(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）新生物を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、
ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＡＤＰＧＫ）及び／又はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ２）の生物活性、又は、（ｂ）前記ＡＤＰＧＫ又はＧＰＤ２をコードする遺伝子の発現、を調節できる化合物を含み、
前記化合物は、
前記ＡＤＰＧＫ又はＧＰＤ２に対するアンチセンスヌクレオチド、
前記ＡＤＰＧＫ又はＧＰＤ２をコードする前記遺伝子の発現を減少又は阻害するｓｉＲＮＡ、
前記ＡＤＰＧＫ又はＧＰＤ２に対して向けられたアンタゴニスト抗体又は同一特異性を有するそのフラグメント、
活性型の突然変異誘因によって生成される前記ＡＤＰＧＫ又はＧＰＤ２の不活性バージョン、又は、
前記ＡＤＰＧＫ又はＧＰＤ２の前記不活性バージョンをコードするポリ核酸、であり、
そして、
治療対象の前記新生物は、強化ＮＦ−κＢレベルを示すＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）又は腫瘍である、医薬組成物。
【請求項２】
強化ＮＦ−κＢレベルを示すＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）又は腫瘍を治療できる化合物を同定するための方法であって、
候補化合物をＡＤＰＧＫ若しくはＧＰＤ２、又はＡＤＰＧＫ若しくはＧＰＤ２をコードする遺伝子を含む試験系とともにインキュベートする工程、及び、
ＡＤＰＧＫ又はＧＰＤ２の生物活性をアッセイする工程を含み、
このときＡＤＰＧＫ又はＧＰＤ２の前記生物活性の減少は、ＡＤＰＧＫ若しくはＧＰＤ２の生物活性、又はＡＤＰＧＫ若しくはＧＰＤ２をコードする遺伝子の発現を調節する所望の特性を有し、強化ＮＦ−κＢレベルを示すＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）又は腫瘍を治療できる候補化合物の存在の指標であり、
前記ＡＤＰＧＫ又はＧＰＤ２の前記生物活性の減少は、前記試験化合物の非存在を特徴とする試験系との比較によって決定される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）異常細胞増殖に関連する疾患、例えば新生物、又は（ｂ）免疫系の疾患、例えば自己免疫疾若しくは移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）の治療に使用するために（ａ）ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＡＤＰＧＫ）及び／又はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ２）の生物活性、又は（ｂ）ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２をコードする遺伝子の発現を調節できる化合物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
経済的及び人的資源の莫大な投資にもかかわらず、癌は、依然として死亡の主要原因の１つである。癌に対する管理選択肢は、化学療法、放射線療法、手術、モノクローナル抗体療法及びその他の方法を含めて数多く存在する。いずれの治療が使用されるのかは、癌のタイプ、腫瘍の位置や悪性度、及び疾患の病期ならびに個人の全身の健康状態に左右される。身体の他の部位を損傷させずに癌を完全に切除することがほとんどの癌に対する治療の目標である。これは時には手術によって達成可能であるが、隣接組織を侵襲する、又は顕微的転移によって遠隔部位へ伝播する癌の性質がその有効性を制限することが多い。手術は、広範囲の切除縁もしくは自由縁の除去を必要とすることが多かった。自由縁の幅は、癌のタイプ、切除方法（ＣＣＰＤＭＡ、モース手術（Mohs surgery）、ＰＯＭＡなど）に左右される。縁は、ＣＣＰＤＭＡもしくはモース手術を使用した基底細胞癌の１ｍｍから侵襲性の強い癌の数センチメートルまでに及ぶ場合がある。化学療法の有効性は、身体内の他の組織への毒性によって限定されることが多い。放射線もまた、正常組織に損傷を引き起こす可能性がある。癌は１クラスの疾患であるので、そもそも全ての感染性疾患に対する単一治療がない以上に単一の「癌の治療法」は存在しそうにもない。血管形成抑制因子は、以前は多数のタイプの癌に適用可能な「特効薬」治療として効力があると考えられていたが、実際はそうではない。
【０００３】
癌の免疫療法についても、当該技術分野では、腫瘍特異的免疫応答を増幅させる試みにおいて、アジュバント、例えばカルメット・ゲラン棹菌（ＢＣＧ）及びコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium  parvum）と混合された自己腫瘍死菌もしくは腫瘍細胞可溶化物から成る細胞ベースの癌ワクチンについての初期の試みを含む多数のアプローチについて記載がある。また別の免疫療法戦略には、遺伝子治療、小分子阻害剤、及び及び活性化剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ワクチン、活性化自己細胞、抗体、並びにサイトカイン及びケモカイン、天然もしくは組み換えタンパク質、イン ヴィトロ修飾自己細胞の投与が含まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの療法が長期にわたって研究されてきたにもかかわらず、依然として、腫瘍療法ならびに免疫疾患の療法に対する改良された戦略が必要とされている。
【０００５】
そこで、本発明の課題は、そのような療法のための安全で効果的な手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によると、この課題は、特許請求の範囲に規定した主題によって達成される。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介しての活性化は、Ｔ細胞を駆動して急速に増殖及び分化させる。ＰＬＣγ１誘導の段階で、ＴＣＲ応答は２つの経路に分かれる。イノシトール３，４，５−三リン酸は、細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇及びＣａ２＋依存性転写因子、例えばＮＦ−ＡＴの活性化を誘導する。ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）は、ＰＫＣθ及びＲａｓＧＲＰタンパク質を活性化し、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の誘因を引き起こす。これら３つの転写因子は、Ｔ細胞活性化誘導性遺伝子発現を本質的に制御する。そこでＣａ２＋イオノフォア、例えばイオノマイシン（Ｉｏｎｏ）、及びＤＡＧミメティック、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を用いた同時治療は、完全Ｔ細胞活性化駆動転写反応を生じさせる。Ｔ細胞活性化には、酸化依存性転写因子であるＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の活性化を促進する、低いが生理学的に重要なレベルのＲＯＳ、すなわちＨ２Ｏ２媒介性酸化シグナルの一過的生成が平行して生じることが証明されている（１、２）。酸化シグナルは、Ｔ細胞活性化に不可欠である。Ｃａ２＋インフラックスと一緒に、酸化シグナルは、Ｔ細胞活性化誘導性遺伝子発現（例、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＣＤ９５Ｌ）の最小要件を構成する。いずれのシグナルも、単独では十分ではない（１、３、４）。
