(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウドンコ病抵抗性付与遺伝子であって、該ウドンコ病抵抗性付与遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と９９％超の同一性を有するアミノ酸配列であり、かつ、該ウドンコ病抵抗性付与遺伝子は、配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする遺伝子が損傷していることによって、ウドンコ病に対する抵抗性を付与する、ウドンコ病抵抗性付与遺伝子。
【請求項２】
ウドンコ病抵抗性付与遺伝子であって、該ウドンコ病抵抗性付与遺伝子から転写されるｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ配列が、配列番号１および配列番号３からなる群から選択されるｃＤＮＡ配列と９９％超の同一性を有するｃＤＮＡ配列であり、かつ、該ウドンコ病抵抗性付与遺伝子は、配列番号１および配列番号３からなる群から選択されるｃＤＮＡ配列が損傷していることによって、ウドンコ病に対する抵抗性を付与する、ウドンコ病抵抗性付与遺伝子。
【請求項３】
前記損傷が、タンパク質発現産物の非存在をもたらす、前記遺伝子における１つまたは複数の変異である、請求項１または請求項２に記載のウドンコ病抵抗性付与遺伝子。
【請求項４】
前記損傷が、非機能性タンパク質発現産物をもたらす、前記遺伝子における１つまたは複数の変異である、請求項１または請求項２に記載のウドンコ病抵抗性付与遺伝子。
【請求項５】
前記損傷が、遺伝子サイレンシングである、請求項１または請求項２に記載のウドンコ病抵抗性付与遺伝子。
【請求項６】
メロンから得られるものである、請求項１〜５のいずれかに記載のウドンコ病抵抗性付与遺伝子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のウドンコ病抵抗性付与遺伝子をそのゲノム内に含むメロン植物であって、該ウドンコ病抵抗性付与遺伝子は損傷を有しており、前記損傷がウドンコ病抵抗性をもたらすものである、メロン植物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のウドンコ病抵抗性付与遺伝子をそのゲノム内に含む、請求項７に記載の植物の種子、植物部分または繁殖材料であって、該ウドンコ病抵抗性付与遺伝子は損傷を有しており、前記損傷が前記植物におけるウドンコ病抵抗性をもたらすものである、種子、植物部分または繁殖材料。
【請求項９】
配列番号１および配列番号３からなる群から選択されるｃＤＮＡ配列と９９％超の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ、配列番号１および配列番号３からなる群から選択されるｃＤＮＡ配列が損傷していることによってウドンコ病に対する抵抗性を付与するヌクレオチド配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と９９％超の同一性を有するアミノ酸配列であり、かつ、配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列のタンパク質をコードする遺伝子が損傷していることによってウドンコ病に対する抵抗性を付与するアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
ウドンコ病抵抗性のメロン植物を提供するための、請求項１〜６のいずれかに記載のウドンコ病抵抗性付与遺伝子、請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド、または請求項１０に記載の単離されたポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ）のウドンコ病抵抗性提供遺伝子に関する。ここでは、前記抵抗性は、発現またはタンパク質段階での本発明遺伝子の損傷(impairment)によって提供される。さらに、本発明は、本発明の抵抗性付与遺伝子を含む植物、およびその種子、胚、または他の繁殖材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウドンコ病（ＰＭ）は、メロンなどのウリ科に属する植物において知られている、露地と温室との両方における主な菌類病の１つである。
【０００３】
ウドンコ病は一般に、ウドンコカビ目の多くの異なる種の菌類によって引き起こされる。この病気は、葉および茎上の白色の粉様斑点などの特有の徴候を特徴とする。一般に、下部の葉が最も影響を受けるが、ウドンコカビは、植物の、地上に露出したどの部分にも出現し得る。この病気が進行するにつれて、莫大な数の胞子が生じて、斑点は大きく厚くなり、ウドンコカビは、植物の全長の上から下、例えば茎、さらには果実へと広がる。
【０００４】
深刻な影響を受けた葉は、乾燥して砕けやすくなる、あるいは萎びて枯れる可能性がある。感染が原因で、果実は、サイズの縮小、数の減少、貯蔵性が十分である可能性の低さ、日焼け、成熟不十分、および風味不良の可能性がある。この病気はまた、植物を、他の病原体の影響を受けやすくする可能性がある。最終的には、植物は枯死する可能性がある。
