(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物の生体内において再生歯胚を培養する再生歯ユニットの製造方法であって、下記工程を含み、
スペーサーを準備する工程、
前記再生歯胚を前記スペーサー内において前記非ヒト哺乳動物の生体内に配置する工程、
前記再生歯胚を前記非ヒト哺乳動物の生体内において培養する工程、
ここで、
前記スペーサーは、金、銀、鉄、銅、アルミニウム、ポリエチレン、樹脂、歯科用レジン、または歯科用セメントから選択される材質からなる、前記再生歯胚が最大許容値以上に伸長することを防止可能、且つ、内部に配置された再生歯胚がスペーサー外部と連通可能な、略円筒状構造物であり、
再生歯胚を培養する際、前記非ヒト哺乳動物の外部から機械的刺激を与える工程をさらに含む、
製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、
前記再生歯胚を前記スペーサー内において前記非ヒト哺乳動物の生体内に配置する工程は、再生歯胚の将来咬合面になる部位が前記スペーサーの内壁付近に面するように配置し、且つ将来根尖になる部位が前記スペーサーの当該内壁とは反対方向のより広い空間に向けて伸長するように配置する工程であることを特徴とする製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、
前記再生歯胚を前記スペーサー内において前記非ヒト哺乳動物の生体内に配置する工程は、前記スペーサー内を満たす支持担体によって前記再生歯胚が支持されるように配置されることを特徴とする製造方法。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記再生歯胚は、間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて支持担体内部に配置されて培養・維持されたものであり、間葉系細胞と上皮細胞の少なくともいずれか一方が歯胚由来であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記機械的刺激は、約２００００Ｈｚ〜約４００００Ｈｚの振動であることを特徴とする製造方法。
【請求項６】
前記スペーサーは、所望の再生歯ユニットのサイズを有する再生歯ユニットを発生させることができる内部空間を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記スペーサーは、該筒の高さが、所望の再生歯ユニットの厚みより大きく、該筒の内径が、再生歯ユニットの長さの略最大許容値である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記スペーサーが、円筒状である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含み、前記スペーサー内において個別に調製された複数の再生歯胚を互いに隣接させて配置することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の再生歯ユニットの製造方法であって、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含み、前記スペーサー内において個別に調製された複数の再生歯胚を、各再生歯胚の将来咬合面になる部位の中心と将来根尖になる部位の中心とを結んだ軸線の方向を略並行にそろえて配置することを特徴とする方法。
【請求項１２】
哺乳動物の生体内において再生歯胚をその中にいれて培養することにより再生歯ユニットを製造するためのスペーサーであって、金、銀、鉄、銅、アルミニウム、ポリエチレン、樹脂、歯科用レジン、または歯科用セメントから選択される材料からなる、前記再生歯胚が最大許容値以上に伸長することを防止可能、且つ、内部に配置された再生歯胚がスペーサー外部と連通可能な、略円筒状構造物であることを特徴とするスペーサー。
【請求項１３】
請求項１２に記載のスペーサーであって、前記スペーサーの内部に配置された再生歯胚が、個別に調製された複数の再生歯胚を含むことを特徴とするスペーサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大きさ及び形状を制御可能な再生歯ユニットの製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯は、最外層にエナメル質、その内層に象牙質という硬組織を有し、さらにその内側に象牙質を産生する象牙芽細胞、中心部に歯髄を有する器官である。歯は、齲蝕や歯周病によって失われることがあるが、歯の有無は外見や食べ物の味覚に大きく影響し、また健康維持や質の高い生活を維持するため、歯の再生技術への関心が高まっている。
歯は、胎児期の発生過程の誘導によって形成され、複数の細胞種によって構築された機能単位である。そのため、歯は、成体内の造血幹細胞や間葉系幹細胞のような幹細胞から細胞種が発生する幹細胞システムによって発生するのではなく、現在、再生医療によって進められている幹細胞の移入のみ（幹細胞移入療法）では歯を再生することはできない。歯の発生過程で特異的に発現する遺伝子を同定し、歯胚を人為的に誘導することによる歯の再生も検討されているが、遺伝子を特定しただけでは、歯の再生を完全に誘導することはできない。【０００３】
そこで、近年、単離された歯胚由来の組織や細胞を用いて歯胚を再構成し、これを培養して歯と歯周組織からなる再生歯ユニットを得て、当該再生歯ユニットを移植することによって口腔内に再生歯を得る方法が検討されている。【０００４】
本発明者らは、これまでに、間葉系細胞と上皮系細胞を用いて、これらの細胞のうちの少なくともいずれか一方を歯胚由来の細胞とし、コラーゲンゲルなどからなる支持担体の内部に、間葉系細胞から実質的になる第１の細胞凝集塊と、上皮系細胞から実質的になる第２の細胞凝集塊を接触させて配置し、第１及び第２の細胞凝集塊を支持担体の内部で培養することによって、細胞の分化が効果的に誘導され、特有の細胞配置と方向性を備えた再生歯胚や再生歯ユニットを作製できることを見出した（例えば、特許文献１参照）。【０００５】
また、口腔内上皮細胞やその初代培養細胞を上皮系細胞として利用した場合（例えば、特許文献２参照）、羊膜由来細胞を間葉系細胞として利用した場合（例えば、特許文献３参照）、全能性幹細胞を分化誘導した細胞を間葉系細胞として利用した場合（例えば、特許文献４参照）にも、同様に特有の細胞配置と方向性を備えた再生歯胚や再生歯ユニットが得られることを示した。
さらに、再生歯胚作製時に、再生歯胚に含まれるエナメル結節の数を調整することにより、形成される再生歯の数を制御できること（例えば、特許文献５参照）を示した。【０００６】
歯は部位や個人差によって大きさや形態が異なるので、再生歯胚や再生歯ユニットを作製する際には大きさや形態を制御することが重要である。特に喪失した歯の部位に適合する歯を再生する場合、喪失した歯と同等の大きさ及び形態を有する歯を作製しないと、必要とされる機能が発揮できない。
所望の大きさや形状を有する再生歯の作製方法としては、歯乳頭や象牙質を形成する歯髄由来の間葉系細胞とエナメル形成に寄与する上皮系細胞とを含む歯胚の細胞混合物を、ポリグリコール酸−ポリ酢酸共重合体等からなる生分解性ポリマーを固化させたスキャフォールドに播種し、動物の体内に移植して歯を形成する方法も提案されている。この方法では、所定の形状のスキャフォールドを使用することによって、歯の形状を制御することが試みられている。しかしながら、再生歯は、上皮細胞層と間葉細胞層からなる歯胚に由来しており、歯胚は上皮細胞層と間葉細胞層間でおこる経時的な上皮・間葉相互作用をしながら成長するところ、スキャフォールドを用いると十分な細胞間相互作用が得られなくなるため、スキャフォールドの使用が望ましくないとの意見もある（例えば、非特許文献１参照）。また、スキャフォールドが分解する時間よりも、歯が形成される速度が速いことから、スキャフォールドを巻き込んだ歯が形成される可能性もあり、細胞配置や歯の形状の再現性が必ずしも高くないことが予想される。【０００７】
ところで、再生歯ユニットを作製する際、再生歯胚を動物の生体内に移植して培養する方法も用いられる。生体内で培養すると、動物細胞から各種サイトカイン等の作用を受け、また周囲から栄養も供給されるため、移植片が組織学的に正常な組織を形成しやすく、歯及び歯周組織の培養を早めることもできる。生体内の移植としては、例えば腎皮膜下移植が広く用いられている。
しかしながら、再生歯胚を、例えば、腎皮膜下等の生体内で培養すると、皮膜の圧力や移植スペースの関係から再生歯の大きさや形態が制限されることがある。具体的には、再生歯胚が側面から圧力を受け、歯の咬合面がつぶれた形状になりやすい。
