(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの設計方法であって、
前記プライマーの３’末端側に、前記標的核酸配列の３’末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ’）を含み、
前記プライマーの５’末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ’）を含み、
以下の条件［１］および／または条件［２］を満たすことを特徴とするプライマーの設計方法
条件［１］：前記プライマーの前記配列（Ｂ’）の５’末端側から３塩基の配列（Ｂ’５’−３）と相補的な配列が、前記プライマー配列の中に２個以下であるようにする。
条件［２］：前記プライマーの前記配列（Ａｃ’）の３’末端側から３塩基の配列（Ａｃ’３’−３）と相補的な配列が、前記プライマー中に、存在しない（０個）ようにする。
【請求項２】
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの製造方法であって、
プライマーの設計工程およびプライマーの合成工程を含み、
前記プライマーセットの設計工程が、請求項１記載のプライマーの設計方法によって実施されることを特徴とするプライマーの製造方法。
【請求項３】
第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸中の標的核酸配列の増幅に用いるプライマーセットの設計方法であって、
前記プライマーセットは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含み、
前記第一のプライマーを、請求項１に記載の設計方法により設計し、
前記第二のプライマーの３’末端側に、前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列の３’末端側の配列（Ｅ）に相補的な配列（Ｅｃ’）を含み、
前記第二のプライマーの５’末端側に、前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列の前記配列（Ｅ）よりも５’側に存在する配列（Ｆ）と同じ配列（Ｆ’）を含み、
前記第一のプライマーの前記配列（Ａｃ’）の３’末端側から３塩基の配列（Ａｃ’３’−３）と相補的な配列が、前記第二のプライマー中に、存在せず（０個）、
前記第二のプライマーの前記配列（Ｅｃ’）の３’末端側から３塩基の配列（Ｅｃ’３’−３）と相補的な配列が、前記第一のプライマー中に、存在しない（０個）ように設計することを特徴とするプライマーセットの設計方法。
【請求項４】
前記第一のプライマーが前記条件［２］を満たし、
前記第二のプライマーの前記配列（Ｅｃ’）の３’末端側から３塩基の配列（Ｅｃ’３’−３）と相補的な配列が、前記第二のプライマー中に、存在しない（０個）ように設計する、請求項３記載のプライマーセットの設計方法。
【請求項５】
第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸中の標的核酸配列の増幅に用いるプライマーセットの製造方法であって、
プライマーセットの設計工程およびプライマーセットの合成工程を含み、
前記プライマーセットの設計工程が、請求項３または４記載のプライマーセットの設計方法によって実施されることを特徴とするプライマーセットの製造方法。
【請求項６】
鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を合成する前記相補的な核酸の増幅方法であって、下記の（Ｓ１）〜（Ｓ５）の工程を含むことを特徴とする核酸の増幅方法。
（Ｓ１）請求項２記載の製造方法によりプライマーを製造する工程。
（Ｓ２）鋳型核酸を提供する工程。
（Ｓ３）前記プライマーを前記鋳型核酸にアニーリングさせ、プライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む相補核酸を合成する工程。
（Ｓ４）前記工程（Ｓ３）により合成された相補核酸の５’側に存在する配列（Ｂ’）を同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）にハイブリダイズさせ、これにより、鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分を一本鎖とする工程。
（Ｓ５）工程（Ｓ４）により一本鎖とされた鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（Ｓ３）により合成された相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程。
【請求項７】
工程（Ｓ５）により得られた二本鎖の核酸を工程（Ｓ４）で繰り返して使用することを特徴とする請求項６記載の核酸の増幅方法。
【請求項８】
工程（Ｓ３）、工程（Ｓ４）および工程（Ｓ５）を等温で行うことを特徴とする請求項６または７記載の核酸の増幅方法。
【請求項９】
二本鎖からなる鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、下記の（Ｓ’１）〜（Ｓ’５）の工程を含むことを特徴とする核酸の増幅方法。
（Ｓ’１）請求項５記載の製造方法によりプライマーセットを製造する工程。
（Ｓ’２）第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸を提供する工程。
（Ｓ’３）前記第一および第二のプライマーをそれぞれ前記第一および第二の鋳型核酸にアニーリングさせ、それぞれプライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む第一および第二の相補核酸を合成する工程。
（Ｓ’４）工程（Ｓ’３）により合成された第一および第二の相補核酸の５’側に存在する配列（Ｂ’）および配列（Ｆ’）を、同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）および配列（Ｆｃ）にそれぞれハイブリダイズさせ、これにより、第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｅ）の部分を一本鎖とする工程。
（Ｓ’５）工程（Ｓ’４）により一本鎖とされた第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｅ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（Ｓ’３）により合成された第一および第二の相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程。
【請求項１０】
工程（Ｓ’５）により得られた二本鎖の核酸を工程（Ｓ’４）で繰り返して使用する請求項９記載の核酸の増幅方法。
【請求項１１】
工程（Ｓ’３）、工程（Ｓ’４）および工程（Ｓ’５）を等温で行う請求項９または１０記載の核酸の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅用プライマーの設計方法、核酸増幅用プライマーの製造方法、核酸増幅用プライマー、プライマーセット、および核酸の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ターンバックプライマー（ＴＰ）を含むプライマーセットおよび鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼを用いた等温核酸増幅法は、例えば、医学および分子生物学等の広い分野で利用されている（非特許文献１−５）。ＴＰは、標的核酸配列にアニ−リングする配列と、そこから伸長された先にある配列にアニーリングできる配列を５'側に有する、ステム−ループ構造を形成可能なプライマーである。ＴＰの他、標的核酸配列にアニーリングする配列と、５'側にプライマー内部で折り返し構造を形成可能な配列を有するフォールディングプライマー（ＦＰ）、ブーストプライマー（ＢＰ）、２つのアウタープライマー（ＯＰ１およびＯＰ２）を使用することも可能である。これらのプライマーを用いた核酸増幅法は、サーマルサイクラー等の特別な装置を必要とせず、また、温度設定に要する時間も必要無いという優れた効果を奏する。また、前記核酸増幅法は、疾患の早期診断にも、好ましく適用可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４（２００７）２５７−２６２．
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３（２００７）４９７４−４９８３．
【非特許文献３】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４３（２００７）４７９−４８４．
【非特許文献４】Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ３６（２００８）２３４−２３８．
【非特許文献５】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．  １０（２００９）１３７３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＴＰを含むプライマーセットを用いた等温核酸増幅法において、核酸増幅速度の向上および核酸増幅の特異性向上が求められている。
【０００５】
そこで、本発明は、ＴＰを含むプライマーセットを用いた等温核酸増幅法に用いる核酸増幅用プライマーであって、核酸の増幅速度および核酸増幅の特異性を向上可能な核酸増幅用プライマーの設計方法、核酸増幅用プライマーの製造方法、核酸増幅用プライマー、プライマーセット、および核酸の増幅方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の核酸増幅用プライマーの設計方法は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの設計方法であって、下記の（Ｄ１）、（Ｄ２）および（Ｄ３）の工程を含むことを特徴とする。
（Ｄ１）前記標的核酸配列において、配列（Ａ）を選択し、プライマーの３'末端側のアニーリング配列として、前記配列（Ａ）と相補的な配列（Ａｃ'）を決定する工程。
（Ｄ２）前記標的核酸配列において、前記配列（Ａ）よりも５'末端側に存在する配列（Ｂ）を選択し、前記プライマーの５'末端側のステムループ形成配列として、前記配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を決定する工程。
（Ｄ３）前記標的核酸配列において、前記配列（Ａ）および前記配列（Ｂ）の間の配列（Ｗ）と、前記配列（Ａ）より３'末端側における前記配列（Ｗ）と相補的な配列（Ｗｃ）とを選択し、前記プライマーの前記配列（Ａｃ'）および（Ｂ'）の間の配列として、前記配列（Ｗ）と同じ配列（Ｗ'）を決定する工程。
【０００７】
本発明のプライマーの製造方法は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの製造方法であって、
プライマー設計工程およびプライマーの合成工程を含み、
前記プライマーの設計工程が、前記本発明のプライマーの設計方法によって実施されることを特徴とする。
【０００８】
本発明のプライマーセットは、
第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸中の標的核酸配列の増幅に用いるプライマーセットであって、
前記プライマーセットは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含み、
前記第一のプライマーは、前記第一の鋳型核酸中の前記標的核酸配列に基づき、前記本発明の製造方法により製造されるプライマーであり、
前記第二のプライマーは、３'末端側に、前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ｅ）に相補的な配列（Ｅｃ'）を含み、５'末端側に、前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列の前記配列（Ｅ）よりも５'側に存在する配列（Ｆ）と同じ配列（Ｆ'）を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明の第一の核酸の増幅方法は、
鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を合成する前記相補的な核酸の増幅方法であって、下記の（Ｓ１）〜（Ｓ５）の工程を含むことを特徴とする。
（Ｓ１）前記本発明のプライマーの製造方法によりプライマーを製造する工程。
（Ｓ２）鋳型核酸を提供する工程。
（Ｓ３）前記プライマーを前記鋳型核酸にアニーリングさせ、プライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む相補核酸を合成する工程。
（Ｓ４）前記工程（Ｓ３）により合成された相補核酸の５'側に存在する配列（Ｂ'）を同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）にハイブリダイズさせ、これにより、鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分を一本鎖とする工程。
（Ｓ５）工程（Ｓ４）により一本鎖とされた鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（Ｓ３）により合成された相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程。
【００１０】
本発明の第二の核酸の増幅方法は、
二本鎖からなる鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、下記の（Ｓ’１）〜（Ｓ’５）の工程を含むことを特徴とする。
（Ｓ’１）前記本発明のプライマーセットを提供する工程。
（Ｓ’２）第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸を提供する工程。
（Ｓ’３）前記第一および第二のプライマーをそれぞれ前記第一および第二の鋳型核酸にアニーリングさせ、それぞれプライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む第一および第二の相補核酸を合成する工程。
（Ｓ’４）工程（Ｓ’３）により合成された第一および第二の相補核酸の５'側に存在する配列（Ｂ’）および配列（Ｆ’）を、同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）および配列（Ｆｃ）にそれぞれハイブリダイズさせ、これにより、第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｅ）の部分を一本鎖とする工程。
（Ｓ’５）工程（Ｓ’４）により一本鎖とされた第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｅ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（Ｓ’３）により合成された第一および第二の相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程。
【００１１】
本発明のプライマーは、標的核酸配列の増幅に用いるプライマーであって、
前記本発明の製造方法により製造され、前記本発明の第二の核酸の増幅方法に用いることを特徴とする。
【００１２】
なお、以下において、前記本発明のプライマーの設計方法を、「プライマーの設計方法（０）」ということがある。本発明のプライマーの設計方法は、前記プライマーの設計方法（０）に代えて、後述するプライマーの設計方法（１）〜（１０）のいずれかであっても良い。また、前記プライマーの設計方法（０）を用いた前記本発明のプライマーの製造方法を、以下において、「プライマーの製造方法（０）」ということがある。本発明のプライマーの製造方法は、前記プライマーの設計方法（０）に代えて、後述するプライマーの設計方法（１）〜（１０）のいずれかを用いても良く、これらを、それぞれ「プライマーの製造方法（１）」、「プライマーの製造方法（２）」、「プライマーの製造方法（３）」、「プライマーの製造方法（４）」、「プライマーの製造方法（５）」、「プライマーの製造方法（６）」、「プライマーの製造方法（７）」、「プライマーの製造方法（８）」、「プライマーの製造方法（９）」、または「プライマーの製造方法（１０）」ということがある。
【００１３】
前記プライマーの製造方法（０）により製造されるプライマーを、以下において、「プライマー（０）」ということがある。また、前記プライマーの製造方法（１）〜（１０）のいずれかにより製造されるプライマーを、それぞれ「プライマー（１）」、「プライマー（２）」、「プライマー（３）」、「プライマー（４）」、「プライマー（５）」、「プライマー（６）」、「プライマー（７）」、「プライマー（８）」、「プライマー（９）」、または「プライマー（１０）」ということがある。ただし、プライマー（０）〜（１０）は、構造が同一であれば、他の任意の方法により製造したプライマーであっても良い。
【００１４】
本発明のプライマーは、前記のとおり、前記本発明の第二の核酸の増幅方法に用いる前記プライマー（０）である。本発明のプライマーは、これに代えて、前記プライマー（８）であっても良い。また、本発明のプライマーセットは、前述のとおり、前記第一のプライマーが、前記プライマー（０）である。本発明のプライマーセットは、前記第一のプライマーが、前記プライマー（０）に代えて、前記プライマー（８）であっても良い。
【００１５】
本発明の第一の核酸増幅方法は、前述のとおり、前記工程（Ｓ１）において、前記プライマーの製造方法（０）によりプライマーを製造する。本発明の第一の核酸増幅方法は、前記前記工程（Ｓ１）において、前記プライマーの製造方法（０）に代えて、後述する本発明のプライマーの製造方法（１）〜（１０）のいずれかによりプライマーを製造しても良いし、任意の方法により、前記プライマー（８）を提供しても良い。
【００１６】
本発明の第二の核酸の増幅方法は、前述のとおり、前記工程（Ｓ’１）において、前記第一のプライマーが、前記プライマー（０）または前記プライマー（８）である前記本発明のプライマーセットを提供する。本発明の第二の核酸の増幅方法は、前記工程（Ｓ’１）において、前記本発明のプライマーセットの提供に代えて、後述する本発明のプライマーセットの製造方法（プライマーセットの製造方法（０）〜（１０）およびプライマーセットの製造方法（６’））のいずれかにより、プライマーセットを製造しても良い。
【発明の効果】
【００１７】
前記目的を達成するために、本発明者らは、種々の検討を行った結果、ＴＰの前記配列（Ａｃ'）および（Ｂ'）の間に、前記標的核酸配列の配列（Ｗ）と同じ配列（Ｗ'）を設けたプライマー（０）を使用することにより、前記等温核酸増幅法において核酸の増幅速度を向上できることを見出し、本発明に至った。本発明は、前述のとおり、前記プライマーの設計方法（０）、前記プライマーの製造方法（０）、または前記プライマー（０）に代えて、後述するプライマーの設計方法（１）〜（１０）、後述するプライマーの製造方法（１）〜（１０）、または後述するプライマー（１）〜（１０）のいずれかを用いた核酸増幅用プライマーの設計方法、核酸増幅用プライマーの製造方法、核酸増幅用プライマー、プライマーセット、または核酸の増幅方法であっても良い。また、本発明の核酸増幅用プライマーの設計方法、核酸増幅用プライマーの製造方法、核酸増幅用プライマー、プライマーセット、または核酸の増幅方法を使用することにより、核酸増幅反応の特異性が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の核酸増幅用プライマーの一例を示す模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の核酸増幅用プライマーの設計方法の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の核酸増幅用プライマーによる核酸合成の作用機序を例示する模式図である。
【図３】図３は、本発明の核酸増幅用プライマーによる核酸合成の作用機序の別の一例を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明のプライマーセットに含まれる第二のプライマー（ＦＰ）の一例を示す模式図である。
【図５Ａ】図５（Ａ）は、本発明の核酸の増幅方法の基本的なメカニズムの一例を示す模式図である。
【図５Ｂ】図５（Ｂ）は、本発明の核酸の増幅方法の基本的なメカニズムの一例を示す模式図である。
【図６】図６ａからｎは、本発明の核酸の増幅方法のメカニズムのその他の例を示す模式図である。
【図７】図７（Ａ）は、本発明の実施例１におけるＴＰの分類基準となる塩基を示す模式図であり、図７（Ｂ）は、前記基準によって分類したＴＰの各組合せの核酸増幅反応の速度および特異性の評価点数を示すグラフである。
【図８】図８（Ａ）は、本発明の実施例２におけるＴＰの分類基準となる塩基を示す模式図であり、図８（Ｂ）は、前記基準によって分類したＴＰの各組合せの核酸増幅反応の速度および特異性の評価点数を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明のプライマーの一例を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明のプライマーの別の一例を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明のプライマーのさらに別の一例を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明のプライマーのさらに別の一例を示す図である。
【図１３】図１３は、本発明のプライマーのさらに別の一例を示す図である。
【図１４】図１４は、本発明のプライマーのさらに別の一例を示す図である。
【図１５】図１５は、本発明のプライマーのさらに別の一例を示す図である。
【図１６】図１６は、本発明のプライマーのさらに別の一例を示す図である。
【図１７】図１７は、本発明のプライマーのさらに別の一例を示す図である。
【図１８】図１８は、本発明のプライマーのさらに別の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
つぎに、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
前記プライマー（０）は、
前記プライマー（０）の３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマー（０）の５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記標的核酸配列において、配列（Ａ）および配列（Ｂ）の間に配列（Ｗ）が存在し、かつ前記配列（Ａ）より３'末端側に、前記配列（Ｗ）と相補的な配列（Ｗｃ）が存在し、
さらに、前記プライマーの配列（Ａｃ'）および（Ｂ'）の間に、前記標的核酸配列の配列（Ｗ）と同じ配列（Ｗ'）を含むことを特徴とする。具体的には、例えば図１Ａに示すとおりである。同図において「ＴＰ」とは、前記プライマー（０）を示す。なお、このような構造を有するプライマー（０）の設計方法および製造方法は特に限定されないが、本発明の前記プライマーの設計方法（０）により設計するか、または、前記プライマーの製造方法（０）により製造することが好ましい。また、以下において、単に「ＴＰ」と記す場合は、特に示さない限り、本発明で用いる前記プライマー（０）〜（１０）のいずれかを表すものとする。
【００２１】
本発明において「標的核酸」または「標的核酸配列」とは、増幅しようとする核酸またはその配列そのものだけでなく、これに相補的な配列または前記配列を有する核酸をも意味する。
【００２２】
本発明において、前記配列（Ｗ'）の塩基数は特に制限されないが、例えば、１以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上である。すなわち、前記標的核酸配列の前記配列（Ｗ）の塩基数は、例えば、１以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上である。また、前記標的核酸配列の前記配列（Ｗ）は、前記配列（Ａ）および前記配列（Ｂ）の少なくとも一方の配列に含まれていてもよい。
【００２３】
ＴＰによる増幅反応のメカニズムを図２に模式的に示す。まず、鋳型となる核酸中の標的核酸配列を決定し、その標的核酸配列の３'末端部分の配列（Ａ）、および配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）を決定する。さらに、前記標的核酸配列において、前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）との間に存在する配列（Ｗ）で、かつ、前記配列（Ｗ）の相補的な配列（Ｗｃ）が前記配列（Ａ）より３'末端側に存在するような配列（Ｗ）を決定する。ＴＰは、配列（Ａｃ'）を含んでなり、さらにその５'側に配列（Ｂ'）を含む。さらに、前記プライマーの配列（Ａｃ'）および（Ｂ'）の間に、前記標的核酸配列の配列（Ｗ）と同じ配列（Ｗ'）を含む。配列（Ａｃ'）は、配列（Ａ）にハイブリダイズするものであり、配列（Ｂ'）は、配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズするものであり、配列（Ｗ'）は、配列（Ｗ）の相補配列（Ｗｃ）にハイブリダイズするものである。ここで、ＴＰは、前記配列（Ｗ'）と前記配列（Ｂ'）の間、または、前記配列（Ｗ'）と前記配列（Ａｃ'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を含んでいてもよい。このようなプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせると、プライマー中の配列（Ａｃ'）および（Ｗ'）（（Ａｃ'−Ｗ'）とする。以下同様。）が、標的核酸配列の配列（Ａ−Ｗｃ）にハイブリダイズした状態となる（図２（ａ））。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的核酸配列の相補配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の５'末端側に存在する配列（Ｂ'−Ｗ'）が、同核酸中に存在する配列（Ｂｃ−Ｗｃ）にハイブリダイズし、これにより、合成された核酸の５'末端部分においてステム−ループ構造が形成される。その結果、鋳型核酸上の配列（Ａ−Ｗｃ）が一本鎖となり、この部分に先のＴＰと同一の配列を有する他のＴＰがハイブリダイズする（同図（ｂ））。その後、鎖置換反応により、新たにハイブリダイズしたＴＰからの伸長反応が起こると同時に、先に合成された核酸が鋳型核酸から分離される（同図（ｃ））。
【００２４】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明によるプライマーの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明によるプライマーとその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）等を参照することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、プライマーを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）などを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーは、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。
【００２５】
上記の増幅反応において、配列（Ｂ'−Ｗ'）が、配列（Ｂｃ−Ｗｃ）にハイブリダイズする現象は、典型的には、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。上記ＴＰによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステム−ループ構造を形成することができる。このステム−ループ構造は安定的には存在しないが、その構造の形成により剥き出しとなった相補鎖部分（鋳型核酸上の配列（Ａ−Ｗｃ））に同一の他のプライマーが結合し、すぐさまポリメラーゼが伸長反応を行うことにより、先に合成された鎖が置換されて遊離すると同時に、新たな二本鎖核酸を生成することができる。
【００２６】
ＴＰを使用することにより、前記等温核酸増幅法において核酸増幅の特異性を向上できるメカニズムは、例えば、つぎのように推測される。一般に、核酸増幅法における非特異的増幅産物の多くは、プライマーが標的核酸配列以外の配列に誤ってハイブリダイズすること（ミスハイブリダイズ）によって生じると考えられている。また、標的核酸配列とのハイブリダイズに寄与しない配列がプライマー中に多いほど、前記プライマーはミスハイブリダイズしやすくなり、そのような配列が少ないほど、前記プライマーはミスハイブリダイズしにくくなる。この点、ＴＰにおいては、標的核酸配列（Ａ−Ｗｃ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ'−Ｗ'）と、標的核酸配列（Ｂｃ−Ｗｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ'−Ｗ'）とが重複している。そのため、ＴＰは、配列（Ｗ'）を有さない従来のプライマーに比べてミスハイブリダイズしにくく、その結果、前記等温核酸増幅法において核酸増幅の特異性が向上すると考えられる。また、配列（Ｗ'）の長さが長いほど、核酸増幅の特異性が向上すると考えられる。ただし、このメカニズムは推測であり、本発明を何ら限定しない。
【００２７】
ＴＰを使用することにより、前記等温核酸増幅法において核酸の増幅速度を向上できるメカニズムは、例えば、つぎのように推測される。すなわち、前述のように、ＴＰは、標的核酸配列以外の配列にミスハイブリダイズしにくいため、標的核酸配列にハイブリダイズする効率が上がり、その結果核酸の増幅速度が向上すると考えられる。また、配列（Ｗ'）の長さが長いほど、核酸の増幅速度が向上すると考えられる。ただし、このメカニズムは推測であり、本発明を何ら限定しない。
【００２８】
ＴＰの好ましい態様における設計基準は次のとおりである。まず、プライマーの伸長により鋳型核酸の相補鎖が合成された後に新たなプライマーが効率よく同鋳型核酸にアニーリングするためには、合成された相補鎖の５'末端におけるステム−ループ構造形成により、鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分を一本鎖とする必要がある。そのための条件を、以下、配列（Ａｃ'）の塩基数をＸ、標的核酸配列中における前記配列（Ａ）と前記配列（Ｂ）に挟まれた領域の塩基数をＹ、配列（Ｗ）および（Ｗ'）の塩基数をＺとして考察する。まず、配列（Ａｃ'−Ｗ'）の塩基数（Ｘ＋Ｚ）と、標的核酸配列中における配列（Ａ−Ｗｃ）と配列（Ｂ−Ｗ）とに挟まれた領域の塩基数（Ｙ−Ｚ）との差（Ｘ−Ｙ＋２Ｚ）の、Ｘに対する割合（Ｘ−Ｙ＋２Ｚ）／Ｘが重要となる。ただし、鋳型核酸上において配列（Ａ）よりも５'側に存在する、プライマーのハイブリダイズとは関係無い部分まで一本鎖とする必要はない。また、新たなプライマーが効率よく鋳型核酸にアニーリングするためには、上述のステム−ループ構造形成を効率よく行うことも必要となる。そして、効率の良いステム−ループ構造形成、すなわち、効率の良い配列（Ｂ'−Ｗ'）と配列（Ｂｃ−Ｗｃ）とのハイブリダイゼーションには、前記配列（Ｂ'−Ｗ'）と前記配列（Ｂｃ−Ｗｃ）との間の距離（Ｘ＋Ｙ−Ｚ）が重要となる。一般に、プライマー伸長反応のための最適温度は最高でも７２℃付近であり、そのような低い温度では、伸長鎖が長い領域にわたって解離することは困難である。従って、配列（Ｂ'−Ｗ'）が配列（Ｂｃ−Ｗｃ）に効率よくハイブリダイズするためには、両配列の間の塩基数は少ないほうが好ましいと考えられる。一方で、配列（Ｂ'−Ｗ'）が配列（Ｂｃ−Ｗｃ）にハイブリダイズして鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分を一本鎖とするためには、配列（Ｂ'−Ｗ'）と配列（Ｂｃ−Ｗｃ）との間の塩基数は多い方が好ましいと考えられる。
【００２９】
以上のような観点から、本発明の好ましい実施態様において、前記配列（Ｗ'）と前記配列（Ｂ'）との間、および、前記配列（Ｗ'）と前記配列（Ａｃ'）との間に介在配列が存在しない場合において、（Ｘ−Ｙ＋２Ｚ）／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．５０以下、好ましくは１．００以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ−Ｚ）は、好ましくは１０以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは２５以上とされ、また、好ましくは６０以下、さらに好ましくは５０以下、さらに好ましくは４８以下、さらに好ましくは４５以下、さらに好ましくは４２以下とされる。
【００３０】
また、前記配列（Ｗ'）と前記配列（Ｂ'）との間、または、前記配列（Ｗ'）と前記配列（Ａｃ'）との間に介在配列（塩基数はＹ'）が存在する場合には、本発明の好ましい実施態様において、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ'）＋２Ｚ｝／Ｘが、−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．５０以下、好ましくは１．００以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ＋Ｙ'−Ｚ）は、好ましくは１０以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは２５以上とされ、また、好ましくは１００以下、さらに好ましくは７５以下、さらに好ましくは５０以下とされる。
【００３１】
前記ＴＰは、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。前記ＴＰの鎖長は、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは３０〜６０ヌクレオチドとする。また、前記ＴＰを構成する配列（Ａｃ'）と配列（Ｂ'）の長さは、それぞれ、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。また、必要に応じて、配列（Ｗ'）と配列（Ｂ'）の間、または配列（Ｗ'）と配列（Ａｃ'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
【００３２】
本発明の、前記プライマーの設計方法（０）（核酸増幅用プライマーの設計方法）は、図１Ｂに示すように、下記の（Ｄ１）、（Ｄ２）および（Ｄ３）の工程を含むことを特徴とする。
（Ｄ１）前記標的核酸配列において、配列（Ａ）を選択し、プライマーの３'末端側のアニーリング配列として、前記配列（Ａ）と相補的な配列（Ａｃ'）を決定する工程。
（Ｄ２）前記標的核酸配列において、前記配列（Ａ）よりも５'末端側に存在する配列（Ｂ）を選択し、前記プライマーの５'末端側のステムループ形成配列として、前記配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を決定する工程。
（Ｄ３）前記標的核酸配列において、前記配列（Ａ）および前記配列（Ｂ）の間の配列（Ｗ）と、前記配列（Ａ）より３'末端側における前記配列（Ｗ）と相補的な配列（Ｗｃ）とを選択し、前記プライマーの前記配列（Ａｃ'）および（Ｂ'）の間の配列として、前記配列（Ｗ）と同じ配列（Ｗ'）を決定する工程。
【００３３】
前記（Ｄ３）工程において、前記標的核酸配列の前記配列（Ｗ）の塩基数は、例えば１以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上である。また、前記（Ｄ３）工程において、前記標的核酸配列の前記配列（Ｗ）が、前記配列（Ａ）および前記配列（Ｂ）の少なくとも一方の配列に含まれるようにしてもよい。
【００３４】
本発明のプライマー製造方法は、標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの製造方法であって、
プライマー設計工程およびプライマーの合成工程を含み、
前記プライマーの設計工程が、本発明のプライマーの設計方法によって実施されることを特徴とし、その他の点では特に制限されない。本発明のプライマーの製造方法は、前述のとおり、本発明の前記プライマーの設計方法（０）を用いても良いし、これに代えて、後述するプライマーの設計方法（１）〜（１０）のいずれかを用いても良い。
【００３５】
本発明のプライマー製造方法は、オリゴヌクレオチドの合成に用いることのできる任意の方法を用いることができ、特に制限されないが、例えば、ホスホアミダイト法、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があげられる。
【００３６】
本発明のプライマー製造方法によって製造されるプライマーは、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドにより構成される。本発明において、「リボヌクレオチド」（単に「Ｎ」ということもある）とは、リボヌクレオチド三リン酸をいい、例えば、ＡＴＰ，ＵＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ等がある。さらに、リボヌクレオチドにはこれらの誘導体が含まれ、例えば、α位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌクレオチド（α−チオ−リボヌクレオチド）等がある。
【００３７】
本発明のプライマー製造方法によって製造されるプライマーには、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、および未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、未修飾デオキシヌクレオチドおよび／または修飾デオキシヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマー等も含まれる。
【００３８】
本発明のプライマーセットは、前述のとおり、
