(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基の形態又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、一般式：
Ｍ1−Ｌ−Ｍ2
［式中、Ｍ1及びＭ2は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ互いに独立して、モノマー単位Ｍを表し、そしてＬはＭ1とＭ2とを共有結合で連結するリンカー基を表し、該モノマー単位Ｍは、以下：
【化１】
0006049756.tif 000008
の一般式に相当し、
ここで：
−  アスタリスク*はモノマーとリンカーＬの間の連結部位を示し、各モノマー単位Ｍ1及びＭ2の該連結部位は置換基Ｒ又はＲ2の１つに位置し、
−  Ｒは水素原子（この場合、ＬのＭとの連結部位はＲ2上に位置する）又は基−ＣＯ
ＮＨ*を表し、
−  Ｒ1は水素原子又は直鎖（Ｃ1−Ｃ3）アルキル基を表し、
−  Ｒ2は基−ＣＯＮＨ2（この場合ＬのＭとの連結部位はＲ上に位置する）又は−ＣＯＮＨ*を表し、
−  Ｒ3は基−ＣＯ2Ｒ4を表し、ここでＲ4は水素原子又は直鎖（Ｃ1−Ｃ4）アルキル基を表し、
−  Ｘはフッ素、塩素及び臭素原子から選択されるハロゲン原子である］
に相当するＦＧＦ受容体アゴニスト化合物。
【請求項２】
Ｒ1が水素原子を表すことを特徴とする、塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩
の形態の、請求項１に記載のＦＧＦ受容体アゴニスト化合物。
【請求項３】
Ｒ3が基−ＣＯ2Ｒ4を表し、Ｒ4が水素原子を表す、塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、請求項１又は２に記載のＦＧＦ受容体アゴニスト化合物。
【請求項４】
Ｘがフッ素原子を表すことを特徴とする、塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＦＧＦ受容体アゴニスト化合物。
【請求項５】
−  Ｒは基−ＣＯＮＨ*を表し、ここでアスタリスク*はＬの連結部位を示し、
−  Ｒ1は水素原子又は直鎖（Ｃ1−Ｃ3）アルキル基を表す
ことを特徴とする、
塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＦＧＦ受容体アゴニスト化合物。
【請求項６】
Ｒがメタ位又はパラ位に位置することを特徴とする、塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＦＧＦ受容体アゴニスト化合物。
【請求項７】
−  Ｒは水素原子を表し、
−  Ｒ2は基−ＣＯＮＨ*を表し、ここでアスタリスク*はＬの連結部位を示すことを特徴とする、
塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＦＧＦ受容体アゴニスト化合物。
【請求項８】
リンカー基Ｌがより詳細には以下のＰＥＧラジカル：
【化２】
0006049756.tif 000009
から選択され得、ここで
−  アスタリスク*は、置換基Ｒ*又はＲ2*上のモノマー単位ＭとのＬの連結のための原子を示し；
−  ｎは２〜６の整数を表す
ことを特徴とする、塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＦＧＦ受容体アゴニスト化合物。
【請求項９】
ｎが３又は４の整数であることを特徴とする、塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＦＧＦ受容体アゴニスト化合物。
【請求項１０】
化合物番号１：  ３，３’−｛エタン−１，２−ジイルビス［オキシプロパン−３，１−ジイルカルバモイル（３−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４，６−ジイル）］｝ビス（６−フルオロ安息香酸）；
化合物番号２：  ５−［４−（｛１５−［６−（３−カルボキシ−４−フルオロフェニル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル］−１５−オキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザペンタデカ−１−イル｝カルバモイル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル］−２−フルオロ安息香
酸；
化合物番号３：  ５−［４−（｛１６−［６−（３−カルボキシ−４−フルオロフェニル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル］−１６−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサ−１５−アザヘキサデカ−１−イル｝カルバモイル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル］−２−フルオロ安息香酸；
化合物番号４：  ５−［４−（｛１９−［６−（３−カルボキシ−４−フルオロフェニル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル］−１９−オキソ−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ−１８−アザノナデカ−１−イル｝カルバモイル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル］−２−フルオロ安息香酸；
化合物番号５：  ５−［４−（｛２１−［６−（３−カルボキシ−４−フルオロフェニル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−４−イル］−２１−オキソ−４，７，１０，１３，１６−ペンタオキサ−２０−アザヘニコサ−１−イル｝カルバモイル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル］−２−フルオロ安息香酸；
化合物番号６：  ５−（４−カルバモイル−３−｛３−［（１５−｛３−［４−カルバモイル−６−（３−カルボキシ−４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル］フェニル｝−１５−オキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザペンタデカ−１−イル）カルバモイル］フェニル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル）−２−フルオロ安息香酸；
化合物番号７：  ３，３’−｛エタン−１，２−ジイルビス［オキシエタン−２，１−ジイルカルバモイルベンゼン−３，１−ジイル（４−カルバモイル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３，６−ジイル）］｝ビス（６−フルオロ安息香酸）；
化合物番号８：  ５−（４−カルバモイル−３−｛４−［（１５−｛４−［４−カルバモイル−６−（３−カルボキシ−４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル］フェニル｝−１５−オキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４−アザペンタデカ−１−イル）カルバモイル］フェニル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル）−２−フルオロ安息香酸；
化合物番号９：  ３，３’−｛エタン−１，２−ジイルビス［オキシエタン−２，１−ジイルカルバモイルベンゼン−４，１−ジイル（４−カルバモイル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３，６−ジイル）］｝ビス（６−フルオロ安息香酸）
から選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
少なくとも１つのカルボン酸基を含む少なくとも１つのモノマーと活性化後の式Ｈ2Ｎ
−Ｌ−ＮＨ2の反応物との反応を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＦＧＦ受
容体アゴニスト化合物を製造する方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＦＧＦ受容体アゴニスト化合物、又は薬学的に許容しうる酸若しくは塩基との該化合物の付加塩を含むことを特徴とする薬剤。
【請求項１３】
薬剤としての、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＦＧＦ受容体アゴニスト化合物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物又は該化合物の薬学的に許容しうる塩、及び少なくとも１つの薬学的に許容しうる添加剤を含むことを特徴とする、医薬製剤。
【請求項１５】
ＦＧＦ受容体活性化を必要とする疾患の処置を意図される薬剤を製造するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＦＧＦ受容体アゴニスト化合物の使用。
【請求項１６】
心虚血の処置、動脈の狭窄若しくは閉塞若しくは動脈炎に関連する疾患の処置、狭心症の処置、閉塞性血栓血管炎の処置、アテローム性動脈硬化症の処置、血管形成術後若しくは動脈内膜切除術後の再狭窄を阻止するための処置、治癒の処置、筋肉再生のための処置、筋芽細胞生存のための処置、筋肉減少症の処置、括約筋の平滑筋の機能の喪失、侵害受容の処置及び慢性痛の処置、末梢神経障害の処置、糖尿病患者におけるバイオ人工膵臓移植生存の改善のための処置、脂肪症の減少に関連するコレステロールの減少を生じるための処置、移植片血行再建及び移植片生着を改善するための処置、網膜変性症の処置、色素性網膜炎の処置、変形性関節症の処置、子癇前症の処置、血管病変及び急性呼吸促迫症候群の処置、骨保護処置、又は毛包保護のための処置におけるその使用のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＦＧＦ受容体アゴニスト化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)二量体化を誘導するピラゾロピリジン誘導体である新規な複素環式化合物、その製造方法、及びその治療上の使用に関する。本発明の主題は、特に二量体構造を有するFGFRアゴニストとしての新規な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
FGFは、胚発生の間に多数の細胞により、及び様々な病理学的状態下で成体組織の細胞により合成されるポリペプチドのファミリーである。
【０００３】
FGF2(又はb−FGF)は、これらの増殖因子のうち最初に、かつ最もよく特徴づけされているものである。FGF2は18kダルトン(kDa)のタンパク質であり、これは多数の細胞、及び特に内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞またあるいは骨細胞による増殖、遊走及びプロテアーゼ産生を誘導する。FGF2は、細胞表面及び細胞外マトリックスに位置する高親和性受容体チロシンキナーゼ(FGFR)及び低親和性ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)型受容体の２つのクラスの受容体により細胞と相互作用する。従って、FGF2及びその受容体は、新血管形成、並びに平滑筋細胞、骨細胞及び毛包細胞の再生のプロセスを活性化することを目的とした治療のための非常に関連した標的を代表する。
【０００４】
さらに、細胞表面受容体チロシンキナーゼが、細胞膜を通して、特にこれらの受容体の細胞外ドメインの二量体化の機構を介して情報を伝達するということが知られている。
【０００５】
これらの二量体化機構を活性化することができる公知のリガンドは、典型的には天然の化合物、例えばFGF、PDGF(血小板由来増殖因子)、VEGF(血管内皮増殖因子)、EPO(エリスロポエチン)、G−CSF(顆粒球コロニー刺激因子)、TPO(トロンボポエチン)、特定のサイトカイン又はインスリンである。
【０００６】
B.Seed(非特許文献１)は、アンタゴニストの二量体化によりこれらの受容体のアゴニストを構築することが可能だろうという一般的な原理を提案する。しかし、この概念に従って構築された合成分子の例は記載されていない。S A. Qureshi (非特許文献２)、B E. Welm (非特許文献３)、K. Koide(非特許文献４)のような論文は、非ペプチド化合物又は二量体化の化学誘導物質(CID)を記載し、これらの化合物はキメラ受容体に対して作用するが天然受容体には作用しない。彼らはCIDが天然受容体のシグナル伝達経路を活性化することを可能にするということを示す結果を提示していない。
【０００７】
脊椎動物では、FGFのファミリーに２２のメンバーが存在し、これらは17〜34kDaの範囲に及ぶ分子量を有し、そして13％と71％との間の相同性を共有する。これらのFGFは、遺伝子レベル及びアミノ酸配列レベルの両方で高度に保存されている(非特許文献５)。FGFは高親和性受容体チロシンキナーゼ(FGF−R1、−R2、−R3、−R4)により細胞と相互作用する。FGFの発現は、それらが発生において重要な役割を有するということを示唆する。FGFファミリーの中でも、FGF−2は最も広く記載されているFGFである。これは18kDaのタンパク質であり、様々な細胞型、例えば内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、周皮細胞、骨芽細胞又は毛包細胞において増殖、遊走及びプロテアーゼ産生を誘導する。従って、FGF2が関与する主要な治療領域は、神経及び心血管生理、神経再生、侵害受容、組織修復、ホメオスタシス、及び骨修復を含む。
【０００８】
