(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチマイシンＡの存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含み、
前記イソプレノイド産生植物が、Ｈｅｖｅａ属である、天然ゴムの製造方法。
【請求項２】
アンチマイシンＡが、水又は水溶性媒体に溶解又は分散させたものである、請求項１記載の天然ゴムの製造方法。
【請求項３】
イソプレノイド産生植物がパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）である、請求項１又は２記載の天然ゴムの製造方法。
【請求項４】
カルスの培養が、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン、アンチマイシンＡ、及び炭素源を含む誘導培地中で培養することにより行われる、請求項１〜３のいずれかに記載の天然ゴムの製造方法。
【請求項５】
イソプレノイド産生植物の組織片からカルスを誘導した後、カルスを培養することにより、カルスにより天然ゴムを生合成する請求項１〜４のいずれかに記載の天然ゴムの製造方法。
【請求項６】
アンチマイシンＡの存在条件下で培養して得られる、Ｈｅｖｅａ属であるイソプレノイド産生植物のカルスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプレノイドの製造方法の技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムは、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で天然ゴムを生合成させ、該天然ゴムを植物から手作業により採取することにより得られる。
【０００３】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴムは、パラゴムノキを唯一の採取源としている。しかしながら、パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴムを採取できる期間は２０〜３０年である。今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれているが、上述の理由によりパラゴムノキによる天然ゴムの大幅な増産は困難である。そのため、天然ゴム資源の枯渇が懸念されており、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴム（イソプレノイド）の供給源が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、前記課題を解決し、パラゴムノキの成木に頼らない安定的なイソプレノイドの製造方法、該製造方法により得られるイソプレノイドを提供することを目的とする。また、イソプレノイドを製造可能な新規なカルス、該カルスの誘導方法、該カルスの培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従来から、完全な植物体でなくとも、カルスなどの未分化細胞を用いて、一部の二次代謝物を生合成できることは知られていた。天然ゴム（イソプレノイド）も二次代謝物ではあるが、乳管細胞という特殊な細胞により生合成されることが知られており、乳管細胞以外の細胞（例えば、カルス）では生合成できないものと考えられていた。本発明者らは、鋭意検討した結果、イソプレノイド産生植物の組織片から誘導したカルスにより、イソプレノイド（天然ゴム）を生合成できることを見出した。さらに、カルスに増産剤を適用することにより、カルスによるイソプレノイド産生能を向上させられることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法に関する。
【０００７】
また、本発明は、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法に関する。
【０００８】
また、本発明は、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及びＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させる活性から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法に関する。
【０００９】
増産剤が、水又は水溶性媒体に溶解又は分散させたものであることが好ましい。
【００１０】
イソプレノイド産生植物がパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、グアユール、及びロシアンタンポポから選択されるものであることが好ましい。
【００１１】
カルスの培養が、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン、増産剤、及び炭素源を含む誘導培地中で培養することにより行われることが好ましい。
【００１２】
イソプレノイド産生植物の組織片からカルスを誘導した後、カルスを培養することにより、カルスによりイソプレノイドを生合成することが好ましい。
【００１３】
また、本発明は、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下で培養して得られる、イソプレノイド産生植物のカルスに関する。
【００１４】
また、本発明は、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下で培養して得られる、イソプレノイド産生植物のカルスに関する。
【００１５】
また、本発明は、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及びＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させる活性から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下で培養して得られる、イソプレノイド産生植物のカルスに関する。
【００１６】
また、本発明は、上記の製造方法で製造されたイソプレノイドに関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法により、イソプレノイド産生植物の成木に頼らず、安定的にイソプレノイドを製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】アンチマイシンＡ添加培地で生育させたカルスの各遺伝子の半定量ＰＣＲの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法に関する。また、本発明は、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害、から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法に関する。また、本発明は、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及びＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させる活性から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法に関する。
