(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシルヒドロラーゼであって、該グリコシルヒドロラーゼのアミノ酸配列が配列番号２に示される配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、並びに、該グリコシルヒドロラーゼがβ−キシロシダーゼ活性及びβ−グルコシダーゼ活性を有することを特徴とする、上記グリコシルヒドロラーゼ。
【請求項２】
グリコシルヒドロラーゼのアミノ酸配列が配列番号２に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項３】
グリコシルヒドロラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列における１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加により配列番号２のアミノ酸配列から誘導され、かつ、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質と同じ活性であるβ−キシロシダーゼ活性及びβ−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載のグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のグリコシルヒドロラーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１または配列番号３に示される配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１または配列番号３に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞。
【請求項８】
基質を加水分解してキシロシル基を除去することおよび／または加水分解によりグルコシル基を除去することにおける、請求項１〜３のいずれか１項に記載のグリコシルヒドロラーゼの使用。
【請求項９】
基質を加水分解してキシロシル基を除去することおよび／または加水分解によりグルコシル基を除去することにおける、請求項７に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１０】
前記基質が、キシロシル残基を含んでなる化合物であるタキサン−キシロシド化合物から選択されることを特徴とする、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
前記タキサン−キシロシド化合物が７−キシロシルタキサン化合物から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記７−キシロシルタキサン化合物が
７−キシロシルパクリタキセル、
７−キシロシル−１０−デアセチルパクリタキセル、
７−キシロシルセファロマンニン、
７−キシロシル−１０−デアセチルセファロマンニン、
７−キシロシルパクリタキセルＣ、
７−キシロシル−１０−デアセチルパクリタキセルＣ、
７−キシロシルバッカチンＩＩＩ、
７−キシロシル−１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ
から選択されることを特徴する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
グリコシルヒドロラーゼを用いた７−キシロシルタキサンの加水分解によりキシロシル基を除去した後に得られる生成物が、
パクリタキセル、
１０−デアセチルパクリタキセル、
セファロマンニン、
１０−デアセチルセファロマンニン、
パクリタキセルＣ、
１０−デアセチルパクリタキセルＣ、
バッカチンＩＩＩ、
１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ
から選択される７−ヒドロキシルタキサン化合物であることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記７−キシロシルタキサン化合物がキシロシル含有タキサンの混合物から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記キシロシル含有タキサンの混合物がイチイ属の植物組織、イチイ属植物の細胞培養または７−キシロシルタキサン化合物を生成することができる微生物の細胞培養からのものであることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記イチイ属植物がヨーロッパイチイ、タイヘイヨウイチイ、ヒマラヤイチイ、メディアイチイ、チュウゴクイチイ、ウンナンイチイおよびイチイから選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記イチイ属の植物組織が根、針葉、樹皮または実生全体から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
７−キシロシルタキサンのグリコシルヒドロラーゼの加水分解反応に使用される溶媒が、水、メタノール、エタノール、酢酸エチル、アセトン、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【請求項１９】
宿主がピキア・パストリス（Pichia pastoris）であることを特徴とする、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
宿主がピキア・パストリス（Pichia pastoris）であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ、グリコシドヒドロラーゼまたはグリコシダーゼとも呼ばれる）、前記酵素のアミノ酸配列および前記酵素をコードするヌクレオチド配列に関する。特に、前記酵素はβ−キシロシダー活性とβ−グルコシダーゼ活性の双方を有し、加水分解により７−キシロシルタキサン化合物からキシロシル基を特異的に除去することができる。本発明は、７−キシロシルタキサンの前記グリコシルヒドロラーゼをコードするヌクレオチド配列、前記酵素のアミノ酸配列および／またはグリコシルヒドロラーゼ生産株の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
パクリタキセル（タキソール（登録商標））は、主としてイチイ属(Taxus)の種により生産される。パクリタキセルは、１９９０年代の抗癌薬研究の重要な功績の１つとして、その登場以来、独特な抗腫瘍機構と卓越した抗腫瘍活性のために世界中の注目を集めてきた(Kingston DGIら The taxane diterpenoids. In: Herz Wら編 Progress in the chemistry of organic natural products. New York: Springer-Verlag, 1993,161-165)。パクリタキセルはチューブリンと結合し、チューブリンの重合を促進し、その脱重合を阻害し、その後、細胞の有糸分裂の際に紡錘体の形成を妨げることができ、その結果、細胞はＧ２／Ｍ期で停止する(Horwitz SB. Taxol (paclitaxel): mechanisms of action. Ann Oncol. 1994, 5 Suppl.)。現在、パクリタキセルは、乳癌、卵巣癌および非小細胞肺癌などの治療に第一選択薬として臨床使用されている。パクリタキセルはまた頭頸部癌、黒色腫、結腸癌およびＨＩＶ誘発性カポジ肉腫に対しても有効である。
【０００３】
イチイ属植物のパクリタキセル含量は極めて低く、パクリタキセルは主として樹皮に存在し、この部分は最高のパクリタキセル含量を持つが、約０．０２％に過ぎない（米国特許第６，０２８，２０６号）。樹齢１００年のイチイ木からは３ｋｇの樹皮が得られ、約３００ｍｇのパクリタキセルを提供する(Horwitz, SB. How to make taxol from scratch. Nature 1994, 367: 593-594)。従って、樹皮から１ｋｇのパクリタキセルを採るためには、約３，０００本の木が必要となり、１人の患者の用量の必要を満たすために樹齢１００年の木が３〜４本伐採される。代替法では、より含量の高い１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（最大約０．１％）がヨーロッパイチイ(Taxus baccata L.)などの葉から抽出され、パクリタキセルおよびパクリタキセルよりも若干活性が高く、水溶性が高いその構造類似体タキソテールの半合性用材料として用いられている(Denis JNら A highly efficient, practical approach to natural taxol. J Am Chem Soc. 1988, 110(17):5917-5919; Horwitz RI.  Studies with RP 56976 (Taxotere): A semisynthetic analogue of taxol. J Nat Cancer Inst. 1991, 83(4):288-291;米国特許第４，８１４，４７０号)。また、低木イチイ雑種の育苗も、パクリタキセルを得るための最も簡単で再生可能な低コスト法であると考えられている。
【０００４】
