(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロ二量体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域および結合領域を含むＦｃ含有タンパク質であって、前記Ｆｃ領域が、Ａ鎖およびＢ鎖を含み、前記Ａ鎖およびＢ鎖が野生型ヒトＦｃポリペプチド鎖に比して、ＥＵシステムに従って番号付けした以下のアミノ酸置換を含み：
（ａ）  前記Ａ鎖が、Ｑ３１１ＭおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｂ） 前記Ａ鎖が、Ｅ２３３Ｌ、Ｑ３１１Ｍ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、
（ｃ） 前記Ａ鎖が、Ｌ２３４Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｄ） 前記Ａ鎖が、Ｓ２９８ＴおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｅ） 前記Ａ鎖が、Ａ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｆ） 前記Ａ鎖が、Ａ３３０ＦおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｇ） 前記Ａ鎖が、Ｑ３１１Ｍ、Ａ３３０Ｍ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｈ） 前記Ａ鎖が、Ｑ３１１Ｍ、Ａ３３０Ｆ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｉ） 前記Ａ鎖が、Ｓ２９８Ｔ、Ａ３３０Ｍ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｊ） 前記Ａ鎖が、Ｓ２９８Ｔ、Ａ３３０Ｆ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｋ） 前記Ａ鎖が、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｍ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｌ） 前記Ａ鎖が、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ｔ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｍ） 前記Ａ鎖が、Ｋ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｙ２９６ＷおよびＳ２９８Ｃ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｎ） 前記Ａ鎖が、Ｋ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｏ） 前記Ａ鎖が、Ｌ２３５Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｐ） 前記Ａ鎖が、Ｌ２３５Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｑ） 前記Ａ鎖が、Ｑ３１１ＭおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｆ２４３Ｖ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｒ） 前記Ａ鎖が、Ｑ３１１ＭおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｓ） 前記Ａ鎖が、Ｓ２３９ＤおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｔ） 前記Ａ鎖が、Ｓ２３９ＤおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｕ） 前記Ａ鎖が、Ｆ２４３ＶおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｖ） 前記Ａ鎖が、Ｆ２４３ＶおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｗ） 前記Ａ鎖が、Ｅ２９４ＬおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｘ） 前記Ａ鎖が、Ｅ２９４ＬおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｙ） 前記Ａ鎖が、Ａ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４ＹおよびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、または
（ｚ） 前記Ａ鎖が、Ａ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｋ２９０ＹおよびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
前記Ｆｃ含有タンパク質が、第２のタンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖに結合するＫＤの５分の１以下のＫＤでヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖに結合し、前記第２のタンパク質が、置換なしの野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含有することを除き、前記Ｆｃ含有タンパク質と同一である、Ｆｃ含有タンパク質。
【請求項２】
前記Ｆｃ含有タンパク質が、前記第２のタンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖに結合するＫＤの１０分の１以下のＫＤでヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖに結合する、請求項１に記載のＦｃ含有タンパク質。
【請求項３】
（ａ）前記Ａ鎖が、Ｓ２９８Ｔ、Ａ３３０Ｍ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、
（ｂ）前記Ａ鎖が、Ｓ２９８Ｔ、Ａ３３０Ｆ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である、または
（ｃ）前記Ａ鎖が、Ａ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、前記Ｂ鎖が、Ｌ２３４ＹおよびＹ２９６Ｗ置換を含む、もしくはその逆である
請求項１または２に記載のＦｃ含有タンパク質。
【請求項４】
前記Ａ鎖が、配列番号８、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３７のアミノ酸配列を含み、前記Ｂ鎖が、配列番号１０、１８、３９、もしくは４１のアミノ酸配列を含む、もしくはその逆である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＦｃ含有タンパク質。
【請求項５】
配列番号８および配列番号１０、配列番号１６および配列番号１８、配列番号１２および配列番号１０、配列番号１４および配列番号１０、配列番号２０および配列番号１８、配列番号２２および配列番号１８、配列番号２４および配列番号１０、配列番号２６および配列番号１０、配列番号２８および配列番号１８、配列番号３０および配列番号１８、配列番号３２および配列番号１８、配列番号３４および配列番号１８、配列番号３７および配列番号３９、および配列番号３７および配列番号４１から成る群から選択されるアミノ酸配列対を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＦｃ含有タンパク質。
【請求項６】
脱フコシル化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦｃ含有タンパク質。
【請求項７】
ＣＨＯ細胞内で作製される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦｃ含有タンパク質。
【請求項８】
抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦｃ含有タンパク質。
【請求項９】
Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦｃ含有タンパク質。
【請求項１０】
前記Ｆｃ含有タンパク質が二重特異性抗体であり、かつ／または全長ヒトＩｇＧ１抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦｃ含有タンパク質。
【請求項１１】
前記Ｆｃ含有タンパク質が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕに結合するか、ＣＤ３８およびＣＤ１３８に結合する二重特異性抗体であるか、またはメソテリンに結合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＦｃ含有タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の治療有効量のＦｃ含有タンパク質および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＦｃ含有タンパク質をコードする、核酸。
【請求項１４】
配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３６、３８、または４０のヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１６】
ＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有するＦｃ含有タンパク質を作製する方法であって、
（ａ）請求項１３または１４に記載の１つ以上の核酸を含有する宿主細胞を提供するステップと、
（ｂ）前記Ｆｃ含有タンパク質が発現するような条件下で前記宿主細胞を培養するステップと、
（ｃ）前記Ｆｃ含有タンパク質を細胞集団または培養培地から回収するステップ
とを含む、方法。
【請求項１８】
癌の治療のための請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＦｃ含有タンパク質または請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＦｃ含有タンパク質または医薬組成物の使用。
【請求項２０】
前記医薬が、癌を治療するためのものである、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１１年３月１６日に出願された米国仮出願第６１／４５３，４３３号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ヘテロ二量体であり得、かつアミノ酸置換を含有し得る変異体Ｆｃ領域を含むポリペプチドに関する。本発明はさらに、そのようなポリペプチドを作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
治療用モノクローナル抗体の様々な腫瘍適応症における使用が成功を収めている。例えば、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ６：３４９−３５６を参照されたい。有効性は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、および／もしくは抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）等の抗体のエフェクター機能、またはある場合にアポトーシスを誘導し得る腫瘍細胞表面上での抗原の複合体の抗体誘導形成に依存し得る。例えば、Ｄｅａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１０７：１７６−１８２を参照されたい。一部の抗体の抗腫瘍活性は、治療用抗体とＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）との間の相互作用に依存する。ｄｅ  Ｈａｉｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０（８）：３２０９−３２１７。いくつかの異なるＦｃγＲが存在し、その一部は、細胞毒性、サイトカイン放出、および食作用／飲食作用、続いて抗原提示をもたらす細胞活性をもたらす細胞内シグナル伝達事象を媒介する。他のＦｃγＲは、修飾タンパク質を介してそのような活性を媒介する。当該技術分野において、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰを含むエフェクター機能をより効果的に誘発する抗体が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ６：３４９−３５６
【非特許文献２】Ｄｅａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１０７：１７６−１８２
【非特許文献３】ｄｅ  Ｈａｉｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０（８）：３２０９−３２１７
【発明の概要】
【０００５】
本明細書において、改変されていないＦｃ領域を有する類似のタンパク質と比較して、強化されたエフェクター機能を有し得る改変されたヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有するＦｃ含有タンパク質が説明される。一実施形態では、本発明は、それぞれが野生型ヒトＦｃポリペプチド鎖に対して１〜１０個のアミノ酸置換を含む、Ａ鎖およびＢ鎖を含むヘテロ二量体ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ含有タンパク質は、第２のタンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆに結合するＫＤの５分の１以下のＫＤでヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆに結合し、第２のタンパク質は、置換なしの野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含有することを除き、Ｆｃ含有タンパク質と同一である。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３  Ｆｃ領域であり得る。一部の実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、第２のタンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖおよび／もしくはＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆに結合するＫＤの１０分の１または２０分の１以下のＫＤでヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆに結合し得る。Ｆｃ含有タンパク質のＩｇＧ  Ｆｃ領域はＩｇＧ１  Ｆｃ領域であり得、Ｆｃ領域は脱フコシル化され得る。一部の実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質のＡ鎖およびＢ鎖はそれぞれ、野生型ヒトＦｃポリペプチド鎖に対して１〜６個のアミノ酸置換を含む。それらの置換の少なくとも１つは、ヘテロ二量体化改変であり得る。Ａ鎖およびＢ鎖はそれぞれ、ヘテロ二量体化改変である少なくとも２個のアミノ酸置換を含有し得、例えば、ヘテロ二量体化改変である２個または３個の置換を含有し得る。ヘテロ二量体化改変は、Ａ鎖の置換Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ、並びにＢ鎖の置換Ｅ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ、またはその逆等の電荷対突然変異であり得る。あるいは、ヘテロ二量体化改変は、ノブホール（ｋｎｏｂｓ  ａｎｄ  ｈｏｌｅｓ）置換対であり得る。
【０００６】
さらなる態様では、Ｆｃ含有タンパク質は、以下の置換が存在するＦｃ領域を含み得る：（ａ）Ａ鎖がＱ３１１ＭおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｂ）Ａ鎖がＥ２３３Ｌ、Ｑ３１１Ｍ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｃ）Ａ鎖がＬ２３４Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｄ）Ａ鎖がＳ２９８ＴおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｅ）Ａ鎖がＡ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｆ）Ａ鎖がＡ３３０ＦおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｇ）Ａ鎖がＱ３１１Ｍ、Ａ３３０Ｍ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｈ）Ａ鎖がＱ３１１Ｍ、Ａ３３０Ｆ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｉ）Ａ鎖がＳ２９８Ｔ、Ａ３３０Ｍ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｊ）Ａ鎖がＳ２９８Ｔ、Ａ３３０Ｆ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｋ）Ａ鎖がＳ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｍ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｌ）Ａ鎖がＳ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ｔ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｍ）Ａ鎖がＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＹ２９６ＷおよびＳ２９８Ｃ置換を含むか、またはその逆である、（ｎ）Ａ鎖がＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ置換を含むか、またはその逆である、（ｏ）Ａ鎖がＬ２３５Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｐ）Ａ鎖がＬ２３５Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、およびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ置換を含むか、またはその逆である、（ｑ）Ａ鎖がＱ３１１ＭおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｆ２４３Ｖ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｒ）Ａ鎖がＱ３１１ＭおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｋ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ置換を含むか、またはその逆である、（ｓ）Ａ鎖がＳ２３９ＤおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、Ｙ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｔ）Ａ鎖がＳ２３９ＤおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ置換を含むか、またはその逆である、（ｕ）Ａ鎖がＦ２４３ＶおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｖ）Ａ鎖がＦ２４３ＶおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ置換を含むか、またはその逆である、（ｗ）Ａ鎖がＥ２９４ＬおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、（ｘ）Ａ鎖がＥ２９４ＬおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ置換を含むか、またはその逆である、（ｙ）Ａ鎖がＡ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＬ２３４ＹおよびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である、あるいは（ｚ）Ａ鎖がＡ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ置換を含み、Ｂ鎖がＫ２９０ＹおよびＹ２９６Ｗ置換を含むか、またはその逆である。一部の実施形態では、Ａ鎖は、配列番号８、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３７のアミノ酸配列を含み得、Ｂ鎖は、配列番号１０、１８、３９、または４１のアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、Ｂ鎖は、配列番号８、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４のアミノ酸配列を含み得、Ａ鎖は、配列番号８、１０、または１８のアミノ酸配列を含み得る。
