(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のサンプルの溶液の遊離した分析物の分子変化、配座変化又は相互作用を感知するための光検出システムであって、
ある波長範囲の連続スペクトルを含むビームを放出する広帯域光源と、
前記ビームの少なくとも一部分が前記サンプルに導かれて後方反射ビームを生じるように、前記サンプルを位置決めする２以上の毛細管又は流体チャネルを含む流体セルであって、２以上の毛細管又は流体チャネルのうちの少なくとも１つが対照として作用する流体セルと、
分析物の識別のため前記サンプルからの前記後方反射ビームの干渉スペクトルを解析するスペクトロメータと
を含むシステム。
【請求項２】
前記広帯域光源のスペクトル帯域幅が１０ｎｍよりも大きい、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
２以上の毛細管又は流体チャネルのうちの少なくとも２つが異なる直径を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記流体セルが、所定の温度変化を受けるように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記スペクトロメータが、２以上のサンプルからの１以上の信号を同時に解析する、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記２以上のサンプルのうちの１つが対照として作用する、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記スペクトロメータが、二次元（２−Ｄ）スペクトロメータ、又は一次元（１−Ｄ）スペクトロメータである、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記システムが、インラインプロセス監視システムで使用される、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
サンプルの溶液の遊離した分析物の分子変化、配座変化又は相互作用を検出する方法であって、
ある波長範囲の連続スペクトルを含むビームを放出する広帯域源を準備するステップと、
２以上の毛細管又は流体チャネルを含む流体セルであって、２以上の毛細管又は流体チャネルのうちの少なくとも１つが対照として作用する流体セルを準備するステップと、
前記毛細管又は流体チャネルに導入された前記サンプルを前記ビームの少なくとも一部分と相互作用させて、生じた後方反射ビームを捕捉するステップと、
分析物の識別のためスペクトロメータを用いて前記後方反射ビームからの干渉スペクトルを解析するステップと
を含む方法。
【請求項１０】
前記ビームを第１部分と第２部分とに分割して、前記ビームの第１部分を前記サンプルと相互作用させて、後方反射ビームを生じさせるステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記干渉スペクトルを１Ｈｚ〜１ＭＨｚの範囲の周波数で解析する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記流体セル内に２種以上の異なるサンプルを配置する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記流体セル内で前記２種以上の異なるサンプルを混合するステップを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
対照及びサンプル溶液のスペクトルを同時に測定するステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記流体セル内の直径の異なる２以上のマイクロ流体チャネルに１種以上のサンプルを配置するステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記干渉スペクトルのバックグラウンド干渉を補償するために前記スペクトルに対照信号を印加するステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルの導入を、第１の生化学種を前記毛細管又は流体チャネルに導入し、次いで第２の生化学種を同じ毛細管又は流体チャネルに導入することによって行う、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが液体を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記流体セルの２箇所以上の位置でスペクトルを解析するステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルをインライン監視するステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
１以上の生物−分子相互作用、タンパク質−タンパク質会合又は解離、多タンパク質複合体集合又は脱集合、ＤＮＡ−ＤＮＡ会合又は解離、分子凝集及び分離、ＤＮＡ／ＲＮＡ−タンパク質会合及び解離、タンパク質又はＤＮＡ変性及び多タンパク質競合を測定するステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光検出に関し、より具体的には、溶液中の１種類以上の分子の濃度、配座、及び／又は相互作用を検出するための、光検出システム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微細解析システムの領域は、高い時間効率で多数のサンプルを解析する必要性に迫られている。幾つかの検出手法では、化学タグ又は官能化表面を用いて、少量の分析物を高速で測定できる。このような手法の多くは、電気化学、質量解析、並びに表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び干渉分光法等の光検出手法を含む。しかし、これらの手法の殆どは、検出を実行する必須条件として、分子の表面活性化、化学的タグ付け、又は標識等、大掛かりなサンプル調製を必要とする。このサンプル調製によって、測定が複雑になる。更に、データが輸送動態の影響を受ける可能性があるので、表面における検出により、動的結合データの抽出が煩雑になることがある。
