(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のピクセルから構成された少なくとも１フレームの画像を取得する画像取得ステップと、
前記少なくとも１フレームの画像に対して少なくとも１つの解析領域を設定する解析領域設定ステップと、
各解析領域に対応するピクセルのデータを抽出するデータ抽出ステップと、
複数の相関計算にそれぞれ使用するデータペアの複数の時間間隔を設定する時間間隔設定ステップと、
抽出データを使用して前記複数の時間間隔のおのおのに対して相関計算をおこなう相関計算ステップと、
前記相関計算ステップによる複数の相関計算結果のおのおのに対してフィッティングをおこなうフィッティングステップを有している、画像解析方法。
【請求項２】
前記画像取得ステップは、複数フレームの画像を取得し、
前記解析領域設定ステップは、各フレームの画像に対して１つの解析領域を設定し、前記解析領域は、各フレームの画像内の同じ領域である、請求項１に記載の画像解析方法。
【請求項３】
前記相関計算ステップは、同じフレームの画像内の同じ解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなうことを含む、請求項２に記載の画像解析方法。
【請求項４】
前記相関計算ステップは、異なるフレームの画像内の同じ解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなうことを含む、請求項２に記載の画像解析方法。
【請求項５】
前記画像取得ステップは、複数フレームの画像を取得し、
前記解析領域設定ステップは、各フレームの画像に複数の解析領域を設定し、前記複数の解析領域は、それぞれ、各フレームの画像内の同じ領域である、請求項１に記載の画像解析方法。
【請求項６】
前記相関計算ステップは、同じフレームの画像内の異なる解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなうことを含む、請求項５に記載の画像解析方法。
【請求項７】
前記相関計算ステップは、異なるフレームの画像内の異なる解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなうことを含む、請求項５に記載の画像解析方法。
【請求項８】
前記解析領域の画像は、二次元画像であり、
前記相関計算ステップは、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数１】
0005856814.tif 000014
ここで、Ｇ２ｓｓａは、同じフレームｆｉの同じ解析領域Ａ１の間の自己相関値、Ｉｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙは、測定点の空間的座標、ξ，ψは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍｉｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数である、請求項３に記載の画像解析方法。
【請求項９】
前記解析領域の画像は、二次元画像であり、
前記相関計算ステップは、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数２】
0005856814.tif 000015
ここで、Ｇ２ｓｄｃは、異なるフレームｆｉとフレームｆｊの同じ解析領域Ａ１の間の相互相関値、Ｉｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、Ｉｆｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙは、測定点の空間的座標、ξ，ψは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍｉｊは、フレームｆｉとフレームｆｊの同じ解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数である、請求項４に記載の画像解析方法。
【請求項１０】
前記解析領域の画像は、二次元画像であり、
前記相関計算ステップは、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数３】
0005856814.tif 000016
ここで、Ｇ２ｄｓｃは、同じフレームｆｉの異なる解析領域Ａ１，Ａ２の間の相互相関値、Ｉ１ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、Ｉ２ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙは、測定点の空間的座標、ξ，ψは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１２ｉｉは、フレームｆｉの異なる解析領域Ａ１，Ａ２の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍ１ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍ２ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの総数である、請求項６に記載の画像解析方法。
【請求項１１】
前記解析領域の画像は、二次元画像であり、
前記相関計算ステップは、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数４】
0005856814.tif 000017
ここで、Ｇ２ｄｄｃは、フレームｆｉの解析領域Ａ１とフレームｆｊの解析領域Ａ２の間の相互相関値、Ｉ１ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、Ｉ２ｆｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙは、測定点の空間的座標、ξ，ψは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１２ｉｊは、フレームｆｉの解析領域Ａ１とフレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍ１ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍ２ｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの総数である、請求項７に記載の画像解析方法。
【請求項１２】
前記フィッティングステップは、次式を使用してフィッティングをおこなう、
【数５】
0005856814.tif 000018
ここで、Ｇｓは、ＲＩＣＳの空間相関値、Ｓは、ＲＩＣＳの解析におけるスキャンの影響、Ｇは、ＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、δｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、ξ，ψは、空間的座標の変化量、Ｗ０は、励起レーザビームの横方向の半径、ＷＺは、励起レーザビームの縦方向の半径、τｐはピクセル時間、τｌはライン時間、τｆはフレーム時間である、請求項８〜１１のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項１３】
前記解析領域の画像は、三次元画像であり、
前記相関計算ステップは、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数６】
0005856814.tif 000019
ここで、Ｇ２ｓｓａは、同じフレームｆｉの同じ解析領域Ａ１の間の自己相関値、Ｉｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙ，ｚは、測定点の空間的座標、ξ，ψ，ηは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍｉｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数である、請求項３に記載の画像解析方法。
【請求項１４】
前記解析領域の画像は、三次元画像であり、
前記相関計算ステップは、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数７】
0005856814.tif 000020
