(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも表面を有する容器、
前記表面上に支持された凍結接着細胞、
凍結保存培地
を含む凍結保存細胞培養物であって、そして
表面がポリリジンのみでコーティングされていることで特徴付けられ、
細胞はＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、前記細胞培養物。
【請求項２】
前記容器が、器、バイアル、マイクロタイタープレートおよび細胞培養プレートからなる群より選択される、請求項１記載の細胞培養物。
【請求項３】
細胞培養物中の細胞を凍結保存する方法であって：
ａ）接着細胞を含有する培地を容器表面に添加して、前記細胞が前記表面に付着して、そして細胞培養物を形成するのを可能にし、
ｂ）凍結保存培地を添加し、そして
ｃ）前記細胞培養物の温度を−２０℃以下に下げる
工程を含み；
工程ａ）の前に表面をポリリジンのみでコーティングすることによって特徴付けられ、
細胞はＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、前記方法。
【請求項４】
表面をポリリジン溶液で洗浄することによって、表面をコーティングする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
容器が、器、バイアル、マイクロタイタープレートおよび細胞培養プレートからなる群より選択される、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
細胞培養物を−８０℃未満の温度で保存する工程をさらに含む、請求項３〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
細胞アッセイを行うための方法であって：
ａ）接着細胞を含有する培地を容器表面に添加して、前記細胞が前記表面に付着して、そして細胞培養物を形成するのを可能にし、
ｂ）凍結保存培地を添加し
ｃ）前記培地の温度を下げて、前記細胞培養物を凍結させ、
ｄ）−２０℃未満の温度で細胞培養物を保存し、
ｅ）細胞培養物の温度を上げることによって、前記細胞を融解し、
ｆ）細胞に対して細胞アッセイを行う
工程を含み；
工程ａ）の前に前記容器表面をポリリジンのみでコーティングすることによって特徴付けられ、
細胞はＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞であり、
細胞アッセイは、化合物の作用によって誘発される細胞プロセスを調べるための方法または試験、および細胞アウトプットを測定する手段である、前記方法。
【請求項８】
細胞培養物を−８０℃未満の温度で保存する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
容器が、器、バイアル、マイクロタイタープレートおよび細胞培養プレートからなる群より選択される、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
工程ａ）の細胞が１以上のマイクロキャリアーに付着している、請求項７〜９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
前記の１以上のマイクロキャリアーがポリリジンでコーティングされている、請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞アッセイまたは細胞に基づくアッセイに、そして特にこうしたアッセイで使用するための低温保存細胞の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、当該技術分野で実施されている薬剤発見は、長く多段階のプロセスである。まず、このプロセスには、特異的疾患ターゲットの同定、特異的ターゲットに基づくアッセイの開発、アッセイの検証、最適化、そして次いでスクリーンを産生するためのアッセイの自動化が伴う。次いで、アッセイを用いた化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を実行して、潜在的な薬剤としての見込みを示す候補化合物を同定してもよく；次いでこれらの化合物を検証し、そして化学的に最適化する。このプロセスのアウトプットは、前臨床試験に、そして検証されたならば、最終的に臨床試験に入る、リード化合物である。このプロセスにおいて、スクリーニング期はアッセイ開発期とは別個であり、そして生存している生物学的系における化合物有効性の試験を伴う。
【０００３】
歴史的に、薬剤発見は、何年にも渡り、そして生成される薬剤あたり数億ドルを費やす、緩慢で、そしてコストが掛かるプロセスである。ゲノミクスおよびＨＴＳの分野における開発は、ターゲット同定および化合物スクリーニングの分野における能力および効率の増加を生じてきた。
【０００４】
ＨＴＳ技術の適用によって、薬剤発見プロセスにおいて現在遭遇する障害に取り組み、そしてこれを軽減する潜在能力が提供される。ＨＴＳプロセスでは、生物学的系における可能な効果に関して、そして特定のターゲットに対する、選択したリード化合物の特異性に関して、薬剤候補をスクリーニングする。１００，０００試験／日を超えるスループットレベルを可能にしうる、９６、３８４、１５３６またはそれより多い小型化ウェルを持つマイクロタイターウェルプレート形式を利用した、ＨＴＳアッセイプロセスの開発、およびアッセイ小型化によって、一次スクリーニングに取り組む。
【０００５】
反応産物を基質から分離することを必要としない検出系を適用することによって、元来は、ほとんどが酵素である精製タンパク質の生化学的活性を測定するために開発された、多くのタイプの細胞不含アッセイを、ＨＴＳに容易に変換可能である。例えば、蛍光に基づく技術によって、分離、分画または精製法の必要を伴わずに、酵素活性ならびに分子相互作用の検出が可能になる（Ｈｅｒｔｚｂａｍｅｒｇ  Ｒ  ＰおよびＰｏｐｅ  ＡＪ．  Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：  ｎｅｗ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ２１ｓｔ  ｃｅｎｔｕｒｙ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ４，  ｐｐ４４５−４５１，  ２０００）。これらの自動化アッセイによって、いわゆる「ヒット」、すなわち、単離ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において、特異的ターゲットの生化学的活性に対して望ましい効果を示す化合物を同定する、巨大な化合物ライブラリーの迅速なスクリーンが可能になる。次いで、ヒットを化学修飾およびＨＴＳ系を通じたさらなるスクリーニングに供して、「リード」化合物と呼ばれる、より特異的でそして強力な誘導体を選択する。古典的な薬剤発見プロセスにおいて、リード化合物は、続いて、臨床試験のための薬剤候補となりうるものを選択するため、細胞および動物モデルを用いた、多様なｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、試験される。
【０００６】
最近数年の間に、操作された細胞および微生物を用いた細胞に基づくアッセイは、薬剤発見プロセスの初期におけるＨＴＳのため、ますます、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学的アッセイに対する魅力的な代替法となりつつある。こうしたアッセイに関して必要なのは、定義されたターゲットによって誘発される特異的細胞プロセスを調べる能力、およびＨＴＳ系においてアウトプットを容易に測定する手段である。細胞および微生物を遺伝子修飾するバイオテクノロジー的ツールがますます多く利用可能になることによって、ＨＴＳにおける自動化系に容易に適用可能な、細胞プロセスに関する単純な読み取りアッセイの開発が可能になってきた。
【０００７】
細胞に基づくアッセイには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの伝統的な生化学アッセイに勝る、顕著な利点がある。まず、これらの細胞アッセイは、ターゲットタンパク質の精製を必要とせず、そしてしたがって、生化学的に活性であるターゲットを得るために必要な知識を得る資源の投資を除去する−天然基質が広く未知のままである何百もの新規タンパク質に関する特異的な生化学アッセイをセットアップするのが実際に困難であるため、潜在的な薬剤治療のためにターゲティングされうるタンパク質の数が増加するとともに、この利点が特に重要になってきている。第二に、ターゲットタンパク質のコンホメーションおよび活性、ならびに化合物の効果を監視する読み取りが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイよりも天然生理学的状態により近い状態に相当する可能性が最も高い細胞背景において調べられる。第三に、細胞に基づくアッセイは、一般的に細胞傷害性であるか、または細胞膜に浸透して細胞内ターゲットに到達することが不可能な化合物に対して直ちに選択可能である。したがって、細胞に基づくアッセイを通じて同定されたヒットおよびリード化合物は、重要な検証工程を通過してきている。この情報が入手可能であることから、多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに比較して有利なスタートが提供され、そして薬剤開発において、貴重な時間およびコストが節約可能となる。
【０００８】
しかし、薬剤発見のための、特にＨＴＳのための細胞使用における最近の発展は、細胞提供者および使用者にいくつかの困難を課している；すなわちバッチごとの性能の相違、細胞産生スケジュール決定、ならびに能力および容量管理である。
