(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗ＣＤ２０抗体、ヒト化抗ＣＤ２０抗体及びヒト抗ＣＤ２０抗体からなる群から選択される一の抗体またはその抗原結合フラグメントを改善する方法であって、
前記一の抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖の第３の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列において、カバット１０１位でのアスパラギン残基をアスパラギン酸残基へと置換することによって、置換された抗体または抗原結合フラグメントを作製することを含み、
前記置換された抗体またはその抗原結合フラグメントが、より遅い解離速度を有する、
前記方法。
【請求項２】
前記置換された抗体が、カバット９４位でアルギニン残基を含み、カバット１０１位のアスパラギン酸残基がカバット９４位でアルギニン残基とイオン結合を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記置換された抗体またはその抗原結合フラグメントが、リツキシマブのＣＤ２０に結合することを抑制する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記置換された抗体がベルツズマブである、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
カバット１０１位でのアスパラギンのアスパラギン酸への置換が、ＣＤ２０から抗ＣＤ２０抗体が解離する速度を少なくとも２倍遅くする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記非置換抗体のＣＤＲ配列が、マウス抗ＣＤ２０抗体のＣＤＲ配列と同一である、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記マウス抗ＣＤ２０抗体が、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１（ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ）、ＣＤＲＬ２（ＡＴＳＮＬＡＳ）およびＣＤＲＬ３（ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲＨ１（ＳＹＮＭＨ）、ＣＤＲＨ２（ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ）およびＣＤＲＨ３（ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶ）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記置換された抗ＣＤ２０抗体またはその抗原結合フラグメントが、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１（ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ）、ＣＤＲＬ２（ＡＴＳＮＬＡＳ）およびＣＤＲＬ３（ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲＨ１（ＳＹＮＭＨ）、ＣＤＲＨ２（ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ）およびＣＤＲＨ３（ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＤＶ）を含む、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト化抗ＣＤ２０抗体が、ヒト化抗ＣＤ２２抗体であるエプラツズマブのフレームワーク領域配列、またはヒト化抗ＣＤ２０抗体であるベルツズマブのフレームワーク領域配列を含む、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）に基づき、２００８年７月２１日に出願された米国仮特許出願番号第６１／０８２３９９号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、改善された治療上の特徴を有し、好ましくは相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２０抗体の構造変異体および／またはその抗原結合フラグメントに関する。特定の実施形態では、この構造変異は、抗体重鎖（ＣＤＲＨ３）の第３のＣＤＲ配列への変化、たとえばカバット１０１位でアスパラギン酸塩残基のアスパラギン残基との置換を含むこともある。他の特定の実施形態では、構造変異は、カバット９４位でアルギニン残基を含むこともあり、これによってカバット１０１位でアスパラギン酸塩との塩橋を形成することがきる。さらに他の特定の実施形態では、構造変異は、カバット１０２位でバリン残基を含むこともある。この構造変異体は、Ｂ細胞の増殖に関連した疾患、たとえばＢ細胞白血病、リンパ腫または自己免疫疾患ならびにＢ細胞関連の免疫疾患に改善された治療効果をもたらすことができる。好ましい実施形態では、改善された治療効果は、たとえば８０ｍｇ以下、より好ましくは５０ｍｇ以下、最も好ましくは３０ｍｇ以下の低用量で抗ＣＤ２０抗体またはその抗原結合フラグメントを投与可能にし、この低用量は約１〜３週間の間隔で２回以上、または週に２回以上の投与も可能である。
【０００３】
抗ＣＤ２０抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗ＣＤ２０抗体、特にモノクローナル抗体（ＭＡｂ）であってもよい。他の実施形態は、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗ＣＤ２０抗体の治療用および／または診断用の複合体、ならびにＢ細胞リンパ腫および白血病ならびに種々の自己免疫疾患の治療法、たとえばヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗ＣＤ２０抗体を用いる治療法に関することもある。さらに他の実施形態は、少なくとも１つの抗ＣＤ２０  ＭＡｂまたはその抗原結合フラグメント、一部の例では第２の異なる抗体、特に抗ＣＤ２０抗体、好ましくは抗ＣＤ２０  ＭＡｂとの組み合わせ、またはその抗原結合フラグメントを含む抗体融合タンパク質またはその抗原結合フラグメントに関することもある。ヒト化ＭＡｂ、キメラＭＡｂもしくはヒトＭＡｂ、その抗原結合フラグメントまたは抗体融合タンパク質は、単体で、治療用免疫複合体として、または１つ以上の治療薬と組み合わせて、他の裸の抗体もしくは他の免疫複合体と組み合わせて投与されてもよい。さらに他の実施形態は、ヒト化抗体、キメラ抗体もしくはヒト抗ＣＤ２０抗体および抗体融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにヒト化抗体、キメラ抗体もしくはヒト抗ＣＤ２０抗体を作製する方法に関する。
【０００４】
脊椎動物の免疫系は、正確に外来抗原を認識し、この外来抗原に特異的に結合して、除去／破壊するために進化してきた多くの器官と細胞型とで構成されている。とりわけ、リンパ球は免疫系にとって極めて重要である。リンパ球は、２つの主要な亜集団、Ｔ細胞とＢ細胞とに分けられる。相互依存的であるにもかかわらず、Ｔ細胞は主として細胞性免疫に関与し、Ｂ細胞は主として抗体産生（液性免疫）に関与する。
【０００５】
ヒトにおいて、各Ｂ細胞は、膨大な数の抗体分子を産生することができる。この抗原産生は、一般的に、外来抗原が中和されると止まる（または実質的に低下する）。しかしながら、時に、特定のＢ細胞の増殖が衰えずに続き、結果、Ｂ細胞性リンパ腫または白血病として知られる癌になることもある。非ホジキンリンパ腫のＢ細胞亜類型などのＢ細胞リンパ腫は、癌死亡率の重大な寄与因子である。種々の治療形態に対するＢ細胞悪性腫瘍の応答は混合している。たとえば、非ホジキンリンパ腫の適切な臨床的病期分類が可能な症例では、領域放射線治療は、満足のいく治療をもたらしうる。それでもまだ、約半分の患者はこの疾患が原因で死亡する。Ｄｅｖｅｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７９：７０１（１９８７）。
【０００６】
慢性リンパ性白血病の大部分は、Ｂ細胞系列である。Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．４：４０５（１９９０）。この型のＢ細胞悪性腫瘍は、西欧諸国で最も一般的な白血病である。Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ２２：１（１９９６）。慢性リンパ性白血病の自然経過は、いくつかの段階に分類される。初期段階において、慢性リンパ性白血病は無痛性疾患であり、長期のライフスパンを有する小型の、成熟した機能的に無能な悪性Ｂ細胞が蓄積することによって特徴づけられる。最終的には、悪性Ｂ細胞の倍加時間が減少し、患者に症状が次第に現れる。治療は症状の軽減をもたらしうるが、患者の全生存は最小限に影響を受けるだけである。慢性リンパ性白血病の後期段階の特徴は、著明な貧血および／または血小板減少である。この段階で、生存期間の中央値は２年未満である。Ｆｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｉｎｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１３：５２５（１９９０）。細胞増殖速度が極めて遅いため、慢性リンパ性白血病は細胞毒性薬物療法に耐性を示す。Ｂ細胞由来の慢性および急性リンパ性白血病は、本明細書に記述する諸療法の適切な標的である。
【０００７】
化学療法および放射線療法を含むＢ細胞悪性腫瘍を治療する従来の方法は、細胞毒性副作用のため有用性が限定されていた。直接放射性核種、毒素または他の治療薬にモノクローナル抗体を使用することで、これらの薬剤が選択的に腫瘍部位に送達される可能性を提示し、したがって正常組織への毒性が限定されことになる。また、これらのＢ細胞悪性腫瘍上にＢ細胞抗原が存在すると、Ｂ細胞抗原は、Ｂ細胞上のＣＤ１９，ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、およびＣＤ２２マーカーなどに対する非結合Ｂ細胞抗体による治療の最適な標的となる。ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、および他の抗原は、他の細胞型上でも発現するが、正常および悪性Ｂ細胞の標的として働くこともある。さらに、特定の抗原、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、およびＭＵＣ４、好ましくはＭＵＣ１、ならびにインスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）、インスリン様増殖因子受容体、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、ＣＤ２０および他のＢ細胞マーカーを発現するＢ細胞腫瘍を含むさまざまな造血器悪性腫瘍でも発現する。テネイシン、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）を含む腫瘍の血管内皮に関連する抗原標的、および胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ならびに癌遺伝子産物（ｃＭＥＴ、Ｋｒａｓ、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６）などのＢ細胞悪性腫瘍に関連する他の種類の抗原などさらに他の抗原標的も、治療抗体に適した標的である。
【０００８】
Ｂ細胞は、分化および識別の標識として利用可能な細胞表面タンパク質を含む。このヒトＢ細胞マーカーの１つに、ＣＤ２０と呼ばれる、ヒトＢリンパ球制限分化抗原、Ｂｐ３５がある。ＣＤ２０は、プレＢ細胞発生の初期に発現し、形質細胞分化まで残存する。ＣＤ２０は、正常Ｂ細胞、悪性Ｂ細胞両方に発現し、悪性Ｂ細胞の異常増殖は、Ｂ細胞性リンパ腫および白血病の原因となることもある。ＣＤ２０抗原に対する抗体は、Ｂ細胞性リンパ腫および白血病の治療について検討されてきた。たとえば、「ＩＤＥＣ−ｃ２Ｂ８」（リツキシマブ）と命名されたキメラ抗ＣＤ２０抗体は、非複合抗体として１注射につき５００ｍｇ超の反復注射投与で与えられると、Ｂ細胞性リンパ腫に対して活性を有する。Ｍａｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８４：２４５７（１９９４）；Ｌｏｎｇｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：３５３（１９９６）。軽度の無痛性形態を有し、本レジメンで治療された非ホジキン患者の約５０パーセントは、反応を示した。また、反復投与として１注射につき６００ｍｇ超の非標識抗体の前処置を与えたときも、131Ｉ標識Ｂ１（トシツモマブ）抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体を用いて、治療反応が得られた。Ｋａｍｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２９：４５９（１９９３）；Ｐｒｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２９：１２１９（１９９３）；Ｐｒｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ３４６：３３６（１９９５）。しかし、非複合型としてまたは放射標識型として与えられたかにかかわらず、これらの抗体は、より蔓延した致死型のＢ細胞性リンパ腫（中間型または進行型）の患者において高率の他覚反応および持続的反応を示さなかった。したがって、大幅な持続期間の治療反応を達成する、Ｂ細胞悪性腫瘍のための免疫療法を開発する必要がある。
【０００９】
ＣＤ２０表面抗原を標的にするさらなる研究は、抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体（１Ｆ５）を使用して行われた。１Ｆ５は持続点滴静注によってＢ細胞性リンパ腫患者に投与された。報告によれば、極めて高い濃度（＞２グラム）の１Ｆ５は、循環腫瘍細胞を減少させるために必要とされ、およびその結果は「一過性」であると記述された。Ｐｒｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  １Ｆ５（Ａｎｔｉ−ＣＤ２０）Ｓｅｒｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．"Ｂｌｏｏｄ  ６９／２：５８４−５９１（１９８７）。しかし、このアプローチに関連する潜在的な問題は、非ヒトモノクローナル抗体（たとえばマウスモノクローナル抗体）が通常ヒトエフェクター機能を欠いている、すなわち、非ヒトモノクローナル抗体は補体依存性溶解を媒介することができない、または抗体依存性細胞毒性もしくはＦｃ受容体媒介食作用を介してヒト標的細胞を溶解できないことである。さらに、非ヒトモノクローナル抗体は、外来タンパク質としてヒト宿主によって認識されえ、したがって、このような外来抗体を反復注射すると、有害な過敏症反応を引き起こす免疫応答の誘発をもたらすことがある。マウスに基づいたモノクローナル抗体の場合、これはしばしばヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答と呼ばれる。
【００１０】
キメラ抗体は、マウス抗体ほど強いＨＡＭＡ応答を誘発しないため、キメラ抗体を使用することが好ましい。キメラ抗体は、２つ以上の異なる種に由来する部分を含む抗体である。たとえば、Ｌｉｕ，Ａ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ，"Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｏｕｓｅ−Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＣＤ２０  ｗｉｔｈ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｆｃ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９／１０：３５２１−３５２６（１９８７）、はＣＤ２０抗原に向けられたマウス／ヒトキメラ抗体を記述している。また、ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ８８／０４９３６号を参照されたい。代表的なキメラ抗体は、ヒト抗体定常領域配列に結合したマウス可変領域配列を含むであろう。
【００１１】
ＨＡＭＡ反応を誘発する可能性をさらに減少させるため、ヒト化抗体を用いることがなおさら好ましい。後述するように、マウスフレームワーク配列と定常領域配列を対応するヒト抗体フレームワークと定常領域配列に置換するマウス抗体のヒト化技術は、当該技術分野において周知の技術であり、かつ多数のマウス抗癌抗体に適用されてきた。抗体ヒト化は、親マウスフレームワーク領域配列からの対応する残基と１つ以上のヒトフレームワークアミノ酸残基との置換を含むこともある。
【００１２】
抗体の能力を改善してＢ細胞障害の治療において効果的になった別のアプローチは、放射性医薬品または化学療法薬などの治療薬を、該薬剤が腫瘍部位で局在化するように抗体と抱合させる。たとえば、上述の１Ｆ５抗体と他のＢ細胞抗体は、131Ｉで標識され、２例の患者において生体分布について評価された。Ｅａｒｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ"Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．３１／８：１２５７−１２６８（１９９０）を参照されたい；Ｏ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ＭＢ−１（Ａｎｔｉ−ＣＤ３７）Ａｎｔｉｂｏｄｙ"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．７／８：１０２７−１０３８（１９８９）（131Ｉで標識したＩＦ−５で治療した１例の患者が部分寛解を達成したことを示す）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，  Ｄ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  ｗｉｔｈ  131Ｉ−Ｌａｂｅｌｅｄ  ＬＬ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．９／４：５４８−５６４（１９９１）（複数回注射を投与された患者８例のうち３例がこのＣＤ２２マウス抗体へのＨＡＭＡ応答が進行したと報告された）；Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，Ｆ．Ｒ．"Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ"Ｈｅｍ．／Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎ．Ａｍ．５／５：１０１３−１０２５（１９９１）（総説）；Ｐｒｅｓｓ，Ｏ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．"Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｗｉｔｈ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｓｕｐｐｏｒｔ．"  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３２９／１７：１２１９−１２２２３（１９９３）（131Ｉで標識した抗ＣＤ２０抗体ＩＦ５およびＢ１−トシツモマブ）；およびＫａｍｉｎｓｋｉ，  Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ  "Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｗｉｔｈ  ［131Ｉ］Ａｎｔｉ−Ｂｌ（Ａｎｔｉ−ＣＤ２０）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ"．ＮＥＪＭ  ３２９／７：４５９（１９９３）（131Ｉで標識した抗ＣＤ２０抗体Ｂ１）；ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ９２／０７４６６号（ドキソルビシンまたはマイトマイシンなどの化学療法薬に複合された抗体）も参照されたい。しかしながら、以前の積極的な細胞毒性化学療法を受けた多数のリンパ腫患者が免疫抑制され、したがってきびしい前治療を受けていないリンパ腫患者よりも低いＨＡＭＡ率を有するという事実にもかかわらず、これらのアプローチはマウス抗体を用いることに関連した障害を排除していなかった。
【００１３】
自己免疫疾患は、Ｂ細胞障害と関連する疾患の種類である。例としては、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、Ｉ型糖尿病、ヘーノッホ−シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常天疱瘡、ヴェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および線維化性肺胞炎を含む。最も一般的な治療は、コルチコステロイドおよび細胞毒性薬であり、これは極めて有毒になることがある。これらの薬物はまた、全免疫系を抑制し、重篤感染症をもたらすこともあり、かつ骨髄、肝臓および腎臓に悪影響を及ぼす。自己免疫疾患、特にクラスＩＩＩ自己免疫疾患を治療するさらに効果的な方法が求められている。癌および／または自己免疫疾患の治療のために、より効果的な抗体を開発するさらなる必要性がある。
【００１４】
免疫調節異常を伴うさらに他の疾患、溶血性貧血、クリオグロブリン血症、肝炎（特にＣ型肝炎）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（特に同種幹細胞移植後）、同種感作（特に臓器移植で）などは、本明細書に記述した新規の組成物および方法によって適切に治療される。Ｂ細胞がこれらの病理状態に関与しているエビデンスが現在、増えており、抗Ｂ細胞療法によってＢ細胞を減少させることに関心が高まっている（Ｒｏｃｃａｔｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｒｅｖ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８，３４：１１１−１１７；  Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００６，１０８：７５６−７５２；Ｖｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００８，３５９：２４２−２５１；  Ｖｉｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００４；７７：５４２−５４８；Ａｂｄａｌｌａｈ＆Ｐｒａｋ，  Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｐｌ．２００６：４２７−３７；Ｚａｊａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，２００７，４０：２７３−７７；Ｓａａｄｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００８，２０：２３−８；Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００８，２６：Ｓ３９−４７）。
【００１５】
本発明は、改善された治療上の特徴を有する抗ＣＤ２０抗体の構造変異体および／またはその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施形態では、この構造変異は、ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）のＶHにおいてカバット１０１位で、たとえばアスパラギン残基への置換として、１つのアスパラギン酸塩残基を含むことがある。他の特定の実施形態では、構造変異はカバット９４位でアルギニン残基を含むことがあり、それによってカバット１０１位でアスパラギン酸塩と塩橋を形成することがある。さらに他の特定の実施形態において、この構造変異はカバット１０２位でバリン残基を含むことがある。実施可能なアミノ酸置換は、上述の特定の例に限定されることなく、かつ追加のおよび／または異なるカバット位で置換を含んでもよいことを、当業者は理解する。
【００１６】
改善された治療上の特徴は、たとえば標的抗原からの遅い解離速度、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の増加および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）におけるＥＣ50の減少等様々な形態をとることがある。好ましい実施形態では、この特徴は低投与量での有効性、好ましくはヒト被験者のための８０ｍｇ以下の投与量、より好ましくは５０ｍｇ以下の投与量、最も好ましくは３０ｍｇ以下の投与量を含んでもよい。この投与量は、２回以上、投与されてもよい。複数回の投与が与えられる場合には、投与は約１〜３週の間隔で与えられることが好ましい。しかし、特定の疾患設定では、より頻繁な分割投薬、たとえば慢性リンパ性白血病では４週間以上、毎週２回などが好ましい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｂ細胞障害（Ｂ細胞悪性腫瘍および自己免疫疾患など）、ならびにＢ細胞に関与する他の疾患（ＧＶＨＤ、溶血性貧血、クリオグロブリン血症、同種感作、および臓器移植拒絶反応においてなど）、ならびにいくつかのウイルス性疾患（たとえばＣ型肝炎）の治療および診断に用いるヒトＢ細胞マーカー（抗ＣＤ２０抗体など）に結合するヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体であってもよい。このヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗ＣＤ２０抗体は、哺乳類の被験者（たとえばヒトまたは家畜）の治療法のために、単独でもしくは１つ以上の治療薬との組み合わせいずれかの裸の抗体として、１つ以上の治療薬および／または診断用薬で標識された免疫複合体として、１つ以上の治療薬および／または診断用薬に複合される標的設定可能な構築体によるプレターゲッティング法において抗体融合タンパク質として、または他の抗体、他の治療薬もしくは免疫刺激薬による集学的療法として用いることができる。ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗ＣＤ２０抗体は、単体の画像診断用薬として、他の画像診断用薬と組み合わせて、および／または治療的な用途と併せて使うこともできる。
【００１８】
改善された治療上の特性を有する配列変異のために開示された方法および組成物が、抗ＣＤ２０抗体に限定されることなく、かつ他の腫瘍関連抗原または自己免疫および他の免疫疾患関連の抗原に対する抗体に適用されうることを当業者は理解する。それらとしては炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＤｌ、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ〜ｄ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ６、Ｂ７、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、因子Ｈ、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様増殖因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ−６６、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、Ｉａ、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、ならびにｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、ＫｒａｓおよびｃＭＥＴを含む癌遺伝子産物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１９】
他の実施形態は、特異的マウスＣＤＲまたは２つ以上のマウスもしくはキメラ抗ＣＤ２０ＭＡｂ由来のマウスＣＤＲの組み合わせを含む抗ＣＤ２０  ＭＡｂまたはその抗原結合フラグメントを対象とすることもある。これらのＭＡｂは、ヒト化抗ＣＤ２０  ＭＡｂ、キメラ抗ＣＤ２０  ＭＡｂまたはヒト抗ＣＤ２０  ＭＡｂであってもよい。ＣＤＲ配列としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１（ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ、配列番号１）、ＣＤＲＬ２（ＡＴＳＮＬＡＳ、配列番号２）およびＣＤＲＬ３（ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ、配列番号３）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲＨ１（ＳＹＮＭＨ、配列番号４）、ＣＤＲＨ２（ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ、配列番号５）およびＣＤＲＨ３（ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＤＶ、配列番号６）。
【００２０】
種々の実施形態は、少なくとも２つの抗ＣＤ２０  ＭＡｂもしくはその抗原結合フラグメント、または抗ＣＤ２０ＭＡｂもしくはその抗原結合フラグメントを含む第１のＭＡｂおよび第２のＭＡｂを含む二重特異性抗体または抗体融合タンパク質に関することもある。第２のＭＡｂは、上記に記載したものなどの腫瘍関連抗原、またはたとえば標的設定可能な複合体のハプテンと結合することができる。
【００２１】
他の実施形態は、少なくとも１つの治療薬または少なくとも１つの診断薬に結合した、抗ＣＤ２０  ＭＡｂもしくはその抗原結合フラグメントまたは抗体融合タンパク質の治療用複合体または診断用複合体に関することもある。同種または異種の複数の治療薬を有する抗体および融合タンパク質も包含される。代替実施形態では、抗ＣＤ２０抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質は、たとえば、細胞、疾患、組織または病原体（たとえばＣ型肝炎関連標的抗原）に特異的に結合する１つのアーム、および１つ以上の診断薬もしくは治療薬に付着した標的設定可能な複合体に結合する第２のアームを有する二重特異性抗体を用いるプレターゲッティング治療法またはプレターゲッティング診断法でも使用可能である。二重特異性抗体によるプレターゲッティング法は、当該技術分野では周知である（たとえば米国特許第７，３００，６４４号；第７，１３８，１０３号；第７，０７４，４０５号；第７，０５２，８７２号；第６，９６２，７０２号；第６，４５８，９３３号を参照されたい。各特許の実施例のセクションを参考として本明細書で援用する）。
【００２２】
代替実施形態は、抗ＣＤ２０  ＭＡｂもしくはその抗原結合フラグメントまたは治療用抗体融合タンパク質を、単体、１つ以上の他の治療薬との組み合わせいずれかで、たとえば１つ以上の治療薬による治療用免疫複合体の抗体成分として、または、裸の抗体、抗原結合フラグメント、または単体で、もしくは、１つ以上の他の治療薬との組み合わせで投与される融合タンパク質として用いる方法に関することもある。１つ以上の診断薬との組み合わせで診断方法に使用することも予想される。好ましい実施形態では、診断または治療される疾患は、Ｂ細胞媒介免疫疾患、自己免疫疾患、Ｂ細胞性リンパ腫または白血病である。Ｂ細胞媒介免疫疾患は、自己免疫疾患の亜類型、ならび上述した他の免疫疾患（たとえば、ＧＶＨＤ、クリオグロブリン血症、溶血性貧血、同種感作、移植臓器拒否反応）と呼ばれ、これらの疾患における病態は、自己反応性Ｔリンパ球による、またはＢ細胞とＴ細胞の免疫の組み合わせよりも、むしろ主に自己抗体の産生によって媒介される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】キメラ抗ＣＤ２０抗体、ｃＡ２０配列の可変軽鎖（ｃＡ２０Ｖｋ）および可変重鎖（ｃＡ２０ＶＨ）を示す。ＣＤＲ領域配列は太字および下線で示す。アミノ酸残基およびヌクレオチドには、順次、ナンバリングを行い、同じナンバリング体系を図２に示すヒト化Ｖ配列に使用する。軽鎖可変領域は図１Ａ（配列番号７および８）に示し、重鎖可変領域は図１Ｂ（配列番号９および１０）に示す。カバットのナンバリング法をアミノ酸残基で用いた。１つの文字によりナンバリングしたアミノ酸残基は、カバットに従って挿入残基を表し、前の残基の番号と同じ番号を有する。
【図２】ヌクレオチドおよびｈＡ２０軽鎖ｈＡ２０Ｖｋのアミノ酸配列（図２Ａ）（配列番号１１と１２）、および重鎖ｈＡ２０ＶＨ１（図２Ｂ）（配列番号１３および１４）、ならびにステージングベクターＶＫｐＢＲ２（図２Ａ）およびＶＨｐＢＳ２（図２Ｂ）のそれぞれ隣接するフランキング配列を示す。非翻訳ヌクレオチド配列は、小文字で示す。サブクローニングのために用いた制限部位は、下線で示す。分泌シグナルペプチド配列は、二重下線で示す。
【図３】ｃＡ２０（配列番号８および１０）、リツキシマブ（マウスＣ２Ｂ８由来、配列番号１５および１６）およびｈＡ２０（配列番号１２および１４）の可変領域配列の比較を示す。点線は、ｃＡ２０との相同を示す。ＣＤＲ配列は、枠で囲む。重鎖可変領域の配列（図３Ａ）および軽鎖可変領域の配列（図３Ｂ）を示す。
【図４】スキャッチャード分析−ベルツズマブとリツキシマブの結合特性を、125Ｉで標識したＭＡｂをＲａｊｉ細胞に結合させて測定した。直接細胞表面飽和結合とスキャッチャードプロット分析（挿入図）−黒三角ベルツズマブ；白丸リツキシマブ。ＢmaxおよびＫdは、Ｐｒｉｓｍソフトウェアで１サイト結合モデルを用いて、非線形回帰解析で測定した。これらの結果は、３つの反復実験のうちの１つの代表である。
【図５】ベルツズマブおよびリツキシマブの生細胞からの解離速度の比較を示す。Ｄａｕｄｉ細胞（Ａ）、Ｒａｍｏｓ細胞（Ｂ）およびＲａｊｉ細胞（Ｃ〜Ｅ）は、ＰＥで標識したリツキシマブ（黒三角）、ベルツズマブ（黒四角）、ｃＡ２０（黒逆三角）、Ｄ１０１Ｎ（黒丸）、１Ｆ５（白丸）またはＢ１（トシツモマブ）（白四角）で染色した。標識したＭＡｂを、３７℃で、（Ａ〜Ｄ）と共にまたは（Ｅ）過剰ベルツズマブＦａｂ’−ＮＥＭを除いてインキュベートし、細胞をフローサイトメトリーによって経時的に解析した。解離速度を非線形回帰（１フェーズ指数関数的減衰）によって測定し、次いでＰ値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いたＦ検定により作成した。
【図６】非ホジキンリンパ腫細胞系の増殖へのベルツズマブおよびリツキシマブの効果を示す。増殖抑制効果をＭＴＴ細胞毒性アッセイによって評価した。架橋のための第２の抗体含む、または含まないＭＡｂと共に細胞を培養した。白の縦棒、第２の抗体を含まない；グレーの縦棒、ＧＡＨ第２抗体を含む；エラーバー、標準偏差。
【図７】健常な供血者由来のＢ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ減少を示す。健常ボランティア由来の末梢血リンパ球へのベルツズマブの効果を、フローサイトメトリーを用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。健常ボランティア由来の全血にヘパリン添加し、ベルツズマブと２日間インキュベートした後にリンパ球ゲートに存在するＣＤ１９＋細胞のパーセントの減少を示す。各線は、異なる供血者を表す。エラーバー、標準偏差。
【図８】腹腔内投与対皮下投与を比較する、播種性バーキットリンパ腫異種移植モデルにおけるベルツズマブの生存曲線を示す。Ｃ．Ｂ．１７  ＳＣＩＤマウスに、試験当日に１．５×１０7のＤａｕｄｉ細胞をｉ．ｖ．投与した。ベルツズマブによる治療は１日目に開始し、マウスにベルツズマブを単回ｉ．ｐ．注射または単回ｓ．ｃ．注射のいずれかで投与した。投与した用量は、６０μｇ、２０μｇまたは５μｇベルツズマブであった。対照マウスに、生理食塩水または６０μｇのｈＭＮ−１４ＩｇＧ（ラベツズマブ、抗体に適合した抗ＣＥＡＣＡＭ５アイソタイプ）のいずれかをｉ．ｐ．注射で投与した。
【図９】ベルツズマブの最小有効量を、播種性バーキットリンパ腫異種移植モデルで測定した。Ｃ．Ｂ．１７  ＳＣＩＤマウスに、試験当日、１．５×１０7のＤａｕｄｉ細胞をｉ．ｖ．投与した。ベルツズマブによる治療は１日目に開始し、マウスにベルツズマブを単回ｉ．ｐ．注射で投与した。投与した用量は、０．５μｇ、０．２５μｇ、０．１μｇまたは０．０５μｇベルツズマブであった。対照マウスに、生理食塩水２００μＬをｉ．ｐ．注射した。