また、生体内での培養では、歯の伸長の制御も困難である。特に、必要とする長さ以上に成長してしまうと、そのまま再生歯を顎骨に移植することができない。【０００８】
また、再生歯胚を動物の生体内で培養する方法では、機械的な刺激が少ないため、歯根膜の発生と発達が不十分になることが予測される。歯根膜は、歯根と歯槽骨を繋ぐ機能や、歯からの圧力を緩和する機能、噛み応えを感じさせる機能等を有するものであり、再生歯がもとの歯と同等の機能を果たすために重要な要素である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２９６７２号パンフレット
【特許文献２】特開２００８−２９７５６号公報
【特許文献３】特開２００８−２０６５００号公報
【特許文献４】特開２００８−２０００３３号公報
【特許文献５】特開２００８−２９７５７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ  １２，Ｎｕｍｂｅｒ  ８，２００６，２０６９−２０７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、再生歯胚の生体内での培養に伴う問題点を解決することを課題とする。具体的には、再生歯胚を生体内で培養しても圧力やスペースによって歯の形状が制限されず、且つ、歯の伸長も制御できる方法を提供すること、また、歯根の周囲に十分な歯根膜が形成される方法を提供することを課題とする。また、歯の欠損部位が大型である場合にも再生歯の移植を可能にする方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、再生歯胚を動物の生体内で培養する際、スペーサー内に再生歯胚を配置することによって、当該生体の組織からの圧力による変形を防止することができ、また、必要な長さ以上に伸長しないよう歯の長さを制御できることを見出した。
また、本発明者らは、再生歯胚を動物の生体内で培養する際、当該動物の外部から機械的刺激を与えることにより、歯根の周囲に歯根膜が十分に発達することを見出した。
さらに、本発明者らは、再生歯胚を動物の生体内で培養する際、個別に調製された複数の再生歯胚を並べて培養することによって、複数の再生歯胚ないし再生歯を含む再生歯ユニットを得ることができ、分離等をせずにそのまま歯の大型欠損部位へ移植できることを見出した。
即ち、本発明は、哺乳動物の生体内において再生歯胚を培養する再生歯ユニットの製造方法であって、下記工程を含み、
スペーサーを準備する工程、
前記再生歯胚を前記スペーサー内において前記哺乳動物の生体内に配置する工程、
前記再生歯胚を前記哺乳動物の生体内において培養する工程、
ここで、
前記スペーサーは、前記再生歯胚が最大許容値以上に伸長することを防止可能な構成であり、且つ、内部に配置された再生歯胚がスペーサー外部と連通可能な構成である、
製造方法に関する。
ここで、本発明の再生歯ユニットの製造方法の一実施態様においては、前記哺乳動物が、非ヒト哺乳動物であることを特徴とする。
本発明の再生歯ユニットの製造方法の一実施態様においては、前記スペーサーは、さらに、前記哺乳動物の生体内の組織から前記再生歯胚に過剰な圧力がかかることを防止可能な構成であることを特徴とする。
本発明の再生歯ユニットの製造方法の一実施態様においては、
前記再生歯胚を前記スペーサー内において前記哺乳動物の生体内に配置する工程は、
再生歯胚の将来咬合面になる部位が前記スペーサーの内壁付近に面するように配置し、且つ将来根尖になる部位が前記スペーサーの当該内壁とは反対方向のより広い空間に向けて伸長するように配置する工程であることを特徴とする。
本発明の再生歯ユニットの製造方法の一実施態様においては、
前記再生歯胚を前記スペーサー内において前記哺乳動物の生体内に配置する工程は、前記スペーサー内を満たす支持担体によって前記再生歯胚が支持されるように配置されることを特徴とする。
本発明の再生歯ユニットの製造方法の一実施態様においては、前記再生歯胚は、間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて支持担体内部に配置されて培養・維持されたものであり、間葉系細胞と上皮細胞の少なくともいずれか一方が歯胚由来であることを特徴とする。
本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様においては、前記再生歯胚を培養する際、前記哺乳動物の外部から機械的刺激を与える工程をさらに含むことを特徴とする。
本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様においては、前記機械的刺激は、約２００００Ｈｚ〜約４００００Ｈｚの振動であることを特徴とする。
本発明の再生歯ユニットの製造方法の一実施態様においては、前記スペーサーは、所望の再生歯ユニットのサイズを有する再生歯ユニットを発生させることができる内部空間を有するものであることを特徴とする。
本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様においては、前記スペーサーは略筒状であって、該筒の高さが、所望の再生歯ユニットの厚みより大きく、該筒の内径が、再生歯ユニットの長さの略最大許容値であることを特徴とする。
本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様においては、前記スペーサーが、円筒状であることを特徴とする。
本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様においては、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含むことを特徴とする。
本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様においては、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含み、前記スペーサー内において個別に調製された複数の再生歯胚を互いに隣接させて配置することを特徴とする。
本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様においては、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含み、前記スペーサー内において個別に調製された複数の再生歯胚を、各再生歯胚の将来咬合面になる部位の中心と将来根尖になる部位の中心とを結んだ軸線の方向を略並行にそろえて配置することを特徴とする。
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、哺乳動物の生体内において、スペーサー内において配置され、培養することにより再生歯ユニットを製造するための再生歯胚組成物であって、前記スペーサーは前記再生歯胚が最大許容値以上に伸長することを防止可能な構成であり、且つ、内部に配置された再生歯胚がスペーサー外部と連通可能な構成であることを特徴とする再生歯胚組成物に関する。
本発明の再生歯胚組成物の別の一実施態様においては、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含むことを特徴とする。
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、哺乳動物の生体内において再生歯胚をその中にいれて培養することにより再生歯ユニットを製造するためのスペーサーであって、前記再生歯胚が最大許容値以上に伸長することを防止可能な構成であり、且つ、内部に配置された再生歯胚がスペーサー外部と連通可能な構成であることを特徴とするスペーサーに関する。
本発明のスペーサーの別の一実施態様においては、前記スペーサーの内部に配置された再生歯胚が、個別に調製された複数の再生歯胚を含むことを特徴とする。
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、哺乳動物の生体内で再生歯胚を培養する工程を含む再生歯ユニットの製造方法であって、
前記再生歯胚を培養する際、前記哺乳動物の外部から機械的刺激を与える、方法に関する。
また、本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様において、前記機械的刺激は、約２００００Ｈｚ〜約４００００Ｈｚの振動であることを特徴とする。
