(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩であって、該ペプチドがアミノ酸配列：
【化１０】
0005913115.tif 000022
からなる、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
【請求項２】
単離されたものであるか精製されたものである、請求項１に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組成物。
【請求項４】
薬学的に許容されるキャリア、請求項１〜２のいずれか一項に記載のペプチド、および（ｉ）Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋もしくはＡｌ３＋から選択されるカチオン、または（ｉｉ）立体障害型一級アミンから選択される１つまたは複数の作用物質を含む薬学的組成物。
【請求項５】
前記Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋またはＡｌ３＋が、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、リン酸亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸マンガン、塩化マンガン、リン酸マンガン、硫酸マンガン、酢酸カリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸アルミニウム、塩化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムとして提供される、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記立体障害型一級アミンが、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、またはアミノ酸誘導体から選択されるアミノ酸であり、ここで、該天然に存在するアミノ酸がヒスチジン、フェニルアラニン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、チロシン、トレオニン、イソロイシン、トリプトファンもしくはバリンであり、該天然に存在しないアミノ酸が１−アミノシクロヘキサンカルボン酸、ランタニンもしくはテアニンである、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記立体障害型一級アミンが式：
【化１１】
0005913115.tif 000023
を有し、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルエーテル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオエーテル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボン酸、Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボキシルアミドおよびアルキルアリールから独立して選択され、ここで、任意の基がハロゲンまたはアミノによって単独でまたは多重に置換されてよく、ただし、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１つ以下がＨである、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記立体障害型一級アミンがシクロヘキシルアミン、２−メチルブチルアミン、重合アミン、または、キトサンから選択される、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
薬学的に許容される抗酸化剤、結合剤、添加剤、または充填剤をさらに含む、請求項３〜８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記薬学的に許容される結合剤または添加剤が、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、デンプン、マルトデキストリンまたはセルロースエーテルから選択される、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記薬学的に許容される結合剤または添加剤が、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースから選択されるセルロースエーテルである、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記薬学的に許容される充填剤が、セルロース、イソマルト、マンニトール、ラクトースまたは第二リン酸カルシウムである、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記薬学的に許容される充填剤が、微細セルロースおよび微結晶性セルロースから選択されるセルロースである、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
追加の治療薬をさらに含む、請求項３〜１３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記追加の治療薬が、鎮痛剤、抗うつ薬、作動促進剤もしくは運動促進剤、制吐剤、抗生物質、プロトンポンプインヒビター、酸遮断薬、ＰＤＥ５インヒビター、酸ポンプアンタゴニスト、ＧＡＢＡ−Ｂアゴニスト、胆汁酸隔離剤または粘膜保護剤のうちの１つまたは複数から選択される、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項３〜１５のいずれか一項に記載の薬学的組成物を含む投薬単位。
【請求項１７】
カプセルまたは錠剤である、請求項１６に記載の投薬単位。
【請求項１８】
５μｇ〜１ｍｇの前記ペプチドを含む、請求項１６に記載の投薬単位。
【請求項１９】
請求項１〜２のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む、胃腸障害の処置において使用するための薬学的組成物。
【請求項２０】
前記胃腸障害が、胃不全麻痺、術後胃イレウス、機能性食道障害、機能性胃十二指腸障害、胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）、セリアック病、粘膜炎、十二指腸潰瘍もしくは胃潰瘍である、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記胃腸障害が、特発性、糖尿病性または術後の胃不全麻痺から選択される胃不全麻痺である、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記胃腸障害が、機能性胸やけ、食道起源と推定される機能性胸痛、機能性嚥下障害または食道球から選択される機能性食道障害である、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記胃腸障害が、機能性消化不良、おくび障害、吐き気もしくは嘔吐障害、または反芻症候群から選択される機能性胃十二指腸障害である、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、上部胃腸障害の処置のためのペプチド、組成物および方法に関する。
【０００２】
優先権の主張
本出願は、２００９年１１月９日に出願された米国出願番号第６１／２５９，２６４号への優先権を主張する。上記米国出願の全容は、参考として本明細書に援用される。
【０００３】
配列表
本出願には、参考として、「ＩＷ０７７ＵＳ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（６．６４キロバイト）という名称の配列表の全容が組み込まれる。上記配列表は、２０１０年１１月３日に作成され、本明細書と共に電子的に提出される。
【背景技術】
【０００４】
背景
機能性消化不良（ＦＤ）および胃不全麻痺（ＧＰ）は、鼓脹、上腹部（腹上部）疼痛および／または灼熱、吐き気、嘔吐および早期の満腹を含む症状を一括して特徴とする、上部胃腸（ＧＩ）の障害である。既存の療法の効力の欠如および劣る安全性プロファイルのために、ＦＤおよびＧＰ患者のための治療選択肢は極めて制限される。消化不良は、それらの症状を説明しそうないかなる器質的、全身性または代謝性の疾患も存在しない条件下での、胃十二指腸領域から生じるとみなされる１つまたは複数の消化不良症状（上腹部疼痛、灼熱、厄介な食後の充満感および早期の満腹）の存在と定義される（非特許文献１を参照）。ＦＤは、上部内視鏡検査を含む標準的な医学検査の後に構造上の説明を有さない消化不良を指す。ＦＤに関与することができる病態生理学的機構には、後発性胃内容物排出、損なわれた胃適応、胃膨張への過敏性、脂質または酸への十二指腸感受性の変化、および異常な十二指腸空腸の運動性がとりわけ含まれる。長期にわたる十二指腸の酸曝露も一部のＦＤおよびＧＰ患者で見られ、この曝露は胃内容物排出を遅らせ、ＦＤまたはＧＰ様症状を引き起こすことができる。消化不良は、胃腸病専門医によって見られる症例の約３０％を占めるありふれた症候群であり、ＦＤは全てのそのような消化不良症例の約６０％に相当する。
【０００５】
ＧＰは、機械的な閉塞がない条件下での後発性胃内容物排出を特徴とする異常な胃運動性を指す。ＧＰは特発性であってもよく、またはＩ型もしくはＩＩ型糖尿病、ウイルス感染、強皮症、パーキンソン病などの神経系障害、甲状腺機能低下症などの代謝異常、術後イレウス、ならびに麻薬性疼痛薬物投与、三環系抗うつ薬およびカルシウムチャネル遮断薬を含む特定の薬物投与を含む様々な状態に起因することができる。化学療法薬ならびに胸部および腹部への放射線を含む癌の処置も、胃不全麻痺を一時的または恒久的に引き起こすことができる。最もありふれた症状は、吐き気、嘔吐、鼓脹、上腹部疼痛、体重減少および早期の満腹である。胃不全麻痺は、頻繁な入院、生活の質の低下、および障害の増加、および重症例では死亡率の増加につながることがある慢性状態である。糖尿病を起こしている個体では重症の徴候的なＧＰが一般的であり、米国単独で１，０００，０００人の総患者集団に対して糖尿病患者の５〜１０％に影響している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄｒｏｓｓｍａｎ，  Ｄ．Ａ．編、Ｒｏｍｅ  ＩＩＩ：  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、３版、ＭｃＬｅａｎ、ＶＡ：  Ｄｅｇｎｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＦＤおよびＧＰ、ならびに他の上部胃腸障害のための従来の処置選択肢は、多くの患者で限られた効力のものであった。したがって、ＦＤ、ＧＰおよび他の胃腸障害を処置する新しい化合物および方法の必要性が残されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
本発明は、上部胃腸障害および状態（例えば、消化不良、ＧＰ、術後胃イレウス、機能性食道障害、機能性胃十二指腸障害、胃食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）、または十二指腸もしくは胃潰瘍）を処置するためのペプチド、組成物および関連した方法を特徴とし、ならびに他の状態および障害が本明細書で記載される。組成物は、上部ＧＩでグアニル酸シクラーゼＣ（ＧＣ−Ｃ）を活性化するが、下部ＧＩではＧＣ−Ｃをずっと弱く活性化するかまたはまったく活性化しないペプチドを特徴とする。いかなる特定の理論によっても縛られることなく、本発明のペプチドは、下部ＧＩ管で目立った影響（例えば、下痢を含む腸習性の用量制限性の変化）を引き起こさずに、上部ＧＩ症状を低減するのに十分な用量レベルおよび投与頻度で、上部ＧＩ障害の症状を（全体的にまたは一部、上部ＧＩ運動性を増加させ、および／または上腹部疼痛／不快および鼓脹を低減することによって）軽減することができるので有用である。本発明のペプチドは、胃腸の疼痛および不快を改善するためにも有用である。
【０００９】
本発明の一態様は、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩を提供し、ここで、ペプチドはアミノ酸配列：
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｃｙｓ５  Ｘａａ６  Ｘａａ７  Ｘａａ８  Ｃｙｓ９  Ａｓｎ１０  Ｐｒｏ１１  Ａｌａ１２  Ｃｙｓ１３  Ｘａａ１４  Ｇｌｙ１５  Ｘａａ１６  Ｘａａ１７を含み、ここで、
Ｘａａ１は、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、β−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、α−アミノスベリン酸（Ａｓｕ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、α−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）であるか、または存在せず、
Ｘａａ２は、Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、Ａｓｕ、Ａａｄ、Ａｐｍであるか、または存在せず、
Ｘａａ３は、Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、Ａｓｕ、Ａａｄ、Ａｐｍであるか、または存在せず、
Ｘａａ４は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、
Ｘａａ６は、Ｐ−Ｓｅｒ、Ｐ−Ｔｈｒ、Ｐ−ホモ−Ｓｅｒ、４−ヒドロキシバリンホスフェート、Ｐ−ホモ−Ｔｈｒ、Ｐ−ＣｙｓまたはＰ−Ｔｙｒであり、
Ｘａａ７は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＩｌｅであり、
Ｘａａ８は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、
Ｘａａ１４は、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＰｈｅであり、
Ｘａａ１６は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、
Ｘａａ１７は、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒであるか、または存在せず、
ここで、
Ｘａａ１が存在する場合、Ｘａａ１はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよく、
Ｘａａ１が存在せず、Ｘａａ２が存在する場合、Ｘａａ２はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよく、
Ｘａａ１およびＸａａ２の両方が存在しない場合、Ｘａａ３はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよい。
【００１０】
本発明の第二の態様は、本発明のペプチドを含む薬学的組成物を提供する。
【００１１】
本発明の第三の態様は、本発明による薬学的組成物を投与することを含む、胃腸障害の処置方法を提供する。
一つの実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩であって、該ペプチドは、
アミノ酸配列：
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｃｙｓ５  Ｘａａ６  Ｘａａ７  Ｘａａ８  Ｃｙｓ９  Ａｓｎ１０  Ｐｒｏ１１  Ａｌａ１２  Ｃｙｓ１３  Ｘａａ１４  Ｇｌｙ１５  Ｘａａ１６  Ｘａａ１７を含み、ここで、
Ｘａａ１は、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、β−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、α−アミノスベリン酸（Ａｓｕ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、α−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）であるか、または存在せず、
Ｘａａ２は、Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、Ａｓｕ、Ａａｄ、Ａｐｍであるか、または存在せず、
Ｘａａ３は、Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、Ａｓｕ、Ａａｄ、Ａｐｍであるか、または存在せず、
Ｘａａ４は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、
Ｘａａ６は、Ｐ−Ｓｅｒ、Ｐ−Ｔｈｒ、Ｐ−ホモ−Ｓｅｒ、４−ヒドロキシバリンホスフェート、Ｐ−ホモ−Ｔｈｒ、Ｐ−ＣｙｓまたはＰ−Ｔｙｒであり、
Ｘａａ７は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＩｌｅであり、
Ｘａａ８は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、
Ｘａａ１４は、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＰｈｅであり、
Ｘａａ１６は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、ならびに
Ｘａａ１７は、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒであるか、または存在せず、
ここで、
Ｘａａ１が存在する場合、Ｘａａ１はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよく、
Ｘａａ１が存在せず、Ｘａａ２が存在する場合、Ｘａａ２はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよく、
Ｘａａ１およびＸａａ２の両方が存在しない場合、Ｘａａ３はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよい、
ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目２）
Ｘａａ２およびＸａａ３の両方が存在しない、項目１に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目３）
Ｘａａ２がＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘａａ３が存在しない、項目１に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目４）
Ｘａａ２がＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘａａ３がＡｓｐまたはＧｌｕである、項目１に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目５）
Ｘａａ７がＴｙｒまたはＬｅｕである、項目１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目６）
Ｘａａ１４がＴｈｒである、項目１〜５のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目７）
Ｘａａ１７がＴｙｒであるか、または存在しない、項目１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目８）
Ｘａａ１がＡｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、β−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＤ−Ｇｌｕである、項目１〜７のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目９）
Ｘａａ１がＡｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＤ−Ｇｌｕである、項目８に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目１０）
Ｘａａ６がＰ−ＳｅｒまたはＰ−Ｔｈｒである、項目１〜９のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目１１）
Ｘａａ６がＰ−Ｓｅｒである、項目１０に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目１２）
Ｘａａ１、Ｘａａ２およびＸａａ３が存在しない、項目１に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目１３）
Ｘａａ７がＴｙｒまたはＬｅｕである、項目１２に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目１４）
Ｘａａ１４がＴｈｒである、項目１２または１３のいずれかに記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目１５）
Ｘａａ１７がＴｙｒであるか、または存在しない、項目１２〜１４のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目１６）
Ｘａａ６がＰ−Ｓｅｒである、項目１２〜１５のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目１７）
項目１６に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩であって、該ペプチドがアミノ酸配列：
Ｃｙｓ４  Ｃｙｓ５  Ｐ−Ｓｅｒ６  Ｘａａ７  Ｃｙｓ８  Ｃｙｓ９  Ａｓｎ１０  Ｐｒｏ１１  Ａｌａ１２  Ｃｙｓ１３  Ｔｈｒ１４  Ｇｌｙ１５  Ｃｙｓ１６  Ｘａａ１７を含み、Ｘａａ７がＴｙｒまたはＬｅｕである、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目１８）
項目１に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩であって、該ペプチドがアミノ酸配列：
【化９】
0005913115.tif 000002
を含む、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目１９）
項目１〜１８のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩であって、該ペプチドが５０、４０、３０または２０個以下のアミノ酸を含む、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目２０）
項目１９に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩であって、該ペプチドが１９、１８、１７、１６、１５または１４個以下のアミノ酸を含む、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目２１）
アミノ酸配列：
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｃｙｓ５  Ｘａａ６  Ｘａａ７  Ｃｙｓ８  Ｃｙｓ９  Ａｓｎ１０  Ｐｒｏ１１  Ａｌａ１２  Ｃｙｓ１３  Ｘａａ１４  Ｇｌｙ１５  Ｃｙｓ１６  Ｘａａ１７からなるペプチドまたは薬学的に許容されるその塩であって、ここで、
Ｘａａ１は、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、β−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、α−アミノスベリン酸（Ａｓｕ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、α−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）であるか、または存在せず、
Ｘａａ２は、Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、Ａｓｕ、Ａａｄ、Ａｐｍであるか、または存在せず、
Ｘａａ３は、Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、Ａｓｕ、Ａａｄ、Ａｐｍであるか、または存在せず、
Ｘａａ４は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、
Ｘａａ６は、Ｐ−Ｓｅｒ、Ｐ−Ｔｈｒ、Ｐ−ホモ−Ｓｅｒ、４−ヒドロキシバリンホスフェート、Ｐ−ホモ−Ｔｈｒ、Ｐ−ＣｙｓまたはＰ−Ｔｙｒであり、
Ｘａａ７は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＩｌｅであり、
Ｘａａ８は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、
Ｘａａ１４は、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＰｈｅであり、
Ｘａａ１６は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、ならびに
Ｘａａ１７は、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒであるか、または存在せず、
ここで、
Ｘａａ１が存在する場合、Ｘａａ１はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよく、
Ｘａａ１が存在せず、Ｘａａ２が存在する場合、Ｘａａ２はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよく、
Ｘａａ１およびＸａａ２の両方が存在しない場合、Ｘａａ３はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよい、
ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目２２）
Ｘａａ２およびＸａａ３の両方が存在しない、項目２１に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目２３）
Ｘａａ２がＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘａａ３が存在しない、項目２１に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目２４）
Ｘａａ２がＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘａａ３がＡｓｐまたはＧｌｕである、項目２１に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目２５）
Ｘａａ７がＴｙｒまたはＬｅｕである、項目２１〜２４のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目２６）
Ｘａａ１４がＴｈｒである、項目２１〜２５のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目２７）
Ｘａａ１７がＴｙｒであるか、または存在しない、項目２１〜２６のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目２８）
Ｘａａ１がＡｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、β−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＤ−Ｇｌｕである、項目２１〜２７のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目２９）
Ｘａａ１がＡｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＤ−Ｇｌｕである、項目２８に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目３０）
Ｘａａ６がＰ−ＳｅｒまたはＰ−Ｔｈｒである、項目２１〜２９のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目３１）
Ｘａａ６がＰ−Ｓｅｒである、項目３０に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目３２）
Ｘａａ１、Ｘａａ２およびＸａａ３が存在しない、項目２１に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目３３）
Ｘａａ７がＴｙｒまたはＬｅｕである、項目３２に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目３４）
Ｘａａ１４がＴｈｒである、項目３２または３３のいずれかに記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目３５）
Ｘａａ１７がＴｙｒであるか、または存在しない、項目３２〜３４のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目３６）
Ｘａａ６がＰ−Ｓｅｒである、項目３２〜３５のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目３７）
項目３６に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩であって、該ペプチドがアミノ酸配列：
Ｃｙｓ４  Ｃｙｓ５  Ｐ−Ｓｅｒ６  Ｘａａ７  Ｃｙｓ８  Ｃｙｓ９  Ａｓｎ１０  Ｐｒｏ１１  Ａｌａ１２  Ｃｙｓ１３  Ｔｈｒ１４  Ｇｌｙ１５  Ｃｙｓ１６  Ｘａａ１７からなり、Ｘａａ７がＴｙｒまたはＬｅｕである、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目３８）
項目３２に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩であって、該ペプチドがアミノ酸配列：
【化１０】
0005913115.tif 000003
からなる、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目３９）
単離されているものである、項目１〜３８のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目４０）
精製されているものである、項目３９に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩。
（項目４１）
項目１〜４０のいずれか一項に記載のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組成物。
（項目４２）
薬学的に許容されるキャリア、項目１〜４０のいずれか一項に記載のペプチド、および（ｉ）Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋もしくはＡｌ３＋から選択されるカチオン、または（ｉｉ）立体障害型一級アミンから選択される１つまたは複数の作用物質を含む薬学的組成物。
（項目４３）
前記作用物質がＭｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋またはＡｌ３＋である、項目４２に記載の薬学的組成物。
（項目４４）
前記Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋またはＡｌ３＋が、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、リン酸亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸マンガン、塩化マンガン、リン酸マンガン、硫酸マンガン、酢酸カリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸アルミニウム、塩化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムとして提供される、項目４２または４３に記載の薬学的組成物。
（項目４５）
前記作用物質が立体障害型一級アミンである、項目４２に記載の薬学的組成物。
（項目４６）
前記立体障害型一級アミンがアミノ酸である、項目４５に記載の薬学的組成物。
（項目４７）
前記アミノ酸が天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、またはアミノ酸誘導体である、項目４６に記載の薬学的組成物。
（項目４８）
前記天然に存在するアミノ酸がヒスチジン、フェニルアラニン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、チロシン、トレオニン、イソロイシン、トリプトファンもしくはバリンであり、前記天然に存在しないアミノ酸が１−アミノシクロヘキサンカルボン酸、ランタニンもしくはテアニンである、項目４７に記載の薬学的組成物。
（項目４９）
前記立体障害型一級アミンが式：
【化１１】
0005913115.tif 000004
を有し、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルエーテル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオエーテル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボン酸、Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボキシルアミドおよびアルキルアリールから独立して選択され、ここで、任意の基がハロゲンまたはアミノによって単独でまたは多重に置換されてよく、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１つ以下がＨである、項目４２に記載の薬学的組成物。
（項目５０）
前記立体障害型一級アミンがシクロヘキシルアミンまたは２−メチルブチルアミンである、項目４９に記載の薬学的組成物。
（項目５１）
前記立体障害型一級アミンが重合アミンである、項目４２に記載の薬学的組成物。
（項目５２）
前記重合アミンがキトサンである、項目５１に記載の薬学的組成物。
（項目５３）
Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋またはＡｌ３＋をさらに含むものである、項目４５〜５２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
（項目５４）
前記Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋またはＡｌ３＋が、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、リン酸亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸マンガン、塩化マンガン、リン酸マンガン、硫酸マンガン、酢酸カリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸アルミニウム、塩化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムとして提供される、項目５０に記載の薬学的組成物。
（項目５５）
抗酸化剤をさらに含む、項目４２〜５４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
（項目５６）
前記抗酸化剤がＢＨＡ、ビタミンＥまたは没食子酸プロピルである、項目５５に記載の薬学的組成物。
（項目５７）
薬学的に許容される結合剤または添加剤をさらに含む、項目４２〜５６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
（項目５８）
前記薬学的に許容される結合剤または添加剤が、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、デンプン、マルトデキストリンまたはセルロースエーテルから選択される、項目５７に記載の薬学的組成物。
