(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のポリペプチドリガンドまたはポリペプチドリガンド群のコンホメーションを変更して、第２のポリペプチドリガンドまたはポリペプチドリガンド群を生じさせる方法であって、それぞれの前記第１のポリペプチドリガンドが、反応基と共有結合を形成する分子足場に共有結合したループ配列によって隔てられた少なくとも２つの反応基を含み、前記第２のリガンドまたはリガンド群を、前記第１のリガンドまたはリガンド群のポリペプチド（複数可）および構造的足場からアセンブルするステップを含み、
（ａ）少なくとも１つの前記反応基を変更するステップ、または
（ｂ）前記分子足場の性質を変更するステップ、または
（ｃ）少なくとも１つの前記反応基と前記分子足場との間の結合を変更するステップ、
または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の任意の組合せ
のうちの１つを包含する方法。
【請求項２】
前記反応基が硫黄原子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応基がシステインまたはメチオニンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応基がシステイン、セレノシステインまたはメチオニンに変更されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
変更された前記分子足場が非対称である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分子足場が、ポリペプチド上の前記反応基と共有結合を形成することができる２つ以上の足場反応基を含み、前記２つ以上の反応基が同一でない、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記足場反応基のうちの１つがオルソゴナルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記足場反応基が、ベンジルハロゲン化物部分、α−ハロカルボン酸部分およびアクリロイル部分から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記分子足場と前記ポリペプチドとの間の少なくとも１つの結合が、前記ポリペプチドおよび前記分子足場のアセンブリの後に化学修飾される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドと前記分子足場との間の少なくとも１つのチオエーテル結合が酸化されて、スルホキシドまたはスルホンが形成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のポリペプチド変異体の群が第１のポリペプチド変異体のレパートリーである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記第２のポリペプチド変異体の群が第２のポリペプチド変異体のレパートリーである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
反応基と共有結合を形成する分子足場に共有結合したループ配列によって隔てられた少なくとも２つの反応基を含む第１のポリペプチドリガンドから多様なポリペプチドリガンドの群またはレパートリーを作製する方法であって、リガンドの群またはレパートリーを前記第１のリガンドまたはリガンドの群のポリペプチドおよび足場からアセンブルするステップを含み、
ａ）少なくとも１つの前記反応基を変更するステップ、または
ｂ）前記分子足場の性質を変更するステップ、または
ｃ）少なくとも１つの前記反応基と前記分子足場との間の結合を変更するステップ、
または
ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の任意の組合せ、または
ｅ）（ａ）から（ｄ）のうちの任意の１つと組み合わせて、前記ポリペプチドの前記配列を改変するステップ
のうちの１つを包含する方法。
【請求項１４】
反応基と共有結合を形成する分子足場に共有結合したループ配列によって隔てられた少なくとも２つの反応基を含む複数のポリペプチドを含む、第１のポリペプチドリガンドのレパートリーのコンホメーション多様性を増大させる方法であって、第２のペプチドリガンドのレパートリーを前記第１のレパートリーの前記ポリペプチドおよび足場からアセンブルするステップを含み、
（ａ）少なくとも１つの前記反応基を変更するステップ、または
（ｂ）前記分子足場の性質を変更するステップ、または
（ｃ）少なくとも１つの前記反応基と前記分子足場との間の結合を変更するステップ、
または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の任意の組合せ、
（ｅ）（ａ）から（ｄ）のうちの任意の１つと組み合わせて、前記ポリペプチドの前記配列を改変するステップ
のうちの１つを包含する方法。
【請求項１５】
前記第２のレパートリーが、前記第１のレパートリーの前記ポリペプチドおよび少なくとも２つの構造的に多様な分子足場種からアセンブルされる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ａ．第１のポリペプチドのレパートリーを提供するステップと、
ｂ．前記ポリペプチドを、反応基としての２つ以上のアミノ酸残基で前記ポリペプチドと結合する分子足場とコンジュゲートさせて、第１のポリペプチドコンジュゲートのレパートリーを形成するステップと、
ｃ．前記第１のレパートリーを、標的に対する結合についてスクリーニングし、前記標的と結合する前記第１のレパートリーのメンバーを選択するステップと、
ｄ．（ａ）少なくとも１つの前記反応基を変更するステップ、または
（ｂ）前記分子足場の性質を変更するステップ、または
（ｃ）少なくとも１つの前記反応基と前記分子足場との間の結合を変更するステップ、
または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の任意の組合せ
のうちの１つによって、変動を前記ポリペプチドリガンドに導入して、第２のポリペプチドコンジュゲートのレパートリーを得るステップと、
ｅ．前記第２のレパートリーを、前記標的との改善された結合についてスクリーニングするステップと
を含む、３つ以上のアミノ酸残基で分子足場と共有結合したポリペプチドを含むポリペプチドリガンドを提供する方法。
【請求項１７】
ａ．第１のポリペプチドのレパートリーを提供するステップと、
ｂ．前記ポリペプチドを、反応基としての２つ以上のアミノ酸残基でポリペプチドと結合する分子足場とコンジュゲートさせて、第１のポリペプチドコンジュゲートのレパートリーを形成するステップと、
ｃ．前記第１のレパートリーを、標的に対する結合についてスクリーニングし、前記標的と結合する前記第１のレパートリーのメンバーを選択するステップと、
ｄ．（ａ）少なくとも１つの前記反応基を変更するステップ、または
（ｂ）前記分子足場の性質を変更するステップ、または
（ｃ）少なくとも１つの前記反応基と前記分子足場との間の結合を変更するステップ、
または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の任意の組合せ
のうちの１つによって、変動を前記ポリペプチドリガンドに導入して、第２のポリペプチドコンジュゲートのレパートリーを得るステップと、
ｅ．前記第２のレパートリーをプロテアーゼ耐性についての選択に供するステップと、
ｆ．前記第２のレパートリーを、前記標的との結合について任意選択的にスクリーニングするステップと
を含む、増大したプロテアーゼ耐性を有するペプチドリガンドを選択する方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドの群またはレパートリーのうちの１つ以上が、核酸分子の１つ以上のライブラリによってコードされている、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記レパートリーの前記スクリーニングが、遺伝子ディスプレイ系を用いて行われる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子ディスプレイ系がファージディスプレイである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記群またはレパートリーのいずれかが合成ペプチドで作製されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の群またはレパートリーが合成ペプチドで作製されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記合成ペプチドが固相上にアレイされている、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構造的主鎖を提供して、ペプチドにコンホメーションを与える化合物との結合によってその構造が束縛されているペプチドに関する。より詳細には、本発明は、ペプチドと構造的主鎖との間の相互作用を変更することによって、そのようなペプチドのライブラリのコンホメーション多様性を改変することに関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な研究チームが、以前に、システイン残基を有するポリペプチドを、合成分子構造に繋いできた（Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｓ．およびＭｃＮａｍａｒａ，Ｐ．Ｅ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、１９８５、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．ら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００５）。Ｍｅｌｏｅｎおよび共同研究者らは、タンパク質表面の構造を模倣するために、合成足場上への複数のペプチドループの迅速かつ定量的な環化のためにトリス（ブロモメチル）ベンゼンおよび関連分子を使用している（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｐ．ら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００５）。システイン含有ポリペプチドを分子足場、たとえばトリス（ブロモメチル）ベンゼンに連結させることによって作製される候補薬物化合物を作製する方法は、ＷＯ２００４／０７７０６２号およびＷＯ２００６／０７８１６１号に開示されている。
【０００３】
ＷＯ２００４／０７７０６２号は、候補薬物化合物を選択する方法を開示している。より詳細には、この文献は、第１および第２の反応基を含む様々な足場分子を開示し、前記足場をさらなる分子と接触させて、カップリング反応において前記足場と前記さらなる分子との間に少なくとも２つの連結を形成させることを開示している。
【０００４】
ＷＯ２００６／０７８１６１号は、結合化合物、免疫原性化合物およびペプチド模倣体を開示している。この文献は、既存のタンパク質から取り出された様々なペプチドのコレクションの人工合成を開示している。その後、これらのペプチドを、アミノ酸変化がいくつか導入された一定の合成ペプチドと組み合わせて、コンビナトリアルライブラリを生じさせる。様々なアミノ酸変化を特長とする別々のペプチドに、化学結合を介してこの多様性を導入することによって、所望の結合活性を見つける機会の増大がもたらされる。この文献の図７は、様々なループペプチド構築体の合成の模式図を示している。この文献中に開示されている構築体は、典型的にはシステイン残基を含む−ＳＨ官能化したペプチド、および典型的にはビス−ブロモフェニルベンゼンまたはトリス−ブロモフェニルベンゼンなどのベンジルハロゲン置換基を含む足場上の芳香族複素環基に依存する。そのような基は、反応してペプチドと足場との間にチオエーテル結合を形成する。
【０００５】
本発明者らの同時係属の未公開の国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００３０１号では、本発明者らは、合成分子構造に繋がれたペプチドを選択するための、ファージディスプレイなどの生物学的選択技術の使用を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
足場とポリペプチドとの間の相互作用の性質は、ペプチド−足場のコンジュゲートの構造形態の決定に重要である。従来技術ではポリペプチドに構造を与えるために足場を活用しており、したがってペプチドの配列の変更によってコンホメーション多様性の導入を可能にしているが、ペプチドと足場との間の相互作用を操作すること、および足場自体を変化させることによって、構造および構造的多様性を変更できることは認識されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、足場および足場−ペプチドの接合部分による、構造の変更および／または構造的多様性の導入を提供する。
【０００８】
したがって、第１の態様では、第１のポリペプチドリガンドまたはポリペプチドリガンド群のコンホメーションを変更して、第２のポリペプチドリガンドまたはポリペプチドリガンド群を生じさせる方法であって、それぞれの前記ポリペプチドリガンドが、反応基と共有結合を形成する分子足場に共有結合したループ配列によって隔てられた少なくとも２つの反応基を含み、前記第２のリガンドまたはリガンド群を前記第１のリガンドまたはリガンド群のポリペプチド（複数可）および足場からアセンブルするステップを含み、
ａ）少なくとも１つの前記反応基を変更するステップ、または
ｂ）前記分子足場の性質を変更するステップ、または
ｃ）少なくとも１つの前記反応基と前記分子足場との間の結合を変更するステップ、または
ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の任意の組合せ
のうちの１つを包含する方法が提供される。
【０００９】
本発明で採用された手法は、当業者が、分子足場と共有結合したポリペプチドを含む任意の構造的ポリペプチド、およびそのようなペプチドの群のコンホメーションを改変することを可能にする。構造的ポリペプチドのコンホメーションを変更することは、その機能に影響を与える。たとえば、構造的ポリペプチドが結合分子である場合、結合特異性および／または結合親和性が改変され得る。結合親和性は増大または減少し得る。親和性の増大は、たとえば、より少ない量の治療剤または診断剤の使用を可能にすることにおいて利点を有する場合がある。同様に、低下した親和性を有する化合物が、たとえば、Ｔ細胞受容体リガンドとしての低濃度の標的タンパク質からのバックグラウンドを低下させるためなどに好ましい場合がある。
【００１０】
反応基の変更は、典型的には、足場との共有結合の形成に関与しているアミノ酸側鎖の変化を含む。たとえば、反応性のアミン基またはチオール基を置換することができる。これは、アミノ酸の置換、たとえば、システインをリジンなどの別の天然アミノ酸で置換すること、セレノシステインまたはアジドフェニルアラニンなどの代替アミノ酸で置換すること、および、反応基がポリペプチド中で位置する環境を、たとえば隣接アミノ酸の一方または両方を変化させることによって改変することで、ペプチド構造に影響を与えることによって行うことができる。
【００１１】
分子足場の性質を変更することには、たとえば、足場反応基の性質を変化させることが含まれる。たとえば、トリス（ブロモメチル）ベンゼン足場をトリス（ブロモメチル）メシチレン足場に変更することで、ベンゼン環に付着したメチル基が導入され、足場とポリペプチドとの間の「遊び」の程度がより少なくなり、より強固な構造をもたらすことが可能となる。ポリペプチドコンジュゲートの構造が標的に相補的である場合は、強固な構造と標的との結合が、より柔軟な構造とのものよりも有利となり得る。他方で、ポリペプチドコンジュゲートの構造が相補的でない場合は、より柔軟な構造と標的との結合が好ましい場合があり、これは、ペプチドリガンドと標的との間の適応的な適合の可能性がより高くなるためである。以下に記載のように、いくつかの代替足場反応基が利用可能であり、より多くのものが当業者に明らかであろう。
【００１２】
また、足場自体も、たとえば異なる分子構造を選択することによって変更し得る。これは、第１のレパートリー中の足場とある程度の構造的類似性を有していても有していなくてもよく、したがって、本発明では、構造的に類似であるが化学的に異なる足場を使用することが企図される。さらに、本発明は、構造的に異なる足場を使用することを含む。
【００１３】
反応基と足場との間の結合を変更することは、反応基または足場反応基の性質の変更の結果としてもたらすことができる。さらに、これは、足場の付着後の結合の改変の結果であることができる。たとえば、足場とペプチドとの間のチオエーテル結合の酸化は、変更された形状を有しており、したがってペプチドリガンド中のポリペプチドに異なる構造を与える、スルホキシドの形成をもたらす。
【００１４】
足場、ポリペプチドまたは結合に導入される変更は対称的である必要はない。たとえば、ペプチド上に２つまたは３つの反応基が存在する場合、増大したライブラリの多様性を導入するためには、そのうちの１つのみを変更すればよい。あるいは、反応基の百分率を変更することができる。たとえば、ポリペプチド分子の２０、３０、４０または５０％を、１つ以上の位置において変更された反応基を用いて構築し、残りのポリペプチドを未改変のまま残すまたは異なる方法で改変することができる。
【００１５】
同様に、足場の変更は対称的である必要はない。非対称の足場は、１、２、３またはそれより多くの位置において異なる足場反応基を提示し得る。そのような基は、オルソゴナル（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）であり、ポリペプチドとの結合の特定の配置を指示し、したがって、形成され得るペプチドリガンドの構造異性体の数を低下させ得る。あるいは、さらにより高い多様性を促進するために、異性体の形成を可能にし得る。
【００１６】
本発明のライブラリのアセンブリ自体を活用して、多様性を導入することができる。たとえば、ポリペプチドのレパートリーを、２つ以上の足場種、場合によっては足場のレパートリーに曝露させて、配列の変動および足場の変動の様々な組合せによって増大した多様性をもたらし得る。足場が３つの足場反応基を有する場合、単に前記足場反応基の性質をランダム化することによって、顕著な程度の変動を導入することができる。これは、ポリペプチド配列のランダム化と組み合わせると、著しく増大したサイズのレパートリーをもたらすことができる。
【００１７】
本発明による方法は、ポリペプチドのレパートリーに適用される場合、ポリペプチドリガンドの構造的多様性を増大させるための用いてもよい。さらに、異なる構造的特性を有し得る異なる足場を選択することによって、さらなる多様性を得ることができる。
【００１８】
好ましい実施形態では、本発明は、ポリペプチドリガンドの群またはレパートリーを、たとえば単一のポリペプチドリガンドを含めたより小さなポリペプチドリガンドの群から作製することを含む。そのような実施形態では、多様性は、足場の変更もしくは置換えのうちの任意の１つ以上、ペプチド中の少なくとも１つの反応基の変更、および／またはポリペプチドと足場との間の少なくとも１つの結合の変更によって作製される。適切には、必要に応じて、レパートリーの多様性は、ペプチドの配列の改変によってさらに増強させ得る。たとえば、アミノ酸の付加、欠失または置換をポリペプチド中の反応基間で行うことで、付着点と足場との間に内在する（ｓｕｂｔｅｎｄｅｄ）ループの配列を変更し得る。たとえば、１つのループを変更してよく、第２のループを変化させずにおいてよい。
【００１９】
したがって、本発明は、多様なポリペプチドリガンドの群を、反応基と共有結合を形成する分子足場に共有結合したループ配列によって隔てられた少なくとも２つの反応基を含む第１のポリペプチドリガンドから作製する方法であって、リガンドの群またはレパートリーを前記第１のリガンドまたはリガンドの群のポリペプチドおよび足場からアセンブルするステップを含み、
ａ）少なくとも１つの前記反応基を変更するステップ、または
ｂ）前記分子足場の性質を変更するステップ、または
ｃ）少なくとも１つの前記反応基と前記分子足場との間の結合を変更するステップ、または
ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の任意の組合せ、または
ｅ）（ａ）から（ｄ）のうちの任意の１つと組み合わせて、前記ポリペプチドの配列を改変するステップ
の変更のうちの１つを包含する方法を提供する。
【００２０】
一実施形態では、多様性は、ポリペプチドリガンドの１つ以上のループを完全または部分的なタンパク質分解に供することによって作製し得る。リガンドの１つ以上のループの切断は、構造を、したがってその機能的特性を変更させることができる。有利には、タンパク質分解は、ループのうちの１つ以上のポリペプチド配列の改変と併せて使用することができる。
【００２１】
第２の態様では、本発明は、反応基と共有結合を形成する分子足場に共有結合したループ配列によって隔てられた少なくとも２つの反応基を含む複数のポリペプチドを含む、第１のポリペプチドリガンドのレパートリーのコンホメーション多様性を増大させる方法であって、前記第１のレパートリーの前記ポリペプチドおよび少なくとも２つの構造的に多様な分子足場種から、第２のペプチドリガンドのレパートリーをアセンブルするステップを含む方法を提供する。構造的に異なる分子足場種は、１つ以上の足場反応基の分子構造および／または性質が異なり得る。
【００２２】
分子足場の変動は、選択されたポリペプチドリガンドの親和性成熟を実施するために使用され得る。一実施形態では、
（ａ）第１のポリペプチドのレパートリーを提供するステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドを、２つ以上のアミノ酸残基でポリペプチドと結合する分子足場とコンジュゲートさせて、第１のポリペプチドコンジュゲートのレパートリーを形成するステップと、
（ｃ）前記第１のレパートリーを、標的に対する結合についてスクリーニングし、標的と結合する第１のレパートリーのメンバーを選択するステップと、
（ｄ）上述の本発明の第１の態様に従ってさらなる変動をポリペプチドリガンドに導入して、第２のポリペプチドコンジュゲートのレパートリーを得るステップと、
（ｅ）前記第２のレパートリーを、標的との改善された結合についてスクリーニングするステップと
を含む、２つ以上のアミノ酸残基で分子足場と共有結合したポリペプチドを含むポリペプチドリガンドを提供する方法が提供される。
【００２３】
特に、ポリペプチド構造の柔軟性を増大または低下させる足場中の変更は、必ずしも結合特異性を変更させずに、結合親和性に対して明白な効果を有し得る。
【００２４】
さらに、本発明は、
（ａ）少なくとも１つの反応基を変更するステップ、または
（ｂ）分子足場の性質を変更するステップ、または
（ｃ）少なくとも１つの反応基と分子足場との間の結合を変更するステップ、または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の任意の組合せ、または
（ｅ）（ａ）から（ｄ）のうちの任意の１つと組み合わせて、ポリペプチドの配列を改変するステップ
を含む、２つ以上のアミノ酸残基において反応基と共有結合を形成する分子足場に共有結合したループ配列によって隔てられた少なくとも２つの反応基を含むポリペプチドを含むポリペプチドリガンドの結合活性を変更する方法を提供する。
【００２５】
スクリーニングは、個々の分子の分析によって実施し得る。そのような方法はＷＯ２００４／０７７０６２号およびＷＯ２００６／０７８１６１号中に提供されている。しかし、個々の化合物または化合物の小さな組のスクリーニングは時間がかかり、多数の化合物を分析する場合は高価な場合がある。スクリーニングアッセイでアッセイすることができる化合物の数は、一般に数千個以下である。多数のポリペプチドリガンドをこのような方法でスクリーニングすることは非効率的な場合があるため、スクリーニング能力の改善が非常に望ましい。
【００２６】
好ましい実施形態では、ポリペプチドのレパートリーは核酸ライブラリの形態で提供され、遺伝子ディスプレイ系の一部として組み込まれている。適用可能な系には、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイまたはポリソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイおよび人工マイクロカプセル中のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現が含まれる。好ましい技法は、糸状バクテリオファージを用いたファージディスプレイである。
【００２７】
本発明のポリペプチドリガンドは、分子足場上の２つの反応基の間に内在する少なくとも１つのポリペプチドループを含む。
【００２８】
好ましくは、本発明のポリペプチドコンジュゲートは２つのループを含む。これは、単一の標的に特異的であるか、または２つ以上の標的と結合する多特異性であり得る。いくつかのそのようなポリペプチドコンジュゲートが同じ分子内に一緒に組み込まれていてもよい。たとえば、同じ特異性の２つのそのようなポリペプチドコンジュゲートを、分子足場を介して連結させて、リガンドのその標的に対する結合力を増大させることができる。あるいは、別の実施形態では、複数のポリペプチドコンジュゲートを組み合わせて多量体を形成させる。たとえば、２つの異なるポリペプチドコンジュゲートを組み合わせて多特異性分子を作製する。あるいは、同じまたは異なり得る３つ以上のポリペプチドコンジュゲートを組み合わせて、多特異性リガンドを形成させることができる。
