(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
GLP-1(7-37)(配列番号1)の31位に相当する位置におけるヒスチジン残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に相当する位置におけるグルタミン残基及びGLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記ヒスチジン残基がH31で示され、前記グルタミン残基がQ34で示されるGLP-1アナログ、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
【請求項２】
前記アナログのリジン残基に付着したアルブミン結合部分を含む誘導体、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、請求項1に記載のGLP-1アナログ。
【請求項３】
前記アルブミン結合部分が、化学式1、化学式2、化学式3及び化学式4：
化学式1:    CH3-(CH2)x-CO-*
化学式2:    HOOC-(CH2)x-CO-*
化学式3:    HN4C -(CH2)x-CO-*
化学式4:    HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、xは6〜18の範囲の整数であり、yは3〜17の範囲の整数である)から選択される持続時間延長性部分を含む、請求項2に記載のGLP-1アナログ。
【請求項４】
前記アルブミン結合部分が、化学式5、化学式6、化学式7、化学式8、化学式9及び化学式10：
化学式5:    *-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)k-O-(CH2)n-CO-*
化学式6:    *-NH-C(COOH)-(CH2)2-CO-*
化学式7:    *-N-C((CH2)2COOH)-CO-*
化学式8:    *-NH-C6H8-CO-*
化学式9:    *-NC5H8-CO-*
化学式10:    *-NH-SO2-(CH2)3-CO-*
(式中、kは1〜5の範囲の整数であり、nは1〜5の範囲の整数である)から選択されるリンカーをさらに含む、請求項3に記載のGLP-1アナログ。
【請求項５】
[Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)ペプチド；
【化１】
0006006118.tif 000092
；Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化２】
0006006118.tif 000093
；[Aib8,Glu30,His31,Gln34,Lys36]GLP-1(7-37)イル-Glu38-ペプチドアミド；
【化３】
0006006118.tif 000094
；Nε12-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化４】
0006006118.tif 000095
；Nε12-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys12,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化５】
0006006118.tif 000096
；Nε12-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化６】
0006006118.tif 000097
；Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][His31,Gln34]GLP-1-(7-37)-ペプチド；
【化７】
0006006118.tif 000098
；Nε18-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys18,Glu22,Arg26,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化８】
0006006118.tif 000099
；Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}[Gly8, His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化９】
0006006118.tif 000100
；Nε26[(S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]-エトキシ}アセチルアミノ)ブチリル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化１０】
0006006118.tif 000101
；Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][D-Ala8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化１１】
0006006118.tif 000102
；N83H-イミダゾル-4-イル-アセチル,Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][His31,Gln34]GLP-1(8-37)-ペプチド；
【化１２】
0006006118.tif 000103
；Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Ser8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化１３】
0006006118.tif 000104
；Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化１４】
0006006118.tif 000105
；Nε27-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}-(Aib8,Arg26,Lys27,His31,Gln34)GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化１５】
0006006118.tif 000106
；Nε26-[2-(2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化１６】
0006006118.tif 000107
；Nε26[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)ペプチド；
【化１７】
0006006118.tif 000108
；N9-{2-[2-(1H-イミダゾル-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][His31,Gln34]GLP-1(9-37)ペプチド；
【化１８】
0006006118.tif 000109
；Nε26[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)ペプチド；
【化１９】
0006006118.tif 000110
；Nε27-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}-(Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,His31,Gln34)GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化２０】
0006006118.tif 000111
；[Imp7,Glu22,Arg26,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；
【化２１】
0006006118.tif 000112
；Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Imp7,Glu22,Arg26,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化２２】
0006006118.tif 000113
；Nε36-[2-[2-[2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu30,His31,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Gluアミド；
【化２３】
0006006118.tif 000114
；Nα([Aib8,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル)-リジン；
【化２４】
0006006118.tif 000115
；[Aib8,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；
【化２５】
0006006118.tif 000116
；Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル], Nε37-[(4S)-4-カルボキシ-4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル]-[Aib8,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化２６】
0006006118.tif 000117
；Nε12-12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化２７】
0006006118.tif 000118
；Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]- Nε37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化２８】
0006006118.tif 000119
；Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル], Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド；
【化２９】
0006006118.tif 000120
；Nε26-2,3-bis[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]プロパノイル-[Aib8,His31,Gln34]-GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化３０】
0006006118.tif 000121
；Nε18-18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys18,Glu22,His26,His31,Gln34]-GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化３１】
0006006118.tif 000122
；Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,His31,Gln34,Pro37]-GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化３２】
0006006118.tif 000123
；Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34]-GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化３３】
0006006118.tif 000124
；Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル], Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化３４】
0006006118.tif 000125
；Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル], Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化３５】
0006006118.tif 000126
；Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル], Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化３６】
0006006118.tif 000127
；Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル], Nε37-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド；
【化３７】
0006006118.tif 000128
；Nε26-4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイル-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；
【化３８】
0006006118.tif 000129
；N8-メチル, Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；
【化３９】
0006006118.tif 000130
；Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；
【化４０】
0006006118.tif 000131
；Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu22,Lys24,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；
【化４１】
0006006118.tif 000132
；Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Ile25,Arg26,Lys27,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；
【化４２】
0006006118.tif 000133
；Nε16-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys16,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；
【化４３】
0006006118.tif 000134
；Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；
【化４４】
0006006118.tif 000135
；Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；
【化４５】
0006006118.tif 000136
；Nε12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；
【化４６】
0006006118.tif 000137
；及び；Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[ Glu22,Lys24,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド；
【化４７】
0006006118.tif 000138
から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載のGLP-1アナログ若しくはその誘導体、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
【請求項６】
請求項1から5のいずれか一項に記載のアナログ又はその誘導体を含む、薬剤。
【請求項７】
全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群からなる群から選択される関連疾患の治療及び/若しくは予防のための、並びに/又は脂質異常症の予防及び/若しくは治療、総血清脂質の低下、HDLの低下、小型高密度LDLの低下、VLDLの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、HDLの上昇、ヒトにおける血漿リポタンパク質a(Lp(a))レベルの低下、in vitro及び/若しくはin vivoでのアポリポタンパク質a(apo(a))の生成阻害のための、β細胞のアポトーシスの減少、β細胞の機能及び/若しくはβ細胞の質量の増加のための、並びに/又はβ細胞のグルコース感受性を回復させるための、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための、請求項1から5のいずれか一項に記載のアナログ又はその誘導体を含む、薬剤。
【請求項８】
全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群からなる群から選択される関連疾患の治療及び/若しくは予防のための、並びに/又は脂質異常症の予防及び/若しくは治療、総血清脂質の低下、HDLの低下、小型高密度LDLの低下、VLDLの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、HDLの上昇、ヒトにおける血漿リポタンパク質a(Lp(a))レベルの低下、in vitro及び/若しくはin vivoでのアポリポタンパク質a(apo(a))の生成阻害のための、β細胞のアポトーシスの減少、β細胞の機能及び/若しくはβ細胞の質量の増加のための、並びに/又はβ細胞のグルコース感受性を回復させるための、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための薬剤の製造における、請求項1から5のいずれか一項に記載のアナログ又は誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、31位におけるヒスチジン及び34位におけるグルタミンを含むグルカゴン様ペプチド1(GLP-1)のアナログ及び誘導体、並びにその医薬的使用に関する。
【０００２】
配列表の参照による組み込み
「配列表」と題する配列表は582バイトであり、2010年11月28日に作成されたもので、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
WO00/16797は脳卒中の治療におけるGLP-1又はアナログの使用に関し、インスリン刺激性質が改善された、又は血漿中での分解耐性が増強されたGLP-1アナログ及び誘導体の設計についての提案を多数包含する。
【０００４】
WO2006/096515はGLP-1(7-37)などのGLP-1ペプチドのトランスフェリン融合タンパク質に関し、このGLP-1ペプチドはK34をQ、A又はNに変異させることにより改変されている(WO2006/096515の請求項16)。
【０００５】
WO2009/030771はA-B-C-D-で誘導体化されたGLP-1などのペプチドに関し、K34がQに変異されているものをいくつか包含する(実施例68、69、71)。
【０００６】
米国特許第5,545,618号は糖尿病治療に有用なGLP-1アナログに関し、インスリン刺激性質が改善された、又は血漿中での分解耐性が増強されたGLP-1アナログ及び誘導体の設計についての提案を多数包含する。
【０００７】
Novo Nordisk A/Sにより販売されている1日1回投与のためのGLP-1誘導体であるリラグルチドはWO98/08871の実施例37に開示される。
【０００８】
Novo Nordisk A/Sにより開発中である週1回投与のためのGLP-1誘導体であるセマグルチドはWO06/097537の実施例4に開示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第00/16797号
【特許文献２】国際公開第2006/096515号
【特許文献３】国際公開第2009/030771号
【特許文献４】米国特許第5545618号明細書
【特許文献５】国際公開第98/08871号
【特許文献６】国際公開第06/097537号
【特許文献７】米国特許出願公開第2007/0161087号明細書
【特許文献８】国際公開第2005/058958号
【特許文献９】国際公開第2007/124463号
【特許文献１０】国際公開第2005/058954号
【特許文献１１】国際公開第2004/093823号
【特許文献１２】国際公開第2006/124529号
【特許文献１３】国際公開第2005/027978号
【特許文献１４】国際公開第2009/030738号
【特許文献１５】国際公開第2008/145728号
【特許文献１６】国際公開第2009/083549号
【特許文献１７】欧州特許511600号明細書
【特許文献１８】国際公開第2006/082204号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Needleman,S.B.及びWunsch,C.D.、(1970)、Journal of Molecular Biology、48:443〜453ページ
【非特許文献２】Myers及びW.Miller、「Optimal Alignments in Linear Space」CABIOS(computer applications in the biosciences) (1988) 4:11〜17ページ
【非特許文献３】M.Bodanszky、「Principles of Peptide Synthesis」、第2版、Springer Verlag、1993
【非特許文献４】Greene及びWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999
【非特許文献５】Florencio Zaragoza Dorwald、「Organic Synthesis on solid Phase」、Wiley-VCH Verlag GmbH、2000
【非特許文献６】「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」、W.C.Chan及びP.D.White編、Oxford University Press、2000
【非特許文献７】Hodgsonら、「The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids」、Chemical Society Reviews、vol.33、no.7(2004)、422〜430ページ
【非特許文献８】Remington、「The Science and Practice of Pharmacy」、第19版(1995)
【非特許文献９】W.R.Sampson(1999)、J.Pep.Sci.5、403ページ
【非特許文献１０】Analytical Biochemistry(1976)、vol.72、248〜254ページ
【非特許文献１１】Analytical Biochemistry(1996)、vol.236、302〜308ページ
【非特許文献１２】Poulsen及びJensen、Journal of Biomolecular Screening 2007、vol.12、240〜247ページ
【発明の概要】
【００１１】
本発明はGLP-1のアナログ及びその誘導体に関する。
【００１２】
本発明のGLP-1アナログにおいて、31位、同様に34位における野生型のアミノ酸残基、すなわちそれぞれW及びKは、それぞれH及びQに置換されている。
【００１３】
全体で最大10個のアナログのアミノ酸が野生型のGLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して改変されていることが可能で、これら改変は31位及び34位における置換を包含する。
【００１４】
より詳細には、本発明は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の31位に相当する位置におけるヒスチジン残基及びGLP-1(7-37)の34位に相当する位置におけるグルタミン残基を含むGLP-1アナログに関する。
【００１５】
それ故に、アナログはH31及びQ34を含む、又は持つと言われ得る。アナログはそのうえ、好ましくはGLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して最大10個のアミノ酸改変を持つ。
【００１６】
本発明はまたこのアナログの誘導体に関し、同様に薬学的に許容されるアナログの塩、アミド又はエステル、及び薬学的に許容される誘導体の塩、アミド又はエステルに関する。
【００１７】
本発明はそのうえ、好ましくは全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患の治療及び/若しくは予防のための、並びに/又は脂質パラメーターを改善するための、β細胞機能を改善するための、並びに/又は糖尿病の疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための、これらの化合物の医薬的使用に関する。
【００１８】
本発明はそのうえ側鎖の形の中間生成物に関するものであり、これら中間生成物はある特定の本発明のGLP-1誘導体の調製に関連する。
【００１９】
本発明のペプチド及び誘導体は生物学的に活性がある。さらに又は或いは、本発明の誘導体は持続時間が延長された薬物動態学的プロファイルを持つ。さらに又は或いは、本発明の誘導体は胃腸の酵素による分解に対して安定である。さらに又は或いは、本発明の誘導体は経口での高い生物学的利用能がある。これらの性質は皮下、静脈内及び/又はとりわけ経口投与のための次世代GLP-1化合物の開発において重要である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の31位に相当する位置におけるヒスチジン残基、GLP-1(7-37)の34位に相当する位置におけるグルタミン残基、及びGLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、H残基がH31で示され、Q残基がQ34で示されるGLP-1アナログ、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルに関する。
【００２１】
本発明はまたこのアナログの誘導体、及び薬学的に許容されるその塩、アミド又はエステルに関し、同様に誘導体及びアナログの医薬的使用に関する。
【００２２】
本発明はそのうえ、2つの中間生成物(化学式67及び化学式68)に関し、これらにおいてPGは保護基を表す。
【００２３】
以下において、ギリシャ文字はシンボル又は相当する書記名称により表され得るものであり、例えばα=アルファ、β=ベータ、ε=イプシロン、γ=ガンマ、ω=オメガなどである。またギリシャ文字のμは例としてμl=ul、μM=uMにおいて、「u」により表され得る。
【００２４】
化学式中のアスタリスク(*)は、i)付着点、ii)ラジカル及び/又はiii)非共有電子を示す。
【００２５】
GLP-1アナログ
本明細書で用いられる「GLP-1アナログ」という用語又は「GLP-1のアナログ」は、ヒトグルカゴン様ペプチド-1(GLP-1(7-37))のバリアントであるペプチド又は化合物をいい、その配列は配列番号1として配列表に包含される。配列番号1の配列を持つペプチドはまた「野生型」GLP-1として示され得る。
【００２６】
配列表において、配列番号1の一番目のアミノ酸残基(ヒスチジン)は1番を割り当てられる。しかしながら以下において、当該技術分野において確立された慣行に従い、このヒスチジン残基は7番と呼ばれ、続くアミノ酸残基はそれに合うように番号を付けられ、グリシンの37番で終わる。それ故、一般に、本明細書におけるGLP-1(7-37)配列のアミノ酸残基番号又は位置番号の参照はいずれも、7位のHisで始まって37位のGlyで終わる配列に対するものである。
【００２７】
特定の実施形態において、本発明のGLP-1アナログは野生型GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して多数のアミノ酸残基が変化した改変GLP-1(7-37)ペプチドに関する。これらの変化又は改変は、独立して、1つ又は複数のアミノ酸の置換、付加及び/又は欠失を表し得る。
【００２８】
本発明のGLP-1アナログは、i)改変されるアミノ酸残基に相当する野生型GLP-1(7-37)におけるアミノ酸残基の番号(すなわち野生型GLP-1中の相当する位置)、及びii)実際の改変への参照により記述され得る。以下は、本明細書で用いられる適切なアナログ命名法の限定されない具体例である。
【００２９】
本発明の化合物はGLP-1(7-37)の31位に相当する位置におけるヒスチジン残基、GLP-1(7-37)の34位に相当する位置におけるグルタミン残基、及びGLP-1(7-37)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含むGLP-1アナログのGLP-1(7-37)であり、ここでGLP-1(7-37)とは配列番号1を持つ野生型GLP-1(7-37)をいう。
【００３０】
例えば本発明のアナログが全体で2つのアミノ酸改変のみを持つ場合、すなわち2つの改変が具体的に参照される場合、このことはアナログのアミノ酸配列がその他の点で野生型GLP-1のアミノ酸配列と同一であることを意味し、かかるアナログはその場合、例として(H31,Q34)-GLP-1(7-37)で示され得る。これは、31位におけるWがHで置換されていて、34位におけるKがQで置換されている野生型GLP-1のアミノ酸配列(配列番号1)を表す。このアナログはまた[His31,Gln34]GLP-1(7-37)ペプチド、[His31,Gln34]GLP-1(7-37)、又は単に(31H、34Q)で示され得るが、ここではGLP-1(7-37)への参照が含蓄される。
【００３１】
本発明のアナログの別の例は合計3個のアミノ酸改変を持つ[Aib8,His31,Gln34]GLP-1-(7-37)であり、これは上記の31位及び34位における2つの置換に加えて、8位におけるアラニンがアルファ-アミノイソ酪酸(Aib)で置換されている。このアナログは単に(8Aib、31H、34Q)で示され得るが、ここではGLP-1(7-37)への参照が含蓄される。
【００３２】
なおさらなる例として、[Aib8,Glu30,His31,Gln34,Lys36]GLP-1(7-37)yl-Gluは合計6個のアミノ酸改変を有する本発明の別のGLP-1(7-37)アナログを示し、これは8位におけるアラニンがアミノイソ酪酸(Aib)で置換されていて、30位におけるアラニンがグルタミン酸で置換されていて、31位におけるトリプトファンがヒスチジンで置換されていて、34位におけるリジンがグルタミンで置換されていて、36位におけるアルギニンがリジンで置換されていて、C末端の38位にグルタミン酸が付加されている。このアナログは単に(8Aib、30E、31H、34Q、36K、38E)で示され得るが、ここではGLP-1(7-37)への参照が含蓄される。
【００３３】
なおさらなる例として、GLP-1(7-37)のアナログに関してのdes7(又はDes7)は、GLP-1(7-37)のN末端アミノ酸に相当するアミノ酸であるヒスチジンが欠失しているアナログをいう。このアナログはまたGLP-1(8-37)とも示され得る。
【００３４】
同様に、GLP-1(7-37)のアナログに関する(des7+des8)、(des7、des8)、(des7-8)又は(Des7、Des8)は、2つのN末端アミノ酸であるヒスチジン及びアラニンが欠失しているアナログをいう。このアナログはまたGLP-1(9-37)で示され得る。
【００３５】
なおさらなる例として、「Des7又はImp7を含む」アナログは、野生型のGLP-1と比較した場合にそれぞれ7位におけるヒスチジンの欠失、又は7位におけるヒスチジンのイミダゾプロピオン酸(Imp)での置換を含むGLP-1(7-37)アナログをいう。
【００３６】
ある特定の改変を「含む」アナログは、配列番号1と比較した場合にさらなる改変を含み得る。例えばDes7又はImp7を含む本発明のアナログの限定されない例は、化学式31、化学式37、化学式40及び化学式41のペプチド部であり、化学式40を除いた全てが本発明の誘導体である(化学式40は本発明のアナログである)。
【００３７】
Des7、His31及びGln34を含むアナログの限定されない例は、[Des7,His31,Gln34]GLP-1(7-37)ペプチド、及びN8 3H-イミダゾル-4-イル-アセチル][His31,Gln34]GLP-1(8-37)ペプチドである。後者の化合物において、Hisのモノペプチド模倣物は、新たなN末端であるAla8にアミド結合を通じて付着される。
【００３８】
欠失N末端アミノ酸の置換の一種として用いられ得る適切なHis又はHis-Ala模倣物は、もしあるならば、例としてピリジン又はイミダゾールといった複素環式の窒素含有芳香環構造を含む。好ましいHis又はHis-Ala模倣物はHis及びHis-Ala以外のイミダゾール又はピリジンの誘導体であり、これは1つの実施形態において遊離のカルボン酸基を有する置換基を持ち、このカルボン酸基はペプチドのN末端アミノ酸のアミノ基とアミド結合を形成することができるものである。イミダゾールという用語は類似の環構造を有するが置換基が変化している複素環の一種としてのイミダゾールをいい、ピリジンについて逆もまた同様である。
【００３９】
上記の例から明らかなように、アミノ酸残基はその正式名称、1文字表記及び/又は3文字表記により同定され得る。これらの3つの方法は完全に等価である。
【００４０】
「に対応する位置」又は「相当する位置」という表現は、改変されたGLP-1(7-37)配列中の改変部位を野生型GLP-1(7-37)(配列番号1)の参照により特徴づけるのに用いられ得る。対応する又は相当する位置、同様に改変の数は、例として単なる筆記及び視認により容易に推測され、及び/又はNeedleman-Wunschアラインメントである「align」などの標準的なタンパク質又はペプチドアラインメントプログラムが用いられてもよい。アルゴリズムはNeedleman,S.B.及びWunsch,C.D.、(1970)、Journal of Molecular Biology、48:443〜453ページに記載されており、alignプログラムはMyers及びW.Millerにより「Optimal Alignments in Linear Space」CABIOS(computer applications in the biosciences) (1988) 4:11〜17ページに記載されている。アラインメントのため、デフォルトのスコア行列であるBLOSUM50及びデフォルトの同一性行列を用いることが可能であり、ギャップ中の第一の残基についてのペナルティを-12、又は好ましくは-10に設定し、ギャップ中の付加的な残基についてのペナルティを-2、又は好ましくは-0.5に設定することが可能である。
【００４１】
かかるアラインメントの例は下に挿入されるが、配列の1番は配列番号1、配列の2番はそのアナログ(8Aib、30E、31H、34Q、36K、38E)である。
# 1: GLP-1(7-37):
# 2: GLP-1(7-37)_アナログ:
# 行列: EBLOSUM62
# ギャップ_ペナルティ: 10.0
# 伸長__ペナルティ: 0.5
# 長さ: 32
# 同一性:      26/32 (81.2%)
# 類似性:    28/32 (87.5%)
# ギャップ:           1/32 ( 3.1%)
# スコア: 132.0
1:  1  HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG-     31
| . | ||||| | |||||| || ||||| | . . | | : | : | 
2:  1  HXEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIEHLVQGKGE    32
【００４２】
