(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥｒｂＢ３受容体に結合し、細胞に内部移行することができる抗体またはそのフラグメントであって、
（ａ）配列番号１でコードされる重鎖アミノ酸配列、または少なくともその可変領域、またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および
（ｂ）配列番号２でコードされる軽鎖アミノ酸配列、または少なくともその可変領域、またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、
抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体であって、
前記抗体のＥｒｂＢ３への結合が、ＥｒｂＢ３仲介のシグナル伝達を減少させることを特徴とする、
抗体。
【請求項３】
請求項２に記載の抗体であって、
前記シグナル伝達の減少が、ＥｒｂＢ３の下方制御により引き起こされることを特徴とする、
抗体。
【請求項４】
請求項２または３に記載の抗体であって、
細胞表面上のＥｒｂＢ３のレベルを減少させる能力を有する、
抗体。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体であって、
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、またはそのフラグメントである、
抗体。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体であって、
組み換え抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、またはそのフラグメントである、
抗体。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体であって、
Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆｖ−フラグメント、ダイアボディ、ＳｃＦｖ、ＳＭＩＰ、単鎖抗体、アフィボディ、アビマー、ナノボディおよび／またはドメイン抗体である、
抗体。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体であって、
前記抗体のアイソタイプが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体からなる群から選択されることを特徴とする、
抗体。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体であって、
ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ３０１８またはその誘導体から産生される、
抗体。
【請求項１０】
ヒト化抗体である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体であって、
配列３〜１４（配列番号３〜１４）に示される、少なくとも１つの配列を含む、
抗体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の抗体であって、
配列７〜１４（配列番号７〜１４）に示される、少なくとも１つの配列を含む、
抗体。
【請求項１３】
配列番号３と配列番号６、配列番号３と配列番号７、配列番号５と配列番号６、配列番号５と配列番号７、配列番号８と配列番号１２、配列番号８と配列番号１３、配列番号８と配列番号１４、配列番号８と配列番号１５、配列番号９と配列番号１２、配列番号９と配列番号１３、配列番号９と配列番号１４、配列番号９と配列番号１５、配列番号１０と配列番号１２、配列番号１０と配列番号１３、配列番号１０と配列番号１４、配列番号１０と配列番号１５、配列番号１１と配列番号１２、配列番号１１と配列番号１３、配列番号１１と配列番号１４、および、配列番号１１と配列番号１５、からなる群から選択される一組の配列の組み合わせを含む、
抗体。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体であって、
標識グループと結合している、
抗体。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体であって、
エフェクターグループと結合している、
抗体。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメントをコードする核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸を含む、
ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターであって、
発現ベクターであり、前記核酸の配列は動作可能に制御配列に結合している、
ベクター。
【請求項１９】
請求項１６に記載の核酸、または、請求項１７または１８に記載のベクターを含む、
宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体を含む、
医薬組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の医薬組成物であって、
薬学的に許容できる担体、希釈剤および／または賦形剤をさらに含む、
医薬組成物。
【請求項２２】
治療での使用のための、請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項２３】
診断での使用のための、請求項２０または２１に記載の組成物。
【請求項２４】
過剰増殖性の疾患、特に腫瘍性疾患またはがんの、治療および／または予防での使用のための、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組成物であって、
前記疾患がメラノーマ、乳がん、卵巣がん、腎臓がん、胃腸／大腸がん、肺がん、腎明細胞がんおよび／または前立腺がんであることを特徴とする、
組成物。
【請求項２６】
請求項２０から２５のいずれか一項に記載の組成物であって、
抗体、抗体フラグメント、小分子、代謝拮抗剤、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管標的剤、キナーゼ阻害剤、タンパク質合成阻害剤、免疫治療剤、ホルモンまたはその類似体、および／またはｍＴＯＲ阻害剤からなる群から選択される、さらなる活性化剤を含むことを特徴とする、
組成物。
【請求項２７】
請求項２０から２６のいずれか一項に記載の組成物であって、
静脈内、筋肉内、および／または皮下に投与される、
組成物。
【請求項２８】
請求項２０から２７のいずれか一項に記載の組成物であって、
さらなる治療的組成物および／または照射と組み合わせて投与される、
組成物。
【請求項２９】
対象でのＥＧＦ様リガンド仲介のＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害するための剤の製造のための、請求項１から１５のいずれか一項に記載の、ＥｒｂＢ３受容体に結合する抗体またはその抗原結合部位の使用。
【請求項３０】
ＥｒｂＢ３に関連するがんを診断するためのキットを調製するための、ＥｒｂＢ３受容体に結合する抗体またはその抗原結合部位の使用であって、
（ａ）前記対象由来の細胞を請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位と生体外または生体内で接触させること、および、
（ｂ）細胞上でのＥｒｂＢ３への結合レベルを測定することを含み、
異常に高いレベルのＥｒｂＢ３への結合は、前記対象がＥｒｂＢ３に関連するがんを患っていることを示すことを特徴とする、
使用。
【請求項３１】
請求項２９または３０に記載の使用であって、
前記対象がヒトであることを特徴とする、
使用。
【請求項３２】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体を製造する方法であって、
請求項１９に記載の宿主から前記抗体を得るステップを含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体、特にＥｒｂＢ３受容体に結合するモノクローナル抗体であって、前記結合は、ＥｒｂＢ３受容体仲介のシグナル伝達を減少させるものであり、および、そのような抗体を含む組成物、ならびに、そのような抗体を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、隣接する組織に浸潤して破壊する形質転換細胞の無制御な増殖により特徴付けられる疾患であり、転移と呼ばれる過程を経て、離れた解剖的部位に広がり得る１−４。転移性疾患の存在で、がんは、数か月から何年かの様々な期間に死を引き起こし得る１−４。
【０００３】
最も用いられているがん治療薬は、細胞傷害性化学療法剤（抗芽細胞剤（ａｎｔｉｂｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）または化学療法剤とも呼ばれる）である。これらの薬は、ＤＮＡを損傷する、または細胞増殖を阻害することにより作用する。この方法では、それらは、全ての急速に分裂している細胞を、がん細胞だけでなく、細胞分裂が行われている正常細胞も殺す。がん細胞に対する化学療法薬の作用の特異性欠如は、それらの投与の後にかなりの毒性の原因となる。この１０年間で、基礎的な科学的研究が細胞の形質転換および細胞増殖の分子メカニズムに関する我々の知識を著しく増加させて、「分子標的」薬または「標的治療」の発展につながった５。それらは特定の分子および／または機能的な異常を有するがん細胞に対して作用するように特異的に設計された薬について言及する。しかしながら、標的治療も、副作用に関係し、ほとんどの場合には、腫瘍の成長を一時的に止めることができるだけである。
【０００４】
