(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）細胞が注入された１つの脳半球から反対側の脳半球に転移することにより特徴付けられるヒト多形グリオブラストーマ（ＧＢＭ）細胞の高浸潤グリオーマ細胞（ＨＩＧＣ）サブタイプ、及び
（ｉｉ）自己複製し、外来の有糸分裂促進因子又は成長因子の添加なしでの神経半球を形成し、及び免疫不全マウスの脳に移植したときにｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍を誘発する能力により特徴付けられるヒトＧＢＭ細胞の脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）サブタイプ、の１つに優先的に結合するペプチド組成物であって、ペプチドが、優先的に結合するのに有効な量の、１２−２０アミノ酸の単離ペプチドであり、ＨＩＧＣの優先的結合についての配列番号２−５、７、８、および１０から選択される配列を含み、及びＢＴＩＣの優先的結合についての配列番号１１−１６からなる群より選択される配列を含むことを特徴とするペプチド組成物。
【請求項２】
前記ペプチドが、Ｌ−アミノ酸からなる、請求項１のペプチド組成物。
【請求項３】
ヒトＧＢＭ腫瘍を有する個体においてＨＩＧＣ又はＢＴＩＣの局在化のために用いるものであり、かつ前記ペプチドに結合している放射性造影剤を更に含む、請求項１に記載のペプチド組成物。
【請求項４】
ヒトＧＢＭ腫瘍を有する個体においてＨＩＧＣ又はＢＴＩＣを抑制又は死滅させるため用いるものであり、かつ前記ペプチドに結合した抗がん剤を更に含む、請求項１のペプチド組成物。
【請求項５】
ＨＩＧＣのターゲティングに用いるものであり、かつ前記ペプチドが配列番号２−５、７、８、および１０からなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載のペプチド組成物。
【請求項６】
前記ペプチド組成物が配列番号２または７からなる群より選択される配列を含む、請求項５のペプチド組成物。
【請求項７】
前記ペプチドが配列番号７で定義される配列を含む、請求項６のペプチド組成物。
【請求項８】
ＢＴＩＣのターゲティングに用いるものであり、かつ前記ペプチドが配列番号１１−１６からなる群より選択される配列を含む、請求項１のペプチド組成物。
【請求項９】
前記ペプチドが配列番号１１、１３、及び１６から選択される配列を含む、請求項８のペプチド組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドが配列番号１１で定義される配列を含む、請求項９のペプチド組成物。
【請求項１１】
脳血液関門を通過してヒトＧＢＭ細胞を個体に届けるための使用において、前記ペプチドが配列番号１７又は１８で定義されるキャリアペプチドに結合されている、請求項１のペプチド組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドがポリ（ラクチドｃｏ−グリセリド）コポリマー、シクロデキストリン、又はセチルアルコール／ポリソルベートからなるナノ粒子内に封入されている、請求項１のペプチド組成物。
【請求項１３】
脳に神経薬理学的抗がん剤を届けるための組成物であって、前記神経薬理学的抗がん剤が、配列番号７で定義される配列を含み、かつ１２−２０アミノ酸長である単離されたキャリアペプチドに結合されている、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は２００９年１１月２４日に提出された米国仮出願Ｎｏ．６１／２６４，０６４に対して優先権を主張する。この文献を参照により本発明に援用する。
【０００２】
本発明は悪性グリア細胞、特にヒト多形グリオブラストーマ（ＧＢＭ）細胞の脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）サブタイプ及びヒトＧＢＭ細胞の高浸潤性グリオーマ細胞（ＨＩＧＣ）サブタイプを標的とすることができるペプチド、並びにこのペプチドを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
１．  Ｖａｎ  Ｍｅｉｒ，  Ｅ．Ｇ．，  Ｈａｄｊｉｐａｎａｙｉｓ，  Ｃ．Ｇ．，  Ｎｏｒｄｅｎ，  Ａ．Ｄ．，  Ｓｈｕ，  Ｈ．Ｋ．，  Ｗｅｎ，  Ｐ．Ｙ．，  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｊ．Ｊ．  Ｅｘｃｉｔｉｎｇ  ｎｅｗ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ：  ｔｈｅ  ａｖｅｎｕｅ  ｔｏ  ａ  ｃｕｒｅ  ｆｏｒ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ．  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ６０，  １６６−１９３．
【０００４】
２．  Ｔｒａｎ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，  Ｍ．Ａ．  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｉｎｃｕｒａｂｌｅ  ｃａｎｃｅｒｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７，  ４１７−４２１．
【０００５】
３．  Ｌａｃｒｏｉｘ，  Ｍ．，  Ａｂｉ−Ｓａｉｄ，  Ｄ．，  Ｆｏｕｒｎｅｙ，  Ｄ．Ｒ．，  Ｇｏｋａｓｌａｎ，  Ｚ．Ｌ．，  Ｓｈｉ，  Ｗ．，  ＤｅＭｏｎｔｅ，  Ｆ．，  Ｌａｎｇ，  Ｆ．Ｆ．，  ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ，  Ｉ．Ｅ．，  Ｈａｓｓｅｎｂｕｓｃｈ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｈｏｌｌａｎｄ，  Ｅ．，  Ｈｅｓｓ，  Ｋ．，  Ｍｉｃｈａｅｌ，  Ｃ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｓａｗａｙａ，  Ｒ．  （２００１）．  Ａ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ４１６  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ：  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，  ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ９５，  １９０−１９８．
【０００６】
４．  Ｍａｎｇｉｏｌａ，  Ａ．，  ｄｅ  Ｂｏｎｉｓ，  Ｐ．，  Ｍａｉｒａ，  Ｇ．，  Ｂａｌｄｕｃｃｉ，  Ｍ．，  Ｓｉｃａ，  Ｇ．，  Ｌａｍａ，  Ｇ．，  Ｌａｕｒｉｏｌａ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ａｎｉｌｅ，  Ｃ．  （２００８）．  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  １１３，  ８４１−８４６．
【０００７】
５．  Ｗａｎｇ，  Ｌ．，  Ｒａｈｎ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｌｕｎ，  Ｘ．，  Ｓｕｎ，  Ｂ．，  Ｋｅｌｌｙ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｗｅｉｓｓ，  Ｓ．，  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｆｏｒｓｙｔｈ，  Ｐ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｓｅｎｇｅｒ，  Ｄ．Ｌ．  （２００８）．  Ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｇｌｉｏｍａ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐ７５  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ６，  ｅ２８９．
【０００８】
６．  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  Ａ．Ｌ．，  Ｌｕｎ，  Ｘ．，  Ｒａｈｎ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｌｉａｃｉｎｉ，  Ａ．，  Ｗａｎｇ，  Ｌ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｍ．Ｇ．，  Ｐａｒｎｅｙ，  Ｉ．Ｆ．，  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，  Ｂ．Ｌ．，  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｆｏｒｓｙｔｈ，  Ｐ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｓｅｎｇｅｒ，  Ｄ．Ｌ．  （２００７）．  Ｔｈｅ  ｐ７５  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｇｌｉｏｍａ  ｉｎｖａｓｉｏｎ．  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ５，  ｅ２１２．
【０００９】
７．  Ｋｏｕｋｏｕｒａｋｉｓ，  Ｇ．Ｖ．，  Ｋｏｕｌｏｕｌｉａｓ，  Ｖ．，  Ｚａｃｈａｒｉａｓ，  Ｇ．，  Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ，  Ｃ．，  Ｐａｎｔｅｌａｋｏｓ，  Ｐ．，  Ｍａｒａｖｅｌｉｓ，  Ｇ．，  Ｆｏｔｉｎｅａｓ，  Ａ．，  Ｂｅｌｉ，  Ｉ．，  Ｃｈａｌｄｅｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｋｏｕｖａｒｉｓ，  Ｊ．  （２００９）．  Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｅ  ｂｒａｉｎ  ｇｌｉｏｍａｓ：  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ；  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｒｔｉｃｌｅ．  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １４，  １５６１−１５７７．
【００１０】
８．  Ｋｉｔａｎｇｅ，  Ｇ．Ｊ．，  Ｃａｒｌｓｏｎ，  Ｂ．Ｌ．，  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，  Ｍ．Ａ．，  Ｇｒｏｇａｎ，  Ｐ．Ｔ．，  Ｌａｍｏｎｔ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｄｅｃｋｅｒ，  Ｐ．Ａ．，  Ｗｕ，  Ｗ．，  Ｊａｍｅｓ，  Ｃ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｓａｒｋａｒｉａ，  Ｊ．Ｎ．  （２００９）．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＧＭＴ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．  Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ  １１，  ２８１−２９１．
【００１１】
９．  Ｈａｌａｔｓｃｈ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｌｏｗ，  Ｓ．，  Ｍｕｒｓｃｈ，  Ｋ．，  Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ，  Ｔ．，  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｕ．，  Ｕｎｔｅｒｂｅｒｇ，  Ａ．，  Ｖｏｕｇｉｏｕｋａｓ，  Ｖ．Ｉ．，  ａｎｄ  Ｆｅｕｅｒｈａｋｅ，  Ｆ．  （２００９）．  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｔｏ  ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ．  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  １１１，  ２１１−２１８．
【００１２】
１０．  Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，  Ｂ．，  ＭｃＥｌｌｉｎ，  Ｂ．，  Ｃａｍａｃｈｏ，  Ｃ．Ｖ．，  Ｔｏｍｉｍａｔｓｕ，  Ｎ．，  Ｓｉｒａｓａｎａｇａｎｄａｌａ，  Ｓ．，  Ｎａｎｎｅｐａｇａ，  Ｓ．，  Ｈａｔａｎｐａａ，  Ｋ．Ｊ．，  Ｍｉｃｋｅｙ，  Ｂ．，  Ｍａｄｄｅｎ，  Ｃ．，  Ｍａｈｅｒ，  Ｅ．，  Ｂｏｏｔｈｍａｎ，  Ｄ．Ａ．，  Ｆｕｒｎａｒｉ，  Ｆ．，  Ｃａｖｅｎｅｅ，  Ｗ．Ｋ．，  Ｂａｃｈｏｏ，  Ｒ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｂｕｒｍａ，  Ｓ．  （２００９）．  ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ：  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９，  ４２５２−４２５９．
【００１３】
１１．  Ｒｅｙａ，  Ｔ．，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｍ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，  Ｉ．Ｌ．  （２００１）．  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，  ｃａｎｃｅｒ，  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４，  １０５−１１１．
【００１４】
１２．  Ｂｏｎｎｅｔ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｄｉｃｋ，  Ｊ．Ｅ．  （１９９７）．  Ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｓ  ｏｒｇａｎｉｚｅｄ  ａｓ  ａ  ｈｉｅｒａｒｃｈｙ  ｔｈａｔ  ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ３，  ７３０−７３７．
【００１５】
