(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレアーゼによって、細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入するためのベクターであって、
ここで、前記細胞に含まれる核酸は、５’末端から３’末端の方向において、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、前記所定の部位、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含み、
前記ヌクレアーゼは、前記細胞に含まれる前記所定の部位に対して特異的な切断を行うものであり、
前記ベクターは、５’末端から３’末端の方向において、順に、５’側のｇＲＮＡ標的配列または第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列、第１のヌクレオチド配列からなる領域、前記所望の核酸、第２のヌクレオチド配列、および３’側のｇＲＮＡ標的配列または第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域を含み、
前記ベクターは、前記ヌクレアーゼによって、５’末端から３’末端の方向において、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、前記所望の核酸、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含む核酸断片を生じさせるものであり、
前記細胞に含まれる核酸における第１のヌクレオチド配列と前記ベクターにおける第１のヌクレオチド配列がマイクロホモロジー媒介性結合によって連結され、前記細胞に含まれる核酸における第２のヌクレオチド配列と前記ベクターにおける第２のヌクレオチド配列がマイクロホモロジー媒介性結合によって連結され、それによって前記所望の核酸が挿入され、
第１のヌクレオチド配列が３塩基長〜１０塩基長であり、かつ第２のヌクレオチド配列が３塩基長〜１０塩基長である、
ベクター。
【請求項２】
第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼによって、細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入するためのベクターであって、
ここで、前記細胞に含まれる核酸は、５’末端から３’末端の方向において、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、前記所定の部位、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含み、
前記細胞に含まれる核酸において、第１のヌクレオチド配列からなる領域、前記所定の部位、および第２のヌクレオチド配列からなる領域は、それぞれ、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域と、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域との間にあり、
ここで、前記ベクターは、５’末端から３’末端の方向において、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、前記所望の核酸、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含み、
前記ベクターにおいて、第１のヌクレオチド配列からなる領域、および第２のヌクレオチド配列からなる領域は、それぞれ、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域と、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域との間にあり、
前記ベクターは、前記ヌクレアーゼによって、５’末端から３’末端の方向において、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、前記所望の核酸、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含む核酸断片を生じさせるものであり、
前記細胞に含まれる核酸における第１のヌクレオチド配列と前記ベクターにおける第１のヌクレオチド配列がマイクロホモロジー媒介性結合によって連結され、前記細胞に含まれる核酸における第２のヌクレオチド配列と前記ベクターにおける第２のヌクレオチド配列がマイクロホモロジー媒介性結合によって連結され、それによって前記所望の核酸が挿入され、
第１のヌクレオチド配列が３塩基長〜１０塩基長であり、かつ第２のヌクレオチド配列が３塩基長〜１０塩基長である、
ベクター。
【請求項３】
前記ヌクレアーゼがホモダイマー型のヌクレアーゼであり、前記ベクターが環状ベクターである、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
ヌクレアーゼがＴＡＬＥＮである、請求項２に記載のベクター。
【請求項６】
細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入するためのキットであって、請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクター、およびヌクレアーゼを発現させるためのベクターを含む、キット。
【請求項７】
細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、あるいは非ヒト生物においてｉｎ  ｖｉｖｏで挿入する方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクター、およびヌクレアーゼを発現させるためのベクターを、細胞に導入する工程を含む、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法によって細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入する工程を含む、所望の核酸を含む細胞を製造する方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によって細胞を製造する工程、および製造された細胞を分化させる工程を含む、所望の核酸を含む非ヒト生物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内の核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入するため方法、ならびにそのためのベクター、キット、および当該方法によって取得された細胞に関する。さらに、本発明は、所望の核酸を含む細胞を含む生物、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインからなるヌクレアーゼサブユニットを複数含むポリペプチドとして、ＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）やＺＦＮ（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）などが知られている（特許文献１〜４、非特許文献１）。これらの人工ヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメインの結合部位において複数のＤＮＡ切断ドメインが近接して多量体を形成することによって、ＤＮＡの二本鎖切断を引き起こす。ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールを繰り返して含み、それぞれのＤＮＡ結合モジュールが、ＤＮＡ鎖中の特定の塩基対を認識する。そのため、ＤＮＡ結合モジュールを適切に設計することによって、特定のヌクレオチド配列に特異的な切断を行うことができる。特定のヌクレオチド配列に特異的な切断を行う他のヌクレアーゼとしては、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムなどのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（非特許文献２）や、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムとＦｏｋｌヌクレアーゼを融合させたＲＮＡ誘導型Ｆｏｋｌヌクレアーゼ（Ｆｏｋｌ−ｄＣａｓ９）（非特許文献３）が知られている。これらのヌクレアーゼによる切断の修復の際に生じるエラーや組換えを利用することによって、ゲノムＤＮＡ上の遺伝子の欠失、挿入、および変異導入などの各種の遺伝子改変が行われている（特許文献５〜６、非特許文献４参照）。【０００３】
人工ヌクレアーゼを用いて細胞に所望の核酸を挿入する方法として、非特許文献５〜８に記載された方法が知られている。非特許文献５には、ＴＡＬＥＮを用いて、相同組換えによって外来ＤＮＡを挿入する方法が記載されている。また、非特許文献６には、ＺＦＮを用いて、相同組換えによって外来ＤＮＡを挿入する方法が記載されている。しかしながら、相同組換えを利用するベクターは、長鎖に及び、簡便に作製することができない。また、細胞や生物種によっては、相同組換え効率が低いことがあるため、これらの方法は、限られた細胞および生物種にしか使用することができない。所望の核酸を挿入した細胞を安定的に有する改変生物を取得するためには、動物胚に目的とする核酸を導入した後に分化させて成体を得ることが効果的であるが、動物胚においては、相同組換え効率が低く、これらの方法は非効率的である。動物胚に外来性ＤＮＡを導入する技術として、ｓｓＯＤＮ媒介性遺伝子修飾が知られているが、この技術においては、約数１０ｂｐ程度の短いＤＮＡしか導入できない。【０００４】
非特許文献７および８に記載された方法は、相同組換えを利用せずに人工ヌクレアーゼを用いて細胞に核酸を挿入する方法である。非特許文献７は、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮを用いて、細胞内の核酸と挿入すべき外来ＤＮＡを切断し、両者の切断部位を非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の作用によって連結することによって、外来ＤＮＡを挿入する方法を開示している。しかしながら、非特許文献７に記載の方法においては、挿入する核酸の向きが制御されておらず、挿入する核酸のつなぎ目も正確ではない。非特許文献８に記載の方法は、向きの制御と正確な連結を可能にするために、ヌクレアーゼによる切断によって細胞内の核酸から生じる一本鎖末端と、外来性ＤＮＡから生じる一本鎖末端とを相互にアニーリングさせて連結している。しかしながら、非特許文献８に記載の方法は、挿入後のＤＮＡに対する再度の切断を防ぐために、ヘテロダイマー型のＺＦＮおよびＴＡＬＥＮを使用しなければならず、活性の高いホモダイマー型の人工ヌクレアーゼを用いることができない。また、非特許文献８に記載の方法は、動物胚への所望の核酸の挿入には用いられていない。さらに、非特許文献８に記載の方法は、誤った箇所への一本鎖末端のアニーリングが生じる頻度が高く、正確な挿入を受けた細胞が得られる頻度は高くなかった。なお、非特許文献５〜８には、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムなどのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼやＦｏｋｌ−ｄＣａｓ９などのＲＮＡ誘導型Ｆｏｋｌヌクレアーゼを用いる方法は記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０７２２４６号
