(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡのループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）をモニタリングする方法であって：
同化プローブ及びＤＮＡポリメラーゼをＬＡＭＰ反応混合物と接触させる工程［ここでＬＡＭＰ反応混合物は標的ＤＮＡ及び該標的ＤＮＡとハイブリダイズする１つ又はそれ以上のＬＡＭＰプライマーを含み、
ここで該同化プローブは第一及び第二のオリゴヌクレオチド鎖を含み、ここで第一のオリゴヌクレオチド鎖は３’末端にクエンチャープローブを含み、そしてここで同化プローブの第二のオリゴヌクレオチド鎖は５’末端にフルオロフォアを含み；
ここで第一のオリゴヌクレオチド鎖の量に対する第二のオリゴヌクレオチド鎖の量の比は、１：１未満であり；
第一のオリゴヌクレオチド鎖の量が、０.０２〜０.８μＭの範囲内であり；
第二のオリゴヌクレオチド鎖の量が、０.０１μＭ〜０.４μＭの範囲内である］；及び
同化プローブ及びＤＮＡポリメラーゼと接触させたＬＡＭＰ反応混合物により放射される蛍光を測定する工程；
を含む、上記方法。
【請求項２】
クエンチャーが、ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭＲＡ又はブラックホールクエンチャーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フルオロフォアが、フルオレセイン、ｃｙ３、ｃｙ５又は１つ若しくはそれ以上の量子ドットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第一のオリゴヌクレオチド鎖及び第二のオリゴヌクレオチド鎖が、互いにハイブリダイズしていない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡポリメラーゼの濃度が、８Ｕに等しいか又はそれより高い、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的ＤＮＡが、バクテリオファージラムダ、青枯病菌のｒａｃｅ３ｂｉｏｖａｒ２株、青枯病菌、サルモネラ菌又は黄色ブドウ球菌からのＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標的ＤＮＡのループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）をモニタリングするための同化プローブであって：
第一のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端にクエンチャープローブを含む第一のオリゴヌクレオチド鎖；及び
第二のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端にフルオロフォアを含む第二のオリゴヌクレオチド鎖；
を含み、
ここで第一のオリゴヌクレオチド鎖に対する第二のオリゴヌクレオチド鎖の量の比は１：１未満であり；
第一のオリゴヌクレオチド鎖の量が、０.０２〜０.８μＭの範囲内であり；
第二のオリゴヌクレオチド鎖の量が、０.０１μＭ〜０.４μＭの範囲内である、
上記同化プローブ。
【請求項８】
フルオロフォアが、フルオレセイン、ｃｙ３、ｃｙ５又は１つ若しくはそれ以上の量子ドットを含む、請求項７に記載のプローブ。
【請求項９】
クエンチャーが、ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭＲＡ又はブラックホールクエンチャーを含む、請求項７に記載のプローブ。
【請求項１０】
第一のオリゴヌクレオチド鎖及び第二のオリゴヌクレオチド鎖が、互いにハイブリダイズしていない、請求項７に記載のプローブ。
【請求項１１】
第二のオリゴヌクレオチド鎖が、第一のオリゴヌクレオチド鎖に相補的でないオーバーハングした非対応部分を含む、請求項７に記載のプローブ。
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼをＬＡＭＰ反応混合物と接触させる前に、同化プローブをＬＡＭＰ反応混合物と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡポリメラーゼを、同化プローブを含むＬＡＭＰ反応混合物と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
標的ＤＮＡの存在又は不存在を検出する方法であって：
同化プローブ及びＤＮＡポリメラーゼをＬＡＭＰ反応混合物と接触させる工程［ここでＬＡＭＰ反応混合物は、標的ＤＮＡの存在を調べるためのサンプル及び該標的ＤＮＡを増幅できる１つ又はそれ以上のＬＡＭＰプライマーを含み、
ここで該同化プローブは第一及び第二のオリゴヌクレオチド鎖を含み、ここで第一のオリゴヌクレオチド鎖は３’末端にクエンチャープローブを含み、そしてここで同化プローブの第二のオリゴヌクレオチド鎖は５’末端にフルオロフォアを含み；
ここで第一のオリゴヌクレオチド鎖の量に対する第二のオリゴヌクレオチド鎖の量の比は、１：１未満であり；
第一のオリゴヌクレオチド鎖の量が、０.０２〜０.８μＭの範囲内であり；
第二のオリゴヌクレオチド鎖の量が、０.０１μＭ〜０.４μＭの範囲内である］；及び
標的ＤＮＡの存在又は不存在を検出する工程；
を含む、上記方法。
【請求項１５】
検出が、同化プローブ及びＤＮＡポリメラーゼと接触させたＬＡＭＰ反応混合物により放射される蛍光を測定する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
異なった標的ＤＮＡの存在又は不存在を同時に検出する工程［ここで、該標的ＤＮＡを増幅できる１つ又はそれ以上のＬＡＭＰプライマーが異なった標的ＤＮＡを増幅でき、ここで複数の同化プローブをＬＡＭＰ反応混合物と接触させる］
を含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６１／３５７，４２８号（表題「ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＳＰＥＣＩＦＩＣ  ＲＥＡＬ−ＴＩＭＥ  ＭＯＮＩＴＯＲＩＮＧ  ＯＦ  ＬＯＯＰ−ＭＥＤＩＡＴＥＤ  ＩＳＯＴＨＥＲＭＡＬ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（ＬＡＭＰ）」、２０１０年６月２２日出願）に対して優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に加入され、そして本明細書の一部とみなされるべきである。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、助成番号２００６−５５６０５−１６６８３及び０７−５５６０５−１７８４３で政府支援を受けて行われ、そして米国農務省（ＵＳＤＡ−ＮＲＩ）により認められたプロジェクトＨＡＷ００５５９−０４Ｇであった。政府は本発明に所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
病原性細菌は、植物、動物、及びヒトにおいて病害を引き起こし得る細菌である。病原性細菌の多様性のために、多種多様な病原性細菌及び付随する病害が存在する。これらの病害の例としては、植物における立ち枯れ病、軟腐病、及び胴枯れ病、イヌにおけるパルボウイルス、ジアルジア（ｇｉａｒｄｉａ）、及びロッキー山紅斑熱、並びにヒトにおける結核、肺炎、及び破傷風が挙げられる。
【０００４】
細菌性病原体により引き起こされる病害は、資産及び生命に深刻な被害を生じ得る。例えば、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）は、２００を超える植物種において立ち枯れ病を引き起こす細菌性病原体である。主にジャガイモ作物に影響を及ぼすこの病原体のうちの１つの種ｒａｃｅ３ｂｉｏｖａｒ２は、毎年約９億５千万ドルを超える損害を生じると見積もられている。
【０００５】
細菌性病害の伝染を減速及び防止することは、最初に病原性細菌の存在を同定することを含む。しかし、病原性細菌の検出技術は比較的遅いかもしれない。さらに、これらの技術は、細菌性病原体の選択された種を他の種と区別することができないかもしれない。生物学的病原体を正確に同定することができないことの結果として、蔓延を封じ込めて根絶するための行動が極度に遅れるかもしれない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、選択された病原体株を迅速に検出し、そして選択された病原体株の亜集団を同じ種内の他の集団と区別することができる検出技術を開発することに大いに興味が持たれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
一局面において、標的ＤＮＡのループ媒介性等温増幅（ＬＯＯＰ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＡＭＰ）をモニタリングする方法が提供される。本方法は、一般的に、標的ＤＮＡ、及び標的ＤＮＡを増幅することができる１つ又はそれ以上のＬＡＭＰプライマーを含むＬＡＭＰ反応混合物を供給することを含む。同化（ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｎｇ）プローブがＬＡＭＰ反応混合物に加えられ得、ここでこの同化プローブは２つのオリゴヌクレオチド鎖を含み、第一のオリゴヌクレオチド鎖は３’末端に位置するクエンチャープローブを含み、そして同化プローブの第二のオリゴヌクレオチド鎖は、５’末端に結合されたフルオロフォアを含む。ＬＡＭＰ反応混合物に加えられる第一のオリゴヌクレオチド鎖の量に対する第二のオリゴヌクレオチド鎖の量の比は、１：１未満であり得る。ＤＮＡポリメラーゼを、同化プローブを含むＬＡＭＰ反応混合物に加えてもよい。同化プローブ及びＤＮＡポリメラーゼを含むＬＡＭＰ反応混合物により発せられる蛍光を測定することができる。
【０００８】
別の局面において、標的ＤＮＡのループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）をモニタリングするための同化プローブが提供される。プローブは典型的に、その鎖の３’末端に位置するクエンチャープローブを含む第一のオリゴヌクレオチド鎖を含む。いくつかの実施態様において、プローブは、その鎖の５’末端に結合されたフルオロフォアを含む第二のオリゴヌクレオチド鎖を含む。さらに、いくつかの実施態様において、第一のオリゴヌクレオチド鎖に対する第二のオリゴヌクレオチド鎖の量の比は１：１未満であり得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】温度制御のためのレーザードライバー及びハイブリダイゼーションプローブのモニタリングのための蛍光光度計の回路の略図である。
【図２】ＣＤベースのプラットフォームにおける放射源の略図である。
【図３】図３Ａは、本開示の実施態様のカスタムの蛍光光度計及びレーザードライバーのための回路基板レイアウトの略図である；図３Ｂは、図３Ａのカスタムの蛍光光度計及びレーザードライバーのために装着された回路基板の光学写真である。パイロメーターヘッドがポリカーボネートＣＤ上にさらに示されている。
【図４】様々なサイズの反応ウェルを有するＡＢＳにおいてプリントされたＣＤの光学写真である。
【図５】熱電対により測定された実際のウェル温度と比較した、非接触温度計（例えばパイロメーター）から見積もられた補正したウェル温度のプロットである。ウェルを通る放射の透過及びウェル表面からの周囲放射の反射に関する係数を見積もるために使用された較正データを挿入図に示す。
【図６】周囲温度付近から約６５℃の設定点までの反応ウェルにおける温度制御を示す温度測定値のプロットである。
【図７】約０．４μＭの分子ジッパーを用いたｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰについての時間に対する相対的蛍光のプロットである。
【図８】分子ジッパー構造の形成前にＬＡＭＰ反応混合物に蛍光鎖及びクエンチャー鎖を直接加えることによる、ｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応の実時間モニタリングを示す、時間に対する相対的蛍光のプロットである。