【０００３】
例えば、ＳＰＲ及び導波路ベース等の表面感受性屈折率感知に依存する無標識の感知手法は、化学的タグ付けを必要としないので望ましい。化学的タグ付けは、分子間の相互作用を誘発してこれに干渉する可能性があるので、通常は疑似的なアーチファクトを伴う。ＳＰＲは、やはり解析時間を短縮する光検出手法である。表面上の分子結合を測定するにあたり、これらの手法が広範に使用されているが、必要なセンサ表面の活性化及び再生プロセスによって、これらの手順に時間がかかり、バルク媒体中ではなく表面で発生する相互作用に起因する、測定由来のアーチファクトが加わる可能性がある。加えて、ＳＰＲの欠点として、注意深く制御された被膜厚を有する金属メッキ基板、並びに調査対象の表面層内への光を結合させる高品質光学プリズム又は光格子を使用する必要性も含まれる。
【０００４】
干渉分光法は、最も高感度の周知の光検出手法の１つである。マイクロ干渉後方散乱検出法（ＭＩＢＤ）は、円筒形の毛細管に衝突するコヒーレント光が高度に変調された干渉パターンを生成する、という原理によって行われる。通常、ＭＩＢＤは、毛細管中の異なる領域で反射された後のレーザー光の干渉に基づいている。しかし、ＭＩＢＤ手法は、所与の時間でのたった１つの検査サンプルの検出しかできない。したがって、２つ以上の検査サンプルを測定する場合には、異なる種について検出サイクルを個別に行う必要がある。例えば、基準サンプルと検査サンプルとを同時に測定することはできない。更に、ＭＩＢＤの検出限界は、投影フリンジの正確な測定位置に大きく依存する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００７／０１９５２７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、２つ以上の検査サンプルの分子配座変化又は相互作用を同時に検出可能な、簡便、強固、高感度の光検出手法を提供することが、望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、干渉検出によって分子組成、配座、又は相互作用を測定するための光検出システムに関する。有利には、本発明は、分子組成、配座、又は相互作用の、無標識、表面調製無しの測定方法を提供する。本システム及び方法では、単純で強固な信号処理を用いた単純で強固なジオメトリを採用しており、２つ以上のサンプルの屈折率を同時に測定できる。「無標識」及び「表面調製無し」のシステムは、操作の数を減少させるのみならず、複雑さを軽減することによって測定アーチファクトも減少させる。本システム及び方法では、追加の標識又は表面処理を伴わずに、そのままの状態で標的分子を調査／解析できる。相互作用が生じるのは溶液中なので、分子の拡散は表面への拡散による影響を受けない。
【０００８】
広帯域光源を使用すると、市販されている幅広い光源から、光源を選択できる。また、広帯域光源を使用すると、緩衝液（基準液）及びサンプル溶液の同時測定も可能になる。例えば、広帯域光源からの異なる波長を使用して、緩衝液及びサンプル溶液の測定を行うことで、システムが効率的で時間がかからないものになる。また、緩衝液とサンプル溶液を同時に測定することで、測定に影響を及ぼす何らかの環境外乱の可能性が減る。例えば、緩衝液とサンプル溶液の測定を同時に行うことから、環境中に存在する、振動、温度変化、又は緩衝液中の変動等のいかなる環境外乱も、基準液及びサンプル溶液の両方に存在することになる。したがって、緩衝溶液の測定結果を用いて、サンプル溶液の測定結果から、このような変動／外乱を正規化又は減算できる。
【０００９】
一実施例において、１つ以上のサンプルを感知するための光検出システムを提供する。光検出システムは、波長範囲にわたって連続スペクトルを含むビームを放出する広帯域光源と、ビームの少なくとも一部分がサンプルに向かい後方反射ビームが創出されるように、サンプルを位置決めする１つ以上のチャネルを含む流体セルと、サンプルから後方反射されたビームの干渉スペクトルを解析するスペクトロメータと、を含む。
【００１０】
別の実施例において、サンプルを解析するための光検出システムを提供する。この光検出システムは、波長範囲にわたって連続スペクトルを含むビームを放出する広帯域光源と、ビームを第１部分及び第２部分に分割するビームスプリッタと、ビームの第１部分の少なくとも一部がサンプルに向かい後方反射ビームが創出されるように、サンプルを位置決めする流体セルと、後方反射ビームからの干渉スペクトルを解析するスペクトロメータと、を含む。
【００１１】
更に別の実施例において、サンプル中の分子配座変化又は相互作用を検出する方法を提供する。本方法は、波長範囲にわたって連続スペクトルを含むビームを放出する広帯域源を準備するステップと、１つ以上のチャネルを含む流体セルを準備するステップと、チャネルに導入されたサンプルをビームの少なくとも一部分と相互作用させ、結果的に生じる後方反射ビームを捕捉するステップと、スペクトロメータを用いて後方反射ビームからの干渉スペクトルを解析するステップと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】複数のサンプルを光検出するための、本発明のシステムの一実施例の概略図である。
【図２】図１の流体セルにおける分子相互作用アッセイの一例の概略図である。
【図３】図１の流体セルにおける分子相互作用アッセイの一例の概略図である。
【図４】図１の流体セルにおける分子相互作用アッセイの一例の概略図である。
【図５】図１の流体セルにおける分子相互作用アッセイの一例の概略図である。
【図６】流路中の複数箇所におけるサンプルの同時光検出システムの一例の概略図である。