配列中にImp、N-メチル-Ala及び/又はAibなどの非天然アミノ酸が包含される場合、又はHis-Ala模倣物の場合、これらはアラインメントの目的のためにXで置き換えられてもよい。所望の場合、Xを後で手動で修正することができる。
【００４３】
例として、本発明のアナログの文脈において用いられる「ペプチド」という用語は、アミド(又はペプチド)結合により相互連結された一連のアミノ酸を含む化合物をいう。
【００４４】
特定の実施形態において、ペプチドはかなりの程度まで、又は主に、アミド結合により相互連結されたアミノ酸から構成される(例としてモル質量で少なくとも50%、60%、70%、80%又は少なくとも90%)。別の特定の実施形態において、ペプチドはペプチド結合により相互連結されたアミノ酸からなる。
【００４５】
本発明のペプチドは、ペプチド結合により連結された少なくとも5個の構成アミノ酸を含む。特定の実施形態において、ペプチドは少なくとも10個、好ましくは少なくとも15個、より好ましくは少なくとも20個、一層より好ましくは少なくとも25個、又は最も好ましくは少なくとも28個のアミノ酸を含む。
【００４６】
特定の実施形態において、ペプチドは少なくとも5個の構成アミノ酸から構成され、好ましくは少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、又は最も好ましくは少なくとも28個のアミノ酸から構成される。
【００４７】
付加的な特定の実施形態において、ペプチドは、i)29個、ii)30個、iii)31個又はiv)32個のアミノ酸からa)構成される、又はb)なる。
【００４８】
なおさらなる特定の実施形態において、ペプチドはペプチド結合により相互連結されたアミノ酸からなる。
【００４９】
アミノ酸はアミン基及びカルボン酸基、さらに任意で1つ又は複数の、しばしば側鎖と呼ばれる付加的な基を含有する分子である。
【００５０】
「アミノ酸」という用語はタンパク新生のアミノ酸(天然アミノ酸及び標準的なアミノ酸を包含する遺伝暗号によりコードされるアミノ酸)、同様に非タンパク新生のアミノ酸(タンパク質中に見出されない、及び/又は標準的な遺伝暗号でコードされないアミノ酸)並びに合成アミノ酸を包含する。それ故に、アミノ酸はタンパク新生アミノ酸、非タンパク新生アミノ酸、及び/又は合成アミノ酸の群から選択され得る。
【００５１】
遺伝暗号によりコードされないアミノ酸の限定されない例はガンマ-カルボキシグルタミン酸、オルニチン及びホスホセリンである。合成アミノ酸の限定されない例はD-アラニン(以下において、例えば「a8」において「a」と略されることもあり、従ってD-Ala8をいう)及びD-ロイシンなどのアミノ酸のD-異性体、Aib(α-アミノイソ酪酸)、β-アラニン、N-メチル-アラニン並びにdes-アミノ-ヒスチジン(desH、別名イミダゾプロピオン酸、略してImp)である。
【００５２】
以下において、光学異性体が述べられない全てのアミノ酸は、(他に指定されない限り)L-異性体を意味すると理解されるものである。
【００５３】
本発明のGLP-1アナログ及び誘導体はGLP-1活性を持つ。この用語は、GLP-1受容体に結合してシグナル伝達経路を惹起することで当該技術分野で知られているインスリン分泌性作用又は他の生理的効果をもたらす能力をいう。例えば、本発明のアナログ及び誘導体は、本明細書の実施例48に記載のアッセイを用いてGLP-1活性を試験することができる。
【００５４】
GLP-1誘導体
本明細書でGLP-1ペプチド又はアナログの文脈において用いられる「誘導体」という用語は、化学的に改変されたGLP-1ペプチド又はアナログを意味し、この中で1つ又は複数の置換基がペプチドに共有結合で付着されている。置換基はまた側鎖とも呼ばれ得る。
【００５５】
特定の実施形態において、側鎖は少なくとも10個の炭素原子、又は少なくとも15個、20個、25個、30個、35個、又は少なくとも40個の炭素原子を持つ。さらなる特定の実施形態において、側鎖は少なくとも5個のヘテロ原子、とりわけO及びNをさらに包含してもよく、例えば少なくとも1個、2個若しくは3個のN原子及び/又は少なくとも3個、6個、9個、12個若しくは15個のO原子などの、少なくとも7個、9個、10個、12個、15個、17個又は少なくとも20個のヘテロ原子をさらに包含してもよい。
【００５６】
GLP-1誘導体の限定されない例としては、例としてIgGなどの免疫グロブリンのFc部分、ヒトアルブミン、グルカゴン結合抗体の重鎖可変領域などの抗体、又はこれらの任意の断片若しくはアナログと、GLP-1アナログとの異種融合タンパク質又はコンジュゲ、国際公開第2005/058958号及び国際公開第2007/124463号を参照)。付加的な例としては、ペグ化されたGLP-1ペプチド(例として国際公開第2005/058954号、国際公開第2004/093823号及び国際公開第2006/124529号を参照)、同様にアシル化されたGLP-1ペプチド(例として国際公開第98/08871号、国際公開第2005/027978号、国際公開第06/097537号及び国際公開第2009/030771号を参照)が挙げられる。
【００５７】
好ましい実施形態において、側鎖はアルブミンと非共有結合性の凝集物を形成する能力があり、それによって血流に伴う誘導体の循環を促進するが、また誘導体の作用時間を延長する効果も持ち、これはGLP-1-誘導体とアルブミンとの凝集物は医薬品有効成分を放出するのにゆっくりとしか崩壊しないという事実に起因する。それ故に、好ましい置換基又は側鎖は全体としてアルブミン結合部分と呼ばれ得る。
【００５８】
別の特定の実施形態において、アルブミン結合部分はアルブミンの結合及びそれによる持続時間延長にとりわけ関連する部分を含み、この部分は従って持続時間延長性部分と呼ばれ得る。持続時間延長性部分は、ペプチドへの付着点に対してアルブミン結合部分の反対側の端又はその近傍にあり得る。
【００５９】
なおさらなる特定の実施形態において、アルブミン結合部分は持続時間延長性部分とペプチドへの付着点との中間の部分を含み、この部分はリンカー、リンカー部分、スペーサー等と呼ばれ得る。リンカーの存在は任意である。故にリンカーが存在しない場合、アルブミン結合部分は持続時間延長性部分と同一であってもよい。
【００６０】
特定の実施形態において、アルブミン結合部分及び/又は持続時間延長性部分は親油性であり、及び/又は生理的pH(7.4)において負の電荷を持つ。
【００６１】
アルブミン結合部分、持続時間延長性部分又はリンカーは、アルキル化、アシル化、エステル形成若しくはアミド形成などの結合化学によりGLP-1ペプチドのリジン残基に共有結合で付着されてもよく、又はマレイミド若しくは(臭化、フッ化、ヨウ化などの)ハロゲン化アセトアミドカップリングなどによりシステイン残基に共有結合で付着されてもよい。
【００６２】
好ましい実施形態において、アルブミン結合部分及び/又は持続時間延長性部分の活性エステルは、任意でリンカーを有し、リジン残基のアミノ基、好ましくはそのイプシロンアミノ基にアミド結合の形成下で、共有結合で結びつけられる(このプロセスはアシル化と呼ばれる)。
【００６３】
他に述べられない限り、リジン残基のアシル化への参照がなされる場合、そのイプシロン-アミノ基に対するものと理解される。
【００６４】
1つの実施形態において、本発明は、i)K12、ii)K16、iii)K18、iv)K22、v)K24、vi)K26、vii)K27、iix)K36、及び/又はix)K37に付着されるアルブミン結合部分を含む、好ましくは持つ誘導体に関する。上記で説明されるように、上付き文字での各残基の番号はGLP-1(7-37)(配列番号1)中での相当する位置をいう。そのうえ、これもまた上記で説明されるように、通常の書体が上付き文字の代わりに位置番号を示すのに用いられてもよい。例として、「K12」は「12K」と完全に等価である。
【００６５】
相当する位置番号は好ましくは筆記及び視認により、又は上記で説明されるような適切なアラインメントプログラムを用いることにより、同定される。
【００６６】
本目的のために、「アルブミン結合部分」、「持続時間延長性部分」及び「リンカー」という用語はこれら分子の未反応型、同様に反応型を包含する。どちらの型が意味されるかは、用語が用いられる文脈から明白である。
【００６７】
1つの態様において、アルブミン結合部分は化学式1、化学式2、化学式3及び化学式4
化学式1:   CH3-(CH2)x-CO-*
化学式2:   HOOC-(CH2)x -CO-*
化学式3:   HN4C-(CH2)x-CO-*
化学式4:   HOOC-C6H4-O-(CH2)yCO-*
(式中xは6〜18の範囲の整数、yは3〜17の範囲の整数)から選択される持続時間延長性部分を含む、又は持続時間延長性部分からなる。
【００６８】
1つの実施形態において、*-(CH2)x-*は直鎖又は分枝の、好ましくは直鎖のアルキレンをいい、式中xは6〜18の範囲の整数である。
【００６９】
別の実施形態において、*-(CH2)y-*は直鎖又は分枝の、好ましくは直鎖のアルキレンをいい、式中yは3〜17の範囲の整数である。
【００７０】
別の態様において、アルブミン結合部分は、脂肪二酸、及び任意で置換されている遠位(末端)のフェニル基又はフェノキシ基を有する脂肪酸から選択される持続時間延長性部分を含む、又は持続時間延長性部分からなる。フェニル基及びフェノキシ基への任意の置換基は150Da以下、好ましくは125Da以下、より好ましくは100Da以下、一層より好ましくは75Da以下、又は最も好ましくは50Da以下のモル質量を持つ。置換基の例としては、直鎖又は分枝のC1〜C5低級アルキルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
化学物質のモル質量(M)はその物質1モルの質量である。モル質量はダルトンで、シンボルはDaで引用され、定義は1Da=1g/molである。
【００７２】
モル質量は標準的な原子量から計算可能であり、しばしば化学カタログに収載される。化合物のモル質量は、化合物を形成する原子の標準的な原子量を1g/molと等しいモル質量定数Muで乗算したものの合計により与えられる。例として、tert-ブチル(C4H9)の分子質量はM(C4H9)=([4×12.01]+[9×1.008])×1g/mol=57Daである。
【００７３】
標準的な原子量はInternational Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC)により公開されていて、また幅広い種々の教科書、市販カタログ、掛図等において転載もされている。
【００７４】
GLP-1ペプチドへの付着のため、脂肪酸の酸性基、又は脂肪二酸の酸性基のうちの1つは、GLP-1ペプチド中のリジン残基のイプシロンアミノ基と、任意で1つ又は複数のリンカーを通じてアミド結合を形成する。
【００７５】
「脂肪酸」という用語は4個から28個までの炭素原子を持つ脂肪族モノカルボン酸をいい、好ましくは分枝しておらず、及び/又は偶数であり、飽和であっても不飽和であってもよい。
【００７６】
「脂肪二酸」という用語は上記で定義された脂肪酸であるがオメガ位において付加的なカルボン酸基を有するものをいう。それ故に、脂肪二酸はジカルボン酸である。
【００７７】
命名法は当該技術分野で通常のものであり、例えば*-COOH、同様にHOOC-*はカルボキシ、*-C6H4-*はフェニレン、*-CO-*、同様に*-OC-*はカルボニル(O=C<**)、C6H5-O-*はフェノキシ、HN4Cは任意のテトラゾリルラジカルをいう。特定の実施形態において、フェノキシラジカル及びフェニレンラジカルなどの芳香族化合物は独立してオルト、メタ又はパラであってもよい。別の特定の実施形態において、テトラゾリルラジカルは1H-テトラゾリル-5イルである。
【００７８】
好ましい実施形態において、リンカー部分は存在する場合、5個から30個までのC原子、好ましくは5個から25個までのC原子、より好ましくは5個から20個までのC原子、又は最も好ましくは5個から17個までのC原子を持つ。付加的な好ましい実施形態において、リンカー部分は存在する場合、4個から20個までのヘテロ原子、好ましくは4個から18個までのヘテロ原子、より好ましくは4個から14個までのヘテロ原子、又は最も好ましくは4個から12個までのヘテロ原子を持つ。ヘテロ原子のとりわけ好ましい例はN原子及びO原子である。H原子はヘテロ原子ではない。
【００７９】
別の実施形態において、リンカーは少なくとも1つのOEG分子、及び/又は少なくとも1つのグルタミン酸残基、厳密にいえば相当するラジカル(OEGは8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸のジラジカル、すなわちこのラジカル:*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*を示す)を含む。
【００８０】
アミノ酸であるグルタミン酸は2つのカルボン酸基を含む。そのガンマ-カルボキシ基は好ましくはリジンのイプシロン-アミノ基と、又は存在する場合はOEG分子のアミノ基と、又は存在する場合は別のGlu残基のアミノ基とアミド結合を形成するのに用いられる。Gluのアミノ基は今度は持続時間延長性部分のカルボキシ基と、又は存在する場合はOEG分子のカルボキシ基と、又は存在する場合は別のGluのガンマ-カルボキシ基とアミド結合を形成する。Gluのこの封入方法は時折短縮して「ガンマ-Glu」と呼ばれる。
【００８１】
本発明の誘導体は、同じ分子式及び結合原子の配列を持つがそれら原子の空間における3次元配向のみにおいて相違する、異なる立体異性型で存在し得る。例示された本発明の誘導体の立体異性は、実施例の節において、名称、同様に構造が標準的な命名法を用いて指し示される。他に述べられない限り、本発明は特許請求の範囲に記載される誘導体の全ての立体異性型に関する。
【００８２】
本発明のGLP-1アナログ及び誘導体の血漿中の濃度は任意の適切な方法を用いて決定され得る。例えばLC-MS(液体クロマトグラフィー質量分析)が用いられてもよく、又はRIA(ラジオイムノアッセイ)、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)及びLOCI(蛍光酸素チャンネリングイムノアッセイ)などのイムノアッセイが用いられてもよい。適切なRIA及びELISAアッセイのための一般的なプロトコールは、例えば国際公開第09/030738号の116〜118ページに見出される。好ましいアッセイはLOCIアッセイである。このアッセイは、本明細書の実施例51、実施例53及び実施例55に記載される。
【００８３】
薬学的に許容される塩、アミド又はエステル
本発明のアナログ、誘導体及び中間生成物は、薬学的に許容される塩、アミド又はエステルの形であり得る。
【００８４】
塩は例として塩基と酸との間の化学反応、例としてNH3+H2SO4→(NH4)2SO4により形成される。
【００８５】
塩は塩基性塩、酸性塩であってもよく、又はどちらでもないもの(すなわち中性塩)であってもよい。塩基性塩は水中で水酸化物イオンを生み出し、酸性塩はヒドロニウムイオンを生み出す。
【００８６】
本発明のアナログ及び誘導体の塩は、それぞれアニオン基又はカチオン基と反応する追加されたカチオン又はアニオンを伴って形成され得る。これらの基はペプチド部分の中に、及び/又は本発明の化合物の側鎖の中に置かれ得る。
【００８７】
本発明の化合物のアニオン基の限定されない例としては、側鎖中の遊離カルボキシル基、もしあるならば同様にペプチド部分中の遊離カルボキシル基が挙げられる。ペプチド部分はしばしばC末端において遊離のカルボン酸基を包含し、また内部のAsp及びGluなどの酸性アミノ酸残基において遊離のカルボキシル基をも包含し得る。
【００８８】
ペプチド部分中のカチオン基の限定されない例としては、N末端における遊離のアミノ基、存在する場合は同様にHis、Arg及びLysなどの内部の塩基性アミノ酸残基の任意の遊離アミノ基が挙げられる。
【００８９】
本発明のペプチド及び誘導体のエステルは例として遊離カルボン酸基とアルコール又はフェノールとの反応により形成され得るもので、少なくとも1つのヒドロキシル基のアルコキシ基又はアリールオキシ基による置換につながる。
【００９０】
エステル形成はペプチドのC末端における遊離カルボキシル基、及び/又は側鎖中の任意の遊離カルボキシル基と関係し得る。
【００９１】
本発明のペプチド及び誘導体のアミドは、例として遊離カルボン酸基とアミン若しくは置換アミンとの反応により、又は遊離若しくは置換アミノ基とカルボン酸との反応により形成され得る。
【００９２】
アミド形成はペプチドのC末端における遊離カルボキシル基、側鎖中の任意の遊離カルボキシル基、ペプチドのN末端における遊離アミノ基、並びに/又はペプチド中及び/若しくは側鎖中のペプチドの任意の遊離若しくは置換アミノ基と関係し得る。
【００９３】
特定の実施形態において、ペプチド又は誘導体は薬学的に許容される塩の形である。別の特定の実施形態において、ペプチド又は誘導体は薬学的に許容されるアミドの形であり、好ましくはペプチドのC末端においてアミド基を有する。なおさらなる特定の実施形態において、ペプチド又は誘導体は薬学的に許容されるエステルの形である。
【００９４】
中間生成物
本発明はそのうえ2つの中間生成物(化学式67及び化学式68)に関し、これらにおいてPGは保護基を表す。PG基の限定されない例は-OH、又は活性化エステルとして官能化されている基、例えばOPfp、OPnp及びOSucであるが、これらに限定されるものではない。
【００９５】
他の適切な活性化エステルは例としてM.Bodanszky、「Principles of Peptide Synthesis」、第2版、Springer Verlag、1993の教示に従って選択され得る。
【００９６】
機能的性質
第一の態様において、本発明のアナログ及び/又は誘導体は良好な効力を持つ。さらに又は或いは、第二の態様において、本発明のアナログ及び/又は誘導体は持続時間が延長された薬物動態学的プロファイルを持つ。さらに又は或いは、第三の態様において、本発明のアナログ及び/又は誘導体は胃腸の酵素による分解に対して安定である。さらに又は或いは、第四の態様において、本発明のアナログ及び/又は誘導体は比較的低いアルブミン結合アフィニティーを持つ。さらに又は或いは、第五の態様において、本発明のアナログ及び/又は誘導体は経口での高い生物学的利用能を持つ。
【００９７】
生物学的活性(効力)
第一の態様によると、アナログ及び誘導体は生物学的に活性がある、又は効力がある。
【００９８】
特定の実施形態において、効力及び/又は活性はin vitroでの効力、すなわち機能的GLP-1受容体アッセイにおける性能をいい、より詳細にはクローニングされたヒトGLP-1受容体を発現する細胞株においてcAMP形成を刺激する能力をいう。
【００９９】
ヒトGLP-1受容体を含有する培地におけるcAMP形成の刺激は、好ましくはBHK467-12A(tk-ts13)などの安定的に形質導入された細胞株を用いて、及び/又はcAMPの決定のために機能受容体アッセイを用いて決定され得るが、このアッセイは例として内因的に形成されたcAMPと外因的に追加されたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づくもので、このアッセイにおいてcAMPはより好ましくは特異的な抗体を用いて捕捉され、及び/又は一層より好ましくは、アッセイはAlphaScreen cAMP Assayであり、最も好ましくは実施例48に記載されるアッセイである。
【０１００】
最大半量効果濃度(EC50)という用語は一般にベースラインと最大値との間の中間の応答を誘導する濃度をいい、用量応答曲線への参照によるものである。EC50は化合物の効力測定値として用いられ、最大の効果が認められる50%の濃度を表す。
【０１０１】
本発明の誘導体のin vitroでの効力は上記のように決定可能で、当該誘導体のEC50が決定される。EC50が低いほど、効力は良い。
【０１０２】
特定の実施形態において、培地は50mM TRIS-HCl、5mM HEPES、10mM MgCl2,6H2O、150mM NaCl、0.01% Tween、0.1% BSA、0.5mM IBMX、1mM ATP、1uM GTP、pH7.4の組成(アッセイ中の終濃度)を有する。
【０１０３】
代替的な培地は50mM Tris-HCl、1mM EGTA、1.5mM MgSO4、1.7mM ATP、20mM GTP、2mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、0.01% Tween-20、pH7.4である。
【０１０４】
さらなる特定の実施形態において、本発明のアナログ及び/又は誘導体は4500pM以下の、好ましくは4500pMより低い、より好ましくは4000pMより低い、一層より好ましくは3500より低い、又は最も好ましくは3000pMより低いEC50を持つ。
【０１０５】
別の特定の実施形態において、本発明のアナログ及び/又は誘導体はin vivoで効力があり、これは当該技術分野で知られているように適切な動物モデルにおいて、同様に臨床試験において決定され得る。
【０１０６】
糖尿病のdb/dbマウスは適切な動物モデルの1つの例であり、血糖低下効果はかかるマウスにおいてin vivoで、例として本明細書の実施例54に記載されるように、又は国際公開第09/030738号の実施例43に記載されるように決定され得る。
【０１０７】
さらに又は或いは、in vivoでのグルコース仲介性インスリン分泌に対する効果は、ミニブタにおける薬力学的研究(IVGTT)において、例として実施例55に記載されるように決定され得る。
【０１０８】
さらに又は或いは、in vivoでの飼料摂取に対する効果は、ブタにおける薬力学的研究において、例として実施例56に記載されるように決定され得る。
【０１０９】
持続時間延長-受容体結合/低及び高アルブミン
第二の態様によると、本発明のアナログ及び/又は誘導体は持続時間が延長されている。
【０１１０】
本発明のアナログ及び/又は誘導体の低濃度及び高濃度それぞれのアルブミン存在下でのGLP-1受容体に結合する能力は、本明細書の実施例49に記載されるように決定され得る。
【０１１１】
一般に、低アルブミン濃度でのGLP-1受容体への結合は、低いIC50値に対応して、可能な限り良好であるはずである。
【０１１２】
高アルブミン濃度でのIC50値は、誘導体のGLP-1受容体への結合に対するアルブミンの影響の測定値である。知られているように、GLP-1誘導体もまたアルブミンに結合する。これは一般に望ましい効果であり、血漿における存続時間を延ばす。それ故、高アルブミンでのIC50値は低アルブミンでのIC50値よりも一般に高く、これはGLP-1受容体への結合低減に対応して、GLP-1受容体への結合と競合するアルブミンの結合により引き起こされるものである。
【０１１３】
高比率(IC50値(高アルブミン)/IC50値(低アルブミン))はそれ故、当該誘導体がアルブミンに良好に結合し(長い半減期を持ち得る)、それ自体もまたGLP-1受容体に良好に結合する(IC50値(高アルブミン)が高く、IC50値(低アルブミン)が低い)ことの指標として受け取られ得る。他方、アルブミンの結合は常に望ましいものではなく、又はアルブミンへの結合が強すぎる場合もある。それ故、IC50(低アルブミン)、IC50(高アルブミン)/、及び高/低の比率についての望ましい範囲は、意図される使用及びかかる使用を取り囲む環境、並びに潜在的に興味深い他の化合物性質に依存して、化合物ごとに変わり得る。
【０１１４】
特定の実施形態において、0.005% HSA(低アルブミン)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)は1000.00nMより低く、好ましくは600.00nMより低く、より好ましくは100.00nMより低く、又は最も好ましくは50.00nMより低い。
【０１１５】
高及び低アルブミン濃度での受容体結合を決定するための適切なアッセイは本明細書の実施例49に開示される。
【０１１６】
持続時間延長-ラットにおけるin vivoの半減期
第二の態様によると、本発明の誘導体は持続時間が延長されている。特定の実施形態において、持続時間延長は静脈内投与後のラットにおけるin vivoの半減期(T1/2)として決定され得る。付加的な実施形態において、半減期は少なくとも4時間、好ましくは少なくとも5時間、一層より好ましくは少なくとも6時間、又は最も好ましくは少なくとも7時間である。
【０１１７】
静脈内投与後のラットにおけるin vivoの半減期を決定するための適切なアッセイは本明細書の実施例51に開示される。
【０１１８】
持続時間延長-ミニブタにおけるin vivoの半減期
第二の態様によると、本発明の誘導体は持続時間が延長されている。特定の実施形態において、持続時間延長は静脈内投与後のミニブタにおけるin vivoの半減期(T1/2)として決定され得る。付加的な実施形態において、半減期は少なくとも8時間、好ましくは少なくとも12時間、より好ましくは少なくとも16時間、なおより好ましくは少なくとも24時間、一層より好ましくは少なくとも36時間、又は最も好ましくは少なくとも48時間である。
【０１１９】
静脈内投与後のミニブタにおけるin vivoの半減期を決定するための適切なアッセイは本明細書の実施例52に開示される。
【０１２０】
胃腸の酵素による分解
第三の態様によると、本発明のアナログ及び/又は誘導体は1つ又は複数の胃腸の酵素による分解に対して安定である、又は安定化されている。
【０１２１】
胃腸の酵素としては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びカルボキシペプチダーゼなどのエキソペプチダーゼ及びエンドペプチダーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。安定性は、精製された酵素の形の、又は胃腸系からの抽出物の形のこれら胃腸の酵素に対して試験され得る。
【０１２２】
特定の実施形態において、本発明のアナログ又は誘導体のラット小腸抽出物におけるin vitro半減期(T1/2) を相当するGLP-1(7-37)の半減期(T1/2)で除算したものが、少なくとも1、好ましくは1.0より高い、より好ましくは少なくとも1.2、なおより好ましくは少なくとも2.0、一層より好ましくは少なくとも3.0、又は最も好ましくは少なくとも4.0である。言い換えれば、比率(SI)は、すなわちラット小腸抽出物中の当該誘導体のin vitro半減期(T1/2)を相当するGLP-1(7-37)の半減期(T1/2)で除算したものとして、各誘導体について定義され得る。
【０１２３】
ラット小腸の抽出物におけるin vitro半減期を決定するための適切なアッセイは本明細書の実施例50に開示される。
【０１２４】
付加的な特定の実施形態において、実施例50の方法などの適切な方法を用いて決定される本発明の誘導体の酵素安定性は、a)国際公開第2009/030771号の実施例68の化合物、b)国際公開第2009/030771号の実施例69の化合物、及び/又はc)国際公開第2009/030771号の実施例71の化合物と比較して改善されている。
【０１２５】
アルブミン結合アフィニティー
第四の態様によると、本発明の誘導体はヒト血清アルブミン、HSAへの比較的低い結合アフィニティーを持つ。
【０１２６】
持続時間延長の観点からある一定のレベルのアルブミン結合が一般に望ましい一方、アルブミンへの結合は堅固すぎるべきではないが、この理由は結合が堅固すぎると生物学的活性に重要である誘導体のGLP-1受容体への結合に潜在的に悪影響を及ぼす可能性があるためである。
【０１２７】
HSAへの結合アフィニティーは、本明細書の実施例57の方法などの任意の適切な方法を用いて決定され得る。
【０１２８】
HSAへの結合アフィニティーはKd又は見かけのKdとして表現され得るが、KdはHSAに結合した誘導体を導く化学平衡式を参照する解離定数である。
【０１２９】
解離定数(Kd)が小さいほど、GLP-1誘導体とHSAとの間の結合アフィニティーは高い。
【０１３０】
それ故に、この第四の態様によると、本発明の誘導体のKd又は見かけのKdは、HSAへの比較的低い結合に対応して、比較的高いものであり得る。
【０１３１】
特定の実施形態において、驚くべきことに、HSAへの比較的低い結合を有するこれらの誘導体はそれでもなお、とりわけ胃腸の酵素による分解に対して酵素安定性が改善されており、ここで酵素安定性は本明細書の実施例50に記載されるように決定され得る。上の「胃腸の酵素による分解」と題する節への参照もまた、具体的になされる。
【０１３２】
改善された酵素安定性と低いアルブミン結合アフィニティーとの組み合わせは血漿中のアナログ又は誘導体の遊離画分を増加させ、それによってin vivoでの効力を増加させる可能性を与える。これまでは主に半減期を延ばすことに焦点が合わされてきたが、この組み合わせはまた、一般に高いアルブミン結合アフィニティーを持つ既知のGLP-1誘導体と比較して、血漿半減期に関してより大きな設計範囲を与える。
【０１３３】
経口での生物学的利用能
第五の態様によると、本発明の誘導体は経口での高い生物学的利用能を持つ。
【０１３４】
市販のGLP-1誘導体の経口での生物学的利用能は非常に低い。静脈内投与又は皮下投与用に開発中であるGLP-1誘導体の経口での生物学的利用能もまた低い。
【０１３５】
従って、GLP-1誘導体の技術分野において、経口での生物学的利用能改善についての需要がある。かかる誘導体は効力が一般に満足なものである限り、及び/又はその半減期がまた一般に満足なものである限り、経口投与のための適切な候補であり得る。
【０１３６】
本発明者は新規の種類のGLP-1誘導体を同定したが、これらは驚くべきことに経口での高い生物学的利用能と、同時に満足な効力及び/又は半減期を持つ。
【０１３７】
特定の実施形態において、驚くべきことに、経口での高い生物学的利用能を持つこれらの誘導体は、低アルブミン濃度でのGLP-1受容体への高い結合アフィニティー(すなわち低いIC50値)も持つ。これらの特徴は経口での低い医薬品有効成分1日量を獲得する目的で重要であり、例として生産の経済性、潜在的な安全性問題の可能性、同様に投与の快適性の問題及び環境への懸念を包含する様々な理由のために望ましい。
【０１３８】
別の特定の実施形態において、驚くべきことに、経口での高い生物学的利用能を持つこれらの誘導体はまたヒト血清アルブミン(HSA)への比較的低い結合を呈し、ここでHSAへの結合は例として本明細書の実施例57に記載されるように決定され得る。上の「アルブミン結合アフィニティー」と題する節への参照もまた、具体的になされる。
【０１３９】
経口での高い生物学的利用能と低いアルブミン結合アフィニティーとの組み合わせは医薬品有効成分の用量を低下させる可能性を与えるものであり、例として生産の経済性、潜在的な安全性問題の可能性、同様に投与の快適性の問題及び環境への懸念を包含する様々な理由のために望ましい。この組み合わせはまた、一般に高いアルブミン結合アフィニティーを持つ既知のGLP-1誘導体と比較して、血漿半減期に関してより大きな設計範囲を与える。
【０１４０】
一般に、本発明のアナログ又は誘導体の生物学的利用能という用語は、変化せずに体循環に達する本発明のアナログ又は誘導体などの医薬品有効成分(API)の投与量の画分をいう。定義によると、APIが静脈内に投与される場合、その生物学的利用能は100%である。一方、他の経路(経口など)を通じて投与される場合、その生物学的利用能は減少する(不完全な吸収及び初回通過代謝に起因する)。生物学的利用能に関する知識は非静脈内投与経路のための用量を計算する場合に必須である。
【０１４１】
経口での絶対的生物学的利用能は、経口投与後の体循環中のAPIの生物学的利用能(曲線下面積すなわちAUCとして推定される)を、静脈内投与後の同じAPIの生物学的利用能と比較する。これは相当する同じAPIの静脈内投与と比較される、非静脈内投与を通じて吸収されるAPIの画分である。比較は異なる用量が用いられるならば正規化された用量でなければならず、その結果として、各AUCは相当する投与量で除算されることで補正される。
【０１４２】
時間に対する血漿API濃度のプロットは経口投与及び静脈内投与の両方の後に作られる。絶対的生物学的利用能(F)は、用量補正されたAUC-経口投与をAUC-静脈内投与で除算したものである。
【０１４３】
本発明の誘導体は、a)リラグルチド及び/又はb)セマグルチドより、好ましくは少なくとも10%高い、より好ましくは少なくとも20%高い、一層より好ましくは少なくとも30%高い、又は最も好ましくは少なくとも40%高い、経口での絶対的生物学的利用能を持つ。経口での生物学的利用能を試験する前に、本発明のアナログ及び/又は誘導体は、インスリン分泌性化合物の経口製剤の技術分野で知られているように、例として国際公開第2008/145728号に記載される製剤の任意の1つ又は複数を用いて適切に処方され得る。
【０１４４】
実施例53に記載される試験が開発され、これは経口での生物学的利用能の非常に良好な予測であることが見出された。この試験によると、GLP-1誘導体のラット腸管腔内への直接注射の後、血漿中のGLP-1誘導体の濃度(曝露)が決定され、投薬溶液の濃度(umol/l)で除算された血漿濃度(pmol/l)の比率がt=30分について計算される。この比率は腸の生物学的利用能の測定値であり、実際の経口での生物学的利用能のデータと正確に相関することが示された。
【０１４５】
本発明の誘導体の付加的な特定の実施形態は、実施例の節の前の「特定の実施形態」という見出しのある節に記載される。
【０１４６】
生産プロセス
GLP-1(7-37)及びそのアナログのようなペプチドの生産は当該技術分野で周知である。
【０１４７】
本発明のアナログ又はその断片は、例えば古典的なペプチド合成、例としてt-Boc若しくはFmoc化学、又は、他の良く確立された技術を用いた固相ペプチド合成により生産され得るものであり、例としてGreene及びWuts、「Protective Groups in Organic Synthesis」、John Wiley & Sons、1999やFlorencio Zaragoza Dorwald、「Organic Synthesis on solid Phase」、Wiley-VCH Verlag GmbH、2000、及び「Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis」、W.C.Chan及びP.D.White編、Oxford University Press、2000を参照されたい。
【０１４８】
さらに又は或いは、本発明の誘導体(又はその断片)のGLP-1部分は組換え法により、すなわち断片をコードするDNA配列を含有し、適切な栄養培地中でペプチドの発現を可能にする条件下でペプチドを発現する能力を持つ宿主細胞を培養することにより、生産され得る。これらペプチドの発現に適した宿主細胞の限定されない例は、大腸菌(Escherichia coli)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、同様に哺乳類のBHK又はCHO細胞株である。
【０１４９】
非天然アミノ酸及び/又は共有結合で付着されたN末端モノペプチド若しくはジペプチドの模倣物を包含する本発明のアナログは、例として実施例部に記載されるように生産され得る。又は例としてHodgsonら、「The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids」、Chemical Society Reviews、vol.33、no.7(2004)、422〜430ページ及び「Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues」と題する国際公開第2009/083549号を参照されたい。
【０１５０】
本発明のアナログ及び誘導体のいくつかを調製する方法の特定の例は実施例部に包含される。
【０１５１】
医薬組成物
本発明のアナログ若しくは誘導体又は薬学的に許容されるその塩、アミド、アルキル若しくはエステル及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物は、当該技術分野で知られているように調製され得る。
【０１５２】
「賦形剤」という用語は、広くは治療有効成分以外の任意の成分をいう。賦形剤は不活性な物質、不活発な物質であり得る。別の実施形態において、賦形剤は不活性な物質、及び/又は医薬活性物質でないものである。
【０１５３】
賦形剤は、例として担体、ビヒクル、希釈賦形剤剤、錠剤助剤として、並びに/又は投与及び/若しくは活性物質の吸収を改善するためといった様々な目的に役立つことが可能である。
【０１５４】