パクリタキセルが極めて低含量であることに加え、７−β−キシロシル−１０−デアセチルタキソール(deacytyltaxol)（ＸＤＴ）、７−β−キシロシル−１０−デアセチルセファロマンニン（ＸＤＣ）および７−β−キシロシル−１０−デアセチルタキソール(deacytyltaxol)Ｃ（ＸＤＴＣ）などを含む、パクリタキセルの母核構造を有するＣ−７キシロシルタキサン化合物（タキサン−キシロシド）がイチイ樹皮から単離されており、この中で７−β−キシロシル−１０−デアセチルタキソール(deacytyltaxol)（ＸＤＴ）が最も多い(Senilh Vら Mise en evidence de nouveaux analogues du taxol extraits de Taxus baccata. J Nat Prod. 1984, 47:131-137; Rao KV. Taxol and related taxanes. I. Taxanes of Taxus brevifolia bark. Pharm Res. 1993, 10:521-524)。例えば、ＸＤＴ、ＸＤＣおよびＸＤＴＣは、それぞれ０．５％、０．０２％および０．００７５％の収量で得ることができた（欧州特許第０，９０５，１３０Ｂ１号）。これらの７−キシロシルタキサン化合物は、化学的アプローチ（米国特許第６，０２８，２０６号；欧州特許第１，２９８，１２８Ｂ１号）または生物学的アプローチ（米国特許第５，７００，６６９号；中国特許第２００６１００４６２９６．６号；中国特許第２００７１００１２６９８．９号）によって加水分解してキシロシル基を除去し、対応する７−ヒドロキシルタキサンを生成することができ、これをパクリタキセルまたはタキソテールの化学的半合成に用い、イチイ木の供給源の利用率を高め、パクリタキセルまたはその類似体の供給と需要の不均衡を緩和させることができる。比較してみると、化学的アプローチには相対的に収量が低いこと、反応プロセスがより複雑であることおよび環境汚染などの欠点があり、生物学的アプローチはより環境に優しい。
【０００５】
米国特許第５，７００，６６９Ａ号、欧州特許第０，６６８，３６０Ｂ１号および関連文献(Hanson RLら Enzymatic hydrolysis of 7-xylosyltaxanes by xylosidase from Moraxella sp. Biotechnol Appl Biochem 1997, 26: 153-158)は、モラクセラ(Moraxella)種（ＡＴＣＣ５５４７５）、バチルス・マセランス(Bacillus macerans)（ＡＴＣＣ５５４７６）、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)（ＡＴＣＣ５５４７７）およびミクロコッカス(Micrococcus)種（ＡＴＣＣ５５４７８）の細菌の使用によりＣ−７キシロシルタキサンをＣ−７ヒドロキシルタキサンに変換する加水分解法を開示しており、中でも、モラクセラ種の株は最も高い変換能力を示した。０．５ｍｇの７−キシロシル−１０−デアセチルタキソール(deacytyltaxol)（ＸＤＴ）を２ｍｌの細胞懸濁液（湿潤細胞９１．５ｍｇ／ｍｌ；ＸＤＴ０．２５ｍｇ／ｍｌ）に加え、この懸濁液を２８℃で２１時間、１２ｒｐｍで転倒混合した。次に、この反応をメタノールで停止させ、サンプルをＨＰＬＣにより分析した。ＸＤＴの残留は見られず、１０−デアセチルタキソール(deacytyltaxol)（ＤＴ）の収率は０．２３ｍｇ／ｍｌであった。
【０００６】
中国特許（第２００６１００４６２９６．６号）および関連文献(Hao DCら Bacterial diversity of Taxus rhizosphere: culture-independent and culture-dependent approaches. FEMS Microbiol Lett 2008, 284:204-212)は、レイフソニア・シンシュエンシス(Leifsonia shinshuensis)ＤＩＣＰ１６（ＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．Ｍ２０６０２６）を用いてＣ−７キシロシルタキサンをＣ−７ヒドロキシルタキサンに変換する加水分解法を開示している。上述の米国特許に記載されているものと同様の培養および変換条件が採用され、１ｍｇのＸＤＴが２ｍｌの細胞懸濁液に加えられた。１００ｒｐｍにて３０℃で２１時間反応させた後、この反応は２ｍｌのメタノールで停止された。ＨＰＬＣによれば反応溶液中にＸＤＴの残留は見られず、０．４ｍｇ／ｍｌのＤＴが生産された。別の実験では、種々の濃度の７−キシロシル−１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（０．５、０．９、１．９５、３．１、４．４、５．２および６．７５ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ２ｍｌの反応溶液に加え、この反応溶液中の湿潤細胞の濃度は２３１．５８ｍｇであった。反応は３１℃および１２０ｒｐｍで４０時間にわたって行われた。１０−デアセチルバッカチンＩＩＩの収量は、基質濃度が１．９５ｍｇ／ｍｌである場合に最大収量に達した(Hao DCら Bacterial diversity of Taxus rhizosphere: culture-independent and culture-dependent approaches. FEMS Microbiol Lett 2008, 284:204-212)。
【０００７】
別の中国特許第２００７１００１２６９８．９号は、放線菌(actinomycete)株セルロシミクロビウム・セルランス(Cellulosimicrobium cellulans)（ＸＺ−５ＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．Ｍ  ２０７１３０）、ヒドロラーゼおよびタキサンの変換におけるそれらの使用を開示している。すなわち、１０ｍｌのＸＤＴ（濃度５ｍｇ／ｍｌ）を９０ｍｌの粗酵素溶液（３０℃２日間培養した株セルロシミクロビウム・セルランスシード溶液１ｍｌを１００ｍｌの培地に加え、３０℃、１５０ｒｐｍで５日間培養し、得られたものを遠心分離し、上清を単離して、いわゆる粗酵素溶液を得た）に加え、３０℃、５０ｒｐｍで２０時間反応を行ったところ４０ｍｇのＤＴが得られた。
【０００８】
全体的にみて、上述の生物学的アプローチは全て、７−キシロシルタキサンの加水分解に潜在的適用価値を持つ。しかしながら、それらの収量は、細胞内の酵素が遍在して低量であるため、また、従来技術においては水に対する基質溶解度が低いために、工業的大量生産の必要を満たすほど高くない。
【０００９】
数種のβ−キシロシダーゼが真菌およびその他の生物から単離されており(Tuohy MGら The xylan-degrading enzyme system of Talaromyces emersonii: novel enzymes with activity against aryl beta-D-xylosides and unsubstituted xylans. Biochem J. 1993, 290 (Pt 2):515-523; Golubev AMら Purification, crystallization and preliminary X-ray study of β-xylosidase from Trichoderma reesei. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000, 56 (Pt 8):1058-1060; Pan Iら Effective extraction and purification of beta-xylosidase from Trichoderma koningii fermentation culture by aqueous two-phase partitioning. Enzyme Microb Technol. 2001, 28 (2-3):196-201; Rizzatti ACSら Purification and properties of a thermostable extracellular β-D-xylosidase produced by a thermotolerant Aspergillus phoenicis. J Ind Microbiol Biotechnol. 2001, 26(3):156-160; Saha BC. Purification and characterization of an extracellular β-xylosidase from a newly isolated Fusarium verticillioides. J Ind Microbiol Biotechnol. 2001, 27 (4):241-245; Gargouri Mら Fungus beta-glycosidases: immobilization and use in alkyl-beta-glycoside synthesis. J Mol Catal B: Enzym. 2004, 29, Issues 1-6:89-94; Lama Lら Purification and characterization of thermostable xylanase and β-xylosidase by the thermophilic bacterium Bacillus thermantarcticus. Res Microbiol. 2004,155(4):283-289; Belfaquih N & Penninckx MJ. A bifunctional β-xylosidase-xylose isomerase from Streptomyces sp. EC 10. Enzyme Microb Technol. 2000, 27(1-2): 114-121)、いくつかのβ−キシロシダーゼ遺伝子（数種の真菌供給源に由来するものなど）のクローニングおよび同定に成功している(Margolles-Clark Eら Cloning of genes encoding alpha-L-arabinofuranosidase and beta-xylosidase from Trichoderma reesei by expression in Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol. 1996, 62(10):3840-3846.; van Peij NNら β-Xylosidase activity, encoded by xlnD, is essential for complete hydrolysis of xylan by Aspergillus niger but not for induction of the xylanolytic enzyme spectrum. Eur J Biochem. 