のリアルタイムＰＣＲの原理を図１９に示した。Ｄｓｓに対してＣｙ３−ｈｘ−ｄＰｘが相補鎖に取り込まれると、３５０ｎｍ付近の照射でＤｓｓとＣｙ３間にＦＲＥＴが起こるため、ＰＣＲ増幅された二本鎖ＤＮＡを特異的に光らせることができる。また、このＦＲＥＴによる蛍光は目視検出が可能なこともわかった（図２０）。【０１７３】
実験に用いた配列は図１５と同一である。
実験に使用した配列  （下線部はプライマーアニーリング部位に相当）
５’−プライマー配列  ：５’−ＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣ−３’（配列番号１５）
３’−プライマー配列  ：５’−ＡＡＴＡＡＴＧＣＤｓｓＴＣＣＴＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１６）
二本鎖鋳型ＤＮＡ  （９８  ｂｐ；片方の鎖のみ記載）：
５’−ＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＡＧＡＣＧＴＡＧＡＡＧＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＧＡＧＧＡ−３’（配列番号１７）
具体的には、リアルタイムＰＣＲ装置（ストラタジーン、Ｍｘ３００５Ｐ）を用いて、プライマー各１μＭ、天然型塩基基質ｄＮＴＰ各０．２ｍＭ、人工塩基基質Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ  ２μＭの存在下、９４℃−２分の後、９４℃−５秒、６８℃−４０秒を１サイクルとする２ステップＰＣＲの条件で５５サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応スケールは２５μｌで、反応液の組成は４０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１６ｍＭ  ＫＣｌ、３．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１×ＴｉｔａｎｉｕｍＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。鋳型に用いたＤＮＡ断片は、反応液中にそれぞれ、０、３、３０、３００、３０００、３００００、３０００００、３００００００コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、ＰＣＲを実施した。その反応チューブを直接、３６５ｎｍのＵＶで照射し、オレンジフィルターを通して目視で蛍光を検出した。【０１７４】
実施例１５  蛍光性分子Ｃｙ３を結合した消光性Ｐｘ塩基によるリアルタイムＰＣＲ（図２２）
人工塩基Ｄｓを含むプライマーを用いて、蛍光性分子（Ｃｙ３など）を結合したｄＰｘＴＰ誘導体の基質存在下でＰＣＲを行った場合のリアルタイムＰＣＲの原理を図２１に示した。蛍光性分子を、消光性のＰｘ塩基に結合させると、蛍光性分子の蛍光が３０％程度消光する。これを基質（Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ）  にして、Ｄｓ塩基を導入したプライマーを用いたＰＣＲを行うと、Ｃｙ３−ｈｘ−ＰｘがＤＮＡ中に取り込まれることで、Ｃｙ３の蛍光強度が増大する。図２２は、実際に下記のＤＮＡ断片を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した結果であり、定量的な増幅プロットが得られ、反応液中（２５μｌ）に３コピーのＤＮＡでも検出可能であることがわかった。【０１７５】
実験に使用した配列（下線部はプライマーアニーリング部位に相当）
５’−プライマー配列：５’−ＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣ−３’（配列番号１５）
３’−プライマー配列：５’−ＡＡＴＡＡＴＧＣＤｓＴＣＣＴＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号２４）
二本鎖鋳型ＤＮＡ（９８ｂｐ；片方の鎖のみ記載）：
５’−ＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＡＧＡＣＧＴＡＧＡＡＧＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＧＡＧＧＡ−３’（配列番号１７）
具体的には、リアルタイムＰＣＲ装置  （ストラタジーン、Ｍｘ３００５Ｐ）を用いて、プライマー各１μＭ、天然型塩基基質ｄＮＴＰ各０．２ｍＭ、人工塩基基質Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ  ２μＭの存在下、９４℃−２分の後、９４℃−５秒、６８℃−４０秒を１サイクルとする２ステップＰＣＲの条件で５５サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応スケールは２５μｌで、反応液の組成は４０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１６ｍＭ  ＫＣｌ、３．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１×ＴｉｔａｎｉｕｍＴａｑＤＮＡポリメラーゼである。鋳型に用いたＤＮＡ断片は、反応液中にそれぞれ、０、３、３０、３００、３０００、３００００、３０００００、３００００００コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、ＰＣＲを実施した。検出に用いたフィルターセットは、励起５４５ｎｍ−蛍光５６８ｎｍ（ＣＹ３用）である。データ解析には、付属の解析ソフトＭｘＰｒｏ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１０を用いた。【０１７６】
実施例１６  蛍光性分子Ｃｙ３を結合した消光性Ｐｘ塩基によるリアルタイムＰＣＲ産物のゲル電気泳動上での検出（図２３）
図２２に示したＰＣＲ産物は、Ｃｙ３が取り込まれているため、この産物をアガロースゲルで電気泳動した場合、従来のＥｔＢｒやＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎなどのＤＮＡ染色色素を用いることなく、ゲル上でＰＣＲ産物をＣｙ３の蛍光で検出可能である。図２３では、図２２に示したＰＣＲ産物１２μｌを、４％アガロースゲルで電気泳動し、バイオイメージングアナライザー、ＦＬＡ７０００（富士フィルム）のＣｙ３検出モード（励起レーザー：５３２ｎｍ、検出フィルター：Ｏ５８０）でバンドパターンを検出した結果を示した。【０１７７】
実施例１７  蛍光性分子  Ｃｙ３  ならびに蛍光性人工塩基Ｓを含むＤＮＡの蛍光特性（図２４）
化学合成後ＨＰＬＣ精製したＤＮＡ断片を最終濃度が５μＭとなるように、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で調製し、これらの溶液の蛍光特性を目視ならびに蛍光スペクトルで調べた結果を図２４に示した。【０１７８】
ＵＶ照射は、ＵＶトランスイルミネーターを用いて、下方より行った。蛍光性人工塩基ｓを一つ含むＤＮＡ断片は、２５４ｎｍ、３０２ｎｍ、３６５ｎｍの照射で発光し（写真レーン２）、ｓを２つ隣接してＤＮＡ中に導入すると、その蛍光が消光した（写真レーン３）。Ｃｙ３を導入したＤＮＡは、２５４ｎｍ、３０２ｎｍの照射で少し発光するが、３６５ｎｍの照射ではほとんど発光しなかった（写真レーン４）。これに対し、ＤＮＡ中のＣｙ３の近傍に、ｓを１つあるいは２つ導入するとＣｙ３の蛍光が観測され、ＦＲＥＴが起こることが確認できた（写真レーン５−７）。溶液を３６５ｎｍで励起した場合の蛍光スペクトルをグラフに示した。【０１７９】
実施例１８  蛍光性分子  Ｃｙ３を結合した消光性のＰｘ塩基と蛍光性人工塩基Ｓを組み合わせた可視化ＰＣＲ法（図２６−２８）
人工塩基Ｄｓおよび蛍光性人工塩基ｓを隣接して２つ含むプライマーを用いて、Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ基質存在下でＰＣＲを行った場合のリアルタイムＰＣＲの原理を図２５に示した。ｓを隣接して２つ導入するとｓの蛍光は完全に消光する。しかし、Ｓの近傍にＤｓを配置し、そのＤｓにＣｙ３−ｈｘが相補して特異的に組み込まれると、３６５ｎｍ付近の照射でＳとＣｙ３間にＦＲＥＴが起こり、ＰＣＲ増幅された二本鎖ＤＮＡのみを特異的に光らせることができる。【０１８０】