【０００５】
ウドンコ病は、数ある中でも特に、菌類Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ（最近Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｘａｎｔｈｉｉと改名され、Ｏｉｄｉｕｍ  ｅｒｙｓｉｐｈｏｉｄｅｓとも称される）および／またはＥｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ  ＤＣ（最近Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍと改名され、Ｏｉｄｉｕｍ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉとも称される）によって引き起こされる可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
メロンなどのキュウリ属植物種の経済的重要性を考慮すると、ウドンコ病抵抗性提供遺伝子を提供する、引き続いての必要性が、当技術分野において存在する。
【０００７】
当技術分野の上述の必要性を考慮すると、本発明の一目的は、特に、この必要性を満たすことである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、いくつかの目的の中でも特に、この目的は、添付の請求項１で定義されるウドンコ病抵抗性付与遺伝子によって達成される。
【０００９】
具体的には、いくつかの目的の中でも特に、本発明のこの目的は、該抵抗性付与遺伝子によってコードされるアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の（例えば９６％超、９７％超、９８％超、９９％超の）同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択され、かつ、該抵抗性付与遺伝子が損傷している(impaired)ウドンコ病抵抗性付与遺伝子によって達成される。
【００１０】
いくつかの目的の中でも特に、本発明の目的は、該抵抗性付与遺伝子から転写されるｃＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の（例えば９６％超、９７％超、９８％超、９９％超の）同一性を有するｃＤＮＡ配列からなる群から選択され、かつ、該抵抗性付与遺伝子が損傷しているウドンコ病抵抗性付与遺伝子によって、さらに達成される。
【００１１】
本発明による損傷した抵抗性付与遺伝子は、ウドンコカビ目に属する菌類、例えばＳｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ（最近Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｘａｎｔｈｉｉと改名され、Ｏｉｄｉｕｍ  ｅｒｙｓｉｐｈｏｉｄｅｓとも称される）および／またはＥｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ  ＤＣなどの、葉および茎上の白色の粉様斑点によって示される菌類によって引き起こされるウドンコ病に対する、感受性の低下、さらには喪失を提供する遺伝子を示すことが意図される。
【００１２】
本発明による損傷した抵抗性付与遺伝子は、変異遺伝子である。本発明の遺伝子の変異は、様々な機構を介して、損傷をもたらすことができる。例えば、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の変異は、変異した、短縮された、または非機能性のタンパク質をもたらすことができる。非コードＤＮＡ配列の変異は、選択的スプライシング、翻訳、またはタンパク質輸送を引き起こすことができる。あるいは、タンパク質への翻訳に利用可能なｍＲＮＡの量を決定する、遺伝子の転写活性の変化をもたらす変異は、低レベルのタンパク質またはタンパク質の非存在をもたらすことができる。さらに、遺伝子機能の損傷は、翻訳後、すなわちタンパク質段階で引き起こすことができる。
【００１３】
本発明による損傷はまた、本明細書で提供する配列番号と比較して、タンパク質段階で変異している遺伝子を含むメロン植物におけるウドンコ病抵抗性を観察すること、あるいは、本明細書で提供する配列番号の発現が認められないことによって示される。
【００１４】
損傷はまた、本明細書では、非機能性遺伝子またはタンパク質として示される。本発明の遺伝子の機能は、まだ特定されていないが、非機能性遺伝子またはタンパク質は、植物におけるウドンコ病抵抗性（非機能性）またはウドンコ病感受性（機能性）を確かめることによって容易に決定することができる。ウドンコ病抵抗性（非機能性）植物は、本明細書で提供する配列番号と比較してタンパク質段階で変異している遺伝子を含むこと、あるいは、本明細書で提供する配列番号の発現が認められないことによって示される。
【００１５】
機能性および非機能性の遺伝子またはタンパク質は、相補性実験を使用して決定することもできる。例えば、本発明の遺伝子またはタンパク質のいずれかを用いてウドンコ病抵抗性のメロン植物を形質転換することは、遺伝子またはタンパク質が機能性である場合にはウドンコ病感受性のメロン植物をもたらすことになるのに対し、遺伝子またはタンパク質が非機能性である場合には、メロン植物は、抵抗性のままとなる。