【００２９】
一実施形態では、同じまたは異なり得る分子足場を連結させて、多価複合体を構築し得る。
【００３０】
当業者には、標的分子の選択肢は広く、変化に富むことが理解されよう。これらは、たとえば、ヒトまたは動物のタンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素の補因子またはＤＮＡ結合タンパク質であり得る。適切なサイトカインおよび成長因子には、それだけには限定されないが、ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カルジオトロフィン−１、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＥＮＡ７８、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｅｘｏｄｕｓ−２、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、線維芽細胞成長因子−１０（３０）、ＦＬＴ３リガンド、フラクタルカイン（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−ｌ、インスリン、ＩＦＮｙ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−ｌａ、ＩＬ−１（３、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２個のアミノ酸）、ＩＬ−８（７７個のアミノ酸）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−１７ｃ、ＩＬ−１７ｄ、ＩＬ−１７ｅ、ＩＬ−１７ｆ、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、インヒビンα、インヒビンβ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト成長因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンフォタクチン、ミュラー管抑制因子、単球コロニー阻害因子、単球誘引タンパク質（３０、同書）、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７個のアミノ酸）、ＭＤＣ（６９個のアミノ酸）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７個のアミノ酸）、ＭＤＣ（６９個のアミノ酸）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＭＩＰ−３ａ、ＭＩＰ３（３、ＭＩＰ−４、骨髄前駆体阻害因子−１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニューチュリン（Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、神経成長因子、Ｐ−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦｌａ、ＳＤＦｌｐ、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ受容体Ｉ、ＴＮＦ受容体ＩＩ、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＶＥＧＦ受容体３、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ１，１−３０９、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４が含まれる。サイトカイン受容体には、前述のサイトカインの受容体が含まれる。ケモカイン標的には、ＣＣケモカインリガンドＣＣＬ２１／６Ｃｋｉｎｅ、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１／ＨＣＣ−３、ＣＣＬ３Ｌ１／ＭＩＰ−１アルファアイソフォームＬＤ７８ベータ、ＣＣＬ２３／Ｃｋベータ８−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１アルファ、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ−１、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１ベータ、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２／ＭＰＩＦ−２、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−１デルタ、ＣＣＬ２６様／エオタキシン−３様、ＣＣＬ９／１０／ＭＩＰ−１ガンマ、ＣＣＬ２６��エオタキシン−３、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３ベータ、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３アルファ、ＣＣＬ１４ａ／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１、ＣＣＬ１４ｂ／ＨＣＣ−３、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、ＣＣＬ１６／ＨＣＣ−４、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１／Ｉ−３０９／ＴＣＡ−３、ＴＡＦＡ１／ＦＡＭ１９Ａ１、ＭＣＫ−２、ＴＡＦＡ５／ＦＡＭ１９Ａ５、ＣＣＬ２／ＪＥ／ＭＣＰ−１、ＴＡＦＡ３／ＦＡＭ１９Ａ３、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＴＡＦＡ４／ＦＡＭ１９Ａ４、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３／ＭＡＲＣ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４およびＣＣＬ２５／ＴＥＣＫが含まれ、ケモカイン受容体には、ＣＣＲ１、ＣＣＲ７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ８、ＣＣＲ３、ＣＣＲ９、ＣＣＲ４、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ５、ＣＣＲＬ２／ＬＣＣＲ／ＣＲＡＭ−Ａ／ＢおよびＣＣＲ６が含まれ、ＣＸＣケモカインリガンドには、ＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０／ＣＲＧ−２、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ＬＩＸ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１５／Ｌｕｎｇｋｉｎｅ、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＣＸＣＬ１／２／３／ＧＲＯ、ＣＸＣＬ４／ＰＦ４、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯアルファ／ＫＣ／ＣＩＮＣ−１、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１アルファ、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯベータ／ＭＩＰ−２／ＣＩＮＣ−３、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１ベータ、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯガンマ／ＣＩＮＣ−２／ＤＣＩＰ−１、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＣＸＣＬ７／胸腺ケモカイン−１およびＣＸＣＬ８／ＩＬ−８が含まれ、ＣＸＣケモカイン受容体には、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ７／ＲＤＣ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ１／ＩＬ−８ＲＡ、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８ＲＢおよびＣＸＣＲ６が含まれ、ＴＮＦスーパーファミリーリガンドには、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、リンフォトキシン、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、リンフォトキシンベータ／ＴＮＦＳＦ３、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦＳＦ１Ａ、ＥＤＡ（パン）、ＴＮＦ−ベータ／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、ＥＤＡ−Ａ１／エクトジスプラシンＡ１、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＥＤＡ−Ａ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２およびＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８が含まれ、ＴＮＦスーパーファミリー受容体には、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／ＣＤ１３７、ＮＧＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＨ３／ＴＮＦＲＳＦ２６、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ１��ＴＮＦＲＳＦ２３、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＥＤＡＲ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６／ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＷＥＡＫ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、リンフォトキシンベータＲ／ＴＮＦＲＳＦ３およびＸＥＤＡＲが含まれ、ＴＬＲ−１、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−６、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＴＬＲ−９を含めたトール様受容体、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＦ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＭＭＰ２３Ａ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８、ウロキナーゼを含めた酵素、ＫＬＫ１、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ９、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４およびＫＬＫ１５を含めたカリクレイン、補体系の構成要素、細胞内シグナル伝達分子および転写因子、ｐ５３、ならびにＭＤＭ２である。
【００３１】
また、標的は、以下に記載のように血清アルブミンなどの大きな血漿タンパク質であってもよい。
【００３２】
このリストは決して網羅的でないことを理解されたい。
【００３３】
第３の態様では、本発明は、反応基と共有結合を形成する少なくとも３つの足場反応基を含む分子足場に共有結合したループ配列によってそれぞれ隔てられた少なくとも３つの反応基を含むポリペプチドを含み、分子足場が少なくとも２つの異なる足場反応基を含む、ポリペプチドコンジュゲートを提供する。
【００３４】
好ましくは、分子足場は３つの異なる反応基を含む。
【００３５】
追加の結合または機能的活性を、分子足場と共有結合したペプチドのＮ末端またはＣ末端に付着させ得る。官能基は、たとえば、ポリペプチドリガンドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長する分子と結合することができる基、およびポリペプチドリガンドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長する分子からなる群から選択される。そのような分子は、たとえば、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質であることができ、ポリペプチドリガンドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長する分子と結合することができる基は、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質に特異的な抗体または抗体断片である。
【００３６】
一実施形態では、官能基は、分子足場と共有結合したポリペプチドを含む第２のポリペプチドリガンド、および抗体または抗体断片からなる群から選択される結合分子である。２、３、４、５個またはそれより多くのポリペプチドリガンドを結合し得る。これらのリガンドのうちの任意の２つ以上の特異性は同じまたは異なっていてよく、これらが同じ場合は、一価結合分子と比較して標的に対する結合力が増大している多価結合構造が形成される。さらに、分子足場は同じまたは異なっていてよく、同じまたは異なるループ数が内在し得る。
【００３７】
官能基は、さらに、エフェクター基、たとえば抗体Ｆｃ領域であることができる。
【００３８】
Ｎ末端またはＣ末端への付着は、ペプチドと分子足場との結合の前、またはその後に行い得る。したがって、ペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端のポリペプチド基が既に配置されて生成し得る（合成、または核酸の発現によって）。しかし、好ましくは、Ｎ末端またはＣ末端の付加は、ペプチドが分子主鎖と組み合わさってコンジュゲートが形成された後に起こる。たとえば、塩化フルオレニルメチルオキシカルボニルを用いてＦｍｏｃ保護基をポリペプチドのＮ末端に導入することができる。ＦｍｏｃはＨＳＡを含めた血清アルブミンと高い親和性で結合し、Ｆｍｏｃ−ＴｒｐまたはＦＭＯＣ−Ｌｙｓは増大した親和性で結合する。ペプチドは、Ｆｍｏｃ保護基を残したままで合成し、その後、システインを介して足場とカップリングさせることができる。代替物は、やはりＨＳＡと結合し、たとえばリラグルチドにおいて、このＧＬＰ−１類似体の半減期を延長するために使用されている、パルミトイル部分である。
【００３９】
Ｆｍｏｃ基は、二環式ペプチドにヒト血清アルブミン結合機能を与える。あるいは、ペプチドと足場とのコンジュゲートを作製し、その後、Ｎ末端で、たとえばアミンおよびスルフヒドリル反応性リンカーＮ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）を用いて修飾することができる。このリンカーを介して、ペプチドコンジュゲートを他のポリペプチド、たとえば抗体Ｆｃ断片と連結させることができる。
【００４０】
結合機能は、分子足場と結合して多量体を作製する別のペプチド、抗体もしくは抗体断片を含む別の結合タンパク質、または、血清アルブミンもしくは抗体Ｆｃ領域などのエフェクター基を含む任意の他の所望のものであり得る。
【００４１】
追加の結合または機能的活性を、分子足場にさらに直接結合させることができる。
【００４２】
有利には、分子足場は、追加の活性を結合させることができる反応基を含む。好ましくは、この基は、ペプチドとの相互作用を回避するために、分子足場上の他の反応基に対してオルソゴナルである。一実施形態では、追加の活性をコンジュゲートさせることが必要な場合に、反応基を保護し、脱保護し得る。
【００４３】
別の態様では、本発明は、本発明のペプチドリガンドを少なくとも含むキットをさらに提供する。
【００４４】
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法によって得られるペプチドリガンド、および製薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物を提供する。
【００４５】
さらに、本発明は、本発明によるペプチドリガンドまたは組成物を用いた、疾患を処置する方法を提供する。
【００４６】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるペプチドリガンドまたは組成物を用いた疾患の診断を含めた、診断方法を提供する。したがって、一般に、置換時にシグナルの発生をもたらす薬剤を置換するために、分析物とペプチドリガンドとの結合を活用し得る。たとえば、分析物（第２の標的）の結合は、ペプチドリガンドと結合した酵素（第１の標的）を置き換えることができ、特にその酵素がその活性部位を介してペプチドリガンドに保持されている場合には結合アッセイの基盤を提供することができる。
【００４７】
本発明のポリペプチドコンジュゲートの特定の利点は、従来技術の結合剤よりも小さいことである。典型的には、そのようなリガンドは、５０００ダルトン未満、好ましくは４０００ダルトン未満、好ましくは３０００ダルトン未満の分子量を有する。本発明の第２の構成に記載のようにペプチドリガンドを「数珠つなぎに接続する」ことによって構築したリガンドは、より高い分子量を保有することを理解されたい。さらに、ＨＳＡなどの分子と結合したペプチドリガンドは、はるかに高い分子量を有する。
【００４８】
リガンドの小さなサイズは、小さな分子足場、典型的には５００ダルトンの質量のものを使用した結果生じる。ペプチド自体は、Ｎ末端と分子足場が付着するＣ末端の付着点との間を測定して、好ましくは２７個未満のアミノ酸の長さである。当然に、さらなるペプチドが付着点の外に存在するか、付着点の外に付着して、ペプチド構造を伸ばしてもよい。ポリペプチドのそれぞれのループは、隣接する付着点の間を測定して、好ましくは０〜９個のアミノ酸の長さである。有利には、任意のペプチドリガンド内のループは、独立して３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸の長さである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学ならびに生化学の分野などの当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。分子生物学、遺伝子学および生化学的な方法には、標準の技法が使用され、これらは参照することにより本明細書の一部をなすものとする（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第３版、２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌら、分子生物学の手短なプロトコル（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照）。
【００５０】
本明細書中で言及するペプチドリガンドとは、分子足場と共有結合したペプチドをいう。典型的には、そのようなペプチドは、足場と共有結合を形成することができる２つ以上の反応基、および、ペプチドが足場と結合した際にループを形成することからループ配列と呼ばれる、前記反応基間に内在する配列を含む。
【００５１】
反応基とは、分子足場と共有結合を形成することができる基である。典型的には、反応基は、ペプチド上のアミノ酸側鎖上に存在する。システイン、リジンおよびセレノシステインなどのアミノ含有基が好ましい。
【００５２】
標的とは、ペプチドリガンドが結合する分子またはその一部である。典型的には、標的はエピトープに類似である。
【００５３】
分子足場とは、複数の点でペプチドと接続して、ペプチドに１つ以上の構造的特長を与えることができる任意の分子である。これは、ジスルフィド結合を単に置き換えるのではなく、その代わりに、ペプチドの２つ以上の付着点をもたらすという点で、架橋結合剤ではない。好ましくは、分子足場は、足場反応基と呼ばれる、ペプチドの付着点を少なくとも３つ含む。これらの基は、ペプチド上の反応基と反応して共有結合を形成することができる。分子足場の好ましい構造を以下に記載する。
【００５４】
レパートリーとは、その配列が異なる変異体、この場合はポリペプチド変異体のコレクションである。一部の実施形態では、反応基の位置および性質は変動しないが、反応基の間でループを形成する配列がランダム化されている場合がある。他の実施形態では、反応基自体が変動し得る。レパートリーのサイズは変動する場合があり、本発明では、これはレパートリーの目的に依存し得る。たとえば、第１のレパートリーは、有利には大きなレパートリーであり、これはファージを用いた選択に適切であり得る。そのようなレパートリーは、有利には、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５個またはそれより多くのポリペプチド変異体からなる。より小さなレパートリーは、遺伝子ディスプレイ系、たとえばファージディスプレイによる選択を意図しない場合があり、１００個以下の多様なポリペプチド変異体からなる場合がある。たとえば、これらは、１０、２０、３０、４０または５０個の多様なポリペプチド変異体からなり得る。したがって、たとえば、第１のレパートリーから開始して、メンバーの小集団を本明細書中に記載の方法に従って変動させて、それ自体をファージディスプレイなどの遺伝子ディスプレイ技術を用いずにスクリーニングすることができる第２のより小さなレパートリーを生じさせ得る。
【００５５】
ポリペプチド変異体の群は、少なくとも２つの多様なポリペプチド変異体を含み、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０またはそれより多くの多様な変異体を含み得る。より小さなレパートリーと同様、変異体の群は、ファージディスプレイなどの遺伝子ディスプレイ技術を用いずにスクリーニングすることができるが、固相ポリペプチドアレイ、マイクロタイタープレートなどの任意の適切なポリペプチドディスプレイ技術を用いたスクリーニングを受け入れることができる。
【００５６】
結合活性（または任意の他の所望の活性）のスクリーニングは、当分野で周知の方法に従って、たとえばファージディスプレイ技術から実施する。たとえば、固相に固定した標的を用いて、レパートリーの結合メンバーを同定および単離することができる。スクリーニングにより、所望の特徴に応じたレパートリーのメンバーの選択が可能となる。
【００５７】
ライブラリという用語は、不均一のポリペプチドまたは核酸の混合物をいう。ライブラリは、それぞれが単一のポリペプチド配列または核酸配列を有するメンバーから構成される。この点で、ライブラリはレパートリーと同義である。ライブラリメンバー間の配列の相違が、ライブラリ中に存在する多様性を担っている。ライブラリは、ポリペプチドもしくは核酸の単純な混合物の形態をとり得るか、または、核酸のライブラリで形質転換させた生物もしくは細胞、たとえば、細菌、ウイルス、動物もしくは植物細胞などの形態であり得る。好ましくは、それぞれの個々の生物または細胞は、１つのみまたは限定された数のライブラリメンバーを含有する。
【００５８】
有利には、核酸によってコードされているポリペプチドの発現を可能にするために、核酸を発現ベクター内に組み込む。したがって、好ましい態様では、ライブラリは宿主生物の集団の形態をとってよく、それぞれの生物は、発現させてその対応するポリペプチドメンバーを産生させることができる、ライブラリの単一のメンバーを核酸の形態で含有する発現ベクターの１つ以上のコピーを含有する。したがって、宿主生物の集団は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードする可能性を有する。
【００５９】
好ましくは、核酸のライブラリはポリペプチドのレパートリーをコードしている。ライブラリのそれぞれの核酸メンバーは、好ましくは、ライブラリの１つ以上の他のメンバーに関連する配列を有する。関連する配列は、少なくとも５０％の同一性、適切には少なくとも６０％の同一性、適切には少なくとも７０％の同一性、適切には少なくとも８０％の同一性、適切には少なくとも９０％の同一性、適切には少なくとも９５％の同一性、適切には少なくとも９８％の同一性、適切には少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を意味する。同一性は、適切には、少なくとも１０個のアミノ酸、適切には少なくとも１２個のアミノ酸、適切には少なくとも１４個のアミノ酸、適切には少なくとも１６個のアミノ酸、適切には少なくとも１７個のアミノ酸の連続的なセグメントまたは参照配列の完全長にわたって判断する。
【００６０】
本明細書中で使用する、反応基または足場を変更することとは、反応基のうちの任意の１つもしくは複数、または足場の任意の部分の、化学構造もしくは組成を変化させる、または置き換えることをいう。また、これは足場全体を置き換えることもいう。
【００６１】
一実施形態では、反応基または足場を変更することは、アセンブルされたペプチドリガンドのコンホメーションの変化をもたらす。たとえば、これには、結合の形状、足場上の反応基の構造、したがって空間的な配置、ポリペプチド上の反応基の構造、したがって空間的な配置、足場の主鎖自体の構造、ならびにそのような特長の組合せを変更させる変化が含まれる。また、ペプチドリガンドの予測可能な適応的な適合のレベルを変更させ得る、結合および連結の柔軟性に影響を与える変化も含まれる。