1997, 245 (1):164-173; Perez-Gonzalez JAら Molecular cloning and transcriptional regulation of the Aspergillus nidulans xlnD gene encoding a β-xylosidase. Appl Environ Microbiol. 1998, 64(4):1412-1419; Kitamoto Nら Sequence analysis, overexpression, and antisense inhibition of a β-xylosidase gene, xylA, from Aspergillus oryzae KBN616. Appl Environ Microbiol. 1999, 65(1):20-24; Berrin JGら High-level production of recombinant fungal endo-β-1,4-xylanase in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Protein Expr Purif. 2000, 19(1): 179-187; Reen FJら Molecular characterisation and expression analysis of the first hemicellulase gene (bxl1) encoding β-xylosidase from the thermophilic fungus Talaromyces emersonii. Biochem Biophys Res Commun. 2003, 305(3):579-585; Kurakake M, et al. Characteristics of transxylosylation by beta-xylosidase from Aspergillus awamori K4. Biochim Biophys Acta. 2005, 1726(3):272-279; Wakiyama Mら Purification and properties of an extracellular β-Xylosidase from Aspergillus japonicus and sequence analysis of the encoding gene. J Biosci Bioeng. 2008, 106(4):398-404)。しかしながら、これらの（天然または組換え）β−キシロシダーゼには、７−キシロシルタキサンを特異的に加水分解する能力を有することが分かったものはない。従って、合理的に、７−キシロシルタキサン化合物に対して特異的触媒活性を有するβ−キシロシダーゼの遺伝子がこれまでに、機能分析は言うまでもなく、クローニングされたことはないと考えられる。実際に、多くの市販のキシロシダーゼ、キシラナーゼおよびその他のグリコシダーゼでは、７−キシロシルタキサンからキシロシル基を除去する能力がまったく示されていない(Hanson RLら Enzymatic hydrolysis of 7-xylosyltaxanes by xylosidase from Moraxella sp. Biotechnol Appl Biochem 1997, 26: 153-158)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，０２８，２０６号
【特許文献２】米国特許第４，８１４，４７０号
【特許文献３】欧州特許第０，９０５，１３０Ｂ１号
【特許文献４】欧州特許第１，２９８，１２８Ｂ１号
【特許文献５】米国特許第５，７００，６６９号
【特許文献６】中国特許第２００６１００４６２９６．６号
【特許文献７】中国特許第２００７１００１２６９８．９号
【特許文献８】欧州特許第０，６６８，３６０Ｂ１号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Kingston DGIら The taxane diterpenoids. In: Herz Wら編 Progress in the chemistry of organic natural products. New York: Springer-Verlag, 1993, 161-165
【非特許文献２】Horwitz SB. Taxol (paclitaxel): mechanisms of action. Ann Oncol. 1994, 5 Suppl.
【非特許文献３】Horwitz, SB. How to make taxol from scratch. Nature 1994, 367: 593-594
【非特許文献４】Denis JNら A highly efficient, practical approach to natural taxol. J Am Chem Soc. 1988, 110(17):5917-5919
【非特許文献５】Horwitz RI.  Studies with RP 56976 (Taxotere): A semisynthetic analogue of taxol. J Nat Cancer Inst. 1991, 83(4):288-291
【非特許文献６】Senilh Vら Mise en evidence de nouveaux analogues du taxol extraits de Taxus baccata. J Nat Prod. 1984, 47:131-137
【非特許文献７】Rao KV. Taxol and related taxanes. I. Taxanes of Taxus brevifolia bark. Pharm Res. 1993, 10:521-524
【非特許文献８】Hanson RLら Enzymatic hydrolysis of 7-xylosyltaxanes by xylosidase from Moraxella sp. Biotechnol Appl Biochem 1997, 26: 153-158
【非特許文献９】Hao DCら Bacterial diversity of Taxus rhizosphere: culture-independent and culture-dependent approaches. FEMS Microbiol Lett 2008, 284:204-212
【非特許文献１０】Tuohy MGら The xylan-degrading enzyme system of Talaromyces emersonii: novel enzymes with activity against aryl beta-D-xylosides and unsubstituted xylans. Biochem J. 1993, 290 (Pt 2):515-523
【非特許文献１１】Golubev AMら Purification, crystallization and preliminary X-ray study of β-xylosidase from Trichoderma reesei. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000, 56 (Pt 8):1058-1060
【非特許文献１２】Pan Iら Effective extraction and purification of beta-xylosidase from Trichoderma koningii fermentation culture by aqueous two-phase partitioning. Enzyme Microb Technol. 2001, 28 (2-3):196-201
【非特許文献１３】Rizzatti ACSら Purification and properties of a thermostable extracellular β-D-xylosidase produced by a thermotolerant Aspergillus phoenicis. J Ind Microbiol Biotechnol. 2001, 26(3):156-160
【非特許文献１４】Saha BC. Purification and characterization of an extracellular β-xylosidase from a newly isolated Fusarium verticillioides. J Ind Microbiol Biotechnol. 2001, 27 (4):241-245
【非特許文献１５】Gargouri Mら Fungus beta-glycosidases: immobilization and use in alkyl-beta-glycoside synthesis. J Mol Catal B: Enzym. 2004, 29, Issues 1-6:89-94
【非特許文献１６】Lama Lら Purification and characterization of thermostable xylanase and β-xylosidase by the thermophilic bacterium Bacillus thermantarcticus. Res Microbiol. 2004,155(4):283-289
【非特許文献１７】Belfaquih N & Penninckx MJ. A bifunctional β-xylosidase-xylose isomerase from Streptomyces sp. EC 10. Enzyme Microb Technol. 2000, 27(1-2): 114-121
【非特許文献１８】Margolles-Clark Eら Cloning of genes encoding alpha-L-arabinofuranosidase and beta-xylosidase from Trichoderma reesei by expression in Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol. 1996, 62(10):3840-3846.
