(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで、患者における癌、又は癌が発生する素因を検出する方法であり、当該癌が乳癌であり、以下：
当該患者から採取した試料中のRANKL活性及びOPGの量を判定する工程；
RANKL活性とOPGの量との間の差し引き又は比率を計算する工程；及び
当該差し引き又は比率を、陰性対照試料のものと、及び／又は陽性対照試料のものと比較することにより、当該癌、又は癌が発生する素因を検出する工程；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記RANKL活性が、前記試料中のRANKL及び／又はRANKの量を判定することにより判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記RANKL活性が、RANK、IKK-アルファ、IkB-アルファ、P-NF-カッパ-B、サイクリンD1のいずれか１つのシグナリングを判定することにより判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が、患者の胸部細胞を含む、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、プロゲステロン受容体、又はエストロゲン受容体から選択されるホルモン受容体を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
RANKLが、前記患者の血清試料中で判定される、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記患者が、ホルモンによる治療、又はホルモン避妊を受けている、請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
更に、月経周期のホルモン、その機能的誘導体、又はRANKLリガンドの、患者の試料中の血清濃度を判定する工程を含む、請求項１〜５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料中のプロゲステロン及び／又はプロゲスチンレベルを判定する工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくともRANK活性、並びにプロゲステロン及び／又はプロゲスチンレベルの数値の両方により、乳癌発生の素因が検出される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者中の試料中のプロゲステロンの量を判定する工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によってインビトロで癌、又は癌が発生する素因を検出するためのキットであって、RANKLを検出する薬剤、及びOPGを検出する薬剤、及び女性ホルモンを検出する薬剤を有するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌の診断の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、ヒトの最もありふれた癌の一つであり、欧米において、平均で女性の８人に１人が生涯で乳癌に罹患する。Women's Health Initiative (WHI)及びMillion Women Studyは、ホルモン補充治療(ＨＲＴ)が、乳癌の発生リスク及び死亡率の増大に関与することを示している。特に、ＨＲＴ及び避妊のために数百万人の女性に使用されるメドロキシプロゲステロン(ＭＰＡ)等の合成プロゲステロン誘導体(プロゲスチン)は、乳癌発生のリスクを顕著に増大させる。
【０００３】
ＮＦ−κＢリガンドの受容体活性化因子(ＲＡＮＫＬ、あるいはＯＤＦ、ＴＲＡＮＣＥ、ＯＰＧＬ、ＴＮＦＳＦ１１)及びその受容体ＲＡＮＫ（ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）は、破骨細胞の発達及び活性化に必須である。ＲＡＮＫＬの阻害は、骨の減少を防止するものとして承認され、当該治療の潜在的な患者は数百万人に及ぶ(US 6,017,729, EP 0 873 998, EP 0 911 342, US 5,843,678, WO 98/46751, WO 98/54201)。ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫのいずれの発現も、ヒトの原発性乳癌及び乳癌細胞株において観察され、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ系は、細胞の増殖又は死に対して影響せず、上皮細胞癌の骨転移を制御出来ることを提示している。
【０００４】
Terpos et al., Blood 102 (3) (2003): 1064-1069は、骨病変を引き起こし、骨髄中の血液細胞の生産に影響を及ぼす癌である、多発性骨髄腫の発生を予測するマーカーを記載している。
【０００５】
Hashimoto et al., Cancer & Chemotherapy 7 (31) (2004): 1027-1033 (abstract)は、破骨細胞及び骨芽細胞の活性を反映する可溶性RANKL及びOPGを含む骨代謝マーカーが、骨疾患の重症度及び予測についての情報を提供することを示す。
【０００６】
WO 2005/060627 A2は、RANKLのレベルを測定することにより、非外傷的骨折のリスクを判定する方法に関する。そのような方法に使用されるツールは、例えばRANK又はRANKLに対する抗体である。
【０００７】
WO 00/43553 A1は、エストロゲン関連マーカーのレベルを判定することによる、女性の乳癌のスクリーニング方法を開示する。この方法において判定されるマーカーは、アロマターゼ酵素、アロマターゼ活性、エストロゲン合成の副産物、及び乳腺液から取得されるエストロゲン合成の上流に作用するタンパク質作用因子である。
【０００８】
Beleut et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107 (7) (2010): 2989-2994は、乳腺増殖をもたらすメカニズムの調査を提供する。特に、プロゲステロンは、胸部上皮細胞の増殖を駆動する。
【０００９】
Leibbrandt et al., European Journal of Clinical Investigation 39 (10) (2009): 842-850は、骨芽細胞及び破骨細胞に対するRANK、RANKL及びOPGの機能を概説する文献である。
【００１０】
Reid et al., Molecular Cancer 8 (49) (2009): 1-10は、内皮細胞によるOPG生産の刺激を開示する。
【００１１】
Bo-Ying et al., Annals of Surgical Oncology 17 (6) (2010): 1675-1681は、前立腺癌の骨転移の増大に関与するTNFRSF11Bの幾つかの多形の同定を記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目標は、癌を同定する診断方法の提供である。
【００１３】
本発明は、癌におけるRANKLの特定の役割、癌及び癌の発生の診断及び予測におけるその使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第一の側面において、本発明は、癌を検出する方法、又は癌が発生する患者を予測する方法、又は癌に罹患した患者の癌の進行の速度を判定する方法に関し、当該方法は、当該患者の試料中のRANKL活性及び／又はOPGの量を判定する工程を含む。
【００１５】
本発明において、RANK/RANKL経路は、癌発生に関与し、癌の検出及び癌の発生の予測に使用され得ることが見出された。RANKLは、癌性の突然変異から細胞を保護する役割を果たすことによりDNAダメージにより誘導されるそのような突然変異後の細胞死を阻害することが見出された。形質転換突然変異が生じた細胞の生存は、癌細胞の重要な性質の一つである。この活性におけるＲＡＮＫＬの新しく発見された役割は、RANKL活性及び／又はOPG濃度と癌発生との関連付けを可能とする。故に、患者が癌を有する又は癌を発症する可能性が推定される。また、本発明は、患者の試料中のRANKL活性及び／又はOPG濃度を判定することによる、患者の癌発症のリスクを同定又は予測する方法に関する。
【００１６】
本発明において、「予測する」は、絶対的な意味に解釈されるべきでない。即ち、100%の確実性で患者が癌を発症することを予測できるわけでなく、本願は、癌の発生についてのリスクを推定することに関する。同様に、「乳癌の検出」も、全ての癌患者が、RANKL活性を判定することにより同定されるわけでなく、患者は、癌を有する可能性を有しているに過ぎない。故に、RANKL活性は最初の癌の同定に用いられて、その後、より侵襲的な試験により追試される。
【００１７】
本発明は、RANKL活性、あるいは、その天然のリガンドであるOPGの濃度が、癌の発生及び発達と関連するという結果を基礎としており、故に、好ましい態様において、そのような関連は、本発明の方法に包含され得る。陰性対照(例えば癌を発症していない、又はしていなかった患者)及び／又は陽性対照(癌を発症した患者)のデータを関連付け、そしてそのような陰性又は陽性対照のデータと患者の使用のRANKL活性とを比較することが可能である。更に、診断の精度を改善するために、RANKL活性をモニタリングすること、即ち異なる辞典の患者の試料のRANKL活性を測定することも可能である。例えば1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、1か月、2ヶ月、3か月、4か月、5か月、6か月、7か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月又はそれ以上のインターバルでモニタリングされる。2つ以上の時点でのRANKL活性の変化は、癌の発生を示唆し得る。特定の態様において、RANKL活性は女性ホルモンの影響を受けるため、RANKL活性の値は、月経周期と同時にモニタリングされるのが好ましい。例えば、試料のRANKL活性は、排卵後所定の日数後に測定される。
【００１８】
好ましい態様において、前記癌は、増殖がホルモンに依存する癌である。そのようなホルモンは、女性ホルモン、例えばプロゲステロン又はエストロゲン等であってもよい。癌細胞は、ホルモン受容体、特にプロゲステロン受容体及び/又はエストロゲン受容体を有していてもよい。エストロゲン受容体の例は、ＥＳＲ１（ＥＲアルファ鎖を含む）、ＥＳＲ２（ＥＲベータ鎖を含む）又はヘテロマー受容体、例えばＥＲアルファ及びＥＲベータ鎖の混成受容体である。そのような受容体の存在は、細胞においてホルモンシグナリングが要求されることを示唆する。特に、このシグナリングは、ＲＡＮＫＬ介在性であってもよい。ホルモンによるＲＡＮＫＬの活性化は、ＤＮＡダメージ誘導性の細胞死から癌又は癌前駆細胞を保護する。故に、これらのホルモンは、本発明において癌を診断又は予測するのに使用され得るＲＡＮＫＬ活性を増大することにより、癌を支持し得る。
【００１９】
本発明において、診断される好ましい癌の種類は、発生の過程で性ホルモン依存性を示す癌、特に乳癌又は前立腺癌である。更なる癌の種類として、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病/Ｔ細胞リンパ腫、ＮＫ細胞腫瘍、大型顆粒リンパ球白血病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、骨髄性新生物、急性骨髄性白血病、急性単球性白血病、骨髄異形成症候群、及び慢性骨髄増殖性疾患が挙げられる。特に好ましくは、前記癌は、肺癌、乳癌、胸部癌(mammary cancer)、黒色腫、肉腫、前立腺癌、頭頸部癌、原発起源が不明な癌、リンパ腫、白血病、腎臓癌及び消化管癌から選択される。
