(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細胞におけるタウ遺伝子産物のレベルを特異的に低下させる核酸剤；及び
ｂ）薬学的に許容できる賦形剤；
を含み、
前記核酸剤がタウ遺伝子の標的領域を標的とするｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸であり、標的領域が
ａ）５’−ｇａｔ  ｃｔｔａｇｃａａｃｇ  ｔｃｃａｇｔｃｃａａ  ｇｔｇｔｇｇｃｔｃａ  ａａｇｇａｔａａｔａ  ｔｃａａａｃａｃｇｔ  ｃｃｃｇｇｇａｇｇｃ  ｇｇｃａｇｔｇｔｇｃ  ａａａｔａｇｔｃｔａ  ｃａａａｃｃａｇｔｔ−３’（配列番号１３）；
ｂ）５’−ｇａｃｃｔｇａｇｃａ  ａｇｇｔｇａｃｃｔｃ  ｃａａｇｔｇｔｇｇｃ  ｔｃａｔｔａｇｇｃａ  ａｃａｔｃｃａｔｃａ  ｔａａａｃｃａｇｇａ  ｇｇｔｇｇｃｃａｇｇ  ｔｇｇａａｇｔａａａ  ａｔｃｔｇａｇａａｇ  ｃｔｔ−３’（配列番号１４）；
ｃ）５’−ｇａｃｔｔｃａ  ａｇｇａｃａｇａｇｔ  ｃｃａｇｔｃｇａａｇ  ａｔｔｇｇｇｔｃｃｃ  ｔｇｇａｃａａｔａｔ  ｃａｃｃｃａｃｇｔｃ  ｃｃｔｇｇｃｇｇａｇ  ｇａａａｔａａａａａ  ｇａｔｔｇａａａｃｃ  ｃａｃａａｇｃｔｇ−３’（配列番号１５）；
ｄ）５’−ａａｇｔｃｇｃｃｇｔ  ｃｔｔｃｃｇｃｃａａ  ｇａｇｃｃｇｃｃｔｇ−３’（配列番号１６）；及び
ｅ）５’−ｇｃｃａａｇａｃａｇ  ａｃｃａｃｇｇｇｇｃ  ｇｇａｇａｔｃｇｔｇ−３’（配列番号１７）
から選択され、
当該核酸剤がバックボーン修飾を含む、医薬組成物。
【請求項２】
薬学的に許容できる賦形剤が血液脳関門を越えることを可能にする薬剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タウ遺伝子産物が、野生型タウ対立遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
さらに脂質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
さらに生分解性ポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記核酸剤がリポソームに封入されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記核酸剤が組換え発現ベクターにコードされている、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
組換え発現ベクターがアデノ随伴ウィルス又はレトロウィルスに基づく、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
核酸剤が血液脳関門を越えるように処方されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
核酸剤がアンチセンス核酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
ポリエチレンイミン、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン、又はポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記核酸剤が膜崩壊剤と複合体を形成している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
個体のニューロン中の神経細胞の過剰刺激に応じた興奮毒性を低下させるための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
個体の興奮毒性関連障害を治療するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
興奮毒性関連障害が、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、多発性硬化症、ハンチントン病、卒中、パーキンソン病、および発作から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
少なくとも１種類の追加の治療薬をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
標的領域が５’−ｇａｔ  ｃｔｔａｇｃａａｃｇ  ｔｃｃａｇｔｃｃａａ  ｇｔｇｔｇｇｃｔｃａ  ａａｇｇａｔａａｔａ  ｔｃａａａｃａｃｇｔ  ｃｃｃｇｇｇａｇｇｃ  ｇｇｃａｇｔｇｔｇｃ  ａａａｔａｇｔｃｔａ  ｃａａａｃｃａｇｔｔ−３’（配列番号１３）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
標的領域が５’−ｇａｃｃｔｇａｇｃａ  ａｇｇｔｇａｃｃｔｃ  ｃａａｇｔｇｔｇｇｃ  ｔｃａｔｔａｇｇｃａ  ａｃａｔｃｃａｔｃａ  ｔａａａｃｃａｇｇａ  ｇｇｔｇｇｃｃａｇｇ  ｔｇｇａａｇｔａａａ  ａｔｃｔｇａｇａａｇ  ｃｔｔ−３’（配列番号１４）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
標的領域が５’−ｇａｃｔｔｃａ  ａｇｇａｃａｇａｇｔ  ｃｃａｇｔｃｇａａｇ  ａｔｔｇｇｇｔｃｃｃ  ｔｇｇａｃａａｔａｔ  ｃａｃｃｃａｃｇｔｃ  ｃｃｔｇｇｃｇｇａｇ  ｇａａａｔａａａａａ  ｇａｔｔｇａａａｃｃ  ｃａｃａａｇｃｔｇ−３’（配列番号１５）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
標的領域が５’−ａａｇｔｃｇｃｃｇｔ  ｃｔｔｃｃｇｃｃａａ  ｇａｇｃｃｇｃｃｔｇ−３’（配列番号１６）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
標的領域が５’−ｇｃｃａａｇａｃａｇ  ａｃｃａｃｇｇｇｇｃ  ｇｇａｇａｔｃｇｔｇ−３’（配列番号１７）である、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００７年４月５日出願の米国仮特許出願第６０／９２２，０８２号の利益を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
連邦政府により資金提供を受けた研究に関する記述
アメリカ連邦政府は、国立衛生研究所（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた助成金番号ＡＧ０２２０７４、ＡＧ１１３８５、およびＮＳ０５４８１１に従って本発明に一定の権利を有することができる。
【背景技術】
【０００３】
神経の過度な興奮は、多岐にわたる神経系症状の根底にあると考えられる。発作は神経の過度な興奮のよくある発現であり、癲癇は最も広く認められている神経系症状の１つである。発作はまた、多くの他の神経系疾患の特徴として起こる。興奮毒性、すなわち細胞および／または神経回路網の機能不全もしくは死を引き起こす神経の過度な興奮によって特徴づけられる病態生理学的過程は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症、ハンチントン病、卒中、および他の神経系症状において役割を果たすと考えられる。
【０００４】
興奮毒性を低減させるのに用いられる現在の薬物はわずかに効果があるに過ぎない。さらにこのような薬物の使用は有害な副作用と関係する。例えば興奮毒性薬物は、正常な神経機能に悪影響を与える。
【０００５】
タウは、微小管結合タンパク質である。タウは、アルツハイマー病では過リン酸化されるようになり、また他の翻訳後修飾を受けて、集まって神経原線維変化になる。タウは、選択的ｍＲＮＡスプライシングによって単一遺伝子から誘導される６種類のタンパク質系統群である。ヒトの脳のタウアイソフォームは、アミノ酸３５２個から４４１個に及ぶ。これらタウアイソフォームは、Ｃ末端半分の中にそれぞれアミノ酸３１個または３２個の３個または４個のチューブリン結合ドメインを含有し、かつ分子のＮ末端部分の中にそれぞれアミノ酸２９個の挿入フラグメントを２個、１個含有するか、または何も含有しない。６種類のアイソフォームのすべてが、アルツハイマー病などのタウオパチーと関連する対螺旋状線維中に過リン酸化状態で存在することが報告されている。
【０００６】
先行技術文献
米国特許出願公開第２００４／０２４１８５４号明細書
Ｒａｐｏｐｏｒｔら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：６３６４〜６４６９
Ｄｉｃｋｅｙら（２００６）Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ．１：６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、興奮毒性関連障害を治療するための候補薬剤を識別する方法を提供する。本発明はさらに、興奮毒性関連障害を治療するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ−Ｅ】ｈＡＰＰマウスにおける水迷路学習機能障害に及ぼすタウの影響を示す図である。
【図２Ａ−Ｅ】ｈＡＰＰマウスにおける行動異常および早期死亡に及ぼすタウの影響を示す図である。
【図３Ａ−Ｄ】Ａβプラーク堆積、神経突起ジストロフィー、または異常新芽形成に及ぼすタウの影響を示す図である。
【図４Ａ−Ｄ】興奮毒誘発性発作に及ぼすタウの影響を示す図である。
【図５】ヒトのタウアイソフォームの模式的描写を示す図である。
【図６Ａ−Ｈ】様々なヒトのタウアイソフォームのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。
【図７Ａ−Ｃ】カルビンディンおよびＮＰＹのｈＡＰＰ／Ａβ誘発性変化に及ぼすタウの影響を示す図である。
【図８】ｈＡＰＰｌｏｗ／ＦＹＮバイジェニックマウスにおいて神経機能に及ぼすタウ減少の影響を示す図である。
【図９】ｈＡＰＰｌｏｗ／ＦＹＮバイジェニックマウスにおいて死亡率に及ぼすタウ減少の影響を示す図である。
【図１０Ａ−Ｃ】ｈＡＰＰ／ＦＹＮバイジェニックマウスにおいて行動欠陥に及ぼすタウ減少の影響を示す図である。
【図１１】ＴＡＳＤマウスにおいて死亡率に及ぼすタウ減少の影響を示す図である。
【図１２Ａ−Ｃ】様々な遺伝子型のマウス由来の海馬のホモジネート中のタウおよびｈＡＰＰのレベルを示す図である。
【図１３Ａ−Ｃ】タウ減少がＡβレベルに影響を及ぼさないことを示す結果を描いた図である。
【図１４Ａ−Ｈ】タウ減少が若いマウス中のプラーク負荷に影響を及ぼさないことを示す結果を描いた図である。
【図１５Ａ−Ｂ】タウの減少がＡβ＊５６のレベルに影響を及ぼさないことを示す結果を描いた図である。
【図１６Ａ−Ｂ】ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスにおけるタウのリン酸化を示す図である。
【図１７Ａ−Ｂ】タウタンパク質分解を示す図である。
【図１８】タウ減少がｈＡＰＰ−Ｊ９／ＦＹＮバイジェニックマウスにおいて抑制性のリモデリングを遮断することを示す結果を描いた図である。
【図１９】タウ減少がｈＡＰＰマウスの異常興奮活動を遮断することを示す結果を描いた図である。
【図２０】タウ減少が頭部損傷後の回復を増進させることを示す結果を描いた図である。
【図２１】タウ減少が頭部損傷後の発作を改善することを示す結果を描いた図である。
【０００９】
定義
本明細書中で用いられる用語「興奮毒性」は、細胞の機能不全および／または神経回路網の機能不全および／または細胞死を引き起こす神経の過度な興奮を特徴とする病態生理学的過程を指す。
【００１０】
本明細書中で「核酸」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味するか、あるいはデオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含有する分子を意味する。これら核酸には、センスおよびアンチセンス核酸を含むゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびオリゴヌクレオチドが含まれる。ｓｉＲＮＡなどのｓｉＮＡもまた含まれる。このような核酸はまた、生理的環境中でのこのような分子の安定性および半減期を増すためにリボースリン酸バックボーンの修飾を含有することもできる。
【００１１】
核酸は、二本鎖、一本鎖であってもよく、または二本鎖および一本鎖配列の両方の一部を含有することもできる。当業者には分かるはずだが、一本鎖の描写（「ワトソン」）はまた、もう一方の鎖の配列（「クリック」）も定める。本明細書中で用語「組換え核酸」とは、元来はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、一般にはエンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって形成され、普通は自然界に見出されない形態の核酸を意味する。したがって線形の単離された核酸、あるいは普通では接合されないＤＮＡ分子を結紮することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成された発現ベクターは、両方とも本発明の目的の組み換え体であるとみなされる。いったん組換え核酸が作られ、再び宿主細胞または生物体中へ導入されると、それは組換えによらずに、すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作においてではなく宿主細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞機構を用いて複製することになるが、このような核酸は、いったん組換えにより産生されると、その後は組換えによらずに複製されるけれども、まだ本発明の目的の組み換え体であるとみなされると理解される。
【００１２】
核酸配列の同定（およびアミノ酸配列の同定）は、保存モチーフ、コード領域、フランキング領域などのより大きな配列のサブセットであることができる参照用配列に基づいて計算される。参照用配列は、少なくとも約１８個の長さの残基、または少なくとも約３０個の長さの残基であることができ、あるいは対照されるその完全配列まで延びていてもよい。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０に記載されているＢＬＡＳＴ（デフォルト設定値すなわちパラメーターｗ＝４およびＴ＝１７）などの配列解析用アルゴリズムが当業界で知られている。
【００１３】
或る核酸が前述の核酸配列とハイブリッドを形成すると言われる場合、ハイブリッド形成はストリンジェントな条件下にある。ストリンジェントなハイブリッド形成条件の例は、５０℃以上および０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム／１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）でのハイブリッド形成である。ストリンジェントなハイブリッド形成条件の別の例は、溶液、すなわち５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍＬの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡの中で、４２℃で一晩のインキュベーション、続いて約６５℃の０．１×ＳＳＣ中でのその濾過物の洗浄である。ストリンジェントなハイブリッド形成条件は、上記の代表的な条件のような少なくともストリンジェントなハイブリッド形成条件であり、その場合これら条件はそれらが上記特定のストリンジェントな条件と少なくとも約８０％同じであるか、または少なくとも約９０％同じであるならば、少なくともストリンジェントであるとみなされる。他のストリンジェントなハイブリッド形成条件が当業界で知られており、それらもまた本発明のこの特定の実施形態の核酸を同定するために利用することができる。
【００１４】
同様に、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で区別なく使用され、ペプチドおよびオリゴペプチドを包含することができる。本明細書中で「ポリペプチド」が天然に産出するタンパク質分子のアミノ酸配列を指すために述べられる場合、「ポリペプチド」などの用語は、上述のタンパク質分子と関連した完全な天然のアミノ酸配列には必ずしも限定されず、本明細書中で提供されるアミノ酸配列と実質的な配列類似性または配列同一性を有するポリペプチドを含む生物学的に活性な変異型またはフラグメントを包含することができる。一般にフラグメントまたは変異型は、それらの配列が由来する親ポリペプチドの生物学的活性を保有する。
【００１５】
本明細書中で用いられる「ポリペプチド」は、ｉ）天然ポリペプチドの、ｉｉ）ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントの、またはｉｉｉ）ポリペプチドの生物学的に活性な変異型のアミノ酸配列を有する組換えまたは非組換えポリペプチドを指す。本発明において有用なポリペプチドは、任意の種、例えば天然であろうと、合成であろうと、半合成であろうと、または組換えであろうと任意の供給源由来の哺乳動物または非哺乳動物（例えば爬虫類、両生類、鳥類（例えば鶏））、特にヒト、齧歯類（例えば、ネズミまたはラット）、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、非ヒト霊長類動物、またはウマを含めた哺乳動物から得ることができる。幾つかの実施形態ではヒトポリペプチドの配列を含むポリペプチドが、特に対象となる。
【００１６】
ポリペプチドの「変異型」は、１つまたは複数のアミノ酸（例えば欠失、付加、挿入、および／または置換）によって変えられるアミノ酸配列として定義される。一般に「付加」は、その分子の末端に付加されるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指し、一方「挿入」は、天然に産出する分子の残基間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。変異型は、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する「保存的」変化、例えばロイシンのイソロイシンによる置き換えを有することができる。幾つかの例では変異型は、「非保存的」変化、例えばグリシンのトリプトファンによる置き換えを有することができる。類似の重要度の低い変異にはまた、アミノ酸の欠失または挿入、あるいはその両方を挙げることができる。生物活性または免疫活性を完全に破壊することなく、どのアミノ酸残基を、またはいかに多くのアミノ酸残基を置換、付加、挿入、または欠失することができるかを決定する指針は、当業界でよく知られているコンピュータ・プログラム、例えばＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを用いて見出すことができる。
【００１７】
症状または疾患を「治療すること」またはその「治療」には、（１）それら症状の少なくとも１つの症候を予防すること、すなわちその疾患に曝されるかまたは罹りやすい状態にあるが、まだその疾患の症候を経験または示していない哺乳動物に臨床的症候を顕著には発現させないこと、（２）その疾患を抑制すること、例えば疾患またはその症候の進展を阻止または緩和すること、あるいは（３）その疾患を取り除くこと、すなわち疾患またはその臨床的症候の退縮を引き起こすことが含まれる。
【００１８】
「治療に有効な量」または「効き目のある量」とは、疾患を治療するために哺乳動物または他の被検体に投与した場合、その疾患のためのそのような治療を実施するのに十分な化合物の量を意味する。「治療に有効な量」は、その化合物、疾患、およびその重症度、ならびに治療される被検体の年齢、体重などに応じて変わることになる。
【００１９】
用語「被検体」、「宿主」、「個体」、および「患者」は、本明細書中で述べる医薬的方法、組成物、および治療の必要性を有する任意の哺乳動物または非哺乳動物の種の１つまたは複数のメンバーを指すために本明細書中では区別なく使用される。したがって被検体および患者には、これらに限定されないがヒト、非ヒト霊長類動物、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、イノシシ（例えばブタ））、鳥類、および他の哺乳動物の被検体が含まれる。ヒトが、特に対象となる。
【００２０】
「哺乳動物」は、任意の哺乳動物の種の１つまたは複数のメンバーを指し、例としてイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、齧歯類等、および霊長類、特にヒトが挙げられる。非ヒト動物モデル、例えば哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ネズミ（ラット、マウス）、ウサギ等を実験的調査用に使用することができる。
【００２１】
本明細書中で用いられる用語「単位剤形」は、ヒトおよび動物の被検体用の単位投与量として適した物理的に分離した単位を指し、それぞれの単位が、薬学的に許容できる増量剤、担体、または賦形剤と共同して所望の効果を生むのに十分な量に計算された所定量の化合物を含有する。
【００２２】
「薬学的に許容できる医薬剤添加剤」、「薬学的に許容できる増量剤」、「薬学的に許容できる担体」、および「薬学的に許容できる補助剤」は、一般には安全で非毒性の、かつ生物学的にも他の点でも望ましくないものでない医薬組成物を調製するのに有用な医薬剤添加剤、担体、および補助剤を意味し、これらにはヒトの医薬用途だけでなく獣医用途のためにも許容できる医薬剤添加剤、増量剤、担体、および補助剤が含まれる。本明細書および特許請求の範囲で使用される「薬学的に許容できる医薬剤添加剤、増量剤、担体、および補助剤」には、両方のそのような医薬剤添加剤、増量剤、担体、および補助剤の１種類および２種類以上が含まれる。
【００２３】
本明細書中で用いられる「医薬組成物」は、哺乳動物、特にヒトなどの被検体に投与するのに適した組成物を包含することを意図する。一般に「医薬組成物」は無菌であり、またその被検体の体内で望ましくない反応を誘発する恐れのある汚染物質を含まない（例えば、その医薬組成物中の化合物が医薬用である）ことが好ましい。医薬組成物は、経口、口腔内、直腸、非経口、腹膜内、皮内、気管内などを含めた複数の様々な投与経路によりそれを必要とする被検体または患者に投与するように設計することができる。
【００２４】
用語「生体試料」は、生物から得られる様々なサンプル型を包含する。この用語は、生物学的起源の血液および他の液体試料、生検標本などの固体組織試料、あるいはそれらから得られる組織培養物または細胞、およびその子孫を包含する。この用語は、試薬による処理、可溶化、または特定成分の富化などによりそれらを獲得した後に任意の方法で操作されている試料を包含する。この用語は、臨床試料を包含し、また細胞培養における細胞、細胞上清、細胞ライゼート、血清、血漿、生体液、および組織試料も含む。
【００２５】
本発明についてさらに述べる前に、本発明は、記述する特定の実施形態には限定されず、したがって当然変わる可能性があることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるので、本明細書中で用いられる用語法は、単に特定の実施形態を記述するためのものに過ぎず、限定することを意図するものでないこともまた理解されたい。
【００２６】
数値の範囲が与えられる場合、文脈で明らかに別段の指示がない限り下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限および下限の値と、その表示された範囲中の任意の他の表示されたまたは間に挟まれた値との間にあるその間に挟まれた各値は、本発明の範囲内に包含されると了解される。その表示された範囲中の任意の具体的に除外される限界値の支配下で、これらの小さい方の範囲の上限値および下限値は独立にそれら小さい方の範囲に含めることができ、これらもまた本発明の範囲内に包含される。この表示された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、これらの含まれた限界値のどちらかまたは両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
【００２７】
別に定義しない限り、本明細書中で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する業界の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書中で述べるものと類似または同等の任意の方法および材料もまた本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を次に述べる。本明細書中で述べるすべての刊行物は、それら刊行物が引用されているものと関連した方法および／または材料を開示しまた記述するために参照により本明細書中に援用される。
【００２８】
本明細書中および添付の特許請求の範囲中で用いられる単数形「或る（ａ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈で明らかに別に指示されない限り複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば「或るタウ遺伝子産物」に関する言及は複数種類のそのような遺伝子産物を含み、また「そのｓｉＲＮＡ」に関する言及は１種類または複数種類のｓｉＲＮＡおよび当業者に知られているその等価物に関する言及を含むなど。さらに特許請求の範囲は何らかの任意選択の要素を除外するように書くことができることに留意されたい。したがってこの記述は、請求要素の列挙に関連して「唯一」、「単に」等のような排除的な用語法を使用するための、または「否定的」限定を使用するための根拠として働くことを意図している。
【００２９】
本明細書中で考察される刊行物は、本発明の出願日前のそれらの開示に対してのみ向けられる。本明細書においては、本発明が従来の発明によりそのような公開に先行する権利を与えられないことを認めるものと決して解釈されるべきではない。さらに、提供されるこれら公開日は実際の公開日とは異なる可能性もあり、それとは無関係に確認する必要がある場合もある。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、興奮毒性関連障害を治療するための候補薬剤を識別する方法を提供する。本発明はさらに、興奮毒性を減らす方法、および興奮毒性関連障害を治療する方法を提供する。
【００３１】
スクリーニング法
本発明は、興奮毒性関連障害を治療するための候補薬剤を識別する方法を提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法およびｉｎ  ｖｉｖｏ法の両方が提供される。
【００３２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法：
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、一般にタウ遺伝子産物を産生する細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験薬剤と接触させるステップ、およびもしあれば細胞中のタウ遺伝子産物のレベルに及ぼすその試験薬剤の効果を判定するステップを含む。細胞中のタウ遺伝子産物のレベルを低下させる試験薬剤は、興奮毒性関連障害の治療用候補薬剤と考えられる。幾つかの実施形態では主題のスクリーニング法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われ、例えば細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験薬剤と接触し、また判定のステップはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【００３３】
例えば、その試験薬剤の不在下でのタウ遺伝子産物のレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはそれ以上、細胞中のタウ遺伝子産物のレベルを低下させる試験薬剤は、興奮毒性関連障害の治療用候補薬剤とみなされる。
【００３４】
幾つかの実施形態ではその試験薬剤の不在下でのタウｍＲＮＡのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはそれ以上、細胞中（例えば神経細胞中）のタウｍＲＮＡのレベルを低下させる試験薬剤は、興奮毒性関連障害の治療用候補薬剤とみなされる。
【００３５】
幾つかの実施形態ではその試験薬剤の不在下での細胞中のタウポリペプチドのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはそれ以上、細胞中（例えば神経細胞中）のタウポリペプチドのレベルを低下させる試験薬剤は、興奮毒性関連障害の治療用候補薬剤とみなされる。
【００３６】
幾つかの実施形態ではその試験薬剤の不在下での細胞中の非過リン酸化タウポリペプチドのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはそれ以上、細胞中（例えば神経細胞中）の非過リン酸化タウポリペプチドのレベルを低下させる試験薬剤は、興奮毒性関連障害の治療用候補薬剤とみなされる。
【００３７】
幾つかの実施形態ではその試験薬剤の不在下での細胞中の非凝集性（例えば可溶性）タウポリペプチドのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはそれ以上、細胞中（例えば神経細胞中）の非凝集性（例えば可溶性）タウポリペプチドのレベルを低下させる試験薬剤は、興奮毒性関連障害の治療用候補薬剤とみなされる。
【００３８】
これら遺伝子産物には、タウポリペプチドおよびタウ核酸（例えば、タウｍＲＮＡ、タウｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーなど）が挙げられる。幾つかの実施形態では主題の方法は、そのタウポリペプチドのリン酸化状態とは関係なく、またそのタウポリペプチドの凝集状態（「可溶性状態」）とは関係なくタウポリペプチドのレベルを低下させる薬剤を識別する。例えばこの方法は、過リン酸化タウおよび過リン酸化されないタウの両方のレベルを低下させる薬剤を識別し、また凝集性タウおよび非凝集性（例えば可溶性）タウの両方のレベルを低下させる薬剤を識別する。他の実施形態では主題の方法は、非過リン酸化タウのレベルを低下させる薬剤、および非凝集性（例えば可溶性）タウのレベルを低下させる薬剤を特異的に識別する。例えば、幾つかの実施形態では主題の方法は、タウをリン酸化するキナーゼのレベルまたは活性を低下させる薬剤を識別しない。
【００３９】
