(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程（１）〜（３）を含む、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法：
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で好気培養する工程１、
（２）工程１の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して前記菌体を培養し、培養液にて３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を産生する工程２、
（３）工程２で得られる培養液から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程３。
【請求項２】
工程２にて得られる培養液１Ｌ当り、３ｇ以上の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が含まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
有機炭素源がグリセロールまたは廃グリセロールである請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記好塩菌がハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９９５）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年ピークオイルが叫ばれ、エネルギーのみならずケミカル・リファイナリーのバイオベース化、工業用原料の石油からバイオマスへの転換等が、焦眉の課題となっている。
【０００３】
３−ヒドロキシ酪酸は、人間では肝臓でアセチルＣｏＡから作られ、血中グルコース濃度が少ない時に脳のエネルギー源として使われること、また、腸内細菌の血中への転移を抑制することから（特許文献１）、輸液としての利用がなされている。また、生分解性プラスチックの原料にも使われている。
【０００４】
非特許文献１の「バイオリファイナリーの出発中間体として期待しうる３２化合物」には、３−ヒドロキシ酪酸
が、バイオリファイナリーの出発中間体の有望な化合物として挙げられており、今後その利用の拡大が大いに見込まれている。
【０００５】
３−ヒドロキシ酪酸の製造方法として、例えば本化合物がポリ−３−ヒドロキシブチレート（以下、本明細書においてＰＨＢと呼ぶことがある。）のモノマーであることから、ＰＨＢを各種菌体で製造した後、別途調整したリパーゼ等で分解し、モノマーである３−ヒドロキシ酪酸を得る方法（特許文献２）、突然変異体を用い、８．７ｇ／Ｌの３−ヒドロキシ酪酸を得る方法（非特許文献２）、遺伝子組換え手法を用い１２ｇ／Ｌの収量にて３−ヒドロキシ酪酸を得る方法（非特許文献３）等が知られている。
【０００６】
本発明者らは、商業的な屋外培養を行っても、他の菌の混入がほとんどないことが知られている微細藻類スピルリナの効率的な培養方法を検討していたところ、ある条件下では、特定の好塩菌が唯一の混入する菌として生育することを認めた。当該好塩菌そのものは、通常はｐＨ５〜１２程度の条件下の、高濃度のナトリウムを含む培地中でも良好に生育するため、好気発酵下であっても他のバクテリア等の混入が極めて起こりにくいことが推定された。そこで、当該好塩菌の各種の炭素源の資化性を検討していたところ、当該好塩菌の菌体内に著量のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）が蓄積していること明らかにしている（特許文献３）。
【０００７】
さらに、特許文献４では当該好塩菌のＰＨＡｓの産生について特化した調査が記載され、当該好塩菌が乳酸、酢酸等といった特定の物質の産生に関与することも知られている（特許文献４）。また、特定の属に属する菌体を培養し、その後、嫌気的な条件で菌体を約６時間かけて自己融解させることで、１１７ｇ／Ｌの収量にて３−ヒドロキシ酪酸を産生する方法も報告されている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平７−６１９２４号公報
【特許文献２】特開２０１０−１６８５９５号公報
【特許文献３】国際公開第２００９／０４１５３１号パンフレット
【特許文献４】特開２０１０−２７３５８２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】第１５回地球環境産業技術動向調査報告会資料−持続可能な発展を求めて−バイオリファイナリー産業の早期構築へ向けて（財）地球環境産業技術研究機構（ＲＩＴＥ）微生物研究グループ  湯川英明  平成１８年１月３１日
【非特許文献２】Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １０２，  Ｉｓｓｕｅ  １２，  Ｊｕｎｅ  ２０１１，  Ｐａｇｅｓ  ６７６６−６７６８  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｕ．  Ｕｇｗｕ，  ，  ，  Ｙｕｔａｋａ  Ｔｏｋｉｗａ  ａｎｄ  Ｔｏｓｈｉｏ  Ｉｃｈｉｂａ
【非特許文献３】Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２００７）  ７６：８１１-８１８  Ｑｉａｎ  Ｌｉｕ，  Ｓｈａｏ−Ｐｉｎｇ  Ｏｕｙａｎｇ，  Ａｈｌｅｕｍ  Ｃｈｕｎｇ，  Ｑｉｏｎｇ  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｇｕｏ−Ｑｉａｎｇ  Ｃｈｅｎ
【非特許文献４】三重保環研年報  第９号（通巻第５２号），２７−３２頁  ２００７年
【非特許文献５】Ｍｏｎｔｅｉｌ−Ｒｉｖｅｒａ  Ｆら．２００７  Ｊｕｎ  ２２；１１５４（１−２）：３４−４１  Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ
【非特許文献６】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ６５，  ３６３−３６８．  （１９９９）  Ｌｅｅ，  Ｓ．Ｙ．，  Ｌｅｅ，  Ｙ．，  Ｗａｎｇ，  Ｆ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は安価に、簡便で、且つ、高効率な３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法を提供することを主な目的とする。上記非特許文献６では、菌体を用いた３−ヒドロキシ酪酸の製造方法が開示されているものの、用いる菌体はＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓであり、当該菌体を溶解しながら３−ヒドロキシ酪酸を産生する方法である。従って、当該菌体の培養時に他の菌体が混入することに配慮をする必要があること、高価な培地を必要とすること、さらに、ＤＮＡやタンパク質などといった菌体由来の夾雑物が多く含まれる溶解液から、３−ヒドロキシ酪酸を精製する必要が有るという問題点を有している。
【００１１】
本願発明者は、特定の属に属する好塩菌を、無機塩と単一又は複数の有機炭素源を含む培地を用いて培養すれば、菌体内にＰＨＢを蓄積することを見いだしている（特許文献３）。ＰＨＢは、菌体内にエネルギー源や炭素源として蓄積されているため、好気条件においては、炭素源が枯渇し、エネルギー源が不足した場合、これらが分解され、解糖系、ＴＣＡサイクルを経て利用されていると想定された。しかしながら、微好気条件又は嫌気条件においては、これらがどのように作用しているかの報告は認められない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者は、斯様な背景のもとで鋭意研究を進めた結果、特定の属に属する好塩菌を、好気的な条件で培養することによって菌体内にＰＨＢを蓄積させた後、培養条件を微好気条件に変更することにより、菌体内でＰＨＢが分解して減少し、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が、菌体外の培地中にて産生することを見いだした。
【００１３】
上記のＰＨＢを蓄積するための培養は、バイオディーゼル（以下、本明細書でＢＤＦと呼ぶことがある。）廃液等を用いた培養、光合成できる微細藻類スピルリナ等との混合培養、及び他の細菌の混入が起こりにくい環境での培養が可能であることも見出した。
【００１４】
さらに、ＰＨＢから３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の産生は、特定の属に属する好塩菌体の一連の増殖と共に行われるため、培地の変更を伴わず、同じ培養槽を用い、培養条件を変更することだけで、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造が可能であることも明らかとなった。
【００１５】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、以下に示す３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法を広く包含するものである。
【００１６】
項１
下記の工程（１）〜（３）を含む、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法：
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で好気培養する工程１、
（２）工程１の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して前記菌体を培養し、培養液にて３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を生産する工程２、
（３）工程２で得られる培養液から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程３。
【００１７】
項２  工程２にて得られる培養液１Ｌ当り、３ｇ以上の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が含まれることを特徴とする上記項１に記載の方法。
【００１８】
項３  有機炭素源がグリセロールまたは廃グリセロールである上記項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【００１９】
項４  
前記好塩菌がハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９９５）である、上記項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【００２０】
以下に、本発明に係る製造方法の効果を示すが、下記のすべての効果を発揮する発明が本願発明にかかる製造方法ではなく、１以上の効果を有していればよい。
【００２１】
本発明に係る製造方法は、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を、培地中に著量、一部は菌体中に蓄積することができる。
【００２２】
本発明に係る製造方法は、ハロモナス属に属する好塩菌を培養する工程が含まれるが、斯かる好塩菌の培養は、他の細菌の混入が起こりにくい環境で培養することが可能であり、供気条件を変更も容易であることから優れた製造方法である。
【００２３】
本発明に係る製造方法において用いる好塩菌は、例えば、安価な無機塩に加え、バイオディーゼル生産に副生する廃グリセロール、エタノール発酵等の過程で生産される木材糖化液等を有機炭素源として単独で、又は他の有機炭素源と組み合わせて用いることが可能である。さらに、酵母細胞を用いたエタノール発酵において得られ、利用が難しいとされる五炭糖のキシロース、アラビノース等を有機炭素源として有効に利用することも可能である。
【００２４】
これらのことから、例えば現状の遺伝子組換えをしていない酵母細胞を用いた木材糖化液のエタノール発酵後の残渣（主にキシロールやアラビノースを含む）を有機炭素源として利用して、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産を行うことが可能である。
【００２５】
本発明に係る製造方法では、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を培地中にて生産することが可能である。培養液から３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を含む画分を簡便に回収することが可能であり、精製工程を行ったとしても、簡易な精製方法が適用できるため、優れた製造方法である。
【００２６】
この点に関して、本発明に係る製造方法では、ハロモナス属に属する好塩菌体の溶菌を伴わない条件にて３−ヒドロキシ酪酸又はその塩をその培養液中から回収することができるので、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を精製する際に、溶菌に伴う核酸、タンパク質、糖質、脂質等といった夾雑分子を除去するための精製工程が非常に簡便になるといった効果を有する。