【０００７】
数種の異なる酵素源、例えばミトコンドリア呼吸鎖、リポオキシゲナーゼ及びＮＡＤＰＨオキシダーゼ、ＮＯＸ２及びＤＵＯＸ２は、Ｔ細胞活性化誘因ＲＯＳ産生に関与すると記載されてきた（１、３、５〜８）。以前の研究は、酸化シグナルの起源としてのミトコンドリアの重要な役割を証明している。様々な実験アプローチを使用して、ＴＣＲ近位シグナロソーム媒介性ＰＫＣθ活性化が、ミトコンドリア呼吸複合体ＩからのＲＯＳ産生を駆動することを証明することができた。さらに、酸化シグナルの生成は、抗糖尿病薬であるメトホルミンによって遮断されることが証明された（３）。
【０００８】
Ｔ細胞活性化誘導性遺伝子発現は、グルコース取り込みに左右される（９、１０）。さらに、Ｔ細胞活性化には、ミトコンドリアＡＴＰ産生から好気性解糖への代謝スイッチ、即ち急速に増殖する癌細胞にとっても特徴的な現象（１１、１４）であるワールブルク（Warburg）効果が付随する（１１〜１３）。さらに、癌細胞には高内因性ＲＯＳ産生及びＮＦ−κＢ経路の構成的活性化が不随することが多い（１５〜１８）。興味深いことに、高血糖性及び低酸素性条件下でアップレギュレートされたグルコース代謝は、様々な細胞系においてミトコンドリアＲＯＳ遊離を誘導することが証明された（１８〜２１）。これらの観察所見は、Ｔ細胞が活性化されると、ミトコンドリア呼吸鎖がＡＴＰ産生からシグナリング機構へ切り替わることを証明している。
【０００９】
本発明を生じさせた実験中、酸化シグナルの生成に付随する（即ち、ＴＣＲもしくはＰＭＡ誘因の１時間以内に発生する）代謝変化について、部分的解糖性増殖細胞−イン ヴィトロ拡張末梢ヒトＴ細胞（１３、２２）及びジャーカット（Jurkat）Ｔ細胞（２３）−内で（１、３））研究した。選択的、典型的な古細菌解糖酵素であるＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＡＤＰＧＫ）のＴＣＲ誘因活性化が酸化シグナルの生成を媒介することを証明することができた。解糖流動におけるＡＤＰＧＫ駆動性増加は、ＴＣＲ誘導性グルコース取り込み、ミトコンドリア呼吸のダウンレギュレーション及びミトコンドリアグリセロール−３−リン酸（ＧＰＤ）シャトルに向かう解糖の偏向、即ちワールブルク代謝変化と一致する。呼吸鎖関連性ＧＰＤ２の活性化は、ユビキノンの過剰還元及びミトコンドリア複合体ＩからのＲＯＳ遊離を生じさせる。これと平行して、ミトコンドリアの生体エネルギー抗−ＣＤ３及び超微細構造が変化する。酸化シグナルはＮＦ−κＢ媒介性遺伝子発現を駆動するので、ＡＤＰＧＫ及びＧＰＤ２のダウンレギュレーションはＮＦ−κＢ誘導を阻害するが、他方ＡＤＰＧＫの過剰発現はそれを強化する。興味深いことに、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞内のＡＤＰＧＫ及びＧＰＤ２の発現強化は、腫瘍形成機能を示唆している。本明細書に記載した新規なシグナリング及び代謝経路は、腫瘍原性にとって重要な意味を有しており、さらに療法に新規な手段を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（Ａ）イン ヴィトロ拡張末梢Ｔ細胞の呼吸速度を可溶性抗−ＣＤ３抗体もしくはＰＭＡでの刺激後にモニターした。「コントロール」状態（１５分間の先行誘導）と「刺激」状態（指示した時間間隔）の間で計算された「ミトコンドリア呼吸速度」における減少。（ｎ＝３）回の実験（即ち、ドナー）。（Ｂ）活性化１時間後にＴ細胞中で測定したＤ−［３−３Ｈ］グルコースの取り込み（Ａと同様）。結果はコントロール（ＧＡＭ−抗−ＣＤ３に対して、未処理−ＰＭＡに対して）の［％］として示した、（ｎ＝８）回の実験±ＳＤ。（Ｃ）活性化されたＴ細胞の細胞内ＡＴＰ含量（Ａ及びＢと同様）、（ｎ＝３）回の実験の結果±ＳＤ。（Ｄ〜Ｊ）細胞はプレート結合ＣＤ３抗体（３０μｇ／ｍｌ）又はＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて１時間刺激した。Ｄ及びＥ、プレインキュベーション後に測定した刺激誘導性酸化シグナルで、（Ｄ）ＨＡＮＫＳ緩衝液＋１１０μｇ／ｍｌのピルビン酸＋Ｇｌｃ／ＤＯＧ中（３０分間）、又は（Ｅ）培養培地＋ＢｒＰｙｒ中（２０分間）。Ｆ、ＩＬ−２及びＩκＢα発現を、（Ｅ）と同様に処理したＴ細胞中で決定した。代表的な３回の測定。Ｇ、細胞を瞬間冷凍し、透過処理し、ＥＴＣ複合体の定常状態酵素活性を測定した。（ｎ＝８、上方パネル）又は（ｎ＝４、下方パネル）の実験についての結果は、未処理コントロール（１００％に設定、点線）の［％］±ＳＤとして示した。Ｈ及びＩ、細胞はＢＩＭを用いて前処理した（２０分間）。（Ｈ）では、酸化シグナル発生を測定し、代表的な３回ずつの測定±ＳＤを示した。（Ｉ）では、定常状態酵素活性を測定し、（Ｇ）と同様に提示した。Ｊ、複合体Ｉ（ＣＩ）／複合体ＩＩ（ＣＩＩ）から複合体ＩＩＩ（ＣＩＩＩ）への電子流動を透過性細胞もしくはミトコンドリア分画内で測定した。（ｎ）回の実験についてのデータは、±ＳＤで提示した（図１Ｇと同様）。Ｋ、細胞抽出物を分離し、ＨＰＬＣによって分析した。ユビキノン酸化還元状態における変化はコントロール細胞（０に設定）及び活性化細胞のユビキノノール／ユビキノン比の差［％］として提示した。データは、（ｎ）回の実験（即ち、ドナー）についての平均値±ＳＤとして提示した。スチューデントｔ検定。ｐ＜０．００１（＊＊＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．０５（＊）。
【図２】Ｔ細胞活性化後のミトコンドリアの急速な超微細構造の変化（Ａ〜Ｃ）イン ヴィトロ拡張末梢ヒトＴ細胞は、未処理のまま放置した（Ａ）、また１時間活性化（Ｂ、Ｃ）し、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｂ）、若しくはプレート結合抗−ＣＤ３抗体（３０μｇ／ｍｌ）（Ｃ）を用いて活性化した。細胞を固定し、染色し、電子顕微鏡検査にかけた。代表的画像を提示した。スケールバー。１μＭ（倍率７，０００倍）、若しくは２００ｎＭ（倍率５０,０００倍）。