幾つかの実施形態ではタウ遺伝子産物のレベルを低下させる試験薬剤はまた、１）タウの川下効果、２）タウ以外の分子（例えばｆｙｎキナーゼ）とタウの相互作用、３）タウの１つまたは複数の生理機能（ただしタウの生理機能には、ａ）微小管の安定化、ｂ）細胞内の輸送および転送の調節（例えば軸索輸送の調節、樹状突起輸送、オルガネラの転送など）、およびｃ）神経突起伸長の促進が含まれる）のうちの１つまたは複数を変える（例えば増加または減少させる）。タウ遺伝子産物のレベルの低下は、Ａβ誘発性欠陥から新生ニューロン（例えば歯状回（ＤＧ）ニューロン）を防護することができ、またＤＧ神経回路網中へのこのような新生ニューロンの組込みを向上させることができる。したがって幾つかの実施形態ではタウ遺伝子産物のレベルを低下させる試験薬剤はまた、歯状回（ＤＧ）回路への新生ニューロンの組込みを向上させ、かつ／またはＡβ誘発性欠陥から新生ＤＧニューロンを防護する。
【００４０】
「タウポリペプチド」は、微小管と結合する、例えばβ−チューブリンと結合する、また本明細書中で詳細に考察される構造的な特徴および／またはアミノ酸配列の特徴を有するポリペプチドを指す。「タウポリペプチド」は、中枢神経系（ＣＮＳ、例えばＧｏｅｄｅｒｔおよびＪａｋｅｓ（１９９０）Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．９：４２２５〜４２３０参照）中に、または末梢神経系（ＰＮＳ、例えばＣｏｕｃｈｉｅら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４３７８参照）中に見出される任意のタウアイソフォームを指す。ヒトのタウアイソフォームを図５に模式的に示す。タウポリペプチドは当業界で知られており、また様々なタウタンパク質のアミノ酸配列が知られている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＣ０４２７７，ＮＰ＿０５８５１９、ＡＡＣ０４２７９，ＮＰ＿００５９０１、ＮＰ＿０５８５１８、ＮＰ＿０５８５２５、およびＡＡＨ９８２８１を参照されたい。このようなタウタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、当業界で知られている。例えば、図６Ａに示したアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ０４２７７、アイソフォーム１）をコードするＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１６８３５（図６Ｂ、配列番号２）、図６Ｃに示したアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０１６８３５、アイソフォーム２）をコードするＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００５９１０（図６Ｄ、配列番号４）、図６Ｅに示したアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿０５８５１８、アイソフォーム３）をコードするＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１６８３４（図６Ｆ、配列番号６）、図６Ｇに示したアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＨ９８２８１、アイソフォーム４）をコードするＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ０９８２８１（図６Ｈ、配列番号８）を参照されたい。
【００４１】
用語「タウポリペプチド」は、任意の既知のタウアミノ酸配列、そのフラグメント（例えばその微小管結合フラグメント）、またはそのオルソログを含むポリペプチドを包含する。さらに用語「タウポリペプチド」は、任意の既知のタウポリペプチドと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列アイデンティティを有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。例えば、幾つかの実施形態ではタウポリペプチドは、図６Ａ（配列番号１）、図６Ｃ（配列番号３）、図６Ｅ（配列番号５）、および図６Ｇ（配列番号７）の１つまたは複数に示したアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列アイデンティティを有するアミノ酸配列を含む。
【００４２】
タウポリペプチドには、配列番号１（また図６Ａに示す）で示されるアミノ酸配列の長さ約５０個から約７５８個のアミノ酸（例えば、長さ約５０個から約１００個、約１００個から約２００個、約２００個から約３００個、約３００個から約４００個、約４００個から約５００個、約５００個から約６００個、または約６００個から約７５８個の連続するアミノ酸）の対応するフラグメントと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列アイデンティティを有する、長さ約５０個から約７５８個のアミノ酸（例えば、長さ約５０個から約１００個、約１００個から約２００個、約２００個から約３００個、約３００個から約４００個、約４００個から約５００個、約５００個から約６００個、または約６００個から約７５８個のアミノ酸）のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。
【００４３】
タウポリペプチドには、配列番号３で示される（また図６Ｃに示す）アミノ酸配列の５０個から約１００個、約１００個から約１５０個、約１５０個から約２００個、約２００個から約２５０個、約２５０個から約３００個、約３００個から約３５０個、約３５０個から約４００個、または約４００個から約４４０個の連続するアミノ酸の対応するフラグメントと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列アイデンティティを有する、長さ約５０個から約４４０個のアミノ酸（例えば、長さ約５０個から約１００個、約１００個から約１５０個、約１５０個から約２００個、約２００個から約２５０個、約２５０個から約３００個、約３００個から約３５０個、約３５０個から約４００個、または約４００個から約４４０個のアミノ酸）のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。
【００４４】
タウポリペプチドには、配列番号５で示される（また図６Ｅに示す）アミノ酸配列の０個から約１００個、約１００個から約１５０個、約１５０個から約２００個、約２００個から約２５０個、約２５０個から約３００個、約３００個から約３５０個、または約３５０個から約３８０個の連続するアミノ酸の対応するフラグメントと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列アイデンティティを有する、長さ約５０個から約３８０個のアミノ酸（例えば、長さ約５０個から約１００個、約１００個から約１５０個、約１５０個から約２００個、約２００個から約２５０個、約２５０個から約３００個、約３００個から約３５０個、または約３５０個から約３８０個のアミノ酸）のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。
【００４５】
タウポリペプチドには、配列番号７で示される（また図６Ｇに示す）アミノ酸配列の長さ５０個から約１００個、約１００個から約１５０個、約１５０個から約２００個、約２００個から約２５０個、約２５０個から約３００個、または約３００個から約３５０個の連続するアミノ酸の対応するフラグメントと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列アイデンティティを有する、長さ約５０個から約３５０個のアミノ酸（例えば、長さ約５０個から約１００個、約１００個から約１５０個、約１５０個から約２００個、約２００個から約２５０個、約２５０個から約３００個、または約３００個から約３５０個のアミノ酸）のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。
【００４６】
タウポリペプチドの活性フラグメント（例えば、微小管結合フラグメント）には、１）図６Ａ（配列番号１）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸第５６９番〜第６９３番、２）図６Ｃ（配列番号３）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸第２５２番〜第３７６番、３）図６Ｅ（配列番号５）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸第１９４番〜第３１８番、および４）図６Ｇ（配列番号７）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸第１９４番〜第２８７番のうちの１つまたは複数で示されるアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列アイデンティティを有するタウポリペプチドの少なくとも約３０個、少なくとも約６０個、少なくとも約９０個、または少なくとも約１２０個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドが含まれる。
【００４７】
幾つかの実施形態では「タウポリペプチド」は、過リン酸化タウポリペプチドと非過リン酸化タウポリペプチドの両方を含む。他の実施形態では過リン酸化タウポリペプチドが、特に除外される。タウポリペプチドが過リン酸化されているとみなされるか否かは、個々のタウポリペプチドのレベルで、またはタウポリペプチドの集団のレベルで決めることができる。「過リン酸化」タウとはまた、タウのリン酸化のレベルが、正常な対照よりも著しく高い、例えばタウのリン酸化のレベルが、正常な個体（例えば、アルツハイマー病またはいかなる他の興奮毒性関連障害もない個体）中のタウポリペプチドの集団中に存在するタウのリン酸化のレベルよりも少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％（すなわち２倍）、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍、または１００倍超であるタウポリペプチドの集団（例えば、細胞中または組織中のタウポリペプチド）も意味する。「非過リン酸化」タウは、リン酸化のレベルが対照のレベル、例えば正常な個体中のタウポリペプチドの集団中に存在するリン酸化のレベルよりも２０％以下高いタウポリペプチドの集団を指す。生理的条件下でリン酸化され得るタウ中のアミノ酸残基には、Ｓｅｒ−４６、Ｓｅｒ−１９５、Ｓｅｒ−１９８、Ｓｅｒ−１９９、Ｓｅｒ−２０２、Ｓｅｒ−２１４、Ｓｅｒ−２３５、Ｓｅｒ−２６２、Ｓｅｒ−２９３、Ｓｅｒ−３２４、Ｓｅｒ−３５６、Ｓｅｒ−３９６、Ｓｅｒ−４０４、Ｓｅｒ−４０９、Ｔｈｒ−５０、Ｔｈｒ−６９、Ｔｈｒ−１１１、Ｔｈｒ−１５３、Ｔｈｒ−１７５、Ｔｈｒ−１８１、Ｔｈｒ−２０５、Ｔｈｒ−２１２、Ｔｈｒ−２１７、およびＴｈｒ−２３１が挙げられる。ただしこの付番はタウの４４１個のアミノ酸形態（例えば、図５に示した４個の反復および２個の挿入を含むタウアイソフォーム）に基づく。
【００４８】
タウポリペプチドの集団のリン酸化状態は、リン酸化タウエピトープに対して特異的な１種類または複数種類の抗体を用いるイムノアッセイ（例えば、酵素免疫吸着測定、蛋白（または「ウェスタン」）ブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、免疫組織化学染色など）を使用して簡単に判定することができる。例えば、Ａｌｏｎｓｏら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３７９７を参照されたい。例えば、下記の抗体およびそれらが特異的に認識するアミノ酸残基（抗体の後の括弧内に示す）、すなわち１２Ｅ８（Ｓｅｒ−Ｐ２６２／３５６）、Ｍ４（Ｔｈｒ−Ｐ２３１およびＳｅｒ−Ｐ２３５）、ＰＨＦ−１（Ｓｅｒ−Ｐ３９６／４０４）、ＡＦ１００（Ｔｈｒ−Ｐ２１２およびＳｅｒ−Ｐ２３５）、ＡＦ１２０（Ｔｈｒ−Ｐ１８１）、およびＲ１４５（Ｓｅｒ−Ｐ４２２）が使用に適している。例えば、米国特許第６，１２１，００３号明細書、同第７，１７６，２９０号明細書、および同第６，５００，６７４号明細書に記載されている抗体もまた使用に適している。
【００４９】
用語「タウポリペプチド」にはまた、タウ融合タンパク質、例えばタウおよび融合パートナーを含むタンパク質が含まれる。この場合、好適な融合パートナーには、これらに限定されないがエピトープタグ、金属イオン親和性ペプチド、蛍光タンパク質、検出可能な（例えば、色素産生、蛍光、化学発光など）産物を生む酵素が挙げられる。タウ融合タンパク質は、異種ポリペプチド（例えば、タウポリペプチド以外のポリペプチド）と融合したタウポリペプチドを含み、この場合、異種ポリペプチドもまた「融合パートナー」と呼ばれる。タウ融合タンパク質においてタウポリペプチドは、融合パートナーのＮ末端と、融合パートナーのＣ末端と、または内部で融合パートナーと融合することができる。融合パートナーが短い（例えば、アミノ酸５０個未満の長さ）ポリペプチドの場合、融合パートナーはそのタウポリペプチドのＮ末端と、タウポリペプチドのＣ末端と、またはタウポリペプチド中の内部部位で融合することができる。
【００５０】
エピトープタグには、そのペプチドと、例えばそのペプチドによって形成されるエピトープと特異的に結合する抗体（例えば、検出可能に標識された抗体）を用いて検出することができるペプチドが含まれる。好適なエピトープタグには、これらに限定されないがグルタチオン−Ｓ転移酵素（ＧＳＴ）タグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ（例えば、Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９〜２１６５（１９８８）参照）、ｃ−ｍｙｃタグ（例えば、Ｅｖａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ，５：３６１０〜３６１６（１９８５）参照）、単純へルペスウィルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ（例えば、Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７〜５５３（１９９０）参照）、およびフラジェリン（ＦＬＡＧ）タンパク質タグ（例えば、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓを含むペプチド、配列番号９）が挙げられる。好適な金属イオン親和性ペプチドには、ポリヒスチジンペプチド（例えば（Ｈｉｓ）ｎ、ただしｎ＝３〜６）などが挙げられる。
【００５１】
好適な酵素融合パートナーには、基質に作用して検出可能なシグナル（例えば、有色産物、蛍光産物、化学発光産物など）を発生する産物を産生する酵素を含む酵素類が挙げられる。好適な酵素には、これらに限定されないがルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどが挙げられる。
【００５２】
好適な融合パートナーには、これらに限定されないが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３（５１４８）：８０２〜８０５（Ｆｅｂ  １１，１９９４）、およびＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ−ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ５５７６２））、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、１．Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（１８０１  ｄｅ  Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ  Ｂｌｖｄ．  Ｗｅｓｔ，８ｔｈ  Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ（Ｑｕｅｂｅｃ）Ｃａｎａｄａ  Ｈ３Ｈ  １Ｊ９）、２．Ｓｔａｕｂｅｒ，Ｒ．Ｈ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（３）：４６２〜４７１（１９９８）、３．Ｈｅｉｍ，Ｒ．およびＴｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８〜１８２（１９９６））、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、１．Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（１０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ  ９４３０３））、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１２）：５４０８〜５４１７（１９９３））、β−ガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５（８）：２６０３〜２６０７（Ａｐｒ  １９８８））、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）（国際公開第９２／１５６７３号パンフレット、国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９８／１４６０５号パンフレット、国際公開第９８／２６２７７号パンフレット、国際公開第９９／４９０１９号パンフレット、米国特許第５，２９２，６５８号明細書、米国特許第５，４１８，１５５号明細書、米国特許第５，６８３，８８８号明細書、米国特許第５，７４１，６６８号明細書、米国特許第５，７７７，０７９号明細書、米国特許第５，８０４，３８７号明細書、米国特許第５，８７４，３０４号明細書、米国特許第５，８７６，９９５号明細書、および米国特許第５，９２５，５５８号明細書）、レニラ・レニホルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、レニラ・ムレリ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉ）、またはプチロサルクス・ゲルニ（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ  ｇｕｅｒｎｙｉ）などの種由来のＧＦＰ（例えば、国際公開第９９／４９０１９号パンフレットおよびＰｅｅｌｌｅら（２００１）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０：５０７〜５１９に記載されている）、「ヒト化」組換えＧＦＰ（ｈｒＧＦＰ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａｎ）の種由来の様々な蛍光および有色タンパク質のいずれか（例えば、Ｍａｔｚら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９〜９７３、米国特許出願公開第２００２／０１９７６７６号明細書、または米国特許出願公開第２００５／００３２０８５号明細書に記載されている）などが挙げられる。
【００５３】
タウ遺伝子産物には、核酸遺伝子産物、例えばタウｍＲＮＡが挙げられる。タウｍＲＮＡ（および対応するｃＤＮＡ）は当業界で知られており、またタウｍＲＮＡおよびタウｃＤＮＡのヌクレオチド配列が知られている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１６８３５、ＮＭ＿００５９１０、ＮＭ＿０１６８３４、およびＢＣ０９８２８１を参照されたい。用語「タウ核酸遺伝子産物」は、任意の既知のタウアミノ酸配列、そのフラグメント（例えばその活性フラグメント）、またはそのオルソログを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。さらに用語「タウ核酸遺伝子産物」は、任意の既知のタウ核酸と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のヌクレオチド配列アイデンティティを有するヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。例えば用語「タウ核酸遺伝子産物」は、図６Ａ、６Ｃ、６Ｅ、および６Ｇのいずれか１つ（例えば、配列番号１、３、５、および７のいずれか１つ）で示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のヌクレオチド配列アイデンティティを有するヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。上記タウフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もまた包含される。タウ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸もまた包含される。
【００５４】
タウ遺伝子産物を産生し、かつ主題のスクリーニング法に使用するのに適した細胞には、タウ遺伝子産物を普通に産生する哺乳動物細胞と、タウ遺伝子産物を産生するように遺伝的修飾を加えられた哺乳動物細胞（例えば、タウ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝的修飾を加えられ、その核酸の発現が遺伝的修飾を加えられた細胞中でタウ遺伝子産物の産生を引き起こす細胞）とが含まれる。
【００５５】
好適な哺乳動物細胞には、一次細胞および不死化細胞系統が挙げられる。好適な哺乳動物細胞系統には、ヒト細胞系統、非ヒト霊長類動物細胞系統、齧歯動物（例えばマウス、ラット）細胞系統などが挙げられる。好適な哺乳動物細胞系統には、これらに限定されないがＨｅＬａ細胞（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）Ｎｏ．ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬＩ．３）、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞などが挙げられる。
【００５６】
幾つかの実施形態では細胞は、神経細胞または神経様細胞である。これら細胞は、ヒト、非ヒト霊長類動物、マウス、またはラット起源のものであるか、あるいはヒト、非ヒト霊長類動物、ラット、またはマウス以外の哺乳動物から得られるものであることができる。好適な細胞系統には、これらに限定されないがヒト神経膠腫細胞系統、例えばＳＶＧｐ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８６２１）、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７１８）、ＳＷ  １０８８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２）、ＳＷ  １７８３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３）、ＬＬＮ−１８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６１０）、ＬＮＺＴＡ３ＷＴ４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１５４３）、ＬＮＺＴＡ３ＷＴ１１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１５４４）、Ｕ−１３８  ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１６）、Ｕ−８７  ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４）、Ｈ４（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４８）、およびＬＮ−２２９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６１１）と、ヒト髄芽細胞腫由来の細胞系統、例えばＤ３４２  Ｍｅｄ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１８７）、Ｄａｏｙ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１８６）、Ｄ２８３  Ｍｅｄ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１８５）と、ヒト腫瘍由来の神経様細胞、例えばＰＦＳＫ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０６０）、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１４９）、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１３７）、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１４２）、ＩＭＲ−３２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２７）などと、マウス神経細胞系統、例えばＢＣ３Ｈ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４４３）、ＥＯＣ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４６７）、Ｃ８−Ｄ３０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３４）、Ｃ８−Ｓ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３５）、Ｎｅｕｒｏ−２ａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１３１）、ＮＢ４１Ａ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１４７）、ＳＷ１０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７６６）、ＮＧ１０８−１５（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２３１７）と、ラット神経細胞系統、例えばＰＣ−１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７２１）、ＣＴＸ  ＴＮＡ２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２００６）、Ｃ６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０７）、Ｆ９８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３９７）、ＲＧ２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４３３）、Ｂ３５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７５４）、Ｒ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７６４）、ＳＣＰ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７００）、ＯＡ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６５３８）が挙げられる。
【００５７】
「試験薬剤」、「候補薬剤」、および本明細書中での文法的同義語は、本明細書中で区別なく使用され、神経細胞中のタウ遺伝子産物のレベルを低下させる活性の有無を試験されることになる任意の分子（例えば、タンパク質（これには、本明細書中ではタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドが含まれる）、小型の（すなわちサイズが５〜１０００Ｄａ、１００〜７５０Ｄａ、２００〜５００Ｄａ、または５００Ｄａ未満）あるいは有機または無機の分子、多糖、ポリヌクレオチドなど）を意味する。
【００５８】
様々な異なる候補薬剤を、上記方法によってスクリーニングすることができる。候補薬剤は、非常に多くの化学的等級、例えば５０ダルトンを超え（例えば、少なくとも約５０Ｄａ、少なくとも約１００Ｄａ、少なくとも約１５０Ｄａ、少なくとも約２００Ｄａ、少なくとも約２５０Ｄａ、または少なくとも約５００Ｄａ）、かつ約２０，０００ダルトン未満、約１０，０００ダルトン未満、約５，０００ダルトン未満、または約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小型有機化合物を包含する。例えば、幾つかの実施形態では好適な候補薬剤は、約５００Ｄａから約２０，０００Ｄａ、例えば約５００Ｄａから約１０００Ｄａ、約１０００Ｄａから約２０００Ｄａ、約２０００Ｄａから約２５００Ｄａ、約２５００Ｄａから約５０００Ｄａ、約５０００Ｄａから約１０，０００Ｄａ、または約１０，０００Ｄａから約２０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する有機化合物である。
【００５９】
候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、例えば水素結合にとって必要な官能基を含むことができ、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基、あるいは少なくとも２種類のこれら官能性化学基を含むことができる。候補薬剤は、１種類または複数種類の上記官能基で置換された環状炭素または複素環式構造および／もしくは芳香族または多環芳香族構造を含むことができる。候補薬剤はまた、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体、構造的類似物、または組合せを含めた生体分子の中に見出される。
【００６０】
候補薬剤は、合成または天然の化合物を含めた様々な供給源から得られる。例えば非常に多くの手段が、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含めた様々な有機化合物および生体分子のランダムおよび指向合成に利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーが利用可能であるか、または容易に作り出される。さらに天然の、または合成的に作り出されるライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的、および生化学的手段により容易に修飾され、また組合せライブラリーを作り出すために使用することができる。既知の薬理作用のある物質を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指向またはランダム化学修飾にかけて構造的類似物を作り出すこともできる。さらにスクリーニングを、既知の薬理学的に活性な化合物およびその化学的類似物へ、または未知の特性を有する新規薬剤、例えば合理的薬物設計により創り出されるものへ向けることもできる。