【図７】流体セルのマイクロ流体チャネルのサイズに基づく、複数のサンプルの光検出システムの一例の概略図である。
【図８】図５のマイクロ流体チャネルからの干渉スペクトルの高速フーリエ変換（ＦＦＴ）である。
【図９】溶液のバルク屈折率の変化の光検出方法のフローチャートである。
【図１０】分子組成、配座、又は相互作用の変化から生じる溶液中の変化を光検出するための、本発明のシステムの別の実施例の概略図である。
【図１１】抗ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）抗体を有するＢＳＡとニワトリリゾチームとの間の分子相互作用によって生じる、測定位相変化のグラフである。
【図１２】分子組成、配座、又は相互作用の変化から生じる溶液の変化を光検出するための、本発明のシステムの別の実施例の概略図である。
【図１３】ｋ空間において１Ｈｚで記録されたサンプル溶液の干渉スペクトルである。
【図１４】図１１のグラフの高速フーリエ変換（ＦＦＴ）のグラフである。
【図１５】漸増する溶液中ＮａＣｌ濃度下における、バルク屈折率の経時変化のグラフである。
【図１６】漸増する溶液中ＢＳＡ濃度下における、バルク屈折率の経時変化のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
全図面を通じて同様の符号で同様のパーツを示す添付図面を参照しながら下記の詳細な説明を読めば、本発明のこれら及びその他の特徴、態様、及び利点の理解が深まるであろう。
【００１４】
本発明により、サンプル溶液中の分子組成、配座、又は相互作用の測定が可能になる。サンプル溶液は、チャネル内で相互作用してバルク屈折率に影響を及ぼす、２以上の分子数を有し得る。本発明により、幾つかの物理チャネルにわたって同時にバルク屈折率を測定できる。例えば、別個のチャネルに存在する基準サンプル及び検査サンプルの屈折率を、同時に測定できる。
【００１５】
特許請求される発明の主題をより明確且つ簡潔に記述するにあたり、下記の説明及び添付の特許請求の範囲で使用する具体的な用語を、下記のように定義する。本明細書を通じて、具体的な用語の例証は非限定的な例とみなされるべきである。
【００１６】
本明細書で用いる「無標識」という用語は、検出にあたり、分子の化学的タグ付けを必要としない測定を意味する。
【００１７】
本明細書で用いる「遊離溶液」という用語は、分析物の識別にあたり、特定の表面に依存しない検出を意味する。
【００１８】
本明細書で使用する際に、「広帯域光源」という用語は、いずれかの所定時点において、波長範囲にわたって連続スペクトル出力を放出する光源を指す。
【００１９】
本明細書で使用する際に、「干渉スペクトル」という用語は、溶液の屈折率に応じてその位置が推移する、複数の光帯域を指す。
【００２０】
一部の実施例では、所定の（一定の）角度でサンプルの照射を行い、通常は別の固定角度で、サンプルの測定を行う。この測定を行うのは、照明に対して１８０度の角度であってもよく、照明及び検出がいずれもサンプル表面に対して直角である「エピ検出」構成においてであってもよい。角度を固定することで、単一のサンプルの屈折率測定に対する干渉ノードが１つになるので、検出角度の変化に依存する測定で生じていた、複数の干渉ノードによるいかなる曖昧さも回避できる。単一の角度でサンプルを照射して測定を行い、単一の角度を使用して光検出を行うので、システムのジオメトリは単純で強固になる。加えて、幾つかのＭＩＢＤシステムで見られるような、（各ノードが特定角度に対応している）多ノードの場合とは対称的に、サンプル毎に１つの信号のみを読み取るので、データ処理が単純で強固になる。また、このような多角多ノードシステムの感度は、いずれのノードを解釈に使用するかに依存している。
【００２１】
有利には、同じ又は異なる測定チャネル径を有する（二次元）２−Ｄスペクトロメータ、或いは異なる測定チャネル径を有する（一次元）１−Ｄスペクトロメータのいずれかを用いて、複数のサンプルを一度で読み取ることができる。
【００２２】
光検出システムは、遊離溶液中の無標識タンパク質及びＤＮＡのアッセイが必要な、プロテオミクス用途に適している。本発明のシステム及び方法は、結合変化、配座変化、又は解離及び変性等の用途に適用可能であるが、これらに限定されない。加えて、本発明のシステムは、毛細管電気泳動（ＣＥ）、毛細管電気クロマトグラフィ（ＣＥＣ）、フローインジェクション解析（ＦＩＡ）、生理機能測定、細胞選別又は細胞検出、サンプル溶液中の生化学種の濃度の変化、流量感知、及び温度感知用の検出装置としても適している。
【００２３】
様々な実施例において、生物−分子相互作用、タンパク質−タンパク質会合又は解離、多タンパク質複合体集合又は脱集合、ＤＮＡ−ＤＮＡ会合又は解離、分子凝集及び分離、ＤＮＡ／ＲＮＡ−タンパク質会合及び解離、タンパク質又はＤＮＡ変性及び多タンパク質競合アッセイのうちの１つ以上を、本発明のシステム及び方法を用いて測定可能である。相互作用は、温度、ｐＨ、リン酸化、脱リン酸化、又はその他の翻訳後修飾、塩、酵素、補因子、及びその他の修飾によって誘導される、１つ以上の実体の化学変化又は物理変化による影響を受けるだろう。
【００２４】
一部の実施例において、光検出システムは、ビームを放出する広帯域光源と、ビームの少なくとも一部分がサンプルのバルクに向かい後方反射ビームが創出されるようにサンプルを配置する流体セルと、サンプルからの後方反射ビームによって形成される干渉スペクトルを解析するスペクトロメータと、を含む。例えば、個別の波長を有する２つ以上の単色レーザーの組み合わせは、広帯域光源ではないが、その理由は、このような組み合わせが連続波長を有するものではないからである。一例において、スペクトルは、約１０ｎｍの波長範囲にわたって連続的である。
【００２５】