１３．  Ｌａｇａｓｓｅ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，  Ｉ．Ｌ．  （１９９７）．  Ｅｎｆｏｒｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ｉｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｏｐ／ｏｐ  ｍｉｃｅ．  Ｃｅｌｌ  ８９，  １０２１−１０３１．
【００１６】
１４．  Ｔｒａｖｅｒ，  Ｄ．，  Ａｋａｓｈｉ，  Ｋ．，  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，  Ｉ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｌａｇａｓｓｅ，  Ｅ．  （１９９８）．  Ｍｉｃｅ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｔｗｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９，  ４７−５７．
【００１７】
１５．  Ｎｏｗｅｌｌ，  Ｐ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｃｒｏｃｅ，  Ｃ．Ｍ．  （１９８６）．  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ，  ｇｅｎｅｓ，  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １２５，  ７−１５．
【００１８】
１６．  Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ，  Ｄ．，  Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，  Ｔ．，  Ｓｃｈｗｅｃｈｈｅｉｍｅｒ，  Ｋ．，  Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，  Ｍ．Ｌ．，  Ｃａｖａｎｅｅ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｂ．  （１９９２）．  Ｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｍｕｔａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５，  ８４６−８４７．
【００１９】
１７．  Ｓｈａｃｋｌｅｔｏｎ，  Ｍ．，  Ｖａｉｌｌａｎｔ，  Ｆ．，  Ｓｉｍｐｓｏｎ，  Ｋ．Ｊ．，  Ｓｔｉｎｇｌ，  Ｊ．，  Ｓｍｙｔｈ，  Ｇ．Ｋ．，  Ａｓｓｅｌｉｎ−Ｌａｂａｔ，  Ｍ．Ｌ．，  Ｗｕ，  Ｌ．，  Ｌｉｎｄｅｍａｎ，  Ｇ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｖｉｓｖａｄｅｒ，  Ｊ．Ｅ．  （２００６）．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３９，  ８４−８８．
【００２０】
１８．  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｍ．Ｆ．，  Ｄｉｃｋ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｄｉｒｋｓ，  Ｐ．Ｂ．，  Ｅａｖｅｓ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｊａｍｉｅｓｏｎ，  Ｃ．Ｈ．，  Ｊｏｎｅｓ，  Ｄ．Ｌ．，  Ｖｉｓｖａｄｅｒ，  Ｊ．，  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，  Ｉ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｗａｈｌ，  Ｇ．Ｍ．  （２００６）．  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ−−ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ：  ＡＡＣＲ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６，  ９３３９−９３４４．
【００２１】
１９．  Ｈｅｍｍａｔｉ，  Ｈ．Ｄ．，  Ｎａｋａｎｏ，  Ｉ．，  Ｌａｚａｒｅｆｆ，  Ｊ．Ａ．，  Ｍａｓｔｅｒｍａｎ−Ｓｍｉｔｈ，  Ｍ．，  Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，  Ｄ．Ｈ．，  Ｂｒｏｎｎｅｒ−Ｆｒａｓｅｒ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｋｏｒｎｂｌｕｍ，  Ｈ．Ｉ．  （２００３）．  Ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ａｒｉｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００，  １５１７８−１５１８３．
【００２２】
２０．  Ｓｉｎｇｈ，  Ｓ．Ｋ．，  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｉ．Ｄ．，  Ｔｅｒａｓａｋｉ，  Ｍ．，  Ｂｏｎｎ，  Ｖ．Ｅ．，  Ｈａｗｋｉｎｓ，  Ｃ．，  Ｓｑｕｉｒｅ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｄｉｒｋｓ，  Ｐ．Ｂ．  （２００３）．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３，  ５８２１−５８２８．
【００２３】
２１．  Ｓｉｎｇｈ，  Ｓ．Ｋ．，  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｉ．Ｄ．，  Ｈｉｄｅ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｄｉｒｋｓ，  Ｐ．Ｂ．  （２００４）．  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３，  ７２６７−７２７３．
【００２４】
２２．  Ｂａｏ，  Ｓ．，  Ｗｕ，  Ｑ．，  ＭｃＬｅｎｄｏｎ，  Ｒ．Ｅ．，  Ｈａｏ，  Ｙ．，  Ｓｈｉ，  Ｑ．，  Ｈｊｅｌｍｅｌａｎｄ，  Ａ．Ｂ．，  Ｄｅｗｈｉｒｓｔ，  Ｍ．Ｗ．，  Ｂｉｇｎｅｒ，  Ｄ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｒｉｃｈ，  Ｊ．Ｎ．  （２００６）．  Ｇｌｉｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４４，  ７５６−７６０．
【００２５】
２３．  Ｌｅｅ，  Ｊ．，  Ｋｏｔｌｉａｒｏｖａ，  Ｓ．，  Ｋｏｔｌｉａｒｏｖ，  Ｙ．，  Ｌｉ，  Ａ．，  Ｓｕ，  Ｑ．，  Ｄｏｎｉｎ，  Ｎ．Ｍ．，  Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ，  Ｓ．，  Ｐｕｒｏｗ，  Ｂ．Ｗ．，  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ，  Ｎ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｗ．，  Ｐａｒｋ，  Ｊ．Ｋ．，  ａｎｄ  Ｆｉｎｅ，  Ｈ．Ａ．  （２００６）．  Ｔｕｍｏｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｉｎ  ｂＦＧＦ  ａｎｄ  ＥＧＦ  ｍｏｒｅ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｍｉｒｒｏｒ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒｓ  ｔｈａｎ  ｄｏ  ｓｅｒｕｍ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９，  ３９１−４０３．
【００２６】
２４．  Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｏ，  Ｓ．Ｇ．，  Ｃｏｍｂｉ，  Ｒ．，  Ｃａｊｏｌａ，  Ｌ．，  Ｐａｔｒｉｚｉ，  Ａ．，  Ｒｅｄａｅｌｌｉ，  Ｓ．，  Ｂｅｎｔｉｖｅｇｎａ，  Ａ．，  Ｂａｒｏｎｃｈｅｌｌｉ，  Ｓ．，  Ｍａｉｒａ，  Ｇ．，  Ｐｏｌｌｏ，  Ｂ．，  Ｍａｎｇｉｏｌａ，  Ａ．，  ＤｉＭｅｃｏ，  Ｆ．，  Ｄａｌｐｒａ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｖｅｓｃｏｖｉ，  Ａ．Ｌ．  （２００９）．  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐｏｏｌｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｅｘｉｓｔ  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２８，  １８０７−１８１１．
【００２７】
２５．  Ｖｅｓｃｏｖｉ，  Ａ．Ｌ．，  Ｇａｌｌｉ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  Ｂ．Ａ．  （２００６）．  Ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ６，  ４２５−４３６．
【００２８】
２６．  Ｗｕ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｐ．Ｙ．  （２００９）．  ＣＤ１３３  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｒｎｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ  １８，  １１２７−１１３４．
【００２９】
２７．  Ｃｈｅｎｇ，  Ｊ．Ｘ．，  Ｌｉｕ，  Ｂ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．  （２００９）．  Ｈｏｗ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｉｓ  ＣＤ１３３  ａｓ  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ？  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ  ３５，  ４０３−４０８．
【００３０】
２８．  Ｋｅｌｌｙ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｓｔｅｃｈｉｓｈｉｎ，  Ｏ．，  Ｃｈｏｊｎａｃｋｉ，  Ａ．，  Ｌｕｎ，  Ｘ．，  Ｓｕｎ，  Ｂ．，  Ｓｅｎｇｅｒ，  Ｄ．Ｌ．，  Ｆｏｒｓｙｔｈ，  Ｐ．，  Ａｕｅｒ，  Ｒ．Ｎ．，  Ｄｕｎｎ，  Ｊ．Ｆ．，  Ｃａｉｒｎｃｒｏｓｓ，  Ｊ．Ｇ．，  Ｐａｒｎｅｙ，  Ｉ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，  Ｓ．  （２００９）．  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｃｃｕｒｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｍｉｔｏｇｅｎｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７，  １７２２−１７３３．
【００３１】
２９．  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  Ｂ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，  Ｓ．  （１９９２）．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５，  １７０７−１７１０．
【００３２】
３０．  Ｏｈ，  Ｙ．，  Ｍｏｈｉｕｄｄｉｎ，  Ｉ．，  Ｓｕｎ，  Ｙ．，  Ｐｕｔｎａｍ，  Ｊ．Ｂ．，  Ｊｒ．，  Ｈｏｎｇ，  Ｗ．Ｋ．，  Ａｒａｐ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，  Ｒ．  （２００５）．  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．  Ｃｈｅｓｔ  １２８，  ５９６Ｓ−６００Ｓ．
【００３３】
３１．  Ｒａｆｉｉ，  Ｓ．，  Ａｖｅｃｉｌｌａ，  Ｓ．Ｔ．，  ａｎｄ  Ｊｉｎ，  Ｄ．Ｋ．  （２００３）．  Ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ａｄｄｒｅｓｓ  ｂｏｏｋ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｖｅｓｓｅｌ  ｚｉｐ  ｃｏｄｅｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４，  ３３１−３３３．
【００３４】
３２．  Ｈａｒｔ，  Ｓ．Ｌ．，  Ｋｎｉｇｈｔ，  Ａ．Ｍ．，  Ｈａｒｂｏｔｔｌｅ，  Ｒ．Ｐ．，  Ｍｉｓｔｒｙ，  Ａ．，  Ｈｕｎｇｅｒ，  Ｈ．Ｄ．，  Ｃｕｔｌｅｒ，  Ｄ．Ｆ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｃｏｕｔｅｌｌｅ，  Ｃ．  （１９９４）．  Ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ａ  ｃｙｃｌｉｃ  Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９，  １２４６８−１２４７４．
【００３５】
３３．  Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，  Ｅ．，  Ｗａｎｇ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．  （１９９４）．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ５  ｂｅｔａ  １  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２４，  ３７３−３８０．
【００３６】
３４．  Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，  Ｅ．，  Ｇａｙ，  Ｄ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．  （１９９３）．  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ５  ｂｅｔａ  １  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８，  ２０２０５−２０２１０．