【００２０】
本発明において、前記癌は、原発性癌であってもよい。本明細書中、臨床的な癌の兆候の2年前であっても、癌の発生は診断可能であり、癌は、RANKL活性の判定により予測可能である。故に、前記原発性癌は、診断又は予測できる。加えて、再発する癌の発生を診断又は予測することも出来る。
【００２１】
本発明において、RANKLレベルは、癌発生の2年も前から、陰性対象から明確に異なることが見出された。例えば、血清のRANKLレベルは、例えば公知の生検により診断され得る癌の臨床的兆候の発生の12〜24ヶ月前から顕著に増大していることが見出された。驚くべきことに、RANKL血清レベルは、癌の兆候の5〜12ヶ月前から減少する。癌が発生した患者から採取した試料の陽性対照データとの比較により、試料のデータと将来の癌発生の予測とを関連付けることが出来、癌の臨床的兆候が発生するまでの時間は、生検等の公知の手段により検出できる。
【００２２】
ＲＡＮＫＬは、樹状細胞及び破骨細胞の機能を制御する細胞表面受容体ＲＡＮＫの公知のリガンドである。本発明において、癌の発生における更なるメカニズムが発見された。ＲＡＮＫＬは、ホルモンに影響される癌の発生を促進する。そのようなホルモンは、各人の正常のホルモンのバックグラウンド由来のものであってもよく、又は人工的に投与されてもよい(例えば更年期障害のホルモン補充治療、又は避妊剤として)。更に、このリガンドの癌における細胞メカニズム及び作用が調査され、特定された。ＲＡＮＫＬの効果、「ＲＡＮＫＬ活性」は、ＲＡＮＫＬのＲＡＮＫへの結合及びその結果引き起こされる活性化を含む。ＲＡＮＫは、更に、ＩＫＫα、ＩκＢα、Ｐ−ＮＦκＢ及びサイクリンＤ１、並びにＩｄ２−ｐ２１、ＭＡＰＫ、Ｅｒｋ及びｐ３８経路を活性化する。この経路のRANKLによる上方制御は、本発明の診断方法におけるインジケーターとして使用できる。同様に、これらの因子の活性の変化は、本願に更に記載される治療的方法に使用できる。故に、この経路のいずれかのメンバーの何らかの上方制御又は活性化は、「RANKL活性」を推定するのに使用できる。これらのタンパク質の殆どは細胞内にあるから、細胞試料を使用して、それらの濃度を評価することが出来る。タンパク質濃度に代えて、又はそれに加えて、細胞内、例えば胸部組織細胞内のmRNA濃度を判定することにより、これらのタンパク質の発現を判定することが出来る。故に、本発明は、RANK、IKK-アルファ、 IkB-アルファ、 P-NF-カッパ-B, CyclinD1 (Id2-p21, MAPK Erk or p38)のいずれか１つのシグナリングを判定することにより、RANKL活性を判定することを含む。これらの因子のいずれかのシグナリング及び活性化は、例えば、活性化RANK、IKK-アルファ、 IkB-アルファ、 P-NF-カッパ-B及び／又はCyclinD1又はId2-p21, MAPK Erk及び／又はp38の検出又は定量により測定され得る。これらのタンパク質の活性化形態は、例えば、これらのタンパク質のリン酸化版を判定することにより、又はタンパク質の集合を判定することにより、判定され得る。陰性又は陽性対象との比較は、これらのタンパク質の1つ以上の活性化を道程するのに助けとなりうる。患者の血液又は血清中のRANKL濃度を判定するのが好ましい。
【００２３】
ＲＡＮＫはＲＡＮＫＬの唯一の受容体ではない。オステオプロテギン（ＯＰＧ）は、ＲＡＮＫＬ活性（ＲＡＮＫＬのＲＡＮＫへの結合及びそのIKKα、IκBα、P-NFκB及びサイクリンD1を介した、又はId2-p21、MAPK Erk及びp38を介したシグナル経路）を低下させられる分泌性のデコイ受容体である。加えて、RANKLはOPG発現を上方制御し、また、血中又は血清中のOPG濃度の増大をもたらし得る。OPGは、遊離のRANKLに結合することにより、その濃度を低下させ得る。本発明の幾つかの態様において、RANKL濃度は、その遊離の可溶性形態において判定され得る。他の態様において、癌の指標として、全RANKL濃度（遊離RANKLとOPG結合RANKL）が用いられうる。RANKの活性は乳癌発生の要因であるが、RANKL濃度の上方制御は、その制御的リガンドのOPGをも上方制御するため、OPGも、癌を診断又は予測するための診断マーカーとして機能し得る。故に、診断のため、「RANKL活性を判定する」とは、RANKLシグナリング経路の、又はいずれかのRANKL濃度の何らかの上方制御の判定を含む。RANKL活性と記載されている場合、任意で、それに代えて、あるいは加えて、OPG濃度を使用し得る。特に好ましい態様において、OPG及びRANKLの組合せが本発明の予測又は診断におけるマーカーとして使用され、特に、試料中のRANKLとOPG量の比率が使用され得る。遊離の可溶性RANKLの減少をもたらすOPG濃度の増大は、恐らく、癌発生の最初のステップが既に開始されたRANKL濃度の増大の前段階（OPG緩衝効果の増大が無い）の結果である。故に、癌発生、その後の臨床的癌の発生における、異なるステージの過程での異なるRANKL濃度の知見と一致して、OPGも同様に癌発生の逆のマーカーである。故に、本発明は、癌の診断又は予測のための診断マーカーとしての、OPGの使用に関する。
【００２４】
好ましい態様においてRANKL活性又はRANKL活性濃度の増大は、12〜24ヶ月以内の癌の発生の可能性を推定するのに使用される。血清RANKL濃度の減少は、5〜12ヶ月以内の癌の発生を予測するのに使用され得て、増大及び減少のいずれも、好ましくは、陰性対象と比較して検出される。好ましくは、RANKLの減少及びOPGの増大は、本発明の診断又は予測における指標として使用される。好ましい態様において、比較可能な陽性対照が、癌が発生するであろう時間を推定するのに使用される。陽性及び陰性対照の値は、関連性の解析において使用され得て、好ましくは、統計的な優位性を判定するための統計的解析、例えばスチューデントｔ検定により評価される。
【００２５】
RANKL活性は、好ましくは、試料中のRANKL及び／又はRANKの量を判定することにより判定される。RANKL/RANK経路中のいずれかのシグナル因子を解析して、乳がんの発生が予測されうるが、好ましくは、RANKL及び／又はRANK自体の量を判定する。通常、RANKL又はRANKの量は、試料体積中の濃度、又は試料中の細胞あたりの量として示される。特に、RANKLの場合、好ましくは、可溶性RANKLの、特に血液又は血清試料中の濃度を判定する。
【００２６】
細胞試料は、好ましくは、更なる癌の発生が診断又は示唆され得る組織の患者の細胞を含む。好ましくは、当該細胞は、胸部細胞を含む。RANKL、RANK又はRANKLシグナリング経路のいずれかの更なるメンバーの濃度は、当該技術分野で公知の方法により、特にリガンドを結合させてそのような結合事象を検出することにより、推定され得る。好ましいリガンドは、RANKL、RANK又はRANKLシグナリング経路のいずれかの更なるメンバーに対する抗体である。抗RANKL抗体は市販されており、たとえばDenosumab等があり、これはUS 2008/107597に開示されている。細胞内のタンパク質を判定するために、通常は、細胞膜の破壊、又は細胞試料の破砕、又は細胞内ラベルの使用が必要である。好ましくは、結合事象は、ラベル、特に蛍光ラベルを使用することにより検出される。
【００２７】
更なる態様において、RANKL、RANK又はRANKLシグナリング経路のいずれかの更なるメンバー、即ちRANK, IKKα, IκBα, P-NFκB及びcyclinD1の単独又はそれらの組合せ、好ましくはRANKLの濃度を決定することにより、RANKL活性を推定することが出来る。これらの因子のいずれか、特にRANKLの発現の増大は、癌の発生を引き起こす、即ち癌を診断又は予測するのに使用できる、RANKL活性の増大の直接の指標である。
【００２８】
更に、RANKL活性は、癌、特に乳がん又は前立腺癌等のホルモン駆動性癌の進行及び拡大と関連し得る。そのような癌は、上皮由来である。好ましくは、そのような関連は、特定の速度で進行した癌を発症した患者の陽性対象試料と比較することにより行われる。
【００２９】
前記患者は、好ましくは哺乳類、特に好ましくは霊長類、尚もより好ましくはヒト、特に女性である。患者は、ホルモン、特に女性ホルモンによる治療を受けており、又は受けたことがあってもよい。
【００３０】
プロゲステロン及び特にその合成誘導体(プロゲスチン)は、閉経後の女性における組合せホルモン補充治療(HRT)において使用され、当該治療は、最初はエストロゲン駆動性子宮頸がんの発生のリスクを低下させ、そして更年期障害を緩和する。酢酸メドロキシプロゲステロン(MPA)は、最も頻繁に、かつ最も長い期間、ホルモン避妊に使用されてきたプロゲスチンであり、HRTにも使用される。
【００３１】
本発明において、癌の発生におけるＲＡＮＫＬ活性は、性ホルモンにより、特にエストロゲン又はプロゲステロン若しくはその誘導体(プロゲスチン)に影響されることが見出された。故に、好ましい態様において、患者は、ホルモンで治療され、好ましくはエストロゲン、プロゲステロン又はプロゲスチンによるホルモン補充治療を受け、又はホルモン避妊を受けている。プロゲスチンの例として、メドロキシプロゲステロン(又はその酢酸塩、例えば17-酢酸塩)、ノルエチステロン、エチステロン、ノルエチノドレル、酢酸ノルエチンドロン、二酢酸エチノジオール、レボノルゲストレル、ノルゲストレル、デソゲストレル、ゲストデン、ノルゲスチメート、ドロスピレノン、ジエノゲスト、ネステロン、酢酸ノメゲストロール、トリメゲストロン、タナプロゲット、酢酸メゲストロール、エトノゲストレルが挙げられる。好ましくは、前記ホルモン又は誘導体は、プロゲスチンと同一の効果を有する。
【００３２】
天然のホルモンのレベルは、細胞中の癌性突然変異の癌性RANKL保護を誘導するのに十分である。ホルモンは、対象中で人工的に増大させられてもよい。ホルモン補充治療において、又はホルモン避妊において、ホルモン、一般に性ホルモンのレベルは、プロゲステロンのレベルが増大するように上方制御されて、これが、ＲＡＮＫＬ経路を介して癌の発生と結び付き得る。故に、ホルモンによる治療又はホルモン避妊を受けている、又は受けたことのある患者は、乳癌が発生するリスクが増大している。これらの患者において、上記のようにRANKL活性を判定することは、癌、癌の発生又は癌の進行の良い指標となる。
【００３３】
特に、月経周期のホルモン又は女性ホルモン又はそれらの機能的誘導体（プロゲスチン等）判定を含むことにより、及び好ましくはこのデータをRANKL活性の数値と関連付け、特に陰性及び／又は陽性対象と比較することにより、本発明の癌の診断又は予測、又は癌の進行の予測の精度を改善できることが見出された。加えて、又はあるいは、試料中のRANKLリガンドの濃度を判定することも出来る。リガンドに結合し得るRANKLの上方を含ませることにより、遊離血清RANKL濃度の判定を補正できる。RANKLの好ましいリガンドは、RANKLの血清リガンド、例えばOPGである。故に、更に好ましい態様において、本発明の方法は、患者の試料中の月経周期ホルモン又はその機能的誘導体又はRANKLリガンドの血清濃度の決定を含む。RANKLリガンドは、RANKLのインビボ濃度により制御されるRANKL制御タンパク質、例えばOPGであってもよい。
【００３４】