第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸中の標的核酸配列の増幅に用いるプライマーセットであって、
前記プライマーセットは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含み、
前記第一のプライマーは、前記本発明のプライマー（０）または本発明のプライマー（８）であり、
前記第二のプライマーは、３'末端側に、前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ｅ）に相補的な配列（Ｅｃ'）を含み、５'末端側に、前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列の前記配列（Ｅ）よりも５'側に存在する配列（Ｆ）と同じ配列（Ｆ'）を含むことを特徴とする。なお、本発明のプライマー（８）については後述する。
【００３９】
本発明のプライマーセットは、前記一対のプライマーの二つのプライマーが、いずれもＴＰであってもよい。すなわち、前記第二のプライマーが、前記プライマー（０）〜（１０）のいずれかであっても良い。
【００４０】
前記一対のプライマーの二つのプライマーが、いずれもＴＰである（ＴＰ−ＴＰ）プライマーセットによる核酸増幅反応について考えられる作用機序を、図３を用いて説明する。ただし、同図は、核酸増幅反応の工程の一部について、考えられる作用機序の一例を示すに過ぎず、本発明を何ら限定しない。また、同図では、説明を簡略化するため、ハイブリダイズする２つの配列を相互に相補的な配列としているが、これにより本発明が限定されるものではない。まず、ＴＰが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、前記プライマーの伸長反応が起きる（同図（ａ））。次いで、伸長鎖（−）上においてステム−ループ構造が形成され、これにより一本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列（Ａ）に新たなＴＰがハイブリダイズし（同図（ｂ））、前記プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（−）が脱離する。次に、脱離した伸長鎖（−）上の配列（Ｅ）に第二のＴＰがハイブリダイズし（同図（ｃ））、前記プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（＋）が合成される（同図（ｄ））。生成した伸長鎖（＋）の３'末端と伸長鎖（−）の５'末端ではステム−ループ構造が形成されるとともに、伸長鎖（−）上の配列（Ｅ）に新たな第二のＴＰがハイブリダイズし、前記伸長鎖（−）が脱離して、伸長鎖（＋）からなる中間体が形成される（同図（ｆ））。その配列（Ａ）および配列（Ｂｃ）にＴＰがハイブリダイズし（同図（ｇ））、その伸長反応により伸長鎖（−）が生成する（同図（ｈ））。以下、ループ形成、伸長反応等が次々に起こり、標的核酸配列が増幅される。
【００４１】
前記第二のプライマーは、前記プライマー（０）と同様の製造方法により製造されるプライマーであっても良い。すなわち、
前記第二のプライマーが、プライマー設計工程およびプライマーの合成工程を含む製造方法により製造され、
前記プライマーの設計工程が、下記の（Ｄ’１）、（Ｄ’２）および（Ｄ’３）の工程を含んでも良い。
（Ｄ’１）前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列において、配列（Ｅ）を選択し、プライマーの３'末端側のアニーリング配列として、前記配列（Ｅ）と相補的な配列（Ｅｃ'）を決定する工程。
（Ｄ’２）前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列において、前記配列（Ｅ）よりも５'末端側に存在する配列（Ｆ）を選択し、前記プライマーの５'末端側のステムループ形成配列として、前記配列（Ｆ）と同じ配列（Ｆ'）を決定する工程。
（Ｄ’３）前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列において、前記配列（Ｅ）および前記配列（Ｆ）の間の配列（Ｖ）と、前記配列（Ｅ）より３'末端側における前記配列（Ｖ）と相補的な配列（Ｖｃ）とを選択し、前記プライマーの前記配列（Ｅｃ'）および（Ｆ'）の間の配列として、前記配列（Ｖ）と同じ配列（Ｖ'）を決定する工程。
【００４２】
本発明のプライマーセットにおいて、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、前記本発明の核酸増幅用プライマーであり、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３'末端部分の配列（Ｇ）にハイブリダイズする配列（Ｇｃ'）を３'末端部分に含み、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｈ−Ｈｃ'）を前記配列（Ｇｃ'）の５'側に含むプライマー（以後、ＦＰと記載する。）であってもよい。
【００４３】
本発明のプライマーセットに含まれるＦＰは、上述のように、前記標的核酸配列の相補配列（ＴＰがハイブリダイズする鎖に対して反対側の鎖）の３'末端部分の配列（Ｇ）にハイブリダイズする配列（Ｇｃ'）を３'末端部分に含み、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｈ−Ｈｃ'）を前記配列（Ｇｃ'）の５'側に含むものである。このようなＦＰの構造は、例えば、図４に示すようなものであるが、同図に示される配列やヌクレオチド数に限定されるものではない。ＦＰを構成する配列（Ｇｃ'）の長さは、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。また、前記折返し配列（Ｈ−Ｈｃ'）の長さは、好ましくは２〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは４〜６０ヌクレオチド、さらに好ましくは６〜４０ヌクレオチドであり、折返し配列の内部におけるハイブリダイゼーションによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは２〜５００ｂｐ、より好ましくは２〜５０ｂｐ、さらに好ましくは２〜３０ｂｐ、さらに好ましくは３〜２０ｂｐである。折返し配列（Ｈ−Ｈｃ'）のヌクレオチド配列はいかなる配列であってもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは標的核酸配列にハイブリダイズしない配列とされる。また、必要に応じて、配列（Ｇｃ'）と折返し配列（Ｈ−Ｈｃ'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
【００４４】
これらＴＰおよびＦＰによる核酸増幅反応について考えられる作用機序を、図５（図５（Ａ）および図５（Ｂ））を用いて説明する。なお、同図では、説明を簡略化するため、ハイブリダイズする２つの配列を相互に相補的な配列としているが、これにより本発明が限定されるものではない。まず、ＴＰが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、前記プライマーの伸長反応が起きる（同図（ａ））。次いで、伸長鎖（−）上においてステムループ構造が形成され、これにより一本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列（Ａ）に新たなＴＰがハイブリダイズし（同図（ｂ））、前記プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（−）が脱離する。次に、脱離した伸長鎖（−）上の配列（Ｇ）にＦＰがハイブリダイズし（同図（ｃ））、前記プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（＋）が合成される（同図（ｄ））。生成した伸長鎖（＋）の３'末端と伸長鎖（−）の５'末端ではステム−ループ構造が形成され（同図（ｅ））、遊離型の３'末端である伸長鎖（＋）のループ先端から伸長反応が起こると同時に、前記伸長鎖（−）が脱離する（同図（ｆ））。ループ先端からの前記伸長反応により、伸長鎖（＋）の３'側に配列（Ａ）および配列（Ｂｃ）を介して伸長鎖（−）が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列（Ａ）および配列（Ｂｃ）にＴＰがハイブリダイズし（同図（ｇ））、その伸長反応により伸長鎖（−）が生成する（同図（ｈ）および（ｉ））。また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の３'末端に存在する折返し配列によって遊離型の３'末端が提供され（同図（ｈ））、そこからの伸長反応により（同図（ｉ））、両端に折返し配列を有し、ＴＰおよびＦＰに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（同図（ｊ））。この一本鎖核酸では、その３'末端に存在する折返し配列により遊離型の３'末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（同図（ｋ））、同様の伸長反応が繰り返され、１回の伸長反応あたり２倍の鎖長となる（同図（ｌ）および（ｍ））。また、同図（ｉ）において脱離したＴＰからの伸長鎖（−）では、その３'末端に存在する折返し配列により遊離型の３'末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（同図（ｎ））、そこからの伸長反応により、両端にステム−ループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（同図（ｏ））。この一本鎖核酸においても、３'末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供されるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。このようにして自動的に延長される一本鎖核酸には、ＴＰおよびＦＰに由来する配列が伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）との間に含まれているため、各プライマーがハイブリダイズして伸長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖が顕著に増幅される。
【００４５】
本発明によるプライマーセットは、ＴＰおよびＦＰ以外に、ブーストプライマー（以後、ＢＰと記載する。）を含むものとすることができる。ＢＰは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズするものであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないものとされる。
【００４６】
本発明において「競合しない」とは、そのプライマーが標的核酸にハイブリダイズすることによって他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意味する。
【００４７】
ＴＰおよびＦＰにより標的核酸が増幅された場合には、上述のように、増幅産物は標的核酸配列とその相補配列とを交互に有するものとなる。その増幅産物の３'末端には折返し配列またはループ構造が存在し、これにより提供される相補鎖合成起点から次々に伸長反応が起こっている。ＢＰは、このような増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的配列にアニ−リングすることができる。これにより、増幅産物中の標的核酸配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、核酸増幅反応がより迅速に行われるようになる。
【００４８】
ＢＰは必ずしも１種類に限定されるわけではなく、核酸増幅反応の迅速性および特異性を向上させるためには２種類以上のＢＰを同時に用いてもよい。これらのＢＰは、典型的にはＴＰおよびＦＰとは異なる配列からなるが、これらのプライマーと競合しない限りにおいて、部分的に重なる領域にハイブリダイズするものとしてもよい。ＢＰの鎖長は、好ましくは２〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜３０ヌクレオチドとされる。
【００４９】
ＢＰは、ＴＰおよびＦＰによる核酸増幅反応をより迅速に進めるための補助的な働きをその主目的とするものである。従って、ＢＰは、ＴＰおよびＦＰの各３'末端のＴｍ値よりも低いＴｍ値を有するものとすることが好ましい。また、ＢＰの増幅反応液への添加量は、ＴＰおよびＦＰのそれぞれの添加量よりも少ない方が好ましい。
【００５０】
ＢＰとしては、国際公開第０２／２４９０２号パンフレットに記載のような、ループを形成できる構造をもつものを鋳型として、そのループ部分に相補鎖合成の起点を与えるものを挙げることができるが、これに限定されるものではない。すなわち、標的核酸配列内であれば、いかなる部位に相補鎖合成起点を提供するものであってもよい。
【００５１】
図６の（ａ）から（ｎ）に、ＢＰを用いた場合の増幅反応の模式図を示す。前記増幅反応には、同図（ａ）（ｂ）（ｅ）（ｆ）（ｉ）（ｌ）、（ａ）（ｂ）（ｆ）（ｊ）（ｍ）、（ａ）（ｂ）（ｆ）（ｊ）（ｇ）（ｋ）（ｎ）、（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｋ）（ｎ）または（ａ）（ｄ）（ｈ）をそれぞれ主経路とする５つの経路が存在する。以下、これらの経路を順に説明する。まず、同図（ａ）（ｂ）（ｅ）（ｆ）（ｉ）（ｌ）を主経路とする第一の経路を説明する。本経路においては、まず、第一のプライマー（ＴＰ）が標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし（同図（ａ））、前記ＴＰの伸長反応が起き、伸長鎖ｔｐ＿１が生じる（同図（ｂ））。次に、前記伸長鎖ｔｐ＿１に、ＢＰがハイブリダイズし（同図（ｂ））、前記ＢＰの伸長反応が起き、伸長鎖ｅｌＢＰが生じる（同図（ｅ））。また、前記伸長鎖ｔｐ＿１に、第二のプライマー（ＦＰ）がハイブリダイズし（同図（ｂ））、前記ＦＰの伸長反応が起き、伸長鎖ｆｐ＿ｔｐ＿１が生じる（同図（ｆ））。次に、前記伸長鎖ｆｐ＿ｔｐ＿１に、前記伸長鎖ｅｌＢＰがハイブリダイズし（同図（ｉ））、前記伸長鎖ｅｌＢＰの伸長反応が起き、伸長鎖ｂｐ＿ｆｐ＿１が生じる（同図（ｌ））。さらに、前記伸長鎖ｂｐ＿ｆｐ＿１の３'末端でステム−ループ構造が形成され（同図（ｌ））、前記３'末端を相補鎖合成起点とした伸長反応が起こる。続いて、同図（ａ）（ｂ）（ｆ）（ｊ）（ｍ）を主経路とする第二の経路を説明する。本経路は、伸長鎖ｆｐ＿ｔｐ＿１が生じる（同図（ｆ））までは、前記第一の経路と共通である。前記伸長鎖ｆｐ＿ｔｐ＿１の３'末端でステム−ループ構造が形成され（同図（ｆ））、前記３'末端を相補鎖合成起点とした伸長反応が起こり、伸長鎖ｆｐ＿ｆｐ＿２が生じる（同図（ｊ））。次に、前記伸長鎖ｆｐ＿ｆｐ＿２の３'末端でステム−ループ構造が形成され（同図（ｊ））、前記３'末端を相補鎖合成起点とした伸長反応が起こり、伸長鎖ｆｐ＿ｆｐ＿４が生じる（同図（ｍ））。さらに、前記伸長鎖ｆｐ＿ｆｐ＿４の３'末端でステム−ループ構造が形成され（同図（ｍ））、前記３'末端を相補鎖合成起点とした伸長反応が起こる。続いて、同図（ａ）（ｂ）（ｆ）（ｊ）（ｇ）（ｋ）（ｎ）を主経路とする第三の経路を説明する。本経路は、伸長鎖ｆｐ＿ｆｐ＿２が生じる（同図（ｊ））までは、前記第二の経路と共通である。前記伸長鎖ｆｐ＿ｆｐ＿２に、ＴＰがハイブリダイズし（同図（ｊ））、前記ＴＰの伸長反応が起き、伸長鎖ｔｐ＿ｆｐ＿１が生じる（同図（ｇ））。前記伸長鎖ｔｐ＿ｆｐ＿１の３'末端でステム−ループ構造が形成され（同図（ｇ））、前記３'末端を相補鎖合成起点とした伸長反応が起こり、伸長鎖ｔｐ＿ｔｐ＿２が生じる（同図（ｋ））。また、前記伸長鎖ｔｐ＿ｔｐ＿２の３'末端でステム−ループ構造が形成され（同図（ｋ））、前記３'末端を相補鎖合成起点とした伸長反応が起こり、伸長鎖ｔｐ＿ｔｐ＿４が生じる（同図（ｎ））。さらに、前記伸長鎖ｔｐ＿ｔｐ＿４の３'末端でステム−ループ構造が形成され（同図（ｎ））、前記３'末端を相補鎖合成起点とした伸長反応が起こる。また、前記伸長鎖ｔｐ＿ｔｐ＿４に、ＴＰがハイブリダイズし（同図（ｎ））、前記ＴＰの伸長反応が起こ���。続いて、同図（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｋ）（ｎ）を主経路とする第四の経路を説明する。本経路においては、まず、ＦＰが標的核酸のアンチセンス鎖にハイブリダイズし（同図（ａ））、前記ＦＰの伸長反応が起き、伸長鎖ｆｐ＿１が生じる（同図（ｃ））。次に、前記伸長鎖ｆｐ＿１に、第一のプライマー（ＴＰ）がハイブリダイズし（同図（ｃ））、前記ＴＰの伸長反応が起き、伸長鎖ｔｐ＿ｆｐ＿１が生じる（同図（ｇ））。同図（ｇ）以後は、前記第三の経路と共通である。最後に、同図（ａ）（ｄ）（ｈ）を主経路とする第五の経路を説明する。本経路においては、まず、ＢＰが標的核酸のアンチセンス鎖にハイブリダイズし（同図（ａ））、前記ＢＰの伸長反応が起き、伸長鎖ｂｐ＿１が生じる（同図（ｄ））。次に、前記伸長鎖ｂｐ＿１に、ＴＰがハイブリダイズし（同図（ｄ））、前記ＴＰの伸長反応が起き、伸長鎖ｅｌＴＰが生じる（同図（ｈ））。なお、前記説明した反応経路は、例示であって、本発明は、前記反応経路により何ら制限および限定されるものではない。
【００５２】
本発明の第一の核酸増幅方法は、前述のとおり、鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を合成する前記相補的な核酸の増幅方法であって、下記の（Ｓ１）〜（Ｓ５）の工程を含んでいればよく、その他の点は特に制限されない。
（Ｓ１）本発明のプライマーの製造方法（０）〜（１０）のいずれかによりプライマーを製造するか、または、任意の方法により本発明のプライマー（８）を提供する工程。
（Ｓ２）鋳型核酸を提供する工程。
（Ｓ３）前記プライマーを前記鋳型核酸にアニーリングさせ、プライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む相補核酸を合成する工程。
（Ｓ４）工程（Ｓ３）により合成された相補核酸の５'側に存在する配列（Ｂ'）を同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）にハイブリダイズさせ、これにより、鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分を一本鎖とする工程。
（Ｓ５）工程（Ｓ４）により一本鎖とされた鋳型核酸上の前記配列（Ａ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（Ｓ３）により合成された相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程。なお、プライマーの製造方法（１）〜（１０）については後述する。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様によれば、工程（Ｓ５）により得られた二本鎖の核酸は工程（Ｓ４）で繰り返して使用される。すなわち、工程（Ｓ５）により得られた二本鎖の核酸は工程（Ｓ３）により得られるものと同一の構造を有するため、そのまま工程（Ｓ４）において利用される。これにより、鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を量産することができる。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の第一の核酸増幅方法は、等温で実施される。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、前記工程（Ｓ３）、前記工程（Ｓ４）および前記工程（Ｓ５）が等温で行われる。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。
【００５５】
本発明の好ましい実施態様において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。
【００５６】
本発明のプライマーセットの設計方法は、
第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸中の標的核酸配列の増幅に用いるプライマーセットの設計方法であって、
前記プライマーセットは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含み、
前記第一のプライマーを、本発明のプライマーの設計方法（０）〜（１０）のいずれかにより設計し、
前記第二のプライマーの３'末端側に、前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ｅ）に相補的な配列（Ｅｃ'）を含み、５'末端側に、前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列の前記配列（Ｅ）よりも５'側に存在する配列（Ｆ）と同じ配列（Ｆ'）を含むように設計することを特徴とする。本発明のプライマーの設計方法（０）〜（１０）のいずれかを用いた、本発明の前記プライマーセットの設計方法を、それぞれ、「プライマーセットの設計方法（０）」、「プライマーセットの設計方法（１）」、「プライマーセットの設計方法（２）」、「プライマーセットの設計方法（３）」、「プライマーセットの設計方法（４）」、「プライマーセットの設計方法（５）」、「プライマーセットの設計方法（６）」、「プライマーセットの設計方法（７）」、「プライマーセットの設計方法（８）」、「プライマーセットの設計方法（９）」、「プライマーセットの設計方法（１０）」というものとする。なお、本発明のプライマーの設計方法（１）〜（１０）については後述する。
【００５７】
また、本発明のプライマーセットの製造方法は、
第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸中の標的核酸配列の増幅に用いるプライマーセットの製造方法であって、
プライマーセットの設計工程およびプライマーセットの合成工程を含み、
前記プライマーセットの設計工程が、前基本発明のプライマーセットの設計方法によって実施されることを特徴とする。本発明のプライマーセットの設計方法（０）〜（１０）のいずれかを用いた、本発明の前記プライマーセットの製造方法を、それぞれ、「プライマーセットの製造方法（０）」、「プライマーセットの製造方法（１）」、「プライマーセットの製造方法（２）」、「プライマーセットの製造方法（３）」、「プライマーセットの製造方法（４）」、「プライマーセットの製造方法（５）」、「プライマーセットの製造方法（６）」、「プライマーセットの製造方法（７）」、「プライマーセットの製造方法（８）」、「プライマーセットの製造方法（９）」、「プライマーセットの製造方法（１０）」というものとする。
【００５８】
本発明の第二の核酸増幅方法は、前述のとおり、二本鎖からなる鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、下記の（Ｓ’１）〜（Ｓ’５）の工程を含んでいればよく、その他の点は特に制限されない。
（Ｓ’１）前記本発明のプライマーセットの製造方法によりプライマーセットを製造するか、または、前記第一のプライマーが、前記プライマー（０）もしくは前記プライマー（８）である前記本発明のプライマーセットを、任意の方法により提供する工程。
（Ｓ’２）第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸を提供する工程。
（Ｓ’３）前記第一および第二のプライマーをそれぞれ前記第一および第二の鋳型核酸にアニーリングさせ、それぞれプライマー伸長反応を行なって前記標的核酸配列の相補配列を含む第一および第二の相補核酸を合成する工程。
（Ｓ’４）工程（Ｓ’３）により合成された第一および第二の相補核酸の５'側に存在する配列（Ｂ’）および配列（Ｆ’）を、同相補核酸上に存在する配列（Ｂｃ）および配列（Ｆｃ）にそれぞれハイブリダイズさせ、これにより、第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｅ）の部分を一本鎖とする工程。
（Ｓ’５）工程（Ｓ’４）により一本鎖とされた第一および第二の鋳型核酸上の前記配列（Ａ）および配列（Ｅ）の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーをアニーリングさせて鎖置換反応を行なうことにより、工程（Ｓ’３）により合成された第一および第二の相補核酸を、前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸で置換する工程。
【００５９】
本発明の好ましい実施態様によれば、工程（Ｓ’５）により得られた二本鎖の核酸は工程（Ｓ’４）で繰り返して使用される。すなわち、工程（Ｓ’５）により得られた二本鎖の核酸は工程（Ｓ’３）により得られるものと同一の構造を有するため、そのまま工程（Ｓ’４）において利用される。これにより、鋳型核酸中の標的核酸配列と相補的な核酸を量産することができる。
【００６０】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の第二の核酸増幅方法は、等温で実施される。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、前記工程（Ｓ’３）、前記工程（Ｓ’４）および前記工程（Ｓ’５）が等温で行われる。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。
【００６１】
本発明の第一の核酸増幅方法と同様、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。
【００６２】
本発明の前記第一および第二の核酸増幅方法（以下、単に「本発明の核酸増幅方法」ということがある）において用いられる、標的核酸配列を含む鋳型核酸、または核酸試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらでもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。ＲＮＡには、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。これらの核酸は、例えば、血液、組織、細胞、さらには動物、植物のような生体由来試料、または生体由来試料、食品、土壌、排水等から分離された微生物由来試料から調製することができる。
【００６３】
鋳型核酸または核酸試料の単離は任意の方法で行うことができ、例えば、界面活性剤による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌およびフレンチプレス等を用いる方法が挙げられる。また、内在性ヌクレアーゼが存在する場合には、単離された核酸を精製することが好ましい。核酸の精製は、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、密度に依存した遠心分離等により実施することが可能である。
【００６４】
より具体的には、前記鋳型核酸または前記核酸試料としては、上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖核酸、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖核酸のいずれも使用可能である。上記二本鎖核酸の場合は、変性工程（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）を行って一本鎖とすることにより、より最適に利用することができる。
【００６５】
上記の逆転写反応に用いられる酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ  ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能である。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が最適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ等）、バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に好ましい酵素を例示すれば、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＢ．ｃａ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ）、例えばＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。例えば、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼは、反応にマンガンイオンを必要とせず、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが可能である。
【００６６】
本発明の核酸増幅方法では、鋳型核酸が二本鎖核酸の場合でも、これをそのまま反応に用いることができるが、必要に応じてそれらを変性して一本鎖にすることにより、鋳型核酸へのプライマーのアニーリングを効率よく行うこともできる。温度を約９５℃に上昇させることは、好ましい核酸変性法である。他の方法として、ｐＨを上昇させることにより変性させることも可能であるが、この場合には、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせるためにｐＨを低下させる必要がある。
【００６７】
本発明の核酸増幅方法に用いられるポリメラーゼは、鎖置換（strand  displacement）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus  stearothermophilus、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Bacillus  caldotenax、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。核酸増幅反応において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Vent  DNAポリメラーゼ、Vent  (Exo-)  DNAポリメラーゼ、DeepVent  DNAポリメラーゼ、DeepVent  (Exo-)  DNAポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Z-Taq  DNAポリメラーゼ、Pfu  DNAポリメラーゼ、Pfu  turbo  DNAポリメラーゼ、KOD  DNAポリメラーゼ、9°Nm  DNAポリメラーゼ、Therminater  DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
【００６８】
さらに、本発明の核酸増幅方法においては、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等を使うことにより、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡからの逆転写反応とｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡポリメラーゼ反応を１種類のポリメラーゼで行うことが可能である。また、ＤＮＡポリメラーゼと、ＭＭＬＶ逆転写酵素等の上述の逆転写酵素とを組み合わせて用いてもよい。
【００６９】
本発明の核酸増幅方法において使用するその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。
【００７０】
本発明の核酸増幅方法において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Ｔｍ）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調整剤を添加することにより、２本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、前記核酸増幅反応においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するＧＣの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とされる。
【００７１】
さらに、本発明の核酸増幅方法において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類等の、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。
【００７２】
さらに、本発明の核酸増幅方法において、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等の酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物とされる。
【００７３】
本発明の核酸増幅方法は、等温で実施可能である。従って、前記核酸増幅方法の好ましい実施態様によれば、前記核酸増幅方法は、核酸増幅用溶液を等温でインキュベートする工程を含んでなる。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。さらに、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。
【００７４】
一定の温度条件下での核酸増幅方法は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅方法において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。
【００７５】
本発明の核酸増幅方法においては、酵素が失活するか、またはプライマーをはじめとする試薬のうちの一つが使い尽くされるかのいずれかまで増幅反応が繰り返される。
【００７６】
本発明の核酸増幅方法においては、非天然ヌクレオチドを含む核酸を鋳型核酸とすることも可能である。本明細書において「非天然ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチドに含まれる塩基（アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンもしくはウラシル）以外の塩基を含むヌクレオチドであって、核酸配列中に取り込まれうるものを意味し、例えば、キサントシン類、ジアミノピリミジン類、isoG，isoC（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  92,  6329-6333,  1995）等が挙げられる。非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅には、一般に、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる。一方で、上記核酸増幅反応は、例えば５０℃前後の等温で行うことが可能であるため、従来のＰＣＲ法と比較して核酸増幅酵素（ＤＮＡポリメラーゼ等）が失活する可能性が低い。従って、本発明によるプライマーセットによる核酸増幅反応は、耐熱性を持たない核酸増幅酵素が用いられる非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅にも有効である。非天然ヌクレオチドを含む核酸の増幅に用いられる酵素は、そのような標的核酸を増幅可能なものであればよく、特に限定されないが、特に取り込み効率の観点から、Y188L/E478Q変異型ＨＩＶ  Ｉ  逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、９°N  DNA  ポリメラーゼ、HotTub  DNAポリメラーゼ等が好適である（Michael  Sismour1  et  al.,  Biochemistry  42,  No.28,  8598,  2003／米国特許第６６１７１０６号明細書、Michael  J.  Lutz  et  al.,  Bioorganic  &  Medical  Chemistry  letters  8,  1149-1152,  1998等）。さらに、核酸増幅酵素の耐熱性を向上させる物質、例えばトレハロース等、を反応溶液に添加することもでき、これにより、より効率的に非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅を行うことができる。
【００７７】
つぎに、前記プライマーの設計方法（１）〜（１０）、プライマーの製造方法（１）〜（１０）、プライマー（１）〜（１０）等について説明する。
【００７８】
前記プライマー（１）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーであって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の５'末端側から３塩基の配列（Ａ５'−３）と相補的な配列が、前記標的核酸の配列（Ａ）と、前記標的核酸の配列（Ａ）および配列（Ｂ）の間の配列（Ｃ）とで形成されるループ配列（Ａ−Ｃ）中において、前記３塩基の配列（Ａ５'−３）と、前記配列（Ａ５'−３）の５’末端側に隣接する３塩基の配列と、前記配列（Ａ５'−３）の３’末端側に隣接する３塩基の配列とを含む９塩基以外の配列の中に、１個以下である、
ことを特徴とする。前記プライマー（１）の、上記以外の特徴は、前記プライマー（０）と同じであっても良い。
【００７９】
例えば図９に示すように、プライマー（ＴＰ）の相補配列が折り返しによってループを形成した際に、前記ＴＰが新たにアニーリングする部位（Ａ５'−３）が１本鎖になっている割合が大きいと、効率の良い増幅が可能である。このため、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の５'末端側から３塩基の配列（Ａ５'−３）と相補的な配列が、前記標的核酸の配列（Ａ）と、前記標的核酸の配列（Ａ）および配列（Ｂ）の間の配列（Ｃ）とで形成されるループ配列（Ａ−Ｃ）中において、前記３塩基の配列（Ａ５'−３）と、前記配列（Ａ５'−３）の５’末端側に隣接する３塩基の配列と、前記配列（Ａ５'−３）の３’末端側に隣接する３塩基の配列とを含む９塩基以外の配列の中に、１個以下とする。
【００８０】