様々な賦形剤を伴う医薬品有効成分の製剤は当該技術分野で知られており、例として「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」(例として第19版(1995)、及びその後の任意の版)を参照されたい。
【０１５５】
賦形剤の限定されない例は、溶媒、希釈剤、緩衝剤、保存剤、張性調節剤、キレート剤及び安定化剤である。
【０１５６】
製剤の例としては液体製剤、すなわち水を含む水性製剤が挙げられる。液体製剤は溶液剤又は懸濁剤であり得る。水性製剤は典型的に少なくとも50% w/wの水、又は少なくとも60%、70%、80%、又は少なくとも90% w/wの水を含む。
【０１５７】
或いは、医薬組成物は固体製剤、例として凍結乾燥又はスプレードライされた組成物であってもよく、そのまま用いられてもよいし、又は内科医若しくは患者が使用の前にこの組成物に溶媒及び/又は希釈剤を添加する。
【０１５８】
水性製剤のpHは、pH3からpH10の間のいずれであってもよく、例えばおよそ7.0からおよそ9.5まで、又はおよそ3.0からおよそ7.0までである。
【０１５９】
医薬組成物は緩衝剤を含んでもよい。緩衝剤は例として、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸並びにこれらの混合物からなる群より選択され得る。
【０１６０】
医薬組成物は保存剤を含んでもよい。保存剤は例として、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、2-フェノキシエタノール、p-ヒドロキシ安息香酸ブチル、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール及びチオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(3p-クロルフェノキシプロパン-1,2-ジオール)並びにこれらの混合物からなる群より選択され得る。保存剤は0.1mg/mlから20mg/mlまでの濃度で存在し得る。
【０１６１】
医薬組成物は等張化剤を含んでもよい。等張化剤は例として、塩(例として塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例としてグリシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例としてグリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)、ポリエチレングリコール(例としてPEG400)及びこれらの混合物からなる群より選択され得る。例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、乳糖、ショ糖、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファ及びベータHPCD、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン及びカルボキシメチルセルロース-Naを包含する単糖、二糖若しくは多糖又は水可溶性グルカンなどの任意の糖が用いられ得る。糖アルコールは少なくとも1つの-OH基を持つC4〜C8炭化水素として定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ダルシトール、キシリトール及びアラビトールを包含する。1つの実施形態において、糖アルコール添加物はマンニトールである。
【０１６２】
医薬組成物はキレート剤を含んでもよい。キレート剤は例として、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸及びアスパラギン酸の塩並びにこれらの混合物から選択され得る。
【０１６３】
医薬組成物は安定化剤を含んでもよい。安定化剤は例として、1つ若しくは複数の酸化阻害剤、凝集阻害剤、界面活性剤及び/又は1つ若しくは複数のプロテアーゼ阻害剤であり得る。これら様々な種類の安定化剤の限定されない例は以下に開示される。
【０１６４】
「凝集物形成」という用語は、オリゴマーの形成をもたらすポリペプチド分子の間の物理的な相互作用をいい、可溶性のままであっても、又は溶液から沈殿する目に見える大きな凝集物であってもよい。液体医薬組成物保存中のポリペプチドによる凝集物形成はそのポリペプチドの生物学的活性に悪影響を及ぼすことがあり、医薬組成物の治療的有効性の喪失をもたらす。そのうえ、凝集物形成は、ポリペプチドを含有する医薬組成物が注入系を用いて投与される場合に管、膜又はポンプの閉塞などの他の問題を引き起こし得る。
【０１６５】
医薬組成物は、組成物保存中のポリペプチドの凝集物形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含んでもよい。「アミノ酸塩基」という用語は、1つ又は複数のアミノ酸(メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニンなど)又はそのアナログをいう。任意のアミノ酸が遊離の塩基の形、又は塩の形のいずれかで存在し得る。アミノ酸塩基の任意の立体異性体(すなわちL、D又はそれらの混合物)が存在してもよい。
【０１６６】
メチオニン(若しくは他の含硫アミノ酸又はアミノ酸アナログ)は、治療薬として働くポリペプチドがメチオニンスルホキシドへの酸化を受けやすいメチオニン残基を少なくとも1つ含むポリペプチドである場合、メチオニン残基のかかる酸化を阻害するために添加されてもよい。任意のメチオニン立体異性体(L若しくはD)又はそれらの組み合わせを使用できる。
【０１６７】
医薬組成物は高分子量ポリマー又は低分子化合物の群から選択される安定化剤を含んでもよい。安定化剤は例として、ポリエチレングリコール(例としてPEG3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロース又はそれらの派生物(例としてHPC、HPC-SL、HPC-L及びHPMC)、シクロデキストリン、モノチオグリセロールやチオグリコール酸及び2-メチルチオエタノールのような含硫物質並びに異なる塩(例として塩化ナトリウム)から選択され得る。
【０１６８】
医薬組成物は、メチオニン酸化に対してポリペプチドを保護するメチオニン及びEDTA、並びに凍結融解又は機械的剪断に関連した凝集に対してポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤などの付加的な安定化剤を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【０１６９】
医薬組成物は、1つ又は複数の界面活性剤、好ましくは界面活性剤、少なくとも1つの界面活性剤又は2つの異なる界面活性剤を含んでもよい。「界面活性剤」という用語は、水溶性(親水性)部及び脂溶性(親油性)部から構成される任意の分子又はイオンをいう。界面活性剤は例として、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及び/又は両イオン性界面活性剤からなる群より選択され得る。
【０１７０】
医薬組成物は、例としてEDTA(エチレンジアミン四酢酸)及び/又はベンズアミジンHClなどのプロテアーゼ阻害剤を1つ又は複数含んでもよい。
【０１７１】
医薬組成物の付加的な、任意選択の成分としては、例として湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、増量剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例としてヒト血清アルブミン、ゼラチン)並びに/又は両性イオン(例としてベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジンなどのアミノ酸)が挙げられる。
【０１７２】
なおさらに、医薬組成物はインスリン分泌性化合物の経口製剤の技術分野で知られているように、例として国際公開第2008/145728号に記載される製剤の任意の1つ又は複数を用いて、処方され得る。
【０１７３】
投与量は0.01mg〜100mgのアナログ又は誘導体、又は0.01〜50mg、又は0.01〜20mg、又は0.01〜10mgを含有し得る。
【０１７４】
本発明の誘導体は医薬組成物の形で投与され得る。誘導体はその必要がある患者に数ヶ所の部位において、例えば皮膚又は粘膜部位などの局所部位において;動脈内、静脈内又は心臓内などのバイパス吸収部位において;及び皮内、皮下、筋肉内又は腹腔内などの吸収に関与する部位において投与され得る。
【０１７５】
投与の経路は、例えば舌;舌下;頬側;口内;経口;胃内;腸内;鼻;細気管支を通じて、肺胞を通じて若しくはそれらの組み合わせなどの肺;非経口、表皮;真皮;経皮;結膜;尿管;膣;直腸;及び/又は眼球であり得る。特定の実施形態において、組成物は経口組成物であり、投与の経路は経口である。
【０１７６】
組成物は数種の剤形で、例えば溶液剤;懸濁剤;乳剤;微細乳剤;多層乳剤;フォーム剤;塗剤;ペースト剤;貼付剤;軟膏剤;錠剤;コーティング錠;チューインガム;すすぎ剤;ハード若しくはソフトのゼラチンカプセル剤などのカプセル剤;坐剤;直腸カプセル剤;ドロップ剤;ゲル剤;スプレー剤;粉末剤;エアゾール剤;吸入剤;点眼剤;眼軟膏剤;眼すすぎ剤;膣ペッサリー;膣リング;膣軟膏剤;注射液剤;in situゲル化、硬化、沈殿及びin situ結晶化などのin situ変換液剤;輸液剤;又はインプラント剤として投与され得る。組成物は錠剤、任意でコーティング錠、カプセル剤又はチューインガムであってもよい。
【０１７７】
組成物はさらに、例として安定性、生物学的利用能及び/又は溶解性を改善するため、薬物担体又は薬物送達システム中に調合され得る。特定の実施形態において、組成物は共有結合性、疎水性、及び/又は静電気的な相互作用を通じてかかるシステムに付着され得る。かかる調合の目的は例として副作用を減少させること、時間治療を達成すること、及び/又は患者コンプライアンスを増加させることであり得る。
【０１７８】
組成物はまた、制御された、持続性の、持続時間延長の、遅延の、及び/又は徐放のド薬物送達システムの製剤においても用いられ得る。
【０１７９】
非経口投与は皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内注射により、シリンジ、任意でペン様シリンジを使って、又は輸液ポンプを使って行われ得る。
【０１８０】
組成物は溶液剤、懸濁剤又は粉末剤の形で経鼻的に投与されてもよく、液体又は粉末のスプレー剤の形で経肺的に投与されてもよい。
【０１８１】
経皮的投与、例として無針注射による、イオントフォレーシスパッチなどのパッチからの、又は経粘膜の経路、例として頬側を通じた投与は、なおさらなる選択肢である。
【０１８２】
組成物は安定化製剤であってもよい。「安定化製剤」という用語は、物理的な、及び/又は、化学的な安定性が増大した、好ましくは両者が増大した製剤をいう。一般的に、製剤は(推奨される使用及び保存条件に従った)使用及び保存の間、使用期限に達するまで安定でなければならない。
【０１８３】
「物理的安定性」という用語は、熱機械的ストレスへの曝露並びに/又は不安定な界面及び表面(疎水性表面など)との相互作用の結果として生物学的に不活性な及び/又は不溶性の凝集物を形成するポリペプチドの傾向をいう。水性ポリペプチド製剤の物理的安定性は目視検査を使って、及び/又は異なる温度における様々な時間間隔での機械的/物理的ストレス(例として撹拌)への曝露後の濁度測定により評価され得る。或いは、物理的安定性は、例としてチオフラビンT又は「疎水性パッチ」プローブなどのポリペプチドの立体構造状態の分光剤又は分光プローブを用いて評価され得る。
【０１８４】
「化学的安定性」という用語は、無傷のポリペプチドと比較して低減された生物学的効力及び/又は上昇した免疫原性作用を潜在的に持つ化学的分解産物の形成につながる、ポリペプチド構造中の化学的(とりわけ共有結合性の)変化をいう。化学的安定性は、異なる環境条件への曝露後の様々な時点における化学的分解産物の量を、例としてSEC-HPLC及び/又はRP-HPLCにより測定することにより評価できる。
【０１８５】
本発明による誘導体を使用した治療はまた、1つ又は複数の付加的な薬理活性物質と組み合わされてもよく、薬理活性物質は例として抗糖尿病剤、抗肥満剤、食欲調節剤、降圧剤、糖尿病から生じる又は糖尿病に関連した合併症の治療及び/又は予防のための剤、並びに肥満から生じる又は肥満に関連した合併症及び障害の治療及び/又は予防のための剤から選択される。これら薬理活性物質の例は:インスリン、スルホニルウレア、ビグアナイド、メグリチニド、グルコシダーゼ阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト、DPP-IV(ジペプチジルペプチダーゼ-IV)阻害剤、糖新生及び/又はグリコーゲン分解の刺激に関与する肝酵素の阻害剤、グルコース取り込み調節因子、HMG CoA阻害剤(スタチン)のような抗高脂血症剤などの脂質代謝を改変する化合物、胃抑制ポリペプチド(GIPアナログ)、食事摂取量を低下させる化合物、RXRアゴニスト及びβ細胞のATP依存性カリウムチャネルに対して働く剤;コレスチラミン、コレスチポール、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、プロブコール、デキストロチロキシン、ナテグリニド、レパグリニド;アルプレノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、プロプラノロール及びメトプロロールなどのβ遮断薬、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、アラトリオプリル、キナプリル及びラミプリルなどのACE(アンジオテンシン変換酵素)阻害剤、ニフェジピン、フェロジピン、ニカルジピン、イスラジピン、ニモジピン、ジルチアゼム及びベラパミルなどのカルシウムチャネル遮断薬、並びにドキサゾシン、ウラピジル、プラゾシン及びテラゾシンなどのα遮断薬;CART(コカインアンフェタミン調節転写産物)アゴニスト、NPY(神経ペプチドY)アンタゴニスト、PYYアゴニスト、Y2受容体アゴニスト、Y4受容体アゴニスト、混合性Y2/Y4受容体アゴニスト、MC4(メラノコルチン4)アゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、TNF(腫瘍壊死因子)アゴニスト、CRF(副腎皮質刺激ホルモン放出因子)アゴニスト、CRF BP(副腎皮質刺激ホルモン放出因子結合タンパク質)アンタゴニスト、ウロコルチンアゴニスト、β3アゴニスト、オキシントモジュリン及びアナログ、MSH(メラニン細胞刺激ホル
モン)アゴニスト、MCH(メラニン細胞凝集ホルモン)アンタゴニスト、CCK(コレシストキニン)アゴニスト、セロトニン再取り込み阻害剤、セロトニン及びノルアドレナリン再吸収阻害剤、混合セロトニン及びノルアドレナリン作動性化合物、5HT(セロトニン)アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、TRH(甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン)アゴニスト、UCP2又は3(脱共役タンパク質2又は3)モジュレーター、レプチンアゴニスト、DAアゴニスト(ブロモクリプチン、ドプレキシン)、リパーゼ/アミラーゼ阻害剤、RXR(レチノイドX受容体)モジュレーター、TRβアゴニスト;ヒスタミンH3アンタゴニスト、胃抑制ポリペプチドアゴニスト又はアンタゴニスト(GIPアナログ)、ガストリン及びガストリンアナログである。
【０１８６】
本発明に従った誘導体での治療はまた、胃緊縛術又は胃バイパス術などのグルコースレベル及び/又は脂質恒常性に影響する外科手術と組み合わされてもよい。
【０１８７】
医薬の適応症
本発明はまた、薬剤として使用するための本発明のアナログ及び本発明の誘導体に関する。
【０１８８】
特定の実施形態において、本発明のアナログ又は誘導体は以下の薬物治療に用いられ得るが、これらの全ては好ましくは何らかの形で糖尿病に関する。
(i)高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、MODY(若年発症成人型糖尿病)、妊娠性糖尿病などの全ての型の糖尿病の予防及び/若しくは治療、並びに/若しくはHbA1Cの低減;
(ii)2型糖尿病の進行などの糖尿病性疾患進行を遅延させること若しくは予防すること、耐糖能障害(IGT)のインスリン要求性2型糖尿病への進行を遅延させること、及び/若しくは非インスリン要求性2型糖尿病のインスリン要求性2型糖尿病への進行を遅延させること;
(iii)β細胞のアポトーシスの減少、β細胞の機能及び/若しくはβ細胞の質量の増加などのβ細胞の機能を改善すること、並びに/若しくはβ細胞のグルコース感受性を回復させること;
(iv)認知障害の予防及び/若しくは治療;
(v)例として食事摂取量の減少、体重低減、食欲抑制、飽満誘導による肥満などの摂食障害の予防及び/若しくは治療;過度の摂食障害、神経性過食症、及び/若しくは統合失調症治療薬若しくはステロイドの投与により誘導される肥満を治療若しくは予防すること;胃運動の低減;並びに/若しくは胃排出を遅延させること;
(vi)末梢神経障害を包含する神経障害、腎症若しくは網膜症などの糖尿病合併症の予防及び/若しくは治療;
(vii)脂質異常症の予防及び/若しくは治療、総血清脂質の低下、HDLの低下、小型高密度LDLの低下、VLDLの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、HDLの上昇、ヒトにおける血漿リポタンパク質a(Lp(a))レベルの低下、in vitro及び/若しくはin vivoでのアポリポタンパク質a(apo(a))の生成阻害などの脂質パラメーターを改善すること;
(iix) X症候群、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈心疾患、脳卒中、大脳虚血、左心室性肥大などの早期心疾患若しくは早期心血管疾患、冠動脈疾患、本態性高血圧、急性高血圧緊急症、心筋症、心機能不全、運動耐性、慢性心不全、不整脈、心不整脈、失神、アテローム性動脈硬化症、軽度慢性心不全、狭心症、心臓バイパス再狭窄、間欠性跛行(閉塞性動脈硬化症)、拡張機能障害及び/若しくは収縮不全などの心血管疾患の予防及び/若しくは治療;
(ix)炎症性腸症候群、小腸症候群若しくはクローン病、消化不良、及び/若しくは胃潰瘍などの胃腸疾患の予防及び/若しくは治療;
(x)重篤疾患患者、重篤疾患多発性腎症(CIPNP)患者及び/若しくは潜在的なCIPNP患者の治療などの重篤疾患の予防及び/若しくは治療;重篤疾患若しくはCIPNP発展の予防;患者における全身性炎症反応症候群(SIRS)の予防、治療及び/若しくは治癒;並びに/若しくは入院中に患者が菌血症、敗血症、及び/若しくは敗血症性ショックを患うことの予防若しくは可能性の低減;並びに/又は
(xi)多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)の予防及び/若しくは治療。
【０１８９】
特定の実施形態において、適応症は(i)〜(iii)及び(v)〜(iix)からなる群より選択され、適応症(i)、(ii)及び/若しくは(iii);又は適応症(v)、適応症(vi)、適応症(vii)及び/若しくは適応症(iix)などである。
【０１９０】
別の特定の実施形態において、適応症は(i)である。さらなる特定の実施形態において、適応症は(v)である。なおさらなる特定の実施形態において、適応症は(iix)である。
【０１９１】
以下の適応症、2型糖尿病及び/又は肥満は、とりわけ好ましい。
【０１９２】
特定の実施形態
以下は本発明の特定の実施形態である。
【０１９３】
1. GLP-1(7-37)(配列番号1)の31位に相当する位置におけるヒスチジン(H)残基、GLP-1(7-37)(配列番号1)の34位に相当する位置におけるグルタミン(Q)残基、及びGLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して最大10個のアミノ酸改変を含み、前記H残基がH31で示され、前記Q残基がQ34で示されるGLP-1アナログ、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
【０１９４】
2. 最大9個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０１９５】
3. 最大8個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０１９６】
4. 最大7個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０１９７】
5. 最大6個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０１９８】
6. 最大5個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０１９９】
7. 最大4個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０２００】
8. 最大3個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０２０１】
9. 最大2個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０２０２】
10. 最小2個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜9のいずれか1つのアナログ。
【０２０３】
11. 最小3個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜8のいずれか1つのアナログ。
【０２０４】
12. 最小4個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜7のいずれか1つのアナログ。
【０２０５】
13. 最小5個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜6のいずれか1つのアナログ。
【０２０６】
14. 最小6個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜5のいずれか1つのアナログ。
【０２０７】
15. 最小7個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜4のいずれか1つのアナログ。
【０２０８】
16. 最小8個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜3のいずれか1つのアナログ。
【０２０９】
17. 最小9個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜2のいずれか1つのアナログ。
【０２１０】
18. 最小10個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０２１１】
19. 2個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０２１２】
20. 3個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０２１３】
21. 4個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０２１４】
22. 5個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０２１５】
23. 6個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０２１６】
24. 7個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０２１７】
25. 8個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０２１８】
26. 9個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０２１９】
27. 10個のアミノ酸改変を持つ、実施形態1のアナログ。
【０２２０】
28. アミノ酸改変が独立して、置換、付加及び/又は欠失である、実施形態1〜27のいずれか1つのアナログ。
【０２２１】
29. アミノ酸改変が置換である、実施形態1〜28のいずれか1つのアナログ。
【０２２２】
30. アミノ酸改変が欠失である、実施形態1〜28のいずれか1つのアナログ。
【０２２３】
31. アミノ酸改変が付加である、実施形態1〜28のいずれか1つのアナログ。
【０２２４】
32. C末端のアミドを持つ、実施形態1〜31のいずれか1つのアナログ。
【０２２５】
33. C末端*-COOH-基を持つ、実施形態1〜31のいずれか1つのアナログ。
【０２２６】
34. アミノ酸改変がGLP-1(7-37)(配列番号1)の7位、8位、12位、16位、18位、22位、24位、25位、26位、27位、30位、31位、34位、36位、37位及び/又は38位に相当する位置の1つ又は複数にある、実施形態1〜33のいずれか1つのアナログ。
【０２２７】
35. H31及びQ34以外のアミノ酸改変が(R34若しくはQ34)、K37、(Des7若しくはImp7)、(Des7、Aib8、N-メチル-Ala8、D-Ala8、G8若しくはS8)、K12、K16、K18、(E22若しくはK22)、K24、I25、(R26若しくはH26)、K27、E30、H31、Q34、K36、(K37若しくはP37)及び/又は(E38若しくはG38)から選択される、実施形態1〜34のいずれか1つのアナログ。
【０２２８】
36. i)Des7又はii)Imp7、好ましくはii)Imp7を含む、実施形態1〜35のいずれか1つのアナログ。
【０２２９】
37. i)Des7、ii)Aib8、iii)D-Ala8、iv)N-メチル-Ala8、v)G8若しくはvi)S8、好ましくはiii)D-Ala8、iv)N-メチル-Ala8、v)G8若しくはvi)S8、より好ましくはv)G8若しくはvi)S8、一層より好ましくはiii)D-Ala8若しくはiv)N-メチル-Ala8、又は最も好ましくはii)ib8を含む、実施形態1〜36のいずれか1つのアナログ。
【０２３０】
38. K12を含む、実施形態1〜37のいずれか1つのアナログ。
【０２３１】
39. K16を含む、実施形態1〜38のいずれか1つのアナログ。
【０２３２】
40. K18を含む、実施形態1〜39のいずれか1つのアナログ。
【０２３３】
41. i)E22又はii)K22、好ましくはi)E22を含む、実施形態1〜40のいずれか1つのアナログ。
【０２３４】
42. K24を含む、実施形態1〜41のいずれか1つのアナログ。
【０２３５】
43. I25を含む、実施形態1〜42のいずれか1つのアナログ。
【０２３６】
44. i)R26又はii)H26、好ましくはi)R26を含む、実施形態1〜43のいずれか1つのアナログ。
【０２３７】
45. K27を含む、実施形態1〜44のいずれか1つのアナログ。
【０２３８】
46. E30を含む、実施形態1〜45のいずれか1つのアナログ。
【０２３９】
47. K36を含む、実施形態1〜46のいずれか1つのアナログ。
【０２４０】
48. i)K37又はii)P37、好ましくはi)K37を含む、実施形態1〜47のいずれか1つのアナログ。
【０２４１】
49. i)E38又はii)K38、好ましくはi)E38を含む、実施形態1〜48のいずれか1つのアナログ。
【０２４２】
50. 以下のアミノ酸改変:(i) (31H, 34Q); (ii) (31H, 34Q, 37K); (iii) (8G, 31H, 34Q); (iv) (8Aib, 31H, 34Q); (v) (8a, 31H, 34Q); (vi) (des7, 31H, 34Q); (vii) (8S, 31H, 34Q); (iix) (8-N-メチル-A, 31H, 34Q); (ix) (des7-8, 31H, 34Q); (x) (8Aib, 31H, 34Q, 38K); (xi) (8Aib, 12K, 31H, 34Q); (xii) (8Aib, 31H, 34Q, 37K); (xiii) (22K, 26R, 31H, 34Q); (xiv) (22E, 24K, 26R, 31H, 34Q); (xv) (12K, 22E, 26R, 31H, 34Q); (xvi) (8Aib, 26R, 27K, 31H, 34Q); (xvii) (7Imp, 22E, 26R, 31H, 34Q, 37K); (iixx) (8Aib, 30E, 31H, 34Q, 36K, 38E); (ixx) (8Aib, 12K, 22E, 26R, 31H, 34Q); (xx) (8Aib, 18K, 22E, 26R, 31H, 34Q); (xxi) (8Aib, 18K, 22E, 26H, 31H, 34Q); (xxii) (8Aib, 22E, 26R, 27K, 31H, 34Q); (xxiii) (8Aib, 22E, 24K, 26R, 31H, 34Q); (xiv) (8Aib, 25I, 26R, 27K, 31H, 34Q); (xv) (8Aib, 16K, 22E, 26R, 31H, 34Q);又は(xvi) (8Aib, 22E, 26R, 27K, 30E, 31H, 34Q, 37P)を含む、好ましくは持つ、好ましくは化学式20、化学式22、化学式41、化学式44又は化学式45である、実施形態1〜49のいずれか1つのアナログ。
【０２４３】
51. GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して少なくとも1つのアミノ酸残基が欠失している、実施形態1〜50のいずれか1つのアナログ。
【０２４４】
52. des7及び/又はdes8、好ましくは両方を含む、実施形態1〜51のいずれか1つのアナログ。
【０２４５】
53. 1つのアミノ酸がGLP-1(7-37)(配列番号1)の7位に相当する位置において欠失している、実施形態1〜52のいずれか1つのアナログ。
【０２４６】
54. 1つのアミノ酸がGLP-1(7-37)(配列番号1)の8位に相当する位置において欠失している、実施形態1〜53のいずれか1つのアナログ。
【０２４７】
55. 2つのアミノ酸がGLP-1(7-37)(配列番号1)の7位及び8位に相当する位置において欠失している、実施形態1〜54のいずれか1つのアナログ。
【０２４８】
56. GLP-1(8-37)(配列番号1のアミノ酸の2〜31)のアナログであって、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して10個まで、9個まで、8個まで又は6個までのアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜55のいずれか1つのアナログ。
【０２４９】
57. GLP-1(9-37)(配列番号1のアミノ酸のそれぞれ3〜31)のアナログであって、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して10個まで、9個まで、8個まで又は6個までのアミノ酸改変を持つ、実施形態1〜56のいずれか1つのアナログ。
【０２５０】
58. His以外のHis模倣物がGLP-1(7-37)(配列番号1)の2位に相当する位置にある、実施形態1〜57のいずれか1つのアナログ。
【０２５１】
59. His-Ala以外のHis-Ala模倣物がGLP-1(7-37)(配列番号1)の7位及び8位に相当する位置にある、実施形態1〜58のいずれか1つのアナログ。
【０２５２】
60. His模倣物又はHis-Ala模倣物がa)イミダゾール、又はb)ピリジンを含む、実施形態58〜59のいずれか1つのアナログ。
【０２５３】
61. イミダゾールがアナログのN末端アミノ酸の*-NHへのアミド結合の形成を通じた共有結合性カップリングのための*-CO末端を含むイミダゾールの誘導体である、実施形態60のアナログ。
【０２５４】
62. ピリジンがアナログのN末端アミノ酸の*-NHへのアミド結合の形成を通じた共有結合性カップリングのための*-CO末端を含むピリジンの誘導体である、実施形態60のアナログ。
【０２５５】
63. イミダゾール誘導体が一置換体である、実施形態61のアナログ。
【０２５６】
64. ピリジン誘導体が一置換体である、実施形態62のアナログ。
【０２５７】
65. イミダゾール誘導体が1個から6個までの炭素原子を持つ低級アルキルのカルボン酸ラジカルを含む基で置換されている、実施形態61及び63のいずれか1つのアナログ。
【０２５８】
66. ピリジン誘導体が1個から6個までの炭素原子を持つ低級アルキルのカルボン酸ラジカルを含む基で置換されている、実施形態62及び64のいずれか1つのアナログ。
【０２５９】
67. カルボン酸ラジカルがアセチル及び直鎖又は分枝のプロピニル、ブチリル、ペンタノイルから選択される、好ましくはアセチルである、実施形態65〜66のいずれか1つのアナログ。
【０２６０】
68. GLP-1(7-37)(配列番号1)の8位に相当する位置におけるアミノ酸残基のN原子に3H-イミダゾール-4-イル-アセチルが付着されている、実施形態1〜67のいずれか1つのアナログ。
【０２６１】
69. 配列番号1の8位に相当する位置におけるアミノ酸残基がアラニンである、実施形態1〜68のいずれか1つのアナログ。
【０２６２】
70. イミダゾールが(メチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル、(エチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル、(プロピルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル又は(ブチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニルで置換されている、好ましくは(エチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニルで置換されている、実施形態60〜69のいずれか1つのアナログ。
【０２６３】
71. GLP-1(7-37)(配列番号1)の9位に相当する位置におけるアミノ酸残基のN原子に{2-[2-(1H-イミダゾール-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}が付着されている、実施形態1〜70のいずれか1つのアナログ。
【０２６４】
72. ピリジンが(メチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル、(エチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル、(プロピルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニル又は(ブチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニルで置換されている、好ましくは(メチルカルバモイル)-2-メチル-プロピオニルで置換されている、実施形態60〜71のいずれか1つのアナログ。
【０２６５】
73. GLP-1(7-37)(配列番号1)の9位に相当する位置におけるアミノ酸残基のN原子に [2,2-ジメチル-3-オキソ-3-(ピリジン-2-イルメチルアミノ)プロパノイル]が付着されている、実施形態1〜72のいずれか1つのアナログ。
【０２６６】
74. GLP-1アナログの9位に相当する位置におけるアミノ酸残基がグルタミン酸である、実施形態1〜73のいずれか1つのアナログ。
【０２６７】
75. 最大2個のK残基を持つ、実施形態1〜74のいずれか1つのアナログ。
【０２６８】
76. 最大1個のK残基を持つ、実施形態1〜75のいずれか1つのアナログ。
【０２６９】
77.
a)GLP-1(7-37)(配列番号1)の指示された位置のいずれかに相当する位置、及び/又は
b)GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したアミノ酸改変の数
が筆記及び視認により同定される、実施形態1〜76のいずれか1つのアナログ。
【０２７０】
78.
