(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤松根のエタノール抽出物を有効成分として含む皮膚老化の防止用の皮膚外用剤組成物。
【請求項２】
上記組成物は、紫外線照射による細胞膜損傷の保護用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項３】
上記組成物は、ＨＳＰ７０タンパク質の生成を促進する細胞の保護用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項４】
上記組成物は、紫外線照射によるＭＭＰ−２の生合成の抑制用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項５】
上記組成物は、損傷されたＤＮＡを回復させるＳＩＲＴ１遺伝子、及び核膜の構造を維持するＬＭＮＡ１遺伝子の発現の誘導用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項６】
上記組成物は、皮膚しわの改善用であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分として松根抽出物を含有する皮膚外用剤組成物に関する。より詳細には、本発明による皮膚外用剤組成物は、有効成分として松根抽出物を含有し、優れた自由ラジカル消去、紫外線照射による細胞膜損傷保護、紫外線照射による活性酸素種生成抑制、紫外線照射によるスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ：superoxide dismutase）及びカタラーゼ（catalase）発現減少の回復、ＨＳＰ７０生成促進を用いた細胞保護、紫外線照射によるＭＭＰ−２生合成抑制、ＤＮＡ損傷を回復させるＳＩＲＴ１遺伝子発現誘導及び核膜の構造を維持するＬＭＮＡ１遺伝子発現誘導などの効果を示す窮極的に皮膚の老化を防止する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚組職には、皮膚を保護するための多様な抗酸化体系と保護因子、例えば、熱衝撃タンパク質（ＨＳＰ：heat shock protein）などを構築しているが、内因性老化や光老化によって発生する活性減少に起因して皮膚細胞の損傷が生じ、皮膚組職を分解する酵素である基質蛋白分解酵素（ＭＭＰｓ：matrix metalloproteinases)の生合成が増加し、コラーゲンの生合成が減少し、シワが生じ、弾力が減少し、皮膚の老化を誘導するものと知られている。また、老化に起因してＤＮＡ損傷と核膜の構造が崩れるが、損傷されたＤＮＡを回復、核膜の構造を維持させることは、老化防止に重要な要素である。したがって、皮膚細胞を保護することができる抗酸化物質、皮膚を構成する基質物質であるコラーゲンを分解するＭＭＰｓ生合成を抑制することができる物質、皮膚細胞の損傷を防止する物質、細胞内ＤＮＡ損傷回復タンパク質及び核膜構造維持構造タンパク質などの生成を誘導する物質が皮膚老化を緩和させるものと明らかにされている。
【０００３】
このような皮膚老化を緩和させる物質のうち、皮膚老化現象を漢方原料を利用して予防または解決するために、機能性漢方素材の研究開発が絶えず行われている。漢方皮膚美容において最大の特徴は、人体を全体的な観点から見て皮膚老化を起こす原因を把握し、全身的な症状を改善するだけでなく、皮膚問題を起こす原因を根本的に改善し、再発を防止する根本的な治療に重点を置いている。
【０００４】
昔から松は、無病長寿して神仙になるようにすると言われ、韓国民族の節義と忍耐などを象徴する。松（Pinus densiflora Sieb. et Zucc.）の別名は、赤松であって、部位ごとに異なる効能をもって病症に使用して来た。
【０００５】
赤松は、枝と幹の節を松節、幼い根または根白皮を松根、幼い枝または幼い枝の先端を松筆頭、葉を松葉、花粉を松花粉、丸い実を松球、樹皮を松木皮などと異なる名前で呼びながら薬用する。
【０００６】
それらのうち、特に根は、春期に収穫して乾かして使用してきたが、漢方医学的には、味が苦くて、性質が暖かくて、毒がないと知られている。効能成分としては、α−ピネン７５％、カンフェン、ジペンテン、α−テルピネオール、カンファー及びｐ−メンタノールなどがある。
【０００７】
漢方医学的には、五労（五臓の疲れ）を保養し、打撲によるあざや疼痛、筋骨痛、吐血、虫歯痛を治療するのに使用してきた。しかし、皮膚老化と関連した体系的な研究はなされていない実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、有効成分として漢方生薬成分のうち赤松根のエタノール抽出物を含有し、優れた皮膚老化防止効果を示す皮膚外用剤組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明による皮膚外用剤組成物は、赤松根のエタノール抽出物を含む。
【００１０】