また、本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様において、前記再生歯胚は、間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて支持担体内部に配置されて培養・維持されたものであり、間葉系細胞と上皮細胞の少なくともいずれか一方が歯胚由来であることを特徴とする。
また、本発明の再生歯ユニットの製造方法の別の一実施態様において、前記再生歯胚が個別に調製された複数の再生歯胚を含むことを特徴とする方法。
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、動物の欠損した歯の修復方法であって、
上記再生歯ユニットの製造方法で製造された再生歯ユニットを、前記欠損部に移植する工程を含む、方法に関する。
本発明の動物の欠損した歯の修復方法の一実施態様において、前記動物が非ヒト哺乳動物であることを特徴とする。
本発明の動物の欠損した歯の修復方法の一実施態様において、前記再生歯ユニットが、歯冠−歯根方向が略並行にそろった複数の歯を含むことを特徴とする。
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、上記再生歯ユニットの製造方法で製造された再生歯ユニットに関する。
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、動物の口腔内の欠損した歯を修復するために欠損部に移植するための、上記再生歯ユニットの製造方法で製造された再生歯ユニットに関する。
本発明の再生歯ユニットの別の一実施態様において、前記再生歯ユニットは、歯冠−歯根方向が略並行にそろった複数の歯を含むことを特徴とする。
本発明の再生歯ユニットの別の一実施態様において、前記再生歯ユニットは、歯冠−歯根方向が略並行にそろった複数の歯を含み、歯周組織が一体として形成されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、再生歯胚を動物の生体内で培養しても、当該動物の組織等から過剰な圧力を受けることなく、自然な形に歯を成長させることができる。また、歯が必要以上に伸長するのも防ぐことができる。
さらに、本発明によれば、再生歯胚を動物の生体内で培養しても、十分な歯根膜組織を有する再生歯を得ることができる。
さらに、本発明の一態様によれば、骨の大型欠損部位に対して、個別の再生歯ユニットを一本ずつ移植することなく、複数の再生歯を含む再生歯ユニットを一度に移植することができる。さらに、本発明の一態様によれば、複数の再生歯の歯槽骨が一体として形成されるため、移植時ないし移植後に複数の再生歯の方向がばらつくことなく、一体の歯槽骨により強固に支えられた一体のものとして移植することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の再生歯ユニット製造方法に従い、マウスの腎皮膜下に配置したスペーサー内で再生歯胚の生体内培養を行う様子を示す写真である。
【図２】図２は、スペーサーを用いて作製した再生歯ユニットのマイクロＣＴ画像である。
【図３】図３は、スペーサーを用いないで作製した再生歯ユニットのマイクロＣＴ画像である。
【図４】図４は、スペーサーを用いて作製した再生歯ユニット（制御）、スペーサーなしで作製した再生歯ユニット（非制御）、及び天然歯の歯冠部の長径／短径比を、ＣＴ画像上で測定・算出した結果を示す。
【図５】図５は、スペーサーを用いて作製した再生歯ユニット（制御）、及びスペーサーなしで作製した再生歯ユニット（非制御）の長さをＣＴ画像上で測定した結果を示す。
【図６】図６は、機械的刺激を与えながら再生歯胚を生体内培養して作製した再生歯ユニットと、刺激を与えずに作製した再生歯ユニットのＨＥ染色像である。
【図７】図７は、機械的刺激を与えながら再生歯胚を生体内培養して作製した再生歯ユニットと、刺激を与えずに作製した再生歯ユニットの歯根膜の幅をＣＴ画像上で測定した結果である。
【図８】図８は、本発明の方法で製造した再生歯ユニットを顎骨移植した様子を示す。
【図９】図９は、本発明の方法で製造した再生歯ユニットを顎骨移植した後、０日、１４日、３０日目のＣＴ画像である。
【図１０】図１０は、本発明の方法で製造した再生歯ユニットを顎骨移植した後、３０日目のＨＥ染色像である。
【図１１】図１１は、スペーサー内に再生歯胚を配置した状態を模式的に示した平面図及び側面図である。
【図１２】図１２は、スペーサー内に、複数の再生歯胚を配置した状態の模式図である。
【図１３】図１３は、スペーサー内に、複数の再生歯胚を配置した状態の実体写真である。
【図１４】図１４は、腎皮膜下移植６０日後の多数歯再生歯ユニットの実体写真である。
【図１５】図１５は、腎皮膜下移植６０日後の多数歯再生歯ユニットのＣＴ画像である。（ａ）はＣＴ外観像を示し、（ｂ）左側は、歯列方向のＣＴ断面像であり、（ｂ）右側は、頬舌方向のＣＴ断面画像である。
【図１６】図１６は、多数歯再生歯ユニットを口腔内に移植後１日目のＣＴ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係る歯の製造方法の第一の態様は、哺乳動物の生体内で、スペーサー内に再生歯胚を配置して培養する工程を含む再生歯ユニットの製造方法であって、スペーサーは、非ヒト哺乳動物の生体内の組織から再生歯胚に過剰な圧力がかかることと、再生歯胚が最大許容値以上に伸長することとを防止可能な構成であり、且つ、内部に配置された再生歯胚がスペーサー外部と連通可能な構成であることを特徴とする。なお、ここで、「連通可能」とは、スペーサーの内部と外部との間で、スペーサーを通じて、栄養物質やサイトカイン等の物質が通り抜け可能であること、すなわち、物質の供給路を有することをいう。
【００１６】
本明細書において、「歯」とは、内側に象牙質及び外側にエナメル質の層を連続して備えた組織をいい、歯冠や歯根を有する方向性を備えた組織を意味する。歯の方向性は歯冠や歯根の配置によって特定することができる。歯冠や歯根は、形状や組織染色などに基づいて目視にて確認することができる。歯冠とは、エナメル質と象牙質の層構造を有する部分をいい、歯根にはエナメル質の層は存在しない。
【００１７】
象牙質及びエナメル質は、当業者が、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。また、エナメル質は、エナメル芽細胞の存在によって特定することができ、エナメル芽細胞の存在は、アメロジェニンの有無によって確認することができる。一方、象牙質は、象牙芽細胞の存在によって特定することができ、象牙芽細胞の存在は、デンチンシアロプロテインの有無によって確認することができる。アメロジェニン及びデンチンシアロプロテインの確認は、この分野で周知の方法によって容易に実施することができ、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、抗体染色等を挙げることができる。
【００１８】
本明細書において「歯胚」とは、将来歯になることが決定付けられた歯の初期胚であり、歯の発生ステージで一般的に用いられる蕾状期（Ｂｕｄ  ｓｔａｇｅ）から鐘状期（Ｂｅｌｌ  ｓｔａｇｅ）までの段階のものを指し、特に歯の硬組織としての特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が認められない組織である。一方、本明細書において「歯芽」とは、「歯胚」の段階より後の組織を指し、歯の硬組織の特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が始まった段階から、歯が歯肉から萌出して一般的に歯としての機能を発現する前の段階の組織をいう。
本明細書において「再生歯胚」とは、細胞培養技術により人工的に形成した歯胚をいう。
【００１９】
本明細書において「再生歯ユニット」とは、再生歯胚を培養し、再生歯胚に含まれる各種細胞を分化させた結果得られる、歯と歯を支持する歯周組織からなるユニットをいう。
再生歯ユニットにおける歯の部分は、上述した歯芽から歯の段階の構成を有している。また、歯周組織は、歯根膜と歯槽骨を含む。
すなわち、再生歯胚を哺乳動物の生体内で培養すると再生歯ユニットが得られ、再生歯ユニットを口腔内に移植して生着させる、または萌出、成長させることにより再生歯が得られる。
【００２０】
本明細書において、スペーサーとは、哺乳動物の生体内で再生歯胚を培養する際に、再生歯胚が必要以上に伸長しないことを目的として、再生歯胚を覆うように配置される器具を意味する。また、スペーサーは、例えば、腎皮膜下等の生体内で培養する場合においては、皮膜の圧力や生体内の組織から過剰な圧力を再生歯胚が受けないようにする役割を果たすことができる。スペーサーの形状は、これらの目的が達成される限りどのような形状であってもよい。
【００２１】