【００６１】
一実施形態では候補の修飾物質は合成化合物である。かなり多くの手法が、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含めた様々な有機化合物および生体分子のランダムおよび指向合成に利用可能である。例えば、酵素的方法だけでなくランダム化学の方法を含めて新規化合物を生み出すための方法について考察している国際公開第９４／２４３１４号パンフレット（これにより明示的に参照により援用される）を参照されたい。国際公開第９４／２４３１４号パンフレットに記載されているように本発明の方法の利点の１つは、アッセイに先立って候補の修飾物質の特徴を明らかにする必要がなく、タウ遺伝子産物のレベルに影響を与える候補の修飾物質のみを識別する必要があることである。
【００６２】
別の実施形態では候補薬剤は、利用可能なまたは容易に作り出される細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態で天然の化合物のライブラリーとして提供される。さらに天然または合成的に作り出されるライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的、および生化学的手段により容易に修飾される。既知の薬理作用のある物質を、酵素的修飾を含めた指向またはランダム化学修飾にかけて構造的類似物を作り出すこともできる。
【００６３】
一実施形態では候補薬剤は、タンパク質（抗体、抗体フラグメント（すなわち、抗原結合領域を含有するフラグメント、例えばＦＡｂ）、一本鎖抗体などを含めた）、核酸、および化学部分を含む。一実施形態では候補薬剤は、天然に産出するタンパク質または天然に産出するタンパク質のフラグメントである。したがって、例えばタンパク質を含有する細胞抽出物、あるいはタンパク質性細胞抽出物のランダムまたは指向消化物を試験することができる。この方法で原核および真核タンパク質のライブラリーをスクリーニング用に作成することができる。他の実施形態には、細菌、真菌、ウィルス、および哺乳動物のタンパク質（例えばヒトのタンパク質）のライブラリーが含まれる。
【００６４】
一実施形態では候補薬剤は有機部分である。この実施形態では国際公開第９４／２４３１４号パンフレット中に全般的に述べられているように候補薬剤は、化学的に修飾することができる一連の物質から合成される。本明細書中で「化学的に修飾される」には、酵素的反応だけでなく伝統的な化学反応が含まれる。これらの物質には、一般にアルキル基（アルカン、アルケン、アルキン、およびヘテロアルキルを含めた）、アリール基（アレーンおよびヘテロアリールを含めた）、アルコール、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン、酸、エステル、アミド、環式化合物、複素環式化合物（プリン、ピリミジン、ベンゾジアゼピン、β−ラクタム、テトラシクリン（ｔｅｔｒａｃｙｌｉｎｅｓ）、セファロスポリン、および炭水化物を含めた）、ステロイド（エストロゲン、アンドロゲン、コルチゾン、エクジソン（ｅｃｏｄｙｓｏｎｅ）などを含めた）、アルカロイド（麦角、ビンカ、クラーレ、ピロリジジン（ｐｙｒｏｌｌｉｚｄｉｎｅ）、およびマイトマイシンを含めた）、有機金属化合物、ヘテロ原子を有する化合物、アミノ酸、およびヌクレオシドが挙げられるが、これらには限定されない。化学反応（酵素的反応を含めた）をこれら部分の上で行って新規物質または候補薬剤を形成することができ、次いで本発明を用いて試験することができる。
【００６５】
本明細書中で用いられる用語「判定する」は量的および質的判定の両方を指し、したがって用語「判定する」は、本明細書中では「アッセイする」、「測定する」などと区別せずに用いられる。
【００６６】
アッセイは、１種類または複数種類の追加の試薬を含むことができる。これらには、最適な酵素活性を促進するためにかつ／もしくは非特異的またはバックグラウンド活性を低下させるために用いられる薬剤を含めた塩などの試薬、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などが挙げられる。プロテアーゼ阻害剤、殺菌剤などのアッセイの効率を向上させる試薬を使用することができる。アッセイ混合物の成分は、必要な活性を可能にする任意の順序で加えることができる。インキュベーションは、例えば４℃から４０℃の間の任意の適切な温度で行われる。インキュベーション期間は、最適な活性を得るように選択されるが、また迅速な高処理量のスクリーニングを容易にするように最適化することもできる。一般には０．１時間から１時間の間で十分なはずである。
【００６７】
本発明のアッセイは対照を含み、好適な対照には標本（例えば、試験薬剤の不在下でタウ遺伝子産物を産生する細胞を含む標本）が挙げられる。通常は複数のアッセイ混合物を、異なる薬剤濃度で並行に流して様々な濃度に対する応答差を得る。一般にこれら濃度の１つが負の対照として、すなわちゼロ濃度におけるまたは検出レベル未満の負の対照として役立つ。
【００６８】
候補薬剤は、トリパンブルー色素排除、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド）アッセイなどのよく知られているアッセイを用いて、それが生きている真核細胞に対して示す可能性のある任意の細胞傷害作用（抗増殖作用以外の）に関して評価される。細胞傷害作用を示さない薬剤は候補薬剤とみなされる。
【００６９】
タウ核酸レベルの検出
幾つかの実施形態では主題のスクリーニング法は、タウ核酸を産生する細胞を試験薬剤と接触させ、もしあればタウ核酸レベルに及ぼすその試験薬剤の効果を判定することを含む。タウ核酸は、タウｍＲＮＡ、タウｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーなどを含む。細胞中のタウ核酸のレベルを検出するための好適な方法には、核酸ハイブリッド形成法および／または核酸増幅法が挙げられる。例えば核酸ハイブリッド形成法は、細胞中のタウｍＲＮＡか、またはタウｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを検出する核酸プローブを用いて行うことができる。核酸増幅法は、タウｍＲＮＡ（またはタウｍＲＮＡのｃＤＮＡコピー）を特異的に増幅する核酸プライマーを用いて行うことができる。幾つかの実施形態ではタウ特異的プライマーを用いた核酸増幅の後に、タウ特異的プローブを用いた核酸ハイブリッド形成が続く。
【００７０】
遺伝的修飾を加えた哺乳動物細胞
上記で言及したように幾つかの実施形態では主題のスクリーニング法は、試験薬剤を、タウ遺伝子産物を普通に産生する哺乳動物細胞と接触させるステップを含むことになる。他の実施形態では主題のスクリーニング法は、試験薬剤を、タウ遺伝子産物を産生するように遺伝的修飾を加えた哺乳動物細胞と接触させるステップを含むことになる。これらの実施形態では外来の核酸を親哺乳動物細胞中に導入する。この場合、外来の核酸（「タウ核酸」）は、タウ遺伝子産物を産生する遺伝的に修飾された哺乳動物細胞を生み出すタウ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００７１】
幾つかの実施形態ではタウをコードする核酸は、遺伝的修飾を加えた細胞中でのタウ遺伝子産物の産生を可能にする発現ベクター内に入れられる。発現ベクターは、誘導性または構成性であることができる転写および翻訳開始領域と、転写および翻訳終止領域とを与える。その場合、タウコード領域はこの転写開始領域と作用自在に連結し、かつこの転写開始領域の転写制御下にある。
【００７２】
当業界で知られている任意の発現ベクターを用いてタウ核酸を発現させることができる。発現ベクターは、一般にはプロモーターおよび／または細胞中で活性な他の転写制御エレメントと、適切な終止およびポリアデニル化シグナルとを含むはずである。発現ベクターは、一般に異種遺伝子産物（例えばタウ遺伝子産物）をコードする核酸配列の挿入を可能にするようにプロモーター配列の近くに位置した好都合な制限部位を有する。発現宿主中で作用する選択マーカーが存在してもよい。
【００７３】
好適な発現ベクターには、これらに限定されないがウィルスベクター（例えば、種痘ウィルス、ポリオウィルス、アデノウィルス（例えば、Ｌｉら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３５：２５４３〜２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６：５１５〜５２４，１９９９、ＬｉおよびＤａｖｉｄｓｏｎ、ＰＮＡＳ  ９２：７７００〜７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：１０８８〜１０９７，１９９９、国際公開第９４／１２６４９号パンフレット、同第９３／０３７６９号パンフレット、同第９３／１９１９１号パンフレット、同第９４／２８９３８号パンフレット、同第９５／１１９８４号パンフレット、および同第９５／００６５５号パンフレット参照）、アデノ随伴ウィルス（例えば、Ａｌｉら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：８１〜８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙら、ＰＮＡＳ  ９４：６９１６〜６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３８：２８５７〜２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：６８３〜６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：６４１〜６４８，１９９９、Ａｌｉら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ５：５９１〜５９４，１９９６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａの国際公開第９３／０９２３９号パンフレット、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２〜３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４〜１６５、およびＦｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３〜１０６１７参照）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウィルス、ヒト免疫不全ウィルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉら、ＰＮＡＳ  ９４：１０３１９〜２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：７８１２〜７８１６，１９９９参照）に基づくウィルスベクター）、およびレトロウィルスベクター（例えば、ネズミ白血病ウィルス、脾臓壊死ウィルス、ならびにラウス肉腫ウィルス、ハーベイ肉腫ウィルス、トリ白血病ウィルス、レンチウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、骨髄増殖性肉腫ウィルス、および乳癌ウィルスなどのレトロウィルスから得られるベクター）などが挙げられる。
【００７４】
非常に多くの好適な発現ベクターが当業者に知られており、多くが市販されている。例としては次のベクター、すなわちｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＣＭＶ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が提供される。しかし任意の他のベクターもそれが宿主細胞と適合性がある限り使用することができる。
【００７５】
利用される宿主／ベクター系によっては、構成性または誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めた複数の適切な転写および翻訳調節エレメントのいずれかを発現ベクター中で使用することができる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒらの著述（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６〜５４４参照）。
【００７６】
好適な真核プロモーター（真核細胞中で機能しうるプロモーター）の非限定的な例には、前初期サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、早期および後期ＳＶ４０、レトロウィルス由来の長末端重複配列（ＬＴＲ）、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベルの完全に範囲内にある。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有することもできる。発現ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含むこともできる。
【００７７】
幾つかの実施形態ではタウをコードしているヌクレオチド配列が、ニューロン特異的調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）と作用自在に連結している。ニューロン特異的プロモーターおよび他の調節エレメント（例えばエンハンサー）が当業界で知られている。好適なニューロン特異的調節配列には、これらに限定されないがニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ  ＨＳＥＮＯ２、Ｘ５１９５６参照）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）プロモーター、ニューロフィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７参照）、シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１参照）、ｔｈｙ−１プロモーター（例えば、Ｃｈｅｎら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：７〜１９参照）、セロトニン受容体プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｓ６２２８３参照）、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（ＴＨ）（例えば、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：２３６３〜２３８４（１９８７）およびＮｅｕｒｏｎ  ６：５８３〜５９４（１９９１）参照）、ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３４０２〜３４０６（１９９１）参照）、Ｌ７プロモーター（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：２２３〜２２６（１９９０）参照）、ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Ｂａｒｔｇｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３６４８〜３６５２（１９８８）参照）、エンケファリンプロモーター（例えば、Ｃｏｍｂら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：３７９３〜３８０５（１９８８）参照）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、およびＣＭＶエンハンサー／血小板由来増殖因子−βプロモーター（例えば、Ｌｉｕら（２００４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：５２〜６０参照）が挙げられる。
【００７８】
組換え発現ベクターは、幾つかの実施形態においては１種類または複数種類の選択マーカーを含むことになる。さらに発現ベクターは多くの実施形態において、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、あるいは真核細胞培養のためのネオマイシン耐性などの形質転換宿主細胞選択のための表現型形質を与えるために、１種類または複数種類の選択マーカー遺伝子を含有することになる。
【００７９】
遺伝的修飾を加えた哺乳動物細胞を作り出すためのタウ核酸による親哺乳動物細胞の遺伝的修飾は、当業界で知られている方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８２））参照）を用いて行われる。外来のＤＮＡを、ウィルス媒介性感染（レトロウィルス、修飾ヘルペスウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルスなど）によって、または直接ＤＮＡトランスフェクション（リポフェクション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーションなど）によって親細胞中に導入することができる。
【００８０】
核酸プローブ
好適な核酸プローブには、タウｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）とハイブリッドを形成し、その検出を可能にする核酸プローブが挙げられる。好適な核酸プローブは、幾つかの実施形態においては、ヌクレオチドの長さが１０から５０個、１２から４５個、１５から４０個、２０から３５個、２５から３０個などのヌクレオチドの長さが１０〜５０個の範囲内にある。例えばプローブは、幾つかの実施形態においては、ヌクレオチドの長さが１８から４０個、１９から３５個、２０から３０個、２１から２９個、２２から２８個、２３から２７個、２４から２５個の間の範囲内にあり、また言及した範囲の間の任意の長さであることになる。長さが約２０から２２個のヌクレオチドのプローブが、幾つかの実施形態においては特に考察の対象である。
【００８１】
好適なプローブは、検出用の標識と共役することができる。標識の付加を可能にする反応性官能基でオリゴヌクレオチドを誘導体化するための既知の幾つかの方法および組成物がある。例えば幾つかのアプローチが、プローブをビオチン化して、アビジンを介して放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、または電子高密度標識を付着することを可能にするために利用できる。例えば、フェリチン−アビジン−ビオチン標識の使用について開示しているＢｒｏｋｅｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９７８）５：３６３〜３８４、およびアミノアルキルホスホルアミドリンカーアームを介するオリゴヌクレオチドの５’末端のビオチン化について開示しているＣｈｏｌｌｅｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８５）１３：１５２９〜１５４１を参照されたい。幾つかの方法がまた、イソチオシアン酸エステル、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミドなどのアミノ反応性基により誘導体化された蛍光または他の型の化合物によって容易に標識されるアミノ誘導体化オリゴヌクレオチドを合成するために利用でき、例えばＣｏｎｎｏｌｌｙ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３１３１〜３１３９、Ｇｉｂｓｏｎら、（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６４５５〜６４６７、およびＭｉｙｏｓｈｉらの米国特許第４，６０５，７３５号明細書を参照されたい。これらの方法はまた、チオール特異的標識と反応することができるスルフヒドリル誘導体化オリゴヌクレオチドを合成するために利用でき、例えばＦｕｎｇらの米国特許第４，７５７，１４１号明細書、Ｃｏｎｎｏｌｌｙら（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４８５〜４５０２、およびＳｐｏａｔら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：４８３７〜４８４８を参照されたい。ＤＮＡフラグメントを標識するための方法体系の包括的な概説は、Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１６９：１〜２５中で得られる。
【００８２】
例えばプローブは、蛍光分子をプローブの非結紮末端に連結することによって蛍光標識することができる。適切な蛍光標識を選択するための指針は、Ｓｍｉｔｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：２６０〜３０１、Ｋａｒｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１）１９：４９５５〜４９６２、Ｈａｕｇｌａｎｄ著（１９８９）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）中に見出すことができる。蛍光標識の具体例には、米国特許第４，３１８，８４６号明細書およびＬｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９８９）１０：１５１〜１６４中に開示されているようなフルオレセインおよびその誘導体、ならびに６−ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＨＥＸ−１、ＨＥＸ−２、ＺＯＥ、ＴＥＴ−１、またはＮＡＮ−２などが挙げられる。
【００８３】
さらにプローブは、アクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識することができる。複数の具体的な技術が、ＡＥ標識をプローブ内の任意の場所に配置することを可能にする。例えば、Ｎｅｌｓｏｎら（１９５５）「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ」、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｋｒｉｃｋａ  Ｌ．Ｊ．編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）と、Ｎｅｌｓｏｎら（１９９４）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＨＰＡ）ｔｏ  ＰＣＲ」、Ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編（Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）と、Ｗｅｅｋｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）２９：１４７４〜１４７９と、Ｂｅｒｒｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）３４：２０８７〜２０９０を参照されたい。ＡＥ分子は、プローブ内の任意の場所に標識を配置することを可能にする非ヌクレオチド系リンカーアームの化学を用いてプローブに直接に付着することができる。例えば、米国特許第５，５８５，４８１号明細書および同第５，１８５，４３９号明細書を参照されたい。
【００８４】
固体支持体をアッセイにおいて使用する（例えば、プローブを用いて標的核酸の単位複製配列を捕捉するために）場合、オリゴヌクレオチドプローブは様々な方法でその固体支持体に付着させることができる。例えばプローブは、そのプローブの３’または５’末端ヌクレオチドを固体支持体に付着させることによって固体支持体に付着させることができる。幾つかの実施形態ではプローブは、プローブを固体支持体から離して遠くに置くように働くリンカーによって固体支持体に付着される。リンカーは、多くの実施形態においては少なくとも原子１５〜３０個の長さ、または少なくとも原子１５〜５０個の長さである。リンカーの必要な長さは、その使用される特定の固体支持体によって決まることになる。例えば、固体支持体として高架橋ポリスチレンを使用する場合、一般には原子６個のリンカーで十分である。
【００８５】
オリゴヌクレオチドプローブを固体支持体に付着させるために使用することができる様々なリンカーが当業界で知られている。リンカーは、固体支持体に付着させたプローブと標的配列のハイブリッド形成を顕著には妨げない任意の化合物から作ることができる。リンカーは、自動合成によってリンカー上に容易に付加することができるホモポリマーオリゴヌクレオチドから作ることができる。あるいは、官能基付きポリエチレングリコールなどのポリマーをリンカーとして使用することもできる。幾つかの実施形態では官能基付きポリエチレングリコールなどのポリマーを、それらが標的配列とプローブのハイブリッド形成を顕著には妨げないので使用する。幾つかの実施形態ではリンカーはポリエチレングリコールである。
【００８６】
固体支持体、リンカー、およびプローブの間の結合は、普通は高温の塩基性条件下での塩基保護基の除去の間に切断されない。好適な結合の例にはカルバミン酸エステルおよびアミド結合が挙げられる。
【００８７】
オリゴヌクレオチドプローブの固定化用固体支持体の好適な種類の例には、制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、ガラスプレート、ポリスチレン、アビジン被覆ポリスチレンビーズ、セルロース、ナイロン、アクリルアミドゲル、および活性化デキストランが挙げられる。
【００８８】
核酸プライマー
幾つかの実施形態では主題の方法は、タウ核酸（例えば、タウｍＲＮＡ、タウｍＲＮＡのｃＤＮＡコピー）を増幅することを含む。核酸増幅法は、タウｍＲＮＡ（例えば、タウｍＲＮＡのｃＤＮＡコピー）を特異的に増幅する核酸プライマーを用いて行うことができる。幾つかの実施形態ではタウ特異的プライマーを用いた核酸増幅の後に、タウ特異的プローブを用いた核酸ハイブリッド形成が続く。一般にプライマーは、タウ標的核酸増幅産物（また「単位複製配列」とも呼ばれる）を産生するためのタウ標的核酸の増幅を可能にする。プライマーは、幾つかの実施形態においては核酸プローブと共に使用されることになる。５’プライマーは、一般に標的核酸の増幅を可能にする領域と結合し、また多くの実施形態においては標的配列の５’部分と結合する。
【００８９】
５’および３’プライマーがハイブリッドを形成する標的タウヌクレオチド配列は、約１０個のヌクレオチドから約２２７７個のヌクレオチド、例えば約１０個のヌクレオチドから約２０個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチドから約３０個のヌクレオチド、約３０個のヌクレオチドから約４０個のヌクレオチド、約４０個のヌクレオチドから約５０個のヌクレオチド、約５０個のヌクレオチドから約６０個のヌクレオチド、約６０個のヌクレオチドから約７０個のヌクレオチド、約７０個のヌクレオチドから約１００個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチドから約１５０個のヌクレオチド、約１５０個のヌクレオチドから約２００個のヌクレオチド、約２００個のヌクレオチドから約２５０個のヌクレオチド、約２５０個のヌクレオチドから約３００個のヌクレオチド、約３００個のヌクレオチドから約４００個のヌクレオチド、約４００個のヌクレオチドから約５００個のヌクレオチド、約５００個のヌクレオチドから約７５０個のヌクレオチド、約７５０個のヌクレオチドから約１０００個のヌクレオチド、約１０００個のヌクレオチドから約１５００個のヌクレオチド、約１５００個のヌクレオチドから約２０００個のヌクレオチド、または約２０００個のヌクレオチドから約２２７０個のヌクレオチドによって互いに分離することができる。
【００９０】
生成する増幅産物は、ヌクレオチド約３０個からヌクレオチド約２２７０個、例えばヌクレオチド約３０個からヌクレオチド約５０個、ヌクレオチド約５０個からヌクレオチド約１００個、ヌクレオチド約１００個からヌクレオチド約１５０個、ヌクレオチド約１５０個からヌクレオチド約２００個、ヌクレオチド約２００個からヌクレオチド約２５０個、ヌクレオチド約２５０個からヌクレオチド約３００個、ヌクレオチド約３００個からヌクレオチド約４００個、ヌクレオチド約４００個からヌクレオチド約５００個、ヌクレオチド約５００個からヌクレオチド約７５０個、ヌクレオチド約７５０個からヌクレオチド約１０００個、ヌクレオチド約１０００個からヌクレオチド約１５００個、ヌクレオチド約１５００個からヌクレオチド約２０００個、またはヌクレオチド約２０００個からヌクレオチド約２２７０個の長さを有するはずである。
【００９１】
幾つかの実施形態ではプライマー配列の長さは、例えばヌクレオチド１０から７０個、ヌクレオチド１２から６５個、ヌクレオチド１５から６０個、ヌクレオチド２０から５５個、ヌクレオチド２５から５０個、ヌクレオチド３０から４５個などのヌクレオチド１０〜７５個の間の範囲にある。幾つかの実施形態ではプライマーは、ヌクレオチド１８から４０個、１９から３５個、２０から３０個、２１から２９個、２２から２８個、２３から２７個、２４から２５個の範囲の長さ、および言及した範囲の間の任意の長さである。ヌクレオチド約２０から２２個のプライマーを用いることができる。
【００９２】
幾つかの実施形態ではその第一および／または第二プライマーが、検出可能な標識を含む。好適な標識には、蛍光色素、例えばフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）と、放射性標識、例えば３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈなどとが挙げられる。標識は、その増幅ＤＮＡが高親和性結合パートナー、例えばアビジン、特異的抗体などを有するビオチン、ハプテンなどと複合し、その結合パートナーが検出可能な標識と複合する二段階系であることができる。標識は、プライマーの一方または両方と複合することができる。あるいは、増幅に使用されるヌクレオチドのプールが、標識を増幅産物中に組み込むために標識される。
【００９３】