ここで、Ｇ２ｓｄｃは、異なるフレームｆｉとフレームｆｊの同じ解析領域Ａ１の間の相互相関値、Ｉｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、Ｉｆｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙ，ｚは、測定点の空間的座標、ξ，ψ，ηは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍｉｊは、フレームｆｉとフレームｆｊの同じ解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数である、請求項４に記載の画像解析方法。
【請求項１５】
前記解析領域の画像は、三次元画像であり、
前記相関計算ステップは、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数８】
0005856814.tif 000021
ここで、Ｇ２ｄｓｃは、同じフレームｆｉの異なる解析領域Ａ１，Ａ２の間の相互相関値、Ｉ１ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、Ｉ２ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙ，ｚは、測定点の空間的座標、ξ，ψ，ηは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１２ｉｉは、フレームｆｉの異なる解析領域Ａ１，Ａ２の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍ１ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍ２ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの総数である、請求項６に記載の画像解析方法。
【請求項１６】
前記解析領域の画像は、三次元画像であり、
前記相関計算ステップは、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数９】
0005856814.tif 000022
ここで、Ｇ２ｄｄｃは、フレームｆｉの解析領域Ａ１とフレームｆｊの解析領域Ａ２の間の相互相関値、Ｉ１ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、Ｉ２ｆｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙ，ｚは、測定点の空間的座標、ξ，ψ，ηは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１２ｉｊは、フレームｆｉの解析領域Ａ１とフレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍ１ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍ２ｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの総数である、請求項７に記載の画像解析方法。
【請求項１７】
前記フィッティングステップは、次式を使用してフィッティングをおこなう、
【数１０】
0005856814.tif 000023
ここで、Ｇｓは、ＲＩＣＳの空間相関値、Ｓは、ＲＩＣＳの解析におけるスキャンの影響、Ｇは、ＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、δｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、ξ，ψ，ηは、空間的座標の変化量、Ｗ０は、励起レーザビームの横方向の半径、ＷＺは、励起レーザビームの縦方向の半径、τｐはピクセル時間、τｌはライン時間、τｆはフレーム時間である、請求項１３〜１６のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項１８】
前記フィッティングをおこなうことにより前記解析領域内の各成分の分子種の分子数を推定し、次式を使用して分子種の割合を計算するステップをさらに有している、
【数１１】
0005856814.tif 000024
ここで、Ｎｉは、ｉ成分の分子種の分子数、ＰＮｉは、ｉ成分の分子種の分子数Ｎｉの割合、Ｎｋは、ｋ成分の分子種の分子数、ｍは、多成分解析の成分数である、請求項１〜１７のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項１９】
前記解析領域内のピクセルのデータを再構成するステップをさらに有しており、前記相関計算ステップは、再構成されたデータを使用して相関計算をおこなう、請求項１〜１８のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項２０】
各フレームの画像は、光走査によって時系列的にデータが取得された複数のピクセルから構成されている、請求項１〜１９のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項２１】
相関解析結果を表示するステップをさらに有している、請求項１〜２０のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項２２】
複数のピクセルから構成された少なくとも１フレームの画像を取得する画像取得部と、
前記少なくとも１フレームの画像に対して少なくとも１つの解析領域を設定する解析領域設定部と、
各解析領域に対応するピクセルのデータを抽出するデータ抽出部と、
複数の相関計算にそれぞれ使用するデータペアの複数の時間間隔を設定する時間間隔設定部と、
抽出データを使用して前記複数の時間間隔のおのおのに対して相関計算をおこなうとともに、複数の相関計算結果のおのおのに対してフィッティングをおこなう解析処理部を有している、画像解析装置。
【請求項２３】
前記画像取得部は、複数フレームの画像を取得し、
前記解析領域設定部は、各フレームの画像に対して１つの解析領域を設定し、前記解析領域は、各フレームの画像内の同じ領域である、請求項２２に記載の画像解析装置。
【請求項２４】
前記解析処理部は、同じフレームの画像内の同じ解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなう、請求項２３に記載の画像解析装置。
【請求項２５】
前記解析処理部は、異なるフレームの画像内の同じ解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなう、請求項２３に記載の画像解析装置。
【請求項２６】
前記画像取得部は、複数フレームの画像を取得し、
前記解析領域設定部は、各フレームの画像に複数の解析領域を設定し、前記複数の解析領域は、それぞれ、各フレームの画像内の同じ領域である、請求項２２に記載の画像解析装置。
【請求項２７】
前記解析処理部は、同じフレームの画像内の異なる解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなう、請求項２６に記載の画像解析装置。
【請求項２８】
前記解析処理部は、異なるフレームの画像内の異なる解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなう、請求項２６に記載の画像解析装置。
【請求項２９】
前記解析領域の画像は、二次元画像であり、
前記解析処理部は、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数１２】
0005856814.tif 000025
ここで、Ｇ２ｓｓａは、同じフレームｆｉの同じ解析領域Ａ１の間の自己相関値、Ｉｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙは、測定点の空間的座標、ξ，ψは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍｉｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数である、請求項２４に記載の画像解析装置。
【請求項３０】
前記解析領域の画像は、二次元画像であり、
前記解析処理部は、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数１３】
0005856814.tif 000026