【図９】ｒｓｆｌｉＣ標的化同化プローブ（０．０８μＭの蛍光鎖及び０．１６μＭのクエンチャー鎖）を用いたｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ及びラムダファージＬＡＭＰについての時間に対する相対的蛍光のプロットである。
【図１０】ｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ増幅の終点検出のための分子ビーコン及びｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応の速度観測の使用を示す、時間に対する相対的蛍光のプロットである。
【図１１】増加する濃度のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせてｒｋ２２０８．１及びｒｓｆｌｉＣプライマーセットを使用した場合に測定された蛍光を示す、時間に対する相対的蛍光のプロットである。
【図１２】増加する濃度のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてｒｋ２２０８．１プライマーセットを使用して得られた観察可能な蛍光増加を示す、時間に対する相対的蛍光のプロットである。
【図１３】図１２からのデータにおける、検出閾値に到達するまでの時間対Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ含有量のプロットである。
【図１４】同化プローブを用いてモニタリングされた、ループＦプライマーを用いずにプライマーセットｒｋ２２０８．１を用いたＬＡＭＰ反応についての、時間に対する相対的蛍光のプロットである。蛍光鎖は、約０．０８μＭ、約０．４μＭ、及び約０．８μＭの濃度で供給され、そしてクエンチャー鎖は、約０．１６μＭ、約０．８μＭ、及び約１．６μＭの濃度で供給された。
【図１５】異なる濃度の同化プローブ蛍光鎖及びクエンチャー鎖と共に、ループＦを用いたｒｋ２２０８．１  ＬＡＭＰ反応についての時間に対する相対的蛍光のプロットである。クエンチャー鎖の濃度は、蛍光鎖の濃度の約２倍であった。
【図１６】本開示の同化プローブの実施態様及び挿入色素（ＥｖａＧｒｅｅｎ）を使用したＬＡＭＰ反応についての、時間に対する相対的蛍光のプロットである。
【図１７】サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）及びバクテリオファージラムダゲノムＤＮＡについての多重化ＬＡＭＰ反応の、時間に対する相対的蛍光のプロットである。
【図１８】サルモネラ菌についてフルオレセイン標識同化プローブを使用した、サルモネラ菌及び／又はバクテリオファージラムダゲノムＤＮＡを増幅する多重化ＬＡＭＰ反応についての、フルオレセインのためのスペクトル設定を使用して観察された相対蛍光の時間に対するプロットである。
【図１９】ラムダファージについてｃｙ３標識同化プローブを使用した、サルモネラ菌及び／又はバクテリオファージラムダゲノムＤＮＡを増幅する多重化ＬＡＭＰ反応についての、ｃｙ３のためのスペクトル設定を使用して観察された相対蛍光の時間に対するプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
本明細書で使用される用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」、「約（ａｂｏｕｔ）」、及び「実質的に」は、望まれる機能をなお果たすか又は望まれる結果をなお達成する、示された量に近い量を表す。例えば、用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」、「約（ａｂｏｕｔ）」、及び「実質的に」は、示された量の１０％未満以内、５％未満以内、１％未満以内、０．１％未満以内、又は０．０１％未満以内を指し得る。
【００１１】
本開示の実施態様は、選択された病原体の選択された株を、同じ種内の他の集団と迅速に区別することができる遺伝子ベースの診断法を提供する。例としては、限定されないが、バクテリオファージラムダ、青枯病菌のｒａｃｅ３ｂｉｏｖａｒ２、青枯病菌、サルモネラ菌、及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）が挙げられ得る。標的ＤＮＡのループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）の配列特異的実時間モニタリングは、ＬＡＭＰプライマー及び標的ＤＮＡを含む混合物に、特定のオリゴヌクレオチドプローブ（本明細書では「同化プローブ」と呼ぶ）を加えることにより達成され得る。
【００１２】
同化プローブ自体は、２つの異なるオリゴヌクレオチド鎖を含み得る。第一のオリゴヌクレオチド鎖はクエンチャーを含み得（消光プローブと呼ばれる）、そして第二のオリゴヌクレオチド鎖はフルオロフォアを含み得る（蛍光プローブと呼ばれる）。これら２つの鎖がＬＡＭＰ反応の間に互いに置き換わる場合に蛍光シグナルが生じる。放射された蛍光をモニタリングすることにより、ＬＡＭＰ反応が検出され得る。
【００１３】
さらに、同化プローブの実施態様は、選択された標的ＤＮＡの増幅が起こる場合に実質的な置き換えを受ける鎖を含み得る。従って、同化プローブは、標的ＤＮＡの増幅が起きない場合は実質的に蛍光を発しないかもしれず、そして標的ＤＮＡの増幅が存在する場合には実質的に蛍光を発し得る。従って、標的ＤＮＡの増幅は配列特異的であり得る。
【００１４】
本明細書で使用される用語同化（ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｎｇ）プローブは、当業者に理解されるその通常の意味を示し得、そしてさらに、互いにハイブリダイズしていない場合、そしてまた蛍光プローブ及び消光プローブが一緒にハイブリダイズしている場合も、蛍光プローブ及び消光プローブを指し得る。
【００１５】
以下でより詳細に考察されるように、ＬＡＭＰ反応混合物内の同化プローブの存在は、ＬＡＭＰ反応が進行する速度を低下させ得る。しかし、同化プローブの存在に起因するＬＡＭＰ反応速度に対する同化プローブの効果を低減する同化プローブのパラメーターが確認されている。これらのパラメーターとしては、限定されないが、クエンチャープローブに対する蛍光プローブの比、鎖（蛍光プローブ及びクエンチャープローブ）を混合して同化プローブを生成する方法、及び同化プローブの総量が挙げられる。ＬＡＭＰ反応速度に対する同化プローブの効果を低減することにより、ＬＡＭＰ反応の実時間モニタリングが容易になる。これらのパラメーターはまた、ＬＡＭＰ反応を検出するために必要とされる時間を低減するように選択された範囲内で変更され得、さらに実時間検出を容易にし得る。
【００１６】
別々のＬＡＭＰ反応のために設計された同化プローブの実施態様はまた、１つより多い特有の遺伝子配列の実時間検出（多重化検出）のために使用され得る。ＬＡＭＰ反応の実時間での多重化検出を行うために、各同化プローブは、独立してモニタリングすることができるスペクトル的に特異的なフルオロフォアを使用し得る。
【００１７】
本開示のさらなる実施態様は、実時間でのこれらの遺伝子ベースの診断法の適用を容易にする基板ベースのハードウェアプラットフォームを提供する。いくつかの実施態様において、このプラットフォームは、ＬＡＭＰ反応を行うためのウェルのパターンを形成されたコンパクトディスク（ＣＤ）又は他の基板を含む。いくつかの実施態様において、基板ベースのプラットフォームの反応ウェル内の温度をモニタリングするための非接触温度センサーとしてパイロメーターが使用され得る。パイロメーターは、反応ウェルから発せられる熱放射の測定に基づいて基板の反応ウェル内の温度を見積もり得る。水の存在及び反応ウェルを密封する透明フィルムに起因する、パイロメーターにより測定される温度の誤差を補正するために較正手順がさらに開発される。これらの温度測定値は、加熱源を制御するためにさらに使用され得る。このやり方で、反応ウェル内の温度はその中で起こるＬＡＭＰ反応の間ほぼ一定に維持され得る。
【００１８】
これらのツールは、病原体の正確な区別を有利に容易にし得、そして例えば、病害の導入に応じた適時な管理決定がなされることを可能にする。開示される実施態様が多くの他の状況（限定されないが、少ない供給源の状況のような臨床診断、並びに軍及び国家安全の人員による生物学的因子の同定を含む）でも同様に有用であり得る。
【００１９】
一実施態様において、ＤＮＡの選択された配列のＬＡＭＰによる実時間検出方法が提供される。本方法は、選択された基板（例えばＣＤ）にパターンを形成して反応ウェルを形成することを含み得る。本方法は、本明細書に記載されるＬＡＭＰ反応混合物及び同化プローブを反応ウェルに加えることをさらに含み得る。本方法は、ウェルを密封し、そして標的ＤＮＡをそのウェルに加えることをさらに含み得る。本方法は、熱源（例えばレーザー）を用いて、蛍光を誘導するために十分な温度までウェルの内容物を加熱することをさらに含み得る。本方法はまた、蛍光を検出することを含み得る。
【００２０】
ハードウェア設計
ＬＡＭＰプロセスは、個々のＬＡＭＰ反応のための複数のウェルを含む基板上で行われ得る。基板は当該分野で公知のいずれかの材料、例えばプラスチック、金属、又は複合材料のものであり得る。いくつかの実施態様において、コンパクトディスク（ＣＤ）プラットフォームは、ＤＮＡ増幅及び検出のためのループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）を行うために使用され得る。ＣＤプラットフォームは、サンプル調製及び反応工程の自動化を可能にし、さらに良好な閉じ込め（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）をもたらす。ＣＤ基板の点から本明細書において一般的に記載されるが、複数の反応ウェルを提供する他の基板が使用され得る。
【００２１】
ＬＡＭＰ反応は、ＣＤ又は他の基板内に含まれる反応ウェル内で行われる。特定の実施態様において、反応ウェルはパターン形成により製造され得る。ＣＤのような基板におけるパターンは、ラピッドプロトタイピングのためのレーザー及び／又は印刷、大量生産のための射出成形、並びに当該分野で公知のコンパクトディスク及び他の基板にパターン形成するための他の機構を含むがこれらに限定されない機構により作製され得る。
【００２２】
例えば、一実施態様において、パターンは、黒いポリカーボネート（例えばＬｅｘａｎ）のディスク上でレーザー彫刻機（例えばＶｅｎｕｓ−３０、ＧＣＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔａｉｐｅｉ  Ｈｓｉｅｎ、Ｔａｉｗａｎ）を使用して作製され得る。別の実施態様において、ポリカーボネートのブランクディスクはコンピュータ数値制御（ＣＮＣ）機械を用いてパターン形成され得る。さらなる実施態様において、パターン形成されたアクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）ディスクは、それら全体が３Ｄプリンタ（例えばＳＳＴ  １２００、Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎｃ、Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ  ＭＮ）を使用して製造され得る。ディスクの断面の形状は、所望の用途に従って製造され得る。例えば、特定の実施態様において、ウェルは概して円形の断面を有する円筒形構造で製造され得る。
【００２３】
いくつかの実施態様において、ＬＡＭＰモニタリングに使用される基板の厚さは、約１．２ｍｍから約１．８ｍｍの範囲内であり得る。しかし、基板の実施態様が、限定されることなく、当該分野で公知の他のポリマーのような材料から形成され得るということが理解され得る。
【００２４】
反応ウェルの断面積も必要に応じて変更され得る。例えば、概して円形の断面を有する円筒形構造を有するウェルの実施態様において、反応ウェルの直径は、限定されることなく、ウェルにおいて行われる特定の反応に基づいて変更され得る。いくつかの実施態様において、ウェルの直径の値は、約３ｍｍから約４ｍｍ、又はその間のいずれかの値であり得る。
【００２５】
