(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）および（２）の反応工程を含み、さらに（５）の工程を含む、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
（１）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からフルクトシルバリルヒスチジンを切り出す能力を有するプロテアーゼにより、糖化タンパク質を糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに断片化する反応
（２）断片化されたフルクトシルバリルヒスチジンに反応し、かつ、以下の（ａ）および（ｂ）に示す特性を満たすフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、該フルクトシルバリルヒスチジンと酸化還元反応を行い、発生した過酸化水素または酸素を定量する反応
（ａ）フルクトシルリジンに対する反応性がフルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性の３０％以下であること。
（ｂ）フルクトシルバリルヒスチジンに対するＫｍ値が０．９ｍＭ以下であること。
（５）フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含む第一試薬およびプロテアーゼを含む第二試薬の２種類の試薬を用意し、
ここで、第二試薬は、第一試薬と合わせることによって、前記（１）および（２）の反応工程に必要な物質を全て含むよう構成されており、
まず、測定対象物と第一試薬とを混合させ、
次いで、前記の測定対象物と第一試薬との混合物に、さらに第二試薬を混合させることにより（１）および（２）の反応工程を開始させる。
【請求項２】
請求項１に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、
第一試薬は、以下の（３）および（４）の反応工程に必要な物質を全て含み、
まず、測定対象物と第一試薬とを混合することにより（３）および（４）の反応工程を開始させる工程を含むヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
（３）フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、測定対象物中に存在する遊離の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドと酸化還元反応を行い、過酸化水素を発生させる反応。
（４）発生した過酸化水素を、（１）および（２）の反応工程に影響を与えないように変化させる反応。
【請求項３】
請求項２に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、プロテアーゼを添加してから反応タイムコースがエンドになるまでの時間が５分以下である、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
【請求項４】
請求項２に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、プロテアーゼを添加してから反応タイムコースがエンドになるまでの時間が２．５分以下である、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
【請求項５】
請求項２に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、プロテアーゼを添加してから反応タイムコースがエンドになるまでの時間が１分以下である、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかに記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、ヘモグロビンＡ１ｃの測定が行われている間のいずれかの時点で、ヘモグロビンが本来有している色の吸光度、または、ヘモグロビンが酸化した物質の吸光度を測定することにより、ヘモグロビンの測定を行う、ヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃとを同時に測定する方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）に記載のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質である、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
（Ｉ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ＩＩ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、下記の（ａ）から（ｃ）に示す特性を全て有する、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）ＦＶＨに反応する。
（ｂ）ＦＫに対する反応性がＦＶＨに対する反応性の３０％以下である。
（ｃ）ＦＶＨに対するＫｍ値が０．９ｍＭ以下である。
【請求項８】
請求項７に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、（ＩＩ）に記載のタンパク質であって、アミノ末端から５８番目のイソロイシン、アミノ末端から１１０番目のグリシンおよびアミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンのうち少なくとも１箇所以上が他のアミノ酸に置換されているタンパク質である、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
【請求項９】
請求項７に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの熱安定性が、以下の（ｘ）または（ｙ）のいずれかである、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
（ｘ）５０℃１０分処理後の酵素残存活性が７０％以上である。
（ｙ）５５℃１０分処理後の酵素残存活性が２０％以上である。
【請求項１０】
請求項７に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの「フルクトシルバリンに対する反応性の、フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する比率」が５．０以下である、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［１］
本発明は、ヘモグロビンＡ１ｃ（以下ＨｂＡ１ｃとも記載）の測定方法に関する。ＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビンのβ鎖が糖化された糖化タンパク質のことである。
【背景技術】
【０００２】
［２］
［２−１］
糖尿病患者の血糖コントロールマーカーとして、血液中に含まれる糖化タンパク質であるヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）や、グリコアルブミンの測定が重用されている。これらの糖化タンパク質は、血液中に存在するＤ−グルコースと、血液タンパク質を構成するアミノ酸残基とが非酵素的に反応して生成するため、血液中のグルコース量をよく反映する。
【０００３】
血液タンパク質の主な糖化部位は、内部リジン残基のε−アミノ基、およびアミノ末端（Ｎ末端）アミノ酸のα−アミノ基である。例えば、アルブミンでは、内部リジン残基のε−アミノ基にＤ−グルコースが結合して糖化タンパク質が生じる。また、ヘモグロビンでは、内部リジン残基のε−アミノ基、もしくは、α鎖またはβ鎖のＮ末端アミノ酸であるバリンのα−アミノ基にＤ−グルコースが結合して糖化タンパク質が生じる。
【０００４】
糖尿病の診断に際しては、糖化タンパク質のなかでも、２〜３ヶ月の中期的な生活習慣を反映するとされるＨｂＡ１ｃ（ヘモグロビンのβ鎖が糖化された糖化タンパク質）が重要であるとされている。
【０００５】
［２−２］
近年、血液中の糖化タンパク質を簡便且つ短時間で測定できる酵素的測定法（以下、「酵素法」と称する。）が開発され、既に商品化されている。酵素法を利用することにより、糖化タンパク質をハイスループットに測定することが可能となり、臨床検査分野で役立てられている。
【０００６】
これまでに例えば以下のような酵素法が知られている。
まず、プロテアーゼで糖化タンパク質を加水分解し、次に、加水分解で生じたフルクトシルバリン（以下ＦＶとも記載）、フルクトシルリジン（以下ＦＫとも記載）、フルクトシルバリルヒスチジン（以下ＦＶＨとも記載）などの糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドをフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下ＦＡＯＤとも記載）で酸化的加水分解する。最後に、オキシダーゼ反応により生じた過酸化水素を、ペルオキシダーゼ−色原体反応システムにより比色定量する。
【０００７】
すなわち上記の酵素法は、以下の（１）および（２）の反応を含む。
（１）プロテアーゼにより、糖化タンパク質を糖化アミノ酸または糖化ペプチドに断片化する反応（以下「断片化反応」とも記載）
（２）断片化された糖化アミノ酸または糖化ペプチドとＦＡＯＤとが酸化還元反応を行い、これによって発色する反応（以下「発色反応」とも記載）
【０００８】
これらの酵素法を実施する手段は特に限定されず、市販の器具や機器を適宜選択して使用して良いが、汎用の自動分析機（たとえば、日立７１８０形自動分析機）を用いるのが便利である。
これらの自動分析機に酵素法を適用するためには、典型的には、測定前に、酵素法を実施するための試薬を、液状の２剤（第一試薬（以下Ｒ１とも記載）、第二試薬（以下Ｒ２とも記載））に分けて調製する。
典型的な測定パターンは、測定セルに試料を分注したあと、第一試薬を投入し数分間（たとえば、前出の日立７１８０形自動分析機では約５分間）一定温度で保持（この工程を以下第一反応とも記載）した後、第二試薬を投入してさらに数分間（たとえば、前出の日立７１８０形自動分析機では約５分間）一定温度で保持（この工程を以下第二反応とも記載）する。
この手順においては、典型的には、プロテアーゼをＲ１に、ＦＡＯＤをＲ２に配することにより、Ｒ１投入後に「断片化反応」が開始され、次いでＲ２投入後に「発色反応」が開始される。そして、この間にほぼ一定の時間間隔で吸光度が継続して測定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−２７５０１３
【特許文献２】特開２００３−２３５５８５
【特許文献３】ＷＯ２００４／１０４２０３
【特許文献４】ＷＯ２００７／１２５７７９
【特許文献５】ＷＯ２００４／０３８０３３
【特許文献６】ＷＯ２００４／０３８０３４
【特許文献７】ＷＯ２００５／０５６８２３
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １８０：  ２２７−２３１  （２００３）
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ３１１：  １０４−１１１  （２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
［３］
［３−１］
酵素法による糖化タンパク質の測定では、主反応酵素の一つであるＦＡＯＤの基質特異性が重要な要素となる。
【００１２】
ＨｂＡ１ｃの測定においては、糖化ヘモグロビンのβ鎖に特異的な測定を行うために、以下の（１）〜（４）に示すような基質特異性を有するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが望まれている。
【００１３】
（１）フルクトシルバリルヒスチジン（ＦＶＨ）に作用すること。
これは、ヘモグロビンα鎖およびβ鎖のＮ末端アミノ酸が共にバリンであることから、β鎖に特異的な測定を行うためには、β鎖のＮ末端アミノ酸２残基（すなわち、フルクトシルバリルヒスチジン）を、α鎖のＮ末端アミノ酸２残基（すなわち、フルクトシルバリルロイシン）と区別して認識する必要があるためである。
【００１４】
（２）フルクトシルバリルロイシン（ＦＶＬ）に対する反応性が低いこと。
（３）フルクトシルバリン（ＦＶ）に対する反応性が低いこと。
このことから、当然に、ヘモグロビンβ鎖に特異的な測定を行うためには、α鎖のＮ末端アミノ酸２残基（すなわち、フルクトシルバリルロイシン（以下ＦＶＬとも記載））に対する反応性が低いこと、および、フルクトシルバリンに対する反応性が低いことが望まれる。
【００１５】
（４）フルクトシルリジン（ＦＫ）に対する反応性が低いこと
さらに、ＨｂＡ１ｃの測定においては、プロテアーゼによる糖化タンパク質の加水分解工程で、不所望なフルクトシルリジンが比較的多量に生じる場合があるため、当該フルクトシルリジンに対する反応性が低いフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが望まれる。
この点は、特に糖化アルブミンと区別して測定を行うために重要である。すなわち、血液サンプル中には糖化アルブミンが含まれているので、ＨｂＡ１ｃを測定する場合には、この影響を回避する必要がある。糖化アルブミンは、アルブミンのリジン残基のε−アミノ基が糖化されているため、プロテアーゼによる切断によって発生するフルクトシルリジンにＦＡＯＤが反応すると、測定値が高値化する。
【００１６】
［３−２］
我々の検討によれば、上記の（１）〜（４）に示す基質特異性の全てを有し、かつ、その程度が実用上十分なレベルを満足させるＦＡＯＤは、これまで見出されていない。
【００１７】
例えば、特許文献１では、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するオキシダーゼ（実質的にＦＡＯＤと同義）を生産する菌株がスクリーニングされている。
しかしながら、特許文献１の実施例に示されているネオコスモスポラ・バシンフェクタ、コニオケチジウム・サボリ、アルスレニウム・エスピーＴＯ６、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３、レプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０、プレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２、オフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来の各ＦＡＯＤは、ＦＶＨに反応し、ＦＶＬへの作用は全くないかＦＶＨと比較して約５分の１〜約１５６分の１であるものの、ＦＶに対して最も高い反応性を示す。
【００１８】
また、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するオキシダーゼ（実質的にＦＡＯＤと同義）に関して、遺伝子組み換え体を用いて当該オキシダーゼの産生、抽出、及び精製を行った報告があり、該オキシダーゼをコードする遺伝子も単離されている（特許文献２、特許文献３、非特許文献１、非特許文献２参照）。
【００１９】
しかしながら、特許文献２の実施例に示されているアカエトミエラ属、アカエトミウム属、シエラビア属、カエトミウム属、ゲラシノスポラ属、ミクロアスカス属、コニオカエタ属、ユウペニシリウム属の各糸状菌が生産する酵素は、それぞれＦＶＨに反応するものの、ＦＫに対しても反応する。
また、特許文献４には、上記のうち、コニオカエタ属、ユウペニシリウム属の各糸状菌が生産する酵素をさらに改変させた酵素が例示されているが、これらの改変酵素もそれぞれＦＶＨに反応するものの、ＦＫに対しても反応する。
【００２０】
特許文献３には、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来のケトアミンオキシダーゼ（ケトアミンオキシダーゼはＦＶＨに反応するため実質的にＦＡＯＤと同義）をさらに改変させた酵素がいくつか例示されており、ＦＫに対する反応性がＦＶＨに対する反応性の２．５％にまで低減させたことが記載されている。しかしながら、当該酵素は、ＦＶに対してＦＶＨより高い反応性を有する。
また、特許文献３には、ネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来の酵素、および、該酵素をさらに改変させた酵素が例示されているが、いずれもＦＫに対する反応性がＦＶＨに対する反応性の２０％にまでしか低減されていないし、ＦＶに対してＦＶＨより高い反応性を有する。
【００２１】
特許文献５には、バラ科、ブドウ科又はセリ科植物由来の脱フルクトシル化酵素（実質
的にＦＡＯＤと同義）が開示されている。また、特許文献６には、ショウガ科植物由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（実質的にＦＡＯＤと同義）が開示されている。
しかしながら、これらの酵素は、それぞれＦＶＨに反応するものの、ＦＶに対しても反応する。また、その他の基質に対する特異性は不明である。
【００２２】
［３−３］
上記に示したとおり、［３−１］で示した（１）〜（４）に示す基質特異性の全てを有し、かつ、その程度が実用上十分なレベルを満足させるＦＡＯＤは知られていない。
それにもかかわらず、いくつかの先行文献において「ＨｂＡ１ｃの測定方法」と称される方法が開示されているが、これらの方法においては、ＦＡＯＤ単独ではヘモグロビンβ鎖とα鎖との区別が不十分であるためヘモグロビンβ鎖に特異的な測定ができないので、さらに他の手段を組み合わせて複雑な測定系を構築することにより、測定系全体としてヘモグロビンβ鎖に特異的な測定を達成したと考えられる。
【００２３】
そのような測定系の一つに、プロテアーゼ消化後に生じるＦＶＨ以外の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを、ＦＶＨの測定に影響を与えないように変化させ測定系外に除去する方法がある。
例えば、特許文献２では、プロテアーゼ消化後に生じるＦＫを、ＦＫに作用する酵素で消化した後、ＦＶＨを測定する方法について言及されている。しかしＦＫのみを測定系から除いただけでは、ＦＶが残るため、依然としてヘモグロビンβ鎖とα鎖との区別ができない。
【００２４】
また、そのような測定系の一つに、ＦＡＯＤとプロテアーゼの組み合わせや、反応条件などを検討することにより、測定系全体としてヘモグロビンβ鎖に特異的な測定を可能にさせる方法がある。
例えば、特許文献３には、基質特異性が不十分なＦＡＯＤを使用する場合であっても、ＦＡＯＤとプロテアーゼの特定の組み合わせや、反応条件の選定などを検討した結果、測定系全体としてヘモグロビンβ鎖に特異的な測定が可能であるとされる方法が、いくつか開示されている。
しかしながら、これらの測定系は、２剤を越える数の試薬を必要とする方法であるため、汎用の自動分析機に適用することはできない（実施例には、Ｒ１、Ｒ２以外にも種々の試薬を必要とすることが記載されている。）。
また、特許文献３では、実施例に記載された試薬組成・処方においては、測定系全体としてヘモグロビンβ鎖に特異的な測定が可能になっていることが確認されているとされるが、これらの測定系は非常に複雑に構築されているため、明細書の記載に基づく限り、実施例に記載されている組成・処方以外でも、ヘモグロビンβ鎖に特異的な測定ができる確証はない。
さらに、このような複雑な測定系においては、不測の事態によって測定系のバランスが崩れると測定値に大きな影響を及ぼすリスクも考えられる。
【００２５】
［３−４］
また、ＨｂＡ１ｃをより正確に測定するために、測定対象物であるＨｂＡ１ｃがプロテアーゼで加水分解される前に、予め、測定対象物に存在している遊離の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドをＦＡＯＤにより消去する測定系（いわゆる消去系）が開発されてきた。
【００２６】
予め測定対象物に存在している遊離の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドは、例えば、高カロリー輸液用製剤が投与された患者から得られた測定対象物のＨｂＡ１ｃ値を測定する際に問題となる。
その理由は、輸液によって高濃度の糖およびアミノ酸が体内に補充された場合に、血中
もしくは輸液バック中で遊離の糖化アミノ酸または糖化ペプチドが生成するためであると考えられている。特に、ＨｂＡ１ｃ測定の場合には、ＦＡＯＤの基質特異性が厳密でないと、ＦＶやＦＫなどの混入によって測定値が異常に高値を示すことになる。
【００２７】
この消去系を含む糖化タンパク質測定方法は、以下の（１）〜（４）の反応を含む。これらの反応において少なくとも消去反応と除去反応とは、発色反応よりも前に行う必要がある。
（１）遊離アミンをＦＡＯＤで消去する反応（以下「消去反応」とも記載）
（２）消去反応で発生した過酸化水素を除去する反応（以下「除去反応」とも記載）
（３）断片化反応
（４）発色反応
この手順においては、典型的には、ＦＡＯＤをＲ１に、プロテアーゼをＲ２に配することにより、Ｒ１投入後に「消去反応」が開始され、それに引続いてすぐに（ほぼ同時に）「除去反応」が開始される。次いでＲ２投入後に「断片化反応」が開始され、それに引続いてすぐに（ほぼ同時に）「発色反応」が開始される。
【００２８】
例えば、特許文献７の実施例には、第一反応において、ジベレラ属由来ＦＡＯＤ（アークレイ社製）を用いて、試料にもともと含まれるＦＶＨおよびＦＶを予め消去した後に、第二反応において、第一反応で投入された該ＦＡＯＤをそのまま使用して、プロテアーゼで分解されたＦＶＨを測定する方法が開示されている。
しかしながら、特許文献７の実施例において使用されているジベレラ属由来ＦＡＯＤ（アークレイ社製）は、上記のとおりＦＶとも反応するので、依然としてヘモグロビンβ鎖とα鎖との区別ができず、基質特異性は不十分である。
特許文献７では、実施例に記載された特定の試薬組成・処方において、測定系全体としてヘモグロビンβ鎖に特異的な測定が可能になっているとされるが、使用されているメタロプロテイナーゼの由来が明確でなく、明細書の記載に基づく限り、当業者がヘモグロビンβ鎖に特異的な測定ができる方法を確実に再現することができない。（プロテイナーゼは、タンパク質を基質とするペプチド結合加水分解酵素の総称に過ぎない。また、メタロプロテイナーゼは、活性中心に金属を含むプロテイナーゼの総称に過ぎない。いずれも慣用的に用いられている呼び方であり、具体的に、「活性中心に金属を含む」こと以外に何ら物質を特定するものではなく、また、「タンパク質を基質とする」こと以外に何ら物理化学的特性を特定するものでもない。）
さらに、このような複雑な測定系においては、不測の事態によって測定系のバランスが崩れると測定値に大きな影響を及ぼすリスクも考えられる。
【００２９】
［３−５］
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来よりシンプルかつ正確な、ＨｂＡ１ｃの測定方法、ＨｂＡ１ｃの測定用試薬組成物、ＨｂＡ１ｃの測定キット、およびＨｂＡ１ｃの測定用センサー、等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
［４］
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた。その結果、ヘモグロビンβ鎖に特異的な測定を行うためには、意外にも、必ずしも上記［１−１］で示した（１）〜（４）の基質特異性をすべて満たすＦＡＯＤを用いる必要はなく、ＦＶＨに対してある程度以上の基質特異性と親和性を有するＦＡＯＤを用いることにより、すなわち、以下の（ａ）および（ｂ）に示す特性を満たすＦＡＯＤを用いることにより、シンプルで正確性の高い測定方法を構築できることを見出し、本発明に到達した。
（ａ）ＦＫに対する反応性がＦＶＨに対する反応性の３０％以下であること。
（ｂ）ＦＶＨに対するＫｍ値が０．９ｍＭ以下であること。
【００３１】
すなわち本発明の概要は、以下の通りである。
項１．
以下の（１）および（２）の反応工程を含む、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
（１）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からフルクトシルバリルヒスチジンを切り出す能力を有するプロテアーゼにより、糖化タンパク質を糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに断片化する反応
（２）断片化されたフルクトシルバリルヒスチジンに反応し、かつ、以下の（ａ）および（ｂ）に示す特性を満たすフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、該フルクトシルバリルヒスチジンと酸化還元反応を行い、発生した過酸化水素または酸素を定量する反応
（ａ）フルクトシルリジンに対する反応性がフルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性の３０％以下であること。
（ｂ）フルクトシルバリルヒスチジンに対するＫｍ値が０．９ｍＭ以下であること。
項２．
項１に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、さらに、（１）および（２）の反応工程を開始する前に、以下の（３）および（４）の反応工程を含むヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
（３）フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、測定対象物中に存在する遊離の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドと酸化還元反応を行い、過酸化水素を発生させる反応。
（４）発生した過酸化水素を、（１）および（２）の反応工程に影響を与えないように変化させる反応。
項３．
項２に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、
第一試薬および第二試薬の２種類の試薬を用意し、
ここで、第一試薬は、（３）および（４）の反応工程に必要な物質を全て含み、
第二試薬は、第一試薬と合わせることによって（１）および（２）の反応工程に必要な物質を全て含むよう構成されており、
まず、測定対象物と第一試薬とを混合することにより（３）および（４）の反応工程を開始させ、
次いで、上記の測定対象物と第一試薬との混合物に、さらに第二試薬を混合させることにより（１）および（２）の反応工程を開始させる、
ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
項４．
項３に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、測定対象物と第一試薬とを混合してから測定終了までの時間が１０分以下である、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
項５．
項１ないし４に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、ヘモグロビンＡ１ｃの測定が行われている間のいずれかの時点で、ヘモグロビンが本来有している色の吸光度、または、ヘモグロビンが酸化した物質の吸光度を測定することにより、ヘモグロビンの測定を行う、ヘモグロビンとヘモグロビンＡ１ｃとを同時に測定する方法。
項６．
項１ないし５に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）のいずれかに記載のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質である、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