幾つかの実施形態では内部対照（ＩＣ）または内標準が加えられて、任意の否定的結果がそのアッセイの失敗のせいではないことを示すための対照として働く。ＩＣの使用は、分離過程、増幅過程、および検出系の制御を可能にし、かつ試料に対するアッセイ遂行の監視および定量化を可能にする。ＩＣは、任意の適切な時点で、例えば溶解バッファー中に含めることができる。一実施形態ではＩＣは、ファージ核酸を含む。アッセイにおいて固体支持体を使用する場合にはその固体支持体は内標準に対して特異的なプローブ（ＩＣプローブ）をさらに含み、それによってＩＣプローブを用いた場合の捕捉を容易にすることができる。任意選択でＩＣプローブを、標的配列の検出可能な標識とは異なる検出可能な標識と共役させることができる。検出可能な標識が蛍光団である実施形態ではＩＣを分光光度的に、また検出限界の検討によって定量することができる。
【００９４】
別の実施形態では本明細書中で述べたＩＣを、当業者に知られているまた本明細書中で述べた標準的な手法に従って試料から単離されたＲＮＡと組み合わせる。次いで逆転写酵素を用いてＲＮＡを逆転写してコピーＤＮＡを得る。任意選択で、標識したプライマーを用いてこのｃＤＮＡ配列を増幅（例えばＰＣＲによって）することができる。この増幅産物を一般には電気泳動によって分離し、放射能の量（増幅された産物の量に比例する）が求められる。次いで、必要に応じて既知の標準が生成するシグナルと比較することによって試料中のｍＲＮＡの量を計算することができる。
【００９５】
プライマーおよびプローブの合成
上記プライマーおよびプローブは、本明細書中で開示される配列に基づいて設計され、また標準的手法、例えば米国特許第４，４５８，０６６号明細書および同第４，４１５，７３２号明細書（参照により本明細書中に援用される）、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：２２２３〜２３１１、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１３（１  Ａｐｒ．１９８７）中に開示されているようなホスホルアミダイト化学反応による固相合成によって容易に合成される。他の化学合成法には、例えばＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：９０に記載のホスホトリエステル法およびＢｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：１０９に記載のホスホジエステル法が挙げられる。ポリ（Ａ）またはポリ（Ｃ）、あるいは他の非相補的ヌクレオチド伸長部を、これらの同じ方法を用いてプローブ中に組み込むことができる。ヘキサエチレンオキシド伸長部を、当業界で知られている方法によってプローブと共役させることができる。Ｃｌｏａｄら（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６３２４〜６３２６、Ｌｅｖｅｎｓｏｎらの米国特許第４，９１４，２１０号明細書、Ｄｕｒａｎｄら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６３５３〜６３５９、およびＨｏｒｎら（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：４７０５〜４７０８。
【００９６】
タウポリペプチドレベルの検出
幾つかの実施形態では主題の方法は、細胞中のタウポリペプチドのレベルを検出することを含む。タウポリペプチドのレベルを検出するための好適な方法には、免疫学的測定法、例えば酵素免疫吸着測定法、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、タンパク質（「ウェスタン」）ブロット、タウ融合タンパク質の融合パートナーを検出するアッセイなどが挙げられる。
【００９７】
幾つかの実施形態では免疫学的測定法は、タウポリペプチドに対して特異的な抗体の使用を含む。その抗タウ抗体は、検出可能な標識を含むことができる。抗タウ抗体は、幾つかの実施形態においては、例えば放射性同位元素、検出可能な産物を生成する酵素、蛍光タンパク質、色素産生タンパク質などにより検出可能に標識されることになる。抗タウ抗体は、さらに特異的結合対のメンバー、例えばビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対のメンバー）などの他の部分と複合させることができる。抗タウ抗体はまた、これらに限定されないがポリスチレンプレートまたはビーズ、磁性ビーズ、試験ストリップ、膜などを含めた固体支持体と結合させることができる。
【００９８】
幾つかの実施形態では抗タウ抗体は、直接的または間接的に検出可能に標識される。直接標識には、放射性同位元素（例えば１２５Ｉ、３５Ｓなど）と、その産物が検出可能な酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなど）と、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリンなど）と、蛍光発光金属、例えばＥＤＴＡなどの金属キレート基を通じて抗体に付着した１５２Ｅｕまたは他のランタン系列のものと、化学発光化合物、例えばルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩などと、生物発光化合物、例えばルシフェリンと、蛍光タンパク質などが挙げられる。間接標識には、タウ特異的抗体に対して特異的な第二抗体（この第二抗体が前述のように標識される）と、特異的結合対のメンバー、例えばビオチン−アビジンなどとが挙げられる。
【００９９】
幾つかの実施形態では抗タウ抗体は、検出可能なシグナルを可能にするタンパク質を、その抗体と共有結合した状態で含む。好適なタンパク質には、これらに限定されないが蛍光タンパク質および酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなど）が挙げられる。好適な蛍光タンパク質には、これらに限定されないが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と、黄色蛍光タンパク質と、青色蛍光タンパク質と、赤色タンパク質と、例えばＭａｔｚら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９〜９７３、米国特許出願公開第２００２／０１９７６７６号明細書、または米国特許出願公開第２００５／００３２０８５号明細書などに記載の花虫（Ａｎｔｈｏｚｏａｎ）種由来の様々な蛍光および有色タンパク質のいずれかとが挙げられる。この緑色蛍光タンパク質には、これらに限定されないが発酵オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｉａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）またはその誘導体由来のＧＦＰ（その幾つかは市販されている）と、例えば国際公開第９９／４９０１９号パンフレットおよびＰｅｅｌｌｅら（２００１）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０：５０７〜５１９に記載されているレニラ・レニホルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、レニラ・ムレリ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｎｉ）、またはプチロサルクス・ゲルニ（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ  ｇｕｅｒｎｙｉ）などの種由来のＧＦＰとが含まれる。
【０１００】
幾つかの実施形態では主題のスクリーニング法に使用される抗タウ抗体は、タウの特定のアイソフォームに対して特異的である。他の実施形態では主題のスクリーニング法に使用される抗タウ抗体は、２種類以上のタウアイソフォームと交差反応する。幾つかの実施形態では主題のスクリーニング法に使用される抗タウ抗体は、チューブリン結合反復のエピトープと特異的に結合する。例えばこの抗体は、図６Ａ（配列番号１）に示すアミノ酸配列の第５６９〜第６９３番アミノ酸、図６Ｃ（配列番号３）に示すアミノ酸配列の第２５２〜３７６番アミノ酸、図６Ｅ（配列番号５）に示すアミノ酸配列の第１９４〜３１８番アミノ酸、または図６Ｇ（配列番号７）に示すアミノ酸配列の第１９４〜２８７番アミノ酸によって表わされるエピトープと結合する。
【０１０１】
ポリペプチドレベルはまた、タウ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え構築物を持つ遺伝的修飾を加えた哺乳動物細胞中で測定することもできる。その場合、その融合パートナーは検出可能なシグナルを可能にするか、または別の方法で検出することができる。例えば、融合パートナーが免疫学的に認識可能なエピトープ（「エピトープタグ」）を与える場合、その融合パートナーのエピトープに対して特異的な抗体を用いてタウのレベルを検出し定量することができる。幾つかの実施形態ではその融合パートナーが、検出可能なシグナルを可能にし、これらの実施形態ではその検出方法は、融合パートナーが発するシグナルの型に基づいて選択される。例えば、融合パートナーが蛍光タンパク質の場合には蛍光が測定される。好適な蛍光タンパク質には、前述のものが挙げられる。
【０１０２】
候補薬剤は、興奮毒性障害のｉｎ  ｖｉｖｏの非ヒト動物モデルにおいてさらに分析することができる。例えば候補薬剤を興奮性毒で処理したタウ＋／＋マウスに投与することができ、また、もしあれば発作の回数および／または重症度および／または発症の時期に及ぼす候補薬剤の効果を測定することができる。使用に適した興奮性毒には、これらに限定されないがカイニン酸、ペンチレンテトラゾールなどが挙げられる。
【０１０３】
幾つかの実施形態では候補薬剤は、その候補薬剤で処理しなかった非ヒト動物における発作の回数および／または重症度および／または発症の時期と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはそれ以上、その非ヒト動物における発作の回数および／または重症度および／または発症の時期を低減させるものである。
【０１０４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ法：
幾つかの実施形態では主題の方法はｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。例えば、試験薬剤を興奮毒性障害の非ヒト動物モデルに投与し、もしあればタウ遺伝子産物のレベルに及ぼすその試験薬剤の効果を判定する。例えば、試験薬剤を興奮毒性関連障害の非ヒト動物モデルに投与し、もしあればタウ遺伝子産物のレベルに及ぼすその試験薬剤の効果を判定する。幾つかの実施形態ではこの方法は、その興奮毒性関連障害に対する読み出し情報を得るためのアッセイを行うステップをさらに含む。興奮毒性関連障害に対する読み出し情報には、これらに限定されないが、ａ）発作の回数および／または重症度および／または発症の時期、ｂ）興奮毒性関連障害に付随する行動の欠陥、およびｃ）興奮毒性関連障害に付随するカルシウム応答遺伝子産物の異常レベルが含まれる。
【０１０５】
好適な非ヒト動物モデルには、タウ＋／−またはタウ＋／＋遺伝子型を有する齧歯動物、例えばラットおよびマウスが挙げられる。幾つかの実施形態では非ヒト動物モデルは、野生型非ヒト動物であり、興奮性毒がこの動物に投与される。使用に適した興奮性毒には、これらに限定されないがカイニン酸、ペンチレンテトラゾールなどが挙げられる。他の実施形態では非ヒト動物モデルは、アルツハイマー病の非ヒト動物モデルである。アルツハイマー病の非ヒト動物モデルは当業界で知られており（例えば、米国特許第６，０４６，３８１号明細書、同第６，１７５，０５７号明細書、同第６，３００，５４０号明細書、同第６，４５５，７５７号明細書、同第６，５８６，６５６号明細書、および同第７，０８１，５６１号明細書参照）、複数種類のこのような動物が市販（例えばＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから）されている。他の実施形態では非ヒト動物モデルは、パーキンソン病の非ヒト動物モデルである。パーキンソン病の非ヒト動物モデルには、６−ＯＨＤＡ（６−ヒドロキシドーパミン）モデル、米国特許出願公開第２００３／００５６２３１号明細書に記載されているモデルなどが挙げられる。他の実施形態では非ヒト動物モデルは、多発性硬化症の非ヒト動物モデルである。また好適な非ヒト動物モデルの例には実施例中で述べるもの、例えばＪ２０マウス、Ｊ９マウス、Ｊ９／ＦＹＮマウス（例えばｈＡＰＰｌｏｗ／ＦＹＮマウス）、およびＴＡＳＤマウスが挙げられる。幾つかの実施形態では非ヒト動物モデルは、頭部外傷の非ヒト動物モデルである。
【０１０６】
タウ遺伝子産物の試験薬剤レベルが減少するか否は、上記のように判定することができる。例えば、その動物由来の生体試料中のタウ遺伝子産物のレベルを上記のように判定することができる。
【０１０７】
上記で述べたように幾つかの実施形態では興奮毒性関連障害に対する読み出し情報が検定され、その読み出し情報には、例えばａ）発作の回数および／または重症度および／または発症の時期、ｂ）興奮毒性関連障害に付随する行動の欠陥、およびｃ）興奮毒性関連障害に付随するカルシウム応答性遺伝子産物の異常レベルが含まれる。行動の欠陥には、学習障害、記憶障害、恐怖反応などが含まれる。行動の欠陥は、様々なよく知られている方法のいずれか、例えば高架式十字迷路試験、モーリス水迷路試験、受動的回避試験などを用いて検定することができる。
【０１０８】
検出するのに適したカルシウム応答性遺伝子産物（また「カルシウム依存性遺伝子産物」とも呼ばれる）には、例えば興奮毒性関連神経性障害を有する個体中の（例えば個体の歯状回中の）より低いカルシウム依存性遺伝子産物（例えば、カルビンディン、ｐ−ＥＲＫ、α−アクチニンＩＩ、およびｃ−Ｆｏｓを含めた）と、興奮毒性関連神経性障害を有する個体中の（例えば個体の歯状回中の）より高いカルシウム依存性遺伝子産物（例えば神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）を含めた）とが挙げられる。例えば、Ｐａｌｏｐら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｄａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：９５７２を参照されたい。
【０１０９】
治療方法：
興奮毒性関連障害の治療方法を提供する。一般にこれら方法は、個体におけるニューロン中のタウ遺伝子産物のレベルを低下させる有効量の薬剤を、それが必要な個体に投与することを含む。
【０１１０】
好適な薬剤には、興奮毒性関連障害の少なくとも１つの徴候またはパラメーターの程度、頻度、または重症度を、その薬剤で処理していない個体におけるパラメーターの程度、頻度、または重症度と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％軽減する薬剤が挙げられる。
【０１１１】
例えば幾つかの実施形態では好適な薬剤は、その薬剤で処理していない個体における発作の回数、または発作の重症度、または発作の発症の時期と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、その個体における発作の回数を減じ、かつ／または発作の重症度を下げ、かつ／または発作の発症を遅らせる薬剤である。
【０１１２】
例えば幾つかの実施形態では好適な薬剤は、その薬剤で処理していない個体における行動と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、その個体における行動パラメーター（例えば記憶、認知、学習）を改善する薬剤である。
【０１１３】
タウ遺伝子産物のレベルを低下させる薬剤：
タウ遺伝子産物のレベルを低下させる薬剤には、細胞中のタウｍＲＮＡおよび／またはタウポリペプチドのレベルを低下させる薬剤が挙げられる。幾つかの実施形態では、細胞中のタウ遺伝子産物のレベルを低下させる薬剤は、細胞と接触した場合、その薬剤が存在しない細胞中のタウ遺伝子産物のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、タウおよび／またはタウポリペプチドのレベルを低下させる薬剤である。例えば好適な薬剤には、その薬剤を投与しない場合のニューロン中のタウ遺伝子産物のレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、タウ遺伝子産物のレベルを低下させる薬剤が挙げられる。
【０１１４】
個体において細胞中のタウ遺伝子産物のレベルを低下させる（例えば、個体においてニューロン中のタウ遺伝子産物のレベルを低下させる）好適な薬剤には、野生型タウ遺伝子産物のレベルを低下させる薬剤が挙げられる。幾つかの実施形態では好適な薬剤は、野生型タウ遺伝子産物のレベルを選択的に低下させるものである。
【０１１５】
幾つかの実施形態では好適な薬剤は、その薬剤による処理なしの細胞中のタウポリペプチドのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはそれ以上、細胞中の（例えば神経細胞中の）タウポリペプチドのレベルを低下させる。
【０１１６】
幾つかの実施形態では好適な薬剤は、その薬剤による処理なしの細胞中の非過リン酸化タウポリペプチドのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはそれ以上、細胞中の（例えば神経細胞中の）非過リン酸化タウポリペプチドのレベルを低下させる。
【０１１７】
幾つかの実施形態では好適な薬剤は、その薬剤による処理なしの組織中の非過リン酸化タウポリペプチドのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはそれ以上、組織（例えば脳組織）中の非過リン酸化タウポリペプチドのレベルを低下させる。
【０１１８】
幾つかの実施形態では好適な薬剤は、その薬剤による処理なしの細胞中の非凝集性（例えば可溶性）タウポリペプチドのレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはそれ以上、細胞中の（例えば神経細胞中の）非凝集性（例えば可溶性）タウポリペプチドのレベルを低下させる。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、タウ遺伝子産物のレベルを低下させる薬剤はまた、１）タウの川下効果、２）タウ以外の分子（例えばｆｙｎキナーゼ）とタウの相互作用、３）タウの１つまたは複数の生理機能（ただしタウの生理機能には、ａ）微小管の安定化、ｂ）細胞内の輸送および転送の調節（例えば軸索輸送の調節、樹枝状輸送の調節、オルガネラの転送など）、およびｃ）神経突起伸長の促進が含まれる）のうちの１つまたは複数を変える（例えば増加または減少させる）。タウ遺伝子産物のレベルの低下は、Ａβ誘発性欠陥から新生ニューロン（例えば歯状回（ＤＧ）ニューロン）を防護することができ、またＤＧ神経回路網中へのこのような新生ニューロンの取込みを向上させることができる。したがって幾つかの実施形態ではタウ遺伝子産物のレベルを低下させる薬剤はまた、歯状回（ＤＧ）回路への新生ニューロンの取込みを向上させ、かつ／またはＡβ誘発性欠陥から新生ＤＧニューロンを防護する。
【０１２０】
好適な薬剤は、タウ遺伝子産物、例えばタウｍＲＮＡ、タウポリペプチド（例えば、非過リン酸化タウポリペプチド、非凝集性タウポリペプチド）のレベルを低下させる。タウをリン酸化するキナーゼのレベルまたは活性を低下させる薬剤は、幾つかの実施形態においては特に除外される。さらに、タウの凝集を低減する、または凝集したタウを標的にする薬剤は、幾つかの実施形態においては特に除外される。
【０１２１】
アンチセンス核酸
細胞中の、例えばニューロン中のタウ遺伝子産物のレベルを低下させる薬剤には、アンチセンス核酸が挙げられる。例えば、アンチセンス核酸を用いて細胞中の（例えばニューロン中の）タウ遺伝子の発現を下方制御することができる。そのアンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、例えば天然の核酸からの複数の化学修飾を有する合成ＯＤＮか、またはこのようなアンチセンス分子をＲＮＡとして発現させる核酸構築物であることができる。アンチセンス配列は、標的にされる遺伝子（例えばタウ）のｍＲＮＡに相補的であり、標的にされる遺伝子産物の発現を抑制する。アンチセンス分子は、様々な機構により、例えばＲＮアーゼＨの活性化、または立体障害を通して翻訳に利用可能なｍＲＮＡの量を低下させることによって遺伝子発現を抑制する。アンチセンス核酸の１種類または組合せを投与することができ、その場合、組合せは多様な異なる配列を含むことができる。
【０１２２】
アンチセンス核酸は、転写開始をアンチセンス鎖がＲＮＡ分子として産生されるような方向に向ける適切なベクター中における標的遺伝子配列（例えばタウ）の全体または一部の発現によって産生することができる。あるいは、アンチセンス核酸は、合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンス核酸は、長さが少なくとも約７個、少なくとも約１２個、または少なくとも約２０個のヌクレオチドであり、かつ長さが約５００個以下、約５０個ｖ、または約３５個以下のヌクレオチドであることができる。その場合、長さは抑制の効率、交差反応性の不在を含めた特異性などによって左右される。長さが塩基７から８個の短いオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現の強力かつ選択的阻害剤であることができることが分っている（Ｗａｇｎｅｒら（１９９６）Ｎａｔｕｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４０〜８４４参照）。
【０１２３】
内因性センス鎖ｍＲＮＡ配列の１つまたは複数の特異的領域は、アンチセンス配列によって補完されるように選択される。オリゴヌクレオチドの特異的配列の選択は、幾つかの候補配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデルで標的遺伝子の発現の抑制について検定する経験的方法を用いることができる。配列の組合せもまた使用することができ、その場合、ｍＲＮＡ配列の幾つかの領域はアンチセンス相補性が得られるように選択される。
【０１２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業界で知られている方法によって化学的に合成することができる（Ｗａｇｎｅｒら（１９９３、上記）およびＭｉｌｌｉｇａｎら（上記）参照）。好適なオリゴヌクレオチドは、それらの細胞内安定性および結合親和性を増すために天然のホスホジエステル構造から化学的に修飾することができる。複数のこのような修飾については文献に記載されており、これらの修飾はバックボーン、糖、または複素環塩基の化学的性質を変える。
【０１２５】
バックボーンの化学的性質の有用な変化には、ホスホロチオアート、両方の非架橋酸素がイオウで置換されているホスホロジチオアート、ホスホロアミダイト、アルキルホスホトリエステル、およびボラノホスファートがある。アキラルリン酸誘導体には、３’−Ｏ’−５’−Ｓ−ホスホロチオアート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオアート、３’−ＣＨ２−５’−Ｏ−ホスホナート、および３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミダートが挙げられる。ペプチド核酸は、リボースホスホジエステルバックボーン全体をペプチド結合と取り換える。糖修飾もまた、安定性および親和性を高めるために使用される。デオキシリボースのβ−アノマーを使用することができ、その場合、塩基が天然のα−アノマーに対して転化される。リボース糖の２’−ＯＨを変えて２’−Ｏ−メチル糖または２’−Ｏ−アリル糖を形成することができ、これは親和性を含むことなしに分解に対する抵抗性を与える。複素環塩基の修飾は、適切な塩基の対合を維持しなければならない。幾つかの有用な置換には、デオキシチミジンからデオキシウリジンへの、デオキシシチジンから５−メチル−２’−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−デオキシシチジンへの置換が挙げられる。５−プロピニル−２’−デオキシウリジンおよび５−プロピニル−２’−デオキシシチジンが、それぞれデオキシチミジンおよびデオキシシチジンから置換される場合、親和性および生物活性を増すことが示されている。
【０１２６】
干渉核酸
細胞中のタウ遺伝子産物のレベルを低下させる好適な薬剤には、干渉核酸、例えば干渉ＲＮＡ分子が挙げられる。一実施形態ではタウ遺伝子産物レベルの低下は、細胞を、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などの小型核酸分子と接触させることによるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、あるいはタウ遺伝子産物のレベルの低下を可能にするように低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の発現を調節することにより達成される。
【０１２７】
干渉核酸は、タウをコードするヌクレオチド配列のそのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば幾つかの実施形態では、配列番号２、４、６、および８の１つまたは複数に示されるタウをコードするヌクレオチド配列が、干渉核酸の設計に使用される。
【０１２８】
本明細書中で用いられる用語「短鎖干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「短鎖干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「短鎖干渉核酸分子」、「短鎖干渉オリゴヌクレオチド分子」、または「化学的修飾を加えた短鎖干渉核酸分子」は、例えば配列特異的なやり方でＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）または遺伝子抑制を仲介することによって遺伝子発現を抑制または下方制御することができる任意の核酸分子を指す。標的遺伝子を与えられた場合のＲＮＡｉ分子の設計は、当業界ではごく普通である。米国特許出願公開第２００５／０２８２１８８号明細書（参照により当明細書中に援用される）およびその中に引用されている参考文献もまた参照されたい。例えば、Ｐｕｓｈｐａｒａｊら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００６  Ｍａｙ〜Ｊｕｎｅ；３３（５〜６）：５０４〜１０、Ｌｕｔｚｅｌｂｅｒｇｅｒら、Ｈａｎｄｂ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒａｍｃｏｌ．２００６；（１７３）：２４３〜５９、Ａｒｏｎｉｎら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６  Ｍａｒ；１３（６）：５０９〜１６、Ｘｉｅら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．２００６  Ｊａｎ；１１（１〜２）：６７〜７３、Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒら、Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５；１２（２６）：３１４３〜６１、およびＰｅｋａｒａｉｋら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ．２００５  Ｄｅｃ  １５；６８（１〜２）：１１５〜２０．Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｓｅｐ  ９を参照されたい。
【０１２９】
ｓｉＲＮＡを所望の標的に向ける設計および産生の方法は当業界で知られており、また本明細書中で開示された目的のためのタウ遺伝子へのそれらの利用については当業者に容易に理解できるはずであり、例えば高度な安定性、バイオアベイラビリティー、および治療法としての利用を増すための他の特性を可能にする修飾（例えば化学修飾）を有するｓｉＲＮＡの産生の方法も同様である。さらに被検体へのｓｉＲＮＡの処方および送達の方法もまた当業界でよく知られている。例えば、米国特許出願公開第２００５／０２８２１８８号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２３９７３１号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２３４２３２号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１７６０１８号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５９８１７号明細書、米国特許出願公開第２００５／００２０５２５号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１９２６２６号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７３６４０号明細書、米国特許出願公開第２００２／０１５０９３６号明細書、米国特許出願公開第２００２／０１４２９８０号明細書、および米国特許出願公開第２００２／０１２０１２９号明細書明細書を参照されたい。これらはそれぞれ参照により本明細書中に援用される。
【０１３０】
ｓｉＲＮＡの設計を容易にするための公的に利用可能なツールを当業界で利用できる。例えば、ＤＥＱＯＲすなわちＤｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＲＮＡｉ（インターネット上でｃｌｕｓｔｅｒ−１．ｍｐｉ−ｃｂｇ．ｄｅ／Ｄｅｑｏｒ／ｄｅｑｏｒ．ｈｔｍｌで利用できる）を参照されたい。また、Ｈｅｎｓｃｈｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４  Ｊｕｌ  １；３２（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１１３−２０も参照されたい。ＤＥＱＯＲは、ｓｉＲＮＡ設計用の従来技術のパラメーターに基づく採点法を用いてｓｉＲＮＡの抑制可能性を評価するウェブベースのプログラムである。したがってＤＥＱＯＲは、（ｉ）その塩基対組成に基づく高いサイレンシング能力を示す遺伝子中の領域、および（ｉｉ）化学合成に対して高いサイレンシング可能性を有するｓｉＲＮＡを予測するのに役立つことができる。さらに入力した質問から生ずる各ｓｉＲＮＡは、選択された生物のトランスクリプトームまたはゲノムに対するＢＬＡＳＴ検索を行うことによって、あり得るクロスサイレンシング（ｃｒｏｓｓ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）活性について評価される。したがってＤＥＱＯＲは、ｍＲＮＡフラグメントが細胞中で他の遺伝子と交差反応する可能性を予測することができ、また研究者がｓｉＲＮＡの特異性または化学的に設計されたｓｉＲＮＡを試験するための実験を設計するのに役立つ。