従って、FGF2及びその受容体は、血管新生及び動脈新生プロセスを誘導することを目的とした治療に非常に関連した標的を代表する(非特許文献６)。血管が閉塞した場合、虚血期が観察され、これは器官における動脈循環の減少を誘導し、それにより損傷した組織における酸素濃度の減少をもたらす。いくつかの増殖因子は血管新生及び動脈新生プロセスを刺激するということがインビトロ及びインビボで示されている。FGF2はまたインビボで新血管新生も誘導し、そしてまた薬理モデルにおける血管の結紮後に側副血管の発生も誘導する。
【０００９】
いくつかの証拠は、FGF2が血管芽細胞の内皮前駆細胞への分化にも関与し、従って閉塞後の血行再建にも参加するということを実証する(非特許文献７)。従って、血管樹の細胞の応答を増加させることを目的とした方策は、虚血後の特に心臓又は冠動脈の血行再建を増加させるための適切な方策である(非特許文献８；非特許文献９)。
【００１０】
心虚血の処置については、最も有望な臨床試験のうちの１つは、FGF2がヘパリンの存在下でアルギネートミクロスフェア中に捕捉された試験である(非特許文献１０)。９０日後、FGF2で処置された全ての患者が虚血心臓症状を示さなかった。相対的に、コントロール群では、７人の患者のうち３人が９０日目に持続した症状を有しており、そして２人の患者は心臓手術を頼みとしていた。興味深いことに、治療の利益は３年の経過観察後に維持されていた。さらに、冠動脈へのFGF2の注射に関する３つの臨床試験が冠動脈狭窄の処置において行われた(非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３)。これら３つの試験の結果は、FGF2の冠動脈内注入が十分に許容されるものであり、そして患者の臨床状態を有意に改善するということを示す。
【００１１】
別のフェーズＩ臨床試験において、跛行をもたらす末梢動脈疾患を有する患者にFGF2注射を投与した(非特許文献１４)。この状況において、FGF2はこれらの患者において十分に許容されるものであり、そして臨床データは、遠位血管構造に影響を及ぼし、そして痛み及び潰瘍を伴う肢における遠位動脈炎を特徴とする末梢疾患、例えばバージャー病又は閉塞性血栓血管炎を有する患者における歩行の改善に関して特に有益な効果を示唆する。
【００１２】
改善された血管新生を必要とする別の状況において、バイオ人工膵臓における血管新生はそれらの膵臓にFGF2担持するミクロスフェアを含浸させた場合に非常に高いということが明らかに実証されている(非特許文献１５)。従ってこの血行再建は移植されたバイオ人工膵臓の生存を改善し、そして結果的に移植片の生着を改善する。従って、FGFは糖尿病患者におけるバイオ人工膵臓移植片生着の改善に寄与するようであり、そしてより一般的には、移植片血行再建の改善に寄与するようであり、そして移植片生着に関与するようである。
【００１３】
血管新生誘導効果に加えて、FGF2はアポトーシスの誘導因子に対して内皮細胞を保護する。FGF2は内皮細胞生存因子であることが今や明確に記載されている(非特許文献１６)。急性呼吸促迫症候群(ARDS)は心血管及び精神神経の問題により特徴づけられる。心血管問題の状況において、患者はかなりの血管損傷を示し、そして特に高レベルの内皮細胞アポトーシスの誘導を示す。近年、Hamacherらは、ARDSに罹患した患者からの気管支肺胞洗浄液が肺微小血管内皮細胞に対してアポトーシス促進活性を示すということを実証した(非特許文献１７)。
【００１４】
子癇前症は、血管新生の欠乏に関連する胎盤の病理的状態である(非特許文献１８)。これらの血管新生（vascularization）の欠乏は、新血管形成（angiogenesis）の欠乏に起因し、そして胎仔の死亡を生じ得るレベルの胎盤の破壊をもたらすと考えられている。
【００１５】
治癒は、大部分の場合は処置を必要としない組織再生プロセスである。しかし、感染又はケロイド瘢痕の出現のような合併症は起こり得、このケロイド瘢痕は、線維性コンシステンシー（consistency）のひだ、又は皮膚の弾力性の喪失を生じる皮膚退縮を特徴とする病理的瘢痕である。治癒期は５段階で起こる：第一期は炎症期であり、これは組織修復の開始点である。この炎症反応は血管拡張を引き起こし、そして病変の透過性を増加させる。第二期は新血管形成であり、これは細胞に必須の栄養分及び酸素の供給を可能にする。第三期は遊走期であり：再生（従って肉芽）組織が適所に置かれる：これが瘢痕生成の始まりである。全ての結合組織細胞は病変の中心へと遊走し、特に線維芽細胞及びケラチノサイトである。第四期は増殖期であり、これは結合組織細胞及び血管発生に関連する線維の大量増殖からなる。最終期は成熟期であり、これは最も長い段階である：これは18〜24日間続く。その後、線維芽細胞の数が減少するに連れて血管の数が減少し、治癒の終了へと至る。糖尿病患者の場合、治癒は遅くかつ困難なプロセスであり、彼らは、二次的に切断に至り得る感染事象をしばしば合併するようになる、治癒が非常に困難な慢性創傷に曝される。それらの多面的活性のために、FGFは特にケラチノサイト及び線維芽細胞を活性化することにより、そして新血管形成事象に参加することにより、組織修復に参加する。従って、FGFは健常患者又は糖尿病患者において、治癒の速度の観点、そして瘢痕の質の観点の両方から治癒の改善において役割を果たすようである。治癒事象に関与する増殖因子、及び特にFGFのレベルが年齢と共に非常に大幅に減少するということも明確に記載されている。従って、高齢患者において、治癒の欠乏及び遅延は皮膚におけるFGFの欠乏と関連付けられる。
【００１６】
グルタミン酸は後根（dorsal）神経節細胞の推定伝達物質であり、そしてブラジキニンは炎症の間に産生される分子であり、侵害受容線維を活性化及び刺激し得る。この状況において、侵害受容線維に対するFGF2の調節作用はインビトロで実証されていないが、FGF2は炎症性疼痛を調節し得る。しかし、FGF2がインビトロでブラジキニン刺激グルタミン酸放出を完全に遮断するということが実証されている(非特許文献１９)。従って、FGFは侵害受容及び慢性痛において役割を果たし得る。
【００１７】
末梢神経障害は、運動及び／又は感覚末梢神経に対する軸索又は脱髄損傷であり、四肢遠位の脱感作をもたらす。神経損傷の結果の１つは穿孔性潰瘍で有り得、これは、この場合、体重が常に同じ支持点により支えられる傾向を有するので、重度の感受性に対するかなりの損傷がある場合に特に恐れられる。糖尿病の主要な二次的合併症の１つは末梢神経障害の慢性的な発症である。この状況において、FGF2が軸索再生を誘導することが実証されており、これは末梢神経損傷の処置、従って末梢神経障害の処置における最適な治療であり得る(非特許文献２０)。
【００１８】
FGF系は筋肉再生、並びに筋芽細胞生存及び増殖に必須の系であるということが提案されてきた(非特許文献２１)。FGF2は特に筋肉減少症、括約筋における平滑筋機能の喪失の場合に、筋肉再生を促進するため、そしてまた特にデュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて、移植された筋芽細胞の生存及び発達のために開発され得る。VEGF又はFGF2のような増殖因子はまた、虚血後の心筋灌流を改善するようであった(非特許文献２２)。さらに、脈管ネットワークは組織発達及び維持のために必須である。栄養分、酸素及び細胞の送達を促進することにより、血管は組織の機能的及び構造的完全性の維持に役立つ。この状況において、新血管形成及び脈管形成は、虚血後に組織を保存し灌流することを可能にする。従ってFGF2のような新血管形成増殖因子は組織再生のための血管再建を促進する。従ってFGF2は、骨格筋細胞及び新血管形成に直接作用することにより、ジストロフィー又は正常筋肉の再生に対して効果を有するだろう(非特許文献２３)。
【００１９】
主要な増殖因子の中でも、FGF2の全身投与は骨折後の骨修復を促進するということが今では明確に確立されている(非特許文献２４)。霊長類においてゼラチンマトリックス中のFGF2の局所投与は骨修復を加速し、骨折の処置におけるFGF2の臨床上の有用性を示唆する。
【００２０】
FGF7(又はKGF)及びFGF18の内因性過剰調節（overregulation）は、病的症例において、又は細胞傷害性薬剤での処置後の毛包の増殖、遊走及び保護を促進するための重要な機構であるようである(非特許文献２５)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】B. Seed  Chemistry and Biology、November、1994、1、125−129
【非特許文献２】S A. Qureshi、PNAS、1999、vol 96、no 21、12156−12161
【非特許文献３】B E. Welm、The Journal of cell biology、2002、vol 157、4、703−714
【非特許文献４】K. Koide、J. Am. Chem. Soc.、2001、123、398−408
【非特許文献５】D Ornitz. & N. Itoh、Fibroblast growth factors. Genome Biology、30005.1−3005.12、2001
【非特許文献６】Khurana、R. & Simons、M. Insights from angiogenesis trials using fibroblast growth factor for advanced arteriosclerotic disease. Trends Cardiovasc Med 13、116−22、2003
【非特許文献７】Burger、P. E. et al. Fibroblast growth factor receptor−1 is expressed by endothelial progenitor cells. Blood 100、3527−35、2002
【非特許文献８】Freedman、S. B. & Isner、J. M. Therapeutic angiogenesis for ischemic cardiovascular disease. J Mol Cell Cardiol 33、379−93、2001
【非特許文献９】Freedman、S. B. & Isner、J. M. Therapeutic angiogenesis for coronary artery disease. Ann Intern Med 136、54−71、2002
【非特許文献１０】Laham、R. J. et al. Local perivascular delivery of basic fibroblast growth factor in patients undergoing coronary bypass surgery： results of a phase I randomized、double−blind、placebo−controlled trial. Circulation 100、1865−71、1999
【非特許文献１１】Laham、R. J. et al. Intracoronary basic fibroblast growth factor (FGF−2) in patients with severe ischemic heart disease： results of a phase I open−label dose escalation study. J Am Coll Cardiol 36、2132−9、2000
【非特許文献１２】Simons、M. et al. Pharmacological treatment of coronary artery disease with recombinant fibroblast growth factor−2： double−blind、randomized、controlled clinical trial. Circulation 105、788−93、2002
【非特許文献１３】Unger、E. F. et al. Effects of a single intracoronary injection of basic fibroblast growth factor in stable angina pectoris. Am J Cardiol 85、1414−9、2000
【非特許文献１４】Lazarous、D. F. et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication： results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol 36、1239−44、2000
【非特許文献１５】Sakurai、Tomonori； Satake、Akira、Sumi、Shoichiro、Inoue、Kazutomo、Nagata、Natsuki、Tabata、Yasuhiko. The Efficient Prevascularization Induced by Fibroblast Growth Factor 2 With a Collagen−Coated Device Improves the Cell Survival of a Bioartificial Pancreas. Pancreas. 28(3)：e70−e79、April 2004
【非特許文献１６】Role of Raf in Vascular Protection from Distinct Apoptotic Stimuli： A Alavi、J.D. Hood、R. Frausto、D. G. Stupack、D.A. Cheresh： Science 4 July 2003： Vol. 301. no. 5629、pp. 94−96
【非特許文献１７】Tumor necrosis factor−alpha and angiostatin are mediators of endothelial cytotoxicity in bronchoalveolar lavages of patients with acute respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 2002 Sep 1；166(5)：651−6： Hamacher J、Lucas R、Lijnen HR、Buschke S、Dunant Y、Wendel A、Grau GE、Suter PM、Ricou B.