前記プライマーの設計方法（１）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの設計方法であって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の５'末端側から３塩基の配列（Ａ５'−３）と相補的な配列が、前記標的核酸の配列（Ａ）と、前記標的核酸の配列（Ａ）および配列（Ｂ）の間の配列（Ｃ）とで形成されるループ配列（Ａ−Ｃ）中において、前記３塩基の配列（Ａ５'−３）と、前記配列（Ａ５'−３）の５’末端側に隣接する３塩基の配列と、前記配列（Ａ５'−３）の３’末端側に隣接する３塩基の配列とを含む９塩基以外の配列の中に、１個以下であるように設計する、
ことを特徴とする。本発明のプライマーの設計方法は、前記プライマーの設計方法（１）であっても良い。
【００８１】
また、前記プライマーの製造方法（１）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの製造方法であって、
プライマー設計工程およびプライマーの合成工程を含み、
前記プライマーの設計工程が、上記のプライマーの設計方法（１）によって実施されることを特徴とする。本発明のプライマーの製造方法は、前記プライマーの製造方法（１）であっても良い。
【００８２】
前記プライマー（１）の設計方法および製造方法は特に制限されないが、前記プライマーの設計方法（１）により設計するか、または、前記プライマーの製造方法（１）により製造することが好ましい。
【００８３】
前記プライマー（２）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーであって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の５'末端側から３塩基の配列（Ａ５'−３）と相補的な配列が、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）と、前記配列（Ａ）の３'末端側に隣接する２０塩基の配列と、前記配列（Ａ）の５'末端側に隣接する２０塩基の配列とを含む配列（Ａ−２０）中において、前記３塩基の配列（Ａ５'−３）と、前記配列（Ａ５'−３）の５’末端側に隣接する３塩基の配列と、前記配列（Ａ５'−３）の３’末端側に隣接する３塩基の配列とを含む９塩基以外の配列の中に、１個以下であることを特徴とする。前記プライマー（２）の、上記以外の特徴は、前記プライマー（０）と同じであっても良い。
例えば図１０に示すように、ゲノム配列上において前記プライマー（ＴＰ）がアニーリングする部位が１本鎖になっている割合が大きいと、効率の良い増幅が可能である。このために、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の５'末端側から３塩基の配列（Ａ５'−３）と相補的な配列が、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）と、前記配列（Ａ）の３'末端側に隣接する２０塩基の配列と、前記配列（Ａ）の５'末端側に隣接する２０塩基の配列とを含む配列（Ａ−２０）中において、前記３塩基の配列（Ａ５'−３）と、前記配列（Ａ５'−３）の５’末端側に隣接する３塩基の配列と、前記配列（Ａ５'−３）の３’末端側に隣接する３塩基の配列とを含む９塩基以外の配列の中に、１個以下とする。
【００８４】
前記プライマーの設計方法（２）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの設計方法であって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の５'末端側から３塩基の配列（Ａ５'−３）と相補的な配列が、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）と、前記配列（Ａ）の３'末端側に隣接する２０塩基の配列と、前記配列（Ａ）の５'末端側に隣接する２０塩基の配列とを含む配列（Ａ−２０）中において、前記３塩基の配列（Ａ５'−３）と、前記配列（Ａ５'−３）の５’末端側に隣接する３塩基の配列と、前記配列（Ａ５'−３）の３’末端側に隣接する３塩基の配列とを含む９塩基以外の配列の中に、１個以下であるように設計する、
ことを特徴とする。本発明のプライマーの設計方法は、前記プライマーの設計方法（２）であっても良い。
【００８５】
また、前記プライマーの製造方法（２）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの製造方法であって、
プライマー設計工程およびプライマーの合成工程を含み、
前記プライマーの設計工程が、上記のプライマーの設計方法（２）によって実施されることを特徴とする。本発明のプライマーの製造方法は、前記プライマーの製造方法（２）であっても良い。
【００８６】
前記プライマー（２）の設計方法および製造方法は特に制限されないが、前記プライマーの設計方法（２）により設計するか、または、前記プライマーの製造方法（２）により製造することが好ましい。
【００８７】
前記プライマー（３）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーであって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記標的核酸配列の前記配列（Ｂ）の５'末端側から６塩基において、ＧおよびＣの割合が４塩基以上であることを特徴とするプライマーである。前記プライマー（３）の、上記以外の特徴は、前記本発明のプライマー（０）と同じであっても良い。
具体的には、例えば図１１に示すとおりである。前記標的核酸配列の前記配列（Ｂ）の５'末端側から６塩基（（Ｂｃ）の３'末端側から６塩基）において、ＧおよびＣの割合が４塩基以上であると、この部分におけるハイブリダイズ結合が強いために、図示の配列（Ａ）と、配列（Ａ）および（Ｂ）の間の配列とで形成されるループが強固で、増幅反応が効率よく行われやすい。
【００８８】
前記プライマーの設計方法（３）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの設計方法であって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記標的核酸配列の前記配列（Ｂ）の５'末端側から６塩基において、ＧおよびＣの割合が４塩基以上となるように設計することを特徴とする。本発明のプライマーの設計方法は、前記プライマーの設計方法（３）であっても良い。
【００８９】
また、前記プライマーの製造方法（３）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの製造方法であって、
プライマー設計工程およびプライマーの合成工程を含み、
前記プライマーの設計工程が、上記のプライマーの設計方法（３）によって実施されることを特徴とする。本発明のプライマーの製造方法は、前記プライマーの製造方法（３）であっても良い。
【００９０】
前記プライマー（３）の設計方法および製造方法は特に制限されないが、前記プライマーの設計方法（３）により設計するか、または、前記プライマーの製造方法（３）により製造することが好ましい。
【００９１】
前記プライマー（４）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーであって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の５’末端側から９塩基目から１３塩基目までの５塩基の配列（Ａ５’−９−１３）のうち、連続する任意の３塩基の配列（Ａ５’−９−１３（３））と相補的な配列が、前記配列（Ａ５’−９−１３（３））の５’末端側に３塩基を隔てて隣接する２０塩基の配列（ただし、前記配列（Ｂ）および前記配列（Ｂ）の５’末端側に隣接する配列を除く）、および、前記配列（Ａ５’−９−１３（３））の３’末端側に３塩基を隔てて隣接する２０塩基の配列（ただし、前記配列（Ｂ）と相補的な配列（Ｂｃ）および前記配列（Ｂｃ）の３’末端側に隣接する配列を除く）の中に１個以下であるか、または、
前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の３’末端側から６塩基目から１０塩基目までの５塩基の配列（Ａ３’−６−１０）のうち、連続する任意の３塩基の配列（Ａ３’−６−１０（３））と相補的な配列が、前記配列（Ａ３’−６−１０（３））の５’末端側に３塩基を隔てて隣接する２０塩基の配列（ただし、前記配列（Ｂ）および前記配列（Ｂ）の５’末端側に隣接する配列を除く）、および、前記配列（Ａ３’−６−１０（３））の３’末端側に３塩基を隔てて隣接する２０塩基の配列（ただし、前記配列（Ｂ）と相補的な配列（Ｂｃ）および前記配列（Ｂｃ）の３’末端側に隣接する配列を除く）の中に１個以下であるように設計することを特徴とする。前記プライマー（４）の、上記以外の特徴は、前記プライマー（０）と同じであっても良い。
例えば図１２に示すように、前記プライマー（ＴＰ）の相補配列が折り返しによってループを形成した際に、前記ＴＰが新たにアニーリングする部位（Ａ３'−３）が１本鎖になっている割合が大きいと、効率の良い増幅が可能である。このため、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の５’末端側から数えて９塩基目から１３塩基目までの５塩基のうち、任意に選んだ連続する３塩基と相補的な配列が、当該連続する３塩基の５’末端から上流側に数えた配列の４塩基目から（すなわち、５’末端側に３塩基を隔てて隣接する）最大２３塩基目までの計最大２０塩基（ただし配列（Ｂ）およびその上流側の配列は含まない）および当該連続する３塩基の３’末端から下流側に数えた配列の４塩基目から（すなわち、３’末端側に３塩基を隔てて隣接する）最大２３塩基目までの計最大２０塩基（ただしターンバック配列（Ｂｃ）およびその下流側の配列は含まない）の中に、１個以下とするか、または、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の３’末端側から数えて６塩基目から１０塩基目までの５塩基のうち、任意に選んだ連続する３塩基と相補的な配列が、当該連続する３塩基の５’末端から上流側に数えた配列の４塩基目から（すなわち、５’末端側に３塩基を隔てて隣接する）最大２３塩基目までの計最大２０塩基（ただし配列（Ｂ）およびその上流側の配列は含まない）および当該連続する３塩基の３’末端から下流側に数えた配列の４塩基目から（すなわち、３’末端側に３塩基を隔てて隣接する）最大２３塩基目までの計最大２０塩基（ただしターンバック配列（Ｂｃ）およびその下流側の配列は含まない）の中に、１個以下とする。なお、本発明において、塩基配列の「上流側」は、特に断らない限り、５’末端側をいう。塩基配列の「下流側」は、特に断らない限り、３’末端側をいう。また、「塩基」は、特に断らない限り、核酸塩基（「ベース」とも言われることがある）をいう。
【００９２】
前記プライマー（４）が効果のある科学的理由は、より具体的には、例えば下記１．〜３．のように説明できる。ただし、これらは、あくまで理論的考察の一例であって、本発明を何ら限定しない。
１．ループの端はステム構造によって固定されているため、新しいＴＰがらせん状にハイブリダイズする必要がある。
２．ＴＰの５'端はターンバックの領域があり長いため、５'側が先に核を作り、３'側がらせん状にハイブリダイズするほうが有利である。
３．５'端はステム構造の立体障害があるため、初めの核形成は５'端からある程度離れていたほうが有利である。
【００９３】
前記プライマーの設計方法（４）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの設計方法であって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の５’末端側から９塩基目から１３塩基目までの５塩基の配列（Ａ５’−９−１３）のうち、連続する任意の３塩基の配列（Ａ５’−９−１３（３））と相補的な配列が、前記配列（Ａ５’−９−１３（３））の５’末端側に３塩基を隔てて隣接する２０塩基の配列（ただし、前記配列（Ｂ）および前記配列（Ｂ）の５’末端側に隣接する配列を除く）、および、前記配列（Ａ５’−９−１３（３））の３’末端側に３塩基を隔てて隣接する２０塩基の配列（ただし、前記配列（Ｂ）と相補的な配列（Ｂｃ）および前記配列（Ｂｃ）の３’末端側に隣接する配列を除く）の中に１個以下であるか、または、
前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の３’末端側から６塩基目から１０塩基目までの５塩基の配列（Ａ３’−６−１０）のうち、連続する任意の３塩基の配列（Ａ３’−６−１０（３））と相補的な配列が、前記配列（Ａ３’−６−１０（３））の５’末端側に３塩基を隔てて隣接する２０塩基の配列（ただし、前記配列（Ｂ）および前記配列（Ｂ）の５’末端側に隣接する配列を除く）、および、前記配列（Ａ３’−６−１０（３））の３’末端側に３塩基を隔てて隣接する２０塩基の配列（ただし、前記配列（Ｂ）と相補的な配列（Ｂｃ）および前記配列（Ｂｃ）の３’末端側に隣接する配列を除く）の中に１個以下であるように設計することを特徴とする。本発明のプライマーの設計方法は、前記プライマーの設計方法（４）であっても良い。
【００９４】
前記プライマーの製造方法（４）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの製造方法であって、
プライマー設計工程およびプライマーの合成工程を含み、
前記プライマーの設計工程が、上記のプライマーの設計方法（４）によって実施されることを特徴とする。本発明のプライマーの製造方法は、前記プライマーの製造方法（４）であっても良い。
【００９５】
前記プライマー（４）の設計方法および製造方法は特に制限されないが、前記プライマーの設計方法（４）により設計するか、または、前記プライマーの製造方法（４）により製造することが好ましい。
【００９６】
前記プライマー（５）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーであって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記プライマーの前記配列（Ａｃ’）の３’末端側から６塩基の配列（Ａｃ’３’−６）と相補的な配列が、前記プライマーの伸長反応で形成される反応中間体の配列であって前記プライマーの配列およびその相補配列部分を除く配列の中に、存在しない（０個）ように設計することを特徴とする。前記プライマー（５）の、上記以外の特徴は、前記本発明のプライマー（０）と同じであっても良い。
具体的には、例えば図１３に示すとおりである。前記プライマーの３’末端側から６塩基の配列と相補的な配列が、前記プライマーの伸長反応で形成される反応中間体の配列であって前記プライマーの配列およびその相補配列部分を除く配列の中に、存在しない（０個）と、前記プライマー（ＴＰ）が本来設計した場所以外の場所にハイブリダイズすることを防止しやすく、増幅反応を効率よく行うことができる。
【００９７】
前記プライマーの設計方法（５）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの設計方法であって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記プライマーの前記配列（Ａｃ’）の３’末端側から６塩基の配列（Ａｃ’３’−６）と相補的な配列が、前記プライマーの伸長反応で形成される反応中間体の配列であって前記プライマーの配列およびその相補配列部分を除く配列の中に、存在しない（０個）ように設計することを特徴とする。本発明のプライマーの設計方法は、前記プライマーの設計方法（５）であっても良い。
【００９８】
また、前記プライマーの製造方法（５）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの製造方法であって、
プライマー設計工程およびプライマーの合成工程を含み、
前記プライマーの設計工程が、上記のプライマーの設計方法（５）によって実施されることを特徴とする。本発明のプライマーの製造方法は、前記プライマーの製造方法（５）であっても良い。
【００９９】
前記プライマー（５）の設計方法および製造方法は特に制限されないが、前記プライマーの設計方法（５）により設計するか、または、前記プライマーの製造方法（５）により製造することが好ましい。
【０１００】
前記プライマー（６）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーであって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記プライマーの前記配列（Ａｃ’）の３’末端側から３塩基の配列（Ａｃ’３’−３）と相補的な配列が、前記プライマー中に、存在しない（０個）ことを特徴とする。前記プライマー（６）の、上記以外の特徴は、前記プライマー（０）と同じであっても良い。
前記３塩基の配列は、例えば、図１４（ａ）の模式図に示すとおりである。このように、プライマーにおける３'末端側から３塩基の配列と相補的な配列が、同種のプライマーの配列の中に存在しないことにより、同種のプライマー同士が望ましくない増幅反応を起こすことを防止しやすい。
【０１０１】
前記プライマーの設計方法（６）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの設計方法であって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記プライマーの前記配列（Ａｃ’）の３’末端側から３塩基の配列（Ａｃ’３’−３）と相補的な配列が、前記プライマー中に、存在しない（０個）ように設計する、
ことを特徴とする。。本発明のプライマーの設計方法は、前記プライマーの設計方法（６）であっても良い。
【０１０２】
前記プライマーの製造方法（６）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの製造方法であって、
プライマー設計工程およびプライマーの合成工程を含み、
前記プライマーの設計工程が、上記のプライマーの設計方法（６）によって実施されることを特徴とする。。本発明のプライマーの製造方法は、前記プライマーの製造方法（６）であっても良い。
【０１０３】
前記プライマー（６）の設計方法および製造方法は特に制限されないが、前記プライマーの設計方法（６）により設計するか、または、前記プライマーの製造方法（６）により製造することが好ましい。
【０１０４】
本発明のプライマーセットの設計方法は、
第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸中の標的核酸配列の増幅に用いるプライマーセットの設計方法であって、
前記プライマーセットは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含み、
前記第一のプライマーの３'末端側に、前記第一の鋳型核酸中の前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記第一のプライマーの５'末端側に、前記第一の鋳型核酸中の前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記第二のプライマーの３'末端側に、前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ｅ）に相補的な配列（Ｅｃ'）を含み、
前記第二のプライマーの５'末端側に、前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列の前記配列（Ｅ）よりも５'側に存在する配列（Ｆ）と同じ配列（Ｆ'）を含み、
前記第一のプライマーの前記配列（Ａｃ’）の３’末端側から３塩基の配列（Ａｃ’３’−３）と相補的な配列が、前記第二のプライマー中に、存在せず（０個）、
前記第二のプライマーの前記配列（Ｅｃ’）の３’末端側から３塩基の配列（Ｅｃ’３’−３）と相補的な配列が、前記第一のプライマー中に、存在しない（０個）ように設計する、
ことを特徴とするプライマーセットの設計方法であっても良い。このような本発明のプライマーセットの設計方法を、「プライマーセットの設計方法（６’）」というものとする。このようなプライマーセットの設計方法（６’）により設計されるプライマーセットのその他の特徴は、例えば、前述した本発明のプライマーセットと同じであっても良い。なお、前記第一のプライマー中における前記３塩基の配列の位置は、例えば図１４（ｂ）の模式図に示す通りである。このように、前記第一のプライマーにおける３'末端側から３塩基の配列と相補的な配列が、前記第二のプライマーの配列の中に存在しないことにより、前記第一のプライマーと前記第二のプライマーとが望ましくない増幅反応を起こすことを防止しやすい。
【０１０５】
前記プライマーセットの設計方法（６’）において、
前記第一のプライマーの前記配列（Ａｃ’）の３’末端側から３塩基の配列（Ａｃ’３’−３）と相補的な配列が、前記第一のプライマー中に、存在せず（０個）、
前記第二のプライマーの前記配列（Ｅｃ’）の３’末端側から３塩基の配列（Ｅｃ’３’−３）と相補的な配列が、前記第二のプライマー中に、存在しない（０個）ように設計することが好ましい。これにより、前記第一のプライマー同士、および前記第二のプライマー同士が望ましくない増幅反応を起こすことを防止しやすい。
【０１０６】
本発明のプライマーセットの製造方法は、
第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸中の標的核酸配列の増幅に用いるプライマーセットの製造方法であって、
プライマーセットの設計工程およびプライマーセットの合成工程を含み、
前記プライマーセットの設計工程が、前記プライマーセットの設計方法（６’）によって実施されることを特徴とするプライマーセットの製造方法であっても良い。このようなプライマーセットの製造方法を、「プライマーセットの製造方法（６’）」というものとする。
【０１０７】
前記プライマー（７）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーであって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記プライマーの前記配列（Ｂ’）の５’末端側から３塩基の配列（Ｂ’５’−３）と相補的な配列が、前記プライマー配列の中に２個以下であるように設計することを特徴とする。前記プライマー（７）の、上記以外の特徴は、前記本発明のプライマー（０）と同じであっても良い。
具体的には、例えば図１５に示すとおりである。このように、任意の一つのプライマーにおける５’末端側から３塩基の配列と相補的な配列が、同一のプライマー配列の中に２個以下にすると、同じプライマー同士がダイマーを形成して望ましくない増幅反応を起こすことや、ターンバックする働きを阻害することを防止しやすいと考えられる。
【０１０８】
前記プライマーの設計方法（７）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの設計方法であって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記プライマーの前記配列（Ｂ’）の５’末端側から３塩基の配列（Ｂ’５’−３）と相補的な配列が、前記プライマー配列の中に２個以下であるように設計することを特徴とする。本発明のプライマーの設計方法は、前記プライマーの設計方法（７）であっても良い。
【０１０９】
前記プライマーの製造方法（７）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの製造方法であって、
プライマー設計工程およびプライマーの合成工程を含み、
前記プライマーの設計工程が、上記のプライマーの設計方法（７）によって実施されることを特徴とする。本発明のプライマーの製造方法は、前記プライマーの製造方法（７）であっても良い。
【０１１０】
前記プライマー（７）の設計方法および製造方法は特に制限されないが、前記プライマーの設計方法（７）により設計するか、または、前記プライマーの製造方法（７）により製造することが好ましい。
【０１１１】
前記プライマー（８）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーであって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の５'末端側から４塩基目から１０塩基目までの７塩基のうち連続する任意の４塩基の配列（Ａ５’−４−１０（４））と相補的な配列が、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）と、前記配列（Ａ）の３'末端側に隣接する２０塩基の配列と、前記配列（Ａ）の５'末端側に隣接する２０塩基の配列とを含む配列（Ａ−２０）中において、前記配列（Ａ５’−４−１０（４））と、前記配列（Ａ５’−４−１０（４））の５’末端側に隣接する３塩基の配列と、前記配列（Ａ５’−４−１０（４））の３’末端側に隣接する３塩基の配列とを含む１０塩基以外の配列の中に、２個以上であることを特徴とする。本発明のプライマーは、前記プライマー（８）であっても良い。前記プライマー（８）の、上記以外の特徴は、前記本発明のプライマー（０）と同じであっても良い。
例えば図１６に示すように、ゲノム配列上において前記プライマー（ＴＰ）がアニーリングする部位が１本鎖になっている割合が大きいと、効率の良い増幅が可能である。このために、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の５'末端側から数えて４塩基目から１０塩基目までの７塩基のうち任意に選んだ連続する４塩基と相補的な配列が、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）と、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の３'末端側に隣接する２０塩基の配列と、前記標的核酸配列（Ａ）の５'末端側に隣接する２０塩基の配列とを含む配列の中に、当該連続する４塩基、その上流側３塩基およびその下流側３塩基の計１０塩基の領域を除いて、２個以上であるようにする。
【０１１２】
前記プライマーの設計方法（８）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの設計方法であって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）の５'末端側から４塩基目から１０塩基目までの７塩基のうち連続する任意の４塩基の配列（Ａ５’−４−１０（４））と相補的な配列が、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）と、前記配列（Ａ）の３'末端側に隣接する２０塩基の配列と、前記配列（Ａ）の５'末端側に隣接する２０塩基の配列とを含む配列（Ａ−２０）中において、前記配列（Ａ５’−４−１０（４））と、前記配列（Ａ５’−４−１０（４））の５’末端側に隣接する３塩基の配列と、前記配列（Ａ５’−４−１０（４））の３’末端側に隣接する３塩基の配列とを含む１０塩基以外の配列の中に、２個以上であるように設計する、
ことを特徴とする。本発明のプライマーの設計方法は、前記プライマーの設計方法（８）であっても良い。
【０１１３】
前記プライマーの製造方法（８）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの製造方法であって、
プライマー設計工程およびプライマーの合成工程を含み、
前記プライマーの設計工程が、上記のプライマーの設計方法（８）によって実施されることを特徴とする。本発明のプライマーの製造方法は、前記プライマーの製造方法（８）であっても良い。
【０１１４】
前記プライマー（８）の設計方法および製造方法は特に制限されないが、前記プライマーの設計方法（８）により設計するか、または、前記プライマーの製造方法（８）により製造することが好ましい。
【０１１５】
前述した本発明のプライマーセットにおいて、本発明の核酸増幅用プライマーを、前記本発明のプライマー（８）としても良い。このようなプライマーセットも、本発明のプライマーセットに含まれる。すなわち、本発明のプライマーセットは、
第一の鋳型核酸および第二の鋳型核酸からなる二本鎖鋳型核酸中の標的核酸配列の増幅に用いるプライマーセットであって、
前記プライマーセットは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含み、
前記第一のプライマーは、前記プライマー（８）であり、
前記第二のプライマーは、３'末端側に、前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ｅ）に相補的な配列（Ｅｃ'）を含み、５'末端側に、前記第二の鋳型核酸中の前記標的核酸配列の前記配列（Ｅ）よりも５'側に存在する配列（Ｆ）と同じ配列（Ｆ'）を含むことを特徴とするプライマーセットであっても良い。
【０１１６】
また、前述した本発明の核酸の増幅方法において、本発明の核酸増幅用プライマーを、前記本発明のプライマー（８）としても良い。このような核酸の増幅方法も、本発明の核酸の増幅方法に含まれる。
【０１１７】
前記プライマー（９）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーであって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記標的核酸配列の前記配列（Ｂ）の３'末端側から４塩基の配列（Ｂ３’−４）と相補的な配列が、前記配列（Ｂ３’−４）の５’末端側に３塩基を隔てて隣接する２０塩基の配列、および、前記配列（Ｂ３’−４）の３’末端側に３塩基を隔てて隣接する２０塩基の配列の中に、１個以上であるように設計することを特徴とする。前記プライマー（９）の、上記以外の特徴は、前記本発明のプライマー（０）と同じであっても良い。
例えば図１７に示すように、ゲノム配列上において前記プライマー（ＴＰ）がターンバックする領域が１本鎖になっている確率が大きいと、効率の良い増幅が可能である。このために、前記標的核酸配列の前記配列（Ｂ）の３'末端側から４塩基と相補的な配列が、当該４塩基の５’末端から上流側に数えた配列の４塩基目から（すなわち、５’末端側に３塩基を隔てて隣接する）２３塩基目までの２０塩基、および当該４塩基の３’末端から下流側に数えた配列の４塩基目から（すなわち、３’末端側に３塩基を隔てて隣接する）２３塩基目までの２０塩基の中に、１個以上とする。
【０１１８】
前記プライマーの設計方法（９）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの設計方法であって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記標的核酸配列の前記配列（Ｂ）の３'末端側から４塩基の配列（Ｂ３’−４）と相補的な配列が、前記配列（Ｂ３’−４）の５’末端側に３塩基を隔てて隣接する２０塩基の配列、および、前記配列（Ｂ３’−４）の３’末端側に３塩基を隔てて隣接する２０塩基の配列の中に、１個以上であるように設計することを特徴とする。本発明のプライマーの設計方法は、前記プライマーの設計方法（９）であっても良い。
【０１１９】
前記プライマーの製造方法（９）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの製造方法であって、
プライマー設計工程およびプライマーの合成工程を含み、
前記プライマーの設計工程が、上記のプライマーの設計方法（９）によって実施されることを特徴とする。本発明のプライマーの製造方法は、前記プライマーの製造方法（９）であっても良い。
【０１２０】
前記プライマー（９）の設計方法および製造方法は特に制限されないが、前記プライマーの設計方法（９）により設計するか、または、前記プライマーの製造方法（９）により製造することが好ましい。
【０１２１】
前記プライマー（１０）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーであって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記配列（Ａｃ’）の３’末端側から６塩基目から１３塩基目までの８塩基の配列（Ａｃ’３’−６−１３）のうち、連続する任意の５塩基の配列（Ａｃ’−３’−６−１３（５））と相補的な配列が、前記プライマー配列の中に存在しないように設計することを特徴とする。前記プライマー（１０）の、上記以外の特徴は、前記プライマー（０）と同じであっても良い。
具体的には、例えば図１８に示すとおりである。このように、任意の一つのプライマーにおける３’末端側から数えて７塩基目から１１塩基目までの５塩基の配列と相補的な配列が、前記プライマー配列の中に存在しないようにすると、その領域における一本鎖構造を維持することでハイブリダイゼーションの核形成が容易になり、効率的な増幅反応に寄与することが考えられる。
【０１２２】
前記プライマーの設計方法（１０）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの設計方法であって、
前記プライマーの３'末端側に、前記標的核酸配列の３'末端側の配列（Ａ）に相補的な配列（Ａｃ'）を含み、
前記プライマーの５'末端側に、前記標的核酸配列の前記配列（Ａ）よりも５'側に存在する配列（Ｂ）と同じ配列（Ｂ'）を含み、
前記配列（Ａｃ’）の３’末端側から６塩基目から１３塩基目までの８塩基の配列（Ａｃ’３’−６−１３）のうち、連続する任意の５塩基の配列（Ａｃ’−３’−６−１３（５））と相補的な配列が、前記プライマー配列の中に存在しないように設計することを特徴とする。本発明のプライマーの設計方法は、前記プライマーの設計方法（１０）であっても良い。
【０１２３】
前記プライマーの製造方法（１０）は、
標的核酸配列の増幅に用いるプライマーの製造方法であって、
プライマー設計工程およびプライマーの合成工程を含み、
前記プライマーの設計工程が、上記のプライマーの設計方法（１０）によって実施されることを特徴とする。本発明のプライマーの製造方法は、前記プライマーの製造方法（１０）であっても良い。
【０１２４】
前記プライマー（１０）の設計方法および製造方法は特に制限されないが、前記プライマーの設計方法（１０）により設計するか、または、前記プライマーの製造方法（１０）により製造することが好ましい。
【実施例】
【０１２５】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により、なんら制限および限定されない。
【０１２６】
Ｔｍ値（融解温度）の予測
Ｔｍ値予測は、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアパッケージ（S.Rozenら、  Bioinformatics  Methods  and  Protocols:  Methods  in  Molecular  Biology.  Humana  Press,  Totowa,NJ,365-386(2000).）中の「ｏｌｉｇｏｔｍ」ソフトウェアを使用して行った。前記Ｔｍ値予測時のシミュレーションにおいて、イオン条件は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ+および８ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｍｇ2+に設定した。
【０１２７】
ＴＰプライマーの配列
標的核酸配列を、２つのＴＰを使用して検出するためのＴＰの配列を以下の方法で決定した。まず、一方のＴＰについて、配列（Ａｃ'）の長さが１２〜２５塩基、Ｔｍ値が５０〜６０℃、ＧＣ含有量が４０〜６０％となるように、前記配列（Ａｃ'）を決定した。前記配列（Ａｃ'）に対応する標的核酸配列中の配列（Ａ）の１５〜４０塩基上流に、配列（Ｂ）を設定し、前記配列（Ｂ）に対応するＴＰの（Ｂ'）を決定した。これによって決定されたＴＰをＦ１  ＴＰとした。さらに、Ｆ１  ＴＰの配列（Ａｃ'）に対応する標的核酸配列中の配列（Ａ）を１塩基上流に移動させた配列に相補的な配列を、Ｆ２  ＴＰの配列（Ａｃ'）とした。以下、同様にして順番にＦ３  ＴＰ〜Ｆ８  ＴＰの配列（Ａｃ'）を決定し、Ｆｏｒｗａｒｄ  ＴＰ（Ｆ１  ＴＰ〜Ｆ８  ＴＰ）とした。なお、配列（Ｂ'）は、前記Ｆｏｒｗａｒｄ  ＴＰ全てで同一である。また、これらのＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰと対になって使用されるＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰ（Ｒ１  ＴＰ〜Ｒ８  ＴＰ）を、増幅配列の長さが２００ｂｐ以内になるように決定した。配列（Ａｃ'）および配列（Ｂ'）の決定方法は、前記Ｆ１  ＴＰ〜Ｆ８  ＴＰの場合と同様である。２１種類のターゲット配列に対して、以上の方法により、Ｆ１  ＴＰ〜Ｆ８  ＴＰおよびＲ１  ＴＰ〜Ｒ８  ＴＰを決定し、合計２００対（４００種類）のＴＰを設計し、作製した。なお、上記標的核酸配列（２１種類のＳＮＰターゲット配列）および対応するＴＰの配列を、以下に示す。
【０１２８】
Beta-2  AR（配列番号１）            GGTCCGCCCGCTGAGGCGCCCCCAGCCAGTGCGCTCACCTGCCAGACTGCGCGCCATGGGGCAACCCGGGAACGGCAGCGCCTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGGACCACGACGTCACGCAGCAAAGGGACGAGGTGTGGGTGGTGGGCATGGGCATCGTCATGTCTCTCATCGTCCTGGCCATCGTGTT
Beta-2  AR    B2  TP-F1（配列番号２）CTATTGGGTGCATGGGGCAACCCGGGAACG
Beta-2  AR    B2  TP-F2（配列番号３）CTATTGGGTGCCATGGGGCAACCCGGGAAC
Beta-2  AR    B2  TP-F3（配列番号４）CTATTGGGTGGCCATGGGGCAACCCGGGAA
Beta-2  AR    B2  TP-F4（配列番号５）CTATTGGGTGCGCCATGGGGCAACCCGGGA
Beta-2  AR    B2  TP-F5（配列番号６）CTATTGGGTGGCGCCATGGGGCAACCCGGG
Beta-2  AR    B2  TP-F6（配列番号７）CTATTGGGTGCGCGCCATGGGGCAACCCGG
Beta-2  AR    B2  TP-F7（配列番号８）CTATTGGGTGGCGCGCCATGGGGCAACCCG