【０１３１】
タウのｓｉＮＡ分子の設計のための標的部位の非限定的な例には下記が挙げられる。すなわち
標的領域１：
５’−ＡＡＴＣＡＣＡＣＣＣＡＡＣＧＴＧＣＡＧＡＡ−３’（配列番号１０、これは図６Ｂで表わされ、また配列番号２に示したヌクレオチド配列のヌクレオチド第９１８番〜第９３８番に該当する）、
標的領域２：
５’−ＡＡＣＴＧＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡＡ−３’（配列番号１１、これは図６Ｂで表わされ、また配列番号２に示したヌクレオチド配列のヌクレオチド第１３４４番〜第１３６４番に該当する）、
標的領域３：
５’−ｇａｃｃｔｇ  ａａｇａａｔｇｔｃａ  ａｇｔｃｃａａｇａｔ  ｃｇｇｃｔｃｃａｃｔ  ｇａｇａａｃｃｔｇａ  ａｇｃａｃｃａｇｃｃ  ｇｇｇａｇｇｃｇｇｇ  ａａｇｇｔｇｃａｇａ  ｔａａｔｔａａｔａａ  ｇａａｇｃｔｇ−３’（配列番号１２、これは図６Ｂで表わされ、また配列番号２に示したヌクレオチド配列のヌクレオチド第１７０５番〜第１７９７番に該当する）、
標的領域４：
５’−ｇａｔ  ｃｔｔａｇｃａａｃｇ  ｔｃｃａｇｔｃｃａａ  ｇｔｇｔｇｇｃｔｃａ  ａａｇｇａｔａａｔａ  ｔｃａａａｃａｃｇｔ  ｃｃｃｇｇｇａｇｇｃ  ｇｇｃａｇｔｇｔｇｃ  ａａａｔａｇｔｃｔａ  ｃａａａｃｃａｇｔｔ−３’（配列番号１３、これは図６Ｂで表わされ、また配列番号２に示したヌクレオチド配列のヌクレオチド第１７９８番〜第１８９０番に該当する）、
標的領域５：
５’−ｇａｃｃｔｇａｇｃａ  ａｇｇｔｇａｃｃｔｃ  ｃａａｇｔｇｔｇｇｃ  ｔｃａｔｔａｇｇｃａ  ａｃａｔｃｃａｔｃａ  ｔａａａｃｃａｇｇａ  ｇｇｔｇｇｃｃａｇｇ  ｔｇｇａａｇｔａａａ  ａｔｃｔｇａｇａａｇ  ｃｔｔ−３’（配列番号１４、これは図６Ｂで表わされ、また配列番号２に示したヌクレオチド配列のヌクレオチド第１８９１番〜第１９８３番に該当する）、
標的領域６：
５’−ｇａｃｔｔｃａ  ａｇｇａｃａｇａｇｔ  ｃｃａｇｔｃｇａａｇ  ａｔｔｇｇｇｔｃｃｃ  ｔｇｇａｃａａｔａｔ  ｃａｃｃｃａｃｇｔｃ  ｃｃｔｇｇｃｇｇａｇ  ｇａａａｔａａａａａ  ｇａｔｔｇａａａｃｃ  ｃａｃａａｇｃｔｇ−３’（配列番号１５、これは図６Ｂで表わされ、また配列番号２に示したヌクレオチド配列のヌクレオチド第１９８４番〜第２０７９番に該当する）、
標的領域７：
５’−ａａｇｔｃｇｃｃｇｔ  ｃｔｔｃｃｇｃｃａａ  ｇａｇｃｃｇｃｃｔｇ−３’（配列番号１６、これは図６Ｂで表わされ、また配列番号２に示したヌクレオチド配列のヌクレオチド第１６５１番〜第１６８０番に該当する）、
標的領域８：
５’−ｇｃｃａａｇａｃａｇ  ａｃｃａｃｇｇｇｇｃ  ｇｇａｇａｔｃｇｔｇ−３’（配列番号１７、これは図６Ｂで表わされ、配列番号２に示したヌクレオチド配列のヌクレオチド第２１０１番〜第２１３０番に該当する）。
【０１３２】
下記のヌクレオチド配列は特に除外される。すなわち、
１）５’−ｔｃｇａａｇｔｇａｔｇｇａａｇａｔｃａｃｇｃ−３’（配列番号１８）、
２）５’−ｃａｇｃｃｇｇｇａｇｔｃｇｇｇａａｇｇｔｇｃ−３’（配列番号１９）、
３）５’−ａｃｇｔｃｃｔｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｔｇｔｇｃ−３’（配列番号２０）、
４）５’−ａｃｇｔｃｔｃｃａｔｇｇｃａｔｃｔｃａｇｃ−３’（配列番号２１）、
５）５’−ｇｔｇｇｃｃａｇａｔｇｇａａｇｔａａａａｔｃ−３’（配列番号２２）、
６）５’−ｇｔｇｇｃｃａｃａｔｇｇａａｇｔａａａａｔｃ−３’（配列番号２３）、および
７）５’−ｇｔｇｇｃｃａｇａｔｇｃａａｇｔａａａａｔｃ−３’（配列番号２４）。
【０１３３】
上記で与えられる配列はその標的遺伝子をコードするｍＲＮＡの標的配列であり、かつ使用されるｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドはその標的に相補的な配列を含むことになることを理解されたい。
【０１３４】
ｓｉＮＡ分子は、様々な形態のいずれでもよい。例えばｓｉＮＡは、自己相補的センスおよびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であることができ、このアンチセンス領域は標的核酸分子またはその部分中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、またこのセンス領域は標的核酸配列またはその部分に該当するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡはまた、２つの別個のオリゴヌクレオチドから構築することもでき、その場合、一方の鎖がセンス鎖、他方がアンチセンス鎖であり、それらアンチセンスおよびセンス鎖は自己相補的である。この実施形態では一般にそれぞれの鎖は、もう一方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。例えば、そのアンチセンス鎖およびセンス鎖が、例えばその二本鎖領域が約１５塩基対から約３０塩基対、例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基対である二重鎖または二本鎖構造を形成する場合、そのアンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその部分中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、またそのセンス鎖は、この標的核酸配列またはその部分に該当するヌクレオチド配列を含む（例えば、そのｓｉＮＡ分子のヌクレオチド約１５個からヌクレオチド約２５個以上が、この標的核酸分子またはその部分に相補的である）。
【０１３５】
あるいは、ｓｉＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドから構築することもでき、その場合、そのｓｉＮＡの自己相補的センスおよびアンチセンス領域は、核酸系または非核酸系リンカーによって結合される。そのｓｉＮＡは、自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有する二重、不斉二重、ヘアピン、または不斉ヘアピン二次構造のポリヌクレオチドであることができ、そのアンチセンス領域は別個の標的核酸分子またはその部分中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、またそのセンス領域はこの標的核酸配列またはその部分に該当するヌクレオチド配列を有する。
【０１３６】
ｓｉＮＡは、２個以上のループ構造と、自己相補的センスおよびアンチセンス領域を含むステムとを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであることができる。このアンチセンス領域は、標的核酸分子またはその部分中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、このセンス領域はこの標的核酸配列またはその部分に該当するヌクレオチド配列を有する。また、この環状ポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで処理して、ＲＮＡｉを仲介することができる活性なｓｉＮＡ分子を生成させることができる。ｓｉＮＡはまた、標的核酸分子またはその部分中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含むことができ（例えば、このようなｓｉＮＡ分子が、標的核酸配列またはその部分に該当するヌクレオチド配列のｓｉＮＡ分子内に存在する必要がない場合）、その一本鎖ポリヌクレオチドは、５’−リン酸（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら（２００２）Ｃｅｌｌ．，１１０．５６３〜５７４、およびＳｃｈｗａｒｚら（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，１０，５３７〜５６８参照）または５’，３’−二リン酸などの末端リン酸基をさらに含むことができる。
【０１３７】
幾つかの実施形態ではｓｉＮＡ分子は、離れたセンスおよびアンチセンス配列または領域を含有し、それらセンスおよびアンチセンス領域は当業界で知られているヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーによって共有結合するか、あるいはその代わりにイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用、および／またはスタッキング相互作用によって非共有結合している。幾つかの実施形態ではｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の実施形態ではｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子の発現の抑制を引き起こすように標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。
【０１３８】
本明細書中で用いられるｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有するｓｉＮＡ分子に限定される必要はなく、さらに化学修飾を加えたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドも包含する。幾つかの実施形態では本発明の短鎖干渉核酸分子は、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠いている。ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡｉを仲介するための２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必ずしも必要とせず、したがって本発明のｓｉＮＡ分子は、場合によってはいかなるリボヌクレオチド（例えば２’−ＯＨを有するヌクレオチド）も含まない。しかしながら、ＲＮＡｉを支持するためにｓｉＮＡ分子内にリボヌクレオチドの存在を必要としないこのようなｓｉＮＡ分子は、１つまたは複数の付着リンカー、あるいは他の付着または結合した基、部分、もしくは２’−ＯＨ基を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含有する鎖を有することができる。任意選択でｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド位置の約５、１０、２０、３０、４０、または５０％にリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の修飾短鎖干渉核酸分子はまた、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド「ｓｉＭＯＮ」と呼ぶこともできる。
【０１３９】
本明細書中で用いられる用語「ｓｉＮＡ」は、配列特異的ＲＮＡｉ、例えば短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学的修飾を加えたｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子抑制ＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）などを仲介することができる核酸分子を記述するために使用される他の用語と同義であることを意味する。さらに本明細書中で用いられる用語ｓｉＮＡは、転写後遺伝子抑制、翻訳抑制、または後成などの配列特異的ＲＮＡ干渉を記述するために使用される他の用語と同義であることを意味する。例えば本発明のｓｉＮＡ分子は、転写後のレベルおよび転写前のレベルの両方で標的遺伝子を後成的に発現停止させるために使用することができる。非限定的な例では本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の後成的調節は、クロマチン構造またはメチル化パターンのｓｉＮＡ仲介修飾の結果として生じて遺伝子発現を変える可能性がある（例えば、Ｖｅｒｄｅｌら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６７２〜６７６、Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６６９〜６７２、Ａｌｌｓｈｉｒｅ（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８〜１８１９、Ｖｏｌｐｅら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３〜１８３７、Ｊｅｎｕｗｅｉｎ（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５〜２２１８、およびＨａｌｌら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２〜２２３７参照）。
【０１４０】
本明細書中で検討されるｓｉＮＡ分子は、二重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）を含むことができる（例えば、参照により本明細書中に援用されている国際公開第０５／０１９４５３号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００５／０２３３３２９号明細書参照）。本明細書中で検討されるｓｉＮＡ分子にはまた、多機能ｓｉＮＡが含まれる（例えば、国際公開第０５／０１９４５３号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００４／０２４９１７８号明細書参照）。この多機能ｓｉＮＡは、例えばタウの２つの領域を標的にする配列を含むことができる。
【０１４１】
本明細書中で検討されるｓｉＮＡ分子は、不斉ヘアピンまたは不斉二重鎖を含むことができる。本明細書中で用いられる「不斉ヘアピン」とは、アンチセンス領域と、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むことができるループ部分と、センス領域がアンチセンス領域と塩基対をつくるのに、またループと二重鎖を形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する程度にそのアンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含むセンス領域とを含む直鎖ｓｉＮＡ分子を意味する。例えば不斉ヘアピンｓｉＮＡ分子は、細胞中またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ系中でＲＮＡｉを仲介するのに十分な長さ（例えば、ヌクレオチド約１５個から約３０個、すなわち約１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個）を有するアンチセンス領域と、ヌクレオチド約４個から約１２個（例えば、約４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個）を含むループ領域と、このアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド約３個から約２５個（例えば、約３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個）を有するセンス領域とを含むことができる。この不斉ヘアピンｓｉＮＡ分子はまた、化学的に修飾することができる５’−末端リン酸基を含むこともできる。不斉ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、または本明細書中で述べる共役分子を含むことができる。
【０１４２】
本明細書中で用いられる「不斉二重鎖」とは、センス領域およびアンチセンス領域を含む２本の別個の鎖を有するｓｉＮＡ分子を意味し、そのセンス領域は、アンチセンス領域と塩基対をつくるのに、また二重鎖を形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する程度にそのアンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば本発明の不斉二重鎖ｓｉＮＡ分子は、細胞中またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ系中でＲＮＡｉを仲介するのに十分な長さ（例えば、ヌクレオチド約１５個から約３０個、すなわち約１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個）を有するアンチセンス領域と、このアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド約３個から約２５個（例えば、約３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個）を有するセンス領域とを含むことができる。
【０１４３】
ｓｉＮＡの安定性および／または半減期は、血清リボヌクレオチドによるそれらの分解を防止することができ、またそれらの有効性を増すことができる修飾（塩基、糖、および／またはリン酸）を有する核酸分子を化学的に合成することにより改善することができる（例えば、本明細書中で述べた核酸分子の塩基、リン酸、および／または糖部分に対して行うことができる様々な化学修飾について記載されているＥｃｋｓｔｅｉｎらの国際公開第９２／０７０６５号パンフレット、Ｐｅｒｒａｕｌｔら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４４，５６５、Ｐｉｅｋｅｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３，３１４、ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４、Ｕｓｍａｎらの国際公開第９３／１５１８７号パンフレット、Ｒｏｓｓｉらの国際公開第９１／０３１６２号パンフレット、Ｓｐｒｏａｔの米国特許第５，３３４，７１１号明細書、Ｇｏｌｄらの米国特許第６，３００，０７４号明細書、およびＢｕｒｇｉｎら（上記）を参照されたい。これらの全てが参照により本明細書中に援用される）。細胞中でのそれらの効力を高める修飾、およびオリゴヌクレオチド合成時間を短縮し化学的必要条件を減らすための核酸分子からの塩基の除去が望ましい。
【０１４４】
例えばオリゴヌクレオチドは、安定性を高めかつ／または生物活性を高めるようにヌクレアーゼ耐性基、例えば２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈによる修飾、すなわちヌクレオチド塩基修飾によって修飾される（概説については、ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ（１９９２）ＴＩＢＳ．１７，３４、Ｕｓｍａｎら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１．１６３、Ｂｕｒｇｉｎら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０参照）。核酸分子の糖修飾は、当業界で広範囲に述べられてきた（Ｅｃｋｓｔｅｉｎらの国際公開第９２／０７０６５号パンフレット、Ｐａｒｒａｕｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４，５６５〜５６８、Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５３，３１４〜３１７、ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９２，１７，３３４〜３３９、Ｕｓｍａｎらの国際公開第９３／１５１８７号パンフレット、Ｓｐｒｏａｔの米国特許第５，３３４，７１１号明細書、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２５７０２、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらの国際公開第９７／２６２７０号パンフレット、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらの米国特許第５，７１６，８２４号明細書、Ｕｓｍａｎらの米国特許第５，６２７，０５３号明細書、Ｗｏｏｌｆらの国際公開第９８／１３５２６号パンフレット、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらの米国仮特許出願第６０／０８２，４０４号明細書（１９９８年４月２０日出願）、Ｋａｒｐｅｉｓｋｙら（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１、ＥａｍｓｈａｗおよびＧａｉｔ（１９９８）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）４８，３９〜５５、ＶｅｒｍａおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９〜１３４、およびＢｕｒｌｉｎａら（１９９７）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１９９９〜２０１０参照。これらはそれぞれそれらの全体が本明細書中に参照により援用される）。このような教示を考慮して、細胞中のＲＮＡｉを促進させるｓｉＮＡの能力が顕著に阻害されない限り類似の修飾を本明細書中で述べるように使用して、本明細書中で開示されるｓｉＮＡ核酸分子を修飾することができる。
【０１４５】
活性を維持または高める化学修飾を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を本明細書中で検討する。このような核酸はまた、修飾されていない核酸よりもヌクレアーゼに対して一般に抵抗性がある。したがってｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ活性を顕著に低下させるべきでない。外因により送達される核酸分子は、標的遺伝子産物のレベルの低下を容易にするように、標的ＲＮＡの転写および／または翻訳が起こるのに、かつコードされたｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドの産生の調節を可能にするのに少なくとも十分な期間のあいだ細胞内で安定であるように一般に選択される。
【０１４６】
ＲＮＡおよびＤＮＡ分子の産生は、合成的に達成することができ、また高度なヌクレアーゼ安定性を可能にするようにヌクレオチド修飾の導入を可能にすることができる（例えば、Ｗｉｎｃｏｔｔら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３〜１９参照（これらは参照により本明細書中に援用される））。一実施形態では本発明の核酸分子は、１個または複数個（例えば、約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上）のＧ−クランプヌクレオチドを含み、これらは二重鎖内の相補的グアニンのワトソン−クリック面およびフーグスティーン面の両方を水素結合させる能力を付与し、核酸標的に高度な親和性および特異性を与えることができる修飾シトシン類似体である（例えば、Ｌｉｎら（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，８５３１〜８５３２参照）。別の例では核酸分子は、２’，４’−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドなどの１個または複数個（例えば、約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上）のＬＮＡ「ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」ヌクレオチドを含むことができる（例えば、Ｗｅｎｇｅｌらの国際公開第００／６６６０４号パンフレットおよび同第９９／１４２２６号パンフレット参照）。
【０１４７】
ｓｉＮＡ分子は、例えば細胞中へのｓｉＮＡ分子の送達を容易にするために抱合体および／または複合体として与えることができる。抱合体および／または複合体の実例には、ｓｉＮＡと、小分子、脂質、コレステロール、リン脂質、ヌクレオシド、抗体、毒素、負に帯電したポリマー（例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール、またはポリアミン）とからなるものが挙げられる。一般に前述の輸送体は、分解性リンカーの有無に関係なく個別にまたは多成分系の一部として使用されるように設計される。これらの化合物は、血清の存在または不在下における核酸分子の細胞中への送達および／または局在化を改善することができる（例えば、米国特許５，８５４，０３８号明細書参照）。本明細書中で述べた分子の抱合体は、生分解性核酸リンカー分子などの生分解性のリンカーを介して生物学活性のある分子に付着させることができる。
【０１４８】
薬剤の投与および処方
被検体への送達のための当該薬剤の処方およびこれら薬剤（前述のｓｉＮＡ分子、アンチセンス核酸などを含む）の送達方法は当業界において入手可能である。これらには薬剤の全身的送達を行うための処方および送達方法ならびに薬剤の局所的送達を行うための処方および送達方法（例えば、特定の器官または区画に対して行うための（例えば中枢神経系（ＣＮＳ）に対して送達を行うための）など）が含まれる。これら薬剤は被検体に投与するための送達用賦形剤、担体、および増量剤と、それらの塩とを含むように処方することができ、かつ／または薬剤は薬学的に許容できる製剤中に存在することができる。
【０１４９】
適切な処方は、少なくとも部分的には使用法または侵入経路、例えば非経口、経口、または経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）経路によって決まる。本明細書中で用いられる用語「非経口」には、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下、血管内（例えば静脈内）、筋内、または鞘内の注射、あるいは点滴技術などが含まれる。製剤は、当該薬剤の薬学的に許容できる塩、例えば酸付加塩を含む。
【０１５０】
一実施形態では化合物は、薬学的に許容できる組成物または製剤の状態で全身的投与によって被検体に投与される。「全身的投与」とは、体の至るところに分配することを容易にするための血流中の薬物のｉｎ  ｖｉｖｏでの全身的吸収または蓄積を意味する。全身的投与経路には、例えば静脈内、皮下、門脈、腹膜内、吸入、経口、肺臓内、および筋内が挙げられる。
【０１５１】
薬剤の製剤はまた、薬学的に許容できる担体、補助剤、および／または賦形剤を含有する用量単位の製剤の状態で経口的に、局所的に、非経口的に、吸入または噴霧によって、あるいは直腸に投与することもできる。治療用途のための薬学的に許容できる担体または増量剤は医薬業界でよく知られており、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）中に記載されており、これにより本明細書中に参照により援用される。例えば保存剤、安定剤、染料、および着香料を与えることができる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。さらに酸化防止剤および懸濁化剤を用いることができる。
【０１５２】
薬学的に有効な用量は、発現を防止し抑制するために、または疾患の状態を治療する（症状を少なくともある程度和らげる）ために必要な用量である。薬学的に有効な用量は、疾患の種類、使用される組成、投与の経路、治療される被検体のタイプ、被検体によって異なる考慮中の特徴、併用薬物療法、および医薬業者が認識するはずの他の要因に左右される。一般には１日につき体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇから１００ｍｇの間の有効成分の量が投与される。
【０１５３】
生物学的区画を画定する組織（例えば、脳、心室、鞘内腔、脊髄、滑液腔など）中への局所注射もまた考察の対象である。
【０１５４】
薬剤は、肺への送達が望まれる場合、肺組織中への薬剤の取り込みを可能にする吸入装置（例えば、噴霧器、吸入器、定量吸入器など）で投与されるエアロゾルまたは噴霧乾燥製剤の、例えば吸入によって投与することができる。当該化合物（例えば核酸）を含有する微粉化組成物の吸入可能な固体乾燥粒子を、標準的な方法で調製することができる。固体粒子組成物は、エアロゾルの形成を容易にするのに役立つ分散剤を任意選択で含有することができる。好適な分散剤はラクトースであり、これは重量比１対１などの任意の適切な比で薬剤とブレンドすることができる。有効成分は、一般に製剤の約０．１から１００ｗ／ｗで存在する。薬剤は、懸濁または溶液製剤として送達することができ、また液化プロペラント、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、およびこれらの混合物などのクロロフルオロカーボン化合物の使用を伴うことができる。エアロゾル製剤は、１種類または複数種類の補助溶剤、例えばエタノールと、オレイン酸またはトリオレイン酸ソルビタンなどの乳化剤および他の製剤用界面活性剤と、酸化防止剤と、適切な着香料とをさらに含有することができる。肺への送達のための他の方法は、例えば、米国特許出願公開第２００４／００３７７８０号明細書、および米国特許第６，５９２，９０４号明細書、同第６，５８２，７２８号明細書、同第６，５６５，８８５号明細書に記載されており、これらのそれぞれが参照により本明細書中に援用される。
【０１５５】
単核白血球およびリンパ球を含めた造血細胞への薬剤の処方および送達方法は、当業界で知られており、例えばＨａｒｔｍａｎｎら（１９８８）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８５（２），９２０〜９２８、Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ，９１（３），８５２〜８６２、ＦｉｌｉｏｎおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１３２９（２），３４５〜３５６、ＭａおよびＷｅｉ（１９９６）Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２０（１１／１２），９２５〜９３０、およびＢｏｎｇａｒｔｚら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２），４６８１〜８を参照されたい。上記のような方法には、化合物を造血細胞中に送達するための、遊離化合物（例えばオリゴヌクレオチド）、カチオン脂質製剤、ｐＨに敏感なリポソームおよびイムノリポソームを含めたリポソーム製剤、ならびに膜融合ペプチドと複合させたオリゴヌクレオチドを含めたバイオコンジュゲートの使用が挙げられる。