【００１６】
本発明によれば、本発明のウドンコ病抵抗性付与遺伝子は、本発明の遺伝子が損傷した場合に、ウドンコ病抵抗性を提供する。本発明による損傷は、本明細書で配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４として特定される、機能性または非変異タンパク質の非存在または減少によって示すことができる。当技術分野では、転写段階、翻訳段階、またはタンパク質段階で遺伝子の損傷をもたらす、多くの機構が知られている。
【００１７】
例えば、転写段階での損傷は、プロモーター、エンハンサー、および開始、終止、またはイントロンスプライシング配列などの転写調節配列における１つまたは複数の変異の結果であり得る。これらの配列は一般に、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３によって表されるコード配列の５’、３’または内部に位置する。損傷はまた、本発明の遺伝子の欠失、再編成、または挿入によって提供することもできる。
【００１８】
翻訳段階での損傷は、未成熟終止コドンまたは他のＲＮＡ→タンパク質制御機構（スプライシングなど）、あるいは、例えばタンパク質フォールディングもしくは細胞内輸送に影響を与える翻訳後修飾によって提供することができる。
【００１９】
タンパク質段階での損傷は、タンパク質の短縮、タンパク質のミスフォールド、またはタンパク質−タンパク質相互作用の妨害によって提供することができる。
【００２０】
根本的な機構にかかわらず、本発明による損傷は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４による機能性タンパク質の減少または非存在によって示される。
【００２１】
好ましい実施形態によれば、本発明による損傷は、タンパク質発現産物の非存在をもたらす、本発明の遺伝子における１つまたは複数の変異によって提供される。示した通り、こうした変異は、転写または翻訳段階での不完全な発現を引き起こす可能性がある。
【００２２】
別の好ましい実施形態によれば、本発明による損傷は、非機能性タンパク質発現産物をもたらす、本発明の遺伝子における１つまたは複数の変異によって引き起こされる。非機能性タンパク質発現産物は、例えば、未成熟終止コドン、誤った翻訳もしくは翻訳後プロセシングによって、または挿入、欠失、もしくはアミノ酸変化によって、もたらすことができる。
【００２３】
本発明の遺伝子の損傷はまた、分子生物学的方法を使用して、例えばｓｉＲＮＡを使用する遺伝子サイレンシングまたは本発明の遺伝子のノックアウトによって実現することもできる。核酸を他のヌクレオチドにランダムに変化させることが可能なＥＭＳまたは他の変異原性化学物質に基づく方法も、本発明の文脈内であると意図される。こうした変異の検出は一般に、高感度融解曲線分析またはヌクレオチド配列決定に基づくＴＩＬＬＩＮＧ手順を含む。
【００２４】
本発明は、ヌクレオチド段階またはアミノ酸段階で、７０％超、好ましくは８０％超、より好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超の配列同一性を有するヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関する。
【００２５】
配列同一性は、本明細書では、本発明の配列の完全長に対して同一の連続的に並んだヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、本発明の配列の全長のヌクレオチドまたはアミノ酸の数で割り、１００％を掛けたものと定義される。
【００２６】
例えば、配列番号１に対して８０％の同一性を有する配列は、配列番号１の１７１３ヌクレオチドの全長に対して１３７０または１３７１の同一の連続的に並んだヌクレオチドを含む（すなわち、１３７０または１３７１／１７１３＊１００％＝８０％）。
【００２７】
本発明によれば、本発明の遺伝子は、メロンから得られる。
【００２８】
別の実施態様によれば、本発明は、そのゲノム内に本発明の損傷したウドンコ病抵抗性付与遺伝子を含む、すなわち、植物が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される機能性タンパク質を発現しないメロン植物に関する。
【００２９】
一般に、好ましくは、本発明の植物は、本発明の損傷した遺伝子についてホモ接合となる、すなわち、該抵抗性付与遺伝子から転写されるｃＤＮＡ配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するｃＤＮＡ配列からなる群から選択される、２つの損傷したウドンコ病抵抗性付与遺伝子を含むこととなる。
【００３０】
本発明の植物の利益、すなわち、メロン植物におけるウドンコ病抵抗性を提供することを考慮すると、本発明はまた、１つまたは複数の本発明のウドンコ病抵抗性付与遺伝子、すなわち、損傷したウドンコ病抵抗性付与遺伝子（ここでは、前記抵抗性付与遺伝子から転写されるｃＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するｃＤＮＡ配列からなる群から選択される）を含む、種子、植物部分、または繁殖材料を含む本発明のウドンコ病抵抗性のメロン植物を提供することが可能な、種子、植物部分、または繁殖材料に関する。