【非特許文献１８】Sherer、D. M. & Abulafia、O. Angiogenesis during implantation、and placental and early embryonic development. Placenta 22、1−13、2001
【非特許文献１９】Rydh−Rinder et al. (2001) Regul Pept 102：69−79
【非特許文献２０】Basic fibroblast growth factor isoforms promote axonal elongation and branching of adult sensory neurons in vitro. Klimaschewski L、Nindl W、Feurle J、Kavakebi P、Kostron H. Neuroscience. 2004；126(2)：347−53
【非特許文献２１】Neuhaus、P. et al. Reduced mobility of fibroblast growth factor (FGF)−deficient myoblasts might contribute to dystrophic changes in the musculature of FGF2／FGF6／mdx triple−mutant mice. Mol Cell Biol 23、6037−48、2003
【非特許文献２２】Hendel、R. C. et al. Effect of intracoronary recombinant human vascular endothelial growth factor on myocardial perfusion： evidence for a dose−dependent effect. Circulation 101、118−21、2000
【非特許文献２３】Fibbi、G.、D’Alessio、S.、Pucci、M.、Cerletti、M. & Del Rosso、M. Growth factor−dependent proliferation and invasion of muscle satellite cells require the cell−associated fibrinolytic system. Biol Chem 383、127−36、2002
【非特許文献２４】Acceleration of fracture healing in nonhuman primates by fibroblast growth factor−2. Kawaguchi H、Nakamura K、Tabata Y、Ikada Y、Aoyama I、Anzai J、Nakamura T、Hiyama Y、Tamura M. J Clin Endocrinol Metab. 2001 Feb；86(2)、875−880
【非特許文献２５】Comprehensive Analysis of FGF and FGFR Expression in Skin： FGF18 Is Highly Expressed in Hair Follicles and Capable of Inducing Anagen from Telogen Stage Hair Follicles. Mitsuko Kawano、Akiko Komi−Kuramochi、Masahiro Asada、Masashi Suzuki、Junko Oki、Ju Jiang and Toru Imamura
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
出願者らは今や、FGF受容体二量体化を誘導することができる新規な合成分子を見出し、これはFGFRが関与する多数の機構、例えば新血管形成、又は平滑筋、骨若しくは毛包の細胞再生において有用であり得る。
【００２３】
本発明の目的は、二量体構造を有するFGF受容体アゴニスト化合物を提案することである。
これらの化合物はFGF受容体の二量体化を引き起こし、これがそれらの活性化を生じ、そして結果的に細胞活性化を生じる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の主題は、一般式：
M1−L−M2
［式中、M1及びM2は、同一でも異なっていてもよく、それぞれ互いに独立してモノマー単位Mを表し、そしてLはM1とM2とを共有結合で連結するリンカー基を表す］
に相当するFGF受容体アゴニスト化合物である。
【００２５】
本発明に従う式M1−L−M2のアゴニストは、M1及びM2と呼ばれる一般式Mの２つのモノマー単位を含み、これらは同一でも異なっていてもよく、それぞれFGFRアンタゴニスト活性を有するように選択される。
【００２６】
本発明の主題は、塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、上で定義されたとおりの式M1−L−M2のFGF受容体アゴニスト化合物であり、これは該モノマー単位M1及びM2が以下の一般式Mに相当することを特徴とし：
【化１】
0006049756.tif 000002
式中、
−  アスタリスク*はモノマー単位MとリンカーLとの間の連結部位を示し、各モノマー単位M1及びM2の該連結部位は置換基R又はR2のうちの１つに位置し、
−  Rは水素原子(この場合、MとのLの連結部位はR2上に位置する）又は基−CONH*を表し、
−  R1は水素原子又は直鎖(C1−C3)アルキル基を表し、
−  R2は基−CONH2(この場合、MとのLの連結部位はR上に位置する)又は−CONH*を表  し、
−  R3は基−CO2R4を表し、ここでR4は水素原子又は直鎖(C1−C4)アルキル基を表し、
−  Xは、フッ素、塩素及び臭素原子から選択されるハロゲン原子である。
【００２７】
Lは、２つのモノマー単位M1及びM2間の距離が２つのFGF受容体の二量体化を可能にするように、M1とM2とを共有結合で連結するリンカー基を表す。このリンカー基は好ましくは11〜20個の連結を含む。該リンカー基Lはより詳細には12〜16個の連結を含む。用語「連結」は、モノマー単位M1をM2に（et）接続することを可能にする原子間の結合のみを意味すると意図される。
【００２８】
リンカー基Lは、式M1−L−M2の化合物の各モノマー単位がFGFR膜貫通受容体の細胞外結合部位との接触を確立することを可能にする可撓性を特徴とする。
【００２９】
Lは置換基R又はR2のいずれか１つ上にある原子により最初に式M1のモノマー単位に結合され、そして次に、置換基R又はR2のいずれか１つ上にある原子により式M2の他方のモノマー単位に結合され、M1及びM2は同一であるか又は異なる。
【００３０】
前述の事柄において、本発明の主題はまた、上で定義された化合物でもあり、該化合物は：
Lは２つのモノマー単位M1及びM2をラジカルRを介して接続する；又は
Lは２つのモノマー単位M1及びM2をラジカルR2を介して接続する；又は
Lは２つのモノマー単位M1及びM2をそのパラ位におけるラジカルRを介して接続する；又は
Lは２つのモノマー単位M1及びM2をそのメタ位におけるラジカルRを介して接続する
ことを特徴とする。
【００３１】
式M1−L−M2のこれらの化合物は、塩基の形態で、又は酸若しくは塩基、特に薬学的に許容しうる酸若しくは塩基で塩化された形態で存在し得る。このような付加塩は本発明の一部である。これらの塩は薬学的に許容しうる酸又は塩基を用いて有利に製造されるが、例えば本発明の化合物の精製又は単離のために有用である他の酸又は塩基の塩もまた本発明の一部である。
【００３２】
本発明の文脈において、かつ文章中でそうではないと述べられていなければ：
−  用語アルキルは、１〜６個の炭素原子を含む直鎖又は分枝の飽和炭化水素ベースの脂肪族基を意味することを意図され；
−  用語ハロゲンは、塩素、フッ素、臭素又はヨウ素原子を意味することを意図され；
−  用語アリールは、１つ若しくはそれ以上のエステル基及び／又はハロゲン原子で場合により置換された、５〜10の間の炭素原子を含む環状芳香族基、例えばフェニル基を意味することを意図される。
【００３３】
本発明の主題は特に、式中R1が水素原子を含表す式Mのモノマー単位を含む、塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、上で定義された化合物である。
【００３４】
本発明の主題は特に、式中R3が基−CO2R4を表し、R4が水素原子を表す式Mのモノマー単位を含む、塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、上で定義された化合物である。
【００３５】
本発明の主題は特に、式中Xがフッ素原子を表す式Mのモノマー単位を含む、塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、上で定義された化合物である。
【００３６】
本発明の主題は特に、式中：
−  Rは基−CONH*を表し、ここでアスタリスク*は、一つ目はモノマー単位Ｍ1との、そして２つ目はモノマー単位のＭ2とのＬの連結部位を示し；有利には、Rはメタ位又はパラ位に位置し、
R1は水素原子又は直鎖(C1−C3)アルキル基を表し、そして有利には水素原子である、
式Mのモノマー単位を含む、塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、上で定義された化合物である。
【００３７】
本発明の主題は特に、式中：
−  R1は水素原子を表し、
−  R2は基−CONH*を表し、ここでアスタリスク*は、一つ目はモノマー単位Ｍ1との、そして２つ目はモノマー単位のＭ2とのＬの連結部位を示す、
式Mのモノマー単位を含む、塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、上で定義された化合物である。
【００３８】
本発明の主題は特に、モノマー単位M1及びM2が同一であり、一般式M［式中：
−  Rは水素原子(この場合MとのLの連結部位はR2上に位置する）又は基−CONH*を表し、
−  R1は水素原子を表し、
−  R2は基−CONH2(この場合、MとのLの連結部位はR上に位置する)又は−CONH*を表し、
−  R3は基−CO2R4を表し、ここでR4は水素原子を表し、
−  Xはフッ素原子である］
に相当することを特徴とする、塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態の、式M1−L−M2のFGF受容体アゴニスト化合物である。
【００３９】
リンカー基Lは、より詳細には、以下のPEGラジカル：
【化２】
0006049756.tif 000003
［ここで
−  アスタリスク*は、置換基R*又はR2*上のモノマー単位MとのLの連結のための原子を示し；
−  nは２〜６の整数を表し、有利にはnは２〜５の整数を表し、そしてより有利には３又は４である］
から選択され得、
これらの化合物は場合により塩基の形態、又は酸若しくは塩基との付加塩の形態で存在する。
【００４０】
上で定義された部分群はまた、別々に、又は組み合わせて考慮され、本発明の一部を形成する。
【００４１】
本発明の主題である式M1−L−M2の化合物の中でも、本明細書以後の表の化合物の順番で、以下の化合物が特に言及され得る：
化合物番号1：  3,3’−｛エタン−1,2−ジイルビス[オキシプロパン−3,1−ジイルカルバモイル(3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4,6−ジイル)]｝ビス(6−フルオロ安息香酸)；
化合物番号2：  5−[4−(｛15−[6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル]−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル｝カルバモイル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸；
化合物番号3：  5−[4−(｛16−[6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル]−16−オキソ−3,6,9,12−テトラオキサ−15−アザヘキサデカ−1−イル｝カルバモイル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸；