ここで、Ｇ２ｓｄｃは、異なるフレームｆｉとフレームｆｊの同じ解析領域Ａ１の間の相互相関値、Ｉｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、Ｉｆｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙは、測定点の空間的座標、ξ，ψは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍｉｊは、フレームｆｉとフレームｆｊの同じ解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数である、請求項２５に記載の画像解析装置。
【請求項３１】
前記解析領域の画像は、二次元画像であり、
前記解析処理部は、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数１４】
0005856814.tif 000027
ここで、Ｇ２ｄｓｃは、同じフレームｆｉの異なる解析領域Ａ１，Ａ２の間の相互相関値、Ｉ１ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、Ｉ２ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙは、測定点の空間的座標、ξ，ψは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１２ｉｉは、フレームｆｉの異なる解析領域Ａ１，Ａ２の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍ１ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍ２ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの総数である、請求項２７に記載の画像解析装置。
【請求項３２】
前記解析領域の画像は、二次元画像であり、
前記解析処理部は、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数１５】
0005856814.tif 000028
ここで、Ｇ２ｄｄｃは、フレームｆｉの解析領域Ａ１とフレームｆｊの解析領域Ａ２の間の相互相関値、Ｉ１ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、Ｉ２ｆｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙは、測定点の空間的座標、ξ，ψは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１２ｉｊは、フレームｆｉの解析領域Ａ１とフレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍ１ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍ２ｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの総数である、請求項２８に記載の画像解析装置。
【請求項３３】
前記解析処理部は、次式を使用してフィッティングをおこなう、
【数１６】
0005856814.tif 000029
ここで、Ｇｓは、ＲＩＣＳの空間相関値、Ｓは、ＲＩＣＳの解析におけるスキャンの影響、Ｇは、ＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、δｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、ξ，ψは、空間的座標の変化量、Ｗ０は、励起レーザビームの横方向の半径、ＷＺは、励起レーザビームの縦方向の半径、τｐはピクセル時間、τｌはライン時間、τｆはフレーム時間である、請求項２９〜請求項３２のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【請求項３４】
前記解析領域の画像は、三次元画像であり、
前記解析処理部は、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数１７】
0005856814.tif 000030
ここで、Ｇ２ｓｓａは、同じフレームｆｉの同じ解析領域Ａ１の間の自己相関値、Ｉｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙ，ｚは、測定点の空間的座標、ξ，ψ，ηは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍｉｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数である、請求項２４に記載の画像解析装置。
【請求項３５】
前記解析領域の画像は、三次元画像であり、
前記解析処理部は、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数１８】
0005856814.tif 000031
ここで、Ｇ２ｓｄｃは、異なるフレームｆｉとフレームｆｊの同じ解析領域Ａ１の間の相互相関値、Ｉｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、Ｉｆｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙ，ｚは、測定点の空間的座標、ξ，ψ，ηは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍｉｊは、フレームｆｉとフレームｆｊの同じ解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数である、請求項２５に記載の画像解析装置。
【請求項３６】
前記解析領域の画像は、三次元画像であり、
前記解析処理部は、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数１９】
0005856814.tif 000032
ここで、Ｇ２ｄｓｃは、同じフレームｆｉの異なる解析領域Ａ１，Ａ２の間の相互相関値、Ｉ１ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、Ｉ２ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙ，ｚは、測定点の空間的座標、ξ，ψ，ηは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１２ｉｉは、フレームｆｉの異なる解析領域Ａ１，Ａ２の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍ１ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍ２ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの総数である、請求項２７に記載の画像解析装置。
【請求項３７】
前記解析領域の画像は、三次元画像であり、
前記解析処理部は、次式を使用して相関計算をおこなう、
【数２０】
0005856814.tif 000033
ここで、Ｇ２ｄｄｃは、フレームｆｉの解析領域Ａ１とフレームｆｊの解析領域Ａ２の間の相互相関値、Ｉ１ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータ、Ｉ２ｆｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータ、ｘ，ｙ，ｚは、測定点の空間的座標、ξ，ψ，ηは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１２ｉｊは、フレームｆｉの解析領域Ａ１とフレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍ１ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍ２ｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの総数である、請求項２８に記載の画像解析装置。
【請求項３８】
前記解析処理部は、次式を使用してフィッティングをおこなう、
【数２１】
0005856814.tif 000034
