(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の馬尿酸の濃度を測定する方法であって、
（１）生体から採取された生体試料の一定量に、馬尿酸に対する基質特異性が高く、かつメチル馬尿酸に対する比活性が低い酵素であって、該馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解する酵素を作用させて、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解する工程、
（２）（１）の工程で得た反応液に、安息香酸に対する基質特異性が高く、メチル安息香酸に対する比活性が低い酵素を作用させる工程、
（３）（２）の工程で得た反応液中の酵素反応産物の濃度を特定する工程、および
（４）（３）の工程で得た酵素反応産物の濃度から該生体試料中の馬尿酸の濃度を算出する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、馬尿酸の濃度を液状試薬にて測定する方法ならびにキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
馬尿酸はトルエンの尿中代謝物として特殊健康診断での測定項目のひとつになっている。
【０００３】
しかしながら、この測定は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるものであり（例えば、特許文献１および２参照）、測定が煩雑である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６２−２３０７６１号公報
【特許文献２】特開平０６−０４３１５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、より簡便に馬尿酸の濃度を測定するための方法ならびにキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、馬尿酸に対する基質特異性が大きい酵素を用いることによって、より簡便に馬尿酸の濃度を測定できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
本発明は、生体試料中の馬尿酸の濃度を測定する方法を提供し、該方法は、（１）生体から採取された生体試料の一定量に、馬尿酸に対する基質特異性が高く、かつメチル馬尿酸に対する比活性が低い酵素を作用させて、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解する工程、（２）（１）の工程で得た反応液に、安息香酸に対する基質特異性が高い酵素を作用させる工程、（３）（２）の工程で得た反応液中の酵素反応産物の濃度を特定する工程、および（４）（３）の工程で得た酵素反応産物の濃度から該生体試料中の馬尿酸の濃度を算出する工程を含む。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、より簡便に馬尿酸のみの濃度を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】海産性好熱性細菌由来馬尿酸ヒドロラーゼの基質特異性を示すグラフである。
【図２】バークホルデリア・ゼノボランス由来安息香酸−ＣｏＡリガーゼ（Ｂｘｅ）、鉄還元細菌由来安息香酸−ＣｏＡリガーゼ（Ｇｍｅ）の基質特異性を示すグラフである。
【図３】馬尿酸に馬尿酸ヒドロラーゼおよび安息香酸−ＣｏＡリガーゼを作用させる反応系を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、馬尿酸の濃度を液状試薬にて測定する方法ならびにキットに関する。
【００１１】
本発明における「馬尿酸」とは、何も修飾されていない馬尿酸そのものをいい、別名でＮ−ベンゾイルグリシンをいう。馬尿酸は、トルエンの代謝産物である。
【００１２】
本発明における「メチル馬尿酸」とは、馬尿酸のベンゼン環構造のｏ−位、ｍ−位、ｐ−位のいずれか１つがメチル基で修飾されたものをいい、別名でＮ−トルオイルグリシンをいう。メチル馬尿酸は、キシレンの代謝産物である。なお、「メチル馬尿酸」は、馬尿酸の不斉炭素がメチル基で修飾されたもの（Ｎ−ベンゾイルアラニン）の別名としても用いられることがあるが、本発明における「メチル馬尿酸」としては、Ｎ−ベンゾイルアラニンは除外される。
【００１３】
本発明における「安息香酸」とは、何も修飾されていない安息香酸そのものをいう。安息香酸は、馬尿酸の分解産物である。
【００１４】
本発明における「メチル安息香酸」とは、安息香酸のベンゼン環構造のｏ−位、ｍ−位、ｐ−位のいずれか１つがメチル基で修飾されたものをいい、別名でトルイル酸をいう。メチル安息香酸は、メチル馬尿酸の分解産物である。