【図３】Ｔ細胞活性化は解糖流動をミトコンドリアＧＰＤシャトルに向けて偏向させる（Ａ）解糖経路（白抜き矢印は転換された代謝流を示す）。イン ヴィトロ拡張Ｔ細胞は、１時間にわたりプレート結合ＣＤ３抗体（３０μｇ／ｍｌ）（Ｂ、Ｃ、Ｅ）、ＧＡＭ架橋結合抗−ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）（Ｄ、コントロール−ＧＡＭ単独）若しくはＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｅ、Ｇ）を用いて刺激した。（Ｂ）Ｔ細胞活性化後の解糖酵素の状態（頭字語−Ａを参照されたい）。結果は、未処理コントロール（１００％に設定、点線）の［％］として示した。（ｎ＝３）回の実験（即ち、ドナー）±ＳＤ。（Ｃ）活性化Ｔ細胞のサイトゾル中で測定されたＧＰＤ１／ＧＡＰＤＨに向かうフルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）の代謝流動。（Ｂ）と同様の活性化及びデータ提示。（Ｄ）拡張Ｔ細胞の活性化後の乳酸濃度の変化。（ｎ）回の実験±ＳＤ。（Ｅ）非刺激コントロールの［％］として示した、活性化Ｔ細胞±ＢＩＭを用いた前処理のミトコンドリア分画内のＧＰＤ２活性の変化、（ｎ）回の実験（即ちドナー）±ＳＤ。（Ｆ）ジャーカット細胞内のｓｉＲＮＡ媒介性ＧＰＤ２ノックダウンのリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ（左のパネル）及びＷＢ（右のパネル）分析。（Ｇ〜Ｉ）ＧＰＤ２発現は、ジャーカット細胞（Ｇ、Ｉ）において、若しくは安定性ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポータージャーカット細胞（Ｈ）において、ノックダウンされた。細胞を、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）±Ｉｏｎｏ（１μＭ）及びＲＯＳ（Ｇ）を用いて活性化し、ＮＦ−κＢ活性化（Ｈ）、若しくはＩＬ−２発現の誘導（Ｉ）をアッセイした。データは、代表的な実験、又は（ｎ）回の実験の平均値±ＳＤとして提示した。スチューデントｔ検定、ｐ＜０．００１（＊＊＊）；ｐ＜０．０１（＊＊）；ｐ＜０．０５（＊）。
【図４】Ｔ細胞はＡＤＰＧＫ酵素活性を誘因する。細胞をプレート結合ＣＤ３抗体（３０μｇ／ｍｌ）（Ｂ〜Ｄ）、若しくはＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｃ、Ｅ）を用いて１時間刺激した（Ａ）拡張Ｔ細胞のミトコンドリア（「高ｇ」分画）内での呼吸共役ヘキソキナーゼ（ＨＫ）活性を測定するための実験構成。（Ｂ）（Ａ）において描出した実験の結果、ＣＣＣＰ（０．１２５μＭ）、ＮａＣＮ（１０ｍＭ）。（Ｃ）左のパネル、活性化Ｔ細胞、若しくはジャーカット細胞±ＢＩＭを用いた前処理（２０分間）のミトコンドリア（「高ｇ」分画）で測定されたＡＤＰＧＫ活性。（ｎ）回の実験（即ち、ドナー）についての結果は、未処理コントロールの［％］±ＳＤとして示した。右のパネル、拡張ヒトＴ細胞、又はジャーカット細胞の全可溶化物におけるヒトＡＤＰＧＫのＷＢ。（Ｄ）活性化、拡張Ｔ細胞のミトコンドリア（「高ｇ」）及びサイトゾル分画のＷＢ分析。（Ｅ）ジャーカット細胞（Ｆ−ＡＤＰＧＫジャーカット、ＥＶジャーカット−空ベクターコントロール細胞）内のＦＬＡＧ−ＡＤＰＧＫ構築物の発現。左のパネル、（Ｆ−）ＡＤＰＧＫ含量及び発現のＷＢ（矢印−Ｆ−ＡＤＰＧＫ及びＡＤＰＧＫタンパク質）、及びリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ分析。右上方パネル、レトロウイルス構築物。右下方パネル、活性化Ｆ−ＡＤＰＧＫ及びＥＶジャーカット細胞の「ＥＲ濃縮」分画におけるＡＤＰＧＫ活性。代表的な３回ずつの実験±ＳＤは、Ｃと同様に提示した（未処理ＥＶジャーカット細胞のサンプルについての活性を０に設定した）。（Ｆ）上方パネル、免疫沈降Ｆ−ＡＤＰＧＫのＷＢ（ＩＰ、矢印、下方パネル、Ｆ−ＡＤＰＧＫ及びＡＤＰＧＫタンパク質、ＦＬＡＧ  ＷＢ−ウサギ抗ＦＬＡＧ抗体、ＡＤＰＧＫ  ＷＢ−マウス抗体、ＥＶジャーカット「洗浄」ライン内のＡＤＰＧＫ  ＷＢ上の上方バンド−マウス抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）抗体のＨ鎖）。下方パネル、免疫沈降物（「溶出液」）中のＡＤＰＧＫ活性。スチューデントｔ検定、ｐ＜０．００１（＊＊＊）；ｐ＜０．０１（＊＊）。
【図５】低下したＡＤＰＧＫ内容物は、活性化誘導性酸化シグナル発生及びＮＦ−κＢ応答を阻害する（Ａ）ジャーカット細胞をｓｉＲＮＡトランスフェクトし、ＡＤＰＧＫ発現及び含量をリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ及びＷＢによって分析した。（Ｂ〜Ｄ）ＡＤＰＧＫのノックダウン後、ジャーカット細胞（Ｂ、Ｄ）、若しくは安定性ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ受容体ジャーカット細胞（Ｃ）を、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）±Ｉｏｎｏ（１μＭ）を用いて活性化し、酸化シグナル（Ｂ）、ＮＦ−κＢ活性化（Ｃ）、又はＩＬ−２発現の誘導（Ｄ）を分析した。代表的な実験を３回ずつ実施した（Ｃ及びＤ、上方パネル）、又は実験間比較（Ｂ及びＤ、下方パネル）を提示した。（Ｅ）「静止」及びイン ヴィトロ拡張（「予め活性化された」）ヒトＴ細胞内のＡＤＰＧＫタンパク質レベル。（Ｆ）「静止」ヒトＴ細胞の「高ｇ」ミトコンドリア分画におけるＡＤＰＧＫ及びＧＰＤ２活性の変化はプレート結合抗−ＣＤ３抗体（３０μｇ／Ｌ）を用いて１時間刺激した。（ｎ）回の実験（即ち、ドナー）についての結果は、未処理コントロールの［％］±ＳＤとして示した。（Ｇ）左のパネル、「静止」Ｔ細胞内のＡＤＰＧＫ発現のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンのリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ分析。右のパネル、ＡＤＰＧＫノックダウンの後、Ｔ細胞をＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて１時間刺激し、酸化シグナル生成を測定した（ｎ＝３回の実験）。スチューデントｔ検定、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．０５（＊）。