【特許文献２】国際公開第２０１１／１５４３９３号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１５９３６９号
【特許文献４】国際公開第２０１２／０９３８３３号
【特許文献５】特表２０１３−５１３３８９号公報
【特許文献６】特表２０１３−５２９０８３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２０１０  Ｓｅｐ；１１（９）：６３６−４６．
【非特許文献２】Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８．
【非特許文献３】Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｊｕｎ；３２（６）：５６９−７６．
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ．２０１１  Ｊｕｌ  ２２；１４６（２）：３１８−３１．
【非特許文献５】Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ｊｕｌ  ７；２９（８）：７３１−４．
【非特許文献６】Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９  Ｓｅｐ；２７（９）：８５１−７．
【非特許文献７】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２０１３  Ｍａｒ；１１０（３）：８７１−８０．
【非特許文献８】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｍａｒ；２３（３）：５３９−４６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明は、長鎖のベクターの作製などの煩雑な工程を必要とすることなく、様々な生物種の細胞内の核酸の所定の部位に、所望の核酸を、正確かつ簡便に挿入することができる方法であって、比較的長鎖に及ぶ核酸を挿入することもでき、ホモダイマー型のＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、またはＲＮＡ誘導型Ｆｏｋｌヌクレアーゼと組み合わせて使用することができる方法を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、核酸を挿入することを目的とする所定の部位を挟む第１のヌクレオチド配列からなる領域と第２のヌクレオチド配列からなる領域に着目し、細胞内の核酸に含まれるこれらの領域からなる部分に対して特異的な切断を行うヌクレアーゼを設計した。また、本発明者らは、５’末端から３’末端の方向において、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、挿入を目的とする所望の核酸、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含むベクターを設計した。そして、本発明者らは、設計したベクターを細胞に導入し、前記ヌクレアーゼを細胞に作用させて、細胞内の核酸における前記の所定の部位において切断を生じさせた。また、ベクターに対してもヌクレアーゼを作用させて、５’末端から３’末端の方向に、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、前記所望の核酸、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含む核酸断片を生じさせた。すると、細胞内において、前記細胞内の核酸における第１のヌクレオチド配列と前記ベクターにおける第１のヌクレオチド配列がマイクロホモロジー媒介性結合（ＭＭＥＪ）によって連結され、前記細胞内の核酸における第２のヌクレオチド配列と前記ベクターにおける第２のヌクレオチド配列がＭＭＥＪによって連結された。これにより、所望の核酸が、細胞の核酸の所定の部位に正確に挿入された。挿入は、数ｋｂ以上の比較的長鎖に及ぶ核酸について可能であった。用いたヌクレアーゼは、挿入前の細胞内の核酸に含まれる第１のヌクレオチド配列からなる領域、および第２のヌクレオチド配列からなる領域からなる部分に対して特異的な切断を行うものであるが、連結後の核酸は、前記所望の核酸の挿入により、当該部分の一部分を失っている。そのため、細胞内に存在するヌクレアーゼによる再度の切断を受けず、安定的に保持され、所望の核酸の挿入は、高頻度で生じた。【０００９】
当該方法は、多くの細胞において機能するマイクロホモロジー媒介性末端結合によって連結を行うものであるため、相同組換え効率が低い発生段階の細胞などに対しても、所望の核酸を正確に高頻度で挿入することができ、適用できる生物および細胞の種類の範囲が広い。また、当該方法は、ヌクレアーゼを導入するためのベクターと、核酸を挿入するためのベクターの細胞に対する挿入を同時に行うことができ、操作が簡便である。さらに、当該方法は、マイクロホモロジー媒介性末端結合による細胞内の核酸の部分の変化によって、挿入後の核酸に対する再度の切断を防ぐことができるため、ヌクレアーゼに含まれるＤＮＡ切断ドメインとして、活性の高いホモダイマー型のドメインを使用することもでき、実験材料の選択の幅が広い。【００１０】
すなわち、本発明は、第１の態様において、ヌクレアーゼによって、細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入するためのベクターであって、
ここで、前記細胞に含まれる核酸は、５’末端から３’末端の方向において、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、前記所定の部位、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含み、
前記ヌクレアーゼは、前記細胞に含まれる前記の第１のヌクレオチド配列からなる領域、および前記の第２のヌクレオチド配列からなる領域からなる部分に対して特異的な切断を行うものであり、
前記ベクターは、５’末端から３’末端の方向において、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、前記所望の核酸、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含む、
ベクター、を提供するものである。【００１１】
すなわち、本発明は、第２の態様において、第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼによって、細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入するためのベクターであって、
ここで、前記細胞に含まれる核酸は、５’末端から３’末端の方向において、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、前記所定の部位、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含み、
前記細胞に含まれる核酸において、第１のヌクレオチド配列からなる領域、前記所定の部位、および第２のヌクレオチド配列からなる領域は、それぞれ、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域と、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域との間にあり、
ここで、前記ベクターは、５’末端から３’末端の方向において、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、前記所望の核酸、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含み、
前記ベクターにおいて、第１のヌクレオチド配列からなる領域、および第２のヌクレオチド配列からなる領域は、それぞれ、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域と、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域との間にあり、
前記ベクターは、前記ヌクレアーゼによって、５’末端から３’末端の方向において、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、前記所望の核酸、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含む核酸断片を生じさせるものである、
ベクター、を提供するものである。【００１２】
また、本発明は、第３の態様において、前記細胞に含まれる核酸における第１のヌクレオチド配列と前記ベクターにおける第１のヌクレオチド配列がマイクロホモロジー媒介性結合（ＭＭＥＪ）によって連結され、前記細胞に含まれる核酸における第２のヌクレオチド配列と前記ベクターにおける第２のヌクレオチド配列がＭＭＥＪによって連結され、それによって前記所望の核酸が挿入される、第１または第２の態様に記載のベクター、を提供するものである。【００１３】
また、本発明は、第４の態様において、前記ヌクレアーゼがホモダイマー型のヌクレアーゼであり、前記ベクターが環状ベクターである、第２の態様に記載のベクター、を提供するものである。【００１４】
また、本発明は、第５の態様において、ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、第１の態様に記載のベクター、を提供するものである。【００１５】
また、本発明は、第６の態様において、ヌクレアーゼがＴＡＬＥＮである、第２の態様に記載のベクター、を提供するものである。【００１６】
また、本発明は、第７の態様において、細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入するためのキットであって、第１の態様〜第６の態様のいずれか１つに記載のベクター、およびヌクレアーゼを発現させるためのベクターを含む、キットを提供するものである。【００１７】
また、本発明は、第８の態様において、細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入する方法であって、第１の態様〜第６の態様のいずれか１つに記載のベクター、およびヌクレアーゼを発現させるためのベクターを、細胞に導入する工程を含む、方法を提供するものである。【００１８】
また、本発明は、第９の態様において、第８の態様に記載の方法によって取得された細胞を提供するものである。【００１９】