【００２０】
イソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）で構成された重合体の総称である。イソプレノイドとしては、例えばモノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０）、天然ゴムなどの重合体が挙げられる。
【００２１】
本発明のイソプレノイドの製造方法は、イソプレノイド産生植物の組織片からカルスを誘導し、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下、又は、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及びＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させる活性から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下で、カルスによりイソプレノイドを生合成する製造方法である。具体的には、イソプレノイド産生植物の組織片からカルスを誘導し、前記増産剤の存在条件下でカルスを培養することにより、イソプレノイドを生合成すればよい。
【００２２】
誘導したカルスをそのまま培養してイソプレノイドを製造することとしてもよいが、より多量のイソプレノイドが得られるという理由から、誘導したカルスをまず増殖させ、増殖させたカルスによりイソプレノイドを製造することが好ましい。
【００２３】
具体的には、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する誘導工程と、カルスを生育培地中で培養して増殖させる増殖工程と、増殖工程により増殖させたカルスを上記増産剤を含む生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する生産工程とを含む製造方法が好ましい。なお、増殖工程及び生産工程において液体培養を行う場合には、カルスの増殖が比較的速いため、増殖工程と生産工程を明確に分けずに、１つの工程でカルスを増殖させつつ、カルスによりイソプレノイドを生合成することとしてもよい。
【００２４】
（誘導工程）
誘導工程では、例えば、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する。
【００２５】
イソプレノイド産生植物としては、イソプレノイドを産生可能な植物であれば特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ  ｆ．  ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ａｉｔ．  ｖａｒ．  ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ  Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｖｅｎｕｓｔｕｍ  Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ  Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ  Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｗｅｂｅｒ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｒｅｃｔａ  Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ａｍｐｅｌａｓ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｉｒｉｓａｎａ  Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｓｅｐｔｉｃａ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。なかでも、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物であることが好ましく、なかでも、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、Ｆｉｃｕｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましく、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ���及びイチジクからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
【００２６】
組織片としては、特に限定されないが、葉、茎、根、芽、花弁、子葉、胚軸、葯、及び種子からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。なかでも、葉、茎がより好ましい。
【００２７】
誘導工程では、まず、イソプレノイド産生植物の組織片の表面を洗浄する。組織片として植物の内部にある組織を利用する場合は、例えば、磨き粉で洗浄しても良いが、界面活性剤を約０．１％含む水で洗浄してもよい。葉などを利用する場合は、軟らかいスポンジで表面を洗浄することが好ましい。
【００２８】
次に、組織片を殺菌又は滅菌する。殺菌又は滅菌は、周知の殺菌剤、滅菌剤を用いて行うことができるが、エタノール、塩化ベンザルコニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液が好ましい。
【００２９】
次に、殺菌又は滅菌した組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することにより、カルスの誘導を行う。なお、誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、カルス化しやすいため、固体培養が好ましい。また、誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【００３０】
植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。
【００３１】