【０００７】
上記または以下に記載のＦｃ含有タンパク質のいずれも脱フコシル化され得る。
【０００８】
Ｆｃ含有タンパク質は、以下のアミノ酸配列の組み合わせ：配列番号８および配列番号１０、配列番号１６および配列番号１８、配列番号１２および配列番号１０、配列番号１４および配列番号１０、配列番号２０および配列番号１８、配列番号２２および配列番号１８、配列番号２４および配列番号１０、配列番号２６および配列番号１０、配列番号２８および配列番号１８、配列番号３０および配列番号１８、配列番号３２および配列番号１８、配列番号３４および配列番号１８、配列番号３７および配列番号３９、または配列番号３７および配列番号４１のうちの１つを含み得る。
【０００９】
本明細書に記載のＦｃ含有タンパク質のうちのいずれかは、抗体またはＦｃ融合タンパク質であり得、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＮＳ０細胞内で作製され得る。そのような抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、もしくは多選択性であり得、かつ／または一価または二価もしくは四価を含む多価であり得る全長ヒトＩｇＧ１抗体であり得る。Ｆｃ含有タンパク質は、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＧＭ２／ＧＤ２シンターゼ、ＣＥＡ、ＭＬＡＮＡ／ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、サバイビン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、肉腫転位限界点、ＥＰＨＡ２、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、アポトーシスのメラノーマ阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＲＧ、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド（ＶＬＰＤＶＦＩＲＣ）、ペアードボックス３（ＰＡＸ３）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、アンドロゲン受容体、クローディン３、クローディン４、クローディン６、クローディン９、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ｒｈｏ関連ＧＴＰ結合タンパク質ＲｈｏＣ、ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス関連癌遺伝子（ＭＹＣＮ）、ＴＲＰ−２、ＧＤ３ガングリオシド、フコシルＧＭ１、メソテリン、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、テトラネクチン（ＴＮ）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１（特に、限界点を含むペプチド）、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２前駆体（ＯＹ−ＴＥＳ−１）、精子タンパク質１７（Ｓｐ１７）、ＬＣＫ、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしても知られる）、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ−１、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）、レグマイン、ＴＩＥ２、前立腺関連遺伝子４タンパク質（ＰＡＧＥ−４）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、プロタミン２（ＭＡＤ−ＣＴ−１としても知られる）、グロムリン（ＦＡＰとしても知られる）、ＰＤＧＦＲ−β、ＳＳＸ２、ＳＳＸ５、Ｆｏｓ関連抗原１、ＣＤ２０、インテグリンαｖβ３、５Ｔ４癌胎児性抗原、ＣＡ  ＩＸ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ−２としても知られる）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８としても知られる）、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ−３としても知られる）、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ５５、ＣＤ５６（ＮＣＡＭとしても知られる）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２としても知られる）、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ１０（ＭＨＣ  ＩＩ）、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ−６、シアリルルイスＹ、メソテリン、ＴＡＧ−７２、ＴＡＬ６、ＴＲＡＩＬＲ２、ＶＥＧＦ、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ−１としても知られる）、ＣＤ４、ＣＤ７３、ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６としても知られる）、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ８０（Ｂ７−１としても知られる）、ＰＤＧＦＲβ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ、多くの他の名前の中でもグルタメートカルボキシペプチダーゼ２と���ても知られる）、ヘルペスウイルス４タンパク質ＬＭＰ２、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７、ならびにグリコセラミドグロボＨ、α４β１およびα４β７インテグリンのα４サブ単位、α４β７インテグリン、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃ５補体タンパク質、ＩｇＥ、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ならびに腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）から成る群から選択される１つ以上の標的分子に結合し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のＦｃ含有タンパク質は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕまたはメソテリンに結合することができるか、またはＣＤ３８とＣＤ１３８の両方、ＣＤＨ１９、ＣＤＨ３、ＢＣＭＡ、およびＩＬ１３ＲＡ２に結合することができる。
【００１０】
さらなる実施形態では、本発明は、治療有効量の上記および以下に記載のＦｃ含有タンパク質のうちのいずれか、ならびに薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。
【００１１】
別の実施形態では、上記および以下に記載のＦｃ含有タンパク質のうちのいずれかをコードする核酸、ならびにそのような核酸を含有する宿主細胞が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、Ａ鎖およびＢ鎖が、別個の核酸分子によってコードされるが、他の実施形態では、Ａ鎖およびＢ鎖は、同一の核酸分子上にコードされ得る。宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＮＳ０細胞であり得る。さらに、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含むＦｃ含有タンパク質を作製する方法が本明細書に記載されており、該方法は、Ｆｃ含有タンパク質が発現するような条件下で宿主細胞を培養すること、および一部の実施形態において、細胞集団または培養培地からポリペプチドを回収することを含む。
【００１２】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有するＦｃ含有タンパク質を含む薬学的組成物を作製する方法も本明細書に記載されており、該方法は、（ａ）Ｆｃ含有タンパク質が発現するような条件下で、本明細書に記載のヘテロ二量体Ｆｃ含有タンパク質をコードする１つ以上の核酸を含有する宿主細胞を培養するステップ、（ｂ）細胞集団または培養培地からＦｃ含有タンパク質を回収するステップ、および（ｃ）Ｆｃ含有タンパク質を薬学的に許容される担体共に製剤化するステップを含む。
【００１３】
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含有するＦｃ含有タンパク質を作製する方法も本明細書に記載されており、該方法は、（ａ）ヘテロ二量体ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域および結合領域を含むＦｃ含有タンパク質をコードする１つ以上の核酸を含有する宿主細胞を提供するステップであって、Ｆｃ領域が、それぞれが野生型ヒトＦｃポリペプチド鎖に対して１〜１０個のアミノ酸置換を含む、Ａ鎖およびＢ鎖を含み、Ｆｃ含有タンパク質が、第２のタンパク質がヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８ＦまたはＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖに結合するＫＤの５分の１以下のＫＤを有するヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖに結合し、第２のタンパク質が、置換なしの野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含有することを除き、Ｆｃ含有タンパク質と同一である、ステップ、（ｂ）Ｆｃ含有タンパク質が発現するような条件下でヘテロ二量体Ｆｃ含有タンパク質をコードする１つ以上の核酸を含有する宿主細胞を培養するステップ、ならびに（ｃ）細胞集団または培養培地からＦｃ含有タンパク質を回収するステップを含む。さらに、Ｆｃ含有タンパク質は、薬学的組成物を作製するために、薬学的に許容される担体と共に製剤化され得る。
【００１４】
別の態様では、癌を治療するための方法が本明細書に記載されており、該方法は、治療有効量の上記または以下に記載のＦｃ含有タンパク質または薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み、該Ｆｃ含有タンパク質は、癌細胞上に表示される分子に結合する。化学療法剤または非化学療法抗新生物薬は、患者に、Ｆｃ含有タンパク質の投与前、投与後、または投与と同時に投与され得る。癌は、中皮腫、扁平上皮細胞癌、骨髄腫、骨肉腫、膠芽腫、膠腫、癌、腺癌、メラノーマ、肉腫、急性および慢性白血病、リンパ腫、髄膜腫、ホジキン病、セザリー症候群、多発性骨髄腫、ならびに肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、咽頭癌、乳癌、頭頚部癌、膀胱癌、卵巣癌、皮膚癌、前立腺癌、子宮頸癌、膣癌、胃癌、腎細胞癌、腎臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、肝胆道癌、骨癌、皮膚癌、および血液癌、ならびに鼻腔および副鼻腔、鼻咽頭、口腔、中咽頭、咽頭、咽頭下部、唾液腺、縦隔、胃、小腸、結腸、直腸および肛門領域、尿管、尿道、陰茎、精巣、外陰部、内分泌系、中枢神経系、ならびに血漿細胞の癌から成る群から選択され得る。
【００１５】
別の態様では、ヒト疾患、例えば、自己免疫疾患、喘息、全身性エリテマトーデス、感染性疾患、もしくは癌等の細胞増殖性疾患の治療、または薬剤の製造における、上記または以下に記載のＦｃ含有タンパク質または薬学的組成物の使用が本明細書に記載されており、該薬剤は、癌、喘息、全身性エリテマトーデス、または感染性疾患を治療するためのものであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｆｃ領域に結合するＦｃγＲＩＩＩＢの三次構造図。この図は、ＦｃγＲＩＩＩＢの細胞外領域および二量体Ｆｃ領域を含むＦｃ−ＦｃγＲＩＩＩＢ（タンパク質データバンクコード：１Ｔ８３）複合体のＸ線の結晶構造の描写である。ＦｃγＲＩＩＩＢ構造は、上記のワイヤモデルで示される。Ｆｃ鎖ＡおよびＦｃ鎖Ｂは、リボンモデルで以下に示される。ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢの細胞外領域の三次構造は、これらの２つの細胞外領域内の１７６個のアミノ酸のうち５個しか異ならないため、類似すると予測される。後に決定されたＦｃ−ＦｃγＲＩＩＩＡ複合体（タンパク質データバンクコード：３ＳＧＫ）の構造は、このＦｃ−ＦｃγＲＩＩＩＢ複合体構造に非常に類似する。
【図２】ヒトＩｇＧ１  Ｆｃポリペプチドのアミノ酸配列。ヒンジ領域で開始し、ＣＨ３領域のカルボキシル末端で終始するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、一文字表記で示され、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６３：７８−８５のＥＵシステムに従って番号付けされている。下線が引かれ、かつ太字の活字のアミノ酸は、実施例１に記載のライブラリの構築時にランダム化された。それらのアミノ酸のそれぞれの下に「１」、「２」、または「３」が付されており、これは、実施例１に記載の対応する部位で変異体をコードするＤＮＡが、列１、２、または３のライブラリに含まれたことを示す。
【図３】ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を強化する置換に関する一次スクリーニングおよび初期のコンビナトリアルスクリーニングを示す図。長方形の表示「ＳＩＧ」は、哺乳類細胞由来のタンパク質分泌を促進するシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを表す。ヒンジ領域をコードする領域は、「ヒンジ」と標識される横線によって表される。長方形の表示「Ｆｃポリペプチド」は、Ｆｃポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを表す。５点星および４点星は、Ｆｃポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドが実施例１に記載の選択された位置で、ランダム化されたコドンをそれぞれの分子に１つ含有することを意味する。円形の表示「ＶＨ」および「ＶＬ」は、それぞれ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする領域を表す。長方形の表示「Ｆｃポリペプチド」内の「＋＋」および「−−」の記号は、それらの領域が、コードされたＦｃポリペプチド鎖がそれぞれ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３９９Ｋ、およびＫ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ置換を有するような突然変異を含むことを意味する。
【図４】変異体Ｆｃ領域を含有する全長ＩｇＧ１抗体によるＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）シグナルのパーセント阻害。グラフは、競合物の濃度の関数として、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）シグナルのパーセント阻害を示す。ヒトＩｇＧ１抗体である様々な競合物は、グラフでは別名で示され、それぞれの競合物に含有される置換は、表３に示される。
【図５】変異体Ｆｃ領域を含有する全長ＩｇＧ１抗体によるＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）シグナルのパーセント阻害。グラフは、競合物の濃度の関数として、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）シグナルのパーセント阻害を示す。ヒトＩｇＧ１抗体である様々な競合物は、グラフでは別名で示され、それぞれの競合物に含有される置換は、表３に示される。
【図６】変異体Ｆｃ領域を含有する全長ＩｇＧ１抗体によるＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）シグナルのパーセント阻害。グラフは、競合物の濃度の関数として、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）シグナルのパーセント阻害を示す。ヒトＩｇＧ１抗体である様々な競合物は、グラフでは別名で示され、それぞれの競合物に含有される置換は、表３に示される。
【図７】変異体Ｆｃ領域を含有する全長ＩｇＧ１抗体によるパーセント細胞死滅。グラフは、抗体依存性細胞性細胞毒性（％ＡＤＣＣ）に関するアッセイにおいて死滅した細胞の割合対抗体濃度を示す。それらのアッセイで使用された様々なヒトＩｇＧ１抗体は、グラフでは別名で示され、それぞれの抗体に含有される置換は、表３に示される。
【図８】変異体Ｆｃ領域を含有する全長ＩｇＧ１抗体によるパーセント細胞死滅。グラフは、抗体依存性細胞性細胞毒性（％ＡＤＣＣ）に関するアッセイにおいて死滅した細胞の割合対抗体濃度を示す。それらのアッセイで使用された様々なヒトＩｇＧ１抗体は、グラフでは別名で示され、それぞれの抗体に含有される置換は、表３に示される。
【図９】変異体Ｆｃ領域を含有する全長ＩｇＧ１抗体によるパーセント細胞死滅。グラフは、抗体依存性細胞性細胞毒性（％ＡＤＣＣ）に関するアッセイにおいて死滅した細胞の割合対抗体濃度を示す。それらのアッセイで使用された様々なヒトＩｇＧ１抗体は、グラフでは別名で示され、それぞれの抗体に含有される置換は、表３に示される。
【図１０】変異体Ｆｃ領域を含有する全長ＩｇＧ１抗体によるヒトＦｃγＲ  ＩＩＩＡ（１５８Ｆ）対立遺伝子変異体への結合に関するＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）シグナルのパーセント阻害。グラフは、競合物濃度の対数の関数として、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）シグナルのパーセント阻害を示す。ヒトＩｇＧ１抗体である様々な競合物は、グラフでは別名で示され、それぞれの競合物に含有される置換は、表３および４に示される。別名に先行する表記「ＡＦＵＣＯ」は、抗体がフコースを欠如することを意味する。
【図１１】変異体Ｆｃ領域を含有する全長ＩｇＧ１抗体によるヒトＦｃγＲ  ＩＩＩＡ（１５８Ｖ）対立遺伝子変異体への結合に関するＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）シグナルのパーセント阻害。グラフは、競合物濃度の対数の関数として、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）シグナルのパーセント阻害を示す。ヒトＩｇＧ１抗体である様々な競合物は、グラフでは別名で示され、それぞれの競合物に含有される置換は、表３および４に示される。別名に先行する表記「ＡＦＵＣＯ」は、抗体がフコースを欠如することを意味する。
【図１２】変異体Ｆｃ領域を含有する全長ＩｇＧ１抗体により高レベルの抗原を発現する細胞のパーセント細胞溶解。グラフは、抗体依存性細胞性細胞毒性（％特異的溶解）に関するアッセイにおいて死滅した細胞の割合対抗体濃度（ｐＭ）の対数を示す。それらのアッセイに使用される様々なヒトＩｇＧ１抗体は、グラフでは別名で示され、それぞれの競合物に含有される置換は、表３および４に示される。
【図１３】変異体Ｆｃ領域を含有する全長ＩｇＧ１抗体により中程度レベルの抗原を発現する細胞のパーセント細胞溶解。グラフは、抗体依存性細胞性細胞毒性（％特異的溶解）に関するアッセイにおいて死滅した細胞の割合対抗体濃度（ｐＭ）の対数を示す。それらのアッセイに使用される様々なヒトＩｇＧ１抗体は、グラフでは別名で示され、それぞれの競合物に含有される置換は、表３および４に示される。