a)GLP-1(7-37)(配列番号1)の指示された位置のいずれかに相当する位置、及び/又は
b)GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較したアミノ酸改変の数
が標準的なタンパク質又はペプチドアラインメントプログラムの使用により同定される、実施形態1〜77のいずれか1つのアナログ。
【０２７１】
79. アラインメントプログラムがNeedleman-Wunschアラインメントである、実施形態78のアナログ。
【０２７２】
80. デフォルトのスコア行列及びデフォルトの同一性行列が用いられる、実施形態78〜79のいずれか1つのアナログ。
【０２７３】
81. スコア行列がBLOSUM62である、実施形態78〜80のいずれか1つのアナログ。
【０２７４】
82. ギャップ中の第一の残基についてのペナルティが-10(マイナス10)である、実施形態78〜81のいずれか1つのアナログ。
【０２７５】
83. ギャップ中の付加的な残基についてのペナルティが-0.5(マイナス0.5)である、実施形態78〜82のいずれか1つのアナログ。
【０２７６】
84. 実施形態1におけるH31及びQ34の定義と同様に、アミノ酸残基の後ろの上付き文字で、又は当該アミノ酸残基の前若しくは後ろの通常の書体で表される残基の番号、好ましくは任意の残基の番号が、GLP-1(7-37)(配列番号1)の相当する位置を参照する、実施形態1〜83のいずれか1つのアナログ。
【０２７７】
85. 実施形態1〜84のいずれか1つのアナログの誘導体、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
【０２７８】
86. アナログのリジン残基に、より好ましくはそのイプシロン-アミノ基に、アミド結合を通じて付着されたアルブミン結合部分を持つ、実施形態85の誘導体。
【０２７９】
87. i)K12、ii)K16、iii)K18、iv)K22、v)K24、vi)K26、vii)K27、iix)K36、及び/又はix)K37に付着されたアルブミン結合部分を持ち、上付き文字の各残基の番号がGLP-1(7-37)(配列番号1)における相当する位置を参照する、実施形態86の誘導体。
【０２８０】
88. i)K12、iii)K18、vi)K26、及び/又はvii)K27;好ましくはvi)K26に付着されたアルブミン結合部分を持つ、実施形態87の誘導体。
【０２８１】
89. i)K12、iii)K18、v)K24、vi)K26、及び/又はvii)K27に付着されたアルブミン結合部分を持つ、実施形態87の誘導体。
【０２８２】
90. i)K12、vi)K26、及び/又はvii)K27に付着されたアルブミン結合部分を持つ、実施形態87〜88のいずれか1つの誘導体。
【０２８３】
91. 好ましくはK26及びK37に付着された、2つのアルブミン結合部分を持つ、実施形態87の誘導体。
【０２８４】
92. アルブミン結合部分が持続時間延長性部分を含む、実施形態85〜91のいずれか1つの誘導体。
【０２８５】
93. 持続時間延長性部分が化学式1、化学式2、化学式3及び化学式4
化学式1:        CH3-(CH2)x-CO-*
化学式2:        HOOC-(CH2)x-CO-*
化学式3:        HN4C-(CH2)x-CO-*
化学式4:        HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中xは6〜18、好ましくは6〜16の範囲の整数、yは3〜17の範囲の整数)から選択される、実施形態92の誘導体。
【０２８６】
94. 持続時間延長性部分が化学式1又は化学式2であり、xが好ましくは偶数である、実施形態93の誘導体。
【０２８７】
95. xがi)10、ii)12、iii)14、iv)16若しくはv)18、好ましくはiii)14若しくはiv)16、より好ましくはi)10、ii)12若しくはv)18、又は最も好ましくはiv)16である、実施形態93〜94のいずれか1つの誘導体。
【０２８８】
96. 持続時間延長性部分が化学式1である、実施形態93〜95のいずれか1つの誘導体。
【０２８９】
97. 化学式1が化学式1a
化学式1a:
【０２９０】
【化１】
0006006118.tif 000002
【０２９１】
により表され、xが実施形態93〜95のいずれか1つに規定される、実施形態93〜96のいずれか1つの誘導体。
【０２９２】
98. 持続時間延長性部分が化学式2である、実施形態93〜95のいずれか1つの誘導体。
【０２９３】
99. 化学式2が化学式2a
化学式2a:
【０２９４】
【化２】
0006006118.tif 000003
【０２９５】
により表され、xが実施形態84〜86のいずれか1つに規定される、実施形態93〜95のいずれか1つの誘導体。
【０２９６】
100. 持続時間延長性部分が化学式3で、xが好ましくは奇数である、実施形態93の誘導体。
【０２９７】
101. xがi)11、ii)13、iii)15、iv)17又はv)19、好ましくはiii)15である、実施形態93及び100のいずれか1つの誘導体。
【０２９８】
102. 化学式3が化学式3a
化学式3a:
【０２９９】
【化３】
0006006118.tif 000004
【０３００】
により表され、xが実施形態93及び100〜101のいずれか1つに規定される、実施形態93及び100〜101のいずれか1つの誘導体。
【０３０１】
103. 持続時間延長性部分が化学式4で、yが好ましくは奇数である、実施形態93の誘導体。
【０３０２】
104. yがi)5、ii)7、iii)9、iv)11又はv)13、好ましくはiii)9である、実施形態93及び103のいずれか1つの誘導体。
【０３０３】
105. 化学式4が化学式4a又は化学式4b
化学式4a:
【０３０４】
【化４】
0006006118.tif 000005
【０３０５】
化学式4b:
【０３０６】
【化５】
0006006118.tif 000006
【０３０７】
により、好ましくは化学式4aにより表され、yが実施形態93及び103〜104のいずれか1つに規定される、実施形態93及び103〜104のいずれか1つの誘導体。
【０３０８】
106. アルブミン結合部分が1つの持続時間延長性部分を含む、実施形態86〜105のいずれか1つの誘導体。
【０３０９】
107. アルブミン結合部分が2つの持続時間延長性部分を含む、実施形態86〜105のいずれか1つの誘導体。
【０３１０】
108. 持続時間延長性部分が全く同一のリジン残基に、好ましくはリンカーを通じて付着されている、実施形態107の誘導体。
【０３１１】
109. 持続時間延長性部分が2つの異なるリジン残基に、好ましくはリンカーを通じて付着されている、実施形態107の誘導体。
【０３１２】
110. リンカーを含む、実施形態87〜109のいずれか1つの誘導体。
【０３１３】
111. アルブミン結合部分がリンカーを含む、実施形態87〜110のいずれか1つの誘導体。
【０３１４】
112. アルブミン結合部分がリンカーをさらに含む、実施形態92〜111のいずれか1つの誘導体。
【０３１５】
113. リンカーがNラジカル及びCOラジカルを含むジラジカルであって、
i)Nラジカルが第一の*-NR1R2基により表され、R1及びR2は独立して水素、炭素又は硫黄を示すことが可能で、任意で置換されており、及び
ii)COラジカルが第一の*-CO基により表され、
好ましくは、第一の*-NR1R2基は第二の*-CO基とアミド結合を形成する能力があり、第一の*-CO基は第二の*-NR1R2基とアミド結合を形成する能力があり、第二の*-NR1R2基及び第二の*-CO基はそれぞれ第一の*-NR1R2基及び第一の*-CO基として規定され、i)アナログ、ii)持続時間延長性部分、及び/又はiii)別のリンカーの構造の一部を独立して形成する、実施形態110〜112のいずれか1つの誘導体。
【０３１６】
114. 化学式5、化学式6、化学式7、化学式8、化学式9及び化学式10
化学式5:   *-NH-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)k-O-(CH2)n-CO-*
化学式6:   *-NH-C(COOH)-(CH2)2-CO-*
化学式7:   *-N-C((CH2)2COOH)-CO-*
化学式8:   *-NH-C6H8-CO-*
化学式9:   *-NC5H8-CO-*
化学式10:   *-NH-SO2-(CH2)3-CO-*
(式中kは1〜5の範囲の整数、nは1〜5の範囲の整数、化学式6及び化学式7はGluのジラジカル)からなる群より選択される少なくとも1つのリンカーを含む、実施形態86〜113のいずれか1つの誘導体。
【０３１７】
115. リンカーが化学式5を含み、好ましくは化学式5が第一のリンカー構成成分である、実施形態110〜114のいずれか1つの誘導体。
【０３１８】
116. kが1である、実施形態114〜115のいずれか1つの誘導体。
【０３１９】
117. nが1である、実施形態114〜116のいずれか1つの誘導体。
【０３２０】
118. 化学式5がm回包含され、mが1〜10の範囲の整数である、実施形態114〜117のいずれか1つの誘導体
【０３２１】
119. mが1〜6の範囲の整数、好ましくは1〜4の範囲の整数、より好ましくはmが1若しくは2、一層より好ましくはmが1、又は最も好ましくはmが2である、実施形態118の誘導体。
【０３２２】
120. mが1でない場合、化学式5構成成分がアミド結合を通じて相互連結されている、実施形態118〜119のいずれか1つの誘導体。
【０３２３】
121. リンカーが1つ又は複数の化学式5構成成分からなる、実施形態114〜120のいずれか1つの誘導体。
【０３２４】
122. 化学式5が化学式5a
化学式5a:
【０３２５】
【化６】
0006006118.tif 000007
【０３２６】
により表され、k及びnが実施形態114〜117のいずれか1つに規定される、実施形態114〜121のいずれか1つの誘導体。
【０３２７】
123. リンカーが化学式6及び化学式7などのGluジラジカルを含む、実施形態114〜122のいずれか1つの誘導体。
【０３２８】
124. 化学式6及び化学式7が独立して、それぞれ化学式6a及び化学式7a
化学式6a:
【０３２９】
【化７】
0006006118.tif 000008
【０３３０】
化学式7a:
【０３３１】
【化８】
0006006118.tif 000009
【０３３２】
により、最も好ましくは化学式6aにより表され得る、実施形態114〜123のいずれか1つの誘導体。
【０３３３】
125. 独立して化学式6及び/又は化学式7などのGluジラジカルがp回包含され、pが1〜3の範囲の整数である、実施形態114〜124のいずれか1つの誘導体。
【０３３４】
126. pが1、2若しくは3、好ましくは1若しくは2、又は最も好ましくは1である、実施形態125の誘導体。
【０３３５】
127. GluジラジカルがL-Glu又はD-Gluのラジカル、好ましくはL-Gluのラジカルである、実施形態114〜126のいずれか1つの誘導体。
【０３３６】
128. リンカーがGluジラジカルから、好ましくは化学式6から、より好ましくは化学式6aからなる、実施形態114〜127のいずれか1つの誘導体。
【０３３７】
129. リンカーが化学式8を含む、実施形態114〜128のいずれか1つの誘導体。
【０３３８】
130. 化学式8が化学式8a
化学式8a:
【０３３９】
【化９】
0006006118.tif 000010
【０３４０】
により表され、好ましくは化学式8bにより表される、実施形態129の誘導体。
化学式8b:
【０３４１】
【化１０】
0006006118.tif 000011
【０３４２】
131. 化学式9を含む、実施形態114〜130のいずれか1つの誘導体。
【０３４３】
132. 化学式9が化学式9aにより表される、実施形態131の誘導体。
化学式9a:
【０３４４】
【化１１】
0006006118.tif 000012
【０３４５】
133. 化学式10を含む、実施形態114〜132のいずれか1つの誘導体。
【０３４６】
134. 化学式10が化学式10aにより表される、実施形態133の誘導体。
化学式10a:
【０３４７】
【化１２】
0006006118.tif 000013
【０３４８】
135. リンカーがアミド結合を通じて相互連結された2回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、リンカーの*-CO末端においてGLP-1アナログのリジン残基のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態114〜134のいずれか1つの誘導体。
【０３４９】
136. リンカーが化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、リンカーの*-CO末端においてGLP-1アナログのリジン残基のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態114〜134のいずれか1つの誘導体。
【０３５０】
137. リンカーが化学式6からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、リンカーの*-CO末端においてGLP-1アナログのリジン残基のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態114〜134のいずれか1つの誘導体。
【０３５１】
138. リンカーがアミド結合を通じて指示された順序で相互連結された、2回の化学式5、及び1回の化学式6からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、リンカーの*-CO末端においてGLP-1アナログのリジン残基のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態114〜134のいずれか1つの誘導体。
【０３５２】
139. リンカーがアミド結合を通じて指示された順序で相互連結された、1回の化学式6、及び2回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、リンカーの*-CO末端においてGLP-1アナログのリジン残基のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態114〜134のいずれか1つの誘導体。
【０３５３】
140. リンカーがアミド結合を通じて指示された順序で相互連結された、1回の化学式5、1回の化学式6、及び1回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、リンカーの*-CO末端においてGLP-1アナログのリジン残基のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態114〜134のいずれか1つの誘導体。
【０３５４】
141. リンカーがアミド結合を通じて指示された順序で相互連結された、1回の化学式6、及び1回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、リンカーの*-CO末端においてGLP-1アナログのリジン残基のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態114〜134のいずれか1つの誘導体。
【０３５５】
142. リンカーがアミド結合を通じて指示された順序で相互連結された、1回の化学式8、1回の化学式6、好ましくはD型の化学式6、及び2回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、リンカーの*-CO末端においてGLP-1アナログのリジン残基のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態114〜134のいずれか1つの誘導体。
【０３５６】
143. リンカーがアミド結合を通じて指示された順序で相互連結された、1回の化学式9、1回の化学式6、及び2回の化学式5からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、リンカーの*-CO末端においてGLP-1アナログのリジン残基のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態114〜134のいずれか1つの誘導体。
【０３５７】
144. リンカーが1回の化学式10からなり、リンカーの*-NH末端において持続時間延長性部分の*-CO末端に連結され、リンカーの*-CO末端においてGLP-1アナログのリジン残基のイプシロンアミノ基に連結されている、実施形態114〜134のいずれか1つの誘導体。
【０３５８】
145. １つ又は複数のリンカーがアミド結合を通じて相互連結される、実施形態110〜144のいずれか1つの誘導体。
【０３５９】
146. 化学式20、化学式21、化学式22、化学式23、化学式24、化学式25、化学式26、化学式27、化学式28、化学式29、化学式30、化学式31、化学式32、化学式33、化学式34、化学式35、化学式36、化学式37、化学式38、化学式39、化学式40、化学式41、化学式42、化学式43、化学式44、化学式45、化学式46、化学式47、化学式48、化学式49、化学式50、化学式51、化学式52、化学式53、化学式54、化学式55、化学式56、化学式57、化学式58、化学式59、化学式60、化学式61、化学式62、化学式63、化学式64、化学式65、及び化学式66から選択される化合物、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
【０３６０】
147. 名称により特徴づけられ、本明細書の実施例1〜47の各々の化合物名称の表から選択される化合物、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
【０３６１】
148. 実施形態146の化合物である、実施形態147の化合物。
【０３６２】
149. 実施形態1〜84のいずれか1つのアナログである、実施形態146〜148のいずれか1つの化合物。
【０３６３】
150. 実施形態85〜145のいずれか1つの誘導体である、実施形態146〜148のいずれか1つの化合物。
【０３６４】
151. 実施形態85〜150のいずれか1つの誘導体である、以下から選択される化合物である。
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド;
化学式21:
【０３６５】
【化１３】
0006006118.tif 000014
【０３６６】
Nε12-12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド;
化学式46:
【０３６７】
【化１４】
0006006118.tif 000015
【０３６８】
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]-Nε37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド;
化学式47: 
【０３６９】
【化１５】
0006006118.tif 000016
【０３７０】
Nε26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Ser8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド;
化学式32:
【０３７１】
【化１６】
0006006118.tif 000017
【０３７２】
Nε26[2-(2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド:
化学式35:
【０３７３】
【化１７】
0006006118.tif 000018
【０３７４】
Nε26[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド;
化学式38:
【０３７５】
【化１８】
0006006118.tif 000019
【０３７６】
Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]、Nε37-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド;
化学式56:
【０３７７】
【化１９】
0006006118.tif 000020
【０３７８】
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu22,Lys24,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド;
化学式60:
【０３７９】
【化２０】
0006006118.tif 000021
【０３８０】
Nε16-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys16,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド;
化学式62:
【０３８１】
【化２１】
0006006118.tif 000022
【０３８２】
Nε12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド;及び
化学式65: から選択される、実施形態85〜150のいずれか1つの誘導体。
【０３８３】
【化２２】
0006006118.tif 000023
152.以下から選択される、実施形態85〜150のいずれか1つの誘導体。
【０３８４】
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド;
化学式21:
【０３８５】
【化２３】
0006006118.tif 000024
【０３８６】
Nε12-12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド;
化学式46:
【０３８７】
【化２４】
0006006118.tif 000025
【０３８８】
Nε26[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
; 化学式38:
【０３８９】
【化２５】
0006006118.tif 000026
【０３９０】
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu22,Lys24,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド;
化学式60:
【０３９１】
【化２６】
0006006118.tif 000027
【０３９２】
Nε16-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys16,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド;
化学式62:
【０３９３】
【化２７】
0006006118.tif 000028
【０３９４】
Nε12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド;及び
化学式65: 
【０３９５】
【化２８】
0006006118.tif 000029
【０３９６】
153. 以下から選択される、実施形態85〜150のいずれか1つの誘導体。
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式21:
【０３９７】
【化２９】
0006006118.tif 000030
【０３９８】
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]-Nε37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド;
化学式47:
【０３９９】
【化３０】
0006006118.tif 000031
【０４００】
Nε26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Ser8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド;
化学式32:
【０４０１】
【化３１】
0006006118.tif 000032
【０４０２】
Nε26[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド;及び
化学式38:
【０４０３】
【化３２】
0006006118.tif 000033
【０４０４】
から選択され、好ましくは、
Nε26[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Ser8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド;
化学式32:
【０４０５】
【化３３】
0006006118.tif 000034
【０４０６】
及び
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド;
化学式21: から選択される、実施形態85〜150のいずれか1つの誘導体。
【０４０７】
【化３４】
0006006118.tif 000035
【０４０８】
154. 化学式21又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態151〜153のいずれか1つの誘導体。
【０４０９】
155. 化学式32又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態151〜153のいずれか1つの誘導体。
【０４１０】
156. 化学式35又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態151〜153のいずれか1つの誘導体。
【０４１１】
157. 化学式38又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態151〜153のいずれか1つの誘導体。
【０４１２】
158. 化学式46又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態151〜153のいずれか1つの誘導体。
【０４１３】
159. 化学式47又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態151〜153のいずれか1つの誘導体。
【０４１４】
160. 化学式56又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態151〜153のいずれか1つの誘導体。
【０４１５】
161. 化学式60又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態151〜153のいずれか1つの誘導体。
【０４１６】
162. 化学式62又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態151〜153のいずれか1つの誘導体。
【０４１７】
163. 化学式65又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステルである、実施形態151〜153のいずれか1つの誘導体。
【０４１８】
164. GLP-1活性を持つ、実施形態1〜163のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４１９】
165. GLP-1活性がヒトGLP-1受容体を活性化する能力をいう、実施形態164のアナログ又は誘導体。
【０４２０】
166. ヒトGLP-1受容体の活性化がin vitroアッセイにおいてcAMP生産能として測定される、実施形態165のアナログ又は誘導体。
【０４２１】
167. 4500pM以下、好ましくは4500pMより低い、より好ましくは4000pMより低い、一層より好ましくは3500pMより低い、又は最も好ましくは3000pMより低いEC50に相当する効力を持つ、実施形態1〜166のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４２２】
168. 2500pMより低い、好ましくは2000pMより低い、より好ましくは1500pMより低い、一層より好ましくは1000pMより低い、又は最も好ましくは800pMより低いEC50に相当する効力を持つ、実施形態1〜167のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４２３】
169. 600pMより低い、好ましくは500pMより低い、より好ましくは400pMより低い、一層より好ましくは300pMより低い、又は最も好ましくは200pMより低いEC50に相当する効力を持つ、実施形態1〜168のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４２４】
170. 180pMより低い、好ましくは160pMより低い、より好ましくは140pMより低い、一層より好ましくは120pMより低い、又は最も好ましくは100pMより低いEC50に相当する効力を持つ、実施形態1〜169のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４２５】
171. 80pMより低い、好ましくは60pMより低い、より好ましくは50pMより低い、一層より好ましくは40pMより低い、又は最も好ましくは30pMより低いEC50に相当する効力を持つ、実施形態1〜170のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４２６】
172. 効力がヒトGLP-1受容体を含有する培地における用量依存的なcAMP形成を示す用量応答曲線についてのEC50として、好ましくはBHK467-12A(tk-ts13)などの安定的に形質導入された細胞株を用いて、及び/又はcAMPの決定のために機能受容体アッセイを用いて決定される、実施形態1〜171のいずれか1つのアナログ又は誘導体であって、前記アッセイが例として内因的に形成されたcAMPと外因的に追加されたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づくものであり、前記アッセイにおいてcAMPはより好ましくは特異的な抗体を用いて捕捉され、及び/又は一層より好ましくは前記アッセイがAlphaScreen cAMP Assayであり、最も好ましくは実施例48に記載されるアッセイである、アナログ又は誘導体。
【０４２７】
173. EC50がセマグルチドのEC50の10倍より小さい、好ましくはセマグルチドのEC50の8倍より小さい、より好ましくはセマグルチドのEC50の6倍より小さい、一層より好ましくはセマグルチドのEC50の4倍より小さい、又は最も好ましくはセマグルチドのEC50の2倍より小さい、実施形態1〜172のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４２８】
174. EC50がセマグルチドのEC50より小さい、好ましくはセマグルチドのEC50の0.8倍より小さい、より好ましくはセマグルチドのEC50の0.6倍より小さい、一層より好ましくはセマグルチドのEC50の0.4倍より小さい、又は最も好ましくはセマグルチドのEC50の0.2倍より小さい、実施形態1〜173のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４２９】
175. EC50がリラグルチドのEC50の10倍より小さい、好ましくはリラグルチドのEC50の8倍より小さい、より好ましくはリラグルチドのEC50の6倍より小さい、一層より好ましくはリラグルチドのEC50の4倍より小さい、又は最も好ましくはリラグルチドのEC50の2倍より小さい、実施形態1〜174のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４３０】
176. EC50がリラグルチドのEC50より小さい、好ましくはリラグルチドのEC50の0.8倍より小さい、より好ましくはリラグルチドの効力の0.6倍より小さい、一層より好ましくはリラグルチドのEC50の0.5倍より小さい、又は最も好ましくはリラグルチドのEC50の0.4倍より小さい、実施形態1〜175のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４３１】
177. 比率[0.005% HSA(低アルブミン)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)で除算された2.0% HSA(高アルブミン)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)]が
a)少なくとも0.5、好ましくは少なくとも1.0、より好ましくは少なくとも10、一層より好ましくは少なくとも20、若しくは最も好ましくは少なくとも30;
b)少なくとも40、好ましくは少なくとも50、より好ましくは少なくとも60、一層より好ましくは少なくとも70、若しくは最も好ましくは少なくとも80;
c)少なくとも90、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも200、なおより好ましくは少なくとも300、一層より好ましくは少なくとも400、若しくは最も好ましくは少なくとも500;
d)少なくとも600、好ましくは少なくとも700、より好ましくは少なくとも800、一層より好ましくは少なくとも1000、若しくは最も好ましくは少なくとも1300;
e)セマグルチドの比率の少なくとも20%、好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも50%、より好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも75%、一層より好ましくはセマグルチドの比率と少なくとも等しい、若しくは最も好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも2倍である;又は
f)リラグルチドの比率と少なくとも等しい、好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも2倍、より好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも3倍、一層より好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも5倍、若しくは最も好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも10倍
である、実施形態85〜176のいずれか1つの誘導体。
【０４３２】
178. 0.005% HSA(低アルブミン)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)が
a)600.00nMより低い、好ましくは500.00nMより低い、より好ましくは200.00nMより低い、一層より好ましくは100.00nMより低い、若しくは最も好ましくは50.00nMより低い;又は
b)20.00nMより低い、好ましくは10.00nMより低い、より好ましくは5.00nMより低い、一層より好ましくは2.00nMより低い、若しくは最も好ましくは1.00nMより低い、実施形態1〜177のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４３３】
179. 2.0% HSA(高アルブミン)存在下でのGLP-1受容体結合アフィニティー(IC50)が
a)1000.00nM以下、好ましくは900.00nMより低い、より好ましくは800nMより低い、一層より好ましくは700nMより低い、若しくは最も好ましくは600nMより低い;又は
b)400.00nMより低い、好ましくは300.00nMより低い、より好ましくは200.00nMより低い、一層より好ましくは100.00nMより低い、若しくは最も好ましくは50.00nMより低い、実施形態85〜178のいずれか1つの誘導体。
【０４３４】
180. GLP-1受容体への結合アフィニティーが受容体からの125I-GLP-1の転置として、好ましくはSPA結合アッセイを用いて測定される、実施形態1〜179のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４３５】
181. GLP-1受容体が安定的に形質導入された細胞株を用いて、好ましくはハムスター細胞株を用いて、より好ましくはBHK tk-ts13などのベビーハムスター腎臓細胞株を用いて調製される、実施形態1〜180のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４３６】
182. IC50値が受容体から125I-GLP-1の50%を転置させる濃度として決定される、実施形態1〜181のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４３７】
183. リラグルチドより高い経口での生物学的利用能;及び/又はセマグルチドより高い経口での生物学的利用能、好ましくは経口での絶対的生物学的利用能を持つ、実施形態85〜182のいずれか1つの誘導体。
【０４３８】
184. 経口での生物学的利用能がラットにおいて、腸管腔への直接注射後の血漿中曝露としてin vivoで測定される、実施形態183の誘導体。
【０４３９】
185. 注射された溶液の濃度(μM)で除算された、ラット空腸内への誘導体溶液注射の30分後に決定された誘導体の血漿濃度(pM)(用量補正された30分時の曝露)が、少なくとも15、好ましくは少なくとも30、より好ましくは少なくとも48、なおより好ましくは少なくとも62、一層より好ましくは少なくとも80、又は最も好ましくは少なくとも100である、実施形態85〜184のいずれか1つの誘導体。
【０４４０】
186. 注射された溶液の濃度(μM)で除算された、ラット空腸内への誘導体溶液注射の30分後に決定された誘導体の血漿濃度(pM)(用量補正された30分時の曝露)が、少なくとも110、好ましくは少なくとも120、より好ましくは少なくとも130、なおより好ましくは少なくとも140、一層より好ましくは少なくとも150、又は最も好ましくは少なくとも160である、実施形態85〜185のいずれか1つの誘導体。
【０４４１】
187. 注射された溶液の濃度(μM)で除算された、ラット空腸内への誘導体溶液注射の30分後に決定された誘導体の血漿濃度(pM)(用量補正された30分時の曝露)が、少なくとも180、好ましくは少なくとも210、より好ましくは少なくとも240、又は最も好ましくは少なくとも280である、実施形態85〜186のいずれか1つの誘導体。
【０４４２】
188. GLP-1誘導体が1000uMの濃度で55mg/mlカプリン酸ナトリウムとの混合物中で試験される、実施形態85〜187のいずれか1つの誘導体。
【０４４３】
189. 雄性Sprague Dawleyラットが用いられ、好ましくは到着時のその体重がおよそ240gである、実施形態85〜188のいずれか1つの誘導体。
【０４４４】
190. ラットを実験前におよそ18時間絶食させる、実施形態85〜189のいずれか1つの誘導体。
【０４４５】
191. ラットが絶食後、空腸内への誘導体の注射前に全身麻酔をかけられる、実施形態85〜190のいずれか1つの誘導体。
【０４４６】
192. 誘導体が空腸の近位部(十二指腸の10cm遠位)内、又は中腸(盲腸の50cm近位)内に投与される、実施形態85〜191のいずれか1つの誘導体。
【０４４７】
193. 100μlの誘導体が1mlシリンジを使用してカテーテルを通じて空腸管腔内に注射され、続いて200μlの空気が別のシリンジを使用して空腸管腔内に押し入れられ、その後カテーテル内への逆流を防ぐためにカテーテルに連結されたままにされる、実施形態85〜192のいずれか1つの誘導体。
【０４４８】
194. 血液サンプル(200ul)が0、10、30、60、120及び240分時などの所望の間隔で尾静脈からEDTAチューブ内に回収され、20分以内に4℃で5分間、10000Gで遠心分離される、実施形態85〜193のいずれか1つの誘導体。
【０４４９】
195. 血漿(75ul)が分離され、速やかに凍結され、血漿中の誘導体濃度について分析されるまで-20℃で保存される、実施形態85〜194のいずれか1つの誘導体。
【０４５０】
196. LOCI(蛍光酸素チャンネリングイムノアッセイ)が血漿中の誘導体濃度を分析するために用いられる、実施形態85〜195のいずれか1つの誘導体。
【０４５１】
197. db/dbマウスにおいてin vivoで血糖を低下させるのに有効である、実施形態1〜196のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４５２】
198. db/dbマウスにおいてin vivoで体重を低下させるのに有効である、実施形態1〜197のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４５３】
199. db/dbマウスが適切な用量範囲のGLP-1アナログ又は誘導体を皮下に処置され、血糖及び/又は体重が適当な間隔で決定される、実施形態1〜198のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４５４】
200. GLP-1アナログ又は誘導体の用量が0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、3.0nmol/kg,10nmol/kg、30nmol/kg及び100nmol/kgであって、kgはマウスの体重を参照する、実施形態199のアナログ又は誘導体。
【０４５５】
201. 対照群がビヒクル、好ましくはGLP-1アナログ又は誘導体が溶解される溶媒、例として50mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウム、0.05% tween 80、pH7.4の組成の溶媒を皮下に処置される、実施形態197〜200のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４５６】
202. -1/2時間時(投薬(t=0)の30分前)、及び1、2、4、8、24、48、72及び96時間時に血糖が決定され、及び/又はマウスが秤量される、実施形態197〜201のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４５７】
203. グルコース濃度がグルコースオキシダーゼ法を用いて測定される、実施形態197〜202のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４５８】
204.