また、本発明は、第１０の態様において、第９の態様に記載の細胞を含む生物を提供するものである。【００２０】
また、本発明は、第１１の態様において、第８の態様に記載の方法によって取得された細胞を分化させる工程を含む、所望の核酸を含む生物の製造方法を提供するものである。【００２１】
また、本発明は、第１２の態様において、第１１の態様に記載の方法によって製造された生物を提供するものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のベクターを用いれば、長鎖のベクターの作製などの煩雑な工程を必要とすることなく、細胞や生物種における相同組換え効率によらずに、広く様々な生物種の細胞内の核酸の所定の部位に、所望の核酸を、フレームシフトを起こさずに、正確かつ簡便に挿入することができ、数ｋｂ以上の比較的長鎖に及ぶ核酸を挿入することもできる。また、本発明のベクターを用いる核酸の挿入方法は、高ヌクレアーゼ活性を有するホモダイマー型のＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼと組み合わせて使用することができる。あるいは、本発明のベクターを用いる核酸の挿入方法は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムなどのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと組み合わせて使用することもできる。さらに、本発明のベクターを用いれば、つなぎ目を正確にデザインすることができ、インフレームで機能ドメインをノックインすることができるため、標識となる遺伝子を含む核酸を使用すれば、当該遺伝子の発現を検出することによって、目的とする挿入が生じた生物を簡易に同定することができ、所望の核酸が挿入された生物を、簡便かつ高頻度で取得することができる。また、本発明のベクターを用いる核酸の挿入方法は、相同組換え効率の低い動物胚などの未分化細胞に対して用いることができるため、本発明のベクターを用いて未分化細胞に所望の核酸を挿入し、得られた未分化細胞を分化させることによって、所望の核酸を安定的に保持する成体生物を簡便に取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＴＡＬＥＮを用いて、所望の核酸を含むベクター全体が挿入される場合の、ｔｙｒ遺伝子座へのターゲットインテグレーションの概略図を示す。
【図２】図２は、ＴＡＬＥＮを用いて、所望の核酸を含むベクターの一部分が挿入される場合の概略図を示す。
【図３】図３は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた本発明のベクター設計の概略図を示す。
【図４ａ】図４ａは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、所望の核酸を含むベクター全体が挿入される場合の概略図を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、所望の核酸を含むベクター全体が挿入される場合の概略図を示す。
【図５】図５は、Ｆｏｋｌ−ｄＣａｓ９を用いて、所望の核酸を含むベクター全体が挿入される場合の概略図を示す。
【図６】図６は、ＴＡＬＥＮ及びターゲットインテグレーション用ベクター（ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクター）を微量顕微注入した胚の表現型を示す。図６は、ＴＡＬＥＮ  Ｒ  ＋ベクター注入胚（ネガティブコントロール群；Ａ）、及びＴＡＬＥＮ  ｍｉｘ  ＋ベクター注入胚（実験群；Ｂ）の明視野像（上段）とＧＦＰ蛍光像（下段）を示す。
【図７】図７は、ネガティブコントロール群及び実験群における表現型の割合を示す。異常発生胚（灰色、Ａｂｎｏｒｍａｌ）を除いて、表現型を４つ（Ｆｕｌｌ、Ｈａｌｆ、Ｍｏｓａｉｃ、Ｎｏｎ）に分類した。個体数はそれぞれのグラフの上部に示す。
【図８】図８は、標的遺伝子座へのドナーベクター（ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクター）導入の検出を示す。下の図は、ｔｙｒＴＡＬＥＮの標的配列上流及び下流、ベクター側のプライマーセットを用いたＰＣＲ産物の電気泳動写真である。上の図はプライマーの位置を示す。下の図において、矢印は、ベクターがインテグレーションされたことを示すバンドを示す。数字は図６の個体番号に対応する。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、挿入部位とドナーベクター（ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクター）のつなぎ目のシーケンス解析を示す。Ｎｏ．３及び４（図６）由来のＰＣＲ産物（図８；５’側及び３’側）をシーケンスした結果を示す。ＭＭＥＪ依存的に導入された際に期待される配列を上段に示す。ＴＡＬＥＮ標的配列には下線を付している。中央付近のボックスはそれぞれ５’側、３’側のＭＭＥＪによって短くなったスペーサー周辺配列を示す。欠失はダッシュライン（−）で示し、挿入は斜体文字で示す。
【図１０】図１０は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いる、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＦＢＬ遺伝子座へのターゲットインテグレーションの概略図である。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、ドナーベクター（ＣＲＩＳ−ＰＩＴＣｈベクター）の全長配列を示す。ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎのコード配列は緑色、２Ａペプチドのコード配列は紫色、ピューロマイシン耐性遺伝子のコード配列は青色で、それぞれ示される。下線は５’側および３’側のｇＲＮＡ標的配列を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａの続きである。
【図１２】図１２は、３種類のｇＲＮＡおよびＣａｓ９を発現するベクターと、ドナーベクター（ＣＲＩＳ−ＰＩＴＣｈベクター）とを共導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表現型を示す、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ蛍光像である。
【図１３】図１３は、挿入部位とドナーベクター（ＣＲＩＳ−ＰＩＴＣｈベクター）のつなぎ目のシーケンス解析を示す。ＭＭＥＪ依存的に導入された際に期待される配列を上段に示す。欠失はダッシュライン（−）で示し、挿入は二重下線で示し、置換は下線で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
第１の態様の本発明によって提供されるベクターは、細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入するためのものである。細胞に含まれる核酸としては、たとえば、細胞のゲノムＤＮＡが挙げられる。細胞の由来としては、ヒト；ウシ、ミニブタ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、サルなどの非ヒト哺乳動物；鳥類；ゼブラフィッシュなどの魚類；カエルなどの両生類；爬虫類；ショウジョウバエなどの昆虫類；甲殻類などが挙げられる。また、細胞の由来としては、シロイヌナズナなどの植物などが挙げられる。細胞は、培養細胞であってもよい。細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞などの、成熟度の高い組織細胞に分化し得る能力をもつ未成熟な細胞であってもよい。胚性幹細胞、人工多能性幹細胞は、無限に増殖可能であり、機能的な細胞の大量供給源として有益である。
【００２５】
第１の態様の本発明のベクターを挿入する細胞は、５’末端から３’末端の方向において、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、核酸を挿入することを目的とする所定の部位、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含む核酸を含む。第１のヌクレオチド配列、および第２のヌクレオチド配列は、挿入するベクターに含まれる配列との関係を示すための便宜的な表記である。第１のヌクレオチド配列、および第２のヌクレオチド配列は、前記所定の部位と直接的に隣接していてもよいし、特定の塩基配列からなる領域を介して隣接していてもよい。特定の塩基配列からなる領域を介して隣接する場合、当該特定の塩基配列は、好ましくは、１塩基長〜７塩基長、より好ましくは、１塩基長〜３塩基長である。第１のヌクレオチド配列は、好ましくは、３塩基長〜１０塩基長、より好ましくは、４塩基長〜８塩基長、さらに好ましくは、５塩基長〜７塩基長である。また、第２のヌクレオチド配列は、好ましくは、３塩基長〜１０塩基長、より好ましくは、４塩基長〜８塩基長、さらに好ましくは、５塩基長〜７塩基長である。
【００２６】
第１の態様の本発明によって提供されるベクターは、ヌクレアーゼによって、細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入するためのものである。第１の態様の本発明において、前記ヌクレアーゼは、前記細胞に含まれる前記の第１のヌクレオチド配列からなる領域、および前記の第２のヌクレオチド配列からなる領域からなる部分に対して特異的な切断を行うものである。このようなヌクレアーゼとしては、第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼが挙げられるが、このヌクレアーゼについては、本明細書のうち、第２の態様の本発明によって提供されるベクターを説明する箇所において説明する。前記のような特異的な切断を行う他のヌクレアーゼとしては、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムによるヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいては、ＰＡＭと呼ばれる部分が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる二本鎖切断に必須である。Ｃａｓ９ヌクレアーゼには、たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＳｐＣａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＳｔＣａｓ９が挙げられる。ＳｐＣａｓ９のＰＡＭは「５’−ＮＧＧ−３’」配列であり（Ｎは任意のヌクレオチドである）、二本鎖切断が起こる箇所は、ＰＡＭより３塩基上流（５’末端側）に位置する。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、二本鎖切断が起こる箇所の５’側に位置する塩基配列を認識する。そして、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおける二本鎖切断が生じる箇所は、細胞に含まれる核酸において、所望の核酸を挿入することを目的とする前記の所定の部位に対応する。当該所定の部位の両端には、第１のヌクレオチド配列からなる領域と、第２のヌクレオチド配列からなる領域が存在する。そのため、細胞における核酸に含まれるＰＡＭよりも５’末端側に位置する塩基配列を認識するｇＲＮＡを用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、第１のヌクレオチド配列からなる領域および第２のヌクレオチド配列からなる領域からなる部分に対して特異的な切断を行うことができる。
