(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミンポリペプチドに融合されたブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）ポリペプチドを含むアルブミン融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、ＢＣｈＥ活性を有し、
（ａ）前記ＢＣｈＥポリペプチドは、配列番号７８６のアミノ酸２４から５５２に示されるＢＣｈＥ（Ｅ２９−Ｖ５５７）（Ａ２２７Ｓ，Ｓ３１５Ｇ，Ａ３５６Ｗ，Ｙ３６０Ｇ）であり、
（ｂ）前記アルブミンポリペプチドは、配列番号７８６のアミノ酸５５３から１１３７に示される成熟アルブミンであり、前記アルブミンポリペプチドは、前記ＢｃｈＥポリペプチドの血清血漿半減期を増大させる、アルブミン融合タンパク質。
【請求項２】
配列番号：７８６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項３】
疾患、障害、または状態の処置、予防、診断、または改善を必要とする対象における、疾患、障害、または状態を処置、予防、診断、または改善するための医薬組成物であって、有効量の請求項１または２に記載のアルブミン融合タンパク質を含み、前記疾患、障害、または状態の処置、予防、診断、または改善が：
（ａ）コカインの過剰摂取の解毒、ここで該対象はコカインを摂取したものである；または
（ｂ）対象におけるコカインの報酬探索効果を低減させること、ここで該対象はコカイン中毒である、
から選択される、医薬組成物。
【請求項４】
前記疾患、障害、または状態の処置、予防、診断、または改善が、コカインの過剰摂取の解毒である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記疾患、障害、または状態が、コカインの過剰摂取である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
請求項１または２に記載のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のアルブミン融合タンパク質をコードするベクター。
【請求項８】
請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項９】
哺乳類細胞、酵母細胞、または原核細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記アルブミン融合タンパク質の発現に適している条件下で、請求項８に記載の宿主細胞を培養するステップ、および前記アルブミン融合タンパク質を回収するステップを含む、アルブミン融合タンパク質を発現するための方法。
【請求項１１】
グリコシル化、非グリコシル化、またはグリコシル化異性体である、請求項８に記載の宿主細胞により発現されるアルブミン融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１に記載のアルブミン融合タンパク質および医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組成物およびその使用のための取扱説明書を含むキット。
【請求項１４】
対象がコカインの過剰摂取から救出される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
コカイン禁断後のコカイン中毒の再発を防ぐ、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
対象におけるコカイン加水分解を加速させる、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
対象において、コカインの生物学的標的へコカインが進入するのを妨げる、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
コカインの生物学的標的が心臓である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
コカインの生物学的標的が脳である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
対象が哺乳類である、請求項３−５または１４−１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国出願第１１／４９５，６２４号の一部継続出願であり、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２００５年８月１２日出願の米国仮出願第６０／７０７，５２１号、２００５年８月３１日出願の同第６０／７１２，３８６号、２００５年１１月３日出願の同第６０／７３２，７２４号、２００６年２月２８日出願の同第６０／７７６，９１４号、２００６年３月１３日出願の同第６０／７８１，３６１号、２００６年６月２日出願の同第６０／８１０，１８２、および２００６年６月１５日出願の同第６０／８１３，６８２号の利益を主張する。米国出願第１１／４９５，６２４号はまた、２００５年２月９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００４０４１号の一部継続出願であり、１１９（ｅ）の下で、２００４年２月９日出願の米国仮出願第６０／５４２，２７４号、２００４年３月５日出願の同第６０／５４９，９０１号、および２００４年３月２９日出願の同第６０／５５６，９０６号、および２００４年１２月１７日出願の同第６０／６３６，６０３号の利益を主張する。米国出願第１１／４９５，６２４号はまた、２００５年７月７日出願の米国出願第１１／１７５，６９０号の一部継続出願であり、２００４年１月２０日出願の国際出願第ＰＣＴ／２００４／００１３６９号の継続出願であり、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２００３年１月２２日出願の米国仮出願第６０／４４１，３０５号、２００３年３月１１日出願の同第６０／４５３，２０１号、２００３年５月２日出願の同第６０／４６７，２２２号、２００３年５月２３日出願の同第６０／４７２，８１６号、２００３年６月６日出願の同第６０／４７６，２６７号、２００３年９月２４日出願の同第６０／５０５，１７２号、および２００３年９月３０日出願の同第６０／５０６，７４６号の利益を主張する。米国出願第１１／４９５，６２４号はまた、２００６年５月８日出願の米国出願第１１／４２９，２７６号の一部継続出願であり、それは２００４年２月１１日出願の米国出願第１０／７７５，２０４号の継続出願であり、その出願は２００２年１２月２３日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／４０８９１号の継続出願であり、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２００１年１２月２１日出願の米国仮出願第６０／３４１，８１１号、２００２年１月２４日出願の同第６０／３５０，３５８号、２００２年１月２８日出願の同第６０／３５１，３６０号、２００２年２月２６日出願の同第６０／３５９，３７０号、２００２年２月２８日出願の同第６０／３６０，０００号、２００２年３月２７日出願の同第６０／３６７，５００号、２００２年４月８日出願の同第６０／３７０，２２７号、２００２年５月１０日出願の同第６０／３７８，９５０号、２００２年５月２４日出願の同第６０／３８２，６１７号、２００２年５月２８日出願の同第６０／３８３，１２３号、２００２年６月５日出願の同第６０／３８５，７０８号、２００２年７月１０日出願の同第６０／３９４，６２５号、２００２年７月２４日出願の同第６０／３９８，００８号、２００２年８月９日出願の同第６０／４０２，１３１号、２００２年８月１３日出願の同第６０／４０２，７０８号、２００２年９月１８日出願の同第６０／４１１，４２６号、２００２年９月１８日出願の同第６０／４１１，３５５号、２００２年１０月２日出願の同第６０／４１４，９８４号、２００２年１０月１１日出願の同第６０／４１７，６１１号、２００２年１０月２３日出願の同第６０／４２０，２４６号、および２００２年１１月５日出願の同第６０／４２３，６２３号の利益を主張する。上記の全ての出願はその全体が本明細書に参照することにより組み込まれる。
【０００２】
コンパクトディスクにおける配列表の参照
本願は、「コピー１」「コピー２」および「ＣＲＦ」のラベルを付けた３つの同一のコンパクトディスク（ＣＤ−Ｒ）中の電子文書として米国出願第１１／４９５，６２４号とともに提供される、「配列表」を参照する。これらのコンパクトディスクはそれぞれ、ファイル「ＰＦ６１７  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」（１，１９３，４８２バイト、２００６年７月２８日作成）を含み、その全体が参照することにより組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、概して、アルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくは変異体に融合された治療用タンパク質（少なくとも１つのポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそのフラグメントおよび変異体が挙げられるが、これらに限定されない）に関する。本発明は、治療用アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、治療用アルブミン融合タンパク質、組成物、医薬組成物、製剤、およびキットを含む。治療用アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞もまた、本発明により包含され、同様に、これらのポリヌクレオチド、および／または宿主細胞を用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する方法も本発明に包含される。
【０００４】
その成熟形態において、（図１（配列番号１）に示されるような）５８５個のアミノ酸のタンパク質であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）は、血清の浸透圧の相当な割合に関与しており、内因性および外因性リガンドの担体としても機能する。現在、臨床用のＨＡは、ヒト血液からの抽出物により生成される。微生物における組換えＨＡ（ｒＨＡ）の生成は、欧州特許出願第３３０４５１号および欧州特許出願第３６１９９１号に開示されている。
【０００５】
天然状態における、または組換え産生される場合の治療用タンパク質（例えば、インターフェロンおよび成長ホルモン）は、典型的には、特に水溶液中で製剤化される場合、短い貯蔵寿命を示す不安定な分子である。投与用に製剤化する場合のこれらの分子の不安定性は、該分子の多くが貯蔵中、常に凍結乾燥および冷蔵されなければならず、それにより、該分子を輸送および／または貯蔵するのを困難にする。貯蔵の問題は、医薬製剤が、病院の環境の外で貯蔵および調剤されなければならない場合に、特に深刻である。
【０００６】
不安定なタンパク質分子の貯蔵問題に対する実際的な解決策はほとんど提案されていない。したがって、容易に調剤できる、好ましくは、貯蔵後の操作を最小限しか必要としない単純な処方による、タンパク質治療用分子の安定化された持続性のある製剤が必要とされている。
【０００７】
生体内に投与する場合、天然状態における、または組換えにより産生された治療用タンパク質（例えばインターフェロンおよび成長ホルモン）は、血流からの迅速なクリアランスに起因して短い血漿安定性を示す。したがって、これらのタンパク質により提供される治療効果も短命である。したがって、生体内においてそれらの所望の治療効果を維持するためには、血液からのこれらのタンパク質の迅速なクリアランスにより、治療用分子をより頻繁に、またはより高用量で投与する必要がある。しかしながら、治療用タンパク質を投与するための投薬スケジュールの増加は、多くの場合、注入部位反応、副作用、および毒性の増加を患者にもたらす。同様に、高用量での治療用タンパク質の投与も、一般的に、毒性および副作用の増加を患者にもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
化学的共役を含む、提案されている治療用分子の血漿安定性を増大させるためのいくつかの実際的な解決策は、患者に限定的な利点を提供している。概して、ほとんどの場合、これらの化学修飾された治療用分子は、頻繁な投薬スケジュールでなお投与され、著しい注入部位反応、副作用、および毒性を患者に与え続ける。したがって、天然または組換えにより産生された治療剤単独よりも高い生体内での血漿安定性を保持し、かつより少ない頻度での投与を可能にし、それにより、患者への潜在的な副作用を軽減する安定化された形態の治療用分子が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント（部分）もしくは変異体に融合された治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、またはペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体）を含むアルブミン融合タンパク質を含有する。本発明はまた、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント（部分）もしくは変異体に融合された治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、またはペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体）をコードする核酸分子を含む、または代替としてそれからなるポリヌクレオチドも包含する。本発明はまた、治療用タンパク質の貯蔵寿命を延長し、その非融合状態と比較して、治療用タンパク質の血漿安定性を増大させ、ならびに／または体外および／もしくは生体内で溶液中（または医薬組成物中）の治療用タンパク質および／もしくはその活性を安定化するのに十分な、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント（部分）もしくは変異体に融合された治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、またはペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体）を含むタンパク質をコードする核酸分子を含む、または代替として、それからなるポリヌクレオチドも包含する。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアルブミン融合タンパク質もまた、本発明により包含され、同様に、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞、本発明のアルブミン融合タンパク質の作製方法、ならびに本発明のこれらのポリヌクレオチドおよび／もしくは宿主細胞の使用方法も、本発明により包含される。
【００１０】
本発明の好ましい態様において、アルブミン融合タンパク質は、表２に記載のもの、およびかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および医薬的に許容される希釈剤または担体を含む医薬製剤も包含する。かかる製剤はキットまたは容器中にあってもよい。かかるキットまたは容器は、長期化した貯蔵寿命の治療用タンパク質に付属する使用説明書と一緒にパッケージされていてもよい。かかる製剤は、患者、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトにおける、疾患または疾患徴候を処置、予防、改善、または診断する方法に使用され得、患者へ該医薬製剤を投与する工程を含む。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、疾患または障害の予防、処置、または改善する方法を包含する。好ましい実施形態において、本発明は、表１の「好適な適応症Ｙ」の列に挙げた疾患または障害の処置方法を包含し、該方法は、かかる処置、予防、または改善が所望される患者に、疾患または障害を処置、予防、または改善するために有効な量で、（表１の「好適な適応症Ｙ」の列に挙げた処置すべき疾患または障害と同じ行にある）表１の「治療用タンパク質Ｘ」の列に開示された治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に対応する治療用タンパク質または部分を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与することを含む。
【００１３】
一実施形態において、表１または２に記載のアルブミン融合タンパク質は長期化した貯蔵寿命を有する。
【００１４】
第２の実施形態において、表１または２に記載のアルブミン融合タンパク質は、表１に記載の対応する非融合治療用分子よりも安定である。
【００１５】
本発明は、本発明の核酸分子（表１および２に記載のポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない）を含むよう修飾された、好ましくは本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するよう修飾されたトランスジェニック生物をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄは、ヒトアルブミン（配列番号１）の成熟形態のアミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチド（配列番号２）を示す。配列番号２のヌクレオチド１〜１７５５はヒトアルブミン（配列番号１）の成熟形態をコードする。
【図１Ｂ】図１Ａに同じ。
【図１Ｃ】図１Ａに同じ。
【図１Ｄ】図１Ａに同じ。
【図２】図２は、ｐＰＰＣ０００５クローニングベクターＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３２７８の制限酵素切断地図を示す。
【図３】図３は、ｐＳＡＣ３５パン酵母（ｙｅａｓｔ  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発現ベクター（Ｓｌｅｅｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２（１９９０））の制限酵素切断地図を示す。
【図４】図４は、Ｈｓ２９４Ｔメラノーマ細胞におけるＣＩＤ３１６５（ＣＩＤ３１６５タンパク質）によりコードされるＩＦＮアルブミン融合タンパク質と組換えＩＦＮａ（ｒＩＦＮａ）の抗増殖活性を比較する。様々な濃度のＣＩＤ３１６５タンパク質またはｒＩＦＮａのいずれかと共に細胞を培養し、次いで、培養の３日後に、ＢｒｄＵ取り込みにより増殖を測定した。ＣＩＤ３１６５タンパク質は、１０ｎｇ／ｍｌより高い濃度で細胞増殖の測定可能な阻害を惹起し、約２００ｎｇ／ｍｌにおいて５０％阻害を示した。（■）＝ＣＩＤ３１６５タンパク質、（◆）＝ｒＩＦＮａ。
【図５】図５は、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞における、様々な希釈度のＩＦＮａアルブミン融合タンパク質のＳＥＡＰ活性に対する効果を示す。アルブミンの上流に融合されたＩＦＮａの一調製物（◆）、ならびにアルブミンの下流に融合されたＩＦＮａの２つの異なる調製物（●）および（■）を試験した。
【図６】図６は、処置したサル（実施例７６を参照のこと）における、ＯＡＳ（ｐ４１）のｍＲＮＡレベルへの、構築物２２４９（ＣＩＤ２２４９タンパク質）に含まれるＤＮＡによりコードされるＩＦＮａアルブミン融合タンパク質の時間および用量効果を示す。各時点につき：１番目の棒＝媒体対照、２番目の棒＝３０ｕｇ／ｋｇ  ＣＩＤ２２４９タンパク質、１日目、静脈内、３番目の棒＝３０ｕｇ／ｋｇ  ＣＩＤ２２４９タンパク質、１日目、皮下、４番目の棒＝３００ｕｇ／ｋｇ  ＣＩＤ２２４９タンパク質、１日目、皮下、５番目の棒＝４０ｕｇ／ｋｇ  組換えＩＦＮａ、１、３および５日目、皮下。
【図７】図７は、構築物ＣＩＤ３６９１および３６１８（ＣＩＤ３６９１および３６１８タンパク質）に含まれるＤＮＡによりコードされるＢＮＰアルブミン融合タンパク質の、ＮＰＲ−Ａ／２９３Ｆレポーター細胞におけるｃＧＭＰ形成の活性化に対する用量反応関係を示す（実施例７８および７９を参照のこと）。ＢＮＰペプチド（■）ならびにアルブミンの上流に融合されたＢＮＰの２つの異なる調製物（□）および（●）を共に試験した。
【図８】図８は、自然発生的な高血圧ラットにおける平均動脈圧に対するＢＮＰアルブミン融合タンパク質の効果を示す（実施例７８を参照のこと）。媒体（□）、ＢＮＰペプチド（●）、またはＢＮＰアルブミン融合タンパク質（○）を尾部への静脈内注射により送達した。ｃｕｆｆ−ｔａｉｌ法により、収縮期血圧および拡張期血圧を記録した。
【図９】図９は、組換えＢＮＰペプチド（●）またはＢＮＰアルブミン融合タンパク質（○）の静脈内注射後の、１１〜１２週齢の雄のＣ５７／ＢＬ６マウスにおける血漿ｃＧＭＰレベルを示す（実施例７８を参照のこと）。ｃＧＭＰレベルを、静脈内注射後のいくつかの時点に集めた尾部の血液から調製した血漿から測定した。
【図１０】図１０は、構築物ＣＩＤ３７９６および３９５９に含まれるＤＮＡによりコードされるＢＮＰペプチドおよびＢＮＰアルブミン融合タンパク質の、ＮＰＲ−Ａ／２９３Ｆレポーター細胞におけるｃＧＭＰ形成の活性化に対する用量反応関係を示す（実施例８０を参照のこと）。ＢＮＰペプチド（■）ならびにアルブミンの下流に融合されたＢＮＰを含む２つの異なる調製物（□）および（◇）を共に試験した。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ネプリライシンでの処置を行う、または行わない、ＢＮＰおよびＡＮＰペプチドの、ＮＰＲ−Ａ／２９３Ｆレポーター細胞におけるｃＧＭＰ形成の活性化に対する、２４時間での用量反応関係を示す（実施例８１を参照のこと）。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ネプリライシンまたは対照ＭＥＳ緩衝液での処置後の、ＡＮＰペプチドの、ＮＰＲ−Ａ／２９３Ｆレポーター細胞におけるｃＧＭＰ形成の活性化に対する、２０分間、１時間、または２４時間での用量反応関係を示す（実施例８１を参照のこと）。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ネプリライシンまたは対照ＭＥＳ緩衝液での処置後の、アルブミンの上流に融合されたＡＮＰを含み、構築物ＣＩＤ３４８４に含まれるＤＮＡによりコードされる、ＡＮＰアルブミン融合タンパク質の、ＮＰＲ−Ａ／２９３Ｆレポーター細胞におけるｃＧＭＰ形成の活性化に対する、２０分間、１時間、または２４時間での用量反応関係を示す（実施例８１を参照のこと）。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ネプリライシンでの処理後の、特定の時間での無傷ナトリウム利尿ペプチドの割合（％）を示す。ＡＮＰおよびＢＮＰペプチド、ならびに三部構造を有するグリシン（ＣＩＤ３８０９）によりアルブミンの上流に融合されたＢＮＰおよびアルブミン（ＣＥＤ３４８４）の上流に融合されたＡＮＰを含む、２つのアルブミン融合タンパク質を共に試験した（実施例８１を参照のこと）。
【図１２】図１２は、慢性Ｃ型肝炎遺伝子型１に感染し、０〜２４週間、リバビリンと組み合わせて、ＨＳＡ−ＩＦＮα２ｂでの処置後、リバビリン（ＰＥＧ−ＲＢＶ）と組み合わせて、ペグインターフェロンアルファの少なくとも１つの処置計画に以前応答しなかった患者（非応答者）における、ＨＣＶ  ＲＮＡ中央値の変化（ｌｏｇ１０  ＩＵ／ｍｌ）により測定される、ＨＣＶ  ＲＮＡ滴定濃度の減少を示す。
【図１３】図１３ＡおよびＢは、正常で健全なブタ（ｎ＝４〜６／群）における、５ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラスの投与後、それぞれの血漿および尿ｃＧＭＰレベルに対するＨＳＡ−ＢＮＰ（構築物ＩＤ番号３９５９）の効果を示す。アスタリスクは、媒体からのｃＧＭＰレベルの有意な差異（ｐ＜０．０５）を示す。
【図１４】図１４Ａは、ブタ実験的心不全モデル（ｎ＝１０／群）における、拡張末期径の変化に対する２ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＢＮＰ（構築物ＩＤ番号３９５９）の静脈内ボーラスの投与の効果を示す。心室ペーシングにより、ブタにおいて心不全を誘導した。心エコー検査法により、拡張末期径を測定した。媒体すなわち基準値からの有意な変化（ｐ＜０．０５）が示される（それぞれ＆および＃）。  図１４Ｂは、ブタ実験的心不全モデル（ｎ＝１０／群）における、短縮率に対する２ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＢＮＰ（構築物ＩＤ番号３９５９）の静脈内ボーラスの投与の効果を示す。心室ペーシングにより、ブタにおいて心不全を誘導した。媒体すなわち基準値からの有意な変化（ｐ＜０．０５）が示される（それぞれ＆および＃）。
【図１５】図１５Ａ〜Ｈは、正常なイヌモデルにおいて、０．５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇでの単一静脈内ボーラスにより投与されたＨＳＡ−ＢＮＰ（構築物ＩＤ番号３９５９）の血行動態の効果を示す。心拍出量（ＣＯ）、平均動脈圧（ＭＡＰ）、肺毛細血管楔入圧（ＰＣＷＰ）、および肺動脈圧（ＰＡＰ）を、麻酔状態の正常な雑種イヌ（ｎ＝８／群）において、０．５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＢＮＰ（構築物ＩＤ番号３９５９）の静脈内ボーラス前の基準値、ならびに注入してから３０、６０、９０、１５０、２１０、および２７０分後、測定した。アスタリスクは、基準値からの統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）を示す。
【図１６】図１６Ａ〜Ｈは、正常なイヌモデルにおいて、０．５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇでの単一静脈内ボーラスにより投与されたＨＳＡ−ＢＮＰ（構築物ＩＤ番号３９５９）の腎臓に関する効果を示す。尿流量（速度／３０分間の採集）、ナトリウム利尿、腎血流量、および糸球体濾過量（ＧＦＲ）を、麻酔状態の正常な雑種イヌ（ｎ＝８／群）において、０．５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＢＮＰ（構築物ＩＤ番号３９５９）の静脈内ボーラス前の基準値、ならびに注入してから３０、６０、９０、１５０、２１０、および２７０分後、測定した。アスタリスクは、基準値からの統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）を示す。
【図１７】図１７Ａ〜Ｆは、正常なイヌモデルにおいて、０．５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇでの単一静脈内ボーラスにより投与されたＨＳＡ−ＢＮＰ（構築物ＩＤ番号３９５９）のホルモン効果を示す。血漿アルドステロン、レニン、およびアンジオテンシンＩＩレベルを、麻酔状態の正常な雑種イヌ（ｎ＝８／群）において、０．５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＢＮＰ（構築物ＩＤ番号３９５９）の静脈内ボーラス前の基準値、ならびに注入してから３０、６０、９０、１５０、２１０、および２７０分後、測定した。アスタリスクは、基準値からの統計的に有意な差異（ｐ＜０．０５）を示す。
【図１８】図１８Ａ〜Ｃは、全身動脈血圧、心拍数、およびＥＣＧデータ収集能力を有する、Ｄａｔａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製の無線遠隔送信機を外科的に埋め込まれた正常な、健全な、覚醒中のビーグルにおける収縮期および平均動脈圧における、５ｍｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＢＮＰ（構築物ＩＤ番号３９５９）の単一静脈内ボーラスの効果を示す。注入してから４８時間の連続データを記録し、最大血圧の基準値からの変化（図１８Ａ）、平均最大血圧の差異（図１８Ｂ）、および平均動脈圧における基準値からの変化（図１８Ｃ）を示す。アスタリスクは、媒体と比較して、５ｍｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＢＮＰ（構築物ＩＤ番号３９５９）に対する基準調整された平均値の統計的に有意な差異を示す（ｐ＜０．０５）。
【図１９】図１９ＡおよびＢは、全身動脈血圧、心拍数、およびＥＣＧデータ収集能力を有する、Ｄａｔａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製の無線遠隔送信機を外科的に埋め込まれた正常な、健全な、覚醒中のビーグルの全身血圧における、０．０２ｍｇ／ｋｇの非融合ＢＮＰペプチドの静脈内ボーラスと、１０ｍｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＢＮＰ（構築物ＩＤ番号３９５９）の皮下注射の効果の比較を示す。ＢＮＰ（図１９Ａ）およびＨＳＡ−ＢＮＰ（構築物ＩＤ番号３９５９）を投与してから４８時間の連続データを記録し、最大血圧の基準値からの変化を示す。アスタリスクは、媒体と比較して、５ｍｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＢＮＰ（構築物ＩＤ番号３９５９）に対する基準調整された平均値の統計的に有意な差異を示す（ｐ＜０．０５）。
【図２０Ａ】図２０は、ＢＣｈＥ−アルブミン融合の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。融合は、実施例９０で論じられる。
【図２０Ｂ】図２０は、ＢＣｈＥ−アルブミン融合の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。融合は、実施例９０で論じられる。
【図２０Ｃ】図２０は、ＢＣｈＥ−アルブミン融合の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。融合は、実施例９０で論じられる。
【図２１】図２１は、野生型ＢＣｈＥ（ＷＴ）およびこの酵素から誘導されるコカイン加水分解酵素の触媒能力を示す。値は、ｋｃａｔ（酵素１分子毎の１分間あたりの天然、（−）−コカイン加水分解された酵素の分子）として表される。ＢｃｈＥ変異体におけるアミノ酸置換は、Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ａ（ＣｏｃＥ，Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、Ｆ２２７Ａ／Ｓ２８７Ｇ／Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ａ（ＡＭＥ３５９，Ｐａｎｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ  ２００３）、Ａ３２８Ｗ／Ｙ３３２Ｇ／Ｓ２８７Ｇ／Ａ１９９Ｓ（ＣｏｃＨ，Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００４）である。
【図２２】図２２は、Ａｌｂｕ−ＣｏｃＨの精製および滴定を示す。Ａ）最終産物のクマシーブルー染色されたＳＤＳ電気泳動ゲル（Ｍ＝マーカー、Ｒ＝還元状態下での試料、ＮＲ＝非還元状態下での試料）  Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）およびＮ末端シークエンシングによる精製の評価  Ｃ）活性部位の滴定  残留ＢｃｈＥ活性は、半化学量論的な量の不可逆的有機リン酸エステル系コリンエステラーゼ阻害薬であるジイソプロピルフルオロリン酸塩（ＤＦＰ）を増加させながら、一晩培養後、線形的に減少した。この典型的なバッチ（３つのうちの１つ）のＸ軸の切片は、約７．７ｐｍｏｌの活性部位セリン残基（推定上のＤＦＰ標的）を示す。酵素タンパク質の量は、０．７２μｇであり、８．５ｐｍｏｌに等しい。したがって、９０％を超える精製物質は、酵素的に活性であった。
【図２３】図２３は、生体内のＡｌｂｕ−ＣｏｃＨの安定性を示す。ゼロ時間での、Ａｌｂｕ−ＣｏｃＨの３ｍｇ／ｋｇの静脈内投与を注入された５匹のラットのうちの１匹における血漿コカイン加水分解酵素の代表的な経時変化。二重指数減衰式に適合した、これらのデータは、７．９時間の末端消失半減期を示した。初期でのより高い傾きは、予備的な再分布相は、酵素の組織要素への結合、代謝破壊、または細胞外液への制限された経毛細管経路を示し得る
【図２４】図２４は、コカイン誘起される高血圧の鈍化を示す。ラットは、動脈カニューレのために、ウレタン（１．４５ｇ／ｋｇ）で麻酔された。次いで、Ａｌｂｕ−ＣｏｃＨ（黒丸、３ｍｇ／ｋｇの静脈投与）、または生理食塩水（白丸）を投与し、次いで、アトロピン（１ｍｇ／ｋｇ）を投与し、迷走神経反射を減少させ、基準圧力を１０分間記録した。ゼロ時間での、ラットをコカイン（３．５ｍｇ／ｋｇ）でチャレンジし、ノルエピネフィリン（ＮＥ、６μｇ／ｋｇ）で１０分後に、チャレンジした。平均血圧の変化を示す（平均±標準誤差、１群あたり５匹のラット）。
【図２５】図２５は、コカインの過剰摂取からの保護および救出。Ａ：生理食塩水（ｎ＝１０）、Ａｌｂｕ−ＣｏｃＨ（１用量あたりｎ＝６）、または野生型ＢＣｈＥ（ＷＴ、ｎ＝３）を静脈投与してから１０分後、コカイン（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を与えられた際の覚醒および発作の発生の割合（％）。Ｂ：コカインを投与されてから１０分後の、用量反応曲線におけるＡｌｂｕ−ＣｏｃＨ（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果（１群あたりｎ＝６）。
【図２６】図２６は、加速したコカインのクリアランスを示す。１０分前にＡｌｂｕ−ＣｏｃＨ（３ｍｇ／ｋｇの静脈投与−黒記号、ｎ＝４）または生理食塩水（白記号、ｎ＝４）を接種したラットに、コカイン（３０μＣｉ、３．５ｍｇ／ｋｇの静脈投与）を注入した後の血漿コカインレベルを、時間の関数として示す。血液試料は、コカイン投与の３０秒後から開始して、大腿動脈から採取し、放射分析でアッセイした。ここに示されるように、対照ラットにおける血漿コカインレベルは徐々に減少したが、Ａｌｂｕ−ＣｏｃＨで処置されたラットにおいては、最も早い採取時点（薬物注射の３０秒後）でほとんど検出限界まで低下した。
【図２７】図２７は、コカインの組織内蓄積の減少を示す。ラット（１群あたりｎ＝４）は、Ａｌｂｕ−ＣｏｃＨ（３ｍｇ／ｋｇの静脈投与）また生理食塩水で処置されてから１０分後、３Ｈ−コカイン（３０μＣｉ、３．５ｍｇ／ｋｇの静脈投与）が投与された。コカインを注射してから１０分後、脳、心臓、および血漿を、コカイン、およびその代謝物である安息香酸の分析のために採取した。Ａｌｂｕ−ＣｏｃＨによる処置は、組織負荷を大いに低下させた。未変化のコカインは、酵素で処置されたラットからの心臓および血漿において、ほとんど検出されず、代謝物である安息香酸により定量的に置換されていた。処置効果は脳においても十分ではあったが、小さく、神経組織がコカインの摂取に対して好ましい部位であるという事実と一致した。
【図２８】図２８は、薬物探索行動の、コカインで薬物刺激された復元の選択的遮断を示す。コカインを予め自己投与し、それを生理食塩水と置き換え、コカインを絶たれた１５匹のラットを、１日各１２回の２時間のセッションの直前に、生理食塩水（Ｓ）、コカイン（Ｃ、１０ｍｇ／ｋｇ）、またはアンフェタミン（Ａ、２ｍｇ／ｋｇ）の静脈注射で薬物刺激した。４日目と６日目に、２時間前に、Ａｌｂｕ−ＣｏｃＨの酵素（Ｅ）（２ｍｇ／ｋｇの静脈投与）を接種した。示されるデータは、以前は動作した（その時点ではなんの結果ももたらさない）レバーに対する全ての応答の平均±標準誤差である。水平ブラケットは、統計比較を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
以下の定義は、本明細書を通して用いる特定の用語の理解を容易にするために提供される。
【００１８】
本明細書に使用される「ポリヌクレオチド」とは、少なくとも１つの治療用タンパク質Ｘ（またはそのフラグメントもしくは変異体）のフレーム内に連結させたアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子を含む、または代替として、それからなる融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；配列番号Ｙのアミノ酸配列（表２の列６に記載のような）またはそのフラグメントもしくは変異体を含む、または代替として、それからなる融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；配列番号Ｘに示される配列を含む、または代替として、それからなるヌクレオチド配列を有する核酸分子；配列番号Ｚのアミノ酸配列を含む、または代替として、それからなる融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；表２または実施例において記載のように産生される本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；本発明の治療用アルブミン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子、表２に記載のアルブミン融合構築物中に含まれるヌクレオチド配列を有する核酸分子、または（表３に記載のような）ＡＴＣＣに寄託されたアルブミン融合構築物に含まれるヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。
【００１９】
本明細書に使用される「アルブミン融合構築物」とは、治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドのフレーム内に連結させたアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードするポリヌクレオチドを含むあるいはそれからなる核酸分子含む、または代替として、それからなる核酸分子；表２または実施例に記載のように産生された治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドのフレーム内に連結させたアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードするポリヌクレオチドを含む、または代替として、それからなる核酸分子；または治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドのフレーム内に連結されたアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードするポリヌクレオチドを含む、または代替として、それからなり、例えば、以下の要素：（１）自己複製機能ベクター（シャトルベクター、発現ベクター、組み込みベクター、および／または複製系が挙げられるが、これらに限定されない）、（２）転写開始領域（例えば、プロモーター領域（例えば、制御または誘導プロモーター、構成的プロモーター等））、（３）転写終結領域、（４）リーダー配列、および（５）選択可能なマーカーのうちの１つ以上をさらに含む、核酸分子を指す。治療用タンパク質およびアルブミンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アルブミン融合構築物の一部になると、それぞれ、アルブミン融合構築物の「一部（ｐｏｒｔｉｏｎ）」、「領域」、または「部分（ｍｏｉｅｔｙ）」とも称され得る。
【００２０】
本発明は、概して、アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、アルブミン融合タンパク質、およびアルブミン融合タンパク質をコードするアルブミン融合タンパク質またはポリヌクレオチドを用いて、疾患または障害を処置、予防または改善する方法に関する。本明細書に使用される「アルブミン融合タンパク質」とは、治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子にアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子を融合することにより形成されたタンパク質を指す。本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体およびヒト血清アルブミンの少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含み、それらは遺伝子融合により互いに結合される（すなわち、アルブミン融合タンパク質は核酸の翻訳により産生され、ここで、治療用タンパク質のすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチドは、アルブミンのすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチドのフレーム内に連結されている）。治療用タンパク質およびアルブミンタンパク質は、アルブミン融合タンパク質の一部になると、それぞれ、アルブミン融合タンパク質の「一部（ｐｏｒｔｉｏｎ）」、「領域」、または「部分（ｍｏｉｅｔｙ）」（例えば、「治療用タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」）とも称され得る。非常に好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、少なくとも１つの分子の治療用タンパク質Ｘまたはそのフラグメントもしくは変異体（治療用タンパク質Ｘの成熟形態が挙げられるが、これに限定されない）、および少なくとも１つの分子のアルブミンまたはそのフラグメントもしくは変異体（アルブミンの成熟形態が挙げられるが、これに限定されない）を含む。
【００２１】
さらなる好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、宿主細胞によりプロセシングを受け、周りの培地に分泌される。発現のために使用される宿主の分泌経路において生じる新生アルブミン融合タンパク質のプロセシングは、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合形成、適切な折りたたみ、炭水化物の付加およびプロセッシング（例えば、Ｎ結合型グリコシル化およびＯ結合型グリコシル化等）、特異的タンパク質切断、および多量体タンパク質へのアセンブリが挙げられ得るが、これらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、プロセシングされた形態である。最も好ましい実施形態において、「アルブミン融合タンパク質のプロセシングされた形態」とは、Ｎ末端シグナルペプチド切断をうけたアルブミン融合タンパク質産物を指し、本明細書において「成熟アルブミン融合タンパク質」とも称する。
【００２２】
いくつかの場合、本発明のアルブミン融合構築物を含む代表的クローンを、アメリカンタイプカルチャーコレクション（本明細書において「ＡＴＣＣ（登録商標）」と称する）に寄託した。さらに、当該技術分野で周知の技法および本明細書中に別記されている技法によって、寄託物から所定のアルブミン融合構築物を取り出すことが可能である。ＡＴＣＣ（登録商標）は、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに所在する。ＡＴＣＣ（登録商標）寄託は、特許手続目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に拠って行われた。
【００２３】
一実施形態において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質を含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質を含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、表２に記載されるポリヌクレオチドによりコードされる治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質を含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる好ましい実施形態において、本発明は、その配列が表２の配列番号Ｙとして示されているアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。他の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントを含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な変異体を含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は、血清アルブミンの成熟部分である。本発明は、これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに包含する。
【００２４】
さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントを含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な変異体を含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の成熟部分である。さらなる好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の細胞外可溶性ドメインである。代替的な実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の活性形態である。本発明は、これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに包含する。
【００２５】
さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントもしくは変異体、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントもしくは変異体を含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の成熟部分および血清アルブミンの成熟部分を含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。本発明は、これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに包含する。
【００２６】
治療用タンパク質
上記のように、本発明のポリヌクレオチドは、（好ましくは遺伝子融合により）互いに結合されている、治療用タンパク質の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体、およびヒト血清アルブミンの少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む、または代替として、それからなるタンパク質をコードする。
【００２７】
さらなる実施形態は、治療用タンパク質の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体、およびヒト血清アルブミンの少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む、または代替として、それからなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、これらは、互いに化学的共役により連結されている。
【００２８】
本明細書に使用される「治療用タンパク質」とは、１つ以上の治療的および／または生物学的活性を有する、タンパク質、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体を指す。本発明により包含される治療用タンパク質は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、および生物製剤が挙げられるが、これらに限定されない。（ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドという用語は、本明細書に同義的に用いられる。）「治療用タンパク質」という用語は、抗体ならびにそのフラグメントもしくは変異体を包含することが特に企図される。したがって、本発明のタンパク質は、治療用タンパク質の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体、および／または抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。さらに、「治療用タンパク質」という用語は、治療用タンパク質の内在性または天然に存在する相関物に言及してもよい。
【００２９】
「治療活性」を示すポリペプチドまたは「治療的に活性」であるタンパク質とは、本明細書に記載の、またはさもなければ当該技術分野で周知の１つ以上の治療用タンパク質のような、治療用タンパク質と関連する１つ以上の既知の生物学的活性および／または治療的活性を保有する、ポリペプチドを意味する。非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、疾患、状態または障害を処置、予防、または改善するために有用なタンパク質である。非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、特定の細胞型（正常（例えば、リンパ球）または異常（例えば、癌細胞））に特異的に結合し、したがって、その細胞型に化合物（薬物または細胞傷害性薬剤）を特異的に標的化するために使用され得るタンパク質であり得る。
【００３０】
例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質に含まれ得る「治療用タンパク質」部分の非包括的なリストには、ＩＦＮα、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＬＡＮＰ、ＶＤＰ、ＫＵＰ、ＣＮＰ、ＤＮＰ、ＨＣＣ−１、ベータデフェンシン−２、フラクタルカイン、オキシントモジュリン、キラー毒素ペプチド、ＴＩＭＰ−４、ＰＹＹ、アドレノメデュリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）、グレリン、ＣＧＲＰ、ＩＧＦ−１、ノイラミニダーゼ、血球凝集素、ブチリルコリンエステラーゼ、エンドセリン、およびメカノ成長因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
インターフェロンハイブリッドはまた、アルブミンのアミノまたはカルボキシ末端に融合され、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質を形成し得る。インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、増強された、または代替として抑制されたインターフェロン活性、例えば、抗ウイルス応答、細胞成長の調節、および免疫応答の調節を有し得る（Ｌｅｂｌｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，７３：３１０７−３１１１（１９７６）、Ｇｒｅｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５１：５４３−５４５（１９７４）、およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ，３５：３５７−３６９（１９７７））。各インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、ウイルス感染（例えば、肝炎（例えば、ＨＣＶ）、またはＨＩＶ）、多発性硬化症、または癌を処置、予防、または改善するために用いられ得る。
【００３２】
一実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンアルファ−インターフェロンアルファハイブリッド（本明細書においてアルファ−アルファハイブリッドと称する）を含む。例えば、該インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のアルファ−アルファハイブリッド部分は、インターフェロンアルファＤに融合されたインターフェロンアルファＡからなる、または代替として、それを含む。さらなる実施形態において、Ａ／Ｄハイブリッドは、一般的なＢｇＩＩＩ制限部位にてインターフェロンアルファＤに融合し、ここで、Ａ／ＤハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンアルファＡのアミノ酸１〜６２に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンアルファＤのアミノ酸６４〜１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｄハイブリッドは、アミノ酸配列：ＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＸ１ＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＴＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＤＬＬＤＫＦＣＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＭＱＥＥＲＶＧＥＴＰＬＭＮＸ２ＤＳＩＬＡＶＫＫＹＦＲＲＩＴＬＹＬＴＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＬＳＬＳＴＮＬＱＥＲＬＲＲＫＥ（配列番号９９）を含み、ここで、Ｘ１は、ＲまたはＫであり、Ｘ２は、ＡまたはＶである。さらなる実施形態において、Ａ／Ｄハイブリッドは、一般的なＰｖｕＩＩＩ制限部位にて融合し、ここで、Ａ／ＤハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンアルファＡのアミノ酸１〜９１に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンアルファＤのアミノ酸９３〜１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｄハイブリッドは、アミノ酸配列：ＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＸ１ＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＭＱＥＥＲＶＧＥＴＰＬＭＮＸ２ＤＳＩＬＡＶＫＫＹＦＲＲＩＴＬＹＬＴＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＬＳＬＳＴＮＬＱＥＲＬＲＲＫＥ（配列番号１００）を含み、ここで、Ｘ１は、ＲまたはＫであり、第２のＸ２は、ＡまたはＶである。これらのハイブリッドは、米国特許第４，４１４，５１０号（参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）にさらに記載される。
【００３３】
さらなる実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のアルファ−アルファハイブリッド部分は、インターフェロンアルファＦに融合されたインターフェロンアルファＡからなる、または代替として、それを含む。さらなる実施形態において、Ａ／Ｆハイブリッドは、一般的なＰｖｕＩＩＩ制限部位にて融合し、ここで、Ａ／ＦハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンアルファＡのアミノ酸１〜９１に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンアルファＦのアミノ酸９３〜１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｆハイブリッドは、アミノ酸配列：ＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＸＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＭＥＡＣＶＩＱＥＶＧＶＥＥＴＰＬＭＮＶＤＳＩＬＡＶＫＫＹＦＱＲＩＴＬＹＬＴＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＦＳＬＳＫＩＦＱＥＲＬＲＲＫＥ（配列番号１０１）を含み、ここで、Ｘは、ＲまたはＫのいずれかである。これらのハイブリッドは、米国特許第４，４１４，５１０号（参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）にさらに記載される。さらなる実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のアルファ−アルファハイブリッド部分は、インターフェロンアルファＢに融合されたインターフェロンアルファＡからなる、または代替として、それを含む。さらなる実施形態において、Ａ／Ｂハイブリッドは、一般的なＰｖｕＩＩＩ制限部位にて融合し、ここで、Ａ／ＢハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンアルファＡのアミノ酸１〜９１に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンアルファＢのアミノ酸９３〜１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｂハイブリッドは、アミノ酸配列：ＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＸ１ＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＱＥＶＧＶＩＥＳＰＬＭＹＥＤＳＩＬＡＶＲＫＹＦＱＲＩＴＬＹＬＴＥＫＫＹＳＳＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＦＳＬＳＩＮＬＱＫＲＬＫＳＫＥ（配列番号１０２）を含み、ここで、Ｘ１は、ＲまたはＫであり、Ｘ２〜Ｘ５は、ＳＣＶＭまたはＶＬＣＤである。これらのハイブリッドは、米国特許第４，４１４，５１０号（参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）にさらに記載される。
【００３４】
別の実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンベータ−インターフェロンアルファハイブリッド（本明細書においてベータ−アルファハイブリッドと称する）を含む。例えば、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のベータ−アルファハイブリッド部分は、インターフェロンアルファＤに融合されたインターフェロンベータ−１からなる、または代替として、それを含む（インターフェロンアルファ−１とも称する）。さらなる実施形態において、ベータ−１／アルファＤハイブリッドが融合され、ここでＮ末端部分は、インターフェロンベータ−１のアミノ酸１〜７３に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンアルファＤのアミノ酸７４〜１６７に対応する。例えば、このベータ−１／アルファＤハイブリッドは、アミノ酸配列：ＭＳＹＮＬＬＧＦＬＱＲＳＳＮＦＱＣＱＫＬＬＷＱＬＮＧＲＬＥＹＣＬＫＤＲＭＮＦＤＩＰＥＥＩＫＱＬＱＱＦＱＫＥＤＡＡＬＴＩＹＥＭＬＱＮＩＦＡＩＦＲＱＤＳＳＡＡＷＤＥＤＬＬＤＫＦＣＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＭＱＥＥＲＶＧＥＴＰＬＭＮＸＤＳＩＬＡＶＫＫＹＦＲＲＩＴＬＹＬＴＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＲＳＬＳＬＳＴＮＬＱＥＲＬＲＲＫＥ（配列番号１０３）を含み、Ｘは、ＡまたはＶである。これらのハイブリッドは、米国特許第４，７５８，４２８号（参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）にさらに記載される。
【００３５】
別の実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンアルファ−インターフェロンベータハイブリッド（本明細書においてアルファ−ベータハイブリッドと称する）を含む。例えば、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のアルファ−ベータハイブリッド部分は、インターフェロンベータ−１に融合されたインターフェロンアルファＤ（インターフェロンアルファ−１とも称する）からなる、または代替として、それを含む。さらなる実施形態において、アルファＤ／ベータ−１ハイブリッドが融合され、ここで、Ｎ末端部分は、インターフェロンアルファＤのアミノ酸１〜７３に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンベータ−１のアミノ酸７４〜１６６に対応する。例えば、このアルファＤ／ベータ−１ハイブリッドは、アミノ酸配列：ＭＣＤＬＰＥＴＨＳＬＤＮＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＳＲＩＳＰＳＳＣＬＭＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＤＧＮＱＦＱＫＡＰＡＩＳＶＬＨＥＬＩＱＱＩＦＮＬＦＴＴＫＤＳＳＳＴＧＷＮＥＴＩＶＥＮＬＬＡＮＶＹＨＱＩＮＨＬＫＴＶＬＥＥＫＬＥＫＥＤＦＴＲＧＫＬＭＳＳＬＨＬＫＲＹＹＧＲＩＬＨＹＬＫＡＫＥＹＳＨＣＡＷＴＩＶＲＶＥＩＬＲＮＦＹＦＩＮＲＬＴＧＹＬＲＮ（配列番号１０４）を有する。これらのハイブリッドは、米国特許第４，７５８，４２８号（参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）にさらに記載される。
【００３６】
さらなる実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、アルファ−アルファインターフェロンハイブリッド、アルファ−ベータインターフェロンハイブリッド、およびベータ−アルファインターフェロンハイブリッドのさらなる組み合わせを含み得る。さらなる実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンハイブリッドのアミノ酸配列に対して変異、置換、欠失、または付加を含むように改変され得る。インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質に対するこのような改変は、例えば、産生のレベルを改善し、安定性を増大し、活性を増大または減少し、あるいは新たな生物学的特性を付与するように行われ得る。
【００３７】
上記のインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、本発明により包含され、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞およびベクターも同様に含まれる。一実施形態において、上記のポリヌクレオチドによりコードされるインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、長期化した貯蔵寿命を有する。さらなる実施形態において、上記のポリヌクレオチドによりコードされるインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、体外および／または生体内において、対応する非融合インターフェロンハイブリッド分子より長い血清半減期、および／または溶液中（または医薬組成物中）でのより安定した活性を有する。
【００３８】
別の非限定的例において、「治療用タンパク質」は、生物学的活性、特に、疾患を処置、予防、または改善するために有用な生物学的活性を有するタンパク質である。治療用タンパク質により保持され得る生物学的活性の非包括的なリストには、細胞のＨＩＶ−１感染の阻害、腸上皮細胞増殖の刺激、腸上皮細胞透過性の減少、インスリン分泌の刺激、気管支拡張および血管拡張の誘導、アルドステロンおよびレニン分泌の阻害、血圧調節、ニューロン成長の促進、免疫応答の亢進、炎症亢進、食欲抑制、または以下の「生物学的活性」の項に記載される、および／または表１（列２）の特定の治療用タンパク質について開示される任意の１つ以上の生物学的活性が含まれる。
【００３９】
一実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物を用いて、カテゴリーＡ−フィロ（エボラ）、アレナ（Ｐｉｃｈｅｎｄｅ）、カテゴリーＢ−トガ（ＶＥＥ）またはカテゴリーＣ−ブンヤ（Ｐｕｎｔｏ  ｔｏｒｏ）、フラビ（黄熱病、ウエストナイル）に分類されるウイルス物質を阻害する。例えば、ＣＰＥ阻害、ニュートラルレッド染色、およびウイルス産生アッセイを採用して、ＨＳＡ（ＣＩＤ３１６５タンパク質）の下流に融合されたＩＮＦ−アルファの抗ウイルス活性を評価した。カニクイザルおよびヒト対象においてＣＩＤ３１６５タンパク質の薬物動態および薬動力学活性を評価した。結果は、好ましい安全性指標を伴って評価したすべてのＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性が成し遂げられたことを示す。ＣＰＥアッセイにおいてＩＣ５０値は、＜０．１ｎｇ／ｍｌ（Ｐｕｎｔａ  ＴｏｒｏＡ）〜１９ｎｇ／ｍｌ（ＶＥＥ）であった。カニクイザルにおいて、ＣＩＤ３１６５タンパク質の半減期は、９０時間であり、投与から最高１４日後まで検出可能であった。ヒト対象において、ＣＩＤ３１６５タンパク質は安全であり、かつ十分に許容された。１回注入投与後のＣｍａｘは用量に比例した。５００ｕｇのコホートにおける平均Ｃｍａｘは、２２ｎｇ／ｍｌであり、および平均ｔ１／２は、１５０時間であった。２〜４週以上ごとに１回の投与が薬物動態により支持される。１回注入のコホート（１２０〜５００ｕｇ）の大部分の対象において、Ｃ型肝炎に対抗する抗ウイルス応答が観察された。
【００４０】
さらなる実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物を用いて、慢性Ｃ型肝炎感染（ＨＣＶ）を有する患者を処置する。インターフェロンアルファまたは白血球インターフェロンとしても周知のインターフェロンアルファは、ＨＣＶに感染した患者を処置するための処置基準である。「インターフェロンアルファ」という用語は、抗ウイルス活性を有するポリペプチドに関連した高度に相同なファミリーを指す。ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物のインターフェロンアルファ部分は、当該技術分野で周知の任意のインターフェロンアルファまたはフラグメントからなる、または代替として、それを含む。本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質のインターフェロンアルファのインターフェロンアルファ部分の非限定的な例としては、表１の治療用タンパク質の列に開示されるインターフェロンアルファタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、インターフェロンアルファ部分は、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ｃ、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンアルファ−ｎｌ、インターフェロンアルファ−ｎ３、インターフェロンアルファの任意の商業的に入手可能な形態、例えば、ＩＮＴＲＯ（登録商標）Ａ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，Ｎ．Ｊ．）、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）Ａ（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，Ｎ．Ｊ．）、Ｂｅｒｏｆｏｒアルファインターフェロン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｄｇｅｆｉｅｄ，Ｃｏｎｎ．）、ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（商標）（Ｖｉｒａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＦＬ）、ＭＵＬＴＩＦＥＲＯＮ（商標）（Ｖｉｒａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＦＬ）ＷＥＬＬＦＥＲＯＮ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔｉａｎ）、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄｓ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＳＵＭＩＦＥＲＯＮ（登録商標）（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ，Ｊａｐａｎ）、ＢＥＬＥＲＯＦＯＮ（登録商標）（Ｎａｕｔｉｌｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＭＡＸＹ−ＡＬＰＨＡ（商標）（Ｍａｘｙｇｅｎ，Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ／Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，Ｎ．Ｊ．）、または任意の精製インターフェロンアルファ産物もしくはそのフラグメントからなる、または代替として、それらを含む。さらなる実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質のインターフェロンアルファ部分は、持続放出、または制御放出に対して修飾された、または処方されたインターフェロンアルファからなる、または代替として、それらを含む。例えば、インターフェロンアルファ部分は、インターフェロンアルファ−ＸＬ（Ｆｌａｍｅｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＬＯＣＴＥＲＯＮ（商標）（ＢｉｏＬｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ＯｃｔｏＰｌｕｓ，Ｐｉｔｔｓｂｏｒｏ，ＮＣ）が挙げられるが、これらに限定されない、商業的��入手可能である持続放出、または制御放出インターフェロンアルファからなる、または代替として、それらを含む。さらなる実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質のインターフェロンアルファ部分は、化学的部分の付着により修飾されてもよい。例えば、インターフェロンアルファ部分はペグ化により修飾されてもよい。したがって、さらなる実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質のインターフェロンアルファ部分は、インターフェロンアルファ−２ａ、２ｂ、またはコンセンサスインターフェロンのペグ化形態からなる、または代替として、それらを含み、商業的に入手可能であるペグ化インターフェロンアルファ、例えば、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，Ｎ．Ｊ．）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，Ｎ．Ｊ．）、ＰＥＧ−ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（商標）（Ｖｉｒａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＦＬ）またはそのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、本明細書に使用される「ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ」融合物とは、当該技術分野で周知の任意のインターフェロンアルファタンパク質に融合されたＨＳＡまたはそのフラグメントを指す。
【００４１】
ＨＣＶに感染した患者は、ＨＣＶ感染を処置するためにインターフェロン療法を事前に受けたか否かに基づいて２つのカテゴリー内にあり得る。「無処置患者（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−ｎａｉｖｅ  ｐａｔｉｅｎｔまたはｎａｉｖｅ  ｐａｔｉｅｎｔ）」は、インターフェロン療法を用いた処置を未だ受けていない患者である。「処置経験のある患者（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔまたはｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ）」は、インターフェロン療法を用いた処置を受けた、または現在受けている患者である。「非応答患者（Ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）」は、インターフェロン療法を用いた処置を事前に受けたが、早期のウイルス量減少（ＥＶＲ）または処置終了時の応答（ＥＴＲ）等の処置の主要なエンドポイントを満たさなかった、処置経験のある患者である。「再発者（Ｒｅｌａｐｓｅｒ）」は、インターフェロン療法を用いた処置を事前に受け、ＥＶＲまたはＥＴＲ等の処置の主要なエンドポイントに達したが、その後、さらに後の時点で、ＨＣＶに対して陽性を示した、処置経験のある患者である。しかしながら、本明細書に使用される「ＨＣＶ患者」とは、ＨＣＶに感染している患者、および無処置患者あるいは処置経験のある患者のいずれかである、患者を指す。加えて、本明細書に使用される「処置経験のある」「ＨＣＶ患者」は、非応答患者あるいは再発者のいずれかである。
【００４２】
加えて、Ｃ型肝炎ウイルスは、数多くの遺伝子型に分類することができ、最も４つの遺伝子型である、遺伝子型１、２、３、または４の４つの遺伝子型が最も一般的である。概して、ＨＣＶ患者に感染するＣ型肝炎ウイルスは、単一の遺伝子型を含む。しかしながら、該肝炎ウイルスは、２つ以上の遺伝子型の組み合わせを含むことができる。加えて、Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型は、既知のＨＣＶ遺伝子型の１つの変異体であり得る。さらなる実施形態において、ＨＣＶ患者のＣ型肝炎ウイルスは、遺伝子型１またはその変異体である。しかしながら、本明細書に使用される「ＨＣＶ」は、任意の遺伝子型もしくはそれらの組み合わせまたは変異体のＣ型肝炎ウイルスを指す。
【００４３】
ＨＣＶに罹患する患者についての標準的な処置療法は、リバビリン等の抗ウイルス剤と組み合わせたインターフェロンアルファを用いた処置を含む。一般的に、インターフェロンアルファは、毎日、１週間に２回、または１週間に１回投与され、リバビリンは、毎日投与される。しかしながら、最近の研究は、ＨＣＶの処置のために当該技術分野で周知の他の抗ウイルス剤と組み合わせて、インターフェロンアルファも用いている。したがって、さらなる実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物は、単独、または例えばリバビリン等の抗ウイルス剤と組み合わせて、ＨＣＶ患者へ投与されてもよい。さらに好ましい実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス剤、例えば、リバビリンおよびさらなる抗ウイルス剤等と組み合わせて、ＨＣＶ患者に投与され得る。
【００４４】
上記のように、ＣＩＤ３１６５タンパク質の薬物動態は２〜４週以上ごとに１回という投薬スケジュールを支持する。したがって、さらなる実施形態において、ＨＣＶ患者は、２〜４週ごとに１回、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物を単独または有効量の抗ウイルス剤と組み合わせて投与することにより処置される。好ましい実施形態において、ＨＣＶ患者は、２〜４週ごとに１回、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物を、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス剤と組み合わせて、投与することにより処置される。さらなる好ましい実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物は、４週ごとに１回、ＨＣＶ患者へ投与される。さらなる好ましい実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物は、４週ごとに１回以上、ＨＣＶ患者へ投与される。さらなる実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物は、４週またはそれ以上に１回、ＨＣＶ患者へ投与され、ここで、処置は、有効量の１つ、２つ、３つまたはそれ以上の抗ウイルス剤の投与も含む。
【００４５】
別の実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物は、ＨＣＶの維持治療のために低用量の単独治療法として用いられてもよい。さらなる追加の実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物は、ＨＣＶの処置のためにリバビリン、および１つ以上の他の抗ウイルス剤と組み合わせて用いられてもよい。代替として、別の実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物は、ＨＣＶの処置のためにリバビリン以外の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス剤と組み合わせて用いられてもよい。
【００４６】
さらなる実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物は、他のウイルス感染の処置のために用いられてもよい。例えば、一実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物は、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）の処置のために用いられてもよい。さらなる実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の処置のために用いられてもよい。さらなる実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合物は、有毛細胞白血病、悪性メラノーマ、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、多発性骨髄腫、または腎細胞癌が挙げられるが、これらに限定されない癌の処置において用いられてもよい。
【００４７】
別の実施形態において、ＡＮＰ−ＨＳＡ融合物またはＢＮＰ−ＨＳＡ融合物が挙げられるが、これらに限定されないナトリウム利尿ペプチドを有するＨＳＡ融合物は、心血管疾患の処置のために用いられてもよい。例えば、好ましい実施形態において、ＡＮＰ−ＨＳＡ融合物またはＢＮＰ−ＨＳＡ融合物が挙げられるが、これらに限定されないナトリウム利尿ペプチドを有するＨＳＡ融合物は、うっ血性心不全の処置のために用いられてもよい。さらなる好ましい実施形態について、ＡＮＰ−ＨＳＡ融合物またはＢＮＰ−ＨＳＡ融合物が挙げられるが、これらに限定されないナトリウム利尿ペプチドを有するＨＳＡ融合物は、心筋梗塞後の処置のために用いられてもよい。さらなる実施形態において、ＡＮＰ−ＨＳＡ融合物またはＢＮＰ−ＨＳＡ融合物が挙げられるが、これらに限定されないナトリウム利尿ペプチドを有するＨＳＡ融合物は、高血圧、食塩感受性高血圧、狭心症、末梢動脈障害、低血圧、心容積の過負荷、心代償不全、心不全、左心室機能障害、呼吸困難、心筋再かん流傷害、または左室リモデリングが挙げられるが、これらに限定されないさらなる心血管疾患の処置のために用いられてもよい。別の実施形態において、ＡＮＰ−ＨＳＡ融合物またはＢＮＰ−ＨＳＡ融合物が挙げられるが、これらに限定されないナトリウム利尿ペプチドを有するＨＳＡ融合物は、血管収縮、心拍出量低下および／または高血圧を引き起こし得る、アルドステロン濃度の上昇の治療において用いられてもよい。さらなる実施形態において、ＡＮＰ−ＨＳＡ融合物またはＢＮＰ−ＨＳＡ融合物が挙げられるが、これらに限定されないナトリウム利尿ペプチドを有するＨＳＡ融合物は、糖尿病腎症、糸球体肥大、糸球体損傷、腎糸球体疾患、急性および／または慢性腎不全が挙げられるが、これらに限定されない腎臓病の処置において用いられてもよい。さらなる実施形態において、ＡＮＰ−ＨＳＡ融合物またはＢＮＰ−ＨＳＡ融合物が挙げられるが、これらに限定されないナトリウム利尿ペプチドを有するＨＳＡ融合物は、脳卒中または組織の過剰な流体を処置するために用いられてもよい。
【００４８】
さらなる実施形態において、ＨＳＡは、融合タンパク質のＢＮＰ成分がＢＮＰアミノ酸残基１〜２９である、ＢＮＰ−ＨＳＡ融合物が挙げられるが、これに限定されないナトリウム利尿ペプチド変異体と融合し得る。一実施形態において、ＨＳＡ融合タンパク質のＢＮＰ要素は、縦に連結した、２つのＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）からなる。別の実施形態において、ＨＳＡ融合タンパク質のＢＮＰ成分は、縦に連結した、３つ、４つ、５つ、またそれ以上のＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）からなる。好ましい実施形態において、ＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）とのＨＳＡ融合は、うっ血性心不全の処置のために用いられ得る。さらなる好ましい実施形態において、ＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）とのＨＳＡ融合は、心筋梗塞後の処置において用いられてもよい。さらなる実施形態において、ＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）とのＨＳＡ融合は、高血圧、食塩感受性高血圧、狭心症、末梢動脈障害、低血圧、心容積の過負荷、心代償不全、心不全、非血液動態的慢性心不全、左心室機能障害、呼吸困難、心筋再かん流傷害、または左室リモデリングが挙げられるが、これらに限定されないさらなる心血管疾患の処置のために用いられ得る。別の実施形態において、ＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）とのＨＳＡ融合は、血管収縮、心拍出量低下および／または高血圧を引き起こし得る、アルドステロン濃度の上昇の治療において用いられ得る。好ましい実施形態において、ＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）とのＨＳＡ融合は、糖尿病腎症、糸球体肥大、糸球体損傷、腎糸球体疾患、急性および／または慢性腎不全が挙げられるが、これらに限定されない腎臓障害または腎臓病の処置において用いられて得る。さらなる実施形態において、ＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）とのＨＳＡ融合は、脳卒中または組織の過剰な流体を処置するために用いられ得る。
【００４９】
関連するが異なる実施形態において、本発明は、ペプチドが、ＨＳＡと融合しない、ＢＮＰアミノ酸残基１−２９を含むが、これらに限定されないナトリウム利尿ペプチド変異体を対象にする。一実施形態において、本発明のＢＮＰ変異体は、縦に連結した、２つのＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）の配列を有する。さらなる実施形態において、本発明のＢＮＰ変異体は、縦に連結した、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）の配列を有する。好ましい実施形態において、本発明のＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）は、うっ血性心不全の処置のために用いられ得る。さらなる好ましい実施形態において、本発明のＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）は、心筋梗塞後の処置において用いられ得る。さらなる実施形態において、本発明のＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）は、高血圧、食塩感受性高血圧、狭心症、末梢動脈障害、低血圧、心容積の過負荷、心代償不全、心不全、非血液動態的慢性心不全、左心室機能障害、呼吸困難、心筋再かん流傷害、または左室リモデリングが挙げられるが、これらに限定されないさらなる心血管疾患の処置のために用いられ得る。別の実施形態において、本発明のＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）は、血管収縮、心拍出量低下および／または高血圧を引き起こし得る、アルドステロン濃度の上昇の処置において用いられ得る。好ましい実施形態において、本発明のＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）は、糖尿病腎症、糸球体肥大、糸球体損傷、腎糸球体疾患、急性および／または慢性腎不全が挙げられるが、これらに限定されない腎臓障害または腎臓病の処置において用いられ得る。さらなる実施形態において、本発明のＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）は、脳卒中または組織の過剰な流体を処置するために用いられ得る。
【００５０】
さらなる実施形態において、本発明は、半減期を延長する、生物学的活性を改善する、および／または変異体の精製を容易にするために、改変されている、ＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）を含むが、これらに限定されないナトリウム利尿ペプチド変異体を対象にする。本実施形態によれば、ナトリウム利尿ペプチド変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）は、ペグ化、メチル化、またはさもなければ当該技術分野で周知の技法を用いて化学修飾もしくは共役され得る。代替として、当該技術分野で周知の方法は、半減期を延長する、生物学的活性を改善する、および／または精製を容易にするために、当該技術分野で周知の他のペプチド配列に本発明のナトリウム利尿ペプチド変異体を組み換え技術により融合するために用いられてもよい。例えば、本発明のナトリウム利尿ペプチド変異体は、抗体Ｆｃ領域またはその部分に融合または共役され得る。本発明のナトリウム利尿ペプチド変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）に融合される抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、または全ドメインまたはその部分の任意の組み合わせを含み得る。ナトリウム利尿変異体はまた、多量体を形成するために、上記の抗体部分に融合または共役され得る。例えば、本発明のポリペプチド（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）に融合されるＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合を通して二量体を形成することができる。それ以上の多量体型は、ＩｇＡおよびＩｇＭの部分に変異体を融合することにより作製され得る。抗体部分に本発明の変異体を融合または共役するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、同第５，１１２，９４６号、欧州特許出願第３０７，４３４号、同第３６７，１６６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０４３８８号、同第ＷＯ９１／０６５７０号、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９５）、およびＶｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）を参照のこと（該参照は、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）。さらなる実施形態において、本発明の修飾されたＢＮＰ変異体は、縦に連結した、２つのＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）の配列を有する。さらなる実施形態において、本発明の修飾されたＢＮＰ変異体は、縦に連結した、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）の配列を有する。好ましい実施形態において、本発明の修飾されたＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）は、うっ血性心不全の処置のために用いられ得る。好ましい実施形態において、本発明の修飾されたＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）は、心筋梗塞後の処置において用いられ得る��さらなる実施形態において、本発明の修飾されたＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）は、高血圧、食塩感受性高血圧、狭心症、末梢動脈障害、低血圧、心容積の過負荷、心代償不全、心不全、非血液動態的慢性心不全、左心室機能障害、呼吸困難、心筋再かん流傷害、または左室リモデリングが挙げられるが、これらに限定されないさらなる心血管疾患の処置のために用いられ得る。別の実施形態において、本発明の修飾されたＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）は、血管収縮、心拍出量低下および／または高血圧を引き起こし得る、アルドステロン濃度の上昇の処置において用いられ得る。好ましい実施形態において、本発明の修飾されたＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）は、糖尿病腎症、糸球体肥大、糸球体損傷、腎糸球体疾患、急性および／または慢性腎不全が挙げられるが、これらに限定されない腎臓障害または腎臓病の処置において用いられ得る。さらなる実施形態において、本発明の修飾されたＢＮＰ変異体（例えば、ＢＮＰアミノ酸残基１〜２９）は、脳卒中または組織の過剰な流体を処置するために用いられ得る。
【００５１】
別の実施形態において、ＣＮＰ−ＨＳＡ融合物は、軟骨内骨化（ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の調節において用いられ得る。例えば、好ましい実施形態において、ＣＮＰ−ＨＳＡ融合物は、軟骨形成不全症、軟骨低形成症、および致死性骨異形成症が挙げられるが、これらに限定されない骨異形成症の処置において用いられ得る。
【００５２】
本明細書に使用される「治療活性」または「活性」は、その効果が、ヒトにおける所望の治療結果に一致する活性、あるいは非ヒト哺乳類または他の種もしくは生物における所望の効果を指し得る。治療活性は、生体内または体外で測定することができる。例えば、所望の効果は、細胞培養にてアッセイされ得る。このような体外または細胞培養アッセイは、当該技術分野において記載される多数の治療用タンパク質のために一般的に使用可能である。アッセイの例としては、実施例の項または表１の「例示的な活性アッセイ」の列（列３）における本明細書に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
例えば、細胞表面および分泌タンパク質等の本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質は、多くの場合、１つ以上のオリゴ糖基の付着により修飾される。グリコシル化と称されるこの修飾は、タンパク質の物理的特性に顕著に作用し得、タンパク質の安定性、分泌、および局在性において重要であり得る。グリコシル化は、ポリペプチド骨格に沿った特定の位置において生じる。通常、グリコシル化には２つの主要な型：セリンまたはトレオニン残基に付着する、Ｏ−結合オリゴ糖により特徴付けられるグリコシル化；およびＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列［式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であり得る］中のアスパラギン残基に付着する、Ｎ−結合オリゴ糖により特徴付けられるグリコシル化がある。Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸としても知られている）は、通常、Ｎ−結合およびＯ−結合オリゴ糖の双方の末端残基である。タンパク質構造および細胞型等の可変要素は、鎖内の異なるグリコシル化部位での炭水化物単位の数および性質に影響する。グリコシル化アイソマーもまた、所定の細胞型内の同じ部位で一般的である。
【００５４】
本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、ならびにそのアナログおよび変異体に対応する治療用タンパク質は、１つ以上の部位でのグリコシル化が、それらが発現される宿主細胞により、またはそれらの発現の他の条件に起因して、それらの核酸配列の操作の結果として変化するように改変され得る。例えば、グリコシル化アイソマーは、グリコシル化部位を除去または導入することにより、例えば、アスパラギンをグルタミンで置換する等のアミノ酸残基の置換または欠失により作製されてもよく、またはグリコシル化されていない組換えタンパク質は、それらをグリコシル化しない宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはグリコシル化欠損酵母においてタンパク質を発現させることにより作製されてもよい。これらのアプローチは、以下でより詳細に記載され、当該技術分野で周知である。
【００５５】
（特に表１に開示される）治療用タンパク質、およびそれらの核酸およびアミノ酸配列は、当該技術分野でよく知られており、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ（例えば、ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベース、およびＧｅｎＳｅｑ（例えば、Ｄｅｒｗｅｎｔ）等の定期購読契約型提供データベースにおいて入手可能である。本発明のポリヌクレオチドを誘導するために使用され得る治療用タンパク質の例示的なヌクレオチド配列を、表２の列７「配列番号Ｘ」に示す。配列番号Ｘとして示される配列は、所定の治療用タンパク質（例えば、全長または成熟型のいずれか）をコードする野生型ポリヌクレオチド配列であってもよく、またはいくつかの場合、該配列は、該野生型ポリヌクレオチド配列の変異体（例えば、野生型治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ここで、該ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列は、例えば、特定の種における発現のために最適化されている、または野生型治療用タンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチド（すなわち、部位特異的変異；対立遺伝子変異体））であってもよい。配列番号Ｘとして示される配列を用いて同じ列に記載の構築物を誘導することは、当業者の能力の範囲内に十分にある。例えば、配列番号Ｘが全長タンパク質に対応するが、そのタンパク質の一部分のみを用いて特定のＣＩＤを生成する場合、ＰＣＲ等の分子生物学技法に依存して特定のフラグメントを増幅し、それを適切なベクターにクローニングすることは、当該技術分野の範囲内である。
【００５６】
本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応するさらなる治療用タンパク質としては、表１の「治療用タンパク質Ｘ」列（列１）に開示される１つ以上の治療用タンパク質もしくはペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
表１は、本発明のアルブミン融合タンパク質、または本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質の非限定的なリストを提供する。第１の列「治療用タンパク質Ｘ」は、治療用タンパク質分子を開示し、治療用タンパク質分子、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む、または代替として、それからなるタンパク質の学名および商品名を含む括弧書きが続き得る。本明細書に使用される「治療用タンパク質Ｘ」は、個々の治療用タンパク質分子またはこの列において開示される所定の治療用タンパク質分子に関連する治療用タンパク質の群全体のいずれかを指し得る。「生物学的活性」の列（列２）は、治療用タンパク質分子に関連する生物学的活性を記載する。列３の「例示的な活性アッセイ」は、治療用タンパク質Ｘ、または治療用タンパク質Ｘ（またはそのフラグメント）部分を含むアルブミン融合タンパク質の治療および／または生物学的活性を試験するために用いられてもよいアッセイを記載している参考文献を提供する。「例示的な活性アッセイ」列に引用される参考文献のそれぞれは、特に、表１の「生物学的活性」の列に示される対応する生物学的活性をアッセイするために参考文献（例えば、その中の「方法」の項を参照のこと）に記載される各活性アッセイの例の記述に関して、その全体が本明細書に参照することにより組み込まれる。４番目の列の「好適な適応症Ｙ」は、治療用タンパク質Ｘまたは治療用タンパク質Ｘ（またはそのフラグメント）部分を含むアルブミン融合タンパク質により処置、予防、診断、および／または改善され得る疾患、障害、および／または状態を記載する。「構築物ＩＤ」の列（列５）は、参照した治療用タンパク質Ｘ（またはそのフラグメント）部分を含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質をコードする、表２に開示される例示的なアルブミン融合構築物に対する関連を提供する。
【００５８】
【表１−１】
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【００５９】
【表１−２】
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【００６０】
【表１−３】
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【００６１】
【表１−４】
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【００６２】
【表１−５】
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【００６３】
【表１−６】
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【００６４】
【表１−７】
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【００６５】
【表１−８】
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【００６６】
【表１−９】
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【００６７】
【表１−１０】
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【００６８】
【表１−１１】
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【００６９】
【表１−１２】
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【００７０】
【表１−１３】
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【００７１】
【表１−１４】
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【００７２】
【表１−１５】
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【００７３】
【表１−１６】
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【００７４】
【表１−１７】
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【００７５】
【表１−１８】
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【００７６】
【表１−１９】
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【００７７】
【表１−２０】
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【００７８】
【表１−２１】
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【００７９】
【表１−２２】
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【００８０】
【表１−２３】
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【００８１】
【表１−２４】
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【００８２】
【表１−２５】
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【００８３】
【表２−１】
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【００８４】
【表２−２】
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【００８５】
【表２−３】
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【００８６】
【表２−４】
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【００８７】
【表２−５】
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【００８８】
【表２−６】
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【００８９】
【表２−７】
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【００９０】
【表２−８】
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【００９１】
【表２−９】
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【００９２】
【表２−１０】
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【００９３】
【表２−１１】
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【００９４】
【表２−１２】
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【００９５】
【表２−１３】
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【００９６】
【表２−１４】
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【００９７】
【表２−１５】
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【００９８】
【表２−１６】
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【００９９】
【表２−１７】
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【０１００】
【表２−１８】
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【０１０１】
【表２−１９】
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【０１０２】
【表２−２０】
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【０１０３】
【表２−２１】
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【０１０４】
【表２−２２】
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【０１０５】
【表２−２３】
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【０１０６】
【表２−２４】
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【０１０７】
【表２−２５】
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【０１０８】
【表２−２６】
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【０１０９】
【表２−２７】
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【０１１０】
【表２−２８】
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【０１１１】
【表２−２９】
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【０１１２】
【表２−３０】
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【０１１３】
【表２−３１】
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【０１１４】
【表２−３２】
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【０１１５】
表２は、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む、または代替として、それからなる本発明のポリヌクレオチドの非包括的なリストを提供する。初めの列の「融合番号」は、各ポリヌクレオチドの融合番号を与える。列２の「構築物ＩＤ」は、本発明の各ポリヌクレオチドについて固有の数字による識別子を提供する。この構築物ＩＤは、表１の対応する列に列挙される所定の治療用タンパク質Ｘに対応する治療用タンパク質部分を含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを特定するために使用され得る。ここでその構築物ＩＤは、第５列に列挙される。「構築物名」の列（列３）は、所定のアルブミン融合構築物またはポリヌクレオチドの名称を提供する。
【０１１６】
表２の４番目の列「説明」は、所定のアルブミン融合構築物の一般的な説明を提供し、５番目の列の「発現ベクター」は、所定のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む、または代替として、それからなるポリヌクレオチドがクローニングされるベクターを記載する。ベクターは当該技術分野で知られており、かつ購入可能であり、または他に記載されている。例えば、実施例に記載されるように、（１）所定のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（２）リーダー配列、（３）プロモーター領域、および（４）転写ターミネーターの１つ以上を含む、または代替として、それらからなる「発現カセット」を、都合の良いクローニングベクターに構築し、次いで、例えば、酵母発現ベクターまたは哺乳類の発現ベクターを含む発現ベクター等の代替的なベクターに移動し得る。一実施形態において、パン酵母（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）における発現のために、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む、または代替として、それからなる発現カセットは、ｐＳＡＣ３５中にクローニングされる。別の実施形態において、ＣＨＯ細胞における発現のために、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む、または代替として、それからなる発現カセットは、ｐＣ４中にクローニングされる。さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードする核酸分子を含む、または代替として、それからなるポリヌクレオチドは、ｐＣ４：ＨＳＡ中にクローニングされる。なおさらなる実施形態において、ＮＳＯ細胞における発現のために、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む、または代替として、それからなる発現カセットは、ｐＥＥ１２中にクローニングされる。他の有用なクローニングおよび／または発現ベクターは、当業者に知られており、本発明の範囲内である。
【０１１７】
列６の「配列番号Ｙ」は、本発明のアルブミン融合タンパク質の全長アミノ酸配列を提供する。ほとんどの場合、配列番号Ｙは、コードされるアルブミン融合タンパク質のプロセッシングされていない形態を示す。つまり、配列番号Ｙは、シグナル配列、ＨＳＡ部分、および特定の構築物によりコードされる治療用部分すべてを示す。特に、配列番号Ｙをコードするすべてのポリヌクレオチドが本発明により企図される。これらのポリヌクレオチドが、細胞からコードされるタンパク質を発現するために用いられる場合、細胞の自然な分泌およびプロセッシング工程は、表２の列４および／または１１に記載されるシグナル配列を欠失しているタンパク質を生じる。記載されるシグナル配列の特定のアミノ酸配列は、本明細書において後述されるか、または当該技術分野で公知である。したがって、本発明の最も好ましい実施形態は、細胞により産生されるアルブミン融合タンパク質（表２の列４および／または１１に示されるリーダー配列を欠失し得る）を含む。また、表２の列４および／または１１に記載される特定のリーダー配列のない配列番号Ｙを含むポリペプチドが、最も好ましい。これらの２つの好ましい実施形態を含む組成物（医薬組成物を含む）もまた好ましい。さらに、表２の列４および／または１１に示されるシグナル配列を、異なるシグナル配列（例えば、プロセッシングされたアルブミン融合タンパク質の分泌を容易にするために、本明細書中で後に記載されるシグナル配列）で置換することは、十分に、当業者の能力の範囲内である。
【０１１８】
７番目の列の「配列番号Ｘ」は、所定のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドが由来し得る親核酸配列を提供する。一実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドが由来し得る親核酸配列は、表１に示される治療用タンパク質をコードする野生型遺伝子配列を含む。代替的な実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドが由来し得る親核酸配列は、表１に示される治療用タンパク質をコードする野生型遺伝子配列の変異体または誘導体、例えば、治療用タンパク質をコードする野生型遺伝子配列の合成コドン最適化変異体を含む。
【０１１９】
８番目の列の「配列番号Ｚ」は、親核酸配列（配列番号Ｘ）の予測される翻訳を提供する。この親配列は、特定の構築物、親タンパク質の成熟部分、野生型タンパク質の変異体もしくはフラグメント、または記載の構築物を作製するために用いられ得る人工配列を得るために用いられる全長親タンパク質であり得る。当業者は、配列番号Ｚに示されるこのアミノ酸配列を用いて、所定の構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質のどのアミノ酸残基が治療用タンパク質に由来するかを決定することができる。さらに、配列番号Ｚに示される配列を用いて同じ行に記載される構築物を作製することは、十分に当業者の能力の範囲内にある。例えば、配列番号Ｚが全長タンパク質に対応するが、そのタンパク質の一部分のみを用いて特定のＣＩＤを生成する場合、ＰＣＲ等の分子生物学技法に依存して特定のフラグメントを増幅し、それを適切なベクターにクローニングすることは、当該技術分野の範囲内である。
【０１２０】
列９および１０において提供される増幅用プライマー、「配列番号Ａ」および「配列番号Ｂ」はそれぞれ、所定のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードする核酸分子を含む、または代替として、それからなるポリヌクレオチドを産生するために用いられる例示的なプライマーである。本発明の一実施形態において、列９および／または１０に示される配列（配列番号Ａおよび／またはＢ）を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、対応する列の列７において提供されるヌクレオチド配列（配列番号Ｘ）を含む、または代替として、それからなる核酸分子をテンプレートＤＮＡとして用いて、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するために用いられる。ＰＣＲ方法は、当該技術分野において十分に確立されている。さらなる有用なプライマー配列は、当業者により容易に構想および利用されよう。
【０１２１】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーをオーバーラッピングＰＣＲ反応に用いて、テンプレートＤＮＡ配列内に変異を生じさせてもよい。ＰＣＲ方法は、当該技術分野で周知である。
【０１２２】
表３に示されるように、本明細書に開示される特定のアルブミン融合構築物は、ＡＴＣＣ（登録商標）に寄託されている。
表３
【０１２３】
【表３】
0005856131.tif 000059
【０１２４】
さらに、当該技術分野で周知の技法および本明細書中に別記されている技法により、寄託物から所定のアルブミン融合構築物を回収することが可能である（実施例１０を参照）。ＡＴＣＣは、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに所在する。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に拠って行われた。
【０１２５】
本発明のさらなる実施形態において、（１）特定のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（２）リーダー配列、（３）プロモーター領域、および（４）転写ターミネーターのうちの１つ以上を含む、または代替として、それらからなる「発現カセット」は、１つのベクターから別のベクターへ移されるか、または「サブクローニング」され得る。サブクローニングされるべきフラグメントは、当該技術分野で公知の方法、例えば、ＰＣＲ増幅（例えば、配列番号ＡまたはＢで示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いる）および／または制限酵素消化により生成され得る。
【０１２６】
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、表１の対応する列に示されるアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質の治療活性および／または生物学的活性に対応する治療活性および／または生物学的活性の能力がある。さらなる好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療活性のあるタンパク質部分は、表２の配列番号Ｘの列に示される配列によりコードされるタンパク質のフラグメントもしくは変異体であり、対応する治療用タンパク質の治療活性および／または生物学的活性の能力がある。
【０１２７】
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドフラグメントおよび変異体
フラグメント
本発明は、表１に記載の治療用タンパク質、アルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のフラグメントをさらに対象にする。
【０１２８】
本発明は、表１に記載の治療用タンパク質、アルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のフラグメントをコードするポリヌクレオチドも対象にする。
【０１２９】
タンパク質のＮ末端から１つ以上のアミノ酸の欠失が、本発明の治療用タンパク質、アルブミンタンパク質、および／またはアルブミン融合タンパク質のうちの１つ以上の生物学的機能を修飾または欠失をもたらせる場合であっても、他の治療活性、および／または機能活性（例えば、生物学的活性、多量体形成能、リガンド結合能）がなお保持され得る。例えば、Ｎ末端に欠失のあるポリペプチドの、完全または成熟形態のポリペプチドを認識する抗体を誘導する、および／またはそれに結合する能力は、完全なポリペプチドの過半数に満たない残基をＮ末端から除去した場合、概して保持され得る。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠失している特定のポリペプチドが、このような免疫活性を保持しているかどうかは、本明細書に記載される、およびそうでなければ当該技術分野で周知の慣用法により容易に決定され得る。Ｎ末端のアミノ酸残基が多数欠失した変異が、いくつかの生物学的活性または免疫活性を保持し得ることは不可能ではない。実際に、わずか６個のアミノ酸残基からなるペプチドが、多くの場合、免疫応答を引き起こし得る。
【０１３０】
したがって、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質のフラグメントは、全長タンパク質、ならびに参照ポリペプチド（すなわち、表１で参照される治療用タンパク質、または表２に記載のポリペプチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分）のアミノ酸配列のアミノ末端から１つ以上の残基が欠失しているポリペプチドを含む。特に、Ｎ末端の欠失は、一般式ｍからｑで示されてもよく、ここでｑは、参照ポリペプチド（例えば、表１で参照される治療用タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、または表２に記載のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分）中のアミノ酸残基の総数を示す整数値であり、ｍは２からｑ−６の範囲の任意の整数と定義される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。
【０１３１】
加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応する血清アルブミンポリペプチドのフラグメントは、全長タンパク質、ならびに参照ポリペプチド（すなわち、血清アルブミン、または表２に記載のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の血清アルブミン部分）のアミノ酸配列のアミノ末端から１つ以上の残基が欠失しているポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、Ｎ末端の欠失は、一般式ｍから５８５で示され、ここで５８５は、成熟ヒト血清アルブミン（配列番号１）にあるアミノ酸残基の総数を示す整数値であり、ｍは、２から５７９の範囲の任意の整数と定義される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。さらなる実施形態において、Ｎ末端の欠失は、一般式ｍから６０９で示され、ここで６０９は、成熟ヒト血清アルブミン（配列番号３）にあるアミノ酸残基の総数を示す整数値であり、ｍは、２から６０３の範囲の任意の整数と定義される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。
【０１３２】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質のフラグメントは、全長アルブミン融合タンパク質、ならびにアルブミン融合タンパク質（例えば、表２に記載のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質、または表２の列６に開示されるアミノ酸配列を有するアルブミン融合タンパク質）のアミノ末端から１つ以上の残基が欠失しているポリペプチドを含む。特に、Ｎ末端の欠失は、一般式ｍからｑで示されてもよく、ここでｑは、アルブミン融合タンパク質にあるアミノ酸残基の総数を示す整数値であり、ｍは、２からｑ−６の範囲の任意の整数と定義される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。
【０１３３】
上述のように、参照ポリペプチド（例えば、治療用タンパク質、血清アルブミンタンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質）のＮ末端またはＣ末端から１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能を修飾または欠失をもたらせる場合であっても、他の機能活性（例えば、生物学的活性、多量体形成能、リガンド結合能）、および／または治療活性はなお保持され得る。例えば、Ｃ末端に欠失のあるポリペプチドの、完全または成熟形態のポリペプチドを認識する抗体を誘導する、および／またはそれに結合する能力は、完全または成熟ポリペプチドの過半数に満たない残基をＣ末端から除去した場合、概して保持され得る。参照ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の残基を欠失している特定のポリペプチドが、治療活性を保持するかどうかは、本明細書に記載される、および／またはそうでなければ当該技術分野で周知の慣用法により容易に決定され得る。
【０１３４】
本発明はさらに、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質（例えば、表１で参照される治療用タンパク質、または表２に記載のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分）のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失しているポリペプチドを提供する。特に、Ｃ末端の欠失は、一般式１からｎで示されてもよく、ここで、ｎは、６からｑ−１の範囲の任意の整数値であり、ｑは、参照ポリペプチド（例えば、表１で参照される治療用タンパク質、または表２に記載のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分）のアミノ酸残基の総数を示す整数値である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。
【０１３５】
加えて、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミン、または表２に記載のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分）のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失しているポリペプチドを提供する。特に、Ｃ末端の欠失は、一般式１からｎで示され得、ここで、ｎは、６から５８４の範囲の任意の整数値であり、５８４は、成熟ヒト血清アルブミン（配列番号１）のアミノ酸残基の総数を示す整数から１を引いたものである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。特に、Ｃ末端の欠失は、一般式１からｎで示され得、ここで、ｎは、６から６０８の範囲の任意の整数値であり、６０８は、血清アルブミン（配列番号３）のアミノ酸残基の総数を示す整数から１を引いたものである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。
【０１３６】
さらに、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失しているポリペプチドを提供する。特に、Ｃ末端の欠失は、一般式１からｎで示され得、ここで、ｎは、６からｑ−１の範囲の任意の整数値であり、ｑは、本発明のアルブミン融合タンパク質にあるアミノ酸残基の総数を示す整数値である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。
【０１３７】
加えて、上記のＮまたはＣ末端の欠失のいずれかを組み合わせて、ＮおよびＣ末端の欠失の参照ポリペプチドを産生することができる。本発明はまた、アミノおよびカルボキシル末端の両方から１つ以上のアミノ酸を欠失させたポリペプチドも提供し、これは、概して、参照ポリペプチド（例えば、表１で参照される治療用タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、または表２に記載のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされる治療用タンパク質部分、または血清アルブミン（例えば、配列番号１）、または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分、または表２に記載のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミンタンパク質部分、またはアルブミン融合タンパク質、または本発明のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質）のｍ〜ｎ個の残基を有するものとして示され得、ここでｎおよびｍは、上記の整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。
【０１３８】
本願はまた、本明細書に記述されている参照ポリペプチド配列（例えば、表１で参照される治療用タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、または表２に記載のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされる治療用タンパク質部分、または血清アルブミン（例えば、配列番号１）、または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分、または表２に記載のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミンタンパク質部分、またはアルブミン融合タンパク質、または本発明のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質）、またはそれらのフラグメントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含むタンパク質も対象にする。好ましい実施形態において、本出願は、上記のようにＮおよびＣ末端に欠失のあるアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含むタンパク質も対象にする。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。
【０１３９】
本発明の好ましいポリペプチドフラグメントは、そのアミノ酸配列がフラグメントである治療用タンパク質または血清アルブミンタンパク質のポリペプチド配列の治療活性および／または機能活性（例えば、生物学的活性）を示すアミノ酸配列を含む、または代替として、それらからなるフラグメントである。
【０１４０】
他の好ましいポリペプチドフラグメントは、生物学的活性のあるフラグメントである。生物学的活性のあるフラグメントは、本発明のポリペプチドの活性と同一である必要はないが、類似する活性を示すものである。フラグメントの生物学的活性は、所望の活性の改善または望ましくない活性の減少を含んでもよい。
【０１４１】
変異体
「変異体」とは、参照核酸またはポリペプチドとは異なるが、その必須な特性を保持しているポリヌクレオチドまたは核酸を指す。概して、変異体は、全体としてその参照核酸またはポリペプチドに対して非常に類似しており、および多くの領域において同一である。
【０１４２】
本明細書に使用される「変異体」とは、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分、または本発明のアルブミン融合タンパク質であって、それぞれ治療用タンパク質（例えば、表１の「治療用」の列を参照のこと）、アルブミンタンパク質および／またはアルブミン融合タンパク質と配列が異なるが、本明細書中別記されているか、またはそうでなければ当該技術分野で周知の少なくともその１つの機能特性および／または治療特性を保持しているものを指す。概して、変異体は、全体としてアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質、アルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質および／またはアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列に非常に類似しており、ならびに多くの領域においてそれと同一である。これらの変異体をコードする核酸も本発明により包含される。
【０１４３】
本発明はまた、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質のアミノ酸配列（例えば、表１に開示される治療用タンパク質Ｘのアミノ酸配列、または表１および２に記載のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分のアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは変異体）、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質（例えば、表１および２に記載のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分のアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは変異体）、および／またはアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、または代替として、それらからなるタンパク質も対象にする。これらのポリペプチドのフラグメント（例えば、本明細書に記載のフラグメント）も提供される。本発明により包含されるさらなるポリペプチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、６×の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルターに結合させたＤＮＡと約４５℃でハイブリダイズさせ、次いで、約５０〜６５℃、０．２×のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で１回以上洗浄する）、よりストリンジェントな条件下（例えば、６×の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルターに結合させたＤＮＡと約４５℃でハイブリダイズさせ、次いで、約６８℃、０．１×のＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ中で１回以上洗浄する）、または当業者に周知の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ａｔ  ｐａｇｅｓ  ６．３．１−６．３．６および２．１０．３を参照のこと）にて、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする相補的な核酸分子にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。
【０１４４】
クエリアミノ酸配列に対して例えば、少なくとも９５％「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドは、対象とするポリペプチドのアミノ酸配列が、クエリアミノ酸配列の各アミノ酸１００個あたり最高５個までの変更を含み得ることを除いては、そのクエリ配列に同一であることが意図される。つまり、クエリアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列のアミノ酸残基の５％までを挿入、欠失、または他のアミノ酸と置換することができる。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置で生じてもよく、またはこれらの末端の間のどこでも、参照配列内の残基中に個々に散在するか、もしくはその参照配列内の１つ以上の連続した群で散在していてもよい。
【０１４５】
実際的な問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質またはそのフラグメント（アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、またはアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分等）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラムを用いて慣用的に決定することができる。クエリ配列（本発明の１つの配列）と対象配列との間の全体として最も良好なマッチを決定するための好ましい方法は、グローバルシークエンスアライメントとも称され、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定することができる。配列アライメントにおいて、クエリと対象配列は、共にヌクレオチド配列、あるいは共にアミノ酸配列のいずれかである。該グローバルシークエンスアライメントの結果は、同一性パ−セントとして表される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アライメントにて用いられる好ましいパラメータは、以下の通りである。マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＰＡＭ  ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝１、ジョイニングペナルティ（Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝２０、ランダム化グループ長（Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ）＝０、カットオフスコア（Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ）＝ｌ、ウィンドウサイズ（Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ）＝配列の長さ、ギャップペナルティ（Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝５、ギャップサイズペナルティ（Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または短い方の対象アミノ酸配列の長さ。
【０１４６】
対象配列が内部での欠失のためではなく、ＮまたはＣ末端の欠失に起因してクエリ配列より短いならば、結果に対して手動補正を行う必要がある。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが全体的な同一性パ−セントを計算する際に対象配列のＮおよびＣ末端の切断を考慮しないためである。ＮおよびＣ末端で切断されている対象配列については、クエリ配列に対する同一性パ−セントを、対象配列のＮおよびＣ末端にあり、対応する対象残基とマッチ／アライメントしない、クエリ配列の残基数をクエリ配列の全塩基のパ−セントとして計算することにより補正する。残基がマッチ／アライメントしているかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果により決定される。次いで、このパーセンテージを、指定したパラメータを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムから計算した同一性パ−セントから差し引いて、最終的な同一性パーセントスコアを導く。この最終的な同一性パーセントスコアは、本発明の目的のために用いられるものである。クエリ配列にマッチ／アライメントしない、対象配列のＮおよびＣ末端に対する残基のみが、同一性パーセントスコアを手動補正するために考慮される。すなわち、対象配列のＮおよびＣ末端残基の最も遠い位置にあるものの外側にあるクエリ残基の位置のみである。
【０１４７】
例えば、９０個のアミノ酸残基の対象配列を、１００個の残基のクエリ配列とアライメントさせて、同一性パ−セントを決定する。対象配列のＮ末端に欠失が生じており、したがって、ＦＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ末端の初めの１０個の残基にマッチング／アライメントを示さない。１０個の対をなさない残基は、配列の１０％を占めることとなり（マッチしなかったＮおよびＣ末端の残基数／クエリ配列の残基の総数）、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性パーセントスコアから１０％が差し引かれる。残りの９０個の残基が、完全にマッチしているならば、最終的な同一性パ−セントは、９０％になるだろう。別の例では、９０個の残基の対象配列を、１００個の残基のクエリ配列と比較する。この場合、欠失は、内部の欠失であるので、クエリ配列とマッチ／アライメントしないような対象配列のＮまたはＣ末端の残基はない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算された同一性パ−セントは手動補正しない。再度述べれば、ＦＡＳＴＤＢアライメントにより示された対象配列のＮおよびＣ末端の最後の残基の外側に位置する残基で、クエリ配列とマッチ／アライメントしないものについてのみ手動補正する。他の手動補正は、いずれも本発明のために行われない。
【０１４８】
通常、変異体は、その変異体と同じ長さである正常なＨＡもしくは治療用タンパク質と少なくとも７５％（好ましくは、少なくとも約８０％、９０％、９５％または９９％）の配列同一性を有する。ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列レベルでの相同性もしくは同一性は、配列類似性検索のために最適化されたｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘプログラムに採用されたアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００（１９９３）、参照することにより完全に組み込まれる）を用いたＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）分析により決定される。
【０１４９】
ＢＬＡＳＴプログラムで用いられるアプローチは、まず、クエリ配列とデータベース配列間の類似のセグメントを考慮し、次いで、特定されたすべてのマッチの統計学的有意性を評価し、最終的に、予め選択した有意性の閾値を満たすマッチのみを要約することである。配列データベースの類似性検索における基本的事項の考察については、参照することにより完全に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１１９−１２９（１９９４））を参照のこと。ヒストグラム、説明（ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、アライメント、期待値（ｅｘｐｅｃｔ）（すなわち、データベース配列に対するマッチを報告するための統計学的有意性の閾値）、カットオフ、マトリックス、およびフィルターのための検索パラメータは、デフォルト設定とする。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘで用いられるデフォルトスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）、参照することにより完全に組み込まれる）である。ｂｌａｓｔｎについては、スコアリングマトリックスは、Ｍ（すなわち、マッチしている残基のペアについての報酬（ｒｅｗａｒｄ）スコア）対Ｎ（すなわち、ミスマッチの残基についてのペナルティースコア）の比率によって設定され、ここで、ＭおよびＮのデフォルトスコアはそれぞれ、５および−４である。４つのｂｌａｓｔｎパラメータを以下のように補正し得る：Ｑ＝１０（ギャップクリエーションペナルティ）、Ｒ＝１０（ギャップエクステンションペナルティ）、ｗｉｎｋ＝１（クエリ配列に沿ってｗｉｎｋｔｈの位置ごとにワードヒット（ｗｏｒｄ  ｈｉｔｓ）を作製する）、およびｇａｐｗ＝１６（ウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）幅を設定し、その中にギャップ化されたアライメントを作製する）。等価なＢｌａｓｔｐパラメータの設定は、Ｑ＝９、Ｒ＝２、ｗｉｎｋ＝１、およびｇａｐｗ＝３２であった。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０において利用可能な配列間のベストフィット比較は、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップクリエーションペナルティ）およびＬＥＮ＝３（ギャップエクステンションペナルティ）を用いており、タンパク質の比較における等価な設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【０１５０】
本発明のポリヌクレオチド変異体は、コーディング領域、非コーディング領域、またはその両方において変更を含んでもよい。サイレントな置換、付加、または欠失を生じるが、コードされるポリペプチドの特性または活性を改変しない変更を含むポリヌクレオチド変異体が、特に好ましい。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな置換により産生されるヌクレオチド変異体が好ましい。さらに、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満、または５〜５０、５〜２５、５〜１０、１〜５、または１〜２個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、欠失、または付加されているポリペプチド変異体も好ましい。ポリヌクレオチド変異体は、様々な理由、例えば、特定の宿主でのコドンの発現を最適化するために（ヒトｍＲＮＡ中のコドンを、細菌宿主（酵母または大腸菌等）により好ましいものに変更する）産生することができる。
【０１５１】
好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分をコードする本発明のポリヌクレオチドは、酵母または哺乳類の細胞における発現のために最適化される。さらに好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードする本発明のポリヌクレオチドは、酵母または哺乳類の細胞における発現のために最適化される。さらに一層好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、酵母または哺乳類の細胞における発現のために最適化される。
【０１５２】
代替的な実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、治療用タンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、アルブミンタンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。別の実施形態において、アルブミン融合タンパク質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、治療用タンパク質部分またはアルブミンタンパク質部分をコードする野生型ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。
【０１５３】
さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは、治療用タンパク質の自然に発生する配列を含まない、または代替として、それからならない。さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは、アルブミンタンパク質の自然に発生する配列を含まない、または代替として、それからならない。代替的な実施形態において、アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、治療用タンパク質部分もしくはアルブミンタンパク質部分の自然に発生する配列を含まない、または代替として、それからならない。
【０１５４】
自然に発生する変異体は、「対立遺伝子変異体」と呼ばれ、生物体の染色体上の所定の座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の１つを指す。（Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドレベルで異なり得、および本発明に含まれる。代替として、自然に発生しない変異体を、突然変異誘発技法または直接合成により産生することができる。
【０１５５】
タンパク質工学および組換えＤＮＡ技法の周知の方法を用いて、本発明のポリペプチドの特徴を改善または改変するために変異体を作製することができる。例えば、１つ以上のアミノ酸を、生物学的機能の実質的な損失を伴わずに、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失させることができる。一例としては、Ｒｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３））が、アミノ末端のアミノ酸残基の３、８または２７個を欠失させても、変異体ＫＧＦタンパク質ではヘパリン結合活性を有することを報告している。同様に、インターフェロンガンマでは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させると活性が最高１０倍まで高くなることが示された（Ｄｏｂｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：１９９−２１６（１９８８））。
【０１５６】
さらに、十分な証拠により、変異体が、多くの場合、自然に発生するタンパク質のものと類似する生物学的活性を保持することが実証されている。例えば、Ｇａｙｌｅおよび共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２１０５−２２１１１（１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−ｌａの大規模な変異分析を行った。彼らは、ランダムな突然変異誘発を利用して、分子全長にわたって１変異体あたり平均２．５個のアミノ酸の変化がある、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ変異体を作製した。すべての起こり得るアミノ酸位置について複数の突然変異を調べた。研究者らは、「分子の大部分が、［結合または生物学的活性］のいずれかにほとんど作用することなく、改変できる」ことを見出した。実際に、調べた３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、わずか２３個の固有のアミノ酸配列のみが、野生型の活性とは有意に異なるタンパク質を生じた。
【０１５７】
さらに、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失させることが、１つ以上の生物学的機能の修飾または欠失をもたらしたとしても、他の生物学的活性はなお、保持され得る。例えば、欠失変異体のその分泌形態を認識する抗体を誘導する、および／またはそれに結合する能力は、分泌形態の過半数に満たない残基をＮ末端またはＣ末端から除去した場合、保持されると可能性が高いであろう。タンパク質のＮまたはＣ末端の残基を欠失している特定のポリペプチドが、このような免疫原性活性を保持しているかどうかは、本明細書に記載される、およびそうでなければ当該技術分野で周知の慣用法により容易に決定され得る。
【０１５８】
したがって、本発明はさらに、機能活性（例えば、生物学的活性および／または治療活性）を有するポリペプチド変異体を含む。一実施形態において、本発明は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質の１つ以上の生物学的および／または治療活性に対応する機能活性（例えば、生物学的活性および／または治療活性）を有するアルブミン融合タンパク質の変異体を提供する。別の実施形態において、本発明は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質の１つ以上の生物学的および／または治療活性に対応する機能活性（例えば、生物学的活性および／または治療活性）を有するアルブミン融合タンパク質の変異体を提供する。このような変異体は、活性にほとんど作用しないように、当該技術分野で周知の一般原則に従って選択される、欠失、挿入、反転、反復、および置換を含む。このような変異体をコードするポリヌクレオチドも本発明により包含される。
【０１５９】
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、保存的置換を有する。「保存的置換」は、例えば、脂肪族または疎水性アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｉｎの置換、塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換等の群内での交換が意図される。
【０１６０】
表現型としてサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関するガイダンスは、例えば、Ｂｏｗｉｅら、“Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供され、ここで、著者らは、アミノ酸配列を変化させることによる寛容性を研究するために２つの主な戦略があることを示している。
【０１６１】