【００３７】
３５．  Ａｒａｐ，  Ｗ．，  Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．  （１９９８）．  Ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，  ３７７−３８０．
【００３８】
３６．  Ｎｏｒｒｉｓ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｐａｉｇｅ，  Ｌ．Ａ．，  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｃ．Ｙ．，  Ｈｕａｃａｎｉ，  Ｍ．Ｒ．，  Ｆａｎ，  Ｄ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｐ．Ｔ．，  Ｆｏｗｌｋｅｓ，  Ｄ．Ｍ．，  ａｎｄ  ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，  Ｄ．Ｐ．  （１９９９）．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，  ７４４−７４６．
【００３９】
３７．  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．，  Ｓｐｒｉｎｇ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｂ，  Ｍ．  （２００１）．  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  １７１，  １５３−１６４．
【００４０】
３８．  Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，  Ｕ．Ｂ．，  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，  Ｖ．，  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｈ．，  Ｍｉｓｃｈｌｅｒ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｇｈａｒｔ，  Ｋ．  （２００２）．  Ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９，  ６０６−６１２．
【００４１】
３９．  Ａｕｒｉａｃ，  Ａ．，  Ｗｉｌｌｅｍｅｔｚ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｃａｎｏｎｎｅ−Ｈｅｒｇａｕｘ，  Ｆ．  Ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ：  ａ  ｎｅｗ  ｒｏｕｔｅ  ｆｏｒ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．
【００４２】
４０．  Ｌｉｎｄｎｅｒ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｋｎｏｒｒ，  Ｒ．  （２００９）．  Ｒａｆｔｉｎｇ  ｔｒｉｐｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ．  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｂｉｏｌ  ２，  ４２０−４２１．
【００４３】
４１．  Ｐａｔｒａ，  Ｓ．Ｋ．  （２００８）．  Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７８５，  １８２−２０６．
【００４４】
４２．  Ｒｏｌｌａｓｏｎ，  Ｒ．，  Ｋｏｒｏｌｃｈｕｋ，  Ｖ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｃ．，  Ｓｃｈｕ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｂａｎｔｉｎｇ，  Ｇ．  （２００７）．  Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｌｉｐｉｄ−ｒａｆｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｄｕａｌ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｍｏｔｉｆ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １２０，  ３８５０−３８５８．
【００４５】
４３．  Ｏｓｔｒｏｍ，  Ｒ．Ｓ．，  ａｎｄ  Ｌｉｕ，  Ｘ．  （２００７）．  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ｆｒｅｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｅ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ  ａｎｄ  ｃａｖｅｏｌａｅ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４００，  ４５９−４６８．
【００４６】
４４．  Ｅｃｈａｒｒｉ，  Ａ．，  Ｍｕｒｉｅｌ，  Ｏ．，  ａｎｄ  Ｄｅｌ  Ｐｏｚｏ，  Ｍ．Ａ．  （２００７）．  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｒａｆｔ／ｃａｖｅｏｌａｅ  ｄｏｍａｉｎｓ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １８，  ６２７−６３７．
【００４７】
４５．  Ｇｉｍｐｌ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｇｅｈｒｉｇ−Ｂｕｒｇｅｒ，  Ｋ．  （２００７）．  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２７，  ３３５−３５８．
【００４８】
４６．  Ｒｏｕｑｕｅｔｔｅ−Ｊａｚｄａｎｉａｎ，  Ａ．Ｋ．，  Ｐｅｌａｓｓｙ，  Ｃ．，  Ｂｒｅｉｔｔｍａｙｅｒ，  Ｊ．Ｐ．，  ａｎｄ  Ａｕｓｓｅｌ，  Ｃ．  （２００６）．  Ｒｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｒａｆｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １８，  １０５−１２２．
【００４９】
４７．  Ｐａｎｇ，  Ｈ．，  Ｌｅ，  Ｐ．Ｕ．，  ａｎｄ  Ｎａｂｉ，  Ｉ．Ｒ．  （２００４）．  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ＧＭ１  ｌｅｖｅｌｓ  ａｒｅ  ａ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｖｅｏｌａｅ／ｒａｆｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｏｌｇｉ  ａｐｐａｒａｔｕｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１７，  １４２１−１４３０．
【００５０】
４８．  Ｓｉｎｇｈ，  Ｒ．Ｄ．，  Ｐｕｒｉ，  Ｖ．，  Ｖａｌｉｙａｖｅｅｔｔｉｌ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｍａｒｋｓ，  Ｄ．Ｌ．，  Ｂｉｔｔｍａｎ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｐａｇａｎｏ，  Ｒ．Ｅ．  （２００３）．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃａｖｅｏｌｉｎ−１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １４，  ３２５４−３２６５．
【００５１】
４９．  Ｇｉｌ，  Ｃ．，  Ｃｕｂｉ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ａｇｕｉｌｅｒａ，  Ｊ．  （２００７）．  Ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ７５ＮＴＲ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８１，  １８５１−１８５８．
【００５２】
５０．  Ｅｚｒａｔｔｙ，  Ｅ．Ｊ．，  Ｂｅｒｔａｕｘ，  Ｃ．，  Ｍａｒｃａｎｔｏｎｉｏ，  Ｅ．Ｅ．，  ａｎｄ  Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｇ．Ｇ．  （２００９）．  Ｃｌａｔｈｒｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｆｏｒ  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ  ｉｎ  ｍｉｇｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８７，  ７３３−７４７．
【００５３】
５１．  ｄｉ  Ｂｌａｓｉｏ，  Ｌ．，  Ｄｒｏｅｔｔｏ，  Ｓ．，  Ｎｏｒｍａｎ，  Ｊ．，  Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｐｒｉｍｏ，  Ｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｄ１  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＶＥＧＦ−Ａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｌｐｈａｖｂｅｔａ３  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．  Ｔｒａｆｆｉｃ．
【００５４】
５２．  Ｍｉａｃｚｙｎｓｋａ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｂａｒ−Ｓａｇｉ，  Ｄ．  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ：  ｓｅｅｉｎｇ  ｉｓ  ｂｅｌｉｅｖｉｎｇ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．
【００５５】
５３．  Ｕｒｒａ，  Ｓ．，  Ｅｓｃｕｄｅｒｏ，  Ｃ．Ａ．，  Ｒａｍｏｓ，  Ｐ．，  Ｌｉｓｂｏｎａ，  Ｆ．，  Ａｌｌｅｎｄｅ，  Ｅ．，  Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ，  Ｐ．，  Ｐａｒｒａｇｕｅｚ，  Ｊ．Ｉ．，  Ｚａｍｐｉｅｒｉ，  Ｎ．，  Ｃｈａｏ，  Ｍ．Ｖ．，  Ａｎｎａｅｒｔ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｂｒｏｎｆｍａｎ，  Ｆ．Ｃ．  （２００７）．  ＴｒｋＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ７５  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ７５  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２，  ７６０６−７６１５．
【００５６】
５４．  Ｊａｂｂｏｕｒ，  Ｍ．Ｎ．，  ａｎｄ  Ｍａｔｉｏｌｉ，  Ｇ．Ｔ．  （２００６）．  Ａｇｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｉｇｉｎ  （ｓｔｅｍ  ｖｅｒｓｕｓ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）  ｏｆ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ  ６７，  １４３７−１４４２．
【００５７】
５５．  Ｔｒｏｇ，  Ｄ．，  Ｙｅｇｈｉａｚａｒｙａｎ，  Ｋ．，  Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ，  Ｍ．，  Ｆｒｉｅｄｌｅｉｎ，  Ａ．，  Ｍｏｅｎｋｅｍａｎｎ，  Ｈ．，  Ｈａｅｒｔｅｌ，  Ｎ．，  Ｓｃｈｕｅｌｌｅｒ，  Ｈ．，  Ｂｒｅｉｐｏｈｌ，  Ｗ．，  Ｓｃｈｉｌｄ，  Ｈ．，  Ｌｅｐｐｅｒｔ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｇｏｌｕｂｎｉｔｓｃｈａｊａ，  Ｏ．  （２００６）．  Ｐｒｏ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ−ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５４２，  ８−１５．
【００５８】
５６．  Ｔｒｏｇ，  Ｄ．，  Ｙｅｇｈｉａｚａｒｙａｎ，  Ｋ．，  Ｓｃｈｉｌｄ，  Ｈ．Ｈ．，  ａｎｄ  Ｇｏｌｕｂｎｉｔｓｃｈａｊａ，  Ｏ．  （２００８）．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｌｉｏｍａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｇｌｉｏｍａｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｉｎｓｔ  Ｍｅｃｈ  Ｅｎｇ  Ｈ  ２２２，  １１４９−１１６０．
【００５９】
５７．  Ｂｒｏｎｆｍａｎ，  Ｆ．Ｃ．，  Ｔｃｈｅｒｐａｋｏｖ，  Ｍ．，  Ｊｏｖｉｎ，  Ｔ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｆａｉｎｚｉｌｂｅｒ，  Ｍ．  （２００３）．  Ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ７５  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：  ａ  ｓｌｏｗ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｎｄｏｓｏｍｅ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３，  ３２０９−３２２０．
【００６０】
