(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経膠腫の治療において遺伝子治療ベクターと共に使用するための、アルブミンを含む医薬組成物であって、遺伝子治療ベクターを投与する前に、アルブミンを患者の脳に予め注入することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２】
遺伝子治療ベクターを投与する前に、アルブミンが、患者の脳の白質に予め注入される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
アルブミンが等張溶液中にある、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
アルブミンが人工CSF中にある、請求項１〜３いずれか記載の医薬組成物。
【請求項５】
アルブミンおよび遺伝子治療ベクターが、注入により投与される、請求項１〜４いずれか記載の医薬組成物。
【請求項６】
アルブミンおよび遺伝子治療ベクターが、細いカテーテルを介して投与される、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
アルブミンおよび/または遺伝子治療ベクターが、対流強化送達により投与される、請求項５または６記載の医薬組成物。
【請求項８】
遺伝子治療ベクターがウイルスベクターである、請求項１〜７いずれか記載の医薬組成物。
【請求項９】
ウイルスベクターが、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ウイルスベクターの直径が少なくとも１００ｎｍである、請求項８または９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ウイルスベクターがヘパリン結合受容体に結合する、請求項８〜１０いずれか記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ウイルスベクターが単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）である、請求項８〜１１いずれか記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、神経膠腫の治療における使用のための組成物および化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
悪性神経膠腫は、最も一般的な原発性脳腫瘍であり、非常によくない予後を伴う(Wrensch et al, 2002)。神経膠腫は、内因性のグリア前駆細胞または神経幹細胞から生じ(Canoll and Goldman, 2008)、それとともに、白質路ならびに脈管周囲空間および軟膜下空間に沿って移動する能力を有すると仮説が立てられている(Louis, 2006)。その結果、悪性神経膠腫は、高度に浸潤性の腫瘍であり、完全な外科的な切除は不可能である。浸潤性の腫瘍細胞の適切な治療における従来の治療様式の限界は、元の腫瘍塊の2〜3cm以内に悪性神経膠腫の80%が再発するという観察により強調される(Hess et al, 1994)。
【０００３】
単純ヘルペスウイルス(HSV-1)は、大きな、天然に神経向性の二本鎖DNAウイルスであり、有用な複製選択性(replication-selective)(腫瘍崩壊性)および複製欠損性(replication-defective)の遺伝子治療ベクターへと積極的に開発されている(Bowers et al, 2003)。今日までに、2種類の複製選択性ウイルス構築物が、悪性神経膠腫を有する患者における臨床試験に達している(Rampling et al, 2000；Markert et al, 2000；Papanastassiou et al, 2002；Harrow et al, 2004)。G207およびHSV1716と称されるこれらのウイルスは、γ134.5遺伝子の両方のコピーにおいてヌル突然変異を有する。この遺伝子の産物は、HSV-1がニューロンに感染し、ウイルス感染に対する宿主細胞応答に打ち勝つ能力を高めるのに重要である(He et al, 1997)。また、γ134.5遺伝子のヌル突然変異は、これらのベクターが腫瘍細胞において選択的に複製する能力を付与する(Shah et al, 2003)。
【０００４】
今日までに、選択的複製性(selectively-replicating)HSV-1の全ての臨床試験において、直接的な腫瘍内注射または実質内注射によりベクター投与が達成されている。初期の臨床試験は、直接MRI増強(MRI-enhancing)腫瘍塊へのベクターの直接注射を含んだ(Rampling et al, 2000；Markert et al, 2000；Papanastassiou et al, 2002)。これらの研究により安全性が示され、悪性神経膠腫を有する患者におけるHSV1716のインビボ複製のわずかな証拠が提供された。しかしながら、依然として有意なベクター分布および治療効果の決定的な証拠を示す必要がある。これは、ベクターの複製を臨床的に確認することの方法論的な困難さに関連するかもしれないが、腫瘍内注射の効果に関して重大な不確実さがある(Dempsey et al, 2006)。
【０００５】
定義により、グレードIV神経膠腫は、組織壊死の面積により特徴付けられる(世界保健機関、2007)。結果的に、生きた悪性神経膠腫細胞中で複製し得る複製選択性ウイルスベクターでの、壊死性の原発性腫瘍塊の直接接種は、原発性腫瘍塊、またはより重要だが、浸潤性腫瘍細胞のいずれかを効率的に治療する可能性が低い。また、原発性腫瘍塊はしばしば、複製選択性ベクターの腫瘍内注射を不要にする外科的切除に従順(amenable)である。実際、Harrowら(2004)は、再発性または新たに診断された悪性神経膠腫のいずれかの切除を受けている患者において、HSV1716の腫瘍周囲注射のフェーズI/II試験を行った。この試験により、このアプローチは安全であることが示されたが、このアプローチが効果的であるためには、ウイルス分布を最適化して、可能な限り多くの浸潤性腫瘍細胞の形質導入を容易にしなければならないことが明らかに重要である。
【０００６】
対流強化送達(convection-enhanced delivery)(CED)は、おそらく神経膠腫細胞が移動し得るのと可能な限り同じ細胞外経路に沿って、バルクフロー(bulk-flow)により直接脳の細胞外空間に治療剤を分布させるための細いカテーテルおよび正確に制御された注入速度の使用を含む。カルムスチン含浸生分解性ポリマーなどの適切な薬物分布を達成するための拡散に依存した薬物送達技術とは対照的に、CEDを用いると、治療剤の分子サイズに関係なく、潜在的に大きな脳の体積にわたり均一に薬物を分布させることが可能になる(Morrison et al, 1994)。このように、CEDは、悪性神経膠腫を有する患者の脳へのウイルスベクター媒介性遺伝子治療の施与のための理想的な技術である。
【０００７】