Beta-2  AR    B2  TP-F8（配列番号９）CTATTGGGTGTGCGCGCCATGGGGCAACCC
Beta-2  AR    B2  TP-R1（配列番号１０）AGAAGCCATGCACCCACACCTCGTCCCTTT
Beta-2  AR    B2  TP-R2（配列番号１１）AGAAGCCATGCCACCCACACCTCGTCCCTT
Beta-2  AR    B2  TP-R3（配列番号１２）AGAAGCCATGACCACCCACACCTCGTCCCT
Beta-2  AR    B2  TP-R4（配列番号１３）AGAAGCCATGCACCACCCACACCTCGTCCC
Beta-2  AR    B2  TP-R5（配列番号１４）AGAAGCCATGCCACCACCCACACCTCGTCC
Beta-2  AR    B2  TP-R6（配列番号１５）AGAAGCCATGCCCACCACCCACACCTCGTC
Beta-2  AR    B2  TP-R7（配列番号１６）AGAAGCCATGGCCCACCACCCACACCTCGT
Beta-2  AR    B2  TP-R8（配列番号１７）AGAAGCCATGTGCCCACCACCCACACCTCG
Beta-3  AR（配列番号１８）        TAGCCGGGGCCCTGCTGGCGCTGGCGGTGCTGGCCACCGTGGGAGGCAACCTGCTGGTCATCGTGGCCATCGCCTGGACTCCGAGACTCCAGACCATGACCAACGTGTTCGTGACTTCGCTGGCCGCAGCCGACCTGGTGATGGGACTC
Beta-3  AR    B3  TP-F1（配列番号１９）CAGGCGATGGCTGGCCACCGTGGGAGGCA
Beta-3  AR    B3  TP-F2（配列番号２０）CAGGCGATGTGCTGGCCACCGTGGGAGGC
Beta-3  AR    B3  TP-F3（配列番号２１）CAGGCGATGGTGCTGGCCACCGTGGGAGG
Beta-3  AR    B3  TP-F4（配列番号２２）CAGGCGATGGGTGCTGGCCACCGTGGGAG
Beta-3  AR    B3  TP-F5（配列番号２３）CAGGCGATGCGGTGCTGGCCACCGTGGGA
Beta-3  AR    B3  TP-F6（配列番号２４）CAGGCGATGGCGGTGCTGGCCACCGTGGG
Beta-3  AR    B3  TP-F7（配列番号２５）CAGGCGATGGGCGGTGCTGGCCACCGTGG
Beta-3  AR    B3  TP-F8（配列番号２６）CAGGCGATGTGGCGGTGCTGGCCACCGTG
Beta-3  AR    B3  TP-R1（配列番号２７）CTGGACTCCAGCGAAGTCACGAACACGTT
Beta-3  AR    B3  TP-R2（配列番号２８）CTGGACTCCCAGCGAAGTCACGAACACGT
Beta-3  AR    B3  TP-R3（配列番号２９）CTGGACTCCCCAGCGAAGTCACGAACACG
Beta-3  AR    B3  TP-R4（配列番号３０）CTGGACTCCGCCAGCGAAGTCACGAACAC
Beta-3  AR    B3  TP-R5（配列番号３１）CTGGACTCCGGCCAGCGAAGTCACGAACA
Beta-3  AR    B3  TP-R6（配列番号３２）CTGGACTCCCGGCCAGCGAAGTCACGAAC
Beta-3  AR    B3  TP-R7（配列番号３３）CTGGACTCCGCGGCCAGCGAAGTCACGAA
Beta-3  AR    B3  TP-R8（配列番号３４）CTGGACTCCTGCGGCCAGCGAAGTCACGA
UCP1（配列番号３５）        AATGAGAGAATTATGGGAAAGTATAGAACACTATTCAAATGCAAAGCACTGTATGATTTTTATTTAATAGGAAGACATTTTGTGCAGCGATTTCTGATTGACCACAGTTTGATCAAGTGCATTTGTTAATGTGTTCTACATTTTCAAAAAGGAAAGGAGAATTTGTTACATTCAGAACTTGCTGCCACTCCTTTGCTACGTCATAAAGGGTCAGTTGCCCTTGCTCATACTGA
UCP1    UCP  TP-F1（配列番号３６）CTTGATCAAACTGTAATAGGAAGACATTTTGTGCAGCG
UCP1    UCP  TP-F2（配列番号３７）CTTGATCAAACTGTTAATAGGAAGACATTTTGTGCAGC
UCP1    UCP  TP-F3（配列番号３８）CTTGATCAAACTGTTTAATAGGAAGACATTTTGTGCAG
UCP1    UCP  TP-F4（配列番号３９）CTTGATCAAACTGATTTAATAGGAAGACATTTTGTGCA
UCP1    UCP  TP-F5（配列番号４０）CTTGATCAAACTGTATTTAATAGGAAGACATTTTGTGC
UCP1    UCP  TP-F6（配列番号４１）CTTGATCAAACTGTTATTTAATAGGAAGACATTTTGTG
UCP1    UCP  TP-F7（配列番号４２）CTTGATCAAACTGTTTATTTAATAGGAAGACATTTTGT
UCP1    UCP  TP-F8（配列番号４３）CTTGATCAAACTGTTTTATTTAATAGGAAGACATTTTG
UCP1    UCP  TP-R1（配列番号４４）CAAGTGCATTTGTGTAACAAATTCTCCTTTCCTTTTTG
UCP1    UCP  TP-R2（配列番号４５）CAAGTGCATTTGTTGTAACAAATTCTCCTTTCCTTTTT
UCP1    UCP  TP-R3（配列番号４６）CAAGTGCATTTGTATGTAACAAATTCTCCTTTCCTTTT
UCP1    UCP  TP-R4（配列番号４７）CAAGTGCATTTGTAATGTAACAAATTCTCCTTTCCTTT
UCP1    UCP  TP-R5（配列番号４８）CAAGTGCATTTGTGAATGTAACAAATTCTCCTTTCCTT
UCP1    UCP  TP-R6（配列番号４９）CAAGTGCATTTGTTGAATGTAACAAATTCTCCTTTCCT
UCP1    UCP  TP-R7（配列番号５０）CAAGTGCATTTGTCTGAATGTAACAAATTCTCCTTTCC
UCP1    UCP  TP-R8（配列番号５１）CAAGTGCATTTGTTCTGAATGTAACAAATTCTCCTTTC
G2＿template（配列番号５２）        GGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGG
norovirus  G2  1    G2  fTP1-1（配列番号５３）CTCATCCATCTGGGCATGGATTTTTACGTG
norovirus  G2  1    G2  fTP1-2（配列番号５４）TCTCATCCATCTGCATGGATTTTTACGTGC
norovirus  G2  1    G2  fTP1-3（配列番号５５）ATCTCATCCATCCATGGATTTTTACGTGCC
norovirus  G2  1    G2  fTP1-4（配列番号５６）AATCTCATCCATATGGATTTTTACGTGCCC
norovirus  G2  1    G2  fTP1-5（配列番号５７）GAATCTCATCCATGGATTTTTACGTGCCCA
norovirus  G2  1    G2  fTP1-6（配列番号５８）AGAATCTCATCCGGATTTTTACGTGCCCAG
norovirus  G2  1    G2  fTP1-7（配列番号５９）GAGAATCTCATCGATTTTTACGTGCCCAGA
norovirus  G2  1    G2  fTP1-8（配列番号６０）TGAGAATCTCATATTTTTACGTGCCCAGAC
norovirus  G2  1    G2  rTP1-1（配列番号６１）GATCTGAGCACGTTCACAAAGCTGGGAGCC
norovirus  G2  1    G2  rTP1-2（配列番号６２）ATCTGAGCACGTATTCACAAAGCTGGGAGC
norovirus  G2  1    G2  rTP1-3（配列番号６３）TCTGAGCACGTGCATTCACAAAGCTGGGAG
norovirus  G2  1    G2  rTP1-4（配列番号６４）CTGAGCACGTGGTCATTCACAAAGCTGGGA
norovirus  G2  1    G2  rTP1-5（配列番号６５）TGAGCACGTGGGTTCATTCACAAAGCTGGG
norovirus  G2  1    G2  rTP1-6（配列番号６６）GAGCACGTGGGACTTCATTCACAAAGCTGG
norovirus  G2  1    G2  rTP1-7（配列番号６７）AGCACGTGGGAGTCTTCATTCACAAAGCTG
norovirus  G2  1    G2  rTP1-8（配列番号６８）GCACGTGGGAGGATCTTCATTCACAAAGCT
G2＿template（配列番号５２）        GGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGG
norovirus  G2  2    G2  fTP2-1（配列番号６９）TCATTCGACGCCGCGATCGCAATCTGGCTC
norovirus  G2  2    G2  fTP2-2（配列番号７０）GTCATTCGACGCCGATCGCAATCTGGCTCC
norovirus  G2  2    G2  fTP2-3（配列番号７１）CGTCATTCGACGGATCGCAATCTGGCTCCC
norovirus  G2  2    G2  fTP2-4（配列番号７２）GCGTCATTCGACATCGCAATCTGGCTCCCA
norovirus  G2  2    G2  fTP2-5（配列番号７３）GGCGTCATTCGATCGCAATCTGGCTCCCAG
norovirus  G2  2    G2  fTP2-6（配列番号７４）TGGCGTCATTCGCGCAATCTGGCTCCCAGC
norovirus  G2  2    G2  fTP2-7（配列番号７５）TTGGCGTCATTCGCAATCTGGCTCCCAGCT
norovirus  G2  2    G2  fTP2-8（配列番号７６）GTTGGCGTCATTCAATCTGGCTCCCAGCTT
norovirus  G2  2    G2  rTP2-1（配列番号７７）CCATCTGATGGGACCTCATTATTGACCTCT
norovirus  G2  2    G2  rTP2-2（配列番号７８）CATCTGATGGGTAACCTCATTATTGACCTC
norovirus  G2  2    G2  rTP2-3（配列番号７９）ATCTGATGGGTCTAACCTCATTATTGACCT
norovirus  G2  2    G2  rTP2-4（配列番号８０）TCTGATGGGTCCATAACCTCATTATTGACC
norovirus  G2  2    G2  rTP2-5（配列番号８１）CTGATGGGTCCGCATAACCTCATTATTGAC
norovirus  G2  2    G2  rTP2-6（配列番号８２）TGATGGGTCCGCCCATAACCTCATTATTGA
norovirus  G2  2    G2  rTP2-7（配列番号８３）GATGGGTCCGCAGCCATAACCTCATTATTG
norovirus  G2  2    G2  rTP2-8（配列番号８４）ATGGGTCCGCAGAGCCATAACCTCATTATT
G2＿template（配列番号５２）        GGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGG
norovirus  G2  3    G2  fTP3-1（配列番号８５）GAGCCATAACCTTGGGTCCGCAGCCAACCT
norovirus  G2  3    G2  fTP3-2（配列番号８６）AGAGCCATAACCGGGTCCGCAGCCAACCTC
norovirus  G2  3    G2  fTP3-3（配列番号８７）CAGAGCCATAACGGTCCGCAGCCAACCTCG
norovirus  G2  3    G2  fTP3-4（配列番号８８）CCAGAGCCATAAGTCCGCAGCCAACCTCGT
norovirus  G2  3    G2  fTP3-5（配列番号８９）TCCAGAGCCATATCCGCAGCCAACCTCGTC
norovirus  G2  3    G2  fTP3-6（配列番号９０）CTCCAGAGCCATCCGCAGCCAACCTCGTCC
norovirus  G2  3    G2  fTP3-7（配列番号９１）GCTCCAGAGCCACGCAGCCAACCTCGTCCC
norovirus  G2  3    G2  fTP3-8（配列番号９２）GGCTCCAGAGCCGCAGCCAACCTCGTCCCA
norovirus  G2  3    G2  rTP3-1（配列番号９３）CGTTGTTGGTGCTTACGTTTTGTTGGCCCG
norovirus  G2  3    G2  rTP3-2（配列番号９４）GTTGTTGGTGCCATTACGTTTTGTTGGCCC
norovirus  G2  3    G2  rTP3-3（配列番号９５）TTGTTGGTGCCGAATTACGTTTTGTTGGCC
norovirus  G2  3    G2  rTP3-4（配列番号９６）TGTTGGTGCCGCCAATTACGTTTTGTTGGC
norovirus  G2  3    G2  rTP3-5（配列番号９７）GTTGGTGCCGCTTCAATTACGTTTTGTTGG
norovirus  G2  3    G2  rTP3-6（配列番号９８）TTGGTGCCGCTAGTCAATTACGTTTTGTTG
norovirus  G2  3    G2  rTP3-7（配列番号９９）TGGTGCCGCTATGGTCAATTACGTTTTGTT
norovirus  G2  3    G2  rTP3-8（配列番号１００）GGTGCCGCTATTGGGTCAATTACGTTTTGT
G2＿template（配列番号５２）    GGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGG
norovirus  G2  4    G2  fTP4-1（配列番号１０１）CAGGTGCCGCAATGAGGTTATGGCTCTGGA
norovirus  G2  4    G2  fTP4-2（配列番号１０２）ACAGGTGCCGCAGAGGTTATGGCTCTGGAG
norovirus  G2  4    G2  fTP4-3（配列番号１０３）CACAGGTGCCGCAGGTTATGGCTCTGGAGC
norovirus  G2  4    G2  fTP4-4（配列番号１０４）CCACAGGTGCCGGGTTATGGCTCTGGAGCC
norovirus  G2  4    G2  fTP4-5（配列番号１０５）GCCACAGGTGCCGTTATGGCTCTGGAGCCC
norovirus  G2  4    G2  fTP4-6（配列番号１０６）CGCCACAGGTGCTTATGGCTCTGGAGCCCG
norovirus  G2  4    G2  fTP4-7（配列番号１０７）CCGCCACAGGTGTATGGCTCTGGAGCCCGT
norovirus  G2  4    G2  fTP4-8（配列番号１０８）CCCGCCACAGGTATGGCTCTGGAGCCCGTT
norovirus  G2  4    G2  rTP4-1（配列番号１０９）CCAACAAAACGTGGGCTTGTACAAAATTGT
norovirus  G2  4    G2  rTP4-2（配列番号１１０）CAACAAAACGTAGGGGCTTGTACAAAATTG
norovirus  G2  4    G2  rTP4-3（配列番号１１１）AACAAAACGTAAAGGGGCTTGTACAAAATT
norovirus  G2  4    G2  rTP4-4（配列番号１１２）ACAAAACGTAATCAGGGGCTTGTACAAAAT
norovirus  G2  4    G2  rTP4-5（配列番号１１３）CAAAACGTAATTCCAGGGGCTTGTACAAAA
norovirus  G2  4    G2  rTP4-6（配列番号１１４）AAAACGTAATTGACCAGGGGCTTGTACAAA
norovirus  G2  4    G2  rTP4-7（配列番号１１５）AAACGTAATTGACACCAGGGGCTTGTACAA
norovirus  G2  4    G2  rTP4-8（配列番号１１６）AACGTAATTGACCCACCAGGGGCTTGTACA
G2＿template（配列番号５２）    GGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGG
norovirus  G2  5    G2  fTP5-1（配列番号１１７）TACAAAATTGTTTGGCGGGCCAACAAAACG
norovirus  G2  5    G2  fTP5-2（配列番号１１８）GTACAAAATTGTGGCGGGCCAACAAAACGT
norovirus  G2  5    G2  fTP5-3（配列番号１１９）TGTACAAAATTGGCGGGCCAACAAAACGTA
norovirus  G2  5    G2  fTP5-4（配列番号１２０）TTGTACAAAATTCGGGCCAACAAAACGTAA
norovirus  G2  5    G2  fTP5-5（配列番号１２１）CTTGTACAAAATGGGCCAACAAAACGTAAT
norovirus  G2  5    G2  fTP5-6（配列番号１２２）GCTTGTACAAAAGGCCAACAAAACGTAATT
norovirus  G2  5    G2  fTP5-7（配列番号１２３）GGCTTGTACAAAGCCAACAAAACGTAATTG
norovirus  G2  5    G2  fTP5-8（配列番号１２４）GGGCTTGTACAACCAACAAAACGTAATTGA
norovirus  G2  5    G2  rTP5-1（配列番号１２５）CTGGTGGAGAGTCAGTATCTCACCTGGAGC
norovirus  G2  5    G2  rTP5-2（配列番号１２６）TGGTGGAGAGTTACAGTATCTCACCTGGAG
norovirus  G2  5    G2  rTP5-3（配列番号１２７）GGTGGAGAGTTCCACAGTATCTCACCTGGA
norovirus  G2  5    G2  rTP5-4（配列番号１２８）GTGGAGAGTTCACCACAGTATCTCACCTGG
norovirus  G2  5    G2  rTP5-5（配列番号１２９）TGGAGAGTTCACTCCACAGTATCTCACCTG
norovirus  G2  5    G2  rTP5-6（配列番号１３０）GGAGAGTTCACACTCCACAGTATCTCACCT
norovirus  G2  5    G2  rTP5-7（配列番号１３１）GAGAGTTCACAGGCTCCACAGTATCTCACC
norovirus  G2  5    G2  rTP5-8（配列番号１３２）AGAGTTCACAGTCGCTCCACAGTATCTCAC
G2＿template（配列番号５２）    GGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGG
norovirus  G2  6    G2  fTP6-1（配列番号１３３）AGGGCGCGCTCCCACAGTGTCCCCTAGAAA
norovirus  G2  6    G2  fTP6-2（配列番号１３４）AAGGGCGCGCTCACAGTGTCCCCTAGAAAC
norovirus  G2  6    G2  fTP6-3（配列番号１３５）CAAGGGCGCGCTCAGTGTCCCCTAGAAACG
norovirus  G2  6    G2  fTP6-4（配列番号１３６）CCAAGGGCGCGCAGTGTCCCCTAGAAACGC
norovirus  G2  6    G2  fTP6-5（配列番号１３７）CCCAAGGGCGCGGTGTCCCCTAGAAACGCT
norovirus  G2  6    G2  fTP6-6（配列番号１３８）GCCCAAGGGCGCTGTCCCCTAGAAACGCTC
norovirus  G2  6    G2  fTP6-7（配列番号１３９）GGCCCAAGGGCGGTCCCCTAGAAACGCTCC
norovirus  G2  6    G2  fTP6-8（配列番号１４０）GGGCCCAAGGGCTCCCCTAGAAACGCTCCA
norovirus  G2  6    G2  rTP6-1（配列番号１４１）TGATCTGAACCCCATAACCATTGTACATTC
norovirus  G2  6    G2  rTP6-2（配列番号１４２）GATCTGAACCCCGCATAACCATTGTACATT
norovirus  G2  6    G2  rTP6-3（配列番号１４３）ATCTGAACCCCTTGCATAACCATTGTACAT
norovirus  G2  6    G2  rTP6-4（配列番号１４４）TCTGAACCCCTACTGCATAACCATTGTACA
norovirus  G2  6    G2  rTP6-5（配列番号１４５）CTGAACCCCTATCCTGCATAACCATTGTAC
norovirus  G2  6    G2  rTP6-6（配列番号１４６）TGAACCCCTATCACCTGCATAACCATTGTA
norovirus  G2  6    G2  rTP6-7（配列番号１４７）GAACCCCTATCTCACCTGCATAACCATTGT
norovirus  G2  6    G2  rTP6-8（配列番号１４８）AACCCCTATCTTCCACCTGCATAACCATTG
ABCB1（配列番号１４９）  ACCTGGGCATCGTGTCCCAGGAGCCCATCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGAGAACATTGCCTATGGAGACAACAGCCGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATCGTGAGGGCAGCAAAGGAGGCCAACATACATGCCTTCATCGAGTCACTGCCTAATGTAAGTCTCTCTTCAAATAAACAGCCTGGGAGCATGTGGCAGCCTC
ABCB1  ABCB1  TP＿F1（配列番号１５０）CGATCTCTTCGCATTGCTGAGAACATTGC
ABCB1  ABCB1  TP＿F2（配列番号１５１）CGATCTCTTCAGCATTGCTGAGAACATTG
ABCB1  ABCB1  TP＿F3（配列番号１５２）CGATCTCTTCCAGCATTGCTGAGAACATT
ABCB1  ABCB1  TP＿F4（配列番号１５３）CGATCTCTTCGCAGCATTGCTGAGAACAT
ABCB1  ABCB1  TP＿F5（配列番号１５４）CGATCTCTTCTGCAGCATTGCTGAGAACA
ABCB1  ABCB1  TP＿F6（配列番号１５５）CGATCTCTTCCTGCAGCATTGCTGAGAAC
ABCB1  ABCB1  TP＿F7（配列番号１５６）CGATCTCTTCACTGCAGCATTGCTGAGAA
ABCB1  ABCB1  TP＿F8（配列番号１５７）CGATCTCTTCGACTGCAGCATTGCTGAGA
ABCB1  ABCB1  TP＿R1（配列番号１５８）TCGTGAGGGCCAGTGACTCGATGAAGGCA
ABCB1  ABCB1  TP＿R2（配列番号１５９）TCGTGAGGGCGCAGTGACTCGATGAAGGC
ABCB1  ABCB1  TP＿R3（配列番号１６０）TCGTGAGGGCGGCAGTGACTCGATGAAGG
ABCB1  ABCB1  TP＿R4（配列番号１６１）TCGTGAGGGCAGGCAGTGACTCGATGAAG
ABCB1  ABCB1  TP＿R5（配列番号１６２）TCGTGAGGGCTAGGCAGTGACTCGATGAA
ABCB1  ABCB1  TP＿R6（配列番号１６３）TCGTGAGGGCTTAGGCAGTGACTCGATGA
ABCB1  ABCB1  TP＿R7（配列番号１６４）TCGTGAGGGCATTAGGCAGTGACTCGATG
ABCB1  ABCB1  TP＿R8（配列番号１６５）TCGTGAGGGCCATTAGGCAGTGACTCGAT
ABCG2（配列番号１６６）  ATGGTCTTAGAAAAGACTCATTATCATTATGTCTCATTAAAATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACGAACGGATTAACAGGGTCATTCAAGAGTTAGGTCTGGATAAAGTGGC
ABCG2  ABCG2  TP＿F1（配列番号１６７）TGTAAGTTTTTAAGGATGATGTTGTGATG
ABCG2  ABCG2  TP＿F2（配列番号１６８）TGTAAGTTTTTTAAGGATGATGTTGTGAT
ABCG2  ABCG2  TP＿F3（配列番号１６９）TGTAAGTTTTCTTAAGGATGATGTTGTGA
ABCG2  ABCG2  TP＿F4（配列番号１７０）TGTAAGTTTTCCTTAAGGATGATGTTGTG
ABCG2  ABCG2  TP＿F5（配列番号１７１）TGTAAGTTTTGCCTTAAGGATGATGTTGT
ABCG2  ABCG2  TP＿F6（配列番号１７２）TGTAAGTTTTTGCCTTAAGGATGATGTTG
ABCG2  ABCG2  TP＿F7（配列番号１７３）TGTAAGTTTTTTGCCTTAAGGATGATGTT
ABCG2  ABCG2  TP＿F8（配列番号１７４）TGTAAGTTTTTTTGCCTTAAGGATGATGT
ABCG2  ABCG2  TP＿R1（配列番号１７５）ACAGTTCTCAATGATTCGTCATAGTTGTT
ABCG2  ABCG2  TP＿R2（配列番号１７６）ACAGTTCTCACATGATTCGTCATAGTTGT
ABCG2  ABCG2  TP＿R3（配列番号１７７）ACAGTTCTCATCATGATTCGTCATAGTTG
ABCG2  ABCG2  TP＿R4（配列番号１７８）ACAGTTCTCATTCATGATTCGTCATAGTT
ABCG2  ABCG2  TP＿R5（配列番号１７９）ACAGTTCTCATTTCATGATTCGTCATAGT
ABCG2  ABCG2  TP＿R6（配列番号１８０）ACAGTTCTCATTTTCATGATTCGTCATAG
ABCG2  ABCG2  TP＿R7（配列番号１８１）ACAGTTCTCATTTTTCATGATTCGTCATA
ABCG2  ABCG2  TP＿R8（配列番号１８２）ACAGTTCTCATTTTTTCATGATTCGTCAT
EGFR20（配列番号１８３）            GACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAgCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGA
EGFR20    EGFR20  TP＿F1（配列番号１８４）CGTGATGAGGCCGCCTGCTGGGCATCTG
EGFR20    EGFR20  TP＿F2（配列番号１８５）CGTGATGAGTGCCGCCTGCTGGGCATCT
EGFR20    EGFR20  TP＿F3（配列番号１８６）CGTGATGAGGTGCCGCCTGCTGGGCATC
EGFR20    EGFR20  TP＿F4（配列番号１８７）CGTGATGAGTGTGCCGCCTGCTGGGCAT
EGFR20    EGFR20  TP＿F5（配列番号１８８）CGTGATGAGGTGTGCCGCCTGCTGGGCA
EGFR20    EGFR20  TP＿F6（配列番号１８９）CGTGATGAGCGTGTGCCGCCTGCTGGGC
EGFR20    EGFR20  TP＿F7（配列番号１９０）CGTGATGAGACGTGTGCCGCCTGCTGGG
EGFR20    EGFR20  TP＿F8（配列番号１９１）CGTGATGAGCACGTGTGCCGCCTGCTGG
EGFR20    EGFR20  TP＿R1（配列番号１９２）ACGCAGCTCTGTTCCCGGACATAGTCCA
EGFR20    EGFR20  TP＿R2（配列番号１９３）ACGCAGCTCGTGTTCCCGGACATAGTCC
EGFR20    EGFR20  TP＿R3（配列番号１９４）ACGCAGCTCTGTGTTCCCGGACATAGTC
EGFR20    EGFR20  TP＿R4（配列番号１９５）ACGCAGCTCTTGTGTTCCCGGACATAGT
EGFR20    EGFR20  TP＿R5（配列番号１９６）ACGCAGCTCTTTGTGTTCCCGGACATAG
EGFR20    EGFR20  TP＿R6（配列番号１９７）ACGCAGCTCCTTTGTGTTCCCGGACATA
EGFR20    EGFR20  TP＿R7（配列番号１９８）ACGCAGCTCTCTTTGTGTTCCCGGACAT
EGFR20    EGFR20  TP＿R8（配列番号１９９）ACGCAGCTCGTCTTTGTGTTCCCGGACA
EGFR20  mutant（配列番号２００）        GACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAgCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGA
EGFR20    EGFR20m  TP＿F1（配列番号２０１）CATGATGAGGCCGCCTGCTGGGCATCTG
EGFR20    EGFR20m  TP＿F2（配列番号２０２）CATGATGAGTGCCGCCTGCTGGGCATCT
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EGFR20    EGFR20m  TP＿R2（配列番号２１０）CATGCAGCTGTGTTCCCGGACATAGTCC
EGFR20    EGFR20m  TP＿R3（配列番号２１１）CATGCAGCTTGTGTTCCCGGACATAGTC
EGFR20    EGFR20m  TP＿R4（配列番号２１２）CATGCAGCTTTGTGTTCCCGGACATAGT
EGFR20    EGFR20m  TP＿R5（配列番号２１３）CATGCAGCTTTTGTGTTCCCGGACATAG
EGFR20    EGFR20m  TP＿R6（配列番号２１４）CATGCAGCTCTTTGTGTTCCCGGACATA
EGFR20    EGFR20m  TP＿R7（配列番号２１５）CATGCAGCTTCTTTGTGTTCCCGGACAT
EGFR20    EGFR20m  TP＿R8（配列番号２１６）CATGCAGCTGTCTTTGTGTTCCCGGACA
FTO（配列番号２１７）      TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
FTO      FTO  TP＿F1（配列番号２１８）CTAAATTCACTAGAATGTCTGAATTATTATTC
FTO      FTO  TP＿F2（配列番号２１９）CTAAATTCACTTAGAATGTCTGAATTATTATT
FTO      FTO  TP＿F3（配列番号２２０）CTAAATTCACTTTAGAATGTCTGAATTATTAT
FTO      FTO  TP＿F4（配列番号２２１）CTAAATTCACATTTAGAATGTCTGAATTATTA
FTO      FTO  TP＿F5（配列番号２２２）CTAAATTCACCATTTAGAATGTCTGAATTATT
FTO      FTO  TP＿F6（配列番号２２３）CTAAATTCACGCATTTAGAATGTCTGAATTAT
FTO      FTO  TP＿F7（配列番号２２４）CTAAATTCACTGCATTTAGAATGTCTGAATTA
FTO      FTO  TP＿F8（配列番号２２５）CTAAATTCACATGCATTTAGAATGTCTGAATT
FTO      FTO  TP＿R1（配列番号２２６）AGTGATGCACCTGTTACCTATTAAAACTTTAG
FTO      FTO  TP＿R2（配列番号２２７）AGTGATGCACACTGTTACCTATTAAAACTTTA
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FTO      FTO  TP＿R4（配列番号２２９）AGTGATGCACTGACTGTTACCTATTAAAACTT
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FTO      FTO  TP＿R6（配列番号２３１）AGTGATGCACTCTGACTGTTACCTATTAAAAC
FTO      FTO  TP＿R7（配列番号２３２）AGTGATGCACTTCTGACTGTTACCTATTAAAA
FTO      FTO  TP＿R8（配列番号２３３）AGTGATGCACTTTCTGACTGTTACCTATTAAA
FTO      TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
FTO      FTO＿2  TP＿F1（配列番号２３４）CTAAATTCACAGCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGA
FTO      FTO＿2  TP＿F2（配列番号２３５）CTAAATTCACAGTCAGTTATGCATTTAGAATGTCTG
FTO      FTO＿2  TP＿F3（配列番号２３６）CTAAATTCACAGATCAGTTATGCATTTAGAATGTCT
FTO      FTO＿2  TP＿F4（配列番号２３７）CTAAATTCACAGCATCAGTTATGCATTTAGAATGTC
FTO      FTO＿2  TP＿F5（配列番号２３８）CTAAATTCACAGACATCAGTTATGCATTTAGAATGT
FTO      FTO＿2  TP＿F6（配列番号２３９）CTAAATTCACAGAACATCAGTTATGCATTTAGAATG
FTO      FTO＿2  TP＿F7（配列番号２４０）CTAAATTCACAGTAACATCAGTTATGCATTTAGAAT
FTO      FTO＿2  TP＿F8（配列番号２４１）CTAAATTCACAGCTAACATCAGTTATGCATTTAGAA
FTO      FTO＿2  TP＿R1（配列番号２４２）AGTGATGCACTTCCATTTCTGACTGTTACCTATTAA
FTO      FTO＿2  TP＿R2（配列番号２４３）AGTGATGCACTTTCCATTTCTGACTGTTACCTATTA
FTO      FTO＿2  TP＿R3（配列番号２４４）AGTGATGCACTTCTCCATTTCTGACTGTTACCTATT
FTO      FTO＿2  TP＿R4（配列番号２４５）AGTGATGCACTTACTCCATTTCTGACTGTTACCTAT
FTO      FTO＿2  TP＿R5（配列番号２４６）AGTGATGCACTTCACTCCATTTCTGACTGTTACCTA
FTO      FTO＿2  TP＿R6（配列番号２４７）AGTGATGCACTTCCACTCCATTTCTGACTGTTACCT
FTO      FTO＿2  TP＿R7（配列番号２４８）AGTGATGCACTTCCCACTCCATTTCTGACTGTTACC
FTO      FTO＿2  TP＿R8（配列番号２４９）AGTGATGCACTTTCCCACTCCATTTCTGACTGTTAC
GGCX（配列番号２５０）    CTCCCTGCTTTCCTAGGTATGTTCTCCTACGTCATGCTGGCCAGCAGCCCTCTCTTCTGCTCCCCTGAGTGGCCTCGGAAGCTGGTGTCCTACTGCCCCCGAAGGTTGCAACAACTGTTGCCCCTCAAGGCAGCCCCTCAGCCCAGTGTTTCCTGTGTGTATAAGAGGAGCCGGGGCAAAAGTGGCCAGAAGCCAGGGCTG
GGCX    GGCX  TP＿F1（配列番号２５１）TCGGGGGCAGTGCTCCCCTGAGTGGC
GGCX    GGCX  TP＿F2（配列番号２５２）TCGGGGGCAGCTGCTCCCCTGAGTGG
GGCX    GGCX  TP＿F3（配列番号２５３）TCGGGGGCAGTCTGCTCCCCTGAGTG
GGCX    GGCX  TP＿F4（配列番号２５４）TCGGGGGCAGTTCTGCTCCCCTGAGT
GGCX    GGCX  TP＿F5（配列番号２５５）TCGGGGGCAGCTTCTGCTCCCCTGAG
GGCX    GGCX  TP＿F6（配列番号２５６）TCGGGGGCAGTCTTCTGCTCCCCTGA
GGCX    GGCX  TP＿F7（配列番号２５７）TCGGGGGCAGCTCTTCTGCTCCCCTG
GGCX    GGCX  TP＿F8（配列番号２５８）TCGGGGGCAGTCTCTTCTGCTCCCCT
GGCX    GGCX  TP＿R1（配列番号２５９）CGAAGGTTGCGGGCTGAGGGGCTGCC
GGCX    GGCX  TP＿R2（配列番号２６０）CGAAGGTTGCTGGGCTGAGGGGCTGC