５８．  Ｄｅｉｎｈａｒｄｔ，  Ｋ．，  Ｒｅｖｅｒｓｉ，  Ａ．，  Ｂｅｒｎｉｎｇｈａｕｓｅｎ，  Ｏ．，  Ｈｏｐｋｉｎｓ，  Ｃ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｉａｖｏ，  Ｇ．  （２００７）．  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  Ｒｅｄｉｒｅｃｔ  ｐ７５ＮＴＲ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｏ  ａ  ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ａｘｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．  Ｔｒａｆｆｉｃ  ８，  １７３６−１７４９．
【００６１】
５９．  Ｂｉｌｄｅｒｂａｃｋ，  Ｔ．Ｒ．，  Ｇａｚｕｌａ，  Ｖ．Ｒ．，  Ｌｉｓａｎｔｉ，  Ｍ．Ｐ．，  ａｎｄ  Ｄｏｂｒｏｗｓｋｙ，  Ｒ．Ｔ．  （１９９９）．  Ｃａｖｅｏｌｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｒｋ  Ａ  ａｎｄ  ｐ７５（ＮＴＲ）  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，  ２５７−２６３．
【００６２】
６０．  Ｂｉｌｄｅｒｂａｃｋ，  Ｔ．Ｒ．，  Ｇｒｉｇｓｂｙ，  Ｒ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｄｏｂｒｏｗｓｋｙ，  Ｒ．Ｔ．  （１９９７）．  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ７５（ＮＴＲ）  ｗｉｔｈ  ｃａｖｅｏｌｉｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｔｏ  ｃａｖｅｏｌａｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，  １０９２２−１０９２７．
【００６３】
６１．  Ｂａｒｂａｓｓ，  Ｃ．Ｂ．，  ＤＲ．  Ｓｃｏｔｔ，  ＪＫ．    Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，  ＧＪ．  （２００４）．  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ）．
【００６４】
６２．  ｒａｐｐａｔｚ  Ｊ，  Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＡＪ，  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  ＡＮＧ１００５：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．２８（１５  Ｓｕｐｐｌ．）  （２０１０）  （Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２００９）．
【００６５】
６３．  ａｒｄｒｉｄｇｅ，  Ｗ．Ｍ．，    Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｒｉａｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  （１９９７）  １７，  ７１３−７３１．
【００６６】
６４．  ａｂａｔｈｕｌｅｒ，  Ｒ．，  ＣＮＳ  Ｎｅｕｒ０ｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，  ８（３）：１９５−２０４  （２００９）．  
【００６７】
６５．  ｅｎｅｉ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ２００５  Ｍａｒ；２（２）：３６３−７６．  
【００６８】
６６．  ｔｕｋｅｌ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ，  Ｊｕｎｅ，  （２００９）．  
【００６９】
６７．  ｅｌｐｅｒｉｎａ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａ．  Ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ，  ７４（２）：  １５７−１６３  （Ｆｅｂ．  ２０１０）．         
【００７０】
６８．  Ｇｉｌ，  ＥＳ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  １０（３）：５０５−５１６，  Ｍａｒｃｈ，  ２００９）．  
【００７１】
６９．  Ｋｏｚｉａｒａ，  Ｊ．  Ｍ．，  ａｔ  ｅｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ９９（２）：  ２５９−２６９  （Ｓｅｐｔ，  ２００４）．
【００７２】
７０．  Ｙａｎｇ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｒｏｙ  Ｓｏｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，  ７（Ｓｕｐｐ４）：Ｓ４１１−Ｓ４２２  （Ｊｕｎｅ，  ２０１０）．
【００７３】
７１．  Ａｇａｒｗａｌ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ，  １５（８）：９１７−９２５  （２００９）．
【００７４】
多形膠芽腫（ＧＢＭ）は、手術、放射線、及びテモゾロミドで治療した際に、短期の再発および約１年の生存期間中央値を示す、複雑で異質な疾患である［１−３］。前神経（よりよい患者生存プロフィール）、内決定因子（「神経」）、間充織（ＮＦ−１ロスに関係する）、増殖（古典的には；ＥＧＦＲ突然変異あるいは増幅に関係する）サブタイプ（［１］で参照されている）への転写クラスタリングによる分類は、ターゲットとされた治療方法の合理的な選択だけでなく予後を決定する際に、個々の患者のプロファイルに有用性であることが強調されている。しかしながら、これらのサブタイプを臨床的にターゲットとすることへの実際的なアプローチを開発する必要がある。
【００７５】
徹底的な放射線及び化学的治療にもかかわらず、腫瘍再増殖は事実上避けられず、通常、切除マージンの数センチメートル内に生じる［４］。治療の失敗に寄与する２つの潜在的な疾患病原巣がある。１つは、薬物耐性遺伝子と高いＤＮＡ修復能力を獲得するためでなく、主な腫瘍部位から、遺伝的及び表現型として個別の細胞が主な腫瘍容積から、数センチメートルの距離まで伸びる長いつる状のものを形成することができる、又は離れて位置するという利点により、科学的治療又は放射線治療に耐性のある主要の浸潤腫瘍のサブ集団を形成することができることを示した、近年の臨床及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究により、浸潤性グリオーマが特徴付けられてきた（７乃至１０）ことである。これらの細胞は、本発明において高浸潤グリオーマ細胞又はＨＩＧＣと言う。
【００７６】
第二の推定上の病原巣は癌幹細胞（ＣＳＣ）のコンセプトに基づいている。ＣＳＣは自己複製のメカニズムにより生じ、幹細胞と癌細胞との間の性質を有する（１１）。この癌幹細胞の仮説は、形質転換された一部の極わずかな幹細胞の集団又は自己複製性質を必要とされている原始細胞が癌細胞複製のソースであると提案している。癌幹細胞の存在の証拠は、いくつかの血液学的悪性腫瘍について示唆されてきた（１２−１４）。より近年では、固形腫瘍について示唆されている（１４−１８）。
【００７７】
現在、グリオブラストーマにおいて、ＣＳＣの関与があることを至適する  ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータが蓄積されている（１９−２５）。増殖、予後、及び治療に対する反応を含む腫瘍の挙動を決定するであろうことから、脳腫瘍幹細胞のコンセプト、又は本明細書で用いられるように、脳腫瘍原始細胞又はＢＴＩＣは、潜在的に重要である。ＢＴＩＣの１つの重要な特徴は、それらはヒトの病気に非常に類似しており、それゆえ、脳腫瘍の生物学的理解及び治療の開発について、最良のシステムとなるかもしれないということである（２３）。更に、ＢＴＩＣはより小さい細胞遺伝学的及び分子的異常性を有している（２１、２３）。この異常性は脳腫瘍形成において、偶然生じるイベント（即ち、形質転換の連続として生じる変化だけでなく）を同定することにより簡単に検出できる。ＢＴＩＣの存在と、正確な操作定義と、用語の使用が議論の話題となるべきである。ＡＳ  ＣＤ１３３は、「幹細胞」のインジケーターとして議論の的になっている（２６−２８）ので、本明細書では、ＢＴＩＣを、自己複製することができ、別の系統に分化して、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍を形成することができる患者由来細胞であると定義する。
【発明の概要】
【００７８】
本発明は、１つの側面において、（ｉ）ヒトの脳半球から細胞が注入された反対側へ転移する能力により特徴付けられる、ヒト多形グリオーマ（ＧＢＭ）の高浸潤グリオーマ細胞（ＴＩＣＢ）サブタイプ、及び（ｉｉ）自己複製し、外来の有糸分裂促進因子及び成長因子の添加をしないで、球をつくり、及び免疫不全マウスの脳に移植した場合、生体内で、腫瘍形成を誘発することができる幹細胞様性質により特徴づけられる、ヒトＧＢＭ細胞の脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）サブタイプ、の１つを標的とするペプチド組成物である。この組成物は１２―２０の間のアミノ酸数であり、配列番号１―１０からなる群より選択される配列を含む単離されたペプチドを含む。この組成物は１２−２０の間のアミノ酸でＨＩＧＣのターゲティングのための配列番号１−１０からなる群より選択される配列、又はＢＴＩＣをターゲティングする配列番号１１−１６からなる群より選択される配列を含む。
【００７９】
この組成物のペプチドはＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｌアミノ酸及びＤアミノ酸の混合物、又は逆の順に配列されたＤアミノ酸のレトロインベルソペプチドからなる。
【００８０】
ヒトＧＢＭ腫瘍を有する患者において、ＨＩＧＣ又はＢＴＩＣの局在化について、使用するために、この組成物はペプチドに結合した放射性造影剤を含む。
【００８１】
ヒトＧＢＭ腫瘍を有する患者においてＨＩＧＣ又はＢＴＩＣを抑制または死滅させるための使用において、この組成物はペプチドに結合した抗腫瘍剤を更に含む。
【００８２】
ＨＩＧＣのターゲティングのためには、このペプチドは配列番号１−１０からなる群より選択される配列、好ましくは配列番号２、７、及び９を含む。より好ましくは、この配列は配列番号７である。
【００８３】
ＢＴＩＣのターゲティングのための使用では、このペプチドは配列番号１１−１６からなる群より選択される配列を含み、好ましくは配列番号１１、１３、及び１６、より好ましくは配列番号１１により定義される配列を含む。
【００８４】
血液脳関門を横断して、ヒトＧＢＭ腫瘍を患者に届けるための使用では、この単離されたペプチドは配列番号１７乃至１８で定義される配列を有するキャリアペプチドに結合している。他の態様では、この単離されたポリペプチドはポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、シクロデキストリン、又はセチルアルコール／ポリソルベートで作られた、ナノ粒子の中に包含されている。
【００８５】
本明細書では、ヒトＧＢＭ腫瘍を有する患者においてＨＩＧＣ又はＢＴＩＣサブタイプの細胞の存在を検出するための前述のペプチドの使用を開示する。この組成物は、このペプチドに結合した検出可能な放射性造影剤を含む。ＨＩＧＣサプタイプの細胞の存在を検出するための例示的な組成物中のペプチドは配列番号７を含む。ＢＴＩＣサブタイプの細胞の存在を検出するための例示的な組成物におけるペプチドは配列番号１１を含む。
【００８６】
更に、ヒト多形クギオーマ（ＧＢＭ）腫瘍を有する患者においてＨＩＧＣ又はＢＴＩＣサブタイプ細胞を抑制又は死滅させるための、前述のペプチド組成物の使用も開示される。ここにおいて、この組成物はこのペプチドに結合した抗がん剤を含む。ＨＩＧＣサブタイプの細胞を抑制又は死滅させるための１つの例示的な組成物は配列番号７の配列を含む。ＢＩＴＣサブタイプの細胞を抑制又は死滅させるための例示的な組成物におけるペプチドは配列番号１１の配列を含む。
【００８７】
他の側面において、本発明は悪性グリオーマの分子的に異種性を表し、腫瘍の再発の理由と考えられている腫瘍細胞のサブポピュレーションを特徴付ける及び／又は処理することにより、患者においてＧＢＭ腫瘍を治療するための方法における改善を含む。この方法は患者に、（ｉ）細胞が反対側に注入された脳半球から反対側の脳半球に転移をする能力により特徴付けられるヒトＧＢＭ細胞の高浸潤グリオーマ細胞（ＨＩＣＧ）サブタイプ、及び
（ｉｉ）自己複製し、外来の有糸分裂促進因子及び成長因子添加がなくとも、神経球を生成し、免疫不全マウスの脳に移植された場合にｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍形成を誘発することができる幹細胞様性質により、特徴づけられるヒトＧＢＭ細胞の脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）のサブタイプの、１つへ優先的に結合する能力について選択された、１２−２０の間のアミノ酸長のペプチドを含む、ペプチド組成物を、投与する工程を含む。標的となったＨＩＧＣ及び／又はＢＴＩＣサブタイプの細胞において、このペプチド組成物の局在は、（ｉ）ペプチド組成物がペプチドに結合している検出可能な放射性造影剤を含むことで、標的となった検出されるべきサブタイプの細胞の存在を明らかにし、
（ｉｉ）ペプチド組成物がペプチドへの結合した抗がん剤を含むことで、標的となったＨＩＧＣ又はＧＴＩＣ細胞を抑制又は死滅させることができ、及び
（ｉｉｉ）ペプチド単独により抑制されるべき腫瘍部位へＨＩＧＣ細胞を移動（転移）させることができる。
【００８８】
腫瘍の再発が原因であると考えられている、腫瘍細胞のサプタイプを特徴付けるための使用について、この組成物中の単離されたペプチドは配列番号１−１６の配列の１つを含む、ペプチド及びそれに結合した放射性造影剤を含む。この方法は、局在化された放射性造影剤を検出して、腫瘍領域をイメージングする工程を含む。
【００８９】
腫瘍の再発が原因であると考えられている、腫瘍細胞のサブタイプを抑制又は死滅させるための使用について、このペプチド組成物中のペプチドは配列番号１−１６の１つの配列及びそれに結合している抗がん剤を含む。このペプチド組成物は治療有効量で投与される。
【００９０】
腫瘍部位へ向けて、高浸潤性サプタイプ細胞を移動させるための使用では、ペプチド組成物中のペプチドは配列番号１−１０で定義される配列の１つを有するペプチドでよい。
【００９１】
この組成物は、（ｉ）静脈内に、（ｉｉ）動脈内に、（ｉｉｉ）側脳室内に設置されたカテーテルによる対流強化拡散（ＣＥＤ）法によるペプチドの投与、（ｉｖ）脳内移植片からのペプチドの放出、（ｖ）血液脳関門の物理的阻害、（ｖｉ）ナノ粒子内に包入されたペプチドの静脈内又は動脈内注射、（ｖｉｉ）Ａｎｇｉｏ−ｐｅｐ担体ペプチドに結合したペプチドの静脈内又は動脈内投与、及び（Ｖｉｉｉ）ペプチドの細胞内投与、の１つ又はそれ以上により投与される。