【非特許文献１９】van Peij NNら β-Xylosidase activity, encoded by xlnD, is essential for complete hydrolysis of xylan by Aspergillus niger but not for induction of the xylanolytic enzyme spectrum. Eur J Biochem. 1997, 245 (1):164-173
【非特許文献２０】Perez-Gonzalez JAら Molecular cloning and transcriptional regulation of the Aspergillus nidulans xlnD gene encoding a β-xylosidase. Appl Environ Microbiol. 1998, 64(4):1412-1419
【非特許文献２１】Kitamoto Nら Sequence analysis, overexpression, and antisense inhibition of a β-xylosidase gene, xylA, from Aspergillus oryzae KBN616. Appl Environ Microbiol. 1999, 65(1):20-24
【非特許文献２２】Berrin JGら High-level production of recombinant fungal endo-β-1,4-xylanase in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Protein Expr Purif. 2000, 19(1): 179-187
【非特許文献２３】Reen FJら Molecular characterisation and expression analysis of the first hemicellulase gene (bxl1) encoding β-xylosidase from the thermophilic fungus Talaromyces emersonii. Biochem Biophys Res Commun. 2003, 305(3):579-585
【非特許文献２４】Kurakake M, et al. Characteristics of transxylosylation by beta-xylosidase from Aspergillus awamori K4. Biochim Biophys Acta. 2005, 1726(3):272-279
【非特許文献２５】Wakiyama Mら Purification and properties of an extracellular β-Xylosidase from Aspergillus japonicus and sequence analysis of the encoding gene. J Biosci Bioeng. 2008, 106(4):398-404
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従来技術に存在する上述の問題を鑑みて、本発明の目的は、７−キシロシルタキサンからキシロシル基を特異的に海水分解することができる新規かつ有効なヒドロラーゼならびにその遺伝子配列を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上述の技術的問題を解決するために、本発明者らは多くの検討を行った。まず、７−キシロシルタキサンの特異的グリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）を、特異的β−キシロシダーゼ活性を示し７−キシロシルタキサンを７−ヒドロキシルタキサンに変換することができた真菌Ｍ９５．３３から精製した。精製された酵素に対してＬＣ−ＭＳ／ＭＳデノボシーケンシングを行い、数種のオリゴペプチドのアミノ酸配列を得た。これらのオリゴペプチドのアミノ酸配列に基づき、一連の縮重プライマーを設計した。前記酵素のｃＤＮＡおよび構造遺伝子を、ネステッドＰＣＲ、ＲＡＣＥおよびゲノムウォーキングを含む分子生物学的技術によってクローニングした。このような酵素をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のｃＤＮＡ断片を好適な発現ベクターに連結して組換えプラスミドを構築し、これを、増殖が速く高密度発酵に使用可能なピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの、対応する宿主細胞に導入した。この組換え株は、７−キシロシルタキサンのグリコシル加水分解反応を高効率で触媒して７−ヒドロキシルタキサンを生産することができた。本発明者らはまた、この酵素が、加水分解によりグルコシドからグルコース残基を除去することができる二機能性酵素であることも発見した。
【００１４】
このヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている他のヌクレオチド配列とほぼ全く相同性を示さず、最も近い配列は大抵の場合、仮説タンパク質遺伝子配列であり、それらの間のカバー率は３〜７％に過ぎない。ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列は、トウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)の仮説タンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＰ＿７６０１７９）に最も近く、比較可能な領域において４３％の同一性および５９％類似性を示す。
【００１５】
本発明は以下の内容を含む。
【００１６】
７−キシロシルタキサンの新規なグリコシルヒドロラーゼ（本明細書ではＬＸＹＬ−Ｐ１と表記）が提供される。
【００１７】
本発明の第二の目的は、前記酵素をコードするヌクレオチド配列を提供することである。
【００１８】
本発明の第三の目的は、前記ヌクレオチド配列を含む組換えプラスミドを提供することである。
【００１９】
本発明の第四の目的は、このような組換えプラスミドまたはヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供することである。
【００２０】
本発明の第五の目的は、このような酵素の使用を提供することである。
【００２１】
本発明の目的を実現するために、以下の技術的解決法を採用する。
【００２２】
本発明は、７−キシロシルタキサンのグリコシルヒドロラーゼ（二機能性β−キシロシダーゼ−β−グルコシダーゼ）（本明細書ではＬＸＹＬ−Ｐ１と表記）を提供する。
【００２３】
７−キシロシルタキサンのグリコシルヒドロラーゼ（ＬＸＹＬ−Ｐ１）のアミノ酸配列は、
配列番号２に示される配列と少なくとも３０％の同一性を示すアミノ酸配列；
好ましくは、配列番号２と少なくとも４０％の同一性を示すアミノ酸配列；
より好ましくは、配列番号２と少なくとも５０％の同一性を示すアミノ酸配列；
さらに好ましくは、配列番号２と少なくとも６０％の同一性を示すアミノ酸配列；
さらに好ましくは、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を示すアミノ酸配列；
さらに好ましくは、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列；
さらに好ましくは、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を示すアミノ酸配列；
さらに好ましくは、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を示すアミノ酸配列
を含んでなる。
【００２４】
または、前記酵素は、配列番号２のアミノ酸配列における１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加により配列番号２から誘導され、かつ、配列番号２のアミノ酸残基配列と同じ活性を有するタンパク質である。
【００２５】
本発明はまた、７−キシロシルタキサンの前記グリコシルヒドロラーゼ（ＬＸＹＬ−Ｐ１）をコードするヌクレオチド配列またはコード遺伝子（Ｌｘｙｌ−Ｐ１と表記）も提供する。前記ヌクレオチド配列は、
配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも３０％の同一性を示すヌクレオチド配列；
好ましくは、配列番号１または配列番号３と少なくとも４０％の同一性を示すヌクレオチド配列；
より好ましくは、配列番号１または配列番号３と少なくとも５０％の同一性を示すヌクレオチド配列；