すなわち、スペーサーの形状は、所望の再生歯ユニットのサイズ（主には、長さと厚み）を有する再生歯ユニットを発生させることができる内部空間を確保できるものであればよい。再生歯ユニットの長さとは、再生歯ユニットの歯の部分において将来咬合面となる部位から将来根尖となる部位までの長さをいう。将来根尖となる部位のまわりに歯周組織が形成されている場合は、その先端（将来咬合面となる部位から最も遠い部位）までの距離を意味する。再生歯ユニットの長さの略最大許容値とは、哺乳動物の生体内で再生歯胚を培養した後に得られる再生歯ユニットの長さとして許容される最大値程度を意味する。当該略最大許容値は、再生歯胚がその後移植される対象や部位によって当業者が適宜決定することができる。再生歯ユニットの厚みは、一般には、再生歯ユニットの歯冠部の厚みをいうが、将来根尖となる部位のまわりに、歯周組織が形成されている場合には、歯周組織のある部分の厚みをいうこともある。人間の歯がそうであるように、歯冠部の断面は、通常、完全な正方形でも長方形でもなく、むしろ長径と短径によって規定される。
【００２２】
従来の知見から、再生歯胚の伸長の方向は、相当程度、制御可能であるため、スペーサー内部において、再生歯胚組成物を配置する際の再生歯胚組成物自体の方向や、スペーサー内部における相対的位置を、望ましい伸長の方向を意図して、任意に調整することができる。したがって、所望のサイズが得られるように、再生歯胚組成物の伸長の方向を考慮して、スペーサーの３次元の大きさを設計することができる。
一般的には、スペーサーの内部空間は、所望の再生歯ユニットよりも大きいものでなければならない。換言すれば、スペーサーの内部空間は、再生歯ユニットが、最大許容値以上に伸長することを防止する役割を果たすことになる。
【００２３】
以下において、スペーサーの形状を、上下が開いた円筒状（リング状）とする場合について説明する。もっとも、当業者であれば、本明細書の開示等に基づき、所望の形状を有するスペーサーをデザインすることは、容易になし得るであろう。
このような上下が開いた円筒状（リング状）とする場合には、上下の解放部を通じて、スペーサー外部からの栄養供給路も十分に確保され、再生歯ユニットの形成が可能となる。
また、そのような円筒状（リング状）のスペーサーを用いる場合、再生歯胚の伸長方向を円筒リングの横方向（すなわち、円筒の径方向）とすると、円筒の縦方向（すなわち、円筒の高さ）は、所望の再生歯ユニットの咬合面の厚みを得られるように、また、最大許容値を超えないように、設定すればよい。また、リングの内径は、再生歯ユニットが必要以上に伸長するのを防ぐため、再生歯ユニットの長さの略最大許容値を意図して設定すればよい。
このような円筒状のスペーサーを用いる場合に、リングの径方向を伸長方向として、縦方向（高さ方向）を再生歯ユニットの歯冠の幅となるように、再生歯胚を配置する場合には、筒の高さは、例えば、ヒトの歯を培養する場合は３−１５ｍｍ、好ましくは５−１２ｍｍとし、マウスの歯を培養する場合は０．４−２．０ｍｍ、好ましくは０．６−１．８ｍｍとし、その内径（内直径）は、ヒトの歯を培養する場合は１０−３０ｍｍ、好ましくは１５−２６ｍｍとし、マウスの歯を培養する場合は、０．９−２．０ｍｍ、好ましくは１．２−１．９ｍｍとする。
【００２４】
さらに、略円筒状のスペーサーを利用する場合には、再生歯胚の将来咬合面になる部位を、スペーサーの内壁のごく近くに、内壁に面するように配置し、且つ、将来根尖になる部位を筒の径方向に向かうように配置することによって、再生歯胚が、生体内の組織から過剰な圧力を受けず、再生歯胚が必要以上に伸長するのを防ぎ、且つ外部と連通可能で物質供給路を確保できる。
再生歯胚の咬合面は、圧力によってつぶされることなく自然な形状に成長することができ、歯は筒の直径方向に伸長し、一般に、反対側の壁に到達する前に、または、到達後、最大許容値未満の長さで伸長を止めることができる。
再生歯胚は、筒の水平方向からの圧力をスペーサーの壁によって回避することができるとともに、上下方向からの圧力をスペーサーの上端及び下端によってほとんど回避することができる。
【００２５】
当業者であれば、円筒状に限らず、本明細書で規定した所望の目的を達成すべく、または、その他、場合によって必要とされる他の目的を達成すべく、生体内において再生歯ユニットの製造において任意の所望の形状のスペーサーを用いることができる。例えば、円筒の代わりに底面が楕円や多角形のものや、球状のもの等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明のスペーサーは、内部に配置された再生歯胚が、スペーサーの外部と連通可能な構成となっている。再生歯胚は、哺乳動物の生体内の組織から栄養等の供給を受けたり、動物細胞が産生するサイトカインの作用を受けたりするため、これらの物質がスペーサー内の再生歯胚に到達するための供給路を確保する必要があるからである。連通可能であるために、スペーサーの形状として、大小、個数を問わず、物質の供給に足る孔を形成することができる。例えば、筒状のように部分的に大きな孔を有するものであってよく、また、スペーサー全体について、メッシュのように小さな孔を多数有するものであってもよい。また、スペーサーの材質が物質の透過可能なものであれば、孔があるものでなくてもよい。
【００２７】
本明細書において哺乳動物とは、生体内で再生歯胚を培養することができる限り特に限定されないが、非ヒト哺乳動物であってもよい。例えば、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウスを挙げることができ、好ましくは、ブタ、マウスである。また、歯胚組織と同一の種であることが特に好ましい。歯胚組織と同一の種でない動物に移植して培養する場合は、免疫不全に改変した動物を用いることが好ましい。生体内成育に好適な生体部位としては、動物細胞の器官や組織をできる限り正常に発生させるために、腎皮膜下、腸間膜、皮下等が好ましい。
移植後の培養期間は、移植時の歯の大きさと発生させる歯の大きさによって異なるが、一般に３日〜４００日とすることができる。例えば、腎皮膜下に移植する場合、移植する歯胚の大きさと再生させる歯の大きさによっても異なるが、７日〜６０日程度が好ましい。
【００２８】
スペーサーの材質は特に限定されず、生体内の組織からの圧力に対して十分な硬性を有するものであればよく、例えば、金、銀、鉄、銅、アルミニウム、ポリエチレン、樹脂、歯科用レジン、歯科用セメント等が挙げられる。
【００２９】
また、本発明に係る再生歯ユニットの製造方法では、スペーサー内に再生歯胚を配置して培養する工程が、スペーサー内を支持担体で満たし、該支持担体内に再生歯胚を配置して行われることが好ましい。
支持担体は、内部で細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ゲル状、繊維状、固体状のものが好ましく、かかる支持担体を用いることによって、さらに生体内で再生歯胚に過剰な圧力がかかるのを防ぐことができる。
本発明で用いられる支持担体としては、例えば、コラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス（商品名）、メビオールゲル（商品名）、マトリゲル（商品名）、エラスチン、フィブリン、ラミニン、細胞外マトリクス混合物、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸／グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等を挙げることができる。中でも、適切な硬さや保持力を有するコラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス、メビオールゲル、マトリゲル、細胞外マトリクス混合物、エラスチン、フィブリン、ラミニンが好ましい。
例えば、支持担体は液状のものを用い、再生歯胚を配置した後に硬化させてもよい。例えば、スペーサー内部をコラーゲン溶液で満たし、コラーゲン溶液内に再生歯胚を配置した後、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で培養することにより、コラーゲンをゲル化させることができる。次いで、再生歯胚をスペーサーごと哺乳動物の生体内に配置して培養を行うことができる。
【００３０】
また、本発明の別の態様は、哺乳動物の生体内で再生歯胚を培養する工程を含む歯の製造方法であって、再生歯胚を培養する際、哺乳動物の外部から機械的刺激を与えることを特徴とする。
機械的刺激を与えることによって、再生歯ユニットにおける歯根膜の形成が促進される。機械的刺激とは、例えば、振動、圧迫、摩擦等が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、音波程度の周波数（例えば、２００００Ｈｚ〜４００００Ｈｚ程度）の振動を与えることが好ましい。