【００２７】
本発明に係る製造方法によって得られる３−ヒドロキシ酪酸又はその塩は、医療用の輸液に添加したり、そのまま重合してプラスチックとするだけでなく、化粧品、医薬品、機能性食品等、光学活性を持った原料やリファイナリーとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を、グルコース、グリセロールを用い３３℃にて培養したときの菌体濁度ＯＤ６００（縦軸）と培養時間（横軸：ｈ）を調べたグラフである。凡例に示す「％」はすべて、「ｗ／ｖ％」を示す（以下、図２〜１０においても同じ）。グルコース、グリセロールともに計１０％の場合は、生育初期と培養後２４時間にそれぞれ５％の炭素源を、計１５％の場合は、生育初期と培養後２４時間、３６時間後にそれぞれ５％の炭素源を供給した。培養当初は、２００ｒｐｍで、好気的な条件で培養し、３６時間目に５０ｒｐｍの微好気条件に変更した。以下の条件は同じ培養時の分析値をグラフに示したものである。
【図２】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を、グルコース、グリセロールを用い３３℃にて培養したときに蓄積された乾燥菌体重量（縦軸：ｇ／Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。
【図３】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を、グルコース、グリセロールを用い３３℃にて培養したときに蓄積されたＰＨＢの割合（縦軸：ＰＨＢ／乾燥菌体（％））と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。
【図４】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を、グルコース、グリセロールを用い３３℃にて培養したときに蓄積されたＰＨＢの総量（縦軸：ｇ（ＰＨＢ）／Ｌ（培養液））と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。
【図５】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を、グルコース、グリセロールを用い３３℃にて培養したときに、上清中に蓄積された３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の上清中の割合（縦軸：３−ヒドロキシ酪酸又はその塩（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ）を調べたグラフである。
【図６】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株、ハロモナス・パンテラリエンシス（ＡＴＣＣ  ７００２７３）、並びにハロモナス・カンピサリス（ＡＴＣＣ  ７００５９７）を、グリセロール１０％を用い３３℃にて培養したときの菌体濁度ＯＤ６００（縦軸）と培養時間（横軸：ｈ）を調べたグラフである。培養当初は、２００ｒｐｍで、好気的な条件で培養し、４８時間目に５０ｒｐｍの微好気に変更した。以下の条件は同じ培養時の分析値をグラフに示したものである。
【図７】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株、ハロモナス・パンテラリエンシス（ＡＴＣＣ  ７００２７３）、並びにハロモナス・カンピサリス（ＡＴＣＣ  ７００５９７）を、グリセロール１０％を用い３３℃にて培養したときに蓄積された乾燥菌体重量（縦軸：ｇ／Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。
【図８】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株、ハロモナス・パンテラリエンシス（ＡＴＣＣ  ７００２７３）、並びにハロモナス・カンピサリス（ＡＴＣＣ  ７００５９７）を、グリセロール１０％を用い３３℃にて培養したときに蓄積されたＰＨＢの割合（縦軸：ＰＨＢ／乾燥菌体（％））と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。
【図９】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株、ハロモナス・パンテラリエンシス（ＡＴＣＣ  ７００２７３）、並びにハロモナス・カンピサリス（ＡＴＣＣ  ７００５９７）を、グリセロール１０％を用い３３℃にて培養したときに蓄積されたＰＨＢの総量（縦軸：ｇ（ＰＨＢ）／Ｌ（培養液））と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。
【図１０】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株、ハロモナス・パンテラリエンシス（ＡＴＣＣ  ７００２７３）、並びにハロモナス・カンピサリス（ＡＴＣＣ  ７００５９７）を、グリセロール１０％を用い３３℃にて培養したときに、上清中に蓄積された３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の上清中の割合（縦軸：３−ヒドロキシ酪酸（ｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ）を調べたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明に係る３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法は、ハロモナス属に属する好塩菌を用いた下記の工程（１）〜（３）を含む製造方法である。
【００３０】
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で好気培養する工程１、
（２）工程１の培養条件を好気培養から微好気培養に変更して前記菌体を培養し、培養液にて３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を生産する工程２、
（３）工程２で得られる培養液から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程３。
【００３１】
本発明に係る製造方法によって製造される３−ヒドロキシ酪酸又はその塩とは、生体内にて通常の光学活性を持った化合物であり、Ｄ体である。