図２６は、実際に下記のＤＮＡ断片を用いて、ＰＣＲ２５サイクルを行った産物を目視で確認した結果である。図２６のｓｓ−Ｃｙ３を利用した系では、ＰＣＲ装置  （ＭＪリサーチ、ＰＴＣ−１００）を用いて、プライマー各１μＭ、天然型塩基基質ｄＮＴＰ各０．２  ｍＭ、人工塩基基質Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ  ２μＭの存在下、９４℃−２分の後、９４℃−５秒、６８℃−４０秒を１サイクルとする２ステップＰＣＲの条件で２５サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応スケールは２５μｌで、反応液の組成は４０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ８．０）、１６ｍＭ  ＫＣｌ、３．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１×ＴｉｔａｎｉｕｍＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。鋳型に用いたＤＮＡ断片濃度は０．５  ｎＭである。従来法であるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  存在下でのＰＣＲでは、人工塩基基質Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ  ２μＭの代わりに、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（最終濃度１／３００００）、レファレンス色素としてＲＯＸ（最終濃度  １／５００）を加えている。【０１８１】
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ存在下でのリアルタイムＰＣＲ検出は最もよく用いられる方法の一つであるが、図２６中、右側２レーンの写真に示したとおり、ＤＮＡ有無での蛍光変化が大きくないために、目視での検出は難しい。図２６の左側２レーンに示した通り、本法ではＰＣＲ検出を目視での検出が可能である。【０１８２】
図２７ａに示したリアルタイムＰＣＲでは、リアルタイムＰＣＲ装置（ストラタジーン、Ｍｘ３００５Ｐ）を用いて、プライマー  各１μＭ、天然型塩基基質ｄＮＴＰ  各０．２  ｍＭ、人工塩基基質Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ  ２μＭの存在下、９４℃−２分の後、９４℃−５秒、６８℃−４０秒を１サイクルとする２ステップＰＣＲの条件で５５サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応スケールは２５μｌで、反応液の組成は４０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ  ｐＨ８．０）、１６ｍＭ  ＫＣｌ、３．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１×ＴｉｔａｎｉｕｍＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。鋳型に用いたＤＮＡ断片は、反応液中にそれぞれ、０、３、３０、３００、３０００、３００００、３０００００、３００００００コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、ＰＣＲを実施した。【０１８３】
さらに、図２７ａに示したように、反応液中（２５μｌ）に３コピーのＤＮＡでも３６５ｎｍ照射により、ＰＣＲ産物を目視で検出可能であることがわかった。
また、図２８は図２７ａの可視化ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動した場合で、３１２ｎｍ照射でｓからＣｙ３へのＦＲＥＴにより産物検出ができること、また５３２ｎｍ照射でＤＮＡ中に直接取り込まれたＣｙ３の蛍光により産物検出ができることが確認できた。【０１８４】
実験に使用した配列（下線部はプライマーアニーリング部位に相当）
５’−プライマー配列：５’−ＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣ−３’（配列番号１５）
３’−プライマー配列：５’−ＡＡＴＡＡＳＳＧＣＤｓＴＣＣＴＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号２５）
二本鎖鋳型ＤＮＡ  （９８  ｂｐ；片方の鎖のみ記載）：
５’−ＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＡＧＡＣ
ＧＴＡＧＡＡＧＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＧＡＧＧＡ−３’（配列番号１７）
図２８では、図２７ａに示したＰＣＲ産物１２μｌを、４％アガロースゲルで電気泳動し、バイオイメージングアナライザー、ＬＡＳ４０００  （富士フィルム）のＥｔＢｒ検出モード（励起：３１２ｎｍ透過ＵＶ、検出フィルター  ６０５ＤＦ４０）を用いてｓとＣｙ３間のＦＲＥＴにより産物を検出した結果、およびＦＬＡ７０００  （富士フィルム）
のＣｙ３検出モード（励起レーザー：５３２ｎｍ、検出フィルター：Ｏ５８０）でＣｙ３の蛍光から直接産物を検出した結果を示した。【０１８５】
実施例１９  蛍光性分子  Ｃｙ３  を結合した消光性のＰｘ塩基と蛍光性人工塩基ｓを組み合わせた可視化ＰＣＲ法：  各ＰＣＲサイクルの蛍光強度の定量）（図２７ｂ−図２７ｄ）
本実施例は、図２７ａの実験の追実施例である。【０１８６】
人工塩基Ｄｓおよび蛍光性人工塩基ｓを隣接して２つ含むプライマーを用いて、Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ基質存在下でＰＣＲを行った場合、増幅されたＤＮＡ中のＣｙ３の蛍光強度の増加を測定することにより、リアルタイムＰＣＲ（図２７ｂ）にも利用できた。また、異なる初濃度のＤＮＡのＰＣＲ増幅を目視での検出（図２７ｃ）も可能になった。さらには、ＰＣＲサイクル毎で、その増幅の過程をチューブの撮影画像を処理して、ＤＮＡの増幅を定量化することもできた（図２７ｄ）。【０１８７】
実験に使用した配列（下線部はプライマーアニーリング部位に相当）
５’−プライマー配列  ：５’−ＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣ−３’（配列番号１５）
３’−プライマー配列：５’−  ＡＡＴＡＡｓｓＧＣＤｓＴＣＣＴＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号２６）
二本鎖鋳型ＤＮＡ（９８ｂｐ；片方の鎖のみ記載）：
５’−ＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＡＧＡＣＧＴＡＧＡＡＧＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＧＡＧＧＡ−３’（配列番号１７）
ＰＣＲ反応は、リアルタイムＰＣＲ装置（ストラタジーン、Ｍｘ３００５Ｐ）を用いて、プライマー  各１μＭ、天然型塩基基質ｄＮＴＰ  各０．２ｍＭ、人工塩基基質Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ  ２μＭの存在下、９４℃−２分の後、９４℃−５秒、６８℃−４０秒を１サイクルとする２ステップＰＣＲの条件で３０、３５、４０、４５、５５サイクルのＰＣＲを行った。【０１８８】