HSV-1ベクターは120〜300nmの直径を有し(Jacobs et al, 1999)、一方、平均すると脳の細胞外空間は、38〜64nmの直径を有する(Thorne and Nicholson, 2006)。これは明らかに、CEDによるHSV-1系ベクターが投与を達成できなくなる可能性を有する。従って、この研究において、CEDによる複製選択性HSV-1ウイルス構築物の分布は、灰白質および白質の両方で試験され、ウイルスベクター分布を高めるための種々の戦略が評価されている。
【０００８】
しかしながら、上述の臨床試験(6〜9)に加えて、HSVベクターは、定位注射(stereotactic injection)により、正常マウスの脳(17〜19)、ラットの脳(20〜26)および霊長類の脳(20〜28)、高度(high-grade)神経膠腫の動物モデル(29〜35)、ムコ多糖症VII型の動物モデル(36)、GM2ガングリオシドーシスの動物モデル(37)およびパーキンソン病の動物モデル(37〜39)に投与され、CEDにより神経膠腫ラットモデルに投与されている(40)。この多くの試験を考慮すると、今日までに、これらのベクターの脳への直接送達を体系的に評価して最適化する試みがなされていないことは驚くべきことである。従って、この研究において、CEDによる複製選択的HSV-1ウイルス構築物の分布は、灰白質および白質の両方で試験され、ウイルスベクター分布を高めるための種々の戦略が評価されている。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
本研究に基づいて、本発明者らは、特に対流強化送達による白質への治療剤の送達を最適化するために有用な組成物および化合物を同定した。これは特に、遺伝子治療ベクターの送達に有用である。
【００１０】
本発明の第1の局面は、治療剤およびアルブミンまたは機能的に有効なその断片を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
好ましくは、該組成物は、神経学的疾患の治療のための治療剤を含む。該治療剤は、好ましくは脳または脊髄の疾患、特に脳の疾患の治療のためのものである。該疾患は、癌、特に白質の癌、詳細には神経膠腫であり得る。代替的に、該疾患は、任意の他の適切な神経学的疾患、特に多発性硬化症などの白質の疾患であり得る。
【００１２】
該治療剤は、神経学的疾患の治療のための任意の薬剤、例えば遺伝子治療剤、特に遺伝子治療ベクターであり得る。代替的に、該治療剤は、神経栄養因子、特にグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)；抗体もしくはその断片；免疫抑制剤；免疫調節剤、特にフィンゴリモド；サイトカイン、特にインターフェロン、例えばインターフェロン1αもしくはβ；または抗炎症剤などの薬剤であり得る。
【００１３】
遺伝子治療ベクターは、細胞に遺伝物質を導入するために使用され得る任意のベクターである。遺伝子治療は、周知のとおり、疾患を治療するための、個体の細胞中の遺伝子を調節するか、または該遺伝子に添加される遺伝物質の使用である。導入される遺伝物質は、任意の適切な遺伝物質、例えばDNAおよびRNAであり得る。遺伝物質は、任意の公知の様式、例えば遺伝子置換、遺伝子ノックダウン、生存促進性(pro-survival)遺伝子治療および細胞自殺(cell suicide)治療において疾患を治療するために使用され得る。
【００１４】
遺伝子治療ベクターは、例えばウイルスベクターを含む、被験体に遺伝子治療を施与するのに適した任意のベクターであり得る。単純ヘルペスウイルスベクター、特にHSV-1；アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどの任意の適切なウイルスベクターが使用され得る。ウイルスベクターは少なくとも直径100nmの大きなベクターであることが好ましい。さらに、ウイルスベクターがヘパリン結合受容体に結合することが好ましい。
【００１５】
該組成物はさらに、アルブミンまたはその機能的断片を含む。上述のように、該組成物は、遺伝子治療のために使用され得る。アルブミンは、最初に細胞間の空間を開け、治療剤、特に大きなウイルスベクターが、より容易に細胞間に移動することを可能にするために組成物中に含まれる。アルブミンはまた、ヘパリン、アルブミンを含む種々のタンパク質およびHSVベクターに結合する低特異性結合受容体である、細胞上のヘパリン受容体をブロックする。ヘパリン受容体をアルブミンでブロックすることにより、HSVの受容体への結合が低減され、形質導入に利用可能なHSVの割合が増加する。アルブミンは、別のヘパリン受容体結合剤、例えばヘパリン自身と置き換えてもよいが、アルブミンが好ましい。アルブミンの機能的断片は、全長タンパク質として少なくとも75%の結合効率でヘパリン受容体に結合する断片である。
【００１６】
該組成物は、好ましくは、さらに脳脊髄液(CSF)、特に人工脳脊髄液を含む。人工脳脊髄液は、当該技術分野で周知であり、特にその塩成分に関して天然のCSFを模倣する液体である。好ましくは、該組成物は、天然のCSF中に見られるものと同様の濃度のNaClを含み、すなわち該濃度は、天然のCSF中の濃度から好ましくは15%以内、より好ましくは10%以内である。好ましくは、該組成物は、天然のCSF中に見られるものと同様の濃度のNaHCO3を含み、すなわち該濃度は、天然のCSF中の濃度から好ましくは15%以内、より好ましくは10%以内である。好ましくは、該組成物は、天然のCSF中に見られるものと同様の濃度のKClを含み、すなわち該濃度は、天然のCSF中の濃度から好ましくは15%以内、より好ましくは10%以内である。好ましくは、該組成物は、天然のCSF中に見られるものと同様の濃度のNaH2PO4を含み、すなわち該濃度は、天然のCSF中の濃度から好ましくは15%以内、より好ましくは10%以内である。好ましくは、該組成物は、天然のCSF中に見られるものと同様の濃度のMgCl2を含み、すなわち該濃度は、天然のCSF中の濃度から好ましくは15%以内、より好ましくは10%以内である。好ましくは、該組成物は、天然のCSF中に見られるものと同様の濃度のグルコースを含み、すなわち該濃度は、天然のCSF中の濃度から好ましくは15%以内、より好ましくは10%以内である。代替的に、人工CSFは、被験体に組成物を投与するために使用される任意のカテーテル中での細菌の増殖の可能性を低減するように、グルコースを省いてもよい。
【００１７】
該組成物はさらに、他の活性剤を含み得る。本発明の医薬組成物はまた、任意の薬学的に許容され得る担体、アジュバントまたはビヒクルを含み得る。医薬組成物中で使用され得る薬学的に許容され得る担体、アジュバントおよびビヒクルとしては、限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などのバッファー物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレン-ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、任意の適切な経路で投与され得るが、好ましくは、注入を介して、特に神経カテーテルを介して、詳細には、対流強化送達により投与される。該医薬組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に許容され得る担体、アジュバントまたはビヒクルを含み得る。
