(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は２以上のタンパク質分解部位を除去することによりタンパク質分解されにくくなっている改変Ｇａｇ抗原に結合した樹状細胞（ＤＣ）標的化抗体又はその抗原結合性断片を含む抗体−抗原複合体であって、
前記ＤＣ標的化抗体又はその抗原結合性断片と、前記改変Ｇａｇ抗原との間に、セルロース分解生物に由来するリンカー配列から選択される１又は２以上の新たなグリコシル化部位を含む可動性リンカーをさらに含み、前記可動性リンカーが、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドである、
前記抗体−抗原複合体。
【請求項２】
ＤＣ標的化抗体又はその抗原結合性断片が、コヘシン／ドッケリン対の片方に結合し、改変Ｇａｇ抗原が、前記コヘシン／ドッケリン対の相補的な片方に結合して複合体を形成する、請求項１に記載の抗体−抗原複合体。
【請求項３】
ＤＣ標的化抗体又はその抗原結合性断片がヒト化されている、請求項１又は２に記載の抗体−抗原複合体。
【請求項４】
抗体−抗原複合体の抗体軽鎖を除く部分が、配列番号３、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は３１から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体−抗原複合体。
【請求項５】
ＤＣ標的化抗体又はその抗原結合性断片が、ＣＤ４０に特異的に結合する抗体又は抗原結合性断片から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体−抗原複合体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の抗体−抗原複合体を含む、ワクチン。
【請求項７】
ＤＣ標的化抗体若しくはその抗原結合性断片又は改変Ｇａｇ抗原に結合して抗体−抗原複合体の一部を形成しているＮｅｆ抗原をさらに含み、Ｇａｇ ｐ１７、Ｇａｇ ｐ２４、及びＮｅｆに対するＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導することができる、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
改変Ｇａｇ抗原及びＮｅｆ抗原が融合タンパク質の状態にある、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
抗体−抗原複合体が、改変Ｇａｇ抗原とＮｅｆ抗原との間に、セルロース分解生物に由来する１又は２以上の新たなグリコシル化部位を含む可動性リンカーをさらに含む、請求項７又は８に記載のワクチン。
【請求項１０】
抗体−抗原複合体の抗体軽鎖を除く部分が、配列番号３、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は３１から選択される、請求項７〜９のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１１】
樹状細胞の有効性を増加させるための方法に用いるワクチンであって、前記方法が、
患者の樹状細胞を単離すること、
活性化量のワクチンに前記樹状細胞を曝露すること、及び
抗原が負荷され活性化された前記樹状細胞を、前記患者に再導入すること
を含む、請求項６〜１０のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１２】
請求項６〜１１のいずれかに記載のワクチンの製造に使用するための、配列番号３、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は３１から選択される単離及び精製されたポリペプチド。
【請求項１３】
請求項６〜１１のいずれかに記載のワクチンの製造に使用するための、配列番号３、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は３１から選択されるポリペプチドをコードする単離及び精製された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ウイルスタンパク質を樹状細胞に対して標的化する作用物質の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、その背景を抗原提示に関して記述する。
【０００３】
樹状細胞は、可溶性細胞間シグナルを提供し、その後病原体を認識することにより先天性免疫と獲得免疫との橋渡しを制御する上で極めて重要な役割を果たす。ＤＣのこれらの機能は、トール様受容体（ＴＬＲ、toll-like receptor）及びＣ型レクチン又はレクチン様受容体（ＬＬＲ、lectin-like receptor）によって最も顕著に代表される特殊な表面受容体、「パターン認識受容体」（ＰＲＲ、pattern recognition receptor）の発現に大きく依存する。
【０００４】
現在の理論的枠組では、ＴＬＲの主な役割は、免疫応答を開始するためにインターロイキン１２（ＩＬ−１２、interleukin 12）及び他の炎症性サイトカインを産生するように、ＤＣに警報を出すことである。Ｃ型ＬＬＲは、マクロファージ及びＤＣの強力な抗原捕捉及び取込み機序の構成要素として作用する。しかしながら、ＬＬＲは、ＴＬＲと比較して、細胞遊走、細胞間相互作用を含むより広範囲の生物学的機能を有している可能性がある。こうしたＬＬＲの多機能性は、ＬＬＲがＴＬＲと異なり自己及び非自己を両方とも認識することができるという事実に起因する可能性がある。しかしながら、多くのＬＬＲが免疫細胞で発現されるという重複性を含めて、ＬＬＲの複雑性は、個々のＬＬＲの詳細な機能の理解を妨げる主な障害の１つである。加えて、これらの受容体の大部分に対する天然リガンドは依然として特定されていない。それにもかかわらず、最近の研究から得られた根拠によると、ＬＬＲは、ＴＬＲと協働して、微生物感染中の免疫細胞の活性化に寄与し得ることが示唆されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一実施形態では、本発明は、１又は２以上のタンパク質分解部位を除去することによりタンパク質分解されにくくなっている改変Ｇａｇ抗原に結合して抗体−抗原複合体を形成するＤＣ特異的抗体又はその断片を単離及び精製し、抗体−抗原複合体がプロセシングされＴ細胞認識のために提示される条件下で抗原提示細胞を接触させることにより、抗原提示細胞による抗原提示の有効性を増加させるための組成物及び方法を含む。一態様では、抗原提示細胞は樹状細胞を含む。別の態様では、ＤＣ特異的抗体若しくはその断片は、コヘリン（Coherin）／ドッケリン（Dockerin）対の片方に結合するか、又はＤＣ特異的抗体若しくはその断片は、コヘリン／ドッケリン対の片方に結合し、改変Ｇａｇ抗原はコヘリン／ドッケリン対の相補的な片方に結合して複合体を形成する。別の態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体若しくはその断片とＧａｇ抗原の間に可動性リンカーをさらに含む。一態様では、抗体−抗原複合体は、１又は２以上の新しいグリコシル化部位をさらに含むか、又は抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＧａｇ抗原の間に可動性リンカーをさらに含み、このリンカーは、抗体と抗原との間の可動性の増加、リンカーのタンパク質分解の減少、及び分泌の増加を提供する１又は２以上のグリコシル化部位を含む。さらに別の態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＧａｇ抗原の間に可動性リンカーをさらに含み、このリンカーは、配列番号４及び６から選択される１又は２以上のリンカーを含む。
【０００６】
本発明の別の態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＧａｇ抗原の間に可動性リンカーをさらに含み、このリンカーは、セルロース分解生物に由来するリンカー配列から選択される１又は２以上のグリコシル化部位を含む。一態様では、ＤＣ特異的抗体又はその断片はヒト化されている。特定の一態様では、抗体−抗原複合体は、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３１、又は３２から選択される。別の態様では、抗体−抗原複合体は、複合体の精製又は特定に使用される配列タグをさらに含む。さらに別の態様では、ＤＣ特異的抗体又はその断片は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン（Langerin）、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１、並びにＡＳＰＧＲに特異的に結合する抗体から選択される。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、抗体−抗原複合体の分泌を増加させる１又は２以上のコドン使用頻度の最適化がなされた改変Ｎｅｆ抗原に結合して抗体−抗原複合体を形成するＤＣ特異的抗体又はその断片を単離及び精製し、抗体−抗原複合体がプロセシングされＴ細胞認識のために提示される条件下で抗原提示細胞を接触させることにより、抗原提示細胞による抗原提示の有効性を増加させるための組成物及び方法を含む。一態様では、抗原提示細胞は樹状細胞を含む。別の態様では、ＤＣ特異的抗体若しくはその断片はコヘリン／ドッケリン対の片方に結合するか、又はＤＣ特異的抗体若しくはその断片はコヘリン／ドッケリン対の片方に結合し、改変Ｎｅｆ抗原はコヘリン／ドッケリン対の相補的な片方に結合して複合体を形成する。別の態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＮｅｆ抗原の間に可動性リンカーをさらに含む。一態様では、抗体−抗原複合体は、１又は２以上の新しいグリコシル化部位をさらに含むか、又は抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＮｅｆ抗原の間に可動性リンカーをさらに含み、このリンカーは、抗体と抗原との間の可動性の増加、リンカーのタンパク質分解の減少、及び分泌の増加を提供する１又は２以上のグリコシル化部位を含む。一態様では、抗体−抗原複合体は、配列番号４及び６から選択される１又は２以上のリンカーを含む、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＮｅｆ抗原の間に可動性リンカーをさらに含む。一態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＮｅｆ抗原の間に可動性リンカーをさらに含み、このリンカーは、セルロース分解生物に由来するリンカー配列から選択される１又は２以上のグリコシル化部位を含む。一態様では、ＤＣ特異的抗体又はその断片はヒト化されている。さらに別の態様では、抗体−抗原複合体は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、及び１７を含む。別の態様では、抗体−抗原複合体は、複合体の精製又は特定に使用される配列タグをさらに含む。一態様では、ＤＣ特異的抗体又はその断片は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１、並びにＡＳＰＧＲに特異的に結合する抗体から選択される。
【０００８】
本発明のさらに別の実施形態は、１又は２以上のタンパク質分解部位を除去することによりタンパク質分解されにくくなっている改変Ｇａｇ抗原に結合して抗体−抗原複合体を形成するＤＣ特異的抗体又はその断片を含むワクチンである。一態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＧａｇ抗原の間に可動性リンカーをさらに含む。さらに別の態様では、抗体−抗原複合体は、１又は２以上の新しいグリコシル化部位をさらに含む。さらに別の態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＧａｇ抗原の間に可動性リンカーをさらに含み、このリンカーは、抗体と抗原との間の可動性の増加、リンカーのタンパク質分解の減少、及び分泌の増加を提供する１又は２以上のグリコシル化部位を含む。別の態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＧａｇ抗原の間に可動性リンカーをさらに含み、このリンカーは、配列番号４及び６から選択される１又は２以上のリンカーを含む。別の態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＧａｇ抗原の間に可動性リンカーをさらに含み、このリンカーは、セルロース分解生物に由来するリンカー配列から選択される１又は２以上のグリコシル化部位を含む。一態様では、ＤＣ特異的抗体又はその断片はヒト化されている。特定の一態様では、抗体−抗原複合体は、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３１、又は３２から選択される。別の態様では、抗体−抗原複合体は、複合体の精製に使用される配列タグをさらに含む。当業者であれば、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片と抗原との間の結合は、共有結合若しくは非共有結合により形成されてもよいことや、どちらかの部分のアミノ末端若しくはカルボキシ末端における融合タンパク質の形態であってもよいことや、１若しくは２以上の両方の部分によるコンカテマー（contactamer）として形成してもよいことを理解する。一態様では、ＤＣ特異的抗体又はその断片は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１、並びにＡＳＰＧＲに特異的に結合する抗体から選択される。
【０００９】
本発明のさらに別の実施形態は、抗体−抗原複合体の分泌を増加させる１又は２以上のコドン使用頻度の最適化がなされた改変Ｎｅｆ抗原に結合して抗体−抗原複合体を形成するＤＣ特異的抗体又はその断片を含むワクチンである。一態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＮｅｆ抗原の間に可動性リンカーをさらに含む。別の態様では、抗体−抗原複合体は、１又は２以上の新しいグリコシル化部位をさらに含む。さらに別の態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＮｅｆ抗原の間に可動性リンカーをさらに含み、このリンカーは、抗体と抗原との間の可動性の増加、リンカーのタンパク質分解の減少、及び分泌の増加を提供する１又は２以上のグリコシル化部位を含む。別の態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＮｅｆ抗原の間に可動性リンカーをさらに含み、このリンカーは、配列番号４及び６から選択される１又は２以上のリンカーを含む。さらに別の態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＮｅｆ抗原の間に可動性リンカーをさらに含み、このリンカーは、セルロース分解生物に由来するリンカー配列から選択される１又は２以上のグリコシル化部位を含む。特定の一態様では、ＤＣ特異的抗体又はその断片はヒト化されている。別の特定の態様では、抗体−抗原複合体は、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３１、又は３２を含む。さらに別の態様では、抗体−抗原複合体は、複合体の精製に使用される配列タグをさらに含む。当業者であれば、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片と抗原との間の結合は、共有結合若しくは非共有結合により形成されてもよいことや、どちらかの部分のアミノ末端若しくはカルボキシ末端における融合タンパク質の形態であってもよいことや、１若しくは２以上の両方の部分によるコンカテマー（contactamer）として形成してもよいことを理解する。別の態様では、ＤＣ特異的抗体又はその断片は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１、並びにＡＳＰＧＲに特異的に結合する抗体から選択される。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態は、１又は２以上のタンパク質分解部位を除去することによりタンパク質分解されにくくなっている改変Ｇａｇ抗原に結合して抗体−抗原複合体を形成するＤＣ特異的抗体又はその断片と、抗体−抗原複合体の分泌を増加させる１又は２以上のコドン使用頻度の最適化がなされた改変Ｎｅｆ抗原に結合して抗体−抗原複合体を形成するＤＣ特異的抗体又はその断片とを含むワクチンであって、Ｇａｇ  ｐ１７、Ｇａｇ  ｐ２４、及びＮｅｆに対するＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導することができるワクチンである。一態様では、Ｇａｇ及びＮｅｆ抗原は、融合タンパク質を構成する。別の態様では、Ｇａｇ及びＮｅｆ抗原は、１又は２以上の可動性リンカーによって隔てられて融合タンパク質を構成する。一態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＧａｇ又はＮｅｆ抗原の間に可動性リンカーをさらに含み、このリンカーは、配列番号４及び６から選択される１又は２以上のリンカーを含む。一態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＧａｇ抗原の間に可動性リンカーをさらに含み、このリンカーは、セルロース分解生物に由来するリンカー配列から選択される１又は２以上のグリコシル化部位を含む。一態様では、ＤＣ特異的抗体又はその断片はヒト化されている。特定の一態様では、ワクチンは、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３１、又は３２から選択される。別の態様では、抗体−抗原複合体は、複合体の精製に使用される配列タグをさらに含む。