【０００９】
細胞株は、通常、週２回継代培養され、そして各アッセイのためにスケールアップされる。この継代培養およびスケールアップは、通常、数ヶ月の期間に渡る周期で反復される。大規模な単一バッチで増殖させ、そしてフリーザー中で保存した凍結保存細胞を使用すると、大きな利点が提供される：（ａ）細胞に基づくアッセイの結果の一貫性が改善される−凍結されたら、同じ細胞バッチを長期間に渡って使用可能である、（ｂ）柔軟性が増加する−試験する化合物が届いたらいつでも新規アッセイを開始可能である、そして（ｃ）コストが減少する−薬剤スクリーニング活動と平行して、培養中の細胞株を維持するために費やされる時間が節約される。その結果、細胞培養試薬、廃棄物および細胞培養施設の使用が減少する。
【００１０】
凍結保存はそれ自体、一般的に、化合物の薬理に影響を持たず、そして多くの細胞種およびアッセイに適用可能である（Ｇｕｉｄｏ  Ｊ．Ｒ．  Ｚａｍａｎら  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ．  Ｖｏｌｕｍｅ  １２，  Ｎｕｍｂｅｒｓ  １３／１４，  Ｊｕｌｙ  ２００７）。例えば、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）トランス活性化アッセイで使用するため、凍結保存され、一過性にトランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞を、新鮮にトランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞に比較した。アッセイ性能はどちらの細胞調製に関しても類似であった；しかし、凍結保存細胞は、より少ないアッセイ間変動を示した。異なるＰＸＲ活性化強度および有効性の薬剤で検証すると、凍結保存細胞および新鮮細胞間で、優れた相関（ｒ２＞０．９５）が示された。凍結保存は、細胞浸透性が劣った、既知のＣＹＰ３Ａ４誘導因子の効果を変化させず、このことから凍結保存が膜浸透性にほとんど影響を及ぼさないことが示された。さらに、凍結保存ＨｅｐＧ２細胞は、一過性にトランスフェクションされた対照細胞に比較して、細胞傷害性化合物に対する感受性増進を示さなかった。凍結保存細胞を使用すると、このアッセイの効率を増進させて実行することが可能になる（Ｚｈｕ，  Ｚ．ら  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｒｅｇｎａｎｅ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．  １２，  ２４８−２５４，  ２００７）。該文献に記載される実施例には、薬剤スクリーニングに広く用いられる細胞種、例えばＣＨＯおよびＨＥＫ２９３、ならびに読み取り、例えばベータ−ラクタマーゼおよびＦＬＩＰＲが含まれる。
【００１１】
ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（スウェーデン・モルンダル）のＬｏｕｉｓｅ  Ｓｔｊｅｒｎｂｏｒｇおよび同僚らは、ルビジウム流出アッセイを用いてヒトＥＲＧ（ｈＥＲＧ）チャネルに対する化合物の副作用をスクリーニングするための凍結細胞の使用を記載する。彼らの機関では、ｈＥＲＧチャネルスクリーニングは毎日ではなく、十分な化合物が集まってから、毎月行われる。凍結細胞を使用した結果、細胞培養維持に費やされる時間が有意に節約される（Ｄｉｎｇ，  Ｍ．ら  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｈＥＲＧ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｒｂ＋  ｅｆｆｌｕｘ  ａｓｓａｙ．  Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ４，  ８３−８８，  ２００６）。
【００１２】
したがって、薬剤発見において凍結保存細胞を使用すると３つの利点がある。まず、新規アッセイをいつでも開始可能であるため、柔軟性が増加する。第二に、特定のアッセイにおける特定の化合物に関するすべての試験結果を同じバッチの細胞で生じることが可能であるため、データ品質が改善される。第三に、凍結細胞で作業すると、細胞培養作業、特に細胞株の維持に費やされる時間が実質的に減少し、そしてその結果、細胞培養施設、材料および廃棄物の使用が減少する。
【００１３】
ポリリジンは、非特異的な細胞付着因子として用いられ、そして合成培養表面；ガラススライド電子顕微鏡グリッドなどの固体支持体への特定の細胞種の接着を促進するのにルーチンに用いられる（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，  Ｂ．ら  Ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ：  ｒａｐｉｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｂｅａｄｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９５：  ３０２−３０４，１９７７）。ポリリジンは、一般的に、通常は固体表面に接着しない細胞に用いられる（Ｍａｚｉａら  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｃｏａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ．  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ  ６６，  １９８−２００，  １９７５）。これは単に、固体表面（プラスチック、ガラス等）を陽イオン性ポリリジンの溶液でコーティングすることによって達成される。ポリリジン部分は、プラスチックおよびガラス表面中に存在する負荷電分子と静電相互作用を形成する。
【００１４】
しかし、ポリリジンはまた、伝統的な生存細胞に基づく分析から免疫組織化学に渡る技術において、多くの他の非哺乳動物細胞および組織の接着を増加させるのにも用いられる。哺乳動物／非哺乳動物細胞の付着を促進するためのポリリジンの使用の多くの例が科学的文献中に存在する。ポリリジンは、哺乳動物、昆虫、両生類、魚類、爬虫類および鳥類科を含む主要な生物学的種すべてに由来する細胞を付着させるのに用いられる。さらに、細菌、線虫および腹足類というほど広い種に由来する細胞を含む例が提供される。
【００１５】
ポリリジン上でルーチンに培養される細胞株のいくつかの例には−ＨＥＫ２９３ヒト肺性腎細胞（Ｓｕｇａｗａｒａ，  Ｔ．ら  Ａ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａ＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｌｐｈａ  ＩＩ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇｅｎｅ  Ｎａ（ｖ）１．２  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｆｅｂｒｉｌｅ  ａｎｄ  ａｆｅｂｒｉｌｅ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ  ｃａｕｓｅｓ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９８（１１），  ６３８４−９，  ２００１）、ＭＤＡ−２３１、乳癌細胞株（Ｙｏｎｅｄａ，  Ｔ．ら  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９９（１０），  ２５０９−１７，  １９９７）、下垂体前葉細胞（Ｈｉｎｕｍａ，  Ｓら  Ａ  ｐｒｏｌａｃｔｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９３（６６８２），  ２７２−６，  １９９８）、ミクログリアＭＧ−７細胞（Ｓｚｃｚｅｐａｎｉｋ，  ＡＭ．ら  Ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｐ３  ａｎｄ  ｐ４  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ７７（１），  ３０４−１７，  ２００１）、およびラット初代星状膠細胞（Ｌｉｔｔｌｅ，  ＥＢ．ら  Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  （Ｎ−ＣＡＭ）  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｎ−ＣＡＭ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  ９８（５），  ２２３８−４３，  ２００１）が含まれる。
【００１６】
ＧＢ２４２７４１１Ａは、アルギン酸塩／多糖ミクロカプセル／ヒドロゲルを用いた、組織由来の細胞のための凍結保存法に関する。ポリリジンは、多糖への細胞付着を促進するために用いられる。この文書には、アッセイ性能の改善のためにポリリジンを使用する記述はない。
【００１７】
米国特許第６６５７００３号は、長期安定性および細胞接着特性を示すコーティング物質のための溶液を開示する。より詳細には、該文献は、細胞学的標本スライドに適用するための架橋されたアミノ酸ポリマーを含む溶液に言及する。本発明で使用するようなアミノ酸ポリマーは、中性または塩基性アミノ酸より選択され、例えばポリｌ−リジンまたはポリｌ−アルギニンである。
【００１８】