【００１９】
該医薬組成物は、滅菌注射可能製剤の形態で存在し得、例えば滅菌注射可能水性懸濁液または滅菌注射可能油性懸濁液として存在し得る。この懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤(例えばTween 80など)および懸濁化剤を使用して、当該技術分野に公知の技術に従って製剤化され得る。該滅菌注射可能製剤はまた、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能溶液または滅菌注射可能懸濁液であり得、例えば1,3-ブタンジオール中の溶液として存在し得る。許容され得るビヒクルおよび溶媒の中で、使用され得るものは、マンニトール、水、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液である。また、溶媒または懸濁化媒体として、通常、滅菌性の固定油が使用される。この目的のために、合成モノ-またはジグリセリドなどの任意の弱刺激性固定油が使用され得る。天然の薬学的に許容され得る油、例えばオリーブ油またはひまし油、特にそれらのポリオキシエチル化型のもののように、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸が、注射可能物質の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、Ph. Helvもしくは同様のアルコールなどの長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含み得る。
【００２０】
該組成物はさらに、特に投与後の組成物の識別または可視化を可能にする標識を含み得る。放射性標識などの任意の適切な標識が使用され得る。かかる標識は当該技術分野で公知である。
【００２１】
本発明の第2の局面は、治療における使用のための第1の局面の組成物を提供する。
【００２２】
本発明の第3の局面は、神経学的疾患の治療における使用のための第1の局面の組成物を提供する。
【００２３】
本発明の第4の局面は、神経学的疾患の治療を必要とする被験体に、本発明の組成物を投与する工程を含む、神経学的疾患を治療するための方法を提供する。
【００２４】
本発明の第5の局面は、被験体にアルブミンまたはその機能的断片を投与する工程を含む、遺伝子治療ベクターの、特に白質細胞への形質導入を改善するための方法を提供する。代替的に、該局面は、遺伝子治療ベクターを受ける被験体にアルブミンまたはその機能的断片を投与する工程を含む、遺伝子治療ベクターの治療有効用量を低減するための方法を提供する。治療有効用量は、ある面積またはある量の細胞の形質導入などの、特定の治療効果を達成するために必要な用量を意味する。治療有効用量の低減は、アルブミンの投与なしで必要とされる用量よりも少ない用量が投与され得ることを意味する。
【００２５】
本発明の第6の局面は、被験体にアルブミンまたはその機能的断片を投与する工程を含む、白質を通る治療剤の注入を改善するための方法を提供する。
【００２６】
本発明の第7の局面は、神経学的疾患、特に白質の疾患の治療における使用のためのアルブミンまたはその機能的断片を提供する。該アルブミンはまた、細胞または組織、特に白質、グリア細胞または神経膠腫細胞への遺伝子ベクターの形質導入を改善するためのものであり得る。
【００２７】
本発明の第8の局面は、神経学的障害の治療における使用のための治療剤を提供し、ここで該治療剤は、アルブミンまたはその機能的断片が投与された被験体への投与のためのものであるかまたはアルブミンまたはその機能的断片と同時の投与のためのものである。
【００２８】
第2〜第8の局面において、神経学的疾患は、好ましくは脳または脊髄の疾患、特に脳の疾患である。該神経学的疾患は癌、特に白質の癌、詳細には神経膠腫であり得る。代替的に、該神経学的疾患は、任意の他の適切な神経学的疾患、特に白質の疾患、例えば多発性硬化症であり得る。
【００２９】
特に、本発明の第5〜第8の局面において、アルブミンは、治療剤、特に遺伝子治療ベクターが投与される被験体における使用のためのものであり得る。好ましくは、該治療剤は、アルブミンの投与の前、該投与と同時、または該投与の後に投与される。好ましくは、アルブミンは、治療剤の直前または治療剤と同時の投与のためのものである。好ましくは、該治療剤は、脳または脊髄の疾患、特に脳の疾患の治療のためのものである。該疾患は、癌、特に白質の癌、詳細には神経膠腫であり得る。代替的に、該疾患は、任意の他の適切な神経学的疾患、特に白質の疾患、例えば多発性硬化症であり得る。該治療剤は、遺伝子治療剤、特に遺伝子治療ベクターであり得る。代替的に、該治療剤は、神経栄養因子などの薬剤、特にグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)；抗体もしくはその断片；免疫抑制剤；免疫調節剤、特にフィンゴリモド；サイトカイン、特にインターフェロン、例えばインターフェロン1αもしくはβ；または抗炎症剤であり得る。該治療剤、特に遺伝子治療ベクターは、好ましくは、通常の治療有効用量と比較して異なる、特に少ない用量での投与のためのものである。該用量は、実際に与える用量を低減することによって、または注入によって与えられる場合は、薬剤の流量を低減もしくは増加することによって、注入液(infusate)を希釈することによって、または注入が与えられる時間を増加もしくは低減することによって変更し得る。
【００３０】
好ましくは、アルブミンは等張溶液中、特に人工CSFの溶液中に存在する。人工CSFは、好ましくは本発明の第1の局面において定義される通りである。
【００３１】
好ましくは、被験体は哺乳動物、好ましくは霊長類、特にヒトである。該被験体は、好ましくは癌、特に脳癌、詳細には神経膠腫を患っている。
【００３２】
好ましくは、該組成物、アルブミンおよび遺伝子治療ベクターは、特に注入、最も好ましくは細いカテーテルによる脳への投与のためのものである。特に、該組成物、アルブミンおよび遺伝子治療ベクターは、対流強化送達による投与のためのものである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明はここで、以下の図面に関して、実施例のみによって説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図1は、ブタ注入デバイスを示す。このデバイスは、連続した(a series of)ジルコニアチューブで構築された(a)。このチューブの内側には、遠位端から3mm突出した、ある長さの溶融シリカ(外径220μmおよび内径150μm)があった。この溶融シリカは、最も近いものから、硬いカニューレから、可撓性のある長さのtecothaneチューブを介して三叉コネクタへと伸びた。図1bは、開通器定位ロボットアームのステレオガイド(stereo-guide)によって、小さなバールホール(burr-hole)を通って脳に挿入されるカニューレを示す。図1cは、シリンジ駆動機中に設置された2つのガラス製Hamiltonシリンジに取り付けられた三叉コネクタを示す。