(i)ED50(体重(BW))がアナログ又は誘導体の皮下投与後24時間のBWのデルタ(例として減少)に対する最大半量効果を生じる用量として計算される、及び/又は
(ii)ED50(血糖(BG))がアナログ又は誘導体の皮下投与後8時間のBGのAUC(曲線下面積)デルタ(例として減少)に対する最大半量効果を生じる用量として計算される、
実施形態197〜203のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４５９】
205. S字状の用量反応関係、好ましくは最大応答が明確に規定されるS字状の用量反応関係が存在する、実施形態197〜204のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４６０】
206. リラグルチドより持続時間延長された作用プロファイルを持つ、実施形態85〜205のいずれか1つの誘導体。
【０４６１】
207. 持続時間延長がdb/dbマウス、ラット、ブタ、及び/又は好ましくはミニブタなどの関連する動物種におけるin vivoの半減期を意味し、誘導体がi)皮下、及び/又は好ましくはii)皮下に投与される、実施形態206の誘導体。
【０４６２】
208. ミニブタにおける静脈内投与後の終末相半減期(T1/2)が
a)少なくとも12時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも36時間、一層より好ましくは少なくとも48時間、若しくは最も好ましくは少なくとも60時間;又は
b)セマグルチドの半減期の少なくとも0.2倍、好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも0.4倍、より好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも0.6倍、一層より好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも0.8倍、若しくは最も好ましくはセマグルチドの半減期と少なくとも同じ
である、実施形態206〜207のいずれか1つの誘導体。
【０４６３】
209. ミニブタが雄性Gottingenミニブタである、実施形態207から208のいずれか1つの誘導体。
【０４６４】
210. ミニブタが7〜14カ月齢で、好ましくは16〜35kgの体重である、実施形態207〜209のいずれか1つの誘導体。
【０４６５】
211. ミニブタが個別に飼育され、1日1回又は2回、好ましくはSDSミニブタ食を給餌される、実施形態207〜210のいずれか1つの誘導体。
【０４６６】
212. 少なくとも2週間の順化の後、誘導体が静脈内に投薬される、実施形態207〜211のいずれか1つの誘導体。
【０４６７】
213. 動物を投薬前およそ18時間及び投薬後少なくとも4時間絶食させ、及び全期間を通じて水を自由摂取させる、実施形態207〜212のいずれか1つの誘導体。
【０４６８】
214. GLP-1誘導体が50mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウム、0.05% tween 80、pH7.4の中に、適切な濃度、好ましく20〜60nmol/mlで溶解される、実施形態207〜213のいずれか1つの誘導体。
【０４６９】
215. 誘導体の静脈内注射が1〜2nmol/kgに相当する容量でなされる、実施形態207〜214のいずれか1つの誘導体。
【０４７０】
216. ミニブタにおけるグルコース刺激性インスリン分泌を増加させる、実施形態1〜215のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４７１】
217. ミニブタが雄性Gottingenミニブタである、実施形態216のアナログ又は誘導体。
【０４７２】
218. ミニブタが7〜14カ月齢である、実施形態216〜217のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４７３】
219. ミニブタが一匹用の檻の中で飼育され、1日1回又は2回、好ましくはSDSミニブタ飼料を給餌される、実施形態216〜218のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４７４】
220. 単回投与が、任意で用量増加を伴う期間の後に、耳の後ろの薄い皮膚において静脈内又は皮下になされる、実施形態216〜219のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４７５】
221. 動物を投薬前におよそ18時間絶食させる、実施形態216〜220のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４７６】
222. ベースライン群及び2〜6の異なる血漿濃度レベルに相当するいくつかの誘導体用量群が試験され、ベースライン群がa)ビヒクル処置される、又はb)処置されない、実施形態216〜221のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４７７】
223. 血漿濃度レベルが3000〜80000pMである、実施形態216〜222のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４７８】
224. 1又は2時間の静脈内耐糖能試験(IVGTT)が行われる、実施形態216〜223のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４７９】
225. 0.3g/kgグルコースが30秒間かけて静脈内に与えられ、血液サンプルが-10、-5、0、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120分時などの適切な時点(t=0はグルコース急速投与に相当する)で採取される、実施形態216〜224のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４８０】
226. アナログ又は誘導体、グルコース及びインスリンの血漿中濃度が決定される、実施形態225のアナログ又は誘導体。
【０４８１】
227. アナログ又は誘導体濃度がt=0分、及び任意で試験終了時(t=60分又はt=120分)に測定される、実施形態226のアナログ又は誘導体。
【０４８２】
228. グルコースがグルコースオキシダーゼ法を用いて分析される、実施形態216〜227のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４８３】
229. インスリンの曲線下領域(AUCインスリン)が計算され、インスリン分泌の測定値として用いられる、実施形態216〜228のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４８４】
230. 少なくとも1つのアナログ又は誘導体濃度について、AUCインスリンがベースラインのAUCインスリンより、好ましくは少なくとも110%、より好ましくは少なくとも120%、一層より好ましくは少なくとも130%、又は最も好ましくは少なくとも140%高い、実施形態216〜229のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４８５】
231. ブタにおいて対照(好ましくはビヒクル処置又は未処置)と比べて低減された飼料摂取を引き起こす、実施形態230のアナログ又は誘導体であって、任意で飼料摂取(0〜24時間)がビヒクル処置対照と比べて90%以下、好ましくは80%以下、より好ましくは70%以下、一層より好ましくは60%以下、又は最も好ましくは50%以下であってもよく、飼料摂取(0〜24時間)が誘導体又はビヒクルの投与後の最初の24時間をいう、アナログ又は誘導体。
【０４８６】
232. ブタが雌性ランドレースヨークシャーデュロック(LYD)ブタである、実施形態231のアナログ又は誘導体。
【０４８７】
233. LYDブタが3カ月齢で、好ましくは30〜35kgの体重である、実施形態232のアナログ又は誘導体。
【０４８８】
234. 動物が順化のために群の中で1〜2週間飼育される、実施形態231〜233のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４８９】
235. 実験期間中、個々の食事摂取の測定のために動物が月曜日の朝から金曜日の午後まで個別の檻の中に置かれる、実施形態231〜234のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４９０】
236. 動物がブタ飼料(Svinefoder、Antonioなど)を自由摂餌する、実施形態231〜235のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４９１】
237. 食事摂取が飼料の重量を15分ごとに、好ましくはMpigwinシステムを用いてログを取ることによりオンラインでモニターされる、実施形態231〜236のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４９２】
238. 0.3、1.0、3.0、10、又は30nmol/kgの用量で、好ましくはリン酸緩衝液(50mMリン酸、0.05% tween 80、pH8)中に溶解され、より好ましくは12、40、120、400、又は1200nmol/mlの濃度で投薬される、実施形態231〜237のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４９３】
239. リン酸緩衝液がビヒクルとして役立つ、実施形態231〜238のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４９４】
240. 動物が誘導体又はビヒクルの皮下への単回用量を(好ましくは0.025ml/kgの投薬量で)1日目の朝に投薬され、食事摂取が投薬後4日間測定される、実施形態231〜239のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４９５】
241. 相当するGLP-1(7-37)の半減期(T1/2)で除算されたラット小腸抽出物中でのin vitroの半減期(T1/2)が少なくとも1.0、好ましくは少なくとも2.0、なおより好ましくは少なくとも4.0、又は最も好ましくは少なくとも5.0である、実施形態1〜240のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４９６】
242. 相当するGLP-1(7-37)の半減期(T1/2)で除算されたラット小腸抽出物中でのin vitroの半減期(T1/2)が少なくとも9.0、好ましくは少なくとも10.0、より好ましくは少なくとも12.0、一層より好ましくは少なくとも14.0、なおより好ましくは少なくとも16.0、又は最も好ましくは少なくとも18.0;さらに少なくとも20.0である、実施形態1〜241のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４９７】
243. ラット小腸抽出物が実施例50に記載されるように調製され、アナログ又は誘導体が37℃で1時間インキュベートされ、抽出物の濃度がGLP-1(7-37)の半減期が10〜20分の範囲になるように、例として1.4ug/mlに設定され、結果として生じるサンプルがUPLC及び/若しくはMALDI-TOFにより分析される、並びに/又はインキュベーション及び分析が実施例57に記載されるように行われる、実施形態241〜242のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４９８】
244. 比率[GLP-1(7-37)のラット小腸抽出物中でのin vitroの半減期(T1/2)で除算されたラット小腸抽出物中でのin vitroの半減期(T1/2)]が、相当するセマグルチドの比率の少なくとも0.5倍、好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも2倍、より好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも3倍、一層より好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも5倍、又は最も好ましくはセマグルチドの比率の少なくとも7倍である、実施形態241〜243のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０４９９】
245. 比率[GLP-1(7-37)のラット小腸抽出物中での半減期(T1/2)で除算されたラット小腸抽出物中での半減期(T1/2)]が、相当するリラグルチドの比率の少なくとも0.1倍、好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも0.4倍、より好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも0.8倍、一層より好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも1.2倍、又は最も好ましくはリラグルチドの比率の少なくとも1.5倍である、実施形態241〜244のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０５００】
246. 静脈内投与後のラットにおけるin vivoの半減期(T1/2)が少なくとも4時間、好ましくは少なくとも6時間、一層より好ましくは少なくとも8時間、又は最も好ましくは少なくとも10時間である、実施形態85〜245のいずれか1つの誘導体。
【０５０１】
247. 静脈内投与後のラットにおけるin vivoの半減期(T1/2)が少なくとも11時間、好ましくは少なくとも12時間、一層より好ましくは少なくとも13時間、又は最も好ましくは少なくとも14時間である、実施形態85〜246のいずれか1つの誘導体。
【０５０２】
248. ラットが体重300gから600gまでの雄性Sprague Dawleyラットである、実施形態85〜247のいずれか1つの誘導体。
【０５０３】
249. 静脈内投与後のラットにおけるin vivoの半減期(T1/2)がセマグルチドの半減期と少なくとも同じ、好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも2倍、より好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも3倍、一層より好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも4倍、又は最も好ましくはセマグルチドの半減期の少なくとも5倍である、実施形態85〜248のいずれか1つの誘導体。
【０５０４】
250. HSAへの比較的低い結合アフィニティー、好ましくはa)WO2009/030771の実施例68の化合物、b)WO2009/030771の実施例69の化合物、及び/又はc)WO2009/030771の実施例71の化合物より低い結合アフィニティー及び/又は高いKd(若しくは見かけのKd)を持ち、HSAへの結合アフィニティーが解離定数(Kd、μMで表す)、好ましくは見かけの解離定数として表現され得るものであり、より好ましくは解離定数又は見かけの解離定数が
i)1以上、好ましくは5以上、一層より好ましくは10以上、若しくは最も好ましくは20以上、
ii)25以下、好ましくは20より低い、より好ましくは10より低い、一層より好ましくは5.0より低い、若しくは最も好ましくは1.0より低い、及び/又は
iii)例として1から5の間、1から10の間、1から20の間、1から25の間、5から10の間、5から20の間、5から25の間、10から20の間、若しくは20から25の間など、i)及びii)の限定により規定される範囲内
である、実施形態85〜249のいずれか1つの誘導体。
【０５０５】
251. 解離定数が実施例57に記載されるものなどの競合シンチレーション近接アッセイ(SPA)を用いて測定される、実施形態250の誘導体。
【０５０６】
252. ストレプトアビジン-SPAビーズ(GE Healthcare RPNQ0009など)がビオチン化されたHSAと5時間インキュベートされる、実施形態250〜251のいずれか1つの誘導体。
【０５０７】
253. 結合していないHSAを除去するためにビーズが好ましくはバッファーで洗浄され、続いて125I標識されたアシル化GLP-1アナログ(N-イプシロン37-[2-(2-[2-((S)-4-((S)-4-(12-[4-(16-(1H-テトラゾル-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,125I-Tyr19,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-NH2など)と、100mM Hepes、100mM NaCl、10mM MgSO4、0.025% Tween-20を含有するpH7.4のバッファー中で混合される、実施形態252の誘導体。
【０５０８】
254. 反応混合物が例としてPerkin Elmer Optiplate-96 6005290のウェル内に、好ましくは1ウェルあたり100μlがピペットで移され、測定されるGLP-1誘導体の希釈系列100μlが次いで同じバッファー中に添加される、実施形態253の誘導体。
【０５０９】
255. 室温で20時間穏やかに振とうした後、プレートが遠心分離され、例としてTopCounter上でカウントされ、その後、結合したcpmがGLP-1誘導体濃度の関数としてプロットされ、Kd及び/又は見かけ上のKdが、当該GLP-1誘導体のモル濃度をHSAのモル濃度で乗算してGLP-1-HSA複合体のモル濃度で除算したものとして計算され得る、実施形態254の誘導体。
【０５１０】
256. 分子質量が80kDaより小さい、好ましくは40kDaより小さいなどの60kDaより小さい、一層より好ましくは20kDaより小さい、なおより好ましくは10kDaより小さい、又は最も好ましくは6kDaより小さい、実施形態1〜255のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０５１１】
257. 実施例18の化合物でない、好ましくは化学式37でない、実施形態85〜256のいずれか1つの誘導体。
【０５１２】
258. 実施例28、29、34、35、36及び37の化合物でない、好ましくは化学式47、化学式48、化学式53、化学式54、化学式55及び化学式56でない、実施形態85〜257のいずれか1つの誘導体。
【０５１３】
259. 以下から選択される化合物を含む、好ましくはそれらから成る中間生成物であって、
【０５１４】
【化３５】
0006006118.tif 000036
【０５１５】
【化３６】
0006006118.tif 000037
【０５１６】
(式中PGは保護基を表す)中間生成物は化学式67の持続時間延長性部分の遠位の*-COOH基が任意で当該技術分野で知られているようにまた保護されている、好ましくは非反応性エステルの形成下で、より好ましくはi)フェノールのエステルなどのアルコールとかさ高い側鎖とのエステルであって、任意で置換されているエステル;又はii)分枝のアルキル、好ましくは低級アルキルのエステルの形成下で保護されている、最も好ましくはOtBu、OBz等として保護されている中間生成物、又は薬学的に許容されるその塩、アミド若しくはエステル。
【０５１７】
260. PGが中間生成物を可逆的に反応性でないものとする基、及び選択的に除去可能な基である、実施形態259の中間生成物。
【０５１８】
261. PGがi)-OH、又はii)活性化エステルとして官能化されている、実施形態259〜260のいずれか1つの中間生成物。
【０５１９】
262. 活性化エステルがp-ニトロフェノール;2,4,5-トリクロロフェノール;N-ヒドロキシサクシニミド;N-ヒドロキシスルホサクシニミド;3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4-オン;5-クロロ-8-ヒドロキシキノリン;N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボン酸イミド;ペンタフルオロフェノール;p-スルホテトラフルオロフェノール;N-ヒドロキシフタルイミド;1-ヒドロキシベンゾトリアゾール;1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール;N-ヒドロキシマレイミド;4-ヒドロキシ-3-ニトロベンゼンスルホン酸のエステル、又は当該技術分野で知られている任意の他の活性化エステルである、実施形態261の中間生成物。
【０５２０】
263. 薬剤としての使用のための、実施形態1〜258のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０５２１】
264. 全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患の治療及び/若しくは予防における使用のための、並びに/又は脂質パラメーターを改善するための、β細胞機能を改善するための、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための、実施形態1〜258のいずれか1つのアナログ又は誘導体。
【０５２２】
265. 全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患の治療及び/若しくは予防のための、並びに/又は脂質パラメーターを改善するための、β細胞機能を改善するための、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防するための薬剤の製造における、実施形態1〜258のいずれか1つのアナログ又は誘導体の使用。
【０５２３】
266. 実施形態1〜258のいずれか1つのアナログ又は誘導体の薬学的な活性量を投与することによる、全ての型の糖尿病並びに摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病合併症、重篤疾患及び/若しくは多嚢胞性卵巣症候群などの関連疾患を治療若しくは予防する方法、並びに/又は脂質パラメーターを改善、β細胞機能を改善する方法、並びに/又は糖尿病性疾患の進行を遅延させる若しくは予防する方法。
【０５２４】
(実施例)
本実施例部は略語の表で始まり、本発明のペプチド及び誘導体を合成して性質決定する一般的な方法を包含する節が続く。次いで特定のGLP-1ペプチド誘導体の調製に関するいくつかの実施例が続き、最後にこれらのペプチド及び誘導体の活性及び性質に関するいくつかの実施例が包含される(薬理学的方法という見出しの節)。
【０５２５】
実施例は本発明を例証するのに役立つ。
【０５２６】
略語
次の略語(アルファベット順)が以下で用いられる。
Aib:   アミノイソ酪酸(α-アミノイソ酪酸)
API:   医薬品有効成分
AUC:   曲線下面積
BG:   血糖
BHK   ベビーハムスター腎臓
Boc:   t-ブチルオキシカルボニル
Bom:   ベンジルオキシメチル
BW:   体重
Bzl:   ベンジル
Clt:   2-クロロトリチル
コリジン:   2,4,6-トリメチルピリジン
cpm:   １分当たりのカウント数
DCM:   ジクロロメタン
Dde:   1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DIC:   ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA:   ジイソプロピルエチルアミン
DMAP:   4-ジメチルアミノピリジン
DMEM:   ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)
EDTA:   エチレンジアミン四酢酸
EGTA:   エチレングリコール四酢酸
FCS:   ウシ胎児血清
Fmoc:   9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HATU:   (O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HBTU:   (2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HEPES:   4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
HFIP   1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール又はヘキサフルオロイソプロパノール
HOAt:   1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt:   1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC:   高速液体クロマトグラフィー
HSA:   ヒト血清アルブミン
IBMX:   3-イソブチル-1-メチルキサンチン
Imp:   イミダゾプロピオン酸(des-アミノヒスチジン、DesHとも呼ばれる)
i.v.   静脈内
ivDde:   1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル
IVGTT:   静脈内耐糖能試験
LCMS:   液体クロマトグラフィー質量分析
LYD:   ランドレースヨークシャーデュロック
MALDI-MS:   MALDI-TOF MSを参照
MALDI-TOF MS:   マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析
MeOH:   メタノール
Mmt:   4-メトキシトリチル
Mtt:   4-メチルトリチル
NMP:   N-メチルピロリドン
OBz:   ベンゾイルエステル
OEG:   8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
OPfp:   ペンタフルオロフェノキシ
OPnp:   パラ-ニトロフェノキシ
OSu:   O-サクシニミジルエステル(ヒドロキシサクシニミドエステル)
OSuc:   2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル
OtBu:   tertブチルエステル
Pbf:   2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
PBS:   リン酸緩衝生理食塩水
PD:   薬力学
Pen/Strep:   ペニシリン/ストレプトマイシン
PK:   薬物動態
RP:   逆相
RP-HPLC:   逆相高速液体クロマトグラフィー
RT:   室温
Rt:   保持時間
s.c.:   皮下
SD:   標準偏差
SEC-HPLC:   サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
SEM:   平均値の標準誤差
SPA:   シンチレーション近接アッセイ
SPPS:   固相ペプチド合成
tBu:   tert-ブチル
TFA:   トリフルオロ酢酸
TIS:   トリイソプロピルシラン
TLC:   薄層クロマトグラフィー
Tos:   トシレート(又はパラ-トルエンスルホニル)
Tris:   トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン又は2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-プロパン-1,3-ジオール
Trt:   トリフェニルメチル又はトリチル
Trx:   トラネキサム酸
UPLC:   超高速液体クロマトグラフィー
【０５２７】
調製の方法
A.一般的方法
この節は、樹脂に結合したペプチドを合成する方法(SPPS法。アミノ酸の脱保護の方法、樹脂からペプチドを切断する方法、及びその精製方法を包含する)、同様に結果として生じるペプチドを検出して性質決定する方法(LCMS法、MALDI法、及びUPLC法)に関する。ペプチドの合成は、酸性条件下で切断できる基とのジペプチドアミド結合上で保護されるジペプチドの使用により、場合によっては改善可能であって、この酸性条件下で切断できる基は2-Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジル又は2,4,6-トリメトキシベンジルなどであるが、これらに限定されない。セリン又はスレオニンがペプチド中に存在する場合、擬プロリンジペプチドが用いられ得る(例としてNovabiochemから入手可能、W.R.Sampson(1999)、J.Pep.Sci.5、403ページも参照)。用いられた保護アミノ酸誘導体は標準的なFmoc-アミノ酸(例としてAnaspec、IRIS又はNovabiochemから供給されたもの)であった。N末端アミノ酸はアルファアミノ基においてBoc保護された(例としてN末端にHisを有するペプチドについてBoc-His(Boc)-OH、又はBoc-His(Trt)-OH)。配列中のリジンのイプシロンアミノ基は、アルブミン結合部分及びスペーサーの付着経路に応じて、Mtt、Mmt、Dde、ivDde又はBocのいずれかで保護された。アルブミン結合部分及び/又はリンカーは、樹脂に結合したペプチドのアシル化、又は保護されていないペプチドの溶液中でのアシル化のいずれかによりペプチドに付着できる。保護されたペプチジル樹脂へのアルブミン結合部分及び/又はリンカーの付着の場合、付着はSPPS及び適切に保護された構成ブロックを用いたモジュール式であることができ、この構成ブロックはFmoc-Oeg-OH(Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸)、Fmoc-Trx-OH(Fmoc-トラネキサム酸)、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、ノナデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル又は4-(9-カルボキシノニルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルなどであるが、これらに限定されない。
【０５２８】
1.樹脂結合ペプチドの合成
SPPS法A
SPPS法Aは、Fmoc化学を用いて、Applied Biosystems 433ペプチド合成装置(ABI433A合成装置とも示される)上で、0.25mmol又は1.0mmol規模で、NMP中でのHBTU又はHATU仲介性カップリング及びFmoc保護基の脱保護のUVモニタリングを利用する製造業者のFastMoc UVプロトコールを用いる、保護されたペプチジル樹脂の合成をいう。
【０５２９】
ペプチドアミドの合成に用いられる開始樹脂は、適切なRink-Amide樹脂(ペプチドアミド用)又は(カルボキシC末端を持つペプチド用には)適切なWang樹脂若しくは適切なクロロトリチル樹脂のいずれかであった。適切な樹脂は、例としてNovabiochemから市販されている。
【０５３０】
SPPS法B
SPPS法Bは、Fmoc化学を用いた、マイクロ波に基づくLibertyペプチド合成装置(CEM Corp.、North Carolina)上での保護されたペプチジル樹脂の合成をいう。適切な樹脂は、Novabiochemから入手可能な、予め充填された低充填Wang樹脂(例として低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂、0.35mmol/g)である。Fmoc-脱保護は5%ピペリジンのNMP溶液を使用して、70℃又は75℃以下であった。カップリング化学はDIC/HOAtのNMP溶液であった。アミノ酸/HOAt溶液(0.3MのNMP溶液、3〜10倍モル過剰)が樹脂に添加され、その後、同じモル当量のDIC(0.75MのNMP溶液)が添加された。例えば、以下の量の0.3Mアミノ酸/HOAt溶液が、以下の規模の反応についてのカップリングごとに用いられた:規模/ml、0.10mmol/2.5ml、0.25mmol/5ml、1mmol/15ml。カップリング時間及び温度は一般に5分間、70℃又は75℃以下であった。より規模の大きい反応については、より長いカップリング時間、例えば10分間が用いられた。ヒスチジンアミノ酸は50℃で二重にカップリングされ、又は前のアミノ酸が立体障害を持つ場合(例としてAib)は四重にカップリングされた。アルギニンアミノ酸は室温で25分間カップリングされ、次いで70℃又は75℃で5分間加熱された。いくらかのアミノ酸は「二重にカップリングされた」が、これは最初のカップリング(例として75℃で5分間)の後、樹脂が排出され、さらなる試薬(アミノ酸、HOAt及びDIC)が添加されて、混合物が再度加熱される(例として75℃で5分間)ことを意味する。リジン側鎖の化学的修飾が望まれる場合、リジンはLys(Mtt)として組み込まれた。Mtt基は、樹脂をDCMで洗浄し、樹脂を原液の(希釈されていない)ヘキサフルオロイソプロパノール中に20分間懸濁し、その後DCM及びNMPで洗浄することにより除去された。リジンの化学的修飾は、手作業の合成(SPPS法Dを参照)、又は上記のLibertyペプチド合成装置上での1つ若しくは複数の自動化ステップのいずれかにより、適切に保護された構成ブロックを用いて(一般的方法を参照)、任意で手作業のカップリングを包含して、行われた。
【０５３１】
SPPS法D
SPPS法Dは、手作業のFmoc化学を用いた、保護されたペプチジル樹脂の合成をいう。これはペプチド骨格へのリンカー及び側鎖の付着に典型的に用いられた。カップリング化学は4〜10倍モル過剰の、DIC/HOAt/コリジンのNMP溶液であった。カップリング条件は室温で1〜6時間であった。Fmoc-脱保護は20〜25%ピペリジンのNMP溶液を使用して行われ(3×20ml、各10分間)、その後、NMP洗浄(4×20mL)が行われた。Dde-脱保護又はivDde-脱保護は2%ヒドラジンのNMP溶液を使用して行われ(2×20ml、各10分間)、その後、NMP洗浄(4×20mL)が行われた。Mtt-脱保護又はMmt-脱保護は2% TFA及び2〜3% TISのDCM溶液を使用して行われ(5×20ml、各10分間)、その後、DCM洗浄(2×20ml)、10%メタノール及び5% DIPEAのDCM溶液での洗浄(2×20ml)及びNMP洗浄(4×20ml)が行われるか、又は原液のヘキサフルオロイソプロパノールでの処理(5×20ml、各々10分間)が行われ、その後、上の洗浄が行われた。アルブミン結合部分及び/又はリンカーは、樹脂に結合したペプチドのアシル化、又は保護されていないペプチドの溶液中でのアシル化のいずれかにより、ペプチドに付着できる(下に記載される経路を参照)。保護されたペプチジル樹脂へのアルブミン結合部分及び/又はリンカーの付着の場合、付着はSPPS及び適切に保護された構成ブロックを用いたモジュール式であることができる(一般的方法を参照)。
【０５３２】
樹脂に結合したペプチドへの付着-経路I:オクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら、EP511600、樹脂に結合したペプチドに対して4モル当量)などの活性化された(活性エステル若しくは対称的無水物)アルブミン結合部分又はリンカーは、NMP(25mL)中に溶解され、樹脂に添加され、室温で一晩振とうされた。反応混合物はろ過され、樹脂はNMP、DCM、2-プロパノール、メタノール及びジエチルエーテルで十分に洗浄された。
【０５３３】
樹脂に結合したペプチドへの付着-経路II:アルブミン結合部分はNMP/DCM中に溶解された(1:1、10ml)。HOBt(樹脂に対して4モル当量)及びDIC(樹脂に対して4モル当量)などの活性化試薬が添加され、溶液は15分間撹拌された。溶液は樹脂に添加され、DIPEA(樹脂に対して4モル当量)が添加された。樹脂は室温で2〜24時間振とうされた。樹脂はNMP(2×20ml)、NMP/DCM(1:1、2×20ml)及びDCM(2×20ml)で洗浄された。
【０５３４】
溶液中のペプチドへの付着-経路III:オクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら、EP511600)などの活性化された(活性エステル若しくは対称的無水物)アルブミン結合部分又はリンカーは、ペプチドに対して1〜1.5モル当量がアセトニトリル、THF、DMF、DMSOなどの有機溶媒中に、又は水/有機溶媒の混合物(1〜2ml)中に溶解され、ペプチド水溶液(10〜20ml)に10モル当量のDIPEAと共に添加された。tert-ブチルなどのアルブミン結合残基上の保護基の場合、反応混合物は一晩凍結乾燥され、単離された粗ペプチドは後で脱保護された。tert-ブチル保護基の場合、脱保護はトリフルオロ酢酸、水及びトリイソプロピルシランの混合物(90:5:5)中にペプチドを溶解することにより行われた。30分後、混合物は減圧下で蒸発されて、粗ペプチドは後記の調製用HPLCにより精製された。
【０５３５】
SPPS法E
SPPS法Eは、Fmoc化学による、Protein Technologies社(Tucson、AZ85714 U.S.A.)のPrelude Solid Peptide Synthesiser上でのペプチド合成をいう。適切な樹脂は、Novabiochemから入手可能な、予め充填された低充填Wang樹脂(例として低充填fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂、0.35mmol/g)である。Fmoc-脱保護は25%ピペリジンのNMP溶液を使用して、2×10分間であった。カップリング化学はDIC/HOAt/コリジンのNMP溶液であった。アミノ酸/HOAt溶液(0.3MのNMP溶液、3〜10倍モル過剰)が樹脂に添加され、その後、同じモル当量のDIC(3MのNMP溶液)及びコリジン(3MのNMP溶液)が添加された。例えば、以下の量の0.3Mアミノ酸/HOAt溶液が、以下の規模の反応についてのカップリングごとに用いられた:規模/ml、0.10mmol/2.5ml、0.25mmol/5ml。カップリング時間は一般に60分間であった。アルギニン及びヒスチジンを包含するがこれらに限定されないいくらかのアミノ酸は「二重にカップリングされた」が、これは最初のカップリング(例として60分間)の後、樹脂が排出され、さらなる試薬(アミノ酸、HOAt、DIC及びコリジン)が添加されて、混合物が再度反応される(例として60分間)ことを意味する。リジン側鎖の化学的修飾が望まれる場合、リジンはLys(Mtt)として組み込まれた。Mtt基は、樹脂をDCMで洗浄し、樹脂をヘキサフルオロイソプロパノール/DCM(75:25)中に3×10分間懸濁し、その後DCM、20%ピペリジン及びNMPで洗浄することにより除去された。リジンの化学的修飾は、手作業の合成(SPPS法Dを参照)、又は上記のPreludeペプチド合成装置上での1つ若しくは複数の自動化ステップのいずれかにより、適切に保護された構成ブロックを用いて(一般的方法を参照)、行われた。