さらに好ましくは、配列番号１または配列番号３と少なくとも６０％の同一性を示すヌクレオチド配列；
さらに好ましくは、配列番号１または配列番号３と少なくとも７０％の同一性を示すヌクレオチド配列；
さらに好ましくは、配列番号１または配列番号３と少なくとも８０％の同一性を示すヌクレオチド配列；
さらに好ましくは、配列番号１または配列番号３と少なくとも９０％の同一性を示すヌクレオチド配列；
さらに好ましくは、配列番号１または配列番号３と少なくとも９５％の同一性を示すヌクレオチド配列
を含んでなる。
【００２６】
または、本発明は、配列番号１もしくは配列番号３に示されるＤＮＡの全部もしくは一部と、または配列番号１もしくは配列番号３に示される配列と相補的なＤＮＡの全部もしくは一部とストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、７−キシロシルタキサンからキシロシル基を加水分解する活性を有するタンパク質をコードする、糸状菌由来の遺伝子を提供する。
【００２７】
本発明はまた、ヌクレオチド配列を含み、ＬＸＹＬ−Ｐ１をコードする組換えプラスミドを提供する。前記プラスミドは適切な宿主細胞に導入することができる。
【００２８】
本発明はさらに、配列番号１または配列番号３に示されるものと少なくとも３０％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなるＬｘｙｌ−ｐ１遺伝子配列を担持し得る適切な宿主細胞を提供する。前記宿主生物は、配列番号２に示されるものと少なくとも３０％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなるペプチド（ＬＸＹＬ−Ｐ１）の同種生産宿主であってもよいし、または異種宿主細胞であってもよい。
【００２９】
好適な宿主生物は、細菌、放線菌、酵母、糸状菌、植物細胞または動物細胞から選択される。
【００３０】
好ましい細菌はエシェリキア(Escherichia)種、バチルス(Bacillus)種から選択され；
好ましい放線菌はストレプトミセス(Streptomyces)種から選択され；
好ましい酵母はサッカロミセス(Saccharomyces)種、ピキア(Pichia)種およびシゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)種から選択され；
好ましい糸状菌はアスペルギルス(Aspergillus)種、トリコデルマ(Trichoderma)種、ペニシリウム(Penicillium)種、トリコローマ(Tricholoma)種、レンチヌラ(Lentinula)種およびアガリクス(Agaricus)種から選択され；
好ましい植物細胞は双子葉植物から選択され；
好ましい動物細胞は昆虫細胞から選択される。
【００３１】
好ましいエシェリキア種は好ましくは大腸菌であり；
好ましいバチルス種は好ましくは枯草菌(B. subtilis)であり；
好ましいストレプトミセス種は好ましくはＳ．リブダンス(S. lividans)であり；
好ましいサッカロミセス種は好ましくはサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であり；
好ましいピキア種は好ましくはＰ．パストリス(P. pastoris)であり；
好ましいシゾサッカロミセス種は好ましくはシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)であり；
好ましいアスペルギルス種は好ましくは、Ａ．ニガー(A. niger)、Ａ．オリザエ(A. oryzae)およびＡ．ニデュランス(A. nidulans)であり；
好ましいトリコデルマ種は好ましくはＴ．リーゼイ(T. reesei)およびＴ．ビリデ(T. viride)であり；
好ましいペニシリウム種は好ましくはペニシリウム・クロソゲナム(Penicillium chrysogenum)であり；
好ましいトリコローマ種は好ましくはトリコローマ・モンゴリクム(Tricholoma mongolicum)であり；
好ましいレンチヌラ種は好ましくはＬ．エドデス(L. edodes)であり；
好ましいアガリクス種は好ましくはアガリクス・ビスポラス(Agaricus bisporus)であり；
好ましい双子葉植物は好ましくはシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)であり；
好ましい昆虫細胞は好ましくは、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)Ｓｆ９細胞である。
【００３２】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列、本発明の７−キシロシルタキサンのグリコシルヒドロラーゼ、および本発明のヌクレオチド配列を含んでなる宿主細胞の使用を提供する。
【００３３】
特に、前記の使用は以下のように記載される：好適な宿主細胞が当技術分野の従来法によって前記ＤＮＡで形質転換されており、種々の基質、特にグリコシド化合物が、形質転換後に組換え細胞により生産された組換え酵素によって加水分解される。
【００３４】
基質として使用される好ましいグリコシド化合物は、キシロシル残基を含んでなる化合物またはグルコシル残基を含んでなる化合物から選択され、すなわち、本発明の使用は、加水分解によってこれらのグリコシド化合物からキシロシル基および／またはグルコシル基を除去することである。
【００３５】
キシロシル残基を有する好ましい化合物はタキサン−キシロシド化合物から選択され、基質は好ましくは、７−キシロシル残基を含むタキサン化合物、すなわち、７−キシロシルタキサンであり、これは天然にまたは非天然に、例えば、化学合成、生合成または半合成の手段によって形成され得る。
【００３６】
本発明における７−キシロシルタキサンのグリコシルヒドロラーゼの適用として、それは好ましくは７−ヒドロキシルタキサンを製造するための７−キシロシルタキサンの生物変換または生物触媒において使用される。
【００３７】
基質として使用される７−キシロシルタキサンは、限定されるものではないが、以下の化合物：７−キシロシル−１０−デアセチルタキソール、７−キシロシル−１０−デアセチルセファロマンニン、７−キシロシル−１０−デアセチルタキソールＣ、７−キシロシル−１０−デアセチル−バッカチンＩＩＩ、７−キシロシルタキソール、７−キシロシルセファロマンニン、７−キシロシルタキソールＣ、７−キシロシルバッカチンＩＩＩを含んでなる。加水分解により、キシロシル基を除去した後に得られる生成物は、限定されるものではないが、以下の化合物：１０−デアセチルタキソール、１０−デアセチルセファロマンニン、１０−デアセチルタキソールＣ、１０−デアセチル−バッカチンＩＩＩ、パクリタキセル、セファロマンニン、タキソールＣおよびバッカチンＩＩＩを含んでなる。
【００３８】
これらの基質は単独で、または互いに組み合わせて、または他のタキサンとの混合物として使用され得る。
【００３９】
本明細書に記載の基質は、キシロシル含有タキサン化合物の混合物から選択され得る。この混合物は、限定されるものではないが、好ましくはヨーロッパイチイ(T. baccata)、タイヘイヨウイチイ(T. brevifolia)、ヒマラヤイチイ(T. wallichiana)、メディアイチイ(T. media)、チュウゴクイチイ(T. chinensis)、ウンナンイチイ(T. yunnanensis)およびイチイ(T. cuspidate)から選択されるイチイ属の植物組織、またはこれらの植物の細胞培養、または７−キシロシルタキサン生産微生物の細胞培養を含む。本明細書に記載の植物組織は、前記植物の根、針葉、樹皮および実生全体を含む。
【００４０】
本発明において提供される方法により製造されるパクリタキセルまたはその類似体（生成物）および使用する場合にはＣ−７−キシロシルタキサン材料（基質）の構造的特徴を式Ｉに示す。
【化１】
0005868395.tif 000002
【００４１】
0005868395.tif 000003
【００４２】
基質を溶解させるのに用いる溶媒は、水、メタノール、エタノール、酢酸エチル、アセトン、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択され得る。
【００４３】
本発明の適用はまた、本発明のグリコシルヒドロラーゼがパン生地の特性の改良、動物飼料の特性の改良、キシリトールの製造のためのＤ−キシロースの生産および再生紙のインク除去のために使用されることも含む。本発明のグリコシルヒドロラーゼはさらに、エタノールおよびブタノールなどの生物燃料のさらなる製造向けの単糖類を得ることを目的にリグノセルロースを加水分解するためにセルラーゼおよびヘミセルラーゼと組み合わせて使用してもよい。本発明のグリコシルヒドロラーゼはさらに、他のグリコシド化合物から生物活性分子を遊離させるために使用してもよく、これを製薬分野で適用することができる。