【００３１】
上述した、本発明に係るスペーサーを用いる再生歯ユニットの製造方法において、再生歯胚を生体内で培養する際、哺乳動物の外部から機械的刺激を与えることも好ましい。
【００３２】
次に、本発明の方法に用いられる再生歯胚について説明する。
再生歯胚はどのような方法で作製したものであってもよいが、例えば、間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、第１及び第２の細胞集合体を支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法によって作製することができる。なお、本明細書において、２つの細胞集合体を区別するために、便宜上、間葉系細胞で実質的に構成される細胞集合体の方を第１の細胞集合体と呼んだが、上皮細胞で実質的に構成される細胞集合体の方を第１の細胞集合体と呼ぶこともでき、いずれを第１の細胞集合体と呼ぶか否かは重要ではない。
【００３３】
本発明において「間葉系細胞」は、間葉組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味し、「上皮系細胞」は、上皮組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味する。
また、本発明において「歯周組織」とは、歯の主として外層に形成された歯槽骨及び歯根膜をいう。歯槽骨及び歯根膜は、当業者が、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。
【００３４】
「間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて配置する工程」は、例えば、特許文献１乃至５に記載されており、それら各文献の開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００３５】
上記第１の細胞集合体と第２の細胞集合体は、それぞれ実質的に間葉系細胞のみ、又は上皮系細胞のみで構成されている。「実質的に間葉系細胞のみで構成されている」とは、本発明において、ある細胞集合体が間葉系細胞のみから構成されている場合と同じ機能を果たすことを意味し、間葉系細胞となる細胞以外のものをできるだけ含まない状態をいう。「実質的に上皮系細胞のみからなる」という場合も同様である。
ここで、細胞集合体とは、細胞が密着した状態をいい、組織であっても、ばらばらの細胞から調製された細胞凝集塊であってもよい。組織を用いれば、細胞配置や形状の正しい歯が得られやすいという利点があるが、入手できる量に制約がある場合もある。細胞凝集塊は、培養細胞も用いることができるので、比較的入手しやすく好ましい。本発明に係る方法によれば、細胞凝集塊を用いても、細胞配置や形状の正しい再生歯を得ることができる。
【００３６】
細胞集合体を構成する間葉系細胞及び上皮系細胞は、少なくともいずれか一方を歯胚由来とする。これにより、生体内での細胞配置を再現して特有の構造及び方向性を有する歯を効果的に形成することができる。間葉系細胞及び上皮系細胞がいずれも歯胚由来であることがより好ましい。当該歯胚は、細胞の分化段階の幼若性と均質性の観点から、蕾状期から帽状期のものであることが好ましい。
【００３７】
歯胚以外に由来する間葉系細胞として、生体内の他の間葉系組織に由来する細胞を用いることもできる。好ましくは、血液細胞を含まない骨髄細胞や間葉系細胞、さらに好ましくは口腔内間葉系細胞や顎骨の内部の骨髄細胞、頭部神経堤細胞に由来する間葉系細胞、これらの間葉系細胞に分化しうる間葉系前駆細胞やその幹細胞等である。間葉系細胞として、羊膜由来細胞を用いる例が特許文献３に、全能性幹細胞を分化誘導した細胞を用いる例が特許文献４に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００３８】
歯胚以外に由来する上皮系細胞として、生体内の他の上皮系組織に由来する細胞を用いることもできる。好ましくは、皮膚や口腔内の粘膜や歯肉の上皮系細胞、さらに好ましくは皮膚や粘膜などの分化した、例えば角化した、あるいは錯角化した上皮系細胞に分化しうる未熟な上皮系前駆細胞、例えば非角化上皮系細胞やその幹細胞等である。口腔内上皮細胞やその初代培養細胞を上皮系細胞として用いる例が特許文献２に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００３９】
歯胚及び他の組織は、哺乳動物の霊長類（例えばヒト、サルなど）、有蹄類（例えばブタ、ウシ、ウマなど）、小型哺乳類のげっ歯類（例えばマウス、ラット、ウサギなど）のほか、イヌ、ネコなど種々の動物の顎骨等から採取することができる。歯胚及び組織の採取は、通常、組織の採取で用いられる条件をそのまま適用すればよく、無菌状態で取り出し、適当な保存液に保存すればよい。なお、ヒトの歯胚としては、第３大臼歯いわゆる親知らずの歯胚のほか、胎児歯胚を挙げることができるが、自家組織の利用の観点から、親知らずの歯胚を用いることが好ましい。また、マウスの場合、胎児齢１０日から１６日の歯胚を用いることが好ましい。
【００４０】
歯胚からの間葉系細胞及び上皮系細胞の調製は、まず周囲の組織から単離された歯胚を、形状に従って、歯胚間葉組織及び歯胚上皮組織に分離することによって行われる。この際、分離を容易に行うため酵素を用いてもよい。酵素としては、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等を挙げることができる。
【００４１】
本発明における細胞凝集塊は、間葉組織または上皮組織に由来する細胞が凝集したものを意味し、間葉組織又は上皮組織をばらばらに分散させて得た細胞、あるいは当該細胞の初代または継代培養によって得た細胞を凝集させて調製することができる。
【００４２】
細胞を分散させるためには、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等の酵素を用いてもよい。十分な細胞数を得るために、細胞凝集塊を調製する前に分散した細胞の初代または継代培養を行う場合、培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等を用いることができる。細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常１０％前後とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、例えば約３７℃の温度で５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加したものであってもよい。
【００４３】
細胞を凝集させるためには、例えば、細胞懸濁液を遠心処理すればよい。間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞凝集塊は、両者を密着させたときに確実に細胞相互作用するよう、それぞれを高密度の状態にしておくことが好ましい。高密度の状態とは、組織を構成する際の密度と同等程度であることをいい、例えば、５×１０７個／ｍｌ〜１×１０９個／ｍｌ、好ましくは１×１０８個／ｍｌ〜１×１０９個／ｍｌ、最も好ましくは２×１０８個／ｍｌ〜８×１０８個／ｍｌである。細胞凝集塊を高密度にする方法は特に限定されないが、例えば、細胞を遠心処理によって凝集させ沈殿化する方法によって行うことができる。遠心処理は細胞の活性を損なわずに簡便に高密度化できるため好ましい。遠心処理は、３００×ｇ〜１２００×ｇ、好ましくは５００×ｇ〜１０００×ｇの遠心力を与える回転数で３分間〜１０分間行えばよい。３００×ｇよりも低い遠心処理では、細胞密度を十分に高くできなくなる傾向があり、一方、１２００×ｇよりも高い遠心処理では、細胞が損傷を受ける場合がある。
【００４４】
遠心分離によって高密度の細胞凝集塊を調製する場合には、通常、細胞の遠心分離をするために用いられるチューブ等の容器に細胞の懸濁液を調製してから遠心分離を行い、沈殿物としての細胞を残して上清をできるだけ除去すればよい。このとき、目的とする細胞以外の成分（例えば、培養液、緩衝液等）は、細胞の容量と等量以下であることが好ましく、目的とする細胞以外の成分を含まないことが最も好ましい。このような高密度の細胞集合体を後述する方法により支持担体内で密着させれば、細胞が緊密に接触し、細胞間相互作用が効果的に発揮される。
【００４５】