化合物番号4：  5−[4−(｛19−[6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル]−19−オキソ−3,6,9,12,15−ペンタオキサ−18−アザノナデカ−1−イル｝カルバモイル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸；
化合物番号5：  5−[4−(｛21−[6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル]−21−オキソ−4,7,10,13,16−ペンタオキサ−20−アザヘニコサ−1−イル｝カルバモイル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸；
化合物番号6：  5−(4−カルバモイル−3−｛3−[(15−｛3−[4−カルバモイル−6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル]フェニル｝−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル)カルバモイル]フェニル｝−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル)−2−フルオロ安息香酸；
化合物番号7：  3,3’−｛エタン−1,2−ジイルビス[オキシエタン−2,1−ジイルカルバモイルベンゼン−3,1−ジイル(4−カルバモイル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3,6−ジイル)]｝ビス(6−フルオロ安息香酸)；
化合物番号8：  5−(4−カルバモイル−3−｛4−[(15−｛4−[4−カルバモイル−6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル]フェニル｝−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル)カルバモイル]フェニル｝−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル)−2−フルオロ安息香酸；
化合物番号9：  3,3’−｛エタン−1,2−ジイルビス[オキシエタン−2,1−ジイルカルバモイルベンゼン−4,1−ジイル(4−カルバモイル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3,6−ジイル)]｝ビス(6−フルオロ安息香酸)。
【００４２】
本発明はまた、式M1−L−M2のダイマーを製造する方法に関し、該方法は、カルボン酸官能基を有する式Mのモノマー単位の少なくとも１つの反応物と、式H2N−L−NH2の反応物［ここでM及びLは前と同じ意味を有する］との反応を含む。
【００４３】
以下において、用語「保護基PG」は、第一に、合成の間にヒドロキシル又はカルボン酸のような反応性官能基を保護すること、そして第二に、合成の最後にインタクトな反応性官能基を再生することを可能にする基を意味することを意図される。保護基並びに保護及び脱保護の方法の例は、「Protective Groups in Organic Synthesis」、Green et al.、4th Edition (John Wiley & Sons、Inc.、New York)に示される。
【００４４】
以下において、用語「脱離基」は、電子対の離脱と共にヘテロリティック結合の開裂により分子から容易に切断され得る基を意味することを意図される。従ってこの基は例えば置換反応において別の基と容易に置き換えられ得る。このような脱離基は、例えばハロゲン又は活性化ヒドロキシル基、例えばメシル、トシル、トリフラート、アセチル、パラ−ニトロフェニルなどである。脱離基及びそれらを製造するための方法の例は、「Advanced Organic Chemistry」、J. March、5st Edition、Wiley Interscience、p. 310−316に示される。
【００４５】
本発明によれば、本発明の化合物は、本明細書以後の方法に従って製造され得る。
【００４６】
スキーム１：モノマーの製造
【化３】
0006049756.tif 000004
【００４７】
スキーム１は、式(VII)及び(IX)のモノマーの合成を図示する。PG1（これは保護基、例えばBn又はPMBである）、及びPG2（これは基Alk又はBn又はPMBである）で保護された、式（Ｉ)の6−ヒドロキシ−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸誘導体は、H.Dorn及びT.Mueller（Zeitschrift fuer Chemie、1980、20(3)、95）により記載される方法に従って、又はこの方法の適応後に得られる。式(Ｉ)のヒドロキシ誘導体を、60〜100℃に加熱しながらDMFのような不活性溶媒中でPOCl3と反応させて、以前に定義されたとおりのPG1及びPG2で保護された式（II)の6−クロロ−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸誘導体を得る。例えば炭酸セシウムのような弱塩基の存在下で、DMFのような不活性溶媒中にて６０〜１２０℃に加熱しながら例えばPd(PPh3)4を使用する、アリールボロン酸又はアリールボロン酸エステルのいずれかとのパラジウム触媒有機金属カップリング反応において式(II)の化合物を使用して、R3がエステルを表す式（III)の化合物を得る。式(III)の化合物を、ピラゾール及び４位のカルボン酸を選択的に脱保護することを可能にする操作条件、例えば４０〜６０℃に加熱しながら例えば濃硫酸を用いる酸性条件、又はPd／Cを用いる水素化分解に曝して、式(IV)の化合物を得る。式(IV)の1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン誘導体の３位におけるハロゲン原子の位置選択的導入を、場合によりNaHCO3のような弱塩基の存在下で、無水若しくは水性MeOH、ジオキサン又はDCMのような不活性溶媒中で、周囲温度にて例えばヨウ素、NIS、NBS又は臭素を用いる芳香族求電子置換反応を介して行う。式（Ｖ)の化合物のピラゾールを、例えば、DMFのような溶媒中で周囲温度にて触媒量の酸、例えばAPTSの存在下にてDHPを使用してTHPのような保護基PG3で選択的に保護して、式(VI）の化合物を得ることができる。
【００４８】
式(Ｖ)又は(VI)の化合物を、例えば、2’−ジシクロヘキシルホスフィノ−2,6−ジメトキシ−1,1’−ビフェニル−3−スルホン酸ナトリウム水和物のようなリガンドの存在下で、場合により例えば炭酸カリウムのような弱塩基の存在下で、DMFのような不活性溶媒中で60〜120℃に加熱しながら、例えば、Pd(PPh3)4又はPd(OAc)2又はPdCl2(dppf)を使用して、アリールボロン酸若しくはアリールボロン酸エステル又はアリールトリアルキルスタンナン誘導体のいずれかと、パラジウム触媒有機金属カップリング反応させて、式(VII)の化合物を得ることができる。
【００４９】
PG4がBn基又はPMB基又はtert−ブチル基であり、保護基PG3（例えばTHP）を有するか又は有していない置換基−CO2(PG4)を有する式(VII)のカルボン酸を、例えばBoc2Oを用いて無水物形態で、又は例えばPyBopを用いてエステル形態で活性化することができ、次いでアンモニア水又は水性アンモニア誘導体と反応させて式(VIII)のアミドを得ることができる。式(VIII)の化合物の、例えば濃硫酸を含む酸性媒体中での周囲温度での処理又はPd／Cを用いる水素化分解条件下での処理により、式(IX)のカルボン酸が得られる。直鎖アルキル置換基R1は当業者に周知の反応条件下で求核置換反応により挿入される。
【００５０】
スキーム２：二量体の製造
【化４】
0006049756.tif 000005
【００５１】
スキーム２は本発明の二量体の製造を示す。式(VII)及び(IX)のカルボン酸を、例えばPyBopを用いて、トリエチルアミンのような弱塩基の存在下で、THF又はDMFのような溶媒中で周囲温度にて活性化した後に、式H2N−L−NH2のジアミンとカップリングさせて、それぞれ式(Ｘ)及び(XI)の二量体を得る。それぞれ式(Ｘ)及び(XI)の化合物中のエステルR3の鹸化により本発明の化合物を得る。式(Ｘ)及び(XI)の化合物のピラゾールを保護基PG3で保護する場合、さらなる工程、例えば乾燥条件下で酸性媒体中で例えばTFAを用いて処理することが、本発明の化合物を得るためにR3の鹸化の前又は後に必要である。
【００５２】
上記のスキーム１及び２において、出発化合物、中間体及び反応物は、それらの製造方法が記載されていない場合、市販されているか若しくは文献に記載されているか、又はそこに記載されるか若しくは当業者に公知の方法に従って製造することができる。
【００５３】
その別の局面によれば、本発明の主題はまた、上で定義された式(II)〜(XI)の化合物である。これらの化合物は、本発明の化合物の合成中間体として有用である。
【００５４】
以下の実施例は、本発明に従う特定の化合物の製造を記載する。これらの実施例は限定するものではなく、単に本発明を説明するにすぎない。例示された化合物の番号は、本明細書以後の表に示された番号を指し、この表は本発明に従ういくつかの化合物の化学構造及び物理特性を示す。
【００５５】
以下の略号及び分子式が使用される：
PTSA＝パラ−トルエンスルホン酸
EtAOc＝酢酸エチル
Bn＝ベンジル
Boc2O＝二炭酸ジ−tert−ブチル
DCM＝ジクロロメタン
DHP＝ジヒドロピラン
DMF＝N,N−ジメチルホルムアミド
EtOH＝エタノール
h＝時間
KHSO4＝硫酸水素カリウム
LCMS＝液体クロマトグラフィ質量スペクトル
MeOH＝メタノール
MeTHF＝2−メチルテトラヒドロフラン
min＝分
mL＝ミリリットル
(m)mol＝(ミリ)モル
NaHCO3＝炭酸水素ナトリウム
NBS＝N−ブロモスクシンイミド
NIS＝ N−ヨードスクシンイミド
Pd(PPh3)4=テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)
PMB＝パラ−メトキシベンジル基
ppm＝百万分の１
PyBop＝ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリスピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート
NMR＝核磁気共鳴
RT＝保持時間
TFA＝トリフルオロ酢酸
THF＝テトラヒドロフラン
THP＝テトラヒドロピラニル基
【００５６】
以下において：
−  以下に記載されるプロトン磁気共鳴(1H NMR)スペクトルは、250MHz又は500MHzでDMSO−d6中にてDMSO−d6ピークを参照として使用して記録された。化学シフトδを百万分の１(ppm)で示す。観察されたシグナルを以下のように表す：  s＝一重線；d＝二重線；t＝三重線；m＝多重線又はbr.s.＝幅広一重線；
−  以下に示されるLCMS特性は、引き続いて、以下で詳述される使用された高速液体クロマトグラフィの分析方法(方法1〜8)、質量分析により同定された[M+H]+ピーク及び化合物の保持時間RT（分で表される）を示す。
【００５７】
*方法1
機器：  1100(Agilent)又はAlliance(Waters)型のHPLCシステム；MSD(Agilent)又はZQ(Waters)型の単一（simple）四重極質量分光計
カラム：  Waters Symmetry C18 3.5μm(2.1x50mm)
溶媒A：  H2O＋0.005％TFA；溶媒B：  CH3CN＋0.005％ TFA
流量：  0.4mL／min
グラジエントA／B：  100／0(t0min)〜0／100(t10min)〜0／100(t15min)
検出：  UV  220nm
イオン化：  ポジティブエレクトロスプレーモードESI+
*方法2＝mグラジエントを変更した方法１
グラジエントA／B：  100／0(t0min)〜0／100(t30min)〜0／100(t35min)
*方法3
機器：  1100(Agilent)又はAlliance(Waters)型のHPLCシステム；MSD(Agilent)又はZQ(Waters)型の単一四重極質量分光計