【００４４】
本発明はまた、パクリタキセルおよびその類似体の製造のための生物変換法を提供し、７−キシロシルタキサンを出発材料として用い、該出発材料のキシロシル基を、本発明の遺伝子配列を含む宿主細胞によるかまたは該宿主細胞により生産される酵素による加水分解によって除去してパクリタキセルまたはその類似体を得る。好ましい宿主細胞はキシメジ科(Tricholomareceae)の真菌または組換え株であり、より好ましい宿主細胞はピキア属のピキア・パストリスの酵母細胞である。
【００４５】
まとめると、本発明により提供される二機能性グリコシルヒドロラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２に示される配列と少なくとも３０％の同一性を示すアミノ酸配列を含む。本発明により提供される機能性ＧＨは、７−キシロシルタキサンまたはその他のグリコシド化合物からキシロシル残基またはグルコシル残基を除去するために使用することができる。本発明はまた、いずれも上記のようなヌクレオチド配列を含む組換えプラスミドおよび宿主細胞に関する。さらに、本発明は、加水分解によるキシロシル基および／またはグルコシル基の除去における、７−キシロシルタキサンのグリコシルヒドロラーゼまたは７−キシロシルタキサンのグリコシルヒドロラーゼを含む宿主細胞の適用に関する。
【００４６】
β−キシロシダーゼ−β−グルコシダーゼの明確なアミノ酸配列および二機能性特性を有する、本発明により提供される７−キシロシルタキサンのグリコシルヒドロラーゼは、キシメジ科の真菌レンチヌラ・エドデスＭ９５．３３により、または該酵素のコード遺伝子を含む組換え細胞により生産される。該酵素は細胞内に存在しても細胞外に分泌されてもよく、７−キシロシルタキサンのパクリタキセルまたはその類似体への変換に使用することができる。
【００４７】
本発明のグリコシルヒドロラーゼをコードするヌクレオチド配列は完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、これは真菌原株もしくは他の真菌宿主に導入することができる、または原核細胞（大腸菌、放線菌を含む）、植物細胞および動物細胞などの宿主細胞に導入することができる、多種の組換え発現プラスミドを構築するために使用可能である。これらの宿主は、グリコシルヒドロラーゼ遺伝子の発現による７−キシロシルタキサンの７−ヒドロキシルタキサンへの加水分解能を獲得することができる。このような組換え宿主は他の糖含有化合物の生体変換にも使用可能である。
【００４８】
本発明の適用はまた、本発明のグリコシルヒドロラーゼがパン生地の特性の改良、動物飼料の特性の改良、キシリトールの製造のためのＤ−キシロースの生産および再生紙のインク除去のために使用されることも含む。さらに、本発明により提供されるグリコシルヒドロラーゼは、エタノールおよびブタノールなどの生物燃料のさらなる製造向けの単糖類を得ることを目的にリグノセルロースを加水分解するためにセルラーゼおよびヘミセルラーゼなどと組み合わせて使用してもよい。さらに、本発明のグリコシルヒドロラーゼは、他のグリコシド化合物から生物活性分子を遊離させるために使用してもよく、これを製薬分野で適用することができる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明は、７−キシロシルタキサンから７−ヒドロキシルタキサンを特異的に触媒し得るグリコシルヒドロラーゼをコードする遺伝子を初めてクローニングし、異種発現させ、このような酵素の活性を有する生物工学的操作株を構築し、このようにして７−ヒドロキシルタキサンの大規模生産の新規かつ有効な方法を提供する。
【００５０】
用語および省略形
ＣＤＳ：開始コドンから停止コドンまでのタンパク質のコード配列
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】真菌Ｍ９５．３３のタンパク質抽出物からのβ−キシロシダーゼ−β−グルコシダーゼのフェニルセファロース疎水性カラムクロマトグラフィー（Ａ）、およびＸＤＴ変換の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（Ｂ）。Ａ：Ｐ１．ＬＸＹＬ−Ｐ１の活性溶出ピーク；Ｐ２．ＬＸＹＬ−Ｐ２の活性溶出ピーク。水平な横座標は種々の画分（種々の画分の回収試験管の番号）を示し、垂直な軸はＡ４０５（４０５ｎｍ）の吸収値を示す。Ｂ：１．ＸＤＴ（対照）；２．ＤＴ（対照）；３．ＬＸＹＬ−Ｐ１によるＸＤＴ生物変換；４．ＬＸＹＬ−Ｐ２によるＸＤＴ生物変換。
【図２】ＬＸＹＬ−Ｐ１の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。１．タンパク質の分子量マーカー；２．還元処理ＬＸＹＬ−Ｐ１；３．非還元処理ＬＸＹＬ−Ｐ１。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のタンパク質バンドを矢印で示す。
【図３】組換え酵母に対するコロニーＰＣＲ同定のアガロースゲル電気泳動。Ｍ．分子量マーカー；１．組換え株ＧＳ１１５−９Ｋ（対照、ｐＰＩＣ９Ｋで形質転換）；２．組換え株ＧＳ１１５−９Ｋ−Ｐ１−２（ｐＰＩＣ９Ｋ−Ｐ１−２で形質転換）；３．組換えプラスミドｐＰＩＣ９Ｋ−Ｐ１−２（対照）。
【図４】β−キシロシダーゼ活性に対する組換え株ＧＳ１１５−９Ｋ−Ｐ１−２とＧＳ１１５−９Ｋ（対照）の比較。
【図５】組換え株ＧＳ１１５−９Ｋ−Ｐ１−２によるＸＤＴ変換のＨＰＬＣ分析。Ａ．変換前；Ｂ．変換後。
【図６】組換え株ＧＳ１１５−３．５Ｋ−Ｐ１−２による７−キシロシルタキサン混合物の変換のＨＰＬＣ分析。Ａ．混合基質（対照）；Ｂ．ヌルベクター（ｐＰＩＣ３．５Ｋ）を導入した組換え酵母ＧＳ１１５−３．５Ｋ＋混合基質（対照）；Ｃ．Ｌｘｙｌ−ｐ１遺伝子を担持するプラスミドｐＰＩＣ−３．５Ｋ−Ｐ１−２を導入した組換え酵母ＧＳ１１５−３．５Ｋ−Ｐ１−２＋混合基質。１、２および３はそれぞれ７−キシロシル−１０−デアセチルセファロマンニン（ＸＤＣ）、７−キシロシル−１０−デアセチルタキソール（ＸＤＴ）、および７−キシロシル−１０−デアセチルタキソールＣ（ＸＤＴＣ）を表し、１’、２’および３’はそれぞれキシロシルタキサンの対応する生成物、すなわち、１０−デアセチルセファロマンニン（ＤＣ）、１０−デアセチルタキソール（ＤＴ）、および１０−デアセチルタキソールＣ（ＤＴＣ）を表す。
【図７】組換え株ＧＳ１１５−３．５Ｋ−Ｐ１−２による７−キシロシル−１０−デアセチルバッカチンＩＩＩの変換のＨＰＬＣ分析（保持時間２分の溶媒ピークがＸＤＴの前にある）。
【図８】ＰＣＲ増幅プロセスの概略図。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
発明の詳細な説明
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は例示に過ぎず、本特許請求の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００５３】
実施例１：Ｌ．エドデスのβ−キシロシダーゼ−β−グルコシダーゼ（ＬＸＹＬ−Ｐ１）の精製
真菌Ｍ９５．３３の培養  培養後の菌糸スラントから採取した約１ｃｍ２の菌叢を植え込み、１００ｍｌの無菌小麦ふすま液体培地［１リットル当たり５０．００ｇの小麦ふすま（適当量の水を加え、３０分煮沸した後、濾過して固体残留物を除去）、２０．００ｇのペプトン、１．５０ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．７５ｇのＭｇＳＯ４、そのままのｐＨは約６．３］中、オービタルシェーカーにて１６０ｒｐｍ、２５〜２６℃で６〜８日間増殖させた。
【００５４】
グリコシルヒドロラーゼの単離、精製および分析  菌糸を濾過により採取した。液体窒素を用いて摩砕した後、３〜５容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ細胞溶解バッファー（ｐＨ８．０）を加え、その後、得られたものに氷上で５分間、超音波処理を施した（１３０Ｗ、１０秒間隔で各１０秒）。遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分）後に上清を回収し、これをさらなる単離および精製のための粗酵素溶液として用いた。
【００５５】