また、本発明による皮膚外用剤組成物は、皮膚老化防止用であることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明による皮膚外用剤組成物は、紫外線照射による細胞膜損傷保護用であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明による上記皮膚外用剤組成物は、ＨＳＰ７０タンパク質の生成を促進する細胞保護用であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明による上記皮膚外用剤組成物は、紫外線照射によるＭＭＰ−２の生合成抑制用であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明による上記皮膚外用剤組成物は、ＤＮＡ損傷を回復させるＳＩＲＴ１遺伝子の発現を誘導し、核膜の構造を維持するＬＭＮＡ１遺伝子の発現を誘導することを特徴とする。
【００１５】
また、本発明による上記皮膚外用剤組成物は、皮膚しわ改善用であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の皮膚老化防止用皮膚外用剤組成物は、松根抽出物を含有し、紫外線照射による光老化を抑制する効能があり、細胞で過度な内因性または外因性ストレスに抵抗するための調節物質を分泌させて、以後に発生し得る細胞損傷をあらかじめ防止することができる効果を示すだけでなく、皮膚抗老化指標であるＭＭＰｓ活性抑制効果に優れている。また、ＤＮＡ損傷を回復させるＳＩＲＴ１遺伝子発現を誘導し、核膜の構造を維持するＬＭＮＡ１遺伝子発現を誘導する効果に優れている。したがって、本発明による松根抽出物が含有された皮膚外用剤組成物は、皮膚のしわを緩和させて皮膚の老化を抑制した。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明による松根抽出物（赤松根）がＳＯＤ及びカタラーゼタンパク質の発現に及ぼす効能を示す。
【図２】図２は、本発明による松根抽出物（赤松根）がＨＳＰ７０タンパク質の発現に及ぼす効能を示す。
【図３】図３は、本発明による松根抽出物（赤松根）がＳＩＲＴ１遺伝子及びＬＭＮＡ１遺伝子の発現に及ぼす効能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明において使用される赤松は、マツ科松（pinus densiflora Siebold et Zuccarini）であって、味は、苦いものの、性質は暖かくて且つ毒がなく、昔から心経と脾経に作用し、風湿滄、頑癬、疳滄、大風癩滄及び歴節滄などの症状治療に使用されて来た。
【００２０】
本発明に使用された松根抽出物は、上記赤松の根部分をエタノール水溶液などの溶媒に入れ、当業界によく知られた通常的な方法で抽出するか、または松根の樹液を直接使用することもできる。
【００２１】
本発明の皮膚外用剤組成物は、上記松根抽出物を組成物の全体重量に対して０．００１〜９９重量％で含有することができる。
【００２２】
本発明による皮膚外用剤組成物は、化粧品学及び皮膚科学的に許容可能な媒質及び／または基剤を含有する。これは、局所適用に適したすべての剤形、例えば、溶液、ゲル、固体または混練無水生成物、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球またはイオン型（リポソーム）及び／または非イオン型の小胞分散剤、クリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレー及びコンシールスティックの形態で提供されることができる。これらの組成物は、当該分野における通常の方法によって製造されることができる。また、本発明による皮膚外用剤組成物は、フォームの形態、または圧縮された推進剤をさらに含有するエアロゾール組成物の形態で使用されることができる。
【００２３】
本発明による皮膚外用剤組成物は、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型もしくは非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性もしくは親油性活性剤、脂質小胞、または化粧品に通常的に使用される任意の他の成分のような化粧品学または皮膚科学分野において通常的に使用される補助剤などを含有することができる。これらの補助剤は、化粧品学または皮膚科学分野において一般的に使用される含量で導入される。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明の内容を実施例及び試験例によりさらに具体的に説明する。これらの実施例は、本発明の内容を理解するために提示されるものに過ぎず、本発明の権利範囲がこれらの実施例に限定されるものではなく、当業界において通常的に知られた変形、置換及び挿入などを行うことができ、これに関するものも本発明の範囲に含まれる。
【００２５】
［実施例１］松根（赤松根）抽出物の製造