支持担体としては、上述したスペーサー内に配置される支持担体と同じものを使用することができる。第１及び第２の細胞集合体を培養する目的で用いられる支持担体は、細胞が分散することなく、細胞集合体の密着状態を保持可能な保持力を備えていることが好ましい。密着した状態とは、上述した高密度の間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞集合体が、間葉系細胞と上皮系細胞の接触面付近においても同程度の高さの密度を維持している状態を意味する。密着状態を保持可能な支持担体は、例えば、コラーゲンの場合、最終濃度２ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌの濃度、即ちＪＩＳ−Ｋ６５０３−１９９６に準拠した方法（１２．７ｍｍ径のプランジャーで４ｍｍ押し下げるのに必要な荷重として測定）によって１２０ｇ〜２５０ｇのゼリー強度となる濃度での使用が適切な硬さを提供する。他の種類の支持担体においても、同様の評価方法によって同様の強度があれば本発明の支持担体として好ましく用いられる。また１種又は複数種の支持担体を混合することによって、目的とするゼリー強度に相当する硬さの支持担体を得てもよい。
【００４６】
第１及び第２の細胞集合体を支持担体内に配置する方法は特に限定されないが、細胞集合体が細胞凝集塊である場合は、例えば上述した遠心分離で得られる沈殿物をマイクロシリンジ等で支持担体内に挿入して配置することができる。細胞集合体が組織である場合には、シリンジの針の先端などを用いて支持担体内の任意に位置に配置することができる。
【００４７】
本発明において第１と第２の細胞集合体を支持担体に密着させて配置する方法は特に限定されないが、例えば、一方の細胞集合体を支持担体内に配置したあと、他方の細胞集合体をそれに押しつけるように配置することによって、両者を密着させることができる。より具体的には、支持担体内において上記シリンジの針の先端の位置を適宜変更することで一方の細胞集合体を他方の細胞集合体に押し付けることが可能である。なお、細胞集合体として上皮系組織又は間葉系組織を用いる場合には、当該組織が元々の歯胚において間葉系組織又は上皮系組織と接触していた面を、他方の細胞集合体に接触するように配置することが好ましい。
また、配置した後に、支持担体を固化する工程を設けることも好ましい。これにより、細胞がさらに凝集して、より高密度な状態とすることができる。例えば、コラーゲンゲルの場合、培養温度下で数分〜数十分間静置することによって固化することができる。このとき、細胞集合体内に細胞以外の成分が少なければ少ないほど、より高密度な状態が実現される。
【００４８】
本発明における、「第１及び第２の細胞集合体を支持担体の内部で培養する工程」は、例えば、特許文献１乃至４及び特開２００８−２９７５７号公報に記載されており、それら各文献の開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００４９】
培養期間は、支持担体内部に配置された細胞数、細胞集合体の状態、培養の条件、動物種等によって異なり、当業者が適宜選択することができる。口腔内に移植した際に機能的な歯として萌出するためには、少なくとも１日培養することが好ましく、３日以上がより好ましい。
培養期間を長くすることによって、象牙質及びエナメル質の蓄積、歯冠の形成、及び歯根の形成のように、再構成歯胚の形成をより進行させることができる。所望の状態を得るために、例えば、６日以上、３０日以上、５０日以上、１００日以上、又は３００日以上培養してもよく、培養の途中で、培地や培養条件を変更することもできる。
【００５０】
支持担体内部における培養工程は、第１及び第２の細胞集合体を内包する支持担体を単独で培養してもよく、他の動物細胞等の存在下で培養してもよい。
支持担体を単独で培養する場合、培養条件は、一般的な動物細胞の培養に用いられる条件とすることができる。また、培養には、哺乳動物由来の血清を添加してもよく、またこれらの細胞の増殖や分化に有効であることが知られている各種細胞因子を添加してもよい。このような細胞因子としては、ＦＧＦ、ＢＭＰ等を挙げることができる。
【００５１】
細胞集合体のガス交換や栄養供給の観点、及び他の動物細胞との接触・混入がなく、且つ全工程をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができるという観点から、支持担体内部における培養を、器官培養とすることが好ましい。器官培養では、一般に、動物細胞の増殖に適した培地上に多孔性の膜をフロートさせ、その膜上に第１及び第２の細胞集合体を内包する支持担体を載置して培養を行う。ここで用いられる多孔性の膜は、０．３〜５μｍ程度の孔を多数有するものであることが好ましく、例えば、セルカルチャーインサート（商品名）やアイソポアフィルター（商品名）を挙げることができる。
【００５２】
本発明に係る歯の製造方法では、哺乳動物の生体内に再生歯胚を配置して培養する前に、再生歯胚を生体外で前培養することも好ましい。前培養によって細胞間の結合、及び細胞間相互作用をより強固にすることができ、その結果、全体の成育期間を短縮することができる。
【００５３】
本発明に係る方法によって得られる歯は、内側に象牙質、外側にエナメル質という歯特有の細胞配置（構造）を有するものであり、好ましくは、歯の先端（歯冠）と歯根を正しい位置に有する方向性も備えたものであり、歯としての機能を十分に果たすものである。従って、歯の代替物として広く利用することが可能である。また、歯の発生過程を解明するための研究に有用なリサーチツールとして用いることもできる。
【００５４】
さらに、培養期間を延長することによって、歯そのものに加え、歯を顎骨上で支持し固定化する歯槽骨や歯根膜などの歯周組織も形成させることができる。これにより、移植後の歯の実用性をさらに高めることができる。また、歯周組織のみを分離して利用することも可能である。
【００５５】
［歯の欠損部の修復方法］
本発明に係る口腔内の歯の欠損部の修復方法は、本発明に係る再生歯ユニットの製造方法で製造された再生歯ユニットを欠損部に移植する工程を含む。本方法によれば、欠損部の大きさ及び形状に適合する再生歯ユニットを製造し移植することが可能である。
本発明に係る再生歯ユニットの製造方法によれば、再生歯胚を生体内で培養する際、歯が生体内で圧力を受けてつぶれることがなく、自然な形状に成長させることができるので、欠損部に適合した形状の歯を製造しやすい。
また、欠損部に移植するためには、欠損した歯と同じ長さを有する再生歯を作製することが望ましいところ、本発明に係る歯の製造方法によれば、歯の長さの最大値を制御することができる。歯の長さが最大許容値を超えている場合、その歯をそのまま移植することができないが、最大許容値より短ければ、移植してから成長させて所望の長さの再生歯を得ることが可能である。
【００５６】
本発明に係る口腔内の歯の欠損部の修復方法においては、再生歯ユニットとして、歯の発生のどの段階にあるものを移植してもよい。すでに歯冠の形成が認められていれば歯冠が口腔内側となるように配置することが好ましい。歯冠の形成が認められない段階の場合には、歯冠相当部の上皮細胞層又は再成歯胚の上皮細胞層を口腔内側となるように配置することが好ましい。また、再成歯胚の上皮・間葉細胞層の開放部分が口腔内側とは反対側となるように配置することも好ましい。これにより、歯の先端部（歯冠）が、口腔内側となり、周囲の歯と同様の方向性をもたせることができる。
【００５７】
欠損部とは、抜歯等により歯肉に設けられた部分を意味し、形状に特に制限はない。再生した歯胚又は歯を埋設可能である限り、欠損場所、目的とする歯の種類は特に限定されない。
欠損部は、通常、顎骨、口腔の歯槽骨などに位置する。また歯の喪失に伴って歯槽骨量が低下している場合には、欠損部位に対してＧＴＲ法（ｇｕｉｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：組織再生誘導法）など、インプラントの埋設のために臨床で用いられる公知の方法により歯周組織の再生を促そうとしてもよい。歯胚または歯を孔部へ配置した後は、通常の処理に従って、縫合等を行うことが好ましい。
【００５８】
本発明に係る口腔内の歯の欠損部の修復方法では、移植対象を、歯の製造に用いた歯胚を摘出した動物と同種とすることが好ましく、歯胚を摘出した個体と同一個体とすることがさらに好ましい。動物としては、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス等を含む哺乳動物を挙げることができる。非ヒト哺乳動物とすることも好ましい。
【００５９】