ＰＣＲの反応スケールは２５μｌで、反応液の組成は４０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１６ｍＭ  ＫＣｌ、３．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１×ＴｉｔａｎｉｕｍＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。鋳型に用いたＤＮＡ断片は、反応液中にそれぞれ、０、３、３０、３００、３０００、３００００、３０００００、３００００００コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、ＰＣＲを実施した。【０１８９】
反応終了後のチューブでの画像処理による定量解析は、以下の手順で行った。ＵＶトランスイルミネーターを用いて、下方より３６５ｎｍのＵＶ照射下で、ＵＶカットフィルターおよびオレンジフィルター越しにデジタルカメラにより撮影し、得られたファイル（ＪＰＥＧ形式）をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ｖｅｒ．６．０で、画像モードをグレースケール、解像度を７２ｐｉｘｅｌ／ｉｎｃｈとしてＴｉｆｆ形式ファイルに変換した。このファイルを、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂ  ２００５  Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅソフトウエアで読み込み、定量解析を行った。具体的には、チューブの反応溶液部分［１０１５（ｐｉｘｅｌ）２］のＱｕａｎｔｕｍ  Ｌｅｖｅｌ（ＱＬ値）から、バックグラウンドの値（チューブ間のエリア、７カ所の平均値）を差し引き、その単位面積あたりの値を、それぞれＰＣＲサイクルに対して、あるいは鋳型に用いたコピー数に対して、プロットした結果をグラフに示した。【０１９０】
結果を図２７ｂ−ｄに示す。
実施例２０  蛍光性分子（ｓ塩基）を天然型塩基にリンカーを介して結合したヌクレオシド誘導体（ｓ−ｈｘ−ｄＵ）とＤｓ−Ｐｘ塩基対を用いたＰＣＲ産物の検出法（図２９ｂ−図２９ｄ）
本実施例は図２９ａの対実施例である。【０１９１】
蛍光性人工塩基であるｓをリンカーを介して天然型塩基Ｕに結合した修飾塩基（ｓ−ｈｘ−ｄＵ）を隣接して２つ含むプライマーを用いて、Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ基質存在下でＰＣＲを行った場合のリアルタイムＰＣＲの原理を図２９ａに示した。ｓ−ｈｘ−ｄＵを隣接して２つ導入すると、ｓを隣接して２つ導入した場合と同様に（図２５）、ｓの蛍光は消光される。しかし、ｓ−ｈｘ−ｄＵの近傍にＤｓを配置し、そのＤｓにＣｙ３−ｈｘ−ｄＰｘが相補して特異的に組み込まれると、３６５ｎｍ付近の照射でｓとＣｙ３間にＦＲＥＴが起こり、ＰＣＲ増幅された二本鎖ＤＮＡのみを特異的に光らせることができる。図２５の場合にはｓ塩基がプライマー中に２つ入るので、ＰＣＲによる相補鎖合成がこの部分で停止する可能性があるが、本法ではｓを天然型塩基にリンカーを介して結合しているので、ＰＣＲでの相補鎖合成が進む。これにより、人工塩基を含む発色のための部位をプライマー中のどの部分にも導入できＬＡＭＰ法やＳＭＡＰ法などのＰＣＲ法に利用できる。またパドロックＰＣＲ法などのプライマー領域以外にも本手法を用いることができる。【０１９２】
図２９ｂは、用いたＤＮＡの配列、ならびにＰＣＲの条件を示した。図２９ｃには５５サイクルのリアルタイムＰＣＲの結果を、図２９ｄには５５サイクルのＰＣＲ後の増幅産物を目視で確認した結果をそれぞれ示す。標的とするＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）の量を０−３００００００コピーの間でＰＣＲ増幅を行ったところ、３コピー以上で目視判定ができた。【０１９３】
実験に使用した配列（下線部はプライマーアニーリング部位に相当；Ｕｓ＝ｓ−ｈｘ−ｄＵ）
５’−プライマー配列  ：５’−ＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣ−３’（配列番号１５）
３’−プライマー配列  ：５’−  ＡＡＴＡＡＵｓＵｓＧＣＤｓＴＣＣＴＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＣＴＴＣ−３’（配列番号２７）
二本鎖鋳型ＤＮＡ  （９８  ｂｐ；片方の鎖のみ記載）：
５’−ＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＡＧＡＣＧＴＡＧＡＡＧＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＧＡＧＧＡ−３’（配列番号１７）
具体的には、リアルタイムＰＣＲ装置（ストラタジーン、Ｍｘ３００５Ｐ）を用いて、プライマー各１μＭ、天然型塩基基質ｄＮＴＰ各０．２ｍＭ、人工塩基基質Ｃｙ３−ｈｘ−ｄＰｘＴＰ  ２μＭの存在下、９４℃−２分の後、９４℃−５秒、６８℃−４０秒を１サイクルとする２ステップＰＣＲの条件で５５サイクルのＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応スケールは２５μｌで、反応液の組成は４０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１６ｍＭ  ＫＣｌ、３．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１×ＴｉｔａｎｉｕｍＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。鋳型に用いたＤＮＡ断片は、反応液中にそれぞれ、０、３、３０、３００、３０００、３００００、３０００００、３００００００コピーになるように希釈し、それぞれの濃度につき、ＰＣＲを実施した。その反応チューブを直接、３６５ｎｍのＵＶで照射し、オレンジフィルターを通して目視で蛍光を検出した。【０１９４】
実施例２１  ｓ−ｈｘ−ｄＵアミダイト試薬（図６の化合物）の化学合成（図３０）
８−ブロモ−１−オクチンの合成（図３０の工程（ａ））
８−ヒドロキシ−１−オクチン（１．９５ｇ，１５ｍｍｏｌ）に脱水ジクロロメタン（２０ｍｌ）、トリフェニルホスフィン（５．９１ｇ，２２．５ｍｍｏｌ）を加え、０℃に冷却後、脱水ジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解させた四臭化炭素（７．４６ｇ，２２．５ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で２時間攪拌した。ジクロロメタン（１００ｍｌ）、５％  炭酸水素ナトリウム（１５０ｍｌ）で分液、有機層を飽和食塩水（１５０ｍｌ）で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝１００：０→９９：１）で精製し、８−ブロモ−１−オクチン（ｃｒｕｄｅ）を得た。【０１９５】
８−ブロモ−１−オクチンの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ３．５１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），２．７１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），２．１２−２．１７（ｍ，２Ｈ），１．７５−１．８４（ｍ，２Ｈ），１．２４−１．５４（ｍ，６Ｈ）．
２）  ６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−アミノプリンの合成（図３０の工程（ｂ））
６−（チエン−２−イル）−２−アミノプリン（１．２ｇ，５．５ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（２．３ｇ，１６．５ｍｍｏｌ）の脱水ジメチルホルムアミド（２５ｍｌ）溶液に、１）で得られた８−ブロモ−１−オクチン（２．０ｇ，１０．６ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１５時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、酢酸エチルと水で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し中圧分取カラムクロマトグラムにより精製して６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−アミノプリン（１．６ｇ，４．９ｍｍｏｌ，８７％）を得た。【０１９６】