【００３１】
さらに別の実施態様によれば、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択される、単離されたヌクレオチド配列に関する。
【００３２】
さらに別の実施態様によれば、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４、ならびに７０％超の同一性、好ましくは８０％超の同一性、より好ましくは９０％超の同一性、最も好ましくは９５％超の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、単離されたアミノ酸配列に関する。
【００３３】
本発明はまた、ウドンコ病抵抗性のメロン植物を提供するための、１つまたは複数の本発明のウドンコ病抵抗性付与遺伝子、１つまたは複数の本発明の単離されたヌクレオチド配列、または１つまたは複数の本発明の単離されたアミノ酸配列の使用に関する。示した通り、本発明の使用は、発現段階またはタンパク質段階での本発明に記載する遺伝子の損傷に基づくものであり、また、ウドンコ病抵抗性の存在または非存在の決定と任意に組み合わせて、かつ／または、相補性試験と組み合わせて、本発明で提供されるｃＤＮＡおよびアミノ酸配列によって容易に決定することができる。
【００３４】
本発明を、本発明の好ましい実施形態の以下の実施例において、さらに説明することとする。実施例では、以下のような図に関して言及する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ウドンコ病感受性経路に関する機能獲得をもたらす３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ１＿ｃＤＮＡ（３５Ｓ：：ＣｍＭｌｏ１＿ｃＤＮＡと称される）についての相補性試験の結果を示す図である。接種の１２日後の、罹病した葉面積の割合を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型（ＷＴ）、Ａｔｍｌｏ２／６、およびＡｔｍｌｏ２／６／１２変異体について示し、データは、２つの個体の平均±標準偏差を表す。Ａｔｍｌｏ２＋３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ１＿ｃＤＮＡ、Ａｔｍｌｏ２／６＋３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ１＿ｃＤＮＡ、およびＡｔｍｌｏ２／６／１２＋３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ１＿ｃＤＮＡについては、データは、それぞれ４、４、および９つの一次形質転換体の平均±標準偏差を表す。
【図２】ウドンコ病感受性経路に関する機能獲得をもたらす３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ１＿ｃＤＮＡ（３５Ｓ：：ＣｍＭｌｏ１＿ｃＤＮＡと称される）についての相補性試験の結果を示す図である。Ａｔｍｌｏ２／６およびＡｔｍｌｏ２／６／１２変異体について、また、一次形質転換体Ａｔｍｌｏ２＋３５Ｓ：：３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ１＿ｃＤＮＡ、Ａｔｍｌｏ２／６＋３５Ｓ：：３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ１＿ｃＤＮＡ、およびＡｔｍｌｏ２／６／１２＋３５Ｓ：：３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ１＿ｃＤＮＡについて観察された抵抗性のレベルを、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型（ＷＴ）の表現型と比較して表す。
【図３】Ａｔｍｌｏ２／６／１２と、ウドンコ病感受性経路に関する機能獲得をもたらす３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ２＿ｃＤＮＡとの相補を示す図である。（Ａ）野生型Ｃｏｌｕｍｂｉａの葉上のＧ．ｏｒｏｎｔｉｉの感受性の相互作用表現型；透明な菌糸および分生子柄の発達。（Ｂ）Ａｔｍｌｏ２／６／１２の葉上のＧ．ｏｒｏｎｔｉｉの抵抗性の相互作用表現型；葉表面上の胞子は発芽したが、さらなる発育は観察されない。（Ｃ、Ｄ、Ｅ）３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ２＿ｃＤＮＡとの相補の後にＡｔｍｌｏ２／６／１２上で観察される中間の相互作用表現型；いくつかの一次形質転換体上では、発芽した胞子がさらに発育することはなく（Ｃ）、他の一次形質転換体上では、胞子の発芽が観察され、菌糸は発育し、分生子柄が形成される（Ｄ，Ｅ）。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（実施例）