GGCX    GGCX  TP＿R3（配列番号２６１）CGAAGGTTGCCTGGGCTGAGGGGCTG
GGCX    GGCX  TP＿R4（配列番号２６２）CGAAGGTTGCACTGGGCTGAGGGGCT
GGCX    GGCX  TP＿R5（配列番号２６３）CGAAGGTTGCCACTGGGCTGAGGGGC
GGCX    GGCX  TP＿R6（配列番号２６４）CGAAGGTTGCACACTGGGCTGAGGGG
GGCX    GGCX  TP＿R7（配列番号２６５）CGAAGGTTGCAACACTGGGCTGAGGG
GGCX    GGCX  TP＿R8（配列番号２６６）CGAAGGTTGCAAACACTGGGCTGAGG
MTHFR（配列番号２６７）  TGACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGCCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGGCTGACACATTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGCACCGACATGGGCATCACTTGCCCCATCGTCCCCGGG
MTHFR  MTHFR  TP＿F1（配列番号２６８）GGCTCCCGCATTTGAGGCTGACCTGAAGC
MTHFR  MTHFR  TP＿F2（配列番号２６９）GGCTCCCGCACTTTGAGGCTGACCTGAAG
MTHFR  MTHFR  TP＿F3（配列番号２７０）GGCTCCCGCAGCTTTGAGGCTGACCTGAA
MTHFR  MTHFR  TP＿F4（配列番号２７１）GGCTCCCGCAAGCTTTGAGGCTGACCTGA
MTHFR  MTHFR  TP＿F5（配列番号２７２）GGCTCCCGCAGAGCTTTGAGGCTGACCTG
MTHFR  MTHFR  TP＿F6（配列番号２７３）GGCTCCCGCAGGAGCTTTGAGGCTGACCT
MTHFR  MTHFR  TP＿F7（配列番号２７４）GGCTCCCGCAGGGAGCTTTGAGGCTGACC
MTHFR  MTHFR  TP＿F8（配列番号２７５）GGCTCCCGCAAGGGAGCTTTGAGGCTGAC
MTHFR  MTHFR  TP＿R1（配列番号２７６）GCCGATTTCAGAAGAATGTGTCAGCCTCA
MTHFR  MTHFR  TP＿R2（配列番号２７７）GCCGATTTCAGGAAGAATGTGTCAGCCTC
MTHFR  MTHFR  TP＿R3（配列番号２７８）GCCGATTTCACGGAAGAATGTGTCAGCCT
MTHFR  MTHFR  TP＿R4（配列番号２７９）GCCGATTTCAGCGGAAGAATGTGTCAGCC
MTHFR  MTHFR  TP＿R5（配列番号２８０）GCCGATTTCAAGCGGAAGAATGTGTCAGC
MTHFR  MTHFR  TP＿R6（配列番号２８１）GCCGATTTCAAAGCGGAAGAATGTGTCAG
MTHFR  MTHFR  TP＿R7（配列番号２８２）GCCGATTTCAAAAGCGGAAGAATGTGTCA
MTHFR  MTHFR  TP＿R8（配列番号２８３）GCCGATTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTC
MTHFR  TGACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGCCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGGCTGACACATTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGCACCGACATGGGCATCACTTGCCCCATCGTCCCCGGG
MTHFR  MTHFR＿2  TP＿F1（配列番号２８４）GGCTCCCTTTGAGGCTGACCTGAAGC
MTHFR  MTHFR＿2  TP＿F2（配列番号２８５）GGCTCCCCTTTGAGGCTGACCTGAAG
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MTHFR  MTHFR＿2  TP＿F4（配列番号２８７）GGCTCCCAGCTTTGAGGCTGACCTGA
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MTHFR  MTHFR＿2  TP＿F6（配列番号２８９）GGCTCCCGGAGCTTTGAGGCTGACCT
MTHFR  MTHFR＿2  TP＿F7（配列番号２９０）GGCTCCCGGGAGCTTTGAGGCTGACC
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MTHFR  MTHFR＿2  TP＿R1（配列番号２９２）GCCGATTGAAGAATGTGTCAGCCTCA
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MTHFR  MTHFR＿2  TP＿R3（配列番号２９４）GCCGATTCGGAAGAATGTGTCAGCCT
MTHFR  MTHFR＿2  TP＿R4（配列番号２９５）GCCGATTGCGGAAGAATGTGTCAGCC
MTHFR  MTHFR＿2  TP＿R5（配列番号２９６）GCCGATTAGCGGAAGAATGTGTCAGC
MTHFR  MTHFR＿2  TP＿R6（配列番号２９７）GCCGATTAAGCGGAAGAATGTGTCAG
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MTHFR  MTHFR＿2  TP＿R8（配列番号２９９）GCCGATTCAAAGCGGAAGAATGTGTC
NAT2-341（配列番号３００）        ACAATCGGTTTTCAGACCACAATGTTAGGAGGGTATTTTTACATCCCTCCAGTTAACAAATACAGCACTGGCATGGTTCACCTTCTCCTGCAGGTGACCATTGACGGCAGGAATTACATTGTCGATGCTGGGTCTGGAAGCTCCTCCCAGATGTGGCAGCCTCTAGAATTAATTTCTGGGAAGGATCAGCCTCAGGTGCCT
NAT2-341        NAT2-341  TP＿F1（配列番号３０１）  CAATGGTCACCAGTTAACAAATACAGCACT
NAT2-341        NAT2-341  TP＿F2（配列番号３０２）      CAATGGTCACCCAGTTAACAAATACAGCAC
NAT2-341        NAT2-341  TP＿F3（配列番号３０３）      CAATGGTCACTCCAGTTAACAAATACAGCA
NAT2-341        NAT2-341  TP＿F4（配列番号３０４）      CAATGGTCACCTCCAGTTAACAAATACAGC
NAT2-341        NAT2-341  TP＿F5（配列番号３０５）      CAATGGTCACCCTCCAGTTAACAAATACAG
NAT2-341        NAT2-341  TP＿F6（配列番号３０６）      CAATGGTCACCCCTCCAGTTAACAAATACA
NAT2-341        NAT2-341  TP＿F7（配列番号３０７）      CAATGGTCACTCCCTCCAGTTAACAAATAC
NAT2-341        NAT2-341  TP＿F8（配列番号３０８）      CAATGGTCACATCCCTCCAGTTAACAAATA
NAT2-341        NAT2-341  TP＿R1（配列番号３０９）      CATTGACGGTCTGGGAGGAGCTTCCAGAC
NAT2-341        NAT2-341  TP＿R2（配列番号３１０）      CATTGACGGATCTGGGAGGAGCTTCCAGA
NAT2-341        NAT2-341  TP＿R3（配列番号３１１）      CATTGACGGCATCTGGGAGGAGCTTCCAG
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NAT2-341        NAT2-341  TP＿R6（配列番号３１４）      CATTGACGGATCTGGGAGGAGCTTCCAG
NAT2-341        NAT2-341  TP＿R7（配列番号３１５）      CATTGACGGGGCTGCCACATCTGGGAG
NAT2-341        NAT2-341  TP＿R8（配列番号３１６）      CATTGACGGAGGCTGCCACATCTGGGA
NAT2-590（配列番号３１７）        ATCAGGAGAGAGCAGTATATTACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCATCTCCTGCCAAAGAAGAAACACCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCTCGAACAATTGAAGATTTTGAGTCTATGAATACATACCTGCAGACGTCTCCAACATCTTCATTTATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCAGACCCCAGAAGGG
NAT2-590        NAT2-590  TP＿F1（配列番号３１８）      TCGAGGTTCACTGCCAAAGAAGAAACACCAAA
NAT2-590        NAT2-590  TP＿F2（配列番号３１９）      TCGAGGTTCACCTGCCAAAGAAGAAACACCAA
NAT2-590        NAT2-590  TP＿F3（配列番号３２０）      TCGAGGTTCATCCTGCCAAAGAAGAAACACCA
NAT2-590        NAT2-590  TP＿F4（配列番号３２１）      TCGAGGTTCACTCCTGCCAAAGAAGAAACACC
NAT2-590        NAT2-590  TP＿F5（配列番号３２２）      TCGAGGTTCATCTCCTGCCAAAGAAGAAACAC
NAT2-590        NAT2-590  TP＿F6（配列番号３２３）      TCGAGGTTCAATCTCCTGCCAAAGAAGAAACA
NAT2-590        NAT2-590  TP＿F7（配列番号３２４）      TCGAGGTTCACATCTCCTGCCAAAGAAGAAAC
NAT2-590        NAT2-590  TP＿F8（配列番号３２５）      TCGAGGTTCATCATCTCCTGCCAAAGAAGAAA
NAT2-590        NAT2-590  TP＿R1（配列番号３２６）      CGAACAATTGTGGAGACGTCTGCAGGTATGTA
NAT2-590        NAT2-590  TP＿R2（配列番号３２７）      CGAACAATTGTTGGAGACGTCTGCAGGTATGT
NAT2-590        NAT2-590  TP＿R3（配列番号３２８）      CGAACAATTGGTTGGAGACGTCTGCAGGTATG
NAT2-590        NAT2-590  TP＿R4（配列番号３２９）      CGAACAATTGTGTTGGAGACGTCTGCAGGTAT
NAT2-590        NAT2-590  TP＿R5（配列番号３３０）      CGAACAATTGATGTTGGAGACGTCTGCAGGTA
NAT2-590        NAT2-590  TP＿R6（配列番号３３１）      CGAACAATTGGATGTTGGAGACGTCTGCAGGT
NAT2-590        NAT2-590  TP＿R7（配列番号３３２）      CGAACAATTGAGATGTTGGAGACGTCTGCAGG
NAT2-590        NAT2-590  TP＿R8（配列番号３３３）      CGAACAATTGAAGATGTTGGAGACGTCTGCAG
NAT2-857（配列番号３３４）        GTCGAGTTTAAAACTCTCACTGAGGAAGAGGTTGAAGAAGTGCTGAAAAATATATTTAAGATTTCCTTGGGGAGAAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATGGATCCCTTACTATTTAGAATAAGGAACAAAATAAACCCTTGTGTATGTATCACCCAACTCACTAATTATCAACTTATGTGCTATCAGATATCCTCTCTACC
NAT2-857        NAT2-857  TP＿F1（配列番号３３５）      TCCATCACCAATTTAAGATTTCCTTGGGGAGA
NAT2-857        NAT2-857  TP＿F2（配列番号３３６）      TCCATCACCATATTTAAGATTTCCTTGGGGAG
NAT2-857        NAT2-857  TP＿F3（配列番号３３７）      TCCATCACCAATATTTAAGATTTCCTTGGGGA
NAT2-857        NAT2-857  TP＿F4（配列番号３３８）      TCCATCACCATATATTTAAGATTTCCTTGGGG
NAT2-857        NAT2-857  TP＿F5（配列番号３３９）      TCCATCACCAATATATTTAAGATTTCCTTGGG
NAT2-857        NAT2-857  TP＿F6（配列番号３４０）      TCCATCACCAAATATATTTAAGATTTCCTTGG
NAT2-857        NAT2-857  TP＿F7（配列番号３４１）      TCCATCACCAAAATATATTTAAGATTTCCTTG
NAT2-857        NAT2-857  TP＿F8（配列番号３４２）      TCCATCACCAAAAATATATTTAAGATTTCCTT
NAT2-857        NAT2-857  TP＿R1（配列番号３４３）      GATCCCTTACTGGGTGATACATACACAAGGGT
NAT2-857        NAT2-857  TP＿R2（配列番号３４４）      GATCCCTTACTTGGGTGATACATACACAAGGG
NAT2-857        NAT2-857  TP＿R3（配列番号３４５）      GATCCCTTACGTTGGGTGATACATACACAAGG
NAT2-857        NAT2-857  TP＿R4（配列番号３４６）      GATCCCTTACAGTTGGGTGATACATACACAAG
NAT2-857        NAT2-857  TP＿R5（配列番号３４７）      GATCCCTTACGAGTTGGGTGATACATACACAA
NAT2-857        NAT2-857  TP＿R6（配列番号３４８）      GATCCCTTACTGAGTTGGGTGATACATACACA
NAT2-857        NAT2-857  TP＿R7（配列番号３４９）      GATCCCTTACGTGAGTTGGGTGATACATACAC
NAT2-857        NAT2-857  TP＿R8（配列番号３５０）      GATCCCTTACAGTGAGTTGGGTGATACATACA
NAT2-857        GTCGAGTTTAAAACTCTCACTGAGGAAGAGGTTGAAGAAGTGCTGAAAAATATATTTAAGATTTCCTTGGGGAGAAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATGGATCCCTTACTATTTAGAATAAGGAACAAAATAAACCCTTGTGTATGTATCACCCAACTCACTAATTATCAACTTATGTGCTATCAGATATCCTCTCTACC
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿F1（配列番号３５１）  TCCATCACCAATTTAAGATTTCCTTGGGGAGAAAT
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿F2（配列番号３５２）  TCCATCACCATATTTAAGATTTCCTTGGGGAGAAA
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿F3（配列番号３５３）  TCCATCACCAATATTTAAGATTTCCTTGGGGAGAA
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿F4（配列番号３５４）  TCCATCACCATATATTTAAGATTTCCTTGGGGAGA
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿F5（配列番号３５５）  TCCATCACCAATATATTTAAGATTTCCTTGGGGAG
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿F6（配列番号３５６）  TCCATCACCAAATATATTTAAGATTTCCTTGGGGA
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿F7（配列番号３５７）  TCCATCACCAAAATATATTTAAGATTTCCTTGGGG
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿F8（配列番号３５８）  TCCATCACCAAAAATATATTTAAGATTTCCTTGGG
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿R1（配列番号３５９）  GATCCCTTACATACATACACAAGGGTTTATTTTGT
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿R2（配列番号３６０）  GATCCCTTACGATACATACACAAGGGTTTATTTTG
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿R3（配列番号３６１）  GATCCCTTACTGATACATACACAAGGGTTTATTTT
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿R4（配列番号３６２）  GATCCCTTACGTGATACATACACAAGGGTTTATTT
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿R5（配列番号３６３）  GATCCCTTACGGTGATACATACACAAGGGTTTATT
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿R6（配列番号３６４）  GATCCCTTACGGGTGATACATACACAAGGGTTTAT
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿R7（配列番号３６５）  GATCCCTTACTGGGTGATACATACACAAGGGTTTA
NAT2-857        NAT2-857＿2  TP＿R8（配列番号３６６）  GATCCCTTACTTGGGTGATACATACACAAGGGTTT
rs7566605（配列番号３６７）      AGTTGATCTAATGTTCTCTCTCCTACCTCCCTCCAATACCCCATCGGAATTGAAATCATTGCAATAGCCACTGCCAAGTACTTAACAATGGATATTTGATCGTGGTCCTTTAGGTCTGTACCAGGGTGGTTTTCAGTTTTTTACTTCATCAGCACAGGAAGGCAAGGACATCGCACTGACTCTCATATTTCATCCTTAGCT
rs7566605      rs7566605  TP＿F1（配列番号３６８）CGATCAAATAATCATTGCAATAGCCACTG
rs7566605      rs7566605  TP＿F2（配列番号３６９）CGATCAAATAAATCATTGCAATAGCCACT
rs7566605      rs7566605  TP＿F3（配列番号３７０）CGATCAAATAAAATCATTGCAATAGCCAC
rs7566605      rs7566605  TP＿F4（配列番号３７１）CGATCAAATAGAAATCATTGCAATAGCCA
rs7566605      rs7566605  TP＿F5（配列番号３７２）CGATCAAATATGAAATCATTGCAATAGCC
rs7566605      rs7566605  TP＿F6（配列番号３７３）CGATCAAATATTGAAATCATTGCAATAGC
rs7566605      rs7566605  TP＿F7（配列番号３７４）CGATCAAATAATTGAAATCATTGCAATAG
rs7566605      rs7566605  TP＿F8（配列番号３７５）CGATCAAATAAATTGAAATCATTGCAATA
rs7566605      rs7566605  TP＿R1（配列番号３７６）TCGTGGTCCTGAAGTAAAAAACTGAAAAC
rs7566605      rs7566605  TP＿R2（配列番号３７７）TCGTGGTCCTTGAAGTAAAAAACTGAAAA
rs7566605      rs7566605  TP＿R3（配列番号３７８）TCGTGGTCCTATGAAGTAAAAAACTGAAA
rs7566605      rs7566605  TP＿R4（配列番号３７９）TCGTGGTCCTGATGAAGTAAAAAACTGAA
rs7566605      rs7566605  TP＿R5（配列番号３８０）TCGTGGTCCTTGATGAAGTAAAAAACTGA
rs7566605      rs7566605  TP＿R6（配列番号３８１）TCGTGGTCCTCTGATGAAGTAAAAAACTG
rs7566605      rs7566605  TP＿R7（配列番号３８２）TCGTGGTCCTGCTGATGAAGTAAAAAACT
rs7566605      rs7566605  TP＿R8（配列番号３８３）TCGTGGTCCTTGCTGATGAAGTAAAAAAC
KCNQ1＿rs2283228（配列番号３８４）      CCCAAGAAGAAAACTCTGAGAAGTCAGGACAGGAGATGGTGTCGTCAGGGGGCTGCTGGAAGGTTTGGTGACCGGAGCAGCAGGTGCCAGAGCTGAAAGCACTGGTTAAACGTGATGGGTAAACACATGTCTATTTCAGCTTCTTTGAATCCCACTAAGGTGACAGTAAAGGCATGAAAAACATGGAAACATGTAAATCAA
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-F1（配列番号３８５）    gTGCTTTCAGCTGGCTGCTGGAAGGTTTGGTG
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-F2（配列番号３８６）    gTGCTTTCAGCTGCTGCTGGAAGGTTTGGTGA
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-F3（配列番号３８７）    gTGCTTTCAGCTCTGCTGGAAGGTTTGGTGAC
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-F4（配列番号３８８）    gTGCTTTCAGCTTGCTGGAAGGTTTGGTGACC
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-F5（配列番号３８９）    gTGCTTTCAGCTGCTGGAAGGTTTGGTGACCG
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-F6（配列番号３９０）    gTGCTTTCAGCTCTGGAAGGTTTGGTGACCGG
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-F7（配列番号３９１）    gTGCTTTCAGCTTGGAAGGTTTGGTGACCGGA
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-F8（配列番号３９２）    gTGCTTTCAGCTGGAAGGTTTGGTGACCGGAG
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-R1（配列番号３９３）    CActggttaaacttcaaagaagctgaaataga
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-R2（配列番号３９４）    CActggttaaacattcaaagaagctgaaatag
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-R3（配列番号３９５）    CActggttaaacgattcaaagaagctgaaata
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-R4（配列番号３９６）    CActggttaaacggattcaaagaagctgaaat
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-R5（配列番号３９７）    CActggttaaacgggattcaaagaagctgaaa
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-R6（配列番号３９８）    CActggttaaactgggattcaaagaagctgaa
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-R7（配列番号３９９）    CActggttaaacgtgggattcaaagaagctga
KCNQ1＿rs2283228      KCNQ1＿rs2283228  TP-R8（配列番号４００）    CActggttaaacagtgggattcaaagaagctg
KCNQ1＿rs2237897（配列番号４０１）      AGGCCTGGGTGGAGACAGAACACAGCAGGCTGTGGGCGTGGCCAATGTTGAGGGACGGAGGTGGCCAGAGGCCTCTCAGTGGTGCCCAGGGAGCTGGGGACGAGGGGCCTCATCCTTCCCCTGAGCCCCTCCCTTCAGGCCCAGGGAGTGGCCTGGGGCCCAGGAGAGCCCGCTCCGCGCTCACAGCCTCCGTTCCCAGAC
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-F1（配列番号４０２）    CGTCCCCAGCTCCCTAGGGACGGAGGTGGCCAGAG
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-F2（配列番号４０３）    CGTCCCCAGCTCCCTGGGACGGAGGTGGCCAGAGG
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-F3（配列番号４０４）    CGTCCCCAGCTCCCTGGACGGAGGTGGCCAGAGGC
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-F4（配列番号４０５）    CGTCCCCAGCTCCCTGACGGAGGTGGCCAGAGGCC
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-F5（配列番号４０６）    CGTCCCCAGCTCCCTACGGAGGTGGCCAGAGGCCT
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-F6（配列番号４０７）    CGTCCCCAGCTCCCTCGGAGGTGGCCAGAGGCCTC
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-F7（配列番号４０８）    CGTCCCCAGCTCCCTGGAGGTGGCCAGAGGCCTCT
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-F8（配列番号４０９）    CGTCCCCAGCTCCCTGAGGTGGCCAGAGGCCTCTC
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-R1（配列番号４１０）    ACGAGGGGCCTCACCCTGGGCCTGAAGGGAGGG
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-R2（配列番号４１１）    ACGAGGGGCCTCATCCCTGGGCCTGAAGGGAGG
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-R3（配列番号４１２）    ACGAGGGGCCTCACTCCCTGGGCCTGAAGGGAG
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-R4（配列番号４１３）    ACGAGGGGCCTCAACTCCCTGGGCCTGAAGGGA
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-R5（配列番号４１４）    ACGAGGGGCCTCACACTCCCTGGGCCTGAAGGG
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-R6（配列番号４１５）    ACGAGGGGCCTCACCACTCCCTGGGCCTGAAGG
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-R7（配列番号４１６）    ACGAGGGGCCTCAGCCACTCCCTGGGCCTGAAG
KCNQ1＿rs2237897      KCNQ1＿rs2237897  TP-R8（配列番号４１７）    ACGAGGGGCCTCAGGCCACTCCCTGGGCCTGAA
【０１２９】
鋳型プラスミドの調製
増幅する領域以外のゲノム断片が、核酸増幅の結果に影響しないように、以下に示す方法により調製したプラスミドを、核酸増幅の鋳型核酸とした。まず、ＰＣＲにより、各種標的遺伝子の標的核酸配列を増幅した。前記増幅産物を、ｐＧＥＭ−Ｔプラスミドに挿入してクローン化し、各種標的遺伝子の標的核酸配列を含むプラスミドを得た。前記プラスミドを、核酸増幅の鋳型核酸とした。前記プラスミドは、鋳型核酸として使用するまで、−２０℃で保存した。
【０１３０】
核酸増幅反応
以下の方法で、各種ターゲット配列に対し、Ｆ１  ＴＰ〜Ｆ８  ＴＰとＲ１  ＴＰ〜Ｒ８  ＴＰとの全ての組合せ（６４通り）を用いて核酸増幅反応を行った。前記鋳型核酸プラスミドは、２０００コピー／μＬに希釈した後、９８℃に熱し、変性させたものを使用した。核酸増幅反応液の組成は、下記に示す通りである。反応液に鋳型核酸を含まないものをネガティブコントロールとした。前記反応液は、氷上で調製し、２５μＬとした。前記反応液を、６０℃で９０分インキュベートすることにより、核酸を増幅した。増幅産物の生成は、リアルタイム蛍光検出装置（商品名Ｍｘ３０００Ｐ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、または、商品名ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＲ４８０、Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて１分ごとにモニタリングした。前記リアルタイム蛍光検出装置によって各時点でモニタリングされる蛍光強度が最大蛍光強度の半分に到達するまでの時間を、増幅反応の反応時間として決定した。
【０１３１】
（核酸増幅反応液）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ                トリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)
１０ｍｍｏｌ／Ｌ                塩化カリウム
１０ｍｍｏｌ／Ｌ                硫酸アンモニウム
８ｍｍｏｌ／Ｌ                  硫酸マグネシウム
５％                            ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
０．１％                        Ｔｗｅｅｎ２０
１．４ｍｍｏｌ／Ｌ              ｄＮＴＰ
２×３．３μｍｏｌ／Ｌ          ２×ＴＰ
０．００１％                    ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）
６ｕｎｉｔｓ                    ＡａｃＤＮＡポリメラーゼ
（ダナフォーム社製）
１μＬ                          鋳型核酸
【０１３２】
核酸増幅反応評価方法
以下の（ａ）〜（ｃ）の条件を全て満たしている場合に、そのＴＰの組合せの評価を１とし、条件を一つでも満たしていない場合は、そのＴＰの組合せの評価を０とすることによって、核酸増幅反応の速度および特異性を評価した。
（ａ）鋳型核酸を入れた試料の反応時間と、鋳型核酸を入れていない試料（ネガティブコントロール）の反応時間との差が２５分以上である。
（ｂ）鋳型核酸を入れた試料の反応時間が４０分以内である。
（ｃ）最大蛍光強度が１以上である。
ある一つのＦｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＴＰを含むＴＰの組合せ数は、対応するＲｅｖｅｒｓｅ／Ｆｏｒｗａｒｄ  ＴＰ（Ｒ１  ＴＰ〜Ｒ８  ＴＰ）の数である８つであるので、評価点数は０〜８点となる。
【０１３３】
[実施例１]
本実施例では、前記プライマーの設計方法（０）および前記プライマーの製造方法（０）に基づき、前記プライマー（０）を設計および製造し、これを用いて核酸増幅を行った。すなわち、図７（Ａ）に示すように、ＴＰの配列（Ａｃ'）の５'末端に隣接した塩基を５'から３'の順にａ、ｂとし、ＴＰ伸長鎖の配列（Ｂｃ）の５'末端に隣接した塩基を５'から３'の順にｃ、ｄとする。塩基ａとｄ、または、塩基ｂとｃとが相補的であれば、そのＴＰには配列（Ｗ）が存在する。前記塩基ａとｄ、および、前記塩基ｂとｃとが相補的であることと、そのＴＰによる核酸増幅反応の速度および特異性との関係の解析を以下のように行った。まず、前述のＴＰと標的核酸配列との様々な組み合わせを、前記塩基ａとｄ、および、前記塩基ｂとｃとの相補関係の有無にしたがって分類した。次に、各分類における、核酸増幅反応の速度および特異性を解析した。その結果を図７（Ｂ）に示す。同図（Ｂ）のグラフの横軸は、各分類のＴＰの組合せの核酸増幅反応の評価点数を示し、同グラフの縦軸は、各々の評価点数を与えるＴＰの組合せの個数を示す。まず、比較例１は、前記塩基ａとｄ、および、前記塩基ｂとｃのいずれも相補的な関係を有さない場合である。このときの評価点数の平均は、０．２５７点であり、評価点数が３点以上のものは全体の２．４％であった。一方、実施例１−１および１−２では、それぞれ前記ａとｄ、または、前記塩基ｂとｃとが相補的な関係を有し、ＴＰは、塩基数１の配列（Ｗ）を有する。このときの評価点数の平均は、それぞれ０．２８６点、０．４６５点であり、評価点数が３点以上のものはそれぞれ全体の２．９％、７．０％であり、いずれも比較例１の場合より優れていた。さらに実施例１−３では、それぞれ前記塩基ａとｄ、および、前記塩基ｂとｃの両方が相補的な関係を有し、ＴＰは、塩基数２の配列（Ｗ）を有する。このときの評価点数の平均は、０．８７５点であり、評価点数が３点以上のものは全体の１６．７％であり、さらに優れた増幅速度・特異性を示した。これらの結果より、配列（Ｗ）を有するＴＰは、優れた増幅速度・特異性を示し、配列（Ｗ）の長さが２塩基のときは、１塩基のときよりもさらに優れた増幅速度・特異性を示すことが明らかになった。
【０１３４】
[実施例２]
図８（Ａ）に示した、塩基ａとｆ、塩基ｂとｅ、および、塩基ｃとｄとの相補関係にしたがってＴＰと標的核酸配列との組み合わせを分類した以外は、実施例１と同様に核酸増幅反応の評価点数を解析した。その結果を図８（Ｂ）に示す。グラフの縦軸、横軸の示すものは実施例１と同様である。まず、比較例２は、前記塩基ａとｆ、前記塩基ｂとｅ、および、前記塩基ｃとｄのいずれも相補的な関係を有さない場合である。このときの評価点数の平均は、０．３１６点であり、評価点数が３点以上のものは全体の２．６％であった。一方、実施例２−１および２−２では、それぞれ前記塩基ａとｆ、または、前記塩基ｂとｅが相補的な関係を有し、ＴＰは、塩基数１の配列（Ｗ）を有する。このときの評価点数の平均は、それぞれ０．３４点、０．４３５点であり、評価点数が３点以上のものはそれぞれ全体の３．８％、８．７％であり、いずれも比較例２の場合より優れていた。また、実施例２−３および２−４では、それぞれ、前記塩基ａとｆおよび前記塩基ｂとｅ、前記塩基ｂとｅおよび前記塩基ｃとｄが相補的な関係を有し、ＴＰは、塩基数２の配列（Ｗ）を有する。このときの評価点数の平均は、それぞれ０．９２９点、０．５点であり、評価点数が３点以上のものはそれぞれ全体の１４．３％、５．０％であり、いずれも比較例２の場合より優れていた。さらに、実施例２−５では、前記塩基ａとｆ、前記塩基ｂとｅおよび前記塩基ｃとｄの全てが相補的な関係を有し、ＴＰは、塩基数３の配列（Ｗ）を有する。このときの評価点数の平均は、それぞれ０．８点であり、評価点数が３点以上のものはそれぞれ全体の２０．０％であり、さらに優れた増幅速度・特異性を示した。これらの結果より、配列（Ｗ）を有するＴＰは、優れた増幅速度・特異性を示し、配列（Ｗ）の長さが３塩基のときは、２塩基のときよりもさらに優れた増幅速度・特異性を示すことが明らかになった。