【００１１】
さらに別の実施形態では、本発明は、１又は２以上のタンパク質分解部位を除去することによりタンパク質分解されにくくなっている改変Ｇａｇ抗原に結合して抗体−抗原複合体を形成するＤＣ特異的抗体又はその断片と、ＤＣ特異的抗体若しくはその断片又は改変Ｇａｇ抗原に結合して抗体−抗原複合体を形成し、抗体−抗原複合体の分泌を増加させる１又は２以上のコドン使用頻度の最適化がなされた改変Ｎｅｆ抗原とを含むワクチンであって、Ｇａｇ  ｐ１７、Ｇａｇ  ｐ２４、及びＮｅｆに対するＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導することができるワクチンである。一態様では、ＤＣ特異的抗体又はその断片とＧａｇ及びＮｅｆ抗原は、融合タンパク質を構成する。一態様では、Ｇａｇ及びＮｅｆ抗原は、１又は２以上の可動性リンカーによって隔てられて融合タンパク質を構成する。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態は、患者の樹状細胞を単離し、１又は２以上のタンパク質分解部位を除去することによりタンパク質分解されにくくなっている改変Ｇａｇ抗原に結合して抗体−抗原複合体を形成するＤＣ特異的抗体又はその断片と、ＤＣ特異的抗体若しくはその断片又は改変Ｇａｇ抗原に結合して抗体−抗原複合体を形成し、抗体−抗原複合体の分泌を増加させる１又は２以上のコドン使用頻度の最適化がなされた改変Ｎｅｆ抗原とを含む活性化量のワクチンであって、Ｇａｇ  ｐ１７、Ｇａｇ  ｐ２４、及びＮｅｆに対するＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導することができるワクチンに樹状細胞を曝露し、抗原が負荷され活性化された樹状細胞を患者に再導入することにより、樹状細胞の有効性を増加させるための方法を含む。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態は、１又は２以上のタンパク質分解部位を除去することによりタンパク質分解されにくくなっているサイクリンＤ１又はその断片を含む改変抗原に結合して抗体−抗原複合体を形成するＤＣ特異的抗体又はその断片を含むワクチンを含む。一態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とサイクリンＤ１抗原の間に可動性リンカーをさらに含む。別の態様では、抗体−抗原複合体は、１又は２以上の新しいグリコシル化部位をさらに含む。さらに別の態様では、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とサイクリンＤ１抗原の間に可動性リンカーをさらに含み、このリンカーは、抗体と抗原との間の可動性の増加、リンカーのタンパク質分解の減少、及び分泌の増加を提供する１又は２以上のグリコシル化部位を含む。例えば、抗体−抗原複合体は、ＤＣ特異的抗体又はその断片とサイクリンＤ１抗原の間に可動性リンカーをさらに含むこともでき、このリンカーは、セルロース分解生物に由来するリンカー配列から選択される１又は２以上のグリコシル化部位を含む。一態様では、ＤＣ特異的抗体又はその断片はヒト化されている。別の態様では、ＤＣ特異的抗体又はその断片はコヘリン／ドッケリン対の片方に結合し、改変サイクリンＤ１抗原はコヘリン／ドッケリン対の相補的な片方に結合して複合体を形成する。本発明は、樹状細胞の有効性を増加させるための方法であって、患者の樹状細胞を単離する方法や、１又は２以上のタンパク質分解部位を除去すること、又はグリコシル化部位を導入すること、又は発現を向上させる１又は２以上のコドンの選択により発現を向上させることによりタンパク質分解されにくくなっているサイクリンＤ１又はその断片（複数可）を含む改変抗原に結合して抗体−抗原複合体を形成するＤＣ特異的抗体又はその断片を含む活性化量のワクチンに樹状細胞を曝露する方法や、抗原が負荷され活性化された樹状細胞を患者に再導入する方法も含む。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態は、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３１、又は３２から選択されるポリペプチドをコードする、単離及び精製された核酸を含む。本発明のさらに別の実施形態は、配列番号１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３１、又は３２から選択される、単離及び精製されたポリペプチドを含む。
【００１５】
本発明の特徴及び利点に関するより完全な理解のために、本発明の詳細な記述が、添付の図面と共にここで参照される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｈ鎖−ｇａｇ  ｐ２４融合体をコードする発現ベクターを一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ又は２９３Ｆ細胞から得られ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製されたｇａｇ  ｐ２４−抗体融合タンパク質のクマシーブルー染色還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を、構築体及び予測分子量の略図と共に示す図である。
【図２】セルロソームにアンカーするスキャフォールディンＢ(scaffoldin B)前駆体［バクテロイデス・セルロソルベンス（Bacteroides cellulosolvens）］に由来するＨ鎖−ｇａｇ  ｐ２４リンカーとのＨ鎖−ｇａｇ  ｐ２４融合体をコードする発現ベクター及び対応する軽（Ｌ）鎖発現プラスミドを一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ又は２９３Ｆ細胞から得られ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製されたｇａｇ  ｐ２４−抗体融合タンパク質のクマシーブルー染色還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を、構築体並びに予測グリコシル化部位及び分子量の略図と共に示す図である。
【図３Ａ−３Ｃ】ｃｉｐＡの構造ドメイン模式図を示す図である。
【図４Ａ−４Ｃ】セルロソームにアンカーするスキャフォールディンＢ前駆体［バクテロイデス・セルロソルベンス］の構造ドメイン模式図を示す図である。
【図５】Ｃ５３５コードＨ鎖の予測される近似的位置を示すゲルを、構築体及び予測分子量の略図と共に示す図である。
【図６】適切なＬ鎖発現プラスミドを同時トランスフェクトした［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖａｒ１−Ｖｉｒａｌｇａｇ−ｐ４０−ｖａｒ１−６ｘＨｉｓ］Ｃ６０１の部分的に精製された発現産物のゲルを、構築体並びに予測グリコシル化部位及び分子量の略図と共に示す図である。
【図７】同一の適切なＬ鎖発現構築体と共に２９３Ｆ細胞に一過的に同時トランスフェクトした種々のＨ鎖−抗原構築体を、構築体並びに予測グリコシル化部位及び分子量の略図と共に示す図である。
【図８】ＣＤ４０に結合しそれを活性化することができる抗ＣＤ４０抗体のサブセットを検出するためのスクリーニングから得られたグラフである。
【図９】１０μｇ／ｍｌ〜無抗ＣＤ４０１２Ｅ１２−ｈＩｇＧ４ドッケリン−コヘシンインフルエンザＭ１コンジュゲートの用量範囲により誘導された際のＣＤ８＋染色［横軸］対インフルエンザＭ１四量体染色［縦軸］のＦＡＣＳ解析を示す図である。
【図１０】１０μｇ／ｍｌ〜無対照ｈＩｇＧ４ドッケリン−コヘシンインフルエンザＭ１コンジュゲートの用量範囲により誘導された際の、ＣＤ８＋染色［横軸］対インフルエンザＭ１四量体染色［縦軸］のＦＡＣＳ解析を示す図である。
【図１１】ＰＢＭＣ培養の状況で抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘導する抗ＤＣ受容体−抗原標的化分子（ＴＭ、Targeting Molecule）の効能を、インビトロでアッセイするために使用されるプロトコールを示す図である。
【図１２】抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４ワクチンによるＤＣ標的化［ＰＢＭＣ内］の効果を示す図である。
【図１３】ワクチンが、ｇａｇ  ｐ２４ペプチドクラスターすべてに対して特異性を有するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導することを示す図である。
【図１４】ＦＡＣＳデータを示す図であり、縦軸はＩＦＮγ産生細胞のパーセントを示す［上段パネル］。下段パネルは、ＰＢＭＣ培養内のＣＤ８＋Ｔ細胞に関する同様のデータを示し、このデータは、ｇａｇ  ｐ１７配列を包含するペプチドクラスターがすべて、非ペプチド対照よりも著しく高いＩＦＮγ産生Ｔ細胞の産生を誘導したことも示す。
【図１５】ワクチンが、試験された最も低いワクチン用量でさえ、ほとんどのＨＩＶ  ｎｅｆペプチドクラスターに対して特異性を有するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導し、ＩＦＮγ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントが、細胞をペプチドで処理しなかった場合より著しく高かったことを、グラフ形態のデータで示す図である。
【図１６】ＦＡＣＳデータを示す図であり、ワクチンが、試験された最も低いワクチン用量でさえ、ほとんどのＨＩＶ  ｎｅｆペプチドクラスターに対して特異性を有するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導し、ＩＦＮγ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントが、細胞をペプチドで処理しなかった場合よりも著しく高かったことを示す。
【図１７】データをグラフ形態で示す図であり、縦軸はＩＦＮγ産生細胞のパーセントを示す［上段パネル］。下段パネルは、ＰＢＭＣ培養内のＣＤ８＋Ｔ細胞に関する同様のデータを示し、このデータは、ｎｅｆ配列を包含するペプチドクラスターがすべて、非ペプチド対照よりも著しく高いＩＦＮγ産生Ｔ細胞の産生を誘導したことも示す。
【図１８】前立腺特異的抗原［ＰＳＡ、prostate-specific antigen］に連結された抗ＣＤ４０−１２Ｅ１２を含むワクチンが、未感作Ｔ細胞集団から、広範なＰＳＡエピトープに対応するＰＳＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導する能力を試験するプロトコールの概略を示す図である。
【図１９】多くのＰＳＡペプチドが、強力なＩＦＮγ産生応答を誘導することを示す図であり、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２及び類似の抗ＣＤ４０作用物質が、抗原をＤＣに効果的に送達することができ、抗原の複数のエピトープに対する免疫応答の初回刺激に帰着することを示す。
【図２０】ＤＣを標的とする抗ＣＤ４０−ＰＳＡで標的とされたＤＣが、ＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することを示す図である。ＩＦＮＤＣを、ＰＳＡとのｍＡｂ融合タンパク質１μｇで標的とした。精製された自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞を１０日間共培養した。細胞を、抗ＣＤ８及びＰＳＡ（ＫＬＱＣＶＤＬＨＶ）四量体で染色した。細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性健常供与体に由来する。その結果は、抗ＣＤ４０が効果的にＰＳＡをＤＣに送達し、それはひいてはＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導することを実証する。
【図２１】ＤＣによる標的化された取込み及びその細胞表面上での抗原エピトープの提示に起因する抗原特異的Ｔ細胞の増殖を指図するその能力について、抗ＤＣ受容体標的化ワクチンを試験するためのＤＣ標的化プロトコールを概説する図である。
【図２２】［上段パネル］抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｎｅｆ、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ２４、及び抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４ワクチンの効能の比較を示す図である［患者Ａｐｈ００２］。
【図２２】［下段パネル］抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｎｅｆ、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ２４、及び抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４ワクチンの効能の比較を示す図である［患者Ａｐｈ００２］。
【図２３】［上段パネル］抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｎｅｆ、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ２４、及び抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４ワクチンの効能の比較を示す図である［患者Ａｐｈ０１０］。
【図２３】［下段パネル］抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｎｅｆ、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ２４、及び抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４ワクチンの効能の比較を示す図である［患者Ａｐｈ００２］。
【図２４】コヘシン−サイクリンＤ１融合タンパク質と抗ＤＣ受容体−ドッケリン組換え抗体との相互作用の分析を示すゲルである。
【図２５】サイクリンＤ１に由来する重複ペプチドの模式図を示す図である。