サンプルの照明用の光路及び干渉スペクトル検出用の光路が少なくとも幾つかの部分において一致する実施例では、光検出システムにビームスプリッタを使用する。これらの実施例において、光検出システムは、ビームを放出する広帯域光源と、ビームを第１部分及び第２部分に分割するビームスプリッタと、ビームの第１部分の少なくとも一部がサンプルに入射して後方反射ビームが創出されるようにサンプルを配置する流体セルと、を含む。後方散乱光は、ビーム経路及びサンプルに沿ったチャネルの壁又は界面に起因する、干渉フリンジを含む。本システムは、干渉スペクトルを解析するスペクトロメータを更に含む。干渉は、スペクトロメータにおける波長の関数として測定可能である。フリンジパターン又は干渉パターンには、溶液の屈折率が変化するにつれてその位置が推移する、複数の光帯域を含む。イオン、原子、及び／又は分子に対応する溶液中の分子組成、配座、又は相互作用の変化を、光帯域の位置の変化を解析することによって調べることができる。溶液の屈折率は、組成変化、配座変化、及び／又は同じ又は異なる種の分子の間の相互作用のうちの１つ以上によって変動することがある。
【００２６】
広帯域光源によって、システムが単純なハードウェアを用いて２つ以上の検査サンプルの痕跡の捕捉が可能になる。単色光を用いる従来のシステムでは、２つ以上のサンプルの同時検出が不可能であり、第２のサンプルを検出するためにはシステムを再度運転する必要がある。その他のシステムに対する本システムの利点を幾つか挙げると、１−Ｄスペクトロメータによる異なるチャネルサイズに基づく、又は２Ｄスペクトロメータによるライン検出に基づく、より単純なハードウェア、明確なデータ処理、及び２つ以上のサンプルの同時測定を容易に実施することが含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
分子配座及び相互作用測定に際し、２つ以上の化学種を流体セルに導入し、これらを混合し、マイクロ流体チャネル等のチャネルを通じて流体チャネル内部の検出領域まで通したところで、フローが停止する。干渉スペクトルの変化は、時間関数として測定可能である。一例において、分子相互作用に続く種の配座変化は、バルク屈折率の変化を、ひいては干渉信号のスペクトルの変化を、引き起こす。
【００２８】
一部の実施例において、本システムは、フローが停止する分子相互作用のインライン検出用に構成されている。これらの実施例において、混合の後に複数回にわたって屈折率の変化を観察するために、混合の下流の複数の地点でチャネルを観察してもよい。停止したフロー配置の使用を回避することにより、本システムを、例えば分離手法による溶出種の監視等の、ただしこれに限定されない、インライン監視に使用できる。また、一実施例において、本システムは、サンプル採取地点の上流又は下流のいずれかにある、基準測定を有してもよい。このような実施例において、基準及びサンプル測定のいずれも、混合領域の下流で行われる。このようにして、単純な濃度上昇による信号ではなく、分子結合に固有の信号の抽出が可能である。
【００２９】
図１は、広帯域光源１２を有する光検出システム１０を示す。広帯域光源１２は、発光ダイオード、スーパールミネセント・レーザー・ダイオード（ＳＬＤ）、白熱光源（タングステン、キセノン、ハロゲン等）、固体レーザー、又はテーパ型増幅器を含む。一実施例において、広帯域光源１２のスペクトル帯域幅は、約１０ｎｍよりも大きい。システム１０は、複数のサンプルのバルク又は体積屈折率測定用に使用可能である。
【００３０】
ファイバ（例えば単一モードファイバ）によって、流体セル又はフローセル１４にビームを向かわせる。このファイバは、光源から流体セル１４まで広帯域光ビームを伝送する。或いは、自由空間伝送によってビームを流体セル１４に向かわせてもよい。
【００３１】
流体セル１４の拡大上面図を、破線円１５に示す。フローセル１４を基板１６上に設けてもよい。基板１６は、ケイ素、ガラス、又はプラスチック（例えばポリメチルシロキサン（ＰＤＭＳ））で作製可能である。一例において、基板１６は、例えばマイクロ流体チップである。測定チャネル２０には、フローチャネル、マイクロ流体チャネル、又は毛細管を含む。フローセル１４は、混合チャネル１８及び測定チャネル２０を含む。流体セル１４の混合チャネル１８及び測定チャネル２０の数は、検出すべきサンプルの数、並びに所望の数の混合チャネル１８及び測定チャネル２０を備える流体セル１４の作り易さに依存する。測定チャネル２０の各々は、紙面奥に向かって延在している。測定チャネル２０のサンプル溶液の流入口及び排出口を、それぞれ参照符号２２及び２４で示す。サンプル溶液及び基準液は、液体、気体、又は固体である。サンプル溶液は、混合チャネル１８で混合され、測定チャネル２０を通る。溶液は、流体セル１４内で流動又は静止している。
【００３２】
測定チャネル２０は、円形断面、矩形断面、又はその他いずれの幾何学形状を有してもよい。測定チャネル２０どうしの寸法は、大幅に異なっていてもよく、主にスペクトロメータのスペクトル分解能及び入射ビームの幅によって制限される。一実施例において、ビーム幅はチャネル幅よりも約５％から約１０％大きい。測定チャネル２０は、所望のサンプル溶液の検出が可能な、これに適した寸法を有する。一部の実施例において、流体チャネル１４には、異なる直径を有する、２つ以上の異なるチャネル２０（毛細管等）を使用する。異なる直径を有するチャネル２０を使用して、異なる化学物質又は組成を有するサンプルを検出できる。異なるサイズを有するチャネル２０から反射した光の干渉は、異なる周波数成分を有する干渉フリンジを生じる。高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を行うことにより、各チャネルに対応する干渉信号を区別し、異なる周波数成分を有する干渉フリンジの位相又は推移を定量化することができる。このような測定の実施は、２−Ｄスペクトロメータ又は１−Ｄスペクトロメータのいずれかを用いても可能である。
【００３３】