【０１３５】
［実施例３］
本実施例では、前記プライマーの設計方法（１）および前記プライマーの製造方法（１）に基づき、前記プライマー（１）を設計および製造し、さらに、これを用いて核酸増幅を行い、標的核酸配列の増幅効率を確認した。すなわち、本実施例では、前記核酸増幅反応の作用機序（図３）の中で、ＴＰの相補配列が折り返しによってステム−ループ構造（図３（ｅ）（ｆ））を形成した際に、新たなＴＰがハイブリダイズするループ上の部位が１本鎖になっている確率が増幅反応に及ぼす影響を調べた。１本鎖になっている確率は、まず、当該ループ上の、ＴＰがハイブリダイズする配列中に注目する配列を定め、次にその注目配列に対する相補配列が当該ループ上にいくつ存在するかで評価することとし、当該相補配列の数がより多い場合に一本鎖になっている確率はより小さいとした。なお、図３（ｇ）の一部を以下に示す。
【０１３６】
【数１】
0006006814.tif 000002
【０１３７】
鋳型プラスミドの調製
増幅する領域以外のゲノム断片が、核酸増幅の結果に影響しないように、以下に示す方法により調製したプラスミドを、核酸増幅の鋳型核酸とした。まず、ＰＣＲにより、各種標的遺伝子の標的核酸配列を増幅した。前記増幅産物を、ｐＧＥＭ−Ｔプラスミドに挿入してクローン化し、各種標的遺伝子の標的核酸配列を含むプラスミドを得た。前記プラスミドを、核酸増幅の鋳型核酸とした。前記プラスミドは、鋳型核酸として使用するまで、−２０℃で保存した。
【０１３８】
核酸増幅反応
増幅反応のターゲット配列：（後記）
使用したＴＰペア（Ｆｏｒｗａｒｄ  ＴＰおよびＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰ）：（後記）
上記ターゲット配列に対し、各種ＴＰペアを用いて核酸増幅反応を行った。前記鋳型核酸プラスミドは、２０００コピー／μＬに希釈した後、９８℃に熱し、変性させたものを使用した。核酸増幅反応液の組成は、下記に示す通りである。反応液に鋳型核酸を含まないものをネガティブコントロールとした。前記反応液は、氷上で調製し、２５μＬとした。前記反応液を、６０℃で９０分インキュベートすることにより、核酸を増幅した。増幅産物の生成は、リアルタイム蛍光検出装置（商品名Ｍｘ３０００Ｐ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、または、商品名ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＲ４８０、Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて１分ごとにモニタリングした。前記リアルタイム蛍光検出装置によって各時点でモニタリングされる蛍光強度が最大蛍光強度の半分に到達するまでの時間を、増幅反応の反応時間として決定した。
【０１３９】
（核酸増幅反応液）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ                トリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)
１０ｍｍｏｌ／Ｌ                塩化カリウム
１０ｍｍｏｌ／Ｌ                硫酸アンモニウム
８ｍｍｏｌ／Ｌ                  硫酸マグネシウム
５％                            ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
０．１％                        Ｔｗｅｅｎ２０
１．４ｍｍｏｌ／Ｌ              ｄＮＴＰ
２×３．３μｍｏｌ／Ｌ          ２×ＴＰ
０．００１％                    ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）
６ｕｎｉｔｓ                    ＡａｃＤＮＡポリメラーゼ
（ダナフォーム社製）
１μＬ                          鋳型核酸
【０１４０】
核酸増幅反応評価方法
前記ループ上に新たにハイブリダイズするＴＰ上の配列（Ａｃ’）に対応する前記ループ上の配列（Ａ）（すなわち、核酸増幅の標的となるゲノム上の配列の一部と同じもの）について、配列（Ａ）の５'末端から３塩基の配列（注目配列1-3）と相補的な３塩基の逆方向の配列（相補配列）がループ全体（配列（Ｂ）と配列（Ｂｃ）に挟まれた領域で、（Ａ）（Ｂ）間の介在配列を含む領域）の中に何個存在するかを計算した。ただし、注目配列、その上流側３塩基およびその下流側３塩基の計９塩基の領域は個数計算の対象外とした。そして、注目配列をさらに３'側に１塩基ずつずらした配列（順に注目配列2-4、注目配列3-5、注目配列4-6・・・）についても同様の計算を行った。
【０１４１】
次いで、使用した各ＴＰについて鋳型核酸を入れた試料の反応時間が４５分以内で、鋳型核酸を入れた試料の反応時間と、鋳型核酸を入れていない試料（ネガティブコントロール）の反応時間との差が３０分以上のものを「成功」、それ以外のものを「失敗」と判定した。なお、増幅反応はＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰのペアで行われるが、各々のＴＰを評価するために、１つのＴＰペアの成功・失敗はそれを構成するＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰそれぞれにカウントした。
【０１４２】
＜結果＞
下記表１に示すように、ループ上の配列（Ａ）の５'末端から３塩基の配列を注目配列とした場合（注目配列1-3）、相補配列数が０個の場合の成功の割合は８例／８例（１００％）、相補配列数が１個の場合には８例／８例（１００％）であったのに対し、相補配列数が２個の場合は０例／８例（０％）となり、相補配列を１個以下に抑えた場合と２個の場合とでは顕著な相違が見られた。
一方、データは示していないが、注目配列として下流側に１塩基以上ずらした３塩基の配列（注目配列2-4、注目配列3-5、・・・）を選択した場合は、相補配列数を１個以下に抑える効果は顕著には見られなかった。
以上のことから、注目配列としてループ上の配列（Ａ）の５'末端から３塩基の配列を選択し、相補配列数を１個以下に抑えた場合に、優れた増幅速度・特異性を示すことが明らかになった。
【０１４３】
【表１】
0006006814.tif 000003
（表中「−」は９０分以内で反応が見られなかったことを示す。）
【０１４４】
なお、上記表１で用いたＴＰの塩基配列と標的核酸配列は以下のとおりである。
ABCG2  TP＿F3（配列番号１６９）TGTAAGTTTTCTTAAGGATGATGTTGTGA
ABCG2  TP＿R6（配列番号１８０）ACAGTTCTCATTTTCATGATTCGTCATAG
ABCG2  template  0（配列番号４１８）
ATGGTCTTAGAAAAGACTCATTATCATTATGTCTCATTAAAATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACGAACGGATTAACAGGGTCATTCAAGAGTTAGGTCTGGATAAAGTGGC
ABCG2  TP＿F3（配列番号１６９）TGTAAGTTTTCTTAAGGATGATGTTGTGA
ABCG2  TP＿R7（配列番号１８１）ACAGTTCTCATTTTTCATGATTCGTCATA
ABCG2  template  0（配列番号４１８）
ATGGTCTTAGAAAAGACTCATTATCATTATGTCTCATTAAAATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACGAACGGATTAACAGGGTCATTCAAGAGTTAGGTCTGGATAAAGTGGC
G2  fTP3-5（配列番号８９）TCCAGAGCCATATCCGCAGCCAACCTCGTC
G2  rTP3-8（配列番号１００）GGTGCCGCTATTGGGTCAATTACGTTTTGT
norovirus  G2  3  template  0（配列番号４１９）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP3-6（配列番号９０）CTCCAGAGCCATCCGCAGCCAACCTCGTCC
G2  rTP3-8（配列番号１００）GGTGCCGCTATTGGGTCAATTACGTTTTGT
norovirus  G2  3  template  0（配列番号４１９）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
ABCG2  TP＿F4（配列番号１７０）TGTAAGTTTTCCTTAAGGATGATGTTGTG
ABCG2  TP＿R4（配列番号１７８）ACAGTTCTCATTCATGATTCGTCATAGTT
ABCG2  template  0（配列番号４１８）
ATGGTCTTAGAAAAGACTCATTATCATTATGTCTCATTAAAATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACGAACGGATTAACAGGGTCATTCAAGAGTTAGGTCTGGATAAAGTGGC
ABCG2  TP＿F4（配列番号１７０）TGTAAGTTTTCCTTAAGGATGATGTTGTG
ABCG2  TP＿R5（配列番号１７９）ACAGTTCTCATTTCATGATTCGTCATAGT
ABCG2  template  0（配列番号４１８）
ATGGTCTTAGAAAAGACTCATTATCATTATGTCTCATTAAAATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACGAACGGATTAACAGGGTCATTCAAGAGTTAGGTCTGGATAAAGTGGC
G2  fTP3-2（配列番号８６）AGAGCCATAACCGGGTCCGCAGCCAACCTC
G2  rTP3-5（配列番号９７）GTTGGTGCCGCTTCAATTACGTTTTGTTGG
norovirus  G2  3  template  0（配列番号４１９）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP3-2（配列番号８６）AGAGCCATAACCGGGTCCGCAGCCAACCTC
G2  rTP3-8（配列番号１００）GGTGCCGCTATTGGGTCAATTACGTTTTGT
norovirus  G2  3  template  0（配列番号４１９）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
FTO  TP＿F1（配列番号２１８）CTAAATTCACTAGAATGTCTGAATTATTATTC
FTO  TP＿R2（配列番号２２７）AGTGATGCACACTGTTACCTATTAAAACTTTA
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
FTO  TP＿F1（配列番号２１８）CTAAATTCACTAGAATGTCTGAATTATTATTC
FTO  TP＿R3（配列番号２２８）AGTGATGCACGACTGTTACCTATTAAAACTTT
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
FTO  TP＿F2（配列番号２１９）CTAAATTCACTTAGAATGTCTGAATTATTATT
FTO  TP＿R1（配列番号２２６）AGTGATGCACCTGTTACCTATTAAAACTTTAG
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
FTO  TP＿F2（配列番号２１９）CTAAATTCACTTAGAATGTCTGAATTATTATT
FTO  TP＿R2（配列番号２２７）AGTGATGCACACTGTTACCTATTAAAACTTTA
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
【０１４５】
［実施例４］
本実施例では、前記プライマーの設計方法（２）および前記プライマーの製造方法（２）に基づき、前記プライマー（２）を設計および製造し、さらに、これを用いて核酸増幅を行い、標的核酸配列の増幅効率を確認した。すなわち、本実施例では、前記核酸増幅反応の作用機序（図３）の中で、核酸増幅の標的となるゲノム配列上にＴＰがハイブリダイズする（図３（ａ））際にその部位が１本鎖になっている確率が影響増幅反応に及ぼす影響を調べた。１本鎖になっている確率は、まず、当該ゲノム配列上の、ＴＰがハイブリダイズする配列中に注目する配列を定め、次にその注目配列に対する相補配列が当該ゲノム配列上にいくつ存在するかで評価することとし、当該相補配列の数がより多い場合に一本鎖になっている確率はより小さいとした。なお、図３（ａ）の一部を以下に示す。
【０１４６】
【数２】
0006006814.tif 000004
【０１４７】
鋳型プラスミドの調製
前記実施例３（本発明のプライマー（１））と同様にして行った。
【０１４８】
核酸増幅反応
前記実施例３（本発明のプライマー（１））と同様にして行った。
【０１４９】
核酸増幅反応評価方法
核酸増幅の標的となるゲノム配列上にハイブリダイズするＴＰ上の配列（Ａｃ’）に対応する前記ゲノム配列上の配列（Ａ）について、配列（Ａ）の５'末端から３塩基の配列（注目配列1-3）と相補的な３塩基の逆方向の配列（相補配列）が、配列（Ａ）の上流側２０塩基、配列（Ａ）および配列（Ａ）の下流側２０塩基の領域中に何個存在するかを計算した。ただし、注目配列、その上流側３塩基およびその下流側３塩基の計９塩基の領域は個数計算の対象外とした。そして、注目配列をさらに３'側に１塩基ずつずらした配列（順に注目配列2-4、注目配列3-5、注目配列4-6・・・）についても同様の計算を行った。
【０１５０】
次いで、使用した各ＴＰについて鋳型核酸を入れた試料の反応時間が４５分以内で、鋳型核酸を入れた試料の反応時間と、鋳型核酸を入れていない試料（ネガティブコントロール）の反応時間との差が３０分以上のものを「成功」、それ以外のものを「失敗」と判定した。なお、増幅反応はＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰのペアで行われるが、各々のＴＰを評価するために、１つのＴＰペアの成功・失敗はそれを構成するＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰそれぞれにカウントした。
【０１５１】
＜結果＞
下記の表２に示すように、ゲノム配列上の配列（Ａ）の５'末端から３塩基の配列を注目配列とした場合（注目配列1-3）、相補配列数が０個の場合の成功の割合は８例／８例（１００％）、相補配列数が１個の場合には８例／８例（１００％）であったのに対し、相補配列数が２個または３個の場合は０例／８例（０％）となり、相補配列を１個以下に抑えた場合と２個以上の場合とでは顕著な相違が見られた。
一方、データは示していないが、注目配列として下流側に１塩基以上ずらした３塩基の配列（注目配列2-4、注目配列3-5、・・・）を選択した場合は、相補配列数を１個以下に抑える効果は顕著には見られなかった。
以上のことから、注目配列としてゲノム配列上の配列（Ａ）の５'末端から３塩基の配列を選択し、相補配列数を１個以下に抑えた場合に、優れた増幅速度・特異性を示すことが明らかになった。
【０１５２】
【表２】
0006006814.tif 000005
（表中「−」は９０分以内で反応が見られなかったことを示す。）
【０１５３】
なお、上記表２で用いたＴＰの塩基配列と標的核酸配列は以下のとおりである。
EGFR20  TP＿F4（配列番号１８７）CGTGATGAGTGTGCCGCCTGCTGGGCAT
EGFR20  TP＿R4（配列番号１９５）ACGCAGCTCTTGTGTTCCCGGACATAGT
EGFR20  template  0（配列番号４２１）
GACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGA
EGFR20  TP＿F4（配列番号１８７）CGTGATGAGTGTGCCGCCTGCTGGGCAT
EGFR20  TP＿R7（配列番号１９８）ACGCAGCTCTCTTTGTGTTCCCGGACAT
EGFR20  template  0（配列番号４２１）
GACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGA
G2  fTP4-7（配列番号１０７）CCGCCACAGGTGTATGGCTCTGGAGCCCGT
G2  rTP4-6（配列番号１１４）AAAACGTAATTGACCAGGGGCTTGTACAAA
norovirus  G2  4  template  0（配列番号４２２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP4-8（配列番号１０８）CCCGCCACAGGTATGGCTCTGGAGCCCGTT
G2  rTP4-6（配列番号１１４）AAAACGTAATTGACCAGGGGCTTGTACAAA
norovirus  G2  4  template  0（配列番号４２２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP4-1（配列番号１０１）CAGGTGCCGCAATGAGGTTATGGCTCTGGA
G2  rTP4-1（配列番号１０９）CCAACAAAACGTGGGCTTGTACAAAATTGT
norovirus  G2  4  template  0（配列番号４２２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP4-5（配列番号１０５）GCCACAGGTGCCGTTATGGCTCTGGAGCCC
G2  rTP4-1（配列番号１０９）CCAACAAAACGTGGGCTTGTACAAAATTGT
norovirus  G2  4  template  0（配列番号４２２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP2-2（配列番号７０）GTCATTCGACGCCGATCGCAATCTGGCTCC
G2  rTP2-3（配列番号７９）ATCTGATGGGTCTAACCTCATTATTGACCT
norovirus  G2  2  template  0（配列番号４２３）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP2-6（配列番号７４）TGGCGTCATTCGCGCAATCTGGCTCCCAGC
G2  rTP2-3（配列番号７９）ATCTGATGGGTCTAACCTCATTATTGACCT
norovirus  G2  2  template  0（配列番号４２３）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
ABCB1  TP＿F1（配列番号１５０）CGATCTCTTCGCATTGCTGAGAACATTGC
ABCB1  TP＿R3（配列番号１６０）TCGTGAGGGCGGCAGTGACTCGATGAAGG
ABCB1  template  0（配列番号４２４）
ACCTGGGCATCGTGTCCCAGGAGCCCATCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGAGAACATTGCCTATGGAGACAACAGCCGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATCGTGAGGGCAGCAAAGGAGGCCAACATACATGCCTTCATCGAGTCACTGCCTAATGTAAGTCTCTCTTCAAATAAACAGCCTGGGAGCATGTGGCAGCCTC
ABCB1  TP＿F1（配列番号１５０）CGATCTCTTCGCATTGCTGAGAACATTGC
ABCB1  TP＿R7（配列番号１６４）TCGTGAGGGCATTAGGCAGTGACTCGATG
ABCB1  template  0（配列番号４２４）
ACCTGGGCATCGTGTCCCAGGAGCCCATCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGAGAACATTGCCTATGGAGACAACAGCCGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATCGTGAGGGCAGCAAAGGAGGCCAACATACATGCCTTCATCGAGTCACTGCCTAATGTAAGTCTCTCTTCAAATAAACAGCCTGGGAGCATGTGGCAGCCTC
EGFR20  TP＿F6（配列番号１８９）CGTGATGAGCGTGTGCCGCCTGCTGGGC
EGFR20  TP＿R7（配列番号１９８）ACGCAGCTCTCTTTGTGTTCCCGGACAT
EGFR20  template  0（配列番号４２１）
GACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGA
EGFR20  TP＿F6（配列番号１８９）CGTGATGAGCGTGTGCCGCCTGCTGGGC
EGFR20  TP＿R8（配列番号１９９）ACGCAGCTCGTCTTTGTGTTCCCGGACA
EGFR20  template  0（配列番号４２１）
GACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGA
【０１５４】
［実施例５］
本実施例では、前記プライマーの設計方法（３）および前記プライマーの製造方法（３）に基づき、前記プライマー（３）を設計および製造し、さらに、これを用いて核酸増幅を行い、標的核酸配列の増幅効率を確認した。すなわち、本実施例では、前記核酸増幅反応の作用機序（図３）の中で、ＴＰの相補配列が折り返しによってステム−ループ構造（図３（ｅ）（ｆ））を形成した際に、配列（Ｂｃ）（以下「ターンバック配列」という）が配列（Ｂ）にハイブリダイズする結合の強さが増幅反応に及ぼす影響を調べた。結合の強さは、まずターンバック配列中に注目する配列を定め、次にその注目配列を構成する塩基にＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）がいくつ含まれるか（Ｇ/Ｃ数）で評価することとし、その数がより多い場合に結合の強さがより強いとした。なお、当該Ｇ/Ｃ数はプライマー（３）の配列（Ｂ’）の５’端からみた注目配列中のＧ/Ｃ数に一致する。図３（ｆ）の一部を以下に示す。
【０１５５】
【数３】
0006006814.tif 000006
【０１５６】
鋳型プラスミドの調製
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０１５７】
核酸増幅反応
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０１５８】
核酸増幅反応評価方法
注目配列を、ターンバック配列（Ｂｃ）の３'末端から６塩基の配列（注目配列1-6）とし、当該配列を構成する塩基に含まれるＧまたはＣの個数を数える。そして、注目配列をさらに５’側に１塩基ずつずらした配列（順に注目配列2-7、注目配列3-8、注目配列4-9、・・・）についても同様に数える。次いで、使用した各ＴＰについて鋳型核酸を入れた試料の反応時間が４５分以内で、鋳型核酸を入れた試料の反応時間と、鋳型核酸を入れていない試料（ネガティブコントロール）の反応時間との差が３０分以上のものを「成功」、それ以外のものを「失敗」と定義する。なお、増幅反応はＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰのペアで行われるが、各々のＴＰを評価するために、１つのＴＰペアの成功・失敗はそれを構成するＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰそれぞれにカウントする。
【０１５９】
＜結果＞
下記の表３に示すように、ターンバック配列（Ｂｃ）の３'末端から６塩基の配列に、Ｇ/Ｃ数が４、５、６のときに、成功の割合がそれぞれ７例／７例（１００％）、５例／５例（１００％）、１例／１例（１００％）となり、Ｇ/Ｃ数が３以下の場合の成功の割合が１例／１３例（７．７％）であるのに比べて顕著な相違が見られた。なお、Ｇ/Ｃ数が３以下の場合の唯一の成功例は、Ｇ/Ｃ数が６であるＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰと組み合わせたプライマーセット（ペア）による増幅反応であることから、前記Ｆｏｒｗａｒｄ  ＴＰのＧ/Ｃ数（＝６）が、増幅速度と特異性の向上に関与していることが考えられる。
一方、データは示していないが、注目配列として上流側に１塩基ずつずらした６塩基の配列（注目配列2-7、注目配列3-8、・・・）を選択した場合は、Ｇ/Ｃ数を一定数以上とする効果は顕著には見られなかった。
以上のことから、ターンバック配列（Ｂｃ）の３'末端から数えた６塩基のうち４塩基以上をＧまたはＣとすることによって、ターンバック配列がハイブリダイズするための適度な結合の強さが得られ、それによって優れた増幅速度・特異性を示すことが明らかになった。
【０１６０】
【表３】
0006006814.tif 000007
（表中「−」は９０分以内で反応が見られなかったことを示す。）
【０１６１】
なお、上記表３で用いたＴＰの塩基配列と標的核酸配列は以下のとおりである。
G2  fTP4-8（配列番号１０８）  CCCGCCACAGGTATGGCTCTGGAGCCCGTT
G2  rTP4-1（配列番号１０９）  CCAACAAAACGTGGGCTTGTACAAAATTGT
norovirus  G2  1  template  0（配列番号４３２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP3-8（配列番号９２）GGCTCCAGAGCCGCAGCCAACCTCGTCCCA
G2  rTP3-7（配列番号９９）TGGTGCCGCTATGGTCAATTACGTTTTGTT
norovirus  G2  3  template  0（配列番号４１９）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP3-8（配列番号９２）GGCTCCAGAGCCGCAGCCAACCTCGTCCCA
G2  rTP3-8（配列番号１００）GGTGCCGCTATTGGGTCAATTACGTTTTGT
norovirus  G2  3  template  0（配列番号４１９）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
GGCX  TP＿F1（配列番号２５１）TCGGGGGCAGTGCTCCCCTGAGTGGC
GGCX  TP＿R4（配列番号２６２）CGAAGGTTGCACTGGGCTGAGGGGCT
GGCX  template  0（配列番号４２５）
CTCCCTGCTTTCCTAGGTATGTTCTCCTACGTCATGCTGGCCAGCAGCCCTCTCTTCTGCTCCCCTGAGTGGCCTCGGAAGCTGGTGTCCTACTGCCCCCGAAGGTTGCAACAACTGTTGCCCCTCAAGGCAGCCCCTCAGCCCAGTGTTTCCTGTGTGTATAAGAGGAGCCGGGGCAAAAGTGGCCAGAAGCCAGGGCTG
GGCX  TP＿F1（配列番号２５１）TCGGGGGCAGTGCTCCCCTGAGTGGC
GGCX  TP＿R8（配列番号２６６）CGAAGGTTGCAAACACTGGGCTGAGG
GGCX  template  0（配列番号４２５）
CTCCCTGCTTTCCTAGGTATGTTCTCCTACGTCATGCTGGCCAGCAGCCCTCTCTTCTGCTCCCCTGAGTGGCCTCGGAAGCTGGTGTCCTACTGCCCCCGAAGGTTGCAACAACTGTTGCCCCTCAAGGCAGCCCCTCAGCCCAGTGTTTCCTGTGTGTATAAGAGGAGCCGGGGCAAAAGTGGCCAGAAGCCAGGGCTG
G2  fTP3-2（配列番号８６）AGAGCCATAACCGGGTCCGCAGCCAACCTC
G2  rTP3-7（配列番号９９）TGGTGCCGCTATGGTCAATTACGTTTTGTT
norovirus  G2  3  template  0（配列番号４１９）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP3-4（配列番号８８）CCAGAGCCATAAGTCCGCAGCCAACCTCGT
G2  rTP3-7（配列番号９９）TGGTGCCGCTATGGTCAATTACGTTTTGTT
norovirus  G2  3  template  0（配列番号４１９）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP2-3（配列番号７１）CGTCATTCGACGGATCGCAATCTGGCTCCC
G2  rTP2-5（配列番号８１）CTGATGGGTCCGCATAACCTCATTATTGAC
norovirus  G2  2  template  0（配列番号４２３）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP2-3（配列番号７１）CGTCATTCGACGGATCGCAATCTGGCTCCC
G2  rTP2-6（配列番号８２）TGATGGGTCCGCCCATAACCTCATTATTGA
norovirus  G2  2  template  0（配列番号４２３）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP2-1（配列番号６９）TCATTCGACGCCGCGATCGCAATCTGGCTC
G2  rTP2-4（配列番号８０）TCTGATGGGTCCATAACCTCATTATTGACC
norovirus  G2  2  template  0（配列番号４２３）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP2-2（配列番号７０）GTCATTCGACGCCGATCGCAATCTGGCTCC
G2  rTP2-4（配列番号８０）TCTGATGGGTCCATAACCTCATTATTGACC
norovirus  G2  2  template  0（配列番号４２３）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
UCP1＿fTP＿3（配列番号４２６）TTGAATAGTGCCAGTGGTGGCTAATGAGAG
UCP1＿rTP(0.5)（配列番号４２７）GTTAATGTGTTATGTAACAAATTCTCCTTTCCTTT
UCP1  template  0（配列番号４２８）
TTGTATTTCTTCTTTTAGAAATTGATTCTTCTGTCATTTGCACATTTATCTGTATAATTATAACAGGGTATTTCCCAGTGGTGGCTAATGAGAGAATTATGGGAAAGTATAGAACACTATTCAAATGCAAAGCACTGTATGATTTTTATTTAATAGGAAGACATTTTGTGCAGCGATTTCTGATTGACCACAGTTTGATCAAGTGCATTTGTTAATGTGTTCTACATTTTCAAAAAGGAAAGGAGAATTTGTTACATTCAGAACTTGCTGCCACTCCTTTGCTACGTCATAAAGGGTCAGTTGCCCTTGCTCATACTGACCTATTCTTTACCTCTCTGCTTCTTCTTTGTGCCAGAAGAGTAGAAATCTGACCCTTTGGGGATACCACCCTCTCCCCTACT
UCP1＿fTP＿3（配列番号４２６）TTGAATAGTGCCAGTGGTGGCTAATGAGAG
UCP1＿rTP(1)（配列番号４２９）TACATTTTCAAATGTAACAAATTCTCCTTTCCTTT
UCP1  template  0（配列番号４２８）
TTGTATTTCTTCTTTTAGAAATTGATTCTTCTGTCATTTGCACATTTATCTGTATAATTATAACAGGGTATTTCCCAGTGGTGGCTAATGAGAGAATTATGGGAAAGTATAGAACACTATTCAAATGCAAAGCACTGTATGATTTTTATTTAATAGGAAGACATTTTGTGCAGCGATTTCTGATTGACCACAGTTTGATCAAGTGCATTTGTTAATGTGTTCTACATTTTCAAAAAGGAAAGGAGAATTTGTTACATTCAGAACTTGCTGCCACTCCTTTGCTACGTCATAAAGGGTCAGTTGCCCTTGCTCATACTGACCTATTCTTTACCTCTCTGCTTCTTCTTTGTGCCAGAAGAGTAGAAATCTGACCCTTTGGGGATACCACCCTCTCCCCTACT
【０１６２】
［実施例６］
本実施例では、前記プライマーの設計方法（４）および前記プライマーの製造方法（４）に基づき、前記プライマー（４）を設計および製造し、さらに、これを用いて核酸増幅を行い、標的核酸配列の増幅効率を確認した。すなわち、本実施例では、前記核酸増幅反応の作用機序（図３）の中で、ＴＰの相補配列が折り返しによってステム−ループ構造（図３（ｅ）（ｆ））を形成した際に、新たなＴＰがハイブリダイズするループ上の部位が１本鎖になっている確率が増幅反応に及ぼす影響を調べた。１本鎖になっている確率は、まず、当該ループ上の、ＴＰがハイブリダイズする配列中に注目する配列を定め、次にその注目配列に対する相補配列が当該ループ上にいくつ存在するかで評価することとし、当該相補配列の数がより多い場合に一本鎖になっている確率はより小さいとした。なお、図３（ｇ）の一部を以下に示す。
【０１６３】
【数４】
0006006814.tif 000008
【０１６４】
なお、前述のように、ループ上の特定の部位が一本鎖となる確率を上げると効果がみられる科学的理由は、例えば以下のように考えられる。ただし、これらはあくまで理論的考察の一例であって、本発明を何ら限定しない。
１．ループの端はステム構造によって固定されているため、新しいＴＰがらせん状にハイブリダイズする必要がある。
２．ＴＰの５'端はターンバックの領域があり長いため、５'側が先に核を作り、３'側がらせん状にハイブリダイズするほうが有利である。
３．５'端はステム構造の立体障害があるため、初めの核形成は５'端からある程度離れていたほうが有利である。
【０１６５】
鋳型プラスミドの調製
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０１６６】
核酸増幅反応
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０１６７】
核酸増幅反応評価方法
前記ループ上に新たにハイブリダイズするＴＰ上の配列（Ａｃ’）に対応する前記ループ上の配列（Ａ）（すなわち、核酸増幅の標的となるゲノム上の配列の一部と同じもの）について、配列（Ａ）の５'末端から３塩基の配列（注目配列５'側１−３）と相補的な３塩基の逆方向の配列（相補配列）が、「注目配列５'側１−３」の５'末端から上流側に数えた配列の４塩基目から最大２３塩基目までの計最大２０塩基（ただし配列（Ｂ）およびその上流側の配列は含まない）、および注目配列１−３の３'末端から下流側に数えた配列の４塩基目から最大２３塩基目までの計最大２０塩基（ただし配列（Ｂｃ）およびその下流側の配列は含まない）の中に、合計何個存在するかを計算した。そして、注目配列をさらに３'側に１塩基ずつずらした配列（順に「注目配列５'側２−４」、「注目配列５'側３−５」、「注目配列５'側４−６」・・・）についても同様の計算を行った。同様に、配列（Ａ）の３'末端から３塩基の配列（注目配列３'側１−３）とそれを５'側に１塩基ずつずらした配列（順に「注目配列３'側２−４」、「注目配列３'側３−５」、「注目配列３'側４−６」・・・）についても同様の計算を行った。
次いで、使用した各ＴＰについて鋳型核酸を入れた試料の反応時間が４５分以内で、鋳型核酸を入れた試料の反応時間と、鋳型核酸を入れていない試料（ネガティブコントロール）の反応時間との差が３０分以上のものを「成功」、それ以外のものを「失敗」と判定した。
【０１６８】
＜結果＞
ループ上の配列（Ａ）の５'末端から数えて注目配列を定めた場合
以下の表４に示すように、ループ上の配列（Ａ）の５'末端から９塩基目から１１塩基目の３塩基の配列を注目配列とした場合（注目配列５'側９−１１）、相補配列数が０個の場合の成功の割合は４例／４例（１００％）、相補配列数が１個の場合には４例／４例（１００％）であったのに対し、相補配列数が２個の場合は０例／２例（０％）となり、相補配列を１個以下に抑えた場合と２個の場合とでは顕著な相違が見られた。
【０１６９】
また、ループ上の配列（Ａ）の５'末端から１０塩基目から１２塩基目の３塩基の配列を注目配列とした場合（注目配列５'側１０−１２）、相補配列数が０個の場合の成功の割合は５例／５例（１００％）、相補配列数が１個の場合には３例／３例（１００％）であったのに対し、相補配列数が２個以上の場合は全体で０例／４例（０％）となり、相補配列を１個以下に抑えた場合と２個以上の場合とでは顕著な相違が見られた。
【０１７０】
さらに、ループ上の配列（Ａ）の５'末端から１１塩基目から１３塩基目の３塩基の配列を注目配列とした場合（注目配列５'側１１−１３）、相補配列数が０個の場合の成功の割合は４例／４例（１００％）、相補配列数が１個の場合には４例／４例（１００％）であったのに対し、相補配列数が２個以上の場合は全体で０例／４例（０％）となり、相補配列を１個以下に抑えた場合と２個以上の場合とでは顕著な相違が見られた。
【０１７１】
一方、データは示していないが、注目配列５'側７−９、注目配列５'側８−１０、注目配列５'側１２−１４の場合は、相補配列数を小さくする効果は顕著には見られなかった。
【０１７２】