ＷＯ  ２００５／０３４６２５は、細胞接着耐性（ＣＡＲ）物質が結合した支持体であって、そして該ＣＡＲ物質に、コラーゲンＶＩまたはその生物学的活性断片または変異体、および場合によって、１以上の他のＥＣＭタンパク質、またはその生物学的断片または変異体、ならびに／あるいは１以上のポリカチオン性ポリマーが結合した、前記支持体を含む表面（例えば細胞培養表面）に関する。
【００１９】
米国特許第５５１２４７４号は、細胞生物学分野におけるバイオリアクターの細胞培養表面を記載し、そして特に、表面を改善して、より優れた細胞付着および細胞増殖を得る方法を記載する。マイクロキャリアーの形で支持体物質を含み、そして細胞付着のための支持表面を含む、細胞培養支持体を開示し、該表面は：正荷電分子およびアクリルアミドまたはメタクリルアミドから重合したアクリルを含む組み合わせを所持する。
【００２０】
米国特許第５９３２４７３号は、塩溶液中、細胞接着プロモーターを含有する組成物でコーティングされた細胞培養支持体を記載する。プラスチック、ガラスまたは微小孔性ファイバーなどの支持体が、０．００５Ｍ〜約０．５Ｍクエン酸または硫酸塩溶液中、約５μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌのポリＤ−リジンを含有する組成物でコーティングされて、支持体１ｃｍ２あたり、約５０μｌ〜約５００μｌの組成物が提供される。
【００２１】
Ｍａ，  Ｍら，  ２００６（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔ．，  ４０３，  ８４−８９）は、接着性哺乳動物ニューロンネットワークの凍結保存を記載した。解離脊髄細胞が、２つの接着因子ポリＤ−リジンおよびラミニンでコーティングされている３５ｍｍペトリ皿に付着された。次いで、ネットワークはコラーゲン中に包埋され、そしてＤＭＳＯ、ＦＢＳおよび培地を含有する凍結培地に移される前に、凍結保護剤であるトレハロースとともに装填された。ネットワークは−１９６℃の液体窒素中に、最長２ヶ月間保存された。凍結保存後のネットワークの特徴付けは；蛍光プローブを用いた細胞生存度の決定（生存／細胞傷害性キット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、免疫細胞化学によるニューロンマーカーの発現、および蛍光プローブＦＭ１−４３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いたシナプス小胞リサイクリングの解明を伴った。
【００２２】
Ｓｏｎ，  Ｊ．Ｈ．ら，  ２００４（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２６，  ８２９−８３３）は、ラット肝細胞の凍結保存を容易にするための、１型コラーゲンをコーティングした６ウェルプレート、ならびにＤＭＳＯ、ウシ胎児血清および培地を含有する凍結混合物の使用を記載した。細胞は、−７０℃で短期間（２４時間）しか凍結保存されなかった。凍結保存後の肝細胞の特徴付けは、単純な分光測定ＭＴＴアッセイを用いた細胞生存度、およびＥＬＩＳＡに基づく系を用いたアルブミン分泌の決定を伴った。
【００２３】
Ｓｈｏｊｉ  Ｒ．ら，  ２０００（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３２，  １４７−１５５）は、１型コラーゲン、プロネクチンＦまたはフィブロネクチンのいずれかでコーティングされた９６ウェルプレートを用いた、ヒト肝細胞腫細胞の凍結保存を記載した。細胞付着を促進するために、これらの試薬が用いられた。１０％ＤＭＳＯを補充した肝細胞培地を用いて、−８５℃で凍結保存が達成された。これらの条件は、〜７日間、細胞を最適な状態に維持した。凍結保存後の肝細胞の特徴付けは、わずか７日間しか保存されていない細胞に限定され、そしてこれは、酸ホスファターゼ活性の測定による細胞生存度の決定およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性試験（毒性試薬への曝露に反応した生存／死亡用量反応曲線）を伴った。
【００２４】
技術的な問題
製薬産業内には、低温保存に使用することも、そして続いてスクリーニング目的に使用することもどちらも可能な容器中で細胞を凍結保存する必要がある；したがって、容器はゼロ未満の温度で保存され、そして単にフリーザーから取り出して、細胞が融解し、そしてＨＴＳで直接用いられるのを可能にするであろう。現在、細胞は、一般的に、バイアル（例えばクライオバイアル）中で凍結保存され、そしてこれらのバイアル中、低温で、試験のために必要とされるまで保存される；次いで、細胞は次第に再構成され／融解され、緩衝液で洗浄され、そしてＨＴＳでの試験／アッセイの準備が出来た形で、培養ディッシュまたはマイクロウェルプレートに移される。現時点では、細胞は、融解の際の死亡率が高いことおよびアッセイ反応における変動が大きいことの両方のために、培養ディッシュまたはマイクロウェルプレート中で凍結保存されることが不可能である。後者は、こうしたアッセイで得られるＺ因子が低いことから明らかである。同じ容器または器の中で、細胞を凍結保存し、そして再構成された細胞に対してアッセイを行うことが可能であれば、製薬産業にとって役に立つ技術が提供されるであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】ＧＢ２４２７４１１Ａ
【特許文献２】米国特許第６６５７００３号
【特許文献３】ＷＯ  ２００５／０３４６２５
【特許文献４】米国特許第５５１２４７４号
【特許文献５】米国特許第５９３２４７３号
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Ｈｅｒｔｚｂａｍｅｒｇ  Ｒ  ＰおよびＰｏｐｅ  ＡＪ．  Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：  ｎｅｗ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ２１ｓｔ  ｃｅｎｔｕｒｙ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ４，  ｐｐ４４５−４５１，  ２０００
【非特許文献２】Ｇｕｉｄｏ  Ｊ．Ｒ．  Ｚａｍａｎら  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ．  Ｖｏｌｕｍｅ  １２，  Ｎｕｍｂｅｒｓ  １３／１４，  Ｊｕｌｙ  ２００７
【非特許文献３】Ｚｈｕ，  Ｚ．ら  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｒｅｇｎａｎｅ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．  １２，  ２４８−２５４，  ２００７
【非特許文献４】Ｄｉｎｇ，  Ｍ．ら  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｈＥＲＧ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｒｂ＋  ｅｆｆｌｕｘ  ａｓｓａｙ．  Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ４，  ８３−８８，  ２００６
【非特許文献５】Ｊａｃｏｂｓｏｎ，  Ｂ．ら  Ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ：  ｒａｐｉｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｂｅａｄｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９５：  ３０２−３０４，１９７７
【非特許文献６】Ｍａｚｉａら  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｃｏａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ．  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ  ６６，  １９８−２００，  １９７５
【非特許文献７】Ｓｕｇａｗａｒａ，  Ｔ．ら  Ａ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａ＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｌｐｈａ  ＩＩ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇｅｎｅ  Ｎａ（ｖ）１．２  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｆｅｂｒｉｌｅ  ａｎｄ  ａｆｅｂｒｉｌｅ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ  ｃａｕｓｅｓ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９８（１１），  ６３８４−９，  ２００１
【非特許文献８】Ｙｏｎｅｄａ，  Ｔ．ら  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９９（１０），  ２５０９−１７，  １９９７
【非特許文献９】Ｈｉｎｕｍａ，  Ｓら  Ａ  ｐｒｏｌａｃｔｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９３（６６８２），  ２７２−６，  １９９８