【００６２】
本明細書中で言及するコンホメーション多様性とは、ペプチドリガンドのレパートリー中のペプチドリガンドの様々なコンホメーションの選択肢の程度である。リガンドのレパートリーが１つの足場を用いて構築されている場合、多様性はペプチド配列中の変動から生じる。本発明によれば、ペプチドが足場と付着する様式、または足場自体を変動させることによって、さらなる多様性を達成することができる。レパートリーのコンテキストでは、変動は、任意の所定の変化について多くの選択肢を含むことができ、したがってさらなる多様性を導入する。したがって、得られるレパートリーは、元のレパートリーによって網羅されていない多様性空間を網羅する。この空間は、より大きくてもよく、またはより小さくよもよく、または部分的に重複してもよい。
【００６３】
［リガンドの多様性の増大］
一般に、ペプチドリガンドレパートリーは、従来技術で知られている技術、または本明細書中に記載の技術によって調製し得る。リガンドの基本的な構成要素、特に分子足場およびポリペプチド構成要素は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら、２００５、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、６：８２１〜８２４、ならびにＷＯ２００４／０７７０６２号、ＷＯ２００６／０７８１６１号およびＷＯ２００８／０１３４５４号により知られている。分子足場と複合体を形成したポリペプチドを選択するためのファージディスプレイの使用は、Ｈｅｉｎｉｓら、２００９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：５０２〜５０７、および本発明者らの同時係属の未公開の国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ０９／０００３０１号に記載されている。これらの文献のそれぞれは、参照することにより本明細書の一部をなすものとする。本発明によるリガンドおよびリガンドレパートリーを構築する好ましい方法、ならびにファージディスプレイの使用は、以下により詳細に記述する。
【００６４】
一般に、足場−ペプチドの接合部分の改変を活用して、レパートリーの多様性を増大させ、または所望する場合は低下させることができる。上述のように、この目的を達成するために３つの基本的な経路が存在する。すなわち、（ａ）ポリペプチドの反応基を変更すること、（ｂ）足場の反応基を含めた足場を変更すること、（ｃ）ポリペプチドと足場との間の結合を、特に結合が形成された後に変更すること。複数の方法の組合せも可能である。
【００６５】
（Ａ）構築リガンドレパートリー
（ｉ）分子足場
分子足場は、時折「分子コア」または「コネクタ化合物」と呼ばれる。一部の実施形態では芳香族小分子であるこの分子は、ペプチドと共有結合を形成することができる足場反応基を含む。ペプチド上の反応基は、足場反応基と相互作用して前記共有結合を形成する。
【００６６】
適切には、分子足場は、ヌクレオシド、糖、またはステロイドなどの天然の単量体であり得、またはそれらに基づき得る。適切には、分子足場は、二量体または三量体などの、そのようなものの短いポリマーを含み得る。
【００６７】
多種多様の足場構造が知られており、当分野において、たとえばＣＡＳレジストリにカタログ化されている。Ｌｉｐｋｕｓら、（２００８）Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ、７３：４４４３〜４４５１を参照されたい。また、ヘテロ原子のサイズおよび位置などの、構造の多様性に寄与する要素も知られている。
【００６８】
適切には、分子足場は、既知の毒性、適切には低い毒性の化合物である。適切な化合物の例には、コレステロール、ヌクレオチド、ステロイド、またはタマゼパム（ｔａｍａｚｅｐａｍ）などの既存の薬物が含まれる。
【００６９】
適切には、分子足場は巨大分子であり得る。適切には、分子足場は、アミノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物から構成される巨大分子である。
【００７０】
適切には、分子足場は、標的ポリペプチドの官能基（複数可）と反応して共有結合を形成することができる反応基を含む。
【００７１】
本発明の分子足場は、本発明のコードされているライブラリのポリペプチドの官能基が分子足場と共有結合を形成することを可能にする化学基を含有する。前記化学基は、ベンジルハロゲン化物、α−ハロカルボン酸またはアミド、アクリロイル部分、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、酸無水物、スクシンイミド、マレイミド、アジド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルを含めた広範囲の官能基から選択される。
【００７２】
適切には、分子足場は、トリス（ブロモメチル）ベンゼン、特に１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（「ＴＢＭＢ」）、またはその誘導体を含み得るか、またはそれからなり得る。
【００７３】
一部の実施形態では、分子足場は、コードされているポリペプチドの４つの官能基と分子足場との反応が２つ以下の生成物異性体しか生じないように、四面体の形状を有し得る。他の形状も可能であり、実際、ほぼ無限数の足場の形状が可能であり、ペプチドリガンドの多様化のより高い可能性がもたらされる。
【００７４】
適切な分子足場は２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンである。これは、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼンに類似であるが、ベンゼン環に付着した３つのメチル基をさらに含有する。この足場の場合、追加のメチル基がポリペプチドとのさらなる接触を形成し、それにより、さらなる構造的束縛が追加され得る。したがって、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼンよりも異なる多様性の範囲が達成される。
【００７５】
もちろん、メチル基はすべての位置で付加される必要はなく、置換の位置は対称である必要はない。したがって、さらなる多様性を達成することができる。
【００７６】
本発明の分子足場は、小分子または巨大分子構造のいずれかから選択される。前記分子足場は、有機、無機または有機および無機の構成要素から構成される。
【００７７】
好ましい実施形態では、分子足場は、たとえば直鎖状アルカンなどの有機小分子である。より適切には、分子足場は、柔軟性が低い（すなわちより強固である）という利点を提供する、分枝状アルカン、環状アルカン、多環アルカン、芳香族、複素環アルカンまたは複素環芳香族である。最も適切には、分子足場は少なくとも１つのベンジル基を含む。
【００７８】
別の実施形態では、分子足場は、たとえば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは多糖などの巨大分子構造から選択される。
【００７９】
（ｉｉ）ポリペプチド
以下により詳細に記載するように、ペプチドリガンドのポリペプチド要素は、足場との結合を担う２つ以上の反応基、好ましくは３つ以上の反応基、および反応基間のループ配列を含む。多様性は、従来技術のように、ループの配列を変動させることによって得ることができる。一実施形態では、ペプチドを分子足場にコンジュゲートさせるための反応基は、官能化した−ＳＨ基である。そのような基を有する好ましいアミノ酸はシステインである。しかし、他の反応基を、任意の所定のポリペプチドにおいて、システインと併せて、またはその代わりに使用し得る。たとえば、２つの反応基は、１つのシステイン、および、たとえばメチオニン、リジン、セレノシステインまたは他のものを含み得る１つのさらなる適切な反応基を含み得る。本発明によれば、反応基の変動によってさらなる多様化を達成することができる。
【００８０】
ポリペプチドの反応基は、適切には、天然または非天然のアミノ酸の側鎖によって提供される。コードされているポリペプチドの反応基は、適切には、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、グアニジニル基、フェノール基またはヒドロキシル基から選択される。コードされているポリペプチドの反応基は、適切には、アジド、ケト−カルボニル、アルキン、ビニル、またはハロゲン化アリール基から選択され得る。分子足場と連結させるためのコードされているポリペプチドの反応基は、適切には、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端であり得る。
【００８１】
一部の実施形態では、分子足場と連結させるためのポリペプチドの反応基のそれぞれは、同じ種類のものである。たとえば、それぞれの反応基はシステイン残基であり得る。
【００８２】
一部の実施形態では、分子足場と連結させるための反応基は、２つ以上の異なる種類を含み得るか、または３つ以上の異なる種類を含み得る。たとえば、反応基は、２つのシステイン残基および１つのメチオニン残基またはリジン残基を含み得るか、あるいは、１つのシステイン残基、１つのメチオニン残基またはリジン残基および１つのＮ末端アミン、あるいは上述したリストから選択される任意の基を含み得る。
【００８３】
システインは、その反応性がすべての他のアミノ酸と最も異なっているという利点を有するため、ペプチドリガンドのコンテキストにおいて有用である。システインのチオール基と反応させるために分子足場上で使用することができる足場反応基は、ベンジルハロゲン化物、α−ハロカルボン酸またはアミド、アクリロイル部分、アジリジン、ビニルスルホンであり、例はブロモメチルベンゼンである（足場反応基はＴＢＭＢによって例示される）。化合物をタンパク質中のシステインと選択的にカップリングさせるために使用される他の足場反応基はマレイミドである。本発明において分子足場として使用し得るマレイミドの例には、トリス−（２−マレイミドエチル）アミン、トリス−（２−マレイミドエチル）ベンゼン、トリス−（マレイミド）ベンゼンが含まれる。また、様々な足場反応基の任意の変動および組合せも可能である。
【００８４】
セレノシステインは、システインと類似の反応性を有しており、同じ反応に使用することができる天然アミノ酸である。したがって、システインに言及する場合はいつでも、文脈によりそうでないと示唆される場合以外は、セレノシステインを代わりに用いることが典型的には許容される。
【００８５】
また、リジン（およびペプチドのＮ末端の第一級アミン）も、分子足場との連結によってファージ上のペプチドを修飾するための反応基として適している。しかし、ファージを選択に使用する場合は、リジンはファージタンパク質中でシステインよりも豊富に存在し、ファージ粒子が架橋結合し得る危険性またはファージ粒子がその感染力を失い得る危険性が高くなる。それにもかかわらず、リジンは、分子内反応（たとえば、分子足場が既にファージペプチドと連結している場合）において、分子足場と第２のまたは連続した連結を形成するために特に有用であることが見出されている。この場合、分子足場は、ディスプレイされたペプチドのリジン（特に、非常に近位にあるリジン）と優先的に反応し得る。第一級アミンと選択的に反応する足場反応基は、スクシンイミド、アルデヒドまたはハロゲン化アルキルなどの活性化されたエステルである。
【００８６】
添付の実施例のうちのいくつかにおいて使用されているブロモメチル基では、ベンゼン環の電子が陽イオン性の遷移状態を安定化することができる。したがって、この特定のハロゲン化アルキルは、ベンゼン（より一般には（複素環）芳香族系）基に接続していないハロゲン化アルキルよりも反応性が１００〜１０００倍高い。
【００８７】
分子足場として使用するためのスクシンイミドの例には、トリス−（スクシンイミジルアミノトリアセテート）、１，３，５−ベンゼン三酢酸が含まれる。分子足場として使用するためのアルデヒドの例には、トリホルミルメタン、およびベンゼン１，３，５トリスカルボアルデヒド（１，３，５−トリスホルミルベンゼン）が含まれる。分子足場として使用するためのハロゲン化アルキルの例には、１，３，５−トリス（ブロモメチル）−２，４，６−トリメチルベンゼン、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン、１，３，５−トリス（ブロモメチル）−２，４，６−トリエチルベンゼンが含まれる。
【００８８】
一部の実施形態では、分子リンカーまたは修飾は、分子足場の付着の前に、コードされているポリペプチドの反応基に付加（またはそれを作製）してよく、前記リンカーまたは修飾体は、分子足場と反応することができる。
【００８９】
分子足場と連結させるための反応基を有するアミノ酸は、コードされているポリペプチド内の任意の適切な位置に位置していてよい。作製された特定の構造またはループに影響を与えるために、反応基を有するアミノ酸の位置は、たとえば、産生されるポリペプチドを突然変異させるためにポリペプチドをコードしている核酸を操作することによって、熟練した技術者によって変動させ得る。
【００９０】
コードされているポリペプチドのアミノ酸のそれぞれが、当業者の要求または本発明を適用する目的に従った、突然変異誘発（たとえば制限的変化（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｖａｒｉａｎｃｅ）突然変異誘発）の標的であり得る。分子足場との結合のために、明らかに少なくとも２つの反応基が対象のポリペプチド上に必要である。分子足場との結合に必要なもの以外のアミノ酸は、技術者の要求に応じて自由に変動させてよく、「可変アミノ酸」と呼ばれる。コードされているポリペプチド（たとえばポリペプチドライブラリメンバー（複数可））の前記可変アミノ酸は、ランダム、部分的にランダム、または一定であり得る。
【００９１】
ポリペプチドは分子足場結合セグメントを含む。これは分子足場が付着する領域である。適切には、ポリペプチド上の反応基に関する解説は、この結合セグメントに適用される。適切には、標的ポリペプチドの分子足場結合セグメントは、１〜２７個のアミノ酸残基、適切には５〜２０個のアミノ酸残基を含む。適切には、標的ポリペプチドの分子足場結合セグメントは、１０個未満のアミノ酸を含む。これは、分子足場に付着している場合にポリペプチドセグメントにさらなるコンホメーション束縛を与えるという利点を有する。
【００９２】
標的ポリペプチドは、適切には、配列ＸＣ（Ｘ）６Ｃ（Ｘ）６ＣＸ（式中、Ｘはランダムな天然アミノ酸を表す）を含む。適切には、本明細書中で言及する式中、Ｃは、足場反応基と共有結合を形成する別のアミノ酸で置き換えてもよい。
【００９３】
標的ポリペプチドは、適切には、配列（Ｘ）ｌＹ（Ｘ）ｍＹ（Ｘ）ｎＹ（Ｘ）ｏ（式中、Ｙは反応基を有するアミノ酸を表し、Ｘはランダムなアミノ酸を表し、ｍおよびｎは、介在ポリペプチドセグメントの長さを定義する１〜２０の数字であり、ｌおよびｏは、隣接ポリペプチドセグメントの長さを定義する、０〜２０の数字である）を含む。
【００９４】
一部の実施形態では、本発明のペプチドリガンドは、配列Ｃ（Ｘ）６Ｃ（Ｘ）６Ｃを有するポリペプチドを含み得る。一実施形態では、本発明のライブラリメンバーまたはペプチドリガンドは、メシチレン分子足場および配列Ｃ（Ｘ）６Ｃ（Ｘ）６Ｃを有するポリペプチドを含み得、ポリペプチドは、ポリペプチドのシステイン残基を介して分子足場の環外メチル基と繋がれて、それらと３つのチオエーテル結合を形成し、Ｘはアミノ酸（適切には天然アミノ酸）を表す。
【００９５】
本発明の一実施形態では、ポリペプチドの反応基のうちの少なくとも１つは、残りの反応基とオルソゴナルである。オルソゴナルな反応基の使用は、前記オルソゴナルな反応基を分子コアの特異的な部位に向けることを可能にする。オルソゴナルな反応基を含む連結戦略は、形成される生成物異性体の数を制限するために使用し得る。言い換えれば、少なくとも３つの結合のうちの１つ以上について、少なくとも３つの結合のうちの残りについて選択したものと区別されるか異なる反応基を選択することによって、特定の順序の結合、またはポリペプチドの特定の反応基を分子足場上の特定の位置に指示することが、有用に達成され得る。
【００９６】
別の実施形態では、本発明のコードされているポリペプチドの反応基を分子リンカーと反応させ、前記リンカーは、リンカーが最終的な結合状態において分子足場とポリペプチドとの間に介在するように、分子足場と反応することができる。
【００９７】
遺伝的にコードされているコンビナトリアル化学ライブラリのメンバーの適切なアミノ酸は、任意の天然または非天然のアミノ酸によって置き換えることができる。交換可能なアミノ酸から除外されるのは、ポリペプチドを分子コアに架橋結合させる官能基を保有するものである。変動させることができる隣接アミノ酸の群は、ポリペプチドセグメントとして定義される。単一のポリペプチドセグメントのサイズは、適切には、１〜２０個のアミノ酸の範囲である。ポリペプチドセグメントは、ランダム配列、一定配列またはランダムおよび一定のアミノ酸を有する配列のいずれかを有する。反応基を有するアミノ酸は、本発明のコードされているポリペプチド内の定義された位置またはランダムな位置のいずれかに位置する。
【００９８】
一実施形態では、分子足場／分子コアと結合するための反応基を保有する２個のアミノ酸によって結合したポリペプチドセグメントは、１０個以下のアミノ酸の短いアミノ酸配列である。前記コードされているポリペプチド配列と分子コアとの反応は、高いコンホメーション束縛を有するライブラリメンバーを生じる。コンホメーション束縛されたリガンドは、一般により特異的であり、より高い結合親和性を有する。また、コンホメーション束縛は、リガンドを、たとえば体液中でのタンパク質分解性から保護することもできる。
【００９９】
一実施形態では、３つの反応基を有するコードされているポリペプチドは、配列（Ｘ）ｌＹ（Ｘ）ｍＹ（Ｘ）ｎＹ（Ｘ）ｏ（式中、Ｙは反応基を有するアミノ酸を表し、Ｘはランダムなアミノ酸を表し、ｍおよびｎは、介在ポリペプチドセグメントの長さを定義する１〜２０の数字であり、ｌおよびｏは、隣接ポリペプチドセグメントの長さを定義する、０〜２０の数字である）を有する。
【０１００】
好ましい実施形態では、本発明のコードされているポリペプチドライブラリは、配列ＡＣ（Ｘ）６Ｃ（Ｘ）６ＣＧ（式中、Ａはアラニンを表し、Ｃはシステインを表し、Ｘはランダムな天然アミノ酸を表し、Ｇはグリシンを表す）を有する。
【０１０１】
チオール媒介性のコンジュゲーションに代替する手段を使用して、共有的相互作用を介して分子足場をペプチドに付着させることができる。あるいは、これらの技法は、本発明に従ってこれらが選択され、単離された後に、修飾またはさらなる部分（分子足場とは異なる対象小分子など）とポリペプチドとの付着に使用し得る。したがって、本実施形態では、明らかに、付着は共有的である必要はなく、非共有的な付着を包含し得る。これらの方法は、非天然アミノ酸を保有し、必須の化学反応基を、相補的反応基を保有する小分子と組み合わせて有するタンパク質およびペプチドをディスプレイするファージを産生させることによって、または、分子が選択／単離段階の後に作製される場合は、化学的にもしくは組換えによって合成したポリペプチド内に非天然アミノ酸を組み込ませることによって、チオール媒介性方法の代わりに（またはそれと組み合わせて）使用し得る。
【０１０２】
ファージ上のペプチドおよびタンパク質に組み込まれる非天然アミノ酸には、１）ヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよびその誘導体と特異的に反応させることができるケトン反応基（パラアセチル−フェニルアラニンまたはメタアセチル−フェニルアラニン中に見られるものなど）（大腸菌の遺伝コードへのケト反応基の付加（Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｅｔｏ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．）、Ｗａｎｇ  Ｌ、Ｚｈａｎｇ  Ｚ、Ｂｒｏｃｋ  Ａ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、２００３年１月７日、１００（１）：５６〜６１、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．、２００６年１０月１５日、１６（２０）：５３５６〜９．、ジケトン含有アミノ酸のタンパク質中への遺伝的導入（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｉｋｅｔｏｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）、Ｚｅｎｇ  Ｈ、Ｘｉｅ  Ｊ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ）、２）銅触媒の「クリック化学」もしくはひずみが促進する（３＋２）付加環化を介してアルキンと反応させて、対応するトリアゾールを形成することができるアジド（ｐ−アジド−フェニルアラニン中に見られるものなど）（大腸菌の遺伝コードへのｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンの付加（Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ−ａｚｉｄｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．）、Ｃｈｉｎ  ＪＷ、Ｓａｎｔｏｒｏ  ＳＷ、Ｍａｒｔｉｎ  ＡＢ、Ｋｉｎｇ  ＤＳ、Ｗａｎｇ  Ｌ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．、２００２年８月７日、１２４（３１）：９０２６〜７、出芽酵母の遺伝コードへの、新規反応性を有するアミノ酸の付加（Ａｄｄｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．）、Ｄｅｉｔｅｒｓ  Ａ、Ｃｒｏｐｐ  ＴＡ、Ｍｕｋｈｅｒｊｉ  Ｍ、Ｃｈｉｎ  ＪＷ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＪＣ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．、２００３年１０月１日、１２５（３９）：１１７８２〜３）、または、シュタウディンガーライゲーション（ｐ−アジドフェニルアラニンを含有するタンパク質の選択的シュタウディンガー修飾（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐ−ａｚｉｄｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ．）、Ｔｓａｏ  ＭＬ、Ｔｉａｎ  Ｆ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．、２００５年１２月、６（１２）：２１４７〜９）を介してアリールホスフィンと反応させて、対応するアミドを形成することができるアジド、４）アジドと反応させて対応するトリアゾールを形成することができるアルキン（大腸菌中のタンパク質中への、アルキンのｉｎ  ｖｉｖｏの組込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｋｙｎｅ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．）��Ｄｅｉｔｅｒｓ  Ａ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．、２００５年３月１日、１５（５）：１５２１〜４）、５）複数の適切な間隔のヒドロキシル基を含有する化合物と特異的に反応させることができる、またはハロゲン化化合物を用いたパラジウム媒介性カップリングを受ける、ボロン酸（ボロネート）（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．、２００８、４７（４３）：８２２０〜３．、遺伝的にコードされたボロネート含有アミノ酸（Ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｏｒｏｎａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ．）、Ｂｒｕｓｔａｄ  Ｅ、Ｂｕｓｈｅｙ  ＭＬ、Ｌｅｅ  ＪＷ、Ｇｒｏｆｆ  Ｄ、Ｌｉｕ  Ｗ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ）、６）金属イオンを特異的に配位することができる、ビピリジルを保有するものを含めた金属キレート化アミノ酸（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．、２００７、４６（４８）：９２３９〜４２．、遺伝的にコードされた二座の金属結合アミノ酸（Ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｉｄｅｎｔａｔｅ，ｍｅｔａｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ．）、Ｘｉｅ  Ｊ、Ｌｉｕ  Ｗ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ）が含まれ得る。
【０１０３】
