(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ザクロ果汁の乳酸菌発酵物を含有することを特徴とするヒアルロン酸合成促進剤(皮膚外用剤及び浴用剤を除く)。
【請求項２】
乳酸菌がラクトバチルス・プランタラムであることを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸合成促進剤。
【請求項３】
ザクロ果汁のラクトバチルス・プランタラムによる乳酸菌発酵物を含有することを特徴とする関節炎の予防又は改善剤。
【請求項４】
ザクロ果汁のラクトバチルス・プランタラムによる乳酸菌発酵物を含有することを特徴とする化膿性関節炎又は通風性関節炎の予防又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ザクロ果汁の乳酸菌発酵物を有効成分として含有することにより、生体内のヒアルロン酸の合成能力を高める事で皮膚の老化やアトピー性皮膚炎、乾癬や魚鱗癬等の皮膚疾患、リウマチ等関節炎の予防・治療に用いることのできるヒアルロン酸合成促進剤及び皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、皮膚中には真皮・表皮のいずれにもヒアルロン酸があることが知られている。ヒアルロン酸はグルクロン酸とＮ―アセチルグルコサミンが交互に結合した高分子で、その分子量は数百万にも及び、多くの水分を保持できる事が明らかとなっている。しかしながらこのヒアルロン酸は加齢と共に減少する事が報告されており（特許文献１）、これにより老化に伴う皮膚の保水力の減少を引き起こし、乾燥肌等の原因となると考えられている。また関節リウマチ患者の場合、関節中のヒアルロン酸が減少し、同様に化膿性関節炎や通風性関節炎等でもヒアルロン酸含量の低下が起こることから、それらの症状を改善するためにヒアルロン酸合成促進剤が有効であることが記載されている（特許文献２、特許文献３）。
【０００３】
ザクロには、エラグ酸等の抗酸化成分が含まれ、抗老化作用が期待できること、また、女性ホルモン様成分が含まれ、美容と健康に対する効果が期待できることから、その花、果実、種子等が健康食品や化粧品原料として利用されている。その主要な特許文献としては、抗酸化作用を有する化粧品（特許文献４）、美白作用を有する化粧品（特許文献５）、抗アレルギー作用（ヒアルロニダーゼ阻害作用）を有する皮膚外用剤（特許文献６）、女性ホルモン様作用を有する化粧品（特許文献７）、エラスターゼ阻害剤（特許文献８）、炎症性サイトカインの合成抑制剤（特許文献９）が挙げられる。しかしながら、生体内のヒアルロン酸の合成能力を高める効果については、記載されていない。
【０００４】
なお、ザクロ果汁の乳酸菌による発酵物の利用は、ザクロ果汁の酸度が高く発酵性が悪いことからあまり利用されていない。果汁の乳酸菌発酵物を有効成分とする美容剤に関する特許文献（特許文献１０）には、果汁の乳酸菌発酵物の美容剤に関する記載があるが、ザクロ果汁に関する具体的な有効性に関する記載はない。また、特許文献（特許文献１１）には、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムのヒドロキシペルオキシドとリノール酸ヒドロキシペルオキシドに対する分解特性を示す抗酸化剤に関して記載されている。しかしながら、乳酸菌発酵に用いる具体的な対象物について、及び抗酸化作用以外の効果にについては記載されていない。
また、ザクロ果汁又はその乳酸菌発酵物のヒアルロン酸合成促進効果についての先行文献はなく、また、ザクロ果汁の乳酸菌発酵物を含有する皮膚外用剤に関する文献情報もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−１８２４０２
【特許文献２】特開２００２−３６３０８１
【特許文献３】特開２００４−５１５７９
【特許文献４】特開平０５−３２００３７
【特許文献５】特開平０５−３３１０４１
【特許文献６】特開平０９−１１０７１０
【特許文献７】特開２００１−１３１０５３
【特許文献８】特開２００５−５３８７３
【特許文献９】特開２００５−８９３０４
【特許文献１０】特開２００６−８５６６
【特許文献１１】特開２００６−２９１１４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
かかる状況に鑑み、本願発明の課題は、天然で安全性の高い素材を用いて、より効果の高いヒアルロン酸合成促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
食習慣のある果汁又はそれらの発酵物についてヒアルロン酸合成促進作用を検討した。本願発明者らは、上記課題の解決に向けて鋭意検討を行った結果、ザクロ果汁にヒアルロン酸合成を促進する効果を見出した。その中で、さらに果汁の乳酸菌発酵物についても検討を行ったが、本願発明に用いたザクロ果汁については、乳酸菌による効率的な発酵方法が検討課題であった。さらに鋭意検討を行った結果、ヒアルロン酸合成を促進する効果は、ザクロ果汁の乳酸菌発酵物にのみ、偶然にも向上することを見出し、本願発明を完成するに至った。
【０００８】
本願発明に用いるザクロ果汁とは、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ）の果汁である。果汁は、市販のザクロから、圧搾により絞ることが可能であるが、業務用に流通しているザクロ果汁の濃縮物を利用することができる。果汁は、そのまま用いても良く、又は濃縮果汁を用いてもよく、また希釈して用いても良い。また、発酵を効率的にするため、水酸化ナトリウム等のアルカリでｐＨを３〜８に調整して用いても良い。また、乳酸桿菌の生育促進を目的として、酵母エキスや大豆ペプチド等の有機物、硫酸マグネシウム等のミネラルを添加しても良い。
【０００９】
本願発明に用いる乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、又はペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する乳酸菌が挙げられる。好ましくは、発酵による有効性向上の点でラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に属する乳酸菌であって、植物、又はその発酵食品である漬け物等から分離した菌株であっても、菌株保存機関に登録されたものであっても良い。また、ザクロ果汁をｐＨ３〜５の範囲で効率よく発酵させ得るものが好ましい。
【００１０】