（実施例１  シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）Ａｔｍｌｏ変異体植物の相補）
（材料および方法）
メロンＣｍＫＩＰ遺伝子の完全長ｃＤＮＡを、標準のクローニング技術を使用して、ｐＢＩＮＰＬＵＳまたはＧａｔｅｗａｙベクターで、３５Ｓプロモーターの制御下でクローン化した。
【００３７】
同定されたメロンウドンコ病抵抗性遺伝子の植物体における機能を分析するために、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、Ｓｕｔｔｏｎ  Ｂｏｎｉｎｇｔｏｎ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＬＥ１２  ５ＲＤ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ、ｈｔｔｐ：／／Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｉｎｆｏ／）を介して、シロイヌナズナ生態型(ecotype)Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ）変異体系統ＮＡＣＳ  ＩＤ  Ｎ９７０７（ｍｌｏ２−５単一変異体）、Ｎ９７１０（ｍｌｏ２−５、ｍｌｏ６−２二重変異体）、およびＮ９７１５（ｍｌｏ２−５、ｍｌｏ６−２、ｍｌｏ１２−１三重変異体）の種子を入手した。
【００３８】
これらの種子を、土壌で栽培し、ＤＮＡを抽出し、変異に隣接するプライマー（表１）を用いるＰＣＲアッセイを使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＴＡＩＲ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）に記載されている変異の存在について第４週の植物を選別した。
【表１】
0006035253.tif 000002
【００３９】
フローラルディップ法を使用して、推定上のメロンＭｌｏオルソログを含む構築物を用いて、シロイヌナズナ生態型Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ならびに単一、二重、および三重変異体を形質転換させた。カナマイシン上での形質転換体植物の選択後、ウドンコ病（Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｏｎｔｉｉ）感染に対する抵抗性の表現型と感受性の表現型を特定するために、分析を実施した。
【００４０】
Ｒ．Ｐａｎｓｔｒｕｇａ博士（ＭＰＩ社、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｏｎｔｉｉを感染させたシロイヌナズナ生態型Ｃｏｌｕｍｂｉａの葉を快く提供してくれた。新たに成長するＧｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｏｎｔｉｉの培養を維持するために、胞子形成をしているＧｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｏｎｔｉｉを伴う葉を、１０〜１４日おきに使用して、新しいシロイヌナズナ生態型Ｃｏｌｕｍｂｉａの葉に擦り付けて感染させた。さらに、メロンＭｌｏ候補遺伝子で相補させた、ｍｌｏの単一、二重、および三重変異体、ならびにこれらの子孫に、ウドンコ病感受性レベルを確認するために、胞子形成をしているＧｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｏｎｔｉｉを植え付けた。
【００４１】
（結果）
同定されたＣｍＫＩＰ遺伝子の、ウドンコ病に対する感受性への予測していた関与を確認するために、ＣｍＫＩＰ１、ＣｍＫＩＰ２、ＣｍＫＩＰ３、およびＣｍＫＩＰ４の完全長ｃＤＮＡ配列を、ユビキタス３５Ｓプロモーターを使用して、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）内で発現させた。さらに、完全長ゲノムフラグメントも、３５Ｓプロモーターを使用して、ＣｍＫＩＰ２について発現させた。
【００４２】
３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ１＿ｃＤＮＡ、３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ２＿ｃＤＮＡ、３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ２＿ゲノム、３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ３＿ｃＤＮＡ、および３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ４＿ｃＤＮＡ構築物を、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）変異体系統ＮＡＣＳ  ＩＤ  Ｎ９７０７（ｍｌｏ２−５単一変異体）、Ｎ９７１０（ｍｌｏ２−５、ｍｌｏ６−２二重変異体）、およびＮ９７１５（ｍｌｏ２−５、ｍｌｏ６−２、ｍｌｏ１２−１三重変異体）に形質転換させた。さらに、シロイヌナズナにおけるＣｍＫＩＰ過剰発現の上位性効果を試験するために、野生型Ｃｏｌｕｍｂｉａ植物も、同じシリーズの構築物を用いて形質転換させた。