（項目５９）
前記薬学的に許容される結合剤または添加剤がポリビニルアルコールである、項目５８に記載の薬学的組成物。
（項目６０）
前記薬学的に許容される結合剤または添加剤がセルロースエーテルである、項目５９に記載の薬学的組成物。
（項目６１）
前記セルロースエーテルがメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースから選択される、項目６０に記載の薬学的組成物。
（項目６２）
薬学的に許容される充填剤をさらに含む、項目４２〜６１のいずれかに記載の薬学的組成物。
（項目６３）
前記薬学的に許容される充填剤が、セルロース、イソマルト、マンニトール、ラクトースまたは第二リン酸カルシウムである、項目６２に記載の薬学的組成物。
（項目６４）
前記セルロースが微細セルロースおよび微結晶性セルロースから選択される、項目６３に記載の薬学的組成物。
（項目６５）
追加の治療薬をさらに含む、項目４１〜６４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
（項目６６）
前記追加の治療薬が、鎮痛剤、抗うつ薬、作動促進剤もしくは運動促進剤、制吐剤、抗生物質、プロトンポンプインヒビター、酸遮断薬、ＰＤＥ５インヒビター、酸ポンプアンタゴニスト、ＧＡＢＡ−Ｂアゴニスト、胆汁酸隔離剤または粘膜保護剤の１つまたは複数から選択される、項目６５に記載の薬学的組成物。
（項目６７）
項目４１〜６７のいずれか一項に記載の薬学的組成物を含む投薬単位。
（項目６８）
カプセルまたは錠剤である、項目６７に記載の投薬単位。
（項目６９）
項目６９に記載の投薬単位であって、該投薬単位の各々が５μｇ〜１ｍｇの前記ペプチドを含む、投薬単位。
（項目７０）
項目４１〜６９のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、胃腸障害を処置するための方法。
（項目７１）
前記胃腸障害が、胃不全麻痺、術後胃イレウス、機能性食道障害、機能性胃十二指腸障害、胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）、セリアック病、粘膜炎または十二指腸潰瘍もしくは胃潰瘍である、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記胃腸障害が胃不全麻痺である、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記胃不全麻痺が特発性、糖尿病性または術後の胃不全麻痺である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記胃腸障害が術後胃イレウスである、項目７１に記載の方法。
（項目７５）
前記胃腸障害が機能性食道障害である、項目７１に記載の方法。
（項目７６）
前記機能性食道障害が、機能性胸やけ、食道起源と推定される機能性胸痛、機能性嚥下障害または食道球である、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記胃腸障害が機能性胃十二指腸障害である、項目７１に記載の方法。
（項目７８）
前記機能性胃十二指腸障害が、機能性消化不良、おくび障害、吐き気もしくは嘔吐障害、または反芻症候群である、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記機能性消化不良が食後愁訴症候群または上腹部痛症候群である、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記おくび障害が空気嚥下または特徴付けられていない過度のおくびである、項目７８に記載の方法。
（項目８１）
前記吐き気もしくは嘔吐障害が、慢性特発性の吐き気、機能性嘔吐または周期性嘔吐症候群である、項目７８に記載の方法。
（項目８２）
前記胃腸障害が胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）である、項目７１に記載の方法。
（項目８３）
前記胃腸障害が十二指腸潰瘍または胃潰瘍である、項目７１に記載の方法。
【００１２】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、付随する記載に示される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａは、本発明の例示的なペプチドのアルカリホスファターゼとの反応を図示する。図１Ｂは、対照のｐ−ニトロフェニルリン酸のホスファターゼによる加水分解を図示する。
【図２】図２は、ペプチド２およびペプチド４が十二指腸の液分泌を促進することを示す例を提示する。
【図３】図３は、マウス腸（空腸）の液中のペプチド２、デホスホペプチド２およびペプチド３の安定性に関する試験の結果を提示する。
【図４】図４は、ＳＴＺによって誘導された糖尿病のラットにおける液体胃内容物排出に及ぼすペプチド２および３の影響に関する試験の結果を提示する。
【００１４】
これらの図は例として提供され、本発明の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
グアニル酸シクラーゼＣ（ＧＣ−Ｃ）は、胃および腸の上皮細胞の先端表面に位置する膜貫通受容体である。受容体は、細胞外のリガンド結合性ドメイン、単一の膜貫通領域およびＣ末端のグアニリルシクラーゼドメインを有する。リガンドがＧＣ−Ｃの細胞外ドメインに結合するとき、細胞内の触媒ドメインはＧＴＰからのｃＧＭＰの生成を触媒する。ｉｎ  ｖｉｖｏで、細胞内ｃＧＭＰのこの増加は、腸内腔への塩化物および重炭酸塩の分泌の増加、内腔ｐＨの上昇、内腔ナトリウム吸収の減少、液分泌の増加ならびに腸管輸送の促進に導くカスケード事象を開始する。上皮から粘膜および内腔へ双方向に分泌されるｃＧＭＰは、求心性Ｃ線維ファイヤリングを弱めることも示され、内臓痛に対するＧＣ−Ｃアゴニストの観察された鎮痛効果の可能な機構を示唆した。
【００１６】
経口投与され、現在便秘を伴う過敏性腸症候群（ＩＢＳ−ｃ）および慢性便秘（ＣＣ）の処置のために治験中であるペプチドＧＣ−Ｃアゴニストリナクロチドは、下部ＧＩ生理に対して（１）内臓痛の減少、（２）鼓脹の減少、および（３）ＧＩ輸送の増加を含む多数の効果を有し、それらは便通頻度の増加および改善された大便硬度をもたらすことができる。経口投与されたリナクロチドは、内腔表面のＧＣ−Ｃを活性化することによって局所的に作用する。治療量レベルでの経口投与の後に全身で見られるリナクロチドの検出可能なレベルはない。したがって、リナクロチドの治験、ならびにリナクロチドおよび関連したペプチドで実施された前臨床試験からの結果は、ＧＣ−Ｃペプチドアゴニストを治療的に用いることができることを示唆する。
【００１７】
ＧＩ管の下部部分でＧＣ−Ｃの刺激から生じる可能性がある腸習性に対する顕著な影響を促進することなく、上部ＧＩの障害および症状（例えば、機能性消化不良（ＦＤ）および胃不全麻痺（ＧＰ））を軽減するために用いることができるであろうＧＣ−Ｃアゴニストを有することは有用であろう。そのようなＧＣ−Ｃアゴニストは、変化した腸習性および下痢を含む下部ＧＩの有害事象の可能性を減少させよう。本明細書に記載されるＧＣ−Ｃペプチドアゴニストは、上部のＧＩ管（例えば、胃および十二指腸）でより活性であり、下部ＧＩ管では活性がより低い。そのようなアゴニストは、（１）ｃＧＭＰ生成およびまたは／他の機構を通して内臓痛を低減すること、（２）鼓脹を減少させること、（３）胃内容物排出および／または上部小腸輸送（例えば、十二指腸輸送）を増加させること、ならびに（４）重炭酸塩分泌を促進することによって十二指腸で酸を中和することによって、上部ＧＩ障害（例えば、ＦＤおよびＧＰ）を有する患者で利点を有する。重要なことに、これらのアゴニストは、上部ＧＩを標的にするそれらの活性によって、腸習性に顕著な影響（例えば、ＧＩ管の下部部分でＧＣ−Ｃの刺激から生じることができる）を及ぼすことなく、ＦＤおよびＧＰの症状を軽減することができよう。
【００１８】
一態様では、本発明は、胃腸障害、特にＦＤおよびＧＰなどの上部ＧＩ障害の処置のために有用な新規ＧＣ−Ｃペプチドアゴニストを提供する。ＧＣ−Ｃペプチドアゴニストは、食道、胃および上部小腸（十二指腸）を含む上部ＧＩで活性であるが、それが残りの小腸および大腸を移動するにしたがい活性が低くなるように設計されている。本発明のペプチドは、胃腸の疼痛および不快を改善するためにも有用である。ＧＣ−Ｃアゴニストペプチドは、他のＧＣ−Ｃアゴニストペプチドで見出される保存されたグルタミン酸またはアスパラギン酸を置換するためのホスホアミノ酸、例えばホスホセリンを含む。ホスホセリンなどのホスホアミノ酸−ＯＰＯ３２−のリン酸塩は、グルタミン酸またはアスパラギン酸のＣＯＯ−の生物模倣剤として作用することができ、その結果ホスホアミノ酸を含むペプチドはＧＣ−Ｃに結合してそれを活性化することができる。ホスホアミノ酸を含むペプチドは、ペプチドのＧＣ−Ｃ結合性およびアゴニスト活性を大いに減少させる腸アルカリホスファターゼが脱リン酸化することができる。腸アルカリホスファターゼはＧＩ管全体で見出され、小腸を含むアルカリ性内腔環境で最も活性である。ホスホアミノ酸を含むペプチドは、酸性胃環境および上部ＧＩ管を含む上部ＧＩ管でＧＣ−Ｃを活性化し、液および重炭酸塩の分泌を促進することができる。ペプチドが上部ＧＩで液および重炭酸塩の分泌の増加を促進するので、腸の内腔はよりアルカリ性になり、このようにアルカリホスファターゼ活性を活性化する。したがって、ＧＣ−Ｃに対するペプチドの作用ならびに腸を通るペプチドの移動を通して、ペプチドのホスホアミノ酸は脱リン酸化されたアミノ酸に変換され、それによって、それが上部から下部のＧＩに移動するにしたがってＧＣ−Ｃアゴニストとしてのその活性を減少させる。
【００１９】
本明細書で用いるように、アミノ酸またはその３文字略記号の前の用語「Ｐ−」は、ホスホアミノ酸を指す。例えば、用語「Ｐ−Ｓｅｒ」、「Ｐ−Ｔｈｒ」、「Ｐ−Ｔｙｒ」、「Ｐ−Ｃｙｓ」、「Ｐ−ホモ−Ｃｙｓ」、「Ｐ−ホモ−Ｓｅｒ」および「Ｐ−ホモ−Ｔｈｒ」は、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン、ホスホシステイン、ホスホホモシステイン、ホスホホモセリンおよびホスホホモトレオニンをそれぞれ指す。本明細書で用いるように、ホスホアミノ酸は、アミノ酸およびリン酸のエステルまたはチオエステルを指し、例えばアルコールまたはチオール官能基の水素は、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２によって置換される。例えば、Ｐ−Ｓｅｒは、構造：
【００２０】
【化１】
0005913115.tif 000005
を有し、Ｐ−Ｔｈｒは、構造：
【００２１】
【化２】
0005913115.tif 000006
を有し、Ｐ−Ｔｙｒは、構造：
【００２２】
【化３】
0005913115.tif 000007
を有し、Ｐ−Ｃｙｓは、構造：
【００２３】
【化４】
0005913115.tif 000008
を有する。
【００２４】
一態様では、本発明は、アミノ酸配列：
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｃｙｓ５  Ｘａａ６  Ｘａａ７  Ｘａａ８  Ｃｙｓ９  Ａｓｎ１０  Ｐｒｏ１１  Ａｌａ１２  Ｃｙｓ１３  Ｘａａ１４  Ｇｌｙ１５  Ｘａａ１６  Ｘａａ１７を含み、ここで、
Ｘａａ１は、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、β−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、α−アミノスベリン酸（Ａｓｕ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、α−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）であるか、または存在せず、
Ｘａａ２は、Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、Ａｓｕ、Ａａｄ、Ａｐｍであるか、または存在せず、
Ｘａａ３は、Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、Ａｓｕ、Ａａｄ、Ａｐｍであるか、または存在せず、
Ｘａａ４は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、
Ｘａａ６は、Ｐ−Ｓｅｒ、Ｐ−Ｔｈｒ、Ｐ−ホモ−Ｓｅｒ、４−ヒドロキシバリンホスフェート、Ｐ−ホモ−Ｔｈｒ、Ｐ−ＣｙｓまたはＰ−Ｔｙｒであり、
Ｘａａ７は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＩｌｅであり、
Ｘａａ８は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、
Ｘａａ１４は、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＰｈｅであり、
Ｘａａ１６は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、
Ｘａａ１７は、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒであるか、または存在せず、
ここで、
Ｘａａ１が存在する場合、Ｘａａ１はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよく、
Ｘａａ１が存在せず、Ｘａａ２が存在する場合、Ｘａａ２はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよく、
Ｘａａ１およびＸａａ２の両方が存在しない場合、Ｘａａ３はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよい、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００２５】
一部の実施形態では、Ｘａａ２およびＸａａ３の両方が存在しない。他の実施形態では、Ｘａａ２はＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘａａ３は存在しない。さらに他の実施形態では、Ｘａａ２はＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘａａ３はＡｓｐまたはＧｌｕである。
【００２６】
一部の実施形態では、Ｘａａ７はＴｙｒまたはＬｅｕである。
【００２７】
一部の実施形態では、Ｘａａ１４はＴｈｒである。
【００２８】
一部の実施形態では、Ｘａａ１７はＴｙｒ、または存在しない。
【００２９】
一部の実施形態では、Ｘａａ１はＡｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、β−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＤ−Ｇｌｕである。さらなる実施形態では、Ｘａａ１はＡｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＤ−Ｇｌｕである。
【００３０】
一部の実施形態では、Ｘａａ６はＰ−ＳｅｒまたはＰ−Ｔｈｒである。さらなる実施形態では、Ｘａａ６はＰ−Ｓｅｒである。
【００３１】
一部の実施形態では、Ｘａａ１、Ｘａａ２およびＸａａ３は存在せず、Ｘａａ４はＤ−ＣｙｓまたはＣｙｓである。さらなる実施形態では、Ｘａａ７はＴｙｒまたはＬｅｕである。さらなる実施形態では、Ｘａａ１４はＴｈｒである。さらなる実施形態では、Ｘａａ１７はＴｙｒ、または存在しない。さらなる実施形態では、Ｘａａ６はＰ−Ｓｅｒである。
【００３２】
一部の実施形態では、Ｘａａ４、Ｘａａ８またはＸａａ１６の少なくとも１つはＣｙｓである。一部の実施形態では、Ｘａａ４、Ｘａａ８またはＸａａ１６の少なくとも２つはＣｙｓである。一部の実施形態では、Ｘａａ４、Ｘａａ８およびＸａａ１６の全てはＣｙｓである。一部の実施形態では、Ｘａａ４、Ｘａａ８またはＸａａ１６の少なくとも１つはＤ−Ｃｙｓである。一部の実施形態では、Ｘａａ４、Ｘａａ８またはＸａａ１６の少なくとも２つはＤ−Ｃｙｓである。一部の実施形態では、Ｘａａ４、Ｘａａ８およびＸａａ１６の全てはＤ−Ｃｙｓである。
【００３３】
一部の実施形態では、ペプチドがアミノ酸配列：
Ｃｙｓ４  Ｃｙｓ５  Ｐ−Ｓｅｒ６  Ｘａａ７  Ｃｙｓ８  Ｃｙｓ９  Ａｓｎ１０  Ｐｒｏ１１  Ａｌａ１２  Ｃｙｓ１３  Ｔｈｒ１４  Ｇｌｙ１５  Ｃｙｓ１６  Ｘａａ１７を含み、ここでＸａａ７はＴｙｒまたはＬｅｕである、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩が提供される。
【００３４】
一部の実施形態では、ペプチドがアミノ酸配列：
【００３５】
【化５】
0005913115.tif 000009
を含む、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩が提供される。
【００３６】
一部の実施形態では、ペプチドが５０、４０、３０または２０個以下のアミノ酸を含む、ペプチドまたはその薬学的に許容される塩が提供される。さらなる実施形態では、ペプチドは１９、１８、１７、１６、１５または１４個以下のアミノ酸を含む。
【００３７】
別の態様では、本発明は、ペプチドがアミノ酸配列：
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｃｙｓ５  Ｘａａ６  Ｘａａ７  Ｘａａ８  Ｃｙｓ９  Ａｓｎ１０  Ｐｒｏ１１  Ａｌａ１２  Ｃｙｓ１３  Ｘａａ１４  Ｇｌｙ１５  Ｘａａ１６  Ｘａａ１７、または薬学的に許容されるその塩からなり、ここで、
Ｘａａ１は、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、β−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、α−アミノスベリン酸（Ａｓｕ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、α−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）であるか、または存在せず、