さらなる非限定的な例において、１つ又はそれ以上の反応ウェルが１つ又はそれ以上の壁及びチャネルにより囲まれ得る。壁及び／又はチャネルの存在は、反応ウェルの周りの断熱を有利に改善し得る。壁厚さの値は、特定の実施態様において、約０．５ｍｍ〜５ｍｍの範囲内で選択され得る。チャネル厚さの値は、特定の実施態様において、約０．５〜約５ｍｍの範囲内の値を有するように選択され得る。しかし、壁厚さ及びチャネル厚さは、必要に応じて、ＬＡＭＰモニタリングに適したいずれかの値を選ぶように選択され得るということが理解され得る。別の記載がなければ、以下で考察される実施例において使用された反応ウェル厚さ及びチャネル厚さは、それぞれ約１ｍｍ及び約２ｍｍであった。いくつかの実施態様において、反応ウェル及びチャネルの深さは、反応ウェル及び／又はチャネルの下に５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．５ｍｍ、０．３ｍｍ又はそれ以下の基板材料を保持するように選択され得る。以下の実施例において、反応ウェル及びチャネルの深さは、反応ウェルの下のディスク材料の厚さが約０．３ｍｍを保持するように選択された。
【００２６】
ＣＤ又は他の基板の温度は、非接触温度センサーを使用して記録することができる。一実施態様において、非接触温度センサーは、光源及び検出器を含むパイロメーターを含み得る。例えば、小型光学ヘッドを有する市販のパイロメーターを可撓性のケーブル（例えばＭＩＤ２０ＬＴＣＢ３、Ｒａｙｔｅｋ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）に取り付けてもよい。あるいは、モノリシック型（例えばＭＬＸ９０６１４ＥＳＦ−ＢＡＡ、Ｍｅｌｅｘｉｓ、Ｉｅｐｅｒ  Ｂｅｌｇｉｕｍ）を反応ウェルの配置に隣接した回路基板上に直接備え付けてもよい。較正のために、熱電対（例えば、細熱電対線から作られたＫ型熱電対、例えばＯｍｅｇａ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）を使用して標準温度を記録し得る。熱電対線をソフトウェア補正マルチメーターに接続してもよい（例えばＦｌｕｋｅ  １８６、Ｅｖｅｒｅｔｔ、ＷＡ）。
【００２７】
以下により詳細に記載されるように、非接触温度センサーの較正を容易にするために、ウェルを蒸留水（又は他の非反応性液体）で実質的に満たし、そして接着性裏地を有する透明フィルム（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ  「Ｂ」  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｓｅａｌｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）で覆ってもよい。非接触温度センサーを較正して反応ウェルにおける非放射性液体及びフィルムの影響を補正することにより、反応ウェル内の温度はより正確に有利に制御され得る。
【００２８】
反応ウェルの加熱は熱源によっても行われ得る。熱源としては、限定されないが、当該分野で公知の接触型及び非接触型の熱源が挙げられ得る。一実施態様において、熱源は光学加熱デバイスを含み得る。例えば、この光学デバイスは、反応ウェルの下面に向けられた脱焦点（ｄｅｆｏｃｕｓｅｄ）レーザーを含み得る。例えば、加熱は、ウェルの下面上付近に向けられた約１５０ｍＷで作動する８０８ｎｍ赤外半導体レーザーモジュール（例えばｉｃｅｔｅｃ−ＵＫ）を使用して達成され得る。レーザーはディスクの燃焼を抑制し、そして熱をウェルに一様に分布させるためにほぼ脱焦点され得る。レーザーの出力は、マイクロコントローラ（例えば、Ｆｏｘ  ＬＰ３５００、Ｒａｂｂｉｔ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ、Ｄａｖｉｓ、ＣＡ）からのパルス幅変調（ＰＷＭ）信号により駆動されるロジックオプトカプラー（ｌｏｇｉｃ  ｏｐｔｏｃｏｕｐｌｅｒ）（図１を参照のこと）によりゲート制御されるｎ形パワーＭＯＳＦＥＴにより制御され得る。
【００２９】
温度制御を行うために、コントローラはパイロメーターからのフィードバックを使用する修正比例積分制御ルーチンを用いてプログラムされ得る。パイロメーターフィードバックは、以下に記載されるように、較正補正が適用された後にマイクロコントローラにより受信され得る。光学的温度検出を行うために、サンプルを、例えば選択された波長を有する高光度光源により斜めに照射し得る。一実施態様において、光源は約４５０ｎｍから約４７５ｎｍの範囲内で選択された波長（例えば約４７０ｎｍ）の光を放射する青色発光ダイオード（ＬＥＤ）を含み得る。この照射をすることができるＬＥＤ光源の例は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）製のＨＬＭＰ  ＣＢ２８  ＳＴＤ００である。
【００３０】
反応ウェルから発せられる熱放射は検出器により検出され得る。一実施態様において、検出器は光源に隣接して位置づけられたフォトダイオードを含み得る。検出器は、水及び透明フィルムを通ってきたウェル表面からの熱放射を受け取るために取り付けられ得る。検出器は、図１において示されるように、約１０10Ｖ／Ａ〜１０12Ｖ／Ａの範囲内で作動する高利得光増幅回路（例えばＴ−５  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｉｎｔｏｒ  Ｉｎｃ．、Ｓｏｃｏｒｒｏ  ＮＭ）を使用して操作され得る。検出器によって測定される励起及び発光スペクトルを、狭帯域パス干渉フィルタ（例えばＩｎｔｏｒ）を使用して調整し得る。しかし、代替の実施態様において、接触温度センサーが上記のフォトダイオード検出器の代わりに、又は上記のフォトダイオードと組み合わせて使用され得るということが理解され得る。
【００３１】
非接触温度センサーの較正
非接触温度センサーは、例えば使い捨てのＣＤプラットフォームにおいて、汚染を防止するようにシステムにおける温度測定のために選択され得る。例えば、パイロメーターは非接触温度センサーとして使用され得る。しかし検出器は、調べられた領域における温度（例えば、個々のウェルの温度又は選択された一群のウェルの平均温度）を決定するために、反応ウェルの表面から発せられる熱放射を測定する。この熱放射は、反応液（例えば水）、そしてウェルを密封するために使用される材料（例えば透明フィルム）フィルムの存在）を通過する。理論により限定されないが、これらの材料は低い放射率を有するので、ウェルの内側から発生する放射、さらには周囲からの熱放射に反射を導入し得ると考えられる。結果として、これらの材料は、パイロメーターにより測定される熱放射から計算された温度に誤差を導入し得る。
【００３２】
パイロメーターは、これらの誤差を補正するために較正され得る。以下に考察されるように、反応ウェル内の温度は、定常状態の熱源からの異なる光出力の関数として、パイロメーター、さらには反応ウェルと接触した熱電対を使用して測定され得る。これらの測定値は、パイロメーターにより測定された温度に基づいて反応ウェルの正しい温度を計算する較正モデルに入力され得る。
【００３３】
ＣＤベースの検出システム２００の略図を図２に放射源とともに示す。システム２００は、１つ又はそれ以上の反応ウェル２０４を有する基板２０２（例えば、ポリカーボネート、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、又は別の適切なプラスチック材料のようなプラスチックディスク）を含む。透明フィルム２０６は、汚染物質が反応ウェル２０４に入るのを阻止するために反応ウェル２０４上に配置される。
【００３４】
検出器２１０は、基板２０２から発生される熱放射を測定するために基板２０２上に位置づけられ得る。いくつかの実施態様において、検出器２１０はパイロメーターを含み得る。較正モデルは、反応ウェル内の物質（例えば、ＬＡＭＰ反応混合物、ウェルを覆う保護フィルム）を通る熱放射の透過及び基板自体による入射蛍光の吸収に起因する検出器２１０の温度測定値の誤差を補正するために使用され得る。図１において示されるように、Ｅcは、反応ウェル２０４の温度を制御するための熱源から基板２０２中に吸収される熱放射である。ＥTは、反応ウェル２０４の表面から発せられる熱放射である。Ｅtは、反応ウェル２０４及び透明フィルム２０６を通って検出器２１０に達する、反応ウェル２０４の表面からの熱放射の一部である。Ｅambは、透明フィルム２０６に影響を与える周囲から発せられる熱放射である。Ｅrは、検出器２１０中に反射される周囲熱エネルギーの一部である。一実施態様において、較正モデルは、反応ウェル２０４の表面から、又は周囲から生じ、そして反応ウェル２０４中の水及び透明フィルム２０６のいずれかを横切った後、又はこれらの表面に反射した後に検出器２１０で検出される放射の実質的に全てを想定し得る。
【００３５】
これらの状況下でのマクスウェル方程式の解は、それらのそれぞれの境界における様々な材料の正規化波動インピーダンスに関連付けられる反射及び透過係数を生じる。次にこれらの波動インピーダンスは、波動が通過する材料のそれぞれの誘電率及び透磁率に関連付けられる。最終結果は、反応ウェル２０４から発られる全熱放射の割合ａが検出器２１０に達し、そして周囲から生じる全熱放射の割合ｂが、反応ウェル２０４から離れて反射されて検出器２１０に達するということである。
【００３６】
灰色体に適用されるステファン−ボルツマンの法則から、物体から放射される全熱エネルギーＥは、等式１に従って、材料の放射率ε、及び透明フィルム２０６の表面の絶対温度Ｔに関連付けられる：
【数１】
0005984802.tif 000002
【００３７】
ここでσはステファン−ボルツマン定数である。検出器２１０は、選択された放射率の材料を仮定して、パイロメーター２１０の検出器に達する熱放射に基づいて透明フィルム２０６の表面の温度を見積もり得る。パイロメーター２１０の検出器に達する全熱エネルギーＥを使用して、等式２に従って表示される温度Ｔiを計算し得る：
【数２】
0005984802.tif 000003
【００３８】
Ｅtは反応ウェル２０４内の反応物質の体積及び透明フィルム２０６を通って伝達された後に検出器パイロメーター２１０に達する、反応ウェル２０４から生じた熱放射である。Ｅrは、透明フィルム２０６の表面に反射した後に検出器２１０の検出器に達する、周囲からの熱エネルギーである（例えば図２を参照のこと）。
【００３９】
ステファン−ボルツマンの法則、並びに上記からの経験的係数ａ及びｂを前記の等式における各項に適用して、等式３が得られ得る：
【数３】
0005984802.tif 000004
【００４０】
εsetは検出器２１０の放射率設定である。特定の実施態様において、εsetについてのデフォルトの値が想定され得る（例えば約０．９５）。しかし、検出器２１０に依存して他の放射率の値が採用され得る。εwellは、反応ウェル表面の放射率である。εambは、周囲温度Ｔambでの周囲の材料の放射率である。
【００４１】
温度Ｔi、Ｔamb、及びＴは互いに関連し得る。例えば等式３を書き換えることにより、ＴiはＴamb、Ｔ及び経験的係数（Ａ及びＢと呼ばれる）、並びに周囲環境（伝達及び／又は反射の損失に関する補正を含む）で表され得る：
【数４】
0005984802.tif 000005
【００４２】
経験的係数Ａ及びＢは、系（例えばウェル）の放射率の比を表し、そして一定の周囲温度Ｔambでの真のウェル温度Ｔの４乗の関数として、表示された温度Ｔiの４乗の線形回帰を行うことにより決定され得る。実際のウェル温度Ｔについて等式４ａを解くことにより、係数Ａ及びＢが得られる。次にこれらの係数を使用して、等式５に従って所定の検出器温度表示ＴiからＴが見積もられ得る：
【数５】
0005984802.tif 000006
【００４３】
このやり方で、検出器２１０は、非接触温度測定値の精度を改善するために較正され得る。しかし、他の実施態様において、温度測定値は他の機構により、例えば反応ウェルと接触した熱電対により得られ得る。
【００４４】
蛍光光度計及びレーザードライバー
図３Ａは、本開示の実施態様のカスタムの蛍光光度計及びレーザードライバーのための回路基板レイアウトの略図である。
【００４５】
図３Ｂは、図３Ａのカスタムの蛍光光度計及びレーザードライバーのために装着された回路基板の写真である。パイロメーターヘッドがポリカーボネートＣＤ上にさらに示されている。
【００４６】
ループ媒介性等温増幅及び検出：