【図２６】抗ＣＤ４０−サイクリンＤ１複合体が、サイクリンＤ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖をインビトロで誘導する能力を試験する研究計画の模式図（左）、及びそれにより得られたＦＡＣＳ結果（右）を示す図である。
【図２７】図２６に詳述されているものと類似した、異なる正常供与体でのＦＡＣＳ解析を示す図であり、この場合、抗ＣＤ４０−サイクリンＤ１複合体は、サイクリンＤ１ペプチドＰ４、Ｐ４３、及びＰ７０に特異的なＩＦＮｇ陽性の増殖性ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導した。
【図２８】ＣＤ８＋Ｔ細胞が使用されたことを除いて、図２６に示すものと類似した模式図（左）及び解析（右）を示す図である。
【図２９】図２８と同じ供与体に由来するが、ペプチドの貯留に由来する個々のペプチドで解析した類似データを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の種々の実施形態の作製及び使用を下記で詳細に考察するが、本発明は、多種多様な特定の状況で実施することができる多数の応用可能な発明概念を提供することを認識されたい。本明細書で考察される特定の実施形態は、本発明を作製及び使用する特定の方法を例示するに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１８】
本発明の理解を容易にするため、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書で定義する用語は、本発明に関連する分野における当業者によって共通に理解される意味を有する。「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの用語は、単一の実体のみを指すものではなく、その具体例が例示に使用されることがある一般的な種類を含む。本明細書の用語を使用して本発明の特定の実施形態を記載するが、その使用は、特許請求の範囲での記述を除いて、本発明を限定するものではない。
【００１９】
樹状細胞（ＤＣ、dendritic cell）は、抗原特異的免疫を調節する上で重要な役割を果たす抗原提示細胞である（Mellman and Steinman 2001）、（Banchereau, Briere et al. 2000）、（Cella, Sallusto et al. 1997）。ＤＣは、抗原を捕捉し、それらをペプチドにプロセシングし、これらをＴ細胞に提示する。したがって、抗原をＤＣに直接送達することは、ワクチンを改良するための重要な領域である。そのような一例は、その後患者に再投与される自己由来ＤＣのエクスビボ抗原負荷を使用した、ＤＣに基づくワクチンの開発である（Banchereau, Schuler-Thurner et al. 2001）、（Steinman and Dhodapkar 2001）。ワクチン効能を向上させる別の戦略は、内部移行化ＤＣ特異的受容体に対する抗体とコンジュゲートした抗原をＤＣに特異的に標的化することである。ワクチン接種用にＤＣを標的とする可能性は、重要なマウス研究により注目されている。インビボにおいて、オバルブミン（ＯＶＡ、ovalbumin）と結合した抗ＬＯＸ−１  ｍＡｂによる標的化は、ＭＨＣクラスＩ経路に対する外来性抗原交差提示により、防御的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導した（Delneste, Magistrelli et al. 2002）。また、抗ＤＥＣ２０５  ｍＡｂとコンジュゲートしたＯＶＡは、ＣＤ４０Ｌ成熟刺激との組み合わせで、ＤＣによるＭＨＣクラスＩ限定的提示をインビボで増強し、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の永続的形成に結び付いた（Bonifaz, Bonnyay et al. 2004）。これらの研究は両方とも、劇的な用量低減（つまり、非常に低い抗原用量で強力な免疫応答）を示し、他のタイプのＯＶＡ免疫で通常見られるより広範な応答を示唆した。ＤＥＣ２０５によるＨＩＶ  ｇａｇ抗原のＤＣへの標的化に関する最近の研究は、これらの概念を臨床的に関連する抗原に拡張し、抗原をＤＣに標的化することに関するテネント（tenent）、劇的な用量低減、単回ワクチン接種からの防御的応答、並びにＣＤ８及びＣＤ４の両区画の抗原特異的Ｔ細胞の増殖を確認した（Trumpfheller, Finke et al. 2006）。
【００２０】
本発明は、複数の抗原又はタンパク質（一次ｍＡｂから独立して改変され、発現され、精製された）を、制御された多変量の様式で単一の一次組換えｍＡｂと複合体化することを提供する。現在、異なるタンパク質（各々が別々に改変されてストレプトアビジンに連結される）が１つの一次ｍＡｂに付加されることを提供する部位特異的なビオチン化部位を改変するための方法が存在する。しかしながら、本発明は、複数の組み合わせの一次ｍＡｂを、一定の等モル比率及び位置で、別々に改変されたタンパク質に付加することを提供する。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「抗体又はその断片」という用語は、標的特異的抗体を提供するように改変された組換え抗体系を記述するために使用される。モノクローナル抗体は、標準的ハイブリドーマ技術、組換え抗体ディスプレイ、及びヒト化モノクローナル抗体などを使用して作製された。抗体を使用して、例えば、複数の抗原及び／又は抗原及び樹状細胞（ＤＣ）に対する活性化サイトカインを標的とすることができる（内部移行化受容体、例えばヒト樹状細胞受容体に対する１つの一次組換え抗体により）。
【００２２】
抗体の抗原結合部分には、１又は２以上の可変ドメイン、１又は２以上の可変ドメイン、及び第１の定常ドメインを含んでいてもよい１又は２以上の断片（つまり、その断片）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、並びにＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片、並びに／又は同系モジュール型結合部分がアミノ酸配列に付加及び／若しくは結合されたＦｃドメインの部分を有するＦａｂ断片が含まれる。使用する抗体は、任意のアイソタイプ若しくはクラス、サブクラス、又は任意の供給源由来（動物及び／又は組換え）であってもよい。ある態様では、抗原結合部位は、当技術分野で周知の技術を使用して、ヒト抗体骨格上に移植されている非ヒトモノクローナル抗体に由来し、それにより抗体が「ヒト化」される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗原の受容個体において体液性免疫反応及び／又は細胞性免疫反応を開始することができる分子を指す。抗原は、抗体又は改変抗体若しくは組換え抗体（ｒＡｂ、recombinant antibody）の他の抗原認識ドメインの標的として、又はコンジュゲート（共有結合又は非共有結合で結合されている）若しくは融合タンパク質としてｒＡｂにより細胞に及び／若しくは細胞内に運搬するか若しくは細胞を標的とする分子として、本発明では２つの異なる状況で使用することができる。抗原は、通常、ワクチン接種が有利な治療であるはずの疾患を引き起こす作用物質である。抗原がＭＨＣ上に提示される場合、ペプチドは、約８〜約２５個のアミノ酸であることが多い。抗原には、例えば、単純な中間代謝産物、糖、脂質、及びホルモン、並びに複合糖質、リン脂質、核酸、及びタンパク質などの巨大分子を含む任意のタイプの生体分子が含まれる。抗原の一般的な分類には、これらに限定されないが、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物及び他の寄生虫抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギー、及び移植片拒絶に関与する抗原、並びに他の様々な抗原が含まれる。本発明は、特徴（例えば、タンパク質分解の減少、分泌の増強、発現又は安定性の増強）が向上し且つ抗体又はその断片を使用して抗原提示細胞に標的化される、ウイルス由来の抗原を使用する。
【００２４】
ウイルス抗原の例には、これらに限定されないが、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、及び他のＨＩＶ成分などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ、human immunodeficiency virus）抗原に由来するレトロウイルス抗原などのレトロウイルス抗原；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ、及びＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスの前Ｓ抗原、及びＣ型肝炎ウイルスＲＮＡなどの他の肝炎、例えばＡ型、Ｂ型、及びＣ型肝炎ウイルス成分などの肝炎ウイルス抗原；赤血球凝集素及びノイラミニダーゼ及び他のインフルエンザウイルス成分などのインフルエンザウイルス抗原；麻疹ウイルス融合タンパク質及び他の麻疹ウイルス成分などの麻疹ウイルス抗原；タンパク質Ｅ１及びＥ２並びに他の風疹ウイルス成分などの風疹ウイルス抗原；ＶＰ７ｓｃ及び他のロタウイルス成分などのロタウイルス抗原；エンベロープ糖タンパク質Ｂ及び他のサイトメガロウイルス抗原成分などのサイトメガロウイルス抗原；ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２タンパク質、及び他の呼吸器多核体ウイルス抗原成分などのＲＳウイルス性抗原；前初期タンパク質、糖タンパク質Ｄ、及び他の単純ヘルペスウイルス抗原成分などの単純ヘルペスウイルス抗原；ｇｐＩ、ｇｐII、及び他の水痘帯状疱疹ウイルス抗原成分などの水痘帯状疱疹ウイルス抗原；タンパク質Ｅ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ、８０％Ｅ、及び他の日本脳炎ウイルス抗原成分などの日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質、及び他の狂犬病ウイルス抗原成分などの狂犬病ウイルス抗原が含まれる。ウイルス抗原のさらなる例は、Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. （Raven Press, New York, 1991）を参照されたい。
【００２５】
本発明のｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンを使用して送達することができる抗原標的には、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、又は寄生虫抗原などの抗原をコードする遺伝子が含まれる。ウイルスには、ピコルナウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビルウイルス（flavirvirus）、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、パピローマウイルス（papilomavirus）、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、及び海綿状ウイルス（spongiform virus）が含まれる。他のウイルス標的には、インフルエンザ、単純疱疹ウイルス１及び２、麻疹、デング熱、天然痘、ポリオ、又はＨＩＶが含まれる。病原体には、トリパノソーマ、サナダムシ、回虫、蠕虫、マラリアが含まれる。胎児性抗原又は前立腺特異的抗原などの腫瘍マーカーを、この様式で標的とすることができる。他の例には、ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質及びＢ型肝炎表面抗原が含まれる。ワクチン接種用の本発明によるベクターの投与には、ベクター関連抗原が、それに対する強力な免疫応答が望ましい導入遺伝子の長期的発現を可能にするほど十分に非免疫原性であることが必要とされよう。ある場合には、個体のワクチン接種は、年１回又は２年に１回など、低頻度でしか必要とされなくてもよく、感染因子に対する長期的な免疫学的防御を提供することができる。ベクターに及び最終的には抗原として本発明と共に使用するための生物、アレルゲン、並びに核酸配列及びアミノ配列の具体的な例は、米国特許第６，５４１，０１１号明細書に見出すことができ、関連部分、特に本発明と共に使用することができる生物及び特定の配列と一致する表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２６】
本発明のｒＡｂを使用して標的とすることができる、免疫細胞、例えば抗原提示細胞又は樹状細胞の表面上の抗原は、一般的に、内部移行化の可能性、免疫細胞特異性のレベル、標的とされる免疫細胞のタイプ、免疫細胞成熟及び／又は活性化のレベルなどを含むいくつもの要因に基づいて選択されることになる。樹状細胞の細胞表面マーカーの例には、これらに限定されないが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、Ｂ７−２、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、及び／又はＡＳＰＧＲなどが含まれ、その一方である場合では、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、及び／又はＣＤ５７が存在しないこともある。抗原提示細胞の細胞表面マーカーの例には、これらに限定されないが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ４０、ＣＤ４５、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１、又はＡＳＰＧＲが含まれる。Ｔ細胞の細胞表面マーカーの例には、これらに限定されないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが含まれる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「エピトープ（複数可）」という用語は、病原体ＤＮＡ又はＲＮＡによりコードされた多数の病原体ポリペプチドのいずれか内に位置するエピトープに類似した一次、二次、又は三次構造を含むペプチド抗原又はタンパク質抗原を指す。類似性のレベルは、一般的に、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体がそのようなポリペプチドに向けられた場合、そのペプチド又はタンパク質抗原に結合、反応するか、又はかかるペプチド又はタンパク質抗原を認識するレベルである。例えばウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、及びＲＩＡなどの種々のイムノアッセイ法を、そのような抗体と共に使用することができ、それらのすべては当業者に公知である。ワクチンに使用するのに好適な病原体エピトープ及び／又はそれらの機能的同等物の特定は本発明の一部である。単離及び特定されれば、機能的同等物を容易に取得することができる。例えば、親水性に基づくアミノ酸配列からのエピトープの特定及び調製を教示する米国特許第４，５５４，１０１号明細書に教示されているようなＨｏｐｐ法を使用することができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。他のいくつかの文献に記述されている方法及びそれに基づくソフトウェアプログラムを使用して、エピトープコア配列を特定することもできる（例えば、Jameson and Wolf, 1988、Wolf et al., 1988、米国特許第４，５５４，１０１号明細書）。その後、これら「エピトープコア配列」のアミノ酸配列を、ペプチド合成又は組換え技術のいずれかを応用することにより、ペプチドに容易に組み込むことができる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、均質な抗体集団を有する抗体組成物を指す。この用語は、抗体の種又は由来に関して制限を受けず、それが作られる様式により制限されることも意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及び親モノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の断片などの断片を包含する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」又は「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基により形成される。重鎖及び軽鎖のＶ領域内にある３つの高度に多様な伸長は「超可変領域」と呼ばれ、それは、「フレームワーク領域」（ＦＲ、framework region）として知られているより保存された隣接伸長の間に挿入されている。本明細書で使用される場合、「ＦＲ」という用語は、天然では、免疫グロブリンの超可変領域の間に隣接して見出されるアミノ酸配列を指す。抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域が、三次元空間で互いに対して配置され、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合する抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「ヒト化」抗体という用語は、ヒト定常ドメインに融合されたげっ歯動物Ｖ領域及びそれらに伴うＣＤＲを有するキメラ抗体、適切なヒト抗体定常ドメインと組換え的に表面修飾された（veneered）げっ歯動物ＦＲにより支持されたげっ歯動物ＣＤＲとを融合させる前にヒト支持ＦＲに移植されたげっ歯動物ＣＤＲを有するキメラ抗体を含む、非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含む分子を指す。これら「ヒト化」分子は、ヒト受容個体におけるそれらの部分の治療応用の作用期間及び有効性を制限する、げっ歯動物抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小限に抑えるように設計されている。
