(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の段階を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質の生産収率を向上させる方法：
（ａ）全炭素源の濃度が６％超過１４％以下である培地を用意する段階；及び
（ｂ）上記用意した培地にヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質発現細胞を接種して９６時間以上培養する段階；
ここで、該全炭素源が、グルコース及びガラクトースであり、
該ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質発現細胞が、ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質を発現するベクターで形質転換された酵母細胞である。
【請求項２】
上記ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質は、ＨＰＶタイプ１６、ＨＰＶタイプ１８またはＨＰＶタイプ５８のＬ１タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記段階（ａ）で、培地の全炭素源の濃度が７〜１４％であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記段階（ａ）で、培地の全炭素源の濃度が８〜１４％であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質発現細胞が、Ａ６００測定時のＯＤ値＝３０〜４７まで培養されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記段階（ｂ）後に、培地に炭素源をさらに添加して追加培養する段階（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記培地にさらに添加する炭素源は、ガラクトースであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記追加培養は、２４時間以上であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質の生産収率を向上させる方法に関する。より詳細に、全炭素源を高濃度で含有する培地でＨＰＶ  Ｌ１タンパク質発現細胞を培養する段階を含むＨＰＶ  Ｌ１タンパク質の生産収率を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸部癌は、ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ、ＨＰＶ）の感染によって発病される［１］。子宮頸部癌は、毎年５００，０００名の女性で発病し、２５０，０００名が死亡に至る［２］。多数の女性が一生で一定の時期に無症状のＨＰＶに感染されるものと考えられる［３、４］。ＨＰＶ１６（ＨＰＶ  ｔｙｐｅ  １６）は、子宮頸部癌の５０％以上の発病原因になっており、頭頸部癌の９０％の原因になっていて、最も重要なタイプのウイルスである［５］。Ｌ１タンパク質は、カプシド構造の８０〜９０％を占めていおり、天然タイプのＨＰＶビリオンに似ているウイルス類似粒子（ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ、ＶＬＰ）であって、自己組立可能な特性を有する［６］。したがって、ＨＰＶ  ＶＬＰで免疫化させれば、保護性中和抗体を効果的に誘導することができると思われている［７］。現在２種のＶＬＰ−基盤予防ワクチンが開発されており、１つは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発現システムを利用して生産されるガーダシル（ＧａｒｄａｓｉｌＴＭ、Ｍｅｒｃｋ）であり、他の１つは、昆虫細胞発現システムで生産されるサーバリックス（ＣｅｒｖａｒｉｘＴＭ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）である［８］。これらワクチンは、いずれもＨＰＶ  １６及びＨＰＶ  １８  ＶＬＰを含み、３−容量プロトコルによって投与され、約７０％の子宮頸部癌を予防する効果がある［９］。ガーダシル（ＧａｒｄａｓｉｌＴＭ）の消費者価格は、１回投与量当たり約１２０ドルであり、全体投与量に対しては、３６０ドルであり、サーバリックス（ＣｅｒｖａｒｉｘＴＭ）の価格もこれに似ている［１０］。このようにこれらの価格が高いため、広く使用されていないし、子宮頸部癌の発生頻度が高い発展途上国でこれらワクチンに対する接近が容易ではない理由になって来た［１１］。したがって、ＨＰＶワクチン分野で、ワクチンの生産収率を向上させるための戦略が重要な要求事項として現れている。
【０００３】
生物医薬の製造過程で経済性を確保するためには、アップストリーム（ｕｐｓｔｒｅａｍ）段階である生物反応期の生産性向上が最終産物の収率を増加させなければならない［１２］。しかし、このような原則が重要に浮き彫りになっていないし、組み換えＨＰＶ  Ｌ１タンパク質生産の場合、培養条件を最適化することによって、生産収率を向上させようとする研究は、まだ多く行われていない。また、ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質を精製するプロトコルは、長時間がかかり、労動力を必要とし、高費用が要求され、多様な培養条件の下でＬ１タンパク質の生産性を比較する研究を行いにくい。最近、本発明者らは、大量精製に適していて、多様な試料に対して適用可能な方法として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内で生産されたＨＰＶ  Ｌ１タンパク質を精製することができる１段階（ｏｎｅ  ｓｔｅｐ）のクロマトグラフィー方法を開発した［１３］。
【０００４】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ１０プロモータは、組み換えタンパク質の生産に最も強力であり、頻繁に使用されるプロモータである［１４、１５］。グルコースとガラクトースが存在する場合、サッカロミセス・セレビシエは、グルコースを選好的に使用し、ＧＡＬ遺伝子は、グルコースシステムが抑制されたとき、ガラクトースによって誘導される［１６］。したがって、ＧＡＬ１０プロモータシステム下での組み換えタンパク質の生産において最も重要な要素は、炭素源の組成である［１７〜１９］。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でのＬ１タンパク質の生産は、一般的に２〜４％のグルコースまたはガラクトースを含む培地を使用して４８〜７２時間培養して行われる［２０−２２］。しかし、現在まで培地内の炭素源の濃度や組成を変化させて、ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質の発現収率を向上させた結果は、ほとんど報告されていない。
【０００５】
本明細書全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として挿入され、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容が一層明確に説明される。
【０００６】
本発明者らは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質を発現する細胞を培養する工程でＨＰＶ  Ｌ１タンパク質の生産収率を増加させることができる方法を開発するために研究努力した。その結果、全炭素源の濃度を通常の培養水準よりも高い高濃度で添加した培地でＨＰＶ  Ｌ１タンパク質発現細胞を培養すれば、ＨＰＶのＬ１タンパク質の生産収率が顕著に大きく向上すると共に、生産されたＬ１タンパク質の免疫原性が大きく増加するという事実を確認した。このような事実は、高濃度の炭素源を含有する培地での細胞培養がＬ１タンパク質の発現及び生産効率を増加させることができると共に、Ｌ１タンパク質の免疫学的活性を大きく増大させることができることを示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、全炭素源を高濃度で含有する培地でＨＰＶ  Ｌ１タンパク質発現細胞を培養する段階を含むＨＰＶ  Ｌ１タンパク質の生産収率を向上させる方法を提供することにある。
【０００８】
本発明の目的及び長所は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によって一層明確になる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一様態によれば、本発明は、全炭素源の濃度が６〜１４％である培地でヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質発現細胞を培養する段階を含むＨＰＶ  Ｌ１タンパク質の生産収率を向上させる方法を提供する。
【００１０】
本発明の他の一様態によれば、本発明は、次の段階を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質の生産収率を向上させる方法を提供する：（ａ）全炭素源の濃度が６〜１４％である培地を用意する段階；及び（ｂ）上記用意した培地にＨＰＶ  Ｌ１タンパク質発現細胞を接種して培養する段階。
【００１１】
本明細書において用語“炭素源（ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ）”は、ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質の発現細胞培養時に細胞によって吸収され、この細胞の生体を構成する物質の炭素源や生体エネルギー源として用いられる炭素化合物を意味する。例えば、本発明の炭素源は、グルコース、ガラクトース、スクロース、マルトース、フルクトース、ラクトース、キシロース、ピルビン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、 シス-アコニット酸、α-ケトグルタル酸塩、フマル酸塩、リンゴ塩酸及びオキサル酢酸塩を含むが、これに限定されない。好ましくは、本発明において上記炭素源は、グルコース、ガラクトース、スクロース、マルトース、フルクトース、ラクトース、またはキシロースであり、より好ましくは、グルコースまたはガラクトースである。