ＨＥＲ−３としても知られるＥｒｂＢ３受容体は、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼファミリー（ＥｒｂＢ）に属する。この受容体ファミリーは、４つのメンバー：ＥｒｂＢ１（ＨＥＲ１）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）からなる。多くの研究が、細胞の生存、増殖、および分化、ならびに悪性転換におけるＥｒｂＢ受容体の重要な役割を示唆している６−７。チロシンキナーゼ受容体により仲介されるシグナル伝達は、複雑であり、２種類のリガンド：上皮成長因子（ＥＧＦ）およびＥＧＦ様リガンド（例えばＴＧＦαおよびアンフィレギュリン）、ニューレグリン（ＮＲＧ）、ヘレグリン（ＨＲＧ）またはＮｅｕ分化因子（ＮＤＦ）とも定義される、との相互作用に関わる。ＥｒｂＢ受容体に結合するリガンドは、受容体ホモおよびヘテロ二量体の形成および内因性のキナーゼドメインの活性化を誘導し、細胞質側末端にある特定のチロシン残基に対してリン酸化をもたらす。これらのリン酸化残基は、様々なタンパク質のための結合部位としての役目を果たし、その動員は細胞内シグナルパスウェイの活性化につながる。一般的に、ヘテロ二量体化は、ホモ二量体化よりも好ましく、ＥｒｂＢ２は、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦまたはＥＧＦ様リガンドにより活性化される）、およびＥｒｂＢ３とＥｒｂＢ４（ニューレグリン、ＮＲＧにより活性化される）を含む、他のＥｒｂＢ受容体の、好ましいヘテロ二量体化パートナーである。ＥｒｂＢ受容体により活性化される２つの主なシグナルパスウェイは、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ−ＡＫＴパスウェイである８−１０。
【０００５】
ＥｒｂＢ２遺伝子は、２０〜３０％の乳がんにおいて増幅され、予後不良と関係がある。同様に、ＥｒｂＢ３受容体は、乳がん患者で過剰発現されることも示されている。ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３受容体の両方の高レベルな発現は、腫瘍の浸潤性の生物学と関係がある。実際に、ＮＲＧ刺激により、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロ二量体は、ＥｒｂＢファミリーメンバーのペアの可能な組み合わせの中で、最も強力で長く持続する増殖性細胞内シグナルを送達する８−１１。様々な研究が、前立腺がん、メラノーマ、および胃がんのような多くのヒトの腫瘍型の進行における、ＥｒｂＢ３受容体の重要な役割を示してきた。
【０００６】
同時に、実験的および臨床的データは、ＥｒｂＢ３が腫瘍の発達および進行において重要な役割を果たすことを示し、ＥｒｂＢ３を標的とする薬剤が、いくつかのがんの治療への新規かつ有望なアプローチを提供することができることを示唆している１２−２４。
科学的進歩および新しい化学療法剤および標的治療の診療への導入にも関わらず、がんは治療が困難な疾患のままであり、世界中で約１３％の死亡原因となっている１−４。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それ故に、より効果的で、できる限り毒性がより少ない、新しい抗腫瘍治療を開発する緊急の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、特定のＥｒｂＢ３阻害剤が腫瘍退縮を誘導することが可能であることを見出した。特に、モノクローナル抗体ＭＰ−ＲＭ−１が、抗ＥｒｂＢ３阻害剤として用いられている。
【０００９】
このように、本発明の第１の態様は、
（ａ）配列番号１でコードされる重鎖アミノ酸配列、または少なくともその可変領域、またはそれと少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列、
および／または
（ｂ）配列番号２でコードされる軽鎖アミノ酸配列、または少なくともその可変領域、またはそれと少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列
を含む、
ＥｒｂＢ３受容体に結合する抗体またはそのフラグメントに関する。
【００１０】
ＶＨ配列（配列番号１）
ｇａｃｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｔｃｔｇｇｇｇｇａｇａｃｔｔａｇｔｇａａｇｃｃｔｇｇａｇｇｇｔｃｃｃｔｇａａａｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇｔａｇｔｃｔｃｔｇｇａｔｔｃａｃｔｔｔｃａｇｔａｃｃｔａｔｇｇｃａｔｇｔｃｔｔｇｇｇｔｔｃｇｃｃａｇａｃｔｃｃａｇａｃａｇｇａｇｇｃｔｇｇａｇｔｇｇｇｔｃｇｃａａｃｃａｔｔａｇｔｃａｔｇｇｔｇａｃｇｇｔｔａｔａｃｃｔａｃｔａｔｃｃａｇａｃａｇｔｇｔｇａａｇｇｇｇｃｇａｔｔｃａｃｃａｔｃｔｃｃａｇａｇａｃａａｔｇｃｃａａｇａａｃａｃｃｃｔｇｃａｃｃｔｇｃａａａｔｇａｇｃａｇｔｃｔｇａａｇｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇｃｃａｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｇｃａａｇａｃａｔｇｇｇｇａｔｔａｃｇａｃｇａｔｇａｔｔａｃｔａｔｇｃｔａｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｔｃａａｇｇａａｃｃｔｃａｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃａ
【００１１】
ＶＬ配列（配列番号２）
ｇａｔａｔｔｇｔｇａｔｇａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｃｃｔｇａｃｔｇｔｇａｔａｇｃａｇｇａｇａｇａａｇｇｔｃａｃｔａｔｇａｇｃｔｇｃａａｇｔｃｃａｇｔｃａｇａｇｔｃｔｇｔｔａａａｃａｇｔｇｇａａａｔｃａａａａｇａａｃｔａｃｔｔｇａｃｃｔｇｇｔａｃｃａａｃａｇａａａｃｃａｇｇｇｃａｇｃｃｔｃｃｔａａａｃｔｇｔｔｇａｔｃｔａｃｔｇｇｇｃａｔｃｃａｃｔａｇｇｇａａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｃｃｔｇａｔｃｇｃｔｔｃａｃａｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇａａｃａｇａｔｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｔｇｔｇｃａｇｇｃｔｇａａｇａｃｃｔｇｇｃａｇｔｔｔａｔｔａｃｔｇｔｃａｇａａｔｇａａｔａｔａｃｔｔａｔｃｃｇｃｔｃａｃｇｔｔｃｇｇｔｇｃｔｇｇｇａｃｃａａｇｃｔｇｇａｇｃｔｇａａａｃｇｇｇ
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＭＰ−ＲＭ−１が、乳がん細胞表面上のＥｒｂＢ３受容体の発現を減少させることを示す。
【図２】ＭＰ−ＲＭ−１が、乳がん細胞においてＥｒｂＢ３受容体を下方制御することを示す。
【図３】ＭＰ−ＲＭ−１が、ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５において、ＥｒｂＢ３受容体の半減期を減少させることが可能であることを示す。
【図４】ＭＰ−ＲＭ−１が、ヒト乳がん細胞ＳＫＢＲ−３において、ＥｒｂＢ３受容体の半減期を減少させることが可能であることを示す。
【図５】ＥｒｂＢ３受容体の半減期の減少に対するＭＰ−ＲＭ−１の効果が、リソソーム阻害剤クロロキンにより阻害されることを示す。
【図６】ＭＰ−ＲＭ−１が、ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびヒトメラノーマ細胞ＩＲ−８において、受容体リガンドＮＲＧ−１により誘導されるＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリン酸化を阻害することを示す。
【図７】ＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリガンド誘導性のリン酸化が、ＭＰ−ＲＭ−１によって時間依存的な態様で阻害されることを示す。
【図８】ＭＰ−ＲＭ−１が、ＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリガンド誘導性の活性化を拮抗することが可能であることを示す。
【図９】ＭＰ−ＲＭ−１が急速（３０分）に細胞内に内部移行されることを示す。
【図１０】ヒト乳がん細胞およびヒト前立腺がん細胞における、ＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリガンド誘導性の活性化に対するＭＰ−ＲＭ−１およびトラスツズマブの効果を比較する。
【図１１】ＭＰ−ＲＭ−１が、ＭＥＴ増幅のヒト胃がん細胞ＭＫＮ−４５において、基底のＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリン酸化（ｐｈｏｓｈｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を、阻害することが可能であることを示す。
【図１２】ＭＰ−ＲＭ−１が、ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５におけるリガンド誘導性の増殖を阻害することを示す。
【図１３】ＭＰ−ＲＭ−１が、ヒト前立腺がん異種移植片ＤＵ１４５の増殖を阻害することを示す。
【図１４】マウスへの注射後４時間という早さで、ヒトメラノーマ異種移植片ＩＲ−８において、ＭＰ−ＲＭ−１がＥｒｂＢ３の下方制御を誘導し、ＡＫＴの活性化を阻害することを示す。
【図１５】ヒトメラノーマ細胞ＩＲ−８の、ｃＭＰ−ＲＭ−１＃１、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０のＭＰ−ＲＭ−１抗体変異体での処理が、細胞表面上のＥｒｂＢ３受容体の発現を減少させることを示す。
【図１６】ヒト化変異体ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６が急速（３０分）に細胞内に内部移行されることを示す。