そのようなホルモンの例として、プロゲステロンが挙げられ、プロゲステロンの誘導体は例えばプロゲスチンであり、例えば酢酸メドロキシプロゲステロン(MPA)である。特に、高いプロゲスチン又はプロゲステロンレベル(例えば血清濃度>0.3ng/ml)及びRANKL活性は、癌の発生と関連し得る。故に、好ましい態様において、本発明は、RANKL活性及びプロゲステロン(及び/又はプロゲスチンレベル)、特にその血清濃度の両方を推定することにより、乳癌発生のリスクを判定することを提供する。
【００３５】
あるいは、又は加えて、本発明は、患者の試料、好ましくは血清試料中の、オステオプロテゲリン(OPG)の量の判定も含む。オステオプロテゲリンは、遊離血清RANKL濃度を減少できる分泌性のRANKLリガンドである。加えて、OPGは、血清中のRANKL濃度増大に応答して上方制御され得るため、OPGは、癌の、又は癌発生のリスクの、代替的又は追加的なインジケーターである。
【００３６】
特に、好ましくは、本発明の癌の診断又は予測において、RANKL活性とOPG濃度の両方を判定して、これらの濃度及び活性を、陰性及び/又は陽性対象の試料と比較する。そのような関連付けにおいて、オステオプロテゲリン及びRANKLの間の差し引き又は比率が使用され得る。好ましい態様において、（新たに生じた）癌は、オステオプテゲリンとRANKLの比率の判定により、診断又は予測される。驚くべきことに、そのような比率は、オステオプロテゲリンの血清濃度及び遊離か要請RANKLの血清濃度を使用することにより、非常に高い統計的優位性を達成した。遊離可溶性RANKLは、本発明で判定されるRANKLの好ましい種類である。
【００３７】
RANKLを検出する手段は、結合リガンド、特にRANKLに特異的な抗RANKL抗体を含む。適切な抗体はUS 2008/107597に記載されており、例えばDenosumabとして市販されている。「抗ＲＡＮＫＬ抗体」は、任意の機能的類似体及び誘導体を含む、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ又は単鎖抗体（ｓｃＡｂ）等を含む。ＲＡＮＫＬ活性に関連するタンパク質及び印紙、特にＲＡＮＫＬ及びＲＡＮＫ、並びにＲＡＮＫＬシグナリング経路のいずれかのタンパク質に特異的に結合する抗体も、本発明で意図される。当該抗体は、全長タンパク質、タンパク質の可溶化形態、又はその断片による免疫化により生産されてもよい。本発明の抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよく、組み換え抗体であってもよく、例えば軽鎖及び重鎖のマウス定常領域がヒト配列に置き換えられたキメラ抗体、又は相補鎖決定領域のみマウス起源であるＣＤＲグラフト抗体等であってもよい。本発明の抗体は、ヒト抗体であってもよく、例えば、ヒト抗体を産生できる組換え動物の免疫化により産生されたものであってもよい（WO 93/12227））。当該抗体は、試料中のRANKL検出に有用であり、前記タンパク質を生産する組織又は細胞の同定を可能とする。
【００３８】
本発明は、RANKLリガンド、例えばOPG、及び/又は女性ホルモン、例えばプロゲステロン、プロゲスチン及びエストロゲンを検出するキットを提供する。
【００３９】
キットは、添加物、検出薬剤、洗浄溶液及び/又は様々なpH及びイオン強度を有する緩衝剤(Tris、酢酸又はリン酸緩衝剤)、通うかざい、例えばTween又はPolysorbate、担体、例えばヒト血清アルブミン又はゼラチン、保存料、例えばチメロサール又はベンジルアルコール、及び抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又はメタ重亜硫酸ナトリウムを含みうる。具体的なキットの構成は、使用される試料の種類等の多くの要因に依存する。
【００４０】
前記キットは、RANKLを検出する薬剤、及び生理的RANKLリガンド及び/又はプロゲスチンを検出する薬剤を含有し得る。好ましい組合せは、RANKL検出剤及び生理的RANKLリガンド検出剤；又はRANKL検出剤及び女性ホルモン検出剤である。「検出剤」とは、試料中の解析対象を検出及び/又は定量する手段に関する。
【００４１】
生理的RANKLリガンドは、OPGであってもよい。ホルモンは、プロゲスチン、特にプロゲステロンであってもよい。
【００４２】
RANKL検出剤は、RANKL結合リガンド、合成リガンド及び小分子であってもよい。好ましくは、RANKL結合リガンドは、抗RANKL抗体であってもよい。RANKL結合リガンドは、標識、例えば蛍光標識又は放射性標識されてもよい。
【００４３】
当該キットは、上記のような、癌、癌の発生を検出、予測する方法、又は癌細胞を同定する方法に使用される。
【００４４】
好ましい態様において、本発明は、以下のように定義される。
【００４５】
１．癌を検出する方法、又は癌が発生する患者を予測する方法、又は癌に罹患した患者の癌の進行の速度を判定する方法であり、当該患者の試料中のRANKL活性を判定する工程を含む、前記方法。
２．前記RANKL活性が、前記試料中のRANKL及び／又はRANKの量を判定することにより判定される、項１に記載の方法。
３．前記RANKL活性が、RANK、IKK-アルファ、IkB-アルファ、P-NF-カッパ-B、サイクリンD1のいずれか１つのシグナリングを判定することにより判定される、項１に記載の方法。
４．前記試料が、患者の細胞を含む、項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
５．前記細胞が胸部細胞を含む、項３に記載の方法。
６．前記細胞が、プロゲステロン受容体、好ましくはESR1、ESR2又はヘテロダイマー受容体から選択されるエストロゲン受容体から選択されるホルモン状態を有する、項４又は５に記載の方法。
７．RANKLが、前記患者の血清試料中で判定される、項１又は２のいずれかに記載の方法。
８．前記癌が、乳癌である、項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
９．前記癌が、前立腺癌である、項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
１０．前記患者が、ホルモンによる治療を受けている、項１〜９のいずれか1項に記載の方法。
１１．前記患者が、ホルモン補充治療、又はホルモン避妊を受けている、項１０に記載の方法。
１２．前記ホルモンが、プロゲステロン又はプロゲスチンである、項１０又は１１に記載の方法。
１３．更に、月経周期のホルモン、その機能的誘導体、又はRANKLリガンドの、患者の試料中の血清濃度を判定する工程を含む、項１〜１２のいずれか1項に記載の方法。
１４．前記RANKLリガンドが、RANKLリガンド、又はインビボでのRANKL濃度により制御されるRANKL制御タンパク質である、項１３に記載の方法。
１５．前記試料中のプロゲステロン及び／又はプロゲスチンレベルを判定する工程を含む、項１３に記載の方法。
１６．前記乳癌発生のリスク、又は癌の診断が、少なくともRANK活性、並びにプロゲステロン及び／又はプロゲスチンレベルの数値の両方により推定される、項１３〜１５に記載の方法。
１７．前記患者の試料中のオステオプロテゲリンの量を判定する工程を含む、項１３又は１６の方法。
１８．前記試料が血清試料である、項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
１９．新しく発生した乳がんが、オステオプロテゲリンとRANKLの比率を判定することにより診断又は予測される、項１２〜１８の方法。
２０．RANKL検出剤、及び生理的RANKLリガンド検出剤及び/又はプロゲスチン検出剤を含むキット。
２１．RANKL検出剤と女性ホルモン検出剤を含む、項２０記載のキット。
２２．前記RANKLリガンドがOPGである、項２０又は２１に記載のキット。
２３．RANKL検出剤と女性ホルモン検出剤を含む、項２０記載のキット。
２４．前記ホルモンがプロゲステロである、項２３記載のキット。
２５．前記RANKL検出剤が、RANKL結合リガンドである、項２０〜２４のいずれか１項に記載のキット。
２６．前記RANKL結合リガンドが抗RANKL抗体である、項２５記載のキット。
２７．前記RANKL結合リガンドが標識されている、項２５又は２６に記載の方法。
【００４６】
本発明は、以下の図面及び実施例により更に詳述される。そのような具体例は、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】プロゲステロン誘導体ＭＰＡが、ＲＡＮＫを介して、インビトロでＲＡＮＫＬ発現及び胸部上皮細胞の増殖を引き起こすことを示す。(a)、偽処理及びMPA移植の3日後の対照の同腹及びRANKΔmam雌の乳腺における上皮増殖を示す。増殖は、In situ Ki67免疫染色により決定された。(b)、(c)対照においてMPA処理された乳腺の幹細胞に富むCD24+CD49high集団(MaSC)の顕著な増大は、RANKΔmam乳腺では見られなかった。(b)、代表的なFACSプロフィールは、8週齢未産雌をMPA又は偽処理したもの由来の胸部MaSCのLineage陰性(CD31- (内皮細胞) CD45- (造血細胞) TER199- (赤血球系細胞))のCD24及びCD49発現を示す。(c)、MPA又は偽処理した未産RANKΔmam及び同腹対照の雌のMaSCに富むCD24+CD49high集団を定量した。全てのMaSC実験において、マウスは、MPAで3日間処理された。集団+/- semあたりn=4である。* P < 0.05; *** P < 0.001 (スチューデントt検定)。
【００４８】
【図２】RANKはプロゲスチン駆動胸部癌の発生率及び発生をコントロールする。(a)、MPA/DMBA腫瘍形成スキームを示す。未産6週齢雌マウスにMPAペレットを皮下移植し、図に示すように8週間DMBAを経口投与した。(b) MMTV-Cre rankfloxed/Δ 雌(RANKΔmam) (n=14)及び同週齢の同腹対照の雌(n=19)を図2aに示すようにMPAペレット及びDMBAで処理したものの触知可能な胸部腫瘍の発生を示す。データは、最後のDMBA試行後の無腫瘍マウスのパーセンテージで表現する。対照の腫瘍発生率の中間値は、最後のDMBA処理後11日で、RANKΔmam雌は30日であった。(c)最後のDMBA処理後22日の同腹対照及びRANKΔmam雌から単離した胸部腫瘍の組織切片を示す。サイトケラチン５染色を示している。倍率はx20である。(d)、(e)、最後のDMBA処理後7日(d)及び22日(e)における対照及びRANKΔmam雌のその場の及び浸潤胸部癌の数を示す。データはマウス+/- semあたりの平均値として示す。遺伝型あたりマウスn=3。各マウスについて10個の乳腺全てを解析した。* P < 0.05 (スチューデントt検定)。下部のパネルは、対照の雌における典型的な浸潤性の腺癌の組織切片を示す。H&E染色切片及びKi67増殖マーカーの免疫染色を示す。倍率はx20である。
【００４９】