【図６】（Ａ〜Ｃ）ＦＬＡＧ−ＡＤＰＧＫ（Ｆ−ＡＤＰＧＫ）タンパク質を安定性で発現するジャーカット細胞（Ａ、Ｃ）又はジャーカット細胞（Ｃ）、及び２４時間にわたりＷＴ−ＡＤＰＧＫタンパク質を一過性で過剰発現する（Ｂ、Ｃ）ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ受容体ジャーカット細胞（Ｂ）を１時間（Ａ、Ｃ）又は６時間（Ｂ）にわたりＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）±Ｉｏｎｏ（１０μＭ）を用いて活性化した。その後、（Ａ）酸化シグナル、（Ｂ）ＮＦ−κＢ活性化、（Ｃ）ＩＬ−２、ＩＬ−８もしくはＩκＢα発現の誘導を分析した。（ｎ）回の３回ずつの実験の統計的比較を提示した（ＥＶコントロール細胞の応答を１００に設定した）。Ｂ、一過性ＷＴ−ＡＤＰＧＫ過剰発現のＷＢ分析。（Ｄ）ＡＤＰＧＫ及びＨＫの特異的酵素活性は、２５℃、３０℃、３５℃及び４２℃で拡張ヒトＴ細胞の「高ｇ」ミトコンドリア分画内で測定した。２５℃でのＡＤＰＧＫ活性を１００％に設定した。（Ｅ）正常Ｂ細胞（ｎ＝９）及びＣＬＬ細胞（ｎ＝１０）中でのＡＤＰＧＫ及びＧＰＤ２遺伝子発現をリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。２種の実験設定からの「相対遺伝子発現」レベルの数値（アクチン転写産物に標準化した）を「ｚスコア」として提示した。スチューデントｔ検定、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．０５（＊）。「異常値」は、丸印でマーキングした。（Ｆ）上述した経路のスキーム。白抜き矢印、酵素活性、輸送（グルコース）、ユビキノール含量、又は偏向された代謝流動の方向における変化。
【図７】（Ａ）活性化前後のイン ヴィトロ拡張ヒト末梢Ｔ細胞のΔｃＯ２［Ｏ２（ｍｌ）／Ｌ］として描出したミトコンドリア酸素消費速度。矢印−可溶性抗−ＣＤ３（１０μｇ／ｍｌ＋２μｇ／ｍｌ  ＧＡＭ）抗体、又はＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いた刺激。３回の独立実験についての代表的記録を示した。（Ｂ及びＣ）ジャーカットＴ細胞もしくは一次ヒトＴ細胞をＨ２ＤＣＦ−ＤＡで染色し、グルコース（Ｇｌｃ）、２−デオキシ−グルコース（ＤＯＧ）、若しくは３−ブロモピルビン酸（ＢｒＰｙｒ）を用いて図１Ｄ及びＥに記載したように活性化した。Ｂ、細胞内酸化状態は、染色強度（相対ＭＦＩ単位）によって推定した。Ｃ、図１Ｅと同様に測定した抗−ＣＤ３酸化シグナル。Ｄ、細胞は、図１Ｆに示したように処理及び刺激し、ＩＬ−４遺伝子発現は、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによってアッセイした。
【図８Ａ】イン ヴィトロ拡張ヒト末梢Ｔ細胞を指示した期間にわたってプレート結合抗−ＣＤ３抗体（３０μｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。次に、選択した呼吸鎖成分の細胞内含量をＷＢによって分析した。
【図８Ｂ】左のパネル、抗−ＣＤ３処理Ｔ細胞（Ａと同様、２例のドナー）のミトコンドリア分画を０．０１％ジギトニンを含有する緩衝液中に可溶化し、ＢＮ−ＰＡＧＥによって分解した。右のパネル−ジギトニンが複合体ＩＩＩ（ＢＣ１複合体）の移動挙動に及ぼす影響。点線の枠−複合体ＩＩＩ／ＧＰＤ２について屈曲。右のパネル、分子量マーカー及びＧＰＤ２についてのＢＮ−ＰＡＧＥゲルのＷＢ分析。
【図９Ａ】イン ヴィトロ拡張ヒト末梢Ｔ細胞をＨ２ＤＣＦ−ＤＡで染色し、１５分間にわたり各阻害剤を用いて前処理し、プレート結合抗−ＣＤ３抗体（３０μｇ／ｍｌ）もしくはＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）によって１時間刺激した。次に、酸化シグナル生成をＦＡＣＳによって測定した。
【図９Ｂ】イン ヴィトロ拡張ヒト末梢Ｔ細胞もしくはマウス心筋組織から単離したミトコンドリア内のミトコンドリア呼吸鎖複合体の比活性。
【図１０】（Ａ及びＢ）イン ヴィトロ拡張ヒト末梢Ｔ細胞は、ビス−インドリル‐マレイミデートＩ（ＢＩＭ）を用いて２０分間前処理し、プレート結合抗−ＣＤ３抗体（３０μｇ／ｍｌ）を用いて１時間にわたり刺激した。ミトコンドリア「高ｇ」分画は、ＨＫ１及びＨＫ２含量（Ａ）、若しくはＨＫ活性（Ｂ）について評価した。Ａでは、矢印は抗ＨＫ２抗体に対するＷＢバンドを示している。Ｂでは、（ｎ）回の独立実験（即ち、ドナー）についての結果は、未処理コントロール（１００％に設定、点線）の［％］±実験間ＳＤ、ｔ試験ｐ＞０．０５（有意ではない）として示した。
【図１１】（Ａ）ＦＬＡＧ−ＡＤＰＧＫタンパク質（Ｆ−ＡＤＰＧＫ）を安定性で発現するジャーカットＴ細胞、及び（Ｂ）イン ヴィトロ拡張ヒト末梢Ｔ細胞（刺激±プレート結合抗−ＣＤ３抗体、３０μｇ／ｍｌ）をサイトゾル、「ミトコンドリア濃縮」及び「ＥＲ濃縮」分画への細胞内分画化に供した。ＡＤＰＧＫ含量をＷＢによって分析した。ＭｎＳＯＤ−ミトコンドリアマーカー、カルレチキュリン−可溶性ＥＲマーカー、ＺｎＣｕＳＯＤ−細胞質マーカー。Ｂ、ＡＤＰＧＫ  ＷＢ上の上方バンド−刺激のために使用されたマウス抗−ＣＤ３抗体のＨ鎖。
【図１２】ＡＤＰＧＫ発現（トランスフェクション７２時間後）のｓｉＲＮＡ媒介性ダウンレギュレーション後のジャーカットＴ細胞を１時間にわたりＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノマイシン（Ｉｏｎｏ、１μＭ）を用いて刺激した。ＩＬ−８及びＩκＢα遺伝子発現の誘導（アクチン転写産物に標準化した）をリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。
【図１３】ＦＬＡＧ−ＡＤＰＧＫタンパク質（Ｆ−ＡＤＰＧＫ）を安定性で発現する、もしくはＷＴ  ＡＤＰＧＫタンパク質を一過性で過剰発現する（ＷＴ−ＡＤＰＧＫ、トランスフェクション２４時間後）非刺激ジャーカットＴ細胞における基礎（basal）ＩＬ−２、ＩκＢα及びＩＬ−８遺伝子発現レベル。転写レベルをアクチン発現に標準化し、各空ベクター（ＥＶ）コントロール細胞（１に設定、点線）の発現レベルと比較した。（ｎ）回の独立実験についての結果±実験間ＳＤを示した。
【図１４】ヒト（Homo sapiens）及びパイロコッカス・ホリコシイ（Pyroccocus horikoshii）ＯＴ３  ＡＤＰＧＫタンパク質のアミノ酸（ａａ）配列及び二次構造の比較好熱性ＡＤＰＧＫタンパク質の公知の結晶構造（１６）について一般的である、ヒトに対して−Ｊｐｒｅｄ  ｖ．３（１４）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ正準配列Ｑ９ＢＲＲ６−１）による二次構造予測、パイロコッカス・ホリコシイに対して−結晶構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋコード：１Ｌ２Ｌ）（１５）に基づく二次構造モチーフ。グレーの四角形−同種アミノ酸、白抜き四角形−類似のアミノ酸、ＸＸＤ及びＧＸＧＤモチーフ−保存活性中心、枠−予測シグナルペプチド。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
そこで、本発明は、（ａ）異常細胞増殖に関連する疾患もしくは（ｂ）免疫系の疾患の治療に使用するための（ａ）ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＡＤＰＧＫ）及び／又はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ２）の生物活性、又は（ｂ）ＡＤＰＧＫ又はＧＰＤ２をコードする遺伝子の発現を調節できる化合物に関する。
【００１２】