ループ媒介性増幅（ＬＡＭＰ）は、等温的に、かつテンプレートＤＮＡを変性させることなく遺伝子複製を達成するために使用され得る。ＬＡＭＰはまた、細胞を溶解も抽出もすることなくその標的ＤＮＡを増幅することができるが、より低い検出限界をもたらす。ＬＡＭＰの実施態様は以下の書類に詳細に記載され、それらは各々それらの全体が参照により加入される。
【００４７】
・Ｎ．  Ｔｓｕｇｕｎｏｒｉ、ｅｔ  ａｌ．、「Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ」  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．２８、Ｎｏ．２、Ｊｕｎｅ  １５、２０００．
・Ｙ．  Ｍｏｒｉ、ｅｔ  ａｌ．、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、Ｖｏｌ．２８９、Ｎｏ．１、ｐ．１５０−１５４、Ｎｏｖ．２３、２００１．
・Ｋ．  Ｎａｇａｍｉｎｅ，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｖｏｌ．２９０、Ｎｏ．４、ｐ．１１９５−１１９８、Ｆｅｂ  １、２００２．
・Ｋ．  Ｎａｇａｍｉｎｅ、ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｌｏｏｐ  ｐｒｉｍｅｒｓ」  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｖｏｌ．１６、Ｎｏ．３、ｐ．２２３−２２９、Ｊｕｎｅ  ２００２．
【００４８】
一実施態様において、ＬＡＭＰは４つのプライマーのセットを使用し得る。これらの４つのプライマーは、６つの個別の配列を認識し得、そして例えばＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメントによる自己サイクリング鎖置換（ａｕｔｏ−ｃｙｃｌｉｎｇ  ｓｔｒａｎｄ−ｄｉｓｐｌａｃｉｎｇ）ＤＮＡ合成に依存し得る。ＬＡＭＰ反応のためのプライマーは内部プライマー（例えばＦＩＰ及びＢＩＰ）及び外部プライマー（例えばＦ３及びＢ３）であり得る。ＬＡＭＰ反応は、内部プライマー（例えばＦＩＰ又はＢＩＰ）のずれかの標的ＤＮＡ上のそのそれぞれのプライミング部位（例えばＦ２ｃ又はＢ２ｃ）へのハイブリダイゼーションにより開始され得る。外部プライマー（例えばＦ３又はＢ３）は、標的ＤＮＡ上のそのプライミング部位（例えばＦ３ｃ又はＢ３ｃ）に二次的にハイブリダイズし、そして既に内部プライマーから伸長されたＤＮＡ配列を置き換える新しい相補配列の合成を開始する。その結果は、両端にステムループ構造を形成し得るＤＮＡ配列である。この自己プライム「ダンベル」構造は、ＬＡＭＰ自己サイクリング増幅の出発物質である。
【００４９】
ＬＡＭＰ反応はまた、ループプライマーと呼ばれるさらなるプライマーを使用して加速され得る。ループプライマーは、標的ＤＮＡテンプレートから転写されたループの部分にハイブリダイズし得る。このさらなるプライミングがＬＡＭＰ反応を加速し得、そして正しい出発物質の転写を必要とするのでＬＡＭＰ選択性を改善し得る。特定の実施態様において、ＬＡＭＰ反応は、所望の範囲内、例えば約６０℃〜約７０℃、又は約６０℃〜約６５℃の間で選択される温度値で等温条件下で行われ得る。増幅産物はステムループＤＮＡであり得、これは典型的には標的のいくつかの逆方向反復を有する。逆方向反復は典型的には複数のループを有するカリフラワー様の構造を示す。
【００５０】
ＬＡＭＰによるＤＮＡのポジティブ増幅を検出するために様々な機構が開発されている。一局面において、ＤＮＡのポジティブ増幅は、挿入色素、例えばＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ又はＥｖａＧｒｅｅｎ(R)を使用して実時間でモニタリングされ得る。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は好熱性ヘリカーゼ依存性増幅（ｔＨＤＡ）に対して阻害作用を有することが知られている。対照的に、ＥｖａＧｒｅｅｎはＰＣＲに対するより低い阻害作用を有することが報告されており、そしてまたＬＡＭＰ反応を検出するために使用されてきた。しかし、以下により詳細に考察するように、ＥｖａＧｒｅｅｎのＬＡＭＰ反応に対する高い阻害作用が観察され得る。さらに、この機構はＤＮＡ産物の配列特異的な確認を可能にしない。しかしとりわけ、この機構はＤＮＡ産物の配列特異的な確認を可能にしない。むしろこの技術はポジティブ増幅を単に検出するだけである。
【００５１】
別の実施態様において、ポジティブＬＡＭＰ反応は、ＬＡＭＰ反応混合物の白濁を測定することにより同定され得る。この白濁は、ピロリン酸マグネシウムがＬＡＭＰ反応の副生成物であるのでポジティブＬＡＭＰ反応の指標である。しかし、白濁はポジティブ増幅が起こったことの指標を提供し得るが、その濁り自体は目的の特定の配列がＬＡＭＰを受けたことの決定的な指標ではない。従って、配列特異性を決定するための濁りのみの信頼性は、より高い率の疑陽性を生じやすい。
【００５２】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの検出方法、例えば分子ビーコン、Ｔａｑｍａｎプローブ、及び分子ジッパーは、ＤＮＡ増幅プロセスの実時間配列特異的モニタリングを提供する技術である。分子ビーコンは、一方の末端で蛍光分子に、そして反対の末端でクエンチャー分子に結合された自己相補的ステムループ構造を有する核酸プローブを含む。標的配列が存在しない場合、相補ステムループ配列のためにクエンチャーはフルオロフォアに近接しているので、蛍光は発せられない。ループ領域が標的にハイブリダイズする場合、クエンチャー及びフルオロフォアは互いに離れて蛍光発光が検出され得る。
【００５３】
しかしとりわけ、ＬＡＭＰをモニタリングするための分子ビーコンの使用は困難であり得る。例えば、分子ビーコンは等温条件下でＬＡＭＰアンプリコンのようなｄｓＤＮＡ産物に対して十分接近可能でないかもしれない。さらに、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼにはエキソヌクレアーゼ活性がないので、Ｔａｑｍａｎプローブは一般的にはＬＡＭＰ反応を検出するために使用されない。それでもなお、これらの技術のいずれかが特定の実施態様において使用され得る。
【００５４】
分子ジッパーは、部分的に二本鎖の短いＤＮＡフラグメントを含む分子である。分子ジッパーの第一の鎖は、３’末端にクエンチャーを含み、そして消光プローブと呼ばれ得る。分子ジッパーの第二の鎖は、５’末端に結合されたフルオロフォア、及び標的ＤＮＡの選択された小片に相補的なプライミング配列（例えばラムダファージＦ、ラムダファージＢ、ｒｋ１２４９．１  Ｆ、ｒｋ２２０８．１  Ｆ、ｒｋ２４０３．１  Ｆ、ｒｓｆｌｉＣ  Ｂ、ｒｓｆｌｉＣ  Ｆ、Ｓｅ０１  Ｆ、ＳＥ０１  Ｂ、ｓｐａ１．）を有する部分的相補鎖を含む。この第二の鎖は蛍光プローブと呼ばれ得る。クエンチャーの例としては、限定されないが、ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭＲＡ、及びブラックホールクエンチャー（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）（ＢＨＱ）（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）が挙げられ得る。フルオロフォアの例としては、限定されないが、フルオレセイン、ｃｙ３、ｃｙ５、及び当該分野で公知のいずれかの数の量子ドットが挙げられ得る。フルオロフォアに結合された末端は、組み立てられたジッパー構築物においてクエンチャーと整列する。特定の実施態様において、ＤＮＡ重合反応においてプライマーとして作用する蛍光鎖のオーバーハングした（ｏｖｅｒｈａｎｇｉｎｇ）非対応部分を除いて、分子ジッパーの鎖は相補的である必要がある。いくつかの実施態様において、分子ジッパーは、ジッパーの２つの鎖が互いにハイブリダイズする場合に蛍光が実質的に消光されるような配置にされ得る。
【００５５】
ジッパーの２つの鎖が置き換わる場合に分子ジッパーから蛍光シグナルが生じる。結果として、分子ジッパーはＬＡＭＰにおいて使用され得る。さらなる実施態様において、ＬＡＭＰ産物のループ領域にハイブリダイズするようにオーバーハングした領域を設計することにより、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性による分子ジッパーの分離が、次の重合反応の間に起こり得る。また、さらなる実施態様において、ＬＡＭＰプロセスの温度（例えば約６５℃）を超える融点を有するジッパー配列を構成することにより、分子ジッパーは低いバックグラウンドレベルでＬＡＭＰ反応における実時間モニタリングのために使用され得る。分子ジッパーは、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）及び分枝（ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ）増幅（ＲＡＭ）の実時間モニタリングに関して以前に実証されている。
【００５６】
分子ジッパーにおいて、蛍光プローブ及びクエンチャープローブは典型的にはほぼ等しい量で混合され、そしてハイブリダイズして二本鎖ジッパーを形成する。例えば、特定の実施態様において、等量の蛍光プローブ及びクエンチャープローブ（例えば約２０μＭ）を約９５℃で約５分間インキュベートし、そして二本鎖分子ジッパーを形成するために室温付近までゆっくりと冷却し得る。
【００５７】
ハイブリダイズした分子ジッパープローブをＬＡＭＰ反応混合物に加える。いくつかの実施態様において、ハイブリダイズした分子ジッパープローブを加えて、約０〜約１００μＭの範囲で選択された最終濃度値にし得る。特定の実施態様いおいて、分子ジッパーの濃度は、約０μＭ〜約１０μＭの範囲内で選択された値を有し得る。さらなる実施態様において、分子ジッパーの濃度は、約０μＭ〜約１μＭの範囲内であり得る。一実施態様において、分子ジッパーの濃度は約０．４μＭであり得る。
【００５８】
いくつかの実施態様において、本開示は改善された検出技術を提供する。本明細書で「同化プローブ」と呼ばれる一対の標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、ＦＲＥＴの原理を使用してＤＮＡのＬＡＭＰの配列特異的実時間モニタリングを行うために設計された。プローブ対は上で考察した分子ジッパーと類似している。しかし、分子ジッパーと本開示の同化プローブの実施態様とは、反応プロセスのそれらの実行に関して少なくとも異なっている。
【００５９】
表１は、様々なＬＡＭＰプライマー及び標的生物とともに使用するための蛍光プローブ及びクエンチャープローブの実施態様を示す。
【００６０】
【表１】
0005984802.tif 000007
【００６１】
各プライマー及びプローブの分子構造／配列を表２にまとめる。
【００６２】
【表２】
0005984802.tif 000008
【００６３】
【表３】
0005984802.tif 000009
【００６４】
【表４】
0005984802.tif 000010
【００６５】
同化プローブに関連するいくつかのパラメーターが同定されており、これらは、いくつかの実施態様において、他の検出技術と比較して同化プローブの性能を有意に改善し得る
。これらのパラメーターとしては、クエンチャープローブに対する蛍光プローブの量の比、ＬＡＭＰ反応混合物に同化プローブを加える方法、及びＬＡＭＰアンプリコンの単鎖ループ上のアニーリング部位に関して競合する同化プローブの総量が挙げられる。例えば、ＬＡＭＰ反応混合物中の同化プローブの存在はＬＡＭＰ反応速度の減少を引き起こし得るが、パラメーター値が選択された範囲内にある場合、ＬＡＭＰ反応混合物中の同化プローブの存在がＬＡＭＰ反応速度を抑制する程度は無視できるほどになり得る。
【００６６】
蛍光プローブ及びクエンチャープローブに関して、特定の実施態様において、クエンチャープローブに対する蛍光プローブの比は、約１：１未満（例えば、蛍光プローブより高い濃度のクエンチャープローブ）になるように選択され得る。このような比の例としては、限定されないが、約１：１．１未満、約１：１．２未満、約１：１．３未満、約１：１．４未満、約１：１．５未満、約１：１．６未満、約１：１．７未満、約１：１．８未満、約１：１．９未満、及びより小さいものが挙げられ得る。このような比の例としては、限定されないが、約１：２未満、約１：３未満、約１：４未満、約１：５未満及びより小さいものがさらに挙げられ得る。