非天然アミノ酸は、１）オルソゴナルなアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素およびコドンに応答して非天然アミノ酸の組込みを指示するｔＲＮＡ、２）非天然アミノ酸の組込みの部位で選択されたコドンを含有するように変更されたファージＤＮＡまたはファージミドプラスミド、を保有するプラスミドまたはプラスミドの組合せを用いて大腸菌を形質転換させることによって、ファージ上にディスプレイされるタンパク質およびペプチド中に組み込ませ得る（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、２００８年１１月１８日、１０５（４６）：１７６８８〜９３、拡大された遺伝コードを有するタンパク質の進化（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．）、Ｌｉｕ  ＣＣ、Ｍａｃｋ  ＡＶ、Ｔｓａｏ  ＭＬ、Ｍｉｌｌｓ  ＪＨ、Ｌｅｅ  ＨＳ、Ｃｈｏｅ  Ｈ、Ｆａｒｚａｎ  Ｍ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ、Ｓｍｉｄｅｒ  ＶＶ、非天然アミノ酸を有するファージディスプレイ系（Ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．）、Ｔｉａｎ  Ｆ、Ｔｓａｏ  ＭＬ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．、２００４年１２月１５日、１２６（４９）：１５９６２〜３）。オルソゴナルなアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素およびｔＲＮＡは、メタンコッカス・ジャナシイ（Ｍｅｔｈａｎｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎａｓｃｈｉｉ）のチロシル対または合成酵素（大腸菌の遺伝コードへの光架橋結合アミノ酸の付加（Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．）、Ｃｈｉｎ  ＪＷ、Ｍａｒｔｉｎ  ＡＢ、Ｋｉｎｇ  ＤＳ、Ｗａｎｇ  Ｌ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、２００２年８月２０日、９９（１７）：１１０２０〜４）およびピロールリジンを天然に組み込んでいるｔＲＮＡ対（部位特異的タンパク質修飾のためにＮ（イプシロン）−（ｏ−アジドベンジルオキシカルボニル）リジンを遺伝的コードするための、ピロールリジル−ｔＲＮＡ合成酵素の複数ステップの操作（Ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｔｏ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅ  Ｎ（ｅｐｓｉｌｏｎ）−（ｏ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）  ｌｙｓｉｎｅ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．）、Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  Ｔ、Ｉｓｈｉｉ  Ｒ、Ｆｕｋｕｎａｇａ  Ｒ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｔ、Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｋ、Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｓ．、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．、２００８年１１月２４日、１５（１１）：１１８７〜９７、組換えタンパク質中へのＮ（イプシロン）−アセチルリジンの遺伝的コード（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｎ（ｅｐｓｉｌｏｎ）−ａｃｅｔｙｌｌｙｓｉｎｅ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）、Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｈ、Ｐｅａｋ−Ｃｈｅｗ  ＳＹ、Ｃｈｉｎ  ＪＷ．、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．、２００８年４月、４（４）：２３２〜４．、電子出版２００８年２月１７日）に由来し得る。組込みのためのコドンは、アンバーコドン（ＵＡＧ）、別のストップコドン（ＵＧＡまたはＵＡＡ）であり得るか、または、これは４個の塩基のコドンであり得る。アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素およびｔＲＮＡは、ｐＢＫベクターシリーズ、ｐＳＵＰ（大腸菌におけるタンパク質中への非天然アミノ酸の効率的な組込み（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．）、Ｒｙｕ  Ｙ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ．、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２００６年４月、３（４）：２６３〜５）ベクターおよびｐＤＵＬＥベクター（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２００５年５月、２（５）：３７７〜８４、遺伝的にコードされたベンゾフェノンを有する光架橋結合相互作用タンパク質（Ｐｈｏｔｏ−ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ．）、Ｆａｒｒｅｌｌ  ＩＳ、Ｔｏｒｏｎｅｙ  Ｒ、Ｈａｚｅｎ  ＪＬ、Ｍｅｈｌ  ＲＡ、Ｃｈｉｎ  ＪＷ）を含めた既存のベクターから産生し得る。使用する大腸菌株は、（一般にｔｒａオペロンを介して）Ｆ’線毛を発現する。アンバー抑制を使用する場合、大腸菌株自体は活性アンバー抑制ｔＲＮＡ遺伝子を含有しない。アミノ酸を、増殖培地に、好ましくは１ｍＭ以上の最終濃度で加える。アミノ酸の組込みの効率は、オルソゴナルなリボソーム結合部位を有する発現構築体を用いて、ｒｉｂｏ−Ｘを用いて遺伝子を翻訳することによって増強させ得る（進化したオルソゴナルなリボソームが合成遺伝コードの拡大の効率を増強させる（Ｅｖｏｌｖｅｄ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．）、Ｗａｎｇ  Ｋ、Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｈ、Ｐｅａｋ−Ｃｈｅｗ  ＳＹ、Ｃｈｉｎ  ＪＷ．、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００７年７月、２５（７）：７７０〜７）。これにより、効率的な複数部位の非天然アミノ酸の組込みが可能となり、リガンドとの複数部位の付着が提供され得る。
【０１０４】
（ｉｖ）付着後の修飾
一部の実施形態では、ポリペプチド−分子足場の複合体は、付着後の時点で修飾し得る。
【０１０５】
［プロテアーゼ切断］
一部の実施形態では、本発明のポリペプチド要素は、分子足場／分子コアに繋がれた後にタンパク質分解によって切断される。切断により、１つの分子足場／分子コアに繋がれた別々のペプチド断片を有するリガンドが生じる。
【０１０６】
たとえば、ポリペプチドの１つ以上のアミド結合は、ポリペプチドを分子コアに繋げた後に、タンパク質分解によって切断され得る。これは、それぞれが少なくとも１つの共有結合によって分子足場に結合されているが、親ポリペプチドをコードしている核酸を含む複合体中に保持されている異なる分子構造を提示する、短いポリペプチドが作製されるという利点を有する。ポリペプチドの切断は、制御された加水分解、または、より適切には、適切なプロテアーゼによる酵素切断などの、当分野で知られている任意の適切な手段によって適切に触媒される。プロテアーゼは、任意の適切なプロテアーゼであり得るが、好ましくは、特異的なポリペプチド認識配列またはモチーフを有するプロテアーゼである。これは、より明確なおよび／またはより予測可能なポリペプチド切断産物の生成を有利にもたらす。実際、本実施形態では、プロテアーゼ認識配列は、標的ポリペプチドに、たとえばそれをコードしている核酸（複数可）を操作することによって、系統的に付加またはそれから除去し得る。これは、有利に、より高い程度の制御をもたらし、本発明によってディスプレイされた分子においてより高い多様性が生じることを可能にする。したがって、ポリペプチド分子中のプロテアーゼ切断部位の性質および位置を変動させることによって、増強された多様性が得られ得る。最も適切には、ポリペプチドは少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む。適切には、それぞれの前記切断部位は、分子足場との共有結合に使用されるポリペプチド上の反応基間のアミノ酸配列（複数可）内に含まれる。適切には、それぞれの前記認識部位は、分子足場との共有結合に使用されるポリペプチド上の反応基間のアミノ酸配列（複数可）内に含まれる。
【０１０７】
ペプチドループは、トリプシン（Ｐ１位置におけるアルギニンもしくはリジン）またはサーモリシン（Ｐ１位置における脂肪族側鎖）などの特定のアミノ酸位置でポリペプチドを認識およびプロセッシングするプロテアーゼを用いて適切に切断する。酵素は、ディスプレイされた分子のペプチドループの効率的なプロセッシングを可能にするが、ファージ粒子を残す濃度で使用する。最適な条件は、ポリペプチドループの長さおよび使用するプロテアーゼに応じて変動する場合がある。たとえば、トリプシンは、典型的には、ＴＢＳ−Ｃａ緩衝液（２５ｍＭのトリスＨＣｌ／１３７ｍＭのＮａＣｌ／１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中に２００ｎＭで、１０分間、１０℃で使用する。ディスプレイされたポリペプチドの修飾に適しているが、ファージを残すプロテアーゼのあらゆる種類が、Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｐ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．（糸状バクテリオファージを用いたタンパク質の折り畳みのタンパク質分解性選択（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ）、Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ．、１９９８、３（５）：３２１〜８）に記載されている。限られた数のファージコートタンパク質が切断されることを排除することはできないため、ファージ上のペプチドの酵素プロセッシングは「部分的タンパク質分解」であり得る。したがって、条件の最適化において、標的の切断の最大化とファージ粒子を最大に残すこととの間の最良のバランスを適切に選択する。
【０１０８】
適切には、標的ポリペプチドは、少なくとも１つのそのようなタンパク質分解性切断部位を含む。適切には、標的ポリペプチドは、少なくとも２つのそのようなタンパク質分解性切断部位を含む。
【０１０９】
適切には、標的ポリペプチドは、少なくとも３つのそのようなタンパク質分解性切断部位を含む。
【０１１０】
それぞれのそのようなタンパク質分解の実施形態では、適切には、前記プロテアーゼ部位（複数可）は、分子足場によって範囲を定められる標的ポリペプチドループ内に位置する。これは、分子足場が複合体上に保持されるという利点を有し、そうでなければ、ポリペプチド−分子足場の複合体は標的ポリペプチドをコードしている核酸から分離される場合があり、これは本発明の用途の大多数に望ましくない。
【０１１１】
短いループ（短いとは、たとえば６個以下のアミノ酸残基である）の使用は、一部のプロテアーゼの、ループ内を切断する能力を損ない得る。この場合、プロテアーゼがより接近可能である可能性の高い、より長いループを選択することが望ましい場合がある。さらに、エンドプロテアーゼによるループの切断後、他のエンドプロテアーゼ、または実際にはカルボキシペプチダーゼもしくはアミノペプチダーゼなどのエクソプロテアーゼを用いて、ループをさらに削減することが望ましい場合がある。
【０１１２】
標的ポリペプチドが複数のそのようなプロテアーゼ部位を含む場合、適切には、部位のそれぞれは、標的ポリペプチドと分子足場との間に作製された２つの共有結合の間で起こる。複数の切断部位は、必要な場合は結合間で存在し得る。
【０１１３】
切断の実施形態では、適切には、少なくとも２つまたは３つの共有結合によって分子足場に付着しているかどうかの評価のために、親ポリペプチドを完全体としてみなす。より適切には、標的ポリペプチドは、それが少なくとも３つの共有結合によって分子足場に付着しているかどうかを評価する場合に、インタクトな（切断されていない）ポリペプチドとみなされる。
【０１１４】
［プロテアーゼ耐性］
別の実施形態では、ポリペプチドはプロテアーゼ切断に対して耐性であり得る。一般に、密に折り畳まれたポリペプチド構造は、プロテアーゼがポリペプチドに物理的に接近してそれを切断することができないため、プロテアーゼに対してより耐性である。したがって、ペプチドリガンドにおける足場および足場付着の操作は、ポリペプチドループの折り畳みに影響を与えることによって、プロテアーゼ感度を調節することができる。
【０１１５】
先の段落に示したように、化学的足場に付着したループ内の接近可能な部位を切断するために、プロテアーゼステップを導入することができる。ペプチドコンジュゲートのレパートリーがファージ上にディスプレイされている場合、それぞれ少なくとも１つの共有結合によって化学的足場と結合しているが、親ポリペプチドをコードしている核酸を含む複合体中に保持されているペプチドがもたらされる。抗原を用いた選択の前に、化学修飾したファージをプロテアーゼで処理することは、切断されたループ（複数可）を有するペプチドコンジュゲートを保有するファージ、および切断部位を欠くこと、または他の様式で切断に耐性であることが原因で切断されていないループ（複数可）を有するペプチドコンジュゲートを保有するファージを生じさせると予測される。一方が抗原と結合し、他方が結合しない場合は、選択されたファージクローンと標的抗原との結合をプロテアーゼ処理の前と後とで比較することによって、これらの種を識別することが可能である。したがって、切断されたループを有する種は、プロテアーゼ処理後に結合するが、プロテアーゼ処理前には結合しないと予測される一方で、プロテアーゼ耐性種は、処理の前および後のどちらにも結合すると予測される。コンジュゲートが、切断されたループおよび切断されていないループのどちらを有していても結合する場合（カリクレイン切断後のＰＫ１５など、Ｈｅｉｎｉｓら、２００９を参照）、そのコンジュゲートはプロテアーゼ耐性として不正確に同定されている場合があることに注意されたい。このことは、たとえばペプチドコンジュゲートを化学的に合成することによって切断を確認するための直接方法の使用、たとえば質量分析によって切断の証拠を確認することの重要性を示している。
【０１１６】
切断されたループコンジュゲートがプロテアーゼ耐性コンジュゲートよりも好ましい場合は、化学修飾したファージレパートリーを第１回目の選択の前にプロテアーゼで処理し、続く回で同じプロテアーゼ、または共通の切断部位を有するものを使用し続けることが有利である。しかし、プロテアーゼ耐性コンジュゲートが代替として所望され得る。そのようなペプチドは、腸内プロテアーゼを生き延びるための経口投与において、または他の様式で血液、組織もしくは細胞におけるタンパク質分解性の攻撃に供されるものに有用であり得る。この場合、プロテアーゼを用いない第１回目の選択、次いでプロテアーゼを用いた続く選択の回が、耐性種の選択を支持するであろう。
【０１１７】
プロテアーゼの使用は、選択プロセス中にさらなる有用性を有する。たとえば、（ａ）ヌクレオチドの合成における誤りにより、必要なシステイン残基をコードすることに失敗したこと、あるいは（ｂ）必要なシステイン残基が、溶液中の遊離システインとジスルフィド結合を生じたこと（場合によっては不十分な還元もしくは再酸化が原因）、または不可逆的な様式で反応したこと（たとえば、システイン酸に酸化された、もしくは必要なシステインのうちの１つが足場の異なる分子と反応して他のものとなった）が原因で、一部の形成されていないループ（直鎖状の配列のセグメント）がライブラリ中に存在し得る。したがって、直鎖状の配列のセグメントはループよりもプロテアーゼ攻撃に対して感受性があるため、切断部位が存在することを前提条件として、プロテアーゼを用いてそのような結合剤を回避することが可能であり得る。
【０１１８】
また、（還元剤の存在下での）プロテアーゼステップは、化学的足場ではなく、必要なシステイン間のジスルフィドを介して形成されたループを排除するためにも有利である。これは、ファージ上のシステインの不十分な還元（または続く再酸化）が存在する場合に予測される。このため、本発明者らは化学的架橋結合ステップ中に脱気した緩衝液を使用した。また、本発明者らは、還元環境を維持するために、ＴＢＭＢとの反応中に低レベルの還元剤（ＴＣＥＰ）も保った。それにもかかわらず、本発明者らは、ＭＤＭ２に対するレパートリーの選択において、第１回目の選択後に４つのシステイン残基が含まれる多くの配列（３つの必要なシステイン残基、およびループ中にさらに１つのシステイン残基）、たとえばＣＦＮＳＥＷＳＣＬＱＳＣＳＮＣを見つけた（実施例１を参照）。合成ヌクレオチドライブラリにはランダムなコドン（ＮＮＫ多様性：Ｎは、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンヌクレオチドのそれぞれの２５％混合物を表し、Ｋは、チミンおよびグアニンヌクレオチドのそれぞれの５０％混合物を表す）が含まれるため、そのような余分なシステインがペプチドレパートリー中に存在することが予測される。一部の条件下、たとえば、不十分な還元、または必要なシステインと化学的足場との不完全な反応が存在する場合は（場合によっては、アミノ基または水による、足場に対する競合反応が原因）、余分なシステインは、酸化条件下で、３つの必要なシステインのうちの１つとジスルフィドループを形成することが予測され得る。あるいは、余分なシステインは足場と反応して、残された必要なシステインのうちの２つがジスルフィド閉ループを形成し得る。
【０１１９】
その発生の背景にある正確な機構が何であれ、そのようなジスルフィド閉ループは足場閉ループと競合し、優勢となり得る。単量体ではなく三つ組から構築された合成ヌクレオチドライブラリを使用することで、ループ中のシステインコドンを回避することによって、および／または選択を還元剤の存在下で行うことで、ジスルフィド閉ループを開くことによって、余分なシステインの頻度を減らすことが可能であろう。より好都合には、本発明者らは、還元剤（ジチオスレイトールなど）の存在下で化学修飾したファージレパートリーをプロテアーゼで処理することで、ループを開き、その後切断することが、そのような種の寄与を最小限にするために役立つことを見出した。
【０１２０】
したがって、好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドリガンドは実質的にプロテアーゼ耐性である。したがって、本発明は、
（ａ）第１のポリペプチドのレパートリーを提供するステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドを、２つ以上のアミノ酸残基においてポリペプチドと結合する分子足場とコンジュゲートさせて、ポリペプチドコンジュゲートのレパートリーを形成するステップと、
（ｃ）前記レパートリーを、標的に対する結合についてスクリーニングし、標的と結合する第１のレパートリーのメンバーを選択するステップと、
（ｄ）選択されたレパートリーを還元剤で任意選択的に処理するステップと、
（ｄ）レパートリーをプロテアーゼ耐性についての選択に供するステップと、
（ｅ）前記レパートリーを、標的との結合についてさらにスクリーニングするステップと
を含む、増大したプロテアーゼ耐性を有するペプチドリガンドを選択する方法を提供する。
【０１２１】
最も好ましい実施形態では、プロテアーゼステップを、レパートリーをスクリーニングするステップの前に含む。したがって、本発明は、
（ａ）第１のポリペプチドのレパートリーを提供するステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドを、２つ以上のアミノ酸残基においてポリペプチドと結合する分子足場とコンジュゲートさせて、ポリペプチドコンジュゲートのレパートリーを形成するステップと、
（ｃ）レパートリーを還元剤で任意選択的に処理するステップと、
（ｄ）レパートリーをプロテアーゼ耐性についての選択に供するステップと、
（ｅ）前記レパートリーを、標的に対する結合についてスクリーニングし、標的と結合する第１のレパートリーのメンバーを選択するステップと
を含む、増大したプロテアーゼ耐性を有するペプチドリガンドを選択する方法を提供する。
【０１２２】
プロテアーゼ耐性のスクリーニングは、単純に、プロテアーゼを用いた限定的な消化の形態をとることができる。プロテアーゼに感受性のあるレパートリーのメンバーは排除される。二環式ペプチドを使用する条件下、たとえば血清の存在下で活性のあるプロテアーゼを使用することが最も望ましい。
【０１２３】
［結合の修飾］
足場における結合、または足場とポリペプチドとの間の結合は、ペプチドリガンドの構造を変化させるために、付着後に修飾し得る。たとえば、チオエーテル結合をスルホンに酸化してもよく、これは、結合の立体化学を、したがって足場の付着点に内在されるペプチドループ（複数可）の構造を変更させる。
【０１２４】
より一般に、ヘテロ原子を含有する基は、結合の立体化学を変更させ、したがってさらなるレベルの多様性をペプチドリガンド内に導入するために、酸化または還元し得る。
【０１２５】
（ｖ）合成
対象ポリペプチドを本発明に従って単離または同定した後は、その後の続く合成は、可能な場合はいつでも単純化し得ることに留意されたい。たとえば、対象ポリペプチドの配列を決定してよく、これを標準の技法によって合成的に製造し、次いで分子足場とｉｎ  ｖｉｔｒｏで反応させ得る。これを行う場合、遺伝的にコードされている担体粒子の機能性または完全性を保存する必要はもはやないため、標準的化学を使用し得る。これにより、さらなる下流の実験または妥当性確認のための、可溶性物質の迅速な大規模の調製が可能となる。この点において、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎらに開示されているものなどの慣用の化学を用いて、本発明の方法によって同定された候補またはリードの大規模調製を達成することができる。
【０１２６】
したがって、本発明はまた、以下に記載する、任意のさらなるステップを含む、本明細書中に記載のように選択されたポリペプチドまたはコンジュゲートの製造にも関する。最も適切には、これらのステップは、ファージ上ではなく、化学合成によって作製された最終産物ポリペプチド／コンジュゲート上で実施する。
【０１２７】
任意選択的に、コンジュゲートまたは複合体を製造する際に、たとえば最初の単離／同定ステップの後に、対象ポリペプチド中のアミノ酸残基を置換し得る。
【０１２８】
また、ペプチドを、たとえば別のループを組み込むように延長して、したがって複数の特異性を導入することもできる。ペプチドを延長するためには、標準的な固相または溶液相の化学を用いて、そのＮ末端またはＣ末端を単純に化学的に延長すればよい。標準的な活性化／バイオコンジュゲーションの化学を使用して、活性化可能なＮ末端またはＣ末端を導入し得る。あるいは、付加を、断片の縮合、もしくは、たとえば（Ｄａｗｓｏｎ  ＰＥ、Ｍｕｉｒ  ＴＷ、Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉ、Ｋｅｎｔ，ＳＢＨ．、１９９４．、ネイティブ化学的ライゲーションによるタンパク質の合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６：７７６〜７７９）に記載のネイティブ化学的ライゲーションによって、または、酵素によって、たとえば（サブチリガーゼ：タンパク質の半合成のツール（Ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ：ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｃｈａｎｇ  ＴＫ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＤＹ、Ｂｕｒｎｉｅｒ  ＪＰ、Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、１９９４年１２月２０日、９１（２６）：１２５４４〜８、もしくはＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、プロテオミクスのためにタンパク質のＮ末端をサブチリガーゼで標識するためのタグ（Ｔａｇｓ  ｆｏｒ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｉ  ｗｉｔｈ  ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、第１８巻、第２２号、２００８年１１月１５日、ページ６０００〜６００３、プロテオミクスのためにタンパク質のＮ末端をサブチリガーゼで標識するためのタグ（Ｔａｇｓ  ｆｏｒ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｉ  ｗｉｔｈ  ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、Ｈｉｋａｒｉ  Ａ．Ｉ．Ｙｏｓｈｉｈａｒａ、Ｓａｍｉ  ＭａｈｒｕｓおよびＪａｍｅｓ  Ａ．Ｗｅｌｌｓ）に記載のサブチリガーゼを用いて行い得る。