【図１４】野生型または変異体Ｆｃ領域を含有するＩｇＧ１抗体のフコシル化および脱フコシル化調製物のＡＤＣＣ活性の比較。グラフは、抗体依存性細胞性細胞毒性（％特異的溶解）に関するアッセイにおいて死滅した細胞の割合対抗体濃度［ｐＭ］の対数を示す。上のパネルでは、抗体が結合する高レベルの抗原を発現する細胞系が標的細胞（ＳＫＢＲ３）として使用された。下のパネルでは、中程度の抗原を発現する細胞系が標的細胞（ＪＩＭＴ１）として使用された。それらのアッセイで使用された様々なヒトＩｇＧ１抗体は、以下のようにグラフに示される：「Ｍ０１」は、抗原に結合する野生型Ｆｃ領域を含有するＩｇＧ１抗体を示し、「ＡＦＵＣＯ−Ｍ０１」は、フコースを含有しない同一のＩｇＧ１抗体の調製物を示し、「Ｗ１１７」は、抗原に結合し、かつＷ１１７変異体Ｆｃ領域を含有するＩｇＧ１抗体を示し、「ＡＦＵＣＯ−Ｗ１１７」は、フコースを含有しないＷ１１７の調製物を示し、「Ｗ１２５」は、抗原に結合し、かつＷ１２５変異体Ｆｃ領域を含有するＩｇＧ１抗体を示し、「ＡＦＵＣＯ−Ｗ１２５」は、フコースを含有しない「Ｗ１２５」の調製物を示す。
【００１７】
【表１】
0005972915.tif 000002
0005972915.tif 000003
【発明を実施するための形態】
【００１８】
標的分子に結合し、かつＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ等のＦｃ含有タンパク質に関連するエフェクター機能の強化により、治療薬として改善された活性を有する治療用ポリペプチドの必要性が当該技術分野において存在する。そのようなタンパク質は、癌、自己免疫疾患および感染性疾患、ならびに／または特定の標的分子を発現する細胞の選択的死滅が有益である任意の状態を治療するのに特に有用であり得る。ＡＤＣＣは、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲｓ）、特にヒトにおけるＦｃγＲＩＩＩＡと、抗体またはＦｃ含有タンパク質のＦｃ領域との相互作用に依存する。図１に示されるように、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡのヒトＦｃ領域との相互作用は非対称であり、つまり、ＦｃγＲＩＩＩＡは、Ｆｃ領域を構成する２つのＦｃポリペプチド鎖上の異なるアミノ酸残基と接触する。Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：２６７−２７３も参照されたい。ＩｇＧ  Ｆｃ領域上のＦｃγＲの結合部位が詳細にマッピングされている。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４。具体的には、Ｘ線結晶学により決定されるように、ＦｃγＲＩＩＩＡの一部は、一方のＦｃポリペプチド鎖上のアミノ酸残基Ｌ２３５、Ｓ２３９、Ｄ２６５、Ｌ３２８、Ｐ３２９、Ａ３３０、およびＩ３３２、ならびにもう一方の鎖上のアミノ酸残基Ｌ２３５、Ｐ２３８、Ｓ２３９、Ｄ２６５、Ｓ２６７、Ｄ２７０、Ｙ２９６、Ｎ２９７、Ｓ２９８、Ｔ２９９、およびＡ３２７の５．０Å以内にある。したがって、ＦｃγＲＩＩＩＡのＦｃ含有タンパク質のＦｃ領域との相互作用を最大限に強化し、ひいてはＡＤＣＣを強化するために、Ｆｃ領域の非対称改変が必要とされ得る。別の態様では、そのようなヘテロ二量体Ｆｃ領域は、それぞれのＦｃポリペプチド鎖に付着される異なる結合領域も有し、ひいてはその２つの結合アーム上のそれぞれに異なる結合特異性を有することができる分子を作りだすことができる。本発明は、それらのＦｃ領域にそのような非対称置換を含み、ＦｃγＲＩＩＩＡへの増加した結合、および強化されたＡＤＣＣ活性を有するＦｃ含有タンパク質を提供する。いくつかの場合には、そのようなポリペプチドは、二重特異性または多選択性でもあり得、つまり、それらは２つ以上の異なる標的分子に結合し得る。
定義
【００１９】
ＩｇＧ定常領域のアミノ酸残基の番号付けはすべて、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６３：７８−８５のＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。この番号付けシステムに記載および／または図示されるこの参照の一部は、参照により本明細書に組み込まれる。このシステムは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸の連続的な番号付けである。図２は、ＥＵシステムに従って番号付けされたヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の配列を示す。抗体のＩｇＧ１定常領域の特定のアミノ酸残基は、アミノ酸の一文字コードおよびＥＵ番号付けシステムを用いて記録される。例えば、「Ｄ３９９」は、３９９位で野生型ＩｇＧに存在するアスパラギン酸を指す。特定の残基での突然変異も同様に記録される。例えば、「Ｄ３９９Ｋ」は、３９９位で野生型ＩｇＧ１に存在するアスパラギン酸がリジンに変更されたことを意味する。
【００２０】
「ＡＤＣＣ」は、主にヒトのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって媒介される免疫応答である、抗体依存性細胞性細胞毒性と呼ばれるプロセスを指す。ＡＤＣＣにおいて、ＮＫ細胞の表面上のＦｃγＲＩＩＩは、標的細胞の表面上に表示される抗原に結合される抗体のＦｃ領域を認識する。これは、パーフォリンおよびグランザイムを放出するＮＫ細胞を活性化し、標的細胞の溶解およびアポトーシスをもたらす。
【００２１】
「ＣＤＣ」は、２つの主な経路のいずれかを介して作用することができるタンパク質のカスケードの作用を介して細胞死滅をもたらすことができる、補体依存性細胞毒性と呼ばれる複合プロセスを指す。例えば、Ｌｉｓｚｅｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｃｈ．２６ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄｅｄ．，Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３，ｐｐ．９１７−９４０を参照されたい。ＣＤＣを記載するその一部は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２２】
「ＡＤＣＰ」は、抗体依存性細胞媒介食作用と呼ばれるプロセスを指す。このＦｃ受容体媒介プロセスにおいて、抗体が結合する標的細胞はマクロファージ、単球、好中球、および樹状細胞等の食作用性細胞によって貪食される。複数のＦｃ受容体がこのプロセスに関与する。Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．７（８）：２５１７−２５２７（２００８）が、ＡＤＣＰの生体外アッセイを説明している。このアッセイを説明しているＲｉｃｈａｒｄｓらの一部は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２３】
本明細書で意味する「抗体」は、少なくとも１つの重鎖または軽鎖免疫グロブリン可変領域、多くの場合、重鎖および軽鎖可変領域を含有するタンパク質である。したがって、「抗体」という用語は、単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ、リンカーによって接合される重鎖および軽鎖可変領域を含有する）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２’、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ：Ｆｃ抗体（Ｃａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｒａ，Ｃｈ．９  ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄｅｄ．，Ｐａｕｌ，  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３，ｐｐ．２８４−２８６に記載される）、または哺乳類に見られる天然に生じるＩｇＧ抗体等、２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含有する全長抗体を包含する。同文献。そのようなＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４イソ型のものであり得、ヒト抗体であり得る。抗体の構造を説明したＣａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｒａの一部は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、「抗体」という用語は、ラクダおよび他のヒトコブラクダ種並びにサメに見られる天然に生じる抗体等、２つの重鎖を含み、軽鎖を含まない二量体抗体を含む。例えば、Ｍｕｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２、Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０、Ｓｔｒｅｌｔｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ１４：２９０１−２９０９を参照されたい。抗体は、単一特異性（つまり、１種類の抗原にのみ結合する）、または多選択性（つまり、２つ以上の種類の抗原に結合する）であり得る。一部の実施形態では、抗体は、二重特異性（つまり、２つの異なる種類の抗原に結合する）であり得る。さらに、抗体は、一価、二価、または多価であり得、一度に１つまたは２つ以上の抗原分子に結合することができることを意味する。そのような抗体の可能な形式のいくつかは、多くの他の可能な抗体形式の中でも、単一特異性もしくは二重特異性全長抗体、それらが結合する分子を阻害または活性化してよい単一特異性一価抗体（国際出願第ＷＯ２００９／０８９００４号および米国公開第２００７／０１０５１９９号に記載され、その関連する一部は、参照により本明細書に組み込まれる）、二価単一特異性もしくは二重特異性二量体Ｆｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、またはダイアボディＦｃ、単一特異性一価ｓｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ、ならびに米国公開第２００９／０３１１２５３号（その関連する一部は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される多選択性結合タンパク質および二重可変ドメイン免疫グロブリンを含む。
【００２４】
本明細書で意味する「Ｆｃ融合タンパク質」は、標的分子に結合する結合領域を含み、抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含まない別のポリペプチドに融合されるＦｃポリペプチド鎖を含有するタンパク質である。Ｆｃ融合タンパク質の結合領域は、受容体の可溶性部分もしくは標的分子に結合する（例えば、米国特許第７，８２０，７９０号に論じられるように選択され得る標的タンパク質に結合する、米国特許第７，８２０，７９０号に定義される「単量体ドメイン」等）１つ以上のペプチド等の非免疫グロブリンポリペプチド、または他のポリペプチドを含むことができる。単量体ドメインおよびそれらがどのように選択されるかを記載する米国特許第７，８２０，７９０号の一部は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｆｃ融合タンパク質の結合領域の一部であり得る他のポリペプチドは、ある位置にランダム化され、ある標的分子への結合のために選択を受けた足場ドメインを含むポリペプチドを含む。そのような足場ドメインは、例えば、Ｔ−リンパ球関連タンパク質−４（ＣＴＬＡ−４；Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｐｒｏｔｅｉｎｓ３６：２１７−２２７）、ブドウ球菌タンパク質１のＺドメイン（Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：６０１−６０８）、緑色蛍光タンパク質、およびヒトフィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３；Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４：１１４１−１１５１、Ｋａｒａｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．１１：８３５−８４４）を含む。足場ドメインおよび結合ドメインを発生させるためのそれらの使用を記載するそれらの参照の一部は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃポリペプチド鎖を含有する他のタンパク質と同様、一般に、二量体であり得る多量体を形成する。本明細書に記載のＦｃ領域は、一般にヘテロ二量体であるため、そのようなＦｃ融合タンパク質は、ヘテロ二量体を形成することができる。そのような場合、Ｆｃポリペプチド鎖に融合されるポリペプチドは、一緒にヘテロ二量体を形成するポリペプチド鎖のそれぞれにおいて異なってよい。したがって、Ｆｃ融合タンパク質は、ヘテロ二量体、および二重特異的、または単一特異的、または多選択性であり得る。
【００２５】
本明細書で意味する「結合領域」は、例えば、癌細胞上で、自己免疫もしくは炎症状態を媒介する細胞上で、感染細胞上で、病原菌上で、または免疫エフェクター機能を媒介する細胞（例えばＮＫ細胞）上で、高レベルで発現するタンパク質等、標的分子に結合する、本明細書に記載のＦｃ含有タンパク質の領域である。結合領域は、重鎖もしくは軽鎖免疫グロブリン可変領域または非免疫グロブリンポリペプチドを含有することができる。
【００２６】
本明細書で意味する「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」は、抗体のＦｃポリペプチド鎖、任意にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体等のヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域が続くリンカーによって接合された抗体の重鎖および軽鎖可変領域から成るポリペプチドである。
【００２７】
本明細書で意味する全長「重鎖」は、重鎖可変領域（ＶＨ）、第１の重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）、ヒンジドメイン、第２の重鎖定常ドメイン（ＣＨ２）、および第３の重鎖定常ドメイン（ＣＨ３）を含む。
【００２８】
本明細書で意味する全長「軽鎖」は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む。
【００２９】
本明細書で意味する「Ｆｃ領域」は、１つ以上のジスルフィド結合により接合される２つのポリペプチド鎖から成る二量体であり、それぞれの鎖は、ヒンジドメインの一部またはすべて、ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ポリペプチド鎖のそれぞれは、「Ｆｃポリペプチド鎖」と称される。２つのＦｃポリペプチド鎖を区別するために、一方は、本明細書において「Ａ鎖」と称され、もう一方は「Ｂ鎖」と称される。より具体的には、本発明で使用することが想定されるＦｃ領域は、哺乳類またはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり得るＩｇＧ  Ｆｃ領域である。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の中でも、少なくとも２つの対立遺伝子型が公知である。対立遺伝子型の一方は、図２に示される配列を有する（配列番号２）。もう一方は、図２の配列に対して２つの置換、即ち、Ｅ３５６ＤおよびＭ３５８Ｌを有する。別の天然に生じるヒトＩｇＧ１では、４３１位（配列番号２の２１６位に対応する）のアラニンはグリシンである。本明細書で意味するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、それらのアミノ酸配列の変型のいずれかを含有することができる。
【００３０】
本明細書で意味する「Ｆｃ含有タンパク質」は、本明細書に記載するＦｃ領域および標的分子に結合する結合領域を含むタンパク質である。「Ｆｃ含有タンパク質」という用語は、Ｆｃ領域を含有する抗体またはＦｃ融合タンパク質を包含する。
【００３１】
「ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ」は、配列番号３５に示されるＦｃγＲＩＩＩＡのアミノ酸配列の１５８位でバリンを有するヒトＦｃγＲＩＩＩＡの対立遺伝子変異体を指す。同様に、「ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆ」は、ＦｃγＲＩＩＩＡのアミノ酸配列の１５８位でフェニルアラニンを有するヒトＦｃγＲＩＩＩＡの対立遺伝子変異体を指す。１７アミノ酸シグナルペプチドを含むヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆの配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１１２１０６５に報告され、参照により本明細書に組み込まれる。この配列は、成熟タンパク質に不在のシグナルペプチドを含むため、１５８位はアミノ酸１７６と等しい。配列番号３５は、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖの成熟形態のアミノ酸配列を含有する。
【００３２】
本明細書で意味する「ヘテロ二量体」Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域のＡ鎖およびＢ鎖が、同一のアミノ酸配列ではなく、異なるアミノ酸配列を有するものである。
【００３３】
「ｓｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ」は、本質的にｓｃＦｖ−ＦｃとＦｃポリペプチド鎖（本明細書において「ダミーＦｃ」と称される）から成る二量体タンパク質である。ｓｃＦｖ−Ｆｃは、１つ以上のジスルフィド架橋を介してダミーＦｃに連結され得る。さらに、Ｆｃ領域は、以下に記載する１つ、２つ、３つ以上の電荷対置換対等、ＣＨ３ドメインに「ヘテロ二量体化改変」を含有することができる。
【００３４】
「ＣＨ３−ＣＨ３接合点」は、Ｆｃ領域および／または全長抗体に関連して、他のＣＨ３領域の残基と密接に接触するＣＨ３領域のこれらのアミノ酸から成る。より具体的には、それらの残基は、Ｆｃ領域に関連して、他のＣＨ３領域上のアミノ酸残基の４．５Å以内にある。ＩｇＧ１抗体において、それらは以下の位置で残基である（ＥＵ残基番号の後にカッコに配列番号２の位置が続く）：３４７（１３２）、３４９（１３４）、３５０（１３５）、３５１（１３６）、３５２（１３７）、３５３（１３８）、３５４（１３９）、３５５（１４０）、３５６（１４１）、３５７（１４２）、３６０（１４５）、３６４（１４９）、３６６（１５１）、３６８（１５３）、３７０（１５５）、３９０（１７５）、３９２（１７７）、３９３（１７８）、３９４（１７９）、３９５（１８０）、３９７（１８２）、３９８（１８３）、３９９（１８４）、４００（１８５）、４０５（１９０）、４０７（１９２）、４０８（１９３）、４０９（１９４）、および４３９（２２４）。
【００３５】