オーキシン系植物ホルモンとしては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、クロロフェノキシ酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、パラクロロフェノキシ酢酸、２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸、４−フルオロフェノキシ酢酸、２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸、２−フェニル酸、ピクロラム、ピコリン酸等が挙げられる。なかでも、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸が好ましく、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸がより好ましく、ナフタレン酢酸が更に好ましい。
【００３２】
サイトカイニン系植物ホルモンとしては、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチン、ベンジルアミノプリン、イソペンチニルアミノプリン、チジアズロン、イソペンテニルアデニン、ゼアチンリポシド、ジヒドロゼアチン等が挙げられる。なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましく、ベンジルアデニンが更に好ましい。
【００３３】
炭素源としては、特に限定されず、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アロース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、イドース、アラビノース、アピオース、マルトース等の糖類が挙げられる。また、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール等の糖アルコールであってもよい。なかでもスクロース、グルコースが好ましく、スクロースがより好ましい。
【００３４】
誘導培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｈｅｌｌｅｒの培地（Ｈｅｌｌｅｒ  Ｒ，  Ｂｏｔ．Ｂｉｏｌ．Ｖｅｇ．Ｐａｒｉｓ  １４  １−２２３（１９５３））、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましい。また、カルスの維持および細胞分裂の促進に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。
【００３５】
誘導培地は、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含んでもよい。モノテルペン化合物としては、Ｄ−リモネン、α−ピネン、β−ピネン、ｌ−メントール、ゲラニオール、カラン、ピナン、ミルセン、オシメン、コスメン等が挙げられる。なかでも、Ｄ−リモネン、α−ピネンが好ましい。
【００３６】
誘導培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、ゼラチン、シリカゲル等が挙げられる。
【００３７】
好適な誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は以下の組成である。
【００３８】
誘導培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
【００３９】
誘導培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【００４０】
なお、微量無機塩類とは、ホウ素、マンガン、亜鉛、銅、モリブデン、塩素、コバルト、チタン、バナジウム、アルミニウム、ケイ素等の培地に少量含有させる無機塩類を意味する。すなわち、微量無機塩類には、カルシウム、マグネシウム、カリウム等の主要無機塩類（培地に多量に含めなければ培養が成立しない無機塩類）は含まれない。上記微量無機塩類のなかでも、ホウ素、マンガン、亜鉛が好ましく、ホウ素、マンガン、亜鉛の合計濃度が上記微量無機塩類の好ましい濃度範囲内であることが好ましい。
【００４１】
誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。
【００４２】
誘導培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上、更に好ましくは０．１ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは３ｍＭ以下である。
【００４３】
誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．２ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下である。
【００４４】
誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．２ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下である。
【００４５】
誘導培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【００４６】
誘導培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【００４７】
誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。
【００４８】
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。また、本明細書において、暗所とは、照度が０〜０．１ｌｘであることを意味し、明所とは、照度が０．１ｌｘを超えていることを意味する。
【００４９】
固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【００５０】
以上のように、殺菌又は滅菌した組織片を上記誘導培地中で培養することにより、カルスの誘導を行うことが可能である。なお、イソプレノイド産生植物の組織片を上記誘導培地中で培養し、上記誘導培地で継代培養を繰り返すことにより、イソプレノイド産生植物の組織片から誘導された細胞１００質量％中のカルスの割合を２０質量％以上（好ましくは６０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上）とすることが可能となり、カルスを効率的、安定的に誘導できる。この誘導工程により誘導されたカルスは、次の増殖工程に使用される。なお、イソプレノイド産生植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物（特に、ヒマワリ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物（特に、タンポポ）、Ｆｉｃｕｓ属に属する植物（特に、イチジク））の組織片から誘導されたカルスは、イソプレノイドの製造に優れている。
【００５１】