培養条件としては、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが、目安として１５〜４５℃あり、２５〜４０℃が良い。
【００１１】
ザクロ果汁又はその乳酸菌発酵物は、そのまま用いても良く、必要に応じて、抽出、濃縮、稀釈、ろ過等の処理及び活性炭等による脱色、脱臭処理をして用いても良い。抽出する溶媒としては、水、エタノール、１，３−ブチレングリコール、又はその混合液でも良く、抽出温度は室温でも加熱しても良い。
【００１２】
本願発明のヒアルロン酸合成促進剤又は皮膚外用剤への配合は、上記抽出物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬部外品、医薬品又は食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分を配合することもできる。
【００１３】
本願発明のヒアルロン酸合成促進剤又は皮膚外用剤の剤型としては、例えば、化粧水、クリーム、マッサージクリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、坐剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤等を含む）、錠菓、飲料等が挙げられる。
【００１４】
本願発明のヒアルロン酸合成促進剤又は皮膚外用剤において、ザクロ果汁及びその乳酸菌発酵物の含有量は特に限定されないが、固形分として３０％以下であることが好ましく、０．００１〜１０重量％含まれる濃度で使用することが最も好ましい。０．０００１重量％未満であると本願発明の効果が十分に発揮されにくい場合がある。
【００１５】
本願発明に用いるザクロ果汁は、天然で安全性の高い素材であり、優れたヒアルロン酸合成促進効果を認めた。また、その乳酸菌発酵物は、発酵前よりさらにヒアルロン酸合成促進効果が増大することから、皮膚の老化やアトピー性皮膚炎、乾癬や魚鱗癬等の皮膚疾患、リウマチ等関節炎の予防・治療に効果が期待でき、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等への配合や応用が可能である。
【発明の効果】
【００１６】
本願発明に用いるザクロ果汁及びその乳酸菌発酵物は、優れたヒアルロン酸合成促進効果を有しており、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品の分野において利用できるものである。さらに、ザクロ果汁を特定の条件で発酵すると、上記効果が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
次に本願発明を詳細に説明するため、実施例として本願発明に用いる乳酸菌発酵物の製造例、処方例及び実験例を挙げるが、本願発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量の部とは重量部を、％とは重量％を示す。
以下に、ザクロ果汁の乳酸菌発酵物の製造例を示す。
【実施例１】
【００１８】
製造例１  ザクロ果汁の発酵物
濃縮ザクロ果汁(Ｂｒｉｘ６５)を、水で希釈してＢｒｉｘ１５に調整し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ５に調整した。調整液５００ｇにラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌（漬物由来）の種菌を加えた。３０℃にて２日間発酵してろ過し、ザクロ果汁の発酵物４５０ｇを得た。
【００１９】
製造例２  ザクロ果汁の発酵物
濃縮ザクロ果汁(Ｂｒｉｘ６５)を、水で希釈してＢｒｉｘ１１に調整し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ４．５に調整した。調整液５００ｇにラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌（漬物由来）の種菌を加えた。３０℃にて２日間発酵してろ過し、ザクロ果汁の発酵物４５０ｇを得た。
【００２０】
製造例３  ザクロ果汁の発酵物
濃縮ザクロ果汁(Ｂｒｉｘ６５)を、水で希釈してＢｒｉｘ８に調整し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ４．５に調整した。調整液５００ｇにラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌（漬物由来）の種菌を加えた。３０℃にて２日間発酵してろ過し、ザクロ果汁の発酵物４５０ｇを得た。
【００２１】
製造例４  ザクロ果汁の発酵物
ザクロ果汁を、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ４．５に調整した。調整液５００ｇにラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌（漬物由来）の種菌を加えた。３０℃にて２日間発酵してろ過し、ザクロ果汁の発酵物４５０ｇを得た。
【００２２】
製造例５  ザクロ果汁の発酵物
製造例２のザクロ果汁の発酵物２１０ｇに１，３−ブチレングリコール９０ｇを加えてろ過し、ザクロ果汁の発酵物２８０ｇを得た。
【００２３】
製造例６  ザクロ果汁の発酵物の凍結乾燥物
製造例１のザクロ果汁の発酵物１００ｇについて、凍結乾燥し、ザクロ果汁の発酵物の凍結乾燥物１５ｇを得た。
【００２４】
製造例７  ザクロ果汁の発酵物の凍結乾燥物
製造例３のザクロ果汁の発酵物１００ｇについて、凍結乾燥し、ザクロ果汁の発酵物の凍結乾燥物８ｇを得た。
【００２５】
製造例８  ザクロ果汁の発酵物の乾燥物
製造例４のザクロ果汁の発酵物２００ｇに１２０ｇのデキストリンを加え、スプレードライヤーにて乾燥し、ザクロ果汁の発酵物の乾燥物１４５ｇを得た。
【実施例２】
【００２６】
以下に、ザクロ果汁又はその乳酸菌発酵物を用いたヒアルロン酸合成促進剤及び皮膚外用剤の処方例を示す。
【００２７】
処方例１  化粧水
成分                                                              配合量（部）
１．ザクロ果汁の発酵物（製造例５）                                ５．０
２．１，３−ブチレングリコール                                    ８．０
３．グリセリン                                                    ２．０