Ｘａａ２は、Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、Ａｓｕ、Ａａｄ、Ａｐｍであるか、または存在せず、
Ｘａａ３は、Ａｓｐ、γ−カルボキシル化Ａｓｐ、Ｇｌｕ、γ−カルボキシル化Ｇｌｕ、Ａｓｕ、Ａａｄ、Ａｐｍであるか、または存在せず、
Ｘａａ４は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、
Ｘａａ６は、Ｐ−Ｓｅｒ、Ｐ−Ｔｈｒ、Ｐ−ホモ−Ｓｅｒ、４−ヒドロキシバリンホスフェート、Ｐ−ホモ−Ｔｈｒ、Ｐ−ＣｙｓまたはＰ−Ｔｙｒであり、
Ｘａａ７は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＩｌｅであり、
Ｘａａ８は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、
Ｘａａ１４は、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＰｈｅであり、
Ｘａａ１６は、ＣｙｓまたはＤ−Ｃｙｓであり、
Ｘａａ１７は、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒであるか、または存在せず、
ここで、
Ｘａａ１が存在する場合、Ｘａａ１はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよく、
Ｘａａ１が存在せず、Ｘａａ２が存在する場合、Ｘａａ２はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよく、
Ｘａａ１およびＸａａ２の両方が存在しない場合、Ｘａａ３はそのアミノ基上でメチル、エタン二酸、プロパン二酸、ブタン二酸、ペンタン二酸、ヘキサン二酸、ヘプタン二酸またはオクタン二酸によって修飾されてもよい、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩が提供される。
【００３８】
一部の実施形態では、Ｘａａ２およびＸａａ３の両方は存在しない。他の実施形態では、Ｘａａ２はＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘａａ３は存在しない。さらに他の実施形態では、Ｘａａ２はＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘａａ３はＡｓｐまたはＧｌｕである。
【００３９】
一部の実施形態では、Ｘａａ７はＴｙｒまたはＬｅｕである。
【００４０】
一部の実施形態では、Ｘａａ１４はＴｈｒである。
【００４１】
一部の実施形態では、Ｘａａ１７はＴｙｒ、または存在しない。
【００４２】
一部の実施形態では、Ｘａａ１はＡｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、β−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＤ−Ｇｌｕである。さらなる実施形態では、Ｘａａ１はＡｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＤ−Ｇｌｕである。
【００４３】
一部の実施形態では、Ｘａａ６はＰ−ＳｅｒまたはＰ−Ｔｈｒである。さらなる実施形態では、Ｘａａ６はＰ−Ｓｅｒである。
【００４４】
一部の実施形態では、Ｘａａ１、Ｘａａ２およびＸａａ３は存在せず、Ｘａａ４はＤ−ＣｙｓまたはＣｙｓである。さらなる実施形態では、Ｘａａ７はＴｙｒまたはＬｅｕである。さらなる実施形態では、Ｘａａ１４はＴｈｒである。さらなる実施形態では、Ｘａａ１７はＴｙｒ、または存在しない。さらなる実施形態では、Ｘａａ６はＰ−Ｓｅｒである。
【００４５】
一部の実施形態では、ペプチドがアミノ酸配列：
Ｃｙｓ４  Ｃｙｓ５  Ｐ−Ｓｅｒ６  Ｘａａ７  Ｃｙｓ８  Ｃｙｓ９  Ａｓｎ１０  Ｐｒｏ１１  Ａｌａ１２  Ｃｙｓ１３  Ｔｈｒ１４  Ｇｌｙ１５  Ｃｙｓ１６  Ｘａａ１７からなり、ここでＸａａ７はＴｙｒまたはＬｅｕである、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩が提供される。
【００４６】
一部の実施形態では、ペプチドがアミノ酸配列：
【００４７】
【化６】
0005913115.tif 000010
からなる、ペプチドまたは薬学的に許容されるその塩が提供される。
【００４８】
場合により、ペプチドは単離されている。他の場合、ペプチドは精製されている。
【００４９】
一部の実施形態では、Ｘａａ６は、リン酸化されてもよい任意のアミノ酸である。
【００５０】
一部の実施形態では、ペプチドの薬学的に許容される塩が提供される。場合により、薬学的に許容される塩は塩化物塩である。
【００５１】
変異体ペプチド
一部の状況では、腸のＧＣ−Ｃ受容体に結合してそれを活性化するが、ペプチドの非変異形よりも活性でないかより活性である変異体ペプチドで患者を処置することが好ましいことがある。活性の低下は、受容体への親和性の低下、または結合した受容体を活性化する能力の低下、またはペプチドの安定性の低下から生じることができる。活性の増加は、受容体への親和性の増加、または結合した受容体を活性化する能力の増加、またはペプチドの安定性の増加から生じることができる。
【００５２】
一部のペプチドでは、正常なジスルフィド結合の位置で代替の内部架橋を形成するために、ジスルフィド結合を通常形成するＣｙｓ残基の一方または両方の対の一方または両方のメンバーは、ホモシステイン、ペニシラミン、３−メルカプトプロリン（Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊら１９９６年Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ４８巻：２７４頁）、β，β−ジメチルシステイン（Ｈｕｎｔら１９９３年Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ４２巻：２４９頁）またはジアミノプロピオン酸（Ｓｍｉｔｈら１９７８年Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ２１巻：１１７頁）によって置換されてよい。他の実施形態では、ジスルフィド結合は炭化水素架橋によって置換されてよい（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒら２０００年Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ１２２巻：５８９１頁、Ｐａｔｇｉｒｉら２００８年Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ４１巻：１２８９頁、Ｈｅｎｃｈｅｙら２００８年Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ１２巻：６９２頁）。
【００５３】
ペプチドの生成
一実施形態では、それらに限定されないが、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、昆虫細胞系（例えば、ショウジョウバエＳｆ９細胞系）、酵母細胞系（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）または糸状菌発現系、または動物細胞発現系（例えば、哺乳動物細胞発現系）を含む任意の公知のタンパク質発現系で組換えにより本発明のペプチドまたは前駆体ペプチドを生成することができる。本発明のペプチドまたは前駆体ペプチドは、化学的に合成されてもよい。
【００５４】
ペプチドまたは変異体ペプチドが例えばＥ．ｃｏｌｉなど組換えで生成される場合、ペプチドをコードする核酸分子は、細胞からの成熟ペプチドの分泌を可能にするリーダー配列をコードすることもできる。したがって、ペプチドをコードする配列は、例えば天然に存在する細菌性ＳＴペプチドのプレ配列およびプロ配列を含むことができる。分泌された成熟ペプチドは、培地から精製することができる。
【００５５】
本明細書に記載されるペプチドをコードする配列は、細菌細胞で核酸分子を送達および維持することが可能なベクターに挿入することができる。ＤＮＡ分子は自己複製ベクター（適するベクターには、例えばｐＧＥＭ３ＺおよびｐｃＤＮＡ３、およびその誘導体が含まれる）に挿入することができる。ベクター核酸は、バクテリオファージラムダまたはＭ１３およびその誘導体などの細菌またはバクテリオファージのＤＮＡであってよい。本明細書に記載される核酸を含むベクターの構築には、細菌などの宿主細胞の形質転換が後に続くことができる。適する細菌宿主には、それらに限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａが含まれる。遺伝子構築物は、コード核酸分子に加えて、プロモーターおよび調節配列などの発現を可能にするエレメントも含む。発現ベクターは、転写開始を制御する転写調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列を含むことができる。様々な転写制御配列が当業者に周知である。発現ベクターは、翻訳調節配列（例えば、非翻訳５’配列、非翻訳３’配列またはリボソーム内部進入部位）を含むこともできる。ベクターは自己複製が可能であってよく、またはペプチド生成の間の安定性を確実にするために宿主ＤＮＡに組み込まれてもよい。
【００５６】
本明細書に記載されるペプチドを含むタンパク質コード配列は、精製を促進するために、ペプチド親和性タグ、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、プロテインＡ、ＦＬＡＧタグ、ヘキサヒスチジン、ｍｙｃタグまたはインフルエンザＨＡタグをコードする核酸に融合されてもよい。翻訳融合が生成されるように、親和性タグまたはリポーター融合は、親和性タグをコードする遺伝子の読み枠に対象ペプチドの読み枠を連結する。融合遺伝子の発現は、対象ペプチドおよび親和性タグの両方を含む単一のペプチドの翻訳をもたらす。親和性タグが利用される一部の例では、プロテアーゼ認識部位をコードするＤＮＡ配列が、親和性タグおよび対象ペプチドの読み枠の間に融合される。
【００５７】
当業者に周知であり、細菌以外のタンパク質発現系で本明細書に記載されるペプチドおよび変異体の未熟および成熟形の生成に適する遺伝子構築物および方法も、生物系でペプチドを生成するために用いることができる。
【００５８】
組換えで生成されるペプチドは、当業者に公知である方法を用いてリン酸化することができる。一部の実施形態では、ペプチドは、組換えで生成され、発現された細胞から単離され、タンパク質キナーゼ、例えばセリン／トレオニンキナーゼまたはチロシンキナーゼを用いて次にリン酸化される。多数のキナーゼが当技術分野で公知であり、この目的のために用いることができる。異なるキナーゼは異なる基質特異性を有することを当業者は認め、ペプチドの配列に基づいて用いるキナーゼを選出する。他の実施形態では、ペプチドは、ペプチドをリン酸化するセリン／トレオニンキナーゼまたはチロシンキナーゼも発現する細胞で組換えによって生成される。他の実施形態では、ホスホアミノ酸を組み込むことによって、ペプチドを組換えで生成することができる。非天然のおよび／または任意のアミノ酸の組込みを可能にするために、それらに限定されないが、アンチコドン、アミノ酸付着部位および／または受容体ステムを修飾することを含む、ｔＲＮＡを修飾する方法が当技術分野で公知である（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．（２００８年）３７２巻：４８０〜４８５頁、Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．（２００９年）１６巻：３２３〜３６頁、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００７年）４巻：２３９〜４４頁、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００６年）７巻：７７５〜８２頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００５年）３６巻：２２７〜２３８頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００５年）３６巻：２７０〜２７８頁、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００４年）７３巻：１４７〜１７６頁、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００４年）３２巻：６２００〜６２１１頁、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（２００３年）１００巻：６３５３〜６３５７頁、Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃ．  Ｃｈｅｍ．（２００４年）３３巻：４２２〜４３０頁）。
【００５９】
一部の実施形態では、ペプチドは化学的に生成することができる。ペプチドは、伝統的なＢＯＣまたはＦＭＯＣ保護を用いる溶液および固相合成を含む、いくつかの異なる方法によって合成することができる。例えば、ペプチドは、連続アミノ酸結合を用いて２−クロロトリチルクロリドまたはＷａｎｇ樹脂で合成することができる。以下の保護基を用いることができる：フルオレニルメチルオキシカルボニルまたはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（アルファ−アミノ基、Ｎ末端）；トリチルまたはｔｅｒｔ−ブチル（Ｃｙのチオール基）；ｔｅｒｔ−ブチル（存在するならばグルタミン酸のγ−カルボキシルおよびトレオニンのヒドロキシル基）；トリチル（存在するならばアスパラギン側鎖のβ−アミド官能基およびチロシンのフェノール基）；トリチルまたはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（存在するならばセリンのヒドロキシ基）、ならびにｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（以降の側鎖改変より前のＮ末端）。結合は第三アミンの存在下でＤＩＣおよびＨＯＢｔによって実行することができ、カクテルＫ（トリフルオロ酢酸８１％、フェノール５％、チオアニソール５％、１，２−エタンジチオール２．５％、水３％、ジメチルスルフィド２％、ヨウ化アンモニウム１．５％ｗ／ｗ）を用いることで、ペプチドを脱保護し、固体支持体から切断することができる。トリフルオロ酢酸および他の揮発性物質の除去の後、有機溶媒を用いてペプチドを沈殿することができる。Ｃｙｓ残基間のジスルフィド結合は、ジメチルスルホキシドを用いて（Ｔａｍら（１９９１年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．１１３巻：６６５７〜６２頁）または空気酸化手法を用いて形成することができる。生じたペプチドは逆相クロマトグラフィーによって精製し、凍結乾燥することができる。
【００６０】
当業者に公知である任意の方法によって、ホスホアミノ酸、例えばホスホセリンをペプチドに導入することができる（例えばＧ．Ｋ．Ｔｏｔｈら（２００７年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１１巻：４０９〜４２６頁を参照）。一部の実施形態では、保護されたホスホアミノ酸類似体、例えばホスホセリンアミノ酸類似体は、固相の上にペプチドアセンブリーの一部として、例えばＦｍｏｃ−Ｓｅｒ［ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ］−ＯＨとして（Ｔ．  Ｗａｋａｍｉｙａら（１９９７年）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５巻：１３５〜１４５頁、１９９７年）、またはＦｍｏｃ−Ｓｅｒ［ＰＯ（Ｏアリール／アルキル）２］−ＯＨとして（Ｇ．Ｋ．Ｔｏｔｈら（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１巻：４０９〜４２６頁）導入することができる。別の実施形態では、保護されたアミノ酸類似体、例えば保護されたセリンアミノ酸類似体は、固相の上にペプチドアセンブリーの一部として導入することができる（例えばヒドロキシル側鎖のためのトリチル保護を有するＦｍｏｃ保護セリン）。ペプチド鎖の完全なアセンブリーの後、Ｓｅｒ［Ｔｒｔ］またはＳｅｒ［ＳｉＭｅ２ｔＢｕ］を選択的に脱保護することができ、ホスホラミダイト／酸化手法を用いてリン酸基を導入することができる（Ｇ．  Ｓｈａｐｉｒｏら（１９９４年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ３５巻：８６９〜８７２頁、Ｐ．  Ｈｏｒｍｏｚｄｉａｒｉら（１９９６年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３７巻：８２２７〜８２３０頁）。他の実施形態では、前記のようにセリン／トレオニンキナーゼまたはチロシンキナーゼを用いて、化学的に生成されたペプチドをリン酸化することができる。
【００６１】
ペプチドは、遊離塩基の形で、または薬学的に許容されるその塩として、作製し、単離し、または用いることができる。塩の例には、ペプチドの酢酸塩、塩化物、硫酸塩およびリン酸塩が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
ペプチドおよびＧＣ−Ｃ受容体アゴニストの組成物
別の態様では、単独または併用のペプチドを、任意の薬学的に許容されるキャリアまたは媒体と組み合わせることができる組成物が提供される。患者に投与されるとき、有害であるか、アレルギー性であるか、他の望ましくない反応を起こさない材料とペプチドを組み合わせることができる。用いられるキャリアまたは媒体には、溶媒、分散剤、コーティング、吸収促進剤、制御放出剤、および１つまたは複数の不活性の賦形剤（デンプン、ポリオール、造粒剤、微結晶性セルロース（例えば、ｃｅｌｐｈｅｒｅ、Ｃｅｌｐｈｅｒｅ  ｂｅａｄｓ（登録商標））、希釈剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などが含まれる）などを含むことができる。所望により、開示される組成物の錠剤投薬量は、標準の水性または非水性の技術によってコーティングされてもよい。