本発明では、誘導されたカルスの遺伝子を組み替えてもよい。組み換え遺伝子の導入方法は一般的に用いられているものを、通常知られた条件で使用すればよく、例えば、プロトプラスト法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法（以上「生物化学実験法４１植物細胞工学入門」１９９８年９月１日、学会出版センター、第２５５頁〜３２６頁，「植物バイオテクノロジー」２００９年５月２５日、幸書房、第１３０頁〜１３６頁）などがあるが、これらに限らない。
【００５２】
（増殖工程）
増殖工程では、例えば、誘導工程により誘導されたカルス（上述の方法等により遺伝子が組み替えられていてもよい）を生育培地中で培養して増殖させる。なお、生育培地は、液体であっても固体であってもよい。また、生育培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【００５３】
生育培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地、Ｈｅｌｌｅｒの培地、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に必要に応じて植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。なお、生育培地と誘導培地の組成が同一であってもよい。また、カルスの維持および細胞分裂の促進に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。
【００５４】
生育培地は、ジャスモン酸、モノテルペン化合物、及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種を含んでもよい。なかでも、糖アルコールが好ましいが必須成分ではない。
【００５５】
モノテルペン化合物としては、Ｄ−リモネン、α−ピネンが好ましく、Ｄ−リモネンがより好ましい。
【００５６】
糖アルコールとしては、上述のエリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール等が挙げられるが、なかでも、エリスリトールが好ましい。
【００５７】
生育培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【００５８】
好適な生育培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は以下の組成である。
【００５９】
生育培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【００６０】
生育培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０５質量％以上、特に好ましくは０．１０質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．７５質量％以下、更に好ましくは０．５０質量％以下、特に好ましくは０．３０質量％以下である。
【００６１】
生育培地中の糖アルコールの濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０５質量％以上、特に好ましくは０．２０質量％以上、最も好ましくは０．４０質量％以上である。該糖アルコールの濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．７５質量％以下、更に好ましくは０．６０質量％以下である。
【００６２】
生育培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５５ｍＭ以下である。
【００６３】
生育培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【００６４】
生育培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは４質量％以下である。生育培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【００６５】
生育培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下、更に好ましくは０．５ｍＭ以下である。生育培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【００６６】
生育培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは１．２ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが更に好ましい。
【００６７】
生育培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【００６８】
生育培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、固体培地の場合には、５．６〜５．８が更に好ましく、液体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましい。なお、生育培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【００６９】
固体培地の場合、生育培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【００７０】
以上のように、増殖工程では、カルスを上記生育培地中で培養することにより、カルスを増殖させることが可能である。なお、イソプレノイド産生植物のカルスを上記生育培地中で培養することにより、４週間当たりの質量基準のカルスの生長率を２倍以上（好ましくは２．５倍以上）とすることが可能となり、カルスを効率的、安定的に生育できる。４週間当たりの質量基準のカルスの生長率は、実施例に記載の方法により算出できる。この増殖工程により増殖させたカルスは、次の生産工程に使用される。なお、増殖工程では、カルスの増殖と共にイソプレノイドの生合成を行ってもよいし、イソプレノイドの生合成は行わずに、カルスの増殖のみを行ってもよい。これは、生育培地の組成や増殖工程の培養条件を適宜変更することにより制御可能である。
【００７１】
（生産工程）
生産工程では、例えば、増殖工程により増殖させたカルスを上記増産剤を含む生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する。なお、生産培地は、液体であっても固体であってもよい。また、生産培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【００７２】
生産培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地、Ｈｅｌｌｅｒの培地、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に必要に応じて植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。なお、生産培地と、誘導培地及び／又は生育培地の組成が同一であってもよい。また、カルスの維持及び細胞分裂の促進に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。