【図２】図2は、HSV-1注入による組織損傷を示す。代表的な冠状組織学的切片は、HSV-1の注入後の線条(左)および白質(右)中の損傷を示す。白い実線は、注入カニューレの軌跡および位置を表す。白い点線は、ラットの脳内の灰白質と白質の境界を表す。上の白い点線の上に皮質がある。下の白い点線の下は、側脳室および中線隔壁(midline septum)の両側の線条体(striata)である。損傷した組織の縁にわずかな数のEGFP陽性細胞がある。
【図３−１】図3は、ラット線条およびラット白質中のHSV-1ベクターの分布を示す。遅い速度(0.5μl/分)、速い速度(2.5μl/分)、ヘパリンありおよび1% BSAありの組織の予めの注入の後でのHSV-1の注入。24、48および72時間での0.5μl/分(p=0.012)、2.5μl/分(p=0.013)のEGFP陽性細胞の数(a)および0.5μl/分(p=0.019)、2.5μl/分(p=0.011)のEGFP陽性細胞の分布の体積(b)。線条への注入後、24、48および72時間でのEGFP陽性細胞の数(c)およびEGFP陽性細胞の分布の体積(d)。P値は、標準バッファー中のベクター注入と比較する。
【図３−２】図3は、ラット線条およびラット白質中のHSV-1ベクターの分布を示す。遅い速度(0.5μl/分)、速い速度(2.5μl/分)、ヘパリンありおよび1% BSAありの組織の予めの注入の後でのHSV-1の注入。24、48および72時間での0.5μl/分(p=0.012)、2.5μl/分(p=0.013)のEGFP陽性細胞の数(a)および0.5μl/分(p=0.019)、2.5μl/分(p=0.011)のEGFP陽性細胞の分布の体積(b)。線条への注入後、24、48および72時間でのEGFP陽性細胞の数(c)およびEGFP陽性細胞の分布の体積(d)。P値は、標準バッファー中のベクター注入と比較する。
【図４】図4は、HSVおよびヘパリンの共注入に伴う出血を示す。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した冠状切片は、ラットの線条へのHSV-1およびヘパリンのCEDに基づく共注入を試みた後の過剰な出血を示す。平行の白い点線は、注入カニューレの軌跡および位置を表す。
【図５】図5は、HSV-1を注入したラットの白質への免疫細胞の浸潤を示す。代表的な画像は、白質中の広範囲のEGFP発現(a)、48時間でのED1陽性ミクログリア(b)およびCD8陽性T細胞(c)の白質への浸潤を示す。白質中で明らかな組織損傷がないことに留意のこと(白いバー=200μm)。輪郭で示されたボックスは、代表的な領域の高倍率画像を示す。グラフは、白質への成功裏のHSV-1ベクターの分布後の脳内のED1およびCD8陽性細胞の密度の急速な増加を示す(d)。
【図６】図6は、ラットの脳梁におけるHSV-1の形質導入の向性(tropism)を示す。代表的な画像は、白質におけるEGFP発現細胞(a)、GFAPについての免疫陽性(b)およびEGFPとGFAPの共局在(c)を示す。上部皮質(overlying cortex)中のEGFP発現細胞(d)。NeuNと共局在する皮質中の少数の形質導入された細胞(e)およびEGFPとNeuNの共局在(f)。表は、24、48および72時間での白質中のHSV-1の形質導入の向性を示す(g)。
【図７】図7：ブタ放線冠へのHSV-1注入(左半球画像)。画像は、脳梁、放線冠および上部皮質中のEGFP陽性細胞を示す(a〜g)。EGFP陽性細胞は、レンズ核中の静脈の周囲の脈管周囲空間に濃縮された(h)。中央の切片は、カニューレの軌跡に沿った染色していない冠状組織切片である。カニューレ先端の部位に明らかに目に見える出血がある。注入部位の周囲のT2強調(weighted)冠状MR画像(i〜k)は、放線冠を通って広がる高いシグナルの証拠を明確に示す。
【図８】図8、ブタ放線冠へのHSV-1注入(右半球画像)。中央の切片は、カニューレの軌跡に沿った染色していない冠状切片である。カニューレの溶融シリカ先端の位置を矢印で示す。画像1〜6および8は、脳梁、放線冠および皮質中のEGFP陽性細胞の広範囲の分布を示す(a〜f、h)。大量のEGFP陽性細胞は、レンズ核線条体動脈の分枝の脈管周囲空間に濃縮された(g)。T2強調冠状MR画像(i〜k)は、放線冠を通って広がる高いシグナルの明確な証拠を示す。(白いスケールバーは200μmを表す)。
【図９】図9：ブタ放線冠におけるHSV-1の形質導入の向性。代表的な画像は、ブタ放線冠におけるEGFP発現細胞を示す。これらの細胞の大部分は、星状細胞についてのマーカー(GFAP)または活性化ミクログリアについてのマーカー(ED1)と共局在した。EGFP発現細胞(a)、ED1発現細胞(b)およびEGFPとED1を重ねたもの(c)の代表的な顕微鏡写真。EGFP発現細胞(d)、GFAP(e)およびEGFPとGFAPを重ねたもの(f)の顕微鏡写真。
【実施例】
【００３５】
導入
悪性神経膠腫は最も一般的な原発性脳腫瘍であり、ほぼ常に不治である。このことの決定的な理由としては、これらの腫瘍が高度に浸潤性であること、腫瘍に化学抵抗性が本来備わっていること、および毒性を引き起こすことなく脳内で化学療法の治療濃度を達成することが困難なことが挙げられる。対流強化送達(CED)による腫瘍崩壊性ウイルスベクターの実質内の直接投与は、有望な新規の治療戦略を提示する。しかしながら、HSV-1程度の大きさの腫瘍崩壊性ウイルスをCEDにより投与できることを示唆する証拠はない。この研究において、HSV-1ウイルスベクターを投与する能力は、小さな動物モデル(ラット)および大きな動物モデル(ブタ)の両方の灰白質および白質において詳細に評価された。
【００３６】
EGFPレポーター遺伝子を発現するHSV-1系ベクターの、ラットの線条および脳梁ならびにブタの放線冠への注入は、CEDと適合性の注入パラメーターを使用して行った。それぞれの注入後の形質導入された細胞の分布の体積および数は、立体解析学的方法を用いて決定した。ベクターの形質導入の向性を決定するためおよび脳への免疫細胞の浸潤の存在を評価するために免疫組織化学を使用した。速い流速の注入、ヘパリンの共注入または等張アルブミン溶液を用いての組織のへのプレ注入を使用するなどのベクター分布を改善させるための戦略を評価した。
【００３７】
遅い注入速度(0.5μl/分)および速い注入速度(2.5μl/分)の両方でのラットの灰白質および白質へのHSV-1注入により、広範囲の組織損傷およびごくわずかな細胞形質導入が起こった。非特異的なベクターの結合を最小化するための低濃度のヘパリンとの共注入により、広範囲の出血が起こった。等張アルブミン溶液での組織のプレ注入により、白質中の広範囲のベクター分布および細胞形質導入が促進されたが、灰白質におけるベクター分布は改善されなかった。ブタの脳においてこのアプローチを使用すると、注入部位に対して遠位の皮質および脈管周囲空間において形質導入された細胞を有する、星状細胞および活性化ミクログリアの広範囲の形質導入を有する広範囲のベクター分布が起こった。ラットの脳において、EGFP発現のピークは、ベクター投与後48時間であり、ED1陽性ミクログリアおよびCD8陽性T細胞の浸潤を特徴とする活発な免疫応答を伴った。
【００３８】