カラム：  Waters X Terra C18 3.5μm(2.1x50mm)
溶媒A：  H2O＋10mM AcONH4、pH7；溶媒B：  CH3CN
流量：  0.4mL／min
グラジエントA／B：  100／0(t0min)〜10／90(t10min)〜10／90(t15min)
検出：  UV 220nm
イオン化：  ポジティブエレクトロスプレーモードESI+
*方法4＝グラジエントを変更した方法3
グラジエントA／B：  100／0(t0min)〜10／90(t30min)〜10／90(t35min)
*方法5
機器：  1100(Agilent)又はAlliance(Waters)型のHPLCシステム；MSD(Agilent)又はZQ(Waters)型の単一四重極質量分光計
カラム：  Waters Symmetry C18 3.5μm (2.1x50 mm)
溶媒A：  H2O＋0.05％ TFA； 溶媒B：  CH3CN＋0.035％ TFA
流量：  0.5mL／min
グラジエントA／B：  100／0(t0min)〜0／100(t7min)
検出：  UV 220nm
イオン化：  ポジティブエレクトロスプレーモードESI+
*方法6
機器：  1100(Agilent)又はAlliance(Waters)型のHPLCシステム；MSD(Agilent)又はZQ(Waters)型の単一四重極質量分光計
カラム：  Phenomenex Luna C18(2)−HST (30x2 mm) 2.5μm；カラム温度：50℃
溶媒A：  H2O＋0.05％ TFA； 溶媒B：  CH3CN＋0.035％ TFA
流量：  1mL／min
グラジエントA／B：  100／0(t0min)〜0／100(t2.5min)〜0／100(t3.5min)
検出：  UV 220nm
イオン化：  ポジティブエレクトロスプレーモードESI+
*方法7
機器：  Waters UPLC
カラム：  BEH C18(2.1x50mm) 1.7μm；カラム温度：  55℃
溶媒A：  H2O＋0.1％ HCO2H； 溶媒B：  CH3CN＋0.08％ HCO2H 
流量：  0.9mL／min 
グラジエントA／B：  95／5(t0min)〜5／95(t1.1min)〜5／95(t1.7min)
検出：  220nM
イオン化：  ポジティブエレクトロスプレーモードESI+
*方法8
機器：  Waters UPLC
カラム：  Waters XBridge C18 (4.6x50 mm) 2.5μm
溶媒A：  H2O＋0.1％ TFA； 溶媒B：  CH3CN＋0.1％ TFA
グラジエントA／B：  97／3(t0min)〜40／60(t3.5min)〜2／98(t4min)〜2／98(t5min)
検出：  220nM
イオン化：  ポジティブエレクトロスプレーモードESI+
【００５８】
実施例１：  5−[4−(｛15−[6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル]−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル｝カルバモイル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸のリジン塩(化合物番号2)
工程1.1 1−ベンジル−6−クロロ−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸エチル
塩化ホスホリル(74mL／0.81mol)を、1−ベンジル−6−ヒドロキシ−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸エチル[CAS74439−45−5](40.0ｇ／0.135mol)のDMF  450mL中の溶液に０℃で窒素下にて滴下した。反応媒体を80℃で24時間撹拌して暗褐色溶液を得た。次いでこれを氷−冷水の混合物に入れてEtOAcで抽出した。有機相を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮乾固させた。得られた固形物をイソプロパノールに入れて濾過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、オーブン乾燥して黄色粉末30.6ｇを得た(収率：72％)。
LCMS(方法1)：  [M+H]+＝316.1、RT＝9.34min
【００５９】
工程1.2.  1−ベンジル−6−クロロ−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸
水酸化ナトリウムの１モル濃度溶液(116 mL／0.116mol)を、1−ベンジル−6−クロロ−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸エチル(30.5ｇ／96.8mmol)のTHF  195mL中の溶液に加えた。この混合物を周囲温度で２時間撹拌し、次いでNaHCO3の飽和水溶液中に入れた。水相を酢酸エチルで洗浄し、次いでKHSO4溶液（1M)で酸性化し、そしてEtOAcで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで濃縮乾固させた。生成物をジイソプロピルエーテルに入れて濾過し、次いで真空下で乾燥して淡黄色粉末27.3ｇを得た(収率：98％)。
LCMS(方法1)：  [M+H]+＝288.1、RT＝7.59min
【００６０】
工程1.3  1−ベンジル−6−クロロ−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸ベンジル
臭化ベンジル(11mL／89mol)を、1−ベンジル−6−クロロ−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸 (27.0ｇ／93.9mmol)及び炭酸カリウム(15.6ｇ／112mmol)のDMF  310mL中の懸濁液に滴下した。この混合物を周囲温度で２時間撹拌し、次いで氷冷NaHCO3の飽和水溶液中に入れた。形成した沈殿物を濾過し、水で徹底的に洗浄し、そして真空下で乾燥して淡黄色粉末32.6ｇを得た(収率：92％)。
LCMS(方法1)：[M+H]+＝378.0、RT＝10.20min
【００６１】
工程1.4  1−ベンジル−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸ベンジル
触媒Pd(t−BuP)2 (2.03、3.97 mmol)又はPd(PPh3)4(4.58ｇ／4.0mmol)を、1−ベンジル−6−クロロ−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸ベンジル(15.0ｇ／40mol)、3−フルオロ−3−メトキシカルボニルフェニルボロン酸(15.7ｇ／79mol)及び炭酸セシウム(25.9ｇ／0.079mol)の無水DMF  125mL中の懸濁液にアルゴン下で加えた。この混合物を80℃で２時間アルゴン下で撹拌した。反応混合物をタルクを通して熱ろ過し、NaHCO3の飽和水溶液に入れてEtOAcで抽出した。二相を分離した後、有機相を水で洗浄し、中酸ナトリウムで乾燥し、次いで最初の結晶が現れるまで濃縮した。結晶性生成物をろ過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、次いで真空下で乾燥した。ろ液をDCM／シクロヘキサン(50／50)混合物に入れて、得られた沈殿物を濾過して真空下で乾燥した。２つのバッチを併せて黄色粉末12.3ｇを得た(収率：62％)。
LCMS(方法5)：  [M+H]+＝496.4、RT＝6.88min
【００６２】
工程1.5  1−ベンジル−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸
1−ベンジル−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸ベンジル(12.0ｇ／24.2mmol)を濃硫酸100mLに溶解した。この溶液を５０℃に１時間加熱した。次いで反応混合物をゆっくりと氷冷水にいれてEtOAcで抽出した。有機相を水で洗浄し、次いでNaClの飽和水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮乾固させて黄色−橙色粉末6.25ｇを得た(収率：82％)。
LCMS(方法1)：[M+H]+＝316.2、RT＝6.80min
【００６３】
工程1.6  1−ベンジル−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−ヨード−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸
炭酸水素ナトリウム(11.39ｇ／0.136mol)及びN−ヨードスクシンイミド(30.51ｇ／0.136mol)を、1−ベンジル−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸(14.25ｇ／45.2mmol)のジオキサン410mL中の懸濁液に少しずつ加えた。反応混合物を２４時間周囲温度で撹拌した。反応媒体をNaHCO3の飽和水溶液に入れた。水相をEtOAcで洗浄し、次いでKHSO4の溶液(1M)を使用してpH＝２〜３まで酸性化し、そしてEtOAcで抽出した。有機相を水、チオ硫酸ナトリウムの溶液(0.1M)そしてNaClの飽和水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで濃縮乾固させて黄色粉末13.9ｇを得た(収率：70％)。
LCMS(方法6)：[M+H]+＝442.3、RT＝1.92min
【００６４】
工程1.7  6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−ヨード−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸
パラ−トルエンスルホン酸(38mg／0.20mmol)及び3,4−ジヒドロ−2H−ピラン (2.75mL／30.1mmol)を続けて1−ベンジル−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−ヨード−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸 (4.43ｇ／10.0mmol)のDCM  50mL中の溶液に加えた。この溶液を周囲温度で１２時間撹拌した。反応媒体をKHSO4の溶液(1M)に入れてEtOAcで抽出した。有機相を水、そしてNaClの飽和水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮乾固させた。得られた褐色粘性物質をDCM 75mLに溶解し、そしてTEAスカベンジャー樹脂(PL−TEA、Polymerlab、Variant、3.53mmol／ｇ)(3.3ｇ／11mmol)に加えた。周囲温度で２時間撹拌した後、この樹脂を濾過し、そしてDCMで洗浄した。真空下で乾燥した後、次いでこの樹脂を、DCM  90mL中のトリエチルアミン(2.6mL／18mmol)の溶液中で２０分間撹拌し、次いで濾過し、そしてDCMですすいだ。ろ液をKHSO4の溶液（1M)を用いて酸性化した。EtOAcで抽出した後、有機相を水、そしてNaClの飽和水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮乾固させて橙色粉末4.3ｇを得た(収率：82％)。
LCMS(方法1)：[M+H]+＝526.8、RT＝8.78min
【００６５】
工程1.8 6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−フェニル−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸
リガンドの2’−ジシクロヘキシルホスフィノ−2,6−ジメトキシ−1,1’−ビフェニル−3−スルホン酸ナトリウム水和物(84mg／0.17mmol)及び触媒Pd(OAc)2(185mg／0.83mmol)を、アルゴン下でマイクロ波反応器中に入れた6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−ヨード−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸(0.865ｇ／1.65mmol)及びトリブチルフェニルスタンナン(1.61mL／4.94mmol)の無水DMF11mL中の溶液に加えた。反応器を密封し、この混合物を２０分間１３０℃にてマイクロ波で加熱した。反応媒体を冷却し、タルクを通して濾過した後、濃縮乾固させた。シリカフラッシュクロマトグラフィ(DCM／EtOAc：90／10〜80／20、次いでシクロヘキサン／EtOH 1％TEA：95／5〜70／30)により精製した後、橙色粉末525mgを得た(収率：67％)。
LCMS(方法1)：[M+H]+＝476.0、RT＝9.13min
【００６６】
工程1.9  6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸
ジオキサン中無水塩化水素の溶液10mL(4M)を、6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−フェニル−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸(2.0ｇ／4.20mmol)のDCM  35mL中の溶液に加えた。この溶液を周囲温度で１５分間撹拌し、次いで水に入れてEtOAcで抽出した。有機相を水、そしてNaClの飽和水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮乾固させて淡黄色粉末1.4ｇを得た(収率：86％)。
LCMS(方法2)：[M+H]+＝392.3、RT＝13.6min
【００６７】
工程1.10.  2−フルオロ−5−｛4−[(15−｛6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル｝−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル)カルバモイル]−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル｝安息香酸メチル
PyBop(R)(0.59ｇ／1.13mmol)を、6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸(370mg／0.95mmol)及びトリエチルアミン(0.33mL／2.36mmol)の無水THF 4.3mL中の溶液に０℃にてアルゴン下で加えた。０℃で３０分間撹拌した後、3,3’−[オキシビス(エタン−2,1−ジイルオキシ)]ジプロパン−1−アミン(0.10mL／ 0.47mmol)を加えた。この溶液を周囲温度で１時間撹拌し、次いでKHSO4の溶液(1M)中に入れてEtOAcで抽出した。有機相を水、そしてNaClの飽和水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮乾固させて白色粉末を得、これを以下の工程で使用した。
LCMS(方法3)：[M+H]+＝967.2、RT＝8.70min
【００６８】
工程1.11.  5−[4−(｛15−[6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル]−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル｝カルバモイル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸
水酸化ナトリウム(1M、1.46mL／1.46mmol)を、2−フルオロ−5−｛4−[(15−｛6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル｝−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル)カルバモイル]−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル｝安息香酸メチル(370mg／0.42mmol)のDCM／MeOH(50／50)４mL中の懸濁液に加えた。この溶液を周囲温度で１時間撹拌し、次いでKHSO4の溶液(1M)に入れてEtOAcで抽出した。有機相を水、そしてNaClの飽和水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮乾固させた。フラッシュシリカクロマトグラフィ(DCM／EtOH 0.1％TEA：99／1〜80／20)により精製して、得られた固形物をMeOHに溶解し、そしてKHSO4の溶液（1M)に入れた。沈殿物をろ別し、水で洗浄し、そして真空下で乾燥して白色粉末を得た(収率：40％、４工程1.7及び1.8)。
LCMS(方法3)：[M+H]+＝939.2、RT＝5.97min
【００６９】
工程1.12.  5−[4−(｛15−[6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル]−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル｝カルバモイル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸のリジン塩
5−[4−(｛15−[6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル]−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル｝カルバモイル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸(18.8mg；0.02mmol)を、水1mL中のリジン(5.8mg；0.04mmol)の溶液に加えた。この溶液を１時間撹拌し、濾過し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥物（lyophilisate）をジエチルエーテル中に入れ、そしてこの懸濁液を３時間撹拌し、濾過し、そして真空下で乾燥して白色粉末23mg(2リジン；93％)を得た。
LCMS(方法3)：[M+H]+＝939.2、RT＝5.96min
1H NMR  [(CD3)2SO、250 MHz]：δppm 8.67 (t、2 H) 8.47 (dd、2 H) 8.06 − 8.15 (m、2 H) 7.70 (s、2 H) 7.55−7.60 (m、4 H) 7.51−9.53 (br. s.、8 H) 7.35−7.45 (m、6 H) 7.18 (t、2 H) 3.44−3.49 (m、4 H) 3.38−3.42 (m、4 H) 3.32 (t、4 H) 3.25 (t、2 H) 3.10 (q、4 H) 2.76 (t、4 H) 1.31−1.81 (m、16 H)。
【００７０】
実施例２：  5−[4−(｛16−[6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル]−16−オキソ−3,6,9,12−テトラオキサ−15−アザヘキサデカ−1−イル｝カルバモイル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸のリジン塩
(化合物番号3)
工程2.1  2−フルオロ−5−｛4−[(16−｛6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル｝−16−オキソ−3,6,9,12−テトラオキサ−15−アザヘキサデカ−1−イル)カルバモイル]−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル｝安息香酸メチル
工程1.10に記載される方法に従って、6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸[工程1.9.に記載される]及び3,6,9,12−テトラオキサテトラデカン−1,14−ジアミンを使用して、白色粉末の形態で得た(収率：66％)。
LCMS(方法4)：[M+H]+＝983.3、RT＝17.81min
【００７１】
工程2.2  5−[4−(｛16−[6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル]−16−オキソ−3,6,9,12−テトラオキサ−15−アザヘキサデカ−1−イル｝カルバモイル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸
工程1.11に記載される方法に従って、2−フルオロ−5−｛4−[(16−｛6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル｝−16−オキソ−3,6,9,12−テトラオキサ−15−アザヘキサデカ−1−イル)カルバモイル]−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル｝安息香酸メチルを使用して、白色粉末の形態で得た(収率：81％)。
LCMS(方法3)：[M+H]+＝955.2、RT＝10.17min
【００７２】
工程2.3  5−[4−(｛16−[6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル]−16−オキソ−3,6,9,12−テトラオキサ−15−アザヘキサデカ−1−イル｝カルバモイル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸のリジン塩
工程1.12に記載される方法に従って、5−[4−(｛16−[6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−イル]−16−オキソ−3,6,9,12−テトラオキサ−15−アザヘキサデカ−1−イル｝カルバモイル)−3−フェニル−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸を使用して、白色粉末の形態で得た(収率：91％)。
LCMS(方法4)：[M+H]+＝955.2、RT＝10.27min
1H NMR  (500 MHz、DMSO−d6)δppm 8.82 (t、2 H) 8.46 (dd、2 H) 8.07−8.13 (m、2 H) 7.70 (s、2 H) 7.55−7.61 (m、4 H) 7.35−7.46 (m、6 H) 7.19 (t、2 H) 3.44 (d、12 H) 3.34 (t、4 H) 3.21 (dt、6 H) 2.75 (t、4 H) 1.58−1.78 (m、4 H) 1.32−1.57 (m、8 H)
【００７３】
実施例３：  5−(4−カルバモイル−3−｛3−[(15−｛3−[4−カルバモイル−6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル]フェニル｝−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル)カルバモイル]フェニル｝−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル)−2−フルオロ安息香酸のリジン塩(化合物番号6)
工程3.1 3−｛3−[(ベンジルオキシ)カルボニル]フェニル｝−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸
リガンドの2’−ジシクロヘキシルホスフィノ−2,6−ジメトキシ−1,1’−ビフェニル−3−スルホン酸ナトリウム水和物(146mg／0.3mmol)及び触媒PdCl2(dppf)(280mg／0.36mmol)を、続けてアルゴン下で6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−ヨード−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸[工程1.7.に記載される](1.5ｇ／3mmol)、3−(4,4,5,5−テトラメチル−1,3,2−ジオキサボロラン−2−イル)安息香酸ベンジル[880157−10−8](1.16ｇ／3.4mmol)及び炭酸カリウム(828mg／6.0mmol)のDMF  9.5mL中の懸濁液に加えた。反応混合物を９５℃に１時間加熱した。これをNaHCO3の飽和水溶液に入れてEtOAcで抽出した。有機相を水、そしてNaClの飽和水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、そして濃縮乾固させた。シリカフラッシュクロマトグラフィ(DCM／EtOH 0.1％ TEA：100／0〜90／10)により精製した後、黄色固形物1.31ｇを得た(トリエチルアミン塩；収率：72％)。