６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−アミノプリンの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８．５３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２，３．７Ｈｚ），８．１４（ｓ，１Ｈ），７．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２，５．０Ｈｚ），７．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．０Ｈｚ），６．４８（ｂｒｓ，２Ｈ），４．０５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．７２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ），２．１２（ｍ，２Ｈ），１．７８（ｍ，２Ｈ），１．２３−１．４６（ｍ，６Ｈ）．
３）  ６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−フェノキシアセタミドプリンの合成（図３０の工程（ｃ））
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．１９ｇ，８．８４ｍｍｏｌ）を脱水ピリジンで３回共沸乾燥し、脱水ピリジン（２．５ｍｌ）、脱水アセトニトリル（２．５ｍｌ）、フェノキシアセチルクロリド（１．０８ｍｌ，７．８５ｍｍｏｌ）を加え、室温で５分間攪拌後、０℃に冷却し、これに脱水ピリジン（２５ｍＬ）に溶解した。２）で得られた６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−アミノプリン（１．６０ｇ，４．９１ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌した。酢酸エチル（１５０ｍｌ）、飽和食塩水（１５０ｍｌ×２回）で分液し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝１００：０→９９：１）で精製し、６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−フェノキシアセタミドプリン（１．４４ｇ，３．１３ｍｍｏｌ，６４％）を得た。【０１９７】
６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−フェノキシアセタミドプリンの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １０．７１（ｓ，１Ｈ），８
．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ），８．５４（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．０Ｈｚ），７．３１（ｍ，３Ｈ），６．９２−６．９３（ｍ，３Ｈ），５．１５（ｂｒｓ，２Ｈ），４．２０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．７１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ），２．０９−２．１３（ｍ，２Ｈ），１．８２−１．９２（ｍ，２Ｈ），１．２７−１．４１（ｍ，６Ｈ）．
４）  ５−［６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−フェノキシアセタミドプリン］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジンの合成（図３０の工程（ｄ））
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（１．６４ｇ，２．５ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１４５ｍｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（７６ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）、脱水ジメチルホルムアミド（７．５ｍｌ）を加え、アルゴンガスで置換し、脱水トリエチルアミン（５２３μｌ，３．７５ｍｍｏｌ）を加えた後、脱水ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）、脱水ピリジン（１０ｍｌ）に溶解した、３）で得られた６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−フェノキシアセタミドプリン（１．３８ｇ，３．００ｍｍｏｌ）を加え、マイクロウェーブ装置（スタンダードモード）で６０℃，３時間攪拌した。酢酸エチル（１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ）で分液、有機層を飽和食塩水（１００ｍｌ）で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝１００：０→９７：３）で精製し、５−［６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−フェノキシアセタミドプリン］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン（９３１ｍｇ，０．９４ｍｍｏｌ，３８％）を得た。【０１９８】
５−［６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−フェノキシアセタミドプリン］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジンの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １１．５９（ｂｒｓ，１Ｈ），
１０．７０（ｂｒｓ，１Ｈ），８．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．９，３．８Ｈｚ），８．５１（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．９，５．０Ｈｚ），７．８７（ｓ，１Ｈ），７．１７−７．３７（ｍ，１２Ｈ），６．８２−６．９６（ｍ，７Ｈ），６．１１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），５．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），５．１４（ｂｒｓ，２Ｈ），４．０２−４．２８（ｍ，３Ｈ），３．７０−３．９１（ｍ，１Ｈ），３．１２−３．１６（ｍ，２Ｈ），２．０４−２．２４（ｍ，４Ｈ），１．７６−１．９９（ｍ，２Ｈ），１．１５−１．２０（ｍ，６Ｈ）．
５）  ５−［６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−フェノキシアセタミドプリン］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトの合成（図３０の工程（ｅ））