【００３１】
本発明の抗原をコードする核酸を活性成分として含むワクチン組成物の調製は、液状の液剤又は懸濁剤のいずれかとして注射剤として調製することができ、感染前に液剤又は懸濁剤に液状化するのに好適な固体形態を調製することもできる。調製物は、乳化されていてもよく、リポソームに封入されていてもよい。活性免疫原成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合する担体と混合されていることが多い。
【００３２】
「薬学的に許容される担体（キャリヤ［carrier］）」という用語は、それを投与する対象にアレルギー反応又は他の悪影響を引き起こさない担体を指す。好適な薬学的に許容される担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、又はエタノールなどの１又は２以上及びそれらの組み合わせが含まれる。加えて、必要に応じて、ワクチンは、湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの有効性を増強するアジュバントなどの少量の補助物質を含有することができる。有効であり得るアジュバントの例には、これらに限定されないが、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン、（ｔｈｒ−ＭＤＰ、N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine）、Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、ＭＴＰ−ＰＥ、及びＲ１Ｂ１（これは、２％スクワレン／トウィーン８０乳濁液中に細菌から抽出された３つの成分、モノホスポリル（monophosporyl）リピドＡ、トレハロースジミコラート（trehalose dimycolate）及び細胞壁骨格（ＭＰＬ（monophosporyl lipid A）＋ＴＤＭ（trehalose dimycolate）＋ＣＷＳ（cell wall skeleton））を含有する）が含まれる。アジュバントの他の例には、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ、dimethyldioctadecylammonium bromide）、フロインド完全及び不完全アジュバント、及びＱｕｉｌＡが含まれる。加えて、リンホカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＩＬ−１２）又はポリＩ：Ｃなどの合成ＩＦＮ−γ誘導因子などの免疫調節物質を、本明細書に記述されているアジュバントと組み合わせて使用することができる。
【００３３】
本発明で記述されている、血漿リポタンパク質上に存在するアポリポタンパク質の特異的ＤＮＡ結合部位に結合する単一コピー又は複数コピーの特定のヌクレオチド配列を有するネイキッドポリヌクレオチド（naked polynucleotide）を含んでいてもよい医薬品。ポリヌクレオチドは、生物学的活性ペプチド、アンチセンスＲＮＡ、又はリボザイムをコードするものであってよく、生理学的に許容される投与可能な形態で提供されるであろう。本発明から生じ得る別の医薬品は、本明細書に記述されている方法により患者血液又は他の供給源から単離された高度に精製された血漿リポタンパク質画分と、血漿リポタンパク質上に存在するアポリポタンパク質の特異的ＤＮＡ結合部位に結合する単一コピー又は複数コピーの特定のヌクレオチド配列を含有し、生理学的に許容される投与可能な形態の精製リポタンパク質分画にあらかじめ結合されているポリヌクレオチドとを含むこともできる。
【００３４】
さらに別の医薬品は、単一コピー又は複数コピーの特定のヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドにあらかじめ結合された単一コピー又は複数コピーの特定のＤＮＡ結合モチーフを含有する組換えアポリポタンパク質断片を含有する、高度に精製された血漿リポタンパク質画分を、生理学的に許容される投与可能な形態で含むこともできる。さらに別の医薬品は、単一コピー又は複数コピーの特定のヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドにあらかじめ結合された単一コピー又は複数コピーの特定のＤＮＡ結合モチーフを含有する組換えアポリポタンパク質断片を含有する、高度に精製された血漿リポタンパク質画分を、生理学的に許容される投与可能な形態で含むこともできる。
【００３５】
投与される用量は、治療されている対象の体重及び身体状況、並びに投与経路及び治療の頻度に大きく依存する。高度に精製されたリポタンパク質画分にあらかじめ結合されたネイキッドポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、１μｇ〜１ｍｇの範囲の量のポリヌクレオチド及び１μｇ〜１００ｍｇの範囲の量のタンパク質で投与することができる。
【００３６】
患者へのワクチン投与は、ベクターに毒性があればそれを考慮に入れて、化学療法剤投与の一般的なプロトコールに従うことになる。必要に応じて、治療サイクルが繰り返されることになることが予想される。記述されている遺伝子治療と組み合わせて、種々の標準的治療並びに外科的介入を適用することができることも企図される。
【００３７】
遺伝子治療の臨床応用が企図される場合、意図されている応用に適切な医薬組成物として複合体を調製することが必要とされよう。一般的に、これには、発熱性物質並びにヒト又は動物に有害であり得る任意の他の不純物を本質的に含まない医薬組成物を調製することも必要とされよう。複合体を安定化させ、標的細胞による複合体取込みを可能にする適切な塩及び緩衝剤を使用することが、一般的に望ましいであろう。
【００３８】
本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体又は水性媒質中に溶解又は分散された有効量の化合物を含むことができる。そのような組成物は、接種物と呼ばれる場合もある。医薬活性物質用のそのような媒質及び作用物質の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒質又は作用物質が活性成分と適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助活性成分を、組成物に組み込むこともできる。本発明の組成物は、古典的な医薬品を含んでいてもよい。分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物、並びに油中で調製することもできる。通常の保管及び使用条件下では、これら調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。
【００３９】
疾患状態。治療される特定の疾患に応じて、本発明による治療用組成物の投与は、最大限の（又は、ある場合では最小限の）免疫応答のために、ある部位への抗原の送達を最大化するために標的組織がその経路で利用可能である限り、任意の一般的な経路により行われるであろう。投与は、一般的に同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈注射により行われるであろう。送達用の他の領域には、経口、経鼻、頬側、直腸内、膣内、又は局所送達が含まれる。局所投与は、特に皮膚癌の治療に有利であろう。そのような組成物は、通常、生理学的に許容される担体、緩衝剤、又は他の賦形剤を含む薬学的に許容される組成物として投与される。
【００４０】
本発明のワクチン又は治療用組成物は、注射により非経口的に、例えば皮下又は筋肉内のいずれでも投与することができる。他の投与方法に好適なさらなる製剤には、坐剤、及びある場合には、経口製剤、又はエアゾール剤としての分配に好適な製剤が含まれる。経口製剤の場合、Ｔ細胞サブセットの操作には、アジュバント、抗原パッケージング、又は種々の製剤への個々のサイトカインの添加を使用し、それは最適化された免疫応答を有する改良された経口ワクチンに帰着する。坐剤の場合、従来の結合剤及び担体は、例えばポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含んでいてもよく、そのような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成されてもよい。経口製剤は、例えば医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、及び炭酸マグネシウムなどのような通常使用される賦形剤を含む。これら組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、又は散剤の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含有する。
【００４１】
本発明の核酸をコードする抗原を、中性又は塩形態としてワクチン又は治療用組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）が含まれており、それらは、例えば、塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、及びマレイン酸などの有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又はヒドロイド第二鉄（ferric hydroide）などの無機塩基、並びにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、及びプロカインなどの有機塩基に由来する場合もある。
【００４２】
ワクチン又は治療用組成物は、投与製剤と適合するように、予防的に及び／又は治療的に有効となる量で投与される。投与される量は、治療される対象に依存し、それには、例えば抗体を合成する対象の免疫系の能力、及び所望の保護作用又は治療の程度が含まれる。好適な用量範囲は、１ワクチン接種当たり約数百マイクログラムの活性成分であり、約１ｍｇ〜３００ｍｇの範囲、及び好ましくは約１０ｍｇ〜５０ｍｇの範囲など、約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲である。初回投与及び追加接種に好適な投与計画も多様であるが、典型的には、初回投与を行い、その後次回接種又は他の投与を行う。投与に必要な正確な量の活性成分は専門家の判断により、各対象に固有であり得る。本発明の核酸分子又は融合ポリペプチドの治療上有効量は、特に、投与スケジュール、投与される抗原の単位用量、核酸分子又は融合ポリペプチドが他の治療薬と組み合わせて投与されるかどうか、受容個体の免疫状態及び健康状態、並びに特定の核酸分子又は融合ポリペプチドの治療活性に依存することになることは当業者であれば明白であろう。
【００４３】
本組成物は、単回投与スケジュールで投与してもよく、又は複数回投与スケジュールで投与してもよい。複数回投与スケジュールは、ワクチン接種の一次治療単位が、例えば１〜１０回の個別投与後、免疫応答を維持及び／又は強化するのに必要なその後の時間間隔で他の投与が行われ、例えば第２の投与の場合は１〜４カ月で投与され、必要な場合には、数カ月後に次回投与（複数可）を行うことを含んでいてもよいスケジュールである。１〜５年、通常は３年の間隔での定期的追加接種が、所望のレベルの防御免疫を維持するために望ましい。免疫化の治療単位の後、ＥＳＡＴ６又はＳＴ−ＣＦと共に共培養された末梢血リンパ球（ＰＢＬ、peripheral blood lymphocyte）のインビトロ増殖アッセイを行い、感作リンパ球から放出されるＩＦＮ−γレベルを測定することができる。アッセイは、放射性ヌクレオチド、酵素、及び蛍光標識などの従来の標識を使用して実施することができる。これらの技術は当業者に公知であり、米国特許第３，７９１，９３２号明細書、第４，１７４，３８４号明細書、及び第３，９４９，０６４号明細書に見出すことができ、関連部分は参照により組み込まれる。
【００４４】
本発明のワクチンは、核酸ベクターが使用されるのか、最終精製タンパク質又は最終ワクチン形態が使用されるのかに依存して、１又は２以上の「単位用量」で提供することができる。単位用量は、その投与、つまり適切な経路及び治療計画に従って所望の応答をもたらすように計算された所定量の治療用組成物を含有することと定義される。投与される量並びに特定の経路及び製剤は、臨床分野の当業者の技術範囲内にある。治療される対象は、特に、対象の免疫系の状態及び所望の防御を評価することもできる。単位用量は、単回注射として投与する必要はないが、所定の期間にわたる持続点滴を含んでいてもよい。本発明の単位用量は、体重１ｋｇ当たりのＤＮＡ（又はタンパク質）の単位で便利に記述することができ、体重１ｋｇ当たり約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５、１、１０、５０、１００、又は１，０００ｍｇ以上のＤＮＡ又はタンパク質の間の範囲で投与される。同様に、送達されるｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの量は、体重１ｋｇ当たり約０．２〜約８．０ｍｇで変動する場合がある。したがって、特定の実施形態では、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．８ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、４．０ｍｇ、５．０ｍｇ、５．５ｍｇ、６．０ｍｇ、６．５ｍｇ、７．０ｍｇ、及び７．５ｍｇのワクチンを、インビボで個体に送達することができる。投与されるワクチンの用量は、治療されている対象の体重及び身体状態、並びに投与経路及び治療の頻度に大きく依存する。リポソーム又はウイルス送達ベクターにあらかじめ結合されたネイキッドポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、１μｇ〜１ｍｇのポリヌクレオチドから１μｇ〜１００ｍｇのタンパク質の範囲の量で投与することができる。したがって、特定の組成物は、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３．０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、又は１００ｍｇのベクターに独立して結合されている、約１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、又は１，０００μｇの間のポリヌクレオチド又はタンパク質を含むこともできる。