松根１ｋｇを収去し、８０％エタノール水溶液５Ｌを入れ、３回還流抽出した後、１５℃で１日間浸漬した。その後、濾過布を利用した濾過と遠心分離を通じて残渣と濾過液を分離し、分離した濾過液を減圧濃縮し、松根抽出物１７３ｇを得た。
【００２６】
［比較例１］赤松葉抽出物の製造
赤松葉１ｋｇを収去し、８０％エタノール水溶液０．５Ｌを入て、３回還流抽出した後、１５℃で１日間浸漬した。その後、濾過布を利用した濾過と遠心分離を通じて残渣と濾過液を分離し、分離した濾過液を減圧濃縮し、赤松葉抽出物０．１ｇを得た。
【００２７】
［試験例１］自由ラジカル消去活性測定
抗酸化力を測定するために使用された方法は、１,１−ジフェニル−２−ピクリル−ヒドラジル（1,1-diphenyl-2-pycryl-hydrazyl）（ＤＰＰＨ）法で上記実施例１及び比較例１の抽出物を各々エタノールに濃度別（０、５０、１００、２００、３００、４００μｇ／ｍＬ）に希釈し、１０μＬずつ９６ウェルプレートに入れ、５ｍＭエタノール溶液で製造されたＤＰＰＨを全体体積が２００μＬとなるように注入し、３７℃で３０分間放置した後、５２０ｎｍ  ＥＬＩＳＡ読み取り機（ＤＩ  ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｋｏｒｅａ）で吸光度を測定し、自由ラジカル消去活性を下記数式１によって判定した。この際、陽性対照群として、抗酸化力に優れていると広く知られたビタミンＣを使用し、その結果を下記表１に示した。
【００２８】
【数１】
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【００２９】
【表１】
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【００３０】
上記表１の結果から、本発明による実施例１の松根（赤松根）抽出物が比較例１の赤松葉抽出物より優れたラジカル消去活性を示し、濃度が高くなるほど強力な抗酸化剤として知られたビタミンＣと同等の水準のラジカル消去活性を示した。
【００３１】
［試験例２］細胞膜損傷保護測定
９６ウェルプレートの各ウェルにドイツ癌研究センター（German Cancer Research Center、Heidelberg、、Germany）から分譲されたヒト角質細胞（human keratinocytes）ＨａＣａＴ細胞株（cell line）を１×１０5ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞を１００μＬずつ入れ、３７℃、５％ＣＯ2培養器で２４時間培養して付着した。培養後、上記実施例１及び比較例１の抽出物を各々０．６２５、１．２５、２．５及び５μｇ／ｍＬ濃度で含ませた培養液に交替し、３時間培養した後、培養液を除去し、各ウェルに５０μＬのリン酸緩衝塩液を入れた。紫外線Ｂランプを利用して紫外線３０ｍＪ／ｃｍ2を照射した後、リン酸緩衝塩液を除去した。各ウェルに上記濃度の抽出物が含まれた細胞培養液２００μＬを添加し、２４時間培養した。２４時間後、培養上層液を適当量取り、細胞損傷の指標酵素である乳酸脱水素化酵素（ＬＤＨ）の量を非放射性細胞毒性分析キット（ｃｙｔｏｔｏｘ  ９６  ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）を利用して測定し、６回繰り返し測定した後、平均値を下記表２に示した。この際、対照群は、実施例１または比較例１の抽出物を処理しない実験群である。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
上記表２の結果から、実施例１の松根抽出物を濃度別に処理し、紫外線Ｂを照射した群では、紫外線Ｂの照射によるＬＤＨの細胞培養培地での活性増加が濃度依存的に減少し、同量の赤松葉抽出物（比較例１）を処理した群と比較しても、その効果が有意的に優れている。特に、５μｇ／ｍＬの松根抽出物を処理した場合、紫外線Ｂを照射しない対照群水準にＬＤＨを抑制することを観察することができた。このような結果から、本発明による実施例１の松根抽出物が紫外線Ｂの照射によるＨａＣａＴ細胞の細胞膜損傷を効果的に抑制することを確認することができた。
【００３４】
［試験例３］活性酸素種生成抑制測定
蛍光測定用９６ウェルブラックプレート（black plate）の各ウェルに２．０×１０5ｃｅｌｌ／ｍＬのヒト角質細胞ＨａＣａＴを１００μＬで分注し、３７℃、５％ＣＯ2培養器で２４時間培養した後、上記実施例１及び比較例１の抽出物を各々処理した。上記抽出物の濃度は、０．６２５、１．２５、２．５及び５μｇ／ｍＬにした。試験試料を入れて２４時間培養した後、ＨＣＳＳ（HEPES-buffered control salt solution）で洗浄し、残留の培地を除去し、ＨＣＳＳに２０μＭで用意した２’,７’−ジクロロジヒドロ−フルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ−ＤＡ：dichlorodihydro-fluorescein diacetate）を１００μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ2培養器で２０分間培養し、さらにＨＣＳＳで洗浄した。その後、各抽出物の濃度別に処理されたＨＣＳＳを１００μＬ加えた後、紫外線Ｂ（３０ｍＪ／ｃｍ2）を照射し、３時間後、蛍光分析機（fluorometer）（Ｅｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５３０ｎｍ）で蛍光強度を測定し、その結果を下記表３に示した。測定結果は、６回繰り返し測定した後、平均値を示し、対照群は、実施例１または比較例１の抽出物を処理しない実験群である。