【非特許文献１０】Ｓｚｃｚｅｐａｎｉｋ，  ＡＭ．ら  Ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｐ３  ａｎｄ  ｐ４  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ７７（１），  ３０４−１７，  ２００１
【非特許文献１１】Ｌｉｔｔｌｅ，  ＥＢ．ら  Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  （Ｎ−ＣＡＭ）  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｎ−ＣＡＭ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  ９８（５），  ２２３８−４３，  ２００１
【非特許文献１２】Ｍａ，  Ｍら，  ２００６（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔ．，  ４０３，  ８４−８９）
【非特許文献１３】Ｓｏｎ，  Ｊ．Ｈ．ら，  ２００４（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２６，  ８２９−８３３）
【非特許文献１４】Ｓｈｏｊｉ  Ｒ．ら，  ２０００（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３２，  １４７−１５５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
したがって、バイアル／クライオバイアルから培養ディッシュ／マイクロウェルプレートに移すプロセスにおける１以上の工程を除去し、したがって、方法を単純化してコストおよび時間を減少させることによって、ワークフローを改善することが必要である。さらに、培養ディッシュまたはマイクロウェルプレート中で凍結保存された細胞の生存度および／または細胞のアッセイ性能を改善する必要がある。
【００２８】
本発明は、上記の問題に取り組み、そして凍結保存された細胞培養、および該細胞を産生するための方法であって、単一容器中で凍結保存および再構成された細胞のアッセイを可能にする、前記方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明の第一の側面にしたがって：少なくとも表面を有する容器、該表面上に支持された凍結細胞を含み、表面がポリリジンでコーティングされている、凍結保存細胞培養を提供する。
【００３０】
ポリリジンは、表面への特定の細胞種の付着を促進することが知られるが、また驚くべきことに、細胞付着とは独立のプロセスによって、アッセイ性能を改善する（長期凍結保存後でさえ）ことが見出されてきている。
【００３１】
ポリリジンは、細胞培養処理表面への哺乳動物細胞の接着を増加させる分子としてルーチンに用いられる。これは、単に、陽イオン性ポリリジンの溶液で固体支持体（プラスチック、ガラス等）をコーティングすることによって達成される。ポリリジン部分は、プラスチックおよび／またはガラス表面中に存在する負荷電分子と静電気引力を形成可能である。
【００３２】
ポリリジンは、多くの供給業者より入手可能である（例えばＳｉｇｍａ、Ｐ７４０５、＞３００ｋまたはＰ６４０７、７０〜１５０ｋ）。ポリリジンは、細胞膜の負荷電イオンおよび培養表面間の静電相互作用を増進させる。培養表面上に吸着された際、ポリリジンは、細胞結合に利用可能な正荷電部位の数を増加させる。ポリＤ−リジンおよびポリＬ−リジン両方のポリマー、ならびにその混合物を用いて、固体表面をコーティングしてもよい。しかし、特定の細胞は、タンパク質分解的にポリＬ−リジンを分解することが可能であり、この場合、一般的にポリＤ−リジンを用いて、過剰な分解および最終的なＬ−リジン取り込みを防止する。
【００３３】
より低分子量のポリリジン（Ｍｒ＝３０，０００〜７０，０００ｋＤ）は、溶液中でより粘性が低いため使用しやすいが、より高分子量の＞３００，０００ｋＤのものは、分子あたり、より優れた細胞付着を提供する。細胞生物学において一般的に使用するためのポリリジンの分子量は、典型的には、７０，０００〜１５０，０００ｋＤの範囲である。
【００３４】
本発明の別の側面において、細胞培養容器は、器、バイアル、マイクロタイタープレートおよび細胞培養プレートからなる群より選択される。
本発明の別の側面において、細胞培養表面上で凍結される細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および鳥類細胞からなる群より選択される。好ましくは細胞は哺乳動物細胞である。より好ましくは、細胞は、ＣＨＯ細胞（供給源：ＥＣＡＣＣ−８５０５０３０２）、ＨＥＫ２９３細胞（供給源：ＡＴＣＣ−ＣＲＬ１５７３）およびＡＤ２９３細胞（供給源：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｒ７０５−０７）からなる群より選択される。
【００３５】
本発明の第二の側面にしたがって、細胞培養中の細胞を凍結保存する方法であって：
ａ）細胞を含有する培地を容器表面に添加して、該細胞が該表面に付着して、そして細胞培養を形成するのを可能にし、
ｂ）凍結保存培地を添加し、そして
ｃ）該細胞培養の温度を−２０℃以下に下げる
工程を含み；
工程ａ）の前に表面をポリリジンでコーティングする、前記方法を提供する。
【００３６】
ポリリジンは、プラスチックおよびガラス表面への細胞付着を増進させるコーティングとして用いられる分子である。ポリリジンは、ニューロン、グリア細胞およびトランスフェクション細胞を含む、非常に多様な細胞種を培養するのに用いられてきている。ポリＤリジンは、一般的に、多様なニューロンおよびトランスフェクション細胞株の接着、増殖、および分化を促進する培養基質として用いられている。ポリＤ、ポリＬリジン両方およびその混合物を用いて、固体表面をコーティングしてもよく、そしてこれらは、細胞の非特異的付着因子として伝統的に機能する。ポリリジンの既知の機能の１つは、細胞膜と会合する負荷電イオンおよび細胞培養表面間の静電相互作用を増進させることである。培養表面上に吸収された際、ポリリジンは、細胞結合に利用可能な正荷電部位の数を増加させる。
【００３７】
本発明の別の側面において、細胞培養容器は、器、バイアル、マイクロタイタープレートおよび細胞培養プレートからなる群より選択される。
本発明のさらに別の側面において、細胞培養系の表面上で凍結される細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および鳥類細胞からなる群より選択される。好ましくは細胞は哺乳動物細胞である。より好ましくは、細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびＡＤ２９３細胞からなる群より選択される。
【００３８】
本発明の別の側面において、細胞を−８０℃未満の温度で保存した。より好ましくは、細胞培養プレートを−８０℃で１６時間凍結し、その後、より長い保存のため−１４０℃に移した。
【００３９】
本発明の第三の側面において、細胞アッセイを行うための方法であって：ａ）細胞を含有する培地を容器表面に添加して、該細胞が該表面に付着して、そして細胞培養を形成するのを可能にし；ｂ）凍結保存培地を添加し；ｃ）該細胞培養の温度を下げて、該細胞を凍結させ；ｄ）−２０℃未満の温度で該細胞培養を保存し；ｅ）該細胞培養の温度を上げることによって、該細胞を融解し；そしてｆ）細胞に対して細胞アッセイを行う工程を含み、工程ａ）の前に容器表面をポリリジンでコーティングする、前記方法を提供する。
【００４０】
１つの側面において、該方法は、細胞を含有する培地を容器表面に添加して、１６時間の期間、表面に細胞を付着させ、そして細胞培養を形成し、増殖培地を凍結保存培地（９０％ウシ胎児血清および１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））と交換し、細胞培養の温度を下げて細胞を凍結させ、−２０℃未満の温度で細胞培養を保存し、次いで細胞培養の温度を上げることによって、細胞を融解し、そして細胞に対して細胞アッセイを行う工程を含む。
【００４１】
別の側面において、細胞培養を−８０℃の温度で保存する。
さらなる側面において、ポリリジンは、ポリＤ−リジン、ポリＬ−リジンおよびその混合物からなる群より選択される。
【００４２】
さらにさらなる側面において、容器は、器、バイアル、マイクロタイタープレートおよび細胞培養プレートからなる群より選択される。好ましくは容器は細胞培養プレートである。
【００４３】
１つの側面において、細胞は接着細胞である。特に、細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および鳥類細胞からなる群より選択される。好ましくは細胞は哺乳動物細胞である。より好ましくは、細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびＡＤ２９３細胞からなる群より選択される。
【００４４】
別の側面において、工程ａ）で用いられる細胞は１以上のマイクロキャリアーに付着している。好ましくは、マイクロキャリアーはポリリジンでコーティングされている。
本発明のさらに別の側面において、細胞培養容器は、器、バイアル、マイクロタイタープレートおよび細胞培養プレートからなる群より選択される。
【００４５】
定義：
以下の用語は、本発明の背景で理解されるものとする：
細胞アッセイ・・・化合物の作用によって誘発される細胞プロセスを調べるための方法または試験、および細胞アウトプットを測定する手段。こうしたアッセイは，特に、薬剤スクリーニングにおいて役立つ。当業者には、細胞死または生存度はこの定義内には含まれないことが理解されるであろう。