【００１２】
本明細書において用語“全炭素源（ｔｏｔａｌ  ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ）”は、培地に含まれる炭素源をすべて合わせた炭素源を意味する。例えば、本発明の培地に炭素源としてグルコースとガラクトースが含まれている場合、グルコースとガラクトースを合わせた炭素源を意味する。本発明においては、全炭素源の濃度が６〜１４重量％である培地を使用する。本明細書において培地中の炭素源の濃度を示す単位“％”は、培地体積に対する炭素源または全炭素源の重量％（Ｗ／Ｖ）を意味する。
【００１３】
本発明において使用される全炭素源の濃度６〜１４％は、通常の組み換えタンパク質発現宿主細胞の培養時に使用される全炭素源の濃度よりも非常に高い水準である。本発明は、高濃度の全炭素源を含有する培地でヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質を発現させれば、Ｌ１タンパク質の生産収率が大きく増加すると共に、生産されたＬ１タンパク質の免疫原性のような生物学的活性が大きく向上することを知見したことに基礎する。
【００１４】
好ましくは、本発明において培地に含まれた全炭素源の濃度は、６％超過１４％以下であり、より好ましくは、６〜１３％、または６〜１２％である。さらに好ましくは、７〜１４％、７〜１３％、または７〜１２％であり、よりさらに好ましくは、８〜１４％、８〜１３％、または８〜１２％である。
【００１５】
本発明において全炭素源がグルコースとガラクトースよりなる場合、全炭素源中のグルコース及びガラクトースの比率は、特に限定されないが、好ましくは、グルコース（％）：ガラクトース（％）＝５：５〜９：１の範囲であり、より好ましくは、４：４〜７：１の範囲である。
【００１６】
本発明の好ましい具現例によれば、上記段階（ｂ）以後に、培地に炭素源を添加して追加培養する段階（ｃ）をさらに含む。
【００１７】
本発明において上記段階（ｃ）でさらに添加する炭素源は、グルコースまたはガラクトースであり、好ましくは、ガラクトースである。
【００１８】
本発明において“ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質”は、ヒトパピローマウイルスのカプシドを構成する主要タンパク質Ｌ１タンパク質を意味し、宿主細胞で組み換えタンパク質形態に発現される場合、自らウイルス類似粒子（ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ、ＶＬＰ）を形成する自己組立特性を有する。したがって、本明細書においてヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のウイルス類似粒子（ＶＬＰ）と同一の意味で使用される。
【００１９】
本発明においてＬ１タンパク質が由来されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のタイプ（ｔｙｐｅ）は、特に限定されず、ＨＰＶタイプ６ａ、ＨＰＶタイプ６ｂ、ＨＰＶタイプ１１、ＨＰＶタイプ１６、ＨＰＶタイプ１８、ＨＰＶタイプ３１、ＨＰＶタイプ３３、ＨＰＶタイプ３５、ＨＰＶタイプ３９、ＨＰＶタイプ４５、ＨＰＶタイプ５１、ＨＰＶタイプ５２、ＨＰＶタイプ５６、ＨＰＶタイプ５８及びＨＰＶタイプ６８などを例示することができるが、これに限定されない。
【００２０】
好ましくは、本発明のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質は、ＨＰＶタイプ１６、ＨＰＶタイプ１８またはＨＰＶタイプ５８のＬ１タンパク質である。
【００２１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質は、好ましくは、公知された野生型のＬ１タンパク質発現に使用される。
【００２２】
本発明において“ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質発現細胞”は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質を発現する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を意味する。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質を発現する発現ベクターは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド配列を適合な発現ベクター内にクローニングすることによって製造することができる。このような発現ベクターは、当業界に公知された多様な方法を用いて製造されることができ、これに関する具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されており、この文献は、本明細書に参照として挿入される。
【００２３】
本発明のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド配列は、宿主細胞内での効率的な発現のために、転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）または翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）の調節配列と作動的に連結されることができ、このような調節配列としては、例えばプロモータ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）または終決配列（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）としてこれらに作動的に連結される。本発明の好ましい具現例によれば、プロモータ配列としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ１プロモータを使用することができ、酵母の他のプロモータ、例えばＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３またはＰＧＫプロモータまたは他の真核細胞プロモータをも使用することができる。転写終決配列としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ１終決配列を使用することができ、他の真核細胞終決配列をも使用することができる。
【００２４】
本発明において宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、昆虫細胞、またはバクテリアが使用されることができ、好ましくは、動物細胞または酵母細胞であり、最も好ましくは、酵母細胞を利用する。酵母細胞は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質の発現効率及び生物反応期での大容量生産にも非常に適した宿主細胞である。
【００２５】
本発明の好ましい具現例によれば、宿主細胞である酵母としては、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、 ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、パフィア（Ｐａｆｆｉａ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）属、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属などを含むが、これに限定されない。
【００２６】
より好ましくは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クリベロマイセスフラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クリベロマイセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）またはスゾサッカロミケスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）であり、最も好ましくは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａ）またはピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【００２７】
本発明において形質転換は、宿主細胞が酵母細胞のように真核細胞である場合、微細注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ．Ｒ．、Ｃｅｌｌ、２２：４７９（１９８０））、カルシウムフォスフェート沈殿法（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６（１９７３））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｅ．ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１：８４１（１９８２））、リポソーム−媒介形質感染法（Ｗｏｎｇ、Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１０：８７（１９８０））、ＤＥＡＥ−デキシトラン処理法（Ｇｏｐａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５：１１８８〜１１９０（１９８５））、及び遺伝子銃法（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８７：９５６８〜９５７２（１９９０））などによってベクターを宿主細胞内に注入して行う。一方、宿主細胞が原核細胞である場合、形質転換は、ＣａＣｌ２方法（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９：２１１０−２１１４（１９７３））、ハナハン方法（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９：２１１０−２１１４（１９７３）；及びＨａｎａｈａｎ、Ｄ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６：５５７〜５８０（１９８３））及び電気穿孔方法（Ｄｏｗｅｒ、Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  ＲｅＳ．、１６：６１２７〜６１４５（１９８８））などによって実施されることができる。