（Ｉ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ＩＩ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、下記の（ａ）から（ｃ）に示す特性を全て有する、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ＩＩＩ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８６．０％以上の相同性を有するアミ
ノ酸配列からなり、且つ、下記の（ａ）から（ｃ）に示す特性を全て有する、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）ＦＶＨに反応する。
（ｂ）ＦＫに対する反応性がＦＶＨに対する反応性の３０％以下である。
（ｃ）ＦＶＨに対するＫｍ値が０．９ｍＭ以下である。
項７．
項６に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）に記載のタンパク質であって、アミノ末端から５８番目のイソロイシン、アミノ末端から１１０番目のグリシンおよびアミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンのうち少なくとも１箇所以上が他のアミノ酸に置換されているタンパク質である、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
項８．
項６に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの熱安定性が、以下の（ｘ）または（ｙ）のいずれかである、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
（ｘ）５０℃１０分処理後の酵素残存活性が７０％以上である。
（ｙ）５５℃１０分処理後の酵素残存活性が２０％以上である。
項９．
項６に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定方法において、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの「フルクトシルバリンに対する反応性の、フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対する比率」が５．０以下である、ヘモグロビンＡ１ｃ測定方法。
項１０．
以下の（１）および（２）を含む、ヘモグロビンＡ１ｃ測定キット。
（１）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からフルクトシルバリルヒスチジンを切り出す能力を有するプロテアーゼ
（２）フルクトシルバリルヒスチジンに反応し、かつ、以下の（ａ）および（ｂ）に示す特性を満たすフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
（ａ）フルクトシルリジンに対する反応性がフルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性の３０％以下であること。
（ｂ）フルクトシルバリルヒスチジンに対するＫｍ値が０．９ｍＭ以下であること。
項１１．
項１０に記載のヘモグロビンＡ１ｃ測定キットにおいて、さらに、過酸化水素または酸素を定量するために必要な試薬を含む、ヘモグロビンＡ１ｃ測定キット。
項１２．
以下の（１）および（２）を含む、ヘモグロビンＡ１ｃ測定センサー。
（１）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からフルクトシルバリルヒスチジンを切り出す能力を有するプロテアーゼ
（２）フルクトシルバリルヒスチジンに反応し、かつ、以下の（ａ）および（ｂ）に示す特性を満たすフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
（ａ）フルクトシルリジンに対する反応性がフルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性の３０％以下であること。
（ｂ）フルクトシルバリルヒスチジンに対するＫｍ値が０．９ｍＭ以下であること。
【００３２】
上記において、基質特異性（ＦＫに対する反応性のＦＶＨに対する反応性に対する比率、ＦＫ／ＦＶＨとも表記）は、各基質を２ｍＭ以上になるように調製して、後述の活性測定法を用い、下記計算式により算出した値とする。
基質特異性（ＦＫ／ＦＶＨ）＝（ＦＫを基質としたときの活性値）÷（ＦＶＨを基質としたときの活性値）
例えば、後述の＜５．参考例３＞および／または＜７．基質特異性評価方法＞に記載の方法により測定することにより算出できる。
【００３３】
また、上記においてＦＶＨに対するＫｍ値は、ＦＶＨ濃度を１．７５ｍＭ、０．３５ｍＭになるように調製した試薬を用いて、後述の活性測定法を実施し、ラインウィーバー・バークプロットより算出した値とする。
【発明の効果】
【００３４】
［５］
本発明により、従来よりシンプルで正確性の高いＨｂＡ１ｃの測定方法を構築することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＦＡＯＤの違いによる反応タイムコースの差を示した図
【図２】本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関
【図３】本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関
【図４】本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関
【図５】本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関
【図６】本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関
【図７】短時間での測定で本発明を実施した際の反応タイムコース
【図８】短時間での測定で本発明を実施した際の、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関
【図９】短時間での測定で本発明を実施した際の標準物質の測定結果
【図１０】高値直線性の確認
【発明を実施するための形態】
【００３６】
［６］
本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「〜」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「★〜☆」と記載されていれば「★以上、☆以下」を示す。また本明細書中の「および／または」は、いずれか一方または両方を意味する。
【００３７】
［６−１］
［測定対象物］
本発明の測定方法の測定対象物は、ＨｂＡ１ｃ（ヘモグロビンのβ鎖が糖化された糖化タンパク質）である。
測定対象試料は、ＨｂＡ１ｃの有無や濃度を検出すべき対象物であれば特に限定されるものではなく、例えば、全血、血漿、血清、血球等の他に、尿、髄液等の生体試料（すなわち生体から採取された試料）や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。
本発明の方法は、糖尿病の診断に応用することができるため、上記の中でも特に全血試料、血球試料に有用である。特に限定されるものではないが、赤血球内の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、全血をそのまま溶血したり、全血から分離した赤血球を溶血したりして、この溶血試料を測定用の試料とすればよい。
【００３８】
溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法、凍結溶解による方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法または、浸透圧の差を利用する方法が好ましい。また、自動溶血機能付きの自動分析機（例えば、日本電子ＢＭ９１３０形自動分析機）では、自動溶血時の攪拌力が強いため、界面活性剤では、気泡を発生しサンプリングに支障をきたすことから、浸透圧の差を利用する方法がより好ましい。    
【００３９】
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン ソルビタン アルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン アルキルエーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、商品名Ｔｗｅｅｎ−２０、商品名Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．１〜１重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で５秒〜１分程度攪拌すればよい。
【００４０】
また、前記浸透圧の差を利用する場合は、例えば、全血の体積に対し２〜１００倍体積量の精製水を添加して溶血させる。
【００４１】
なお、溶血処理は、後述の、本発明の測定方法の具体的な態様において、第一反応と同時に行うこともできる。
【００４２】
［６−２］
［測定方法の基本構成］
本発明の測定方法は、前述のように、以下の（１）および（２）の反応工程を含む方法により、ＨｂＡ１ｃを測定する方法である。
（１）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からＦＶＨを切り出す能力を有するプロテアーゼにより、糖化タンパク質を糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに断片化する反応
（２）断片化されたＦＶＨに反応し、かつ、以下の（ａ）および（ｂ）に示す特性を満たすＦＡＯＤが、該ＦＶＨと酸化還元反応を行い、発生した過酸化水素または酸素を定量する反応
（ａ）ＦＫに対する反応性がＦＶＨに対する反応性の３０％以下であること。
（ｂ）ＦＶＨに対するＫｍ値が０．９ｍＭ以下であること。
【００４３】
本発明の測定方法の具体的な態様は、上記の（１）および（２）の反応工程を含むように設計されていれば特に限定されない。
好ましくは、測定試薬を、自動分析機に適用できる２剤に分けて調製して測定を行う。以下に典型的な２つの態様を例示する。
【００４４】
［６−２−１］
［態様１］
例えば、Ｒ１にプロテアーゼ、Ｒ２にＦＡＯＤを配した試薬を作製し、自動分析機を用いて測定を行えばよい。
この試薬を自動分析機に適用した場合、第一反応で、Ｒ１投入により、プロテアーゼによりＨｂＡ１ｃからＦＶＨを切り出す工程（「断片化反応」）が開始され、次いで第二反応で、Ｒ２投入により、ＦＶＨにＦＡＯＤが作用して酸化還元反応により過酸化水素を生成する工程が開始される。
【００４５】
第二反応では、さらにそれに引続いてすぐに（ほぼ同時に）、前記発生した過酸化水素を定量する工程を含む。
過酸化水素を定量するためには、例えば、得られた過酸化水素に酸化酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）と酸化により発色する基質とを添加して、前記発生した過酸化水素と前記基質とを前記酸化酵素により反応させる工程を含むことが好ましい。
例えば、ペルオキシダーゼによって、測定対象ＨｂＡ１ｃ由来の過酸化水素を還元し、同時に酸化により発色する基質（発色性基質）を酸化し、発色した前記基質の発色程度を例えば分光光度計等により吸光度として測定することによって過酸化水素の量が決定でき
、その結果から適宜計算によって（例えば、この過酸化水素濃度と検量線等とを用いて）試料中のＨｂＡ１ｃを測定することができる。
酸化酵素および酸化により発色する基質の添加順序は特に制限されない。Ｒ２を添加した時に両者が揃っていれば良く、それぞれＲ１、Ｒ２のどちらに配してもよい。
【００４６】
過酸化水素を定量するために必要な試薬については、「測定方法のその他の構成」の［２］定量系（発色系）の項で詳述する。
【００４７】
［６−２−２］
［態様２］
別の態様としては、Ｒ１にＦＡＯＤ、Ｒ２にプロテアーゼを配した試薬を作製し、自動分析機を用いて測定を行ってもよい。
この試薬を自動分析機に適用した場合、第一反応では、Ｒ１投入により、ＦＡＯＤが測定対象物中に何らかの理由で存在している遊離の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに作用して過酸化水素が生成する（「消去反応」）。
【００４８】
この、「測定対象物中に何らかの理由で存在している遊離の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチド」は、本来ＦＡＯＤが作用すべき対象である「プロテアーゼによってＨｂＡ１ｃから切り出された」ものではなく、非測定対象であり、上記の反応によって生成した過酸化水素は、例えばＲ１にカタラーゼ等を配することにより、それに引続いてすぐに（ほぼ同時に）、後の反応に影響を与えないように変化させることができる（「除去反応」）。なおこの場合は、ペルオキシダーゼはＲ２に配することが好ましい。
【００４９】
第二反応では、Ｒ２投入により、プロテアーゼによるＨｂＡ１ｃからＦＶＨを切り出す工程（「断片化反応」）が開始され、それに引続いてすぐに（ほぼ同時に）、切り出されたＦＶＨにＦＡＯＤが作用して酸化還元反応により過酸化水素を生成する工程が開始される。
【００５０】
第二反応においては、ＦＡＯＤを新たに添加する必要はなく（Ｒ２にＦＡＯＤを配する必要はなく）、Ｒ１に配されたものをそのまま用いることができるが、必要であればＲ２にもＦＡＯＤを配し、第二反応で追添しても差し支えない。
【００５１】
予め第一反応で、測定対象物中にもともと存在する遊離の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを消去しているため、第二反応において、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼで分解しても、もはやＦＡＯＤと非測定対象物とが反応することはなく、プロテアーゼによってＨｂＡ１ｃから切り出されたもののみをＦＡＯＤと反応させることができる。
【００５２】
第二反応においては、Ｒ１で添加したカタラーゼの影響を排除するため、Ｒ２にアジ化ナトリウムなどのカタラーゼ阻害剤を配してもよい。
あるいは、カタラーゼとペルオキシダーゼの基質に対する親和性の違いを利用して、カタラーゼとペルオキシダーゼとの添加比率を適切に設定することにより、Ｒ２にカタラーゼ阻害剤を配さない設定も可能である。例えば、第二反応において、過剰量のペルオキシダーゼおよび発色性基質を添加すればよい。この場合、ペルオキシダーゼは、前記カタラーゼの添加量（Ｕ）に対し、例えば、５〜１００倍の活性（Ｕ）量を添加することが好ましい。
【００５３】
測定対象に血球が含まれる場合、非測定対象の消去には、血球中に本来存在しているカタラーゼやグルタチオンペルオキシダーゼ等の作用を利用しても良い。
【００５４】
また、非測定対象の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドから発生する過酸化水素
を除去する方法としては、この他に以下の方法も採用できる。
例えば、プロテアーゼを添加する前に、ＦＡＯＤとペルオキシダーゼならびに電子供与体を共存させる方法がある。これによれば、プロテアーゼを添加する前に、非測定対象の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドより発生した過酸化水素は、ペルオキシダーゼ反応によって脱水素を起こし、電子は電子供与体に供与され、その結果、過酸化水素は除去される。
また、プロテアーゼを添加する前に、ＦＡＯＤとペルオキシダーゼならびに酸化により発色する発色剤を添加し、この発色量を予め測定しておき、この発色量で補正を行うことも可能である。
【００５５】
［６−２−３］
上記の態様においては、ヘモグロビン（以下Ｈｂとも記載）を同時測定することも可能である。
例えば、ＨｂＡ１ｃの測定が行われている間のいずれかの時点で、Ｈｂが本来有している赤色（５５０ｎｍ付近）の吸光度を測定することにより、ＨｂとＨｂＡ１ｃの同時測定をすることができる。
ここで、発色反応において、酸化により発色する基質を適宜選択することにより、Ｈｂ測定とＨｂＡ１ｃ測定とで測定波長が一致しないよう設定することが好ましい。これにより、互いの測定に与える影響を小さくすることができる。
【００５６】
また、Ｈｂは反応液中で酸化されメトヘモグロビンに変化し、徐々に吸光度が変化するので、ＨｂおよびＨｂＡ１ｃの測定値に影響を与える場合がある。
これを防止するためには、試料に、前処理として、フェロシアン化物、亜硝酸塩、硝酸カリウム、アジ化物などの酸化剤を加えることにより予めＨｂをメトヘモグロビンに変えておく（以下「メト化」とも記載）ことが好ましい。あるいは、Ｒ１に同様に前処理として、フェロシアン化物、亜硝酸塩、硝酸カリウム、アジ化物などの酸化剤を配しておき第一反応でメト化を行わせることもできる。
【００５７】
［６−３］
［プロテアーゼ］
本発明に用いるプロテアーゼは、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からＦＶＨを切り出す能力があるものであれば特に限定されず、該プロテアーゼがさらにＦＶ、ＦＶＬおよびＦＫのいずれか１つ以上を切り出すものであっても差し支えないし、さらに、アミノ酸配列上のその他の位置に作用して上記以外の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出すものであっても差し支えない。
【００５８】
これらのプロテアーゼは、市販のものをそのまま用いても良いし、公知文献に記載されたものをその記載にしたがって製造したものを使用しても良い。公知のプロテアーゼとして、例えば、以下のものが挙げられる。
【００５９】
メタロプロテアーゼ、ニュートラルプロテアーゼ、エラスターゼ、ブロメライン、パパイン、トリプシン（たとえば、豚膵臓由来）、プロテイナーゼＫ、ズブチリシン、アミノペプチダーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のプロテアーゼ（例えばプロテアーゼＮ（シグマ・アルドリッチ社製）、プロテアーゼＮ「アマノ」（天野エンザイム（株）製））、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｒｅｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＫＤＫ１００２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７１３５））由来のプロテアーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ＫＤＫ１００１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７１３３））由来のプロテアーゼ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＳｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｚｕｔａｅ  ＫＤＫ１００３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４８））由来のプロテアーゼ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ（例えばＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＫＤＫ１００４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４１））由来のプロテアーゼ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ（例えばＣｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＫＤＫ１００５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４６））由来のプロテアーゼ、Ｍｕｃｏｒ（例えばＭｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｆ．ｊａｎｓｓｅｎｉｉ  ＫＤＫ３００４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４５））由来のプロテアーゼ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ（例えばＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｗａｋｓｍａｎｉｉ  ＫＤＫ３００５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３４４））由来のプロテアーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．１）、デブロッキングアミノペプチダーゼ（Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）（例えばＰｆｕ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来）、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、Ｎ−アシルアミノアシル−ペプチドハイドロラーゼ（Ｎ−Ａｃｙｌａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、ヘミセルラーゼ（Ｈｅｍｉｃｅｌｕｌｌａｓｅ）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、リゾバクター（例えばリゾバクター・エンザイモゲネスＹＫ−３６６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００１０））由来のプロテアーゼ、バチラス（例えばバチラス・エスピー  ＡＳＰ−８４２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６４１））由来のプロテアーゼ、エアロモナス（例えばエアロモナス・ヒドロフィラＮＢＲＣ３８２０）由来のプロテアーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１５．１）（例えばアンギオテンシン変換酵素）、デオキシン１（ｆｒｏｍ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ＧＯＤＯ高純度プロテアーゼ（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、プロテアーゼＳ“アマノ”（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アミノペプチダーゼＭ（ｆｒｏｍ  Ｈｏｇ  ｋｉｄｎｅｙ）、アミノペプチダーゼＴ（ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｒｍｕｓ）、乳酸菌（ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｇ１５、Ｇ３０、プロテアーゼＰ“アマノ”（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ���、プロテアーゼＫ“アマノ”（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、プロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ  ｆｒｏｍ  Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）、ペクチナ−ゼＸＰ−５３４（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スミチームＭＰ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、プロテアーゼタイプＸＸＩＩＩ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）。
【００６０】
本発明に用いるプロテアーゼは、上記以外のものであっても、製造方法が知られているプロテアーゼについて精製し構造を解明したもの、あるいは、精製した酵素の部分アミノ酸配列等を明らかにし、その情報を利用して新規にスクリーニングして得られたものであっても良い。また、データベースに公開されている情報などから推定される遺伝子やタンパク質の配列を利用して、新規にスクリーニングして得られたものであっても良い。
さらには、遺伝子やタンパク質の配列が現実に知られているプロテアーゼ、あるいは、上記の方法により新規に得られたプロテアーゼに、さらに遺伝子工学的または化学的等の方法で改変を加えたものであっても良い。
【００６１】
本発明に用いるプロテアーゼは、安定性、反応速度（比活性）、入手の容易性などから、以下のものが好ましい。
メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来プロテアーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来プロテアーゼ等が使用でき、好ましくはエンドプロテアーゼである。
市販品としては、例えば、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム社製）、パパインＭ−４０（天野エンザイム社製）、サーモリシン（大和化成社製）、サモアーゼＰＣ１０（大和化成社製）、商品名プロテアーゼＮ（フルカ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（東洋紡社製：商品名トヨチーム）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（ロシュ社製）等があげられる。なかでも、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（東洋紡社製：商品名トヨチーム）、サーモリシン（天野エンザイム社製）、サモアーゼＰＣ１０（天野エンザイム社製）、プロテアーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来、フルカ社製）、プロテアーゼ（Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来、シグマ社製）がより好ましい。
【００６２】
［６−４］
［フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ］
ＦＡＯＤは、公知文献では「フルクトシルペプチドオキシダーゼ」「フルクトシルアミンオキシダーゼ」「真核型アマドリアーゼ」「フルクトシルアミンデグリカーゼ」「脱フルクトシル化酵素」「ケトアミンオキシダーゼ」「フルクトシルアミン酸化酵素」など、種々の名称で呼ばれている。
【００６３】
［６−４−１］
本発明に用いるＦＡＯＤは、ＦＶＨに反応し、かつ、以下の（ａ）および（ｂ）に示す特性を満たすＦＡＯＤであれば、特に限定されない。
（ａ）ＦＫに対する反応性がＦＶＨに対する反応性の３０％以下であること。
（ｂ）ＦＶＨに対するＫｍ値が０．９ｍＭ以下であること。
【００６４】
本発明に用いるＦＡＯＤはＦＫ／ＦＶＨ（ＦＫに対する反応性のＦＶＨに対する反応性に対する比率）が３０％以下であるが、さらにはＦＫ／ＦＶＨが１３％以下であることが好ましい。さらにはＦＫ／ＦＶＨが５％以下であることが好ましい。さらにはＦＫ／ＦＶＨが２％以下であることが好ましい。
【００６５】
本発明に用いるＦＡＯＤはＦＶＨに対するＫｍ値が０．９ｍＭ以下であるが、さらにはＦＶＨに対するＫｍ値が０．６ｍＭ以下であることが好ましい。さらには０．５ｍＭ以下であることが好ましい。さらには０．４ｍＭ以下であることが好ましい。
【００６６】
本発明に用いるＦＡＯＤは、さらには、ＦＶ／ＦＶＨ（ＦＶに対する反応性のＦＶＨに対する反応性に対する比率）が低いほど好ましい。好ましくは６．１以下である。さらに好ましくは４．８以下である。さらに好ましくは３．５以下である。さらに好ましくは２．０以下である。
【００６７】
本発明に用いるＦＡＯＤの基質特異性は、［３−１］で説明した（１）〜（４）を完全に満たすものでなくてもかまわない。
【００６８】