【００３５】
【表３】
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【００３６】
上記表３の結果から、紫外線照射３時間経過後、紫外線を照射しない対照群に比べて紫外線Ｂを照射した群で細胞内活性酸素種が１８２．１％増加する現象を示した。このような増加は、実施例１の松根抽出物を濃度別に処理した場合、濃度に依存的に活性酸素種生成が抑制された。これにより、本発明による実施例１の松根抽出物が紫外線照射による細胞内活性酸素種の生成を抑制することを確認することができ、比較例１の赤松葉と比較しても、その効果に優れている。
【００３７】
［試験例４］スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ：Superoxide dismutase）及びカタラーゼ（catalase）発現減少回復測定
６ウェルプレートに１×１０5ｃｅｌｌ／ｍＬのヒト角質細胞ＨａＣａＴ細胞を２ｍＬずつ入れ、３７℃、５％ＣＯ2培養器で２４時間培養した後、上記実施例１及び比較例１の抽出物を各々５μｇ／ｍＬの濃度で処理し、２４時間培養した後、リン酸緩衝塩液で洗浄し、残留の培地を除去し、５０μＬのリン酸緩衝塩液を入れ、紫外線Ｂを照射した後、リン酸緩衝塩液を除去し、各抽出物を処理し、４８時間培養した。４８時間培養した後、細胞を補集し、細胞破砕液［Lysis buffer：２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１％ＮＰ−４０、０．１Ｍ  ＰＭＳＦ、１Ｍ  ＤＴＴ、プロテアーゼ抑制剤カクテル（protease inhibitor cocktail）、蒸留水（ＤＷ）］で４℃で破砕した後、ＢＣＡ溶液で蛋白質量を定量化した。同量で合わせたタンパク質と各抽出物緩衝溶液を混合して試料を作った後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：sodium dodesyl sulfate）ポリアクリルアミドゲル（polyacrylamide gel）電気泳動で分離した。ウェスタンブロッティング（Western blot analysis）のために、分離したタンパク質を含有するアクリルアミドゲル（acrylamide gel）をニトロセルローズ膜（nitrocellulose membrane）に電気ブロッティング（electroblotting）によって転移させた後、５％脱脂乳（skim milk）を含有するＴＢＳ−Ｔ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｉｎ  ＴＢＳ）で２回洗浄した。洗浄後、ＳＯＤとカタラーゼ１次抗体（１：２０００）を各々処理し、４℃で１２時間放置した後、１次抗体に対応する２次抗体（１：２０００）を使用して常温で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、化学発光（ＥＣＬ：enhanced chemiluminescence）溶液を適用させた後、暗室でＸ線フィルムに感光させて、ＳＯＤ及びカタラーゼタンパク質の発現様相を比較分析した。タンパク質が同量転移されたことを確認するために、１次抗体としてアクチン（actin）を使用して上記過程を繰り返して分析し、その結果を図１に示した。
【００３８】
図１で、ＨａＣａＴ細胞に紫外線Ｂを照射し、４８時間後、ＳＯＤ及びカタラーゼ（catalase）のタンパク質発現を観察した結果、ＳＯＤ及びカタラーゼの発現が顕著に減少することが分かり、実施例１の松根抽出物（赤松根）５μｇ／ｍＬを処理した時、紫外線による抗酸化酵素発現減少を効果的に抑制させ、比較例１の赤松葉と比較しても、その効果に優れている。この結果から、本発明による松根抽出物は、それ自体で抗酸化効能を有するだけでなく、内部または外部で誘発される酸化的ストレスに対して細胞内に保有している抗酸化酵素システム損傷に対する保護効果に優れているので、窮極的に皮膚細胞を保護する機能があると判断することができた。
【００３９】
［試験例５］細胞保護測定