【００６７】
この範囲内の比が、同化プローブの存在がＬＡＭＰ反応の速度を抑制する程度を減少させ、かつバックグラウンド蛍光の交絡検出の程度を減少させるということが有利に見出されている。例えば、以下により詳細に考察されるように、実施例４は、約１：１のクエンチャープローブに対する蛍光プローブの比（例えば分子ジッパー）が、約６５℃で約１２０分間のインキュベーション後に、高い蛍光バックグラウンドを伴って、蛍光シグナルの実質的な増加をもたらさないということを説明し、これはその反応温度での分子ジッパーにおける蛍光鎖の不完全な組み立てを示している。
【００６８】
対照的に、約１：２のクエンチャープローブ対蛍光プローブ比を使用する場合、大量のアンプリコンが、約６５℃で約６０分のインキュベーション後に観察された（実施例６）。いくつかの実施態様において、同様の結果が約１：２未満の比について得られ得る。
【００６９】
さらなる実施態様において、同化プローブ鎖をＬＡＭＰ反応混合物中に混合する方法は、ＬＡＭＰの速度を増加させ、従って検出に十分な増幅された標的ＤＮＡの量を生成するために必要とされる時間を減少させるように変更され得る。蛍光プローブ及びクエンチャープローブは、ＬＡＭＰ反応混合物に加えられた場合に互いに対してハイブリダイズしていない状態であり得る。すなわち、蛍光プローブ及びクエンチャープローブは、ＬＡＭＰ反応混合物に別々に加えられ得る。これは、蛍光プローブ及びクエンチャープローブを一緒にハイブリダイズさせ、次いでＬＡＭＰ反応混合物に加える分子ジッパーの場合と対照的である。特定の実施態様において、本開示の蛍光プローブ及びクエンチャープローブは、ＬＡＭＰ反応混合物に互いに同時に加えられても異なる時点で加えられてもよい。
【００７０】
二本鎖同化プローブ構造（蛍光プローブ及びクエンチャープローブを含む）をＬＡＭＰ反応混合物に加えることとは対照的に、蛍光プローブ及びクエンチャープローブをＬＡＭＰ反応混合物に個別に直接加えると、ＬＡＭＰ反応速度は比較的抑制されず、ポジティブな反応のより速い表示をもたらすということが観察される（実施例５）。
【００７１】
さらなる実施態様において、ポリメラーゼ濃度を変更してＬＡＭＰ反応の速度に影響を与え、従ってポジティブ反応を同定するために必要とされる時間を減少させ得るということが確認された。例えば、一実施態様において、ポリメラーゼ濃度は、約８Ｕに等しいか又はそれ以上、約１６Ｕに等しいか又はそれ以上、約２４Ｕに等しいか又はそれ以上、約３２Ｕに等しいか又はそれ以上などのポリメラーゼであり得、ＬＡＭＰ反応速度を増加させ、そして検出時間を減少させるために使用され得る。
【００７２】
例えば、以下で詳細に考察されるように（実施例８）、ｒｋ２２０８．１プライマーセット及び約８ＵのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して約２０分後に蛍光が検出された。対照的に、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの量を約８Ｕから約１６Ｕに二倍にした場合、蛍光は約１０分後に検出された。この結果は、ＬＡＭＰ反応速度はポリメラーゼ濃度を二倍にするとおよそ二倍になるということを示す。ポリメラーゼ濃度をさらに増加させることは、検出時間を減少させると予測される。律速的プライマーアニーリング速度が、酵素触媒重合速度がそれらを超えるにつれて制限されるようになる時点付近まで、速度のさらなる増加はほぼ線形であるとも考えられる。
【００７３】
反応混合物内の同化プローブの総量はまた、ＬＡＭＰ反応の速度及び観察可能な蛍光の開始に影響を及ぼすように変更され得る。反応混合物に加えられる蛍光プローブ及びクエンチャープローブの量を増加させることにより検出時間が有意に減少されるということが確認されている（例えば、実施例１０を参照のこと）。例えば実施例８において考察されるように、ＬＡＭＰ反応混合物に加えられる蛍光プローブの量は、約０．０８μＭより高い、約０．４μＭに等しいか又はそれより高い、約０．８μＭに等しいか又はそれより高い、などであり得、そしてクエンチャープローブのそれぞれの濃度は、約０．１６μＭに等しいか又はそれより高い、約１．６μＭに等しいか又はそれより高い、などでありえる。
【００７４】
さらなる実施態様において、クエンチャープローブに対する蛍光プローブの比は約１：１未満である。このような比の例としては、限定されないが、約１：１．５未満より低い、約１：２未満、約１：２．５未満、約１：３未満、約１：３．５未満、約１：１．４未満、約１：１．４．５未満、約１：５未満、約１：５．５未満、約１：１．６０未満、約１：１．６５未満、約１：１．７０未満、約１：１．７５未満、約１：１．８０未満、約１：８．５未満、約１：９未満、約１：９．５、及びより小さいものが挙げられ得る。このような比の例としては、限定されないが、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５及びより小さいものがさらに挙げられ得る。
【００７５】
特定の実施態様において、蛍光プローブ及びクエンチャープローブの量は、ＬＡＭＰによるＤＮＡのポジティブな増幅がＬＡＭＰ反応混合物中で起こる場合に検出可能なレベルの蛍光がまだ生じている間は、できるだけ低く維持され得る。この方法では、同化プローブの存在に起因するＬＡＭＰ反応速度の減少を実質的に排除している間は検出がまだ行われ得る。特定の実施態様において、蛍光プローブの量は、約０．０１〜約０．４μＭの範囲内であり得る。さらなる実施態様において、クエンチャープローブの量は、約０．０２〜約０．８μＭの範囲内で選択され得る。他の実施態様において、同化プローブの総量は約０．０３μＭ〜約１．２μＭの範囲内であり得る。
【００７６】
実施例において以下でより詳細に考察されるように、ＬＡＭＰ反応混合物中の同化プローブの量を多くするほど、蛍光検出の開始の遅延が長くなるということが、実施例１０において決定された。これは、同化プローブが多量に存在する場合にＬＡＭＰ反応速度を抑制するために起こり得る。例えば、蛍光プローブ及びクエンチャープローブ濃度を１０倍増加させると（例えばそれぞれ約０．０８μＭ及び約０．１６μＭから約０．８μＭ及び１．６μＭ）、蛍光検出時間は、約２０分から約１２０分へと約６倍の増加を生じる。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例において、同化プローブの実施態様を、ＬＡＭＰ反応をモニタリングするそれらの能力を評価するために試験する。同化プローブの実施態様と、分子ジッパー、分子ビーコン、及び挿入色素を使用する検出技術との比較も行う。
【００７８】
ＬＡＭＰプライマー
様々な異なるＬＡＭＰプライマーセットを使用して同化プローブの性能を評価した：ラムダファージＬＡＭＰ、ｒｋ１２４９．１、ｒｋ２２０８．１、ｒｋ２４０３．１、ｒｓｆｌｉＣ、並びにＳｅ０１及びＳｐａ１。ｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰプライマーセットは、この種の大部分のメンバーに存在する青枯病菌（Ｒｓ）フラゲリンサブユニットＣ（ｆｌｉＣ）遺伝子を標的とするように設計されている。
【００７９】
ｒｋ１２４９．１、ｒｋ２２０８．１及びｒｋ２４０３．１プライマーセットは、Ｒａｃｅ３Ｂｉｏｖａｒ２（Ｒ３Ｂ２）として分類されるＲｓ株のサブグループに固有のＤＮＡ配列領域を標的とするように設計されている。ラムダファージＤＮＡ  ＬＡＭＰプライマーセットは、ラムダファージＤＮＡを標的とするように設計されている。Ｓｅ０１プライマーセットは、サルモネラ菌を標的とするように設計されている。Ｓｐａ１  ＬＡＭＰプライマーセットは、黄色ブドウ球菌を標的とするように設計されている。
【００８０】
一実施態様において、ＬＡＭＰプライマーは供給業者から得られ得る。他の実施態様において、ＬＡＭＰプライマーは誘導体化されるように設計され得る。このような誘導体化ＬＡＭＰプライマーの例としては、限定されないが、Ｋｕｂｏｔａ、Ｒ．、Ｂ．  Ｇ．  Ｖｉｎｅ、Ａ．  Ｍ．  Ａｌｖａｒｅｚ、ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．  Ｊｅｎｋｉｎｓ、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ｂｙ  ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．９８（９）：１０４５−１０５１（２００８）（その全体が参照により本明細書に加入される）に開示されるものが挙げられ得る。プライマーセット及び同化プローブ鎖の各々についての配列は表２に見られ得る。
【００８１】
以下で考察される実験において、Ｋｕｂｏｔａらのプロトコルを、異なる標的配列を選択的に増幅するために使用した。一実施態様において、ＤＮＡ標的は、バクテリオファージラムダ、青枯病菌のｒａｃｅ３ｂｉｏｖａｒ２株、青枯病菌、サルモネラ菌及び黄色ブドウ球菌のうちの１つを含み、共著者のＳｃｈｅｌｌ及びＡｌｌｅｎにより提供された配列比較情報（データは示していない）を使用した。
【００８２】
一実施態様において、ＬＡＭＰ反応を、約１．６μＭのＦＩＰ及びＢＩＰ、約０．２μＭ濃度のＦ３及びＢ３プライマー、約０．４μＭ濃度のループＢプライマー、約４００μＭのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、約１．０Ｍのベタイン（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（約ｐＨ８．８）、約１０ｍＭ  ＫＣｌ、約１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、約６ｍＭ
ＭｇＳＯ4、約０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びテンプレートＤＮＡを含有する反応混合物約２５μｌ（総体積）で行った。温度制御のためにサーマルサイクラーを使用して、約０．２ｍｌのマイクロチューブ中で反応を行った。この混合物を約９５℃の温度に約５分間加熱し、次いで約８Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を加える前に氷上で冷却した。
【００８３】
別の実施態様において、多重化実時間ＬＡＭＰ反応を、Ｓｅ０１  ＬＡＭＰ及びラムダファージＬＡＭＰプライマーセットの両方を以下の濃度で含有する２５μｌで行った：１．６μＭ  ＦＩＰ及びＢＩＰ；０．２μＭ  Ｆ３及びＢ３、並びに；０．４μＭループＦ及びＢ。同化プローブを、ＦＡＭ  Ｓｅ０１  Ｆプローブ、ＦＡＭ  Ｓｅ０１  Ｂプローブ、及びラムダファージＦプローブをそれぞれ０．０８μＭで、並びに０．４μＭのクエンチャープローブ０１の濃度で反応混合物中に含有させた。
【００８４】
他の試薬の濃度は以下のとおりであった：４００μＭ  ｄＮＴＰ；１．０Ｍベタイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．８）；１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4；８ｍＭ  ＭｇＳＯ4；０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；８Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、及び；テンプレートＤＮＡ（５０ｎｇサルモネラ菌ＤＮＡ及び／又はラムダＤＮＡについては５ｎｇ）。
【００８５】
ＬＡＭＰ反応の実時間モニタリングのために、反応混合物を６５℃で６０分間インキュベートし、そして蛍光シグナル（フルオレセイン；λｅｘ／ｅｍ＝５００／５３０、Ｃｙ３；λｅｘ／ｅｍ＝５５０／５７０）をｉＱ５実時間ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して１分ごとに測定した。次いで８０℃に１０分間加熱することにより反応を終了させた。各サンプルについて反応を四重に行い、そして蛍光値を反応の各時点についてサンプルの各組について平均した。チャネル間の蛍光データの比較のために、０及び１，０００ＲＦＵが、反応の間に所定のチャネルにおいて最も広い範囲の蛍光値で平均されたサンプルについて観察された最小及び最大の蛍光値にそれぞれ対応する場合の値に対して、全ての蛍光値を正規化した。