【図１７】キメラ変異体ｃＭＰ−ＲＭ−１＃１、および、ヒト化変異体ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０の抗体変異体の、ヒトメラノーマ細胞ＩＲ−８におけるＥｒｂＢ３の半減期に対する効果を示す。
【図１８】（Ａ）ヒト卵巣がん細胞、および（Ｂ）ヒト胃がん細胞でのＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリン酸化に対する、ｃＭＰ−ＲＭ−１＃１、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０およびｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０の抗体変異体の阻害効果を示す。
【図１９】（Ａ）ヒトメラノーマ細胞、または（Ｂ）ヒト胃がん細胞の軟寒天でのコロニー形成に対する、ｃＭＰ−ＲＭ−１＃１、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０およびｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０の抗体変異体の阻害効果を示す。
【図２０】ｃＭＰ−ＲＭ−１＃１、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０およびｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０の抗体変異体で処理されたマウスの腫瘍異種移植片が、対照マウスのものよりも著しく低く増殖することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、その抗体の少なくとも１つの抗原結合部位を有し、および／または、同じ生物学的活性を示す、「フラグメント」または「誘導体」を含む。
【００１４】
さらに、抗体は、好ましくは、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖および少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖を含む。免疫グロブリン鎖は、可変領域および場合により定常領域を含む。可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域、およびフレームワーク領域を含んでよい。
【００１５】
本明細書において用いられる、２つのポリペプチド配列の間の「配列相同性」は、配列番号１および／または配列番号２でコードされるアミノ酸配列の好ましくは全長にわたる、配列間での同一のアミノ酸の割合を示す。本発明の好ましいポリペプチド配列は、少なくとも８０％、さらに好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有する。
【００１６】
他の好ましい実施態様によれば、本発明の抗体は、ＥｒｂＢ３受容体仲介のシグナル伝達を減少させる。前記のＥｒｂＢ３受容体仲介のシグナル伝達の減少は、好ましくは、ＥｒｂＢ３の下方制御により引き起こされる。さらなる実施態様によれば、ＥｒｂＢ３の下方制御は、好ましくは、細胞表面上のＥｒｂＢ３のレベルを減少させることにより達成され、すなわち、好ましくは、本発明の抗体は、細胞表面上のＥｒｂＢ３のレベルを減少させる能力を有する。
【００１７】
本発明の抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位、例えば、１つまたは２つの抗原結合部位を有してよい。
【００１８】
本発明の抗体は、好ましくは、ＥｒｂＢ３の細胞外ドメインに結合する。
【００１９】
抗体は、天然および／または合成起源の任意の抗体であってよく、例えば、哺乳類起源の抗体である。好ましくは、もし存在するならば、定常領域がヒトの定常領域である。可変領域は、好ましくは、哺乳類の可変領域、例えば、ヒト化またはヒトの可変領域である。
【００２０】
本発明による抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体が好ましい。特に、本発明の抗体は、好ましくは、組み換え抗体、ヒト化または完全なヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、特に二重特異性抗体、またはそのフラグメントからなる群から選択される。
【００２１】
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ２５の方法のような任意の適切な方法によって、または組み換えＤＮＡ方法によって、生産されてよい。モノクローナル抗体は、Ｃｌａｃｋｓｏｎら２６に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーから分離されてもよい。
【００２２】
抗体のヒト化型は、キメラ化またはＣＤＲ移植（ＣＤＲ  ｇｒａｆｔｉｎｇ）のような、当技術分野で知られている方法によって生産されてよい。ヒト化抗体の生産のための代替方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、欧州特許出願公開第０２３９４００（Ａ１）号明細書および国際公開第９０／０７８６１号パンフレットに記載されている。ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法によって得ることもできる。適切な例は、限定されないが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、および同類のものを含む。
【００２３】
本発明によれば、「キメラ抗体」は、例えば、マウスとヒトのような、異なる種由来のポリペプチドを含む抗体に関する。キメラ抗体の生産は、例えば、国際公開第８９／０９６２２号パンフレット（ＷＯ８９／０９６２２）に記載されている。
【００２４】
単一特異性抗体は、全てが同一の抗原に対して親和性を有する抗体である。多重特異性抗体は、様々な抗原に対して親和性を有する抗体である。二重特異性抗体は、２つの異なる抗原に対して親和性を有する。
【００２５】
抗体という用語は、抗体の少なくとも１つの抗原結合部位を有する「フラグメント」または「誘導体」を含む。好ましい実施態様によれば、抗体またはそのフラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ＳｃＦｖ、小モジュール免疫薬剤（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＳＭＩＰ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ドメイン抗体および／または単鎖であってよい。
【００２６】
「アビマー」は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのエクソンシャッフリングおよびファージディスプレイを用いて改変された、多重結合タンパク質またはペプチドに関する。多重結合ドメインは連結していて、単一エピトープの免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）ドメインと比較して、より高い親和性および特異性をもたらす。
【００２７】
「ナノボディ」または単一ドメイン抗体は、単一の単量体の抗体可変領域からなる抗体フラグメントに関する。
【００２８】
「アフィボディ」分子は、数多くの標的タンパク質に特異的に結合するように改変された、小さくて高い親和性のタンパク質である。
【００２９】
本発明の抗体は、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体型であってよい。生産される抗体は、初めはそのようなアイソタイプを有する必要はないが、むしろ、生産された抗体は任意のアイソタイプを有することができ、その抗体はアイソタイプ転換（ｉｓｏｔｙｐｅ−ｓｗｉｔｃｈｅｄ）され得ることが理解されよう。
【００３０】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、場合により、治療目的のために脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）される。
【００３１】
本発明の特に好ましい実施態様において、抗体は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）に２００９年１０月１５日に寄託され、ＤＳＭ  ＡＣＣ３０１８と命名されたＭＰ−ＲＭ−１である。
【００３２】
さらに好ましい実施態様によれば、抗体またはそのフラグメントは、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ３０１８またはその誘導体から生産されてよい。
本発明の好ましい実施態様によれば、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ３０１８またはその誘導体から生産される抗体またはフラグメントは、ヒト化抗体またはそのフラグメントである。好ましくは、このヒト化抗体は、本発明の配列３〜１４の少なくとも１つを含む。特に好ましい実施態様によれば、抗体は、ｃＭＰ−ＲＭ−１＃１、ｃＭＰ−ＲＭ−１＃２、ｃＭＰ−ＲＭ−１＃３、ｃＭＰ−ＲＭ−１＃４、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃５、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃７、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃８、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃９、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１１、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１２、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１３、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１４、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１５、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１７、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１８、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１９、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０（ｃ：キメラ抗体；ｈ：ヒト化抗体）の群から選択される。