ここで、Ｇｓは、ＲＩＣＳの空間相関値、Ｓは、ＲＩＣＳの解析におけるスキャンの影響、Ｇは、ＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、δｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、ξ，ψ，ηは、空間的座標の変化量、Ｗ０は、励起レーザビームの横方向の半径、ＷＺは、励起レーザビームの縦方向の半径、τｐはピクセル時間、τｌはライン時間、τｆはフレーム時間である、請求項３４〜請求項３７のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【請求項３９】
前記解析処理部は、前記フィッティングをおこなうことにより前記解析領域内の各成分の分子種の分子数を推定し、次式を使用して分子種の割合を計算する、
【数２２】
0005856814.tif 000035
ここで、Ｎｉは、ｉ成分の分子種の分子数、ＰＮｉは、ｉ成分の分子種の分子数Ｎｉの割合、Ｎｋは、ｋ成分の分子種の分子数、ｍは、多成分解析の成分数である、請求項２２〜請求項３８のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【請求項４０】
前記解析処理部は、前記解析領域内のピクセルのデータを再構成し、再構成したデータを使用して相関計算をおこなう、請求項２２〜請求項３９のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【請求項４１】
各フレームの画像は、光走査によって時系列的にデータが取得された複数のピクセルから構成されている、請求項２２〜請求項４０のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【請求項４２】
相関解析結果を表示する表示部をさらに有している、請求項２２〜請求項４１のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【請求項４３】
各フレームの画像の各ピクセルのデータは蛍光強度データである、請求項８〜請求項１６のいずれかひとつに記載の画像解析方法。
【請求項４４】
各フレームの画像の各ピクセルのデータは蛍光強度データである、請求項２９〜請求項３７のいずれかひとつに記載の画像解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、画像解析方法および画像解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光相関分光分析法（ＦＣＣＳ）と呼ばれる画像解析の手法が知られている。ＦＣＣＳは、たとえば特許文献１に示されている。ＦＣＣＳでは、試料中の一つまたは複数の測定点に対して、ある程度の時間のあいだ（たとえば１０秒間）励起光を継続的に照射し、測定点から発する蛍光の強度の揺らぎを検出して相関解析をおこなうことによって分子数や拡散定数の推定をおこなう。
【０００３】
また、ラスターイメージ相関分光法（ＲＩＣＳ：Raster Image Correlation Spectroscopy）と呼ばれる画像解析の手法も知られている。ＲＩＣＳは、たとえば非特許文献２に示されている。ＲＩＣＳでは、１フレーム以上のラスター走査画像を取得する。ラスター走査画像はたとえば蛍光画像であってよい。蛍光画像の各ピクセルのデータは、対応する試料中の点から発生した蛍光の強度の情報を表す。ピクセルのデータは、それぞれ取得された時間および取得された位置が異なる。
【０００４】
これらのピクセルのデータを用いて空間自己相関解析することによって分子の揺らぎによる相関特性が得られる。分子の相関特性からは拡散定数や分子数を求めることができる。拡散定数からは分子拡散時間を求めることができる。分子拡散時間からは分子量を求めることができる。
【０００５】
このように、空間自己相関解析をすることによって分子量や分子数等を評価することができるため、分子間の相互作用を観察することが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−０９３２７７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「Measuring Fast Dynamics in Solutions and Cells with a Laser Scanning Microscope」, Michelle A. Digman, Claire M. Brown, Parijat Sengupta, Paul W. Wiseman, Alan R. Horwitz, and Enrico Gratton, Biophysical Journal, Vol.89, P1317-1327, August 2005.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のＲＩＣＳの解析処理は、分子の拡散時間（または分子数など）を主な解析パラメータとして扱うが、解析可能な成分は２成分にとどまる。また、フィッティング用パラメータの設定が難しく、２成分解析も難しい。そのため、複数の分子種からなるサンプルにおいて、事実上、多成分解析はほとんどおこなわれていない。
【０００９】
本発明は、多成分解析可能な画像解析方法および画像解析装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明による画像解析方法は、複数のピクセルから構成された少なくとも１フレームの画像を取得する画像取得ステップと、前記少なくとも１フレームの画像に対して少なくとも１つの解析領域を設定する解析領域設定ステップと、各解析領域に対応するピクセルのデータを抽出するデータ抽出ステップと、複数の相関計算にそれぞれ使用するデータペアの複数の時間間隔を設定する時間間隔設定ステップと、抽出データを使用して前記複数の時間間隔のおのおのに対して相関計算をおこなう相関計算ステップと、前記相関計算ステップによる複数の相関計算結果のおのおのに対してフィッティングをおこなうフィッティングステップを有している。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、多成分解析可能な画像解析方法および画像解析装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】一実施形態による画像解析装置を概略的に示している。
【図２】図１に示される制御部の機能ブロックを示している。
【図３】一実施形態による画像解析のフローチャートである。
【図４】１フレームの二次元画像の蛍光画像を示している。
【図５】１フレームの三次元画像の蛍光画像を示している。
【図６】複数フレームの観察領域の画像と１つの解析領域の抽出画像を示している。
【図７】複数フレームの観察領域の画像と２つの解析領域の抽出画像を示している。
【図８】同じフレームの画像内の同じ解析領域に対する相関計算を模式的に示している。
【図９】異なるフレームの画像内の同じ解析領域に対する相関計算を模式的に示している。
【図１０】同じフレームの画像内の異なる解析領域に対する相関計算を模式的に示している。
【図１１】異なるフレームの画像内の異なる解析領域に対する相関計算を模式的に示している。
【図１２】試料中の分子に関する空間相互相関値の計算結果を輝度で示した画像である。
【図１３】図１２の空間相互相関値の計算結果のフィッティング結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００１４】
[装置構成]
図１は、一実施形態による画像解析装置を概略的に示している。この画像解析装置は、試料の蛍光観察のための走査型共焦点光学顕微鏡をベースに構成されている。
【００１５】
図１に示すように、画像解析装置１００は、試料Ｓに光たとえば励起光を照射する光照射部１１０と、試料Ｓからの光たとえば蛍光を検出する光検出部１３０と、画像解析に必要な制御をおこなう制御部１６０と、試料Ｓを支持する試料ステージ１９０とを有している。
【００１６】
試料Ｓはマイクロプレートやスライドガラスなどの試料容器に収容され、試料ステージ１９０に載置される。試料ステージ１９０は、たとえば、試料Ｓを光照射部１１０および光検出部１３０に対して横方向（ｘｙ方向）および高さ方向（ｚ方向）に移動可能に支持する。たとえば、試料ステージ１９０は、出力軸が互いに直交する三つのステッピング・モーターを含んでおり、これらのステッピング・モーターによって試料Ｓをｘｙｚ方向に移動し得る。
【００１７】