文字ｘ、ｙ、ｚで示す列の各々が、異なるサンプルを有してもよい。例えば、列ｘのマイクロ流体チャネル２０が基準サンプル（緩衝液等）を有し、列ｙ及びｚがバルク又は体積屈折率を測定するためのサンプル溶液を有してもよい。基準サンプルを有する測定チャネル２０は、基準信号を提供する。基準測定チャネルは、緩衝溶液で満たされる。基準チャネルは、測定の精度を改善する一助となる。例えば、基準信号は、チャネル内の、例えば温度変化等の好ましくない環境変化を補償する。基準チャネル及び（解析対象の）サンプル溶液を有するチャネルを互いに近接して配置して、同時に又は連続的に照射できる。結果的に得られる両方のフリンジパターンの位置変化を監視することにより、サンプルによって生成された所望の屈折率信号とバックグラウンドノイズの区別が可能であり、これによって結果的に信号対ノイズ比（ＳＮＲ）が改善する。バックグラウンド干渉は、サンプルの流れ、又は温度及び／又は圧力変化等の環境変動によって、発生する可能性がある。（ＭＩＢＤの場合のように連続的にではなく）検査チャネルと同時に基準チャネルを測定することにより、時間依存のバックグラウンドノイズをリアルタイムに正規化する。
【００３４】
測定チャネル２０を、単一走査線２６によって照射できる。単一走査線２６でチャネル２０を照射すると、異なるチャネル２０において発生する複数の反応を同時に検出できる。光学システムを使用して、ビームを流体セル１４に合焦、視準、及び／又は配向できる。一例において、ビームを流体セル１４上に合焦させるために、流体セル１４の手前に円柱レンズ２８を使用する。
【００３５】
測定チャネル２０に監視領域を備えることで、この領域を流れるサンプル溶液を連続的に監視し、サンプルの内容の経時変化を観察できる。これらの変化には、例えば細胞の有無を含む。一実施例において、測定チャネル２０の排出口２４の方向を変えることで、例えば、屈折率の測定結果に応じて細胞を選別できる。
【００３６】
屈折率及び分子相互作用は温度に大きく依存しているので、不用意な熱変動を抑制することで、測定にノイズを加える熱変動を防止する必要がある。このことは、周囲温度の変化に対して装置を物理的に絶縁することによって、並びに能動的熱制御を用いることによって可能である。一部の実施例において、流体セル１４を、温度変化を受けるように構成する。例えば、ＤＮＡ相互作用の場合と同様に、流体セル１４を熱的に制御し、流体セル１４の内部の分子相互作用を調節する。ヒーター又は（ペルチェクーラー等の）クーラー等の温度制御装置３０を、温度測定装置及び動的フィードバックループ（図示せず）と一緒に用いてもよい。別の例において、結合済みＤＮＡを含む溶液を、緩衝液のみの溶液と同時に注入して混合し、緩衝液の温度、ｐＨ、又は塩濃度のうちの１つ以上の変動に伴う、これに続く解離又は変性を監視できる。
【００３７】
図示していないが、システム１０には、コリメータ、集束レンズ、反射鏡等の、ただしこれらに限定されない、追加の光学システムを使用してもよい。例えば、円柱レンズ２８に加えて、流体セル１４の入り口の手前にコリメータを設置して、ビームが流体セル１４に入射する前にビームを視準してもよい。集束レンズを、流体セル１４の出口又は出口から距離を置いて設置し、出てくる放射線の全てを収集してもよい。収集された放射線は、反射鏡に向けて合焦し、ファイバ内で反射する。
【００３８】
参照符号３２は、広帯域光源１２から流体セル１４まで伝播する光のビームを示す。ビーム３２は、ビームスプリッタ３８を用いて２つの部分に分割される。一例において、ビームスプリッタ３８は、２×２ファイバ結合器又は自由空間ビームスプリッタを含む。
【００３９】
被伝送部分３４は、流体セル１４内に配置されたサンプルに衝突する。部分３４はサンプルに、固定角度で衝突する。この衝突角度は、サンプルに対して直角であってもよいが、サンプルの軸外であってもよい。広帯域アーキテクチャは、アライメントの僅かなずれに対して強固である。ビーム部分３４の一部は、流体セル１４内に設けられたサンプルと相互作用した後、後方反射する（参照符号４０で示す）。後方反射ビーム４０は、干渉スペクトルを生成する。干渉スペクトルは、空間的に離間した、交互に配置された光と暗いフリンジとを含む。
【００４０】
干渉スペクトルをスペクトロメータ４２によって解析し、サンプルの屈折率を判定する。一実施例において、スペクトロメータは２−Ｄスペクトロメータである。２−Ｄスペクトロメータは、適切な分解能の２−Ｄアレイを含むものでもよい。流体セル１４内のチャネルｘ、ｙ、ｚの各々について、流体セル１４の対応するチャネルの干渉フリンジを測定するために、２−Ｄスペクトロメータ内に対応する行又は列がある。干渉フリンジの推移を定量化することによって、各チャネル２０内の屈折率変化又は分子相互作用の測定が可能である。別の実施例において、スペクトロメータ４２は１−Ｄスペクトロメータである。異なるチャネル径を有する複数のチャネルを使用することにより、１−Ｄスペクトロメータ上に、各々が異なるチャネルに対応する複数のピークを投影する。これらのピークの各々の推移を定量化することによって、各チャネル内の配座変化又は分子相互作用を測定可能である。スペクトロメータ４２は、スペクトロメータから光強度の測定結果を受信して解析を実行するデータプロセッサに接続可能であり、この解析には、干渉スペクトルのパラメータを判定することが含まれる。このようなパラメータの非限定例には、干渉フリンジの周波数、位相、及び強度が含まれる。次に、このパラメータを使用して、溶液の屈折率を判定できる。
【００４１】
測定された屈折率は、例えば、溶質物の有無又は濃度、同一の（凝集）又は同一ではない（結合）分子の相互作用を含む、サンプルの様々な特性を示し得る。特性の非限定例には、配座変化、圧力、ｐＨ、温度、又は流量（例えば、液体フロー中の熱的摂動がいつスペクトロメータに到達するかを判定することによる）が含まれる。
【００４２】