【０１２９】
あるいは、ペプチドは、ジスルフィド結合を介したさらなるコンジュゲーションによって延長または修飾し得る。これは、第１および第２のペプチドが、細胞の還元環境内に入った後に互いに解離することを可能にするという追加の利点を有する。この場合、分子足場（たとえばＴＢＭＢ）は、３つのシステイン基と反応するように、第１のペプチドの化学合成中に付加することができ、その後、さらなるシステインを、このシステインが第２のペプチドの遊離システインのみと反応するように、第１のペプチドのＮ末端に付加することができる。
【０１３０】
同様の技法が、２つの二環式大環状分子の合成／カップリングに同等に適用される。さらに、他の官能基またはエフェクター基の付加を、同じ様式で、適切な化学を用いて、側鎖を介してＮ末端またはＣ末端でカップリングさせて、達成し得る。適切には、カップリングは、どちらの実体の活性も遮断しないような様式で実施する。
【０１３１】
一態様では、分子足場は、合成された分子中で、構造的に等価である別の足場で置き換え得る。そのような実施形態では、ペプチドリガンドの構造、したがってその特異性は、好ましくは変化しない。
【０１３２】
この手法の利点は、臨床もしくは他の設定において有利であり得るか、またはより安価であり得るが、生物学的選択のコンテキストにおいては企図することができない代替的な化学を導入できることである。たとえば、ファージを使用する場合、化学的操作は、ファージの感染力に影響を与え得るため、束縛を受けやすい。そのような束縛は、ペプチドリガンドを合成する場合は、ファージの感染力はもはや問題ではなくなるため、取り除かれ得る。
【０１３３】
（Ｂ）ペプチドリガンドのレパートリー
（ｉ）ライブラリの構築
選択を目的とするライブラリは、たとえばＷＯ２００４／０７７０６２号に記載の当分野で知られている技法、または本明細書中に記載のファージベクター系を含めた生物系を用いて構築し得る。他のベクター系が当分野で知られており、他のファージ（たとえばファージラムダ）、細菌プラスミド発現ベクター、酵母ベクターを含めた真核細胞に基づく発現ベクターなどが含まれる。
【０１３４】
ＷＯ２００４／０７７０６２号に記載のものなどの非生物系は、慣用の化学的スクリーニング手法に基づく。これらは単純であるが、ペプチドリガンドの大きなライブラリをスクリーニングすることは不可能か、少なくとも非実用的に煩雑であるため、生物系の能力を欠く。しかし、これらは、たとえば、少数のペプチドリガンドのみをスクリーニングする必要がある場合に有用である。しかし、そのような個々のアッセイによるスクリーニングは時間がかかる場合があり、特定の標的との結合について試験することができるユニークな分子の数は、一般に１０６個の化学的実体を超えない。
【０１３５】
対照的に、生物学的なスクリーニングまたは選択方法は、一般に、はるかにより多数の様々な分子のサンプリングを可能にする。したがって、生物学的方法が本発明の用途においてより適切に使用される。生物学的手順では、分子を単一の反応器中でアッセイし、好都合な特性（すなわち結合）を有するものを、不活性の分子から物理的に分離する。１０１３個を超える個々の化合物を同時に作製およびアッセイすることを可能にする選択戦略が利用可能である。強力な親和性選択技法の例は、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイまたはＲＮＡ／ＤＮＡアプタマー方法である。これらの生物学的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択方法は、リガンドレパートリーがＤＮＡまたはＲＮＡによってコードされていることが共通している。これらは、配列決定によって選択されたリガンドの増殖および同定を可能にする。ファージディスプレイ技術は、たとえば、事実上任意の標的に対して非常に高い結合親和性を有する抗体の単離に使用されている。
【０１３６】
生物系を使用する場合は、ベクター系を選択し、対象のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸配列をライブラリベクター内にクローニングした後、発現前に突然変異誘発を行うことによってクローニングした分子内に多様性を発生させ得るか、あるいは、突然変異誘発の前にコードされているタンパク質を発現および選択し、さらなる選択の回を行い得る。
【０１３７】
そのような手法は、本明細書中に記載のペプチドリガンドの親和性成熟に特に示される。たとえば、第１および第２の標的と結合する第１および第２のペプチドリガンドのレパートリーを組み合わせて、生じる第３のレパートリーを、レパートリーをコードしている核酸ライブラリメンバーの突然変異誘発による親和性成熟に供し得る。
【０１３８】
構造的に最適化されたポリペプチドをコードしている核酸配列の突然変異誘発は、標準の分子学的方法によって実施する。特に有用なものは、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわちＰＣＲである（参照することにより本明細書の一部をなすものとするＭｕｌｌｉｓおよびＦａｌｏｏｎａ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５：３３５）。対象の標的配列を増幅するために熱安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される、複数のサイクルのＤＮＡ複製を使用するＰＣＲは、当分野で周知である。様々な抗体ライブラリの構築は、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２、４３３〜５５、およびそれにおいて引用される参考文献中に記述されている。
【０１３９】
ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ（少なくともｌｆｇ、より有用には１〜１０００ｎｇ）および少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行う。プライマーのプールが非常に不均一である場合は、それぞれの配列がプールの分子の小さな画分のみしか表さず、後の増幅サイクルにおいて量が限定されるため、より大量のプライマーを使用することが有利であり得る。典型的な反応混合物には、２μｌのＤＮＡ、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液１（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、０．４μｌの１．２５μＭのｄＮＴＰ、０．１５μｌ（または２．５単位）のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）および２５μｌの合計体積までの脱イオン水が含まれる。１．鉱物油で覆い、プログラム可能なサーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲサイクルのそれぞれのステップの長さおよび温度、ならびにサイクルの回数は、与えられたストリンジェンシー要件に従って調節する。アニーリングの温度および時間は、プライマーが鋳型とアニーリングすると予測される効率および許容されるミスマッチの程度の両方によって決定される。明らかに、核酸分子を同時に増幅および突然変異誘発させる場合、ミスマッチは少なくとも第１回目の合成において必要である。プライマーのアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化する能力は、当業者の知識の範囲内に十分ある。３０℃〜７２℃のアニーリング温度を使用する。鋳型分子の初期変性は通常９２℃〜９９℃で４分間起こり、次いで、変性（９４〜９９Ｃで１５秒間〜１分間）、アニーリング（温度は上述のように決定、１〜２分間）、および伸長（７２℃で１〜５分間、増幅産物の長さに依存する）からなる２０〜４０回のサイクルを行う。最終伸長は一般に４分間、７２℃であり、次いで４℃での無期限（０〜２４時間）のステップであり得る。
【０１４０】
あるいは、本発明によるポリペプチドの短い鎖長を考慮すると、変異体を好ましくは新規合成し、適切な発現ベクター内に挿入する。ペプチド合成は、上述のように当分野で知られている標準の技法によって実施することができる。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ４３３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）などの自動ペプチド合成機が広く利用可能である。
【０１４１】
（ｉｉ）遺伝的にコードされている多様性
対象のポリペプチドは、適切には遺伝的にコードされている。これは、増強された多様性と共に取扱いの容易性の利点を提供する。遺伝的にコードされているポリペプチドライブラリの一例はｍＲＮＡディスプレイライブラリである。別の例は、ファージディスプレイライブラリなどの複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージ（ｒｇｄｐ）ライブラリである。適切には、対象のポリペプチドは、ファージディスプレイライブラリとして遺伝的にコードされている。
【０１４２】
したがって、適切には、本発明の複合体は、ファージ粒子などの複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージ（ｒｇｄｐ）を含む。これらの実施形態では、適切には、核酸はファージゲノムによって含まれる。これらの実施形態では、適切には、ポリペプチドはファージのコートによって含まれる。
【０１４３】
一部の実施形態では、本発明を使用して、いくつかの核酸を対応するポリペプチドへと翻訳し、前記分子足場の分子を前記ポリペプチドと連結させることによって作製される、遺伝的にコードされているポリペプチドのコンビナトリアルライブラリを生成し得る。
【０１４４】
遺伝的にコードされているポリペプチドのコンビナトリアルライブラリは、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイによって作製し得る。
【０１４５】
適切には、遺伝的にコードされているポリペプチドのコンビナトリアルライブラリは、ファージディスプレイによって作製する。ファージディスプレイの実施形態では、適切には、ポリペプチドを、以下に記述するものなどの確立されている技法に従って、ファージ上にディスプレイさせる。最も適切には、そのようなディスプレイは、対象の標的ポリペプチドと対象のポリペプチドの外部ディスプレイを可能にする操作した遺伝子との融合によって達成する。適切には、前記操作した遺伝子は、ファージの操作した遺伝子９（ｐ９もしくは遺伝子ＩＸ）、遺伝子８（遺伝子ＶＩＩＩ）、遺伝子７（ｐ７もしくは遺伝子ＶＩＩ）、遺伝子６（ｐ６もしくは遺伝子ＶＩ）または遺伝子３（ｐ３もしくは遺伝子ＩＩＩ）を含む。これらのタンパク質は、ＴＢＭＢなどの分子足場と反応して副産物を生じることができるシステインを、より少ない数しか含有しないまたは含有しないという利点を提供する。ｐ６では、システイン８４をセリンに突然変異させることが有利である。ｐ７およびｐ９中のシステインは埋もれている可能性が最も高く、したがって、必ずしもそれらを突然変異させて除去する必要はない場合がある。ｐ８は、システイン残基を含有しないという利点を提供する。したがって、より適切には、前記操作した遺伝子は、ファージの操作した遺伝子８（遺伝子ＶＩＩＩ）、遺伝子６（遺伝子ＶＩ）または遺伝子３（遺伝子ＩＩＩ）を含む。
【０１４６】
最も適切には、そのようなディスプレイは、対象の標的ポリペプチドと、ドメイン１およびドメイン２中にシステイン残基を欠く、操作した遺伝子３タンパク質との融合によって達成する。この融合は、システインをコードしているコドンを他のアミノ酸（複数可）をコードしているコドン（複数可）に変化させるために、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしている核酸を操作すること、および、ファージ粒子の外側に遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質としてディスプレイされるように、標的ポリペプチドをコードしている核酸配列を遺伝子ＩＩＩコード配列内にインフレームで挿入することなどの、当分野で知られている任意の適切な技法によって達成し得る。
【０１４７】
生じる操作した遺伝子（複数可）は、ファージを感染性のままにする、すなわち感染および増殖が可能なままにすることが、本発明の一つの利点である。操作した遺伝子が遺伝子３以外の遺伝子（遺伝子６または遺伝子８など）である場合でも、遺伝子３を操作して、システイン残基（複数可）のうちの１つ以上（すべてのシステイン残基など）を除去することが望ましい場合がある。
【０１４８】
好ましい実施形態では、本発明の遺伝的にコードされているポリペプチドは、核酸を翻訳し、生じたポリペプチドを前記コードに連結させることによって作製する。表現型と遺伝子型との連結により、コードされているリガンドレパートリーの増殖またはデコードが可能となる。ポリペプチドをそのポリヌクレオチドのコードと連結させるための様々な技法が利用可能である。技法には、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、酵母ディスプレイおよび細菌ディスプレイなどが含まれる。１０１３個までの個々のメンバーを含む、コードされているポリペプチドレパートリーが、前記方法で作製されている。本発明に従って作製することができる個々のリガンドの数は、慣用のスクリーニングにおいて一般にアッセイされる個々の分子の数を明らかに上回る。
【０１４９】
好ましい実施形態では、ファージディスプレイ技術を用いて、本発明のポリペプチドを遺伝的にコードする。ファージディスプレイとは、ポリペプチドの遺伝子をファージコートタンパク質の遺伝子と融合させる方法である。ファージを細菌細胞中で産生させる場合、ポリペプチドはコートタンパク質の融合体として発現される。ファージ粒子のアセンブリの際、ポリペプチドがファージの表面上にディスプレイされる。ファージレパートリーを固定した抗原と接触させることによって、一部のファージは抗原に結合したまま残される一方で、他のものは洗浄によって除去される。ファージを溶出させ、増殖させることができる。選択されたファージのポリペプチドをコードしているＤＮＡを配列決定することができる。ファージディスプレイを使用して、１０１０個を超えるの個々のポリペプチドをコードすることができる。ファージディスプレイの好都合な一態様は、遺伝暗号である一本鎖ＤＮＡがコート中にパッケージされることである。コートはＤＮＡを分子コアとの反応から保護し得る。
【０１５０】
別の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドライブラリは、遺伝子３タンパク質融合体としてファージ上にディスプレイされる。それぞれのファージ粒子は、約３〜５個のコピーの前記ファージコートタンパク質を有する。未修飾のポリペプチドの複数のコピーがディスプレイされる結果、マイクロモラーの親和性を有するリガンド（弱い結合剤）もファージ選択において単離することができる。あるいは、結合力効果を回避し、より高い親和性を有するリガンドを選択するために、ファージミドを使用してファージ１個あたりのポリペプチドの数を低下させる。
【０１５１】
別の好ましい実施形態では、修飾されたコートタンパク質を有するファージを使用して、本発明のポリペプチドライブラリをコードする。詳細には、コートタンパク質中に特定の種類のアミノ酸を欠くまたはその数が低下しているファージを使用する。分子コアが前記特定の種類のアミノ酸に対して反応性である場合に、前記コートタンパク質の使用が有利な場合がある。このことは、分子コアを架橋結合するためのディスプレイされたポリペプチドの反応基が天然アミノ酸であり、同じ種類の天然アミノ酸がファージのコート中の表面に曝露された領域で存在する場合に、明白にそうである。修飾されたコートタンパク質を有する前記ファージの使用は、複数のファージのアミノ酸と同じ分子コアとの反応によって、ファージ粒子の架橋結合を防止することができる。さらに、前記ファージを使用することで、ポリペプチド中の反応基のアミノ酸側鎖の架橋結合およびファージコートタンパク質と同じ分子コアとの架橋結合をどちらも低下させることができる。
【０１５２】
さらに別の好ましい実施形態では、ドメイン１およびドメイン２中のジスルフィド橋Ｃ７−Ｃ３６、Ｃ４６−Ｃ５３、Ｃ１８８−Ｃ２０１のシステイン残基を欠く遺伝子３タンパク質を有するファージを使用して、本発明のポリペプチドライブラリをディスプレイさせる。前記位置（Ｃ７Ｃ、Ｃ３６Ｉ、Ｃ４６Ｉ、Ｃ５３Ｖ、Ｃ１８８Ｖ、Ｃ２０１Ａ）中に突然変異を有し、低下した熱安定性を補償するために遺伝子３タンパク質中に１４個の追加の突然変異（Ｔ１３Ｉ、Ｎ１５Ｇ、Ｒ２９Ｗ、Ｎ３９Ｋ、Ｇ５５Ａ、Ｔ５６Ｉ、Ｉ６０Ｖ、Ｔ１０１Ｉ、Ｑ１２９Ｈ、Ｎ１３８Ｇ、Ｌ１９８Ｐ、Ｆ１９９Ｌ、Ｓ２０７Ｌ、Ｄ２０９Ｙ）を有するファージが、Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｆ．Ｘ．および共同研究者ら（Ｋａｔｈｅｒ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００５）によって作製された。ポリペプチドを分子コアと架橋結合させるための機能的アミノ酸のうちの１つ以上がシステイン残基である場合は、前記副コートタンパク質中にチオール基を有さないファージが適している。ファージコートタンパク質中のシステイン残基を除去することで、それらがポリペプチドと分子足場との間の前記結合反応を干渉することが防止される。
【０１５３】
本発明の用途におけるこの例示的なファージを、以下にさらに詳述する。
【０１５４】
ＦＸ  Ｓｃｈｍｉｄのジスルフィドを含まないファージ（ドメインＤ１−Ｄ２）は、ベクターｆＣＫＣＢＳに由来するｆｄファージを含む（Ｋｒｅｂｂｅｒ，Ｃ．、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）。ベクターｆＣＫＣＢＳは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ：１５６６９−Ｂ２）に由来するｆｄファージベクターに基づく。
【０１５５】
野生型ｆｄファージのｐ３のドメイン１およびドメイン２のアミノ酸配列は、たとえばＰｕｂＭｅｄデータベースにおいて公的に入手可能である。参照を容易にするために、例示的な配列は以下のとおりである。
ＡＥＴＶＥＳＣＬＡＫＰＨＴＥＮＳＦＴＮＶＷＫＤＤＫＴＬＤＲＹＡＮＹＥＧＣＬＷＮＡＴＧＶＶＶＣＴＧＤＥＴＱＣＹＧＴＷＶＰＩＧＬＡ
ＩＰＥＮＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＴＫＰＰＥＹＧＤＴＰＩＰＧＹＴＹＩＮＰＬＤＧＴＹＰＰＧＴＥＱＮＰＡＮＰＮＰＳＬＥＥＳ
ＱＰＬＮＴＦＭＦＱＮＮＲＦＲＮＲＱＧＡＬＴＶＹＴＧＴＶＴＱＧＴＤＰＶＫＴＹＹＱＹＴＰＶＳＳＫＡＭＹＤＡＹＷＮＧＫＦＲＤＣＡＦ
ＨＳＧＦＮＥＤＰＦＶＣＥＹＱＧＱＳＳＤＬＰＱＰＰＶＮＡＰＳＧ
【０１５６】
ＦＸ  Ｓｃｈｍｉｄおよび共同研究者らは、４個のアミノ酸を突然変異させることによって、このファージのｐ３を進化的に安定化した（Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．およびＳｃｈｍｉｄ，ＦＸ．、２００３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）。連続的な研究において、ＦＸ  Ｓｃｈｍｉｄおよび共同研究者らは、３つのジスルフィド橋を排除するために６個のシステインを突然変異させ、安定性の損失を補償するために追加の突然変異を挿入した（Ｋａｔｈｅｒ，Ｉ．およびＳｃｈｍｉｄ  ＦＸ．、２００５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）。複数の進化的サイクルにおいて、彼らは、すべてジスルフィドを含まない様々な熱安定性を有するｐ３を有する、クローン１９、２０、２１、および２３を作製した。
【０１５７】
突然変異体２１（「クローン２１」）は、記載のように作製するか、または単純にＦＸ  Ｓｃｈｍｉｄおよび共同研究者らから入手することができる。ＦＸ  Ｓｃｈｍｉｄの出版物によれば、このクローンは、ドメイン１およびドメイン２中に、Ｃ７Ｓ、Ｔ１３Ｉ、Ｎ１５Ｇ、Ｒ２９Ｗ、Ｃ３６Ｉ、Ｎ３９Ｋ、Ｃ４６Ｉ、Ｃ５３Ｖ、Ｇ５５Ａ、Ｔ１０１Ｉ、Ｑ１２９Ｈ、Ｃ１８８Ｖ、Ｆ１９９Ｌ、Ｃ２０１Ａ、Ｄ２０９Ｙの突然変異を含有する。さらに、本発明者らは、クローンを配列決定し、その野生型ｆｄファージと比較した場合に、ドメイン１およびドメイン２中にＰ１１ＳおよびＰ１９８Ｌの突然変異を発見した。理論に束縛することを望まずに、これらの突然変異は、ベクターｆＣＫＣＢＳのファージ中に既に存在していたと推定された。
【０１５８】
クローン２１のドメインＤ１およびＤ２は以下のアミノ酸配列を有する。
ＡＥＴＶＥＳＳＬＡＫＳＨＩＥＧＳＦＴＮＶＷＫＤＤＫＴＬＤＷＹＡＮＹＥＧＩＬＷＫＡＴＧＶＶＶＩＴＧＤＥＴＱＶＹＡＴＷＶＰＩＧＬＡ
ＩＰＥＮＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＴＫＰＰＥＹＧＤＴＰＩＰＧＹＩＹＩＮＰＬＤＧＴＹＰＰＧＴＥＱＮＰＡＮＰＮＰＳＬＥＥＳ
ＨＰＬＮＴＦＭＦＱＮＮＲＦＲＮＲＱＧＡＬＴＶＹＴＧＴＶＴＱＧＴＤＰＶＫＴＹＹＱＹＴＰＶＳＳＫＡＭＹＤＡＹＷＮＧＫＦＲＤＶＡＦ
ＨＳＧＦＮＥＤＬＬＶＡＥＹＱＧＱＳＳＹＬＰＱＰＰＶＮＡＰＳＧ
【０１５９】
一実施形態では、スクリーニングは、本発明のライブラリを標的と接触させ、前記標的と結合する１つ以上のライブラリメンバー（複数可）を単離することによって行い得る。
【０１６０】
別の実施形態では、前記ライブラリの個々のメンバーをスクリーニングにおいて標的と接触させ、前記標的と結合する前記ライブラリのメンバーを同定する。
【０１６１】
別の実施形態では、前記ライブラリのメンバーを標的と同時に接触させ、前記標的と結合する前記ライブラリのメンバーを選択する。
【０１６２】
標的は、ペプチド、タンパク質、多糖、脂質、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０１６３】
標的は、受容体、受容体リガンド、酵素、ホルモンまたはサイトカインであり得る。
【０１６４】
標的リガンドは、原核生物タンパク質、真核生物タンパク質、または古細菌タンパク質であり得る。より詳細には、標的リガンドは、哺乳動物タンパク質もしくは昆虫タンパク質または細菌タンパク質もしくは真菌タンパク質もしくはウイルスタンパク質であり得る。
【０１６５】
標的リガンドは、プロテアーゼなどの酵素であり得る。
【０１６６】
また、本発明には本発明によるスクリーニングから単離したライブラリメンバー（複数可）も包含されることに留意されたい。適切には、本発明のスクリーニング方法（複数可）は、前記標的と結合することができるものとして単離された、一定量の本発明の複合体を製造するステップをさらに含む。
【０１６７】
本発明はまた、本発明によるスクリーニングによって単離される、または単離されることができるライブラリメンバーに関し、続いて、前記メンバーは、本発明の複合体の一部である場合は、前記ポリペプチドをコードしていた核酸をさらに使用せずに作製／製造される。たとえば、本発明の方法は、分子足場をポリペプチドに付着させることによって、本発明の方法によって単離または同定された一定量のポリペプチドを製造する追加のステップを適切にさらに含み、前記ポリペプチドは、組換えによって発現するまたは化学合成する。たとえば、ポリペプチドが本実施形態において組換えによって合成される場合、本発明の複合体の一部としてそれを元々コードしている核酸は、もはや直接存在しない場合があり、中間ステップ、たとえば、複合体の元の核酸のＰＣＲ増幅またはクローニングにおいて存在する場合があり、これは鋳型核酸をもたらし、それから、この追加のステップにおいてポリペプチドが合成され得る。
【０１６８】
ポリペプチドリガンドは、１個、２個、または２個より多くのループを有し得る。たとえば、本発明による分子足場に結合した二環式ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端を結合させることによって、分子足場に結合した三環ポリペプチドを作製することができる。この様式で、結合したＮ末端およびＣ末端が第３のループを作り、三環ポリペプチドが作製される。本実施形態は、適切にはファージ上では実施せず、適切には本発明のポリペプチド−分子足場のコンジュゲート上で実施する。Ｎ末端およびＣ末端の結合は、ルーチン的なペプチド化学の事項である。指導が必要な場合は、Ｃ末端を活性化し得る、および／またはたとえばそれぞれの末端にシステインを付加するためにＮ末端およびＣ末端を延長させ、その後、ジスルフィド結合によってそれらを結合させ得る。あるいは、結合は、Ｎ／Ｃ末端内に組み込ませたリンカー領域の使用によって達成し得る。あるいは、Ｎ末端およびＣ末端は、慣用のペプチド結合によって結合させ得る。あるいは、Ｎ末端およびＣ末端を結合させる任意の他の適切な手段を用いてもよく、たとえば、Ｎ−Ｃ環化は、たとえばＬｉｎｄｅら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、９０、６７１〜６８２（２００８）「主鎖の環化およびメラノコルチンペプチドのＮ−メチル化の、構造−活性の関係性および代謝安定性の研究（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、またはＨｅｓｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、５１、１０２６〜１０３４（２００８）「新規の経口投与薬としての主鎖環状ペプチド模倣体メラノコルチン−４受容体作用剤は、肥満の処置をもたらした（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ−４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｏｒａｌｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｄｒｕｇ  ｌｅａｄ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｏｂｅｓｉｔｙ）」に開示されているように、標準の技法によって行うことができる。そのような三環分子の一つの利点は、特にエクソプロテアーゼ作用による、遊離末端のタンパク質分解の回避である。この性質の三環ポリペプチドの別の利点は、ＨＳＡ結合、細胞進入もしくは輸送効果、タグ付けまたは任意の他のそのような使用などの、一般に適用可能な機能のために第３のループを利用し得ることである。この第３のループは典型的には選択に利用可能でなく（ファージ上ではなく、ポリペプチド−分子足場のコンジュゲート上でのみ生成されるため）、したがって、他のそのような生物学的機能におけるその使用は、特異性を選択／作製するためにループ１およびループ２をどちらも有利に残すことに留意されたい。したがって、本発明はまた、そのような三環ポリペプチドならびにその製造および使用にも関する。