４）で得られた５−［６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−フェノキシアセタミドプリン］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン（８９０ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ）を脱水ピリジンで３回、脱水テトラヒドロフランで３回共沸乾燥した。次いで、脱水テトラヒドロフラン（４．５ｍｌ）、脱水ジイソプロピルエチルアミン（２３５μｌ，１．３５ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルクロロホスホルアミジド（２４１μｌ，１．０８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。脱水メタノール（５０μｌ）を加え、酢酸エチル：トリエチルアミン（２０：１，５０ｍｌ）、５％  炭酸水素ナトリウム（５０ｍｌ）で分液、有機層を飽和食塩水（１００ｍｌ）で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝９８：０：２→７８：２０：２）で精製し、５−［６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−フェノキシアセタミドプリン］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシ
トリチル）−２’−デオキシウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト（８６７ｍｇ，０．７３ｍｍｏｌ，８１％）を得た。【０１９９】
５−［６−（チエン−２−イル）−９−（７−オクチニル）−２−フェノキシアセタミドプリン］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトの物性値１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １１．５７（ｂｒｓ，１Ｈ），１０．７０（ｂｒｓ，１Ｈ），８．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，３．７Ｈｚ），８．５０（ｓ，１Ｈ），７．８９−７．９２（ｍ，２Ｈ），７．１４−７．３６（ｍ，１２Ｈ），６．７９−６．９５（ｍ，７Ｈ），６．１０（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．２，６．３Ｈｚ），５．１３（ｂｒｓ，２Ｈ），４．５０−４．６０（ｍ，１Ｈ），４．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），３．９９−４．０６（ｍ，１Ｈ），３．１７−３．７１（ｍ，１２Ｈ），２．２６−２．７６（ｍ，４Ｈ），２．０５−２．１０（ｍ，２Ｈ），１．７４−１．７７（ｍ，２Ｈ），０．８２−１．３９（ｍ，１８Ｈ）．
３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １４８．６７，１４８．３２．
実施例２２  Ｄｓｓ−ｈｘ−ｄＵアミダイト試薬（図６の化合物）の化学合成（図３３）
１）７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの合成（図３３の工程（ａ））
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（８５０ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（１．３ｇ，９．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１５ｍｌ）溶液を６０℃で１時間撹拌した。次いで、８−ブロモ−１−オクチン（８５０ｍｇ，４．５ｍｍｏｌ）を加えて、６０℃で６時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し中圧分取カラムクロマトグラムにより精製して７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（５２０ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ，４４％）を得た。【０２００】
７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８．５６（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），８．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），７．５８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．４６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，３．６Ｈｚ），７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），７．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，５．１Ｈｚ），４．２９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），２．７２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），２．１２（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｍ，２Ｈ），１．４３−１．３１（ｍ，６Ｈ）．
２）  ５−［７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン］−２’−デオキシウリジンの合成（図３３の工程（ｂ））
５−ヨード−２’−デオキシウリジン（２９４ｍｇ，０．８３ｍｍｏｌ）、７−（２，２’−ビチエニル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（２７０ｍｇ，０．６９ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（２５ｍｇ）、テトラキストリフェニルホスフィン（４８ｍｇ）、トリエチルアミン（１７３μｌ）のＤＭＦ（４．２ｍｌ）溶液を室温で１７時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと水で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥しカラムクロマトグラム（３％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）により精製して５−［７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン］−２’−デオキシウリジン（１５５ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ，３６％）を得た。【０２０１】
５−［７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン］−２’−デオキシウリジンの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １１．５４（ｓ，１Ｈ），８．５６（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），８．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），８．０９（ｓ，１Ｈ），７．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），７．５８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．４６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，３．６Ｈｚ），７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），７．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，５．１Ｈｚ），６．１０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），５．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），５．０６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．３０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．２１（ｍ，１Ｈ），３．７７（ｍ，１Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），２．３３（ｍ，２Ｈ），２．０９（ｍ，２Ｈ），１．８８（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｍ，４Ｈ），１．２９（ｍ，２Ｈ）．