【００２７】
第１の態様の本発明によって提供されるベクターは、５’末端から３’末端の方向において、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、細胞に挿入することを目的とする所望の核酸、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含む。ベクターに含まれる第１のヌクレオチド配列からなる領域は、前記の細胞に含まれる核酸における第１のヌクレオチド配列からなる領域と同一である。また、ベクターに含まれる第２のヌクレオチド配列からなる領域は、前記の細胞に含まれる核酸における第２のヌクレオチド配列からなる領域と同一である。ベクターに含まれる第１のヌクレオチド配列、および第２のヌクレオチド配列と、細胞に含まれる核酸における第１のヌクレオチド配列、および第２のヌクレオチド配列との関係を、図１を一例として説明する。図１のＴＡＬＥＮ  ｓｉｔｅに含まれるＡＡｃａｔｇａｇが、第１のヌクレオチド配列である。第１のヌクレオチド配列におけるＡＡは、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列と、第１のヌクレオチド配列との重複部分である。図１のＴＡＬＥＮ  ｓｉｔｅに含まれるａｔｔｃａｇａＡが、第２のヌクレオチド配列である。第２のヌクレオチド配列の大文字のＡは、第２のヌクレオチド配列と、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列との重複部分である。一方、図１のドナーベクターに含まれるＡｔｔｃａｇａａは、第２のヌクレオチド配列である。第２のヌクレオチド配列に含まれる大文字のＡは、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列と、第１のヌクレオチド配列との重複部分である。図１のドナーベクターに含まれるａａｃａｔｇａｇは、第１のヌクレオチド配列である。図１のドナーベクターに含まれるＣＭＶおよびＥＧＦＰをコードする配列は、細胞に挿入することを目的とする所望の核酸である。図１のドナーベクターの模式図に示されるように、第１のヌクレオチド配列（ａａｃａｔｇａｇ）からなる領域を起点として順に説明すると、図１のドナーベクターは、５’末端から３’末端の方向に向けて、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、細胞に挿入することを目的とする所望の核酸、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含む。図１のドナーベクターと図１のＴＡＬＥＮ  ｓｉｔｅとの対比で説明すると、ＴＡＬＥＮ  ｓｉｔｅにおいては、第１のヌクレオチド配列の３’末端と第２のヌクレオチド配列の５’末端が、隣接または接触しているのに対して、ドナーベクターにおいては、第２のヌクレオチド配列の３’末端と第１のヌクレオチド配列の５’末端が、隣接または接触している。この点で、図１の一例においては、細胞における核酸における第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との位置関係は、ベクターにおけるこれらの位置関係と比較して、逆転している。このような関係は、図１のドナーベクターが環状ベクターであること、ならびにヌクレアーゼがベクターにおける第１のヌクレオチド配列からなる領域および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含む部分に対して切断を行うことに起因する。このように、第１の態様の本発明のベクターは、好ましくは、環状ベクターである。また、第１の態様の本発明のベクターが、環���ベクターである場合には、第１の態様の本発明のベクターに含まれる第２のヌクレオチド配列の３’末端と、第１のヌクレオチド配列の５’末端は、好ましくは、隣接している、または直接的に連結している。第１の態様の本発明のベクターが、環状ベクターであって、第２のヌクレオチド配列と第１のヌクレオチド配列とが隣接する場合には、第２のヌクレオチド配列の３’末端と、第１のヌクレオチド配列の５’末端は、好ましくは、１〜７塩基長、より好ましくは、１〜５塩基長、さらに好ましくは、１〜３塩基長の塩基配列からなる領域によって隔てられている。
【００２８】
第２の態様の本発明によって提供されるベクターは、第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼによって、所望の核酸を挿入するためのものである。
【００２９】
ＤＮＡ結合ドメインの由来としては、植物病原菌ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＴＡＬＥ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）、ジンクフィンガー（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ）などが挙げられる。ＤＮＡ結合ドメインは、好ましくは、塩基対を特異的に認識する１または複数のＤＮＡ結合モジュールを、Ｎ末端側から連続的に含む。１つのＤＮＡ結合モジュールは、１つの塩基対を特異的に認識する。したがって、第１のＤＮＡ結合ドメイン、および第２のＤＮＡ結合ドメインは、それぞれ、特定のヌクレオチド配列からなる領域を認識する。第１のＤＮＡ結合ドメインが認識するヌクレオチド配列と第２のＤＮＡ結合ドメインが認識するヌクレオチド配列は、同一であってもよいし、異なってもよい。ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールの数は、ＤＮＡ切断ドメインのヌクレアーゼ活性の高さとＤＮＡ配列認識特異性の高さの両立性の観点から、好ましくは、８〜４０、より好ましくは、１２〜２５、さらにより好ましくは、１５〜２０である。ＤＮＡ結合モジュールとしては、たとえば、ＴＡＬエフェクターリピート（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｒｅｐｅａｔ）などが挙げられる。１つのＤＮＡ結合モジュールの長さとしては、例えば、２０〜４５、３０〜３８、３２〜３６、または３４などが挙げられる。ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールの長さは、好ましくは、全てのＤＮＡ結合モジュールに関して同一である。第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ結合ドメインは、好ましくは、由来、特性などが同一である。
【００３０】
ＲＮＡ誘導型Ｆｏｋｌヌクレアーゼ（Ｆｏｋｌ−ｄＣａｓ９）を用いる場合、ｇＲＮＡと複合体を形成したＦｏｋｌ−ｄＣａｓ９が、上述した第２の態様におけるＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼに相当する。ｄＣａｓ９はその触媒活性が不活性化されたＣａｓ９であり、二本鎖切断が起こる箇所の近傍に位置する塩基配列を認識するｇＲＮＡに導かれ、核酸に結合する。つまり、ｇＲＮＡと複合体を形成したｄＣａｓ９が、上述した第２の態様におけるＤＮＡ結合ドメインに相当する。
【００３１】
第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼは、好ましくは、第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第１のＤＮＡ切断ドメインを含む第１のヌクレアーゼサブユニット、ならびに第２のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ切断ドメインを含む第２のヌクレアーゼサブユニットを含む。
【００３２】
第１のＤＮＡ切断ドメインおよび第２のＤＮＡ切断ドメインは、好ましくは、第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ結合ドメインがそれぞれＤＮＡに結合した後、相互に接近して多量体を形成し、向上したヌクレアーゼ活性を取得する。このようなＤＮＡ切断ドメインとしては、制限酵素Ｆｏｋｌに由来するものなどが挙げられる。ＤＮＡ切断ドメインは、ヘテロダイマー型のＤＮＡ切断ドメインであってもよく、ホモダイマー型のＤＮＡ切断ドメインであってもよい。第１のＤＮＡ切断ドメインと第２のＤＮＡ切断ドメインが接近すると、多量体が形成され、向上したヌクレアーゼ活性が得られるが、第１のＤＮＡ切断ドメインと第１のＤＮＡ切断ドメインが接近しても、多量体が形成されず、向上したヌクレアーゼ活性が得られず、また、第２のＤＮＡ切断ドメインと第２のＤＮＡ切断ドメインが接近しても、多量体が形成されず、向上したヌクレアーゼ活性が得られない場合、当該第１のＤＮＡ切断ドメインと当該第２のＤＮＡ切断ドメインは、ヘテロダイマー型のＤＮＡ切断ドメインである。また、第１のＤＮＡ切断ドメインと第１のＤＮＡ切断ドメインが接近すると、多量体を形成し、ヌクレアーゼ活性の向上が生じる場合、当該第１のＤＮＡ切断ドメインは、ホモダイマー型のＤＮＡ切断ドメインである。ホモダイマー型のＤＮＡ切断ドメインを用いる場合には、一般的に、高いヌクレアーゼ活性が得られる。第１のＤＮＡ切断ドメインおよび第２のＤＮＡ切断ドメインは、好ましくは、由来、特性などが同一である。
【００３３】
ＴＡＬＥＮを用いる場合、第１のヌクレアーゼサブユニットにおいて、第１のＤＮＡ結合ドメインと第１のＤＮＡ切断ドメインは、２０〜７０、２５〜６５、または３０〜６０、好ましくは、３５〜５５、より好ましくは、４０〜５０、更に好ましくは、４５〜４９、最も好ましくは、４７のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されている。ＺＦＮを用いる場合、第１のヌクレアーゼサブユニットにおいて、第１のＤＮＡ結合ドメインと第１のＤＮＡ切断ドメインは、０〜２０、または２〜１０、好ましくは、３〜９、より好ましくは、４〜８、更に好ましくは、５〜７のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されている。Ｆｏｋｌ−ｄＣａｓ９を用いる場合、第１のヌクレアーゼサブユニットにおいて、ｄＣａｓ９とＦｏｋｌは、１〜２０、１〜１５、または１〜１０、好ましくは、２〜８、より好ましくは、３〜７、更に好ましくは、４〜６、最も好ましくは、５のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されている。第２のヌクレアーゼサブユニットについても同様である。このような長さのポリペプチドにより接続された第１のヌクレアーゼサブユニットは、第１のヌクレオチド配列からなる領域、および第２のヌクレオチド配列からなる領域からなる部分の長さに対する特異性が高く、特定の長さのスペーサー領域に対して特異的に切断を行うため、非特異的な切断によって目的外の部位へ核酸が挿入される頻度が低く、また、後述のマイクロホモロジー媒介性末端結合による連結後の核酸に対する再度の切断が生じる頻度が低く、好ましい。