【０１６９】
本発明は、遺伝的にコードされている化合物ライブラリを標的リガンドと接触させる方法および前記標的リガンドと結合するリガンドを同定する方法をさらに提供する。遺伝的にコードされている化合物ライブラリは、スクリーニング手順または選択手順のどちらかによってアッセイする。
【０１７０】
スクリーニング手順では、ライブラリの個々のメンバーをアッセイする。ライブラリの個々のメンバーの複数のコピーを、たとえば標的リガンドと共にインキュベーションする。標的リガンドは、ライブラリのメンバーを接触させる前または後に固定し、結合していないメンバーは洗浄によって除去される。結合したリガンドは、たとえば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において検出する。標的リガンドと結合するライブラリのメンバーのアミノ酸配列は、遺伝暗号の配列決定によって決定される。
【０１７１】
選択手順では、コードされている化合物ライブラリの複数のメンバーを１つ以上の標的と接触させる。標的は、ライブラリのメンバーを接触させる前または後に固定し、結合していないメンバーは洗浄によって除去される。結合したリガンドの遺伝暗号を配列決定する。あるいは、選択されたリガンドを増殖させて、さらなる選択の回を行う。
【０１７２】
本発明の一実施形態では、化合物ライブラリはファージディスプレイによってコードされており、選択はファージのパンニングによって行う。
【０１７３】
（ｉｉｉ）ファージの精製
ファージを精製するための任意の適切な手段を使用し得る。標準の技法を本発明において適用し得る。たとえば、ファージは、濾過またはＰＥＧ沈殿などの沈殿によって精製し得る。ファージ粒子は、以前に記載のようにポリエチレン−グリコール（ＰＥＧ）沈殿によって生成および精製し得る。
【０１７４】
さらなる指導が必要な場合は、Ｊｅｓｐｅｒｓら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２００４、１７（１０）：７０９〜７１３．、化学合成抗体ライブラリからの光バイオセンサーの選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｃｈｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ））を参照されたい。適切には、その中に教示されているようにファージを精製し得る。この出版物の本文は、ファージ精製の方法について、参照することにより具体的に本明細書の一部をなすものとする。詳細には、Ｊｅｓｐｅｒｓらのページ７０９の右段の途中から始まる材料および方法の段落を参照されたい。
【０１７５】
さらに、ファージの生成／精製をどのように実施するかの具体的な説明について参照することにより具体的に本明細書の一部をなすものとするＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、第２２２巻、ページ５８１〜５９７によって公開されているように、ファージを精製し得る。
【０１７６】
さらなる指導が必要な場合は、ファージを以下のように還元および精製し得る。約５×１０１２個のファージ粒子を１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）と３０分間、室温で反応させ、その後、ＰＥＧ沈殿させる。水ですすいだ後、ペレットを１ｍｌの反応緩衝液（１０ｍＭのリン酸緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）に再懸濁させる。その後、ファージを、任意選択的に、５０μｌの１．６ｍＭのＮ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤＩＡ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と２時間、室温で反応させるか、またはより適切には、本明細書中に記載の分子足場と反応させる。反応はファージ粒子のＰＥＧ沈殿によって停止させる。
【０１７７】
ファージを生成／精製し得るさらなる方法は、ＳｃｈｒｅｉｅｒおよびＣｏｒｔｅｓｅ（一本鎖バクテリオファージＭ１３中でクローニングしたＤＮＡの素早くかつ単純な配列決定方法（Ａ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｍ１３．）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ、１２９（１）：１６９〜７２、１９７９）に教示されている。この出版物は、鋳型として一本鎖ＤＮＡを必要とするＳａｎｇｅｒら（１９７７）の連鎖停止ＤＮＡ配列決定手順を扱っている。Ｍ１３ファージＤＮＡは一本鎖として存在し、したがって、Ｍ１３中でクローニングされたすべてのＤＮＡ配列は、この形態で容易に得ることができる。ＳｃｈｒｅｉｅｒおよびＣｏｒｔｅｓｅは、配列決定の鋳型として使用するために十分に純粋であるＭ１３の一本鎖ＤＮＡは、ファージ粒子の単純な遠心分離およびフェノールを用いた抽出によって調製できることを示している。ＳｃｈｒｅｉｅｒおよびＣｏｒｔｅｓｅの出版物は、ファージの精製方法について参照することにより具体的に本明細書の一部をなすものとする。疑わしさを回避するために、フェノール抽出は、核酸精製の目的であるため、本発明による複合体を作製するために行うのではない。したがって、ＳｃｈｒｅｉｅｒおよびＣｏｒｔｅｓｅのフェノールステップは適切に省略される。ＳｃｈｒｅｉｅｒおよびＣｏｒｔｅｓｅの方法は、精製したファージ粒子の時点までのみ従う。
【０１７８】
したがって、ファージの精製には無数の技法が当分野で周知である。本発明のコンテキストでは、そのような精製は、分子足場を結合させるための対象のポリペプチド中の反応基を還元するために使用する還元剤を除去するために、特にそのような結合がシステイン残基を介するものである場合に使用する。
【０１７９】
任意選択的に、以下の反応化学のセクションに記述するように、ファージ精製の特に有利な技法を採用し得る。これらの技法は本発明に必須であるとみなされず、本発明のファージ粒子を作製するための特に役立つ方法、またはさらには最良の形態を表し得ることに明確に注意されたい。しかし、分子足場の付着前の還元剤の除去の段階でファージ上の還元された官能基／反応基の再酸化を回避することに注意を払うという条件で、原理上は任意の技法を用いてこれを達成し得る。記載した濾過技法が特に有効であるが、標準の技法よりも複雑であるため、操作員は、本発明のその特定の作業に最も適した技法を選択するであろう。最も適切には、濾過技法を用いる。
【０１８０】
（ｉｖ）反応化学
ポリペプチドを修飾するための従来技術の技術は、厳しい化学および独立したポリペプチド修飾反応を含んでいた。対照的に、本発明は、生成物の遺伝的にコードされている要素の機能および完全性を有利に保持する、ポリペプチドの修飾の化学条件を活用する。具体的には、遺伝的にコードされている要素が、それをコードしているファージの表面上にディスプレイされるポリペプチドである場合、化学は、有利には、ファージの生物学的完全性を損なわせない。これらの化学反応を増強または促進させることができる条件が非常に狭いことが、本明細書中に開示されている。詳細には、以下にさらに詳述するように、使用する溶媒および温度が効率的な反応に重要である。さらに、使用する試薬の濃度も、正しい結合を促進する一方で、修飾する架橋結合を寛解もしくは排除するまたはポリペプチド部分を損傷するために有益である。
【０１８１】
詳細には、標的ポリペプチド中のシステインの還元が最も効率的な反応に必要であることが開示されている。明らかに、所望の付着を行うために、これらのシステインを化学的に還元させるために使用した還元剤は除去しなければならない。１つの知られている技法は、システインの還元にはジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を使用し、還元剤の除去には、沈殿反応においてファージ粒子の粒子を沈殿させることである。そのような沈殿反応は、典型的には、２０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を２．５モラーのＮａＣｌと共に含み、これはファージ粒子の沈殿をもたらす。しかし、再酸化を回避することが重要である。以下にさらに詳細に開示するように、解決策は、脱気した緩衝液の使用、反応混合物中でのキレート剤の使用、および粒子を抽出するための濾過の使用、またはＴＢＭＢの存在下での低濃度のＴＣＥＰの使用を含めた、様々な戦略中で見つかる。
【０１８２】
たとえば分子足場を標的ポリペプチドに付着させるための反応条件は、注意深く選択するべきである。条件の選択は、本発明を行う用途に応じて変動し得る。標的ポリペプチドがファージ粒子によって含まれる場合は特に注意が必要である。指導は明細書および実施例のセクションの全体にわたって提供されている。
【０１８３】
反応温度、分子足場の濃度、溶媒および／またはｐＨなどの反応条件は、標的ポリペプチドの反応基と分子足場との効率的な反応を可能にするが、ポリペプチドをコードしている核酸を、単離した分子のデコード（たとえば配列への）および／または増殖（たとえば、ＰＣＲもしくはファージ増殖または任意の他の適切な技法による）を可能にする状態のままにするように、選択するべきである。さらに、反応条件は、ファージコートタンパク質を、それがファージの増殖を可能にする状態のままにするべきである。
【０１８４】
ファージにコードされているポリペプチドのチオール基は、分子足場の付着の前に還元剤を用いて還元し得る。そのような実施形態、特にはファージディスプレイの実施形態、または特にＴＣＥＰが還元剤である場合には、過剰量の還元剤は、濾過、たとえばファージの濾過によって適切に除去する。これは、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿などの還元剤を除去するための慣用技術は、恐らくは標的ポリペプチドの還元された機能的側基の再酸化が原因で場合によっては分子足場の最適未満の反応をもたらす可能性があることを本出願人らが初めて開示するため、特に有利である。したがって、標的ポリペプチドが還元、次いで濾過による精製（還元剤の除去）によって調製される実施形態では、ポリペプチドの還元された（したがって反応性の）反応基の優れた保存がアーカイブされることが一つの利点である。
【０１８５】
本発明では、一方ではコードされているポリペプチドを分子足場に効率的に連結させ、他方では付属した核酸（およびファージコートタンパク質）を、その増殖またはデコードが可能となる状態に残す反応条件を適用する。前記反応条件は、たとえば、反応温度、分子足場の濃度、溶媒の組成またはｐＨである。
【０１８６】
本発明の一実施形態では、システイン残基のチオール基を、ポリペプチドを分子コアに連結させるための反応基として使用する。一部の化学反応では、ポリペプチドのチオール基を還元する必要がある。ファージディスプレイされたポリペプチド中のチオール基は、たとえばトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤の添加によって効率的に還元される。過剰量の還元剤は付着反応と干渉する可能性があるため、ファージの濾過またはＰＥＧ沈殿によって大部分が除去されるが、低濃度（１０マイクロモラー以下）が付着反応中の還元状態を維持するために望ましい場合がある。
【０１８７】
ＴＣＥＰの除去後のチオール基の再酸化は、反応緩衝液の脱気によって適切に防止される。
【０１８８】
また、チオール基の再酸化は、キレート化、たとえばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）とのキレート化による金属イオンの錯体形成によっても適切に防止される。
【０１８９】
最も適切には、チオール基の再酸化は、キレート化および脱気した緩衝液の使用の両方によって防止または阻害される。
【０１９０】
本発明の一実施形態では、ポリペプチドの分子足場への付着は、ファージにコードされているポリペプチドのチオール基などのポリペプチドの反応基を分子足場と共に１時間反応させることによって達成する。
【０１９１】
適切には、これらは３０℃で反応させる。
【０１９２】
適切には、これらは１０μＭの濃度の分子足場（トリス（ブロモメチル）ベンゼンなど）と反応させる。
【０１９３】
適切には、反応は水性緩衝液中である。
【０１９４】
適切には、反応はｐＨ８である。
【０１９５】
適切には、反応緩衝液はアセトニトリルを含有する。適切には、反応緩衝液は２０％のアセトニトリルを含有する。
【０１９６】
最も適切には、反応は、上記条件のうちの２つ以上を特長とする。適切には、反応は、上記条件のうちの３つ以上を特長とする。適切には、反応は、上記条件のうちの４つ以上を特長とする。適切には、反応は、上記条件のうちの５つ以上を特長とする。適切には、反応は、上記条件のうちの６つ以上を特長とする。適切には、反応は、上記条件のそれぞれを特長とする。
【０１９７】
これらの反応条件は、ポリペプチドのチオール基をトリス（ブロモメチル）ベンゼンの反応基と定量的に反応させるために最適化される。同じ反応条件下では、ファージ粒子の約２０％が、増殖およびデコードのために遺伝暗号を細菌細胞内に持ち込むために感染性に保たれる。
【０１９８】
一実施形態では、ポリペプチドのチオール基を、２０％のアセトニトリルを含有する水性緩衝液、ｐＨ８中に１０μＭの濃度のＴＢＭＢ（すなわちトリス（ブロモメチル）ベンゼン）と共に１時間、３０℃で反応（インキュベーション）させることによって、ＴＢＭＢなどの分子足場を、ファージにコードされているポリペプチドなどの標的ポリペプチドに付着させ得る。
【０１９９】
また、本発明者らは、ファージの感染力に対する反応中の分子足場の濃度の効果も開示する。詳細には、本発明は、反応中で使用する分子足場の濃度を適切に最小限にする。言い換えれば、常に十分な分子足場がファージポリペプチドと結合される限りは、ファージのポリペプチドとの反応の時点で使用する分子足場の濃度は低ければ低いほど良い。この様式で存在する分子足場を最小限にすることの利点は、分子足場のカップリング後のファージの感染力の優れた保存である。たとえば、分子足場がＴＢＭＢである場合、１００μＭより高い分子足場の濃度は感染力を損なわせる場合がある。したがって、適切には、分子足場がＴＢＭＢである場合、適切には、ポリペプチドとの結合の時点で存在するＴＢＭＢの濃度は１００μＭ未満である。
【０２００】
（Ｃ）本発明によるペプチドリガンドの使用
本発明の方法に従って選択されたペプチドリガンドは、ｉｎ  ｖｉｖｏの治療的および予防的な用途、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの診断的な用途、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイおよび試薬の用途などに用い得る。
【０２０１】
一般に、ペプチドリガンドの使用は抗体の使用の代わりになることができる。本発明に従って選択されたリガンドは、ウエスタン分析および標準の免疫組織化学的手順によるｉｎ  ｓｉｔｕタンパク質検出において診断的に有益である。これらの用途における使用では、選択されたレパートリーのリガンドを当分野で知られている技法に従って標識し得る。さらに、そのようなポリペプチドリガンドは、樹脂などのクロマトグラフィー支持体と複合体を形成している場合に、アフィニティークロマトグラフィー手順において調製的に使用し得る。すべてのそのような技法は当業者に周知である。本発明によるペプチドリガンドは、抗体と同様の結合能力を保有しており、そのようなアッセイにおいて抗体の代わりになり得る。
【０２０２】
診断的使用には、試験紙アッセイ、実験室アッセイおよび免疫診断的アッセイを含めた、抗体が通常置かれる任意の使用が含まれる。
【０２０３】
本発明に従って調製したペプチドリガンドの治療的および予防的な使用は、本発明に従って選択されたリガンドをヒトなどのレシピエント哺乳動物に投与することを含む。少なくとも９０〜９５％の均一性の実質的に純粋なペプチドリガンドが哺乳動物への投与に好ましく、９８〜９９％またはそれより高い均一性が、特に哺乳動物がヒトである場合に製薬的な使用に最も好ましい。所望に応じて部分的にまたは均一まで精製した後、選択されたポリペプチドを、診断もしくは治療（体外が含まれる）において、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などの展開および実行において使用し得る（ＬｅｆｋｏｖｉｔｅおよびＰｅｒｎｉｓ、（１９７９および１９８１）免疫学的方法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第ＩおよびＩＩ巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）。
【０２０４】
本発明のペプチドリガンドは、典型的には、炎症性状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス感染症、および自己免疫障害（それだけには限定されないが、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無力症が含まれる）の予防、抑制または処置において使用が見つかる。
【０２０５】
本出願では、用語「予防」は、疾患の誘導前に保護的組成物を投与することを含む。「抑制」とは、誘導事象の後であるが、疾患の臨床的所見の前に組成物を投与することをいう。「処置」とは、疾患の症状が顕性となった後に保護的組成物を投与することを含む。
【０２０６】
疾患に対する保護、またはその処置におけるペプチドリガンドの有効性をスクリーニングするために使用できる動物モデル系が利用可能である。
【０２０７】
感受性マウスにおいて全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を試験する方法は当分野で知られている（Ｋｎｉｇｈｔら（１９７８）Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１４７：１６５３、Ｒｅｉｎｅｒｓｔｅｎら（１９７８）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ：Ｍｅｄ．、２９９：５１５）。重症筋無力症（ＭＧ）は、ＳＪＬ／Ｊ雌マウスにおいて、別の種からの可溶性ＡｃｈＲ  タンパク質を用いて疾患を誘導することによって試験する（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｎｚｎ７ｕｎｏｌ．、４２：２３３）。関節炎は、マウスの感受性株においてＩＩ型コラーゲンを注射することによって誘導する（Ｓｔｕａｒｔら（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４２：２３３）。感受性ラットにおいてマイコバクテリア熱ショックタンパク質を注射することによってアジュバント関節炎を誘導するモデルが記載されている（Ｖａｎ  Ｅｄｅｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ、３３１：１７１）。甲状腺炎は、マウスにおいて記載のようにサイログロブリンを投与することによって誘導する（Ｍａｒｏｎら（１９８０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５２：１１１５）。インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、Ｋａｎａｓａｗａら（１９８４）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、２７：１１３によって記載されているものなどの特定のマウス株において自然に発生するか、または誘導することができる。マウスおよびラットにおけるＥＡＥは、ヒトにおけるＭＳのモデルとして役割を果たす。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク質を投与することによって脱髄性疾患が誘導される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９８６）免疫病理学の教科書（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、Ｍｉｓｃｈｅｒら編、ＧｒｕｎｅおよびＳｔｒａｔｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ページ１７９〜２１３、ＭｃＦａｒｌｉｎら（１９７３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、１７９：４７８、ならびにＳａｔｏｈら（１９８７）Ｊ；Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８：１７９を参照）。
【０２０８】
一般に、本発明のペプチドリガンドは、精製された形態で、薬理学的に適切な担体と共に利用される。典型的には、これらの担体には、生理食塩水および／または緩衝媒体を含めた、任意の水性またはアルコール／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸加リンゲルが含まれる。ポリペプチド複合体を懸濁液に保つために必要な場合は、適切な生理的に許容されるアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートなどのシックナーから選択し得る。
【０２０９】
静脈内ビヒクルには、リンゲルデキストロースに基づくものなどの、体液および栄養素補充液ならびに電解質補充液が含まれる。また、抗微生物、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなどの保存料および他の添加剤も存在し得る（Ｍａｃｋ（１９８２）レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１６版）。
【０２１０】
本発明のポリペプチドリガンドは、別々に投与する組成物として、または他の薬剤と併せて使用し得る。これらには、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチン、および免疫毒素などの、抗体、抗体断片および様々な免疫治療薬が含まれる場合がある。医薬組成物には、様々な細胞毒性がある薬剤または他の薬剤と、本発明の選択された抗体、その受容体もしくは結合タンパク質、またはさらには様々な標的リガンドを用いて選択されたポリペプチドなどの様々な特異性を有する本発明による選択されたポリペプチドの組合せとを併せた「カクテル」が含まれる場合があり、これらを投与前にプールするかどうかに拘らない。
【０２１１】
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られているもののうちの任意のものであり得る。それだけには限定されないが免疫療法を含めた治療には、本発明の選択された抗体、その受容体または結合タンパク質は、標準の技法に従って任意の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺の経路、また、適切には、カテーテルを用いた直接輸液によるものを含めた、任意の適切な様式であることができる。用量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、禁忌ならびに臨床家が考慮すべき他のパラメータに依存する。
【０２１２】
本発明のポリペプチドリガンドは、貯蔵用に凍結乾燥し、使用前に適切な担体で再構成することができる。この技法は有効であることが示されており、当分野で知られている凍結乾燥および再構成の技法を用いることができる。当業者には、凍結乾燥および再構成は様々な程度の活性の損失をもたらす場合があり、補償するために使用レベルを上方調節する必要があり得ることが理解されよう。
【０２１３】
本発明のポリペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的な処置のために投与することができる。特定の治療的の用途では、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅、または何らかの他の測定可能なパラメータを達成するために十分な量は、「治療上有効な用量」として定義される。この用量を達成するために必要な量は、疾患の重篤度および患者自身の免疫系の一般的状態に依存するが、一般に体重１キログラムあたり０．００５〜５．０ｍｇの選択されたペプチドリガンドの範囲であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に使用される。予防的な用途では、本発明のポリペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物を、同様またはわずかに低い用量で投与してもよい。