【図１０】播種性濾胞細胞リンパ腫を有し、ベルツズマブの用量を減少させて処置したマウスの代表的な生存曲線を示す。Ｃ．Ｂ．１７  ＳＣＩＤマウスに、試験当日、２．５×１０6のＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ細胞をｉ．ｖ．投与した。５日目にマウスに、ベルツズマブの単回ｉ．ｐ．注射を３５、３．５μｇ、０．３５μｇ、または０．０３５μｇの用量で投与した。対照マウスには生理食塩水だけを投与した。
【図１１】抗リンパ腫活性に対するＮＫ細胞および好中球を減少させ、その効果をＳＣＩＤマウスで評価した。本方法セクションに記述したように、Ｃ．Ｂ．１７  ＳＣＩＤマウスのＮＫおよび好中球を減少させ、１×１０6のＲａｊｉ細胞をｉ．ｖ．注射した。ベルツズマブによる治療は３日目に開始し、３日、５日、７日、および１１日目にマウスに２００μｇのベルツズマブをｉ．ｖ．注射で投与した。対照マウスに、生理食塩水１００μＬを投与した。
【図１２】血清薬物動態−ナイーブＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにベルツズマブ（１５０μｇ）をｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．経路のいずれかで投与した。動物を１４日の期間にわたって採血し、次いで実施例１１に記述したように、ベルツズマブの濃度に関して血清を分析した（Ｎ＝６）。
【図１３】ＳＣＩＤマウスにおけるリンパ腫増殖のｉｎ  ｖｉｖｏ抑制において、ベルツズマブはリツキシマブより効果的である。ＳＣＩＤマウスに、尾静脈注射によってＲａｊｉ細胞を接種した。＋５日、＋１０日、＋１５日、および＋２０日目に、マウスにリツキシマブまたはベルツズマブ（ｈＡ２０）のいずれかを１０ｍｇ／ｋｇ／投与で投与した。同一の投与量のリツキシマブによる処置と比較して、ベルツズマブによる処置は、有意に長い累積生存期間をもたらした（Ｐ＝０．００５）。
【図１４】非ホジキンリンパ腫におけるベルツズマブ効果に関するヒトでの試験において、２４例の濾胞リンパ腫レスポンダーについての奏功期間（ＤＲ）および増殖抑制期間（ＴＴＰ）についてのカプラン・マイヤー推定値を示す。
【図１５】異なる投与量群のベルツズマブで治療を受けたＮＨＬ患者について、ベースラインで、２回目、３回目、および４回目の注入前に、４週間後および１２週間後に、次いで最後の注射から最高１２カ月の間に３カ月間隔で測定したＢ細胞レベルを示す。
【００２４】
定義
本明細書で用いるように、抗体とは完全長（すなわち、天然に生じる、もしくは正常な免疫グロブリン遺伝子フラグメントの組換え法により形成される）の免疫グロブリン分子（たとえばＩｇＧ抗体）または抗体フラグメントのように、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な抗原結合部分をいう。
【００２５】
抗体フラグメントとは、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどのような抗体の一部分をいう。構造に関係なく、抗体フラグメントは、無傷抗体によって認識されるのと同じ抗原に結合する。たとえば、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体フラグメントは、ＣＤ２０に結合する。用語「抗体フラグメント」は、また、たとえば重鎖および軽鎖可変領域を含む［Ｆｖ」フラグメントなどの可変領域から成る単離されたフラグメント、その中の軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって結合されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最小認識単位を含む。本明細書で用いるように、用語「抗体フラグメント」は、Ｆｃフラグメントなどの抗原結合活性がない抗体の部分を含まない。
【００２６】
裸の抗体とは、治療薬に複合されていない抗体またはその抗原結合フラグメントをいう。抗体分子のＦｃ部分は、補体結合およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞毒性）などのエフェクター機能を与えることができ、それによって免疫機構を始動させ、細胞溶解をもたらす。しかし、アポトーシスなどの他の機構が作用し始めると、Ｆｃ部分は治療的機能に必要とされない可能性がある。裸の抗体としては、ポリクロナール抗体およびモノクローナル抗体、ならびにキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体などの組換え抗体が挙げられる。
【００２７】
治療薬は、別々に、同時にまたは経時的に、抗体部分と共にまたは抗体部分（すなわち抗体もしくは抗体フラグメント、またはサブフラグメント）と複合させて投与される分子または原子であり、疾患の治療に有用である。治療薬の非限定的な例としては、抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン類、免疫刺激剤、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤、オリゴヌクレオチド（たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ）および放射性同位元素が挙げられる。
【００２８】
診断薬は、疾患または病状に関連した細胞、組織、病原または他の標的に送達するための抗体、抗体フラグメント、標的可能な構築体または他の部分に複合することができる検出可能な分子または原子である。有用な診断薬としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：放射性同位元素、超音波、色素（たとえばビオチン−ストレプトアビジン複合体と共に）、造影剤、蛍光化合物もしくは蛍光性分子および増強剤（たとえば磁気共鳴画像法用の常磁性イオン）。
【００２９】
免疫複合体は、抗体成分と、少なくとも１つの治療薬または診断薬との複合体である。抗体成分は、免疫複合体を形成するために、複数の治療薬および／または診断薬と複合されてもよい。
【００３０】
用語、抗体融合タンパク質とは、同一もしくは異なる特異性を有する１つ以上の同一もしくは異なる一本鎖抗体または抗体フラグメントのセグメントが連結されている、組換えで作製された抗原結合分子をいうことができる。融合タンパク質の原子価は、融合タンパク質が１つの抗原またはエピトープに対していくつの結合アームもしくは結合部位を有しているか；すなわち、一価、二価、三価、または多価を示す。抗体融合タンパク質の多原子価は、それが抗原と結合する際に複数の相互作用を活用可能なこと、したがって、抗原に結合する結合活性の増加を意味する。特異性は、抗体融合タンパク質がいくつの抗原または異なるエピトープに結合することができるか；すなわち単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性を示す。これらの定義を用いると、たとえばＩｇＧなどの自然抗体は結合アームを２つ有するため、二価であるが、この抗体が１つのピトープ型に結合するため、単一特異性である。単一特異性で、多価の融合タンパク質は、エピトープに対して２つ以上の結合部位を有するが、１つのエピトープのみに結合する。融合タンパク質は、１つの抗体成分、異なる抗体成分の多価もしくは多重特異性の組み合わせ多重特異性組み合わせ、または同じ抗体成分の複数のコピーを含みうる。融合タンパク質は、さらに、抗体または抗体フラグメントおよび治療薬を含みうる。この融合タンパク質に適した治療薬の例としては、免疫刺激剤（「抗体−免疫刺激剤融合タンパク質」）および毒素（「抗体−毒素融合タンパク質」）が挙げられる。１つの好ましい毒素は、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、好ましくは組換えＲＮａｓｅを含む。別の好ましい免疫刺激剤融合タンパク質は、本明細書に記述するように、インターフェロンを特異抗体または多価抗体もしくは多重特異性抗体に融合するなどの免疫サイトカインである。
【００３１】
多重特異性抗体は、構造の異なる少なくとも２つの標的、たとえば２つの異なる抗原、同じ抗原上の２つの異なるエピトープ、または１つのハプテンおよび／または１つの抗原もしくは１つのエピトープに同時に結合可能な抗体である。１つの特異性は、Ｂ細胞抗原、Ｔ細胞抗原、骨髄系細胞抗原、形質細胞抗原またはマスト細胞抗原もしくはエピトープに対することもある。別の特異性は、Ｂ細胞上のＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、ＭＵＣｌまたはＣＤ２２などの同じ細胞型上の異なる抗原に対することもある。多重特異性の、多価抗体は、２つ以上の結合部位を有し、かつその結合部位の特異性が異なる構築体である。
【００３２】
二重特異性抗体は、構造が異なる２つの標的に同時に結合可能な抗体である。好ましい実施形態では、二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）および二重特異性抗体フラグメント（ｂｓＦａｂ）は、たとえばＢ細胞抗原、Ｔ細胞抗原、骨髄系細胞抗原、形質細胞抗原またはマスト細胞抗原もしくはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのアームと、治療薬または診断薬を有する標的設定可能な複合体に特異的に結合する少なくとも１つの別のアームとを有する。
【００３３】
改善した抗ＣＤ２０抗体
この１０年の医学療法における進歩は、さまざまな癌の治療に９種類の抗体が導入されたことで証明される（Ｓｈａｒｋｅｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２００６，５６：２２６−２４３）。これらの新しい生物学的治療学の大半は、従来の細胞毒性薬と組み合わせて用いられ、抗体がその有効性を改善するさらなる対策を必要とすることを示している（同書）。これは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）治療のための単剤療法として最初に承認された、第一世代のキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ＭＡｂ）であるリツキシマブで最も良く例証される（Ｃａｓｔｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００８，３６：７５５−７６８）。リツキシマブは当該技術分野で周知であり、Ｂｉｏｇｅｎ／ＩＤＥＣおよびＧｅｎｅｎｔｅｃｈから市販されている（たとえば米国特許第５，７３６，１３７号；第５，７７６，４５６号；第６，３９９，０６１号；第６，４５５，０４３号；第６，８４６，４７６号を参照されたい）。この成功に基づき、改善した抗ＣＤ２０抗体を導入する取り組みが進んでいる（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４，１０：２８６８−７８；Ｔｅｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００４，１０４：１７９３−１８００；Ｖｕｇｍｅｙｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５，２８：２１２−２１９，Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００８，１９（Ｓｕｐｐｌ  ７），ａｂｓｔｒａｃｔ  ９８；Ｆｏｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  ９９th  Ａｎｎ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００８，ａｂｓｔｒａｃｔ  ＬＢ−７０；Ｇｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７，４４：３８２３−３７）。
【００３４】
これらの新しい抗ＣＤ２０ＭＡｂの大半は、ＦｃγＲまたは補体媒介性機能を向上させつつ、マウス成分を減少することを目的としている（Ｇｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７，  ４４：３８２３−３７；  Ｍａｌｏｎｅｙ，  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ．２００７：２２６−２３２；  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２００８，  ４５：１２６−１３２）。リツキシマブによる注入関連反応を軽減するために開発された第一、第二世代のＭＡｂの１つは、現在ベルツズマブと名付けられているｈＡ２０  ＭＡｂである（たとえば、Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００８，１１１：２２１１−１９；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４，１０：２８６８−７８；米国特許第７，１５１，１６４号、この特許の実施例のセクションを参考として本明細書で援用する）。ベルツズマブは、リツキシマブに関して報告されているよりも高い完全寛解（ＣＲ）率を示す一方で、注入時間はリツキシマブよりも短い（Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００７，２５（１８Ｓ）：４４９ｓ；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ａｍｅｒ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００８，２６（１５Ｓ）：１４２ｓ）。下記の実施例に記述するように、ベルツズマブはヒト化抗ＣＤ２２  ＭＡｂ、エプラツズマブまたはｈＬＬ２の骨格フレームワーク領域を用いて組換え設計され（たとえば、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５，３２：１４１３−１４２７；米国特許第６，３０６，３９３号；第６，１８３，７７４号および第７，０７４，４０３号を参照されたい。各特許の実施例のセクションを参考として本明細書で援用する）以下の第１表に示すようにリツキシマブと比較すると、同一の軽鎖ＣＤＲ、同一の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２を有するが、異なる構築体ＣＤＲ３−ＶH（ＣＤＲＨ３）を有する。
【００３５】
下記の実施例で述べるように、配列の違いによる結果として、ベルツズマブは、Ｄａｕｄｉ細胞系において大幅に改善した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関して、リツキシマブと比較して試験した３つのすべてのリンパ腫細胞系において遅い解離速度、およびカニクイザルにおける強力な抗Ｂ細胞活性とヒトリンパ腫−マウスモデルでの治療効果、ならびにリツキシマブと比較してマウスでのＲａｊｉリンパ腫異種移植の著しく良好な制御というユニークな特性を有し、極めて低い用量で患者において観察された活性を裏付ける。Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，"Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ（ｈＡ２０），ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，"Ｂｌｏｏｄ  １１３：１０６２−７０を参照されたい。下記の実施例で記述するように、ベルツズマブとリツキシマブのこうした機能的な差異が、リツキシマブ重鎖の第３相補性決定領域（ＣＤＲＨ３）（カバット残基１０１）において非保存的な単一アミノ酸変化に関連しているのは驚きである。この非保存的な変化が、指定した特性で抗体を改善するための適切な機会の不足または成功する可能性の減少によるとは、当業者は思わないであろう。
【００３６】
種々の実施形態において、本発明は、哺乳類の被験者、ヒトおよび家畜の治療に有用な、単体で、複合体として、または、他の裸の抗体および抗体治療的用複合体を含む治療薬と組み合わせて投与されるヒト化抗ＣＤ２０抗体、キメラ抗ＣＤ２０抗体もしくはヒト抗ＣＤ２０抗体、およびその抗体融合タンパク質を提供する。
【００３７】
好ましい実施形態において、本抗ＣＤ２０  ＭＡｂまたはその抗原結合フラグメントは、カバット１０１位にアスパラギン酸塩残基、カバット９４位にアルギニン残基、およびＣＤＲ３のＶHのカバット１０２位にバリン残基を含む。より好ましくは、抗ＣＤ２０抗体およびその抗原結合フラグメントは、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲＬｌ（ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ、配列番号１）、ＣＤＲＬ２（ＡＴＳＮＬＡＳ、配列番号２）およびＣＤＲＬ３（ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ、配列番号３）ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲＨｌ（ＳＹＮＭＨ、配列番号４）、ＣＤＲＨ２（ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ、配列番号５）およびＣＤＲＨ３（ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＤＶ、配列番号６）を有するベルツズマブのＣＤＲ配列を含む。最も好ましい実施形態において、抗ＣＤ２０抗体はベルツズマブである。
【００３８】
ヒト化抗ＣＤ２０  ＭＡｂまたはその抗原結合フラグメントは、親マウス抗ＣＤ２０  ＭＡｂの、Ｂ細胞、Ｂ細胞性リンパ腫およびＢ細胞白血病に対する標的特性を保持しつつ、マウス抗ＣＤ２０  ＭＡｂのＣＤＲ（またはマウス抗ＣＤ２０抗体のＣＤＲに由来する配列）ならびに一つ以上のヒト抗体の軽鎖のフレームワーク（ＦＲ）と定常領域および可変領域、一つ以上のヒト抗体の重鎖のフレームワーク（ＦＲ）と定常領域および可変領域を含んでいてもよい。ヒト化抗ＣＤ２０  ＭＡｂまたはその抗原結合フラグメントは、親マウスＭＡｂの対応するＦＲに由来する少なくとも１つのアミノ酸をさらに含んでいてもよい。具体的には、ヒト化抗ＣＤ２０  ＭＡｂまたはその抗原結合フラグメントは、図２Ｂ（ｈＡ２０ＶＨ１、配列番号１４）に示す重鎖可変領域のアミノ酸１、５、２７、３０、３８、４８、６７、６８、７０、９５、１１５または１１６に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基および／または図２Ａ（ｈＡ２０Ｖｋ、配列番号１２）に示す軽鎖可変領域のアミノ酸残基４、２１、３５、３８、４５、４６、５９、９９、１０４または１０６に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を含んでもよい。適切な結合を維持する、またはＣＤ２０抗原との結合を強化する必要があれば、マウスフレームワークアミノ酸残基は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域で置換されうる。より好ましくは、ヒト化抗ＣＤ２０  ＭＡｂまたはその抗原結合フラグメントは、ｈＡ２０Ｖｋ（配列番号１２）およびｈＡ２ＶＨｌ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
キメラ抗ＣＤ２０  ＭＡｂまたはその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体定常領域配列に結合したマウス抗ＣＤ２０抗体の（またはマウス抗ＣＤ２０抗体に由来する）可変領域配列を含んでよい。好ましい実施形態において、キメラ抗ＣＤ２０  ＭＡｂの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、図１Ａおよび図１Ｂに示すｃＡ２０Ｖｋ（配列番号８）およびｃＡ２０ＶＨ（配列番号１０）のＣＤＲ配列を含む。もっとも好ましくは、キメラ抗ＣＤ２０  ＭＡｂまたはその抗原結合フラグメントは、ｃＡ２０Ｖｋ（配列番号８）およびｃＡ２０ＶＨ（配列番号１０）の軽鎖可変領域および重鎖可変領域配列を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態は、ヒト抗ＣＤ２０ＭＡｂまたはその抗原結合フラグメントに関することもあり、実質的に、マウス抗ＣＤ２０ＭＡｂのＢ細胞、およびＢ細胞性リンパ腫と白血病細胞の標的特性および細胞結合特性を有し、ここでＣＤＲは、上述のように、図１および図２に示すようにキメラ抗ＣＤ２０  ＭＡｂおよびヒト化抗ＣＤ２０  ＭＡｂのためのものある。
【００４１】
他の実施形態は、上述のように、少なくとも１つの抗ＣＤ２０  ＭＡｂまたはその抗原結合フラグメントを含む、抗体融合タンパク質またはその抗原結合フラグメントを包含してもよい。抗体融合タンパク質またはその抗原結合フラグメントは、上述のように少なくとも１つの第１の抗ＣＤ２０  ＭＡｂまたはその抗原結合フラグメントおよび上述の抗ＣＤ２０ＭＡｂまたはその抗原結合フラグメント以外の少なくとも第２のＭＡｂまたはその抗原結合フラグメントを含む、抗体融合タンパク質またはその抗原結合フラグメントを包含することも目的とする。より好ましくは、この第２のＭＡｂは、Ｂ７、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ６、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、Ｈ因子、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−Ｉ、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様増殖因子−１（ＩＬＧＦ−１）、インスリン様増殖因子−１受容体（ＩＬＧＦ−１Ｒ）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ−６６、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、補体因子Ｃ５、および癌遺伝子産物（たとえば、Ｋｒａｓ、ｃＭＥＴ、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６）またはそれらの組み合わせと反応有し、ならびに本明細書に記述する抗ＣＤ２０  ＭＡｂとは異なる抗ＣＤ２０  ＭＡｂとも反応性するＭＡｂである。
【００４２】
Ｂ細胞性リンパ腫と白血病を含むＢ細胞障害および自己免疫疾患、ならびにＢ細胞（ＧＶＨＤ、溶血性貧血、臓器移植拒絶反応）を含む他の免疫疾患の治療のための優れた治療薬を得るため、ＣＤＲ変異および可変領域でのＣＤＲと他の配列との操作の結果、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗ＣＤ２０抗体は、エピトープとの親和結合が強化され、抗腫瘍および抗Ｂ細胞活性を有しうる。
【００４３】
アミノ酸置換
アミノ酸配列を修飾して、エフェクター機能を改善する、たとえば、抗体依存性細胞依存性傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を強化することが望ましいこともある。Ｆｃ領域で１つ以上のアミノ酸を置換するまたはシステインを導入することができ、それによって内部移行能力および／または増大した補体依存性細胞死滅およびＡＤＣＣを改善する。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７６：１１９１−１１９５（１９９１）およびＳｈｏｐｅｓ，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：２９１８−２０２２（１９９２）を参照されたい（参考として本明細書で援用する）。強化された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有する二重Ｆｃ領域を有する抗体融合タンパク質の製造が可能である。
【００４４】
エフェクター機能または他の抗体機能特性を強化するためのＦｃ領域への変化が報告されている（たとえばＬａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００６，１０３：４００５−１０；Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７，６７：８８８２−９０；Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６，１７６：３４６−５６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１，１６６：２５７１−７５を参照されたい）。この既知のＦｃ領域のアミノ酸置換のいずれも、特許請求する方法および組成物で利用してよい。たとえば、カバット２３９位でセリン残基のアスパラギン酸塩残基との置換により、ＡＣＤＤ活性が強化されると報告された（Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，同書、２００６）。フェニルアラニン２４３のロイシンとの、アルギニン２９２のプロリンとの、チロシン３００のロイシンとの、バリン３０５のイソロイシンとの、プロリン３９６のロイシンとの置換によっても、ＡＤＣＣ活性は最適化するようであった（Ｓｔａｇｅｎｈａｇｅｎｅｔ  ａｌ．、２０００７）。スレオニン２５０のグルタミンとの、メチオニン４２８のロイシンとの置換により、血清半減期に明らかな増加がもたらされた（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，同書、２００６）。リジン３２６のトリプトファンとの、グルタミン酸塩３３３のセリンとの置換によりＣＤＣ活性が増加するようである（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，同書、２００１）。抗体の生理機能を強化するこれらの、および他の既知の修飾を、本明細書に記述した可変領域配列への変化と組み合わせて、改善した治療上の特性を有する抗ＣＤ２０抗体を製造することができる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、開示した方法および組成物は、１つ以上の置換アミノ酸残基を有する抗体およびその抗原結合フラグメンットの製造および使用を含んでよい。後述するように、実質的にどのような標的抗原に対してもモノクローナル抗体を作製する方法は当該技術分野で周知である。一般的に、これらの方法は標的抗原に対するマウス抗体の産生をもたらす。当該技術分野で周知のように、マウスモノクローナル抗体の抗原結合特異性は、主に超可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列で決定される。マウス抗体は、通常、抗体軽鎖上に３つ、重鎖上に３つの計６つのＣＤＲ配列を含む。以下に詳細に述べるように、マウス抗体のキメラバージョン、ヒト化バージョンまたはヒトバージョンは、たとえば、ヒト抗体フレームワーク領域配列および定常領域配列にＣＤＲ配列を挿入するＣＤＲ移植などの技法によって、またはマウス可変領域配列全体をヒト抗体定常領域配列に結合させることによって構築されてもよい。代替実施形態では、抗体の可変領域配列は、たとえば、抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域全体をコードするオリゴヌクレオチドを化学合成し組立てることよって構築されうる。
【００４６】
種々の実施形態において、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の構造特性、物理特性および／または治療上の特性は、１つ以上のアミノ酸残基を置換することによって最適化されうる。
【００４７】
通常、アミノ酸置換は、アミノ酸と比較的類似した特性を有する別のアミノ酸とを置換すること（すなわち同類アミノ酸置換）を一般的に含むことを当業者は承知しているであろう。種々のアミノ酸の特性およびアミノ酸置換のタンパク質構造ならびに機能への影響は、当該技術分野で広範囲にわたる研究の主題および知識である。
【００４８】
たとえば、アミノ酸のハイドロパシックインデックスを考えてもよい（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２）。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性は、得られたタンパク質の二次構造に寄与し、ひいてはこのタンパク質と他の分子との相互作用を限定する。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシックインデックスが割り当てられており（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）、これらは以下のとおりである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。同類置換を行なう際、ハイドロパシックインデックスが±２以内のアミノ酸を使用することが好ましく、±１以内がより好ましく、±０．５以内がさらにより好ましい。
【００４９】
アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性を考慮に入れてもよい（たとえば米国特許第４，５５４，１０１号）。親水性値はアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０）；グルタミン酸塩（＋３．０）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５．＋‐．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸と同様の親水性を有する他との置換は、好ましいが、必要とされない。
【００５０】
他に考慮すべきこととして、アミノ酸側鎖の大きさが挙げられる。たとえば、アミノ酸をグリシンもしくはセリン等小型の側鎖と置換する、またはたとえば、アミノ酸をトリプトファン、チロシン等大きな側鎖と置換することは通常好ましくないであろう。種々のアミノ酸残基のタンパク質二次構造への影響も、考慮すべきことである。実証的研究を通して、タンパク質ドメインがαヘリカル、βシートまたは折り返しの二次構造を取り入れる傾向への異なるアミノ酸残基の影響は、決定されており当該技術分野において既知である（たとえば、Ｃｈｏｕ＆Ｆａｓｍａｎ，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２−２４５；１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６；  １９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４を参照されたい）。
【００５１】
こうした考慮すべきことと広範囲な実証的試験とに基づき、同類アミノ酸置換の表が作成され、当該技術分野で既知となっている。たとえば：アルギニンとリジン；グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリン、ロイシンならびにイソロイシンが挙げられる。あるいは：Ａｌａ（Ａ）ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ；Ａｒｇ（Ｒ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ｌｙｓ；Ａｓｎ（Ｎ）ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、ａｒｇ、ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）ａｓｎ、ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）ａｌａ、ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）ｇｌｕ、ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｅ）ｇｌｎ、ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｉｌｅ（Ｉ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｉｌｅ；Ｌｙｓ（Ｋ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）ｐｈｅ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）、ｔｈｒ；Ｔｈｒ（Ｔ）ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）ｐｈｅ、ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒ；Ｖａｌ（Ｖ）ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａ。
【００５２】
アミノ酸置換について他に考慮すべきこととして、残基がタンパク質の内部に位置するか、または溶媒露出であるかが挙げられる。ＣＤＲ残基の場合、遊離抗体中のアミノ酸残基は溶媒露出であると、通常想定されるであろう。内部残基の場合、同類置換として以下が挙げられる：ＡｓｐとＡｓｎ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＳｅｒとＡｌａ；ＴｈｒとＡｌａ；ＡｌａとＧｌｙ；ＩｌｅとＶａｌ；ＶａｌとＬｅｕ；ＬｅｕとＩｌｅ；ＬｅｕとＭｅｔ；ＰｈｅとＴｙｒ；ＴｙｒとＴｒｐ（たとえばｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕのＰＲＯＷＬウェブサイトを参照されたい）。溶媒露出残基の場合、同類置換としては以下が挙げられる：ＡｓｐとＡｓｎ；ＡｓｐとＧｌｕ；ＧｌｕとＧｌｎ；ＧｌｕとＡｌａ；ＧｌｙとＡｓｎ；ＡｌａとＰｒｏ；ＡｌａとＧｌｙ；ＡｌａとＳｅｒ；ＡｌａとＬｙｓ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＬｙｓとＡｒｇ；ＶａｌとＬｅｕ；ＬｅｕとＩＩｅ；ＩＩｅとＶａｌ；ＰｈｅとＴｙｒ（同書）。ＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス、Ｄａｙｈｏｆｆマトリックス、Ｇｒａｎｔｈａｍマトリックス、ＭｃＬａｃｈｌａｎマトリックス、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅマトリックス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆマトリックス、Ｍｉｙａｔａマトリックス、Ｆｉｔｃｈマトリックス、Ｊｏｎｅｓマトリックス、Ｒａｏマトリックス、ＬｅｖｉｎマトリックスおよびＲｉｓｌｅｒマトリックス等、種々のマトリックスが構築され、アミノ酸置換の選択に役立っている（同書）。
【００５３】
アミノ酸置換を決定する際に、分子間結合または分子内結合の存在、たとえば正に帯電した残基（たとえばＨｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）と負に帯電した残基（たとえばＡｓｐ、Ｇｌｕ）とのイオン結合または近傍のシステイン残基間のジスルフィド結合形成も考えられる。
【００５４】
キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体の製造
実質的にいかなる標的抗原に対するモノクローナル抗体を製造する技法も、当該技術分野で周知である。たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）およびＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１，ｐａｇｅｓ  ２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９１）を参照されたい。簡単にいうと、モノクローナル抗体は、マウスに抗原を含む組成物を注射し、脾臓を摘出してＢリンパ球を得、このＢリンパ球と骨髄腫細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、次いでハイブリドーマ培養物から抗体を単離することで得られる。
【００５５】
ＭＡｂは、ハイブリドーマ培養物から種々の確立した技法によって単離、精製されうる。この単離技法として、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎ、ページ２．７．１〜２．７．１２およびページ２．９．１〜２．９．３を参照されたい。また、Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ），"ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１０，ｐａｇｅｓ  ７９−１０４（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）を参照されたい。
【００５６】
免疫原に対する抗体をまず産生し、配列決定し、続いて組換え技法によって製造することができる。マウス抗体および抗原フラグメントのヒト化またはキメラ化は、当業者にとって周知である。たとえば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖由来のマウス相補性決定領域をヒト可変領域に移入し、次いでマウスのカウンターパートのフレームワーク領域でヒト残基を置換することによって作製される。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分を用いることで、マウス定常領域の免疫原性と関連した潜在的な諸問題が取り除かれる。