【００４６】
凍結保存されている・・・凍結保存（低温、典型的には−２０℃以下での、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞および生存細胞を含む生物学的組織の保存）の使用によって保存されている。
【００４７】
凍結細胞・・・−２０℃以下で維持された損なわれていない生物学的細胞および生存生物学的細胞。
凍結保存培地・・・ときに、「細胞凍結培地」と称され、凍結保存または凍結中の細胞損傷または傷害を減少させる試薬または組成物を含有する任意の培地である。こうした凍結保存培地の例には、限定されるわけではないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ウシ胎児血清、グリセロール、ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）、トレハロースおよびその混合物が含まれる。
【００４８】
シグナル：バックグラウンド（Ｓ：Ｂ）
これは本質的に、＋アゴニスト（刺激）アッセイの平均を−アゴニスト（刺激）アッセイの平均で割ったものである。
【００４９】
シグナル：ノイズ（Ｓ：Ｎ）
この式は、シグナルおよびバックグラウンドアッセイ両方で観察された標準偏差を考慮に入れる。これはアッセイ性能の指標である。
【００５０】
【化１】
0005943607.tif 000002
【００５１】
Ｚ因子
これは、一般的に、アッセイ性能を評価するため製薬産業によって用いられる。統計において、Ｚ因子は、ハイスループットスクリーニングアッセイの品質または強度の測定値である。式には、＋および−アゴニストアッセイの平均および標準偏差が含まれる。値が１により近づくほど、性能がより優れている。細胞に基づくアッセイにおいて、＞０．４０が一般的に優れていると見なされ、一方、０．５以上の値は優秀であると見なされる（Ｚｈａｎｇら（１９９９）  Ａ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ．（Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．，  ４  （２）  ６７−７３）。
【００５２】
【化２】
0005943607.tif 000003
【００５３】
本発明のさらなる特徴および利点は、付随する図への言及とともに、例として提供される、本発明の好ましい態様の以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
例として提供される以下の説明は、本発明が、記載するいかなる特定の態様にも限定されることを意図しない。説明は、本明細書に援用される、付随する図と併せて理解されうる。
【図１】図１ａは、凍結保存前および凍結保存後の、ポリリジンでコーティングされたおよびコーティングされないプレート上で増殖させた、水疱性口内炎ウイルスエピトープタグ−β２アドレナリン受容体−増進緑色蛍光タンパク質からなる組換えタンパク質を安定して発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ安定細胞）の画像の比較を示す。図１ｂは、凍結保存前および凍結保存後の、ポリリジンでコーティングされたおよびコーティングされないプレート上で増殖させた、ヒト胚性腎２９３−水疱性口内炎ウイルスタグ−β２アドレナリン受容体−増進緑色蛍光タンパク質細胞（ＨＥＫ２９３  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ安定細胞）の画像の比較を示す。
【図２】図２は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた、融解後に決定される、ポリリジンでコーティングされたおよびコーティングされないプレート上に植え付けられた細胞株（ＣＨＯ  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ安定細胞およびＨＥＫ２９３  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ安定細胞）の生存度の比較を示す。
【図３】図３は、ポリリジンでコーティングされたおよびコーティングされないプレート上に植え付けられた、凍結保存ＡＤ２９３細胞のアッセイ性能の比較を示す。
【図４】図４は、ＣＨＯ  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ細胞に関するアゴニスト（ａ）およびアンタゴニスト（ｂ）用量反応曲線を示す。
【図５】図５は、ＨＥＫ２９３  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ細胞に関するアゴニスト（ａ）およびアンタゴニスト（ｂ）用量反応曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
第一の側面において、本発明は、凍結細胞が支持される表面を少なくとも有する容器で構成され、そして細胞培養表面がポリリジンでコーティングされている、凍結保存細胞培養である。細胞培養系において、あらかじめ分配された凍結保存細胞が提供されると、細胞培養操作に費やされる時間の量が減少するであろう。細胞は、一過性または安定のいずれでトランスフェクションされていてもよい。「準備が出来た（ｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｇｏ）」前凍結細胞のプロセシングは、プレートの単純な解凍、凍結培地の除去、その後、単純なＰＢＳ洗浄およびアッセイ培地の添加を伴うであろう。
【００５６】
ポリリジン化合物は、驚くべきことに、プロセスによるアッセイ性能を改善する（長期凍結保存後であってさえ）ことが見出され、これは細胞付着とは独立である。この改善は、少なくとも２つの別個の機構によって機能する：
ｉ）特に長期凍結保存後および多数回の洗浄工程を通じた、ＨＥＫ２９３細胞接着の促進および維持。ポリリジンが仲介する細胞付着は、ＨＥＫ２９３細胞に関してよく確立された現象であり；実際に、細胞接着の増加は、ポリリジンの主な細胞生物学的用法の１つである。
【００５７】
ｉｉ）ポリリジンは、ＣＨＯ細胞株形態に影響を及ぼす（Ｓｏｒｄｅｌら  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｌａｓｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏａｔｉｎｇｓ  ｏｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｖｏｌ．  ２８，  Ｉｓｓｕｅ  ８，  １５７２−１５８４，  ２００７）。伝統的なＣＨＯ細胞培養において、ＣＨＯ細胞は「細胞培養プラスチック」に非常に効率よく接着するため、ポリリジンは不要と見なされていることから、ルーチンには用いられない。しかし、細胞凍結保存前にポリリジンを使用すると、細胞接着に影響を及ぼすことなく、アッセイ性能が増進するようである。ＣＨＯ細胞±ポリリジンをより詳しく調べると、隆起した形態を示す細胞の数およびアッセイ性能の改善の間には、相関が存在するようである（Ｚ因子測定によって決定した際）。
【００５８】
ポリＤおよびポリＬリジンの両方が、固体表面をコーティングするのに使用可能であり、そして細胞の非特異的付着因子として伝統的に機能する。ポリリジンの既知の機能の１つは、細胞膜と会合する負荷電イオンおよび細胞培養表面間の静電相互作用を増進させることである。細胞培養表面に吸収された際、ポリリジンは、細胞結合に利用可能な正荷電部位の数を増加させる。ポリリジンは異なる分子量範囲で入手可能であり、例えば、Ｍｒ  ３０，０００〜７０，０００は、溶液中でより粘性が低く、そしてしたがって分配がより容易であるが、＞３００，０００のポリリジンは、分子あたり、より多くの付着部位を提供する。妥協案として、好ましいポリリジンＭｒは、７０，０００〜１５０，０００である。
【００５９】
いくつかの例において、特定の細胞は、タンパク質分解的にポリＬ−リジンを分解することが可能であり、この状況においては、細胞は、Ｌ−リジンの過剰な取り込みによって乱される可能性もあり、そしてしたがって、ポリカチオンとしてポリＤ−リジンを用いるべきである。
【００６０】
細胞培養容器は、器、バイアル、マイクロタイタープレートおよび細胞培養プレートからなる群より選択される。
細胞培養表面上で凍結される細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および鳥類細胞からなる群より選択される。好ましくは細胞は哺乳動物細胞であり；より好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびＡＤ２９３細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である。
【００６１】
以下のリストは、本発明で使用するのに適用可能である可能性が高いものの代表となる哺乳動物細胞からなる。リストは例として提供され、そして限定として見なされてはならない。さらに、異種遺伝子を安定して発現する細胞もまた、この態様の一部であり、例えば、先に記載するように、β２アドレナリン受容体を安定して発現する細胞株ＨＥＫ２９３およびＣＨＯがある。
【００６２】
ａ．代表的な細胞株
ＨｅＬａ    黒人系子宮頸部腺癌（ヒト）
ＨＥＫ  ２９３    胚性腎臓（ヒト）
１３２１−Ｎ１    脳星状細胞腫（ヒト）
Ｕ−２  ＯＳ    骨骨肉腫細胞（ヒト）
Ｈｕｈ−７    肝細胞腫（ヒト）
Ｋ−５６２    リンパ芽球（慢性骨髄性白血病）（ヒト）
ＨｅｐＧ２    肝細胞癌（ヒト）
Ｈｅｐ３Ｂ    肝細胞癌腫（ヒト）
ＢＪ    包皮線維芽細胞（ヒト）