本発明に用いるＦＡＯＤは、ＦＶＨに対して強い親和性を有する（ＦＶＨに対するＫｍ値が０．９ｍＭ以下である）ので、ＦＶＨ以外の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドが存在してもＦＶＨに優先的に作用する。
特に、［６−２−２］で説明した［態様２］においては、ＦＡＯＤが作用する対象となる糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの濃度は、第二反応でのＲ２投入直後はゼロであり、プロテアーゼによる切り出しが開始された後も非常に低濃度であって、さらに、それらはすぐにＦＡＯＤの作用を受けて変化するため、第二反応の間はずっと低濃度のままであるから、ＦＶＨに対して強い親和性を有する（ＦＶＨに対するＫｍ値が０．９ｍＭ以下である）ＦＡＯＤを用いることで、ＦＶＨに対してのみ選択的に反応が進む。
【００６９】
また、ＦＶＨに対して強い親和性を有するＦＡＯＤを用いることにより、従来のＦＡＯＤを用いるより反応が早く進むことにもなる。
したがって、本発明の方法を用いることにより、現在、第一反応５分・第二反応５分の
計１０分で行われている測定が、５分以下で行われる場合、従来の方法と比較してそのメリットは大きくなる。さらに測定時間が３分以下、さらには１分（たとえば第一反応３０秒・第二反応３０秒の計１分）以下などと短くなるにつれて、本発明のメリットはさらに大きくなる。
【００７０】
また、上記のＦＡＯＤを用いることにより、本発明ではプロテアーゼの選択に制約を受けない。［６−３］で好ましいものとして記載したプロテアーゼは、入手の容易性など実用上の観点も含めて例示したに過ぎない。
なお、ＦＶＨを高い選択性で切り出す能力を有するプロテアーゼを選定することが好ましいことは言うまでもない。
【００７１】
別の観点からは、本発明に用いるＦＡＯＤは、熱安定性および／または比活性などの酵素特性に優れていることが好ましい。
熱安定性は、５０℃１０分処理後の酵素残存活性が７０％以上であることが好ましい。さらには８０％以上であることが好ましい。さらには９０％以上であることが好ましい。または、熱安定性は、５５℃１０分処理後の酵素残存活性が２０％以上であることが好ましい。さらには３０％以上であることが好ましい。さらには４０％以上であることが好ましい。
比活性は、２．０以上であることが好ましい。さらに好ましくは３．０以上、さらに好ましくは４．０以上、さらに好ましくは５．０以上である。
【００７２】
［６−４−２］
このようなＦＡＯＤとしては、例えば、市販のものでは、ＦＰＯ−３０１（商標）（東洋紡績株式会社）などを使用することができる。
【００７３】
また、このようなＦＡＯＤとしては、後述の［８］［参考例］にその入手方法・特性等を詳細に示した、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来酵素およびその改変体から選ばれるＦＡＯＤが挙げられる。
ここではその要旨を例示する。詳細は、後述の［８］［参考例］を参照されたい。
【００７４】
本発明に用いるＦＡＯＤとして、例えば、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）のいずれかに記載の、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
（Ｉ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ＩＩ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ＩＩＩ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８６．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【００７５】
このようなＦＡＯＤとしては、中でも、上記（ＩＩ）または（ＩＩＩ）に記載のタンパク質であって、アミノ末端から５８番目のイソロイシン、アミノ末端から１１０番目のグリシンおよびアミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンのうち少なくとも１箇所以上が他のアミノ酸に置換されているタンパク質が好ましい。
このようなＦＡＯＤとしては、上記アミノ末端から５８番目のイソロイシンが、メチオニン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、セリン、バリン、または、ロイシンに置換されているタンパク質が好ましい。
このようなＦＡＯＤとしては、上記アミノ末端から１１０番目のグリシンが、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、システイン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、アルギニン、セリン、バリン、ロイシン、アスパラギン酸、イソロイシン、チロシンまたはフェニルアラニンに置換されているタンパク質が好ましい。
このようなＦＡＯＤとしては、上記アミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンが、
チロシンに置換されているタンパク質が好ましい。
【００７６】
あるいは、これらの変異が組み合わさったものでも良い。このような変異体としては、例えば、後述の［参考例］に具体的に記載されたものが挙げられる。
【００７７】
上記のＦＡＯＤの入手方法については、後述の［参考例］で詳細に述べるが、例えば、以下の（ＩＶ）から（ＶＩＩ）のいずれかのポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを作製し、該組換えベクターで宿主を形質転換した形質転換体を培養してフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を生成させ、当該タンパク質を採取すればよい。
（ＩＶ）配列番号２に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（Ｖ）配列番号２に記載される塩基配列において、１つ以上３０以下の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ＶＩ）本発明のタンパク質のうちの何れかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ＶＩＩ）上記（ＩＶ）から（ＶＩ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００７８】
［６−４−３］
なお、現時点では本願発明に使用することはできないＦＡＯＤであっても、今後遺伝子工学的または化学的等の方法で改変を加え、上記の特性を有するように改良したものは、本願発明に使用できる。
あるいは、今後新規に得られたＦＡＯＤであって、上記の特性を有するＦＡＯＤは、本願発明に使用できる。
そして、そのようなＦＡＯＤを用いて構築したＨｂＡ１ｃの測定系もまた、本願発明の技術思想に包含される。
【００７９】
本願出願時点で、市販されていたり、文献に記載されていたりして公知となっているＦＡＯＤとしては、例えば、特許文献２に記載の、コニオカエタ属、ユウペニシリウム属由来酵素およびその改変体、あるいは、特許文献３に記載のカーブラリア・クラベータＹＨ９２３またはネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ４７４由来酵素およびその改変体が挙げられる。
【００８０】
本願出願時点で公知のＦＡＯＤとして、さらには、以下のもの（由来のもの）が例示できる。
ＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン社製、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来）あるいはその１８４、２７２、３８８位のいずれか１つ以上を改変したもの、ＦＰＯＸ−ＥＥ（キッコーマン社製、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来）あるいはその１８４、２７２、３８８、９４、２６５、３０２位のいずれか１つ以上を改変したもの、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＦＶ１−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７５４）由来あるいはその５１位および／または３５４位を改変したもの、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１由来、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．Ｎ１−１由来、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｍｕｃｏｉｄｅｓＫＤＫ４００１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７１３４）由来、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ  ＧＰ−１（ＦＥＲＭＢＰ−５６８４）由来、Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍＳ−３４１３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４７５）由来、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ  ＩＦＯ６３５６由来、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｓ−１Ｆ４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０１０）由来、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｃ５８（ＡＴＣＣ３３９７０）由来、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．（ＦＥＲＭ  Ｐ−８２４５）由来、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ３２３９３由来、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｓｐ．  ＮＩＳＬ  ９３３５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７９９）由来、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ  ＡＴＣＣ  １８５４７由来、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｍ  ＩＦＯ  ９１５８由来、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｉｄａｈｏｅｎｓｅ  ＩＦＯ  ９５１０由来、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｕｇｌａｕｃｕｍ  ＩＦＯ  ３１７２９由来、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．  ＮＩＳＬ  ９３３０（ＦＥＲＭＢＰ−７７９８）由来、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ＮＢＲＣ７５９０由来、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ  ｓａｖｏｒｙｉ  ＡＴＣＣ３６５４７由来、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．  ＴＯ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１１）由来、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｐｈａｅｏｓｐｅｒｍｕｍ  ＮＢＲＣ３１９５０由来、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｐｈａｅｏｓｐｅｒｍｕｍ  ＮＢＲＣ６６２０由来、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ＮＢＲＣ３１０９８由来、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．  ＹＨ８０７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１０）由来、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｇｅｎｔｉａｎｉｃｏｌａ）ＭＡＦＦ４２５５３１由来、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ  ＮＢＲＣ  ３０９２９由来、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ（分生子世代名（Ｐｈｏｍａ  ｈｅｎｎｅｂｅｒｇｉｉ））ＮＢＲＣ７４８０由来、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｄｏｌｉｏｌｕｍ  ＪＣＭ２７４２由来、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ（分生子世代名（Ｐｈｏｍａ  ｌｉｎｇｕｍ））ＭＡＦＦ７  ２６５２８由来、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ  ｈｅｒｂａｒｕｍ  ＮＢＲＣ３２０１２由来、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ  ｂｅｔａｅ（分生子世代名（Ｐｈｏｍａ  ｂｅｔａｅ））ＮＢＲＣ５９１８由来、Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｕｓ  ＮＢＲＣ６１５８由来、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ  ＹＨ９２３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２０９）由来、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ  ＧＬ２−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９００５）由来、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ  ７０８７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８７８）由来、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｓ−１Ｆ４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０１０）由来、バラ科植物由来、ブドウ科植物由来、セリ科植物由来、ショウガ科植物由来、フザリウム・オキシスポルムＩＦＯ−９９７２由来あるいはその３３２位を改変したもの。
【００８１】
［６−５］
［測定方法のその他の構成］
［６−５−１］
［プロテアーゼとＦＡＯＤ］
【００８２】
ＨｂＡ１ｃとプロテアーゼとを、それぞれＲ１、Ｒ２のどちらに配するかは、測定目的や測定対象試料などに応じて、適宜決定されうる。
【００８３】
ＨｂＡ１ｃとプロテアーゼとを反応させる際の具体的な条件は、所望のＦＶＨが調製され得る条件であれば特に限定されるものではなく、試料の濃度や種類、プロテアーゼの種類や濃度などに応じて適宜好適な条件を検討の上、採用されればよい。
【００８４】
本発明におけるプロテアーゼおよびＦＡＯＤの添加量は、特に限定されない。非測定対象の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの消去ならびにプロテアーゼによってＨｂＡ１ｃから切り出されたＦＶＨとの反応が十分に行うことができる量であればよい。
例えば、プロテアーゼは、０．１〜３０ＭＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは２〜１５ＭＵ／Ｌであり、より好ましくは３〜１０ＭＵ／Ｌである。
また、例えば、ＦＡＯＤは、０．１〜４５Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは２〜１５Ｕ／Ｌであり、より好ましくは３〜１０Ｕ／Ｌである。
【００８５】
プロテアーゼによってＨｂＡ１ｃから切り出されたＦＶＨのみをＦＡＯＤと反応させる際の具体的な条件は、ＦＶＨに作用して、酸化的加水分解反応により酸素が消費され、過酸化水素が発生し得る条件であれば特に限定されるものではなく、試料の濃度や種類、プロテアーゼの種類や濃度に応じて適宜好適な条件を検討の上、採用されればよい。
【００８６】
反応温度は、例えば、２〜６０℃、好ましくは４〜４０℃である。
反応時間は、特に限定されるわけではないが、例えば、全工程であれば、０．５〜３０分間、好ましくは１０分以下であり、さらに好ましくは５分以下、さらに好ましくは３分以下、さらに好ましくは２分以下、さらに好ましくは１分以下である。
第一反応では、特に限定されるわけではないが、例えば、全工程であれば、０．２５  〜１５分間が例示できる。好ましくは５分以下であり、さらに好ましくは２．５分以下、さらに好ましくは１．５分以下、さらに好ましくは１分以下、さらに好ましくは０．５分以下である。
第二反応では、特に限定されるわけではないが、例えば、全工程であれば、０．２５  〜    １５分間が例示できる。好ましくは５分以下であり、さらに好ましくは２．５分以下、さらに好ましくは１．５分以下、さらに好ましくは１分以下、さらに好ましくは０．５分以下である。
好ましい第一反応時間−第二反応時間の組合せは１０分−１０分、さらに好ましくは５分−５分、さらに好ましくは２．５分−２．５分、さらに好ましくは１．５分―１．５分、さらに好ましくは１分−１分、さらに好ましくは０．５分−０．５分である。
ｐＨは、例えば、６〜９の範囲である。また、この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前記緩衝液としては、特に制限されないが、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等があげられる。
【００８７】
なお、ＦＡＯＤを、非測定対象の糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを消去するためにも用いる場合は、Ｒ１とＲ２の液量比などを考慮して、両方の反応を行いうる条件に適宜設定すればよい。
【００８８】
なお、本発明において、酵素の活性については、明細書に記載がないものについては、原則として、市販品については容器や添付の説明書・パンフレット等に測定法や単位の記載があればそれに従う。また、文献に記載されたものであれば、その文献に記載されている活性測定方法に従う。
活性の定義（測定方法）がわからない場合や、測定に必要な試薬の入手に制約がある場合などにおいては、当業者の常識に基づいて合理的に適宜基質を選定し、測定条件を決定した上で測定する。
【００８９】
［６−５−２］
［定量系（発色系）］
ＦＶＨとＦＡＯＤとが酸化還元反応を行い、これによって発生する過酸化水素または酸素を定量する反応の、具体的な条件は、反応により生じた過酸化水素の量または酸素の量を測定し得る方法であれば、その具体的方法は特に限定されるものではない。
【００９０】
例えば、過酸化水素を定量する方法としては、酸化還元反応により過酸化水素が発生した反応液に、ペルオキシダーゼ、および酸化により発色する還元剤（以下、発色系基質とも記載）を添加し、前記ペルオキシダーゼを触媒として前記過酸化水素と前記還元剤との間で酸化還元反応を生じさせる方法が挙げられる。
前記酸化還元反応により前記還元剤を発色させ、この発色強度を測定することにより前記過酸化水素量を測定できる（発色系）。
【００９１】
上記の定量系（発色系）に用いるペルオキシダーゼは特に限定されるものではなく、例えば市販のものが使用できる。好適なものとしては、西洋ワサビ、微生物などに由来するものが挙げられる。中でも、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好ましい。前記ペルオキシダーゼは、高純度かつ低価格のものが商業的に入手可能である。
本発明におけるペルオキシダーゼの濃度は、例えば、０．０１ｋＵ／Ｌ〜４ＭＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．１ｋＵ／Ｌ〜２００ｋＵ／Ｌ、より好ましくは５ｋＵ／Ｌ〜１００ｋＵ／Ｌである。
【００９２】
本発明に用いる発色性基質としては、特に限定されないが、水素供与体、ロイコ体、テトラゾリウム塩などが挙げられる。
【００９３】
水素供与体はカップラーと組み合せて用いることができる。例えば、水素供与体として
のトリンダー試薬とカップラーとしての４−アミノアンチピリンとの組み合せがあげられる。
上記トリンダー試薬としては、限定されないが、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。
これらは、例えば、ペルオキシダーゼの存在下で、カップラー（４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）など）に対して酸化縮合反応し色素を生成する。
【００９４】
水素供与体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。
【００９５】
カップラーとしては、前記４−アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）（更に具体的には、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）（更に具体的には、スルホン化３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）等も使用できる。
【００９６】
ロイコ体としては、特に限定されないが、例えば、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体などが使用できる。
これらは、ペルオキシダーゼの存在下で直接酸化呈色する。
【００９７】
例えば、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（例えばナトリウム塩）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩等が挙げられる。
【００９８】
特に好ましくは、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
【００９９】
テトラゾリウム塩としては、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム］塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が挙げられる。
【０１００】
上記発色系基質の使用量としては、溶解度を考慮して反応終濃度として０．００１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。より好ましくは０．００５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌである。
【０１０１】
［６−５−３］
［定量系（センサー系）］
この工程における前記過酸化水素量の測定において、前記ペルオキシダーゼ等を用いた発色方法以外に、各種センサー系を用いた測定法が当業者に一般的に知られている（限定されないが、例えば、特開２００１−２０４４９４号公報を参照のこと。）。
【０１０２】
具体的には、各種センサー系に用いる電極としては、酸素電極、カーボン電極、金電極、または白金電極などが挙げられる。本発明において、作用電極として酵素を固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば、白金電極など）、および参照電極（例えば、Ａｇ／Ｃｌ電極など）と共に、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持しながら、作用電極に一定の電圧を加え、さらに試料を添加して、酵素反応の結果生じる過酸化水素に起因する電流の増加値を測定することができる。
【０１０３】
また、カーボン電極、金電極、および白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する方法として、固定化電子メディエーターを用いる系がある。例えば、作用電極として、酵素および電子メディエーター（例えば、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、およびフェナジンメトサルフェートなど）を吸着、または共有結合法により高分子マトリクスに固定化した電極を用い、対極（例えば、白金電極など）、および参照電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。続いて、作用電極に一定の電圧を加え、試料を添加して酵素反応の結果生じる過酸化水素に起因する電流の増加値を測定することができる。
【０１０４】
この工程で消費された酸素量を測定することで糖化アミン（糖化アミノ酸および／または糖化ペプチド）量を測定することもできる（限定されないが、例えば、特開２００１−２０４４９４号公報を参照のこと）。
具体的には、酸素電極を用い、電極表面に酸素を固定化して、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。ここに試料を加えて、電流の減少値を測定する。
【０１０５】
カーボン電極、金電極、白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する場合には、作用電極として酵素を固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば、白金電極など）、および参照電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に、メディエーターを含む電流の増加量を測定する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、およびフェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。
【０１０６】
［６−５−４］
［その他の組成］
本発明において、上記構成の他、緩衝剤（例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、およびＧＯＯＤ緩衝液など）が含まれていてもよい。
さらに上記試薬組成物には、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬（例えば、ＥＤＴＡおよびＯ−ジアニシジンなど）、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコ
ルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、各種界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００およびＮＰ−４０など）、ならびに各種抗菌剤および防腐剤（例えば、ストレプトマイシンおよびアジ化ナトリウムなど）などが含まれていてもよい。
さらには、塩類、酵素安定化剤、色源体安定化剤などを、必要に応じて添加することができる。
これらの試薬は、単一試薬でも２種類以上の試薬を組み合わせてなるものであってもよい。
【０１０７】
本発明に用いることができる緩衝剤（緩衝液）は特に限定されない。各試薬の設定ｐＨなどに応じて適宜選択される。
例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。