３）  ５−［７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン］−５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジンの合成（図３３の工程（ｃ））
５−［７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン］−２’−デオキシウリジン（１５０ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（９１ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）のピリジン（２．４ｍｌ）溶液を室温で１時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥しカラムクロマトグラム（２％メタノールの塩化メチレン溶液で溶出）により精製して５−［７−（２，２’−ビチエニル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン］−５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン（１８３ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ，８２％）を得た。【０２０２】
５−［７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン］−５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジンの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １１．５８（ｓ，１Ｈ），８．５３（ｓ，１Ｈ），８．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），８．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．８７（ｓ，１Ｈ），７．６０−７．５７（ｍ，２Ｈ），７．４６−７．４３（ｍ，２Ｈ），７．３５−７．３２（ｍ，２Ｈ），７．２６−７．１３（ｍ，８Ｈ），６．８１（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．１０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），５．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），４．２６（ｍ，３Ｈ），３．８９（ｍ，１Ｈ），３．６９（ｓ，６Ｈ），３．１５（ｍ，２Ｈ），２．１８（ｍ，２Ｈ），２．０５（ｍ，２Ｈ），１．７８（ｍ，２Ｈ），１．２２−１．１３（ｍ，６Ｈ）．
４）  ５−［７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトの合成（図３３の工程（ｄ））
５−［７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン］−５’−Ｏ−（４，４−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン  （１８０ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）をピリジンで３回、ＴＨＦで３回共沸乾燥した後、ＴＨＦ（１．０ｍｌ）とジイソプロピルエチルアミン（５２μｌ）を加えて撹拌した。この溶液に、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（５４μｌ，０．２４ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応溶液に脱水メタノール（５０μｌ）を加えた後、酢酸エチル／トリエチルアミン（２０：１，ｖ／ｖ）と５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して濃縮した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラム（酢酸エチル：塩化メチレン：トリエチルアミン、４５：４５：１０、ｖ／ｖ／ｖで溶出）で精製して５−［７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト（２２０ｍｇ，９９％）を得た。【０２０３】
５−［７−（２，２’−ビチエン−５−イル）−３−（７−オクチニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １１．５９（ｓ，１Ｈ），８．５３（ｓ，ｓ，１Ｈ，１Ｈ），８．３２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），８．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），７．６０−７．５７（ｍ，２Ｈ），７．４６−７．４３（ｍ，２Ｈ），７．３４（ｍ，２Ｈ），７．２６−７．１３（ｍ，８Ｈ），６．８１（ｍ，４Ｈ），６．９８（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３，６．５Ｈｚ），４．４７（ｍ，１Ｈ），４．２５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．０５−３．９８（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｍ，１Ｈ），３．６９（ｓ，６Ｈ），３．６０−３．４２（ｍ，２Ｈ），３．２０（ｍ，２Ｈ），２．７３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），２．６１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），２．４４−２．２５（ｍ，２Ｈ），２．０７（ｍ，２Ｈ），１．７７（ｍ，２Ｈ），１．０９（ｍ，１８Ｈ）．
３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １４８．６８，１４８．３２．
実施例２３  図２及び図３の化合物の合成【０２０４】
【化３４】
0005874152.tif 000036
【０２０５】
１）  １−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨード−２−ニトロピロールの合成
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ニトロピロール（４５６ｍｇ，２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（８ｍｌ）溶液にＮ−ヨードスクシンイミド（９００ｍｇ，４ｍｍｏｌ）を加えた。室温で一晩反応後、酢酸エチル（２００ｍｌ）、水（２００ｍｌ）で分液し、有機層を濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ精製し、１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨード−２−ニトロピロール（５８７ｍｇ，１．６６ｍｍｏｌ，８３％）を得た。【０２０６】