【００６３】
薬学的に許容されるキャリアおよび薬学的に許容される不活性のキャリアとして用いる賦形剤ならびに前述のさらなる成分の例には、それらに限定されないが、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、抗微生物剤およびコーティング剤が含まれる。
【００６４】
本明細書で用いるように、用語「結合剤」は、本発明の実施で用いることができる任意の薬学的に許容される結合剤を指す。薬学的に許容される結合剤の非限定例には、デンプン（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプンおよびアルファ化デンプン（例えば、ＳＴＡＲＣＨ  １５００（登録商標）およびＳＴＡＲＣＨ  １５００  ＬＭ（登録商標）、Ｃｏｌｏｒｃｏｎ，Ｌｔｄ．から販売）および他のデンプン）、マルトデキストリン、ゼラチン、天然ならびに合成ゴム、例えばアカシア、トラガント末、グアーガム、セルロースおよびその誘導体（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ヒプロメロース）、エチルセルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、粉末セルロース、微細セルロース（ｍｉｃｒｏｆｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、微結晶性セルロース（例えば、ＡＶＩＣＥＬ（商標）、例えばＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０１（商標）、−１０３（商標）および１０５（商標）、ＦＭＣ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｒｃｕｓ  Ｈｏｏｋ、ＰＡ、ＵＳＡから販売））、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（例えば、ポリビニルピロリドンＫ３０）、ならびにその混合物が含まれる。
【００６５】
薬学的組成物で特に用いることができる結合剤の例には、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、デンプン、マルトデキストリンまたはセルロースエーテル（例えばメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース）が含まれる。
【００６６】
本明細書で用いるように、用語「充填剤」は、本発明の実施で用いることができる任意の薬学的に許容される充填剤を指す。薬学的に許容される充填剤の非限定例には、タルク、炭酸カルシウム（例えば、粒剤または粉末）、第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、硫酸カルシウム（例えば、粒剤または粉末）、微結晶性セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０１またはＣｅｌｐｈｅｒｅ  ＣＰ−３０５）、微細セルロース、粉末セルロース、デキストレート、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、デンプン（例えば、Ｓｔａｒｃｈ  １５００）、アルファ化デンプン、ラクトース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、トレハロース、ショ糖、マルトース、イソマルト、ラフィノース、マルチトール、メレチトース、スタキオース、ラクチトール、パラチナイト、キシリトール、ミオイノシトールおよびその混合物が含まれる。
【００６７】
ペプチドをコーティングするために特に用いることができる薬学的に許容される充填剤の非限定例には、タルク、微結晶性セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０１またはＣｅｌｐｈｅｒｅ  ＣＰ−３０５）、粉末セルロース、デキストレート、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、デンプン、アルファ化デンプン、ラクトース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、トレハロース、ショ糖、マルトース、イソマルト、第二リン酸カルシウム、ラフィノース、マルチトール、メレチトース、スタキオース、ラクチトール、パラチナイト、キシリトール、マンニトール、ミオイノシトールおよびその混合物が含まれる。
【００６８】
本明細書で用いるように、用語「添加剤」は、任意の薬学的に許容される添加剤を指す。薬学的に許容される添加剤には、それらに限定されないが、崩壊剤、分散添加剤、潤滑剤、流動促進剤、抗酸化剤、コーティング添加剤、希釈剤、界面活性剤、着香添加剤、湿潤剤、吸収促進添加剤、制御放出添加剤、固化防止添加剤、抗菌剤（例えば、保存剤）、着色剤、乾燥剤、可塑剤および色素が含まれる。本明細書で用いるように、「賦形剤」は、任意の薬学的に許容される添加剤、充填剤、結合剤または剤である。
【００６９】
本発明の組成物は、他の治療成分、固化防止剤、保存剤、甘味剤、着色剤、着香剤、乾燥剤、可塑剤、色素、流動促進剤、接着防止剤、帯電防止剤、界面活性剤（湿潤剤）、抗酸化剤、フィルムコーティング剤などを任意選択で含むこともできる。製剤の安定性を保証するために、そのようないかなる任意選択の成分も、本明細書に記載される化合物と適合しなければならない。組成物は必要に応じて、例えばラクトース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、トレハロース、ショ糖、マルトース、ラフィノース、マルチトール、メレチトース、スタキオース、ラクチトール、パラチナイト、デンプン、キシリトール、マンニトール、ミオイノシトールなど、およびその水和物、ならびにアミノ酸、例えばアラニン、グリシンおよびベタイン、ならびにペプチドおよびタンパク質、例えばアルブミンを含む、他の添加剤を含むことができる。
【００７０】
組成物は、例えば、様々なさらなる溶媒、分散剤、コーティング、吸収促進添加剤、制御放出添加剤および１つまたは複数の不活性の添加剤（例えば、デンプン、ポリオール、造粒添加剤、微結晶性セルロース、希釈剤、潤滑剤、結合剤、崩壊添加剤などが含まれる）などを含むことができる。所望により、開示される組成物の錠剤投薬量は、標準の水性または非水性の技術によってコーティングされてもよい。組成物は、例えば、固化防止添加剤、保存剤、甘味添加剤、着色剤、着香剤、乾燥剤、可塑剤、色素などを含むこともできる。
【００７１】
適する崩壊剤には、例えば、寒天、炭酸カルシウム、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポビドン、ポラクリリンカリウム、グリコール酸デンプンナトリウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、他のデンプン、アルファ化デンプン、粘土、他のアルギン、他のセルロース、ゴムおよびその混合物が含まれる。
【００７２】
適する潤滑剤には、例えば、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、軽鉱油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、他のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、水素添加植物油（例えば、落花生油、綿実油、ヒマワリ油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル、寒天、サイロイドシリカゲル（ＡＥＲＯＳＩＬ  ２００、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ  Ｃｏ．、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）、合成石英の凝固エアゾール（Ｅｖｏｎｉｋ  Ｄｅｇｕｓｓａ  Ｃｏ．、Ｐｌａｎｏ、ＴＸ、ＵＳＡ）、発熱性二酸化ケイ素（ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ、Ｃａｂｏｔ  Ｃｏ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびその混合物が含まれる。
【００７３】
適する流動促進剤には、例えば、ロイシン、コロイド状二酸化ケイ素、三ケイ酸マグネシウム、粉末セルロース、デンプン、タルクおよび第三リン酸カルシウムが含まれる。
【００７４】
適する固化防止添加剤には、例えば、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、二酸化ケイ素、コロイド状二酸化ケイ素、タルクおよびその混合物が含まれる。
【００７５】
例えばペプチド組成物のための保存剤として用いることができる、適する抗微生物性添加剤には、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチルパラベン、セチルピリジニウム塩化物、クレゾール、クロロブタノール、デヒドロ酢酸、エチルパラベン、メチルパラベン、フェノール、フェニルエチルアルコール、フェノキシエタノール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、ソルビン酸カリウム、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、タイム（ｔｈｙｍｏ）およびその混合物が含まれる。
【００７６】
適する抗酸化剤には、例えば、ＢＨＡ（ブチル化ヒドロキシアニソール）、ＢＨＴ（ブチル化ヒドロキシトルエン）、ビタミンＥ、没食子酸プロピル、アスコルビン酸およびその塩またはエステル、トコフェロールおよびそのエステル、アルファ−リポ酸ならびにβ−カロテンが含まれる。
【００７７】
適するコーティング添加剤には、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、ゼラチン、医薬用釉薬、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルアセテートフタレート、セラック、ショ糖、二酸化チタン、カルナバワックス、微結晶性ワックスおよびその混合物が含まれる。適する保護コーティングには、Ａｑｕａｃｏａｔ（例えば、Ａｑｕａｃｏａｔエチルセルロース水性分散液、１５％ｗ／ｗ、ＦＭＣバイオポリマー、ＥＣＤ−３０）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｅ  ＰＯ  ＰＥ−ＥＬ、Ｒｏｅｈｍ  Ｐｈａｒｍａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）およびＯｐａｄｒｙ（例えばＯｐａｄｒｙ  ＡＭＢ分散液、２０％ｗ／ｗ、Ｃｏｌｏｒｃｏｎ）が含まれる。
【００７８】
特定の実施形態では、ペプチド組成物のための適する添加剤には、ショ糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、クロスポピドンまたはＢＨＡの１つまたは複数が含まれる。
【００７９】
本発明の組成物は、それらに限定されないが、Ｌ−ヒスチジン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒｓ（Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）およびＰｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８など）、アスコルビン酸、グルタチオン、透過性強化剤（例えば、脂質、コール酸ナトリウム、アシルカルニチン、サリチレート、混合胆汁酸塩、脂肪酸ミセル、キレート化剤、脂肪酸、界面活性剤、中鎖グリセリド）、プロテアーゼインヒビター（例えば、大豆トリプシンインヒビター、有機酸）、ｐＨ低下剤、および生物学的利用能の促進に有効な吸収強化剤（米国特許第６０８６９１８号および米国特許第５９１２０１４号に記載のものを含むがこれらに限定されない）、咀嚼錠のための材料（ブドウ糖、フルクトース、ラクトース一水和物、ラクトースおよびアスパルテーム、ラクトースおよびセルロース、マルトデキストリン、マルトース、マンニトール、微結晶性セルロースおよびグアーガム、ソルビトール結晶など）；非経口投与薬（マンニトールおよびポビドンなど）；可塑剤（セバシン酸ジブチル、コーティングのための可塑剤、ポリビニルアセテートフタレートなど）；粉末潤滑剤（ベヘン酸グリセリルなど）；軟質ゼラチンカプセル（ソルビトール特殊溶液など）；コーティングための球（糖球など）；球状化剤（ベヘン酸グリセリルおよび微結晶性セルロースなど）；懸濁／ゲル化剤（カラゲナン、ゲランゴム、マンニトール、微結晶性セルロース、ポビドン、グリコール酸デンプンナトリウム、キサンタンガムなど）；甘味料（アスパルテーム、アスパルテームおよびラクトース、ブドウ糖、フルクトース、蜂蜜、マルトデキストリン、マルトース、マンニトール、糖蜜、ソルビトール結晶、ソルビトール特殊溶液、ショ糖など）；湿式造粒剤（炭酸カルシウム、ラクトース無水物、ラクトース一水和物、マルトデキストリン、マンニトール、微結晶性セルロース、ポビドン、デンプンなど）、キャラメル、カルボキシメチルセルロースナトリウム、チェリークリーム着香剤およびチェリー着香剤、クエン酸無水物、クエン酸、粉砂糖、Ｄ＆Ｃレッド３３号、Ｄ＆Ｃイエロー１０号アルミニウムレーキ、エデト酸二ナトリウム、エチルアルコール１５％、ＦＤ＆Ｃイエロー６号アルミニウムレーキ、ＦＤ＆Ｃブルー１号アルミニウムレーキ、ＦＤ＆Ｃブルー１号、ＦＤ＆Ｃブルー２号アルミニウムレーキ、ＦＤ＆Ｃグリーン３号、ＦＤ＆Ｃレッド４０号、ＦＤ＆Ｃイエロー６号アルミニウムレーキ、ＦＤ＆Ｃイエロー６号、ＦＤ＆Ｃイエロー１０号、グリセロールパルミトステアレート、モノステアリン酸グリセリン、インジゴカルミン、レシチン、マニトール、メチルおよびプロピルパラベン、グリチルリジン酸一アンモニウム、天然および人工のオレンジ着香剤、医薬用釉薬、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８、ポリデキストロース、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリビドン、アルファ化コーンスターチ、アルファ化デンプン、赤色酸化鉄、サッカリンナトリウム、ナトリウムカルボキシメチルエーテル、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、イチゴ着香剤、合成黒色酸化鉄、合成赤色酸化鉄、二酸化チタンならびに白蝋を含む、他の賦形剤、作用物質およびそのカテゴリーを含むこ��もできる。
【００８０】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるペプチド、およびＭｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋またはＡｌ３＋、その組合せおよび／または立体障害型一級アミンから選択される１つまたは複数の安定化剤を含む薬学的組成物が提供される。さらなる実施形態では、作用物質はＭｇ２＋、Ｃａ２＋またはＺｎ２＋またはその組合せである。一部の実施形態では、それらに限定されないが、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、リン酸亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸マンガン、塩化マンガン、リン酸マンガン、硫酸マンガン、酢酸カリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸アルミニウム、塩化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムとしてカチオンが提供される。さらなる実施形態では、カチオンは、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸亜鉛、塩化マンガン、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたは塩化アルミニウムとして提供される。他の実施形態では、カチオンは、塩化カルシウム、塩化マグネシウムまたは酢酸亜鉛として提供される。
【００８１】
別の実施形態では、安定化剤は立体障害型一級アミンである。さらなる実施形態では、立体障害型一級アミンは、アミノ酸である。さらなる実施形態では、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。さらなる実施形態では、天然に存在するアミノ酸は、ヒスチジン、フェニルアラニン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、チロシン、トレオニン、イソロイシン、トリプトファン、グリシンおよびバリンからなる群から選択され、さらに、天然に存在するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、アラニンまたはメチオニンである。別の実施形態では、立体障害型一級アミンは、天然に存在しないアミノ酸（例えば、１−アミノシクロヘキサンカルボン酸）である。さらなる実施形態では、立体障害型一級アミンは、シクロヘキシルアミン、２−メチルブチルアミンまたはキトサンなどの重合アミンである。別の実施形態では、組成物で１つまたは複数の立体障害型一級アミンを用いることができる。
【００８２】
場合によっては、立体障害型一級アミンは、式：
【００８３】
【化７】
0005913115.tif 000011
を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルエーテル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオエーテル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボン酸、Ｃ１〜Ｃ６アルキルカルボキシルアミドおよびアルキルアリールから独立して選択され、任意の基がハロゲンまたはアミノによって単独でまたは多重に置換されてもよく、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の２つ以下がＨである。別の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１つしかＨでない。