【０２１４】
本発明によるポリペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的細胞集団の変更、不活性化、死滅または除去を支援するために、予防的および治療的な設定で利用し得る。さらに、本明細書中に記載のポリペプチドの選択されたレパートリーは、不均一な細胞のコレクションから標的細胞集団を死滅、枯渇または他の様式で有効に除去するために、体外またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択的に使用し得る。哺乳動物からの血液を体外で選択されたペプチドリガンドと合わせ、これにより所望しない細胞を死滅させるか、または他の様式で血液から除去して、標準の技法に従って哺乳動物に戻し得る。
【０２１５】
［実施例］
以下の実施例では、本発明者らは第１のペプチドリガンドのレパートリーの個々のメンバーの変更を記載し、同様の方法を使用してレパートリー全体の変更を行うすることができる。一部の例では、両方のレパートリーを作製するために同様の化学およびライブラリ様式を使用することが可能であり得る。したがって、システイン残基を介してトリスブロモメチルベンゼンとコンジュゲートした第１のペプチドリガンドのレパートリーを、本発明に従って変更して、同様の条件下でトリスブロモメチルメシチレンとコンジュゲートした同じペプチドの第２のレパートリーを得ることができる。さらに、化学および反応の条件はファージディスプレイに適しているため、第１および第２のレパートリーをどちらもファージ上でディスプレイおよび選択することができる。
【０２１６】
しかし、他の足場、たとえば足場のヨードアセチル部分またはアクリロイル部分を介して反応するものとのコンジュゲーションによって行った変更は、合成ペプチドの作製には同様であるが、ファージディスプレイには適切でない可能性があり、その場合は、異なるライブラリ様式を使用することが必要である。より広い範囲の化学およびより極端な反応条件を許容する一様式は、合成ペプチドアレイである。参考には、たとえばＭｉｎおよびＭｒｋｓｉｃｈ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第８巻、第５号、２００４年１０月、ページ５５４〜５５８を参照されたい。好都合にアレイすることができるペプチドの数は、ファージディスプレイによって選択することができる数百万個または数十億個ではなく、数百個または数千個であるため、この様式は、必要な選択要因（したがってライブラリのサイズ）が大きくない場合に特に好都合である。したがって、これは、リードペプチドの特性の洗練、たとえば、プロテアーゼに対する耐性または標的に対する結合親和性の改善に適している。
【０２１７】
また、合成ペプチドアレイは、複数の足場種と反応させるためにも非常に適切な様式であり、このようにして、同じペプチド組を様々な足場種で用いて、第２のレパートリーの構造的多様性を増大させることができる。また、合成ペプチドの使用は、ペプチドの反応基を通常は生物学的ペプチド合成中に組み込まれないものへと変更するため、たとえばシステインをホモシステインに変更するためにも、非常に適している。
【０２１８】
ファージディスプレイを第１および第２のレパートリーの両方の作製に使用できる場合は、第２のレパートリーを作製するために必要な変更を行うために第１のレパートリーのそれぞれのメンバーの配列を決定することは必要ない（または好都合でない）。しかし、ファージディスプレイに第１のレパートリーを使用し、合成ペプチドアレイを第２のレパートリーに使用する場合は、第２のレパートリーのものを指定するために、第１のレパートリーのポリペプチド配列を決定する必要がある。この場合、ディスプレイされたペプチドコンジュゲートのそれぞれの領域をコードしているファージ核酸を容易に配列決定することができる。
【０２１９】
本発明を、以下の実施例を参照してさらに記載する。
【実施例１】
【０２２０】
＜ＭＤＭ２に対するプロテアーゼ耐性二環式ペプチド＞
ＭＤＭ２とは、腫瘍抑制因子であるｐ５３のトランス活性化ドメインを認識し、プロテアソームによるｐ５３のユビキチン化および分解をもたらす酵素（Ｅ３ユビキチンリガーゼ）である。ｐ５３−ＭＤＭ２の相互作用のｎｕｔｌｉｎ阻害剤はｐ５３経路のｉｎ  ｖｉｖｏ活性化をもたらす場合があり、そのような薬剤が抗癌剤としての潜在性を有し得ることが示唆されている。本明細書では、本発明者らは標的「抗原」であるＭＤＭ２に対する２つの二環式ペプチド（ＰＥＰ１０およびＰＥＰ４８）の選択を記載する。それぞれの合成ペプチドの親和性は２５０〜７５０ｎＭの範囲であった。
【０２２１】
プロトコルは、別段に指定しない限りは、以前にＨｅｉｎｉｓら、２００９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５、５０２〜５０７に記載されているものに一般的に従った。Ｈｅｉｎｉｓらの研究では、どちらの標的、すなわちカリクレインおよびカテプシンＧもプロテアーゼであり、カリクレイン阻害剤にはカリクレイン切断部位が含まれるが、カリクレインによるタンパク質分解に対して比較的耐性である。ＭＤＭ２はプロテアーゼではなく、したがって、選択されたペプチドもプロテアーゼに対して耐性であるかどうかは明白でなかった。このため、および他の理由のために（詳細には以下を参照）、本発明者らは、ファージペプチドレパートリーとＴＢＭＢとの反応（還元条件下のものが含まれる）の後およびレパートリーをＭＤＭ２に対して選択した後に、１つ以上のプロテアーゼ（キモトリプシン）ステップを含めた。ファージＥＬＩＳＡによって示されるように、２つの選択されたファージペプチドＰＥＰ１０およびＰＥＰ４８は、タンパク質分解に対して耐性であると見られる。
【０２２２】
［ファージの産生および精製］
少なくとも４×１０９個のクローンの多様性を有するファージペプチドライブラリを調製し、既に記載した方法にわずかな改変を加えて、ＴＢＭＢをコンジュゲートさせた。
１．既に記載したｃｘ６ファージライブラリ（ＴＧ１細胞から調製）を使用して非抑制株ＨＢ２１５１を感染させ（Ｃａｒｔｅｒ、ＢｅｄｏｕｅｌｌｅおよびＷｉｎｔｅｒ．、１９８５．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３：４４３１〜４３）、感染細胞を播種した。細菌をプレートから約８ｍｌの２×ＴＹ培地、３０ｕｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、１０％のグリセロール（ｖ／ｖ）中にかき集めた。
２．約０．８ｍｌのストックを３０ｕｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む８００ｍｌの２×ＴＹ培地に加えて、６００ｎｍで約０．１のＯＤを得た。培養物を３０℃でインキュベーションし、２リットルのフラスコ中、２００ｒｐｍで１６時間振盪した。
３．細胞培養物を４，０００ｒｐｍ（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｅｇａｆｕｇｅ  ２Ｒ）で３０分間、４℃で遠心分離した。上清を２００ｍｌの冷２０％のＰＥＧ、２．５ＭのＮａＣＬに移した。混合物を氷上に１時間静置した。
４．沈殿した上清／ファージ混合物を３０分間、４℃で遠心沈殿させ、上清を廃棄した。
５．ファージを３５ｍｌのＰＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁させ、次いで、１５分間、４０００ｒｐｍ（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｅｇａｆｕｇｅ  ２Ｒ）で遠心して細胞細片を除去した。上清を新しい５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移した。
【０２２３】
［ＴＢＭＢを用いたファージの修飾］
１．５ｍｌの８ｍＭのＴＣＥＰ（Ｈ２Ｏ中）をファージに加えて、最終濃度１ｍＭのＴＣＥＰを得た。チューブを数回逆転させて混合し、１時間、４２℃の水浴でインキュベーションした。
２．ＴＣＥＰを第２のＰＥＧ沈殿によって除去した。１０ｍｌの２０％のＰＥＧ、２．５ＭのＮａＣＬ（脱気した溶液）を加え、混合し、氷上で４５分間インキュベーションし、３０分間、４０００ｒｐｍ、４℃で遠心した。
３．上清を注意深く除去し、ペレットを１２ｍｌのＰＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｕＭのＴＣＥＰ（脱気した緩衝液）に再懸濁させた。
４．３ｍｌのアセトニトリル中に５０ｕＭのＴＢＭＢを１２ｍｌの還元したファージに加えて、１０ｕＭの最終ＴＢＭＢ濃度を得た。チューブを数回逆転させ、３０℃で１時間、水浴中に静置した。ファージを氷上で冷却し、１／５倍体積の２０％のＰＥＧ、２．５ＭのＮａＣＬを用いて３０分間沈殿させた。４０００ｒｐｍ（Ｈｅｒｅａｕｓ  Ｍｅｇａｆｕｇｅ  ２Ｒ）で２０分間遠心することによってファージを回収した。上清を除去し、ファージを４ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。ファージを２ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、１３０００ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆベンチトップ遠心分離）で１０分間遠心した。上清を新しいＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、ファージの感染力を測定した。
【０２２４】
［ファージの選択：一般プロトコル］
（第１回目の選択）
１．上記のように精製および化学的にコンジュゲートさせたファージを、ストレプトアビジンでコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の表面上に固定した、ビオチン標識したＭＤＭ２（ビオ−ＭＤＭ２）ペプチド（残基２〜１２５）に対して選択した。８０μｌのビーズを最初に洗浄し洗浄、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）のＭａｒｖｅｌｌ粉乳（ＰＢＳＭ）で４０分間遮断し、次いで、１００ｎＭのビオ−ＭＤＭ２と共に２０分間、１ｍｌの合計体積中でインキュベーションした。
２．化学修飾したファージ（１０１０〜１０１１ＴＵ）をＰＢＳＭと共に４０分間インキュベーションした。
３．ステップ１からの遮断したＡｇでコーティングされたビーズを、過剰量のＡｇからＰＢＳ中の０．１％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）を用いて洗浄し、遮断したファージと共に３０分間、１ｍｌの合計体積中でインキュベーションした。
４．結合していないファージをＰＢＳＴで１０回、次いでＰＢＳで２回洗浄した。３回の洗浄ステップ毎に、ファージでコーティングされたビーズを新しいＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。
５．ファージを、５００μｌの５０ｍＭのグリシン、ｐＨ２．２と共に１０分間、回転ホイール上でインキュベートすることによって溶出させた。溶出されたファージを２５０μｌの１Ｍのトリス、ｐＨ７．５で中和した。
６．３７５μｌのファージを、１０ｍｌのＨＢ２１５１細胞と共に９０分間、３７℃で振盪せずにインキュベーションした。
７．その後、感染細胞を３０分間、３７℃で振盪し、その後、クロラムフェニコールプレート（２０×２０ｃｍ）上に播種した。
８．上述のようにコロニーをプレートから２×ＴＹ、クロラムフェニコール、１０％のグリセロール中に掻き落とし、グリセロールストックとして−８０℃で保管した。細胞の一画分を使用して、第２回目の選択用にファージを調製した。
【０２２５】
（第２回目の選択）
第２回目の選択は、わずかな改変以外は第１回目と同様であった。
１．ストレプトアビジンの代わりにＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎでコーティングされた磁気ビーズを使用した。
２．選択において使用した抗原の量は２０ｎＭであった。
３．化学修飾したファージ（１０１０〜５×１０１０ＴＵ）を最初に５０ｕｇ／ｍｌのキモトリプシンで２分間処理し、次いでＰＢＳＭで４０分間遮断した。
４．結合していないファージをＰＢＳＴで１５回、次いでＰＢＳで２回洗浄し、その他は上述のとおりである。
【０２２６】
［ファージの選択：変異体プロトコル］
クローン４８は上記の一般プロトコルを使用して選択されたが、クローン１０は改変したプロトコルを導入した結果として開発された。改変は以下のとおりである：
１．第１回目では、化学修飾したファージを５０ｕｇ／ｍｌのキモトリプシンで２分間前処理し、次いでＰＢＳＭで４０分間遮断した。
２．第２回目では、化学修飾したファージを最初に５ｍＭのＤＴＴで２０分間還元し、次いで５０ｕｇ／ｍｌのキモトリプシンと共に２分間インキュベーションし、ＰＢＳＭで４０分間遮断した。
【０２２７】
［ペプチドの合成］
ファージクローン４８およびファージクローン１０からのコードされているペプチドを、遊離Ｎ末端およびＣ末端を有するように合成した。ＰＥＰ１０：Ｈ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ、ＰＥＰ４８：Ｈ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ。
【０２２８】
合成は、Ｆｍｏｃ化学を用いて、ＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロ波ペプチド合成機上で、０．１ｍｍｏｌスケールで行った。ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰおよびＮＭＰ中のＤＩＰＥＡ（それぞれ１当量および２当量で活性化した５倍過剰量のＦｍｏｃ−アミノ酸を用いたＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ  ＰＳ樹脂。側鎖保護基は以下のとおりであった：Ａｒｇ（Ｐｂｆ）；Ａｓｎ（Ｔｒｔ）；Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）；Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）；Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）；Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）；Ｓｅｒ（ｔＢｕ）；Ｔｈｒ（ｔＢｕ）；Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）。Ｆｍｏｃ−脱保護は、０．１ＭのＨＯＢｔを含有する２０％ｖ／ｖのピペリジン／ＤＭＦを用いて実施した。Ｈ−ペプチジル−樹脂をＤＭＦで洗浄し、その後、プロパン−２−オールで洗浄し、真空下で乾燥させた。側鎖保護基の切断および支持体からの切断は、９４：２．５：２．５：１ｖ／ｖ／ｖ／ｖのＴＦＡ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ／ｉＰｒ３ＳｉＨを２時間用いてもたらした。ペプチド／ＴＦＡの混合物を濾過して支持体を除去し、ペプチド／ＴＦＡの混合物を水で希釈し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し（５回）、水層を凍結乾燥させた。
【０２２９】
逆相ＨＰＬＣをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ５μ  Ｃ１８  ３００Å  ２５０×４．６ｍｍのカラムで行った。緩衝液Ａ：０．１％のＴＦＡ／Ｈ２０；緩衝液Ｂ：１０％の緩衝液Ａを含有するＣＨ３ＣＮ。カラムを１０％の緩衝液Ｂで２分間、均一濃度で溶出させ、その後、１０〜９０％の直線勾配を用いて２５分間かけて溶出させた。検出は、２１５／２３０ｎｍ；１．５ｍｌ／分の流速であった。
【０２３０】
ペプチドを凍結乾燥させ、質量分析によって確認した。ＰＥＰ１０のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量（Ｍ＋Ｈ）：２０９９．９Ｄａ（理論値：２０９８．４Ｄａ）。ＰＥＰ４８のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量（Ｍ＋Ｈ）：２０４３．８Ｄａ（理論値：２０４２．８Ｄａ）。その後、ペプチドをＴＢＭＢとコンジュゲートさせた。
【０２３１】
［ＴＢＭＢ−ペプチドのコンジュゲートの合成］
初期反応は、ファージの選択中に使用する条件を模倣するように行った。典型的には、５ｍｇの精製したペプチドを１ｍｌの水に溶かし、０．８ｍｌの５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を加え、次いで、最終濃度を１０ｍのＴＣＥＰにするために十分なＴＣＥＰを加えた。ＭｅＣＮに溶かしたＴＢＭＢ（ペプチドの重量に基づいて３当量）を反応に加えた。反応を１．５時間静置し、その後、ＨＰＬＣによって監視した。完了した後、反応をＨＰＬＣによって精製した。典型的には、０．５〜１．５ｍｇの最終生成物が得られた。しかし、この方法はいくつかの副産物を生じ、その主要なものは＋２５０ダルトンの追加の質量を有する。これは、所望の生成物へのＴＣＥＰの付加に対応しており、この生成物の収量は反応時間に伴って増大する。さらに、第２のＴＢＭＢの付加に対応する、他のより高い質量の生成物がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって観察されたが、単離しなかった。
【０２３２】
ＴＣＥＰ付加物の形成に基づいて、好ましい方法を開発した。ペプチドを樹脂から切断した後、ＨＰＬＣによって直接、またはＨＰＬＣ精製の前にＴＣＥＰ／ＤＴＴで１５分間前処理して、精製した。ＨＰＬＣ溶出緩衝液（典型的には６ｍｌ）中の、ＨＰＬＣ精製からの生成物を、５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（４ｍｌ）で中和し、上記のようにＴＢＭＢをＭｅＣＮ中で加えた。１０％のＴＨＦの添加は透明な溶液をもたらし、したがって反応が加速される。反応は質量分析によって監視するが、典型的には１〜２時間以内に完了する。この反応からは最小限の副産物しか存在しない（しかし、生成物＋１６の存在が質量分析によって観察される）。この反応は、ＨＰＬＣ精製の前に有機溶媒を除去するために濃縮を必要とし、行わない場合は、生成物が溶媒先端と共に溶出される傾向にある。この方法からの生成物の収量は、典型的には３ｍｇのペプチドから０．５〜１．５ｍｇであるが、これは最適化されていない。
【０２３３】
［結合アッセイ］
（ファージＥＬＩＳＡアッセイ）
０．６μｇ／ｍＬのビオチン標識したＭＤＭ２ペプチド（残基２〜１２５）を、ストレプトアビジンでコーティングされたプレート（Ｒｏｃｈｅ）上に固定した。プレートをＰＢＳＭ（ただし４％の粉乳）で遮断し、直鎖状またはＴＢＭＢとコンジュゲートしたファージ（５ｍＭのＤＴＴの存在下または非存在下でＰＢＳＭ中に１０７ＴＵ／ウェル）を、プレート上で５０分間、室温でインキュベーションした。同様に、ファージを最初に５ｍＭのＤＴＴで２０分間還元し、キモトリプシン（ＰＢＳ中に５０ｕｇ／ｍｌ）で２分間処理し、ＰＢＳＭ（最終濃度）で混合し、プレート上で５０分間、室温でインキュベーションした。ファージは、抗Ｍ１３−ＨＲＰモノクローナル抗体（１：５０００、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。
【０２３４】
結果は、ファージクローン１０およびクローン４８がどちらも、環状コンジュゲートとしてのＭＤＭ２とは結合したが、コンジュゲートしていないペプチド（ＤＴＴで前処理したかどうかに拘らず）としてのものとは結合しなかったことを、定性的に示した。さらに、コンジュゲートしたペプチドの結合はタンパク質分解に耐性がある。５ｍＭのＤＴＴは、キモトリプシンのジスルフィド結合を還元させて、そのプロテアーゼとしての不活性化をもたらすことができることに留意されたい。キモトリプシンがアッセイの条件下で活性であったことを確実にするために、本発明者らは、５ｍＭのＤＴＴを用いた上述の前処理の後にＭＤＭ２と結合する直鎖状ペプチドを保有する対照ファージをインキュベーションした。本発明者らの実験の条件下では、対照ファージの結合活性はタンパク質分解の際に失われた。他の実験では、本発明者らは、０．２ｍＭ〜５ｍＭまでのＴＣＥＰを、キモトリプシンの存在下（０．１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ）で、２分間、室温、ＰＢＳ中で使用した。また、これらの条件により、本発明者らがファージ上の直鎖状ペプチドと環状ペプチドとの間を識別することも可能となった。
【０２３５】
（蛍光異方性の測定）
滴定実験は、実験室ソフトウェアによって制御される、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｍｉｃｒｏｌａｂ滴定器を備えたＨｏｒｉｂａ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ蛍光計上で実行した。使用したλｅｘおよびλｅｍは、それぞれ２９５ｎｍおよび３５０ｎｍであった。励起および発光のスリット幅は５ｎｍおよび１５ｎｍであり、１０秒間の積分時間をそれぞれの測定に用いた。ペプチド１０、４８中のトリプトファンの固有の蛍光を使用して、ＭＤＭ２（残基２〜１２５）に対するその結合親和性を測定した。実験は、２３℃、ＰＢＳ中、５ｍＭのＤＴＴで行った。通常は、２５０μｌのＭＤＭ２（１５０マイクロモラー）を１．２ｍｌのペプチド（１マイクロモラー）内に滴定した。滴定データは、標準の１：１の結合モデルを用いて、平衡Ｋｄ＝［Ａ］［Ｂ］／［ＡＢ］の二次方程式の解を使用することによって分析した。Ｋｄは解離速度であり、［Ａ］および［Ｂ］は、それぞれ滴定液（ＭＤＭ２）ならびに蛍光ペプチド１０および４８の濃度をいう。適合方程式は、直線のずれを考慮するために余分な項を含有していた。
【０２３６】
結果（図２および以下）は、それぞれのペプチドの親和性はマイクロモラー以下であり、２５０〜７５０ｎＭの範囲にあることを示している。ＰＥＰ４８の測定を繰り返した。
ＰＥＰ１０＋ＭＤＭ２、測定されたλｅｘ＝２９５ｎｍ、Ｋｄ＝２６７ｎＭ；
ＰＥＰ４８＋ＭＤＭ２、測定されたλｅｘ＝２８０ｎｍ、Ｋｄ＝７６０ｎＭ；
ＰＥＰ４８＋ＭＤＭ２、測定されたλｅｘ＝２９５ｎｍ、Ｋｄ＝５６７ｎＭ
【０２３７】
（競合アッセイ）
ＰＥＰ４８ファージとＭＤＭ２との結合は、Ｋｄ＝３．３ｎＭでｐ５３部位においてＭＤＭ２と結合するペプチドｐＭＩ（ＴＳＦＡＥＹＷＮＬＬＳＰ）によって競合された（Ｐａｚｇｉｅｒら、２００９、ＰＮＡＳ、１０６、４６６５〜４６７０）。０．６μｇ／ｍｌのビオチン標識したＭＤＭ２ペプチド（残基２〜１２５）をストレプトアビジンでコーティングされたプレート（Ｒｏｃｈｅ）上に固定した。プレートをＰＢＳＭで遮断した。ＴＢＭＢとコンジュゲートしたファージ（１％のＰＢＳＭ中に１０７ＴＵ／ウェル）を様々な濃度のｐＤＩ（６．９４ｎＭ〜１ｕＭ）と事前に混合し、プレート上で７５分間、室温でインキュベーションした。ファージは、抗Ｍ１３−ＨＲＰモノクローナル抗体（１：５０００、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。ＰＥＰ４８ファージとＭＤＭ２との結合は、ｐＭＩペプチドを加えることによって阻害され、推定ＩＣ５０＝１２５ｎＭであった。
【実施例２】
【０２３８】
＜ＰＫ１５−ＴＢＭＢのコンジュゲートからそのスルホキシドおよびスルホンへの酸化＞
ＰＫ１５−ＴＢＭＢをＨｅｉｎｉｓら、２００９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５、５０２〜５０７に記載のように合成した。約１ｍｇのＰＫ１５−ＴＢＭＢを１ｍｌの１×ＰＢＳに溶かし、過酸化水素を０．３％の濃度まで加えた。反応を室温で一晩静置した。ＭＡＬＤＩ質量分析により、１、２および３個の酸素原子が付加されているが、不完全である反応に対応する様々なピークが示された。反応を１％のＨ２Ｏ２に調節し、８時間静置して、＋３（酸素）の生成物が主要であることを見ることができたが、反応は依然として不完全であった。反応を最初は氷上で冷却し、５０Ｗまでの電力を用いてマイクロ波合成機中で３７℃の温度まで加熱した。１５分後、質量分析により、３個の酸素原子の付加に対応し、したがってスルホキシドに対応する、１９９２での本質的に単一のピークが示された。これらの条件下では、さらなる酸素原子の付加の兆候は事実上なかった。ＨＰＬＣは本質的に単一のピークを示した。
【０２３９】
酸化された誘導体を、カリクレインを阻害するその能力について比較した。
【０２４０】
酵素はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、基質はＢａｃｈｅｍ  ＡＧから購入した。アッセイ緩衝液は、１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＢＳＡ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００および５％のＤＭＳＯから構成される。基質を加える前に、酵素を阻害剤と共に３０分間、室温でインキュベーションした。すべての実験は３０℃で９０分間記録した。
【０２４１】