第１の戦略は、進化の過程での自然淘汰によるアミノ酸置換の寛容性を利用する。異なる種のアミノ酸配列を比較することにより、保存されているアミノ酸を、特定することができる。これらの保存されているアミノ酸は、タンパク質機能にとっておそらく重要である。対照的に、置換が自然淘汰により寛容されるアミノ酸の位置は、これらの位置がそのタンパク質の機能のために重要ではないことを示す。したがって、タンパク質の生物学的活性をなお維持しながら、アミノ酸置換に寛容な位置を修飾することができる。
【０１６２】
第２の戦略は、遺伝子工学を利用して、クローン化された遺伝子の特定の位置にアミノ酸の変化を導入し、タンパク質機能にとって重要な領域を特定する。例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発（分子内のすべての残基に単一のアラニン変異を導入する）が用いられ得る。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）を参照のこと。次いで、得られた変異分子を、生物学的活性について試験することができる。
【０１６３】
上記の著者らが述べるように、これらの２つの戦略は、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど寛容であることを明らかにした。前記著者らはさらに、タンパク質の特定のアミノ酸の位置でどのアミノ酸の変化が寛容される可能性があるかを示す。例えば、（タンパク質の３次構造内で）最も埋め込まれたアミノ酸残基は、非極性の側鎖を必要とする一方で、表面の側鎖の特徴は、概して、ほとんど保存されない。さらに、寛容な保存的アミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｉｎの置換、塩基性残基Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの置換；芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換および小さなサイズのアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。保存的アミノ酸置換に加えて、本発明の変異体は、（ｉ）１つ以上の非保存的アミノ酸残基の置換を含むポリペプチド、ここで、置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによりコードされたものであってもなくてもよい、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むポリペプチド、または（ｉｉｉ）別の化合物、例えば、ポリペプチド（例えば、ポリエチレングリコール）の安定性および／または溶解性を増大させる化合物等に融合されたまたは化学的に共役されたポリペプチド、（ｉｖ）例えば、ＩｇＧＦｃ融合領域ペプチド等のさらなるアミノ酸を含むポリペプチドを含む。このような変異体ポリペプチドは、本明細書の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【０１６４】
例えば、電荷したアミノ酸と他の電荷した、または中性のアミノ酸とのアミノ酸置換を含むポリペプチド変異体は、凝集が少ない等の改善された特徴を有するタンパク質を産生し得る。医薬製剤の凝集は、凝集体の免疫原性活性に起因して、活性を減少し、クリアランスを増大させる。Ｐｉｎｃｋａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８−８４５（１９８７）、Ｃｌｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７−３７７（１９９３）を参照のこと。
【０１６５】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、アルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列、治療用タンパク質および／またはヒト血清アルブミンのアミノ酸配列のフラグメントもしくは変異体を含む、または代替として、それからなり、ここで、該フラグメントもしくは変異体は、参照アミノ酸配列と比較した場合、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０、または５０〜１５０個のアミノ酸残基の付加、置換および／または欠失を有する。好ましい実施形態において、アミノ酸置換は、保存的である。これらのポリペプチドをコードする核酸も本発明により包含される。
【０１６６】
本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸からなるもの、すなわち、ペプチドイソスターからなることができ、遺伝子によりコードされる２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドは、翻訳後プロセッシング等の自然な過程または当該技術分野で公知の化学的修飾技法により修飾されてもよい。このような修飾は、基本書およびより詳細な研究書、ならびに豊富な研究文献にて十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチドの任意の位置で生じさせることができる。同種の修飾は、所定のポリペプチドのいくつかの部位において、同じまたは異なる程度で存在してもよいことが理解されよう。また、所定のポリペプチドは、多種の修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐していてもよく、それらは、分岐を有するまたは有しない環状であってもよい。環状、分岐、および分岐環状ポリペプチドは、翻訳後の自然な過程から生じてもよく、または合成方法により作成されてもよい。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、閉環、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性の架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、トランスファーＲＮＡが介在するタンパク質へのアミノ酸の付加（例えばアルギニン化等）、およびユビキチン化を含む（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）、ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）、Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【０１６７】
機能活性
「機能活性を有するポリペプチド」とは、治療用タンパク質の全長、プロタンパク質、および／または成熟形態に関連する１つ以上の周知の機能活性を示すことが可能なポリペプチドを指す。このような機能活性は、生物学的活性、抗原性［抗ポリペプチド抗体に結合する（または結合のためにポリペプチドと競合する）能力］、免疫原性（本発明の特定のポリペプチドに結合する抗体を生じる能力）、本発明のポリペプチドとともに多量体を形成する能力、およびポリペプチドための受容体もしくはリガンドに結合する能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
「生物学的活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイにて測定される際に、用量依存性を伴い、または伴うことなく、成熟形態を含む本発明の治療用タンパク質の活性に必ずしも一致しなくともよいが、類似する活性を示すポリペプチドを指す。用量依存性が存在する場合、それはポリペプチドのものと同一である必要はなく、本発明のポリペプチドと比較した場合、所定の活性において、実質的に類似の用量依存性であればよい（すなわち、候補ポリペプチドは、本発明のポリペプチドに対して、より高い活性、または、約２５分の1より低くない、好ましくは、約１０分の1より低くない活性、また最も好ましくは、約３分の１より低くない活性を示し得る）。
【０１６９】
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されない場合、治療用タンパク質部分（またはそのフラグメントもしくは変異体）に関連する少なくとも１つの生物学的および／または治療活性を有する。
【０１７０】
さらに好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、非融合状態の治療用タンパク質部分（またはそのフラグメントもしくは変異体）と比較して増大した血漿安定性を有する。本発明のアルブミン融合タンパク質または非融合治療用タンパク質部分（またはそのフラグメントもしくは変異体）の血漿安定性は、当該技術分野で周知のアッセイを用いて、またはそれを慣例的に改変して用いて、アッセイできる。
【０１７１】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該技術分野で周知のアッセイ、ならびに本明細書に記載のアッセイを用いて、またはそれを慣例的に改変して用いて、機能活性（例えば、生物学的活性）をアッセイできる。さらに、当業者は、表１の対応する列（例えば、表１の列３）に参照されるアッセイを用いて、その活性について、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質のフラグメントを慣用的にアッセイしてもよい。さらに、当業者は、当該技術分野で周知の、および／または以下の実施例の項に記載されるアッセイを用いて、その活性について、アルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質のフラグメントを慣用的にアッセイしてもよい。
【０１７２】
例えば、抗治療用ポリペプチド抗体および／または抗アルブミン抗体に結合するために治療用タンパク質に結合する、またはそれと競合するアルブミン融合タンパク質の能力についてアッセイする一実施形態において、当該技術分野で周知の様々なイムノアッセイを用いることができ、該アッセイは、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、原位置イムノアッセイ（例えば、金コロイド、酵素または放射性同位元素標識等を用いて）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、タンパク質Ａアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等の技術を用いた競合的および非競合的アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することにより検出される。別の実施形態において、一次抗体は、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出される。さらなる実施形態において、二次抗体は、標識される。多くの方法が、イムノアッセイにおいて結合を検出するために当該技術分野で周知であり、本発明の範囲内である。
【０１７３】
治療用タンパク質の結合パートナー（例えば、受容体またはリガンド）が特定される好ましい実施形態において、その結合パートナーと、その治療用タンパク質を融合物の治療用タンパク質部分として含むアルブミン融合タンパク質の結合は、例えば、当該技術分野で公知の方法、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、およびアフィニティーブロッティングによりアッセイされ得る。概して、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）を参照のこと。別の実施形態において、アルブミン融合タンパク質と生理学的に相互に関連のあるものが、融合物の治療用タンパク質部分に対応する治療用ポリペプチドの基質に結合する能力は、当該技術分野で周知の技法を用いて慣用的にアッセイされ得る。
【０１７４】
アルブミン融合タンパク質の多量体化する能力を評価する代替的な実施形態において、多量体の他の成分との結合が、例えば、当該技術分野で公知の方法、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニティーブロッティングを用いてアッセイされ得る。概して、上記Ｐｈｉｚｉｃｋｙらを参照のこと。
【０１７５】
好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体のすべてまたは一部を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されていない場合、治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体に関連する少なくとも１つの生物学的および／または治療活性（例えば、ポリペプチドまたはエピトープに特異的に結合する）を有する。他の好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体のすべてまたは一部を含むアルブミン融合タンパク質の生物学的活性および／または治療活性は、治療用タンパク質に結合する抗体に特異的に結合されたポリペプチドに関連する１つ以上の生物学的活性および／または治療活性の阻害（すなわち、アンタゴニズム）または活性化（すなわち、アゴニズム）である。
【０１７６】
治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、様々な方法で特徴付けられ得る。特に、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、本明細書に記載の技法または当該技術分野で周知の慣例的に改変する技法を用いて、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質に結合する抗体に特異的に結合された同じ抗原に特異的に結合する能力についてアッセイされてもよい。
【０１７７】
特定のタンパク質またはエピトープに（特異的に）結合するためのアルブミン融合タンパク質（例えば、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む）の能力についてのアッセイは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２４２１（１９９２））、ビーズ上で（例えば、Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ上で（例えば、Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ３６４：５５５−５５６（１９９３））、細菌で（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子で（例えば、特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド上で（例えば、Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９（１９９２））、またはファージ上で（例えば、Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）、Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６（１９９０）、Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２（１９９０）、およびＦｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０（１９９１））で行われてもよい（これらの参考文献のそれぞれは、その全体が本明細書に参照することにより組み込まれる）。治療用抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、本明細書に記載されているか、またはそうでなければ当該技術分野で周知の技法を用いて、またはそれを慣例的に改変して、特定のタンパク質またはエピトープに対するそれらの特異性および親和性についてアッセイされてもよい。
【０１７８】
治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、当該技術分野で周知の任意の方法により、他の抗原（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体と特異的に結合する分子で保存されている配列／構造を有する分子）との交差反応性についてアッセイされてもよい。
【０１７９】
（免疫特異的）結合および交差反応性を分析するために用いられ得るイムノアッセイは、例をいくつか挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光イムノアッセイ、およびタンパク質Ａイムノアッセイ等の技法を用いる競合的および非競合的アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは、慣用的であり、かつ当該技術分野で公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）。例示的なイムノアッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図されない）。
【０１８０】
概して、免疫沈降プロトコルは、溶解緩衝液、例えば、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を追加したＲＩＰＡ緩衝液（１％のＮＰ−４０またはトリトンＸ−１００、１％のナトリウムデオキシコール酸、０．１％のＳＤＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％のトラジロール）中に細胞集団を溶解し、本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む）を細胞溶解物に加え、一定時間（例えば、１〜４時間）、４０℃で培養し、抗アルブミン抗体に結合されたセファロースビーズを例えば細胞溶解物に加え、約１時間以上４０℃で培養し、そのビーズを溶解緩衝液で洗浄し、次いで、ＳＤＳ／試料緩衝液中にそのビーズを再懸濁させることを含む。特定の抗原を免疫沈降させるアルブミン融合タンパク質の能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により評価され得る。当業者は、抗原へのアルブミン融合タンパク質の結合を増大させ、バックグラウンドを減少させるために変更され得るパラメータ（例えば、セファロースビーズを用いる細胞溶解物の前清浄化）について認識することができよう。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  １０．１６．１を参照のこと。
【０１８１】
概して、ウエスタンブロット分析は、タンパク質試料を調製し、そのタンパク質試料をポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じて８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で電気泳動し、そのタンパク質試料をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン等の膜へ転写し、ブロッキング溶液（例えば、３％のＢＳＡを伴うＰＢＳまたは脱脂乳）中でその膜をブロッキングし、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中でその膜を洗浄し、本発明のアルブミン融合タンパク質（ブロッキング緩衝液中で希釈されている）をその膜に適用し、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈した酵素基質（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に共役させた二次抗体（例えば、抗ヒト血清アルブミン抗体等のアルブミン融合タンパク質を認識するもの）を適用し、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄し、次いで、抗原の存在を検出することを含む。当業者は、検出されるシグナルを増大させ、バックグラウンドノイズを減少させるように変更できるパラメータについて認識することができよう。ウエスタンブロットプロトコルについてのさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  １０．８．１を参照のこと。
【０１８２】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製し、９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルをその抗原でコーティングし、ウェルに結合しなかった抗原を洗い流し、酵素基質（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）等の検出可能な化合物に共役させた本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む）をウェルに加え、次いで、一定時間培養し、結合しなかったもしくは非特異的に結合したアルブミン融合タンパク質を洗い流し、次いで、ウェルにコーティングされた抗原と特異的に結合したアルブミン融合タンパク質の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡでは、アルブミン融合タンパク質は、検出可能な化合物と共役させる必要がなく、その代わりに、検出可能な化合物に共役させた二次抗体（アルブミン融合タンパク質を認識する）をウェルに加えてもよい。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、アルブミン融合タンパク質を、ウェルにコーティングしてもよい。この場合、検出可能な分子は、酵素基質（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）等の検出可能な化合物に共役させた抗原であり得る。当業者は、検出されるシグナルを増大するように変更され得るパラメータならびに当該技術分野で周知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションについて認識できるだろう。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  １１．２．１を参照のこと。
【０１８３】
タンパク質、抗原、またはエピトープに対するアルブミン融合タンパク質の結合親和性およびアルブミン融合タンパク質−タンパク質／抗原／エピトープ相互作用の解離速度は、競合的結合アッセイにより測定できる。競合的結合アッセイの一例は、ラジオイムノアッセイであり、該アッセイは、増大量の非標識抗原の存在下、本発明のアルブミン融合タンパク質と標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）とを培養し、次いで、標識抗原に結合した抗体を検出することを含む。特定のタンパク質、抗原、またはエピトープについてのアルブミン融合タンパク質の親和性および結合の解離速度は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット分析によるデータから決定することができる。アルブミン融合タンパク質と同じタンパク質、抗原、またはエピトープに結合する二次タンパク質との競合も、ラジオイムノアッセイを用いて決定することができる。この場合、タンパク質、抗原、またはエピトープを、本発明のアルブミン融合タンパク質と同じタンパク質、抗原、またはエピトープに結合する増大量の非標識二次タンパク質の存在下、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に共役させたアルブミン融合タンパク質と共に培養する。
【０１８４】
好ましい実施形態において、ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析を用いて、タンパク質、抗原、またはエピトープに対する本発明のアルブミン融合タンパク質の結合および解離速度を決定する。ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析は、それらの表面上に固定化した特異的ポリペプチド、抗原もしくはエピトープまたはアルブミン融合タンパク質をそれぞれ有するチップへの、アルブミン融合タンパク質、または特定のポリペプチド、抗原もしくはエピトープの結合および解離を分析することを含む。
【０１８５】
アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質に結合する抗体は、所定のタンパク質または抗原、好ましくはそれらが特異的に結合する抗原についてのそれらの結合親和性に関して記載、または特定されてもよい。好ましい結合親和性は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有するものを含む。より好ましい結合親和性は、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、または１０−８Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有するものを含む。さらにより好ましい結合親和性は、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×ｌ０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有するものを含む。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミン融合タンパク質の結合価（治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む）および対応する抗体の結合価を考慮に入れて、治療用タンパク質に結合する対応する抗体（アルブミンに融合されていない）のものに類似する、所定のタンパク質またはエピトープについての親和性を有する。加えて、本明細書に記載される（実施例および表１を参照のこと）およびそうでなければ当該技術分野で周知のアッセイを慣用的に適用して、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／またはアルブミン部分のいずれかに関連する生物学的活性および／または治療活性（体外または生体内のいずれかにおいて）を誘発するアルブミン融合タンパク質、ならびにそのフラグメント、変異体および誘導体の能力を測定してもよい。他の方法も当業者に周知であり、かつ本発明の範囲内であり得る。
【０１８６】
アルブミン
上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、好ましくは遺伝子融合により互いに結合されている治療用タンパク質の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体、およびヒト血清アルブミンの少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む。
【０１８７】
さらなる実施形態は、化学的共役により互いに結合されている治療用タンパク質の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体、およびヒト血清アルブミンの少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む。
【０１８８】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）という用語は、本明細書に同義的に用いられる。「アルブミン」および「血清アルブミン」という用語は、より広く、ヒト血清アルブミン（ならびにそのフラグメントおよび変異体）、ならびに他の種由来のアルブミン（ならびにそのフラグメントおよび変異体）を包含する。
【０１８９】
本明細書に使用される「アルブミン」とは、アルブミンの１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）を有する、アルブミンのタンパク質もしくはアミノ酸配列、またはアルブミンのフラグメントもしくは変異体を集合的に指す。特に、「アルブミン」とは、ヒトアルブミンまたはそのフラグメント（例えば、欧州特許出願第２０１  ２３９号、同第３２２  ０９４号、国際公開第ＷＯ９７／２４４４５号、同第ＷＯ９５／２３８５７号を参照のこと）を指し、特に、図１および配列番号１に示されるようなヒトアルブミンの成熟形態、あるいは他の脊椎動物由来のアルブミンもしくはそのフラグメント、またはこれらの分子のアナログもしくは変異体もしくはそのフラグメントを指す。
【０１９０】
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質において用いられるヒト血清アルブミンは、配列番号１を参照として、以下のセットの点突然変異の１つまたはその両方を含む：Ｌｅｕ−４０７をＡｌａに、Ｌｅｕ−４０８をＶａｌに、Ｖａｌ−４０９をＡｌａに、およびＡｒｇ−４１０をＡｌａに；またはＡｒｇ−４１０をＡに、Ｌｙｓ−４１３をＧｌｎに、およびＬｙｓ−４１４をＧｌｎに（例えば、国際公開第ＷＯ９５／２３８５７号を参照のこと、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）。さらにより好ましい実施形態において、上記したセットの点突然変異の１つまたは両方を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母Ｙａｐ３ｐタンパク質による切断に対して安定性／耐性が改善されており、それにより、酵母宿主細胞中で発現される組換えアルブミン融合タンパク質の産生の増大が可能となる。
【０１９１】
本明細書に使用される治療用タンパク質の治療活性または血漿安定性または貯蔵寿命を延長するのに十分なアルブミンの部分は、非融合状態の貯蔵寿命または血漿安定性と比較して、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分の貯蔵寿命または血漿安定性が延長または拡大されるように、タンパク質の治療活性または血漿安定性を安定化させるまたは長期化するために十分な長さまたは構造を有するアルブミンの部分を指す。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、上記したような全長のＨＡ配列を含んでもよく、または治療活性を安定化または延長し得る１つ以上のそのフラグメントを含んでもよい。このようなフラグメントは、１０個以上のアミノ酸の長さであってもよく、またはＨＡ配列に由来する約１５、２０、２５、３０、５０個またはそれ以上の隣接したアミノ酸を含んでもよく、またはＨＡの特定のドメインの一部またはすべてを含んでもよい。例えば、初めの２つの免疫グロブリン様ドメインにわたる１つ以上のＨＡのフラグメントが用いられてもよい。好ましい実施形態において、ＨＡフラグメントは、ＨＡの成熟形態である。
【０１９２】
本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、通常のＨＡの変異体であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、本明細書に記載のような治療用タンパク質の変異体であってもよい。「変異体」という用語は、挿入、欠失および保存的あるいは非保存的のいずれかの置換を含み、ここで、このような変化は、アルブミンの浸透圧（ｏｎｃｏｔｉｃ）特性、有用なリガンド結合性および非免疫原性特性、または治療用タンパク質の治療活性を付与する活性部位もしくは活性ドメインのうちの１つ以上を実質的に改変しない。
【０１９３】
特に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ヒトアルブミンおよびヒトアルブミンのフラグメントの自然に発生する多形変異体、例えば欧州特許出願第３２２  ０９４号において開示されたフラグメント（すなわち、ＨＡ（Ｐｎ）、ここで、ｎは３６９〜４１９である）を含み得る。アルブミンは、任意の脊椎動物、特に、任意の哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタ）に由来してもよい。非哺乳動物アルブミンとしては、メンドリおよびサケが挙げられるが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、治療用タンパク質部分とは異なる動物に由来してもよい。
【０１９４】
一般的に言うと、ＨＡフラグメントもしくは変異体は、少なくとも１００個のアミノ酸長、好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸長であり得る。ＨＡ変異体は、ＨＡの少なくとも１つの全ドメイン、例えばドメイン１（配列番号１のアミノ酸１〜１９４）、ドメイン２（配列番号１のアミノ酸１９５〜３８７）、ドメイン３（配列番号１のアミノ酸３８８〜５８５）、ドメイン１および２（配列番号１の１〜３８７）、ドメイン２および３（配列番号１の１９５〜５８５）、またはドメイン１および３（配列番号１のアミノ酸１〜１９４および配列番号１のアミノ酸３８８〜５８５）からなる、または代替として、それらを含んでもよい。各ドメインそれ自体は、２つの相同なサブドメイン、すなわち、１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１、および５１２〜５８５から構成され、Ｌｙｓ１０６ないしＧｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２ないしＶａｌ３１５、およびＧ１ｕ４９２ないしＡｌａ５１１の残基を含む可撓性のサブドメイン間リンカー領域を有する。
【０１９５】
好ましくは、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメインもしくはドメインまたはその保存的修飾を含む。融合が、サブドメインに基づくならば、好ましくは、隣接するリンカーの一部またはすべてが、治療用タンパク質部分を連結するために用いられる。
【０１９６】
治療用タンパク質に特異的に結合する抗体も治療用タンパク質である
本発明はまた、表１に開示される治療用タンパク質に特異的に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質も包含する。特に、「治療用タンパク質」という用語が、治療用タンパク質（例えば、表１の列Ｉに記載されるような）ならびにそのフラグメントおよび変異体に結合する抗体を包含することが企図される。したがって、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体、および／または抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
【０１９７】
抗体構造およびバックグラウンド
基本的な抗体構造単位は、４量体を含むことが周知である。各４量体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対からなり、各ペアは、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）および１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして規定する。概して、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ３−５（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，４ｔｈ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９８））（すべての目的のために、参照することにより、その全体が組み込まれる）を参照のこと。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【０１９８】
したがって、無傷ＩｇＧ抗体は、２つの結合部位を有する。二重機能性または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は同じである。
【０１９９】
該鎖はすべて、相補性決定領域またはＣＤＲとも言われる３つの超可変領域により連結された比較的良く保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と同じ一般構造を示す。一般的に、ＣＤＲ領域は、抗原と接触し、その特異性を決定する抗体の部分である。各対の重鎖および軽鎖に由来するＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列し、特定のエピトープとの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端までの軽鎖および重鎖可変領域は共に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４ドメインを含む。可変領域は、重鎖または軽鎖定常領域に連結されている。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ  Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【０２００】
本明細書に使用される「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性のある部分、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子（例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲ領域を含む分子）を指す。アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体には、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体（例えば、一本鎖Ｆｖｓ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリにより産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に特異的な抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記の任意のエピトープ結合フラグメント（例えば、ＶＨドメイン、ＶＬドメインまたは１つ以上のＣＤＲ領域）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０１】
治療用タンパク質に結合する抗体
本発明は、治療用タンパク質（例えば、表１に開示したもの）またはそのフラグメントもしくは変異体に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質を包含する。
【０２０２】
治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体は、鳥類および哺乳類を含む任意の動物に由来してもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、ネズミ（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ抗体である。最も好ましくは、抗体は、ヒト抗体である。本明細書に使用される「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリおよびヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたゼノマウスまたは他の生物から単離された抗体を含む。
【０２０３】
治療用タンパク質に結合する、および本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体分子は、ＩｇＧ１である。他の好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ２である。他の好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ４である。
【０２０４】
最も好ましくは、治療用タンパク質に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、およびＶＬあるいはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を、単独、またはヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインの全体もしくは部分と組み合わせて含み得る。
【０２０５】
治療用タンパク質に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはそれ以上の多重特異性であってもよい。多重特異性抗体は、治療用タンパク質の異なるエピトープについて特異的であり得、または治療用タンパク質、ならびに異種ポリペプチドもしくは固体支持物質等の異種エピトープの両方について特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１７７１５号、同第ＷＯ９２／０８８０２号、同第ＷＯ９１／００３６０号、同第ＷＯ９２／０５７９３号、Ｔｕｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）、米国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０２０６】
治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体は、二重特異性または二重機能性であってもよく、これは、その抗体が２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体であることを意味する。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含む様々な方法により産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０），Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７  １５５３（１９９２）を参照のこと。加えて、二重特異性抗体は、「二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．“‘Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ’：ｓｍａｌｌ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３））または「ジャニュシン（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）ｔａｒｇｅｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｏｎ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ”  ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：３６５５−３６５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ｊａｎｕｓｉｎ：ｎｅｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅａｇｅｎｔｓ”Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ  ７：５１−５２（１９９２））として形成されてもよい。
【０２０７】
本発明はまた、本明細書に記載される、または当該技術分野で周知の抗体のフラグメントもしくは変異体（誘導体を含む）を含むアルブミン融合タンパク質も提供する。当業者に周知の標準的な技法を用いて、本発明の分子をコードするヌクレオチド配列に、例えば、アミノ酸の置換をもたらす部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発を含む変異を導入することができる。好ましくは、変異体（誘導体を含む）は、参照ＶＨドメイン、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬドメイン、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３に対して、５０個未満のアミノ酸の置換、４０個未満のアミノ酸の置換、３０個未満のアミノ酸の置換、２５個未満のアミノ酸の置換、２０個未満のアミノ酸の置換、１５個未満のアミノ酸の置換、１０個未満のアミノ酸の置換、５個未満のアミノ酸の置換、４個未満のアミノ酸の置換、３個未満のアミノ酸の置換、または２個未満のアミノ酸の置換をコードする。特定の実施形態において、変異体は、ＶＨＣＤＲ３の置換をコードする。好ましい実施形態において、変異体は、必須でないと考えられている１つ以上のアミノ酸残基において保存的アミノ酸の置換を有する。
【０２０８】
治療用タンパク質に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、それらが認識または特異的に結合する治療用タンパク質のエピトープまたは部分に関して、記載または特定化され得る。治療用タンパク質または治療用タンパク質の特定のエピトープに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。したがって、本発明は、治療用タンパク質に特異的に結合する抗体を包含し、その排除を可能にする。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、その抗体それ自体の融合されていないフラグメントもしくは変異体と同じエピトープに結合する。
【０２０９】
治療用タンパク質に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体はまた、それらが交差反応性に関して、記載または特定化され得る。治療用タンパク質の任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログに結合しない抗体が含まれる。治療用タンパク質に対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の配列同一性（当該技術分野で周知の、および本明細書に記載される方法を用いて計算されるような）を有するポリペプチドに結合する抗体も本発明に含まれる。特定の実施形態において、治療用タンパク質に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、ヒトタンパク質のネズミ、ラットおよび／またはウサギホモログおよび対応するそのエピトープと交差反応する。治療用タンパク質に対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の配列同一性（当該技術分野で周知の、および本明細書に記載される方法を用いて計算されるような）を有するポリペプチドに結合しない抗体も本発明に含まれる。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、本明細書に開示される、任意の単一の特定の抗原性もしくは免疫原性ポリペプチド、または特定の抗原性および／または免疫原性ポリペプチドのうちの２、３、４、５またはそれ以上の組み合わせに関する。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、その特定の抗体自体のフラグメントもしくは変異体と比較して、類似するまたは実質的に同一な交差反応性を有する。
【０２１０】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書に記載のような）、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに結合する抗体もさらに本発明に含まれる。治療用タンパク質に結合する、および本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体はまた、本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性により、記載または特定化され得る。好ましい結合親和性は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有するものを含む。より好ましい結合親和性は、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、または１０−８Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有するものを含む。さらにより好ましい結合親和性は、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×ｌ０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有するものを含む。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミン融合タンパク質の結合価（治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む）および対応する抗体の結合価を考慮に入れて、治療用タンパク質に結合する対応する抗体（アルブミンに融合されていない）のものに類似する、所定のタンパク質またはエピトープについての親和性を有する。
【０２１１】
本発明はまた、競合的結合を測定するために当該技術分野で周知の任意の方法、例えば本明細書に記載のイムノアッセイにより測定されるような、治療用タンパク質エピトープへの抗体の結合を競合的に阻害する抗体も提供する。好ましい実施形態において、抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％でエピトープへの結合を競合的に阻害する。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質のエピトープへの第２の抗体の結合を競合的に阻害する。他の好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％で治療用タンパク質のエピトープへの第２の抗体の結合を競合的に阻害する。
【０２１２】
治療用タンパク質に結合する、および本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、治療用タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドと受容体／リガンドの相互作用を部分的あるいは完全に破壊する抗体を含む。本発明は、受容体特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方を特徴とする。本発明はまた、リガンド結合を阻害しないが、受容体活性化を阻害する受容体特異的抗体も特徴とする。受容体活性化（すなわち、シグナリング）は、本明細書に記載される、またはそうでなければ当該技術分野で周知の技法により測定されてもよい。例えば、受容体活性化は、受容体またはその基質のリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）を、免疫沈降、次いで、ウエスタンブロット分析（例えば、上記のような）により検出することにより測定することができる。特定の実施形態において、抗体の不在下、リガンド活性または受容体活性を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提供される。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質に結合する抗体の融合されていないフラグメントもしくは変異体と比較して、リガンド結合の防止および／または受容体活性化の防止に関して、類似するまたは実質的に類似する特徴を有する。
【０２１３】
本発明はまた、リガンド結合および受容体活性化の両方を妨げる受容体特異的抗体、ならびに受容体−リガンド複合体を認識し、好ましくは、結合していない受容体または結合していないリガンドを特異的に認識しない抗体も特徴とする。同様に、リガンドに結合し、受容体へのリガンドの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それにより受容体活性化を妨げるが、リガンドが受容体へ結合するのを妨げない抗体も本発明に含まれる。さらに、その受容体を活性化する抗体も本発明に含まれる。これらの抗体は、受容体アゴニストとして作用し、すなわち、例えば、受容体の二量体化を誘発することにより、リガンド介在受容体活性化の生物学的活性のすべてあるいはサブセットのいずれかを増強または活性化し得る。該抗体は、治療用タンパク質（例えば、表１に開示される）の特異的生物学的活性を含む生物学的活性に対するアゴニスト、アンタゴニスト、または逆アゴニストとして特定化され得る。上記の抗体のアゴニストは、当該技術分野で周知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４０２８１号、米国特許第５，８１１，０９７号、Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）、Ｈａｒｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）、Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）、Ｐｉｔａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）、Ｌｉａｕｔａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ９（４）：２３３−２４１（１９９７）、Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）、Ｔａｒｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １４（４）：７５５−７６２（１９９５）、Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）、Ｂａｒｔｕｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８（１）：１４−２０（１９９６）（それは、参照することにより、その全体が本明細書にすべて組み込まれる）を参照のこと。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質に結合する抗体の融合されていないフラグメントもしくは変異体と、類似するか、または実質的に同一のアゴニストまたはアンタゴニスト特性を有する。
【０２１４】
治療用タンパク質に結合する、および本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、例えば、治療用タンパク質を精製、検出、および標的化するために用いられ得、これらは、体外および生体内の両方での診断および治療方法を含む。例えば、抗体は、生体試料中の治療用タンパク質のレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおける有用性を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）（参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。同様に、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、例えば、治療用タンパク質を精製、検出、および標的化するために用いられ得、これらは、体外および生体内の両方での診断および治療方法を含む。
【０２１５】
治療用タンパク質に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、改変される（すなわち任意の型の分子と抗体の共有結合により）誘導体を含む。例えば、これらに限定されないが、抗体の誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンド／または他のタンパク質への結合等により修飾された抗体を含む。任意の非常に多くの化学修飾が、特定の化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等が挙げられるが、これらに限定されない周知の技法により行われてもよい。さらに、誘導体は、１つ以上の古典的でないアミノ酸を含んでもよい。本発明のアルブミン融合タンパク質も上記のように修飾されてもよい。
【０２１６】
治療用タンパク質に結合する抗体の産生方法
治療用タンパク質に結合する、および本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、当該技術分野で周知の任意の好適な方法により産生され得る。関心対象となる抗原に対するポリクローナル抗体は、当該技術分野で公知の様々な方法により産生できる。例えば、治療用タンパク質は、ウサギ、マウス、ラット等が挙げられるが、これらに限定されない様々な宿主動物に投与され、抗原特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導してもよい。様々なアジュバントを用い、宿主種に応じて免疫応答を増加してもよく、該アジュバントは、フロイント（完全および不完全）、水酸化物アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン等の界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウムパルブム（ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ））が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアジュバントはまた、当該技術分野で公知である。
【０２１７】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技法、またはそれらの組み合わせの使用を含む当該技術分野で周知の多種多様な技法を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野で周知のもの、および例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（該参考文献は、参照することにより、その全体が組み込まれる）において教示されているものを含むハイブリドーマ技法を用いて産生され得る。本明細書に使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技法により産生された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、単一のクローンに由来する抗体を指し、任意の真核、原核、またはファージクローンが挙げられるが、それを産生する方法は含まれない。
【０２１８】
ハイブリドーマ技法を用いる特定の抗体の産生およびスクリーニング方法は、慣用的であり、当該技術分野で公知である。非限定的な一例では、治療用タンパク質またはそのフラグメントもしくは変異体、アルブミン融合タンパク質、またはこのような治療用タンパク質もしくはそのフラグメントもしくは変異体、またはアルブミン融合タンパク質を発現する細胞を用いて、マウスを免疫することができる。免疫応答が検出されたらすぐに（例えば、抗原に特異的な抗体が、マウス血清中に検出されたらすぐに）、マウスの脾臓を摘出し、脾細胞を単離する。次いで、脾細胞を、公知の技法により任意の好適な骨髄腫細胞、例えばＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０に由来する細胞に融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によりクローン化する。次いで、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該技術分野で周知の方法によりアッセイする。概して高いレベルの抗体を含む腹水は、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫することにより産生することができる。
【０２１９】
したがって、本発明は、モノクローナル抗体の産生方法、ならびに該方法により産生される抗体を提供し、ここで、該方法は、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含み、好ましくは、該ハイブリドーマは、本発明の抗原を用いて免疫したマウスから単離した脾細胞を骨髄腫細胞と融合させ、次いで、該融合から生じたハイブリドーマを、本発明のポリペプチドに結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングすることにより産生される。
【０２２０】
ポリクローナルおよびモノクローナルヒトＢ細胞株の両方を産生するために公知の別の方法は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を用いる形質転換である。ＥＢＶにより形質転換されたＢ細胞株を産生するためのプロトコルは、当該技術分野で一般的に周知であり、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ７．２２  ｏｆ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，１９９４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹにおいて概説されているプロトコルであり、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。形質転換のためのＢ細胞源は、一般的にヒト末梢血であるが、形質転換のためのＢ細胞はまた、リンパ節、扁桃、脾臓、腫瘍組織、および感染組織が挙げられるが、これらに限定されない他の供給源に由来してもよい。組織は、概して、ＥＢＶ形質転換前に、単一細胞懸濁液にされる。さらに、抗ＥＢＶ抗体について血清陽性である個体に由来するＴ細胞が、ＥＢＶによるＢ細胞不死化を抑制し得るので、Ｂ細胞を含む試料中のＴ細胞を物理的に除去する、または不活性化する（例えば、シクロスポリンＡを用いる処置により）かのいずれかの工程が行われてもよい。
【０２２１】
一般に、ヒトＢ細胞を含む試料を、ＥＢＶと共に播種し、次いで、３〜４週間培養する。ＥＢＶの典型的な供給源は、Ｂ９５−８細胞株（ＡＴＣＣ番号＃ＶＲ−１４９２）の培養上清である。ＥＢＶによる形質転換の物理的徴候は、概して、３〜４週の培養期間の終わり頃に認められ得る。位相差顕微鏡検査により、形質転換細胞は、大きく、透明で、有毛に見え得、密な細胞クラスター状態に凝集する傾向があり得る。最初は、ＥＢＶ株は、概して、ポリクローナルである。しかしながら、長い細胞培養期間にわたって、ＥＢＶ株は、特定のＢ細胞クローンの選択的成長の結果として、モノクローナルまたはポリクローナルになり得る。代替として、ポリクローナルＥＢＶ形質転換株を、好適な融合パートナーにサブクローニング（例えば、限界希釈培養により）または融合し、次いで、限界希釈濃度でプレーティングし、モノクローナルＢ細胞株を得てもよい。ＥＢＶ形質転換細胞株のための好適な融合パートナーは、マウス骨髄腫細胞株（例えば、ＳＰ２／０、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）、ヘテロミエローマ（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株（ヒト×マウス、例えば、ＳＰＡＭ−８、ＳＢＣ−Ｈ２０、およびＣＢ−Ｆ７）、ならびにヒト細胞株（例えば、ＧＭ１５００、ＳＫＯ−００７、ＲＰＭＩ８２２６、およびＫＲ−４）を含む。したがって、本発明はまた、ヒトＢ細胞のＥＢＶ形質転換を含む、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントに対するポリクローナルまたはモノクローナルヒト抗体を産生する方法も提供する。
【０２２２】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、周知の技法により産生されてもよい。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するために）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するために）等の酵素を用いて、免疫グロブリン分子をタンパク質分解することにより産生されてもよい。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０２２３】
例えば、治療用タンパク質に結合する抗体はまた、当該技術分野で周知の様々なディスプレー法を用いても産生され得る。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面に表示される。特定の実施形態において、このようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えば、ヒトもしくはマウス）から発現される抗原結合ドメインを表示するために利用され得る。関心対象となる抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原（例えば、標識抗原、または固体表面もしくはビーズ上に結合もしくは捕捉された抗原を用いて）を用いて選択または特定され得る。これらの方法に用いられるファージは、典型的に、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ）である。治療用タンパク質に結合する抗体を産生するために用いられ得るファージディスプレイ法の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）、Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）、Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８（１９９７）、Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０２８０９号、同第ＷＯ９１／１０７３７号、同第ＷＯ９２／０１０４７号、同第ＷＯ９２／１８６１９号、同第ＷＯ９３／１１２３６号、同第ＷＯ９５／１５９８２号、同第ＷＯ９５／２０４０１号、米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号、および同第５，９６９，１０８号（これらのそれぞれは、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるものを含む。
【０２２４】
上記の参考文献に記載されるように、ファージを選択した後、例えば以下に詳述するように、ファージに由来する領域をコードする抗体を単離し、次いで、ヒト抗体を含む全抗体、または任意の他の所望の抗原に結合するフラグメントを産生するために用いて、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生する技法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２２３２４号、Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）、およびＳａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）、およびＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（該参考文献は、参照することにより、その全体が組み込まれる）において開示されているような当該技術分野で周知の方法を用いても行われ得る。
【０２２５】
一本鎖Ｆｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技法の例は、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）、Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）、およびＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）において記載されるものを含む。ヒトにおける抗体の生体内での使用および体外での検出アッセイを含む一部の使用のために、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を用いることが所望され得る。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する一分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。キメラ抗体を産生するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）、Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２、米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、および同第４，８１６３９７号（参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ヒト化抗体は、所望の抗原に結合する非ヒト種の抗体に由来する抗原分子であり、ヒトでない種に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する。多くの場合、ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体に由来する対応する残基を用いて置換され、抗原結合を改変、好ましくは改善し得る。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野で公知の方法により、例えば、ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用をモデリングし、抗原結合および配列比較のために重要なフレームワーク残基を特定し、特定位置における異常なフレームワーク残基を特定することにより特定される（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）（参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。抗体は、例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許出願第２３９，４００号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０９９６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許出願第５９２，１０６号、同第５１９，５９６号、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）、Ｒｏｇｕｓｋａ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））、および鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当該技術分野で周知の様々���技法を用いてヒト化され得る。
【０２２６】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療処置のために特に所望される。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを用いた上記のファージディスプレイ方法を含む当該技術分野で周知の様々な方法により作製され得る。また、米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ９８／４６６４５号、同第ＷＯ９８／５０４３３号、同第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９８／１６６５４号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、同第ＷＯ９６／３３７３５号、および同第ＷＯ９１／１０７４１号（これらの各々は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０２２７】
ヒト抗体はまた、機能的な内因性免疫グロブリンを発現し得ないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いても作製され得る。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムまたは相同組換えによりにマウス胚性幹細胞に導入してもよい。代替として、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域を、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞中に導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えにより、ヒト免疫グロブリン座の導入と別々にまたは同時に非機能性を付与してもよい。特に、ＪＨ領域のホモ接合型欠失は、内因性抗体の産生を妨げる。修飾された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞中に微量注入して、キメラマウスを産生する。次いで、キメラマウスを交配させ、ヒト抗体を発現するホモ接合型子孫を生じさせる。トランスジェニックマウスを、選択した抗原、例えば、本発明のポリペプチドのすべてまたは一部を用いて通常の様態で免疫する。その抗原に対して生成されるモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技法を用いて、免疫したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが有するヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再構成され、その後、クラススイッチングおよび体細胞突然変異が起こる。したがって、このような技法の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体、およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技法の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技法、およびこのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細な考察については、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９２／０１０４７号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、同第ＷＯ９６／３３７３５号、欧州特許出願第０  ５９８  ８７７号、米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８８５，７９３号、同第５，９１６，７７１号、同第５，９３９，５９８号、同第６，０７５，１８１号、および同第６，１１４，５９８号（これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）等の企業は、上記したものと類似する技法を用いて、選択された抗原に対して作製されたヒト抗体を提供することを受託することができる。
【０２２８】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイドされた選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称される技法を用いて産生することができる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）が、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を導くために用いられる。（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８）参照）。
【０２２９】
抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明はさらに、抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェントまたは代替として、より低いストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で（例えば、上記に定義されるような）、好ましくは、治療用タンパク質に特異的に結合する抗体、およびより好ましくは、表２の「配列番号Ｚ」の列に開示されるような「治療用タンパク質Ｘ」のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
【０２３０】
当該技術分野で周知の任意の方法により、ポリヌクレオチドを得、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が周知であるならば、抗体をコードするポリヌクレオチドを、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築してもよく（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：２４２（１９９４）に記載のように）、これには、簡潔に言うと、抗体をコードする配列部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いで、連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅が含まれる。
【０２３１】
代替として、抗体をコードするポリヌクレオチドは、好適な供給源からの核酸から産生され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが入手できないが、その抗体分子の配列は周知であるならば、免疫グロブリンをコードする核酸は、配列の３’および５’末端にハイブリダイズできる合成プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うか、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングを行い、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリに由来するｃＤＮＡクローンを特定することにより、化学的に合成される、または好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞）から作製されたｃＤＮＡライブラリ、またはそれらから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））から得られてもよい。ＰＣＲにより産生された増幅された核酸は、次いで、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る（実施例６５を参照のこと）。
【０２３２】
抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該技術分野で公知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技法、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ等（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ＭＯｌｅｃｕｌａｒ  ＢＩｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載の技法（これらは共に、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）を用いて操作し、異なるアミノ酸配列を有する抗体を産生させる、例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入を作り出してもよい。
【０２３３】
特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、当該技術分野で公知の方法、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列と比較して、配列の超可変領域を決定することにより、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を特定するために調べられ得る。慣用的な組換えＤＮＡ技法を用いて、１つ以上のＣＤＲは、フレームワーク領域内、例えば、ヒトフレームワーク領域中に挿入され、上記のように非ヒト抗体をヒト化し得る。フレームワーク領域は、自然に発生するまたはコンセンサスなフレームワーク領域、および好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストについては、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせにより生じるポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上に述べられるように、１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そのアミノ酸置換は、その抗原と抗体の結合を改善する。さらに、このような方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸の置換または欠失を生じさせ、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠失している抗体分子を産生することができる。ポリヌクレオチドに対する他の修飾は、本発明により包含され、かつ当該技術分野の範囲内にある。
【０２３４】
加えて、適切な生物学的活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子と一緒に、適切な抗原特異性のマウス抗体分子に由来する遺伝子をスプライシングすることにより、「キメラ抗体」の産生について開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））も用いることができる。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する一分子であり、例えば、ネズミｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの、例えばヒト化抗体である。
【０２３５】
代替として、一本鎖抗体の産生について記載されている技法（米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３（１９８８）、およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４（１９８９））は、一本鎖抗体を産生するために適用され得る。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントを連結させることにより形成され、一本鎖ポリペプチドを生じる。大腸菌中での機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技法も用いられてもよい（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０２３６】
抗体の組換え発現
抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、抗体の重鎖もしくは軽鎖、または一本鎖抗体）の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を必要とする。抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部分（好ましくは重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含む）をコードする本発明のポリヌクレオチドが得られると、抗体分子を産生するためのベクターは、当該技術分野で公知の技法を用いる組換えＤＮＡ技法により生成され得る。したがって、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含むポリヌクレオチドを発現させることにより、タンパク質を調製するための方法が、本明細書に記載される。当業者に公知の方法を用いて、抗体をコードする配列および適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築ができる。これらの方法には、例えば、体外の組換えＤＮＡ技法、合成技法、および生体内の遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８６／０５８０７号、ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０１０３６号、および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、該抗体の可変ドメインは、全重鎖または全軽鎖の発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得る。
【０２３７】
発現ベクターは、従来の技法により宿主細胞へと移入され、次いで、トランスフェクションされた細胞は、従来の技法により培養されて、抗体を生じる。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるように、全免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞中に同時発現され得る。
【０２３８】
様々な宿主−発現ベクター系を利用して、本発明の抗体分子を発現させてもよい。このような宿主−発現系は、関心対象となるコード配列を産生させ、次いで精製され得る媒体を表わすが、さらに、適切なヌクレオチドをコードする配列を用いて形質転換または形質移入する場合、本発明の抗体分子を原位置で発現する細胞も表わす。これらは、抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換させた細菌（例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ））等の微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換させた酵母（例えば、サッカロミケス、ピキア）；抗体をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いて感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワ−モザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を用いて感染させた、または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を用いて形質転換させた植物細胞系；または哺乳類細胞（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；牛痘ウイルス７．５Ｋプロモーター）のゲノムに由来するプロモーターを含む組換え発現構築物を有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、大腸菌等の細菌細胞、およびより好ましくは、特に、全組換え抗体分子の発現のために真核細胞が、組換え抗体分子の発現のために用いられる。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主な中間初期遺伝子プロモーターエレメント（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）等のベクターと組み合わせた、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳動物細胞が、抗体に対する効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）、Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０２３９】
細菌系において、多数の発現ベクターは、発現されるべき抗体分子の使用目的に応じて有利に選択されてもよい。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生されるべき場合、抗体分子の医薬組成物の生成のために、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を導くベクターが所望され得る。このようなベクターは、抗体をコードする配列が、ｌａｃ  Ｚをコードする領域を有するフレーム内でベクターに個々に連結され、その結果、融合タンパク質が産生される大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））等が挙げられるが、これに限定されない。また、ｐＧＥＸベクターを用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来ポリペプチドを発現させてもよい。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、次いで、遊離グルタチオンの存在下で溶離させることにより、溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターをトロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ開裂部位を含むように設計し、その結果、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から遊離することができる。
【０２４０】
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｍｉｃａの核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて、外来遺伝子を発現する。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖する。抗体をコードする配列は、このウイルスの非必須の領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０２４１】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスに基づく発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、関心対象となる抗体をコードする配列は、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列）に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、体外または生体内での組換えにより、アデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を発現する能力のある組換えウイルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。特定の開始シグナルはまた、挿入された抗体をコードする配列の効果的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、該開始コドンは、挿入部分全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）と同相でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の天然および合成の両方の起源であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等の含有により高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０２４２】
加えて、挿入された配列の発現を調節し、または所望の特定の様態で遺伝子産物を修飾および処理する宿主細胞系が選択され得る。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、開裂）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび修飾について、特徴的で特異的な機構を有する。発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセッシングを確実にするために、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。この目的のために、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化、およびリン酸化の適当なプロセッシングのための細胞機構を有する、真核宿主細胞が用いられてもよい。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、およびＴ４７Ｄ等の乳癌細胞株、ならびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔ等の正常な乳腺細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４３】
組換えタンパク質の長期間にわたる高収率の産生には、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株を操作してもよい。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）および選択可能なマーカーにより制御されるＤＮＡで形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を富化培地中で１〜２日間成長させ、次いで、選択培地に交換してもよい。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞が、プラスミドをその染色体内に安定的に組み込み、成長して、細胞巣を形成することができ、順に、クローニング化し、細胞株に増殖することを可能にする。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を操作するために有利に用いられ得る。このような操作された細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において、特に有用であり得る。
【０２４４】
多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７（１９８０））の遺伝子（これらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ採用され得る）が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性を以下の遺伝子についての選択の基準として用いることができる：メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）、Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ；Ｃｌｉｎｉｃｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３））；およびハイグロマイシンに耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術の分野で一般に周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適用され得、このような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、およびＣｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載され、これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４５】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅により増大され得る（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤のレベルにおける増加は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加する。増幅される領域は抗体遺伝子に関連付けられるので、抗体の産生も増大し得る（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０２４６】
グルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを選択可能なマーカーとして使用するベクターはそれぞれ、薬物メチオニンスルホキシミン（ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ）またはメトトレキセートの存在下で、増幅され得る。グルタミンシンターゼベースのベクターの利点は、グルタミンシンターゼネガティブである細胞株（例えば、マウス骨髄腫細胞株、ＮＳＯ）の利用可能性にある。グルタミンシンターゼ発現系はまた、内因性遺伝子の機能を妨げるさらなる阻害剤を提供することにより、グルタミンシンターゼを発現する細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）中で機能することもできる。グルタミンシンターゼ発現系およびその成分は、ＰＣＴ公開第Ｗ０８７／０４４６２号、同第Ｗ０８６／０５８０７号、同第Ｗ０８９／０１０３６号、同第Ｗ０８９／１０４０４号、および同第Ｗ０９１／０６６５７号に詳述されており、これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本発明にしたがって使用され得るグルタミンシンターゼ発現ベクターは、例えば、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）を含む供給元から市販されている。マウス骨髄腫細胞においてＧＳ発現系を使用する、モノクローナル抗体の発現および産生は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９（１９９２）ならびにＢｉｂｌｉａ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１：１（１９９５）（これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。
【０２４７】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクター）で、同時形質移入され得る。この２つのベクターは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択可能なマーカーを含み得る。代替として、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現することができる、単一のベクターが使用され得る。このような状況において、過剰の毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０２４８】
本発明の抗体分子が、動物により産生されるか、化学的に合成されるか、または組換えにより発現されると、当該技術分野で周知の、免疫グロブリン分子の精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティーによる）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技法により、精製され得る。加えて、治療用タンパク質に結合する、および本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に応答し得る抗体またはそのフラグメントは、本明細書に記載される、またはそうでなければ当該分野で周知の、異種ポリペプチド配列に融合され得、精製を容易にする。
【０２４９】
抗体の修飾
治療用タンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントもしくは変異体は、精製を容易にするために、ペプチド等のマーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多くは、市販されている。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）において記載されるように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製のために有用な他のペプチドタグとしては、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球凝集素タグ（「ＨＡ」タグとも称される）（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５０】
本発明はさらに、診断剤または治療剤に結合体化される、抗体またはそのフラグメントを包含する。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置療法の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生または進行を監視するために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質と連結させることにより容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放射断層撮影を用いる陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、当該技術分野で周知の技法を用いて、直接的または中間体（例えば、当該技術分野で周知のリンカーのような）を介して間接的に抗体（またはそのフラグメント）に連結または共役されてもよい。本発明に従って診断剤として用いるための抗体に共役され得る金属イオンについては、例えば、米国特許第４、７４１、９００号を参照のこと。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、または９９Ｔｃが挙げられる。検出可能な物質の他の例は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【０２５１】
さらに、本発明の抗体は、治療用部分（例えば、細胞毒（例えば、細胞増殖抑制性もしくは細胞破壊の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン（例えば、α−エミッター（例えば、２１３Ｂｉ）等）に共役され得る。細胞毒または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アンスラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５２】
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を修飾するために使用され得、治療剤または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されるものと解釈されない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス薬（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照のこと）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号を参照のこと））、血栓症薬もしくは血管新生阻害剤（例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答修飾剤（例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子等）が挙げられ得る。
【０２５３】
抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、これは、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５４】
このような治療部分を抗体に結合する技法は、公知である。例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）、“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０２５５】
代替として、抗体は、２次抗体に共役され、米国特許第４，６７６，９８０号（これは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）においてＳｅｇａｌにより記載のような抗体の異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る。
【０２５６】
単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有しない抗体が、治療薬として使用され得る。
【０２５７】
抗体−アルブミンの融合
治療用タンパク質に結合する、および本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体としては、表１の「治療用タンパク質Ｘ」の列に開示される治療用タンパク質に結合する抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５８】
特定の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＨドメインを含む、または代替として、それからなる。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントもしくは変異体は、１、２または３個のＶＨ  ＣＤＲを含む、または代替として、それらからなる。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＨ  ＣＤＲ１を含む、または代替として、それらからなる。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＨ  ＣＤＲ２を含む、または代替として、それらからなる。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＨ  ＣＤＲ３を含む、または代替として、それらからなる。
【０２５９】
特定の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＬドメインを含む、または代替として、それからなる。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントもしくは変異体は、１、２、または３個のＶＬ  ＣＤＲを含む、または代替として、それらからなる。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合する抗体、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＬ  ＣＤＲ１を含む、または代替として、それらからなる。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＬ  ＣＤＲ２を含む、または代替として、それらからなる。他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＬ  ＣＤＲ３を含む、または代替として、それらからなる。
【０２６０】
他の実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントもしくは変異体は、１、２、３、４、５、または６個のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲを含む、または代替として、それらからなる。
【０２６１】
好ましい実施形態において、治療用タンパク質に免疫特異的に結合する、およびアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントもしくは変異体は、ペプチドリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号４））により治療抗体のＶＬドメインに連結された、治療抗体のＶＨドメインを含むｓｃＦｖを含む、または代替として、それらからなる。
【０２６２】
免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）
本発明の抗体、あるいは治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、細胞株および生物学的試料の免疫表現型分類のために利用され得る。本発明の治療用タンパク質は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより具体的には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して作製されるモノクローナル抗体（あるいは治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質）は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技法が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクローナル抗体（あるいは治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質）を用いて利用され得、その技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パンニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照のこと）が挙げられる。
【０２６３】
これらの技法は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における微小残存病変（ＭＲＤ））および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にする。代替として、これらの技法により、ヒト臍帯血において見出されるような増殖および／または分化を起こし得る造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングが可能となる。
【０２６４】
治療用タンパク質ならびに治療用タンパク質に結合する抗体のフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質に結合する抗体の特徴付け
本発明の抗体、または治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、様々に特徴付けられ得る。特に、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、本明細書に記載の技法または当該技術分野で周知の慣例的に改変する技法を用いて、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質に結合する抗体に特異的に結合された同じ抗原に特異的に結合する能力についてアッセイされてもよい。
【０２６５】
本発明の抗体、または治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質が、特異的タンパク質またはエピトープに（特異的に）結合する能力についてのアッセイは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１（１９９２））、ビーズ上で（例えば、Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ上で（例えば、Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６（１９９３））、細菌で（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子で（例えば、米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，２２３，４０９号）、プラスミドで（例えば、Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９（１９９２））、またはファージで（例えば、Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）、Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６（１９９０）、Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２（１９９０）、およびＦｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０（１９９１））行なうことができる（これらの参考文献の各々は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。本発明の抗体、または治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、本明細書に記載される、またはそうでなければ、他の当該技術分野で周知の技法を使用または慣用的に改変して、特定のタンパク質またはエピトープに対するそれらの特異性および親和性について、アッセイされ得る。
【０２６６】
治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該技術分野で周知の任意の方法により、他の抗原（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する、治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体により特異的に結合される分子との、配列保存／構造保存を有する分子）との交差反応性について、アッセイされ得る。
【０２６７】
（免疫特異的）結合および交差反応性を分析するために用いられ得るイムノアッセイは、例をいくつか挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光イムノアッセイ、およびタンパク質Ａイムノアッセイ等の技法を用いる競合的および非競合的アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは、慣用的であり、かつ当該技術分野で公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。例示的なイムノアッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図されない）。
【０２６８】
概して、免疫沈降プロトコルは、溶解緩衝液、例えば、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を追加したＲＩＰＡ緩衝液（１％のＮＰ−４０またはトリトンＸ−１００、１％のナトリウムデオキシコール酸、０．１％のＳＤＳ、０．１５ＭのＮａＣ１、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％のトラジロール）中に細胞集団を溶解し、本発明の抗体または治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を細胞溶解物に加え、一定時間（例えば、１〜４時間）４０℃で培養し、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｇセファロースビーズ（または治療用抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質の場合は、適切な抗イディオタイプ抗体または抗アルブミン抗体を用いてコーティングされたビーズ）を細胞溶解物に加え、約１時間以上４０℃で培養し、溶解緩衝液でビーズを洗浄し、次いで、ＳＤＳ／試料緩衝液中にビーズを再懸濁することを含む。本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質の特定の抗原を免疫沈澱させる能力は、例えば、ウエスタンブロット分析によりアッセイすることができる。当業者は、抗体またはアルブミン融合タンパク質と抗原の結合を増大させ、バックグラウンドを減少させるように修飾され得るパラメータ（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を予め洗浄すること）について認識できるだろう。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  １０．１６．１を参照のこと。
【０２６９】
概して、ウエスタンブロット分析は、タンパク質試料を調製し、そのタンパク質試料をポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じて８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で電気泳動し、そのタンパク質試料をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン等の膜へ転写し、ブロッキング溶液（例えば、３％のＢＳＡを伴うＰＢＳまたは脱脂乳）中でその膜をブロッキングし、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中でその膜を洗浄し、本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質（ブロッキング緩衝液中で希釈されている）をその膜に適用し、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈した酵素基質（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に共役させた二次抗体（例えば、抗ヒト血清アルブミン抗体等のアルブミン融合タンパク質を認識するもの）を適用し、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄し、次いで、抗原の存在を検出することを含む。当業者は、検出されるシグナルを増大させ、バックグラウンドノイズを減少させるように改変できるパラメータについて認識することができよう。ウエスタンブロットプロトコルについてのさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  １０．８．１を参照のこと。
【０２７０】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製し、９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルをその抗原でコーティングし、ウェルに結合しなかった抗原を洗い流し、酵素基質（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）等の検出可能な化合物に共役させた本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む）をウェルに加え、次いで、一定時間培養し、結合しなかったもしくは非特異的に結合したアルブミン融合タンパク質を洗い流し、次いで、ウェルにコーティングされた抗原と特異的に結合した抗体またはアルブミン融合タンパク質の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡでは、抗体またはアルブミン融合タンパク質は、検出可能な化合物と共役させる必要がなく、その代わりに、検出可能な化合物に共役させた二次抗体（抗体またはアルブミン融合タンパク質をそれぞれ認識する）をウェルに加えてもよい。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体またはアルブミン融合タンパク質を、ウェルにコーティングしてもよい。この場合、検出可能な分子は、酵素基質（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）等の検出可能な化合物に共役させた抗原であり得る。当業者は、検出されるシグナルを増大するように修飾され得るパラメータならびに当該技術分野で周知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションについて認識できるだろう。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  １１．２．１を参照のこと。
【０２７１】
タンパク質、抗原、またはエピトープに対するアルブミン融合タンパク質の結合親和性および抗体またはアルブミン融合タンパク質−タンパク質／抗原／エピトープ相互作用の解離速度は、競合的結合アッセイにより測定できる。競合的結合アッセイの一例は、ラジオイムノアッセイであり、該アッセイは、増大量の非標識抗原の存在下、本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質と標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）とを培養し、次いで、標識抗原に結合した抗体を検出することを含む。特定のタンパク質、抗原、またはエピトープについての本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質の親和性および結合の解離速度は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット分析によるデータから決定することができる。抗体またはアルブミン融合タンパク質と同じタンパク質、抗原、またはエピトープに結合する二次タンパク質との競合も、ラジオイムノアッセイを用いて決定することができる。この場合、タンパク質、抗原、またはエピトープを、本発明のアルブミン融合タンパク質と同じタンパク質、抗原、またはエピトープに結合する増大量の非標識二次タンパク質の存在下、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に共役させた本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質と共にインキュベートする。
【０２７２】
好ましい実施形態において、ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析を用いて、タンパク質、抗原、またはエピトープに対する本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質の結合および解離速度を決定する。ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析は、それらの表面上に固定化特異的ポリペプチド、抗原もしくはエピトープ、抗体もしくはアルブミン融合タンパク質をそれぞれ有するチップへの、抗体、アルブミン融合タンパク質、または特定のポリペプチド、抗原もしくはエピトープの結合および解離を分析することを含む。
【０２７３】
治療用途
本発明はさらに、１つ以上の開示された疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与することを包含する、抗体に基づいた治療に関するものである。本発明の治療用化合物としては、本発明の抗体（本明細書に記載されるようなそのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）、本発明の抗体（本明細書に記載されるようなそのフラグメント、アナログおよび誘導体、ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）をコードする核酸、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質、ならびにこのようなアルブミン融合タンパク質をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、本明細書に記載される任意の１つ以上の疾患、障害、または状態が挙げられるが、これらに限定されない、治療用タンパク質の異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害、または状態を処置、阻害、または予防するために用いられ得る。治療用タンパク質の異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害、または状態の処置および／または予防は、それらの疾患、障害または状態に関連する兆候を改善することが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該技術分野で周知の、または本明細書に記載されるような医薬的に許容される組成物に提供され得る。
【０２７４】
特定かつ好ましい実施形態において、本発明は、神経障害、免疫系疾患、筋疾患、生殖器障害、胃腸疾患、肺障害、心血管疾患、腎障害、増殖性疾患および／または癌性疾患および状態および／または本明細書に別記されているものが挙げられるが、これらに限定されない、１つ以上の疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与することを含む、抗体に基づく治療を対象にする。本発明の治療用化合物としては、本発明の抗体（例えば、哺乳類細胞の細胞表面上に発現される全長タンパク質に対する抗体；治療用タンパク質のエピトープに対する抗体）および本発明の抗体（本明細書に記載されるようなそのフラグメント、アナログおよび誘導体、ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、本明細書に記載される任意の１つ以上の疾患、障害、または状態が挙げられるが、これらに限定されない、治療用タンパク質の異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害、または状態を処置、阻害、または予防するために用いられ得る。治療用タンパク質の異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害、または状態の処置および／または予防は、それらの疾患、障害、または状態に関連した症状を緩和することが挙げられるが、これに限定されない。本発明の抗体、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該技術分野で周知の、または本明細書に記載されるような医薬的に許容される組成物に提供され得る。
【０２７５】
本発明の抗体または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を治療的に用いてもよい方法の概要には、体内の局所もしくは全身における、または例えば補体（ＣＤＣ）またはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような抗体の直接的な細胞障害性により治療用タンパク質を結合させることが含まれる。これらのアプローチの一部は、以下により詳細に記載する。本明細書に提供される教示があれば、当業者は、過度な実験を行うことなく、診断、モニタリング、または治療のために、本発明の抗体または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質の使用方法を認識する。
【０２７６】
本発明の抗体、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体と組み合わせて、または例えば抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増大するのに役立つリンホカインまたは造血成長因子（例えば、ＩＬ、２、ＩＬ−３およびＩＬ−７等の）と組み合わせて、有利に利用され得る。
【０２７７】
本発明の抗体、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線治療、化学療法、ホルモン性治療、免疫治療、および抗腫瘍薬剤）と組み合わせて投与され得る。概して、患者と同じ種である種起源または種の反応性（抗体の場合）を有する産物の投与が、好ましい。したがって、好ましい実施形態において、ヒト抗体、フラグメント誘導体、アナログまたは核酸が、治療または予防のためにヒト患者に投与される。
【０２７８】
そのフラグメントを含む本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを対象にするイムノアッセイおよびそれに関連する障害の治療の両方を目的として、治療用タンパク質、そのフラグメントまたは領域、（またはこのような抗体に相関するアルブミン融合タンパク質）に対して、高親和性および／または強力な生体内阻害抗体および／または中和抗体を用いることが、好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に対する親和性を有する。好ましい結合親和性は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを含む。より好ましい結合親和性は、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０７Ｍ、５×１０−８Ｍまたは１０−８Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有するものを含む。さらにより好ましい結合親和性は、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有するものを含む。
【０２７９】
遺伝子治療
特定の実施形態において、治療用タンパク質、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質に結合する抗体をコードする配列を含む核酸を投与して、遺伝子治療により、治療用タンパク質の異常な発現および／または活性に関連する疾患または障害を処置、阻害、または予防する。遺伝子治療とは、発現されたまたは発現可能な核酸を対象に投与することにより行われる治療を指す。本発明のこの実施形態において、核酸は、治療効果を媒介するこれらのコードしたタンパク質を産生する。
【０２８０】
当該技術分野で利用可能な遺伝子治療についての任意の方法は、本発明に従い使用され得る。例示的な方法は、本出願の他の部分により詳細に記載される。
【０２８１】
治療的または予防的活性の立証
本発明の化合物または医薬組成物は、好ましくは、ヒトにおいて使用する前に所望の治療活性または予防活性について体外で、および次いで生体内で試験される。例えば、化合物または医薬組成物の治療的または予防的有用性を立証するための体外アッセイは、細胞株または患者組織試料への化合物の効果を含む。細胞株および／または組織試料への化合物または組成物の効果は、ロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイが挙げられるが、これらに限定されない当業者に周知の技法を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が必要であるかどうかを決定するために用いられ得る体外アッセイは、患者組織試料を培地で成長させ、次いで、化合物に曝露するか、またはそうでなければ、化合物を投与し、次いで、組織試料への該化合物の効果を観察する、体外細胞培養アッセイを含む。
【０２８２】
治療的／予防的な投与および組成物
本発明は、有効量の本発明の化合物または医薬組成物を対象に投与することによる処置、阻害、および予防方法を提供する。好ましい実施形態において、化合物は、実質的に精製されている（例えば、その効果を限定するまたは所望されない副作用を生じる物質は実質的にない）。好ましくは、対象は、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物が挙げられるが、これらに限定されない動物であり、および好ましくは哺乳類であり、および最も好ましくはヒトである。
【０２８３】
化合物が、核酸または免疫グロブリンを含む場合、採用され得る製剤および投与方法は、上で説明されている。さらなる適切な製剤および投与経路は、本明細書の以下に記載されているものから選択され得る。
【０２８４】
様々な送達系が知られており、本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発現が可能な組換え細胞中でのカプセル化、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築な等）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物または組成物は、任意の簡便な経路、例えば、注入またはボーラス注射、上皮または皮膚粘膜を介する吸収（例えば、口腔粘膜、直腸、および小腸粘膜等）により投与されてもよく、他の生物活性剤と共に投与されてもよい。投与は、全身または局所投与であり得る。加えて、脳室内およびくも膜下腔内注入を含む任意の好適な経路により、本発明の医薬化合物または組成物を中枢神経系に導入することが望ましい場合がある。脳室内注入は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザ−バー等のリザ−バーに取り付けられた脳室内カテーテルにより促進され得る。例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル剤を伴う製剤を用いた経肺投与も採用できる。
【０２８５】
特定の実施形態において、本発明の医薬化合物または組成物を処置の必要な領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、限定するものではないが、例えば、手術中の局所注入、例えば、手術後の創傷包帯と併用する局所適用、注入、カテーテル、坐剤またはインプラント等により成し遂げられてもよく、該インプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜等の膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン様物質である。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収しない材料を用いるように注意が必要である。
【０２８６】
別の実施形態において、化合物または組成物は、ベシクル、特にリポソーム中において送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）、Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，ｐｐ．３１７−３２７を参照のこと、概して同書を参照のこと）。
【０２８７】
さらなる別の実施形態において、化合物または組成物は、制御された放出系において送達することができる。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ、上記参照、Ｓｅｆｔｏｎ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４：２０１  （１９８７）、Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７  （１９８０）、Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２１：５７４  （１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、ポリマー物質が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を、参照のこと、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）、Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）、Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照のこと）。さらなる別の実施形態において、制御された放出系は、治療標的、例えば、脳の近傍に配置することができるので、全身用量のごく一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上記参照、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照のこと）。
【０２８８】
他の制御された放出系は、Ｌａｎｇｅｒによる総説にて論じられている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０２８９】
本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である特定の実施形態において、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、そして、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いて、または直接注入により、または微粒子ボンバードメントを用いて（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングして、または核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチド等に連結させてこれを投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）等により、細胞内に位置するように核酸を生体内において投与し、それがコードするタンパク質の発現を改善することができる。代替として、相同組換えにより、核酸は細胞内に導入され、発現のための宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれる。
【０２９０】
本発明はまた、医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の化合物、および医薬的に許容される担体を含む。特定の実施形態において、「医薬的に許容される」という用語は、動物、およびより具体的には、ヒトにおける使用のために、連邦または州の規制当局により認可されているか、または米薬局方または概して認識されている他の薬局方に記載されているものを意味する。「担体」という用語は、治療剤と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、水および油（石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等）を含む）等の滅菌した液体であり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合、好ましい担体である。生理的食塩水溶液、ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体、特に、注入可能な溶液として採用され得る。好適な医薬的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。組成物はまた、所望されるならば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性処方等の形態をとり得る。組成物は、伝統的な結合剤および担体、例えば、トリグリセリドと共に坐剤として処方され得る。経口処方物は、標準的な担体、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等を含み得る。好適な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”に記載されている。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、好適な量の担体と共に含んで、患者への適切な投与のための形態を提供する。処方物は、投与形態に適するべきである。
【０２９１】
好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投与のために採用された医薬組成物として、処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカイン等の局部麻酔を含み得る。概して、成分は、別々に、あるいは単一投薬形態で一緒に混合して、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたはサシェット等の密封された容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。組成物が注入投与される必要がある場合、それは、滅菌された医薬グレードの水または生理的食塩水を含む注入用ボトルを用いて調剤される。組成物が注入投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注入用の滅菌水または生理的食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２９２】
本発明の化合物は、中性または塩形態として処方され得る。医薬的に許容される塩としては、アニオン（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、洒石酸等に由来するものを用いて形成されたもの）、およびカチオン（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものを用いて形成されたもの）が挙げられる。
【０２９３】
治療用タンパク質の異常な発現および／または活性に関連する疾患または障害の処置、阻害および予防において有効であり得る本発明の化合物の量は、標準的な診断技法により決定され得る。加えて、任意に、体外アッセイを採用して、最適な投与範囲の決定に役立ててもよい。製剤において採用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤度に依存し、医療従事者の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効量は、体外で、または動物モデル実験系から得られる用量反応曲線から推定されてもよい。
【０２９４】
抗体については、患者に投与される用量は、典型的に、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、患者に投与される用量は、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは、患者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。概して、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答に起因して、ヒト体内において他の種に由来する抗体よりも長い半減期を有する。したがって、多くの場合、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与が可能である。さらに、例えば、脂質化等の修飾により、抗体の取り込みおよび組織浸透（例えば、脳への）を高めることにより、本発明の抗体の投与の用量および頻度は軽減され得る。
【０２９５】
診断および画像化
治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）（治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質を含む）に結合する標識抗体およびその誘導体およびアナログを診断目的のために用いて、治療用タンパク質の異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害、および／または状態を検出、診断、または監視することができる。本発明は、治療用タンパク質の異常な発現の検出を提供するものであって、（ａ）着目ポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を用いて、個体の細胞または体液内の治療用タンパク質の発現をアッセイすることと、（ｂ）標準遺伝子発現レベルとその遺伝子発現レベルを比較することとを含み、これにより、標準発現レベルと比較して、アッセイした治療用タンパク質の発現レベルにおける増大または減少が、異常な発現の指標となる。
【０２９６】
本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供するものであって、（ａ）治療用タンパク質または治療用タンパク質に特異的な抗体の変異体の少なくとも１つのフラグメントを含むアルブミン融合タンパク質に特異的な１つ以上の抗体を用いて、個体の細胞または体液内の治療用タンパク質の発現をアッセイすることと、（ｂ）標準遺伝子発現レベルとその遺伝子発現レベルを比較することとを含み、これにより、標準発現レベルと比較して、アッセイした治療用タンパク質の発現レベルにおける増大または減少が、特定の障害の指標となる。癌については、個体からの生検用組織における比較的大量の転写産物の存在が、疾患の発症についての素因を示し得、または実際に臨床徴候が出現する前に疾患を検出するための手段を提供し得る。この種のより確定的な診断により、医療の専門家は、癌の発症またはさらなる進行をより早く予防する予防的手段または積極的処置を採用することができる。
【０２９７】
本発明の抗体、または治療用タンパク質に特異的な抗体の変異体の少なくとも１つのフラグメントを含むアルブミン融合タンパク質を用いて、当業者に周知の古典的な免疫組織学的方法により、生体試料中のタンパク質レベルをアッセイできる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）、Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体ベースの方法は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等のイムノアッセイを含む。好適な抗体アッセイ標識は、当該技術分野で知られており、グルコースオキシダーゼ等の酵素標識；放射性同位元素、例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）；ルミノール等の発光標識；ならびにフルオレセインおよびローダミン等の蛍光標識、ならびにビオチンが挙げられる。
【０２９８】
本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトにおける、治療用タンパク質の異常な発現と関連する疾患または障害の検出および診断である。一実施形態において、診断は、ａ）関心対象となるポリペプチドに特異的に結合する有効量の標識分子を対象に（例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に）投与すること、ｂ）標識分子を治療用タンパク質を発現する対象における部位で、優先的に濃縮させるために（および非結合標識分子をバックグラウンドレベルまで排出させるために）投与後、時間間隔を待つこと、ｃ）バックグラウンドレベルを決定すること、およびｄ）対象における標識分子を検出すること、を含み、その結果、該バックグラウンドレベルを超える標識分子の検出は、対象が治療用タンパク質の異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バックグラウンドレベルは、特定の系について予め決定された標準値と、検出された標識分子の量を比較することを含む、種々の方法により決定され得る。
【０２９９】
対象のサイズおよび用いられる画像化システムが、診断画像を生成するために必要とされる画像化部分の量を決定することが当該技術分野で理解されよう。放射性同位元素部分の場合、ヒト対象については、注入される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃであり得る。標識抗体、抗体フラグメント、または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、その後、特定の治療用タンパク質を含む細胞の位置に選択的に蓄積し得る。生体内での腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”（Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｄｓ．，Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２））において記載される。
【０３００】
用いる標識の型および投与方法を含むいくつかの可変要素に応じて、標識分子を対象における部位で、優先的に濃縮させるため、および非結合標識分子をバックグラウンドレベルまで排出させるための、投与後の時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態において、投与後の時間間隔は、５〜２０日または５〜１０日である。
【０３０１】
一実施形態において、疾患または障害のモニタリングは、例えば、初めの診断から１ヶ月後、初めの診断から６ヶ月後、初めの診断から１年後等に、疾患または障害を診断するための方法を繰り返すことにより行われる。
【０３０２】
標識分子の存在は、生体内スキャニングについて当該技術分野で周知の方法を用いて患者において検出され得る。これらの方法は、用いる標識の種類に依存する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明の診断方法において用いられ得る方法および装置としては、コンピュ−タ連動断層撮影法（ＣＴ）、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）等の全身スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波検査が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０３】
特定の実施形態において、分子は、放射性同位元素を用いて標識され、放射線応答手術装置を用いて患者において検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態において、分子は、蛍光化合物を用いて標識され、蛍光応答スキャニング装置を用いて患者において検出される。別の実施形態において、分子は、陽電子放出金属を用いて標識され、陽電子放出断層撮影法を用いて患者において検出される。さらなる別の実施形態において、分子は、常磁性標識を用いて標識され、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて患者において検出される。アルブミン融合タンパク質を特異的に検出し、アルブミンまたは治療用タンパク質単独では検出しない抗体が、好ましい実施形態である。本明細書にわたって記載されるように、これらは、アルブミン融合タンパク質を検出するために用いられ得る。
【０３０４】
キット
本発明は、上記方法において用いられ得るキットを提供する。一実施形態において、キットは、１つ以上の容器中に１つの抗体、好ましくは１つの精製された抗体を含む。特定の実施形態において、本発明のキットは、キットに含まれる抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチドを含む。好ましくは、本発明のキットはさらに、関心対象となるポリペプチドと反応しない対照抗体を含む。別の特定の実施形態において、本発明のキットは、関心対象となるポリペプチドとの抗体の結合（例えば、該抗体は、検出可能な基質を検出するための手段を含む（例えば、抗体は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物、または発光化合物と共役され得るか、あるいは第１の抗体を認識する第２の抗体が、検出可能な基質と共役され得る）。