【図３】RANKは、NFκBシグナリング、接触非依存的増殖、及び放射線誘導上皮アポトーシスからの保護を誘導する。(a)、RANKL刺激(1μg/ml)に応答した単離したマウス乳腺上皮細胞(MEC)における、リン酸化(P)IKKα、全IKKα、リン酸化(P)p65 NFκB、全p65  NFκB、リン酸化(P)IκBα、及び全IκBαのウエスタンブロッティングを示す。ローディング対照としてβアクチンを示す。(b)対照、RANKΔmam、及びIKKαΔmam雌で発生したプールされた後期胸部腺癌(各レーンn＝4)における、IKKα、IKKβ、IKKγ、リン酸化(P)p65 NFκB、全p65  NFκB、リン酸化(P)IκBα、及び全IκBαのウエスタンブロッティングを示す。ローディング対照としてβアクチンを示す。(c)、対照、RANKΔmam、及びIKKαΔmam雌で発生した後期胸部腺癌におけるRANK、サイクリンD1及びp21のmRNAの発現を示す。発現は、qRT-PCRで判定された。データは、平均値+/- semである。群あたりn=4である。(d)、ソフトアガーコロニー形成アッセイ。RANKL(1μg/ml)又はEGF(100ng/ml)の刺激に応答したソフトアガー中でのヒトSKBR3乳癌細胞の増殖を示す。接触非依存的な肉眼で見えるコロニーがRANKL存在下での培養18日後に形成されたが、コロニー形成はデコイ受容体OPG(1μg/ml)により予防された。無刺激SKBR3細胞を対照とした。(e)、MPAペレット及びDMBAで処理したIKKαΔmam (n=10)及び同週齢の同腹の雌(n=11)における触診可能な胸部腫瘍の発生を示す。データは、最後のDMBA試行後の無腫瘍マウスのパーセンテージとして示す。対照の腫瘍発生率の中間値は、最後のDMBA処理後10日で、IKKαΔmam雌は24日であった。(f)、(g)、偽手術又はMPAペレットを移植した対照及びRANKΔmam雌の同腹におけるγ放射線(5Gray)誘導胸部上皮細胞のアポトーシスを示す。アポトーシスは、活性カスパーゼ3における免疫染色により検出された。(f)、乳腺切片の上皮細胞のアポトーシスを示す核を示す(矢印)。倍率はx40である。(g)、胸部上皮のアポトーシスの定量を行った。各マウスについて、最低5000個の各をカウントした。結果は平均値+/- semとして示す。群あたりマウスn＝3。* P < 0.05; ** P< 0.02(スチューデントt検定)。
【００５０】
【図４】RANKは、ヒト乳がん患者における癌肝細胞自己神聖及びRANKL/OPG血清レベルをコントロールする。(a)  (e)におけるのと同一のコホートの血清試料のsRANKL及びプロゲステロンを解析した。対照群において血清プロゲステロン及びRANKLの間に関係性は見られなかったが(p=0.43)、血清サンプリング後１２〜２４ヶ月で乳がんを発症した女性において、sRANKLと血清プロゲステロンレベルの間には明確な関連性があった。p = 0.047 (Spearman rank test)。血清が試験された６〜１２ヶ月以内に乳癌を発症した女性において、血清プロゲステロン及びRANKLレベルの関連性は無かった(p=0.76)。データは、血清プロゲステロンの関数として示す(低<0.2 ng/ml; 中0.2-0.3ng/mL; 高>0.3 ng/mL)。(b)フォローアップ期間中に乳癌を発症しなかった182人の健康な閉経後女性と、血清回収後５〜１２ヶ月でER陽性乳癌を発症した４１人のマッチする年齢の女性から採取したUKCTOCS血清試料におけるOPGとsRANKLの比率を解析した。ボックスプロットは、血清サンプリング後1年以内に乳癌を発症した女性において、顕著に高いOPGとsRANKLの比率を示す。p = 0.022 (Mann Whitney U test)。(c)182人の閉経後女性と、血清回収後１２〜２４ヶ月でER陽性乳癌を発症した４１人の健康なマッチする年齢の女性から採取したUKCTOCS血清試料におけるOPGとsRANKLの比率を解析した。顕著な差は認められなかった。
【００５１】
【図５】K5-Creマウスと交配した雌は、妊娠中に小葉腺胞(lobulo-alveolar)の異常を示す。(a)、K5-Creと交配した未産及び泌乳(L1) RANKfl/Δ雌の胸部組織と対照同腹の乳腺のホールマウント解析を行った。妊娠野生型雌(矢印)における胞は小葉腺胞構造を形成するが、この発達は、K5-Cre RANKfl/Δ雌において、未発達な胞芽(rudimentary alveolar bud)(矢印)でアレストされる。(b)、RANKflox/Δ及びRANKflox/Δ; K5-Cre+雌由来の精製胸部上皮細胞のサザンブロットを示す。野生型又はフロックスしたRANK遺伝子座(fl/+; 9.6 kb)及び欠失したRANK遺伝子座(Δ;3.9 kb)は、は、ゲノムDNAをPvuII及びSphIで消化した後に示される。(c)、対照BALBｃヌード(nu/nu)雌の乳腺は、ホールマウント解析で泌乳1日(L1)での正常小葉腺胞構造を示し、野生型乳腺組織を移植した「クリアー」nu/nuマウスにおいてL1で正常小葉腺胞構造を示し、そしてRANKfl/Δ; K5-Cre乳腺組織を移植した「クリアー」nu/nuマウスにおいてL1で異常な小葉腺胞が発達した。外科的洗浄後のnu/nuマウスの脂肪体(Fat pad)も示す。全て倍率はx5である。
【００５２】
【図６】妊娠MMTV-Cre, RANKfl/Δ雌における泌乳乳腺の正常の形成。(a)、未産同腹対照及びMMTV-Cre, RANKfl/Δ雌の胸部組織のH&E解析は、正常の胞／管上皮構造を示す。倍率はx10(上)及びx40(下)である。(b)、MMTV-Creと交配した未産及び泌乳(L1) RANKfl/Δ雌の胸部組織と対照同腹の乳腺をホールマウント解析した。MMTV-Cre誘導のRANKの欠失は、泌乳乳腺の形成に影響しなかった。(c)、RANKflox/Δ及びRANKflox/Δ; MMTV-Cre雌由来の精製胸部上皮細胞のサザンブロットを示す。野生型又はフロックスしたRANK遺伝子座(fl/+; 9.6 kb)及び欠失したRANK遺伝子座(Δ;3.9 kb)は、は、ゲノムDNAをPvuII及びSphIで消化した後に示される。RANKflox/Δ; MMTV-Cre動物は、以後RANKΔmamと表記する。
【００５３】
【図７】MPAは、乳腺におけるRANKL発現及び上皮の増殖を誘導する。(a)〜(c)、図1の(d)と同様に、偽処理及びMPA移植の3日後の対照同腹及びRANKΔmam雌の乳腺における上皮増殖の定量を示す。(a)、データは、各遺伝子型の偽処理した雌に対する全Ki67陽性上皮細胞の相対変化として示す。マウスあたり最低1000個の乳腺上皮細胞がカウントされた。遺伝子型あたりマウスはn＝3とした。** P < 0.005; *** P < 0.001 (スチューデントt検定)。(b)、MPA皮下移植3日後の対照同腹及びRANKΔmam雌の乳腺の腺房あたりのKi67免疫染色細胞のIn situ定量を示す。対照の雌では腺房の〜80%が中〜高度の増殖のサインを示したが、雌において、腺房の60%以上が、非常に低い増殖速度を示した。(c)、発情期依存的なバックグラウンドの増殖レベルをコントロールするため、過排卵した偽処理対照同腹及びRANKΔmam雌を解析した。乳腺あたり1000個以上の細胞がカウントされた。遺伝子型あたりn＝３である。(b)及び(c)において、データは、増殖細胞の数+/- semが低(上皮細胞の＜20%がKi67+)、中(上皮細胞の２０〜８０%がKi67+)及び高(上皮細胞の>80%がKi67+)の腺房／管のパーセンテージとして示される。*** P < 0.001; * P < 0.03(スチューデントt検定)。(d)、PBS又はRANKL(1μg)を腹腔内注射した1日後の対照同腹及びRANKΔmam雌の乳腺における上皮増殖を示す。増殖は、In situ Ki67免疫染色により判定された。倍率はx40である。(e)、PBS又はRANKL(1μg)を腹腔内注射した1日後の上皮増殖の定量を示す。Ki67陽性細胞の平均のパーセンテージ+/- semを示す。* P < 0.03; n=5 (スチューデントt検定)。
【００５４】
【図８】RANKΔmamマウスにおけるプロゲスチン駆動胸部癌の生存曲線。(a)、(b)、MPAは、胸部上皮細胞においてRANKL発現を誘導する。未産野生型雌をDMBA又は油ビヒクル経口投与で処理し、徐放性MPAペレットを皮下移植し、又は偽手術を行った。(a)、移植／経口投与の3日後、qRT-PCRにより、精製胸部上皮細胞中のRANKL mRNAを判定した。データは、偽処理と比較した倍数変化+/- semとして示す。群あたりのマウスはn=3とした。(b)、油ビヒクル、DMBA、MPA又は偽手術で処理した3日後、ウエスタンブロッティングにより、精製胸部上皮細胞の細胞ライゼートにおける可溶性RANKLタンパク質(19kDa)の発現をアッセイした。βアクチンをローディング対照とした。MPAにおいてのみRANKL mRNAの誘導及びタンパク質発現が認められ、DMBA又は油ビヒクル単独では認められなかった。(c)、MPAペレット及びDMBAで処理した、RANKΔmam (n=14)における、及びMMTV-Cre有り(Cre+対照; n=13)又は MMTV-Cre無し(Cre- 対照; n=9)の同齢同腹対照雌における触診可能な胸部腫瘍の発生を示す。データは、最後のDMBA試行後の腫瘍の無いマウスのパーセンテージとして示す。Cre+及びCre-対照群の間で、顕著な差は見られなかった。Cre+対照における腫瘍発生の中間値は、最後のDMBA処理後9日であったが、Cre-対照は11日であり、RANKΔmam雌は30日であった。(d)、RANKflox/+; MMTV-Cre+及びRANKflox/Δ ; MMTV-Cre+ (RANKΔmam)雌のMPA/DMBA誘導胸部腫瘍のサザンブロットを示す。野生型又はフロックスしたRANK遺伝子座(fl/+; 9.6 kb)及び欠失したRANK遺伝子座(Δ;3.9 kb)は、は、ゲノムDNAをPvuII及びSphIで消化した後に示される。RANKΔmam雌由来の腫瘍は、全て、ほとんど完全な欠失を示した。(e)、MPA/DMBA処理後のRANKΔmam (n=9)及び同齢同腹対照の雌(n=9)の全生存率におけるKaplan Mayer解析を示す。中間生存率は、対照ではRANKΔmam 48日であり、RANKΔmam雌では93日であった。
【００５５】
【図９】RANKΔmam雌における扁平腺癌の発生。(a)、(b)、最後のDMBA処理後7日(a)及び21日(b)の対照同腹及びRANKΔmam雌から単離した胸部腫瘍の組織切片を示す。H&E及びEカドヘリン染色が示され、これらは、対照同腹及びRANKΔmam雌の腫瘍中の管腺癌の典型的な特徴である。サイトケラチン14(K14)の発現は、対照及びRANKΔmam雌の両方における基底細胞起源を示す。しかしながら、RANKΔmam雌は、典型的な扁平化生の特徴を示す傾向がある。全ての倍率はx20である。
【００５６】
【図１０】Mx-Cre RANKfloxed/Δ及び NeuT RANKΔmamマウスにおける胸部癌の発生。(a)、MPAペレット及びDMBAで処理したMx-Cre rankfloxed/Δ (n=4)及び同齢のMx-Cre rank+/Δ同腹対照の雌(n=6)における触診可能な胸部癌の発生を示す。Mx駆動Creレコンビナーゼは、8日間で4回のポリI:C腹腔内注射(200mlPBS 中200μg)により活性化された。データは最後のDMBA試行後の無腫瘍マウスのパーセンテージとして示す。顕著な差は見られなかった。(b)、Mx-Cre rankfloxed/Δマウスにおける非欠失RANKfloxed遺伝子座(fl/+)及び欠失誘導後(Δ)のサザンブロットを示す。(c)、Mx-Cre rankfloxed/Δマウスにおける欠失誘導後(Δ)の様々な機関のサザンブロットを示す。胸腺、心臓、肝臓及び脾臓において様々な程度の欠失(50〜100%)が見られるが、RANKfloxed遺伝子座の欠失は、精製胸部上皮細胞(MEC)では誘導されなかった。
【００５７】
【図１１】MECにおけるRANKL/RANK下流シグナリング。(a)、妊娠中の泌乳乳腺のRANKL-RANK誘導形成をコントロールする遺伝的に確認されたシグナリング経路の概要を示す。(b)、RANKL刺激(1μg/ml)に応答した単離初代マウス乳腺上皮細胞における、リン酸化(P)AKT、全AKT、リン酸化(P)ERK1/2、リン酸化(P)p38-MAPK、及びp38-MAPKのウエスタンブロッティングを示す。データは4回の実験の代表である。