【００５７】
キメラ抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、たとえば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の可変領域と置換された組換えタンパク質である。被験者への投与時、キメラ抗体は免疫原性の低下と安定性の増加を示す。マウス免疫グロブリンの可変ドメインをクローニングするための一般的な技法は、たとえば、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：３８３３（１９８９）に開示されている。キメラ抗体を構築する技法は、当業者に周知である。一例として、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４６９（１９９４））は、マウスＬＬ２のＶκおよびＶHドメインをコードするＤＮＡ配列、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体とヒトκおよびＩｇＧ1それぞれの定常領域ドメインとを組み合わせることによってＬＬ２キメラを作製した。
【００５８】
ヒト化抗体
ヒト化ＭＡｂを作製する技法は、当該技術分野で周知ある（たとえば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８），Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５（１９９２），Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２），およびＳｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３）を参照されたい）。キメラモノクローナル抗体またはマウスモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖由来のマウスＣＤＲをヒト抗体の対応する可変ドメインに移入することによってヒト化することができる。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒトＦＲ配列とも置換される。マウスＣＤＲをヒトＦＲに移入するだけで、しばしば抗体親和性の減少または損失さえもたされるため、マウス抗体の本来の親和性を回復させるためにさらなる修飾を必要とすることもある。この修飾は、その抗体のエピトープに良好な結合親和性を有する抗体を得るため、１つ以上のヒト残基の一部をＦＲ領域にてマウスのそれらのカウンターパートと置換することで達成される。たとえば、Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６（１９９１）およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）を参照されたい。ある標的のためのヒト化抗体の親和性は、選択したＣＤＲ配列の修飾によって増加させることもできる（国際公開第ＷＯ００２９５８４Ａ１号）。
【００５９】
ヒト抗体
組み合わせのアプローチまたはヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換されたトランスジェニック動物のいずれかを用いて完全ヒト抗体を作製する方法は、当該技術分野で既知である（たとえば、Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５−２８；  Ｃｏｎｒａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７−２６；Ｂｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  Ｌｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．３：５４４−５０）。完全ヒト抗体も、遺伝子または染色体のトランスフェクション法、ならびにファージディスプレイ技法によって構築されうる。これらの方法すべては当該技術分野で既知である。たとえば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。この完全ヒト抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体よりさらに少ない副作用を示し、かつｉｎ  ｖｉｖｏで本質的に内在性のヒト抗体として機能することが期待される。いくつかの実施形態において、特許請求する方法および手順は、そうした技法によって作製されたヒト抗体を利用することができる。
【００６０】
一代替実施形態において、ファージディスプレイ技法を用いて、ヒト抗体を作製することもできる（たとえば、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６−４０）。ヒト抗体は、正常なヒトから、または、癌など特定の病態を示すヒトから作製することができる（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。罹患した個人に由来するヒト抗体を構築する利点は、循環抗体レパートリーが疾患関連抗原に対する抗体に偏る可能性があるということである。この方法論の一非限定例では、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）が、骨肉腫患者由来のヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリーを構築した。ほとんどの場合、全ＲＮＡは、循環血液リンパ球から得られた（同上）。組換えＦａｂは、μ鎖、γ鎖およびκ鎖の抗体レパートリーからクローン化し、ファージディスプレイライブラリーに挿入された（同書）。ＲＮＡをｃＤＮＡに変えて使用し、重鎖免疫グロブリン配列および軽鎖免疫グロブリン配列に対して特定のプライマーを用いてＦａｂ  ｃＤＮＡライブラリーを作製した（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７）。ライブラリー構築は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１st  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ｐｐ．９．１−９．２２）に従って行なわれた。最終的なＦａｂフラグメントを、制限酵素で消化し、バクテリオファージゲノムに挿入してファージディスプレイライブラリーを作製した。当該技術分野で既知のように、このライブラリーは標準ファージディスプレイ方法でスクリーニングされうる。ファージディスプレイは、種々のフォーマットで行なわれえ、フォーマットのレビューに関しては、たとえばＪｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化したＢ細胞によって作製することもできる。米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号を参照されたい。それぞれの実施例のセクションは参考として本明細書で援用される。これらの技法が代表的なものであり、ヒト抗体または抗体フラグメントを作製しスクリーニングするための既知のいかなる方法も利用され得ることを、当業者は理解する。
【００６１】
別の代替実施形態において、ヒト抗体を作製するために遺伝子組換えが行なわれたトランスジェニック動物を用いて、標準免疫方法により本質的にどのような免疫原標的に対してでも抗体を作製することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４），Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）およびＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）に開示されている。この系の非限定例として、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）からのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）が挙げられる（たとえば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３、参考として本明細書で援用される）。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）および同様の動物において、マウス抗体遺伝子は不活性化され、機能的ヒト抗体遺伝子と置換されているが、マウス免疫系の残りの部分はインタクトのままである。
【００６２】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、アクセサリー遺伝子および制御配列と共に可変領域配列の大部分を含むヒトＩｇＨおよびＩｇκ遺伝子座の部分を含む生殖細胞形成ＹＡＣ（酵母人工染色体）で形質変換された。ヒト可変領域レパートリーを用いて、既知の技法によってハイブリドーマにプロセシングされうる抗体産生Ｂ細胞を作製してもよい。標的抗原で免疫されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、正常な免疫応答によってヒト抗体を産生する。このヒト抗体は、上述の標準技法によって収集および／または作製されうる。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）の種々の系統は入手可能であり、異なるクラスの抗体を産生することができる。遺伝子導入で作製されたヒト抗体は、正常なヒト抗体の薬物動態特性を保持する一方で、治療可能性を有することが示される（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。当業者は、特許請求する組成物および方法がＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系の使用に限定されることなく、ヒト抗体を産生するように遺伝子組換えが行なわれるいずれのトランスジェニック動物も利用できることを理解する。
【００６３】
抗体フラグメントの作製
特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の技法によって作製することができる。抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の抗原結合部分である。Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって作製することができ、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることによって作製することができる。あるいは、Ｆａｂ’発現ライブラリーを構築（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７４−１２８１）することで、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’フラグメントの同定が迅速かつ簡単に実施される。
【００６４】
一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む。ＶＬおよびＶＨのドメインは、結合して標的結合部位を形成する。これら２つのドメインは、ペプチドリンカー（Ｌ）によってさらに共有結合的に結合される。ｓｃＦＶ分子を作製し、適切なペプチドリンカーを設計する方法は、参考として本明細書で援用される、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｒ．Ｒａａｇ  ａｎｄ  Ｍ．Ｗｈｉｔｌｏｗ，"Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｆｖｓ．"ＦＡＳＥＢ  Ｖｏｌ  ９：７３−８０（１９９５）およびＲ．Ｅ．Ｂｉｒｄ  ａｎｄ  Ｂ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ，"Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ，"  ＴＩＢＴＥＣＨ，Ｖｏｌ  ９：１３２−１３７（１９９１）に記述されている。
【００６５】
抗体フラグメントは、完全長の抗体のタンパク質加水分解によって、または、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくは別の宿主内で該フラグメントをコードするＤＮＡの発現によって調製されうる。抗体フラグメントは、従来の方法により完全長抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得られる。たとえば、パパインを用いる酵素切断によって、２つの一価ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを作製する。これらの方法は、たとえば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，０３６，９４５号および第４，３３１，６４７号ならびにそれらの参考文献に記載されており、両特許は参考として本明細書で援用される。また、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０（１９６０）；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９（１９５９），Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  ＶＯＬ．１，ｐａｇｅ  ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７）、ならびにＣｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．８．１−２．８．１０および２．１０．−２．１０．４を参照されたい。
【００６６】
二重特性抗体および多重特異性抗体
二重特異性抗体は、多くの生物医学的用途において有用である。たとえば、腫瘍細胞表面抗原の結合部位およびＴ細胞表面受容体の結合部位を有する二重特異性抗体は、Ｔ細胞によって特定の腫瘍細胞の溶解を導くことができる。Ｔ細胞上でグリオーマおよびＣＤ３エピトープを認識する二重特異性抗体を用いた、ヒト患者の脳腫瘍治療は成功を収めている（Ｎｉｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  １９９０；３５５：３６８−３７１）。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または他の疾患標的のための少なくとも１つの結合部位、ならびに治療薬または診断薬に複合した標的設定可能な構築体のための少なくとも１つの結合部位を含む二重特異性抗体によるプレターゲッティング法は、当該技術分野でも周知ある（たとえば、米国特許第７，３００，６４４号；第７，１３８，１０３号；第７，０７４，４０５号；第７，０５２，８７２号；第６，９６２，７０２号；第６，４５８，９３３号を参照されたい。各特許の実施例のセクションは、参考として本明細書で援用される）。
【００６７】
既知のいずれの抗ＴＡＡ抗体の抗原結合可変領域の配列を含む二重特異性抗体も利用でき、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ｈＰＡＭ４（米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬｌ（米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ−９（米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（米国特許出願番号第１１／３６８，２９６号）、ｈＭＮ−１４（米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＲＳ７（米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（米国特許出願番号第１０／６７２，２７８号）およびｈＲｌ（米国特許仮出願番号第６１／１４５，８９６号、提出日１／２０／０９）。引用した各特許または特許出願の実施例セクションは参考として本明細書で援用される。
【００６８】
幅広い既知のソースから市販されている他の抗体を使用することができる。たとえば、ハイブリドーマ系統を分泌する種々の抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から市販されている。種々の疾患標的に対する多数の抗体は、腫瘍関連抗原を含むがこれに限定されることなく、ＡＴＣＣに寄託されおよび／または可変領域配列を公開されており、ならびに本明細書にて特許請求する方法および組成物での使用に利用できる。たとえば、米国特許第７，３１２，３１８号；第７，２８２，５６７号；第７，１５１，１６４号；第７，０７４，４０３号；第７，０６０，８０２号；第７，０５６，５０９号；第７，０４９，０６０号；第７，０４５，１３２号；第７，０４１，８０３号；第７，０４１，８０２号；第７，０４１，２９３号；第７，０３８，０１８号；第７，０３７，４９８号；第７，０１２，１３３号；第７，００１，５９８号；第６，９９８，４６８号；第６，９９４，９７６号；第６，９９４，８５２号；第６，９８９，２４１号；第６，９７４，８６３号；第６，９６５，０１８号；第６，９６４，８５４号；第６，９６２，９８１号；第６，９６２，８１３号；第６，９５６，１０７号；第６，９５１，９２４号；第６，９４９，２４４号；第６，９４６，１２９号；第６，９４３，０２０号；第６，９３９，５４７号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，５３３号；第６，９１９，４３３号；第６，９１９，０７８号；第６，９１６，４７５号；第６，９０５，６８１号；第６，８９９，８７９号；第６，８９３，６２５号；第６，８８７，４６８号；第６，８８７，４６６号；第６，８８４，５９４号；第６，８８１，４０５号；第６，８７８，８１２号；第６，８７５，５８０号；第６，８７２，５６８号；第６，８６７，００６号；第６，８６４，０６２号；第６，８６１，５１１号；第６，８６１，２２７号；第６，８６１，２２６号；第６，８３８，２８２号；第６，８３５，５４９号；第６，８３５，３７０号；第６，８２４，７８０号；第６，８２４，７７８号；第６，８１２，２０６号；第６，７９３，９２４号；第６，７８３，７５８号；第６，７７０，４５０号；第６，７６７，７１１号；第６，７６４，６８８号；第６，７６４，６８１号；第６，７６４，６７９号；第６，７４３，８９８号；第６，７３３，９８１号；第６，７３０，３０７号；第６，７２０，１５号；第６，７１６，９６６号；第６，７０９，６５３号；第６，６９３，１７６号；第６，６９２，９０８号；第６，６８９，６０７号；第６，６８９，３６２号；第６，６８９，３５５号；第６，６８２，７３７号；第６，６８２，７３６号；第６，６８２，７３４号；第６，６７３，３４４号；第６，６５３，１０４号；第６，６５２，８５２号；第６，６３５，４８２号；第６，６３０，１４４号；第６，６１０，８３３号；第６，６１０，２９４号；第６，６０５，４４１号；第６，６０５，２７９号；第６，５９６，８５２号；第６，５９２，８６８号；第６，５７６，７４５号；第６，５７２；８５６号；第６，５６６，０７６号；第６，５６２，６１８号；第６，５４５，１３０号；第６，５４４，７４９号；第６，５３４，０５８号；第６，５２８，６２５号；第６，５２８，２６９号；第６，５２１，２２７号；第６，５１８，４０４号；第６，５１１，６６５号；第６，４９１，９１５号；第６，４８８，９３０号；第６，４８２，５９８号；第６，４８２，４０８号；第６，４７９，２４７号；第６，４６８，５３１号；第６，４６８，５２９号；第６，４６５，１７３号；第６，４６１，８２３号；第６，４５８，３５６号；第６，４５５，０４４号；第６，４５５，０４０号，第６，４５１，３１０号；第６，４４４，２０６’６，４４１，１４３号；第６，４３２，４０４号；第６，４３２，４０２号；第６，４１９，９２８号；第６，４１３，７２６号；第６，４０６，６９４号；第６，４０３，７７０号；第６，４０３，０９１号；第６，３９５，２７６号；第６，３９５，２７４号；第６，３８７，３５０号；第６，３８３，７５９号；第６，３８３，４８４号；第６，３７６，６５４号；第６，３７２，２１５号；第６，３５９，１２６号；第６，３５５，４８１号；第６，３５５，４４４号；第６，３５５，２４５号；第６，３５５，２４４号；第６，３４６，２４６号；第６，３４４，１９８号；第６，３４０，５７１号；第６，３４０，４５９号；第６，３３１，１７５号；第６，３０６，３９３号；第６，２５４，８６８号；第６，１８７，２８７号；第６，１８３，７４４号；第６，１２９，９１４号；第６，１２０，７６７号；第６，０９６，２８９号；第６，０７７，４９９号；第５，９２２，３０２号；第５，８７４，５４０号；第５，８１４，４４０号；第５，７９８，２２９号；第５，７８９，５５４号；第５，７７６，４５６号；第５，７３６，１１９号；第５，７１６，５９５号；第５，６７７，１３６号；第５，５８７，４５９号；第５，４４３，９５３号，第５，５２５，３３８号を参照されたい。これらの各特許の実施例セクションは参考として本明細書で援用される。これらは代表的なものだけであって、種々の他の抗体およびそれらのハイブリドーマが、当該技術分野において既知である。いずれの疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマのほとんどを、選択された関心のある疾患関連標的に対する抗体のためにＡＴＣＣ、ＮＣＢＩおよび／またはＵＳＰＴＯデータベースの単純な検索によって得られると当業者は理解する。クローン化抗体の抗原結合ドメインを、当該技術分野で周知の標準的技法を用いて、増幅し、切除し、発現ベクターに連結し、適合した宿主細胞にトランスフェクトし、タンパク質産生のために使用することができる。
【００６９】
たとえば米国特許出願公開第２００５０００２９４５号（提出日２／１１／２００４）に開示されているように、二重特異性抗体または多重特異性抗体を作製する多くの方法が既知である。該特許の実施例セクションは参考として本明細書で援用される。二重特異性抗体は、クアドローマ方法によって作製されうる。この方法は、異なる抗原部位を認識するモノクローナル抗体をそれぞれ産生する２つの異なるハイブリドーマの融合を含む（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３；３０５：５３７−５４０）。
【００７０】
二重特異性抗体を作製する別の方法は、ヘテロ二官能性化架橋剤を用いて、２つの異なるモノクローナル抗体を化学的につなぎとめる方法である（Ｓｔａｅｒｚ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８５；３１４：６２８−６３１；Ｐｅｒｅｚ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８５；３１６：３５４−３５６）。二重特異性抗体は、２つの親モノクローナル抗体の各々を半分子に還元し、次いで混合して再酸化させ、ハイブリッド構造を得ることによって作製することもできる（Ｓｔａｅｒｚ  ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８６；８３：１４５３−１４５７）。別の代替案は、別々に精製した２つまたは３つＦａｂ’フラグメントを、適切なリンカーを用いて化学的に架橋させることを含む。（たとえば欧州特許出願第０４５３０８２号を参照されたい。）
【００７１】
他の方法としては、識別および選択可能なマーカーをレトロウイルス由来のシャトルベクターを介して、それぞれの親ハイブリドーマに遺伝子をトランスフェクトし、続いて融合することによって（ＤｅＭｏｎｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９０，８７：２９４１−２９４５）；または異なる抗体の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含む発現プラスミドを用いてハイブリドーマ細胞系をトランスフェクトすることによってハイブリッドハイブリドーマの作製効率を向上させることを含む。
【００７２】
同族のＶHドメインおよびＶLドメインは、適切な組成物および長さ（通常、１２超のアミノ酸残基から成る）のペプチドリンカーで結合され、結合活性によって一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することができる。ｓｃＦｖの製造法は、米国特許第４，９４６，７７８号および米国特許第５，１３２，４０５号に開示されており、それぞれの実施例セクションは参考として本明細書で援用される。ペプチドリンカーの長さを１２未満のアミノ酸残基に減少させると、同じ鎖上でのＶHドメインとＶLドメインの対形成を阻止し、他の鎖上での相補的なドメインによるＶHドメインとＶLドメインの対形成を強制し、機能性多量体の形成をもたらす。３〜１２のアミノ酸残基がリンカーで結合されているＶHドメインとＶLドメインのポリペプチド鎖は、主に二量体（二機能性抗体と称される）を形成する。０〜２のアミノ酸残基がリンカーで結合されている、三量体（三機能性抗体と称される）と四量体（四機能性抗体と称される）が好ましいが、オリゴマー形成の正確なパターンは、リンカーの長さに加えて、組成物ならびにＶドメインの配向性（ＶH−リンカー−ＶLまたはＶL−リンカー−ＶH）に依存するようである。
【００７３】
多重特異性抗体または二重特異性抗体を作製するためのこれらの技法は、低収率、精製の必要性、低安定性または作業集約型技法の点から種々の問題点を示す。「ドックロック」（ＤＮＬ）として知られる、最近の技法を利用して、実質的にどのような所望の抗体、抗体フラグメントおよび他のエフェクター分子の組み合わせを作製する（たとえば、米国特許出願公開第２００６０２２８３５７号（現在、米国特許第７，５５０，１４３号を発行）；第２００６０２２８３００号（現在、米国特許第７，５２１，０５６号を発行）；第２００７００８６９４２号（現在、米国特許第７，５３４，８６６号を発行）；第２００７０１４０９６６号（現在、米国特許第７，５２７，７８７号を発行）；第２００７０２６４２６５号および第２００９００６０８６２号ならびに２００９年４月８日出願の米国特許出願第１２／４１８，８７７号。これらの特許のそれぞれの実施例セクションは参考として本明細書で援用される）。この技法は、アンカードメインと称される相補的タンパク質結合ドメインおよび二量体形成ドメインならびにドッキングドメインを利用する。これらは互いに結合して、二量体から三量体、四量体、五量体および六量体に及ぶ複合構造の構築を可能にする。これらは、大量の精製を必要とせず、高収率で安定な複合体を形成する。ＤＮＬ技法は、裸の抗体部分として、または免疫刺激剤、酵素、化学療法剤、ケモカイン、サイトカイン、診断薬、治療薬、放射性核種、造影剤、血管新生阻害剤、増殖因子、オリゴヌクレオチド、ホルモン類、ペプチド、毒素、アポトーシス促進剤、もしくはそれらの組み合わせなどの広範な他のエフェクター分子との組み合わせとしてのいずれかで、単一特異性抗体、二重特異性抗体、または多重特異性抗体の構築を可能にする。二重特異性抗体または多重特異性抗体を作製するための当該技術分野で既知のどのような技法も、現在特許請求する方法を実施する際に利用することができる。
【００７４】
プレターゲッティング
二重特異性抗体または多重特異性抗体を、プレターゲッティング技法で利用してもよい。プレターゲッティングは当初は、直接、抗体を標的設定する遅い血液クリアランスを解決するために開発された多段階方法である。この遅れは骨髄など正常組織に対する望ましくない毒性の一因となる。プレターゲッティングによって、血液から数分内に除去される小型の送達分子（標的可能な構築体または標的可能な複合体）に、放射性核種または他の治療薬を付着させる。標的可能な構築体ならびに標的抗原との結合部位を有するプレターゲッティング二重特異性抗体または多重特異性抗体が最初に投与されることで、遊離抗体が血液循環から除去され、次いで標的可能な構築体が投与される。
【００７５】
プレターゲッティング法は、当該技術分野で周知の方法であり、たとえばＧｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８６３，７１３号；Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：２２６，１９８８；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：１２９４，１９８７；Ｏｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：７２８，１９８８；Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：１９５１，１９８８；Ｓｉｎｉｔｓｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３０：６６，１９８９；Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：１７９１，１９９０；Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４８：１６７，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５９６０，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：２１１，１９９１；米国特許第５，２５６，３９５号；Ｓｔｉｃｋｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６６５０，１９９１；Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３１１９，１９９１；米国特許第６，０７７，４９９号；米国特許出願第０９／５９７，５８０号；米国特許出願第１０／３６１，０２６号；米国特許出願第０９／３３７，７５６号；米国特許出願第０９／８２３，７４６号；米国特許出願第１０／１１６，１１６号；米国特許出願第０９／３８２，１８６号；米国特許出願第１０／１５０，６５４号；米国特許第６，０９０，３８１号；米国特許第６，４７２，５１１号；米国特許出願第１０／１１４，３１５；米国特許仮出願第６０／３８６，４１１号；米国特許仮出願第６０／３４５，６４１号；米国特許仮出願第６０／３３２８，８３５号；米国特許仮出願第６０／４２６，３７９号；米国特許出願第０９／８２３，７４６；米国特許出願第０９／３３７，７５６；米国特許仮出願第６０／３４２，１０３号；および米国特許第６，９６２，７０２号に開示されている。
【００７６】
被験者における疾患または障害を治療または診断するプレターゲッティング法は、以下によってもたらされる：（１）被験者に二重特異性抗体または抗原結合抗体フラグメントを投与すること；（２）被験者に除去組成物を随意に投与して、該組成物が血液循環から該抗体を除去するのを可能にすること；および（３）１つ以上のキレート化したもしくは化学結合した治療薬または診断薬を含む標的可能な構築体を被験者に投与すること。標的可能な構築体に複合された酵素を投与し、該酵素によって活性型に変えられるプロドラッグを投与することによって、この技法を抗体依存性酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）に利用してもよい。
【００７７】
治療薬および診断薬
いくつかの実施形態において、本明細書に記述する抗体、抗原結合抗体フラグメントまたは融合タンパク質は、「裸の」抗体、その抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質として、単体で投与されることができる。代替実施形態では、少なくとも１つの他の治療薬の投与前に、投与と同時に、または投与後に、この抗体、抗原結合抗体フラグメントまたは融合タンパク質を投与してもよい。他の代替実施形態において、抗体、その抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質は、免疫複合体を形成するために、少なくとも１つの治療薬および／または診断薬に、共有結合的にまたは非共有結合的に付着されてもよい。
【００７８】
診断薬は、放射性核種、放射線学的造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光ラベル、化学発光ラベル、超音波造影剤および光活性化剤からなる群から選択されることが好ましい。この診断薬は周知であり、この既知の診断薬のいずれを用いてもよい。診断薬の非限定的な例としては、110Ｉｎ、111Ｉｎ、177Ｌｕ、18Ｆ、52Ｆｅ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、86Ｙ、90Ｙ、89Ｚｒ、94mＴｃ、94Ｔｃ、99mＴｃ、120Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、154〜158Ｇｄ、32Ｐ、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、51Ｍｎ、52mＭｎ、55Ｃｏ、72Ａｓ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、82mＲｂ、83Ｓｒ、または他のガンマ放射体、ベータ放射体、もしくは陽電子放射体が挙げられる。使用する常磁性イオンには、クロミウム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）またはエルビウム（ＩＩＩ）が挙げられる。金属造影剤には、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）またはビスマス（ＩＩＩ）が挙げられる。超音波造影剤は、気体充填リポソームなどのリポソームを含んでもよい。放射線不透過性診断薬は、バリウム化合物、ガリウム化合物およびタリウム化合物から選択されてもよい。広範な蛍光ラベルは、当該技術分野において既知であり、以下を含むがこれらに限定されない：フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オルトフタルアルデヒドおよびフルオレサミン。有用な化学発光ラベルとして、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩またはシュウ酸エステルが挙げられる。
【００７９】
治療薬は、放射性核種、免疫刺激剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、オリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、アポトーシス促進剤、光活性化治療薬、細胞傷害性薬物からなる群から選択されることが好ましく、それらは化学療法剤または毒素、第２の抗体もしくはそのフラグメントおよびそれらの組み合わせであってもよい。有用な薬物は、有糸分裂阻止剤、抗キナーゼ、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗生物質、アルカロイド、血管新生阻害剤、アポトーシス促進剤およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤学的特性を有してもよい。
【００８０】
有用で代表的な薬物は、以下を含むがこれらに限定されない：５‐フルオロウラシル、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトセシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトセシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、コックス−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアン−モルフォリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシン・グルクロニド、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エストロジェン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロキシウリジン（ＦＵｄＲ）、３′，５′−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリダミド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチナ、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンカアルカロイド。
【００８１】
有用な毒素には、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）（たとえばオンコナーゼ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスたんぱく質、ゲロニン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、および緑膿菌内毒素が挙げられる。
【００８２】