【００３２】
また、３−ヒドロキシ酪酸の塩とは、製造時に使用するハロモナス属に属する好塩菌の培地中に含まれる成分に由来する陽イオンによって形成される塩であり、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等、マグネシウム塩、コバルト塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩等が挙げられる。
【００３３】
工程１について
本発明に係る３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法における工程１は、ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で好気培養する工程である。
【００３４】
＜Ａ：好塩菌＞
本発明の製造方法工程１にて用いる好塩菌は、下記の（i）又は（ii）のいずれかによって示されるハロモナス属に属する好塩菌を用いればよい。
（i）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて好気的に増殖し、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を菌体外の培地中に生産させることを特徴とする好塩菌。
（ii）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて好気的に増殖し、ＰＨＢを自らの菌体内にて蓄積した後、微好気条件下で３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を菌体外の培養液にて生産することを特徴とする好塩菌。
【００３５】
なお、「無機塩」及び「有機炭素源」については、＜培地＞の欄にて後述する。また、「微好気条件」については、下記工程２の＜培養方法＞の欄にて詳述する。
【００３６】
このようなハロモナス属に属する好塩菌は、酸化的代謝も嫌気的代謝も使い分けることができ、遊離酸素の存在の有無にかかわらず生存が可能で、且つ、遊離酸素の存在下のほうが生育し易い傾向となる、所謂、通性嫌気性菌の性質を有する菌体である。
【００３７】
上述のハロモナス属に属する好塩菌は、０．１〜１．０Ｍの塩濃度を適とする好塩性を有し、時には塩を含まない培地においても生育する細菌である。そして、上述のハロモナス属に属する好塩菌は、通常はｐＨ５〜１２程度の培地にて生育する。
【００３８】
上述のハロモナス属に属する好塩菌として、例えば、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＭ−１株が挙げられる。ハロモナス・エスピーＫＭ−１株は、平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３１６として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９９５である。当該ハロモナス・エスピーＫＭ−１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、ＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ４７７０１５として登録されている。
【００３９】
また、上述したようなハロモナス属に属する好塩菌の生育特性等に鑑みて、本発明に係る製造方法において用いる好塩菌として、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株以外に、ハロモナス・パンテラリエンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｐａｎｔｅｌｌｅｒｉｅｎｓｉｓ：ＡＴＣＣ  ７００２７３）、ハロモナス・カンピサリス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｉｓａｌｉｓ：ＡＴＣＣ  ７００５９７）等も挙げることができる。
【００４０】
さらに、１６ＳリボゾームＲＮＡ配列による分析から、上述のハロモナス属に属する好塩菌に限らず、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリア等も、本発明に係る製造方法にて用いるハロモナス属に属する好塩菌として使用してもよい。
【００４１】
なお、上述したハロモナス属に属する好塩菌には、遺伝子が導入されていてもよい。導入される遺伝子は、本発明に係る製造方法において、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産効率等を向上させる機能を発現させるものであれば特に限定されない。例えば、ＰＨＢの発現量を増大させる遺伝子、ＰＨＢの該菌体内への蓄積を上昇させる機能を発現させる遺伝子；３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を培養液にて生産する機能を増大させる遺伝子；３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の産生量を増大させる遺伝子；ＰＨＢを分解する遺伝子等が挙げられる。
【００４２】
これらの遺伝子のハロモナス属に属する好塩菌へ導入は、導入される遺伝子が当該菌体内で発現できる組換えＤＮＡを作成し、これを当該菌体に導入して形質転換することにより行なわれる。例えば当該菌体内で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に該遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に転写開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい。かくして得られる所望の組換えＤＮＡの当該菌体への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。
【００４３】
＜Ｂ：培地＞
工程１にて用いる培地は、無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源に追加した培地である。培地のｐＨは特に限定されないが、上述した好塩菌の生育条件を満たすｐＨであることが好ましく、具体的にはｐＨ５〜１２程度にすればよい。より好ましくはｐＨ８．８〜１２の培地である。アルカリ性の培地を用いれば、他の菌のコンタミネーションをより効果的に防止することができるので好ましい。
【００４４】