【００１５】
本発明の生体試料中の馬尿酸の濃度を測定する方法は、（１）生体から採取された生体試料の一定量に、馬尿酸に対する基質特異性が高く、かつメチル馬尿酸に対する比活性が低い酵素を作用させて、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解する工程、（２）（１）の工程で得た反応液に、安息香酸に対する基質特異性が高い酵素を作用させる工程、（３）（２）の工程で得た反応液中の酵素反応産物の濃度を特定する工程、および（４）（３）の工程で得た酵素反応産物の濃度から該生体試料中の馬尿酸の濃度を算出する工程を含む。
【００１６】
（１）生体から採取された生体試料の一定量に、馬尿酸に対する基質特異性が高く、かつメチル馬尿酸に対する比活性が低い酵素を作用させて、馬尿酸を安息香酸とグリシンとに加水分解する工程
生体としては、特に限定されず、例えば、ヒト、動物（イヌ、ネコ、ブタ、ウシなど）が挙げられる。好ましくはヒト、より好ましくは有機溶媒を取り扱うヒトである。本発明の方法は、有機溶媒を取り扱うヒトの特殊健康診断に好適に用いられる。
【００１７】
生体試料としては、特に限定されず、例えば、尿、血液、唾液、骨髄液、細胞間質液が挙げられる。好ましくは尿、より好ましくは有機溶媒を取り扱うヒトの尿である。
【００１８】
「馬尿酸に対する基質特異性が高く、かつメチル馬尿酸に対する比活性が低い酵素」としては、特に限定されないが、好ましくは馬尿酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．３２）である。馬尿酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．３２）は、馬尿酸をほぼ１００％安息香酸とグリシンとに加水分解するが、メチル馬尿酸についてはほとんど加水分解しない。また、馬尿酸のベンゼン環構造のメチル基が付加された位置、すなわちｏ−位、ｍ−位またはｐ−位によって、馬尿酸ヒドロラーゼの加水分解活性が異なる。
【００１９】
馬尿酸ヒドロラーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、微生物から調製されたものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されない。微生物としては、特に限定されず、例えば、海産性好熱性細菌（Rhodothermus marinus）が挙げられる。
【００２０】
馬尿酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．３２）以外にも、アミノアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．１４）、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸デアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．８１）などに遺伝子組換え技術により変異を導入して、「馬尿酸に対する基質特異性が高く、かつメチル馬尿酸に対する比活性が低い酵素」とすることも可能である。
【００２１】
図１は、海産性好熱性細菌由来馬尿酸ヒドロラーゼについて、馬尿酸の分解（安息香酸の生成）を１００％とした場合のメチル馬尿酸の分解（メチル安息香酸酸の生成）（相対活性；％）を示す。ｏ−メチル馬尿酸およびｍ−メチル馬尿酸は約１０％であり、そしてｐ−メチル馬尿酸は約４０％である。
【００２２】
（２）（１）の工程で得た反応液に、安息香酸に対する基質特異性が高い酵素を作用させる工程
「安息香酸に対する基質特異性が高い酵素」としては、特に限定されず、例えば、安息香酸−ＣｏＡリガーゼ（ＥＣ６．２．１．２５）、安息香酸−４−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１３．１２）、安息香酸−１，２−ジオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１２．１０）が挙げられる。
【００２３】
安息香酸−ＣｏＡリガーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、微生物から調製されたものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されない。微生物としては、特に限定されず、例えば、バークホルデリア・ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）、鉄還元細菌（Geobacter metallireducens）が挙げられる。
【００２４】