【００４３】
図１および図２は、３５Ｓ：：ＫＩＰ１＿ｃＤＮＡ構築物に関する相補性試験に関して得られる結果を示す。シロイヌナズナ変異体Ａｔｍｌｏ２は、野生型Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ−０）と比較して、感受性の低下を示す（データは示していない）。二重変異体Ａｔｍｌｏ２／６は、Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｏｎｔｉｉに対する感受性が、さらに低下する。三重変異体Ａｔｍｌｏ２／６／１２は、Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｏｎｔｉｉ感染に対して完全に抵抗性である。
【００４４】
３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ１＿ｃＤＮＡ構築物を用いる一次形質転換体Ａｔｍｌｏ２／６／１２は、Ａｔｍｌｏ２／６二重変異体と比較すると、Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｏｎｔｉｉ感染に対する感受性を、感受性の水準で保持していた。シロイヌナズナのＡｔｍｌｏ２／６二重変異体と、３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ１構築物との相補は、Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｏｎｔｉｉの感染の、野生型に近い水準を有する植物をもたらした。
【００４５】
胞子形成をしている菌糸をもたらす菌の急速かつ強力な発育が検出された。シロイヌナズナのＡｔｍｌｏ２／６／１２三重変異体と、３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ１＿ｃＤＮＡ構築物との相補は、分析された一次形質転換体のほとんどについて、植え付けられた葉上の明確な視認できるウドンコ病感染をもたらした。Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｏｎｔｉｉに対して十分に抵抗性であるとあらかじめ示されているシロイヌナズナ三重変異体の、Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｏｎｔｉｉに対する感受性を保持することは、同定されたＣｍＫＩＰ１遺伝子が、シロイヌナズナにおけるウドンコ病感受性経路を回復させることが可能であることを示唆している。この結果、本発明者らは、本発明者らが、ＣｍＫＩＰ１、すなわち、ウドンコ病感受性経路における機能性遺伝子を同定することができたことを示した。
【００４６】
図３は、３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ２＿ｃＤＮＡ構築物についての相補性試験で得られた結果を示す。Ａｔｍｌｏ２／６／１２と、３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ２  ｃＤＮＡ構築物との一次形質転換体は、少数例では、Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｏｎｔｉｉ感染に対するわずかな感受性徴候を保持する。しかし、この感受性は、目で検出することは難しく、また、すべての一次形質転換体が、この弱い感受性表現型を示すとは限らない。Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｏｎｔｉｉの発育を、より詳細に研究するために、顕微鏡による研究を実施した。
【００４７】
葉を、７０％のＥｔＯＨ中で４８時間洗浄し、ＣＢＢで染色した。この顕微鏡による選別で、ウドンコ病抵抗性のＡｔＭｌｏ２／６／１２変異体系統と、３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ２＿ｃＤＮＡで相補させたこの系統との間に、明らかな相違が認められた。
【００４８】
分析された相補系統の中では、いくつかは、葉における菌糸の明確な発育を示したのに対し、三重変異体上の胞子の発芽はすべて、葉への侵入後、直ちに停止した。３５Ｓ：：ＣｍＫＩＰ２＿ｃＤＮＡ相補系統では、菌糸の明確な発育が検出され、これは、ＣｍＫＩＰ２遺伝子が、シロイヌナズナにおけるウドンコ病感受性経路を回復させることが可能であることを示唆していた。
【００４９】
ＣｍＫＩＰ３過剰発現構築物についても、これと同等の結果、すなわちシロイヌナズナにおける相補性が認められた。
【表２】
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【００５０】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【配列表】
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