工程１にて用いる培地に配合する無機塩は、特に限定されることは無く、例えばリン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩、及びナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト等の金属塩が挙げられる。
【００４５】
例えば、ナトリウムを無機塩として用いる場合は、ＮａＣｌ、ＮａＮＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３等を用いればよい。
【００４６】
これらの無機塩は、上述の好塩菌にとって窒素源やリン源となるような化合物を用いることが好ましい。
【００４７】
例えば、窒素源として、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩等を用いればよく、より具体的には、ＮａＮＯ３、ＮａＮＯ２、ＮＨ４Ｃｌ等の化合物が用いればよい。
【００４８】
窒素源の使用量は、菌体の生育に影響を及ぼすことなく、本発明の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産目的が達成される範囲において適宜設定すればよく、具体的には、培地１００ｍｌあたり通常であれば硝酸塩として５００ｍｇ程度以上とすればよく、より好ましくは１０００ｍｇ程度以上、更に好ましくは１２５０ｍｇ程度以上である。
【００４９】
また、リン源としては、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等を用いればよく、より具体的には、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４等の化合物を用いればよい。
【００５０】
リン源の使用量も、上記の窒素源の使用量と同様の観点から適宜設定すればよく、具体的には、リン酸二水素塩として培地１００ｍｌあたり通常は５０〜４００ｍｇ程度とすればよく、より好ましくは１００〜２００ｍｇ程度である。
【００５１】
これらの無機塩は単一で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５２】
その他の化合物等も含めた無機塩は、総量で通常は０．１〜２．５Ｍ程度となる濃度で用いればよく、好ましくは０．２〜１．０Ｍ程度、より好ましくは０．２〜０．５Ｍ程度である。
【００５３】
工程１にて用いる培地に配合する有機炭素源は、特に限定はされないが、例えば、トリプトン、イーストエキストラクト、可溶性デンプン、六炭糖（グルコース、フラクトース）、五炭糖（キシロース、アラビノース）、二糖（スクロース）、糖アルコール（マンニトール、ソルビトール）、エタノール、ｎ−プロパノール、酢酸、酢酸ナトリウム、プロピオン酸、グリセロール、廃グリセロール等が挙げられる。
【００５４】
また、廃蜜糖、木材糖化液、若しくはその残渣も、上述の有機炭素源として用いることができる。中でも、製造方法にかかるコストを低減する観点から、廃グリセロール、廃蜜糖等が好ましい。これらの有機炭素源は、単一で使用してもよい、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５５】
本発明の廃グリセロールとは、植物、動物等に由来する油脂に、メタノール等のアルコールと、ＫＯＨ、ＮａＯＨ等のアルカリ触媒を添加し、６５℃程度の温度にて反応させて得られる、脂肪酸メチルエステルを主体とするバイオディーゼルの製造時に、副産物として得られるものである。
【００５６】
上記の廃グリセロールの組成は、バイオディーゼルの製造設備や、原料として用いる油脂の組成により異なり、特に限定されるものではない。例えば、非特許文献４に示されるように、グリセロール濃度がおよそ３０〜６５％程度で、上記のアルカリ触媒をおよそ４〜７％程度含有し、ｐＨは１０〜１２程度の廃グリセロールが挙げられる。また、上記の廃グリセロールには、得られるバイオディーゼルを洗浄する際に用いられる水が含まれている。
【００５７】
上述の有機炭素源の使用量は、使用する有機炭素源の種類により区々ではあるが、通常は培地に対して終濃度が、通常１〜２０％ｗ／ｖ程度となる量で使用すればよい。
【００５８】
中でも、有機炭素源として廃グリセロールを用いる場合、その使用量は、培地に対して終濃度が通常１〜２０ｗ／ｖ％程度とすればよく、好ましくは１０〜１５ｗ／ｖ％程度である。
【００５９】
本発明に係る製造方法では、塩濃度が比較的高い条件の培地で、ハロモナス属に属する好塩菌を培養するため、他の菌体の混入の恐れがほとんどないので、上述の培地に対して滅菌処理等を行う必要も無く、簡便な設備で培養することも可能である。
【００６０】
＜Ｃ：培養方法＞
工程１における上述のハロモナス属に属する好塩菌の培養は、好気培養を採用する。工程１における好気培養は、当該菌体が増殖し、且つ、該菌体内にＰＨＢが著量蓄積するような条件となる好気培養である限り、特に限定はされないが、例えば、５ｍｌ程度の培地に当該好塩菌を植菌し、通常３０〜３７℃程度、攪拌速度は１２０〜１８０ｒｐｍ程度で１晩振盪しながら前培養を行う。
【００６１】
続いて前培養して得られた菌体を、三角フラスコ、発酵槽、ジャーファーメンター等に入った培地中に１００倍程度に希釈し本培養する。本培養は通常２０〜４５℃程度で可能であるが、３０〜３７℃程度で行うことが好ましい。この際の攪拌速度は通常は１５０〜２５０ｒｐｍ程度とすればよい。なお、培養環境は培地が空気に触れる環境とすればよく、培養液表面に積極的に酸素を含む気体を吹き付ける方法や培地中に斯かる気体を吹き込む方法を採用してもよい。
【００６２】
工程１では、このような培養条件でハロモナス属に属する好塩菌を好気培養すればよい。具体的に好気培養時の培養液中の溶存酸素濃度は、特に限定はされないが、通常は２ｍｇ／Ｌ以上とすればよい。
【００６３】
工程１での培養方法は、回分培養、半回分培養、連続培養等の培養方法が挙げられ、特に限定はされないが、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を効率よく製造するには、本発明に係る方法によって用いる好塩菌が他の菌が混入する可能性が極めて低いことを考慮すれば、回分培養又は半回分培養が好ましい。
【００６４】
工程２について
本発明に係る３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法における工程２は、上記工程１の終了後、前記菌体を微好気培養して、培養液にて３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を生産する工程である。
【００６５】