【００３４】
第２の態様の本発明によって提供されるベクターによる挿入を目的とする細胞に含まれる核酸において、第１のヌクレオチド配列からなる領域は、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域と、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域との間にある。また、第２のヌクレオチド配列からなる領域は、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域と、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域との間にある。また、前記所定の部位は、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域と、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域との間にある。当該核酸において、第１のヌクレオチド配列からなる領域を囲むＤＮＡ結合ドメインによって認識される２つのヌクレオチド配列の組合せは、第２のヌクレオチド配列からなる領域を囲むＤＮＡ結合ドメインによって認識される２つのヌクレオチド配列の組合せと異なっていてもよい。この場合、第１のヌクレオチド配列からなる領域の周辺を切断するためのヌクレアーゼと、第２のヌクレオチド配列からなる領域の周辺を切断するためのヌクレアーゼには、別異のものが用いられる。前記細胞に含まれる核酸において、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域と、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域は、好ましくは、５〜４０塩基長の、より好ましくは、１０〜３０塩基長の、さらに好ましくは、１２〜２０塩基長のヌクレオチド配列からなる領域によって隔てられている。両者を隔てる領域の塩基長は、第１のヌクレオチド配列の塩基長、および第２のヌクレオチド配列の塩基長の合計の塩基長と同一であってもよいが、異なってもよい。たとえば、前記細胞に含まれる核酸において、第１のヌクレオチド配列の３’末端と、第２のヌクレオチド配列の５’末端とが直接に接触すること、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列と、第１のヌクレオチド配列との間に重複がないこと、ならびに第２のヌクレオチド配列と第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列との間に重複がないことの条件を満たす場合には、前記の両者を隔てる領域の塩基長は、第１のヌクレオチド配列の塩基長、および第２のヌクレオチド配列の塩基長の合計の塩基長と同一である。しかしながら、これらの条件から選ばれる１または複数が満たされない場合には、前記の両者を隔てる領域の塩基長は、第１のヌクレオチド配列の塩基長、および第２のヌクレオチド配列の塩基長の合計の塩基長と異なる。細胞に含まれる核酸において、第１のヌクレオチド配列からなる領域は、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域と部分的に重複していてもよい。また、細胞に含まれる核酸において、第２のヌクレオチド配列からなる領域は、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域と部分的に重複していてもよい。部分的な重複がある場合、重複する部分は、好ましくは、１〜６塩基長、より好ましくは、１〜５塩基長、さらに好ましくは、２〜４塩基長のヌクレオチド配列からなる。部分的な重複がある場合には、後述のマイクロホモロジー媒介性末端結合による連結によって、ＤＮＡ結合ドメインによって認識される２つの領域を隔てる部分であって、第１のヌクレオチド配列からなる領域、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含んでいた部分の長さがより大きく減少するため、連結後の再度の切断を一層受けにくく、挿入した核酸がより安定的に保持され、好ましい。
【００３５】
第２の態様の本発明によって提供されるベクターにおいて、第１のヌクレオチド配列からなる領域、および第２のヌクレオチド配列からなる領域は、それぞれ、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域と、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域との間にある。当該ベクターにおいて、第１のヌクレオチド配列からなる領域を囲むＤＮＡ結合ドメインによって認識される２つのヌクレオチド配列の組合せは、第２のヌクレオチド配列からなる領域を囲むＤＮＡ結合ドメインによって認識される２つのヌクレオチド配列の組合せと異なっていてもよい。この場合、第１のヌクレオチド配列からなる領域の周辺を切断するためのヌクレアーゼと、第２のヌクレオチド配列からなる領域の周辺を切断するためのヌクレアーゼには、別異のものが用いられる。ベクターにおいて、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域は、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域と対比して、５’末端側に存在してもよく、３’末端側に存在してもよい。しかしながら、ベクターにおいて、第１のヌクレアーゼ配列の３’末端側に位置し、第１のＤＮＡ結合ドメインまたは第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列は、細胞に含まれる核酸における第２のヌクレオチド配列の３’末端側に位置し、第１のＤＮＡ結合ドメインまたは第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識される配列とは異なることが好ましい。また、ベクターにおいて、第２のヌクレアーゼ配列の５’末端側に位置し、第１のＤＮＡ結合ドメインまたは第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列は、細胞に含まれる核酸における第１のヌクレオチド配列の５’末端側に位置し、第１のＤＮＡ結合ドメインまたは第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識される配列とは異なることが好ましい。これらの場合、ヘテロダイマー型のＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼを組み合わせて用いることによって、所望の核酸の挿入後に生じる再度の切断の頻度を、より低減することができる。また、ベクターは、第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ結合ドメインを含む１または複数のヌクレアーゼによって、１ヶ所の切断部位を生じるものであってもよく、２ヶ所以上の切断部位を生じるものであってもよい。２ヶ所の切断部位を生じるベクターとしては、たとえば、５’末端から３’末端の方向において、順に、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域、第１のヌクレオチド配列からなる領域、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域、細胞に挿入することを目的とする所望の核酸、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域、第２のヌクレオチド配列からなる領域、および第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域、を含むベクターが挙げられる。２ヶ所の切断部位を生じるベクターを用いる場合には、ヌクレアーゼによる切断によって、ベクターに含まれる不要な核酸を除去することができるため、不要な核酸を含まない所望の細胞を、より安全に取得することができる。
【００３６】
第２の態様の本発明によって提供されるベクターにおいて、第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域と、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域とを隔てる領域であって、第１のヌクレオチド配列からなる領域、または第２のヌクレオチド配列からなる領域を含む領域は、好ましくは、５〜４０塩基長、より好ましくは、１０〜３０塩基長、さらに好ましくは、１２〜２０塩基長のヌクレオチド配列からなる。第１のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域と、第２のＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域とを隔てる領域が、第１のヌクレオチド配列、および第２のヌクレオチド配列の両方を含む場合には、前記の隔てる領域の塩基長は、第１のヌクレオチド配列の塩基長と、第２のヌクレオチド配列の塩基長の合計と、同一である、または概ね同一である。前述のように、第１のヌクレオチド配列は、好ましくは、３塩基長〜１０塩基長、より好ましくは、４塩基長〜８塩基長、さらに好ましくは、５塩基長〜７塩基長である。また、前述のように、第２のヌクレオチド配列は、好ましくは、３塩基長〜１０塩基長、より好ましくは、４塩基長〜８塩基長、さらに好ましくは、５塩基長〜７塩基長である。第１のヌクレオチド配列もしくは第２のヌクレオチド配列からなる領域と、ＤＮＡ結合ドメインによって認識されるヌクレオチド配列からなる領域とに重複がある場合、第１のヌクレオチド配列からなる領域と第２のヌクレオチド配列からなる領域とに重複がある場合、または第１のヌクレオチド配列からなる領域と第２のヌクレオチド配列からなる領域とが直接的に接続しない場合には、前記の隔てる領域の塩基長は、第１のヌクレオチド配列の塩基長および第２のヌクレオチド配列の塩基長の合計の塩基長と同一にはならず、概ね同一であるにとどまる。
【００３７】
第１または第２の態様の本発明によって提供されるベクターにおいて、たとえば、前記細胞に含まれる核酸における第１のヌクレオチド配列と前記ベクターにおける第１のヌクレオチド配列はマイクロホモロジー媒介性結合（ＭＭＥＪ）によって連結され、前記細胞に含まれる核酸における第２のヌクレオチド配列と前記ベクターにおける第２のヌクレオチド配列はＭＭＥＪによって連結され、それによって、前記所望の核酸が、前記細胞に含まれる核酸における所定の部位に挿入される。
【００３８】