【００７３】
生産培地は、イソプレノイドの生産を促すという理由から、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましいが、これらは必須成分ではない。モノテルペン化合物を含む場合、Ｄ−リモネン、α−ピネンが好ましく、Ｄ−リモネンがより好ましい。
【００７４】
生産培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【００７５】
好適な生産培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は以下の組成である。
【００７６】
生産培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは７．５ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
【００７７】
生産培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。
【００７８】
生産培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。生産培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。
【００７９】
生産培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下である。生産培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。
【００８０】
生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【００８１】
生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【００８２】
生産培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【００８３】
生産培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０５質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。
【００８４】
生産培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、固体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましく、液体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましい。なお、生産培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。
【００８５】
固体培地の場合、生産培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。
【００８６】
（増産剤）
増産剤は、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される。
【００８７】
或いは、増産剤は、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害、から選択される活性を有する。イソプレノイドはメバロン酸経路と非メバロン酸経路の２種の経路により合成されることが一般に良く知られている。これらの経路は、ミトコンドリアにある呼吸鎖複合体の調節により制御を受けるので、前記増産剤を使用することにより、イソプレノイド産生能を向上させることができる。
【００８８】
或いは、増産剤は、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及びＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子（以下ＨＭＧＲと略）発現量を増加させる活性、から選択される活性を有する。ＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子産物はメバロン酸経路における主要酵素を制御するので、前記増産剤を使用することにより、イソプレノイド産生能を向上させることができる。
【００８９】
抗生物質とは、微生物が産生し、ほかの微生物の増殖を抑制する物質のことをいう。抗生物質の具体例としては、アンチマイシン、アンホテリシン、ツニカマイシン、ニスタマイシン、フォスミドマイシンが挙げられる。この中でも、呼吸鎖複合体阻害剤であるという理由でアンチマイシンが好ましい。アンチマイシンとしては、アンチマイシンＡが好ましい。アンチマイシンＡのタイプはＡ１であってもよく、Ａ３であってもよい。
【００９０】
副腎皮質ホルモン、或いは／及びステロイド系抗炎症剤は、メバロン酸経路におけるＨＭＧＲ−ＣｏＡ還元酵素のはたらきを阻害するという理由で増産剤として使用される。副腎皮質ホルモン、或いは／及びステロイド系抗炎症剤としては、ハイドロコルチゾン、グルココルチコイド、フルドロコチゾン、プロドニゾロン、デキサメタゾン等が挙げられる。
【００９１】
抗コレステロール剤としてはスタチン系薬剤、例えば、ロバスタチン、メバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチンが挙げられる。
【００９２】
高血圧薬としては、ロテニン等が挙げられる。
【００９３】
抗真菌剤としてロダニン−３−酢酸、呼吸鎖複合体ＩおよびＩＩＩ阻害剤としてアラキドン酸、呼吸鎖ＩＶ阻害剤としてシアン酸塩、起炎物質としてカプサイシン、呼吸阻害剤としてアジ化合物（アジ化ナトリウム等）、呼吸鎖複合体Ｉ阻害剤としてアミタール、電子伝達阻害剤として硫化ナトリウム、呼吸鎖複合体ＩＩＩ阻害剤としてｎ−ヘプチルヒドロキシキノリン−Ｎ−オキシド、電子伝達阻害剤として２，３−ジメルカプトプロパノールを使用することもできる。これらは、単独で用いても、２つ以上を併用しても構わない。
【００９４】
増産剤は、水又は水溶性媒体に溶解又は分散させてから使用されることが好ましい。水又は水溶性媒体に溶解又は分散させることにより、増産剤を細胞に対して効果的に作用させることができる。具体的には、増産剤は、少量の水溶性媒体に溶かし、さらに水で希釈してから使用されることが好ましい。増産剤を溶解又は分散させるための水溶性媒体としては、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
【００９５】
水溶性媒体／（水溶性媒体＋水）の希釈率は、１／１００〜１／１０００であることが好ましく、１／２００〜１／８００であることがより好ましく、１／３５０〜１／６５０であることがさらに好ましい。これより水の量が多いと、必要な増産剤の濃度が得られない傾向がある。他方、これより水の量が少ないと、水溶性媒体が、イソプレノイドを製造する細胞に対し悪影響を及ぼす可能性がある。