【００９２】
更なる他の側面において、本発明はヒトＧＢＭ腫瘍の診断又は治療のために、ペプチド化合物を同定する方法を含む。
【００９３】
この方法は、
（ａ）（ｉ）細胞が注射された脳の半球から、反対側の脳半球へ移動する能力により特徴付けられるヒトＧＢＭ細胞の高浸潤性細胞（ＨＩＧＣ）サブタイプ、並びに
（ｉｉ）自己複製し、外来の有糸分裂促進因子又は成長因子の添加なしに、神経球を形成し、及び免疫不全マウスの脳に移植した時に生体内で腫瘍形成を誘発することができる幹細胞様性質により特徴づけられるヒトＧＢＭ細胞の脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）サブタイプ、から選択される、ヒトＧＢＭ細胞のサブタイプに特異的に結合する能力についてのファージ提示ペプチドスクリーニング、
【００９４】
（ｂ）工程（ａ）で同定されたペプチドを、細胞の動物脳腫瘍において、ヒトＧＢＭ細胞サブタイプの２つのうちの１つに関係する細胞局在化能力についての更なるスクリーニング工程、
【００９５】
（ｃ）前述の動物において、ＧＢＭ腫瘍の深溝をとめる能力についての工程（ｂ）で同定されたペプチドの更なるスクリーニング、及び
【００９６】
（ｄ）（ｃ）からのペプチドをヒトＧＢＭ腫瘍の治療又は診断あるいは、ヒトＧＢＭ腫瘍の診断又は治療についてのリード化合物として使用する工程、を含む。
【００９７】
工程（ｃ）で同定された例示的なペプチドはＨＩＧＣのターゲティングについては配列番号７を含み、ＢＴＩＣのターゲティングについては配列番号１１を含む。
【００９８】
神経薬理学的薬剤又は抗がん剤を脳に届けるための組成物も開示されている。この組成物は１２−２０アミノ酸長であり、配列番号７で定義される配列を含むキャリアペプチドに共役結合した神経薬理学的薬剤又は抗がん剤を含む。
【００９９】
これらの及び本発明の他の目的及び特徴は、本明細書の発明の詳細な説明を添付の図を一緒に読んだときにより完全に理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
図１Ａはｉｎ  ｖｉｖｏの連続継代により開発された高浸潤グリオーマ細胞集団に優先的に結合し、Ｕ８７Ｒといわれるファージの選択についての概略的図である。ペプチド選択は細胞間の任意の共通のファージを除去するために、連続的バイオパニングを用いる２段階プロセスにおいて、行われた。第一に、ＰｈＤ−１２Ｍ１３組み合わせファージ提示ライブラリーが、非標的細胞、非浸潤Ｕ８７Ｔ細胞に結合するファージについて差し引かれる。次に、標的細胞Ｕ８７Ｒに優先的に結合するファージについて陽性選択を行った。任意の非結合ファージを捨て、残ったファージを１２Ｒライブラリーを呼ばれる標的特異結合ファージを高める連続工程において、増殖した。
【０１０１】
図１Ｂは、細胞の表面に結合しているファージを検出する全細胞ＥＬＩＳＡアッセイを示す。この１２Ｒファージライブラリーを浸潤性Ｕ８７Ｒ又は非浸潤性Ｕ８７Ｔ細胞をインキュベーションして、任意の非結合ファージを除去して、ＨＰＲ−抗−Ｍ１３抗体及びＭＴＢ基質（青）を用いて、結合ファージを検出した。１２Ｒライブラリーは高浸潤Ｕ８７Ｒ細胞に優先的に結合した。
【０１０２】
図２Ａは、グリオーマ浸潤を選択的に抑制する１２ＲライブラリーサブクローンＨ１０の抑制能力を示す。アガロースプレート上の宿主細胞をファージを連続希釈したものを平板培養を用いて、ファージサブクローンを単離した。個々のクローンが単離され、増幅され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイにおいてそれらの抑制能力を試験した。Ｈ１０とされたファージは、トランスウェルメンブラン（３ｘ１０１０ｐｆｕ：４時間、３７℃）でコートされた脳様マトリクスを通過するＵ８７Ｒ細胞浸潤の転移を特異的にそして、有意にブロックした。ＬＳＰ又はランダムファージの影響をアッセイして宿主細胞により可能性のあるコンタミネーションを抑制した。
【０１０３】
図２ＢはＨ１０ファージに加えて、Ｈ１０合成ペプチド（５０μＭ）がグリオーマ浸潤を示すタンパク質である、ｐ７５ＮＴＲで形質転換してＵ８７ＭＧ細胞だけでなく、高浸潤Ｕ８７Ｒの転移を効果的及び選択的に抑制することを示す。
【０１０４】
図２Ｃはグリブラストーマ患者から隔離された３／５（６０％）脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）が、Ｈ１０ペプチドに抑制されたことによる、Ｈ１０ペプチドの臨床関連性を示す。アスタリスクは未処置対照とは有意差があることを示している（Ｄｅｎｎｅｔｔ’ｓ  （ｐ≦０．０５）。
【０１０５】
図３Ａはコレステロースオキシダーゼが細胞転移を抑制することを示すグラフである。浸潤性Ｕ８７Ｒ細胞はトランスウェルメンブランでコートされた基質上で平板培養され、コレステロールオキシダーゼで４時間処理された（１．８Ｕ／ｍｌ）。トランスウェル面ブランの下方に転移した細胞はクリスタルバイオレットで染色され、光学顕微鏡でカウントされた。
【０１０６】
図３Ｂはコレステロールオキシダーゼが脂質ラフトマーカーＧＭ１の内部局在化を阻害することを示している。Ｕ８７Ｒ細胞は、トランスウェル面ブランでコートされた基質上で平板培養され、コレステロールオキシダーゼとＡｌｅｘａ５５５−コレラトキシンＢサブユニットで１２０分間処理されて、そのレセプターであるＧＭ１の取り込み及び／又は代謝回転における違いについて評価された。白矢印はＧＭ１の膜蓄積を示す。
【０１０７】
図４ＡはＨ１０の存在におけるＧＭ１の蓄積を示す。浸潤性Ｕ８７Ｒ細胞は、トランスウェルメンブランでコートされたマトリックス上で平板培養され、Ａｌｅｘａ５５５−コレラトキシンサブユニットの存在下で３０分間インキュベーションして、脂質ラフトマーカーＧＭ１の取り込み及び／又は代謝回転における違いを評価した。Ｈ１０で処理された細胞は、ＧＭ１染色の全体的な蓄積がみられ、球状の内部構造及び膜上に配置されたことを特徴とする（白矢印）。
【０１０８】
図４ＢはＨ１０μコレステロールオキシダーゼで処理された浸潤性グリオーマ細胞が、脂質ラフトに見られる膜タンパク質であって、細胞転移を促進すると知られている、ｐ７５ＮＴＲ高分子量複合体を蓄積させることを示すウエスタンブロットである。濃度勾配分画がコラーゲン上で平板培養されたＵ８７Ｒ細胞から調製され、ＰＢＳ（対照）、Ｈ１０ファージ、Ｆ２ファージ、又はコレステロールオキシダーゼ、で２時間処理し、ｐ７５ＮＴＲについてウエスタンブロットにより解析した。白矢印は、複合体を含む高分子量ｐ７５ＮＴＲを示す。図下方の線で示すのは、一般的な器官において見られた分画である。
【０１０９】
図４ＣはＨ１０でのグリオーマ細胞の処理がプラズマメンブランにおいて、ｐ７５ＮＴＲを蓄積させることを示す。ＢＴＩＣ２５細胞（非ＧＦＴ）をトランスウェルメンブランでコートされたマトリックス上で平板培養し、ファージで２時間処理した。ｐ７５ＮＴＲシグナリングの間に、通常切断される、ｐ７５ＮＴＲレセプターがＨ１０処理の後に細胞膜において、大きく高められる。ｐ７５ＮＴＲはＨ１０で処理されたＧＭ１コンパートメントに蓄積するわけではないようだ。この事は、Ｈ１０が膜構造の１つ以上のクラスに影響するということを示している。
【０１１０】
図５はビオチン化７Ａペプチドで染色されたＢＴＩＣ単離体の共焦点顕微鏡写真からのシングルｚスタック投影である。非標的（Ｕ８７ＭＧＨ；ＮＳＣ）及び標的（ＢＴＩＣ）細胞で、ビオチン化７Ａペプチド（赤）を用いて、７Ａペプチドの結合特異性を共焦点顕微鏡写真を用いて評価した。
【０１１１】
図６はＨ１０のｉｎｖｉｖｏ帰着能力を示す。浸潤性Ｕ８７Ｒ又は非浸潤性Ｕ８７Ｔ細胞をＳＣＩＤマウスの右脳半球で成長させた。一旦腫瘍が確立されると、マウスを麻酔所処理して。Ｈ１０ファージを１０分間灌流させた。未結合ファージをＰＢＳで系から洗浄した。脳の凍結切片を作成し、Ｍ１３ファージ又はヒト核抗原（ｈＮＡ）について、免疫組織学的染色を行った。Ｕ８７Ｔ細胞を用いて確立させた腫瘍との比較について、Ｈ１０ファージはより効率的にＵ８７Ｒ腫瘍細胞へ帰着した。このことは、Ｕ８７Ｒ細胞体の染色及び異種移植片の縁にそって、染色が濃くなっていたことにより証明される。
【０１１２】
図６Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏで７ＡがＢＴＩＣ１２及びＢＴＩＣ２５異種移植片に帰着することを示す。細胞をＳＣＩＤマウスの右脳半球に移植し、３ヶ月間腫瘍を確立させた。ファージ結合の分布は２つのＢＴＩＣ異種移植で独特であり、サンプル間で違いを示した。７Ａ帰着はＵ２５Ｎ細胞株から生成した腫瘍を有するマウスでは観察されなかった。ランダムに選択されたファージＡ１でＢＴＩＣ２５外来職片を染色すると、最小染色を示した。
【０１１３】
図７Ａは、７ＡペプチドがＢＴＩＣ単離体内で所定の細胞挙動を有するサブポピュレーションを区別することができることを示している。ＢＴＩＣは限界希釈法によりサブスクリーニングされ、ビオチン化７Ａペプチド（赤）への結合について、スクリーニングされた。７Ａに結合するサブポピュレーションは培地中で神経球を形成する能力が高く、ＳＣＩＤマウスに見られる異種移植のように高度な増殖性を示さず、脳側室近くに優先的に観察された。ヒト異種移植片をマウスの右脳半球に移植し、ヒト核抗原を視覚化するためにトルイジンブルーで切片を対比染色した。
【０１１４】
図８はＢＴＩＣ単離体の代表的選択におけるＢＴＩＣ選択性ペプチドの結合特異性を示す。
【０１１５】
図９ＡはＦＩＴＣトランスフェリンの取り込みについて、視覚化されたｐ７５ＮＴＲ形質転換グリオーマ細胞（Ｕ８７ｐ７５）の共焦点像である。Ｈ１０及びコレステロールオキシダーゼ存在下での、Ｕ８７ｐ７５ＮＴＲ成長が細胞をコラーゲンでコートしたトランスウェルメンブラン上で平板培養した後に、ＦＩＴＣトランスフェリンの取り込みを２時間評価した。Ｈ１０とコレステロールオキシダーゼはクラスリンコート小胞のマーカーであるトランスフェリン又はトランスフェリンレセプターの分散に影響しなかった。
【０１１６】
図９Ｂは、イオジキサノール勾配分離法をもちいた浸潤性Ｕ８７細胞の分画を示す。Ｕ８７Ｒ細胞はＨ１０、Ｆ１２、コレステロールオキシダーゼ又は対象ＰＢＳで２時間処理した。細胞を溶解し、イオジキサノール勾配を用いて分画した後、トランスイフェリンレセプターについてウエスタンブロット解析を行った。
【０１１７】
図１０Ａは、抗−ｐ７５ＮＴＲウエスタンブロットと完全長ｐ７５ＮＴＲを示す。Ｃ末端フラグメント（αセクレターゼ）及び細胞内ドメイン（γセクレターゼ）切断生成物をＨ１０、ＭｂＣＤ、又はＨ１０＋ＭｂＣＤで処理した後視覚化した。
【０１１８】
図１０ＢはＨ１０に４時間及び１週間曝した後の完全長ｐ７５ＮＴＲのウエスタンブロットを示す。
【０１１９】
図１０Ｃはコレステロールオキシダーゼ及びメチル−β−シクロデキストリンの存在下で行われたｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイである。コレステロールオキシダーゼとメチル−βシクロデキストリンはＵ８７ｐ７５グリオーマ細胞の細胞浸潤を有意に抑制した。
【０１２０】
図１１はいくつかのビオチン化合成ペプチド（赤：縦列）への特異結合についてスクリーニングされた患者由来ＢＴＩＣ単離体（横列）のパネルの共焦点像である。
【０１２１】
図１２Ａと図１２Ｂは異なる細胞外マトリクスの存在下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのトランスウェル転移アッセイを示す。脳基質の存在は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｈ１０が仲介する細胞転移の抑制に必要であり（図１２Ａ）コラーゲンＩがこの影響を仲介する（図１２Ｂ）。
【発明の詳細な説明】
【０１２２】
定義
【０１２３】
「ヒト多形グリオブラストーマ（ＧＭＢ）」はヒトにおける最も一般的でアグレッシブなタイプの原始脳腫瘍細胞を意味する。ＧＢＭ腫瘍は未分化細胞（偽柵構造壊死）囲まれた、壊死組織の小さい領域に存在により特徴付けられる。血管の過形成のほかにこの特徴がこれらの特徴を有していないグレード３の星状細胞腫とは異なる。
【０１２４】
「高浸潤グリオブラストーマ細胞」又は「ＨＩＧＣ」は細胞が注入された脳半球から反対側の半球へ細胞が転移する能力により特徴付けられるヒトＧＢＭ細胞のサブタイプ（サブポピュレーション）である。ＨＩＧＣの例としては、Ｕ８７ＭＧヒトグリオーマ細胞のＵ８７Ｒサブタイプがある。
【０１２５】
「脳腫瘍原始細胞」又は「ＢＴＩＣ」は自己複製、外来の有糸分裂促進因子及び成長因子なしに神経球を生成する、及び免疫不全マウスの脳に移植したときにｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍形成を誘発するもとができる、幹細胞様性質により特徴付けられるヒトＧＢＭ細胞のサブタイプ（サブポピョレーション）である。
【０１２６】
「ペプチド提示ファージ」の語はそれらの表面に外来パプチドのライブラリー、通常組み合わせライブラリー、を発現するように遺伝子工学的に修飾されたバクテリオファージを意味する。このバクテリオファージは、外来ライブラリーペプチドのファージ表面の存在に基づいてファージ選択を可能にする。
【０１２７】
「ＨＩＧＣ特異ペプチド」の語は、以下のセクションＶＩＩＩＣで説明するファージディスプレイパニングの条件下でＨＩＧＣに優先的に結合する、通常ペプチドディスプレイファージに関連するペプチド、を意味する。
【０１２８】
「ＢＴＩＣ特異ペプチド」の語は、通常、ペプチドディスプレイファージに関連するペプチドで、以下のセクションＶＩＩＩＤで説明するファージディスプレイパニングの条件下でＢＴＩＣに優先的に結合するペプチドを意味する。
【０１２９】
以下のセクションＶＩＩＩＣ及びＶＩＩＩＤで説明するファージ提示洗浄条件下で固定されたＨＩＧＣ又はＴＩＧＣ標的細胞に結合したままであれば、「優先的にＨＩＧＣ又はＢＴＩＣに結合する」ペプチド提示ファージである。
【０１３０】
アミノ酸残渣はそれらの標準的な１文字コードにより本明細書では記載される（例えば、ｗｗｗ．ｍｕｎ．ｃａ／ｂｉｏｃｈｅｍ／ｃｏｕｒｓｅｓ／３１０７／ａａｓｙｍｂｏｌｓ．ｈｔｍｌ参照。）
ＩＩ．Ｕ８７Ｒ細胞特異ペプチド
【０１３１】
本発明において、浸潤性グリオーマ及びＢＴＩＣコンパートメントが新たに形作られ、可能性のある標的可能成分も詳細な試験を可能にする。本明細書で説明する浸潤グリオーマモデルは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるマウスの脳を通過して、ＧＦＰネオ形質転換されたＵ８７ＭＧヒトグリオブラストーマ細胞が通過して、注入された部位に対して反対側の脳半球から浸潤したサブポピュレーションを単離するために開発された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されたときと、非浸潤の反対部分（Ｕ８７Ｒ、原始主要から離れた）を比較すると、これらの細胞は高度に侵略する性質をｉｎ  ｖｉｔｒｏとマウスの脳に再注入したときの両方示した。マイクロアレイ解析は、多くの遺伝子が、Ｕ８７Ｔ細胞と比較して、Ｕ８７Ｒ細胞において、ｐ７５ＮＴＲの高められた発現を示すと共に、下方調整又は上方調整のいずれかを行うことを示した。機能的、生物学的、及び臨床の研究の組み合わせを用いて、ｐ７５ＮＴＲは劇的に高められた浸潤と遺伝的には別のグリオーマ細胞の浸潤と侵入を劇的に高め、しばしば高浸潤グリオブラストーマ患者の検体において強く発現していることが発見された（６）。これらの観察はＵ８７Ｒサブポピュレーションが、後のペプチドスクリーニングにおいて好適なモデルであることを示している。このＵ８７Ｒサブタイプは高浸潤グリオーマ細胞の一例である。