【００５８】
【図１２】MPAは、RANKL/RANK NFκB経路を活性化し、サイクリンD1発現を引き起こす。(a)、MPAによるNFκB経路の活性化及びサイクリンD1発現を示す。未産RANKΔmam及び同腹対照の雌に、徐放型MPAペレットを皮下移植し、又は偽手術した。(a)、MPA処理3日後のRANKΔmam及び同腹対照の雌の胸部上皮細胞のリン酸化(P)IκBαを検出するためのIn situ免疫染色を示す。(b)、 MPA処理3日後のRANKΔmam及び同腹対照の雌の単離された胸部上皮細胞におけるサイクリンD1及びRANKLのウエスタンブロット解析を示す。組換えマウスsRANKLタンパク質を分子サイズ比較のために示す。βアクチンは、ローディング対照として示す。
【００５９】
【図１３】RANKL/RANK下流シグナリング経路。RANKL刺激(1μg/ml)に応答したSKBR3乳癌細胞におけるリン酸化(P) p65 NFκB、全p65 NFκB、リン酸化(P) IκBα、全IκBα、リン酸化(P) ERK1/2、全ERK1/2、リン酸化(P) p38-MAPK、及び p38-MAPKのウエスタンブロッティングを示す。データは3回の実験の代表である。(b)、通常の増殖培地(対照、10%SCS添加DMEM)、又はRANKLの存在下(1μg/ml)で培養されたSKBR3乳癌細胞の増殖曲線を示す。細胞の数は、3日間の生細胞カウント(トリパンブルー排出)により判定された。(c)、MPAペレット及びDMBAで処理したNFATc1Δmam (n=10)及び同齢同腹対照(n=16)雌における触診可能な胸部腫瘍の発生を示す。データは、最後のDMBA試行後の無腫瘍マウスのパーセンテージとして示される。顕著な差は見られなかった。(d)、NFATc1Δmam及び同腹対照の雌の精製胸部上皮細胞(MEC)及びMPA駆動胸部腫瘍におけるNFATｃ1  mRNA発現の定量を示す。mRNAは、qRT-PCRにより判定された。データは、対照に対する倍数の変化として示される(+/- sem)。群あたりn=5である。* P < 0.05 (スチューデントt検定)。
【００６０】
【図１４】RANKLは、γ放射線に応答したアポトーシスから初代マウス胸部上皮細胞及びヒトSKBR3乳癌細胞を保護する。(a)、RANKL刺激の存在下(1μg/ml)又は非存在下のγ放射線(2Gray)に応答した単離された初代マウス乳腺上皮細胞におけるγH2AX、リン酸化(P) Chk1、全Chk1, p53及びβアクチンについてのウエスタンブロット解析を示す。(b)、(c)、RANKL刺激の存在下(1μg/ml)又は非存在下のγ放射線(2Gray)後の、(b)胸部上皮細胞及び(c)SKBR3ヒト乳癌細胞をプロピジウムヨーダイド(PI)染色してFACSで解析した。データは、3回以上の実験の代表である。DNA量が<2nのアポトーシス細胞は、サブG1領域に見られる。サブG1(M1)、G1相(M2)、S/G2/M相(M3)及びDNA量が>4nのポリプロイド細胞のパーセンテージは、所定の時点で示される。
【００６１】
【図１５】RANKLは、ドキソルビシンに応答したアポトーシスから初代マウス胸部上皮細胞及びヒトSKBR3乳癌細胞を保護する。(a)、(b)、RANKL刺激の存在下(1μg/ml)又は非存在下の遺伝子毒性剤ドキソルビシン(Dox、1μM)下でインキュベートした、(a)、胸部上皮細胞、及び(b)、SKBR3ヒト乳癌細胞のFACS解析を示す。データは、3回以上の実験の代表である。サブG1(M1)、G1相(M2)、S/G2/M相(M3)及びDNA量が>4nのポリプロイド細胞のパーセンテージは、ドキソルビシン処理後24時間及び36時間において評価される。(c)、RANKL刺激の存在下(1μg/ml)又は非存在下のγ放射線(2Gray)後6時間における、Bim、Puma及びNoxaプロアポトーシス遺伝子のmRNA発現を示す。データは、対照に対する倍数の変化として示される(+/- sem)。 n=3、* P < 0.05; ** P < 0.005(スチューデントt検定)。
【００６２】
【図１６】IKKαは、放射線誘導上皮アポトーシスからのMPA誘導保護を媒介する。(a)、(b)、IKKαΔmam雌におけるγ放射線に対する胸部上皮細胞のアポトーシスの誘導の低下を示す。同腹対照及びIKKαΔmam雌を、MPAペレット皮下移植又は偽手術に供し、そしてγ放射線(5Gray)を照射した。MPAペレットは、γ放射線照射の3日前に移植された。照射24時間後、活性カスパーゼ3の免疫染色によりアポトーシスが検出された。(a)、乳腺切片において、上皮細胞にアポトーシス核が認められる(矢印)。倍率はx40である。(b)、胸部上皮アポトーシスの定量を示す。各マウスにおいて5000個以上の核がカウントされた。結果は、平均値+/- semとして示される。群あたりのマウスはn=3である。* P < 0.05(スチューデントt検定)。
【００６３】
【図１７】血清サンプリング後５〜１２ヶ月以内に乳癌を発症した女性においてRANKL/OPG比が変化するが、１２〜２４ヶ月においては変化しない。(a)フォローアップ期間中乳癌を発症しなかった182人の健康な閉経後女性と血清回収後5〜12ヶ月でER陽性乳癌を発症した健康なマッチする年齢の41人の女性から採取したUKCTOCS (UK Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening)の血清試料におけるRANKLとOPGレベルを解析した。乳癌の発症は生検により診断された。これらの女性のいずれも試料回収時点でホルモン補充治療を受けていなかった。ボックスプロットは、OPG及びsRANKLレベルとOPGとsRANKLの比率を示している。癌を発症しなかった女性と比較して、血清試験後1年以内に乳癌を発症した女性のOPGレベルは顕著に高く(p=0.041; Mann Whitney U test)、またOPGとsRANKLの比率も顕著に増大した。(b) フォローアップ期間中乳癌を発症しなかった182人の健康な閉経後女性と血清回収後12〜24ヶ月でER陽性乳癌を発症した健康なマッチする年齢の41人の女性から採取したUKCTOCSの血清試料におけるRANKLとOPGレベルを解析した。ボックスプロットは、OPG及びsRANKLレベルとOPGとsRANKLの比率を示している。顕著な差は見られなかった(Mann Whitney U test)。ボックスプロットは、中間比レベル及び四分位数範囲を示す。
【００６４】
【図１８】ウエスタンブロットの定量を示す。実験あたり３つの独立したウエスタンブロットにおいてデンシトメトリーを実施した。データは、図1b、図1c、図3a、及び図3bのウエスタンブロットについて示す。表示されたタンパク質の発現値は、ローディング対象のβ-アクチンで補正された。リン酸化データの定量は、各全タンパク質のバンドで補正された。* P <0.05; ** P < 0.001 (スチューデントt検定)。
【実施例】
【００６５】
実施例１：マウス
Rankfloxedマウスが最近作製された。要するに、Rank遺伝子座を有しないマウスを作製するために、rankfloxedマウスが、βアクチンCreユビキタスデリーターマウスと交配させられた。rankfloxed又はrankΔ遺伝子座を有するマウス及びMMTV-CreマウスをBALBｃバックグラウンド上に7回バッククロスした後、MMTV-Cre rankΔ/floxedが作製された。MMTV-NeuTマウスは、Guido Forni, Milanから提供して頂いた。MMTV-Cre (stock # 003553) 及びMx-Creマウス(stock # 003556)はJackson Laboratoryから取得された。K5-Cre、IKKαfloxed及びNFATc1floxedマウスは、既に記載されている(2〜4)。マウスの遺伝型は、PCR及びサザンブロット解析により判定された。全ての実験において、同一のブリーディングからの同腹マウスのみが使用された。全てのマウスは、制度的ガイドラインに従い交配及び維持された。
【００６６】
腫瘍におけるRANKの欠失及びCreの効果
RankΔmam雌で発生した腫瘍のサザンブロットは、RANKの欠失を示し、いくつかの残りの野生型のバンドが観察された(図８ｃ)が、これは、他の細胞腫及び又はエスケーパー細胞の存在により説明され得る。Cre陰性対照の雌及びMMTV-Creトランス遺伝子を発現する同腹において腫瘍発生の差は見られず、これは、Creの発現が、MPA/DMBA胸部腫瘍モデルで腫瘍の発生率に影響しないことを示唆する(図８ｄ)。
【００６７】
実施例２：MPA/DMA誘導胸部癌形成
MPA/DMBA処理は、公知のように実施された(５，６)。要するに、6週齢マウスをケタミンキシラジンで麻酔し、徐放型Medroxyprogesterone Acetat (MPA)ペレット(50mg、90日放出；Innovative Research of America)を右脇腹に皮下移植した。図2aに概説したように、その後8週間に6回、200μlのDMBA(コットンシード油に希釈5mg/ml)を経口投与した。胸部腫瘍の発生は、触診により判断した。Cre陰性対照の雌及びMMTV-Creトランス遺伝子を発現する同腹において腫瘍発生に差は見られず、これは、Creの発現自体はMPA/DMBA胸部腫瘍モデルにおいて腫瘍の発生に影響しないことを示唆する。
【００６８】
実施例３：胸部組織移植
移植実験のために、未産3週齢ドナーから胸部上皮組織を切り出し、公知のように(7)、それを3週齢ホストnu/nuマウスの胸部脂肪体に移植した。手術の3週間後、ホストをつがわせ、胸部組織を解析のために切り出した。
【００６９】
実施例４：組織学、ホールマウント及び免疫組織化学
組織学的解析のために、5μm切片を切り出し、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。乳腺のホールマウント染色は、公知のように実施された(8)。イムノペルオキシダーゼ染色のため、パラフィン包埋切片を脱水し、抗原エピトープを10mMクエン酸緩衝剤又は超音波を使用して露出させた。切片を、サイトケラチン5、サイトケラチン14、Eカドヘリン、抗Ki67(Novocastra)及び抗活性カスパーゼ3(Cell Signalling)に対する抗体とインキュベーションし、ペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体で可視化した。組織形態的指標(増殖及びアポトーシス)は、陽性上皮細胞数を全上皮細胞数で割って算出され、Ki67染色では核の数は1000個以上で、活性カスパーゼ3染色では5000個以上であった。
【００７０】
実施例５：ウエスタンブロット