【０１５６】
皮膚または粘膜への薬剤の処方および送達方法は当業界で知られている。このような送達系には、例えば水性および非水性ゲル剤、クリーム、多層乳剤、マイクロエマルション、リポソーム、軟膏、水性および非水性液剤、ローション剤、パッチ貼付剤、坐剤、および錠剤が挙げられ、可溶化剤などの医薬剤添加剤、浸透増強剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、およびアミノ酸）、および親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）を含有することができる。
【０１５７】
中枢神経系（ＣＮＳ）および／または末梢神経系への送達は、例えば神経細胞への核酸の局所投与によって達成することができる。使用することができるＣＮＳ送達の従来の方法には、これらに限定されないが鞘内および脳室内投与、カテーテルおよびポンプの埋込み、創傷または病巣の部位における直接注射または灌流、脳動脈系中への注射、あるいは血液脳関門の化学的または浸透圧性解放によるものが挙げられる。他の方法には、様々な輸送および担体系の使用、例えば抱合体および生分解性ポリマーの使用による方法を挙げることができる。また、ＣＮＳへの核酸分子の送達について記載した米国特許第６，１８０，６１３号明細書、国際公開第０４／０１３２８０号パンフレット（これらは参照により本明細書中に援用される）も参照されたい。
【０１５８】
経口投与は、錠剤、トローチ剤、水性または油性懸濁剤、飛散性散剤または顆粒剤、乳剤、硬または軟カプセル剤、あるいはシロップまたはエリキシル剤として製剤化された当該薬剤を含有する医薬組成物を用いて達成することができる。このような経口組成物は、薬学的に洗練され口に合う処方を実現するために１種または複数種のこのような甘味料、着香料、着色料、または保存剤を含有することができる。錠剤は、コーティングされてもコーティングされなくてもよく、非毒性の薬学的に許容できる医薬剤添加剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなどの不活性増量剤と混ぜ合わせた、造粒および崩壊剤、例えばトウモロコシデンプンまたはアルギン酸と混ぜ合わせた、結着剤、例えばデンプン、ゼラチン、またはアラビアゴムと混ぜ合わせた、また滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクと混ぜ合わせた有効成分を含有するように製剤化することができる。コーティング剤を使用する場合、そのコーティング剤は胃腸管中での崩壊および吸収を遅らせ、それによってより長時間にわたる持続作用を可能にする。
【０１５９】
製剤が水性懸濁剤である場合、そのような製剤は、この活性薬剤を適切な医薬剤添加剤との混合物の状態で含有することができる。このような医薬剤添加剤は、必要に応じて懸濁化剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントゴム、およびアラビアゴム）、分散または湿潤剤、保存剤、着色料、および／または着香料であることができる。
【０１６０】
例えば薬剤の直腸投与用の坐剤は、その薬剤を、通常の温度では固体だが直腸の温度では液体の適切な非刺激性の医薬剤添加剤と混合することによって調製することができ、したがって直腸内で溶解してその薬物を放出することになる。このような材料には、カカオバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１６１】
用量レベルは、通常の臨床医が容易に決めることができ、また必要に応じて、例えば療法に対する被検体の応答を変更するために必要に応じて変更することができる。一般には用量レベルは、１日につき体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇから約１４０ｍｇ台である。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される宿主およびその特定の投与様式に応じて変わる。投与単位形態は、一般には有効成分を約１ｍｇから約５００ｍｇの間で含有する。
【０１６２】
薬剤は、例えば総合的な治療効果を増すために他の治療用化合物と組み合わせて被検体に投与することができる。
【０１６３】
前述のｓｉＮＡは、特に重要である。核酸分子の送達のための具体的な処方および方法は、当業界で知られている。例えば核酸分子は、これらには限定されないがイオントフォレシスによる、あるいは生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚら（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８〜１０７４、Ｗａｎｇらの国際公開第０３／４７５１８号パンフレットおよび同第０３／４６１８５号パンフレット参照）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフィア（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号明細書および米国特許出願公開第２００２１３０４３０号明細書参照）、生分解性ナノカプセル、および生体接着ミクロスフィアなどの他の賦形剤中に組み込むことによる、あるいはタンパク様のベクター（Ｏ’ＨａｒｅおよびＮｏｒｍａｎｄの国際公開第００／５３７２２号パンフレット）によるリポソーム中への封入を含めた当業者に知られている様々な方法によって細胞へ投与することができる。別の実施形態では本発明の核酸分子はまた、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、例えばポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体と共に処方するか、またはそれと複合体を形成させることもできる。一実施形態では本発明の核酸分子は、米国特許出願公開第２００３００７７８２９号明細書（参照によりその全体が本明細書中に援用される）に記載のように処方することができる。
【０１６４】
一実施形態ではｓｉＮＡ分子は、米国特許出願公開第２００１／０００７６６６号明細書（参照によりその全体が本明細書中に援用される）に記載のものなどの膜崩壊剤と複合体を形成する。別の実施形態では１種類または複数種類の膜崩壊剤およびｓｉＮＡ分子はまた、米国特許第６，２３５，３１０号明細書（参照によりその全体が本明細書中に援用される）に記載の脂質などのカチオン脂質またはヘルパー脂質分子と複合体を形成させることもできる。一実施形態ではｓｉＮＡ分子は、米国特許出願公開第２００３／０７７８２９号明細書、国際公開第００／０３６８３号パンフレット、および国際公開第０２／０８７５４１号パンフレット（それぞれが参照により本明細書中に援用される）に記載の送達系と複合体を形成する。
【０１６５】
あるいは、本発明のある種のｓｉＮＡ分子を、細胞内で真核プロモーター（例えば真核細胞中で機能しうるプロモーター）から発現させることができる（例えば、ＩｚａｎｔおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，３４５、ＭｃＧａｒｒｙおよびＬｉｎｄｑｕｉｓｔ（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，３９９、Ｓｃａｎｌｏｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０５９１〜５、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら（１９９２）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３〜１５、Ｄｒｏｐｕｌｉｃら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４３２〜４１、Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，５５３１〜４、Ｏｊｗａｎｇら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２〜６、Ｃｈｅｎら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４５８１〜９、Ｓａｒｖｅｒら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２〜１２２５、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，２２５９、Ｇｏｏｄら（１９９７）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５）。当業者は、任意の核酸を真核細胞中で適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができることを理解する。このような核酸の活性は、酵素の核酸による一次転写物からそれらを放出させることによって増すことができる（Ｄｒａｐｅｒらの国際公開第９３／２３５６９号パンフレットおよびＳｕｌｌｉｖａｎらの国際公開第９４／０２５９５号パンフレット、Ｏｈｋａｗａら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５〜６、Ｔａｉｒａら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９，５１２５〜３０、Ｖｅｎｔｕｒａら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，３２４９〜５５，Ｃｈｏｗｒｉｒａら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５８５６）。
【０１６６】
ｓｉＮＡがＲＮＡ分子である場合、そのｓｉＮＡを、ベクターに挿入された転写単位から発現させることができる。その組換えベクターは、ＤＮＡプラスミド、非ウィルスベクター、またはウィルスベクターであることができる。ｓｉＮＡ発現ウィルスベクターは、これらに限定されないが、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、またはアルファウィルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ分子を発現させることができる組換えベクターは上記のように送達することができ、一時的または安定な発現を可能にする。例えばこのようなベクターは、１）転写開始領域、２）任意選択で転写終結領域、および３）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含むことができ、その配列は、ｓｉＮＡ分子の発現および／または送達を可能にするように開始領域および終結領域に作用自在に連結する。
【０１６７】
幾つかの実施形態では活性薬剤が血液脳関門を越えるように処方される。血液脳関門は、全身循環から脳および脊髄中への多くの治療薬の取込みを制限する。血液脳関門を越える分子は２つの主要な機構、すなわち自由拡散および促進輸送を使用する。血液脳関門が存在するために、ＣＮＳ中での所与の治療薬の有益濃度を達成するには、薬物送達戦略の使用を必要とする場合がある。ＣＮＳへの治療薬の送達は、幾つかの方法によって達成することができる。
【０１６８】
１つの方法は神経外科的手法に頼る。様々な形態の痴呆に罹った患者などの重病患者の場合、外科的介入が、その付随するリスクにもかかわらず正当化される。例えば治療薬は、薬物の脳室内または鞘内注射などのＣＮＳ中への物理的な直接導入によって送達することができる。脳室内注射は、例えばオマヤ（Ｏｍｍａｙａ）レザバーなどのレザバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易にすることができる。導入の方法はまた、再充填可能なまたは生分解性の装置によって可能にすることができる。別のアプローチは、血液脳関門の透過性を増す物質による血液脳関門の破壊である。例には、マンニトールなどの拡散しにくい薬剤の、エトポシドなどの脳血管透過性を増す処方薬の、またはロイコトリエンなどの血管作用薬の動脈内点滴が挙げられる。ＮｅｕｗｅｌｔおよびＲａｐｐｏｐｏｒｔ（１９８４）Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．４３：２１４〜２１９、Ｂａｂａら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１１：６３８〜６４３、およびＧｅｎｎｕｓｏら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．１１：６３８〜６４３。
【０１６９】
さらに、治療が必要な部位に医薬品を局所的に投与することが望ましい場合があり、これは、例えば外科治療の間の局所的点滴によって、注射によって、カテーテルによって、あるいはシラスティック（ｓｉｌａｓｔｉｃ）膜などの膜または繊維を含めた細孔、非細孔、またはゼラチン状材料の埋没物によって達成することができる。
【０１７０】
治療化合物はまた、化学的変性または血液脳関門を越える類似体の選別を含めた薬理学的方法を使用することによって送達することもできる。この化合物を変性して、血液脳関門を越えて普通に輸送される分子に似たように分子の疎水性を増し、分子の実効電荷または分子量を減じ、あるいは分子を変性することができる。Ｌｅｖｉｎ（１９８０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：６８２〜６８４、Ｐａｒｄｒｉｇｅ（１９９１）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ中の、およびＫｏｓｔｉｓら（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４：９８９〜９９６。
【０１７１】
リポソームなどの疎水性環境中での薬物のカプセル化もまた、ＣＮＳへの薬物の送達に有効である。例えば、国際公開第９１／０４０１４号パンフレットは、薬物をリポソーム中にカプセル化するリポソーム送達システムについて記載している。この場合、このリポソームに血液脳関門を越えて普通に輸送される分子が添加されている。
【０１７２】
血液脳関門を通過するように薬物を処方する別の方法は、シクロデキストリン中に薬物をカプセル化することである。これらに限定されないがα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、およびそれらの誘導体を含めた血液脳関門を通過する任意の適切なシクロデキストリンを採用することができる。全般的には米国特許第５，０１７，５６６号明細書、同第５，００２，９３５号明細書、および同第４，９８３，５８６号明細書を参照されたい。これらの組成物にはまた、米国特許第５，１５３，１７９号明細書によって記載されているグリセロール誘導体を挙げることができる。
【０１７３】
送達はまた、治療薬を輸送可能な薬剤と複合して新規な輸送可能なキメラ治療薬を作り出すことによって得ることもできる。例えば、血管に作用する腸ペプチド類似体（ＶＩＰａ）は、特異的担体分子トランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）と複合させた後にのみその血管作用効果を発揮し、このトランスフェリン受容体が、血液脳関門を通り抜けるＶＩＰａ−Ｍａｂ複合体の取込みを容易にする。Ｐａｒｄｒｉｇｅ（１９９１）、およびＢｉｃｋｅｌら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２６１８〜２６２２。幾つかの他の特異的輸送系が確認されており、これらに限定されないがそれらにはインスリンを輸送するためのもの、またはインスリン様増殖因子ＩおよびＩＩが挙げられる。他の好適な非特異的担体には、これらに限定されないがピリジニウム、脂肪酸、イノシトール、コレステロール、およびグルコース誘導体が挙げられる。中枢神経系に入ると、薬物が担体から切断されて活性薬物を放出する幾つかのプロドラッグについて述べられてきた。米国特許第５，０１７，５６６号明細書。
【０１７４】
幾つかの実施形態では活性薬剤の複数回投与がなされる。活性薬剤の投与頻度は、様々な要因のいずれか、例えば症状の重さなどに応じて変えることができる。例えば幾つかの実施形態では活性薬剤は、１ヶ月につき１回、１ヶ月につき２回、１ヶ月につき３回、各週（ｑｏｗ）、１週間につき１回（ｑｗ）、１週間につき２回（ｂｉｗ）、１週間につき３回（ｔｉｗ）、１週間につき４回、１週間につき５回、１週間につき６回、１日おき（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、１日２回（ｑｉｄ）、または１日３回（ｔｉｄ）投与される。
【０１７５】
活性薬剤の投与の継続期間ｒ、例えば活性薬剤が投与される期間は、様々な要因のいずれか、例えば患者の反応などに応じて変えることができる。例えば活性薬剤は、約１日から約１週間、約２週間から約４週間、約１ヶ月から約２カ月、約２ヶ月から約４カ月、約４ヶ月から約６カ月、約６ヶ月から約８カ月、約８ヶ月から約１年、約１年から約２年、または約２年から約４年、またはそれ以上の範囲に及ぶ期間にわたって投与することができる。
【０１７６】
幾つかの実施形態では主題の方法は、２種類以上の異なる薬剤の投与を含む。例えば幾つかの実施形態では主題の方法は、個体におけるニューロン中のタウ遺伝子産物のレベルを低下させる薬剤、および少なくとも第二の薬剤の投与を含む。例えばアルツハイマー病の治療においては主題の方法は、ニューロン中のタウ遺伝子産物のレベルを低下させる薬剤と、Ａｒｉｃｅｐｔ（登録商標）（ドネペジルＨＣｌ）、Ｅｘｉｂａ（登録商標）（メマンチンＨＣｌ）、Ｅｘｅｌｏｎ（商標）（リバスチグミン）、ガランタミン、およびＲｅｍｉｎｙｌ（商標）（徐放性ガランタミン臭化水素酸塩）から選択される薬剤との併用有効量を投与することを含む。タウ遺伝子産物のレベルを低下させる薬剤は、第二の薬剤と同一の製剤として、または第二の薬剤とは別の製剤として投与することができる。タウ遺伝子産物のレベルを低下させる薬剤は、第二の薬剤と同一または異なる投薬計画で投与することができる。
【０１７７】
それら方法は、これらに限定されないがアルツハイマー病、パーキンソン病、発作、多発性硬化症、癲癇、筋委縮性側索硬化症、およびハンチントン病を含めた様々な神経毒性関連障害の治療に役立つ。これら方法はまた、頭部外傷の治療にも役立つ。
【０１７８】
治療に適した被検体
主題の方法による治療に適した個体には、これらに限定されないが神経毒関連障害と診断された個体、神経毒関連障害について治療されたが治療の効果を現わさなかった個体、および神経毒関連障害について治療され再発した個体が含まれる。好適な被検体には、頭部損傷を受けた個体が含まれる。
【実施例】
【０１７９】
下記の実施例は、当業者に本発明をどのように実施し使用するかの完全な開示と説明を与えるために公表されるものであり、これらは本発明者らが自分の発明と考えているものの範囲を限定するものでも、また下記の実験が実施された全部またはこれら実験のみであることを意味するものでもない。使用される数値（例えば量、温度など）に関して精度を保証するための努力がなされたが、若干の実験誤差および偏差は考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、また圧力は大気圧または大気圧近傍である。標準的な略語、例えばｂｐ（塩基対）、ｋｂ（キロ塩基）、ｐｌ（ピコリットル）、ｓまたはｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（分）、ｈまたはｈｒ（時間）、ａａ（アミノ酸）、ｋｂ（キロ塩基）、ｂｐ（塩基対）、ｎｔ（ヌクレオチド）、ｉ．ｍ．（筋内（に））、ｉ．ｐ．（腹膜内（に））、ｓ．ｃ．（皮下（に））などを使用する場合がある。
【０１８０】
実施例１：興奮毒性発作に及ぼすタウ減少の影響
材料および方法
マウス：スウェーデン（Ｋ６７０Ｍ／Ｎ６７１Ｌ）およびインディアナ（Ｖ７１７Ｆ）家族性アルツハイマー病（ＡＤ）変異を有するｈＡＰＰミニジーンをＰＤＧＦプロモーターの制御下で発現するＪ２０系統（１）を、Ｔａｕ−／−マウス（２）と交配させた。ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−×Ｔａｕ＋／−交配由来の同胞の子孫について検討を行った。雄のみを試験した水迷路試験を除いては雄および雌の両方が使用された。７つの別々のコホートにおいて解析される４５４匹（１遺伝子型につき６６〜８３匹）のマウス全体が、行動および／または神経病理学的実験において試験された。
【０１８１】
より低レベルのｈＡＰＰ（ｈＡＰＰｌｏｗ、系統Ｊ９）を発現するマウスと、ネズミＳｒｃファミリーチロシンキナーゼＦＹＮ（系統Ｎ８）の導入遺伝子を発現するマウスとを交配させてタウノックアウトマウスにした。ｈＡＰＰｌｏｗ／Ｔａｕ−／−マウスとＦＹＮ／Ｔａｕ−／−マウスを交配させて、タウ欠損のバックグラウンド上でバイジェニック（および非トランスジェニック対照）マウスを作製し、これらマウスを、通常のタウレベル（Ｔａｕ＋／＋）を有するｈＡＰＰｌｏｗおよびＦＹＮトランスジェニックマウスの交配から作製されたバイジェニック（および非トランスジェニック対照）マウスと比較した。
【０１８２】
全てのマウスは、近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド上にある。マウスは、明１２時間／暗１２時間のサイクルに、また随意に食物および水が入手可能に保たれた。この研究は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ）により認可され、また合衆国国立衛生研究所（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の「実験動物の注意および使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）」に従って行われた。すべての実験は、マウスの遺伝子型または処理法に対して盲目にされた検査員によって行われた。
【０１８３】
水迷路試験：水没した１４ｃｍ平方のプラットホームを表面より２ｃｍ下に備えた水迷路水槽（直径１２２ｃｍ）に不透明な水（１８℃）を入れた。キュー訓練セッションの場合、白黒縞模様の柱がプラットホームより高く装着された。マウスは、それぞれ２回の試行（１５分間隔てて）を含む６セッション（４時間隔てて１日につき２回）にわたってプラットホームを捜し出すように訓練された。プラットホームの位置は各セッションについて変更された。隠れたプラットホームの訓練が３日後に始まり、これにはそれぞれ３回の試行（１５分間隔てて）を含む１０セッション（４時間隔てて１日につき２回）が含まれる。プラットホームの位置は、隠れたプラットホームのセッションのあいだ一定のままであり、入口点はそれら試行のあいだ半無作為に変更された。隠れたプラットホームの訓練の第４日目を始める前に６０秒のプローブ試行が行われ、その間にプラットホームが除去された。プローブ試行の入口点は標的四分円の反対側の四分円の中にある。追加のプローブ試行が、隠れたプラットホームの試行の第５日目の７２時間後に行われた。行動は、ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎビデオ追跡システム（Ｎｏｌｄｕｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により監視された。
【０１８４】
Ｙ迷路試験：Ｙ迷路は、高さ１０ｃｍの黒色プラスチック壁で構築された。それは、４ｃｍ×５ｃｍの通路で繋がった３つの区画（１０ｃｍ×１０ｃｍ）からなる。マウスを区画の１つに入れ、６分間自由に運動させた。アーム侵入は、４本の全ての足が区画に入った時に手動で記録された。各マウスの試験後、迷路を完全に浄化して匂いを標準化した。
【０１８５】
新しい檻の探検：マウスを通常のルーム・ランプ下で５分間清潔な空の檻の中に置いて探検させた。５秒ごとに検査員は、マウスが活動的（例えば、歩行、跳躍、または立ち上がり）であるか、またはほとんど活動しないか（例えば、匂いを嗅ぐかまたは動かない）を記録した。
【０１８６】
十字迷路試験：十字迷路試験は（３）に記載のように行った。簡潔に言えば試験室内でほのかな明かりに３０分間慣らした後に、マウスを個々に装置（Ｈａｍｉｌｔｏｎ−Ｋｉｎｄｅｒ，Ｐｏｗａｙ，ＣＡ）の中央に置き、１０分間探検させた。アームのそれぞれの中で費やした時間および移動した距離を赤外線ビームの途切れによって求めた。各マウスの試験後、装置を完全に浄化して匂いを標準化した。
【０１８７】
イムノブロッティング：プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液中で海馬をホモジナイズし、短時間のあいだ音波処理し、１５，０００×ｇで１０分間遠心した。タンパク質濃度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓシステム（Ｐｉｅｒｃｅ）により求めた。（４）に記載のように、試料のローディングに先立って２％塩化ナトリウムおよび５％β−メルカプトエタノールを加え、試料を１００℃で１０分間加熱し、氷上で３０分間インキュベートし、４℃において１２，０００×ｇで１５分間遠心分離した。試料緩衝液をこの熱安定性上澄みに加え、Ｎｏｖｅｘゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にローディングした。使用した抗体は、モノクローナル非ホスホ選択性抗タウクローン５Ｅ２（１：１０００、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、モノクローナル抗ｈＡＰＰクローン８Ｅ５（１：１０００、Ｐｅｔｅｒ  Ｓｅｕｂｅｒｔ，Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、モノクローナル抗リン酸化タウＴｈｒ１８１クローンＡＴ２７０（１：３０００、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、モノクローナル抗リン酸化タウＳｅｒ２０２クローンＣＰ１３（１：４０、Ｐｅｔｅｒ  Ｄａｖｉｅｓ，Ａｌｂｅｒｔ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、モノクローナル抗リン酸化タウＴｈｒ２３１クローンＣＰ９（１：２５、Ｐｅｔｅｒ  Ｄａｖｉｅｓ）、モノクローナル抗リン酸化タウＳｅｒ２６２クローン１２Ｅ８（１：４０００、Ｐｅｔｅｒ  Ｓｅｕｂｅｒｔ）、モノクローナル抗リン酸化タウＳｅｒ３９６／４０４クローンＰＨＦ１（１：１００、Ｐｅｔｅｒ  Ｄａｖｉｅｓ）、またはモノクローナル抗チューブリンクローンＢ−５−１−２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）である。ブロットは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ５．２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）により定量した。
【０１８８】
ｈＡＰＰマウス中のタンパク質分画およびＡβ＊５６検出は、（５）に記載のように行われた。簡潔に言えばＲＩＰＡ可溶性画分由来の全タンパク質（１００μｇ）を１０．５〜２０％トリシンゲル上で分離し、ニトロセルロース膜（孔径０．２μｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。ビオチン化６Ｅ１０抗体（１：１０００、Ｓｉｇｎｅｔ，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）およびＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（１：５０００、Ｓｉｇｍａ）をイムノブロッティング用に使用した。
【０１８９】
Ａβ  ＥＬＩＳＡ：グアニジン可溶化海馬ホモジネートを（６）に記載のようにアッセイした。Ａβ１〜４２ＥＬＩＳＡは、抗体２１Ｆ１２および３Ｄ６を使用した。Ａβ１〜ｘＥＬＩＳＡは、抗体２６６および３Ｄ６を使用した。
【０１９０】
病理組織学：免疫組織化学法を、（７）に記載のようにフローティング３０μｍ回転式ミクロトーム切片上で行った。Ａβ沈着物を、ビオチン化モノクローナル抗体３Ｄ６（１：５００、Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）で、アビジン−ビオチン／ペルオキシダーゼ法（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて染色した。他のアッセイは、モノクローナル抗ＧＡＰ４３クローンＧＡＰ−７Ｂ１０（１：４００、Ｓｉｇｍａ）、ＣＰ１３、およびＰＨＦ１を含む非抱合一次抗体を、ビオチン化二次抗体と共に使用した。画像は、デジタル・マイクロスコープ（Ａｘｉｏｃａｍ，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で取得した。面積％およびデンシトメトリーによる定量は、Ｂｉｏｑｕａｎｔソフトウェア・パッケージ（ＢＩＯＱＵＡＮＴ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行った。
【０１９１】
アミロイドプラークおよびジストロフィー性神経突起の二重標識の場合、フローティング切片をモノクローナル抗ｈＡＰＰ抗体８Ｅ５（１：１０００、Ｐｅｔｅｒ  Ｓｅｕｂｅｒｔ，Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）で染色し、ガラススライド上に取り付け、０．０１５％チオフラビン−Ｓで染色した。画像を共焦点顕微鏡（Ｂｉｏｒａｄ）により収集した。
【０１９２】
カルビンディン免疫染色をウサギ抗カルビンディン（１：１５，０００、Ｓｗａｎｔ，Ｂｅｌｌｉｎｚｏｎａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で行い、ＮＰＹをウサギ抗神経ペプチドＹ（１：８，０００、ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＷＩ）で染色した。
【０１９３】