【０３０５】
本発明の別の特定の実施形態において、キットは、増殖性および／または癌性ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスクリーニングで用いる診断キットである。このようなキットは、関心対象となるポリペプチドと反応しない対照抗体を含んでもよい。このようなキットは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を含んでもよい。さらに、このようなキットは、該抗体と抗原の結合を検出するための手段を含む（例えば、抗体は、フローサイトメトリーにより検出され得るフルオレセインまたはローダミン等の蛍光化合物に共役されていてもよい）。特定の実施形態において、該キットは、組換えにより産生された、または化学的に合成されたポリペプチド抗原を含んでもよい。キットのポリペプチド抗原はまた、固体支持体に付着させてもよい。
【０３０６】
さらに特定の実施形態において、上記のキットの検出手段は、該ポリペプチド抗原を付着させる固体支持体を含む。このようなキットはまた、非付着レポーター標識抗ヒト抗体を含み得る。本実施形態において、ポリペプチド抗原との抗体の結合は、該レポーター標識抗体の結合により検出され得る。
【０３０７】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血清をスクリーニングするために用いる診断キットを含む。診断キットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である実質的に単離された抗体、および抗体とのポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の結合を検出するための手段を含む。一実施形態において、抗体は、固体支持体に付着させる。特定の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。キットの検出手段は、第２の、標識モノクローナル抗体を含み得る。代替として、または加えて、検出手段は、標識された競合抗原を含み得る。
【０３０８】
１つの診断の構成においては、試験血清は、本発明の方法により得られる表面結合抗原を有する固相試薬と反応する。特定の抗原抗体を本試薬と結合させ、非結合血清成分を洗浄により除去した後、固体支持体上に結合する抗抗原抗体の量に比例して、レポーターを本試薬と結合させるために、本試薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。本試薬を再び洗浄し、非結合標識抗体を除去し、次いで、試薬に関連するレポーターの量を決定する。典型的に、該レポーターは、好適な蛍光性、発光、または比色分析用基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下、固相を培養することにより検出される酵素である。
【０３０９】
上記のアッセイの固体表面試薬は、タンパク質物質を固体支持物質、例えば、ポリマービーズ、ディップスティック、９６ウェルプレート、またはフィルター物質に付着させるための周知の技法により調製される。これらの付着方法としては、概して、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着、または固体支持体上の化学的に活性な基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）とのタンパク質の共有結合（典型的には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。代替として、ストレプトアビジンでコートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。
【０３１０】
したがって、本発明は、本診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供する。該キットは、概して、表面結合された組換え抗原を有する支持体、および表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識抗ヒト抗体を含む。
【０３１１】
アルブミン融合タンパク質
本発明は、概して、アルブミン融合タンパク質、および疾患または障害の処置、予防、または改善方法に関する。本明細書に使用される「アルブミン融合タンパク質」とは、治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子に対してアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子を融合することにより形成されたタンパク質を指す。本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体およびヒト血清アルブミンの少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含み、それらは、好ましくは、遺伝子融合により互いに結合される（すなわち、アルブミン融合タンパク質は、核酸の翻訳により生じ、ここで、治療用タンパク質のすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチドは、アルブミンのすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチドのフレーム内に連結されている）、または互いに結合する。治療用タンパク質およびアルブミンタンパク質は、アルブミン融合タンパク質の一部となった際、それぞれ、アルブミン融合タンパク質の「一部（ｐｏｒｔｉｏｎ）」、「領域」、または「部分（ｍｏｉｅｔｙ）」と称され得る。
【０３１２】
好ましい実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドによりコードされるアルブミン融合タンパク質または表１または表２に記載のアルブミン融合構築物を提供する。これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。
【０３１３】
本発明の好ましいアルブミン融合タンパク質としては、治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドのフレーム内に連結されたアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードするポリヌクレオチドを含む、または代替として、それからなる核酸分子；表１、表２または実施例に記載のように作製した治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドのフレーム内に連結されたアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードするポリヌクレオチドを含む、または代替として、それからなる核酸分子；または治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドのフレーム内に連結されたアルブミン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子をコードするポリヌクレオチドを含む、または代替として、それからなる核酸分子であって、さらに、例えば、１つ以上の以下の要素：（１）機能的な自己複製ベクター（シャトルベクター、発現ベクター、組み込みベクター、および／または複製系が挙げられるが、これらに限定されない）、（２）転写開始領域（例えば、制御または誘導プロモーター、構成的プロモーター等のプロモーター領域）、（３）転写終結領域、（４）リーダー配列、および（５）選択可能なマーカーを含む核酸分子によりコードされるアルブミン融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、本発明は、治療用タンパク質（例えば、表１に記載のような）および血清アルブミンタンパク質を含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントを含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な変異体を含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は、血清アルブミンの成熟部分である。
【０３１４】
さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントを含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な変異体を含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の成熟部分である。
【０３１５】
さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントもしくは変異体、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントもしくは変異体を含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の成熟部分および血清アルブミンの成熟部分を含む、または代替として、それからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。
【０３１６】
好ましくは、アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてＨＡおよびＣ末端部分として治療用タンパク質を含む。代替として、Ｃ末端部分としてＨＡ、およびＮ末端部分として治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質が、用いられてもよい。
【０３１７】
他の実施形態において、アルブミンのＮ末端およびＣ末端の両方に融合された治療用タンパク質を有する。好ましい実施形態において、ＮおよびＣ末端に融合された治療用タンパク質は、同じ治療用タンパク質である。代替的な好ましい実施形態において、ＮおよびＣ末端に融合された治療用タンパク質は、異なる治療用タンパク質である。別の好ましい実施形態において、ＮおよびＣ末端に融合された治療用タンパク質は、同じまたは関連する疾患、障害、または状態（例えば、表１の「好適な適応症Ｙ」の列に記載のような）を処置または予防するために用いられ得る異なる治療用タンパク質である。別の好ましい実施形態において、ＮおよびＣ末端に融合された治療用タンパク質は、当該技術分野で、一般的に、同時に、一緒に、または連続して患者に生じることが知られているか、または一般的に互いに関連して患者に生じる疾患または障害（例えば、表１の「好適な適応症Ｙ」の列に記載のような）を処置、改善、または予防するために用いられて得る異なる治療用タンパク質である。
【０３１８】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質のＮまたはＣ末端および／またはアルブミンまたはその変異体のＮまたはＣ末端に融合された所定の治療用タンパク質Ｘまたはその変異体の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の分子を含むタンパク質を包含する。所定の治療用タンパク質Ｘまたはその変異体の分子は、「頭部−頭部」の配向（例えば、治療用タンパク質Ｘの１つの分子のＮ末端が、治療用タンパク質Ｘの別の分子のＮ末端に融合されている）、または「頭部−尾部」の配向（例えば、治療用タンパク質Ｘの１つの分子のＣ末端が、治療用タンパク質Ｘの別の分子のＮ末端に融合されている）が挙げられるが、これらに限定されない、様々な配向性であってもよい。
【０３１９】
一実施形態において、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の立て連結に配向した治療用タンパク質Ｘポリペプチド（またはそのフラグメントもしくは変異体）は、本発明のアルブミン融合タンパク質のＮまたはＣ末端および／またはアルブミンまたはその変異体のＮおよび／またはＣ末端に融合される。
【０３２０】
本発明のアルブミン融合タンパク質はさらに、本発明のアルブミン融合タンパク質のＮまたはＣ末端および／またはアルブミンまたはその変異体のＮおよび／またはＣ末端に融合される所定の治療用タンパク質Ｘまたはその変異体の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の分子を含むタンパク質も包含し、ここで、分子はペプチドリンカーにより連結される。例えば、米国特許第５，０７３，６２７号（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されるペプチドリンカーを含む。ペプチドリンカーにより分離される複数の治療用タンパク質Ｘポリペプチドを含むアルブミン融合タンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技法を用いて産生することができる。小さなペプチドを大きなＨＳＡ分子へ融合する場合、リンカーは、特に重要である。ペプチドそれ自体が、ペプチドのタンデムコピーを融合させるリンカーであり得、または他の周知のリンカーが用いられ得る。リンカーを組み込む構築物は、表２に記載されているか、または配列番号Ｙを検討することにより明らかである。
【０３２１】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、分子内および／または分子間の多量体型を形成させるように、治療用タンパク質Ｘまたはその変異体をアルブミンまたはその変異体のＮ末端および／またはＣ末端に融合させることにより産生されてもよい。本発明の一実施形態において、アルブミン融合タンパク質は、単量体型または多量体型（すなわち、二量体、三量体、四量体、およびそれ以上の多量体）であってもよい。本発明のさらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、単量体型または多量体型（すなわち、二量体、三量体、四量体、およびそれ以上の多量体）であってもよい。特定の実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、多量体型（すなわち、二量体、三量体、四量体、およびそれ以上の多量体）であり、アルブミンタンパク質部分は、単量体型である。
【０３２２】
アルブミン部分が、治療用タンパク質部分のＮ末端および／またはＣ末端に融合されているアルブミン融合タンパク質に加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、関心対象となる治療用タンパク質またはペプチド（例えば、表１に開示されるような治療用タンパク質Ｘ、または治療用タンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントもしくは変異体）をＨＡの内部領域へ挿入することにより産生されてもよい。例えば、ＨＡ分子のタンパク質配列内には、多数のループまたはターンが、α−へリックスの終点と始点の間に存在し、それらはジスルフィド結合により安定化されている。ＨＡの結晶構造から決定されるようなループ（ＰＤＢ識別子１ＡＯ６、１ＢＪ５、１ＢＫＥ、１ＢＭ０、１Ｅ７Ｅ〜１Ｅ７Ｉおよび１ＵＯＲ）は、大部分が分子本体から離れて延びる。これらのループは、治療活性のあるペプチド、特に機能するために二次構造を必要とするものを挿入または内部融合して、特定の生物活性を有するアルブミン分子を本質的に生成するために有用である。
【０３２３】
ペプチドまたはポリペプチドが挿入されて、本発明のアルブミン融合タンパク質を生成し得るヒトアルブミン構造中のループは：Ｖａｌ５４〜Ａｓｎ６１、Ｔｈｒ７６〜Ａｓｐ８９、Ａ１ａ９２〜Ｇ１ｕｌ００、Ｇｌｎ１７０〜Ａｌａ１７６、Ｈｉｓ２４７〜Ｇｌｕ２５２、Ｇｌｕ２６６〜Ｇｌｕ２７７、Ｇｌｕ２８０〜Ｈｉｓ２８８、Ａｌａ３６２〜Ｇｌｕ３６８、Ｌｙｓ４３９〜Ｐｒｏ４４７、Ｖａｌ４６２〜Ｌｙｓ４７５、Ｔｈｒ４７８〜Ｐｒｏ４８６およびＬｙｓ５６０〜Ｔｈｒ５６６を含む。より好ましい実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、成熟ヒトアルブミン（配列番号１）のＶａｌ５４〜Ａｓｎ６ｌ、Ｇｌｎ１７０〜Ａｌａ１７６、および／またはＬｙｓ５６０〜Ｔｈｒ５６６ループへ挿入される。
【０３２４】
挿入しようとするペプチドは、特定の生物活性についてスクリーニングされたファージディスプレイまたは合成ペプチドのいずれか、あるいは所望の機能を有する分子の活性部分に由来され得る。さらに、特定のループ内で、またはランダム化したペプチドをＨＡ分子の特定のループ中へ挿入することにより、ランダムペプチドライブラリを生成してもよく、ここでは、アミノ酸のすべての可能な組み合わせが示される。
【０３２５】
かかるライブラリは、以下の方法の１つにより、ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメント上で生成することができる：ＨＡまたはＨＡドメインフラグメントの１つ以上のペプチドループ内でのアミノ酸のランダム突然変異。この方法により、１ループ内の１以上またはすべての残基を突然変異させることができる；
長さＸｎ（ここで、Ｘはアミノ酸であり、ｎは残基の数である）のランダム化ペプチドの、ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメント１つ以上のループの置換またはそのループへの挿入（すなわち、内部融合）；
（ａ）および／または（ｂ）に加えて、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端ペプチド／タンパク質融合。
【０３２６】
ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメントはまた、同じＨＡまたはＨＡのドメインフラグメントへの異なる標的に対する、異なるループの異なるスクリーニングに由来するペプチドを移植することにより、多官能性にされ得る。
【０３２７】
好ましい実施形態において、ヒト血清アルブミンのループ中へ挿入されたペプチドは、表１に開示される治療用タンパク質のペプチドフラグメントまたはペプチド変異体である。より具体的には、本発明は、ヒト血清アルブミンのループ中へ挿入された、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、または少なくとも４０個のアミノ酸長のペプチドフラグメントまたはペプチド変異体を含むアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明はまた、ヒト血清アルブミンのＮ末端に融合された、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、または少なくとも４０個のアミノ酸長のペプチドフラグメントまたはペプチド変異体を含むアルブミン融合タンパク質も包含する。本発明はまた、ヒト血清アルブミンのＣ末端に融合された、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、または少なくとも４０個のアミノ酸長のペプチドフラグメントまたはペプチド変異体を含むアルブミン融合タンパク質も包含する。例えば、表１および２（例えば、治療用Ｙ）に記載の短いペプチドをアルブミンループ中に挿入することができる。
【０３２８】
概して、本発明のアルブミン融合タンパク質は、１つのＨＡに由来する領域および１つの治療用タンパク質に由来する領域を有し得る。しかしながら、それぞれのタンパク質の複数の領域は、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために用いられてもよい。同様に、１個より多い治療用タンパク質を、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために用いてもよい。例えば、治療用タンパク質は、ＨＡのＮおよびＣ末端の両方に融合されてもよい。このような構成では、治療用タンパク質部分は、同じまたは異なる治療用タンパク質分子であってもよい。二官能性アルブミン融合タンパク質の構造は、Ｘ−ＨＡ−ＹまたはＹ−ＨＡ−Ｘとして表され得る。
【０３２９】
例えば、抗−ＢＬｙＳ（商標）ｓｃＦｖ−ＨＡ−ＩＦＮα−２ｂ融合物を調製し、抗−ＢＬｙＳ（商標）ｓｃＦｖによるＩＦＮα−２ｂに対する免疫応答を調節してもよい。代替法は、二（または多）官能性用量のＨＡ融合物、例えば、官能、半減期等に応じて様々な比で、ＨＡ−抗−ＢＬｙＳ（商標）ｓｃＦｖ融合物または他のＨＡ−融合物と混合されたＨＡ−ＩＦＮａα−２ｂ融合物を作製することである。
【０３３０】
また、二官能性または多官能性アルブミン融合タンパク質を作製して、ＨＡの反対側の末端にあるタンパク質またはペプチドを介して、標的の器官または細胞型に、融合物の治療用タンパク質部分を標的化させてもよい。
【０３３１】
周知の治療用分子の融合物の代替物として、ペプチドは、典型的に６、８、１２、２０、もしくは２５、またはＸｎ（ここで、Ｘはアミノ酸（ａａ）であり、ｎは残基の数である）のランダム化アミノ酸からなる、ＨＡのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端またはＨＡのドメインフラグメントとの融合物として構築されたライブラリをスクリーニングすることにより得ることができ、ここでは、アミノ酸のすべての可能な組み合わせが示される。このアプローチの特に有利な点は、ペプチドをＨＡ分子上で原位置で選択してもよいこと、したがって、そのペプチドの特性を、任意の他の方法により誘導し、次いで、ＨＡに付着させたペプチドの場合と同様に潜在的に変更することなく、選択できることである。
【０３３２】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、融合された部分の間にリンカーペプチドを含み得、部分間のより大きい物理的距離を提供し得、ひいては、例えば、その同族受容体に対する結合についての治療用タンパク質の部分の接近可能性を最大化することができる。このリンカーペプチドは、アミノ酸からなり得、その結果、これは、可撓性またはより剛性である。
【０３３３】
リンカー配列は、プロテアーゼにより、または化学的に開裂されて、成長ホルモン関連部分を産生してもよい。好ましくは、このプロテアーゼは、宿主により天然に産生されるプロテアーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロテアーゼｋｅｘ２または等価なプロテアーゼ）である。
【０３３４】
したがって、上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、以下の式、すなわちＲ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１；またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１を有し得、ここで、Ｒ１は、少なくとも１つの治療用タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド配列であり、必ずしも同じ治療用タンパク質である必要はなく、Ｌは、リンカーであり、Ｒ２は、血清アルブミン配列である。
【０３３５】
好ましい実施形態において、治療用タンパク質を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されていない同じ治療用タンパク質の血漿安定性と比較して、より高い血漿安定性を有する。典型的に、血漿安定性とは、治療用タンパク質が生体内投与され、血流中にもたらされてから、治療用タンパク質が分解され、血流から、腎臓または肝臓等の器官中へ排除される、つまり、最終的に治療用タンパク質を体内から排除するまでの時間を指す。血漿安定性は、血流中の治療用タンパク質の半減期に関して算出される。血流中の治療用タンパク質の半減期は、当該技術分野で周知の一般的なアッセイにより容易に決定され得る。
【０３３６】
好ましい実施形態において、治療用タンパク質を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されていない同じ治療用タンパク質の貯蔵寿命と比較して長期化した貯蔵寿命を有する。典型的に、貯蔵寿命とは、溶液中または一部の他の貯蔵用製剤中の治療用タンパク質の治療活性が、治療活性の過度の損失を伴うことなく安定である期間を指す。多くの治療用タンパク質は、非融合状態において非常に不安定である。以下に記載されるように、これらの治療用タンパク質の典型的な貯蔵寿命は、本発明のアルブミン融合タンパク質中に組み込まれると、著しく延長される。
【０３３７】
「延長された（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ）」または「長期化した（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）」貯蔵寿命を有する本発明のアルブミン融合タンパク質は、同じ貯蔵および取扱い条件に供された標準型と比較して、より高い治療活性を示す。この標準型は、非融合の全長治療用タンパク質であってもよい。アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分がアナログ、変異体であるか、またはそうでなければ改変されているか、またはそのタンパク質についての完全な配列を含んでいない場合、代替として、治療活性の延長は、アナログ、変異体、改変されたペプチド、または不完全な配列の非融合等価物と比較されてもよい。一例として、本発明のアルブミン融合タンパク質は、所定の時点で比較した場合、標準と同じ貯蔵および取扱い条件に供された標準の治療活性の約１００％よりも高い治療活性、または約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％、もしくは２００％よりも高い治療活性を保持し得る。
【０３３８】
また、貯蔵寿命を、貯蔵後に残存する治療活性に関して評価し、貯蔵開始時の治療活性に対して正規化してもよい。延長された、または長期化した貯蔵寿命を有する本発明のアルブミン融合タンパク質は、同じ条件に供される融合されていない対応する治療用タンパク質の治療活性の約５０％よりも高い治療活性、約６０％、７０％、８０％もしくは９０％、またはそれ以上よりも高い治療活性を保持し得る。
【０３３９】
融合タンパク質の発現
本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母、細菌等の微生物、またはヒトもしくは動物細胞株からの分泌により、組換え分子として産生されてもよい。好ましくは、ポリペプチドは、宿主細胞から分泌される。
【０３４０】
本発明の特定の実施形態は、酵母における分泌を導くために有効なシグナル配列、特に、酵母に由来するシグナル配列（特に、酵母宿主に相同なもの）をコードするＤＮＡ構築物と、本発明の第１の態様の融合された分子を含み、シグナルおよび成熟ポリペプチドの間には酵母由来のプロ配列は存在しない。
【０３４１】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼシグナルは、酵母由来のシグナル配列の好ましい例である。
【０３４２】
別々に調製されたポリペプチドが、化学的架橋結合により連結されている、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３９：１８（１９８８））により調製される類の結合体は、企図されない。
【０３４３】
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するように形質転換させた細胞、好ましくは酵母細胞も含む。形質転換させた宿主細胞それ自体に加えて、本発明はまた、栄養培地中のそれらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に同種）培養物、またはモノクローナル培養物に由来する培養物も企図する。ポリペプチドが分泌される場合、該培地は、細胞を伴って、またはそれらが濾過または遠心分離により除去される場合には、細胞を伴わずに、ポリペプチドを含み得る。細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、糸状菌（例えば、アスペルギルス属）、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞を含む多くの発現系が知られており、使用され得る。
【０３４４】
アルブミン融合タンパク質の産生において用いられるべき好ましい酵母株は、Ｄ８８、ＤＸＹ１、およびＢＸＰ１０である。Ｄ８８［ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎｌ、ｐｒａｌ、ｕｂｃ４］は、親株ＡＨ２２ｈｉｓ＋（ＤＢ１とも称される；例えば、Ｓｌｅｅｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２−４６（１９９０）を参照のこと）の誘導体である。該株は、ｌｅｕ２変異を含み、これにより、ＬＥＵ２遺伝子を含む２ミクロン単位のプラスミドの栄養要求性選択が可能となる。Ｄ８８は、グルコース過剰において、ＰＲＢ１の抑制も示す。通常、ＰＲＢ１プロモーターは、グルコースレベルおよび成長段階を監視する２つのチェックポイントにより制御される。該プロモーターは、グルコースが枯渇し、定常期に入ると、野生型酵母において活性化される。株Ｄ８８は、グルコースによる抑制を示すが、定常期へ入ると、誘導を維持する。ＰＲＡ１遺伝子は、ＥＲに位置する酵母液胞プロテアーゼであるＹｓｃＡエンドプロテアーゼＡをコードする。ＵＢＣ４遺伝子は、ユビキチン化経路に存在し、ユビキチン依存性分解のために、短命および異常なタンパク質の標的化に関与する。このｕｂｃ４突然変異の単離は、細胞中の発現プラスミドのコピー数を増大させ、該プラスミドから発現される所望のタンパク質の発現レベルの増大を惹起することが見出されている（例えば、国際公開第Ｗ０９９／００５０４号を参照のこと。参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３４５】
Ｄ８８の誘導体であるＤＸＹ１は、以下の遺伝子型：［ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎｌ、ｐｒａｌ、ｕｂｃ４、ｕｒａ３：：ｙａｐ３］を有する。Ｄ８８において単離した突然変異に加えて、この株はまた、ＹＡＰ３プロテアーゼのノックアウトも有する。このプロテアーゼは、主に二塩基性の残基（ＲＲ、ＲＫ、ＫＲ、ＫＫ）の開裂を惹起するが、タンパク質中の一塩基性の残基における開裂も促進し得る。このｙａｐ３突然変異の単離は、全長ＨＳＡの生産レベルをもたらした（例えば、米国特許第５，９６５，３８６号およびＫｅｒｒｙ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  １４：１６１−１６９（１９９８）を参照のこと。参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３４６】
ＢＸＰ１０は、以下の遺伝子型：ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎｌ、ｐｒａｌ、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐｌ５０：：ＬＹＳ２、ｐｍｔｌ：：ＵＲＡ３を有する。ＤＸＹ１において単離された突然変異に加えて、この株は、ＰＭＴ１遺伝子およびＨＳＰ１５０遺伝子のノックアウトも有する。ＰＭＴ１遺伝子は、ドリキル−ホスフェート−Ｄ−マンノースタンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｐｍｔ）の進化的に保存されたファミリーのメンバーである。Ｐｍｔ１ｐの膜貫通トポロジーは、Ｏ結合グリコシル化における役割を有する小胞体の内在性膜タンパク質であることを示唆する。この変異は、ＨＳＡ融合物のＯ結合グリコシル化を、低減／排除するために役立つ（例えば、国際公開第ＷＯ００／４４７７２号を参照のこと。参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。研究は、Ｈｓｐ１５０タンパク質が、イオン交換クロマトグラフィーにより、ｒＨＡから非効率的に分離されることを明らかとなった。ＨＳＰ１５０遺伝子における変異は、標準的な精製技法では除去が困難であることが証明されている潜在的な汚染を除去する。例えば、米国特許第５，７８３，４２３号を参照のこと、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３４７】
所望のタンパク質は、例えば、宿主染色体に挿入されたコード配列または遊離プラスミド上のコード配列から従来の方法で産生される。酵母は、通常の任意の方法、例えば、エレクトロポレーションにより、所望のタンパク質についてのコード配列を用いて形質転換される。エレクトロポレーションによる酵母の形質転換方法は、Ｂｅｃｋｅｒ  ＆  Ｇｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，１８２に開示される。
【０３４８】
首尾よく形質転換した細胞、すなわち、本発明のＤＮＡ構築物を含む細胞は、公知の技法により特定することができる。例えば、発現構築物の導入から得られる細胞を成長させて、所望のポリペプチドを産生することができる。細胞を回収し、次いで、溶解し、次いで、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３またはＢｅｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，２０８により記載のような方法を用いて、そのＤＮＡ内容物をＤＮＡの存在について調べることができる。代替として、抗体を用いて、上清中のタンパク質の存在を検出することができる。
【０３４９】
有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６を含み、概して、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７，ＵＳＡから入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組込みプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択可能なマーカーのＨＩＳ３、７ＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３を組み込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母動原体プラスミド（Ｙｃｐ）である。
【０３５０】
酵母における発現のためのアルブミン融合タンパク質を作製するために好適なベクターは、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、およびｐＣ４：ＨＳＡを含み、これらは実施例１に詳細に記載される。図２は、基本ベクターとして用いることができるｐＰＰＣ０００５プラスミドのマップを示し、ここに、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングして、ＨＡ融合物を形成し得る。それは、ＰＲＢ１  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロモーター（ＰＲＢｌｐ）、融合リーダー配列（ＦＬ）、ＨＡ（ｒＨＡ）をコードするＤＮＡ、およびＡＤＨ１  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅターミネーター配列を含む。融合リーダー配列の配列は、ヒト血清アルブミン（配列番号３）のシグナルペプチドの最初の１９個のアミノ酸、および接合因子アルファ１プロモーターの最後の５個のアミノ酸からなる（ＳＬＤＫＲ、欧州特許出願第Ａ−３８７  ３１９号を参照のこと、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３５１】
ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、およびｐＣ４：ＨＳＡのプラスミド、は、２００１年４月１１日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９に寄託され、それぞれ受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３２７８、ＰＴＡ−３２７６、ＰＴＡ−３２７９、およびＰＴＡ−３２７７を付与された。酵母においてアルブミン融合タンパク質を発現するために有用な別のベクターは、Ｓｌｅｅｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２（１９９０）に記載されるｐＳＡＣ３５ベクターであり、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３５２】
アルブミン融合タンパク質を発現させるために用いることができる酵母プロモーターは、ＭＥＴ２５プロモーターである。例えば、Ｄｏｍｉｎｉｋ  Ｍｕｍｂｕｒｇ，Ｒｏｌｆ  Ｍｕｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ  Ｆｕｎｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２５，ｐｐ．５７６７−５７６８を参照のこと。Ｍｅｔ２５プロモーターは、３８３塩基長（塩基−３８２〜−１）であり、このプロモーターにより発現される遺伝子はまた、Ｍｅｔ１５、Ｍｅｔ１７、およびＹＬＲ３０３Ｗとしても知られている。好ましい実施形態は、以下の配列を使用し、ここで、以下の配列の５’末端において、クローニングに使用されるＮｏｔ１部位に下線を付し、そして３’末端において、ＡＴＧ開始コドンに下線を付している：
ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＡＴＧＣＡＡＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＴＴＡＧＣＴＣＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＡＴＣＧＣＡＡＡＡＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＧＡＴＡＴＴＧＧＧＧＡＡＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＡＣＴＡＡＴＴＡＡＧＴＴＡＧＴＣＡＡＧＧＣＧＣＣＡＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡＡＡＣＴＧＴＧＴＡＡＣＡＴＡＡＴＡＡＣＣＧＡＡＧＴＧＴＣＧＡＡＡＡＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＴＣＣＡＡＴＴＧＡＡＣＡＣＧＣＴＣＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＧＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＧＧＴＴＡＡＧＴＡＡＡＧＣＧＴＣＴＧＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＴＧＣＴＣＴＣＴＴＧＴＣＴＴＴＴＣＡＴＣＴＡＣＴＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＴＧＴＡＡＴＡＣＡＧＧＧＴＣＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＴＡＧＡＴＡＣＡＡＴＴＣＴＡＴＴＡＣＣＣＣＣＡＴＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧ（配列番号５）
【０３５３】
酵母においてアルブミン融合タンパク質を発現させるために用いることができるさらなるプロモーターは、以下を含む。
ａ）ｃｂｈ１プロモーター：
ＴＣＴＡＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＴＧＴＡＴＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＧＴＣＧＣＡＴＣＴＡＡＡＴＡＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＣＣＣＧＧＡＧＡＡＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＡＡＴＴＡＧＣＡＴＧＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＡＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＣＴＴＧＴＴＧＡＡＴＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＣＡＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣＧＴＴＣＣＧＴＣＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＧＡＧＡＴＴＣＣＴＡＡＧＴＡＧＣＧＡＴＧＧＡＡＣＣＧＧＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＴＡＧＧＣＡＡＴＡＣＡＴＴＧＡＧＴＴＧＣＣＴＣＧＡＣＧＧＴＴＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＧＧＴＡＣＴＧＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＴＡＡＣＴＧＴＴＣＣＧＴＡＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＴＧＡＴＴＣＡＧＣＧＴＡＣＣＣＧＴＡＣＡＡＧＴＣＧＴＡＡＴＣＡＣＴＡＴＴＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＧＡＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＣＣＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＧＴＣＡＴＴＧＣＧＡＴＧＴＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧＡＣＣＧＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＡＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＣＧＣＣＴＣＧＡＡＧＧＴＴＣＡＣＧＧＣＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＧＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＧＣＡＡＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＣＣＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＧＴＡＣＡＴＡＡＧＴＴＡＡＴＧＣＣＴＡＡＡＧＡＡＧＴＣＡＴＡＴＡＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＣＡＡＴＣＡＡＧＴＧＧＣＴＡＡＡＣＧＴＡＣＣＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＴＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣＣＡＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣＴＴＧＴＴＴＧＴＴＣＣＧＧＴＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＣＴＧＡＣＴＣＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＡＴＡＣＡＡＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＧＣＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＧＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＴＡＣＧＡＣＧＡＡＴＡＣＴＧＴＡＴＡＧＴＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴＧＴＡＡＧＴＣＧＧＣＡＣＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＡＴＴＧＡＧＴＴＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＡＡＧＡＴＣＴＣＧＧＧＣＣＣＴＣＧＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣＣＴＴＴＧＧＧＴＧＴＡＣＡＴＧＴＴＴＧＴＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＧＴＧＴＧＧＴＡＧＧＡＴＣＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＧＧＧＴＡＴＧＴＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＴＧＴＴＣＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＡＧＣＣＧＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＣＣＴＣＡＴＴＡＡＡＣＧＧＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣＧＡＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＧＧＴＴＣＧＡＧＧＴＣＣＧＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＴＧＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴＣＡＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＧＴＣＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＴＧＧＣＡＴＣ（配列番号１１３）
ｂ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓに由来するｃｙｓＤプロモーター：
ＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＣＧＡＴＧＣＧＣＣＴＣＧＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＡＧＡＴＴＣＣＴＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣＴＡＴＣＧＴＴＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＴＴＧＧＡＣＣＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＴＴＡＴＴＣＡＣＧＣＡＡＴＴＡＣＧＡＴＡＧＴＡＴＴＴＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＧＴＴＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＴＣＧＧＧＴＡＡＧＡＣＧＣＧＡＴＣＡＣＧＣＣＡＴＴＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＴＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＣＣＣＣＧＣＡＴＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＧＧＣＴＴＴＧＣＧＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＴＣＴＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＴＣＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＡＣＣＣＣＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣ（配列番号１１４）
ｃ）以下の配列を有する修飾ｃｂｈ１プロモーター： 
ＴＣＴＡＧＡＧＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＡＡＴＣＣＣＧＣＴＧＴＡＴＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＧＴＣＧＣＡＴＣＴＡＡＡＴＡＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＣＣＣＧＧＡＧＡＡＴＣＧＡＧＡＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＴＡＡＡＴＴＡＧＣＡＴＧＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＡＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＣＴＴＧＴＴＧＡＡＴＣＡＴＧＧＣＧＴＴＣＣＡＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＡＡＡＧＣＧＴＴＣＣＧＴＣＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＧＡＧＡＴＴＣＣＴＡＡＧＴＡＧＣＧＡＴＧＧＡＡＣＣＧＧＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＴＡＧＧＣＡＡＴＡＣＡＴＴＧＡＧＴＴＧＣＣＴＣＧＡＣＧＧＴＴＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＧＧＴＡＣＴＧＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＴＡＡＣＴＧＴＴＣＣＧＴＡＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＴＧＡＴＴＣＡＧＣＧＴＡＣＣＣＧＴＡＣＡＡＧＴＣＧＴＡＡＴＣＡＣＴＡＴＴＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣＣＧＧＡＣＧＴＧＴＴＴＴＧＣＣＣＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＧＴＣＡＴＴＧＣＧＡＴＧＴＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧＡＣＣＧＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＡＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＧＴＡＧＡＧＧＣＡＴＧＴＴＧＴＧＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＣＧＣＣＴＣＧＡＡＧＧＴＴＣＡＣＧＧＣＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＧＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＣＴＧＴＡＡＡＧＣＣＧＣＡＡＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＣＣＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＧＴＡＣＡＴＡＡＧＴＴＡＡＴＧＣＣＴＡＡＡＧＡＡＧＴＣＡＴＡＴＡＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＣＡＡＴＣＡＡＧＴＧＧＣＴＡＡＡＣＧＴＡＣＣＧＴＡＡＴＴＴＧＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＴＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣＣＡＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣＴＴＧＴＴＴＧＴＴＣＣＧＧＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＣＴＧＡＣＴＣＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＧＣＡＴＡＣＡＡＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＧＣＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＧＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＴＡＣＧＡＣＧＡＡＴＡＣＴＧＴＡＴＡＧＴＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＡＴＡＴＴＧＡＡＡＴＧＴＡＡＧＴＣＧＧＣＡＣＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＡＴＴＧＡＧＴＴＧＡＡＡＣＴＧＣＣＴＡＡＧＡＴＣＴＣＧＧＧＣＣＣＴＣＧＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣＣＴＴＴＧＧＧＴＧＴＡＣＡＴＧＴＴＴＧＴＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＧＴＧＴＧＧＴＡＧＧＡＴＣＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＧＧＧＴＡＴＧＴＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＴＧＴＴＣＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣＡＴＧＧＴＴＴＣＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＴＡＴＣＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＣＣＧＴＣＧＣＴＣＧＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧＣＴＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＣＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＧＧＴＣＣＴＡＧＣＴＴＡＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＡＧＣＣＧＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＣＣＴＣＡＴＴＡＡＡＣＧＧＡＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣＧＡＡＴＧＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＧＧＴＴＣＧＡＧＧＴＣＣＧＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＴＧＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴＣＡＡＣＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＡＴＡＧＴＣＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＴＧＧＣＡＴＣ（配列番号１１５）
ｄ）以下の配列を有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓに由来するｃｙｓＤプロモーター：
ＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＣＴＧＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＣＧＡＴＧＣＧＣＣＴＣＧＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＴＡＧＣＣＧＣＡＴＧＡＧＡＴＴＣＣＴＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＴＣＣＴＡＴＣＧＴＴＣＡＧＧＧＴＣＣＴＡＴＴＴＧＧＡＣＣＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＴＴＡＴＴＣＡＣＧＣＡＡＴＴＡＣＧＡＴＡＧＴＡＴＴＴＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＧＴＴＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＴＣＧＧＧＴＡＡＧＡＣＧＣＧＡＴＣＡＣＧＣＣＡＴＴＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＴＡＴＣＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＣＣＧＴＣＧＣＴＣＧＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＧＣＴＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴＧＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＣＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＧＧＴＣＣＴＡＣＧＣＣＧＧＣＧＴＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＣＣＣＣＧＣＡＴＡＴＡＡＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＧＧＣＴＴＴＧＣＧＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＴＣＴＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＴＣＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＡＣＣＣＣＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣ（配列番号１１６）
【０３５４】
相補的付着末端を介してＤＮＡをベクターに作動可能に連結させるための様々な方法が開発されている。例えば、相補的なホモポリマー区域を、ベクターＤＮＡに挿入されるべきＤＮＡセグメントに付加することができる。次いで、ベクターおよびＤＮＡセグメントは、相補的なホモポリマーテイル間での水素結合により連結され、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【０３５５】
１つ以上の制限部位を含む合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに連結するための代替法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化により生成されるＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて処理し、これらの酵素が、３’５’−エキソヌクレアーゼ活性をもつ、突出したガンマ一本鎖末端を除去し、その重合活性により、くぼんだ３’末端を充填する。
【０３５６】
したがって、これらの活性の組み合わせは、平滑末端のＤＮＡセグメントを生成する。次いで、平滑末端セグメントを、平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒することのできる酵素（例えば、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ）の存在下、多大なモル過剰のリンカー分子と共にインキュベートする。したがって、その反応産物は、その末端にポリマーリンカー配列を有するＤＮＡセグメントである。次いで、これらのＤＮＡセグメントは、適切な制限酵素を用いて開裂され、ＤＮＡセグメントのものに適合する末端を生じる酵素を用いて分解された発現ベクターに連結される。
【０３５７】
様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡを含む多数の製造業者から市販されている。
【０３５８】
例えば、ＨＡ変異体を調製する必要がある場合、本発明に従ってＤＮＡを修飾するために望ましい方法は、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９、４８７−４９１により開示されているように、ポリメラーゼ連鎖反応を用いることである。この方法では、酵素的に増幅されるべきＤＮＡは、それ自体増幅されたＤＮＡに組み込まれる２つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーによって隣接されるこの特定のプライマーは、当該技術分野で周知の方法を用いて、発現ベクター中にクローニングするために使用することができる制限エンドヌクレアーゼ認識部位に含み得る。
【０３５９】
アルブミン融合タンパク質を発現するための宿主として本発明の実施において有用であることが企図される酵母の例示的な属は、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）（ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ））、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ）、サイテロミセス属（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パキソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、デバロミセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、ミチニコウィア属（Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ）、ロドスポリウジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロイコスポリジウム属（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ボトリオアスクス属（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ）、スポリディオボルス属（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、エンドミコプシス属（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）等である。好ましい属は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、およびトルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）からなる群より選択されるものである。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）の例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓ、およびＳ．ｒｏｕｘｉｉである。
【０３６０】
クルイベロミセス属の例は、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓである。好適なトルラスポラの属種は、Ｔ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである。ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）ｓｐｐ．）の例は、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（以前はＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ（以前はＨ．ａｎｏｍａｌａ）、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換方法は、概して、欧州特許出願第２５１  ７４４号、欧州特許出願第２５８  ０６７号、および国際公開第ＷＯ９０／０１０６３号にて教示されており、これらのすべては参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０３６１】
サッカロミセス属の好ましい例示的な種は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、およびＺｙｇｏ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉを含む。クルイベロミセス属の好ましい例示的な種は、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓを含む。ハンセヌラ属の好ましい例示的な種は、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在はＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、Ｈ．ａｎｏｍａｌａ（現在はＰｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）、およびＰｉｃｈｉａ  ｃａｐｓｕｌａｔａを含む。ピキア属のさらに好ましい例示的な種は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを含む。アスペルギルス属の好ましい例示的な種は、Ａ．ｎｉｇｅｒおよびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓを含む。ヤロウィア属の好ましい例示的な種は、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む。多くの好ましい酵母種は、ＡＴＣＣから入手可能である。例えば、以下の好ましい酵母種は、ＡＴＣＣから入手可能であり、アルブミン融合タンパク質の発現において有用である：  サッカロミセスセレビシエハンセン（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｈａｎｓｅｎ）、テレオモルフ（ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈ）株ＢＹ４７４３  ｙａｐ３突然変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２２７３１）；サッカロミセスセレビシエハンセン、テレオモルフ株ＢＹ４７４３  ｈｓｐ１５０突然変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２１２６６）；サッカロミセスセレビシエハンセン、テレオモルフ株ＢＹ４７４３  ｐｍｔ１突然変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２３７９２）；サッカロミセスセレビシエハンセン、テレオモルフ（ＡＴＣＣ受託番号２０６２６；４４７７３；４４７７４；および６２９９５）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ  Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  ｅｘ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ、テレオモルフ（ＡＴＣＣ受託番号６２９８７）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ）ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ、テレオモルフ（ＡＴＣＣ受託番号７６４９２）；Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ（Ｔｅｕｎｉｓｓｏｎら）Ｋｕｒｔｚｍａｎ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ｄｅ  Ｍｏｒａｉｓ  ｅｔ  Ｍａｉａとして寄託されたテレオモルフ、テレオモルフ（ＡＴＣＣ受託番号２６０１２）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｎ  Ｔｉｅｇｈｅｍ、アナモルフ（ＡＴＣＣ受託番号９０２９）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｎ  Ｔｉｅｇｈｅｍ，アナモルフ（ＡＴＣＣ受託番号１６４０４）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｅｉｄａｍ）Ｗｉｎｔｅｒ、アナモルフ（ＡＴＣＣ受託番号４８７５６）；およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍら．）ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｉｔ  ｅｔ  ｖｏｎ  Ａｒｘ、テレオモルフ（ＡＴＣＣ受託番号２０１８４７）。
【０３６２】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのための好適なプロモーターは、ＰＧＫＩ遺伝子、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣＩ、ＰＨＯ５、ＴＲＰＩ、ＡＤＨＩ、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素についての遺伝子、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、アルファ−接合因子フェロモン、［接合因子フェロモン］、ＰＲＢＩプロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤＩプロモーター、および他のプロモーターの５’調節領域の部分または上流活性部位を有する５’調節領域の部分のハイブリッドを含むハイブリッドプロモーター（例えば、欧州特許出願第Ａ−２５８０６７号のプロモーター）に関連するものが挙げられる。
【０３６３】
シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）で用いる簡便な制御プロモーターは、Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、１０８５７−１０８６４により記載のようなｎｍｔ遺伝子に由来するチアミン抑制プロモーターおよびＨｏｆｆｍａｎ  ＆  Ｗｉｎｓｔｏｎ（１９９０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２４、８０７−８１６に記載のようなグルコース抑制ｊｂｐｌ遺伝子プロモーターである。
【０３６４】
異種遺伝子の発現のためにＰｉｃｈｉａを形質転換する方法は、例えば、Ｃｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、および様々なＰｈｉｌｌｉｐ特許（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８５７，４６７号）等において教示され、Ｐｉｃｈｉａ発現キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ，Ｌｅｅｋ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている。好適なプロモーターは、ＡＯＸＩおよびＡＯＸ２を含む。Ｇｌｅｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２，３４５９−３４６５は、ハンセヌラ属ベクターおよび形質転換についての情報を含み、好適なプロモーターは、ＭＯＸ１およびＦＭＤ１であり；一方で、欧州特許出願第３６１  ９９１号、Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）およびＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒからの他の刊行物では、クルイベロミセス属における外来タンパク質を発現させるための方法、適当なプロモーターがＰＧＫＩであることが教示されている。
【０３６５】
好ましくは、転写終結シグナルは、転写終結およびポリアデニル化のための適切なシグナルを含む真核遺伝子の３’フランキング配列である。好適な３’フランキング配列は、例えば、用いる発現制御配列に自然に連結されたものであり得、すなわち、プロモーターに相当し得る。代替として、それらは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＤＨＩ遺伝子の終結シグナルが好ましい場合に異なり得る。
【０３６６】
所望のアルブミン融合タンパク質は、初めに、分泌リーダー配列で発現され得、該配列は、選択された酵母において有用な任意のリーダーであり得る。酵母において有用なリーダーは、以下のいずれかを含む：
ａ）    ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１〜２１）ＭＫＶＳＶＡＡＬＳＣＬＭＬＶＴＡＬＧＳＱＡ（配列番号６）
ｂ）    スタニオカルシンシグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ、配列番号７）
ｃ）    ＨＳＡシグナル配列のプレプロ領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ、配列番号８）
ｄ）    ＨＳＡシグナル配列のプレプロ領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ、配列番号９）または例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ、（配列番号１０）等のその変異体
ｅ）    インベルターゼシグナル配列（例えば、ＭＬＬＱＡＦＬＦＬＬＡＧＦＡＡＫＩＳＡ、配列番号１１）
ｆ）    酵母接合因子アルファシグナル配列（例えば、ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲ、配列番号１２またはＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＤＫＲ、配列番号１２）
ｇ）    Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素リーダー配列
ｈ）    ハイブリッドシグナル配列（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＥＫＲ、配列番号１３）
ｉ）    ＨＳＡ／ＭＦα−１ハイブリッドシグナル配列（ＨＳＡ／ｋｅｘ２としても知られている）（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＤＫＲ、配列番号１４）
ｊ）    Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー／ＭＦα−１融合リーダー配列（例えば、ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＳＬＤＫＲ、配列番号１５）
ｋ）    免疫グロブリンＩｇシグナル配列（例えば、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ、配列番号１６）
ｌ）    フィブリンＢ前駆体シグナル配列（例えば、ＭＥＲＡＡＰＳＲＲＶＰＬＰＬＬＬＬＧＧＬＡＬＬＡＡＧＶＤＡ、配列番号１７）
ｍ）    クラスター前駆体シグナル配列（例えば、ＭＭＫＴＬＬＬＦＶＧＬＬＬＴＷＥＳＧＱＶＬＧ、配列番号１８）
ｎ）    インスリン様成長因子−結合タンパク質４シグナル配列（例えば、ＭＬＰＬＣＬＶＡＡＬＬＬＡＡＧＰＧＰＳＬＧ、配列番号１９）
ｏ）    ＨＳＡシグナル配列のプレプロ領域の変異体、例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ（配列番号２０）、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＬＧ（配列番号２１）、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＬＧ（配列番号２２）、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧ（配列番号２３）、修飾されたＨＳＡリーダーＨＳＡ＃６４−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号２４）；修飾されたＨＳＡリーダーＨＳＡ＃６６−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号２５）；修飾されたＨＳＡ（Ａ１４）リーダー−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号２６）；修飾されたＨＳＡ（Ｓ１４）リーダー（修飾されたＨＳＡ＃６５としても知られている）−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＳＧ（配列番号２７）、修飾されたＨＳＡ（Ｇ１４）リーダー−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号２８）、またはＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧＤＬＨＫＳ（配列番号２９）
ｐ）    コンセンサスシグナル配列（例えば、ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ、配列番号３０）
ｑ）    酸ホスファターゼ（ＰＨ０５）リーダー（例えば、ＭＦＫＳＶＶＹＳＩＬＡＡＳＬＡＮＡ  配列番号３１）
ｒ）    ＭＦｏｚ−１のプレ配列
ｓ）    ０グルカナーゼ（ＢＧＬ２）のプレ配列
ｔ）    キラー毒素リーダー
ｕ）    キラー毒素のプレ配列
ｖ）    ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素プレプロ（２９個のアミノ酸；プレの１６個のアミノ酸およびプロの１３個のアミノ酸）ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＬＥＨＴＨＲＲＧＳＬＤＫＲ（配列番号３２）
ｗ）    Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓグルコアミラーゼＩＩ分泌リーダー配列
ｘ）    Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓβ−ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）分泌リーダー配列
ｙ）    カンジダグルコアルニラーゼリーダー配列
ｚ）    欧州特許出願第Ａ−３８７  ３１９号（参照することにより本明細書に組み込まれる）において開示されるイブリッドリーダー
ａａ）  （バキュロウイルス発現系と併せた）ｇｐ６７シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１〜１９）または
ｂｂ）  治療用タンパク質Ｘの天然リーダー；
ｃｃ）  ＪＰ６２−０９６０８６（９１１０３６５１６として特許されている、参照することにより本明細書に組み込まれる）において開示されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ（ＳＵＣ２）リーダー；または
ｄｄ）  イヌリナーゼ−ＭＫＬＡＹＳＬＬＬＰＬＡＧＶＳＡＳＶＩＮＹＫＲ（配列番号３３）
ｅｅ）  修飾されたＴＡ５７プロペプチドリーダー変異体＃１−ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＫＲ（配列番号３４）
ｆｆ）  修飾されたＴＡ５７プロペプチドリーダー変異体＃２−ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＥＥＧＥＰＫＲ（配列番号３５）
ｇｇ）  コンセンサスシグナル配列−ＭＷＷＲＬＷＷＬＬＬＬＬＬＬＬＷＰＭＶＷＡ（配列番号１１１）
ｈｈ）  修飾されたＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列−ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＧＳＬＤＫＲ（配列番号１１２）
ｉｉ）  コンセンサスシグナルペプチド＃２−ＭＲＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ（配列番号１０５）
【０３６７】
アルブミン融合タンパク質の組換えおよび合成による産生のさらなる方法
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、ならびに合成および組換え技法によるアルブミン融合タンパク質の産生にも関連する。例えば、ベクターは、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製可能、または複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、概して、宿主細胞を補完する場合にのみ生じる。
【０３６８】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択可能なマーカーを含むベクターに連結され得る。概して、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物等の沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベクターがウイルスである場合、このベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いて体外でパッケージングされ、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【０３６９】
ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター（いくつか挙げれば、例えば、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の好適なプロモーターは、当業者に周知である。発現構築物はさらに、転写開始、転写終結のための部位、および転写領域には、翻訳のためのリボソーム結合部位を含み得る。この構築物により発現される転写物のコード部分は、好ましくは、初めに翻訳開始コドン、および翻訳されるべきポリペプチドの末端に適切に位置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含み得る。
【０３７０】
記載したように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含み得る。かかるマーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、グルタミンシンターゼ、または真核細胞培養についてのネオマイシン耐性、および大腸菌および他の細菌の培養についてのテトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞、例えば、大腸菌、ストレプトミセスおよびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞；および植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記した宿主細胞についての適切な培養培地および条件は、当該技術分野で周知である。
【０３７１】
細菌で用いる好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）が挙げられる。好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。酵母系で用いる好ましい発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（すべてが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０３７２】
一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質の局在化を原核生物細胞または真核生物細胞の特定の画分を導く、および／または原核生物細胞または真核生物細胞由来の本発明のタンパク質の分泌を導くシグナル配列に融合され得る。例えば、大腸菌において、周辺質空間にタンパク質の発現を導くことが望まれ得る。本発明のアルブミン融合タンパク質が、ポリペプチドの発現を細菌の周辺質空間に導くために融合され得るシグナル配列またはタンパク質（またはそのフラグメント）の例としては、ｐｅｌＢシグナル配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）シグナル配列、ＭＢＰ、ｏｍｐＡシグナル配列、ペリプラズム大腸菌非耐熱性エンテロトキシンＢサブユニットのシグナル配列、およびアルカリンホスファターゼのシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのベクターは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能なｐＭＡＬシリーズ（特にｐＭＡＬ−ｐシリ−ズ）のベクター等のタンパク質の局在化を導く融合タンパク質の構築のために市販されている。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドアルブミン融合タンパク質は、ｐｅｌＢペクチン酸リアーゼシグナル配列に融合されて、グラム陰性細菌におけるこのようなポリペプチドの発現および精製効率を増大してもよい。米国特許第５，５７６，１９５号および同第５，８４６，８１８号（これらの内容は、参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０３７３】
哺乳類細胞におけるその分泌を導くために本発明のアルブミン融合タンパク質に融合され得るシグナルペプチドの例は：
ａ）    ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１−２１）ＭＫＶＳＶＡＡＬＳＣＬＭＬＶＴＡＬＧＳＱＡ（配列番号６）
ｂ）    スタニオカルシンシグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ、配列番号７）
ｃ）    ＨＳＡシグナル配列のプレプロ領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ、配列番号８）
ｄ）    ＨＳＡシグナル配列のプレプロ領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ、配列番号９）または例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ、（配列番号１０）等のその変異体
ｅ）    インベルターゼシグナル配列（例えば、ＭＬＬＱＡＦＬＦＬＬＡＧＦＡＡＫＩＳＡ、配列番号１１）
ｆ）    酵母接合因子アルファシグナル配列（例えば、ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲ、配列番号１２またはＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＤＫＲ、配列番号１２）
ｇ）    Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素リーダー配列
ｈ）    ハイブリッドシグナル配列（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＥＫＲ、配列番号１３）
ｉ）    ＨＳＡ／ＭＦα−１ハイブリッドシグナル配列（ＨＳＡ／ｋｅｘ２としても知られている）（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＤＫＲ、配列番号１４）
ｊ）    Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー／ＭＦα−１融合リーダー配列（例えば、ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＳＬＤＫＲ、配列番号１５）
ｋ）    免疫グロブリンＩｇシグナル配列（例えば、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ、配列番号１６）
ｌ）    フィブリンＢ前駆体シグナル配列（例えば、ＭＥＲＡＡＰＳＲＲＶＰＬＰＬＬＬＬＧＧＬＡＬＬＡＡＧＶＤＡ、配列番号１７）
ｍ）    クラスター前駆体シグナル配列（例えば、ＭＭＫＴＬＬＬＦＶＧＬＬＬＴＷＥＳＧＱＶＬＧ、配列番号１８）
ｎ）    インスリン様成長因子−結合タンパク質４シグナル配列（例えば、ＭＬＰＬＣＬＶＡＡＬＬＬＡＡＧＰＧＰＳＬＧ、配列番号１９）
ｏ）    ＨＳＡシグナル配列のプレプロ領域の変異体、例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ（配列番号２０）、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＬＧ（配列番号２１）、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＬＧ（配列番号２２）、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧ（配列番号２３）、修飾されたＨＳＡリーダーＨＳＡ＃６４−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号２４）；修飾されたＨＳＡリーダーＨＳＡ＃６６−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号２５）；修飾されたＨＳＡ（Ａ１４）リーダー−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号２６）；修飾されたＨＳＡ（Ｓ１４）リーダー（修飾されたＨＳＡ＃６５としても知られている）−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＳＧ（配列番号２７）、修飾されたＨＳＡ（Ｇ１４）リーダー−ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号２８）、またはＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧＤＬＨＫＳ（配列番号２９）
ｐ）    コンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ、配列番号３０）
ｑ）    酸ホスファターゼ（ＰＨ０５）リーダー（例えば、ＭＦＫＳＶＶＹＳＩＬＡＡＳＬＡＮＡ  配列番号３１）
ｒ）    ＭＦｏｚ−１のプレ配列
ｓ）    Ｏグルカナーゼ（ＢＧＬ２）のプレ配列
ｔ）    キラー毒素リーダー
ｕ）    キラー毒素のプレ配列
ｖ）    ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素プレプロ（２９個のアミノ酸；プレの１６個のアミノ酸およびプロの１３個のアミノ酸）ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＬＥＨＴＨＲＲＧＳＬＤＫＲ（配列番号３２）
ｗ）    Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓグルコアミラーゼＩＩ分泌リーダー配列
ｘ）    Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓβ−ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）分泌リーダー配列
ｙ）    カンジダグルコアルニラーゼリーダー配列
ｚ）    欧州特許出願第Ａ−３８７  ３１９号（参照することにより本明細書に組み込まれる）において開示されるイブリッドリーダー
ａａ）  （バキュロウイルス発現系と併せた）ｇｐ６７シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１〜１９）または
ｂｂ）  治療用タンパク質Ｘの天然リーダー；
ｃｃ）  ＪＰ６２−０９６０８６（９１１０３６５１６として特許されている、参照することにより本明細書に組み込まれる）において開示されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ（ＳＵＣ２）リーダー；または
ｄｄ）  イヌリナーゼ−ＭＫＬＡＹＳＬＬＬＰＬＡＧＶＳＡＳＶＩＮＹＫＲ（配列番号３３）
ｅｅ）  修飾されたＴＡ５７プロペプチドリーダー変異体＃１−ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＫＲ（配列番号３４）
ｆｆ）  修飾されたＴＡ５７プロペプチドリーダー変異体＃２−ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＥＥＧＥＰＫＲ（配列番号３５）
ｇｇ）  コンセンサスシグナル配列−ＭＷＷＲＬＷＷＬＬＬＬＬＬＬＬＷＰＭＶＷＡ（配列番号１１１）
ｊｊ）  修飾されたＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列−ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＧＳＬＤＫＲ（配列番号１１２）
ｋｋ）  コンセンサスシグナルペプチド＃２−ＭＲＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ（配列番号１０５）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７４】
好ましい実施形態において、修飾されたＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列（配列番号１１２）は、本明細書に記載されるアルブミンおよび治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質、ならびに国際公開第Ｗ０９３／１５１９９号；同第Ｗ０９７／２４４４５号；同第Ｗ００３／６００７１号；同第Ｗ００３／５９９３４号；およびＰＣＴ／ＵＳ０４／０１３６９において開示されるアルブミン融合タンパク質のアミノ末端に融合され、これらのそれぞれは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。修飾されたＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列は、例えば、Ｓｌｅｅｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９０，ｖｏｌ．８，ｐｐ．４２−４６；および米国特許第５，３０２，６９７号において開示されるＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列（配列番号１４）に基づき、これらの双方は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される修飾されたＨＳＡ／ｋｅｘ２リーダー配列は、親シグナルペプチドの残基１９において非保存的アミノ酸置換（ＡｒｇからＧｌｙ）を含む。修飾されたＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナルペプチドは、酵母において発現される場合、意外にも、修飾されていないＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列よりも良好なアルブミン融合タンパク質の発現量および／またはよりよい開裂効率を生じることが見出されている。修飾されたＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナルペプチドの変異体も本発明により包含される。特に、配列番号１１２の位置１９にあるＧｌｙ残基は、Ｐｒｏ残基で置換されてもよい。修飾されたＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列の他の保存的置換された変異体も企図される。配列番号１１２の修飾されたＨＳＡ／ｋｅｘ２シグナル配列をコードする核酸、ならびにその保存的置換された変異体も本発明により包含される。
【０３７５】
グルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを選択可能なマーカーとして使用するベクターはそれぞれ、薬物メチオニンスルホキシミン（ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ）またはメトトレキセートの存在下で、増幅され得る。グルタミンシンターゼベースのベクターの利点は、グルタミンシンターゼネガティブである細胞株（例えば、マウス骨髄腫細胞株、ＮＳＯ）の利用可能性にある。グルタミンシンターゼ発現系はまた、内因性遺伝子の機能を妨げるさらなる阻害剤を提供することにより、グルタミンシンターゼを発現する細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）中で機能することもできる。グルタミンシンターゼ発現系およびその成分は、ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号、同第ＷＯ８６／０５８０７号、同第ＷＯ８９／０１０３６号、同第ＷＯ８９／１０４０４号、および同第ＷＯ９１／０６６５７号に詳述されており、これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、グルタミンシンターゼ発現ベクターは、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）から入手できる。マウス骨髄腫細胞においてＧＳ発現系を使用する、モノクローナル抗体の発現および産生は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９（１９９２）ならびにＢｉｂｌｉａ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１：１（１９９５）（これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。
【０３７６】
本発明はまた、本明細書に記載の上記したベクター構築物を含む宿主細胞にも関連し、さらに当該技術分野で周知の技法を用いて、１つ以上の異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に作動可能に連結される本発明のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を包含する。宿主細胞は、高等真核細胞、例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒトに由来する細胞）、または下等真核細胞（例えば、酵母細胞）であり得、または宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞であり得る。挿入された遺伝子配列の発現を調節し、または所望の特定の様態で遺伝子産物を修飾および処理する宿主株が選択されてもよい。あるプロモーターに由来する発現が、ある誘導物質の存在下で高められ得る；したがって遺伝子操作されたポリペプチドの発現は制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えば、リン酸化、開裂）について、特徴的で特異的な機序を有する。発現される外来タンパク質の所望の修飾およびプロセッシングを確実にするために、適切な細胞株が選択され得る。
【０３７７】
宿主細胞への本発明の核酸および核酸構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、カチオン性脂質介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法により達成され得る。このような方法は、多くの標準的な実験マニュアル、例えば、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）において記載されている。特に、組換えベクターを欠失している宿主細胞により本発明のポリペプチドを実際に発現させることが特に企図される。
【０３７８】
本明細書に論じられるベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに加えて、本発明はまた、脊椎動物に由来する、特に哺乳類に由来する一次、二次および不死化させた宿主細胞も包含し、該細胞は、内因性遺伝物質を欠失または置換するように（例えば、治療用タンパク質に対応するコード配列は、治療用タンパク質に対応するアルブミン融合タンパク質を用いて置換されてもよい）、および／または遺伝物質を含むように（例えば、治療用タンパク質に対応する本発明のアルブミン融合タンパク質等の異種ポリヌクレオチド配列が含まれてもよい）操作される。内因性ポリヌクレオチドに作動可動に連結される遺伝物質は、内因性ポリヌクレオチドを活性化、改変、および／または増幅し得る。
【０３７９】
加えて、当該技術分野で周知の技法を用いて、相同組換えにより、異種ポリヌクレオチド（例えば、アルブミンタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントもしくは変異体）、および／または異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を、治療用タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結してもよい（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日公開）、国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、Ｋｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５（１９８９）、およびＺｉｊｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと。これらの各文献の開示内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３８０】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性荷電相互作用クロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法により、組換え細胞培養物から回収または精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために採用される。
【０３８１】
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、Ｑ−セファロース、ＤＥＡＥセファロース、ｐｏｒｏｓＨＱ、ｐｏｒｏｓＤＥＡＥ、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＱ、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＱＡＥ、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＤＥＡＥ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／ＳｏｕｒｃｅＱおよびＤＥＡＥ、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＱおよびＤＥＡＥカラム上でのクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されないアニオン交換クロマトグラフィーを用いて精製される。
【０３８２】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＳＰ−セファロース、ＣＭセファロース、ｐｏｒｏｓＨＳ、ｐｏｒｏｓＣＭ、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＳＰ、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＣＭ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／ＳｏｕｒｃｅＳおよびＣＭ、ＦｒａｃｔｏｇｅｌＳおよびＣＭカラム、ならびにそれらの等価物および同等物が挙げられるが、これらに限定されないカチオン交換クロマトグラフィーを用いて精製される。
【０３８３】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、フェニル、ブチル、メチル、オクチル、ヘキシル−セファロース、ｐｏｒｏｓフェニル、ブチル、メチル、オクチル、ヘキシル、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌフェニル、ブチル、メチル、オクチル、ヘキシルＲｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅフェニル、ブチル、メチル、オクチル、ヘキシル、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌフェニル、ブチル、メチル、オクチル、ヘキシルカラム、ならびにそれらの等価物および同等物が挙げられるが、これらに限定されない疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて精製される。
【０３８４】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、セファロース１００、Ｓ２００、Ｓ３００、ｓｕｐｅｒｄｅｘ樹脂カラム、ならびにそれらの等価物および同等物が挙げられるが、これらに限定されないサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製される。
【０３８５】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＨＳＡまたは「融合標的」分子のいずれかを選択する模倣色素（Ｍｉｍｅｔｉｃ  Ｄｙｅ）アフィニティー、ペプチドアフィニティー、および抗体アフィニティーカラムが挙げられるが、これらに限定されないアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製される。
【０３８６】
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、上記の１つ以上のクロマトグラフィー法を用いて精製される。他の好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、以下のクロマトグラフィーカラム、すなわちＱセファロースＦＦカラム、ＳＰセファロースＦＦカラム、Ｑセファロース高速カラム、ＢｌｕｅセファロースＦＦカラム、Ｂｌｕｅカラム、フェニルセファロースＦＦカラム、ＤＥＡＥセファロースＦＦ、またはメチルカラムのうちの１つ以上を用いて精製される。
【０３８７】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ００／４４７７２号において記載の過程を用いて精製されてもよい（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。当業者は、本発明のアルブミン融合タンパク質の精製で用いるそこに記載される過程を容易に修正できよう。
【０３８８】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、化学合成手順による産物；および例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳類細胞を含む原核または真核宿主から組換え技法により生成される産物から回収されてもよい。組換え製造手順に採用された宿主に応じて、本発明のポリペプチドをグリコシル化してもよいし、またはグリコシル化しなくてもよい。加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、宿主媒介過程の結果として、場合によっては、開始改変メチオニン残基を含んでもよい。したがって、当該技術分野で公知の翻訳開始コドンによりコードされるＮ末端のメチオニンは、概して、すべての真核細胞において翻訳後の任意のタンパク質から高い効率で除去される。大部分のタンパク質上にあるＮ末端のメチオニンは、大部分の原核生物においても効率よく除去されるが、一部のタンパク質について、Ｎ末端のメチオニンが共有結合されたアミノ酸の性質に応じて、この原核生物の除去過程は効率が悪い。
【０３８９】
一実施形態において、酵母ピチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いて、真核系における本発明のアルブミン融合タンパク質を発現させる。ピチアパストリスは、その唯一の炭素供給原としてメタノールを代謝できるメチロトローフ酵母である。メタノール代謝経路における主要な工程は、Ｏ２を用いてメタノールをホルムアルデヒドへ酸化することである。この反応は、酵素アルコールオキシダーゼにより触媒される。その唯一の炭素供給原としてメタノールを代謝するために、ピチアパストリスは、一部にはアルコールオキシダーゼのＯ２に対する比較的低い親和性に起因して、高レベルのアルコールオキシダーゼを生成しなければならない。結果的に、主要な炭素供給源としてメタノールに依存する増殖培地において、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）のうちの１つのプロモーター領域は、非常に活性である。メタノールの存在下で、ＡＯＸ１遺伝子から産生されるアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける総可溶性タンパク質のうちの約３０％までを含む。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１〜２１（１９８５）；Ｋｏｕｔｚ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ５：１６７〜７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３８５９〜７６（１９８７）を参照のこと。したがって、ＡＯＸ１制御配列のすべてまたは一部の転写調節下の異種コード配列（例えば、本発明のポリヌクレオチド等）は、メタノールの存在下で成長するピチア酵母において極めて高いレベルで発現する。
【０３９０】
１つの例において、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋは、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」，Ｄ．Ｒ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃｒｅｇｇ，ｅｄｓ．（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８）において記載されるように、本質的にＰｉｃｈｅａ酵母系において、本明細書に示されるように、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現させるために使用される。この発現ベクターは、マルチクローニング部位の上流に位置するピチアパストリスアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、リーダー）に連結された強力なＡＯＸ１プロモーターにより、本発明のポリペプチドの発現および分泌を可能にする。
【０３９１】
当業者には容易に理解されるように、考案した発現構築物が、必要に応じてフレーム内のＡＵＧを含む、適切に位置した転写、翻訳、分泌（所望ならば）のためのシグナルを提供する限りは、ｐＰＩＣ９Ｋの代わりに多くの他の酵母ベクター、例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺアルファ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５等を用いることができる。
【０３９２】
別の実施形態において、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド等の異種コード配列の高レベルな発現は、本発明の異種ポリヌクレオチドを、例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺアルファ等の発現ベクター中にクローニングし、次いで、メタノール不在下で酵母培養液を成長させることにより達成することができる。
【０３９３】
加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該技術分野で周知の技法（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）を用いて化学的に合成できる。例えば、ポリペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチドシンセサイザーの使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのポリペプチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、一般的なアミノ酸のＤアイソマー、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般のアミノ酸アナログが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０３９４】
本発明は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合等により、翻訳の間または後に様々に修飾される本発明のアルブミン融合タンパク質を包含する。多くの化学修飾のいずれも、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学開裂；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；等が挙げられるが、これらに限定されない周知の技法により行うことができる。
【０３９５】
本発明により包含されるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセッシング）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加もしくは欠失が挙げられる。アルブミン融合タンパク質はまた、検出可能な標識（例えば、酵素、蛍光、同位体、または親和性標識）を用いて改変して、このタンパク質の検出および単離が可能にされ得る。
【０３９６】
好適な酵素の例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み、好適な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み、好適な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、またはフィコエリトリンを含み、発光物質の例は、ルミノールを含み、生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み、および好適な放射性物質の例は、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、および９７Ｒｕを含む。
【０３９７】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質またはそのフラグメントもしくは変異体は、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１１６Ｈｏ、および１５３Ｓｍが挙げられるが、これらに限定されない、ポリペプチドに対する放射性金属イオンに会合されるマクロサイクル（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ）キレート剤に付着させる。好ましい実施形態において、マクロサイクルキレート剤に会合される放射性金属イオンは、１１１Ｉｎである。別の好ましい実施形態において、マクロサイクルキレート剤に会合される放射性金属イオンは、９０Ｙである。特定の実施形態において、マクロサイクルキレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。他の特定の実施形態において、ＤＯＴＡは、リンカー分子を介して本発明の抗体またはそのフラグメントに付着させる。ＤＯＴＡをポリペプチドに共役するために有用なリンカー分子の例は、一般的に当該技術分野で周知である。例えば、ＤｅＮａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４（１０）：２４８３−９０（１９９８）；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５５３−７（１９９９）；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：９４３−５０（１９９９）を参照のこと；参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３９８】
上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、自然な過程（例えば、翻訳後プロセッシング）または当該技術分野で周知の化学的改変技法のいずれかにより修飾され得る。同じ型の修飾が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じ程度または種々の程度で存在し得ることが、理解されよう。本発明のポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐していてもよく、それらは、分岐を有するまたは有しない環状であってもよい。環状、分岐、および分岐環状ポリペプチドは、翻訳後の自然な過程から生じてもよく、または合成方法により作成されてもよい。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、閉環、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性の架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、トランスファーＲＮＡが介在するタンパク質へのアミノ酸の付加（例えばアルギニン化等）、およびユビキチン化を含む（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）、ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）、Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【０３９９】
本発明のアルブミン融合タンパク質および治療用タンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントもしくは変異体は、精製を容易にするために、ペプチド等のマーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多くは、市販されている。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）において記載されるように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製のために有用な他のペプチドタグとしては、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４００】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用部分（例えば、細胞毒素（例えば、細胞増殖抑制性もしくは細胞破壊の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン（例えば、α−エミッター（例えば、２１３Ｂｉ）等）に共役され得る。細胞毒または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アンスラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０１】
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を修飾するために使用され得、治療剤または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されるものと解釈されない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス薬（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照のこと）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号を参照のこと））、血栓症薬もしくは血管新生阻害剤（例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答修飾剤（例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子等）が挙げられ得る。このような治療用部分をタンパク質（例えば、アルブミン融合タンパク質）に共役するための技法は、当該技術分野で公知である。
【０４０２】
アルブミン融合タンパク質はまた、固体支持体に付着してもよく、これは、本発明のアルブミン融合タンパク質が結合する、それに結合する、またはそれに会合するポリペプチドのイムノアッセイまたは精製のために特に有用である。このような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０３】
単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与される、それに共役する治療部分を有するかまたは有しないアルブミン融合タンパク質が、治療薬として使用され得る。
【０４０４】
本発明のアルブミン融合タンパク質が、治療用タンパク質に結合する抗体のＶＨドメインのみを含む実施形態において、融合タンパク質と治療用タンパク質に結合する同じ抗体のＶＬドメインを共に発現させることが必要とされる、および／または所望されてもよく、その結果、ＶＨアルブミン融合タンパク質およびＶＬタンパク質は、翻訳後に結合され得る（共有結合または非共有結合）。
【０４０５】
本発明のアルブミン融合タンパク質が、治療用タンパク質に結合する抗体のＶＬドメインのみを含む実施形態において、融合タンパク質と治療用タンパク質に結合する同じ抗体のＶＨドメインを共に発現させることが必要とされる、および／または所望されてもよく、その結果、ＶＬアルブミン融合タンパク質およびＶＨタンパク質は、翻訳後に結合され得る（共有結合または非共有結合）。
【０４０６】
一部の治療用抗体は、二重特異性抗体であり、これは、治療用タンパク質に結合する抗体が２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体であることを意味する。その治療用タンパク質に対応するアルブミン融合タンパク質を作製するために、アルブミンタンパク質部分のＮ末端およびＣ末端の双方に融合されたｓｃＦｖフラグメントを有するアルブミン融合タンパク質を作製することが可能である。より具体的には、アルブミンのＮ末端に融合されたｓｃＦｖは、治療用タンパク質に結合する元々の抗体の重鎖／軽鎖（ＶＨ／ＶＬ）対の１つに対応し得、アルブミンのＣ末端に融合されたｓｃＦｖは、治療用タンパク質に結合する元々の抗体の他の重鎖／軽鎖（ＶＨ／ＶＬ）対の１つに対応し得る。
【０４０７】
本発明により、ポリペプチドの溶解性、安定性、および循環時間の増大または免疫原性の減少等のさらなる利点を提供し得る、本発明のアルブミン融合タンパク質の化学修飾された誘導体も提供される（米国特許第４、１７９、３３７号を参照のこと）。誘導体化のための化学的部分は、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等から選択されてもよい。アルブミン融合タンパク質は、分子内のランダムな位置、または分子内の予め決定した位置において修飾されてもよく、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の結合された化学的部分を含んでもよい。
【０４０８】
ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分岐しているまたは分岐していなくてもよい。ポリエチレングリコールについては、取扱いおよび製造を容易にするための好ましい分子量は、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製中、一部の分子が記載の分子量より大きな分子量を有し、いくつかはより小さい分子量を有し得ることを示す）。所望の治療特性（例えば、所望の徐放持続時間、該当する場合、生物活性への効果、取扱いの容易性、抗原性の程度または欠損、および治療用タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの他の周知の効果）に応じて、他の大きさが用いられてもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００、０００ｋＤａの平均分子量を有してもよい。
【０４０９】
上記したように、ポリエチレングリコールは、分岐構造を有してもよい。分岐したポリエチレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：２７４５−２７５０（１９９９）；およびＣａｌｉｃｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）に記載されており、これらの各開示内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０４１０】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、タンパク質の機能または抗原性ドメインへの効果を考慮して、タンパク質に付着させる必要がある。例えば、欧州特許出願第０  ４０１  ３８４号（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧの結合）において開示されている方法等の、当業者に利用可能な多数の付着方法があり、これは参照することにより本明細書に組み込まれる；トレシルクロライドを用いるＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）を報告する、Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５（１９９２），ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＭ−ＣＳＦ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒｅｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅもまた参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離のアミノ基またはカルボキシル基等の反応性基を経由してアミノ酸残基を通じて共有結合され得る。反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合され得るものである。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含み得、遊離カルボキシル基を有するものは、アスパラギン酸残基グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基を含み得る。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリコール分子を付着するための反応性基として用いられ得る。治療目的のために、アミノ基における付着、例えば、Ｎ末端またはリジン基における付着が好ましい。
【０４１１】
上で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、多くのアミノ酸残基のうちの任意のものへの結合を経由してタンパク質に付着され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基への共有結合を経由してタンパク質に結合され得る。１つ以上の反応化学が、ポリエチレングリコールを、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）、またはタンパク質の１つ以上の型のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびそれらの組み合わせ）に付着するために採用され得る。
【０４１２】
特に、Ｎ末端において化学修飾されたタンパク質を望む場合がある。本発明の組成物の例示として、ポリエチレングリコールを用いて、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝等により）から、反応混合物中のタンパク質（ポリペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の割合、行われるペグ化反応の型、および選択されるＮ末端ペグ化タンパク質を得る方法を選択し得る。Ｎ末端ペグ化調製物を得る（すなわち、必要に応じて、この部分を他のモノペグ化部分から分離する）方法は、ペグ化タンパク質分子の集団からＮ末端ペグ化物質を精製することであり得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択性タンパク質は、特定のタンパク質の誘導体化のために使用可能な異なる型の一級アミノ基（リジン対Ｎ末端）の示差反応性を利用する還元的アルキル化より達成され得る。適切な反応条件の下で、カルボキシル基含有ポリマーを用いたＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０４１３】
上に記載したように、本発明のアルブミン融合タンパク質のペグ化は、任意の数の手段により達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、アルブミン融合タンパク質に、直接的または介在リンカーのいずれかにより結合され得る。ポリエチレングリコールをタンパク質に結合させるリンカーのない系は、Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）、Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）、米国特許第４，００２，５３１号、米国特許第５，３４９，０５２号、国際公開第ＷＯ９５／０６０５８号、および同第ＷＯ９８／３２４６６号において記載されており、これらの内容のそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０４１４】
介在リンカーなしにポリエチレングリコールをタンパク質のアミノ酸残基に直接結合させる１つの系は、トレシル化ＭＰＥＧを採用し、それは、トレシルクロリド（ＣｌＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３）を用いて、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）を修飾することにより産生される。トレシル化ＭＰＥＧとタンパク質の反応において、ポリエチレングリコールは、タンパク質のアミン基に直接結合される。したがって、本発明は、２，２，２−トリフルオロエタンスルホニル基を有するポリエチレングリコール分子と本発明のタンパク質の反応により生じる、タンパク質−ポリエチレングリコール結合体を含む。
【０４１５】
ポリエチレングリコールはまた、多数の異なる介在リンカーを用いてもタンパク質に結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（この開示全体は、参照することにより本明細書に組み込まれる）は、ポリエチレングリコールをタンパク質に連結するためのウレタンリンカーを開示する。タンパク質−ポリエチレングリコール結合体（ここで、該ポリエチレングリコールは、リンカーによりタンパク質に結合される）はまた、タンパク質と、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロペニル（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｅｎｙｌ）カーボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカーボネート、および種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体等の化合物との反応により生成され得る。ポリエチレングリコールをタンパク質に結合するための、多くのさらなるポリエチレングリコール誘導体および反応化学は、国際公開第ＷＯ９８／３２４６６号（この開示全体は、参照することにより本明細書に組み込まれる）において記載される。本明細書に記載される反応化学を用いて生成されるペグ化タンパク質産物は、本発明の範囲内に含まれる。
【０４１６】
本発明の各アルブミン融合タンパク質に結合されるポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換度）はまた、様々であってもよい。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、平均して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、１７個、２０個、またはそれ以上のポリエチレングリコール分子に連結され得る。同様に、平均置換度は、１個のタンパク質分子あたり、１〜３個、２〜４個、３〜５個、４〜６個、５〜７個、６〜８個、７〜９個、８〜１０個、９〜１１個、１０〜１２個、１１〜１３個、１２〜１４個、１３〜１５個、１４〜１６個、１５〜１７個、１６〜１８個、１７〜１９個、または１８〜２０個等のポリエチレングリコール部分の範囲である。置換度を決定する方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）において記載される。
【０４１７】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない標準的な方法により、化学合成および組換え細胞培養物から回収および精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。タンパク質の再折りたたみのための周知の技法は、そのポリペプチドが、単離および／または精製の間に変性される場合、活性なコンホメーションを再生するために採用され得る。
【０４１８】
本発明のアルブミン融合タンパク質の存在および量は、当該技術分野で周知のイムノアッセイであるＥＬＩＳＡを用いて決定され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質を検出／定量化するために有用であり得るＥＬＩＳＡプロトコルの１つには、抗ヒト血清アルブミン抗体を用いてＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、非特異的結合を防ぐためにプレートをブロッキングし、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、本発明のアルブミン融合タンパク質（１つ以上の異なる濃度で）を含む溶液を加え、検出可能な標識（本明細書に記載される、またはそうでなければ当該技術分野で知られている）にカップリングされている二次抗治療用タンパク質特異的抗体を加え、次いで、二次抗体の存在を検出する工程を含む。このプロトコルの代替的バージョンにおいて、ＥＬＩＳＡプレートは、抗治療用タンパク質特異的抗体でコーティングされ得、その標識二次試薬は、抗ヒトアルブミン特異的抗体であり得る。
【０４１９】
ポリヌクレオチドの使用
本明細書にて特定されるポリヌクレオチドの各々は、多くの方法において試薬として使用され得る。以下の説明は、例示的であると見なされるべきであり、周知の技法を利用する。
【０４２０】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のアルブミン融合タンパク質を産生するために有用である。以下により詳細に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド（アルブミン融合タンパク質をコードする）は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされるアルブミン融合タンパク質を発現する細胞、細胞株、または組織を作製するために、遺伝子操作において有用な組換えＤＮＡ法において使用され得る。
【０４２１】
本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝子治療の１つの目的は、遺伝的欠損を矯正するために、欠損遺伝子を有する生物体に正常な遺伝子を挿入することである。本発明において開示されるポリヌクレオチドは、非常に正確な様態でこのような遺伝的欠損を標的化する手段を提供する。別の目的は、宿主ゲノムに存在しなかった新たな遺伝子を挿入し、それにより宿主細胞において新たな形質を生じさせることである。本発明により包含される遺伝子治療法のさらなる非限定的な例は、本明細書で他の箇所により綿密に記載される（例えば、「遺伝子治療」の項ならびに実施例６１および６２を参照のこと）。
【０４２２】
ポリペプチドの使用
本明細書にて特定されるポリペプチドの各々は、多くの方法において使用され得る。以下の記載は、例示的であると見なされるべきであり、周知の技法を利用する。
【０４２３】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、組織（例えば、ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼのような免疫組織化学アッセイ（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２９：５７７−５８０（１９８１））または細胞型（例えば、免疫細胞化学アッセイ）の識別特定のための免疫学的プローブを提供するために有用である。
【０４２４】
アルブミン融合タンパク質は、当業者に周知の古典的な免疫組織学的方法（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）を用いて生体試料中のポリペプチドのレベルをアッセイするために使用され得る。タンパク質の遺伝子発現を検出するために有用な他の方法には、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等のイムノアッセイが含まれる。好適なアッセイ標識は、当該技術分野で知られており、酵素標識、例えば、グルコースオキシダーゼ；放射性同位元素、例えば、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ；ルミノール等の発光標識；ならびにフルオレセインおよびローダミン等の蛍光標識、ならびにビオチンを含む。
【０４２５】
本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、画像化により生体内で検出され得る。タンパク質の生体内の画像化のための標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）により検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法については、好適な標識は、検出可能な放射線を放出するが、対象に対して過度に有害でないバリウムまたはセシウム等の放射性同位元素を含む。ＮＭＲおよびＥＳＲに好適なマーカーは、重水素等の検出可能な特徴的なスピンを有するものを含み、これは、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現する細胞株に付与した栄養素の標識により、アルブミン融合タンパク質中に取り込まれ得る。
【０４２６】
適切な検出可能な画像化部分、例えば、放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ、（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ）、放射線不透過（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）物質、または核磁気共鳴により検出可能な物質を用いて標識されているアルブミン融合タンパク質は、哺乳類に導入され（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に）、免疫系疾患について調べられる。対象のサイズおよび用いられる画像化システムが、診断画像を生成するために必要とされる画像化部分の量を決定することが当該技術分野で理解されよう。放射性同位元素部分の場合、ヒト対象については、注入される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃであり得る。次いで、標識されたアルブミン融合タンパク質は、１つ以上の受容体、リガンド、または基質（本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために用いられる治療用タンパク質のものに対応する）が位置する体内の部位（例えば、組織、細胞、細胞外空間、またはマトリックス）において選択的に蓄積し得る。代替として、アルブミン融合タンパク質が、治療用抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む場合、標識されたアルブミン融合タンパク質は、次いで、（本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために用いられる）治療用抗体により結合されたものに対応するポリペプチド／エピトープが位置する体内の部位（例えば、組織、細胞、細胞外空間、またはマトリックス）において選択的に蓄積し得る。生体内での腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”（Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｄｓ．，Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２））において記載される。本明細書に記載されるプロトコルは、本発明のアルブミン融合タンパク質について用いるために、当業者により容易に修正され得るだろう。
【０４２７】
一実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドおよび／または抗体）を投与することによる、細胞への本発明のアルブミン融合タンパク質の特異的な送達のための方法を提供する。一例において、本発明は、治療用タンパク質を標的細胞に送達するための方法を提供する。別例において、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込み得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され得るＤＮＡ）を、標的細胞に送達するための方法を提供する。
【０４２８】
別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグとともに本発明のアルブミン融合タンパク質を投与することによる細胞の特異的な破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０４２９】
「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、放射性同位元素、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分子もしくは酵素を結合および活性化する１つ以上の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、当該技術分野で周知の放射性同位元素、生来のまたは誘導された内因性細胞傷害性エフェクター系に結合する抗体（またはその部分を含む補体結合）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、アルファ毒素、リシン、アブリン、シュ−ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヨウシュヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質、アルファサルシンおよびコレラ毒素挙げられるが、これらに限定されない。「毒素」はまた、細胞分裂阻害剤または細胞破壊剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、２１３Ｂｉ等のアルファ放出体、または他の放射性同位元素、例えば、１０３Ｐｄ、１３３Ｘｅ、１３１Ｉ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、３５Ｓ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、９０イットリウム、１１７スズ、１８６レニウム、１６６ホルミウム、および１８８レニウム；ルミノール等の発光標識；ならびにフルオレセインおよびローダミン等の蛍光標識、ならびにビオチンも含む。特定の実施形態において、本発明は、放射性同位元素９０Ｙとともに本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を投与することにより、細胞を特異的に破壊する（例えば、腫瘍細胞の破壊）ための方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、放射性同位元素１１１Ｉｎとともに本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を投与することにより、細胞を特異的に破壊する（例えば、腫瘍細胞の破壊）ための方法を提供する。さらなる特定の実施形態において、本発明は、放射性同位元素１３１Ｉとともに本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を投与することにより、細胞を特異的に破壊する（例えば、腫瘍細胞の破壊）ための方法を提供する。
【０４３０】
当該技術分野で周知の技法を用いて、本発明のポリペプチドを標識してもよい。このような技法としては、二官能性結合体物質（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号、同第５，７１４，６３１号、同第５，６９６，２３９号、同第５，６５２，３６１号、同第５，５０５，９３１号、同第５，４８９，４２５号、同第５，４３５，９９０号、同第５，４２８，１３９号、同第５，３４２，６０４号、同第５，２７４，１１９号、同第４，９９４，５６０号、および同第５，８０８，００３号を参照のこと。これらの各々の内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３１】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける様々な障害の診断、処置、予防、および／または予後診断のために有用である。このような障害としては、以下の「生物学的活性」と題する項の下で本明細書に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３２】
したがって、本発明は、疾患の診断方法を提供するものであって、（ａ）本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、個体の細胞または体液内のあるポリペプチドの発現レベルをアッセイすることと、（ｂ）標準的なポリペプチド発現レベルとそのアッセイしたポリペプチド発現レベルを比較することとを含み、これにより、標準発現レベルと比較して、アッセイしたポリペプチド発現レベルにおける増大または減少が、疾患の指標となる。癌については、個体からの生検用組織における比較的大量の転写産物の存在が、疾患の発症についての素因を示し得、または実際に臨床徴候が出現する前に疾患を検出するための手段を提供し得る。この種のより確定的な診断により、医療の専門家は、癌の発症またはさらなる進行をより早く予防する予防的手段または積極的処置を利用することができる。
【０４３３】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、例えば、神経障害、免疫系障害、筋疾患、生殖器系障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎障害、増殖性障害および／または癌性疾患および状態等の疾患または状態を処置または予防するために用いることができる。例えば、患者に本発明のポリペプチドを投与して、ポリペプチド（例えば、インスリン）の欠失または低下レベルを補う、異なるポリペプチド（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘモグロビンＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、ＤＮＡ修復タンパク質）の欠失または低下レベルを補う、ポリペプチド（例えば、オンコジーンまたは腫瘍抑制因子）の活性を阻害する、ポリペプチド（例えば、受容体に結合することにより）の活性を活性化させる、遊離リガンド（例えば、炎症の軽減において用いられる可溶性ＴＮＦ受容体）と競合させることにより膜結合型タンパク質の活性を減少する、または所望の応答（例えば、血管成長阻害、増殖性細胞または組織に対する免疫応答の亢進）を引き起こすことができる。
【０４３４】