調節、例えば生物活性の減少もしくは阻害は、化合物のＡＤＰＧＫ及びＧＰＤ２各々との直接相互作用もしくは結合によって、又は間接的相互作用、例えばＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２の生物活性と関連する化合物との相互作用によって実行可能である。該生物活性の減少もしくは阻害は、さらにまたＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２の変化した、例えば不活性形の、好ましくは過剰な適用によって達成することもできる。
【００１３】
治療効果を得るという目的で、ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２の生物活性を減少、若しくは阻害する適当な化合物の例、例えば免疫抑制因子、又は、対応する遺伝子の発現を減少、若しくは阻害する適当な化合物の例には、
（ａ）プラスミド、ベクター、又は天然／合成／突然変異ウイルス、様々は種類の改変オリゴヌクレオチド（例、ＰＴＯ、ＬＮＡ、２’Ｆ−ＡＮＡ、タンパク質−ヌクレオチド複合体、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉｃｒｏｍｉＲＮＡ、メチルメトキシ−、ホスホロアミデート、ＰＮＡ、モルホリノ、ホスホルアミデート、シクロヘキセン（ＣｅＮＡ）、ギャップマー、リボザイム、アプタマー、ＣｐＧ−オリゴ、ＤＮＡ−ザイム、リボスイッチ、又は脂質もしくは脂質含有分子）、
（ｂ）全種類のリンカーを含む、ペプチド類、ペプチド複合体、
（ｃ）小分子、
（ｄ）抗体及びそれらの誘導体、特にキメラ、Ｆａｂ−フラグメント、Ｆｃ−フラグメント、又は
（ｅ）担体、リポソーム、ナノ粒子、複合体、又は上記に挙げた構築物を含有する任意の他の送達系、
（ｆ）酸化剤もしくはスルフヒドリル（ＳＨ基）修飾剤が含まれる。
【００１４】
以下では、本発明の目的に適合するまた別の化合物及びそのような化合物を同定／選択する方法についてより詳細に説明する。
【００１５】
好ましくは、医薬組成物では、上記及び下記に記載する当該の化合物が薬学的に許容される担体と結合される。「薬学的に許容される」は、有効成分の生物活性の有効性に干渉しない、そしてそれが投与される患者にとって毒性ではないあらゆる担体を含むことを意味している。適切な医薬担体の例は当該技術分野において周知であり、リン酸緩衝食塩液、水、エマルジョン、例えば油／水型エマルジョン、様々な種類の湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。そのような担体は、従来法によって調製することができ、活性化合物を被験者に有効量で投与できる。
【００１６】
「有効量」は、疾患、例えば新生物の経過及び重症度に影響を及ぼし、そのような病状の減少もしくは寛解をもたらすのに十分な有効成分の量を意味する。治療に有用な「有効量」は、当業者に公知の方法を使用して決定できる。
【００１７】
適切な組成物の投与は、様々な方法によって、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所もしくは皮内投与によって実施できる。投与経路は、当然ながら、療法の種類、及び該医薬組成物中に含有された化合物の種類に左右される。投与計画は、主治医及び他の臨床因子によって決定されることになる。当該医療分野において周知であるように、任意の１例の患者のための用量は、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与対象の特定化合物、投与の時間及び経路、療法の種類、全身健康状態及び同時に投与される他の薬物を含む多数の因子に左右される。
【００１８】
当業者であれば、ＡＤＰＧＫ及びＧＰＤ２のアミノ酸配列、ならびにこれらのタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列に関する知識（ＧＰＤ２、ヌクレオチド配列：ＮＣＢＩ  ＮＭ＿００１０８３１１２．２、アミノ酸配列：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ基準配列Ｐ４３３０４−１。ＡＤＰＧＫ、ヌクレオチド配列：ＮＣＢＩ  ＮＭ＿０３１２８４．４（４９６アミノ酸アイソフォーム）＋ＮＭ＿０３１２８４．２（４９７アミノ酸アイソフォーム）、アミノ酸配列：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ基準配列Ｑ９ＢＲＲ６−２（４９６アミノ酸アイソフォーム）＋Ｑ９ＢＲＲ６−１（４９７アミノ酸アイソフォーム）に基づいて、本発明の治療に有用な化合物を容易に同定又は生成できる。
【００１９】
本発明のまた別の好ましい実施形態では、ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２をコードする遺伝子の発現を減少もしくは阻害するために有用である化合物は、前記遺伝子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡである。
【００２０】
適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドの生成は、所望の作用、例えば該タンパク質の発現の阻害が結果として生じるように該アンチセンス相互作用を発生させる該ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２コード遺伝子内の１つ以上の部位の決定を含んでいる。好ましい遺伝子内部位は、（ａ）該遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始もしくは終止コドンを含む領域、又は（ｂ）「ループ」もしくは「バルジ」である、即ち二次構造の一部ではないｍＲＮＡの領域である。１つ以上の標的部位が同定されると、該標的に十分に相補的である、即ち十分良好に、及び十分な特異性でハイブリダイズして所望の作用を生じさせるオリゴヌクレオチドが選択される。本発明の状況では、「ハイブリダイゼーション」は、相補的ヌクレオシドもしくはヌクレオチド塩基間のワトソン・クリック、フーグスティーン、若しくは逆フーグスティーン水素結合であってよい水素結合を意味する。本明細書で使用する「相補的」は、２つのヌクレオチド間の正確に対合する能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドの所定の位置にあるヌクレオチドがＤＮＡもしくはＲＮＡ分子の同一位置でヌクレオチドと水素結合可能であれば、該オリゴヌクレオチド及び該ＤＮＡもしくはＲＮＡは、その位置で相互に対して相補的であると考えられる。該オリゴヌクレオチド及び該ＤＮＡもしくはＲＮＡは、各分子内の十分な数の対応する位置が相互に水素結合可能なヌクレオチドによって占められる場合、相互に相補的である。そこで、「特異的にハイブリダイズ可能」及び「相補的」は、該オリゴヌクレオチド及び該ＤＮＡもしくはＲＮＡとの間に安定性及び特異性結合が発生するような十分な程度の相補性もしくは正確な対合を示すために使用される用語である。当該技術分野では、アンチセンス化合物の配列が特異的にハイブリダイズ可能であるその標的核酸の配列に対して１００％相補的である必要はないと理解されている。アンチセンス化合物は、該化合物の該標的ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子への結合が該標的ＤＮＡもしくはＲＮＡが有用性の消失を引き起こす正常機能を妨害する場合に特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が所望である、即ち治療的処置の場合の条件下で該アンチセンス化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するために十分な相補性度が存在する。