【０１３２】
ＢＴＩＣモデルは新たに再分泌されたヒト脳腫瘍検体由来の一連の一次細胞培養物からなる。腫瘍の起源は一般的な抗体のパネルに対して試験を行いＧＢＭの診断を確認する。サブポピュレーションは培養中で神経球を自己再生する能力、並びにグリオーマの大きな星状細胞、オリゴデンドロサイト、又は神経系統への分化能力により選択される。１０細胞ほどをマウスの脳に注入すると、これらの脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）は臨床的にはＧＢＭ検体に見られるのと類似して、原始腫瘍を再発生し、並びに強固に進入する（２８）。もしＢＴＩＣが脳腫瘍幹細胞を最も良く表しているかどうかが不明確であっても、それらはヒトに疾患の挙動を示すことについての優秀なモデルである。
【０１３３】
本発明にしたがって、ＧＢＭの治療後に再発した患者の病巣からの細胞のターゲティング、特徴付け、及び操作に有用なペプチドが確立された。このペプチド選択は他の研究において既に証明されているファージ提示技術を用いて達成される。例えば、標的細胞又は精製された分子におけるファージ提示ライブラリーは、機能的有用性を有するペプチド試薬の単離だけでなく、確立された細胞集団のサブポピュレーション特有の細胞表面タンパク質の特徴付け（例えば、血管調査システム［３０、３１］）及び特定のタンパク質機能のモチーフ重要性の同定（例えば、インテグリン会合のために必要なＲＧＤモチーフ「３２――３４」）を導く。特定の用語において、グリオブラストーマ患者の診断又は治療に有用な独特のファージ提示ペプチドの選択はｅｘ  ｖｉｖｏで、治療的困難性を引き起こすＧＢＭの特定の性質を再補足する、我々の独特の臨床的に信頼の置けるモデルシステムの必要性を満たし、単離体において研究されるべき原因となる細胞を特定することができる。
【０１３４】
本明細書で説明する選択されたペプチドの最終パネルは細胞集団間の違い、所与の細胞集団内で分子的不均一性を示すのに有用であると証明され、患者の治療効果と腫瘍遺伝的表現型のマッチング、又は特定の治療領域、癌治療における個人用医薬品の必須成分のマッチングを可能にする、グリオブラストーマサブタイプの特徴付けにおいて、更に改善されるであろう。あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用調査の理由から、これらのペプチドは臨床的なイメージングツールとして、又は特定の腫瘍サブタイプの化学治療の標的試薬として用いることができる。浸潤性を示す患者からの検体だけでなく、Ｕ８７Ｒ細胞の有糸分裂及び浸潤能力をこれらの１つが劇的に抑制するので未修飾ペプチドの固有の治療可能性もある。
Ａ．グリオーマ細胞有糸分裂を抑制するＵ８７Ｒ特異ペプチドの単離となる、ファージ提示ライブラリーの選択バイオパニング
【０１３５】
本発明は、高浸潤性である（Ｕ８７Ｒ）ヒトグリオーマ細胞のポピュレーションのｉｎ  ｖｉｖｏでの選択を既に説明した。これらの高浸潤性グリオーマ細胞に結合することができるペプチドを単離するために、組み合わせファージ提示ライブラリーを用いたバイオパニング実験を用いた。はじめに、非浸潤（Ｕ８７Ｔ）性Ｕ８７細胞を用いてサブトラクティブバイオパニングを行い、次いで、Ｕ８７Ｒ細胞を用いてセレクティブバイオパニングを行い、全細胞ＥＬＩＳＡアッセイ（図１Ｂ）により、Ｕ８７Ｒと優先的に相互作用することが確認されたファージ（図１Ａ）のライブラリーを単離する。これらのファージをアガロースプレート上で宿主細胞を用いてファージを連続希釈して平板培養してサブクローニングし、ペプチド挿入の配列を決定し、表１に列挙した。この表は左から右に向かって（ｉ）同定されたペプチド（ｉｉ）ペプチド配列、（ｉｉｉ）配列番号、及び（ｉｖ）これらの配列を含む細胞結合ファージの数を示す。
【０１３６】
更なる生化学的及びｉｎ  ｖｉｖｏでの評価のためにファージを選択するために、Ｕ８７Ｒ細胞の挙動に機能的に影響を与える能力について試験を行った。Ｈ１０ファージ提示配列（配列番号７）は脳様細胞外マトリクスでコートされた膜を通過するＵ８７Ｒ細胞の転移を抑制することが発見された（図２Ａ）。他のファージペプチド、例えば、Ｍ３２及びＭ３４、もＨ１０で処理した場合同様の抑制効果を示したが、同じ程度ではなかった。宿主細胞からのバクテリアの成分が抑制を引き起こすという可能性は、ランダムに選択されたファージのＬＳＰ及び２０倍要領の効果を試験からは達成できなかった。Ｕ８７Ｒ細胞の転移、ならびに脳腫瘍異種移植において、悪性表現型を付与するのに有効であるとされている分子であるｐ７５ＮＴＲで形質転換されたＵ８７ＭＧ細胞［６］もＨ１０ペプチドの合成バージョンは抑制することができる。これらの結果は、ファージペプチドの不存在下で、このペプチドの抑制性質を証明している。
【０１３７】
【表１】
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【０１３８】
個々の患者の生検から確立されたＢＴＩＣを用いたトランスウェルアッセイにおいてＨ１０ペプチドの幅広い有用性を評価した。これらは、切除された腫瘍から直接単離されたので、Ｈ１０の真の臨床的ポテンシャルについての示唆を与えると思われた。試験されたＢＴＩＣ株の６０％（３／５）の転移は有意に抑制され、５つすべてが抑制傾向を示した（図２Ｃ）。Ｈ１０が有意な効果を示さないケースでは、この細胞は高度に浸潤しなかった。
Ｂ．Ｈ１０はＧＭ１含有構造及び他の脂質ラフト成分のターンオーバーに影響する
【０１３９】
Ｈ１０ペプチドがグリオーマの浸潤を抑制することによる分子メカニズムを決定するために、このペプチドのビオチン化バージョンをパートナーに結合する能力を引き下げ、マススペクトロメトリーで解析した。検出されたタンパク質の多くが、エンドソームの又は血管輸送の役割を担うか又はこれらに関係を有していた（表２）。
【０１４０】
脂質ラフトはエンドサイトーシスプロセスに含まれることから［３９−４４］、脂質ラフト阻害物質として知られているコレステロールオキシダーゼで処理したＵ８７Ｒ細胞の反応を試験した。細胞移動はトランスウェルアッセイで抑制され（図３Ａ）、非カベオラ脂質ラフト及びカベオラの成分である［４７、４８］、ＧＭ１が細胞内、特に原形質膜に蓄積することが観察された（図３Ｂ）。同様の影響は、対照との比較において、３つの独立した細胞株において、Ｈ１０で細胞を処理した場合に観察された（図４Ａ）。
【表２】
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【０１４１】
ｐ７５ニューロトロフンレセプター（ＮＴＲ）は所定の試薬で単離された脂質ラフトにおいて、差別的に検出することができる［４９］。あるいは、細胞内小胞は細胞のポーラエクストリームに対する特定の機能に必要な分子、例えば、有糸分裂の間のリーディングエッジに対するインテグリン等の消化酵素又は構造分離の輸送、を届けることができる［５０−５２］。
【０１４２】
ｐ７５ＮＴＲは特定の試薬で単離された脂質ラフトにおいて差別的に検出することができ［４９］、グリオーマ細胞において、タンパク分解プロセスを経て細胞有糸分裂を引き起こす［５］。従って、ｐ７５ＮＴＲが細胞内取り込み現象の後に脂質ラフト内で切断もされていることが考えられる［５３］。Ｈ１０がエンドソームに位置するｐ７５ＮＴＲに影響を及ぼすかどうかを決定するために、細胞を超持続的に溶解し（小胞及び小胞内器官を少なくとも部分的に維持して）１０−４０％のスクロース／イオジキサノール勾配を用いて分離して、このフラクションを別々に収集した。Ｈ１０とコレステロールオキシダーゼの両方はｐ７５ＮＴＲのより高い分子量にシフトしてより濃厚な勾配分画に収集された。ｐ７５ＮＴＲの大部分はＧＭ１含有脂質ラフトと関係がなかったようであるが、Ｈ１０で細胞をインキュベーションすると、ｐ７５ＮＴＲが細胞内及細胞外ドメインに共存することになる（図４Ｃ）。データを考慮すると、（ｉ）Ｈ１０はＧＭ１及びｐ７５ＮＴＲ含有脂質ラフトの代謝回転を抑制することができる（ｉｉ）Ｈ１０は細胞内生成されたｐ７５ＮＴＲ細胞外ドメインの少なくとも１部分の放出を阻害するようである。対照的に、Ｈ１０とコレステロールオキシダーゼは、クラスリンコート小胞のマーカーである、トランスフェリン又はそのレセプターの細胞内局在化又は分画勾配の影響を与えない（図９Ａ及び９Ｂ）。一方Ｈ１０は過剰に発現されたｐ７５ＮＴＲに明確な影響を与えないけれども、内生的に発現された完全長タンパク質のわずかな蓄積を引き起こした。（図１０Ａ−１０Ｃ）。
ＩＩＩ．ＢＴＩＣ特異ペプチド
【０１４３】
ＢＴＩＣ特異ペプチドは１２Ｒライブラリーとして、Ｕ８７ＧＭ細胞、Ｕ２５１Ｎ細胞、バックグラウンドファージのライブラリーを補正するためのサブトラクション細胞としてのヒト清浄胎児星状細胞、及び選択のための異なる患者由来のＴＩＣ単離体の混合物（ＢＴＩＣ１２、２５、４２、５０）を用いて生成された。
Ａ．バイオパニングされたＢＴＩＣ単離体からのペプチドは培養された神経球内で異質性を示す
【０１４４】
単離された最も豊富なファージは７Ａ（２５／５０）とされ、１２マーの配列、Ｎ−ＰＳＰＨＲＱＲＱＨＩＬＲ−Ｃ（配列番号１１）をコードしていた。更に、５つの別のファージ（１０Ｃ、Ｅ１０、３Ｆ、Ｃ１、及び３Ｂ）が１つ以上から単離され、スクリーニングされたサブクローニングの５０％（２５／５０）を含んでいた。結果を表３に示す。
【０１４５】
サブトラクションのために用いた細胞よりもＢＴＩＣに優先的に結合する７Ａを確認するために、神経半球及びＵ８７ＭＧ細胞をビオチン標識合成ペプチドを含む懸濁液中で染色した。ＢＴＩＣ株の２つが神経球内において陽性細胞の高いパーセンテージを示したが、図５Ｂに示すように、正常幹細胞（非癌性であり、抑制又は選択に使用されていない）及びＵ８７ＭＧ細胞は主に陰性であった。ＢＴＩＣラインのパネルを通過したすべての選択されたペプチドの相互作用の検査は、各細胞集団内の異質性を強調し、特別のペプチド配列に、細胞挙動あるいは患者への影響のいずれかを結び付ける能力を関連させるためのプラットフォームを確立した。図８はＢＴＩＣの代表的な選択において、発見されたＢＴＩＣに特異的なペプチドの結合特異性を示す。
【０１４６】
【表３】
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ＩＶ．Ｕ８７Ｒ及びＢＴＩＣ結合ペプチドの帰着性質
【０１４７】
選択されたファージ又はそれらに対応するペプチドの能力を、同所異種移植モデルにおいてグリオーマ細胞を検出するそれらの能力に従って、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて個々のＵ８７Ｒ又はＢＴＩＣグリオーマ細胞標的に対して「帰着」する能力について、試験した。Ｈ１０の場合、Ｕ８７Ｒ又はＵ８７Ｔ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスに、ＰＢＳに予め曝して未結合粒子を除去した、試験ファージを１０分間注入した。脳の連続切片をＭ１３ファージについて免疫組織学的に染色すると、Ｈ１０がＵ８７Ｒにおいて特異的に帰着しており、Ｕ８７Ｔ細胞では帰着していないことが検出された（図６Ａ）。
【０１４８】
７Ａが神経球内のサブセット細胞に特的結合を示すかどうかを確認するために、ＢＴＩＣ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスに７Ａファージを注射して、抗ファージ免疫組織学的脳凍結切片を作成した。神経球のｅｘ  ｖｉｖｏ染色で見られるように、ＢＴＩＣ１２及び２５のメイン腫瘍容積内の細胞のサブセットのみが陽性染色を示した（図６Ｂ）。更に、周辺の組織ならびに非標的細胞から作成された異種移植片、特にＵ２５Ｎヒトグイオブラストーマ株において染色は検出されなかった。ＢＴＩＣ異種移植を対照ファージで予備灌流すると（Ａ１、ランダムにせんたくされたサブクローン）最小の染色を示した。このことは、再度７Ａ提示ペプチドの選択性及び結合特異性が確認された。
【０１４９】
上に報告された研究は、７Ａファージ／ペプチドが個々のＢＴＩＣ系統（図５、図６Ｂ）内の細胞の部分集合だけを認識することを示す。したがって、７Ａ結合が指標かもしれないこれらの細胞のユニークな特性があったかどうかを判断することは興味のあることであった。ＢＴＩＣ  ２５細胞は限界希釈法によってサブクローン化され、ペプチド結合のためにスクリーニングされた。７Ａ結合が豊富な細胞集団は接着性コロニーとは対照的に、培地において神経球を形成する非結合性カウンターパートとは明らかに異なっていた（図７）。更に、７Ａ結合しているサブポピュレーションは同所異種移植（３ヶ月育成期間）においてあまり増殖をせず、神経幹細胞ニッチを宿すと知られている脳の領域である、脳室下領域内でわずかに検出されたのみであった。７Ａ非結合サブポピュレーションは非常に腫瘍形成能力があり、周辺組織においてわずかに浸潤しただけで非常に大きな腫瘍容積を形成する。それゆえ、７Ａペプチドは、神経球形成、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける低増殖活性、及び脳室領域の優先的局在に関係する細胞の集団とは異なる。両方の集団はＢＴＩＣ培地由来であるという事実は、両方の集団がＢＴＩＣ培養に由来したという事実は、隠れた前駆体から再発された腫瘍まで７Ａがこの病巣内の細胞の進行を追跡することができることを示す。
Ｖ．ペプチド組成物及びペプチド会合体
【０１５０】
１つの側面において、本発明は（ｉ）ヒトＧＢＭ細胞の高浸潤前グリオーマ細胞（ＨＩＧＣ）サブタイプ、例えば、Ｕ８７ＧＭ細胞のＵ８７Ｒサブタイプ、又は（ｉｉ）上で特徴付けをした、ヒトＧＢＭ細胞の脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）サブタイプのいずれかを標的とするペプチド組成物を含む。組成物中のペプチドは１２−２０アミノ酸残基の長さであり、配列番号１−１６で定義される配列又は所与の配列に９０％の同一性を有する配列の１つを含む。即ち、このペプチドは配列番号１−１６のいずれか１つと同じか、又はこれらの配列のなかで最大でも１つのアミノ酸が異なる配列のみを含む。このペプチドはアミノ酸の所与の配列のみを含むか、又は２０残基の中にＮ末端及び／又はＣ末端残基を含む。従って、例えば、配列番号７、ＴＮＳＩＷＹＴＡＰＹＭＦ  （Ｈ１０）は、これと正確に同一な配列、同じ配列において１つのアミノ酸が置換、付加、又は欠失された配列、又はＮ末端又はＣ末端の両方又はいずれかにおいて８つまでの追加的な残基を有するペプチドである。
Ａ．ペプチド
【０１５１】