アッセイは、ＢＭＧ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダー上で、３５０／４５０ｎｍの励起／発光の波長で行った。カリクレインは１０８０μｇ／ｍＬの溶液として購入し、アッセイ緩衝液中で０．３ｎＭの作業濃度まで希釈した。基質Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣをＤＭＳＯ中で１０ｍＭのストック濃度に溶かし、アッセイ緩衝液で３００μＭの作業濃度まで希釈した。阻害剤は、アッセイ緩衝液中で６０μＭのストック濃度に溶かした。５０μＬのそれぞれの試薬をウェル中に１５０μＬ／ウェルの最終体積で導入した。アッセイにおけるカリクレインの最終濃度は０．１ｎＭであり、基質は１００μＭである。
【０２４２】
阻害剤の最終濃度は、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、８０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、８００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、８μＭ、１０μＭおよび２０μＭであった。初期反応速度は、阻害剤のそれぞれの濃度について蛍光＝ｆ（時間）のデータをプロットすること、および直線の傾向線を当てはめることによって得られる。阻害曲線は、初期速度＝ｆ（［Ｉ］）をプロットすることによって得られ、ＩＣ５０値を評価することができる。
【０２４３】
ＰＫ１５−ＴＢＭＢがカリクレインを１３ｎＭのＩＣ５０で阻害した条件下では、予備結果により、酸化されたＰＫ１５−ＴＢＭＢがカリクレインを約２．４μＭのＩＣ５０で阻害したことが示された。したがって、コアとペプチドとの付着の性質の変化は、リガンドの親和性に劇的な影響を与えていた。単一の酸素原子での酸化が硫黄原子にキラル中心を作るため、３つの部位でのスルホキシドの形成は、束縛されたペプチドの立体異性体をもたらすと予測されることに留意されたい。立体異性体は、標的とのその相互作用が異なる可能性が高く、したがって、ＩＣ５０値はそれぞれの立体異性体のＩＣ５０値の平均である。
【０２４４】
続いて、コンジュゲートからスルホンへ酸化させるための条件を確立した。ＰＫ１５−ＴＢＭＢ（４ｍｇ）を１ｍｌの水に溶かし、マグネシウムモノペルオキシフタレート（１０当量、０．５ｍｌの水中に１０ｍｇ）を加えた。反応は、反応が４５分間で完了するまでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって監視し、その後、ＨＰＬＣによって精製した。収量は１．８ｍｇであり、実測分子量は２０３８であった（計算値２０３８）。生成物をＨＰＬＣによって精製した。この場合、硫黄はもはやキラル中心ではなく、したがって単一の分子種が予測されることに留意されたい。この酸化されたＰＫ１５−ＴＢＭＢは、カリクレインを１．３マイクロモラーのＩＣ５０で阻害した。硫黄の酸化は、硫黄の周りに対する結合角度、また、コアの周りの原子のパッキングを変化させると予測されている。どちらの効果も結合親和性の変更を担っている可能性がある。
【実施例３】
【０２４５】
＜トリメチルメシチレンおよびトリエチルメシチレンのコアの使用＞
ＰＫ１５を、トリス（ブロモメチル）ベンゼンについて既に記述したものと同様の条件下で、トリス（ブロモメチル）メシチレンとコンジュゲートさせ（Ｈｅｉｎｉｓら、２００９）、ＨＰＬＣによって精製した。実施例１に記載の手順に従って、コンジュゲートを、カリクレインを阻害するその能力について比較した。ＰＫ１５−ＴＢＭＢがカリクレインを１３ｎＭのＩＣ５０阻害した条件下では、予備結果により、ヘキサメチルベンゼンコンジュゲートがカリクレインを１５０ｎＭのＩＣ５０で阻害したことが示された。また、ＰＫ１５も上記のようにトリス（ブロモエチル）メシチレンとコンジュゲートさせ、これにより、阻害のさらなる損失がもたらされ、ＩＣ５０は約４００ｎＭであった。したがって、コアの性質の変化は、リガンドの親和性に劇的な影響を与えていた。この場合、３個のメチルまたはエチル基の余分な嵩がコアの周りのパッキングを変化させ、したがって結合親和性を変化させた可能性が高い。
【実施例４】
【０２４６】
＜ヨードアセチル（ＩＡｃ）およびアクリロイル（Ａｃｒ）官能基に基づく他の足場コアの使用＞
すべての足場前駆体の構造を表１に示す。その後、これらをチオール反応性官能基で修飾して最終足場を得て、これらも表１に示す。
【０２４７】
足場前駆体、トリスヒドロキシメチルエタン（ＴＨＭＥ（ＩＡｃ３）用）、ペンタエリスリトール（ＰＥ（ＩＡｃ４）用）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ（ＩＡｃ３）用）、スチレンＲ−エポキシド（ＴＰＥＡ（ＩＡｃ３）用）、トリス（４−ホルミルフェニル）アミン（ＴＰＢＡ（ＩＡｃ３）用）、サリチルアミド（ＴＯＨＰＴ（ＩＡｃ３））、塩化シアヌルおよびＢｏｃ−ピペラジン（ＴＰＴ（Ａｃｒ３）用）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。
【０２４８】
ＴＰＥＡ（ＩＡｃ３）の前駆体の合成は、Ｆａｖｒｅｔｔｏら、およびＮｕｇｅｎｔら（それぞれＴｅｔ．Ｌｅｔ．、２００２、４３、２５８１〜２５８４、およびＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９４、１１６、６１４２〜６１４８）に記載のように、メタノール（２Ｍ、Ｓｉｇｍａ）中、反応速度の増強のためにマイクロ波照射を使用した、スチレンＲ−エポキシドとアンモニアとの縮合によって行った。粗（Ｒ，Ｒ，Ｒ）−トリス（２−フェニル）−エタノールアミン生成物の精製は、記載のようにフラッシュカラムクロマトグラフィーおよびＴＬＣを用いて行った。
【０２４９】
ＴＰＢＡ（ＩＡｃ３）の前駆体（トリス−（４−ヒドロキシメチルフェニル）アミン）は、市販のアルデヒド（トリス（４−ホルミルフェニル）アミン、０．１ｍｍｏｌｅ）から、２０ｍＬのＴＨＦ中でのＮａＢＨ４を用いた還元（１時間、室温）によって調製し、１ｍＬのＨＡｃ（１００％）で反応停止させ、ＤＣＭ／Ｈ２Ｏで相抽出した。生じたトリス−（４−ヒドロキシメチルフェニル）アミンは、さらなる修飾のためにＤＣＭ溶液中に保存した（以下を参照）。
【０２５０】
前駆体トリス（オルト−ヒドロキシフェニル）トリアジンは、Ｊｏｈｎｓら（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９６２、２７（２）、ページ５９２〜５９４）およびＣｏｕｓｉｎら（Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｈｉｍ．Ｆｒａｎｃｅ、１９１４、（４）１５、４１６）に記載のように、２７０℃で３時間のサリチルアミドの縮合によって得た。粗黄色生成物（３ｇ）を濃ＮａＯＨ（ａｑ）に溶かし、希硫酸で沈殿させた。黄色沈殿物を遠心分離によって回収し、Ｈ２ＯおよびＥｔＯＨ、その後ＤＣＭでで繰返し洗浄し、乾燥させた。その後、生成物を熱ＤＭＦ中に採り、これは、−２０℃まで冷却した際に、トリス（オルト−ヒドロキシフェニル）トリアジンを小さな暗黄色結晶クラスターとして沈殿させた。
【０２５１】
Ｂｏｃ−保護したＴＰＴ（Ａｃｒ３）の前駆体（トリス−（Ｂｏｃ−ピペラジン）−１，３，５トリアジン）は、Ｃｈｏｕａｉら（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００８、７３（６）、ページ２３５７〜２３６６）によって詳述されているように、塩化シアヌルおよびＮ−ｂｏｃピペラジンから調製した。Ｂｏｃの除去は、ＭｅＯＨ中の６ＮのＨＣｌを用いて１２時間で達成した。粗トリス−ピペラジノ−トリアジンは標準の酸／塩基抽出、次いでＤＣＭ／Ｈ２Ｏを溶媒として用いた相抽出によって精製した。
【０２５２】
ヨードアセチルおよびアクリロイル基は、十分に確立された、かつ選択的なチオール反応基である（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、バイオコンジュゲート技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００８）。これらの基を使用することの利点は、これらは付近に芳香族系を必要とせず（ＴＢＭＢの場合のように）、したがって、チオール反応性の足場が利用可能な範囲および化学的空間が広くなることである。
【０２５３】
表１中のすべての足場前駆体は、ヒドロキシル基（またはＴＰＴ（Ａｃｒ３）の前駆体の場合は第二級アミノ基）を含有する。ヨードアセチルチオール反応性官能基をヒドロキシル上に導入することは、以下の２ステップの手法によって達成される。
【化１】
0005856957.tif 000002
（クロロ−アセチルクロライドとアルコールとの反応）
【０２５４】
その後、精製した生成物をハロゲン交換（フィンケルシュタイン反応）に供して、最終のヨードアセチル化された生成物が得られる：
【化２】
0005856957.tif 000003
【０２５５】
式１によるクロロ−アセチルクロライドとの反応は、通常は１５ｍＬの無水ＴＨＦ中に溶かした約０．１ｍｍｏｌｅの足場前駆体を用いて行った。４当量のピリジンおよび３．５当量のクロロ−アセチルクロライド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた後、反応を１〜２時間、室温で進行させた。その後、生じたＴＨＦに不溶性のピリジン−ＨＣｌを遠心分離によって除去し、残ったクロロ−アセチルクロライド（理論上は０．５当量）を、０．５ｍＬのＨ２Ｏ中の飽和ＮａＨＣＯ３を加えることによって反応停止させた。溶媒をロータリー蒸発させた後、油性の生成物を約１０ｍＬのアセトン中に採り、５当量のＮａＩ（アセトン中で１Ｍに事前に溶かした）を加えた（式２）。これを４時間まで室温で反応させた。反応が進行するにつれて、ＮａＣｌが沈殿し、ＮａＣｌ沈殿の停止が、すべての塩素がヨウ素で完全に置き換わったことを示した。溶媒を以前のようにロータリー蒸発させ、生成物をＤＣＭで抽出し、遠心分離して懸濁したＮａＣｌ／ＮａＩを除去し、Ｈ２Ｏで３回洗浄した。その後、ＤＣＭを再度除去し、油性のオレンジ色／茶色生成物を１０ｍＬのアセトン中に採り、−２０℃、暗所で保管した。
【０２５６】
アクリロイル基を、式１と同一の様式で、代わりに塩化アクリロイル（Ｃｌ−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ２、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて導入した。
【０２５７】
チオール基とヨードアセチル基との反応は、以下に従って進行する。
【化３】
0005856957.tif 000004
【０２５８】
生じたＨＩ（ヨウ化水素）は、塩基の存在によって反応停止される。チオール基とアクリロイル官能基との反応は以下に従って進行する。
【化４】
0005856957.tif 000005
【０２５９】
中性からわずかに塩基性のｐＨが、チオールに対する選択性を達成するために望ましい。したがって、すべての反応は、水中の３０％のアセトニトリルに事前に溶かした、精製した還元した直鎖状３−Ｃｙｓペプチを用いて、１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（約ｐＨ８）の存在下で行った。ペプチドの濃度は１００〜１０００ｍＭであり、足場の濃度はわずかに過剰量に保った（約１．５倍）。これは、適切な体積のアセトン足場ストック溶液の添加を伴った。アセトンストック中の足場の濃度は、ヨードアセチル化またはアクリレート化された誘導体への定量的な変換、および後処理中の２０％の損失を想定して、用いた前駆体の初期の量から推定した。
【０２６０】
以下の配列のいくつかの３−Ｃｙｓペプチドを試験した（システインに下線を引いた）。
Ｐｅｐ４８−３ｓ１  ＳＤＤＣＶＲＦＧＷＴＣＰＴＶＭＣＧ
Ｐｅｐ４８−５８  ＳＤＤＣＶＲＦＧＷＴＣＥＰＳＬＰＧＣＧ
Ｐｅｐ４８−３７  ＳＤＣＶＲＦＧＷＴＣＳＰＧＭＶＧＣＤ
【０２６１】
質量分析（ＭＡＬＤＩ）によって判断して、すべてのヨードアセチル足場は任意のペプチドと非常に迅速に反応した（これらの条件下で、変換は通常１０分間以内に完了していた）。一例として、ＴＰＥＡ（ＩＡｃ３）（（Ｒ，Ｒ，Ｒ）−トリス（２−フェニル）−エタノールアミントリスヨードアセテート）とＰｅｐ４８−５８との反応を５分後にサンプリングし、ＭＡＬＤＩによって分析した。
【０２６２】
４９９Ｄａの質量の増大（足場の付加および３つのＨＩによる）は、理論的な予測値（５００Ｄａ、表１）と良好に相関する。中間生成物（すなわち、ペプチドの他の箇所と部分的にカップリングしているままでヨウ素原子がまだ足場に付着しており、質量がより高い）はどの場合でも観察されなかった。より束縛された足場（すなわちＴＯＨＰＴ（ＩＡｃ３）、表１を参照）との反応はより遅かった（約１時間）。中間カップリング生成物もこの場合で観察されなかった（すなわち、＋１つのＨＩ、＋２つのＨＩ）。
【０２６３】
すべてのＣｙｓがＬｙｓによって置き換えられたＰｅｐ４８−３７誘導体は、２時間後にＴＨＭＥ（ＩＡｃ３）による感知できるほどの修飾を示さず、これは、システインに関するヨードアセチル官能基の良好な選択性を示している。アクリレート化された足場ＴＨＭＥ（Ａｃｒ３）およびＴＰＢＡ（Ａｃｒ３）も３−Ｃｙｓペプチドとカップリングしたが、より遅い速度であった（約＜１時間）。
【０２６４】
【表１Ａ】
0005856957.tif 000006
【表１Ｂ】
0005856957.tif 000007
【表１Ｃ】
0005856957.tif 000008
【実施例５】
【０２６５】
＜トリスヒドロキシメチルエタントリスヨードアセテート（ＴＨＭＥ（ＩＡｃ３））コアの使用＞
実施例１に記載のように、ペプチドコンジュゲートをタンパク質ＭＤＭ２に対する選択によって作製した。ＰＥＰ４８の場合、第２のループの配列をランダム化し、ファージレパートリーをさらなる選択の回に供した。これにより、改善された結合親和性を有するいくつかのコンジュゲートがもたらされた（いくつかのそのようなＰＥＰ４８誘導体の配列には、実施例４を参照）。これらのうちの１つであるコンジュゲートＰＥＰ４８−３ｓ１は、蛍光異方性によって測定して２７〜１００ｎＭの範囲の結合親和性を有していた。
【０２６６】
同じペプチドＰＥＰ４８−３ｓ１を、実施例４に記載のように、ＴＢＭＢの代わりに上記のようにＴＨＭＥ（ＩＡｃ３）とコンジュゲートさせた。３つのヨードアセチル基は、ペプチドの３つまでのシステイン残基と反応すると予測される。この場合、コアはペプチドに四面体の形状を課し、２つの立体異性体をもたらすと予測される。これは、蛍光異方性によって測定した場合に異なる結合親和性を有していた（６４０ｎＭおよび１６００ｎＭ）、ＨＰＬＣを用いたコンジュゲートの精製で見られる同一の質量の２つのピークと一致している。
【０２６７】
したがって、予測どおり、ＴＨＭＥ（ＩＡｃ３）コアによって課される様々な形状およびパッキングは、ＴＢＭＢコアによって課されるものとは異なり、変更された結合親和性をもたらす。
【実施例６】
【０２６８】
＜コア変異体の作製：ベンゾオキサゾール誘導体への合成経路＞
例示として、ＴＢＭＢなどのコアを作製するための試薬を化学的に誘導体化して、変異体コアを作製することができる。以下の例は、ベンゾオキサゾール誘導体を作製するために使用し得る２つの合成経路を示す。
【０２６９】
（スキーム１−直接経路）
【化５】
0005856957.tif 000009
Ｋｏｃｉら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ、２００２、１２、３２７５〜３２７８。
【０２７０】
乾燥ＤＭＦ（８ｍＬ）に溶かした２−メルカプトベンゾオキサゾール（５ｍｍｏｌ、１５１ｍｇ）を、乾燥エタノール（２．５ｍＬ）中のナトリウム（５ｍｍｏｌ、１１５ｍｇ）の溶液に加える。室温で１０分間攪拌した後、ＴＢＭＢ（５ｍｍｏｌ、１．７８５ｇ）を少量ずつ加え、生じた懸濁液を６時間攪拌する。その後、反応混合物を氷浴中に注ぎ、一晩静置する。得られた固形物を濾取し、冷水で洗浄し（３×２０ｍＬ）、空気乾燥させる。粗生成物は、ＥｔＯＡｃ−ヘキサン（２０／８０）を溶出液の系として用いたフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０２７１】
（スキーム２−間接経路）
【化６】
0005856957.tif 000010
Ｈｅｉｎｅｎら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、２０００、３９、８０６〜８０９。
【０２７２】
１，３，５−トリス（ヒドロキシメチル）ベンゼン（１１．９ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１１．９ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの乾燥ＴＨＦ中、アルゴン下で攪拌する。フラスコを０℃まで冷却し、テトラブロモメタン（１１．９ｍｍｏｌ）を加える。溶液を室温で２．５時間攪拌し、反応をＴＬＣによって監視する。沈殿したトリフェニルホスフィンオキシドを濾過した。濾液を蒸発させて残渣が得られ、その後、これを、ＥｔＯＡｃを溶出液として用いたフラッシュクロマトグラフィーによって分画して、ブロモメチル−３，５−ビス（ヒドロキシメチル）ベンゼンが得られた。
【０２７３】
乾燥ＤＭＦ（８ｍＬ）に溶かした２−メルカプトベンゾオキサゾール（５ｍｍｏｌ）を、乾燥エタノール（２．５ｍＬ）中のナトリウム（５ｍｍｏｌ）の溶液に加える。室温で１０分間攪拌した後、ブロモメチル−３，５−ビス（ヒドロキシメチル）ベンゼン（５ｍｍｏｌ）を少量ずつ加え、生じた懸濁液を６時間攪拌する。その後、反応混合物を氷浴中に注ぎ、一晩静置する。得られた固形物を濾取し、冷水で洗浄し（３×２０ｍＬ）、空気乾燥させる。粗生成物は、ＥｔＯＡｃ−ヘキサン（２０／８０）を溶出液の系として用いたフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０２７４】
ベンゾオキサゾリル−２’−チオメチル−３，５−ビス（ヒドロキシメチル）ベンゼン（１．２ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１．２ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中、アルゴン下で攪拌する。フラスコを０℃まで冷却し、テトラブロモメタン（１．２ｍｍｏｌ）を加える。溶液を室温で２．５時間攪拌し、反応をＴＬＣによって監視する。沈殿したトリフェニルホスフィンオキシドを濾過した。濾液を蒸発させて残渣が得られ、その後、これを、ＥｔＯＡｃを溶出液として用いたフラッシュクロマトグラフィーによって分画して、ベンゾオキサゾリル−２’−チオメチル−３，５−ビス（ブロモメチル）ベンゼンが得られた。
【０２７５】
そのようなベンゾオキサゾールのコンジュゲートは、本発明に従って以下のように使用し得る。ジブロモメチルベンゼンとコンジュゲートした、１つのループ配列によって隔てられた２つのシステイン残基を含む第１のポリペプチドリガンドのレパートリーのポリペプチドを、ベンゾオキサゾールおよびＴＢＭＢの上記生成物とコンジュゲートさせることができる。第２のポリペプチドのレパートリーは足場に付着した余分なベンゾオキサゾール環を含むため、これは、第１のレパートリーのコンホメーション多様性を変更させることが予測される。これは、ひいては、さらなる束縛および結合接触を有する、第２のレパートリーから選択されるリガンドを提供し得る（改善された親和性および／もしくは標的に対する特異性、ならびに／または増強されたプロテアーゼ耐性がもたらされる）。
【０２７６】
また、コアへの他の機能、たとえば、血清アルブミンと結合する部分（半減期の延長のため）、またはグアニジン部分（細胞浸透のため）、または酵素阻害剤、または毒性薬物（細胞死滅のため）の付加も、レパートリーのコンホメーション多様性を変更させるために使用することができる。
【実施例７】
【０２７７】
＜足場のオルソゴナルな反応基＞
カリクレイン阻害剤ＰＫ１５の第１のループを含むペプチド（Ｎ末端およびＣ末端に追加のアスパラギン酸残基を有する）を、ＴＢＭＢ、続いてプロピルアルギルアミン（ｐｒｏｐｙｌａｒｇｙｌａｍｉｎｅ）とカップリングさせて、以下の生成物が得られた。
【化７】
0005856957.tif 000011
【０２７８】
反応の詳細は以下のとおりである：６００μｌの水中のＰＫ１５−Ｌ１ＤＤ（（Ａｃ）−ＤＣＳＤＲＦＲＮＣＤ−（ＮＨ２））（５ｍｇ）をＴＣＥＰ（６０μｌ）で３０分間処理し、その後、ＨＰＬＣ精製した（２回の実行、約７ｍｌの緩衝液で溶出、ｍ／ｚ１２７１）。緩衝液を等体積の１００ｍＭの炭酸水素アンモニウムでｐＨ約８まで、およびＴＢＭＢ（５当量、０．５ｍｌのＭｅＣＮ中に７ｍｇ）で処理し、反応を室温で静置した。２０分後、ＭＡＬＤＩ  ＭＳにより反応の完了が示され（ｍ／ｚ１３７５）、反応をプロパルギルアミン（５０当量、１０μｌ）で反応停止させ、反応を一晩静置した。生成物をＨＰＬＣ精製し、白色粉末まで凍結乾燥させた（ｍ／ｚ１４４０、計算値１４４０）。
【０２７９】
プロパルギルアミンは、ＴＢＭＢのベンジル臭素にオルソゴナルな足場反応基を提供する。これは、クリック化学によって、ポリペプチド内またはそれに付着したアジド官能基と反応することができ、したがって第２のポリペプチドループを作製する。アジド官能基は、アジドアミノ酸（たとえばアジド−チロシン）をポリペプチド内に組み込むことによって、または二官能性リンカーを使用することによって提供することができる。
【０２８０】
さらに、プロパルギルアミンは他のポリペプチドと反応することができる。本明細書中では、本発明者らは、第２のポリペプチドリガンドとカップリングさせて二官能性リガンドを作製するためのその使用を記載する。
【０２８１】
最初に、ＭＤＭ２阻害剤ＰＥＰ４８の第１のループを含むペプチド（Ｎ末端およびＣ末端に追加のアスパラギン酸残基を有する）を、以下のようにＤＢＭＢとカップリングさせた。６００μｌの水中のＰｅｐ４８−Ｌ１ＤＤ（（Ｈ）−ＤＧＣＶＲＦＧＷＴＣＤ−（ＮＨ２））（５ｍｇ）をＴＣＥＰ（６０μｌ）で３０分間処理し、その後、ＨＰＬＣ精製した（２回の実行、約７ｍｌの緩衝液で溶出、ｍ／ｚ１２５８）。緩衝液を等体積の１００ｍＭの炭酸水素アンモニウムでｐＨ約８まで、およびＤＢＭＢ（０．５ｍｌのＭｅＣＮ中に５ｍｇ）で処理し、反応を室温で静置した。２０分後、ＭＡＬＤＩ  ＭＳにより反応の完了が示され、生成物をＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥させた。生成物を水（１ｍｌ）に再度溶かし、これに１０当量のアジドリンカー（以下の構造を参照、１００μｌの１００ｍＭの炭酸アンモニウム中に４．５ｍｇ）およびＥＤＣ（１００μｌの水中に５ｍｇ）を加え、反応を一晩静置した。ＭＡＬＤＩ  ＭＳにより所望の生成物が示され（ｍ／ｚ１４７１、計算値１４７２）、これをＨＰＬＣによって精製した。
【化８】
0005856957.tif 000012
【０２８２】
その後、ＰＫ１５−Ｌ１ＤＤ−ＴＢＭＢ−プロパルギルアミンのコンジュゲート（約１ｍｇ、約０．７μｍｏｌｅ）を０．５ｍｌの水に溶かし、これに、アスコルビン酸ナトリウム（５０μｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ中に２５μＭ）、硫酸銅（２５μｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ中に２．５μＭ）およびアジドリンカーで修飾したＰｅｐ４８−Ｌ１ＤＤ−ＤＢＭＢのコンジュゲート（上記、約１ｍｇ）を加えた。１時間後にＭＡＬＤＩ  ＭＳにより生成物が示され、これをＨＰＬＣ精製した（ｍ／ｚ２９１１、以下の予測された構造の計算値２９１０）
【化９】
0005856957.tif 000013
【実施例８】
【０２８３】
＜ペプチドの反応基の変更＞
以前の実験により、システインとＴＢＭＢとの反応が示されている。メチオニンはＴＢＭＢおよびＤＢＭＢのどちらとも反応することが見出されている。１：１のアセトニトリル：水および２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム中のメチオニン（１ｍｇ／ｍｌ）の溶液を、ＤＢＭＢまたはＴＢＭＢ（ＭｅＣＮ中に１ｍｇ／ｍｌ）のどちらかで処理した。１時間の反応後に、反応をＬＣ−ＭＳによって監視した。ＤＢＭＢでは、メチオニンは生成物ｍ／ｚ３３４を示し（ＤＢＭＢの単一の付加計算値３３３）、ＴＢＭＢでは、ｍ／ｚ４２６の生成物が示された（単一のＴＢＭＢの付加の計算値）。以下の提案された生成物を参照されたい。
【化１０】
0005856957.tif 000014
【０２８４】
本発明者らがＰＫ１５ペプチドの中心システインをメチオニンに変更し［配列（Ｈ）−ＡＣＳＤＲＦＲＮＭＰＡＤＥＡＬＣＧ−（ＯＨ）］、これをＴＢＭＢと反応させた際、本発明者らは、ＨＰＬＣ上で同一の質量を有する２つのピークを観察し、システインおよび単一のメチオニンのどちらを介したＴＢＭＢのコンジュゲートでも予測された質量（１８８４）を有する。どちらの生成物もカリクレインの活性を阻害したが、ＩＣ５０値は１０マイクロモラーより高かった。したがって、システインをメチオニンに変化させることは、結合親和性に対して劇的な効果を有し、これは、恐らくは、追加のメチレン基およびメチル基からの変更されたパッキングの相互作用、ならびに／またはメチオニンの硫黄原子の周りの結合の形状、ならびに／または追加の正電荷が原因である。
【０２８５】
上記明細書中で言及したすべての出版物は、参照することにより本明細書の一部をなすものとする。本発明の記載した態様および実施形態の様々な改変および変形が、本発明の範囲から逸脱せずに当業者に明らかであろう。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載したが、特許請求した本発明はそのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解されたい。実際、当業者に明らかな、記載した発明を実施するための形態の様々な改変が、実際に以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。