特に、治療用抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質を用いて、疾患（上記、および本明細書に別記されるような）を処置することもできる。例えば、治療用抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質の投与は、特異的に結合するアルブミン融合タンパク質を作製するために使用される治療用抗体がポリペプチドに結合および／もしくそれをは中和し得、ならびに／または特異的に結合するアルブミン融合タンパク質を作製するために使用される治療用抗体がポリペプチドの過剰な産生を軽減することができる。同様に、治療用抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質の投与は、膜（受容体）に結合したポリペプチドに結合させることにより、アルブミン融合タンパク質を作製するために使用される治療用抗体が特異的に結合するポリペプチドを活性化することができる。
【０４３５】
少なくとも、本発明のアルブミン融合タンパク質は、当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され得る。また、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、抗体を惹起し得、それによって、宿主細胞または生体試料における形質転換を評価する方法として、治療用タンパク質、アルブミンタンパク質、および／または組換え細胞に由来する本発明のアルブミン融合タンパク質のタンパク質発現を測定するために用いることができる。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、本明細書に記載される生物活性を試験するために用いることができる。
【０４３６】
診断アッセイ
本発明の化合物は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける様々な障害の診断、処置、予防、および／または予後診断のために有用である。このような障害は、表１の対応する行において各治療用タンパク質について記載されているもの、および本明細書の以下の「免疫活性」、「血液関連疾患」、「過増殖性疾患」、「腎障害」、「心血管疾患」、「呼吸器疾患」、「抗血管新生活性」、「細胞レベルにおける疾患」、「創傷治癒および上皮細胞増殖」、「神経活性および神経疾患」、「内分泌性障害」、「生殖器系障害」、「感染症」、「再生」、および／または「胃腸障害」の項に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３７】
多数の障害について、「標準の」遺伝子発現レベル、すなわち、障害を有しない個体に由来する組織または体液における発現レベルと比較して、遺伝子発現の大幅に変化した（増大された、または減少された）レベルが、このような障害を有する個体から得られた組織、細胞、または体液（例えば、血清、血漿、尿、精液、滑液、もしくは髄液）において検出され得る。したがって、本発明は、障害の診断中、有用な診断方法を提供し、それには、個体に由来する組織、細胞、もしくは体液においてポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを測定し、次いで、その測定された遺伝子発現レベルを標準遺伝子発現レベルと比較することを含み、これにより、標準と比較して、遺伝子発現レベルにおける増大および減少が、障害の指標となる。これらの診断アッセイは、生体内または体外で、例えば、血液試料、生検組織、または剖検組織において行われてもよい。
【０４３８】
本発明はまた、予後指標としても有用であり、これにより、遺伝子発現の亢進または抑制を示す患者がより悪い臨床結果を被る。
【０４３９】
「ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」とは、特定のポリペプチド（例えば、表１に開示される治療用タンパク質に対応するポリペプチド）のレベルまたは第１の生体試料において本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを、直接的（例えば、絶対タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定または推定することによる）または相対的（例えば、第２の生体試料におけるポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルと比較することによる）に、定性的または定量的に測定または推定することが意図される。好ましくは、第１の生体試料におけるポリペプチド発現レベルまたはｍＲＮＡレベルが、測定または推定され、次いで、標準ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルと比較され、該標準は、障害を有しない個体から得られた第２の生体試料から得られるものであるか、または障害を有しない個体の集団からのレベルを平均して決定されるものである。当該技術分野で理解されるように、標準ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが判明すると、比較のための標準として繰り返し使用することができる。
【０４４０】
「生体試料」とは、本発明のポリペプチド（その一部を含む）またはｍＲＮＡを含有する、個体、細胞株、組織培養、または他の供給源から得られた、任意の生体試料を意図する。示されるように、生体試料としては、ポリペプチドまたはｍＲＮＡの全長またはそのフラグメントを発現することが見出されている体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）および組織供給源が挙げられる。哺乳動物から組織生検および体液を得る方法は、当該技術分野で公知である。生体試料が、ｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。
【０４４１】
全細胞ＲＮＡは、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）において記載される単一工程のグアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法等の任意の好適な技法を用いて生体試料から単離され得る。次いで、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルは、任意の適切な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を含む。
【０４４２】
本発明はまた、ポリペプチドの正常なおよび異常なレベルの決定を含む、生体試料（例えば、細胞および組織）において、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドのレベルを検出するための定量および診断アッセイ等の診断アッセイに関する。したがって、例えば、正常な対照組織試料と比較して、アルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドの異常な発現を検出するための本発明に従う診断アッセイは、腫瘍の存在を検出するために用いられ得る。宿主に由来する試料における本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドのレベルを決定するために用いられ得るアッセイ技法は、当業者に公知である。このようなアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。生体試料におけるポリペプチドレベルのアッセイは、任意の当該技術分野に周知の方法を用いて行うことができる。
【０４４３】
生体試料におけるポリペプチドレベルをアッセイすることは、様々な技法を用いて行われ得る。例えば、組織中のポリペプチド発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る（Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）、Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７））。ポリペプチド遺伝子発現を検出するために有用な他の方法には、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等のイムノアッセイが含まれる。好適な抗体アッセイ標識は、当該技術分野で知られており、グルコースオキシダーゼ等の酵素標識、およびヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）等の放射性同位元素、ならびにフルオレセインおよびローダミン等の蛍光標識、ならびにビオチンを含む。
【０４４４】
分析されるべき組織または細胞型は、概して、関心対象となる遺伝子（例えば、癌等の）を発現することが知られているか、またはその疑いのあるものを含み得る。本明細書に利用されるタンパク質単離方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，１９８８，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）において記載されるようなものを含み得、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。単離される細胞は、細胞培養または患者に由来し得る。培養物から得られた細胞の分析は、細胞に基づく遺伝子治療法の一部として用いられ得る細胞の評価において、または代替として、遺伝子の発現における化合物の効果を試験するために、必須な工程であり得る。
【０４４５】
例えば、アルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドの存在を定量的または定性的に検出するために用いられてもよい。これは、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光分析による検出と共に、蛍光標識されたアルブミン融合タンパク質を利用する免疫蛍光技法により達成され得る。
【０４４６】
好ましい実施形態において、本明細書に開示される少なくとも１つの治療用タンパク質（表１に開示される治療用タンパク質）に特異的に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントもしくは変異体を含む、またはそうでなければ当該分野で周知のアルブミン融合タンパク質は、遺伝子産物、またはその保存された変異体もしくはペプチドフラグメントの存在を定量的にまたは定性的に検出するために用いられ得る。これは、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光分析による検出と共に、蛍光標識された抗体を利用する免疫蛍光技法によって達成され得る。
【０４４７】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドの原位置検出のために、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡法、または非免疫学的アッセイ等において、組織学的に利用され得る。原位置検出は、患者由来の組織学的標本を取り出すこと、およびそれに本発明の標識抗体またはポリペプチドを適用することによって達成され得る。アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、生体試料上に標識されたアルブミン融合タンパク質を重層することにより適用される。このような手順を用いて、アルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドの存在だけでなく、被検組織におけるその分布も測定することが可能である。本発明を用いて、当業者は、多種多様の組織学的方法のいずれか（例えば、染色手順）が、例えば、原位置検出を達成するために改変され得ることを容易に認識するだろう。
【０４４８】
アルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドを検出するイムノアッセイおよび非イムノアッセイは、典型的に、遺伝子産物またはその保存変異体またはペプチドフラグメントに結合し得る検出可能に標識抗体の存在下、試料、例えば、生物の体液、組織抽出物、新たに回収した細胞、または細胞培養にてインキュベートされた細胞の溶解物を培養し、次いで、当該技術分野で公知の多数の技法のうちの任意の技法により結合された抗体を検出することを含む。
【０４４９】
生体試料は、ニトロセルロース等の固相支持体もしくは担体、または細胞、細胞粒子、もしくは可溶性タンパク質を固定化し得る他の固体支持体と接触させ、次いで、そこに固定化されてもよい。その後、この支持体を、好適な緩衝液で洗浄し、次いで、本発明の検出可能な標識を施したアルブミン融合タンパク質で処理し得る。その後、この固相支持体を、緩衝液で２度目の洗浄をし、非結合の抗体またはポリペプチドを除去し得る。必要に応じて、この抗体は、その後、標識される。その後、固体支持体上に結合された標識の量を、従来の手段を用いて検出することができる。
【０４５０】
「固相支持体または担体」とは、ポリペプチド（例えば、アルブミン融合タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、もしくは会合するポリペプチド）を結合し得る任意の支持体を意図する。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変したセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のためにある程度可溶性であるか、または不溶性のいずれかであり得る。支持体材料は、付着した分子が、ポリペプチドに結合し得る限り、事実上、任意の可能な構造配置を有し得る。したがって、支持体の形状は、ビーズにおけるような球状、あるいは試験管の内表面またはロッドの外表面におけるような円柱状であってもよい。代替として、該表面は、平面（例えば、シート、試験ストリップ等）であり得る。好ましい支持体は、ポリスチレンビーズを含む。当業者には、抗体または抗原を結合し得る多くの他の好適な担体が知られているか、または慣用的な実験を用いてそれを確認することができよう。
【０４５１】
所定のロットのアルブミン融合タンパク質の結合活性は、公知の方法により決定され得る。当業者は、慣用的な実験を利用することにより、各々の決定のための有効かつ最適のアッセイ条件を決定することができよう。
【０４５２】
個体から得られた生体試料におけるポリペプチドレベルをアッセイすることに加えて、ポリペプチドはまた、画像化によっても生体内にて検出できる。例えば、本発明の一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、罹患細胞または新生物細胞を画像化するために用いられる。
【０４５３】
本発明のアルブミン融合タンパク質の生体内画像化のための標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＣＡＴ−スキャン、またはＥＳＲにより検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法については、好適な標識は、検出可能な放射線を放出するが、対象に対して過度に有害でないバリウムまたはセシウム等の放射性同位元素を含む。ＮＭＲおよびＥＳＲに好適なマーカーは、重水素等の検出可能な特徴的なスピンを有するものを含み、これは、操作された細胞株（または細菌または酵母株）の栄養素を標識することにより、アルブミン融合タンパク質中に取り込んでもよい。
【０４５４】
さらに、その存在が検出され得る本発明のアルブミン融合タンパク質が、投与され得る。例えば、放射線不透過なまたは他の適切な化合物を用いて標識された本発明のアルブミン融合タンパク質は、標識抗体について、上で論じられたように、生体内において投与および可視化され得る。さらに、このようなポリペプチドは、体外診断手順においても利用され得る。
【０４５５】
適切な検出可能な画像化部分、例えば、放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透過物質、もしくは核磁気共鳴により検出可能な物質を用いて標識されているポリペプチド特異的抗体または抗体フラグメントを、障害について検査しようとする哺乳動物に（例えば、非経口的、皮下または腹腔内に）導入される。対象のサイズおよび用いられる画像化システムが、診断画像を生成するために必要とされる画像化部分の量を決定することが当該技術分野で理解されよう。放射性同位元素部分の場合、ヒト対象については、注入される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃであり得る。標識されたアルブミン融合タンパク質は、その後、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合する、ポリペプチドまたは他の基質を含む体内の位置に選択的に蓄積し得る。生体内での腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”（Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｄｓ．，Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２））において記載される。
【０４５６】
本発明のアルブミン融合タンパク質が、検出可能に標識され得る１つの方法は、レポーター酵素へそれを連結し、そしてこの連結された産物を酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）に用いることによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，“Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”，１９７８，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）、Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（ｅｄ．），１９８０，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９８１，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ）。抗体に結合するレポーター酵素は、例えば、分光光度法、蛍光分析または視覚的手段により検出できる化学的部分を生じるような様態で、適切な基質（好ましくは色素基質）と反応させることができる。抗体を検出可能に標識するために用いられ得るレポーター酵素としては、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロリン酸、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、検出は、レポーター酵素のために発色性基質を利用する比色分析方法により達成することができる。検出はまた、同様に調製した標準物と比較して、基質の酵素反応の程度を目視比較することにより達成され得る。
【０４５７】
アルブミン融合タンパク質はまた、放射標識されてもよく、任意の様々な他のイムノアッセイにおいて用いられてもよい。例えば、アルブミン融合タンパク質を放射標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）においてアルブミン融合タンパク質を用いることが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｂ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６を参照のこと、参照することにより本明細書に組み込まれる）。放射性同位元素は、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない手段により検出され得る。
【０４５８】
さらに、キレート剤分子は、当該技術分野で知られており、アルブミン融合タンパク質を標識するために使用され得る。キレート剤分子は、本発明のアルブミン融合タンパク質に付着され、放射線核種または蛍光標識を含む金属イオンを用いる該タンパク質の標識を容易にし得る。例えば、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｒ．  ａｎｄ  Ｍｅａｒｅｓ，Ｃ．Ｆ．，“Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒａｄｉｏｍｅｔａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｅｄ．）Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｓｔｏｎ、Ｓａｊｉ，Ｈ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ：ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．７５：２０９−２４４（１９９９）、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｓ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｍｅａｓｅ  Ｒ．Ｃ．，“Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  ｌｉｇａｎｄｓ，ｎｕｃｌｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ａｐｐｌ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．Ｂ  ７５：５８９−６０３（１９９１）、およびＬｉｕ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｄ．Ｓ．，“Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈｅｌａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．  １２：１−３４（２００１）を参照のこと。該アルブミン融合タンパク質に共有結合され得る任意のキレート剤を、本発明に従って用いることができる。キレート剤はさらに、アルブミン融合タンパク質にキレート剤部分を接続するリンカー部分を含んでもよい。
【０４５９】
一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、非環式キレート剤、例えば、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−五酢酸（ＤＰＴＡ）、ＤＰＴＡのアナログ、およびＤＰＴＡの誘導体に結合される。非限定的な例として、キレート剤は、２−（ｐ−イソチオシアナートベンジル）−６−メチルジエチレントリアミン五酢酸（１Ｂ４Ｍ−ＤＰＴＡ、ＭＸ−ＤＴＰＡとしても知られている）、２−メチル−６−（ｒｈｏ−ニトロベンジル）−１，４，７−トリアザヘプタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−五酢酸（ニトロ−１Ｂ４Ｍ−ＤＴＰＡまたはニトロ−ＭＸ−ＤＴＰＡ）；２−（ｐ−イソチオシアナートベンジル）−シクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（ＣＨＸ−ＤＴＰＡ）、またはＮ−［２−アミノ−３−（ｒｈｏ−ニトロフェニル）プロピル］−トランス−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−五酢酸（ニトロ−ＣＨＸ−Ａ−ＤＴＰＡ）であり得る。
【０４６０】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、非環式テルピリジンキレート剤、例えば、６，６’’−ビス［［Ｎ，Ｎ，Ｎ’’，Ｎ’’−テトラ（カルボキシメチル）アミノ］メチル］−４’−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）−２，２’：６’，２’’−テルピリジン（ＴＭＴ−アミン）に結合される。
【０４６１】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合される大環状キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。他の特定の実施形態において、ＤＯＴＡは、リンカー分子を介して本発明のアルブミン融合タンパク質に結合される。ＤＯＴＡをポリペプチドに共役するために有用なリンカー分子の例は、一般的に当該技術分野で周知である。例えば、ＤｅＮａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４（１０）：２４８３−９０（１９９８）、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５５３−７（１９９９）、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：９４３−５０（１９９９）を参照のこと、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。加えて、抗体に共役し得るキレート剤、ならびにそれらを製造するおよび使用するための方法を開示する、米国特許第５，６５２，３６１号および同第５，７５６，０６５号は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許第５，６５２，３６１号および同第５，７５６，０６５号は、抗体へのキレート剤の共役に焦点を合わせているが、当業者は、それらに開示される方法を容易に適合させ、他のポリペプチドにキレート剤を共役させ得る。
【０４６２】
共役が、リガンドの炭素骨格に結合した活性化アームまたは官能基を介するものである、大環状リガンドに基づく二官能性キレート剤が、Ｍ．Ｍｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４９：２６３９（１９８９）（２−ｐ−ニトロベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸）、Ｓ．Ｖ．Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ３１：４７３（１９９０）、Ｇ．Ｒｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１：３４５（１９９０）、Ｃ．Ｊ．Ｂｒｏａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２３：１７３９（１９９０）、およびＣ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３６：８５０（１９９５）に記載のように利用され得る。
【０４６３】
一実施形態において、大環状キレート剤（例えば、ポリアザ大環状キレート剤）（必要に応じて１つ以上のカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキサメート基、ホスファネート基、またはリン酸基を含む）は、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合する。別の実施形態において、キレート剤は、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡのアナログ、およびＤＯＴＡの誘導体からなる群より選択されるキレート剤である。
【０４６４】
一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合し得る好適なキレート剤分子としては、ＤＯＸＡ（１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカントリ酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナントリ酢酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンテトラ酢酸）、およびＴＨＴ（４’−（３−アミノ−４−メトキシ−フェニル）−６，６’’−ビス（Ｎ’，Ｎ’−ジカルボキシメチル−Ｎ−メチルヒドラジノ）−２，２’：６’，２’’−テルピリジン）、およびそれらのアナログおよび誘導体が挙げられる。例えば、Ｏｈｍｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：１５７−１６２（１９９２）、Ｋｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．２５：３２６−３３２（１９８４）、Ｊｕｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５：１１３７−１１５６（１９９３）、および米国特許第５，３６７，０８０号を参照のこと。他の好適なキレート剤は、米国特許第４，６４７，４４７号、同第４，６８７，６５９号、同第４，８８５，３６３号、欧州特許出願第Ａ−７１５６４号、国際公開第ＷＯ８９／００５５７号、および欧州特許出願第Ａ−２３２７５１号において開示されるキレート剤を含む。
【０４６５】
別の実施形態において、本発明において用いられ得る好適な大環状カルボン酸キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）；１，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（１５Ｎ４）；１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸（９Ｎ３）；１，５，９−トリアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸（１２Ｎ３）；および６−ブロモアセトアミド−ベンジル−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＢＡＴ）を含む。
【０４６６】
本発明のアルブミン融合タンパク質に結合し得る好ましいキレート剤は、α−（５−イソチオシアナート−２−メトキシフェニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＭｅＯ−ＤＯＴＡ−ＮＣＳとしても知られている）である。α−（５−イソチオシアナート−２−メトキシフェニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸の塩またはエステルもまた使用され得る。
【０４６７】
記載されるようなキレート剤が共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療、診断、または治療および診断の双方を目的として適している放射線核種を用いて（キレート剤の配位部位を介して）標識されてもよい。適切な金属の例は、Ａｇ、Ａｔ、Ａｕ、Ｂｉ、Ｃｕ、Ｇａ、Ｈｏ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｐｂ、Ｐｄ、Ｐｍ、Ｐｒ、Ｒｂ、Ｒｅ、Ｒｈ、Ｓｃ、Ｓｒ、Ｔｃ、Ｔｌ、Ｙ、およびＹｂを含む。診断目的のために用いられる放射線核種の例は、Ｆｅ、Ｇｄ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、または６８Ｇａを含む。別の実施形態において、診断目的のために用いられる放射線核種は、１１１Ｉｎまたは６７Ｇａである。治療目的のために用いられる放射線核種の例は、１６６Ｈｏ、１６５Ｄｙ、９０Ｙ、１１５ｍＩｎ、５２Ｆｅ、または７２Ｇａである。一実施形態において、治療目的のために用いられる放射線核種は、１６６Ｈｏまたは９０Ｙである。治療および診断双方を目的として用いられる放射線核種の例は、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１７５Ｙｂ、または４７Ｓｃを含む。一実施形態において、放射線核種は、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１７５Ｙｂ、または１５９Ｇｄである。
【０４６８】
好ましい金属放射線核種は、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、４７Ｓｃ、６７Ｇａ、５１Ｃｒ、１７７ｍＳｎ、６７Ｃｕ、１６７Ｔｍ、９７Ｒｕ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１９９Ａｕ、４７Ｓｃ、６７Ｇａ、５１Ｃｒ、１７７ｍＳｎ、６７Ｃｕ、１６７Ｔｍ、９５Ｒｕ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂ、および１４１Ｃｅを含む。
【０４６９】
特定の実施形態において、キレート剤が共有結合される本発明のアルブミン融合タンパク質は、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、２１５Ｂｉ、および２２５Ａｃからなる群より選択される金属イオンを用いて標識されてもよい。
【０４７０】
さらに、診断画像化のために、γ−放出放射線核種、例えば、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、および１６９Ｙｂが認可されているかまたは研究されている一方で、β−放射物質、例えば、６７Ｃｕ、１１１Ａｇ、１８６Ｒｅ、および９０Ｙは、腫瘍治療に適用するために有用である。他の有用な放射線核種はまた、γ−放射物質（例えば、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、および１６９Ｙｂ）、およびβ−放射物質（例えば、６７Ｃｕ、１１１Ａｇ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、および９０Ｙ）、ならびに関心対象とする他の放射線核種（例えば、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、１７７Ｌｕ、８６Ｒｂ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、１９８Ａｕ、１４９Ｐｍ、８５Ｓｒ、１４２Ｐｒ、２１４Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１６６Ｈｏ、２０８Ｔｌ、および４４Ｓｃ）も含む。キレート剤が共有結合される本発明のアルブミン融合タンパク質は、上記の放射線核種を用いて標識されてもよい。
【０４７１】
別の実施形態において、キレート剤が共有結合される本発明のアルブミン融合タンパク質は、遷移およびランタニド金属のイオン、例えば、原子番号２１〜２９、４２、４３、４４、または５７〜７１を有する金属のイオン、特に、Ｃｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、およびＬｕのイオンを含む常磁性金属イオンを用いて標識されてもよい。磁気共鳴画像法のために組成物中に用いられる常磁性金属は、原子番号２２〜２９、４２、４４、および５８〜７０を有する元素を含む。
【０４７２】
別の実施形態において、キレート剤が共有結合される本発明のアルブミン融合タンパク質は、ランタニド、特に、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ（例えば、１５２Ｅｕ）、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、およびＬｕを含む蛍光金属イオンを用いて標識されてもよい。
【０４７３】
別の実施形態において、キレート剤が共有結合される本発明のアルブミン融合タンパク質は、Ｍｏ、Ｂｉ、Ｓｉ、およびＷの原子を含み得る、重金属を含むレポーターを用いて標識されてもよい。
【０４７４】
蛍光化合物を用いてアルブミン融合タンパク質を標識することも可能である。蛍光標識抗体が適切な波長の光に曝される場合、その後、その存在が、蛍光に起因して検出され得る。最も一般的に用いられる蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレスカミンがある。
【０４７５】
アルブミン融合タンパク質はまた、１５２Ｅｕ等の蛍光放出金属またはランタニド属の他のものを用いて検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）等の金属キレート基を用いて抗体に結合され得る。
【０４７６】
アルブミン融合タンパク質はまた、それを化学発光化合物に結合することによっても検出可能に標識され得る。その後、化学発光タグ化アルブミン融合タンパク質の存在は、化学反応の経過の間に生じる発光の存在を検出することにより測定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
【０４７７】
同様に、生物発光化合物は、本発明のアルブミン融合タンパク質を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒タンパク質は化学発光反応の効率を増大する生物系において見出される化学発光の型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより測定される。標識のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。
【０４７８】
トランスジェニック生物体
本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック生物体も本発明に含まれる。トランスジェニック生物体は、組換え、外因性またはクローン化された遺伝物質が移入されている遺伝学的に改変された生物体である。このような遺伝物質は、多くの場合、トランスジーンと称される。トランスジーンの核酸配列は、コードされたタンパク質の最適な発現および分泌のために必要とされ得る、１つ以上の転写制御配列およびイントロン等の他の核酸配列を含み得る。トランスジーンは、生物体または生物体が産生する産物、例えば、生物体の乳、血液、尿、卵、髪または種からのその回収を高める様態で、コードされたタンパク質の発現を導くように設計され得る。トランスジーンは、標的動物の種と同種または異種のゲノムに由来する核酸配列からなり得る。トランスジーンは、特定の核酸配列が他の正常に見出されないゲノムの遺伝子座、あるいはトランスジーンの正常な遺伝子座でのいずれかに組み込まれ得る。
【０４７９】
「生殖細胞系トランスジェニック生物体」という用語は、遺伝的改変または遺伝情報を生殖系列細胞系に導入することにより、遺伝情報を子孫へ伝達するトランスジェニック生物体の能力を付与されたトランスジェニック生物体を指す。このような子孫が実際にその改変または遺伝情報の一部またはすべてを有するならば、それらもトランスジェニック生物体である。改変または遺伝情報は、レシピエントが属する生物体の種とは異なり得、特定の個体のレシピエントに対してのみ異なり得、またはレシピエントが既に保有される遺伝情報であり得る。後者の場合、改変されたまたは導入された遺伝子は、天然の遺伝子と異なって発現され得る。
【０４８０】
トランスジェニック生物体は、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物であり得る。トランスジェニック動物は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング、ならびに組換えウイルス感染および組換えレトロウイルス感染を含む種々の異なる方法で産生できる（米国特許第４，７３６，８６６号、同第５，６０２，３０７号、Ｍｕｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２２（４）：６３０−６３３、Ｂｒｅｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６（２）９９−１１０、Ｔｕａｎ（ｅｄ．），Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｎｏ．６２，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照のこと）。組換えコンピテント哺乳類細胞中に核酸フラグメントを導入する方法は、複数の核酸分子の共形質転換を支持する任意の方法により行うことができる。トランスジェニック動物を産生する詳細な手順は、当業者に容易に入手可能であり、米国特許第５，４８９，７４３号および同第５，６０２，３０７号における開示を含む。
【０４８１】
多数の組換えまたはトランスジェニックマウスが産生されており、活性化癌遺伝子配列を発現するもの（米国特許第４，７３６，８６６号）；サルＳＶ４０Ｔ−抗原を発現するもの（米国特許第５，７２８，９１５号）；インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）の発現を欠失しているもの（米国特許第５，７３１，４９０号）；ドーパミン作動性機能障害を示すもの（米国特許第５，７２３，７１９号）；血圧制御に関与する少なくとも１つのヒト遺伝子を発現するもの（米国特許第５，７３１，４８９号）；自然発症性アルツハイマー病に認められる状態と大きな類似性を示すもの（米国特許第５，７２０，９３６号）；細胞接着を媒介する能力が低下したもの（米国特許第５，６０２，３０７号）；ウシ成長ホルモン遺伝子を有するもの（Ｃｌｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４３（４）：１７５３−１７６０）；または十分なヒト抗体応答を生じ得るもの（ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９９７）Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３４９（９０４９）：４０５）を含む。
【０４８２】
マウスおよびラットは、多くのトランスジェニック実験のために好んで使用される動物であるが、場合によっては、代替の動物種を使用することが好ましい、または必要でさえある。トランスジェニックの手順は、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジ−、ハムスター、ウサギ、ウシ、およびモルモットを含む様々な非マウス動物において首尾よく利用されている（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６（４）：５１５−５２６、Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（１９９５）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｎｕｔｒ．Ｄｅｖ．３５（６）：６０９−６１７、Ｐｅｔｔｅｒｓ（１９９４）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６（５）：６４３−６４５、Ｓｃｈｎｉｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８（５３４６）：２１３０−２１３３、およびＡｍｏａｈ（１９９７）Ｊ．Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７５（２）：５７８−５８５を参照のこと）。
【０４８３】
トランスジェニック動物の乳汁中に、本発明のトランスジーンによりコードされたタンパク質の分泌を導くためには、哺乳類上皮細胞において優先的に活性化されたプロモーターの制御下に置かれ得る。乳タンパク質をコードする遺伝子を制御するプロモーター、例えば、カゼイン、β―ラクトグロブリン、ホエー酸タンパク質、またはラクトアルブミンのプロモーターが好ましい（例えば、ＤｉＴｕｌｌｉｏ（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７４−７７、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：４８７−４９２、Ｇｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：１１８３−１１８７、およびＳｏｕｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．２９７：１３を参照のこと）。好んで使用されるトランスジェニック哺乳動物、例えば、ヤギ、ウシ、ラクダまたはヒツジは、大量の乳を産生し、長い授乳期間を有する。
【０４８４】
本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、トランスジェニック植物、例えば、ＤＮＡトランスジーンを核またはプラスチドゲノムに挿入した植物において発現させることもできる。植物細胞またはプロトプラスト中に外来核酸を導入するために用いられる植物形質転換法は、当該技術分野で周知である。一般的に、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５３（“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｐａｒｔ  Ｄ”）１９８７，Ｗｕ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｍａｎ  Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、および欧州特許出願第６９３  ５５４号を参照のこと。操作された植物の生産方法は、米国特許第５，２８３，１８４号、米国特許第５，４８２，８５２号、および欧州特許出願第６９３  ５５４号においてさらに記載されており、これらのすべては、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０４８５】
医薬または治療用組成物
本発明のアルブミン融合タンパク質またはそれらの製剤は、非経口（例えば、皮下または筋肉内）注入または静脈内注入を含む任意の従来の方法により投与され得る。処置は、期間にわたって、単一回投与または複数回投与からなり得る。
【０４８６】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、単独で投与されることが可能であるが、１つ以上の許容される担体と共に医薬製剤とすることが好ましい。該担体は、アルブミン融合タンパク質に適合し、かつその投与を受ける個体に有害ではないという意味において「許容される」べきである。典型的に、担体は、滅菌および無発熱物質である水または生理食塩水である。本発明のアルブミン融合タンパク質は、特に、溶液中のそれらの長期化した貯蔵寿命のために、水性担体（例えば、滅菌無発熱物質水、生理食塩水、または他の等張溶液）中の製剤によく適する。例えば、本発明の医薬組成物は、あらかじめ水性形態で、例えば、分散される数週間前または数ヶ月前、あるいはそれ以上の期間前に、十分に製剤化され得る。
【０４８７】
例えば、アルブミン融合タンパク質を含有する製剤は、水性製剤におけるアルブミン融合タンパク質の長期化した貯蔵寿命を考慮して調製され得る。上記のように、これら治療用タンパク質の多くの貯蔵寿命は、ＨＡに融合した後、著しく増大されるか、または延期される。
【０４８８】
エアロゾル投与が適切な場合、本発明のアルブミン融合タンパク質は、標準的な手順を用いてエアロゾルとして製剤化され得る。「エアロゾル」という用語は、細気管支または鼻腔経路に吸入可能な、本発明のアルブミン融合タンパク質の任意のガスによって送達される懸濁相を含む。特に、エアロゾルは、定量吸入用量吸入器または噴霧器、あるいはミスト噴霧器において生成され得るような、本発明のアルブミン融合タンパク質の水滴からなるガスによって送達される懸濁液を含む。エアロゾルはまた、例えば、吸入デバイスからの吸入により送達され得る空気または他の担体ガスに懸濁された本発明の化合物の乾燥粉末組成物も含む。Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ  ＆  Ｊｏｎｅｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｔｒａｃｔ，  Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ（１９８７）、Ｇｏｎｄａ（１９９０）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ６：２７３−３１３、およびＲａｅｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７：１４３−１５９を参照のこと。
【０４８９】
典型的に、本発明の製剤はまた、一つには、適切な種に由来するアルブミン融合タンパク質の成分を用いるため、非免疫原性であり得る。例えば、ヒトへの使用のために、治療用タンパク質およびアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分の両方は、典型的にヒトである。いずれかの成分が非ヒト由来であるような場合によっては、その成分は主要アミノ酸の置換によりヒト化され得、その結果、特異的なエピトープが、ヒト免疫系に対し、外来性ではなく、むしろ天然のヒトのようになる。
【０４９０】
製剤は、都合よく単位投与形態とし得、当該薬学分野で周知の任意の方法により調製され得る。このような方法は、１つ以上の付属成分を構成する担体とアルブミン融合タンパク質を会合させる工程を含む。一般的に、製剤は、活性成分と液体担体または微粉状の固体担体、またはそれら両方を均一にかつ親密に会合させ、その後、必要な場合、産物を形成することにより、調製する。
【０４９１】
非経口投与に適する製剤としては、意図されるレシピエントに適する製剤にする抗酸化物、緩衝液、静菌剤、および溶質を含有し得る水性滅菌注入溶液または非水性滅菌注入溶液；ならびに懸濁剤および濃化剤を含み得る水性滅菌注入溶液または非水性滅菌注入溶液が挙げられる。製剤は、単位用量容器または複数用量容器（例えば、密封されたアンプル、バイアルまたはシリンジ）中で調整し得、使用の直前に滅菌液体担体（例えば、注入用の水）の添加のみを必要とする凍結乾燥（親液性）状態で保存され得る。即席の注入溶液および懸濁液は、滅菌散剤から調製され得る。投与製剤は、本発明の多くのアルブミン融合タンパク質により示される長期化した血清半減期により、治療用タンパク質のための非融合標準製剤と比較して、低いモル濃度またはより低い投与量で治療用タンパク質部分を含有し得る。
【０４９２】
一例として、本発明のアルブミン融合タンパク質が、１つ以上の治療用タンパク質領域として、表１の「治療用タンパク質Ｘ」列に列挙されたタンパク質の１つを含む場合、投与形態は、天然の治療用タンパク質のものと比較して、アルブミン融合タンパク質の延長された血清半減期および貯蔵寿命を考慮しながら、治療用タンパク質単独の効力に対するアルブミン融合タンパク質の効力に基づいて計算することができる。例えば、治療用タンパク質が、典型的に、０．３〜３０．０ＩＵ／ｋｇ／週または０．９〜１２．０ＩＵ／ｋｇ／週で投与されるならば、一年以上にわたって、３または７回に分けて投与される。治療用タンパク質に融合した全長ＨＡからなるアルブミン融合タンパク質では、単位に関しては同等の用量でも、より大きい薬剤重量を示すことになるが、投与頻度は、例えば、１週間に２回、１週間に１回またはそれ未満に減らすことができる。
【０４９３】
本発明の製剤または組成物は、アルブミン融合タンパク質成分の長期化した貯蔵寿命について言及する説明書または包装挿入物と共に包装されるか、または共にキットに納めることができる。例えば、このような説明書または包装挿入物は、本発明のアルブミン融合タンパク質の延期された、または長期化した貯蔵寿命を考慮して、推奨される貯蔵条件（例えば、時間、温度、および光）に注意を向け得る。このような説明書または包装挿入物はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質の特定の利点（例えば、管理された病院、診療所または会社環境以外の現場での使用が必要となり得る製剤についての貯蔵の容易さ）に注意を向け得る。上記のように、本発明の製剤は、水性形態であり得、治療活性を有意に損なうことなく、理想に満たない状況下において、貯蔵され得る。
【０４９４】
本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、栄養補助食品中に含めることができる。例えば、本発明の特定のアルブミン融合タンパク質は、アルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック哺乳類から得られた乳または乳製品を含む、天然産物中にて投与され得る。このような組成物はまた、アルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック植物から得られた植物または植物生成物も含み得る。アルブミン融合タンパク質はまた、他の周知の添加剤、担体、充填剤、および希釈剤を伴うまたは伴うことなく、散剤または錠剤形態でも提供され得る。栄養補助食品は、Ｓｃｏｔｔ  Ｈｅｇｅｎｈａｒｔ，Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄｅｃ．１９９３において記載される。
【０４９５】
本発明はまた、医薬的に許容される担体中の有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（「アルブミン融合ポリヌクレオチド」）を対象に投与することにより、疾患または障害（例えば、本明細書に開示される任意の１つ以上の疾患または障害等）を処置および／または予防する方法も提供する。
【０４９６】
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、個々の患者の臨床状態（特に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを単独で用いた処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与スケジュール、および当業者に周知の他の要因を考慮して、良質の医療のための原則（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で製剤化および投薬する。したがって、本明細書の目的のための「有効量」は、これらを考慮することにより決定される。
【０４９７】
一般的提案として、１用量あたりの非経口投与されるアルブミン融合タンパク質の医薬上の合計有効量は、患者体重１ｋｇあたり約１ｕｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり得るが、上記のように、これは治療的裁量に委ねられる。より好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日であり、ヒトについて最も好ましくは、ホルモンの場合、約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。連続投与する場合、典型的に、アルブミン融合タンパク質は、例えば、ミニポンプを用いて、１日あたり１〜４回の注入または連続的な皮下注入のいずれかにより、約１ｕｇ／ｋｇ／時間〜約５０ｕｇ／ｋｇ／時間の投与速度で投与される。静脈用バッグ溶液もまた利用され得る。変化を観察するために必要とされる処置期間および処置から応答が現れるまでの時間は、所望の効果に応じて変化すると思われる。
【０４９８】
上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質部分（またはそのフラグメントもしくは変異体）単独と比較して、より高い血漿安定性を有する。投与されるべきアルブミン融合タンパク質の１用量あたりの有効量および用量投与スケジュールを決定する場合、この血漿安定性における増大を考慮する必要がある。特に、より高い血漿安定性により、投与頻度が同じ場合にはより低い用量でのアルブミン融合タンパク質の投与が可能となり、または代替として、アルブミン融合タンパク質をより少ない頻度で投与することが可能となる得る。好ましくは、より高い安定性により、本発明のアルブミン融合タンパク質を低い頻度で投与することが可能となる。より好ましくは、アルブミン融合タンパク質は、２週間ごとに１回投与され得る。さらにより好ましくは、アルブミン融合タンパク質の薬物動態に応じて、アルブミン融合タンパク質は、３、４、５またはそれ以上の週ごとに１回投与され得る。例えば、上で論じられたように、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質の薬物動態は、２〜４週以上ごとに１回の投与計画および４週または４週以上ごとに１回の間隔での投与を支持する。
【０４９９】
１用量あたりの投与され得る有効量のアルブミン融合タンパク質はまた、１用量あたり与えられる全体の製剤化されたアルブミン融合タンパク質濃度として表わすことができる。一実施形態において、１用量あたり患者に投与される全体の製剤化されたアルブミン融合タンパク質濃度は、約１０ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量の範囲である。より好ましくは、全濃度は、約１００ｕｇ／用量から約１０００ｕｇ／用量であり、または代替として、約１０００ｕｇ／用量から約１２００ｕｇ／用量、または約９００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量である。
【０５００】
特定の実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、全体の製剤化された濃度の約９０ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量において投薬される。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、全体の製剤化された濃度の約９００ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量、約９００ｕｇ／用量から約１２００ｕｇ／用量、約９００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量、および最も好ましくは、全体の製剤化された濃度の約１２００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量において投薬される。さらなる好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、全体の製剤化された濃度の約６００ｕｇ／用量、７２０ｕｇ／用量、８００ｕｇ／用量、９００ｕｇ／用量、１０００ｕｇ／用量、１２００ｕｇ／用量、１５００ｕｇ／用量、１８００ｕｇ／用量、または２０００ｕｇ／用量において投薬される。さらなる実施形態において、全体の製剤化された用量の本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独あるいはリバビリン等の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、投与される。さらなる好ましい実施形態において、全体の製剤化された用量の本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、リバビリンが挙げられるが、これに限定されない、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物および任意に別の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、投与される。
【０５０１】
さらなる実施形態において、全体の製剤化された濃度の本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、ＨＣＶに感染した患者を処置するために投与される。特定の実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは有効量の抗ウイルス性化合物（リバビリン等）と組み合わせて、全体の製剤化された濃度の約９０ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量において、ＨＣＶに罹患する未処置患者に投与される。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは有効量の抗ウイルス性化合物（リバビリン等）と組み合わせて、全体の製剤化された濃度の約９００ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量、約９００ｕｇ／用量から約１２００ｕｇ／用量、約９００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量、および最も好ましくは、全体の製剤化された濃度の約１２００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量において、ＨＣＶに罹患する未処置患者に投与される。さらなる好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは有効量の抗ウイルス性化合物（リバビリン等）と組み合わせて、全体の製剤化された濃度の６００ｕｇ／用量、７２０ｕｇ／用量、８００ｕｇ／用量、９００ｕｇ／用量、１０００ｕｇ／用量、１２００ｕｇ／用量、１５００ｕｇ／用量、１８００ｕｇ／用量、または２０００ｕｇ／用量において、ＨＣＶに罹患する未処置患者に投与される。
【０５０２】
さらなる実施形態において、全体の製剤化された濃度の本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質は、有効量の１つ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）と組み合わせて、全体の製剤化された濃度の約９０ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量において、ＨＣＶに罹患する未処置患者に投与される。さらなる好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）、および任意に別の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、全体の製剤化された濃度の約９００ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量、約９００ｕｇ／用量から約１２００ｕｇ／用量、約９００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量、および最も好ましくは、全体の製剤化された濃度の約１２００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量において、ＨＣＶに罹患する未処置患者に投与される。さらなる好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、有効量の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）と組み合わせて、全体の製剤化された濃度の６００ｕｇ／用量、７２０ｕｇ／用量、８００ｕｇ／用量、９００ｕｇ／用量、１０００ｕｇ／用量、１２００ｕｇ／用量、１５００ｕｇ／用量、１８００ｕｇ／用量、または２０００ｕｇ／用量において、ＨＣＶに罹患する未処置患者に投与される。
【０５０３】
さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは、有効量の抗ウイルス性化合物（リバビリン等）と組み合わせて、全体の製剤化された濃度の約９０ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量において、ＨＣＶに罹患する処置経験のある患者に投与される。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは、有効量の抗ウイルス性化合物（リバビリン等）と組み合わせて、全体の製剤化された濃度の約９００ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量、約９００ｕｇ／用量から約１２００ｕｇ／用量、約９００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量、および最も好ましくは、全体の製剤化された濃度の約１２００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量において、ＨＣＶに罹患する処置経験のある患者に投与される。さらなる好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは有効量の抗ウイルス性化合物（リバビリン等）と組み合わせて、全体の製剤化された濃度の６００ｕｇ／用量、７２０ｕｇ／用量、８００ｕｇ／用量、９００ｕｇ／用量、１０００ｕｇ／用量、１２００ｕｇ／用量、１５００ｕｇ／用量、１８００ｕｇ／用量、または２０００ｕｇ／用量において、ＨＣＶに罹患する処置経験のある患者に投与される。
【０５０４】
さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）、および任意に別の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、全体の製剤化された濃度の約９０ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量において、ＨＣＶに罹患する処置経験のある患者に投与される。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）、および任意に別の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、全体の製剤化された濃度の約９００ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量、約９００ｕｇ／用量から約１２００ｕｇ／用量、約９００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量、および最も好ましくは、全体の製剤化された濃度の約１２００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量において、ＨＣＶに罹患する処置経験のある患者に投与される。さらなる好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、有効量の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）、および任意に別の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、全体の製剤化された濃度の６００ｕｇ／用量、７２０ｕｇ／用量、８００ｕｇ／用量、９００ｕｇ／用量、１０００ｕｇ／用量、１２００ｕｇ／用量、１５００ｕｇ／用量、１８００ｕｇ／用量、または２０００ｕｇ／用量において、ＨＣＶに罹患する処置経験のある患者に投与される。
【０５０５】
アルブミン融合タンパク質の全体の製剤化された濃度およびアルブミン融合タンパク質が投与される投与間隔は、所望の効果および投与される特定の治療用タンパク質に応じて変化するであろう。一実施形態において、１用量あたり患者に投与される全体の製剤化されたアルブミン融合タンパク質濃度は、週に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間または４週以上ごとに１回、約１０ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量の範囲である。より好ましくは、全体の濃度は、週に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間または４週以上ごとに１回、約１００ｕｇ／用量から約１０００ｕｇ／用量、または代替として、週に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間または４週以上ごとに１回、約１０００ｕｇ／用量から約１２００ｕｇ／用量、または約９００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量の範囲である。
【０５０６】
特定の実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約９０ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量で投与される。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約９００ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、約９００ｕｇ／用量から約１２００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、約９００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量；および最も好ましくは、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約１２００ｕｇ／用量から１８００ｕｇ／用量において、投薬される。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約６００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、８００ｕｇ／用量、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、９００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１０００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１２００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１５００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１６００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１８００ｕｇ／用量；または１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、２０００ｕｇ／用量で、投与される。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、２週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の９００ｕｇ／用量、およびより好ましくは、２週間ごとに１回、全体の濃度の１２００ｕｇ／用量、４週間ごとに１回、１２００ｕｇ／用量、または４週間ごとに１回、１８００ｕｇ／用量で、投与される。さらなる実施形態において、全体の製剤化された用量の本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは抗ウイルス性化合物（リバビリン等）と組み合わせて、投与される。さらなる好ましい実施形態において、全体の製剤化された用量の本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリンを含む）および任意に別の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、投与される。
【０５０７】
特定の実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは抗ウイルス性化合物（リバビリン等）と組み合わせて、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約９０ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量で、未処置のＨＣＶ患者に投与される。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは抗ウイルス性化合物（リバビリン等を含む）と組み合わせて、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約９００ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、約９００ｕｇ／用量から約１２００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、約９００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量；および最も好ましくは、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約１２００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量において、未処置のＨＣＶ患者に投与される。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは抗ウイルス性化合物（リバビリン等）と組み合わせて、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約６００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、８００ｕｇ／用量、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、９００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１０００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１２００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１５００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１６００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１８００ｕｇ／用量；または１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、２０００ｕｇ／用量において、未処置のＨＣＶ患者に投与される。
【０５０８】
好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）、および任意に別の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約９０ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量で、未処置のＨＣＶ患者に投与される。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、１つ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）と組み合わせて、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）、および任意に別の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約９００ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、約９００ｕｇ／用量から約１２００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、約９００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量；および最も好ましくは、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約１２００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量において、未処置のＨＣＶ患者に投与される。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）、および任意に別の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約６００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、８００ｕｇ／用量、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、９００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１０００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１２００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１５００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１６００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１８００ｕｇ／用量；または１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、２０００ｕｇ／用量で、未処置のＨＣＶ患者に投与される。
【０５０９】
さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは抗ウイルス性化合物（リバビリン等）と組み合わせて、２週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の９００ｕｇ／用量で、およびより好ましくは、２週間ごとに１回、全体の濃度の１２００ｕｇ／用量で、４週間ごとに１回、１２００ｕｇ／用量で、または４週間ごとに１回、１８００ｕｇ／用量で、未処置のＨＣＶ患者に投与される。最も好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）、および任意に別の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、２週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の９００ｕｇ／用量で、およびより好ましくは、２週間ごとに１回、全体の濃度の１２００ｕｇ／用量で、４週間ごとに１回、１２００ｕｇ／用量で、または４週間ごとに１回、１８００ｕｇ／用量で、未処置のＨＣＶ患者に投与される。
【０５１０】
さらなる特定の実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは抗ウイルス性化合物（リバビリン等）と組み合わせて、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約９０ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量で、処置経験のあるＨＣＶ患者に投与される。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは抗ウイルス性化合物（リバビリン等）と組み合わせて、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約９００ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、約９００ｕｇ／用量から約１２００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、約９００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量；および最も好ましくは、１週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約１２００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量、または最も好ましくは、２週間ごとに１回、約１２００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量において、処置経験のあるＨＣＶ患者に投与される。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは抗ウイルス性化合物（リバビリン等）と組み合わせて、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約６００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、８００ｕｇ／用量、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、９００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１０００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１２００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１５００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１６００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１８００ｕｇ／用量；または１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、２０００ｕｇ／用量において、処置経験のあるＨＣＶ患者に投与される。
【０５１１】
さらに特定の実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）、および任意に別の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約９０ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量で、処置経験のあるＨＣＶ患者に投与される。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）、および任意に別の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約９００ｕｇ／用量から約２０００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、約９００ｕｇ／用量から約１２００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、約９００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量；および最も好ましくは、１週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約１２００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量において、または最も好ましくは、２週間ごとに１回、約１２００ｕｇ／用量から約１８００ｕｇ／用量において、処置経験のあるＨＣＶ患者に投与される。さらなる実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）、および任意に別の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の約６００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、８００ｕｇ／用量、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、９００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１０００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１２００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１５００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１６００ｕｇ／用量；１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、１８００ｕｇ／用量；または１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、または５週間ごとに１回、２０００ｕｇ／用量で、処置経験のあるＨＣＶ患者に投与される。
【０５１２】
さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、単独、あるいは抗ウイルス性化合物（リバビリン等）と組み合わせて、２週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の９００ｕｇ／用量で、およびより好ましくは、２週間ごとに１回、全体の濃度の１２００ｕｇ／用量で、４週間ごとに１回、１２００ｕｇ／用量で、または４週間ごとに１回、１８００ｕｇ／用量で、処置経験のあるＨＣＶ患者に投与される。最も好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質（例えば、ＣＩＤ２２４９、２３４３、２３６６、２３８１、２３８２、２４１０、３１６５、３４２２、３４２３、３４２４、３４７６、３９６０、４２９０、４２９１、４２９２、４２９５、または４２９６により生成された）は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の抗ウイルス性化合物（例えば、リバビリン等を含む）、および任意に別の抗ウイルス性化合物と組み合わせて、２週間ごとに１回、全体の製剤化された濃度の９００ｕｇ／用量で、およびより好ましくは、２週間ごとに１回、全体の濃度の１２００ｕｇ／用量で、４週間ごとに１回、１２００ｕｇ／用量で、または４週間ごとに１回、１８００ｕｇ／用量で、処置経験のあるＨＣＶ患者に投与される。
【０５１３】
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、経口、直腸内、非経口、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所（例えば、散剤、軟膏、ゲル、ドロップ、または経皮パッチによる）、頬側投与されるか、または経口または鼻腔スプレーとして投与され得る。「医薬的に許容される担体」とは、任意の非毒性の固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化物質、または製剤補助剤を指す。本明細書に使用される「非経口」という用語は、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射および注入を含む投与形態を指す。
【０５１４】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドはまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドの例としては、経口、直腸内、非経口、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所（例えば、散剤、軟膏、ゲル、ドロップ、または経皮パッチによる）、頬側投与されるか、または経口または鼻腔スプレーとして投与され得る。「医薬的に許容される担体」とは、任意の型の非毒性の固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化物質、または製剤補助剤を指す。本明細書に使用される「非経口」という用語は、静脈内、筋内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射および注入を含む投与形態を指す。徐放性アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドのさらなる例としては、好適なポリマー物質（例えば、造形した物品の形態をした半透性ポリマー物質（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル））、好適な疎水性物質（例えば、許容される油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂、および難溶性誘導体（例えば、難溶性塩等）が挙げられる。
【０５１５】
徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許出願第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセタ−ト（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄ．）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願第１３３，９８８号）が挙げられる。
【０５１６】
徐放性アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとしては、リポソーム封入された本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドが挙げられる（概して、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）、Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３１７−３２７  ａｎｄ  ３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを含有するリポソームは、それ自体が知られている方法により調製される：ＤＥ  ３，２１８，１２１、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１９８０）、欧州特許出願第５２，３２２；欧州特許出願第３６，６７６号、欧州特許出願第８８，０４６号、欧州特許出願第１４３，９４９号、欧州特許出願第１４２，６４１号、日本国特許出願第８３−１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号、ならびに欧州特許出願第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、その脂質含有量は、約３０モル％のコレステロールよりも多く、選択された割合が、最適な治療剤のために適合される。
【０５１７】
さらなる追加の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ポンプにより送達される（Ｌａｎｇｅｒ、上記参照、Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）、Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）、Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【０５１８】
他の制御された放出系は、Ｌａｎｇｅｒによる総説にて論じられている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０５１９】
非経口投与のために、一実施形態において、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、概して、それを所望の程度の純度で、医薬的に許容される担体、すなわち、採用される用量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ製剤の他の成分に適合するものと、単位用量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、または乳剤）で混合することにより製剤化される。例えば、製剤は、好ましくは、酸化剤および治療剤に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【０５２０】
概して、製剤は、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを液体担体または微粉状の固体担体、またはその両方と均一かつ密接に接触させることにより調製される。その後、必要ならば、生成物は所望の製剤に成形される。好ましくは、担体は、非経口用担体であり、より好ましくは、レシピエントの血液と等張な溶液である。このような担体ビヒクルの例としては、水、生理的食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液を含む。固定油およびオレイン酸エチル等の非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０５２１】
担体は、等張性および化学安定性を亢進する物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、採用される用量および濃度で投与を受ける個体に対して毒性がなく、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩類のような緩衝液；アスコルビン酸等の抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、もしくはアルギニン等のアミノ酸；セルロースもしくはその誘導体、ブドウ糖、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールもしくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の対イオン；ならびに／またはポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０を含む）、ポロキサマーもしくはＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０５２２】
アルブミン融合タンパク質は、典型的に、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に製剤化される。特定の前記した賦形剤、担体、または安定化剤がポリペプチド塩の形成をもたらし得ることが理解されよう。
【０５２３】
治療投与のために用いられる任意の医薬は、滅菌することができる。滅菌は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロンの膜）で濾過することにより容易に達成される。アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、概して、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。
【０５２４】
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥製剤として貯蔵される。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）治療剤水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。注入溶液は、注射のための静菌水を用いて、凍結乾燥されたアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを再構成することにより調製される。
【０５２５】
特定および好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質製剤は、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５ｍＭの塩化ナトリウム、融合タンパク質１ミリグラムあたり０．１６マイクロモルのオクタン酸ナトリウム、１ミリリットルあたり１５マイクログラムのポリソルベート８０、ｐＨ７．２を含む。別の特定のおよび好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質製剤は、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５ｍＭの塩化ナトリウム、融合タンパク質１ミリグラムあたり０．１６マイクロモルのオクタン酸ナトリウム、１ミリリットルあたり１５マイクログラムのポリソルベート８０、ｐＨ７．２を含む。ｐＨおよび緩衝液は、生理学的条件に適合するように選択され、および等張化剤として塩を加える。オクタン酸ナトリウムは、溶液中のタンパク質の温度安定性を増大する能力が報告されていることから、選択された。最後に、ポリソルベートは、溶液の表面張力を低下させ、および容器密閉系に対するアルブミン融合タンパク質の非特異的吸着を軽減する遺伝子界面活性剤として加えられた。
【０５２６】
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドの１つ以上の成分が充填された１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。このような容器には、医薬または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された形式の注意書きを付属することができ、その注意書きは、当局による、ヒトへの投与のための製造、使用、または販売の認可を示すものである。加えて、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを採用して、他の治療用化合物と組み合わせてもよい。
【０５２７】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独またはアジュバントと組み合わせて投与され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得るアジュバントとしては、ミョウバン、ミョウバン＋デオキシコール酸塩（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ  Ｃｏｒｐ．）、ＱＳ２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ（例えば、ＴＨＥＲＡＣＹＳ（登録商標））、ＭＰＬおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍの無生育性（ｎｏｎｖｉａｂｌｅ）調製物が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ミョウバンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＱＳ−２１と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得るさらなるアジュバントとしては、モノホスホリル脂質免疫調節剤、ＡｄｊｕＶａｘ１００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩、ＭＦ−５９、およびヴィロソマル（Ｖｉｒｏｓｏｍａｌ）アジュバント技術が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得るワクチンとしては、ＭＭＲ（はしか、おたふく風邪、風疹）、ポリオ、水疱瘡、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヘモウイルスインフルエンザＢ菌、百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイルス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、ポリオ（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、狂犬病、腸チフス、および百日咳（ｐｅｒｔｕｓｉｓ）を防御するために行われるワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して、または連続して投与され得る。これは、組み合わせた薬剤を治療混合物として共に投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０５２８】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独または他の治療剤と組み合わせて投与され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド剤は、化学治療剤、抗生物質、ステロイドおよび非ステロイド系抗炎症剤、従来の免疫治療剤、および／または以下に記載の治療用処置が挙げられるが、これらに限定されない。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して、または連続して投与され得る。これは、組み合わせた薬剤を治療混合物として共に投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０５２９】
一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗凝血剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗凝血剤は、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ワルファリンナトリウム（例えば、ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））、ジクマロール、４−ヒドロキシクマリン、アニシンジオン（例えば、ＭＩＲＡＤＯＮ（商標））、アセノクマロール（例えば、ニクマロン、ＳＩＮＴＨＲＯＭＥ（商標））、インダン−１、３−ジオン、フェンプロクモン（例えば、ＭＡＲＣＵＭＡＲ（商標））、ビスクマセタートエチル（例えば、ＴＲＯＭＥＸＡＮ（商標））、およびアスピリンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ヘパリンおよび／またはワルファリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ワルファリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ワルファリンおよびアスピリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ヘパリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ヘパリンおよびアスピリンと組み合わせて投与される。
【０５３０】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、血栓溶解薬と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る血栓溶解薬は、プラスミノーゲン、ｌｙｓ−プラスミノーゲン、アルファ２−抗プラスミン、ストレプトキナーゼ（例えば、ＫＡＢＩＫＩＮＡＳＥ（商標））、抗レスプラス（ａｎｔｉｒｅｓｐｌａｃｅ）（例えば、ＥＭＩＮＡＳＥ（商標））、組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ、アルテバーゼ、ＡＣＴＩＶＡＳＥ（商標））、ウロキナーゼ（例えば、ＡＢＢＯＫＩＮＡＳＥ（商標））、ソールプラーゼ、（プロウロキナーゼ、一本鎖ウロキナーゼ）、およびアミノカプロン酸（例えば、ＡＭＩＣＡＲ（商標））が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組成物は、組織プラスミノーゲン活性化剤およびアスピリンと組み合わせて投与される。
【０５３１】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗血小板薬と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗血小板薬は、アスピリン、ジピリダモ−ル（例えば、ＰＥＲＳＡＮＴＩＮＥ（商標））およびチクロピジン（例えば、ＴＩＣＬＩＤ（商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５３２】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせた抗凝血剤、血栓溶解薬、および／または抗血小板薬の使用は、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、血栓塞栓症、肺塞栓症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、一過性脳虚血発作、不安定狭心症の予防、診断、および／または処置のために企図される。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせた抗凝血剤、血栓溶解薬および／または抗血小板薬の使用は、伏在移植片の閉塞の予防、血管形成術に付随し得る手術周辺血栓症の危険性の減少、非リウマチ性心房細動を含む心房細動を有する患者における脳卒中の危険性の減少、人工心臓弁および／または僧帽弁疾患に関連する塞栓症の危険性の減少のために企図される。単独または抗血小板剤、抗凝血剤、および／または血栓溶解薬と組み合わせた本発明の治療剤の他の使用としては、体外デバイス（例えば、血管内カニューレ、血液透析患者における血管進入シャント、血液透析機器、および心肺バイパス装置）における閉塞の予防が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５３３】
ある実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗レトロウイルス剤、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）および／またはプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るＮＲＴＩとしては、ＲＥＴＲＯＶＩＲ（商標）（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸ（商標）（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤ（商標）（ザルシタビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴ（商標）（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲ（商標）（ラミブジン／３ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲ（商標）（ジドブジン／ラミブジン）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るＮＮＲＴＩは、ＶＩＲＡＭＵＮＥ（商標）（ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ（商標）（デラビルジン）、およびＳＵＳＴＩＶＡ（商標）（エファビレンツ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るプロテアーゼ阻害剤は、ＣＲＩＸＩＶＡＮ（商標）（インジナビル）、ＮＯＲＶＩＲ（商標）（リトナビル）、ＩＮＶＩＲＡＳＥ（商標）（サキナビル）、およびＶＩＲＡＣＥＰＴ（商標）（ネルフィナビル）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、および／またはプロテアーゼ阻害剤は、ＡＩＤＳを処置するため、および／またはＨＩＶ感染を予防もしくは処置するために、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとの任意の組み合わせで使用され得る。
【０５３４】
さらなるＮＲＴＩは、ＬＯＤＥＮＯＳＩＮＥ（商標）（Ｆ−ｄｄＡ；酸安定性アデノシンＮＲＴＩ；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ；ＣＯＶＩＲＡＣＩＬ（商標）（エムトリシタビン／ＦＴＣ；構造的にラミブジン（３ＴＣ）に関連するが、体外で３〜１０倍より大きな活性を有する；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）；ｄＯＴＣ（ＢＣＨ−１０６５２もまた構造的にラミブジンに関連するが、ラミブジン耐性単離物の実質的比率に対して、活性を保持する；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａ）；アデフォビル（ＦＤＡにより抗ＨＩＶ治療に対する認可を拒絶された；Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＰＲＥＶＥＯＮ（登録商標）（Ａｄｅｆｏｖｉｒ  Ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ、アデフォビルの活性プロドラッグ；その活性形態はＰＭＥＡ−ｐｐである）；ＴＥＮＯＦＯＶＩＲ（商標）（ｂｉｓ−ＰＯＣＰＭＰＡ、ＰＭＰＡプロドラッグ；Ｇｉｌｅａｄ）；ＤＡＰＤ／ＤＸＧ（ＤＡＰＤの活性代謝物；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）；Ｄ−Ｄ４ＦＣ（３ＴＣに関連する、ＡＺＴ／３ＴＣ耐性ウイルスに対抗する活性を有する）；ＧＷ４２０８６７Ｘ（ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅ）；ＺＩＡＧＥＮ（商標）（アバカビル／１５９Ｕ８９；ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅＩｎｃ．）；ＣＳ−８７（３’アジド−２’、３’−ジデオキシウリジン；国際公開第ＷＯ９９／６６９３６号）；およびβ−Ｌ−ＦＤ４Ｃおよびβ−Ｌ−ＦｄｄＣ（国際公開第ＷＯ９８／１７２８１号）のＳ−アシル−２−チオエチル（ＳＡＴＥ）をもたらすプロドラッグ形態を含む。
【０５３５】
さらなるＮＮＲＴＩとしては、ＣＯＡＣＴＩＮＯＮ（商標）（エンビリン／ＭＫＣ−４４２、ＨＥＰＴクラスの強力なＮＮＲＴＩ；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）；ＣＡＰＲＡＶＩＲＩＮＥ（商標）（ＡＧ−１５４９／Ｓ−１１５３、Ｋ１０３Ｎ変異体を含むウイルスに対する活性を有する次世代のＮＮＲＴＩ；Ａｇｏｕｒｏｎ）；ＰＮＵ−１４２７２１（前駆体（デラビルジン）よりも２０〜５０倍大きな活性を有し、そしてＫ１０３Ｎ変異体に対して活性である；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）；ＤＰＣ−９６１およびＤＰＣ−９６３（エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）の第２世代誘導体、Ｋ１０３Ｎ変異を有するウイルスに対して活性であるように設計される；ＤｕＰｏｎｔ）；ＧＷ−４２０８６７Ｘ（ＨＢＹ０９７よりも２５倍大きな活性を有し、そしてＫ１０３Ｎ変異体に対して活性である；Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）；ＣＡＬＡＮＯＬＩＤＥＡ（ラテックスの木由来の天然に存在する薬剤；Ｙ１８１ＣおよびＫ１０３Ｎ変異のいずれかまたは両方を含むウイルスに対して活性）；ならびにプロポリス（国際公開第ＷＯ９９／４９８３０号）が挙げられる。
【０５３６】
さらなるプロテアーゼ阻害剤としては、ＬＯＰＩＮＡＶＩＲ（商標）（ＡＢＴ３７８／ｒ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；ＢＭＳ−２３２６３２（アザペプチド；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｒｅｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）；ＴＩＰＲＡＮＡＶＩＲ（商標）（ＰＮＵ−１４０６９０、非消化性ジヒドロピロン；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）；ＰＤ−１７８３９０（非ペプチド性ジヒドロピロン；Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）；ＢＭＳ２３２６３２（アザペプチド；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）；Ｌ−７５６，４２３（インジナビルアナログ；Ｍｅｒｃｋ）；ＤＭＰ−４５０（環状尿素化合物；Ａｖｉｄ  ＆  ＤｕＰｏｎｔ）；ＡＧ−１７７６（プロテアーゼ阻害剤耐性ウイルスに対する体外活性を有するペプチド模倣物；Ａｇｏｕｒｏｎ）；ＶＸ−１７５／ＧＷ−４３３９０８（アンプレナビルのリン酸プロドラッグ；Ｖｅｒｔｅｘ  ＆  Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｃｏｍｅ）；ＣＧＰ６１７５５（Ｃｉｂａ）；ならびにＡＧＥＮＥＲＡＳＥ（商標）（アンプレナビル；Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。
【０５３７】
さらなる抗レトロウイルス剤としては、融合阻害剤／ｇｐ４１結合剤が挙げられる。融合阻害剤／ｇｐ４１結合剤としては、Ｔ−２０（その休止状態にてｇｐ４１に結合し、融合誘導状態への形質転換を阻止するＨＩＶ  ｇｐ４１膜貫通型タンパク質の外部ドメインの６４３〜６７８残基に由来するペプチド；Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）ならびにＴ−１２４９（第２世代融合阻害剤；Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）が挙げられる。
【０５３８】
さらなる抗レトロウイルス剤は、融合阻害剤／ケモカイン受容体アンタゴニストを含む。融合阻害剤／ケモカイン受容体アンタゴニストとしては、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、例えば、ＡＭＤ３１００（バイサイクラム（ｂｉｃｙｃｌａｍ））、ＳＤＦ−１およびそのアナログ、ならびにＡＬＸ４０−４Ｃ（カチオン性ペプチド）、Ｔ２２（１８個のアミノ酸のペプチド；Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）およびＴ２２アナログＴ１３４およびＴ１４０；ＣＣＲ５アンタゴニスト、例えば、ＲＡＮＴＥＳ（９−６８）、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＡＫ−７７９；ならびにＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、例えば、ＮＳＣ６５１０１６（ジスタマイシンアナログ）が挙げられる。ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ３、およびＣＣＲ６アンタゴニストも含む。ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β等のケモカイン受容体アゴニストもまた、融合を阻害し得る。
【０５３９】
さらなる抗レトロウイルス剤は、インテグラーゼ阻害剤を含む。インテグラーゼ阻害剤としては、ジカフェオイルキナ酸（ＤＦＱＡ）；Ｌ−チコリ酸（ジカフェオイル酒石酸（ＤＣＴＡ））；キナリザリン（ＱＬＣ）および関連するアントラキノン；ＺＩＮＴＥＶＩＲ（商標）（ＡＲ  １７７、真性インテグラーゼ阻害剤としてよりも細胞表面で作用すると考えられるオリゴヌクレオチド；Ａｒｏｎｄｅｘ）；ならびにナフトール（例えば、国際公開第ＷＯ９８／５０３４７号に開示されるもの）が挙げられる。
【０５４０】
さらなる抗レトロウイルス剤としては、ヒドロキシ尿素様化合物、例えば、ＢＣＸ−３４（プリンヌクレオチドホスホリラーゼ阻害剤；Ｂｉｏｃｒｙｓｔ）；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤、例えば、ＤＩＤＯＸ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ）；イノシンモノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）阻害剤、例えば、ＶＸ−４９７（Ｖｅｒｔｅｘ）；およびミコフェノール酸、例えば、ＣｅｌｌＣｅｐｔ（ミコフェノラートモフェチル；Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。
【０５４１】
さらなる抗レトロウイルス剤としては、ウイルスインテグラーゼの阻害剤、ウイルスゲノム核転座の阻害剤、例えば、アリーレンビス（メチルケトン）化合物；ＨＩＶ侵入の阻害剤、例えば、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ−ＩｇＧ融合タンパク質、ＲＡＮＴＥＳおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の可溶性複合体、ならびにＡＭＤ−３１００；ヌクレオカプシドジンクフィンガ−阻害剤、例えば、ジチアン化合物；ＨＩＶ  ＴａｔおよびＲｅｖの標的；ならびに薬学的エンハンサー、例えば、ＡＢＴ−３７８が挙げられる。
【０５４２】
他の抗レトロウイルス治療剤および補助治療剤としては、サイトカインおよびリンホカイン、例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＳＤＦ−１α、ＩＬ−２、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）（アルデスロイキン／Ｌ２−７００１；Ｃｈｉｒｏｎ）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１３；インターフェロン、例えば、ＩＦＮ−アルファ２ａ、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、またはＩＦＮ−ベータ；ＴＮＦ、ＮＦκＢ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１０のアンタゴニスト；免疫活性を調節する薬剤、例えば、シクロスポリンおよびプレドニゾン；ワクチン、例えば、Ｒｅｍｕｎｅ（商標）（ＨＩＶ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）、ＡＰＬ４００−００３（Ａｐｏｌｌｏｎ）、組換えｇｐ１２０およびフラグメント、二価（Ｂ／Ｅ）組換えエンベロープ糖タンパク質、ｒｇｐ１２０ＣＭ２３５、ＭＮ  ｒｇｐ１２０、ＳＦ−２  ｒｇｐ１２０、ｇｐ１２０／可溶性ＣＤ４複合体、デルタＪＲ−ＦＬタンパク質、不連続ｇｐ１２０Ｃ３／Ｃ４ドメインに由来する分岐合成ペプチド、融合−コンピテント免疫原およびＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、およびＴａｔワクチン；遺伝子に基づく治療、例えば、遺伝子抑制エレメント（ＧＳＥ；国際公開第ＷＯ９８／５４３６６号）、およびイントラカイン（新しく合成されたＣＣＲ５の表面発現を阻害するために、ＥＲに標的化された遺伝子修飾ＣＣケモカイン（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ９４：１１５６７−７２（１９９７）、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１１０−１６（１９９７））；抗体、例えば、抗−ＣＸＣＲ４抗体１２Ｇ５、抗−ＣＣＲ５抗体２Ｄ７、５Ｃ７、ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２、およびＰＡ１４、抗−ＣＤ４抗体Ｑ４１２０およびＲＰＡ−Ｔ４、抗−ＣＣＲ３抗体７Ｂ１１、抗−ｇｐ１２０抗体１７ｂ、４８ｄ、４４７−５２Ｄ、２５７−Ｄ、２６８−Ｄおよび５０．１、抗−Ｔａｔ抗体、抗−ＴＮＦ−α抗体、およびモノクローナル抗体３３Ａ；アリール炭素水素（ＡＨ）受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、例えば、ＴＣＤＤ、３，３’，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、３，３’，４，４’−テトラクロロビフェニル、およびα−ナフトフラボン（国際公開第ＷＯ９８／３０２１３号）；ならびに抗酸化剤、例えば、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエチルエステル（ｙ−ＧＣＥ；国際公開第ＷＯ９９／５６７６４号）が挙げられる。
【０５４３】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、１つ以上の抗ウイルス剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る抗ウイルス剤は、アシクロビル、リバビリン、リバビリンアナログ、アマンタジン、レマンチジン、マクサミン（ｍａｘａｍｉｎｅ）、またはチマルファシンが挙げられるが、これらに限定されない。特に、インターフェロンアルブミン融合タンパク質は、任意のこれらの薬剤と組み合わせて投与され得る。さらに、インターフェロンアルファアルブミン融合タンパク質も、任意のこれらの薬剤と共に投与され得、および好ましくは、インターフェロンアルファ２ａまたは２ｂアルブミン融合タンパク質が任意のこれらの薬剤と共に投与され得る。さらに、インターフェロンベータアルブミン融合タンパク質も、任意のこれらの薬剤と共に投与され得る。さらに、任意のＩＦＮハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、任意のこれらの薬剤と組み合わせて投与され得る。
【０５４４】
最も好ましい実施形態において、本発明のインターフェロンアルブミン融合タンパク質は、リバビリンまたはリバビリンアナログと組み合わせて投与される。好ましい実施形態において、インターフェロンアルブミン融合タンパク質と組み合わせて投与され得るリバビリンまたはリバビリンアナログとしては、ＣＯＰＥＧＵＳ（登録商標）（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，Ｎ．Ｊ．）、ＲＥＢＥＴＯＬ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，Ｎ．Ｊ．）、ＶＩＲＡＺＯＬＥ（登録商標）（Ｖａｌｅａｎｔ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）、ＲＩＢＡＶＩＮ（商標）（Ｌｕｐｉｎ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）、ＲＩＢＡＺＩＤ（商標）（Ｅｐｌａ，Ｋｉｒａｃｈｉ，Ｐａｋｉｓｔａｎ）、トリバビリン、ＶＩＲＡＭＩＤＩＮＥ（商標）（Ｖａｌｅａｎｔ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）、およびＲＩＢＡＳＰＨＥＲＥ（商標）（Ｔｈｒｅｅ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃｒａｎｂｅｒｒｙ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，ＰＡ）が挙げられる。さらに好ましい実施形態において、インターフェロンアルファアルブミン融合タンパク質は、リバビリンまたはリバビリンアナログと組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態において、インターフェロンアルファ２ａアルブミン融合タンパク質は、リバビリンまたはリバビリンアナログと組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態において、インターフェロンアルファ２ｂアルブミン融合タンパク質は、リバビリンまたはリバビリンアナログと組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態において、インターフェロンベータアルブミン融合タンパク質は、リバビリンまたはリバビリンアナログと組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態において、ハイブリッドインターフェロンアルブミン融合タンパク質は、リバビリンまたはリバビリンアナログと組み合わせて投与される。
【０５４５】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ウイルス感染の処置のために、単独または１つ以上の抗ウイルス剤と組み合わせて投与され得る。好ましい実施形態において、本発明のインターフェロンアルブミン融合タンパク質は、１つ以上の抗ウイルス剤と組み合わせて投与され得る。さらなる好ましい実施形態において、ウイルス感染は、肝炎ウイルスの感染から生じる。最も好ましい実施形態において、肝炎ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る抗ウイルス剤としては、ウイルス酵素の小分子阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼの小分子阻害剤、核酸ベースの抗ウイルス剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、チアゾライド（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｅ）、新免疫調節剤、およびインターフェロンエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る抗ウイルス酵素阻害剤としては、ＶＸ−９５０（プロテアーゼ阻害剤、Ｖｅｒｔｅｘ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＶＸ−４９７（メリメポディブ（ｍｅｒｉｍｅｐｏｄｉｂ）、経口ＩＭＰＤＨ阻害剤、Ｖｅｒｔｅｘ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ＢＩＬＢ  １９４１（プロテアーゼ阻害剤、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＳＣＨ７（プロテアーゼ阻害剤、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，Ｎ．Ｊ．）、ＭＸ−３２５３（グルコシダーゼ阻害剤、Ｍｉｇｅｎｉｘ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）、ＩＤＮ−６５５６（カスパーゼ阻害剤、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ＵＴ２３１Ｂ（グルコシダーゼ阻害剤、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）、Ｒ１６２６（ウイルスプロテアーゼ阻害剤、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＩＴＭＮ−Ｂ（ＩＴＭＮ−１９１、プロテアーゼ阻害剤、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ，Ｂｒｉｓｂａｎｅ，ＣＡ）、セルゴシビル（Ｃｅｌｇｏｓｉｖｉｒ）（ＭＢＩ−３２５３、α−グルコシダーゼ阻害剤、Ｍｉｇｅｎｉｘ，  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂ．Ｃ．）、ＳＣＨ  ５０３０３４（プロテアーゼ阻害剤、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＣＨ  ８０６（ＧＳ９１３２、経口プロテアーゼ阻害剤、Ａｃｈｉｌｌｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ／Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤は、ヌクレオシドアナログまたは非ヌクレオシド阻害剤（ＮＮＩ）であり得る。好ましい実施形態において、抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤は、ＨＣＶ  ＲＮＡポリメラーゼを阻害する。一実施形態において、抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤は、ＮＭ２８３（２３’−Ｃ−メチル−シチジンの経口プロドラッグ、Ｉｄｅｎｉｘ，Ｃａｍｂｒｉｄｅ，ＭＡ）および２’−Ｃ−メチルヌクレオシドが挙げられるが、これらに���定されないヌクレオシドアナログであり得る。別の実施形態において、抗ウイルスポリメラーゼ阻害剤は、ＪＴＫ−１０３、ＪＴＫ−００３、およびＪＴＫ−１０９（Ｊａｐａｎ  Ｔａｂａｃｃｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、Ｒ８０３（Ｒｉｇｅｌ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ＨＣＶ−３７１、ＨＣＶ−０８６、およびＨＣＶ−７９６（ＶｉｒｏＰｈａｒｍ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ／Ｗｙｅｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ）、およびＸＴＬ−２１２５（ＢＣ２１２５、ＸＴＬｂｉｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これらに限定されない非ヌクレオシド阻害剤であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る抗ウイルス核酸ベースの薬剤としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、およびｓｉＲＮＡまたは短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る抗ウイルスアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤としては、ＮＥＵＧＥＮＥ（登録商標）ＡＶＩ−４０６５（ＡＶＩ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）が挙げられるが、これに限定されない。別の実施形態において、チアゾライド（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｅ）は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る。好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るチアゾライド（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｅ）は、ＡＬＩＮＩＡ（登録商標）（ニタゾキサニド、Ｒｏｍａｒｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌ．Ｃ．，Ｔａｍｐａ，ＦＬ）が挙げられるが、これに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る抗ウイルス免疫調節剤としては、ＺＡＤＸＩＮ（登録商標）（サイモシンアルファ１、サイマルアシン（ｔｈｙｍａｌｆａｓｉｎ）、ＳｃｉＣｌｏｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｔ’ｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ）、ならびにＡＮＡ２４５（ＴＬＲ−７アゴニスト、Ａｎａｄｙｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＡＮＡ９７５（ＡＮＡ２４５の経口プロドラッグ、Ａｎａｄｙｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＣＰＧ−１０１０１（ＡＣＴＩＬＯＮ（商標）、ＴＬＲ−９アゴニスト、Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されないトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るインターフェロンエンハンサーとしては、ＥＭＺ７０２（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）が挙げられるが、これに限定されない。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る抗ウイルス抗体としては、Ｔａｒｖａｃｉｎ（腫瘍内皮細胞の表面��にホスファチジルセリンを標的化するヒト化モノクローナル抗体、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｓｔｉｎ，ＣＡ）が挙げられるが、これに限定されない。
【０５４６】
好ましい実施形態において、単独または本発明により包含される１つ以上の抗ウイルス剤と組み合わせて投与され得るアルブミン融合タンパク質は、インターフェロンアルブミン融合タンパク質である。さらなる実施形態において、インターフェロンアルブミン融合タンパク質のインターフェロン部分は、インターフェロンアルファである。本発明により包含されるインターフェロンアルファの非限定的な例としては、表１の治療用タンパク質の列に開示されるインターフェロンアルファタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、インターフェロンアルファ部分は、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ｃ、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンアルファ−ｎｌ、インターフェロンアルファ−ｎ３、インターフェロンアルファの任意の商業的に入手可能な形態、例えば、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，Ｎ．Ｊ．）、ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）Ａ（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，Ｎ．Ｊ．）、Ｂｅｒｏｆｏｒアルファインターフェロン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｄｇｅｆｉｅｄ，Ｃｏｎｎ．）、ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（商標）（Ｖｉｒａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．，Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＦＬ）、ＭＵＬＴＩＦＥＲＯＮ（商標）（Ｖｉｒａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＦＬ）ＷＥＬＬＦＥＲＯＮ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔｉａｎ）、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄｓ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＳＵＭＩＦＥＲＯＮ（登録商標）（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ，Ｊａｐａｎ）、ＢＥＬＥＲＯＦＯＮ（登録商標）（Ｎａｕｔｉｌｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＭＡＸＹ−ＡＬＰＨＡ（商標）（Ｍａｘｙｇｅｎ，Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ／Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，Ｎ．Ｊ．）、または任意の精製インターフェロンアルファ産物もしくはそのフラグメントからなる、または代替として、それらを含む。さらなる実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質のインターフェロンアルファ部分は、持続放出、または制御放出に対して修飾された、または処方されたインターフェロンアルファからなる、または代替として、それらを含む。例えば、インターフェロンアルファ部分は、インターフェロンアルファ−ＸＬ（Ｆｌａｍｅｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＬＯＣＴＥＲＯＮ（商標）（ＢｉｏＬｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／ＯｃｔｏＰｌｕｓ，Ｐｉｔｔｓｂｏｒｏ，ＮＣ）が挙げられるが、これらに限定されない、商業的に入手可能である持続放出、または制御放出インターフェロンアルファからなる、または代替として、それらを含む。さらなる実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質のインターフェロンアルファ部分は、化学的部分の結合により修飾されてもよい。例えば、インターフェロンアルファ部分はペグ化により修飾されてもよい。したがって、さらなる実施形態において、ＩＦＮ−アルファ−ＨＳＡ融合タンパク質のインターフェロンアルファ部分は、インターフェロンアルファ−２ａ、２ｂ、またはコンセンサスインターフェロンのペグ化形態からなる、または代替として、それらを含み、商業的に入手可能であるペグ化インターフェロンアルファ、例えば、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，Ｎ．Ｊ．）、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，Ｎ．Ｊ．）、ＰＥＧ−ＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（商標）（Ｖｉｒａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＦＬ）またはそのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質のインターフェロンアルファ部分は、インターフェロンアルファ２ａまたは２ｂインターフェロンであり、インターフェロンアルブミン融合タンパク質は、これらの薬剤と組み合わせて投与され得る。さらに、別の実施形態において、インターフェロンアルブミン融合タンパク質のインターフェロンアルファ部分は、インターフェロンベータまたはインターフェロンハイブリッドである。さらなる実施形態において、インターフェロンアルブミン融合タンパク質の非融合インターフェロン部分は、単独または本発明により包含される１つ以上の抗ウイルス剤と組み合わせて使用され得る。
【０５４７】
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗日和見感染剤と組み合わせて投与され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る抗日和見感染剤としては、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ（商標）、ダプソン（商標）、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥ（商標）、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ（商標）、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ（商標）、ＲＩＦＡＭＰＩＮ（商標）、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ（商標）、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ（商標）、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ（商標）、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ（商標）、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ（商標）、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ（商標）、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ（商標）、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲ（商標）、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）、ケトコナゾール（商標）、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ（商標）、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲ（商標）、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥ（商標）、ロイコボリン（商標）、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（商標）（フィルグラスチム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥ（商標）（サルグラスチム／ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見ニューモサイティスカリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）肺炎感染を予防的処置または予防するために、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ（商標）、ダプソン（商標）、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥ（商標）、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ（登録商標）と任意に組み合わせて用いられる。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見マイコバクテリウムアビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）複合感染を予防的処置または予防するために、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ（商標）、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ（商標）、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥＴＭ（商標）、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ（商標）と任意に組み合わせて用いられる。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）結核菌感染を予防的処置または予防するために、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ（商標）、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ（商標）、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ（商標）と任意に組み合わせて用いられる。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見サイトメガロウイルス感染を予防的処置または予防するために、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ（商標）、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ（商標）、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲ（商標）と任意に組み合わせて用いられる。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見真菌感染を予防的処置または予防するために、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）、および／またはケトコナゾール（商標）と任意に組み合わせて��いられる。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見単純ヘルペスウイルスＩ型および／またはＩＩ型感染を予防的処置または予防するために、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ（商標）および／またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲ（商標）と任意に組み合わせて用いられる。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見トキソプラスマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）感染を予防的処置または予防するために、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥ（商標）および／またはロイコボリン（商標）と任意に組み合わせて用いられる。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見細菌感染を予防的処置または予防するために、ロイコボリン（商標）および／またはＮＥＵＰＯＧＥＮ（商標）と任意に組み合わせて用いられる。
【０５４８】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗生物質製剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る抗生物質製剤は、アモキシシリン、ベータ−ラクタマーゼ、アミノグリコシド、ベータ−ラクタム（グリコペプチド）、ベータ−ラクタマーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン、マクロライド、メトロニダゾール、ペニシリン、キノロン、ラパマイシン、リファンピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、およびバンコマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５４９】
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、免疫賦活剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る免疫賦活剤としては、レバミゾール（例えば、ＥＲＧＡＭＩＳＯＬ（商標））、イソプリノシン（例えば、ＩＮＯＳＩＰＬＥＸ（商標））、インターフェロン（例えば、インターフェロンアルファ）、およびインターロイキン（例えば、ＩＬ−２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５５０】
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、免疫抑制剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る免疫抑制剤は、ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスホアミドメチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスペルグアリン、およびＴ細胞に応答する機能を抑制することにより作用する他の免疫抑制剤が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る他の免疫抑制剤は、プレドニゾロン、メトトレキセート、サリドマイド、メトキサレン、ラパマイシン、レフルノミド、ミゾリビン（ＢＲＥＤＩＮＩＮ（商標））、ブレキナル、デオキシスペルグアリン、およびアザスピラン（ＳＫＦ１０５６８５）、ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥＯＫＴ（登録商標）３（ムロモナブ−ＣＤ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ（商標）、ＮＥＯＲＡＬ（商標）、ＳＡＮＧＤＹＡ（商標）（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦ（登録商標）（ＦＫ５０６、タクロリムス）、ＣＥＬＬＣＥＰＴ（登録商標）（ミコフェノラートモテフィル、その活性代謝物はミコフェノール酸である）、ＩＭＵＲＡＮ（商標）（アザチオプリン）、グルココルチコステロイド、副腎皮質ステロイド（例えば、ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標）（プレドニゾン）およびＨＹＤＥＬＴＲＡＳＯＬ（商標）（プレドニゾロン））、ＦＯＬＥＸ（商標）およびＭＥＸＡＴＥ（商標）（メトトレキサート）、ＯＸＳＯＲＡＬＥＮ−ＵＬＴＲＡ（商標）（メトトレキサレン）ならびにＲＡＰＡＭＵＮＥＴＭ（シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、免疫抑制剤は、臓器または骨髄移植の拒絶を予防するために使用され得る。
【０５５１】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独または１つ以上の静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物は、ＧＡＭＭＡＲ（商標）、ＩＶＥＥＧＡＭ（商標）、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮ（商標）、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤＳ／Ｄ（商標）、ＡＴＧＡＭ（商標）（抗胸腺細胞グロブリン）、およびＧＡＭＩＭＵＮＥ（商標）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、移植療法（例えば、骨髄移植）において静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
【０５５２】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、癌の治療のために、患者に生体内、あるいは細胞に体外のいずれかにおいて、単独で、または組み合わせ治療の一部として投与される。特定の実施形態において、アルブミン融合タンパク質、特に、ＩＬ−２−アルブミン融合は、Ｄｕｄｌｅｙら  （Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，１９  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００２、ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓ．ｏｒｇにて、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）において記載されるように、転移性メラノーマのための養子細胞移植療法等の、癌のための受動的免疫療法の間、繰り返し投与される。
【０５５３】