ここで、「培養液にて３−ヒドロキシ酪酸を生産する」とは、工程１にて培養して得られたハロモナス属に属する好塩菌体から、培養液に３−ヒドロキシ酪酸を分泌することを意味し、「培養液にて３−ヒドロキシ酪酸の塩を生産する」とは、培養液に分泌された３−ヒドロキシ酪酸が、培養液中に存在する上述の陽イオン成分と反応して、３−ヒドロキシ酪酸の塩を形成することを意味する。
【００６６】
工程２では、培養条件を微好気条件に変更しさえすればよく、工程１にて得られるＰＨＢを菌体内に蓄積したハロモナス属に属する好塩菌を回収して、新たな培地にて培養しても、培地を変更せずにそのまま培養条件を微好気条件に変更しても、工程１の終了時に新たな培地を追加して、培養してもよい。
【００６７】
工程１の好気培養を終了し、工程２の微好気培養に培養条件を変更する時期は、工程１にて得られるハロモナス属に属する好塩菌体内に蓄積されるＰＨＢの量が最大となる時期が好ましい。ここで、最大となる時期とは必ずしも一点の時期に限定されることは無く、当該菌体内におけるＰＨＢの蓄積量が最大値の通常６０％以上となる時期に、培養条件を微好気培養に変更すればよい。なお、当該菌体内のＰＨＢの量は、後述する実施例に記載の方法を採用して算出すればよい。
【００６８】
＜Ｄ：培養方法＞
工程２における微好気培養とは、培地中又は培養環境を完全に嫌気条件下にするのではなく、積極的に酸素の通気を行わない方法で培養することである。
【００６９】
このような微好気条件での培養方法は、特に限定はされないが、例えば培地表面が空気に触れる状態で、攪拌速度を１００ｒｐｍ以下、望ましくは５０ｒｐｍ以下にて培養する方法が挙げられる。なお、撹拌を完全に止めてしまうことは、培養液中の溶存酸素が速やかに消失してしまうことから、工程２において好ましくない。このとき、培養液中の溶存酸素濃度は、特に限定はされないが、通常は２ｍｇ／Ｌ以下とすればよい。ここで、培養液中に溶存する酸素が全く存在しない条件とすれば、ハロモナス属に属する好塩菌が速やかに溶菌するので、工程２において好ましくない。
【００７０】
工程２において、工程１によって得られるＰＨＢを菌体内に著量蓄積したハロモナス属に属する好塩菌を微好気培養することによって、当該好塩菌は死滅すること無く培養される。
【００７１】
なお、当該好塩菌の死滅を確認するには、当該菌体の死滅に基づく菌体から培養液に溶出するＤＮＡの有無を判断すればよく、例えば、当該好塩菌の培養液上清を分光光度計で測定することにより、ＤＮＡに基づく２６０ｎｍ付近に吸光の顕著なピークが存在しないことによって確認すればよい。
【００７２】
また、他の手法としては、ハロモナス菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ配列に特異的なＰＣＲプライマー（例えば８３２Ｆ：配列番号１、１０１６Ｒ：配列番号２等）を用い（増幅長さは１８４ｂｐ）、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて上清中のゲノムＤＮＡ濃度を測定することにより確認してもよい。
【００７３】
上述のような方法を用いた微好気条件における培養液中のＤＮＡ量は、微好気条件での培養の開始から、おおよそ７２時間までの間では、通常０．５〜２．５ｍｇ／Ｌ程度となる。
【００７４】
即ち、工程２では上述のような培養液中におけるＤＮＡ量となるような条件にてハロモナス属に属する好塩菌を培養すればよく、このような培養液中におけるＤＮＡ量となる培養条件を、本発明における微好気条件を満たすことの、ひとつの目安となる。
【００７５】
培養時間は、培地に用いる無機塩、有機炭素源などといった培地の条件により異なるが、後述するような所望の量の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が回収できるのに十分な時間の培養時間とすればよく、特に限定はされないが、上述のように微好気培養に変更した後に、培養液中に放出されるハロモナス属に属する好塩菌の溶菌に伴う核酸、タンパク質、等を除去する精製工程を簡便にすること、すなわち、培養液中のＤＮＡ濃度や、当該培養液中の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の濃度等に鑑みて、適宜決定すればよい。
【００７６】
工程３について
本発明に係る３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の製造方法における工程３は、上記工程２にて得られた培養液から、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を回収する工程である。ここで、回収とは工程２によって得られる培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が存在している時に上述の工程２の培養を停止し、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を含む培養液と、上記好塩菌体を分離することである。
【００７７】
具体的な分離の手法は、遠心操作、濾過等の公知の固液分離の操作を採用すればよい。また、培養の停止方法も特に限定はされず、例えば、上記好塩菌を加熱、酸処理等の方法によって殺菌する方法、遠心操作、濾過等の公知の固液分離方法を用いて培養液と上記好塩菌体を分離する方法等が挙げられる。
【００７８】
培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が含まれたまま培養をし続けていると、好気的な条件の場合には特に、培養液中に分泌された３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が、当該好塩菌体内に再度取り込まれて利用されるために、結果として培養液中の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が減少し、ひいては培養液から消失してしまうために、培養液中に３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が存在しているときに、上記培養を停止する必要がある。
【００７９】
培養液中の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の存在を確認する方法は、菌種、培地成分、培養条件等により変わり得るものであるので、これらの要素を考慮して適宜決定する。例えば、キャピラリー電気泳動等の分析方法を使用して、培養を行いながら培養を停止する時間を決定することもできる。
【００８０】
また、３−ヒドロキシ酪酸は酸性を示す化合物であることから、培養の際の培地のｐＨの低下を基準にして、３−ヒドロキシ酪酸の存在を確認してもよい。