【００２８】
本発明において使用されることができる培地は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質発現細胞を培養するのに適した培地であって、宿主細胞によって適合な培地を選択して使用することができる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明において培地は、宿主細胞が酵母である場合、酵母細胞が成長することができる通常の培地なら使用することができ、特に限定されない。例えば、酵母抽出物、ペプトン及びグルコース／デキストロースが含まれたＹＰＤ（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）培地またはこれを変形した培地を使用することができ、上記ＹＰＤ培地に炭素源としてグルコース以外にガラクトースがさらに含まれたＹＰＤＧ培地を使用することもできる。
【００２９】
細胞の培養は、通常、振とう培養または回転器を用いた回転によるもののような好気性条件の下で行う。培養温度は、好ましくは、１５〜４０℃で行い、培養時間は、培養条件及び必要によって調節することができ、通常、５時間〜７日間行う。培地のｐＨは、培養液の中で好ましくは、３．０〜９．０の範囲を維持する。培地のｐＨは、無機または有機酸、アルカリ溶液、ウレア、カルシウムカーボネート、アンモニアなどで調節することができる。培養中には、必要な場合、アンピシリン及びテトラサイクリンのような抗生剤を添加することができる。
【００３０】
本発明において培養された細胞から発現されたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質を分離する方法は、当業界で通常的に利用されるタンパク質の分離及び精製方法を使用して行うことができる。例えば、アンモニウムサルフェートまたはＰＥＧなどを利用した溶解度による分離（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、分子量による限外濾過分離、多様なクロマトグラフィー（サイズ、電荷、疎水性または親和性による分離のために製作されたもの）による分離、透析による分離など、多様な方法が利用されることができ、通常、前述した方法の組合を利用して分離及び精製する。培養された細胞から発現されたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質の分離は、好ましくは、公知された文献、Ｈ．Ｊ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．７０（２０１０）６８〜７４に記述された方法によって行うことができる。
【００３１】
本発明の方法は、多様な組み換えタンパク質生産用細胞培養方式に適用されることができ、例えば、回分培養（ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）方法に適用されることができるが、これに限定されない。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は、全炭素源を高濃度で含有する培地でヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質発現細胞を培養する段階を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質の生産収率を向上させる方法に関する。本発明の高濃度炭素源含有培地を利用した培養方法によれば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質の生産収率を顕著に向上させることができると共に、最終的に回収されるＬ１タンパク質ＶＬＰの免疫原性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１ａ】ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の精製過程を示す。
【図１ｂ】実験に使用された炭素源の組成を示す。炭素源の濃度によるＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の発現量と精製して最終回収されたＬ１タンパク質の量とを比較した。黒色ボックスの炭素源の組成がＬ１タンパク質を精製して最終回収された量を確認した組成である。
【図２ａ】炭素源の組成によるＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質発現細胞の成長を測定した結果である。
【図２ｂ】炭素源の組成による細胞当たりＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の発現量を測定した結果である。細胞当たりＬ１タンパク質の量をウェスタンブロットで示した。チューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）を内部対照群として使用し、ウェスタンブロット分析は、実施例の実験方法に記述されたように行った。
【図３ａ】炭素源の組成によるＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の容積収率（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｙｉｅｌｄ）を測定した結果である。Ｌ１タンパク質の容積収率を測定するためにＬ１タンパク質発現サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を５０ｍＬ  ＹＰＤＧ培地で培養した。各炭素源の組成の培養液で細胞を培養しながら４８、９６、１４４時間にそれぞれ１ｍＬずつ培養液を取った後、０．２ｍＬ細胞溶解バッファー（ｂｒｅａｋ  ｂｕｆｆｅｒ）［２０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．７ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ７．２＋０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０］を使用して細胞を破砕した。破砕液は、ＤＷに１：５０で希釈した後、１０μＬずつゲルにローディングし、電気泳動を行った後、Ｌ１タンパク質バンドをウェスタンブロット分析法で検出した。
【図３ｂ】全炭素源の各条件で１４４時間培養した停止期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ）細胞のＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の容積収率を示すグラフである。Ｌ１タンパク質の容積収率は、全炭素源がグルコース（％）：ガラクトース（％）＝６：６である条件でのＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質バンドの強度を１００％としてこれに対する相対値で表現した。この実験結果は、独立した２回の実験を通じて得、容積収率は、平均±ＳＤで示した。
【図４ａ】それぞれ４％、４．５％、５％、５．５％、６％の全炭素源で組成された培地条件でＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の容積収率を測定した結果である。４％と６％間の全炭素源の組成によるＬ１タンパク質の発現量を調査するために培地に添加される全炭素源の濃度を４％、４．５％、５％、５．５％、６％で用意した。各全炭素源の組成内のグルコースとガラクトースの比率は、１：１条件に設定した。したがって、各培地は、グルコース（％）：ガラクトース（％）＝２：２、２．２５：２．２５、２．５：２．５、２．７５：２．７５、３：３の組成で含んでいる。各組成の培地で細胞を細胞密度（ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）が６００ｎｍで測定したＯＤが３０程度に至るまで培養した後、回収し、０．２ｍＬの細胞溶解バッファー（ｂｒｅａｋ  ｂｕｆｆｅｒ）［２０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．７ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ７．２＋０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０］を使用して破砕した。破砕液は、ＤＷに１：５０で希釈した後、１０μＬずつゲルにローディングし、電気泳動を行った後、Ｌ１タンパク質バンドは、ウェスタンブロット分析法で測定した。
【図４ｂ】図４ａのウェスタンブロットのＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の強度をグラフで示す結果である。Ｌ１タンパク質のバンド強度は、全炭素源６％条件で培養したＬ１タンパク質バンド強度を１００％としてこれに対する相対値で表現した。
【図５ａ】炭素源の組成によるＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の純度を測定した結果である。停止期（Ａ６００測定時にＯＤ＝３０−４７）にある細胞を回収して精製した結果である。精製したＬ１タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットで確認した。