４．キサンタンガム                                                ０．０２
５．クエン酸                                                      ０．０１
６．クエン酸ナトリウム                                            ０．１
７．エタノール                                                    ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．）                ０．１
１０．香料                                                          適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合しろ過して製品とする。
【００２８】
比較例１  従来の化粧水
処方例１において、ザクロ果汁の発酵物（製造例５）を精製水に置き換えたものを従来の化粧水とした。
【００２９】
処方例２  クリーム
成分                                                              配合量（部）
１．ザクロ果汁の発酵物（製造例５）                                ０．５
２．スクワラン                                                    ５．５
３．オリーブ油                                                    ３．０
４．ステアリン酸                                                  ２．０
５．ミツロウ                                                      ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル                                  ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）              ３．０
８．ベヘニルアルコール                                            １．５
９．モノステアリン酸グリセリン                                    ２．５
１０．香料                                                          ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル                                      ０．０５
１３．１，３−ブチレングリコール                                    ８．５
１４．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００３０】
処方例３  ゲル剤
成分                                                              配合量（部）
１．ザクロ果汁(発酵前)                                            ５．０
２．エタノール                                                    ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）                ０．１
５．香料                                                          適量
６．１，３−ブチレングリコール                                    ５．０
７．グリセリン                                                    ５．０
８．キサンタンガム                                                ０．１
９．カルボキシビニルポリマー                                      ０．２
１０．水酸化カリウム                                                ０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜５と、成分１及び６〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。
【００３１】
処方例４  浴用剤
成分                                                              配合量（部）
１．ザクロ果汁の発酵物の凍結乾燥物（製造例６）                    １．０
２．炭酸水素ナトリウム                                          ５０．０
３．黄色２０２号（１）                                            適量
４．香料                                                          適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜５を均一に混合し製品とする。
【００３２】
処方例５  錠剤
成分                                                              配合量（部）
１．ザクロ果汁の発酵物の凍結乾燥物（製造例７）                    ５．０
２．乾燥コーンスターチ                                          ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム                        ２０．０