図２は、（図１の流路２０等の）流路内で発生する相互作用の例を示す。本発明により、このような相互作用を測定するための、バルク又は体積屈折率測定の使用が可能になる。バルク屈折率測定により、システム設計が更にフレキシブルになり、必要なサンプル調製時間が短くなる。ジオメトリも、本来の相互作用とより良く類似している。例えば、バルク屈折率測定では、標的分子を結合するために、結合部を有する表面がチャネル２０内に存在しなくてもよい。所定時間において同時に実行されるライン走査２６（図１）は、チャネル２０の３つの列ｘ、ｙ、ｚに存在する３つのサンプル溶液（そのうちの１つは基準液であってもよい）に、バルク屈折率に関する個別情報を提供する。２つの分子の相互作用の経時変化を調べるにあたり、幾つかのライン走査を異なる時間間隔で実行してもよい。列ｘが緩衝溶液を含む一例において、屈折率の測定結果が経時変化しないことがある。列ｙのサンプル溶液は、２つの異なる分子種１７及び１９の混合物であってもよい。２つの分子種を含む溶液が、チャネル２０の中で混合される（矢印４４）。図３は、（図１のチャネル２０等の）流路内の解離又は変性の一例を示す。分子種２１及び２３の解離又は変性の冠詞は、緩衝液２５の温度、ｐＨ、又は塩濃度のうちの１つ以上を変化させることによって可能である。図４は、多タンパク質複合体集合の一例を示す。分子種２１及び２３は、タンパク質２７との複合体３１を形成する。図６は多タンパク質競合アッセイの一例を示し、ここでは、最初は互いに結合していたタンパク質２１及び２３が、タンパク質２９の存在下で解離する。タンパク質２３及び２９は競合して、タンパク質２１と結合して複合体を形成する。図示の例において、タンパク質２１及び２９は結合して複合体３３を形成する。対応するチャネルのＦＦＴピークの位置の推移等、干渉スペクトルの変化は、結合又は解離の量の指標である。時間ｔ1（４６）からｔ2（４８）まで、混合物が増加し、分子が互いに結合又は互いに解離するにつれて、各チャネルの対応する列ｙの、ＦＦＴにおけるＦＦＴピークが推移する。
【００４３】
図６は、フローを停止せずにシステムのチャネルに封じ込められたサンプル溶液のバルク屈折率を測定する、インラインプロセス監視システムの一例を示す。システム５０は、流体セル５４内に配置されたサンプルを照射する広帯域抗原５２を含む。ビームスプリッタ５６を使用して、光ビーム５８を２つの部分に分割する。被伝送部分６０を使用して、流体セル５４内に設けられたサンプルを照射する。サンプルから後方反射されたビーム６４は、スペクトロメータ６８によって検出される。円柱レンズ６６を使用して、１列になったビーム６０を、流体セル５４内に設けられたサンプルに合焦する。流体セル５４の温度制御は、温度制御装置６９を用いて可能である。
【００４４】
流体セル５４の設計を、破線円７０で示した拡大図に示す。流体セル５４は、基板７１、マイクロ流体チャネル７２、及び混合チャネル７４を含む。検出対象のサンプルは、流入口７３を用いてマイクロ流体チャネル７２内に配置されており、このサンプルは、チャネル７２を流れた後、排出口７５から流体セル５４を出る。流路７２に沿った幾つかの地点を監視することで、流路７２に沿った屈折率の変化を判定できる。サンプルの屈折率の変化の原因は、チャネル７２内に存在する種の組成、配座、又は相互作用変化である可能性がある。所与の事例で実行されるライン走査７６では、流路７２の形状に応じて、複数の箇所に関する情報を提供できる。図示の例において、ライン走査７６は、流路７４内の４つの異なる箇所に情報を提供する。図示の例では、測定の目的で、３つの箇所７８、８０、８２を使用する。表面依存測定システム（ＳＰＲ等）では、本発明の場合のように流路に沿って結合活性が着実に進行するわけではないので、このような測定の実施は不可能である。事実上、流路に沿った複数の箇所を照射することにより、ライン走査は、異なる時間間隔で測定を行い、バルク屈折率の測定に時間及び運動の次元を付加する。
【００４５】
図７は、バルク屈折率測定の干渉スペクトルを解析する、１−Ｄ検出器を使用した光検出システム９０を示す。広帯域光源９２は、ビーム９４を生成する。ビームスプリッタ９３を用いて、ビーム９４の一部分９８をサンプルに向かわせる。サンプルは、サンプルホルダ又は流体セル９７内に配置される。後方反射光９５は、格子１０４及びライン走査カメラ１００から成るスペクトロメータによって検出される。
【００４６】
サンプルホルダ９７には、異なるサイズの測定チャネル１０４、１０５、１０６を使用する。サンプルホルダ９７では、製造プロセスによる必要に応じて又は実施可能性に応じて、測定チャネルを幾つ使用してもよい。矢印１０９で示すように、測定チャネル１０４、１０５、１０６内でサンプル溶液を混合する。なお、図示の実施例では、チャネル１０４、１０５、１０６のサイズが漸次的に大きくなるように示されているが、チャネルのその他いずれの可能なサイズ分布も、本発明の範囲内において考えられる。個々のチャネル１０４、１０５、１０６の温度を制御するために、温度制御装置１０８を使用してもよい。
【００４７】
図８に示すように、３つのチャネル１０４、１０５、１０６（図７）を同時に測定できる。後方反射光の強度（縦座標１１２）を、グラフ１１４に示す波長（横座標１１０）の関数として表すことができる。サイズの異なるチャネル１０４、１０５、１０６から反射された光の干渉は、結果的に干渉スペクトル１１４において異なる周波数成分となる。グラフ１１４をＦＦＴを用いて変換することで、それぞれ異なるチャネル１０４、１０５、１０６に対応するピーク１１６、１１８、１２０を明確に表せる。横座標１２２は周波数を表す。ＦＦＴを使用することによって、各チャネルに対応する干渉信号を区別し、個別に測定できる。
【００４８】
図９は、屈折率を検出するための、本発明の方法の一例のフローチャートである。ブロック１４０において、広帯域光源を準備する。広帯域光源はビームを提供する。ブロック１４２において、チャネル内に１種類以上の分子を有する流体セルを提供する。一例において、流体セルは、少なくとも２つの異なるチャネルを含む。基準溶液を使用する実施例において、サンプルチャネルは、反応／変化を受ける監視対象のサンプルを受容し、基準チャネルは、バックグラウンド干渉の影響のみを受けることになる基準サンプルを受容する。結果的に得られる両方のフリンジパターンの位置変化を監視することにより、サンプルによって生成された所望の屈折率信号と、温度ドリフト、周囲振動、及び緩衝液中の変動等の要因によって生じるバックグラウンド干渉とを区別できる。異なる又は同じ種類の２つの分子を流体セルに導入し、混合領域で混合し、時間関数として結合について解析する。一例では、１つ以上のチャネルの流体フローを停止し、複数の反応を同時に監視できる。別の例では、フローを停止することなく、流体セル中の２つ以上の箇所からの干渉スペクトルを解析する。