画像解析装置１００は、たとえば、多重光照射・多重光検出型である。このため、光照射部１１０はｎチャンネルの光源ユニット１１１を含み、光検出部１３０はｍチャンネルの光検出ユニット１３１を含んでいる。光源ユニット１１１は、ｎ個のチャンネルを有し、ｎ種類の異なる波長の励起光を射出し得る。また光検出ユニット１３１は、ｍ個のチャンネルを有し、ｍ種類の異なる波長の蛍光を検出し得る。光源ユニット１１１は必ずしも複数のチャンネルを有している必要はなく、１つのチャンネルだけを有していてもよい。また光検出ユニット１３１も必ずしも複数のチャンネルを有している必要はなく、１つのチャンネルだけを有していてもよい。
【００１８】
光照射部１１０のｎチャンネルの光源ユニット１１１は、光源１１２ａ，…，１１２ｎとコリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎとダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎとを含んでいる。光源１１２ａ，…，１１２ｎは、試料Ｓに含まれる蛍光色素を励起して試料Ｓから光（蛍光）を発せさせるための励起光を発する。光源１１２ａ，…，１１２ｎから発せられる励起光の波長は、試料Ｓに含まれる蛍光色素の種類に対応して、互いに相違している。光源１１２ａ，…，１１２ｎは、たとえば、試料Ｓ中の蛍光色素に合った発振波長のレーザー光源で構成される。コリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎは、それぞれ、光源１１２ａ，…，１１２ｎから発せられた励起光をコリメートする。ダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎは、それぞれ、コリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎを通過した励起光を同じ方向に反射する。ダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎは、それぞれ、図１の上方から入射する励起光を透過し、図１の右方から入射する励起光を反射する。その結果、光源１１２ａ，…，１１２ｎからそれぞれ射出された異なる波長の励起光は、ダイクロイックミラー１１６ａの通過後に一本のビームに合成される。ダイクロイックミラー１１６ｎは、励起光を透過する必要がないので、単なるミラーに変更されてもよい。
【００１９】
光照射部１１０はさらに、ダイクロイックミラー１２２とガルバノミラー１２４と対物レンズ１２６と対物レンズ駆動機構１２８を含んでいる。ダイクロイックミラー１２２は、光源ユニット１１１からの励起光をガルバノミラー１２４に向けて反射し、試料Ｓから発せられる蛍光を透過する。ガルバノミラー１２４は、励起光を対物レンズ１２６に向けて反射するとともに、その反射方向を変更する。対物レンズ１２６は、励起光を収束して試料Ｓ内の測定点に照射するとともに、試料Ｓ内の測定点からの光を取り込む。対物レンズ１２６には、微小な共焦点領域（測定点）の形成のために、ＮＡ（開口数）の大きいものが使用される。これにより得られる共焦点領域の大きさは、直径０．６μｍ程度（ｘｙ面内）、長さ２μｍ程度（ｚ方向）の略円筒状となる。ガルバノミラー１２４は、測定点をｘｙ方向に走査するｘｙ走査機構を構成している。ｘｙ走査機構は、ガルバノミラーを使用して構成するほかに、音響光学変調素子（ＡＯＭ）やポリゴンミラー、ホログラムスキャナーなどを使用して構成してもよい。対物レンズ駆動機構１２８は、対物レンズ１２６を光軸に沿って移動させる。これにより、測定点がｚ方向に移動される。つまり、対物レンズ駆動機構１２８は、測定点をｚ方向に走査するｚ走査機構を構成している。
【００２０】
光検出部１３０は、対物レンズ１２６とガルバノミラー１２４とダイクロイックミラー１２２を光照射部１１０と共有している。光検出部１３０はさらに、収束レンズ１３２とピンホール１３４とコリメートレンズ１３６とを含んでいる。収束レンズ１３２は、ダイクロイックミラー１２２を透過した光を収束する。ピンホール１３４は、収束レンズ１３２の焦点に配置されている。つまり、ピンホール１３４は、試料Ｓ内の測定点に対して共役な位置にあり、測定点からの光だけを選択的に通す。コリメートレンズ１３６は、ピンホール１３４を通過した光を平行にする。コリメートレンズ１３６を通過した光は、ｍチャンネルの光検出ユニット１３１に入射する。
【００２１】
ｍチャンネルの光検出ユニット１３１は、ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｍと蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｍと光検出器１４２ａ，…，１４２ｍとを含んでいる。ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｍは、それぞれ、検出対象の蛍光の波長域付近の波長の光を選択的に反射する。ダイクロイックミラー１３８ｍは、光を透過する必要がないので、単なるミラーに変更されてもよい。蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｍは、それぞれ、ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｍによって反射された光から、不所望な波長成分の光を遮断し、光源１１２ａ，…，１１２ｎからの励起光によって生成された蛍光だけを選択的に透過する。蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｍを透過した蛍光はそれぞれ光検出器１４２ａ，…，１４２ｍに入射する。光検出器１４２ａ，…，１４２ｍは、入射した光の強度に対応した信号を出力する。すなわち、光検出器１４２ａ，…，１４２ｍは、試料Ｓ内の測定点からの蛍光強度信号を出力する。
【００２２】
制御部１６０はたとえばパーソナルコンピューターで構成される。制御部１６０は、試料Ｓの観察領域の蛍光画像の取得・記憶・表示、解析領域の設定などの入力待ち、画像の解析処理（相関値の計算や分子数・拡散時間の推定など）をおこなう。また制御部１６０は、ｘｙ走査機構であるガルバノミラー１２４、ｚ走査機構である対物レンズ駆動機構１２８、試料ステージ１９０などの制御をおこなう。
【００２３】
図１に示される制御部の機能ブロックを図２に示す。制御部１６０は、図２に示すように、走査制御部１６２と画像形成部１６４と記憶部１６６と表示部１６８と入力部１７０と解析領域設定部１７２とデータ抽出部１７４と解析処理部１７８と時間間隔設定部１７８とステージ制御部１８０とを含んでいる。走査制御部１６２と画像形成部１６４と記憶部１６６とステージ制御部１８０は、上述した光照射部１１０と光検出部１３０と共働して画像取得部を構成する。
【００２４】
走査制御部１６２は、試料Ｓの蛍光画像を取得する際、励起光の照射位置を試料Ｓに対してラスター走査するようにガルバノミラー１２４を制御する。走査制御部１６２はまた、必要であれば、励起光の照射位置を試料Ｓに対してｚ走査するように対物レンズ駆動機構１２８を制御する。画像形成部１６４は、走査制御部１６２から入力される励起光の照射位置の情報と光検出器１４２ａ，…，１４２ｍの出力信号とから試料Ｓの蛍光画像を形成する。これにより、蛍光画像が取得される。記憶部１６６は、画像形成部１６４で形成された蛍光画像を記憶する。表示部１６８は、試料Ｓの蛍光画像や解析処理結果を表示する。入力部１７０は、たとえばマウスやキーボードを含み、表示部１６８と共同してＧＵＩを構成する。このＧＵＩは、観察領域や解析領域の設定などに利用される。ステージ制御部１８０は、たとえば観察領域を設定するために、入力部１７０からの入力情報にしたがって試料ステージ１９０を制御する。解析領域設定部１７２は、入力部１７０からの入力情報にしたがって解析領域を設定する。データ抽出部１７４は、相関計算をおこなう解析領域のデータを抽出する。時間間隔設定部１７６は、複数の相関計算にそれぞれ使用するデータのペアの複数の時間間隔を設定する。解析処理部１７８は、解析領域の画像のピクセルのデータを使用して相関計算をおこなう。解析処理部１７８の処理の詳細は後述する。
【００２５】