有用な免疫刺激剤は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポイエチン、トロンボポエチンおよびそれらの組み合わせから選択されてもよい。特に有用なのは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）などの造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、インターフェロン−α、−βまたは−γなどのインターフェロン、および「Ｓ１因子」と名付けられたものなど幹細胞増殖因子である。サイトカインに含まれるのは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；上皮小体ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝細胞増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−αおよび−β；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；骨形成誘導因子；インターフェロン−αおよび−βなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５のようなインターロイキン（ＩＬ）；ＬＩＦ、キットリガンドまたはＦＬＴ−３、Ｆｌｔ−１、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＴＮＦ−αなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ならびにＬＴが挙げられる。本明細書に用いるように、用語サイトカインという用語は自然源由来のまたは組換え細胞培養由来のタンパク質および天然配列サイトカインの生物活性等価物を含む。
【００８３】
有用なケモカインとして、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−βおよびＩＰ−１０が挙げられる。
【００８４】
患部組織の治療に有用な放射性同位元素として以下を含むがこれらに限定されない：111ＩＮ、177Ｌｕ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、211Ａｔ、62Ｃｕ、67Ｃｕ、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、33Ｐ、47Ｓｃ、111Ａｇ、67Ｇａ、142Ｐｒ、153Ｓｍ、161Ｔｂ、166Ｄｙ、166Ｈｏ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、189Ｒｅ、212Ｐｂ、223Ｒａ、225Ａｃ、59Ｆｅ、75Ｓｅ、77Ａｓ、89Ｓｒ、99Ｍｏ、105Ｒｈ、109Ｐｄ、143Ｐｒ、149Ｐｍ、169Ｅｒ、194Ｉｒ、198Ａｕ、199Ａｕおよび211Ｐｂ。治療用放射性核種は、Ａｕｇｅｒエミッタの場合は２０〜６，０００ｋｅＶの範囲、好ましくは６０〜２００ｋｅＶの範囲、ベータエミッタの場合は１００〜２，５００ｋｅｖＶの範囲、アルファエミッタの場合は４，０００〜６，０００ｋｅＶの範囲で崩壊エネルギーを有することが好ましい。有用なベータ粒子放出核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、および最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。また、Ａｕｇｅｒ放出粒子により実質的に崩壊する放射性核種が好ましい。たとえば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、ｌ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍおよびＩｒ−１９２。有用なベータ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは＜１，０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶ、および最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。また、アルファ粒子の生成によって実質的に崩壊する放射性核種が好ましい。これらの放射性核種としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３およびＦｍ−２５５。有用なアルファ粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、および最も好ましくは４，０００−７，０００ｋｅＶである。さらに有用で有望な放射性同位元素として、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、75Ｂｒ、198Ａｕ、224Ａｃ、126Ｉ、133Ｉ、77Ｂｒ、113mＩｎ、95Ｒｕ、97Ｒｕ、103Ｒｕ、105Ｒｕ、107Ｈｇ、203Ｈｇ、121mＴｅ、122mＴｅ、125mＴｅ、165Ｔｍ、167Ｔｍ、168Ｔｍ、197Ｐｔ、109Ｐｄ、105Ｒｈ、142Ｐｒ、143Ｐｒ、161Ｔｂ、166Ｈｏ、199Ａｕ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、51Ｃｒ、59Ｆｅ、75Ｓｅ、201Ｔｌ、225Ａｃ、76Ｂｒ、169Ｙｂ等が挙げられる。一部の有用な診断用核種として、124Ｉ、123Ｉ、131Ｉ、18Ｆ、52Ｆｅ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、67Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、86Ｙ、89Ｚｒ、94Ｔｃ、94mＴｃ、99mＴｃ、または111Ｉｎが挙げられる。
【００８５】
治療薬は、光活性剤または色素を含んでもよい。蛍光色素などの蛍光組成物、および他の色源体、または可視光に感受性のあるポルフィリンなどの色素を用いて、病変に適切な光を向けることによって病変を検出し、治療してきた。治療において、これは光放射、光線療法、または光線力学療法と称されてきた。Ｊｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（編），ＰＨＯＴＯＤＹＮＡＭＩＣ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＯＦ  ＴＵＭＯＲＳ  ＡＮＤ  ＯＴＨＥＲ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ（Ｌｉｂｒｅｒｉａ  Ｐｒｏｇｅｔｔｏ  １９８５）；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈ，Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ（１９８６），２２：４３０を参照されたい。さらに、モノクローナル抗体は光線療法を達成するために、光活性化色素に結合されてきた。Ｍｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８３），１３０：１４７３；（同書），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９８５），４５：４３８０；Ｏｓｅｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６），８３：８７４４；（同書），Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．（１９８７），４６：８３；Ｈａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（１９８９），２８８：４７１；Ｔａｔｓｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｓｅｒｓ  Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ．（１９８９），９：４２２；Ｐｅｌｅｇｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ（１９９１），６７：２５２９を参照されたい。
【００８６】
副腎皮質ホルモンは他の化学療法剤の効果を増加させえ、したがって、併用療法で多用される。プレドニゾンおよびデキサメタゾンは、副腎皮質ホルモンの例である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、血管新生阻害剤は、たとえばアンジオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰｌＧＦペプチドと抗体、抗血管増殖因子抗体、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗Ｆｌｔ−１抗体とペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドチリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサン多硫酸塩、アンジオポエチン−２、インターフェロンα、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチンフラグメント、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンギオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板第４因子またはミノサイクリンが有用であろう。
【００８８】
他の有用な治療薬は、オリゴヌクレオチドを含み、好ましくは癌遺伝子およびＢ細胞悪性腫瘍の癌遺伝子産物（ｂｃｌ−２など）に向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドが特に好ましい。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉとして知られるものが挙げられる。
【００８９】
免疫複合体
本明細書に記述した抗体、抗原結合抗体フラグメントまたは抗体融合タンパク質のいずれも、１つ以上の治療薬もしくは診断薬と複合させてよい。治療薬は同一である必要はなく、たとえば薬物および放射性同位元素など、異なることもあり得る。たとえば、131Ｉは、抗体または融合タンパク質のチロシンおよびリジン残基のεアミノ基に付着した薬物に組み込まれうる。治療薬および診断薬も、たとえば還元型ＳＨ基および／または糖質側鎖に付着させられる。治療薬または診断薬を抗体または融合タンパク質と共有結合複合体または非共有結合複合体にする多くの方法は、当該技術分野で既知であり、そのような既知の方法のいずれも利用することができる。
【００９０】
治療薬または診断薬は、ジスルフィド結合形成を介して還元型抗体成分のヒンジ領域で付着されうる。あるいは、このような薬剤は、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）などのヘテロ二官能性架橋剤を使用することによっても付着されうる。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６：２４４（１９９４）。この複合のための一般的な技法は、当該技術分野で周知である。たとえば、Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，"ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １８７−２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；Ｐｒｉｃｅ，"Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，"ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照されたい。あるいは、治療薬または診断薬は、抗体のＦｃ領域で炭水化物分子を介して複合されうる。炭水化物群を用いてチオール基に結合している同じ薬剤の添加を増加させることができ、またはこの炭水化物分子を用いて異なる治療薬または診断薬を結合することができる。
【００９１】
抗体炭水化物分子を介して抗体成分にペプチドを複合する方法は、当業者に周知である。たとえば、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：８３２（１９８８）；Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１（１９９０）；およびＳｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，０５７，３１３号（参考として本明細書で援用される）を参照されたい。この一般的な方法は、炭水化物分子を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有する担体ポリマーと反応させることを含む。この反応は最初のＳｃｈｉｆｆ塩基（イミン）結合をもたらす。これにより、二級アミンへの還元よって安定化し、最終的な複合体を形成することができる。
【００９２】
免疫複合体の抗体成分として使用される抗体が抗原結合抗体フラグメントである場合、Ｆｃ領域は存在しない可能性がある。しかし、炭水化物分子を完全長抗体または抗原結合性抗体フラグメントの軽鎖可変領域に導入することは可能である。たとえば、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９１９（１９９５）；Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，４４３，９５３号（１９９５），Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第６，２５４，８６８号を参照されたい。各々の特許は参考として本明細書で援用される。操作された炭水化物分子を用いて、治療薬または診断用薬に付着させる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、キレート剤は、抗体、抗原結合性抗体フラグメントもしくは融合タンパク質に、または標的設定可能な構築体に付着されて、放射性核種などの治療薬もしくは診断薬をキレート化するのに用いられる。代表的なキレート剤は以下を含むがこれらに限定されない：Ｍｘ−ＤＴＰＡなどのＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡまたはＮＯＴＡ。金属または他のリガンドをタンパク質に付着させるための複合方法およびキレート剤の使用は、当該技術分野で周知である（たとえば、米国特許出願番号第１２／１１２，２８９号を参照されたい。該特許の実施例セクションは参考として本明細書で援用される）。
【００９４】
いくつかの実施形態において、放射性金属または定磁性イオンは、結合イオンのための多数のキレート基を付着させられる長い尾部を有する試薬との反応によってタンパク質またはペプチドに付着されうる。この尾部は、ポリリシン、多糖、または、たとえばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシム、および本目的に有用であることが知られている基等のキレート基に結合することができるペンダント基を有する誘導体化された鎖もしくは誘導体化可能な鎖などのポリマーであり得る。
【００９５】
キレートは、たとえば米国特許第４，８２４，６５９号（参考として本明細書で援用される）に開示されるように、抗体またはペプチドに直接結合されうる。特に有用な金属−キレート類の組み合わせは、２−ベンジル−ＤＴＰＡおよびそのモノメチルとシクロヘキシル類似体が挙げられ、放射線イメージングのために、125Ｉ、131Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、62Ｃｕ、64Ｃｕ、18Ｆ、111Ｉｎ、67Ｇａ、68Ｇａ、99mＴｃ、94mＴｃ、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、76Ｂｒなど６０〜４，０００ｋｅＶの一般のエネルギー範囲の診断用同位元素と併用される。マンガン、鉄およびガドリニウム等非放射性金属で複合体化されるとき、同様のキレート類は、ＭＲＩにおいて有用となる。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡおよびＴＥＴＡのような大環状キレートは、種々の金属および放射性金属と併用され、最も好ましくはそれぞれガリウム、イットリウムおよび銅の放射性核種と使用される。この金属−キレート複合体は、関心の金属に合わせて環サイズを調整し、非常に安定にすることができる。ＲＡＩＴのための223Ｒａなど安定な結合核種のために興味深い、大環状ポリエーテル等他の環型キレートが包含される。
【００９６】
最近、ＰＥＴスキャン技術において18Ｆ標識を使用する方法、たとえば、アルミニウムなどの金属または他の原子とＦ−１８との反応による方法が開示されている。18Ｆ−Ａｌ複合体は、抗体に直接付着されるかまたはプレターゲッティング方法で標的可能な構築体を標識するために用いられるＤＯＴＡ、ＮＯＴＡもしくはＮＥＴＡなどのキレート基と複合体化されてもよい。このＦ−１８標識技法は、米国特許出願番号第１２／１１２，２８９に開示されており、該特許の実施例セクションは参考として本明細書で援用される。
【００９７】
治療処置方法
種々の実施形態は、ヒト、家畜、コンパニオンペット（イヌおよびネコ）を含む哺乳類などの被験者におけるＢ細胞性リンパ腫もしくは白血病細胞疾患または自己免疫疾患を治療する方法に関し、この方法には該被験者に治療有効量の抗体、その抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質を投与することを含む。好ましい実施形態において、この抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗ＣＤ２０  ＭＡｂである。いくつかの実施形態においは、治療は、それに結合した治療薬を含まない「裸の抗体」を利用することもある。
【００９８】
「裸の」抗ＣＤ２０抗体の投与は、標的細胞の表面上で別の抗原と結合もしくは反応する別の「裸の抗体」の治療有効量を同時にまたは経時的に投与することによって補充されうる。好ましいＭＡｂは、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ６、Ｂ７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、ＶＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−ＩＲ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、テネイシン、ＭＩＦ、補体Ｃ５因子、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓ、ｃＭＥＴ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのヒト化ＭＡｂ、キメラＭＡｂまたはヒトＭＡｂをさらに含む。
【００９９】
単体でもしくは他の裸のＭＡｂとの組み合わせでの裸の抗ＣＤ２０の治療のいずれも、上述のように少なくとも１つの治療薬を同時にまたは経時的に投与することでさらに補充されうる。集学的治療は、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２１、抗ＣＤ７４、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ４５、またはＨＬＡ−ＤＲ（インバリアント鎖を含む）抗体を、裸の抗体、融合タンパク質の形状で、または免疫複合体として投与することで補充される裸の抗ＣＤ２０抗体による治療を含んでよい。免疫複合体は、上述のように１つ以上のどのような治療薬および／または診断薬と複合した抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでもよい。裸の抗ＣＤ２０抗体またはその抗原結合フラグメントは、特定のＢ細胞上で発現するＭＵＣ１抗原に対する裸の抗体で補充されてもよい。抗ＣＤ１９抗体および抗ＣＤ２２抗体等種々の抗体の使用は、当業者に既知である。たとえば、Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６１０（１９８８）；Ｈｅｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３２：３６４（１９９１）；Ｌｏｎｇｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：３５３（１９９６）、米国特許第５，７９８，５５４号；第６，１８７，２８７号；第６，３０６，３９３号；第６，６７６，９２４号；第７，１０９，３０４号；第７，１５１，１６４号；第７，２３０，０８４号；第７，２３０，０８５号；第７，２３８，７８５号；第７，２３８，７８６号；第７，２８２，５６７号；第７，３００，６５５号；第７，３１２，３１８号；および米国特許出願公開第２００８０１３１３６３号；第２００８００８９８３８号；第２００７０１７２９２０号；第２００６０１９３８６５号；第２００６０２１０４７５号；第２００８０１３８３３３号；および第２００８０１４６７８４号を参照されたい。各々の特許または特許出願の実施例のセクションは、参考として本明細書で援用される。
【０１００】
集学的療法の別の形態では、被験者は、標準的な癌化学療法と併せて、裸の抗ＣＤ２０抗体および／または免疫複合体を投与される。たとえば、「ＣＶＢ」（１．５ｇ／ｍ2シクロホスファミド、２００〜４００ｍｇ／ｍ2エトポシド、および１５０〜２００ｍｇ／ｍ2カルムスチン）は、非ホジキンリンパ腫を治療するのに用いられるレジメンである。Ｐａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．５１：１８（１９９３）。他の適切な併用化学療法レジメンは、当業者に周知である。たとえば、Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，"ｉｎ  ＣＡＮＣＥＲ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＶＯＬＵＭＥ  ２，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ２０２８−２０６８（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９３）を参照されたい。具体例として、中悪性度の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）治療のための第一世代の化学療法レジメンには、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）ならびにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）が含まれる。有用な第二世代の化学療法レジメンは、ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキセート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾンおよびロイコボリン）であリ、適切な第三世代のレジメンは、ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）である。さらなる有用な薬物として、フェニル酪酸塩、ベンダムスチン、およびブリオスタチン−１が挙げられる。好ましい集学的療法では、化学療法薬およびサイトカインのいずれも、抗体、免疫複合体または融合タンパク質と共投与され、好ましくは抗ＣＤ２０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。通常、共投与は、抗体および治療薬など２つ以上の薬剤の同時投与をいう。サイトカイン、化学療法薬および抗体または免疫複合体は、どのような順序でも、または一緒に投与されてもよい。
【０１０１】
免疫複合体または裸の抗体は、薬学的に有用な組成物を製造するために既知の方法によって製剤化されえ、それによって免疫複合体または裸の抗体は、混合物として薬学的に適切な賦形剤と組み合わせられる。無菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に適切な賦形剤の一例である。他の適切な賦形剤は、当業者に周知である。たとえば、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０），およびＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ′Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）およびその改訂版を参照されたい。
【０１０２】
免疫複合体または裸の抗体は、たとえばボーラス注射または持続注入を介する静脈内投与用に製剤化されうる。好ましくは、この抗体は約４時間未満にわたって、およびより好ましくは、約３時間未満の時間にわたって注入される。たとえば、最初の２５〜５０ｍｇは、３０分以内に、好ましくは１５分以内に注入され、残りは次の２〜３時間にわたって注入されてもよい。注射用の製剤は、たとえばアンプル以上回投与用容器で、添加された保存剤を含む単位剤形であってよい。組成物は、油性溶媒または水性溶媒中の懸濁剤、溶液剤または乳剤などの形状をとってよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有することができる。あるいは、有効成分は、使用前に、無菌の発熱性物質除去蒸留水などの適切な溶媒との組成のための粉末形態であり得る。
【０１０３】
さらなる製薬方法を用いて、治療用または診断用の複合体もしくは裸の抗体の作用持続時間を制御することができる。免疫複合体または裸の抗体を複合体化するまたは吸着するために、ポリマーを用いることによって徐放製剤を調製することができる。たとえば、生体適合性ポリマーには、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）のマトリックスおよびステアリン酸二量体とセバシン酸のポリ酸無水物共重合体のマトリックスが含まれる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４４６（１９９２）。免疫複合体またはそのようなマトリックス由来の抗体の放出速度は、免疫複合体または抗体の分子量、免疫複合体の量、マトリックス内の抗体、および分散粒子径に依る。Ｓａｌｔｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．．（上記参照）。他の固体剤形は、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０），およびＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ′Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、その改訂版に記載がある。
【０１０４】
免疫複合体、抗体融合タンパク質、または裸の抗体は、皮下経路もしくは他の非経口経路で、哺乳類に投与されてもよい。さらに、この投与は持続注入による、または、単回もしくは複数回のボーラスによるものであってもよい。好ましくは、この抗体は約４時間未満の時間にわたって、およびより好ましくは、約３時間未満にわたって注入される。最初はゆっくり注入することが好ましい。たとえば、２５〜５０ｍｇの用量は１５〜３０分以内に注入され、用量の残りは最長２〜３時間にわたって注入される。
【０１０５】
通常、ヒトに投与される免疫複合体、融合タンパク質または裸の抗体の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身病状および病歴などの要素により変化する。ベルツズマブより有効性の低い治療用抗体を用いて、単回静脈注入として約１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇまでの範囲にある免疫複合体、抗体融合タンパク質または裸の抗体の投与量をレシピエントに供給することが望ましいこともあるが、状況に応じてより低いまたはより高い投与量が投与されることもある。投与量は、１〜２０、５〜１０、２〜１０、１０〜２０、５〜１５、１〜１０、１〜５、２〜５ｍｇ／ｋｇまたは１〜２０ｍｇ／ｋｇのどのような範囲にわたってもよい。この投与量は必要に応じて、たとえば４〜１０週間は毎週１回、８週間は毎週１回、４週間は毎週１回、２〜８週間は毎週２回または３回繰り返されてもよい。維持療法の必要に応じて、投与は、数カ月間は隔週、または何カ月間は毎月１回もしくは３カ月ごとに１回など、より低い頻度で与えられてもよい。
【０１０６】
あるいは、裸の抗ＣＤ２０ＭＡｂなどの抗体は、２または３週ごとに１つの投与量として投与され、合計少なくとも３つの投与量で繰り返されてもよい。また、抗体は４〜８週間の間は毎週１回投与されてもよい。投与量を約２００〜３００ｍｇ／ｍ2（１．７−ｍ2患者に対して１投与につき３４０ｍｇ、または７０ｋｇの患者に対して４．９ｍｇ／ｋｇ）まで下げる場合、この投与量は４〜８週間は毎週１回投与されてもよい。あるいは、投与計画は減少させてもよい、すなわち２〜３カ月間は２または３週ごとにする。投薬計画は、場合により他の間隔で繰り返してよく、投与量を投与回数および計画を適切に調整することで、種々の非経口経路を介して与えてもよい。
【０１０７】
代表的な実施形態では、ＮＨＬまたは自己免疫疾患は、ヒト化抗ＣＤ２０抗体の毎週４回の注入を毎週１００〜４００ｍｇ／ｍ2の用量で（２〜６時間にわたるｉ．ｖ．（静脈内））で４週連続、治療され、必要に応じて翌月／翌年にわたり繰り返されてもよい。あるいは、ヒト化抗ＣＤ２０抗体は、隔週または３週間おきに１回、１００〜３００ｍｇ／ｍ2の用量で、４から８回の注射で投与されてもよい。別の代替実施形態では、ＮＨＬは、上述のように毎週４回の注入によって、または上述のようにより少ない頻度の注射によって治療されうるが、同じ日にエプラツズマブ（抗ＣＤ２２ヒト化抗体）と併用して、３６０ｍｇ／ｍ2の用量で、１時間にわたるｉ．ｖ．（静脈内）注入として、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の注入前、注入または注入後のいずれかに与える。または、併用療法で用いられる複数の抗体は、それらの抗体が異なる週代わり、各抗体の４から８以上の投与回数の全注射順が、結果として各抗体が隔週与えられるように代替順番で注入されてもよい。これらの投与計画は、次いで患者の臨床状態および各療法レジメンへの反応に応じて、３〜６カ月など異なる間隔で繰り返されてもよい。さらなる代替案では、ＮＨＬは、イットリウム９０などの治療用同位元素で放射標識したＣＤ２２ＭＡｂの１回以上の注射と併用して（数週または数カ月間にわたり１回以上の注射として、５〜３５ｍＣｉ／ｍ2のＹ−９０総線量で）、抗ＣＤ２０抗体を毎週４回、またはより低い頻度で注入することで治療されうる。米国特許番号第０９／５９０，２８４号（参考として本明細書で援用される）は、抗ＣＤ２２抗体を用いた自己免疫不全の免疫療法を開示する。
【０１０８】
好ましい実施形態において、ベルツズマブなどの、特に有効であるように操作された、裸の抗体または複合型抗ＣＤ２０抗体は、Ｂ細胞性リンパ腫もしくは白血病、全身性エリテマトーデス、濾胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫もしくは免疫性血小板減少性紫斑病、または尋常天疱瘡などのＢ細胞疾患、ならびにＧＶＨＤ、溶血性貧血、クリオグロブリン血症、同種感作などの免疫疾患、および臓器移植拒絶反応などの疾患の治療のために極めて低い投与量で投与されうる。以下の実施例に記述するように、ヒト被験者に投与されるとき、最低８０ｍｇ以下の用量のベルツズマブ、より好ましくは５０ｍｇ以下、最も好ましくは３０ｍｇ以下の低用量が有効であり得る。そのような投与量は、好ましくは、約１から３週間の間隔で２回以上被験者に投与されてもよく、および数週間にわたり続けてもよい分割投与（たとえば慢性リンパ性白血病などの特定の疾患において好まれることがある）などで、毎週１回超、たとえば毎週２回または３回与えられてもよい。驚くべきことに、ベルツズマブなどの高度に有効な抗ＣＤ２０抗体のこのような低用量が、循環Ｂ細胞を激減させおよび／またはＢ細胞関連腫瘍の増殖を阻害するために効果的であることがわかった。低用量抗ＣＤ２０抗体の投与は、静脈または皮下送達によることが好ましい。
【０１０９】
以下の実施例で説明するように、ベルツズマブの低用量投与のための好ましいプロトコルは、特許請求する方法を実行する際に有効であり、利用できる。たとえば、バーキットリンパ腫のマウスモデル系において、２０ｇｍマウスあたり５μｇと低量のベルツズマブの単回ｉ．ｐ．（腹腔内）またはｓ．ｃ．（皮下）注射は、対照（実施例１３）と比較して、死亡率に有意の減少をもたらした。７０ｋｇのヒトに５μｇ投与する場合を推定量することは、ベルツズマブ１７．５ｍｇの単回注射に等しい。２０μｇベルツズマブ（７０ｋｇの個人に対しての７０ｍｇに等しい）のより高いマウス投与量は、単回ｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．注射として投与され、平均生存時間において４倍の増加をもたらした（実施例１３）。最低０．０５μｇという単回用量のマウスでの投与量（７０ｋｇの個人に対しての０．１７５ｍｇに等しい）もなお、平均生存時間の２倍の増加と、対照と比較して生存時間において有意な改善をもたらした。この低投与量は対照と比較して有意な改善をもたらすが、Ｂ細胞関連疾患の効果的な治療は、良好な治療効果のためにいくらか高い投与量を使用してもよい。非限定的な例として、８０ｍｇベルツズマブｉ．ｖ．を２週間間隔で２回投与（実施例１５）、１３８ｍｇ（８０ｍｇ／ｍ2）ベルツマブｉ．ｖ．を週１回で４回投与（実施例１５）、８０ｍｇベルツズマブｓ．ｃ．を２週間間隔で４回投与（実施例１５）、８０ｍｇ／ｍ2ベルツズマスｉ．ｖ．を毎週４回投与（実施例１５）、１０ｍｇベルツズマブｓ．ｃ．を２週間間隔で２回投与（実施例１７）、４０ｍｇベルツズマブｓ．ｃ．を毎週２回投与で６週間（実施例１８）、４０ｍｇベルツズマブｓ．ｃ．を２週間隔で２回投与（実施例１９）、１２０ｍｇベルツズマブｓ．ｃ．を毎週３回投与（実施例２０）、１５ｍｇベルツズマブの初回ｉ．ｖ．注射に続いて４０ｍｇ  ｓ．ｃ．を毎週１回、３週間（実施例２１）、４０ｍｇベルツズマブのｓ．ｃ．注射を４回、０日目、８日目、１２日目および２１日目に投与（実施例２２）および８０ｍｇベルツズマブのｓ．ｃ．注射を２週間隔で４回投与（実施例１６）が挙げられる。後者（実施例１６）の場合、８０ｍｇベルツズマブの単回ｓ．ｃ．注射が、腫瘍頚部腫瘤の有意な退行および循環Ｂ細胞の急速な減少をもたらしたことは、注目に値する。実施例２４は、低用量８０ｍｇ／ｍ2のベルツズマブを週１回、４回投与によって、少なくともＮＨＬヒト患者の一部において完全寛解をもたらしたことを示している。
【０１１０】
当業者は、ベルツズマブの開示された投与量が代表的なものだけであり、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ｍｇのベルツズマブ（全用量）、または５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ｍｇ／ｍ2のベルツズマブ（ｉ．ｖ．投与、またはより好ましくはｓ．ｃ．投与）などの、他の非限定的な投与量が、特許請求する方法を実行する際に利用してよいことを理解する。いくつかの実施形態において、潜在的に有用なベルツズマブの範囲は、１０〜１８０、１０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、３０〜６０ｍｇ、４０〜５０ｍｇもしくは他のいかなる範囲の投与量で、ｓ．ｃ、ｉ．ｖ．もしくは他の非経口注射のために調剤された薬剤充填済み注射器もしくは自動注射ペンの形態で提供されてもよい。
【０１１１】
ｓ．ｃ．、ｉ．ｖ．もしくはｉ．ｐ．投与用の低用量ベルツズマブの代表的な範囲は、１ｍｇ未満、１〜２ｍｇ、１〜５ｍｇ、１〜１０ｍｇ、１〜２０ｍｇ、１〜５０ｍｇ、１〜７５ｍｇ、１〜１００ｍｇ、２〜５ｍｇ、２〜１０ｍｇ、２〜２０ｍｇ、２〜５０ｍｇ、２〜７５ｍｇ、２〜１００ｍｇ、５〜１０ｍｇ、５〜２０ｍｇ、５〜３０ｍｇ、５〜４０ｍｇ、５〜５０ｍｇ、５〜６０ｍｇ、５〜７５ｍｇ、５〜１００ｍｇ、１０〜２０ｍｇ、１０〜３０ｍｇ、１０〜４０ｍｇ、１０〜５０ｍｇ、１０〜６０ｍｇ、１０〜７５ｍｇ、１０〜１００ｍｇ、２０〜３０ｍｇ、２０〜４０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、２０〜６０ｍｇ、２０〜７５ｍｇ、２０〜１００ｍｇ、２５〜４０ｍｇ、２５〜５０ｍｇ、２５〜６０ｍｇ、２５〜７５ｍｇ、２５〜１００ｍｇ、３０〜４０ｍｇ、３０〜５０ｍｇ、３０〜６０ｍｇ、３０〜７５ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、４０〜５０ｍｇ、４０〜６０ｍｇ、４０〜７５ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜６０ｍｇ、５０〜７５ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜７０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、６０〜９０ｍｇ、６０〜１００ｍｇまたは７５〜１００ｍｇであってよい。あるいは、ｍｇ／ｍ2の同じ範囲を、ヒト被験者に投与してもよい。以下の実施例で述べるように、ベルツズマブのこの低用量は、少なくとも動物モデル系およびＢ細胞関連の白血病もしくはリンパ腫または自己免疫疾患、または他の免疫疾患を有する一部の代表的な被験者において効果的であることが示されている。