本発明では、６〜８．５のｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有する緩衝剤を使用することが好ましい。このｐＨ範囲の緩衝剤としては、リン酸塩、トリス、ビス−トリスプロパン、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、および、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）などが挙げられる。特に、好ましい緩衝剤はＭＥＳおよびＰＩＰＥＳである。また特に、好ましい濃度範囲は２０〜２００ｍＭであり、好ましいｐＨ範囲はｐＨ６〜７である。
【０１０８】
本発明に用いることができる界面活性剤は特に限定されない。例えば、非イオン界面活性剤および／または両性イオン界面活性剤などを用いることができる。
【０１０９】
非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられる。
【０１１０】
両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインなどが挙げられる。
【０１１１】
防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。抗菌剤としては、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。
【０１１２】
塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。
【０１１３】
酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。
また、酵素安定化剤として、血清アルブミン類、グロブリン類または繊維性タンパク質類などの不活性タンパク質を添加することができる。好ましいタンパク質は、ウシ血清アルブミンである。好ましい不活性タンパク質は、酵素分解を起こすプロテアーゼ不純物を含まないものである。
【０１１４】
上記の各成分（試薬中に存在するプロテアーゼ、ＦＡＯＤなどの酵素、および、他の成分）の濃度・条件等は、使用する試薬・酵素等の種類により、反応性および／または安定性などを考慮して適宜決定することが出来る。
その際には、試薬中に存在するそれぞれの成分が互いに干渉しあうことにより、ＨｂＡ
１ｃの測定や試薬の安定性等に影響が及ぶ可能性についても、考慮することが好ましい。例えば、第二反応で、プロテアーゼとＦＡＯＤが共存する場合は、できるだけ両酵素の特性を活かせるよう適宜条件決定することができる。
上記の決定は、必ずしも最適解である必要はなく、目的や状況に応じて、ＨｂＡ１ｃの測定に関して実用上十分な性能が担保されていれば差し支えない。
【０１１５】
［６−６］
［ＨｂＡ１ｃ測定キット］
本発明のＨｂＡ１ｃ測定キット（以下「本発明のキット」ともいう）は、以下の（１）および（２）を含む、ＨｂＡ１ｃ測定キットである。
（１）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からＦＶＨを切り出す能力を有するプロテアーゼ
（２）ＦＶＨに反応し、かつ、以下の（ａ）および（ｂ）に示す特性を満たすＦＡＯＤ
（ａ）ＦＫに対する反応性がＦＶＨに対する反応性の３０％以下であること。
（ｂ）ＦＶＨに対するＫｍ値が０．９ｍＭ以下であること。
【０１１６】
本発明のキットを用いてＨｂＡ１ｃを測定する手段は特に限定されず、市販の器具や機器を適宜選択して使用して良いが、汎用の自動分析機を用いるのが便利である。
本発明のキットの形態は特に限定されるものではないが、好ましくは、汎用の自動分析機（たとえば、日立７１８０形自動分析機）に適用できることが好ましい。典型的には、測定前に、酵素法を実施するための試薬を、液状の２剤（第一試薬（以下Ｒ１とも記載）、第二試薬（以下Ｒ２とも記載））に分けて調製することができるようになっていればよい。具体的な形態としては、例えば、水溶液、懸濁液または凍結乾燥粉末など形態が採用され得る。中でも、直接自動分析機にセットできる２剤の液状試薬が好ましい。
本発明のキットは、様々な添加物を備え得るが、当該添加物の配合法は特に制限されるものではない。
【０１１７】
本発明のＨｂＡ１ｃ測定キットは、さらに、過酸化水素または酸素を定量するために必要な試薬を含んでいても良い。
過酸化水素を定量するために必要な試薬としては、ペルオキシダーゼ、および発色性基質が例示できる。
【０１１８】
本発明のキットには、例えば、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ、緩衝液、プロテアーゼ、ＰＯＤ、発色試薬、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、界面活性剤、安定化剤、賦形剤、抗菌剤、防腐剤、ウェルプレート、蛍光スキャナー、自動分析機、および本発明にかかる測定方法を紙などの記録媒体に記載した取り扱い説明書などが含まれていてもよい。
【０１１９】
本発明の測定キットは、本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法に利用し得るものである。よって、本発明のキットは、本発明の測定方法の実施に用いられる物品により構成されていてもよい。上記物品の説明については、本発明の測定方法の項における緩衝剤等の説明を援用することができる。
【０１２０】
なお、本発明のキットには、測定に必要な全ての構成をセットにしたものだけでなく、分割されている各構成それぞれも、実質的に包含される。例えば、液状のＲ１とＲ２のセットであれば、Ｒ２と組合せて使用することを前提としたＲ１、または、Ｒ２と組合せて使用することを前提としたＲ２についても、実質的に本発明のキットに包含される。
【０１２１】
［６−７］
［ＨｂＡ１ｃ測定センサー］
本発明のＨｂＡ１ｃ測定センサー（以下「本発明のセンサー」）は、ＨｂＡ１ｃを検出するために用いられるセンサーであり、以下の（１）および（２）を含む、ＨｂＡ１ｃ測定センサーである。
（１）糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端からＦＶＨを切り出す能力を有するプロテアーゼ
（２）ＦＶＨに反応し、かつ、以下の（ａ）および（ｂ）に示す特性を満たすＦＡＯＤ
（ａ）ＦＫに対する反応性がＦＶＨに対する反応性の３０％以下であること。
（ｂ）ＦＶＨに対するＫｍ値が０．９ｍＭ以下であること。
【０１２２】
本発明のセンサーの一実施形態は、上記のプロテアーゼおよびＦＡＯＤを支持体に固定して用いることができる。支持体としては、該ＦＡＯＤを固定化できるものであれば、特に限定されるものではなく、形状や材質は該タンパク質の性質に応じて好適なものを使用してよい。支持体の形状は、該ＦＡＯＤが固定化できる十分な面積を有するものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、基板、ビーズおよび膜などが挙げられる。支持体の材料としては、例えば、無機系材料、天然高分子、および合成高分子などが挙げられる。
なお、本発明は上記の各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種種の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１２３】
本発明のセンサーは、本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法に利用し得るものである。よって、本発明のセンサーは、本発明の測定方法の実施に用いられる物品により構成されていてもよい。上記物品の説明については、本発明の測定方法および本発明のキットの項における緩衝剤等の説明を援用することができる。
【０１２４】
なお、本発明のセンサーには、測定に必要な全ての構成を搭載したものだけでなく、分割されている各構成それぞれも、実質的に包含される。例えば、センサーと組合せて使用することを前提とした使い捨てチップについても、実質的に本発明のセンサーに包含される。
【実施例１】
【０１２５】
［７］
［実施例１］ＦＡＯＤの違いによる反応タイムコースの差
以下の測定を実施した。
１．試薬
Ｒ１
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）  １００ｍＭ
ＮａＣｌ                    ２．９９２ｇ／Ｌ
ＤＡ−６４（和光純薬）      ５０．５ｍｇ／Ｌ
Ｒ２
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）  １００ｍＭ
ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ−３０２  東洋紡績）２０ｋＵ／Ｌ
ＦＡＯＤ  
（１）後述の参考例９に記載のＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｅ（実施例）
（２）ＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン）（比較例）
ＤＡ−６４は、Ｎ−（カルボキシメチルアミノ−カルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩
２．試料  
ＦＶＨ  ０．１２ｍＭ
ＦＶ    ０．１２ｍＭ
ＦＫ    ０．１２ｍＭ
３．測定パラメーター
測定機種   日立７１７０ 
分析法／測定ポイント   ２ポイントエンド（１０）１６−３４
このパラメータを用いた場合、測定に要する時間は、第一反応約３００秒、第二反応約３００秒の計約６００秒である。
波長（副／主）   ８００／７００ 
液量比  試料／Ｒ１／Ｒ２ １８μＬ／１６２μＬ／５４μＬ（Ｓ：Ｒ１＝１：９）
反応温度  ３７℃
ＡＢＳ  ＬＩＭＩＴ   ３２０００増加 
キャリブレーション   ０．０−１００００吸光度打出し 
（Ｈｂ濃度の測定）
３７℃にインキュベートされたＲ１；１８０μＬに下記の検体を精製水で１／２０倍希釈したものからＨｂＡ１ｃ検体１５μＬを添加し、３７℃で反応を開始し、５分後に５０５ｎｍの吸光度を測定した。
結果を、キャリブレーター１（Ｈｂ  １０１．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ  ３．５４μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ％が５．０％）とキャリブレーター２（Ｈｂ  １５３．８μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ  １３．７０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ％が１０．２％）とを用いて作成した検量線と対比してＨｂ濃度を求めた。
（ＨｂＡ１ｃ濃度の測定）
また、Ｒ１添加、５分後にＲ２；６０μＬを添加した。Ｒ２添加前及び添加５分後の６６０ｎｍの吸光度を測定した。結果を、上記と同じキャリブレーター１とキャリブレーター２とを用いて作成した検量線と対比してＨｂＡ１ｃ濃度を求めた。
（ＨｂＡ１ｃ  ％  の測定）
上記で得られた各検体のＨｂ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）から、下記式によりＨｂＡ１ｃ（％）を算出した。
ＨｂＡ１ｃ（％）＝
｛９６．３×ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）／Ｈｂ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）｝＋１．６２
【０１２６】
実施例で用いたＦＡＯＤは、後述の参考例９（表７）に記載されているとおり、ＦＫに対する反応性がＦＶＨに対する反応性の３％であった。また、ＦＶＨに対するＫｍ値は０．３２ｍＭであった。一方、比較例で用いたＦＰＯＸ−ＣＥは、実施例で用いたＦＡＯＤと同時に測定したところ、ＦＫに対する反応性がＦＶＨに対する反応性の２３％であり、また、ＦＶＨに対するＫｍ値は０．９２ｍＭであった。
【０１２７】
図１に反応タイムコースを示す。
実施例のＦＡＯＤを用いてＨｂＡ１ｃ測定系を組んだ場合は、ＦＶＨに対して速やかに反応しタイムコースがエンドになっているのに対し、比較例のＦＰＯＸ−ＣＥを用いてＨｂＡ１ｃ測定系を組んだ場合はやや遅れて反応している。一方ＦＶに対しては、ＴＣのＦＡＯＤよりもＦＰＯＸ−ＣＥの方が速やかに反応している。ＦＫに対しては、両方の測定系ともに、反応性は低い。
この結果は、実施例のＦＡＯＤが、ＦＶＨに対する親和性が向上しており、特に、基質濃度が低い場合や、反応時間を長くとれない場合に有利であることを示す。
【実施例２】
【０１２８】
（ＨＰＬＣ法との相関）
以下の測定を実施した。
［酵素法］
１．試薬
Ｒ１
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）  １００ｍＭ
ＮａＣｌ                    ２．９９２ｇ／Ｌ
ＤＡ−６７（和光純薬）      １０ｍｇ／Ｌ
ＦＡＯＤ  後述の参考例９に記載のＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｅ
Ｒ２
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）  １００ｍＭ
ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ−３０２  東洋紡績製）２０ｋＵ／Ｌ
プロテアーゼ  各々２ＭＵ／Ｌ
（１）ＮＥＰ−２０１（東洋紡績製）  
（２）サーモライシン（大和化成社製）
（３）プロティナーゼＫ(シグマ社製)          
（４）プロテアーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来、フルカ社製）
（５）プロテアーゼ（Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来、シグマ社製）
２．試料  
全血  ６０検体
３．測定パラメーター
実施例１と同じ。
［ＨＰＬＣ法］
アークレイ社製ＨＡ８１６０を用いて通法に従い測定を実施した。
【０１２９】
図２〜図６に相関データを示す。上記（１）〜（５）のプロテアーゼを用いたときの相関式はそれぞれ次のとおり。
（１）Ｙ＝１．０３９７Ｘ−０．２３６４  、Ｒ２＝０．９８５０        
（２）Ｙ＝１．０１２２Ｘ−０．０３９１  、Ｒ２＝０．９８２９        
（３）Ｙ＝１．０４８５Ｘ−０．２３８１  、Ｒ２＝０．９７９８        
（４）Ｙ＝１．０４４１Ｘ−０．２３８５  、Ｒ２＝０．９８２６        
（５）Ｙ＝１．０３９７Ｘ−０．１５７３  、Ｒ２＝０．９８２４        
このように、どのプロテアーゼと組み合わせても、実施例とＨＰＬＣ法との相関はきわめて良好で、本発明の方法が正確にＨｂＡ１ｃを測定できていることを示す。
【実施例３】
【０１３０】
［実施例３］（短時間（６０秒−６０秒）での測定）
［酵素法］
１．試薬
Ｒ１
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）  １００ｍＭ
ＮａＣｌ                    ２．９９２ｇ／Ｌ
ＤＡ−６７（和光純薬）      １０ｍｇ／Ｌ
ＦＡＯＤ  後述の参考例９に記載のＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｅ
Ｒ２
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）  １００ｍＭ
ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ−３０２  東洋紡績）２０ｋＵ／Ｌ
サーモライシン  １０ＭＵ/Ｌ
２．試料  
（１）全血  １８０検体
（２）標準物質  
３．測定パラメーター
実施例１と同じ。測光ポイントの１３−２０ポイントから測定結果を算出した。
分析法／測定ポイント   ２ポイントエンド（１０）１３−２０
このパラメータを用いた場合、測定に要する時間は、第一反応約６０秒、第二反応約６０秒の計約１２０秒である。
［ＨＰＬＣ法］
アークレイ社製ＨＡ８１６０を用いて通法に従い測定を実施した。（メーカーに推奨されている方法）
【０１３１】
３検体について測定タイムコースの一例を図７に示す。また、相関データを図８に示す。また、標準物質の測定結果を図９に示す。
これらの結果より、本発明を用いることにより短時間測定が可能となり、測定結果の迅速なレポートが可能になる。
【実施例４】
【０１３２】
［実施例４、比較例１］高値直線性の確認
［実施例４］
１．試薬
Ｒ１
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）  ５０ｍＭ
ＮａＣｌ                    ２．９９２ｇ／Ｌ
ＦＡＯＤ（ＦＰＯ−３０１（東洋紡社製）  ２ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７（和光純薬）      ５０μｍｏｌ／Ｌ
Ｒ２
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）  １００ｍＭ
ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ−３０２  東洋紡績）２０ｋＵ／Ｌ
サーモライシン  ５ＭＵ/Ｌ
［比較例１］
１．試薬
Ｒ１
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）  ５０ｍＭ
ＮａＣｌ                    ２．９９２ｇ／Ｌ
ＦＡＯＤ（ＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン社製）  ２ｋＵ／Ｌ
ＤＡ−６７（和光純薬）      ５０μｍｏｌ／Ｌ
Ｒ２
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）  １００ｍＭ
ペルオキシダーゼ（ＰＥＯ−３０２  東洋紡績）２０ｋＵ／Ｌ
サーモライシン  ５ＭＵ/Ｌ
２．試料  
（１）ＨｂＡ１ｃ％が４．２％と１３．７％の２濃度の検体を用いて、各々を混合し直線性試料を作成した。なお、試料の濃度については、アークレイ社製ＨＡ８１６０を用いて、メーカーに推奨されている方法を用いて測定を実施した。
３．測定パラメーター
実施例２と同じ。測光ポイントの１３−２０ポイントから測定結果を算出した。
分析法／測定ポイント   ２ポイントエンド（１０）１３−２０
このパラメータを用いた場合、測定に要する時間は、第一反応約６０秒、第二反応約６０秒の計約１２０秒である。
【０１３３】
実施例４の測定結果を図１０、表１０に、比較例１の結果を図１０、表１１に示す。
図１０において、高値領域において比較例１のＨｂＡ１ｃ（％）の測定値が実施例４の測定値より低下してくる傾向が見られる。
その理由は、比較例１では、特に高値試料では短時間で反応が終了せず、ＨｂＡ１ｃの測定が十分にできていないためだと考えられる。
このことは、表１０および表１１の最右欄に示されている、各直線性試料（希釈系列）の「ＨｂＡ１ｃ測定値」の「差分」の値が、実施例４では全ての測定対象範囲において１．０μｍｏｌ／Ｌ前後の値を示したのに対し、比較例１では１０水準希釈系列の６番目までは、差分が１．０μｍｏｌ／Ｌ前後の値を示したが、７番目以降においては０．８μｍｏｌ／Ｌ付近に低下したことからも裏付けられる。
これらの結果より、本発明を用いることにより短時間において高値試料についても正確に測定することが可能となる。
【０１３４】
【表１０】
0005927771.tif 000002
【０１３５】
【表１１】
0005927771.tif 000003
【０１３６】
［８］
［参考例］
以下、本発明に用いることができるＦＡＯＤについて具体的に説明する。
以下の説明では、ＦＡＯＤのことを「フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ」とも呼んでいる。
本参考例では、まず、［８−１］本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質、［８−２］該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、［８−３］該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターで宿主を形質転換した形質転換体、および、［８−４］該形質転換体を培養してフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を得る方法について概説し、次いで、［８−５］具体的な例示をする。
【０１３７】
［８−１］
＜１．本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質＞
本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質は、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）のいずれかに記載の、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。つまり、
（Ｉ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ＩＩ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（ＩＩＩ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８６．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【０１３８】
上記配列番号１に示されるアミノ酸配列は、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍのゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｖａｌ＝ＮＺ＿ＡＡＧＩ００００００００）に基づき探索をし、単離をしたフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼのアミノ酸配列である。
【０１３９】
また、本発明に用いることができるＦＡＯＤは、上記で説示したタンパク質のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をも包含するが、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加される部位は、置換、欠失、挿入および／または付加後のタンパク質がフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有していれば、該アミノ酸配列中のどの部位であってもよい。ここで「１または数個のアミノ酸残基」とは、具体的には１０個以内の範囲のアミノ酸残基数であり、好ましくは６個以内の範囲のアミノ酸残基である。
【０１４０】
また、本発明に用いることができるＦＡＯＤは、上記で説示した本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１に示す）において、当該アミノ酸配列と８６．０％以上、より好ましくは９０．０％以上、より好ましくは９５．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を包含する。
【０１４１】
なお、アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製の商品名）を当該商品のマニュアルに従って使用し、配列番号１に示すアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ）により一致するアミノ酸配列の割合（％）として、相同性を計算することができる。相同性は、比較対象の配列の全領域にわたって最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定され得る。ここで、比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。
【０１４２】
上述した、「配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質」、または、「配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８６．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質」では、配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、アミノ末端から５８番目のイソロイシン、および／またはアミノ末端から１１０番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されていることが好ま
しい。
【０１４３】
上記タンパク質では、上記アミノ末端から５８番目のイソロイシンおよび／またはアミノ末端から１１０番目のグリシンが、他のアミノ酸に置換されている。上記他のアミノ酸としては特に限定されず、適宜公知のアミノ酸に置換され得る。置換されるアミノ酸としては、例えば、天然のタンパク質の構成成分である基本アミノ酸、何らかの化学修飾を受けた修飾アミノ酸、基本アミノ酸から誘導された特殊アミノ酸などを挙げることできるが、これらに限定されない。
【０１４４】
アミノ末端から５８番目のイソロイシンを他のアミノ酸に置換することによって、上記タンパク質のフルクトシルバリルヒスチジンに対する基質特異性を更に上昇させることが可能となり、アミノ末端から１１０番目のグリシンを他のアミノ酸の置換することによって、上記タンパク質の熱安定性を更に上昇させることが可能となる。
【０１４５】
以下に、まず、アミノ末端から５８番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されている場合について、具体的に説明する。
上記アミノ末端から５８番目のイソロイシンは、例えばメチオニン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、セリン、バリン、または、ロイシンに置換されていることが好ましい。上記構成であれば、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの基質特異性（フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性）を更に上昇させることができる。
フルクトシルバリルヒスチジンに対する基質特異性を更に上昇させる（換言すれば、フルクトシルバリンおよびフルクトシルリジンの両基質への反応性を大幅に低下させる）という観点からは、上記アミノ末端から５８番目のイソロイシンは、トレオニン、セリン、バリンまたはアラニンに置換されることが更に好ましい。
【０１４６】
一方、基質特異性のみならず熱安定性をも上昇させるという観点からは、上記アミノ末端から５８番目のイソロイシンは、メチオニン、セリンまたはアラニンに置換されることが更に好ましい。
したがって、基質特異性を更に上昇させるとともに熱安定性をも上昇させるという観点からは、上記アミノ末端から５８番目のイソロイシンは、セリンまたはアラニンに置換されることが最も好ましいといえる。
アミノ末端から５８番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されている場合には、アミノ末端から５８番目以外の部位においても、アミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加され得る。このとき、アミノ末端から５８番目以外で置換、欠失、挿入、および／または付加が生じる箇所としては、特に限定されない。
【０１４７】
次いで、アミノ末端から１１０番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されている場合について、具体的に説明する。