以上のことから、注目配列としてループ上の配列（Ａ）の５'末端から数えて９塩基目から１３塩基目までの計５塩基のうち、９塩基目から１１塩基目の３塩基、１０塩基目から１２塩基目の３塩基、または１１塩基目から１３塩基目の３塩基の配列の相補配列数を１個以下に抑えた場合に、優れた増幅速度・特異性を示すことが明らかになった。
【０１７３】
ループ上の配列（Ａ）の３'末端から数えて注目配列を定めた場合
以下の表５に示すように、ループ上の配列（Ａ）の３'末端から６塩基目から８塩基目の３塩基の配列を注目配列とした場合（注目配列３'側６−８）、相補配列数が０個の場合の成功の割合は５例／５例（１００％）、相補配列数が１個の場合には３例／３例（１００％）であったのに対し、相補配列数が２個の場合は０例／４例（０％）となり、相補配列を１個以下に抑えた場合と２個の場合とでは顕著な相違が見られた。
また、ループ上の配列（Ａ）の３'末端から７塩基目から９塩基目の３塩基の配列を注目配列とした場合（注目配列３'側７−９）、相補配列数が０個の場合の成功の割合は４例／４例（１００％）、相補配列数が１個の場合には４例／４例（１００％）であったのに対し、相補配列数が２個の場合は０例／４例（０％）となり、相補配列を１個以下に抑えた場合と２個の場合とでは顕著な相違が見られた。
【０１７４】
さらに、ループ上の配列（Ａ）の３'末端から８塩基目から１０塩基目の３塩基の配列を注目配列とした場合（注目配列３'側８−１０）、相補配列数が０個の場合の成功の割合は５例／５例（１００％）、相補配列数が１個の場合には３例／３例（１００％）であったのに対し、相補配列数が２個の場合は０例／４例（０％）となり、相補配列を１個以下に抑えた場合と２個の場合とでは顕著な相違が見られた。
【０１７５】
一方、データは示していないが、注目配列３'側４−６、注目配列３'側５−７、注目配列３'側９−１１、注目配列３'側１０−１２の場合は、相補配列数を小さくする効果は顕著には見られなかった。
【０１７６】
以上のことから、注目配列としてループ上の配列（Ａ）の３'末端から６塩基目から１０塩基目までの計５塩基のうち、６塩基目から８塩基目の３塩基、７塩基目から９塩基目の３塩基、または８塩基目から１０塩基目の３塩基の配列の相補配列数を１個以下に抑えた場合に、優れた増幅速度・特異性を示すことが明らかになった。
【０１７７】
【表４】
0006006814.tif 000009
【０１７８】
【表５】
0006006814.tif 000010
（表４〜表５中「−」は９０分以内で反応が見られなかったことを示す。）
【０１７９】
なお、上記表４および表５で用いたＴＰの塩基配列と標的核酸配列は以下のとおりである。
5'end    9-11  base
ABCG2  TP＿F4（配列番号１７０）TGTAAGTTTTCCTTAAGGATGATGTTGTG
ABCG2  TP＿R6（配列番号１８０）ACAGTTCTCATTTTCATGATTCGTCATAG
ABCG2  template  0（配列番号４１８）
ATGGTCTTAGAAAAGACTCATTATCATTATGTCTCATTAAAATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACGAACGGATTAACAGGGTCATTCAAGAGTTAGGTCTGGATAAAGTGGC
ABCG2  TP＿F4（配列番号１７０）TGTAAGTTTTCCTTAAGGATGATGTTGTG
ABCG2  TP＿R7（配列番号１８１）ACAGTTCTCATTTTTCATGATTCGTCATA
ABCG2  template  0（配列番号４１８）
ATGGTCTTAGAAAAGACTCATTATCATTATGTCTCATTAAAATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACGAACGGATTAACAGGGTCATTCAAGAGTTAGGTCTGGATAAAGTGGC
NAT2-590  TP＿F6（配列番号３２３）TCGAGGTTCAATCTCCTGCCAAAGAAGAAACA
NAT2-590  TP＿R4（配列番号３２９）CGAACAATTGTGTTGGAGACGTCTGCAGGTAT
NAT2-590  template  0（配列番号４３０）
ATCAGGAGAGAGCAGTATATTACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCATCTCCTGCCAAAGAAGAAACACCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCTCGAACAATTGAAGATTTTGAGTCTATGAATACATACCTGCAGACGTCTCCAACATCTTCATTTATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCAGACCCCAGAAGGG
NAT2-590  TP＿F6（配列番号３２３）TCGAGGTTCAATCTCCTGCCAAAGAAGAAACA
NAT2-590  TP＿R5（配列番号３３０）CGAACAATTGATGTTGGAGACGTCTGCAGGTA
NAT2-590  template  0（配列番号４３０）
ATCAGGAGAGAGCAGTATATTACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCATCTCCTGCCAAAGAAGAAACACCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCTCGAACAATTGAAGATTTTGAGTCTATGAATACATACCTGCAGACGTCTCCAACATCTTCATTTATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCAGACCCCAGAAGGG
FTO  TP＿F2（配列番号２１９）CTAAATTCACTTAGAATGTCTGAATTATTATT
FTO  TP＿R1（配列番号２２６）AGTGATGCACCTGTTACCTATTAAAACTTTAG
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
5'end    10-12  base
G2  fTP3-7（配列番号９１）GCTCCAGAGCCACGCAGCCAACCTCGTCCC
G2  rTP3-5（配列番号９７）GTTGGTGCCGCTTCAATTACGTTTTGTTGG
norovirus  G2  3  template  0（配列番号４１９）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP3-7（配列番号９１）GCTCCAGAGCCACGCAGCCAACCTCGTCCC
G2  rTP3-8（配列番号１００）GGTGCCGCTATTGGGTCAATTACGTTTTGT
norovirus  G2  3  template  0（配列番号４１９）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
GGCX  TP＿F3（配列番号２５３）TCGGGGGCAGTCTGCTCCCCTGAGTG
GGCX  TP＿R4（配列番号２６２）CGAAGGTTGCACTGGGCTGAGGGGCT
GGCX  template  0（配列番号４２５）
CTCCCTGCTTTCCTAGGTATGTTCTCCTACGTCATGCTGGCCAGCAGCCCTCTCTTCTGCTCCCCTGAGTGGCCTCGGAAGCTGGTGTCCTACTGCCCCCGAAGGTTGCAACAACTGTTGCCCCTCAAGGCAGCCCCTCAGCCCAGTGTTTCCTGTGTGTATAAGAGGAGCCGGGGCAAAAGTGGCCAGAAGCCAGGGCTG
G2  fTP4-5（配列番号１０５）GCCACAGGTGCCGTTATGGCTCTGGAGCCC
G2  rTP4-2（配列番号１１０）CAACAAAACGTAGGGGCTTGTACAAAATTG
norovirus  G2  4  template  0（配列番号４２２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
FTO  TP＿F8（配列番号２２５）CTAAATTCACATGCATTTAGAATGTCTGAATT
FTO  TP＿R8（配列番号２３３）AGTGATGCACTTTCTGACTGTTACCTATTAAA
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
FTO  TP＿F1（配列番号２１８）CTAAATTCACTAGAATGTCTGAATTATTATTC
FTO  TP＿R8（配列番号２３３）AGTGATGCACTTTCTGACTGTTACCTATTAAA
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
5'end    11-13  base
G2  fTP6-5（配列番号１３７）CCCAAGGGCGCGGTGTCCCCTAGAAACGCT
G2  rTP6-5（配列番号１４５）CTGAACCCCTATCCTGCATAACCATTGTAC
norovirus  G2  6  template  0（配列番号４３１）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP6-5（配列番号１３７）CCCAAGGGCGCGGTGTCCCCTAGAAACGCT
G2  rTP6-7（配列番号１４７）GAACCCCTATCTCACCTGCATAACCATTGT
norovirus  G2  6  template  0（配列番号４３１）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
EGFR20  TP＿F4（配列番号１８７）CGTGATGAGTGTGCCGCCTGCTGGGCAT
EGFR20  TP＿R4（配列番号１９５）ACGCAGCTCTTGTGTTCCCGGACATAGT
EGFR20  template  0（配列番号４２１）
GACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGA
EGFR20  TP＿F4（配列番号１８７）CGTGATGAGTGTGCCGCCTGCTGGGCAT
EGFR20  TP＿R7（配列番号１９８）ACGCAGCTCTCTTTGTGTTCCCGGACAT
EGFR20  template  0（配列番号４２１）
GACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGA
FTO  TP＿F7（配列番号２２４）CTAAATTCACTGCATTTAGAATGTCTGAATTA
FTO  TP＿R7（配列番号２３２）AGTGATGCACTTCTGACTGTTACCTATTAAAA
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
FTO  TP＿F7（配列番号２２４）CTAAATTCACTGCATTTAGAATGTCTGAATTA
FTO  TP＿R8（配列番号２３３）AGTGATGCACTTTCTGACTGTTACCTATTAAA
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
3'end    6-8  base
G2  fTP3-3（配列番号８７）CAGAGCCATAACGGTCCGCAGCCAACCTCG
G2  rTP3-3（配列番号９５）TTGTTGGTGCCGAATTACGTTTTGTTGGCC
norovirus  G2  3  template  0（配列番号４１９）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP3-3（配列番号８７）CAGAGCCATAACGGTCCGCAGCCAACCTCG
G2  rTP3-8（配列番号１００）GGTGCCGCTATTGGGTCAATTACGTTTTGT
norovirus  G2  3  template  0（配列番号４１９）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATC
CTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP2-2（配列番号７０）GTCATTCGACGCCGATCGCAATCTGGCTCC
G2  rTP2-3（配列番号７９）ATCTGATGGGTCTAACCTCATTATTGACCT
norovirus  G2  2  template  0（配列番号４２３）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP2-2（配列番号７０）GTCATTCGACGCCGATCGCAATCTGGCTCC
G2  rTP2-3（配列番号７９）ATCTGATGGGTCTAACCTCATTATTGACCT
norovirus  G2  2  template  0（配列番号４２３）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
FTO  TP＿F5（配列番号２２２）CTAAATTCACCATTTAGAATGTCTGAATTATT
FTO  TP＿R3（配列番号２２８）AGTGATGCACGACTGTTACCTATTAAAACTTT
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
FTO  TP＿F5（配列番号２２２）CTAAATTCACCATTTAGAATGTCTGAATTATT
FTO  TP＿R4（配列番号２２９）AGTGATGCACTGACTGTTACCTATTAAAACTT
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
3'end    7-9  base
ABCG2  TP＿F3（配列番号１６９）TGTAAGTTTTCTTAAGGATGATGTTGTGA
ABCG2  TP＿R4（配列番号１７８）ACAGTTCTCATTCATGATTCGTCATAGTT
ABCG2  template  0（配列番号４１８）
ATGGTCTTAGAAAAGACTCATTATCATTATGTCTCATTAAAATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACGAACGGATTAACAGGGTCATTCAAGAGTTAGGTCTGGATAAAGTGGC
ABCG2  TP＿F3（配列番号１６９）TGTAAGTTTTCTTAAGGATGATGTTGTGA
ABCG2  TP＿R5（配列番号１７９）ACAGTTCTCATTTCATGATTCGTCATAGT
ABCG2  template  0（配列番号４１８）
ATGGTCTTAGAAAAGACTCATTATCATTATGTCTCATTAAAATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACGAACGGATTAACAGGGTCATTCAAGAGTTAGGTCTGGATAAAGTGGC
EGFR20  TP＿F1（配列番号１８４）CGTGATGAGGCCGCCTGCTGGGCATCTG
EGFR20  TP＿R4（配列番号１９５）ACGCAGCTCTTGTGTTCCCGGACATAGT
EGFR20  template  0（配列番号４２１）
GACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGA
EGFR20  TP＿F1（配列番号１８４）CGTGATGAGGCCGCCTGCTGGGCATCTG
EGFR20  TP＿R7（配列番号１９８）ACGCAGCTCTCTTTGTGTTCCCGGACAT
EGFR20  template  0（配列番号４２１）
GACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGA
FTO  TP＿F6（配列番号２２３）CTAAATTCACGCATTTAGAATGTCTGAATTAT
FTO  TP＿R6（配列番号２３１）AGTGATGCACTCTGACTGTTACCTATTAAAAC
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
FTO  TP＿F6（配列番号２２３）CTAAATTCACGCATTTAGAATGTCTGAATTAT
FTO  TP＿R7（配列番号２３２）AGTGATGCACTTCTGACTGTTACCTATTAAAA
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
3'end    8-10  base
G2  fTP1-7（配列番号５９）GAGAATCTCATCGATTTTTACGTGCCCAGA
G2  rTP1-6（配列番号６６）GAGCACGTGGGACTTCATTCACAAAGCTGG
norovirus  G2  1  template  0（配列番号４３２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP1-7（配列番号５９）GAGAATCTCATCGATTTTTACGTGCCCAGA
G2  rTP1-7（配列番号６７）AGCACGTGGGAGTCTTCATTCACAAAGCTG
norovirus  G2  1  template  0（配列番号４３２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
EGFR20m  TP＿F2（配列番号２０２）CATGATGAGTGCCGCCTGCTGGGCATCT
EGFR20m  TP＿R6（配列番号２１４）CATGCAGCTCTTTGTGTTCCCGGACATA
EGFR20  template  1（配列番号４３３）
GACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGA
G2  fTP3-2（配列番号８６）AGAGCCATAACCGGGTCCGCAGCCAACCTC
G2  rTP3-1（配列番号９３）CGTTGTTGGTGCTTACGTTTTGTTGGCCCG
norovirus  G2  3  template  0（配列番号４１９）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
FTO  TP＿F7（配列番号２２４）CTAAATTCACTGCATTTAGAATGTCTGAATTA
FTO  TP＿R5（配列番号２３０）AGTGATGCACCTGACTGTTACCTATTAAAACT
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
FTO  TP＿F7（配列番号２２４）CTAAATTCACTGCATTTAGAATGTCTGAATTA
FTO  TP＿R6（配列番号２３１）AGTGATGCACTCTGACTGTTACCTATTAAAAC
FTO  template  0（配列番号４２０）
TTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTG
【０１８０】
［実施例７］
本実施例では、前記プライマーの設計方法（５）および前記プライマーの製造方法（５）に基づき、前記プライマー（５）を設計および製造し、さらに、これを用いて核酸増幅を行い、標的核酸配列の増幅効率を確認した。すなわち、本実施例では、ＴＰが本来設計した場所以外の場所にハイブリダイズする数が増幅反応に及ぼす影響を調べた。また、ＴＰの３'端の塩基配列に注目し、その配列と相補になる配列がいくつＴＰに挟まれる領域の配列（計算対象配列）中に現れるかで評価をすることとした。ここで、ＴＰに挟まれる領域の配列とは、本実施例では、下図に示すとおり、センス鎖のＴＰとアンチセンス鎖のＴＰに挟まれた領域の配列、と定義した。
【０１８１】
【数５】
0006006814.tif 000011
【０１８２】
鋳型プラスミドの調製
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０１８３】
核酸増幅反応
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０１８４】
核酸増幅反応評価方法
まず、注目するＴＰ（センス鎖のＴＰ、アンチセンス鎖のＴＰの両方）の３'端の配列の長さを３'側からの４〜８塩基に設定し、それぞれの注目配列の相補配列が計算対象配列（センス鎖、アンチセンス鎖の両方）の配列中にいくつ存在するかを計算した。すなわち、例えば、あるセンス鎖のＴＰの３'側からの６塩基の配列について、その配列と相補になる配列（ハイブリダイズする可能性がある配列）が、計算対象配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖に合計でいくつ存在するか数えた。
次いで、使用した各ＴＰペアについて鋳型核酸を入れた試料の反応時間が４５分以内で、鋳型核酸を入れた試料の反応時間と、鋳型核酸を入れていない試料（ネガティブコントロール）の反応時間との差が３０分以上のものを「成功」、それ以外のものを「失敗」と判定した。なお、増幅反応はＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰのペアで行われるが、各々のＴＰを評価するために、１つのＴＰペアの成功・失敗はそれを構成するＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰそれぞれにカウントした。ただし、各ＴＰペアそれぞれの相補配列数の合計と成功・失敗との関係を調べる場合は１つのＴＰペアの成功・失敗は１つのみカウントした。
【０１８５】
＜結果＞
以下の表６に示すように、ＴＰの３'端からの６塩基を注目配列とした場合、ＴＰペアのそれぞれのＴＰについて数えた相補配列数の合計が０個の場合の成功の割合は４例／４例（１００％）であったのに対し、１個の場合は０例／４例（０％）となり、相補配列数の合計が０個の場合と１個以上の場合とでは顕著な相違が見られた。
一方、データは示していないが、注目配列数を５塩基以下とした場合は、同じく相補配列数の合計を０個にする効果は顕著には見られなかった。また、当然のことながら注目配列数を７塩基以上とした場合も、６塩基とした場合と同様の効果が見られた。
以上のことから、Ｆｏｒｗａｒｄ  ＴＰまたはＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰの３'端からの６塩基以上を注目配列として選択し、ＴＰに挟まれる領域の配列上にその注目配列の相補配列が１つも存在しないようにした場合に、優れた増幅速度・特異性を示すことが明らかになった。
【０１８６】
【表６】
0006006814.tif 000012
（表中「−」は９０分以内で反応が見られなかったことを示す。）
【０１８７】
なお、上記表６で用いたＴＰの塩基配列と標的核酸配列は以下のとおりである。
G2  fTP4-7（配列番号１０７）CCGCCACAGGTGTATGGCTCTGGAGCCCGT
G2  rTP4-6（配列番号１１４）AAAACGTAATTGACCAGGGGCTTGTACAAA
norovirus  G2  4  template  0（配列番号４２２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP4-7（配列番号１０７）CCGCCACAGGTGTATGGCTCTGGAGCCCGT
G2  rTP4-8（配列番号１１６）AACGTAATTGACCCACCAGGGGCTTGTACA
norovirus  G2  4  template  0（配列番号４２２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP4-8（配列番号１０８）CCCGCCACAGGTATGGCTCTGGAGCCCGTT
G2  rTP4-6（配列番号１１４）AAAACGTAATTGACCAGGGGCTTGTACAAA
norovirus  G2  4  template  0（配列番号４２２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP4-8（配列番号１０８）CCCGCCACAGGTATGGCTCTGGAGCCCGTT
G2  rTP4-8（配列番号１１６）AACGTAATTGACCCACCAGGGGCTTGTACA
norovirus  G2  4  template  0（配列番号４２２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP6-8（配列番号１４０）GGGCCCAAGGGCTCCCCTAGAAACGCTCCA
G2  rTP6-3（配列番号１４３）ATCTGAACCCCTTGCATAACCATTGTACAT
norovirus  G2  6  template  0（配列番号４３１）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP6-8（配列番号１４０）GGGCCCAAGGGCTCCCCTAGAAACGCTCCA
G2  rTP6-4（配列番号１４４）TCTGAACCCCTACTGCATAACCATTGTACA
norovirus  G2  6  template  0（配列番号４３１）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP6-7（配列番号１３９）GGCCCAAGGGCGGTCCCCTAGAAACGCTCC
G2  rTP6-2（配列番号１４２）GATCTGAACCCCGCATAACCATTGTACATT
norovirus  G2  6  template  0（配列番号４３１）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP5-8（配列番号１２４）GGGCTTGTACAACCAACAAAACGTAATTGA
G2  rTP5-3（配列番号１２７）GGTGGAGAGTTCCACAGTATCTCACCTGGA
norovirus  G2  5  template  0（配列番号４３４）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
【０１８８】
［実施例８］
本実施例では、前記プライマーの設計方法（６）および前記プライマーの製造方法（６）に基づき、前記プライマー（６）を設計および製造し、さらに、これを用いて核酸増幅を行い、を用いて標的核酸配列の増幅効率を確認した。
【０１８９】
［１］１種類のＴＰの間でのダイマー（ホモダイマー）
ＴＰの３'端が同一のＴＰにハイブリダイズする数が増幅反応に及ぼす影響を調べた。そこで、ＴＰの３'端の塩基配列に注目し、それと相補になる配列がいくつ同一ＴＰ配列中に現れるかで評価をすることとした。
【０１９０】
【数６】
0006006814.tif 000013
【０１９１】
［２］２種類（Ｆｏｒｗａｒｄ，Ｒｅｖｅｒｓｅ）  のＴＰの間でのダイマー（ヘテロダイマー）
一方のＴＰの３'端が逆側のＴＰにハイブリダイズする数が増幅反応に及ぼす影響を調べた。そこで、ＴＰの３'端の塩基配列に注目し、それと相補になる配列がいくつ逆側のＴＰ配列中に現れるかで評価をすることとした。
【０１９２】
【数７】
0006006814.tif 000014
【０１９３】
鋳型プラスミドの調製
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０１９４】
核酸増幅反応
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０１９５】
核酸増幅反応評価方法
まず、注目するＴＰの３'端の配列の長さを３'側からの２〜６塩基に設定し、それぞれの注目配列の相補配列が同一ＴＰ配列中または逆側のＴＰの配列中にいくつ存在するかを数えた。
次いで、使用した各ＴＰについて鋳型核酸を入れた試料の反応時間が４５分以内で、鋳型核酸を入れた試料の反応時間と、鋳型核酸を入れていない試料（ネガティブコントロール）の反応時間との差が３０分以上のものを「成功」、それ以外のものを「失敗」と判定した。なお、増幅反応はＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰのペアで行われるが、各々のＴＰを評価するために、１つのＴＰペアの成功・失敗はそれを構成するＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰそれぞれにカウントした。ただし、各ＴＰペアそれぞれの相補配列数の合計と成功・失敗との関係を調べる場合は１つのＴＰペアの成功・失敗は１つのみカウントした。
【０１９６】
＜結果＞
［１］１種類のＴＰの間でのダイマー（ホモダイマー）
以下の表７に示すように、ＴＰの３'端からの３塩基を注目配列とした場合、相補配列数が０個の場合の成功の割合は８例／８例（１００％）であったのに対し、相補配列数が１個の場合は０例／８例（０％）となり、相補配列が存在しない場合と存在する場合とでは顕著な相違が見られた。
一方、データは示していないが、ＴＰの３'端からの２塩基を注目配列とした場合は、相補配列が存在しないようにする効果は顕著には見られなかった。また、当然のことながらＴＰの３'端からの４塩基以上を注目配列とした場合も、３塩基とした場合と同様の効果が見られた。
以上のことから、ＴＰの３'端からの３塩基以上を注目配列として選択し、同一ＴＰ配列中にその注目配列の相補配列が存在しないようにした場合に、優れた増幅速度・特異性を示すことが明らかになった。
【０１９７】
【表７】
0006006814.tif 000015
（表中「−」は９０分以内で反応が見られなかったことを示す。）
【０１９８】
なお、上記表７で用いたＴＰの塩基配列と標的核酸配列は以下のとおりである。
NAT2-590  TP＿F6（配列番号３２３）TCGAGGTTCAATCTCCTGCCAAAGAAGAAACA
NAT2-590  TP＿R1（配列番号３２６）CGAACAATTGTGGAGACGTCTGCAGGTATGTA
NAT2-590  template  0（配列番号４３０）
ATCAGGAGAGAGCAGTATATTACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCATCTCCTGCCAAAGAAGAAACACCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCTCGAACAATTGAAGATTTTGAGTCTATGAATACATACCTGCAGACGTCTCCAACATCTTCATTTATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCAGACCCCAGAAGGG
NAT2-590  TP＿F6（配列番号３２３）TCGAGGTTCAATCTCCTGCCAAAGAAGAAACA
NAT2-590  TP＿R3（配列番号３２８）CGAACAATTGGTTGGAGACGTCTGCAGGTATG
NAT2-590  template  0（配列番号４３０）
ATCAGGAGAGAGCAGTATATTACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCATCTCCTGCCAAAGAAGAAACACCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCTCGAACAATTGAAGATTTTGAGTCTATGAATACATACCTGCAGACGTCTCCAACATCTTCATTTATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCAGACCCCAGAAGGG
NAT2-590  TP＿F1（配列番号３１８）TCGAGGTTCACTGCCAAAGAAGAAACACCAAA
NAT2-590  TP＿R5（配列番号３３０）CGAACAATTGATGTTGGAGACGTCTGCAGGTA
NAT2-590  template  0（配列番号４３０）
ATCAGGAGAGAGCAGTATATTACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCATCTCCTGCCAAAGAAGAAACACCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCTCGAACAATTGAAGATTTTGAGTCTATGAATACATACCTGCAGACGTCTCCAACATCTTCATTTATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCAGACCCCAGAAGGG
NAT2-590  TP＿F3（配列番号３２０）TCGAGGTTCATCCTGCCAAAGAAGAAACACCA
NAT2-590  TP＿R4（配列番号３２９）CGAACAATTGTGTTGGAGACGTCTGCAGGTAT
NAT2-590  template  0（配列番号４３０）
ATCAGGAGAGAGCAGTATATTACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCATCTCCTGCCAAAGAAGAAACACCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCTCGAACAATTGAAGATTTTGAGTCTATGAATACATACCTGCAGACGTCTCCAACATCTTCATTTATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCAGACCCCAGAAGGG
NAT2-590  TP＿F4（配列番号３２１）TCGAGGTTCACTCCTGCCAAAGAAGAAACACC
NAT2-590  TP＿R2（配列番号３２７）CGAACAATTGTTGGAGACGTCTGCAGGTATGT
NAT2-590  template  0（配列番号４３０）
ATCAGGAGAGAGCAGTATATTACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCATCTCCTGCCAAAGAAGAAACACCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCTCGAACAATTGAAGATTTTGAGTCTATGAATACATACCTGCAGACGTCTCCAACATCTTCATTTATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCAGACCCCAGAAGGG
NAT2-590  TP＿F4（配列番号３２１）TCGAGGTTCACTCCTGCCAAAGAAGAAACACC
NAT2-590  TP＿R8（配列番号３３３）CGAACAATTGAAGATGTTGGAGACGTCTGCAG
NAT2-590  template  0（配列番号４３０）
ATCAGGAGAGAGCAGTATATTACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCATCTCCTGCCAAAGAAGAAACACCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCTCGAACAATTGAAGATTTTGAGTCTATGAATACATACCTGCAGACGTCTCCAACATCTTCATTTATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCAGACCCCAGAAGGG
NAT2-590  TP＿F7（配列番号３２４）TCGAGGTTCACATCTCCTGCCAAAGAAGAAAC
NAT2-590  TP＿R2（配列番号３２７）CGAACAATTGTTGGAGACGTCTGCAGGTATGT
NAT2-590  template  0（配列番号４３０）
ATCAGGAGAGAGCAGTATATTACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCATCTCCTGCCAAAGAAGAAACACCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCTCGAACAATTGAAGATTTTGAGTCTATGAATACATACCTGCAGACGTCTCCAACATCTTCATTTATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCAGACCCCAGAAGGG
NAT2-590  TP＿F7（配列番号３２４）TCGAGGTTCACATCTCCTGCCAAAGAAGAAAC
NAT2-590  TP＿R8（配列番号３３３）CGAACAATTGAAGATGTTGGAGACGTCTGCAG
NAT2-590  template  0（配列番号４３０）
ATCAGGAGAGAGCAGTATATTACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCATCTCCTGCCAAAGAAGAAACACCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCTCGAACAATTGAAGATTTTGAGTCTATGAATACATACCTGCAGACGTCTCCAACATCTTCATTTATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCAGACCCCAGAAGGG
【０１９９】
［２］２種類（Ｆｏｒｗａｒｄ，Ｒｅｖｅｒｓｅ）のＴＰの間でのダイマー（ヘテロダイマー）
以下の表８は、各ＴＰペアにおけるそれぞれＴＰの３'端からの５塩基を注目配列とし、各ＴＰペアについて、一方のＴＰの注目配列が逆側のＴＰ配列中に存在する相補配列数と、当該逆側のＴＰの注目配列が当該一方のＴＰ配列中に存在する相補配列数との合計数と成功・失敗の関係を示したものである。合計の相補配列数が０個の場合の成功の割合は４例／４例（１００％）であったのに対し、相補配列数が１の場合は０例／４例（０％）となり、相補配列が存在しない場合と存在する場合とでは顕著な相違が見られた。
一方、データは示していないが、ＴＰの３'端からの４塩基以下を注目配列とした場合は、逆側のＴＰ配列に相補配列が存在しないようにする効果は顕著には見られなかった。また、当然のことながらＴＰの３'端からの６塩基以上を注目配列とした場合も、５塩基とした場合と同様の効果が見られた。
以上のことから、Ｆｏｒｗａｒｄ  ＴＰまたはＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰの３'端からの５塩基以上を注目配列として選択し、逆側のＴＰ配列中にその注目配列の相補配列が存在しないようにした場合に、優れた増幅速度・特異性を示すことが明らかになった。