ストレスに反応して誘導されるタンパク質であるＨＳＰ７０は、様々なストレスに対抗して細胞と個体を保護し、細胞死を防止すると知られている。また、あらかじめ過発現されているＨＳＰ７０タンパク質は、細胞をストレスや各種毒性から保護すると知られている。ＨＳＰ７０生成促進を用いた細胞保護測定をするために、６ウェルプレートに１×１０5ｃｅｌｌ／ｍＬの正常線維芽細胞（normal fibroblast）を２ｍＬずつ入れ、３７℃、５％ＣＯ2培養器で２４時間培養し、細胞を付着させた後、実施例１及び比較例１の抽出物を各々１μｇ／ｍＬずつ処理し、２４時間培養した後、細胞を補集し、細胞破砕液で４℃で破砕した後、ＢＣＡ溶液で蛋白質量を定量した。同量で合わせたタンパク質と各抽出物緩衝溶液を混合して試料を作った後、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。ウェスタンブロット分析のために、分離したタンパク質を含有するアクリルアミドゲルをニトロセルロース膜に電気ブロッティングによって転移させた後、Ｐｏｎｃｅｕｓ Ｓ溶液で染色し、同量転移されたことを確認した。タンパク質が転移された膜を５％脱脂乳を含有するＴＢＳ−Ｔ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｉｎ  ＴＢＳ）で常温で１時間培養し、非特異的なタンパク質に対するブロッキング（blocking）を行い、ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄した。洗浄後、ＨＳＰ７０ １次抗体（１：１０００）を処理し、４℃で一晩放置した後、１次抗体に対応する２次抗体（１：２０００）を使用して常温で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、化学発光溶液を適用させた後、暗室でＸ線フィルムに感光させて、ＨＳＰ７０タンパク質の発現様相を比較分析し、その結果を図２に示した。
【００４０】
図２の結果から、実施例１の松根抽出物を１μｇ／ｍＬ処理時、ＨＳＰ７０タンパク質生成が多く誘導され、処理濃度に依存的にＨＳＰ７０タンパク質生成が誘導されることが分かった。したがって、本発明による松根抽出物（赤松根）は、ＨＳＰ７０タンパク質を一定の水準以上に発現させて、以後に与えられるストレスに対して細胞保護効果を示すことができると判断することができ、比較例１の赤松葉と比較しても、その効果に優れていた。
【００４１】
［試験例６］ＭＭＰ−２生合成抑制測定
培養した皮膚細胞及び人体皮膚に紫外線を照射する場合、各種基質蛋白分解酵素（ＭＭＰｓ）の発現が増加し、増加したＭＭＰｓが皮膚を構成している膠原質を分解し、皮膚しわを形成するという仮説によって、老化した細胞の老化程度を評価する方法で、且つ老化した皮膚の欠乏された膠原質量を増加させる方法で、紫外線によってＥＣＭ損傷抑制に対する松根抽出物の効果を調べるために、６ウェルプレートに１×１０5ｃｅｌｌ／ｍＬの正常線維芽細胞を２ｍＬずつ入れ、３７℃、５％ＣＯ2培養器で２４時間培養し、細胞を付着させた後、上記実施例１及び比較例１の抽出物を０．２５、０．５及び１μｇ／ｍＬで処理した。その後、上記試験例５の方法と同様に、紫外線Ｂ  ３０ｍＪ／ｃｍ2を照射した後、松根抽出物を処理し、２４時間培養した。培養後、細胞培養液を収去し、細胞培養液と松根抽出物緩衝溶液を混合して試料を作った後、ゼラチンを含有するザイモグラムゲル（zymogram gel)に導入した後、電気泳動で分離した。ＭＭＰ−２確認のために、分離したタンパク質を含むザイモグラムゲルを試薬社の使用法によって再生緩衝溶液（renaturing buffer；２．７％トリトンＸ−１００）で室温で３０分間培養し、現像緩衝溶液（developing buffer）［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ｂａｓｅ、４０ｍＭ  ６Ｎ  ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ2・Ｈ2Ｏ、ＢｒｉＪ  ３５  ０．０２％］で室温に１時間培養した後、新しい現像緩衝溶液に交替し、３７℃で一晩反応させた。反応済みのゲルは、染色し、その生合成程度を比較した。サンプル間に差異がないことを確認するために、細胞を補集し、細胞破砕液で４℃で破砕した後、ニトロセルロース膜に電気ブロッティングによって転移させた後、Ｐｏｎｃｅｕｓ  Ｓ溶液で染色し、同量転移されたことを確認し、その結果を下記表４に示した。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
上記表４の結果から、実施例１の松根抽出物を１μｇ／ｍＬ処理時、ＭＭＰ−２生合成が抑制され、処理濃度に依存的に抑制されていることが確認され、比較例１の赤松葉と比較しても、その効果に優れていたた。これから、松根抽出物は、紫外線による細胞のＭＭＰ−２生合成促進とＥＣＭ損傷を抑制し、皮膚老化症状であるしわ発生を遮断することができると考えられる。
【００４４】
［試験例７］ＳＩＲＴ１とＬＭＮＡ１遺伝子の発現誘導効果