第２の態様の本発明によって提供されるベクターにおいて、たとえば、前記ヌクレアーゼはホモダイマー型のヌクレアーゼであり、前記ベクターは環状ベクターである。
【００３９】
第１の態様の本発明によって提供されるベクターにおいて、たとえば、前記ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムによるヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。好ましくは、前記ヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。
【００４０】
第２の態様の本発明によって提供されるベクターにおいて、前記ヌクレアーゼは、好ましくはＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＦｏｋｌ−ｄＣａｓ９であり、より好ましくはＴＡＬＥＮである。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＦｏｋｌ−ｄＣａｓ９はホモダイマー型であってもよく、ヘテロダイマー型であってもよい。前記ヌクレアーゼは、好ましくはホモダイマー型のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＦｏｋｌ−ｄＣａｓ９であり、より好ましくはホモダイマー型のＴＡＬＥＮである。
【００４１】
上述したヌクレアーゼにはそれらの変異体も含まれる。このような変異体は、前記ヌクレアーゼの活性を示す限り、どのようなものであってもよい。このような変異体には、たとえば、前記ヌクレアーゼのアミノ酸配列において、数個、たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むヌクレアーゼが挙げられる。
【００４２】
本発明によって提供されるベクターに含まれる所望の核酸は、たとえば、１０〜１００００塩基長からなるものであってよく、数キロ塩基長からなるものであってもよい。所望の核酸は、遺伝子をコードする核酸を含んでもよい。コードされる遺伝子は任意の遺伝子とすることができ、たとえば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの化学発光基質を変換する酵素をコードする遺伝子が挙げられる。所望の核酸は、光シグナルによって発現を検出することができる遺伝子をコードする核酸を含んでもよい。この場合、ベクター導入後の細胞における光シグナルの有無を検出することによって、挿入の成否を簡便に確認することができ、所望の核酸が挿入された細胞を取得する効率および頻度が向上する。光シグナルによって発現を検出することができる遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒト化ウミシイタケ緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、黄緑色蛍光タンパク質（ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ）、増強青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、増強シアン蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰまたはＤｓＲｅｄ）などの蛍光タンパク質をコードする遺伝子；ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００４３】
本発明によって提供されるベクターにおいて、第１のヌクレオチド配列からなる領域と前記の所望の核酸は、好ましくは、直接的に隣接している。また、前記の所望の核酸と第２のヌクレオチド配列からなる領域は、好ましくは、直接的に隣接している。また、前記所望の核酸が遺伝子などの機能的因子を含む場合には、当該ベクターに含まれる第１のヌクレオチド配列、および第２のヌクレオチド配列は、当該機能的因子の一部をコードするものであってもよい。
【００４４】
本発明によって提供されるベクターは、環状のベクターであってもよく、直鎖状のベクターであってもよい。好ましくは、本発明によって提供されるベクターは環状ベクターである。本発明のベクターとしては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクターなどが挙げられる。人工染色体ベクターとしては、酵母人工染色体ベクター（ＹＡＣ）、細菌人工染色体ベクター（ＢＡＣ）、Ｐ１人工染色体ベクター（ＰＡＣ）、マウス人工染色体ベクター（ＭＡＣ）、ヒト人工染色体ベクター（ＨＡＣ）が挙げられる。また、ベクターの成分としては、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、ＧＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡなどの核酸アナログなどが挙げられる。ベクターは、糖類などの核酸以外の成分によって修飾されていてもよい。
【００４５】
第７の態様において、本発明は、細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入するためのキットを提供する。第７の態様の本発明のキットは、第１の態様〜第６の態様のいずれか１つの本発明のベクターを含む。また、第７の態様の本発明のキットは、ヌクレアーゼを発現させるためのベクターを含む。ヌクレアーゼを発現させるためのベクターとしては、たとえば、第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼを発現させるためのベクターが挙げられる。前記ヌクレアーゼを発現させるためのベクターにおいて、ベクターとしては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクターなどが挙げられる。前記ヌクレアーゼを発現させるためのベクターとしては、たとえば、第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第１のＤＮＡ切断ドメインを含む第１のヌクレアーゼサブユニットをコードする遺伝子を含む第１のベクター、ならびに第２のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ切断ドメインを含む第２のヌクレアーゼサブユニットをコードする遺伝子を含む第２のベクターからなるベクターセットが挙げられる。あるいは、前記第１のヌクレアーゼサブユニットをコードする遺伝子と前記第２のヌクレアーゼサブユニットをコードする遺伝子の両方を含むベクターが挙げられる。前記第１のベクターと前記第２のベクターは、別異の核酸断片中に存在してもよく、同一の核酸断片中に存在してもよい。第１のヌクレオチド配列からなる領域の周辺を切断するためのヌクレアーゼと、第２のヌクレオチド配列からなる領域の周辺を切断するためのヌクレアーゼに、別異のものが用いられる場合には、第７の態様の本発明のキットは、前述の第１のベクターおよび第２のベクターからなるベクターセットを、複数含む。ヌクレアーゼとして、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるヌクレアーゼを用いる場合には、第７の態様の本発明のキットは、第１の態様の本発明のベクターにおける第１のヌクレオチド配列からなる領域の近辺を切断するｇＲＮＡおよびヌクレアーゼを発現させるためのベクター、第１の態様の本発明のベクターにおける第２のヌクレオチド配列からなる領域の近辺を切断するｇＲＮＡおよびヌクレアーゼを発現させるためのベクター、および細胞に含まれる核酸における所定の部位を切断するためのｇＲＮＡおよびヌクレアーゼを発現させるためのベクターを含んでもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるヌクレアーゼを発現するためのベクターは、１ヶ所の切断につき、ｇＲＮＡを発現するためのベクター、およびＣａｓ９を発現するためのベクターを含んでもよい。上述したｇＲＮＡおよびＣａｓ９を発現させるためのベクターは、ｇＲＮＡをコードする遺伝子とＣａｓ９をコードする遺伝子の両方を含むベクターであってもよい。あるいは、ｇＲＮＡをコードする遺伝子を含むベクター、およびＣａｓ９をコードする遺伝子を含むベクターからなるベクターセットであってもよい。異なる機能を有する複数のベクターは、同一の核酸断片上に存在してもよいし、異なる核酸断片上に存在してもよい。
【００４６】
第８の態様において、本発明は、細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入する方法を提供する。第８の態様の本発明の方法は、第１の態様〜第６の態様のいずれか１つの本発明のベクター、ならびにヌクレアーゼを発現させるためのベクターを、細胞に導入する工程を含む。ヌクレアーゼを発現させるためのベクターとしては、たとえば、上述のような、第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼを発現させるためのベクターが挙げられる。あるいは、第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第１のＤＮＡ切断ドメインを含む第１のヌクレアーゼサブユニットをコードする遺伝子を含む第１のベクター、ならびに第２のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ切断ドメインを含む第２のヌクレアーゼサブユニットをコードする遺伝子を含む第２のベクターからなるベクターセットが挙げられる。細胞への導入は、これらのベクターを、生体外で培養された細胞に接触させて行ってもよく、これらのベクターを生体に投与して、生体内に存在する細胞に間接的に接触させて行ってもよい。これらのベクターは、同時に、あるいは別々に、細胞へ導入することができる。これらのベクターを別々に細胞へ導入する場合、例えば、予めヌクレアーゼを発現させるためのベクターを細胞に導入して、当該ヌクレアーゼの安定発現株または誘導型発現株を作製し、次いで、作製した安定発現株または誘導型発現株に、第１の態様〜第６の態様のいずれか１つの本発明のベクターを導入してもよい。上述した細胞への導入工程を行うと、細胞内において、前記の第１のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼなどのヌクレアーゼが機能して、前記ベクターから、５’末端から３’末端の方向に、順に、第１のヌクレオチド配列からなる領域、挿入を目的とする所望の核酸、および第２のヌクレオチド配列からなる領域を含む核酸断片が生じる。また、前記工程によって、細胞内の核酸における所定の部位において切断が生じる。その後、細胞内において、前記細胞内の核酸における第１のヌクレオチド配列と前記ベクターにおける第１のヌクレオチド配列がマイクロホモロジー媒介性結合（ＭＭＥＪ）によって連結され、前記細胞内の核酸における第２のヌクレオチド配列と前記ベクターにおける第２のヌクレオチド配列がＭＭＥＪによって連結される。これにより、所望の核酸が、細胞の核酸の所定の部位に正確に挿入される。