一次ニューロン培養物のＡβ処理：皮質をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ仔ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から生後０〜１日に単離した。細胞を、ダルベッコ変性イーグル培地、１０％ウシ胎児血清、０．５ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ、ペニシリン１００単位／ｍｌ、およびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含有する平板培地中で１ｍｌ当たり細胞１６０，０００個を塗布した。線維性Ａβを、さきの記載（８）と同様に１００μＭ  Ａβを１０ｍＭ  ＨＣｌ中で３７℃において２４時間インキュベートすることによって調製した。細胞を、培養における５日後に２０μＭ線維性Ａβで処理し、４８時間処理後に集めた。
【０１９４】
興奮毒性の評価：薬物をＰＢＳ中に溶解し、腹膜内注射により送達した。ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を濃度５ｍｇ／ｍｌおよび用量４０ｍｇ／ｋｇで使用した。カイニン酸（Ｔｏｃｒｉｓ，Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ）を濃度２ｍｇ／ｍｌおよび用量２０〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲で使用した。ＰＴＺを与えられたマウスの場合、各マウスを檻の中に入れ、ビデオ撮りにより投与後２０分間観察した。遺伝子型に対して盲目にされた検査員がビデオテープを解析して、公表されている等級（９、１０）に従って発作の経時変化および重症度を定量した。発作の重症度の評点は、０＝普通の行動、１＝動きなし、２＝全身の痙攣、震え、または引き攣り、３＝尾部伸展、４＝前肢間代、５＝全身の間代性行動、６＝跳ね上がりまたは走行発作、７＝完全な強直性伸展、８＝死亡である。ＫＡを与えられたマウスの場合、各マウスを檻の中に入れ、投与後３時間観察した。遺伝子型に対して盲目にされた検査員が公表されている尺度（１１）に従って発作の経時変化および重症度を定量した。段階６（全身の間代性発作）に達したマウスの割合を提示する。
【０１９５】
ＣＣＩおよびワイヤぶら下がり試験（Ｗｉｒｅ  Ｈａｎｇ  ｔｅｓｔ）：制御皮質衝撃（ＣＣＩ）試験の場合、雄マウス、Ｔａｕ＋／＋およびＴａｕ−／−（各遺伝子型についてｎ＝２２）を使用した。複数の群を確保するためにＣＣＩの直前にワイヤぶら下がり試験に関して予備試験を受けたマウスは、基準動作のバランスが考慮された。各群について１２匹のマウスがＣＣＩを有し、１０匹が偽の手術を受けた。マウスは、ＣＣＩの１、４、７、９、１４、および２９日後に再びワイヤぶら下がり試験で試験された。簡潔に言えばマウスは、木製ロッド間のベンチトップの約１８インチ上方に掛けられたワイヤ上に置かれた。マウスをロッド上に置き、ビデオテープ録画した。遺伝子型および処理法に対して盲目にされた検査員が、１〜５の等級に基づいて行動に評点を付けた（Ｈａｌｌら（１９８８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．６８：４５６〜４６１）。損傷の１ヶ月後、マウスは前述のように発作閾値に関して試験を受けた。
【０１９６】
統計分析：Ｐ＜０．０５の値を有意とみなした。エラー・バーは、平均値の標準誤差を表す。生存データ（図２Ｅ）は、カプラン・マイヤー法およびポストホックログランク（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｌｏｇ  ｒａｎｋ）検定により分析した。フィッシャーの正確確率検定を用いて、ＰＴＺ注射後の致命的状態の癲癇発作繰り返しによる意識障害の発現を分析した。ロジスティック回帰を用いて、ＫＡ投与後のマウスの発作の比率に関する用量−反応曲線を作成し比較した（図４Ｄ）。他の実験については遺伝子型の違いを、ポストホック比較に関するテュキー検定を用いてＡＮＯＶＡ（指示された場合、反復測定）により分析した。
【０１９７】
結果
アミロイド−β−ペプチド（Ａβ）およびタウの沈着は、アルツハイマー病（ＡＤ）の病理学的証明である。Ａβの産生、クリアランス、および凝集に照準を定めた治療は、すべて臨床実験中である。しかしながら標的としてのタウへの関心は、部分的にはタウ病変がＡβの川下で起こるように見える（１〜４）ために弱められてきた。また、ＡＤにおいてタウは翻訳後に修飾され（５〜８）、どの修飾を標的にするべきかに関して論争が続いている。タウレベル全体を低下させることは代替のアプローチである（９）。若干高いタウ発現を後押しするタウハプロタイプはＡＤのリスクを増す（１０）。Ａβ産生を増加させる家族性ＡＤ変異によりヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）を発現するトランスジェニックマウスにおける認知障害に及ぼす内因性タウ発現の低下の影響を測定した。
【０１９８】
ｈＡＰＰマウス（１１）をＴａｕ−／−マウス（１２）と交配し、内因性タウ対立遺伝子を２種類有する（ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋）、１種類有する（ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−）、または何も有さない（ｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−）マウスにおけるｈＡＰＰ／Ａβの影響を、ｈＡＰＰのないＴａｕ＋／＋、Ｔａｕ＋／−、およびＴａｕ−／−マウスと比較して調べた。タウ減少は海馬のｈＡＰＰ発現に影響を及ぼさない、また逆に言えばｈＡＰＰは海馬のタウレベルに影響を及ぼさなかった。これら６種類の遺伝子型は、体重、全般的健康、基本的反射能力、感覚反応、または全体の運動機能の違いを何も示さなかった。
【０１９９】
学習および記憶を試験するためにモーリス水迷路試験を用いた。このキューバージョンではマウスは、プラットホームの直上に置かれた、目立つマーカーを用いてその標的のプラットホームを見つけることを学習する。月齢４〜７ヶ月でＴａｕ＋／＋、Ｔａｕ＋／−、およびＴａｕ−／−マウスは迅速に学習したが、予想通り（１３、１４）、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスはこの課題をマスターするのにより長くかかった（図１Ａ、Ｐ＜０．００１）。これとは対照的にｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−およびｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスは、管理水準で行動した。
【０２００】
水迷路試験の一層困難な隠れたプラットホームバージョンは、空間的な学習を要求する。ｈＡＰＰのないマウスはタウ遺伝子型に関係なく訓練の３日間かけてこの課題を学習したが、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスは４〜５日間まで学習の形跡を示さなかった（Ｐ＜０．００１、図１Ｂ）。明らかにｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−マウスは、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスほどは損なわれておらず（Ｐ＜０．０２）、またｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスは、ｈＡＰＰのない対照と違わなかった（図１Ｂ）。プラットホームを除去し、マウスが水槽を探検するのに６０秒間を与えたプローブ試行では、タウ減少の有益な効果が確認された（図１Ｃ〜Ｅ）。３日間の訓練の２４時間後の最初のプローブ試行においてｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスは、プラットホームの位置の明白な空間的記憶を有しておらず、標的プラットホームの位置を横断したが、マウスは標的でない四分円でも等価の面積を横断したに過ぎない（図１Ｄ）。しかしｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスは、ｈＡＰＰのないマウスと同様に、標的プラットホームの位置をより頻繁に横断した（Ｐ＜０．０１、図１Ｄ）。訓練を２日間追加した後、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−マウスもまた非標的の横断よりも多回数の標的の横断を有し（Ｐ＜０．０１）、一方、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスは、まだ空間的学習および記憶を有していなかった（図１Ｅ）。したがってタウ低減遺伝子は、ｈＡＰＰ／Ａβに誘発される水迷路学習および記憶機能障害を用量依存的に改善する。
【０２０１】
図１：タウ低減は、ｈＡＰＰマウスにおける水迷路学習機能障害を防止した（ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス７〜１１匹、月齢４〜７ヶ月）。（Ａ）キュープラットホーム学習曲線。「０」日は、第一試行での行動を示し、後続の点は毎日の全試行の平均を表す。行動は、遺伝子型によって異なった（ＲＭＡＮＯＶＡ：Ｐ＜０．００１、またｈＡＰＰ×タウ交互作用Ｐ＝０．０５８）。ポストホック比較においてはｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋のみが、ｈＡＰＰのない群と異なった（Ｐ＜０．００１）。（Ｂ）遺伝子型によって異なる、隠れたプラットホームの学習曲線（ＲＭＡＮＯＶＡ：Ｐ＜０．００１、またｈＡＰＰ×タウの交互作用Ｐ＝０．０２）。ポストホック比較において、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋はｈＡＰＰのないすべての群と異なり（Ｐ＜０．００１）、またｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−はｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋（Ｐ＜０．０２）およびｈＡＰＰのない群（Ｐ＜０．０１）と異なり、またｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−はｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋と異なる（Ｐ＜０．００１）が、ｈＡＰＰのないいずれの群とも異ならなかった。（Ｃ〜Ｄ）３日間の隠れたプラットホームの訓練の完了の２４時間後のプローブ試行。（Ｃ）代表的な経路の痕跡。（Ｄ）遺伝子型によって異なるその他の３つの四分円中の等価の面積の横断に対する標的プラットホームの横断の回数（標的横断×遺伝子型の交互作用Ｐ＜０．００１）。ポストホック比較においてはｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋およびｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−を除くすべての遺伝子型が、その他の３つの四分円中の等価の面積よりも標的位置に対して選択傾向を示した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｅ）５日間の隠れたプラットホームの訓練完了の７２時間後のプローブ試行。標的プラットホームの選択傾向は、遺伝子型によって異なった（標的横断×遺伝子型の交互作用Ｐ＜０．００１、また標的横断×ｈＡＰＰ×タウの交互作用Ｐ＜０．０５）。ポストホック比較においてｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋を除くすべての遺伝子型が、標的位置の選択傾向を示した（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【０２０２】
探検自発運動活性の増加は嗅内皮質の損傷後に見られ、空間情報処理の機能障害を反映している可能性があり（１５）、ｈＡＰＰマウスは類似の機能亢進状態を示す（１４）。ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスは、Ｙ迷路試験において（Ｐ＜０．００１、図２Ａ）、新しい檻において（Ｐ＜０．０５、図２Ｂ）、また高架式十字迷路試験において（Ｐ＜０．００１、図２Ｃ）活動過多であった。一方、これらの異常は、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−およびｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスにおいては見られなかった（図２Ａ〜Ｃ）。タウ減少によって与えられる利益が持続するかどうかを判定するために、本発明者らは高齢のマウスを調査した。機能亢進は、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスでは持続し、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスでは１２〜１６か月ではないままであった（Ｐ＜０．０５、図２Ｄ）。
【０２０３】
病因の不明確な早期死亡にもまた、ｈＡＰＰマウスにおいて観察された（Ｐ＜０．００５、図２Ｅ、参考文献１６、１７）。さらにｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−およびｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−マウスの両方ともこの早期死亡から防護された。したがってタウ減少は、ｈＡＰＰマウスにおける主要なＡβ依存性悪影響を防止した。タウ減少が保護効果を発揮する可能性のある幾つかの妥当と思われるメカニズムを検討し、タウの予期しない役割を発見した。
【０２０４】
図２：タウ減少は、ｈＡＰＰマウスにおける行動障害および早期死亡を防止した。（Ａ）Ｙ迷路の６分間の探検の間の総アーム侵入回数（ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス４９〜５８匹、月齢４〜７ヶ月、ＡＮＯＶＡ：遺伝子型の影響Ｐ＜０．０００１、ｈＡＰＰ×タウの交互作用Ｐ＜０．０００１、ｈＡＰＰのない群と対比して＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｂ）新しい檻の５分間の探検の間に活発に過ごした時間のパーセント（ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス７〜１４匹、月齢４〜７ヶ月、ＡＮＯＶＡ：遺伝子型の影響Ｐ＜０．０１、ｈＡＰＰ×タウの交互作用Ｐ＜０．０５、ｈＡＰＰのない群と対比して＊Ｐ＜０．０５）。（Ｃ）高架式十字迷路の１０分間の探検の間にオープンアームおよびクローズドアームの両方の中を移動した総距離（ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス４９〜５９匹、月齢４〜７ヶ月、ＡＮＯＶＡ：遺伝子型の影響Ｐ＜０．０００１、ｈＡＰＰ×タウの交互作用Ｐ＜０．０５、ｈＡＰＰのない群と対比して＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｄ）高架式十字迷路の探検の間に移動した総距離（ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス６〜１３匹、月齢１２〜１６ヶ月、ＡＮＯＶＡ：ｈＡＰＰの影響Ｐ＜０．００１、ｈＡＰＰ×タウの交互作用Ｐ＜０．０７９、ｈＡＰＰのない群と対比して＊Ｐ＜０．０５）。（Ｅ）ｈＡＰＰマウスにおける早期死亡に及ぼすタウ減少の影響を示すカプラン・マイヤー生存曲線。コロニー中の全遺伝子型マウス（ｎ＝８８７）がこの分析に含まれた。ログランク比較によればｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスのみが他のすべての群と異なった（Ｐ＜０．００５）。
【０２０５】
タウ減少が単にＡβレベルまたは凝集を変えるのみである可能性は排除された。タウの減少は、ｈＡＰＰの発現、可溶性Ａβ１−ｘまたはＡβ１−４２レベル、あるいはＡβ１−４２／Ａβ１−ｘ比を変えなかった。さらにｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−、およびｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスは、４〜７ヶ月および１４〜１８ヶ月において類似のプラーク負荷を示した（図３Ａ〜Ｂ）。またＡβ＊５６のレベル、すなわち記憶機能障害につながる特異的Ａβ集合体に及ぼすタウ減少の影響も見出されなかった（１８）。したがってタウ減少の有利な効果はＡβ負荷量の検出可能な変化を伴わずに観察され、これはタウ減少がＡβを川下の発病機構から切り離すことを示唆している。
【０２０６】
次にｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスにおいてＡβの川下エフェクターとして働く可能性のあるタウの異常形態を捜した。ヒトのタウにおけるＡＤに関係する主要なリン酸化部位は、ＧＳＫ−３βおよびｃｄｋ５などのプロリン指向性キナーゼによって、または微小管親和性調節キナーゼ（ＭＡＲＫ）によってリン酸化されるものを含めてネズミのタウ中に保存される。これらの部位におけるネズミのタウのリン酸化の変化は、例えば低体温症の直後に簡単に検出される（参考文献１９）。しかし月齢４〜７ヶ月のｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスの海馬のホモジネートにおいては、Ｔｈｒ１８１、Ｓｅｒ２０２、Ｔｈｒ２３１、およびＳｅｒ３９６／４０４を含めたプロリン指向性キナーゼの部位での、またはＭＡＲＫの主要部位Ｓｅｒ２６２でのタウのリン酸化には何も変化が見出されなかった。神経毒性タウフラグメントの世代もまた、Ａβ毒性のメカニズムの原因だと指摘されてきた（２０）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡβ毒性が１７ｋＤのタウフラグメントの産生を伴うことは明らかである（２０）ので、タウを欠く初代ニューロンはＡβに誘発される退化に抵抗を示す（３、２１）。Ａβで処理した初代ニューロンのライゼート中の１７ｋＤのタウフラグメントの存在は確認されているが、異常なタウタンパク質分解は、ｈＡＰＰマウス由来の海馬のホモジネート中に何も見出されず、これはこれら２つの系におけるタウ減少の神経保護効果が機構的に異なることを示唆している。修飾されたタウの相対的欠乏はまた、ヒトにおいてＡＤではなく前頭側頭性痴呆を引き起こす変異を有するタウを過剰発現するトランスジェニック系統（２、４、２２）と本発明者らのモデルを区別する。この検討において内因性の野生型タウの減少はｈＡＰＰマウスをＡβ依存性認知機能障害から防護し、これは典型的なＡＤ随伴性修飾を有する大量のタウの除去を伴わなかった。これらの実験は、他の型のタウ修飾、あるいは限られた細胞内区画または細胞集団中の少量の修飾されたタウがＡβの川下で役割を果たす可能性を否定しなかった。
【０２０７】
この可能性への取組みを始めるためにＴａｕ＋／＋およびｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウス由来の脳の切片をリン酸化タウ抗体で染色した。リン酸化タウ免疫活性においてＴａｕ＋／＋とｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスの間に全体的にはほとんど差は見られなかったが、アミロイドプラークを取り巻くジストロフィー性神経突起中に散在しているリン酸化タウ陽性の点を観察した。ｈＡＰＰマウスにおけるタウ減少の利点が、ＡＤに関係のある認知機能低下の一因の可能性のある神経突起のジストロフィー防止に関係する可能性があるかどうか尋ねた（２３）。それらの行動の違いにもかかわらず、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−、およびｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスには似た量の神経突起のジストロフィーがあった（図３Ｃ）。したがってタウは、プラーク随伴ジストロフィー性神経突起の形成にとっては必要でない。タウ減少が神経突起のジストロフィーではなく行動の欠陥を防止すると仮定すると、これらは原因となって連鎖する疾患の発現ではなく、同時進行の疾患の発現を意味するか、またはタウ減少は神経突起のジストロフィーの川下で作用する可能性がある。
【０２０８】
タウは、軸索の生長において十分に特徴が明らかにされている役割を有し（１２）、したがってタウ減少がＡＤ（２４）およびｈＡＰＰマウス（１７）において観察される海馬の軸索の異常新芽形成を防止するかどうかが試験された。タウ遺伝子型に関係なく、似た程度の新芽形成が観察された（図３Ｄ）。したがってタウ減少はＡβ誘発性神経機能障害に関係する重要な測定指標に影響を及ぼしたが、Ａβのすべての影響が遮断されたとは言えない。
【０２０９】
図３：タウ減少は、Ａβプラークの沈着、神経突起のジストロフィー、または異常新芽形成を変えなかった。（Ａ）ｈＡＰＰマウスにおける海馬のアミロイドプラークのチオフラビン−Ｓ染色。プラークによって覆われた海馬面積のパーセントをｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスにおける平均値に関して正規化した（ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス６〜１１匹、月齢１４〜１８ヶ月）。（Ｂ）ｈＡＰＰマウスにおける海馬のＡβ沈着の免疫染色。プラークによって覆われた海馬面積のパーセントをｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスにおける平均値に関して正規化した（ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス６〜１１匹、月齢１４〜１８ヶ月）。（Ｃ）月齢１４〜１８ヶ月のｈＡＰＰマウスにおけるジストロフィー性神経突起（抗体８Ｅ５、赤色）およびアミロイドプラーク（チオフラビン−Ｓ、緑色）に対する海馬の二重染色。ただし、ジストロフィー性神経突起の定量化は、取り巻く神経突起のジストロフィーによるチオフラビン−Ｓ陽性プラークのパーセントとして表わされる（ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス９〜１１匹）。（Ｄ）歯状回の分子層中の異常な軸索新芽形成のＧＡＰ４３免疫染色（ｏｍｌは外側分子層、ｍｍｌは中間分子層、ｉｍｌは内側分子層、ｄｇｃは歯状顆粒細胞）。ブラケットは、ｈＡＰＰマウスの外側分子層中のＧＡＰ４３陽性新芽形成を強調している。新芽形成は、デンシトメトリーにより定量し、正規化した（ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス７〜１４匹、月齢４〜７ヶ月、ｈＡＰＰのない群と対比して＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【０２１０】
興奮毒性はＡＤの病因に関与している（２５、２６）。ＡＤ患者における発作の高い発病率と矛盾することなく（２７）、ＴｇＣＲＮＤ８  ｈＡＰＰマウスは、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストのペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）の影響をより受けやすい（２８）。同様のパラダイムを用いて本発明者らは、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスはまたＰＴＺに対しても異常に敏感であり、ｈＡＰＰのないマウスに対する非致死用量において２０％が致命的な癲癇持続状態に罹ることを見出した（Ｐ＜０．０５）。タウ減少はこの影響を防止した。したがってｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−またはｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスは死亡しなかった。ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−またはｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスにおける発作はそれほど重症ではなく、またｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスの場合よりも長い潜伏期で起こった（Ｐ＜０．０１、図４Ａ〜Ｂ）。
【０２１１】
タウ減少はまた、ｈＡＰＰ非トランスジェニックマウスにおけるＰＴＺに対する耐性を増し、発作の重症度を下げかつ発作の発病を遅らせる（Ｐ＜０．０１、図４Ａ、Ｃ）。タウ減少が神経の異常な過度の興奮を減らすことができることを確かめるために、マウスをグルタミン酸受容体アゴニストであるカイニン酸の興奮毒性用量で試した。予想されるようにカイニン酸の腹膜内注射は、Ｔａｕ＋／＋マウスにおいて用量依存的に発作を誘発した（図４Ｄ）。一方、Ｔａｕ＋／−およびＴａｕ−／−マウスは、一定の範囲の用量にわたってカイニン酸に耐えた（Ｐ＜０．０５、図４Ｄ）。したがってタウは、興奮毒に対する感度を調節し、また神経活動の制御に関与している可能性がある。ｈＡＰＰのないマウスにおけるタウ減少の抗興奮毒性作用は、タンパク質の病的形態の除去よりもタウの生理学的機能に関係している可能性が高い。タウの生理学的形態によるＡβへのニューロンの感作は、それらの明らかなタウ修飾の欠乏にもかかわらずタウ減少がなぜｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスに有効なのかを説明することができる。
【０２１２】
図４：タウ減少は興奮毒誘発性発作に対する抵抗性を増した。（Ａ）タウ減少は、ＰＴＺの単回ｉ．ｐ．注射後の発作の重症度を低減させた（４０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス１０〜１１匹、月齢４〜７ヶ月、ＡＮＯＶＡ：タウの影響Ｐ＜０．０００１）。発作の重症度は、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスよりもｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−およびｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスにおいてより軽かった（ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋と対比して＊＊Ｐ＜０．０１）。発作の重症度はまた、Ｔａｕ＋／＋マウスよりもＴａｕ−／−マウスにおいてより軽かった（Ｔａｕ＋／＋と対比して＃＃Ｐ＜０．０１）。（Ｂ〜Ｃ）ＰＴＺ投与後に発作の重症度の各ステージに到達する潜伏期。（Ｂ）ＰＴＺ誘発性発作は、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−およびｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスよりもｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスにおいてより急速に起こった（ＲＭＡＮＯＶＡ：Ｐ＜０．０１）。（Ｃ）タウ減少はまた、ｈＡＰＰのないマウスにおけるＰＴＺ誘発性発作の発病を遅らせた（ＲＭＡＮＯＶＡ：Ｐ＜０．００１）。（Ｄ）表示した用量でのカイニン酸の単回ｉ．ｐ．注射後に全身の強直性〜間代性発作の発生に評点を付けた。タウ減少は、カイニン酸に対する感受性を低下させ、用量−反応曲線を右方にシフトさせた（ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス１９〜２４匹、月齢２〜５ヶ月、ロジスティック回帰：Ｐ＜０．０５）。
【０２１３】
マウスの健康または認識力に及ぼすタウ減少の悪影響は見つからず、また部分的なタウ減少でさえＡβおよび興奮毒性薬剤からマウスを確実に保護するという事実は、神経の過度な興奮の低減におけるその利点を目立たせる。
【０２１４】
回路網興奮性に及ぼすタウ減少の影響を調査した。興奮回路と抑制回路の間の平衡異常を有する神経回路網機能障害は、ＡＤ関連認識機能障害の一因となる可能性があり（Ｐａｌｏｐら、２００６）、多数のＡＤマウスモデルに見出される。このような回路網機能障害の１つの特徴は、歯状顆粒細胞中のカルビンディンの欠失、すなわちＡＤ患者およびｈＡＰＰマウスの両方で起こる過度な興奮に対する神経保護反応（Ｎａｅｇｅｒｌら、２０００）である（Ｐａｌｏｐら、２００３）。タウ減少がＪ２０マウスにおける過度な興奮を遮断するならば、抑制回路の代償的なアップレギュレーションは不必要なはずであり、かつそれもまた遮断されるはずであると予想した。ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウス中では予想されるカルビンディンの欠失（Ｐ＜０．００１、図７Ａ〜Ｃ）が観察されたが、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−およびｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウス中のカルビンディンの変化はなく、これはタウ減少がＡβ誘発性回路網機能障害を改善するという証拠を与える。多くの系統のｈＡＰＰマウスがまた、歯状回中の神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）の正常でない発現を起こす。カルビンディンの欠失と同様に異常なＮＰＹ発現は、神経の過度な興奮の補償と関連づけられる可塑性の形態である（Ｖｅｚｚａｎｉら、１９９９）。ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスの歯状回および苔状線維中の高レベルの正常でないＮＰＹが観察されたが、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−マウス中ではあまり観察されず、またｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウス中ではまったく観察されなかった（図７Ａ〜Ｃ）。タウ減少によるカルビンディンおよびＮＰＹの補償的変化が存在しないことは、タウ減少が神経回路網機能障害を防止するという仮説をさらに裏付ける。
【０２１５】