【００４５】
本発明は、例えば、リシン、炭疽菌毒素、及びスタフィロコッカスＢエンテロトキシン（Staphylococcus B enterotoxin）に由来する防御抗原と複合体化された組換えヒト化ｍＡｂ（特定のヒト樹状細胞受容体に対する）であるモジュール型ｒＡｂ担体を作製するために使用することもできる。この物質の潜在的市場は、全軍関係者のワクチン接種、及びこれら作用物質と関連するあらゆる生物脅威に対応して大規模人口密集地に投与するための備蓄される保存ワクチンである。本発明は、一般的に、ヒト及び動物の両方に使用するためのワクチンを設計するための広範な応用を有する。対象とする産業には、医薬品産業及びバイオテクノロジー産業が含まれる。
【００４６】
本発明は、抗原に対する強力で広範な免疫応答を誘導するために、抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ、antigen-presenting cell）に特異的に標的化する（送達する）ワクチンを含む組成物及び方法を含む。これら組成物は、抗原がそれに由来した作用物質（病原体又は癌）に対する防御的又は治療的免疫応答を誘起する。加えて、本発明は、それらが抗原提示細胞と特異的に結び付くことにより、直接的に又は他の作用物質と協同して治療的である作用物質を生成する。
【００４７】
Ｇａｇ−Ｎｅｆワクチン。下記に示す配列は、ｐ２４領域［イタリック体］が、ヒト主要組織適合複合体クラスII、ＤＲアルファ前駆体の可動性ループに由来する短スペーサー［太字］を介してｈＩｇＧ４ＨのＣ末端に連結されている、重鎖（Ｈ）−ＨＩＶ  ｇａｇ  ｐ２４融合タンパク質である。下線のＡＳ残基は、構築目的に使用された制限部位［この場合は、ＮｈｅＩ］によりコードされている。このタイプの抗体−ｐ２４融合タンパク質は、科学文献に記述されている［例えば、Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses(2006) Boscardin et al., JEM, Volume 203, Number 3, 599-606］。
【００４８】
改良された抗体−抗原リンカー配列。［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｖｉｒａｌｇａｇ］Ｃ２４１は以下の通りである:
【００４９】
【表１】
0005984388.tif 000002
【００５０】
図１のレーン１及び２は、Ｈ鎖−ｇａｇ  ｐ２４融合体をコードする［例えば、天然シグナル配列に先行して上記のＣ２４１をコードする］発現ベクター及び対応する軽鎖［Ｌ］発現プラスミドを一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ又は２９３Ｆ細胞から得られ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製されたｇａｇ  ｐ２４−抗体融合タンパク質の、クマシーブルー染色還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。典型的には、分泌されるタンパク質産生の場合、同時トランスフェクション培養を数日間まで継続させ、その後培養液上清を回収し、その後精製する。全長［約７７ｋＤａ］Ｈ鎖−ｇａｇ  ｐ２４融合体鎖は、上の矢印により示す。切断されたＨ鎖産物［下の矢印］は、別のタンパク質に融合されていないＨ鎖［約５０ｋＤａバンドとしてレーン４に示す］よりわずかにゆっくりと移動することも示される。この結果は、Ｈ鎖−ｐ２４リンカー配列がタンパク質分解性切断に感受性であり、そのため産生され分泌される抗体−抗原融合タンパク質の完全性が損なわれることを示唆する。
【００５１】
対照的に、抗体−インフルエンザＨＡ１−１融合タンパク質は、Ｈ鎖Ｃ末端とＨＡ１−１ドメインとの間での著しい切断が観察されることなく分泌及び回収することができる。［ｍＡｎｔｉ−ＬＯＸ−１１５Ｃ４Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ＦｌｕＨＡ１−１−６ｘＨｉｓ］Ｃ１１４は、以下の通りである：
【００５２】
【表２】
0005984388.tif 000003
【００５３】
この場合、セルロソームにアンカーするスキャフォールディンＢ(scaffoldin B)前駆体［クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）ＡＴＣＣ２７４０５に由来するＣｉｐＡ］に由来する短リンカー［太字］を、Ｈ鎖Ｃ末端と［下線で示す連結配列を介して］インフルエンザＨＡ１−１ドメイン［イタリック体］との間に挿入した。Ｈ鎖Ｃ末端とＨＡ１−１ドメインとの間に明らかなタンパク質分解性切断はない［図１レーン３］。
【００５４】
図２のレーン３は、セルロソームにアンカーするスキャフォールディンＢ前駆体［バクテロイデス・セルロソルベンス］に由来するＨ鎖−ｇａｇ  ｐ２４リンカーとのＨ鎖−ｇａｇ  ｐ２４融合体をコードする発現ベクター及び対応する軽［Ｌ］鎖発現プラスミドを一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｓ又は２９３Ｆ細胞から得られ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製されたｇａｇ  ｐ２４−抗体融合タンパク質の、クマシーブルー染色還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【００５５】
［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖａｒ１−Ｖｉｒａｌｇａｇ−ｖａｒ１−６ｘＨｉｓ］Ｃ５６０は、下記に示す［下線の残基は制限部位連結配列に由来し、太字は可動性リンカー残基である］：
【００５６】
【表３】
0005984388.tif 000004
【００５７】
上記の抗体−ｇａｇ  ｐ２４融合タンパク質は、Ｈ鎖Ｃ末端とｇａｇ  ｐ２４ドメインとの間に検出可能な切断がなく、完全のまま（インタクト）で産生される。したがって、ＱＴＰＴＮＴＩＳＶＴＰＴＮＮＳＴＰＴＮＮＳＮＰＫＰＮＰ（配列番号４）リンカー配列は、ｇａｇ  ｐ２４ワクチンの生産目的に優れている。
【００５８】
好ましいリンカー配列は、スキャフォールディン及び関連タンパク質に由来した。下記の配列は、セルロース分解バクテリアに由来するスキャフォールディンであるＣｉｐＡである。このタンパク質は、明らかに可動性になるように進化したリンカー配列［イタリック体］で分散された複数のコヘシンドメインを含有し、このタンパク質が（ｉ）糖結合ドメイン［ＣＢＭ−３、図３］を介してセルロースマトリックスにアンカーする、及び（ii）酵素連結ドッケリンドメインを介してエンドグルカナーゼＤなどのセルロース分解酵素に結合する役割を反映する。
【００５９】
＞ｇｉ｜２５０６９９１｜ｓｐ｜Ｑ０６８５１｜ＣＩＰＡ＿ＣＬＯＴＭ  セルロソーム足場プロテインＡ前駆体（セルロソーム糖タンパク質Ｓ１／ＳＬ）（セルロース組み込みプロテインＡ）（コヘシン）［クロストリジウム・サーモセラム  ＡＴＣＣ２７４０５］。太字の残基は、上記のＣ１１４構築体に使用されるリンカー配列である。
【００６０】
【表４】
0005984388.tif 000005
【００６１】
図３Ａ〜３Ｃは、ｃｉｐＡの構造ドメインの模式図を示す。図３Ａは、構造ドメインの模式図を示し、ｃｉｐＡのＮｅｔＯＧｌｙｃ１．０サーバー及びＮｅｔＮＧｌｙｃ１．０サーバー解析は、高度に予測されたＯ結合グリコシル化部位（図３Ｃ）及びＮ結合グリコシル化部位を示す（図３Ｃ）。特に、Ｏ結合部位は、大部分がリンカー配列内にある。
【００６２】
ｃｉｐＡ  Ａに類似する別の例を、下記に示す。上記のＣ５６０に示すリンカー配列［ＱＴＰＴＮＴＩＳＶＴＰＴＮＮＳＴＰＴＮＴＳＴＰＫＰＮＰ］（配列番号６）は、この配列［ＮからＴの置換は除いて、太字イタリック体で下記に示す］に由来し、２つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を含有する［下線］。下記に記述されている構築体及び／又はＨＩＶペプチド開示で使用される他のリンカー配列は、太字で示す。
【００６３】
＞ｇｉ｜５０６５６８９９｜ｇｂ｜ＡＡＴ７９５５０．１｜  セルロソームにアンカーするスキャフォールディンＢ前駆体［バクテロイデス・セルロソルベンス］
【００６４】
【表５】
0005984388.tif 000006
【００６５】
図４Ａ〜４Ｃは、セルロソームにアンカーするスキャフォールディンＢ前駆体［バクテロイデス・セルロソルベンス］の構造ドメインの模式図を示す。図４Ａは、構造ドメインの模式図を示し、ｃｉｐＡのＮｅｔＯＧｌｙｃ１．０サーバー及びＮｅｔＮＧｌｙｃ１．０サーバー解析は、高度に予測されたＯ結合グリコシル化部位（図４Ｂ）及びＮ結合グリコシル化部位（図４Ｃ）を示す。特に、Ｏ結合部位は、大部分がリンカー配列内にある。
【００６６】
本発明は、セルロース分解生物に由来する構造ドメイン間リンカー配列、好ましくはタンパク質工学のドメイン間リンカー配列、特に真核生物発現宿主で産生される改変タンパク質に使用するための高度に予測されたグリコシル化部位を有するドメイン間リンカー配列を使用するための組成物及び方法を含む。これら配列を使用して得られる特性の向上の中には、ｉ）固有な可動性（それにより、連結されたドメインの分離が容易になり、それが、連結されたドメインが合成中に正しく折り畳まれることに大きく寄与するはずであり、Ｂ細胞受容体を抗原立体構造エピトープと一致させることによる明確な接近可能性を維持する）；ii）グリコシル化（それにより、産物融合タンパク質の分泌及び溶解性に寄与し、リンカー配列をプロテアーゼから遮蔽する）がある。
【００６７】
ｇａｇ配列のタンパク質分解性切断部位の除去。図５のレーン１［下］は、適切なＬ鎖発現プラスミドと共に同時トランスフェクトした［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｖｉｒａｌｇａｇ−ｐ４０］Ｃ５３５の精製された発現産物を示す。Ｃ５３５の成熟Ｈ鎖配列［ｇａｇ残基はイタリック体であり、連結制限部位をコードする残基は下線で示す］は、以下の通りである：
【００６８】
【表６】
0005984388.tif 000007
【００６９】
図５の上の矢印は、Ｃ５３５をコードしたＨ鎖の予測される近似的位置を示し、産物のほんの一部だけがこの位置のバンドを有することを示す。下の矢印で示す大部分の産物は、サイズがより短いＨ鎖であり、ｇａｇ  ｐ１７−ｐ２４境界付近にプロテアーゼ感受性部位が存在することを示唆する。
【００７０】
図６のレーン３［下］は、適切なＬ鎖発現プラスミドと共に同時トランスフェクトした［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖａｒ１−Ｖｉｒａｌｇａｇ−ｐ４０−ｖａｒ１−６ｘＨｉｓ］Ｃ６０１の部分的に精製された発現産物を示す。Ｃ５３５の成熟Ｈ鎖配列［ｇａｇ残基はイタリック体であり、連結制限部位をコードする残基は下線で示し、可動性リンカー残基は太字である］は、以下の通りである：
【００７１】
【表７】
0005984388.tif 000008
【００７２】
上記のｇａｇ配列は、ｇａｇ  ｐ１７のＣ末端側にある潜在的プロテアーゼ感受性部位を取り除く、ＫＫＫからＶＤＥＳＦへの配列変更［上記に下線で示す］を有しており、図６は、このバリアント形態が、大部分は分解されていないＨ鎖と共に産生されることを示す［レーン３のより低分子量のバンドは「バックグラウンド不純物」である。図７を参照］。
【００７３】
特定の一実施形態では、本発明は、分泌される連結ｇａｇ  ｐ１７＋ｐ２４タンパク質のタンパク質分解性切断を防止する、上記で定義されたＫＫＫ配列に関する変更を有するｇａｇ  ｐ４０［ｐ１７＋ｐ２４］のバリアントを含む。
【００７４】
好ましいＨＩＶ  ｎｅｆ抗原に連結された抗体。ＨＩＶ抗原を樹状細胞に標的化する１つの好ましいワクチンは、最大量のｎｅｆ抗原と連結された最大量のｇａｇ抗原を有することになり、本発明は、限定ではないがこれを含む。図７のレーン４［下］は、適切なＬ鎖発現プラスミドと共に同時トランスフェクトした［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−ＶｉｒａｌＮｅｆ］Ｃ７５７の部分的に精製された発現産物を示す。Ｃ７５７の成熟Ｈ鎖配列［ｎｅｆコンセンサスクレードＢ残基はイタリック体であり、連結制限部位をコードする残基は下線で示し、可動性リンカーは太字である］は、以下の通りである：
【００７５】
【表８】
0005984388.tif 000009
【００７６】
図７に示す抗体−抗原産物の分析は、種々のＨ鎖−抗原構築体が、同一の適切なＬ鎖発現構築体と共に２９３Ｆ細胞に一過的に同時トランスフェクトされたことを示す。各レーンは、５ｍｌのトランスフェクション細胞上清［３日間の産生］に由来する産物を表しており、この産物は、過剰量のプロテインＡビーズに結合させ、ＰＢＳ＋１Ｍ  ＮａＣｌで２回洗浄し、２０ｍＭのＨＣｌで溶出し、乾燥し、還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ試料緩衝液に溶解し、クマシーブルー染色還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。この技術は、予測Ｈ鎖産物の完全性の評価を可能にするだけでなく、抗体−抗原産物の相対的産生レベルの評価も可能にする。相対的産生レベルの問題は、ワクチン生産コストが、大規模哺乳動物細胞発酵系での完全分泌ワクチンの収量に大きく依存するため、非常に重要である。発現レベルは、特に、哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれた際の転写増強及び高度産生トランスフェクション細胞のクローンの選択に有利なＤＮＡエレメントを担持する代替的ベクター系により大きく増加させることができるが、これらの手法は、これらのさらなる手法を適用せずに完全な分泌される産物を良好な収量で発現する構築体から開始することにより、大きく補助される。トランスフェクトした哺乳動物細胞からの分泌抗体−抗原融合体の産生に大きな変動があることは、以前の特許出願で十分に記述されており［コヘシン−ドッケリン及びＤＣＩＲ］、これらのデータは、産生レベルが抗体媒体［可変及び定常領域］にそれほど依存しないが、むしろ抗原自体の固有な特性であることを示す。したがって、図７のレーン４は、［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−ＶｉｒａｌＮｅｆ］が非常に効率よく産生されたことを示し、ＱＴＰＴＮＴＩＳＶＴＰＴＮＮＳＴＰＴＮＮＳＮＰＫＰＮＰにより連結されたｎｅｆコンセンサスクレードＢ抗原と融合された抗体のこの配置が、非常に有利であることを示す。
【００７７】
ある好ましいＨＩＶ  ｇａｇ及びｎｅｆ抗原に連結された抗体。［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−Ｖｉｒａｌｇａｇ−ｐ４０−ＶｉｒａｌＮｅｆ］Ｃ７５８は、上記に記述されているバリアントｇａｇ  ｐ４０抗原の近位に直接追加されたｎｅｆコンセンサスクレードＢ抗原を有する［連結残基は下線で示し、可動性リンカー配列は太字である］：
【００７８】
【表９】
0005984388.tif 000010
【００７９】
図７のレーン５は、この発現プラスミドが、適切なＬ鎖と共に同時トランスフェクトされた場合、このＨ鎖−抗原融合体の合成を対象とするが、分泌される産物としての発現は非常に不良であることを示す。レーン６〜９は、Ｌ鎖発現プラスミド、並びに近位及び／又は遠位に可動性リンカー配列が伴うｎｅｆコンセンサスクレードＢ抗原コード配列インサートを有するＨ鎖−ｇａｇ発現構築体と共に同時トランスフェクトした２９３Ｆ細胞からの分泌産物を示す。可動性リンカー配列の付加は、完全抗体−ｇａｇ／ｎｅｆ融合ワクチンの分泌を容易にする。ワクチンを最高レベルで産生するための好ましい１つの構築体は、［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−ｐ１７−ｆ３−ｎｅｆ−ｆ４−ｐ２４−６ｘＨｉｓ］Ｃ７９１である［レーン９を参照］。そのような哺乳動物発現系における抗体−抗原融合体の相対的レベルは、抗体Ｖ領域にそれほど依存しないため、［−Ｆｌｅｘ−ｖ１−ｐ１７−ｆ３−ｎｅｆ−ｆ４−ｐ２４−６×Ｈｉｓ］がそれらのＨ鎖Ｃ末端に追加される場合、異なるＤＣ受容体を標的とする抗体−ｇａｇ／ｎｅｆ抗原ワクチンの産生は、同様の利点を有するはずである。