【図５ｂ】１５０ｍＬ  ＹＰＤＧ培地で停止期（６００ｎｍでＯＤ値３０−４７）まで培養した細胞を回収して精製したＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の量を示す。この結果は、独立した２回の実験を通じて得、Ｌ１タンパク質の量は、平均±ＳＤで示した。
【図６ａ】流加培養（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）でガラクトース添加（ｆｅｅｄｉｎｇ）によるＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の発現量増加を測定した結果である。ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質発現サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、７％グルコースと１％ガラクトース含有の培地条件で１４４時間培養した後、１４４、１６８、１９２時間にそれぞれ１．４％含有量条件でガラクトースを培地に添加し、２１６時間まで追加培養した。培養後、ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質をウェスタンブロットで検出した。
【図６ｂ】図６ａのウェスタンブロット結果のＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質のバンド検出強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示すグラフである。ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質のバンド強度は、２１６時間培養した細胞内Ｌ１タンパク質のバンド強度を１００％として相対的なバンド強度で数値化して示した。
【図７】培地内の全炭素源をグルコースとガラクトースの比率を１：１にして組成しながら全炭素源の重量が２％、４％、６％、８％となるようにして培養した後、停止期（Ａ６００測定時にＯＤ＝１８〜３８）の細胞を回収し、ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質を精製した結果である。全炭素源が６％以上に含まれた培地条件で細胞培養時に回収されるＬ１タンパク質の量が大きく増加することを確認した。
【図８ａ】ネズミ免疫化のために注入されるＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質が同一の量であることを保証するために、全炭素源の重量が２％、４％、６％、８％である各条件で培養して精製したＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の純度及び濃度を測定した結果を示す。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量法で定量した各Ｌ１タンパク質を１２％ポリアクリルアミドゲルの各ウェル（ｗｅｌｌ）に３００、１５０、７５ｎｇの量でローディングして展開し、銀染色法（ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）でタンパク質を視覚化した。２％、４％、６％、８％全炭素源含有培養条件から精製した各Ｌ１タンパク質の純度が同一であり、定量されたタンパク質濃度も正確であった。これにより、２％、４％、６％、８％全炭素源含有培養条件から精製した各Ｌ１タンパク質の同一の量がネズミ免疫化に使用されたことを確認した。
【図８ｂ】２％、４％、６％、８％全炭素源含有培養条件から精製した各ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質をネズミに１０ｎｇずつ３回免疫させた後に測定した抗−ＨＰＶ  １６  Ｌ１ＩｇＧ抗体の力価と抗−ＨＰＶ  １６中和抗体の力価を示す。２％、４％全炭素源含有培養条件で得られたＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の場合、抗−ＨＰＶ  １６  Ｌ１  ＩｇＧ抗体価において３２００以下の数値を示す一方で、６％、８％全炭素源含有培養条件で得られたＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質は、５１２００と５１２０００の数値を示し、４％以下の炭素源条件より１６倍と１６０倍高い抗体力価数値を示した。このような差異は、中和抗体力価でも類似に現われた。これにより、６％以上の全炭素源を含む培養条件を使用する場合、ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の免疫原性が顕著に大きく向上することを実験的に確認した。
【図９】全炭素源含量によるＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の発現態様を比較測定した結果である。グルコースとガラクトースの比率を１：１にしながら培地内の全炭素源重量がそれぞれ２％、４％、６％、８％及び１０％になるようにして細胞を停止期まで培養した（Ａ６００測定時にＯＤ＝２２−４０）。培養された細胞内でＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の発現量は、ウェスタンブロットを用いて確認した。２％、４％炭素源が含まれた条件より炭素源が６％以上含まれた条件でＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の発現が大きく増加することを確認した。
【図１０ａ】６％以上の炭素源含有条件がＬ１発現に及ぶ影響をウェスタンブロットを用いて確認した結果である。４％、４．５％、５％、５．５％、６％全炭素源が含まれた培養条件で得たＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の容積収率を測定した。各炭素源の組成でグルコースとガラクトースの比率を１：１条件で設定した。各条件の細胞は、停止期まで培養した後、細胞を回収し、０．２ｍＬの細胞溶解バッファー［２０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．７ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ７．２＋０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０］を使用して破砕した。破砕液は、ＤＷに１：５０で希釈した後、１０μＬずつゲルにローディングし、電気泳動を行った後、Ｌ１タンパク質バンドは、ウェスタンブロットで分析した。
【図１０ｂ】図１０ａのウェスタンブロット上のＬ１タンパク質バンドの相対強度をグラフで示すものである。６％全炭素源含有培養条件のＬ１タンパク質バンドの強度を１００％として相対値で表現した。培地内の全炭素源含量が４％から６％に増加するにつれて、Ｌ１発現が増加することを確認した。
【図１１ａ】２％、４％、６％、８％全炭素源が含まれた培地条件でＨＰＶ  １８  Ｌ１を発現させて最終的に精製されたＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の量を比較した結果である。Ｌ１タンパク質を精製した後、各炭素源培養条件の最終産物は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク質量を定量した後、ゲルの各ウェル（ｗｅｌｌ）に５００ｎｇと２５０ｎｇの量でローディングして確認した。６％と８％の全炭素源条件で生産したＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の場合、５５ｋＤａ位置にＬ１タンパク質バンドが鮮明に確認された一方で、２％と４％炭素源含有条件では、ＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質バンドがほとんど確認されなかった。
【図１１ｂ】図１１ａのウェスタンブロットで５００ｎｇにローディングしたＬ１タンパク質バンドの相対強度を示すグラフである。８％全炭素源培養条件のＬ１タンパク質バンドの強度を１００％として相対値で表現した。ＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質を高い収率で精製するためには、全炭素源が６％以上高濃度で含まれなければならないことを確認した。
【図１１ｃ】４％と８％全炭素源を含む培地でＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質を発現して精製した結果を示す。４％と８％全炭素源の組成のためにグルコース（％）：ガラクトース（％）＝２：２と７：１にした。各条件の細胞は、１４４時間培養した後、１４４時間の時点にガラクトースを培地内で１．４％の濃度になるように添加し、１６８時間の時点まで追加培養した。
【図１２ａ】培地内の全炭素源含有量の増加によるＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質の容積収率を示す。細胞は、停止期（Ａ６００測定時にＯＤ＝２７〜３８）まで培養した。
【図１２ｂ】２％、４％、６％、８％全炭素源含有条件で培養時にＬ１タンパク質の発現量をＬ１バンド強度で表現したグラフである。各培養条件別にＬ１バンド強度は、８％全炭素源条件のＬ１タンパク質バンド強度を１００％として相対値で表現した。この結果に示されたように、ＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質の発現量は、培地内の炭素源含量が６％以上であるとき、大きく増加することを確認した。
【図１３ａ】４％、４．５％、５％、５．５％、６％炭素源で組成した培地条件でＨＰＶ５８Ｌ１タンパク質の容積収率を測定した結果である。各炭素源条件でグルコースとガラクトースの比率は、１：１にした。
【図１３ｂ】図１３ａのウェスタンブロット上のＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質バンドの相対強度をグラフで示すものである。各培養条件でのＬ１タンパク質バンドの強度は、６％炭素源条件のＬ１タンパク質バンド強度を１００％として示した。