【０５３６】
2.樹脂からのペプチドの切断及び精製
合成後に樹脂はDCMで洗浄され、ペプチドは2〜3時間のTFA/TIS/水(95/2.5/2.5又は92.5/5/2.5)での処理により樹脂から切断され、その後、ジエチルエーテルを使用して沈殿された。ペプチドは適切な溶媒(例として30%酢酸など)中に溶解され、C18、5μMカラムに対してアセトニトリル/水/TFAを用いた標準的なRP-HPLCにより精製された。画分はUPLC法、MALDI法及びLCMS法の組み合わせにより分析され、適当な画分がプールされて凍結乾燥された。
【０５３７】
3.検出及び性質決定の方法
LCMS法
LCMS法1(LCMS1)
Agilent Technologies LC/MSD TOF(G1969A)質量分析装置はAgilent 1200シリーズHPLCシステムからの溶出後サンプルの質量を同定するのに用いられた。タンパク質スペクトルの逆重畳はAgilent社のタンパク質確認ソフトウェアを使用して計算された。
溶出液:
A:0.1%トリフルオロ酢酸水溶液
B:0.1%トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液
カラム:Zorbax 5u、300SB-C3、4.8×50mm
グラジエント:25%〜95%アセトニトリルの15分間
【０５３８】
LCMS法2(LCMS2)
Perkin Elmer Sciex API 3000質量分析装置はPerkin Elmer Series 200 HPLCシステムからの溶出後サンプルの質量を同定するのに用いられた。
溶出液:
A:0.05%トリフルオロ酢酸水溶液
B:0.05%トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液
カラム:Waters Xterra MS C-18×3mm id 5μm
グラジエント:5%〜90%アセトニトリルの7.5分間、1.5ml/分
【０５３９】
LCMS法3(LCMS3)
Waters Micromass ZQ質量分析装置はWaters Alliance HT HPLCシステムからの溶出後サンプルの質量を同定するのに用いられた。
溶出液:
A:0.1%トリフルオロ酢酸水溶液
B:0.1%トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液
カラム:Phenomenex、Jupiter C4 50×4.60mm id 5μm
グラジエント:10%〜90% Bの7.5分間、1.0ml/分
【０５４０】
LCMS法4(LCMS4)
LCMS4はWaters Acquity UPLCシステム及びMicromass社のLCT Premier XE質量分析装置からなる構成上で行われた。UPLCポンプは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.1%ギ酸水溶液
B:0.1%ギ酸のアセトニトリル溶液
分析は室温で適当な量のサンプル(好ましくは2〜10μl)をカラム上に注入することにより行われ、A及びBのグラジエントを使用して溶出された。UPLC条件、検出器の設定及び質量分析装置の設定は以下であった。
カラム:Waters Acquity UPLC BEH、C-18、1.7μm、2.1mm×50mm
グラジエント:5%〜95%アセトニトリルの4.0分間(或いは8.0分間)のリニアグラジエント、0.4ml/分
検出:214nm(TUV(可変同調UV検出器)からのアナログ出力)
MSイオン化モード:API-ES
スキャン:100〜2000amu(或いは500〜2000amu)、ステップ0.1amu
【０５４１】
UPLC法及びHPLC法
方法  05 B5 1
UPLC(方法05_B5_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10% CH3CN(pH3.5)
B:70% CH3CN、30% H2O
60% A、40% Bから30% A、70% Bの8分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
【０５４２】
方法  05 B7 1
UPLC(方法05_B7_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10% CH3CN(pH3.5)
B:70% CH3CN、30% H2O
80% A、20% Bから40% A、60% Bの8分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
【０５４３】
方法  04 A2 1
UPLC(方法04_A2_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:90% H2O、10% CH3CN、0.25M重炭酸アンモニウム
B:70% CH3CN、30% H2O
【０５４４】
90% A、10% Bから60% A、40% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
【０５４５】
方法  04 A3 1
UPLC(方法04_A3_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:90% H2O、10% CH3CN、0.25M重炭酸アンモニウム
B:70% CH3CN、30% H2O
【０５４６】
75% A、25% Bから45% A、55% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
【０５４７】
方法  04 A4 1
UPLC(方法04_A4_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:90% H2O、10% CH3CN、0.25M重炭酸アンモニウム
B:70% CH3CN、30% H2O
【０５４８】
65% A、35% Bから25% A、65% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
【０５４９】
方法  08 B2 1
UPLC(方法08_B2_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
【０５５０】
95% A、5% Bから40% A、60% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
【０５５１】
方法  08 B4 1
UPLC(方法08_B4_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
【０５５２】
95% A、5% Bから95% A、5% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
【０５５３】
方法  05 B10 1
UPLC(方法05 B10 1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10% CH3CN(pH3.5)
B:70% CH3CN、30% H2O
【０５５４】
40% A、60% Bから20% A、80% Bの8分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
方法  09 B4 1
【０５５５】
UPLC(方法09_B4_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
95% A、5% Bから5% A、95% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
【０５５６】
方法  09 B2 1
UPLC(方法09_B2_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
95% A、5% Bから40% A、60% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
【０５５７】
方法  10 B14 1
UPLC(方法10_B14_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH Shield RP18、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、50℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
70% A、30% Bから40% A、60% Bの12分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
【０５５８】
方法  05 B8 1
UPLC(方法05_B8_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4、10% CH3CN(pH3.5)
B:70% CH3CN、30% H2O
50% A、50% Bから20% A、80% Bの8分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
【０５５９】
方法  07 B4 1
UPLC(方法07_B4_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
95% A、5% Bから5% A、95% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
【０５６０】
方法  04 A6 1
UPLC(方法04_A6_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:10mM TRIS、15mM硫酸アンモニウム、80% H2O、20% CH3CN、pH7.3
B:80% CH3CN、20% H2O
95% A、5% Bから10% A、90% Bの16分間、流速0.35ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
【０５６１】
方法  05 B2 1
UPLC(方法05_B2_1):RP分析はデュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はACQUITY UPLC BEH130、C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラムを用いて、40℃で収集された。UPLCシステムは以下を含有する2つの溶出液リザーバーに連結された。
A:99.95% H2O、0.05% TFA
B:99.95% CH3CN、0.05% TFA
95% A、5% Bから40% A、60% Bの16分間、流速0.40ml/分でのリニアグラジエントが用いられた。
【０５６２】
方法  02 B4 4
UPLC(方法02_B4_4):RP分析はWaters 2487デュアルバンド検出器を取り付けたAlliance Waters 2965システムを用いて行われた。214nm及び254nmにおけるUV検出値はSymmetry300 C18、5um、3.9mm×150mmカラムを用いて、42℃で収集された。5〜95%アセトニトリル、90〜0%水、及び5%トリフルオロ酢酸(1.0%)水溶液の15分間のリニアグラジエントを使用して、流速1.0ml/分で溶出された。
【０５６３】
方法02 B5 1
HPLC(方法02_B5_1):RP分析はWaters 2487デュアルバンド検出器を取り付けたAlliance Waters 2695システムを用いて行われた。UV検出値はSymmetry C18、3.5um、3.0mm×100mmカラムを用いて収集された。10〜95%アセトニトリル、95〜0%水、及び5%トリフルオロ酢酸(1.0%)水溶液の8分間のリニアグラジエントを使用して、流速1.0ml/分で溶出された。
【０５６４】
MALDI-MS法
分子量はマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析を用いて決定され、Microflex又はAutoflex(Bruker)上に記録された。アルファ-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸のマトリックスが用いられた。
【０５６５】
NMR法
プロトンNMRスペクトルはBrucker Avance DPX 300(300 MHz)を用いて、テトラメチルシランを内部標準として使用して、記録された。化学シフト(σ)はppmで与えられ、分裂パターンは、sが一重線、dが二重線、ddが二重の二重線、dtが二重の三重線、tが三重線、ttが三重の三重線、qが四重線、quintが五重線、sextが六重線、mが多重線、及びbr=ブロードで示される。
【０５６６】
B.中間体の合成
1. 脂肪二酸のモノエステルの合成
C12、C14、C16及びC18の二酸をBoc無水物、DMAP及びt-ブタノールと共にトルエン中で一晩還流すると、t-ブチルモノエステルを優位に与える。集成後に取得されるのは一酸、二酸及びジエステルの混合物である。精製は洗浄、ショートプラグのシリカろ過及び結晶化により実施される。
【０５６７】
2. 2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチルアミンの合成
化学式13:
【０５６８】
【化３７】
0006006118.tif 000038
【０５６９】
無水メタノール(400mL)中のヒスタミン二塩酸塩(20.47g、0.111mol)及びトリエチルアミン(48mL、0.345mol)は室温で10分間撹拌された。メタノール(30mL)中のトリフルオロ酢酸エチルエステル(14.6mL、0.122mol)は0℃で30分間かけて液滴で添加された。反応混合物は室温で3.5時間撹拌され、次いで乾燥するまで減圧下で蒸発された。残渣はジクロロメタン(450mL)中に溶解され、トリエチルアミン(31mL、0.222mol)が添加された。次いで、トリチルクロライド(34.1g、0.122mol)が少しずつ添加され、混合物は室温で一晩撹拌された。クロロホルム(400mL)及び水(600mL)が反応混合物中に注ぎ込まれた。水層は分離され、クロロホルム(3×400mL)で抽出された。合わせられた有機層は無水硫酸マグネシウムで乾燥された。溶媒は除去され、ベージュ色の固体はヘキサン(1000mL)を使用してすりつぶされた。懸濁液はろ過され、2,2,2-トリフルオロ-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-アセトアミドが白色の固体として得られた。
収率:45.54g(91%)
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 8.44 (bs, 1H); 7.43 (s, 1H); 7.41〜7.33 (m, 9H); 7.19〜7.10 (m, 6H); 6.65 (s, 1H); 3.66 (q, J=5.9Hz, 2H); 2.79 (t, J=5.9Hz, 2H)。
【０５７０】
上のアミド(45.54g、0.101mmol)はテトラヒドロフラン(1000mL)及びメタノール(1200mL)中に溶解された。水酸化ナトリウム(20.26g、0.507mol)の水溶液(500mL)が添加された。混合物は室温で2時間撹拌され、次いで減圧濃縮された。残渣はクロロホルム(1200mL)と水(800mL)との間で分離された。水層はクロロホルム(3×400mL)で抽出された。有機層は合わされ、無水硫酸マグネシウムで乾燥された。溶媒の蒸発は茶色の油をもたらしたが、これは3日間減圧乾燥されて、標題の産物をベージュ色の固体として与えた。
収率:32.23g(90%)
全体収率:82%
M.p.:111〜113℃
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.39 (d, J=1.3, 1H); 7.38〜7.32 (m, 9H); 7.20〜7.12 (m, 6H); 6.61 (s, 1H); 3.00 (t, J=6.6Hz, 2H); 2.70 (t, J=6.5Hz, 2H); 1.93 (bs, 2H)。
【０５７１】
3. 2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸の合成
化学式14:
【０５７２】
【化３８】
0006006118.tif 000039
【０５７３】
アセトニトリル(75mL)中のメルドラム酸(5.52g、38.3mmol)、炭酸カリウム(26.5g、191mmol)及びヨウ化メチル(7.15mL、115mmol)の混合物は封をされたチューブ内で75℃で7時間加熱された。混合物は室温まで冷却され、ジクロロメタン(300mL)で希釈され、ろ過されて、ろ液は乾燥するまで減圧下で蒸発された。酢酸エチル(75mL)、ヘキサン(75mL)及び水(50mL)が添加され、相が分離された。有機層は10%チオ硫酸ナトリウム水溶液(50mL)及び水(50mL)で洗浄され、無水硫酸マグネシウムで乾燥され、溶媒が減圧下で除去されて、2,2,5,5-テトラメチル-[1,3]ジオキサン-4,6-ジオンを白色の固体として与えた。
収率:6.59g(79%)
RF(SiO2、クロロホルム/酢酸エチル、98:2):0.60
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 1.76 (s, 6H); 1.65 (s, 6H)。
【０５７４】
上記のように調製された2-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-エチルアミン(5.00g、14.2mmol)及びトリエチルアミン(9.86mL、70.7mmol)のトルエン溶液(80mL)は、上のジオン化合物(3.65g、21.2mmol)のトルエン溶液(40mL)に75℃で50分間かけて液滴で添加された。混合物はこの温度でさらに3時間(先発のアミンがTLC上で検出されるまで)撹拌され、次いで乾燥するまで蒸発された。残渣はクロロホルム(300mL)中に再溶解され、10%クエン酸水溶液(200mL)で洗浄された。水相はクロロホルム(2×60mL)で抽出され、クロロホルム相は合わされ、無水硫酸マグネシウムで乾燥され、溶媒は減圧下で除去された。残渣は熱クロロホルム(140mL)ですりつぶされ、ヘキサン(70mL)が添加されて、懸濁液は室温で一晩撹拌された。固体はろ過で取り除かれ、クロロホルム/ヘキサン混合物(1:1、2×50mL)で洗浄され、減圧乾燥されて標題の産物を与えた。
収率:6.73g(88%)
M.p.:161〜162℃
RF(SiO2、クロロホルム/メタノール、85:15):0.40
1H NMRスペクトル(300MHz, DMSO-d6, δH): 12.45 (bs, 1H); 7.66 (t, J=5.1Hz, 1H); 7.57〜7.31 (m, 9H); 7.26 (s, 1H); 7.20〜7.02 (m, 6H); 6.66 (s, 1H); 3.25 (m, 2H); 2.57 (t, J=7.3Hz, 2H); 1.21 (s, 6H)。
【０５７５】
4. 4-(4-tert-ブチル-フェニル)-酪酸の合成
化学式15:
【０５７６】
【化３９】
0006006118.tif 000040
【０５７７】
塩化アルミニウムの粉末(80.0g、600mmol)はtert-ブチルベンゼン(40.0g、300mmol)及び無水コハク酸(26.7g、267mmol)及び1,1,2,2-テトラクロロエタン(100mL)の撹拌された混合物に分けながら添加された。全ての塩化アルミニウムが添加された後、混合物は氷(500mL)と濃塩酸(100mL)との混合物の中に注ぎ込まれた。有機層は分離され、水(500mL)で洗浄され、溶媒が蒸留で取り除かれた。固体残渣は熱15%炭酸ナトリウム水溶液(1000mL)中に溶解され、ろ過され、冷却され、酸は塩酸で沈殿された(pH=1に酸性化)。粗精製の酸はろ過され、風乾され、ベンゼン(500mL)から再結晶化されて、4-(4-tert-ブチル-フェニル)-4-オキソ-酪酸を無色の結晶として与えた。
収率:36.00g(58%)
M.p.:117〜120℃
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.93 (dm, J=8.3Hz, 2H); 7.48 (dm, J=8.3Hz, 2H); 3.30 (t, J=6.6Hz, 2H); 2.81 (t, J=6.6Hz, 2H); 1.34 (s, 9H)。
【０５７８】
上の酸(36.0g、154mmol)、水酸化カリウム(25.8g、462mmol)、ヒドラジン水和物(20mL、400mmol)及びエチレングリコール(135mL)の混合物は3時間還流され、次いで蒸気の温度が196〜198℃に上がるまで蒸留された。さらに14時間の還流後、混合物は少し冷却されて、次いで冷水(200mL)中に注ぎ込まれた。混合物は濃塩酸で(pH=1に)酸性化され、ジクロロメタン(2×400mL)で抽出された。有機抽出物は合わされ、無水硫酸マグネシウムで乾燥され、溶媒が減圧下で除去されて、残渣がカラムクロマトグラフィー(Silicagel 60A、0.060〜0.200mm、溶出液:ヘキサン/酢酸エチル10:1〜6:1)により精製されて、標題の産物をオフホワイト色の固体として与えた。
収率:16.25g(48%)
M.p.:59〜60℃
RF(SiO2、酢酸エチル):0.60
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.31 (dm, J=8.1Hz, 2H); 7.12 (dm, J=8.1Hz, 2H); 2.64 (t, J=7.6Hz, 2H); 2.38 (t, J=7.4Hz, 2H); 1.96 (m, 2H); 1.31 (s, 9H)。
【０５７９】
5. 2,2-ジメチル-N-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イルメチル)-マロンアミド酸の合成
化学式16:
【０５８０】
【化４０】
0006006118.tif 000041
【０５８１】
ヒドロキシルアミン塩酸塩(15.9g、229mmol)は4(5)-イミダゾールカルボキシアルデヒド(20.0g、209mmol)及び炭酸ナトリウム(12.1g、114mmol)の水溶液(400mL)に添加され、結果として生じた溶液は室温で一晩撹拌された。混合物は100mLまで蒸発され、氷浴中で冷却された。固体はろ過により分離され、ろ液は40mLに濃縮された。0℃に冷却後、別の結晶部分が取得された。固体(23g)は合わされ、エタノール(およそ160mL)から再結晶化されて、イミダゾール-4(5)-カルボアルデヒドオキシムを無色の結晶として産出した。
収率:15.98g(69%)
1H NMRスペクトル(300MHz, アセトン-d3+D2O, δH): 7.78 (bs, 1H); 7.74 (d, J=0.9Hz, 1H); 7.43 (s, 1H)。
【０５８２】
アセチルクロライド(51.0mL、718mmol)は0℃、アルゴン下でメタノール(670mL)に液滴で添加された。30分後、冷浴が除去され、上のオキシム(16.0g、144mmol)が添加され、その後、炭素上のパラジウム(5wt%、6.1g)が添加された。混合物は大気圧で17時間水素付加され、次いでセライトを通じてろ過され、溶媒が蒸発されて、純粋な4-(アミノメチル)-イミダゾール二塩酸塩を無色の結晶として与えた。
収率:23.92g(98%)
1H NMRスペクトル(300MHz, D2O, δH): 8.72 (s, 1H); 7.60 (s, 1H); 4.33 (s, 2H)。
【０５８３】
メタノール(1000mL)中の上のアミン二塩酸塩(18.9g、111mmol)及びトリエチルアミン(93mL、667mmol)は、室温で10分間撹拌された。メタノール(30mL)中のトリフルオロ酢酸エチルエステル(13.3mL、111mmol)が0℃で40分間かけて液滴で添加された。反応混合物は室温で18時間撹拌され、次いで減圧下で乾燥するまで蒸発された。残渣は乾燥ジクロロメタン(2000mL)中に溶解され、トリエチルアミン(31mL、222mmol)が添加された。次いでトリチルクロライド(31.6g、113mmol)が添加され、混合物は室温で一晩撹拌された。クロロホルム(1000mL)及び水(1000mL)が反応混合物中に注ぎ込まれた。水層は分離され、クロロホルム(2×300mL)で抽出された。合わされた有機層は無水硫酸マグネシウムで乾燥された。溶媒が除去され、ベージュ色の固体はヘキサン(1000mL)ですりつぶされた。懸濁液はろ過され、2,2,2-トリフルオロ-N-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イルメチル)-アセトアミドが白色の固体として得られた。
収率:46.59g(96%)
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール  95:5):0.35
1H NMRスペクトル(300MHz, DMSO-d6, δH): 9.77 (t, J=5.7Hz, 1H); 7.47〜7.34 (m, 9H); 7.33 (d, J=1.5Hz, 1H); 7.13〜7.03 (m, 6H); 6.80 (d, J=0.8Hz, 1H); 4.25 (d, J=5.7Hz, 2H)。
【０５８４】
上のアミド(46.6g、107mmol)はテトラヒドロフラン(600mL)及びエタノール(310mL)中に溶解された。水酸化ナトリウム(21.4g、535mmol)の水溶液(85mL)が添加された。混合物は室温で5時間撹拌され、次いで減圧濃縮された。残渣はクロロホルム(1600mL)と水(800mL)との間で分離された。水層はクロロホルム(4×200mL)で抽出された。有機層は合わされ、無水硫酸マグネシウムで乾燥された。溶媒の蒸発は(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-メチルアミンをオフホワイト色の固体としてもたらした。
収率:36.30g(100%)
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.38 (d, J=1.3, 1H); 7.36〜7.30 (m, 9H); 7.18〜7.10 (m, 6H); 6.69 (m, 1H); 3.77 (s, 2H); 1.80 (bs, 2H)。
【０５８５】
上のアミン(10.0g、29.5mmol)及びトリエチルアミン(20.5mL、147mmol)のトルエン溶液(220mL)は、75℃で45分間かけて2,2,5,5-テトラメチル-[1,3]ジオキサン-4,6-ジオン(3.65g、21.2mmol)のトルエン溶液(80mL)中に液滴で添加された。混合物はこの温度でさらに3時間(先発のアミンがTLC上で検出されるまで)撹拌され、次いで乾燥するまで蒸発された。残渣はクロロホルム(500mL)中に再溶解され、10%クエン酸水溶液(300mL)で洗浄された。水相はクロロホルム(100mL)で抽出され、クロロホルム相は合わされ、水(150mL)で洗浄され、無水硫酸マグネシウムで乾燥されて、溶媒は減圧下で除去された。残渣はフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲルFluka 60、ジクロロメタン/メタノール  98:2〜9:1)により精製され、クロロホルム/ヘキサン混合物から結晶化されて、標題の産物をベージュ色の結晶として与えた。
収率:9.80g(73%)
M.p.:174〜175℃
RF(SiO2、クロロホルム/メタノール、85:15):0.35
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 8.45 (t, J=5.8Hz, 1H); 7.53 (s, 1H); 7.40〜7.28 (m, 9H); 7.14〜7.01 (m, 6H); 6.84 (s, 1H); 4.39 (d, J=5.8Hz, 2H); 1.44 (s, 6H)。
【０５８６】
6. 3-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-プロピルアミンの合成
化学式17:
【０５８７】
【化４１】
0006006118.tif 000042
【０５８８】
テトラヒドロフラン/ジエチルエーテル(1:1、100mL)中のエチル3-(1-トリチル-4-イミダゾリル)プロピオネート(93.0g、223mmol)は水素化アルミニウムリチウムの懸濁液(17.0g、446mmol)に1時間の間に液滴で添加された。混合物は3時間還流され、次いで氷/水で冷却しながら水(100mL)、20%水酸化ナトリウム(100mL)及び水(100mL)で処理され、ろ過されて、固体はテトラヒドロフランで洗浄された。有機相は無水炭酸カリウムで乾燥され、ろ過され、蒸発されて、3-(1-トリチル-4-イミダゾリル)プロパノールを白色の固体として与えた。
収率:68.0g(82%)
M.p.:127〜129℃
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.40〜7.24 (m, 10H); 7.17〜7.06 (m, 6H); 6.55 (s, 1H); 3.72 (t, J=5.3Hz, 2H); 2.68 (t, J=6.6Hz, 2H); 1.86 (m, 2H)。
【０５８９】
メタンスルホニルクロライド(8mL、104mmol)は、上のアルコール(32.0g、86.8mmol)のジクロロメタン(400mL)及びトリエチルアミン(15.5mL)の溶液に液滴で、0℃で1時間の間に添加された。混合物はさらに1時間、冷却せずに撹拌され、次いで5%重炭酸ナトリウムで洗浄され、無水硫酸マグネシウムで乾燥された。ジクロロメタンは30℃で減圧下で蒸発され、残渣の油状のメシレートが次のステップにおいて直接用いられた。
収率:31.2g(80%)
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.37〜7.30 (m, 10H); 7.16〜7.09 (m, 6H); 6.58 (s, 1H); 4.24 (t, J=6.3Hz, 2H); 2.96 (s, 3H); 2.67 (m, 2H); 2.10 (m, 2H)。
【０５９０】
上のメシレート(30.0g、67mmol)、フタルイミドカリウム(18.0g、100mmol)、ヨウ化ナトリウム(4.0g、26.7mmol)及びジメチルホルムアミド(200mL)の混合物は外界温度で一晩撹拌され、次いで水(2L)及びベンゼン(2L)で処理された。有機相は無水硫酸マグネシウムで乾燥され、ろ過され、溶媒が蒸発されて残渣を与えたが、この残渣はベンゼンから再結晶化されて、1-トリチル-4-(3-フタルイミドプロピル)イミダゾールを白色の固体としてもたらした。
収率:17.2g(52%)
M.p.:211〜214℃
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.83 (m, 2H); 7.72 (m, 2H); 7.39〜7.27 (m, 10H); 7.18〜7.07 (m, 6H); 6.60 (d, J=0.9Hz, 1H); 3.72 (t, J=7.4Hz, 2H); 2.60 (t, J=7.5Hz, 2H); 1.99 (m, 2H)。
【０５９１】
上のイミダゾール誘導体(26.6g、53.5mmol)はエタノール(300mL)及びテトラヒドロフラン(150mL)中に60℃で溶解され、ヒドラジン水和物(50g、1mol)が添加され、溶液は6時間還流されて、次いで70℃で一晩加熱された。固体はろ過により除去され、ろ液は25%アンモニア水溶液(2.5l)及びジクロロメタン(2.5L)で処理された。有機層は無水炭酸カリウムで乾燥され、蒸発されて残渣を与えたが、この残渣はシリカゲル(Fluka 60、アンモニア/メタノールで飽和されたクロロホルム)上のカラムクロマトグラフィーにより精製されて、標題の化合物を白色の固体として与えた。
収率:14.2g(72%)
M.p.:112〜113℃
RF(SiO2、アンモニア/メタノール  9:1で飽和されたクロロホルム):0.30
1H NMRスペクトル(300MHz, CDCl3, δH): 7.37〜7.28 (m, 10H); 7.18〜7.09 (m, 6H); 6.53 (d, J=1.3Hz, 1H); 2.74 (t, J=6.9Hz, 2H); 2.59 (t, J=7.4Hz, 2H); 1.95 (bs, 2H); 1.78 (m, 2H)。
【０５９２】
7. 2,2-ジメチル-N-[3-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-プロピル]-マロンアミド酸の合成
化学式18:
【０５９３】
【化４２】
0006006118.tif 000043
【０５９４】
2-クロロトリチルクロライド樹脂(2.3g、3.0mmol)はDCM中で20分間膨潤され、ろ過された。ジメチルマロン酸(2当量、6.0mmol、793mg)はDCM:DMF 1:1(10mL)中に溶解され、樹脂に添加され、その後、DIPEA(6当量、18.0mmol、3.14mL)及びDCM(10mL)が添加された。樹脂は室温で一晩振とうされた。樹脂はろ過され、DCM:MeOH:DIPEA(17:2:1)、DCM、NMP及びDCM(各々2×5mL)で洗浄された。樹脂はDMF中で20分間膨潤され、ろ過された。HOAt(3当量、9.0mmol、1.23g)、DIC(3当量、9.0mmol、1.40mL)及びDMF(25mL)が添加され、樹脂は室温で90分間振とうされた。樹脂はろ過され、3-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-プロピルアミン(1.8当量、5.40mmol、1.84g)、DIPEA(4当量、6.0mmol、2.09mL)及びDMF(10mL)が添加された。樹脂は2日間振とうされた。樹脂はろ過され、NMP(5×20mL)及びDCM(10×20mL)で洗浄された。2,2,2-トリフルオロエタノール/ジクロロメタン1:1(20mL)が樹脂に添加され、2時間振とうされた。樹脂は2,2,2-トリフルオロエタノール/ジクロロメタン1:1(10mL)で洗浄され、合わされたろ液は回収され、減圧下で濃縮されて、標題の化合物が得られた。
収率:600mg(41%)
LCMS4:m/z=482(M+1)
UPLC(方法02_B4_4):Rt=8.07分
1H NMRスペクトル(300MHz, DMSO-d6, δH): 7.36〜7.44 (9H, m)、7.07〜7.12 (6H, m)、6.62 (1H, s)、3.02〜3.09 (2H, q)、2.38〜2.43 (2H, t)、1.61〜1.69 (2H, m)、1.26 (6H, s)。
【０５９５】
8. 2,2-ジメチル-N-[3-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)-プロピル]-マロンアミド酸の合成
2,2-ジメチル-N-ピリジン-2-イルメチルマロンアミド酸の合成
化学式19:
【０５９６】
【化４３】
0006006118.tif 000044
【０５９７】
クロロトリチルクロライド樹脂(2.3g、3.0mmol)はDCM中で20分間膨潤され、ろ過された。ジメチルマロン酸(2当量、6.0mmol、793mg)はDCM:NMP 1:1(10mL)中に溶解され、樹脂に添加され、その後、DIPEA(6当量、18.0mmol、3.14mL)及びDCM(10mL)が添加された。樹脂は室温で一晩振とうされた。樹脂はろ過され、DCM:MeOH:DIPEA(17:2:1)、DCM、NMP及びDCM(各々2×5mL)で洗浄された。樹脂はNMP中で20分間膨潤され、ろ過された。HOAt(3当量、9.0mmol、1.23g)、DIC(3当量、9.0mmol、1.40mL)及びNMP(25mL)が添加され、樹脂は室温で90分間振とうされた。樹脂はろ過され、2-(アミノメチル)ピリジン(2当量、6mmol、659g)、DIPEA(4当量、6.0mmol、2.09mL)及びNMP(10mL)が添加された。樹脂は一晩振とうされた。樹脂はろ過され、NMP(5×20mL)及びDCM(10×20mL)で洗浄された。TFA/TIS/水(95:2.5:2.5、30mL)が樹脂に添加され、1時間振とうされ、ろ過され、減圧下で濃縮されて、標題の化合物が得られた。
収率:600mg(41%)
LCMS4:m/z=223(M+1)
UPLC(方法08_B4_1):Rt=1.79分
【０５９８】
C.本発明の化合物の合成
(実施例1)
[Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式20:
【０５９９】
【化４４】
0006006118.tif 000045
【０６００】
調製方法: SPPS法A
HPLC(方法05_B2_1):Rt=9.78分(97%)
HPLC(方法04_A2_1):Rt=13.48分(93%)
LCMS4:(M/4)+1=830、(M/3)+1=1106、正確な質量=3320、計算値=3320
【０６０１】
(実施例2)
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式21:
【０６０２】
【化４５】
0006006118.tif 000046
【０６０３】
調製方法: SPPS法Aの後、手作業でMtt基除去、手作業でFmoc-OEG-OH、Fmoc-Glu-OtBu及びオクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステルのカップリング
HPLC(方法02_B4_4):Rt=9.02分(99%)
HPLC(方法02_B5_1):Rt=13.15分(98%)
LCMS4:(M/4)+1=1010、(M/3)+1=1346、正確な質量=4036、計算値=4036
【０６０４】
(実施例3)
[Aib8,Glu30,His31,Gln34,Lys36]GLP-1(7-37)イル-Glu38-ペプチドアミド
化学式22:
【０６０５】
【化４６】
0006006118.tif 000047
【０６０６】
調製方法: SPPS法A
HPLC(方法05_B2_1):Rt=9.46分(100%)
HPLC(方法04_A3_1):Rt=5.12分(93%)
LCMS4:(M/4)+1=870、(M/3)+1=1160、正確な質量=3479、計算値=3479
【０６０７】
(実施例4)
Nε12-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチル)[Aib8,Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式23:
【０６０８】
【化４７】
0006006118.tif 000048
【０６０９】
調製方法:ペプチドはSPPS法BによりWang樹脂(LL)を用いて調製された。Fmoc-Lys(Mtt)-OHが12位において用いられ、Boc-His(trt)-OHが7位において用いられた。MttはHFIPを使用して手作業で除去された。最終産物はUPLC及びMALDI-MSにより性質決定された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.2分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=9.85分
MALDI-MS:3986
【０６１０】
(実施例5)
Nε12-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys12,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式24:
【０６１１】
【化４８】
0006006118.tif 000049
【０６１２】
調製方法:ペプチドはSPPS法BによりWang樹脂(LL)を用いて調製された。Fmoc-Lys(Mtt)-OHが12位において用いられ、Boc-His(trt)-OHが7位において用いられた。MttはHFIPを使用して手作業で除去された。最終産物はUPLC及びMALDI-MSにより性質決定された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=7.9分
UPLC(方法04_A4_1):Rt=3.9分
MALDI-MS:4016.8
【０６１３】
(実施例6)
Nε12-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式25:
【０６１４】
【化４９】
0006006118.tif 000050
【０６１５】
調製方法:ペプチドはSPPS法BによりWang樹脂(LL)を用いて調製された。Fmoc-Lys(Mtt)-OHが12位において用いられ、Boc-His(trt)-OHが7位において用いられた。MttはHFIPを使用して手作業で除去された。最終産物はUPLC及びMALDI-MSにより性質決定された。
UPLC(方法08_B4_1):Rt=7.9分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=7.1分
MALDI-MS:4114
【０６１６】
(実施例7)
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][His31,Gln34]GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式26:
【０６１７】
【化５０】
0006006118.tif 000051
【０６１８】
調製方法: SPPS法A
HPLC(方法08_B2_1):Rt=12.90分(96%)
HPLC(方法05_B5_1):Rt=6.34分(91%)
LCMS4:(M/4)+1=1006、(M/3)+1=1341、正確な質量=4022、計算値=4023
【０６１９】
(実施例8)
Nε18-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,Lys18,Glu22,Arg26,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式27:
【０６２０】
【化５１】
0006006118.tif 000052
【０６２１】
調製方法:ペプチドはSPPS法Bにより調製され、最終産物は、Mtt除去及びリンカーのカップリングが方法Dによりなされたことを除いて、分析用UPLC及びLC-MSにより性質決定された。
UPLC(方法08_B2_1):Rt=12.4分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=8.5分
LCMS4:4178.0
計算されたMW=4177.7
【０６２２】
(実施例9)
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}[Gly8, His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式28:
【０６２３】
【化５２】
0006006118.tif 000053
【０６２４】
調製方法:ペプチドはSPPS法Bにより調製され、最終産物は、Mtt除去及びリンカーのカップリングが方法Dによりなされたことを除いて、分析用UPLC及びLC-MSにより性質決定された。
UPLC(方法08_B2_1):Rt=13.0分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=10.0分
LCMS4:4008.0
計算されたMW=4008.49
【０６２５】
(実施例10)
Nε26[(S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)エトキシ]-エトキシ}アセチルアミノ)ブチリル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式29:
【０６２６】
【化５３】
0006006118.tif 000054
【０６２７】
SPPS法Bが用いられ、最終産物はUPLC及びLC-MSにより性質決定された。
UPLC(方法04_A4_1):Rt=6.08分
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.61分
LCMS4:(1010x4)-4=4036
計算されたMW=4036.5
【０６２８】
(実施例11)
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][D-Ala8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式30:
【０６２９】
【化５４】
0006006118.tif 000055
【０６３０】
調製方法: SPPS法Bが用いられ、最終産物はUPLC及びLCMSにより性質決定された。
UPLC(方法04_A3_1):Rt=10.33分
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.80分
LCMS4:(1005.97x4)-4=4019.9
計算されたMW=4022.5
【０６３１】
(実施例12)
N83H-イミダゾル-4-イル-アセチル,Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][His31,Gln34]GLP-1(8-37)-ペプチド
化学式31:
【０６３２】
【化５５】
0006006118.tif 000056
【０６３３】
調製方法:ペプチドはSPPS法Bにより調製され、最終産物は、2当量のDIEAがイミダゾール-4-酢酸塩酸塩及びHOAtの溶液に添加され、使用前に溶液がろ過されたことを除いて、分析用UPLC及びLC-MSにより性質決定された。
UPLC(方法04_A3_1):Rt=9.82分
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.95分
LCMS1:(999.26x4)-4=3393.0
計算されたMW=3393.5
【０６３４】
(実施例13)
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Ser8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式32:
【０６３５】
【化５６】
0006006118.tif 000057
【０６３６】
調製方法:ペプチドはSPPS法Bにより調製され、最終産物は、Mtt除去及びリンカーのカップリングが方法Dによりなされたことを除いて、分析用UPLC及びLC-MSにより性質決定された。
UPLC(方法08_B2_1):Rt=12.8分
UPLC(方法04_A4_1):Rt=4.5分
LCMS4:4038.0
計算されたMW=4008.51
【０６３７】
(実施例14)
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式33:
【０６３８】
【化５７】
0006006118.tif 000058
【０６３９】
調製方法: SPPS法A
HPLC(方法09_B2_1):Rt=12.48分(91%)
HPLC(方法05_B5_1):Rt=5.67分(91%)
LCMS4:(M/4)+1=1002、(M/3)+1=1337、正確な質量=4008、計算値=4008
【０６４０】
(実施例15)
Nε27-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}-(Aib8,Arg26,Lys27,His31,Gln34)GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式34:
【０６４１】
【化５８】
0006006118.tif 000059
【０６４２】
調製方法:ペプチドはSPPS法Eにより調製され、最終産物は分析用UPLC及びMALDI TOF-MSにより性質決定された。
UPLC(方法07_B4_1):Rt=8.3分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=11.2分
MALDI-MS:4062
計算されたMW=4064
【０６４３】
(実施例16)
Nε26-[2-(2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式35:
【０６４４】
【化５９】
0006006118.tif 000060
【０６４５】
ペプチドは充填量0.22mmol/gのGly-PHB Tentagel樹脂上で合成された。合成はLiberty合成装置上で、マイクロ波条件を用いて、DIC/HOAtを使用した70℃以下での5分間の単一カップリングを用いて行われたが、ヒスチジンは50℃以下で20分間カップリングされた。全てのアミノ酸は標準的な保護基で保護されたが、アシル化されるリジン(この場合はLys26)はMttで保護された。脱保護はNMP中の5%ピペリジンを使用して、50℃で3分間であった。合成完了後、N末端は10当量のBoc-炭酸塩及び10当量のDIPEAで30分間ブロックされた。Mtt基は原液のヘキサフルオロイソプロパノールでの20分間の処理により除去され、側鎖はLiberty上で、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Fmoc-Glu-OBut及びヘキサデカン二酸モノ-t-ブチルエステルを用いた上と同じプロトコールを用いて、段階的に構築された。ペプチドはTFA/水/TIS(95:2.5:2.5)を使用して2時間切断され、ジエチルエーテルでの沈殿により単離された。粗ペプチドは5u又は7uいずれかのC18シリカが充填された20mm×250mmカラム上での調製用HPLCにより精製された。ペプチドは5mlの50%酢酸中に溶解され、H2Oで20mlに希釈され、カラム上に注入されて、次いで0.1% TFA中の40〜60% CH3CNの10ml/分、50分間の間のグラジエントで、40℃で溶出された。ペプチド含有画分は回収され、純度がMALDI及びUPLCにより査定された。精製されたペプチドは溶出液を水で希釈した後、凍結乾燥された。
理論的な分子質量の3863.3はMALDIにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1)上の保持時間は8.32分であった。
UPLC(方法04_A3_1)上の保持時間は8.69分であった。
【０６４６】
(実施例17)
Nε26[(S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブチリル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式36:
【０６４７】
【化６０】
0006006118.tif 000061
【０６４８】
この化合物は実施例16にあるように調製された。
理論的な分子質量の3716.2はMALDIにより確認された。
UPLC(方法08_B4_1)上の保持時間は8.48分であった。
UPLC(方法04_A3_1)上の保持時間は9.07分であった。
【０６４９】
(実施例18)
N9-{2-[2-(1H-イミダゾル-4-イル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-プロピオニル}-Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][His31,Gln34]GLP-1(9-37)ペプチド
化学式37:
【０６５０】
【化６１】
0006006118.tif 000062
【０６５１】
調製方法:SPPS法B。2,2-ジメチル-N-[2-(1-トリチル-1H-イミダゾル-4-イル)-エチル]-マロンアミド酸、Fmoc-Oeg-OH、Fmoc-Glu-OtBu及びオクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステルは、Aibアミノ酸と同じカップリング条件を用いてカップリングされた。
UPLC(方法04_A3_1):Rt=10.16分
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.76分
LCMS4:Rt=2.23分  m/z=1341(m/3)、1006(m/4)
【０６５２】
(実施例19)
Nε26[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(2-{2-[2-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式38:
【０６５３】
【化６２】
0006006118.tif 000063
【０６５４】
調製方法:SPPS法B。Fmoc-Oeg-OH、Fmoc-Glu-OtBu及びオクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステルは、Aibアミノ酸と同じカップリング条件を用いてカップリングされた。
UPLC(方法04_A3_1):Rt=11.9分
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.67分
LCMS4:(1010x4)-4=4036, (1346x3)-3=4036.5
計算された質量=4036
【０６５５】
(実施例20)
Nε27-{2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル}-(Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,His31,Gln34)GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式39:
【０６５６】
【化６３】
0006006118.tif 000064
【０６５７】
調製方法:ペプチドはSPPS法Eにより調製され、最終産物は分析用UPLC及びMALDI TOF-MSにより性質決定された。
UPLC(方法07_B4_1):Rt=8.2分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=9.9分
MALDI-MS:4136
計算されたMW=4135
【０６５８】
(実施例21)
[Imp7,Glu22,Arg26,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式40:
【０６５９】
【化６４】
0006006118.tif 000065
【０６６０】
調製方法: SPPS法A
UPLC(方法05_B2_1):Rt=9.50分
UPLC(方法04_A2_1):Rt=13.22分
LCMS4(M/4)+1=866、(M/3)+1=1154、正確な質量=4874
【０６６１】
(実施例22)
Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Imp7,Glu22,Arg26,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式41:
【０６６２】
【化６５】
0006006118.tif 000066
【０６６３】
調製方法: SPPS法A
UPLC(方法05_B2_1):Rt=14.15分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=11.41分
LCMS4(M/5)+1=870、(M/4)+1=1087、正確な質量=4345
【０６６４】
(実施例23)
Nε36-[2-[2-[2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu30,His31,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Gluアミド
化学式42:
【０６６５】
【化６６】
0006006118.tif 000067
【０６６６】
調製方法: SPPS法A
UPLC(方法05_B2_1):Rt=13.32分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=10.14分
LCMS4(M/5)+1=785、(M/4)+1=981、正確な質量=3920
【０６６７】
(実施例24)
Nα([Aib8,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル)-リジン
化学式43:
【０６６８】
【化６７】
0006006118.tif 000068
【０６６９】
調製方法: SPPS法A
UPLC(方法08_B2_1):Rt=9.30分
UPLC(方法04_A2_1):Rt=15.55分
LCMS4(M/5)+1=690、(M/4)+1=863、正確な質量=3449
【０６７０】
(実施例25)
[Aib8,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式44:
【０６７１】
【化６８】
0006006118.tif 000069
【０６７２】
調製方法: SPPS法A
UPLC(方法08_B2_1):Rt=9.28分
LCMS4(M/5)+1=679、(M/4)+1=849、正確な質量=3449
【０６７３】
(実施例26)
Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル]、Nε37-[(4S)-4-カルボキシ-4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル]-[Aib8,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式45:
【０６７４】
【化６９】
0006006118.tif 000070
【０６７５】
調製方法: SPPS法A
UPLC(方法08_B4_1):Rt=11.76分
LCMS4(M/5)+1=815、(M/4)+1=1018、正確な質量=4071
【０６７６】
(実施例27)
Nε12-12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式46:
【０６７７】
【化７０】
0006006118.tif 000071
【０６７８】
調製方法: SPPS法B
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.08分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=6.01分
LCMS4: Rt=1.85分、m/z:3975、M/4=994、M/5=795
【０６７９】
(実施例28)
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル]- Nε37-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式47:
【０６８０】
【化７１】
0006006118.tif 000072
【０６８１】
調製: SPPS法A、低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂を使用して開始。Fmoc-Lys(Mtt)-OHが26位において用いられ、Boc-His(trt)-OHが7位において用いられた。MttはHFIPを使用して除去され、8-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-アミノ)-3,6-ジオキサオクタン酸(Iris Biotechから市販されている)は2回カップリングされ、その後、Fmoc-Glu-OtBu及び4-(9-カルボキシ-ノニルオキシ)-安息香酸tert-ブチルエステル(WO2006/082204のステップ2、実施例25に記載されるように調製されたもの)がSPPS法Aを用いてカップリングされた。
UPLC(方法05_B5_1):Rt=4.95分(92%)
LCMS4:m/z=4011、計算値=4011
【０６８２】
(実施例29)
Nε26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル]、Nε37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブチリルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチルアミノ]エトキシ}エトキシ)アセチル][Aib8,His31,Gln34,Lys37]GLP-1(7-37)ペプチド
化学式48:
【０６８３】
【化７２】
0006006118.tif 000073
【０６８４】
調製方法:充填量0.35mmol/gのLys(Mtt)-Wang樹脂が用いられたこと以外は実施例16同様。
理論的な分子質量の4655.2はMALDIにより確認された。
UPLC(方法  08_B4_1):Rt 7.72分
UPLC(方法  04_A3_1):Rt 5.70分
【０６８５】
(実施例30)
Nε26-2,3-bis[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]プロパノイル-[Aib8,His31,Gln34]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式49:
【０６８６】
【化７３】
0006006118.tif 000074
【０６８７】
調製方法: SPPS法B
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.12分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=7.12分
LCMS_4: Rt=1.42分、m/z:4727、M/3=1575、M/4=1182
【０６８８】
(実施例31)
Nε18-18-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[1-(19-カルボキシノナデカノイル)ピペリジン-4-カルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys18,Glu22,His26,His31,Gln34]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式50:
【０６８９】
【化７４】
0006006118.tif 000075
【０６９０】
調製方法: SPPS法B
LCMS4: Rt=3.62分、m/z:4297.0
UPLC(方法08_B2_1):Rt=12.25分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=10.68分
【０６９１】
(実施例32)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,His31,Gln34,Pro37]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式51:
【０６９２】
【化７５】
0006006118.tif 000076
【０６９３】
調製方法: SPPS法B
理論的な分子質量の4234はMALDI-MS(アルファ-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸)により確認された。m/z:4234(1A)
UPLC(方法  07_B4_1):Rt=8.3分
UPLC(方法  04_A3_1):Rt=9.2分
【０６９４】
(実施例33)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式52:
【０６９５】
【化７６】
0006006118.tif 000077
【０６９６】
調製方法: SPPS法B
LCMS4:Rt=1.94分、m/z:3994.5
UPLC(方法  08_B2_1):Rt=12.25分
UPLC(方法  04_A3_1):Rt=8.63分
【０６９７】
(実施例34)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式53:
【０６９８】
【化７７】
0006006118.tif 000078
【０６９９】
調製方法: SPPS法B
LCMS4Rt：=1.92分、m/z:4797.3、M/4:1199.8、M/3:1599.4
UPLC(方法  09_B4_1):Rt=8.12分
UPLC(方法  05_B8_1):Rt=2.03分
【０７００】
(実施例35)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式54:
【０７０１】
【化７８】
0006006118.tif 000079
【０７０２】
調製方法: SPPS法B
LCMS4:Rt=1.99分、m/z:4697.0
UPLC(方法  09_B2_1):Rt=12.20分
UPLC(方法  05_B5_1):Rt=5.31分
【０７０３】
(実施例36)
Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]、Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式55:
【０７０４】
【化７９】
0006006118.tif 000080
【０７０５】
調製方法: SPPS法B
LCMS4:Rt=1.89分、m/z:4641.2
UPLC(方法  09_B2_1):Rt=11.20分
UPLC(方法  05_B5_1):Rt=4.00分
【０７０６】
(実施例37)
Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]、Nε37-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[His31,Gln34,Lys37]-GLP-1(7-37)-ペプチド
化学式56:
【０７０７】
【化８０】
0006006118.tif 000081
【０７０８】
調製方法: SPPS法B
LCMS4Rt=1.97分、m/z:4797.3、M/4:1200.1、M/5:1599.8
UPLC(方法  09_B4_1):Rt=8.24分
UPLC(方法  05_B8_1):Rt=2.88分
【０７０９】
(実施例38)
Nε26-4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイル-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式57:
【０７１０】
【化８１】
0006006118.tif 000082
【０７１１】
調製方法: SPPS法A
UPLC(方法  09_B2_1):Rt=8.29分
UPLC(方法  05_B5_1):Rt=6.40分
LCMS4 m/z:3762
【０７１２】
(実施例39)
N8-メチル, Nε26-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式58:
【０７１３】
【化８２】
0006006118.tif 000083
【０７１４】
調製方法: SPPS法B
理論的な分子質量の4037はMALDI-MS(アルファ-シアノ-4-ヒドロキシ ケイ皮酸)により確認された。m/z:4035(1A)
UPLC(方法  07_B5_1):Rt=5.8分
UPLC(方法  07_B4_1):Rt=8.5分
【０７１５】
(実施例40)
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式59:
【０７１６】
【化８３】
0006006118.tif 000084
【０７１７】
調製方法: SPPS法B
LCMS4:Rt=1.89分、m/z:4121.6
UPLC(方法  09_B2_1):Rt 11.97分
UPLC(方法  05_B8_1):Rt 5.30分
【０７１８】
(実施例41)
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu22,Lys24,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式60:
【０７１９】
【化８４】
0006006118.tif 000085
【０７２０】
調製方法: SPPS法B
UPLC(方法  08_B4_1):Rt=7.9分
UPLC(方法  05_B8_1):Rt=3.11分
MALDI-MS(アルファ-シアノ-4-ヒドロキシ ケイ皮酸):m/z:4194
【０７２１】
(実施例42)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Ile25,Arg26,Lys27,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式61:
【０７２２】
【化８５】
0006006118.tif 000086
【０７２３】
調製方法: SPPS法B
理論的な分子質量の4106はMALDI-MS(アルファ-シアノ-4-ヒドロキシ ケイ皮酸)により確認された。m/z:4105(1A)
UPLC(方法  07_B4_1):Rt 8.5分
【０７２４】
(実施例43)
Nε16-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys16,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式62:
【０７２５】
【化８６】
0006006118.tif 000087
【０７２６】
調製方法: SPPS法B
UPLC(方法  08_B4_1):Rt 8.06分
LCMS4: (M/5)+1=834、(M/4)+1=1042、正確な質量=4167
【０７２７】
(実施例44)
Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式63:
【０７２８】
【化８７】
0006006118.tif 000088
【０７２９】
調製方法: SPPS法A
UPLC(方法  10_B14_1):Rt=6.66分
LCMS4(M/4)+1=927、(M/3)+1=1235、正確な質量=3704
【０７３０】
(実施例45)
Nε26-[(4S)-4-カルボキシ-4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル]-[His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式64:
【０７３１】
【化８８】
0006006118.tif 000089
【０７３２】
調製方法: SPPS法A
UPLC(方法  10_B14_1):Rt=10.13分
LCMS4(M/4)+1=913、(M/3)+1=1226、正確な質量=3675
【０７３３】
(実施例46)
Nε12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys12,Glu22,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式65:
【０７３４】
【化８９】
0006006118.tif 000090
【０７３５】
調製方法: SPPS法B
UPLC(方法  08_B4_1):Rt=7.76分
MALDI-MS(アルファ-シアノ-4-ヒドロキシ ケイ皮酸):m/z:4102
【０７３６】
(実施例47)
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[ Glu22,Lys24,Arg26,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
化学式66:
【０７３７】
【化９０】
0006006118.tif 000091
【０７３８】
調製方法: SPPS法B
UPLC(方法  08_B4_1):Rt=7.78分
MALDI-MS(アルファ-シアノ-4-ヒドロキシ ケイ皮酸):m/z:4178
【０７３９】
薬理学的方法
(実施例48)
in vitroの効力
本実施例の目的は、本発明のGLP-1化合物のin vitroでの活性又は効力を試験することである。
【０７４０】
実施例1〜47のGLP-1アナログ及び誘導体の効力は下記のように、すなわちヒトGLP-1受容体を発現する膜を含有する培地中のサイクリックAMP(cAMP)の形成刺激として、決定された。
【０７４１】
原理
ヒトGLP-1受容体を発現する安定的に形質導入された細胞株であるBHK467-12A(tk-ts13)から精製された細胞膜は当該GLP-1アナログ又は誘導体で刺激され、cAMP生産能はPerkin Elmer Life Sciences社のAlphaScreen(商標) cAMP Assay Kitを用いて測定された。AlphaScreen Assayの基本原理は、内因的なcAMPと外因的に追加されたビオチンcAMPとの間の競合である。cAMPの捕捉は、アクセプタービーズにコンジュゲートされた特異的な抗体を用いることにより達成される。
【０７４２】
細胞培養及び膜の調製
安定的に形質導入された細胞株及び高発現クローンはスクリーニング用に選択された。細胞は5% CO2において、5% FCS、1% Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)及び0.5mg/mlの選択マーカーG418を含むDMEM中で増殖された。
【０７４３】
およそ80%コンフルエンスの細胞はPBSで2回洗浄され、Versene液(エチレンジアミン四酢酸の四ナトリウム塩水溶液)で収集され、5分間、1000rpmで遠心分離されて上清が除去された。付加的なステップは全て氷上でなされた。細胞ペレットはUltrathuraxにより20〜30秒間、10mlのBuffer 1(20mM Na-HEPES、10mM EDTA、pH=7.4)中でホモジェナイズされ、15分間、20,000rpmで遠心分離され、ペレットは10mlのBuffer 2(20mM Na-HEPES、0.1mM EDTA、pH=7.4)中に再懸濁された。懸濁液は20〜30秒間ホモジェナイズされ、15分間、20,000rpmで遠心分離された。Buffer 2における懸濁、ホモジェナイズ及び遠心分離は1回繰り返され、膜はBuffer 2中に再懸濁された。タンパク質濃度が決定され、膜は使用するまで-80℃で保存された。
【０７４４】
アッセイは平底96ウェルプレート(Costarカタログ番号:3693)の半分の領域内で行われた。1ウェルあたりの終容量は50μlであった。
【０７４５】
溶液及び試薬
Perkin Elmer Life Sciences社のAlphaScreen cAMP Assay Kit(カタログ番号:6760625M);抗cAMP Acceptor Beads(10U/μl)、ストレプトアビジンDonor Beads(10U/μl)及びビオチン化cAMP(133U/μl)を含有。
【０７４６】
AlphaScreen Buffer、pH=7.4:50mM TRIS-HCl(Sigma、カタログ番号:T3253)、5mM HEPES(Sigma、カタログ番号:H3375)、10mM MgCl2,H2O(Merck、カタログ番号:5833)、150mM NaCl(Sigma、カタログ番号:S9625)、0.01% Tween(Merck、カタログ番号:822184)。使用前にAlphaScreen Bufferに以下が添加された(終濃度が指し示される):BSA(Sigma、カタログ番号A7906)が0.1%、IBMX(Sigma、カタログ番号I5879)が0.5mM、ATP(Sigma、カタログ番号A7699)が1mM、GTP(Sigma、カタログ番号G8877)が1uM。
【０７４７】
cAMP標準物質(アッセイにおける希釈係数=5):cAMP Solution:5μLの5mM cAMPストック+495μLのAlphaScreen Buffer