【００９６】
上記の生産工程において、生産培地に増産剤を添加することにより、カルスによるイソプレノイドの産生効率を向上させることができる。増産剤の存在条件は、イソプレノイドの製造効率を向上させられる条件であれば特に限定されない。生産培地中の増産剤の濃度は、０．１〜２０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５〜１５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、１〜１０μｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましく、１．５〜４．５μｍｏｌ／Ｌであることがさらにより好ましい。これらの濃度にすることで、イソプレノイド合成効率を向上できると共に、不必要に高濃度としてコストを増大させてしまうことを防ぐことができる。
【００９７】
以上のように、増殖工程により増殖させたカルスを生産培地で培養することにより、カルスによりイソプレノイドを生合成できる。カルスにより生合成されたイソプレノイドは、細胞内に蓄積又は細胞外に放出（分泌）される。特に、生産培地（特に液体培地）の培地組成が上記好適な範囲内の場合には、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積され、更に蓄積されたイソプレノイドが好適に細胞外に放出され、より好適にイソプレノイドを製造することができる。これにより、イソプレノイドの抽出が容易となるだけでなく、連続培養の可能性が広がる。
【００９８】
細胞内にイソプレノイドが蓄積している場合には、例えば、公知の方法により細胞を破砕し、破砕物からイソプレノイドを公知の方法により抽出することによりイソプレノイドが得られる。また、イソプレノイドが細胞外に放出されている場合は、例えば、培地からイソプレノイドをトルエン・ヘキサン混合溶媒により抽出することによりイソプレノイドが得られる。
【００９９】
イソプレノイド産生植物の組織片から誘導されたカルス（好ましくは増殖工程により増殖させたカルス）を上記生産培地中で培養することにより、カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量（イソプレノイド細胞内蓄積量）を、カルス乾燥質量に対し、０．０１質量％以上とすることが可能となり、イソプレノイドを好適に製造できる。ここで、イソプレノイド細胞内蓄積量は、カルスを凍結乾燥させ、該カルスから精製回収したイソプレノイドのカルス乾燥質量に対する割合（質量％）を意味し、実施例に記載の方法により算出できる。
【０１００】
本発明の製造方法により得られるイソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）が直鎖状に（共）重合した構造を有するゴム（天然ゴム）である。
【０１０１】
イソプレノイドの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは１０００以上、より好ましくは１００００以上、更に好ましくは１０００００以上、特に好ましくは１００００００以上である。１０００未満では、ゴムとして利用しにくい傾向がある。また、上記重量平均分子量の上限は、特に限定されない。なお、本明細書において、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）（東ソー（株）製ＧＰＣ−８０００シリーズ等、検出器：示差屈折計、ＵＶ）による測定値をもとに標準ポリイソプレン又は標準ポリスチレン換算により求めることができる。具体的には、実施例に記載の方法により測定できる。
【０１０２】
イソプレノイドに含まれるイソプレンユニット中の１，４−シス構造の含有量は、好ましくは１０モル％以上、より好ましくは３０モル％以上、更に好ましくは６０モル％以上、特に好ましくは９０モル％以上である。１，４−シス構造の含有量の上限は特に限定されない。１，４−シス構造の含有量は、ＮＭＲにより測定できる。
【実施例】
【０１０３】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１０４】
（１）実施例で使用した化合物等について、まとめて説明する。
２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
ＫＩ：カイネチン
リモネン：Ｄ−リモネン
固形化剤：寒天、アガロース、ゼラチン
パラゴムノキ：東京大学大学院農学生命科学研究科附属  科学の森教育研究センター  樹芸研究所より入手
【０１０５】
（２）誘導工程
パラゴムノキから茎を採取した。次に、採取した茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。
【０１０６】
次に、滅菌した茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を３質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。
【０１０７】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）で約１ヶ月培養し、パラゴムノキの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。誘導培地の組成を表１に示す。
【０１０８】
【表１】
0005975252.tif 000002
【０１０９】
上記誘導培地で継代培養を繰り返した後（合計培養日数：９０日）、目視によりカルスの誘導を確認し、誘導されたカルスの直径が３ｍｍ以上のものをカルスの誘導有りと判断した。試験を１８回実施し、その平均を総合して評価結果とした。その結果、表１に示した誘導培地では、イソプレノイド産生植物の組織片から誘導された細胞１００質量％中のカルスの割合（誘導効率）が９０質量％以上であり、ほぼカルスのみが誘導された。
【０１１０】
（３）増殖工程
表１の誘導培地により誘導されたカルスを、約１ヶ月ごとに生育培地（固体培地）で継代培養してカルスを増殖させた。
【０１１１】
生育培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を２〜６質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。
【０１１２】
オーキシン系植物ホルモンとして２，４−Ｄと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンとを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）で培養し、カルスの生育を促した。生育培地の組成を表２に示す。
【０１１３】
【表２】
0005975252.tif 000003
【０１１４】
この増殖工程において、カルスの生長率を算出した。カルスの生長率は、培養初期のカルス仕込み量（質量）と継代時（本例では、培養２８日間（４週間）終了時）に測定したカルス質量の比率（継代時に測定したカルス質量／培養初期のカルス仕込み量）から算出した。その結果、培養２８日間でのカルスの生長率は４．２であった。