【００８４】
他の実施形態では、薬学的に許容されるキャリア、ペプチド、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋またはＡｌ３＋から選択されるカチオン、またはその混合物、および立体障害型一級アミンを含む薬学的組成物が提供される。一実施形態では、カチオンはＭｇ２＋、Ｃａ２＋またはＺｎ２＋またはその混合物である。さらなる実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される結合剤および／または薬学的に許容される流動促進剤、潤滑剤、または流動促進剤および潤滑剤として作用する添加剤および／または抗酸化剤をさらに含む。一部の実施形態では、薬学的組成物はキャリアに塗布される。一部の実施形態では、キャリアは充填剤である。
【００８５】
一部の場合、キャリアに塗布される水溶液中のカチオン：立体障害型一級アミン：ペプチドのモル比は、５〜１００：５〜５０：１である。一部の場合、カチオン：立体障害型一級アミンのモル比は、２：１以上（例えば、５：１と２：１との間）であってよい。したがって、一部の場合、キャリアに塗布されるカチオン：立体障害型一級アミン：ペプチドのモル比は、１００：５０：１、１００：３０：１、８０：４０：１、８０：３０：１、８０：２０：１、６０：３０：１、６０：２０：１、５０：３０：１、５０：２０：１、４０：２０：１、２０：２０：１、１０：１０：１、１０：５：１または５：１０：１である。キャリアに塗布されるＧＣ−Ｃアゴニストペプチド溶液に結合剤、例えばメチルセルロースが存在する場合、それは０．５％〜２．５重量％（例えば、０．７％〜１．７％または０．７％〜１％または１．５％または０．７％）で存在することができる。
【００８６】
保管の間、ＧＣ−Ｃ受容体アゴニストポリペプチドの酸化生成物の形成を抑制するために、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋およびＡｌ３＋から選択されるカチオンが有用であることが分かっている。保管の間、ＧＣ−Ｃ受容体アゴニストポリペプチドのホルムアルデヒドイミンアダクト（「ホルムアルデヒドイミン生成物」）の形成を抑制するために、立体障害型一級アミンが有用であることも分かっている。したがって、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋またはＡｌ３＋から選択されるカチオン−例えば、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋から選択される二価のカチオン−および／または立体障害型一級アミン、例えばアミノ酸を含むＧＣ−Ｃ受容体アゴニストポリペプチド製剤は、薬剤の製造、保存および流通のために十分な貯蔵寿命（クロマトグラフィーによる純度および／または重量／重量アッセイによって測定される）を有する。さらに、立体障害型アミンだけの存在は、保管中のリナクロチドの加水分解生成物の形成を増加させることができるが、立体障害型一級アミンおよびカチオンの組合せ、例えばそれに限定されないがロイシンおよびＣａ２＋の組合せは、保管中のＧＣ−Ｃ受容体アゴニストポリペプチドの加水分解生成物ならびにＧＣ−Ｃ受容体アゴニストポリペプチドの酸化生成物の形成を抑制し、重量／重量アッセイおよび／またはクロマトグラフィーによる純度によって判定されるさらにより大きな全体的安定性をもたらす。
【００８７】
さらなる実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される結合剤もしくは添加剤、および／または薬学的に許容される流動促進剤、潤滑剤、または流動促進剤および潤滑剤として作用する添加剤、ならびに／または抗酸化剤をさらに含む。
【００８８】
本発明による適する薬学的組成物は、使用目的によって様々な最終濃度を与えるために、活性化合物（複数可）の量を無菌水溶液などの許容される医薬用希釈剤または賦形剤と一緒に一般に含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年）によって例示されるように、調製技術は一般に当技術分野で周知である。
【００８９】
胃腸障害の処置のために、本明細書に記載されるペプチドは、好ましくは経口的に、例えば所定量の有効成分を含む錠剤、カプセル、小袋、ペレット、ゲル、ペースト、シロップ、ボーラス、舐剤、スラリー、粉末、凍結乾燥粉末、粒剤として、水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、水中油型の液体乳濁液もしくは油中水型の液体乳濁液として、リポソーム製剤を通して（例えば欧州特許第７３６２９９号を参照）、またはなんらかの他の形で投与される。経口投与される組成物は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑性、界面活性または分散性の作用物質、着香剤および湿潤剤を含むことができる。錠剤などの経口投与される製剤は、任意選択でコーティングすることまたは刻みを付けることができ、その中の有効成分の徐放、遅延放出または制御放出を提供するように製剤化することができる。ペプチドは、それに限定されないが本明細書に記載される作用物質を含む、胃腸障害を処置するために用いられる他の作用物質と同時投与されてもよい。
【００９０】
別の態様では、適する薬学的組成物は、１つまたは複数の他の治療薬を含むことができる。そのような治療薬には、それらに限定されないが、鎮痛剤；プロトンポンプインヒビター、酸ポンプアンタゴニスト、Ｈ２受容体アンタゴニストを含む抗分泌剤；ＰＤＥ５インヒビター；ＧＡＢＡ−Ｂアンタゴニスト；胆汁酸隔離剤（ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔ）；運動促進剤（ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）および作動促進剤（ｐｒｏｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）；抗うつ薬；抗生物質；制吐剤；および粘膜保護剤が含まれる。
【００９１】
処置の方法
本発明の一部の実施形態では、胃腸障害のための処置方法が提供される。
【００９２】
一部の実施形態では、胃腸障害は上部ＧＩ障害である。さらなる実施形態では、障害はＧＰ、術後胃イレウス、機能性食道障害、機能性胃十二指腸障害、胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）、セリアック病、粘膜炎または十二指腸もしくは胃の潰瘍である。
【００９３】
一部の実施形態では、胃腸障害はＧＰである。さらなる実施形態では、ＧＰは特発性、糖尿病性または術後のＧＰである。
【００９４】
一部の実施形態では、胃腸障害は術後胃イレウスである。
【００９５】
一部の実施形態では、胃腸障害は機能性食道障害である。
【００９６】
一部の実施形態では、機能性食道障害は、機能性胸やけ、食道起源と推定される機能性胸痛、機能性嚥下障害または食道球（ｇｌｏｂｕｓ）である。
【００９７】
一部の実施形態では、胃腸障害は機能性胃十二指腸障害である。
【００９８】
一部の実施形態では、機能性胃十二指腸障害は、ＦＤ、おくび障害、吐き気もしくは嘔吐障害、または反芻症候群である。さらなる実施形態では、機能性胃十二指腸障害は、ＦＤである。一部の実施形態では、ＦＤは、食後愁訴症候群（ｐｏｓｔｐｒａｎｄｉａｌ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）または上腹部痛症候群である。一部の実施形態では、おくび障害は、空気嚥下または特徴付けられていない過度のおくび（ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ  ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ  ｂｅｌｃｈｉｎｇ）である。一部の実施形態では、吐き気もしくは嘔吐障害は、慢性特発性の吐き気、機能性嘔吐または周期性嘔吐症候群である。
【００９９】
一部の実施形態では、胃腸障害は胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）である。
【０１００】
一部の実施形態では、胃腸障害はセリアック病である。
【０１０１】
一部の実施形態では、胃腸障害は粘膜炎である。
【０１０２】
一部の実施形態では、胃腸障害は十二指腸または胃潰瘍である。
【０１０３】
本明細書に記載されるペプチドおよびアゴニストは、上部胃腸障害に関連する内臓痛、または本明細書に記載される別の障害に関連する疼痛の処置、予防または減少のために単独で、または併用療法で用いることができる。
【０１０４】
本明細書に記載されるＧＣ−Ｃ受容体アゴニストは、他の作用物質と併用投与することができる。例えば、ペプチドは鎮痛性のペプチドまたは化合物と投与することができる。鎮痛性のペプチドまたは化合物は本明細書に記載されるペプチドと共有結合させることができ、またはそれは併用療法で本明細書に記載されるペプチドと一緒にもしくは逐次的に投与される別個の作用物質であってもよい。本明細書に記載されるＧＣ−Ｃ受容体アゴニストは、抗うつ薬、作動促進もしくは運動促進剤、制吐剤、抗生物質、プロトンポンプインヒビター、酸遮断薬（例えば、ヒスタミンＨ２受容体アンタゴニスト）、酸ポンプアンタゴニスト、ＰＤＥ５インヒビター、ＧＡＢＡ−Ｂアゴニスト、胆汁酸隔離剤および粘膜保護剤を含む、上部ＧＩ障害を処置するために用いられる他の作用物質と併用投与されてもよい。
【０１０５】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドと用いることができる有用な鎮痛剤には、Ｃａチャネル遮断薬（例えば、ジコノチド）、５ＨＴ受容体アンタゴニスト（例えば、５ＨＴ３、５ＨＴ４および５ＨＴ１受容体アンタゴニスト）、５ＨＴ４アゴニスト（例えば、テガセロド（Ｚｅｌｎｏｒｍ（登録商標））、モサプリド、メトクロプラミド、ザコプリド、シサプリド、レンザプリド、ＢＩＭＵ１およびＢＩＭＵ８などのベンゾイミダゾロン誘導体およびリレキサプリド）、５ＨＴ１アゴニスト（例えば、スマトリプタンおよびブスピロン）、オピオイド受容体アゴニスト（例えば、ロペラミド、フェドトジン、エンケファリンペンタペプチド、モルヒネ、ジフェニルオキシレート、フラケファミド、トリメブチンおよびフェンタニル）、ＣＣＫ受容体アゴニスト（例えば、ロキシグルミドおよびデキスロキシグルミド）、ＮＫ１受容体アンタゴニスト（例えば、アプレピタント、ボホピタント、エズロピタント、Ｒ−６７３（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｌｔｄ）、ＳＲ−４８９６８およびＳＲ−１４０３３、（Ｓａｎｏｆｉ  Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ）、ＣＰ−１２２，７２１（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）、ＧＷ６７９７６９（Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）およびＴＡＫ−６３７（Ｔａｋｅｄａ／Ａｂｂｏｔ））、ＮＫ２受容体アンタゴニスト（例えば、ネパズタント、サレズタント、ＧＷ５９７５９９（Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ＳＲ−１４４１９０（Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ）およびＵＫ−２９０７９５（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ））、ＮＫ３受容体アンタゴニスト（例えば、オサネタント（ＳＲ−１４２８０１；Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ）、ＳＲ−２４１５８６およびタルネタント）、ノルエピネフリン−セロトニン再取込みインヒビター（ＮＳＲＩ）（例えば、ミルナシプラン）、バニロイドおよびカンナバノイド受容体アゴニスト、シアロルフィンおよびシアロルフィン関連のペプチドが含まれる。様々なクラスの鎮痛剤が文献に記載されている。
【０１０６】
一部の実施形態では、１つまたは複数の他の治療薬を本明細書に記載されるペプチドと併用してもよい。そのような治療薬には、抗うつ薬、作動促進もしくは運動促進剤、制吐剤、抗生物質、プロトンポンプインヒビター、酸遮断薬（例えば、ヒスタミンＨ２受容体アンタゴニスト）、酸ポンプアンタゴニスト、ＰＤＥ５インヒビター、ＧＡＢＡ−Ｂアゴニスト、胆汁酸隔離剤および粘膜保護剤が含まれる。
【０１０７】
抗うつ薬の非限定例には、アミトリプチリン（Ｅｌａｖｉｌ（登録商標））、デシプラミン（Ｎｏｒｐｒａｍｉｎ（登録商標））、イミプラミン（Ｔｏｆｒａｎｉｌ（登録商標））、アモキサピン（Ａｓｅｎｄｉｎ（登録商標））、ノルトリプチリンなどの三環系抗うつ薬；パロキセチン（Ｐａｘｉｌ（登録商標））、フルオキセチン（Ｐｒｏｚａｃ（登録商標））、セルトラリン（Ｚｏｌｏｆｔ（登録商標））およびシトラロプラム（Ｃｅｌｅｘａ（登録商標））などの選択的セロトニン再取込みインヒビター（ＳＳＲＩ）；ならびにドキセピン（Ｓｉｎｅｑｕａｎ（登録商標））およびトラゾドン（Ｄｅｓｙｒｅｌ（登録商標））などの他の作用物質が含まれる。
【０１０８】
作動促進および運動促進剤の非限定例には、イトプリド、オクトレオチド、ベタネコール、メトクロプラミド（Ｒｅｇｌａｎ（登録商標））、ドンペリドン（Ｍｏｔｉｌｉｕｍ（登録商標））、エリスロマイシン（およびその誘導体）およびシサプリド（Ｐｒｏｐｕｌｓｉｄ（登録商標））が含まれる。制吐剤の例にはプロクロルペラジンが含まれるが、これに限定されない。
【０１０９】
用いることができる抗生物質の例には、アモキシシリン、テトラサイクリン、メトロニダゾールまたはクラリスロマイシンなどの、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉによる感染を処置するために用いることができるものが含まれる。エリスロマイシンおよびその誘導体などの他の抗生物質を、本明細書に記載されるペプチドと併用することもできる。
【０１１０】
プロトンポンプインヒビターの非限定例には、オメプラゾール（Ｐｒｉｌｏｓｅｃ（登録商標））、エゾメプラゾール（Ｎｅｘｉｕｍ（登録商標））、ランソプラゾール（Ｐｒｅｖａｃｉｄ（登録商標））、パントプラゾール（Ｐｒｏｔｏｎｉｘ（登録商標））およびラベプラゾール（Ａｃｉｐｈｅｘ（登録商標））が含まれる。Ｈ２受容体遮断薬の非限定例には、シメチジン、ラニチジン、ファモチジンおよびニザチジンが含まれる。酸ポンプアンタゴニストの非限定例には、レバプラザン、ＣＳ−５２６（Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．（２００７年）３２３巻：３０８〜３１７頁）、ＰＦ−０３７１６５５６（Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．（２００９年）３２８巻（２号）：６７１〜９頁）、およびＹＨ１８８５（Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｐｏｓ．（２００１年）２９巻（１号）：５４〜９頁）が含まれる。
【０１１１】
ＰＤＥ５インヒビターの非限定例には、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、シルデナフィルクエン酸塩、タダラフィル、バルデナフィルおよびウデナフィルが含まれる。ＧＡＢＡ−Ｂアゴニストには、バクロフェンおよびＸＰ１９９８６（ＣＡＳレジストリ番号８４７３５３−３０−４）が含まれるが、これらに限定されない。胆汁酸隔離剤の非限定例には、ＧＴ１０２−２７９、コレスチラミン、コレセベラム、塩酸コレセベラム、ウルソデオキシコール酸、コレスチポール、コレスチラン、セベラマー、エピクロロヒドリンで架橋されるポリジアリルアミン、架橋デキストランのジアルキルアミノアルキル誘導体、およびＮ−（シクロアルキル）アルキルアミンが含まれる。粘膜保護剤の非限定例には、スクラルフェート（Ｃａｒａｆａｔｅ）、テプレノン、ポラプレ亜鉛、セトラキサートおよび次サリチル酸（ｓｕｂｓａｌｉｃｙｃｌａｔｅ）ビスマスが含まれる。
【０１１２】
それぞれは別々に製剤化、投与される２つ以上の作用物質、例えば本明細書に記載されるＧＣ−Ｃ受容体アゴニストおよび別の治療的なペプチドもしくは化合物を投与することによって、または単一の製剤の２つ以上の作用物質を投与することによって併用療法を達成することができる。他の組合せも、併用療法に包含される。例えば、２つの作用物質を一緒に製剤化し、第三の作用物質を含む別個の製剤と併用投与されてもよい。併用療法での２つ以上の作用物質は同時に投与されてもよいが、それらが同時投与される必要はない。例えば、第一の作用物質（または作用物質の組合せ）の投与は、数分、数時間、数日または数週、第二の作用物質（または作用物質の組合せ）の投与に先行することができる。したがって、２つ以上の作用物質は、互いに数分以内に、または互いに１、２、３、６、９、１２、１５、１８もしくは２４時間以内に、または互いに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４日以内に、または互いに２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０週以内に投与することができる。場合によっては、さらにより長い間隔は可能である。多くの場合、併用療法で用いられる２つ以上の作用物質が患者の体内に同時に存在することが望ましいが、これはそうである必要はない。
【０１１３】
投薬量
成人ヒトのための用量範囲は、本明細書に記載されるＧＣ−Ｃペプチドアゴニストの一般に経口で５μｇ〜１００ｍｇ／日であってよい。別々の単位で提供される錠剤、カプセルまたは他の提示形は、そのような投薬量で、または同量の複数回投与で有効な本明細書に記載される化合物の量を便利に含むことができ、例えば、単位は２５μｇ〜２ｍｇまたは約１００μｇ〜１ｍｇを含む。患者に処方される化合物の正確な量は、担当医師の責任である。しかし、使用される用量は、患者の年齢および性別、処置される正確な障害およびその重症度を含むいくつかの因子に依存する。
【０１１４】