【００３３】
特に好ましい実施態様は、ｃＭＰ−ＲＭ−１＃４、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１４、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１７またはｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０の群から選択された抗体に関する。
【００３４】
別の好ましい実施態様は、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃７、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃８、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃９、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１１、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１２、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１９およびｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０からなる抗体グループに関する。特に好ましい抗体グループは、抗体ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０およびｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０を含む。
【００３５】
本発明の抗体が、例えば、薬物ターゲッティングおよびイメージング応用のために、他の部分とさらに結合され得ることは、当業者にとって明らかである。そのような結合は、抗体または抗原結合部位の発現後に化学的に行われてよく、または、その結合産物は、本発明の抗体または抗原の中にＤＮＡレベルで操作されてよい。
【００３６】
したがって、診断目的のために、本発明の抗体または抗体フラグメントは、標識され、すなわち標識グループに結合されてよい。適切な標識は、放射線ラベル、蛍光ラベル、適切な色素群、酵素ラベル、色素原、化学発光群、ビオチニル群、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープなどを含む。
【００３７】
これらの標識化抗体または抗体フラグメントは、特に免疫組織化学分析において、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの分子イメージングのために用いられてよい。
【００３８】
治療目的のために、本発明の抗体または抗体フラグメントは、エフェクターグループ、特に、放射性グループまたは細胞傷害性グループのような治療エフェクターグループと結合されてよい。
【００３９】
標識グループまたはエフェクターグループは、潜在的な立体障害を減らすために、様々な長さのスペーサーアームによって結合されてよい。
【００４０】
別の態様によれば、本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメントをコードする核酸分子、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズすることが可能な核酸に関する。上述の抗体、抗体フラグメント、またはその誘導体をコードする本発明の核酸分子は、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成的に生産されたＤＮＡまたはＲＮＡ、または、任意のこれらの核酸分子を単独または組み合わせのいずれかで含む、組み換えで生産されたキメラ核酸分子であってよい。核酸分子は、遺伝子全体またはその実質的部分、またはそのフラグメントおよび誘導体に対応する、ゲノムＤＮＡでもよい。ヌクレオチド配列は、自然発生のヌクレオチド配列に対応し、または単一または複数のヌクレオチド置換、欠失または付加を含む。本発明の特に好ましい実施態様において、核酸分子はｃＤＮＡ分子である。
【００４１】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」の用語は、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡの、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ」に記載されている標準化されたハイブリダイゼーション条件下で、２つの核酸断片がお互いにハイブリダイズすることを意味する。そのような条件は、例えば、６．０×ＳＳＣ中で約４５℃でのハイブリダイゼーションに続く、２．０×ＳＳＣで５０℃、好ましくは２．０×ＳＳＣで６５℃、または０．２×ＳＳＣで５０℃、好ましくは０．２×ＳＳＣで６５℃での洗浄工程である。
【００４２】
本発明の別の態様は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。前記ベクターは例えば、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターであってよい。レトロウイルスベクターは、複製可能または複製欠損であってよい。好ましくは、本発明のベクターは、核酸分子が原核生物および／または真核生物宿主細胞における転写および場合により発現を可能にする１つまたは複数の制御配列に動作可能に結合している発現ベクターである。
【００４３】
本発明はさらに、本発明のベクターを含む宿主に関する。前記宿主は、原核生物または真核生物細胞または非ヒト遺伝子導入動物であってよい。宿主内に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主のゲノム内に組み込まれるか染色体外に留まるかのいずれかでよい。
【００４４】
宿主は、細菌、昆虫、真菌、植物、動物、哺乳類のような任意の原核生物または真核生物の細胞であってよく、または、好ましくは、ヒトの細胞である。好ましい真菌細胞は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属のもの、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種のものである。
【００４５】
本発明は加えて、前記抗体の合成が可能な条件下で本発明の宿主を培養して、前記培養液から前記抗体を回収することを含む、抗体の調製方法に関する。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、本発明の抗体またはそのフラグメント、本発明の核酸分子、ベクター、宿主、または本発明の方法により得られた抗体を含む医薬組成物に関する。本明細書で用いられる用語「組成物」は、少なくとも１つの本発明の化合物を含む。好ましくは、そのような組成物は治療／医薬または診断の組成物である。
本発明の診断の組成物は、本明細書で定義された過剰増殖性の疾患の発症または疾患状態を評価するために用いられてよい。
【００４７】
組成物は、好ましくは、薬学的に許容できる担体、希釈剤および／または賦形剤を含む。
【００４８】
適切な医薬担体、賦形剤および／または希釈の例は、当技術分野でよく知られており、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、油／水エマルションのようなエマルション、様々な型の湿潤剤、滅菌溶液などを含む。そのような担体、賦形剤および／または希釈剤を含む組成物は、よく知られた従来型の方法で処方され得る。
【００４９】
適切な組成物の投与は、異なる方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、鼻腔内または気管支内投与により達成されてよい。好ましいのは静脈内、筋肉内および／または皮下投与である。
【００５０】
これらの医薬組成物は、適切な用量で対象に投与されてよい。投与計画は、主治医および臨床学的因子により決定されてよい。
【００５１】
本発明の組成物は、局所的または全身的に投与されてよい。非経口投与用の調製液は、滅菌された含水または非水の溶液、懸濁液、およびエマルションを含む。非水の溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびエチルオレイン酸のような注射可能な有機物エステルである。含水の担体は、水、アルコール／含水の溶液、エマルションまたは懸濁液を含み、生理食塩水および緩衝培地が含まれる。非経口の賦形剤は、食塩水、リンゲルブドウ糖（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油を含む。静脈内の賦形剤は、液体および栄養の補給、電解質補給（リンゲルブドウ糖に基づくもののような）、および同類のものを含む。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスおよび同類のもののような、防腐剤および他の添加剤が存在してもよい。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の使用目的に応じてさらなる薬剤を含む。
【００５２】
特に好ましい実施態様によれば、組成物は、さらなる抗体または抗体フラグメントのような、さらなる活性化剤を含む。
【００５３】