HSV-1系ウイルスベクターの脳への直接注入により、最小限のベクター分布、ごくわずかな細胞形質導入および広範囲の損傷が引き起こされる。ベクター投与の前の等張溶液での組織のプレ注入は、広範囲のベクター分布を達成するための実用的でかつ非常に効果的な技術を提示し、該細胞のプレ注入は、HSV-1系ウイルスベクターを使用する進行中および将来の臨床試験において採用されるべきである。
【００３９】
方法
ベクター
ICP4およびICP27遺伝子中にヌル突然変異を有し、CMVプロモーターの制御下で強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現するHSV-1ウイルス構築物は、好意によりBiovexから提供された。
【００４０】
ベクター注入
全ての手順は、英国内務省動物福祉規則および適切な内務省免許に従って行った。
【００４１】
ラット注入装置および手順
外径220μmおよび内径150μmのある長さの溶融シリカから鋭形の注入カニューレを構築した。Hamiltonシリンジのチャンバーと溶融シリカの内腔の間に封(seal)を作製するように働き、溶融シリカカニューレを、Hamiltonシリンジから、硬膜を通過して、脳へと誘導する自社製の連結デバイスを介して、これらのある長さの溶融シリカを10μlのHamiltonシリンジに連結した。次いで、このコネクタデバイスを介してカニューレを取り付けたHamiltonシリンジを、ラットが固定された定位フレーム(Stoelting Co, Wood Dale, IL USA)に取り付けられた注入ポンプ(World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL, USA)に据え付けた。カニューレを挿入するために、ポンプ/シリンジ/コネクタ/カニューレの構築物の全体を、標的の深さに到達するまで、定位フレーム中で下げた。
【００４２】
雄のWistarラット(B & K, UK)を群で収容して、実験手順の前に慣らした。体重225〜275gの雄ラットを、ケタミンおよびキシラジンの腹腔内投与で麻酔して、定位フレーム(Stoelting Co, Wood Dale, IL USA)に置いた。グラベラと後頭の間で直線状の切開を行い、頭蓋骨を露出させた。直径約2mmのバールホールを、ブレグマの0.5mm前方、2.75mm側方に開け、線条を標的とする場合は硬膜の下5mmの深さまで、脳梁を標的とする場合は2mmの深さまでカニューレを挿入した。脳に挿入する前に、全てのカニューレにベクターを予め充填した(pre-primed)。全ての試みは、注入カニューレ内に気泡が入らないことを確実にするように行った。全てのベクター注入は1x107pfu/mlの濃度で4μlとした。使用した注入パラメーターに基づいて、動物を4つの群再分した(表1)。ヘパリン共注入は、ウイルス注入物と2μlの5000IU/mlヘパリン(10IUのヘパリン)を混合して達成した。ウシ血清アルブミン(BSA; Sigma, UK)と滅菌食塩水を混合した。組織のBSAのプレ注入は、4μlの等張1% BSAを、ベクター注入の直前に、線条および脳梁に注入して達成した。注入の完了時に、カニューレを5分間、その部位に残し、その後1mm/分の速度で除去した。次いで、傷を4/0バイクリルで閉じ、一用量の筋肉内ブプレノルフィンを投与し(30μg/kg)、麻酔薬を0.1mg/kg腹腔内用量の塩酸アチパメゾール(Antisedan; 200μg/kg; Pfizer, Kent, UK)で逆転させた。
【００４３】
それぞれの群内で、動物を、深い全身麻酔状態下で100mlのリン酸緩衝化食塩水、続いて100mlの4%パラホルムアルデヒド(pH7.4)を用いて、かん流固定により24、48、72または96時間の時点で屠殺した。次いで頭蓋骨から脳を取出し、4%パラホルムアルデヒド(pH7.4)中に48時間入れ、次いで30%スクロースで凍結保護し、その後切片を作製した。
【００４４】
ブタ注入装置および手順
体重45kgの雄の大きな白色ランドレースブタに、ケタミンの一筋肉内用量(0.1mg/体重kg)を投与した。次いで全身麻酔を誘導して、イソフルラン(2〜5%)で維持し、動物に、カフ付き(cuffed)気管内チューブを挿管した。耳静脈内に配置したカニューレを使用して、静脈内アクセスを得て、250ml/時の速度で通常の食塩水を注入した。
【００４５】
ブタの頭部の固定は、両側のMRI適合性頬骨ネジ、成形可能口蓋トレイおよび鼻ストラップを組み込んだ、特別注文の固定デバイスを使用して達成した。全ての物質は、画像化アーティファクトを防ぐように、充分にMR適合性であった。ブタ頭部の強固な固定の後、動物の頭部の上に基準の弧(arc of fiducial)を配置した。次いで頭部の側面(lateral aspects)にフレックス-L(Flex-L)コイルを取り付け、動物を1.5T MRIスキャナー(Intera, Phillips)に移した。開通器(Prosurgics, UK)定位ロボットアームおよび関連するソフトウェアを使用して、定位外科的プランニング(planning)および手順を行った。簡潔に、この定位アームは以下のように機能した。動物の頭部上の決まった位置に配置された多くの(an array of)基準ボール(fiducial ball)を用いてブタの画像を撮った。手術室(In theatre)で、基準ボールを、正確に同じ位置に配置した光学反射ボールに置き換えた。反射ボールの位置は、ロボットアームの下側にあるカメラを使用して視覚化した。光学反射ボールおよびMRI基準を一緒に、プランニングソフトウェアにより自動的に記録した。ソフトウェアは、1つの面からMR画像を視覚化するのみであった。結果的に、冠状画像は、計画されたカニューレの軌道の最良の視野を容易にしたので、該冠状画像を全ての外科的プランニングに使用した。外科的手順を実行するために、バールホール形成およびカニューレ送達ツール形成(tooling)に適合するように設計されたある範囲のエンドエフェクター(end-effector)をロボットアームの上に配置した。
【００４６】
硬いジルコニアチューブにより鋭形の送達カニューレの遠位の長さに沿って支持された溶融シリカチューブ(外径220μmおよび内径150μm)を組み込んだ、ベクター注入のための鋭形の送達カニューレを開発した。ウイルス注入の前の1% BSAの組織へのプレ注入を容易にするために、2つのシリンジを鋭形のカニューレの溶融シリカチューブに直接取り付けることができるように、溶融シリカのラインを引いた(fused silica-lined)三叉コネクタを開発した(図1)。これにより、カニューレを放線冠に挿入して、カニューレにウイルスを再充填するためにカニューレを取り外す必要なく、BSAおよびウイルスの注入を実施できることが確実になった。以下のように、それぞれの半球の放線冠への80μlのベクター(1x107pfu/ml)の注入を行った。
【００４７】
左半球：カニューレを標的より8mm手前まで挿入し、1% BSAのプレ注入を、1μl/分で2分間、2.5μl/分で2分間、次いで5μl/分で7分間行った(総BSA体積、42μl)。次いで、5μl/分の速度で8分間ベクターを注入した(総ベクター体積、40μl)。次いでカニューレを標的に挿入して、BSAプレ注入を1μl/分で2分間、2.5μl/分で2分間、その後5μl/分で4分間繰り返した(総BSA体積、42μl)。次いで、5μl/分の速度で8分間ベクターを注入した(総ベクター体積、40μl)。