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨード−２−ニトロピロールの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），７．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．５４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），５．１０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），４．２３（ｍ，１Ｈ），３．８３（ｍ，１Ｈ），３．５３−３．８５（ｍ，２Ｈ），２．１８−２．４５（ｍ，２Ｈ）．
２）  １−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（チエン−２−イル）−２−ニトロピロールの合成
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨード−２−ニトロピロール（１７７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、二塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（１８ｍｇ，０．０２５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍｌ）溶液に２−（トリブチルスタニル）チオフェン（４７６μｌ，１．５ｍｍｏｌ）を加えた。マイクロウェーブ装置（スタンダードモード）で１００℃，３０分間反応後、酢酸エチル（５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ）で分液し、有機層を濃縮した。これをＨＰＬＣ精製し、１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（チエン−２−イル）−２−ニトロピロール（９７ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ，６３％）を得た。【０２０７】
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（チエン−２−イル）−２−ニトロピロールの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），７．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），７．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．３３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，３．５Ｈｚ），７．０６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，５．１Ｈｚ），６．５９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），５．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），５．１７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），４．２８（ｍ，Ｈ），３．８６（ｍ，１Ｈ），３．７０−３．７４（ｍ，１Ｈ），３．５８−３．６９（ｍ，１Ｈ），２．４１−２．４５（ｍ，１Ｈ），２．２５−２．３３（ｍ，１Ｈ）．
３）  １−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（フラン−２−イル）−２−ニトロピロールの合成
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨード−２−ニトロピロール（１７７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、二塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（１８ｍｇ，０．０２５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍｌ）溶液に２−（トリブチルスタニル）フラン（４７２μｌ，１．５ｍｍｏｌ）を加えた。マイクロウェーブ装置（スタンダードモード）で１００℃，３０分間反応後、酢酸エチル（５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ）で分液し、有機層を濃縮した。これをＨＰＬＣ精製し、１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（フラン−２−イル）−２−ニトロピロール（１１１ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ，７６％）を得た。【０２０８】
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（フラン−２−イル）−２−ニトロピロールの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），７．６３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．７，１．８Ｈｚ），７．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），６．６９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．７，３．３Ｈｚ），６．６１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），６．５３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８，３．３Ｈｚ），５．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），５．１２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），４．２７（ｍ，１Ｈ），３．８７（ｍ，１Ｈ），３．６５−３．７２（ｍ，１Ｈ），３．５６−３．６３（ｍ，１Ｈ），２．４１−２．４６（ｍ，１Ｈ），２．２３−２．３１（ｍ，１Ｈ）．
４）  １−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−２−ニトロピロールの合成
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨード−２−ニトロピロール（１７７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、二塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（１８ｍｇ，０．０２５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍｌ）溶液に２−（トリブチルスタニル）ジチオフェン（３４１ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）を加えた。マイクロウェーブ装置（スタンダードモード）で１００℃，３０分間反応後、酢酸エチル（５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ）で分液し、有機層を濃縮した。これをＨＰＬＣ精製し、１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−２−ニトロピロール（９０ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ，４６％）を得た。【０２０９】