【図１４ａ】２％、４％、６％、８％全炭素源含有培養条件で精製して回収したＬ１タンパク質の純度を比較した結果である。ＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質精製のために細胞を停止期（Ａ６００測定時にＯＤ＝２９〜３４）まで培養した。各培養条件でＬ１タンパク質を精製した後、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量法で定量し、ゲル上のウェルに３００ｎｇと１５０ｎｇでローディングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを展開した後、銀染色で確認した。
【図１４ｂ】全炭素源含量によるＨＰＶ  ５８  Ｌ１の精製収率を示す。この結果から分かるように、ＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質は、６％以上の炭素源を含有する条件で培養時に最終精製収率が大きく向上することを確認した。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、ただ本発明をさらに具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないということは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。
【実施例】
【００３５】
実施例１：ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の生産
実験方法
１．細胞株製作及び細胞培養
ＨＰＶ  １６  Ｌ１エンコードポリヌクレオチド配列は、野生型アミノ酸配列を維持しながらｍＲＮＡがなるべく２次構造を形成しないようにデザインした［２３］。ポリヌクレオチドは、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、ＷＡ、ＵＳＡ）に依頼して合成し、プラスミドＹＥＧα−ＭＣＳでライゲイションした。このように製造した組み換えプラスミドＹＥＧα−ＭＣＳ−ＨＰＶ  １６  Ｌ１をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙ２８０５に形質転換した。形質転換体をウラシル（ｕｒａｃｉｌ）がない合成完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ）である“ＳＤ−ｕｒａ”に塗抹し、４日または５日間培養した。単一コロニーをＳＤ−ｕｒａ液体培地に接種し、２日間培養した。ＧＡＬ１０プロモータからＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質を発現させるために、培養した形質転換細胞を１％酵母抽出物（Ｄｕｃｈｅｆａ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、２％ペプトン（Ｄｕｃｈｅｆａ）及び多様な濃度及び比率のグルコース（Ｄｕｃｈｅｆａ）及びガラクトース（Ｄｕｃｈｅｆａ）を含むＹＰＤＧ培地で培養した。ＳＤ−ｕｒａ液体培地で培養した細胞は、６００ｎｍで測定した光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ、ＯＤ）は、０．６まで到逹した。液体培養物を１０倍ずつ希釈し、５０または１５０ｍＬのＹＰＤＧ培地を含むフラスコに接種し、３０℃、２３０ｒｐｍの振とう条件下で指定された時間の間に培養した。細胞の密度は、ＯＤ  ６００ｎｍで測定した。
【００３６】
２．ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の精製
ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質は、既に公知された方法によって精製した［１３］。図１ａに示されたように、細胞をガラスビーズ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＯＫ、ＵＳＡ）に破砕した後、細胞残渣を除去した。ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質を４０％飽和アンモニウムサルフェート内で沈殿させ、沈殿されたタンパク質をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）＋０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０に対して透析した。タンパク質の濃度は、バッファー［１０ｍＭ  ソジウムホスフェートｐＨ  ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０］を使用して５ｍｇ／ｍＬに調整し、懸濁液を常温で１２時間の間に維持した。沈殿されたタンパク質汚染物を除去して得たサンプルを陽イオン交換クロマトグラフィー用結合バッファー［ＰＢＳ＋０．３７Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、ｆｉｎａｌ  ＮａＣｌ  ｃｏｎｃ．０．５Ｍ］に対して透析処理した。４ｍＬのＰ−１１ホスホセルロースレジン（Ｐ−１１  ｒｅｓｉｎ、Ｗｈａｔｍａｎ、ＵＫ）でパッキングされたカラムを結合緩衝液で平衡化させ、透析したサンプルをカラム上にローディングした。カラムは、カラム体積の６倍容量の結合緩衝液で洗浄した後、０．６、０．７、０．８、０．９及び１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出させた。溶出された分画を回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を使用して濃縮させた。
【００３７】
３．タンパク質濃度測定
タンパク質濃度は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）を標準物質としてＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用して測定した。
【００３８】
４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉの方法［２４］によって行い、ウェスタンブロットは、既に公知された方法［２５］を使用して行った。ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質は、１次抗体としてウサギの抗−ＨＰＶ  １６  Ｌ１血清を使用し、２次抗体としてヤギＨＲＰ−コンジュゲートされた抗−ウサギＩｇＧポリクロナル抗体（Ｐａｂ、Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）を使用して検出した［１３］。チューブリンは、白色ネズミ（ｒａｔ）抗−チューブリンポリクロナル抗体（Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）、及びＨＲＰコンジュゲートされたヤギ抗−ウサギＩｇＧポリクロナル抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）を使用して検出した。バンドの強度は、ＮＩＨ  ｏｐｅｎ  ｓｏｕｒｃｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｊで測定し、公知方法によって算出した。
【００３９】
５．精製されたＬ１タンパク質の免疫化及び免疫原性評価
ＨＰＶ  １６  Ｌ１の免疫原性評価のために６週齢Ｂａｌｂ／ｃネズミを使用した（Ｏｒｉｅｎｔｂｉｏ．ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）。ネズミは、１週間適応期を経た後、Ｌ１タンパク質で免疫化させた。ネズミは、皮下注射を通じて免疫化させ、２週間隔で３回免疫化させた。１回免疫化に１０ｎｇのＬ１タンパク質及び２００μｇの水酸化アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を投与した。同一量の精製したＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質をネズミに免疫化させるために公知されたタンパク質定量法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法によってＬ１タンパク質の純度及び濃度を確認した。３次免疫１０日後、ネズミのしっぽの静脈から血液を採取し、抗−ＨＰＶ  １６  Ｌ１  ＩｇＧ抗体の力価と抗−ＨＰＶ１６中和活性を測定した。ネズミ血液内の抗−ＨＰＶ  １６  Ｌ１  ＩｇＧ抗体の力価と抗−ＨＰＶ１６中和活性は、既に公知された方法によってＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）とｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙを通じて測定した［Ｋｉｍ  Ｈ．  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（４）：ｅ３５８９３．Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ａｐｒｉｌ  ２６；Ｔｈｅ  ｃｈｏｉｃｅ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ｌｉｇａｎｄ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｌｕｍｎ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ］。
【００４０】
６．統計分析
グループ間の差異の統計学的有意性は、ｔｗｏ  ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを使用して決定した。Ｐ＜０．０５を有意的差異として見なした。