本発明のペプチドは天然のＬ−異性体、Ｄ−アミノ酸形態、又はこれら２つの混合物を有するアミノ酸を用いて、従来の固層又は組み換えＤＮＡ合成技術により形成される。全部がＤ形態又は部分的にＤ形態を有するペプチド組成物は生物学的条件下で、例えば、患者に投与された場合、タンパク質分解により耐性となることが予測される。全てがＬ型アミノ酸、全てがＤ型アミノ酸、又は活性化されたＤ−又はＬ−アミノ酸を用いたＤとＬのアミノ酸の混合物からなるペプチドの調製に用いる固層ペプチド合成方法は、例えば、Ｇｕｉｃｈａｒｄ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｖｏｌ．  ９１，  ｐｐ．  ９７６５−９７６９，  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９４に記載されている。代替的に、このペプチドは逆配列方向に合成されたＤアミノ酸からなっていてもよい。即ち、カルボキシ末端からアミノ末端に向かって、レトロインベルソ（ＲＩ）ポリペプチドと呼ばれているものを生成する。ＲＩ形態ペプチドの合成方法は、例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，  Ｍ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｍ．Ｍ．，  Ｐａｒｔｉａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｒｅｔｒｏ−Ｉｎｖｅｒｓｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ，  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ，  １９９８，  ９８：７６３−７９５に記載されている。本明細書を参照により本明細書に援用する。
【０１５２】
ＨＩＧＣのターゲティングでの使用のために、このペプチドは配列番号１−１０、好ましくは配列番号２、７、９、を含む。配列番号７を代表とする。ＢＴＩＣターゲティングにおける使用について、このペプチドは配列番号１１−１６、配列番号１１、１３、及び１６を含み、配列番号１１を代表とする。
Ｂ．ペプチド会合体及び組成物
【０１５３】
ヒトＧＢＭ腫瘍を有する患者におけるＨＩＧＣ又はＢＴＩＣサブタイプを検出するための診断薬として用いるために、このペプチドは放射性造影剤又は他の検出可能部分、例えば、蛍光剤又は他の光電部分と結合される。現在造影剤を用いる主要な造影技術はｘ線／コンピュータ断層映像法（ＣＴ）、磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）、陽電子放射型コンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射形コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、及び超音波技術がある。幅広く用いられている放射性造影剤は、ガンマグロブリンベース造影剤、テクニチウムベース造影剤、及び放射性ヨウ素剤がある。放射性造影剤又は放射性異性体を担持している配位複合体は、よく知られた方法で、例えば、配位複合体への共有結合により、ペプチドへ共有結合される。
【０１５４】
ＨＩＧＣ又はＢＴＩＣ細胞を抑制又は崩壊させるための治療薬としての使用について、このペプチドは、例えば、アルキル化剤、抗代謝剤、植物アルカロイド及びテルペノイド、例えば、タキソール、トポイソメラーゼ、プロエオソームインヒビター、及びモノクローナル抗体を含む各種抗がん剤の１つに結合されている。
【０１５５】
更なる態様において、本発明のペプチドはアンギオペップ（Ａｎｇｉｇ−ｐｅｐ）２又はアンギオペップ７（それぞれ配位１７及び１８）のようなペプチド担体と融合ペプチドを形成している。この融合ペプチドは脳血液関門（ＢＢＢ）（６２）を横断するペプチドの通過を促進することができる。
【０１５６】
本発明の組成物は（ｉ）ペプチド単独、（ｉｉ）液体又は乾燥状態の好適な担体、例えば、生理食塩水中のペプチド、（ｉｉｉ）前述の結合した形態のペプチド、又は（ｉｖ）ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、シクロデキストリンナノ粒子、又はセチルアルコール／ポリソルベートのナノ粒子内に封入されたペプチドを含む。ＢＢＢを通過して薬を提供するのに有用なナノ粒子は当業者に知られている（例えば、６８−７１）。このナノ粒子は好ましくは３０−１００ｎｍの範囲のサイズで、血液流れ中の循環時間を高めるためにポリエチレングリコールでコートされていてもよい。この粒子は、例えば、生理食塩水等の注射可能な媒体に懸濁されていてもよく、疎水性形態で提供されてもよい。
Ｃ．担持ペプチド
【０１５７】
Ｈ１０ファージを１０分間予備灌流させたＵ８７腫瘍を有するマウスの脳の免疫組織学的染色は、腫瘍部分又は腫瘍の周辺部分のいずれかの位置で陽性シグナルを示した。このことは、Ｈ１０が脳血液関門（ＢＢＢ）を通過する能力を有することを示している。この特徴は、本発明の他の側面では、担体ペプチドとしてＨ１０ペプチドの会合体を含む新規な組成物において、及び脳に届けられるべき神経薬物又は抗がん剤においてにも利用される。このような薬剤は、用いられる任意の薬物を含み、うつ病、不安、統合失調症、運動亢進、アルツハイマー病あるいはパーキンソン病のような神経学的な条件あるいは上に指定されたクラス等のあらゆる抗腫瘍化合物も、脳血液関門を破ることができたならば、それは治療する際に有用である。この薬剤は、ペプチド上のヒドロキシ、スルフィド、アミン、又はカルボキシル基への化合物の直接結合又は化合物上の対応する活性化された基へのペプチドの直接結合、又は二官能性のカップリング剤等の、既知の方法に従ってペプチドに結合される。
ＶＩ．診断及び治療方法
【０１５８】
ＧＢＭの研究は、腫瘍の発達の生物学から、これらの腫瘍についての原始因子及び疾患病巣であると近年信じられている細胞のサブセットに拡大された。近年の見解は所与の脳腫瘍は再発に寄与している固有のポテンシャルを保持している各サブポピュレーションとともに、幹細胞性又は分化の各種ステージを有する細胞の混合物からなるということである［１、５４］。患者への影響を予測し、再発性疾患［１］の性質のためのプロファイルをよりよく描写し始めた。これらのサブポピュレーションのすべてが再発された疾患に結局帰着して、現在の治療によって、治療可能であるとは限られないことは明白になっている。さらに、シナリオを複雑にして、これらの細胞集団も化学的及び放射性治療により刺激されたよりアグレッシブな表現型なるかもしれない［５５、５６］。本発明の１つのゴールは、ＧＢＭ及び関連疾患の確立されたサブタイプの排除についての現実的な解決に寄与することである。
【０１５９】
そのためにも、本発明はヒトＧＢＭ腫瘍を有する患者を診断及び／又は治療するための方法、特に、腫瘍の再発の原因と見られている腫瘍細胞のサブポピュレーションを特徴付け及び／又は処理することによるヒト患者におけるＧＢＭ腫瘍の治療についての改善を提供する。患者は化学療法、ｘ線放射治療、及び／又は外科的除去等の１つ以上の既知の手段で治療されていてもよい。この初期の治療は、腫瘍サイズ又は成長を有意に減少させたが治療領域のその側にあるＨＩＧＣサブポピュレーションの存在により、又はかつ度的にＧＢＭ細胞を分割して腫瘍を再分配することができる細胞のＢＴＩＣサブポピュレーションを通じて、腫瘍は再発する。この方法の実施において、本発明のペプチド総重量は、診断有効量又は治療有効量で患者に投与され、腫瘍医が（ｉ）脳における細胞のＨＩＧＣ及び／又はＢＴＩＣサブタイプの存在を、例えば、本発明のペプチドを放射性造影に用いることにより、同定し、及び（ｉｉ）ペプチドを使用するために、単独で、及び抗がん剤を一緒に用いて、死滅させる又は腫瘍サブタイプの成長又は転移（ＨＩＧＣの場合）を抑制して、腫瘍再発のリスク及び速度を減らすことができる。即ち、標的となったＨＩＧＣ及び／又はＢＴＩＣ細胞における、ペプチド投与後のペプチドの局在化は（ｉ）検出されるべき標的とされたサブタイプの細胞の存在、ここにおいて、ペプチド組成物はペプチドに結合した検出可能な放射性造影剤を含む、（ｉｉ）標的となったＨＩＧＣ及び／又はＢＴＩＣ細胞を抑制又は崩壊させる、ここにおいて、このペプチド組成物はペプチドに結合した抗がん剤を含む、及び（ｉｉｉ）ペプチド単独の存在により抑制されるべき腫瘍部位に向けてＨＩＧＣの転移を、させることができる。
【０１６０】
デリバリーシステムの多くは、ペプチド組成物を脳へ届けることができる（６２−７１）。前述のように、Ｈ１０ペプチドはそれ自身で脳血液関門を通過して抑制されるべき腫瘍部位へ移動することができ、従って、ペプチド単独で又は造影剤又は抗がん剤に結合したペプチドとしてのいずれかで、動脈内、ＩＶ、ＩＭ、ｓｕｂＱ、鼻の粘膜、又は肺を含む全身的な経路に投与される。
【０１６１】
ＣＮＳデリバリーについての他の有用な手段は、灌流高圧デリバリー（６６）、薬理学的ベース、又は物理学的ベース（６３）等のいずれかの浸透（浸潤）（神経外科的な）に幅広く分類される。神経外科的ベース手段は脳室内注入、脳内移植、及びＢＢＢ分裂を含む。薬理学的ベース手段は（例えば、６８−７１に記載のような）ナノ粒子担体を含む。物理学的基本手段は、ペプチドの栄養素の担体仲介輸送又はペプチドの受容体仲介輸送のいずれかの、通常の内生経路の利点を用いるものである。
【０１６２】
後者のカテゴリーにおいて、Ｄｒａｐｐａｔｚらは、再発したグリオブラストーマを有する患者にＡＮＧ１００５のフェーズＩスタディーを行った。ＡＮＧ１００５は低密度のリポタンパク質受容体関連タンパク質１受容体（６２）を介して、脳血液関門を横断して通過させる新規なペプチド、Ａｎｇｉｏ−Ｐｅｐ−２、に結合した３つのパクリタキセル分子からなる。Ａｎｇｉｏ−Ｐｅｐ−２は、ＢＢＢにおいて低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）受容体に結合する１９アミノ酸ペプチド（配列番号１７）であって、受容体仲介輸送により脳に薬物を続ける能力がある。ここにおいて、ＢＴＩＣ−又はＨＩＧＣ−特異ペプチドは、造影剤又は抗がん剤を含んでいてもいなくてもよいが、Ａｎｇｉｏ−ｐｅｐペプチドに結合しており、全身に届けられる。
【０１６３】
代替的に、手術で初期腫瘍を除去した後に、本発明の組成物は、オブラートに包んで直接、又は、このペプチドを定期的に届けるための灌流圧力デリバリーポンプを装着することにより、投与することができる。高灌流デリバリー（ＣＥＤ）はチップが標的部位に近いところに設置されている注入カテーテルを用いる。この技術において、カニューレが処置されるべき棒の領域に直接挿入されており、治療薬をＢＢＢを循環しているカニューレのバルク流れを通じて届ける。このペプチド組成物はマンニトール又は他のＢＢＢ分断薬を用いるＢＢＢの短時間の分断の後、代替的に投与することができる。このアプローチは患者の脳腫瘍にアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）を届けるために用いられている（６７）。
【０１６４】
更なる他の輸送方法は、嗅覚神経経路（軸策輸送）及び嗅覚上皮経路を介する鼻の輸送ルートを用いる。
【０１６５】
前述のように、診断方法は、通常、例えば、手術、放射線治療、又は化学的治療による、ＧＢＭ腫瘍の初期治療の後、ＢＴＩＣ及び／又はＨＩＧＣの病巣をイメージ化して行われる。標的細胞の視覚化における解像度、患者に投与された診断薬の投与量、又は投与経路により、意義のある診断結果が得られるまで、これらを変化させる。
【０１６６】
いずれの細胞タイプの病巣かを同定した後に、患者が治療形態でこのペプチドを用いて治療を行い、再発性細胞の集団をノックアウト又は減らす。この治療の間、減らされたＨＩＧＣ又はＢＴＩＣ集団の進行を本発明の診断方法で定期的にチェックして、必要ならば組成物の治療投与量を変更して、標的であるＨＩＧＣ又はＢＴＩＣの抑制又は崩壊の程度を高める。治療は、例えば、組成物を２週間に１度、又は１週間に１度投与して、所望の最終ポイントが観察されるまで続けることができる。
ＶＩＩ．スクリーニング方法
【０１６７】
ヒト多形グリオブラストーマ（ＧＢＭ）腫瘍の診断又は治療に有用なペプチド組成物を同定するためのスクリーニング方法、及びＨＩＧＣ及びＢＴＩＣの新しいサブタイプを同定するためのスクリーニング方法も開示される。
【０１６８】
ＧＢＭサブタイプをターゲティングすることができるペプチドを同定するための方法において、ファージ提示ライブラリーはヒトＧＢＭ細胞のサブタイプに特異的に結合するそれらの能力についてスクリーニングをした。このスクリーニングは（ｉ）自己複製し、外来の有糸分裂促進因子及び成長因子を添加せずに球を形成し、免疫不全マウスの脳においたときにｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍を誘発することができる、幹細胞様性質により特徴付けられる脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）及び（ｉｉ）細胞が注入された脳半球とは反対の脳半球へ転移する能力により特徴付けられるヒトＧＢＭ細胞の高浸潤グリオーマ細胞（ＨＩＧＣ）サブタイプを含む。
【０１６９】
初期のスクリーニングから同定されたペプチドは、これらの細胞を脳移植した動物において、ヒト悪性グリオブラストーマ細胞に関係しているサブタイプの細胞を局在化するそれらの能力について、更にスクリーニングを行い、ペプチドを同定した。これらのペプチドは同様に、この動物において、グリオブラストーマ腫瘍育成の進行をブロックするそれらの能力についてさらにスクリーニングを行った。そして、同定されたペプチドはヒトＧＢＭの診断又は治療に用いるか、又はヒトＧＢＭの診断又は治療のためのリード化合物として用いられる。
【０１７０】
既に報告したものを含めて、前述の方法で同定されたペプチドは、本発明の発明の側面に従って、これらの２つの細胞タイプの新しいサブポピュレーションを同定するために用いられる。ＢＴＩＣ細胞株の使用により開かれた新たなアプローチの道筋は、決定的な脳肝細胞マーカーが同定されたか否かという近年の議論から特に興味深い。他の分化した組織もＤＣ１３３を発現するが、元々説明されている幹細胞マーカーＤＣ１３３を有していないいくつかの株が依然として自己複製能力及び多機能性（２７）を有することが発見された。
【０１７１】
本発明のこの側面において、７Ａペプチド又は他のＢＴＩＣ結合ペプチド、例えば、傾向ラベルで標識され、幅広い細胞株において、例えば、Ｕ８７ＭＧ細胞株等の細胞又は新たなＧＢＭ患者から得られた細胞等のＧＢＭ腫瘍細胞のサブポピュレーションを証明するために用いる標準的な方法により行うことができる。洗浄の後、ラベルされた細胞は、例えば、ＦＡＣＳで単離され、ラベルされた細胞が、例えば、表面抗原組成物等で特徴付けされ、新しいＧＢＭサブタイプの可能性を同定する。新しいタイプは同様に、前述のスクリーニング方法をもちいて、このサブタイプに特異な新たなペプチドを同定することができる。
【０１７２】
以下で説明する実験方法は、定時的なものであり、特許請求範囲で定義される発明の範囲を限定するものではない。
ＶＩＩＩ．実施例の方法
【０１７３】
動物実験は全て、カルガリー大学の倫理学委員会及び動物療養所によって提供された稟議書に従って行われた。貯蔵されている患者サンプルからの脳腫瘍原始細胞の単離を含む、腫瘍及び正常組織は、アルバータ、カルガリー、Ｆｏｏｔｈｉｌｌｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの腫瘍組織バンクから得た。
Ａ．細胞培養
【０１７４】