【００８０】
レーン６のＨ鎖は、［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−Ｖｉｒａｌｇａｇ−ｐ４０−ｆ４−ｎｅｆ］Ｃ７６７である［連結残基は下線で示し、可動性リンカー残基は太字であり、抗原残基はイタリック体である］：
【００８１】
【表１０】
0005984388.tif 000011
【００８２】
レーン７のＨ鎖は、［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−ｐ１７−ｎｅｆ−ｆ４−ｐ２４−６ｘＨｉｓ］Ｃ７９０  Ｃ７６７である［連結残基は下線で示し、可動性リンカー残基は太字であり、抗原残基はイタリック体である］：
【００８３】
【表１１】
0005984388.tif 000012
【００８４】
レーン８のＨ鎖は、［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−ｐ１７−ｆ３−ｎｅｆ−ｐ２４−６ｘＨｉｓ］Ｃ７９７  Ｃ７６７である［連結残基は下線で示し、可動性リンカー残基は太字であり、抗原残基はイタリック体である］：
【００８５】
【表１２】
0005984388.tif 000013
【００８６】
レーン９のＨ鎖は、［ｍＡｎｔｉ−ＤＣＩＲ＿９Ｅ８＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−ｐ１７−ｆ３−ｎｅｆ−ｆ４−ｐ２４−６ｘＨｉｓ］Ｃ７９１  Ｃ７６７である［連結残基は下線で示し、可動性リンカー残基は太字であり、抗原残基はイタリック体である］：
【００８７】
【表１３】
0005984388.tif 000014
【００８８】
上記のタンパク質をＣＨＯ−Ｓ細胞で産生する際に苛酷な発酵条件下で検出される残存性の分解を除去するために試験されたさらなる改変は、ＫＫＫからＮＫＱへの変更と共に下記で示し、それらは下線、太字、イタリック体で強調されている：
【００８９】
【表１４】
0005984388.tif 000015
【００９０】
最大限の抗原エピトープを有する、あるｇａｇ−ｎｅｆ抗原融合体が、効率的な分泌／産生特性を有することが見出された。好ましい可動性リンカー配列により隣接されたｎｅｆ抗原のインサート又は追加体を有するｇａｇ  ｐ４０のバリアントが、特に良好に産生及び分泌されることが見出された。本明細書で開示され、セルロース分解生物から入手可能である可動性リンカー配列が、完全抗原及び／又は抗体−抗原融合タンパク質として連結された抗原の分泌を容易にすることができたことも見出された。
【００９１】
抗原コード配列のＤＮＡ配列：Ｃ７５７抗原領域は、以下の通りである［太字配列は、連結部位又は終止コドンである］：
【００９２】
【表１５】
0005984388.tif 000016
【００９３】
Ｃ７９１リンカー及び抗原コード配列は、以下の通りである［太字配列は、連結部位又は終止コドンである］：
【００９４】
【表１６】
0005984388.tif 000017
【００９５】
以下の例は、本発明が、ＣＤ４０によりＨＩＶ及び他の抗原をヒトＤＣに標的化することができたことを示す。強力な活性化抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の生成。マウスＩｇＧ２ｂ−ヒトＣＤ４０融合タンパク質でマウスを免疫し、リンパ節由来のＢ細胞を注射部位から排出させ、その後ハイブリドーマとして不死化した。ＦＡＣＳにより検出されるような抗ＣＤ４０反応性抗体を分泌する３５個のハイブリドーマに由来する上清を、ＣＤ４０  ＣＤＮＡをトランスフェクトした２９３Ｆ細胞と比べて、ヒト樹状細胞の終夜培養中でサイトカイン分泌の誘導について試験した。図８は、ＣＤ４０に結合し活性化することができる抗ＣＤ４０抗体のサブセットを検出するように設計されたこのタイプのスクリーニングの例を示す。このデータセットは、２つのハイブリドーマ１２Ｅ１２及び９Ａ１１が、ＩＬ−１２ｐ４０の分泌をＤＣに指図することにおいて特に有効であったことを示す。１２Ｅ１２重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的クローニング及び配列決定技術を使用して得られ、可変領域を改変して、ヒトＩｇＧ４定常領域に移植されたマウス１２Ｅ１２可変領域を発現するベクターとした。
【００９６】
Ｃ２６９  ｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２［ｍａｎｔｉ−ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｋ−Ｖ−ｈＩｇＧＫ−Ｃ］  下記のＤＮＡ配列は、キメラ軽鎖コード領域、及びイタリック体のマウス可変領域を有する予測分泌成熟軽鎖のアミノ酸配列を示す。
【００９７】
【表１７】
0005984388.tif 000018
【００９８】
Ｃ２３０  ｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２［ｍａｎｔｉ−ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−Ｖ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ］  下記のＤＮＡ配列は、キメラ重鎖コード領域、及びイタリック体のマウス可変領域を有する予測分泌成熟軽鎖のアミノ酸配列を示す。
【００９９】
【表１８】
0005984388.tif 000019
【０１００】
Ｃ２３０のバリアントを、ヒトＩｇＧ４  Ｃ末端に融合された抗原を有するＣＤ４０１２Ｅ１２  Ｈ鎖をコードするように改変した。例えば、Ｃ２９１  ｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２［ｍａｎｔｉ−ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−Ｖ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ＦｌｕＨＡ１−１−６ｘＨｉｓ］は、下記に示す配列を有するＨ鎖をコードし、インフルエンザＨＡ１−１抗原領域はイタリック体で示し、可動性リンカー配列及びＣ末端ポリヒスチジンタグは太字で示す：
【０１０１】
【表１９】
0005984388.tif 000020
【０１０２】
別のタイプのバリアントＨ鎖構築体は、Ｃ４５０  ｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２［ｍａｎｔｉ−ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｄｏｃｋｅｒｉｎ−ｖａｒ１］であり、これは下記に示す配列を有するＨ鎖をコードし、Ｃ末端ドッケリンドメイン抗原領域はイタリック体で示す：
【０１０３】
【表２０】
0005984388.tif 000021
【０１０４】
したがって、上記及び類似のバリアントＨ鎖をコードする発現ベクターを、２９３Ｆ又はＣＨＯ−Ｓ細胞に同時トランスフェクトすることができ、これは、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製することができる抗ＣＤ４０１２Ｅ１２−ｈＩｇＧ４抗体融合タンパク質の分泌に帰着する。
【０１０５】
そのような抗体−抗原タンパク質は、インビトロ又はインビボで、抗原をヒト樹状細胞に高効率で送達するためのワクチンとして使用することができる。同様に、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２−ｈＩｇＧ４ドッケリンタンパク質を、コヘシン−抗原融合タンパク質を送達するために使用することができる。例えば、Ｃ３２  Ｅｃｏｌｉ−ｐＥＴ２８［Ｃｏｈｅｓｉｎ−ＦｌｕＭ１−６ｘＨｉｓ］は、下記に示す配列をコードし、インフルエンザＭ１タンパク質はイタリック体で示す：
【０１０６】
【表２１】
0005984388.tif 000022
【０１０７】
上記のタンパク質は、大腸菌で可溶性タンパク質として発現させることができ、イオン交換及び金属アフィニティークロマトグラフィーにより純粋な産物として調製することができる。抗ＣＤ４０１２Ｅ１２−ｈＩｇＧ４ドッケリン融合タンパク質とコヘシンインフルエンザＭ１融合タンパク質との非常に安定した複合体又はコンジュゲートは、高親和性ドッケリン−コヘシン相互作用により構築することができる。
【０１０８】
ある用量範囲のそのような抗ＣＤ４０１２Ｅ１２−ｈＩｇＧ４ドッケリン−コヘシンインフルエンザＭ１コンジュゲートを、ヒト樹状細胞と共に１日間インキュベートし、その後同系ＣＤ８＋Ｔ細胞を添加し、さらに数日間インキュベーションを継続した。その後、細胞を、抗ＣＤ８抗体及び免疫優勢インフルエンザＭ１エピトープ５８〜６６に対応するＴＣＲを保持するＴ細胞に特異的なＨＬＡ−Ａ２四量体試薬で染色した。四量体陽性細胞は、四角で囲まれたゲートに示す。このデータは、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２−ｈＩｇＧ４ドッケリンコヘシンインフルエンザＭ１コンジュゲートの濃度が０．００１μｇ／ｍｌと低くても、コンジュゲートが添加されなかったか［次の図のパネル］又は一連の類似用量範囲の対照ＩｇＧ４ドッケリンコヘシンインフルエンザＭ１コンジュゲートが添加されたかのいずれの場合よりも著しく高いレベルで、インフルエンザＭ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導することを示す。これらのデータは、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２抗体が、ＤＣへの抗原送達に著しく有効であり、抗原特異的Ｔ細胞の増殖により見られるような抗原のプロセシング及び提示に帰着することを実証する。
【０１０９】
図９は、１０μｇ／ｍｌ〜無抗ＣＤ４０１２Ｅ１２−ｈＩｇＧ４ドッケリン−コヘシンインフルエンザＭ１コンジュゲートの用量範囲により誘導された際のＣＤ８＋染色［横軸］対インフルエンザＭ１−四量体染色［縦軸］のＦＡＣＳ解析を示す。
【０１１０】
図１０は、１０μｇ／ｍｌ〜無対照ｈＩｇＧ４ドッケリン−コヘシンインフルエンザＭ１コンジュゲートの用量範囲により誘導された際の、ＣＤ８＋染色［横軸］対インフルエンザＭ１−四量体染色［縦軸］のＦＡＣＳ解析を示す。
【０１１１】
Ｃ２６９（ｓｅｑＡ）抗ＣＤ４０１２Ｅ１２軽鎖配列と、ＣＤ４０結合を保持するように、ヒト軽鎖可変配列との類似性を増強するように、及び分泌産物の発現を増強するのに好ましいコドンを含有させることにより改変されたバリアントとのアラインメント。
seqA DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPS
seqB DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIHYTSILHSGVPS
seqC DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIHYTSILHSGVPS
seqD DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIHYTSILHSGVPS
seqE DIQMTQTTSSLSTSLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIHYTSILHSGVPS
************:***********************************:***********
seqA RFSGSGSGTDYSLTIGNLEPEDIATYYCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
seqB RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
seqC RFSGS-SGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
seqD RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQFNKPPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
seqE RFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQFNKLPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
***** *********.*** ******:****** **************************
seqA SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
seqB SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
seqC SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
seqD SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
seqE SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
************************************************************
seqA LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
seqB LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
seqC LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
seqD LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
seqE LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
**********************************
（上記はそれぞれ配列番号２４、２５、２６、２７、２８）
【０１１２】
Ｃ２６８（ｓｅｑＡ）抗ＣＤ４０１２Ｅ１２重鎖配列と、ＣＤ４０結合を保持するように、ヒト軽鎖可変配列との類似性を増強するように、及び分泌産物の発現を増強するのに好ましいコドンを含有させることにより改変されたバリアントとのアラインメント。
seqA EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYY
seqB EVNLVESGGGLVQPGGSLKVSCVTSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYINSGGGSTYY
**:****************:**.*************************************
seqA PDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTSVTVSSA
seqB PDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSRLKSEDTAMYYCARRGLPFHAMDYWGQGTLVTVSVA
*****************:*********************************** **** *
seqA KTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG
seqB STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG
.***********************************************************
seqA LYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVF
seqB LYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVF
************************************************************
seqA LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR
seqB LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR
************************************************************
seqA VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN
seqB VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN
************************************************************
seqA QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN
seqB QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN
************************************************************
seqA VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS
seqB VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS
****************************
（上記はそれぞれ配列番号２９、３０）
【０１１３】
図１１は、ＰＢＭＣ培養の状況で抗原特異的Ｔ細胞の増殖を誘導する抗ＤＣ受容体−抗原標的化分子［ＴＭ］の効能を、インビトロでアッセイするために使用されるプロトコールを示す。手短に言えば、ＨＩＶ患者のアフェレーシスに由来する２Ｅ６  ＰＢＭＣを、ある用量範囲の標的化ワクチン及び１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共にインキュベートする。培地を２日ごとに取り替える。７日目に、抗原に対応するペプチドのクラスターを添加して、各クラスター内のペプチド配列に対してＴＣＲ特異性を有するＴ細胞によるＩＦＮγ産生を誘導する。ペプチドクラスター及びサイトカイン分泌を阻止する作用物質と共に４時間インキュベーションした後、細胞を、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＩＬ−１３、及び抗ＩＦＮγ試薬で染色し、ＦＡＣＳで解析した。
【０１１４】
図１２及び１３は、ＤＣを［ＰＢＭＣ内で］、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４ワクチンによって標的化する効果を示す。Ｈ鎖組成を下記に示す：Ｃ８１８  ｒＡＢ−ｃｅｔＨＳ−ｐｕｒｏ［ｍａｎｔｉ−ＣＤ４０＿１２Ｅ１２．３Ｆ３＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ｖ１−Ｖｉｒａｌｇａｇ−ｐ１７−ｆ３−ｎｅｆ−ｆ４−ｐ２４−６ｘＨｉｓ］、連結残基は下線で示し、可動性リンカー残基は太字であり、抗原残基はイタリック体である］：
【０１１５】
【表２２】
0005984388.tif 000023
【０１１６】
図１２は、ワクチンが、試験された最も低いワクチン用量でさえ、ｇａｇ  ｐ２４ペプチドクラスターすべてに対して特異性を有するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導し、ＩＦＮγ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントが、細胞をペプチドで処理しなかった場合よりも著しく高かったことを示す。図１３［上段パネル］は、このデータをグラフ形態で示し、縦軸はＩＦＮγ産生細胞のパーセント（％）を示す。下段パネルは、ＰＢＭＣ培養内のＣＤ８＋Ｔ細胞に関する同様のデータを示し、このデータは、ｇａｇ  ｐ２４配列を包含するペプチドクラスターがすべて、非ペプチド対照よりも著しく高いＩＦＮγ産生Ｔ細胞の産生を誘導したことも示す。したがって、このワクチンは、ＨＩＶ  ｇａｇ  ｐ２４内の複数のエピトープに対して強力な応答を誘導した。
【０１１７】
図１４は、ワクチンが、試験された最も低いワクチン用量でさえ、ｇａｇ  ｐ１７ペプチドクラスターすべてに対して特異性を有するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導し、ＩＦＮγ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントが、細胞をペプチドで処理しなかった場合よりも著しく高かったことを示す。図１５は、このデータをグラフ形態で示し、縦軸はＩＦＮγ産生細胞のパーセントを示す［上段パネル］。下段パネルは、ＰＢＭＣ培養内のＣＤ８＋Ｔ細胞に関する同様のデータを示し、このデータは、ｇａｇ  ｐ１７配列を包含するペプチドクラスターがすべて、非ペプチド対照よりも著しく高いＩＦＮγ産生Ｔ細胞の産生を誘導したことも示す。したがって、このワクチンは、ＨＩＶ  ｇａｇ  ｐ１７内の複数のエピトープに対する強力な応答を誘導した。
【０１１８】
図１６は、ワクチンが、試験された最も低いワクチン用量でさえ、ほとんどのＨＩＶ  ｎｅｆペプチドクラスターに対して特異性を有するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導し、ＩＦＮγ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントが、細胞をペプチドで処理しなかった場合よりも著しく高かったことを示す。図１７は、このデータをグラフ形態で示し、縦軸はＩＦＮγ産生細胞のパーセントを示す［上段パネル］。下段パネルは、ＰＢＭＣ培養内のＣＤ８＋Ｔ細胞に関する同様のデータを示し、このデータは、ｎｅｆ配列を包含するペプチドクラスターがすべて、非ペプチド対照よりも著しく高いＩＦＮγ産生Ｔ細胞の産生を誘導したことも示す。したがって、このワクチンは、ＨＩＶ  ｎｅｆ内の複数のエピトープに対する強力な応答を誘導した。
【０１１９】
このデータは、ワクチン［特異的に改変されたｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４融合タンパク質に連結された抗ＣＤ４０１２Ｅ１２］が、最も低い用量でさえ、広範な免疫応答、つまりＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞区画の両方におけるエピトープの広範な提示を誘導することができることを示すことが見出された。このデータは、２つのワクチン部分の各々［抗ＣＤ４０１２Ｅ１２及び類似の特別な特性を有する他の抗体、並びに効率的産生をもたらすエピトープ提示を最大化するように改変されたｇａｇ−ｎｅｆ抗原］、つまり抗ＣＤ４０成分が、他の抗原の送達用媒体であってもよく、抗原成分は、他の抗ＤＣ受容体媒体により送達することができることをさらに実証する。この結果は、記憶細胞［ＨＩＶワクチンを投与されたＨＩＶ患者］及び未感作［ＰＳＡ抗原を投与された正常供与体］Ｔ細胞集団の両方から、多様な抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させる、ＣＤ４０に基づく標的化の能力も実証する。
【０１２０】
抗ＣＤ４０−ＰＳＡで標的とされたＤＣは、ＰＳＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導する。図１８は、ＰＳＡ［前立腺特異的抗原］に連結された抗ＣＤ４０−１２Ｅ１２で構成されたワクチンが、未感作Ｔ細胞集団から、多様なＰＳＡエピトープに対応するＰＳＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を増殖させる能力を試験するためのプロトコールの概略を示す。手短に言えば、正常供与体に由来する単球のＩＦＮα及びＧＭ−ＣＳＦと共に培養することに由来するＤＣを、ワクチンと共にインキュベートする。翌日、細胞を新しい培地に配置し、同じ供与体に由来する純粋なＣＤ４＋Ｔ細胞を添加する。数日後に、ＰＳＡペプチドを添加し、４時間後に、培養上清中のＩＦＮγ分泌レベルを決定する。
【０１２１】
図１９は、多くのＰＳＡペプチドが、強力なＩＦＮγ産生応答を誘導することを示し、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２及び類似の抗ＣＤ４０作用物質が、抗原をＤＣに効果的に送達することができ、抗原の複数のエピトープに対する免疫応答の初回刺激に帰着することを示す。
【０１２２】
図２０は、ＤＣを標的とする抗ＣＤ４０−ＰＳＡで標的とされたＤＣが、ＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することを示す。ＩＦＮＤＣを、１μｇの、ＰＳＡとのｍＡｂ融合タンパク質で標的とした。精製された自己由来ＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０日間共培養した。細胞を、抗ＣＤ８及びＰＳＡ（ＫＬＱＣＶＤＬＨＶ）四量体で染色した。細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性の健常供与体に由来する。その結果は、抗ＣＤ４０が効果的にＰＳＡをＤＣに送達し、それは、ひいてはＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導することを実証する。
【０１２３】
図２１は、ＤＣによる標的化による取込み及びその細胞表面上での抗原エピトープの提示に起因する抗原特異的Ｔ細胞の増殖を指図するその能力について、抗ＤＣ受容体標的化ワクチンを試験するためのＤＣ標的化プロトコールを概説する図である。手短に言えば、ＩＦＮα及びＧＭ−ＣＳＦ中で３日間培養することにより、ＨＩＶ患者の単球をＤＣに分化させる。その後、ワクチン［ＦＰ］を自己由来Ｔ細胞と共に１０μｇ／ｍｌで添加する。１０日後に、抗原ペプチドクラスターを培養中の増殖Ｔ細胞に添加し、４時間後に細胞内ＩＦＮαを測定する。
【０１２４】
図２２［上段パネル］は、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｎｅｆ、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ２４、及び抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４ワクチンの効能の比較を示す［患者Ａｐｈ００２］。抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｎｅｆワクチン［緑色バー］は、ｎｅｆペプチドエピトープにのみ応答するＩＦＮα産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を刺激し、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ２４［青色バー］は、ｐ２４ペプチドエピトープのみに応答するＩＦＮα産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を刺激した一方で、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４は、ｇａｇ  ｐ１７、ｎｅｆ、及びｐ２４ペプチドエピトープに応答するＩＦＮα産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激した。
【０１２５】
図２２［下段パネル］は、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｎｅｆ、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ２４、及び抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４ワクチンの効能の比較を示す［患者Ａｐｈ００２］。抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｎｅｆワクチン［緑色バー］は、ｎｅｆペプチドエピトープにのみ応答するＩＦＮα産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激した一方で、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４［橙色バー］は、ｇａｇ  ｐ１７及びｎｅｆペプチドエピトープの両方に応答するＩＦＮα産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激した。
【０１２６】
図２３［上段パネル］は、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｎｅｆ、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ２４、及び抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４ワクチンの効能の比較を示す［患者Ａｐｈ０１０］。抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｎｅｆワクチン［緑色バー］は、ｎｅｆペプチドエピトープにのみ応答するＩＦＮα産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を刺激し、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ２４［青色バー］は、ｐ２４ペプチドエピトープのみに応答するＩＦＮα産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を刺激した一方で、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４は、ｇａｇ  ｐ１７、ｎｅｆ、及びｐ２４ペプチドエピトープに応答するＩＦＮα産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激した。
【０１２７】
図２３［下段パネル］は、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｎｅｆ、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ２４、及び抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４ワクチンの効能の比較を示す［患者Ａｐｈ００２］。抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｎｅｆワクチン［緑色バー］は、ｎｅｆペプチドエピトープにのみ応答するＩＦＮα産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激し、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ２４［青色バー］は、ｐ２４ペプチドエピトープのみに応答するＩＦＮα産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激した一方で、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４［橙色バー］は、ｇａｇ  ｐ１７及びｎｅｆペプチドエピトープの両方に応答するＩＦＮα産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激した。