上記アミノ末端から１１０番目のグリシンは、例えば、トリプトファンおよびプロリン以外のアミノ酸に置換されていることが好ましい。更に具体的には、上記アミノ末端から１１０番目のグリシンは、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、システイン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、アルギニン、セリン、バリン、ロイシン、アスパラギン酸、イソロイシン、チロシンまたはフェニルアラニンに置換されていることが好ましい。上記構成であれば、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの熱安定性を上昇させることができる。
【０１４８】
熱安定性のみならず比活性をも上昇させるという観点からは、上記アミノ末端から１１０番目のグリシンは、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）またはチロシン（Ｙ）に置換されることが更に好ましい。
熱安定性のみならずＫｍ評価をもより良いものとするという観点からは、上記アミノ末
端から１１０番目のグリシンは、ヒスチジン（Ｈ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、チロシン（Ｙ）、またはフェニルアラニン（Ｆ）に置換されることが更に好ましい。
熱安定性のみならず基質特異性をも上昇させるという観点からは、上記アミノ末端から１１０番目のグリシンは、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）に置換されることが更に好ましい。
アミノ末端から１１０番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されている場合には、アミノ末端から１１０番目以外の部位においても、アミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加され得る。このとき、アミノ末端から１１０番目以外で置換、欠失、挿入、および／または付加が生じる箇所としては、特に限定されない。
【０１４９】
配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から５８番目のアミノ酸と、アミノ末端から１１０番目のアミノ酸との両方が、他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。上記構成によれば、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの熱安定性を上昇させる傾向を示すとともに、フルクトシルリジンへの反応性を低下させる傾向を示す。また、上述したように上記アミノ末端から１１０番目のグリシンが置換される具体的なアミノ酸は特に限定されないが、例えば、グルタミンであることが好ましい。上記構成であれば、更にフルクトシルバリンおよびフルクトシルリジンへの反応性を低下させることができる。
【０１５０】
上記「配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質」、または、「配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８６．０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質」では、配列番号１に記載されるアミノ酸配列におけるアミノ末端から５８番目・１１０番目のアミノ酸以外に、アミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。上記構成によれば、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの熱安定性を上昇させることができる。
【０１５１】
上記アミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンが置換される具体的なアミノ酸としては特に限定されないが、例えば、チロシンであることが好ましい。上記構成であれば、更にフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの熱安定性を上昇させることができる。
【０１５２】
本発明におけるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性は、後述する参考例の「活性測定法」の項において説明した方法によって測定される。フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を測定する場合、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として用いればよい。なお、本発明の説明において「フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有する」とは、フルクトシルバリルヒスチジンを基質としたオキシダーゼ活性を少なくとも有すればよいが、好ましくは０．１Ｕ／ｍｇ‐ｐｒｏｔｅｉｎ以上を意味し、さらに好ましくは１．０Ｕ／ｍｇ‐ｐｒｏｔｅｉｎ以上を意味する。また、本発明にかかるタンパク質は、上記フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性に加えて、他の酵素活性（限定されないが、例えば、フルクトシルバリンに対するオキシダーゼ活性）をさらに有してよい。
【０１５３】
上記本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質は、例えば、自然界から単離した当該タンパク質を産生する生物（例えば、細菌、酵母、昆虫、線虫、ゼブラフィッシュ、哺乳類など）を用いて生産されてもよい。つまり、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質には、様々な生物種由来のタンパク質が包含される。また、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質は、遺伝子組み換え技術を用いて生産されてもよいし、またはアミノ酸合成機などを用いて化学合成されてもよい。遺伝子組み換え技術において、
好適に用いられる各種組換えタンパク質発現系は、例えば、大腸菌発現系、昆虫細胞発現系、哺乳類細胞発現系、および無細胞発現系を用いてもよく、これらに限定されない。本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質等の製造方法については後述する。
【０１５４】
また本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質等は、例えば、分子間架橋および／または分子内架橋（例えば、ジスルフィド結合など）が施されたもの、化学修飾（例えば、糖鎖、リン酸もしくはその他の官能基など）されたもの、標識（例えば、ヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、またはＦｌａｇタグなど）が付与されたもの、または融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、ＧＳＴまたはＧＦＰなど）を付与されたものなどが含まれるが、特にこれらに限定されない。さらに、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質は、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性が実質的に維持される限り、数種のタンパク質の断片を組み合わせて構成したキメラタンパク質も含み得る。
【０１５５】
本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質と、血清タンパク質、有機酸、または、デキストランをはじめとする賦形剤等とからフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤を構成してもよい。上記フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤には、酵素剤の構成物品として公知の物品が含まれていてもよい。
【０１５６】
［８−２］
＜２．本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチド＞
本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下の（ＩＶ）〜（ＶＩＩ）の何れかのポリヌクレオチドからなる、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
（ＩＶ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（Ｖ）配列番号２に記載される塩基配列において、１つ以上３０以下の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＶＩ）本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＶＩＩ）上記（ＩＶ）から（ＶＩ）の何れかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１５７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態で存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
【０１５８】
また、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドは化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を変更してもよい。勿論、同じアミノ酸をコードするコドン同士であれば置換することも可能である。
【０１５９】
本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドの作製方法としては特に限定されず、適宜公知の方法によって作製することが可能である。例えば、野生型のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド（配列番号２）に対して、必要に応じて適宜変異を導入することによって作製することが
可能である。また、化学合成法によって作製することも可能である。
【０１６０】
本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製する方法としては、通常行われるポリヌクレオチド改変方法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドの特定の塩基を置換、欠失、挿入および／または付加することで、所望の組換えタンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドを作製することができる。ポリヌクレオチドの塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；東洋紡績製，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、またはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。これらの方法は当業者に公知である。
【０１６１】
本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上記本発明にかかるタンパク質をコードしていればその塩基配列は特に限定されるものではない。よって本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質のアミノ酸配列に応じた塩基配列からなる全てのポリヌクレオチドが本発明に含まれる。
【０１６２】
本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドを構成する塩基の一部が化学的に合成された塩基（いわゆる非天然型塩基を含む）で置換されたものでもよい。また、該ポリヌクレオチドが置換される部位は特に限定されず、置換後の塩基配列から発現するタンパク質が好適な性質を有していればよい。
【０１６３】
本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、その他の塩基配列が付加されていてもよい。付加される塩基配列としては、限定されないが、標識（例えば、ヒスチジンタグ、ＭｙｃタグまたはＦＬＡＧタグなど）、融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、ＧＳＴ、ＧＦＰまたはＭＢＰなど）、プロモーター配列（例えば、酵母由来プロモーター配列、ファージ由来プロモーター配列または大腸菌由来プロモーター配列など）、およびシグナル配列（例えば、小胞体移行シグナル配列、および分泌配列など）をコードする塩基配列などが挙げられる。これらの塩基配列が付加される部位は特に限定されるものではなく、例えば、翻訳されるタンパク質のＮ末端であっても、Ｃ末端でもあってもよい。
【０１６４】
また本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドには、上記本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド）、またはこれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドも含まれる。
【０１６５】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件をいう。例えば、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件をいう。更に具体的には、上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている周知の方法で行うことができる。
【０１６６】
本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２１４：  １２０５  （１９８１）に記載されたジデオキシ法により決定され得る。
【０１６７】
本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一例に関して、以下に更に詳細に説明するが、これに限定されるものではない。なお、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドには、以下に記載する置換のあらゆる組み合わせによって生じるポリヌクレオチドが包含される。
【０１６８】
まず、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質の一例である、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から５８番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドについて説明する。
【０１６９】
本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から５８番目のイソロイシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。更に具体的には、配列番号２に示されるポリヌクレオチドにおいて、「ａｔｔ（１７２番目〜１７４番目）」がイソロイシン以外をコードするコドンに置換されたポリヌクレオチドであることが好ましい。
【０１７０】
上記「ａｔｔ」を置換する具体的なコドンとしては特に限定されないが、例えば、メチオニン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、セリン、バリン、または、ロイシンをコードするコドンであることが好ましい。更に具体的には、上記「ａｔｔ」は、「ａｔｇ（メチオニンをコードするコドン）」、「ａｃｃ（トレオニンをコードするコドン）」、「ｇｃｔ（アラニンをコードするコドン）」、「ａａｃ（アスパラギンをコードするコドン）」、「ｔｃｇ（セリンをコードするコドン）」、「ｇｔｃ（バリンをコードするコドン）」、または、「ｃｔｃ（ロイシンをコードするコドン）」に置換されることが好ましいが、これらに限定されない。上記アミノ酸をコードする別のコドンに置換することも勿論可能である。
【０１７１】
更に、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上記置換に加えて、配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるアミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。更に具体的には、配列番号２に示されるポリヌクレオチドにおいて、「ｔｔｃ（８４４番目〜８４６番目）」がフェニルアラニン以外をコードするコドンに置換されたポリヌクレオチドであることが好ましい。
【０１７２】
上記「ｔｔｃ」を置換する具体的なコドンとしては特に限定されないが、例えば、チロシンをコードするコドンであることが好ましい。更に具体的には、上記「ｔｔｃ」は、「ｔａｔ（チロシンをコードするコドン）」に置換されることが好ましいが、これに限定されない。上記「ｔｔｃ」を、チロシンをコードする別のコドンに置換することも勿論可能である。
【０１７３】
更に、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上記置換に加えて、配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるアミノ末端から１１０番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。更に具体的には、配列番号２に示されるポリヌクレオチドにおいて、「ｇｇａ（３２８番目〜３３０番目）」がグリシン以外をコードするコドンに置換されたポリヌクレオチドであることが好ましい。
【０１７４】
上記「ｇｇａ」を置換する具体的なコドンとしては特に限定されないが、例えば、グルタミンをコードするコドンであることが好ましい。更に具体的には、上記「ｇｇａ」は、「ｃａｇ（グルタミンをコードするコドン）」に置換されることが好ましいが、これに限定されない。上記「ｇｇａ」を、グルタミンをコードする別のコドンに置換することも勿論可能である。
【０１７５】
次いで、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質の一例である、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から１１０番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドについて説明する。
【０１７６】
本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から１１０番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。更に具体的には、配列番号２に示されるポリヌクレオチドにおいて、「ｇｇａ（３２８番目〜３３０番目）」がグリシン以外をコードするコドンに置換されたポリヌクレオチドであることが好ましい。
【０１７７】
上記「ｇｇａ」を置換する具体的なコドンとしては特に限定されないが、例えば、トリプトファンおよびプロリン以外のアミノ酸をコードするコドンであることが好ましい。更に具体的には、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、システイン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、アルギニン、セリン、バリン、ロイシン、アスパラギン酸、イソロイシン、チロシンまたはフェニルアラニンをコードするコドンであることが好ましい。更に具体的には、上記「ｇｇａ」は、「ａｃｇ（トレオニンをコードするコドン）」、「ｇｃｇ（アラニンをコードするコドン）」、「ｇｔｇ（バリンをコードするコドン）」、「ｃｔｇ（ロイシンをコードするコドン）」、「ａｔｔ（イソロイシンをコードするコドン）」、「ａｔｇ（メチオニンをコードするコドン）」、「ｔｔｃ（フェニルアラニンをコードするコドン）」、「ｔｃｃ（セリンをコードするコドン）」、「ｃａｇ（グルタミンをコードするコドン）」、「ｔｇｔ（システインをコードするコドン）」、「ｔａｃ（チロシンをコードするコドン）」、「ａａｃ（アスパラギンをコードするコドン）」、「ａａｇ（リジンをコードするコドン）」、「ｃａｃ（ヒスチジンをコードするコドン）」、「ａｇｇ（アルギニンをコードするコドン）」、「ｇａｃ（アスパラギン酸をコードするコドン）」、または「ｇａｇ（グルタミン酸をコードするコドン）」に置換されることが好ましいが、これらに限定されない。上記アミノ酸（置換後のアミノ酸）をコードする別のコドンに置換することも勿論可能である。
【０１７８】
更に、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上記置換に加えて、配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるアミノ末端から２８２番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。更に具体的には、配列番号２に示されるポリヌクレオチドにおいて、「ｔｔｃ（８４４番目〜８４６番目）」がフェニルアラニン以外をコードするコドンに置換されたポリヌクレオチドであることが好ましい。
【０１７９】
上記「ｔｔｃ」を置換する具体的なコドンとしては特に限定されないが、例えば、チロシンをコードするコドンであることが好ましい。更に具体的には、上記「ｔｔｃ」は、「ｔａｔ（チロシンをコードするコドン）」に置換されることが好ましいが、これに限定されない。上記「ｔｔｃ」を、チロシンをコードする別のコドンに置換することも勿論可能である。
【０１８０】
［８−３］
＜３．本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター・該ベクターで形質転換された形質転換体＞
本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、上記ポリヌクレオチドを含むものであれば、その他の構成は特に限定されるものではない。
【０１８１】
該ベクターを構成するベースとなるベクターとしては、宿主に対して好適なベクターが適宜選択され得る。例えば、ベースとなるベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、アデノウイルス、またはレトロウイルスなどを使用することが可能であるが、これらに限定されない。
該ベクターとしてプラスミドベクターを用いる場合、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）、ｐＵＣ１８などが使用できる。この場合、ベクターが導入される宿主としては、例えば、酵母、大腸菌（エシェリヒア・コリーＷ３１１０（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α）、昆虫細胞、哺乳類細胞などが利用可能である。
更に、具体的には、上記宿主として、大腸菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなど）等の細菌、酵母（例えば、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅなど）、昆虫細胞、線虫（例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓなど）、アフリカツメガエル（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓなど）の卵母細胞、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）や各種ヒト培養細胞などを用いることが可能であるが、これらに限定されない。また、本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」には、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含まれる。
【０１８２】
該べクターは、導入されるべき宿主に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有することが可能である。プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）などが挙げられるが、これに限定されない。
上記ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、アンピシリン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主に導入されたか否か、さらには宿主中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【０１８３】
上記宿主に該ベクターを導入する方法としては特に限定されるものではないが、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。更に具体的には、エシェリヒア属に属する宿主微生物にベクターを導入する場合は、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡを導入する方法や、エレクトロポレーション法を用いる方法が適用され得る。その他、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いて遺伝子導入が行われても良い。
【０１８４】
上記ベクターを構築するには、本発明にかかるポリヌクレオチド（遺伝子）を分離および精製した後、制限酵素処理などを用いて切断した該ポリヌクレオチドの断片と、ベースとなるベクターを制限酵素で切断して得た直鎖ポリヌクレオチドとを結合閉鎖させて構築することができる。結合閉鎖する際には、ベクターおよび該ポリヌクレオチドの性質に応じてＤＮＡリガーゼなどが使用され得る。該ベクターを複製可能な宿主に導入した後、ベクターのマーカーおよび酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、上記ポリヌクレオチド（遺伝子）を含有する形質転換体を得ることができる。よって、該ベクターには
薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。
【０１８５】
上記ベクターを用いて、該ベクターで形質転換された形質転換体を作製することができる。該ベクターによって形質転換される宿主は、特に限定されないが、上述したように酵母、大腸菌、昆虫細胞、および哺乳類細胞などが挙げられる。
【０１８６】
［８−４］
＜４．本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質の製造方法＞
本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質の製造方法は、上記形質転換体を培養する工程（「培養工程」という）を含む。本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質の製造方法には、上記培養工程の他、形質転換体を用いたタンパク質生産において含まれ得るその他の工程が含まれていてもよい。その他の工程としては、例えば、培養工程後に、該形質転換体が生産したタンパク質を回収する工程や、当該タンパク質を精製する工程が挙げられる。
【０１８７】
（４−１）培養工程
上記培養工程では、上記の形質転換体が栄養培地などで培養されることにより、多量の組換えタンパク質を安定して生産し得る。形質転換体の培養形態（培養方法、培養条件など）は、宿主の栄養生理的性質を考慮して選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【０１８８】