ヒト角質形成細胞であるＨａＣａＴ細胞は、韓国細胞株銀行（Korean Cell Line Bank；韓国ソウル所在）から分譲されて使用した。ＨａＣａＴ細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを含むＤＭＥＭ培地に注入し、３７℃、５％ＣＯ2供給条件を備えた動物細胞培養器で培養した。ウェル当たり１．５×１０6濃度で用意したＨａＣａＴ細胞を、ＦＢＳが含まれていない培地で３時間適応させた。その後、実施例１及び比較例１の抽出物を各々１０ｐｐｍ濃度で処理し、２４時間培養した。全体ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌTM（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、米国メリーランド所在）を使用して抽出し、−８０℃で保管した。全体ＲＮＡ  １ｇを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１Ｍ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ及び４０ユニット／Ｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤が含有された逆転写反応緩衝液２５Ｌに入れ、０．５ｇ／Ｌオリゴ（ｄＴ）16のプライマーと２００ユニットスーパースクリプトＩＩ［ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ、ＧｉｂｏＢＲＬ］の逆転写重合酵素を添加し、４２℃で１時間反応させた後、逆転写反応溶液２．５Ｌをアムプリテック（ＡｍｐｌｉＴａｑ）ＤＮＡ重合酵素［０．０４Ｕ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、米国コネティカット州シェルタン所在）］、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．３）、０．２５ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓが含有されたＰＣＲ反応緩衝液５０Ｌに混合し、１０Ｍのプライマーを添加し、９４℃で３０秒間変性、５３℃で３０秒間アーニル及び７２℃で１分間伸長するサイクルを３０回行った。１％アガロースゲルで電気泳動した後、イメージを獲得した。各々のプライマーは、ＳＣＩ級論文に基づいて製作し、各々のプライマー配列を下記表５に示した。
【００４５】
【表５】
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【００４６】
上記結果を図３に示した。図３の結果から、実施例１の松根抽出物を１μｇ／ｍＬ処理時、老化に起因して損傷されたＤＮＡ損傷を回復させるＳＩＲＴ１遺伝子及びＤＮＡの保護壁である核膜の構造を維持するＬＭＮＡ１遺伝子の発現が誘導されることが分かり、比較例１の赤松葉と比較しても、その効果に優れていた。したがって、本発明による松根抽出物がＳＩＲＴ１及びＬＭＮＡ１遺伝子の発現を誘導することによって、老化に起因して損傷されたＤＮＡ損傷を回復し、ＤＮＡの保護壁である核膜の構造を維持する効果を示すことができると判断することができた。
【００４７】
［剤形例１〜３及び比較剤形例１〜２］
下記表６の組成で剤形例１〜３及び比較剤形例１〜２のクリームを製造した。製造方法は、各々の油相と水相は、７０℃で完全溶解させ、７，０００ｒｐｍで５分間乳化させ、クリームを製造した（単位：重量％）。
【００４８】
【表６】
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【００４９】
［試験例８］皮膚小じわ改善効果
上記剤形例２〜３と比較剤形例１〜２の皮膚小じわ改善効果をヒトを対象として評価した。
実験者（３０〜５０才女性）２５名を対象として顔の右側部位に剤形例２で製造したクリームを、顔の左側部位に比較剤形例２で製造したクリームを各々１日２回ずつ連続６週間塗布した。また。他の実験者（３０〜５０才女性）２５名を対象として顔の右側部位に剤形例３で製造したクリームを、顔の左側部位に比較剤形例１で製造したクリームを各々１日２回ずつ連続６週間塗布した。６週後、皮膚小じわ緩和効果は、製品使用前と６週間使用後、目尻周囲のしわをシリコン樹脂複製物（レプルリカ）で採取し、これを皮膚微細しわ装置と皮膚映像分析機を使用して目尻のしわ状態を比較した。その結果を下記表７に示した。
【００５０】
【表７】
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【００５１】
上記表７の結果から、本発明による松根抽出物が含有された剤形例２及び剤形例３のクリームを使用した場合、実験者の目尻の皮膚で皮膚しわ改善効果が比較剤形例１、２より優れていることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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