好ましくは、本発明の組成物は、少なくとも１つのさらなる抗腫瘍剤と組み合わせて用いられる。前記組み合わせは、例えば、異常な細胞増殖を阻害するのに効果的である。多くの抗腫瘍剤が当技術分野で現在知られている。一般的に、用語は、過剰増殖性障害の予防、軽減および／または治療が可能な全ての薬剤を含む。特に好ましいのは、アポトーシスを誘導する抗腫瘍剤である。
【００５４】
好ましくは、抗腫瘍剤は、抗体、小分子、代謝拮抗剤、アルキル化剤、トポイソメラーゼ（ｔｏｐｏ−ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）阻害剤、微小管標的剤、キナーゼ阻害剤、タンパク質合成阻害剤、免疫療法、ホルモンまたはその類似体、および／またはｍＴＯＲ阻害剤からなる群から選択される。
【００５５】
本明細書で提供される抗体と組み合わせて用いることができる抗腫瘍剤の具体例は、例えば、ゲフィチニブ、ラパチニブ、スニチニブ、ペメトレキセド、ベバシズマブ、セツキシマブ、イマチニブ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、エルロチニブ、ボルテゾミブおよび同類のものを含み、特にトラスツズマブである。本明細書に記載されクレームされる組成物に用いられる、他の具体的な抗腫瘍剤は、パクリタキセル、アントラサイクリン、フルオロピリミジン、ビンカアルカロイド、白金塩のような、例えば化学療法剤を含み、特に、カペシタビン、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビスクロロエチルニトロソウレア（ｂｉｓ−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア（ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスフォラミド（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｅｒｏｘｙｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈｏｒ−ａｍｉｄｅ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、トリメトレキサート、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）である。
【００５６】
本発明の組成物は、上述の活性化剤および／または照射および／または放射線療法を含むさらなる治療的組成物と組み合わせて投与されてよい。
【００５７】
好ましい実施態様によれば、本発明の組成物は、過剰増殖性疾患、特に腫瘍性疾患またはがんの、治療および／または予防での使用のためである。組成物は、過剰増殖性疾患、特に腫瘍性疾患またはがんを、治療および／または予防するための薬剤の製造のために用いられてもよい。
【００５８】
本明細書で定義される過剰増殖性疾患は、任意の腫瘍、すなわち任意の異常な、および／または無制御な組織の新生物を含む。本明細書で使用される用語「無制御な組織の新生物」は、機能障害および／または増殖制御の欠失に依存する。過剰増殖性疾患は、腫瘍性疾患および／または転移性または浸潤性がんのようながんを含む。
【００５９】
過剰増殖性疾患は、好ましくは、がん、特にメラノーマ、乳がん、卵巣がん、腎臓がん、胃腸／大腸がん、肺がん、腎明細胞がんおよび／または前立腺がんのような、ＥｒｂＢ３の発現、過剰発現または機能亢進と関連し、伴い、または起因する障害から選択される。特に、これらの腫瘍に関して、ＥｒｂＢ３の、がんの進行および増殖を促進する役割が明らかにされており、したがって、このタンパク質の阻害は、一定の利益を与えることができる。
【００６０】
本発明はさらに、疾患を治療する方法に関し、本発明の抗体は哺乳類に投与され、前記疾患は直接的または間接的にＥｒｂＢ３の異常なレベルの発現または活性と相関がある。
【００６１】
本発明のさらなる態様は、ＥＧＦ様仲介のＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害するのに十分な量で上述の抗体またはその抗原結合部位を対象に投与することを含む、対象でのＥＧＦ様リガンド仲介のＥｒｂＢ３のリン酸化を阻害する方法に関する。「ＥｒｂＢ３のリン酸化」は、アミノ酸残基、好ましくはチロシン残基のリン酸化をいう。
【００６２】
本発明のさらに別の態様は、対象でのＥｒｂＢ３に関連するがんを診断する方法であって、
（ａ）対象由来の細胞を先行する請求項のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位と生体外または生体内で接触させること、および、
（ｂ）細胞上でのＥｒｂＢ３への結合レベルを測定することを含み、異常に高いレベルのＥｒｂＢ３への結合は、その対象がＥｒｂＢ３に関連するがんを患っていることを示すことを特徴とする方法に向けられる。
【００６３】
本発明の用語では、「異常に高い」は、がんを患っていない健康な対象と比較して、より高いＥｒｂＢ３の結合レベルを意味する。
【００６４】
好ましくは、対象は動物であり、より好ましくは哺乳類であり、特に好ましくはヒトである。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）モノクローナル抗体ＭＰ−ＲＭ−１の生産。
４週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ヒトＥｒｂＢ３受容体を導入したＮＩＨ／３Ｔ３生細胞の腹腔内注射により免疫化された。７日後、マウスは免疫原の腹腔内注射をさらに受けた。さらに７日後、マウスは免疫原で静脈内にブーストされて、３日後に脾臓は細胞融合のために取り除かれた。体細胞雑種は、免疫脾臓細胞とマウス非分泌型骨髄腫細胞株ＮＳ−１の融合により調製された。ハイブリドーマの上清は、ＬＴＲ−ｎｅｏ  ＮＩＨ／３Ｔ３ではなくて、ＬＴＲ−ＥｒｂＢ３が導入された細胞との、微分反応度に基づいて選択された。全ての陽性のハイブリドーマ細胞のコロニーは、限界希釈により二度クローン化され、さらに特性化された。ＭＰ−ＲＭ−１（アイソタイプＩｇＧ２ａ）と命名された選択されたモノクローナル抗体は、ＥｒｂＢ３受容体の細胞外ドメインを特異的に認識することが見出された。
【００６６】
ＭＰ−ＲＭ−１抗体を産生するハイブリドーママウス細胞株は、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）に寄託され、ＤＳＭ  ＡＣＣ３０１８と命名された。
【００６７】
（実施例２）乳がん細胞の表面上のＥｒｂＢ３受容体発現に対するＭＰ−ＲＭ−１の効果。
【００６８】
材料および方法：ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５は、１０μｇ／ｍｌのＭＰ−ＲＭ−１とともに氷上で３０分間保たれ、それから３７℃に戻された。望ましい時間に、細胞はトリプシン処理されて、フルオレセイン標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で染色され、ＦＡＣＳにより分析された。
【００６９】
結果：ＭＰ−ＲＭ−１は、細胞表面上のＥｒｂＢ３受容体発現を、時間依存的な方法で減少させる（図１）。
【００７０】
（実施例３）乳がん細胞におけるＥｒｂＢ３受容体の下方制御に対するＭＰ−ＲＭ−１の効果。
【００７１】
材料および方法：ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５は、０．２％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中で２４時間培養されて、それから、１０μｇ／ｍｌのＭＰ−ＲＭ−１の存在または非存在下で、１５、６０、１２０および２４０分間インキュベートされた。インキュベーション時間の最後に、細胞は溶解されて、ＥｒｂＢ３およびＡＫＴのタンパク質レベルに関して抗ＥｒｂＢ３および抗ＡＫＴでのウエスタンブロッティングにより分析された。同じフィルターが、ローディングのコントロールのために抗ＰＬＣγ−１で再検出された。
【００７２】
結果：ＭＰ−ＲＭ−１は、１２０分後にＥｒｂＢ３受容体の下方制御を誘導する（図２）。
【００７３】
（実施例４）乳がん細胞におけるＥｒｂＢ３受容体の半減期に対するＭＰ−ＲＭ−１の効果。
【００７４】
材料および方法：ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５は、０．２％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中で２４時間培養されて、それから、ＭＰ−ＲＭ−１とともに、または、無しで、１０μｇ／ｍｌのタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドで追跡された。細胞は溶解されて、ＥｒｂＢ３およびＡＫＴのタンパク質レベルに関して抗ＥｒｂＢ３および抗ＡＫＴでのウエスタンブロッティングにより分析された。同じフィルターが、ローディングのコントロールのために抗ＰＬＣγ−１または抗アクチンで再検出された。
【００７５】
結果：ＥｒｂＢ３受容体の半減期は、シクロヘキシミド追跡されたＭＰ−ＲＭ−１処理のＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞では、ＰＢＳ処理の対照細胞と比較して、著しく減少される（図３）。
【００７６】
（実施例５）乳がん細胞におけるＥｒｂＢ３受容体の半減期に対するＭＰ−ＲＭ−１の効果。
【００７７】
材料および方法：ヒト乳がん細胞ＳＫＢＲ−３は、０．２％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中で２４時間培養されて、それから、ＭＰ−ＲＭ−１の存在または非存在下で、１０μｇ／ｍｌのタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドで追跡された。細胞は溶解されて、ＥｒｂＢ３のレベルに関して抗ＥｒｂＢ３でのウエスタンブロッティングにより分析された。
【００７８】
結果：ＥｒｂＢ３受容体の半減期は、シクロヘキシミド追跡されたＭＰ−ＲＭ−１処理のＳＫＢＲ−３細胞では、ＰＢＳ処理の対照細胞と比較して、著しく減少される（図４）。