安息香酸−４−モノオキシゲナーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、微生物から調製されたものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されない。微生物としては、特に限定されず、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属、ロドトルラ(Rhodotorula)属が挙げられる。
【００２５】
安息香酸−１，２−ジオキシゲナーゼとしては、特に限定されず、例えば、市販されているもの、微生物から調製されたものが挙げられる。市販されているものとしては、特に限定されない。微生物としては、特に限定されず、例えば、アシネトバクター(Acinetobacter)属、ロドコッカス(rhodococcus)属が挙げられる。
【００２６】
この工程では、例えば、「安息香酸に対する基質特異性が高い酵素」として安息香酸−ＣｏＡリガーゼを用いた場合、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を添加すると、安息香酸をほぼ１００％ベンゾイルＣｏＡに代謝してアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を生成するが、メチル安息香酸についてはほとんど代謝しない。また、メチル安息香酸のベンゼン環構造のメチル基が付加された位置、すなわちｏ−位、ｍ−位またはｐ−位によって、安息香酸−ＣｏＡリガーゼの代謝活性が異なる。
【００２７】
図２は、バークホルデリア・ゼノボランス由来安息香酸−ＣｏＡリガーゼ（Ｂｘｅ）、鉄還元細菌由来安息香酸−ＣｏＡリガーゼ（Ｇｍｅ）について、安息香酸の代謝を１００％とした場合のメチル安息香酸の代謝（相対活性；％）を示す。ｏ−メチル馬尿酸およびｍ−メチル馬尿酸は１０〜２０％であり、そしてｐ−メチル馬尿酸はほぼ０％である。
【００２８】
上記のように、馬尿酸の分解（安息香酸の生成）を１００％とした場合のメチル馬尿酸の分解（メチル安息香酸の生成）（相対活性；％）は、ｏ−メチル馬尿酸およびｍ−メチル馬尿酸が約１０％であり、そしてｐ−メチル馬尿酸が約４０％であるから（図１）、安息香酸の代謝を１００％とした場合のメチル安息香酸の代謝（相対活性；％）は、ｏ−メチル馬尿酸およびｍ−メチル馬尿酸が１０％×１０〜２０％＝１〜２％であり、そしてｐ−メチル馬尿酸が４０％×１％＝０．４％である。
【００２９】
（３）（２）の工程で得た反応液中の酵素反応産物の濃度を特定する工程
酵素反応産物の濃度を特定する方法としては、特に限定されず、酵素反応産物に応じて適宜公知の方法を採用することができる。好ましくは、液状試薬を用いた方法である。例えば、（２）の工程で、「安息香酸に対する基質特異性が高い酵素」として安息香酸−ＣｏＡリガーゼを用いた場合、酵素反応産物としては、例えば、図３に示すように、代謝産物のＡＭＰが挙げられる。図３の例では、最終的に生成するＮＡＤ＋の濃度を特定することによって、酵素反応産物の濃度を特定することができる。
【００３０】
（４）（３）の工程で得た酵素反応産物の濃度から該生体試料中の馬尿酸の濃度を算出する工程
（３）の工程で得た酵素反応産物の濃度は、馬尿酸のみの濃度に関連する。
【００３１】
本発明はまた、上記方法を実施するためのキットを含む。キットは、上記種々の酵素と酵素反応に必要な試薬とを含む。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００３３】
（実施例１）
表１に記載の処方により試薬Ｒ１およびＲ２を準備する。ヒトから採取した尿の一定量に、試薬Ｒ１を表１に記載のＳ／Ｒ比に従って添加し、十分反応させた後、試薬Ｒ２を表１に記載のＳ／Ｒ比に従って添加する。
【００３４】
【表１】
0005862374.tif 000002
【００３５】
上記で求まる上記尿中のＮＡＤＰ＋の濃度から上記尿中の馬尿酸の濃度を算出する。
【００３６】
（実施例２）
表２に記載の処方により試薬Ｒ１およびＲ２を準備する。ヒトから採取した尿の一定量に、試薬Ｒ１を表２に記載のＳ／Ｒ比に従って添加し、十分反応させた後、試薬Ｒ２を表２に記載のＳ／Ｒ比に従って添加する。
【００３７】
【表２】
0005862374.tif 000003
【００３８】
上記で求まる上記尿中のＮＡＤ＋の濃度から上記尿中の馬尿酸の濃度を算出する。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、特殊健康診断の分野において利用され得る。
【図１】
0005862374.tif 000004
【図２】
0005862374.tif 000005
【図３】
0005862374.tif 000006