【０７４８】
cAMP標準物質、同様に試験されるGLP-1アナログ又は誘導体のAlphaScreen Buffer中の適切な希釈系列は、例としてGLP-1化合物について以下の8濃度:10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13及び10-14Mで、cAMPについて例として10-6から3×10-11までの系列で、調製された。
【０７４９】
膜/Acceptorビーズ
hGLP-1/BHK467-12A膜の使用;0.6mg/mlに相当する6μg/ウェル(ウェルあたりの用いられる膜の量は変わり得る)
「膜無し」:AlphaScreen Buffer中のAcceptor Beads(最終15μg/ml)
「6μg/ウェルの膜」:膜+AlphaScreen Buffer中のAcceptorビーズ(最終15μg/ml)
10μlの「膜無し」をcAMP標準物質(1ウェルあたり、2連)並びに陽性対照及び陰性対照に添加
10μlの「6μg/ウェルの膜」をGLP-1及びアナログに添加(1ウェルあたり、2連/3連)
陽性対照:10μl「膜無し」+10μl AlphaScreen Buffer
陰性対照:10μl「膜無し」+10μl cAMP Stock Solution(50μM)
【０７５０】
ビーズは直接光に敏感なため、あらゆる操作は(できる限り暗い)暗所で、又は緑色光の中であった。全ての希釈は氷上でなされた。
【０７５１】
手順
1. AlphaScreen Bufferを作成
2. GLP-1/アナログ/cAMP標準物質をAlphaScreen Buffer中に溶解して希釈
3. Donor Beads溶液を作成、30分間室温でインキュベート
4. cAMP/GLP-1/アナログをプレートに添加:1ウェルあたり10μl
5. 膜/Acceptor Beads Solutionを調製、これをプレートに添加:1ウェルあたり10μl
6. Donor Beadsを添加:1ウェルあたり30μl
7. プレートをアルミホイル中に包み、振とう機上で3時間(非常に低速で)室温でインキュベート
8. AlphaScreen上でカウント-各プレートはAlphaScreen中でカウント前に3分間プレインキュベート
【０７５２】
結果
EC50[pM]値はGraph-Pad Prismソフトウェア(バージョン5)を用いて計算された。
【０７５３】
全ての化合物、アナログ及び誘導体のin vitroの効力が確認された。44個の化合物はEC50が2000pM以下に相当する良好なin vitroの効力を持っていた。40個の化合物はより一層効力があり、EC50は1000pM以下であった。33個の化合物はEC50が500pM以下に相当する、なおさらに改善された効力を持っていた。21個の化合物は非常に効力があり、EC50は200pM以下に相当した。そして13個の化合物はEC50が100pM以下に相当する非常に良好な効力を持っていた。5個のアナログのEC50は40〜160pMの範囲にあった。
【０７５４】
所望の場合、GLP-1に関する変動倍率は、EC50(GLP-1)/EC50(アナログ)-3693.2として計算され得る。
【０７５５】
(実施例49)
GLP-1受容体結合
本実験の目的は、GLP-1受容体への本発明のGLP-1化合物の結合、及びその結合がアルブミンの存在によりどのように潜在的に影響されるかを調査することである。これは下記のin vitro実験においてなされた。
【０７５６】
実施例1〜47のGLP-1アナログ及び誘導体のヒトGLP-1受容体への結合アフィニティーは受容体から125I-GLP-1を転置させる能力として測定された。化合物のアルブミンへの結合を試験するため、アッセイは低濃度のアルブミン(0.005%-トレーサー中のその残量に相当)を、同様に高濃度のアルブミン(2.0%添加)を使用して行われた。
【０７５７】
結合アフィニティーIC50におけるシフトは当該ペプチドがアルブミンに結合することの指標であり、それにより、当該ペプチドが動物モデルにおいて潜在的な持続時間延長された薬物動態学的プロファイルを持つことの予測である。
【０７５８】
条件
種類(in vitro):ハムスター
生物学的エンドポイント:受容体結合
アッセイ方法:SPA
受容体:GLP-1受容体
細胞株:BHK tk-ts13
【０７５９】
細胞培養及び膜の精製
安定的に形質導入された細胞株及び高発現クローンはスクリーニング用に選択された。細胞は5% CO2において、10% FCS、1% Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)及び1.0mg/mlの選択マーカーG418を含むDMEM中で増殖された。
【０７６０】
細胞(およそ80%コンフルエンス)はPBSで2回洗浄され、Versene液(エチレンジアミン四酢酸の四ナトリウム塩水溶液)で収集され、続いて1000rpmで5分間の遠心分離により分離された。細胞/細胞ペレットは以後のステップにおいて可能な限り氷上で保たれなければならない。細胞ペレットはUltrathurraxを使用して20〜30秒間、適切な量のBuffer 1(細胞の量によるが、例として10ml)中でホモジェナイズされた。ホモジネートは20000rpmで15分間遠心分離された。ペレットは10mlのBuffer 2中に再懸濁(ホモジェナイズ)され、再遠心分離された。このステップはもう1回繰り返された。結果として生じたペレットはBuffer 2中に再懸濁され、タンパク質濃度が決定された。膜はマイナス80℃で保存された。
Buffer 1:20mM Na-HEPES+10mM EDTA、pH7.4
Buffer 2:20mM Na-HEPES+0.1mM EDTA、pH7.4
【０７６１】
結合アッセイ:
SPA:
試験化合物、膜、SPA粒子及び[125I]]-GLP-1(7-36)NH2はアッセイ緩衝液中で希釈された。25ul(マイクロリッター)の試験化合物はOptiplateに添加された。HSA(2% HSAを含有する「高アルブミン」実験)、又は緩衝液(0.005% HSAを含有する「低アルブミン」実験)が添加された(50ul)。5〜10ugのタンパク質/サンプルが0.1〜0.2mgタンパク質/mlに相当して(50ul)添加された(各膜調製物について好ましくは最適化される)。SPA粒子(コムギ胚芽凝集素SPAビーズ、Perkin Elmer、#RPNQ0001)が0.5mg/ウェル(50ul)の量で添加された。インキュベーションは[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2(終濃度0.06nM、49.880DPMに相当、25ul)と共に開始された。プレートはPlateSealerでシールされ、120分間、30℃で、振とうしながらインキュベートされた。プレートは遠心分離され(1500rpm、10分間)、Topcounterにおいてカウントされた。
【０７６２】
アッセイ緩衝液:
50mM HEPES
5mM EGTA
5mM MgCl2
0.005% Tween 20
pH7.4
HSAはSIGMA A1653であった。
【０７６３】
計算
IC50値は受容体から50%の125I-GLP-1を転置させる濃度として曲線から読み取られ、比率[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA]が決定された。
【０７６４】
一般に、低アルブミン濃度でのGLP-1受容体への結合は、低いIC50値に対応して、可能な限り良好であるはずである。
【０７６５】
高アルブミン濃度でのIC50値は、化合物のGLP-1受容体への結合に対するアルブミンの影響の測定値である。知られているように、GLP-1誘導体もまたアルブミンに結合する。これは一般に望ましい効果であり、血漿における存続時間を延ばす。それ故、誘導体については、高アルブミンでのIC50値は低アルブミンでのIC50値よりも一般に高く、これはGLP-1受容体への結合低減に対応して、GLP-1受容体への結合と競合するアルブミンの結合により引き起こされるものである。
【０７６６】
高比率(IC50値(高アルブミン)/IC50値(低アルブミン))はそれ故、当該誘導体がアルブミンに良好に結合し(長い半減期を持つであろう)、それ自体もまたGLP-1受容体に良好に結合する(IC50値(高アルブミン)が高く、IC50値(低アルブミン)が低い)ことの指標として受け取られ得る。
【０７６７】
結果
以下の結果が得られたが、ここで「比率」とは[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA])をいう。
【０７６８】
5個のアナログ及び2個の誘導体を除いて、全ての化合物が1.0より高い比率を持っていた。35個の誘導体は10より高かった。27個の誘導体は25より高かった。23個の誘導体は50より高かった。13個の誘導体は100より高かった。そして7個の誘導体は250より高い比率を持っていた。
【０７６９】
そのうえIC50(低アルブミン)に関しては、全ての化合物が600nMより低いIC50(低アルブミン)を持っていた。1個を除いて全てが500nMより低かった。3個を除いて全てが100nMより低かった。39個は50nMより低かった。34個の化合物は25.00nMより低かった。27個の化合物は10.00nMより低かった。21個の化合物は5.00nMより低かった。そして10個の化合物は1.00nMより低かった。5個のアナログは2〜15nMの範囲のIC50(低アルブミン)を持っていた。
【０７７０】
最後にIC50(高アルブミン)に関しては、全ての化合物が1000.00nM以下のIC50(高アルブミン)を持っていた。41個の化合物は1000.00nMより低かった。29個の化合物は500.00nMより低かった。13個の化合物は100.00nMより低かった。そして10個の化合物は50.00nMより低かった。5個のアナログは0.35〜2.97nMの範囲のIC50(高アルブミン)を持っていた。
【０７７１】
全ての化合物、アナログ、同様に誘導体は、低アルブミンの存在下でGLP-1受容体に良好に結合する。そのうえ予想されたように、上昇したアルブミン濃度により影響されるのは、主として誘導体の受容体への結合である。
【０７７２】
(実施例50)
腸の酵素による分解に対する安定性
本実施例の目的は腸の酵素による分解に対する本発明の化合物の安定性を試験することである。
【０７７３】
GLP-1(7-37)はアッセイにおいて標準物質の一種として用いられ、リラグルチド及びセマグルチドは比較用に包含された。
【０７７４】
試験された化合物は実施例1〜23、27〜30、32〜35、38〜39及び41〜47のアナログ及び誘導体であった。
【０７７５】
腸において最もタンパク質分解活性が強いのは膵臓由来のものであり、セリンエンドペプチダーゼのトリプシン、キモトリプシン、及びエラスターゼ、同様に数タイプのカルボキシペプチダーゼが挙げられる。
【０７７６】
ラットからの小腸抽出物を使用したアッセイが開発され、以下に記載されるように用いられた。
【０７７７】
ラット小腸からの抽出物
小腸はラットから調製され、8mlの150mM NaCl、20mM Hepes pH 7.4で洗い流された。溶液は15分間、4,600rpmで、Heraeus Multifuge 3 S-R遠心機において75006445ローターを使用して遠心分離された。上清が除去され、0.22μm Millipore Millex GV PVDF（登録商標）膜を通じてろ過された。個体差を平均化するため、数匹の動物のろ液がプールされた。
【０７７８】
得られた抽出物のタンパク質含量はBradfordアッセイにより決定された(例としてAnalytical Biochemistry(1976)、vol.72、248〜254ページ、及びAnalytical Biochemistry(1996)、vol.236、302〜308ページを参照)。
【０７７９】
分解アッセイ
2.5nmolの試験される化合物は腸抽出物と共に250μlの容量で37℃で1時間にわたってインキュベートされた。腸サンプルは20mM Hepesの存在下pH7.4でアッセイされた。腸抽出物の濃度はパイロット実験においてGLP-1(7-37)の半減期(t1/2)が10〜20分の範囲になるように設定された。小腸抽出物は濃度1.4μg/mlで用いられた。腸抽出物以外の全ての成分は混合され、10分間、37℃で予め温められた。腸抽出物を添加後すぐにサンプル50μlが採取され、同じ容量の1%トリフルオロ酢酸(TFA)と混合された。さらにサンプルは続く15、30及び60分後に採取された。
【０７８０】
サンプル分析
UPLC分析
10μlのサンプルはWaters Acquityシステムを用いたUPLCにより、BEH C18 1.7μm 2.1×50mmカラムを使用して、0.1% TFA及び0.07% TFAのアセトニトリル溶液の30〜65%グラジエントを5分間かけて、流速0.6ml/分で分析された。ベースライン減算後、波長214nmで記録されたHPLCクロマトグラム中のインタクトな化合物のピーク積分が決定された。
【０７８１】
MALDI-TOF分析
1μlの各サンプルはBruker/Eppendorf PAC HCCA 384 MALDIターゲットに移された。分析はBruker Autoflexマトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析装置を使用して、予め規定された方法「PAC_measure」を用いて、500〜5000Daの拡張検出範囲及び予め規定された較正方法「PAC_calibrate」を使用して行われた。
【０７８２】
データ解析
HPLCクロマトグラムのピーク積分は時間に対してプロットされた。各化合物の半減期はSigmaPlot 9.0ソフトウェア及び2パラメーター指数関数形崩壊についての式を用いてデータを適合させることにより計算された。
【０７８３】
試験された各化合物について、相対的半減期(相対的T1/2)が、同じように決定されたGLP-1(7-37)の半減期(T1/2)で除算された当該化合物の半減期(T1/2)として計算された。
【０７８４】
結果
既知化合物であるリラグルチド及びセマグルチドの相対的半減期はそれぞれ4.8及び1.2であった。
【０７８５】
試験されたGLP-1アナログ及び誘導体の38個全てが少なくとも1の相対的半減期を持っていた。36個の化合物は少なくとも2の相対的半減期を持っていた。30個の化合物は少なくとも5の半減期を持ち、9個の化合物は少なくとも10の半減期を持っていた。そして3個の化合物は少なくとも15の半減期を持っていた。37個の化合物はセマグルチドより高い相対的半減期を持っていた。25個の化合物はリラグルチドより高い相対的半減期を持っていた。試験された3個のアナログの相対的半減期は3〜6の範囲にあった。
【０７８６】
(実施例51)
ラットにおける薬物動態
本実施例の目的は、本発明の誘導体のラットにおけるin vivoの半減期を調査することである。
【０７８７】
ラットにおけるin vivoの薬物動態学的研究は、実施例2、7、14、16〜17、20、30及び38の誘導体を使用して、以下に記載されるように行われた。セマグルチドが比較用に包含された。
【０７８８】
齢が同じで体重400gから600gまでの雄性Sprague DawleyラットはTaconic(Denmark)から入手され、体重に対する単純ランダム化により、1群あたりおよそ3〜6匹のラットが各群における全ての動物が同様の体重であるよう処置群に割り当てられた。
【０７８９】
GLP-1誘導体(およそ6nmole/ml)は50mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウム、0.05% tween 80、pH7.4中に溶解された。化合物の静脈内注射(1.0ml/kg)は右頸静脈内に植え込まれたカテーテルを通じて与えられた。血液は投薬後5日間、舌下静脈から採取された。血液サンプル(200μl)はEDTA緩衝液(8mM)中に回収され、次いで4℃、10000Gで5分間遠心分離された。血漿サンプルは各GLP-1化合物の血漿濃度について分析されるまで-20℃で保存された。
【０７９０】
GLP-1化合物の血漿濃度は蛍光酸素チャンネリングイムノアッセイ(LOCI)を用いて、一般にインスリンの決定についてPoulsen及びJensenによりJournal of Biomolecular Screening 2007、vol.12、240〜247ページに記載されるように、決定された。ドナービーズはストレプトアビジンでコーティングされ、一方アクセプタービーズはペプチドの中央/C末端エピトープを認識するモノクローナル抗体でコンジュゲートされた。N末端に特異的な別のモノクローナル抗体はビオチン化された。3つの反応物は分析物と併合され、2部位化免疫複合体を形成した。複合体を照らすと一重項酸素原子がドナービーズから放出され、これはアクセプタービーズに向けられて化学発光が誘引され、化学発光はEnvisionプレートリーダー内で測定された。光の量は化合物の濃度に比例した。
【０７９１】
血漿濃度-時間プロファイルはWinNonlin(ver.5.0、Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)を用いて分析され、半減期(T1/2)は各動物からの個別の血漿濃度-時間プロファイルを用いて計算された(調和平均)。
【０７９２】
結果
セマグルチドの半減期は4時間であった。
【０７９３】
試験された誘導体の8個全てが少なくとも5時間の半減期を持ち、7個は少なくとも10時間の半減期を持っていた。
【０７９４】
(実施例52)
ミニブタにおける薬物動態学
本研究の目的は、ミニブタへの静脈内投与後の本発明のGLP-1誘導体のin vivoでの持続時間延長、すなわちその作用時間の延長を決定することである。
【０７９５】
これは薬物動態学的(PK)研究においてなされ、当該誘導体の終末相半減期が決定される。終末相半減期は、一般に、ある特定の血漿濃度を半減させるのに必要な時間が意味され、初期の分布相の後に測定される。Ellegaard Gottingen Minipigs(Dalmose、Denmark)から入手された、およそ7〜14カ月齢でおよそ16〜35kgの体重の雄性Gottingenミニブタが研究に用いられた。ミニブタは個別に飼育され、制限された状態で1日1回又は2回、SDSミニブタ食(Special Diets Services、Essex、UK)を給餌された。少なくとも2週間の順化後、2つの常置中心静脈カテーテルが各動物において尾方又は頭方の大静脈内に植え込まれた。動物は外科手術後1週間の回復を許され、次いで投薬の間に適切なウォッシュアウト期間を有する繰り返しの薬物動態学的研究に用いられた。
【０７９６】
動物は投薬前およそ18時間及び投薬後少なくとも4時間絶食させられたが、全期間を通じて水を自由に摂取できた。
【０７９７】
実施例2、7、14〜15及び20のGLP-1誘導体は50mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウム、0.05% tween 80、pH7.4の中に、通常20〜60nmol/mlの濃度になるように溶解された。化合物の静脈内注射(通常1〜2nmol/kgに相当する容量、例えば0.033ml/kg)はカテーテルを通じて与えられ、血液サンプルが予め規定された時点で投薬後13日まで(好ましくは他のカテーテルを通じて)採取された。血液サンプル(例えば0.8ml)はEDTA緩衝液(8mM)中に回収され、次いで4℃、1942Gで10分間遠心分離された。血漿はドライアイス上のMicronicチューブ内にピペットで移され、各GLP-1化合物の血漿濃度についてELISA若しくは類似の抗体に基づくアッセイ又はLC-MSを用いて分析されるまで-20℃で保存された。個々の血漿濃度-時間プロファイルはノンコンパートメントモデルによりWinNonlin v.5.0(Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)において分析され、結果として生じた終末相半減期(調和平均)が決定された。
【０７９８】
結果
試験された誘導体は全てが少なくとも12時間の半減期を持ち、5個は少なくとも24時間の半減期を持ち、4個は少なくとも36時間の半減期を持ち、3個は少なくとも48時間の半減期を持っていた。
【０７９９】
(実施例53)
経口での生物学的利用能の推定
本実験の目的は本発明のGLP-1誘導体の経口での生物学的利用能を推定することである。
【０８００】
この目的を達成するため、実施例2、14〜17、20、28〜30、38及び41〜47のGLP-1誘導体を腸管腔内に直接注射した後の血漿中の曝露が、ラットにおいてin vivoで、以下に記載されるように研究された。
【０８０１】
GLP-1誘導体は1000uMの濃度で55mg/mlカプリン酸ナトリウム溶液中で試験された。
【０８０２】
到着時の体重がおよそ240gの、32匹の雄性Sprague DawleyラットはTaconic(Denmark)から入手され、単純ランダム化により1群あたり4匹のラットが異なる処置群に割り当てられた。ラットは実験前におよそ18時間絶食させられ、全身麻酔(Hypnorm/Dormicum)をかけられた。
【０８０３】
GLP-1誘導体は空腸の近位部(十二指腸の10cm遠位)内、又は中腸(盲腸の50cm近位)内のいずれかに投与された。10cm長のPE50-カテーテルが空腸内に挿入され、少なくとも1.5cm空腸内を進められ、漏れ又はカテーテル転置を防ぐため、投薬前に腸及びカテーテル周囲を3/0縫合を用いて先端から遠位で結紮することにより固定された。カテーテルはシリンジや針を伴わずに置かれ、創傷クリップで切開を閉じる前に2mlの生理食塩水が腹部内に投与された。
【０８０４】
100μlの各GLP-1誘導体は空腸管腔内にカテーテルを通じて1mlシリンジを使用して注射された。続いて、カテーテルを「洗い流す」ため、200μlの空気が空腸管腔内に別のシリンジを使用して押し入れられた。このシリンジはカテーテル内への逆流を防ぐためにカテーテルに連結されたままにされた。
【０８０５】
血液サンプル(200ul)は所望の間隔(通常0、10、30、60、120及び240分時)で尾静脈からEDTAチューブ内に回収され、20分以内に5分間、10000G、4℃で遠心分離された。血漿(75ul)はMicronicチューブに分離され、速やかに凍結され、血漿中の各GLP-1誘導体濃度についてLOCI(蛍光酸素チャンネリングイムノアッセイ)を使用して、一般にインスリンの決定についてPoulsen及びJensenによりJournal of Biomolecular Screening 2007、vol.12、240〜247ページに記載されるように分析されるまで-20℃で保存された。ドナービーズはストレプトアビジンでコーティングされ、一方アクセプタービーズはペプチドの中央/C末端エピトープを認識するモノクローナル抗体でコンジュゲートされた。N末端に特異的な別のモノクローナル抗体はビオチン化された。3つの反応物は分析物と併合され、2部位化免疫複合体を形成した。複合体を照らすと一重項酸素原子がドナービーズから放出され、これはアクセプタービーズに向けられて化学発光が誘引され、化学発光はEnvisionプレートリーダー内で測定された。光の量は化合物の濃度に比例した。
【０８０６】
血液採取後、ラットは麻酔下で屠殺され、腹部が開かれてカテーテル配置が正しいか検証された。
【０８０７】
平均(n=4)血漿濃度(pmol/l)は時間の関数として決定された。投薬溶液の濃度(μmol/l)で除算された血漿濃度(pmol/l)の比率が各処置群について計算され、t=30分(空腸内への化合物注射後30分)についての結果は腸の生物学的利用能のサロゲート測定値として査定された(30分時の用量補正曝露)。用量補正された曝露は実際の生物学的利用能と顕著に相関することが示されている。
【０８０８】
以下の結果が得られたが、ここで30分時の用量補正曝露とは(投薬溶液(μM)中の化合物濃度)で除算された(空腸内への化合物注射の30分後の血漿濃度(pM))をいう。
【０８０９】
結果
3個を除いて全ての試験された誘導体は30分時の用量補正曝露が48より高かった。8個は100より高かった。3個は125より高かった。そして1個は150より高かった。
【０８１０】
比較用のWO09030771の実施例69及び71の化合物は30分時の用量補正曝露がそれぞれ48及び20であった。
【０８１１】
(実施例54)
血糖及び体重に対する効果
本研究の目的は糖尿病設定における血糖(BG)及び体重(BW)に対する本発明のGLP-1化合物の効果を検証することである。
【０８１２】
実施例2、4、7、14及び15のGLP-1誘導体は、肥満の糖尿病マウスモデル(db/dbマウス)における用量応答研究において、以下に記載されるように試験された。
【０８１３】
50匹のdb/dbマウス(Taconic、Denmark)は出生時からNIH31食(NIH 31M Rodent Diet、Taconic Farms、Inc.、USから市販されている、www.taconic.comを参照)を給餌され、7〜9週齢時に研究に加えられた。マウスは標準的な固形飼料(例としてAltromin 1324、Brogaarden、Gentofte、Denmark)及び水道水の自由摂取を与えられ、24℃で保たれた。1〜2週間の順化の後、基礎的な血糖が連続した2日間で2回(すなわち午前9時に)査定された。血糖値が最も低かった8匹のマウスは実験から除外された。平均血糖値に基づいて、残りの42匹のマウスはさらなる実験用に選択され、血糖レベルが合わせられた7つの群(n=6)に割り付けされた。マウスは5日間の期間の実験に4回まで用いられた。最後の実験後、マウスは安楽死させられた。
【０８１４】
7つの群は以下の処置を受けた。
1:ビヒクル、皮下投与
2:GLP-1誘導体、0.3nmol/kg、皮下投与
3:GLP-1誘導体、1.0nmol/kg、皮下投与
4:GLP-1誘導体、3.0nmol/kg、皮下投与
5:GLP-1誘導体、10nmol/kg、皮下投与
6:GLP-1誘導体、30nmol/kg、皮下投与
7:GLP-1誘導体、100nmol/kg、皮下投与
ビヒクル:50mMリン酸ナトリウム、145mM塩化ナトリウム、0.05% tween 80、pH7.4
【０８１５】
GLP-1誘導体は濃度が0.05、0.17、0.5、1.7、5.0及び17.0nmol/mlになるようにビヒクル中に溶解された。動物は6ml/kg(すなわち50gのマウスあたり300μl)の投薬量で、皮下に投薬された。
【０８１６】
投薬の日、血糖は-1/2時間時(午前8時30分)に査定され、その後マウスは秤量された。GLP-1誘導体はおよそ午前9時(0時間時)に投薬された。投薬の日、血糖は1、2、4及び8時間時(午前10時、午前11時、午後1時及び午後5時)に査定された。
【０８１７】
翌日、血糖は投薬後24、48、72及び96時間時(すなわち2、3、4、5日目の午前9時)に査定された。各日においてマウスは血糖採取後に秤量された。
【０８１８】
マウスは個々にデジタル体重計で秤量された。
【０８１９】
血糖測定用のサンプルは意識のあるマウスの尾端毛細血管から得られた。10μlの血液がヘパリン処理されたキャピラリー内に回収され、500μlのグルコース緩衝液(EKFシステム溶液、Eppendorf、Germany)に移された。グルコース濃度はグルコースオキシダーゼ法を用いて測定された(グルコース分析装置Biosen 5040、EKF Diagnostics、GmbH、Barleben、Germany)。サンプルは室温で分析までの1時間以内、保存された。分析が延期される場合、サンプルは4℃で最大24時間保存された。
【０８２０】
ED50は最大半減効果を生じるnmol/kgでの用量である。この値は体重を低下させる誘導体の能力に基づいて、同様に血糖を低下させる能力に基づいて、下に説明されるように計算される。
【０８２１】
体重についてのED50は、誘導体の皮下投与後24時間のデルタBWに対して最大半量効果を生じる用量として計算される。例えば、24時間後の体重の最大減少が4.0gの場合、ED50体重は24時間後に2.0gの体重減少を生じるnmol/kgでの用量であろう。この用量(ED50体重)は用量応答曲線から読み取られ得る。
【０８２２】
血糖についてのED50は、アナログの皮下投与後8時間のAUCデルタBGに対して最大半量効果を生じる用量として計算される。
【０８２３】
ED50値は最大応答の明確な規定を有する妥当なS字状の用量反応関係が存在する場合にのみ計算され得る。それ故に、そうでない場合、当該誘導体は異なる用量範囲でS字状の用量反応関係が得られるまで再試験される。
【０８２４】
以下の結果が得られた。
試験された誘導体は血糖に対して、同様に体重に対して(両方の場合において低下させる)期待された効果を持っていた。そのうえ、S字状の用量応答曲線が得られ、血糖及び体重のそれぞれについてのED50値の計算が上に説明されたように可能となった。
【０８２５】
(実施例55)
グルコース仲介性インスリン分泌に対する効果
本実施例の目的はグルコース仲介性インスリン分泌に対する本発明のGLP-1化合物の効果を試験することである。
【０８２６】
これはGottingenミニブタにおいて静脈内耐糖能試験(IVGTT)を用いることでなされる。
【０８２７】
7〜14カ月齢の雄性Gottingenミニブタ(Ellegaard Gottingen minipigs A/S、Dalmose、Denmark)が研究に用いられる。動物は順化及び実験の間、一匹用の檻の中で飼育される。少なくとも2週間の順化後、2つの常置中心静脈カテーテルが各動物において尾方又は頭方の大静脈内に植え込まれる。動物は外科手術後1週間の回復を許され、次いで投薬の間に適切なウォッシュアウト期間を有する繰り返しの研究に用いられる。
【０８２８】
ブタは制限された状態で1日1回又は2回、SDSミニブタ飼料(Special Diets Services、Essex、UK)を給餌され、水の自由摂取を許される。
【０８２９】
GLP-1化合物の効果は単回投与の後に、又は急性高用量による副作用を回避するための用量増加を伴う期間の後に試験される。GLP-1誘導体は耳の後ろの薄い皮膚において静脈内又は皮下のいずれかに与えられる。
【０８３０】
試験される各GLP-1化合物について、ビヒクル処置される(又は処置されていない)ベースライン群、及び2〜6の異なる血漿濃度レベルに相当する2〜6のGLP用量群があり、この血漿濃度レベルは通常、約3000〜80000pM(n=5〜8)である。
【０８３１】
各GLP-1化合物について、1又は2時間の静脈内耐糖能試験が行われる。ブタは実験前におよそ18時間絶食させられる。中央静脈カテーテルの開存がチェックされ、2つのベースライン血液サンプルが採取される。0分時サンプルの後、0.3g/kgグルコース(グルコース500g/L、SAD)が30秒間かけて静脈内に与えられ、カテーテルは10〜20mlの滅菌0.9% NaClで洗い流される。血液サンプルは通常、グルコース急速投与に関する以下の時点:-10、-5、0、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120分時で採取され、各血液サンプルの後、カテーテルは10U/mlのヘパリンを添加した4mlの滅菌0.9% NaClで洗い流される。インスリン、グルコース及び誘導体の血漿濃度についての血液サンプルはEDTAでコーティングされたチューブに移される。チューブは1時間以内に遠心分離(4℃、3000rpm、10分間)されるまで濡れた氷上で保存され、血漿はドライアイス上のMicronicチューブ内にピペットで移されて、分析まで-20℃で保存される。GLP-1誘導体の半減期に応じて、血漿濃度はt=0分、又はt=0分及び試験終了時(t=60分若しくはt=120分)に測定される。グルコースはグルコースオキシダーゼ法を用いて、製造業者の説明書に従って、500μLの緩衝液中の10μLの血漿を使用して分析される(EBIO plus自動分析装置及び溶液、Eppendorf、Germany)。インスリンは適切な免疫測定アッセイ(LOCIなど、例としてJournal of Biomolecular Screening 2007、vol.12、240〜247ページを参照)を用いて分析される。GLP-1誘導体の血漿濃度はELISA若しくは類似の抗体に基づくアッセイ又はLC-MSを用いて分析される。
【０８３２】
各研究についてインスリンの曲線下領域(AUCインスリン)が計算され、インスリン分泌の測定値として用いられる。異なる用量の群は一元配置ANOVA又は他の適当な統計解析を用いて各ビヒクル/ベースライン群と比較される。AUCインスリンについてのEC50もまた計算され得る。
【０８３３】
(実施例56)
飼料摂取に対する効果
本実験の目的はブタにおける飼料摂取に対する本発明のGLP-1化合物の効果を調査することである。これは薬力学的(PD)研究において下記のようになされ、飼料摂取がGLP-1誘導体の単回用量投与の1、2、3及び4日後に測定され、ビヒクル処置対照群と比較される。
【０８３４】
およそ3カ月齢でおよそ30〜35kgの体重の雌性ランドレースヨークシャーデュロック(LYD)ブタが用いられる(1群あたりn=3〜4)。動物は飼養施設への順化の間、群の中で1〜2週間飼育される。実験期間の間、動物は個々の食事摂取の測定のために月曜日の朝から金曜日の午後まで個別の檻の中に置かれる。動物は順化及び実験期間の間のいずれにおいても、全ての時間、ブタ飼料(Svinefoder、Antonio)を自由摂餌させられる。食事摂取は飼料の重量を15分ごとにログを取ることによりオンラインでモニターされる。用いられるシステムはMpigwin(Ellegaard Systems、Faaborg、Denmark)である。
【０８３５】
GLP-1誘導体はリン酸緩衝液(50mMリン酸、0.05% tween 80、pH8)中に濃度が12、40、120、400又は1200nmol/mlになるように溶解されるが、これは0.3、1、3、10又は30nmol/kgの用量に相当する。リン酸緩衝液はビヒクルとして役立つ。動物はGLP-1誘導体又はビヒクルの皮下への単回用量(投薬量0.025ml/kg)を1日目の朝に投薬され、飼料摂取が投薬後4日間測定される。各研究の最終日である投薬後4日目に、GLP-1誘導体の血漿曝露測定用の血液サンプルが麻酔された動物において心臓から採取される。動物はその後ペントバルビトンの心臓内過剰投与で安楽死させられる。GLP-1誘導体の血漿含量はELISA又は類似の抗体に基づくアッセイを用いて分析される。
【０８３６】
飼料摂取は4日目の24時間食事摂取の平均値±SEMとして計算される。
【０８３７】
4日目のビヒクル群対GLP-1誘導体群における24時間飼料摂取の統計比較は、一元配置又は二元配置ANOVA繰り返し測定を、その後にボンフェローニ事後検定を用いてなされる。
【０８３８】
(実施例57)
アルブミン結合アフィニティー
本実施例の目的は本発明のGLP-1誘導体のヒト血清アルブミン(HSA)へのアフィニティーを測定することである。
【０８３９】
解離定数(Kd)は一般に、薬剤とタンパク質との間のアフィニティー、すなわち薬剤がどのくらい堅固にタンパク質に結合するかを記述するのに用いられる。
【０８４０】
実施例2、4〜9、11〜18、20〜21、23〜25及び27〜46の誘導体のHSAへの解離定数は競合シンチレーション近接アッセイ(SPA)により以下に記載されるように決定された。
【０８４１】
ストレプトアビジン-SPAビーズ(GE Healthcare RPNQ0009)はビオチン化されたHSAと5時間インキュベートされた。結合していないHSAを除去するため、ビーズはバッファーで洗浄された。ビーズはトレーサー、すなわち125I標識されたアシル化GLP-1アナログ(N-イプシロン37-[2-(2-[2-((S)-4-((S)-4-(12-[4-(16-(1H-テトラゾル-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル)ブチリルアミノ]ドデカノイルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)-4-カルボキシブチリルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,125I-Tyr19,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)-NH2)と、100mM Hepes、100mM NaCl、10mM MgSO4、0.025% Tween-20を含有するpH7.4のバッファー中で混合された。混合物はPerkin Elmer Optiplate-96 6005290のウェル内にピペットで移され(1ウェルあたり100μl)、測定されるGLP-1誘導体の希釈系列100μlが同じバッファー中に添加された。室温で20時間穏やかに振とうした後、プレートは遠心分離され、TopCounter上でカウントされた。結合したcpmがGLP-1誘導体濃度の関数としてプロットされた。
【０８４２】
このアッセイは試験される誘導体がトレーサーと同じ結合部位に結合するという前提に基づくものである。
【０８４３】
Kdは、当該GLP-1誘導体のモル濃度をHSAのモル濃度で乗算してGLP-1-HSA複合体のモル濃度で除算したものとして計算され得る。それ故に解離定数は、HSA上の結合部位が半分占有されるGLP-1誘導体の濃度に相当する、すなわちHSA-GLP-1複合体の濃度がGLP-1誘導体が結合していないHSAの濃度と等しいGLP-1誘導体の濃度に相当するモル単位(M)を持つ。解離定数が小さいほど、GLP-1誘導体は堅固に結合しているか、又はGLP-1誘導体とHSAとの間のアフィニティーが高い。
【０８４４】
或いは、競合曲線のEC50値は、HSAについての誘導体のアフィニティー測定値として用いられ得る(本明細書の「見かけのKd」)。
【０８４５】
結果
5個を除いて全ての試験された誘導体は、1以上という比較的高い見かけの解離定数(見かけのKd、μMで表す)に相当する、アルブミンへの比較的低い結合アフィニティーを持っていた。23個は5以上であった。18個は10より大きく、そして12個は20より大きかった。
【０８４６】
本発明のある特定の特徴が本明細書に例証され記載されているが、多くの改変、置換、変更及び等価物は今や当業者が思い付くものであろう。それ故、添付の特許請求の範囲は本発明の真の趣旨の範囲内に入る全てのかかる改変及び変更に及ぶことが意図されると理解されるものである。
【配列表】
0006006118000001.app