第１の態様の本発明のベクターを用いる場合、組み合わせて用いるヌクレアーゼは、挿入前の細胞内の核酸に含まれる第１のヌクレオチド配列からなる領域、および第２のヌクレオチド配列からなる領域からなる部分に対して特異的な切断を行うが、連結後の核酸は、所望の核酸の挿入により、当該部分を含まなくなっている。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるヌクレアーゼを用いる場合には、連結後、全てのｇＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭ配列、およびそれに隣接する３塩基分の配列を失う。そのため、細胞内に存在するヌクレアーゼによる再度の切断を受けず、安定的に保持され、所望の核酸の挿入は、高頻度で生じる。なお、連結後の核酸が、ＰＡＭ配列またはそれに隣接する塩基を失うような、第１の態様の本発明のベクターとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとの組合せは、両者に含まれる第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、これらのヌクレオチド配列に隣接する配列を参照して、適宜設計することができる。設計の一例を、概略図として、図３に示す。第２の態様の本発明のベクターを用いる場合には、連結後の核酸は、２つのＤＮＡ結合ドメインを隔てるスペーサー領域が連結前に比して短くなっているため、細胞内に存在するヌクレアーゼによる再度の切断を受けず、安定的に保持され、所望の核酸の挿入は、高頻度で生じる。なお、複数のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼの切断活性は、ＤＮＡ結合ドメインによって認識される領域に挟まれるスペーサー領域の長さに依存するものであり、当該ヌクレアーゼは、特定の長さを有するスペーサー領域に対して特異的な切断を行う。連結後の核酸において、２つのＤＮＡ結合ドメインを隔てるスペーサー領域は、好ましくは、１〜２０塩基長、より好ましくは、２〜１５塩基長、さらに好ましくは、３〜１０塩基長のヌクレオチド配列からなる。
【００４７】
本発明において、細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入するためのベクターと、ヌクレアーゼを発現するためのベクターは、同一のベクターであってもよく、別異のベクターであってもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるヌクレアーゼを用いる場合には、細胞に含まれる核酸における所定の部位に所望の核酸を挿入するためのベクター、ヌクレアーゼを発現するためのベクター、およびｇＲＮＡを発現するためのベクターが、同一のベクターであってもよく、別異のベクターであってもよい。
【００４８】
本発明のベクターを用いて所望の核酸を挿入する場合、所望の核酸を含むベクターの一部分が、細胞内の核酸における所定の部位に挿入されてもよい。あるいは、所望の核酸を含むベクター全体が、細胞内の核酸における所定の部位に挿入されてもよい。図１は、ＴＡＬＥＮにより、所望の核酸を含むベクター全体が挿入される場合の概略図を表している。図２は、ＴＡＬＥＮにより、所望の核酸を含むベクターの一部分が挿入される場合の概略図を表している。図３は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより、所望の核酸を含むベクターの一部分が細胞内の核酸における所定の部位に挿入される場合の概略図を表している。また、図４は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより、所望の核酸を含むベクター全体が挿入される場合の概略図を表している。図５は、Ｆｏｋｌ−ｄＣａｓ９により、所望の核酸を含むベクター全体が挿入される場合の概略図を表している。
【００４９】
第９の態様において、本発明は、第８の態様の本発明の方法によって取得された細胞を提供する。第９の態様の本発明の細胞は、第８の態様の方法における導入を行った後、挿入の生じた細胞を選択することによって取得することができる。細胞の選択は、たとえば、挿入することを目的とする核酸が特定のレポータータンパク質をコードする遺伝子を含む場合には、当該レポータータンパク質の発現を検出し、検出された発現の量を指標とした選択を行うことによって、簡便かつ高頻度で行うことができる。
【００５０】
第１０の態様において、本発明は、第９の態様の本発明の細胞を含む生物を提供する。第８の態様の本発明の方法において、ベクターを生体に投与して、生体内に存在する細胞への間接的な接触を行う場合、第１０の態様の本発明の生物が得られる。
【００５１】
第１１の態様において、本発明は、第８の態様の本発明の方法によって取得された細胞を分化させる工程を含む、所望の核酸を含む生物の製造方法を提供する。第８の態様の本発明の方法において、生体外で培養された細胞にベクターを接触させて、所望の核酸を含む細胞を得た後、得られた細胞を分化させることによって、所望の核酸を含む成体生物が製造される。
【００５２】
第１２の態様において、本発明は、第１１の態様の本発明の方法によって製造された生物を提供する。当該製造された生物は、生物内の細胞に含まれる核酸の所定の部位に所望の核酸を含んでおり、当該所望の核酸の機能に応じて、遺伝子、タンパク質、脂質、糖類などの生体物質の機能解析などの各種の用途に用いることができる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。【００５４】
実施例１．  ＴＡＬＥＮを利用したターゲットインテグレーション
本実施例では、ＴＡＬＥＮとドナーベクター（ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクター）を用いて、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）のチロシナーゼ（ｔｙｒ）遺伝子のＥｘｏｎ１に蛍光タンパク質遺伝子の発現力セットを導入（ターゲットインテグレーション）した。【００５５】
１−１．  ＴＡＬＥＮの作製：
ＴＡＬＥＮプラスミドは以下のように作製した。ｐＦＵＳ＿Ｂ６ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型とし、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング（クロンテック）によって作製したベクターと、単一のＤＮＡ結合ドメインを有するプラスミドを混合し、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応によって４つのＤＮＡ結合ドメインを連結した（ＳＴＥＰ１プラスミド）。その後ｐｃＤＮＡ−ＴＡＬ−ＮＣ２ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型としてＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング（クロンテック）によって作製したベクターと、前述のＳＴＥＰ１プラスミドを混合し、２段階目のＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応によってＴＡＬＥＮプラスミドを得た。プラスミドの全長配列を配列表の配列番号１〜２（Ｌｅｆｔ＿ＴＡＬＥＮ）、および配列番号３〜４（Ｒｉｇｈｔ＿ＴＡＬＥＮ）に示す。【００５６】
１−２．  ターゲットインテグレーション用ドナーベクター（ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクター）の作製：
ｔｙｒＴＡＬＥＮ標的配列のスペーサーの前半（第１のヌクレオチド配列）と後半（第２のヌクレオチド配列）を入れ替えた、改変ＴＡＬＥＮ配列を持つプラスミドを作製した（図１）。鋳型プラスミドにはｐＣＳ２＋のＣｌａｌとＸｂａｌサイトにＥＧＦＰを挿入したｐＣＳ２／ＥＧＦＰを使用し、上記の配列を付加するプライマーセット（Ｘｌｔｙｒ−ＣＭＶＥＧＦＰ−Ｆ＋Ｘｌｔｙｒ−ＣＭＶＥＧＦＰ−Ｒ；配列を後述の表１に示す）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行った。次に、ＰＣＲ反応液にＤｐｎｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を加え、鋳型プラスミドを消化した。精製した反応液をセルフライゲーションし、サブクローニングを行った。シーケンス解析で正確な挿入が確認されたクローンからプラスミドを調製し、ドナーベクターとした（配列を、配列表の配列番号５〜６に示す。配列番号５において、９８番目〜８１７番目のヌクレオチド配列は、ＥＧＦＰのＯＲＦ配列を示す。これは、ｐＣＳ２＋のＣｌａｌ／Ｘｂａｌ  ｓｉｔｅに挿入されている。配列番号５において、１１１６番目〜１１６７番目のヌクレオチド配列は、改変ＴＡＬＥＮによる認識配列を示す。）。【００５７】
１−３．  アフリカツメガエルへの微量顕微注入：
実験前日に、ヒト下垂体性性腺刺激ホルモン（あすか製薬）をアフリカツメガエルのオスに１５０ｕｎｉｔ、メスに６００ｕｎｉｔ投与した。翌日、採卵した卵に精子懸濁液を数滴加え人工受精させた。約２０分後に３％システイン溶液を加え、受精卵を脱ゼリーした後、０．１×ＭＭＲ（両生類用リンガー液）で数回洗浄し、５％フィコール／０．３×ＭＭＲに移し替えた。上記１−１および１−２で作製したチロシナーゼＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ  ｍｉｘ（Ｌｅｆｔ、Ｒｉｇｈｔ  ２５０ｐｇ  ｅａｃｈ）とドナーベクター（１００ｐｇ）を受精卵に微量顕微注入法によって共導入した（実験群）。ネガティブコントロールとして、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ  Ｒｉｇｈｔのみ（２５０ｐｇ）とドナーベクター（１００ｐｇ）を共導入した。胚は２０℃で培養し、胞胚期に０．１×ＭＭＲに移し替え、発生を進めた。【００５８】
１−４．  ターゲットインテグレーションの検出：
ＴＡＬＥＮとベクターを共導入した胚（オタマジャクシ期）を蛍光実体顕微鏡下で観察し、ＧＦＰ蛍光の有無を判定した。コントロール群及び実験群の胚から個体ごとにゲノムＤＮＡを抽出し、標的サイトへのドナーベクター導入をＰＣＲによって判定した。ＴＡＬＥＮ標的配列の上流及び下流、ベクター側に設計したプライマーのセットを用いて、ゲノムとベクターの５’側と３’側のつなぎ目をＰＣＲにより増幅した。５’側はｔｙｒ−ｇｅｎｏｍｉｃ−ＦとｐＣＳ２−Ｒ、３’側はｔｙｒ−ｇｅｎｏｍｉｃ−ＲとｐＣＳ２−Ｆのプライマーセットを用いた（配列は、後述の表１に示す）。アガロース電気泳動で確認の後、目的サイズのバンドを切り出して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  ベクターにサブクローニングした。コロニーＰＣＲでインサート配列を増幅し、ダイレクトシークエンスにより解析した。シークエンスはＣＥＱ−８０００（ベックマン・コールター）を用いた。【００５９】
結果：