【００８６】
ポリメラーゼを加えた後、この混合物を約６５℃で約６０分間インキュベートした。ポリメラーゼを変性させるために約８０℃に加熱することにより反応を終了させた。増幅産物を約８５Ｖで約９０分間、約２％アガロースゲル（１×Ｔｒｉｓ−アセテート−ＥＤＴＡ）を通して電気泳動させ、続いて適切なサイズマーカー（例えばＨｙｐｅｒ  ｌａｄｄｅｒ  ＩＩ；Ｂｉｏｌｉｎｅ  ＵＳＡ、Ｉｎｃ．、Ｒａｎｄｏｌｐｈ、ＭＡ）を使用して臭化エチジウムで染色した。
【００８７】
ＬＡＭＰ反応を、分子ジッパー及び同化プローブを使用して実時間でモニタリングした。分子ジッパーを、種特異的プライマー（例えば、青枯病菌の全ての株からのＤＮＡの増幅を生じたプライマー）から生じたＬＡＭＰアンプリコンのループ領域を標的とするように設計した。一実施態様において、分子ジッパーを、約１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（約ｐＨ８．０）及び約１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（約８．０のｐＨ）を含有する緩衝液中で約２μＭのポジティブ鎖（フルオロフォア）及びネガティブ鎖（クエンチャー）を混合し、約９５℃で約５分間加熱し、そして室温までゆっくりと冷却することにより製造した。約０．０４μＭ濃度の分子ジッパーを実時間ＬＡＭＰ反応に使用した。
【００８８】
次いでこれらの分子ジッパーを、種選択的ＬＡＭＰプライマー、標的ＤＮＡ（例えば青枯病菌）を含む反応混合物に加え、そしてネガティブコントロール（例えばラムダファージ由来のＤＮＡ、又はＤＮＡを含有しない反応混合物）に加えた。
【００８９】
同化プローブのＬＡＭＰ反応を検出する能力を調べるために、種特異的プライマーから生じたＬＡＭＰアンプリコンのループ領域を標的とするように設計された同化プローブもまた製造した。特定の実施態様において、ポジティブ鎖（フルオロフォア）及びネガティブ鎖（クエンチャー）を互いに分離したままにし、そしてＬＡＭＰ混合物に直接加えた。フルオロフォアとクエンチャーとの濃度比はそれぞれ約１：１未満であった。
【００９０】
ＬＡＭＰ反応混合物中で起こるＬＡＭＰ反応を検出する分子ジッパー及び同化プローブの能力を、反応混合物から発せられる蛍光から決定した。例えば、ＩＱ５実時間ＰＣＲシステム（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）を使用して蛍光を測定した。
【００９１】
実施例１−ハードウェア性能
カスタムの蛍光光度計を使用して、分子ビーコンを含有するがＬＡＭＰアンプリコンを含有しないネガティブコントロールと比較して、ループ領域の１つを標的とする分子ビーコンで標識されたＬＡＭＰ産物間の差異を首尾よく観察した（データは示していない）。ＡＢＳに様々なサイズの反応ウェルをプリントしたカスタムのＣＤを図４に示す。
【００９２】
実施例２−温度較正及び制御の試験
温度較正を、較正技術を評価するために上で考察したように行った。較正測定を、パターン形成したＡＢＳ及びポリカーボネートにおける反応ウェルで行い、そしてウェル及び透明フィルムを通した放射損失にもかかわらず高度に正確な非接触温度測定値が得られた。例えば、図５は、Ｋ型熱電対により測定された実際のウェル温度と比較した、非接触温度計（例えばパイロメーター）から見積もられた補正されたウェル温度を示す。円はポリカーボネートに切削されたウェルから測定されたデータを表し、一方で三角形はＡＢＳに切削されたウェルから測定されたデータを表す。ウェルを通る放射伝達及びウェル表面からの周囲放射の反射についての係数を見積もるために使用された較正データを図５の挿入図に示す。ポリカーボネートＣＤにおける個々の較正されたウェルの温度において観察された標準誤差は約０．３５℃であった。同じ較正を合計で５つのウェル（ＡＢＳに形成されたいくつかのパターンを含む）に適用し、測定された温度における標準誤差約０．９３℃を得た。後者の結果は、観察された温度における熱放射のスペクトル範囲にわたって、ＡＢＳ及びポリカーボネートの放射率が非常に類似しているということを示唆する。
【００９３】
図６は、補正した非接触温度測定値を使用した、反応ウェルにおいて約６５℃の設定点での温度制御を示す過渡的温度測定値を示す。このデータは、設定点に約１分以内に到達したことを示す。さらに、データの解析により、設定点に到達した後の系の（ｓｙｓｔｅｍ）二乗平均平方根誤差が約０．２７℃であったことがわかった。これらの結果は、反応ウェル内の温度が開示される較正方法の実施態様を使用して高度に制御され得るということを示す。
【００９４】
温度制御の範囲及び速度を改善するために、ＤＮＡをＬＡＭＰの前に変性させてもよい。一実施態様において、これをウェルを加熱するために使用したものより高い出力のレーザーを使用して行ってもよい。さらなる実施態様において、反応ウェルの設計は、その熱質量を限定し、そして断熱を改善するために変更されてもよい。
【００９５】
実施例３−ＬＡＭＰ反応設定
ａ）  細菌株及びＤＮＡ精製
Ｒｓ株ＧＭＩ１０００（Ｒ１Ｂ３）及びＵＷ５５１（Ｒ３Ｂ２）を、Ｎｏｒｍａｎ及びＡｌｖａｒｅｚ（Ｎｏｒｍａｎ、Ｄ．、ａｎｄ  Ａｌｖａｒｅｚ、Ａ．  Ｍ．，「Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈｉａｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄｓ」  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ、７３、６５４−６５８（１９８９）、その全体が参照により本明細書に加入される）にしたがって、改変塩化テトラゾリウム（ＴＺＣ）寒天培地で増殖させた。Ｒs株を約４８〜７２時間約２８℃でインキュベートした。ＤＮＡを、製造者の指示に従ってＷｉｚａｒｄ(R)ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いてこれらの細胞から精製し、そして分光光度法で定量した。ラムダＤＮＡ  ＬＡＭＰ反応のために、精製したラムダＤＮＡを購入した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）。
【００９６】
黄色ブドウ球菌株を、溶原培地（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ  ｂｒｏｔｈ）（ＬＢ）を使用してさらに増殖させ、そして約１８〜２４時間約３８℃でインキュベートした。これらの細胞をｄｄＨ２Ｏに懸濁し、そして１００℃で１５分間熱殺菌した。
【００９７】
多重化検出の実施態様において、サルモネラ菌株をキシロース−リジン−デソキシコレート（ＸＬＤ）寒天培地（Ｚａｊｉｃ−Ｓａｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒａｇａｓ、１９７７）でさらに増殖させ、そして１８〜２４時間３８℃でインキュベートした。Ｗｉｚａｒｄ(R)ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて製造者の指示に従ってこれらの細胞からＤＮＡを精製し、そして分光光度法で定量した。ラムダファージＬＡＭＰ反応のために、精製したラムダＤＮＡを購入した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）。
【００９８】
ｂ）  ＬＡＭＰ反応
単一増幅検出のための同化プローブの実施態様において、そうではないと示されている場合以外は、ＬＡＭＰ反応を２５μｌの総体積を有するＬＡＭＰ反応混合物を使用して行った。特定の実施態様において、反応混合物は、約１．６μＭ  ＦＩＰ及びＢＩＰ、約０．２μＭのＦ３及びＢ３プライマー、並びに約０．４μＭ濃度のループプライマーを含んでいた。
【００９９】
ＬＡＭＰ反応混合物中の他の試薬の濃度は以下のとおりであった：約４００μＭ  ｄＮＴＰ、約１．０Ｍベタイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、約２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ約８．８）、約１０ｍＭ  ＫＣｌ、約１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、約６ｍＭ  ＭｇＳＯ4、約０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びテンプレートＤＮＡ約５０ｎｇ（又はラムダＤＮＡについては約５０ｐｇ）。
【０１００】
ｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰプライマーセットについては、ＧＭＩ１０００株の精製したゲノムＤＮＡをポジティブコントロールとして使用し、そしてｒｋ２２０８．１  ＬＡＭＰプライマーセットについてはＵＷ５５１株のＤＮＡをポジティブコントロールとして使用した。この混合物を約９５℃に約５分間加熱し、次いで約８Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を加える前に氷上で冷却した。ポリメラーゼを加えた直後に、反応混合物を約６５℃で約６０分間インキュベートし、次いで約８０℃に加熱することにより反応を終了させた。
【０１０１】
多重化増幅検出のための同化プローブの実施態様について、そうではないと示されている場合を除いて、ＬＡＭＰ反応を２５μｌの総体積を有するＬＡＭＰ反応混合物を使用して行った。特定の実施態様において、反応混合物は約１．６μＭ  ＦＩＰ及びＢＩＰ、約０．２μＭ  Ｆ３及びＢ３、並びに約０．４μＭループＦ及びＢを含んでいた。同化プローブはまた、反応混合物中にＦＡＭ  Ｓｅ０１  Ｆプローブ、ＦＡＭ  Ｓｅ０１  Ｂプローブ、及びラムダファージＦプローブについてはそれぞれ約０．０８μＭ、そしてクエンチャープローブ０１は約０．４μＭの濃度で含有されていた。
【０１０２】
ＬＡＭＰ反応混合物中の他の試薬の濃度は以下のとおりであった：４００μＭ  ｄＮＴＰ；１．０Ｍベタイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）；１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4；８ｍＭ  ＭｇＳＯ4；０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；８Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、及び；テンプレートＤＮＡ（５０ｎｇサルモネラ菌ＤＮＡ及び／又はラムダＤＮＡについては５ｎｇ）。
【０１０３】
ＬＡＭＰ反応の実時間モニタリングのために、反応混合物を６５℃で６０分間インキュベートし、そして蛍光シグナル（フルオレセイン；λｅｘ／ｅｍ＝５００／５３０、Ｃｙ３；λｅｘ／ｅｍ＝５５０／５７０）を１分ごとにｉＱ５実時間ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して測定した。次いで８０℃に１０分間加熱することにより反応を終了させた。各サンプルについて反応を四重に行い、そして蛍光値を反応の各時点についてサンプルの各組について平均した。
【０１０４】
チャネル間の蛍光分析データの比較のために、０及び１，０００ＲＦＵが、反応の間に所定のチャネルにおいて最も広い範囲の蛍光値で平均されたサンプルについて観察された最小及び最大の蛍光値にそれぞれ対応する場合の値に対して、全ての蛍光値を正規化した。
【０１０５】
反応混合物に加えるテンプレートＤＮＡの量を、使用したＬＡＭＰプライマーによって変更した。例えばラムダファージプライマーの場合、約５ｎｇバクテリオファージラムダＤＮＡを加えた。ｒｋ１２４９．１、ｒｋ２２０８、及びｒｋ２４０３．１プライマーの場合は、約５０ｇ青枯病菌Ｒａｃｅ３  Ｂｉｏｖａｒ２  ＤＮＡを加えた。ｒｓｆｌｉＣプライマーの場合、約５０ｇ青枯病菌ＤＮＡを加えた。Ｓｅ０１プライマーの場合、約５０ｎｇサルモネラ菌ＤＮＡを加えた。Ｓｐａ１プライマーの場合、黄色ブドウ球菌ＤＮＡの熱殺菌した細胞約１．０μｌを加えた。
【０１０６】
ｃ）  ＬＡＭＰ反応のための同化プローブの設計