ヒト乳癌細胞株SKBR3及び初代非形質転換マウス胸部上皮細胞を、組み換えマウスRANKLref. 9で刺激し、又はしなかった。腺癌を対照及び突然変異マウスから単離し、タンパク質ライゼートを調製した。ウエスタンブロットを、標準的なプロトコルを使用して実施した。要するに、ブロットを1xTBS 0.1% Tween-20 (TBST)中5%BSAで１時間ブロッキングし、一次抗体(説明書に従いTBSTで希釈した)で一昼夜4℃でインキュベートした。マウスRANKL (AF462; R&D), Cyclin D1 (Santa Cruz #Sc-8396), β-アクチン(Sigma), リン酸化(P) NFκB (#3033), NF-κB (#4767), リン酸化(P) IκBα (#2859), IκBα (#4814), リン酸化(P) IKKα (#2681), IKKα (#2678), IKKβ (#2678), IKKγ (#2685), リン酸化(P) Akt (#3787), Akt (#9272), リン酸化(P) Erk1/2 (#9101), Erk1/2 (#9102), 及び p38-MAPK (#9212), p53 (#2524), リン酸化(P) Chk1 (#2348), Chk1 (#2345) (全て Cell Signaling), p38-MAPK (AF869; R&D), 及びγH2Ax (Ser139 #07-164 Millipore)に反応する一次抗体を使用した。ブロットをTBSTで30分間3回洗浄し、HRPコンジュゲート二次抗体(1：2000、Promega)で1時間室温でインキュベートし、TBSTで30分間3回洗浄し、ECLで可視化した。
【００７１】
実施例6：qRT-PCR
腫瘍の全RNAを、説明書に従い、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を使用して調製した。全RNA(2μg)は、定量的(q)RT-PCR解析に供した。以下のプライマーが使用された。
β-アクチン順プライマー: 5’- GCTCATAGCTCTTCTCCAGGG -3’;
β-アクチン逆プライマー: 5’-CCTGAACCCTAAGGCCAACCG -3’.
RANKL 順プライマー: 5’ - CTGAGGCCCAGCCATTTG -3’
RANKL 逆プライマー: 5’ - GTTGCTTAACGTCATGTTAGAGATCTTG -3’
RANK 順プライマー: 5’ - CTTGGACACCTGGAATGAAG -3’
RANK 逆プライマー: 5’ - CAGCACTCGCAGTCTGAGTT -3’
CyclinD1 順プライマー: 5’ - CTGTGCGCCCTCCGTATCTTA-3’
CyclinD1 逆プライマー: 5’ - GGCGGCCAGGTTCCACTTGAG-3’
p21 (Cdkn1a) 順プライマー: 5’ - GTGGCCTTGTCGCTGTCTT -3’
p21 (Cdkn1a) 逆プライマー: 5’ - GCGCTTGGAGTGATAGAAATCTG -3’
tRANKL 順プライマー: 5’ - GCGCCGGGCCAGCCGAGACTAC-3’
RANKL1 順プライマー: 5’ - GTCCCACACGAGGGTCCGCTGC-3’
RANKL2 順プライマー: 5’ - TGCGCACTCCGGCGTCCCG-3’
RANKL3 順プライマー: 5’ - CCGAGACTACGGCGGATCCTAACAG-3’
RANKLcom. 逆プライマー: 5’ - TCAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAGCCCC-3’
Puma 順プライマー: 5’ -CCGCCTGATGCCCTCCGCTGTAT -3’
Puma 逆プライマー: 5’ -CGGGCCCACTCCTCCTCCTCCAC -3’
Noxa 順プライマー: 5’ -ACTTTGTCTCCAATCCTCCG -3’
Noxa 逆プライマー: 5’ - GTGCACCGGACATAACTGTG-3’
Bim 順プライマー: 5’ - GTTGAACTCGTCTCCGATCC-3’
Bim 逆プライマー 5’ - GCCCCTACCTCCCTACAGAC-3’
【００７２】
実施例７：DNAダメージ応答
細胞周期のアレスト及びアポトーシスの測定のために、マウス胸部上皮細胞及びSKBR3ヒト乳癌細胞を6ウェルプレートに100000細胞／ウェルの細胞密度で播種し、そして24時間培養した。これらの細胞を、組換えRANKL(1μg/ml)の存在下又は非存在下、ドキソルビシン(1μM)又はγ放射線(2Gray)で処理した。細胞周期のアレスト及び死細胞の数は、プロビジウムヨーダイド染色を使用して判定された。インビトロで乳腺上皮細胞死を判定するため、対照及びRANKΔmam同腹雌を、合計の線量5Gray(Gy)でγ放射線処理した。6時間後、乳腺を単離して、アポトーシスの指標である活性カスパーゼ3で免疫染色した(Cell Signaling)。
【００７３】
実施例８：ヒト集団試験
対象は、United Kingdom Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening (UKCTOCS)の参加者で、ある。本試験は、イングランド、ウェールズ及びノーザンアイランドの13のNHSトラストで準備され、UCLのGynecological Cancer Research Centreにより統制された。５０〜７４歳の女性を、27の参加しているPrimary Care Trustsの年齢/性別登録からランダムに招いた。当該招待を承諾した女性は書面及び口頭により試験の情報が提供された。２００１〜２００５年の間に、全部で202 638人の50〜74歳の閉経後の女性がランダムに卵巣癌のスクリーニングに付され、又はスクリーニングされなかった。全ての女性は集合時に血液試料を提供し、50 640人の女性は毎年連続で血液試料が採取された。この試験は、ISRCTN22488978として登録されており、ClinicalTrials.govの番号はNCT00058032である。書面の同意書を取得し、それは彼女らの医学的記録及び将来の研究における彼女らのデータ、資料の用途を含む。書く女性は集合時に試料を提供し、そして病歴及び家族についてのベースラインアンケートを記入した。集合の３．５年後に参加者の女性にフォローアップアンケートを送り、試験に参加後何らかの癌が発症したか否かを尋ねた。フォローアップアンケートで乳癌を自己申告し、又は乳癌を発症したことがOffice of National Statistics (ONS)が認定した女性は、更にその主治医により更にフォローアップされた。ER陽性浸潤性乳がんと診断され、集合時にHRTを受けておらず、そして試験にランダム化された後の診断の前の少なくとも5〜24ヶ月で提供された血清試料を有している女性が、解析に選択された（９８例）。乳癌のケースは、年齢がマッチし、そして乳癌の病歴の無い女性（対照182人）とマッチし、そして彼女らの血清試料が、同日に同じ病院で回収された。その病院で回収された血液試料を2500rpmで5分間回転させ、一昼夜Griengerゲルチューブ中で出荷され、そして翌日中央UKCTOCS研究所で処理された。血清は500マイクロリットルのストローに分注され、加熱して封じられ、バーコードが付され、そして液体窒素中で保存された。この試料は、使用直前に溶解された。倫理的承認は、Joint UCL/UCLH Committees on the Ethics of Human Research (REC reference number: 06/Q0505/102)から受けた。
【００７４】
実施例９：乳癌患者
使用されるUKCTOCS (UK Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening)コホート(10)は、フォローアップ後の期間に乳癌を発症しなかった182人の健康な閉経後の女性及び血清回収後5〜24ヶ月でエストロゲン受容体(ER)陽性乳癌を発症した健康な年齢がマッチした98人の女性から採取した血清試料を含む。98人のうち、41人が1年目以内に乳癌を発症し、57人の女性が血清試料採取後12〜24ヶ月で乳癌を発症した。これらの女性のいずれも試料回収時にホルモン補充治療を受けていなかった。
【００７５】
実施例１０：プロゲステロンアッセイ
・第１のインキュベーション：ビオチン化モノクローナルプロゲステロン特異的抗体及びルテニウム複合体でラベルされたプロゲステロン誘導体の存在下、30μlの試料を、ダナゾールとインキュベーションして、プロゲステロンを放出させた。試料由来のプロゲステロンは、抗体結合部位において、ラベルされたプロゲステロンと競合する。
・第２のインキュベーション:ストレプトアビジン被覆微小粒子を添加した後、前記複合体は、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用により固相に結合する。固相に結合したラベルされたプロゲステロン誘導体の量は、試料のプロゲステロン量と反比例する。
・当該反応混合物を測定セルに充填する。当該セル中で、前記微小粒子は、電極表面に磁気的に捕捉される。未結合の基質は、ProCellで除去される。電極に電圧をかけると、光電子増倍管により測定される化学発光放射を誘導する。
・結果は、2点キャリブレーションにより装置特異的に作成されるキャリブレーション曲線及び試薬バーコードにより提供されるマスター曲線により判定される。
【００７６】
試薬  ワーキング溶液
M  ストレプトアビジン被覆微小粒子(透明キャップ)、1ボトル、6.5ml：ストレプトアビジン被覆微小粒子、0.72mg/mL；保存料。
R1  抗プロゲステロンAb~ビオチン(灰色キャップ)、１ボトル、10ml：ビオチン化モノクローナル抗プロゲステロン抗体(マウス)0.15mg/L、リン酸緩衝剤25mmol/L, pH7.0; 保存料。
R2  プロゲステロン-ペプチド~Ru(bpy)2+ (黒色キャップ)、１ボトル、8ml：プロゲステロン(植物起源)とルテニウム複合体との会合、10ng/ml; リン酸緩衝剤25mmol/L, pH7.0; 保存料。
【００７７】
実施例１１：統計
本明細書中の全ての値は、平均semとして表される。群間の比較は、スチューデントt検定により行われた。腫瘍発生のKaplan-Meier解析において、ログランク検定が実施された。P 0.05は、統計的に顕著なものとして受け入れられた。ログランク検定に加えて、post-hoc power解析が実施され ((PS Power and Sample Size Calculations、 biostat.mc.vanderbilt.edu/PowerSampleSize)、実験動物の数あたり等しい腫瘍発生回数の帰無仮説を正しく否定する可能性を計算した。RANKΔmam動物を含む試験において、帰無仮説は、0,933の確率(パワー)で否定され、IKKαΔmam動物の場合は0.766である。この帰無仮説の試験に関連するI型誤差確率は0.05である。ヒトデータは、ペアt検定、Mann Whitney U検定又はSpearmanランク検定を使用して解析された。
【００７８】
実施例１２：RANKL/RANK機能不全マウス
MPA媒介腫瘍形成におけるRANKL/RANKの役割を試験するため、K5-Cre及びMMTV-Cre媒介RANK遺伝子座除去を使用して、胸部上皮細胞においてRANKを除去した(K5-Cre rankflox/Δ マウス及びMMTV-Cre rankflox/Δ マウス)。いずれのマウスも健康に見え、骨構造やリンパ節形成も正常であった。予想通り、K5-Cre rankflox/Δマウスは、成熟期に正常に見える乳腺を呈したが、これらのマウスは、母乳を分泌する小葉腺胞構造が妊娠中に発達しなかった(図５a, b)。これらの効果は、移植実験を使用した細胞自律的であった(図５c)。MMTV-Cre rankflox/Δマウスにおいて、未産雌における乳腺の発達及び妊娠期の母乳を分泌する小葉腺胞構造の形成は、正常に見えた(図６a-c)。正常の生理学における幾つかの細胞集団に影響し得るK5-Cre rankflox/Δマウスにおける発生の効果の問題を排除するため、MMTV-Cre rankflox/Δマウスは、全ての更なる実験に使用された。これらのMMTV-Cre rankflox/Δ突然変異マウスは、以後RANKΔmamと表記する。
【００７９】
実施例１３：プロゲスチン投与によるRANKL活性化のメカニズム