【０１１２】
本明細書に記述する組成物は、無痛性Ｂ細胞リンパ腫、侵襲性Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症と同様に種々の自己免疫疾患、ならびにＧＶＨＤ、クリオグロブリン血症、溶血性貧血、同種感作、および臓器移植拒絶反応の治療に特に有用である。たとえば、ヒト化抗ＣＤ２０抗体成分および免疫複合体を用いて、無痛性および侵襲性非ホジキンリンパ腫、種々の自己免疫疾患（たとえば、関節リウマチ、ＳＬＥ、シェーグレン症候群、尋常天疱瘡、免疫性血小板減少性紫斑病）、および種々の他の免疫疾患（腎臓と心臓拒絶反応など臓器移植拒絶反応、同種幹細胞移植後のＧＶＨＤ、および免疫性溶血性貧血）を治療することができる。
【０１１３】
上記のように、抗体は、Ｂ細胞リンパ腫および白血病、ならびに他のＢ細胞疾患または障害を治療するために用いられる。標的設定されうる代表的な癌の種類として、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫が挙げられる。
【０１１４】
抗ＣＤ２０抗体を用いて、免疫介在血小板減少症（急性特発性血小板減少性紫斑病および慢性特発性血小板減少性紫斑病）、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、関節リウマチ、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘーノッホ−シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常天疱瘡、ヴェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および線維化性肺胞炎等、クラスＩＩＩ自己免疫疾患を含むＢ細胞関連の自己免疫疾患を治療することができる。
【０１１５】
抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤ２０抗原を発現する細胞で、アポトーシスを誘発することもある。たとえば、アポトーシスは、架橋されるＣＤ２０  ＭＡｂのＩｇＧ１−Ｆｃと反応するＦｃ受容体を有するリンパ球系細胞を用いることで誘発され得ることが示された。Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４８（１２）：６７３−６８３（２０００）を参照されたい。さらに、キメラＣＤ２０  ＭＡｂ、すなわちホモポリマーの凝集体がアポトーシスを誘発することが報告された。Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９７（５）：１３９２−１３９８（２０００）およびＧｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４（１４）：７５０９−７５１４（１９９７）を参照されたい。
【０１１６】
キット
種々の実施形態は、患者における患部組織の治療または診断に適した成分を含むキットに関することがある。代表的なキットは、本明細書に記述するように、少なくとも１つの抗体、抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質を含んでもよい。投与のための成分を含む組成物が、経口送達によるなど消化管を介する送達用に製剤化されない場合、別の経路を介してキット成分を送達しうる装置を含むこともできる。非経口送達などの適用の場合、装置の１つの種類は、組成物を被験者の体内に注射するために用いられる注射器である。吸入装置を用いてもよい。いくつかの実施形態において、ベルツズマブなどの抗ＣＤ２０抗体またはその抗原結合フラグメントは、無菌の液剤または抗体の凍結乾燥製剤を含む薬剤充填済み注射器または自動注射ペンの形態で提供されてもよい（たとえば、Ｋｉｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２００６，２８：１６１９−２９）。
【０１１７】
キット成分を、一緒に包装する、または２つ以上の容器に分けてもよい。一部の実施形態では、この容器は、再構成に適した組成物の無菌の凍結乾燥製剤を含むバイアルであってもよい。キットは、また、再構成に適した１つ以上の緩衝剤および／または他の試薬の希釈物を含んでもよい。用いてもよい他の容器には、ポーチ、トレー、箱、管等が挙げられるがこれらに限定されない。キット成分を、包装しても、容器内に無菌で保持してもよい。キット使用者向けの説明書を含めてもよい。
【０１１８】
発現ベクター
さらに他の実施形態は、抗体、その抗原結合フラグメント、融合タンパク質または二重特異性抗体をコードする核酸を含むＤＮＡ配列に関することがある。コードされて発現されうる代表的な配列として、抗ＣＤ２０  ＭＡｂもしくはその抗原結合フラグメント、少なくとも１つの抗ＣＤ２０抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質、少なくとも１つの第１の抗体もしくはその抗原結合フラグメントおよび少なくとも１つの第２の抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質が挙げられる。第１の抗体および第２の抗体は、Ｂ７、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ６、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＩＦ、ＮＣＡ−６６、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３，テネイシン、補体因子Ｃ５、癌遺伝子産物、Ｋｒａｓ、ｃＭＥＴ、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、および／または標的設定可能な構築体上のハプテンなどの抗ＣＤ２０抗体、腫瘍またはＢ細胞関連抗原に対する抗体を含んでもよい。
【０１１９】
種々の実施形態は、コードＤＮＡ配列を含む発現ベクターに関する。このベクターは、キメラ、ヒト化もしくはヒト可変領域配列が結合されうる、ヒト免疫グロブリンの軽鎖定常領域および重鎖定常領域ならびにヒンジ領域をコードする配列を含んでもよい。ベクターは、選択した宿主細内でＭＡｂを発現させるプロモーター、免疫グロブリンエンハンサーおよびシグナル配列またはリーダー配列をさらに含んでもよい。特に有用なベクターは、ｐｄＨＬ２またはＧＳである。より好ましくは、軽鎖定常領域および重鎖定常領域ならびにヒンジ領域が、ヒトＥＵ骨髄腫免疫グロブリンに由来してよく、アロタイプ部位で少なくとも１つのアミノ酸が、異なるＩｇＧ１アロタイプに見られるアミノ酸に随意に変えられ、かつＥＵ番号付与体系に基づくＥＵの重鎖のアミノ酸２５３が場合によりアラニンと置換されてもよい。Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５（１９６９）を参照されたい。
【０１２０】
また、抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質を発現させる方法を包含する。改変タンパク質を発現させるために発現構築体を遺伝子改変し、宿主細胞へ挿入する方法は当該技術分野で周知であり、日常的な実験の問題であると、当業者は理解する。宿主細胞およびクローン化抗体または抗原結合フラグメントの発現方法は、たとえば米国特許出願番号第１１／１８７，８６３号（７／２５／０５提出）；第１１／２５３，６６６号（１０／２０／０５提出）および第１１／４８７，２１５号（７／１４／０６提出）に記載されており、各特許出願の実施例セクションは参考として本明細書で援用される。
【０１２１】
抗ＣＤ２０抗体の構築のための一般的技法
抗ＣＤ２０抗体のためのＶκ（可変軽鎖）およびＶH（可変重鎖）配列は、ＲＴ−ＰＣＲ，５′−ＲＡＣＥおよびｃＤＮＡライブラリースクリーニングなどの種々の分子クローニング方法によって得られる。具体的には、マウス抗ＣＤ２０  ＭＡｂを発現するある細胞に由来する抗ＣＤ２０  ＭＡｂのＶ遺伝子は、ＰＣＲ増幅によってクローン化され、配列決定されうる。Ｖ遺伝子の確実性を確認するために、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８６：３８３３（１９８９）に記述されているように、クローン化ＶLおよびＶH遺伝子は、キメラ抗体として細胞培養中で発現し得る。Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５）に記述されるように、Ｖ遺伝子配列に基づいて、ヒト化抗ＣＤ２０  ＭＡｂは、設計され、構築されうる。
【０１２２】
マウス抗ＣＤ２０  ＭＡｂを産生するいかなる既知のハイブリドーマ系列または形質移入細胞系からもｃＤＮＡは一般の分子クローン技術によって調製されうる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２nd  Ｅｄ（１９８９））。ＭＡｂのためのＶκ配列は、プライマーＶＫ１ＢＡＣＫおよびＶＫ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）またはＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５：２８６（１９９３））によって記述される伸長プライマーセットを用いて増幅することができる。ＶH配列は、プライマー対ＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨＩＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）またはＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））によって記述されるマウスＩｇＧの定常領域にアニーリングするプライマーを用いて増幅することができる。
【０１２３】
第１ストランドｃＤＮＡ産物を１０μＬ、１０ＸＰＣＲ緩衝液を１０μＬ［５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、ｄＮＴＰ、２００ｎＭのプライマーを各２５０μＭ、およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）を５単位含有するＰＣＲ反応混合物に対して３０サイクルのＰＣＲを行なうことができる。各ＰＣＲサイクルは、９４℃で１分間の変性、５０℃で１．５分間のアニーリング、および７２℃で１．５分間の重合で構成されることが好ましい。増幅したＶκおよびＶＨのフラグメントは２％アガロース上で精製することができる（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）。Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））によって記述されるように、ヒト化Ｖ遺伝子は長いオリゴヌクレオチド鋳型合成とＰＣＲ増幅の組み合わせによって構築することができる。
【０１２４】
ＶκのＰＣＲ産物は、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列およびＶκ  ＰＣＲ産物のインフレームライゲーションを容易にする便利な制限酵素認識部位を含む、ｐＢＲ３２７に基づくステージングベクター、ＶＫｐＢＲなどのステージングベクター中にサブクローニングすることができる。ＶHのＰＣＲ産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づくＶＨｐＢＳなど同様のステージングベクター中にサブクローニングすることができる。それぞれのＰＣＲ産物を含んでいる個々のクローンは、たとえばＳａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４：５４６３（１９７７））の方法によって配列決定してもよい。
【０１２５】
Ｖκ配列およびＶH配列を含む発現カセットは、プロモーター配列およびシグナルペプチド配列と共に、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして二重制限消化によってそれぞれ、ＶＫｐＢＲおよびＶＨｐＢＳから切除されうる。このＶκおよびＶHの発現カセットは、それぞれ、ｐＫｈおよびｐＧ１ｇなど適切な発現ベクターに連結することができる（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））。発現ベクターは、たとえば骨髄腫Ｓｐ２／０−Ａｇｌ４（ＡＴＣＣ、ＶＡ）の適切な細胞に同時導入されえ、ハイグロマイシン耐性に関してコロニーを選択し、およびキメラ、ヒト化またはヒト抗ＣＤ２０  ＭＡｂの産生に関してたとえばＥＬＩＳＡアッセイによって上澄みをモニタリングする。あるいは、Ｇｉｌｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９）によって記述され、およびＬｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，８０：２６６０（１９９７）にも示されているように、ＶκおよびＶＨ発現カセットを、修飾したステージングベクター、ＶＫｐＢＲ２およびＶＨｐＢＳ２中で組み立て、それぞれ、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントおよびＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして切除し、ｐｄＨＬ２など単一の発現ベクター中にサブクローニングすることができる。Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２：１０９−１２３（２０００）に記述されるように、有用な別のベクターは、ＧＳベクターである。他の適切な哺乳類発現系は、Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．４８（ＩＩ），Ｎｒ．８，８７０−８８０（１９９８）に記述されている。
【０１２６】
同時トランスフェクションおよびＥＬＩＳＡによる抗体分泌クローンに関するアッセイは、以下のように行なうことができる。Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１１４９（１９９２）に従って５×１０6ＳＰ２／０骨髄腫細胞をエレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）によってトランスフェクトするために、約１０μｇのＶＫｐＫｈ（軽鎖発現ベクター）および２０μｇのＶＨｐＧ１ｇ（重鎖発現ベクター）を用いることができる。トランスフェクトした後、細胞を３７℃、５％ＣＯ2で、９６ウェルのマイクロタイタープレートで完全ＨＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で増殖させてもよい。選択プロセスは２日後、ハイグロマイシン選択培地（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、５００単位／ｍＬのハイグロマイシンの最終濃度で加えることによって、開始することができる。コロニーは、通常、エレクトロポレーションから２〜３週間後に出現する。次いでこの培養物をさらなる分析のために成長させることができる。キメラ重鎖、ヒト化重鎖またはヒト重鎖の分泌に陽性のトランスフェクトーマクローンをＥＬＩＳＡアッセイによって同定することができる。
【０１２７】
抗体は、以下のように細胞培地から単離することができる。トランスフェクトーマ培養物は、無血清培地に適応している。キメラ抗体を作製するために、ＨＳＦＭを用いることによってローラーボトル中で５００ｍＬの培養物として細胞を増殖させる。培養物を遠心分離し、上清を０．２μ膜で濾過する。濾過した培地を、１ｍＬ／分の流速で、タンパク質Ａカラム（１×３ｃｍ）に通過させる。次いで、この樹脂を約１０カラム容積のＰＢＳで洗浄して、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．５）によってタンパク質Ａ結合抗体をカラムから溶出させた。１．０ｍＬの画分を、１０μＬの３Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）を含む管に収集し、タンパク質濃度を、２８０／２６０ｎｍの吸光度で測定した。ピーク画分をプールして、ＰＢＳに対して透析し、抗体を、たとえばＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ３０（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で濃縮する。抗体濃度をＥＬＩＳＡによって測定し、ＰＢＳを用いて約１ｍｇ／ｍＬに調整する。好都合にはアジ化ナトリウム（０．０１％（ｗ／ｖ））を、保存剤として試料に加える。
【０１２８】
実施例
実施例１．キメラ抗ＣＤ２０抗体およびヒト化抗ＣＤ２０抗体の構築
キメラ（ｃＡ２０）およびヒト化（ｈＡ２０，ベルツズマブ）抗ＣＤ２０抗体の構築を、米国特許第７，１５１，１６４号に記述されるように実施した。該特許の実施例セクションは参考として本明細書で援用される。（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４；１０：２８６８−２８７８を参照されたい。）ｃＡ２０およびｈＡ２０の可変領域ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列をそれぞれ、図１および図２に開示する。
【０１２９】
ｃＡ２０およびｈＡ２０のＣＤＲ配列は、重鎖の第３のＣＤＲ（ＣＤＲＨ３）を除いて、リツキシマブ（親マウスＭＡｂＣ２Ｂ８）のＣＤＲ配列と同一である。便宜上、重鎖ＣＤＲ配列は、ＣＤＲＨ１−Ｈ３と、および軽鎖ＣＤＲはＣＤＲＬ１−Ｌ３と呼ぶ。抗ＣＤ２０抗体に関して報告されているＣＤＲＨ３配列のうち、Ｃ２Ｂ８および対応するリツキシマブのみ、カバット１０１位にアスパラギン残基を有する。
【０１３０】
ベルツズマブ（ｈＡ２０）のフレームワーク領域配列を、ヒト化抗ＣＤ２２抗体エプラツズマブ（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５；３２：１４１３−１４２７）と同じヒトＩｇＧドナーフレームワーク領域（ＦＲ）を用いて構築した。具体的には、ヒトＥＵ抗体のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびヒトＮＥＷＭ抗体のＦＲ４を重鎖のために選択し、ヒトＲＥＩ抗体のＦＲをヒト化ｈＡ２０抗体の軽鎖のために選択した。米国特許第７，１５１，１６４号に開示されるように、主要なマウス残基をＦＲに保持し、ＣＤ２０に対するベルツズマブの結合特異性と親和性を親マウス抗体のそれと同様に維持した。ｈＡ２０（ｈＡ２０ＶＨ１）の重鎖は、ヒトＥＵフレームワークからの９つの変化を含み、一方ｈＡ２０（ｈＡ２０Ｖκ）の軽鎖は、ＲＥＩフレームワークからの７つのアミノ酸変化を含む（米国特許第７，１５１，１６４号）。
【０１３１】
ｃＡ２０、ｈＡ２０およびリツキシマブ（ｃ２Ｂ８由来）の可変領域配列の比較を図３に示す。図３Ａおよび３Ｂに示すように、ｃＡ２０は、可変フレームワーク領域においてベルツズマブ（ｈＡ２０）とは異なるが、ベルツズマブと同一のＣＤＲを有する。ｃＡ２０のフレームワーク領域配列は、軽鎖のＮ末端側終端部の３つのアミノ酸残基以外は、リツキシマブ（ｃ２Ｂ８）のフレームワーク領域配列と同一であり、リツキシマブおよびベルツズマブのフレームワーク領域配列は、軽鎖で１８残基、重鎖で１４残基が異なる。リツキシマブのＣＤＲ配列は、ＣＤＲ３のＶHのカバット１０１位でのみベルツズマブ（ｈＡ２０）およびｃＡ２０のＣＤＲ配列と異なる。
【０１３２】
以下の実施例で説明するように、ベルツズマブおよびリツキシマブは、ＣＤ２０陽性リンパ腫細胞からの解離速度に関して、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特定の治療特性において有意差がある。特性におけるこれらの変化がフレームワーク配列での相違またはＣＤＲ３のＶHのカバット１０１位でＡｓｎへのＡｓｐの置換に起因したか決定するため、ベルツズマブの変異体（Ｄ１０１Ｎと称される）を、ＣＤＲＨ３の１０１位でアスパラギンへのアスパラギン酸の非保存的な単一アミノ酸変化を用いて操作した。このように、Ｄ１０１Ｎは、ベルツズマブと同一のＦＲであるがリツキシマブと同じＣＤＲを有する。Ｄ１０１Ｎの構造に関するさらなる詳細は、以下に述べる。第１表は、ベルツズマブ、ｃＡ２０、Ｄ１０１Ｎ、リツキシマブ、１Ｆ５のＣＤＲＨ３配列を比較する。これらのすべては同一のＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２配列を有する。
【０１３３】
【表１】
0006049163.tif 000002
【０１３４】
実施例２．ベルツズマブのＤ１０１Ｎ配列変異体の構築
制限酵素および他の酵素すべてをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ，ＵＫ）によって合成された。ＰＣＲ反応は、Ａｍｐｌｉｔａｑポリメラ−ゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  システム  ９６００を用いて実施した。鋳型としてｈＡ２０−ｐｄＨＬ２（米国特許第７，１５１，１６４号を参照されたい）およびオリゴヌクレオチドプライマー対５′Ｄ１０１Ｎ（ｃｇｇｔｇａｃｔｇｇｔａｃｔｔｃａａｔｇｔｃｔｇｇｇｇｃｃａａｇｇｃａｃｃａｃｇ配列番号１７）および３′Ｈｉｎｄ３（ａａａｇｃｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｇａｔｃｃ配列番号１８）または３′Ｄ１０１Ｎ（ｃｇｔｇｇｔｇｃｃｔｔｇｇｃｃｃｃａｇａｃａｔｔｇａａｇ  ｔａｃｃａｇｔｃａｃｃｇ配列番号１９）および５′ＸｈｏＩ（ｃｃｔｃｇａｇｃａｃａｃａｇｇａｃｃｔｃ配列番号２０）を用いる２つのＰＣＲ反応で、それぞれ２１０ｂｐもしくは５１０ｂｐのアンプライマーを作製した。鋳型として２１０ｂｐおよび５１０ｂｐの産物の混合物ならびに５′ＸｈｏＩおよび３′Ｈｉｎｄ３のプライマーを用いる第３のＰＣＲ反応で、６８０ｂｐアンプライマーを作製し、これをゲルで分離し、ｐＧｅｍＴ  ＰＣＲクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローン化した。アンプライマーの配列は、自動ＤＮＡ配列決定によって確認した。６８０ｂｐのフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素でｐＧｅｍＴベクターから切除し、同じ酵素での消化によって調製したｈＡ２０−ｐｄＨＬ２ベクターに連結した。最終的なベクター配列、Ｄ１０１Ｎ−ｈＡ２０−ｐｄＨＬ２を、自動ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１３５】
実施例３．抗ＣＤ２０抗体の結合に関するスキャッチャード分析
細胞系
以下の実施例での、マウスハイブリドーマ１Ｆ５およびヒトバーキットリンパ腫株、Ｄａｕｄｉ、ＲａｊｉおよびＲａｍｏｓを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。使用した非バーキットリンパ腫細胞系は、以下のとおりである：Ｄｒ．Ａｌａｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）のＳＵ−ＤＨＬ−６、およびＤｒ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｓｍｉｔｈ（Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）のＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ。これらの細胞を、１０％のウシ胎児血清、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、およびＬ−グルタミン（２ｍＭ）を補充したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中の懸濁培養物として増殖させた。
【０１３６】
スキャッチャード分析
一Ｒａｊｉ細胞あたりの結合部位の最高数およびベルツズマブとリツキシマブとの見かけ解離定数は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、放射ヨウ素標識した試料およびＲａｊｉ細胞で得た飽和結合データについて非線形回帰分析により決定した。Ｒａｊｉ細胞（５×１０5）を、放射ヨウ素標識したＭＡｂと共に２２５μＬのアッセイ容積で、希釈液として組織培養培地を用いて３７℃または室温で１時間インキュベートした。次いで、１％のウマ血清を含むＰＢＳで細胞を２回洗浄し、細胞ペレットをガンマーカウンターで計数した。このＭＡｂを、約２×１０6  ｃｐｍ／２μｇ  ＭＡｂ／管で開始して、２：３の連続希釈で滴定し、これらの手順を３連で行なった。複製した非標識ＭＡｂを含めることによって、非特異的結合を測定した。抗イディオタイプ抗体に結合させることで測定した、放射標識したＭＡｂの免疫反応性は、９０％以上であった。
【０１３７】
図４に示す結果は、一細胞あたりの結合部位の数および平衡解離定数（関数Ｋd）がともにベルツズマブおよびリツキシマブに関して類似していたことを示す。一Ｒａｊｉ細胞あたりの結合部位の数を、ベルツズマブに対する２．０×１０5〜４．２×１０5対リツキシマブに対する１．８×１０5〜３．６×１０5の範囲で算出した。複製アッセイでは、見かけの解離定数値は、ベルツズマブに対する６．２３〜１２．０２ｎＭ対リツキシマブに対する６．７０〜８．６３ｎＭに及んだ。これらの値は、我々を含め他の研究者によっても以前に報告された値、ならびにリツキシマブに関する処方情報の値に類似する（Ｍｅｌｈｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，２２：４６９−４７９，２００７；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０：２８６８−２８７８，２００４）。
【０１３８】
実施例４．競合的細胞表面結合アッセイ
タンパク質Ａカラム上でアフィニティークロマトグラフィーによって精製した抗ＣＤ２０抗体ｃＡ２０、ｈＡ２０、ｃ１Ｆ５に関するＡｇ（抗原）結合特異性および親和性試験を、マウス２Ｂ８およびリツキシマブ（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて細胞表面競合結合アッセイによって評価した。125Ｉ標識したｍ２Ｂ８またはリツキシマブを一定量（１００，０００ｃｐｍ、約１０μＣｉ／μｇ）、種々の濃度（０．２〜７００ｎＭ）の競合抗体（ｃＡ２０、ｈＡ２０、ｍ２Ｂ８、ｃ１Ｆ５、またはリツキシマブ）の存在下で、Ｒａｊｉ細胞と共に４℃で１〜２時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し非結合抗体を除去した。洗浄後、細胞に結合した放射活性を測定した。結果（図示せず）は、ｃＡ２０、ｈＡ２０、ｃ１Ｆ５のすべてが、リツキシマブ（ｃ２Ｂ８）およびマウス２Ｂ８と、ＣＤ２０との結合において競合したことを示した。
【０１３９】
実施例５．解離または解離速度の比較
ベルツズマブ、リツキシマブ、ｃＡ２０、Ｄ１０１Ｎ、１５Ｆおよびトシツモマブ（抗ＣＤ２０、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）を、Ｄａｕｄｉ、ＲａｊｉおよびＲａｍｏｓ細胞を用いてフローサイトメトリーによって比較した（図５）。各ＭＡｂを、製造者の提案するプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｚ−２５４５５）に従い、Ｚｅｎｏｎ  Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ標識キットを使用して、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識した。１×１０6細胞／ｍＬで、０．５ｍＬのＣＭ（１０％ＦＢＳを補充したフェノールレッドフリーＲＰＭＩ１６４０培地）中の細胞（Ｄａｕｊｉ、ＲａｊｉまたはＲａｍｏｓ）を、５μｇの各ＰＥ標識したＭＡｂと室温で３０分間インキュベートし、４００×ｇでペレット化し、ＣＭで２回洗浄し、１．５ｍＬのＣＭ中で再懸濁させて、０．７５ｍＬの２つのアリコートに分けた。再結合を阻止するために、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）をブロックしたベルツズマブ−Ｆａｂ′を、各複製（１ｍｇ／ｍＬの最終濃度）に加え、次いで平均蛍光強度（ＭＦＩ）を直ちに測定し、Ｇｕａｖａ  ＰＣＡ  ａｎｄ  Ｇｕａｖａ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を使用して最大結合（Ｔ＝０）を決定した。これに続く測定は、３０分の間隔で行なった。Ｔ＝ＸでのＭＦＩをＴ＝０でのＭＦＩで割った商であるパーセント最大結合を、時間に対してプロットし、結果をＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって分析し、半減期または解離速度を得た。
【０１４０】
Ｄａｕｄｉ細胞（図５Ａ）、Ｒａｍｏｓ細胞（図５Ｂ）およびＲａｊｉ細胞（図５Ｃ）からのベルツズマブ、リツキシマブおよびｃＡ２０の解離速度を、過剰ベルツズマブ−Ｆａｂ’−ＮＥＭの存在下、３７℃で比較した。さらに測定を行い、同様の条件下で、Ｒａｊｉ細胞（図５Ｄ）からのベルツズマブ、リツキシマブおよびＤ１０１Ｎの解離を比較した。試験した各細胞系に対して、ベルツズマブの平均半減期は、リツキシマブの平均半減期（Ｐ＜０．０００１）よりも２．７（±０．３）倍長かったが、ｃＡ２０の平均半減期（Ｐ＞０．２）と区別できなかった。対照的に、Ｄ１０１Ｎ変異体は、リツキシマブおよびベルツズマブよりもそれぞれ、２倍および６倍早く、Ｒａｊｉ細胞から解離する。これらの結果は、Ａｓｐ101へのＡｓｎ101の変化がベルツズマブのより遅い解離の原因であることを示している。競合するベルツズマブ−Ｆａｂ’−ＮＥＭの非存在下で、Ｒａｊｉ細胞からのベルツズマブ、リツキシマブ、Ｄ１０１Ｎ、１Ｆ５，およびトシツモマブの解離を比較し（図５Ｅ）、ベルツズマブが、最も長い半減期（２８１分）を有し、以下１Ｆ５（１９５分）、リツキシマブ（９４分）、トシツモマブ（５０分）、およびＤ１０１Ｎ（４２分）が続くことが分かった。
【０１４１】
実施例６．ＭＴＴアッセイによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖の抑制
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイは、Ｍｏｓｍａｎｎ（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３，１９８３）の方法に基づいた。簡単にいうと、細胞系を９６ウェルプレートに１〜２×１０4細胞／ウェル（１００μＬ）でプレートし、それに抗体を加えた（１００μＬ）。加湿ＣＯ2（５％）インキュベーター内で、３７℃で４日間インキュベートした後、２５μＬの５．０ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］を加え、次いで３７℃で細胞をさらに４時間インキュベートした。次いで、プレートを遠心分離して、上清を除去した。１００μＬ  ＤＭＳＯ／ウェルを用いてペレットを溶解し、光学濃度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）上、５７０ｎｍで測定した。非標識リツキシマブおよびベルツズマブは、細胞毒性活性のために架橋を必要とすることが以前報告された（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０４：３７０５−３７１１，２００４）ため、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＧＡＨ）を一部のウェルに加えた。ベルツズマブおよびリツキシマブを、５μｇ／ｍＬの最終濃度で使用し、ＧＡＨは２０μｇ／ｍＬで使用した。すべての試験を、４回繰り返した。
【０１４２】
ベルツズマブとリツキシマブの増殖阻害能を、ＳＵ−ＤＨＬ−６、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、およびＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ４種類のリンパ腫細胞系上でＭＴＴ細胞毒性アッセイを用いて調べた。これらのリンパ腫細胞系は、ＣＤ２０を発現するレベルの点で異なる（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１０：２８６８−２８７８，２００４）。両ＭＡｂに対する感受性は、ＣＤ２０発現と相関した（ＳＵ−ＤＨＬ−６＞Ｒａｊｉ＞Ｄａｕｄｉ＞ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ）が、一細胞系内のベルツズマブとリツキシマブとに効力の有意差は観察されなかった（図６）。第２抗体（ＧＡＨ、ヤギ抗ヒトＩｇＧ）との架橋によって、ＣＤ２０発現の中間レベルと、抗ＣＤ２０ＭＡｂによる死滅に対する感受性とを有する２つの細胞系であるＲａｊｉ細胞およびＤａｕｄｉ細胞上でベルツズマブとリツキシマブの有効性が増加した（図６）。どちらかに極端な抗ＣＤ２０感受性（たとえば、非常に感受性が高いＳＵ−ＤＨＬ−６および非常に非感受性であるＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ）の細胞系の増殖抑制に、この第２の抗体の追加は役立たなかった。
【０１４３】
実施例７．Ｂ細胞およびＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの減少。
健常ボランティアのヒト末梢血リンパ球へのベルツズマブの効果を、フローサイトメトリーを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。全血のアリコートをベルツズマブと２日間インキュベートし、ＦＡＣＳによってＢ細胞（ＣＤ１９＋）およびＴ細胞（ＣＤ３＋）の分析を行なった。対照は抗体を含まず、陰性対照はヒト化ＭＡｂ（抗ＣＥＡＣＡＭ５モノクローナル抗体、ｈＭＮ−１４）を含んだ。ベルツズマブと全血をインキュベートすることによって、Ｂ細胞数が有意に減少したがＴ細胞は減少しなかった（図７）。Ｂ細胞の減少は、５μｇ／ｍＬを用いることによって２６〜８０％におよび、１μｇ／ｍＬを用いることによって１１〜６１％に及んだ（３／３供血者に対して１μｇ／ｍＬ［６．７ｎＭ］および５／５供血者に対して５μｇ／ｍＬ［３３．３ｎＭ］によるＰ値対非処置細胞＜０．０５）。インキュベーション混合物に全血を用いたため、細胞数で観察された減少は、ＣＤＣまたはＡＤＣＣ、ならびに直接のシグナリングが原因であると考えられる。
【０１４４】
実施例８．補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ。
蛍光測定法を用いて、ベルツズマブ対リツキシマブのＣＤＣ活性を評価し、比較した。Ｄａｕｄｉ、ＲａｊｉまたはＲａｍｏｓ細胞（１×１０6／ｍＬ）を、黒色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に播種し（一ウェルあたり５０μＬ）、ヒト補体（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下、各テストＭＡｂ（０．００１〜１０μｇ／ｍＬ）を用いて１／２０最終希釈液で、３７℃、５％ＣＯ2で３時間インキュベートした。指示薬色素、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を添加して、インキュベーションを終夜続けた。次いでＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴ  Ｍｕｌｔｉ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ＲｅａｄｅｒおよびＫＣ４  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して、５３０ｎＭの励起波長および５９０ｎＭの発光波長で蛍光強度を測定し生細胞を定量化した。
【０１４５】
６回繰り返した測定の平均値から作成した用量反応曲線を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＥＣ50値を得た。Ｄａｕｄｉ細胞の場合、分析における日々の変動を説明するため、ならびにＥＣ50推定値の精度を上げるために、多因子設計を用いた実験では、各抗体のアッセイを毎日３連で行い、一抗体あたり合計９回の分析を行なうために、別々の３日間に繰り返した。試料は、異なる３ロットのベルツズマブと、リツキシマブの１ロットを含んだ。ＥＣ50データの統計解析は、因子として日数と抗体の型による２方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）モデルを基にして行なった。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較方法を利用して、全実験の誤差比率０．０５で４つすべての構築体についての比較を３回行なった。