【０２００】
【表８】
0006006814.tif 000016
（表中「−」は９０分以内で反応が見られなかったことを示す。）
【０２０１】
なお、上記表８で用いたＴＰの塩基配列と標的核酸配列は以下のとおりである。
G2  fTP1-7（配列番号５９）GAGAATCTCATCGATTTTTACGTGCCCAGA
G2  rTP1-6（配列番号６６）GAGCACGTGGGACTTCATTCACAAAGCTGG
norovirus  G2  1  template  0（配列番号４３２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP1-7（配列番号５９）GAGAATCTCATCGATTTTTACGTGCCCAGA
G2  rTP1-7（配列番号６７）AGCACGTGGGAGTCTTCATTCACAAAGCTG
norovirus  G2  1  template  0（配列番号４３２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP1-7（配列番号５９）GAGAATCTCATCGATTTTTACGTGCCCAGA
G2  rTP1-8（配列番号６８）GCACGTGGGAGGATCTTCATTCACAAAGCT
norovirus  G2  1  template  0（配列番号４３２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP1-4（配列番号５６）AATCTCATCCATATGGATTTTTACGTGCCC
G2  rTP1-7（配列番号６７）AGCACGTGGGAGTCTTCATTCACAAAGCTG
norovirus  G2  1  template  0（配列番号４３２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP1-1（配列番号５３）CTCATCCATCTGGGCATGGATTTTTACGTG
G2  rTP1-1（配列番号６１）GATCTGAGCACGTTCACAAAGCTGGGAGCC
norovirus  G2  1  template  0（配列番号４３２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP1-1（配列番号５３）CTCATCCATCTGGGCATGGATTTTTACGTG
G2  rTP1-2（配列番号６２）ATCTGAGCACGTATTCACAAAGCTGGGAGC
norovirus  G2  1  template  0（配列番号４３２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP1-2（配列番号５４）TCTCATCCATCTGCATGGATTTTTACGTGC
G2  rTP1-7（配列番号６７）AGCACGTGGGAGTCTTCATTCACAAAGCTG
norovirus  G2  1  template  0（配列番号４３２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
G2  fTP1-2（配列番号５４）TCTCATCCATCTGCATGGATTTTTACGTGC
G2  rTP1-8（配列番号６８）GCACGTGGGAGGATCTTCATTCACAAAGCT
norovirus  G2  1  template  0（配列番号４３２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
【０２０２】
［実施例９］
本実施例では、前記プライマーの設計方法（７）および前記プライマーの製造方法（７）に基づき、前記プライマー（７）を設計および製造し、さらに、これを用いて核酸増幅を行い、標的核酸配列の増幅効率を確認した。
【０２０３】
ＴＰの５'端が同一のＴＰにハイブリダイズする数が増幅反応に及ぼす影響を調べた。そこで、ＴＰの５'端の塩基配列に注目し、それと相補になる配列がいくつ同一ＴＰ配列中に現れるかで評価をすることとした。
【０２０４】
【数８】
0006006814.tif 000017
【０２０５】
鋳型プラスミドの調製
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０２０６】
核酸増幅反応
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０２０７】
核酸増幅反応評価方法
まず、注目するＴＰの５'端の配列の長さを５'側からの２〜６塩基に設定し、それぞれの注目配列の相補配列が同一ＴＰ配列中にいくつ存在するかを数えた。
次いで、使用した各ＴＰについて鋳型核酸を入れた試料の反応時間が４５分以内で、鋳型核酸を入れた試料の反応時間と、鋳型核酸を入れていない試料（ネガティブコントロール）の反応時間との差が３０分以上のものを「成功」、それ以外のものを「失敗」と判定した。なお、増幅反応はＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰのペアで行われるが、各々のＴＰを評価するために、１つのＴＰペアの成功・失敗はそれを構成するＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰそれぞれにカウントした。
【０２０８】
＜結果＞
以下の表９に示すように、ＴＰの５'端からの３塩基を注目配列とした場合、相補配列数が０個の場合の成功の割合は４例／４例（１００％）、相補配列数が１個の場合の成功の割合は６例／９例（６７％）、相補配列数が２個の場合の成功の割合は２例／２例（１００％）であったのに対し、相補配列数が３個の場合は０例／３例（０％）となり、相補配列数が２個以下の場合と３個存在する場合とでは顕著な相違が見られた。
一方、データは示していないが、ＴＰの５'端からの２塩基を注目配列とした場合は、相補配列を一定個数以下とする効果は顕著には見られなかった。また、当然のことながらＴＰの５'端からの４塩基以上を注目配列とした場合も、３塩基とした場合と同様の傾向が見られた。
以上のことから、ＴＰの５'端からの３塩基を注目配列として選択し、同一ＴＰ配列中にその注目配列の相補配列数を２個以下とするようにした場合に、優れた増幅速度・特異性を示すことが明らかになった。
【０２０９】
【表９】
0006006814.tif 000018
（表中「−」は９０分以内で反応が見られなかったことを示す。）
【０２１０】
なお、上記表９で用いたＴＰの塩基配列と標的核酸配列は以下のとおりである。
FTO＿2  TP＿F1（配列番号２３４）  CTAAATTCACAGCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGA
FTO＿2  TP＿R2（配列番号２４３）  AGTGATGCACTTTCCATTTCTGACTGTTACCTATTA
FTO＿2  TP＿R3（配列番号２４４）  AGTGATGCACTTCTCCATTTCTGACTGTTACCTATT
FTO＿2  TP＿R5（配列番号２４６）  AGTGATGCACTTCACTCCATTTCTGACTGTTACCTA
FTO＿2  TP＿R7（配列番号２４８）  AGTGATGCACTTCCCACTCCATTTCTGACTGTTACC
FTO＿2＿template（配列番号４３５）
tatcttttggcagatcagaacataatgaaaataaaataaaaaaattcaaaactggctcttgaatgaaataggattcagaagagatgatctcaaatctactTTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTGgtaccctgaagccattaactttaagctggttattcctgacctactgtttggacataagatggtagagaggctgagtgtgacttgaacatttgttccttag
G2  fTP6-3（配列番号１３５）    CAAGGGCGCGCTCAGTGTCCCCTAGAAACG
G2  fTP6-5（配列番号１３７）    CCCAAGGGCGCGGTGTCCCCTAGAAACGCT
G2  fTP6-7（配列番号１３９）    GGCCCAAGGGCGGTCCCCTAGAAACGCTCC
G2  fTP6-8（配列番号１４０）    GGGCCCAAGGGCTCCCCTAGAAACGCTCCA
G2  rTP6-5（配列番号１４５）    CTGAACCCCTATCCTGCATAACCATTGTAC
G2  rTP6-6（配列番号１４６）    TGAACCCCTATCACCTGCATAACCATTGTA
G2  rTP6-7（配列番号１４７）    GAACCCCTATCTCACCTGCATAACCATTGT
G2＿template  （配列番号５２）
GGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGG
【０２１１】
［実施例１０］
本実施例では、前記プライマーの設計方法（８）および前記プライマーの製造方法（８）に基づき、前記プライマー（８）を設計および製造し、さらに、これを用いて核酸増幅を行い、標的核酸配列の増幅効率を確認した。すなわち、本実施例では、前記核酸増幅反応の作用機序（図３）の中で、核酸増幅の標的となるゲノム配列上にＴＰがハイブリダイズする（図３（ａ））際にその部位が１本鎖になっている確率が増幅反応に及ぼす影響を調べた。１本鎖になっている確率は、まず、当該ゲノム配列上の、ＴＰがハイブリダイズする配列中に注目する配列を定め、次にその注目配列に対する相補配列が近傍の当該ゲノム配列上にいくつ存在するかで評価することとし、当該相補配列の数がより多い場合に当該注目配列部分をステム部分とするステムループ構造を形成する可能性が大きくなり、結果としてＴＰがハイブリダイズする部分が一本鎖になっている確率はより大きくなるとした。なお、図３（ａ）の一部を以下に示す。
【０２１２】
【数９】
0006006814.tif 000019
【０２１３】
鋳型プラスミドの調製
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０２１４】
核酸増幅反応
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０２１５】
核酸増幅反応評価方法
核酸増幅の標的となるゲノム配列上にハイブリダイズするＴＰ上の配列（Ａｃ’）に対応する前記ゲノム配列上の配列（Ａ）について、配列（Ａ）の５'末端側から数えて１塩基目から４塩基目までの４塩基の配列（注目配列1-4）と相補的な４塩基の逆方向の配列（相補配列）が、配列（Ａ）の上流側２０塩基、配列（Ａ）および配列（Ａ）の下流側２０塩基の領域中に何個存在するかを計算した。ただし、注目配列、その上流側３塩基およびその下流側３塩基の計１０塩基の領域は個数計算の対象外とした。そして、注目配列をさらに３’側に１塩基ずつずらした配列（注目配列2-5、注目配列3-6、注目配列4-7、注目配列5-8・・・）についても同様の計算を行った。
【０２１６】
次いで、使用した各ＴＰについて鋳型核酸を入れた試料の反応時間が４５分以内で、鋳型核酸を入れた試料の反応時間と、鋳型核酸を入れていない試料（ネガティブコントロール）の反応時間との差が３０分以上のものを「成功」、それ以外のものを「失敗」と判定した。なお、増幅反応はＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰのペアで行われるが、各々のＴＰを評価するために、１つのＴＰペアの成功・失敗はそれを構成するＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰそれぞれにカウントした。
【０２１７】
＜結果＞
下記の表１０に示すように、ゲノム配列上の配列（Ａ）の５'末端側から数えて４塩基目から７塩基目までの４塩基の配列を注目配列とした場合（注目配列4-7）、相補配列数が１個以下の場合の成功の割合は２例／６例（３３％）であったのに対し、相補配列数が２個以上の場合は２例／２例（１００％）となり、相補配列を１個以下の場合と２個以上にした場合とでは顕著な相違が見られた。同様に、注目配列5-8の場合、相補配列数が１個以下の場合の成功の割合は２例／６例（３３％）であったのに対し、相補配列数が２個以上の場合は２例／２例（１００％）となり、注目配列6-9の場合、相補配列数が１個以下の場合の成功の割合は２例／６例（３３％）であったのに対し、相補配列数が２個以上の場合は２例／２例（１００％）となり、注目配列7-10の場合、相補配列数が１個以下の場合の成功の割合は２例／６例（３３％）であったのに対し、相補配列数が２個以上の場合は２例／２例（１００％）となり、いずれも、相補配列を１個以下の場合と２個以上にした場合とでは顕著な相違が見られた。
一方、データは示していないが、注目配列として前後に１〜５塩基ずらした４塩基の配列（注目配列1-4、同2-5、同3-6、同8-11、同9-12、同10-13、同11-14、同12-15）を選択した場合は、相補配列数を２個以上とする効果は顕著には見られなかった。
以上のことから、注目配列としてゲノム配列上の配列（Ａ）の５'末端側から数えて４塩基目から１０塩基目までの計７塩基のうち、４塩基目から７塩基目までの４塩基、５塩基目から８塩基目までの４塩基、６塩基目から９塩基目までの４塩基、または７塩基目から１０塩基目までの４塩基の配列の相補配列数を２個以上とした場合に、優れた増幅速度・特異性を示すことが明らかになった。
【０２１８】
【表１０】
0006006814.tif 000020
（表中「−」は９０分以内で反応が見られなかったことを示す。）
【０２１９】
なお、上記表１０で用いたＴＰの塩基配列と標的核酸配列は以下のとおりである。
G2  fTP3-1（配列番号８５）      GAGCCATAACCTTGGGTCCGCAGCCAACCT
G2  fTP3-2（配列番号８６）      AGAGCCATAACCGGGTCCGCAGCCAACCTC
G2  fTP3-4（配列番号８８）      CCAGAGCCATAAGTCCGCAGCCAACCTCGT
G2  fTP3-5（配列番号８９）      TCCAGAGCCATATCCGCAGCCAACCTCGTC
G2  fTP3-6（配列番号９０）      CTCCAGAGCCATCCGCAGCCAACCTCGTCC
G2  fTP3-7（配列番号９１）      GCTCCAGAGCCACGCAGCCAACCTCGTCCC
G2  fTP3-8（配列番号９２）      GGCTCCAGAGCCGCAGCCAACCTCGTCCCA
G2  rTP3-5（配列番号９７）      GTTGGTGCCGCTTCAATTACGTTTTGTTGG
G2  rTP3-6（配列番号９８）      TTGGTGCCGCTAGTCAATTACGTTTTGTTG
G2  rTP3-7（配列番号９９）      TGGTGCCGCTATGGTCAATTACGTTTTGTT
G2  rTP3-8（配列番号１００）    GGTGCCGCTATTGGGTCAATTACGTTTTGT
G2＿template  （配列番号５２）
GGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGG
KCNQ1＿rs2237897  TP-F1（配列番号４０２）        CGTCCCCAGCTCCCTAGGGACGGAGGTGGCCAGAG
KCNQ1＿rs2237897  TP-F2（配列番号４０３）        CGTCCCCAGCTCCCTGGGACGGAGGTGGCCAGAGG
KCNQ1＿rs2237897  TP-F8（配列番号４０９）        CGTCCCCAGCTCCCTGAGGTGGCCAGAGGCCTCTC
KCNQ1＿rs2237897  TP-R1（配列番号４１０）        ACGAGGGGCCTCACCCTGGGCCTGAAGGGAGGG
KCNQ1＿rs2237897  TP-R2（配列番号４１１）        ACGAGGGGCCTCATCCCTGGGCCTGAAGGGAGG
KCNQ1＿rs2237897  TP-R3（配列番号４１２）        ACGAGGGGCCTCACTCCCTGGGCCTGAAGGGAG
KCNQ1＿rs2237897  TP-R6（配列番号４１５）        ACGAGGGGCCTCACCACTCCCTGGGCCTGAAGG
KCNQ1＿rs2237897  TP-R7（配列番号４１６）        ACGAGGGGCCTCAGCCACTCCCTGGGCCTGAAG
KCNQ1＿rs2237897＿template（配列番号４３６）
catggtgtgcgtgtttgggagcaccctgggcagcctctcgagtgtccagagagaggacaccgtcttgagccagcagggacagccaagagcgcccggggagAGGCCTGGGTGGAGACAGAACACAGCAGGCTGTGGGCGTGGCCAATGTTGAGGGACGGAGGTGGCCAGAGGCCTCTCAGTGGTGCCCAGGGAGCTGGGGACGAGGGGCCTCATCCTTCCCCTGAGCCCCTCCCTTCAGGCCCAGGGAGTGGCCTGGGGCCCAGGAGAGCCCGCTCCGCGCTCACAGCCTCCGTTCCCAGACacgcccgggcctgagcccccaggctgcactgtgccacagaacagactccccggcccctccctgctcgagaggtgaccaaggcccagggtctcccagcgag
【０２２０】
［実施例１１］
本実施例では、前記プライマーの設計方法（９）および前記プライマーの製造方法（９）に基づき、前記プライマー（９）を設計および製造し、さらに、これを用いて核酸増幅を行い、標的核酸配列の増幅効率を確認した。すなわち、本実施例では、前記核酸増幅反応の作用機序（図３）の中で、核酸増幅の標的となるゲノム配列上にＴＰがハイブリダイズした（図３（ａ））後、その伸長鎖上にターンバックする（図３（ｂ））領域が１本鎖になっている確率が増幅反応に及ぼす影響を調べた。１本鎖になっている確率は、まず、当該ゲノム配列上の、ＴＰがターンバックする配列中に注目する配列を定め、次にその注目配列に対する相補配列が近傍の当該ゲノム配列上にいくつ存在するかで評価することとし、当該相補配列の数がより多い場合に当該注目配列部分をステム部分とするステムループ構造を形成する可能性が大きくなり、結果としてＴＰがターンバックする領域が一本鎖になっている確率はより大きくなるとした。なお、図３（ｂ）の一部を以下に示す。
【０２２１】
【数１０】
0006006814.tif 000021
【０２２２】
鋳型プラスミドの調製
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０２２３】
核酸増幅反応
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０２２４】
核酸増幅反応評価方法
核酸増幅の標的となるゲノム配列上にＴＰがハイブリダイズした後、その伸長鎖上にターンバックする際、そのターンバック領域に対応する前記ゲノム配列上の配列（Ｂ）について、配列（Ｂ）の３'末端側から４塩基の配列（注目配列1-4）と相補的な４塩基の逆方向の配列（相補配列）が、当該４塩基の５’末端から上流側に数えた配列の４塩基目から２３塩基目までの２０塩基、および当該４塩基の３’末端から下流側に数えた配列の４塩基目から２３塩基目までの２０塩基の中に何個存在するかを計算した。つまり、注目配列、その上流側３塩基およびその下流側３塩基の計１０塩基の領域は個数計算の対象外とした。そして、注目配列をさらに５’側に１塩基ずつずらした配列（注目配列2-5、注目配列3-6、注目配列4-7・・・）についても同様の計算を行った。
【０２２５】
次いで、使用した各ＴＰについて鋳型核酸を入れた試料の反応時間が４５分以内で、鋳型核酸を入れた試料の反応時間と、鋳型核酸を入れていない試料（ネガティブコントロール）の反応時間との差が３０分以上のものを「成功」、それ以外のものを「失敗」と判定した。なお、増幅反応はＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰのペアで行われるが、各々のＴＰを評価するために、１つのＴＰペアの成功・失敗はそれを構成するＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰそれぞれにカウントした。
【０２２６】
＜結果＞
下記の表１１に示すように、ゲノム配列上の配列（Ｂ）の３'末端側から４塩基の配列を注目配列とした場合（注目配列1-4）、相補配列数が０個の場合の成功の割合は０例／４例（０％）であったのに対し、相補配列数が１個以上の場合は６例／８例（７５％）となり、相補配列を０個の場合と１個以上にした場合とでは顕著な相違が見られた。
一方、データは示していないが、注目配列として５'側に１〜３塩基ずらした４塩基の配列（注目配列2-5、同3-6、同4-7）を選択した場合は、相補配列数を１個以上とする効果は顕著には見られなかった。
以上のことから、注目配列としてゲノム配列上の配列（Ｂ）の３'末端側か４塩基と相補的な配列が、当該４塩基の５’末端から上流側に数えた配列の４塩基目から２３塩基目までの２０塩基、および当該４塩基の３’末端から下流側に数えた配列の４塩基目から２３塩基目までの２０塩基の中に、１個以上である場合に、優れた増幅速度・特異性を示すことが明らかになった。
【０２２７】
【表１１】
0006006814.tif 000022
（表中「−」は９０分以内で反応が見られなかったことを示す。）
【０２２８】
なお、上記表１１で用いたＴＰの塩基配列と標的核酸配列は以下のとおりである。
G2  fTP2-2（配列番号７０）  GTCATTCGACGCCGATCGCAATCTGGCTCC
G2  rTP2-1（配列番号６９）  CCATCTGATGGGACCTCATTATTGACCTCT
norovirus  G2  1  template  0（配列番号４３２）
CATTCTACAGCAAAATTAGCAAGTTAGTTATTGCAGAGCTAAAAGAAGGTGGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGGTTTTGAAGTGCAGGTAATCCTTGCGGGGAACGCGTTCACCGCCGGGAAAA
ABCG2  TP＿F3（配列番号１６９）  TGTAAGTTTTCTTAAGGATGATGTTGTGA
ABCG2  TP＿F6（配列番号１７２）  TGTAAGTTTTTGCCTTAAGGATGATGTTG
ABCG2  TP＿R3（配列番号１７７）  ACAGTTCTCATCATGATTCGTCATAGTTG
ABCG2＿template（配列番号４３７）
ggagttaactgtcatttgcagaactgcaggttcatcattagctagaactttaccttagttatgttatctttgtggattatgttatgtatactaaacagtcATGGTCTTAGAAAAGACTCATTATCATTATGTCTCATTAAAATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACGAACGGATTAACAGGGTCATTCAAGAGTTAGGTCTGGATAAAGTGGCagactccaaggtaatgtggaaaaactgaaagcatcatgatcagcataagtaggactttccctgtgtggataaaatgactctgattcagaagtttcctgta
G2  fTP4-3（配列番号１０３）    CACAGGTGCCGCAGGTTATGGCTCTGGAGC
G2  fTP4-6（配列番号１０６）    CGCCACAGGTGCTTATGGCTCTGGAGCCCG
G2  rTP4-4（配列番号１１２）    ACAAAACGTAATCAGGGGCTTGTACAAAAT
G2  rTP4-7（配列番号１１５）    AAACGTAATTGACACCAGGGGCTTGTACAA
G2＿template  （配列番号５２）
GGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGG
【０２２９】
［実施例１２］
本実施例では、前記プライマーの設計方法（１０）および前記プライマーの製造方法（１０）に基づき、前記プライマー（１０）を設計および製造し、さらに、これを用いて核酸増幅を行い、標的核酸配列の増幅効率を確認した。
【０２３０】
ＴＰが標的核酸配列にハイブリダイズするＴＰ中の領域（Ａｃ'）に含まれる任意の連続する５塩基が同一のＴＰにハイブリダイズする数が増幅反応に及ぼす影響を調べた。そこで、ＴＰの３'端から５塩基の長さで１塩基ずつずらした塩基配列に注目し、それと相補になる配列がいくつ同一ＴＰ配列中に現れるかで評価をすることとした。
【０２３１】
【数１１】
0006006814.tif 000023
【０２３２】
鋳型プラスミドの調製
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０２３３】
核酸増幅反応
前記実施例３（前記プライマー（１））と同様にして行った。
【０２３４】
核酸増幅反応評価方法
まず、注目する塩基配列をＴＰの３'末端側から５塩基の長さで１塩基ずつずらした配列とし（注目配列1-5、同2-6、同3-7、同4-8、・・・）、それぞれの注目配列の相補配列が同一ＴＰ配列中にいくつ存在するかを数えた。
次いで、使用した各ＴＰについて鋳型核酸を入れた試料の反応時間が４５分以内で、鋳型核酸を入れた試料の反応時間と、鋳型核酸を入れていない試料（ネガティブコントロール）の反応時間との差が３０分以上のものを「成功」、それ以外のものを「失敗」と判定した。なお、増幅反応はＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰのペアで行われるが、各々のＴＰを評価するために、１つのＴＰペアの成功・失敗はそれを構成するＦｏｒｗａｒｄ  ＴＰとＲｅｖｅｒｓｅ  ＴＰそれぞれにカウントした。
【０２３５】
＜結果＞
以下の表１２に示すように、ＴＰの３’末端側から数えての６塩基目から１０塩基目までの５塩基の配列を注目配列とした場合（注目配列6-10）、相補配列数が０個の場合の成功の割合は６例／９例（６７％）であったのに対し、相補配列数が１個以上の場合は０例／３例（０％）となり、相補配列数が０個の場合と１個以上存在する場合とでは顕著な相違が見られた。同様に、注目配列7-11、注目配列8-12、および注目配列9-13の場合においても、相補配列数が０個の場合の成功の割合は、それぞれ６例／９例（６７％）、６例／９例（６７％）、および６例／９例（６７％）、であったのに対し、相補配列数が１個以上の場合は、それぞれ０例／３例（０％）、０例／３例（０％）、０例／３例（０％）、となり、相補配列数が０個の場合と１個以上存在する場合とでは顕著な相違が見られた。
一方、データは示していないが、注目配列1-5、同2-6、同3-7、同4-8、同5-9、同10-14、同11-15の場合はいずれも、相補配列を０個とする効果は顕著には見られなかった。
以上のことから、ＴＰの３’末端側から数えて６塩基目から１３塩基目までの８塩基のうち連続する任意の５塩基の配列と相補的な配列が、同一ＴＰ配列中に存在しないようにした場合に、優れた増幅速度・特異性を示すことが明らかになった。
【０２３６】
【表１２】
0006006814.tif 000024
（表中「−」は９０分以内で反応が見られなかったことを示す。）
【０２３７】
なお、上記表１２で用いたＴＰの塩基配列と標的核酸配列は以下のとおりである。
B3  TP-F5（配列番号２３）  CAGGCGATGCGGTGCTGGCCACCGTGGGA
B3  TP-F6（配列番号２４）  CAGGCGATGGCGGTGCTGGCCACCGTGGG
B3  TP-R4（配列番号３０）  CTGGACTCCGCCAGCGAAGTCACGAACAC
Beta-3  AR（配列番号１８）
TAGCCGGGGCCCTGCTGGCGCTGGCGGTGCTGGCCACCGTGGGAGGCAACCTGCTGGTCATCGTGGCCATCGCCTGGACTCCGAGACTCCAGACCATGACCAACGTGTTCGTGACTTCGCTGGCCGCAGCCGACCTGGTGATGGGACTC
NAT2-590  TP＿F6（配列番号３２３）  TCGAGGTTCAATCTCCTGCCAAAGAAGAAACA
NAT2-590  TP＿R1（配列番号３２６）  CGAACAATTGTGGAGACGTCTGCAGGTATGTA
NAT2-590  TP＿R2（配列番号３２７）  CGAACAATTGTTGGAGACGTCTGCAGGTATGT
NAT2-590  TP＿R7（配列番号３３２）  CGAACAATTGAGATGTTGGAGACGTCTGCAGG
NAT2-590  TP＿R8（配列番号３３３）  CGAACAATTGAAGATGTTGGAGACGTCTGCAG
NAT2-590（配列番号３１７）
ATCAGGAGAGAGCAGTATATTACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCATCTCCTGCCAAAGAAGAAACACCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACCTCGAACAATTGAAGATTTTGAGTCTATGAATACATACCTGCAGACGTCTCCAACATCTTCATTTATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCAGACCCCAGAAGGG
G2  fTP4-7（配列番号１０７）  CCGCCACAGGTGTATGGCTCTGGAGCCCGT
G2  rTP4-4（配列番号１１２）  ACAAAACGTAATCAGGGGCTTGTACAAAAT
G2  rTP4-6（配列番号１１４）  AAAACGTAATTGACCAGGGGCTTGTACAAA
G2＿template（配列番号５２）
GGCATGGATTTTTACGTGCCCAGACAAGAGCCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTCAGATCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGCTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGAATGACGCCAACCCATCTGATGGGTCCGCAGCCAACCTCGTCCCAGAGGTCAATAATGAGGTTATGGCTCTGGAGCCCGTTGTTGGTGCCGCTATTGCGGCACCTGTGGCGGGCCAACAAAACGTAATTGACCCCTGGATTAGAAACAATTTTGTACAAGCCCCTGGTGGAGAGTTCACAGTGTCCCCTAGAAACGCTCCAGGTGAGATACTGTGGAGCGCGCCCTTGGGCCCTGATCTGAACCCCTATCTTTCTCATTTGTCCAGAATGTACAATGGTTATGCAGGTGG
KCNQ1＿rs2237897  TP-F1（配列番号４０２）  CGTCCCCAGCTCCCTAGGGACGGAGGTGGCCAGAG
KCNQ1＿rs2237897  TP-F2（配列番号４０３）  CGTCCCCAGCTCCCTGGGACGGAGGTGGCCAGAGG
KCNQ1＿rs2237897  TP-F4（配列番号４０５）  CGTCCCCAGCTCCCTGACGGAGGTGGCCAGAGGCC
KCNQ1＿rs2237897  TP-F8（配列番号４０９）  CGTCCCCAGCTCCCTGAGGTGGCCAGAGGCCTCTC
KCNQ1＿rs2237897  TP-R7（配列番号４１６）  ACGAGGGGCCTCAGCCACTCCCTGGGCCTGAAG
KCNQ1＿rs2237897＿template（配列番号４３６）
catggtgtgcgtgtttgggagcaccctgggcagcctctcgagtgtccagagagaggacaccgtcttgagccagcagggacagccaagagcgcccggggagAGGCCTGGGTGGAGACAGAACACAGCAGGCTGTGGGCGTGGCCAATGTTGAGGGACGGAGGTGGCCAGAGGCCTCTCAGTGGTGCCCAGGGAGCTGGGGACGAGGGGCCTCATCCTTCCCCTGAGCCCCTCCCTTCAGGCCCAGGGAGTGGCCTGGGGCCCAGGAGAGCCCGCTCCGCGCTCACAGCCTCCGTTCCCAGACacgcccgggcctgagcccccaggctgcactgtgccacagaacagactccccggcccctccctgctcgagaggtgaccaaggcccagggtctcccagcgag 
ABCG2  TP＿F3（配列番号１６９）  TGTAAGTTTTCTTAAGGATGATGTTGTGA
ABCG2  TP＿F4（配列番号１７０）  TGTAAGTTTTCCTTAAGGATGATGTTGTG
ABCG2  TP＿F5（配列番号１７１）  TGTAAGTTTTGCCTTAAGGATGATGTTGT
ABCG2  TP＿F7（配列番号１７３）  TGTAAGTTTTTTGCCTTAAGGATGATGTT
ABCG2  TP＿F8（配列番号１７４）  TGTAAGTTTTTTTGCCTTAAGGATGATGT
ABCG2  TP＿R1（配列番号１７５）  ACAGTTCTCAATGATTCGTCATAGTTGTT
ABCG2  TP＿R2（配列番号１７６）  ACAGTTCTCACATGATTCGTCATAGTTGT
ABCG2  TP＿R3（配列番号１７７）  ACAGTTCTCATCATGATTCGTCATAGTTG
ABCG2  TP＿R5（配列番号１７９）  ACAGTTCTCATTTCATGATTCGTCATAGT
ABCG2  TP＿R8（配列番号１８２）  ACAGTTCTCATTTTTTCATGATTCGTCAT
ABCG2＿template（配列番号４３７）
ggagttaactgtcatttgcagaactgcaggttcatcattagctagaactttaccttagttatgttatctttgtggattatgttatgtatactaaacagtcATGGTCTTAGAAAAGACTCATTATCATTATGTCTCATTAAAATGCTATTTGCCTTAAGGATGATGTTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAAAACTTACAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACGAATCATGAAAAAAACGAACGGATTAACAGGGTCATTCAAGAGTTAGGTCTGGATAAAGTGGCagactccaaggtaatgtggaaaaactgaaagcatcatgatcagcataagtaggactttccctgtgtggataaaatgactctgattcagaagtttcctgta
FTO＿2  TP＿F1（配列番号２３４）  CTAAATTCACAGCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGA
FTO＿2  TP＿F3（配列番号２３６）  CTAAATTCACAGATCAGTTATGCATTTAGAATGTCT
FTO＿2  TP＿F4（配列番号２３７）  CTAAATTCACAGCATCAGTTATGCATTTAGAATGTC
FTO＿2  TP＿R1（配列番号２４２）  AGTGATGCACTTCCATTTCTGACTGTTACCTATTAA
FTO＿2  TP＿R6（配列番号２４７）  AGTGATGCACTTCCACTCCATTTCTGACTGTTACCT
FTO＿2＿template（配列番号４３５）
tatcttttggcagatcagaacataatgaaaataaaataaaaaaattcaaaactggctcttgaatgaaataggattcagaagagatgatctcaaatctactTTATGAGATAATGTCCTTTTTAAAAATAAACACTAACATCAGTTATGCATTTAGAATGTCTGAATTATTATTCTAGGTTCCTTGCGACTGCTGTGAATTTAGTGATGCACTTGGATAGTCTCTGTTACTCTAAAGTTTTAATAGGTAACAGTCAGAAATGGAGTGGGAGAGCATAAAAGCAAACTGAAATGCAAATAGCTGgtaccctgaagccattaactttaagctggttattcctgacctactgtttggacataagatggtagagaggctgagtgtgacttgaacatttgttccttag
【産業上の利用可能性】
【０２３８】
本発明は、核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーの設計方法、核酸増幅用プライマーの製造方法、および、核酸の増幅方法に関するものである。本発明の核酸増幅用プライマーの設計方法によって得られるプライマーによれば、ＴＰを含むプライマーセットを用いた等温核酸増幅法において、核酸の増幅速度および核酸増幅の特異性が向上する。このため、本発明の核酸増幅用プライマーの設計方法、核酸増幅用プライマーの製造方法、プライマーセット、および、核酸の増幅方法は、例えば、遺伝子工学分野において、極めて有用なツールと言える。
【図１Ａ】
0006006814.tif 000025
【図１Ｂ】
0006006814.tif 000026
【図２】
0006006814.tif 000027
【図３】
0006006814.tif 000028
【図４】
0006006814.tif 000029
【図５Ａ】
0006006814.tif 000030
【図５Ｂ】
0006006814.tif 000031
【図６】
0006006814.tif 000032
【図７】
0006006814.tif 000033
【図８】
0006006814.tif 000034
【図９】
0006006814.tif 000035
【図１０】
0006006814.tif 000036
【図１１】
0006006814.tif 000037
【図１２】
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【図１３】
0006006814.tif 000039
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
0006006814.tif 000044
【配列表】
0006006814000001.app