β−キシロシダーゼ活性を有するタンパク質を、特的発色基質としてｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ＰＮＰ−Ｘｙｌ）を用いることでモニタリングした。酵素１単位は、基質としてＰＮＰ−Ｘｙｌを用い、５０℃およびｐＨ５．０にて１分間に、触媒作用により１ナノモルのｐ−ニトロフェノールを生産するのに必要な酵素量と定義した。
【００５６】
上記の粗酵素溶液（各８０〜９０ｍｌ）を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＦＦ陰イオン交換カラム（１．６ｃｍ×２０ｃｍ）に適用した。溶出は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で、０、０．１、０．２５および２．０Ｍ  ＮａＣｌの勾配にて行った（流速２ｍｌ／分）。酵素活性を有する０．１〜０．２５Ｍ  ＮａＣｌ溶出剤の画分を回収し、次に続くクロマトグラフィーのために１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を加えた。
【００５７】
上記の工程で溶出した画分を、１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロース疎水性カラム（１．６ｃｍ×２０ｃｍ）に適用した。溶出は、１．０〜０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４の直線勾配のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）で行った（流速２ｍｌ／分）。酵素活性を有する画分を回収し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）で透析した。
【００５８】
この透析溶液をＤＥＡＥセファロースＦＦ陰イオン交換カラム（１．６ｃｍ×２０ｃｍ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．０で平衡化）に適用した。溶出は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）中、０．１〜０．２５Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配にて流速２ｍｌ／分で行った。最高の酵素活性を有する画分を回収し、濃縮し、セファクリルＳ２００  ＨＲモレキュラーシーブクロマトグラフィーカラム［１．６ｃｍ×６０ｃｍ、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）で平衡化］に適用した。溶出は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）中、０．１Ｍ  ＮａＣｌにて、流速０．５ｍｌ／分で行った。最高の酵素活性を有する画分を回収した。最後に、精製酵素を得た。
【００５９】
上記の精製の手順は下記のように概説される。
【００６０】
0005868395.tif 000004
Ｐ１に関する各精製工程の結果を表１にまとめる。
【表１】
0005868395.tif 000005
【００６１】
β−キシロシダーゼ活性を示す２つに分かれたピーク［それぞれＬＸＹＬ−Ｐ１（またはＰ１）およびＬＸＹＬ−Ｐ２（またはＰ２）と呼称］が、フェニルセファロース疎水性カラムを用いた直線勾配での溶出により得られた。Ｐ１およびＰ２は双方とも７−キシロシル−１０−デアセチルタキソール（ＸＤＴ）を１０−デアセチルタキソール（ＤＴ）へ加水分解できた（図１に示される通り）。図１において、パネルＡはクロマトグラフィーにより得られた酵素活性ピークを示し、パネルＢは、それぞれ酵素的に活性なサンプルＰ１およびＰ２による基質ＸＤＴ変換の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を示した。パネルＢでは、１はＸＤＴ対照；２はＤＴ対照；３はＰ１によるＸＤＴ変換；および４はＰ２によるＸＤＴ変換であった。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデノボシーケンシングの結果は、Ｐ１およびＰ２は同じアミノ酸残基配列を持っているが、グリコシル化形態が異なることを示唆した。
【００６２】
ＸＤＴがＤＴおよびキシロースへ加水分解されることを示す反応式は次のように表される。
【化２】
0005868395.tif 000006
【００６３】
実施例２：ＬＸＹＬ−Ｐ１（またはＰ１）タンパク質による種々のグリコシド基質の加水分解に対する特異性試験
β−キシロシダーゼ活性、特に、７−キシロシルタキサンを加水分解する活性の他、他のグリコシド基質に対するＬＸＹＬ−Ｐ１（またはＰ１）の特異性も、４種類の発色基質：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰ−Ｇｌｃ）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノピラノシド（ＰＮＰ−Ａｒａ）およびｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ＰＮＰ−Ｘｙｌ、対照として使用）を用いることによって試験した。これらの各発色基質は、５０ｍＭ酢酸バッファーで５ｍＭ溶液（ｐＨ５．０）となるように調製した。
【００６４】
実施例１で得られた精製Ｐ１タンパク質希釈液（２５μｌ）に対して各１００μｌの発色基質を加えた。反応は５０℃で２０分間行い、２ｍｌのホウ酸ナトリウム飽和溶液で停止させた。ｐ−ニトロフェノールの放出（吸光度）を４０５ｎｍで測定した。結果は、Ｐ１タンパク質はＰＮＰ−ＧｌｃおよびＰＮＰ−Ｘｙｌを加水分解できるが、ＰＮＰ−ＧａｌおよびＰＮＰ−Ａｒａは加水分解できないことを示した。これらの結果を表２に示す。
【表２】
0005868395.tif 000007
【００６５】
実施例３：グリコシルヒドロラーゼＬＸＹＬ−Ｐ１のコード遺伝子（Ｌｘｙｌ−ｐ１）のクローニング
実施例１で得られたＬＸＹＬ−Ｐ１に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い（図２参照）、還元処理後に約１１０ｋＤａの見かけの分子量を有する電気泳動バンドを回収し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。最大のピークを有する５つのオリゴペプチドを選択し、デノボシーケンシングを行ったところ、以下のようにこれらの５つのオリゴペプチドのアミノ酸残基配列が得られた。
【００６６】
1. LPWTWGK
2. QSGSLPLQHPQR
3. HWLAYEQETSR
4. DLPVGDSAVVTYPPR
5. TLTPLEALQK（配列中、ＩとＬ、ＫとＱは識別不能）
これら５つのオリゴペプチドの相対的位置を評価するためにバイオインフォマティクス的アプローチを適用したところ、ＬＸＹＬ−Ｐ１上のその順序は３、２、５、１、４であると決定された。フォワードおよびリバース縮重プライマーを、それぞれオリゴペプチド３および５について次のように設計した。
【００６７】
3F1: CTTGCGTACGAGCARGARAC
3F2: CACTGGCTTGCGTAYGARCA
3F3: CACTGGCTTGCNTAYG
5R1: AGCCTCCAGTGGCGTNAGNGT
5R2: CTGCAGAGCCTCCAGNGGNGT
5R3: TTCTGCAGAGCCTCNAGNGG
真菌Ｍ９５．３３からの全ＲＮＡを鋳型として用い、上記のような縮重プライマーを用いてネスト−ＰＣＲを行った。これらのＰＣＲ産物はオリゴペプチド３、２および５のコード配列を含んでいることが確認された。次に、上述の５つのオリゴペプチドのコード領域を含むｃＤＮＡ断片を得るために、両末端の伸長にＲＡＣＥ技術を適用した。この断片は８０３のアミノ酸をコードする２４１２ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、またはＣＤＳとも呼ばれる、Ｌｘｙｌ−ｐ１と呼称）を含む。ｃＤＮＡ配列（配列番号３）およびこのｃＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列（配列番号２）を配列表に示す。ＰＣＲ増幅プロセスを図８に示す。
【００６８】
このｃＤＮＡ配列に従って特異的プライマーを設計し、鋳型として真菌Ｍ９５．３３由来のゲノムＤＮＡを用い、ＰＣＲ増幅およびゲノムウォーキング技術によりＬＸＹＬ−Ｐ１の構造遺伝子配列（Ｇ−Ｌｘｙｌ−ｐ１）を得た。ゲノムレベルにおいて、本明細書の遺伝子は１９のエキソンと１８のイントロンからなり、開始コドンＡＴＧから停止コドンＴＧＡまで３６０８ｂｐの長さであった。ヌクレオチド配列（配列番号１）を配列表に示す。
【００６９】
実施例４：組換えプラスミドの構築および組換え酵母のスクリーニング