本明細書で使用される「化学療法］は、癌患者を、癌細胞に対して細胞毒性または細胞増殖抑制作用を有する「化学療法剤」で治療することを意味する。「化学療法剤」は、細胞分裂に関与する細胞を特異的に標的とし、細胞分裂に関与しない細胞を標的としない。化学療法剤は、例えば、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ合成、タンパク質合成、組み立て、分解、もしくは紡錘体の機能等の細胞分裂に密接に関連するプロセス、および／またはヌクレオチドもしくはアミノ酸等のそれらのプロセスに機能を果たす分子の合成または安定性に直接干渉する。したがって、化学療法剤は、細胞分裂に関与する癌細胞および他の細胞の両方に細胞毒性または細胞増殖抑制作用を有する。化学療法剤は、当該技術分野において周知であり、多くの当該技術分野において既知の中でも、例えば、アルキル化剤（例えば、ブスルファン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メチルロムスチン、ストレプトゾトシン、シス−ジアミンジ−クロロプラチナム、アジリジニルベンゾ−キノン、およびチオテパ）、無機イオン（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）、ナイトロジェンマスタード（例えば、メルファラン塩酸塩、イフォスファミド、クロラムブシル、およびメクロレタミンＨＣｌ）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ））、抗新生物抗生物質（例えば、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ダウノマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、およびブレオマイシン）、植物誘導体（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンデシン、ＶＰ−１６、およびＶＭ−２６）、代謝拮抗薬（例えば、ロイコボリンを伴う、または伴わないメトトレキサート、ロイコボリンを伴う、または伴わない５−フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、ゲムシタビン、およびフルダラビン）、ポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、イリノテカン、およびトポテカン）、ならびにアクチノマイシンＤ、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ｍＡＭＳＡ、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、Ｌ−アスパラギナーゼ、およびミトキサントロンを含む。例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９３）を参照されたい。その関連する一部は、参照により本明細書に組み込まれる。アルキル化剤およびナイトロジェンマスタードは、ＤＮＡをアルキル化することにより作用し、これは鎖の巻き出しおよび複製を制限する。メトトレキサート、シタラビン、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、およびゲムシタビンは、ヌクレオチド合成に干渉する。パクリタキセルおよびビンブラスチン等の植物誘導体は、紡錘体毒である。ポドフィロトキシンはトポイソメラーゼを阻害し、したがって、ＤＮＡ複製に干渉する。抗生物質のドキソルビシン、ブレオマイ��ン、およびマイトマイシンは、それぞれ、ＤＮＡの塩基間に介在し（巻き出しを阻害）、鎖切断をもたらし、ＤＮＡをアルキル化することによりＤＮＡ合成に干渉する。他の作用機構は、アミノ酸（ロムスチン、カルムスチン）のカルバモイル化、およびアスパラギンプール（アスパラギナーゼ）の枯渇を含む。Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｅｃｔｉｏｎ１１，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１４４．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔａｂｌｅ１４４−２（１９９９）。化学療法剤の中でも、上記に列挙される化学療法剤によって直接影響を受ける同一の細胞プロセスに直接影響を及ぼすものが特に含まれる。
【００３６】
「非化学療法抗新生物薬」は、化学療法剤以外の、癌細胞に対して細胞毒性もしくは細胞増殖抑制作用を有する化学剤、化合物、または分子である。しかしながら、非化学療法抗新生物薬は、ホルモンまたは成長因子の受容体を含む、細胞表面受容体等の細胞分裂に間接的に影響を及ぼす分子と直接相互作用することを標的とし得る。しかしながら、非化学療法抗新生物薬は、例えば、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ合成、タンパク質合成、または紡錘体機能、組み立て、または分解等の細胞分裂に密接に関連するプロセスに直接干渉しない。非化学療法抗新生物薬の例としては、多くの可能な非化学療法抗新生物薬の中でも、Ｂｃｌ２の阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼの阻害剤、タモキシフェン等の抗エストロゲン剤、抗アンドロゲン化合物、インターフェロン、ヒ素、レチノイン酸、レチノイン酸誘導体、腫瘍特異的抗原を標的とする抗体、およびＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼの阻害剤（例えば、Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡおよびＢａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから商標名ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）で販売されている小分子ＳＴＩ−５７１）が挙げられる。
【００３７】
「ヘテロ二量体化改変」は、一般に、ヘテロ二量体Ｆｃ領域、つまり、Ｆｃ領域のＡ鎖およびＢ鎖が同一のアミノ酸配列を持たないＦｃ領域の形成を促進するＦｃ領域のＡ鎖およびＢ鎖における改変を指す。ヘテロ二量体化改変は、非対称であり得、つまり、ある改変を有するＡ鎖は、異なる改変を有するＢ鎖と対合し得る。それらの改変はヘテロ二量体化を促進し、ホモ二量体化は不利である。ヘテロ二量体またはホモ二量体が形成されたか否かは、一方のポリペプチド鎖がダミーＦＣであり、もう一方がｓｃＦｖ−Ｆｃである場合、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される大きさの相違によって評価され得る。そのような対合したヘテロ二量体化改変の例の１つは、いわゆる「ノブホール（ｋｎｏｂｓ  ａｎｄ  ｈｏｌｅｓ）」置換である。例えば、米国特許第７，６９５，９３６号および米国特許出願公開第２００３／００７８３８５号を参照されたい。そのような突然変異を記載するそれらの一部は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で意味する、１対のノブホール置換対を含有するＦｃ領域は、Ａ鎖に置換を１つ、そしてＢ鎖に別に１つ含有する。例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＡ鎖およびＢ鎖の以下のノブホール置換は、未修飾のＡ鎖およびＢ鎖で見られるものと比較して、ヘテロ二量体形成を増加させることが分かった：１）一方の鎖にＹ４０７Ｔ、もう一方の鎖にＴ３６６Ｙ；２）一方の鎖にＹ４０７Ａ、もう一方の鎖にＴ３６６Ｗ；３）一方の鎖にＦ４０５Ａ、もう一方の鎖にＴ３９４Ｗ；４）一方の鎖にＦ４０５Ｗ、もう一方の鎖にＴ３９４Ｓ；５）一方の鎖にＹ４０７Ｔ、もう一方の鎖にＴ３６６Ｙ；６）一方の鎖にＴ３６６ＹおよびＦ４０５Ａ、もう一方の鎖にＴ３９４ＷおよびＹ４０７Ｔ；７）一方の鎖にＴ３６６ＷおよびＦ４０５Ｗ、もう一方の鎖にＴ３９４ＳおよびＹ４０７Ａ；８）一方の鎖にＦ４０５ＷおよびＹ４０７Ａ、もう一方の鎖にＴ３６６ＷおよびＴ３９４Ｓ；ならびに９）Ｆｃの一方のポリペプチドにＴ３６６Ｗ、もう一方の鎖にＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ。あるいは、またはそのような改変に加えて、新しいジスルフィド架橋を作り出す置換は、ヘテロ二量体形成を促進することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３／００７８３８５号を参照されたい。そのような突然変異を記載するその一部は、参照により本明細書に組み込まれる。ＩｇＧ１  Ｆｃ領域のそのような改変は、例えば以下の置換を含む：一方のＦｃポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＳ３５４Ｃ；一方のＦｃポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＥ３５６Ｃ；一方のＦｃポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＥ３５７Ｃ；一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ３５１Ｃ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＳ３５４Ｃ；一方のＦｃポリペプチド鎖にＴ３９４Ｃ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＥ３９７Ｃ；または一方のＦｃポリペプチド鎖にＤ３９９Ｃ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３９２Ｃ。同様に、例えば、ＣＨ３−ＣＨ３接合点における１つ以上の残基の電荷を変更する置換は、第ＷＯ２００９／０８９００４号に説明されるヘテロ二量体形成を強化することができ、そのよう���置換を記載する一部は、参照により本明細書に組み込まれる。そのような置換は、本明細書において「電荷対置換」と称され、１対の電荷対置換対を含有するＦｃ領域は、Ａ鎖に置換を１つ、そしてＢ鎖に異なる置換を含有する。電荷対置換の一般例としては、以下のものが挙げられる：１）一方の鎖にＫ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅ、もう一方の鎖にＤ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒ；２）一方の鎖にＫ３９２ＤまたはＫ３９２Ｅ、もう一方の鎖にＤ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒ；３）一方の鎖にＫ４３９ＤまたはＫ４３９Ｅ、もう一方の鎖にＥ３５６ＫまたはＥ３５６Ｒ；および４）一方の鎖にＫ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅ、もう一方の鎖にＥ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒ。加えて、両鎖の置換Ｒ３５５Ｄ、Ｒ３５５Ｅ、Ｋ３６０Ｄ、またはＫ３６０Ｒは、他のヘテロ二量体化改変と共に使用されるとき、ヘテロ二量体を安定させることができる。特定の電荷対置換は、単独で使用するか、または他の電荷対置換と共に使用するかのいずれかが可能である。単一対の電荷対置換およびその組み合わせの特定の例としては、以下のものが挙げられる：１）一方の鎖にＫ４０９Ｅ、もう一方の鎖にＤ３９９Ｋ；２）一方の鎖にＫ４０９Ｅ、もう一方の鎖にＤ３９９Ｒ；３）一方の鎖にＫ４０９Ｄ、もう一方の鎖にＤ３９９Ｋ；４）一方の鎖にＫ４０９Ｄ、もう一方の鎖にＤ３９９Ｒ；５）一方の鎖にＫ３９２Ｅ、もう一方の鎖にＤ３９９Ｒ；６）一方の鎖にＫ３９２Ｅ、もう一方の鎖にＤ３９９Ｋ；７）一方の鎖にＫ３９２Ｄ、もう一方の鎖にＤ３９９Ｒ；８）一方の鎖にＫ３９２Ｄ、もう一方の鎖にＤ３９９Ｋ；９）一方の鎖にＫ４０９ＤおよびＫ３６０Ｄ、もう一方の鎖にＤ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ；１０）一方の鎖にＫ４０９ＤおよびＫ３７０Ｄ、もう一方の鎖にＤ３９９ＫおよびＥ３５７Ｋ；１１）一方の鎖にＫ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ、もう一方の鎖にＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、およびＥ３５７Ｋ；１２）一方の鎖にＫ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ、もう一方の鎖にＤ３９９Ｋ；１３）一方の鎖にＫ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ、もう一方の鎖にＤ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ；１４）一方の鎖にＫ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ、もう一方の鎖にＤ３９９ＫおよびＤ３５７Ｋ；１５）一方の鎖にＫ４０９ＤおよびＫ３７０Ｄ、もう一方の鎖にＤ３９９ＫおよびＤ３５７Ｋ；１６）一方の鎖にＤ３９９Ｋ、もう一方の鎖にＫ４０９ＤおよびＫ３６０Ｄ；ならびに１７）一方の鎖にＫ４０９ＤおよびＫ４３９Ｄ、もう一方の鎖にＤ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ。それらのヘテロ二量体化改変のいずれも、改変されていないＦｃ領域を有する類似のポリペプチドより低いＫＤでＦｃγＲＩＩＩＡに結合する、本明細書に記載の変異体Ｆ領域を含むポリペプチドに使用され得る。
【００３８】
本明細書で意味する「標的分子」は、本明細書に記載のＦｃ含有タンパク質の結合領域が結合する分子である。一部の実施形態では、標的分子は、例えば、癌細胞上で、自己免疫もしくは炎症状態を媒介する細胞上で、感染細胞上で、病原菌上で、または免疫エフェクター機能を媒介する細胞（例えばＮＫ細胞）上で、高レベルで発現するタンパク質である。
【００３９】
「腫瘍負荷」は、癌に罹患する患者の生存癌細胞の数、腫瘍部位の数、および／または腫瘍（複数可）の大きさを指す。腫瘍負荷の減少は、例えば、腫瘍関連抗原または患者の血液もしくは尿中のタンパク質の量の減少、腫瘍細胞もしくは腫瘍部位の数の減少、および／または１つ以上の腫瘍の大きさの減少として観察することができる。
【００４０】
本明細書に記載の変異体Ｆｃ領域を含むタンパク質の「治療有効量」は、例えば、癌患者の腫瘍負荷を減少させるか、もしくは排除するか、またはタンパク質を用いて治療される任意の疾患状態の症状を減少させるか、もしくは排除する作用を有する量である。治療有効量は、状態のすべての症状を完全に排除する必要はないが、１つ以上の症状の重症度を減少させるか、または治療された状態後にある頻度で生じ得るより重篤な症状もしくはより重篤な疾患の開始を遅延することができる。
【００４１】
本明細書に記述されるいずれかの疾患の「治療」は、疾患の少なくとも１つの症状を軽減する、疾患の重症度を減少させる、またはいくつかの場合において、疾患を伴う、もしくは少なくとも１つの他の疾患をもたらす可能性があるより重篤な症状への疾患の進行を遅延または防止することを包含する。治療は、疾患が完全に治癒することを意味する必要はない。有用な治療薬は、単に、疾患の重症度を減少させるか、疾患もしくはその治療に関連する１つ以上の症状の重症度を減少させるか、または治療された状態後にある頻度で生じ得るより重篤な症状もしくはより重篤な疾患の開始を遅延させることを必要とする。
変異体ＦＣ領域を含有するタンパク質
【００４２】
本発明は、標的分子および変異体Ｆｃ領域に結合する結合領域を含むＦｃ含有タンパク質を包含する。それらは、ヒトもしくはヒト以外の未変更ＦＣ領域と比較して、選択されたアミノ酸残基で改変され、ヒトもしくはヒト以外の未変更ＦＣ領域と比較して強化された親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合する、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり得る、ヒトもしくはヒト以外のＩｇＧ  Ｆｃ領域を含有する抗体およびＦｃ融合タンパク質を含む。ＦｃγＲＩＩＩＡは、非対称様式でＦｃ領域と相互作用する、即ち、Ｆｃ領域を構成する２つのＦｃポリペプチド鎖の異なるアミノ酸残基と接触するため、本明細書に記載の非対称的に改変されたＦｃ領域は、ＦｃγＲＩＩＩＡへの親和性の強化、よってＡＤＣＣに特に有効であり得る。本明細書に記載の改変されたヒトＦｃ領域は、Ｆｃ領域を構成する２つのＦｃポリペプチド鎖、つまりＡ鎖およびＢ鎖の配列が異なるように改変され得る。そのように非対称的に改変されたＦｃ領域の形成を促進するために、それらのＦｃ領域は、ホモ二量体Ｆｃ含有タンパク質の形成を妨げ、ヘテロ二量体Ｆｃ含有タンパク質の形成を助長する、Ａ鎖とＢ鎖で異なるヘテロ二量体化改変も含有することができる。改変されたＦｃ領域を含有するタンパク質は、改変されていないＦｃ領域を含むタンパク質、またはヘテロ二量体化改変のみを含有するＦｃ領域と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合およびＡＤＣＣの誘発にさらに有効であり得、例えば、腫瘍適応症もしくは新生物適応症、および／または自己免疫状態もしくは感染状態の治療における生体内治療薬として増加した有効性を有し得る。本明細書に記載の抗体およびＦｃ融合タンパク質の中でも、それぞれのＦｃポリペプチド鎖が異なるタンパク質に融合されるヘテロ二量体が含まれる。そのようなＦｃ融合タンパク質は、二価および二重特異性である。二価および単一特異性Ｆｃ融合タンパク質も含まれる。同様に、単一特異性もしくは二重特異性全長抗体、一価の抗体、および二重特異性もしくは単一特異性ｓｃＦｖ−Ｆｃは、本明細書に記載の改変されたＦｃ領域を含有し得る多くの他の種類のタンパク質の一部である。本発明は、改変されたＦｃ領域にＦｃポリペプチド鎖をコードする核酸、およびそれらのＦｃポリペプチド鎖を含有するタンパク質も包含する。様々なヒト状態を治療するために、それらのタンパク質を作製する方法およびそれらのタンパク質を使用する方法も提供する。
【００４３】
ＩｇＧ抗体のヒトＦｃγ受容体（ＦｃγＲｓ）には、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩの３つの異なるクラスがある。Ａｂeｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（６）：７３５−７４７。７つのサブクラス、つまりＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＢが特徴付けされている。同文献。それらのサブクラスは、選択的スプライシングに起因するイソ型にさらに分類され、様々なＩｇＧサブクラスに結合する異なる能力を有するいくつかの対立遺伝子変異体、およびトリガーエフェクター機能も発見された。同文献。それらの受容体の大半は、ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１またはＩｇＧ３抗体によるそれらの会合後に細胞を活性化し、細胞毒性、サイトカイン放出、および食作用／飲食作用をもたらし、その後抗原提示が続く。活性化は、ＦｃγＲの細胞内ドメインまたは修飾シグナル伝達タンパク質の細胞内部分のいずれかに存在する免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を通して媒介される。同文献。ＦｃγＲＩＩＢ受容体は、唯一公知のヒト阻害性ＦｃγＲであり、細胞活性化の阻害を媒介する細胞内ドメインに免疫受容体チロシン系阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。同文献。
【００４４】
ＦｃγＲＩＩＩＡに関する抗体の親和性の強化は、腫瘍適応症における臨床有効性の強化を示し得る。アミノ酸１５８でバリンまたはフェニルアラニンのいずれかを有するＦｃγＲＩＩＩＡの対立遺伝子変異体は、それぞれ、ＩｇＧへの高親和性結合または低親和性結合と関連している。Ｋｏｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｂｌｏｏｄ  ９０（３）：１１０９−１１１４。それらの対立遺伝子の相違も、リツキシマブ（ＩｇＧ１抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）で治療された濾胞性リンパ腫を有する患者、およびセツキシマブ（キメラＩｇＧ１抗上皮増殖因子受容体モノクローナル抗体）またはトラスツズマブ（ＩｇＧ１抗上皮増殖因子受容体２モノクローナル抗体）のいずれかで治療された固体腫瘍を有する患者で観察された臨床有効性とかなり相関する。Ａｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（６）：７３５−７４７。本明細書において、ＦｃγＲＩＩＩＡの両方の対立遺伝子に関して強化された親和性を有し、したがって、腫瘍適応症における治療薬として強化された有効性も有し得るＦｃ含有タンパク質を提供する。
【００４５】
Ｆｃポリペプチド鎖のそれぞれ、つまり、本発明の改変されたＦｃ領域を一緒に構成するＡ鎖およびＢ鎖は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリペプチド鎖の配列に対するアミノ酸置換のため、異なるアミノ酸配列を有することができる。Ｆｃポリペプチド鎖は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３  Ｆｃポリペプチドのものであり得る。一部の実施形態では、それぞれのＦｃポリペプチド鎖は、天然に生じるヒトＦｃ配列に対して、１〜２０個、１〜１０個、または１〜５個のアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、Ｆｃポリペプチド鎖は、天然に生じるヒトＦｃポリペプチド鎖に対して、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸置換を含むことができる。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチド鎖は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個以下のアミノ酸置換を含むことができる。置換は、例えば、Ｆｃポリペプチド鎖の以下の部位の１つ以上で生じ得る：Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｓ２３９、Ｆ２４１、Ｆ２４３、Ｋ２４６、Ｋ２４８、Ｄ２４９、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｅ２５８、Ｔ２６０、Ｖ２６４、Ｄ２６５、Ｓ２６７、Ｈ２６８、Ｅ２６９、Ｄ２７０、Ｅ２７２、Ｋ２７４、Ｆ２７５、Ｎ２７６、Ｙ２７８、Ｖ２７９、Ｄ２８０、Ｖ２８２、Ｅ２８３、Ｖ２８４、Ｈ２８５、Ｎ２８６、Ａ２８７、Ｋ２８８、Ｔ２８９、Ｋ２９０、Ｒ２９２、Ｅ２９３、Ｅ２９４、Ｑ２９５、Ｙ２９６、Ｓ２９８、Ｙ３００、Ｒ３０１、Ｖ３０２、Ｖ３０３、Ｖ３０５、Ｔ３０７、Ｌ３０９、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｄ３１２、Ｗ３１３、Ｌ３１４、Ｎ３１５、Ｋ３１７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｓ３２４、Ｋ３２６、Ａ３２７、Ｌ３２８、Ａ３３０、Ｉ３３２、Ｅ３３３、Ｋ３３４、Ｔ３３５、Ｉ３３６、Ｓ３３７、Ｋ３３８、Ａ３３９、Ｋ３４０、Ｒ３５５、Ｅ３５６、Ｄ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｋ３６２、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｄ３９９、Ｋ４０９、Ｄ４１３、および／またはＫ４３９。上記に列挙される、異なる、もしくは同一の個々の置換、またはそれらの置換の組み合わせは、Ｆｃ領域のＡ鎖およびＢ鎖で使用され得る。変異体Ｆｃ領域は、上記に列挙されるものに加えて、部位での改変を含むことができる。