【００２１】
当業者であれば、ＡＤＰＧＫ及びＧＰＤ２各々についての公知のＤＮＡ配列に基づいて本発明に記載のアンチセンス化合物及びｓｉＲＮＡを生成できる。
【００２２】
「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はそれらのミメティックのオリゴマーもしくはポリマーを意味する。この用語には、天然型核酸塩基、糖及び共有結合インターヌクレオシド（骨格）結合、並びに同様に機能する非天然型部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような修飾もしくは置換オリゴヌクレオチドは、天然型より好ましいことが多いが、それは所望の特性、例えば強化された細胞取り込み、核酸標的に対する強化された親和性及びヌクレアーゼの存在下での増加した安定性のためである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは該アンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、以下に記載するようなオリゴヌクレオチドミメティックを含むがそれらに限定されない他のオリゴマーのアンチセンス化合物を包含している。本発明によるアンチセンス化合物は、約８〜約５０個の核酸塩基（即ち、約８〜約５０個の結合ヌクレオシド）を含んでいる。特に好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、いっそうより好ましくは約１５〜約２５個の核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンス化合物には、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）、オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、及び標的核酸にハイブリダイズしてその発現を阻害する他の短鎖触媒性ＲＮＡもしくは触媒性オリゴヌクレオチドが含まれる。
【００２３】
又は、本発明の化合物は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば哺乳動物宿主において転写することを可能にするベクターである。好ましくは、そのようなベクターは、遺伝子療法に有用なベクターである。遺伝子療法に有用な好ましいベクターは、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、又はより好ましくはＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルスである。一層より好ましくは、該レトロウイルスベクターは、マウスもしくは鳥類レトロウイルスの誘導体である。本発明において使用可能なそのようなレトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーヴィーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）である。最も好ましくは、マウスベクターに比較して広範囲の宿主範囲を提供する非ヒト霊長類レトロウイルスベクター、例えばテナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）が使用される。組換え型レトロウイルスには欠陥があるので、感染粒子を生成するためには支援が必要とされる。そのような支援は、例えば、ＬＴＲ内の調節配列の制御下でレトロウイルスの構造遺伝子の全部をコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞系を使用することによって提供できる。適切なヘルパー細胞系は、当業者には周知である。前記ベクターは、さらに形質導入細胞を同定できるように選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含有できる。さらに、該レトロウイルスベクターは、それらが標的特異的になるような方法で修飾できる。これは、例えば糖、糖脂質、又はタンパク質、好ましくは抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって達成できる。当業者であれば、標的特異的ベクターを生成するための別の方法を知っている。イン ヴィトロもしくはインビボ遺伝子療法のためのまた別の適切なベクター及び方法は、文献に記載されており、当業者には公知である。国際公開第９４／２９４６９号パンフレット、又は同第９７／００９５７号パンフレットを参照されたい。
【００２４】
標的器官内でのみ発現を達成するために、該アンチセンスオリゴヌクレオチドの転写のためのＤＮＡ配列を、組織特異的プロモーターに結合させ、遺伝子療法のために使用できる。そのようなプロモーターは、当業者には周知である。
【００２５】
オリゴヌクレオチド構造内で、該リン酸基は一般に、該オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間骨格を形成すると言われている。ＲＮＡ及びＤＮＡの正常結合もしくは骨格は、３’−５’へのホスホジエステル結合である。本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例には、修飾骨格もしくは非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格内にリン原子を維持するオリゴヌクレオチド、及び該骨格内にリン原子を有していないオリゴヌクレオチドが含まれる。安定性の増加を生じさせることのできる修飾オリゴヌクレオチド骨格は、当業者には公知であり、好ましくはそのような修飾はホスホロチオエート結合である。
【００２６】
好ましいオリゴヌクレオチドミメティックは、極めて優れたハイブリダイゼーション特性を有することが証明されているオリゴヌクレオチドミメティックであり、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれている。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置換される。核酸塩基は保持され、該骨格のアミド部分のアザ窒素原子へ直接的又は間接的に結合している。
【００２７】