【００４１】
実験結果
１．炭素源濃度による細胞の成長率及び細胞当たりＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の発現量比較
ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質発現及び生産に対して及ぶ全炭素源濃度の影響を調査するために、炭素源の濃度によるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞の成長と、細胞当たりＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の発現量を比較した。炭素源としてグルコースとガラクトースの含有量をグルコース（％）：ガラクトース（％）＝１：１〜６：６まで変化させて培地を組成した後、Ｌ１タンパク質を発現させて精製した（図１ｂ参照）。実験結果、図２ａから分かるように、１４４時間培養時に最終細胞密度は、培地内で炭素源であるグルコース及びガラクトースの総合計の濃度が増加するにつれて増加する傾向を示した。それぞれの炭素源濃度条件で培養した細胞は、０〜１２０時間培養時まで対数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）の成長を示し、１２０時間以後の培養時には、細胞の成長率が減少し、停止期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ）の態様を示した（図２ａ参照）。
【００４２】
炭素源の濃度による細胞当たりＬ１タンパク質の発現量を調査するために、同一量の細胞溶解タンパク質をローディングし、Ｌ１タンパク質の量をウェスタンブロットによって比較した。グルコース：ガラクトースの比率が１：１と２：２条件の場合、培養９６時間後にＬ１タンパク質の発現量が急激に減少する現象を示す一方で、３：３、４：４、５：５、６：６条件の場合、対数期（１４４時間）までその発現量が維持されることを確認した（図２ｂ参照）。このような結果は、全炭素源が培地内に６％以上である場合、細胞当たりＬ１タンパク質の発現量が対数期まで安定的に維持されることができることを意味する。
【００４３】
２．炭素源の濃度によるＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の容積収率比較
炭素源の濃度による培養液内のＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の量を比較するために、容積収率（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｙｅｉｌｄ）を比較した。容積収率は、一定体積の細胞培養液内に存在するＬ１タンパク質の量を示す。図３ａから分かるように、グルコース（％）：ガラクトース（％）が１：１条件である場合、Ｌ１タンパク質の容積収率は、細胞密度が増加するにつれて減少し、２：２条件である場合、細胞密度が増加するにつれて、Ｌ１タンパク質の容積収率が制限的に増加した。しかし、グルコース（％）：ガラクトース（％）が３：３以上である条件では、細胞密度が増加するにつれてＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の容積収率が比例して増加することを確認することができた（図３ａ及び図３ｂ参照）。このような結果は、図２ｂの結果から確認されたように、全炭素源が６％以上の条件では、細胞当たりＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質発現量が停止期まで安定的に維持されるからであると認められる。したがって、ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質を高効率で発現させるために培地内の全炭素源が６％以上が要求されることを確認した。
【００４４】
図３ａ及び図３ｂの結果は、４％全炭素源濃度に比べて６％以上の全炭素源濃度がＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質発現量を格別に増大させることを示す。次いで、４％と６％の全炭素源濃度の間でＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質発現量がどんなに変わるかを具体的に調査するために、培地内の全炭素源の濃度を４％、４．５％、５％、５．５％、６％でそれぞれ組成し、ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の発現量を測定した。図４ａ及び図４ｂの結果から確認されるように、全炭素源濃度が４％と６％の間で炭素源の濃度が増加するにつれてＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の発現量が増加することを確認することができた。このような結果は、６％以上または超過の全炭素源濃度組成がＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質発現を急激に増加させることをさらに明確に示す。
【００４５】
３．炭素源の濃度によるＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の純度及び回収量比較
グルコース（％）：ガラクトース（％）＝１：１、２：２、４：４でそれぞれ組成された培地で停止期まで培養した細胞内ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質を精製して回収されたＬ１タンパク質の純度を比較した。図５ａの結果から分かるように、各条件でのＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質は、精製が完了した後、最小９２％以上の純度を示した。また、１５０ｍＬ培養液で培養された細胞内ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質を精製し、その量を比較した結果、全炭素源の濃度が増加するにつれてＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の回収量も比例して増加することを確認することができた（図５ｂ参照）。このような結果は、培養液内の全炭素源の濃度がＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の最終収率に重要な影響を及ぼすことを示す結果である。総合的に６％超過の全炭素源濃度条件では、Ｌ１タンパク質の発現だけでなく、最終回収されたＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の収率も増加することを確認した。
【００４６】
４．ガラクトース添加によるＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の発現量増加
ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質発現サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をグルコース（％）：ガラクトース（％）＝７：１の条件で１４４時間培養した後、１４４、１６８、１９２時間にガラクトースを培地に添加した。ガラクトースは、培地で１．４％濃度になるように添加し、細胞は、２１６時間まで追加培養した。図６ａ及び図６ｂから分かるように、ガラクトースが添加された後、ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の発現量が大きく増加することを確認した。これは、６％以上の炭素源条件の培養時に培養液に炭素源を追加する場合、Ｌ１タンパク質の発現量がさらに増加することができることを示す。
【００４７】
５．ガラクトース添加によるＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の精製収率増加
ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質発現サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、ガラクトース（％）＝７：１の条件で９６時間培養した後、ガラクトースを培地内に１．４％濃度になるように添加し、１４４時間まで追加培養した。細胞内のＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質を精製した結果、１．５ｍｇのＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質を回収した（下記表１参照）。これは、グルコース（％）：ガラクトース（％）＝７：１条件で培養し、且つガラクトースの添加なしに培養した条件のＬ１タンパク質の量より２倍程度高い量である。このような結果は、全炭素源濃度６％以上の培養条件で培養した後、培地にガラクトースを添加すれば、ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の発現量の増加が最終精製収率の増加につながることができることを示す。
【００４８】
【表１】
0006001064.tif 000002
【００４９】
６．炭素源濃度によるＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の免疫原性比較
ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質を発現するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を２％、４％、６％、８％全炭素源が含有された培地で停止期まで培養した。ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の精製のために１５０ｍＬ培地の各培養条件で細胞を培養した。培養した細胞を６００ｎｍで測定時に単位面積当たり細胞密度が１８〜３８の数値を示した（図７）。図７には、２％、４％、６％、８％全炭素源含有条件で生産されたＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質を精製して最終回収したＬ１タンパク質の量を示した。上記説明された結果と同様に、６％以上の炭素源が含有された培地で培養時に最終精製されて回収されたＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の量が大きく増加することを確認した。この結果は、高効率でＨＰＶ  １６  Ｌ１を精製するために６％以上の炭素源が要求されることをさらに明確に示す。