【００７９】
（実施例６）ＭＰ−ＲＭ−１により誘導されるＥｒｂＢ３受容体の下方制御に対するクロロキンの効果。
【００８０】
材料および方法：ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５は、０．２％  ＦＢＳ上で２４時間培養されて、１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドで３時間追跡された。細胞は、このとき、クロロキンの存在または非存在下で、ＭＰ−ＲＭ−１とともにインキュベートされた。インキュベーション後、細胞は溶解されて、ＥｒｂＢ３のタンパク質レベルに関して抗ＥｒｂＢ３でのウエスタンブロッティングにより分析された。同じフィルターが、ローディングのコントロールのために抗アクチンで再検出された。
【００８１】
結果：ＭＰ−ＲＭ−１により誘導されるＥｒｂＢ３受容体の下方制御は、クロロキンにより阻害される（図５）。
【００８２】
（実施例７）乳がん細胞およびメラノーマがん細胞における、リガンド誘導性のＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリン酸化に対するＭＰ−ＲＭ−１の効果。
【００８３】
材料および方法：ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ヒトメラノーマ細胞Ａ３７５およびＩＲ−８は、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩでの０．２％  ＦＢＳ中で２４時間、培養された。細胞は、１または１０μｇ／ｍｌのＭＰ−ＲＭ−１の存在または非存在下で、２時間インキュベートされて、それから、１０ｎｇ／ｍｌのＮＲＧ−１で５分間刺激された。インキュベーション後、細胞は溶解されて、ＥｒｂＢ３、ｐ−ＥｒｂＢ３、ＡＫＴ、ｐ−ＡＫＴ、またはｐ−Ｅｒｋｓのタンパク質レベルに関して抗ＥｒｂＢ３、抗ｐ−ＥｒｂＢ３、抗ＡＫＴ、抗ｐ−ＡＫＴおよび抗ｐ−Ｅｒｋｓでのウエスタンブロッティングにより分析された。同じフィルターが、ローディングのコントロールのために抗アクチンで再検出された。
【００８４】
結果：ＭＰ−ＲＭ−１で事前に処理された細胞は、ＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリガンド誘導性のリン酸化の用量依存的な阻害を示す（図６）。
【００８５】
（実施例８）リガンド誘導性のＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリン酸化に対するＭＰ−ＲＭ−１の効果。
【００８６】
材料および方法：ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５は、０．２％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中で２４時間培養されて、それから、１０ｎｇ／ｍｌのＮＲＧ−１で５分間、刺激された。細胞は、このとき、ＮＲＧ−１の刺激の前に、１０μｇ／ｍｌのＭＰ−ＲＭ−１で、１５、６０および１２０分間インキュベートされた。インキュベーション後、細胞は溶解されて、ＥｒｂＢ３、ｐ−ＥｒｂＢ３、ＡＫＴおよびｐ−ＡＫＴのタンパク質レベルに関して抗ＥｒｂＢ３、抗ｐ−ＥｒｂＢ３、抗ＡＫＴおよび抗ｐ−ＡＫＴでのウエスタンブロッティングにより分析された。
【００８７】
結果：ＭＰ−ＲＭ−１で事前に処理された細胞は、ＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリガンド誘導性のリン酸化の、時間依存的な阻害を示す（図７）。
【００８８】
（実施例９）リガンド誘導性のＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリン酸化に対するＭＰ−ＲＭ−１の効果。
【００８９】
材料および方法：ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５は０．２％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中で２４時間培養されて、それから１０ｎｇ／ｍｌのＮＲＧ−１および１０μｇ／ｍｌのＭＰ−ＲＭ−１で５分間、同時に刺激された。インキュベーション後、細胞は溶解されて、ＥｒｂＢ３、ｐ−ＥｒｂＢ３およびｐ−ＡＫＴのタンパク質レベルに関して抗ＥｒｂＢ３、抗ｐ−ＥｒｂＢ３および抗ｐ−ＡＫＴでのウエスタンブロッティングにより分析された。
【００９０】
結果：ＭＰ−ＲＭ−１での５分の刺激は、ＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリン酸化を誘導せず、ＭＰ−ＲＭ−１は受容体アゴニストでないことを示す。対照的に、リガンド誘導性のＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリン酸化は、ＭＰ−ＲＭ−１によって部分的に阻害され、ＭＰ−ＲＭ−１は部分的な受容体アンタゴニストであることを示す（図８）。
【００９１】
（実施例１０）乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５におけるＭＰ−ＲＭ−１の内部移行。
【００９２】
材料および方法：ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５は、２２×２２ｍｍのカバースリップに蒔かれて、０．２％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中で２４時間、培養された。細胞は、それから、１０μｇ／ｍｌのＭＰ−ＲＭ−１とともに氷上で３０分間インキュベートされて、３７℃に戻された。３０および６０分後、細胞は４％パラホルムアルデヒド中で固定され、ＰＢＳ中で０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過処理され、それから、フルオレセイン標識されたヤギ抗マウス抗体（グリーン染色）、ファロイジン（ｐｈａｌｌｏｙｄｉｎ）（レッド染色）で染色された。細胞核はブルーで対比染色された。黄色と白色の矢印は、それぞれ、細胞膜上および細胞質中でのＭＰ−ＲＭ−１の局在化を示す。
【００９３】
結果：ＭＤＡ  ＭＢ  ４３５細胞は、氷上でのＭＰ−ＲＭ−１インキュベーションの３０分後にヤギ抗マウスの膜の陽性（黄色矢印）を示し、ＭＰ−ＲＭ−１抗体は完全に細胞膜上に局在化されることを示す。３７℃のインキュベーションの３０および６０分後、ヤギ抗マウスのシグナルは全体的に細胞内（白色矢印）であり、ＭＰ−ＲＭ−１は細胞ごとに内部移行されたことを示す（図９）。
【００９４】
（実施例１１）乳がん細胞および前立腺細胞におけるＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリガンド誘導性の活性化に対する、ＭＰ−ＲＭ−１およびトラスツズマブの比較効果。
【００９５】
材料および方法：ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびヒト前立腺がん細胞ＤＵ１４５は、０．２％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ中で２４時間培養されて、それから、１０ｎｇ／ｍｌのＮＲＧ−１で５分間刺激された。細胞は、このとき、リガンド刺激の前に、１または１０μｇ／ｍｌのＭＰ−ＲＭ−１、または１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブのいずれかで２時間インキュベートされた。インキュベーション後、細胞は溶解されて、ＥｒｂＢ３、ｐ−ＥｒｂＢ３、ＡＫＴ、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−Ｅｒｋｓのタンパク質レベルに関して抗ＥｒｂＢ３、抗ｐ−ＥｒｂＢ３、抗ＡＫＴ、抗ｐ−ＡＫＴおよび抗ｐ−Ｅｒｋｓでのウエスタンブロッティングにより分析された。
【００９６】
結果：ＭＰ−ＲＭ−１は、リガンド誘導性のＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリン酸化を、トラスツズマブと同程度に阻害する。しかしながら、ＥｒｂＢ３の下方制御はＭＰ−ＲＭ−１によって誘導されるが、トラスツズマブによってはされなかった（図１０）。
【００９７】
（実施例１２）ＭＥＴ増幅の胃がん細胞における、ＭＥＴ／ＥｒｂＢ３／ＡＫＴシグナル伝達軸（ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ａｘｉｓ）に対するＭＰ−ＲＭ−１の効果。
【００９８】
材料および方法：ヒト胃がん細胞ＭＫＮ−４５は、０．２％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中で２４時間培養された。細胞は、それから、１および１０μｇ／ｍｌのＭＰ−ＲＭ−１、または１０μｇ／ｍｌのトラスツズマブ、または０．１、１、および１０μｇ／ｍｌのＭＥＴ阻害剤ＳＵ１１２７４にさらされた。細胞はそれから溶解されて、ＥｒｂＢ３、ｐ−ＥｒｂＢ３、ＡＫＴ、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＭＥＴのタンパク質レベルに関して抗ＥｒｂＢ３、抗ｐ−ＥｒｂＢ３、抗ＡＫＴ、抗ｐ−ＡＫＴおよび抗ｐ−ＭＥＴでのウエスタンブロッティングにより分析された。
【００９９】
結果：ＭＫＮ−４５細胞は、リガンド非依存性、ＭＥＴ依存性のＥｒｂＢ３受容体およびＡＫＴのリン酸化を示す。トラスツズマブはしないが、ＭＰ−ＲＭ−１は、この基礎活性（ｂａｓａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を阻害する。さらに、ＭＰ−ＲＭ−１は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるリガンド非依存性（ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｉｐｅｎｄｅｎｔ）のＭＥＴ／ＥｒｂＢ３の関連性を破壊することが可能である（図１１）。
【０１００】