【００８１】
なお回収される３−ヒドロキシ酪酸の塩は、培養液中に含まれる無機塩に基づく、ナトリウムやカルシウム等のアルカリ金属、アルカリ土類金属陽イオン等と反応したアルカリ金属塩として回収される。従って、３−ヒドロキシ酪酸を製造するには、回収した培養液を蒸留等の常法に供すればよい。また、回収した培養液を適切なカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製工程に供してもよい。さらに、回収した培養液のｐＨを適宜変更して、所望の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩のいずれかを精製工程に供してもよい。
【００８２】
本発明に係る製造方法によって、培地中に菌体由来の溶解物を含むことなく得られる３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の量は、培地１Ｌに対して通常は３ｇ程度以上であり、好ましくは１０ｇ以上、より好ましくは１５．３ｇ以上、さらに好ましくは１７．２ｇ程度以上、最も好ましくは２０ｇ程度以上である。
【００８３】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。なお、本発明が実施例に限定されないことは言うまでも無い。
【実施例】
【００８４】
＜３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の測定＞
培養液にて生産される３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を測定するため、非特許文献５に記載されたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）分析の手法を応用し、以下の実験を行った。
【００８５】
下記の方法で培養して得られた培養液を遠心分離して上清のみ採取し、５０μＬを乾燥させた。この上清乾燥物に、３ｖｏｌ％のＨ２ＳＯ４を含むメタノール０．５０ｍｌを加え１０５℃で１時間加熱し、３−ヒドロキシ酪酸またはその塩をすべて３−ヒドロキシ酪酸メチルに変換した。その後、室温まで冷却した後、クロロホルム０．５０ｍｌ、蒸留水０．２５ｍｌを加えて、激しく攪拌した。その後、１分間遠心分離したのち、クロロホルム層を１μｌ分取し、ガスクロマトグラフ装置を用いて、３−ヒドロキシ酪酸を分析した。３−ヒドロキシ酪酸の標品を上清乾燥物と同様に処理、分析し、これを基準として培地あたりの３−ヒドロキシ酪酸蓄積率（３−ヒドロキシ酪酸（ｇ）／上清液（Ｌ））を求めた。また、「Ｆ-キット Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸」(株式会社Ｊ.Ｋ.インターナショナル)のキットでは、Ｄ体のみが検出される。このキットでの測定値と、ガスクロマトグラフ装置での測定値が一致したことから、分泌された３−ヒドロキシ酪酸は、ほぼＤ体であることが確認された。
【００８６】
＜ＰＨＢ蓄積率測定＞
菌体内に蓄積されたＰＨＢの蓄積量を測定するため、非特許文献２に記載の手法を用い以下の実験を行った。
【００８７】
上記培養した培養液を遠心分離して菌体のみ採取し、蒸留水で数回洗浄したのち乾燥させた。この乾燥菌体１〜３ｍｇに、３ｖｏｌ％のＨ２ＳＯ４を含むメタノール０．５０ｍｌを加え１０５℃で３時間加熱した。その後、室温まで冷却した後、クロロホルム０．５０ｍｌ、蒸留水０．２５ｍｌを加え、激しく攪拌した。その後、１分間遠心分離したのち、クロロホルム層を１μｌ分取し、ガスクロマトグラフ装置を用いて、ＰＨＡｓを分析した。ＰＨＢの標品を乾燥菌体と同様に処理、分析し、これを基準として乾燥菌体あたりのＰＨＢ蓄積率（ＰＨＢ（ｇ）／乾燥菌体重量（ｇ））を求めた。
【実施例１】
【００８８】
本実施例では、ハロモナス属に属する好塩菌を用いた３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を製造する方法について詳述する。
【００８９】
表１に示すＳＯＴ改５（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｄｉｕｍ改５）を基本にした培地を用いた。この培地は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（国立環境研究所のＨＰ）であり、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３の量を調整し、窒素源のＮａＮＯ３を５倍に、リン源のＫ２ＨＰＯ４を４倍に増加させて調整した。上記の培地を調整した後のｐＨは９．４±０．１であり、オートクレーブ等の滅菌操作は行わずにそのまま用いた。
【００９０】
培養の際には、上述の培地に対して各種有機炭素源を適宜追加して用いた。具体的な有機炭素源として、それぞれ培地中での終濃度が１０％若しくは１５％となるグリセリン、又は１０％となるグルコースを使用した。
【００９１】
【表１】
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【００９２】
＜ハロモナス属に属する好塩菌のプレ培養＞
ハロモナス属に属する好塩菌（ハロモナス・エスピーＫＭ−１株、ハロモナス・パンテラリエンシス〔ＡＴＣＣ  ７００２７３〕及びハロモナス・カンピサリス〔ＡＴＣＣ  ７００５９７〕）を、プレート培養より、１６．５ｍｍ径の試験管に５ｍｌの上記ＳＯＴ５改培地（この場合、炭素源として１ｗ／ｖ％グルコース等を含むものを用いた）を加え、３７℃で１晩振盪培養した。
【００９３】
＜ハロモナス属に属する好塩菌の培養、サンプルの回収等＞
プレ培養した各種ハロモナス属に属する好塩菌体０．２ｍｌを、１００ｍｌ容の三角フラスコに入れた上記ＳＯＴ改５培地２０ｍｌに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、３３℃で撹拌速度を２００ｒｐｍとなる条件にて振盪培養し、２４時間後から、およそ１２時間おきに培養液を０．５ｍｌずつ回収して、ＯＤ６００、乾燥菌体重量、ＰＨＢ含有量、及び上清中の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の量を測定した。
【００９４】
有機炭素源としてグルコース又はグリセロールを計１０％用いる場合は、それぞれ生育初期に５％分を培地に含有させ、培養後２４時間には５％の炭素源を追加供給し、計１５％用いる場合は、生育初期に５％分を培地に含有させ、培養後２４時間及び３６時間後にそれぞれ５％分の有機炭素源を追加供給した。
【００９５】