【００５０】
各培養条件で精製回収されたＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の定量的評価のために同一量のタンパク質をローディングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認した。図８ａの結果から分かるように、２％、４％、６％、８％炭素源含有条件で得られたＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の純度及び量が同一であることを確認した。これにより、２％、４％、６％、８％炭素源含有条件から得たＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質を同一の量でネズミに注入し、免疫化したことを確認した。
【００５１】
図８ｂは、ＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質を１０ｎｇずつ投与して３回免疫化した後、抗−ＨＰＶ  １６  Ｌ１ＩｇＧ力価と抗−ＨＰＶ１６中和抗体の力価を測定した結果である。図８ｂの結果から分かるように、２％及び４％炭素源含有条件で生産されたＬ１タンパク質の免疫によって抗−ＨＰＶ  １６  Ｌ１  ＩｇＧ力価は、３２００以下を示す一方で、６％及び８％全炭素源含有条件で生産されたＬ１タンパク質免疫による抗−ＨＰＶ  １６  Ｌ１  ＩｇＧ力価は、５１２００と５１２０００を示した。また、２％及び４％全炭素源含有条件から得たＬ１タンパク質で兔疫されたネズミ血清は、ＨＰＶ  １６に対して中和活性が弱く現われた一方で、６％及び８％全炭素源含有条件で得たＬ１タンパク質で免疫化させたネズミ血清は、６０％以上の中和活性を示すことを確認した。したがって、６％以上の全炭素源条件で得られたＬ１タンパク質の免疫原性が６％以下の炭素源条件で得られたＬ１タンパク質の免疫原性よりもかっきり優れていることを確認した。
【００５２】
実施例２：ＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の生産
実験方法
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のコドン（ｃｏｄｏｎ）使用に最適化されたＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質のＤＮＡ（ＭＯ）配列をＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）に依頼して合成した。ＨＰＶ  １８  Ｌ１発現のための細胞株製作及び発現は、既存文献に公知された方法によって進行した［Ｈ．Ｊ．Ｋｉｍ、Ｓ．Ｊ．Ｌｅｅ、Ｈ．−Ｊ．Ｋｉｍ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５０（２０１０）３１−３６］。ＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の発現のための細胞培養と、ＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の精製、濃度測定及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェストンブロットによるタンパク質確認は、上記実施例１のＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の生産と同一の過程で行った。
【００５３】
実験結果
１．炭素源の濃度によるＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の容積収率比較
グルコース：ガラクトース＝１：１にして全炭素源の濃度がそれぞれ２％、４％、６％、８％及び１０％でそれぞれ組成した培地でＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質発現サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を１４４時間培養し、停止期まで培養した後、細胞内で発現されたＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質を精製して回収したＬ１タンパク質の量を比較した。図９から分かるように、ＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の生産量は、全炭素源の濃度が６％以上てあるとき、大きく増加した。このような結果は、６％以上の炭素源が含まれた培地で培養する場合、ＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質を高効率で発現させることができることを意味する。
【００５４】
４％及び６％の全炭素源濃度の間でＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の発現量がどんなに変わるかを具体的に調査するために、培地内の全炭素源の濃度を４％、４．５％、５％、５．５％、６％でそれぞれ組成し、ＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の発現量を測定した。各炭素源条件でグルコース：ガラクトース＝１：１にし、細胞は、停止期まで培養した。
【００５５】
図１０ａ及び図１０bの結果から確認されるように、４％と６％の間の全炭素源濃度で炭素源の濃度が増加するにつれてＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の発現量が増加することを確認することができた。このような結果は、６％以上（または超過）の炭素源の組成がＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質発現を増加させることをさらに明確に示す。
【００５６】
２．炭素源濃度によるＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の精製収率比較
図１１ａは、２％、４％、６％、８％濃度で全炭素源を含有する培地で停止期まで細胞を培養した後、ＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質を精製して比較した結果である。ＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質精製のために細胞を１５０ｍＬ培地容量で各炭素源濃度条件で停止期まで培養した。最終精製産物のＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の確認のためにＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量法でタンパク質濃度を定量した後、５００ｎｇと２５０ｎｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングして確認した。最終精製産物の各培養条件別に定量されたタンパク質の総量は、２％全炭素源の場合、０．４ｍｇ、４％全炭素源の場合、０．４ｍｇ、６％全炭素源の場合、０．４ｍｇ、８％全炭素源の場合、０．４ｍｇであって、同一のものと確認された。しかし、５５ｋＤａのＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質バンドは、６％と８％全炭素源条件だけで鮮明に確認された。
【００５７】
全炭素源含有量の各条件によるＨＰＶ  １８  Ｌ１のバンド強度は、図１１ｂに具体的に示されている。図１１ｂは、ウェル当たり５００ｎｇのタンパク質をローディングした各培養条件別Ｌ１タンパク質のバンド強度を示すもので、８％炭素源条件のＬ１バンドの強度を１００％にして相対値で示した。この結果によれば、６％以上の全炭素源を含有する培養条件から精製したＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の量が２％または４％全炭素源含有培養条件から得たＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の量よりも極めて多いことを確認することができる。
【００５８】
３．ガラクトース添加によるＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の精製収率増加
ＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質発現サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をグルコース（％）：ガラクトース（％）＝２：２及び７：１の比率で含有する培地で１４４時間まで培養した後、１４４時間の時点にガラクトースを培地内で１．４％の濃度になるように添加し、１６８時間の時点まで追加培養した。培養された２つの培養条件の細胞でＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質を精製し、精製されたＬ１タンパク質の量を比較した。その結果、グルコース（％）：ガラクトース（％）＝７：１条件で生産されたＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質だけが精製され、グルコース（％）：ガラクトース（％）＝２：２条件で生産されたＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質は、ほとんど精製されなかった（図１１ｃ及び表２参照）。このような結果は、７：１条件で生産されたＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質が精製して回収するのに良い形態であることを意味する。結論的に、全炭素源が６％以上に添加された培養条件で高いＬ１タンパク質の発現量を示し、全炭素源が高いグルコースの比率と低いガラクトースの比率で構成された培地で停止期まで培養した細胞内でＬ１タンパク質の精製収率が最も高いことを確認することができた。