ヒトグリオーマ細胞Ｕ８７はアメリカンタイプカルチャーコレクションから提供され、ＧＦＰ形質転換され、前述のようにＵ８７ＴとＵ８７Ｒサブポピュレーション［６］に分離されていた。ヒトグリオーマ細胞株Ｕ２５Ｎとヒト胎児正常細胞は、Ｖ．  Ｗ．  Ｙｏｎｇ  （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｇａｒｙ，  Ｃａｌｇａｒｙ，  Ａｌｂｅｒｔａ，  Ｃａｎａｄａ）から贈られた。全ての細胞は、１０％  熱失活ウシ血清  ［ＦＢＳ］，  ０．１  ｍＭ  非必須アミノ酸，  ２  ｍＭ  Ｌ−グルタミン，  １  ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、及び４００  μｇ／ｍｌのＧ４１８  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７°Ｃ  、湿度５％  のＣＯ２インキュベーター内で感染させた細胞で懸濁された、完全培地（ダルベッコ修飾イーグル培地［ＤＭＥＭ］）中で維持した。細胞を８０−９０％コンフルエンスでトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で収穫して。継代培養した。
【０１７５】
脳腫瘍原始細胞（ＢＴＩＣ）は、ＢＴＩＣ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより供給され、Ｄｒ．Ｊｏｈｎ  Ｋｅｌｌｙ［２８］により単離された後、Ｄｒｓ．Ｇｒｅｇ  ＣａｉｒｎｃｒｏｓｓとＳａｍｕｅｌ  Ｗｅｉｓｓにより維持され、Ｎｅｕｔｒｏ  Ｃｕｌｔ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内で神経半球として維持されているものである。ＢＴＩＣ２５を７Ａ陽性及び陰性集団へサブクローニングすることは、限界希釈法により行った。
Ｂ．バクテリオファージ培養
【０１７６】
Ｔｈｅ  Ｐｈ．Ｄ．ＴＭ−１２ファージ提示ペプチドライブラリーキット  （Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）  を取り扱い説明書のとおりに用いた。簡単に説明すると、ファージライブラリーを以下のように増幅した：バクテリア宿主株ＥＲ２７３８を一晩培養したものを２０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＬＢブロスで１／１００に希釈して、１０μＬのファージ（〜１０８  −  １０１０ｐｆｕ／μＬ）を接種して、３７℃で一晩振とう培養した。バクテリアをペレット状にして、１／６容量の２０％ｗ／ｖＰＥＧ−８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌを加えて上清からファージを沈殿させて、４℃で一晩貯蔵し、１００００ｘｇで１５分間延伸分離をした。ペレットはファージを含んでおり、ＰＢＳ中で戻された。精製されたファージをマウスの実験に用いる場合には、０．２２μｍのフィルターでろ過して用いた。
【０１７７】
ファージ力価は１０μＬの連続希釈されたファージと２００μＬのＥＲ２７３８を３ｍＬの５０℃に温められたＬＢ中７％アガロースに添加して、２０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、４０μｇ／ｍＬ  ＸＧａｌ、及び５０μｇ／ｍＬＩＰＴＧを含む温められたＬＢアガープレートに注いで決定した。３７℃で一晩培養した後、ブループラークをｐｆｕ／μＬの計算のためにカウントした。パスツールピペットを用いてアガロースプレートから単離されたプラークを除去して、１００μＬの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＳＯ４中のファージを４℃で一晩抽出して、プラークをサブクローンした。増幅培地は、前述の２０μＬの抽出緩衝液に接種した。
Ｃ．Ｕ８７Ｒ（浸潤グリオーマ）特異ペプチド配列のバイオパニング
【０１７８】
［６１］に記載のように、バイオパニングを行った。サブトラクション細胞（例えば、Ｕ８７Ｔ）をパックスＥＤＴＡを含む組織培養プラスチックから放出させて、ＰＢＳで洗浄した後、１ｘ１０７細胞を１．５ｘ１０１１ｐｆｕのＰｈ．Ｄ．−１２Ｍ１３ファージライブラリー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含むＰＢＳ中１％ＭＢＳＡに再懸濁させた。この細胞及びファージを緩やかに撹拌しながら、室温で１時間エッペンドルフチューブ内でインキュベーションし、細胞をペレット化して上清を維持する前に、細胞とファージをサブトラクション細胞の他の分割試料を含む新しいチューブに移した。インキュベーションと上清の移動を３回行い、移された上清は最後に空のチューブに移した。選択細胞はパックスＥＤＴＡを含む組織培養プラスチックから放出させて、ＰＢＳで洗浄した。５ｘ１０６細胞を３ｘサブトラクト上清中に再懸濁して、緩やか振とうしながら４℃で４時間インキュベーションした。この細胞ペレットをＰＢＳ中５ｘ冷蔵１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。各洗浄ごとに新しいチューブに移した。１ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含む１ｍＬの０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ２．２中で４℃で１０分間細胞を揺らして、結合ファージを溶出させ、上清を直ちに１５０μＬの１Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ９．１で中和した。最終的なライブラリーを取扱説明書に従って増幅した。
Ｄ．ＢＴＩＣ特異結合配列のバイオパニング
【０１７９】
ＢＴＩＣ特異ファージライブラリーをＵ８７Ｒライブラリーで説明したように生成した。今回は、Ｕ８７ＧＭ細胞、Ｕ２５１Ｎ細胞、及びヒト正常胎児星状細胞をバックグラウンドを補正するために用い、異なる患者からのＢＴＩＣ細胞株の混合物を選択のために用いた。細胞が接着していたら、ＥＤＴＡで放出させ、神経球のように育成した場合（例えば、ＢＴＩＣ）、小さい穴のピペットチップを用いたピペッティングを繰り返して１つ１つの細胞に分離した。特に定義しない限り、サブトラクティブバイオパニングと選択バイオパニングはＵ８７Ｒライブラリーについて説明したように行った。
Ｅ．全細胞ＥＬＩＳＡ
【０１８０】
１ｘ１０４試験細胞を２４ウェルディッシュのウェルの０．５ｍＬの培地中で平板培養し、通常の培養条件で平衡になるまで培養し、この培地をＨＥＰＥＳ緩衝培養培地に置き換えた。５ｘ１０９ｐｆｕファージをこのウェルに添加して、１時間室温で緩やかに振とうし、ＰＢＳで３回洗浄した。結合ファージを抗−Ｍ１３−ＨＲＰ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）  と、不溶性ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）で検出した。
Ｆ．トランスウェルアッセイ
【０１８１】
８μｍ穴サイズのトランスウェルインサートの膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）を脳様マトリクス（７２０μＬの３ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩ  （ＰｕｒｅＣｏｌ）；１８０μＬの１０ｘＤＭＥＭ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；９ｕＬの１ｍｇ／ｍＬヒトプラズマフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ）；９ｕＬの１ｍｇ／ｍＬ硫酸今度路インデューサーチンプロテオグリカン  （Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；１６μＬの０．１５ｍｇ／ｍＬ  ラミニン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））で両面をコートし、乾燥させて、容器上部で１００μＬの培地及び容器下部で５００μＬの培地中で５ｘ１０４細胞を平板培養した。コラーゲンの包含はＨ１０の抑制効果をみるために必要である（図Ｓ４）。３ｘ１０１０ｐｆｕの試験ファージを通常の培養条件下で４時間インキュベーションした細胞を含む上部チャンバーに添加した。インキュベーションの最後に、この培地を吸引して、細胞を固定して、９５％エタノール中１％クリスタルバイオレットで１分間染色した。トランスウェルをＰＢＳですすいで、その後上部膜表面の細胞を綿棒で除去した。膜の表面下に転移した細胞を香華組み合わせ顕微鏡を用いてカウントして、５つの顕微鏡視野における細胞の合計を各膜について記録した。
Ｇ．共焦点顕微鏡検査
【０１８２】
接着細胞：１３ｍｍカバーガラスを中和された３ｍｇ／ｍＬコラーゲンＩ（ＰｕｒｅＣｏｌ）でコートして、乾燥させて、１ｘ１０４／ｍＬの細胞を０．５ｍＬ容量で平板培養して、正常培養条件下で２０分間平衡化させた。カバーガラスを３％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳで１０分間固定して、洗浄して、その後２％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１：１０００に希釈したビオチン化ペプチド（３ｍＭストック）又は一次抗体中でインキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、カバーガラスを洗浄して、ＤＡＫＯマウンティング培地でマウントする前に、二次抗体又はストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ５６８を１：２５０で希釈したものを適用した。
【０１８３】
懸濁神経半球：５０μＬの高密度に懸濁された神経半球をエッペンドルフチューブ中で懸濁した以外は、前述のように染色した。この染色された神経半球をカバーガラスの下にＤＡＫＯマウンティング培地を滴下してマウントした。
Ｈ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏファージホーミング
【０１８４】
３ｘ１０４のＵ８７Ｔ又は１ｘ１０５のＵ８７Ｒ細胞をＳＣＩＤマウスの１つの脳半球に３μＬ注入して、４又は６週間育成した。特定の分子染色のために、ラベルされていない一次抗体、ＦＩＴＣ−トランスフェリン又はＡｌｅｘａ５５５−コレラトキシンＢサブユニット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１：１０００に希釈して、ビオチン化ペプチドの代わりに用いた。必要であれば、種特異蛍光ラベルされた二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：５００に希釈した。用いた一次抗体は抗−ｐ７５  細胞内ドメインｐＡｂ  （Ｐｒｏｍｅｇａ），  抗−ｐ７５  細胞外ドメインｍＡｂクローンＭＥ２０．４  （Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ），  及び抗−トランスフェリンレセプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んでいた。
Ｉ．スクロース／イオジキサノール勾配
【０１８５】
細胞を１ｍＬの０．２５Ｍスクロース、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の中にそぎ落とし、細胞が顕微鏡で見えなくなるまでホモジナイズした。細片を８００ｘｇで５分遠心分離してペレット化し、０．２５Ｍスクロース、１４０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、６０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含むＯｐｔｉＰｒｅｐ  （Ｓｉｇｍａ，  ６０％イオジキサノール）の勾配により作られた、１０ｍＬの１０−４０％の連続グラジエントのはじめに負荷した。勾配をスイングバスケットロター内で流し、０．５ｍＬの分画を収集した。総タンパク質を−２０℃の２０ｍＭＤＴＴ、１５％ＴＣＡ、の２容量を加えて沈殿させ、−２０℃で一晩貯蔵し、４℃で２０分間遠心分離した。ペットを２０μＬの１Ｍトリス及び２０μＬの２Ｘのレアミル緩衝液中に再懸濁した。全体の容量を１つのウェルに負荷させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析とウエスタントランスファーを行った。
Ｊ．Ｉｎ  ｖｉｖｏファージホーミング：
【０１８６】
３ｘ１０４のＵ８７Ｔ細胞、３ｘ１０５のＵ８７Ｒ細胞又は５ｘ１０４ＢＴＩＣをＳＣＩＤマウスの１つの脳半球に３μＬ注入して、４、６、又は１２週間それぞれ育成した。このマウスを麻酔して、頚動脈から脳へ５ｘ１０９ｐｆｕを注入する前に、１５分間２０％（ｗ／ｖ）の１５０μＬのマンニトールで処理した。１０分間ファージを循環させた後、右心房をクリップで閉じた後、左心室へ１５ｍＬのＰＢＳを注入して、循環システムから未結合ファージを洗浄除去した。脳を回収して、ドライアイス上で直ちに凍結して、ＯＣＴで切片を作るために包埋した。
Ｋ．免疫組織学
【０１８７】
連続切片を冷蔵アセトンで固定して、エタノール勾配を利用して脱水し、切片中の内生ペルオキシダーゼを０．０７５％Ｈ２Ｏ２／メタノールで失活させ、非特異結合をＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清でブロックした。この切片をブロック緩衝液中１：１００希釈したラビットポリクローナル抗−Ｍ１３−抗体（自家製）、又は１：５０希釈したマウスモノクローナル抗−ヒト細胞核（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）  でインキュベーションした。ＰＢＳ洗浄に続いて、適当なビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ．ｃｏｍ）  を適応した。アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体をＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮＥｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ  （Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて形成して、ペルオキシダーゼにより茶色反応性生物になるＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＤＡＢ  （３，３９−ジアミノベンンジジエンテトラヒドロクロリド）  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して検出した。トルイジンブルー（凍結切片のための）を核対比染色として用いた。切片はその後、連続的にエタノールキシレンで脱水して、エンテラン（Ｅｎｔｅｌｌａｎ）  （Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓでマウントした。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２ＢＣ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ＡＢ】
0005932658.tif 000016
【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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