LCMS(方法1)：[M+H]+＝610.2、RT＝10.38min
【００７４】
工程3.2  5−[3−｛3−[(ベンジルオキシ)カルボニル]フェニル｝−4−カルバモイル−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸メチル
トリエチルアミン(0.57mL／4.0mmol)、PyBop(R)(1.26ｇ／2.4mmol)及び炭酸水素アンモニウム(192mg／2.4mmol)を、3−｛3−[(ベンジルオキシ)カルボニル]フェニル｝−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸(1.2ｇ／2.0mmol)の無水MeTHF 10mL中の懸濁液に窒素下で続けて加えた。この混合物を周囲温度で２時間撹拌し、次いでNaHCO3の飽和水溶液に入れてEtOAcで抽出した。有機相を水、そしてNaClの飽和水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮乾固させて真空下でオーブン乾燥し、ベージュ色粉末1.02ｇを得た(収率：84％)。
LCMS(方法1)：[M+H]+＝609.2、RT＝9.89min
【００７５】
工程3.3  3−｛4−カルバモイル−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル｝安息香酸
5−[3−｛3−[(ベンジルオキシ)カルボニル]フェニル｝−4−カルバモイル−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸メチル(1.0ｇ／1.64mmol)を濃硫酸6.8mLに溶解した。この溶液を周囲温度で30分間撹拌し、次いで氷冷水中にいれて３０分間撹拌した。得られた沈殿物をろ別し、水で洗浄し、そしてEtOAc／MeTHF(50／50)に溶解した。この溶液を水、そしてNaClの飽和水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、そして濃縮乾固させた。固形物をDCM／メタノールの混合物に入れてろ過し、そして真空下で乾燥してベージュ色粉末0.85ｇを得た(収率：85％)。
LCMS(方法1)：[M+H]+＝435.0、RT＝6.43min
【００７６】
工程3.4  5−[4−カルバモイル−3−(3−｛[15−(3−｛4−カルバモイル−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル｝フェニル)−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル]カルバモイル｝フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸メチル
工程1.10に記載される方法に従って、3−｛4−カルバモイル−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル｝安息香酸及び,3’−[オキシビス(エタン−2,1−ジイルオキシ)]ジプロパン−1−アミンを使用して得た。反応媒体を直接KHSO4の溶液(1M)に入れて、ろ過し、水そしてジイソプロピルエチルエーテルで洗浄した後乾燥して白色粉末を得た(収率：66％)。
LCMS(方法3)：[M+H]+＝1053.2、RT＝7.49min
【００７７】
工程3.5  5−(4−カルバモイル−3−｛3−[(15−｛3−[4−カルバモイル−6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル]フェニル｝−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル)カルバモイル]フェニル｝−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル)−2−フルオロ安息香酸
工程1.11に記載される方法に従って、5−[4−カルバモイル−3−(3−｛[15−(3−｛4−カルバモイル−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル｝フェニル)−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル]カルバモイル｝フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸メチルを使用して白色粉末の形態で得た(収率：60％)。
LCMS(方法6)：[M+H]+＝1025.5、RT＝1.78min
【００７８】
工程3.6  5−(4−カルバモイル−3−｛3−[(15−｛3−[4−カルバモイル−6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル]フェニル｝−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル)カルバモイル]フェニル｝−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル)−2−フルオロ安息香酸のリジン塩
工程1.12に記載される方法に従って、5−(4−カルバモイル−3−｛3−[(15−｛3−[4−カルバモイル−6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル]フェニル｝−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル)カルバモイル]フェニル｝−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル)−2−フルオロ安息香酸を使用して、白色粉末の形態で得た(収率：64％)。
LCMS(方法3)：[M+H]+＝1025.3、RT＝5.17min
1H NMR  (500 MHz、DMSO−d6)：δppm 8.52 (dd、2 H)、8.42 (t、2 H)、8.20 (s、2 H)、8.11−8.18 (m、4 H)、7.85 (dt、2 H)、7.78 (s、2 H)、7.71−7.76 (m、4 H)、7.50 (t、2 H)、7.23 (t、2 H)、3.45−3.53 (m、12 H)、3.34 (q、4 H)、3.22 (t、1 H)、2.77 (t、2 H)、1.78 (五重線、4 H)、1.33−1.74 (m、6 H)。
【００７９】
実施例４：  5−(4−カルバモイル−3−｛4−[(15−｛4−[4−カルバモイル−6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル]フェニル｝−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル)カルバモイル]フェニル｝−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル)−2−フルオロ安息香酸のリジン塩(化合物番号8)
工程4.1  3−｛4−[(ベンジルオキシ)カルボニル]フェニル｝−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸
工程3.1に記載される方法に従って、4−(4,4,5,5−テトラメチル−1,3,2−ジオキサボロラン−2−イル)安息香酸ベンジル及び6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−3−ヨード−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸[工程1.7.に記載される]を使用して、黄色固体の形態で得た(収率：66％)。
LCMS(方法1)：[M+H]+＝610.2、RT＝10.48min
【００８０】
工程4.2  5−[3−｛4−[(ベンジルオキシ)カルボニル]フェニル｝−4−カルバモイル−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸メチル
工程3.2に記載される方法に従って、3−｛4−[(ベンジルオキシ)カルボニル]フェニル｝−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−4−カルボン酸を使用して、ベージュ色固体の形態で得た(収率：79％)。
LCMS(方法1)：[M+H]+＝609.2、RT＝9.91min
【００８１】
工程4.3  4−｛4−カルバモイル−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル｝安息香酸
工程3.3に記載される方法に従って、5−[3−｛4−[(ベンジルオキシ)カルボニル]フェニル｝−4−カルバモイル−1−(テトラヒドロ−2H−ピラン−2−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸メチルを使用して、黄色固体の形態で得た(収率：85％)。
LCMS(方法1)：[M−H]+＝435.0、RT＝6.48min
【００８２】
工程4.4  5−[4−カルバモイル−3−(4−｛[15−(4−｛4−カルバモイル−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル｝フェニル)−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル]カルバモイル｝フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸メチル
工程1.10に記載される方法に従って、4−｛4−カルバモイル−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル｝安息香酸及び3,3’−[オキシビス(エタン−2,1−ジイルオキシ)]ジプロパン−1−アミンを使用して、白色粉末の形態で得た(収率：55％)。
LCMS(方法3)：[M−H]+＝1053.2、RT＝7.29min
【００８３】
工程4.5  5−(4−カルバモイル−3−｛4−[(15−｛4−[4−カルバモイル−6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル]フェニル｝−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル)カルバモイル]フェニル｝−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル)−2−フルオロ安息香酸
工程1.11に記載される方法に従って、5−[4−カルバモイル−3−(4−｛[15−(4−｛4−カルバモイル−6−[4−フルオロ−3−(メトキシカルボニル)フェニル]−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル｝フェニル)−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル]カルバモイル｝フェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル]−2−フルオロ安息香酸メチルを使用して、白色粉末の形態で得た(収率：62％)。
LCMS(方法3)：[M+H]+＝1025.3、RT＝5.19min
【００８４】
工程4.6   5−(4−カルバモイル−3−｛4−[(15−｛4−[4−カルバモイル−6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル]フェニル｝−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル)カルバモイル]フェニル｝−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル)−2−フルオロ安息香酸のリジン塩(化合物番号8)