図１において、光源１１２ａ，…，１１２ｎから発せられた励起光は、コリメートレンズ１１４ａ，…，１１４ｎとダイクロイックミラー１１６ａ，…，１１６ｎとダイクロイックミラー１２２とガルバノミラー１２４と対物レンズ１２６を経て試料Ｓ内の測定点に照射される。励起光が照射される測定点は、ガルバノミラー１２４によってｘｙ方向にラスター走査される。また必要であれば、一回のラスター走査が終了するたびに、対物レンズ駆動機構１２８によってｚ走査される。測定点は観察領域の全体にわたって走査される。励起光を受けた試料Ｓは測定点から蛍光を発する。試料Ｓからの光（蛍光のほかに不所望な反射光などを含む）は、対物レンズ１２６とガルバノミラー１２４とダイクロイックミラー１２２と収束レンズ１３２を経てピンホール１３４に至る。ピンホール１３４は測定点と共役な位置にあるため、試料Ｓ内の測定点からの光だけがピンホール１３４を通過する。ピンホール１３４を通過した光すなわち試料Ｓ内の測定点からの光はコリメートレンズ１３６を経てｍチャンネルの光検出ユニット１３１に入射する。ｍチャンネルの光検出ユニット１３１に入射した光は、ダイクロイックミラー１３８ａ，…，１３８ｍによって波長にしたがって分離される（つまり分光される）とともに、蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｍによって不所望な成分が除去される。蛍光フィルター１４０ａ，…，１４０ｍを通過した蛍光は光検出器１４２ａ，…，１４２ｍにそれぞれ入射する。光検出器１４２ａ，…，１４２ｍは、それぞれ、入射光すなわち試料Ｓ内の測定点から発せられた蛍光の強度を示す蛍光強度信号を出力する。この蛍光強度信号は画像形成部１６４に入力される。画像形成部１６４は、入力される蛍光強度信号をｘｙ方向（およびｚ方向）の位置情報に同期させて処理して、試料Ｓ内の観察領域の蛍光画像を形成する。形成された蛍光画像は、記憶部１６６に保存される。記憶部１６６に保存された蛍光画像は、そのまま表示部１６８に表示されるか、解析処理部１７８によって処理され、解析処理結果が表示部１６８に表示される。
【００２６】
[解析手順]
以下、図３を参照しながら画像解析の手順について説明する。また、各ステップについて、適宜、図４〜図１１を参照しながら説明する。
【００２７】
（ステップＳ１）
試料Ｓの観察領域の１フレームまたは複数フレームの画像たとえば蛍光画像を取得する。蛍光画像は、光源ユニット１１１の１つのチャンネルと、それに対応する光検出ユニット１３１の１つのチャンネルとを介して取得したものである。各フレームの蛍光画像は、励起光の走査によって時系列的にデータが取得された複数のピクセルから構成されている。測定点は、実際には、ｘｙｚ方向に空間的広がりを有しており、ピクセルは、この測定点の空間的広がりに対応した大きさを有する。蛍光画像の各ピクセルのデータは、たとえば、対応する測定点から発せられる蛍光の強度である。
【００２８】
観察領域は二次元の領域または三次元の領域あり、それに対応して蛍光画像は二次元画像または三次元画像である。観察領域が二次元的領域である場合、蛍光画像は、ｘｙ方向に大きさを持つピクセルが二次元的に配列された二次元画像である。また観察領域が三次元的領域である場合、蛍光画像は、ｘｙｚ方向に大きさを持つピクセルが三次元的に配列された三次元画像である。三次元画像はまた、別の見方をすれば、ｚ位置の異なる複数フレームの二次元画像から構成される。
【００２９】
１フレームの二次元画像の蛍光画像を図４に示す。図４において、τｐは、あるピクセルとこれに隣接する次のピクセルとの間の取得時間のずれ（ピクセル時間）である。すなわち、ピクセル時間τｐは、１ピクセルのデータを取得するのに要する時間である。またτｌは、あるラインの最初のピクセルとその次のラインの最初のピクセルとの間の取得時間のずれ（ライン時間）である。すなわち、ライン時間τｌは、１ラインを走査するのに要する時間を意味する。
【００３０】
１フレームの三次元画像を図５に示す。図５において、τｐはピクセル時間、τｌはライン時間、τｆは、あるフレームの最初のピクセルとその次のフレームの最初のピクセルとの間の取得時間のずれ（フレーム時間）である。すなわち、フレーム時間τｆは、１フレームを走査するのに要する時間を意味する。
【００３１】
（ステップＳ２）
取得した１フレームまたは複数フレームのおのおのの観察領域の画像たとえば蛍光画像に対して１つまたは複数の解析領域を設定する。複数の解析領域は、空間的に異なる領域であり、通常、互いに離れていて重複していない。解析領域は、二次元の観察領域に対しては二次元の領域であり、三次元の観察領域に対しては、通常、三次元の領域であるが、二次元の領域であってもよい。図６では、複数フレームｆ１〜ｆ１００のおのおのの観察領域の蛍光画像に対して１つの解析領域Ａ１が設定されており、解析領域Ａ１は細胞の核外に位置している。また図７では、複数フレームｆ１〜ｆ１００のおのおのの観察領域の蛍光画像に対して２つの解析領域Ａ１，Ａ２が設定されており、解析領域Ａ１は細胞の核外に位置し、解析領域Ａ２は細胞の核内に位置している。
【００３２】
（ステップＳ３）
各解析領域に対応するピクセルのデータを抽出する。図６には、抽出された複数フレームｆ１〜ｆ１００の解析領域Ａ１のピクセルのデータすなわち画像が示されている。また図７には、抽出された複数フレームｆ１〜ｆ１００の解析領域Ａ１，Ａ２のピクセルのデータすなわち画像が示されている。
【００３３】
（ステップＳ４）
複数の相関計算にそれぞれ使用するデータペアの複数の時間間隔（遅延時間）を設定する。各時間間隔は、各相関計算のための積和計算に使用する複数ペアのピクセルのデータの取得時間の差に対応している。たとえば、ある時間間隔は、同じフレームの同じまたは異なる解析領域内の２つのピクセルに対応し、別の時間間隔は、異なるフレームの同じまたは異なる解析領域内の２つのピクセルに対応する。これらの時間間隔は、好ましくは、十分な回数の積和計算をおこなえるように設定される。
【００３４】
（ステップＳ５）
抽出したピクセルのデータを使用して相関計算をおこなう。相関計算に適用する計算式は、解析領域の画像が二次元画像か三次元画像かで異なる。さらに、相関計算の積和計算に使用する複数のデータペアのおのおのの２つのピクセルが同じ解析領域に属するか異なる解析領域に属するかで異なる。加えて、相関計算の積和計算に使用する複数のデータペアのおのおのの２つのピクセルが同じフレームの画像に属するか異なるフレームの画像に属するかで異なる。
【００３５】
二次元画像に対する適用計算式は次の通りである。
【００３６】
１．各データペアの２つのピクセルが同じ解析領域の画像に属し、同じフレームの画像に属する場合。この場合、同じフレームの画像内の同じ解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなう。この相関計算は自己相関計算となる。図８は、この場合の相関計算を模式的に示している。
【００３７】
【数１】
0005856814.tif 000002
【００３８】
ここで、Ｇ２ｓｓａは、同じフレームｆｉの同じ解析領域Ａ１の間の自己相関値、Ｉｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータたとえば蛍光強度データ、ｘ，ｙは、測定点の空間的座標、ξ，ψは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍｉｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数である。
【００３９】
２．各データペアの２つのピクセルが同じ解析領域の画像に属し、異なるフレームの画像に属する場合。この場合、異なるフレームの画像内の同じ解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなう。この相関計算は相互相関計算となる。図９は、この場合の相関計算を模式的に示している。
【００４０】
【数２】
0005856814.tif 000003
【００４１】
ここで、Ｇ２ｓｄｃは、異なるフレームｆｉとフレームｆｊの同じ解析領域Ａ１の間の相互相関値、Ｉｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータたとえば蛍光強度データ、Ｉｆｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータたとえば蛍光強度データ、ｘ，ｙは、測定点の空間的座標、ξ，ψは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍｉｊは、フレームｆｉとフレームｆｊの同じ解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数である。
【００４２】
３．各データペアの２つのピクセルが異なる解析領域の画像に属し、同じフレームの画像に属する場合。この場合、同じフレームの画像内の異なる解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなう。この相関計算は相互相関計算となる。図１０は、この場合の相関計算を模式的に示している。
【００４３】
【数３】