【００４９】
ブロック１４４において、光源からのビームを２つ以上の部分に分割する。ブロック１４６において、第１部分が流体セルの中のチャネルの溶液に向かう。ビームの第１部分は、流体セル内の体積のサンプルと相互作用する。
【００５０】
流体セルのサンプルアーム内の光が、ビーム経路に沿った界面によって反射し、干渉スペクトル検出により、対応する干渉信号がわかる。流体セルの２つの対向する表面からの反射光間の干渉の位相を測定する。媒体の屈折率変化による位相は、数１で表される。
【００５１】
Δφ＝２ｋ0ＬΔｎ  （数１）
ここで、ｋ0は中心波長における波数、Ｌは路程（例えば、１００μｍ）、及びΔｎはＲＩ変化である。一例では、セル内の空気を用いて位相変動を測定し、数２で表す検出限界を判定する。
δｎ＝（σφ）／（２ｋ0Ｌ）    （数２）
ブロック１４８において、結果として得られる後方散乱ビームを捕捉する。加えて、流体セルの後に反射鏡を使用する場合、光が反射鏡によって反射され、ファイバ内で再び結合する。一例では、干渉パターンを測定するために、ビームの７０パーセントをスペクトロメータに向かわせる。一実施例では、或る角度範囲にわたって後方散乱ビームが検出される。
【００５２】
ブロック１４９において、スペクトロメータを用いて干渉スペクトルを解析する。一例において、干渉スペクトルの解析は、スペクトロメータの読み取り速度によって決まる、約１Ｈｚから約１ＭＨｚの範囲の周波数で行われる。場合によっては、バックグラウンド干渉を補償するために、基準信号を基準チャネルから印加してもよい。
【実施例１】
【００５３】
以下の部品を用いて、スペクトル干渉型バルク屈折率センサを組み立てる。
【００５４】
図１０に示すように、（１）Ｃｏｖｅｇａ（ＳＬＤ−１０２１、λ0〜１０３０ｎｍ／Δλ〜６０ｎｍ）、又は（２）Ｓｕｐｅｒｌｕｍ（ＳＬＤ−１０２１、λ0〜８４０ｎｍ／Δλ〜５０ｎｍ）スーパールミネセント・レーザー・ダイオード（ＳＬＤ）の２つのうち１つを、ＳＬＤ実装／ドライバと一緒に、広帯域光源１５０として使用する。ファイバ・ビーム・スプリッタ１５２は、単一モード２×２ファイバ結合器（ＡＣ−Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社）である。コリメータ１５４は、ＦＣ／ＡＰＣ用ファイバポート（ＰＡＦ−Ｘ−１５）である。流体セル１５６は、１００μｍの路程を有しており、Ｓｔａｒｎａ  Ｃｅｌｌｓ社から入手した４８−Ｑ−０．１であり、スペクトロメータ１５８はＯｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ製のＵＳＢ４０００である。
【００５５】
１２’’×１８’’の光学ブレッドボードに、全部品を実装する。ＳＬＤ１５０からの光の視準を、アイソレータ１６０及びレンズ１６２に通して行う。ＳＬＤ１５０への後方反射を回避するために、アイソレータ１６０を使用する。後方反射により出力が低下して、ＳＬＤ１５０を損傷する可能性がある。光はその後、ファイバ結合器１５２内で結合し、１つのアームがプローブに向けられる。プローブ内では、流体セル１５６が屈折率測定用に構成されている。プローブからの反射光がファイバ内で再び結合するように、反射鏡１５７及び集束レンズ１５９を配置する。干渉スペクトルを測定するために、再び結合した光の５０パーセントをスペクトロメータ１５８に向かわせる。
【実施例２】
【００５６】
微小毛細管用スペクトル干渉型バルクＲＩセンサ
温度制御システム及び可撓性角形シリカチューブを組み込むことにより、遊離溶液分子相互作用感知用に、実施例１の分子相互作用センサを更に構成する。２つのタンパク質溶液を、蠕動ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓより入手した１１ｐｌｕｓ）を用いて、最大１２μＬ／分で微小チューブに注入した。その後、溶液をＴコネクタ（ＩＤＥＸ  Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｃｏｒｐ．より入手）によって混合し、角形可撓性溶融シリカ微小毛細管（アリゾナ州Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手）内に通した。広帯域光源（アイルランド、ＳＵＰＥＲＬＵＭ製のＳＬＤ−３７１−ＨＰ２−ＤＢＵＴ−ＳＭ−ＰＤ−ＦＣ／ＡＰＣ）からのプローブビームを、Ｔコネクタの出口から約１５ｃｍ下流に位置決めし、チューブからの後方反射光を、スペクトロメータ（Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ製のＵＳＢ４０００）によって収集及び測定した。測定目的のため、フローを停止し、干渉スペクトルにおける位相変化を時間関数として測定した。
【００５７】
図１１は、時間関数（横座標１７４）としての位相変化（縦座標１７２）のグラフである。グラフ１７６及び１７８は、異なる濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び抗ＢＳＡ（ａ−ＢＳＡ）における、ＢＳＡとａ−ＢＳＡとの間の相互作用を表す。グラフ１７６はＢＳＡ（５μｍｏｌ／Ｌ）及びａ−ＢＳＡ（１５μｍｏｌ／Ｌ）を表し、グラフ１７８はＢＳＡ（７μｍｏｌ／Ｌ）及びａ−ＢＳＡ（１５μｍｏｌ／Ｌ）を表し、相互作用の前後で明らかに違うことがわかる。
【００５８】
ＢＳＡとａ−ＢＳＡとの間の相互作用により、位相に顕著な変化が生じた。しかし、グラフ１７９に示すように、ニワトリリゾチーム（１４ｎｍｏｌ／Ｌ）及びＢＳＡ（１００ｎｍｏｌ／Ｌ）で実施した対照実験においては、有意な変化は測定されなかった。測定時の高いノイズは、振動、温度変化、及び緩衝液中の変動等、望ましくない効果に起因する可能性がある。
【実施例３】
【００５９】