【０１１５】
（４）増産剤の調製
抗真菌性抗生物質であり、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害作用のあるアンチマイシンＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．製、有効成分９０％以上）１０ｍｇをエタノール１８．２ｃｃに溶解し１ｍｍｏｌ／Ｌとした。更に、これを水で１００倍〜１０００倍に適宜希釈し、全培地容量に対して、１μｍｏｌ／Ｌ(実施例１及び実施例４)、２μｍｏｌ／Ｌ(実施例２及び実施例５)、１０μｍｏｌ／Ｌ(実施例３及び実施例６)、となる様に添加した。
【０１１６】
（５）生産工程
増殖させたカルスを生産培地（固体培地）で培養して、イソプレノイドの生産を行った。
【０１１７】
生産培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を２〜６質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。
【０１１８】
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンとを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）で培養し、イソプレノイドの生産を促した。カルスの培養は３０日間行った。増産剤として、上記（４）で調製した増産剤を生産培地に添加した。生産培地の組成を表３に示す。
【０１１９】
【表３】
0005975252.tif 000004
【０１２０】
（６）ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子、及びＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子に対する増産剤の効果
ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により、比較例１、及び実施例１の培地で生育させたカルスにおける、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量、及びＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量に対する増産剤の効果を測定した。
【０１２１】
カルスからＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅにより逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量の測定のためのＰＣＲは、以下のプライマーセット：ＨｂＩＰＩ−Ｆ１：ＡＣＣＡＧＡＣＴＣＴＣＧＴＣＣＴＣＧＣＴ、及びＨｂＩＰＩ−Ｒ１：ＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣＣＡＣＡＡＴを使用し、９４℃で１分の後、９４℃で１５秒、６３℃で１５秒、及び７２℃で１分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、４℃で保温する条件により行った。ＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量の測定のためのＰＣＲは、以下のプライマーセット：ＨｂＨＭＧＲ−Ｆ１：ＣＣＡＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣＧＴＣＧＧＡＣ、及びＨｂＨＭＧＲ−Ｒ１：ＣＣＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧを使用し、９４℃で２分の後、９８℃で１５秒、及び６８℃で１分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、４℃で保温する条件により行った。
【０１２２】
ＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動結果を図１に示す。この結果から、アンチマイシンＡが、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させ、またＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させることがわかる。
【０１２３】
（７）イソプレノイドの精製回収
培養後のカルス約７０ｇを生産培地より回収し、液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥させて、カルス中の水分を除去した。次いで、水分を除去したカルスを乳鉢で粉砕した後、ソックスレー抽出装置を用いて有機溶媒によりイソプレノイドの抽出を行った。まず、９９％メタノールで抽出を行い、不要な代謝物を除去した。その後９９％トルエンでさらに抽出することで、イソプレノイドを精製回収した。
【０１２４】
生産工程により製造されたイソプレノイドの量（カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量（イソプレノイド細胞内蓄積量））を算出した。イソプレノイド細胞内蓄積量は、凍結乾燥させたのちのカルス乾燥質量に対し、該カルスから精製回収したイソプレノイドの割合（質量％）により算出した。実施例１〜３におけるイソプレノイド細胞内蓄積量を、比較例１での細胞内蓄積量を１００とした指数に換算した。その結果を表４に示す。また、実施例４〜６におけるイソプレノイド細胞内蓄積量を、比較例２での細胞内蓄積量を１００とした指数に換算した。その結果を表５に示す。
【０１２５】
重量平均分子量（Ｍｗ）は、下記１．〜７．の条件で、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により測定した。
１．装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
２．分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
３．測定温度：４０℃
４．キャリア：テトラヒドロフラン
５．流量：０．６ｍＬ／分
６．検出器：示差屈折、ＵＶ
７．分子量標準：標準ポリスチレン
結果を表４及び表５に示す。
【０１２６】
【表４】
0005975252.tif 000005
【０１２７】
【表５】
0005975252.tif 000006
【０１２８】
表４及び表５の結果より、パラゴムノキのカルスの培養系に増産剤を添加することにより、製造効率を大幅に向上させられることを確認できた。本発明の方法で製造されたイソプレノイドの重量平均分子量は、１，０００，０００以上であり、上記増産剤を用いることにより分子量を増大できることが確認できた。
【図１】
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