様々な実施形態では、投薬単位は、１日の任意の時間に食物と一緒に、１日の任意の時間に食物と別に、一晩の絶食後に食物と一緒に（例えば朝食と一緒に）、低脂肪軽食の後の就寝時刻に投与される。特定の一実施形態では、投薬単位は食物消費（例えば、食事）の前か後に投与される。さらなる実施形態では、投薬単位は、食物消費の約１５分〜１時間前に投与される。様々な実施形態では、投薬単位は、１日に１回、１日に２回、１日に３回、１日に４回、１日に５回または１日に６回投与される。特定の実施形態では、投薬単位および日用量は同等である。
【０１１５】
本発明の併用療法の実施形態では、投薬単位中の２つ以上の有効成分の各々の正確な量は、各構成成分の所望の投薬量に依存する。したがって、特定の投与計画（例えば、投与のための特定数の単位および特定のタイミングを規定する投与計画）によって投与されるとき、患者が単一の構成成分だけで処置される場合に投与されるであろうのと同じ各構成成分の投薬量を送達する投薬単位を作製することが有用なことがある。他の状況では、患者が単一の構成成分だけで処置される場合に投与されるであろうそれ未満の１つまたは複数の構成成分の投薬量を送達する投薬単位を作製することが望ましいかもしれない。最後に、患者が単一の構成成分だけで処置される場合に投与されるであろうそれを超える１つまたは複数の構成成分の投薬量を送達する投薬単位を作製することが望ましいかもしれない。
【０１１６】
薬学的組成物は、有効成分および本明細書に記載される賦形剤を含むさらなる成分を含むことができるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、投薬単位の１つまたは複数の治療薬は、徐放型または制御放出製剤で存在することができ、追加の治療薬は徐放型製剤で存在することができない。例えば、本明細書に記載されるペプチドまたはアゴニストは、制御放出または徐放型製剤であることができるかできない別の作用物質と同じ投薬単位中に、制御放出製剤または徐放型製剤で存在することができる。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載される作用物質の１つまたは複数の即時放出、および１つまたは複数の他の作用物質の制御放出を提供することが望ましいかもしれない。
【０１１７】
本発明は、その特定の例示的な実施形態に関して記載された。しかし、上記の例示的な実施形態のそれら以外の特定の形で本発明を具現化することができることは、当業者に容易に明らかになる。これは、本発明の精神を逸脱しない範囲で実行することができる。例示的な実施形態は単に例証を示すだけであり、いかなる形であれ限定するものとみなすべきでない。本発明の範囲は、前の記載によるよりは、添付の請求項およびそれらの同等物によって定義される。
【実施例】
【０１１８】
本明細書に記載されるＧＣ−Ｃアゴニストペプチドまたは薬学的に許容されるその塩は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）による固相化学合成および自然な折畳み（空気酸化）によって調製した。ペプチドおよびそれらの配列は下に示す（ここで、アミノ酸配列は標準的な１文字コードであり、「ｐＳ」はホスホセリンである）。
【０１１９】
【化８】
0005913115.tif 000012
（実施例１）：ペプチド基質に対するアルカリ性および酸性ホスファターゼの影響
アルカリホスファターゼ反応のために、ペプチド原液を０．１Ｍトリス−  ＨＣｌ  ｐＨ８に１ｍｇ／ｍＬで調製し、アッセイを行うまで−２０℃で保存した。酸性ホスファターゼ反応のために、ペプチド原液を５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６に１ｍｇ／ｍＬで調製し、アッセイを行うまで−２０℃で保存した。
【０１２０】
アルカリホスファターゼ反応
子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡから得た。カタログ番号Ｍ０２９０Ｓ。ＣＩＰ反応溶液は、緩衝液（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０％グリセロール）による０．５単位／μＬへの希釈によって調製した。アルカリホスファターゼ反応溶液は、以下を含む２０μＬの量で組み立てた：
２μＬ  １０×ＣＩＰ緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、５００ｍＭトリス−  ＨＣｌ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２）
２μＬペプチド原液（１ｍｇ／ｍＬ）
１２μＬ  Ｈ２Ｏ
４μＬアルカリホスファターゼ（０、０．５または２単位）。
【０１２１】
反応溶液を静かに混合し、３７℃で９０分間インキュベートした。これらの反応溶液を、分析まで−２０℃で保存した。分析のために、反応溶液を７．５μＬのＣＩＰ処理ペプチドから５０μＬに０．１％ギ酸水溶液で希釈し、最終濃度は１０μＭであった。次に２０μＬの最終溶液を、下の表１に示す条件でＬＣＭＳによって分析した。
【０１２２】
酵素活性のために、ペプチドの代わりに１０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルリン酸を含む対照反応液を組み立てた。インキュベーションの後、反応液を０．１ｍＬの１００ｍＭホウ酸塩緩衝液ｐＨ９で希釈し、ｐ−ニトロフェノールの出現を監視するために、４０５ｎｍの吸光度で読みとった。
【０１２３】
酸性ホスファターゼ反応
ジャガイモ酸性ホスファターゼ（ＰｏＡＰ）をＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＳから得、カタログ番号Ｐ１１４６、ヒト前立腺の酸性ホスファターゼ（ＨｕＰｒＡＰ）をＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨから得た、カタログ番号１５３８７２。５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５、０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を用いて、酸性ホスファターゼを溶解して０．５単位ＡＰ／μＬを含む溶液を提供した。酸性ホスファターゼ反応液は、以下を含む２０μＬの量で組み立てた：
２μＬの１０×酸性ホスファターゼ緩衝液（５００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）
２μＬペプチド原液（１ｍｇ／ｍＬ）
１２μＬ  Ｈ２Ｏ
４μＬ酸性ホスファターゼ（０．５または２単位）。
【０１２４】
反応溶液を静かに混合し、３７℃で９０分間インキュベートした。反応溶液は、後の分析のために−２０℃で保存した。分析のために、７．５μＬの酸性ホスファターゼ反応液を０．１％ギ酸水溶液で５０μＬに希釈し、最終濃度は１０μＭであった。２０μＬの最終反応液を、下の表１に示す条件でＬＣＭＳによって分析した。酵素活性のための対照反応液を組み立て、ペプチドの代わりに１０ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸に希釈した。インキュベーションの後、反応液を０．１ｍＬの１００ｍＭホウ酸塩緩衝液ｐＨ９で希釈し、ｐ−ニトロフェノールの出現を監視するために、４０５ｎｍの吸光度で読みとった。
【０１２５】
【表１】
0005913115.tif 000013
アッセイのために用いた条件下で、０．５単位の子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ｐＨ８）、および０．５単位のジャガイモ酸性ホスファターゼまたはヒト前立腺の酸性ホスファターゼ（ｐＨ５）が、ｐ−ニトロフェニルリン酸を効率的に加水分解したことを表２および３は示す。
【０１２６】
ホスファターゼ処理へのペプチド１およびペプチド２の感受性は、ＬＣ−ＭＳによって反応生成物を分析することによって評価した。ｐＨ８で子ウシ腸アルカリホスファターゼがペプチド１およびペプチド２を効率的に脱リン酸化したことを表２および３は示す。アルカリホスファターゼと対照的に、ジャガイモ酸性およびヒト前立腺酸性ホスファターゼは、それらがｐ−ニトロフェニルリン酸を効率的に加水分解した条件下で、ペプチド１の脱リン酸化は非常に非効率的であった（表２）。ヒト前立腺酸性ホスファターゼは、ペプチド２の脱リン酸化でも非常に非効率的であった（表３）。
【０１２７】
別の対照として、ペプチド３を子ウシ腸アルカリホスファターゼの有り無しで処理し、生じた反応液をＬＣ−ＭＳによって分析した。ペプチド３は、ＣＩＰ処理の影響を受けなかった（データ示さず）。
【０１２８】
【表２】
0005913115.tif 000014
【０１２９】
【表３】
0005913115.tif 000015
（実施例２）：ＧＣ−Ｃ活性の分析のためのＴ８４細胞でのｃＧＭＰ蓄積
ｃＧＭＰアッセイのために、４．５×１０５細胞／ｍＬのＴ８４細胞を、２４穴組織培養プレートで一晩増殖させた。その翌日に、血清を含まない１ｍＬのＤＭＥＭ＋２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５）またはＤＭＥＭ＋５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８）でＴ８４細胞を２回洗浄した。２回目の洗浄の後、いかなるホスホジエステラーゼ活性も妨げるために、ｐＨ５またはｐＨ８の緩衝液中で細胞を４５０μＬの１ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）と３７℃で１０分間インキュベートした。次にペプチドを１０×濃度までｐＨ５またはｐＨ８緩衝液で希釈した。５０μＬのペプチド溶液をＴ８４細胞で５００μＬの最終容量まで希釈し、各ペプチド濃度を１×にした。各ペプチドについて１１ポイントの曲線解析を実行し、各アッセイで、最終ペプチド濃度を１００００、３０００、１０００、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１ｎＭで試験した。
【０１３０】
ｃＧＭＰの内因性レベルを判定するために用いられるペプチド対照はなかった。ペプチドは、３７℃で３０分間インキュベートされた。３０分後に上清を除去し、細胞を０．１Ｍ  ＨＣｌで溶解した。細胞は、氷上で３０分間溶解された。３０分後に溶解物をピペットでとり、９６穴ＨＰＬＣプレートに入れ、あらゆる細胞片を除去するために、１０，０００×ｇで１０分間遠心回転させた。前の遠心回転からの上清を取り出し、新しい９６穴ＨＰＬＣプレートに入れた。より良いクロマトグラフィーのために試料を中和するために、試料を等量の１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７）で希釈した。０．１Ｍ  ＨＣｌで２×ｃＧＭＰ標準曲線を調製し、次に等量の１Ｍ酢酸アンモニウムで希釈し、以下の最終濃度１０２４、５１２、２５６、１２８、６４、３２、１６、８、４、２、１ｎＭを与えた。
【０１３１】
ｃＧＭＰ濃度は、表４のＬＣ／ＭＳ条件および計算された標準曲線を用いて各試料から決定された。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで生成された濃度反応曲線から、ＥＣ５０値が計算された。
【０１３２】
【表４】
0005913115.tif 000016
ｐＨ５においてヒトＴ８４細胞でｃＧＭＰ合成を刺激するペプチド１およびペプチド２およびそれらの脱リン酸化型の能力は、細胞をペプチドとインキュベートし、その後、蓄積された細胞内ｃＧＭＰをＬＣ−ＭＳによって測定することによって試験された。ペプチド１およびペプチド２が、ｐＨ５でｃＧＭＰ合成を刺激することにおいてペプチド３のそれに類似した能力を有することを、表５は示す。しかし、脱リン酸化されたペプチド１およびペプチド２は、Ｔ８４アッセイでペプチド３より能力が低かった。
【０１３３】
【表５】
0005913115.tif 000017
ペプチド５およびペプチド６へのＴ８４細胞のｃＧＭＰ応答も、上記のものと同様に２反復で測定された。ペプチド５のｐＨ５のＥＣ５０は１４．７ｎＭで、ペプチド６のｐＨ５のＥＣ５０は３９．２ｎＭであった。
【０１３４】
（実施例３）：Ｔ８４細胞への競合的ラジオリガンド結合
アメリカ基準株保存機構（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）からの完全なヒトＴ８４細胞を競合的ラジオリガンド結合実験のために用いた。Ｔ８４細胞は、ダルベッコの改変イーグル培地：ハムのＦ−１２  ５０／５０培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）＋５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で、６０〜７０％集密度までＴ−１５０プラスチックフラスコで単層で増殖させた。細胞スクレーパーによる弱い掻きとりによって細胞を収穫し、４℃での１０分間の２０００ｇでの遠心によって細胞を収集した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に静かに再懸濁し、上記のような遠心によってそれらを収集することによって細胞を２回洗浄した。
【０１３５】
１００マイクログラム（１００μｇ）のＮＴＦＹＣＣＥＬＣＣＮＰＡＣＡＧＣＹ（エンテロトキシンＳＴｐ；Ｂａｃｈｅｍ  Ｈ−６２４８）を０．５ｍＬの水に溶解することによって［１２５Ｉ］−ＳＴｐラジオリガンドを調製し、（Ｍａｒｃｈａｎｏｌｉｓ，  Ｊ．Ｊ．、「Ａｎ  ｅｎｚｙｍｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｃｅ  ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．１９６９年、１１３巻、２９９〜３０５頁）に挙げられているラクトペルオキシダーゼ法を用いるヨウ素化のために、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒのＬｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎ．Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に送った。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒは、１０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ５．８で事前に平衡させたＷａｔｅｒｓのＣ−１８μＢｏｎｄａｐａｋカラム（２５ｃｍ）を用いて、ＨＰＬＣによって標識トレーサを精製した。０〜２５％アセトニトリルの勾配を６０分間でカラムに適用し、続いてさらに２０分間、２５％アセトニトリルで定組成溶離させた。この方法は、２つのモノヨード化形を互いから、および非標識の前駆体から分離した。６４分後に溶出し第四チロシンのヨウ素化に対応した第二のモノヨード化ピーク（ピーク２）を、標識トレーサとしてアッセイで用いた。標識トレーサは、２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性を有した。到着後、トレーサを小分けして−２０℃で保存した。
【０１３６】
結合反応液は、以下を含む０．２ｍＬで２反復で組み立てた：２．５×１０５のＴ８４細胞（０．２５ｍｇタンパク質）、２００，０００ｃｐｍの［１２５Ｉ］−ＳＴｐ（４１ｆｍｏｌ、２００ｐＭ）、０．１〜３，０００ｎＭの競合体、および０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。結合アッセイは、ＤＭＥＭ／２０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）中で、ｐＨ５．０で実行した。ｐＨ８．０の結合アッセイは、ＤＭＥＭ／２０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）／５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムで実行した。対照反応は、競合体（全体）または細胞を含まなかった。
【０１３７】
緩衝溶液を先ず調製し、次にプロテアーゼのないＢＳＡを０．５％まで加えた。ラジオリガンドを、０．００１μＣｉ／μＬの最終濃度まで加えた。５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０に１ｍｇ／ｍＬにペプチドを溶解することによって、競合体ペプチドの保存溶液を調製した。分析証明書で提供されるペプチド分子量から、濃度を計算した。結合反応（２０×競合体）で試験されるペプチドの最終濃度の２０倍を含んでいる競合体希釈溶液を、ｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸ナトリウムで作製した。
【０１３８】
結合反応液は、以下の順序で組み立てられた：
ｉ．緩衝溶液中のラジオリガンドおよびＢＳＡ
ｉｉ．２０×競合体の１０μＬ
ｉｉｉ．Ｔ８４細胞
結合反応液を静かに混合し、３７℃で１時間インキュベートした。真空濾過を用いて結合反応液を２．５ｃｍワットマンＧＦ／Ｃグラスファイバーフィルター（ＰＢＳ中の１％ポリビニルピロリドンで前処理される）に加えることによって、遊離のラジオリガンドからの膜結合体の分離を実行した。フィルターを５ｍＬの氷冷ＰＢＳ緩衝液で２回リンスし、捕捉されたラジオリガンドの測定をシンチレーションカウンターで行った。過剰な競合体（１μＭ）を含んだ反応液からの結合した放射能を、各試料の結合した放射能から引くことによって特異的な結合の判定を行った。競合的ラジオリガンド結合曲線の生成は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて行い、非線形回帰でデータを分析して、５０％ラジオリガンド結合をもたらした競合体の濃度（ＩＣ５０）を計算した。各競合体の見かけの解離平衡定数（Ｋｉ）は、（ＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆ、（１９７３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２巻（２３号）３０９９〜３１０８頁）の方法を用いて、ＩＣ５０値、およびラジオリガンドの解離定数の前に決定された推定値、Ｋｄ約１５ｎＭから得られた。アッセイで用いられた２００ｐＭのラジオリガンド濃度は、その解離定数と比較して非常に小さく、計算されたＩＣ５０値およびＫｉ値（表５）は実質的に同一であった。