本発明の別の実施態様としては、再生歯胚として、複数の再生歯胚を用いることができる。複数の再生歯胚は、各再生歯胚が個別に調製された再生歯胚であることが好ましい。個別に調製された再生歯胚とは、将来単一の歯を形成するように調製された再生歯胚をいう。再生歯胚の作製方法は、上記の通りである。個別に調製された再生歯胚とは、例えば特許文献１に記載されているように、複数歯胚を含む再生歯胚を作製してから分離することもできる。しかし、一般により好ましくは、例えば特許文献５及において記載されているように、再生歯胚に含まれるエナメル結節の数を調節することにより、将来単一の歯を形成するように作製することができる。また、前記個別に調製された再生歯胚は、欠損部の大きさや再生させる歯の大きさにより、適宜その大きさを調節して作製することができる。例えば、再生歯胚を作製する際に、前記間葉系細胞集合体と前記上皮系細胞集合体とを接触させて配置する際、それぞれの細胞集合体を略柱状に形成することができ、その場合に、その柱の軸方向の接触長さを制御することによって、一方向に所望の長さを有する歯を形成できる。例えば、前記間葉系細胞集合体と前記上皮系細胞集合体との接触長さを、所望の再生歯の歯冠の幅の±２５％とすることによって、当該所望の長さを有する再生歯を作製することができる。培養の結果、所望の再生歯の大きさ、形状をそなえるように、細胞集合体の長さ等を調節して作製することができる。上記のようにして個別に調製された再生歯胚を並べて配置し培養することによって複数の再生歯を含む再生歯ユニットを作製する。再生歯胚は、将来咬合面になる部位の中心と将来根尖になる部位の中心とを結んだ軸線の方向を略並行にそろえて配置することが好ましい。将来咬合面になる部位の中心と将来根尖になる部位の中心とを結んだ軸線の方向と、再生歯の歯冠と歯根とを結んだ軸線の方向とは概ね一致し、本明細書において、この方向を「歯冠−歯根方向」と呼ぶことがある。この軸線の方向を略並行に揃えて配置することにより、生来の歯と同様に、歯冠―歯根方向のそろった複数の歯を含む再生歯ユニットを得ることができる。また、複数の再生歯胚を配置する場合には、一平面上に配置することが好ましい。一平面上に配置することにより、歯列の整った再生歯ユニットを得ることができる。なお、歯列が歯茎のカーブに沿って整列した状態にしたい場合には、平面上ではなく、歯茎のカーブに沿った曲面上に配置することもできる。再生歯胚を複数配置する場合、再生歯ないし再生歯胚の本数は特に限定されず、歯の欠損部位の形状・大きさ、または、所望の再生歯の本数に応じて選択することができ、好ましくは、２〜６本、より好ましくは、２〜４本配置することができる。
【００６０】
複数の再生歯胚を並べて配置する際には、再生歯胚同士を隣接させて配置することが好ましい。隣接させて配置するとは、再生歯胚を互いに接触またはほぼ接触させて配置することをいう。再生歯胚同士を隣接させて配置させると、歯列方向の歯の間の隙間がない又は小さい再生歯ユニットを得ることができる。また、複数の再生歯胚を隣接させて配置し、培養した場合、培養期間が長くなると、歯周組織が互いに結合し一体となった形状の再生歯ユニットを得ることができる。このように、歯周組織が一体として形成された再生歯ユニットは、再生歯ごとに分離することなく、そのまま歯の欠損部位に移植することができる。このように複数の再生歯を含み一体として形成された再生歯ユニットは、個別の再生歯ユニットを一つずつ移植する場合に比べ、移植を簡便にし、また、個々の歯を一体の歯周組織により強固に支えることができる。また、複数の再生歯を含み一体として形成された再生歯ユニットは、個別の再生歯ユニットを一つずつ移植する場合に比べ、移植時又は移植後に歯列の方向が乱れる心配なく、移植することができる。
【００６１】
本発明の別の実施態様としては、前記複数の再生歯胚を、上述したようにスペーサー内に配置して培養することもできる。スペーサーについては、上記と同様であり、並べる再生歯胚の数に応じて適切な形状とすることが好ましい。複数の再生歯胚を並べる場合には、複数歯胚の歯列方向の歯冠の幅の合計値または歯列方向の歯周組織の長さが得られるような形状とすることが好ましい。そのため、スペーサーとして筒上のものを用いる場合には、楕円または長方形に近い形状を底面とするような筒を用いることが好ましい。複数の再生歯を含む再生歯ユニットを作製する場合に、スペーサーを用いることによって、整列された再生歯胚の状態、すなわち、再生歯胚の方向や再生歯胚同士の間隔、及び、再生歯胚の並ぶ平面を維持したまま、生体内に挿入して生体内培養をすることができるという利点がある。
【００６２】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【実施例】
【００６３】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
<実施例１：スペーサーを用いた再生歯胚の生体内培養>
腎皮膜下移植において腎皮膜の圧力の影響を回避する目的で、スペーサーを用いて再生歯胚の生体内培養を行った。
マイクロピペットチップ（ＨＲＩ−１１０ＮＥＷ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を内径（内直径）１．３ｍｍ、高さ１．３ｍｍになるようリング状（筒状）に切断してスペーサーを作製し、内部にコラーゲン溶液を満たして使用した。再生歯胚は、歯根方向への伸長を促すためスペーサーの壁面に歯冠側を近接させるよう配置し、３７℃のＣＯ２インキュベーター（三洋電機，大阪，日本）で培養し、コラーゲンゲルを硬化させた。次に、再生歯胚を含むスペーサーを７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両側腎皮膜下に移植した。腎皮膜下への移植は、腎臓皮膜に２〜３ｍｍの切開を入れ、腎臓皮膜と腎臓実質を剥離し、その間に再生歯胚を含むスペーサーを挿入することにより行った。比較例として、７日間器官培養した再生歯胚を、スペーサーを用いずに腎皮膜下に移植した。移植時の写真を図１に示す。また、移植時のスペーサーと再生歯胚の位置関係の模式図を図１１に示す。
移植３週間後に、マイクロＣＴ撮影を行い、画像データは統合画像処理ソフトを用いて解析した。歯冠部における最大径を長径とし、長径と直交する最大径を短径と定義し、それぞれの長さを計測し、その比率を算出した。
スペーサーを用いて培養した例を図２に、用いないで培養した例を図３に示す。スペーサーを用いて培養した再生歯ユニットは、正常歯に近い形態である一方、スペーサーを用いないで培養した再生歯ユニットは、長径が短径に対して極端に長く、扁平な形状であった。
スペーサーを用いて培養した群（制御群）及びスペーサーを用いないで培養した群（非制御群）の各７例について長径と短径を計測し、長径／短径比を求めた結果を図４（右側）に示す。再生歯ユニットの長径／短径比は、スペーサーを用いて培養した群（制御群：実施例）では１．４６±０．１６ｍｍであり、スペーサーを用いないで培養した群（非制御群：比較例）では２．３０±０．３５ｍｍであった。
図４（左側）には、成獣マウスの下顎第一、第二、第三臼歯（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）の歯冠部における最大径を長径とし、長径と直交する最大径を短径と定義して測定し、長径／短径比を求めた結果も示す。Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３の長径／短径比は、それぞれ、１．６１±０．０５（ｎ＝５）、１．０９±０．０４（ｎ＝５）、１．１２±０．０４（ｎ＝５）であった。
以上より、スペーサーを用いずに生体内培養した再生歯ユニット形状が扁平となるのに対し、スペーサーを用いて生体内培養した再生歯ユニットは、形状が扁平にならず、両者の長径／短径比は有意差があること、また、スペーサーを用いて生体内培養した再生歯ユニットの長径／短径比は天然の歯と同等になることが確認された（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定、＊ｐ<０．０００１）。【００６４】
また腎皮膜下移植３０日、６０日目の再生歯ユニットを摘出し、マイクロＣＴ撮影、並びに統合画像処理ソフトによる解析を行って長さを測定した。マイクロＣＴ画像上で形成された歯槽骨の領域を含めず、歯の咬頭から根尖までの長さを計測した。
結果を図５に示す。スペーサーを用いない非制御群においては咬頭−根尖長が３０日目に１．０７±０．２０ｍｍ（ｎ＝６）であったところ、６０日目には１．７０±０．２６ｍｍ（ｎ＝６）となっており、有意に歯の長さが増加していた。一方、スペーサーによる制御群では、３０日目で１．０１±０．１９ｍｍ（ｎ＝１３）、６０日目で１．０２±０．１１ｍｍ（ｎ＝１０）と、移植日数による歯の長さの増加は認められなかった（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定、＊ｐ<０．０００１）。