【００４６】
特に、Ｆｃ領域を含む、本明細書に記載の抗体またはＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域を構成するＡ鎖およびＢ鎖のうちの１つまたはその両方に以下の特定のアミノ酸置換のうちの１つ以上を含有することができる：Ｅ２３３Ｌ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ｓ、Ｇ２３６Ｙ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｔ、Ｆ２４３Ｍ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｖ、Ｆ２４３Ｉ、Ｋ２４６Ｗ、Ｋ２４６Ｅ、Ｋ２４６Ｓ、Ｋ２４６Ｖ、Ｋ２４８Ｙ、Ｋ２４８Ｌ、Ｍ２５２Ｄ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｋ、Ｒ２５５Ｓ、Ｒ２５５Ｎ、Ｔ２５６Ｖ、Ｔ２５６Ｑ、Ｅ２５８Ｓ、Ｅ２５８Ｖ、Ｈ２６８Ｅ、Ｈ２６８Ｋ、Ａ２８７Ｆ、Ｋ２８８Ｔ、Ｋ２８８Ｉ、Ｋ２９０Ｇ、Ｋ２９０Ｆ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｗ、Ｋ２９０Ｑ、Ｋ２９０Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、Ｙ２９６Ｗ、Ｙ２９６Ｌ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｃ、Ｓ２９８Ｔ、Ｖ３０２Ｑ、Ｔ３０７Ｐ、Ｔ３０７Ｓ、Ｔ３０７Ｅ、Ｔ３０７Ｇ、Ｌ３０９Ｃ、Ｌ３０９Ｓ、Ｌ３０９Ｋ、Ｌ３０９Ｅ、Ｑ３１１Ｍ、Ｎ３１５Ａ、Ｎ３１５Ｓ、Ａ３３０Ｈ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｍ、Ｉ３３２Ｅ、Ｋ３３４Ｌ、Ｋ３３４Ｖ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｍ、Ａ３３９Ｔ、Ｋ３４０Ｎ、Ｒ３５５Ｄ、Ｒ３５５Ｅ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５６Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｋ３６０Ｄ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｄ４１３Ｎ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅ。加えて、上記のタンパク質のいずれもヘテロ二量体化改変等のさらなる改変を含むことができる。例えば、それらは、一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＥ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋを含むことができる。
【００４７】
より具体的には、本発明のタンパク質は、Ａ鎖およびＢ鎖が以下の置換を含むＦｃ領域を含むことができる：（１）一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＹ２９６ＷおよびＳ２９８Ｃ；（２）一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ；（３）一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３５Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、およびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ；（４）一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３５Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、およびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ；（５）一方のＦｃポリペプチド鎖にＱ３１１ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｆ２４３Ｖ、およびＹ２９６Ｗ；（６）例えば、それぞれ、配列番号８および配列番号１０のように、一方のＦｃポリペプチド鎖にＱ３１１ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ；（７）一方のＦｃポリペプチド鎖にＱ３１１ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ；（８）一方のＦｃポリペプチド鎖にＳ２３９ＤおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ；（９）一方のＦｃポリペプチド鎖にＳ２３９ＤおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ；（１０）一方のＦｃポリペプチド鎖にＦ２４３ＶおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ；（１１）一方のＦｃポリペプチド鎖にＦ２４３ＶおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ；（１２）一方のＦｃポリペプチド鎖にＥ２９４ＬおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ；（１３）一方のＦｃポリペプチド鎖にＥ２９４ＬおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＳ２９８Ｃ；（１４）一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４ＹおよびＹ２９６Ｗ；（１５）一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４ＹおよびＳ２９８Ｃ；（１６）一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＥ２９４ＬおよびＹ２９６Ｗ；（１７）一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３３４ＶおよびＳ２９８Ｃ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４ＹおよびＹ２９６Ｗ；（１８）一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３３４ＶおよびＳ２９８Ｉ、もう一方の一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４ＹおよびＹ２９６Ｗ；（１９）一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３３４ＶおよびＳ２９８Ｔ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４ＹおよびＹ２９６Ｗ；（２０）一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３３４ＶおよびＳ２９８Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４ＹおよびＹ２９６Ｗ；（２１）一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３３４ＶおよびＳ２９８Ｃ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＫ２９０Ｙ；（２２）一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３３４ＶおよびＳ２９８Ｉ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＫ２９０Ｙ；（２３）一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３３４ＶおよびＳ２９８Ｔ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＫ２９０Ｙ；（２４）一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３３４ＶおよびＳ２９８Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、およびＫ２９０Ｙ；（２５）例えば、それぞれ、配列番号１６および配列番号１８のように、一方のＦｃポリペプチド鎖にＳ２９８ＴおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ；（２６）一方のＦｃポリペプチド鎖にＡ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ；（２７）一方のＦｃポリペプチド鎖にＡ３３０ＦおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ；（２８）一方のＦｃポリペプチド鎖にＱ３１１ＭおよびＡ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ；（２９）一方のＦｃポリペプチド鎖にＱ３１１ＭおよびＡ３３０ＦおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ；（３０）一方のＦｃポリペプチド鎖にＳ２９８ＴおよびＡ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ；（３１）一方のＦｃポリペプチド鎖にＳ２９８ＴおよびＡ３３０ＦおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ；（３２）一方のＦｃポリペプチド鎖にＳ２３９ＤおよびＡ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ；（３３）一方のＦｃポリペプチド鎖にＳ２３９ＤおよびＳ２９８ＴおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ；（３４）一方のＦｃポリペプチド鎖にＡ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ２９０ＹおよびＹ２９６Ｗ；（３５）一方のＦｃポリペプチド鎖にＡ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＥ２９４ＬおよびＹ２９６Ｗ；（３６）一方のＦｃポリペプチド鎖にＡ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４ＹおよびＹ２９６Ｗ；（３７）一方のＦｃポリペプチド鎖にＥ２３３ＬおよびＱ３１１ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ；（３８）一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４ＩおよびＱ３１１ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｅ２９４Ｌ、およびＹ２９６Ｗ；（３９）一方のＦｃポリペプチド鎖にＥ２３３ＬおよびＡ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ；（４０）一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４ＩおよびＱ３１１ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ；（４１）一方のＦｃポリペプチド鎖にＡ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＬ２３４ＹおよびＹ２９６Ｗ；または（４２）一方のＦｃポリペプチド鎖にＡ３３０ＭおよびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ２９０ＹおよびＹ２９６Ｗ。上記のタンパク質のいずれも、上述のヘテロ二量体化改変を含むことができる。一部の実施形態では、それらは、一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ、もう一方のＦｃポリペプチド鎖にＥ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋをさらに含むことができる。
【００４８】
本明細書に記載するＦｃポリペプチド鎖のアミノ酸配列の例としては、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３７、３９、および４１が挙げられる。それらの配列は、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を強化するヘテロ二量体化改変および置換を含有する。
【００４９】
本発明のＦｃ含有タンパク質は、ヘテロ二量体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含有することができる。つまり、２つのＦｃポリペプチド鎖が、それぞれが異なるアミノ酸配列を有するＦｃ領域を一緒に構成する。一部の実施形態では、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ヘテロ二量体化改変（上記に定義される）を含有し、したがって、ヘテロ二量体Ｆｃを含有するタンパク質の生成を非常に促進する。
【００５０】
ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、一般に、哺乳類細胞によって生成されるとき、Ｎ２９７でグリコシル化され、この炭水化物におけるフコースの不在は、ＦｃγＲＩＩＩへの結合およびＩｇＧ抗体がＡＤＣＣを誘発する能力を増加させることができる。Ｍａｌｐｈｅｔｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０６（５）：７７４−７８３。抗体を生成するためのＣＨＯ細胞系Ｌｅｃ１３の使用、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子もしくはＧＤＰ−フコース輸送体（ＧＦＴ）遺伝子が破壊された抗体生成のための細胞系の使用、ＦＵＴ８遺伝子もしくはＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子に対する低干渉ＲＮＡを含有する抗体生成のための細胞系の使用、またはβ−１，４−Ｎ−アセチルグルコアミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）およびＧｏｌｇｉα−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）の抗体生成細胞系における同時発現を含む、脱フコシル化抗体を生成するためのいくつかのアプローチが探求されている。Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ１０１：２２２７−２２３３。本明細書に記載の抗体およびＦｃ融合タンパク質を含むＦｃ含有タンパク質は、「脱フコシル化」され得る、つまり、本質的にフコースを含まない、または少量のフコースを含むのみである。本明細書で意味する、脱フコシル化タンパク質調製物から放出される少なくとも約８５％、９０％、または９５％のグリカンは、フコースを含有しない。「脱フコシル化」および「アフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）」という用語は、本明細書において互換的に使用される。そのようなタンパク質は、例えば、ＦＵＴ８−／−またはＧＦＴ−／−ＣＨＯ細胞内で、上述のように生成され得る。タンパク質のフコース含量は、Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ１０１：２２２７−２２３３，ａｔ  ２２２８−２２２９により記載されるように決定され得、その関連する一部は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５１】
癌細胞上、自己免疫もしくは炎症性状態を媒介する細胞上、または病原菌もしくは感染細胞上で、高レベルで発現する多くのタンパク質が公知である。そのようなタンパク質は、本明細書に記載の治療用Ｆｃ含有タンパク質のための潜在的な標的分子である。そのような潜在的な標的タンパク質に結合する抗体またはＦｃ融合タンパク質は、本発明と共に使用するのに特に適切である。ヒト癌細胞上で発現することが知られている潜在的な標的タンパク質は、以下のヒトタンパク質を含む：ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＧＭ２／ＧＤ２シンターゼ、ＣＥＡ、ＭＬＡＮＡ／ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、サバイビン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、肉腫転位限界点、ＥＰＨＡ２、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、アポトーシスのメラノーマ阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＲＧ、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド（ＶＬＰＤＶＦＩＲＣ）、ペアードボックス３（ＰＡＸ３）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ｒｈｏ関連ＧＴＰ結合タンパク質ＲｈｏＣ、ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス関連癌遺伝子（ＭＹＣＮ）、ＴＲＰ−２、ＧＤ３ガングリオシド、フコシルＧＭ１、メソテリン、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、テトラネクチン（ＴＮ）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１（特に、限界点を含むペプチド）、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２前駆体（ＯＹ−ＴＥＳ−１）、精子タンパク質１７（Ｓｐ１７）、ＬＣＫ、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしても知られる）、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ−１、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）、レグマイン、ＴＩＥ２、前立腺関連遺伝子４タンパク質（ＰＡＧＥ−４）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、プロタミン２（ＭＡＤ−ＣＴ−１としても知られる）、グロムリン（ＦＡＰとしても知られる）、ＰＤＧＦＲ−β、ＳＳＸ２、ＳＳＸ５、Ｆｏｓ関連抗原１、ＣＤ２０、インテグリンαｖβ３、５Ｔ４癌胎児性抗原、ＣＡ  ＩＸ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ−２としても知られる）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ１としても知られる）、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ−３としても知られる）、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ５５、ＣＤ５６（ＮＣＡＭとしても知られる）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２としても知られる）、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ１０（ＭＨＣ  ＩＩ）、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ−６、シアリルルイスＹ、ＴＡＧ−７２、ＴＡＬ６、ＴＲＡＩＬＲ２、ＶＥＧＦ、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ−１としても知られる）、ＣＤ４、ＣＤ７３、ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６としても知られる）、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ８０（Ｂ７−１としても知られる）、ＰＤＧＦＲβ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ、多くの他の名前の中でもグルタメートカルボキシペプチダーゼ２としても���られる）。癌抗原は、ヒトヘルペスウイルス４タンパク質ＬＭＰ２、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７、ならびにグリコセラミドグロボＨ（Ｇｉｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８（６）：３２７０−３２７５に記載される、グロボＨを記載する一部は、参照により本明細書に組み込まれる）、α４β１およびα４β７インテグリンのα４サブ単位、α４β７インテグリン、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃ５補体タンパク質、ＩｇＥ、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ならびに腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）も含む。