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２，２’−ビチエン−５−イル）−２−ニトロピロールの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），７．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），７．５０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，５．１Ｈｚ），７．２４−７．３１（ｍ，３Ｈ），７．０８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，５．１Ｈｚ），６．６０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），５．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），５．１７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），４．２９（ｍ，１Ｈ），３．８７（ｍ，１Ｈ），３．６８−３．７５（ｍ，１Ｈ），３．５７−３．６５（ｍ，１Ｈ），２．４１−２．４６（ｍ，１Ｈ），２．２６−２．３４（ｍ，１Ｈ）．
５）  １−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−メチル−２−ニトロピロールの合成
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨード−２−ニトロピロール（１４２ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）、二塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（１４ｍｇ，０．０２ｍｍｏｌ）、トリフェニルアルシン（１２ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍｌ）溶液にテトラメチルスズ（２８７μｌ，２ｍｍｏｌ）を加えた。６０℃，２日間反応後、酢酸エチル（５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ）で分液し、有機層を濃縮した。これをＨＰＬＣ精製し、１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−メチル−２−ニトロピロール（１５ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ，１５％）を得た。【０２１０】
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−メチル−２−ニトロピロールの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ），７．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），６．５５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），５．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），５．００（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），４．２２（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｍ，１Ｈ），３．５２−３．６４（ｍ，２Ｈ），２．３４−２．４２（ｍ，１Ｈ），２．１１−２．１９（ｍ，１Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ）．
６）  １−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−プロピニル−２−ニトロピロールの合成（図３、Ｒ＝−ＣＨ３）
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨード−２−ニトロピロール（１８０ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、二塩化ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）（３８ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍｌ）溶液にトリブチル（１−プロピニル）スズ（３２７μｌ，１ｍｍｏｌ）を加えた。１００  ℃，  ９０分間反応後、濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣ精製し、１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−プロピニル−２−ニトロピロール（７６ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ，５７％）を得た。【０２１１】
１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−プロピニル−２−ニトロピロールの物性値
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），７．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ），６．５５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），５．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ），５．１１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），４．２４（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．５３−３．７０（ｍ，２Ｈ），２．４５（ｍ，１Ｈ），２．２２（ｍ，１Ｈ），１．９９（ｓ，３Ｈ）．
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005874152.tif 000068
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１６】
0005874152.tif 000072
【図１８】
0005874152.tif 000073
【図２７ｄ】
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【図３０】
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【図３３】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
0005874152.tif 000083
【図１９】
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【図２０】
0005874152.tif 000085
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
0005874152.tif 000089
【図２５】
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【図２６】
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【図２７ａ】
0005874152.tif 000092
【図２７ｂ】
0005874152.tif 000093
【図２７ｃ】
0005874152.tif 000094
【図２８】
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【図２９ａ】
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【図２９ｂ】
0005874152.tif 000097
【図２９ｃ】
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【図２９ｄ】
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【図３１】
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【図３２】
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