以上より、スペーサーを用いて再生歯胚を生体内培養すると、再生歯の長さを任意に調節できることが明らかになった。【００６５】
<実施例２：機械的刺激を与えた再生歯胚の生体内培養>
実施例１の方法に従って、スペーサーを用いて器官培養を行った再生歯胚をスペーサーごと腎皮膜下に移植し、機械的刺激として、腎皮膜下移植後７日目から音波電動歯ブラシ（周波数３１，０００Ｈｚ：Ｄｏｌｔｚ（商標）、パナソニック）をマウス背部皮膚に３．９×１０４Ｐａの圧力にて圧接した（５分間／日）。コントロール群には機械的刺激を与えず、３０日間の移植期間後に摘出して比較対象とした。
摘出した再生歯ユニットは実施例１と同様の方法でマイクロＣＴ撮影を行い、三次元画像解析ソフトウェアを用いて歯根膜腔の幅（単に、「歯根膜の幅」と呼ぶこともある。）を計測した。具体的には、三次元画像上で再生歯ユニットの歯根表面と形成された歯槽骨との距離を歯根膜腔の幅とし、長径・短径における断面において、それぞれ６点ずつ計測した。その後、再生歯を４％パラフォルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＰＦＡ）にて固定し、１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）にて脱灰し、パラフィン包埋した。その後、厚さ８マイクロメートルの連続切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行い、組織学的評価を行った。
組織学的評価の結果を図６に示す。図中、Ｂは歯槽骨、Ｄは象牙質、Ｐは歯根膜を示し、図中のＰの文字の隣のバーが歯根膜の幅を示す。なお、図中の右下のスケールバーは１００μｍを示す。有刺激群の歯根膜は、無刺激群より厚く形成され、歯根膜領域の細胞の規則的な配列が認められた。
またＣＴ画像上で歯根膜の幅を計測した結果を図７に示す。有刺激群の歯根膜の幅は、１０８．５±３０．６μｍ（ｎ＝３３）であり、無刺激群の歯根膜の幅は、６８．７±１４．１μｍ（ｎ＝１２）であった（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定、＊ｐ<０．０００１）。
以上の結果から、再生歯胚を生体内培養する際に、外部から機械的な刺激を与えることにより、十分な歯根膜組織を有する再生歯ユニットが得られることが判明した。【００６６】
<実施例３：生体内培養によって得られた再生歯ユニットの顎骨移植>
４週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの下顎第一臼歯を抜歯し、３日間の治癒期間を設けた。その後、同部の歯肉切開・剥離を行い、歯科用マイクロモーター（Ｖｉｖａ−Ｍａｔｅ  Ｐｌｕｓ，ナカニシ，東京，日本）を用いて歯槽骨を切削し、近遠心径１ｍｍ、頬舌径０．８ｍｍの移植窩を形成した。
実施例１に従って、スペーサーを用いて３０日間腎皮膜下で培養し、且つ、実施例２に従って培養中に機械的刺激を加えて作製した再生歯ユニットを、顎骨移植窩に埋入し、８−０ナイロン縫合糸（ベアーメディック，千葉，日本）で歯肉縫合した。
図８に移植窩の形成、及び再生歯ユニットの移植の様子を示す。
再生歯ユニットを移植したマウスは移植０日、１４日、３０日目に前述と同様の方法にてマイクロＣＴ撮影を行い、移植片とレシピエントの歯槽骨における結合を評価した。その後、移植片を含む顎骨を４％ＰＦＡにて固定し、１０％ギ酸‐クエン酸ナトリウム脱灰液にて脱灰し、パラフィン包埋した後に、厚さ８μｍの連続切片を作製し、ＨＥ染色にて組織学的評価を行った。
図９にＣＴ画像、図１０にＨＥ染色像を示す。
図９に示すとおり、移植１４日目には移植片とレシピエントの下顎第二臼歯歯槽骨間に部分的な結合が認められ、移植３０日目にはほぼ全周にわたり骨結合が認められた。図中、矢印は再生歯ユニットを示す。
図１０に示すとおり、移植３０日目の組織像では、再生歯と下顎第二臼歯との槽間中隔歯槽骨が融合しており、再生歯ユニットが骨結合を介して移植部位の歯槽骨に生着している可能性が示された。また組織解析より、移植による偶発症として再生歯歯髄の一部に石灰化が認められた（１６例中３例）ものの、再生歯ユニットの歯根膜は移植後も維持されており、骨性癒着は認められなかった（１６例中０例）。図中、矢印は骨結合による生着を示し、スケールバーは１００μｍを示し、ＢＴは再生歯を、ＮＴは天然下顎第二臼歯を示す。  以上より、本発明の製造方法で製造された再生歯ユニットは、顎骨に移植すると良好に生着することが示された。【００６７】
<実施例４：多数歯再生歯ユニットの作製>
歯の大型欠損に対して移植可能な多数歯再生歯ユニットを作製する目的で、腎皮膜下移植においてスペーサーを用いて複数の再生歯胚の生体内培養を行った。
マイクロピペットチップ（ＨＲＩ‐１１０Ｎｅｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａ，ＵＳＡ）を筒状に切断し、筒の断面形状が長径３ｍｍ・短径２ｍｍ・高さ１．３ｍｍの角丸四角形になるように成形してこれをスペーサーとして用い、その内部にコラーゲン溶液を満たして使用した。筒の高さ方向が将来の再生歯の厚み方向となるように、また、角丸四角形の短径方向が歯の伸長方向、角丸四角形の長径方向が歯の歯列方向となるように４つの再生歯胚を互いに接触させて配置した。その際、歯根方向への伸長を促すためスペーサー断面の角丸四角形の長辺にあたるうちの一方の壁面に再生歯胚の将来歯冠になる側をやや近接させて配置し、３７度のＣＯ２インキュベーター（三洋電機，大阪，日本）でコラーゲンゲルを硬化させた。スペーサー内に複数の再生歯胚を配置した状態について、模式図を図１２に示し、その写真を図１３に示す。図１２及び図１３は、筒状のスペーサーを筒の軸方向から見た図または写真である。次に、再生歯胚を含むスペーサーを７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両側腎皮膜下に移植した。腎皮膜下への移植は、腎臓皮膜に５ｍｍの切開を入れ、腎臓皮膜と腎臓実質を剥離し、その間に複数の再生歯胚を含むスペーサーを挿入することにより行った。
腎皮膜下移植６０日後に、腎臓から摘出したところ、複数の歯をもつ一塊の多数歯ユニットが得られた。腎皮膜下移植６０日後の多数歯ユニットについて、実体写真を図１４に示す。マイクロＣＴ（リガク，東京，日本）にて解析したところ、各々の歯の周囲に歯根膜腔、歯槽骨の槽間中隔が認められた。腎皮膜下移植６０日後の多数歯ユニットについて、Ｔ外観像及びＣＴ断面像を図１５に示す。このことから、本発明の製造方法の一態様として、それぞれ単一の歯に成長する個別の再生歯胚を、将来咬合面となる方向を揃えて配置して培養することにより、複数の個別の歯について、生来の歯と同様に歯冠−歯根方向が一方向にそろい、かつ、複数の歯が歯列を形成するように一列に並んだ状態の再生歯ユニットを得られることが示された。また、本発明の製造方法の一態様として、多数の再生歯胚を配置して作製された再生歯ユニットは、複数の歯が正常な組織構造を有して存在し、かつ、その歯根部分を覆うように歯槽骨が一体として形成されていることが示された。【００６８】
<実施例５：多数歯ユニットの無歯顎モデルへの移植>
４週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの下顎第一、第二、及び、第三臼歯を抜歯し、無歯顎モデルを作製し、３日間の治癒期間を設けた。その後、同部の歯肉切開・剥離を行い、歯科用マイクロモーター（Ｖｉｖａ−Ｍａｔｅ  Ｐｌｕｓ，ナカニシ，東京，日本）を用いて歯槽骨を切削し、近遠心径３〜４ｍｍ、頬舌径１．２ｍｍの移植窩を形成した。マウス腎臓皮膜下で作製した再生歯ユニットを、顎骨移植窩に埋入し、８−０ナイロン縫合糸（ベアーメディック，千葉，日本）で歯肉縫合した。
多数歯ユニットを移植した無歯顎モデルマウスについてマイクロＣＴ撮影を行った。多数歯ユニットの口腔内移植後１日目のＣＴ画像を図１６に示す。本実施例の観察により多数歯ユニット歯槽骨とレシピエント歯槽骨との骨性結合による生着が示唆された。
これにより、歯の欠損部位が大型である場合にも、その形状に適合する複数歯を含む再生歯ユニットを一度に移植できることが示され、移植された再生歯ユニットの歯周組織と移植された固体の顎骨とが良好に骨結合することが示唆された。また、移植後５０日目のＣＴ画像において、移植された再生歯ユニットの歯周組織と移植された固体の顎骨との骨の生着が観察された。
【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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