（実施例１３）乳がん細胞のリガンド誘導性の増殖に対するＭＰ−ＲＭ−１の効果。
【０１０１】
材料および方法：ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５は、０．２％  ＦＢＳ  ＲＰＭＩ中で２４時間培養されて、それから、１または１０μｇ／ｍｌのＭＰ−ＲＭ−１の存在または非存在下で、１０ｎｇ／ｍｌのＮＲＧ−１で４８時間インキュベートされた。インキュベーションの最後に、細胞はトリプシン処理されて計測された。
【０１０２】
結果：ＭＰ−ＲＭ−１は、用量依存的な方法で、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の、リガンド誘導性の増殖を阻害する（図１２）。
【０１０３】
（実施例１４）前立腺がん異種移植片に対するＭＰ−ＲＭ−１の効果。
【０１０４】
材料および方法：ヒト前立腺がん異種移植片は、５×１０６のＤＵ１４５細胞を５週齢ＣＤ１ヌードマウスに皮下注射することにより樹立された。異種移植が明白な場合に、マウスは１０匹の２つのグループに分離された。その２つのグループは同等の平均腫瘍量を有した。１つのグループは、ＰＢＳバッファーでの２０ｍｇ／ｋｇのＭＰ−ＲＭ−１の腹腔内注射を週に２回受け、一方で、その他はＰＢＳのみを受けた（対照群）。腫瘍量はキャリパーにより毎日モニターされた。エラーバーは、各グループでのＳＥを示した。ＭＰ−ＲＭ−１で処理されたマウスとＰＢＳで処理された（対照）マウスとの間の、★は有意差（Ｐ＝０．０１）を表し、★★は有意差（Ｐ＝０．００６）を表す。
【０１０５】
結果：ＭＰ−ＲＭ−１で処理されたマウスは、対照マウスと比較して最大で６０％までの腫瘍量の減少を示す（０．４２ｃｍ３対０．９６ｃｍ３）（図１３）。
【０１０６】
（実施例１５）メラノーマ異種移植片におけるＥｒｂＢ３の下方制御およびＡＫＴのリン酸化に対するＭＰ−ＲＭ−１のｉｎ  ｖｉｖｏでの効果。
【０１０７】
材料および方法：メラノーマ異種移植片ＩＲ−８を有するヌードマウスは、２００μｇのＭＰ−ＲＭ−１で処理され、または、されなかった（Ｕ）。４時間、１６時間、および２４時間後、腫瘍は回収され、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＮＰ−４０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ロイペプチン、ペプスタチン（ｐｅｐｓｔａｔｉｎｅ）、アプロチニンおよびフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ｐｈｅｎｙｌ−ｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆｏｎｙｌ−ｆｌｕｏｒｉｄｅ）存在下の５０ｍＭ  ＮａＦを含む溶解バッファー（ｗ：ｖ；１：１０）中で、ポリトロンホモジナイザーでホモジナイズされた。ホモジネートは、４℃にて１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。上清の一定分量は、ＥｒｂＢ３、ＡＫＴおよびｐ−ＡＫＴのタンパク質レベルに関して抗ＥｒｂＢ３、抗ＡＫＴ、抗ｐ−ＡＫＴでのウエスタンブロッティングにより分析された。同じフィルターが、ローディングのコントロールのために抗ＰＬＣγ−１で再検出された。
【０１０８】
結果：マウスへの注射後最初の４時間、メラノーマ異種移植片において、ＭＰ−ＲＭ−１は、ＥｒｂＢ３の下方制御を誘導し、ＡＫＴのリン酸化を阻害する（図１４）。
【０１０９】
（実施例１６）ＭＰ−ＲＭ−１抗体のキメラおよびヒト化型の生産。
【０１１０】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野でよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒト源からそれに導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と呼ばれ、一般的に、「移入」可変領域から取られる。ヒト化は、公知の方法（２７−２９）に従って、特に、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する配列で置換することにより、基本的に行なうことができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４８１６５６７号）、ここで、無傷のヒト可変領域よりも実質的に少ないのが非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。実際には、ヒト化抗体は、一般的に、いくつかのＣＤＲ残基、および、場合により、いくつかのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、齧歯類抗体における類似の部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。
【０１１１】
ＭＰ−ＲＭ−１抗体のキメラおよびヒト化型を生産するために、従来法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、ＭＰ−ＲＭ−１抗体を産生するハイブリドーマ細胞（ＤＳＭＺに寄託され、ＤＳＭ  ＡＣＣ３０１８と命名された）が増やされ、全ＲＮＡが抽出され、抗体の可変領域をクローニングしてシーケンスするために、ＲＴ−ＰＣＲが行われた。
【０１１２】
ＭＰ−ＲＭ−１抗体の可変領域の配列情報に基づき、前記領域の２０の異なる変異体が、標準的な方法を用いた遺伝子合成により得られた。
抗体のキメラ化のために、マウス定常領域がヒト定常領域と置き換えられた。重鎖（ＨＣ）の２つのキメラ型がＩｇＧ１コンテキスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）内に作成され、重鎖（ＨＣ）の２つのキメラ型がＩｇＧ３コンテキスト内に作成された。
【０１１３】
抗体のヒト化のために、マウス由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト抗体フレームワークへ移植された。
【０１１４】
重鎖（ＨＣ）のヒト化型１６個が、ＩｇＧ１およびＬＣ−ｋａｐｐａコンテキスト内に作成された。それぞれの型は、ＦＲ中の特異的点変異によって特徴付けられる。
【０１１５】
配列情報：
キメラ配列
配列３：キメラＩｇＧ１  ＨＣ配列
0005995851.tif 000002
【０１１６】
配列４Ａ：キメラＩｇＧ２  ＨＣ配列
0005995851.tif 000003
【０１１７】
配列４Ｂ：キメラＩｇＧ３  ＨＣ配列
0005995851.tif 000004
【０１１８】
配列５：キメラＬＣ  ＫＡＰＰＡ配列
0005995851.tif 000005
【０１１９】
配列６：キメラＬＣ  ＬＡＭＢＤＡ配列
0005995851.tif 000006
【０１２０】
ヒト化配列
配列７：ヒト化ＩｇＧ１  ＨＣ配列１
0005995851.tif 000007
【０１２１】
配列８：ヒト化ＩｇＧ１  ＨＣ配列２
0005995851.tif 000008
【０１２２】
配列９：ヒト化ＩｇＧ１  ＨＣ配列３
0005995851.tif 000009
【０１２３】
配列１０：ヒト化ＩｇＧ１  ＨＣ配列４
0005995851.tif 000010
【０１２４】
配列１１：ヒト化ＬＣ  ＫＡＰＰＡ配列１
0005995851.tif 000011
【０１２５】
配列１２：ヒト化ＬＣ  ＫＡＰＰＡ配列２
0005995851.tif 000012
【０１２６】
配列１３：ヒト化ＬＣ  ＫＡＰＰＡ配列３
0005995851.tif 000013
【０１２７】
配列１４：ヒト化ＬＣ  ＫＡＰＰＡ配列４
【０１２８】
0005995851.tif 000014
・シグナルペプチドは小文字（イタリック体でない）
・可変領域は大文字、ＣＲＤｓは下線
・定常領域は小文字のイタリック体
・点変異は太字
【０１２９】
４個のキメラの、および、１６個のヒト化の、合成遺伝子がｐＣＤＮＡ３．１プラスミド発現ベクター中に置かれて、それから、モノクローナル抗体の合成を獲得するために、チャイニーズハムスター卵巣−Ｓ（ＣＨＯ−Ｓ）細胞に導入された。表１は、２０個の異なるベクターの組み合わせおよび相対的な抗体の名前を示す。
【０１３０】
【表１】
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【０１３１】
（所望の特性を有する抗体の一次スクリーニング）
２０個の異なる抗体変異体を含む上清は、それらが、リガンド誘導性のＥｒｂＢ３およびＡｋｔのリン酸化を阻害する、および、ヒトメラノーマ細胞ＩＲ−８におけるＥｒｂＢ３の下方制御を促進する、能力に関して試験された。変異体のリン酸化に対する阻害効果は、長期の分析で（ＮＲＧ−１刺激の前に、１０μｇ／ｍｌの抗体変異体で２時間、細胞の処理）または短期の分析で（抗体変異体およびＮＲＧ−１への、５分間の共暴露（ｃｏ−ｅｘｐｏｓｕｒｅ）、評価された。結果は、長期および短期の分析の両方で、ＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリン酸化の阻害およびＥｒｂＢ３の下方制御において、４つの抗体変異体、すなわち、ｃＭＰ−ＲＭ−１＃１、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０が最も活性があったことを示す（表２）。
【０１３２】
【表２】
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【０１３３】
これらの結果に基づき、４個の抗体変異体ｃＭＰ−ＲＭ−１＃１、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０、およびｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０が選択され、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｃａｐｔｕｒｅ（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製され、ＥｒｂＢ３受容体の内部移行とＥｒｂＢ３受容体の下方制御を促進する、および、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト腫瘍細胞の増殖を阻害する、それらの能力に関してさらに試験された。