培養当初は、撹拌速度を２００ｒｐｍと好気的な条件で培養し、３６時間目に撹拌速度を５０ｒｐｍと、微好気条件に変更した。培養液は、サンプリング後、再度シリコセンをし、３３℃で振盪培養を継続し、回分培養した。
【００９６】
図１、２では、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を３３℃において、グルコース又はグリセロールを炭素源に培養した生育の状況が示している。図３、４では、同条件で培養した際のＰＨＢの生産量について示している。図５では、同条件でハロモナス・エスピーＫＭ−１株を培養した際の培養液上清中の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産量について示している。
【００９７】
有機炭素源としてグルコース又はグリセロールを初期の濃度が５％で含む培地を用い２４時間目及び／又は３６時間目に５％分の有機炭素源を追加しても、特段の炭素源による生育阻害は見られなかった。また、一般に、グルコースの方が、グリセロールより生育速度は早く、ＰＨＢの蓄積量も多い。好気条件から、微好気条件へと供気条件を変更する３６時間目において、１５％のグルコースの場合は３２．５ｇ／Ｌ、１０％及び１５％のグリセロールの場合２１．５ｇ／ＬのそれぞれＰＨＢの蓄積が認められた。
【００９８】
有機炭素源が１５％のグルコースの場合、８１％のＰＨＢが分解され、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が２０ｇ培地中に分泌された。
【００９９】
有機炭素源がグリセロールの場合、１０％並びに１５％ともに、ほぼ１００％のＰＨＢが分解され、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩が、それぞれ１５．３ｇ並びに１７．２ｇ培地中に分泌された。
【０１００】
上記結果から、グルコース、グリセロール等を有機炭素源として含む培地を用いれば、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株は、３−ヒドロキシ酪酸又はその塩を収量として培地１Ｌ当り１５．３ｇ以上を産生することができることが明らかとなり、ＰＨＢの蓄積量を増やせば、特にグリセロールの場合、そのほとんどが分解され、多くが３−ヒドロキシ酪酸又はその塩として培地中に分泌させることも可能であることを示した。
【０１０１】
図６、７では、３３℃において、好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株、ハロモナス・パンテラリエンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｐａｎｔｅｌｌｅｒｉｅｎｓｉｓ：ＡＴＣＣ  ７００２７３）及びハロモナス・カンピサリス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｉｓａｌｉｓ：ＡＴＣＣ  ７００５９７）を、グリセロール１０％を用い３３℃にて培養したときの生育の状況が示している。図８、９では、同条件で培養した際のＰＨＢの生産量について示している。図１０では、同条件で培養した際の培養液の上清中の３−ヒドロキシ酪酸又はその塩の生産量について示している。
【０１０２】
炭素源としてグリセロール１０％を炭素源とした場合、好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株、ハロモナス・パンテラリエンシス及びハロモナス・カンピサリスのそれぞれによって生育状況は異なる。好気条件から微好気条件へと供気条件を変更する４８時間目において、好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株、ハロモナス・パンテラリエンシス、及びハロモナス・カンピサリスは、それぞれ、１６．０ｇ／Ｌ、５．８ｇ／Ｌ、７．３ｇ／ＬのＰＨＢの蓄積が認められた。また、好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株、ハロモナス・パンテラリエンシス、及びハロモナス・カンピサリスは、それぞれ、９８％、４６％、４１％のＰＨＢが分解され、３−ヒドロキシ酪酸が、それぞれ、１６ｇ、２．６ｇ、３．０ｇ培地中にて生産された。
【０１０３】
上記結果から、グルコース、グリセロール等を有機炭素源として含む培地を用いれば、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株は、３−ヒドロキシ酪酸を収量として培地１Ｌ当り１４ｇ以上を産生することができることが明らかとなり、ＰＨＢの蓄積量を増やせば、特にグリセロールの場合、そのほとんどが分解され、多くが３−ヒドロキシ酪酸として培養液中にて生産されることも可能であることを示した。
また、培養時の窒素源については、ある程度の濃度範囲であればＰＨＢの蓄積に差がないことは、特許文献３，５に示すとおりである。
さらに、別のハロモナス属に属する好塩菌においても同様の傾向を示すことは、図６，７，８，９，１０に示すとおりである。
【０１０４】
なお、培地中の溶存酸素量についてもＨＯＲＩＢＡ  Ｄ−５５溶存酸素計で測定した。２００ｒｐｍの場合０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌ、５０ｒｐｍの場合０．１１〜０．２１ｍｇ／ｍｌの溶存酸素量を示した。
【０１０５】
また、微好気条件でハロモナス・エスピーＫＭ−１株を７２時間培養した際の培地中のＤＮＡ量は、２．３１ｍｇ／Ｌであり、好気条件にて培養した際の０．２５ｍｇ／Ｌよりも多いものの、嫌気条件にて培養した際の３８４ｍｇ／Ｌと比較して約０．６％にまで抑えることが明らかとなった。
【０１０６】
なお、微好気条件にて７２時間培養した際の、培養液中のＤＮＡ量は、上述の２．３１ｍｇ／Ｌを越えることはなかった。
【図１】
0005892507.tif 000003
【図２】
0005892507.tif 000004
【図３】
0005892507.tif 000005
【図４】
0005892507.tif 000006
【図５】
0005892507.tif 000007
【図６】
0005892507.tif 000008
【図７】
0005892507.tif 000009
【図８】
0005892507.tif 000010
【図９】
0005892507.tif 000011
【図１０】
0005892507.tif 000012
【配列表】
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