0005856814.tif 000004
【００４４】
ここで、Ｇ２ｄｓｃは、同じフレームｆｉの異なる解析領域Ａ１，Ａ２の間の相互相関値、Ｉ１ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータたとえば蛍光強度データ、Ｉ２ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータたとえば蛍光強度データ、ｘ，ｙは、測定点の空間的座標、ξ，ψは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１２ｉｉは、フレームｆｉの異なる解析領域Ａ１，Ａ２の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍ１ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍ２ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの総数である。
【００４５】
４．各データペアの２つのピクセルが異なる解析領域の画像に属し、同じフレームの画像に属する場合。この場合、異なるフレームの画像内の異なる解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなう。この相関計算は相互相関計算となる。図１１は、この場合の相関計算を模式的に示している。
【００４６】
【数４】
0005856814.tif 000005
【００４７】
ここで、Ｇ２ｄｄｃは、フレームｆｉの解析領域Ａ１とフレームｆｊの解析領域Ａ２の間の相互相関値、Ｉ１ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータたとえば蛍光強度データ、Ｉ２ｆｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータたとえば蛍光強度データ、ｘ，ｙは、測定点の空間的座標、ξ，ψは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１２ｉｊは、フレームｆｉの解析領域Ａ１とフレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍ１ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍ２ｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの総数である。
【００４８】
三次元画像に対する適用計算式は次の通りである。
【００４９】
１．各データペアの２つのピクセルが同じ解析領域の画像に属し、同じフレームの画像に属する場合。この場合、同じフレームの画像内の同じ解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなう。この相関計算は自己相関計算となる。図８は、この場合の相関計算を模式的に示している。
【００５０】
【数５】
0005856814.tif 000006
【００５１】
ここで、Ｇ２ｓｓａは、同じフレームｆｉの同じ解析領域Ａ１の間の自己相関値、Ｉｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータたとえば蛍光強度データ、ｘ，ｙ，ｚは、測定点の空間的座標、ξ，ψ，ηは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍｉｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数である。
【００５２】
２．各データペアの２つのピクセルが同じ解析領域の画像に属し、異なるフレームの画像に属する場合。この場合、異なるフレームの画像内の同じ解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなう。この相関計算は相互相関計算となる。図９は、この場合の相関計算を模式的に示している。
【００５３】
【数６】
0005856814.tif 000007
【００５４】
ここで、Ｇ２ｓｄｃは、異なるフレームｆｉとフレームｆｊの同じ解析領域Ａ１の間の相互相関値、Ｉｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータたとえば蛍光強度データ、Ｉｆｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータたとえば蛍光強度データ、ｘ，ｙ，ｚは、測定点の空間的座標、ξ，ψ，ηは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍｉｊは、フレームｆｉとフレームｆｊの同じ解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数である。
【００５５】
３．各データペアの２つのピクセルが異なる解析領域の画像に属し、同じフレームの画像に属する場合。この場合、同じフレームの画像内の異なる解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなう。この相関計算は相互相関計算となる。図１０は、この場合の相関計算を模式的に示している。
【００５６】
【数７】
0005856814.tif 000008
【００５７】
ここで、Ｇ２ｄｓｃは、同じフレームｆｉの異なる解析領域Ａ１，Ａ２の間の相互相関値、Ｉ１ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータたとえば蛍光強度データ、Ｉ２ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータたとえば蛍光強度データ、ｘ，ｙ，ｚは、測定点の空間的座標、ξ，ψ，ηは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１２ｉｉは、フレームｆｉの異なる解析領域Ａ１，Ａ２の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍ１ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍ２ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの総数である。
【００５８】
４．各データペアの２つのピクセルが異なる解析領域の画像に属し、同じフレームの画像に属する場合。この場合、異なるフレームの画像内の異なる解析領域内のピクセルのデータのペアを使用して相関計算をおこなう。この相関計算は相互相関計算となる。図１１は、この場合の相関計算を模式的に示している。
【００５９】
【数８】
0005856814.tif 000009
【００６０】
ここで、Ｇ２ｄｄｃは、フレームｆｉの解析領域Ａ１とフレームｆｊの解析領域Ａ２の間の相互相関値、Ｉ１ｆｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータたとえば蛍光強度データ、Ｉ２ｆｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータたとえば蛍光強度データ、ｘ，ｙ，ｚは、測定点の空間的座標、ξ，ψ，ηは、測定点からの空間的座標の変化量、Ｍ１２ｉｊは、フレームｆｉの解析領域Ａ１とフレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの積和計算の回数、Ｍ１ｉは、フレームｆｉの解析領域Ａ１の画像のピクセルのデータの総数、Ｍ２ｊは、フレームｆｊの解析領域Ａ２の画像のピクセルのデータの総数である。
【００６１】
相関計算に使用する各ピクセルのデータは、そのピクセルのデータそのものであってもよいし、そのピクセルを含む複数のピクセルのデータの統計値であってもよい。複数のピクセルは、たとえば、注目のピクセルおよびこれに隣接するピクセルであってよい。統計値は、たとえば、ピクセルのデータの平均値、最大値、最小値、相対差、絶対差、相対比のいずれかであってよい。どのような統計値を使用するかは、ＲＩＣＳの解析によってどのような情報を得たいかによって決める。
【００６２】
また相関計算に使用するデータは、ピクセル時間、ライン時間、フレーム時間、ピクセル位置関係、ピクセルサイズまたはそれについての統計値であってもよい。
【００６３】