【００５９】
【表２】
0006001064.tif 000003
【００６０】
前記表２は、ガラクトース添加によるＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質の精製結果を示す。ＨＰＶ  １８  Ｌ１発現サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、グルコース（％）：ガラクトース（％）＝２：２と７：１添加された１５０ｍＬの培地でそれぞれ培養した。上記２つの条件で培養した細胞を１４４時間培養後、ガラクトースを１．４％になるように添加し、１６８時間まで追加培養した。
【００６１】
実施例３：ＨＰＶ５８Ｌ１タンパク質の生産
実験方法
１．細胞株製作
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のコドン（ｃｏｄｏｎ）使用に最適化されたＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質のＤＮＡ（ＭＯ）配列をＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）に依頼して合成した。ＨＰＶ  ５８  Ｌ１  ＭＯ遺伝子のアップストリーム（ｕｐｓｔｒｅａｍ）とダウンストリーム（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）にＨｉｎｄ  IIIとＳａｌ  Ｉサイトがそれぞれ含まれるように製作した。合成されたＨＰＶ  ５８  Ｌ１  ＭＯは、ＹＥＧ  α−ＭＣＳのＨｉｎｄ  IIIとＳａｌ  Ｉサイトとの間に挿入し、ＨＰＶ  ５８  Ｌ１  ＭＯを挿入したＹＥＧ  α−ＭＣＳは、ＹＥＧ  α−ＨＰＶ  ５８  Ｌ１  ＭＯと命名した。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙ２８０５は、既存に公知された方法によってリチウムアセテート（ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）方法を使用して形質転換した［Ｈ．Ｊ．Ｋｉｍ、Ｓ．Ｊ．Ｌｅｅ、Ｈ．−Ｊ．Ｋｉｍ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５０（２０１０）３１〜３６］。ＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質の発現のための細胞培養と、ＨＰＶ  5８  Ｌ１タンパク質の精製、濃度測定及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェストンブロットによるタンパク質確認は、上記実施例１のＨＰＶ  １６  Ｌ１タンパク質の生産と同一の過程を通じて行った。
【００６２】
実験結果
１．炭素源濃度によるＨＰＶ５８Ｌ１タンパク質の発現量比較
図１２ａは、２％、４％、６％、８％の全炭素源で組成された培地でＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質を発現するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を停止期まで培養した後、発現されたＬ１タンパク質の容積収率をウェスタンブロットで比較した結果である。ＨＰＶ  １６  Ｌ１とＨＰＶ  １８  Ｌ１タンパク質発現態様と同様に、６％以上の炭素源を含有する培養培地条件で格段に高いＬ１タンパク質の発現を確認することができた。図１２ｂは、図１２ａに示されたＨＰＶ  ５８  Ｌ１バンドの強度をグラフ化したものである。ＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質発現量の相対比較のために８％炭素源条件のＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質のバンド強度を１００％にして相対値を求めた。
【００６３】
４％〜６％間の全炭素源含有条件でＨＰＶ  ５８  Ｌ１の発現量変化を具体的に調査するために、培地内の炭素源含量を４％、４．５％、５％、５．５％、６％で組成した。各炭素源条件別グルコースとガラクトースの比率は、１：１にした。図１３ａは、培地内炭素源含量を４％、４．５％、５％、５．５％、６％にしたとき、ＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質の容積収率をウェスタンブロットで分析した結果である。図１３ｂは、図１３ａのＨＰＶ  ５８  Ｌ１のバンド強度をグラフ化したものである。バンド強度による差異を比較するために６％全炭素源含有条件のＬ１タンパク質バンドの強度を１００％にした（図１３ｂ）。４〜６％全炭素源条件でＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質の容積収率を調査した結果、炭素源の含量が増加するにつれて、Ｌ１タンパク質の容積収率が増加することを確認した。結論的に、６％以上の炭素源を含有する培地条件で細胞を培養した場合、ＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質の発現量が大きく増加することを示す。
【００６４】
２．炭素源濃度によるＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質の精製収率比較
炭素源濃度によるＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質の精製収率を比較するために、２％、４％、６％、８％の全炭素源を含有する培地で停止期まで細胞を培養した後、ＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質を精製して比較した。各培地条件でグルコースとガラクトースの比率を１：１にした。細胞を１５０ｍＬの培地で停止期（Ａ６００でＯＤ値２９〜３４）まで培養し、ＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質を精製した後、タンパク質の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認した（図１４ａ）。このために培養細胞からＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質を精製した後、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク質を定量した。定量したタンパク質濃度に基づいてウェル当たり３００ｎｇと１５０ｎｇのタンパク質をローディングした。その結果、各培養条件から精製されたＨＰＶ５８Ｌ１タンパク質は、高い純度を示したが、２％炭素源条件で精製されたＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質の場合、非常に弱いバンド強度を示した。
【００６５】
図１４ｂは、最終精製されたＨＰＶ  ５８  Ｌ１タンパク質の量をグラフ化した結果である。各条件別Ｌ１タンパク質の量は、タンパク質定量結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を通じて算出した。図１４ｂに示されたように、最終回収されたＨＰＶ５８Ｌ１タンパク質の量は、培地内の全炭素源の含量が６％以上であるとき、大きく増加した。
【００６６】
以上、本発明の特定部分を詳しく記述したところ、当業界の通常の知識を有する者においてこのような具体的な技術は、ただ好ましい具現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるものではないことは明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物によって定義される。
【００６７】
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【図１ａ】
0006001064.tif 000004
【図１ｂ】
0006001064.tif 000005
【図２ａ】
0006001064.tif 000006
【図２ｂ】
0006001064.tif 000007
【図３ａ】
0006001064.tif 000008
【図３ｂ】
0006001064.tif 000009
【図４ａ】
0006001064.tif 000010
【図４ｂ】
0006001064.tif 000011
【図５ａ】
0006001064.tif 000012
【図５ｂ】
0006001064.tif 000013
【図６ａ】
0006001064.tif 000014
【図６ｂ】
0006001064.tif 000015
【図７】
0006001064.tif 000016
【図８ａ】
0006001064.tif 000017
【図８ｂ】
0006001064.tif 000018
【図９】
0006001064.tif 000019
【図１０ａ】
0006001064.tif 000020
【図１０ｂ】
0006001064.tif 000021
【図１１ａ】
0006001064.tif 000022
【図１１ｂ】
0006001064.tif 000023
【図１１ｃ】
0006001064.tif 000024
【図１２ａ】
0006001064.tif 000025
【図１２ｂ】
0006001064.tif 000026
【図１３ａ】
0006001064.tif 000027
【図１３ｂ】
0006001064.tif 000028
【図１４ａ】
0006001064.tif 000029
【図１４ｂ】
0006001064.tif 000030