培養工程で用いられる栄養培地の栄養源としては、培養に通常用いられるものが広く使用されてよい。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、またはピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、または大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。これらに加えて、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて培地に添加されてよい。
【０１８９】
上記の形質転換体の培養温度は、当該形質転換体が本発明にかかるタンパク質を生産可能な範囲内であれば適宜変更し得るが、例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリー）を宿主として利用する場合、好ましくは２０〜４２℃程度であり、より好ましくは２０〜３０℃である。当該温度範囲であれば、活性を有するタンパク質を多く生産することができる。
培養時間は、本発明にかかるタンパク質が最高収量に達する適当な時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは本発明にかかる形質転換体が好適に発育し、且つ本発明にかかるタンパク質を生産可能な範囲内で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【０１９０】
（４−２）回収工程
回収工程では、上記培養工程中に形質転換体によって生産された、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質が回収される。
上記形質転換体がタンパク質を細胞外に分泌する場合、その培養物には本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質が含まれている。よって培養物を本発明にかかるタンパク質としてそのまま利用することが可能である。この時、例えばろ過や遠心分離などにより、培養液と本発明にかかる形質転換体とを分離してもよい。
【０１９１】
また本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質が形質転換体内に存在する場合、形質転換体を培養して得られた培養物から、ろ過または遠心分離などの手段を用いて形質転換体を採取し、該形質転換体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊後
、目的のタンパク質を回収すればよい。また、必要に応じて、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡなど）および界面活性剤（例えば、トリトン−Ｘ１００など）を添加して本発明にかかるタンパク質を可溶化し、当該タンパク質を水溶液として分離採取してもよい。
【０１９２】
（４−３）精製工程
精製工程は、上記回収工程によって得られたタンパク質を精製する工程である。
精製工程の具体的な方法は特に限定されるものではないが、例えば、本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質を含む溶液を、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムなどを用いる）、または親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトンなど）による分別沈殿法に供すればよい。上記操作によって、目的である本発明に用いることができるＦＡＯＤタンパク質を沈殿させ、精製することができる。
また、前記精製工程では、加熱処理、等電点処理、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせを用いて精製を行ってもよい。
上記手法を用いて得られた目的のタンパク質を含む精製酵素は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行えば単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
上記の精製酵素は、例えば凍結乾燥、真空乾燥、またはスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。また、精製酵素を使用する際は、その用途によって適宜緩衝液に溶解した状態で使用することができる。緩衝液としては、例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、およびＧＯＯＤ緩衝液などが目的のタンパク質の性質、および／または実験条件もしくは環境に応じて好適に選択されてよい。さらに、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グルタミン、またはリジンなど）、および血清アルブミンなどを精製酵素に添加することにより、タンパク質を安定化することができる。
【０１９３】
［８−５］
次いで、具体的な参考例について例示する。
＜１．活性測定試薬＞
表１に参考例において使用した活性測定試薬の組成を示した。なお、参考例において使用した試薬は特記しない限り、ナカライテスク社より購入したものを用いた。
【０１９４】
【表１】
0005927771.tif 000004
【０１９５】
参考例におけるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの活性測定条件を以下に示した。
【０１９６】
＜２．活性測定法＞
下記参考例１〜３における活性測定法を以下に説明する。
各基質に対する酵素活性は、酵素反応により生成する過酸化水素を追随するペルオキシダーゼ反応により生じた色素の吸光度の増加で測定した。活性測定試薬３ｍＬを３７℃で
５分間予備加温後、予め、酵素希釈液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５））で希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、反応を開始する。
３７℃で５分間反応させ、５００ｎｍの吸光度変化を測定する（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）。盲検では、酵素溶液の代わりに酵素希釈液０．１ｍＬを加え、上記同様に操作を行って吸光度変化を測定した（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ）。得られた吸光度変化より、下記計算式に基づき酵素活性を算出した。尚、上記条件で１分間に１マイクロモルの基質を酸化する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
−計算式−
活性値（Ｕ／ｍＬ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．１（ｍＬ）×希釈倍率｝／｛１３×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍＬ）｝
３．１（ｍＬ）：全液量
１３：ミリモル吸光係数
１．０ｃｍ：セルの光路長
０．１（ｍＬ）：酵素サンプル液量
【０１９７】
＜３．参考例１：フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子のクローニング＞
Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼのｃＤＮＡクローニングを行うために、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍのゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｕｔｉｌｓ／ｇｅｎｏｍ＿ｔａｂｌｅ．ｃｇｉ？ｏｒｇａｎｉｓｍ＝ｆｕｎｇｉ＆ｄａｔａｂａｓｅ＝３２１６１４）を検索した。
ゲノムデータベースから、ＦＡＤ依存オキシドレダクターゼ（ＦＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードすることが予測される遺伝子を抽出した。検索結果から得られた種々の遺伝子のうち、フルクトシルバリンに実質的に作用する酵素をコードする可能性を有するという観点からさらに絞り込みを行った結果、ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ．  ＡＡＧＩ０１０００１７７    ２３９５１２  ｂｐ  Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ  ＳＮ１５  ｃｏｎｔ１．１７７，  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｏｔｇｕｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｔｏｏｌ＝ｐｏｒｔａｌ＆ｄｂ＝ｎｕｃｃｏｒｅ＆ｔｅｒｍ＝＆ｑｕｅｒｙ％５Ｆｋｅｙ＝１１＆ｄｏｐｔ＝ｇｂ＆ｄｉｓｐｍａｘ＝２０＆ｐａｇｅ＝１＆ｑｔｙ＝１＆ＷｅｂＥｎｖ＝０ｘ３ｆＴｈＺＱ１ｕｂｖ２Ｅ４ＱＵｔｃＴＦｚＳ２ｙＨＯＶ３ｌｊＯｕＲ６ｋＵｗＧｙＮＯＶＥｉｑＣＧｄＦａｃ８ｙＹＡｌｆｚＺＧ％２ＤｖｐＢｘＸｑＮｒＰＮＥＳＷ３ｓｋｋ％４０２６４４５５８６７８７０１７２０％５Ｆ０１３５ＳＩＤ＆ＷｅｂＥｎｖＲｑ＝１）の７５，１４３  ｂｐから７６，６２５  ｂｐの配列に相当する遺伝子をクローニング候補遺伝子とした。
次に、上記クローニング候補遺伝子のｃＤＮＡについて、スプライシング部位（エキソン−イントロン）の予測ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｓｐｌｉｃｅ．ｈｔｍｌ）の使用や、既知の他の生物種のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子との比較により、タンパク質をコードする部分に対応するｃＤＮＡ全配列を推定した。この情報をもとに、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成、すなわち全ＲＮＡの調製からｍＲＮＡの抽出を経て逆転写を行うことでｃＤＮＡ全配列を合成した。前記のｃＤＮＡを、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて末端の平滑化を行い、ｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部位へサブクローニングした。ｃＤＮＡ部分についてシーケンス解析を行った結果、配列番号２に示した塩基配列が得られた。配列番号２に示した塩基配列におけるｃＤＮＡのコーディング領域は１番目の塩基から１３１４番目の塩基であり、開始コドンは１番目の塩基から３番目の塩基、終止コドンＴＡＧは１３１２番目の塩基から１３１４番目の塩基に相当する。配列番号２に示した塩基配列から明らかとなったアミノ酸配列は、配列番号１に示した。
なお、後述の参考例２及び３に示すように、得られたｃＤＮＡは、新規なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼをコードするものであった。
【０１９８】
＜４．参考例２：フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子の大腸菌での大量発現と精製、酵素アッセイ＞
上記配列番号２に示した塩基配列を有するフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドを作製し、大腸菌におけるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼタンパク質の大量発現を試みた。
フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子の終止コドンを除いた全長ｃＤＮＡ領域（配列番号２に示した塩基配列の１番目から１３１１番目の塩基まで）をＰＣＲで増幅した。その際、アミノ酸配列のＮ末端側に配列番号３に示すプライマーＰ１（５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＧＣＣＣＴＣＣＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＴＣＡＴＴ−３’）（上記塩基配列における「ＣＡＴＡＴＧ」はＮｄｅＩ部位）を用いてＮｄｅＩ切断部位を挿入し、Ｃ末端側に配列番号４に示すプライマーＰ２（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＴＣＧＣＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＴＣＡＴＧＡＴＴＣＣＡＡＣＣ−３’）（上記塩基配列における「ＣＴＣＧＡＧ」はＸｈｏＩ部位）を用いてＸｈｏＩ切断部位を導入した。本ＤＮＡ断片をｐＥＴ−２３ｂベクター（ノバジェン社）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位へＴ７プロモーターと正方向になるようにサブクローニングした。作製したプラスミドは、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ発現用プラスミドとしてｐＩＥ３５３と命名した。
前記のプラスミドｐＩＥ３５３を用いて大腸菌ＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ストラタジーン社）を形質転換した。その後、アンピシリン耐性を示す形質転換体ＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ｐＩＥ３５３）を選択した。
前記形質転換体の培養用の培地として、２００ｍＬのＴＢ培地を容積２Ｌの坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行ったものを用いた。前記培地を放冷後、別途無菌濾過したアンピシリンを終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように培地に添加した。この培地に１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ｐＩＥ３５３）の培養液を２ｍＬ接種した。
続いて、３０℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、細胞を超音波破砕した。
次に、前記懸濁液を遠心分離して、上清液を粗酵素液として得た。フルクトシルバリルヒスチジンを基質として含む酵素活性測定試薬を用いて測定した粗酵素液のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性は、約１．０Ｕ／ｍＬであった。得られた粗酵素液についてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｈｉｓ−ｔａｇ−（東洋紡績製）を用いて、規定のプロトコールに従って精製し、精製酵素標品（ＩＥ３５３）を得た。本方法により得られたＩＥ３５３標品は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、単一であることが確認された。
前記ＩＥ３５３標品の酵素活性を、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として含む酵素活性測定試薬を用いて測定し、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有することを確認した。
【０１９９】
＜５．参考例３：各フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼタンパク質の特性評価＞
本発明にかかるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ（ＩＥ３５３）、及び従来の酵素ＦＰＯＸ−ＣＥ及びＦＰＯＸ−ＥＥ（ともにキッコーマン製）の、熱安定性、基質特異性及びフルクトシルバリルヒスチジン（ＦＶＨ）に対するＫｍ値を測定した結果を表２に示す。
熱安定性は５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に各酵素を０．１ｍｇ／ｍＬになるように調製し、５０℃、１０分間熱処理を行い、下記計算式により算出した。
熱安定性（％）＝（５０℃、１０分熱処理後の活性値）÷（熱処理なし活性値）×１００
基質特異性は各基質を１０ｍＭになるように調製して、前述した活性測定法を用い、下
記計算式により算出した。なお、下記式中で、ＦＫは、酵素反応の基質としてのフルクトシルリジンを指す。また、当該式で定義される基質特異性の値が小さいほど、ＦＶＨに対する特異性に優れ、好ましいと判定される。
基質特異性（ＦＫ／ＦＶＨ）＝（ＦＫを基質としたときの活性値）÷（ＦＶＨを基質としたときの活性値）
ＦＶＨに対するＫｍ値はＦＶＨ濃度を１．７５ｍＭ、０．８８ｍＭ、０．５８ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．１８ｍＭになるように試薬を調製し、それぞれを用いて前述した活性測定を実施し、ラインウィーバー・バークプロットより算出した。
【０２００】
【表２】
0005927771.tif 000005
【０２０１】
表２の結果から明らかなように、ＩＥ３５３はＦＰＯＸ―ＣＥ及びＦＰＯＸ―ＥＥと比較して熱安定性が高く、基質特異性に優れ、且つＫｍ値も低いことがわかる。Ｋｍ値が低いことは基質との親和性が高い、つまり低い基質濃度でも反応性が良いことを示している。よって、糖化タンパク質測定試薬におけるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの添加量を減らすことができる。
【０２０２】
＜６．活性測定方法＞
以下の参考例４〜７、参考例１におけるＦＡＯＤの活性測定方法を、以下に示す。
各基質に対するＦＡＯＤの酵素活性は、酵素反応によって生成される過酸化水素を用いたペルオキシダーゼ反応により生じた色素の吸光度の増加を測定した。
まず、活性測定試薬３ｍＬを３７℃にて５分間加温した後、当該活性測定試薬に、予め酵素希釈液（０．１％トリトンＸ１００を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５））にて希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、反応を開始した。
３７℃にて５分間反応させた後、単位時間あたりの５００ｎｍの吸光度変化を測定した（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）。盲検としては、酵素溶液の代わりに酵素希釈液０．１ｍＬを用い、同様の操作を行って吸光度変化を測定した（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ）。
下記計算式に基づいて、得られた吸光度変化から酵素活性を算出した。なお、上記条件下で１分間に１マイクロモルの基質を酸化する酵素量を１単位（Ｕ）と規定した。
−計算式−
活性値（Ｕ／ｍＬ）＝｛（（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）−（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ））×３．１ｍＬ×希釈倍率｝／（１３×１．０ｃｍ×０．１ｍＬ）
なお、上記計算式において、「３．１ｍＬ」は全液量を示し、「１３」はミリモル吸光係数を示し、「１．０ｃｍ」はセルの光路長を示し、「０．１ｍＬ」は酵素サンプル液量を示す。
【０２０３】
＜７．基質特異性評価方法＞
以下の参考例４〜７、参考例１におけるＦＡＯＤの基質特異性評価方法を、以下に説明する。
各基質（ＦＫ：フルクトシルリジン、ＦＶ：フルクトシルバリン、ＦＶＨ：フルクトシルバリルヒスチジン）の濃度が２ｍＭになるように活性測定試薬を調製し、上述した活性測定法に従って、下記計算式により活性値比（基質特異性）を算出した。
（ＦＶ／ＦＶＨ）＝（ＦＶを基質としたときの活性値）÷（ＦＶＨを基質としたときの活性値）
（ＦＫ／ＦＶＨ）＝（ＦＫを基質としたときの活性値）÷（ＦＶＨを基質としたときの活性値）
なお、当該式で定義される活性値比の値が小さいほど、ＦＶＨに対する特異性に優れ、好ましいと判定される。
【０２０４】
＜８．熱安定性評価方法＞
以下の参考例４〜７、参考例１におけるＦＡＯＤの熱安定性評価方法を、以下に説明する。
精製酵素標品を０．１ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、５０℃にて１０分間の加熱処理を施した。なお、後述する３重変異タンパク質では、加熱温度は５５℃とした。そして、以下の計算式に基づいて、精製酵素標品の熱安定性（％）を算出した。
熱安定性（％）＝［（５０℃、１０分間加熱処理後の活性値）／（加熱処理前の活性値）］×１００
【０２０５】
＜９．参考例４：フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子・タンパク質の改変＞
配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目のイソロイシンをランダムに他のアミノ酸に置換するために、プライマーＲ１およびプライマーＲ２を合成した。
・プライマーＲ１：５’−ｃｔｔａｔｔｇａｇｇｔｃａｔｔｇｃｃｔｇｃａｇａｔｔｇｃｇａｔｇａａｇｇ−３’（配列番号５）
・プライマーＲ２：５’−ｎｎｓａｔｇｇｇｃｇｔｔａｇｃｔｔｇｃｇａａａｃｃｃａｇｔｇｇａｃ−３’（配列番号６）
上記ｐＩＥ３５３、プライマーＲ１、およびプライマーＲ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ
Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記５８番目のイソロイシンに変異が導入された組換えプラスミドを作製した。当該組換えプラスミドを用いてＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す１００個のコロニーをピックアップした。１００個のコロニーに導入されている１００個の組換えプラスミドの塩基配列を確認したところ、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目のイソロイシンが１９種類のアミノ酸の各々に置換されたプラスミドを取得することに成功した。
具体的には、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がトレオニン（Ｔ）をコードする塩基配列（ａｃｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がアラニン（Ａ）をコードする塩基配列（ｇｃｔ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ａ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ａと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がバリン（Ｖ）をコードする塩基配列（ｇｔｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｖ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｖと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がロイシン（Ｌ）をコードする塩基配列（ｃｔｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｌ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｌと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）が
メチオニン（Ｍ）をコードする塩基配列（ａｔｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｍ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｍと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がフェニルアラニン（Ｆ）をコードする塩基配列（ｔｔｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｆ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｆと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がセリン（Ｓ）をコードする塩基配列（ｔｃｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｓ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｓと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がグルタミン（Ｑ）をコードする塩基配列（ｃａａ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｑ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｑと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がシステイン（Ｃ）をコードする塩基配列（ｔｇｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｃ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｃと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がアスパラギン（Ｎ）をコードする塩基配列（ａａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｎ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｎと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がリジン（Ｋ）をコードする塩基配列（ａａｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｋ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｋと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がヒスチジン（Ｈ）をコードする塩基配列（ｃａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｈ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｈと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がアルギニン（Ｒ）をコードする塩基配列（ｃｇｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｒ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｒと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がアスパラギン酸（Ｄ）をコードする塩基配列（ｇａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｄ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｄと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がグルタミン酸（Ｅ）をコードする塩基配列（ｇａａ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｅ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｅと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がトリプトファン（Ｗ）をコードする塩基配列（ｔｇｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｗ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製
酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｗと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がプロリン（Ｐ）をコードする塩基配列（ｃｃｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｐ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｐと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目をコードする塩基配列（ａｔｔ）がグリシン（Ｇ）をコードする塩基配列（ｇｔｔ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｇ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｇと呼ぶ。
取得した各プラスミドを用いてＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す形質転換体をそれぞれ選抜した。
上述した上記ＩＥ３５３の場合と同様に、各形質転換体を培養し、得られた粗酵素液から精製を行うことにより、それぞれの精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ａ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｖ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｌ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｇ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｍ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｆ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｓ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｑ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｃ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｎ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｋ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｈ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｒ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｄ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｅ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｗ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｐ）を得た。各精製酵素標品をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析し、各精製酵素標品が単一のタンパク質であることを確認した。
【０２０６】
本明細書において、例えば「ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ」は、上記ＩＥ３５３標品（野生型）のＮ末端から５８番目のアミノ酸がＩからＴに改変されたことを示す。改変箇所が複数の場合は、さらに「＋」を介してそれぞれの改変内容を記載する。（例えば、「ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｆ２８２Ｙ」などと記載する。
【０２０７】
＜１０．参考例５：フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ変異タンパク質の特性評価＞
まず、上述した活性測定方法にしたがって、野生型フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ（ＩＥ３５３）、および、１９種類の精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ａ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｖ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｌ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｇ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｍ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｆ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｓ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｑ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｃ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｎ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｋ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｈ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｒ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｄ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｅ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｗ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｐ）の酵素活性を測定した。
上記精製酵素標品の中でフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するものは、ＩＥ３５３、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｍ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｓ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｖ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ａ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｎ、およびＩＥ３５３−Ｉ５８Ｌであった。
これらの精製酵素標品に関して、上述した基質特異性評価方法および熱安定性評価方法に従って、更に基質特異性および熱安定性を評価した。その結果を、表３に示す。
【０２０８】
【表３】
0005927771.tif 000006
【０２０９】
熱安定性（％）は、野生型を１．００とした比に基づいても評価し、１．００よりも数値が上昇しているものを「熱安定性が向上している」と評価した。これによって、より客観的に熱安定性を評価することができる。
表３に示すように、配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目のイソロイシンを他のアミノ酸（Ｔ、Ｍ、Ｓ、Ｖ、Ａ，Ｎ、またはＬ）に置換した変異タンパク質は、野生型フルクトシルバリスヒスチジンオキシダーゼタンパク質と比較してＦＫ／ＦＶＨ、ＦＶ／ＦＶＨが低減すること、つまり基質特異性が向上していることが明らかになった。更に、５８番目のイソロイシンをメチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）またはセリン（Ｓ）に置換した変異タンパク質は、野生型のタンパク質と比較して熱安定性も向上していることが明らかになった。
【０２１０】
＜１１．参考例６：更なるアミノ酸置換を含むフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ変異タンパク質（２重変異タンパク質）、および当該変異タンパク質の特性評価＞
配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目のイソロシンの置換に加えて他のアミノ酸をも置換した場合に、当該変異タンパク質の特性がどのように変化するか検討した。
まず、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換された変異タンパク質の発現プラスミドを作製した。以下に、当該発現プラスミドの作製方法を説明する。
配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをチロシンに置換するために、プライマーＹ１およびプライマーＹ２を合成した。
・プライマーＹ１：５’−ｔａｔａｃｇｃｇｃｔｔｃａａｇａｔｇｃａｔｃａａｃｃｃｔｔｔｇｇｃｇ−３’（配列番号７）
・プライマーＹ２：５’−ｇｃｃａｇｇａａａｃｔｃｇｔｃｇｃａｇａｃｔｔｔｇａｔｃａｃｇ−３’（配列番号８）
上記ｐＩＥ３５３、プライマーＹ１、プライマーＹ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換された組換えプラスミドを作製した。更に詳細には、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをコードする塩基配列（ｔｔｃ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｔ）に置換された組換えプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、後
述する表４に示すように、ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙから得られる精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）は、野生型のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼと比較して、熱安定性が向上していた。
上記ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ、プライマーＲ１、およびプライマーＲ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、２８２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンからチロシンへの置換に加えて、更に５８番目のイソロイシンが他のアミノ酸へ置換された変異タンパク質の発現プラスミドを作製した。なお、当該発現プラスミドの作製方法は、５８番目のイソロイシンのみを置換したときと基本的に同じであるので、ここでは、その詳細な説明を省略する。
以上のようにして作製した発現プラスミドを用いて、表３に示す精製酵素標品と同様の方法にて各精製酵素標品を取得し、これらの精製酵素標品の基質特異性および熱安定性を評価した。その結果を、表４に示す。
【０２１１】
【表４】
0005927771.tif 000007
【０２１２】
表４の結果から明らかなように、ＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙに対して更に配列番号１に示したアミノ酸配列の５８番目のイソロイシンを他のアミノ酸に置換した変異タンパク質も、改変前のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼタンパク質（ＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）と比較してＦＫ／ＦＶＨ、ＦＶ／ＦＶＨが低減していること、つまり基質特異性が向上していることが明らかになった。
また、熱安定性に関しては、好ましい特性が得られているものが多く得られた。例えば、置換したアミノ酸が特にＭ、Ａの場合には、野生型と比較して熱安定性が大幅に向上していた。
【０２１３】
＜１２．参考例７：更なるアミノ酸置換を含むフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ変異タンパク質（３重変異タンパク質）、および当該変異タンパク質の特性評価＞
配列番号１に示したアミノ酸配列における５８番目のイソロシンの置換、および２８２番目のフェニルアラニンの置換に加えて他のアミノ酸をも置換した場合に、当該変異タン
パク質の特性がどのように変化するか検討した。
まず、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されるとともに、１１０番目のグリシンがグルタミンに置換された変異タンパク質の発現プラスミドを作製した。以下に、当該発現プラスミドの作製方法を説明する。
配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをチロシンに置換するために、プライマーＱ１およびプライマーＱ２を合成した。
・プライマーＱ１：５’−ｔａｃｃａａｇｃｔｃｔｃｇｔｇｇａｃｇｃｇｇｇｃｔｔｇｇａｔ−３’（配列番号９）
・プライマーＱ２：５’−ｃａｇｔａｃｃａａｇｃｔｃｔｃｇｔｇｇａｃｇｃｇｇｇｃｔｔ−３’（配列番号１０）
上記ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ、プライマーＹ１、プライマーＹ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されるとともに、１１０番目のグリシンがグルタミンに置換された組換えプラスミドを作製した。更に詳細には、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをコードする塩基配列（ｔｔｃ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｔ）に置換されるとともに、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がグルタミン（Ｑ）をコードする塩基配列（ｃａｇ）に置換された組換えプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得しすることに成功した。
上記ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑ＋Ｆ２８２Ｙ、プライマーＲ１、およびプライマーＲ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、２８２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンからチロシンへの置換および１１０番目のアミノ酸であるグリシンからグルタミンへの置換に加えて、更に５８番目のイソロイシンが他のアミノ酸へ置換された変異タンパク質の発現プラスミドを作製した。なお、当該発現プラスミドの作製方法は、５８番目のイソロイシンのみを置換したときと基本的に同じであるので、ここでは、その詳細な説明を省略する。
以上のようにして作製した発現プラスミドを用いて、表３に示す精製酵素標品と同様の方法にて各精製酵素標品を取得し、これらの精製酵素標品の基質特異性および熱安定性を評価した。その結果を、表５に示す。
また、ここで例示されているＦＡＯＤの一部、および、ＦＰＯＸ−ＣＥに関して、ＦＶＨに対するＫｍ値を、ＦＶＨ濃度を１．７５ｍＭ、０．３５ｍＭになるように調製した試薬を用いて前述した活性測定を実施し、ラインウィーバー・バークプロットより算出した。
【０２１４】
【表５】
0005927771.tif 000008
【０２１５】
表５の結果から明らかなように、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑ＋Ｆ２８２Ｙに対して更に配列番号１に示すアミノ酸配列の５８番目のイソロイシンを他のアミノ酸に置換した変異タンパク質も、改変前のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼタンパク質（ＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）と比較してＦＫ／ＦＶＨ、ＦＶ／ＦＶＨが低減していること、つまり基質特異性が向上していることが明らかになった。
また、置換したアミノ酸がＶの場合、ＦＶＨに対するＫｍ値が、ＦＰＯＸ−ＣＥより大幅に低減していた。  
また、置換したアミノ酸がＭ、Ａ、Ｓの場合には、熱安定性も向上していることが明らかになった。よって、配列番号１に示したアミノ酸配列に更なる変異が導入されたフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ改変体に関しても、５８番目のイソロイシンを他のアミノ酸に置換することによって基質特異性が向上することが明らかになった。
【０２１６】
＜１３．参考例１：更なるアミノ酸置換を含むフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ変異タンパク質（３重変異タンパク質）、および当該変異タンパク質の特性評価＞
上述した参考例１０では１１０番目のグリシンをグルタミンに置換しているが、他のアミノ酸に置換した場合にも同様の効果があるか否かを検証した。更に具体的には、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｆ２８２Ｙに対して、更に１１０番目のグリシンを他のアミノ酸に置換し、これらの精製酵素標品の基質特異性を調べた。
まず、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されるとともに、５８番目のイソロイシンがトレオニンに置換された変異タンパク質の発現プラスミドを作製した。以下に、当該発現プラスミドの作製方法を説明する。
配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをランダムに他のアミノ酸に置換するために、プライマーＲ３およびプライマーＲ４を合成した。
・プライマーＲ３：５’−ｓｎｎａｇａｃｔｔｃａｇｇｔｃｔｇｃａａｔｇｔｃｔｔｔｔｔｃ−３’（配列番号１１）
・プライマーＲ４：５’−ｔａｃｃａａｇｃｔｃｔｃｇｔｇｇａｃｇｃｇｇｇｃｔｔｇｇａｔ−３’（配列番号１２）
参考例９で取得した発現プラスミドｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｑ＋Ｆ２８２Ｙ、プライマーＲ３、プライマーＲ４、および、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いて、更に１１０番目のグリシンに変異が導入された組換えプラスミドを作製した。
当該組換えプラスミドを用いてＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す１００個のコロニーをピックアップした。１００個のコロニーに導入されている１００個の組換えプラスミドの塩基配列を確認したところ、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンが１９種類のアミノ酸（野生型も含む）の各々に置換されたプラスミドを取得することに成功した。
具体的には、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がアラニン（Ａ）をコードする塩基配列（ｇｃｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ａ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ａ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がバリン（Ｖ）をコードする塩基配列（ｇｔｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｖ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｖ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がロイシン（Ｌ）をコードする塩基配列（ｃｔｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｌ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｌ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がメチオニン（Ｍ）をコードする塩基配列（ａｔｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｍ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｍ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がフェニルアラニン（Ｆ）をコードする塩基配列（ｔｔｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｆ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｆ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がセリン（Ｓ）をコードする塩基配列（ｔｃｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｓ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｓ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がトレオニン（Ｔ）をコードする塩基配列（ａｃｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｔ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｔ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がシステイン（Ｃ）をコードする塩基配列（ｔｇｔ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｃ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｃ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）
がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｙ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｙ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がアスパラギン（Ｎ）をコードする塩基配列（ａａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｎ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｎ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がリジン（Ｋ）をコードする塩基配列（ａａｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｋ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｋ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がヒスチジン（Ｈ）をコードする塩基配列（ｃａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｈ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｈ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がアルギニン（Ｒ）をコードする塩基配列（ａｇｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｒ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｒ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がアスパラギン酸（Ｄ）をコードする塩基配列（ｇａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｄ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｄ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がグルタミン酸（Ｅ）をコードする塩基配列（ｇａｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｅ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｅ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がトリプトファン（Ｗ）をコードする塩基配列（ｔｇｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｗ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｗ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がプロリン（Ｐ）をコードする塩基配列（ｃｃｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｐ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｐ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目をコードする塩基配列（ｇｇａ）がイソロイシン（Ｉ）をコードする塩基配列（ａｔｔ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｉ＋Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｉ＋Ｆ２８２Ｙと呼ぶ。
上記精製酵素標品の中でフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するもの