野生型の集団において、MPA処理は、胸部上皮細胞の増殖を引き起こす。MPAが誘導する胸部上皮細胞の増殖は、RANKΔmam雌において顕著に低下した(図1a、図7a〜c)。故に、未産雌へのRANKL腹腔内注射は、RANKを介した乳腺上皮細胞の増殖を引き起こした(図7a、e)。最近、内生的プロゲステロンは、妊娠期(15)及び発情周期(16)におけるLin-CD24+CD49fhi幹細胞の数に影響することが報告された。いずれの研究も、系は、インビボ完全抗体ブロッキング試験及びRT−PCR発現に基づいて暗示されたが、これが二次的な効果ではなく哺乳類上皮細胞におけるRANKL-RANKの直接の効果であるか否かはわからなかった。故に、MPA等のプロゲスチンもLin-CD24+CD49fhi細胞を増幅できるか否かをアッセイした。MPA処理は、Lin-CD24+CD49fhi細胞を2倍増幅した。そのような増幅は、MPA処理したRANKΔmam雌では起こらなかった(図1b、c)。これらのデータは、RANKL/RANK系がLin-CD24+CD49fhi細胞の増幅をコントロールするという最初の遺伝的な証明を提供する。
【００８０】
図１４：対照及びRANKL/RANK欠損マウスにおける、RANK/RANKLを介した癌発生に対するプロゲスチンの影響
Women's Health Initiative (WHI)及びMillion Women Studyにおいて、プロゲスチンは、乳癌の発生と疫学的に関連していた。プロゲスチン駆動乳癌は、雌マウスでモデル化されており、DNAダメージ薬剤ジメチルベンズアントラセン(DMBA)の存在下、徐放型MPAペレットの移植は胸部癌を引き起こす(図2a、図8a、b)。
【００８１】
対照雌において、MPA/DMBA処理は、触診可能な乳癌の急速な発生を誘導した。興味深いことに、RANKΔmam雌マウスにおいて、MPA/DMBA誘導胸部癌の発生に顕著な遅延が観察された(図2b、図8c、d)。RANKΔmam雌における腫瘍発生の遅延は、生存率の顕著な向上も引き起こした(図8e)。RANKΔmam雌で発生した腫瘍のサザンブロッティングにおいて、RANKの欠失が確認された(図8c)。対照及びRANKΔmam雌で発生した全ての腫瘍は、サイトケラチン(CK)５及びCK14陽性基底細胞サブタイプのE-カドヘリン発現管腺癌の典型的な組織病理を示した(図2c、図9a、b)。しかしながら、RANKΔmam雌で生じた管腺癌は、扁平新生物の発展領域を頻繁に発生させた(図2c、図11a、b)。
【００８２】
実施例１５：RANKL媒介プロゲスチンシグナルに依存した DNAダメージの後の癌の発生
RANKΔmamがプロゲスチン誘導胸部癌の発生の遅延を示した。次は、MPA/DMBA試行後早期の胸部腫瘍の発生を解析した。RANKL/RANKシグナリングを引き起こすプロゲステロンバックグラウンドを刺激するために、再びMPAを使用した。最後のDMBA処理の1週間後、全てのRANK発現対照雌は、既に、複数のIn situ腺癌を呈しており、浸潤性の胸部腫瘍もあった。対照的に、RANKΔmam動物は、最後のDMAB試行の1週間後、In situで観察された癌は非常に僅かで、浸潤性の胸部癌は認められなかった(図2d)。最後のDMBA試行から3週間後、In situの癌の発生は、対照とRANKΔmam雌の間で同等であったが、浸潤性の癌は、尚もRANKΔmam雌では非常に低頻度であった(図2a)。更に、増殖はRANKΔmam雌の癌において顕著に低下した(図2d、e)。肝臓、心臓、筋肉及び増殖期間を含む複数の他の組織においてRANKの欠失が見られたが、胸部上皮細胞では見られず、Mx-Cre rankflox/floxマウスの使用は、MPA/DMBA誘導胸部癌の発生を遅延しなかった(図10a〜c)。これは、RANK/RANKL機能不全の効果が、胸部上皮細胞中で優勢であることを示唆する。
【００８３】
実施例１６：RANKLシグナリング
胸部上皮細胞におけるIKKα-NFκB-CyclinD1を介したRANKL-RANKシグナリングは、図11aに示されている。RANKL刺激は、実際に、初代マウス乳腺上皮細胞(MEC)におけるNFκB及びIκBαのリン酸化を引き起こした(図3a)。加えて、MECのRANKL刺激は、p38−MAPK及びERKのリン酸化を引き起こした(図11b)。RANKがインビボでプロゲステロンの下流のNFκB-CyclinD1活性化を仲介するか否かを直接示すため、マウスをMPAで処理した。MPA処理の3日後、核へのリン酸化IκBαの蓄積が見られ、これは、活性NFκB経路の指標であり、また、胸部上皮細胞におけるサイクリンD1タンパク質の発現が誘導された。これらのいずれも、RANKΔmam雌では著しく低下した(図12a、b)。更に、対照及びRANKΔmam雌から単離したMPA/DMBA誘導哺乳類腺癌において、我々は、NFκB経路の阻害(図3b)及びサイクリンD1のmRNA発現の下方制御(図3c)を見出した。これらの初代腫瘍において、Id2経路により転写的に抑制される遺伝子であるp21mRNAの上方制御(図3c)も観察された(17)。Id２経路は、胸部上皮細胞においてRANKL/RANKの下流の経路であることが確認されている(17)。これらの知見をヒトに拡張するために、ヒトSKBR3乳癌細胞株がアッセイされた。RANKL刺激は、NFκB、p38-MAPK及び ERK活性化、並びにSKBR3細胞の増殖を誘導した(図13a、b)。更にRANKL刺激の効果を試験するために、インビボでの腫瘍形成に関連するこれらの細胞の接着非依存的な増殖能力をアッセイした(18)。重要なことに、EGFR刺激と類似して、RANKLに誘導されたSKBR3細胞のソフトアガー中の増殖(図3d)は、RANKシグナリングが増殖を引き起こすだけでなく、接着非依存的増殖を誘導する形質転換因子としても振る舞うことを示す。
【００８４】
破骨細胞において、NFκB経路を除いて、カルシニューリン-NFATｃ1シグナリング経路は、RANKL-RANK仲介破骨細胞形成に必須であることが見出された。NFATｃ１は、RANKL仲介破骨細胞形成の過程で、Id2経路によっても制御される。これらの重要なRANKL-RANK活性化経路がMPA/DMBA誘導胸部癌においても操作可能であるか評価するため、MMTV-Cre nfatc1flox/Δ(NFATc1Δmam)及び MMTV-Cre Ikkαflox/flox (IKKαΔmam)マウスを作製して、胸部上皮細胞においてNFATｃ１及びIKKαを欠失させた。いずれの突然変異マウスも健康に見え、アッセイされたいずれの期間においても機能不全を示さなかった。MPA/DMBAによる試行において、IKKαΔmamマウスは、胸部癌の発生の遅延を示した(図3e)。IKKαΔmamマウス由来の腫瘍において、IKKβ及びIKKγの正常な発現は見られたが、NFκBの活性化は低下しており、IκBタンパク質レベルは増大し、p65  NFκBリン酸化は減少し(図3b)、そしてNFκB標的遺伝子のサイクリンD1の発現が下方制御された(図3C)。これは、IKKαが、実際に、これらの癌において、NFκBシグナリングに必要であることを示唆する。予想された通り、Id２経路遺伝子のp21は、IKKαΔmamマウス由来の腫瘍に影響しなかった(図3c)。対照及びNFATc1Δmamマウスの間で、腫瘍発生における顕著な差は見られなかった(図13c、d)。これは、下流のシグナリングの必要性が、破骨細胞前駆体及び乳腺上皮細胞の間で異なることを示唆する。故に、乳腺上皮細胞において、NFATｃ１でなくIKKαの欠失が、プロゲスチン駆動乳癌の発生に影響する。
【００８５】
実施例１７：DNAダメージによるプロゲスチン駆動癌発生
MPA処理は胸部上皮細胞の迅速かつ強力な増殖を誘導するが、MPA単独は、DNA突然変異を誘導する発がん物質を必要とする胸部癌を引き起こすのに充分でない。細胞周期アレストやアポトーシス等のDNAダメージに対する細胞応答におけるRANKLの役割を解析するため、マウス初代胸部上皮細胞(MEC)及びRANKL応答ヒト乳癌細胞株SKBR3を、DNA損傷剤ドキソルビシン又はγ放射線により処理した。RANKL処理は、機能的DNAダメージ応答の古典的なマーカーであるγH2AX 及びp53 の誘導又はChk1の活性化のいずれも引き起こさなかった(図14a)。更に、RANKLは、γ放射線(図14b、c)又はドキソルビシン(図15ａ、ｂ)によるDNAダメージ後の早期の細胞周期のアレストに影響しなかった。驚くべきことに、RANKL処理は、γ放射線(図17b、c)又はドキソルビシン(図15ａ、ｂ)が誘導したDNAダメージに応答した細胞死からの顕著な保護をもたらした。γ放射線が誘導するアポトーシス促進分子Bim、Puma及びNoxaの上方制御は、RANKLの存在下で起こらなかった(図15c)。インビボにおいて、雌マウスのγ放射線照射は、胸部上皮細胞のアポトーシスを5倍に誘導した(19)。故に、この公知のシステムが、γ放射線誘導細胞死に対するプロゲステロン-RANKL/RANKの効果を評価するのに使用された。MPA（プロゲスチン）に誘導されたRANKL/RANKは、実際に、インビボで胸部上皮細胞をγ放射線誘導アポトーシスから保護した。胸部上皮細胞でのRANK発現の喪失は、MPAのγ放射線誘導細胞死に対する保護効果を無効にした(図3f、g)。更に、IKKα経路は、MPA誘導性のγ放射線後の胸部上皮の保護に関与していた(図1６a、b)。故に、細胞周期の進行を促進するのに加え、MPAは、RANKL/RANK及びIKKαシグナリングを介して、DNAダメージ後の細胞死から細胞を保護できる。
【００８６】
実施例１８：乳癌患者における診断マーカーとしてのRANKL
本明細書中で提示したデータは、プロゲスチンが、胸部癌を駆動するRANKL/RANKを誘導し得ることを示す。これらの研究をヒト乳癌患者で確認するために、UKCTOCS (UK Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening)における女性の参加者のRANKL及びプロゲステロンの血清レベルが解析された(実施例９)。このコホートは、乳癌の兆候が生じる前に可溶性RANKL、プロゲステロン及びOPGの血清中のレベルの変化を研究するというユニークな目的を提供した。驚くべきことに、対照女性では、プロゲステロンレベルと血清RANKLの間に関連性が無かったが血清回収後12〜24か月で乳癌を発症した女性において、統計的に有意な関連性が認められた(p = 0.047, Spearman rank test) (図4a)。実際に、高プロゲステロン群内の女性の間で、癌を発症する群において血清RANKLは顕著に高い(p=0.01, one tailed Wilcoxon rank sum test) (図4a)。故に、高レベルのRANKL及び高血清プロゲステロンは、将来の乳癌の発生を予測するのに使用できる。
【００８７】
血清サンプリング後5〜12か月後に乳癌を発症した女性における関連性は異なっていた。この群は、sRANKLとOPGの血清レベルにおける顕著な代替を示し、将来の乳癌発生の確率と関連していた(図4b;図17a)。そのようなOPGとの代替は、乳癌を生じなかったUKCTOCS参加者や、血清サンプリング後12〜24か月で乳癌を発症したUKCTOCS参加者には見られなかった(図4c;図17d)。
【００８８】