【００４８】
右半球：カニューレを標的に挿入して、1% BSAのプレ注入を、1μl/分で2分間、2.5μl/分で2分間、次いで5μl/分で7分間行った(総BSA体積、42μl)。直後に、80μlのベクターを5μl/分の速度で16分間注入した(総ベクター体積、80μl)。
【００４９】
注入の完了後、カニューレを10分間そのままの位置に残し、その後、手でゆっくりと引き抜いた。バールホールおよびカニューレの軌跡からのCSFの漏れをCerebondでふさぎ、その後傷を閉じた。次いで動物をMRIスキャナに移し、T2強調画像化を行って、カニューレが標的に正確に挿入されたことを確認した。28日間で動物は回復し、その後終末麻酔下でかん流固定により屠殺して、組織学的分析のために脳を回収した。
【００５０】
組織学
Leica CM1850クリオスタット(Leica Microsystems, Germany)を使用して、ラットの脳を35μmの厚さの冠状切片に切断した。Leica SM2500ミクロトームを使用して、ブタの脳を100μmの冠状切片に切断した。選択した切片に対して免疫組織化学を行った。簡潔に、免疫組織化学のための全ての溶液は、リン酸緩衝化食塩水(PBS)中で作製した。自由に動くPFA固定切片をPBS中で15分間、3回洗浄し、3%過酸化水素中でインキュベートして、内因性のペルオキシダーゼ活性を除去した。次いで、切片をPBS中で15分間、3回洗浄し、その後、ブロッキング溶液(10%正常ヤギまたはロバ血清)中、室温で1時間ブロッキングした。次いで切片を、ブロッキング溶液から、ブロッキング溶液中に適切に希釈した一次抗体に直接移し、一晩インキュベートした。以下の一次抗体を使用した：マウス抗NeuN (1:300; Chemicon, UK)、ウサギ抗GFAP (1:200; Chemicon)、マウス抗ED1 (1:100; Serotec, UK)、マウス抗CD4 (Ox38)(1:300; Serotec, UK)およびマウス抗CD8 (ox 8)(1:300; Serotec, UK。PBSで3回洗浄後、切片を、二次抗体とともに室温で少なくとも2時間インキュベートした。蛍光免疫組織化学のために、種特異的二次抗体(Cy3)を使用した(1:200; Jackson Laboratories, CA, USA)。PBSで洗浄後、切片を、ゼラチンコートスライドガラス上のVectashield(Vectorlabs, CA, USA)にマウントしてカバーガラスをかけ、その後蛍光画像化を行った。
【００５１】
画像化
Leica DM5500顕微鏡(Leica Microsystems, Germany)およびデジタルカメラ(Microbrightfield, USA)を使用して蛍光画像化を行った。市販のソフトウェア(Stereoinvestigator, Microbrightfield)を使用して、免疫染色した切片に対して立体解析学的計測を行った。簡潔に、代表的な組織切片において母集団推定(population estimate)を行い、計測フレームサイズ、計測フレーム数ならびに0.1未満のGundersen (m=1)誤差係数(Gundersen (m=1) coefficient of error)を有する正確な細胞計測を達成するために必要な組織切片の数および分離(separation)を決定した。次いで、これらのパラメーターを使用して、光学分別機プローブを用いて等間隔の連続切片に対して細胞計数を行った。形質導入された細胞の分布の体積を、それぞれの切片上のEGFP発現細胞の外縁の周囲の輪郭をたどることによって計算した。線条の外側の形質導入された細胞をこれらの輪郭から除外して、線条内の形質導入された細胞の分布の体積のみが計算されることを確実にした。脳室系へのベクターの明らかな漏れに関連した注入は、さらなる解析から除外した。それぞれの注入についてのウイルス分布の体積中の活性化ミクログリアならびにCD4およびCD8陽性Tリンパ球のベクター細胞向性および密度の測定を、分別機プローブを使用して、針の軌跡の近くにある選択された組織切片に対して行った。
【００５２】
統計解析
分散分析(ANOVA)に関してTukey's検定を使用して、異なる注入パラメーターに関連するベクター分布および細胞形質導入に有意な差があったかどうかを決定した。
【００５３】
結果
ラット線条および白質へのHSV注入
0.5μl/分の流量でのラットの線条および白質の両方へのHSV-1の注入は、広範囲の組織損傷および注入部位のごく近位でのごくわずかな数の細胞の形質導入を伴った(図2)。形質導入された細胞の分布の体積および数の改善を試みて、カニューレ先端で達成される圧力を上げるために、より早い流量(2.5μl/分)で注入を繰り返した。しかしながら、低レベルの細胞形質導入およびウイルスにより形質導入された細胞の乏しい分布を伴う同様のパターンの広範囲の組織損傷が観察された。
【００５４】
ウイルスにより形質導入された細胞の乏しい分布およびHSV注入に関連する広範囲の組織損傷は、カニューレ先端のすぐ周囲の組織におけるウイルス粒子の凝集により生じるか、または比較的大きなウイルス粒子(直径約250μm)が狭い細胞外空間に押し込まれるために生じるという仮説が立てられた。結果的に、これらの仮説を試験するための2つの戦略が開発された。カニューレ先端の周りでの多くのウイルスの結合を最小限にすることを試みて、ヘパリン溶液中で注入を繰り返した。0.5μl/分および2.5μl/分での(標準バッファー中での)ベクターの注入と比較して、ヘパリンの存在下では形質導入された細胞の数およびウイルスにより形質導入された細胞の分布の体積が増加したが、これは統計的に有意ではなかった(図3aおよびb)。対照的に、ウイルス注入の直前の1%ウシ血清アルブミン(BSA)の等張溶液を用いた白質へのプレ注入により、形質導入された細胞の数および形質導入された細胞の分布の体積の両方において有意な増加が生じ、その両方のピークは注入後48時間であった(図3aおよびb)。0.5μl/分および2.5μl/分での(標準バッファー中の)ベクター注入と比較して、この効果は、形質導入された細胞の数(それぞれp=0.012およびp=0.013)および形質導入された細胞の分布の体積(それぞれp=0.019およびp=0.011)の両方で統計的に有意であった。この効果は線条では観察されなかった。図4に、HSVとヘパリンの共注入に関する出血を示し、そのために、このアプローチは臨床的に実行できないことを示す。
【００５５】
成功裏のHSV注入後の白質への免疫細胞浸潤
白質への1% BSAのプレ注入により、注入に関連する有意な組織損傷なしで広範囲の細胞形質導入が可能になった(図5a)。EGFP陽性細胞の数およびEGFP陽性細胞の分布の体積のピークは48時間であった。しかしながら、白質におけるHSV-1ウイルス粒子の広範囲の分布は、ED1陽性ミクログリア(図5b)およびCD8陽性T細胞(図5c)の両方の迅速な浸潤を生じ、これは24〜72時間の間に増加した(図5d)。
【００５６】
白質におけるHSV-1の形質導入の向性