４．微結晶セルロース                                            ４０．０
５．ポリビニルピロリドン                                          ７．０
６．タルク                                                        ３．０
［製造方法］成分１〜４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。
【００３３】
処方例６  錠菓
成分                                                              配合量（部）
１．ザクロ果汁の発酵物の乾燥物（製造例８）                        ２．０
２．乾燥コーンスターチ                                          ４９．８
３．エリスリトール                                              ４０．０
４．クエン酸                                                      ５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル                                          ３．０
６．香料                                                          ０．１
７．精製水                                                        ０．１
［製造方法］成分１〜４及び７を混合し、顆粒成型する。成型した顆粒に成分５及び６を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。
［製造方法］成分１及び２を加えて混合する。
【実施例３】
【００３４】
次に、本願発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。
【００３５】
実験例１  ヒアルロン酸合成促進試験
正常ヒト皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸合成促進効果を、ヒアルロン酸合成酵素−２（ＨＡＳ−２）ｍＲＮＡの発現量を指標として評価した。ＨＡＳ−２は、細胞膜に存在するヒアルロン酸を合成する酵素の１つである。
【００３６】
正常ヒト皮膚線維芽細胞を６ｃｍシャーレに播種し、コンフルエントな状態になった後、固形分として０．０１ｍｇ／ｍｌ濃度の試料を添加した培地（１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）にてさらに２４時間培養し、総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡの抽出には、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン）を用いた。細胞から抽出した総ＲＮＡを基に、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＨＡＳ−２のｍＲＮＡ発現量の測定を行った。ＲＴ−ＰＣＲ法にはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ３  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（インビトロジェン）を用いた。ＰＣＲ反応は、９５℃−２分の初期変性を行った後、９５℃−１５秒、６０℃−３１秒を１サイクルとして４０サイクル行った。また、内部標準としては、β−アクチンを用いた。その他の操作は、定められた方法に従い、ＨＡＳ−２  ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるβ−アクチンｍＲＮＡ発現量に対する割合として求めた。コントロールに対する試料添加時のＨＡＳ−２  ｍＲＮＡ発現量の割合を算出し、ヒアルロン酸合成促進率とした。尚、測定に使用したプライマーは以下の通りである。
【００３７】
ＨＡＳ−２用のプライマーセット
ＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＧＣＧＡＴＴＡ（配列番号１）
ＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧ（配列番号２）
【００３８】
β−アクチン用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号３）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号４）
【００３９】
これらの試験結果を表１に示した。発酵前、発酵後（製造例１）共にヒアルロン酸合成促進効果が認められたが、発酵物（製造例１）は、発酵前と比較して、より強くなった。同様に製造例２〜４の発酵物についても強いヒアルロン酸合成促進効果が認められた。なお、このような乳酸菌による発酵に伴うヒアルロン酸合成促進効果の向上については、ザクロ果汁以外では認められなかった。
【００４０】
【表１】
0005972667.tif 000002
【００４１】
実験例２  使用試験
処方例１の化粧水及び比較例１の従来の化粧水を用いて、小じわや肌のハリに悩む女性１５人（２３〜５０才）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、小じわや肌のハリについてのアンケート調査を行った。
【００４２】
アンケート調査の結果を表２に示した。本願発明のザクロ果汁の発酵物を含有する皮膚外用剤は、優れた小じわ、肌のハリの改善作用を示した。なお、試験期間中、皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。また、処方成分の劣化についても問題なかった。
【００４３】
【表２】
0005972667.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本願発明は、生体内のヒアルロン酸の合成能力を高める事で皮膚の老化やアトピー性皮膚炎、乾癬や魚鱗癬等の皮膚疾患、リウマチ等関節炎の予防・治療に用いることのできるヒアルロン酸合成促進剤及び皮膚外用剤を提供できる。
【配列表】
0005972667000001.app