【０１４６】
ＣＤＣに対する標的細胞としてＤａｕｄｉを用いてリツキシマブと比較すると、ベルツズマブに関してＥＣ50の低い値が一貫して観察された（第２表）。日々の変動の効果ならびに異なる複数の日にわたる抗体間のＥＣ50パターンの違いに取り組むさらなる測定は、リツキシマブと３つのロットのベルツズマブの各々に観察されたＥＣ50の平均差は、一貫して統計的に有意であったことを示した（Ｐ＜０．０００１）。しかし、ベルツズマブとリツキシマブの違いは、他の２つの細胞系、ＲａｊｉとＲａｍｏｓでのＣＤＣ結果には観察されなかった。
【０１４７】
【表２】
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【０１４８】
実施例９．抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ。
エフェクターおよび標的細胞として、それぞれ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＤａｕｄｉを用いてＡＤＣＣの誘発を測定した。Ｄａｕｄｉ細胞を５μｇ／ｍＬで各テスト抗体と３７℃および５％ＣＯ2で、３０分間インキュベートし、これらを３連で行なった。次いで、健常ボランティアから採取し、新たに単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、５０：１の所定の最適なエフェクター対標的比で加えた。４時間のインキュベーション後、細胞溶解をＣｙｔｏＴｏｘ−Ｏｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって評価した。ＭＡｂ＋エフェクター細胞、ＭＡｂ＋標的細胞、およびＭＡＢ＋標的細胞＋エフェクター細胞のＡＤＣＣを測定した。ＭＡｂ単体、および標的細胞単体を含む対照ウェルも、アッセイ処理を行なった。
【０１４９】
結果を評価するために、培地だけのウェルから得た平均バックグラウンド値を他のウェル全てから減算し、以下の式を用いて％溶解を算出した。式中、ＭＥＴは、ＭＡｂ、エフェクター細胞および標的細胞を含むウェルを表す；ＥＴは、エフェクター細胞および標的細胞を含むウェルである；Ｔは、標的細胞のみを含むウェルである；Ｍａｘは、標的細胞および溶解緩衝液を含むウェルである：
【数１】
0006049163.tif 000004
【０１５０】
Ｄａｕｄｉ細胞系を発現するＣＤ２０の細胞溶解を測定することによって、５ロットのベルツズマブのＡＤＣＣ活性レベルを、リツキシマブと陰性対照ＭＡｂ（ｈＭＮ−１４）のＡＤＣＣ活性レベルと比較した。エフェクター細胞機能を、二人のボランティア供血者から新たに単離したＰＢＭＣによって得た。結果は、リツキシマブと５ロットのベルツズマブの各々が統計的に同様（Ｐ＝０．１２）のＡＤＣＣレベル（４０〜４５％の溶解）をもたらしたことを示した（データ記載せず）。対照ＭＡｂ（９．９％溶解、ヒト化抗ＣＥＡラベツズマブ）と比較して、リツキシマブおよびベルツズマブは、両方とも有意に高いＡＤＣＣレベル（Ｐ＜０．０００１）を示した。
【０１５１】
実施例１０．ナチュラル‐キラー（ＮＫ）細胞および好中球減少による治療への効果。
前述のように、ＮＫ細胞と好中球の減少を行なった（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｉｌｉｚａｌｉｔｕｒｒｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ９：５８１０−１２，２００３）。簡単にいうと、各マウスに、１００μＬの抗マウスＧｒ−１腹水（Ｄｒ．Ｆ．Ｊ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｉｌｉｚａｌｉｔｕｒｒｉ，Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹによって提供された）および１００μｇ抗マウスＩＬ−２受容体抗体（ＴＭβ−１，ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）をｉ．ｐ．投与し、翌日、１×１０6のＲａｊｉ細胞を接種し、続いてさらに２回、６日目と１３日目に抗マウスＧｒ−１腹水をｉ．ｐ．注射した。３日目と１３日目に、減少したマウス１匹と非減少マウス１匹から採取した血液試料をＦＡＣＳ分析し減少を確認した。３日目、５日目、７日目、および１１日目にベルツズマブ（２００μｇ）または生理食塩水をｉ．ｖ．投与した。
【０１５２】
Ｒａｊｉ腫瘍増殖をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害するベルツズマブに対するエフェクター細胞の役割を調べた（図１１）。ＮＫおよび好中球が減少した動物において、生理食塩対照と処置マウスとに差がなく、両方とも同じＭＳＴ（１６．４±１．３日）を有した。対照的に、非減少マウスにおいて、ベルツズマブ処置されたマウスは、生理食塩対照群よりも有意に改善したＭＳＴを有した（３８．６±７．３日対１８．４±０．９日；Ｐ＜０．００３５）。
【０１５３】
実施例１１．ｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．投与後のマウスにおける血清薬物動態の分析
９週齢のナイーブ雌Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ；Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）１２匹の体重を注射前に測定し、二組のマウスの平均偏差および標準偏差が有意に異ならないよう、１ケージに６匹を集めた。ベルツズマブ、１ｎＭ（１５０μｇ）を２００μＬのｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．注射のいずれかで投与した。血清試料を、０．５、１、４、６、２４、４８、１２０、１６８および３３６時間後に眼窩採血によって採取し、ベルツズマブの分析まで凍結保存した。
【０１５４】
捕獲ＥＬＩＳＡ法を用いて、血清試料中のベルツズマブの量を定量化した。９６ウェルアッセイプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｆｌａｔ−Ｂｏｔｔｏｍ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍｏｄｕｌａｒ  フレーム付き；ＮａｌｇｅＮｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を、ラット抗ベルツズマブイディオタイプモノクローナル抗体、ＷＲ２（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）で被覆した。ベルツズマブ（１００〜１．５６ｎｇ／ｍＬ）を８段階希釈して標準曲線を作成した。マウス血清試料を適切に希釈して、標準試料と共に、３連のウェルにピペットで取り分けた。結合したベルツズマブを、ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ヒトポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で検出し、次いでプレートをＯＰＤ溶液（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて展開した。色が標準曲線で十分に現れるまで、プレートを暗所でインキュベートした（約２０分）。この時点で、４Ｎ硫酸をウェルに加えて反応を停止させ、プレートをプレートリーダー上、ＯＤ490ｎｍにて読んだ。
【０１５５】
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて、マウス血清試料中のベルツズマブの濃度を標準曲線に基づいて算出した。精度を上げるため、各試料の試験を複数回行い、すべての試験からの平均値をＰＫ分析に用いた。上記の分析で測定した血漿濃度を、ｎＭ／ｍＬに変換して、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ  ＰＫソフトウェアパッケージ（ｖ５．１、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して分析した。非コンパートメント分析を、ｉ．ｐ．、ｓ．ｃ．両データで行なった（ベストフィットモデルを表す）。
【０１５６】
血清濃度およびベルツズマブのクリアランスは、ｉ．ｐ．注射をうけた動物対ｓ．ｃ．注射をうけた動物とで極めて類似している（図１２）が、それらの各ＰＫパラメータのいくつかは、有意に異なっていた（第３表および第４表）。最大血清濃度（Ｃmax）およびＣmaxまでの時間（Ｔmax）に関して、注射経路間に有意差はなかった。これは、クリアランス（Ｃｌ）値と濃度曲線下面積（ＡＵＣ）値との比較にもあてはまった。しかしながら、末端半減期（Ｔ1/2）および平均滞留時間（ＭＲＴ）において、顕著な差が観察され、ｉ．ｐ．経路は各々に有意に高い値をもたらした（それぞれ、Ｐ＝０．０３１６およびＰ＝０．０３５７）。
【０１５７】
【表３】
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【０１５８】
ＰＫ試験で用いた腫瘍のないＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの体重は平均３０ｇであった。マウスにおける全血容積は、体重に基づいて推定し、全血のｍＬとして、体重の５．５〜７％の範囲を使用する。平均６．２５％を使用する場合、マウスは約１．９ｍＬの全血を有し、そのうち約５０％が血清、すなわち０．９５ｍＬである。これらのマウスに１５０μｇをｉ．ｐ．注射した。その全てが血液中に入れば、約１５８μｇ／ｍＬの血清濃度になるであろう。これらの３０ｇのマウスに１５０μｇのベルツズマブを注射した後、３０μｇ／ｍＬ血清、すなわち予想された最大値よりも５．３倍少ないＣmaxを達成したことがわかった。
【０１５９】
【表４】
0006049163.tif 000006
【０１６０】
上記の観察結果を用いて、最低治療用量として約２０ｇのＳＣＩＤマウスに５０ｎｇ（０．０５μｇ）を注射した。マウスの体重に基づき、ＳＣＩＤマウスには約１．１４ｍＬの全血容積が投与されるべきで、うち０．５７ｍＬは血清である。５０ｎｇすべてが血液中に入ると、８７．７ｎｇ／ｍＬの血清濃度になるであろう。正常なマウスＰＫ試験で観察されるのと同じ動態を前提として、血清中の約１６．５ｎｇ／ｍＬベルツズマブのＣmax濃度を想定する（８７．７ｎｇ／ｍＬを５．３で割る）。これは、これらのマウスにおける抗原シンクであり得るＤａｕｄｉ細胞の存在を考慮に入れておらず、したがって血清濃度を下げていない。
【０１６１】
実施例１２．カニクイザルにおける耐容性およびトキシコキネティクス。
ベルツズマブの静脈注射およびｓ．ｃ．注射の探索的な単回および反復投与試験は、ＳＮＢＬ  ＵＳＡ，Ｌｔｄ．（Ｅｖｅｒｅｔｔ，ＷＡ）で、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）で行なった。体重２．５〜６．６ｋｇ（年齢３〜７歳）の１６匹の雄ザルおよび１６匹の雌ザルに、０、６．７、３３．５、および６７ｍｇ／ｋｇ（ヒトではそれぞれ、８０、３７５、および８００ｍｇ／ｍ2に相当する）のｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．投与を、１回または３回（２週間隔で）のいずれかで与えた。ＭＡｂタイターおよびＰＫ、血液化学、血液凝固、および血液学的検査のための血液採取、ならびに検尿によってこれらのサルを定期的に検査し、次いで、脾臓リンパ節、下顎リンパ節、および腸間膜リンパ節におけるリンパ組織の状態について死後評価を行なった。
【０１６２】
単回投与または複数回投与としてｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．投与したベルツズマブは、耐容性がよく、循環器官およびリンパ器官でのＢ細胞減少以外に、臨床的異常または持続的な臨床検査異常も見られなかった。すべての用量を受けた動物における死後変化は、すべての用量で脾臓リンパ節、下顎リンパ節、および腸間膜リンパ節の濾胞リンパ球減少を含んだ（データ記載せず）。白血球、好中球、リンパ球、および好塩基球に一過性の減少が見られたが、末梢血Ｂ細胞数では急速な減少および持続的な減少のみが観察された（図示せず）。これらの効果は、いずれかの経路による投薬の２日以内に起こり、かつ６．７ｍｇ／ｋｇ以上の用量で存在した。これらの動物は、一度処置を受けると２８日で、３回投与を受けると５６日でのいずれかで回復した。半減期はｉ．ｖ．注射後５〜８日で、またはｓ．ｃ．投与から６〜１３日後に推定され、かつ両経路のＴmaxは２〜５日に及ぶことを、薬物動態的分析（データ記載せず）は示した。ｉ．ｖ．注射後のＣmaxは線状にのびて蓄積を示さず、ＡＵＣ0〜27日は、ｓ．ｃ．経路よりｉ．ｖ．投与でより大きかった（図示せず）。これは、ＭＡｂがクリアランスと同様の速度でｓ．ｃ．経路を介して血流に入るのに必要とされる長い時間に関連があると思われる。用量を規準化したＡＵＣ値は、すべての用量レベルでｉ．ｖ．注入後またはｓ．ｃ．投与後ベルツズマブの蓄積を示したが、平均分布容積はすべての用量レベルでｉ．ｖ．注入後より、ｓ．ｃ．投与後の方が大きかった（図示せず）。６．７ｍｇ／ｋｇ（ヒトでの８０ｍｇ／ｍ2に相当する）の最低単回用量で、末梢Ｂ細胞の急速な減少および脾臓Ｂ細胞の減少が、この低用量でｉ．ｖ．、ｓ．ｃ．いずれかの経路で与えられたベルツズマブに起こることをこれらの結果は示している。
【０１６３】
実施例１３．マウスモデルにおけるベルツズマブのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。
本試験は、約２０グラム（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹから受け取ったときは７週齢）の、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）のＣ．Ｂ．１７ホモ接合体マウスで行なった。Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫）モデルの場合、試験当日に１．５×１０7細胞でマウスにｉ．ｖ．接種をし、体重を測り、６処置群と２対照群（一群あたり８匹）に無作為に割り当てた。１日目、処置群のマウスに、ベルツズマブ（５、２０または６０μｇ）の単回投与をｓ．ｃ．またはｉ．ｐ．で与え、かつ対照群のマウスに、生理食塩水（２００μＬ）または６０μｇの非Ｄａｕｄｉ標的イソタイプ対応抗ＣＥＡＣＡＭ５モノクローナル抗体、ｈＭＮ−１４ＩｇＧ（ラベツズマブ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）を与えた。
【０１６４】
本試験に加えて、最小有効量実験を、同じＤａｕｄｉモデルで行なった。１４匹のマウス群に、ベルツズマブ（０．５、０．２５、０．１、または０．０５μｇ）の単回投与をｉ．ｐ．で与え、対照群には生理食塩水を与えた。ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ濾胞細胞リンパ腫モデルにおいて、１５の群の各マウスに、２．５×１０6細胞をｉ．ｖ．接種し、５日後、ベルツズマブ（０．０３５、０．３５、３．５、または３５μｇ）の単回投与をｉ．ｐ．で与えた。これらの動物を毎日モニターして、後肢麻痺の発症時、瀕死の際、または、初期体重の２０％超の体重減になった場合、人道的に屠殺した。生存曲線は、Ｐｒｉｓｍ（ｖ４．０３）ソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、カプラン・マイヤープロット（ログランク分析）を用いて分析した。
【０１６５】
バーキットリンパ腫異種移植についての腹腔内治療対皮下治療。
播種性疾患を有するマウスを、ベルツスズマブの単回ｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．注射で処置した。生理食塩水およびラベツズマブの対照群と比較して、ｉ．ｐ．投与かｓ．ｃ．投与かにかかわらず、ベルツズマブの３用量のすべては、マウスの生存時間を有意に増加させた（図８、Ｐ＝０．０００１）。同じ用量を投与されたｉ．ｐ．投与群とｓ．ｃ．投与群とを比較すると、いかなる有意差も示されなかった（図８）。対照マウスは２８日目に疾患に屈した（後肢麻痺）が、２つの６０μｇ群の平均生存時間（ＭＳＴ）は、ｉ．ｐ．群およびｓ．ｃ．群に対してそれぞれ、１０１．９±２６．８日、１１４．６±２１．８日であり、本試験が終了した１２６日目には４／８および６／８マウスが依然として生存していた。２０μｇを与えられた動物についても、１１６．４±１４．０日（ｉ．ｐ．）および１０８．４±２６．２日（ｓ．ｃ．）のＭＳＴ、および本試験の終了時の両群におけるマウス生存５／８、と同様の結果が得られた。最低用量群（５μｇ）のみ、＞５０％の死亡率が観察された（本試験の終了時にｉ．ｐ．／ｓ．ｃ．群それぞれ３／８および１／６マウスが依然として生存）が、これらのマウスは、対照と比較して依然としてＭＳＴ（ｉ．ｐ．群とｓ．ｃ．群それぞれ、９１．１±３０．９日と９１．６±２２．５日）において＞３，２倍の増加であった。
【０１６６】
Ｄａｕｄｉバーキットリンパ腫異種移植におけるベルツズマブの最小有効量。
ベルツズマブの単回５μｇ投与がＤａｕｄｉ播種性バーキットリンパ腫モデルにおいて強力であることがわかったため、さらに低い用量（０．５，０．２５、０．１、および０．０５μｇ）をこの同じ疾患モデルで試験した。意外なことに、生理食塩水対照マウスと比較すると、４用量のすべてが、生存を有意に改善させた（Ｐ＜０．０００１）（図９）。たとえば、０．５μｇの単回投与を受けたマウスは、対照と比較すると、ＭＳＴにおいて３倍の改善があった（６９．５±２３．９日対２１．４±１．１日）。試験した０．０５μｇ（５０ｎｇ）の最低用量でも、対照よりは２倍超のＭＳＴ（５０±８日）増加がもたらされた。
【０１６７】
濾胞細胞リンパ腫異種移植におけるベルツズマブの最小有効量。
播種性濾胞細胞リンパ腫モデル、ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ異種移植において、複数のマウス群に、ベルツズマブの単回ｉ．ｐ．注射を投与した（図１０）。各群に、最高３５μｇ〜最低０．０３５μｇ（３５、３．５、０．３５、および０．０３５μｇ）にわたる１０希釈を投与した。ＷＳＵ−ＦＳＣＣＬ細胞の投与から５日後まで、治療を開始しなかった。生理食塩水対照と比較すると、４用量のすべては、マウスの生存を有意に延長させた（図１０、対照ＭＳＴ＝２８日；Ｐ＜０．０００１）。３５μｇ用量を投与したマウスのＭＳＴ（４４．３±４．９日）は、３．５μｇ群のＭＳＴ（３９．５±４．６日）と有意差はなかったが、０．３５μｇ群と０．０３５μｇ（３５ｎｇ）群のＭＳＴ（それぞれ、４０．５±１．６日と３３．３±２．１日）より有意に長かった（Ｐ＜０．０２１）。しかしながら、３．５μｇ群の１匹を除いたすべてのマウスは、６１日目までに疾患悪化に屈した。
【０１６８】
実施例１４．マウスモデル系においてリツキシマブと比較すると、ベルツズマブはｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性において改善を示す。
尾静脈注射によってＳＣＩＤマウスにヒトバーキットリンパ腫（Ｒａｊｉ）細胞を接種した。接種から５、１０、１５および２０日後、これらのマウスに１０ｍｇ／ｋｇ／投与でリツキシマブまたはベルツズマブ（ｈＡ２０）を投与した。累積生存率の結果を、図１３に示す。
【０１６９】
図１３に見られるように、Ｒａｊｉリンパ腫細胞を注射し、ベルツズマブ（ｈＡ２０）で処置したＳＣＩＤマウスは、同じ用量のリツキシマブで処置したマウスと比較すると、累積生存率において有意な改善を示した（Ｐ＝０．００５）。本試験では、肢麻痺までの時間を、生存の代替エンドポイントとして使用した。接種後９０日を超えて、ベルツズマブで処置したＲａｊｉリンパ腫のＳＣＩＤマウスが約８０％の生存率を示し、一方リツキシマブで処置した同等のマウスはゼロに近い生存率を示したことを図１３は示している。推定される累積生存率の中央値は、対照マウスで２２．１日、リツキシマブで処置したマウスで４７．９日であり、ベルツズマブで処置したマウスはまだ達していなことを図１３の下部に示す。
【０１７０】
ＣＤＲＨ３配列でのカバット１０１アスパラギンのアスパラギン酸塩との置換が、ヒトバーキットリンパ腫細胞を用いるマウスモデル系においてｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性の有意な改善をもたらすことをこれらの結果が示している。
【０１７１】
実施例１５．低用量ベルツズマブによる治療。
特発性血小板減少性紫斑病
ＩＴＰの６カ月の病歴を有する３９歳の女性は、標準療法としてステロイドを投与されたが、血小板レベルに満足する改善はみられなかった。患者は、８０ｍｇ／ｍ2ベルツズマブの２投与を２週間隔で、静脈内投与された。低用量にもかかわらず、患者のＢ細胞レベルは初回投与後に減少し、および血清抗体レベルは初回投与後１０μｇ／ｍＬまで増加し、２回目の投与後１９μｇ／ｍＬに達し、次いで、ゆっくりと除去されていったが、８週後も依然測定可能（１μｇ／ｍＬ）であった。最も重要なことに、患者の血小板レベルは、初回投与後４日以内に、試験参加時点の２４，０００／ｍｍ3から正常範囲（＞１５０，０００／ｍｍ3）まで急速に増加した。この完全寛解は現在も続いており、患者の血小板は治療後１８週目の最終評価時で依然として＞１５０，０００／ｍｍ3である。興味深いことに、この患者は、潰瘍性大腸炎にも罹患しており、ベルツズマブによる試験中、この病状に対する治療をやめた。ベルツズマブの治療中、潰瘍性大腸炎のすべての徴候および症状が、現在の１８週経過観察の間に寛解した。これは、このＢ細胞療法の副次的な効果と思われる。
【０１７２】
辺縁帯リンパ腫
７９歳の周辺帯リンパ腫女性患者は、１２年前に初めて診断され、以前はＣＨＯＰ、次いでＣＶＰによる治療を受けていたがリツキシマブによる治療は受けていなかった。患者は、２つの腸骨リンパ節腫大と骨髄障害とを含む第ＩＶ期疾患を呈した。患者は、１３８ｍｇ（８０ｍｇ／ｍ2）のベルツズマブを毎週１回、４回静脈内投与された。Ｂ細胞レベルは、１回目の投与後に減少し、血清抗体レベルは連続投与によって増加し、最終投与後１２０μｇ／ｍＬに達し、次いでゆっくりと除去され、１２週後の最終評価時、依然測定可能な値（５μｇ／ｍＬ）であった。最も重要なことに、この患者は、治療に良好な反応を示し、ＣＴスキャン上での腸骨リンパ節は正常な大きさまで退縮し、骨髄生検は陰性であった。完全寛解は、１５カ月後の最後の評価時の現在も続いている。
【０１７３】
濾胞性リンパ腫
濾胞性リンパ腫の１５年の病歴を有する４２歳の女性は、静脈ベルツズマブを含む複数の前治療レジメンを受けていた。ベルツズマブに患者は９カ月の反応を達成した。患者は、２週間毎の８０ｍｇベルツズマブの皮下注射投与を合計４回受けた。この経路で低用量を投与されたにもかかわらず、Ｂ細胞レベルは、最初の投与後に減少した。初回投与後、数日にわたって測定された血清抗体レベルは、ゆっくりと１０μｇ／ｍＬまで増加した。これは、静脈内投与で得られたレベルに匹敵する増加である。最終の治療後の４週間の経過観察で、患者を検査したところ、大部分のリンパ節腫大が疾患退縮しているエビデンスが明らかになり、次いで４週間後、コンピュータ断層撮影を含む繰り返し検査では、罹患リンパ節のすべての寸法の合計が、ベースライン時のこれらのリンパ節の累積寸法と比べて５０％超の減少を達成し、患者がこの時点で部分寛解を呈したことを示した。この最近の患者に対するさらなる評価は未決定であるが、良好なバイオアベイラビリティの実証およびＢ細胞減少による活性のエビデンス、ならびに疾患の＞５０％減少は、ｓ．ｃ．経路が効果的であったことを示している。
【０１７４】
濾胞性リンパ腫
第ＩＶ期、第三段階の濾胞性リンパ腫の４１歳の男性は、８年前に初めて診断され、以前はリツキシマブ以外のＣＨＯＰ化学療法を受けていた。患者は、毎週１回の８０ｍｇ／ｍ2ベルツズマブの静脈注射投与を合計４回受けた。Ｂ細胞レベルは、最初の投与後に減少し、血清抗体レベルは連続投与によって増加し、最終投与後８６μｇ／ｍＬに達し、次いでゆっくりと除去され、１２週後の最終評価時、依然測定可能な値（４μｇ／ｍＬ）であった。最も重要なことに、試験参加時に存在した３．６ｃｍの頭皮病変を含むすべての疾患が完全に消失した。完全寛解は治療後、９カ月まで続き、その時点で、新しい病変がＦＤＧ−ＰＥＴイメージングによって見られた。この患者も、低用量のベルツズマブが強力であり、８０ｍｇ／ｍ2のベルツズマブのわずか一回の投与後に、循環Ｂ細胞の除去を含む完全寛解がこの患者で誘発されたことを示している。
【０１７５】
実施例１６．濾胞性大細胞リンパ腫の治療
ＡＦは第三段階の濾胞性大細胞型非ホジキンリンパ腫の６３歳の白人男性であり、２００４年１月にリンパ節生検によってＣＤ２０＋であることが判明した。患者は診断時、第ＩＩＩ期であったが、現在は第ＩＩ期である。１９９２年における患者の前治療は、ドキソルビシン、ビンクリスチン、高用量シクロホスファミドを含み、２４カ月の寛解をもたらした。１９９６年、患者はＩＣＥ（イフォスファミド、カルボプラチンおよびエトポシド）、ならびに幹細胞療法のレジメンを受け、続いて後腹膜腫瘤に硬化放射線を受けた。患者は、８８カ月間効果を現した。患者の最近の症状は、Ｂ症状なし、有意なＣＢＣなし、血清生化学検査または血清免疫グロブリン異常、６８７  ＣＤ３−Ｔ細胞／μＬ、３２  ＣＤ１９−Ｂ細胞／μＬおよび１０×８ｃｍの鎖骨上リンパ節腫大、直径２．０ｃｍと２．８ｃｍの左右腋窩腫瘤、ならびに２〜３ｃｍの側頚部腫瘤を呈した。患者は、８０ｍｇのベルツズマブのｓ．ｃ．注射を４回、２週間隔で投与された。有意な有害反応または安全に係る問題はなく、ただ注射部位に軽度の一過性の紅斑反応および圧痛があった。最初の注射から４日後、血中のＣＤ１９＋  Ｂ細胞の測定値は０であり、完全に除去された。触診で測定すると、患者の大きな頚部腫瘤は最初の注射から４日後、５０％縮小し、患者は前より気分が良くなっていた。ＣＴスキャンは、さらに４週間未決定である。患者は、８０ｍｇのベルツズマブの単回ｓ．ｃ．注射の後、循環Ｂ細胞の急速な減少および頚部腫瘤の有意な退縮を明らかに有した。
【０１７６】
この驚くべき結果は、ＣＤＲＨ３（カバット１０１）を置換した抗ＣＤ２０ヒト化抗体ベルツズマブの８０ｍｇの単回ｓ．ｃ．注射が末梢Ｂ細胞を除去し、明らかなＢ細胞腫瘍腫瘤を有意に縮小することができることを示す。これは、このように低用量のベルツズマブのｓ．ｃ．注射が循環Ｂ細胞および付着Ｂ細胞、ならびにＮＨＬ腫瘤に著しい効果をもたらすという最初の報告である。
【０１７７】
実施例１７．エバンス症候群
ＭＴは、複数の血液学的な自己抗体および汎血球減少症のために１１カ月齢から経過観察された３歳のアジア人の女児である。１１カ月齢で、患者は下痢、両脚の赤斑、血便、頭部、頚部、体幹および四肢上のびまん性点状出血および紫斑、頚部リンパ節腫脹（１ｃｍの腋窩リンパ節をいくつか含む）、多少の脾臓肥大、疲労感の増大、食欲減少、挫傷、および末梢血スミア上の芽球、沈降速度の増加（１１６ｍｍ／時間）、Ｄダイマーの上昇、および過形成性骨髄を示す骨髄液穿刺（＞９０％細胞充実性）、大量の赤血球、骨髄および巨核球前躯体（骨髄細胞／後骨髄球レベルの成熟停止、しかし成熟好中球は見られる）を呈した。赤血球前駆体も、若干の成熟停止が見られたが、細胞遺伝学的異常は見られなかった。臨床検査も、免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭの上昇ならびに循環ＣＤ１９＋  Ｂ細胞の増加（４８％）を示した。ＩＩｂ／ＩＩＩａ特異性に強陽性の好中球抗体および強陽性の血小板抗体のエビデンスもあった。患者に、最初ステロイドを投与したが、初期応答が低かった。したがって、リツキシマブを２コース投与した。１回目のコースでは、患者に毎週４回の投与を与え、血小板数も安定化したが、患者は依然貧血および好中球減少を示した。患者のＣＤ２０およびＣＤ１９リンパ球は減少したが、わずか５〜６週後、劇的に増加した。リツキシマブの２回目のコースは、毎週３回の投与を数週間行ない、血小板数、ヘモグロビンおよび絶対好中球数は正常化し、２〜３カ月後、赤血球および血小板抗体が回復した。リツキシマブに対するこの寛解は９カ月持続したが、次いで定期ＣＢＣで血小板減少症が認められ、再び赤血球、好中球および血小板抗体が検出された。次いで、患者にプレドニゾンおよび静脈免疫グロブリンを投与し、部分寛解が示された。
【０１７８】
次に、リツキシマブの３回目のコース（毎週２回投与）を与え、アナフィラキシが２エピソード起こり、積極的な医学的管理を必要とした。患者は過渡応答（２〜３カ月）を示したが、汎血球減少症および血液抗体が再発した。以来、赤血球抗体および貧血が最も深刻な問題となり、血小板減少の断続的なエピソードをともなう貧血のため、輸血を受けた；患者は、ステロイドまたは静脈免疫グロブリンに応答しなかった。
【０１７９】
次のオプションは脾臓摘出術または細胞毒性化学療法のコースであり、患者に、１０ｍｇ皮下投与からなるベルツズマブの実験的レジメンを与え、２週間後に１０ｍｇベルツズマブの反復用量で皮下に投与した。２回目の投与の前に、循環ＣＤ１９陽性Ｂ細胞の減少が見られ、かつ患者の赤血球数および血小板数の改善が観察された。２回目のベルツズマブのｓ．ｃ．注射から２週間後、患者の全身状態は改善を示し、赤血球、好中球、および血小板抗体はかろうじて計測可能であり、かつ血小板数、好中球数、およびＲＢＣ数は正常範囲の下限にあり、血液学的異常は著しい改善を示した。治療後２カ月で患者は、寛解状態を継続している。いずれのアナフィラキシも、ベルツズマブ治療中いつでも認められるエビデンスがなく、リツキシマブへの免疫交差反応がなく、ベルツズマブの極めて低い用量の皮下投与がこのエバンス症候群患者において治癒力があることを示している。
【０１８０】
実施例１８．慢性リンパ性白血病
ＲＴは、慢性リンパ性白血病の３年の病歴をもつ４７歳の女性であり、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））のコース後で、現在再発しており、患者がクロラムブシルおよび他の細胞傷害性薬物に対して種々の期間の応答を呈したことを既往歴は示している。患者は、現在、骨髄および５８，０００／ｃｍｍの突出した芽球を有する高い末梢リンパ球数でもＣＬＬのエビデンスを呈している。毎週２回、６週間４０ｍｇのベルツズマブの皮下注射を投与し、２回目の注射の後、末梢リンパ球数が５５％減少した。４回目のｓ．ｃ．注射から２週間後、患者の末梢血球数は正常範囲をわずかに越えたが、より重要なことに、骨髄穿刺は確かな、良好な部分寛解を示し、疲労の臨床像、点状出血、ならびに頸部リンパ節および他のリンパ節のびまん性腫大が著しく改善された。
【０１８１】
実施例１９．免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）
ＲＨはＩＴＰに関し１．５年間４つの前治療、脾臓摘出術を受けていない病歴を有する６６歳の男性であり、ベースライン時２６，０００血小板／ｃｍｍを呈した。患者に、２週間隔で２回、４０ｍｇのベルツズマブを皮下投与した。２回目の注射の前に、患者の血液ＣＤ１９＋リンパ球の測定は、＞９０％減少を示していた。２回目のベルツズマブの注射から２週間後、患者の血小板数は倍加を示し、治療後５週目までに７０，０００まで増加した。この状態は、血小板数が再び＜５，０００／ｃｍｍまで低下した１１週目まで維持された。次いで、再び３０ｍｇのベルツズマブｓ．ｃを２週間隔で２回繰り返した。２回目の注射から４日後、血小板数は２８，０００／ｃｍｍまで上昇し、次いで治療後３週目までに４２，０００／ｃｍｍまで上昇した。治療後６週間で、血小板数は６７，０００／ｃｍｍまで有意に改善し、患者は、ベルツズマブ治療中、出血または点状出血のエビデンスもなく、良好な部分寛解を有するとみなされて、フルタイムの活動および仕事に復帰した。
【０１８２】
実施例２０．関節リウマチ
ＦＨは、有痛関節（特に手首の関節）を発症した３７歳の女性であり、３カ月にわたり、疼痛および早朝に約４０分間のこわばりを有した。検査では、両手首および両手の中手指節関節が腫大して圧痛もあったが、変形はなく；小結節または血管病変もなかった。患者は、３０ｍｇ／ＬのＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）上昇を呈する。それ以外は正常な検査所見を呈したが、陽性リウマチ因子および抗核抗体を有する。患者は、明らかにＲＡの初期であり、最初はイブプロフェンで治療した。しかし、症状の初期改善が一部見られたものの、両手の疼痛、こわばりおよび腫大は持続し、２カ月後、患者の膝が同様に発症する。最初の発現から６カ月後、患者は左ひじ上に３箇所皮下結節を発症する。結節は、小さく、無痛性で不動であるが、圧痛はない。両手のＸ線検査は、中手骨頭部に、骨の浸食を示し、ＣＲＰは再び上昇する（５３ｍｇ／Ｌ）。現在、患者は１２０ｍｇベルツズマブを毎週３回の皮下注射で投与されている。改善の最初のエビデンスは、２回目の注射後に生じる。朝の関節痛およびこわばりが約１５分に短縮し、３回目の注射から２週間以内に、患者は動きの改善を経験した。関節の腫大は縮小したように見え、ＣＲＰレベルは正常範囲をやや上回る１５ｍｇ／Ｌまで低下する。患者の症状およびＲＡの徴候は、次の８週間の経過観察中に、顕著に改善した。ベルツズマブ治療中またはその後２カ月、メトトレキセートまたはステロイド治療を必要としていない。
【０１８３】
実施例２１．関節炎を伴うシェーグレン症候群
ＫＳは、口内乾燥症を評価するため口腔外科医に呼ばれた４１歳の女性である。沈降速度（ＥＳＲ、６０ｍｍ／時間）の上昇を除いて、患者は注目すべき検査異常を呈さなかった。患者は、２カ月後に、軽度の結膜炎および眼の痛みを発症する。患者のリウマチ因子は陽性になり、ＩｇＧレベルの上昇（３０ｇ／Ｌ）につれ、血清総タンパク質が上昇する（１００ｇ／Ｌ）。Ｓｈｉｒｍｅｒテストは、顕著に異常を呈した（右目の細い濾紙がわずか３ｍｍおよび左目の細い濾紙が１ｍｍ湿った）。角膜潰瘍を防止するために、メチルセルロース点眼剤で治療した。次の年にわたり、リウマチ因子タイターおよび抗核抗体が着実な上昇を示し、かつ患者の両手と両手首に多発関節炎変化のエビデンスが発生する。患者は軽度のシェーグレン症候群であるとみなし、関節炎に対して投与した非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は合併乾燥症に効果を及ぼさなかった。次いで、患者にベルツズマブのコースを投与する。１５ｍｇの静脈注入から開始し、１週間後に毎週３回の４０ｍｇベルツズマブの皮下注射を投与する。この治療コースの終了から２週間後、患者の多発関節炎症状および徴候はかなりの改善を示し、最も著しい効果は患者の唾液分泌の改善であり、Ｓｃｈｉｒｍｅｒテストによって改善が確認された。患者は現在、最小の口内乾燥および結膜炎または眼の痛みだけを有し、この寛解は４カ月間維持されている。
【０１８４】
実施例２２．腎臓移植期間の脱感作
ＳＷは、５６歳（５５ｋｇ）の女性であり、生児出生数は５人で、末期の腎臓疾患を有し、左腎を交換するため移植待機中である。患者は、ＨＬＡ感受性が高く、高い抗ＨＬＡ抗体力価を示す。患者は、定期的な血液透析を受けている。腎移植を受けるために、患者は抗ＨＬＡ抗体対する脱感作を必要とし、したがって１２０ｇのヒトポリクローナル免疫グロブリン（１０％製剤）の静脈内投与を１回、４日後に４０ｍｇのｓ．ｃ．注射を投与される。ベルツズマブｓ．ｃ．注射を、８日目、１２日目、および再び２１日目に繰り返す。１回目の注射後、血液ＣＤ１９＋  Ｂ細胞は完全に消え、４回目のｓ．ｃ．注射から８週間後、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の減少が維持された。
【０１８５】
免疫グロブリン静脈注射を受ける前、患者は、４０ｍｇの静脈内メチルプレドニゾロン、６５０ｍｇの経口アセトアミノフェンおよび５０ｍｇのジフェンヒドラミンを投与されていた。その後ベルツズマブ注射に先立つ前投薬はない。移植前治療のこのコースの後に、パネル反応抗体レベルは有意に低下し、Ｔ細胞フローサイトメトリーのクロスマッチ試験は、移植前に５０％の低下を示す。３カ月後、患者は、亡くなったドナーから腎臓移植を受け、その後直ちに典型的な導入療法（３０ｍｇのアレムツズマブｓ．ｃ．）および次いでプレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチル、およびタクロリムスからなる免疫抑制療法（翌年にかけて量を減らす）、ならびに予防的抗生剤を与えられる。移植後の年は、患者をモニタリングしたが、拒絶エピソードは起こらず、患者の腎機能は正常化した。これは、腎臓移植を必要とする患者を極めて効果的に脱感作し、良好な移植をもたらした成功症例と見られる。
【０１８６】
実施例２３．ＣＤ２０抗体における構造と機能の関係および治療上の特性
リンパ腫および自己免疫疾患療法に導入された第１のキメラ抗ＣＤ２０ＭＡｂ、リツキシマブを改善するアプローチは、ＣＤＲ移植（ヒト化）によってマウス成分を減少させること、トランスジェニックマウスから完全なヒトＭＡｂを作ること、異なるＣＤ２０エピトープを標的設定すること、Ｆｃ構造を変えてＣＤＣまたはＡＤＣＣ活性を強化することとを含む（Ｆｏｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  ９９th  Ａｎｎ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００８，ａｂｓｔｒａｃｔ  ＬＢ−７０；Ｇｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７，４４：３８２３−３７）。しかしながら、患者におけるＢ細胞減少、自己免疫の抑制、またはリンパ腫反応のいずれかによって測定されるため、特に、患者がリツキシマブに抵抗性すなわち耐性を示すとき、これらの修飾のうちのどれがより強力な抗ＣＤ２０  ＭＡｂをもたらすか、まだわかっていない。