【０１３９】
【表６】
0005913115.tif 000018
ペプチド１およびペプチド２が、ｐＨ５での結合においてペプチド３のそれに類似した能力を有することを、表６は示す。しかし、脱リン酸化されたペプチド１およびペプチド２は、結合アッセイでＧＣ−Ｃに対してペプチド３よりも低い親和性を有する。
【０１４０】
（実施例４）：マウスでの胃腸管輸送
アッセイの目的は、マウスでグアニル酸シクラーゼＣアゴニストペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの胃腸管輸送に及ぼす影響を試験することであった。経口投与されたグアニル酸シクラーゼＣアゴニストは、マウスで炭食事の進行距離の百分率を増加させることが実証された。
【０１４１】
アッセイのために、重さ２５〜３０ｇの雌ＣＤ−１マウス（１群につきｎ＝１０）を一晩絶食させ、水は無制限に与えた。活性炭（２０ｇ；１００メッシュ；Ｓｉｇｍａカタログ番号２４２２７６）を２００ｍＬのアラビアゴムに懸濁させ（１００ｍｇ／ｍＬ）、少なくとも１時間撹拌した。試験ペプチドは、２０ｍＭトリスｐＨ６．９のビヒクルで調製された。
【０１４２】
試験ペプチドおよびビヒクルは、経口栄養法によって２００μＬ用量で投与した。試験ペプチドの投与から７分後に、２００μＬの炭／アラビアゴム懸濁液を経口栄養法によって投与した。１５分後に、ＣＯ２過剰投与によってマウスを屠殺した。胃腸管を、食道から盲腸まで取り出した。小腸の全長を、幽門接合部から回腸盲腸接合部まで測定した。炭の進行距離を、幽門接合部から炭先端まで測定した。進行距離（％）は、（炭進行距離／小腸の全長）ｘ１００で判定した。データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアプログラムに入力し、その後ボンフェローニ多重比較検定を用いてＡＮＯＶＡによって分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージを用いて、データのプロットおよびＥＤ５０も判定した。
【０１４３】
ＧＩ輸送に対するペプチド４、ペプチド１、ペプチド２、ペプチド１の脱リン酸化形およびペプチド２の脱リン酸化形の急性用量の用量依存的効果を、雌ＣＤマウスで判定した。小腸の全長の百分率で表される、７分後の炭先端の進行距離を用いて、ＥＤ５０値を計算した（表７）。
【０１４４】
【表７】
0005913115.tif 000019
マウスの上部ＧＩ輸送モデルで経口投与された場合、ペプチド１およびペプチド２の脱リン酸化形は、それらのそれぞれのペプチドと比較して低い能力を示したことを、表７は示す。
【０１４５】
（実施例５）：ラット腸ループでの液分泌
本明細書に記載されるＧＣ−Ｃアゴニストペプチドを野生型ラットの単離されたループに直接的に注射することによって、分泌に及ぼすＧＣ−Ｃアゴニストペプチドの影響を研究した。
【０１４６】
ラットの小腸で３つのループを外科的に結紮することによって、ループを隔離した。結紮ループの形成方法は、（Ｌｏｎｄｏｎら、１９９７年、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｇ９３〜１０５頁）に記載されたものに類似していた。ループは１〜３ｃｍの長さで大体に集中させた。ループに、ペプチド／ＧＣ−Ｃアゴニスト（０．１〜５μｇ）またはビヒクル（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５もしくはクレブスリンゲル、１０ｍＭグルコース、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＫＲＧＨ））の２００μｌを注射した。最高９０分の回復時間の後、ループを切り取った。その中に含まれる液の除去の前後に、各ループについて重量を記録した。各ループの長さも記録した。分泌に及ぼす本明細書に記載されるＧＣ−Ｃアゴニストペプチドの影響を判定するために、各ループの重さ対長さの比（Ｗ／Ｌ）を計算した。ループ液の容積も測定した。
【０１４７】
ラットの結紮された十二指腸ループでの液分泌の増加、ｐＨ上昇および重炭酸塩分泌の増加を示すデータを、図２および表８に示す。結紮されたラット十二指腸ループでの液蓄積の誘導に関して、ペプチド２がペプチド４のそれに類似した能力を有することを図２は示す。表８は、１ループにつき２．５μｇのペプチドを用いた、結紮されたラット十二指腸ループでの結果を提供する。
【０１４８】
【表８】
0005913115.tif 000020
（実施例６）マウス空腸ループ液でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ代謝
この試験の目的は、マウス空腸ループ液でのリン酸化ペプチドの安定性を判定することであった。ペプチド２、脱リン酸化ペプチド２（デホスホペプチド２）、ペプチド３および同位体標識ペプチド２を試験で用いた。同位体標識ペプチド２は、１３Ｃ、１５Ｎ標識アラニンおよびロイシンで（すなわち、配列ＣＣｐＳ［１３Ｃ６、１５Ｎ］ＬＣＣＮＰ［１３Ｃ６、１５Ｎ］ＡＣＴＧＣで）合成された。
【０１４９】
各ペプチドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．によって合成され、−２０℃で乾燥保存された。マウス腸ループ液アッセイを行う直前に、非標識ペプチドの各々のための１ｍｇ／ｍＬ溶液を、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス−ＨＣｌ）、ｐＨ８で調製した。１３Ｃ、１５Ｎ標識ペプチド２の５００ｎｇ／ｍＬ溶液を０．１％ギ酸水溶液で調製し、アッセイ後ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために空腸試料を希釈するために利用した。
【０１５０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでペプチド２、デホスホペプチド２およびペプチド３の代謝を研究するために、マウスの小腸で結紮したループから抽出されたマウス空腸液中でペプチドをインキュベートした。液を収集するために、水を自由摂取させながらマウスを一晩絶食させた。手術のために次にそれらをイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）で麻酔し、開腹して小腸を露出させた。胃の幽門括約筋から７ｃｍのところから始まる縫合で、長さ３〜４ｃｍの空腸ループを作製した。ループが形成されると、それらに２００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）を注射した。動物の腹壁および皮膚を次に縫合し、動物を３０分間回復させた。回復の後、動物を屠殺し、次にループを切り取り、中の液を回収して使用まで−８０℃で保存した。
【０１５１】
各ペプチドについて、１ｍｇ／ｍＬペプチド保存溶液の２５μＬを、１Ｍトリス−ＨＣｌの２５μＬおよび５００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．１ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を含む１０×の子ウシ腸のホスファターゼ（ＣＩＰ）緩衝液、ｐＨ８の２５μＬに加えた。マウス空腸ループ液の１７５μＬまたは対照反応のための１Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８緩衝液の１７５μＬを加えることによって、反応を開始した。各ペプチドの最終濃度は、１００μｇ／ｍＬであった。プレートシェーカーの上で反応液を連続的に混合し、３７℃に維持した。マウス腸のループ液を加えてから０、２、５、１０、２０、３０、６０、９０および１２０分後に２５μＬの一定量をとり、２５μＬの４℃の１２％トリクロロ酢酸に加えて反応を停止させた。希釈目的のために、０．１％ギ酸水溶液のさらなる２００μＬをこれらの反応液に加えた。次に、各試料の２０μＬをとり、内部標準１３Ｃ、１５Ｎ標識ペプチド２の５００ｎｇ／ｍＬを含む０．１％ギ酸水溶液の４８０μＬにそれを加えることによって、これらの試料をさらに希釈した。
【０１５２】
試料中のペプチド２、デホスホペプチド２およびペプチド３の濃度は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを備えたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  ＳＣＩＥＸ  ＡＰＩ  ４０００トリプル四重極質量分析計を用いて、全ての試料を分析した。多重反応監視（ＭＲＭ）モードで質量分析計を操作し、分解能は１．２Ｄａに設定した。各化合物の機器およびクロマトグラフィーのパラメータを、表９に要約する。
【０１５３】
【表９】
0005913115.tif 000021
Ａｎａｌｙｓｔバージョン１．４．２ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  ＳＣＩＥＸ）を用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータを処理した。各ペプチドの残留百分率を計算するために、ピーク面積比（内部標準ピーク面積に対する分析物のピーク面積の比）を用いた。
【０１５４】
図３は、３７℃のマウス空腸液および対照反応液（１Ｍトリス−ＨＣｌ）での１２０分間のインキュベーションの間に測定された、９時点でのペプチド２およびデホスホペプチド２およびペプチド３の残留百分率を示す。マウス空腸ループ液でのインキュベーションの後、ペプチド２の５．３％だけが１２０分後に残っていた。代謝産物、デホスホペプチド２がこの反応で形成され、最初の２０分間に濃度が上昇し、その後残り時間に緩やかな減少を示した。対照反応では、ペプチド２は代謝されず、デホスホペプチド２は形成されなかった。マウス空腸液でのインキュベーションの後、デホスホペプチド２の５．６％だけが１２０分後に残っていた。対照的に、デホスホペプチド２は対照反応では代謝されなかった。ペプチド３はマウス空腸液で速やかに代謝され、９０分後に検出されなかった。対照反応では、ペプチド３は代謝されなかった。
【０１５５】
ペプチド２、その代謝産物デホスホペプチド２およびペプチド３は、マウス空腸ループ液で代謝された。ペプチド２が３７℃のマウス空腸ループ液中でインキュベートされたとき、デホスホペプチド２の形成が観察された。デホスホペプチド２およびペプチド３は、マウス腸液でペプチド２よりも速く分解された。
【０１５６】
（実施例７）：ストレプトゾトシン（Ｓｔｒｅｐｏｚｏｔｏｃｉｎ）（ＳＴＺ）によって誘導された糖尿病ラットでの液体胃内容物排出
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）によって誘導された糖尿病ラットでの液体胃内容物排出（ＬＧＥ）に及ぼす経口栄養法によって投与されるペプチド２および３の影響を調査した。体重約３００ｇの成体雄ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ；ｎ＝６０）（Ｔａｃｏｎｉｃによって供給される）を、室温（２２℃）および光（１２：１２時間の明暗周期）の制御条件下で飼育し、食物および水を自由に摂取させた。１週間の順化期間の後、Ｉ型糖尿病を誘導するためのＳＴＺプロトコルを開始した。
【０１５７】
ＳＴＺ実験群（ｎ＝５０）の動物でＩ型糖尿病を誘導するために、クエン酸緩衝液に含まれるＳＴＺ（２０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射の日ごとの処方を、５日間投与した。対照群は、同じ注射計画表にわたって等量のビヒクル（ｎ＝１０）を受けた。全ての動物は、糖尿病を発症し／注射から回復するために、９週を与えられた。血糖レベルは、０日目のＳＴＺ注射から５日後（すなわち、６日目）、ならびに１、２および１０週後（すなわち、１０週目の初め−実験日）に監視した。血液が心臓から直接的にとられた液体胃内容物排出（ＬＧＥ）実験の日（１０週目の初め）以外は、血液試料は尾静脈からとられた。
【０１５８】
ＬＧＥ法は６群（ｎ＝１０／群）を含み、その５群は糖尿病であり、１群は糖尿病でなかった。ＬＧＥ実験の前に、食物は一晩控えられたが、水は胃内容物排出法を開始する２時間前に中止された。
【０１５９】
ペプチド３およびペプチド２は、０．１ｍｇ／ｍｌフェノールレッドを含む２０％ショ糖溶液のビヒクルで別々に溶解された。用いた化合物の薬剤用量（ｍｇ／ｋｇで）は、０．１（ペプチド２および３）、０．３および１．０（ペプチド２だけ）であった。ＬＧＥに対するそれらの影響を試験するために、次に１８ゲージ栄養針（長さ６ｃｍ）によって０．５ｍｌ容量の薬剤溶液を糖尿病動物または対照動物の胃に送達した。糖尿病の実験群の各動物は、鉄木化合物（ペプチド２または３）の単一の薬剤用量を受けた。非糖尿病群では、動物は類似した容量のビヒクル溶液だけを投与された。全ての動物は胃内容物排出が起こるために次に１５分間与えられ、その後、それらはイソフルランで安楽死させた。
【０１６０】
安楽死の後、開腹を通して胃を引き寄せ、各動物で下部食道括約筋および幽門括約筋のところで結紮した。次に、横隔膜での切開を通して心臓を露出させ、血液試料をとり、グルコースレベルをグルコメーターで調査した。次に胃を動物から切り取り、９５％エタノールを含む１０ｍｌ管で一晩保存した。次に、組織をホモジナイズし、遠心分離し（４０，０００ｇで３０分間を２回）、分光光度計（ＢｉｏＭａｔｅ  ３、Ｔｈｅｒｍｏｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．）で４１０ｎｍ波長での吸光度について上清を試験した。直ちに屠殺した動物の胃へのショ糖／フェノールレッド溶液の投与に由来する「ゼロ値」と結果を比較し、各群の「保持百分率」を判定するためにその胃を取り出した。
【０１６１】
１５分時点で屠殺した動物で保持される液体の百分率平均（±ＳＥＭ）に関して、データを分析した。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡおよびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ比較事後検定を用いて判定した。統計的有意性は、Ｐ＜０．０５で確立された。
【０１６２】
ＳＴＺ糖尿病動物および対照動物の空腹時グルコースレベルは、胃内容物排出実験当日に＞３００ｍｇ／ｄＬであった。ＳＴＺ糖尿病動物の全重量は、実験当日の非糖尿病動物よりかなり少なかった（平均約１５０ｇ）。両動物群は、ＳＴＺによる処置時に約３００ｇで開始した；無処置動物は、ＬＧＥ処置の前の１０週間に平均して１３０ｇ増えたが、ＳＴＺ糖尿病動物は絶食（平均約２８０ｇ）まで一定の重量（約３００ｇ）にとどまった。
【０１６３】
ＳＴＺによって誘導された糖尿病のラット（９週齢）のＬＧＥに及ぼすペプチド２および３の影響を判定するために実験を行った。ペプチド３の１つの用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）およびペプチド２の３つの用量を評価した。データ（図４）は、以下を示す。
【０１６４】
ＳＴＺによって誘導された糖尿病ラットは、対照ラットと比較して１５分間のビヒクル投与の後の液体食事の胃内容物排出の有意な遅れを示す（対照の４５．３４＋７．１％と比較して８８．２４＋７．１２％の滞留）。
【０１６５】
Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較事後検定によって計算されるように、ＳＴＺ糖尿病動物と対照との間のこの有意差は、ペプチド２およびペプチド３を投与された糖尿病動物にも拡張する。ペプチド２の場合、ビヒクル溶液だけを受けた糖尿病動物と比較して、より高い２つの用量（０．３および１．０ｍｇ／ｋｇ）はＬＧＥを有意に強化した。
【０１６６】
本試験の結果は、非糖尿病対照と比較してＳＴＺによって誘導された糖尿病動物（ビヒクルを与えられた）でＬＧＥの速度の有意な遅れがあったことを示す。さらに、事後の多重比較検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）を使用する一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）データは、ペプチド３（０．１ｍｇ／ｋｇ）またはペプチド２（０．３もしくは１．０ｍｇ／ｋｇ）を受けたものと比較して、ビヒクル溶液を経口投与されたＳＴＺ糖尿病動物の間で統計的有意差がＬＧＥに存在したことを示す。しかし、ビヒクル溶液だけを受けた非糖尿病対照との比較では、これらの前記の差は明らかでなかった。
【０１６７】
非糖尿病対照レベルのそれらへＬＧＥを回復させることにおいて、試験用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）でペプチド３が効果的であったことをこれらの観察は実証する。同様に、経口投与された用量０．３および１．０ｍｇ／ｋｇのペプチド２は、ＳＴＺによって誘導された糖尿病動物でＬＧＥを正常な対照のそれらへ回復させた。最も低い用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）で、ペプチド２はＬＧＥを正常な対照のそれらへ統計学的に有意に回復させなかったが、保持される液体の百分率の減少への視覚的傾向を結果は示した。
【０１６８】
他の実施形態
本開示で参照される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的および個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる特許または刊行物のいずれかでの用語の意味が、この開示で用いられる用語の意味と対立するならば、この開示での用語の意味が支配するものとする。さらに、上記の議論は、本発明の例示的な実施形態を開示および記載するだけである。当業者は、以下の請求項で定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そのような議論から、ならびに添付の図面および請求項から、そこに様々な変更、改変および変形を加えることが可能なことを容易に認識する。
【図１】
0005913115.tif 000024
【図３】
0005913115.tif 000025
【図４】
0005913115.tif 000026
【図２】
0005913115.tif 000027
【配列表】
0005913115000001.app