動的屈折率変化の測定
動的屈折率変化を測定する実験の設計を、図１２に示す。３つのサンプル容器１８０、１８２、１８４を使用して、サンプル溶液を保持する。サンプル容器１８０、１８２、１８４からフローセル１８６内へのサンプルの流量を、弁１８８、１９０、１９２を用いて制御する。フローセル１８６は、１００ミクロンの深さを有する内部フローチャネル（図示せず）を有している。反射の干渉スペクトルの測定は、フローセル１８６の測定チャネルの上面及び底面から行う。
【００６０】
フローセル１８６（Ｓｔａｒｎａ  Ｃｅｌｌｓ、４８−Ｑ−０．１）はビーム経路に沿って透明ガラス窓（図示せず）を有し、測定チャネル（図示せず）は１００ミクロンの深さを有している。機構には更に、集束レンズ１９６、コリメータ１９８、及びフィルタ２００を含む。
【００６１】
光源２０２からのビームは、集束レンズ２０４を用いて合焦され、アイソレータ２０６を通過した後、コリメータ２０８を通過する。更に、ビームスプリッタ２１０を使用してビームを分割し、５０：５０の部分とする。
【００６２】
チャネル内の屈折率変化を検出するために、スペクトロメータ２１２で、チャネル内部のマイクロ流体チャネル界面の上部及び底部からの反射間の干渉信号を測定する。チャネル内の脱イオン水を用いて測定された干渉スペクトルを図１３に示し、ここでの位相変化２２２は、係数ｋ２２０の関数として表される。フリンジ２２４は、ビーム経路に沿った界面からの反射の干渉に起因する。干渉信号のＦＦＴを図１４に示し、チャネル内の上部及び底部界面間の干渉である対象の信号を、参照符号２２６で示している。
【００６３】
図１５は、それぞれ曲線２３６及び２３８で表される、溶液中の増加するＮａＣｌ濃度（横座標２３４））の存在下での、時間（横座標２３２）によるバルク屈折率（縦座標２３０）の変化を示している。異なる濃度のＮａＣｌ溶液を、サンプルとして使用する。５ＭのＮａＣｌ原液を脱イオン水で希釈し、約１５．６ｍＭ、３１．２ｍＭ、６２．５ｍＭのＮａＣｌ溶液を得る。最低から最高の順に溶液がチャネルに流入し、１Ｈｚの干渉スペクトルが取得される。対象の干渉信号の位相情報を精査し、数式３で表す関係を用いて、測定位相変化を屈折率変化に変換する。
【００６４】
Δｎ＝Δφ／２ｋ0ｔ  (数３)
ここで、Δnは屈折率変化、Δφは測定位相変化、ｋ0は中心波長λ0（この場合は８４０ｎｍ）における２π／λ0で定義される中心波数、ｔはチャネル深さ（現在の設計で１００μｍ）である。各濃度の定常状態領域における屈折率値の平均値を求め、平均屈折率変化をＮａＣｌ濃度の関数として評価する。感度に対応する線形適合は、１．２５×１０-5（ＲＩ／ｍＭ）の傾きを有する。システムの検出限界は、１．５×１０-7ＲＩＵと測定された。感度は装置の設計に依存するのに対して、検出限界は、システムノイズの量、及び信号の僅かな変化を分解する能力に依存する。
【実施例４】
【００６５】
高分子濃度の関数としての屈折率変化
実施例２に記載した配置を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を用いる動的屈折率変化測定の実施に用いる。５パーセントＢＳＡ原液（５０ｇ／Ｌ）を希釈して、約２３．７、４７．４、及び９４．７μＭのＳＢＡ溶液を得る。異なる濃度の溶液を、測定フローセル内に順次流し込む。図１６は、時間関数（横座標２４２）としての屈折率変化（縦座標２４０）、及びＢＳＡ濃度（横座標２４４）に対する屈折率（縦座標２４０）の変化を示す。曲線２４６との線形適合２４８は、約１．１２５×１０-8ＲＩＵ／ｎＭの勾配又は感度を有する。
【００６６】
本発明のシステム及び方法を、オンライン解析ツールとして分子相互作用を使用するように適合してもよい。例えば、相互作用センサとして、対象の分子を分離プロセスからの排液と連続的に混合し、混合地点の下流のサンプル採取地点（遅延時間に対応）でこれを測定することにより、分離プロセス中に対象の分子の溶出プロファイルを監視できる。表面結合分子或いは従来のＳＰＲを使用した、このような溶出プロファイルの監視は、表面の持続的再生を要するので困難である。選択性は、適切な第２分子との結合に依存する。
【００６７】
本光検出システムは、その他の蛍光及び放射性マーカに基づく手法とは異なり、標識を必要としない。更に、ユーザは、センサ表面を官能化及び洗浄するにあたり、複雑な表面化学を用いる必要がない。ガラスとの非特異的結合を特に回避する必要がある場合、その効果を最小化するようにチャネルを処理できる。実験設計は、単純で構築し易いものであり、２−Ｄ検出器を用いて、又は多径チャネルを備える１−Ｄ検出器を用いて、２つ以上のサンプルの同時検出用に構成可能である。本システムを使用して、「ラボ・オン・チップ」タイプの装置上で行う分子反応／相互作用の解析が可能である。
【００６８】
本明細書では、本発明の特徴の一部のみを図示及び記載したが、多くの修正及び改変が当業者に想到されよう。したがって、添付の特許請求の範囲は、こうした修正及び改変も全て、本発明の範囲に含まれるものとして、包含することを意図している。
【図１】
0005868327.tif 000002
【図２】
0005868327.tif 000003
【図３】
0005868327.tif 000004
【図４】
0005868327.tif 000005
【図５】
0005868327.tif 000006
【図６】
0005868327.tif 000007
【図７】
0005868327.tif 000008
【図８】
0005868327.tif 000009
【図９】
0005868327.tif 000010
【図１０】
0005868327.tif 000011
【図１１】
0005868327.tif 000012
【図１２】
0005868327.tif 000013
【図１３】
0005868327.tif 000014
【図１４】
0005868327.tif 000015
【図１５】
0005868327.tif 000016
【図１６】
0005868327.tif 000017