ある実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独または抗炎症剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る抗炎症剤としては、コルチコステロイド（例えば、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、およびトリアムシノロン）、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フロクタフェニン、フルルビプロフェン、イビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸、およびトルメチン）、ならびに抗ヒスタミン剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセプロール、ピラニリン、ペリソキサ−ル、ピホキシム、プロクァゾン、プロキサゾール、およびテニダップが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５５４】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独または血管新生阻害剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る血管新生阻害剤としては、アンジオスタチン（Ｅｎｔｒｅｍｅｄ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、トロポニン−１（ＢｏｓｔｏｎＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、抗侵襲因子、レチノイン酸およびその誘導体、パクリタキセル（タキソール）、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織阻害剤、メタロプロテイナーゼ−２の組織阻害剤、ＶＥＧＩ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−２、および様々な形態の軽い「ｄ族」遷移金属が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５５５】
軽い「ｄ族」遷移金属としては、例えば、バナジウム、モリブデン、タングステン、チタニウム、ニオブ、およびタンタルの種が挙げられる。このような遷移金属種は、遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の好適な錯体としては、オキソ遷移金属錯体が挙げられる。
【０５５６】
バナジウム錯体の代表的な例としては、例えば、バナジン酸塩およびバナジル錯体等のオキソバナジウム錯体が挙げられる。好適なバナジン酸塩錯体としては、例えば、アンモニウムメタバナジン酸塩、ナトリウムメタバナジン酸塩、およびナトリウムオルトバナジン酸塩等のメタバナジン酸塩およびオルトバナジン酸塩錯体が挙げられる。好適なバナジル錯体としては、例えば、バナジルアセチルアセトナート、ならびに硫酸バナジル一および三水和物等の硫酸バナジル水和物を含む硫酸バナジルが挙げられる。
【０５５７】
タングステンおよびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯体が挙げられる。好適なオキソタングステン錯体としては、タングステン酸および酸化タングステン錯体が挙げられる。好適なタングテン酸錯体としては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水和物、およびタングステン酸が挙げられる。適切な酸化タングステンとしては、酸化タングステン（ＩＶ）および酸化タングステン（ＶＩ）が挙げられる。好適なオキソモリブデン錯体としては、モリブデン酸錯体、モリブデンオキシド錯体、およびモリブデニル錯体が挙げられる。好適なモリブデン酸錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙げられる。好適な酸化モリブデンとしては、酸化モリブデン（ＶＩ）、酸化モリブデン（ＶＩ）、およびモリブデン酸が挙げられる。好適なモリブデニル錯体としては、例えば、モリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他の好適なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えば、グリセロール、酒石酸、および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。
【０５５８】
広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の文脈において利用され得る。代表的な例としては、血小板因子４；硫酸プロタミン；硫酸化キチン誘導体（ズワイガニの殻から調製）、（Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＣａｎｖｅｒＲｅｓ．５１：２２−２６，（１９９１））；硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、エストロゲン等のステロイドおよびタモキシフェンクエン酸塩の存在により増強され得る）；スタウロスポリン；マトリックス代謝物の修飾因子、例えば、プロリンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ、Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、アルファ、アルファ−ジピリジル、アミノプロピオニトリルフマル酸塩を含む；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキセート；ミトキサントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１−１７３２６，（１９９２））；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．２８６：４７５４８０，（１９９２））；シクロデキストリンテトラデカサルフェート；エポネマイシン；カンプトテシン；フマギリン（Ｉｎｇｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５５−５５７，（１９９０））；金チオリンゴ酸ナトリウム（「ＧＳＴ」；Ｍａｔｓｕｂａｒａ  ａｎｄ  Ｚｉｆｆ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０−１４４６，（１９８７））；抗コラゲナーゼ−血清；アルファ２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（４）：１６５９−１６６４，（１９８７））；ビサントレン（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸二ナトリウムまたは「ＣＣＡ」；（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３６：３１２−３１６，（１９９２））；およびＢＢ９４等のメタロプロテイナーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５５９】
本発明の文脈において利用され得るさらなる抗血管新生因子としては、サリドマイド、（Ｃｅｌｇｅｎｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ）；アンジオスタティックステロイド；ＡＧＭ−１４７０（Ｈ．Ｂｒｅｍ  ａｎｄ  Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２８：４４５−５１（１９９３））；インテグリンアルファｖベータ３アンタゴニスト（Ｃ．Ｓｔｏｒｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：４７−５４（１９９９））；カルボキシアミノールミダゾール；カルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ｃｏｎｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ  Ａ−４（ＣＡ４Ｐ）（ＯＸｉＧＥＮＥ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；スクアラミン（Ｍａｇａｉｎｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）；ＴＮＰ４７０，（Ｔａｐ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）；ＺＤ−０１０１  ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）；ＡＰＲＡ（ＣＴ２５８４）；ベネフィン，バイロスタチン−１（ＳＣ３３９５５５）；ＣＧＰ−４１２５１（ＰＫＣ４１２）；ＣＭ１０１；デクスラゾキサン（ＩＣＲＦ１８７）；ＤＭＸＡＡ；エンドスタチン；フラボプリジオール；ゲネステイン；ＧＴＥ；ＩｍｍＴｈｅｒ；イレッサ（ＺＤ１８３９）；オクトレオチド（ソマトスタチン）；パンレチン；ペナシルアミン；フォトポイント；ＰＩ−８８；プリノマスタット（ＡＧ−３３４０）プルリチン；スラディスカ（ＦＣＥ２６６４４）；タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）；タザロテン；テトラチオモリブデン酸；ゼロ−ダ（カペシタビン）；および５−フルオロウラシルを含む。
【０５６０】
本発明の化合物と組み合わせて投与され得る血管新生阻害剤は、様々な機序を通じて作用し得、これらの機序としては、細胞外マトリックスのタンパク質分解の阻害、増殖因子等の血管新生誘導因子の機能を拮抗することによる内皮細胞−細胞外マトリックス接着分子の機能のブロック、および増殖性内皮細胞において発現されるインテグリン受容体の阻害が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックスタンパク質分解を妨害し、そして本発明の組成物と組み合わせて投与され得る血管新生阻害剤の例としては、ＡＧ−３３４０（Ａｇｏｕｒｏｎ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ＢＡＹ−１２−９５６６（Ｂａｙｅｒ，Ｗｅｓｔ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）、ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、ＣＧＳ−２７０３２Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ）、Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）、およびＭｅｔａｓｔａｔ（Ａｅｔｅｒｎａ，Ｓｔ−Ｆｏｙ，Ｑｕｅｂｅｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。内皮細胞−細胞外マトリックス接着分子の機能をブロックすることにより作用し、そして本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗血管新生阻害剤の例としては、ＥＭＤ−１２１９７４（Ｍｅｒｃｋ  ＫｃｇａＡ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＶｉｔａｘｉｎ（Ｉｘｓｙｓ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。血管新生誘導因子と直接拮抗するか、またはこの誘導因子を阻害することにより作用し、そして本発明の組成物と組み合わせて投与され得る血管新生阻害剤の例としては、Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）、抗ＶＥＧＦ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓ．ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ＰＴＫ−７８７／ＺＫ−２２５８４６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＳＵ−１０１（Ｓｕｇｅｎ，Ｓ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ＳＵ−５４１６（Ｓｕｇｅｎ／ＰｈａｒｍａｃｉａＵｐｊｏｈｎ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）、およびＳＵ−６６６８（Ｓｕｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の血管新生阻害剤は、血管新生を間接的に阻害するように作用する。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る血管新生の間接的阻害剤の例としては、ＩＭ−８６２（Ｃｙｔｒａｎ，Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ）、インターフェロン−α、ＩＬ−１２（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）、およびペントサンポリスルフェート（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６１】
特定の実施形態において、血管新生阻害剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、自己免疫疾患（例えば、本明細書に記載の自己免疫疾患）の処置、予防、および／または改善のために企図される。
【０５６２】
特定の実施形態において、血管新生阻害剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、関節炎の処置、予防、および／または改善のために企図される。さらに特定の実施形態において、血管新生阻害剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、関節リウマチの処置、予防、および／または改善のために企図される。
【０５６３】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、血管新生タンパク質または血管新生タンパク質をコードするポリヌクレオチドと組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る血管新生タンパク質の例としては、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−３、上皮増殖因子アルファおよびベータ、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子アルファ、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、ならびに一酸化窒素シンターゼが挙げられるがこれらに限定されない。
【０５６４】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、化学治療剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る化学治療剤としては、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、シクロホスファミドイホスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）、およびクロランブシル）、エチレンイミン類およびメチルメラミン類（例えば、ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート類（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア類（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、およびストレプトゾシン（ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ））、トリアゼン類（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド））、葉酸アナログ（例えば、メトトレキサート（アメトプテリン））、ピリミジンアナログ（例えば、フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロクスウリジン（Ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）（フルオロデオキシウリジン；ＦｕｄＲ）、およびシタラビン（シトシンアラビノシド））、プリンアナログおよび関連阻害剤（例えば、メルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）、およびペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）））、ビンカアルカロイド類（例えば、ビンブラスチン（ＶＬＢ、硫酸ビンブラスチン））およびビンクリスチン（硫酸ビンクリスチン））、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ）、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、生物学的応答改変剤（例えば、インターフェロン−アルファおよびインターフェロン−アルファ−２ｂ）、白金配位化合物（例えば、シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）およびカルボプラチン）、アントラセンジオン（ミトキサントロン）、置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン；ＭＩＨ）、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、エストラジオール、およびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（テストステロンプロプリオネート（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）、およびフルオキシメステロン）、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド）、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ（例えば、ロイプロリド）、他のホルモンおよびホルモンアナログ（例えば、メチルテストステ���ン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、クロロトリアニセン、およびテストラクトン）、ならびにその他（例えば、ジカルバジン、グルタミン酸、およびミトタン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６５】
一実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上の以下の薬剤：インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標）Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｉｎｃ．としても知られている）、トロカード（Ｒｏｃｈｅ，ＲＯ−３２−３５５５），レフルノミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｍａｒｉｏｎ  Ｒｏｕｓｓｅ１からのＡｒａｖａ（商標）としても知られている），Ｋｉｎｅｒｅｔ（商標）（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．からのＡｎａｋｉｎｒａとしても知られているＩＬ−１受容体アンタゴニスト）と組み合わせて投与される。
【０５６６】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）と組み合わせて、またはＣＨＯＰの１つ以上の成分との組み合わせで投与される。一実施形態において、本発明の組成物は、抗ＣＤ２０抗体（ヒトモノクローナル抗ＣＤ２０抗体）と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、抗ＣＤ２０抗体およびＣＨＯＰと組み合わせて、または抗ＣＤ２０抗体とＣＨＯＰの１つ以上の成分（特に、シクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）との任意の組み合わせで投与される。特定の実施形態において、本発明の組成物は、リツキシマブと組み合わせて投与される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、リツキシマブおよびＣＨＯＰと共に、またはリツキシマブとＣＨＯＰの１つ以上の成分（特に、シクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）との任意の組み合わせと共に投与される。特定の実施形態において、本発明の組成物は、トシツモマブと組み合わせて投与される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、トシツモマブおよびＣＨＯＰと共に、またはトシツモマブとＣＨＯＰの１つ以上の成分（特に、シクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）との任意の組み合わせと共に投与される。抗ＣＤ２０抗体は、必要に応じて、放射性同位元素、毒素または細胞毒性プロドラッグと会合し得る。
【０５６７】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）との組み合わせで投与される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）およびＣＨＯＰと共に、またはＺｅｖａｌｉｎ（商標）とＣＨＯＰの１つ以上の成分（特に、シクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）との任意の組み合わせと共に投与される。Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）は、１つ以上の放射性同位元素と会合し得る。特に好ましい同位体は、９０Ｙおよび１１１Ｉｎである。
【０５６８】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、サイトカインと組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、任意のインターロイキン（ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、およびＩＬ−２１が挙げられるが、これらに限定されない）と共に投与され得る。
【０５６９】
一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＴＮＦファミリーのメンバーと組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得るＴＮＦ、ＴＮＦに関連するまたはＴＮＦに類似する分子としては、ＴＮＦ−アルファ、リンホ毒素−アルファ（ＬＴ−アルファ、ＴＮＦ−ベータとしても知られている）、ＬＴ−ベータ（複合体ヘテロ三量体ＬＴ−アルファ２−ベータにて見出される）ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−ガンマ（国際公開第ＷＯ９６／１４３２８号）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号）、エンドカイン−アルファ（国際公開第ＷＯ９８／０７８８０号）、ＯＰＧ、およびニューロカイン−アルファ（国際公開第ＷＯ９８／１８９２１号、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）の可溶性形態、およびＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開第ＷＯ９６／３４０９５号）、ＤＲ３（国際公開第ＷＯ９７／３３９０４号）、ＤＲ４（国際公開第ＷＯ９８／３２８５６号）、ＴＲ５（国際公開第ＷＯ９８／３０６９３号）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開第ＷＯ９８／５６８９２号）、ＴＲ１０（国際公開第ＷＯ９８／５４２０２号）、３１２Ｃ２（国際公開第ＷＯ９８／０６８４２号）、およびＴＲ１２の可溶性形態、ならびにＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３の可溶性形態が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５７０】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、血管新生タンパク質と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る血管新生タンパク質としては、欧州特許出願第３９９８１６号に開示されるような神経膠腫誘導増殖因子（Ｇｉｌｉｏｍａ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）（ＧＤＧＦ）；欧州特許出願第６８２１１０号に開示されるような血小板誘導増殖因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許出願第２８２３１７号に開示されるような血小板誘導増殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開第ＷＯ９２／０６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるような胎盤増殖因子−２（ＰｌＧＦ−２）；国際公開第ＷＯ９０／１３６４９号に開示されるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許出願第５０６４７７号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開第ＷＯ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖因子−２（ＶＥＧＦ−２）；血管内皮増殖因子−Ｂ（ＶＥＧＦ−３）；国際公開第ＷＯ９６／２６７３６号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際公開第ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；国際公開第ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許第ＤＥ１９６３９６０１号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。上記の参考文献は、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０５７１】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、線維芽成長因子と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る線維芽成長因子は、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５７２】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、造血増殖因子と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る造血増殖因子としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）、ＬＥＵＫＩＮＥ（商標）、ＰＲＯＫＩＮＥ（商標））、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（フィルグラスチン（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（商標））、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１）エリトロポイエチン（エポエチンアルファ、ＥＰＯＧＥＮ（商標）、ＰＲＯＣＲＩＴ（商標））、幹細胞因子（ＳＣＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド、スチール因子（ｓｔｅｅｌ  ｆａｃｔｏｒ））、巨核球コロニー刺激因子、ＰＩＸＹ３２１（ＧＭＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質）、インターロイキン（特に、ＩＬ−１〜ＩＬ−１２のうちの任意の１つ以上）、インターフェロンガンマ、またはトロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５７３】
ある実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、アドレナリン作動遮断薬（例えば、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、カルテオロール、ラベタロール、メトプロロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、およびチモロール）と組み合わせて投与される。
【０５７４】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗不整脈薬（例えば、アデノシン、アミドアロン（ａｍｉｄｏａｒｏｎｅ）、ブレチリウム、ジギタリス、ジゴキシン、ジギトキシン、ジリアゼン（ｄｉｌｉａｚｅｍ）、ジソピラミド、エスモロール、フレカイニド、リドカイン、メキシレチン、モリシジン（ｍｏｒｉｃｉｚｉｎｅ）、フェニトイン、プロカインアミド、Ｎ−アセチルプロカインアミド、プロパフェノン、プロプラノロール、キニジン、ソタロール、トカイニド、およびベラパミル）と組み合わせて投与される。
【０５７５】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、利尿薬（例えば、カルボニックアンヒドラーゼ阻害剤（例えば、アセタゾラミド、ジクロルフェナミド、およびメタゾルアミド）、浸透圧性利尿薬（例えば、グリセリン、イソソルビド、マンニトール、および尿素）、Ｎａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−シンポートを阻害する利尿薬（例えば、フロセミド、ブメタニド、アゾセミド、ピレタニド、トリパミド、エタクリン酸、ムゾリミン、およびトルセミド）、チアジドおよびチアジド様利尿薬（例えば、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリコルメチアジド（ｔｒｉｃｈｏｒｍｅｔｈｉａｚｉｄｅ）、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン、およびキネサゾン（ｑｕｉｎｅｔｈａｚｏｎｅ））、カリウム保持性利尿薬（例えば、アミロライドおよびトリアムテレン）、ならびに鉱質コルチコイド受容体アンタゴニスト（例えば、スピロノラクトン、カンレノン、およびカンレノ酸カリウム）と組み合わせて投与される。
【０５７６】
一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のための処置と組み合わせて投与される。内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のための処置としては、１２７Ｉ、ヨウ素の放射性同位元素（例えば、１３１Ｉおよび１２３Ｉ）；組換え成長ホルモン（例えば、ＨＵＭＡＴＲＯＰＥ（商標）（組換えソマトロピン）；成長ホルモンアナログ（例えば、ＰＲＯＴＲＯＰＩＮ（商標）（ソマトレム））；ドーパミンアゴニスト（例えば、ＰＡＲＬＯＤＥＬ（商標）（ブロモクリプチン）；ソマトスタチンアナログ（例えば、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（商標）（オクトレオチド）；ゴナドトロピン調製物（例えば、ＰＲＥＧＮＹＬ（商標）、Ａ．Ｐ．Ｌ．（商標）およびＰＲＯＦＡＳＩ（商標）（絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ））、ＰＥＲＧＯＮＡＬ（商標）（メノトロピン）、およびＭＥＴＲＯＤＩＮ（商標）（尿性卵胞性刺激ホルモン（ｕＦＳＨ））；合成ヒトゴナドトロピン放出ホルモン調製物（例えば、ＦＡＣＴＲＥＬ（商標）およびＬＵＴＲＥＰＵＬＳＥ（商標）（塩酸ゴナドレリン）；合成ゴナドトロピンアゴニスト（例えば、ＬＵＰＲＯＮ（商標）（酢酸ロイプロリド）、ＳＵＰＰＲＥＬＩＮ（商標）（酢酸ヒストレリン（ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ  ａｃｅｔａｔｅ））、ＳＹＮＡＲＥＬ（商標）（酢酸ナファレリン）、およびＺＯＬＡＤＥＸ（商標）（酢酸ゴセレリン）；甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンの合成調製物（例えば，ＲＥＬＥＦＡＣＴ  ＴＲＨ（商標）およびＴＨＹＰＩＮＯＮＥ（商標）（プロチレリン）；組換えヒトＴＳＨ（例えば、ＴＨＹＲＯＧＥＮ（商標））；甲状腺ホルモンの天然異性体のナトリウム塩の合成調製物（例えば、Ｌ−Ｔ４（商標）、ＳＹＮＴＨＲＯＩＤ（商標）およびＬＥＶＯＴＨＲＯＩＤ（商標）（レボチロキシンナトリウム）、Ｌ−Ｔ３（商標）、ＣＹＴＯＭＥＬ（商標）、およびＴＲＩＯＳＴＡＴ（商標）（リオチロインナトリウム（ｌｉｏｔｈｙｒｏｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ））、およびＴＨＹＲＯＬＡＲ（商標）（リオトリックス））；抗甲状腺化合物（例えば、６−ｎ−プロピルチオウラシル（プロピルチオウラシル）、１−メチル−２−メルカプトイミダゾールおよびＴＡＰＡＺＯＬＥ（商標）（メチマゾール）、ＮＥＯ−ＭＥＲＣＡＺＯＬＥ（商標）（カルビマゾール）；ベータ−アドレナリン作動性受容体アンタゴニスト（例えば、プロプラノロールおよびエスモロール）；Ｃａ２＋チャネル遮断薬；デキサメタゾンおよびヨウ素化放射線造影剤（例えば、ＴＥＬＥＰＡＱＵＥ（商標）（ヨーパン酸（ｉｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））およびＯＲＡＧＲＡＦＩＮ（商標）（イポダートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｉｐｏｄａｔｅ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５７７】
内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のさらなる処置としては、エストロゲンまたは結合型エストロゲン（例えば、ＥＳＴＲＡＣＥ（商標）（エストラジオール）、ＥＳＴＩＮＹＬ（商標）（エチニルエストラジオール）、ＰＲＥＭＡＲＩＮ（商標）、ＥＳＴＲＡＴＡＢ（商標）、ＯＲＴＨＯ−ＥＳＴ（商標）、ＯＧＥＮ（商標）およびエストロピペート（ｅｓｔｒｏｐｉｐａｔｅ）（エストロン）、ＥＳＴＲＯＶＩＳ（商標）（キネストロール）、ＥＳＴＲＡＤＥＲＭ（商標）（エストラジオール）、ＤＥＬＥＳＴＲＯＧＥＮ（商標）およびＶＡＬＥＲＧＥＮ（商標）（吉草酸エストラジオール）、ＤＥＰＯ−ＥＳＴＲＡＤＩＯＬ  ＣＹＰＩＯＮＡＴＥ（商標）およびＥＳＴＲＯＪＥＣＴ  ＬＡ（商標）（サイピオン酸（ｃｙｐｉｏｎａｔｅ）エストラジオール））；抗エストロゲン（例えば、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（商標）（タモキシフェン）、ＳＥＲＯＰＨＥＮＥ（商標）およびＣＬＯＭＩＤ（商標）（クロミフェン）；プロゲスチン（例えば、ＤＵＲＡＬＵＴＩＮ（商標）（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン）、ＭＰＡ（商標）およびＤＥＰＯ−ＰＲＯＶＥＲＡ（商標）（酢酸メドロキシプロゲステロン）、ＰＲＯＶＥＲＡ（商標）およびＣＹＣＲＩＮ（商標）（ＭＰＡ）、ＭＥＧＡＣＥ（商標）（酢酸メゲストロール）、ＮＯＲＬＵＴＩＮ（商標）（ノルエチンドロン）、ならびにＮＯＲＬＵＴＡＴＥ（商標）およびＡＹＧＥＳＴＩＮ（商標）（酢酸ノルエチンドロン））；プロゲステロンインプラント（例えば、ＮＯＲＰＬＡＮＴ  ＳＹＳＴＥＭ（商標）（ノルゲストレルの皮下移植物））；抗黄体ホルモン（例えば、ＲＵ４８６（商標）（ミフェプリストン）；ホルモン性避妊薬（例えば、ＥＮＯＶＩＤ（商標）（ノルエチノドレル＋メストラノール）、ＰＲＯＧＥＳＴＡＳＥＲＴ（商標）（プロゲステロンを放出する子宮内デバイス）、ＬＯＥＳＴＲＩＮ（商標）、ＢＲＥＶＩＣＯＮ（商標）、ＭＯＤＩＣＯＮ（商標）、ＧＥＮＯＲＡ（商標）、ＮＥＬＯＮＡ（商標）、ＮＯＲＩＮＹＬ（商標）、ＯＶＡＣＯＮ−３５（商標）およびＯＶＡＣＯＮ−５０（商標）（エチニルエストラジオール／ノルエチンドロン）、ＬＥＶＬＥＮ（商標）、ＮＯＲＤＥＴＴＥ（商標）、ＴＲＩ−ＬＥＶＬＥＮ（商標）およびＴＲＩＰＨＡＳＩＬ−２１（商標）（エチニルエストラジオール／レボノルゲストレル（ｌｅｖｏｎｏｒｇｅｓｔｒｅｌ）ＬＯ／ＯＶＲＡＬ（商標）およびＯＶＲＡＬ（商標）（エチニルエストラジオール／ノルゲストレル）、ＤＥＭＵＬＥＮ（商標）（エチニルエストラジオール／二酢酸エチノジオール）、ＮＯＲＩＮＹＬ（商標）、ＯＲＴＨＯ−ＮＯＶＵＭ（商標）、ＮＯＲＥＴＨＩＮ（商標）、ＧＥＮＯＲＡ（商標）、およびＮＥＬＯＶＡ（商標）（ノルエチンドロン／メストラノール）、ＤＥＳＯＧＥＮ（商標）およびＯＲＴＨＯ−ＣＥＰＴ（商標）（エチニルエストラジオール／デスゲストレル）、ＯＲＴＨＯ−ＣＹＣＬＥＮ（商標）およびＯＲＴＨＯ−ＴＲＩＣＹＣＬＥＮ（商標）（エチニルエストラジオール／ノルゲスチメート（ｎｏｒｇｅｓｔｉｍａｔｅ））、ＭＩＣＲＯＮＯＲ（商標）およびＮＯＲ−ＱＤ（商標）（ノルエチンドロン）、ならびにＯＶＲＥＴＴＥ（商標）（ノルゲストレル））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５７８】
内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のためのさらなる処置としては、テストステロンエステル類（例えば、酢酸メテノロンおよびウンデカン酸テストステロン；非経口および経口アンドロゲン（例えば、ＴＥＳＴＯＪＥＣＴ−５０（商標）（テストステロン）、ＴＥＳＴＥＸ（商標）（プロピオン酸テストステロン）、ＤＥＬＡＴＥＳＴＲＹＬ（商標）（テストステロンエナンタート）、ＤＥＰＯ−ＴＥＳＴＯＳＴＥＲＯＮＥ（商標）（サイピオン酸テストステロン）、ＤＡＮＯＣＲＩＮＥ（商標）（ダナゾール）、ＨＡＬＯＴＥＳＴＩＮ（商標）（フルオキシメステロン）、ＯＲＥＴＯＮ  ＭＥＴＨＹＬ（商標）、ＴＥＳＴＲＥＤ（商標）およびＶＩＲＩＬＯＮ（商標）（メチルテストステロン）、およびＯＸＡＮＤＲＩＮ（商標）（オキサンドロロン（ｏｘａｎｄｒｏｌｏｎｅ））；テストステロン経皮系（例えば、ＴＥＳＴＯＤＥＲＭ（商標））；アンドロゲン受容体アンタゴニストおよび５−アルファ−レダクターゼ阻害剤（例えば、ＡＮＤＲＯＣＵＲ（商標））（酢酸シプロテロン）、ＥＵＬＥＸＩＮ（商標）（フルタミド）、およびＰＲＯＳＣＡＲ（商標）（フィナステリド）；副腎皮質刺激ホルモン調製物（例えば、ＣＯＲＴＲＯＳＹＮ（商標）（コシントロピン）；副腎皮質ステロイドおよびその合成アナログ（例えば、ＡＣＬＯＶＡＴＥ（商標））（ジプロピオン酸アルクロメタゾン）、ＣＹＣＬＯＣＯＲＴ（商標）（アムシノニド）、ＢＥＣＬＯＶＥＮＴ（商標）およびＶＡＮＣＥＲＩＬ（商標）（ジプロピオン酸ベクロメタゾン）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥ（商標）（ベタメタゾン）、ＢＥＮＩＳＯＮＥ（商標）およびＵＴＩＣＯＲＴ（商標）（安息香酸ベタメタゾン）、ＤＩＰＲＯＳＯＮＥ（商標）（ジプロピオン酸ベタメタゾン）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ（商標）（ベタメタゾンリン酸ナトリウム）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥ  ＳＯＬＵＳＰＡＮ（商標）（ベタメタゾンリン酸ナトリウムおよび酢酸塩）、ＢＥＴＡ−ＶＡＬ（商標）およびＶＡＬＩＳＯＮＥ（商標）（吉草酸ベタメタゾン）、ＴＥＭＯＶＡＴＥ（商標）（プロピオン酸クロベタゾール）、ＣＬＯＤＥＲＭ（商標）（ピバル酸クロコルトロン）、ＣＯＲＴＥＦ（商標）およびＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥ（商標）（コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥ  ＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（酢酸コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＬＯＣＯＩＤ（商標）（酪酸コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ（商標）（コルチゾール（ヒドロコルチゾン）リン酸ナトリウム）、Ａ−ＨＹＤＲＯＣＯＲＴ（商標）およびＳＯＬＵ  ＣＯＲＴＥＦ（商標）（コルチゾール（ヒドロコルチゾン）コハク酸ナトリウム）、ＷＥＳＴＣＯＲＴ（商標）（吉草酸コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＣＯＲＴＩＳＯＮＥ  ＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（酢酸コルチゾン）、ＤＥＳＯＷＥＮ（商標）およびＴＲＩＤＥＳＩＬＯＮ（商標）（デソニド）、ＴＯＰＩＣＯＲＴ（商標）（デソキシメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮ（商標）（デキサメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮ  ＬＡ（商標）（酢酸デキサメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ（商標）およびＨＥＸＡＤＲＯＬ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ（商標）（デキサメタゾンリン酸ナトリウム、ＦＬＯＲＯＮＥ（商標）およびＭＡＸＩＦＬＯＲ（商標）（ジ酢酸ジフロラゾン）、ＦＬＯＲＩＮＥＦ  ＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（酢酸フルドロコルチゾン）、ＡＥＲＯＢＩＤ（商標）およびＮＡＳＡＬＩＤＥ（商標）（フルニソリド）、ＦＬＵＯＮＩＤ（商標）およびＳＹＮＡＬＡＲ（商標）（フルオシノロンアセトニド）、ＬＩＤＥＸ（商標）（フルオシノニド）、ＦＬＵＯＲ−ＯＰ（商標）およびＦＭＬ（商標）（フルオロメトロン）、ＣＯＲＤＲＡＮ（商標）（フルランドレノリド）、ＨＡＬＯＧ（商標）（ハルシノニド）、ＨＭＳ  ＬＩＺＵＩＦＩＬＭ（商標）（メドリゾン）、ＭＥＤＲＯＬ（商標）（メチルプレドニゾロン）、ＤＥＰＯ−ＭＥＤＲＯＬ（商標）およびＭＥＤＲＯＬ  ＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（酢酸メチルプレドニゾン）、Ａ−ＭＥＴＨＡＰＲＥＤ（商標）およびＳＯＬＵＭＥＤＲＯＬ（商標）（メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム）、ＥＬＯＣＯＮ（商標）（フランカルボン酸モメタゾン（ｍｅｍｏｔａｓｏｎｅ  ｆｕｒｏａｔｅ））、ＨＡＬＤＲＯＮＥ（商標）（酢酸パラメタゾン）、ＤＥＬＴＡ−ＣＯＲＴＥＦ（商標）（プレドニゾロン）、ＥＣＯＮＯＰＲＥＤ（商標）（酢酸プレドニゾロン）、ＨＹＤＥＬＴＲＡＳＯＬ（商標）（プレドニゾロンリン酸ナトリウム）、ＨＹＤＥＬＴＲＡ−Ｔ．Ｂ．Ａ（商標）（プレドニゾロンテブテート（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  ｔｅｂｕｔａｔｅ））、ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標）（プレドニゾン）、ＡＲＩＳＴＯＣＯＲＴ（商標）およびＫＥＮＡＣＯＲＴ（商標）（トリアムシノロン（ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ））、ＫＥＮＡＬＯＧ（商標）（トリアムシノロンアセトニド）、ＡＲＩＳＴＯＣＯＲＴ（商標）およびＫＥＮＡＣＯＲＴ  ＤＩＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（トリアムシノロンジアセテート）、ならびにＡＲＩＳＴＯＳＰＡＮ（商標）（トリアムシノロンヘキサアセトニド）；副腎皮質ステロイドの生合成および作用の阻害剤（例えば、ＣＹＴＡＤＲＥＮ（商標）（アミノグルテチミド）、ＮＩＺＯＲＡＬ（商標）（ケトコナゾール）、ＭＯＤＲＡＳＴＡＮＥ（商標）（トリロスタン）、およびＭＥＴＯＰＩＲＯＮＥ（商標）（メチラポン）；ウシ、ブタまたはヒトインスリンまたはその混合物；インスリンアナログ；組換えヒトインスリン（例えば、ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）およびＮＯＶＯＬＩＮ（商標））；経口血糖降下剤（例えば、ＯＲＡＭＩＤＥ（商標）およびＯＲＩＮＡＳＥ（商標）（トルブタミド）、ＤＩＡＢＩＮＥＳＥ（商標）（クロルプロパミド）、ＴＯＬＡＭＩＤＥ（商標）およびＴＯＬＩＮＡＳＥ（商標）（トラザミド）、ＤＹＭＥＬＯＲ（商標）（アセトヘキサミド）、グリベンクラミド、ＭＩＣＲＯＮＡＳＥ（商標）、ＤＩＢＥＴＡ（商標）およびＧＬＹＮＡＳＥ（商標）（グリブリド）、ＧＬＵＣＯＴＲＯＬ（商標）（グリピジド）、およびＤＩＡＭＩＣＲＯＮ（商標）（グリクラジド）、ＧＬＵＣＯＰＨＡＧＥ（商標）（メトホルミン）、シグリタゾン、ピオグリタゾン、およびアルファ−グルコシダーゼ阻害剤；ウシまたはブタグルカゴン；ソマトスタチン（例えば、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（商標）（オクトレオチド）；ならびにジア���キシド（例えば、ＰＲＯＧＬＹＣＥＭ（商標）（ジアゾキシド））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５７９】
一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、子宮運動性障害のための処置と共に投与される。子宮運動障害のための処置としては、エストロゲン薬剤、例えば、共役エストロゲン（例えば、ＰＲＥＭＡＲＩＮ（登録商標）およびＥＳＴＲＡＴＡＢ（登録商標）、エストラジオール（例えば、ＣＬＩＭＡＲＡ（登録商標）およびＡＬＯＲＡ（登録商標））、エストロピペ−トおよびクロロトリアニセン；プロゲスチン薬剤（例えば、ＡＭＥＮ（登録商標）（メドロキシプロゲステロン）、ＭＩＣＲＯＮＯＲ（登録商標）（ノレチドロンアセテート）、ＰＲＯＭＥＴＲＩＵＭ（登録商標）プロゲステロンおよびメゲストロールアセテート）；およびエストロゲン／プロゲステロン併用療法、例えば、共役エストロゲン／メドロキシプロゲステロン（例えば、ＰＲＥＭＰＲＯ（商標）およびＰＲＥＭＰＨＡＳＥ（登録商標））および酢酸ノレシンドロン／エチニルエストラジオール（例えば、ＦＥＭＨＲＴ（商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８０】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、鉄欠乏性貧血および低色素性貧血の処置において有効な薬物と組み合わせて投与され、それには、硫酸第一鉄（硫酸鉄、ＦＥＯＳＯＬ（商標））、フマル酸第一鉄（例えば、ＦＥＯＳＴＡＴ（商標））、グルコン酸第一鉄（例えば、ＦＥＲＧＯＮ（商標））、多糖−鉄錯体（例えば、ＮＩＦＥＲＥＸ（商標））、鉄デキストランの注入（例えば、ＩＮＦＥＤ（商標））、硫酸第二銅、ピロキシジン、リボフラビン、ビタミンＢ１２、シアンコバラミン注入（例えば、ＲＥＤＩＳＯＬ（商標）、ＲＵＢＲＡＭＩＮＰＣ（商標））、ヒドロキソコバラミン、葉酸（例えば、ＦＯＬＶＩＴＥ（登録商標））、ロイコボリン（ホリン酸、５−ＣＨＯＨ４ＰｔｅＧｌｕ、シトロボルム因子）またはＷＥＬＬＣＯＶＯＲＩＮ（ロイコボリンのカルシウム塩）、トランスフェリンまたはフェリチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８１】
ある実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、精神医学的障害を処置するために使用される薬剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る精神医学的薬物としては、抗精神病薬（例えば、クロルプロマジン、クロルプロチキセン、クロザピン、フルフェナジン、ハロペリドール、ロキサピン、メソリダジン、モリンドン、オランザピン、ペルフェナジン、ピモジド、クエチアピン、リスペリドン、チオリダジン、チオチキセン、トリフルオペラジン、およびトリフルプロマジン）、抗躁薬（例えば、カルバマゼピン、ジバルプロックスナトリウム（ｄｉｖａｌｐｒｏｅｘｓｏｄｉｕｍ）、炭酸リチウム、およびクエン酸リチウム）、抗うつ剤（例えば、アミトリプチリン、アモキサピン、ブプロピオン（ｂｕｐｒｏｐｉｏｎ）、シタロプラム、クロミプラミン、デシプラミン、ドキセピン、フルボキサミン、フルオキセチン、イミプラミン、イソカルボキサジド、マプロチリン、ミルタザピン、ネファゾドン、ノルトリプチリン、パロキセチン、フェネルジン、プロトリプチリン、セルトラリン、トラニルシプロミン、トラゾドン、トリミプラミン、およびベンラファキシン）、抗不安剤（例えば、アルプラゾラム、ブスピロン、クロルジアゼポキシド、クロラゼプ酸、ジアゼパム、ハラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、およびプラゼパム）、ならびに興奮剤（例えば、ｄ−アンフェタミン、メチルフェニデート、およびペモリン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８２】
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、神経学的障害を処置するために使用される薬剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る神経剤としては、抗てんかん剤（例えば、カルバマゼピン、クロナゼパム、エトスクシミド、フェノバルビタール、フェニトイン、プリミドン、バルプロ酸、ジバルプロックスナトリウム、フェルバメート、ガバペンチン、ラモトリジン、レベチラセタム、オクスカルバゼピン、チアガビン（ｔｉａｇａｂｉｎｅ）、トピラマート、ゾニサミド、ジアゼパム、ロラゼパム、およびクロナゼパム）、抗パーキンソン病剤（例えば、レボドパ／カルビドパ、セレジリン、アマンチジン（ａｍａｎｔｉｄｉｎｅ）、ブロモクリプチン、ペルゴリド、ロピニロール、プラミペキソール、ベンズトロピン；ビペリデン；エトプロパジン；プロシクリジン；トリヘキシフェニジル、トルカポン（ｔｏｌｃａｐｏｎｅ））、ならびにＡＬＳ治療剤（例えば、リルゾール（ｒｉｌｕｚｏｌｅ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８３】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、血管拡張剤および／またはカルシウムチャネル遮断薬と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る血管拡張剤としては、アンギオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、パパベリン、イソクスプリン、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、エナラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、トランドラプリル、およびニリドリン）ならびに硝酸塩（例えば、イソソルビドジニトレート、イソソルビジドモノニトレート、およびニトログリセリン）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るカルシウムチャネル遮断薬の例としては、アムロジピン、ベプリジル、フェロジピン、フルナリジン、イスラジピン、ニカルジピン、ニモジピン、およびベラパミルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８４】
ある実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、胃腸障害に対する処置と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン癒合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る胃腸障害の処置剤としては、Ｈ２ヒスタミン受容体アンタゴニスト（例えば、ＴＡＧＡＭＥＴ（商標）（シメチジン）、ＺＡＮＴＡＣ（商標）（ラニチジン）、ＰＥＰＣＩＤ（商標）（ファモチジン）、およびＡＸＩＤ（商標）（ニザチジン））；Ｈ＋、Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ（例えば、ＰＲＥＶＡＣＩＤ（商標）（ランソプラゾール））およびＰＲＩＬＯＳＥＣ（商標）（オメプラゾール））；ビスマス化合物（例えば、ＰＥＰＴＯ−ＢＩＳＭＯＬ（商標）（ビスマスサブサリシレート）およびＤＥ−ＮＯＬ（商標）（ビスマスサブシトレート））；種々の制酸剤；スクラルフェート；プロスタグランジンアナログ（例えば、ＣＹＴＯＴＥＣ（商標）（ミソプロストール））；ムスカリンコリンアンタゴニスト；緩下剤（例えば、表面緩下剤、刺激緩下剤、生理食塩水および浸透性緩下剤）；抗下痢剤（例えば、ＬＯＭＯＴＩＬ（商標）（ジフェノキシレート）、ＭＯＴＯＦＥＮ（商標）（ジフェノキシン）、およびＩＭＯＤＩＵＭ（商標）（ロペルアミド塩化水素））、ソマトスタチンの合成アナログ（例えば、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（商標）（オクトレオチド）、抗嘔吐剤（例えば、ＺＯＦＲＡＮ（商標）（オンダンセトロン）、ＫＹＴＲＩＬ（商標）（グラニセトロン塩化水素）、トロピセトロン、ドラセトロン、メトクロプラミド、クロロプロマジン、ペルフェナジン、プロクロペラジン、プロメタジン、チエチルペラジン、トリフルプロマジン、ドンペリドン、ハロペリドール、ドロペリドール、トリメトベンザミド、デキサメサゾン、メチルプレドニソロン、ドロナビノール、およびナビロン）；Ｄ２アンタゴニスト（メトクロプラミド、トリメトベンザミド、およびクロロプロマジン）；胆汁塩；ケノデオキシコリン酸；ウルソデオキシコリン酸；および膵臓酵素調製物（例えば、膵臓および膵臓リパーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８５】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、他の治療レジメンまたは予防レジメン（例えば、放射線治療）と組み合わせて投与される。
【０５８６】
本発明はまた、医薬組成物（本発明のアルブミン融合タンパク質を含む）の１つ以上の成分が充填された１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。このような容器には、医薬または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された形式の注意書きを付属することができ、その注意書きは、当局による、ヒトへの投与のための製造、使用、または販売の認可を任意に示すものである。
【０５８７】
遺伝子治療
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする構築物は、遺伝子治療プロトコルの一部として使用され得、アルブミン融合タンパク質の治療有効投与量を送達し得る。細胞への核酸を生体内導入するための好ましいアプローチは、核酸を含み、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターを用いた細胞の感染は、標的細胞の大部分が、核酸を受け取ることができるという利点を有する。さらに、ウイルスベクター内にコードされる分子（例えば、ウイルスベクター内に含まれたｃＤＮＡとして）は、ウイルスベクターの核酸を取り込んだ細胞内で効果的に発現される。
【０５８８】
レトロウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターは、アルブミン融合タンパク質を生体内でコードする外因性核酸分子の輸送のための組換え遺伝子送達系として使用され得る。これらのベクターは、細胞内への有効な核酸の送達を提供し、輸送された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡに安定して組み込まれる。複製欠損レトロウイルスのみを産生する特殊化した細胞株（「パッケージ細胞」と言われる）の開発により、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性が増大されており、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療のための遺伝子輸送における使用について特徴付けられる（総説については、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１を参照のこと）。複製欠損レトロウイルスは、標準技術により、ヘルパーウイルスの使用を介して、標的細胞を感染させるために使用され得るビリオンに閉じ込められ得る。組換えレトロウイルスを産生するための、およびこのようなウイルスを用いて体外でまたは生体内にて細胞を感染させるためのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ，（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ９．１０−９．１４および他の標準的な実験マニュアルにおいて見出され得る。
【０５８９】
本発明において有用な別のウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来のベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムを遺伝子操作して、その結果、関心対象となる遺伝子産物をコードし、かつ発現するが、正常の溶解性ウイルスのライフサイクルにおいて複製する能力の観点では、不活性化させることができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６（１９８８）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５（１９９２）を参照のこと。アデノウイルス株Ａｄ型５ｄ１３２４または他のアデノウイルスの株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）に由来する好適なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、非分裂細胞を感染させることができないために、特定の状況において有利であり得、上皮細胞を含む多種多様な細胞型を感染させるために用いることができる（上記引用のＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２））。さらに、ウイルス粒子は、精製および濃縮に対して比較的安定しており、かつ修正可能であり、上記のように、感染性のスペクトラムに影響するように、改変され得る。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに取り込まれないが、エピソームに残り、それにより、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）中に取り込まれる場合に挿入変異誘発の結果として生じ得る潜在的な問題を回避できる。さらに、外来ＤＮＡがアデノウイルスゲノムを保有する能力は、他の遺伝子送達系に比べて大きい（最高８キロ塩基）（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記引用、Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７（１９８６））。
【０５９０】
別の実施形態において、本発明の非ウイルス遺伝子送達系は、標的細胞による対象ヌクレオチド分子の取り込みについて、エンドサイトーシス経路に依存する。この型の例示的な遺伝子送達系としては、リポソーム由来系、ポリリジン結合体、および人工ウイルスエンベロープが挙げられる。代表的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子は、表面上に陽電荷を保有するリポソーム（例えば、リポフェクチン）中にトラップされ得、（所望により、）標的組織の細胞表面抗原に対し、抗体でタグが付けられる（Ｍｉｚｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｏ  Ｓｈｉｎｋｅｉ  Ｇｅｋａ  ２０：５４７−５５１、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０６３０９号；日本国特許出願第１０４７３８１号；および欧州特許公開第Ａ−４３０７５号）。
【０５９１】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子送達系は、任意の多数の方法により、患者に導入され得る。例えば、遺伝子送達系の医薬調製物を、全身に（例えば、静脈内注射により）導入することができ、標的細胞へのタンパク質の特異的形質導入は、遺伝子送達ビヒクル、受容体遺伝子の発現を調節する転写制御配列による、細胞型または組織型発現、あるいはそれらの組み合わせによる提供されるトランスフェクションの特異性から主に生じる。他の実施形態において、組換え遺伝子の初期送達は、確実に局在する動物に導入することにより、さらに制限される。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、カテーテル（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位的注入（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＰＮＡＳ９１：３０５４−３０５７）により導入され得る。遺伝子治療構築物の医薬調製物は、本質的に、許容される希釈剤中の遺伝子送達系からなり得、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。アルブミン融合タンパク質が組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから無傷で生産できる場合、医薬調製物は、アルブミン融合タンパク質を産生する１つ以上の細胞を含むことができる。
【０５９２】
さらなる遺伝子治療法
障害、疾患、および状態を処置または予防するための遺伝子治療法も、本発明により包含される。遺伝子治療法は、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を動物に導入し、本発明のアルブミン融合タンパク質の発現を達成することに関する。この方法は、標的組織による融合タンパク質の発現のために必要なプロモーターおよび他の任意の遺伝因子と、作動可能に連結した本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを必要とする。このような遺伝子治療および送達技法は、当該技術分野で知られており、例えば、国際公開第ＷＯ９０／１１０９２号を参照のこと、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０５９３】
したがって、例えば、患者由来の細胞は、生体外で本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて遺伝子操作され得、次いで、操作された細胞は、本発明の融合タンパク質を用いて処置される患者に提供される。このような方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８５：２０７−２１６（１９９３）、Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：１１０７−１１１２（１９９３）、Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５３：４６０４−４６１５（１９９４）、Ｋａｉｄｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６０：２２１−２２９（１９９５）、Ｏｇｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：５１０２−５１０６（１９９０）、Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１−１０（１９９６）、Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２４６−１２５５（１９９７）、およびＺｈａｎｇ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：３１−３８（１９９６））を参照のこと、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態において、操作される細胞は、動脈細胞である。動脈細胞は、動脈、動脈周囲組織への直接注入またはカテーテル注入により患者へ再度導入され得る。
【０５９４】
以下により詳細に論じられるように、ポリヌクレオチド構築物は、注射可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓等）の間質腔への注射）により送達され得る。ポリヌクレオチド構築物は、医薬的に許容される液体または水性の担体中で送達され得る。
【０５９５】
一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、裸の（ｎａｋｅｄ）ポリヌクレオチドとして送達される。「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、またはＲＮＡという用語は、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン、または沈殿剤等を含む、細胞への侵入を補助し、促進し、または容易にするように作用する任意の送達ビヒクルのない配列を指す。しかしながら、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、当業者に周知の方法により調製され得るリポソーム製剤中およびリポフェクチン製剤中等で送達され得る。このような方法は、例えば、米国特許第  ５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号において記載され、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０５９６】
好ましくは、遺伝子治療法において用いられるポリヌクレオチドベクター構築物は、宿主ゲノムへ統合されず、しかも複製を可能にする配列を含まない構築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の好適なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０５９７】
当業者に周知の任意の強力なプロモーターは、ポリヌクレオチド配列の発現を駆動するために用いられ得る。好適なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。プロモーターはまた、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する遺伝子のための天然プロモーターであり得る。
【０５９８】
他の遺伝子治療技法と異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する主な利点の１つは、細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究により、非複製ＤＮＡ配列を細胞に導入し、最高６ヶ月の期間にわたり、所望のポリペプチドを産生を提供し得ることが示されている。
【０５９９】
ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を含む）の間質腔に送達され得る。組織の間質腔は、器官組織の細網繊維、血管または室の壁内の弾性繊維、繊維組織のコラーゲン繊維の間の細胞間液、ムコ多糖マトリックス、あるいは筋肉細胞を覆う結合組織内または骨小腔内の同じマトリックスを含む。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間質腔への送達は、以下で論じられる理由のために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。好ましくは、それらは、分化した持続性の非分裂細胞中に送達され、発現されるが、送達および発現は、例えば、血液または皮膚線維芽細胞の幹細胞等の非分化または完全には分化していない細胞において達成され得る。生体内での筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、かつ発現させる能力において、特に適格である。
【０６００】
裸の核酸配列注射について、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５ｍｇ／体重ｋｇから約５０ｍｇ／体重ｋｇの範囲にある。好ましくは、用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識するように、この用量は、注射の組織部位に応じて変化する。適切かつ有効用量の核酸配列は、当業者により容易に決定され得、および処置される状態および投与経路に依存し得る。
【０６０１】
好ましい投与経路は、組織の間質腔への非経口注射経路による。しかしながら、他の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル製剤の吸入が挙げられる。加えて、裸のＤＮＡ構築物が、血管形成術の間に、この手順において用いられるカテーテルにより動脈に送達され得る。
【０６０２】
裸のポリヌクレオチドとしては、送達部位での直接の針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」が挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野で周知の任意の方法により送達される。これらの送達方法は、当該技術分野で周知である。
【０６０３】
構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン、沈殿剤等の送達ビヒクルを用いて送達され得る。送達のこのような方法は、当該技術分野で周知である。
【０６０４】
ある実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、リポソーム調製物中で複合体化している。本発明で用いるリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）、および中性の調製物を含む。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で強固な荷電複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６、参照することにより、本明細書に組み込まれる）、ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７〜６０８１、参照することにより、本明細書に組み込まれる）、および精製された転写因子（Ｄｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９〜１０１９２、参照することにより、本明細書に組み込まれる）の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０６０５】
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ］プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは特に有用であり、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの商標で、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．から（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６も参照のこと。参照することにより本明細書に組み込まれる）から入手可能である。他の市販されているリポソームは、トランスフェクタース（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含む。
【０６０６】
他のカチオン性リポソームは、当該技術分野で公知の技法を用いて、容易に入手可能な物質から調製できる。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の説明については、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１０９２号（参照することにより、本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は、文献にて説明されており、例えば、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３−７４１７を参照のこと、参照することにより本明細書に組み込まれる。類似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得る。
【０６０７】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ  ＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して容易に調製され得る。このような物質としては、とりわけ、ホスファチジル、コリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合で混合され得る。これらの物質を用いてリポソームを生成する方法は、当該技術分野で公知である。
【０６０８】
例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を様々な組み合わせにおいて使用し、コレステロールを添加しても添加しなくても、従来のリポソームを生成し得る。したがって、例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、各５０ｍｇのＤＯＰＧおよびＤＯＰＣを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣベシクルを調製することができる。試料を吸引ポンプ下に一晩置き、次の日に脱イオン水で水和する。その後、槽を１５℃で循環させながら、最大設定にて、逆転カップ（槽タイプ）プローブを装備したＨｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓモデル３５０ソニケーターを用いて、試料を、栓をしたバイアル中で２時間超音波処理する。代替として、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を産生し得るか、または核孔膜を通して押し出すことにより別々の大きさの単膜小胞を産生し得る。他の方法は、当業者に知られており、利用可能である。
【０６０９】
リポソームとしては、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小さな単膜小胞（ＳＵＶ）、または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好ましい。当該技術分野で周知の方法を使用して、様々なリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）、１０１：５１２−５２７を参照のこと、参照することにより、本明細書に組み込まれる。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラス管の壁面にリン脂質の薄膜を付着させ、その後、カプセル化されるべき物質の溶液を用いて水和することにより調製され得る。ＳＵＶは、ＭＬＶの延長された超音波処理により調製され、単膜リポソームの均質集団を産生する。封入されるべき物質を、予め形成されたＭＬＶの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソームを使用する場合、乾燥した脂質薄膜を、滅菌水または１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ等の等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し、次いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合する。リポソームおよびＤＮＡは、正荷電リポソームとカチオン性ＤＮＡとの結合に起因して、非常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメントを用いる用途を見出す。ＬＵＶは、当該技術分野で公知の多数の方法により調製される。一般に使用される方法としては、Ｃａ２＋−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １７：７７（１９７９））；エーテル注入（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｎｇｈａｍ，Ａ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４４３：６２９（１９７６）、Ｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６（１９７７）、Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：３３４８（１９７９））；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．  ａｎｄ  Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１４５（１９７９））；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０４３１（１９８０）、Ｓｚｏｋａ，Ｆ．ａｎｄ  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１４５（１９７８）、Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１５：１６６（１９８２））が挙げられ、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０６１０】
概して、リポソームに対するＤＮＡの割合は、約１０：１から約１：１０までである。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は、約５：１から約１：５までである。より好ましくは、その割合は、約３：１から約１：３までである。さらにより好ましくは、その割合は、約１：１である。
【０６１１】
米国特許第５，６７６，９５４号（参照することにより、本明細書に組み込まれる）は、カチオン性リポソーム担体と複合体化された遺伝物質のマウスへの注入について報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（参照することにより、本明細書に組み込まれる）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物に形質移入するために用いるカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（参照することにより、本明細書に組み込まれる）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提供する。
【０６１２】
ある実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を用いて、生体外または生体内で細胞を操作する。レトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６１３】
レトロウイルスプラスミドベクターを採用して、パッケージング細胞株を形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。形質移入され得るパッケージング細胞株の例としては、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ  ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、１：５−１４（１９９０）において記載される（参照することにより、本明細書に組み込まれる）ようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、当該技術分野で周知の任意の手段により、パッケージング細胞を形質導入し得る。このような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。１つの代替法において、レトロウイルスプラスミドベクターを、リポソームにカプセル化し得るか、または脂質に結合し得て、次いで宿主に投与し得る。
【０６１４】
プロデューサー細胞株は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生じる。このようなレトロウイルスベクター粒子を採用して、体外で、あるいは生体内のいずれかにおいて、真核細胞を形質導入し得る。形質導入された真核細胞は、本発明の融合タンパク質を発現し得る。
【０６１５】
ある他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含有されるポリヌクレオチドを用いて、生体外、あるいは生体内において細胞を操作する。アデノウイルスは、それが本発明の融合タンパク質をコードおよび発現すると同時に、正常な溶菌性ウイルス生活環において複製するその能力に関しては不活性化されるように遺伝子操作することができる。アデノウイルス発現は、宿主細胞染色体へウイルスＤＮＡを組み込むことなく達成され、それにより、挿入突然変異誘発に関する問題が緩和される。さらに、アデノウイルスは、優れた安全性プロファイルを有する腸溶性生ワクチンとして長年使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１０９：２３３−２３８（１９７４））。最後に、アデノウイルス媒介遺伝子輸送は、コットンラットの肺へのアルファ−１−抗トリプシンおよびＣＦＴＲの輸送を含む、多数の事例において実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５）。さらに、アデノウイルスをヒト癌における原因物質として確立しようとする広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：６６０６）。
【０６１６】
本発明において有用である好適なアデノウイルスベクターが、例えば、Ｋｏｚａｒｓｋｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．３：４９９−５０３（１９９３）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５（１９９２）、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ．Ｔｈｅｒ．４：７５９−７６９（１９９３）、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：３６２−３６９（１９９４）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：６９１−６９２（１９９３）、および米国特許第５，６５２，２２４号において記載されており、参照することにより、本明細書に組み込まれる。例えば、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、ヒト２９３細胞にて増殖され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含有し、構成的にＥｌａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝子の産物を提供することにより欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加えて、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もまた、本発明において有用である。
【０６１７】
好ましくは、本発明において用いられるアデノウイルスは、複製欠損性である。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルスおよび／またはパッケージング細胞株の補助を必要とする。得られたウイルスは、細胞に感染する能力があり、プロモーターに作動可能に連結された関心対象となるポリヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞において複製し得ない。複製欠損アデノウイルスは、次の遺伝子：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａ、またはＬ１〜Ｌ５のすべてまたは一部のうちの１つ以上において欠失され得る。
【０６１８】
ある他の実施形態において、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を用いて、生体外、あるいは生体内において細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を産生するためにヘルパーウイルスを必要とする、自然に存在する欠損ウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７（１９９２））。それはまた、非分裂細胞の中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。わずか３００塩基対のＡＡＶを含有するベクターがパッケージされ得、組み込み得るが、外来性ＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂに限られる。このようなＡＡＶの生成および使用方法は、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号、第５，１７３，４１４号、第５，３５４，６７８号、第５，４３６，１４６号、第５，４７４，９３５号、第５，４７８，７４５号、および第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０６１９】
例えば、本発明で用いる適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みのために必要なすべての配列を含む。ポリヌクレオチドコンストラクトは、標準的なクローニング方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）にて見出されるものを用いて、ＡＡＶベクター中に挿入される。その後、組換えＡＡＶベクターを、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿等を含む任意の標準的な技法を用いて、ヘルパーウイルスに感染するパッケージング細胞中に形質移入する。適切なヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、牛痘ウイルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。パッケージング細胞が形質移入および感染されると、それらは、そのポリヌクレオチド構築物を含有する感染性ＡＡＶウイルス粒子を産生する。その後、生体外あるいは生体内のいずれかで、これらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞を形質導入する。形質導入細胞は、そのゲノムに組み込まれたポリヌクレオチド構築物を含有し、本発明の融合タンパク質を発現する。
【０６２０】
遺伝子治療の別の方法は、相同組換え（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４日公開；Ｋｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のポリペプチドをコードしている配列）を作動可能に連結することを含む。この方法は、標的細胞中に存在しているが、通常はその細胞中で発現しないか、または所望するよりも低いレベルで発現する、遺伝子の活性化を含む。
【０６２１】
当該技術分野で周知の標準的技法を用いて、プロモーターに隣接する標的化配列を有するプロモーターを含む、ポリヌクレオチド構築物を作製する。好適なプロモーターは、本明細書に記載される。標的化配列は、内因性配列とプロモーター−標的化配列の相同組換えが可能となるように、内因性配列に対して十分に相補的である。標的化配列は、所望される内在性ポリヌクレオチド配列の５’末端に十分に近接しており、それゆえ、相同組換えに際して、そのプロモーターは、その内在性配列に作動可能に連結される。
【０６２２】
プロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを用いて増幅され得る。好ましくは、増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に別の制限酵素部位を含有する。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含有し、第２の標的化配列の５’末端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含有する。増幅されたプロモーターおよび標的化配列を消化し、共に連結する。
【０６２３】
プロモーター−標的化配列構築物は、裸のポリヌクレオチドとしてか、もしくは上記に詳細に記載されるようなリポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、全ウイルス、リポフェクション、沈殿剤等のトランスフェクション促進剤と共に組み合わせのいずれかにより、細胞に送達される。Ｐプロモーター−標的化配列は、直接針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、粒子加速器等を含む任意の方法により、送達され得る。該方法は、以下に詳細に記載する。
【０６２４】
プロモーター−標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。この構築物と内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内因性配列は、このプロモーターの制御下に置かれる。その後、プロモーターは内因性配列の発現を駆動する。
【０６２５】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、タンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含み得る。典型的に、シグナル配列は、コード領域の５’末端に向かってかまたは５’末端で発現される、そのポリヌクレオチドのコード領域に位置する。シグナル配列は、関心対象となるポリヌクレオチドに対して同種であってもよいし、または異種であってもよく、形質移入される細胞に対して同種であってもよいし、または異種であってもよい。さらに、当該技術分野で周知の方法を用いて、このシグナル配列は、化学合成され得る。
【０６２６】
その投与形態によって、治療効果を与えるために十分な量において１つ以上の分子が発現される限り、上記のポリヌクレオチド構築物のうちのいずれかの任意の投与形態が使用され得る。これは、直接針注射、全身性注射、カテーテル注入、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲルフォームスポンジデポー（ｄｅｐｏｔ）、他の市販のデポー（ｄｅｐｏｔ）物質、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口または坐剤用固形（錠剤または丸剤）医薬製剤、および手術中のデカンティング（ｄｅｃａｎｔｉｎｇ）または局所適用を含む。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン酸カルシウム沈澱した裸のプラスミドの直接注射、または門脈へのタンパク質被覆プラスミドの直接注射は、ラット肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現をもたらした（Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７５（１９８９））。
【０６２７】
局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビヒクルと複合体化させた本発明のアルブミン融合タンパク質は、動脈領域内部に直接注射により投与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成物の局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、好ましくは数ミリメートルで注射することを指す。
【０６２８】
局所投与の別の方法は、本発明のポリヌクレオチド構築物を外科的創傷中または外科的創傷の周囲に接触させることである。例えば、患者は手術を受け、そしてポリヌクレオチド構築物をその創傷の内側の組織の表面上にコーティングするか、またはこの構築物をその創傷の内側の組織の領域に注入することができる。
【０６２９】
全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体化させた本発明の融合タンパク質を含む。全身投与で使用するために好適な送達ビヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するためのリガンドを含むリポソームを含む。特定の実施形態において、全身投与で使用するための好適な送達ビヒクルは、特定の部位に対してそのビヒクルを標的化するための本発明のアルブミン融合タンパク質を含むリポソームを含む。
【０６３０】
全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮（局所的）送達が挙げられる。当該技術分野で標準的な方法を用いて、静脈内注射が実行され得る。当該技術分野で標準的な方法を用いて、エアロゾル送達もまた実行され得る（例えば、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １８９：１１２７７−１１２８１，１９９２を参照のこと、参照することにより本明細書に組み込まれる）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐える能力をもつ担体に対して本発明のポリヌクレオチド構築物を複合体化させることにより、経口送達は実行され得る。このような担体の例としては、当該技術分野で周知のもの等のような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられる。局所的送達は、皮膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌクレオチド構築物を混合することにより実行され得る。
【０６３１】
送達される物質の有効量の決定は、例えば、その物質の化学構造および生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびその重症度、ならびに投与経路を含む、多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、例えば、１用量あたり投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに対象の健康および病歴のような、多数の因子に依存する。正確な量、投薬回数、および投薬のタイミングは、担当の医師または獣医により決定され得る。
【０６３２】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、任意の動物、好ましくは哺乳類および鳥類に投与され得る。好ましい哺乳類は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、およびブタを含み、特にヒトが好ましい。
【０６３３】
生物学的活性
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の生物学的活性を試験するアッセイにおいて使用され得る。アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドが、特定のアッセイにおいて活性を示した場合、その融合タンパク質に対応する治療用タンパク質が、その生物学的活性に関連する疾患に関与している可能性がある。したがって、融合タンパク質を用いて、関連疾患を処置することができよう。
【０６３４】
好ましい実施形態において、本発明は、表１の「好適な適応症Ｙ」の列に挙げた疾患または障害の処置方法を包含し、該方法は、このような処置、予防、または改善が所望される患者に、疾患または障害を処置、予防、または改善するために有効な量で、（表１の「好適な適応症Ｙ」の列に挙げた処置すべき疾患または障害と同じ行にある）表１の「治療用タンパク質Ｘ」の列に開示された治療用タンパク質に対応する治療用タンパク質部分を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与することを含む。
【０６３５】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、表１の「好適な適応症Ｙ」の列の特定の治療用タンパク質に挙げた疾患または障害の処置方法を包含し、該方法は、このような処置、予防、または改善が所望される患者に、実施例の適応症に関連する、治療用タンパク質に対応する治療用タンパク質部分を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を、疾患または障害を処置、予防、または改善するのに有効な量で投与することを含む。
【０６３６】
配列番号Ｙをコードするポリヌクレオチドによりコードされる場合、細胞により産生されるアルブミン融合タンパク質が、本発明により特に企図される。これらのポリヌクレオチドを用いて、細胞からコードされたタンパク質を発現させる場合、細胞の自然分泌およびプロセッシング工程は、表２の列４および／または１１に明確に列挙されるシグナル配列を欠損しているタンパク質を生じる。列挙されたシグナル配列の特定のアミノ酸配列は、本明細書中に示されているか、当該技術分野で公知である。したがって、本発明の最も好ましい実施形態は、細胞により産生されるアルブミン融合タンパク質（表２の列４および／または１１で示されるリーダー配列を欠損している）を含む。また、表２の列４および／または１１に列挙される特定のリーダー配列のない配列番号Ｙを含むポリペプチドも最も好ましい。これらの２つの好ましい実施態様を含む組成物（医薬組成物を含む）もまた好ましい。これらのアルブミン融合タンパク質は、表１の「好適な適応症Ｙ」の列において特定の治療用タンパク質について列挙された疾患または障害を処置、予防、または改善するために、特に企図される。
【０６３７】
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、内分泌系（例えば、以下の「内分泌性障害」の項を参照のこと）、神経系（例えば、以下の「神経障害」の項を参照のこと）、免疫系（例えば、以下の「免疫活性」の項を参照のこと）、呼吸器系（例えば、以下の「呼吸器疾患」の項を参照のこと）、心血管系（例えば、以下の「心血管疾患」の項を参照のこと）、生殖器系（例えば、以下の「生殖器系障害」の項を参照のこと）、消化器系（例えば、以下の「胃腸障害」の項を参照のこと）、細胞増殖に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「過増殖性疾患」の項を参照のこと）、ならびに／あるいは血液に関連する疾患または障害（例えば、以下の「血液関連疾患」の項を参照のこと）の疾患および障害に関連する疾患および／または障害の診断、予後診断、予防、および／または処置において使用され得る。
【０６３８】
ある実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する遺伝子が発現する組織に関連する疾患および／または障害の診断および／または予後診断するために使用され得る。
【０６３９】
したがって、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、プロホルモン活性化、神経伝達物質活性、細胞シグナル伝達、細胞増殖、細胞分化、および細胞遊走が挙げられるが、これらに限定されない活性に関連する疾患および／または障害の診断、検出、および／または処置において有用である。
【０６４０】
より一般的には、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下の系に関連する疾患および／または障害の診断、予後診断、予防、および／または治療において有用であり得る。
【０６４１】
免疫活性
本発明のアルブミン融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、免疫細胞の増殖、分化もしくは動員（走化性）を活性化または阻害することにより、免疫系の疾患、障害、および／または状態を処置、予防、診断および／または予後診断において有用であり得る。免疫細胞は、造血と呼ばれる過程を通して発達し、多能性幹細胞から骨髄性（血小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）およびリンパ系（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）細胞を生成する。これらの免疫疾患、障害、および／または状態の病因は、遺伝的、身体的（ｓｏｍａｔｉｃ）（例えば、癌およびいくつかの自己免疫性障害）、後天的（例えば、化学療法もしくは毒素による）、または感染的であり得る。さらに、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の免疫系の疾患または障害のマーカーまたは検出物質（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）として使用され得る。
【０６４２】
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫系の疾患および障害を処置するため、ならびに／あるいは本発明のポリペプチドが発現される組織に関連する細胞により生じた免疫応答を阻害または亢進するために使用され得る。
【０６４３】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫不全（先天性または後天性の免疫不全症の両方を含む）の処置、予防、診断、および／または予後診断において有用であり得る。免疫グロブリンレベルＢ細胞機能および／またはＢ細胞数が減少するＢ細胞免疫不全の例としては、Ｘ連鎖性無ガンマグロブリン血症（ブルートン病）、Ｘ連鎖性乳児無ガンマグロブリン血症、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖性免疫不全、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖性免疫不全、Ｘ連鎖性リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、先天性および後天性無ガンマグロブリン血症、成人発症型無ガンマグロブリン血症、遅発性無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、不特定（ｕｎｓｐｅｃｉｆｅｄ）低ガンマグロブリン血症、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型）を含む無ガンマグロブリン血症、選択的ＩｇＭ欠損症、選択的ＩｇＡ欠損症、選択的ＩｇＧサブクラス欠損症、ＩｇＧサブクラス欠損症（ＩｇＡ欠損症を伴うまたは伴わない）、ＩｇＭ増大を伴うＩｇ欠損症、ＩｇＭ増大を伴うＩｇＧおよびＩｇＡ欠損症、正常または増加Ｉｇを伴う抗体欠損症、Ｉｇ重鎖欠失、カッパ鎖欠損症、Ｂ細胞リンパ球増殖障害（ＢＬＰＤ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩ）（後天性）、および一過性乳児低ガンマグロブリン血症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６４４】
特定の実施形態において、毛細血管拡張性失調症または毛細血管拡張性失調症に関連する状態が、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、診断、および／または予後診断される。
【０６４５】
Ｔ細胞および／またはＢ細胞の機能および／または数が減少している先天性の免疫不全の例としては、ディジョージ異常症、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）（Ｘ連鎖性ＳＣＩＤ、常染色体劣性ＳＣＩＤ、アデノシンデアミナーゼ欠損症、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）欠損症、クラスＩＩ  ＭＨＣ欠損症（不全リンパ球症候群）、ウィスコットアルドリッチ症候群、および毛細血管拡張性失調症が挙げられるが、これらに限定されない）、胸腺形成不全症、第３および第４咽頭嚢症候群、２２ｑ１１．２欠損、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ナチュラルキラー細胞欠損症（ＮＫ）、特発性ＣＤ４＋Ｔリンパ球減少症、主要Ｔ細胞欠損（不特定）を伴う免疫不全、および細胞媒介免疫の不特定免疫不全が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６４６】
特定の実施形態において、ディジョージ異常症またはディジョージ異常症に関連する状態が、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、診断、および／または予後診断される。
【０６４７】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、診断、および／または予後診断され得る、他の免疫不全としては、慢性肉芽腫症、チェディアック東症候群、ミエロペルオキシダーゼ欠損症、白血球グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、白血球接着欠損症、補体成分欠損症（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８および／またはＣ９欠損症を含む）、網様発育不全、胸腺リンパ形成不全、胸腺腫を伴う発育不全、重篤な先天性白血球減少症、免疫不全症を伴う異形成症、新生児好中球減少症、短肢小人症、およびＩｇを伴うネゼロフ症候群複合型免疫不全が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６４８】
好ましい実施形態において、免疫不全および／または上記した免疫不全に関連する状態は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、診断、および／または予後診断される。
【０６４９】
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫不全の個体において免疫応答性を増進する薬剤として使用され得る。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞免疫欠損の個体において免疫応答性を増進する薬剤として使用され得る。
【０６５０】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、自己免疫疾患の処置、予防、診断、および／または予後診断において有用であり得る。多くの自己免疫疾患は、免疫細胞が自己を外来物質と不適切に認識することから生じる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊に至る免疫応答をもたらす。したがって、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻害し得る本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与は、自己免疫疾患の予防において有効な治療法であり得る。
【０６５１】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより処置、予防、診断、および／または予後診断され得る自己免疫疾患または障害としては、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性硬化症、自己免疫甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血、溶血性貧血、血小板減少症、自己免疫血小板減少症紫斑病、自己免疫新生児血小板減少症、特発性血小板減少症紫斑病、紫斑病（例えば、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病）、自己免疫性血球減少、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、グレーブス病（甲状腺機能亢進症）およびインスリン耐性真性糖尿病のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６５２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置、予防、および／または診断され得る自己免疫成分を有すると考えられるさらなる障害としては、ＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、神経炎、ブドウ膜炎眼炎、多発性内分泌腺症、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫肺炎、自閉症、ギランバレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症性眼障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６５３】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置、予防、診断、および／または予後診断され得る自己免疫成分を有すると考えられるさらなる障害としては、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（多くの場合、例えば、核および他の核抗体により特徴付けられる）、混合性結合組織病（多くの場合、例えば、可溶性核抗原（例えば、リボ核タンパク質）に対する抗体により特徴付けられる）、多発性筋炎（多くの場合、例えば、非ヒストンＡＮＡにより特徴付けられる）、悪性貧血（多くの場合、例えば、抗壁細胞、ミクロソーム、および内因子抗体により特徴付けられる）、特発性アジソン病（多くの場合、例えば、体液性および細胞媒介性の副腎細胞傷害性により特徴付けられる）、不妊症（多くの場合、例えば、抗精子抗体により特徴付けられる）、糸球体腎炎（多くの場合、例えば、糸球体基底膜抗体または免疫複合体により特徴付けられる）、水疱性類天疱瘡（多くの場合、例えば、基底膜におけるＩｇＧおよび補体により特徴付けられる）、シューグレン症候群（多くの場合、例えば、多組織抗体および／または特定の非ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）により特徴付けられる）、真性糖尿病（多くの場合、例えば、細胞媒介性および体液性島細胞抗体により特徴付けられる）、およびアドレナリン薬物耐性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン薬物耐性を含む）（多くの場合、例えば、ベータ−アドレナリン受容体抗体により特徴付けられる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６５４】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置、予防、診断、および／または予後診断され得る自己免疫成分を有し得るさらなる障害としては、慢性活動性肝炎（多くの場合、例えば、平滑筋抗体により特徴付けられる）、原発性胆汁性肝硬変（多くの場合、例えば、ミトコンドリア抗体により特徴付けられる）、他の内分泌腺不全（例えば、特異的組織抗体により特徴付けられる場合もある）、白斑（多くの場合、例えば、メラノサイト抗体により特徴付けられる）、脈管炎（多くの場合、例えば、血管壁におけるＩｇおよび補体ならびに／または低血清補体により特徴付けられる）、心筋梗塞後症候群（ｐｏｓｔ−ＭＩ）（多くの場合、例えば、心筋抗体により特徴付けられる）、心臓切開症候群（多くの場合、例えば、心筋抗体により特徴付けられる）、じんま疹（多くの場合、例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体により特徴付けられる）、アトピー性皮膚炎（多くの場合、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体により特徴付けられる）、喘息（多くの場合、例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体により特徴付けられる）、ならびに多くの他の炎症性、肉芽腫性、変性および萎縮性障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６５５】
好ましい実施形態において、自己免疫疾患および障害ならびに／または上記した疾患および障害に関連する状態は、例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、診断、および／または予後診断される。特定の好ましい実施形態において、関節リウマチが、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、および／または診断される。
【０６５６】
別の特定の好ましい実施形態において、全身性エリテマトーデスが、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、および／または診断される。別の特定の好ましい実施形態において、特発性血小板減少症紫斑がは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、および／または診断される。
【０６５７】
別の特定の好ましい実施形態において、ＩｇＡネフロパシーが、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、および／または診断される。
【０６５８】
好ましい実施形態において、自己免疫疾患および障害ならびに／または上記した疾患および障害と関連する状態が、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、診断、および／または予後診断される。
【０６５９】
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫抑制剤として用いられる。
【０６６０】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、造血細胞の疾患、障害、および／または状態の処置、予防、予後診断、および／または診断において有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球減少症、好中球減少症、貧血、および血小板減少症が挙げられるが、これらに限定されない、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連した疾患、障害、および／または状態を処置または予防する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させるために用いられ得る。代替として、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、組織球増殖症が挙げられるが、これらに限定されない、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連した疾患、障害、および／または状態を処置または予防する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させるために用いられ得る。
【０６６１】
アレルギー反応および状態（例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸障害）もまた、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、診断、および／または予後診断され得る。さらに、これらの分子は、アナフィラキシー、抗原性分子に対する過敏性、または血液型不適合を処置、予防、予後診断、および／または診断するために用いられ得る。
【０６６２】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＩｇＥ媒介アレルギー応答を処置、予防、診断、および／または予後診断するために使用され得る。このようなアレルギー反応としては、喘息、鼻炎、および湿疹が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、体外または生体内においてＩｇＥ濃度の調節するために使用され得る。
【０６６３】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症状態の診断、予後診断、予防、および／または処置における用途も有する。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症性応答に関与する細胞の活性化、増殖、および／または分化を阻害し得るので、これらの分子は、慢性および急性炎症状態を予防および／または処置するために用いることができる。このような炎症状態としては、例えば、感染に関連する炎症（例えば、敗血症ショック、敗血症、または全身性炎症反応症候群）、虚血再灌流傷害、内毒素による致死、補体媒介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導肺傷害、炎症性腸疾患、クローン病、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の産生過剰、呼吸器疾患（例えば、喘息およびアレルギー）；胃腸障害（例えば、炎症性腸疾患）；癌（例えば、胃、卵巣、肺、膀胱、肝臓、および胸）；ＣＮＳ障害（例えば、多発性硬化症；虚血性脳傷害、および／または脳卒中、外傷性脳損傷、神経変性障害（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）；ＡＩＤＳ関連認知症；およびプリオン病）；心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、心筋炎、心血管疾患、および心肺バイパス合併症）；ならびに炎症（例えば、肝炎、関節リウマチ、痛風、外傷、膵炎、サルコイドーシス、皮膚炎、腎虚血再灌流傷害、グレーブス病、全身性エリテマトーデス、真性糖尿病、および同種移植拒絶反応）により特徴付けられる多くのさらなる疾患、状態および障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６６４】
炎症は、基礎的な防御機構であるので、炎症性障害は、実質的に、身体の任意の組織に影響を与え得る。したがって、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、副腎炎、肺胞炎、胆管胆嚢炎、虫垂炎、亀頭炎、眼瞼炎、気管支炎、滑液包炎、心臓炎、蜂巣炎、子宮頸管炎、胆嚢炎、声帯炎、蝸牛炎（ｃｏｃｈｌｉｔｉｓ）、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、皮膚炎、憩室炎、脳炎、心内膜炎、食道炎、耳管炎、結合組織炎、毛嚢炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、内耳炎、喉頭炎、リンパ管炎、乳腺炎、中耳炎、髄膜炎、子宮筋層炎、粘膜炎、心筋炎、筋炎、鼓膜炎、腎炎、神経炎、精巣炎、骨軟骨炎、耳炎、心膜炎、腱鞘炎、腹膜炎、咽頭炎、静脈炎、灰白髄炎、前立腺炎、歯髄炎、網膜炎、鼻炎、卵管炎、強膜炎、強膜脈絡膜炎、陰嚢炎、副鼻腔炎、脊椎炎、脂肪組織炎、口内炎、滑膜炎、耳管炎、腱炎、扁桃炎、尿道炎、および膣炎が挙げられるが、これらに限定されない組織特異的炎症性障害の処置において用いられる。
【０６６５】
特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、器官移植拒絶反応および移植片対宿主病を診断、予後診断、予防、および／または処置するために有用である。器官拒絶反応は、免疫応答を介した移植組織の宿主免疫細胞破壊により生じる。同様に、免疫応答はＧＶＨＤにも関与するが、この場合、外来の移植された免疫細胞は、宿主組織を破壊する。免疫応答、特に、Ｔ細胞の活性化、増殖、分化、または走化性を阻害する、本発明のポリペプチド、抗体またはポリヌクレオチド、および／またはそれらのアゴニストまたはアンタゴニストは、器官拒絶反応またはＧＶＨＤを予防するために有効な治療法であり得る。特定の実施形態において、免疫応答、特に、Ｔ細胞の活性化、増殖、分化、または走化性を阻害する、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、実験的アレルギーおよび超急性異種移植拒絶反応を予防するために有効な治療法であり得る。
【０６６６】
他の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血清病、膿痂疹後腎炎、結節性多発性動脈炎、および免疫複合体誘導脈管炎が挙げられるが、これらに限定されない免疫複合体疾患を診断、予後診断、予防、および／または処置するために有用である。
【０６６７】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、感染物質を処置、検出、および／または予防するために用いられ得る。例えば、免疫応答を増大させることにより、特に、Ｂおよび／もしくはＴ細胞の増殖活性化ならびに／または分化を増大させることにより、感染症は処置、検出、ならびに／または予防され得る。免疫応答は、存在する免疫応答を高めるか、あるいは新しい免疫応答を惹起するかのいずれかにより、増大され得る。代替として、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、必ずしも免疫応答を惹起することなく、感染物質（感染物質等を列挙する本明細書の項を参照のこと）を直接阻害し得る。
【０６６８】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗原に対する免疫応答を高めるワクチンアジュバントとして用いられる。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍特異的な免疫応答を亢進するためのアジュバントとして用いられる。
【０６６９】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗ウイルス免疫応答を亢進するためのアジュバントとして用いられる。アジュバントとして本発明の組成物を用いて亢進され得る抗ウイルス免疫応答は、ウイルスおよび本明細書に記載される、またはそうでなければ当該技術分野で周知の疾患または徴候に関連するウイルスを含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＡＩＤＳ、髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）からなる群より選択されるウイルス、疾患、または徴候に対する免疫応答を亢進するためのアジュバントとして用いられる。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、呼吸器合胞体ウイルス、デング熱、ロタウイルス、Ｂ型日本脳炎、ＡおよびＢ型インフルエンザ、パラインフルエンザ、はしか、サイトメガロウイルス、狂犬病、フニン、チクングンヤ熱、リフトバレー熱、単純ヘルペス、および黄熱病からなる群より選択されるウイルス、疾患、または徴候に対する免疫応答を亢進するためのアジュバントとして用いられる。
【０６７０】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗細菌または抗真菌免疫応答を亢進するためのアジュバントとして用いられる。アジュバントとして本発明の組成物を用いて高められ得る抗細菌または抗真菌免疫応答は、細菌または真菌ならびに本明細書に記載される、またはそうでなければ当該技術分野で周知の疾患または徴候に関連する細菌または真菌を含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、およびＢ型髄膜炎からなる群より選択される細菌もしくは真菌、疾患または徴候に対する免疫応答を亢進するためのアジュバントとして用いられる。
【０６７１】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、コレラ菌（Ｖｉｖｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ハンセン菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、髄膜炎菌（Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｂ群連鎖球菌、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、腸毒素産出性大腸菌、腸出血性大腸菌、およびライム病（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）からなる群より選択される細菌もしくは真菌、疾患または徴候に対する免疫応答を亢進するためのアジュバントとして用いられる。
【０６７２】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗寄生虫免疫応答を亢進するためのアジュバントとして用いられる。アジュバントとして本発明の組成物を用いて高められ得る抗寄生虫免疫応答は、寄生虫および本明細書に記載される、またはそうでなければ当該技術分野で周知の疾患または徴候に関連する寄生虫を含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、寄生虫に対する免疫応答を亢進するためのアジュバントとして用いられる。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、プラスモディウム（マラリア）またはレーシュマニアに対する免疫応答を亢進するためのアジュバントとして用いられる。
【０６７３】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、単核食細胞の動員および活性化を阻害することにより、珪肺症、サルコイドーシス、および特発性肺線維症を含む感染症を処置するために採用され得る。
【０６７４】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに対する免疫介在応答を阻害または亢進するために、抗体産生の抗原として用いられる。
【０６７５】
一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒト、最も好ましくはヒト）に投与され、免疫系を増進し、１つ以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）の量を増大させるか、より高い親和性抗体の産生および免疫グロブリンクラス転換（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）を誘導するか、および／または免疫応答を増大させる。
【０６７６】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、病原菌に対するＢ細胞反応性の刺激因子として用いられる。
【０６７７】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞の活性化剤として用いられる。
【０６７８】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫抑制療法を受ける前に、個体の免疫状態を高める薬剤として用いられる。
【０６７９】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、より高い親和性抗体を誘導するための薬剤として用いられる。
【０６８０】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血清免疫グロブリン濃度を増大させるための薬剤として用いられる。
【０６８１】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫不全個体の回復を加速するための薬剤として用いられる。
【０６８２】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、老年集団および／または新生児における免疫応答性を増進するための薬剤として用いられる。
【０６８３】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、骨髄移植および／または他の移植（例えば、同種または異種臓器移植）の前、その間、またはその後において、免疫系エンハンサーとして用いられる。移植に関して、本発明の組成物は、移植の前、それと同時に、および／またはその後に投与され得る。特定の実施形態において、本発明の組成物は、移植後、Ｔ細胞集団の回復が開始する前に、投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、移植後、Ｔ細胞集団の回復が開始した後であるが、Ｂ細胞集団が完全に回復する前に、最初に投与される。
【０６８４】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ細胞機能の後天性欠損を有する個体において免疫応答性を増進するための薬剤として用いられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することにより改善または処置され得るＢ細胞機能の後天性欠損をもたらす状態としては、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄移植、およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６８５】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、一時的な免疫欠損を有する個体において免疫応答性を増進するための薬剤として用いられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することにより改善または処置され得る一時的な免疫欠損の状態としては、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）からの回復、栄養不良に関連する状態、感染性単核細胞増加症からの回復、またはストレスに関連する状態、はしかからの回復、輸血からの回復、ならびに手術からの回復が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６８６】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単球、樹枝状細胞、および／またはＢ細胞による抗原提示の調節剤として用いられる。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、体外または生体内において、抗原提示を増強するか、または抗原提示をアンタゴナイズする。さらに、関連する実施形態において、この抗原提示の増強またはアンタゴナイズは、抗腫瘍処置として、または免疫系を調節するために有用であり得る。
【０６８７】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＴＨ１細胞応答とは反対に、体液性応答（すなわち、ＴＨ２）の発生に向けて、個体の免疫系を導く薬剤として用いられる。
【０６８８】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍増殖を誘導し、ひいては、抗新生物剤に対してさらに感受性を高めるための手段として用いられる。例えば、多発性骨髄腫は、緩慢に細胞分裂する疾患であり、それしたがって、実質的にすべての抗腫瘍性レジメンに対して不応性である。これらの細胞を、より迅速に増殖させた場合、これらの感受性プロファイルは、恐らく変化するであろう。
【０６８９】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、ＡＩＤＳ、慢性リンパ球障害、および／または一般的な分類不能型原発性免疫不全等の病理におけるＢ細胞の産生の刺激因子として用いられる。
【０６９０】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、手術、外傷または遺伝子欠損後に、リンパ様組織を産生および／または再生するための治療法として用いられる。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、移植前の骨髄試料の前処置において用いられる。
【０６９１】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＳＣＩＤ患者において観察されるような免疫不適格性／免疫不全をもたらす遺伝性障害に対する遺伝子に基づく治療法として用いられる。
【０６９２】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、レーシュマニア等の単球に影響を及ぼす寄生虫疾患を防御するために、単球／マクロファージを活性化する手段として用いられる。
【０６９３】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドにより導かれる分泌サイトカインを調節する手段として用いられる。
【０６９４】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載の１つ以上の適用において用いられ、同様にそれらを獣医用医薬へ適用してもよい。
【０６９５】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外来物質または自己に対する免疫応答の様々な態様をブロッキングする手段として用いられる。免疫応答の特定の態様のブロッキングが所望され得る疾患または状態の例としては、狼瘡等の自己免疫疾患、関節炎、ならびに皮膚アレルギーへの免疫応答、炎症、腸疾患、病原菌に関連する傷害および疾患／障害が挙げられる。
【０６９６】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、および多発性硬化症等の自己免疫疾患に関連するＢ細胞増殖およびＩｇ分泌を妨げるための治療法として用いられる。
【０６９７】
別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、および／もしくは本発明の融合タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニスト、ならびに／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、内皮細胞におけるＢおよび／またはＴ細胞遊走の阻害剤として用いられる。この活性は、組織構造または同族の（ｃｏｇｎａｔｅ）応答を破壊し、例えば、免疫応答の破壊および敗血症のブロッキングにおいて有用である。
【０６９８】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、重症度が不確かな単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ヴァルデンストレーム疾患、関連する特発性単クローン性免疫グロブリン血症、および形質細胞腫等の疾患において明らかである慢性高ガンマグロブリン血症のための治療法として用いられる。
【０６９９】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、特定の自己免疫および慢性炎症性および感染性疾患において、マクロファージおよびそれらの前駆細胞、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリンパ球およびいくつかのＴ細胞サブセット、例えば、活性化およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞等のポリペプチド走化性および活性化を阻害するために採用され得る。自己免疫疾患の例は、本明細書に記載されており、多発性硬化症およびインスリン依存性糖尿病を含む。
【０７００】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、好酸球の産生および遊走を妨げることにより、特発性好酸球増加症候群を処置するために採用され得る。
【０７０１】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、補体媒介性細胞溶解を高める、または阻害するために使用される。
【０７０２】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗体依存性細胞性細胞毒性を高める、または阻害するために使用される。
【０７０３】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、動脈壁における単球浸潤を妨げることにより、アテローム性動脈硬化症を処置するために採用され得る。
【０７０４】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）を処置するために採用され得る。
【０７０５】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、創傷および組織の修復の刺激、血管新生の刺激、および／または血管もしくはリンパの疾患もしくは障害の修復の刺激において有用であり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、粘膜表面の再生を刺激するために使用され得る。
【０７０６】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、原発性もしくは後天性の免疫不全、欠損性の血清免疫グロブリン産生、再発性の感染、および／または免疫系機能不全により特徴付けられる障害を診断、予測、処置、ならびに／または予防するために使用される。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、関節、骨、皮膚、および／または耳下腺の感染、血液由来の感染（例えば、敗血症、髄膜炎、敗血症性関節炎、および／または骨髄炎）、自己免疫疾患（例えば、本明細書に開示されるような自己免疫疾患）、炎症性障害、および悪性疾患、ならびに／あるいはこれらの感染、疾患および／または悪性疾患に関連する任意の疾患または障害または状態（ＣＶＩＤ、他の原発性免疫不全、ＨＩＶ疾患、ＣＬＬ、再発性気管支炎、静脈洞炎、中耳炎、結膜炎、肺炎、肝炎、髄膜炎、帯状ヘルペス（例えば、重篤な帯状ヘルペス）および／またはニューモシスティスが挙げられるが、これらに限定されない）を処置または予防するために使用され得る。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより予防、診断、予後診断、および／または処置され得る他の疾患および傷害としては、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、リンパ球減少、食細胞殺細菌機能不全、血小板減少、ならびにヘモグロビン尿症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７０７】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、分類不能型免疫不全（「ＣＶＩＤ」；「後天性無ガンマグロブリン血症」および「後天性低ガンマグロブリン血症」としても知られている）またはこの疾患のサブセットを有する個体を、処置および／または診断するために使用される。
【０７０８】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫細胞もしくは免疫組織関連癌もしくは新生物を含む癌または新生物を診断、予後診断、予防、および／または処置するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより、予防、診断、または処置され得る癌または新生物の例としては、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、プラスマ細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ変換性（ＥＢＶ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）疾患、ならびに／または本明細書の他の箇所で「過増殖性疾患」と題される項に記載される疾患および障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７０９】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ラージＢ細胞リンパ腫の細胞増殖を減少するための治療として使用される。
【０７１０】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、慢性骨髄性白血病に関連するＢ細胞およびＩｇの関与を減少させる手段として使用される。
【０７１１】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞免疫不全の個体（例えば、部分的または完全な脾臓摘出術を受けた個体等）の間で免疫応答性を増進するための薬剤として使用される。
【０７１２】
血液関連障害
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、止血性活性（出血を止めること）または血栓溶解活性（血栓を溶解すること）を調節するために使用され得る。例えば、止血活性または血栓溶解活性を増大させることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血液凝固の疾患、障害および／または状態（例えば、無線維素原血症、因子欠損症、血友病）、血液血小板の疾患、障害および／または状態（例えば、血小板減少症）、あるいは外傷、手術または他の原因から生じる創傷を処置または予防するために使用され得る。代替として、止血活性または血栓溶解活性を減少させ得る本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、凝固を阻害または溶解するために使用され得る。これらの分子は、心臓発作（梗塞）、脳卒中、または瘢痕化の処置または予防において重要であり得る。
【０７１３】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、血栓塞栓症、肺塞栓症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、一過性脳虚血発作、不安定狭心症を予防、診断、予後診断、および／または処置するために使用され得る。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、伏在移植片の閉塞の予防、血管形成術に付随し得る手術周辺血栓症の危険性の減少、非リウマチ性心房細動を含む心房細動を有する患者における脳卒中の危険性の減少、人工心臓弁および／または僧帽弁疾患に関連する塞栓症の危険性の減少のために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのための他の使用としては、体外デバイス（例えば、血管内カニューレ、血液透析患者における血管進入シャント、血液透析機器、および心肺バイパス装置）における閉塞の予防が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７１４】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドが発現している組織に関連する血液および／または血液形成器官の疾患および障害を予防、診断、予後診断、および／または処置するために使用され得る。
【０７１５】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、造血活性（血球の形成）を調節するために使用され得る。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、すべての、またはサブセットの血球（例えば、赤血球、リンパ球（ＢまたはＴ細胞）、骨髄性細胞（例えば、好塩基球、好酸球、好中球、肥満細胞、マクロファージ）および血小板等）の量を増大させるために使用され得る。血球もしくは血球のサブセットの量を減少させる能力は、以下に記載される貧血および白血球減少症の予防、検出、診断、および／または処置において有用であり得る。代替として、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、すべての、またはサブセットの血球（例えば、赤血球、リンパ球（Ｂ細胞またはＴ細胞）、脊髄細胞（例えば好塩基球、好酸球、好中球、肥満細胞、マクロファージ）および血小板）の量を減少させるために使用され得る。血球もしくは血球のサブセットの量を減少させる能力は、白血球増加症（例えば、好酸球増加症等）の予防、検出、診断、および／または処置において有用であり得る。
【０７１６】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血液悪液質を予防、処置、または診断するために使用され得る。
【０７１７】
貧血は、赤血球の数またはその中のヘモグロビン（酸素を運ぶタンパク質）の量が正常を下回る状態である。貧血は、過度の出血、減少した赤血球細胞産生、または増加した赤血球細胞破壊（溶血）により引き起こされ得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、貧血を処置、予防、および／または診断するために有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより処置、予防または診断され得る貧血としては、鉄欠乏性貧血、低色素性貧血、小球性貧血、萎黄病、遺伝性鉄芽球性貧血、特発性後天性鉄芽球性貧血、赤芽球癆、巨赤芽球性貧血（例えば、悪性貧血、（ビタミンＢ１２欠乏）および葉酸欠乏性貧血）、再生不良性貧血、溶血性貧血（例えば、自己免疫溶血性貧血、微小血管症性溶血性貧血、および発作性夜間血色素尿症）が挙げられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、全身性エリテマトーデス、癌、リンパ腫、慢性腎疾患、および脾臓肥大等に関連する貧血が挙げられるが、これらに限定されない疾患に関連する貧血を処置、予防、および／または診断するために有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、メチルドパ、ダプソン、および／またはサルファ剤に関連する貧血等の薬物処置から生じる貧血を処置、予防、および／または診断するために有用であり得る。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、遺伝性球状赤血球、遺伝性楕円赤血球症、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損、および鎌状赤血球貧血が挙げられるが、これらに限定されない異常な赤血球細胞構造に関連する貧血を処置、予防、および／または診断するために有用であり得る。
【０７１８】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヘモグロビン異常（例えば、鎌状赤血球貧血、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＳ−Ｃ症、およびヘモグロビンＥ症に関連した異常）を処置、予防、および／または診断するために有用であり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、サラセミア（アルファ−サラセミアおよびベータ−サラセミアのメジャー形態およびマイナー形態が挙げられるが、これらに限定されない）を診断、予後診断、予防、および／または処置するために有用であり得る。
【０７１９】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血小板減少症（例えば、特発性血小板減少性紫斑病、および血栓性血小板減少性紫斑病）、フォンヴィレブランド病、遺伝性血小板障害（例えば、チェディアック東症候群およびヘルマンスキーパドラック症候群等の貯蔵プール疾患（ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｏｏｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、トロンボキサンＡ２機能障害、血小板無力症、およびベルナールスーリエ症候群）、溶血性尿毒症症候群、血友病Ａまたは第ＶＩＩ因子欠損およびクリスマス病または第ＩＸ因子欠損等の血友病、遺伝性出血性末梢血管拡張症（ランデュオースラーウェーバー症候群としても知られている）、アレルギー紫斑病（ヘノッホシェーンライン紫斑病）および播種性血管内凝固症候群が挙げられるが、これらに限定されない出血性障害を診断、予後診断、予防、および／または処置するために有用であり得る。
【０７２０】
血液の凝固時間における、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの効果は、全血部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、活性凝固時間（ＡＣＴ）、再石灰化活性凝固時間またはリーホワイト凝固時間が挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野で周知の任意の凝固試験を用いて監視され得る。