ＣＡＣＯ２    結腸直腸腺癌（ヒト）
ＭＣＦ７    ヒト乳腺癌（ヒト）
ＳｗｉｓｓおよびＮＩＨ  ３Ｔ３    胚線維芽細胞（マウス）
ＣＯＳ−１および−７    ＳＶ４０形質転換腎細胞株（アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ））
ＣＨＯ（ＣＨＯ−Ｋ１）    チャイニーズハムスター卵巣細胞（ハムスター）
ｂ．代表的な初代細胞
ＨＵＶＥＣ    臍帯静脈内皮細胞（ヒト）
ＭＨＥｐＣ    乳腺上皮細胞（ヒト）
ＨＴＥｐＣ    気管上皮細胞（ヒト）
ＨＡＯＥＣ    大動脈内皮細胞（ヒト）
ＰＢＭＣ    末梢血単核細胞（ヒト）
ｃ．代表的な幹／前駆細胞
ｈＥＳＣ−ＢＧ０１Ｖ    胚性幹細胞株（ヒト）
ＥＳ−Ｃ５７ＢＬ／６    胚性幹細胞株（マウス）
ＭＬＰＣ    臍帯血多細胞系譜前駆細胞（ヒト）
ｄ．代表的な癌細胞
ＮＴＥＲＡ  １および２    精巣胚性癌細胞（ヒト）
低分子量ポリリジン（Ｍｒ＝３０，０００〜７０，０００ｋＤ）は、溶液中でより粘性が低いため使用しやすいが、より高分子量の＞３００，０００ｋＤのものは、分子あたり、より優れた細胞付着を提供する。細胞生物学において一般的に使用するためのポリリジンの分子量は、典型的には、７０，０００〜１５０，０００ｋＤの範囲である。
【００６３】
ポリリジンで処理した固体表面は、神経突起伸長を支持し、そして中枢神経系由来の多くの細胞の生存を改善することが示されてきている。ポリ−α−リジンは合成化合物であるため、一般的に、培養細胞中の生物学的反応を刺激しない。ポリ−α−リジンは合成的に生成されるため、他の天然ポリマーに付随する問題となりうる、いかなる生物学的不純物も、ルーチンに含有しない。
【００６４】
ポリリジン上でルーチンに培養される細胞株のいくつかの例には−ＨＥＫ２９３ヒト肺性腎細胞（Ｓｕｇａｗａｒａ，  Ｔ．ら  Ａ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａ＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｌｐｈａ  ＩＩ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇｅｎｅ  Ｎａ（ｖ）１．２  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｆｅｂｒｉｌｅ  ａｎｄ  ａｆｅｂｒｉｌｅ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ  ｃａｕｓｅｓ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９８（１１），  ６３８４−９，  ２００１）、ＭＤＡ−２３１、乳癌細胞株（Ｙｏｎｅｄａ，  Ｔ．ら  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９９（１０），  ２５０９−１７，  １９９７）、下垂体前葉細胞（Ｈｉｎｕｍａ，  Ｓら  Ａ  ｐｒｏｌａｃｔｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９３（６６８２），  ２７２−６，  １９９８）、ミクログリアＭＧ−７細胞（Ｓｚｃｚｅｐａｎｉｋ，  ＡＭ．ら  Ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｐ３  ａｎｄ  ｐ４  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ７７（１），  ３０４−１７，  ２００１）、およびラット初代星状膠細胞（Ｌｉｔｔｌｅ，  ＥＢ．ら  Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  （Ｎ−ＣＡＭ）  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｎ−ＣＡＭ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  ９８（５），  ２２３８−４３，  ２００１）が含まれる。
【００６５】
ポリＬ−リジンはまた、パターン化された共培養として２つの異なる細胞を培養するのにも用いられてきている。最初の細胞をガラス支持体上に固定するには、ヒアルロン酸が用いられた。続いて、ポリＬ−リジンをヒアルロン酸上に別個のパターンで吸収させて、それによって培養表面特性を改変して、そしてこうして第二の細胞種の接着を促進した。線維芽細胞と胚性幹細胞を共培養するためのこのアプローチの有用性が立証されてきている（Ｋｈａｄｅｍｈｏｓｓｅｉｎｉｎ，  Ａ．ら  Ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ  ｆｏｒ  ｐａｔｔｅｒｎｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２５，  ３５８３−９２，  ２００４）。
【００６６】
二本鎖および一本鎖ＤＮＡ分子を視覚化するのに、ポリリジンでコーティングした電子顕微鏡標本フィルムが用いられてきている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ＲＣ．  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ  ｆｏｒ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｔｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｓｐｅｃｉｍｅｎ  ｆｉｌｍｓ．  ＰＮＡＳ，  ７４（６），  ２３１１−２３１５，  １９７７）。
【００６７】
ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、ヒト腸フロラに存在するグラム陽性非運動性嫌気性細菌である。これらの細菌は、凍結保存を容易にするため、微小カプセル調製中、アルギン酸ポリＬ−リジン微小カプセル内に取り込まれてきている。細菌が装填された微小カプセルを凍結乾燥し、そして長期凍結保存に供する。この例では、ポリリジンは、実際には凍結保護剤として機能せず、塩基性アルギン酸塩構造を安定化させる手段として用いられた（Ｃｕｉ，  ＪＨ．ら  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｌｏａｄｅｄ  ｉｎ  Ａｌｇｉｎａｔｅ  Ｐｏｌｙ−ｌ−ｌｙｓｉｎｅ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｓｓ．  Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．，  ２９（８），  ７０７−７１１，  ２００６）。
【００６８】
ポリＬ−リジンでコーティングされたプラスチックおよびガラスディッシュはまた、魚の胚の発生と関連するプロセスを研究するのにも用いられてきている。魚の卵は一般的に、多くの細胞培養処理表面に接着しない。しかし、卵は、ポリリジンでコーティングされているプラスチックおよびガラスディッシュには付着する。次いで、精子を導入し、そして卵を受精させ、そして生じた発生プロセスを監視する（Ａｎｄｏｈ，  Ｔ．ら  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ  ｔｏ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｒｍ  ｅｎｔｒｙ  ｉｎｔｏ  ｐｅｌａｇｉｃ，  ｎｏｎ−ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｆｉｓｈ  ｅｇｇｓ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ５２，  ７５３−７，  ２００８）。
【実施例】
【００６９】
本実施例は、例示目的のみのために提供され、そして付随する請求項に定義されるような本発明の範囲を限定すると見なしてはならない。以下に、そして本明細書の別の箇所に提供されるすべての参考文献は、本明細書に援用される。
【００７０】
１．細胞培養プレートのポリＤ−リジンでのコーティング
ポリＤ−リジン臭化水素酸塩（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７４０５、＞３００ｋまたはＰ６４０７、７０〜１５０ｋ）−ポリＤ−リジンを滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、１ｍｌあたり１００ｎｇの濃度に溶解する。アリコット（５０μｌ）を細胞培養９６ウェルプレートのウェルに分配する。これを室温（典型的には２５℃）で３０分間インキュベーションする。この時間の後、いかなる過剰なポリＤ−リジン溶液もデカントし、そしてウェルを無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（２００μｌ）で３回洗浄する。
【００７１】
１００μｌのＰＢＳを最後に添加して、乾燥を防止するよう保持する。ポリリジンでコーティングしたプレートを冷蔵庫に数日間保存することも可能であるが、ルーチンには、４８時間以内に用いる。
【００７２】
ポリＤ−リジンの使用は、例として提供され、そしていかなる意味でも限定はしない。
２．凍結保存
“Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  Ｓｐｅｃｔｏｒ  Ｄ．Ｌ．，  Ｇｏｌｄｍａｎ  Ｒ．Ｄ．およびＬｅｉｎｗａｎｄ  Ｌ．Ａ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９９８）に記載されるようなルーチンの細胞培養技術を用いて、細胞を細胞培養容器中で増殖させた。適切な増殖期に、商業的に入手可能なｘ１トリプシン／ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を用いて、細胞培養容器表面から細胞を取り除き、そして適切な細胞培地に再懸濁する。製造者の指示にしたがって、Ｃｈｅｍｏｔｅｃ  Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒを用いて、細胞数を決定する。
【００７３】
２０，０００または５，０００の細胞を、それぞれ１００μｌおよび２０μｌの体積中、９６ウェルまたは３８４ウェルのポリリジンコーティングＣｏｓｔａｒ組織培養処理ホワイトポリスチレン細胞培養アッセイプレート（カタログ番号３９１７および３７１２）のいずれかにそれぞれ分配し、そして付着させ、そして１６時間回復させた。翌日、培地を除去し、そして商業的に入手可能なＰＢＳで細胞を２回洗浄した。９０％ウシ胎児血清および１０％ＤＭＳＯで構成される凍結保存培地を、付着細胞の上部に分配した。次いで、細胞培養プレートの縁をパラフィルム（Ｐｅｃｈｉｎｅｙ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｐａｃｋａｇｅｓ）またはＷｈａｔｍａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅａｌｉｎｇフィルムで密封し、そしてプレート全体をＳａｒａｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ  Ｗｒａｐ（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）でラッピングした。細胞培養プレートを−８０℃で１６時間凍結し、その後、より長い保存のため、−１４０℃に移した。
【００７４】
３．アッセイ性能
再生（ｒｅｓｕｒｒｅｃｔｉｏｎ）に際して、凍結細胞培養プレートを−１４０℃から取り出し、そして解凍させた。凍結保存培地を取り除き、そして細胞をあらかじめ温めたＰＢＳで２回洗浄した。次いで、適切なアゴニストを補充したアッセイ培地を添加した。使用するレポーター系に関して、最も適切な方法および／または商業的に入手可能なキットを用いて、細胞に基づくアッセイを行った。
【００７５】
（ｉ）細胞付着および形態に対するポリリジンの影響
細胞付着および形態に対するポリリジンの影響を理解するプロセスにおいて、凍結保存前および保存後、ポリリジンでコーティングされたおよびコーティングされないプレート上で増殖させた細胞の画像を比較した（図１）。
【００７６】
ＣＨＯ  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ安定細胞株の場合（図１ａ）、ポリリジンの存在下で、隆起した細胞形態が観察される。この形態は、細胞をポリリジンの非存在下で増殖させた場合には存在しない。
【００７７】
ＨＥＫ２９３  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ安定細胞の場合（図１ｂ）、ポリリジンは明らかに、細胞付着を促進し、そして維持することによって機能する。ポリリジンの非存在下では、細胞はおそらく、凍結保存および洗浄工程中に脱離する。
【００７８】
ｉｉ）細胞株の生存度に対するポリリジンの影響
Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、融解後に、ポリリジンコーティングプレート上に植え付けられた細胞株の生存度を決定した。
【００７９】
細胞を９６ウェルプレート（±ポリリジン）内に植え付け、凍結保存し、そして次いで再生させた。
図２からわかるように、ＣＨＯ  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ安定細胞株の場合、ＣＨＯ細胞をポリリジンとともにまたはポリリジンを含まずにプレーティングした場合、細胞生存度には有意な相違は見られず、ポリリジンが細胞付着を促進せず、または凍結保存を改善しないことが示された。
【００８０】
しかし、ＨＥＫ２９３  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ安定細胞株の場合、ポリリジンの存在は、生成される発光シグナルを有意に改善する。これらのデータは、細胞画像データとともに、ポリリジンが、凍結保存および洗浄過程中のＨＥＫ２９３細胞付着を支持し、そして維持することを示す。
【００８１】
ｉｉｉ）細胞アッセイ性能に対するポリリジンの影響
ポリリジンを含み（＋）および含まず（−）、９６ウェルプレート中、ウェルあたり２０，０００細胞で細胞を植え付け、そして一晩付着させ、増殖培地を取り除き、そして凍結培地（９０％ウシ胎児血清および１０％ＤＭＳＯ）を添加した。プレートを密封し、そして凍結保存した。対照として、伝統的な「クライオバイアル」保存系（Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｐｅｃｔｏｒ  Ｄ．Ｌ．，  Ｇｏｌｄｍａｎ  Ｒ．Ｄ．およびＬｅｉｎｗａｎｄ  Ｌ．Ａ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９９８））を用いてもまた、細胞を凍結保存した。
【００８２】
クライオバイアル内に含有される細胞を融解するため、凍結保存培地を細胞特異的増殖培地で希釈し、そして懸濁物を遠心分離（１，０００ｘｇで５分間）した。生じた細胞ペレットを新鮮増殖培地中に再懸濁し、そして細胞を９６ウェルプレート（（＋）および（−）ポリリジンコーティング）のウェル内に、ウェルあたり２０，０００細胞で分配した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１６時間インキュベーションして、アッセイ前に細胞付着を促進した。
【００８３】
アッセイに際して、プレートをフリーザーから取り出し、そして解凍した。凍結培地を取り除き、そして細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてβ２ＡＲアゴニスト・イソプロテレノールを含有する培地を添加した。ＤｉｓｃｏｖｅｒＸのＨｉｔｈｕｎｔｅｒ  ｃＡＭＰ  ＩＩおよびＬｅａｄｓｅｅｋｅｒ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＧＰＣＲ活性化に際するｃＡＭＰレベルの増加を監視した。フォルスコリンを用いたアデニル酸シクラーゼ測定を対照として用いた（未提示）。
【００８４】
記載する実験において、β２ＡＲで安定してトランスフェクションされたＨＥＫ２９３およびＣＨＯ細胞両方を、β２ＡＲアゴニスト・イソプロテレノールまたはアンタゴニスト・イソプロプラノロールのいずれかに曝露した。アゴニストに曝露すると、細胞内ｃＡＭＰ濃度が上昇し、そしてこれらは、Ｌｅａｄｓｅｅｋｅｒ装置プラットホーム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と組み合わされた、ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ  ｃＡＭＰＩＩキット（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）などの、ある範囲の商業的に入手可能な発光キットによって、監視可能である。
【００８５】
対照として、偏在性に発現されるアデニル酸シクラーゼ活性をそれぞれのアゴニスト、フォルスコリンに曝露した際の、細胞内ｃＡＭＰ濃度の上昇もまた、別個に監視した。ＡＤ２９３細胞株において、アデニル酸シクラーゼ活性のみを監視した。
【００８６】
ＤｉｓｃｏｖｅＲｘアッセイ系は、細胞内ｃＡＭＰ濃度を監視するよう設計されているため、アッセイ培地に、最終濃度１ｍＭの一般的なホスホジエステラーゼ阻害剤イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を補充した。
【００８７】
イソプロテレノールアッセイ−イソプロテレノール（Ｓｉｇｍａ  Ｉ２７６０）を１００ｍＭのストック濃度まで水に溶解した。次いでアッセイ培地中でこれを希釈して、２００μＭ〜１ｐＭの範囲の最終イソプロテレノール濃度範囲を生じた。
【００８８】
フォルスコリンアッセイ−フォルスコリン（Ｓｉｇｍａ  Ｆ６８８６−  １０ｍｇ）を１０ｍＭのストック濃度までＤＭＳＯ中に溶解した。次いで、半対数希釈を用いて、これをアッセイ培地中で連続希釈して、３１６μＭ〜３．１６ｎＭの範囲の最終フォルスコリン濃度範囲を生じた。
【００８９】
プロプラノロールアッセイ−プロプラノロール（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８６８８）を１００ｍＭのストック濃度まで水に溶解した。次いでアッセイ培地中でこれを希釈して、２００μＭ〜１ｐＭの範囲の最終プロプラノロール濃度範囲を生じた。２０ｎＭイソプロテレノールの存在下で、プロプラノロール用量反応曲線を実行した。
【００９０】
アゴニストまたはアンタゴニストを除いて、アッセイ培地を細胞に添加する、アゴニスト不含対照もまた行った。
ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ  ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ  ｃＡＭＰ  ＩＩアッセイ−製造者の支持にしたがって、これを行い、そして簡潔には、該アッセイには以下を伴った。−１４０℃での保存からの再生に際して、細胞培養処理９６ウェルプレート上で凍結した細胞を融解させた。解凍したら、凍結保存培地を取り除き、そして細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、１ｍＭ  ＩＢＭＸおよび適切なアゴニストおよび／またはアンタゴニストを補充したアッセイ培地を添加した。