ドナーベクター導入胚（オタマジャクシ期）における、実験群（ＴＡＬＥＮ  ｍｉｘ  ＋ベクター注入胚）及びネガティブコントロール群（ＴＡＬＥＮ  Ｒ  ＋ベクター注入胚）の表現型を図６Ａ、および図６Ｂに示す。実験群ではｔｙｒ遺伝子が破壊されるため、網膜色素上皮やメラニン保有細胞において色素を欠く（アルビノ）表現型を示し、加えて全身で強いＧＦＰ蛍光を発する個体が多数観察された（図６Ｂ）。ネガティブロントロール群ではアルビノは観察されず、一部においてモザイクなＧＦＰ蛍光を発する個体が観察された（図６Ａ）。実験群、ネガティブコントロール群の表現型の割合を、Ｆｕｌｌ：ＧＦＰ蛍光が全身で見られる個体、Ｈａｌｆ：左右のどちらか半分が蛍光を持つ個体、Ｍｏｓａｉｃ：モザイクな蛍光を持つ個体、Ｎｏｎ：ＧＦＰ蛍光が観察されない個体の４つに分類した（図７）。ネガティブコントロール群ではＦｕｌｌとＨａｌｆの個体が全く見られなかったのに対し、実験群では生存した個体の約２０％がＦｕｌｌの表現型を、約５０％がＨａｌｆの表現型を示した。
次に、図６で観察した、Ｆｕｌｌの表現型を示すオタマジャクシ５個体とネガティブコントロール群の３個体から、それぞれゲノムＤＮＡを抽出しジェノタイピングを行った。ゲノム上の挿入箇所とベクターのつなぎ目を確認するために、ｔｙｒＴＡＬＥＮ標的配列の上流及び下流、ベクター側に設計したプライマーのセットを用いて、標的部位とドナーベクターの５’側と３’側のつなぎ目をＰＣＲにより増幅した（図８）。ＰＣＲ産物を電気泳動したところ、実験群Ｎｏ．１、３、４（５’側）、Ｎｏ．２、３、４（３’側）において、予想サイズのバンドが確認された（図８、矢印）。一方、ネガティブコントロール群ではＰＣＲ産物は確認されなかった。次に、つなぎ目の配列を調べるために、ＮＯ．３、４で検出された、５’側及び３’側のＰＣＲ産物をサブクローニングし、シーケンス解析を行った。その結果、Ｎｏ．３の５’側のつなぎ目はＭＭＥＪで連結された場合に期待される配列が１００％（５／５クローン）の割合で、３’側のつなぎ目は８０％（４／５クローン）の割合で確認された（図９Ａ）。Ｎｏ．４の５’側のつなぎ目は１０塩基欠失または３塩基挿入の配列が、３’側のつなぎ目は期待される配列が１００％（３／３）の割合で確認できた（図９Ｂ）。【００６０】
上記１−１から１−４において用いたプライマーの配列を、以下の表１に示す。
【表１】
0005900942.tif 000002
【００６１】
実施例２．  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用したＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのターゲットインテグレーション
本実施例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフィブリラリン（ＦＢＬ）遺伝子の最後のコーディングエクソンに蛍光タンパク質遺伝子の発現カセットを導入（ターゲットインテグレーション）した。本実施例の概要を図１０に示す。簡潔に言うと、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、図１０においてオレンジ色、赤色および緑色で示される３種類のｇＲＮＡおよびＣａｓ９を発現するベクターと、ドナーベクター（ＣＲＩＳ−ＰＩＴＣｈベクター）とを共導入し、ピューロマイシンによるセレクション後、ＤＮＡシーケンシングおよび蛍光観察を行った。【００６２】
２−１．  ｇＲＮＡおよびＣａｓ９発現ベクターの作製：
３種類のｇＲＮＡおよびＣａｓ９を同時に発現するベクターを、ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＲＥＰＯＲＴＳ  ２０１４  Ｊｕｎ  ２３；４：５４００．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｓｒｅｐ０５４００に記載されている通りに作製した。簡潔に言うと、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応によって複数のｇＲＮＡ発現カセットを連結できるようｐＸ３３０  ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ；  Ｐｌａｓｍｉｄ  ４２２３０）を改変し、改変型のｐＸ３３０  ベクター３種類に、アニーリングした合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ挿入した。具体的には、オリゴヌクレオチド１３と１４をアニーリングさせて、ゲノム切断用ｇＲＮＡ（図１０のオレンジ色）の生成のための合成オリゴヌクレオチドを作製した。また、オリゴヌクレオチド１５と１６をアニーリングさせて、ドナーベクターの５’側の切断用ｇＲＮＡ（図１０の赤色）の生成のための合成オリゴヌクレオチドを作製した。さらに、オリゴヌクレオチド１７と１８をアニーリングさせて、ドナーベクターの３’側の切断用ｇＲＮＡ（図１０の緑色）の生成のための合成オリゴヌクレオチドを作製した。各プラスミドに作製した各合成オリゴヌクレオチドを挿入した後、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応によってベクターを統合して、３種類のｇＲＮＡおよびＣａｓ９を同時に発現するベクターを得た。【００６３】
２−２．  ターゲットインテグレーション用ドナーベクター（ＣＲＩＳ−ＰＩＴＣｈベクター）の作製：
ＣＲＩＳ−ＰＩＴＣｈベクターは以下のように作製した。ｐＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をベースとするベクター上で、ＣＭＶプロモーターを除きつつ、５’側のｇＲＮＡ標的配列、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎコード配列、２Ａペプチドコード配列、ピューロマイシン耐性遺伝子のコード配列、３’側のｇＲＮＡ標的配列という並びになるように、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングを用いてベクターを構築した。図１１Ａおよび図１１Ｂに構築したベクターの全長配列（配列番号２３）を示す。図１１Ａおよび図１１Ｂにおいて、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎのコード配列は緑色（配列番号２３の１５６６番目〜２２７３番目のヌクレオチド）、２Ａペプチドのコード配列は紫色（配列番号２３の２２７４番目〜２３３６番目のヌクレオチド）、ピューロマイシン耐性遺伝子のコード配列は青色（配列番号２３の２３３７番目〜２９３６番目のヌクレオチド）で、それぞれ示される。下線は５’側および３’側のｇＲＮＡ標的配列を示す。【００６４】
２−３．  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への導入：
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への導入は以下のように行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ウシ胎児血清を１０％含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。培養した細胞を、プラスミドを導入する前日に６ウェルプレートへ１ウェル当たり１×１０５細胞の細胞密度で播種した。プラスミドの導入にはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（ライフテクノロジーズ）を用い、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９発現ベクターを４００ｎｇ、ＣＲＩＳ−ＰＩＴＣｈベクターを２００ｎｇ導入した。プラスミドの導入後、細胞を薬剤フリーの培地で３日間培養した後、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含む培地で６日間培養した。その後、限界希釈によって９６ウェルプレート上で単一細胞クローニングを行った。【００６５】
２−４．  ターゲットインテグレーションの検出：
ｇＲＮＡおよびＣａｓ９を発現するベクターと、ＣＲＩＳ−ＰＩＴＣｈベクターとを共導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察し、蛍光の有無を判定した。次に、ピューロマイシン耐性細胞クローンからゲノムＤＮＡを抽出し、標的サイトへのドナーベクター導入を確認した。ＣＲＩＳＰＲ標的配列の上流及び下流、ベクター側に設計したプライマーのセットを用いて、ゲノムとベクターの５’側と３’側のつなぎ目をＰＣＲにより増幅した。５’側はプライマー１９と２０、３’側はプライマー２１と２２のプライマーセットを用いた（配列は、後述の表２に示す）。アガロース電気泳動で確認の後、目的のサイズのバンドを切り出して、ダイレクトシークエンスにより解析した。シークエンスはＡＢＩ  ３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズ）を用いた。【００６６】
結果：
共焦点レーザー顕微鏡での観察結果を図１２に示す。ＦＢＬは核小体に特異的なタンパク質であるため、ＦＢＬ遺伝子への蛍光タンパク質遺伝子のターゲットインテグレーションが成功した場合、蛍光タンパク質は核小体に局在する。図１２に示される通り、ＦＢＬタンパク質の局在パターン（核小体）と一致する蛍光像が得られた。次に、ゲノムと導入されたベクターの５’側と３’側のつなぎ目の配列を調べた。その結果、５’側のつなぎ目はＭＭＥＪで連結された場合に期待される配列が５０％（２／４クローン）の割合で存在し、残り２クローンは９塩基の欠失または挿入を生じるものであった（図１３）。３’側のつなぎ目は、完全に期待通りの配列になったものは０％（０／４クローン）であったが、１塩基の置換のみが確認されたものが１クローン存在し、その他は１塩基の欠失、５塩基の欠失、７塩基の欠失がそれぞれ１クローンずつ確認された（図１３）。なお、同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用して、ＨＣＴ１１６細胞のβ−アクチン（ＡＣＴＢ）遺伝子座に蛍光タンパク質遺伝子の発現カセットを導入（ターゲットインテグレーション）した場合にも、上述したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるターゲットインテグレーションと同様の結果が得られた。【００６７】
上記２−１から２−４において用いたオリゴヌクレオチドの配列を、以下の表２に示す。
【表２】
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［配列表］
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【図３】
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【図１１Ｂ】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１２】
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