【０１８７】
現在では、大部分は部分寛解であるが、リツキシマブは濾胞性リンパ腫患者の約半分において客観的反応を誘発する（Ｃａｓｔｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００８，３６：７５５−７６８）。それでも最適治療量およびスケジュールは、依然未決定である。この１０年、実質的にすべてのＮＨＬ患者においてリツキシマブを使用したにもかかわらず、モデル系または患者においてリツキシマブならびに他の抗ＣＤ２０  ＭＡｂの反応メカニズムは、ＣＤＣ、ＡＤＣＣが媒介する殺細胞効果、およびアポトーシス効果による直接シグナル伝達を示す多数の研究で依然として討議されている。（Ｇｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７，４４：３８２３−３７；Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ．２００７：２２６−２３２；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００８；４５：１２６−１３２）。
【０１８８】
エプラツズマブと組み合わせたリツキシマブがＮＨＬ患者において、リツキシマブによる単体療法で生じる副作用を増加させることもなく、改善した反応のエビデンスを示すことが観察されたため（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００６，６：１３４１−１３５３；Ｌｅｏｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００５，２３：５０４４−５０５１；Ｓｔｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００６，２４：３８８０−３８８６）、我々の最初の目的は、エプラツズマブと組み合わせられ、エプラツズマブがＦＲを有するために迅速な注入をさらに許容できるヒト化抗ＣＤ２０  ＭＡｂを構築することであった。ベルツズマブの最初の特性試験は、エピトープ結合、親和性、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖阻害に関して、リツキシマブとの類似性を報告した（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４，１０：２８６８−７８）。無痛性ＮＨＬの患者を治療した後、予想される耐容性の改善および注入特性を確認し、さらに完全寛解（ＣＲ／ＣＲｕ）率が高いこともわかった。８２例の無痛性ＮＨＬ患者における第Ｉ／ＩＩ相試験は、試験したすべての用量に対して完全寛解率を示し（週１回×４週間、８０〜７５０ｍｇ／ｍ2の用量をすべての濾胞性リンパ腫患者に対して２７％）（Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００７，２５（１８Ｓ）：４４９ｓ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ８０３２；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ａｍｅｒ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００８，２６（１５Ｓ）：１４２ｓ，  Ａｂｓｔｒａｃｔ．３０４３；Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００９  Ｊｕｌ  １０；２７（２０）：３３４６−５３．  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｍａｙ  １８）、この寛解率は同程度の患者においてその通常の用量でのリツキシマブの反復使用に関して報告された完全寛解率を上回る（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０００，１８：３１３５−３１４３）。これらの所見に促されて、我々は、リツキシマブと比較してベルツズマブの機能特性を再評価することとなった。
【０１８９】
カニクイザルでの試験（実施例１２）では、ｉ．ｖ．およびｓ．ｃ．の種々の用量の効果を確認し、いずれの経路によって投与されても、ヒトにおける８０ｍｇ／ｍ2に相当する低い単回用量が、末梢血およびリンパ器官Ｂ細胞の減少を誘発するのに十分に強力であることを見出した。加えて、ＣＤ２０＋リンパ腫異種移植片を有するマウスにおいて、０．０５μｇまでの低いｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．単回投与後、生存に加え治癒も増進されたことが示された。これらのマウス試験では、用量反応を観察したが、ｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．経路間に有意差が認められなかった。
【０１９０】
異なる抗ＣＤ２０  ＭＡｂが、異なるＣＤＣおよび殺細胞効果が媒介する機能特性およびエピトープ特異性においていくらかの変化を示した（Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．２００７，３１：２９−４０）が、ＣＤ２０の新規のエピトープに結合することが報告されるオファツムマブ（Ｔｅｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００６，  １７７：３６２−３７１）以外は、実質的にすべて、大きな細胞外ループを認識し、互いに部分的に、または完全に、クロスブロックする（Ｐｏｌｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，１６１：３２４２−３２４８；Ｐｏｌｙａｋ  ａｎｄ  Ｄｅａｎｓ，２００２，９９：３２５６−３２６２；Ｐｅｒｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００６，１０７：１０７０−１０７７）。ベルツズマブはリツキシマブによる結合をクロスブロックし（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４，１０：２８６８−７８）、同一のエピトープが両ＭＡｂによって認識される、または隣接するエピトープとの結合が立体障害をもたらし得ることを示唆している。
【０１９１】
上記の実施例において、ベルツズマブとリツキシマブの結合および解離のパラメータを、スキャッチャード分析（実施例３）および解離速度測定（実施例５）の両方で比較した。スキャッチャード分析によって、ベルツズマブおよびリツキシマブが細胞表面ＣＤ２０への親和性および一細胞あたりの結合部位数が類似していることを確認した（実施例３）。
【０１９２】
驚くべきことに、ベルツズマブまたはｃＡ２０対リツキシマブまたはＤ１０１Ｎの間の統計的な有意差は、リツキシマブまたはＤ１０１Ｎと比較すると、テストした３種類のヒトリンパ腫細胞系のすべてにおいて解離速度が遅く（すなわち、細胞表面保持が長い）（実施例５）、Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞においてベルツズマブによるＣＤＣが媒介する殺細胞が高いことがわかった（実施例８）。競合結合剤の存在下または非存在下で測定されるかどうかによって、両方ともＣＤＲ３−ＶHにＡｓｎ101の代わりにＡｓｐ101を含むベルツズマブとｃＡ２０は、リツキシマブまたはＤ１０１Ｎよりも有意に（Ｐ＜０．０００  １）遅い解離速度（約２．５倍）をもたらした（実子麗５）。
【０１９３】
ベルツズマブのＦｃ部分は、ＣＤＣ機能を示すことができないエプラツズマブのＦｃ部分に由来するので、リツキシマブまたはＤ１０１Ｎよりも著しく活性であるＤａｕｄｉにおいてベルツズマブに対してＣＤＣ活性を示すことも、興味深い（Ｃａｒｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７，４４：１３３１−４１）。これは、エプラツズマブが迅速に内部移行するため、膜侵襲複合体を形成するのに十分に長く細胞表面に存在するのを阻止され得ることを示唆する。また、上記の結果は、オファツムマブに対して最初に想定された（Ｔｅｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４，１０４：１７９３−１８００）ように、ベルツズマブとリツキシマブの解離速度の差は、Ｄａｕｄｉ細胞で観察された強化されたＣＤＣに関連しないことも示している。リツキシマブと比較するとベルツズマブと共に著しく遅い解離速度を示した他の２つの細胞系でのＣＤＣに関して、この差は観察されなかったためである（実施例５および８）。ベルツズマブによるこれらの結果は、オファツムマブと異なるＣＤ２０の標的エピトープを明らかに含むため、Ｔｅｅｌｉｎｇら（２００４）によって想定されたように、この解離速度の変化がエピトープの位置によると思われない。にもかかわらず、オファツムマブに関してＴｅｅｌｉｎｇら（２００４）によって示唆され、ベルツズマブに関して本明細書に報告するように、たとえば我々がベルツズマブで見つけたように、なぜ所定の抗ＣＤ２０抗体は他のＭＡｂ（たとえばリツキシマブ）より低い濃度で機能するのかこの解離速度の変化が説明することができると思われる。ＣＤＣが役割を果たすか、依然として不明である。
【０１９４】
これらの差がエプラツズマブのＦＲを有するベルツズマブに関連していることはないと思われる。ｃＡ２０のＶH鎖およびＶΚ鎖は、６つの位置でリツキシマブとは異なるが、ＣＤＲＨ３の１０１残基を除いて、残りの５つの残基（ＦＲ４−ＶHの２つとＦＲＩ−ＶΚの３つ）が、差動解離速度の原因であるとは考えられない。Ｄｕら（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，４５：２８６１−２８６８）は、リツキシマブと比較して、別の抗ＣＤ２０ＭＡｂ（ｃ２Ｈ７）のＣＤＲの弱い相互作用を報告し、ＣＤＲＨ３において同じ位置で２Ｈ７のアミノ酸残基がより大きな側鎖を有し、ＣＤ２０ペプチドを収容するためにより広いポケットをもたらしていることを示唆する。ｃＡ２０およびベルツズマブが実質的に同じ親和性と解離速度を有し、一方ｃＡ２０はベルツズマブよりもリツキシマブにより類似したＦＲを有するという事実は、ＣＤ２０との相互作用においてＦＲよりも重要なＣＤＲの役割を強める。したがって、ベルツズマブ／ｃＡ２０とリツキシマブ／Ｄ１０１Ｎとの解離速度で観察される有意差は、明らかにＣＤＲＨ３における１つのアミノ酸の差異に起因し、ベルツズマブとリツキシマブとのＦＲにおけるより広範囲にわたる差異に起因するのではない。したがって、これは機能効果を生じることが示されるＣＤＲにおける最初の１つのアミノ酸変化であり、より強力な抗体をもたらすと思われる。
【０１９５】
本明細書に記述するｉｎ  ｖｉｔｒｏ解離速度とＣＤＣの差異は、別の抗ＣＤ２０  ＭＡｂ（オファツムマブ）に関する所見に匹敵する。オファツムマブは、リツキシマブと異なるエピトープに結合することが報告され（Ｔｅｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６，１７７：３６２−３７１）、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏでリツキシマブより治療的に活性であると主張されている（Ｔｅｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４，１０４：１７９３−１８００）。しかし、これは臨床試験のために選択された、比較的高い用量のオファツムマブと一致せず、またリツキシマブのように長い注入時間（Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００８，１１１：１０９４−１１００；Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００８，１１１：５４８６０９）、またはリンパ腫異種移植片で増殖阻止を誘発することが示される０．５ｍｇ／ｋｇ（１０μｇ／マウス）の最低用量（Ｂｌｅｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００７，１４０：３０３−３１２）を必要とする。
【０１９６】
さらに別の最近開発された、ＩＩ型抗ＣＤ２０  ＭＡｂの特性を有するヒト抗ＣＤ２０ＭＡｂ（Ｇ１０１）（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００８，１９（Ｓｕｐｐｌ  ７），  ａｂｓｔｒａｃｔ  ９８）は、マウスに１０〜３０ｍｇ／ｋｇの反復投与で与えると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで動物モデルにおいてリツキシマブより強力であることが示された（同書）。言い換えると、２０ｇのマウスで２００〜６００μｇの反復適用の各用量になる。反復適用は、０．０５〜０．３５μｇの単回用量のベルツズマブよりも少なくとも４，０００〜１２，００００倍高く、試験したリンパ腫異種移植片において高い抗増殖活性を示す（実施例１１および１３）。マウスＮＫ細胞および好中球が減少すると、ベルツズマブのこうした効果が阻害され（実施例１０）、リツキシマブに関して以前に示されていたように、ｉｎ  ｖｉｖｏでＡＤＣＣの役割を強める（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｉｌｉｚａｌｉｔｕｒｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３；９：５８６６−７３）。
【０１９７】
これらの、マウス、サル、および他のヒトでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、（ｉ）前臨床のモデルにおいてベルツズマブがリツキシマブの従来の僅かな臨床用量、または他の２つの第二世代の抗ＣＤ２０  ＭＡｂの最小有効治療量のわずかな量で活性であり、（ｉｉ）対リツキシマブにおける２つの特徴的な活性の差異はＣＤＣ機能および解離速度機能を含み、（ｉｉｉ）低い解離速度はＣＤＲＨ３におけるカバット−１０１残基での単一のアミノ酸変異に関連していることを示している。
【０１９８】
実施例２４．再発性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）における低用量ベルツズマブ
概要
合計８２例の患者（男性３４例、女性４８例；年齢３３〜８５）に毎週１回、８０〜７５０ｍｇ／ｍ2ベルツズマブを４回投与し、１２週間、疾患進行まで試験評価を続けた。患者は、濾胞性（ＦＬ、Ｎ＝５５）または他の（Ｎ＝２７）Ｂ細胞ＮＨＬを有し、試験参加時点で主に第ＩＩＩ／ＩＶ期（７９％）であり、かつ１〜７の前治療レジメン（中央値、１．５）、少なくともリツキシマブを含むレジメンをほとんど（８９％）が受けていた。
【０１９９】
ベルツズマブは通常、高い耐容性を示し、一過性（グレード１〜２）の薬物関連有害事象、および低用量でより短い注入時間（通常は最初に２時間およびそれ以降１時間）を有した。濾胞性リンパ腫では、２４／５５患者が、客観的反応（ＯＲ、４４％）を呈し、１５例（２７％）の完全寛解（ＣＲ／ＣＲｕ）が２〜５の前リツキシマブレジメンの後でも起こり、良好な予後（高いＬＤＨ、腫瘍＞５ｃｍ、ＦＬＩＰＩ≧２）が少なく、かつすべての用量レベルで起こった。他のＢ細胞ＮＨＬでは、５／６辺縁帯リンパ腫患者は２例のＣＲ／ＣＲｕ（３３％）（１例は８０ｍｇ／ｍ2）を含むＯＲ（８３％）を有し、一方３／７びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫患者は８０ｍｇ／ｍ2での１例を含む部分寛解（４３％）を有した。８０ｍｇ／ｍ2でも、Ｂ細胞は１回目の注入後に減少し、平均抗体血清レベルは、抗ＣＤ２０療法（この用量の反応者において明らかにより高いレベルを用いる）にとって重要と見なされる値（２５μｇ／ｍＬ）を上回り、リツキシマブと同様のまたはリツキシマブより遅い治療後の血清クリアランスを有した。
【０２００】
背景
キレート抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、１０年以上前に、再発性もしくは不応性低悪性度または濾胞性ＣＤ２０陽性のＢ細胞性リンパ腫の治療用に認可された。この集団の中心的な試験で、毎週１回、４週連続で投与された３７５−ｍｇ／ｍ2用量が４８％の奏功率（６％の完全寛解）をもたらした。（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １６：２８２５−２８３３，１９９８）。この最初の成功をさらに詳しく述べると、リツキシマブは、Ｂ細胞悪性腫瘍での使用（Ｔｒａｕｌｌｅ＆Ｃｏｉｆｆｉｅｒ，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ  １：２９７−３０６，２００５；Ｍａｒｃｕｓ＆Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  ６７：５−１４，２００７；  Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ  ３３：１６１−１７６，２００７）、主に化学療法との併用で、（たとえば、Ｃｚｕｃｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２２：４７１１−４７１６，２００４；Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４６：２３５−２４２，２００２）、ならびに自己免疫障害で（Ｃｈａｍｂｅｒｓ＆Ｉｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｌｕｐｕｓ  １４：２１０−２１４，  ２００５；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １２：２１９４−２２０６，２００７；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５４：２７９３−２８０６，２００６；Ｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５８：６７６−６８８，２００８）と、広く導入されてきた。第二世代の抗ＣＤ２０抗体は、有効性を高め、毒性（主に注入反応）または免疫原性を減少させ、より迅速な投与を可能にするために、構築されてきた（Ｄｏｅｒｎｅｒ  ＆  Ｂｕｒｍｅｓｔｅｒ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２０：２６３−２６８，  ２００８；  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ４５：１２６−１３２，２００８；Ｇｅｎｏｖｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ５４：Ｓ６６，  ２００６；Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１０：１９９ａ，２００７；Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１１：５４８６−５４９５，２００８；Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１１：１０９４−１１００，２００８）。
【０２０１】
ベルツズマブ（ｈＡ２０）は、ＣＤＲ（相補性決定領域）を移植し、ヒト化した抗ＣＤ２０ＩｇＧκＭＡｂであり、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲ１ならびにＣＤＲ２はリツキシマブと同一であるがＣＤＲ３可変領域重鎖は異なる構築体と、エプラツズマブ（ヒト化抗ＣＤ２２ＭＡｂ）由来の残りのフレームワーク領域とで構築された（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２２：５９５，２００３；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６：１４２ｓ，２００８；実施例１）。これらの変化は、リツキシマブと比較すると、重要な差異をもたらし、たとえば試験した３種類のヒトリンパ腫細胞系すべてにおいて解離速度が有意に遅く（実施例５）、これらの細胞系のうちの１つで補体依存性細胞傷害が有意に増加（実施例８）したが、直接の増殖抑制、アポトーシス、または抗体媒介性細胞障害において有意差がｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察されなかった（実施例６および９；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２２：５９５，２００３；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：２８６８−２８７８，２００４；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６：１４２ｓ，２００８）。加えて、正常なカニクイザル（実施例１２）およびヒトリンパ腫異種移植を有するマウス（実施例１３）での試験で判明したのは、静脈内だけでなく、皮下に投与された極めて低い用量のベルツズマブは、Ｂ細胞の減少および腫瘍増殖の制御においてそれぞれ非常に効果的であり、かなりの数のマウスを治癒した（実施例１３および１４；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６：１４２ｓ，２００８）ことが判明した。
【０２０２】
ベルツズマブの最初の臨床試験は、重篤な血球減少症を伴う全身性エリテマトーデス（ＳＬＥＥ）の若い患者であった。患者は、標準的な救済薬物療法に不応性となり、もはやリツキシマブにも反応しなかった（Ｔａｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ４４：５６１−５６２，２００５）。ベルツズマブは、抗リツキシマブ抗体の極度に高い血清レベル（ＨＡＣＡ  ４３，０００ｎｇ／ｍＬ；正常値＜５ｎｇ／ｍＬ）に直面しても、末梢Ｂ細胞レベルを減少させることができ、患者は迅速に反応した。
【０２０３】
リツキシマブの大部分の経験は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）にあるため、本発明の実施例は、この集団、特に濾胞性リンパ腫または低悪性度リンパ腫で、ベルツズマブの基本的な安全性、耐容性、薬物動態、薬力学、免疫原性および予備有効性を特徴づけるために実施した（Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０６：６８３ａ，２００５；Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０８：７６９ａ，２００６；Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２５，４４９，２００７）。現在治療から少なくとも６カ月に入る最近の患者について、および現在３年を超える寛解期が継続している最も初期の何人かの患者についての経過観察を含む完全な臨床試験の結果を以下に示す。
【０２０４】
方法
静脈注入によって不応性あるいは再発性のＮＨＬを有する患者に投与されるベルツズマブについての非盲検、単群、多施設の第Ｉ／ＩＩ相試験を実施して、不応性あるいは再発性ＮＨＬの患者でベルツズマブの安全性と効果を評価した。本試験の評価項目は、安全性、有効性（客観的寛解率と完全寛解率、奏功期間、増殖抑制期間）、薬物動態、薬力学および免疫原性であった。
【０２０５】
すべての患者は、毎週１回の投与を４週連続で受けた。本試験の最初の部分は、１２０ｍｇ／ｍ2から最高７５０ｍｇ／ｍ2まで、すなわち通常リツキシマブで与えられる用量の２倍まで用量レベルを増加して治療を受けたコホートを登録した。本試験の第２の部分では、さらなる患者に、３７５ｍｇ／ｍ2以下のベルツズマブを投与した（Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０６：６８３ａ，２００５）。客観的反応（完全寛解を増加させる）は、明らかな投与反応もなくすべての用量レベルで起こり（Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０８：７６９ａ，２００６）、この抗体が低用量で効果的であり得るという動物試験での観察（実施例１３）と一致することが明らかになった。ベルツズマブは低用量（６０ｍｇ／ｍ2を含む）でも、中等度のＳＬＥ活性を有する数人の他の患者において有望であったため（実施例１５）、このプロトコルを訂正し、本研究に登録した最終的な患者は、さらに低用量の８０ｍｇ／ｍ2で治療を受けた（Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２５，４４９，２００７）。
【０２０６】
患者集団−適格な患者は、ＷＨＯ規準によって実証されたＣＤ２０＋  Ｂ細胞ＮＨＬを有する成人であり、ＮＨＬに関して前に少なくとも１つの標準化学療法レジメンまたはリツキシマブ治療に失敗していなければならず、ＣＴによる少なくとも１つの病変≧１．５ｃｍを有し、腫瘤＞１０ｃｍは有さない、測定可能な疾患を有する。患者は、いずれのリツキシマブ治療からも少なくとも１２カ月を過ぎていなければならず、リツキシマブ治療の間または６カ月以内に進行がなく、リツキシマブに対してＮＣＩ  ＣＴＤＣグレート３または４の毒性を示し、またはＨＡＣＡ陽性がわかっていることが必要である。また以下の適格性を必要とする：ヘモグロビン≧１０ｇ／ｄＬ、ＡＮＣ≧１．５×１０9／Ｌ、血小板≧１００×１０9／Ｌ（すべて輸血補助なし）、クレアチニンおよびビリルビン≦１．５×正常の施設基準値上限（ＩＵＬＮ）、ＡＳＴおよびＡＬＴ≦２．５×ＩＵＬＮ、０−１ＥＣＯＧまたはＫＰＳ≧７０全身状態、平均余命≧６カ月、いかなる自己幹細胞移植から１２週間経過、およびいかなる化学療法、他の実験的治療、または指標病変へのいかなる放射線治療から４週間経過。原発性ＣＮＳリンパ腫、ＨＩＶリンパ腫、形質転換リンパ腫、症候性のＣＮＳ転移またはがん性髄膜炎、リンパ腫に対して細胞診陽性を有する胸水、前の放射免疫治療、または他のヒトモノクローナル抗体もしくはヒト化モノクローナル抗体による以前の治療（ＨＡＨＡテストが陰性の場合を除く）の患者は、不適格とした。他の除外基準は、以下のとおりである：既知のＨＩＶ、Ｂ型またはＣ型肝炎陽性、既知の自己免疫疾患または自己免疫現象の存在、５日以内の感染または抗生物質の使用、２週以内のコルチコステロイド、５年以内の他のがん（非黒色腫皮膚がんまたは子宮頸上皮内がんを除く）および、試験の解釈または方法を妨げるような他の病状。妊娠する可能性のある女性は陰性妊娠試験を受けなければならず、妊娠する可能性のある患者は治療の後、少なくとも１２週間、受胎調節を行わなければならない。
【０２０７】
治療−ベルツズマブを、４週連続で週１回の頻度で与えた。すべての患者に抗ヒスタミン剤と解熱剤を毎週前投与したが、ステロイドは定期的に投与しなかった。投与量増加の期間、３〜６名の患者のコホートに、用量レベルを１２０、２００、３７５、および７５０ｍｇ／ｍ2に上げてベルツズマブを投与し、後の患者にベルツマブを８０、１２０、２００または３７５ｍｇ／ｍ2で投与した。注入反応がなく安定した状態を保っている患者については、ベルツズマブ注入のガイドラインで、最初の注入では、注入速度を１５〜３０分ごとに５０ｍｇ／時間、それ以降の注入では１００〜２００ｍｇ／時間、上げて注入を進めることとした。他に、推奨した措置として、軽度の毒性に対しては、注入速度を遅くすることと；患者が安定である場合、中等度の毒性に対する注入を少なくとも１５分間、または症状が回復するまで中断し、次いで遅くした注入速度で再開すること、より重い毒性に対しては注入を恒久的に中止することとを含む。
【０２０８】
データ収集−ＣＴスキャン（頚部、胸部、腹部、骨盤、既知の他の疾患部位）および理学的検査を、ベースラインおよび最後の注入から４週後に実施した。疾患進行のない患者は、１２週目に、次いで疾患進行が出現するまで、３カ月ごとにＣＴスキャンおよび理学的検査を続けた。骨髄生検は、ベースラインで必要とし、骨髄浸潤の患者においては、完全寛解を確認する必要がある場合だけ、必要とした。注入中、有害反応について患者をモニターし、注入が終了するまで１５分ごとに、終了から３０分後および６０分後にバイタルサインを採集した。最後の注入から４週後および１２週後、次いで治療に関連した異常または追加の経過観察を必要とする他の変化が回復するまで３カ月ごとの評価で有害事象について患者を引き続きモニターした。定期的な安全性検査（血清生化学的検査、血液学的検査）および理学検査のための血液試料を、各注入前に、最後の注入から４週間後および１２週間後に、次いで疾患の進行までの３カ月ごとの経過観察評価で採取した。
【０２０９】
Ｂ細胞数（ＣＤ１９＋）のための血液試料を、各注入前に、最後の注入から１週間後、４週間後、８週間後および１２週間後に、次いで低下したレベルがベースラインに戻るまでの経過観察期間中３カ月ごとに採取した。検尿、Ｔ細胞レベル（ＣＤ３＋）のための血液試料および血清免疫グロブリンを、ベースラインで、最後の注入から４週間後および１２週間後に、次いで治療に関連した異常が回復するまでの経過観察期間中３カ月ごとに測定した。ベルツズマブ血清レベルのための血液試料を、各注入の前に、各注入から３０分後に、最初と最後の注入から２４時間、４８時間，７２時間および９６時間後に、次いで最後の注入から１、２、３、４、８および１２週間後に採集した。免疫原性（ＨＡＨＡ：ヒト抗ベルツズマブ抗体）のための血液試料を、ベースラインで、最後の注入から４週間と１２週間後に、次いで１２週間で陽性の場合、経過観察期間中に採集した。
【０２１０】
試験評価−治療反応を、国際ワークショップ基準（Ｃｈｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９９，１７：１２４４−１２５３）を用いて判定し、各患者の良好な反応を、完全寛解（ＣＲ）、未確認完全寛解（ＣＲｕ）、部分寛解（ＰＲ）、安定な疾患、または進行性疾患のいずれかに分類した。有害事象（ＡＥ）は、ＭｅｄＤＲＡシステム器官別大分類および好ましい用語にしたがって分類した。ＡＥおよび検査の毒性等級付けには、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）共通毒性基準（ＣＴＣ）（バージョン３．０）を利用した。用量制限毒性（ＤＬＴ）は、治療に関連するグレード３もしくは４の毒性または下記のグレード２の現象として定義した：自己免疫反応、無症候性気管支けいれん、または全身性蕁麻疹。ＥＬＩＳＡ検定を用いて、試験依頼者によって実施されたベルツズマブ血清レベルおよびＨＡＨＡの決定を除き、すべての検査値を現地で決定した。最後の注入に続く薬物動態は、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）を使用し、シングルコンパートメントモデルで評価した。
【０２１１】
統計分析−記述の統計学を用いて、実態的人口統計学、安全性と検査値、および正確な９５％の信頼区間が示される場所を含む治療反応率を要約した。試験薬の投与の１日目から疾患進行（身体的エビデンスまたは放射線学的（ＣＴ）エビデンスに基づく）、死亡、または最終接触（最も早く起こったもの）までを持続期間として定義した、無進行生存（ＰＦＳ）を、記述統計学を使用し、ならびにカプラン・マイヤー積極限法に基づいて要約した。患者が疾患進行を経験しなかった場合、または死亡の場合、検閲して削除したと見なされた。客観的な反応（ＯＲ）の発現の第１日目から（すなわちＣＲ、ＣＲｕ、またはＰＲ）疾患進行、死亡、または最終接触（最も早く起こったもの）の発症の１日目から疾患進行、死亡または最後の接触（最も早く起こったもの）までを持続期間として定義した奏功期間を、同様の方法を用いて要約した。
【０２１２】
結果
患者の特徴−計８２例の患者（男性３４人、女性４８人、年齢の中央値６４歳）を登録した。これらの患者の初期診断後の中央値は５年、直近治療後の中央値は１．８年であった。大部分の患者は、試験参加時点で良好な活動状態（８３％  ＥＣＯＣ  ０）にあったが、広範囲にわたる疾患（７９％  第ＩＩＩ／ＩＶ期）を有し、かつ１７例（２１％）の患者は高ＬＤＨ値を有し、および３０例（４０％）は少なくとも＞５ｃｍの腫瘍量を有していた。すべての患者は、少なくとも１つの前治療レジメン（範囲、１〜７）を投与されており、および、大部分の患者（８９％）は、少なくとも１つの、リツキシマブを含むレジメンで投与されていた。ＷＨＯ分類（Ｈａｒｒｉｓ  ＆  Ｆｅｒｒｙ２００１）に基づいて、濾胞性リンパ腫（ＦＣＬ）が認められた患者は５５例、一方非濾胞性リンパ腫が認められた患者は２７例、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ、Ｎ＝７）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ，Ｎ＝７）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ、Ｎ＝５）、周辺帯リンパ腫（ＭＺＬ、Ｎ＝６）［結節性ＭＺＬ（Ｎ＝２）および粘膜関連リンパ組織の結節外ＭＺＬ（ＭＡＬＴ、Ｎ＝４を含む）］、ならびにリンパ形質細胞性リンパ腫（Ｎ＝２）であった。公表されている基準を用いて、それぞれ、濾胞性および非濾胞性リンパ腫患者に対して転帰不良のリスクのＦＬＩＰＩおよびＩＰＩスコアを割り当てた（Ｓｏｌａｌ−Ｃｅｌｉｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０４：１２５８−１２６５，  ２００４）。実態的人口統計学および患者特性を、第５表にまとめる。
【０２１３】
【表５】
0006049163.tif 000007
【０２１４】
薬物投与−８２例の患者のうち、７８例に注入を４回投与した、一方初期の病勢悪化を示した３例の患者は２〜３回のベルツズマブ注入終了後に投与を中止し、および前リツキシマブ投与で蕁麻疹および悪寒を有したＳＬＬ患者１例は初回のベルツズマブ注入でグレード１〜２に類似する反応を示したため投与を中止した。アレルギー性反応により３例の患者には用量を減少して４回の注入のうちの１または２回を投与し、および次の高用量レベルでの注入を１回不注意に投与された１例の患者を除いて、他の患者には、患者の体表面積および用量レベルに基づいて、処方したように用量を投与した。投与したすべての用量に関する注入時間を、第６表にまとめる。
【０２１５】
【表６】
0006049163.tif 000008
【０２１６】
治療反応−初回注入で中止した一人の患者は、有効性を評価することができなかった。評価した８１例の患者のうち、２３例は、治療から４週間後の予定された１回目の評価時点で、または評価前に疾患進行を有し、さらなる反応評価を受けなかった。その他では、疾患進行より前の各患者での最良反応には、１０例のＣＲ、７例のＣＲｕ、１６例のＰＲ，および２５例の安定が含まれる。
【０２１７】
客観的反応（ＣＲ＝ＣＲ＋ＣＲｕ＋ＰＲ）を算出すると、全体的なＯＲおよびＣＲ／ＣＲｕ率は、それぞれ、４０．７％（３３／８１）および２１．０％（１７／８１）であった。濾胞性リンパ腫では、ＯＲおよびＣＲ／ＣＲｕ率は、それぞれ、４４％（２４／５５）および２７％（１５／５５）であった。より好ましくない予後（ＦＬＩＰＩ≧２、高ＬＤＨ値、巨大腫瘤病変＞５ｃｍ）を有する濾胞性患者の間では、ＯＲおよびＣＲ／ＣＲｕの両方は、２〜５回の前リツキシマブレジメン後も、および８０ｍｇ／ｍ2を含むすべての用量レベルで起こった。他の非濾胞性リンパ腫患者の中には、全体的なＯＲおよびＣＲ／ＣＲｕ率は、それぞれ、３５％（９／２６）および２７％（７／２６）であった。これは、２例のＣＲ／ＣＲｕ（３３％）（１例は８０ｍｇ／ｍ2で）を含むＯＲ（８３％）の５／６例のＭＺＬ患者、および３／７例のＤＬＢＣＬ患者（４３％）ならびに１／７例のＭＣＬ患者（１４％）を含んでいた。これらの結果を第７表にまとめる。
【０２１８】
【表７】
0006049163.tif 000009
【０２１９】
Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ推定値に基づき、５５例の濾胞性患者のすべてに対するＴＴＰの中央値は、６．７カ月（９５％  ＣＩ：３．７〜９．３カ月）および初回の注入からＯＲ（ＴＴＲ）の開始までの期間の中央値は、３．３カ月（９５％  ＣＩ：１．７〜３．７カ月）であった。ＯＲを有する２４例の患者は、１０．２カ月（９５％  ＣＩ：６．０〜２２．６カ月）のＤＲ中央値、および１５．２カ月（９５％  ＣＩ：９．５〜２８．２カ月）のＴＴＰ中央値を有した。２４反応者に関するＫａｐｌａｎ−ＭｅｉｅｒのＤＲおよびＴＴＰ曲線を、図１５に示す。初回の注入日から１５．９〜３７．６カ月の長期寛解を依然として継続している５例の患者を含む、ＣＲ／ＣＲｕを達成した１５例の濾胞性リンパ腫患者に関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ推定値によるＤＲおよびＴＴＰの中央値は、それぞれ１９．７カ月（９５％  ＣＩ：８．７〜３２．５カ月）および２４．２カ月（９５％  ＣＩ：１３．８〜３４・４カ月）であった。試料の大きさは小さいが、低用量での完全寛解の永続性において減少が見られなく、および８０ｍｇ／ｍ2で完全寛解を有する１例の濾胞性患者は、初回の注入から１５．９カ月後も依然として寛解期にある。非濾胞性組織型の中には、２例の完全寛解（１例は８０ｍｇ／ｍ2で）が起こり、ならびに長期間安定な反応（すべて周辺帯リンパ腫）であるこれらの完全寛解は、治療から１５〜２４カ月後も依然として続いている。