【００９１】
典型的には、９６ウェル細胞培養処理プレート中で行うアッセイのため、２０，０００細胞を用いた。アッセイ培地を細胞に添加して、アッセイプレートを３７℃で３０分間インキュベーションし、その後、４０μｌのＤｉｓｃｏｖｅＲｘ  ｃＡＭＰ  ＩＩ  ＥＤ／基質混合物を添加した。これは、１部分のｃＡＭＰ  ＩＩ  ＥＤ試薬と、１部分の基質作業溶液（基質作業溶液は、１部分のＧａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ、５部分のＥｍｅｒａｌｄ  ＩＩおよび１９部分の基質希釈剤からなった）からなる。アッセイプレートを旋回させて、十分な細胞被覆を確実にした。次いで、等体積のＥＡ−Ａｂ／溶解混合物（４０μｌ）を添加した。これは、１部分のｃＡＭＰ  ＩＩ  ＥＡ−Ａｂ試薬および１部分のｃＡＭＰ  ＩＩ溶解緩衝液からなる。アッセイプレートを室温で４時間インキュベーションし、そしてＬｅａｄｓｅｅｋｅｒ装置プラットホームを用いて、発光シグナルの生成を監視することによって、ｃＡＭＰ濃度を決定した。
【００９２】
３８４ウェル細胞培養処理プレート中で行うアッセイは、５，０００細胞のみをウェルあたりに分配し、そしてＤｉｓｃｏｖｅＲｘ  ｃＡＭＰ  ＩＩ  ＥＤ／基質混合物およびＥＡ−ＡＢ／溶解混合物体積の５０％の減少を用いる（すなわち２０μｌに減少させる）ことを除いて、上述の通りである。
【００９３】
ＣＨＯ  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ細胞の場合、ポリリジンでコーティングされたクライオバイアルおよびプレートに比較して、ポリリジンの非存在下で、４週間より長く凍結させたプレートのアッセイ性能は、特にＳ／Ｂ、Ｓ／Ｎおよび特にＺ因子に関して減少する。（ｉ）ポリリジンでコーティングされたおよびコーティングされていないプレート上でアッセイされた際のクライオバイアル保存細胞、ならびに（ｉｉ）ポリリジンでコーティングされたプレート上で直接凍結保存されて、そしてアッセイされた細胞の両方によって、匹敵するアッセイ性能が示される。表１から見られうるように、クライオバイアル中で保存され、そして続いて再生され、そしてアッセイのため、マイクロタイタープレートに移された細胞に関して、ポリリジンは、アッセイ性能に対してほとんど影響がないようである。
【００９４】
表１
【００９５】
【表１】
0005943607.tif 000004
【００９６】
ＨＥＫ２９３  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ細胞株の場合、アッセイ性能に対するポリリジンの陽性効果が、凍結保存およびアッセイ系、すなわち（ｉ）凍結プレート上で凍結保存されそしてアッセイされた、ならびに（ｉｉ）クライオバイアル中で凍結保存され、そしてアッセイのためプレートに移されたものの両方で観察された（表２）。ポリリジンの非存在下では、再生細胞のアッセイ性能は劣っている。
【００９７】
表２
【００９８】
【表２】
0005943607.tif 000005
【００９９】
ｉｖ）ポリリジンは、凍結保存されたＡＤ２９３細胞のアッセイ性能に対して有益な影響を有する（図３および表３）。これらは、改善された接着特性を示すように操作されているＨＥＫ２９３細胞である。
【０１００】
表３：
【０１０１】
【表３】
0005943607.tif 000006
【０１０２】
これらのデータからわかるように、ポリリジンは、フォルスコリン刺激に対するＡＤ２９３細胞の反応の度合いを有意に増加させるだけでなく（図３および表３）、より優れたアッセイ性能の指標である、改善されたＺ因子を生じる。
【０１０３】
ＣＨＯ  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ−アゴニストおよびアンタゴニスト用量反応曲線
イソプロテレノール  Ｅｃ５０値−ｉ）伝統的なクライオバイアル系を用いて凍結保存されている（そして続いて、±ポリリジンコーティング・アッセイマイクロタイタープレートに移され、そしてアッセイされている）か、またはｉｉ）ポリリジンでコーティングされたマイクロタイタープレート上で直接凍結保存され、そしてアッセイされているかいずれかの細胞を用いて行ったアッセイに関して、匹敵するアッセイ性能が示される（図４ａ）。
【０１０４】
ポリリジンの非存在下で、マイクロタイター形式を用いて細胞を凍結保存すると、より劣ったアッセイ性能が観察される。アゴニスト刺激に反応したシグナル変動の増加が明らかであり、そしてアゴニストが誘導する反応の度合いが減少する。
【０１０５】
興味深いことに、すべてのアッセイは、アゴニスト・イソプロテレノールに反応して、匹敵したＥｃ５０値を示す。したがって、すべての細胞は、適切なアゴニスト誘導性反応を生じるようである；が、反応の度合いは、細胞をポリリジンの非存在下のプレート上で凍結保存した際、より低い。
【０１０６】
プロプラノロールＩｃ５０値−β２ＡＲアンタゴニスト・プロプラノロールを用いて行ったアッセイに関して、類似の傾向が観察される（２０ｎＭイソプロテレノール（ＩＳＰＬ）の存在下で行う）。ＣＨＯ  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ細胞を、ポリリジンの非存在下で、マイクロタイタープレート内で直接凍結保存したアッセイにおいてのみ、性能減少が観察される。再び（ｏｎ  ａｇａｉｎ）、匹敵するＩｃ５０結果が観察される（図４ｂ）。
【０１０７】
先に示すように、ポリリジンは、ＣＨＯ細胞生存度または付着に影響を及ぼさない。したがって、これらのデータは、ポリリジンが存在すると、９６ウェルマイクロタイタープレート内で直接凍結保存された細胞のアッセイ性能のみが改善されることを示す。これらの細胞の性能は、クライオバイアル中で凍結保存され、そして続いてアッセイプレートに移された細胞によって示されるものと同等である。したがって、アッセイプレートとして使用するのにも適したポリリジンコーティングプレート中で細胞を直接凍結保存すると、必要な時間および手動操作の量が減少する。
【０１０８】
ＨＥＫ２９３  ＶＳＶ−β２ＡＲ−ＥＧＦＰ−アゴニストおよびアンタゴニスト用量反応曲線（図５）
イソプロテレノールＥｃ５０値−細胞がポリリジンでコーティングされたマイクロタイタープレート上に植え付けられているアッセイに関してのみ、匹敵するアッセイ性能が示される。これには、ｉ）クライオバイアル中で凍結保存され、そして続いてアッセイのために、ポリリジンでコーティングされたプレートに移された細胞、およびｉｉ）ポリリジンでコーティングされたプレート中で直接凍結保存された細胞が含まれる（図５ａ）。
【０１０９】
ＨＥＫ２９３細胞は、伝統的に、マイクロタイタープレートにおける細胞付着を促進するために、ポリリジンを必要とする。コーティングされていないプレート上に植え付けられ、そして続いて凍結保存されたＨＥＫ２９３細胞は、ポリリジンでコーティングされたプレート上で凍結保存された同じ細胞に比較して、数の減少を示した。したがって、ＨＥＫ２９３細胞アッセイ性能を改善するポリリジンの特性の１つは、細胞付着増進に関する。
【０１１０】
ポリリジンの非存在下、マイクロタイター形式を用いて、細胞を凍結保存した場合（そしてクライオバイアル中で凍結保存され、そしてコーティングされていないプレートに移された場合であってさえ）、より劣ったアッセイ性能が観察される。再び、アゴニスト刺激に反応したシグナル変動の増加が明らかであり、そしてアゴニストが誘導する反応の度合いが減少する。
【０１１１】
条件とは関わりなく、すべてのアッセイによって、アゴニスト・イソプロテレノールに反応して、匹敵するＥｃ５０値が示され、そしてしたがって、すべての細胞が適切な反応を示す；が、細胞が、ポリリジンの非存在下で凍結保存される（そしてプレート上でアッセイされる）場合に、反応の度合いがより低い。
【０１１２】
プロプラノロールＩｃ５０値−β２ＡＲアンタゴニスト・プロプラノロールを用いて行われるアッセイに関して、類似の傾向が観察される（２０ｎＭ  ＩＳＰＬの存在下で行われる）。凍結保存培地に関わりなく、ポリリジンの非存在下、マイクロタイタープレート中でＨＥＫ２９３細胞をアッセイするアッセイにおいてのみ、性能減少が観察される。再び、すべてのアッセイに関して匹敵するＩｃ５０結果が観察され、そして±ポリリジンコーティングプレートにおいてのみ、度合いおよび変動が異なる（図５ｂ）。
【０１１３】
これらのデータは、ポリリジンが存在すると、９６ウェルマイクロタイタープレート中で直接凍結保存された細胞だけでなく、クライオバイアル中で保存され、そして続いてポリリジンでコーティングされたアッセイプレートに移されたもののアッセイ性能も改善されることを示す。ポリリジンでコーティングされたプレート内で直接凍結保存されたＨＥＫ２９３細胞の性能は、クライオバイアル中で凍結保存され、そして続いてアッセイプレート内に移された細胞によって示されるものと同等である。アッセイで続いて使用可能なプレート上で細胞を直接凍結保存すると、必要な時間および手動操作の量がどちらも減少する。
【０１１４】
これらのデータは、凍結保存前にポリリジンで９６ウェルマイクロタイタープレートをプレコーティングすると、融解に際して細胞アッセイ性能が改善されることをさらに立証する。さらなる利点はまた、必要な時間および手動操作の量が減少することである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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