【０１２８】
これらのデータは、抗ＣＤ４０１２Ｅ１２  ｇａｇ  ｐ１７  ｎｅｆ  ｇａｇ  ｐ２４ワクチンが、ワクチンの３つの抗原エレメントすべて、ＨＩＶ  ｇａｇ  ｐ１７、ＨＩＶ  ｇａｇ  ｐ２４、及びＨＩＶ  ｎｅｆ内の複数のエピトープを包含する多様なＴ細胞応答を誘導することができることを実証する。
【０１２９】
下記の配列は、Ｃ５１５ベクターにより発現されるコヘシン［太字残基］−サイクリンＤ１［下線残基］融合タンパク質のアミノ酸配列である。
Ｃ５１５  大腸菌−ｐＥＴ２８  ［コヘシン−ｈサイクリンＤ１−６ｘＨｉｓ］
【０１３０】
【表２３】
0005984388.tif 000024
【０１３１】
大腸菌中で産生されたＣｏｈ．Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１タンパク質の発現及び精製。
Ｃｏｈ．Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１を、Ｌ培地（Difco社製）中３７℃でカナマイシン耐性（４０μｇ／ｍｌ）によって選択して増殖させた大腸菌株Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ（NEB社製）で発現させ、対数増殖中期まで２００回転／分で振とうした。その後、１２０ｍｇ／ＬのＩＰＴＧ（Bioline社製）を添加し、さらに３時間後、細胞を遠心分離により回収し、−８０℃で保存した。各１Ｌの発酵に由来する大腸菌細胞を、０．２ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテルII（Calbiochem社製）を有する５０ｍｌの氷冷５０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０に再懸濁した。細胞を、５分間の中止期間をおいて２回氷上で４分間、１８の設定で超音波処理（Fisher社製Sonic Dismembrator 60）し、その後１７，０００ｒ．ｐ．ｍ．、４℃で２０分間遠心した（Sorvall社製SA-600）。５０ｍｌの細胞溶解産物上清を、１０ｍｌのＡＮＸセファロースビーズ（GE Healthcare社製）に通し、その後通過画分を、７．５ｍｌの１６０ｍＭトリス、４０ｍＭイミダゾール、４Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．９を有する結合緩衝液に調整して、Ｎｉ＋＋で荷電された５ｍｌのHiTrapキレート化ＨＰカラム（GE Healthcare社製）に充填した。結合したタンパク質を、２０ｍＭ  ＮａＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール  ｐＨ７．６（緩衝液Ａ）で洗浄し、緩衝液Ａ中１０〜５００ｍＭのイミダゾール勾配で溶出した。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析し、貯溜した。およそ１５ミリグラムの貯溜した溶出コヘシン−サイクリンＤ１融合タンパク質を、１０ミリグラムのmPEG-MAL 20k試薬（Nektar社製）と室温で終夜反応させ、それにより２０ｋＤａのペグ化基（pegyl group）を遊離システイン残基［それらのいくつかはサイクリンＤ１ドメイン内にある］に結合させる。この反応の一部をＤＰＢＳ［Gibco社製］に対して透析し、一部をｐＨ７．５に調整し、その後ＤＴＴを室温で１．５時間１０ｍＭになるように添加して、あらゆるジスルフィド結合を還元し、その後室温で１．５時間２５ｍＭヨードアセトアミドを添加して、遊離システイン残基をアルキル化し、その後２０ｍＭ  ＤＴＴを室温で１．５時間添加し、その後ＤＰＢＳに対して透析した。ペグ化は、タンパク質がＤＰＢＳに可溶性であり続けることを保証するために必要であり、アルキル化［インビトロ抗ＣＤ４０標的化の状況では、タンパク質の活性に必要ではなかった］は、産物に分子間ジスルフィド架橋形態が存在しないことを保証する役目を果たした。
【０１３２】
図２４。コヘシン−サイクリンＤ１融合タンパク質と抗ＤＣ受容体−ドッケリン組換え抗体との相互作用の分析。抗体−ドッケリン又は抗体−ＨＩＶ  ｎｅｆ融合タンパク質［２０μｇ］を、１００μｌのプロテインＡセファロースビーズ［GE Biosciences社製］と共にインキュベートし、その後ＤＰＢＳで２回洗浄した。ペグ化された［ｐｅｇ］又はペグ化されアルキル化された［ｐｅｇ  ａｌｋ］コヘシン−サイクリンＤ１［Ｃｏｈ．Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１］を添加し［２０μｇ］、室温で３０分後、上清を遠心分離によりビーズから分離した。ビーズを２０ｍＭ  ＨＣｌで溶出し、溶出液及び上清を乾燥させ、ＳＤＳ．ＰＡＧＥローディング緩衝液に再懸濁し、還元ＤＳＤ．ＰＡＧＥを実行し、クマシーブルー（Coomasssie Blue）染色で視覚化した。レーン１は、抗体−ドッケリン＋ｐｅｇ  Ｃｏｈ．Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１で負荷されたビーズからの上清を示し、レーン２は、対応するビーズ溶出液である。レーン３は、抗体−ＨＩＶ  ｎｅｆ＋ｐｅｇ  Ｃｏｈ．Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１で負荷されたビーズからの上清を示し、レーン４は、対応するビーズ溶出液である。レーン５は、抗体−ドッケリン＋ｐｅｇ  ａｌｋ  Ｃｏｈ．Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１で負荷されたビーズからの上清を示し、レーン６は、対応するビーズ溶出液である。レーン７は、抗体−ＨＩＶ  ｎｅｆ＋ｐｅｇ  ａｌｋ  Ｃｏｈ．Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１で負荷されたビーズからの上清を示し、レーン８は、対応するビーズ溶出液である。レーン９は、抗体−ドッケリンのみを示し、レーン１０は、抗体−ＨＩＶ  ｎｅｆのみを示し、レーン１１は、ｐｅｇ  Ｃｏｈ．Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１のみを示し、レーン１２は、ｐｅｇ  ａｌｋ  Ｃｏｈ．Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１のみを示す。矢印［上から下］は、１）高分子量ペグ化形態のＣｏｈ．Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、２）抗体重鎖の位置、３）非ペグ化Ｃｏｈ．Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１［調製物の約５０％］の位置、４）抗体軽鎖の位置を示す。
【０１３３】
上記の分析により、抗体−ドッケリンは、ほとんどのＣｏｈ．Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１を効果的に捕捉するが、抗体−ＨＩＶ  ｎｅｆは捕捉しないことが示される。これにより、Ｃｏｈ．Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１調製物が、抗ＤＣ受容体−ドッケリン標的化媒体と複合体を構築することができることが実証される。
【０１３４】
マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ、Mantle Cell Lymphoma）は、主に高齢男性の全非ホジキンリンパ腫の５〜１０％に相当するＢ細胞非ホジキンリンパ腫である。マントル細胞リンパ腫は、従来の治療後の予後が最悪であり、頻繁に再発し、生存時間が比較的短い非常に悪性の癌である。マントル細胞リンパ腫は、サイクリンＤ１の過剰発現に結び付く遺伝子特徴：ｔ（１１；１４）（ｑｌ３；ｑ３２）転座を有する。
【０１３５】
代替的にＰＲＡＤ１と名付けられているＧ１／Ｓ特異的サイクリンＤ１、Ｂｃｌ−１は、ＣＤＫ４及び６と複合体を形成することにより、Ｇ１進行及びＧ１／Ｓ移行の細胞周期制御において機能を果たす。発現は細胞周期依存性であり、Ｇ１で発現が最大であり、Ｓにおいて最低であるため、成熟リンパ球では通常発現されない。したがって、サイクリンＤ１を過剰発現する細胞に対して特異的に向けられる細胞毒性Ｔ細胞応答を誘導させることは、魅力的なＭＣＬワクチン接種戦略である。
【０１３６】
図２５は、サイクリンＤ１に由来する重複ペプチドの模式図を示す。これらを、個々のペプチド又はペプチドの貯留のいずれかでＴ細胞培養に添加して、それらをＭＨＣ上に提示させ、それによりペプチド特異的Ｔ細胞の増殖を刺激することができる。
【０１３７】
図２６は、抗ＣＤ４０−サイクリンＤ１複合体が、サイクリンＤ１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖をインビトロで誘導する能力を試験する研究計画の模式図（左パネル）を示す。ＤＣを標的化複合体と共にインキュベーションした後、ＣＦＳＣ染料で標識された自己由来ＣＤ４＋Ｔ細胞［つまり、同じ供与体に由来する］を添加し、さらに８日間ＩＬ−２と共に培養を継続し、その後２日間ＩＬ−２なしで休止させる。次に、培養を分割し、個々のサイクリンＤペプチド又はペプチドなしで８時間刺激し、その後、細胞内ＩＦＮｇ及びＩＬ−２［Ｔ細胞活性化の指標］を染色し、ＦＡＣＳにより解析する。
【０１３８】
この解析は、サイクリンＤペプチドＰ８、Ｐ１６、及びＰ５４が、ペプチドなしで［又は他のサイクリンＤ１ペプチドと共に］インキュベートされた細胞より著しくより高い増殖性［つまり、ＣＦＳＣ希釈により標識された］ＣＤ４＋Ｔ細胞の産生を刺激することを示す［非表示］。したがって、抗ＣＤ４０サイクリンＤ１複合体は、正常供与体のＴ細胞から、エフェクター機能表現型を有するサイクリンＤ１特異的Ｔ細胞の増殖を誘導するように機能する。
【０１３９】
図２７は、異なる正常供与体が使用されたことを除いて、図２６に詳述されているものと類似した研究及び解析を示し、この場合、抗ＣＤ４０−サイクリンＤ１複合体は、サイクリンＤ１ペプチドＰ４、Ｐ４３、及びＰ７０に特異的なＩＦＮｇ陽性の増殖性ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導した。
【０１４０】
図２８は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が使用されたことを除いて、上記の図２６に記述されているものと類似した模式図及び解析を示す。この供与体では、抗ＣＤ４０サイクリンＤ１複合体は、サイクリンＤ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、特に貯留Ｉ及び貯留II内に含有されていたペプチドに対応する特異性を有するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導した。
【０１４１】
図２９は、同じ供与体からであるが、これら貯留に由来する個々のペプチドを用いて解析した同様のデータを示す。特に、これらＴ細胞は、ペプチドＰ７、Ｐ８、及びＰ１０に対する特異性を示す。
【０１４２】
本明細書で考察されている任意の実施形態は、本発明の任意の方法、キット、試薬、又は組成物に関して実施することができ、その逆も同様であることが企図される。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用することができる。
【０１４３】
本明細書に記述されている特定の実施形態は、例示目的で示すものであり、本発明の制限として示すものではないことが理解されよう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱せずに、種々の実施形態で使用することができる。当業者であれば、本明細書に記述されている特定の手順の等価手順を多数認識しているか、又は単なる日常的な実験作業を使用して確認することができよう。そのような等価手順は本発明の範囲内であるとみなされ、特許請求の範囲により包含される。
【０１４４】
本明細書で言及されている刊行物及び特許出願はすべて、本発明が関する分野の当業者の技術レベルを示す。刊行物及び特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物又は特許出願が参照により具体的に及び個々に組み込まれるのが示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
単数の単語が、特許請求の範囲及び／又は本明細書で「含む」という用語と共に使用される場合、「１つ」を意味してもよいが、「１又は２以上（one or more）」、「少なくとも１」、及び「１又は２以上（one or more than one）」の意味とも一致する。特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、選択肢のみを参照すると明示的に示さない限り又は選択肢が相互排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢のみ及び「及び／又は」を指すという定義を支持する。本出願の全体にわたって、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために使用されている装置、方法に固有の誤差の変動、又は研究対象中に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【０１４６】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「含む（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などの含むの任意の形態）、「有する（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」などの有する任意の形態）、「含む（including）」（並びに「含む（includes）」及び「含む（include）」などの含むの任意の形態）、又は「含有する（containing）」（並びに「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」などの含有するの任意の形態）は、包括的又は非限定的であり、追加的な列挙されていない要素又は方法ステップを除外しない。
【０１４７】
「又はその組み合わせ」という用語は、本明細書で使用される場合、その用語に先行する列挙された項目のすべての順列及び組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣの少なくとも１つ、及び特定の状況で順番が重要である場合は、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢの少なくとも１つを含むことが意図される。引き続きこの例では、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、及びＣＡＢＡＢＢなどの１又は２以上の項目又は用語の繰り返しを含有する組み合わせが、明示的に含まれる。当業者であれば、状況からそうでないと明白でない限り、任意の組み合わせにおける項目又は用語の数に、典型的には制限がないことを理解しよう。
【０１４８】
本明細書で開示又は特許請求されている組成物及び／又は方法のすべては、本開示に照らして過剰な実験をせずに作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点で記述されているが、当業者であれば、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱せずに、本明細書に記述されている組成物及び／又は方法、並びに本方法のステップ又はステップの順序に変更を適用できることは明白であろう。当業者に明白なそのような類似の代用物及び変形はすべて、添付の特許請求の範囲により定義されているような本発明の趣旨、範囲、及び概念内にあるとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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