【０１３４】
（実施例１７）ヒトメラノーマ細胞の表面上のＥｒｂＢ３受容体発現に対する、キメラおよびヒト化ＭＰ−ＲＭ−１抗体変異体の効果。
【０１３５】
材料および方法：ヒトメラノーマ細胞ＩＲ−８は、１０μｇ／ｍｌのキメラ（ｃＭＰ−ＲＭ−１＃１）またはヒト化（ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０）のＭＰ−ＲＭ−１抗体変異体の存在下で、氷上で３０分間保たれ、それから、３７℃に６０分間戻された。細胞は回収されて、フルオレセイン標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で染色され、ＦＡＣＳにより分析された。
【０１３６】
結果：キメラおよびヒト化ＭＰ−ＲＭ−１抗体変異体は、ヒトメラノーマ細胞ＩＲ−８の表面上のＥｒｂＢ３受容体発現の減少を誘導する（図１５）。
【０１３７】
（実施例１８）ヒトメラノーマ細胞におけるｈＭＰ−ＲＭ−１＃６の内部移行。
【０１３８】
材料および方法：ヒトメラノーマ細胞ＩＲ−８は、１５×１５ｍｍのカバースリップに蒔かれて、ＲＰＭＩでの０．２％  ＦＢＳ中で２４時間、培養された。細胞は、それから、１０μｇ／ｍｌのヒト化ＭＰ−ＲＭ−１＃６とともに氷上で３０分間インキュベートされて、３７℃に戻された。３０分後、細胞は４％パラホルムアルデヒド中で固定され、ＰＢＳ中で０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で透過処理され、それから、フルオレセイン標識されたヤギ抗ヒト抗体（グリーン）、ファロイジン（レッド）で染色された。細胞核はブルーで対比染色された。グリーン染色はヒト化ＭＰ−ＲＭ−１＃６抗体の局在化を示す。
【０１３９】
結果：氷中で保たれたヒトメラノーマ細胞ＩＲ−８では、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６抗体変異体が細胞膜上に局在化する（グリーンの輪）。細胞を３７℃に３０分間変更した後は、抗体は全体的に細胞内に局在化され、内部移行を示す（図１６）。同様の結果が、ｃＭＰ−ＲＭ−１＃１、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０、およびｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０で得られた（示さず）。
【０１４０】
（実施例１９）ヒトメラノーマ細胞でのＥｒｂＢ３受容体の半減期に対する、キメラおよびヒト化ＭＰ−ＲＭ−１抗体変異体の効果。
【０１４１】
材料および方法：ヒトメラノーマ細胞ＩＲ−８は、ＲＰＭＩでの０．２％  ＦＢＳ中で２４時間培養され、それから、ｃＭＰ−ＲＭ−１＃１、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０またはｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０の抗体変異体の存在または非存在下で、１０μｇ／ｍｌのタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で追跡された。細胞は溶解されて、ｐ−ＥｒｂＢ３のタンパク質レベルに関して抗ｐ−ＥｒｂＢ３特異的抗体でのウエスタンブロッティングにより分析された。同じフィルターが、ローディングのコントロールのために抗ＡＫＴで再検出された。
【０１４２】
結果：シクロヘキシミド追跡されたヒトメラノーマ細胞ＩＲ−８では、抗体変異体への暴露は、ＰＢＳに暴露した対照細胞と比較して、ＥｒｂＢ３受容体の半減期を著しく減少させる（図１７）。
【０１４３】
（実施例２０）ヒト卵巣がん細胞およびヒト胃がん細胞における、ＥｒｂＢ３およびＡＫＴのリン酸化およびＥｒｂＢ３受容体の下方制御に対する、キメラおよびヒト化ＭＰ−ＲＭ−１抗体変異体の効果。
【０１４４】
材料および方法：（Ａ）ヒト卵巣がん細胞ＯＶＣＡＲ−８は、ＲＰＭＩでの０．２％  ＦＢＳ中で２４時間培養された。細胞は、それから、１０μｇ／ｍｌのｃＭＰ−ＲＭ−１＃１、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０またはｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０の抗体変異体で２時間、事前に処理され、１０ｎｇ／ｍｌのＮＲＧ−１で１０分間刺激された。細胞は溶解されて、ＥｒｂＢ３、ｐ−ＥｒｂＢ３、ＡＫＴ、ｐ−ＡＫＴのレベルに関して抗ＥｒｂＢ３、抗ｐ−ＥｒｂＢ３、抗ＡＫＴ、抗ｐ−ＡＫＴ特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分析された。（Ｂ）ヒト胃がん細胞ＭＫＮ−４５は、ＤＭＥＭでの０．２％  ＦＢＳ中で２４時間、培養された。細胞は、それから、１０μｇ／ｍｌのｃＭＰ−ＲＭ−１＃１、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０またはｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０の抗体変異体または１μｇ／ｍｌのＭＥＴ阻害剤ＳＵ１１２７４に２時間さらされた。細胞は溶解されて、ｐ−ＭＥＴ、ｐ−ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ３のレベルに関して抗ｐ−ＭＥＴ、抗ｐ−ＥｒｂＢ３および抗ＥｒｂＢ３特異的抗体でのウエスタンブロッティングにより分析された。同じフィルターが、ローディングのコントロールのために抗ＡＫＴで再検出された。
【０１４５】
結果：抗体変異体でのヒト卵巣がんＯＶＣＡＲ−８の処理は、ＥｒｂＢ−３およびＡＫＴのリガンド誘導性のリン酸化を阻害し、ＥｒｂＢ３受容体の下方制御を促進する（図１８）。ＭＫＮ−４５細胞は、リガンド非依存性、ＭＥＴ依存性の、ＥｒｂＢ３受容体のリン酸化を示す。ＭＰ−ＲＭ−１抗体変異体は、この基礎活性を阻害することができる（図１８）。
【０１４６】
（実施例２１）キメラおよびヒト化ＭＰ−ＲＭ−１抗体変異体は、ヒトメラノーマ細胞およびヒト胃がん細胞のコロニー形成能力を阻害する。
【０１４７】
材料および方法：１．５×１０４のヒトメラノーマＩＲ−８またはヒト胃がん細胞ＭＫＮ−４５は、１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０中の０．３％アガロースに懸濁され、６穴プレートシャーレ中の０．５％アガロースの２ｍｌ層の上に重ねられた。細胞は、５％  ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃にてインキュベートされた。アガロース凝固後、５〜１０〜２０μｇ／ｍｌのｃＭＰ−ＲＭ−１＃１、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０またはｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０の抗体変異体またはＰＢＳがシャーレに添加された。処理の投与は隔日毎に繰り返される。１０倍率での４個の異なる顕微鏡視野におけるコロニー数は、１０〜１６日後に光学顕微鏡により決定された。
【０１４８】
結果：示されたＭＰ−ＲＭ−１抗体変異体は、軟寒天中のＩＲ−８およびＭＫＮ−４５のコロニーの数および大きさを減少させる（図１９Ａ−Ｂ）。棒グラフは、それぞれでのクローン数を表す。
【０１４９】
（実施例２２）ヒト卵巣がん異種移植片に対する、キメラおよびヒト化ＭＰ−ＲＭ−１抗体変異体の効果。
【０１５０】
材料および方法：ヒト卵巣がん異種移植片ＯＶＣＡＲ−８は、５×１０６の細胞を７週齢ＣＤ１ヌードマウスに皮下注射することにより樹立された。２日後、マウスは無造作に１０匹の５つのグループに分けられ、週に２回、４週間、賦形剤（ＰＢＳ）または２０ｍｇ／ｋｇのｃＭＰ−ＲＭ−１＃１、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃６、ｈＭＰ−ＲＭ−１＃１０またはｈＭＰ−ＲＭ−１＃２０の抗体変異体で腹腔内注射された。腫瘍量はキャリパーによりモニターされた。エラーバーは、各グループでのＳＥを示した。矢印は処理の開始（Ｓ）および終了（Ｅ）を示す。
【０１５１】
結果：キメラまたはヒト化抗体変異体を有するマウスの腫瘍異種移植片は、対照マウスのものよりも、有意にゆっくり増殖する（Ｐ<０．０５）（図２０）。
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【図８】
0005995851.tif 000017
【図１９Ａ】
0005995851.tif 000018
【図１９Ｂ】
0005995851.tif 000019
【図１】
0005995851.tif 000020
【図２】
0005995851.tif 000021
【図３】
0005995851.tif 000022
【図４】
0005995851.tif 000023
【図５】
0005995851.tif 000024
【図６】
0005995851.tif 000025
【図７】
0005995851.tif 000026
【図９】
0005995851.tif 000027
【図１０】
0005995851.tif 000028
【図１１】
0005995851.tif 000029
【図１２】
0005995851.tif 000030
【図１３】
0005995851.tif 000031
【図１４】
0005995851.tif 000032
【図１５】
0005995851.tif 000033
【図１６】
0005995851.tif 000034
【図１７】
0005995851.tif 000035
【図１８】
0005995851.tif 000036
【図２０】
0005995851.tif 000037
【配列表】
0005995851000001.app