【０７２１】
いくつかの疾患および様々な薬物は、血小板機能障害を引き起こし得る。したがって、特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、後天性血小板機能障害（例えば、腎不全、白血病、多発性骨髄腫、肝臓の肝硬変、および全身性エリテマトーデスに付随する血小板機能障害、ならびに薬物処置（高用量でのアスピリン、チクロピジン、非ステロイド性抗炎症薬（関節炎、疼痛、および捻挫のために用いられる）、およびペニシリンによる処置を含む）に関連する血小板機能障害）を診断、予後診断、予防、および／または処置するために有用であり得る。
【０７２２】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球数の増加もしくは減少により特徴付けられる、またはそれに関連する疾患および障害を診断、予後診断、予防、および／または処置するために有用であり得る。白血球減少症は、白血球数が正常値よりも減少する場合に生じる。白血球減少症としては、好中球減少症およびリンパ球減少症が挙げられるが、これらに限定されない。正常値と比較した白血球数の増加は、白血球増加症として周知である。身体は、感染中、白血球数の増大を生じる。したがって、白血球増加症は、単純に、感染を反映する通常の生理的パラメータであり得る。代替として、白血球増加症は、損傷または癌のような他の疾患の指標であり得る。白血球増加症としては、好酸球増加症およびマクロファージの蓄積が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球減少症を診断、予後診断、予防および／または処置するために有用であり得る。他の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球増加症を診断、予後診断、予防、および／または処置する際に有用であり得る。
【０７２３】
白血球減少症は、すべての型の白血球の全般的な減少であり得る、または特定の型の白血球の特異的枯渇であり得る。したがって、特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好中球減少症として知られている、好中球数の減少を診断、予後診断、予防、および／または処置するために有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより診断、予後診断、予防、および／または処置され得る好中球減少症としては、小児遺伝性顆粒球減少症（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｏｓｉｓ）、家族性好中球減少症、周期性好中球減少症、食事性欠損（例えば、ビタミンＢ１２欠損または葉酸欠損）から生じるかまたはこれに関連する好中球減少症、薬物処置（例えば、抗生物質レジメン（例えば、ペニシリン処置）、スルホンアミド処置、抗凝血薬処置、抗痙攣剤、抗甲状腺性薬物、および癌化学療法）から生じるかまたはこれに関連する好中球減少症、およびいくつかの細菌感染またはウイルス感染、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、個体が脾臓肥大を有する状態（例えば、フェルティ症候群、マラリア、およびサルコイドーシス）、そしていくつかの薬物処置レジメンに関連して生じ得る好中球破壊の増加から生じる好中球減少症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７２４】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ストレス、薬物処置（例えば、コルチコステロイドを用いる薬物処置、癌化学療法および／もしくは放射線治療）、ＡＩＤＳ感染および／または他の疾患、例えば、癌、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、慢性感染、いくつかのウイルス感染および／または遺伝性障害（例えば、ディジョージ症候群、ウィスコットアルドリッチ症候群、重症複合型免疫不全、毛細血管拡張性失調症）から生じるか、またはこれらに関連するリンパ球減少症が挙げられるが、これに限定されないリンパ球減少症（Ｂおよび／もしくはＴリンパ球の数の減少）を診断、予後診断、予防、ならびに／または処置するために有用であり得る。
【０７２５】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ゴーシェ病、ニーマンピック病、レテラージーヴェ病、およびハンドシュラークリスチャン病が挙げられるが、これらに限定されない、マクロファージ数および／またはマクロファージ機能に関連する疾患および障害を診断、予後診断、予防、および／または処置するために有用であり得る。
【０７２６】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特発性好酸球増加症候群、好酸球増加筋痛症候群、およびハンドシュラークリスチャン病が挙げられるが、これらに限定されない、好酸球数および／または好酸球機能に関連する疾患および障害を診断、予後診断、予防、および／または処置するために有用であり得る。
【０７２７】
さらに別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、急性リンパ性（リンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（骨髄性（ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）、骨髄芽球性または骨髄単球性）白血病、慢性リンパ性白血病（例えば、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞白血病、セザリー症候群、および有毛細胞白血病）、慢性骨髄性（骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）、骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）または顆粒球性）白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および菌状息肉腫が挙げられるが、これらに限定されない白血病およびリンパ腫を診断、予後診断、予防、および／または処置するために有用であり得る。
【０７２８】
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、形質細胞疾患、単クローン性高ガンマグロブリン血症、重症度が不確かな単クローン性高ガンマグロブリン血症、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、クリオグロブリン血症、およびレイノー現象が挙げられるが、これらに限定されない、形質細胞の疾患および障害を診断、予後診断、予防、および／または処置するために有用であり得る。
【０７２９】
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、真性赤血球増加症、相対的赤血球増加症、二次的赤血球増加症（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ）、骨髄線維症、急性骨髄線維症、原因不明骨髄様化生、血小板血症（一次的および二次的血小板血症の両方を含む）、および慢性骨髄性白血病が挙げられるが、これらに限定されない、骨髄増殖性障害を処置、予防、および／または診断するために有用であり得る。
【０７３０】
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外科手術の前に、血球産生を増大させるための処置として有用であり得る。
【０７３１】
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、遊走、食作用、スーパーオキシド産生、好中球、抗酸球およびマクロファージの抗体依存細胞傷害を高めるための薬剤として有用であり得る。
【０７３２】
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、幹細胞フェレーシスの前に、循環系の幹細胞数を増大させるための薬剤として有用であり得る。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血小板フェレーシスの前に、循環系の幹細胞数を増大させるための薬剤として有用であり得る。
【０７３３】
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、サイトカイン産生を増大させるための薬剤として有用であり得る。
【０７３４】
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、一次造血障害を予防、診断、および／または処置するために有用であり得る。
【０７３５】
過増殖性疾患
ある実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、過増殖性疾患（新生物を含む）を処置または検出するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、直接的または間接的相互作用を通して、障害の増殖を阻害し得る。代替として、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、過増殖性疾患を阻害し得る他の細胞を増殖し得る。
【０７３６】
例えば、免疫応答を増大させることにより、特に、過増殖性疾患の抗原性の質を増大させること、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員させることにより、過剰増殖性疾患は処置され得る。この免疫応答は、既存の免疫応答を高めるか、あるいは新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより増大され得る。代替として、免疫応答を減少させることはまた、化学療法剤等の過増殖性疾患を処置する方法であり得る。
【０７３７】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより処置または検出され得る過増殖性疾患の例としては、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（腎上体、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸郭、ならびに泌尿性器管に位置づけられる新生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７３８】
同様に、他の過増殖性疾患もまた、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより処置または検出され得る。このような過増殖性疾患の例としては、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、乳房癌、腎盂および尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹グリオーマ、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視覚伝導路グリオーマ、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上未分化神経外胚葉腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟組織肉腫、小児視覚伝導路および視床下部グリオーマ、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵臓島細胞癌腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連する腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠期栄養膜腫瘍、有毛細胞白血病、頭頸部の癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼球内メラノーマ、島細胞癌腫、島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇および口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、メラノーマ、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平上皮頸癌、転移性原発性扁平上皮頸癌、転移性扁平上皮頸癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、妊娠期の非ホジキンリンパ腫、非メラノーマ皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頸癌、口腔咽頭癌、骨肉腫／悪性繊維肉腫、骨肉腫／悪性繊維組織球腫、骨肉腫／骨の悪性繊維組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性潜在性腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、紫斑病、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎骨盤および尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮頸癌、胃癌、テント上身分か神経外胚葉性および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、腎盂および尿管の移行性癌、絨毛性腫瘍、尿管および腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚伝導路および視床下部グリオーマ、外陰部の癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに上記の列挙された器官系に位置付けられる新生組織形成以外の任意の他の過増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７３９】
別の好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前癌状態を診断、予後診断、予防、および／または処置するため、ならびに上に記載されるような障害が挙げられるが、これらに限定されない腫瘍性状態または悪性状態への進行を妨げるために使用される。このような使用は、特に、過形成、化生、または最も具体的には、異形成症からなる非腫瘍性細胞増殖が起こっている腫瘍または癌への進行に先行することが知られている、または先行する疑いがある状態において必要とされる（このような異常な増殖状態の総説については、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｇｅ１１，１９７６，Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．６８−７９を参照のこと）。
【０７４０】
過形成は、制御された細胞増殖形態であり、これは、構造または機能において有意な変化を伴わない、組織または器官における細胞数の増大を含む。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、診断、予後診断、予防、および／または処置し得る過形成障害としては、血管濾胞性縦隔リンパ節過形成、好酸球増加随伴性血管類リンパ組織過形成、異型メラニン細胞過形成、基底細胞過形成、良性巨大リンパ節過形成、セメント質過形成、先天性副腎過形成、先天性脂腺過形成、嚢胞性過形成、乳房嚢胞性過形成、義歯性線維症、脈管過形成、子宮内膜過形成、線維筋過形成、局所性上皮過形成、歯肉増殖症、炎症性線維性過形成、炎症性乳頭過形成、血管内乳頭内皮過形成、前立腺の結節性過形成、結節性再生過形成、偽上皮腫性過形成、老人性脂腺過形成、ならびに疣贅性肥厚が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７４１】
化生は、成人または完全に分化した細胞の１つの型が、別の型の成人の細胞に置換される制御された細胞増殖形態である。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、診断、予後診断、予防、および／または処置し得る化生障害としては、原因不明骨髄様化生、アポクリン化生、非定型化性（ａｔｙｐｉｃａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）、自己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸上皮化生、化生性貧血、変形骨化、化生性ポリープ、骨髄様化生、原発性骨髄様化生、二次性骨髄様化生、扁平上皮化生、羊膜の扁平上皮化生、および症候性骨髄様化生が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７４２】
異形成症は、癌の前兆であることが多く、主に上皮において見出される。それは、細胞の個々の細胞均一性および構造配向性における損失を含む、非腫瘍性細胞成長の最も混乱した形態である。異形成細胞は、多くの場合、異常に大きく、深く染色される核を有し、そして多形態性を呈する、異形成症は、特色として、慢性過敏または炎症があるところに生じる。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて診断、予後診断、予防および／または処置され得る異形成障害としては、無汗性外胚葉性異形成症、前後異形成症、窒息性胸郭異形成症、心房指異（ａｔｒｉｏｄｉｇｉｔａｌ）形成症、気管支肺異形成症、脳異形成症、子宮頸異形成症、軟骨外胚葉性異形成症、鎖骨頭蓋骨異形成症、先天性外胚葉異形成症、頭蓋骨幹異形成症、頭蓋手根足根骨異形成症、頭蓋骨幹端異形成症、象牙質異形成症、骨幹異形成症、外胚葉異形成症、エナメル質異形成症、脳眼球異形成症、骨端形成異常性半肢症、多発性骨端異形成症、点状骨端異形成症、上皮異形成症、顔面指趾生殖（ｆａｃｉｏｄｉｇｉｔｏｇｅｎｉｔａｌ）異形成症、家族性繊維性顎異形成症、家族性白色襞（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｗｈｉｔｅ  ｆｏｌｄｅｄ）異形成症、繊維筋性異形成症、繊維性骨異形成症、根尖性骨異形成症、遺伝性腎臓網膜異形成症、発汗性外胚葉異形成症、低発汗性外胚葉異形成症、リンパ球減少性胸腺異形成症、哺乳類異形成症、下顎顔面異形成症、骨幹端異形成症、モンディーニ異形成症、単発性繊維異形成症、粘膜上皮異形成症、多発性骨端異形成症、眼耳脊椎異形成症、眼歯指異形成症、眼脊椎（ｏｃｕｌｏｖｅｒｔｅｂｒａｌ）異形成症、歯性異形成症、眼下顎四肢異形成症、歯根尖周囲セメント質異形成症、多発性繊維異形成症、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成症、網膜異形成症、眼中隔異形成症、脊椎骨端異形成症および心室橈骨異形成症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７４３】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて診断、予後診断、予防、および／または処置され得るさらなる前腫瘍性障害は、良性の異常増殖障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞状態、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、および食道異形成症）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、ならびに日光角化症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７４４】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドが発現される、組織に関連する障害を診断および／または予後診断するために使用され得る。
【０７４５】
別の実施形態において、本明細書において記載されるように毒素または放射性同位元素に共役した本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない癌および新生物を処置するために使用され得る。さらなる好ましい実施形態において、本明細書において記載されるように毒素または放射性同位元素に共役した本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、急性骨髄性白血病を処置するために使用され得る。
【０７４６】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アポトーシスに影響し得、したがって、細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関する多くの疾患を処置するために有用であり得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストにより診断、予後診断、予防、および／または処置され得る、細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関連する疾患としては、癌（例えば、結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、メラノーマ、網膜芽細胞腫、グリオブラストーマ、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポジ肉腫、および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない、濾胞性リンパ腫、ｐ５３突然変異を伴う癌腫、およびホルモン依存性腫瘍）；自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎、および関節リウマチ）ならびにウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、移植片対宿主病、急性移植拒絶反応、ならびに慢性移植拒絶反応が挙げられる。
【０７４７】
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌（特に上に列挙したもの）の増殖、進行、および／または転移を阻害するために使用される。
【０７４８】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより診断、予後診断、予防、および／または処置され得る、細胞の生存を増大させることに関するさらなる疾患または状態としては、例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄性白血病（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病を含む）、ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）を含む））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに肉腫および癌（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮性肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経鞘腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｍａ）、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫が挙げられるが、これらに限定されない固形腫瘍）の悪性腫瘍および関連疾患の進行および／または転移が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７４９】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより診断、予後診断、予防、および／または処置され得るアポトーシスの増大に関連する疾患としては、ＡＩＤＳ；神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、小脳変性症、および脳腫瘍または原発性関連疾患）；自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎および関節リウマチ）、骨髄異形成症候群（例えば、再生不良性貧血）、移植片対宿主病、虚血性障害（例えば、心筋梗塞、脳卒中、および再灌流傷害により惹起されるもの）、肝障害（例えば、肝炎に関連する肝障害、虚血／再灌流傷害、胆汁鬱帯（胆管障害）および肝臓癌）；毒素が誘導する肝臓疾患（例えば、アルコールにより惹起されるもの）、敗血症ショック、悪液質および拒食症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７５０】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより診断、予後診断、予防、および／または処置され得る過増殖性疾患および／または障害としては、肝臓、腹部、骨、乳房、消化器系、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、ならびに泌尿生殖管に位置づけられる新生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７５１】
同様に、他の過増殖性疾患もまた、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより診断、予後診断、予防、および／または処置され得る。このような過増殖性疾患の例としては、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖性疾患、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球症、および上記の器官系に位置付けられる新生組織形成以外の任意の他の過増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７５２】
別の好ましい実施形態は、本発明および／またはタンパク質融合またはそのフラグメントを用いる遺伝子治療により異常な細胞分裂を阻害するために、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを利用する。
【０７５３】
したがって、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを異常な増殖性細胞に挿入することにより細胞増殖性疾患を処置するための方法を提供し、ここで、該ポリヌクレオチドは、該発現を抑制する。
【０７５４】
本発明の別の実施形態は、個体において細胞−増殖性疾患を処置する方法を提供し、それには、本発明の１つ以上の活性遺伝子コピーを異常な増殖性細胞または細胞に投与することを含む。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を発現するために有効である組換え発現ベクターを含むＤＮＡ構築物である。本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、レトロウイルス、またはより好ましくは、アデノウイルスベクターを利用して処置されるべき細胞に挿入される（Ｇ  Ｊ．Ｎａｂｅｌ，ｅｔ．  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １９９９  ９６：３２４−３２６を参照のこと、参照することにより本明細書に組み込まれる）。最も好ましい実施形態において、ウイルスベクターは、欠損性であり、非増殖細胞を形質転換せず、増殖する細胞のみ形質転換する。さらに、好ましい実施形態において、単独あるいは他のポリヌクレオチドと組み合わせて、あるいはそれに融合された増殖性細胞に挿入される本発明のポリヌクレオチドは、その後、外部刺激（すなわち、磁気、特定の小分子、化学物質または薬物の投与等）により調節することができ、該ポリヌクレオチドのプロモーター上流に作用し、コードされるタンパク質産物の発現を誘導する。したがって、本発明の有用な治療効果は、該外部刺激に基づいて、明らかに調節され得る（すなわち、本発明の発現を増大、減少、または阻害する）。
【０７５５】
本発明のポリヌクレオチドは、腫瘍性遺伝子または抗原の発現を抑制するために有用であり得る。「腫瘍性遺伝子の発現を抑制する」とは、遺伝子の転写の抑制、遺伝子転写物（プレメッセージＲＮＡ）の破壊、スプライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻訳後改変の妨害、タンパク質の破壊、またはタンパク質の正常な機能の阻害を意図する。
【０７５６】
異常な増殖性細胞への局所投与のために、本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知の任意の方法により投与され得、この方法には、トランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞のマイクロインジェクション、もしくはリポソーム、リポフェクション、または裸のポリヌクレオチド等のビヒクル、あるいは、本明細書にわたって記載される任意の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知のレトロウイルスベクター（Ｇｉｌｂｏａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：８４５（１９８２）、Ｈｏｃｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ３２０：２７５（１９８６）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：３０１４）、ワクシニアウイルス系（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：３４０３（１９８５）、または他の効率的なＤＮＡ送達系（Ｙａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１２（１９８５））等に限定されない周知の遺伝子送達系により送達され得る。これらの参考文献は、例示のみであり、参照することにより本明細書に組み込まれる。異常に増殖している細胞を特異的に送達またはトランスフェクトし、そして非分裂の細胞を残すために、当業者に周知のレトロウイルス、またはアデノウイルス（当該技術分野において説明され、本明細書の他の箇所において説明されるような）送達系を利用することが好ましい。宿主ＤＮＡ複製は、レトロウイルスＤＮＡを組み込むために必要とされ、レトロウイルスは、その生活環に必要とされるレトロウイルス遺伝子を欠損するので、自律複製し得ない。本発明のポリヌクレオチドのためにこのようなレトロウイルス送達系を利用することは、該遺伝子および構築物を異常に増殖している細胞へと標的化し、そして非分裂の正常な細胞を残す。
【０７５７】
本発明のポリヌクレオチドは、疾患部位に直接的に注射針を誘導するために使用される画像化デバイスを使用することにより、内部の器官、体腔等における細胞増殖性障害／疾患の部位に直接的に送達され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、外科的介入時に、疾患部位に投与され得る。
【０７５８】
「細胞増殖性疾患」とは、良性であろうと悪性であろうと、細胞、細胞群、もしくは組織の単一もしくは複数の局所的異常増殖により特徴付けられる、器官、腔、もしくは身体部分のうちのいずれか１つ、またはいずれかの組み合わせに罹患する、任意のヒトまたは動物の疾患または障害を意味する。
【０７５９】
本発明のポリヌクレオチドの任意の量が、それらが処理された細胞の増殖に対して生物学的に阻害する効果を有する限り、投与され得る。さらに、同じ部位に同時に、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを投与することが可能である。「生物学的に阻害する」とは、部分的または全体的な増殖阻害、ならびに細胞の増殖または成長の速度減少を意味する。生物学的な阻害量は、組織培養における標的の悪性または異常な増殖性細胞増殖、動物および細胞培養物における腫瘍増殖に対する本発明のポリヌクレオチドの効果を評価することにより、または当業者に周知の任意の他の方法により、決定され得る。
【０７６０】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、タンパク質融合物として単独か、または本明細書の他の箇所に記載されるように直接的または間接的に他のポリペプチドと組み合わせるかのいずれかで、増殖性細胞または組織の血管新生を阻害するために有用である。最も好ましい実施形態において、該抗血管新生効果は、造血性、腫瘍特異的細胞、例えば、腫瘍関連マクロファージ等の阻害により、間接的に達成され得る（Ｊｏｓｅｐｈ  ＩＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，９０（２１）：１６４８−５３（１９９８）を参照のこと、参照することにより、本明細書に組み込まれる）。
【０７６１】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アポトーシスの誘導を通して増殖性の細胞または組織を阻害するために有用であり得る。これらの融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、例えば、死ドメイン（ｄｅａｔｈ−ｄｏｍａｉｎ）受容体（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体−１、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）、ＴＮＦ受容体関連アポトーシス媒介性タンパク質（ＴＲＡＭＰ）、およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体−１および−２（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ  Ｋ，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２５４（３）：４３９−５９（１９９８）を参照のこと、参照することにより、本明細書に組み込まれる）等）の活性化において、増殖性の細胞および組織のアポトーシスを誘導するように、直接的あるいは間接的のいずれかで作用し得る。さらに、本発明の別の好ましい実施形態において、これらの融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、アポトーシスを活性化する他のタンパク質の活性化におけるような他の機構を通してか、あるいは単独または低分子薬物もしくはアジュバント（例えば、アポプトニン（ａｐｏｐｔｏｎｉｎ）、ガレクチン（ｇａｌｅｃｔｉｎ）、チオレドキシン、抗炎症性タンパク質（例えば、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  ４００（１−２）：４４７−５５（１９９８），Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３（１９９８），Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．Ａｐｒ  ２４；１１１−１１２：２３−３４（１９９８），Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．７６（６）：４０２−１２（１９９８），Ｉｎｔ  Ｊ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅａｃｔ；２０（１）：３−１５（１９９８）を参照のこと、これらはすべて、参照することにより本明細書に組み込まれる）と組み合わせてかのいずれかで、これらのタンパク質の発現を刺激することを通して、アポトーシスを誘導し得る。
【０７６２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、増殖性の細胞または組織の転移を阻害するために有用である。阻害は、これらのアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドの投与の直接的結果として、または間接的に（例えば、転移を阻害することで知られているタンパク質（例えば、アルファ４インテグリン）の発現を活性化する）生じ得る（例えば、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；２３１：１２５−４１を参照のこと、これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）。本発明のこのような治療的影響は、単独または低分子薬物もしくはアジュバントと組み合わせてかのいずれかで達成され得る。
【０７６３】
別の実施形態において、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する組成物を、本発明のアルブミン融合タンパク質により結合される、結合する、もしくは会合するポリペプチドを発現する標的細胞に送達する方法を提供する。本発明のアルブミン融合タンパク質は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合的な相互作用を通じて会合され得る。
【０７６４】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、増殖性抗原および免疫原に対して、直接的（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質が「ワクチン接種」された場合、増殖性の抗原および免疫原に対して応答するように免疫応答を生じる）、あるいは間接的（例えば、該抗原および免疫原に対して、免疫応答を増強することで知られているタンパク質（例えば、ケモカイン）の発現を活性化する）のいずれかで、増殖性の細胞または組織の免疫原性および／または抗原性を高めるために有用である。
【０７６５】
腎障害
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、腎臓系の障害を、処置、予防、診断、および／または予後診断するために使用され得る。本発明の組成物を用いて診断、予後診断、予防、および／または処置され得る腎臓障害としては、腎不全、腎炎、腎臓の血管障害、代謝性および先天性腎臓障害、腎臓の尿障害、自己免疫障害、硬化症および壊死、電解質異常、ならびに腎臓癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７６６】
本発明の組成物を用いて診断、予後診断、予防および／または処置され得る腎臓疾患としては、急性腎不全、慢性腎不全、アテローム性塞栓性腎障害、末期腎疾患、腎臓の炎症性疾患（例えば、急性糸球体腎炎、感染後糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、ネフロ−ゼ症候群、膜性糸球体腎炎、家族性ネフロ−ゼ症候群、膜性増殖性糸球体腎炎ＩおよびＩＩ、メサンギウム増殖糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、急性尿細管間質性腎炎、慢性尿細管間質性腎炎、急性溶血性連鎖球菌感染後糸球体腎炎（ＰＳＧＮ）、腎盂腎炎、ループス腎炎、慢性腎炎、間質性腎炎、および溶血性連鎖球菌感染後糸球体腎炎）、腎臓の血管障害（例えば、腎梗塞、アテローム性塞栓性腎臓疾患、腎皮質壊死、悪性腎硬化症、腎静脈血栓症、腎灌流不全、腎網膜症、腎虚血再灌流、腎動脈塞栓症、および腎動脈狭窄）、ならびに尿道疾患に起因する腎障害（例えば、腎盂腎炎、水腎症、尿石症（腎結石症、腎石病）、逆流性腎症、尿道感染、尿閉、および急性もしくは慢性片側性閉塞性尿路疾患）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７６７】
加えて、本発明の組成物は、腎臓の代謝および先天性障害（例えば、尿毒症、腎アミロイドーシス、腎性骨形成異常症、尿細管性アシドーシス、腎性糖尿、腎原性尿崩症、シスチン尿症、ファンコーニ症候群、腎線維嚢胞骨組織形成（腎性くる病）、ハートナップ病、バーター症候群、リドル症候群、多嚢胞性腎疾患、髄質嚢胞病、髄質海綿腎、アルポート症候群、爪−膝蓋骨症候群、先天性ネフローゼ症候群、クラッシュ症候群、馬蹄腎、糖尿病性ニューロパシー、腎原性尿崩症、鎮痛薬性腎症、腎結石、および膜性腎症）、ならびに腎臓の自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー症候群、ＩｇＡ腎症、およびＩｇＭメサンギウム増殖性糸球体腎炎））を診断、予後診断、予防、および／または処置するために使用され得る。
【０７６８】
本発明の組成物はまた、腎臓の硬化性または壊死性障害（例えば、糸球体硬化症、糖尿病性腎症、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、壊死性糸球体腎炎、および腎乳頭壊死）、腎臓の癌（例えば、腎腫、副腎腫、腎芽細胞腫、腎細胞癌、移行上皮癌、腎増腺癌、扁平上皮細胞癌、およびウィルムス腫瘍）、ならびに電解質異常（例えば、腎石灰沈着症、膿尿症、浮腫、水腎症、タンパク尿、低ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血症、低カルシウム血症、高カルシウム血症、低リン酸血症、および高リン酸血症）を診断、予後診断、予防、および／または処置するために使用され得る。
【０７６９】
本発明の組成物は、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口または坐剤用固形医薬製剤、デカンティングまたは手術中の局所適用、エアロゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野で周知の任意の方法を用いて投与され得る。このような方法は、当該技術分野で周知である。本発明の組成物は、以下でより詳細に記載される、治療剤の一部として投与され得る。本発明のポリヌクレオチドを送達する方法は、本明細書でより詳細に記載される。
【０７７０】
心血管疾患
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、四肢虚血等の末梢動脈疾患が挙げられるが、これに限定されない心血管疾患を処置、予防、診断、および／または予後診断するために使用され得る。
【０７７１】
心血管疾患としては、心血管異常、例えば、動脈−動脈瘻、動静脈瘻、脳動静脈奇形、先天性心欠陥、肺動脈閉鎖、およびシミター症候群が挙げられるが、これらに限定されない。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄、三房心、冠状血管奇形、交差心、右胸心、動脈管開存症、エブスタイン奇形、アイゼンメンゲルコンプレックス、左心低形成症候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残、および心中隔欠損、例えば、大動脈肺動脈中隔欠損、心内膜床欠損、ルタンバッシェ症候群、ファロー三徴症、心室中隔欠損が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７２】
心血管疾患としてはまた、心臓病、例えば、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉｇｈ  ｃａｒｄｉａｃ  ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ  ｃａｒｄｉａｃｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓性浮腫、心肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｈｅａｒｔｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心膜炎（狭窄性および結核性を含む）、心嚢内気腫、心膜切開後症候群、肺性心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充血、心血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７３】
不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダムスストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、ＱＴ延長症候群、副収縮、ラウンギャノンレバイン症候群、マハイム型早期興奮症候群、ウォルフパーキンソンホワイト症候群、洞不全症候群、頻脈、および心室細動が挙げられるが、これらに限定されない。頻脈としては、発作性頻脈、心室頻脈、頻脈性心室固有調律、房室結節内リエントリー性頻脈、異所性心房性頻脈、異所性接合部性頻脈、洞房結節リエントリー性頻拍、トルサードドポアント、および心室性頻脈が挙げられる。
【０７７４】
心臓弁疾患としては、大動脈弁閉鎖不全症、大動脈弁狭窄、心雑音、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁閉鎖不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈閉鎖症、肺動脈弁不全、肺動脈弁狭窄症、三尖弁閉鎖症、三尖弁閉鎖不全症、および三尖弁狭窄が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７５】
心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大性心筋症、大動脈弁下狭窄症、肺動脈弁下狭窄、拘束型心筋症、シャーガス心筋症、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流傷害、および心筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７６】
心筋虚血としては、冠状動脈性疾患、例えば、狭心症、冠動脈瘤、冠状動脈硬化症、冠状動脈性血栓症、冠状動脈血管けいれん、心筋梗塞、および気絶心筋が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７７】
心血管疾患としては、血管疾患、例えば、動脈瘤、血管異形成症、血管腫症、細菌性血管腫症、ヒッペルリンダウ病、クリペルトルノネーウェーバー症候群、スタージウェーバー症候群、血管神経性浮腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリッシュ症候群、動脈閉塞性疾患、動脈炎、動脈内膜炎、結節性多発性動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管症、糖尿病網膜症、塞栓症、血栓症、肢端紅痛症、痔、肝静脈閉塞性疾患、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞性疾患、レイノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張、毛細血管拡張性失調症、遺伝性出血性毛細血管拡張症、精索静脈瘤、静脈瘤、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈不全も含む。
【０７７８】
動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染性動脈瘤、破裂性動脈瘤、大動脈瘤、脳動脈瘤、冠状動脈性動脈瘤、心臓動脈瘤、および腸骨動脈瘤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７７９】
動脈閉塞性疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性異形成症、腸間膜血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉塞性血栓性血管炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７８０】
脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイドアンギオパチー、脳動脈瘤、脳無酸素症、脳動脈硬化症、脳動静脈奇形、脳動脈疾患、脳塞栓症および血栓症、頸動脈血栓症、静脈洞血栓症、ワレンベルク症候群、脳出血症、硬膜外血腫、硬膜下血腫、くも膜下出血、脳梗塞、脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症候群、脳室周囲白質軟化症、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛および椎骨脳底動脈循環不全が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７８１】
塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、ブルートウ症候群、脂肪塞栓症、肺塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられるが、これらに限定されない。血栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症静脈、洞血栓症、ワレンベルク症候群、および静脈血栓症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７８２】
虚血性障害としては、脳虚血、虚血性結腸炎、コンパートメント症候群、前コンパートメント症候群、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢肢虚血が挙げられるが、これらに限定されない。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット症候群、チャーグストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血栓性血管炎、過敏性血管炎、シェンラインヘノッホ紫斑病、アレルギー皮膚脈管炎、およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７８３】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、微粒子銃注射、粒子加速器、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販のデポー物質、浸透圧ポンプ、経口または坐剤用固形医薬製剤、デカンティングまたは手術中の局所適用、エアロゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野で周知の任意の方法を用いて投与され得る。このような方法は、当該技術分野で周知である。ポリヌクレオチドの送達方法は、本明細書でより詳細に記載される。
【０７８４】
呼吸器疾患
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、呼吸系の疾患および／または障害を処置、予防、診断、および／または予後診断するために使用され得る。
【０７８５】
呼吸系の疾患および障害としては、鼻前庭炎、非アレルギー性鼻炎（例えば、急性鼻炎、慢性鼻炎、萎縮性鼻炎、血管運動神経性鼻炎）、鼻ポリープ、および副鼻腔炎、若年性血管線維腫、鼻の癌および若年性乳頭腫、声帯ポリープ、小結節（歌手の小結節）、接触潰瘍、声帯麻痺、喉頭気腫、咽頭炎（例えば、ウイルス性および細菌性）、扁桃炎、扁桃蜂巣炎、副咽頭間隙膿瘍、喉頭炎、喉頭気腫、ならびに咽頭癌（例えば、鼻咽頭の癌、扁桃癌、咽頭癌）、肺癌（例えば、扁平上皮細胞腫、小細胞腫（燕麦細胞腫）、大細胞腫、および腺癌腫）、アレルギー性疾患（好酸球性肺炎、過敏性肺炎（例えば、外因性アレルギー性肺胞炎、アレルギー性間質性肺炎、有機塵肺症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、喘息、ヴェーゲナー肉芽腫症（肉芽腫性脈管炎）、グッドパスチャー症候群））、肺炎（例えば、細菌性肺炎（例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎球菌性肺炎）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ブドウ球菌性肺炎）、グラム陰性細菌肺炎（例えば、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）およびシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍａｓ  ｓｐｐ．）により惹起される）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）肺炎、レジオネラニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（レジオネラ病）、およびオウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（オウム病））、ならびにウイルス肺炎（例えば、インフルエンザ、水痘（水疱瘡））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７８６】
呼吸器系のさらなる疾患および障害としては、細気管支炎、ポリオ（灰白髄炎）、クループ、呼吸器合胞体ウイルス感染、おたふく風邪、伝染性紅斑（第５病）、突発性発疹、進行性風疹全脳炎、風疹、および亜急性硬化性全脳炎）、真菌肺炎（例えば、ヒストプラスマ症、コクシジオイデス真菌症、ブラストミセス症、重篤に抑制される免疫系を有するヒトにおける真菌感染（例えば、クリプトコッカスネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）により惹起されるクリプトコッカス症；アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，ｓｐｐ．）により惹起されるアスペルギルス症；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）により惹起されるカンジダ症；およびムコール症）、カリニ肺炎（ニューモシスチス肺炎）、異型肺炎（例えば、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．））、日和見感染肺炎、院内感染肺炎、化学肺臓炎および吸引性肺炎、胸膜疾患（例えば、胸膜炎、胸水、および気胸症（例えば、単純自然気胸症、合併した自然気胸症、緊張性気胸症））、閉塞性気道疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、慢性もしくは急性気管支炎）、職業性肺疾患（例えば、ケイ肺症、黒色肺（炭坑作業員塵肺症）、石綿肺症、ベリリウム症、職業性喘息、綿肺症、ならびに良性塵肺症）、浸潤性肺疾患（例えば、肺線維症（例えば、線維化性肺胞炎、通常型間質性肺炎）、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、リンパ様間質性肺炎、組織球症Ｘ（例えば、レテラージーヴェ疾患、ハンドシュラークリスチャン病、好酸球性肉芽腫）、特発性肺ヘモジデリン沈着症、サルコイドーシスおよび肺胞タンパク症）、急性呼吸器系窮迫症候群（例えば、成人呼吸窮迫症候群とも言われる）、浮腫、肺塞栓症、気管支炎（例えば、ウイルス、細菌性）、気管支拡張症、無気肺、肺化膿巣（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）またはレジオネラニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）により惹起される）および嚢胞性線維症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７８７】
抗血管新生活性
内因性刺激因子と血管新生阻害剤との間の天然に発生する平衡は、阻害的影響が優勢である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５６：３４５−３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下において生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プロセス）において、血管新生は、厳密に調節され、空間的および時間的に定められる。病的な血管新生の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）の下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない血管新生は病的になり、多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼の障害、および乾癬を含む、異常な新血管形成により支配される。例えば、Ｍｏｓｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０−６３４（１９９１）、Ｆｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３３：１７５７−１７６３（１９９５）、Ａｕｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１−４１１（１９８５）、Ｆｏｌｋｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｅｄｓ．Ｋｌｅｉｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｈｏｕｓｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１７５−２０３（１９８５）、Ｐａｔｚ，Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５−７４３（１９８２）、およびＦｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：７１９−７２５（１９８３）による総説を参照のこと。多くの病的状態において、血管新生の過程は、その疾患状態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が、血管新生に依存することを示唆する有意なデータが蓄積されている。Ｆｏｌｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：４４２−４４７（１９８７）。
【０７８８】
本発明は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与による新血管形成に関連する疾患または障害の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置し得る悪性および転移性状態には、本明細書に記載の悪性疾患、固形腫瘍、および癌、ならびにそうでなければ当該技術分野で周知のもの（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明は、新血管新生関連疾患および／または障害の処置の方法を提供し、これには、治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、その処置の必要な個体に投与する工程を含む。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌または腫瘍を治療的に処置するために、様々なさらなる方法で利用され得る。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置され得る癌としては、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、頸部癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌を含む固形腫瘍；原発性腫瘍および転移；黒色腫；膠芽腫；カポジ肉腫；平滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行性悪性疾患；ならびに血液由来の腫瘍（例えば、白血病）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、およびカポジ肉腫等の癌を処置するために局所送達され得る。
【０７８９】
なお他の態様において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、膀胱内投与によって膀胱癌の表面形態を処置するために利用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、注射またはカテーテルを介して、腫瘍に直接的に、または腫瘍部位付近に送達され得る。当然のことながら、当業者が理解するように、適切な投与形態は、処置されるべき癌により変化する。他の送達形態は、本明細書において述べられる。
【０７９０】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌に加えて、他の障害（新血管新生が関与する）を処置するために有用であり得る。これらの障害としては、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）；動脈硬化性プラーク；眼の血管新生疾患（例えば、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、眼のブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および翼状片（Ｐｔｅｒｙｇｉａ）（異常な血管増殖））；関節リウマチ；乾癬；遅延型創傷治癒；子宮内膜症；脈管形成；肉芽形成；肥厚性瘢痕（ケロイド）；癒着不能骨折；強皮症；トラコーマ；血管接着；心筋の血管新生；冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢血管新生；オースラーウェーバー症候群；プラーク新血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性異形成症；創傷肉芽形成；クローン病；ならびにアテローム性動脈硬化症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７９１】
例えば、本発明の一態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを肥厚性瘢痕またはケロイドに投与する工程を含む、肥厚性瘢痕およびケロイドを処置するための方法が提供される。
【０７９２】
本発明の一実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、肥厚性瘢痕またはケロイドに、これらの病変の進行を妨げるために直接注射される。この治療は、肥厚性瘢痕およびケロイド（例えば、やけど）の発達を生じることが知られている状態の予防的処置において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷害から約１４日後）を有した後であるが、肥厚性瘢痕またはケロイドの発達の前に開始される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、角膜新生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖、および黄斑変性症を含む）を処置するための方法を提供する。
【０７９３】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置され得る新血管形成に関連する眼疾患としては、血管新生緑内障、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植新血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、および脈絡膜または虹彩の新血管形成に関連する疾患が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｗａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．５５：７０４−７１０（１９７８）およびＧａｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１−３１２（１９７８）による総説を参照のこと。
【０７９４】
したがって、本発明の一態様において、血管形成を阻害するように、患者の角膜に治療有効量の化合物（本発明の融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を投与する工程を含む、角膜の新血管形成（角膜移植新血管形成を含む）等の眼の新血管形成疾患を処置するための方法が提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を欠く組織である。しかし、ある病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲脈管叢から角膜に伸長し得る。角膜が血管化されるようになる場合、角膜はまた混濁されるようになり、患者の視力低下を生じる。角膜が完全に混濁するならば、完全に視力が喪失することもある。例えば、角膜感染（例えば、トラコーマ、単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症、および回旋糸状虫症）、免疫学的過程（例えば、移植拒絶反応およびスティーブンスジョンソン症候群）、アルカリによる火傷、外傷、炎症（任意の原因による）、毒性および栄養欠乏状態、ならびにコンタクトレンズ装着による合併症を含む、多種多様な障害が、角膜の新血管形成をもたらし得る。
【０７９５】
本発明の特に好ましい実施形態において、生理食塩水（眼調製物中にて一般的に用いられる任意の保存剤および抗菌剤と組み合わせて）中にて局所投与のために調製され得、点眼剤形態にて投与され得る。溶液または懸濁液は、その純粋な形態で調製され得、１日に数回投与され得る。代替として、上記のように調製される抗血管新生組成物はまた、角膜に直接投与され得る。好ましい実施形態において、抗血管新生組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーと共に調製される。さらなる実施形態において、抗血管新生因子または抗血管新生組成物は、従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治療はまた、血管新生応答（例えば、化学的やけど）を誘導する可能性が高いことが知られている角膜病変において、予防的に有用であり得る。これらの場合において、処置（おそらくステロイドと組み合わせられる）を直ちに開始し、その後の合併症の予防に役立て得る。
【０７９６】
他の実施形態において、眼科医が、顕微鏡使用下で、上記の化合物を角膜基質へ直接注入してもよい。好ましい注入部位は、個々の病巣の形態で変化し得るが、投与の目標は、進行する脈管構造の前部に組成物を置く（すなわち、血管と正常な角膜との間に散在させる）ことであろう。ほとんどの場合において、これは、進行している血管から角膜を「保護する」するための角膜周囲辺縁への注入を含み得る。この方法はまた、角膜新血管形成を予防的に防ぐために、角膜損傷の直後に利用され得る。この状況において、該物質を、角膜病巣とその所望でない潜在的な辺縁系への血液供給との間に散在した角膜周囲辺縁系に注入することができる。このような方法はまた、類似の様態で、移植された角膜の毛細血管浸潤を防ぐするために利用され得る。徐放形態において、注入は、１年に２〜３回しか注入が必要とされないだろう。ステロイドもまた、注入溶液に加えられ、その注射自体から生じる炎症を軽減し得るだろう。
【０７９７】
本発明の別の態様において、血管の形成を阻害するように、治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを患者の眼内に投与する工程を含む、血管新生緑内障を処置するための方法が提供される。一実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形態を処置するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物は、前房隅角領域中に注入により移植され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が房水中に連続的に放出されるように、任意の位置に置かれ得る。本発明の別の態様において、血管の形成が阻害されるように、治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを患者の眼内に投与する工程を含む、増殖性糖尿病網膜症を処置するための方法が提供される。
【０７９８】
本発明の特に好ましい実施形態において、増殖性糖尿病網膜症は、網膜におけるポリヌクレオチドポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストの局所濃度を増大させるために、房水または硝子体への注入により処置され得る。好ましくは、この処置は、光凝固を必要とする重篤な疾患となる前に開始されるべきである。
【０７９９】
本発明の別の態様において、血管形成が阻害されるように、治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを患者の眼内に投与する工程を含む、水晶体後線維増殖症を処置するための方法が提供される。化合物は、硝子体内注入および／または眼内移植を介して局所投与され得る。
【０８００】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置され得る障害としては、血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、動脈硬化性プラーク、遅延型創傷治癒、肉芽形成、血友病性関節、肥厚性瘢痕、癒着不能骨折、オースラーウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管接着が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８０１】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置、予防、診断、および／または予後診断され得る障害および／または状態としては、固形腫瘍、血液由来の腫瘍（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポジ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、関節リウマチ、乾癬、眼の血管新生疾患（例えば、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、およびブドウ膜炎）、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、血管新生、肉芽形成、肥厚性瘢痕（ケロイド）、癒着不能骨折、強皮症、トラコーマ、血管接着、心筋の血管新生、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新血管新生、オースラーウェーバー症候群、プラーク新血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、線維筋性異形成症、創傷肉芽形成、クローン病、アテローム性動脈硬化症、避妊剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防することによる）、病理学的結果として血管新生を有する疾患（例えば、ネコ引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、バルトネラ症、および細菌性血管腫症）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８０２】
避妊法の一態様において、胎芽着床をブロックするに十分な化合物の量を、性交および受精が起こる前またはその後に投与し、ひいては、有効な避妊法、場合により「モーニングアフター」法が提供される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、月経を制御することにおいて使用され得る、または子宮内膜症の処置における腹膜洗浄液として、あるいは腹膜移植のためのいずれかで投与され得る。
【０８０３】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、縫合部（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ得る。
【０８０４】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、広範な種々の外科的処置において利用され得る。例えば、本発明の一態様において、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態において）は、悪性組織から正常な周囲組織を分離するため、および／または周囲組織への疾患の広がりを防ぐために、腫瘍の除去の前に、領域をコーティングまたはスプレーするために利用され得る。本発明の他の態様において、組成物（例えば、スプレーの形態において）は、腫瘍をコーティングするため、または所望の場所において新血管新生を阻害するために、内視鏡的処置を介して送達され得る。本発明のなお他の態様において、本発明の抗血管新生組成物を用いてコーティングされている外科用メッシュが、外科用メッシュが利用され得る任意の処置において利用され得る。例えば、本発明の一実施形態において、抗血管新生組成物を有した外科用メッシュレーデン（ｌａｄｅｎ）は、構造を支持し、一定量の抗血管新生因子を放出するために、腹部癌切除手術の間（例えば、結腸切除の後）に利用され得る。
【０８０５】
本発明のさらなる態様において、癌の局所的再発およびその部位での新しい血管形成が阻害されるように、切除後に、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを腫瘍の切除縁に投与する工程を含む、腫瘍切除部位を処置するための方法が提供される。本発明の一実施形態において、抗血管新生化合物は、腫瘍切除部位に直接投与される（例えば、塗布、ブラッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、またはそうでなければ抗血管新生化合物を用いて腫瘍の切除縁をコーティングすることにより適用される）。代替として、抗血管新生化合物は、投与前に、周知の外科用ペーストに組み込まれてもよい。本発明の特に好ましい実施形態において、抗血管新生化合物は、悪性腫瘍の肝切除後および神経外科手術後に適用される。
【０８０６】
本発明の一態様において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、乳房、結腸、脳、および肝腫瘍を含む広範な種々の腫瘍の切除縁に投与され得る。例えば、本発明の一実施形態において、抗血管新生化合物は、その部位での新しい血管形成が阻害されるように、切除後、神経腫瘍の部位に投与され得る。
【０８０７】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、他の抗血管新生因子と共に投与され得る。他の抗血管新生因子の代表的な例としては、抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織阻害剤、メタロプロテイナーゼ−２の組織阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−２、および様々な形態の軽い「ｄ族」遷移金属が挙げられる。
【０８０８】
軽い「ｄ族」遷移金属としては、例えば、バナジウム、モリブデン、タングステン、チタニウム、ニオブ、およびタンタルの種が挙げられる。このような遷移金属種は、遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の好適な錯体としては、オキソ遷移金属錯体が挙げられる。
【０８０９】
バナジウム錯体の代表的な例としては、例えば、バナジン酸塩およびバナジル錯体等のオキソバナジウム錯体が挙げられる。好適なバナジン酸塩錯体としては、例えば、アンモニウムメタバナジン酸塩、ナトリウムメタバナジン酸塩、およびナトリウムオルトバナジン酸塩等のメタバナジン酸塩およびオルトバナジン酸塩錯体が挙げられる。好適なバナジル錯体としては、例えば、バナジルアセチルアセトナート、ならびに硫酸バナジル一および三水和物等の硫酸バナジル水和物を含む硫酸バナジルが挙げられる。
【０８１０】
タングステンおよびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯体が挙げられる。好適なオキソタングステン錯体としては、タングステン酸および酸化タングステン錯体が挙げられる。好適なタングテン酸錯体としては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水和物、およびタングステン酸が挙げられる。適切な酸化タングステンとしては、酸化タングステン（ＩＶ）および酸化タングステン（ＶＩ）が挙げられる。好適なオキソモリブデン錯体としては、モリブデン酸錯体、モリブデンオキシド錯体、およびモリブデニル錯体が挙げられる。好適なモリブデン酸錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙げられる。好適な酸化モリブデンとしては、酸化モリブデン（ＶＩ）、酸化モリブデン（ＶＩ）、およびモリブデン酸が挙げられる。好適なモリブデニル錯体としては、例えば、モリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他の好適なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えば、グリセロール、酒石酸、および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。
【０８１１】
広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の文脈において利用され得る。代表的な例としては、血小板因子４；硫酸プロタミン；硫酸化キチン誘導体（ズワイガニの殻から調製）、（Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｖｅｒ  Ｒｅｓ．５１：２２−２６，１９９１）；硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、エストロゲン等のステロイドおよびタモキシフェンクエン酸塩の存在により増強され得る）；スタウロスポリン；マトリックス代謝物の修飾因子、例えば、プロリンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、アルファ、アルファ−ジピリジル、アミノプロピオニトリルフマル酸塩を含む；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキセート；ミトキサントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１−１７３２６，（１９９２））；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８６：４７５−４８０，（１９９２））；シクロデキストリンテトラデカサルフェート；エポネマイシン；カンプトテシン；フマギリン（Ｉｎｇｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５５−５５７，１９９０）；金チオリンゴ酸ナトリウム（「ＧＳＴ」；Ｍａｔｓｕｂａｒａ  ａｎｄ  Ｚｉｆｆ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０−１４４６，（１９８７））；抗コラゲナーゼ−血清；アルファ２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（４）：１６５９−１６６４，（１９８７））；ビサントレン（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸二ナトリウムまたは「ＣＣＡ」；（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３６：３１２−３１６，（１９９２））；ＡＧＭ−１４７０；カルボキシアミノルミダゾール；およびＢＢ９４等のメタロプロテイナーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８１２】
細胞レベルでの疾患
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置、予防、診断、および／または予後診断され得る細胞生存の増大あるいはアポトーシスの阻害に関連する疾患としては、癌（例えば、結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、メラノーマ、網膜芽細胞腫、グリオブラストーマ、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポジ肉腫、および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない、濾胞性リンパ腫、ｐ５３突然変異を伴う癌腫、およびホルモン依存性腫瘍）；自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、免疫関連糸球体腎炎、および関節リウマチ）ならびにウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、移植片対宿主病、急性移植拒絶反応、ならびに慢性移植拒絶反応が挙げられる。
【０８１３】
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌（特に上に列挙したもの）の増殖、進行、および／または転移を阻害するために使用される。
【０８１４】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより処置または検出され得る、細胞の生存を増大させることに関するさらなる疾患または状態としては、例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄性白血病（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病を含む）、ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）を含む））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに肉腫および癌（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮性肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経鞘腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｍａ）、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫が挙げられるが、これらに限定されない固形腫瘍）の悪性腫瘍および関連疾患の進行および／または転移が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８１５】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて診断、予防、処置、および／または予後診断され得るアポトーシスの増大に関連する疾患としては、ＡＩＤＳ；神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、小脳変性症、および脳腫瘍または原発性関連疾患）；自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎および関節リウマチ）、骨髄異形成症候群（例えば、再生不良性貧血）、移植片対宿主病、虚血性障害（例えば、心筋梗塞、脳卒中、および再灌流傷害により惹起されるもの）、肝障害（例えば、肝炎に関連する肝障害、虚血／再灌流障害、胆汁鬱帯（胆管障害）および肝臓癌）；毒素が誘導する肝臓疾患（例えば、アルコールにより惹起されるもの）、敗血症ショック、悪液質および拒食症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８１６】
創傷治癒および上皮細胞増殖
本発明のなおさらなる態様に従って、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、治療目的のため、例えば、創傷治癒のために上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激し、毛包生成および皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用する過程が提供される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外科的創傷、切除創傷、深い創傷（真皮および表皮の損傷を含む）、眼組織創傷、歯組織創傷、口腔創傷、糖尿病潰瘍、皮膚潰瘍、肘潰瘍、動脈潰瘍、静脈うっ血性潰瘍、熱への曝露または化学物質から生ずる熱傷、および他の異常な創傷治癒状態（例えば、尿毒症、栄養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロイド、放射線療法および抗腫瘍性薬物および代謝拮抗物質を用いた全身処置に関連する合併症を含む創傷治癒を刺激するために臨床的に有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚損失後の皮膚の回復を促進するために使用され得る。
【０８１７】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、創傷床（ｗｏｕｎｄ  ｂｅｄ）への皮膚移植片の接着を増大するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激するために使用され得る。以下は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが創傷床への接着を増大するために使用され得る、移植片の型である：  自家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己表皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ  ｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕｌａｒ）移植片、ブレアブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層移植片、ヘテロ移植片、異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｒａｆｔ）、増殖性移植片、層板状移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリアティールシュ移植片、大網移植片、パッチ移植片（ｐａｔｃｈ  ｇｒａｆｔ）、茎状移植片、穿通性移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｇｒａｆｔ）、中間層皮膚移植片（ｓｐｌｉｔ  ｓｋｉｎ  ｇｒａｆｔ）、分層植皮片（ｔｈｉｃｋ  ｓｐｌｉｔ  ｇｒａｆｔ）。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚の強度を助長するため、および加齢した皮膚の外見を改善するために使用され得る。
【０８１８】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵臓、胃、小腸、および大腸における上皮細胞増殖における変化を生じると考えられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上皮細胞（例えば、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝細胞、ＩＩ型肺細胞、ムチン産生杯細胞、および他の上皮細胞、ならびに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれらの前駆体）の増殖を促進し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内皮細胞、ケラチノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し得る。
【０８１９】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、放射線、化学療法処置またはウイルス感染から生じる腸の毒性の副作用を軽減するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、小腸粘膜に対して細胞保護的効果を有し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、化学療法およびウイルス感染から生じる粘膜炎（口潰瘍）の治癒を刺激し得る。
【０８２０】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、やけどを含む、完全なおよび部分的な厚さの皮膚欠損における皮膚の完全な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の再増殖）、乾癬等の他の皮膚欠損の処置においてさらに使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、表皮水疱症（これらの病変の再上皮形成を加速することにより、頻繁な開放性かつ疼痛性の水膨れを生じる、下層の真皮への表皮の接着の欠損）を処置するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、粘膜内層の瘢痕形成ならびに腺性粘膜および十二指腸の粘膜の再生により、より迅速な治癒を補助するために使用され得る。炎症性腸疾患、例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎は、小腸または大腸それぞれの粘膜表面の破壊を生じる疾患である。したがって、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、粘膜表面の再表面の形成を促進して、より迅速な治癒を補助し、炎症性腸疾患の進行を防ぐために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いる処置は、胃腸管全体の粘液の産生に対して有意な効果を有すると予期され、摂取された有害な物質から、または外科手術後に、腸粘膜を保護するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、その発現不足に関連する疾患を処置するために使用され得る。
【０８２１】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、様々な病的状態に起因する肺への損傷を予防および治癒するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、急性もしくは慢性肺損傷を予防または処置するために、肺胞および細気管支上皮の増殖および分化を刺激し得、その修復を促進し得る。例えば、肺胞の進行性の損失を生じる肺気腫、ならびに細気管支上皮および肺胞の壊死を生じる吸入傷害（すなわち、煙の吸入およびやけどから生じる）は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストを用いて、効果的に処置され得る。また、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＩＩ型肺細胞の増殖および分化を刺激するために使用され得、これは、早産児における肺硝子膜症（例えば、乳児呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症）等の疾患を処置または予防するために役立ち得る。
【０８２２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、肝細胞の増殖および分化を刺激し得、したがって、肝硬変により惹起される激症肝不全、ウイルス性肝炎および毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素および当該技術分野で周知の他の肝臓毒素）により惹起される肝臓損傷等の肝臓疾患および病理学的状態を緩和または処置するために使用され得る。
【０８２３】
加えて、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、真性糖尿病の発症を処置または予防するために使用され得る。新たに、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病と診断された患者において、いくらかの島細胞機能が残っている場合、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、その疾患の永続的な兆候を、緩和、遅延、または予防するように、その島機能を維持するために使用され得る。また、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、島細胞機能を改善または促進するための島細胞移植における補助として使用され得る。
【０８２４】
神経活性および神経疾患
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、脳および／または神経系の疾患、障害、損傷、または傷害の診断および／または処置のために使用され得る。本発明の組成物（例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を用いて処置され得る神経系疾患としては、軸索の切断、ニューロンの減少もしくは変性、または脱髄のいずれかを引き起こす、神経系損傷および疾患、障害または状態が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法に従って、患者（ヒトおよび非ヒト哺乳動物患者を含む）において処置され得る神経系病変としては、以下の中枢神経系（脊髄、脳を含む）または末梢神経系のいずれかの病変が挙げられるが、これらに限定されない。（１）虚血病変（ここで、神経系の一部における酸素不足により、ニューロンの損傷または死が生じ、これには大脳梗塞もしくは虚血、または脊髄梗塞もしくは虚血が挙げられる）、（２）外傷病変（身体的損傷により生じるかまたは手術に関連する病変、例えば、神経系の一部分を切断する病変、または圧縮損傷を含む）、（３）悪性病変（ここで、神経系の一部分は、神経系関連悪性腫瘍もしくは非神経系組織由来の悪性腫瘍のいずれかである悪性組織により破壊または損傷される）、（４）感染性病変（ここで、神経系の一部分は、感染の結果として、例えば、膿瘍による、またはヒト免疫不全ウイルス、帯状ヘルペスもしくは単純ヘルペスウイルスによる感染か、あるいはライム病、結核、梅毒に関連して、破壊または損傷される）、（５）変性病変（ここで、神経系の一部分は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する変性が挙げられるが、これらに限定されない、変性過程の結果として破壊または損傷される）、（６）栄養疾患または障害に関連する病変（ここで、神経系の一部分は、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ウェルニッケ病、タバコアルコール性弱視、マルキアファーバ−ビニャーミ病（脳梁の一次変性）およびアルコール小脳変性が挙げられるが、これらに限定されない、栄養障害または代謝障害により破壊または損傷される）、（７）全身性疾患に関連する神経性病変（糖尿病（糖尿病性ニューロパシー、ベル麻痺）、全身性エリテマトーデス、癌または類肉腫症が挙げられるが、これらに限定されない）、（８）アルコール、鉛または特定の神経毒を含む、毒性物質により生じる病変、ならびに（９）脱髄性病変（ここで、神経系の一部分は、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連ミエロパシー、横断性ミエロパシーまたは様々な病因、進行性多病巣性白質脳障害、および橋中央ミエリン溶解が挙げられるが、これらに限定されない、脱髄性執権により破壊または損傷される）。
【０８２５】
一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、低酸素症の損傷効果から神経細胞を保護するために用いられる。さらに好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大脳低酸素症の損傷硬化から神経細胞を保護するために用いられる。この実施形態に従って、本発明の組成物は、大脳低酸素症に関連する神経細胞傷害を処置または予防するために用いられる。この実施形態の１つの非限定態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大脳虚血と関連する神経細胞傷害を処置または予防するために用いられる。この実施形態の別の非限定態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大脳梗塞に関連する神経細胞傷害を処置または予防するために用いられる。
【０８２６】
別の好ましいこの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、脳卒中に関連する神経細胞傷害を処置または予防するために用いられる。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、脳卒中に関連する大脳神経細胞傷害を処置または予防するために用いられる。
【０８２７】
別の好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、心臓発作に関連する神経細胞傷害を処置または予防するために用いられる。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、心臓発作に関連する大脳神経細胞傷害を処置または予防するために用いられる。
【０８２８】
神経系障害を処置または予防するために有用な本発明の組成物は、ニューロンの生存または分化の促進における生物学的活性について試験することにより選択され得る。例えば、これらに限定されないが、以下の任意の効果を誘発する本発明の組成物は、本発明に従って有用であり得る。（１）低酸素症または低酸素状態の存在または非存在下のいずれかの培養におけるニューロンの生存時間の増大、（２）培地または生体内におけるニューロンの発芽の増大、（３）培地または生体内におけるニューロン関連分子（例えば、運動ニューロンに関連するコリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンステラーゼ）の産生の増大、あるいは（４）生体内におけるニューロン機能障害の症状の軽減。このような効果は、当該技術分野で周知の任意の方法により測定され得る。好ましい非制限的な実施形態において、ニューロンの生存時間の増大は、本明細書に記載される方法、ないしは別様に、例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：３６３７−４２（２０００）、または、Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１０：３５０７−３５１５（１９９０）等における、当該技術分野で周知の方法を使用して慣用的に測定され得、ニューロンの発芽の増大は、例えば、Ｐｅｓｔｒｏｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，７０：６５−８２（１９８０））、またはＢｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，４：１７−４２（１９８１）等に記載される当該技術分野で周知の方法により検出され得、ニューロン関連分子の産生の増大は、当該技術分野で公知の技術を使用し、測定されるべき分子に応じて、バイオアッセイ、酵素アッセイ、抗体結合、ノーザンブロットアッセイ等により測定され得、運動ニューロンの機能障害は、運動ニューロン障害の物理的発現（例えば、弱さ、運動ニューロンの伝導速度、または機能障害）を評価することにより測定され得る。
【０８２９】
特定の実施形態において、本発明に従って処置され得る運動ニューロン障害は、梗塞、感染、毒素への曝露、外傷、外科的損傷、運動ニューロンおよび神経系他の成分に作用し得る変性疾患または悪性腫瘍等の障害、ならびに筋萎縮性側索硬化症のようにニューロンに特異的に作用し、および進行性脊髄性筋萎縮症、進行性球麻痺、原発性側索硬化症、幼児性および若年性筋萎縮症、小児の進行性延髄麻痺ファチオーロンド症候群）、灰白髄炎およびポリオ後症候群、および遺伝性運動感覚ニューロパシー（シャルコーマリートゥース病）が挙げられるが、これらに限定されない障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８３０】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ニューロンの生存、ナプス形成、コンダクタンス、神経分化等において役割を果たし得る。したがって、本発明の組成物（本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む）は、障害の学習および／または認識が挙げられるが、これらに限定されない、これらの役割に関連する疾患もしくは障害を診断および／または処置または予防するために使用され得る。本発明の組成物は、神経変性疾患状態および／または行動障害の処置または予防において有用であり得る。このような神経変性疾患状態および／または行動障害としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、トゥレット症候群、統合失調症、躁病、認知症、パラノイア、強迫神経症障害、パニック障害、学習障害、ＡＬＳ、精神病、自閉症、ならびに摂食、睡眠パターン、バランスおよび知覚における障害を含む行動変化が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、本発明の組成物は、発生胚に関連する障害または性関連障害の処置、予防、および／または検出においても役割を果たし得る。
【０８３１】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、障害頸動脈疾患（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄、またはモヤモヤ病）、脳のアミロイドアンギオパチー、脳動脈瘤、脳無酸素症、脳動脈硬化症、脳動静脈奇形、脳動脈疾患、脳塞栓症および血栓症（例えば、頸動脈血栓症、静脈洞血栓症、またはワレンベルク症候群）、脳出血症（例えば、硬膜外または硬膜下血腫、またはくも膜下出血）、脳梗塞、脳虚血（例えば、一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群または椎骨脳底動脈循環不全）、血管性認知症（例えば、多発脳梗塞性）、脳室周囲白質軟化症および血管性頭痛（例えば、群発性頭痛または片頭痛）が挙げられるが、これらに限定されない、脳血管に関連する疾患、損傷、障害、または傷害から神経細胞を保護するために有用であり得る。
【０８３２】
本発明のなおさらなる一態様に従って、治療目的のために、例えば、神経細胞の増殖および／または分化を刺激するために、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを利用するための過程が提供される。したがって、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、神経系疾患を処置および／または検出するために使用され得る。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の神経系疾患または障害のマーカーまたは検出器として使用され得る。
【０８３３】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得る神経系疾患の例としては、脳疾患、例えば、母性フェニルケトン尿症等のフェニルケトン尿症を含む代謝脳疾患、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、ビルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損症、ウェルニッケ脳症、脳浮腫、脳新生物、例えば、テント下新生物を含む小脳新生物、脳室新生物、例えば、脈絡叢新生物、視床下部新生物、テント上新生物、カナバン病、小脳疾患、例えば、毛細血管拡張性失調症等の脊髄小脳変性を含む小脳運動失調症、小脳共同運動障害、フリードリッシュ運動失調症、マチャドジョセフ病、オリーブ橋小脳萎縮症、小脳新生物、例えば、テント下新生物、汎発性脳硬化症、例えば、軸周囲脳炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症および亜急性硬化性全脳炎が挙げられる。
【０８３４】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経系疾患としては、脳血管障害（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄およびモヤモヤ病を含む、頸動脈疾患）、脳のアミロイドアンギオパチー、脳動脈瘤、脳無酸素症、脳動脈硬化症、脳動静脈奇形、脳動脈疾患、脳塞栓症および血栓症、例えば、頸動脈血栓症静脈洞血栓症およびワレンベルク症候群、脳出血症、例えば、硬膜外血腫、硬膜下血腫およびくも膜下出血、脳梗塞、脳虚血、例えば、一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群および椎骨脳底動脈循環不全、血管認知症、例えば、多発脳梗塞性認知症、脳室周囲白質軟化症、血管性頭痛、例えば、群発性頭痛および片頭痛が挙げられる。
【０８３５】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経系疾患としては、認知症、例えば、ＡＩＤＳ認知症合併症、初老期認知症、例えば、アルツハイマー病およびクロイツフェルトヤコブ症候群、老年性認知症、例えば、アルツハイマー病および進行性核上麻痺、血管認知症、例えば、多発脳梗塞性認知症、軸周囲脳炎、ウイルス脳炎、例えば、流行性脳炎、日本脳炎、セントルイス脳炎、ダニ媒介脳炎およびウエスト・ナイル熱を含む脳炎、急性播種性脳脊髄炎、髄膜脳炎、例えば、ブドウ膜脳炎症候群、脳炎後パーキンソン病および亜急性硬化性全脳炎、脳軟化症、例えば、脳室周囲白質軟化症、てんかん、例えば、幼児性けいれん、欠神発作、ＭＥＲＲＦ症候群を含むミオクローヌスてんかん、強直間代性てんかん、部分てんかん、例えば、複雑部分てんかん、前頭葉てんかん、および側頭葉てんかん、外傷後てんかん、例えば、持続性部分てんかん等を含むてんかん重積状態、ならびにハレルフォルデンスパッツ症候群のてんかんを含む全般てんかんが挙げられる。
【０８３６】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経系疾患としては、ダンディウォーカー症候群および正常圧水頭症等の水頭症、視床下部性新生物等の視床下部性疾患、脳マラリア、脱力発作を含むナルコレプシー、延髄灰白髄炎、脳偽腫瘍、レット症候群、ライ症候群、視床疾患、脳トキソプラスマ症、頭蓋内結核腫およびツェルヴェーガー症候群、ＡＩＤＳ痴呆複合症等の中枢神経系感染、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、馬脳脊髄炎等の脳脊髄炎、ベネズエラ馬脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、ビスナ、ならびに脳マラリアが挙げられる。
【０８３７】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経系疾患としては、髄膜炎、例えば、くも膜炎、無菌性髄膜炎、例えば、リンパ球性絨毛髄膜炎を含むウイルス髄膜炎、ヘモフィルス髄膜炎、リステリア髄膜炎を含む細菌髄膜炎、髄膜炎菌性髄膜炎、例えば、ウォーターハウスフリーデリクセン症候群、肺炎球菌髄膜炎および髄膜結核症、真菌髄膜炎、例えば、クリプトコックス髄膜炎、硬膜下滲出、髄膜脳炎、例えば、ブドウ膜脳炎症候群、横断性脊髄炎等の脊髄炎、脊髄癆等の神経梅毒、延髄灰白髄炎および灰白髄炎後症候群を含む灰白髄炎、プリオン疾患（例えば、クロイツフェルトヤコブ症候群、ウシ海綿状脳症、ゲルストマンストロイスラー症候群、クールー、スクレピー）、ならびに脳トキソプラズマ症が挙げられる。
【０８３８】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経系疾患としては、中枢神経系新生物を含む脳新生物、例えば、小脳新生物、例えば、テント下新生物、脳室新生物、例えば、脈絡叢新生物、視床下部新生物およびテント上新生物、髄膜新生物、硬膜外新生物を含む脊髄新生物、脱髄疾患、例えば、カナバン疾患、副腎白質ジストロフィーを含む汎発性脳硬化症、軸周囲脳炎、球様細胞白質萎縮症、汎発性脳硬化症、例えば、異染性白質萎縮症、アレルギー性脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、多発性硬化症、橋中央ミエリン溶解、横断性脊髄炎、視神経脊髄炎、スクレピー、脊柱湾曲症、慢性疲労症候群、ビスナ、高圧神経症候群、髄膜症、脊髄疾患、例えば、先天性筋無緊張症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、例えば、ウェルドニッヒホフマン病、脊髄圧迫、脊髄新生物、例えば、硬膜外新生物、脊髄空洞症、脊髄癆、スティフマン症候群、知能発育不全、例えば、アンジェルマン症候群、猫鳴き症候群、ドランジ症候群、ダウン症候群、ガングリオシドーシス、例えば、ガングリオシドーシスＧ（Ｍ１）、サンドホフ病、テイサックス病、ハートナップ病、ホモシスチン尿症、ローレンスムーンビードル症候群、レッシュナイハン症候群、メープルシロップ尿症、ムコリピドーシス、例えば、フコシドーシス、神経セロイドリポフスチン症、眼脳腎症候群、フェニルケトン尿症、例えば、母性フェニルケトン尿症、プラダウィリ症候群、レット症候群、ルビンスタインテイビ症候群、結節硬化症、ＷＡＧＲ症候群、神経系異常、例えば、全前脳症、神経管欠損症、例えば、水無脳症を含む無脳症、ア−ノルドキアリ奇形、脳ヘルニア、髄膜瘤、髄膜脊髄瘤、脊椎管癒合異常、例えば、嚢胞性二分脊椎および潜在性二分脊椎が挙げられる。
【０８３９】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経系疾患は、シャルコーマリー病、遺伝性視神経萎縮、レフサム病、遺伝性痙性対麻痺、ウェルドニッヒホフマン病、遺伝性感覚および自律神経ニューロパシー、例えば、先天性無痛覚症および家族性自律神経失調症を含む遺伝性運動感覚ニューロパシー、精神症状（例えば、ゲルストマン症候群を含む失認症、健忘症、例えば、逆向性健忘症、行動不能症、神経因性膀胱、脱力発作、コミュニケーション障害、例えば、難聴、部分的な聴覚喪失、ラウドネスレクルートメント（ｌｏｕｄｎｅｓｓ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）および耳鳴りを含む聴覚障害、言語障害、例えば、失書症、健忘性失語症、ブローカ失語症およびウェルニッケ失語症を含む失語症、失読症、例えば、後天性失読症、言語発達障害、例えば、健忘性失語症、ブローカ失語症およびウェルニッケ失語症を含む失語症、構音障害、コミュニケーション障害、例えば、構音障、反響言語、無言症および吃音を含む言語障害、発声障害、例えば、失声症および嗄声、除脳硬直状態、狂乱状態、線維束収縮、幻覚、髄膜症、運動障害、例えば、アンジェルマン症候群、運動失調、アテトーシス、舞踏病、筋失調症、運動低下症、筋緊張低下、ミオクローヌス、チック、斜頸および振戦、筋緊張亢進、例えば、筋硬直、例えば、スティフマン症候群、筋痙直、麻痺、例えば、耳帯状疱疹を含む顔面麻痺、胃不全麻痺、片麻痺、眼筋麻痺、例えば、複視、デュアン症候群、ホルネル症候群、慢性進行性外眼筋麻痺、例えば、キーンズ症候群、延髄麻痺、熱帯性痙性不全対麻痺、対麻痺、例えば、ブラウンセカール症候群、四肢麻痺、呼吸麻痺および声帯麻痺、不全麻痺、幻肢、味覚障害、例えば、味覚消失および味覚障害、視覚障害、例えば、弱視、失明、色覚欠如、複視、半盲、暗点および正常以下視力、睡眠障害、例えば、クライネレヴィン症候群を含む過眠、不眠および夢遊、けいれん、例えば、開口障害、意識消失、例えば、昏睡、遷延性植物状態および失神および目まい、神経筋疾患、例えば、先天性筋無緊張症、筋萎縮性側索硬化症、ランバートイートン筋無力症症候群、運動ニューロン障害、筋萎縮症、例えば、脊髄性筋萎縮症、シャルコーマリー病およびウェルドニッヒホフマン病、ポリオ後脊髄炎症候群、筋ジストロフィー、重症筋無力症、萎縮性ミオトニー、先天性ミオトニー、ネマリンミオパシー、家族性周期性四肢麻痺、多発性パラミオクロヌス（Ｐａｒａｍｙｌｏｃｌｏｎｕｓ）、熱帯性痙性不全対麻痺およびスティフマン症候群、末梢神経系疾患、例えば、先端疼痛症、アミロイドニューロパシー、自律神経系疾患、例えば、エーディ症候群、バレーリュー（Ｂａｒｒｅ−Ｌｉｅｏｕ）症候群、家族性自律神経失調症、ホルネル症候群、反射性交感神経性ジストロフィーおよびシャイドレーガー症候群、脳神経疾患、例えば、聴神経疾患、例えば、神経線維腫症を含む聴神経腫、顔面神経疾患、例えば、顔面神経痛、メルカーソンローゼンタール症候群、弱視を含む眼球運動障害、眼振、動眼神経麻痺、眼筋麻痺、例えば、デュアン症候群、ホルネル症候群、キームス症候群を含む慢性進行性���眼筋麻痺、内斜視および外斜視等の斜視、眼球運動神経麻痺、視神経疾患、例えば、遺伝性視神経萎縮を含む視神経萎縮、視神経円板ドルーゼ、視神経炎、例えば、視神経脊髄炎、乳頭浮腫、三叉神経痛、声帯麻痺、脱髄疾患、例えば、視神経脊髄炎および脊柱湾曲症、ならびに糖尿病ニューロパシー、例えば、糖尿病足が挙げられる。
【０８４０】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経系疾患としては、神経圧迫症候群、例えば、手根管症候群、足根管症候群、胸郭出口症候群、例えば、頸肋症候群、尺骨神経圧迫症候群、神経痛、例えば、灼熱痛、頸腕神経痛、顔面神経痛および三叉神経痛、神経炎、例えば、実験的アレルギー性神経炎、視神経炎、多発性神経炎、多発性神経根神経炎および神経根炎、例えば、多発性神経根炎、遺伝性運動および感覚ニューロパシー、例えば、シャルコーマリー疾患、遺伝性視神経萎縮、レフサム病、遺伝性痙性対麻痺およびウェルドニッヒホフマン病、遺伝性感覚および自律神経ニューロパシー（先天性無痛覚症および家族性自律神経障害を含む）、ＰＯＥＭＳ症候群、坐骨神経痛、味覚性発汗およびテタニーが挙げられる。
【０８４１】
内分泌障害
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ホルモン異常に関連する障害および／または疾患、ならびに／あるいは内分泌系の障害または疾患を処置、予防、診断、および／または予後診断するために使用され得る。
【０８４２】
内分泌系の腺により分泌されるホルモンは、身体発育、性機能、代謝、および他の機能を制御する。障害は、２通り、すなわちホルモンの産生における障害、およびホルモンに応答する組織の不全に分類され得る。これらのホルモン異常および内分泌系の疾患、障害または状態の病因は、遺伝的、体細胞性（例えば、癌およびいくつかの自己免疫疾患）、後天性（例えば、化学治療、損傷または毒素によって）、または感染性であり得る。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内分泌系および／またはホルモン異常に関連する特定の疾患または障害のマーカーまたは検出器として使用され得る。
【０８４３】
内分泌系および／またはホルモン異常および／または疾患は、子宮運動の障害を包含し、これには、妊娠および陣痛に伴う合併症（例えば、早期陣痛、過期妊娠、自然流産、ならびに遅延陣痛および停止した陣痛）、ならびに月経周期の障害および／または疾患（例えば、月経困難症および子宮内膜症）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８４４】
内分泌系および／またはホルモン異常の障害および／または疾患としては、膵臓の障害および／または疾患（例えば、真性糖尿病、尿崩症、先天性白内障欠損、褐色細胞腫−島細胞腫瘍症候群）、副腎の障害および／または疾患（例えば、アジソン病、コルチコステロイド欠損、男性化作用疾患、多毛症、クッシング症候群、高アルドステロン症、褐色細胞腫）、下垂体の障害および／または疾患（例えば、下垂体機能亢進症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、下垂体腺腫、汎下垂体機能低下症、先端巨大症、巨人症）、甲状腺の障害および／または疾患（甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、プラマー病、グレーヴス病（毒性散在甲状腺腫）、毒性小結節甲状腺種、甲状腺炎（橋本甲状腺炎、亜急性肉芽腫性甲状腺炎、およびサイレントリンパ球性甲状腺炎）、ペンドレッド症候群、粘液水腫、クレチン病、甲状腺中毒症、甲状腺ホルモン縮合障害、チミン形成不全症、甲状腺のヒュルトレ細胞腫瘍、甲状腺癌、甲状腺悪性腫瘍、髄様甲状腺癌が挙げられるが、これらに限定されない）、副甲状腺の障害および／または疾患（例えば、上皮小体機能亢進症、上皮小体機能低下症）、視床下部の障害および／または疾患が挙げられる。
【０８４５】
加えて、内分泌系および／またはホルモン異常の障害および／または疾患はまた、癌を含む、精巣または卵巣の障害および／または疾患を含み得る。精巣または卵巣の他の障害および／または疾患としては、例えば、卵巣癌、多嚢胞性卵巣症候群、クラインフェルター症候群、消失精巣症候群（両側無睾丸症）、ライディッヒ細胞の先天性欠損、停留睾丸、ヌーナン症候群、筋緊張性ジストロフィー、精巣の毛細血管種（良性）、精巣および新精巣の新生組織形成がさらに挙げられる。
【０８４６】
さらに、内分泌系および／またはホルモン異常の障害および／または疾患はまた、例えば、多内分泌腺機能低下症候群、褐色細胞腫、神経芽細胞腫、多発性内分泌腺腫症等の障害および／または疾患、ならびに内分泌組織の障害および／または癌を含み得る。
【０８４７】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のアルブミンタンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質が発現される、組織に関連する内分泌疾患および／または障害を診断、予後診断、予防、および／または処置するために使用され得る。
【０８４８】
生殖器系障害
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、生殖器系の疾患および／または障害を診断、処置または予防するために使用され得る。本発明の組成物により処置され得る生殖器系障害としては、生殖器系傷害、感染、腫瘍性障害、先天性欠損、ならびに不妊症、妊娠、陣痛または分娩に伴う合併症、および分娩後障害をもたらす疾患または障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８４９】
生殖器系障害および／または疾患としては、精巣萎縮症、精巣性女性化症候群、停留睾丸（片側および両側）、無睾丸症、異所性精巣、精巣上体炎および精巣炎（典型的に、例えば、淋病、おたふく風邪、結核症および梅毒等の感染から生じる）、睾丸捻転、結節性精管炎、生殖細胞腫瘍（例えば、精上皮腫、胚性細胞癌腫、奇形癌、絨毛癌腫、卵黄嚢腫瘍および奇形腫）、間質性腫瘍（例えば、ライディッヒ細胞腫瘍）、睾丸瘤、血瘤、精索静脈瘤、精液瘤、鼠径ヘルニアおよび精子産生の障害（例えば、線毛不動症候群、無精液症、精子無力症、無精子症、精子減少症および奇形無精子症）を含む精巣の疾患および／または障害が挙げられる。
【０８５０】
生殖器系障害としてはまた、例えば、急性非細菌性前立腺炎、慢性非細菌性前立腺炎、急性細菌性前立腺炎、慢性細菌性前立腺炎、前立腺失調症、前立腺炎、肉芽腫性前立腺炎、マラコプラキア、良性前立腺肥大または肥厚、および前立腺腫瘍性障害（腺癌をふくむ）、移行上皮癌、腺管癌、および扁平上皮癌等の前立腺の障害が挙げられ得る。
【０８５１】
さらに、本発明の組成物は、炎症性障害（例えば、亀頭包皮炎、閉塞性乾燥性亀頭炎、包茎、嵌頓包茎、梅毒、単純ヘルペスウイルス、淋病、非淋菌性尿道炎、クラミジア、マイコプラズマ、トリコモナス、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、ライター症候群、尖圭コンジローム、扁平コンジロームおよび真珠様陰茎小丘疹）；尿道異常（例えば、尿道下裂、尿道上裂、および包茎；前癌性病変（ケイラー赤色肥厚症、ボーエン病、ボーエン様丘疹症、ブシュケレーベンシュタインの巨大コンジローム、およびいぼ状癌腫を含む；陰茎癌（扁平上皮細胞癌腫、原位置の癌腫、疣状癌腫および播種性陰茎癌腫を含む）；尿道性腫瘍性障害（陰茎尿道癌腫、尿道球膜癌腫および前立腺尿道性癌腫を含む）；および勃起障害（例えば、持続勃起症、ペイロニー病、勃起機能障害およびインポテンツ）を含むペニスおよび尿道の障害または疾患の診断、処置および／または予防において有用であり得る。
【０８５２】
さらに、輸精管の疾患および／または障害としては、脈管炎およびＣＢＡＶＤ（輸精管の先天性両側性精管欠損）が挙げられ、さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、包虫症、先天性塩素下痢および多発性嚢胞腎臓疾患を含む、精嚢の疾患および／または障害の診断、処置および／または予防において使用され得る。
【０８５３】
男性生殖器系の他の障害および／または疾患としては、例えば、クラインフェルター症候群、ヤング症候群、早漏、真性糖尿病、嚢胞性線維症、カルタゲナー症候群、高熱、多発性硬化症、および女性化乳房が挙げられる。
【０８５４】
さらに、本発明のポリヌクレオチド、融合タンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、細菌性膣炎、カンジダ膣炎、単純ヘルペスウイルス、軟性下疳、鼠径部肉芽腫、鼠径リンパ肉芽腫、疥癬、ヒトパピローマウイルス、膣外傷、外陰外傷、腺症、クラミジア膣炎、淋病、トリコモナス膣炎、尖圭コンジローム、梅毒、伝染性軟属腫、萎縮性膣炎、パジェット病、萎縮性硬化症、扁平苔癬、外陰痛、毒素ショック症候群、膣痙、外陰膣炎、外陰膣前庭炎、ならびに腫瘍性障害（例えば、扁平上皮細胞過形成、明細胞癌腫、基底細胞癌腫、メラノーマ、バルトリン腺癌および外陰上皮内異常増殖）を含む、膣および外陰部の疾患および／または障害の診断、処置および／または予防において有用であり得る。
【０８５５】
子宮の障害および／または疾患としては、月経困難症、後傾子宮、子宮内膜症、子宮筋腫、腺筋症、無排卵性出血、無月経、クッシング症候群、胞状奇胎、アッシェルマン症候群、早期閉経、性的早熟、子宮ポリープ、機能不全性子宮出血（例えば、異常なホルモンシグナルに起因する）、および腫瘍性障害（例えば、腺癌、平滑筋肉腫、および肉腫）が挙げられる。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、双角子宮、中隔子宮、単純単角子宮、非空腔性不全角を有する単角子宮、非交通空腔不全角を有する単角子宮、交通空腔角を有する単角子宮、弓状子宮、子宮二空洞およびＴ型子宮等の子宮異常のマーカーまたは検出器として、ならびに子宮異常の診断、処置および／または予防において有用であり得る。
【０８５６】
卵巣疾患および／または障害としては、無排卵、多嚢胞性卵巣症候群（スタインレーベンタール症候群）、卵巣嚢胞、卵巣機能低下、ゴナドトロピンへの卵巣非感受性、アンドロゲンの卵巣過剰産生、右卵巣静脈症候群、無月経、多毛症、および卵巣癌（一次および二次癌増殖、セルトリライディッヒ腫瘍、卵巣の類内膜癌、卵巣乳頭漿液性腺癌、卵巣粘液性腺癌、および卵巣クルッケンベルグ腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。
【０８５７】
子宮頸疾患および／または障害としては、子宮頸管炎、慢性子宮頸管炎、粘液膿性子宮頸管炎、子宮頸部形成異常、頸部ポリープ、ナボット嚢胞、子宮膣部びらん、子宮膣部不全、および子宮頸部新生物（例えば、子宮頸癌腫、扁平上皮化生、扁平上皮細胞癌腫、腺扁平上皮細胞異常増殖、および円柱状細胞異常増殖を含む）が挙げられる。
【０８５８】
さらに、生殖器系の疾患および／または障害としては、流産および死産（例えば、早期の中絶、後期の中絶、自然流産、人工流産、治療的流産、切迫流産、稽留流産、不全流産、完全流産、習慣性流産、稽留流産、および敗血性流産）、異所性妊娠、貧血、Ｒｈ不適合、妊娠中の膣内出血、妊娠性糖尿病、子宮内成長遅延、羊水過多症、ＨＥＬＬＰ症候群、胎盤早期剥離、前置胎盤、妊娠悪阻、子癇前症、子癇、妊娠性ヘルペス、および妊娠性じんま疹を含む、妊娠の障害および／または疾患を含む。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、心臓疾患、心不全、リウマチ性心臓疾患、先天性心臓疾患、僧帽弁逸脱、高血圧、貧血、腎臓疾患、感染症（例えば、風疹、サイトメガロウイルス、トキソプラズマ症、感染性肝炎、クラミジア、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、および陰部ヘルペス）、真性糖尿病、グレーブス病、甲状腺炎、甲状腺機能低下症、橋本甲状腺炎、慢性活動性肝炎、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、喘息、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、虫垂炎、卵巣嚢胞、胆嚢障害、および腸閉塞を含む妊娠を困難にし得る疾患の診断、処置および／または予防において使用され得る。
【０８５９】
陣痛および分娩に関連する合併症としては、膜の早期破裂、早期陣痛、過期妊娠、過熟妊娠症、非常に遅く進行する陣痛（ｌａｂｏｒ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ  ｔｏｏ  ｓｌｏｗｌｙ）、胎児仮死（例えば、異常な心拍数（胎児または母体）、呼吸困難および異常な胎児位置）、肩甲難産、臍帯脱出、羊水塞栓症、および異常な子宮出血が挙げられる。
【０８６０】
さらに、出産後期間の疾患および／または障害としては、子宮内膜炎、子宮筋層炎、子宮傍結合組織炎、腹膜炎、骨盤内血栓性静脈炎、肺塞栓症、内毒素血症、腎盂腎炎、伏在静脈静脈血栓症、乳腺炎、膀胱炎、分娩後出血、および子宮反転症が挙げられる。
【０８６１】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより診断、処置および／または予防され得る女性生殖器系の他の障害および／または疾患としては、例えば、ターナー症候群、仮性半陰陽、月経前症候群、骨盤内炎症性疾患、骨盤うっ血（血管拡張）、不感症、無オルガスム症、性交疼痛症、卵管破裂および月経中期の排卵に伴う下腹部の違和感や痛み（Ｍｉｔｔｅｌｓｃｈｍｅｒｚ）が挙げられる。
【０８６２】
感染症
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、感染物質を処置または検出するために使用され得る。例えば、免疫応答を増大させる、特に、Ｂおよび／またはＴ細胞の増殖および分化を増大させることにより、感染症は処置され得る。免疫応答は、存在する免疫応答を高めるか、あるいは新しい免疫応答を開始させるかのいずれかにより、増大され得る。代替として、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、免疫応答を必ずしも導くことなく、感染物質を直接的に阻害し得る。
【０８６３】
ウイルスは、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより処置または検出され得る疾患または徴候を惹起し得る感染物質の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡおよびＲＮＡウイルスおよびウイルスファミリーが挙げられるが、これらに限定されないウイルスの例が挙げられるが、これらに限定されない：  アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブニヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイルス科、コロナウイルス科、デング熱、ＥＢＶ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、帯状疱疹）、モノネガウイルス（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス属、ラブドウイルス科）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイルス、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、天然痘または牛痘）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらのファミリー内にあるウイルスは、関節炎、細気管支炎、呼吸器合胞体ウイルス、脳炎、眼感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、Ｂ型日本脳炎、フニン、チクングンヤ熱、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血性熱、はしか、おたふく風邪、パラインフルエンザ、狂犬病、一般的な風邪、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚疾患（例えば、カポジ肉腫、いぼ）、およびウイルス血症が挙げられるが、これらに限定されない、様々な疾患または徴候を惹起し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、任意のこれらの徴候または疾患を処置または検出するために使用され得る。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および／または肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）を処置するために用いられる。追加の特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処置するために用いられる。さらに特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＡＩＤＳを処置するために用いられる。
【０８６４】
同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより処置または検出され得る細菌性あるいは真菌性因子は、以下のグラム陰性およびグラム陽性細菌、細菌ファミリー、および菌類：  アクチノミセス（例えば、放射菌（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ））、アシネトバクター属、クリプトコッカスネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス、バシラス科（例えば、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｓｉｓ））、バクテロイデス属（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒｎｇｉｌｉｓ）、ブラストミセス症、ボルデテラ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、ライム病菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ））、ブルセラ菌、カンジダ、カンピロバクター、クラミジア、クロストリジウム属（例えば、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｃｉｌｅ）、クロストリジウムパーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コクシジオイデス属、コリネバクテリウム属（例えば、ジフテリア菌毒素（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｐｔｈｅｒｉａｅ））クリプトコッカス、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、大腸菌（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（例えば、エンセロバクターエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ））、腸内細菌科（クレブシエラ、サルモネラ（例えば、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ゲルトネル菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ））、セラシア属、エルシニア属、シゲラ）、エリジペロスリックス属、ヘモフィルス（例えば、Ｂ型ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ））、ヘリコバクター属、レジオネラ（例えば、レジオネラニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ））、レプトスピラ属、リステリア（例えば、リステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、マイコプラズマ、マイコバクテリウム属（例えば、ハンセン菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）およびヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、ビブリオ（例えば、ビブリオコレラ（Ｖｉｖｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ナイセリア科（例えば、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｌｉｄｉｓ））、パスツレラ属、プロテウス属、シュードモナス（例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｎｕｇｉｎｏｓａ））リケッチア科、スピロヘータ（例えば、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．））、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ブドウ球菌（例えば、��色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ならびにＡ、ＢおよびＣ群の連鎖球菌）、ならびにウレアプラズマ属が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細菌、寄生虫、および真菌ファミリーとしては、抗生物質耐性感染、菌血症、心内膜炎、敗血症、眼感染症（例えば、結膜炎）、ブドウ膜炎、結核症、歯肉炎、細菌下痢、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連感染）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染、虫歯、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネコ引っかき病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、レジオネラ疾患、慢性および急性炎症、紅斑、酵母感染、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎（例えば、ＡおよびＢ型髄膜炎）、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ハンセン病、ブルセラ症、消化性潰瘍、炭疽、自然流産、出生異常、肺炎、肺感染、耳感染、難聴、失明、無気力、不快感、嘔吐、慢性下痢、クローン病、大腸炎、膣炎、不妊、骨盤内炎症性疾患、カンジダ症、パラ結核、結核症、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚疾患（例えば、蜂巣炎、皮膚嚢腫）、毒血症、尿道感染、創傷感染、院内感染が挙げられるが、これらに限定されない、疾患または徴候を惹起し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、任意のこれらの徴候または疾患を処置または検出するために使用され得る。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および／またはＢ型髄膜炎を処置するために用いられる。
【０８６５】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより処置、予防、および／または診断され得る疾患または徴候を惹起する寄生性因子は、以下のファミリーまたはクラス：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症、媾疫、外部寄生虫、ランブル鞭毛虫症、蠕虫病、リーシュマニア症、住血吸虫、タイレリア症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナスおよび胞子虫（例えば、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｒａｘ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）および卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ））が挙げられるが、これらに限定されない。これらの寄生虫は、疥癬、ツツガムシ病、眼感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ランブル鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラズマ症が挙げられるが、これらに限定されない、様々な疾患または徴候を惹起し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、任意のこれらの徴候または疾患を処置、予防および／または診断するために使用され得る。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、マラリアを処置、予防および／または診断するために用いられる。
【０８６６】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質を患者に投与するか、または患者から細胞を取り出し、その細胞へ本発明のポリヌクレオチドを与え、次いで操作した細胞を患者に戻す（生体外治療）かのいずれかによるものであり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、感染症に対する免疫応答を惹起するために、ワクチン中の抗原として使用され得る。
【０８６７】
再生
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、細胞を分化させ、増殖させ、誘引させ、組織の再生を導くために使用され得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：５９−８７（１９９７）を参照のこと）。組織の再生は、先天性欠損、外傷（創傷、火傷、切断、または潰瘍）、年齢、疾患（例えば、骨粗しょう症、骨関節炎、歯周病、肝不全）、美容形成術を含む手術、線維症、再灌流傷害または全身サイトカイン損傷による組織損傷を修復、置換、または保護するために使用され得る。
【０８６８】
本発明を用いて再生され得る組織としては、器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、脈管構造（血管およびリンパ管を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱、および靭帯）組織が挙げられる。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減されて生じる。再生はまた、血管新生も含み得る。
【０８６９】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、治癒困難な組織の再生を増大し得る。例えば、腱／靭帯の再生の増大は、損傷後の回復時間を早める。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、損傷を回避するために予防的にも使用され得る。処置され得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱または靭帯欠損を含む。治癒しない創傷の組織再生のさらなる一例としては、床擦れ、血管不全、手術および外傷性創傷に関連する潰瘍が挙げられる。
【０８７０】
同様に、神経および脳組織も、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、神経細胞を増殖および分化させることにより、再生され得る。この方法を用いて処置され得る疾患としては、中枢および末梢神経系疾患、ニューロパシー、または機械的および外傷性障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および脳卒中）が挙げられる。特に、末梢神経傷害、末梢ニューロパシー（例えば、化学療法または他の医学的療法から生じる）、限局性ニューロパシー、および中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイドレーガー症候群）に関連する疾患はすべて、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置され得る。
【０８７１】
胃腸障害
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症性疾患および／または状態、感染、癌（例えば、腸新生物（小腸のカルチノイド腫瘍、小腸の非ホジキンリンパ腫、小腸リンパ腫））、および潰瘍（例えば、消化性潰瘍）を含む胃腸障害を処置、予防、診断、および／または予後診断するために使用され得る。
【０８７２】
胃腸障害としては、嚥下障害、嚥下痛、食道の炎症、消化性食道炎、胃逆流、粘膜下繊維症および狭窄、マロリーワイス病変、平滑筋腫、脂肪腫、表皮癌、腺癌、胃滞留障害、胃腸炎、胃萎縮、胃／胃癌、胃のポリープ、自己免疫疾患（例えば、悪性貧血）、幽門狭窄、胃炎（細菌、ウイルス、好酸球性、ストレスに誘導される、慢性びらん性、萎縮性、血漿細胞、およびメネトリエ病）、ならびに腹膜疾患（例えば、乳び腹膜、腹腔内出血、腸間膜嚢胞、腸間膜リンパ節炎、腸間膜血管閉塞、皮下脂肪組織炎、新生物、腹膜炎、気腹、乳児横隔膜下腫瘍（ｂｕｂｐｈｒｅｎｉｃ  ａｂｓｃｅｓｓ））を含む。
【０８７３】
胃腸障害としてはまた、小腸に関連する障害（例えば、吸収不良症候群、膨張、過敏性腸症候群、糖不耐症、セリアック病、十二指腸潰瘍、十二指腸炎、熱帯性スプルー、ウィップル病、腸リンパ管拡張症、クローン病、虫垂炎、回腸の閉塞、メッケル憩室症、多発性憩室症、小腸および大腸の完全な回転障害、リンパ腫、ならびに細菌および寄生虫疾患（例えば、旅行者の下痢、腸チフスおよびパラチフス、コレラ、回虫（Ａｓｃａｒｉａｓｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、線虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）、裂頭条虫類（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、および有鉤条虫（Ｔ．ｓｏｌｉｕｍ）による感染）が挙げられる。
【０８７４】
肝臓疾患および／または障害としては、肝内胆汁うっ滞（アラジール症候群、胆汁性肝硬変）、脂肪肝（アルコール性脂肪肝、ライ症候群）、肝静脈血栓症、肝レンズ核変性症、肝腫大、肝肺症候群、肝腎症候群、門脈圧亢進症（食道および胃静脈瘤）、肝膿瘍（アメーバ性肝膿瘍）、肝硬変（アルコール性、胆汁性および実験的）、アルコール性臓疾患（脂肪肝、肝炎、肝硬変）、寄生虫（肝包虫症、肝蛭症、アメーバ性肝膿瘍）、黄疸（溶血性、肝細胞性および胆汁うっ滞性）、胆汁うっ滞性、門脈圧亢進症、肝拡大、腹水、肝炎（アルコール性肝炎、動物肝炎、慢性肝炎（自己免疫、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、薬物誘導性）、毒性肝炎、ウイルスヒト肝炎（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎）、ウィルソン病、肉芽腫性肝炎、二次性胆汁性肝硬変、肝性脳症、門脈圧亢進症、静脈瘤、肝脳症、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、肝細胞腺腫、血管腫、胆汁石、肝不全（肝脳症、急性肝臓障害）および肝臓新生物（血管筋脂肪腫、石灰化肝臓転移、嚢胞肝臓転移、上皮腫瘍、線維性層状肝細胞癌、限局性結節性過形成、肝腺腫、肝胆汁性嚢胞腺腫、肝芽細胞腫、肝細胞癌腫、肝細胞腫、肝臓癌、肝臓血管内皮腫、間葉過誤腫、肝臓の間葉腫瘍、結節性再生式過形成、良性肝臓腫瘍（肝嚢胞［単純嚢胞、多嚢胞性肝臓疾患、肝胆汁性嚢胞腺腫、総胆管嚢胞］、間葉腫瘍［間葉過誤腫、幼児性血管内皮腫、血管腫、肝臓性紫斑病、脂肪腫、炎症性偽腫瘍、ミスセラネウス（Ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ）］、上皮腫瘍［胆管上皮（胆管過誤腫、胆管腺腫）、肝細胞（腺腫、限局性結節性過形成、結節性再生式過形成）］、悪性肝臓腫瘍［肝細胞、肝芽細胞腫、肝細胞癌腫、胆管細胞、胆管癌腫、嚢胞腺癌腫、血管の腫瘍、血管肉腫、カポジ肉腫、血管内皮腫、他の腫瘍、胚性肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、癌肉腫、奇形腫、カルチノイド、扁平上皮癌腫、原発性リンパ腫］）、肝臓性紫斑病、赤血球性肝性ポルフィリン症、肝性ポルフィリン症（急性間欠性ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症）、ツェルヴェーガー症候群）を含む。
【０８７５】
膵臓疾患および／または障害としては、急性膵炎、慢性膵炎（急性壊死性膵炎、アルコール性膵炎）、新生物（膵臓の腺癌腫、嚢胞腺癌腫、インスリノーマ、ガストリノーマおよびグルカゴノーマ、嚢胞新生物、島−細胞腫瘍、パンクレオブラストーマ）および他の膵臓疾患（例えば、嚢胞性線維症、嚢胞（膵臓偽嚢胞、膵臓瘻、機能不全））が挙げられる。
【０８７６】
胆嚢疾患としては、胆石（胆石症および総胆管結石症）、胆嚢摘出後症候群、胆嚢の憩室症、急性胆嚢炎、慢性胆嚢炎、胆管腫瘍および涙嚢腫が挙げられる。
【０８７７】
大腸の疾患および／または障害としては、抗生物質関連大腸炎、憩室炎、潰瘍性大腸炎、後天性巨大結腸、膿瘍、真菌および細菌感染、肛門直腸疾患（例えば、裂溝、痔）、結腸疾患（大腸炎、結腸新生物（結腸癌、腺腫様結腸ポリープ（例えば、絨毛腺腫）、結腸癌腫（ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、結腸直腸癌）、結腸憩室炎、結腸憩室症、巨大結腸（ヒルシュスプルング病、有害な巨大結腸）；Ｓ状疾患（ｓｉｇｍｏｉｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）［直腸結腸炎、Ｓ字結腸新生物］）、便秘症、クローン病、下痢（乳児期下痢、赤痢）、十二指腸疾患（十二指腸新生物、十二指腸閉塞症、十二指腸潰瘍、十二指腸炎）、腸炎（全腸炎）、ＨＩＶ腸症、回腸疾患（回腸新生物、回腸炎）、免疫増殖性小腸疾患、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、腸閉鎖、寄生虫病（アニサキス症、バランチジウム症、ブラストシスティス属感染症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、アメーバ赤痢、ランブル鞭毛虫症）、腸瘻（直腸瘻）、腸新生物（盲腸新生物、結腸新生物、十二指腸新生物、回腸新生物、腸ポリープ、空腸新生物、直腸新生物）、腸閉塞（輸入脚症候群、十二指腸閉塞、埋伏糞便、腸偽閉塞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｓｅｕｄｏ−ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）［盲腸捻転］、腸重積症）、腸穿孔（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ）、腸ポリープ（結腸ポリープ、ガードナー症候群、ポイツジェガーズ症候群）、空腸疾患（空腸新生物）、吸収不良症候群（盲係蹄症候群、セリアック病、乳糖不耐症、短腸症候群、熱帯性スプルー、ウィップル病）、腸間膜血管閉塞、腸壁嚢胞状気腫、タンパク喪失性腸症（腸リンパギエクタシス（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｌｙｍｐｈａｇｉｅｃｔａｓｉｓ））、腸疾患（肛門疾患、便失禁、痔、直腸炎、腸瘻、脱腸、直腸瘤）、消化性潰瘍（十二指腸潰瘍、消化性食道炎、出血、穿孔、胃潰瘍、ゾリンジャーエリソン症候群）、胃切除後症候群（ダンピング症候群）、胃疾患（例えば、塩酸欠乏症、胃十二指腸の逆流（胆汁逆流）、胃洞血管膨張（ｇａｓｔｒｉｃ  ａｎｔｒａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｃｔａｓｉａ）、胃瘻、胃排出口閉塞（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｕｔｌｅｔ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、胃炎（萎縮性または肥大性）、胃不全麻痺、胃拡張、胃憩室、胃新生物（胃癌、胃ポリープ、胃腺癌、増殖性胃ポリープ）、胃破裂、胃潰瘍、胃腸軸捻）、結核、内臓下垂症、嘔吐（例えば、吐血、妊娠悪阻、手術後悪心および嘔吐）および出血性大腸炎が挙げられる。
【０８７８】
胃腸系のさらなる疾患および／または障害としては、胆管疾患、例えば、胃壁破裂、瘻（例えば、胆汁性瘻、食道瘻、胃瘻、腸瘻、膵臓瘻）、新生物（例えば、胆管新生物、食道新生物、例えば、食道の腺癌腫、食道扁平上皮細胞癌腫、胃腸新生物、膵臓新生物、例えば、膵臓の腺癌腫、膵臓の粘液嚢胞新生物、膵臓嚢胞新生物、膵芽腫および腹膜新生物）、食道疾患（例えば、水疱性疾患、カンジダ症、糖原性表皮肥厚、潰瘍化、バレット食道静脈瘤、閉鎖症、嚢胞、憩室（例えば、ツェンカー憩室）、瘻（例えば、気管食道瘻）、運動障害（例えば、ＣＲＥＳＴ症候群、嚥下障害、アカラシア、けいれん、胃食道逆流）、新生物、穿孔（例えば、ブールハーフェ症候群、マロリーワイス症候群）、狭窄、食道炎、横隔膜ヘルニア（例えば、裂孔ヘルニア）；胃腸疾患、例えば、胃腸炎（例えば、コレラ病、ノーウォークウイルス感染）、出血（例えば、吐血、メレナ、消化性潰瘍出血）、胃新生物（胃癌、胃ポリープ、胃腺癌腫、胃癌））、ヘルニア（例えば、先天的横隔膜ヘルニア、大腿ヘルニア、鼠径部ヘルニア、閉塞筋ヘルニア、へそヘルニア、腹壁ヘルニア）、および腸疾患（例えば、盲腸疾患（虫垂炎、盲腸新生物））が挙げられる。