1% BSAの組織へのプレ注入後の白質における効果的なHSV-1分布により、GFAP陽性星状細胞の広範囲の形質導入が誘導された(図6a、bおよびc)。白質における形質導入された細胞の数および形質導入された細胞の分布の体積の分析には含まれなかったが、細胞は、上部皮質(overlying cortex)においても形質導入された。形態学的にこれらの細胞の大部分は星状細胞であったが、これらの細胞のいくらかは、神経マーカーNeuNと共局在した(図6d、eおよびf)。白質における形質導入された細胞の大部分は、GFAPと共局在したが、ED1陽性活性化ミクログリアの有意な割合も形質導入された(図6中の表)。24〜72時間の間の星状細胞またはミクログリア細胞の形質導入の割合において有意な差はなかった。
【００５７】
HSVのブタ注入
ラットの白質において組織への1% BSAのプレ注入により広範囲のHSV-1ベクター分布が可能になることを決定したので、このアプローチの実践を、ブタモデルにおけるより大きな体積の脳で評価した。放線冠内のカテーテルの軌跡に沿った2つの部位で左半球への注入を実行したのに対して、右半球では、放線冠内の1つの部位で全ウイルス溶液を注入した。動物は2日で回復して、この時点では異常な神経学的徴候は示さなかった。
【００５８】
左側では、近位の注入はカニューレ先端での損傷を伴わなかった。対照的に、遠位の標的部位での注入は、直径約3mmの小さな出血を生じた(図7、中央パネル)。この損傷にもかかわらず、EGFP陽性細胞の広範囲の分布は、放線冠中ならびに前頭皮質、脳梁および島の遠位部位において観察された(図7a〜g)。さらに、EGFP陽性細胞は、注入部位から非常に離れた脈管周囲空間、特にレンズ核線条体動脈の近位に局在することが見られた。EGFP陽性細胞が脈管周囲空間に限局されることを除いて、形質導入された細胞は、注入部位から15mmまでの脳実質において観察された。注入部位の周囲のT2強調冠状MR画像(図7i〜k)は、放線冠およびそれに加えて出血領域にわたって広がる高いシグナルの証拠を明確に示す。
【００５９】
右半球での注入は、カニューレ先端での損傷を伴わなかった(図8、中央パネル)。EGFP陽性細胞の広範囲の分布は、放線冠および上部皮質ならびに脳梁および側頭葉の皮質まで観察された(図8a〜f、h)。左半球と同様に、EGFP陽性細胞は、レンズ核線条体動脈の分枝の周囲の脈管周囲空間に存在した(図8g)。
【００６０】
注入のT1強調MR画像は、放線冠における広範囲の高いシグナルの領域を示した。組織学的に、高いシグナルの領域の全ては、ウイルスにより形質導入された組織の領域に対応した。しかしながら、EGFP発現細胞は、高いシグナルの領域の境界のかなり上にも存在したが、注入部位から離れた細胞の形質導入がCEDよりもむしろ注入されたベクターの軸索輸送(axonal transport)または脈管周囲輸送(perivascular transport)により生じ得たということはありそうなことである。
【００６１】
図9は、ブタの放線冠におけるHSV-1を形質導入された細胞により誘発された免疫応答を示す。EGFPを発現する形質導入された細胞はED1と共局在し(図9a〜c)、これは、CD68発現ミクログリアおよびそれに加えてGFAPの存在を示す(図9d〜f)。
【００６２】
考察
高度の神経膠腫は高度に浸潤性の腫瘍である。主な腫瘍塊はしばしば、手術および/または放射線療法により効果的に治療され得るが、浸潤腫瘍細胞を破壊することは技術的に困難である。ベクター媒介性の腫瘍崩壊が効果的であることを証明するためには、最初のベクター投与で可能な限り多くの腫瘍細胞を形質導入するという多大な必要がある。しかしながら、これらの腫瘍は大きな面積の壊死を含むので、直接的な腫瘍内ベクター送達は有効であるとは思われず、そのためこの研究の焦点ではない。このことは、高度の神経膠腫の治療における有効性の説得力のある証拠を示すための以前の臨床試験の失敗に反映されている(7〜9)。実際、より最近の研究の焦点は、複製選択性HSVベクターを腫瘍周囲組織に投与することである(6)。CEDにより脳における広範囲のベクター分布を達成することは可能であるので、CEDは、臨床実務において、腫瘍崩壊性の複製選択性ベクターの送達のための最も合理的なアプローチである。しかしながら、120〜300nmの直径を有するHSV系ベクター(Jacobs et al, 1999)が、80nmまでの直径を有する脳の細胞外空間を通って注入され得るかどうかは疑わしかった(Thorne and Nicholson, 2006)。そのため、この研究において、CEDにより複製選択的HSV-1ベクターを正常な脳に投与することの実行可能性は詳細に試験された。HSV系ベクターの直接頭蓋内投与を含んだ多くの前臨床研究(17、18、20〜24、26-41)にかかわらず、顕著なことに、これは、灰白質および白質の両方において適切な注入パラメーターを使用して、HSV-1ベクターの分布特性を評価するために最初に公表された研究ならびにベクター分布を改善するための戦略の評価を提示する。
【００６３】
脳の細胞外空間とHSV-1粒子の間の直径のサイズにおける食い違いを考慮すると、0.5μl/分でのベクター注入により、灰白質および白質の両方において広範囲の組織損傷が引き起こされ、組織へのベクターの浸透が最小限であることは驚くべきことではなかった。この損傷を考慮すると、高い流量での注入およびそのための高い圧力は、脳の細胞外空間を広げることによりベクター分布を改善させるかもしれないという仮説が立てられた。しかしながら、同様のレベルの組織損傷が観察され、ベクター分布は不良であった。この組織損傷は、腫瘍内にHSV1716を注射された2人の患者の脳における注入部位に嚢胞性の空洞を見出したRamplingら(2000)によりなされた死後の観察と類似点を示す。
【００６４】
ヘパラン硫酸プロテオグリカン(heparin sulphate proteoglycan)は、HSV-1(WuDunn and Spier, 1989；Shieh et al, 1992)、および血清型2組み換えアデノ随伴ウイルス(rAAV2)などの多くの他のウイルスの細胞表面受容体として働くことが知られている。実際、ヘパリンの共注入は、おそらくはヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合するウイルスの競合的拮抗作用により、成体のラットの線条においてrAAV2の分布を改善することが示されている(Nguyen et al, 2001)。さらに、Mastakovら(2002a)は、500〜5000IU/mlの濃度でのヘパリン共注入は、レポーター遺伝子転移の分布を有意に改善するが、高濃度は致死性の脳内出血を伴うことを示した。しかしながら今日まで、HSV-1とヘパリンの共注入は報告されていない。
【００６５】
この研究において、5000IU/mlの濃度でのHSVの共注入は、EGFP発現の分布のわずかな増加をもたらしたが、動物は、灰白質および白質の両方において、臨床的には検出できないが、広範囲の脳内出血を発症した。ヘパリンの非存在下でのHSV-1の注入に関連する広範囲の損傷を考慮すると、ヘパリンの共注入がこの広範囲の出血を引き起こしたことは驚くべきことではない。このように、このアプローチは、臨床的な実施において有意に価値があるとは思われない。
【００６６】