【００５２】
他の標的は、ウイルス、細菌（多くの他の種の中でもボレリア、ブドウ球菌、エシェリキアの種を含む）、真菌（酵母を含む）、ジアルジア、アメーバ、マラリア原虫属の真核原生生物、繊毛虫、トリパノソーマ、線虫、および他の真核寄生生物を含む、病原生物の表面上に見られるタンパク質または他の分子を含む。
【００５３】
Ｆｃ含有タンパク質が単一特異性または二重特異性または多選択性である実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は、シグナル伝達経路を拮抗する、もしくは刺激するために、または標的分子と別の分子（標的分子であっても、なくてもよい）との間の相互作用の活性もしくは特異性を増加させるために、同一の細胞または異なる種類の細胞上で、同一もしくは異なる標的分子であり得、単量体もしくは多量体であり得る１つまたは２つまたは複数の標的分子に結合することができる。別の態様では、二重特異性または多選択性Ｆｃ含有タンパク質は、上段に記述するもの等の標的分子、および例えば、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２ＤまたはＴ細胞上のＣＤ３もしくはＴ細胞受容体等の免疫系による細胞毒性応答の媒介に関与する細胞上で高レベルで発現する、同様に標的分子であり得る別の分子に結合することができる。上記に説明されるように、標的分子は、例えば以下のうちの１つであり得る：（１）癌細胞上に選択的に発現するヒトタンパク質、（２）病原体の表面もしくは病原体感染宿主細胞の表面上に高度に発現するウイルスまたは他の病原体のタンパク質、あるいは（３）自己免疫疾患または炎症性疾患等の状態を媒介するヒト細胞型の表面上に選択的に発現するヒトタンパク質。
改変されたＦｃ領域を含有するタンパク質をコードする核酸
【００５４】
本明細書に記載のＦｃ含有タンパク質のＦｃポリペプチド鎖をコードする核酸も提供される。一態様では、以下のアミノ酸配列：配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３７、３９、または４１のうちの１つ以上を含む、Ｆｃポリペプチド、および／またはそれらを含むＦｃ含有タンパク質をコードする核酸を提供する。そのようなＦｃポリペプチド鎖をコードする配列の例としては、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３６、３８、および４０が挙げられる。それらの核酸は、それぞれ、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３７、３９、および４１のアミノ酸配列をコードする。本明細書に記載の多くの変異体Ｆｃポリペプチド鎖をコードする多くのさらなる核酸配列も本発明に包含される。それらの核酸は、とりわけ、本明細書に記載の改変されたＦｃポリペプチド鎖を含有する組み換えタンパク質を生成するのに有用である。それらの改変されたＦｃポリペプチド鎖は、野生型Ｆｃ領域よりも低いＫＤで結合することにより示される、強化された親和性でＦｃγＲＩＩＩＡに結合するヘテロ二量体Ｆｃ領域の一部であり得る。そのような核酸は、哺乳類細胞におけるタンパク質の分泌を促進するシグナル配列および／または標的分子に結合する結合領域をコードすることもできる。シグナル配列は、成熟中にタンパク質の残部から切断され、それらはタンパク質をコードする核酸にコードされるが、成熟タンパク質の一部ではないことが、当技術分野では理解される。シグナル配列は、例えば、Ｋｅｒｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１６（８）：７４１−７４２、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｋｒｏｇｈ（１９９８），Ｐｒｏｃ．Ｓｉｘｔｈ  Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ（ＡＡＡＩ  Ｐｒｅｓｓ）：１２２−１３０、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０（１）：１−６、およびＮｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ８（５＆６）：５８１−５９９に記載されるように、容易に識別され得る。参照の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の核酸は、１本鎖および２本鎖形態のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ含有タンパク質の両方のポリペプチド鎖は、単一核酸分子上にコードされる。他の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ含有タンパク質は、２つ、３つ、またはそれ以上の核酸分子上にコードされ得る。
【００５５】
本明細書で意味する「単離された核酸」は、核酸が最初に単離された生物のゲノムに存在する隣接する配列から分離された核酸である。例えば、核酸が改変されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域をコードする場合、隣接する配列は、ヒトゲノムにＩｇＧ１  Ｆｃをコードする配列に隣接する配列であろう。化学的に合成されたか、またはＰＣＲにより酵素学的に生成された核酸は、本明細書で意味する「単離された核酸」であることを理解されたい。単離された核酸分子は、別個の断片の形態の、またはより大きい核酸構築物の構成要素としての核酸分子を指す。
変異体Ｆｃ領域を伴うＦｃ含有タンパク質の作製方法
【００５６】
本明細書により包含される抗体および融合タンパク質等のＦｃ含有タンパク質は、当該技術分野において既知の方法により作製され得る。より具体的には、本明細書に記載の改変されたＦｃポリペプチド鎖を含むＦｃ含有タンパク質をコードする核酸は、宿主細胞内に導入され得るベクター内に導入され得る。本明細書に記載のヘテロ二量体Ｆｃ含有タンパク質は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を必ず含有するため、それらの鎖をコードする核酸は、単一ベクターまたは２つ以上のベクターのいずれか上に存在し得る。２つ以上のベクターが使用される場合、それらのベクターは、宿主細胞内に一緒に導入され得る。そのようなタンパク質をコードする核酸を含むベクターおよび宿主細胞は、本発明により包含される。Ｆｃ含有タンパク質をコードする核酸を含有する宿主細胞は、タンパク質が発現するような条件下で培養され得る。次いで、発現したタンパク質は、細胞が培養された培地から、または細胞自体から得ることができ、当該技術分野において既知の多くの適切な手段のいずれかにより精製され得る。加えて、タンパク質を生成するための遺伝子操作方法は、既知の方法に従う無細胞発現系、細胞宿主、組織、および動物モデルにおけるポリヌクレオチド分子の発現を含む。
【００５７】
ベクターは、宿主における増殖のために、選択マーカーおよび複製元を含むことができる。ベクターは、タンパク質をコードする核酸に操作可能に連結される、哺乳類、鳥類、微生物、ウイルス、植物、または昆虫遺伝子に由来するもの等、好適な転写調節配列および翻訳調節配列をさらに含むことができる。そのような調節配列の例としては、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および転写および翻訳を制御する適切な配列が挙げられる。ヌクレオチド配列は、調節配列が標的タンパク質をコードするＤＮＡに機能的に関連するとき、操作可能に連結される。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列が核酸配列の転写を指示する場合、核酸配列に操作可能に連結される。
【００５８】
本明細書に記載の抗体またはＦｃ融合タンパク質の発現に好適な宿主細胞は、原核生物細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳類または鳥類細胞を含む高等真核生物細胞を含む。ベクターの調節配列は、それらが宿主細胞で操作可能であるように選択される。好適な原核生物宿主細胞は、エシェリキア属、バチルス属、およびサルモネラ菌属の細菌、ならびにシュードモナス属、ストレプトミセス属、およびブドウ球菌属のメンバーを含む。原核生物細胞、例えば大腸菌における発現において、タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子は、好ましくは、組み換えポリペプチドの発現を促進するために、Ｎ末端メチオニン残基を含む。Ｎ末端メチオニンは、任意に、発現したポリペプチドから切断され得る。好適な酵母宿主細胞は、サッカロミセス、ピキア、およびクルベロミセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）を含む属の細胞を含む。好ましい酵母宿主は、出芽酵母およびピキアパストリスである。昆虫宿主細胞における発現に好適な系は、例えば、Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ（（１９８８），ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７）による概説に記載されており、その関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。好適な哺乳類宿主細胞は、サルの腎細胞のＣＯＳ−７系（Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１），Ｃｅｌｌ２３：１７５−１８２）、仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵（ＣＨＯ）細胞（Ｐｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９５８），ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ６０：１２７５−１２８１）、ＣＶ−１（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５：２１−２７）、ヒト胚腎臓（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ（登録商標））カタログ番号ＣＲＬ−１５７３）からのＨＥＫ２９３細胞、およびヒト頚部癌細胞（ＨＥＬＡ）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ  ２）を含む。本段落で参照される参考文献の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。多くの他の宿主細胞は、当該技術分野において既知である。
【００５９】
細胞宿主に使用する発現ベクターは、一般に、１つ以上の表現型選択マーカー遺伝子を含む。そのような遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか、または栄養要求条件を供給するタンパク質をコードする。多種多様のそのようなベクターは、市販供給源から容易に入手可能である。例としては、ｐＧＥＭ（登録商標）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＳＰＯＲＴベクター、およびｐＰＲＯＥＸ（商標）ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、およびｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が挙げられる。酵母ベクターは、２μの酵母プラスミドからの複製配列元、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終止のための配列、および選択マーカー遺伝子を含有することが多い。酵母および大腸菌の両方で複製可能なベクター（シャトルベクターと称される）も使用することができる。酵母ベクターの上述の特徴に加え、シャトルベクターは、大腸菌における複製および選択のための配列も含む。酵母宿主で発現する標的ポリペプチドの直接分泌は、Ｆｃ含有タンパク質の５’端に酵母α因子リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含むことにより達成され得る。Ｂｒａｋｅ（１９８９），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：２６９−２８０。
【００６０】
哺乳類宿主細胞での使用に好適な発現ベクターの例としては、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＣ４０９（ＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１−２８３２）、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）が挙げられる。哺乳類宿主細胞で使用するための発現ベクターは、ウイルス性ゲノムに由来する転写制御配列および翻訳制御配列を含むことができる。本明細書に記載のタンパク質をコードするＲＮＡの転写を促進するために使用され得る一般的に使用されるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス２、ポリオーマウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するものを含むが、これらに限定されない。哺乳類発現ベクターを構築するための方法は、例えば、Ｏｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ（（１９８２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０）、Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（（１９８６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５−９４１）、Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８−７７１）、ＥＰ−Ａ−０  ３６７  ５６６、および第ＷＯ９１／１８９８２号に開示されている。それらの参考文献の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
強化されたＦｃγＲＩＩＩＡ結合を伴うＦｃ含有タンパク質の使用
【００６１】
抗体およびＦｃ融合タンパク質等の本発明のＦｃ含有タンパク質は、特に、特定の標的分子が表示される細胞の選択的死滅が望ましい疾患状況において、治療薬として使用され得る。しかしながら、本発明のＦｃ含有タンパク質は、可溶性リガンド、ウイルス、または外来病原性細胞を排除するのに有用でもあり得る。例えば、癌患者において、本明細書に記載のＦｃ含有タンパク質によって標的とされ得る、あるタンパク質を選択的に発現し得る癌細胞を死滅させることが望ましい。したがって、そのような癌標的タンパク質に結合し、強化された細胞死滅特性を有する抗体またはＦｃ融合タンパク質は、癌適応症において望ましい治療薬であり得る。さらに、癌標的タンパク質に結合する、本明細書に記載の二重特異性Ｆｃ含有タンパク質、つまり、癌細胞上に発現するタンパク質、および細胞毒性細胞上に発現するタンパク質を使用して、癌細胞および細胞毒性細胞を相互に密接に近接させることも有用であり得る。例えば、ＮＫ細胞上に発現するＣＤ１６、または細胞毒性Ｔ細胞およびＮＫ細胞上に発現するＮＫＧ２Ｄは、標的タンパク質であり得る細胞毒性細胞上に発現するタンパク質である。炎症性状態である喘息において、気道において細胞の損傷を媒介し、応答性亢進および粘液分泌過多を誘発する好酸球を死滅させることは、有用であり得る。Ｋｏｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：１３４４−１３５３。したがって、好酸球上に優先的に発現する抗原に対して強化された細胞死滅特性を有するＦｃ含有タンパク質は、喘息において有用であり得る。同様に、ウイルス、外来病原性細胞、または感染宿主細胞も、本明細書に記載の抗体またはＦｃ融合タンパク質によって標的とされ得る。
【００６２】
本発明は、様々な形態の癌を含む細胞増殖疾患に罹患する患者を、本明細書に記載のＦｃ含有タンパク質、または改変されたＦｃ領域を含むＦｃ含有タンパク質と他の治療剤を含む組み合わせで治療するための方法も想定する。患者はヒトであり得るが、本方法は、ペットおよび農業動物等の家畜を含む、あらゆる哺乳類に適用され得る。改変されたＦｃ領域を含有する治療有効量のタンパク質、および一部の場合において、治療有効量の別の治療剤と好適な希釈剤、賦形剤、または担体を含む、そのような方法に使用するための組成物も提供する。
【００６３】
本明細書に記載のＦｃ含有タンパク質は様々な薬剤を用いて投与され得、治療は、例えば、化学療法剤、非化学療法、抗新生物薬、および／または放射線等の癌治療に幅広く利用されている。例えば、化学療法および／または放射線は、本明細書に記載のいずれかの治療前、治療中、および／または治療後に生じ得る。化学療法剤の例としては、シスプラチン、タキソール、エトポシド、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、アクチノマイシンＤ、シクロヘキシミド、カンプトテシン（またはその水溶性誘導体）、メトトレキサート、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、アドリアマイシン（ドキソルビシン）およびダウノマイシン等の抗新生物抗生物質、ならびに上述のすべての化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
Ｃａｎｃｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９３）は、癌療法のガイダンスを提供する文書の１つである。適切な治療アプローチは、関連分野で認識される、特定の種類の癌、および患者の一般状態等の他の因子により選択される。本明細書に記載の抗体またはＦｃ融合タンパク質を使用する、本明細書に記載の治療は、癌患者の治療に他の抗新生物薬を使用する療法レジメンに加えることができる。
【００６５】
本明細書に記載するＦｃ含有タンパク質は、癌細胞の新しい領域への浸潤、即ち転移を可能にできる、隣接する組織および新生血管の成長の破壊を時折伴う細胞の未調節および／または不適切な増殖に関与する、癌を含む細胞増殖疾患を治療するために使用され得る。結腸直腸ポリープ、大脳虚血、肉眼的嚢胞性疾患、多発性嚢胞腎疾患、良性前立腺肥大症、および子宮内膜症を含む、不適切な細胞成長に関与する非悪性状態が、本明細書に記載のタンパク質で治療可能な状態の範囲に含まれる。本発明のタンパク質を使用して治療され得る他の細胞増殖疾患は、例えば、中皮腫、扁平上皮細胞癌、骨髄腫、骨肉腫、膠芽腫、膠腫、癌、腺癌、メラノーマ、肉腫、急性および慢性白血病、リンパ腫、髄膜腫、ホジキン病、セザリー症候群、多発性骨髄腫、ならびに肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、咽頭癌、乳癌、頭頚部癌、膀胱癌、卵巣癌、皮膚癌、前立腺癌、子宮頸癌、膣癌、胃癌、腎細胞癌、腎臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、および食道癌、肝胆道癌、骨癌、皮膚癌、および血液癌、ならびに鼻腔および副鼻腔、鼻咽頭、口腔、中咽頭、咽頭、咽頭下部、唾液腺、縦隔、胃、小腸、結腸、直腸および肛門領域、尿管、尿道、陰茎、精巣、外陰部、内分泌系、中枢神経系、ならびに血漿細胞の癌である。
【００６６】