図７Ａ〜Ｃ：タウ減少はカルビンディンおよびＮＰＹのｈＡＰＰ／Ａβ誘発性変化を防止する。ｈＡＰＰＪ２０マウスを２世代のあいだＴａｕ−／−マウスと交配させて、様々なレベルのタウ発現（縦列）およびｈＡＰＰ（横列）を有する同胞の子孫を生み出した。月齢４〜７ヶ月のマウス由来の脳の切片をカルビンディンまたはＮＰＹに免疫染色し、免疫活性をデンシトメトリーにより定量した。歯状回中のカルビンディン欠失は、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウス中で観察されたが、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−またはｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウス中では観察されなかった（歯状回の分子層中の定量、ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス２５〜４０匹、ｈＡＰＰ×タウの交互作用Ｐ＜０．０００１、ｈＡＰＰのない群と対比して＊＊＊Ｐ＜０．００１）。高いＮＰＹ発現は、ｈＡＰＰＪ２０／Ｔａｕ＋／＋マウスにおいては顕著であり、ｈＡＰＰＪ２０／Ｔａｕ＋／−マウスにおいてはかすかであり、またｈＡＰＰＪ２０／Ｔａｕ−／−マウスにおいては存在しなかった（Ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス９〜１３匹）。ＮＰＹ免疫活性の類似のパターンは歯状回分子層中にも見られ（ｈＡＰＰ×タウの交互作用Ｐ＜０．０２、ｈＡＰＰのない群と対比して＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１）、また苔状線維中にも見られた（ｈＡＰＰ×タウの交互作用Ｐ＜０．０２、ｈＡＰＰのない群と対比して＊＊Ｐ＜０．０１）。
【０２１６】
図８：タウ減少は、別個のＡＤマウスモデル、すなわち低レベルのＡβおよび高レベルのＦＹＮチロシンキナーゼを発現するバイトランスジェニックマウスにおける興奮毒性を防止する。この実験に使用した低発現ｈＡＰＰマウス（Ｊ９系統）は、きわめてかすかなＡβ誘発性神経機能障害を有するに過ぎない。しかしＦＹＮトランスジェニックマウスと交配してｈＡＰＰｌｏｗ／ＦＹＮバイジェニックマウスにした場合、機能障害は重症であり、高発現ｈＡＰＰマウスにおいて観察されたものと似ている（Ｃｈｉｎら（２００４）、Ｃｈｉｎら（２００５））。これらのバイジェニックマウスはまた、非トランスジェニックマウスに対する非致死用量においてＰＴＺに対する高い感受性を有し、癲癇持続状態に関連した死亡を伴った（Ｐ＜０．０２）。これとは対照的にタウ減少の後、ｈＡＰＰｌｏｗおよびバイジェニックマウスは両方ともＰＴＺに耐性を示す。
【０２１７】
図９：タウ減少はｈＡＰＰｌｏｗ／ＦＹＮバイジェニックマウスにおける早期死亡を阻止する。他のｈＡＰＰ系統における場合と同様に、バイジェニックモデルは高レベルの早期死亡率を示す。これとは対照的にタウ減少の後、バイジェニックマウスは通常の生存率を示す。
【０２１８】
図１０Ａ〜Ｃ：タウ減少はｈＡＰＰ／ＦＹＮバイジェニックマウスにおける行動機能障害を防止する。（Ａ）正常なタウ発現を有するバイジェニックマウスは、高架式十字迷路試験においてオープンアーム中で異常なレベルの探検を示す。この異常はタウ減少によって遮断される。（Ｂ）正常なタウ発現を有するバイジェニックマウスは、オープンフィールド中で活動過多である。この異常はタウ減少によって遮断される。（Ｃ）正常なタウ発現を有するバイジェニックマウスは、モーリス水迷路試験において不十分な空間的学習および記憶を示し、標的プラットホームの場所を非トランスジェニック同腹子よりも少ない回数横断した。この異常はタウ減少によって遮断される。
【０２１９】
図１１：タウ減少はＴＡＳＤマウスにおける早期死亡を防止する。ｈＡＰＰマウスの明瞭な系統（ＴＡＳＤ系統）をタウノックアウトマウスと交配した。ＴＡＳＤ系統は、別のプロモーター（Ｊ２０およびＪ９系統においてＰＤＧＦに対してＴｈｙ１）から、また様々なＦＡＤ変異（Ｊ２０およびＪ９系統においてスウェーデンおよびインディアナに対してスウェーデンおよびロンドン）を有するｈＡＰＰを発現する。通常のタウレベルを有するＴＡＳＤマウスは高い早期死亡を示す（Ｐ＜０．０２）が、この異常はタウ減少後には見られない。
【０２２０】
タウ減少がｈＡＰＰマウスにおける神経機能障害を防止するメカニズムを調べるために、タウ減少が単にＡβレベルまたは凝集を変える可能性が否定された。タウ減少は、ｈＡＰＰ発現（図１２Ａ〜Ｃ）、可溶性Ａβ１−ｘまたはＡβ１−４２のレベル、あるいはＡβ１−４２／Ａβ１−ｘ比（図１３Ａ〜Ｃ）を変えなかった。さらにｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−、およびｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスは、４〜７ヶ月（図１４Ａ〜Ｈ）および１４〜１８ヶ月（図３Ａ〜Ｂ）で似たプラーク負荷を示した。Ａβ＊５６、すなわち記憶機能障害に関連した特異的Ａβ集合体（Ｌｅｓｎｅら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４０：３５２〜３５７）のレベルに及ぼすタウ減少の影響は見出されなかった（図１５ＡおよびＢ）。したがってタウ減少の有利な効果は、Ａβ負荷量の検出可能な変化を伴わずに観察され、これはタウ低減がＡβを川下の発病機構から切り離すことを示唆している。
【０２２１】
図１２Ａ〜１２Ｃ：タウおよびｈＡＰＰのレベル。（Ａ）イムノブロットは、この検討における６種類の遺伝子型のそれぞれ由来の海馬ホモジネート中のタウおよびｈＡＰＰのレベルを示す。チューブリンは負荷対照として働いた。（Ｂ）イムノブロッティングによって求め、Ｔａｕ＋／＋対照（ｎ＝遺伝子型１種類につき４匹）のパーセントとして表わしたタウレベルの定量化。（Ｃ）イムノブロッティングによって求め、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋対照（ｎ＝遺伝子型１種類につき４〜８匹）のパーセントとして表わしたｈＡＰＰレベルの定量化。
【０２２２】
図１３Ａ〜Ｃ：タウ減少はＡβレベルに影響を及ぼさない。月齢２〜３．５ヶ月のマウス（プラーク形成前）由来の海馬をグアニジン緩衝液中でホモジネートにし、ＡβをＥＬＩＳＡにより測定した。タウ減少は、Ａβ１−ｘ（Ａ）、Ａβ１−４２（Ｂ）、またはＡβ１−４２対Ａβ１−ｘの比（Ｃ）に影響を及ぼさなかった。
【０２２３】
図１４Ａ〜Ｈ：タウ減少は若いマウスにおけるプラーク負荷に影響を及ぼさない。（Ａ〜Ｃ）ｈＡＰＰマウスにおける海馬のアミロイドプラークのチオフラビン−Ｓ染色。（Ｄ）プラークによって覆われた海馬面積のパーセントとして表わしたチオフラビン−Ｓ染色の定量化（ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス９〜１１匹、月齢４〜７ヶ月）。（Ｅ〜Ｇ）ｈＡＰＰマウスにおける海馬のＡβ沈着の３Ｄ６免疫染色。（Ｈ）プラークによって覆われた海馬面積のパーセントとして表わしたＡβ沈着の定量化（ｎ＝遺伝子型１種類につきマウス１１〜１３匹、月齢４〜７ヶ月）。
【０２２４】
図１５ＡおよびＢ：タウ減少はＡβ＊５６のレベルに影響を及ぼさない。Ａβ＊５６を月齢４〜７ヶ月のマウスの皮質から単離した。左（図１５Ａ）はタウ減少の影響がないことを示す代表的なイムノブロット。右（図１５Ｂ）はｎ＝遺伝子型１種類につきマウス６匹の定量化。
【０２２５】
ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスにおいてＡβの川下のエフェクターとして働く可能性のあるタウの異常形態を評価した。ヒトのタウにおける主要なＡＤ関連リン酸化部位は、ＧＳＫ−３βおよびｃｄｋ５などのプロリン指向性キナーゼによって、または微小管親和性調節キナーゼ（ＭＡＲＫ）によってリン酸化されるものを含めてネズミのタウ中に保存される。これらの部位におけるネズミのタウのリン酸化の変化は、例えば低体温症の直後に簡単に検出される（Ｐｌａｎｅｌら（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：２４０１〜２４１１、図１６Ａおよび１６Ｂ）。しかし月齢４〜７ヶ月のｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスの海馬のホモジネートにおいては、Ｔｈｒ１８１、Ｓｅｒ２０２、Ｔｈｒ２３１、およびＳｅｒ３９６／４０４を含めたプロリン指向性キナーゼ部位での、またはＭＡＲＫの主要部位Ｓｅｒ２６２でのタウのリン酸化には何も変化が見出されなかった（図１６Ａおよび１６Ｂ）。神経毒性タウフラグメントの世代もまた、Ａβ毒性のメカニズムの原因であると指摘されてきた（ＰａｒｋおよびＦｅｒｒｅｉｒａ（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：５３６５〜５３７５）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡβ毒性が１７ｋＤタウフラグメントの産生を伴うことは明らかである（ＰａｒｋおよびＦｅｒｒｅｉｒａ（２００５）、上記）ので、タウを欠く初代ニューロンはＡβに誘発される退化に抵抗を示す（Ｒａｐｏｐｏｒｔら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：６３６４〜６３６９、Ｌｉｕら（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８８：５５４〜５６３）。Ａβで処理した初代ニューロンのライゼート中の１７ｋＤタウフラグメントの存在は確認されたが、ｈＡＰＰマウス由来の海馬のホモジネート中の異常なタウタンパク質分解は何も見出されず（図１７Ａおよび１７Ｂ）、これはこれら２つの系におけるタウ減少の神経保護効果が機構的に異なることを示唆している。
【０２２６】
図１６Ａおよび１６Ｂ：ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスにおけるタウのリン酸化。月齢４〜６ヶ月のＴａｕ＋／＋、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋、およびｈＴａｕ−／−マウス由来の海馬のホモジネートを、表示したような様々なタウのリン酸化部位を認識する抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。下記はイムノブロットの定量化（ｎ＝未処理の非トランスジェニック対照（Ｃｔｒｌ）および低温症（Ｈｙｐｏ）の非トランスジェニックマウスの群につきマウス４匹、またｎ＝Ｔａｕ＋／＋およびｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋の遺伝子型１種類につきマウス１２匹）。
【０２２７】
図１７Ａおよび１７Ｂ：タウタンパク質分解。（Ａ）ラットの初代皮質ニューロンを２０μＭ原線維Ａβで４８時間処理し、ライゼートを総タウ抗体（ｔｏｔａｌ  ｔａｕ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）５Ｅ２でイムノブロットすることによって分析した。Ａβ処理に応じて生成した１７ｋＤタウフラグメントを矢印によって示す。（Ｂ）月齢４〜６ヶ月のＴａｕ−／−、Ｔａｕ＋／＋、およびｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウス由来の海馬のホモジネートを、総タウ抗体５Ｅ２でイムノブロットすることによって分析した。同じブロットの過剰暴露を右側に描き、検出可能なタウフラグメントがないことを示す。
【０２２８】
修飾されたタウの相対的欠乏はまた、ヒトにおいてＡＤではなく前頭側頭性痴呆を引き起こす変異を有するタウを過剰発現するトランスジェニック系統（Ｌｅｖｉｓら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：１４８７〜１４９１、Ｏｄｄｏら（２００４）Ｎｅｕｒｏｎ  ４３：３２１〜３３２、ＳａｎｔａＣｒｕｚら（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：４７６〜４８１）と本発明者らのモデルを区別する。この検討において内因性の野生型タウの減少は、ｈＡＰＰマウスをＡβ依存性認知機能障害から防護し、これは典型的なＡＤ随伴性修飾を有する大量のタウの除去を伴わなかった。これらの実験は、他の型のタウ修飾、あるいは限られた細胞内区画または細胞集団中の少量の修飾されたタウがＡβの川下で役割を果たす可能性を否定しない。
【０２２９】
その代わりにこれらのデータは、タウ減少が癲癇様活動の防止によってｈＡＰＰマウスを保護するという考え方を裏付ける。ｈＡＰＰマウスは、癲癇様棘波性および非痙攣性発作を特徴とする異常脳波（ＥＥＧ）を有する（Ｐａｌｏｐら（２００７）Ｎｅｕｒｏｎ  ５５：６９７〜７１１）。さらにこの異常活性は、二次的な抑制性のリモデリングを引き起こす。それは過活性を抑えようするが、海馬機能の点からおそらく適応しない。この抑制性の変化には、歯状顆粒細胞中のカルビンディン欠失および苔状線維中の神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）の異常発現が含まれる（Ｐａｌｏｐら（２００７）上記）。これらの変化の重大度は、ｈＡＰＰマウスにおける行動機能障害の度合と密接に関係している（Ｐａｌｏｐら（２００７）上記）。
【０２３０】
重大なことに、かつ薬理学的に誘発される発作からのタウ減少の保護効果（図４）と矛盾なく、タウ減少はｈＡＰＰマウスにおける癲癇様異常もまた防止することが分かった（図１９）。ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスはきわめて高いカウントの時間当たり癲癇様棘波を示したが、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−マウスではそれが劇的に減少し、またｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスでは正常であった（図１９）。さらにカルビンディン欠失および異常ＮＰＹ発現を含めてｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスにおいて観察される代償的な抑制性の変化が、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−マウスでは非常に減少し、またｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスでは存在しなかった（図７）。
【０２３１】
図１９：タウ減少は、ｈＡＰＰマウスにおける異常興奮活性を遮断する。正常なタウレベルを有するｈＡＰＰマウス由来のＥＥＧの記録（左上、Ｔａｕ＋／＋）は、頻繁に起こる癲癇様棘波を示している。これらの異常は、タウのないｈＡＰＰマウスでは見られなかった（右上、Ｔａｕ−／−）。癲癇様棘波頻度の定量化（下部）は、ｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／＋マウスで見られた癲癇様異常がｈＡＰＰ／Ｔａｕ＋／−マウスにもｈＡＰＰ／Ｔａｕ−／−マウスにも見られなかったことを実証している。
【０２３２】
タウ減少の保護効果が別のＡＤマウスモデルにおいて見られるかどうかを評価した。低レベルのｈＡＰＰ導入遺伝子、したがって低レベルのＡβを発現するマウスは、重度のＡＤ様行動機能障害を有しない。しかしこれらのマウスを、ＦＹＮチロシンキナーゼの導入遺伝子を発現するマウスと交配した場合、得られるバイジェニックｈＡＰＰｌｏｗ／ＦＹＮマウスは強い機能障害がない。バイジェニック（ｈＡＰＰｌｏｗ／ＦＹＮ）マウスを通常のタウレベル（Ｔａｕ＋／＋）およびタウを欠いたバイジェニックマウス（Ｔａｕ−／−）と比較することができるように、ｈＡＰＰｌｏｗマウスおよびＦＹＮマウスをタウノックアウトバックグラウンド上へ交配し、交配を繰り返した。タウ減少が、水迷路学習および記憶機能障害および異常探検行動（図８）ならびに早期死亡（図９）を含めたこれらマウスにおける行動異常を遮断することを見出した。ｈＡＰＰｌｏｗ／ＦＹＮバイジェニックマウスは、より高発現性ｈＡＰＰマウスにおいて見られる（Ｐａｌｏｐら（２００７）上記）ものと同じ型の癲癇様異常および代償的な抑制性のリモデリング（カルビンディン欠失および異常ＮＰＹ発現）を表す。正常なタウレベルを有するバイジェニックマウスにおいて見られる抑制性の変化がタウ減少によって遮断されることもまた分かり（図１８）、これはタウ減少がその他のｈＡＰＰマウスにおいて見られるものと似たメカニズムによってこの系統を保護するという更なる証拠を与える。
【０２３３】
図１８：タウ減少はｈＡＰＰ−Ｊ９／ＦＹＮバイジェニックマウスにおける抑制性のリモデリングを遮断する。カルビンディンおよびＮＰＹを、正常なタウレベル（＋／＋）またはタウ欠乏バックグラウンド（−／−）のいずれかを発現する非トランスジェニックおよびバイジェニックマウス由来の切片において免疫組織化学的に染色した。正常なタウレベルを有するバイジェニックマウスにおいて見られる抑制性の変化（カルビンディン欠失およびＮＰＹ陽性新芽形成の異常増加）が、タウのないバイジェニックマウスには存在しなかった。
【０２３４】
タウ減少の保護効果の検討を、外傷性脳損傷のモデルまで拡げた。頭部損傷にはまた、癲癇様活動および認知機能障害の両方を含めることができる。Ｔａｕ−／−マウスがＴａｕ＋／＋マウスよりも保護されるかどうかを試験した。各遺伝子型の雄のマウス（ｎ＝１２）を、外傷性脳損傷の制御下皮質衝撃（ＣＣＩ）モデルにかけた。ただし両遺伝子型由来の対照群は偽手術を受けた。ＣＣＩは、運動機能のワイヤぶら下がり試験に関してＴａｕ＋／＋およびＴａｕ−／−マウスに同等の初期機能障害を生じさせた（図２０）。しかし時間の経過とともにＴａｕ−／−マウスでは回復が進み、損傷後１ヶ月で正常な行動に戻ったが、Ｔａｕ＋／＋マウスは残留機能障害を示した（Ｐ＜０．００５）。ＣＣＩはＰＴＺによって誘発される発作の起こし易さを高める（図２１）ので、癲癇様活動はこのモデルにおける病態生理の一因となる可能性がある。さらに、タウ減少の保護効果、すなわちＣＣＩを経験するＴａｕ−／−マウスの発作の重症度は、偽手術を受けたＴａｕ＋／＋マウスとそれほど違わないことが分かった（図２１）。
【０２３５】
図２０：タウ減少は頭部損傷後の回復を増進させる。Ｔａｕ＋／＋マウスおよびＴａｕ−／−マウスの両方は、制御下皮質衝撃（ＣＣＩ）による頭部損傷か、または頭部損傷のない偽手術のどちらかを受けた。生じた機能障害の経時変化をワイヤぶら下がり試験によって評価した。この場合「５」は正常な動作であり、「０」は重度の機能障害である。ＣＣＩは、タウ遺伝子型に関係なく同じ初期機能障害を生じた。しかしＴａｕ−／−マウスはより良く回復し、ＣＣＩの１ヶ月後までにＴａｕ−／−マウスは正常に戻ったが、Ｔａｕ＋／＋マウスでは機能障害が残った。データは、因子として年齢、タウ遺伝子型、および処理を用いた反復測定一般線形モデルによって分析した。タウ×処理の交互作用Ｐ＜０．００１。
【０２３６】
図２１：タウ減少は頭部損傷後の発作を改善する。Ｔａｕ＋／＋マウスおよびＴａｕ−／−マウスの両方は、制御下皮質衝撃（ＣＣＩ）による頭部損傷か、または頭部損傷のない偽手術のどちらかを受けた。損傷の１ヶ月後、発作の起こし易さをペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）４０ｍｇ／ｋｇの注射によって評価した。生ずる発作の重度を、ビデオ分析によって評点を付けた。タウ減少は、偽およびＣＣＩの両方の群で発作の重度を低減させ（Ｐ＜０．０２）、ＣＣＩを受けたＴａｕ−／−マウスの発作は偽処理群における発作に比べて有意には悪くないようなものであった。
【０２３７】
参考文献
1. R. Tanzi, L. Bertram, Cell 120, 545 (2005).
2. J. Lewis et al., Science 293, 1487 (2001).
3. M. Rapoport, H. N. Dawson, L. I. Binder, M. P. Vitek, A. Ferreira, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 6364 (2002).
4. S. Oddo, L. Billings, J. P. Kesslak, D. H. Cribbs, F. M. LaFerla, Neuron 43, 321 (2004).
5. C. X. Gong, F. Liu, I. Grundke-Iqbal, K. Iqbal, J Neural Transm 112, 813 (2005).
6. K. Iqbal et al., Biochim Biophys Acta 1739, 198 (2005).
7. W. H. Stoothoff, G. V. Johnson, Biochim. Biophys. Acta 1739, 280 (2005).
8. I. Khlistunova et al., J Biol Chem 281, 1205 (2006).
9. C. A. Dickey et al., FASEB J. 20, 753 (2006).
10. A. J. Myers et al., Hum. Mol. Genet. 14, 2399 (2005).
11. L. Mucke et al., J. Neurosci. 20, 4050 (2000).
12. H. N. Dawson et al., J. Cell Sci. 114, 1179 (2001).
13. J. J. Palop et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 9572 (2003).
14. D. T. Kobayashi, K. S. Chen, Genes Brain and Behav. 4, 173 (2005).
15. O. Steward, J. Loesche, W. C. Horton, Brain Res. Bull. 2, 41 (1977).
16. K. K. Hsiao et al., Neuron 15, 1203 (1995).
17. J. Chin et al., J. Neurosci. 24, 4692 (2004).
18. S. Lesne et al., Nature 440, 352 (2006).
19. E. Planel et al., J. Neurosci. 24, 2401 (2004).
20. S. Y. Park, A. Ferreira, J. Neurosci. 25, 5365 (2005).
21. T. Liu et al., J. Neurochem. 88, 554 (2004).
22. K. SantaCruz et al., Science 309, 476 (2005).
23. R. B. Knowles et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 5274 (1999).
24. J. W. Geddes et al., Science 230, 1179 (1985).
25. M. P. Mattson, Nature 430, 631 (2004).
26. J. W. Olney, D. F. Wozniak, N. B. Farber, Arch. Neurol. 54, 1234 (1997).
27. J. C. Amatniek et al., Epilepsia 47, 867 (2006).
28. R. A. Del Vecchio, L. H. Gold, S. J. Novick, G. Wong, L. A. Hyde, Neurosci. Lett. 367, 164 (2004).
29. J. J. Palop, J. Chin, L. Mucke, Nature 443, 768 (2006).
30. J. R. Lupski, Nat. Genet. 38, 974 (2006).
31. F. Holsboer, Curr Opin Investig Drugs 4, 46 (2003).
Chin, J., Palop J. J., Yu G.-Q., Kojima N., Masliah E., Mucke L. 2004. Fyn kinase modulates synaptotoxicity, but not aberrant sprouting, in human amyloid precursor protein transgenic mice. J. Neurosci. 24, 4692-4697.
Chin, J., Palop J. J., Puolivaeli J., Massaro C., Bien-Ly N., Gerstein H., Scearce-Levie K., Masliah E., Mucke L. 2005. Fyn kinase induces synaptic and cognitive impairments in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. J. Neurosci. 25, 9694-9703.
Naegerl, U. V., Mody I., Jeub M., Lie A. A., Elger C. E., Beck H. 2000. Surviving granule cells of the sclerotic human hippocampus have reduced Ca2+ influx because of a loss of calbindin-D28K in temporal lobe epilepsy. J. Neurosci. 20, 1831-1836.
Palop, J. J., Chin J., Mucke L. 2006. A network dysfunction perspective on neurodegenerative diseases. Nature 443, 768?773.
Palop, J. J., Jones B., Kekonius L., Chin J., Yu G.-Q., Raber J., Masliah E., Mucke L. 2003. Neuronal depletion of calcium-dependent proteins in the dentate gyrus is tightly linked to Alzheimer’s disease-related cognitive deficits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 9572?9577.
Vezzani, A., Sperk G., Colmers W. F. 1999. Neuropeptide Y: Emerging evidence for a functional role in seizure modulation. Trends Neurosci 22, 25-30.
【０２３８】
本発明をその特定の実施形態に関して述べてきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができ、また等価物を代わりに用いることができることを当業者は理解するはずである。さらに特定の状況、材料、組成物、工程、１つまたは複数の工程段階を本発明の目的、趣旨、および範囲に適合させるために多くの修正を行うことができる。このような全ての修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
【図１Ａ】
0005997241.tif 000002
【図１Ｂ】
0005997241.tif 000003
【図１Ｄ】
0005997241.tif 000004
【図１Ｅ】
0005997241.tif 000005
【図２Ａ】
0005997241.tif 000006
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
0005997241.tif 000008
【図２Ｄ】
0005997241.tif 000009
【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
0005997241.tif 000011
【図３Ｂ】
0005997241.tif 000012
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
0005997241.tif 000014
【図４Ａ】
0005997241.tif 000015
【図４Ｂ】
0005997241.tif 000016
【図４Ｃ】
0005997241.tif 000017
【図４Ｄ】
0005997241.tif 000018
【図６Ａ】
0005997241.tif 000019
【図６Ｂ】
0005997241.tif 000020
【図６Ｃ】
0005997241.tif 000021
【図６Ｄ】
0005997241.tif 000022
【図６Ｅ】
0005997241.tif 000023
【図６Ｆ】
0005997241.tif 000024
【図６Ｇ】
0005997241.tif 000025
【図６Ｈ】
0005997241.tif 000026
【図７Ａ】
0005997241.tif 000027
【図７Ｂ】
0005997241.tif 000028
【図７Ｃ】
0005997241.tif 000029
【図８】
0005997241.tif 000030
【図９】
0005997241.tif 000031
【図１０Ａ】
0005997241.tif 000032
【図１０Ｂ】
0005997241.tif 000033
【図１０Ｃ】
0005997241.tif 000034
【図１１】
0005997241.tif 000035
【図１２Ａ】
0005997241.tif 000036
【図１２Ｂ】
0005997241.tif 000037
【図１２Ｃ】
0005997241.tif 000038
【図１３Ａ】
0005997241.tif 000039
【図１３Ｂ】
0005997241.tif 000040
【図１３Ｃ】
0005997241.tif 000041
【図１４Ｄ】
0005997241.tif 000042
【図１４Ｈ】
0005997241.tif 000043
【図１５Ｂ】
0005997241.tif 000044
【図１６Ａ】
0005997241.tif 000045
【図１６Ｂ】
0005997241.tif 000046
【図１７Ａ】
0005997241.tif 000047
【図１８】
0005997241.tif 000048
【図１９】
0005997241.tif 000049
【図２０】
0005997241.tif 000050
【図２１】
0005997241.tif 000051
【図１Ｃ】
0005997241.tif 000052
【図５】
0005997241.tif 000053
【図１４Ａ−Ｃ】
0005997241.tif 000054
【図１４Ｅ−Ｇ】
0005997241.tif 000055
【図１５Ａ】
0005997241.tif 000056
【図１７Ｂ】
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【配列表】
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