多くの研究により、HSV-1と同様のサイズのナノ粒子のCEDに基づく分布の特性が評価されている。Chenら(2005)およびMacKayら(2005)は、直径200nmのポリスチレンナノ粒子およびリポソームが、ラットの線条に短い距離のみ浸透したことを示した。しかしながら興味深いことに、Chenら(2005)は、該ナノ粒子をアルブミンでコーティングして疎水性粒子表面を覆うことで、それらの分布が有意に改善されることを示した。さらに、Neevesら(2007)は、線条に等張食塩水をプレ注入することで、ラットの線条において、直径53nmのポリスチレンナノ粒子の分布が有意に改善されることを示した。この効果は、脳の細胞外マトリックスを分解するヒアルロニダーゼまたは細胞外空間を浸透により広げる高浸透圧マンニトールのプレ注入により観察されたものよりも大きかった。
【００６７】
この研究において、非特異的結合をさえぎり、脳の細胞外空間の等浸透圧性拡張を達成するためのアルブミン前処理の使用は、一緒になって(amalgamated)、複製選択性HSV-1ベクターの投与を容易にした。このアプローチは、ラットおよびブタの脳の白質におけるベクターの広範囲の分布を容易にしたが、ラットの灰白質では成功しなかった。しかしながら、これらの結果は、組織への適切なプレ注入により、白質において非常に広範囲のベクター分布が可能になることを明確に示している。ブタモデルを使用することの主な利点は、これらの動物が、多くの霊長類の脳よりも(that)大きい大きな皺脳を有し、ヒトの研究に直接変換し得る規模の薬物送達カニューレを用いた大きな体積の注入に適応し得るということであった。実際、将来の臨床試験においてこのカニューレ系を利用することを本発明者らは意図している。
【００６８】
灰白質ではなく白質においてHSVを分布させる能力は、おそらくは白質のより高い弾性、および、それに次いで注入体積に適応する白質のより大きな収容力に関連する(Bobo et al, 1994)。実際、有髄軸索の微小構造の配向は、脳の細胞外空間の実験的に誘導された拡張の存在下で希突起神経膠細胞的プロセスを介して保存されることが示されている(Marmarou et al, 1980)。結果として、白質への等張アルブミン溶液のプレ注入により広範囲のベクター分布が可能になるが、灰白質構造中で生じたかまたは灰白質構造に浸潤した腫瘍細胞を適切に標的化するためにこのアプローチを使用することは実行可能でないかもしれない。しかしながら興味深いことに、放線冠へのベクターの注入後にブタの皮質中の形質導入された細胞の明らかな証拠があった。ラットの脳において灰白質にHSVを分布できないことを考慮すると、皮質細胞の形質導入は、注入部位からのベクターの軸索輸送または脈管周囲輸送により生じた可能性があると考えられる。HSVが白質中でミ有髄軸索を効率的に形質導入し得る可能性は低いと思われ、脈管周囲空間における形質導入された細胞の観察された分布を考慮すると、これら2つの機構の後者が最も可能性が高いように思われる。
【００６９】
白質中のベクターの成功裡の分布により、活性化ミクログリアおよびCD8陽性T細胞の迅速な浸潤を特徴とする活発な免疫応答が生じた。しかしながら、ED1も虚血性脳傷害および外傷性脳傷害における好中球のマーカーであることのいくつかの証拠があり(41)、そのため、これらの浸潤細胞の真の正体はさらに試験する価値があり得る。脳腫瘍の治療の文脈において、抗HSV CD8応答の誘導は、腫瘍細胞の殺傷を高めるというさらなる利益を有し得る(Todo et al, 1999)。しかしながら、動物は検出可能な神経学的な欠損を生じないが、脳における広範囲の分布およびHSV-1ベクターでの細胞の形質導入の長期間の結果ならびに結果的な激しい免疫応答は、注意深く評価する必要がある。この必要性は、かなりのベクターが、比較的に免疫特権を持つ(immune-priviledged)脳から全身性の循環へと逃げてその後、適応性の免疫応答(adaptive immune response)を生じるという可能性により強調される。現実的に、このことは、カニューレ埋め込みに関連する組織損傷、注入に関連する損傷または脈管周囲空間に沿ったベクターの排液(drainage)により媒介され得た。抗原提示樹状細胞は、炎症を起こしていない脳に存在しないが、樹状細胞は、脈管周囲空間およびCSFに存在し、そこに、脈管周囲空間が排液するので、このことは特に重要である(McMahon et al, 2006)。
【００７０】
ウイルスベクターがCSFに漏れて免疫応答が生じる潜在的なリスクは、ベクター分布を臨床的に可視化することの重要性を強調する。このように、ベクター分布の代理マーカーとして働く多くのT1造影剤およびT2造影剤が開発されている(Szerlip et al, 2007；Fiandaca et al, 2008)。しかしながら、ベクターと代理マーカーの共注入は、遺伝子治療ベクターの脳への臨床的投与にかなりの複雑さと調節上の障害を付加する。この研究において、注入関連水腫を視覚化することを試みて、T2強調MR画像化を行った。これらの画像は、白質における形質導入された細胞の位置と組織学的に対応する注入の近位における高いシグナルの領域を明確に示したが、細胞形質導入は、この高いシグナルの端を超えて明らかに広がっていた。しかしながら、CEDにより直接達成された分布を増大させる明らかなベクターの脈管周囲輸送および可能性のあるベクターの軸索輸送を考慮すると、代理マーカーまたはMR画像化の使用が、HSVベクターにより媒介された形質導入された細胞の最終的な分布の現実的な予測をもたらすということはほとんどありえない。
【００７１】
まとめると、この研究の証拠により、標的組織にプレ注入を行って脳の細胞外空間を拡張させない限り、HSV-1ベクターは、大きすぎてCEDにより有効に分布できないということが示唆される。この所見は、脳腫瘍を有する患者を治療するためのHSV系ウイルスベクターの使用を含む臨床試験の結果の解釈における、重要な含み(implication)を有する。実際に、このデータは、これらの試験で使用された注入法が、おそらくはごくわずかなベクター分布をもたらしたということを示唆する。しかしながら、将来の臨床試験においてこの所見を利用することは、形質導入される腫瘍細胞の数を最大限にして、それにより治療効果の可能性を最大限にすることにより患者の結果を改善する可能性を有する。
【００７２】
参考文献
【数１】
0006010047.tif 000002
【数２】
0006010047.tif 000003
【数３】
0006010047.tif 000004
【数４】
0006010047.tif 000005
【００７３】
【表１】
0006010047.tif 000006
【図１】
0006010047.tif 000007
【図２】
0006010047.tif 000008
【図３−１】
0006010047.tif 000009
【図３−２】
0006010047.tif 000010
【図４】
0006010047.tif 000011
【図５】
0006010047.tif 000012
【図６】
0006010047.tif 000013
【図７】
0006010047.tif 000014
【図８】
0006010047.tif 000015
【図９】
0006010047.tif 000016