また相関計算は、ピクセルのデータに基づいて画像をそれぞれ再構成し、再構成した画像について相関計算してもよい。たとえば、隣のピクセルのデータ同士を足して、ピクセルのデータの数を半分にする。または、一つのピクセルのデータを複数に分割する。本来ならば、一度画像を取得するとピクセルのデータの数は増えないが、取得したピクセルのデータの強度がそのピクセルのデータの周囲にガウシアン分布で広がっていると仮定して、本来取得できていないピクセルのデータを補う。本質的にピクセルのデータの数が増えている訳ではないが、見た目が良くなる。
【００６４】
（ステップＳ６）
ステップＳ５の相関計算の結果に対してフィッティングをおこなう。これにより、分子数と拡散時間の少なくとも一方を推定する。フィッティングに適用する計算式は、解析領域の画像が二次元画像か三次元画像かで異なる。
【００６５】
二次元画像に対する適用計算式は次の通りである。
【００６６】
【数９】
0005856814.tif 000010
【００６７】
ここで、Ｇｓは、ＲＩＣＳの空間相関値、Ｓは、ＲＩＣＳの解析におけるスキャンの影響、Ｇは、ＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、δｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、ξ，ψは、空間的座標の変化量、Ｗ０は、励起レーザビームの横方向の半径、ＷＺは、励起レーザビームの縦方向の半径、τｐはピクセル時間、τｌはライン時間、τｆはフレーム時間である。
【００６８】
三次元画像に対する適用計算式は次の通りである。
【００６９】
【数１０】
0005856814.tif 000011
【００７０】
ここで、Ｇｓは、ＲＩＣＳの空間相関値、Ｓは、ＲＩＣＳの解析におけるスキャンの影響、Ｇは、ＲＩＣＳの解析における時間遅延の影響、Ｄは拡散定数、δｒはピクセルサイズ、Ｎは分子数、ξ，ψ，ηは、空間的座標の変化量、Ｗ０は、励起レーザビームの横方向の半径、ＷＺは、励起レーザビームの縦方向の半径、τｐはピクセル時間、τｌはライン時間、τｆはフレーム時間である。
【００７１】
分子数と拡散定数は、式（１）〜式（８）の理論値を、測定値を使った相関演算の結果と残差比較すること（フィッティング）により求める。フィッティングでは、まず、（ａ）所定の拡散定数Ｄと分子数Ｎを用いて、理論値として得られるＧｓ（以下、理論相関値Ｇｓとする）を算出する。次に、（ｂ）理論相関値Ｇｓと測定値として得られる相関値Ｇｓ（以下、測定相関値Ｇｓとする）との比較をおこない、両者の残差を算出する。続いて、（ｃ）理論相関値Ｇｓにおける拡散定数Ｄと分子数Ｎを変化させて、新たな理論相関値Ｇｓを算出する。続いて、（ｄ）新たな理論相関値Ｇｓと測定相関値Ｇｓとの比較をおこない、両者の残差を算出する。続いて、（ｅ）上記の（ｂ）で得られた残差と（ｄ）で得られた残差を比較して、残差が大きくなったか小さくなったかを判定する。このように、フィッティングでは、理論相関値Ｇｓにおける拡散定数Ｄと分子数Ｎを変化させながら（ｂ）〜（ｅ）を繰り返しおこない、測定相関値Ｇｓと理論相関値Ｇｓとの残差が最小となる理論相関値Ｇｓを最終的に求める。最終的に得られた理論相関値Ｇｓにおける拡散定数Ｄと分子数Ｎが、測定相関値Ｇｓにおける拡散定数Ｄと分子数Ｎとなる。このように、式（９）または式（１０）によるフィッティングとは、理論相関値Ｇｓにおける拡散定数Ｄと分子数Ｎを変動させながら、二次元または三次元の観察領域における最適な分子数または拡散定数を推定することである。
【００７２】
拡散定数と拡散時間との間には、次式（１１）で表される関係がある。したがって、求めた拡散定数から拡散時間を求めることができる。
【００７３】
【数１１】
0005856814.tif 000012
【００７４】
（ステップＳ７）
解析結果たとえば分子数または拡散定数の画像を保存する。必要であれば、分子数または拡散定数の画像を表示してよい。解析結果の表示は、すべての時間間隔に対する解析が終了した後におこなってもよい。解析結果の一例を図１２と図１３に示す。図１２は、試料Ｓ中のある分子に関する空間相関値の計算結果を画像としてＣＲＴに表示した例であり、図１３は、図１２の空間相関値の計算結果のフィッティング結果を示している。図１２では、空間相互相関値の大きさをＣＲＴの輝度で示している。
【００７５】
（ステップＳ８）
ステップＳ５〜ステップＳ７の操作によって一つの時間間隔に対する解析が終了する。ステップＳ４で設定した複数の時間間隔のおのおのについてステップＳ５〜ステップＳ７の操作を繰り返す。つまり、解析にまだ適用していない時間間隔が残っている間は、解析に適用する時間間隔を変更してステップＳ５に戻る。言い換えれば、複数の時間間隔のおのおのに対して相関計算をおこない、その複数の相関計算結果のおのおのに対してフィッティングをおこなう。
【００７６】
短い時間間隔に対する解析結果は、小さい分子量の分子種の変化を強く反映しており、長い時間間隔に対する解析結果は、大きい分子量の分子種の変化を強く反映している。つまり、ある一つの時間間隔に対する相関結果は、その時間間隔に対応した分子種の変化を強く反映している。したがって、複数の時間間隔のおのおのに対して相関解析をおこなっているため、複数の分子種のおのおのに関する変化を知ることができる。すなわち、多成分解析をおこなうことができる。
【００７７】
（ステップＳ９）
必要であれば、解析領域内の分子種の割合を計算する。計算に適用する式は次の通りである。
【００７８】
【数１２】
0005856814.tif 000013
【００７９】
ここで、Ｎｉは、ｉ成分の分子種の分子数、ＰＮｉは、ｉ成分の分子種の分子数Ｎｉの割合、Ｎｋは、ｋ成分の分子種の分子数、ｍは、多成分解析の成分数である。
【００８０】
本実施形態によれば、試料Ｓ内の異なる複数の分子について、たとえば動きを評価することが可能になる。つまり、多成分解析が可能になる。たとえば、移動速度が速い分子や遅い分子や中間的な分子などのそれぞれについて、その動きを評価することができる。
【００８１】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【００８２】
たとえば、実施形態では、試料Ｓからの発生する蛍光を検出して構築した画像つまり蛍光画像の解析について説明したが、解析対象の画像は蛍光画像に限らない。解析対象の画像は、蛍光画像のほかに、たとえば、りん光、反射光、可視光、化学発光、生物発光、散乱光を検出して構築した画像であってもよい。
【００８３】
また実施形態では、ラスター走査によって取得された画像について説明したが、画像は、ラスター走査によって取得されたものに限定されるものではなく、ピクセルのデータが時系列的に取得された複数のピクセルからなる画像であればよく、他の走査方法によって取得されたものであってもよい。さらには、画像は、ＣＣＤやＣＭＯＳなどの二次元撮像素子によって撮像されたものであってもよい。この場合、１フレームの画像は、同時にデータが取得された複数のピクセルで構成され、ステップＳ１において、複数フレームの画像を取得することが前提になる。
【符号の説明】
【００８４】
１００…画像解析装置、１１０…光照射部、１１１…光源ユニット、１１２ａ，…，１１２ｎ…光源、１１４ａ，…，１１４ｎ…コリメートレンズ、１１６ａ，…，１１６ｎ…ダイクロイックミラー、１２２…ダイクロイックミラー、１２４…ガルバノミラー、１２６…対物レンズ、１２８…対物レンズ駆動機構、１３０…光検出部、１３１…光検出ユニット、１３２…収束レンズ、１３４…ピンホール、１３６…コリメートレンズ、１３８ａ，…，１３８ｍ…ダイクロイックミラー、１４０ａ，…，１４０ｍ…蛍光フィルター、１４２ａ，…，１４２ｍ…光検出器、１６０…制御部、１６２…走査制御部、１６４…画像形成部、１６６…記憶部、１６８…表示部、１７０…入力部、１７２…解析領域設定部、１７４…データ抽出部、１７６…時間間隔設定部、１７８…解析処理部、１８０…ステージ制御部、１９０…試料ステージ。
【図１】
0005856814.tif 000036
【図２】
0005856814.tif 000037
【図３】
0005856814.tif 000038
【図４】
0005856814.tif 000039
【図５】
0005856814.tif 000040
【図６】
0005856814.tif 000041
【図７】
0005856814.tif 000042
【図８】
0005856814.tif 000043
【図９】
0005856814.tif 000044
【図１０】
0005856814.tif 000045
【図１１】
0005856814.tif 000046
【図１２】
0005856814.tif 000047
【図１３】
0005856814.tif 000048