RANKL/OPGの血清中での代替は、直観に反するように見られる。しかしながら、この知見は、従来のデータと一致する。例えば、変形性関節症の患者において、病変骨におけるRANKL mRNAレベルは骨の破壊と正に相関するが、血清RANKLレベルとは負に相関することが報告されている(11)。更に、類似の現象が血清RANKLレベルと骨粗鬆症においても示されている。閉経後の女性において、低い血清RANKLレベルは、非外傷性骨折の10倍のリスクと関連している(20)。更に、OPGの増大は、ホルモン補充治療をしていない閉経後の女性における骨量減少と関連している(21)。乳癌におけるこれらの血清の変化は、微小な腫瘍の発生に対する補償メカニズム、及び／又は様々な身体の部分におけるRANKL/OPGの再分配／隔離を反映している可能性がある。診断又は予測におけるデータの誤った利用を避けるため、試料のデータを陽性(癌が発生した患者)又は陰性(癌が発生しなかった患者)対照と比較するのが好ましい。
【００８９】
実施例１９：考察
これらの結果に基づき、MPA等のプロゲスチンがどのように胸部癌を駆動するかについての分子的シナリオが明らかになる。プロゲステロン及びプロゲスチン(及び閉経前の内在性プロゲステロン系の脱制御もあり得る)は、主に乳腺において、RANKLの誘導を引き起こす。胸部上皮細胞上のRANKを介したRANKLは、これらの細胞を細胞周期に移行させ、重要なことに、γ放射線を含むDNAダメージに応答するアポトーシスからマウス及びヒト胸部上皮細胞を保護する。更に、RANKL-/RANKは、乳癌幹細胞の自己新生及び接着非依存的増殖をコントロールする。故に、プロゲスチンが誘導したRANKL/RANKは、損傷を受けた胸部上皮に対して、乳癌が発生するのに重要な増殖及び生存の利点を提供する(22)。これらの効果は、少なくとも部分的に、IKKα-NFκBシグナリング経路を介して媒介される。
【００９０】
これらのデータは、いくつかの興味深い示唆を有する。例えば、プロゲスチンは、以上なマンモグラムを有するリスクの増大と関連していた（23）。マンモグラムは、微小な石灰化や、腺密度（glandular density）を検出し、RANKL/RANKは骨代謝／結晶化に重要な役割を果たすから（12、13）、RANKL/RANKは、そのような病変の石灰化及び／又は腺密度に関与していることが伺われる。乳癌の兆候が見つかった後、及び前（5〜12か月）の女性の血清中のRANKL/OPG比率が変化するため、RANKL/OPGの血清レベルが癌の検出の有用な生体マーカーであれば面白い。また、本明細書のデータは、RANKL及びプロゲステロンの血清レベルの増大により、腫瘍が診断される12〜24か月前に将来の乳癌発生を予測できることを示す。  数百万人の女性が避妊及びホルモン補充治療においてプロゲステロン誘導体を服用している。そのようなホルモンは、乳癌発生のリスクの増大と疫学的に関連していた。 
【００９１】
参考文献
1. Hanada, R. et al. Central control of fever and female body temperature by RANKL/RANK. Nature 462, 505-9 (2009).
2. Tarutani, M. et al. Tissue-specific knockout of the mouse Pig-a gene reveals important roles for GPI-anchored proteins in skin development. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 7400-5 (1997).
3. Gareus, R. et al. Normal epidermal differentiation but impaired skin-barrier formation upon keratinocyte-restricted IKK1 ablation. Nat Cell Biol 9, 461-9 (2007).
4. Aliprantis, A.O. et al. NFATc1 in mice represses osteoprotegerin during osteoclastogenesis and dissociates systemic osteopenia from inflammation in cherubism. J Clin Invest 118, 3775-89 (2008).
5. Aldaz, C.M., Liao, Q.Y., LaBate, M. & Johnston, D.A. Medroxyprogesterone acetate accelerates the development and increases the incidence of mouse mammary tumors induced by dimethylbenzanthracene. Carcinogenesis 17, 2069-72 (1996).
6. Cao, Y., Luo, J.L. & Karin, M. IkappaB kinase alpha kinase activity is required for self-renewal of ErbB2/Her2-transformed mammary tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 15852-7 (2007).
7. Robinson, G.W. & Hennighausen, L. Inhibins and activins regulate mammary epithelial cell differentiation through mesenchymal-epithelial interactions. Development 124, 2701-8 (1997).
8. Fata, J.E. et al. The osteoclast differentiation factor osteoprotegerin-ligand is essential for mammary gland development. Cell 103, 41-50 (2000).
9. Lacey, D.L. et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell 93, 165-76 (1998).
10. Menon, U. et al. Sensitivity and specificity of multimodal and ultrasound screening for ovarian cancer, and stage distribution of detected cancers: results of the prevalence screen of the UK Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening (UKCTOCS). Lancet Oncol 10, 327-40 (2009).
11. Findlay, D. et al. Circulating RANKL is inversely related to RANKL mRNA levels in bone in osteoarthritic males. Arthritis Res Ther 10, R2 (2008).
12. Kong, Y.Y. et al. OPGL is a key regulator of osteoclastogenesis, lymphocyte development and lymph-node organogenesis. Nature 397, 315-23 (1999).
13. Dougall, W.C. et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes Dev 13, 2412-24 (1999).
14. Jones, D.H. et al. Regulation of cancer cell migration and bone metastasis by RANKL. Nature 440, 692-6 (2006).
15. Asselin-Labat, M.L. et al. Control of mammary stem cell function by steroid hormone signalling. Nature.
16. Joshi, P.A. et al. Progesterone induces adult mammary stem cell expansion. Nature.
17. Kim, N.S. et al. Receptor activator of NF-kappaB ligand regulates the proliferation of mammary epithelial cells via Id2. Mol Cell Biol 26, 1002-13 (2006).
18. Freedman, V.H. & Shin, S.I. Cellular tumorigenicity in nude mice: correlation with cell growth in semi-solid medium. Cell 3, 355-9 (1974).
19. Ewan, K.B. et al. Transforming growth factor-beta1 mediates cellular response to DNA damage in situ. Cancer Res 62, 5627-31 (2002).
20. Schett, G. et al. Soluble RANKL and risk of nontraumatic fracture. JAMA 291, 1108-13 (2004).
21. Jorgensen, L. et al. Bone loss in relation to serum levels of osteoprotegerin and nuclear factor-kappaB ligand: the Tromso Study. Osteoporos Int 21, 931-8.
22. Hanahan, D. & Weinberg, R.A. The hallmarks of cancer. Cell 100, 57-70 (2000).
23. McTiernan, A. et al. Estrogen-plus-progestin use and mammographic density in postmenopausal women: Women's Health Initiative randomized trial. J Natl Cancer Inst 97, 1366-76 (2005).
【図１】
0006006216.tif 000002
【図２】
0006006216.tif 000003
【図３】
0006006216.tif 000004
【図４】
0006006216.tif 000005
【図５】
0006006216.tif 000006
【図６】
0006006216.tif 000007
【図７】
0006006216.tif 000008
【図８】
0006006216.tif 000009
【図９】
0006006216.tif 000010
【図１０】
0006006216.tif 000011
【図１１】
0006006216.tif 000012
【図１２】
0006006216.tif 000013
【図１３】
0006006216.tif 000014
【図１４】
0006006216.tif 000015
【図１５】
0006006216.tif 000016
【図１６】
0006006216.tif 000017
【図１７】
0006006216.tif 000018
【図１８】
0006006216.tif 000019
【配列表】
0006006216000001.app