単一増幅検出のための同化プローブの実施態様において、同化プローブの蛍光鎖を、ｒｓｆｌｉＣループＢ又はｒｋ２２０８．１ループＦプライマー配列を３’末端に、そしてクエンチャープローブに相補的な配列を５’末端に含有するように設計した。同化プローブ中の消光鎖にアニーリングされた場合に、クエンチャー鎖の３’末端に結合されたクエンチャー分子（例えばブラックホールクエンチャー−１）が蛍光を効果的に消光するように、蛍光分子（例えばフルオレセイン）を蛍光プローブの５’末端に結合させた。各プライマー及びプローブの分子構造／配列を表１にまとめる。
【０１０７】
多重化増幅検出のための同化プローブの実施態様において、同化プローブの蛍光鎖を、Ｓｅ０１ループＦ、Ｓｅ０１ループＢ又はラムダファージループＦプライマー配列を３’末端に、そしてクエンチャープローブに相補的な配列を５’末端に含有するように設計した。同化プローブ中の消光鎖にアニーリングされた場合に、クエンチャー鎖の３’末端に結合されたクエンチャー分子（例えばブラックホールクエンチャー−１）が蛍光を効果的に消光するように、フルオレセイン分子をＳｅ０１  Ｆプローブ及びＳｅ０１  Ｂプローブの５’末端に結合し、そしてＣｙ３分子をラムダファージＦプローブの５’末端に結合した。各プライマー及びプローブの分子構造／配列を表２にまとめる。
【０１０８】
実施例４−ｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応についての分子ジッパーの評価
ＬＡＭＰ反応を実時間でモニタリングするための分子ジッパーの性能を調べるために、分子ジッパーをＹｉらにより以前に記載されたプロトコル（Ｙｉ、Ｊ．Ｚ．、Ｗ．Ｄ．Ｚｈａｎｇ、ａｎｄ  Ｄ．Ｙ．Ｚｈａｎｇ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｚｉｐｐｅｒ：ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３４（２００６）、その全体が参照により加入される）にしたがって形成した。ｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰプライマーセットをこの実験において使用し、そして蛍光プローブを、表１に示されるように、ｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰループＢプライマー配列を３’末端側に含有するように設計した。最終濃度約０．４μＭの分子ジッパーをｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応混合物と混合し、そしてこの混合物を約６５℃で約１２０分間インキュベートした。
【０１０９】
蛍光シグナルを、ｉＱ５実時間ＰＣＲ検出システムを使用して観察した。Ｒs株のゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ）、ＧＭＩ１０００をポジティブサンプルとして使用し、そして二重蒸留水（ｄｄＨ2Ｏ）をネガティブコントロールとして使用した。両方の処理を三重に準備し、そして反復したデータを平均して、所定の反応の全期間にわたって平均蛍光プロフィールを生成した（例えば図７）。
【０１１０】
図７に示されるように、分子ジッパーを使用した２つの処理（ＧＭＩ１０００ゲノムＤＮＡ対ｄｄＨ２Ｏ）の蛍光プロフィールに有意な差は観察されなかった。さらに、いずれの反応の過程においても蛍光シグナルの増加は観察されなかった。両方の処理が実質的に高いバックグラウンド蛍光シグナルを示し、この反応温度における分子ジッパーへの蛍光鎖の不完全な会合を示していた。
【０１１１】
実施例５−同化プローブを使用するｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応の実時間モニタリング
反応速度を実質的に犠牲にすることなく実時間でｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応をモニタリングするために、約０．０８μＭの蛍光プローブ及び約０．１６μＭのクエンチャープローブを二本鎖分子ジッパー構造の形成前に直接反応混合物に含有させた。反応混合物を約６５℃で約１２０分間インキュベートし、そして蛍光シグナルをｉＱ５実時間ＰＣＲ検出システムを使用して観察した。
【０１１２】
図８は、同化プローブ前駆体存在下でのｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応の蛍光シグナルが約３０分のインキュベーション後に現れることを示し、分子ビーコンを使用して解明されたｒｓｆｌｉＣ反応速度（実験６）と実質的に一致する。同化プローブ鎖をハイブリダイズさせ、そしてハイブリダイズした同化プローブをＬＡＭＰ反応混合物に加えることはＬＡＭＰ反応を有意に妨げ、ポジティブ反応の出現の遅延をもたらした。しかし、蛍光プローブ及びクエンチャープローブを直接ｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応混合物に加えることにより、プローブを用いたｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰの速度は劇的に改善され、抑制されていないｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応の速度を示した。
【０１１３】
二本鎖ＤＮＡプローブは約６５℃で動力学的平衡状態にあり、蛍光プローブ及びクエンチャープローブ分子は絶えず解離及び再会合しており、プローブのＬＡＭＰアンプリコンとの相互作用を容易にする。これらの条件下でバックグラウンド蛍光を抑えるために、蛍光プローブがＬＡＭＰアンプリコンに同化される（ａｓｓｉｍｉｌａｔｅｄ）場合にのみ消光されない蛍光が生じるように、クエンチャープローブの濃度は蛍光プローブの濃度より高くするべきである。
【０１１４】
実施例６−ＬＡＭＰ反応速度に対する蛍光プローブとクエンチャープローブとの比の試験
分子ジッパーの蛍光プローブとクエンチャープローブとの比を、ｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応をモニタリングするための同化プローブを提供するために調整した。蛍光プローブのバックグラウンドシグナルを減少させるために、クエンチャープローブに対する蛍光プローブの比を約１：２まで低くした。ＬＡＭＰ反応をモニタリングするために、約０．０８の蛍光プローブ及び約０．１６μＭのクエンチャープローブを含む結果として得られた約０．０８μＭの同化プローブをｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応混合物と混合した。蛍光及びクエンチャープローブの配列特異性を検証するために、ラムダＤＮＡ  ＬＡＭＰプライマーセットを実時間ＬＡＭＰのためのコントロールとしてｒｓｆｌｉＣ同化プローブと共に使用した。
【０１１５】
同化プローブのＬＡＭＰアンプリコンへの同化に伴う蛍光シグナルは、ＧＭＩ１０００ゲノムＤＮＡを含むｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応混合物からのみ観察され、ラムダＤＮＡ  ＬＡＭＰ反応からは観察されなかった。この観察はｒｓｆｌｉＣ  同化プローブの配列特異性を実証する。
【０１１６】
アガロースゲル電気泳動分析を、ｒｓｆｌｉＣ及びラムダＤＮＡ  ＬＡＭＰアンプリコンの両方の存在をそれぞれの反応において確認するためにさらに行った。蛍光プロフィール（図９）は、所定の濃度の同化プローブを使用してｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応を検出することができるが、約６５℃で約６０分のインキュベーション後のみであるということを示した。対照的に、同化プローブが存在しない場合のｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応は、典型的には約６５℃で約６０分以内に大量のアンプリコンを生じた。これは、重合反応の副生成物である沈殿したピロリン酸マグネシウムの蓄積、及び分子ビーコン（以下の実験７を参照のこと）又はゲル電気泳動を用いた様々な間隔で停止された反応の調査により観察され得る。この結果は、同化プローブの存在がＬＡＭＰ反応におけるループプライマーのアニーリングを阻害し得、その全体の進行を遅らせ得るということを示唆する。従って、同化プローブの全体の濃度は、実時間配列特異的検出をなお可能にしながらＬＡＭＰ反応が完全な速度で進行することを可能にするように選択された範囲内で変更され得る。
【０１１７】
実施例７−分子ビーコンによるｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰプライマーセットの速度の測定
ｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応の真の速度を決定するために、表１に示される分子ビーコンを、ｒｓｆｌｉＣループＦ及びループＢ領域を標的とするように設計した。約０．４μＭの分子ビーコンをｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応に加え、そして約６５℃でそれぞれ約０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０分間インキュベートした。各反応を、約８０℃で約１０分間インキュベートすることにより終了させた。分子ビーコンを含むｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ混合物の蛍光強度を、反応を終了させた後に約２５℃で測定した。分子ビーコンが反応を遅らせなかったことを検証するために、分子ビーコンを用いずに様々な間隔で停止させた反応を、ｒｓｆｌｉＣアンプリコンの存在を確認するためにアガロースゲル電気泳動にかけた。
【０１１８】
図１０は、時間の関数としての相対的蛍光についての結果を示す。図１０の結果は、ｒｓｆｌｉＣループＦ及びＢ領域について両方の分子ビーコンが、ｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰアンプリコンのそれらの標的領域に首尾よくハイブリダイズすることができるということを示す。両方の分子ビーコンの配列特異性もまた、ネガティブコントロールとしてラムダＤＮＡ  ＬＡＭＰ反応を使用して確認した（データは示していない）。分子ビーコンのデータは、ｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応からの検出可能な量のアンプリコンの増殖が約３０分以内のインキュベーションで生じ、そして約５５分前後のインキュベーションで飽和が起こるということをさらに示した。
【０１１９】
分子ビーコンを含まないｒｓｆｌｉＣ反応のアガロースゲル電気泳動分析はまた、分子ビーコン含有反応における蛍光の開始と相関する、約３０分に始まるかすかなバンドの出現を示した（データは示していない）。これらの結果は、実験６の結果と比較して、分子ジッパーがｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰ反応の速度を有意に減少させるという結論を支持する。
【０１２０】
実施例８−ＬＡＭＰ反応速度に対する増加したポリメラーゼ濃度の影響
ｒｓｆｌｉＣ及びＲ３Ｂ２特異的ｒｋ２２０８．１  ＬＡＭＰプライマーセットを使用してＬＡＭＰ反応を開始させ、約０．０８μＭ濃度の蛍光プローブ及び約０．１６μＭのクエンチャープローブで対応する同化プローブを使用して実時間でモニタリングした。同化プローブを、二本鎖分子ジッパー構造の形成前に反応混合物中に直接含めた。反応速度の動力学的制約を調べるために、各プライマーセットを用いた反応を異なる量（約８Ｕ又は約１６Ｕ）のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して行った。
【０１２１】
図１１に示されるように、ｒｋ２２０８．１プライマーセットを使用したＬＡＭＰ反応は、約８ＵのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合に約２０分以内に、そして約１６Ｕを使用した場合は約１０分以内に観察可能な蛍光の増加を生じた。ｒｓｆｌｉＣ  ＬＡＭＰプライマーセットを用いたＬＡＭＰ反応は、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ濃度に関わらず約３０分以内に観察可能な蛍光の増加を生じた。