【０２２０】
有害事象−７８例の患者は、本試験の間、１つ以上の有害事象を有した。少なくとも治療に関連する可能性が考えられる事象を有する４８例の患者のうち、わずか１例の患者が、治療後１年を越える長期寛解期間の間に発症した低グロブリン血症、グレード３の事象を有した。その他の、おそらく少なくとも治療に関連すると考えられる事象は、すべて軽度〜中等度（グレード１〜２）であった。その大部分は、主に、初回の注入で生じた注入反応であり、その後の各注入でこの事象を有した患者数は、≦１１例であった。最も頻繁に生じた事象を第８表にまとめる。
【０２２１】
１０例の患者は、重大な有害事象を有したが、それらの事象のいずれも、おそらく治療に関連するとは思われない、既存の心房細動および治療期間中に生じた事象（外傷、蜂巣炎、敗血症）、治療後１２週間の評価期間内（活動状態の減少、背痛、動静脈奇形の偶発病変）または、長期の経過観察間の（膀胱腫瘍、肺動脈塞栓症、尿真菌感染）が含まれた。
【０２２２】
【表８】
0006049163.tif 000010
【０２２３】
１８例の患者（２２％）は、１つ以上の感染症を有した。４例のグレード３〜４の感染症のいずれも、治療に関連すると思われず、ＩＶ抗生物質を必要とした３例の感染症（敗血症、蜂巣炎、真菌性尿路感染症）および複数の経口抗生物質で治療された１例の感染症（他に特定されない）を含んだ。その他の、すべての感染症は、経口薬を用いて治療したグレード１〜２の事象であり、気道、尿路または副鼻洞を主に含んだ。
【０２２４】
安全性検査−血液学的および血清生化学的検査のための血液試料を、各注入の前、最後の注入から４週間後および１２週間後、次いで必要に応じて３カ月ごとに経過観察評価で採取した。標準安全性検査値において変化の異常なパターンは認められず、かつ治療後に毒性グレードが増加した患者はわずかであった（第９表）。
【０２２５】
【表９】
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*グレード３事象：３例の患者は、試験参加時点で、異常な検査値（グレード２  クレアチニン、グレード２  ＡＮＣ、グレード１  ヘモグロビン）を有し、これらの値は１２週目にグレード３になり、一方他の患者は１２週目まで正常なＷＢＣおよびＡＮＣレベルを維持した。
【０２２６】
薬物動態−４回の注入を完了した７２例のすべての患者は、意図された用量ですべてのベルツズマブ投与を受け、初回と最後の注入の後、血清試料を採集された。患者は、ベルツズマブを受ける前にＥＬＩＳＡアッセイ結果は陰性であり（１例の患者は、原因不明の血清干渉因子が明らかになったために除外した）、薬物動態分析に加えた。各注入の前、および注入から３０分後の平均血清レベルを第１０表にまとめる。すべての用量で、初回の注入で平均ピークのレベルは、リツキシマブで有効性を維持するために重要であると思われる２５μｇ／ｍＬ値を上回った（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ９：９９５−１００１，  １９９８；  Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：１０９６−１１０２，  ２００５；  Ｃａｒｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ６２：４３−５２，  ２００７）。抗体は、すべての用量および８０ｍｇ／ｍ2でも、注入番号で蓄積した。平均トラフ血清レベルは、最後の注入までに、２５μｇ／ｍＬ値を上回った。治療後血清試料は、最後の注入から３０分後、１日、２日、３日および４日後、および１週、２週、３週、４週、８週および１２週で採取するように予定を定めた。
【０２２７】
【表１０】
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【０２２８】
シングルコンパートメント（モノ指数関数）モデルを、７２例の患者の各々で、すべて利用できる治療後血清レベルデータにフィッティングした。もたらされたフィッティング決定薬物動態学的パラメータを第１１表にまとめ、用量レベルと共に増加した平均ＣｍａｘおよびＡＵＣを示すが、クリアランス（ＣＬ）値は、用量依存の一貫したパターンを示さない。最も重要なことに、平均Ｔ1/2値は、すべての用量および８０ｍｇ／ｍ2でも、匹敵するように見え、抗体は２０日の平均半減期で、血行内に残存する。正式な比較を行なわなかったが、２２例の他の非濾胞性患者と比較すると、５０例の濾胞性患者の平均ピークおよびトラフまたは治療後薬物動態（データ記載せず）に大きな差異はなかった。
【０２２９】
【表１１】
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【０２３０】
リツキシマブに関して報告されてきた（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ９：９９５−１００１，  １９９８；  Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：１０９６−１１０２，  ２００５；  Ｃａｒｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ６２：４３−５２，  ２００７）ものと同じように、各注入の平均と中央値のピークおよびトラフ血清レベルは概して、非反応者においてよりも客観的反応を有する患者の間でより高く、患者数は少ないが、８０ｍｇ／ｍ2の最低用量で治療された患者でさえ、高い値を示した。利用できるデータを有するすべての濾胞性患者の注入前および注入後の結果の中央値を、第１２表にまとめる。
【０２３１】
【表１２】
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【０２３２】
Ｂ細胞および他の免疫学的変化−末梢血Ｂ細胞レベル（ＣＤ１９＋）を、試験開始時に、各注入の前に、最後の注入から４週間後、次いでベースライン値への回復まで３カ月間隔で測定することにした。試験参加時点で、６８例の患者は低レベルまたは低〜正常レベルの末梢血Ｂ細胞レベル（１〜２５６細胞／μＬ、中央値６０）を有し、９例の患者（すべてのＳＬＬ患者５例を含む）は、高レベル（５７２〜１４，７１２細胞／μＬ、中央値１，７８２）を有し、および５例の患者は、一定のベースラインレベルを有してなかった。
【０２３３】
図１５は、ベースラインでＢ細胞レベルが非上昇し、かつ治療期間中に少なくとも１試料を採取したすべての患者のＢ細胞レベルのコースを図示する。Ｂ細胞レベルが全リンパ球のパーセンテージとして報告された検査値で、定量化（通常１％）の下限を下回る減少を決定することができなく、および分析のため、結果を絶対細胞数に変換する前に、限度で保存的に設定された。このように、Ｂ細胞減少の実際の程度は、おそらくより完了していると思われるが、それにもかかわらず、その結果は、最低量の８０ｍｇ／ｍ2を含むすべての用量レベルに匹敵するように見える。
【０２３４】
Ｂ細胞は、通常、最後の注入から６カ月後に回復が開始されるまで、減少したままであり、減少した値は、次いで９〜１２カ月までにベースライン値に向かって回復する。Ｂ細胞減少が低用量レベルでより永続性がないというエビデンスがないとはいえ、直近の用量レベル８０ｍｇ／ｍ2で治療された患者についての長期データは、依然として限定されている。
【０２３５】
試験参加時点でＢ細胞レベルが高い患者は少なく、明確にするため図１４には含まない。ベースライン値、特にＳＬＬ患者の値は極めて高かったにもかかわらず、患者のＢ細胞レベルは、８０ｍｇ／ｍ2で治療を受けた１例の患者における９４％の減少を含め、治療によって実質的に減少（中央値９６％減少）した。しかし、これらは主に短期間の反応であり、最後の注入から１２週間後までに、ほとんどのケースは高かったベースライン値に向かって回復し始める。
【０２３６】
定量的血清免疫グロブリンおよびＴ細胞レベルは、血液試料から取得し、ベースライン、最後の注入の前、最後の注入から４週間および１２週間後、患者が経過観察にある間は３カ月ごとに、評価されることになっていた。１２週間の試験期間中、または最後の注入から最高１年まで経過観察される患者の少人数のサブセットにおいて、臨床的に有意な減少の一貫したパターンはなく、ベースラインからの中央値変化は、ほとんどの時点で小さくなる（通常は、ＩｇＡおよびＩｇＧに対して＜５％、Ｔ細胞に対して＜１５％、ＩｇＭに対して＜２０％）。
【０２３７】
免疫原性（ＨＡＨＡ）−７０例の患者は、最後の注入から４週間後（Ｎ＝５８）、１２週間後（Ｎ＝５３）、６カ月後（Ｎ＝８）、または１年後（Ｎ＝２）に少なくとも１回、治療後血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡアッセイによってＨＡＨＡ分析を行なっている。以前にリツキシマブとの曝露を有する１例のＳＬＬ患者は、試験参加時点で陰性であったが、何ら明らかな臨床的帰結を示すこともなく、治療から４週間後高いタイター値（３，３８０ｎｇ／ｍＬ）が発現した。他のすべての試料は、陰性であった（＜５０ｎｇ／ｍＬ）。
【０２３８】
考察
抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）によって媒介される殺細胞、補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）、およびアポトーシス効果による直接のシグナリングのエビデンスにもかかわらず、Ｂ細胞悪性腫瘍または種々の自己免疫不全における抗ＣＤ２０免疫療法の作用の臨床的に関連したメカニズムは、不確かなままである（Ｇｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４：３８２３−３８３７，  ２００７）。このように、第二世代の抗ＣＤ２０抗体に関する臨床試験は、依然として必要であり、およびこの臨床試験のほとんどは、リツキシマブによって通常与えられた用量に近い、またはより高い抗体用量に焦点を合わせてきた（Ｍｏｒｓｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １１０：１９９ａ，  ２００７；  Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １１１：５４８６−５４９５，  ２００８；  Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １１１：１０９４−１１００，  ２００８）。しかし、動物試験（実施例１５）、ならびにＣＬＬでのシェービング効果（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：３２８０−３２８８，  ２００４；  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７：７４３５−７４４３，  ２００６）についての非依存的な試験を含むいくつかの問い合わせは、リツキシマブで使用された典型的な３７５ｍｇ／ｍ2よりも低い用量を探究すべきであることを示唆した。少なくともベルツズマブを用いることで、３７５ｍｇ／ｍ2よりもかなり低い用量が、臨床効果および末梢血Ｂ細胞を減少させる能力の両方に対して、効果的であることを本結果が示している。
【０２３９】
本試験におけるほとんどの患者は、濾胞性リンパ腫を有し、この疾患に対してベルツズマブは、全体の４４％の客観的反応を有している。４８％程度の割合でリツキシマブナイーブ患者での最初の中心的な試験においてリツキシマブを有したと報告しており（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １６：２８２５−２８３３，  １９９８）または患者の４０％が以前にリツキシマブに反応した（本試験の多くの患者は１つ以上のリツキシマブを含むレジメンへの前曝露を有しているので）（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １８：３１３５−３１４３，  ２０００）。同様に、完全寛解（ＣＲ／ＣＲｕに対して２７％、またはＣＲ単独に対して１６％のいずれか）の率は、６％およびそれらの群で報告される１１％の完全寛解率を上回ったとはいえ、初期の試験では異なる基準が用いられていた。
【０２４０】
完全寛解を含むベルツズマブ反応は、複数のリツキシマブレジメンを以前に投与された患者において、同様により良好でない結果（高いＦＬＩＰＩスコア、高ＬＤＨ値、腫瘤量＞５ｃｍ）の危険があると通常思われる患者において起こったことは重要である。最高反応率は少数のリツキシマブナイーブ患者に起こり、５７％のＯＲおよび４３％のＣＲ／ＣＲｕを達成した。
【０２４１】
本試験ですべてのＦＬ反応者に対して見出された１０．２カ月のＤＲ中央値は、リツキシマブを最初に適用された後の再発性／不応性、無痛性ＮＨＬ患者で報告された１１．２カ月のＤＲに匹敵する（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １６：２８２５−２８３３，  １９９８）。リツキシマブで再治療された患者においてより長い１５．０カ月のＤＲ中央値が報告されているが、これらの患者はすべて、以前のリツキシマブに対して少なくとも６カ月続いた客観的反応を達成していた（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １８：３１３５−３１４３，  ２０００）。対照的に、本試験で複数の患者は、６カ月内にリツキシマブを進行することがきでなかった可能性はあるが、客観的反応は必要とされなかった。このように、これらの患者は、より不応性である可能性があり、かつベルツズマブが効力を発するまでにより長い時間を必要とし、他のリツキシマブ試験（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）の両方の１．６カ月と比較すると、本試験での３．３カ月の反応開始までの時間の中央値と一致し、かつ本試験で見られた反応者の比較的長い１５．２カ月のＴＴＰ中央値とも一致する。
【０２４２】
上述のように、他の試験の完全寛解と比較すると、ベルツズマブとの完全寛解の数が多いように見える。この点は特に重要である。本試験においてＣＲ／ＣＲｕを有する患者は、概して持続する反応を有し、現在、ＤＲとＰＦＳの中央値はそれぞれ、１９．７カ月と２４．２カ月であり、５例の患者が依然として長期の反応（１５．９〜３７．６カ月）を継続しているので、これら両中央値は、さらに上昇すると思われるからである。このように、本発明で研究されたより低い用量レベルにもかかわらず、ベルツズマブによる有効性の結果は、毎週１回４週間投与すると、リツキシマブとの比較において有利に思われた。
【０２４３】
非小胞組織型の中で、ベルツズマブは、２７％のＣＲ／ＣＲｕと共に３５％の全客観的反応率を達成した。ベルツズマブは、特に周辺帯リンパ腫で効果を呈し、３例の長期反応（１５〜２４カ月）（１例はわずか８０ｍｇ／ｍ2の用量レベルで）を含む、結節外ＭＡＬＴまたは結節性疾患のいずれかを有する５／６例患者（８３％）でのＯＲあった。このように、リツキシマブで以前に報告された（Ｔｓｉｍｂｅｒｉｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  １０７：１２５−１３５，  ２００６；  Ｃｏｎｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０２：２７４１−２７４５，  ２００３）良好な反応と整合して、ベルツズマブは、周辺帯リンパ腫用に有望な活性を示す。
【０２４４】
ＤＬＢＣＬにおいて、完全寛解は起こらなかったが、８０ｍｇ／ｍ2で治療された１例の患者を含む３／７例患者が部分寛解を達成した。ベルツズマブを毎週４回投与することで、本試験で得られた４３％のＯＲ率の結果は、ＤＬＢＣＬで報告されたリツキシマブの毎週８回投与による３７％率に匹敵する（Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ９２：１９２７−１９３２，  １９９８）。有望な活性に関するこれらの結果は、リツキシマブで見出されたこと（Ｃｚｕｃｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２２：４７１１−４７１６，  ２００４；  Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４６：２３５−２４２，  ２００２；  Ｈａｂｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４：３１２１−３１２７，  ２００６）と同様に、ベルツズマブがこの集団で化学療法との併用で有用になり得ることを示唆する。これは、ＣＨＯＰとの併用でＤＬＢＣＬでの用途が承認されている。
【０２４５】
７例のマントル細胞リンパ腫患者のうちのわずか１例が客観的反応を有した。これは１２０ｍｇ／ｍ2のベルツズマブで治療された患者での短期間の部分寛解であった。これは、中程度の反応率で、かつこの疾患で単剤リツキシマブで報告された（Ｉｇａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １３：９２８−９４３，  ２００２；  Ｆｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １８：３１７−３２４，  ２０００）主に部分寛解と一致する。再発性小リンパ球性リンパ腫を有する患者は、単剤のリツキシマブに比較的抵抗性があることが知られており（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８；  Ｆｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １８：３１７−３２４．，  ２０００）、本試験では少数の患者のだれも、客観的反応を呈さなかった。
【０２４６】
しかしベルツズマブはＳＬＬで活性である他のエビデンスがあった。それは、すべての患者のＢ細胞レベルが、試験参加時点で上昇（３例は１０，０００／ｍｍ3を超える）しており、このレベルは、初回のベルツズマブ注入の後減少し、最後の注入後少なくとも４週間の間減少を維持した。これには、最初に、＞１０，０００／ｍｍ3のレベルであったが８０ｍｇ／ｍ2での治療を受け、その後９４％減少した１例の患者が含まれる。ワルデンストレームマクログロブリン血症および免疫細胞腫を有する患者におけるリツキシマブに関する２つの研究では、完全寛解なしで中程度の反応率だけが報告されており（Ｆｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １８：３１７−３２４，  ２０００；  Ｇｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ４５：２０４７−２０５５，  ２００４）、したがって本試験でリンパ形質細胞性リンパ腫の２例の患者のどちらも客観的反応がなかったことは、驚くべきでない。
【０２４７】
ベルツズマブ薬物動態に関して、３７５ｍｇ／ｍ2で、ベルツズマブで達成した平均ピークおよび血清抗体レベルは、リツキシマブに関して報告された値に匹敵した（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ９：  ９９５−１００１，  １９９８）。８０ｍｇ／ｍ2の用量でも、初回の注入後にＢ細胞減少が起こり、この初回の注入の後の抗体血清レベルは、維持された有効性と関連した２５μｇ／ｍＬの値を上回った（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｃａｒｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、かつ連続する注入ごとに増加し続け、ベルツズマブは、リツキシマブ研究で報告された長さに匹敵するまたは少なくともその長さの半減期を有し最後の注入の後血行に残存した（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｃａｒｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００７）。
【０２４８】
リツキシマブで報告された（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｃａｒｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）反応者における高血清レベルの同じ関係を我々は見出した。その数は少なかったが、８０ｍｇ／ｍ2の最低用量で治療されただけの患者でもこの傾向が依然として見られた。これらの薬物動態学的および薬力学的所見は、低いベルツズマブ用量が抗原性シンクを克服するのに十分であったことを示唆し、したがって８０ｍｇ／ｍ2を含む本試験でのすべての用量で起こった臨床活動の証明を支持する。
【０２４９】
低用量を使用する付加的な利点は、注入時間の減少である。ベルツズマブを用いて、初回の注入時間の中央値は、７５０ｍｇ／ｍ2で４．７時間、３７５ｍｇ／ｍ2で３．１時間、およびより低い用量で１．８〜２．４時間であったが、それに続く注入の時間の中央値は、３７５または７５０ｍｇ／ｍ2で２．１〜２．６時間、およびさらに低い用量で１．２〜１．５時間であった。これらのより短い注入時間で、重篤な注入反応は見られず、またはより一般的な注入反応の頻度よりも増えなかった。これは重要である。プロトコルはこの最初の試験において注入速度を限定したので、より早い投与でも本薬剤によって可能になると思われるからである。ベルツズマブはまた、標準安全性検査、Ｔ細胞レベル、または血清免疫グロブリンに明らかな臨床的影響を及ぼさなかった。不確かな臨床的意義について、ＨＡＭＡ応答のわずか１症例が起こり、その他では、ベルツズマブ免疫原性のエビデンスが見られなかった。
【０２５０】
リツキシマブについての最初の初の臨床試験は、１０〜５００ｍｇ／ｍ2の単回投与を評価し、１００ｍｇ／ｍ2以上の用量で、いくつかの部分寛解を達成した（Ｍａｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ８４：  ２４５７−２４６６，  １９９４）。次のリツキシマブの試験では、１２５ｍｇ／ｍ2の用量だけを毎週１回、４週間の間与えた。実際の反応率（すべての部分寛解）は、テストした各用量レベルで同じであったため、明らかに、科学的考慮よりはむしろロジスティック考慮に基づいて、現在の標準用量３７５ｍｇ／ｍ2が、その時点でさらなる開発のために選択された（Ｍａｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １５：３２６６−３２７４，  １９９７）。患者の反応に影響する薬物動態と因子をよりよく理解することは、投与を最適化するために明らかに必要である（Ｃａｒｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ６２：４３−５２，  ２００７）、しかしリツキシマブが最初に認可された後、３７５ｍｇ／ｍ2およびより高い用量さえも、限界評価をせずにまたはより低いレベルを考慮することもなく、抗ＣＤ２０抗体との臨床用途のために受容された。しかし、慢性リンパ性白血病での「シェービング」の最近のエビデンスによって、その疾患では低用量も効果的になり得ることを他の人が提案するようになった（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：３２８０−３２８８，  ２００４；  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７：７４３５−７４４３，  ２００６）。低用量も、腫瘍の容積が小さいまたは維持療法を受けている腫患者、または、悪性疾患におけるよりもＣＤ２０シンクが非常に少ないこともあり、かつあまりにも攻撃的なＢ細胞抑制が必要でないもしくは望ましくないＢ細胞媒介自己免疫疾患などの、より低いＣＤ２０腫瘍量に対して効果的であると思われる。
【０２５１】
要約すると、この実施例は、８０ｍｇ／ｍ2を含む評価したすべての用量で起こるＢ細胞減少および完全寛解によって、ベルツズマブが、耐容性が高いだけでなく、低用量でも活性であることを示した。動物モデル（実施例１５）で示したように、より濃縮された抗体製剤を用いる、皮下注射によってベルツズマブを送達する機会の理由から、低用量も重要である。
【０２５２】
実施例２５．ｈＡ２０変異体
【表１３】
0006049163.tif 000015
【０２５３】
材料および方法
ＰＣＲは、標準ＰＣＲプロトコルに従って行なった。ＤＮＡ配列決定は、ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によって行なわれた。制限酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。プライマーは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを介して作製した。
【０２５４】
Ａ．変異体Ｖ１０２Ｙ
Ｖ１０２Ｙは、ＶＨのＣＤＲ３の１０２位（カバット番号付け）でＶａｌからＴｙｒへの１つのアミノ酸変化を有するｈＡ２０の変異体である。
0006049163.tif 000016
【０２５５】
したがって、Ｖ１０２ＹのＣＤＲＨ３は、ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＤＹ（配列番号２１）である。
【０２５６】
ベクターの構築およびクローニングスキーム
４つのプライマーを使用した：
５′Ｖ１０２Ｙ  プライマー（４０塩基長）
ＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＧ  （配列番号２２）
３′Ｖ１０２Ｙ  プライマー（４０塩基長）
ＣＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＡＴＣＧＡＡＧＴＡＣＣＡＧＴＣＡＣＣＧ  （配列番号２３）
５′Ｘｈｏ  Ｉ  プライマー（２０塩基長）
ＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣ  （配列番号２４）
３′  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩプラマー（２０塩基長）
ＡＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＣＣ  （配列番号２５）
【０２５７】
クローニングスキームは以下のとおりであった：
ＤＮＡ鋳型：ｈＡ２０−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２
５′Ｘｈｏ  Ｉ  プライマー  ＆  ３′Ｖ１０２Ｙ  プライマー
ＰＣＲ産物  ＃１：５１０ｂｐ
ＤＮＡ鋳型：ｈＡ２０−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２
５′Ｖ１０２Ｙプライマー  ＆  ３′Ｈｉｎｄ  ＩＩＩプライマー
ＰＣＲ産物  ＃２：２１０ｂｐ
【０２５８】
ＰＣＲ産物＃１および＃２をゲルから精製し、鋳型として等モル量で混合し、プライマーとして５′Ｘｈｏ  Ｉおよび  ３′Ｈｉｎｄ  ＩＩＩを用いてＰＣＲさせて、ＰＣＲ産物＃３（６８０ｂｐ）を生成し、これをｐＧＥＭＴにクローン化し、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて確認し、続いて配列決定を行なった。ｈＡ２０−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２の制限フラグメントであるＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩとＰＣＲ産物＃３を連結させることで、Ｖ１０２Ｙ用の発現ベクターを完成させ、Ｖ１０２Ｙ−ｈＡ２０−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２と命名した）。
【０２５９】
トランスフェクションおよびタンパク質精製
Ｖ１０２Ｙ−ｈＡ２０−ｐｄＨＬ２（３０μｇ）をＳａｌＩで消化させることによって線形化し、続いて１００％フェノール、クロロホルム抽出、および１００％エタノールと酢酸アンモニウムによる沈殿を行なう。ＤＮＡペレットを、電気穿孔緩衝液（２０ｎＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０；１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、および６ｍＭブドウ糖）に再懸濁させ、次いで、２．８×１０6のＳｐＥＳＦ細胞と混合し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ  ＢｉｏＲａｄ（静電容量２５μＦ、４５０Ｖ、電気抵抗無限大オーム、４ｍｍキューベット）を用いて電気穿孔する。９６ウェルプレート上に培地を加えてプレーティングする。
【０２６０】
４８時間後、０．２μＭ  ＭＴＸを含有する等量の選択培地を加えた。約１０日後、プレートを被覆したマウス抗ｈＡ２０抗体および抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ複合体を用いるＥＬＩＳＡによってクローンをスクリーニングした。ＯＰＤおよびＨ2Ｏ2を用いて色を発色させる。
【０２６１】
最も産生能の高い（４２ｍｇ／Ｌ）クローンを選択して、３Ｄ１０と命名した。Ｖ１０２Ｙをローラーボトル中で作製し、タンパク質Ａを用いて精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除ＨＰＬＣによってその純度を示した。他の特徴付けには、解離速度の決定およびＡＤＣＣ分析が含まれた。
【０２６２】
Ｂ．変異体ＹＤＥ
ＹＤＥは、ＦｃのＣＨ２ドメイン上に２つの２アミノ変異を有するＶ１０２Ｙの変異体である：
Ｓ２３９Ｄ  （ＴＣＡ→ＧＡＴ）  ＆  Ｉ３３２Ｅ  （ＡＴＣ→ＧＡＡ）
Ｖ１０２Ｙのように、ＹＤＥ内のＣＤＲＨ３は、ＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＤＹ  （配列番号２１）である。
【０２６３】
ベクターの構築およびクローニングスキーム
この２つのアミノ酸変異体のために、６つのプライマーを設計した：
５′Ｐｓｔｌ−Ｆｃ（２０塩基長）
５′ＣＴＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴ  （配列番号２６）
３′Ｓ２３９Ｄ（２３塩基長）
５′ＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＧＧＴＣＣＣＣＣＣ  （配列番号２７）
５′Ｓ２３９Ｄ（２３塩基長）
５′ＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴ  （配列番号２８）
３′Ｉ３３２Ｅ（２３塩基長）
５′ＡＴＧＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＧＧＧＧＧＣＴＧＧ  （配列番号２９）
５′Ｉ３３２Ｅ（２３塩基長）
５′ＣＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴ  （配列番号３０）
３′ＰｓｔＩ−Ｆｃ（２０塩基長）
５′ＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＴＣＧＣＡ  （配列番号３１）
【０２６４】
クローニングスキームは以下のとおりであった：
ＤＮＡ鋳型：１８２６−ＳＶ３（社内のステージングベクター）
ＰＣＲ＃１：  ５′ＰｓｔＩ−Ｆｃ  ＆  ３′Ｓ２３９Ｄプライマー→２０７ｂｐ
ＰＣＲ＃２：  ５′Ｓ２３９Ｄ  ＆  ３′Ｉ３３２Ｅプライマー→３０３ｂｐ
ＰＣＲ＃３：  ５′Ｉ３３２Ｅ  ＆  ３′ＰｓｔＩ−Ｆｃプライマー→４７７ｂｐ
【０２６５】
各ＰＣＲ産物をゲル精製し、等モル濃度で混合し、プライマーとして５′ＰｓｔＩ−Ｆｃおよび３′ＰｓｔＩ−Ｆｃを用いて、ＰＣＲ＃４（９４１ｂｐ）を得た。ＰＣＲ＃４をｐＧＥＭＴにクローン化して、配列決定により確認した。次いで、このフラグメントを、ＰｓｔＩを用いてｐＧＥＭＴから消化させ、中間体ベクター（１８２６−ＳＶ３）にクローン化して、これもＰｓｔＩで消化させた。Ｅａｇｌを用いてステージングベクターから切断したＰＣＲ＃４をＥａｇｌ制限Ｖ１０２Ｙ−ｈＡ２０−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２と連結させることで、最終ＹＤＥ−ｈＡ２０−ｐｄＨＬ２の構築を完成させた。
【０２６６】
トランスフェクションおよびタンパク質精製
上述のＶ１０２Ｙと同じ手順を用いて、ＹＤＥのための産生クローンを得て、それを、タンパク質Ａを用いて細胞培地から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥ−ＨＰＬＣによってその精度を示した。ｖ−マブまたはＶ１０２Ｙと比べてＹＤＥは、強化されたＡＤＣＣを有することがわかった。
【０２６７】
Ｃ．変異体ｖ−マブ−ＤＥ
ｖ−マブ−ＤＥは、ｖ−マブのＦＣ変異体であり、ＦｃのＣＨ２ドメイン上にＹＤＥと同じアミノ酸変異を有する。実施例２でＹＤＥについて述べたのと同じプラマーおよびクローニングスキームを、トランスフェクトされていない発現ベクターｖ−マブ−ＤＥ−ｈＡ２０−ｐｄＨＬ２の構築で用いた。
【０２６８】
ｈＡ２０変異体についてのＡＤＣＣアッセイ
ＡＤＣＣアッセイを以下のように行なった。簡単に言うと、Ｄａｕｄｉ細胞を５０μＬのアッセイ培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ）に１０4細胞／ウェルでプレーティングした。１セットのウェルに、バックグラウンド対照として培地だけを加え、別のウェルセットには細胞だけを加えて、最大細胞溶解のための対照として使用した。
【０２６９】
各アッセイに対して各ドナーから採取したＰＢＭＣを使用した。血液を、ヘパリン添加した管（約５０ｍＬの血液／ドナー）に取り出す。その時リンパ球の密度勾配分離のためにＵＮＩ−ＳＥＰマキシ管（ＮＯＶＡｍｅｄ，ＬＴＤ．）を用いた。１．６×１０7細胞／ｍＬで約３ｍＬのＰＢＭＣを各ドナーから採取した。
【０２７０】
各アッセイで、エフェクター対標的の比を４０：１としたエフェクター、５μｇ／ｍＬの抗体を用いた。３７℃、５％ＣＯ2で、加湿インキュベーターで４時間インキュベートした後、プレートをインキュベーターから取り出して、室温まで下げ、製造業者のプロトコルに従って、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｏｎｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用して、分析した。６連の各試料に対する溶解パーセントを、以下の式を用いて決定した。
【０２７１】
【数２】
0006049163.tif 000017
【０２７２】
３名のドナーから標的細胞としてＤａｕｄｉを用いて得たＡＤＣＣ結果（％溶解）を以下の表にまとめる。各ドナーに関して、ＹＤＥとｖ−マブまたはＶ１０２Ｙのいずれかとの差異は、統計的に有意であった（ドナー００９の場合、ｐ＜０．０００１；ドナー００６の場合、ｐ＜０．０００２；ドナー００１の場合、ｐ＜０．０２）。ｖ−マブとＶ１０２Ｙの差異は、統計的に有意でなかった。イソタイプ対照（ｈ７３４  ＩｇＧ）は最小ＡＤＣＣを示した。
【０２７３】
【表１４】
0006049163.tif 000018
【０２７４】
本明細書に開示して、クレームする組成物および方法のすべては、本発明の開示を踏まえて不当な実験法を用いることなく作製して使用することができる。組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記述しているが、本発明の概念、趣旨および適応範囲から逸脱することなく、本明細書に記述する組成物および方法に、ならびに方法のステップまたはステップの順序にバリエーションが適用され得ることは、当業者にとって明らかである。より具体的には、同じまたは同様の結果が達成されることになるのであれば、化学的に、および生理学的に関連がある特定の薬剤を、本明細書に記述する薬剤と置換してもよい。当業者にとって明らかであるこのような同様の置換および修飾のすべては、添付する特許請求の範囲に定義されるように、本発明の趣旨、適応範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【０２７５】
本出願は、２００８年７月２１日に提出された米国特許仮出願番号第６１／０８２，３９９号に基づくものであり、かつ該仮出願の優先権を主張する。その図面、特許請求の範囲、および明細書を含む開示内容全体における優先権主張の開示を参考として本明細書で援用する。加えて、引用されたすべての論文、特許および特許出願の開示内容全体を本明細書で援用する。
【図１Ａ】
0006049163.tif 000019
【図１Ｂ】
0006049163.tif 000020
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0006049163.tif 000024
【図４】
0006049163.tif 000025
【図５】
0006049163.tif 000026
【図６】
0006049163.tif 000027
【図７】
0006049163.tif 000028
【図８】
0006049163.tif 000029
【図９】
0006049163.tif 000030
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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