【０８７９】
走化性
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、炎症、感染、または増殖過剰部位等の体内の特定部位に、細胞（例えば、単球、線維芽、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球上皮、および／または内皮細胞）を誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特定の外傷または異常を撃退および／または治癒し得る。
【０８８０】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。次いで、これらの走化性分子は、体内の特定位置に標的化される細胞の数を増大させることにより、炎症、感染、過増殖性疾患または任意の免疫系障害を処置するために使用され得る。例えば、走化性分子は、免疫細胞を損傷位置に誘導することにより、組織の創傷および他の外傷を処置するために使用され得る。本発明の走化性分子は、線維芽を誘引することもでき、これは、創傷を処置するために使用され得る。
【０８８１】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、走化性活性を阻害し得ることも企図される。これらの分子はまた、障害を処置するために使用され得る。したがって、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、走化性の阻害剤として使用され得る。
【０８８２】
結合活性
本発明のアルブミン融合タンパク質は、この融合タンパク質の治療用タンパク質部分に結合する分子、またはこの融合タンパク質の治療用タンパク質部分が結合する分子についてスクリーニングするために使用され得る。融合タンパク質と分子との結合は、結合した融合タンパク質または分子の活性を活性化（アゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。このような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、受容体）、または低分子が挙げられる。
【０８８３】
好ましくは、分子は、本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質部分の天然のリガンド、例えば、リガンドのフラグメント、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは機能的模倣物に密接に関連する。（Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｌ（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ  ５（１９９１）を参照のこと）。同様に、該分子は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分が結合する天然の受容体、または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分（例えば、活性部位）が結合できる少なくとも１つの受容体フラグメントに密接に関連し得る。いずれの場合でも、該分子は、周知の技法を用いて合理的に設計され得る。
【０８８４】
好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現する適切な細胞を産生する工程を含む。好ましい細胞としては、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌由来の細胞が挙げられる。
【０８８５】
アッセイは、本発明のアルブミン融合タンパク質への候補化合物の結合を単純に試験し得、ここで、結合は、標識により、または標識された競合物との競合に関するアッセイにおいて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がこの融合タンパク質への結合により生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
【０８８６】
代替として、アッセイは、無細胞調製物、固体支持体に担持させた融合タンパク質／分子、化学ライブラリ、または天然産物の混合物を用いて実施され得る。アッセイはまた、候補化合物とアルブミン融合タンパク質を含有する溶液と混合する工程、融合タンパク質／分子の活性または結合を測定する工程、および融合タンパク質／分子の活性または結合を、標準と比較する工程を単純に含み得る。
【０８８７】
好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して、試料（例えば、生体試料）における融合タンパク質のレベルまたは活性を測定することができる。抗体は、アルブミン融合タンパク質への直接的もしくは間接的に結合させるか、あるいは基質についてのアルブミン融合タンパク質との競合させることにより、融合タンパク質のレベルまたは活性を測定することができる。
【０８８８】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分が結合する受容体は、当業者に周知の多くの方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．，１（２）、Ｃｈａｐｔｅｒ  ５，（１９９１））により特定され得る。例えば、応答する細胞から調製される場合に用いられ、融合タンパク質の治療用タンパク質部分がＦＧＦに対応する場合、発現クローニングが採用されてもよく、ここで、ポリアデニル化されたＲＮＡは、アルブミン融合タンパク質に応答する細胞、例えば、ＦＧＦファミリータンパク質について複数の受容体を含有することが知られているＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＳＣ−３細胞から調製し、このＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリをプールに分割し、次いで、ＣＯＳ細胞またはアルブミン融合タンパク質に応答しない他の細胞をトランスフェクトするために用いる。ガラススライド上で成長させた形質移入した細胞を、それらを標識化した後に、本発明のアルブミン融合タンパク質に曝露させる。アルブミン融合タンパク質は、部位特異的なタンパク質キナーゼの認識部位に対するヨウ素化または含有を含む、様々な手段により標識化され得る。
【０８８９】
固定化および培養後、スライドを、オートラジオグラフィー分析に供する。陽性プールを特定し、およびサブプールを調製し、次いで、反復のサブプール化および再スクリーニングの過程を用いて再度形質移入し、最終的に、推定受容体をコードする単一クローンを産生する。
【０８９０】
受容体特定のための代替アプローチとして、標識されたアルブミン融合タンパク質を、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質成分の受容体分子を発現する細胞膜または抽出調製物に光親和性結合させてもよく、結合した物質をＰＡＧＥ分析により分解し、次いで、Ｘ線フィルムに曝露され得る。融合タンパク質の受容体を含有する標識された複合体を切り出し、ペプチドフラグメントに分解し、次いで、タンパク質微量配列決定に供し得る。微量配列決定から得られたアミノ酸配列を用いて、縮重オリゴヌクレオチドプローブの対を設計し、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、推定受容体をコードする遺伝子を特定することができる。
【０８９１】
さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリングおよび／またはコドンシャッフリング（「ＤＮＡシャッフリング」と総称される）の技法を採用して、融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分またはアルブミン成分の活性を調節し、それにより、本発明のアルブミン融合タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に生成し得る。概して、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）、Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）、Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）、およびＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｂｌａｓｃｏ，Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８−１３（１９９８）を参照のこと、これらの特許および刊行物の各々は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび故にそれによりコードされるアルブミン融合タンパク質の改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同または部位特異的組換えにより、所望の分子中への２つ以上のＤＮＡセグメントのアセンブリを含む。別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびコードされたアルブミン融合タンパク質は、組換えの前に、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム変異誘発に供することによって、変更され得る。別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメント等は、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメント等と組換えられ得る。好ましい実施形態において、この異種分子は、ファミリーのメンバーである。好ましい実施態様において、異種分子は、ファミリーメンバーである。さらなる好ましい実施形態において、異種分子は、成長因子、例えば、血小板に由来する成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）−アルファ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽成長因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−ベータ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、アクチビンＡおよびＢ、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドルサリン（ｄｏｒｓａｌｉｎ）、成長分化因子（ＧＤＦ）、ノ−ダル（ｎｏｄａｌ）、ＭＩＳ、インヒビン−アルファ、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ５、ならびにグリアに由来する神経栄養因子（ＧＤＮＦ）である。
【０８９２】
他の好ましいフラグメントは、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／またはアルブミン成分の生物学的活性のあるフラグメントである。生物学的活性のあるフラグメントは、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／またはアルブミン成分の活性と同一である必要はないが、類似する活性を示すものである。フラグメントの生物学的活性は、所望の活性の改善または所望でない活性の減少を含んでもよい。
【０８９３】
さらに、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質の作用を調節するものを特定するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は、線維芽細胞が正常に増殖し得る細胞培養条件下にて、哺乳類の線維芽細胞、本発明のアルブミン融合タンパク質、スクリーニングしようとする化合物、および３［Ｈ］チミジンを合わせる工程を含む。対照アッセイを、スクリーニングされるべき化合物の非存在下にて行い、次いで、化合物の存在下にて線維芽細胞の増殖の量と比較し、各々の場合における３［Ｈ］チミジンの取り込みを測定することにより、化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、３［Ｈ］チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーにより測定される。アゴニストおよびアンタゴニスト化合物は共に、この手順により特定され得る。
【０８９４】
別の方法において、本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質成分に対する受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下にて本発明の標識化された融合タンパク質と共にインキュベートされる。次いで、この相互作用を亢進または遮断する化合物の能力を測定することができる。代替として、スクリーニングされるべき化合物と受容体の相互作用後、周知の第２のメッセンジャー系の応答を測定し、受容体に結合し、かつ第２のメッセンジャー応答を誘導する化合物の能力を測定し、化合物が潜在的な融合タンパク質であるか否かを決定する。このような第２のメッセンジャー系としては、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネル、またはホスホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８９５】
これらの上記のアッセイのすべては、診断または予後マーカーとして使用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、融合タンパク質／分子を活性化または阻害することにより、疾患を処置するか、あるいは患者に特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、アッセイは、適切に操作された細胞または組織からの本発明のアルブミン融合タンパク質の産生を阻害または亢進し得る因子を発見し得る。
【０８９６】
したがって、本発明は、（ａ）候補結合化合物を本発明のアルブミン融合タンパク質と共に培養する工程、（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程を含む、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する化合物を特定する方法を含む。さらに、本発明は、（ａ）候補化合物を本発明のアルブミン融合タンパク質と共に培養する工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイする工程、および（ｂ）融合タンパク質の生物学的活性が改変されているか否かを決定する工程を含む、アゴニスト／アンタゴニストを特定する方法を含む。
【０８９７】
標的化された送達
別の実施形態において、本発明は、組成物を、本発明のアルブミン融合タンパク質の成分についての受容体を発現する標的細胞に送達する方法を提供する。
【０８９８】
本明細書で論じられるように、本発明の融合タンパク質は、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合性の相互作用を介して、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと会合し得る。一実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した本発明の融合タンパク質（抗体を含む）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達のための方法を提供する。一例において、本発明は、治療用タンパク質を標的細胞に送達するための方法を提供する。別例において、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込み得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され得るＤＮＡ）を、標的細胞に送達するための方法を提供する。
【０８９９】
別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合した本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体）を投与することによる細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０９００】
「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分子もしくは酵素を、結合および活性化する化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、当該技術分野で公知の放射性同位体、生来のまたは誘導された内因性細胞傷害性エフェクター系に結合する抗体（またはその部分を含む補体結合）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、アルファ毒素、リシン、アブリン、シュ−ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヨウシュヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質、アルファサルシンおよびコレラ毒素挙げられるが、これらに限定されない。「細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素により、細胞傷害性化合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０９０１】
薬物スクリーニング
本発明のアルブミン融合タンパク質またはアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当するタンパク質の活性を改変する分子についてスクリーニングするための、本発明のアルブミン融合タンパク質、またはこれらの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用が、さらに企図される。このような方法は、融合タンパク質を、アンタゴニストまたはアゴニスト活性を有することが疑われる選択された化合物と接触させる工程、および結合後、融合タンパク質の活性をアッセイする工程を含む。
【０９０２】
本発明は、任意の様々な薬剤スクリーニング技法において、本発明のアルブミン融合タンパク質、またはその結合フラグメントを用いることにより、治療用化合物をスクリーニングするために特に有用である。このような試験にて採用されるアルブミン融合タンパク質は、固体支持体へ担持され得、細胞表面上で発現され得、溶液中に遊離であり得、または細胞内に位置付けられ得る。薬物スクリーニングの一方法は、アルブミン融合タンパク質を発現している組換え核酸を用いて安定に形質転換される真核または原核宿主細胞を利用する。薬物は、競合的結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞またはこのような細胞の培養から得られる上清に対して、スクリーニングされる。例えば、試験されるべき薬剤と本発明のアルブミン融合タンパク質との間の複合体の形成を測定し得る。
【０９０３】
したがって、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質に仲介される活性に作用する薬物または任意の他の薬剤についてスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、当該技術分野で公知の方法により、本発明のアルブミン融合タンパク質またはそのフラグメントとこのような薬剤を接触させ、次いで、該薬剤とアルブミン融合タンパク質またはそのフラグメントとの間の複合体の存在についてアッセイすることを含む。このような競合的結合アッセイにおいて、スクリーニングのための薬剤は、典型的に標識化されている。培養後、遊離の薬剤は、結合形態で存在しているものから分離し、そして、遊離型または複合体化されていない標識の量が、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する特定の薬剤の能力の尺度である。
【０９０４】
薬物スクリーニングのための別の技法は、本発明のアルブミン融合タンパク質に対して適当な結合親和性を有する化合物についての、ハイスループットスクリーニングを提供し、および欧州特許出願第８４／０３５６４号（１９８４年９月１３日発行）にて非常に詳細に記載され、参照することにより本明細書に組み込まれる。簡潔に述べると、大量の異なる小ペプチド試験化合物は、固体基質（例えば、プラスチックピン）またはいくつかの他の表面上で合成される。ペプチド試験化合物を、本発明のアルブミン融合タンパク質と反応させ、洗浄する。次いで、結合ペプチドは、当該技術分野で公知の方法により検出される。精製されたアルブミン融合タンパク質は、前記の薬物スクリーニング技法で用いるために、プレート上に直接コーティングされ得る。加えて、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定し得る。
【０９０５】
本発明はまた、競合的薬物スクリーニングアッセイの使用も企図され、ここで、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合し得る中和抗体は、アルブミン融合タンパク質またはそのフラグメントに結合する試験化合物と特異的に競合する。この方法で、抗体は、本発明のアルブミン融合タンパク質と１つ以上の抗原性エピトープを共有する任意のペプチドの存在を検出するために用いられる。
【０９０６】
結合ペプチドおよび他の分子
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合するポリペプチドおよび非ポリペプチドを特定するためのスクリーニング方法、ならびにそれによって特定された結合分子を包含する。これらの結合分子は、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストは、本発明に従って、以下に詳細に記載される治療実施形態において使用され得る。
【０９０７】
この方法は、本発明のアルブミン融合タンパク質を多数の分子と接触させる工程、およびアルブミン融合タンパク質に結合する分子を特定する工程を含む。
【０９０８】
本発明のアルブミン融合タンパク質を多数の分子と接触させる工程は、多数の方法によりもたらされ得る。例えば、アルブミン融合タンパク質を固体支持体上に固定化させ、多数の分子の溶液を固定したポリペプチドと接触させることを企図し得る。このような手順は、固定した本発明のアルブミン融合タンパク質からなる親和性マトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィープロセスに類似している。その後、アルブミン融合タンパク質に対して選択的な親和性を有する分子が、親和性選択によって精製され得る。固体支持体の性質、アルブミン融合タンパク質の該固体支持体への付着に関するプロセス、溶媒、および親和性単離または親和性選択の条件は、大部分が慣用的であり、当業者に公知である。
【０９０９】
代替として、多数のポリペプチドはまた、ポリペプチドのサブセットまたは個々のポリペプチドを含む実質的に別々の画分へ分離され得る。例えば、多数のポリペプチドは、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー等によるポリペプチドの分離に関して当業者に公知の方法により分離され得る。個々のポリペプチドはまた、形質転換された宿主細胞（例えば、組換えファージ）により、その外表面上またはその周囲で発現されるように生成することができる。次いで、個々の単離物は、アルブミン融合タンパク質により「プローブ化」され得、必要に応じて発現に必要とされるであろう誘導物質の存在下で、アルブミン融合タンパク質と個々のクローンとの間で任意の選択的親和性相互作用が起こったかどうかを決定することができる。アルブミン融合タンパク質を個々のポリペプチドを含む各画分と接触させる前に、該ポリペプチドは、まず、さらなる簡便性のために固体支持体に移され得る。このような固体支持体は、単に、例えば、ニトロセルロースまたはナイロンでできたフィルター膜の断片であり得る。この方法で、陽性クローンは、発現ライブラリの形質転換された宿主細胞の集団（これらは、本発明のアルブミン融合タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を持つ）から特定され得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列が、従来の手段により直接決定され得るか、またはこのポリペプチドをコードするＤＮＡのコード配列が、頻繁により簡便に決定され得る。その後、一次配列が、対応するＤＮＡ配列から推定され得る。アミノ酸配列がポリペプチドそれ自体から決定されるものである場合、マイクロ配列決定技法を使用し得る。該配列決定技法は、質量分析法を含み得る。
【０９１０】
ある状況において、選択的親和性相互作用の存在を決定または検出しようと試みる前に、未結合のポリペプチドを、本発明のアルブミン融合タンパク質と多数のポリペプチドの混合物から洗浄除去することが望ましくあり得る。このような洗浄工程は、本発明のアルブミン融合タンパク質または多数のポリペプチドが固体支持体に結合する場合に、特に望ましくあり得る。
【０９１１】
本方法に従って提供される多数の分子は、多様性ライブラリ（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質へ特異的に結合する分子をスクリーニングし得るランダムまたはコンビナトリアルペプチドもしくは非ペプチドライブラリ）として提供され得る。使用され得る多くのライブラリ（例えば、化学合成ライブラリ、組換えライブラリ（例えば、ファージディスプレイライブラリ）、および体外翻訳ベースのライブラリ）が、当該技術分野で周知である。化学合成ライブラリの例は、Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３（１９９１）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６（１９９１）、Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９９１）、Ｍｅｄｙｎｓｋｉ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：７０９−７１０（１９９４）、Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７（９）：１２３３−１２５１（１９９４）、Ｏｈｌｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２−１０９２６（１９９３）、Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−１１４２６（１９９４）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２（１９９２）、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１６１４−１６１８（１９９４）、Ｓａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１７０８−１１７１２（１９９３）、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／２０２４２号、およびＢｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｒｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３８１−５３８３（１９９２）において記載される。
【０９１２】
ファージディスプレイライブラリの例は、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）、Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：４０４−４０６（１９９０）、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−７１８（１９９２）、Ｌｅｎｓｔｒａ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：１４９−１５７（１９９２）、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １２８：５９−６５（１９９３）、およびＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１８３１８号（１９９４年８月１８日）において記載される。
【０９１３】
体外での翻訳ベースのライブラリとしては、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０５０５８号（１９９１年４月１８日）およびＭａｔｔｈｅａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９０２２−９０２６（１９９４）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０９１４】
非ペプチドライブラリの例として、ベンゾジアゼピンライブラリ（例えば、Ｂｕｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４７０８−４７１２（１９９４）を参照のこと）が、使用のために適応され得る。ペプトイドライブラリ（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７−９３７１（１９９２））がまた使用され得る。使用され得るライブラリの別の例は、Ｏｓｔｒｅｓｈら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１１３８−１１１４２（１９９４））により記載され、ここでは、ペプチド中のアミド官能基が、ペルメチル化されて、化学的に形質転換され、コンビナトリアルライブラリを生成する。
【０９１５】
本発明において有用な非ペプチドライブラリの多様性は大きい。例えば、Ｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｏｏｋｅ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３５１−３６０（１９９５）は、様々なライブラリの基礎を形成する化学種として、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ピペラジンジオン、ビフェニル、糖アナログ、ベータ−メルカプトケトン、アリール酢酸、アシルピペリジン、ベンゾピラン、クバン、キサンチン、アミニミドおよびオキサゾロンを列挙している。
【０９１６】
非ペプチドライブラリは、２つの型、すなわち修飾されたモノマーおよびオリゴマーに大きく分類され得る。修飾モノマーライブラリは、比較的単純な骨格構造を使用し、この上に様々な官能基が付加される。しばしば、骨格は、周知の有用な薬理学的活性を有する分子である。例えば、骨格は、ベンゾジアゼピン構造であり得る。
【０９１７】
非ペプチドオリゴマーライブラリは、モノマーの順序に依存して新たな形状を作製する様態で共に構築される、多数のモノマーを利用する。使用されるモノマー単位の中には、カルバメート、ピロリノン、およびモルホリノがある。ペプトイド（側鎖がアルファ炭素よりもアルファアミノ基に付着するペプチド様オリゴマー）は、非ペプチドオリゴマーライブラリの別のバージョンの基礎を形成する。最初の非ペプチドオリゴマーライブラリは、単一型のモノマーを利用し、したがって、反復骨格を含有した。最近のライブラリは１より多くのモノマーを利用し、ライブラリには柔軟性がある。
【０９１８】
ライブラリをスクリーニングすることは、様々な一般的に周知の方法のいずれかにより達成され得る。例えば、ペプチドライブラリのスクリーニングを開示する以下の参考文献は、Ｐａｒｍｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８（１９８９）、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ，．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）、Ｆｏｗｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４２２−４２７（１９９２）、Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３９３−５３９７（１９９２）、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７６：９３３−９４５（１９９４）、Ｓｔａｕｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５７７−５８０（１９８８）、Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：５６４−５６６（１９９２）、Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６９８８−６９９２（１９９２）、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：８５０−８５２（１９９２）、米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、および米国特許第５，１９８，３４６号（すべてＬａｄｎｅｒらによる）、Ｒｅｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１−６７３（１９９３）、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１８３１８号を参照のこと。
【０９１９】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質を結合する分子を特定するためのスクリーニングは、ライブラリのメンバーを固相に固定化された本発明のアルブミン融合タンパク質と接触させ、アルブミン融合タンパク質に結合するこれらのライブラリメンバーを回収することにより実行され得る。「パニング」技法と言われる、このようなクリーニング方法の例は、Ｐａｒｍｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−３１８（１９８８）、Ｆｏｗｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４２２−４２７（１９９２）、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１８３１８号、および本明細書に引用された参考文献に例として記載される。
【０９２０】
別の実施形態において、酵母において相互作用タンパク質を選択するための２ハイブリッド法（（Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９５７８−９５８２（１９９１）は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子を特定するために使用され得る。
【０９２１】
結合分子がポリペプチドである場合、ポリペプチドは、ランダムペプチドライブラリ、コンビナトリアルペプチドライブラリ、またはバイアスペプチドライブラリを含む任意のペプチドライブラリから簡便に選択され得る。「バイアス（ｂｉａｓｅｄ）」という用語は、この場合のペプチドにおいて、ライブラリを作製する方法が、生じる分子回収の多様性を支配する１つ以上のパラメータを制限するように操作されることを意味するために本明細書に使用される。
【０９２２】
したがって、真のランダムペプチドライブラリは、ペプチドの所定の位置に特定のアミノ酸を見出す可能性がすべて２０のアミノ酸に関して同じである、ペプチドの回収物を作製する。しかしながら、例えば、リジンがアミノ酸５つごとに生じることを特定するか、またはデカペプチドライブラリの４位、８位および９位がアルギニンのみを含むように固定して特定化することにより、バイアスをライブラリに導入することができる。明らかに、多くの型のバイアスが企図され得、本発明は、任意の特定のバイアスに限定されない。さらに、本発明は、特定の型のペプチドライブラリ、例えば、ファージディスプレイペプチドライブラリおよびＤＮＡ挿入物を有するラムダファージベクターを含むＤＮＡ構築物を利用するものを企図する。
【０９２３】
上記のように、結合分子（ポリペプチドである）の場合、ポリペプチドは、約６から約６０未満のアミノ酸残基を有し、好ましくは約６〜約１０のアミノ酸残基、より好ましくは約６〜約２２のアミノ酸であり得る。別の実施形態において、結合ポリペプチドは、１５〜１００の範囲のアミノ酸、または２０〜５０の範囲のアミノ酸を有する。
【０９２４】
選択された結合ポリペプチドは、化学合成または組換え発現により得ることができる。
【０９２５】
他の活性
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、様々な疾患状態（例えば、血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因する虚血組織の再血管再生を刺激するための処置において利用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、上記で論じられるように、血管新生および肢の再形成を刺激するために利用され得る。
【０９２６】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、傷害、火傷、術後の組織修復、および潰瘍に起因する創傷を処置するために採用され得、というのも、それらは、異なる器官の様々な細胞（例えば、線維芽細胞および骨格筋細胞）に対して分裂促進的であり、したがって、損傷または疾患組織の修復または置換を促進するからである。
【０９２７】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、ニューロンの成長を刺激し、あるニューロンの障害または神経変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびＡＩＤＳ関連複合体）において生じるニューロンの損傷を処置および予防するために利用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得、したがって、これらは、骨および歯周の再形成を増強し、組織移植または骨の移植片における補助のために利用され得る。
【０９２８】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、ケラチノサイト増殖を刺激することにより、日焼けに起因する皮膚の老化を予防するために利用され得る。
【０９２９】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、脱毛を予防するために利用され得る。同じように、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、他のサイトカインと組み合わせて用いられる場合、造血細胞および骨髄細胞の成長および分化を刺激するために利用され得る。
【０９３０】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、移植前の器官を維持するため、または一次組織の細胞培養を支持するために採用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、初期の胚における分化のために、中胚葉起源の組織を誘導するために採用され得る。
【０９３１】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、上記に論じられるように、造血系統に加えて、胚性幹細胞の分化もしくは増殖を増加または減少し得る。
【０９３２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色素沈着、大きさ、および形（例えば、美容外科））を調節するために使用され得る。同様に、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、エネルギーの異化、同化、処理、利用、および貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る。
【０９３３】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、バイオリズム、カリカディック（ｃａｒｉｃａｄｉｃ）リズム、鬱病（鬱障害を含む）、暴力の傾向、疼痛への耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビンもしくはインヒビン様活性により）、ホルモンもしくは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、ストレス、または他の認識できる性質に作用することにより、哺乳類の精神状態または身体状態を変化させるために使用され得る。
【０９３４】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加または減少させるような食品添加物または保存剤として使用され得る。
【０９３５】
上記で引用される適用は、広範な様々な宿主における用途を有する。このような宿主としては、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミニブタ、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌ、またはネコである。好ましい実施形態において、宿主は哺乳類である。最も好ましい実施形態において、宿主はヒトである。
【０９３６】
本発明を概括的に説明したが、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解される。該実施例は、例示のために提供されており、制限することを意図されない。
【０９３７】
さらなる記載がなくとも、当業者は、前記および以下の例示的な実施例を用いて、本発明において認められる変更を行い、利用し、および特許請求の範囲の方法を実施することができよう。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を特に示しているが、残りの開示内容をいかようにも限定するものではない。
【実施例】
【０９３８】
実施例１：ｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＳｃＣＨＳＡの生成
ベクターｐＳｃＮＨＳＡ（ＡＴＣＣ信託番号ＰＴＡ−３２７９）およびｐＳｃＣＨＳＡ（ＡＴＣＣ信託番号ＰＴＡ−３２７６）は、ｐＰＰＣ０００５（ＡＴＣＣ信託番号ＰＴＡ−３２７８）の誘導体であり、そして治療用タンパク質またはそれらのフラグメントもしくは変異体をコードするポリヌクレオチドが、ヒト血清アルブミン「ＨＳＡ」をコードするポリヌクレオチドを有する翻訳フレームに隣接して、または翻訳フレーム中に挿入されるクローニングベクターとして使用される。ｐＳｃＣＨＳＡは、治療用タンパク質ＨＳＡ融合を生じるために使用され得る一方、ｐＳｃＮＨＳＡは、ＨＳＡ治療用タンパク質融合を生じるために使用され得る。
【０９３９】
ｐＳｃＣＨＳＡ：アルブミン部分Ｃ末端と治療用部分のアルブミン融合物の生成
治療用タンパク質のＮ末端をコードするＤＮＡの成熟アルブミンタンパク質をコードするＤＮＡのクローニングを促進するためのベクターを、ｐＰＰＣ０００５のキメラＨＳＡシグナルペプチドをコードする核酸配列がＸｈｏＩおよびＣｌａＩ制限酵素部位を含むように変更することにより作製した。
【０９４０】
まず、ｐＰＰＣ０００５に固有のＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位（ＡＤＨ１終結配列の３’に位置する）を、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩでｐＰＰＣ０００５を消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで突出末端を充填し、平滑末端を再連結することで取り除き、ｐＰＰＣ０００６を作製した。
【０９４１】
次に、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩ制限酵素部位を、２ラウンドのＰＣＲを用いて、ｐＰＰＣ０００６中のＨＳＡ（ＨＳＡリーダーのキメラおよび接合因子α「ＭＡＦ」由来のｋｅｘ２部位）のシグナルペプチドをコードする核酸配列中に操作した。第１ラウンドのＰＣＲにおいて、配列番号３６および配列番号３７として示したプライマーを用いた増幅を行った。配列番号３６として配列を示すプライマーは、ＨＳＡのシグナルペプチド配列の一部、接合因子アルファのリーダー配列由来のｋｅｘ２部位、および成熟型ＨＳＡのアミノ末端の一部を含む。４つの点変異を配列に導入し、キメラシグナルペプチドと成熟型ＨＳＡの結合部に見られるＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位を作製した。これらの４つの点変異は、以下に示した配列中に下線を引いて示す。ｐＰＰＣ０００５において、５’から３’までのこれらの４つの位置のヌクレオチドは、Ｔ、Ｇ、Ｔ、およびＧである。
５’−ＧＣＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧ−３’（配列番号３６）および
５’−ＡＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＣＡＴＣＴＣＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＴＡＡＧＣ−３’（配列番号３７）。その後、第２ラウンドのＰＣＲは、上流の隣接プライマー５’−ＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＧＡＧＴＣＣＡＡＴＴＡＧＣ−３’（配列番号３８）および下流の隣接プライマー５’−ＣＡＣＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴ−３’（配列番号３９）を用いて実施された。その後、得られたＰＣＲ産物を精製し、ＡｆｌＩＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＰＰＣ０００６中の同じ部位に連結して、ｐＳｃＣＨＳＡを作製した。得られたプラスミドは、シグナル配列に操作された、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位を有する。ＸｈｏＩ部位の存在により、ＬＤＫＲからＬＥＫＲへのシグナル配列の末端に１アミノ酸の変化を生じる。このＤからＥへの変化は、５’ＳａｌＩ部位（これは、ＸｈｏＩ部位と適合性である）および３’ＣｌａＩ部位を有する、アルブミン融合タンパク質の治療剤部分をコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列が、ｐＳｃＣＨＳＡのＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位に連結される場合、最終的なアルブミン融合タンパク質発現プラスミド中に存在しない。ＳａｌＩのＸｈｏＩへの連結は、シグナルペプチド配列の元のアミノ酸配列を回復させる。アルブミン融合タンパク質の治療用部分をコードするＤＮＡを、Ｋｅｘ２部位（Ｋｅｘ２は、シグナルペプチドの末端の二塩基性アミノ酸配列ＫＲの後ろで切断する）の後ろで、かつＣｌａＩ部位の前に挿入され得る。
【０９４２】
ｐｓｃＮＨＳＡ：アルブミン部分のＮ末端と治療用タンパク質のアルブミン融合物の生成
治療用タンパク質部分のＣ末端をコードするＤＮＡを、成熟アルブミンタンパク質をコードするＤＮＡにクローニングするのを促進するベクターを、３つの８塩基対制限酵素部位をｐＳｃＣＨＳＡに加えることにより作製した。成熟ＨＳＡタンパク質をコードする核酸配列の末端のＢｓｕ３６ＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に、ＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、およびＰｍｅＩ制限酵素部位を加えた。これは、下線を引いて示したＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、およびＰｍｅＩ制限酵素部位を含有する２つの相補的合成プライマー（配列番号４０および配列番号４１）の使用により達成され得た。５’−ＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＣＴ−３’（配列番号４０）および
５’−ＡＧＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴ−３’（配列番号４１）。これらのプライマーを、Ｂｓｕ３６ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてアニールし、消化し、ｐＳｃＣＨＳＡの同じ部位に連結して、ｐＳｃＮＨＳＡを作製した。
【０９４３】
実施例２：酵母形質転換のための一般的な構築物生成
ベクターｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＳｃＣＨＳＡは、治療用タンパク質またはそれらのフラグメントもしくは変異体をコードするポリヌクレオチドが、成熟ヒト血清アルブミン「ＨＳＡ」をコードするポリヌクレオチドに隣接して挿入されるクローニングベクターとして使用され得る。ｐＳｃＣＨＳＡは、治療用タンパク質ＨＳＡ融合を生じるために使用される一方、ｐＳｃＮＨＳＡは、ＨＳＡ治療用タンパク質融合を生じるために使用され得る。
【０９４４】
ＨＳＡ−治療用タンパク質融合産物を含むアルブミン融合構築物の生成
治療用タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号Ｘで示される、または当該技術分野で周知の配列）を、融合構築物の生成を促進するプライマー（例えば、制限酵素部位を加えることにより、継ぎ目のない融合をコードすることにより、リンカー配列をコードすることにより、等）を用いて、ＰＣＲ増幅し得る。例えば、当業者は、治療用タンパク質をコードするＤＮＡの５’末端に、成熟型ＨＳＡの最後の４つのアミノ酸をコードする（かつＢｓｕ３６Ｉ部位を含む）ポリヌクレオチドを加える５’プライマー、ならびに治療用タンパク質コード配列の３’末端に、終止コドンおよび適当なクローニング部位を加える３’プライマーを設計し得る。例えば、治療用タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するために用いられる順方向プライマーは、配列５’−ａａｇｃｔＧＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡ（Ｎ）１５−３’（配列番号４２）を有し得、ここで下線が引かれた配列は、Ｂｓｕ３６Ｉ部位であり、大文字のヌクレオチドは、成熟ＨＳＡタンパク質の最後の４つのアミノ酸（ＡＬＧＬ）をコードし、（Ｎ）１５は、関心対象となる治療用タンパク質をコードする最初の１５のヌクレオチドと同一である。同様に、治療用タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するために用いられる逆方向プライマーは、配列５’−ＧＣＧＣＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＴＴＡ（Ｎ）１５−３’（配列番号４３）を有し得、ここでイタリック体で書かれた配列は、ＰｍｅＩ部位であり、二重に下線が引かれた配列は、ＦｓｅＩ部位であり、単一の下線が引かれた配列は、ＡｓｃＩ部位であり、囲まれたヌクレオチドは、２個の直列の停止コドンの逆相補体であり、（Ｎ）１５は、関心対象となる治療用タンパク質をコードする最後の１５個のヌクレオチドの逆相補体と同一である。ＰＣＲ産物が増幅されると、Ｂｓｕ３６Ｉおよび（ＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、またはＰｍｅＩ）のうちの１つで切られ、ｐＳｃＮＨＳＡに連結され得る。
【０９４５】
ＨＳＡキメラリーダー配列中のＸｈｏＩ部位の存在は、キメラシグナル配列（すなわち、ＬＤＫＲ（配列番号４４）からＬＥＫＲ（配列番号４５）へのＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナル配列）の末端における単一のアミノ酸変化を作製する。
【０９４６】
遺伝子−ＨＳＡ融合産物を含むアルブミン融合構築物の生成
上記の方法と同様に、治療用タンパク質をコードするＤＮＡは、以下のプライマー：ＳａｌＩ部位を含有し、治療用タンパク質をコードするＤＮＡの５’末端上にＨＳＡリーダー配列、ＤＫＲの最後の３つのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを加える５’プライマー、および治療用タンパク質をコードするＤＮＡの３’末端上にＣｌａＩ部位を含有する成熟ＨＳＡの最初のいくつかのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを加える３’プライマーを用いてＰＣＲ増幅され得る。例えば、治療用タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するために用いられる順方向プライマーは、配列５’−ａｇｇａｇｃｇｔｃＧＡＣＡＡＡＡＧＡ（Ｎ）１５−３’（配列番号４６）を有し得、ここで下線が引かれた配列は、ＳａｌＩ部位であり、大文字のヌクレオチドは、ＨＳＡリーダー配列の最後の３つのアミノ酸（ＤＫＲ）をコードし、（Ｎ）１５は、関心対象となる治療用タンパク質をコードする最初の１５のヌクレオチドと同一である。同様に、治療用タンパク質をコードするＤＮＡを逆方向プライマーは、配列５’−ＣＴＴＴＡＡＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＣＡＴＣ（Ｎ）１５−３’（配列番号４７）であり、ここでイタリック体の配列は、ＣｌａＩ部位であり、下線が引かれたヌクレオチドは、ＨＳＡ（ＤＡＨＫＳＥＶＡＨ、配列番号４８）の成熟形態の初めの９のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体であり、（Ｎ）１５は、関心対象となる治療用タンパク質をコードする最後の１５個のヌクレオチドの逆相補体である。ＰＣＲ産物が増幅されると、それは、ＳａｌＩおよびＣｌａで切られ、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩで消化されたｐＳｃＣＨＳＡに連結される。異なるシグナルまたはリーダー配列が、所望され得、例えば、インペルターゼ「ＩＮＶ」（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ００７２４）、交配因子アルファ「ＭＡＦ」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ１８４０５）、ＭＰＩＦ（遺伝子配列ＡＡＦ８２９３６）、フィブリンＢ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２３１４２）、クラステリン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２２６９２）、およびＨＳＡリーダー配列の順列は、当該技術分野で周知の標準的な方法により適切なベクターにサブクローニングされ得る。
【０９４７】
パン酵母（ｙｅａｓｔ  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現に適合するアルブミン融合構築物の生成
次いで、ｐＳｃＮＨＳＡまたはｐＳｃＣＨＳＡから作製されるＮ末端あるいはＣ末端アルブミン融合タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡを含有するＮｏｔＩフラグメントが、ＬＥＵ２選択可能なマーカーを有するｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位にクローニングされ得る。次いで、生じるベクターは、パン酵母の発現システムの形質転換に用いられる。
【０９４８】
実施例３：酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの一般的発現
酵母発現に適合する発現ベクターは、酢酸リチウム形質転換、エレクトロポレーション、または当該技術分野で周知の他の方法、およびもしくはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ．１９８９．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ”，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−３、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４の一部に記載されるような他の方法により、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに形質転換され得る。発現ベクターは、形質転換により、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＤＸＹ１、Ｄ８８、またはＢＸＰ２０に導入され、個々の形質転換体が、例えば、１０ｍＬのＹＥＰＤ（１％ｗ／ｖ  酵母エキス、２％ｗ／ｖ  ペプトン、２％ｗ／ｖ  デキストロース）中、３０℃で３日間増殖され得、細胞は、増殖してから６０時間後、固定相で、採取することができる。上清は、１０分間、３０００ｇで、細胞を除去することで採取される。
【０９４９】
ｐＳＡＣ３５（Ｓｌｅｅｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２および図３を参照のこと）は、ＬＥＵ２選択マーカーに加えて、完全酵母２μｍプラスミドを含み、複製機能、ＰＲＢ１プロモーター、およびＡＤＨ１終止シグナルを提供する。
【０９５０】
実施例４：酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるアルブミン融合から発現されるアルブミン融合タンパク質の一般的精製
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質またはその部分の成熟形態（例えば、表１に列挙される治療用タンパク質の成熟形態、または表２に配列番号Ｚとして示される治療用タンパク質の成熟形態）のＮ末端あるいはＣ末端のいずれかに融合するＨＳＡの成熟形態を含む。本発明の一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを導くシグナル配列をさらに含む。好ましい実施形態において、シグナル配列によりコードされるシグナルペプチドが除去され、成熟アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン、インスリン様増殖因子結合タンパク質４が挙げられるが、これらに限定されない異種シグナル配列（例えば、特定の治療用タンパク質の非天然シグナル配列）、変異体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野で周知の他の異種シグナル配列を含む。表２に列挙されるシグナル配列ならびに／または上の本明細書の「融合タンパク質の発現」および／もしくは「アルブミン融合タンパク質の組換えおよび合成による産生のさらなる方法」の項において列挙されるシグナル配列として、特に好ましい。好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。フラグメントおよび／または変異体を含むこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。
【０９５１】
上記のような酵母中で発現されるアルブミン融合タンパク質は、以下のようなＤｙａｘペプチド親和カラム上に小規模で精製され得る。アルブミン融合タンパク質を発現する酵母由来の上清を、３ｍＭ  リン酸緩衝液  ｐＨ６．２、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０に対して分別濾過して体積を減らし、色素を除去する。次に、溶液を、０．２２μｍのデバイスに通して濾過する。濾液を、Ｄｙａｘペプチド親和カラム上に装填する。カラムを、１００ｍＭ  トリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２で溶出する。タンパク質含有ピーク画分を回収し、５倍に濃縮後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析する。
【０９５２】
大規模な精製のために、以下の方法を利用し得る。２Ｌを超える上清を、分別濾過し、２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ  ｐＨ８．０の５００ｍＬに濃縮する。濃縮されたタンパク質溶液を、予め平衡化した５０ｍＬ  ＤＥＡＥ−セファロースファーストフローカラムに充填し、カラムを洗浄し、タンパク質を、２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０における０〜０．４Ｍ  ＮａＣｌからのＮａＣｌの直線的勾配で溶出する。タンパク質を含有するこれらの画分をプールし、０．５Ｍ  リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）を用いてｐＨ６．８に調節する。最終濃度０．９Ｍの（ＮＲｔ）２ＳＯ４をタンパク質溶液に加え、全溶液を予め平衡化した５０ｍＬ  ブチル６５０Ｓカラムに充填する。タンパク質を、硫酸アンモニウム（０．９〜０Ｍ（ＮＲｔ）２ＳＯ４）の直線的勾配で溶出する。アルブミン融合を有するこれらの画分を再びプールし、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／クエン酸緩衝液ｐＨ５．７５に対して分別濾過し、５０ｍＬの予め平衡化したＳＰ−セファロースファーストフローカラムに装填する。タンパク質を、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌ直線勾配で溶出する。関心対象となるタンパク質を含有する画分を混合し、この緩衝液を、Ａｍｉｃｏｎ濃縮器で１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／クエン酸ｐＨ６．２５に変え、伝導率は、２．５ｍＳ／ｃｍより低い。タンパク質溶液は、１５ｍＬの予め平衡化したＱ−セファロース高性能カラムに装填され、カラムを洗浄し、タンパク質を、０〜０．１５Ｍ  ＮａＣｌのＮａＣｌ直線勾配で溶出する。次いで、精製されたタンパク質を、緩衝液交換により特異的な緩衝液組成物に製剤化し得る。
【０９５３】
実施例５：哺乳類細胞の形質移入のための一般的な構築物の生成
哺乳類細胞株における発現に適合するアルブミン融合構築物の生成
哺乳動物細胞培養系で用いるためのアルブミン融合構築物が、発現ベクターにおいて生成され得る。治療用タンパク質をコードするＤＮＡが、当該技術分野で周知の標準的方法（例えば、ＰＣＲ増幅、制限消化、および連結）により、哺乳類の発現ベクターにおいてＨＳＡのＮ末端またはＣ末端にクローニングされ得る。発現ベクターが構築されると、哺乳類発現系へのトランスフェクションを行うことができる。例えば、ｐＣ４ベクター、および／またはＬｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）より入手可能なベクターが挙げられるが、これらに限定されない好適なベクターが、当該技術分野で周知である。
【０９５４】
ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡを、哺乳動物培養系に適切な、プラスミドｐＣ４：ＨＳＡ（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３２７７）を作製するｐＣ４ベクターにクローニングする。このベクターは、メトトレキサートの存在下、選択を可能にする遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ「ＤＨＦＲ」を有する。
【０９５５】
ｐＣ４：ＨＳＡベクターは、ＣＨＯ細胞におけるアルブミン融合タンパク質の発現について適切である。発現のために、他の哺乳動物細胞培養系において、アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む、または代替として、これから成るフラグメントを代替の発現ベクターにサブクローニングすることが所望され得る。例えば、成熟アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む、または代替として、これから成るフラグメントを、別の発現ベクター（本明細書に記載される任意の哺乳動物発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない）にサブクローニングさせ得る。
【０９５６】
好ましい実施形態において、アルブミン融合構築物をコードするＤＮＡ構築物は、ＮＳ０細胞における発現のため、当該技術分野で周知の手順により、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）により提供されるベクターにサブクローニングされる。
【０９５７】
ＨＳＡ−治療用タンパク質融合産物を含むアルブミン融合構築物の生成
ｐＣ４：ＨＳＡ（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３２７７）を用いて、治療用タンパク質部分が、成熟アルブミン配列のＣ末端である、アルブミン融合構築物を生成することができる。例えば、治療用タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変異体をコードするＤＮＡを、ベクターのＢｓｕ３６ＩとＡｓｃＩ制限酵素部位との間にクローニングすることができる。Ｂｓｕ３６ＩおよびＡｓｃＩにクローニングする場合、酵母ベクター系へのクローニングするために用いられる同じプライマー設計（配列番号４２および４３）が、利用され得る（実施例２を参照のこと）。
【０９５８】
遺伝子−ＨＳＡ融合産物を含むアルブミン融合構築物の生成
ｐＣ４：ＨＳＡ（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３２７７）を用いて、治療用タンパク質部分が、成熟アルブミン配列のＮ末端である、アルブミン融合構築物を生成することができる。例えば、ｐＣ４：ＨＳＡのＢａｍＨＩ（またはＨｉｎｄＩＩＩ）とＣｌａＩとの間に治療用タンパク質自体のシグナル配列を有する治療用タンパク質をコードするＤＮＡをすることができる。ＢａｍＨＩあるいはＨｉｎｄＩＩＩ部位のいずれかにクローニングする場合、治療用タンパク質をコードするＤＮＡの翻訳開始コドンの前にコザック配列（ＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧ、配列番号４９）を含むことが好ましい。治療用タンパク質が、シグナル配列を有しない場合、治療用タンパク質をコードするＤＮＡは、ｐＣ４：ＨＳＡのＸｈｏＩとＣｌａＩ部位との間にクローニングされ得る。ＸｈｏＩ部位を用いる場合、以下の５’（配列番号５０）および３’（配列番号５１）の例示的プライマー、
５’−ＣＣＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＣＧＴＣＧＡ（Ｎ）１８−３’（配列番号５０）
５’−ＡＧＴＣＣＣＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＣＡＴＣ（Ｎ）１８−３’（配列番号５１）が、用いられ得る。
【０９５９】
５’プライマー（配列番号５０）において、下線が引かれた配列は、ＸｈｏＩ部位であり、Ｘｈｏ部位およびＸｈｏＩ部位に続くＤＮＡは、天然のヒト血清アルブミンのリーダー配列の最後の７つのアミノ酸をコードする。配列番号５０では、「（Ｎ）１８」が、関心対象となる治療用タンパク質をコードする最初の１８のヌクレオチドをコードする最初の１８ヌクレオチドと同一なＤＮＡである。３’プライマー（配列番号５１）では、下線が引かれた配列は、ＣｌａＩ部位であり、ＣｌａＩ部位およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号１）の初めの１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体である。配列番号５１では、「（Ｎ）１８」が、関心対象となる治療用タンパク質をコードする最後の１８のヌクレオチドをコードするＤＮＡの逆相補体である。これら２つのプライマーを用いて、関心対象となる治療用タンパク質をＰＣＲ増幅し得、ＰＣＲ産物を精製し得、それをＸｈｏＩおよびＣｌａＩ制限酵素で消化し得、ｐＣ４：ＨＳＡベクターのＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位にクローニングし得る。
【０９６０】
代替的なリーダー配列が所望される場合、天然のアルブミンリーダー配列は、当該技術分野で周知の標準的方法により、キメラアルブミンリーダー、すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド、または代替的なリーダーで置き換えることができる（例えば、当業者は、通常、代替的なリーダーをＰＣＲ増幅し、リーディングフレームを維持しながら、ＰＣＲ産物をアルブミンリーダーの代わりにアルブミン融合構築物にサブクローニングすることができる）。
【０９６１】
実施例６：哺乳類細胞株における一般的発現
哺乳動物細胞株における発現に適合する発現ベクターにおいて生成されるアルブミン融合構築物が、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクトアミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、エレクトロポレーション、または当該技術分野で周知の、および／またはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ．１９８９．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ”およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４に記載されるような、他のトランスフェクション法により、適切な細胞株に形質移入することができる。次に、形質移入した細胞を、発現ベクターにおける選択可能なマーカーにより決定される選択剤の存在により選択する。
【０９６２】
ｐＣ４発現ベクター（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）は、プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である。ｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーターロング末端反復「ＬＴＲ」（Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｒｃｈ  １９８５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７）およびサイトメガロウイルス「ＣＭＶ」エンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０）を含有する。ベクターはまた、ＳＶ４０初期プロモーターの調節下で、３’イントロン、ラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化および終結シグナル、およびマウスＤＨＦＲ遺伝子も含有する。チャイニーズハムスター卵巣「ＣＨＯ」細胞または活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠失している他の細胞株が、形質移入のために用いられる。当該技術分野で周知の方法によるｐＣ４におけるアルブミン融合構築物のＣＨＯ細胞へのトランスフェクションが、ＣＨＯ細胞中のアルブミン融合タンパク質の発現を可能にし、これにリーダー配列開裂および上清への分泌が続く。次いで、アルブミン融合タンパク質を、上清からさらに精製する。
【０９６３】
ｐＥＥ１２．１発現ベクターが、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）により提供され、これは、ｐＥＥ６（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ａｎｄ  Ｃｏｃｋｅｔｔ，１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７１１０）の誘導体である。このベクターは、関心対象となる配列の上流である、ヒトサイトメガロウイルスの主要初期遺伝子「ｈＣＭＶ−ＭＩＥ」（国際公開第ＷＯ８９／０１０３６号）のプロモーター、エンハンサー、および完全５’非翻訳領域、ならびに選択的なメチオニンスルホキシミン含有媒体における形質移入した細胞の選択の目的のためのグルタミン合成遺伝子（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．２２７：２７７−２７９、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９−１７５、米国特許第ＵＳ５，１２２，４６４号）を含む。当該技術分野で周知の方法により、ｐＥＥ１２．１において作製されるアルブミン融合構築物のＮＳ０細胞（国際公開第ＷＯ８６／０５８０７）へのトランスフェクションが、ＮＳ０細胞におけるアルブミン融合タンパク質の発現を可能にし、これにリーダー配列開裂、および上清への分泌が続く。次いで、アルブミン融合タンパク質を、本明細書に記載される、またはそうでなければ当該技術分野で周知の技法を用いて、上清からさらに精製する。
【０９６４】
アルブミン融合タンパク質の発現が、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット、逆相ＨＰＬＣ分析、または当該技術分野で周知の他の方法により、分析され得る。
【０９６５】
アルブミン融合タンパク質で形質移入される安定なＣＨＯおよびＮＳ０細胞株が、当該技術分野で周知の方法（例えば、リポフェクトアミン形質移入法）により生成され、例えば、選択可能なマーカーとして、ジヒドロ葉酸レダクターゼ「ＤＨＦＲ」を有するベクターについて１００ｎＭ  メトトレキサートを用いて、またはグルタミンの非存在下で、増殖を介して選択される。発現レベルが、例えば、第一に、一次抗体として抗ＨＳＡ血清を用いて、または、第二に、一次抗体として所定のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分を対象にする血清含有抗体を用いて、免疫ブロットすることにより、試験され得る。
【０９６６】
発現レベルが、一次抗体として抗ＨＳＡ血清で免疫ブロット検出することにより、試験される。特異的な生産性は、ＥＬＩＳＡを経て決定され、捕捉抗体は、アルブミン融合の治療用タンパク質部分に向かうモノクローナル抗体であり得、検出抗体が、モノクローナル抗ＨＳＡビオチン化抗体であり（または逆）、次いで、これに西洋わさびペルオキシダーゼ／ストレプトアビジンを結合させ、製造者のプロトコルにより分析する。
【０９６７】
実施例７：哺乳類細胞株におけるアルブミン融合タンパク質の発現
本発明のアルブミン融合タンパク質を、哺乳類細胞で発現させることができる。典型的な哺乳類発現ベクターは、プロモーターエレメント（ｍＲＮＡの転写の開始を仲介する）、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含有する。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック配列、ならびにＲＮＡスプライシングのドナーおよび受容体部位に隣接する介在配列を含む。非常に効率的な転写を、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス由来の末端反復配列（ＬＴＲ）、例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成する。しかしながら、細胞エレメントも用いることができる（例えば、ヒトのアクチンプロモーター）。
【０９６８】
本発明の実施で用いるために好適な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、およびｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０等のベクターを含む。使用され得る哺乳類宿主細胞は、ヒトＨｅｌａ、２９３、Ｈ９、およびジャーカット細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３、およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７、およびＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０９６９】
代替として、アルブミン融合タンパク質を、染色体内に一体化したアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する安定な細胞株において、発現させることができる。ＤＨＦＲ、ｇｐｔ、ネオマイシン、またはハイグロマイシン等の選択可能なマーカーとの共トランスフェクションにより、トランスフェクト細胞の特定および単離が可能になる。
【０９７０】
また、融合タンパク質をコードする形質移入したポリヌクレオチドを増幅し、大量のコード化された融合タンパク質を発現させることもできる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、関心対象となる遺伝子を数百または数千のコピーを有する細胞株の開発において有用である（例えば、Ａｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８）、Ｈａｍｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０９７：１０７−１４３（１９９０）、Ｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。別の有用な選択可能なマーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９−１７５（１９９２）。これらのマーカーを用いて、哺乳類細胞を選択培地において成長させ、最も耐性のある細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体内に一体化した増幅遺伝子を含有する。しばしばタンパク質の産生のために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳ０細胞を用いる。
【０９７１】
プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（Ｍａｒｃｈ，１９８５））およびＣＭＶ−エンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０（１９８５））を含有する。例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８を含む多重クローニング部位は、関心対象となる遺伝子のクローニングを促進する。ベクターはまた、ＳＶ４０初期プロモーターの調節下で、３’イントロン、ラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化および終結シグナル、およびマウスＤＨＦＲ遺伝子も含有する。
【０９７２】
具体的には、例えば、プラスミドｐＣ６を、適当な制限酵素で消化し、次いで、当該技術分野で周知の方法により、子ウシ腸リン酸塩を用いて脱リン酸化する。次いで、ベクターを、１％アガロースゲルから単離する。
【０９７３】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、当該技術分野で周知の技法を用いて生成し、当該技術分野で周知のＰＣＲ技法を用いて、このポリヌクレオチドを増幅する。天然に存在するシグナル配列を本発明の融合タンパク質の産生に用いる場合、ベクターは、第２のシグナルペプチドを必要としない。代替として、天然に存在するシグナル配列を用いない場合、ベクターは、異種性シグナル配列を含むように修飾され得る（例えば、国際公開第ＷＯ９６／３４８９１号を参照のこと）。
【０９７４】
本発明の融合タンパク質をコードする増幅フラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を用いて、１％  アガロースゲルから単離する。次いで、フラグメントを、適当な制限酵素で消化し、１％  アガロースゲルにて再び精製する。
【０９７５】
次いで、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする増幅フラグメントを、同じ制限酵素で消化し、１％のアガロースゲルにて精製する。次いで、単離フラグメントと脱リン酸化ベクターを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、大腸菌ＨＢ１０１またはＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、例えば、制限酵素分析を用いて、プラスミドｐＣ６に挿入されたフラグメントを含有するバクテリアを特定する。
【０９７６】
活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞を形質移入のために用いる。５μｇの発現プラスミドｐＣ６またはｐＣ４を、リポフェクチンを用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏと共に同時形質移入する（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性選択可能なマーカーである、Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対する耐性をもたらす酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含有する。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を追加したα−ＭＥＭ中に播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキセートおよび１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を追加したα−ＭＥＭ中ハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４日後、単一クローンをトリプシン処理し、次いで、異なる濃度（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）のメトトレキセートを用いて、６ウェルペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで、高濃度のメトトレキセートにて成長するクローンを、より高濃度（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）のメトトレキセートを含有する新しい６ウェルプレートに移す。１００〜２００μＭの濃度にて成長するクローンを得るまで、同じ手順を繰り返す。所望の融合タンパク質の発現は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより、または逆相ＨＰＬＣ分析により分析される。
【０９７７】
実施例８：哺乳類細胞株におけるアルブミン融合構築物から発現したアルブミン融合たんぱく質の一般的精製
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質またはその部分の成熟形態（例えば、表１に列挙される治療用タンパク質の成熟形態、または表２に配列番号Ｚとして示される治療用タンパク質の成熟形態）のＮ末端あるいはＣ末端のいずれかに融合するＨＳＡの成熟形態を含む。本発明の一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを導くシグナル配列をさらに含む。好ましい実施形態において、シグナル配列によりコードされるシグナルペプチドが除去され、成熟アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン、インスリン様増殖因子結合タンパク質４が挙げられるが、これらに限定されない異種シグナル配列（例えば、特定の治療用タンパク質の非天然シグナル配列）、変異体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野で周知の他の異種シグナル配列を含む。表２に列挙されるシグナル配列ならびに／または上の本明細書の「融合タンパク質の発現」および／もしくは「アルブミン融合タンパク質の組換えおよび合成による産生のさらなる方法」の項において列挙されるシグナル配列等が、特に好ましい。好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。フラグメントおよび／または変異体を含むこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。
【０９７８】
用いた発現系に依存して異なるプロトコルにより、哺乳類細胞株の上清由来のアルブミン融合タンパク質を精製する。
【０９７９】
ＣＨＯおよび２９３Ｔ細胞株からの精製
ＣＨＯ細胞上清または一過性形質移入２９３Ｔ細胞上清からのアルブミン融合タンパク質の精製は、リン酸ナトリウム緩衝液およびリン酸塩勾配溶出を用いて、アニオン性ＨＱ樹脂での初期の補足、次いで、塩勾配溶出を用いたブルーセファロースＦＦカラムでの親和性クロマトグラフィーを含み得る。ブルーセファロースＦＦは、主なＢＳＡ／フェチュイン混入物を除去する。リン酸塩勾配を用いたＰｏｒｏｓ  ＰＩ  ５０樹脂でのさらなる精製により、エンドトキシン混入物を除去し、低下させ、ならびにアルブミン融合タンパク質を濃縮する。
【０９８０】
ＮＳＯ細胞株からの精製
ＮＳ０細胞上清からのアルブミン融合タンパク質の精製は、Ｑ−セファロースアニオン交換クロマトグラフィー、次いで、溶出工程を含むＳＰ−セファロース精製、溶出工程を含むフェニル−６５０Ｍ精製、最後に、分別濾過を含み得る。
【０９８１】
次いで、精製タンパク質を、緩衝液交換により製剤化し得る。
【０９８２】
実施例９：アルブミン融合タンパク質のバクテリア発現
ＤＮＡ配列の５’および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、バクテリアシグナル配列を含む本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを増幅し、挿入フラグメントを合成する。挿入をコードするポリヌクレオチドを増幅するために用いられるプライマーは、好ましくは、増幅産物を発現ベクターにクローニングするために、プライマーの５’末端にて、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ等の制限酵素部位を含有するべきである。例えば、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩは、バクテリア発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは、抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、バクテリアの複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ制御プロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−ヒスチジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位をコードする。
【０９８３】
ｐＱＥ−９ベクターを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、バクテリアＲＢＳにて開始するリーディングフレームを維持するｐＱＥ−９ベクターに増幅フラグメントを連結する。次いで、連結混合物を用いて、プラスミドｐＲＥＰ４の複数コピーを含有する大腸菌株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を形質導入し、それは、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、カナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）ももたらす。形質転換体をＬＢプレート上での成長能により特定し、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析により確認する。
【０９８４】
所望の構築物を含有するクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方を追加したＬＢ培地における液体培養にて、一晩（Ｏ／Ｎ）成長させる。Ｏ／Ｎ培養物を用いて、１：１００から１：２５０の比で大規模培養物を播種する。細胞を、光学濃度６００（Ｏ．Ｄ．６００）を０．４から０．６の間に成長させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を加え、最終濃度１ｍＭとする。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏをきれいにして、遺伝子発現の増大をもたらす。
【０９８５】
細胞を、さらに３〜４時間成長させる。次いで、細胞を、遠心分離（６０００ｘｇにて２０分）により採取する。細胞ペレットを、４℃にて３〜４時間撹拌して、カオトロピック剤６Ｍ  グアニジンＨＣｌ、または好ましくは、８Ｍ  尿素および０．１４Ｍより高濃度の２−メルカプトエタノールに溶解する（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７９：３７９−３８７（１９８９）を参照のこと）。細胞片を、遠心分離により除去し、ポリペプチドを含有する上清を、ニッケル−ニトリロ−トリ−酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）親和性樹脂カラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．より入手可能、上記参照）に充填する。６×Ｈｉｓタグを有するタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂と高親和性で結合し、単純な一工程方法で精製することができる（詳細については、Ｔｈｅ  ＱｌＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（１９９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．を参照のこと、上記）。
【０９８６】
簡潔には、６Ｍ  グアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８中の上清をカラムに充填する。カラムを、まず、１０容量の６Ｍ  グアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８で洗浄し、次いで、１０容量の６Ｍ  グアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ６で洗浄し、最後に、ポリペプチドを、６Ｍ  グアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ５を用いて溶出する。
【０９８７】
次いで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、または５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６および２００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析することにより、精製タンパク質を復元する。代替として、タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに固定化しながら、十分に再折りたたみさせることができる。例示的な条件は次の通りである。５００ｍＭのＮａＣｌ中の直線的勾配６Ｍ〜１Ｍの尿素、２０％のグリセロール、プロテアーゼ阻害剤を含有する２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４を用いて復元させる。復元は、１．５時間以上かけて行われなければならない。復元後、２５０ｍＭのイミダゾールを加えることにより、タンパク質を溶出する。ＰＢＳまたは５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６および２００ｍＭのＮａＣｌに対する最終透析工程により、イミダゾールを除去する。精製タンパク質を、４℃で保存するか、あるいは−８０℃で凍結する。
【０９８８】
上記の発現ベクターに加えて、本発明は、ｐＨＥ４ａ（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４５、１９９８年２月２５日付で寄託）と呼ばれる発現ベクターをさらに含み、それは、ｐＨＥ４ａ（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４５、１９９８年２月２５日付で寄託）と呼ばれる、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと作動可能に結合したファージオペレーターおよびプロモーターエレメントを含有する。このベクターは、１）選択マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）大腸菌の複製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配列、５）シャインダルガノ配列、および６）ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）を含有する。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プロモーターおよびオペレーター配列を合成する。
【０９８９】
ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８でベクターを制限し、制限産物をゲル泳動し、次に、より大きなフラグメント（詰込みフラグメントは、約３１０塩基対である）を単離することにより、ＤＮＡをｐＨＥ４ａに挿入することができる。本明細書に記載のＰＣＲプロトコルまたはそうでなければ、当該技術分野で周知の他のものにより、ＮｄｃＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）の制限酵素部位を有するＰＣＲプライマーを用いて、ＤＮＡ挿入物を生成する。ＰＣＲ挿入物をゲル精製し、適合する酵素で制限する。標準的プロトコルにより、挿入物とベクターを連結する。
【０９９０】
操作したベクターを、上記のプロトコルで置換し、バクテリアシステムにおいてタンパク質を発現させ得る。
【０９９１】
実施例１０：寄託試料からの選択ｃＤＮＡクローンの単離
表３に示されるように、本発明の多くのアルブミン融合構築物は、ＡＴＣＣに寄託されたものである。アルブミン融合構築物は、発現ベクター：酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発現ベクターｐＳＡＣ３５、哺乳類発現ベクターｐＣ４、または哺乳類発現ベクターｐＥＥ１２．１のうちのいずれか１つを含み得る。
【０９９２】
ｐＳＡＣ３５（Ｓｌｅｅｐ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２）、ｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７（１９８５）、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０（１９８５））、およびｐＥＥ１２．１（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ａｎｄ  Ｃｏｃｋｅｔｔ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７１１０（１９８９）、国際公開第ＷＯ８９／０１０３６号、Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９−１７５（１９９２）、米国特許第ＵＳ５，１２２，４６４号、国際公開第ＷＯ８６／０５８０７号）ベクターは、バクテリア細胞での成長のためのアンピシリン耐性遺伝子を含む。これらのベクターおよび／またはそれらを含むアルブミン融合構築物を、Ｈａｎａｈａｎ等の当該技術分野で記載された技法を用いて、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，１１０１１  Ｎ．Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｒｏａｄ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７）等の大腸菌株に形質導入し、１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを含有するルリア培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ）アガープレートに播種し、３７℃で一晩成長させる。
【０９９３】
任意の所定のアルブミン融合構築物について表３に引用したＡＴＣＣ寄託番号を指定した試料中の寄託材料はまた、１つ以上のさらなるアルブミン融合構築物を含有し得、それらは、それぞれ異なるアルブミン融合タンパク質をコードする。したがって、同じＡＴＣＣ寄託番号を共有する寄託物は、表３の対応の列において特定された少なくとも１つのアルブミン融合構築物を含有する。
【０９９４】
２種類のアプローチを用いて、表３のアルブミン融合構築物について引用したプラスミドＤＮＡの寄託試料から、特定のアルブミン融合構築物を単離できる。
【０９９５】
方法１：スクリーニング
まず、アルブミン融合構築物を、当該技術分野で周知の方法を用いて、表１の個々の構築物ＩＤ番号の配列番号Ｘに対応するポリヌクレオチドプローブを用いて寄託プラスミドＤＮＡの試料をスクリーニングすることにより、直接単離することができる。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＤＮＡの合成装置を用いて、報告された配列に従い、３０〜４０ヌクレオチドを有する特定のポリヌクレオチドを合成し得る。オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、例えば、３２Ｐ−γ−ＡＴＰで標識化し、通常の方法により精製することができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＮＹ（１９８２））。所与のＡＴＣＣ寄託物由来のアルブミン融合構築物を、当業者に周知の技法（例えば、ベクター供給源により提供されるもの、または上で引用した関連刊行物もしくは特許）を用いて、上記の好適な宿主（ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等）に形質転換する。形質転換体を、１．５％のアガープレート（適当な選択剤、例えば、アンピシリンを含有する）上に、１プレート当たり約１５０個の形質転換体（コロニー）の密度でプレーティングされる。これらのプレートを、バクテリアのコロニースクリーニングの通常の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔ．，（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ  １．９３  ｔｏ  １．１０４）、または当業者に周知の他の技法により、ナイロン膜を用いて、スクリーニングする。
【０９９６】
方法２：ＰＣＲ
代替として、所定のアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを、例えば、所与のアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡに対して、寄託したアルブミン融合構築物５’および３’をハイブリッド形成する１７〜２０ヌクレオチドからなる２つのプライマーを用いて、配列番号Ｘを有する寄託したアルブミン融合構築物試料から、増幅し得る。ポリメラーゼ連鎖反応を、通常の条件下、例えば、０．５μｇの上記のｃＤＮＡテンプレートとの反応混合物２５μｌにおいて行う。簡便な反応混合物は、１．５〜５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、２０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライマー、および０．２５ＵｎｉｔのＴａｑポリメラーゼである。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ自動化サーマルサイクラーを用いて、３５サイクルのＰＣＲ（変性９４℃、１分；アニール５５℃、１分；伸長７２℃、１分）を行う。増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により分析し、予測分子量を有するＤＮＡバンドを切り出し、精製する。ＰＣＲ産物は、ＤＮＡ産物をサブクローニングし、配列決定することにより、選択配列のものであることを証明する。
【０９９７】
いくつかの方法を、寄託クローンに存在し得ない遺伝子の５’または３’非コード部分の特定に使用可能である。これらの方法は、フィルター探査、特定のプローブを用いたクローン濃縮、および当該技術分野で周知の５’および３’「ＲＡＣＥ」プロトコルに類似または同一のプロトコルが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、５’ＲＡＣＥに類似の方法は、所望の５’末端を欠いた全長転写物を生成するために使用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））。
【０９９８】
簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、おそらく全長遺伝子ＲＮＡ転写物を含有するＲＮＡ集団の５’末端に連結する。連結したＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび関心対象となる遺伝子の周知の配列に特異的なプライマーを含有するプライマーセットを用いて、所望の全長遺伝子の５’部分をＰＣＲ増幅する。次いで、この増幅産物を配列決定し、これを用いて全長遺伝子を生成する。
【０９９９】
上記の方法は、ポリ−Ａ＋ＲＮＡを用いることができるが、所望の供給源から単離した総ＲＮＡで開始する。次いで、ＲＮＡ調製物は、後のＲＮＡリガーゼ工程と干渉し得る変性または損傷ＲＮＡ上の５’ホスフェート基の除去が必要である場合、ホスファターゼで処理することができる。次いで、ホスファターゼを不活性化し、メッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を除去するために、タバコ酸性ピロホスファターゼでＲＮＡを処理するべきである。この反応により、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて、ＲＮＡオリゴヌクレオチドに連結することができるキャップ開裂ＲＮＡの５’末端の５’ホスフェート基を除去する。
【１０００】
この修飾ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いた第１の鎖ｃＤＮＡ合成のテンプレートとして用いる。第１の鎖合成反応物は、連結したＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび関心対象となる遺伝子の周知の配列に特異的なプライマーを用いて、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のテンプレートとして、用いられる。次いで、生じた産物を配列決定し、分析して、５’末端配列が所望の遺伝子に属することを確認する。
【１００１】
実施例１１：複数融合した融合物
アルブミン融合タンパク質（例えば、アルブミン（またはそのフラグメントまたは変異体）に融合された治療用タンパク質（またはそのフラグメントまたは変異体）を含有する）を、さらに他のタンパク質に融合させ、「複数融合した融合物」を生成し得る。これらの複数融合したタンパク質を様々な応用に用いることができる。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質のＨｉｓ−タグ、ＨＡ−タグ、タンパク質Ａ、ＩｇＧドメイン、およびマルトース結合タンパク質との融合物は、精製を促進する（例えば、欧州特許第Ａ３９４，８２７号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこと）。本発明のポリペプチドに融合した核局在性シグナルは、特定の細胞内局在性にタンパク質を標的とすることができるが、共有結合ヘテロ２量体もしくはホモ２量体は、アルブミン融合タンパク質の活性を増大または低減することができる。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質とのさらなるタンパク質配列の融合物は、融合タンパク質の溶解性および／または安定性をさらに増大させ得る。当該技術分野で周知の技法を用いて、またはそれを一般的に変形して、および／または以下のプロトコルを変形することにより、上記の融合タンパク質を作製することができ、それは、ＩｇＧ分子とのポリペプチドの融合物を概説する。
【１００２】
簡潔には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分を、下記の配列の５’および３’末端に及ぶプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅することができる。これらのプライマーはまた、発現ベクター、好ましくは、哺乳類または酵母発現ベクターへのクローニングを促進する簡便な制限酵素部位を有するべきである。
【１００３】
例えば、ｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）を用いる場合、ヒトＦｃ部分を、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結することができる。３’ＢａｍＨＩ部位を破壊しないよう注意されたい。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターを、ＢａｍＨＩで再び制限し、ベクターを直鎖化し、次に、このＢａｍＨＩ部位に本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（当該技術分野で周知の技法を用いて生成し、単離したもの）を連結する。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、終止コドンなしでクローニングし、そうでなければ、融合タンパク質を含有するＦｃが生成されないことに注意されたい。
【１００４】
天然に存在するシグナル配列を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質を産生する場合、ｐＣ４は、第２のシグナルペプチドを必要としない。代替として、天然に存在するシグナル配列を用いない場合、ベクターは、異種性シグナル配列を含むように修飾され得る（例えば、国際公開第ＷＯ９６／３４８９１号を参照のこと）。
【１００５】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域：
ＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＧＧＴＧＣＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＡＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＡＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡＧＴＧＣＧＡＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴ（配列番号５２）
【１００６】
実施例１２：アルブミン融合タンパク質からの抗体の生成
ハイブリドーマ技術
本発明のアルブミン融合タンパク質、および本発明のアルブミン融合タンパク質の部分（例えば、治療用タンパク質部分、または融合タンパク質のアルブミン部分）に結合する抗体を、様々な方法により調製することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ２を参照のこと）。このような方法の１つの例として、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の部分の調製物を製造し、精製して、実質的に天然の混入物がない状態にする。次いで、このような調製物を、より高い特異的活性のポリクローナル抗血清を産生するために、動物に導入する。
【１００７】
本発明のアルブミン融合タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の部分に特異的なモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．５６３−６８１（１９８１））を用いて、調製する。一般に、動物（好ましくは、マウス）を、本発明のアルブミン融合タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の部分を用いて免疫する。このようなマウスの脾細胞を抽出し、好適な骨髄腫細胞株と融合する。任意の好適な骨髄腫細胞株を、本発明に従って、採用し得るが、ＡＴＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を利用することが好ましい。融合後、生じたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地で選択的に維持し、次いで、Ｗａｎｄら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８０：２２５−２３２（１９８１））により記載されるように、限界希釈により、クローニングする。次いで、この選択により得たハイブリドーマ細胞をアッセイして、本発明のアルブミン融合タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の部分と結合可能な抗体を分泌するクローンを特定する。
【１００８】
代替として、本発明のアルブミン融合タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の部分と結合可能なさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗体を用いた２工程方法において、生成することができる。このような方法は、抗体がそれ自体抗原であり、したがって、２次抗体と結合する抗体を得ることができるという事実を用いるものである。この方法に従って、タンパク質特異的な抗体を用い、動物、好ましくは、マウスを免疫する。次いで、このような動物の脾細胞を用いて、ハイブリドーマ細胞を産生し、ハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、本発明のアルブミン融合タンパク質（または本発明のアルブミン融合タンパク質の部分）特異的な抗体と結合する能力が、本発明の融合タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の部分によりブロックされ得る抗体を産生するクローンを特定する。このような抗体は、本発明の融合タンパク質（または、本発明のアルブミン融合タンパク質の部分）特異的な抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、これを用いて、動物を免疫し、さらなる本発明の融合タンパク質（または本発明のアルブミン融合タンパク質の部分）特異的な抗体の形成を誘導する。
【１００９】
ヒトにおける抗体の生体内使用のため、抗体を「ヒト化」する。このような抗体を、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞由来の遺伝子構築物を用いて、産生することができる。キメラおよびヒト化抗体を産生する方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書で論じられる（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６），Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第１７１４９６号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第１７３４９４号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第ＷＯ８６０１５３３号、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第ＷＯ８７０２６７１号、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
【１０１０】
ｓｃＦｖｓライブラリからの本発明のアルブミン融合タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の部分に対する抗体フラグメントの単離。ヒトＰＢＬから単離した天然のＶ遺伝子を、本発明のアルブミン融合タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の部分に対する反応性を含有する抗体フラグメントのライブラリに構築し、それに対してドナーを曝露するか、あるいはしない（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【１０１１】
ライブラリのレスキュー。ｓｃＦｖｓライブラリを、国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号において記載されるように、ヒトＰＢＬのＲＮＡから構築する。抗体フラグメントを示すファージをレスキューするため、ファージミドを宿す大腸菌約１０９個を用いて、１％のグルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５０ｍｌの２×ＴＹ（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）に播種し、振盪しながら、Ｏ．Ｄ．０．８まで成長させる。この培養液５ｍｌを用いて、５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに播種し、２×１０８ＴＵのデルタ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩ、国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号を参照）を加え、培養物を３７℃で４５分間、振盪せずにインキュベートし、次いで、３７℃で４５分間、振盪しながらインキュベートする。培養物を４０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、ペレットを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２Ｌの２×ＴＹ中に再懸濁し、一晩成長させる。ファージを、国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号に記載されるように調製する。
【１０１２】
Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩを次の通り調製する。Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩヘルパーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードせず、ゆえに、抗体フラグメントを示すファージ（ミド）は、抗原により結合するより高い親和性を有する。感染性Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩ粒子は、ファージ形態形成中に野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を供給するｐＵＣ１９派生物を宿す細胞においてヘルパーファージを成長させることにより作製される。培養物を、３７℃で１時間、振盪せずにインキュベートし、次いで、３７℃でさらに１時間、振盪しながらインキュベートする。細胞を、スピンダウン（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ  ８，４００ｒ．ｐ．ｍ．、１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）に再懸濁し、３７℃で一晩、振盪しながら成長させる。２回のＰＥＧ−沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）によりファージ粒子を培養培地から精製、濃縮し、２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ  ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通し、最終濃度約１０１３形質導入ユニット／ｍｌの（アンピシリン耐性クローン）を得る。
【１０１３】
ライブラリのパニング。イムノチューブ（Ｎｕｎｃ）を、１００μｇ／ｍｌあるいは１０μｇ／ｍｌのいずれかの本発明のアルブミン融合タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の部分の４ｍｌを含むＰＢＳで一晩コーティングする。チューブを、２％のＭａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロッキングし、次いで、ＰＢＳにて３回洗浄する。ファージの約１０１３ＴＵを、チューブに適用し、室温で３０分間、上下方向の（ｏｖｅｒ  ａｎｄ  ｕｎｄｅｒ）回転板上で混和しながらインキュベートし、次いで、さらに１．５時間立てたままで培養する。チューブを、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで１０回洗浄し、ＰＢＳで１０回洗浄する。１００ｍＭのトリエチルアミン１ｍｌを加え、上下方向の回転板上で１５分間回転させることにより、ファージを溶出し、その後、直ちに、０．５ｍｌの１．０Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を用いて溶液を中和する。次いで、ファージは、溶出したファージをバクテリアと３７℃で３０分間培養することにより、１０ｍｌのｍｉｄ−ｌｏｇ大腸菌ＴＧＩに感染させるために用いられる。次いで、大腸菌を、１％のグルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレーティングされる。次いで、生じたバクテリアライブラリを、上記のデルタ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューし、次の選択工程のためファージを調製する。次いで、この工程は、合計４ラウンドの親和性精製のために繰り返され、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでのチューブの洗浄を２０回、そして３ラウンドと４ラウンドにおいてはＰＢＳでの洗浄を２０回に増やす。
【１０１４】
結合体の特徴付け。３ラウンドおよび４ラウンド目の選択物から溶出したファージを用いて、大腸菌ＨＢ２１５１を感染させ、アッセイのためシングルコロニーから溶解性ｓｃＦｖを産生する（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。ＥＬＩＳＡは、５０ｍＭの重炭酸塩、ｐＨ９．６中の１０ｐｇ／ｍｌの本発明のアルブミン融合タンパク質、あるいは本発明のアルブミン融合タンパク質の部分のいずれかでコーティングしたマイクロタイタープレートを用いて、行われる。ＥＬＩＳＡで陽性のクローンは、ＰＣＲフィンガープリント（例えば、国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号を参照のこと）により、次いで、配列決定により、さらに特徴付けられる。これらのＥＬＩＳＡポジティブクローンはまた、例えば、エピトープマッピング、結合親和性、受容体シグナル伝達、抗体／抗原結合をブロックするかあるいは競合的に阻害する能力、および競合的アゴニストまたはアンタゴニスト活性等の当該技術分野で周知の技法を用いて、さらに特徴付けられる。
【１０１５】
実施例１３：［３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込みアッセイ
脂肪、骨格筋、および肝臓は、インスリン感受性組織である。インスリンは、グルコース取り込み／これらの組織への輸送を刺激することができる。脂肪および骨格筋の場合、インスリンは、最終的には、特定の細胞内区画から細胞表面へのグルコース輸送体４分子、ＧＬＵＴ４の転位を導くシグナル伝達を開始させる。細胞表面上で、ＧＬＵＴ４は、グルコース取り込み／輸送が可能になる。
【１０１６】
［３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込み
多数の脂肪および筋肉関連細胞株を用いて、真性糖尿病の処置のために列挙された治療剤の任意の１種以上の組み合わせの不存または存在下で、グルコース取り込み／輸送活性を試験することができる。具体的には、３Ｔ３−Ｌ１マウス線維芽細胞およびＬ６マウス骨格筋細胞を、［３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込みアッセイの適当な体外でモデルとなるように、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞および筋管にそれぞれ、分化させ得る（Ｕｒｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７４（４３）：３０８６４−７３（１９９９）、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＭｏＩ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１９（３）：２４１−８（１９９７）、Ｈａｓｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ，１６９（１）：４５−５３（１９９９）、Ｔｓａｋｉｒｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６（１０）：４３１５−２２（１９９５））。簡潔には、２×１０５細胞／１００μＬの脂肪細胞または分化したＬ６細胞を、分化後培地中にプレーティング（すなわち、５０μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リジンでコーティング）された９６ウェル組織培養「ＴＣ」に移し、３７℃、５％  ＣＯ２にて一晩インキュベートする。まず、細胞を、無血清低グルコースＤＭＡＭ培地で１回洗浄し、次いで、１００μＬ／ウェルの同じ培地、および１００μＬ／ウェルの緩衝液あるいは真性糖尿病の処置のために列挙された治療剤の任意の１種以上の組み合わせ、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの漸増する濃度の本発明の治療剤（例えば、配列番号Ｙとして開示された特定の融合物、ならびにそのフラグメントおよび変異体）のいずれかと、１ｎＭのインスリンの不存または存在下、３７℃で１６時間飢餓状態におく。プレートを、１００μＬ／ウェルのＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で３回洗浄する。インスリンを、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中１ｎＭにて、１０μＭの標識［３Ｈ］−２−デオキシグルコース（Ａｍｅｒｃｈａｍ、＃ＴＲＫ６７２）および１０μＭの非標識２−デオキシグルコース（ＳＩＧＭＡ、Ｄ−３１７９）の存在下で、３７℃で３０分間加える。対照として、インスリン不存下を除いて同じ条件を行う。最終濃度１０μＭのサイトカラシンＢ（ＳＩＧＭＡ、Ｃ６７６２）を、別々のウェルに１００μＬ／ウェルにて加え、非特異的な取り込みを測定する。細胞を、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水を用いて３回洗浄する。標識、すなわち、１０μＭの［３Ｈ］−２−デオキシグルコース、および非標識、すなわち、１０μＭの２−デオキシグルコースを、室温にて１０分間加える。細胞を、冷リン酸緩衝食塩水「ＰＢＳ」で３回洗浄する。細胞を、１５０μＬ／ウェルの０．２Ｎ  ＮａＯＨを加えて溶解し、次いで、室温で２０分間振盪しながら培養する。次いで、試料を、シンチレーションバイアルに移し、それに５ｍＬのシンチレーション溶液を加える。バイアルを、ベータ−シンチレーションカウンターにて計数する。インスリンの不存または存在が異なる重複条件下での取り込みを、以下の方程式：［（１分間当たりのインスリン数「ｃｐｍ」−非特異的ｃｐｍ）／（インスリンなしのｃｐｍ−非特異的ｃｐｍ）］を用いて決定する。応答平均は、脂肪細胞および筋管のそれぞれについて、対照の約５倍から３倍の範囲��となる。
【１０１７】
細胞の分化
細胞を、Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ中で完全な集約状態とする。培地を除去し、２５ｍＬの前分化培地と置き換え、４８時間培養する。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２、湿度８５％にてインキュベートする。４８時間後、前分化培地を除去し、２５ｍＬの分化培地と置き換え、４８時間培養する。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２、湿度８５％にて再びインキュベートする。４８時間後、培地を除去し、３０ｍＬの分化後培地と置き換える。分化後培地を、１４〜２０日間、あるいは分化を完全に達成するまで維持する。培地を、２〜３日毎に交換する。ヒト脂肪細胞は、Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，ＩＮＣ（＃ＳＡ−１０９６）から購入することができる。
【１０１８】
実施例１４：膵臓細胞株への［３Ｈ］−チミジン取り込みの体外でのアッセイ
最近、ＧＬＰ−１が、膵島十二指腸ホメオボックス−１（ＩＤＸ−１）およびインスリンｍＲＮＡレベルの増大と関連する時間および用量に依存した方法で、ラット膵管上皮細胞株ＡＲＩＰの分化を誘導することが示された（Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５０（４）：７８５−９６）。ＩＤＸ−１は次いで、ＧＬＰ−１受容体のｍＲＮＡレベルを増大させる。
【１０１９】
試験した細胞型
ＲＩＮ−Ｍ細胞：これらの細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ細胞株番号ＣＲＬ−２０５７）より入手可能である。ＲＩＮ−Ｍ細胞株は、放射線誘発性の移植可能なラット膵島細胞腫瘍からもたらされたものである。腫瘍のヌードマウス異種移植から細胞株を確立した。細胞は、膵島ポリペプチドホルモンを産生して分泌し、かつＬ−ドーパデカルボキシラーゼ（アミン前駆体取り込みおよび脱炭酸反応、またはＡＰＵＤ、活性を有する細胞のマーカー）を産生する。
【１０２０】
ＡＲＩＰ細胞：これらは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ細胞株番号ＣＲＬ−１６７４）から入手可能な上皮形態の膵外分泌腺細胞である。また、参考文献：Ｊｅｓｓｏｐ，Ｎ．Ｗ．ａｎｄ  Ｈａｙ，Ｒ．Ｊ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｒａｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｅｘｏｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｔｕｍｏｒｓ，”Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １６：２１２，（１９８０）、Ｃｏｃｋｅｌｌ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｉｎａｒ  ｐａｎｃｒｅａｓ，”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：２４６４−２４７６，（１９８９）、Ｒｏｕｘ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＰＴＦｌ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＤＮＡ”Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：１６１３−１６２４，（１９８９）、およびＨｕｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｌｅｔ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ−１−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ，”Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：７８５−７９６（２００１）を参照のこと。
【１０２１】
細胞の調製
ＲＩＮ−Ｍ細胞株を、１０％のウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、＃ＳＨ３００８８．０３）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地（ＨｙＣｌｏｎｅ、＃ＳＨ３０００２７．０１）にて成長させ、１：３から１：６の比で、６から８日毎に継代培養する。培地を、３〜４日毎に交換する。
【１０２２】
ＡＲＩＰ細胞株（ＡＴＣＣ番号＃ＣＲＬ−１６７４）を１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムおよび１０％のウシ胎児血清を含有するよう調節された２ｍＭのＬ−グルアミンを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ番号＃３０−２００４）にて成長させる。ＡＲＩＰ細胞株を、１週間に２回、１：３から１：６の比で継代培養する。培地を、３〜４日毎に交換する。
【１０２３】
アッセイプロトコル
細胞を、９６ウェルプレート中４０００細胞／ウェルにて播種し、５０％の集密まで４８〜７２時間培養する。細胞を、１００μＬ／ウェルの無血清培地に切り換える。培養してから４８〜７２時間後、血清および／または本発明の治療剤（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質、ならびにそのフラグメントおよび変異体）をウェルに加える。培養を、さらに３６時間続ける。［３Ｈ］−チミジン（５〜２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、＃ＴＲＫ１２０）を、１マイクロキューリー／５マイクロリットルに希釈する。培養してから３６時間後、１ウェル当たり５マイクロリットルを、さらに２４時間、加える。反応は、細胞を冷リン酸緩衝食塩水「ＰＢＳ」にて１回軽く洗浄することにより、終結させる。次いで、細胞を、１００マイクロリットルの１０％の氷冷ＴＣＡを用いて、４℃にて１５分間固定する。ＰＢＳを除去し、２００マイクロリットルの０．２Ｎ  ＮａＯＨを加える。プレートを、室温にて１時間、振盪しながらインキュベートする。溶液を、シンチレーションバイアルに移し、水溶液に適合する５ｍＬのシンチレーション液を加え、勢いよく混合する。バイアルを、ベータシンチレーションカウンターにて計数する。負対照として、緩衝液のみを用いる。正対照として、ウシ胎児血清を用いる。
【１０２４】
実施例１５：糖尿についてのアッセイ
糖尿（すなわち、尿中の過剰な糖）は容易にアッセイでき、これは真性糖尿病の疾患状態の指標を提供する。正常な患者試料と比較して、患者試料中の過剰な尿は、ＩＤＤＭおよびＮＩＤＤＭの徴候である。結果として生じる尿中の過剰なグルコースの量の低減により、ＩＤＤＭおよびＮＩＤＤＭを有するこのような患者の処置の有効性を示す。ＩＤＤＭおよびＮＩＤＤＭのモニタリングの好ましい実施形態において、患者由来の尿試料を、当該技術分野で周知の技法を用いて、グルコースの存在についてアッセイする。ヒトにおける糖尿は、尿のグルコース濃度が１００ｍｌあたり１００ｍｇを超えるものと定義する。糖尿を示すこれらの患者における過剰な糖濃度を、血液試料を採取し、血清グルコースをアッセイすることにより、より正確に測定することができる。
【１０２５】
実施例１６：Ｂ細胞の増殖および分化の刺激または阻害を検出するアッセイ
機能的な体液性免疫応答の生成には、Ｂ連結細胞とそれらの微小環境との間に溶解性と同族シグナル伝達の双方を必要とする。シグナルは、Ｂ連結細胞が、そのプログラムされた発達を持続し得る正の刺激か、または細胞にその現在の発達経路を停止するように指示する負の刺激を与え得る。今日まで、多くの刺激性および阻害性シグナルが、Ｂ細胞応答に影響を及ぼすことが見出されている（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５を含む）。興味深いことに、これらのシグナルは、それら単独では弱いエフェクターであるが、様々な同時刺激性タンパク質と組み合わせると、Ｂ細胞集団の間で、活性化、増殖、分化、ホーミング、寛容性および死を誘導し得る。
【１０２６】
Ｂ細胞同時刺激性タンパク質の最もよく研究されたクラスの１つは、ＴＮＦスーパーファミリーである。このファミリーにおいて、それぞれのリガンドであるＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３を伴うＣＤ４０、ＣＤ２７、およびＣＤ３０は、様々な免疫応答を調節することが見出されている。これらのＢ細胞集団およびこれらの前駆体の増殖および分化の検出および／または観察を可能にするアッセイは、増殖および分化の点において、これらのＢ細胞集団に対する様々なタンパク質の効果を決定する価値あるツールである。以下に列挙される２つのアッセイは、Ｂ細胞集団およびこれらの前駆体の分化、増殖、または阻害の検出を可能にするように設計される。
【１０２７】
体外アッセイ−本発明のアルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質のフラグメントもしくは変異体ならびに／またはアルブミンあるいはアルブミンのフラグメントもしくは変異体を含有する融合タンパク質を含む）は、Ｂ細胞集団およびこれらの前駆体において活性化、増殖、分化、または阻害および／もしくは死を誘導するそれらの能力について評価され得る。精製されたヒト扁桃Ｂ細胞に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の活性（用量範囲０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の定量的に測定）を、標準的なＢリンパ細胞同時刺激アッセイにおいて評価し、ここで、精製された扁桃Ｂ細胞を、プライム剤としてのホルマリン固定スタフィロコッカスアウレウスコーワン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃｏｗａｎ）Ｉ（ＳＡＣ）あるいは固定化抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存在下で培養する。ＩＬ−２およびＩＬ−１５等の第２のシグナルは、ＳＡＣとＩｇＭとの架橋結合と共同作用して、トリチウム化チミジン取り込みにより測定されるように、Ｂ細胞増殖を誘導する。新規な相乗効果剤は、このアッセイを用いて、容易に特定され得る。アッセイは、ＣＤ３が正の細胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）の減少により、ヒト扁桃Ｂ細胞を単離する工程を含む。得られる細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現により評価して、Ｂ細胞が９５％より多い。
【１０２８】
各試料の様々な希釈物を、９６ウェルプレートの個々のウェルに入れ、そこに合計容量１５０μｌの培養培地（１０％のＦＢＳ、５×１０−５Ｍの２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０−５のＳＡＣ希釈液を含有するＲＰＭＩ  １６４０）に懸濁したＢ細胞１０５個を加える。因子を加えてから７２時間後に、３Ｈ−チミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）による２０時間のパルス（１μＣｉ／ウェル）を開始することにより、増殖または阻害を定量する。正および負対照はそれぞれ、ＩＬ２および培地である。
【１０２９】
生体内アッセイ−１日に２回、緩衝液のみか、または２ｍｇ／Ｋｇの本発明のアルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質のフラグメントもしくは変異体ならびに／またはアルブミンあるいはアルブミンのフラグメントもしくは変異体を含有する融合タンパク質を含む）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに注射（ｉ．ｐ．）する。マウスは、４日連続してこの処理を受け、この時点で、それらを屠殺して、様々な組織および血清を分析のために採取する。正常脾臓および本発明のアルブミン融合タンパク質により処理された脾臓からのＨ＆Ｅセクションの比較により、脾臓細胞に対する融合タンパク質の活性の結果（例えば、動脈周囲リンパ鞘の拡散、および／または赤脾髄の有核細胞の有意な増加）が特定され、このことは、Ｂ細胞集団の分化および増殖の活性化を示し得る。Ｂ細胞マーカーである抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を用いる免疫組織化学的研究を使用して、脾臓細胞に対する任意の生理学的変化（例えば、脾臓分離）が、確立されたＴ細胞領域に浸潤するゆるく規定されたＢ細胞領域内での増加したＢ細胞提示に起因するか否かを決定する。
【１０３０】
アルブミン融合タンパク質で処理されたマウス由来の脾臓のフローサイトメトリ分析を用いて、アルブミン融合タンパク質が、対照マウスにおいて観察される以上に、ＴｈＢ＋、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｄｕｌｌＢ細胞部分の比率を増大させるか否かを示す。
【１０３１】
同様に、予測した結果である生体内での成熟Ｂ細胞顕現の増大は、血清Ｉｇ滴定濃度の相対的増加によるものである。したがって、血漿ＩｇＭおよびＩｇＡのレベルは、緩衝液で処理されたマウスと融合タンパク質で処理されたマウスとの間で比較する。
【１０３２】
実施例１７：Ｔ細胞増殖アッセイ
ＣＤ３誘導性増殖アッセイをＰＢＭＣについて行ない、３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定する。アッセイは、以下のように行なう。９６ウェルプレートを、ＣＤ３に対して１００μｌ／ウェルのｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）か、またはイソ型一致対照ｍＡｂ（Ｂ３３．１）を用いて、４℃で一晩コーティング（０．０５Ｍ  炭酸塩緩衝液中１μｇ／ｍｌ、ｐＨ９．５）し、次いで、ＰＢＳで３回洗浄する。Ｆ／Ｈ勾配遠心分離により、ヒト末梢血からＰＢＭＣを単離し、ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有する）中、様々な濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質のフラグメントもしくは変異体ならびに／またはアルブミンあるいはアルブミンのフラグメントもしくは変異体を含有する融合タンパク質を含む）（全容量２００μｌ）の存在下で、ｍＡｂコーティングプレートの４組のウェル（５×１０４／ウェル）に加える。関連タンパク質緩衝液および培地のみを対照とする。３７℃で４８時間培養後、１０００ｒｐｍで２分間回転させ、１００μｌの上清を除去し、増殖に対する影響が観察される場合、ＩＬ−２（または他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で保存する。ウェルに０．５ｕＣｉの３Ｈ−チミジンを含有する１００μｌの培地を追加し、３７℃で１８〜２４時間培養する。ウェルを採取し、３Ｈ−チミジンの取り込みを増殖の評価基準として用いる。抗ＣＤ３のみが、増殖の正対照である。ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）をまた、増殖を増強する対照として用いる。Ｔ細胞の増殖を誘導しない対照抗体を、本発明の融合タンパク質の効果の負対照として用いる。
【１０３３】
実施例１８：ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現、ならびに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化に関する本発明の融合タンパク質の影響
樹状細胞を、末梢血において見出される増殖前駆体の拡大により生成する：接着ＰＢＣＭまたは浄化した単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）と共に７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞は、未成熟細胞（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現）の特徴的な表現型を有する。ＴＮＦ−α等の活性化因子での処理により、表面表現型の急激な変化（ＮＨＣクラスＩおよびＩＩ、同時刺激分子および細胞接着分子の発現の増大、ＦＣγＲＩＩの下方調節、ＣＤ８３の上方調節）を引き起こす。これらの変化は、樹状細胞の抗原提示能の増大、および機能的成熟と相関する。
【１０３４】
表面抗原のＦＡＣＳ分析を次の通りに行なう。細胞を、漸増する濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質またはＬＰＳ（正対照）で１〜３日間処理し、１％のＢＳＡおよび０．０２ｍＭのアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで、１：２０希釈の適当なＦＩＴＣまたはＰＥ標識モノクローナル抗体と共に４℃にて３０分間インキュベートする。さらに洗浄後、標識細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｌｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーにより分析する。
【１０３５】
サイトカインの産生における影響  樹状細胞により生成されるサイトカイン、特に、ＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始に重要である。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の発生に強く影響し、細胞障害性ＴおよびＮＫ細胞機能を誘導する。ＥＬＩＳＡを用いて、以下の通りにＩＬ−１２の放出を測定する。樹状細胞（１０６／ｍｌ）を、漸増する濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質で２４時間処理する。正対照として、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を細胞培養物に加える。次いで、細胞培養物からの上清を採取し、市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いて、ＩＬ−１２含有量について分析する。キットに添付された標準的なプロトコルを用いる。
【１０３６】
ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子、および接着分子の発現における影響  細胞表面抗原の３つの主要なファミリーすなわち接着分子、抗原提示に関与する分子、およびＦｃ受容体が、単球上で特定することができる。ＭＨＣクラスＩＩ抗原、およびＢ７およびＩＣＡＭ−１等の他の共刺激分子の発現の調節は、単球の抗原提示能およびＴ細胞活性化誘導能の変化を引き起こし得る。Ｆｃ受容体の発現増大は、単球の細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食作用の改善に関連し得る。
【１０３７】
ＦＡＣＳ分析を用いて、以下の通りに表面抗原を調べる。単球を、漸増する濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質またはＬＰＳ（正対照）で１〜５日間処理し、１％のＢＳＡおよび０．０２ｍＭのアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで、１：２０希釈の適当なＦＩＴＣまたはＰＥ標識モノクローナル抗体で、４℃にて３０分間インキュベートする。さらに洗浄後、標識細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上でのフローサイトメトリーにより分析する。
【１０３８】
単球の活性化および／または生存率の増大  単球を活性化（または代替として、不活性化）、および／または単球の生存率を増大させる（または代替として、単球の生存率の低減）分子についてのアッセイは、当該技術分野で周知であり、通常には、本発明の分子が、単球の阻害剤または活性剤として機能するかどうかの決定するために適用され得る。下記の３種類のアッセイを用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質をスクリーニングすることができる。これらのアッセイの各々について、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）による遠心分離により、単一ドナーの白血球パック（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を精製する。単球を、向流遠心分離洗浄により、ＰＢＭＣから単離する。
【１０３９】
単球の生存率アッセイ  ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激物質の不存下で培養する場合、生存率が徐々に低下する。それらの死は、内部の調節過程（アポトーシス）から生じる。ＴＮＦ−α等の活性化因子の培養物への添加は、細胞生存率を劇的に改善し、ＤＮＡのフラグメント化を防ぐ。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を用いて、以下の通りにアポトーシスを測定する。単球を、無血清培地（正対照）中で、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（負対照）の存在下、および試験される各濃度の融合タンパク質の存在下で、ポリプロピレンチューブにて４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌのＰＩを含有するＰＢＳ中で、２×１０６／ｍｌの濃度で懸濁し、次いで、ＦＡＣＳｃａｎ分析する前、室温にて５分間インキュベートする。ＰＩの取り込みは、この実験パラダイムにおいて、ＤＮＡフラグメント化と相関することが実証されている。
【１０４０】
サイトカイン放出における影響  単球／マクロファージの重要な機能は、刺激後のサイトカイン放出を介する免疫系の他の細胞集団に対するそれらの調節活性である。サイトカイン放出を測定するＥＬＩＳＡを、以下の通りに行なう。ヒト単球を、漸増する濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質と共に同じ条件下であるが融合タンパク質の非存在下で、密度５×１０５細胞／ｍｌにてインキュベートする。ＩＬ−１２産生のため、細胞を、融合タンパク質の存在下で、ＩＦＮ（１００Ｕ／ｍｌ）を用いて一晩刺激する。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を加える。２４時間後、条件培地を採取し、使用するまで凍結保存する。次いで、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−８の測定を、市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いて行ない、キットに添付された標準的なプロトコルを適用する。
【１０４１】
酸化的バースト  精製した単球が、９６ウェルプレートに２〜１×１０５細胞／ウェルにてプレーティングされる。漸増する濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質を、合計容量０．２ｍｌの培養培地（１０％のＦＣＳ、グルアミン、および抗生物質を含むＲＰＭＩ）中のウェルに加える。３日間インキュベーションした後、プレートを遠心分離し、培地をウェルから除去する。単層のマクロファージに、０．２ｍｌ／ウェルのフェノールレッド溶液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０、５．５ｍＭのデキストロース、０．５６ｍＭのフェノールレッド、および１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）を、刺激剤（２００ｎＭのＰＭＡ）と共に加える。プレートを、３７℃で２時間インキュベートし、１ウェルあたり２０μｌの１ＮのＮａＯＨを加えることにより、反応を停止させる。吸光度を６１０ｎｍで読み取る。マクロファージにより産生されるＨ２Ｏ２の量を測定するために、周知のモル濃度のＨ２Ｏ２溶液の標準曲線を、各実験について作成する。
【１０４２】
実施例１９：血管内皮細胞の成長における本発明のアルブミン融合タンパク質の影響
１日目に、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１６単位／ｍｌのヘパリン、および５０単位／ｍｌの内皮細胞成長補助剤（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含有するＭ１９９培地中で、２〜５×１０４細胞／３５ｍｍの皿密度にて播種する。２日目に、培地を、１０％  ＦＢＳ、８単位／ｍｌのヘパリンを含有するＭ１９９と置き換える。本発明のアルブミン融合タンパク質、およびＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）等の正対照を、各濃度にて加える。４日目および６日目に、培地を交換する。８日目に、細胞数を、コールターカウンターを用いて決定する。