【０１２２】
この結果は、ｒｋ２２０８．１反応の律速プライマーアニーリング段階の正（ｆｏｒｗａｒｄ）結合速度定数が、ｒｓｆｌｉＣ反応における対応する速度よりも有意に高いことを示した。この改善されたアニーリング速度は、ポリメラーゼ活性の増加によりｒｋ２２０８．１反応において比例した速度論的増進が観察され得るのに有意に十分であった。反応におけるポリメラーゼ濃度の対応する増加により、さらなる増進が観察され得る。
【０１２３】
実施例９−ｒｋ２２０８．１  ＬＡＭＰでのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ濃度の検出速度及び反応速度論に対する影響のさらなる試験
Ｒ３Ｂ２特異的ｒｋ２２０８．１  ＬＡＭＰプライマーセットを使用してＬＡＭＰ反応を開始し、そして約０．０８μＭ蛍光プローブ及び約０．１６μＭクエンチャープローブの濃度を用いて対応する同化プローブを使用して実時間でモニタリングした。二本鎖分子ジッパー構造の形成前に反応混合物に同化プローブを直接含有させた。反応速度の動力学的制約を調べるために、各プライマーセットとの反応を、異なる量（約０Ｕ、約４Ｕ、約８Ｕ、約１２Ｕ、約１６Ｕ、約２０Ｕ、約２４Ｕ、約２８Ｕ、及び約３２Ｕ）のＢｓｔ  ＤＮＡを使用して行った。
【０１２４】
ｒｋ２２０８．１プライマーセットを使用したＬＡＭＰ反応は、約４ＵのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの場合に約３０分以内に観察可能な蛍光増加を生じた（図１２）。ポリメラーゼ濃度を約８Ｕに増加させると、蛍光はより短い時間（約２０分後）で観察された。ポリメラーゼ濃度を約１５Ｕより高く増加させると（例えば、約１５Ｕ、約２０Ｕ、約２４Ｕ、約２８Ｕ、及び約３２Ｕ）、約１０〜１５分以内に観察可能な蛍光が生じた。
【０１２５】
Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ濃度を増加させることは、最大速度に達するまでの時間の増加をさらにもたらす。図１３は、毎分の蛍光増加の最大速度に達するまでの時間との関係を示す。最大速度までの時間は、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ濃度を約４Ｕから約３２Ｕに増加させるのに伴って約４０分から約１５分に減少する。
【０１２６】
実施例１０−ループプライマーを含まない、ｒｋ２２０８．１  ＬＡＭＰプライマーセットのための同化プローブ組成の試験
ループプライマーを含まないｒｋ２２０８．１  ＬＡＭＰプライマーセットを、ＬＡＭＰ反応混合物から蛍光を検出するための時間に対する蛍光プローブ及びクエンチャープローブの量の影響を決定するために使用した。ループプライマーを用いないＬＡＭＰ反応において、それぞれ約０．１６μＭ、約０．８μＭ、及び約１．６μＭのクエンチャープローブ濃度と混合された、約０．０８μＭ、約０．４μＭ、及び約０．８μの蛍光プローブ濃度を使用して反応を行った。これらの試験の結果を図１４に示す。円は低いプローブ濃度（約０．０８μＭ蛍光プローブ及び約０．１６μＭクエンチャープローブ）を表し、三角形は中程度のプローブ濃度（約０．４μＭ蛍光プローブ及び約０．８μＭクエンチャープローブ）であり、そして四角形は高い中程度のプローブ濃度（約０．８μＭ蛍光プローブ及び約１．６μＭクエンチャープローブ）である。網掛けの記号はテンプレートＤＮＡを含む反応であり、そして白抜きの記号はネガティブコントロール（ｄｄＨ2Ｏ）である。
【０１２７】
図１４に示されるように、概して、反応混合物中のより多い量の同化プローブの存在は、観察可能な蛍光の増加の開始のより長い遅延をもたらした。この結果は、より高濃度の同化プローブがｒｋ２２０８．１  ＬＡＭＰ反応の速度を妨害し得るということを裏付けた。この実験はまた、ループプライマーが存在しない場合でも同化プローブがＬＡＭＰアンプリコン中に取り込まれ得るということを実証する。これらの結果はさらに、同化プローブによる反応の阻害がループプライマーのアニーリング及び伸長とは別にＬＡＭＰプロセスにおける段階に影響を及ぼすということを示唆する。
【０１２８】
実施例１１−ループプライマーを含むｒｋ２２０８．１  ＬＡＭＰプライマーセットのための同化プローブ組成の試験
ループプライマーを含むＬＡＭＰ反応に対する同化プローブ組成の効果を決定するために、ループプライマーを反応に含めた後に実験１０を繰り返した。実験の結果を図１５に示し、ここで円は低いプローブ濃度（約０．０８μＭ蛍光プローブ及び約０．１６μＭクエンチャープローブ）を表し、三角形は中程度のプローブ濃度（約０．４μＭ蛍光プローブ及び約０．８μＭクエンチャープローブ）であり、そして四角形は高い中程度のプローブ濃度（約ｔ０．８μＭ蛍光プローブ及び約１．６μＭクエンチャープローブ）である。網掛けの記号はテンプレートＤＮＡを含む反応であり、そして白抜きの記号はネガティブコントロール（ｄｄＨ2Ｏ）である。
【０１２９】
図１５に示されるように、試験した低濃度でのｒｋ２２０８．１のための同化プローブ（約０．０８μＭ蛍光プローブ及び約０．１６μＭクエンチャープローブ）は、約２０分後に蛍光シグナルを生じた。中程度の濃度（約０．４μＭ蛍光プローブ及び約０．８μＭクエンチャープローブ）では、約７０分後に増加した蛍光を生じた。最も高い同化プローブ濃度を含む反応（約０．８μＭ蛍光プローブ及び約１．６μＭクエンチャー鎖）は、約１２０分の反応の間のいずれの時点でも増加した蛍光を生じなかった。この結果は、より高い濃度の同化プローブがｒｋ２２０８．１  ＬＡＭＰ反応の速度を妨害すること、及びｒｋ２２０８．１ループＦプライマーの存在が反応の速度を増大するということを裏付けた。
【０１３０】
実施例１２−挿入色素（ＥｖａＧｒｅｅｎ）のＬＡＭＰ反応及び速度に対する影響の評価
挿入色素（ＥｖａＧｒｅｅｎ）のＬＡＭＰ反応に対する影響を評価するために、ＥｖａＧｒｅｅｎをｒｋ２２０８．１  ＬＡＭＰ反応混合物に加え（ｒｋ２２０８．１ループＦプライマーを含むもの及び含まないもの）、そして蛍光シグナルを測定することにより反応を観察した。これらの条件下での増加した蛍光の開始の時間を、最適な同化プローブ組成を用いるｒｋ２２０８．１  ＬＡＭＰ反応の速度と比較した。この実験の結果を図１６に示す。
【０１３１】
ＥｖａＧｒｅｅｎを用いたｒｋ２２０８．１  ＬＡＭＰ反応（ｒｋ２２０８．１ループＦプライマーを含むもの及び含まないもの）は、それぞれ約３０分及び約８０分のインキュベーション後に蛍光シグナルを示した。同化プローブを用いたＲｋ２２０８．１  ＬＡＭＰ反応は約２０分以内に反応を示した。これらの結果は、挿入色素がｒｋ２２０８．１
ＬＡＭＰ反応を有意に阻害するということを示唆した。この酵素は鎖置換活性を有し、そして挿入色素は二本鎖ＤＮＡを安定化するので、ＥｖａＧｒｅｅｎはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの有効性を妨害し得る。
【０１３２】
実施例１３−サルモネラ菌及びバクテリオファージラムダゲノムＤＮＡの同時ＬＡＭＰベースの検出のための同化プローブ性能の試験
図１７は、サルモネラ菌及びバクテリオファージラムダゲノムＤＮＡを増幅するＬＡＭＰ反応についての時間に対する相対的蛍光のプロットである。蛍光値を、フルオレセインチャネル（λｅｘ／ｅｍ＝５００／５３０−Ｓｅ０１Ｆのためのプローブ標識）及びｃｙ３チャネル（λｅｘ／ｅｍ＝５５０／５７０−ラムダファージＦのためのプローブ標識）で測定した。サルモネラ菌及びバクテリオファージラムダゲノムＤＮＡの両方を含有するサンプルを塗りつぶした円（●／●）で表し、テンプレートＤＮＡを含まないネガティブコントロールを白抜きの円（○／○）で表し、サルモネラ菌ゲノムＤＮＡのみを含むサンプルを塗りつぶした三角形（▼／▼）で表し、そしてバクテリオファージラムダゲノムＤＮＡのみを含むサンプルを塗りつぶした菱形（◆／◆）で表す。
【０１３３】
図１８は、サルモネラ菌及び／又はバクテリオファージラムダゲノムＤＮＡを増幅するＬＡＭＰ反応についての時間に対する相対的蛍光のプロットである。蛍光値を、同化プローブを使用した多重検出の間フルオレセインチャネル（λｅｘ／ｅｍ＝５００／５３０−Ｓｅ０１Ｆのためのプローブ標識）で測定した。サルモネラ菌及びバクテリオファージラムダゲノムＤＮＡの両方を含むサンプルを塗りつぶした円（●）で表し、ｄｄＨ２Ｏを用いたネガティブコントロールを白抜きの円（○）で表し、サルモネラ菌ゲノムＤＮＡのみを含むサンプルを塗りつぶした三角形（▼）で表し、そしてバクテリオファージラムダゲノムＤＮＡのみを含むサンプルを塗りつぶした菱形（◆）で表す。
【０１３４】
図１９は、サルモネラ菌及び／又はバクテリオファージラムダゲノムＤＮＡを増幅するＬＡＭＰ反応についての時間に対する相対的蛍光のプロットである。蛍光値を、同化プローブを使用した多重化検出の間ｃｙ３チャネル（λｅｘ／ｅｍ＝５５０／５７０−ラムダファージＦのためのプローブ標識）で測定した。サルモネラ菌及びバクテリオファージラムダゲノムＤＮＡの両方を含むサンプルを塗りつぶした円（●）で表し、ｄｄＨ２Ｏを用いたネガティブコントロールを白抜きの円（○）で表し、サルモネラ菌ゲノムＤＮＡのみを含むサンプルを塗りつぶした三角形（▼）で表し、そしてバクテリオファージラムダゲノムＤＮＡのみを含むサンプルを塗りつぶした菱形（◆）で表す。
【０１３５】
特に、図１７、１８、及び１９の各実施例において、個々の病原体に対して独特な配列特異的同化プローブをスペクトル的に独特のフルオロフォアと共に使用することにより、異なる病原体を同時に特異的に検出することができる。
【０１３６】
要約すれば、いくつかの強力な新しい技術の実施態様が開示され、これは単独で、又はいずれかの組み合わせで、非常に類似した抗原決定基を示すにもかかわらす、宿主特異性、病原性、又は蔓延する疾患に重要な他の生物学的特徴においてかなり異なり得る細菌性病原体の密接に関連した亜集団のはるかに迅速なタイピングを可能にし得る。遺伝子ベースの技術は、目的の様々な集団を区別するために所定の配列データに容易に移され得る。ＤＮＡ複製に対して等温アプローチを使用することにより、検出の感度及び選択性が、熱サイクルの装置の費用、複雑さ、及びエネルギー必要量を加えることなく比較的大きなサンプル体積でも改善される。
【０１３７】
標準的なデジタル媒体と類似した仕様のレーザー、並びに反応ウェル及び周囲熱放射の反射による伝達損失を補正した後の非接触温度測定値を使用して、コンパクトディスク媒体でのＬＡＭＰ反応のために工程温度を制御することができるということが実証された。
【０１３８】
光学プローブを使用して実時間でＬＡＭＰ複製の進行を観察することができるということも実証された。分子プローブのハイブリダイゼーション条件に影響を及ぼし、かつ検出の改善された速度及び感度を生じ得るパラメーターが同定された。これらのパラメーターには、蛍光プローブに対するクエンチャーの比、同化プローブを生成するために鎖を混合する方法、ポリメラーゼ濃度、及びＬＡＭＰ反応混合物内の同化プローブの総量が含まれ得る。
【０１３９】
ＣＤベースのシステムを用いるカスタムの蛍光光度計の性能は、この反応がＣＤ媒体で実時間でモニタリングされ得ることを示唆し、そしてこれを確実に実証するための実験が進行中である。非接触制御と、サンプル捕捉、洗浄、溶解、及びＤＮＡ抽出の遠心分離ベースの配列決定を用いた検出システムとの統合は、現場において、そして動物及び植物の検疫の状況での病原体の検出を可能にする、迅速でユーザーフレンドリーなシステムを生じ得る。
【０１４０】
前述の記載は本教示の基本的な新規の特徴を示し、記載し、そして指摘してきたが、当然のことながら、示された装置の細部の形態の様々な省略、置換、変更、及び／又は追加、さらにはそれらの使用が、本教示の範囲から逸脱することなく、当業者により為され得る。それ故、本教示の範囲は、前述の考察に限定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲によって規定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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