本明細書に記載のＦｃ含有タンパク質は、ある細胞の種類を枯渇させるのに有益である他の種類の状態にさらに役立つ場合がある。例えば、喘息におけるヒト好酸球の枯渇、全身性エリテマトーデスにおける過剰なヒトＢ細胞、自己免疫状態における過剰なヒトＴｈ２Ｔ細胞、または感染疾患における病原体感染細胞は有益であり得る。
薬学的組成物
【００６７】
本発明は、抗体またはＦｃ融合タンパク質等の、本明細書に記載のＦｃ含有タンパク質を含む薬学的組成物を含む。そのような組成物は、生理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤等の１つ以上のさらなる構成成分を含む改変されたＦｃ領域を有する、治療有効量のＦｃ含有タンパク質を含む。そのようなさらなる構成成分は、多くの可能性の中でも、緩衝剤、炭水化物、ポリオール、アミノ酸、キレート化剤、安定剤、および／または防腐剤を含むことができる。
投薬および投与方法
【００６８】
上述の改変されたＦｃ領域を含むＦｃ含有タンパク質を含む組成物は、非経口、局所、経口、鼻、膣、直腸、または肺（吸入による）投与を含むいずれの適切な手段により投与され得るが、これらに限定されない。注射の場合、組成物（複数可）は、ボーラス注入または連続注入により、関節内、静脈内、動脈内、筋肉内、関節内、腹腔内、皮下投与され得る。経皮送達および移植片または皮膚パッチからの持続放出のような、局部投与、つまり、腫瘍内への直接注射等の疾患の部位の投与が想定される。吸入による送達は、例えば鼻または経口吸入、ネブライザ、エアロゾル形態等の吸入の使用を含む。身体空洞内に挿入される坐剤を介した投与は、例えば、固体形態の組成物を選択した身体空洞に挿入し、それを溶解させることにより達成され得る。他の代替えは、点眼剤、ならびにピル、ロゼンジ剤、シロップ、およびチューインガム等の経口調製物、ならびにローション、ゲル、スプレー、および軟膏等の局所調製物を含む。多くの場合、本明細書に記載されるもの等のポリペプチドである治療用分子は、局所的に、または注射もしくは吸入により投与され得る。
【００６９】
本明細書に記載のＦｃ含有タンパク質は、治療される状態を治療するのに有効である、あらゆる用量、頻度、および持続期間で投与され得る。治療有効量は、Ｆｃ含有タンパク質の分子の性質および治療される障害の性質に依存する。治療は、所望の結果を達成するのに必要な限り継続することができる。Ｆｃ含有タンパク質は、他の可能な用量レジメンの中でも、１日に複数回、毎日、２日に１回、１週間に２回、１週間に３回、毎週、２週間に１回、毎月、６週間に１回、２ヶ月に１回、３、４、５、または６ヶ月に１回、単一用量または周期的に与えられる一連の用量として投与することができる。治療の周期は、治療期間にわたって一定であっても、そうでなくてもよい。例えば、治療を、最初は週間隔で行ってもよく、後に、２週間に１回または上述より長い間隔で行ってもよい。数日、数週間、数ヶ月、または数年の期間を有する治療は、本発明により包含される。治療は、中断され、その後、再開されてもよい。維持量は、最初の治療後に投与され得る。
【００７０】
用量は、体重の１キログラム当たりのミリグラムとして（ｍｇ／ｋｇ）、または皮膚表面の１立法メートル当たりのミリグラム（ｍｇ／ｍ２）として、または身長もしくは体重に関係なく固定量として測定され得る。それらのすべては、当該技術分野において標準用量単位である。個人の皮膚表面積は、標準式を使用して、個人の身長および体重から計算される。本明細書に記載の改変されたＦｃ領域を含有するタンパク質に関して、用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、任意に約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、または約２．５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。あるいは、あらゆる大きさの患者が、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、任意に約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約３００ｍｇ、または約１００ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲である、同一の用量を受容することができる。あるいは、用量は、約５ｍｇ／ｍ２〜約８００ｍｇ／ｍ２、約１０ｍｇ／ｍ２〜約６００ｍｇ／ｍ２、または約２５ｍｇ／ｍ２〜約５００ｍｇ／ｍ２であり得る。用量は、治療継続期間を通して一定であっても、そうでなくてもよい。例えば、用量は、治療継続期間を通して徐々に増大してもよい。あるいは、最初の投与量は、後続の投与量よりも多くてもよい。さらなる代替えとして、用量は、治療の後段階で減らすことができる。
【００７１】
先行の特定の実施形態の説明は、本発明の一般的な性質を明らかにし、したがって、本明細書に提示される一般的な概念から逸脱することなく、他の者は、様々な用途のためにそのような実施形態を容易に修正および／適合させることができる。いずれのそのような適合または修正は、開示される実施形態の等価物の規定および範囲内に入ることが意図される。以下の実施例は、例示にすぎず、本発明の範囲を制限するものではない。それらの実施例に採用される句および用語は、説明の目的のためであり、制限するものではない。
実施例
実施例１：Ｆｃヘテロ二量体として改変されたＦｃ領域のライブラリの構築およびスクリーニング
ライブラリ構築および一次スクリーニング
【００７２】
Ｆｃコード領域内の選択された部位でさらなる改変を有する、電荷対置換Ｅ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋを含有するｓｃＦｖ−Ｆｃ、または電荷対置換Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄを含有するＦｃポリペプチド鎖（「ダミーＦｃ」）のいずれかをコードする核酸のライブラリは、ＰＣＲを使用して作製された。置換のために選択されたＦｃ内のそれぞれの部位において、核酸は、選択された部位で２０すべての異なるアミノ酸を有するＦｃ領域が発生するように変更された。核酸のそれぞれのコドンは、得られたライブラリの核酸分子がそれぞれ潜在的に１つのコドン内でのみ修飾されるように、独立してランダム化された。１つの群の部位は、完全に下のヒンジ領域（残基２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、および２３８、図２を参照）内にあった。それらの残基をコードする部位で突然変異を有する核酸を含有するライブラリは、「列１」ライブラリと称された。別の群の部位は、ＣＨ２領域内にあり、ＦｃγＲＩＩＩＡ（２３９、２４１、２５５、２５６、２５８、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２８０、２８５、２８６、２９０、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０７、３０９、３１５、３２６、３２７、３２８、３３０、３３２、３３３、３３４、３３７、および３３９、図２を参照）に接触する場所に隣接するか、またはその一部のいずれかであった。それらの残基をコードする部位で突然変異を有する核酸を含有するライブラリは、「列２」ライブラリと称された。第３の群は、溶剤に曝露されたＣＨ２領域内の部位に含まれたが、ＦｃγＲＩＩＩＡ（２４３、２４６、２４８、２４９、２５１、２５２、２５３、２５４、２６０、２７４、２７５、２７８、２７９、２８２、２８３、２８４、２８７、２８８、２８９、２９２、２９３、３０１、３０２、３０３、３０５、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１７、３１８、３２０、３２２、３２４、３３５、３３６、３３８、および３４０、図２を参照）に接触する場所に隣接しない、またはその一部ではなかった。それらの残基をコードする部位で突然変異を有する核酸を含有するライブラリは、「列３」ライブラリと称された。図２は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域内のそれらの部位の位置を示す。
【００７３】
より詳細には、ＣＨ３ドメインにＥ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ電荷対突然変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃポリペプチドに融合されたＭ３１５抗体（ラット抗マウスＮＫＧ２Ｄ抗体）のｓｃＦｖをコードするＤＮＡ断片は、哺乳類発現ベクターｐＴＴ５内にサブクローン化された。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ６５（１）：７７−８２。ＣＨ３ドメインにＫ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ電荷対突然変異を有するｈｕＩｇＧ１  ＦｃポリペプチドをコードするＤＮＡ断片も、ｐＴＴ５内にサブクローン化された。上述の６つの小さいＦｃライブラリは、以下に記載されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲによるＳＯＥ）により、スプライスオーバーハング伸長（ｓｐｌｉｃｅ  ｏｖｅｒｈａｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を使用して作製された。例えば、Ｗａｒｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｇｅｎｅ１８６：２９−３５を参照されたい。本方法を記載するその一部は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
ライブラリは以下のように作製された。それぞれのＦｃコード領域内の８２の選択されたコドンのそれぞれにおいて、コドンの最初に２つの位置でランダム化され、第３の位置でＧまたはＣのいずれかを有する（「ＮＮＧ／Ｃコドン）オリゴヌクレオチドを作製した（「ＮＮＧ／Ｃオリゴヌクレオチド」）。このＮＮＧ／Ｃコドンは、上流および下流に伸長する約２１の塩基を有するＮＮＧ／Ｃオリゴヌクレオチドの中央に配置された。ＮＮＧ／Ｃオリゴヌクレオチドは、Ｆｃコード領域においてその５’端が３’端の上流であるように配置された。したがって、ＮＮＧ／Ｃオリゴヌクレオチドの上流の２１の塩基に一致する「逆オリゴヌクレオチド」が別に合成された。ユニバーサル下流プライマーをそれぞれのＮＮＧ／Ｃオリゴヌクレオチドと組み合わせ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に曝し、下流断片を生成した。同様に、ユニバーサル上流オリゴヌクレオチドおよびそれぞれの逆オリゴヌクレオチドを組み合わせ、ＰＣＲ反応に曝し、上流ＤＮＡ断片を作製した。あるいは、ＮＮＧ／Ｃオリゴヌクレオチドは、上流を向くことができ、逆プライマーは下流を向くことができる。この場合、上述の初期のＰＣＲ反応は、１つのＰＣＲ反応にＮＮＧ／Ｃオリゴヌクレオチドと上流オリゴヌクレオチドを含み、上流断片を生成し、別のＰＣＲ反応に逆オリゴヌクレオチドおよび下流オリゴヌクレオチドを含み、下流断片を生成する。上流および下流ＰＣＲ断片はアガロースゲルを使用して精製され、それらのＰＣＲ生成物の量が定量化された。２回目のＰＣＲ反応用に、同一のモル量の個々の上流および下流ＤＮＡ断片を、ユニバーサル上流および下流プライマーと組み合わせ、全長ＰＣＲ生成物を組み立てた。次いで、全長ＰＣＲ断片は、アガロースゲルから精製され、列から等量の個々の全長断片を組み合わせ、制限酵素Ｓａｌ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化し、発現ベクター内に挿入した。
【００７５】
合計６つのライブラリを作成した。ｓｃＦｖ−Ｆｃをコードする核酸に突然変異を有する列１、列２、および列３のライブラリの３つのライブラリを作成した。同様に、ダミーＦｃをコードする核酸のＦｃコード領域内の同一の位置に突然変異を有する列１、列２、および列３のライブラリを作成した。図３に模式的に図示するように、初期のスクリーニングは以下のように実施された。ライブラリを大腸菌内に導入し、ライブラリに異なる変異体が存在するため、少なくとも３倍多いコロニーが選ばれるように十分な個々のコロニーを選んだ。例えば、それぞれの列１ライブラリは、それぞれの９つの部位で２０の異なるアミノ酸を含有し、異なる変異体は合計１８０であった。この場合、１０個の微量滴定プレートのコロニー（９６ウェル／プレートで合計約９６０）を選び、成長させた。プラスミドＤＮＡを単離した。それぞれの列２および列３のライブラリは、３４および３９部位のそれぞれで２０の異なるアミノ酸を含有し、異なる変異体は、それぞれ、合計６８０および７８０であった。したがって、それぞれの列２および列３ライブラリ用に４５個のプレートのコロニー（合計４３２０）を選び、プラスミドＤＮＡを単離した。それらの突然変異させたプラスミドＤＮＡを、改変されていないＤＮＡ（図２に示されるように、改変されたＤＮＡがｓｃＦｖ−Ｆｃである場合、改変されていないＤＮＡはダミーＦｃであり、またその逆であった）と組み合わせ、ＨＥＫ２９３細胞（形質転換されたヒト胚腎細胞系）を形質移入するために使用した。形質移入体を培養し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（カタログ番号６７６０００２およびＡＬ１０９Ｍ）から購入した試薬を使用して、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイを使用して培養培地をアッセイした。
【００７６】
簡潔に、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイは以下のように実施された。形質移入されたＨＥＫ２９３細胞からの細胞培養培地を、ストレプトアビジンコーティングされたドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６７６０００２）、ビオチン化ヒトＩｇＧ抗体（ストレプトアビジン−ビオチン相互作用を介してドナービーズに結合する）、抗グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）抗体に抱合された受容ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＡＬ１０９Ｍ）、ＧＳＴタグ付けされた変型のヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（ＧＳＴ−抗−ＧＳＴ抗体相互作用を介して受容ビーズに結合し、ＦｃγＲＩＩＩＡとビオチン化ヒトＩｇＧ抗体の相互作用を介してドナービーズに結合する）を含有するウェルに添加した。競合物（ｓｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ等）の不在下、ウェルが６８０ｎｍの光で照射されたとき、ドナービーズは活性化される。受容ビーズが活性化ドナー細胞に物理的に近接する場合、それらはドナービーズによって活性化され、約６１５ｎｍで蛍光を発する。ＦｃγＲＩＩＩＡに結合する競合物（ｓｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ等）の存在下、ビオチン化ヒトＩｇＧ抗体ではなく競合物がＦｃγＲＩＩＩＡに結合するとき、特に、競合物がビオチン化ヒトＩｇＧ抗体より効率的にＦｃγＲＩＩＩＡに結合する場合、このシグナルは、ドナーおよび受容ビーズが離れるため減少するだろう。
【００７７】
未変異（本ライブラリにも含まれる電荷対突然変異を除く）変型のｓｃＦｖ−ＦｃおよびダミーＦｃを形質移入された細胞からの上清より大幅にシグナルを阻害した細胞培養上清は、それらが陽性であることを確認するためにさらに２回、再試験された。試験の３回目に、試験は２組で実施された。陽性シグナルをもたらしたそれらのｓｃＦｖ−ＦｃまたはダミーＦｃをコードするプラスミドのＦｃコード領域を配列決定した。
【００７８】
下の表１および２は、それぞれ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−およびダミーＦｃコード核酸で突然変異させた列１、２、および３のライブラリから得られたそれらの陽性形質移入体からのデータのみを示す。
【００７９】
【表２】
0005972915.tif 000004
【００８０】
【表３】
0005972915.tif 000005
【００８１】
計算により、ｓｃＦｖ−Ｆｃコード列１、２、および３を合わせたライブラリに、合計約１６４０の異なる変異体が含まれた。ダミーＦｃコード列１、２、および３を合わせたライブラリに、同一の数の変位型が含まれた。試験した変異体の数を考えると、すべての変異体は、試験された形質移入体の間で少なくとも１回提示された可能性があった。しかしながら、３７の異なるｓｃＦｖ−Ｆｃおよび３４の異なるダミーＦｃのみがこの一次スクリーニングにおいて陽性シグナルを生じた。それらの変異体の多くが複数回、回収された。したがって、全体で、本ライブラリに含まれた１６４０の異なる変異体の約２％のみが陽性シグナルをもたらした。
陽性ヒットのコンビナトリアルスクリーニング
【００８２】
ダミーＦｃライブラリの一次スクリーニングで識別された置換のすべて（表２に示される）を、ｓｃＦｖ−Ｆｃライブラリの一次スクリーニングで識別されたすべての置換（表１に示される）と組み合わせ、より効率的にＦｃγＲＩＩＩＡに結合する組み合わせを識別した。したがって、合計３７×３４＝１２５８の組み合わせが試験された。意外にも、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイにおいて、試験された１２５８の組み合わせのうちの以下の２１のみがビオチン−ｈｕＩｇＧ１／ＦｃγＩＩＩＡ相互作用に対して強い競合を示した：（１）ダミーＦｃのＥ２９４ＬおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＥ２９４Ｌ、（２）ダミーＦｃのＥ２９４ＬおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＹ２９６Ｌ、（３）ダミーＦｃのＥ２９４ＬおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＫ２９０Ｇ、（４）ダミーＦｃのＥ２９４ＬおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＫ２９０Ｓ、（５）ダミーＦｃのＥ２９４ＬおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＳ２９８Ａ、（６）ダミーＦｃのＥ２９４ＬおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＴ３０７Ｇ、（７）ダミーＦｃのＴ３０７ＰおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＴ３０７Ｇ、（８）ダミーＦｃのＴ３０７ＰおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＫ２９０Ｇ、（９）ダミーＦｃのＴ３０７ＰおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＹ２９６Ｌ、（１０）ダミーＦｃのＴ３０７ＰおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＫ２９０Ｓ、（１１）ダミーＦｃのＲ２５５ＳおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＳ２９８Ｃ、（１２）ダミーＦｃのＴ３０７ＰおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＳ２９８Ｃ、（１３）ダミーＦｃのＥ２９４ＬおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＳ２９８Ｃ、（１４）ダミーＦｃのＫ３３４ＶおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＫ２９０Ｙ、（１５）ダミーＦｃのＴ３０７ＰおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＬ３０９Ｅ、（１６）ダミーＦｃのＥ２９４ＬおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＬ３０９Ｅ、（１７）ダミーＦｃのＴ３０７ＰおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＬ２３４Ｙ、（１８）ダミーＦｃのＥ２９４ＬおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＬ２３４Ｙ、（１９）ダミーＦｃのＱ３１１ＭおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＹ２９６Ｗ、（２０）ダミーＦｃのＱ３１１ＭおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＬ２３４Ｙ、ならびに（２１）ダミーＦｃのＫ３３４ＶおよびｓｃＦｖ−ＦｃのＹ２９６Ｗ。したがって、試験した非常に少ない数のＦｃ突然変異のみが、ＦｃγＩＩＩＡへの高い相乗的結合を示した。