工程1.11に記載される方法に従って、5−(4−カルバモイル−3−｛4−[(15−｛4−[4−カルバモイル−6−(3−カルボキシ−4−フルオロフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−3−イル]フェニル｝−15−オキソ−4,7,10−トリオキサ−14−アザペンタデカ−1−イル)カルバモイル]フェニル｝−1H−ピラゾロ[3,4−b]ピリジン−6−イル)−2−フルオロ安息香酸を使用して、白色粉末の形態で得た(収率：78％)。
LCMS(方法4)：[M+H]+＝1025.3、RT＝8.48min
1H NMR  (500 MHz、DMSO−d6)：δppm 8.49 (dd、2 H) 8.43 (t、2 H) 8.23 (s、2 H) 8.14−8.18 (m、2 H) 8.07−8.12 (m、2 H) 7.82−7.87 (m、2 H) 7.76 (s、2 H) 7.70−7.75 (m、4 H) 7.49 (t、2 H) 7.19 (t、2 H) 7.03 (br. s.、10 H) 3.50−3.85 (br. s、4 H) 3.43−3.55 (m、12 H) 3.34 (dd、4 H) 3.20 (t、2 H) 2.73 (t、4 H) 1.78 (五重線、4 H) 1.32−1.73 (m、12 H)
【００８５】
以下の表は、本発明に従う化合物のいくつかの実施例の化学構造及び物理的特性を示す。この表中の「塩」のカラムにおいて、「Lys」はD,L−リジン塩形態の化合物を表し、そして括弧内の比は(塩基：二酸)比である。
【００８６】
実施例の表
以下の一般式を有するMを有するM1−L−M2：
【表１】
0006049756.tif 000006
【００８７】
本発明の化合物の特性を決定する目的で行われたインビトロ及びインビボでの薬理試験の結果を、以下に挙げる；
【表２】
0006049756.tif 000007
【００８８】
インビトロ新血管形成モデル
コラーゲン(ラット尾コラーゲン、Ｉ型：Becton dickinson 354236)中に希釈されたマトリゲル(Becton dickinson 356230)上でヒト静脈内皮細胞(HUVEC)の再構成を引き起こすそれらの能力について生成物を試験した。24時間後に、X4対物レンズを用いて顕微鏡下で細胞を観察し、そして擬管（pseudotubules）の長さを画像解析器(BIOCOM−logiciel Visiolab 2000)を用いて測定した。
インビトロ新血管形成試験については、本発明の化合物は10-6Mと10-12Mとの間の特異的活性を示した。例として、化合物1、2、3、5及び9はインビトロ新血管形成モデルに対して1nMの濃度で活性であった。
【００８９】
スポンジ新血管形成モデル
スポンジ新血管形成モデルは、Andradeらの技術［Andrade SP、Machado R.、Teixeir AS、Belo AV、Tarso AM、Beraldo WT − Sponge−induced angiogenesis in mice and the pharmacological reactivity of the neovasculature quantitated by fluorimetric method、Microvascular Research、1997、54：253−61.］の適応である。
【００９０】
使用したマウスは、Charles River Laboratoryからの７〜１０週齢のBalbC雌であった。動物を、キシラジン／ケタミン混合物(0.9％ NaCl中それぞれ１mg／kg)の腹腔内注射により麻酔した。動物の背部を剪毛し、そして ヘキソメジン（hexomedine）で消毒した。皮下の５mlの空気ポケットを動物の背部に滅菌空気で作製した。次いで、スポンジをポケット中に移植するために動物の背部の上部に切開(約１cm)を施した。生体適合性セルローススポンジ(Cellspon、Interchim、直径10mm)を事前に滅菌し(オートクレーブ１２０℃で20min)、そして試験生成物を含有する滅菌溶液50μlを含浸させた。２つの９mmステンレス鋼autoclipステープル(Subra)を挿入することにより縫合を行った。創傷を再びヘキソメジンで消毒した。実験の期間を通して動物を個々のケージで飼育した。
【００９１】
試験生成物はPBS／0.1％ BSA混合物溶液であった：組換えヒトFGF2(Peprotech)及び本発明の生成物を、選択された濃度に従ってその場で溶液中に入れた。セルローススポンジの移植後２日で、溶液の試験生成物を、ヘキソメジンでその領域を消毒した後に動物の皮膚を通して移植片中に直接再注射した。
【００９２】
移植後８日目に、マウスをペントバルビタールナトリウム(CEVA sante animale、10mg／kg)の致死用量を腹腔内投与して屠殺した。スポンジの周囲の皮膚を切開し(約１cm)、そして結合組織を除去することにより皮膚からスポンジを分離した。このスポンジを３又は４片に切り、そしてRIPA溶解緩衝液1mLと共にセラミックビーズを含有するチューブに入れた。２サイクルの20秒間の撹拌(FastPrep(R) FP120)により溶解を行った。上清を−20℃で凍結させた後、チューブを8000rpmで１０分間遠心分離し、そしてヘモグロビンをアッセイするために上清を除去した。
【００９３】
ヘモグロビンをアッセイするために、各サンプル50μlを９６ウェルプレートに二重に配置した。RIPA溶解緩衝液中４mg／ml〜0.06mg／mlの範囲の溶液をヒトヘモグロビン(ref
H7379、Sigma(R))を用いて調製した。Drabkin試薬(Sigma(R))50μlを全てのウェルに配置した（範囲＋サンプル)。プレートを１５分間周囲温度で暗所にてインキュベートした。OD値を、Bioliseソフトウェア(Tecan、France)を使用して405nmで分光光度計で読み取った。各サンプル中のHb濃度を、その範囲を使用して行われた多項式回帰に従ってmg／mLで表す。
【００９４】
例として、化合物2はインビボ新血管形成モデルでスポンジへの300μMの濃度の注射で活性であった。
【００９５】
本発明の化合物はFGF受容体アゴニスト活性を示す。これらは受容体二量体化を誘導し、そしてそれらの低い毒性及びそれらの薬理的及び生物学的特性により、本発明の化合物は、虚血後血行再建、治癒プロセス、並びにニューロン、筋肉及び骨の修復及び再生のプロセスのようなFGFがポジティブな効果を有する病理的状態における最適な治療を代表する。
【００９６】
本発明の化合物の適用のうちの１つは、末梢動脈の閉塞後の虚血後処置又は心虚血の結果の処置のような新血管形成の増加を必要とする処置である。本発明に記載される化合物は、冠動脈又は動脈の狭窄又は閉塞に関連する疾患の処置において、そして特に狭心症又は閉塞性血栓血管炎の処置において有用であり得る。さらに、上記発明の化合物は、子癇前症（pre−eclamptic）胎盤における新血管形成の欠乏を代償するための最適な処置となり得る。内皮細胞に対するそれらの高アポトーシス活性により、上記発明の生成物は、血管損傷を患った患者、そして特にARDSに罹患した患者における血管改善の治療選択を提供し得る。
【００９７】
それらのFGF受容体アゴニスト活性及び新血管形成を誘導するそれらの能力及び治癒期に関与する間葉系細胞を活性化するそれらの能力により、上記発明の化合物は、特に高齢又は糖尿病の患者における治癒処置のための最適な治療となるだろう。本発明において示される化合物は、筋肉再生のための最適な処置となり得る。
【００９８】
FGF受容体アゴニスト活性により、上記発明の化合物は、侵害受容の処置、慢性痛の処置、及び特に糖尿病患者における末梢神経障害の処置において最適な処置となるだろう。
【００９９】
FGF受容体アゴニスト特性により、上記発明の化合物は、骨折後の骨修復の処置になり得る。
【０１００】
それらのFGF受容体アゴニスト活性により、上記発明の化合物は、毛包の修復及び保護のため、並びに毛髪成長の保護及び調節において、最適な処置を提供し得る。
【０１０１】
従って本発明の主題は、その別の局面によれば、FGF受容体活性化を必要とする疾患の処置において有用である薬剤の製造のための、上で定義された化合物の使用である。
【０１０２】
本発明の主題は、より詳細には、心虚血の処置、動脈の狭窄若しくは閉塞若しくは動脈炎に関連する疾患の処置、狭心症の処置、閉塞性血栓血管炎の処置、アテローム性動脈硬化症の処置、血管形成術後若しくは動脈内膜切除術後の再狭窄を阻止するための処置、治癒の処置、筋肉再生のための処置、筋芽細胞生存のための処置、筋肉減少症の処置、括約筋の平滑筋の機能の喪失、侵害受容の処置及び慢性痛の処置、末梢神経障害の処置、糖尿病患者におけるバイオ人工膵臓移植生存の改善のための処置、脂肪症の減少に関連するコレステロールの減少を生じるための処置、移植片血行再建及び移植片生着を改善するための処置、網膜変性症の処置、色素性網膜炎の処置、変形性関節症の処置、子癇前症の処置、血管病変及び急性呼吸促迫症候群の処置、骨保護処置、又は毛包保護のための処置において有用である薬剤の製造のための、上で定義された化合物の使用である。
【０１０３】
別の局面によれば、本発明の化合物は、心虚血の処置、動脈の狭窄若しくは閉塞若しくは動脈炎に関連する疾患の処置、狭心症の処置、閉塞性血栓血管炎の処置、アテローム性動脈硬化症の処置、血管形成術後若しくは動脈内膜切除術後の再狭窄を阻止するための処置、治癒の処置、筋肉再生のための処置、筋芽細胞生存のための処置、筋肉減少症の処置、括約筋の平滑筋の機能の喪失、侵害受容の処置及び慢性痛の処置、末梢神経障害の処置、糖尿病患者におけるバイオ人工膵臓移植生存の改善のための処置、脂肪症の減少に関連するコレステロールの減少を生じるための処置、移植片血行再建及び移植片生着を改善するための処置、網膜変性症の処置、色素性網膜炎の処置、変形性関節症の処置、子癇前症の処置、血管病変及び急性呼吸促迫症候群の処置、骨保護処置、又は毛包保護のための処置に有用である。
【０１０４】
その別の局面によれば、本発明は、活性成分として本発明に従う化合物を含む医薬組成物に関する。これらの医薬組成物は、有効用量の本発明に従う少なくとも１つの化合物、又は薬学的に許容しうる塩、及び少なくとも１つの薬学的に許容しうる添加剤も含有する。
【０１０５】
上記添加剤は、所望される医薬形態及び投与様式に従って、当業者に公知の通常の添加剤から選択される。
【０１０６】
経口、舌下、皮下、筋内、静脈内、外用、局所、気管内、鼻腔内、経皮、又は直腸投与のための、本発明の医薬組成物において、上記式（Ｉ)の活性成分、又はその塩は、従来の医薬添加剤との混合物として、単位投薬形態で、上記障害又は疾患の予防又は処置のために動物又はヒトに投与され得る。
【０１０７】
適切な単位投薬形態としては、経口形態、例えば錠剤、軟又は硬ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤及び経口液剤又は懸濁剤、舌下、頬側、気管内、眼内及び鼻腔内の投与形態、吸入による投与形態、外用、経皮、皮下、筋内又は静脈内の投与形態、直腸投与形態、及び移植片が挙げられる。局所適用については、本発明に従う化合物は、クリーム剤、ゲル剤、軟膏又はローション剤で使用され得る。
【０１０８】
例として、錠剤形態の本発明に従う化合物の単位投与形態は以下の成分を含み得る：
本発明の化合物                          50.0mg
マンニトール                            223.75mg
クロスカルメロースナトリウム（Sodium croscaramellose）    6.0mg
コーンスターチ                          15.0mg
ヒドロキシプロピルメチルセルロース      2.25mg
ステアリン酸マグネシウム                3.0mg
【０１０９】
より高いかまたはより低い投薬量が適切である特定の場合があり得る；このような投薬量は、本発明の状況から逸脱しない。通常のやり方に従って、各患者に適した投薬量は、投与方法並びにその患者の体重及び反応に従って医師により決定される。
【０１１０】
その別の局面によれば、本発明はまた、有効用量の本発明に従う化合物、又はその薬学的に許容しうる塩を患者に投与することを含む、上記の病的状態を処置及び／又は予防するための方法に関する。