【１０４３】
ＨＵＶＥＣ細胞数の増加は、融合タンパク質が、血管内皮細胞を増殖させ得ることを示す一方、ＨＵＶＥＣ細胞数の減少は、融合タンパク質が、血管内皮細胞を阻害することを示す。
【１０４４】
実施例２０：ラット角膜創傷治癒モデル
この動物モデルは、本発明のアルブミン融合タンパク質の血管新生における影響を示す。実験プロトコルは、
角膜中心から間質細胞層に、１〜１．５ｍｍ切開すること、
目尻と接する切開の端の下に、へらを挿入すること、
くぼみ（その土台は、目の端から１〜１．５ｍｍにある）を作ること、
本発明のアルブミン融合タンパク質の５０ｎｇ〜５μｇを含有するペレットのくぼみ内の位置付けること、を含む。
また、本発明のアルブミン融合タンパク質による処置を、２０ｍｇ〜５００ｍｇの用量範囲（５日間、毎日処置）で角膜創傷に局所適用することもできる。
【１０４５】
実施例２１：糖尿病マウスおよび糖質コルチコイド障害性創傷治癒モデル
糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル
本発明のアルブミン融合タンパク質が治癒過程を加速するかどうかを示すために、一般的に、創傷治癒の糖尿病マウスモデルを用いる。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける全層創傷治癒モデルは、十分に特徴付けられた、臨床的に関連する、再現可能な障害性創傷治癒モデルである。糖尿病創傷の治癒は、萎縮よりむしろ肉芽組織の形成および再上皮形成に依存する（Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９（１９９２）、Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。
【１０４６】
糖尿病動物は、ＩＩ型糖尿病で観察される多くの特徴的特性を有する。ホモ接合型（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常ヘテロ接合型（ｄｂ＋／＋ｍ）同腹子と比較して肥満である。変異糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、４番染色体に１個の常染色体劣性変異（ｄｂ＋）を有する（Ｃｏｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐ  ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ７７：２８３−２９３（１９８２））。動物は、多食、多飲、および多尿を示す。変異糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、血糖の上昇、上昇または正常なインスリンレベル、および細胞介在性免疫の抑制を有する（Ｍａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）、Ｄｅｂｒａｙ−Ｓａｃｈｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１−７（１９８３）；Ｌｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌ．１１４：４６−５５（１９８５））。末梢神経障害、心筋の合併症、および微小血管の損傷、基底膜の肥厚、および糸球体濾過異常が、これらの動物において記載されている（Ｎｏｒｉｄｏ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２ｌ−２３２（１９８４）、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２９（１）：６０−６７（１９８０）、Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）：４６０−４７３（１９７９）、Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３１（Ｓｕｐｐｌ）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合型糖尿病マウスは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似しているインスリンに耐性を示す高血糖を発症する（Ｍａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３７７（１９７８））。
【１０４７】
これらの動物において観察される特徴は、このモデルにおける治癒が、ヒト糖尿病において観察される治癒と類似し得ることを示唆する（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０））。
【１０４８】
遺伝的に糖尿病のメスＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスおよびそれらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）ヘテロ接合型同腹子を、本研究に用いる（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。動物は、６週齢のマウスを購入し、研究の開始時に８週齢とする。動物を、個々に収容し、餌と水を自由に摂取させる。すべての操作を、無菌法を用いて行なう。実験を、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）および実験動物の管理と使用のガイドライン（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ）の規則およびガイドラインに従い、行なう。
【１０４９】
創傷プロトコルを、既に報告された方法（Ｔｓｕｂｏｉ，Ｒ．  ａｎｄ  Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０））に従い、行なう。簡潔には、創傷した日に、動物を、アーバティン（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、脱イオン水に溶解した２，２，２−トリブロモエタノールおよび２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射により、麻酔する。動物の背部を剃り、皮膚を７０％エタノール溶液およびヨウ素で洗浄する。手術範囲を、創傷前に、滅菌ガーゼで拭き取る。次いで、８ｍｍの全層創傷を、キース組織パンチを用いて作製する。創傷後直ちに、周辺の皮膚を軽くのばし、創傷の拡大を防ぐ。創傷は、実験期間中、開いた状態である。処置の適用は、創傷の日から始めて連続して５日間、局所的に投与される。処置する前に、創傷を、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジで優しく拭く。
【１０５０】
創傷を、視覚的に調べ、手術日およびその後は２日間隔で、固定距離にて撮影する。創傷の閉鎖は、１〜５日目および８日目の毎日の測定により決定する。損傷を、目盛付きジェームソンカリパスを用いて、水平および垂直方向で測定する。肉芽組織が、もはやみられなくなり、創傷が一枚の上皮で覆われると、創傷は、治癒したとみなされる。
【１０５１】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、異なる用量範囲、ビヒクル中の４ｍｇ〜５００ｍｇ／創傷／日を用いて、８日間投与される。ビヒクル対照群には、ビヒクル溶液５０ｍＬを投与する。
【１０５２】
動物は、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して、安楽死させる。次いで、創傷および周辺の皮膚を、組織学および免疫組織化学のために採取する。組織標本を、さらに処理するために、生検スポンジ間の組織カセット中、１０％の中性緩衝ホルマリンに入れる。
【１０５３】
各１０匹（糖尿病５匹、および非糖尿病対照５匹）からなる３つの群：１）ビヒクルプラシーボ対照、２）無処置群、および３）処置群を評価する。
【１０５４】
創傷閉鎖を、縦軸および横軸間の領域を測定し、創傷の正方形領域の合計を得ることにより分析する。次いで、最初の創傷領域（０日目）と処置後のもの（８日目）との差を確定することにより、萎縮を評価する。１日目の創傷領域は、皮膚の穿孔に対応する大きさの６４ｍｍ２である。計算は、以下の式を用いて行なわれる：
ａ．［８日目の開口領域］−［１日目の開口領域］／［１日目の開口領域］
【１０５５】
標本を、１０％の緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋ブロックを、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミクロトームを用いて、創傷表面に垂直に薄切（５ｍｍ）する。二分した創傷の断面において、通常のヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行なう。創傷の組織学的検査を用いて、治癒過程および修復された皮膚の形態学的外観が、本発明のアルブミン融合タンパク質による処置により、変化するかどうかを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症性細胞、毛細血管、線維芽細胞、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検証を含む（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９９０））。盲検観測者は、目盛付レンズマイクロメータを用いる。
【１０５６】
組織切片はまた、ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ検出システムを用いて、ポリクローナルウサギ抗ヒトケラチン抗体で、免疫組織化学的に染色される。ヒトの皮膚を、正の組織対照として用いる一方、非免疫ＩｇＧを、負対照として用いる。ケラチノサイトの成長を、目盛付レンズマイクロメータを用いて、創傷の再上皮形成の程度を評価することにより決定する。
【１０５７】
皮膚標本における増殖性細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を、ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ検出システムを用いて、抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を用いることにより決定する。ヒト結腸癌は、正の組織対照としての役割を果たし、ヒト脳組織を、負の組織対照として用いる。各標本は、１次抗体が脱落し、非免疫マウスＩｇＧで置換した切片を含んだ。これらの切片のランキングは、増殖の程度の０〜８の階級に基づき、低い階級ほど増殖がわずかであることを反映し、高いほど急激な増殖を反映する。
【１０５８】
実験データを、不対のｔ検定を用いて、分析する。０．０５未満のｐ値を有意とみなす。
【１０５９】
ステロイド障害性ラットモデル
ステロイドによる創傷治癒の阻害は、様々な体外および生体内システムにおいて十分に示されている（Ｗａｈｌ，Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．Ｉｎ：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）、Ｗａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：４７６−４８１（１９７５）、Ｗｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：１６８４−１６９４（１９７８））。糖質コルチコイドは、血管新生を阻害し、血管透過性（Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７０１−７０５（１９５２））、線維芽細胞増殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）、Ｈａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８））を低減し、循環単球を一過性に低減すること（Ｈａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）、Ｗａｈｌ，“Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ”，Ｉｎ：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２８０−３０２（１９８９））により、創傷治癒を遅延させる。障害のある創傷治癒に対するステロイドの全身投与は、ラットにおいて十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）、Ｈａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）、Ｗａｈｌ，“Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ”，Ｉｎ：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２８０−３０２（１９８９）、Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：２２２９−２２３３（１９８９））。
【１０６０】
本発明のアルブミン融合タンパク質が、治癒過程を加速することができることを示すために、治癒がメチルプレドニゾロンの全身投与により改善されたラットの全層切開性皮膚創傷に対する融合タンパク質の複数局所適用の効果を、評価する。
【１０６１】
体重２５０ｇ〜３００ｇの若い成体のオススプラーグドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、この実施例において用いる。動物は、８週齢にて購入し、研究の開始時に９週齢とする。ラットの治癒応答を、創傷時のメチルプレドニゾロンの全身投与（１７ｍｇ／ｋｇ／ラット  筋肉内）により阻害する。動物を、個々に収容し、餌と水を自由に摂取させる。すべての操作を、無菌法を用いて行なう。この研究は、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）および実験動物の管理と使用のガイドライン（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ）の規則およびガイドラインに従い、行なわれる。
【１０６２】
創傷のプロトコルは、上記に従う。創傷させる日に、動物を、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔する。動物の背部を剃り、皮膚を７０％のエタノール溶液およびヨウ素で洗浄する。手術範囲を、創傷前に、滅菌ガーゼで拭き取る。８ｍｍの全層創傷を、キース組織パンチを用いて作製する。創傷は、実験期間中、開いた状態である。試験物質の適用は、創傷の日から始めて連続して７日間、局所的に投与され、次いで、メチルプレドニゾロンを投与される。処置する前に、創傷を、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジで優しく拭く。
【１０６３】
創傷を、視覚的に調べ、創傷日および処置の終わりに、固定距離にて撮影する。創傷の閉鎖は、１〜５日目および８日目の毎日の測定により決定する。損傷を、目盛付きジェームソンカリパスを用いて、水平および垂直方向で測定する。肉芽組織が、もはやみられなくなり、創傷が一枚の上皮で覆われると、創傷は、治癒したとみなされる。
【１０６４】
本発明の融合タンパク質は、異なる用量範囲、ビヒクル中の４ｍｇ〜５００ｍｇ／創傷／日を用いて、８日間投与される。ビヒクル対照群には、ビヒクル溶液５０ｍＬを投与する。
【１０６５】
動物は、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して、安楽死させる。次いで、創傷および周辺の皮膚を、組織学のために採取する。組織標本を、さらに処理するために、生検スポンジ間の組織カセット中、１０％の中性緩衝ホルマリンに入れる。
【１０６６】
各１０匹（メチルプレドニゾロンあり５匹、および糖質コルチコイドなし５匹）からなる３つの群：１）無処置群、２）ビヒクルプラシーボ対照、および３）処置群を評定する。
【１０６７】
創傷閉鎖を、縦軸および横軸間の領域を測定し、創傷の領域の合計を得ることにより分析する。次いで、最初の創傷領域（０日目）と処置後のもの（８日目）との差を確定することにより、閉鎖を評価する。１日目の創傷領域は、皮膚の穿孔に対応する大きさの６４ｍｍ２である。計算は、以下の式を用いて行なわれる：
ｂ．［８日目の開口領域］−［１日目の開口領域］／［１日目の開口領域］
【１０６８】
標本を、１０％の緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋ブロックを、Ｏｌｙｍｐｕｓミクロトームを用いて、創傷表面に垂直に薄切（５ｍｍ）する。二分した創傷の断面において、通常のヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行なう。創傷の組織学的検査は、治癒過程および修復された皮膚の形態学的外観が、本発明のアルブミン融合タンパク質による処置により、改善されるかどうかを評価することを可能にする。盲検観測者は、目盛付レンズマイクロメータを用い、創傷間の差を決定する。
【１０６９】
実験データを、不対のｔ検定を用いて、分析する。０．０５未満のｐ値を有意とみなす。
【１０７０】
実施例２２：リンパ浮腫動物モデル
この実験アプローチの目的は、ラットの後足のリンパ性循環系のリンパ管形成および再確立における本発明のアルブミン融合タンパク質の治療効果を試験するための適切かつ一貫した、リンパ浮腫モデルを作製することである。有効性は、罹患した足の浮腫容積、リンパ脈管構造の量の定量、総血漿タンパク質の量、および組織病理により測定される。急性リンパ浮腫は、７〜１０日間観察される。おそらくより重要なことは、浮腫の慢性進行は、３〜４週間まで続く。
【１０７１】
手術を開始する前に、血液試料を、タンパク質濃度分析のために採血する。約３５０ｇの体重のオスのラットに、ペントバルビタールを投薬する。次いで、右足を膝から股関節部まで剃毛する。剃毛した範囲を７０％のＥｔＯＨに浸したガーゼで拭く。血液を、血清総タンパク質試験のために採血する。２つの測定レベル（踵の０．５ｃｍ上、足背の中間点）に印をつけた後、足へ色素を注射する前に、周径および体積測定を行なう。右足および左足の両方の背側皮内に、１％のエバンスブルー０．０５ｍｌを注射する。次いで、後足への色素を注射した後、周径および体積測定を行なう。
【１０７２】
目印として膝関節を用いて、中肢鼠径部切開を、大腿血管の位置を確認できるように環状に行なう。鉗子および止血剤を用いて、皮膚弁を切開し、分取する。大腿血管の位置を確認した後、血管の横に沿って、かつ血管の下に走るリンパ管を位置確認する。次いで、この範囲の主要なリンパ管を、電気で凝固させるか、あるいは縫合する。
【１０７３】
顕微鏡を用いて、足の後ろの筋肉（半膜様筋および内転筋の近く）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の位置を確認する。次いで、膝窩リンパ節の２本の近位リンパ管および２本の遠位リンパ管、および遠位の血液供給部を縫合糸により結紮する。次いで、膝窩リンパ節および任意の付随の脂肪組織を、結合組織を切断することにより除去する。
【１０７４】
この手順で生じるいかなる軽度の出血をも制御するように注意する。リンパ管を閉塞した後、皮膚弁を、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ  Ｂｕｃｋ）を使用することにより密封する。別々の皮膚縁を、足の周囲に約０．５ｃｍの隙間を残しながら、その下の筋肉組織に密封する。皮膚はまた、必要な場合には、その下の筋肉に縫合することにより固定してもよい。
【１０７５】
感染を回避するために、動物を、網を用いて個別に収容する（床敷きなし）。回復した動物を、最適な浮腫ピークを通して毎日チェックし、これは、典型的には、５〜７日までに生じる。次いで、プラトーの浮腫ピークを観察する。リンパ浮腫の程度を評定するために、各足の周囲および２ヶ所の指定地点の体積を、手術前、そして７日間毎日測定する。血漿タンパク質のリンパ浮腫における効果を決定し、タンパク質分析が、有用な試験視野計であるかどうかも調べる。対照および浮腫の足の両方の重さを、２地点で評価する。盲検で分析する。
【１０７６】
周囲の測定：四肢の運動を防ぐために簡易ガス麻酔下で、布巻き尺を用いて、足の周囲を測定する。測定を、距骨および足背面にて、２人の異なる人物により行ない、これらの２つの読み取りを平均する。読み取りを、対照肢および水腫肢の両方から得る。
【１０７７】
体積の測定：手術日に、動物を、ペントバルビタールで麻酔し、手術前に試験する。毎日の体積の測定のためには、動物を、簡単なハロタン麻酔（迅速な固定化かつ回復）下におき、両足を剃毛し、防水マーカーを用いて足に等しく印を付ける。足を、最初に水に漬け、次いで、各々印をしたレベルまで装置に漬け、次いで、Ｂｕｘｃｏ水腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔｏｒ）により測定する。データを一人によって記録する一方、もう一人が、印を付けた領域まで足を漬ける。
【１０７８】
血液−血漿タンパク質の測定：手術の前に、血液を採血し、遠心分離し、血清を分離させ、次いで、全タンパク質およびＣａ２＋を比較する。
【１０７９】
足重量の比較：採血後、動物に組織採取の準備をする。キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて足を切断し、次いで、実験した足および対照の足の両方を結紮糸で切断し、重量を測定する。脛踵関節を外し、足の体重を測定することで、第２の重量測定を行う。
【１０８０】
組織学的調製：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、金属型に配置し、凍結ゲルを充填し、冷メチルブタンに漬け、切断するまで、−８０℃にて標識試料バッグに入れる。切断の際に、筋肉を、蛍光顕微鏡の下で、リンパ管について観察する。
【１０８１】
実施例２３：本発明のアルブミン融合タンパク質によるＴＮＦα誘導性接着分子の発現の抑制
炎症および血管新生の領域へのリンパ球の動員は、リンパ球の細胞表面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的な受容体−リガンド相互作用が関与する。接着プロセスは、正常および病理学的設定の両方において、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、および内皮細胞（ＥＣ）における内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチン）の発現を含む、多段階カスケードに続く。血管内皮におけるこれらの分子および他の分子の発現は、白血球が、局所脈管構造に接着し得、炎症応答の発生中、局所組織に溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび成長因子の局所濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。
【１０８２】
強力なプロ炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）は、内皮細胞における３つすべてのＣＡＭの刺激因子であり、多種多様の炎症応答に関与し得、しばしば病理学的結果をもたらす。
【１０８３】
ＴＮＦ−α誘導性ＣＡＭ発現の抑制を媒介する本発明のアルブミン融合タンパク質の潜在能力を試験し得る。改変型ＥＬＩＳＡアッセイ（これは、固相吸着剤としてＥＣを使用する）を採用して、ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質と共に同時刺激した場合に、ＴＮＦ−α処理ＥＣにおけるＣＡＭ発現の量を測定する。
【１０８４】
この実験を行うために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物を、プールした索採取物から得、１０％のＦＣＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンを追加した増殖培地（ＥＧＭ−２；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中で、５％のＣＯ２を含有する３７℃の加湿インキュベーター内において維持する。ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ培地中、１×１０４細胞／ウェルの濃度にて、９６ウェルプレート中に、３７℃で１８〜２４時間または集約状態になるまで播種する。次いで、単層を、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ−１６４０の無血清溶液で３回洗浄し、所定のサイトカインおよび／または増殖因子を用いて、２４時間３７℃にて処理する。インキュベーション後、次いで、この細胞を、ＣＡＭ発現について評価する。
【１０８５】
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、標準的な９６ウェルプレート中で集密まで成長させる。増殖培地を、細胞から取り除き、９０μｌの１９９培地（１０％のＦＢＳ）と置き換える。試験のための試料および正または負対照を、このプレートに三連で添加する（１０μｌ容量中）。プレートを、３７℃にて、５時間（セレクチンおよびインテグリン発現）あるいは２４時間（インテグリン発現のみ）のいずれかでインキュベートする。プレートを吸引して、培地を除去し、１００μｌの０．１％のパラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を有する）を各ウェルに加える。プレートを、４℃にて３０分間保持する。
【１０８６】
次いで、固定剤をウェルから除去し、ウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％のＢＳＡを用いて、１回洗浄し、排水する。ウェルを乾燥させないこと。１０μｌの希釈した一次抗体を、試験および対照ウェルに加える。抗ＩＣＡＭ−１−ビオチン、抗ＶＣＡＭ−１−ビオチン、および抗Ｅ−セレクチン−ビオチンを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ／ｍｌのストック抗体の１：１０希釈）で用いる。細胞を、加湿した環境において、３７℃にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％のＢＳＡを用いて、３回洗浄する。
【１０８７】
次いで、２０μｌの希釈したエキストラアビジン−アルカリホスファターゼ（１：５，０００希釈）を各ウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％のＢＳＡを用いて、３回洗浄する。１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェートｐＮＰＰを、５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。グリシン緩衝液中の１００μｌのｐＮＰＰ基質を、各試験ウェルに加える。三連の標準ウェルを、グリシン緩衝液中のエキストラアビジン−アルカリホスファターゼの実用的希釈物：１：５，０００（１００）＞１０−０．５＞１０−１＞１０−１．５から調製する。５μｌの各希釈物を、三連ウェルに加え、各ウェル中で生じたＡＰ含有量は、５．５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次いで、１００μｌのｐＮＮＰ試薬を、各標準ウェルに加えなければならない。プレートを、３７℃にて４時間インキューベートしなければならない。５０μｌの３Ｍ  ＮａＯＨの容量を、すべてのウェルに加える。結果を、プレートリーダーにおいて４０５ｎｍにて定量する。バックグラウンド減算オプションを、グリシン緩衝液のみで充填したブランクウェルにおいて使用する。テンプレートを、各々の標準ウェルにおけるＡＰ結合体の濃度を示すように設定する［５．５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇ］。結果を、各試料中の結合したＡＰ結合体の量として示す。
【１０８８】
実施例２４：ＧＡＳレポーター構築物の構築
細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路と呼ばれる。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路の活性化されたタンパク質は、多くの遺伝子のプロモーターに位置するガンマ活性化部位「ＧＡＳ」エレメントまたはインターフェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。タンパク質のこれらのエレメントとの結合は、関連遺伝子の発現を変化させる。
【１０８９】
ＧＡＳおよびＩＳＲＥエレメントは、シグナル伝達物質および転写活性化因子、または「ＳＴＡＴ」と呼ばれる転写因子類により認識される。ＳＴＡＴファミリーには６種類のメンバーが存在する。Ｓｔａｔ１およびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２（ＩＦＮ−αに対する応答として、広範囲に存在する）のように、多くの細胞種類に存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定されており、多くの細胞種類には存在しないが、ＩＬ−１２での処置後、ＴヘルパークラスＩの細胞において見出されている。Ｓｔａｔ５は、元々は、乳成長因子と呼ばれたが、骨髄細胞を含む他の細胞においてより高濃度で見出されている。それは、組織培養細胞において、多くのサイトカインにより活性化され得る。
【１０９０】
ＳＴＡＴは、ヤヌスキナーゼ（「Ｊａｋ」）ファミリーとして知られている一連のキナーゼによるチロシンリン酸化において、活性化されて細胞質から核に転位する。Ｊａｋは、可溶性チロシンキナーゼの独特のファミリーを表し、Ｔｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。これらのキナーゼは、有意な配列類似性を示し、概して、休止細胞において触媒的に不活性である。
【１０９１】
Ｊａｋは、以下の表により概説される広範な受容体により活性化される（Ｓｃｈｉｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による総説から適応）。Ｊａｋを活性化できるサイトカイン受容体ファミリーは、２つの群に分けられる。（ａ）クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、１Ｌ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−Ｉ５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンの受容体を含み、（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ−１０を含む。クラス１受容体は、保存されたシステインモチーフ（４個の保存されたシステインおよび１個のトリプトファンのセット）およびＷＳＸＷＳモチーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号５３）をコードする膜近接領域）を共有する。
【１０９２】
したがって、リガンドの受容体との結合において、Ｊａｋは活性化され、それは、次いでＳＴＡＴを活性化し、転位し、ＧＡＳエレメントに結合する。この全過程が、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含される。したがって、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合により反映されるＪａｋ−ＳＴＡＴ経路の活性化を用いて、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示すことができる。例えば、成長因子およびサイトカインは、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路を活性化することが知られている（以下の表５を参照のこと）。したがって、受容体分子に連結したＧＡＳエレメントを用いることにより、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路の活性化因子を特定することができる。
【１０９３】
【表４−１】
0005856131.tif 000060
【１０９４】
【表４−２】
0005856131.tif 000061
【１０９５】
実施例２７〜２９に記載の生物学的アッセイにおいて用いるプロモーターエレメントを含有する合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲベースのストラテジーを採用し、ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を生成する。５’プライマーは、ＩＲＦ１プロモータに見出され、広範なサイトカインでの誘導の際、ＳＴＡＴに結合することが既に示されているＧＡＳ結合部位の４個のタンデムコピーを含有するが（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：４５７−４６８（１９９４））、他のＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントを代わりに用いることもできる。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーターに相補的な配列１８ｂｐを含有し、ＸｈｏＩ部位と隣接する。５’プライマーの配列は、
５’：ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧ：３’（配列番号５４）である。
【１０９６】
下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターに相補的であり、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する：５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列番号５５）。
【１０９７】
ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得たＢ−ｇａｌ：プロモータープラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターテンプレートを用いて、行なう。得られたＰＣＲフラグメントを、ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向および逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列、
５’：ＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴ：３’（配列番号５６）を含むことを確認する。
【１０９８】
次に、ＳＶ４０プロモーターと連結したこのＧＡＳプロモーターエレメントを用いて、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２受容体構築物を操作する。ここで、レポーター分子は、分泌アルカリホスファターゼ、または「ＳＥＡＰ」である。しかしながら、明らかに、本実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意の受容体分子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る公知の受容体分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパク質が挙げられる。
【１０９９】
上記の配列により確認された合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントを、ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを用いて、増幅したＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメントでＳＶ４０プロモーターを有効に置換し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得られたｐＳＥＡＰ−プロモーターベクターにサブクローニングする。しかしながら、このベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を含まず、したがって、哺乳動物の発現系には好ましくない。
【１１００】
したがって、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含有する骨格ベクター（例えば、ｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）等）に挿入する。このベクターを哺乳動物細胞に形質移入すれば、次いで、このベクターは、実施例２７〜２９に記載されるように、ＧＡＳ結合のレポーター分子として使用され得る。
【１１０１】
他の構築物を、上記の説明を用い、異なるプロモーター配列でＧＡＳを置換して、作製し得る。例えば、ＥＧＲおよびＮＦ−ＫＢプロモーター配列を含有するレポーター分子の構築を、実施例２７〜３１に記載する。しかしながら、多くの他のプロモーターを、これらの実施例に記載のプロトコルを用いて置換することができる。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモーターを単独で、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、またはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換することができる。同様に、他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細胞）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞）、または心筋細胞等）を用いて、レポーター構築物の活性を試験することができる。
【１１０２】
実施例２５：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ
本明細書に開示される実施例に記載のアッセイの受容体分子として、ＳＥＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従って、Ｔｒｏｐｉｘ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔキット（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いて、アッセイする。Ｔｒｏｐｉｘ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔキットは、以下で使用される希釈緩衝液、アッセイ緩衝液、および反応緩衝液を供給する。
【１１０３】
容器に２．５×希釈緩衝液を入れ、１５μｌの２．５×希釈緩衝液を、本発明のアルブミン融合タンパク質を含有する３５μｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分配する。プレートを、プラスチックシーラーで密封し、６５℃で３０分間インキュベートする。不均一な加熱を避けるため、光学プレートを離しておく。
【１１０４】
試料を室温まで１５分間冷却する。容器を空にし、アッセイ緩衝液を入れる。アッセイ緩衝液５０ｍｌを加え、室温で５分間インキュベートする。容器を空にし、反応緩衝液（以下の表を参照のこと）を入れる。反応緩衝液５０μｌを加え、室温で２０分間インキュベートする。化学発光シグナルの強度は、時間に依存し、ルミノメーターでプレート５枚を読み取るためには、約１０分間を費やすので、プレート５枚を同時に処理し、１０分後に次のセットを開始すべきである。
【１１０５】
ルミノメーターでは、相対的な光の単位（ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）を読み取る。ブランクとしてＨ１２をセットし、結果を印字する。化学発光の増加は、レポーター活性を示す。
【表５】
0005856131.tif 000062
【１１０６】
実施例２６：ニューロン活性を特定するアッセイ
細胞が、分化および増殖する場合、１群の遺伝子が、多くの異なるシグナル伝達経路を介して、活性化される。これらの遺伝子の１つである、ＥＧＦＲ１（初期成長応答遺伝子１）は、活性化の際様々な組織および細胞型で誘導される。ＥＧＦＲ１のプロモーターは、このような誘導に関与する。レポーター分子と連結したＥＧＦＲ１プロモーターを用いて、本発明の融合タンパク質の細胞を活性化する能力を評価することができる。
【１１０７】
特に、以下のプロトコルを用いて、ＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫細胞）は、ＴＰＡ（テトラデカノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経成長因子）、およびＥＧＦ（表皮成長因子）等の多数のマイトジェンでの活性化により、増殖および／または分化することが知られている。ＥＧＲ１遺伝子発現は、この処置の間に活性化される。したがって、ＳＥＡＰレポーターに連結したＥＧＲプロモーターを含有する構築物でＰＣ１２細胞を安定に形質移入することにより、本発明のアルブミン融合タンパク質によるＰＣ１２細胞の活性化を評価することができる。
【１１０８】
ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を、以下のプロトコルにより構築される。ヒトゲノムＤＮＡからＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３から＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：８６７−８７１（１９９１））を、以下のプロモーター、
第１プロモーター：５’ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＡＴＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧ−３’（配列番号５７）
第２プライマー：５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣ−３’（配列番号５８）を用いて、ＰＣＲ増幅する。
【１１０９】
次いで、実施例２４で産生したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを用いて、ＥＧＲ１増幅産物を、このベクターに挿入することができる。制限酵素ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを直鎖にし、ＧＡＳ／ＳＶ４０詰込みを除去する。これらと同じ酵素を用いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターを連結する。
【１１１０】
細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、３０％  エタノール（滅菌濾過）中のコーティング溶液（Ｉ型コラーゲン（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．カタログ番号０８−１１５）の１：３０希釈）を１０ｃｍプレート１枚当たり２ｍｌ、または９６ウェルプレートの１ウェルあたり５０ｍｌを加え、２時間空気乾燥させる。
【１１１１】
ＰＣ１２細胞を、予めコーティングした１０ｃｍ組織培養皿上で、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを追加した、１０％  ウマ血清（ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号＃１２４４９−７８Ｐ）、５％  熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で、通常の方法で、成長させる。１つから４つへの分割を、３〜４日毎に行う。細胞を、掻き取ることによりプレートから取り出し、１５回以上、上下にピペッティングして再懸濁する。
【１１１２】
ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、当該技術分野で周知の技法を用いて、ＰＣ１２に形質移入する。ＥＧＲ−ＳＥＡＰ／ＰＣ１２安定細胞を、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を、慣用的な増殖のために使用するが、１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で再増殖させるべきである。
【１１１３】
ニューロン活性についてアッセイするために、約７０から８０％の集約状態で細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリーニングする。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いて１回洗浄する。次いで、細胞を、低血清培地（抗生物質を含む１％のウマ血清および０．５％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０）にて一晩飢餓状態におく。
【１１１４】
翌朝、培地を除去し、ＰＢＳを用いて細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻き取り、細胞を２ｍｌの低血清培地中で懸濁する。細胞数を計数し、より低血清の培地を加え、５×１０５細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達させる。
【１１１５】
２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに加える（１×１０５細胞／ウェルに等しい）。一連の異なる濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質を、３７℃で４８〜７２時間加える。正対照として、ＥＧＲを介してＰＣ１２細胞を活性化することが知られている成長因子（例えば、５０ｎｇ／μｌの神経成長因子（ＮＧＦ）等）を使用することができる。典型的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導が、正対照において見られる。通常、ＳＥＡＰアッセイを、当該分野において周知の技法を用いて、および／または実施例２５に記載されるように、行ない得る。
【１１１６】
実施例２７：Ｔ細胞活性についてのアッセイ
以下のプロトコルを用いて、因子を特定し、本発明のアルブミン融合タンパク質が、Ｔ細胞を増殖および／または分化させるかどうかを決定することにより、Ｔ細胞活性を評価する。Ｔ細胞活性を、実施例２４で産生したＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて、評価する。したがって、ＳＥＡＰ活性を増大させる因子は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。このアッセイで用いたＴ細胞は、ジャーカットＴ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ−１５２）であるが、Ｍｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５５２）、およびＭｏｌｔ４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８２）も用いることができる。
【１１１７】
ジャーカットＴ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋Ｔｈ１ヘルパー細胞である。安定な細胞株を生成するために、ジャーカット細胞約２００万個を、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／ｎｅｏベクターでトランスフェクションする（下記のトランスフェクション法）。トランスフェクション細胞を、１ウェルあたり約２０，０００細胞密度で播種し、１ｍｇ／ｍｌのゲンチシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に抵抗性の形質移入体を選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、漸増する濃度のインターフェロンガンマに対するそれらの応答性について試験する。選択したクローンの用量応答性を示す。
【１１１８】
特に、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含有する７５ウェルに十分な細胞を産出する。したがって、これをスケールアップするか、あるいは複数回行ない、複数の９６ウェルプレートに十分な細胞を生成する。ジャーカット細胞を、１％のペニシリン／ストレプトマイシンを添加した、ＲＰＭＩ＋１０％の血清にて維持する。Ｔ２５フラスコ中で、２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とプラスミドＤＮＡ１０μｇとを組み合わせる。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含有するＯＰＴＩ−ＭＥＭ２．５ｍｌを加え、室温にて１５〜４５分間インキュベートする。
【１１１９】
インキュベーション期間中、細胞濃度を計数し、必要な数の細胞（１回の形質移入あたり１０７個）をスピンダウンし、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中に再懸濁し、最終濃度１０７細胞／ｍｌとする。次いで、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中１×１０７細胞１ｍｌを、Ｔ２５フラスコに加え、３７℃で６時間インキュベートする。インキュベーション期間後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％の血清を加える。
【１１２０】
ジャーカット：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株を、ＲＰＭＩ＋１０％の血清、１ｍｇ／ｍｌ  ゲンチシン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンにて維持する。これらの細胞を、様々な濃度の本発明の１種類以上の融合タンパク質で処理する。
【１１２１】
融合タンパク質での処理日に、細胞を洗浄し、新しいＲＰＭＩ＋１０％の血清中に再懸濁し、１ｍｌあたり５００，０００細胞の密度とすべきである。必要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる融合タンパク質の数、および異なる濃度の融合タンパク質の数に依存する。１枚の９６ウェルプレートに対して、約１０００万個の細胞（１０プレートに対して、１億個の細胞）を必要とする。
【１１２２】
融合タンパク質で処理したジャーカット細胞を含有するウェル皿を、インキュベーター内に４８時間置く（注意：この時間は、４８〜７２時間の間で変更可能である）。次いで、各ウェルから試料３５μｌを、１２チャンネルのピペットを用いて、半透明の９６ウェルプレートに移す。半透明のプレートを（セロファンカバーを用いて）覆い、実施例２５に従い、ＳＥＡＰアッセイを行なうまで、−２０℃にて保存するべきである。残りの処理した細胞を含有するプレートを４℃に置き、所望に応じて、特定のウェルについてアッセイを繰り返すための材料の供給源として供する。
【１１２３】
正対照として、ジャーカットＴ細胞を活性化することが知られている１００単位／ｍｌのインターフェロンガンマを使用することができる。典型的には、３０倍を超える誘導が、正対照ウェルにおいて観察される。
【１１２４】
上記のプロトコルは、一過性、ならびに安定な形質移入細胞の生成において、使用され得、これは当業者に明らかだろう。
【１１２５】
実施例２８：Ｔ細胞活性についてのアッセイ
ＮＦ−ＫＢ（核因子ＫＢ）は、多種多様の薬剤（炎症性サイトカインであるＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−アルファおよびリンホトキシン−ベータを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、ならびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転写因子として、ＮＦ−ＫＢは、免疫細胞の活性化、アポトーシスの制御（ＮＦ−ＫＢは、アポトーシスから細胞を保護するようである）、ＢおよびＴ細胞の発生、抗ウイルスおよび抗菌応答、ならびに複数のストレス応答に関与する遺伝子の発現を調節する。
【１１２６】
刺激されない条件において、ＮＦ−ＫＢは、Ｉ−ＫＢ（阻害剤ＫＢ）を有する細胞質に保持される。しかしながら、刺激の際に、Ｉ−ＫＢはリン酸化され、そして分解され、ＮＦ−ＫＢの核への往復（ｓｈｕｔｔｌｅ）を引き起こし、これにより標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−ＫＢにより活性化される標的遺伝子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１、およびクラス１ＭＨＣが挙げられる。
【１１２７】
その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−ＫＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を用いて、融合タンパク質をスクリーニングする。ＮＦ−ＫＢの活性剤または阻害剤は、疾患の処置、予防、および／または診断に有用である。例えば、ＮＦ−ＫＢの阻害剤を用いて、関節リウマチ等の急性または慢性的なＮＦ−ＫＢの活性化に関連する疾患を処置することができる。
【１１２８】
ＮＦ−ＫＢプロモーターエレメントを含有するベクターを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテジーを採用する。上流プライマーは、ＮＦ−ＫＢ結合部位
（ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号５９）の４個のタンデムコピー、ＳＶ４０初期プロモーター配列の５’末端に相補的な配列１８ｂｐを含有し、ＸｈｏＩ部位に隣接する。
５’：ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧ：３’（配列番号６０）。
【１１２９】
下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に相補的であり、ＨｉｎｄＩＩＩ部位と隣接する。
５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列番号５５）。
【１１３０】
ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得たｐＢ−ｇａｌ：プロモータープラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターテンプレートを用いて、行なう。生じたＰＣＲフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７およびＴ３プライマーを用いて配列決定し、挿入物が以下の配列、
５’：ＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴ：３’（配列番号６１）を含有することを確認する。
【１１３１】
次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ｐＳＥＡＰ２−プロモータープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメントを、このＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０フラグメントで置換する。しかしながら、このベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を含まず、したがって、哺乳動物の発現系には好ましくない。
【１１３２】
安定な哺乳動物細胞株を生成するために、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットを、制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて、上記のＮＦ−ＫＢ／ＳＥＡＰベクターから取り出し、ネオマイシン耐性を含有するベクターに挿入する。特に、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットを、ｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入し、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１を制限処理した後に、ＧＦＰ遺伝子を置換した。
【１１３３】
ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製すると、安定なジャーカットＴ細胞を作製し、実施例２５に記載のプロトコルにより維持する。同様に、これらの安定なジャーカットＴ細胞を用いて融合タンパク質をアッセイする方法も実施例２５に記載される。正対照として、外因性ＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）を、ウェルＨ９、Ｈ１０、およびＨ１１に加え、典型的には、５〜１０倍の活性化が観察される。
【１１３４】
実施例２９：ニューロン活性を特定するアッセイ
以下のプロトコルを用いて、融合タンパク質が骨髄細胞を増殖および／または分化させるかどうかを決定することにより、本発明のアルブミン融合タンパク質の骨髄活性を評価する。骨髄細胞活性を、実施例２４で産生したＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて、評価する。したがって、ＳＥＡＰ活性を増大させる因子は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。このアッセイで用いた骨髄細胞は、前単球細胞株のＵ９３７であるが、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１も用いることができる。
【１１３５】
Ｕ９３７細胞を、実施例２４で産生したＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物で、一過性に形質移入するために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（Ｋｈａｒｂａｎｄａ  ｅｔ．ａｌ．，１９９４，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５：２５９−２６５）を用いる。まず、Ｕ９３７細胞２×１０７個を採取し、ＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを追加した１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で成長させる。
【１１３６】
次に、０．５ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇのＧＡＳ−ＳＥＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、３７５μＭのＮａ２ＨＰＯ４７Ｈ２Ｏ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、および６７５μＭのＣａＣｌ２を含有する１ｍｌの２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液に、細胞を懸濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。
【１１３７】
１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、完全培地１０ｍｌ中に再懸濁し、３７℃で３６時間インキュベートする。
【１１３８】
ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を成長させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を、慣用的な増殖のために使用するが、１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で再増殖させるべきである。
【１１３９】
これらの細胞を、１×１０８個の細胞（これは１０枚の９６ウェルプレートアッセイのために十分である）を採取することにより試験し、ＰＢＳで洗浄する。上記の成長培地２００ｍｌ中に細胞を懸濁し、最終密度５×１０５細胞／ｍｌとする。９６ウェルプレートにおいて１ウェルあたり２００μｌの細胞（または１×１０５細胞／ウェル）をプレーティングする。
【１１４０】
異なる濃度の融合タンパク質を加える。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。正対照として、Ｕ９３７細胞を活性化することが知られている１００単位／ｍｌのインターフェロンガンマを使用することができる。典型的には、３０倍を超える誘導が、正対照ウェルにおいて観察される。ＳＥＡＰは、当該技術分野で周知の方法および／または実施例２５に記載のプロトコルにより上清をアッセイする。
【１１４１】
実施例３０：小分子濃度および膜透過性の変化を特定するアッセイ
リガンドの受容体との結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのような小分子の細胞内濃度、およびｐＨを変化させ、ならびに膜電位を変化させることが知られている。これらの変化を、特定細胞の受容体に結合する融合タンパク質を特定するためのアッセイにおいて測定することができる。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッセイを記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、または蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子の変化を検出するように容易に改変され得る。
【１１４２】
以下のアッセイは、蛍光測定画像化プレートリーダー（ＦｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃＩｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）（「ＦＬＩＰＲ」）を使用して、小分子と結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の変化を測定する。明らかに、小分子を検出する任意の蛍光分子を、本明細書で用いるカルシウム蛍光分子、ｆｌｕｏ−４（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．、カタログ番号：Ｆ−１４２０２）の代わりに使用することができる。
【１１４３】
接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底が透明なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートを、ＣＯ２インキュベータ−にて２０時間インキュベートする。接着細胞を、Ｂｉｏｔｅｋ洗浄器内で、２００μｌのＨＢＳＳ（ハンクス緩衝塩溶液）で２回洗浄し、最後の洗浄後、１００μｌの緩衝液を残す。
【１１４４】
１ｍｇ／ｍｌのｆｌｕｏ−４のストック溶液を、１０％のプルロン酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）ＤＭＳＯ中で作製する。細胞にｆｌｕｏ−４を負荷するため、１２μｇ／ｍｌのｆｌｕｏ−４（５０μｌ）を各ウェルに加える。プレートを、ＣＯ２インキュベーターにて、３７℃で６０分間インキュベートする。プレートを、Ｂｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳで４回洗浄し、１００μｌの緩衝液を残す。
【１１４５】
非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０ｍｌのコニカルチューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０６細胞／ｍｌに再懸濁する。１０％のプルロン酸ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍｌのｆｌｕｏ−４ストック溶液４μｌを、細胞懸濁液各１ｍｌに加える。次いで、チューブを３７℃の水浴中に３０〜６０分間置く。細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、マイクロプレートに分注し、１０μｌ／ウェルとする。プレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。次いで、プレートを、Ｄｅｎｌｅｙ細胞洗浄機にて、２００μｌで１回洗浄した後、吸引工程により最終容量を１００μｌとする。
【１１４６】
非細胞ベースのアッセイについて、各ウェルは、ｆｌｕｏ−４等の蛍光分子を含有する。本発明の融合タンパク質をウェルに加え、蛍光の変化を検出する。
【１１４７】
細胞内カルシウムの蛍光を測定するために、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターについて設定する。（１）システムゲイン（Ｓｙｓｔｅｍｇａｉｎ）は、３００〜８００ｍＷであり、（２）曝露時間は、０．４秒であり、（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２であり、（４）励起は４８８ｎｍであり、（５）発光は５３０ｎｍであり、（６）試料添加は５０μｌである。５３０ｎｍでの放出の増大は、本発明のアルブミン融合タンパク質により引き起こされる細胞外シグナル伝達現象、または本発明のアルブミン融合タンパク質により誘発される分子を示し、それは細胞内Ｃａ＋＋濃度の増加を生じる。
【１１４８】
実施例３１：チロシンキナーゼ活性を特定するアッセイ
タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通および細胞質キナーゼを表す。受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）群内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦ、およびインスリン受容体サブファミリーを含む、一連の分裂促進および代謝成長因子の受容体がある。加えて、対応するリガンドが未知である大きなＲＰＴＫのファミリーがある。ＲＰＴＫについてのリガンドは、主に、分泌される小タンパク質を含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク質も含む。
【１１４９】
リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介受容体二量体化を含み、これは受容体サブユニットのトランスリン酸化および細胞質チロシンキナーゼの活性化をもたらす。細胞質チロシンキナーゼは、ｓｒｃ−ファミリー（例えば、ｓｒｃ、ｙｅｓ、Ｉｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）の受容体関連チロシンキナーゼ、ならびにＪａｋファミリー等の非受容体結合および細胞質ゾルタンパク質チロシンキナーゼを含み、これらのメンバーは、受容体のサイトカインスーパーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、およびレプチン）により誘発されるシグナル伝達を媒介する。
【１１５０】
チロシンキナーゼ活性を刺激し得る広範な周知の因子のために、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質により誘導される分子が、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化し得るかどうかを特定することは興味深い。したがって、以下のプロトコルを設計して、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化し得るこのような分子を特定する。
【１１５１】
標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を、約２５，０００細胞／ウェルの密度で、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ  Ｓｉｌｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｐｌａｔｅに播種する。プレートを、１００％のエタノールで３０分間ずつ２回すすぐことにより滅菌し、水ですすぎ、一晩乾燥させる。いくつかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養グレードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリシン（５０ｍｇ／ｍｌ）（これらはすべて、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％のマトリゲル、あるいは仔ウシ血清で２時間コーティングし、ＰＢＳですすぎ、４℃で保存する。これらのプレート上の細胞増殖を、成長培地に５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡｌａｍａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）に記載されるように、アラマーブルー（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ）を使用して、４８時間後に細胞数を間接計量することによりアッセイする。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレートカバー＃３０７１を用いて、Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ  Ｓｉｌｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｐｌａｔｅを覆う。Ｆａｌｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ  ＩＩＩ細胞培養プレートもまた、いくつかの増殖実験において使用され得る。
【１１５２】
抽出物を調製するために、Ａ４３１細胞を  Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、完全培地中で一晩培養する。細胞を、無血清基本培地中で２４時間インキュベートして静止状態とする。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または異なる濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質で５〜２０分間処理した後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００、０．１％のＳＤＳ、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、２ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、およびＢｏｅｈｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手したプロテアーゼ阻害剤のカクテル（＃１８３６１７０））を各ウェルに加え、プレートを、回転振盪器上、４℃で５分間振盪する。次いで、プレートを、真空トランスファーマニホールド（ｖａｃｕｕｍ  ｔｒａｎｓｆｅｒｍａｎｉｆｏｌｄ）に設置し、抽出物を、ハウスバキュームを用いて、各ウェルの底の０．４５ｍｍ膜を通して濾過する。抽出物を、バキュームマニホールドの底の９６ウェル捕獲／アッセイプレートに採取し、直ちに氷上に置く。遠心分離により浄化した抽出物を得るために、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウェルの含有物を取り出し、４℃、１６，０００ｘｇにて、１５分間遠心分離する。
【１１５３】
濾過抽出物を、チロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナーゼ活性を検出する多数の方法が知られているが、本明細書では、１つの方法を記載する。
【１１５４】
概して、本発明のアルブミン融合タンパク質のチロシンキナーゼ活性を、特定の基質（ビオチン化されたペプチド）上のチロシン残基をリン酸化する能力を決定することにより、評価する。この目的に使用され得るビオチン化されたペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃｄｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に相当）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミノ酸１〜１７に相当）が挙げられる。両ペプチドは、一連のチロシンキナーゼの基質であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能である。
【１１５５】
以下の成分を順に加えることにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。まず、５μＭビオチン化されたペプチド１０μｌ、次いで、１０μｌのＡＴＰ／Ｍｇ２＋（５ｍＭのＡＴＰ／５０ｍＭのＭｇＣｌ２）、次いで、１０μｌの５×アッセイ緩衝液（４０ｍＭの塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭのベータ−グリセロリン酸塩、１ｍＭのＥＧＴＡ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＭｎＣｌ２、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）、次いで、５μｌのバナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）、次いで、水５μｌを加える。成分を穏やかに混合し、反応混合物を、３０℃で２分間プレインキュベートする。１０μｌの対照酵素または濾過上清を加えることにより、反応を開始させる。
【１１５６】
次いで、チロシンキナーゼアッセイ反応を、１２０ｍＭ  ＥＤＴＡ（１０μｌ）を加えることにより停止し、その反応物を氷上に置く。
【１１５７】
チロシンキナーゼ活性を、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モジュールに反応混合物の５０μｌのアリコートを移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、決定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａｄｉｎ）でコーティングされた９６ウェルプレートをビオチン化されたペプチドと会合させることが可能である。ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、７５μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）抗体（抗−Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））を、各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように洗浄する。
【１１５８】
次に、１００μｌのペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベートする。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、４０５ｎｍにおける試料の吸光度を測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルを、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて定量し、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。
【１１５９】
実施例３２：リン酸化活性を特定するアッセイ
実施例３１に記載されるタンパク質チロシンキナーゼ活性のアッセイに対する潜在的な代替および／または補助として、主要な細胞内シグナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイを用いることもできる。例えば、下記のように、１つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２キナーゼのチロシンリン酸化を検出することができる。しかしながら、他の分子（例えば、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、Ｔｅｃ、およびヤヌス）、ならびに任意の他のホスホセリン、ホスホチロシン、またはホスホトレオニン分子等のリン酸化は、以下のアッセイにおいて、Ｅｒｋ−１またはＥｒｋ−２の代わりに、これらの分子を用いることにより検出することができる。
【１１６０】
特に、アッセイプレートを、０．１ｍｌのタンパク質Ｇ（１ｕｇ／ｍｌ）を用いて、２時間室温（ＲＴ）で、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをコーティングすることにより、作製する。次いで、そのプレートを、ＰＢＳですすぎ、３％のＢＳＡ／ＰＢＳを用いて、１時間室温でブロッキングする。次いで、タンパク質Ｇプレートを、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２に対する２つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて処理する（室温で１時間）（他の分子を検出するために、この工程を、任意の上記の分子を検出するモノクローナル抗体に置き換えることにより、容易に修飾することができる）。ＰＢＳですすいでから３〜５時間後、そのプレートを、使用時まで４℃で貯蔵する。
【１１６１】
Ａ４３１細胞を、２０，０００／ウェルにて９６ウェルのＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィルタープレートに播種し、成長培地中で一晩培養する。次いで、その細胞を、基本培地（ＤＭＥＭ）中で、４８時間かけて飢餓状態とし、次いで、ＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）または様々な濃度の本発明の融合タンパク質を用いて、５〜２０分間処理する。次いで、細胞を可溶化し、抽出物を、アッセイプレート中に直接濾過する。
【１１６２】
抽出物を１時間室温でインキュベーションした後、ウェルを再度すすぐ。正対照として、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）を、Ａ４３１抽出物の代わりに用いる。次いで、プレートを、Ｅｒｋ−ｌおよびＥｒｋ−２キナーゼのリン酸化されたエピトープを特異的に認識する市販のポリクローナル（ウサギ）抗体（ｌｕｇ／ｍｌ）を用いて処理する（室温で１時間）。この抗体を標準的な方法によりビオチン化する。次に、結合ポリクローナル抗体を、Ｗａｌｌａｃ  ＤＥＬＦＩＡ装置内で、ユーロピウムストレプトアビジンおよびユーロピウム蛍光増強剤と連続的にインキュベートする（時間分解性蛍光）ことにより定量する。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、本発明の融合タンパク質によるリン酸化または本発明のアルブミン融合タンパク質により誘導される分子を示す。
【１１６３】
実施例３３：リン酸化アッセイ
本発明のアルブミン融合タンパク質のリン酸化活性をアッセイするために、米特許第５，９５８，４０５号（該文献は、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されるリン酸化アッセイを利用する。簡潔には、リン酸化活性を、ガンマ標識３２Ｐ−ＡＴＰを用いて、タンパク質基質をリン酸化し、ガンマ放射性同位元素カウンターを用いて、取り込まれた放射能を定量することにより、測定することができる。本発明の融合タンパク質を、タンパク質基質、３２Ｐ−ＡＴＰおよびキナーゼ緩衝液と一緒にインキュベートする。次いで、基質に取り込まれた３２Ｐを、電気泳動により、遊離の３２Ｐ−ＡＴＰから分離し、取り込まれた３２Ｐを計数し、負対照と比較する。負対照を超える放射能計数は、融合タンパク質のリン酸化活性の指標となる。
【１１６４】
実施例３４：ポリペプチドリガンドの存在下での、本発明のアルブミン融合タンパク質のリン酸化活性｛活性化）の検出
当該技術分野で周知の、または本明細書に記載される方法を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質のリン酸化活性を測定し得る。リン酸化活性を決定する好ましい方法は、米国特許第５，８１７，４７１号（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されるように、チロシンリン酸化アッセイを用いることによる。
【１１６５】
実施例３５：骨髄ＣＤ３４＋細胞増殖の刺激についてのアッセイ
このアッセイは、造血成長因子の存在下でのヒトＣＤ３４＋の増殖能力に基づき、ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する本発明の融合タンパク質の能力を評価する。
【１１６６】
ほとんどの成熟前駆細胞は、単一のシグナルだけに応答し得ることが、既に示されている。より未成熟な前駆細胞は、少なくとも２つの応答シグナルを必要とする。したがって、広範な始原細胞の造血活性への本発明の融合タンパク質の効果を試験するために、アッセイは、造血成長因子の存在下または不在下の本発明の所定の融合タンパク質を含有する。単離した細胞を、試験する試料と組み合わせて、幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で５日間培養する。ＳＣＦ単独では、このような条件下では、「生存」因子としてのみ作用するという、骨髄（ＢＭ）細胞の増殖における非常に限られた効果を有する。しかしながら、これらの細胞（例えば、ＩＬ−３）における刺激効果を示す任意の因子と組み合わせると、ＳＣＦは、相乗効果を惹起し得る。したがって、試験される融合タンパク質が造血始原細胞における刺激効果を有する場合、このような活性を、容易に検出することができる。正常なＢＭ細胞は、低レベルのサイクリング細胞を有するので、所定の融合タンパク質のいかなる阻害効果も検出されない可能性がある。したがって、好ましくは、始原細胞における阻害効果のためのアッセイは、初めに、ＳＣＦ＋ＩＬ＋３による体外で刺激に曝し、次いで、このような誘導増殖の阻害について評価しようとする化合物と接触させた細胞において試験する。
【１１６７】
簡潔には、ＣＤ３４＋細胞を、当該技術分野で周知の方法を用いて、単離する。細胞は、解凍され、培地（１％のＬ−グルタミン（５００ｍｌ）Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ  Ｃａｔ＃；１６０−２０４−１０１を加えた、ＱＢＳＦ  ６０無血清培地）に再懸濁される。２００ｘｇで穏やかな遠心分離工程を数回行った後、細胞を１時間静置する。細胞数を２．５×１０５細胞／ｍｌに調節する。この間、１００μｌの滅菌水を９６ウェルプレートの周壁に加える。このアッセイにおいて、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて試験できるサイトカインは、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ＃２５５−ＳＣ）のみ、および３０ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＣＦとｒｈＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ＃２０３−ＭＬ）との組み合わせである。１時間後、１０μｌの調製したサイトカイン、様々な濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質、および２０μｌの希釈した細胞を、１００μｌの最終容量となるように、ウェル中に既に存在する培地に加える。次いで、そのプレートを、３７℃／５％のＣＯ２インキュベーターに５日間置く。
【１１６８】
アッセイ物を採取する１８時間前に、０．５μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンを、各ウェルに１０μｌ容量で加え、増殖速度を測定する。実験を、Ｔｏｍｔｅｃ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ９６を用いて、各９６ウェルプレートからフィルターマットへ細胞を回収することにより終了する。採取後、フィルターマットを乾燥し、トリミングし、１つのＯｍｎｉｆｉｌｔｅｒプレートと１つのＯｍｎｉｆｉｌｔｅｒトレイからなるＯｍｎｉｆｉｌｔｅｒアセンブリに置く。６０μ１のＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔを各ウェルに加え、プレートを、トップシールＡ−プレスオンシーリングフィルムを用いて密封する。バーコード１５ステッカーを、カウンティングのために、第１のプレートに取り付ける。次いで、密封したプレートを装填し、放射能レベルを、Ｐａｃｋａｒｄトップカウントにより測定し、印刷されたデータを、解析のために収集する。放射能のレベルは、細胞増殖の量を反映する。
【１１６９】
この実施例に記載の研究は、骨髄ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する、所定の融合タンパク質の活性を試験するものである。当業者は、本発明の融合タンパク質およびポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）ならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストの活性を試験するために、例示された研究を容易に改変することができよう。骨髄ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する本発明のアルブミン融合タンパク質の能力は、アルブミン融合タンパク質および／またはその融合タンパク質に対応するポリヌクレオチドが、免疫系および造血に影響する障害の診断および処置のために有用であることを示す。代表的な用途は、上記の「免疫活性」および「感染症」の項および本明細書の別の箇所に記載される。
【１１７０】
実施例３６：細胞外マトリックス増強細胞応答（ＥＭＥＣＲ）についてのアッセイ
細胞外マトリックス増強細胞応答（ＥＭＥＣＲ）アッセイの目的は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）誘導シグナルに関連して、造血幹細胞に作用する本発明の融合タンパク質の能力を評定することである。
【１１７１】
細胞は、周囲のミクロ環境から受け取ったシグナルに関連して、制御因子に応答する。例えば、線維芽細胞、ならびに内皮幹細胞および上皮幹細胞は、ＥＣＭからのシグナルの非存在下で、複製することができない。造血幹細胞は、骨髄中で自己再生を起こし得るが、体外懸濁液培養では自己再生を起こさない。体外で自己再生を起こす幹細胞の能力は、間質細胞およびＥＣＭタンパク質フィブロネクチン（ｆｎ）とのそれらの相互作用に依存する。細胞のｆｎへの吸着は、α５−β１およびα４−β１インテグリン受容体により媒介され、これらの受容体は、ヒトおよびマウス造血幹細胞により発現される。ＥＣＭ環境との一体化、幹細胞の自己再生の刺激に関与する因子は、まだ特定されていない。このような因子の発見は、遺伝子治療および脊髄移植適用において非常に興味深いだろう。
【１１７２】
簡潔には、ポリスチレンの組織培養処理されていない９６ウェルプレートは、０．２μｇ／ｃｍ２のコーティング濃度で、ｆｎフラグメントを用いてコーティングされる。マウス骨髄細胞を、０．２ｍｌの無血清培地（１，０００細胞／ウェル）にプレーティングされる。ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）＋ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養された細胞は、幹細胞の自己再生が期待されず、明確な分化が期待される条件で、正対照として作用する。本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＳＣＦ（５．０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、または非存在下で、適切な負対照と共に試験され、ここで、本発明のアルブミン融合タンパク質を含有する投与される組成物の容量は、全アッセイ体積の１０％を示す。次いで、プレーティングされた細胞を、低酸素環境（５％のＣＯ２、７％のＯ２、および８８％のＮ２）の組織培養インキュベーターで、７日間インキュベートすることにより成長させる。次いで、ウェル内の増殖細胞の数を、細胞ＤＮＡへのチミジン組込みを測定することにより定量する。アッセイにおける陽性ヒットの確認には、細胞の表現型の特徴付けを必要とし、この特徴付けは、培養系をスケールアップし、そして細胞表面抗原およびＦＡＣＳｃａｎに対する適切な抗体試薬を使用することにより達成される。
【１１７３】
本発明の特定の融合タンパク質が、造血始原細胞の刺激薬であることが見出される場合、融合タンパク質および融合タンパク質に対応するポリヌクレオチドは、例えば、免疫系および造血に影響する障害の診断および処置に有用であり得る。代表的な用途は、上記の「免疫活性」および「感染症」の項および本明細書の別の箇所に記載される。融合タンパク質はまた、様々な血液系の幹細胞および先駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の増殖、ならびに様々な細胞型の分化および／または増殖において有用であり得る。
【１１７４】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、造血細胞の増殖および分化を阻害するために採用され、したがって、化学療法の間、化学療法剤から骨髄幹細胞を保護するために採用され得る。この抗増殖効果は、より高い用量の化学療法剤の投与、およびしたがって、より有効な化学治療処置が可能となる。
【１１７５】
さらに、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、間質細胞が、造血系の細胞の産生において重要であるため、造血関連障害（例えば、貧血、汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、または白血病）の処置および診断に有用であり得る。用途としては、骨髄細胞生体外培養、骨髄移植、骨髄再形成、新生組織形成の放射線療法または化学療法が、挙げられる。
【１１７６】
実施例３７：ヒト皮膚線維芽細胞および大動脈平滑筋細胞増殖
本発明のアルブミン融合タンパク質を、正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびヒト大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）の培養液に加え、２つの共アッセイを、各試料について行なう。第１のアッセイは、正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）または大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）の増殖における融合タンパク質の効果を調べる。線維芽細胞または平滑筋細胞の異常な成長は、繊維症および再狭窄を含むいくつかの病理学的過程の一部である。第２のアッセイは、ＮＨＤＦおよびＳＭＣの両方によるＩＬ６の産生を調べる。ＩＬ６の産生は、機能的活性化の指標である。活性化された細胞は、多数のサイトカインおよび他の因子の産生を増大させ、炎症誘発または免疫調節の成果をもたらし得る。アッセイは、共刺激性または阻害性活性を調べるために、共ＴＮＦａ刺激を伴うおよび伴わずに行なう。
【１１７７】
簡潔には、１日目、１００μｌの培養培地中に１０００細胞／ウェル（ＮＨＤＦ）または２０００細胞／ウェル（ＡｏＳＭＣ）を有する９６ウェルブラックプレートを設置する。ＮＨＤＦ培養培地は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＦＢ基本培地、１ｍｇ／ｍｌのｈＦＧＦ、５ｍｇ／ｍｌのインスリン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、２％のＦＢＳを含み、一方、ＡｏＳＭＣ培養培地は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＳＭ基本培地、０．５μｇ／ｍｌのｈＥＧＦ、５ｍｇ／ｍｌのインスリン、１μｇ／ｍｌのｈＦＧＦ、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ、５％のＦＢＳを含む。３７℃で少なくとも４〜５時間インキュベーション後、培養培地を吸引し、成長停止培地と置換する。ＮＨＤＦのための成長停止培地は、線維芽細胞基本培地、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、２％のＦＢＳを含み、一方、ＡｏＳＭＣのための成長停止培地は、ＳＭ基本培地、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ、０．４％のＦＢＳを含む。２日目まで３７℃でインキュベートする。
【１１７８】
２日目、本発明のアルブミン融合タンパク質の段階希釈液およびテンプレートを、培地対照および既知のタンパク質対照が常に含まれるように、設計する。刺激および阻害の実験の両方のために、タンパク質を成長停止培地で希釈する。阻害実験のために、ＴＮＦａを最終濃度が２ｎｇ／ｍｌ（ＮＨＤＦ）または５ｎｇ／ｍｌ（ＡｏＳＭＣ）となるように加える。対照または本発明のアルブミン融合タンパク質を含有する培地の１／３を加え、５日目まで、３７℃／５％のＣＯ２でインキュベートする。
【１１７９】
各ウェルから６０μ１を、別の標識した９６ウェルプレートに移し、プレートシーラーで覆い、６日目まで４℃で貯蔵する（ＩＬ６  ＥＬＩＳＡ用）。細胞培養プレート中の残りの１００μｌに、培養容量の１０％に等しい容量（１０ｕｌ）のＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを無菌的に加える。プレートを３〜４時間インキュベーターに戻す。次いで、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒを用いて、５３０ｎｍでの励起および５９０ｎｍでの放射を伴う蛍光を測定する。これにより、成長刺激／阻害データを得る。
【１１８０】
５日目、ＩＬ６  ＥＬＩＳＡを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した５０〜１００μｌ／ウェルの抗ヒトＩＬ６モノクローナル抗体で９６ウェルプレートをコーティングすることにより行うために、室温でＯＮをインキュベートする。
【１１８１】
６日目、プレートの中身を流しに空け、ペーパータオル上で吸い取る。４％のＢＳＡと共にＰＢＳを含有するアッセイ緩衝液を調製する。ＰＢＳ中の２００μｌ／ウェルのＰｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液を用いて、プレートを１〜２時間ブロックし、洗浄緩衝液（ＰＢＳ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを洗浄する。プレートをペーパータオル上で吸い取る。次いで、５０μｌ／ウェルの希釈された抗ヒトＩＬ−６モノクローナルビオチン標識抗体、０．５０ｍｇ／ｍｌを加える。培地中でＩＬ−６ストックの希釈液を作製する（３０、１０、３、１、０．３、０ｎｇ／ｍｌ）。プレートの最上列に二重の試料を加える。プレートを覆い、撹拌器上で、２時間室温でインキュベートする。
【１１８２】
プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、ペーパータオル上で吸い取る。ＥＵ標識ストレプトアビジンをアッセイ緩衝液中に１：１０００希釈し、１００μｌ／ウェルを加える。プレートを覆い、室温で１時間インキュベートする。プレートを再び洗浄緩衝液で洗浄し、ペーパータオル上で吸い取る。
【１１８３】
１００μｌ／ウェルの増強溶液を加える。５分間振盪する。Ｗａｌｌａｃ  ＤＥＬＦＩＡ蛍光測定器でプレートを読み取る。各アッセイでの三連の試料からの読み取りを、表にし、平均をとる。
【１１８４】
このアッセイにおける陽性の結果は、ＡｏＳＭＣ細胞増殖を示唆し、アルブミン融合タンパク質が皮膚線維芽細胞増殖および／または平滑筋細胞増殖に関与し得ることを示唆する。陽性の結果はまた、融合タンパク質およびアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの多くの潜在的な用途も示唆する。本明細書にわたり詳述されるように、例えば、炎症および免疫応答、創傷治癒および血管新生である。特に、融合タンパク質は、創傷治癒および皮膚再生、ならびに血管およびリンパ管の両方の脈管形成の改善において用いられ得る。脈管の成長は、例えば、心血管疾患の処置において用いることができる。さらに、このアッセイにおいてアンタゴニスト活性を示す融合タンパク質は、抗血管剤（例えば、抗血管新生）として作用することにより、血管新生を含む疾患、障害および／または状態の処置において有用であり得る。これらの疾患、障害および／または状態は、例えば、悪性腫瘍、固形腫瘍、良性腫瘍（例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫）；動脈硬化斑；眼の血管新生疾患（例えば、糖尿病生網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および翼状片（Ｐｔｅｒｙｇｉａ）（異常な血管増殖））；関節リウマチ；乾癬；遅延型創傷治癒；子宮内膜症；脈管形成；肉芽形成；肥厚性瘢痕（ケロイド）；癒着不能骨折；強皮症；トラコーマ；血管接着；心筋の血管新生；冠状側副枝；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢血管新生；オースラーウェーバー症候群；プラーク新血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性形成異常；創傷肉芽形成；クローン病；ならびにアテローム性動脈硬化症等の当該技術分野に周知であり、そして／または本明細書に記載される。さらに、このアッセイにおいて、アンタゴニストとして作用するアルブミン融合タンパク質は、当該技術分野で周知であり、そして／または本明細書に記載される抗過増殖性疾患および／または抗炎症性疾患の処置において有用であり得る。
【１１８５】
実施例３８：内皮細胞での細胞接着分子（ＣＡＭ）の発現
炎症および血管新生の領域へのリンパ球の動員は、リンパ球の細胞表面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的な受容体−リガンド相互作用が関与する。接着プロセスは、正常および病理学的設定の両方において、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、および内皮細胞（ＥＣ）における内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチン）の発現を含む、多段階カスケードに続く。血管内皮におけるこれらの分子および他の分子の発現は、白血球が、局所脈管構造に接着し得、炎症応答の発生中、局所組織に溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび成長因子の局所濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。
【１１８６】
簡潔には、内皮細胞（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））を標準的な９６ウェルプレート中で集密まで成長させ、成長培地を細胞から除き、１００μｌの１９９培地（１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ））に交換する。試験のための試料（本発明のアルブミン融合タンパク質を含有する）および正または負対照を、このプレートに三連で添加する（１０μｌ容量中）。次いで、プレートを、３７℃にて、５時間（セレクチンおよびインテグリン発現）あるいは２４時間（インテグリン発現のみ）のいずれかでインキュベートする。プレートを吸引して、培地を除去し、１００μｌの０．１％のパラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を有する）を各ウェルに加える。プレートを４℃で３０分間保持する。固定剤をウェルから除去し、ウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ，Ｍｇ）＋０．５％のＢＳＡを用いて１回洗浄し、排水する。１０μｌの希釈した一次抗体を、試験および対照ウェルに加える。抗ＩＣＡＭ−１−ビオチン、抗ＶＣＡＭ−１−ビオチン、および抗Ｅ−セレクチン−ビオチンを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ／ｍｌのストック抗体の１：１０希釈）で用いる。細胞を、加湿した環境において、３７℃にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％のＢＳＡを用いて、３回洗浄する。２０μｌの希釈したエキストラアビジン−アルカリホスファターゼ（１：５，０００希釈、本明細書中、使用希釈と称する）を各ウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％のＢＳＡを用いて、３回洗浄する。５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）につき１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェートｐＮＰＰを溶解させる。グリシン緩衝液中の１００μｌのｐＮＰＰ基質を、各試験ウェルに加える。三連の標準的なウェルを、グリシン緩衝液中のエキストラアビジン−アルカリホスファターゼの実用的希釈物：１：５，０００（１００）＞１０−０．５＞１０−１＞１０−１．５から調製する。５μｌの各希釈物を、三連ウェルに加え、各ウェル中で生じたＡＰ含有量は、５．５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次いで、１００μｌのｐＮＮＰ試薬を、各標準ウェルに加える。プレートを、３７℃にて４時間インキューベートする。５０μｌの３Ｍ  ＮａＯＨの容量を、すべてのウェルに加える。プレートを、グリシン緩衝液のみを充填したブランクウェルでのバックグラウンド除去オプションを用いて、４０５ｎｍのプレートリーダーにより読み取る。さらに、テンプレートを、各々の標準ウェルにおけるＡＰ結合体の濃度を示すように設定する［５．５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇ］。結果を、各試料中の結合したＡＰ結合体の量として示す。
【１１８７】
実施例３９：Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ内皮細胞増殖アッセイ
このアッセイを用いて、ウシリンパ内皮細胞（ＬＥＣ）、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）、またはヒト微小血管子宮筋層細胞（ＵＴＭＥＣ）のｂＦＧＦ誘導増殖のタンパク質介在阻害を定量的に測定し得る。このアッセイには、代謝活性の検出に基づく蛍光定量的成長指標（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）が組み込まれる。標準的なＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ増殖アッセイは、内皮細胞刺激の供給源として添加される１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを有するＥＧＭ−２ＭＶ中で調製される。このアッセイは、成長培地および細胞濃度を若干変化させて、様々な内皮細胞と共に使用され得る。試験されるタンパク質バッチの希釈物を、適宜、希釈する。ｂＦＧＦ不含の無血清培地（ＧＩＢＣＯ  ＳＦＭ）を非刺激対照として用い、およびアンジオスタチンまたはＴＳＰ−１を既知の阻害対照として用いる。
【１１８８】
簡潔には、ＬＥＣ、ＢＡＥＣ、またはＵＴＭＥＣを、９６ウェルプレートに、５０００〜２０００細胞／ウェルの密度で、成長培地に播種し、３７℃で一晩放置する。細胞を一晩インキュベーションした後、成長培地を除去し、ＧＩＢＣＯ  ＥＣ−ＳＦＭと交換する。細胞を、追加のｂＦＧＦを含む３連のウェル中で、本発明のアルブミン融合タンパク質または対照タンパク質試料の適切な希釈物（ＳＦＭ中で調製）で、１０ｎｇ／ｍｌの濃度まで処理する。細胞を試料で処理すると、プレートを、３７℃のインキュベーターに戻し、３日間放置する。３日後、１０ｍｌのストックａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｃａｔ＃ＤＡＬ１１００）を、各ウェルに加え、プレートを、３７℃のインキュベーターに戻し、４時間放置する。次いで、プレートを、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーを用いて、５３０ｎｍでの励起および５９０ｎｍでの放射で読みとる。直接出力を、相対的な蛍光単位で記録する。
【１１８９】
Ａ１ａｍａｒ  ｂｌｕｅは、細胞成長から生じる成長培地の化学還元に応じて蛍光および色変化の両方を生じる、酸化還元指標である。細胞が培養下で成長するにつれ、本来の代謝活性により、隣接する周囲環境の化学還元が生じる。成長に関連して還元が起こると、指標は、酸化（非蛍光青色）形態から還元（蛍光赤色）形態へ変化する（すなわち、増殖の刺激は、より強いシグナルを生じ、増殖の阻害は、より弱いシグナルを生じ、全シグナルは、全細胞数、ならびにそれらの代謝活性に比例する）。活性のバックグラウンドレベルは、飢餓培地のみで観察される。これを、正対照試料（成長培地中のｂＦＧＦ）およびタンパク質希釈物から観察された結果と比較する。
【１１９０】
実施例４０：混合リンパ球反応の阻害の検出
このアッセイを用いて、本発明の融合タンパク質による混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の阻害を検出および評定することができる。ＭＬＲの阻害は、細胞増殖および生存率における直接的効果、相互作用細胞における共刺激分子の調節、リンパ球とアクセサリー細胞との間の接着の調節、またはアクセサリー細胞によるサイトカイン産生の調節に起因し得る。複数の細胞が、このアッセイで用いられる末梢血単核画分は、Ｔ、Ｂおよびナチュラルキラーリンパ球、ならびに単球および樹枝状細胞を含むので、ＭＬＲを阻害するアルブミン融合タンパク質により標的され得る。
【１１９１】
ＭＬＲを阻害することが見出されている本発明のアルブミン融合タンパク質は、リンパ球および単球の活性化または増殖に関連する疾患に応用され得る。これらとしては、例えば、喘息、関節炎、糖尿病、炎症性皮膚状態、乾癬、湿疹、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、動脈硬化症、肝硬変、移植片対宿主疾患、宿主対移植片疾患、肝炎、白血病、およびリンパ腫等の疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【１１９２】
簡潔には、ヒトドナーに由来するＰＢＭＣを、リンパ球分離培地（ＬＳＭ（登録商標）、密度１．０７７０ｇ／ｍｌ、Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）を用いて、密度勾配遠心分離により精製する。２人のドナーに由来のＰＢＭＣを、１０％のＦＣＳおよび２ｍＭのグルタミンを追加したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中、２×１０６細胞／ｍｌとなるように調整する。第３のドナーに由来のＰＢＭＣを、２×１０５細胞／ｍｌに調整する。各ドナーからの５０マイクロリットルのＰＢＭＣを、９６ウェルの丸底マイクロタイタープレートのウェルに加える。融合タンパク質試験材料の希釈物（５０μｌ）を、３連でマイクロタイターウェルに加える。試験試料（関心対象となるタンパク質の）を、１：４の最終希釈になるまで加え；ｒｈｕＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，カタログ番号２０２−ＩＬ）を１μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで加え；抗ＣＤ４ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，クローン３４９３０．１１，カタログ番号ＭＡＢ３７９）を１０ｕｇ／ｍｌの最終濃度になるまで加える。細胞を、５％のＣＯ２中、３７℃で７〜８日間培養し、１μＣの［３Ｈ］チミジンを、培養の最後の１６時間でウェルに加える。細胞を採取し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔを用いて、チミジンの取り込みを測定する。データを、３連の測定の平均および標準偏差として表す。
【１１９３】
関心対象となる融合タンパク質試料を、別の実験にてスクリーニングし、リンパ球の増殖を阻害する負対照処置、抗−ＣＤ４ｍＡｂ、およびリンパ球の増殖を高める正対照処置、ＩＬ−２（組換え物質あるいは上清のいずれかとして）と比較する。
【１１９４】
実施例４１：プロテアーゼ活性のアッセイ
以下のアッセイを用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質のプロテアーゼ活性を評価し得る。
【１１９５】
ゼラチンおよびカゼイン酵素電気泳動法を、記載のように本質的に行なう（Ｈｅｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２：１９６−２０２（１９８０）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，１４９：６５３−６５８（１９９３））。試料を、１％のゼラチンまたはカゼインを含有する１０％のポリアクリルアミド／０．１％のＳＤＳゲルで泳動し、２．５％のトリトン中に室温で１時間浸漬し、０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ８．３）中に３７℃で５〜１６時間浸漬する。アミド中での染色後、タンパク質分解の黒色領域が、濃紺のバックグラウンドに対する明瞭な領域として出現する。トリプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｔ８６４２）を、正対照として使用する。
【１１９６】
プロテアーゼ活性はまた、ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）（Ｓｉｇｍａ  Ｂ−４５００）の開裂をモニタリングすることにより決定される。反応を、（２５ｍＭＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１ｍＭ  ＢＡＥＥ）、ｐＨ７．５に設定される。試料を加え、時間駆動モードのＢｅｃｋｍａｎ  ＤＵ−６分光光度計にて、２６０ｎｍでの吸光度における変化をモニタリングする。トリプシンを、正対照として使用する。
【１１９７】
２８０ｎｍでの吸光度またはＦｏｌｉｎ法を用いた比色定量により測定される、カゼインまたはヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づくさらなるアッセイを、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，５（１９８４）に記載されるように行なう。他のアッセイは、発色性基質の溶解を含む（Ｗａｒｄ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１−３１７（１９８３））。
【１１９８】
実施例４２：セリンプロテアーゼ基質特異性の特定
当該技術分野で周知の、または本明細書に記載される方法を用いて、セリンプロテアーゼ活性を有する本発明のアルブミン融合タンパク質の基質特異性を測定し得る。基質特異性測定の好ましい方法は、ＧＢ  ２  ３２４  ５２９（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されているように、位置的スキャニング合成コンビナトリアルライブラリの使用による方法である。
【１１９９】
実施例４３：リガンド結合アッセイ
以下のアッセイを用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質のリガンド結合活性を評価し得る。
【１２００】
リガンド結合アッセイは、受容体薬理学を確認するための直接的方法を提供し、ハイスループット方式に適応可能である。本発明のアルブミン融合タンパク質に対する精製リガンドを放射性同位体標識して、結合研究のために高い比放射能（５０〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）にする。次いで、放射性同位体標識の過程が融合タンパク質に対するリガンドの活性を低減させないように、決定を行なう。緩衝液、イオン、ｐＨおよび他の調節因子（例えば、ヌクレオチド）に関するアッセイ条件を最適化して、膜および全細胞のポリペプチド源の両方についての有効なシグナル対ノイズ比を構築する。これらのアッセイについて、特異的なポリペプチド結合を、過剰の非標識競合リガンドの存在下で測定した放射活性を全結合放射能から引いた値として規定する。可能な場合は、１つ以上の競合リガンドを用いて残留非特異的結合を規定する。
【１２０１】
実施例４４：アフリカツメガエル卵母細胞における機能アッセイ
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする線状化プラスミドテンプレートからのキャップＲＮＡ転写物を、標準的な手順に従って、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、体外で合成する。体外転写物を、０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で水中に懸濁する。成体雌ヒキガエルから卵巣葉を取り出し、第Ｖ期の濾胞除去した卵母細胞を得、次いで、ＲＮＡ転写物（１０ｎｇ／卵母細胞）を、マイクロインジェクション装置を用いて、５０ｎｌボーラスで注射する。２電極電圧クランプを用いて、融合タンパク質およびポリペプチドアゴニストの曝露に応答する、個々のアフリカツメガエル卵母細胞からの電流を測定する。室温で、Ｃａ２＋含まないバルト培地で記録を行なう。アフリカツメガエル系を用いて、周知のリガンドおよび組織／細胞抽出物を活性化リガンドについてスクリーニングすることもできる。
【１２０２】
実施例４５：マイクロフィジオメトリック（Ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイ
多種多様な二次メッセンジャー系の活性化により、細胞から少量の酸の放出をもたらす。形成された酸は、主に、細胞内シグナル伝達過程を刺激するのに必要な代謝活性の増大の結果である。細胞周囲の培地のｐＨ変化は非常に小さいが、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲ微量生理機能測定器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅｓＬｔｄ．，ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．）により検出可能である。したがって、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲは、エネルギーを利用する細胞内シグナル伝達系と共役する二次メッセンジャーを活性化させる本発明のアルブミン融合タンパク質の能力を検出可能である。
【１２０３】
実施例４６：抽出物／細胞上清スクリーニング
今のところ同系の活性化リガンド（アゴニスト）が存在しない多数の哺乳類受容体が存在する。したがって、これらの受容体に対する活性リガンドは、今日まで特定されたとしてリガンドバンク内に含まれていない可能性がある。したがって、本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／またはアルブミンタンパク質部分についての天然のリガンドを特定するために、組織抽出物に対して、（カルシウム、ｃＡＭＰ、微量生理機能測定器、卵母細胞電気生理学等機能的スクリーニングを用いて）機能的にスクリーニングされ得る。陽性の機能的応答を生じる抽出物は、活性化リガンドが単離および特定されるまで、連続して細分画され得る。
【１２０４】
実施例４７：ＡＴＰ結合アッセイ
以下のアッセイを用いて、本発明の融合タンパク質のＡＴＰ結合活性を評価することができる。
【１２０５】
本発明のアルブミン融合タンパク質のＡＴＰ結合活性は、米国特許第５，８５８，７１９号に記載のＡＴＰ結合アッセイを用いて検出され得、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。簡潔には、本発明のアルブミン融合タンパク質に対するＡＴＰ結合を、競合アッセイで、８−アジド−ＡＴＰにおける光親和性標識を介して測定する。１ｍｇ／ｍｌのＡＢＣ輸送タンパク質を含有する反応混合物を、様々な濃度のＡＴＰまたは非加水分解性のＡＴＰアナログであるアデニル−５’−イミド二リン酸と、４℃で１０分間インキュベートする。８−アジド−ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）および８−アジド−ＡＴＰ（３２Ｐ−ＡＴＰ）（５ｍＣｉ／μｍｏｌ，ＩＣＮ，Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ．）の混合物を、１００μＭの最終濃度になるまで加え、０．５ｍｌアリコートを氷上の磁器スポットプレートのウェルに入れる。プレートを、短波２５４ｎｍのＵＶランプを用いて、プレートから２．５ｃｍの距離で、１分間の冷却時間をはさんで１分間の照射を２回行なう。反応を、２ｍＭの最終濃度までジチオスレイトールを添加することにより停止する。インキュベーションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供し、乾燥し、オートラジオグラフィーを行なう。本発明のアルブミン融合タンパク質に対応するタンパク質バンドを切り取り、放射能を定量する。ＡＴＰまたはアデニル−５’−イミド二リン酸を増大することによる放射能の低下は、融合タンパク質に対するＡＴＰ親和性の尺度を提供する。
【１２０６】
実施例４８：本発明のアルブミン融合タンパク質と相互作用するシグナル伝達タンパク質の特定
本発明のアルブミン融合タンパク質を、シグナル伝達経路タンパク質または受容体タンパク質の特定、特徴付け、および精製のための研究ツールとして用いることができる。簡潔には、本発明の標識された融合タンパク質は、それと相互作用する分子を精製するための試薬として有用である。アフィニティー精製の一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をクロマトグラフィーカラムに共有結合させる。癌腫組織等の推定上の標的細胞に由来する無細胞抽出物をカラムに通し、適切な親和性を有する分子を、アルブミン融合タンパク質に結合させる。タンパク質複合体をカラムから回収し、分離し、回収した分子をＮ末端タンパク質配列決定に供する。次いで、このアミノ酸配列を用いて、捕捉分子を特定するか、または適切なｃＤＮＡライブラリから関連遺伝子をクローニングするための縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計する。
【１２０７】
実施例４９：ＩＬ−６バイオアッセイ
様々なアッセイが、本発明のアルブミン融合タンパク質の増殖性効果を試験するために、当該技術分野で周知である。例えば、このようなアッセイは、Ｍａｒｚら．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５：３２５１−５６（１９９８）、参照することにより本明細書に組み込まれる）により記載のようなＩＬ−６バイオアッセイである。３７℃で６８時間後、生存細胞の数を、テトラゾリウム塩チアゾリルブルー（ＭＴＴ）を加え、３７℃でさらに４時間インキュベートすることにより、測定する。Ｂ９細胞を、ＳＤＳにより溶解させ、光学密度を５７０ｎｍで測定する。簡潔には、対照は、ＩＬ−６（正対照）を含有するものおよびサイトカインを含まないもの（負対照）である。ＩＬ−６依存性Ｂ９ネズミ細胞をＩＬ−６を含まない培地で３回洗浄し、５０μｌ中５，０００細胞／ウェルの濃度でプレーティングし、５０μｌの本発明の融合タンパク質を加え、利用する。負対照と比較して増強された試験試料（本発明のアルブミン融合タンパク質を含有する）における増殖は、融合タンパク質により媒介された増殖性効果の指標である。
【１２０８】
実施例５０：ニワトリ胚ニューロン生存の支持
交感神経細胞の生存率が、本発明のアルブミン融合タンパク質によって支持されるかどうかを試験するために、Ｓｅｎａｌｄｉらのニワトリ胚ニューロン生存アッセイが利用され得る（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：１１４５８−６３（１９９８）、参照することにより本明細書に組み込まれる）。簡潔には、運動および交感ニューロンをニワトリ胚から単離し、それぞれＬ１５培地（１０％のＦＣＳ、グルコース、亜セレン酸ナトリウム、プロゲステロン、コナルブミン、プトレシン、およびインスリンを含む；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．）およびダルベッコ改変イーグル培地［１０％のＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン、および２５ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２）を含む；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．］中に再懸濁し、本発明の異なる濃度の精製融合タンパク質の存在下で、５％のＣＯ２中にて３７℃でインキュベートし、サイトカインを含まない負対照も同様とする。３日後、ニューロン生存を、細胞形態学の評価により、およびＭｏｓｍａｎｎの比色分析アッセイ（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３（１９８３））を使用して決定する。サイトカインを含まない対照と比較して増強された神経細胞の生存率は、アルブミン融合タンパク質が神経細胞の生存を高める能力の指標である。
【１２０９】
実施例５１：ホスファターゼ活性のアッセイ
以下のアッセイを用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質のセリン／トレオニンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）活性を評価し得る。
【１２１０】
セリン／トレオニンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）活性をアッセイするために、当業者に広く知られているアッセイを利用することができる。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質のセリン／トレオニンホスファターゼ（ＰＳＰａｓｅ）活性を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．からのＰＳＰａｓｅアッセイキットを用いて、測定してもよい。ＰＳＰａｓｅのための基質であるミエリン塩基性タンパク質（ＭｙＢＰ）を、［３２Ｐ］ＡＴＰの存在下、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼを用いて、セリンおよびトレオニン残基上でリン酸化する。次いで、タンパク質セリン／トレオニンホスファターゼ活性を、３２Ｐ−標識ＭｙＢＰからの無機リン酸の放出を測定することにより、測定する。
【１２１１】
実施例５２：他のタンパク質とセリン／トレオニンホスファターゼの相互作用
セリン／トレオニンホスファターゼ活性（例えば、実施例５１にて測定されるような）を有する本発明の融合タンパク質は、例えば、さらなる相互作用タンパク質もしくは受容体タンパク質、または他のシグナル伝達経路タンパク質の特定、特徴付けおよび精製のための研究ツールとして有用である。簡潔には、本発明の標識された融合タンパク質は、それと相互作用する分子を精製するための試薬として有用である。アフィニティー精製の一実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をクロマトグラフィーカラムに共有結合させる。神経または肝臓細胞等の推定上の標的細胞に由来する無細胞抽出物をカラムに通し、適切な親和性を有する分子を、融合タンパク質に結合させる。融合タンパク質複合体をカラムから回収し、分離し、回収した分子をＮ末端タンパク質配列決定に供する。次いで、このアミノ酸配列を用いて、捕捉分子を特定するか、または適切なｃＤＮＡライブラリから関連遺伝子をクローニングするための縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計する。
【１２１２】
実施例５３：ヘパラナーゼ活性のアッセイ
本発明のアルブミン融合タンパク質のヘパラナーゼ活性をアッセイするために採用され得る当該技術分野で周知の多数のアッセイがある。一例として、本発明のアルブミン融合タンパク質のヘパラナーゼ活性を、Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，５：７９３−８０２（１９９９））により記載されているように、アッセイする。簡潔には、細胞溶解物、馴化培地、無傷細胞（３５ｍｍディッシュあたり１×１０６細胞）、細胞培養上清、または精製融合タンパク質を、３５Ｓ標識ＥＣＭまたは可溶性ＥＣＭ誘導ピークＩプロテオグリカンと共に、３７℃で１８時間、ｐＨ６．２〜６．６でインキュベートする。インキュベーション培地を遠心分離し、上清をセファロースＣＬ−６Ｂカラム（０．９×３０ｃｍ）でゲル濾過することにより、分析する。画分を、ＰＢＳで溶出し、その放射能を測定する。ヘパラン硫酸側鎖の分解フラグメントを、０．５＜Ｋ，Ｖ＜０．８（ピ−クＩＩ）でセファロース６Ｂから溶出する。各実験を、少なくとも３回行なう。Ｖｌｏｄａｖｓｋｙらにより記載されるように、「ピークＩＩ」に対応する分解フラグメントは、ヘパラン硫酸の開裂における本発明のアルブミン融合タンパク質の活性の指標である。
【１２１３】
実施例５４：生体分子の固定化
本実施例は、非宿主細胞脂質二重層構築物中の本発明のアルブミン融合タンパク質の安定化のための方法（例えば、Ｂｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：１１０５−１１０８（１９９９）を参照のこと、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）を提供し、この方法は、上記の様々な機能的アッセイにおける本発明の融合タンパク質の研究のために適合され得る。簡潔には、ビオチン化についての糖質特異的化学を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質にビオチンタグを拘束し、ひいては、固定化の際の均一な配向を可能にする。洗浄された膜中の本発明のアルブミン融合タンパク質の５０μＭ溶液を、２０ｍＭ  ＮａＩＯ４、１．５ｍｇ／ｍｌ（４ｍＭ）ＢＡＣＨまたは２ｍｇ／ｍｌ（７．５ｍＭ）ビオチン−ヒドラジド（反応容量、１５０μｌ）と共に、室温で１時間インキュベートする。次いで、試料を、まず４℃で５時間、１時間後毎に緩衝液を交換して透析（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｌｉｄｅａｌｉｚｅｒ  Ｃａｓｓｅｔｔ，１０ｋＤａカットオフ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）を行ない、最終的に５００ｍｌ緩衝液Ｒ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７）で１２時間、透析する。キュベットに加える直前に、この試料を緩衝液ＲＯＧ５０（５０ｍＭオクチルグルコシドを追加した緩衝液Ｒ）で１：５に希釈する。
【１２１４】
実施例５５：メタロプロテイナーゼ活性のアッセイ
メタロプロテイナーゼは、金属イオン（例えば、Ｚｎ２＋）を触媒機序として用いるペプチド加水分解酵素である。本発明のアルブミン融合タンパク質のメタロプロテイナーゼ活性を、当該技術分野で公知の方法に従ってアッセイし得る。以下の例示的方法が提供される。
【１２１５】
アルファ−２−マクログロブリンのタンパク質分解
プロテアーゼ活性を確認するために、本発明の精製融合タンパク質を、１×アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．２ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａｌ２、２５ｕＭのＺｎＣ１２および０．０５％のＢｒｉｊ−３５）中、基質アルファ−２−マクログロブリン（０．２単位／ｍｌ；Ｂｏｅｈｒｌｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合し、３７℃で１〜５日間インキュベートする。トリプシンを、正対照として用いる。負対照は、アッセイ緩衝液中、アルファ−２−マクログロブリンのみを含有する。試料を採取し、５％の２−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で５分間煮沸し、次いで、８％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに充填する。電気泳動した後、タンパク質を銀染色により視覚化する。タンパク質分解は、負対照と比べてより低い分子量のバンドが出現することにより、実証される。
【１２１６】
メタロプロテイナーゼ阻害剤によるアルファ−２−マクログロブリンタンパク質分解の阻害
また、周知のメタロプロテイナーゼ阻害剤（金属キレート剤（ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＨｇＣｌ２）、ペプチドメタロプロテイナーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２）、および市販の小分子ＭＭＰ阻害剤）を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質のタンパク質分解活性を特徴付けることができる。使用し得る３つの合成ＭＭＰ阻害剤は：ＭＭＰ阻害剤Ｉ［ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−８に対して、ＩＣ５０＝１．０μＭ；ＭＭＰ−９に対して、ＩＣ５０＝３０μＭ；ＭＭＰ−３に対して、ＩＣ５０＝１５０μＭ］；ＭＭＰ−３（ストロメリシン−１）阻害剤Ｉ［ＭＭＰ−３に対して、ＩＣ５０＝５μＭ］、およびＭＭＰ−３阻害剤ＩＩ［ＭＭＰ−３に対して、Ｋｉ＝１３０ｎＭ］；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍを通じて入手可能な阻害剤（各々、カタログ番号４４４２５０、４４４２１８、および４４４２２５）である。簡潔には、異なる濃度の小分子ＭＭＰ阻害剤を、２２．９μｌの１×ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，０．２ＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのＣａＣ１２，２５μＭのＺｎＣ１２、および０．０５％のＢｒｉｊ−３５）中、本発明の精製融合タンパク質（５０μｇ／ｍｌ）と混合し、室温（２４℃）で２時間インキュベートし、７．１μｌの基質アルファ−２−マクログロブリン（０．２単位／ｍｌ）を加え、３７℃で２０時間インキュベートする。４×試料緩衝液を加え、その直後に５分間煮沸することにより、反応を停止させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質バンドを銀染色により視覚化する。
【１２１７】
合成蛍光性ペプチド基質の切断アッセイ
メタロプロテイナーゼ活性が実証されている本発明の融合タンパク質の基質特異性は、当該技術分野で周知の技法、例えば、合成蛍光性ペプチド基質（ＢＡＣＨＥＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃから購入）を用いて測定され得る。試験基質は、Ｍ−１９８５、Ｍ−２２２５、Ｍ−２１０５、Ｍ−２１１０、およびＭ−２２５５を含む。初めの４つは、ＭＭＰ基質であり、最後の１つは、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）転換酵素（ＴＡＣＥ）の基質である。これらの基質を、好ましくは、１：１ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）および水中において調製する。ストック溶液は、５０〜５００μＭである。恒温水浴を備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ  ５０Ｂルミネセンス分光計を用いて、蛍光アッセイを行なう。励起λは、３２８ｎｍであり、および放出λは、３９３ｎｍである。簡潔には、アッセイは、１７６μｌの１×ＨＥＰＥＳ緩衝液（０．２ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣ１２、０．０５％のＢｒｉｊ−３５、および５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）を４μｌの基質溶液（５０μＭ）と共に、２５℃で１５分間インキュベーションし、次いで、２０μ１の本発明の精製融合タンパク質をアッセイキュベットに加えることにより、行なわれる。基質の最終濃度は、１μＭである。初期の加水分解速度を３０分間モニタリングする。
【１２１８】
実施例５６：ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発症
雌ＮＯＤ（非肥満糖尿病）マウスは、ヒトにおいて見出されるものと同様の経過を有するＩＤＤＭを示すことにより、特徴付けられるが、該疾患は、雄ＮＯＤマウスよりも雌においてより明白である。以後、別記しない限り、「ＮＯＤマウス」という用語は、雌ＮＯＤマウスを指す。ＮＯＤマウスは、慢性自己免疫疾患により惹起されるベータ細胞の進行性破壊を有する。したがって、ＮＯＤマウスは、正常血糖または正常な血液グルコースレベルを伴って育つ。しかしながら、約１５〜１６週齢までに、ＮＯＤマウスは、高血糖になり始め、それらの膵臓ベータ細胞の大部分の破壊を示し、それに対応して膵臓が十分なインスリンを産生することができなくなる。したがって、疾患の原因および進行はいずれもヒトＩＤＤＭ患者と同様である。
【１２１９】
免疫化レジメンの効力の生体内アッセイは、雌ＮＯＤ／ＬｔＪマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍｅ．から市販されている）において評価することができる。文献では、雌マウスの８０％が２４週齢までに糖尿病を発症し、６〜８週齢の間に膵島炎を発症し始めることが報告されている。ＮＯＤマウスは、近交系であり、様々な免疫制御ストラテジーに対して高度に応答する。成体ＮＯＤマウス（６〜８週齢）は、２０〜２５ｇの平均体重を有する。
【１２２０】
これらのマウスは、未処置（対照）とするか、本発明の治療剤（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質、ならびにそのフラグメントおよび変異体）を単独または上記の他の治療用化合物と組み合わせて、処置され得る。糖尿病の進行におけるこれらの様々な処置の効果は、以下のように測定できる。
【１２２１】
１４週齢にて、雌ＮＯＤマウスは、グルコース耐性に従って表現型化することができる。グルコース耐性は、腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）により測定することができる。簡潔には、血液を、０分およびグルコース（１ｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注入から６０分後、眼窩周囲神経叢から取り出す。正常な耐性を、０分で１４４ｍｇ％未満の、または６０分で１６０ｍｇ％未満の血漿グルコースとして定義される。血中グルコースレベルは、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ装置を用いて決定される。
【１２２２】
この表現型分析に基づき、動物を異なる実験グループに配分し得る。特に、より血中グルコースレベルを上昇させた動物を、耐糖能異常の群に割り当て得る。マウスに、適宜給餌し得、酸性化水（ｐＨ２．３）を供給し得る。
【１２２３】
グルコース耐性および不耐性マウスを、対照、本発明のアルブミン融合タンパク質、およびアルブミン融合タンパク質／治療用化合物組み合わせ群へとさらに細かく分けることができる。対照群のマウスは、１週間につき６回、毎日、ビヒクルを腹膜内注入され得る。アルブミン融合群のマウスは、１週間につき６回、毎日、ビヒクル中の本発明の治療剤（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質ならびにそのフラグメントおよび変異体）を腹膜内注入され得る。アルブミン融合タンパク質／治療用化合物組み合わせ群のマウスは、アルブミン融合タンパク質および上記のような治療用化合物の組み合わせを投与され得る。
【１２２４】
ＮＯＤマウスにおける尿グルコースのレベルは、Ｌａｂｓｔｉｘ（Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて、隔週ごとに測定することができる。体重および液体取り込みもまた、隔週ごとに測定することができる。２つの連続した測定において糖尿が現れたら、糖尿病の発症と定める。処置から１０週間後、さらなるＩＰＧＴＴを行なうことができ、動物は、次の日に屠殺される。
【１２２５】
１０週間にわたる処置の間、グルコース耐性およびグルコース不耐性の両方の群における対照動物は、それぞれ６０％および８６％の割合で糖尿病を発症する（米国特許第５，８６６，５４６号，Ｇｒｏｓｓら．を参照のこと）。したがって、処置介入がなされない場合に、初めにグルコース耐性であるＮＯＤマウスにおいて、糖尿病が、高い割合で発症する。
【１２２６】
処置の前および後に、ＮＯＤマウスにおける血液グルコースレベルを測定することにより、その結果を確証することができる。血液グルコースレベルを、記載した全群のグルコース耐性および不耐性マウスの両方において、上記のように測定する。
【１２２７】
代替的な実施形態において、本発明の治療剤（例えば、配列番号Ｙに開示される特定の融合タンパク質ならびにそれらのフラグメントおよび変異体）を分光学的分析を用いて定量し得、適切なタンパク質量を、注射前に、１用量あたり５０．ｍｕ．ｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し得る。各マウス背部の皮膚下に、１週間の間隔をあけて２回の注射を皮下投与し得る。モニタリングは、免疫化前の２つの異なる時間に行うことができ、処置全体を通して１週間に１回行い、それ以降も継続し得る。毎週、尿のグルコースについて試験することができ（Ｋｅｔｏ−Ｄｉａｓｔｉｘ．ＲＴＭ．；Ｍｉｌｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｋａｎｋａｋｅｅ，Ｉ１１．）、および血清グルコースについて糖尿マウスを調べることができる（ＥｘａｃＴｅｃｈ．ＲＴＭ．，ＭｅｄｉＳｅｎｓｅ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）。空腹時の血糖値が２．５ｇ／Ｌよりも高い場合、糖尿病と診断される。
【１２２８】
実施例５７：ＮＯＤマウスの組織学的試験
ＮＯＤマウスからの組織試料の組織学的試験は、本発明の組成物および／または本発明の組成物および糖尿病のための他の治療剤との組み合わせが、膵臓中のベータ細胞の相対濃度を増大させる能力を、実証し得る。実験的方法は、以下の通りである。
【１２２９】
実施例５６からのマウスを、処置期間の終わりに屠殺でき、組織試料を、膵臓から採取することができる。試料を、０．９％の生理的食塩水中の１０％のホルマリン中に固定し、ワックス中に包埋できる。５つの連続した５μｍ断片の２セットを、免疫標識のために１５０μｍの切断間隔で切断することができる。その断片を、インスリン（モルモット抗インスリン抗血清希釈１：１０００，ＩＣＮ  Ｔｈａｍｅｓ  Ｕ．Ｋ．）およびグルカゴン（ウサギ抗膵臓グルカゴン抗血清希釈１：２０００）について免疫標識することができ、ペルオキシダーゼ接合抗モルモット（Ｄａｋｏ，Ｈｉｇｈ  Ｗｙｃｏｍｂｅ，Ｕ．Ｋ．）またはペルオキシダーゼ接合抗ウサギ抗血清（希釈１：５０，Ｄａｋｏ）を用いて検出することができる。
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本発明臣蒵裦ꦉ臣膀苣ꮃ苣벃苣邀胦誁苣뎁苣ꮃ苣벃苣趸胨Ꞁ臣開觧ꮁ臣蒁臣膀돧뾰韧꺁蟨誺뻥馀臣뺯臣讂諥鲞臣貐꣧ꚺ臣릊黦銂菣벃苣내菨꺁迥隦蟩ꮁ꿥鞁臣覜臣ꚁ臣ꚁ苣뺁臣꾁鳦鞁臣辁臣节苣蒁胣ં䐼噉邀볯銼볯醼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤閼볯骼볯ꦼ볯꒼볯꺁铧鎽蛥麃苣릂菣螃菣㲫牢ਾ†볯膽뷯讽뷯辽뷯₎겼뷯芽뷯銽뷯钽뷯銽뷯袼볯膽뷯ₒꢼ뷯銽뷯辽뷯貼볯ꖼ볯讁苣꺁鯩ꎼ볯鞼볯겼볯隼볯麃苣릂臣膀볯놀뷩讁苣ꖅ触ꞁ臣膀藦ꢔ髧ꪁꏩ벣胣뺁臣꾁蓨ꪂ볯鎼볯躼볯趇蟩薼볯ꊼ뷯辽뷯薽뷯隽볯ꚼ뷯薽뷯莽뷯钽뷯鞽뷯貼볯ꪼ볯芁苣蒁臣閃菣꾂菣벃苣袼볯邼蟩辇볯鮼볯膽뷯貽뷯躽†볯薽뷯貽뷯蒽볯궼뷯蒽뷯鎽뷯躽볯랼뷯覼臣蒁臣貂臣貁뇨貯臣龣ꏩ銂룤袁苣芀꣦隺ꏩ벣臣膀볯躼볯趇蟩薼臣芄苨膀볯鎼蟩辇볯꺁苣뎃菣꾂돨膀볯醼볯馼蟩辇볯꺁菣뎃菣뎃胣鎼볯鞼蟩辇볯꺁菣ꮃ苣袃菣릂胣誁苣뎁볯躼볯趇蟩薼臣誹뛧讁苣ꪁ苣芀ꯩ芄苨袼菣벃菣覼ꏩ꾁胣鎼볯躼볯趇蟩薼臣芄苨膀볯邼蟩辇볯꺁苣뎃菣꾂돨膀볯隼볯钼蟩辇볯꺁菣뎃菣뎃胣邼볯邼蟩辇볯꺁菣ꮃ苣袃菣릂胣誁苣뎁볯躼볯趇蟩薼臣誹뛧讁苣ꪁ苣芀ꯩ閃菣꾂菣벃苣龣臣膀볯趇蟩薼臣芄苨膀볯邼蟩辇볯꺁苣뎃菣꾂돨膀볯躼볯趇蟩薼臣螃菣鞃菣膀볯邼蟩辇볯꺁菣ꮃ苣袃菣릂胣誁苣뎁볯躼볯趇蟩薼臣誹뛧讁苣ꪁ苣芀볯銼駦鎖臣躘볯袍觥隼駦讁苣袍뻥隼駦뺁臣覼볯鞚苣ꒂ苣ꮃ苣뒼臣銼볯슒讼볯銈볯莄臣ꦸ뫥誁苣뎁볯邼볯讼볯銈볯邼볯꺁맦ꚺ臣뚈뻥閁苣龁菩讱臣꺽臣貂臣놂菣뢂臣ꚁ胣麃苣릂臣醼苣벃苣芁臣誂苣骁臣閼賥骁臣벣苨馁苣鎁臣貁臣趁苣袼볯閽뷯₏薽뷯ₔ膽뷯躼볯醼볯馼볯貼볯薽뷯膽뷯辽뷯覽뷯趽†볯鞼볯隼볯骼볯隼볯銈볯貼胢꺼뷯躽뷯薽뷯薽뷯覽뷯₃趽뷯閽뷯薽†뷯辽뷯薽뷯鎽†뷯蚽†뷯辽뷯銈뷯躽뷯閽뷯覽뷯銈뷯薽뷯薽뷯蒽뷯躽뷯ₔ蒽뷯膽뷯薽뷯薽뷯ₓ趽뷯貽뷯覽뷯閽뷯鶀볯겼뷯銽뷯薽뷯₎薽뷯ₔ膽뷯躼볯꒼뷯膽뷯薽뷯薽뷯ₓ閼볯袼볯醼볯骼볯閼볯邼裢馼볯銼볯邼볯覼볯鲀볯馽뷯钽뷯趽뷯莽†뷯蒽뷯覽뷯覽뷯钽뷯膽뷯覽뷯躽†뷯蚽†뷯袽뷯₅貽뷯躽뷯銈뷯莽뷯覽뷯螽†볯겼볯銈볯ₑ蒽뷯銽뷯隽뷯钽뷯隽뷯₅꺼볯銼볯醼볯ₑ覽뷯蒽뷯莽뷯鎽†뷯膽뷯钽뷯躽뷯₇膽뷯蒽†뷯薽뷯薽뷯鎽뷯芽뷯薽†뷯薽뷯螽뷯钽†뷯辽뷯鎽†뷯躽†뷯辽뷯袽†뷯辽뷯趽뷯貽†뷯躽뷯₄辽뷯薽뷯薽†뷯膽뷯鶀볯芀볯놀雩麃苣릂苣鶁苣麁苣ꮁ釦龣臣鮁臣貾胣醼볯邼뷯螽볯讽뷯鎽蟩꺁苣袃菣鞃菣뺂菣랂菣膀胣뎼볯몼胣袼볯覽뷯趽뷯貼볯钽볯겼뷯閽뷯鎽볯궼볯覼臣龁臣鎃菣꾂菣袼볯躼볯閼뷯辽뷯込볯꾂苣뎃藩貼뷯ꢼ볯躼볯覼臣蒁臣貂臣銂铧蒁臣膀菣Ꚃ苣ꮁ藨钅蛥ꢳ藥ꞁ臣膀곦蒁臣膀곦꺁볯놀雩꾁郥颁ꏩ벣苣躸臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣麝ꧧ릅鷦뚻룤ꮁ臣膀ꇨ늶苣膀볯뒼볯꺁볯膀볯誁苣뎁볯놀雩貾臣膀냥ꢃ臣ꂁ뷤ꢃ苣龌苣鎁臣ꮁ苣誂軦随臣讂胣ꚩ雦銂铧蒁臣膀鷩목藨芙ꇨ뾼苣ꮃ苣벃苣誁苣뎁苣뎃苣ꪃ菣莿뫥銂룦骮臣讂胣鎽蟩誁苣뎁ꏩ벣迥誂뻨뾁苣醼胩鎖臣醼鯥風賩馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 낂菣뎂菣릂믥蒣苣몈뿦馁苣ꒂ菣릂菣뎃臣붃諥ꮁ꿥馁苣颫蓨ꪂꏩ벣臣릊黦銂鯧ꖎ뇦骮臣讂臣膂臣膀껥鎨苣膀蓨ꪂꏩ벣苣躸臣覂苣龁胣龣ꏩ銂룤袁苣貂胣鎃菣꾂菣銂돦ꖅ臣貂臣膀臣袂臣芄苨龣ꏩ銂룤袁苣貂胣誸꣨꺁볯놀雩꺁뗧辂苣ꮁ볯뒼볯銂돦ꖅ臣貂臣鎼뻧꺁菣Ꚃ苣ꮁ臣讖꟥ꞁ臣讂胣麃苣릂臣膀껥鎨觥꺁볯芙雩膀ꧧ릅臣馁苣芀鳦鶈臣肸胩꺁껥鎨臣誁臣ꚁ胣麃苣릂苣膀菣袃苣랂菣ꮃ菣뎃볯낼뷯钽뷯膽뷯銈볯辽뷯銽볯궼뷯躽뷯薽뷯薽뷯躽볯ꦼ볯覼郥ꖅ苣ꢔ臣ꚁ胣뮺藩馁苣鎁臣貁臣趁苣芀菣꺂菣ꦃ菣ꒂ菣릂菣뎃볯뎼뷯螽뷯膽볯꾁胣뺰鷩袄臣覂鷩袄蛥ꢳ藥ꞁ臣袼볯ꦼ볯붼볯躼볯떼볯讽뷯鎽蟩覼胣股뛦꾁胣ꢳ藥讁苣鎼胣隼胣馼胣醼볯誁苣뎁볯閼裥貾臣낕臣讂냥馝蓨讁苣ꆎ迥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀ꇨ뾼苣ꮃ苣벃苣莿뫥꾁胣鎁苣覂臣ꚩ雦ꮁ臣겸껥ꞁ臣膀ꇨ뾼臣覂臣낂菣뎂菣릂뛦놤臣認룦龜볯钽猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰醼볯銼⼼畳㹢볯꾁胣랼뷯躽볯辽뷯貽뷯躽볯뎼뷯覽뷯躽뷯覽뷯覽뷯₃ꎼ뷯躽뷯閽뷯钽뷯躽뷯貼볯邽뷯颽볯꺼볯覼臣겖觧開藦込雨開諥ꚭ苣閃菣Ꚃ苣ꊂ菣궃苣ꦃ菣銂铧蒁臣膀껧몇臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં䐼噉邀볯銼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†곧銼臣肸胩꺁껥鎨臣誁臣ꚁ胣릅藨薆菣袃菣Ꚃ菣骃菣袃菣ꮃ菣뾂菣ꮃ볯뎼뷯螽뷯膽볯銂铧蒁臣麃苣릂苣뮺藩馁苣鎁臣貁臣趁苣芀藨钅苣讖臣膀룤膦臣릅藨薆鷩袄苣鶛鳩閁臣膀볯钼苣벃苣꺁볯뚼苣蚃菣蚃菣袼볯辽뷯躽뷯辽뷯銈볯辽뷯躽뷯辽뷯궼뷯蒽뷯莽뷯貽볯ꆼ뷯貽뷯躽뷯钽뷯躽볯뒼볯覼苣ꢔ臣ꚁ苣蚃菣蚃菣ꚇ뷧馁苣芀苣蚃菣蚃菣銂胣릅藨薆鷩袄臣ꎚ軦馁苣训苨蒵맧ꮁ鯥骮臣膀苣ꪃ菣뢂胩邵菩꺁룤뒁苣螈雦鞁胣袺苣薅ꇥ鞁臣낼볯閼볯鞃菣릂菣莃苣膃菣벃菣ꮁ軦骶臣膀ꃩꆬ胣ꢳ藥뚺뛦ꢁ苣ꪃ菣뢂臣銂軦骶臣鮁苣芀곦蒁臣膀藨钅苣ꮸ郥鞁臣視軩馁苣芀臣꺁苣鞃菣벃菣ꮁ苣誂胣鎽臣躽臣ꢃ裥讁苣꺁ꇨ늶臣蚀뗦ꮁ苣讂菣궃菣꾂臣ꪁ臣ꪁ苣ꞁ臣趂臣芀苣ꮃ苣벃苣袼볯钼볯醼뷯螽볯讽뷯込裥覼臣袂臣ꒂ菣릂菣뎃볯醼볯趽볯込뷯螽볯蚈볯銂볯邼볎볯込裥꺁돦ꖅ蟩ꮁ臣膀菣Ꚃ苣ꮁ胩骶髧ꮁ돦ꖅ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣벜ꫧ貾菩꺁ꇨ늶ꧨ首볯蒐볯邼볎볯覼苣膀ꇨ뾼苣ꮃ苣벃苣誁苣뎁苣뎃苣ꪃ菣莿뫥銂룦骮臣讂臣膂臣膀돦ꖅ雩讧臣覂볯邼胣醼볯閼胣醼볯邼臣袂臣醼볯閼裥貾臣膀軦随臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣鎁苣覂볯ꒁ臣ꚩ雦꺁맥螝苣ꢔ臣ꚁ胣蒐该ꦉ臣ꒁ臣ꚁ臣骮룥뚊藦꺁ꇨ뾼苣ꮃ苣벃苣袼볯뎼볯Ꞽ볯誁苣뎁苣뎃苣ꪃ菣袼볯뎼볯ꦼ볯莿뫥銂ꧨꆾ臣讂胣ં䐼噉邀볯銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†鳦貾臣膀跥겋臣讂臣꾁鳧Ꞁ돧뾰韧꺁蟥꺽臣龁苣ꮁ꣨覼臣龁믤辄臣醼臣ꖻ룤꺁닦芙铧겖觥ꢁ뗧뾁郥辂臣龁苣ꮃ菣龃菣趞郥뾂菣醃苣ꪳ胣겜蟥颡臣뮲駧ꢔ뗧邈觧꺁胣股볦낂菣뎂菣릂苣鮸냥閁臣讂菨鮊苣閩껥馁苣龁苣꺁껥鎨臣膀믤许臣銼뻧꺁볯뒼볯銈돦ꖅ胣꺼볯꒼볯궼胣麃苣릂菣螃菣骼볯醼볯芄苨龣ꏩ銂룤袁苣貂臣ꎼ볯鞼볯떼볯ꪼ胣誁苣뎁볯銼볯閃菣꾂菣벃苣龣ꏩ銂룤袁苣貂臣ꎼ볯鞼볯겼볯隼볯ꮁ臣蒁臣財臣蚁臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣鎁苣覂臣钠ꧧꮁ臣蒁臣膀菣Ꚃ苣꺁ꇨ뾼苣ꮃ苣벃苣莿뫥꾁胣銼볯閼胣閼볯閼뷯螽볯蒽볯꺁꿧늛臣辂臣誂뻥讂胣麃苣릂臣膀菣뎃菣ꂃ臣늉苣鎽臣ꚁ胣鎃菣꾂菣膀跥겋臣讂臣꾁鳧Ꞁ돧뾰韧꺁蟥꺽臣龁苣ꮁ꣨覼臣龁믤辄臣醼臣ꖻ룤꺁닦芙铧겖觥ꢁ뗧뾁郥辂臣龁鳦몙飦꺁苣ꮃ菣龃菣趞郥뮲駧ꒉ臣蒁臣貂臣銂铧蒁臣ꚇ뷧馁苣芀藥ꢃ臣鎼铧辇苣閊룤馁苣鎁臣貁臣趁苣芀냥馝蓨꺁ꇨ늶ꧨ首苣膀ꇨ뾼苣ꮃ苣벃苣莿뫥銂룦骮臣讂臣膂臣膀裥膂臣閊룤趉臣袂臣肜뻥꺁諦躸臣覂볯芙雩貾臣膀軦随臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣ં䐼噉邀볯銼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨ뾼苣ꮃ苣벃苣莿뫥銂胣뎼뷯螽뷯膽臣覂臣낂菣뎂菣릂꣨궖苣莃菣袼볯覽뷯趽뷯₁꺼뷯躼볯醼볯覼胣떅듧钯觨ꊂ菣뮂苣銂铧蒁臣膀룦骮臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣股볦ꒂ菣릂菣뎃菣馃菣꾁胣겼뷯躽뷯辽†볯薽뷯薽뷯銽뷯袽臣覂臣ꦃ菣袃苣뎃苣ꪃ菣늼볯ꆼ苣莃菣袼볯늼볯銈볯鎼볯鮼볯钽볯ꎼ뷯膽뷯貽뷯鎽볯궼볯覼苣ꢔ臣ꚁ胣겸껥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖龮雦设볯馼볯ꒂ菣릂菣뎃뷤ꢔ臣誁臣讂雩躸苣몢ꯧ馁苣膀뷤隤臣꺁볯钼볯ꦼ뷯銈볯ꖼ볯낼菣鶃菣뾂菣ꊂ菣뮂苣㲤牢ਾ꟦薀臣ꢼ볯ꦼ볯薽菣鶃菣뾂菣㲼牢ਾ†볯钼볯ꦼ뷯込뷯궼볯낼裢뎼볯ꆼ볯骼菣莃菣讁苣颍鯩閁苣龁菣뎃苣뢅藩ꂴ菣궃菣벃苣벃볯銽볯ꖼ볯覼臣膀苣뎃苣ꪃ菣貵럨ꮁ귥ꢜ臣讂볯낼볯늼裢겂菣麃苣것菣뎃菣銂郥覜臣讂胣鎁臣것菣벃苣벃꟦覯觧銂胣鶂蟨ꢼ볯ꦼ볯薽듧麃ꃦꮁ껥骮臣ꊽ돨뮧藥閁苣讂胣ં䐼噉邀볯銼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†볯钼볯ꦼ뷯込볯늼볯ꊼ볯銈볯ꖼ볯낼볯릂菣궃菣ꮃ裥ꆾ苣것菣뎃菣邵郥뾂菣醃苣ꪳ볯뎼볯ꖼ볯낼裢貽뷯覼臣膀ꓥ낕臣ꒂ菣릂菣뎃뿥钭胦몁볤邭胣设臣낁胣芄苨뢅郥邈藩ꂴ볯ꚼ볯뎼볯꺁菣궃菣벃苣벃臣鲽铧鞁胣誁苣뎁럧궶諨내菨膀蓨ꪂ듧麃臣袂臣鶂듧麃臣誁臣讂蓨ꪂ藩ꎻ골꺁룤膦臣몁볤邭臣몙迧銂裥ꆾ臣讂胣ꊻ蛥ꂛ귥ꞁ臣讂胣芄苨내菨몱껥蚈賥ꂛ귥ꦼ볯ꆼ볯꒼裢醼볯ꢁ臣ꚁ苣ꖟ苣貂臣蒁苣뎼볯ꖼ볯낼裢貽뷯꾁胣芄苨내菨ꮁ臣醁苣몁볤邭駧뺏臣뺯臣讂苣뎃苣ꪃ菣릊黦꺁룤ꆬꫨ肯鯥邭臣莀臣覂苣讂胣鶁臣뮴胦꾁胣ꒂ菣릂菣뎃胣릂菣궃菣ꮃ胣誁苣뎁苣ꮃ苣벃苣꺁菣馃菣ꮁ苣誂ꫨ肯臣貂苣芀臣꺁菣鶃菣뾂菣讧꿧ꦉ苣膀苨鎇볯钼볯ꦼ뷯내菨ꪠ臣覮껥ꮁ뷥ꪳ꟧ꖅ臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꢼ볯ꦼ볯薽볯ꚼ볯뎼裢뎼볯ꆼ볯骼蓨ꪂ藩袐裦떅듧것菣벃苣벃꟦覯觧꾁胣肜냥邙臣뎼볯ꖼ볯낼뿥钭胦ꚼ볯뎼菣궃菣벃苣벃苣ꮐ鳦馁苣芀臣꺁菣鶃菣뾂菣讧꿧ꦉ苣膀苨鎇볯钼볯ꦼ뷯내菨ꪠ臣覮껥ꮁ뷥ꪳ꟧ꖅ臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꢼ볯ꦼ볯薽볯낼볯낼볯ꮼ裢뎼볯ꆼ볯骼菣릂菣ꢂ菣벃菣钃菣鎃菣뢅苣ꮃ菣궂苣궂菣벃苣袼볯ꖼ볯ꎼ볯覼菣궃菣벃苣벃臣膀볯ꖼ볯ꎼ볯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