実施例３で得られたＰ１コード領域のＯＲＦ（Ｌｘｙｌ−ｐ１）の５’末端および３’末端のそれぞれにＰＣＲによりＳｎａＢ  Ｉ制限酵素部位およびＮｏｔ  Ｉ制限酵素部位を導入した。ＳｎａＢ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉで消化した後、得られたものを、これもまたＳｎａＢ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉで消化したピキア・パストリス発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋ（分泌型発現ベクター）またはｐＰＩＣ３．５Ｋ（非分泌型発現ベクター）に連結し、組換え発現プラスミドｐＰＩＣ９Ｋ−Ｐ１−２またはｐＰＩＣ３．５Ｋ−Ｐ１−２を得た。この組換えプラスミドをＳａｃ  Ｉ制限酵素により線状化した後、エレクトロポレーション形質転換法により、ピキア・パストリスのＧＳ１１５コンピテント細胞に形質転換した。同時に対照として、ヌルベクターｐＰＩＣ９ＫまたはｐＰＩＣ３．５Ｋもそれぞれ同じ方法によりピキア・パストリスのＧＳ１１５コンピテント細胞に導入した。形質転換酵母細胞をＭＤプレート［１リットル当たり２０．００ｇのグルコース、１３．４０ｇのＹＮＢ（アミノ酸不含酵母窒素基本培地）、０．４ｍｇのビオチン、１５．００ｇの寒天を含む］に拡げ、２８℃で２〜３日間インキュベートした。単一コロニーを採取し、ＹＰＤ−ジェネティシン（登録商標）耐性プレート（１リットル当たり１０．００ｇの酵母抽出物、２０．００ｇのペプトン、２０．００ｇのグルコース、１５．００ｇの寒天、≦４．００ｇのＧ４１８を含む）に植え込み、培養をさらに２〜３日間続けて耐性コロニーをスクリーニングした。耐性コロニーに対してコロニーＰＣＲ同定を行った。ここでは形質転換体ｐＰＩＣ９ＫおよびｐＰＩＣ９Ｋ−Ｐ１−２の例を示す（図３）。
【００７０】
ＰＣＲプライマーはＡＯＸ１配列と、ｐＰＩＣ９Ｋベクターのクローニング部位の両側で一致する。
【００７１】
フォワード: 5'GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3'
リバース: 5'GGCAAATGGCATTCTGACATCC 3'
ヌルベクターｐＰＩＣ９Ｋで形質転換した株では４９２ｂｐの増幅断片が得られたが、組換えプラスミドｐＰＩＣ９Ｋ−Ｐ１−２とその形質転換株では双方とも２９１０ｂｐの増幅断片が得られた。図３において、１はヌルベクターｐＰＩＣ９Ｋが導入された対照組換え酵母ゲノムの増幅結果を示し、２はｐＰＩＣ９Ｋ−Ｐ１−２が導入された組換え酵母ゲノムの増幅結果を示し、３は対照組換えプラスミドｐＰＩＣ９Ｋ−Ｐ１−２の増幅結果を示した。
【００７２】
ＢＭＧＹ培地（１リットル当たり１０．００ｇの酵母抽出物、２０．００ｇのペプトン、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー、ｐＨ６．０、１０ｍｌのグリセロールを含む）およびＢＭＭＹ培地（炭素源として、ＢＭＧＹ培地の１０ｍｌのグリセロールを１０ｍｌのメタノールに置き換える）を組換え酵母のそれぞれシード培養および発酵培地として用いた。スクリーニングによって得られた株を１０ｍｌのシード培養培地に植え込み、３０℃、２２０ｒｐｍで１８時間インキュベートした。これらの培養物を遠心分離により２回洗浄し、細胞ペレットを５０ｍｌの発酵培地に移した。細胞を３０℃、２２０ｒｐｍで培養し、組換えタンパク質の発現を誘導するために１％メタノールを２４時間おきに加えた。その間、組換え株の酵素活性を定期的に検出した。これらのサンプルを蒸留水で遠心分離により２回洗浄し、細胞ペレットを同容量の蒸留水に懸濁させた。５０μｌの細胞懸濁液に、１００μｌの５ｍＭ  ＰＮＰ−Ｘｙｌを加え、３０〜５５℃で２０分間反応させた。組換え株は基質ＰＮＰ−Ｘｙｌを加水分解する能力を有するが、ヌルベクターで形質転換された対照株はそのような能力を示さないことを見て取ることができた（図４参照）。さらに、組換え株の発酵液の上清では明らかな酵素活性は検出されず、この組換え酵素は主として細胞内に存在していたことが示唆される。
【００７３】
実施例５：組換え酵母による７−キシロシル−１０−デアセチルタキソール（ＸＤＴ）の加水分解
実施例４で得られた組換え酵母ＧＳ１１５−９Ｋ−Ｐ１−２（組換え発現プラスミドｐＰＩＣ−９Ｋ−Ｐ１−２の形質転換体）を培養し、実施例４の方法で５日間誘導を行った。細胞を遠心分離し、回収および洗浄した後、そのまま、または凍結乾燥後に５０ｍＭ酢酸バッファーまたはリン酸バッファー（６５ｍｇ湿潤細胞／ｍｌまたは１６ｍｇ乾燥細胞／ｍｌ、ｐＨ３．５〜７．５）に懸濁させ、加水分解反応溶液として用いた。この細胞反応溶液２０ｍｌに、７−キシロシル−１０−デアセチルタキソール（ＸＤＴ）溶液０．５ｍｌを加えて、ＸＤＴの終濃度を０．６２５ｍｇ／ｍｌとした。得られたものを振盪式ウォーターバスにて３０〜５５℃で１２時間インキュベートした。
【００７４】
反応が完了した後、酢酸エチルで抽出を行った。ＴＬＣ分析は、基質が完全に変換されたことを示した。ＨＰＬＣ［条件：カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）、移動相：アセトニトリル（３８％〜５２％）、流速：１ｍｌ／分、カラム温度：２８℃、検出波長：２３０ｎｍ］を用いて抽出物中のＸＤＴ基質およびＤＴ生成物の含量を分析したところ、変換率は９８．８０％であることが示された。
【００７５】
組換え酵母によるＸＤＴ加水分解反応結果のＨＰＬＣ分析を図５に示し、Ａは返還前、Ｂは変換後である。
【００７６】
実施例６：組換え酵母による７−キシロシルタキサン混合物の加水分解
実施例４で得られた組換え酵母ＧＳ１１５−３．５Ｋ−Ｐ１−２（組換え発現プラスミドｐＰＩＣ３．５Ｋ−Ｐ１−２の形質転換体）を以下の生物変換反応に適用した。この場合、変換される基質は７−キシロシルタキサン混合物であり、その主成分には６２．１２％の７−キシロシル−１０−デアセチルタキソール、１２．７５％の７−キシロシル−１０−デアセチルセファロマンニン、１７．０４％の７−キシロシル−１０−デアセチルタキソールＣ、および８．０９％のその他の成分が含まれた。
【００７７】
組換え株の培養方法は実施例５と同様であった。１６ｍｌの７−キシロシルタキサン混合物（濃度１００ｍｇ／ｍｌ）を２００ｍｌの組換え株反応溶液に加え、７−キシロシルタキサン混合物の終濃度を約８ｍｇ／ｍｌ（過飽和）とした。ヌルベクターを導入した組換え酵母を陰性対照とした。この溶液を、３０〜５５℃で２４時間磁気撹拌することにより混合した。反応が完了した後に実施例５の方法と同様に、変換系の基質および生成物の含量をＨＰＬＣ分析を用いて分析したところ（図６）、以下の変換率：７−キシロシル−１０−デアセチルタキソール（ＸＤＴ）９２．４５％；７−キシロシル−１０−デアセチルセファロマンニン（ＸＤＣ）９３．６０％；および７−キシロシル−１０−デアセチルタキソールＣ（ＸＤＴＣ）９２．００％を示した。３つの主生成物の収率：１０−デアセチルタキソール（ＤＴ）：３．２７ｍｇ／ｍｌ；１０−デアセチルセファロマンニン（ＤＣ）：０．７４ｍｇ／ｍｌ；および１０−デアセチルタキソールＣ（ＤＴＣ）：０．９２ｍｇ／ｍｌ。３つの主生成物の総収率は４．９３ｍｇ／ｍｌであったが、対照は上記の活性を示さなかった（図６）。
【００７８】
図６において、Ａは混合基質（対照）を示し、Ｂはヌルベクターを導入した組換え酵母＋混合基質（対照）を示し、ＣはＬｘｙｌ−ｐ１遺伝子を導入した組換え株＋混合基質を示した。１は７−キシロシル−１０−デアセチルセファロマンニンであり；２は７−キシロシル−１０−デアセチルタキソールであり；３は７−キシロシル−１０−デアセチルタキソールＣであり；１’、２’および３’はそれぞれ対応する７−キシロシルタキサンの生成物であった。
【００７９】
実施例７：組換え酵母による７−キシロシル−バッカチンＩＩＩ（ＸＤＢ）の加水分解
株は実施例６のものと同じであり、基質は７−キシロシル−１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（ＸＤＢ）であった。１．５ｍｌの細胞反応溶液には、１６ｍｇ／ｍｌの乾燥細胞と８ｍｇ／ｍｌのＸＤＢが含まれた。混合物を振盪式ウォーターバスにて３０〜５５℃で２４時間インキュベートした。ＨＰＬＣ分析結果は、ＸＤＢの変換率は８６．５４％であり、生成物１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（ＤＢ）の収率は５．５７ｍｇ／ｍｌであることを示した（図７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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