は、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｑ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｖ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｌ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｉ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｍ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｆ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｓ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｔ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｙ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｎ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｈ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｒ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｅ＋Ｆ２８２Ｙ、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｋ＋Ｆ２８２Ｙ、および、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｄ＋Ｆ２８２Ｙであった。これらの精製酵素標品に関して基質特異性を評価した。その結果を、表６に示す。
【０２１７】
【表６】
0005927771.tif 000009
【０２１８】
表６の結果から明らかなように、ＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｆ２８２Ｙに対して更に配列番号１に示すアミノ酸配列の１１０番目のグリシンを他のアミノ酸に置換した変異タンパク質はＩＥ３５３−Ｉ５８Ｔ＋Ｇ１１０Ｑ＋Ｆ２８２Ｙと同様にＦＶ／ＦＶＨが低減していること、つまり基質特異性が向上していることが明らかになった。
【０２１９】
＜１４．活性測定方法＞
以下の参考例８〜１０におけるＦＡＯＤの活性測定方法を、以下に示す。
各基質に対するＦＡＯＤの酵素活性は、酵素反応によって生成される過酸化水素を用いたペルオキシダーゼ反応により生じた色素の吸光度の増加を測定することによって求めた。
まず、活性測定試薬３ｍＬを３７℃にて５分間加温した後、当該活性測定試薬に、予め酵素希釈液（０．１％トリトンＸ１００を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５））にて希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、反応を開始した。
３７℃にて５分間反応させた後、単位時間あたりの５００ｎｍの吸光度変化を測定した（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）。盲検としては、酵素溶液の代わりに酵素希釈液０．１ｍＬを用い、同様の操作を行って吸光度変化を測定した（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ）。
下記計算式に基づいて、得られた吸光度変化から酵素活性を算出した。なお、上記条件下で１分間に１マイクロモルの基質を酸化する酵素量を１単位（Ｕ）と規定した。
（計算式）
活性値（Ｕ／ｍＬ）＝｛（（ΔＯＤｔｅｓｔ／ｍｉｎ）−（ΔＯＤｂｌａｎｋ／ｍｉｎ））×３．１ｍＬ×希釈倍率｝／（１３×１．０ｃｍ×０．１ｍＬ）
なお、上記計算式において、「３．１ｍＬ」は全液量を示し、「１３」はミリモル吸光係数を示し、「１．０ｃｍ」はセルの光路長を示し、「０．１ｍＬ」は酵素サンプル液量を示す。
【０２２０】
＜１５．比活性の算出方法＞
以下の参考例８〜１０における比活性は、精製酵素標品の活性値（Ｕ／ｍＬ）と、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）とに基づいて、以下計算式にて算出した。
（計算式）
比活性（Ｕ／Ａ２８０）＝活性値（Ｕ／ｍＬ）／Ａ２８０（Ａｂｓ）
なお、比活性の値が高いほど好ましいと判定される。
【０２２１】
＜１６．Ｋｍ評価方法＞
以下の参考例８〜１０におけるＫｍ評価方法について、以下に説明する。
基質であるフルクトシルバリルヒスチジンの濃度が１．７５ｍＭまたは０．３５ｍＭに調製された活性測定試薬を調製した。
上述した活性測定法にしたがって、各活性測定試薬を用いた場合の精製酵素標品の活性値を求めた。次いで、下記計算式に基づいてＫｍ評価を行った。
（計算式）
Ｋｍ評価＝基質濃度０．３５ｍＭでの活性値（Ｕ／ｍＬ）／基質濃度１．７５ｍＭでの活性値（Ｕ／ｍＬ）
また、ＦＶＨに対するＫｍ値を、ＦＶＨ濃度を１．７５ｍＭ、０．３５ｍＭになるように調製した試薬を用いて前述した活性測定を実施し、ラインウィーバー・バークプロットより算出した。
なお、Ｋｍ評価の値が小さいほど、Ｋｍ値（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ定数）が低減する。
【０２２２】
＜１７．基質特異性評価方法＞
以下の参考例８〜１０におけるＦＡＯＤの基質特異性評価方法を、以下に説明する。
各基質（ＦＫ：フルクトシルリジン、ＦＶ：フルクトシルバリン、ＦＶＨ：フルクトシルバリルヒスチジン）の濃度が２ｍＭになるように活性測定試薬を調製し、上述した活性測定法に従って活性値を算出し、下記計算式により活性値比（基質特異性）を算出した。つまり、
（ＦＶ／ＦＶＨ）＝（ＦＶを基質としたときの活性値）／（ＦＶＨを基質としたときの活性値）
（ＦＫ／ＦＶＨ）＝（ＦＫを基質としたときの活性値）／（ＦＶＨを基質としたときの活性値）
なお、当該計算式で定義される活性値比の値が小さいほど、ＦＶＨに対する特異性に優れ、好ましいと判定される。
【０２２３】
＜１８．熱安定性評価方法＞
以下の参考例８〜１０におけるＦＡＯＤの熱安定性評価方法を、以下に説明する。
精製酵素標品を０．１ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、５０℃にて１０分間の加熱処理を施した。そして、以下の計算式に基づいて、精製酵素標品の熱安定性（％）を算出した。つまり、
熱安定性（％）＝［（５０℃、１０分間加熱処理後の活性値）／（加熱処理前の活性値）］×１００
なお、当該計算式で定義される熱安定性の値が高いほど、熱安定性に優れ、好ましいと判定される。
【０２２４】
＜１９．参考例８：フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ遺伝子・タンパク質の改変＞
配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをランダムに他のアミノ酸に置換するために、プライマーＲ３およびプライマーＲ４を合成した。
・プライマーＲ３：５’−ｓｎｎａｇａｃｔｔｃａｇｇｔｃｔｇｃａａｔｇｔｃｔｔｔｔｔｃ−３’（配列番号１１）
・プライマーＲ４：５’−ｔａｃｃａａｇｃｔｃｔｃｇｔｇｇａｃｇｃｇｇｇｃｔｔｇｇａｔ−３’（配列番号１２）
上記ｐＩＥ３５３、プライマーＲ３、およびプライマーＲ４、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ
Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記１１０番目のグリシンに変異が導入された組換えプラスミドを作製した。当該組換えプラスミドを用いてＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す１００個のコロニーをピックアップした。１００個のコロニーに導入されている１００個の組換えプラスミドの塩基配列を確認したところ、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンが１９種類のアミノ酸（野生型のグリシンを除く）の各々に置換されたプラスミドを取得することに成功した。
具体的には、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がトレオニン（Ｔ）をコードする塩基配列（ａｃｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｔ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｔと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がアラニン（Ａ）をコードする塩基配列（ｇｃｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ａ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ａと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がバリン（Ｖ）をコードする塩基配列（ｇｔｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｖ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｖと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がロイシン（Ｌ）をコードする塩基配列（ｃｔｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｌ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｌと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がイソロイシン（Ｉ）をコードする塩基配列（ａｔｔ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｉ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｉと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がメチオニン（Ｍ）をコードする塩基配列（ａｔｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｍ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｍと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がフェニルアラニン（Ｆ）をコードする塩基配列（ｔｔｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｆ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｆと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がセリン（Ｓ）をコードする塩基配列（ｔｃｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｓ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られ
る精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｓと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がグルタミン（Ｑ）をコードする塩基配列（ｃａｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がシステイン（Ｃ）をコードする塩基配列（ｔｇｔ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｃ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｃと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｙ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｙと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がアスパラギン（Ｎ）をコードする塩基配列（ａａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｎ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｎと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がリジン（Ｋ）をコードする塩基配列（ａａｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｋ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｋと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がヒスチジン（Ｈ）をコードする塩基配列（ｃａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｈ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｈと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がアルギニン（Ｒ）をコードする塩基配列（ａｇｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｒ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｒと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がアスパラギン酸（Ｄ）をコードする塩基配列（ｇａｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｄ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｄと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がグルタミン酸（Ｅ）をコードする塩基配列（ｇａｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｅ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｅと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がトリプトファン（Ｗ）をコードする塩基配列（ｔｇｇ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｗ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｗと呼ぶ。
また、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンをコードする塩基配列（ｇｇａ）がプロリン（Ｐ）をコードする塩基配列（ｃｃｃ）に置換されたプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｐ）を取得することに成功した。なお、当該プラスミドから得られる精製酵素標品を、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｐと呼ぶ。
取得した各プラスミドを用いてＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換した後、アンピシリン耐性を示す形質転換体をそれぞれ選抜した。
上述した上記ＩＥ３５３の場合と同様に、各形質転換体を培養し、得られた粗酵素液から精製を行うことにより、それぞれの精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ａ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｖ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｌ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｉ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｍ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｆ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｓ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｔ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｃ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｙ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｎ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｋ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｈ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｒ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｄ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｅ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｗ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｐ）を得た。
各精製酵素標品をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分析し、各精製酵素標品が単一のタンパク質であることを確認した。
【０２２５】
＜２０．参考例９：フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ変異タンパク質の特性評価＞
まず、上述した活性測定方法（基質としては、フルクトシルバリルヒスチジンを用いた）にしたがって、野生型フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ（ＩＥ３５３）、および、１９種類の精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｑ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ａ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｖ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｌ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｉ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｍ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｆ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｓ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｔ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｃ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｙ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｎ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｋ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｈ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｒ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｄ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｅ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｗ、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｐ）の酵素活性を測定した。
ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｐはフルクトシルバリルヒスチジン活性が検出できなかったため、その他の精製酵素標品に関して、熱安定性、比活性、Ｋｍ値、および基質特異性に関する評価を実施した。その結果を、表７に示す。なお、表７において「Ｘのアミノ酸」とは、１１０番目のグリシンが置換されたアミノ酸（換言すれば、ＩＥ３５３−Ｇ１１０ＸにおけるＸ）を示す。
【０２２６】
【表７】
0005927771.tif 000010
【０２２７】
表７の結果から明らかなように、配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンを他のアミノ酸に置換した変異体は、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｗを除き、野生型（ＩＥ３５３）と比較して熱安定性が向上していた。
また、比活性、Ｋｍ評価、基質特異性（ＦＫ／ＦＶＨ、ＦＶ／ＦＶＨ）に関しても、好ましい特性を有する改変タンパク質が存在することも明らかになった。例えば、置換したアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）の場合、比活性が約２．５倍上昇し、基質特異性も向上している。よって、１１０番目のグリシンを他のアミノ酸に置換することにより熱安定性のみならず、他の特性も向上するものが得られることが明らかになった。
【０２２８】
ＦＶＨに対するＫｍ値は、いずれの場合も、参考例７で測定したＦＰＯＸ−ＣＥより大幅に低減していた。  
【０２２９】
＜２１．参考例１０：更なるアミノ酸置換を含むフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ変異タンパク質（２重変異タンパク質）、および当該変異タンパク質の特性評価＞
配列番号１に示したアミノ酸配列の１１０番目のグリシンの置換に加えて他のアミノ酸をも置換した場合に、当該変異タンパク質の特性がどのように変化するか検討した。
まず、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換された変異タンパク質の発現プラスミドを作製した。以下に、当該発現プラスミドの作製方法を説明する。
配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをチロシンに置換するために、プライマーＹ１およびプライマーＹ２を合成した。
・プライマーＹ１：５’−ｔａｔａｃｇｃｇｃｔｔｃａａｇａｔｇｃａｔｃａａｃｃｃｔｔｔｇｇｃｇ−３’（配列番号７）
・プライマーＹ２：５’−ｇｃｃａｇｇａａａｃｔｃｇｔｃｇｃａｇａｃｔｔｔｇａｔｃａｃｇ−３’（配列番号８）
上記ｐＩＥ３５３、プライマーＹ１、プライマーＹ２、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、上記２８２番目のフェニルアラニンがチロシンに置換された組換えプラスミドを作製した。更に詳細には、配列番号１に示したアミノ酸配列の２８２番目のフェニルアラニンをコードする塩基配列（ｔｔｃ）がチロシン（Ｙ）をコードする塩基配列（ｔａｔ）に置換された組換えプラスミド（ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）を取得することに成功した。
上述した各種精製酵素標品と同様の方法にて、所望の精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）を得た。
下記表８に示すように、ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙから得られる精製酵素標品（ＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ）は、野生型のフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ（ＩＥ３５３）と比較して、熱安定性が向上していた。
【０２３０】
【表８】
0005927771.tif 000011
【０２３１】
上記ｐＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙ、プライマーＲ３、およびプライマーＲ４、およびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績製）を用いて、２８２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンからチロシンへの置換に加えて、更に１１０番目のグリシンが他のアミノ酸へ置換された変異タンパク質の発現プラスミドを作製した。なお、当該発現プラスミドの作製方法は、１１０番目のグリシンのみを置換したときと基本的に同じであるので、ここでは、その詳細な説明を省略する。
以上のようにして作製した発現プラスミドを用いて、表７に示す精製酵素標品と同様の方法にて各精製酵素標品を取得し、これらの精製酵素標品の特性を評価した。なお、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｐ＋Ｆ２８２Ｙはフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性が検出できなかったので、その他の精製酵素標品に関して、その特性を評価した。その結果を、表９に示す。なお、表９において「Ｘのアミノ酸」とは、１１０番目のグリシンが置換されたアミノ酸（換言すれば、ＩＥ３５３−Ｇ１１０Ｘ＋Ｆ２８２ＹにおけるＸ）を示す。
【０２３２】
【表９】
0005927771.tif 000012
【０２３３】
表９の結果から明らかなように、ＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙに対して更に１１０番目のグリシンを他のアミノ酸に置換しても、熱安定性が向上していることが明らかになった。
また、比活性、Ｋｍ評価、基質特異性（ＦＫ／ＦＶＨ、ＦＶ／ＦＶＨ）に関しても、好ましい特性が得られているものもある。
よって、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１１０番目のグリシン以外のアミノ酸に対して変異が導入されたものに関しても、更に１１０番目のグリシンを他のアミノ酸に置換することによって熱安定性を向上させることが可能であることが明らかになった
。
【０２３４】
ＦＶＨに対するＫｍ値は、いずれの場合も、参考例７で測定したＦＰＯＸ−ＣＥより大幅に低減していた。  
【０２３５】
本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０２３６】
本発明により、よりシンプルで正確性の高いＨｂＡ１ｃの測定方法を構築することができる。本発明は、予防医学に基づく臨床検査分野、診断医療分野、製薬分野および保健医学分野をはじめ、生命科学分野の産業に広く利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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