実施例２：ＩｇＧ形式での組み合わせ変異体の構築および特徴付け
【００８３】
それらのＦｃ領域に置換を含有する全長抗体がＦｃγＲＩＩＩＡにより効率的に結合するように機能するか否かを決定するために、上述の技法を使用して、全長ヒト抗タンパク質Ｘ  ＩｇＧ１抗体において、置換の組み合わせを作製した。Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．Ｍｏｎｔｒｅａｌ  ＣＡ．の分子モデリングプログラムの分子操作環境（ＭＯＥ）を使用して、すべての主なヒット（表１および２を参照）をＦｃ：ＦｃγＲＩＩＩＢ共結晶構造上にマッピングした。タンパク質データバンクコード１Ｔ８３を参照されたい。上記の図１の説明文に記述されるように、この構造にあるＦｃγＲＩＩＩＢの細胞外領域（図１に示される）は、一次アミノ酸配列においてＦｃγＲＩＩＩＡに非常に類似しているため、Ｆｃ：ＦｃγＲＩＩＩＢ共結晶構造からの情報は、Ｆｃ：ＦｃγＲＩＩＩＡ相互作用に関する可能性があると考えられた。一次スクリーニングおよび／またはコンピュータ支援分子モデリングの結果に基づいてさらに操作するために、Ｆｃ：ＦｃγＲＩＩＩＢ相互作用で突然変異を有した候補置換（即ち、（図２に示される列２の位置）が選択された。Ｆｃ：ＦｃγＲＩＩＩＡ相互作用をさらに強化するために、Ｆｃポリペプチドの別の部分のさらなる置換が列２置換に加えられた。具体的には、いずれかのＦｃ鎖のＮ−グリコシル化部位（Ｎ２９７−Ｓ２９８−Ｔ２９９）内および／またはＰ３２９部位付近の置換が、分子モデリングを使用して調査された。それらの両場所（即ち、Ｓ２９８Ｃ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｍ、およびＡ３３０Ｖ）内の置換は、一次スクリーニングで発見された。以下に論じられる分子モデリングに基づいて好ましいと思われる組み合わせが構築され、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合について、およびいくつかの場合において、ＡＤＣＣアッセイにおける活性について試験された。
【００８４】
置換の候補組み合わせにたどり着き、製造可能性問題（例えば、別のアミノ酸をシステインで置換する）を引き起こす可能性がある置換を排除するために、Ｆｃ−ＦｃγＲＩＩＩＢ結晶構造（タンパク質データバンクコード：１Ｔ８３、１Ｔ８９、および１Ｅ４Ｋ）を使用して構造解析を実施し、タンパク質設計用遺伝子アルゴリズム（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ）（ＥＧＡＤ）を使用して、結合エネルギー計算を行った。Ｐｏｋａｌａ，Ｎ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｅｌ，ＴＭ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３４７（１）：２０３−２２７．（２００５）、その関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。ＥＧＡＤは、タンパク質の１つ以上のアミノ酸残基が置換されるとき、タンパク質安定性における変化を予測する計算タンパク質設計アルゴリズムである。
【００８５】
ＥＧＡＤを使用して、ＦｃγＲＩＩＩへのＦｃ結合を改善する可能性があるＳ２９８位、Ａ３２７位、およびＡ３３０位での置換が識別された。これら３つの位置のそれぞれは、コンピュータ内ですべての他の１９のアミノ酸に変更され、Ｆｃ−ＦｃγＲＩＩＩ相互作用の安定性における変化が予測された。上記に報告されたデータにより、ＦｃγＲに良好に結合した突然変異の組み合わせのいくつかを解析するためにも、ＥＧＡＤを使用した。ＥＧＡＤが予測したＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を強化する可能性のある置換の例としては、Ｓ２９８Ｃ、Ｓ２９８Ｉ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｔ、Ａ３２７Ｙ、Ａ３２７Ｗ、Ａ３２７Ｆ、Ａ３２７Ｈ、Ａ３３０Ｈ、Ａ３３０Ｆ、およびＡ３３０Ｍが挙げられる。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイは、Ｓ２９８位およびＡ３３０位での予測された突然変異のいくつかがＦｃγＲへの改善された結合を示したことを確認した。例えば、一方の鎖にＬ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗ突然変異を有し、もう一方の鎖にＳ２９８ＴおよびＫ３３４Ｖ突然変異を有した「Ｗ２３」と示される組み合わせは、このアプローチから得た。
【００８６】
有益な組み合わせが選択され、上述のＰＣＲ法によるＳＯＥを使用して、抗ヒトタンパク質Ｘ  ｈｕＩｇＧ１重鎖をコードするＤＮＡ内に組み込まれた。小規模でＨＥＫ２９３細胞を一過性に形質移入することにより、ヘテロ二量体ｈｕＩｇＧ１を作製した。粗上清を濃縮し、緩衝液を交換した。そのような方式で、多数の置換を有する新しいＦｃ変異体を含有するヘテロ二量体ｈｕＩｇＧ１のパネルを作り出した。
【００８７】
それらの置換された抗体は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイを使用して、様々な濃度で、生体外でＡＤＣＣを媒介するそれらの能力、およびＦｃγＲＩＩＩＡに結合する能力について試験された。図４〜６は、競合物である抗体の濃度の関数として、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）シグナルのパーセント阻害を示す。下の表３および４において、そのようなデータは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）シグナルの最大阻害の半分が達成される抗体の濃度である「ＥＣ５０」として表される。
【００８８】
ＡＤＣＣアッセイは、以下のように実施された。高い（腫瘍細胞系ＳＫＢＲ３）、中程度（腫瘍細胞系ＪＩＭＴ１）、および低い（腫瘍細胞系ＭＣＦ７）タンパク質Ｘ発現を有する細胞系を使用した。それらのタンパク質Ｘ発現標的細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、次いでＶ字型ウェルを備えた９６ウェル微量滴定プレート内に堆積させる前に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｆ／１５８Ｆドナーからの精製したＮＫ細胞をそれぞれのウェルに加えた。ヘテロ二量体ヒト抗タンパク質Ｘ  ＩｇＧ１抗体およびイソ型一致対照抗体を、１：３系列で希釈し、それぞれのウェルに加えた。細胞を、５％ＣＯ２で、３７℃で３．５時間インキュベートした。Ｔ細胞を遠心し、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）で分析する前に、死細胞を染色する染料ＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３ヨウ化物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）と共に１×ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））に再懸濁した。細胞死滅の割合は、死細胞の数（染色されたＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３ヨウ化物）を細胞の合計数（ＣＦＳＥで染色）で割ることによって計算された。
【００８９】
図７〜９は、抗体濃度の関数として、死滅した細胞の割合を示す。そのようなデータから決定されたＥＣ５０を表３に示す。それらのデータは、変異体Ｆｃ領域を含有する抗体の１４すべてが腫瘍細胞の死滅に非常に有効であることを示し、それぞれ、改変されていない抗体または電荷対突然変異のみを含有する抗体のＥＣ５０より非常に低い約１ｐＭのＥＣ５０を有した。表３。さらに、ＡＤＣＣに関する低いＥＣ５０は、一般に、ＦｃγＲＩＩＩＡ結合に関する低いＥＣ５０と相関し、これは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合がこのＡＤＣＣアッセイにおける活性の前提条件であるため、予測された。
【００９０】
【表４】
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【００９１】
【表５】
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【００９２】
Ｆｃ変異体のいくつかの、組み換えヒトおよびマウスＦｃγＲへの結合は、Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ）に取り付けられたマウス抗Ｈｉｓ抗体を使用してＨｉｓタグ付けされたＦｃγＲを捕獲することによる、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）技術を使用して試験された。別個の実験では、１３１位でヒスチジンを有するＦｃγＲＩＩＡ、１５８位でバリンを有するＦｃγＲＩＩＩＡ、および１５８位でフェニルアラニンを有するＦｃγＲＩＩＩＡが試験された。変異体Ｆｃ領域を含有するヒトＩｇＧ１抗体を、Ｆｃγ受容体が係留され、規定の時間の間、Ｆｃγ受容体に会合させ、それから解離させることができるＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５の表面上に注入した。それらのデータは、結合定数、つまり、ｋｏｎ（１／Ｍｓ）、ｋｏｆｆ（１／ｓ）、およびＫＤ（ｎＭ）を決定するために使用され、これらは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（商標）ソフトウェア上の１：１動態結合モデルを使用して、全体的なフィッティングから計算された。一般に、改変されたＦｃ領域を含有する抗体は、ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｆおよび１５８Ｖ対立遺伝子の両方に対して、２桁台前半のｎＭのＫＤ値を有した。
【００９３】
【表６】
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＊「ＮＤ」は、決定されなかったことを意味する。
＃それらの速度のすべては、１回のみ決定されたＭ７５のものを除き、独立して２回決定された。すべての他のサンプルについて示される値は、２つの測定値の平均である。
【００９４】
これらのデータは、電荷対置換を導入しても、試験したＦｃγＲのいずれかに対する結合の平衡解離定数（ＫＤ）に関して検出可能な相違がなかったことを示す。列Ｍ０１から列Ｍ０４を比較。さらに、試験した様々な非対称Ｆｃ改変は、ＦｃγＲＩＩＩＡの両方の対立遺伝子変異体への結合に関して、ＫＤを劇的に減少させた（すべての場合において、１０倍超）が、ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢへの結合に関して、ＫＤに対する作用はほとんど、または全くなかった。したがって、表５に列挙される変異体ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域における置換は、それらのＦｃ領域のＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の結合活性を劇的に増加させた。
実施例３：さらなるＦｃ変異体の競合アッセイ
【００９５】
いくつかのさらなるＦｃ変異体の、ＦｃγＲＩＩＩＡの１５８Ｖおよび１５８Ｌ対立遺伝子変異体への相対結合親和性を決定するために、本質的に実施例１に上述されるように、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）アッセイを実施した。アッセイされた全長ヒト抗タンパク質Ｘ  ＩｇＧ１抗体を、形質移入したＨＥＫ２９３細胞上清から精製した。いくつかの場合において、抗体調製物は、フコースを欠如していた。結果を図１０（ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｆ対立遺伝子変異体）および１１（ＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｖ対立遺伝子変異体）に示す。
【００９６】
それらのデータは、Ｆｃ変異体を含むすべての試験した抗体がＦｃγＲＩＩＩＡへの結合について野生型Ｆｃを含む抗体より効率的にビオチン化ＩｇＧ１と競合したことを示す。例えば、図１０は、ヒト野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｍ０１）が試験した最高濃度（３６０ｎＭ）で約２５％のみＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｆ）に結合するＩｇＧ１を阻害することを示す。ヘテロ二量体化改変（一方のＦｃポリペプチド鎖にＫ３９２Ｄ＋Ｋ４０９Ｄ、およびもう一方の鎖にＥ３５６Ｋ＋Ｄ３９９Ｋ）を含有するＩｇＧ１抗体であるＭ０４は、Ｍ０１よりわずかに効率的なだけであった。Ｍ０１およびＭ０４と比較して、Ｗ１１７、Ｗ１２５、およびアフコシル化野生型ヒトＩｇＧ１は、曲線の左へのシフトにより証明されるように、非常に強く競合した。図１０のＷ１１７、Ｗ１２５、およびＡＦＵＣＯ−Ｍ０１を参照されたい。Ｗ１１７およびＷ１２５のアフコシル化調製物（ＡＦＵＣＯ−Ｗ１１７およびＡＦＵＣＯ−Ｗ１２５）は、それらの２つの調製物が図１０において左端曲線を生成したため、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ１５８Ｆに関して非常に高い親和性を示した。Ｆｃ変異体Ｗ１５７およびＷ１６５は、強い競合も呈した。
【００９７】
ＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｖ）への結合に関して、類似の結果が図１１に示される。Ｍ０１およびＭ０４は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｖ）への結合に関して、弱い競合を呈した。図１０と同様に、ＡＦＵＣＯ−Ｗ１１７およびＡＦＵＣＯ−Ｗ１２５は、最も有効な競合物であり、Ｗ１５７およびＷ１６５が続く。Ｗ１１７およびＡＦＵＣＯ−ＩｇＧ１、続いてＷ１２５は、あまり有効ではないが、それでもＭ０１および  Ｍ０４よりははるかに有効であった。それらのデータは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の相乗的強化がＩｇＧ１ヘテロ二量体変異体の脱フコシル化調製物を使用して達成され得ることを示す。
実施例４：変異体Ｆｃ領域を含有する抗体のＡＤＣＣアッセイ
【００９８】
さらなる変異体Ｆｃ領域を含有する全長ヒト抗タンパク質Ｘ抗体のＡＤＣＣ活性を決定するために、１つが高レベルのタンパク質Ｘ（ＳＫＢＲ３）を発現し、もう一方が中程度レベルのタンパク質Ｘ（ＪＩＭＴ１）を発現する、標的細胞として上述した２つの異なる細胞系を使用して、細胞に基づくＡＤＣＣアッセイを行った。アッセイは、実施例２に記載されるように実施された。図１２および１３は、ＳＫＢＲ３細胞を使用して得られた結果を示す。
【００９９】
対照抗体Ｍ０１（野生型Ｆｃ領域を有する）およびＭ０４（ヘテロ二量体化改変のみを含有するＦｃ領域を有する）は、試験した抗体の最高濃度（２，６６７ｐＭ）で約６０％〜７５％の死滅を呈した。細胞死滅は、Ｍ０１およびＭ０４の低抗体濃度で急激に下がった。しかしながら、Ｗ２３、Ｗ１１７、Ｗ１２５、Ｗ１４１、Ｗ１４４、Ｗ１６５、Ｗ１６８、およびＷ１８７を含む変異体Ｆｃ領域を含有する抗体は、ほとんどの抗体濃度でＭ０１またはＭ０４のいずれかよりも高レベルの細胞死滅を呈した。変異体Ｗ１８７は、このアッセイで最も高い活性を呈し、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに対して最も高い親和性も呈した事実と相関した。表４。変異体Ｗ１１７、Ｗ１２５、Ｗ１６５、およびＷ１６８も、このアッセイで強いＡＤＣＣ活性を誘発した。
【０１００】
図１４は、全長ヒトＩｇＧ１抗タンパク質Ｘ抗体、および中程度レベルのタンパク質Ｘを発現するＪＩＭＴ１細胞を使用して行われたＡＤＣＣアッセイの結果（パーセント特異的細胞溶解）を示す。Ｍ０１抗体（野生型Ｆｃ領域を含有する）は、試験した最高抗体濃度で約６４パーセントのみの細胞溶解を達成し、このアッセイにおけるＭ０１抗体のＥＣ５０は９８ｐＭであった。Ｍ０１抗体の脱フコシル化調製物は、このアッセイで、試験した最高濃度で８６％の特異的細胞溶解を達成し、０．２７４ｐＭのＥＣ５０を有した。Ｆｃ変異体Ｗ１１７を含有する抗体は、Ｍ０１抗体と比較して強化されたＡＤＣＣ死滅を呈し、約８５％の最大特異的溶解に達し、８５．５倍低いＥＣ５０（１．１５ｐＭ）を有した。同一の抗体（ＡＦＵＣＯ−Ｗ１１７）の脱フコシル化調製物は、このアッセイで、さらに高い死滅活性を示し、非常に低いＥＣ５０（０．０１５ｐＭ）を有した。図１４、上側パネル。
【０１０１】
ＡＤＣＣ活性における類似の増加は、フコシル化調製物（ＥＣ５０は３．９９ｐＭ）と比較して、Ｗ１２５変異体Ｆｃ領域を含有する抗体の脱フコシル化調製物（ＥＣ５０は０．０６１ｐＭ）において観察された。図１４、下側パネル。Ｗ１１７またはＷ１２５Ｆｃ領域のいずれかを含有するＩｇＧ１抗体の脱フコシル化変型は両方とも、それらの抗体のフコシル化変型より非常に高い活性を有したため、それらのデータは、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域が脱フコシル化され、ＦｃγＲＩＩＩＡに対するその親和性を増加するアミノ酸変化も含有するとき、ＡＤＣＣ活性において相乗的改善を示す。
実施例５：さらなる変異体Ｆｃ領域を含有する抗体の結合定数
【０１０２】
さらなる変異体Ｆｃ領域を有するいくつかのヒトＩｇＧ１抗体の、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡの１５８Ｖおよび１５８Ｆ対立遺伝子変異体およびマウスＦｃγＲＩＶへの結合会合速度および解離速度は、実施例２に記載されるＢｉａｃｏｒｅ（商標）技術を使用して決定された。簡潔に、ポリヒスチジンでタグ付けされたＦｃγＲは、ＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））上に捕獲された。ヒトＩｇＧ１抗体は、ＦｃγＲが係留され、規定の時間の間、Ｆｃγに会合し、それから解離させることができるＣＭ５チップの表面上に注入された。得られたデータは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（商標）ソフトウェアにより表６に報告される結合定数を決定するために使用された。それらのデータを下の表６に示す。
【０１０３】
【表７】
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＊Ｂ５０変異体Ｆｃ領域は、一方のＦｃポリペプチドに改変Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ、Ｌ２３４Ｉ、Ａ３３０Ｍ、およびＫ３３４Ｖ、もう一方のＦｃポリペプチドにＥ３５６Ｋ、Ｄ３９９Ｋ、Ｌ２３４Ｙ、Ｋ２９０Ｙ、およびＹ２９６Ｗを有する。
【０１０４】
Ｆｃ領域を含有する抗体は、１５８Ｆおよび１５８Ｖ対立遺伝子変異体を含むヒトＦｃγＲＩＩＩＡへの結合に関して、６．４ｎＭ〜１４３ｎＭの範囲のＫＤ値を有した。上記に論じられるＡＤＣＣと組み合わされたそれらのデータは、フコシル化調製物と比較して、ＡＤＣＣアッセイにおいて、Ｗ１２５またはＷ１１７Ｆｃ領域を含有する抗体の脱フコシル化調製物による細胞死滅の増加が、会合速度の増加および解離速度の減少、即ち、ＫＤの減少と相関することを示す。実施例４のデータと統合すると、フコシル化Ｗ１２５抗体と比較して、脱フコシル化のヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｆ）への結合に関する約１０倍のＫＤの減少（１５．０ｎＭと１４３ｎＭを比較）は、実施例４に記載されるＡＤＣＣアッセイのＥＣ５０における約５０倍の減少（０．０６１ｐＭと３．９９ｐＭを比較）と相関した。同様に、Ｗ１１７抗体に関して、脱フコシル化調製物は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｆ）への結合に関してフコシル化調製物より約１１倍低いＫＤ（９．０ｎＭと１０５ｎＭを比較）を有し、実施例４に記載されるＡＤＣＣアッセイにおいて、約１００倍低いＥＣ５０（０．０１５ｐＭと１．１５ｐＭを比較）を有した。したがって、Ｗ１１７およびＷ１２５抗体の脱フコシル化対フコシル化調製物のＡＤＣＣアッセイにおける活性の増加は、それらがＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｆ）への結合親和性の増加に基づく予測を超えたため、相乗的であった。同様に、Ｗ１１７およびＷ１２５の脱フコシル化調製物が実施例４に記載されるＡＤＣＣアッセイにおいてそれらの抗体のフコシル化調製物または野生型Ｆｃ領域を有する抗体の脱フコシル化調製物（Ｍ０１）より非常に高い活性を有した事実は、さらなる相乗的活性の指標であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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