修飾オリゴヌクレオチドは、１つ以上の置換もしくは修飾糖部分をさらに含有できる。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位で以下の、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルケニル、Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキニル、又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル内の１つを含み、ここで、該アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換もしくは未置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、若しくはＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってよい。特に好ましい修飾糖部分は、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である。
【００２８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、核酸塩基修飾もしくは置換をさらに含むことができる。修飾核酸塩基には、他の合成及び天然核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、及びアデニン及びグアニンの６−メチル、及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシンなどが含まれるが、それらの修飾が核酸二本鎖安定性を増加させることが証明されているので５−メチルシトシン置換が好ましい。
【００２９】
本発明のオリゴヌクレオチドのまた別の修飾は、該オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布もしくは細胞取り込みを強化する１つ以上の成分もしくはコンジュゲートへ該オリゴヌクレオチドを化学結合させる工程を含んでいる。そのような成分には、脂質成分、例えばコレステロール成分、コール酸、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、もしくはアダマンタン酢酸、パルミチル成分、又はオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分が含まれる。
【００３０】
本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物をさらに含んでいる。本発明の状況における「キメラ」アンチセンス化合物もしくは「キメラ」は、各々が少なくとも１つのモノマー単位、即ちオリゴヌクレオチド化合物の場合におけるヌクレオチドから作られている２つ以上の化学的に別個の領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも１つの領域を含有するが、このとき該オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性、増加した細胞取り込み及び／又は該標的核酸に対する増加した結合親和性を付与するように修飾されている。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂できる酵素の基質として機能できる。例として、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞エンドヌクレアーゼである。このため、ＲＮａｓｅＨの活性化は、ＲＮＡ標的の開裂を生じさせ、これにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の有効性を高度に増強する。結果として、キメラオリゴヌクレオチドが使用された場合は、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、短鎖オリゴヌクレオチドを用いて匹敵する結果が得られることが多い可能性がある。本発明のキメラアンチセンス化合物は、上述したような２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチドミメティックの複合構造として形成できる。そのような化合物は、当該技術分野では、さらにまたハイブリッドもしくはギャップマーと呼ばれてきた。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、本発明の化合物は、（ｉ）新生物又は（ｂ）自己免疫疾患、もしくは移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）を治療するために使用される。
【００３２】
「新生物」は、新生物形成の結果としての異常な組織塊である。「新生物形成」は、細胞の異常な増殖である。細胞の増殖が限度を超え、その周囲の正常組織と協調しない。この増殖は、刺激の停止後にさえ同様の過剰な方法で持続する。増殖は、通常は塊もしくは腫瘍を誘因する。新生物は、良性、前癌状態（上皮内癌）又は悪性（癌）の場合がある。本発明によって治療すべき新生物は、ＡＤＰＧＫ及び／又はＧＰＤ２を（過剰）発現する新生物を含んでいる。そこで、新生物中のＡＤＰＧＫ及び／又はＧＰＤ２の決定は、ＡＤＰＧＫ及び／又はＧＰＤ２阻害療法を開始するための指標である。治療対象の新生物は、特にＢ細胞慢性リンパ球性白血病又はＴ細胞活性化が有益な効果を示すことを特徴とする任意の新生物、即ち免疫系の腫瘍及びＮＦ−κＢの構成的活性化及び／又は上昇したＲＯＳレベルによって特徴付けられる腫瘍である。そのような腫瘍の例は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、び漫性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）、小児期／Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ／Ｔ−ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫、マルトリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、例えばセザリー症候群（ＳＳ）及び肝細胞癌（ＨＣＣ）である。
【００３３】
本発明の化合物を用いて治療できる好ましい自己免疫疾患は、例えばリウマチ、紅斑性エリテマトーデス、乾癬、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、又は糖尿病である。
【００３４】
ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２の生物活性を減少もしくは阻害させることのできる化合物のまた別の例は、実質的に同一結合特異性もしくは偽基質を有するこれらのタンパク質もしくはそれらのフラグメントに向けられた（中和）抗体である。用語「抗体」は、好ましくは様々なエピトープ特異性ならびに別個のモノクローナル抗体調製物を備えるプールされたモノクローナル抗体から本質的に成る抗体に関する。モノクローナル抗体は、例えばＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２のフラグメントを含有する抗原から、当業者には周知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５），  ４９５）を参照されたい）によって作成される。本明細書で使用する用語「抗体」（Ａｂ）もしくは「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、無傷分子ならびにタンパク質に特異的に結合できる抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことが意図されている。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントには無傷抗体のＦｃフラグメントが欠如しており、循環からより急速に除去され、無傷抗体より少ない非特異的組織結合を有する可能性がある。（Ｗａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２４：３１６−３２５（１９８３））。そこで、これらのフラグメント、ならびにＦＡＢの生成物又は他の免疫グロブリン発現ライブラリーが好ましい。さらに、本発明のために有用な抗体には、キメラ、一本鎖、及びヒト化抗体が含まれる。
【００３５】
又は、本発明のために好ましい化合物は、ＡＤＰＧＫ及びＧＰＤ２各々の不活性バージョン、又は上述したアプローチ／ベクターにしたがって導入できるこれらのタンパク質の不活性バージョンをコードする核酸配列である。そのような不活性バージョンは、突然変異誘因の周知の方法にしたがって生成できる。そのような化合物は、特に過剰に適用された場合にそれらの機能的に活性な対応物と置換することによって、ヒト身体において治療作用を有することができる。ＡＤＰＧＫ／ＧＰＤ２の潜在的不活性バージョンの分析は、分岐鎖Ｌ−アミノ酸から分岐鎖α−ケト酸への（可逆性）アミノ基転移をアッセイする工程によって、例えばグルタミン酸塩の生成を決定する工程によって実施できる。適切なアッセイについては、文献に記載されている。
【００３６】
また別の好ましい実施形態では、本発明の化合物は、好ましくはこれらのタンパク質のレベルを上昇させることによってＡＤＰＧＫ及び／又はＧＤＰ２の活性を上昇させる化合物である。これは、例えば、当業者には公知の方法／ベクターを使用して遺伝子発現を増加させる工程によって達成できる。そのような化合物は、低レベルのＡＤＰＧＫ及び／又はＧＰＤ２を特徴とする疾患又はＡＤＰＧＫ及び／又はＧＰＤ２の活性／レベルの上昇が有益な作用を有する可能性がある疾患、例えば低免疫性である免疫系の疾患又は例えばＨＩＶによって誘因される後天性免疫不全症候群の治療に有用である。
【００３７】
本発明はさらに、ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２の生物活性及び／又はＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２の発現を調節できる化合物を同定するための方法であって、
（ａ）候補化合物をＡＤＰＧＫもしくはＧＤＰ２を含む試験系又はＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２をコードする遺伝子とともにインキュベートする工程、及び
（ｂ）ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２の生物活性をアッセイする工程を含み、
このとき好ましくは前記試験化合物の非存在下での試験系と比較したＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２の生物活性の増加もしくは減少は、該所望の特性を有する候補化合物の存在の指標である方法に関する。
【００３８】
ＡＤＰＧＫ及び／又はＧＰＤ２の生物活性の増加もしくは減少は、該タンパク質の濃度を決定する工程によって、例えば特異的抗体を使用して、又は該タンパク質の酵素活性を直接的に決定することによって、例えば実施例１に記載した特異的基質もしくは最終生成物の濃度の変化を決定する工程によってアッセイできる。
【００３９】
そのような候補分子の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質、又は小分子が含まれる。そのような分子は、公知の技術を使用して合理的に設計できる。
【００４０】
好ましくは、スクリーニングに使用される前記試験系は、類似の化学的及び／又は物理的特性の基質を含んでおり、最も好ましい前記基質はほぼ同一である。本発明の使用にしたがって調製及び同定できる化合物は、発現ライブラリー、例えばｃＤＮＡ発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、低分子有機化合物、リガンド、ホルモン、ペプチドミメティック、ＰＮＡなどであってよい。
【００４１】
国際公開第９８／２５１４６号パンフレットは、所望の特性、特に、ポリペプチドもしくはその細胞受容体を作動、結合、又は拮抗する能力を有する化合物に関する複合物のライブラリーをスクリーニングする方法についてさらに記載している。そのようなライブラリー内の複合物は、試験下の化合物、該化合物の合成において少なくとも１つの工程を記録するタグ、及び受容体分子による修飾に感受性であるテザー（tether）を含んでいる。該テザーの修飾は、複合物が所望の特性を有する化合物を含有することを示すために使用される。該タグは、そのような化合物の合成における少なくとも１つの工程を解明するために解読することができる。ＡＤＰＧＫ及びＧＰＤ２各々と相互作用する化合物、又はそのような分子をコードする核酸分子を同定するための他の方法は、例えばファージディスプレイ系を用いるイン ヴィトロスクリーニングならびにフィルター結合アッセイ、若しくは相互作用の「リアルタイム」測定である。
【００４２】
さらに当業者であれば、例えば、ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２への基質もしくはリガンドとして機能できる、低分子有機化合物のミメティックを設計、合成、及び評価することが可能であることもまた周知である。
【００４３】
これら全ての方法は、本発明にしたがって、ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２又はそれらの発現の生物活性を調節する、例えば減少もしくは阻害する化合物を同定するために使用できる。
【００４４】
ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２をコードする遺伝子は、さらに活性化剤もしくは阻害剤、例えば免疫抑制調節因子をスクリーニングするための標的として機能できる。阻害剤は、例えば、ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２をコードする遺伝子のｍＲＮＡに結合し、それにより該ｍＲＮＡの天然立体配座を不安定化して転写及び／又は翻訳を阻止するタンパク質を含むことができる。さらに、文献においては、細胞増殖もしくは細胞死の遅延を結果として生じさせる細胞の内部で化合物が結合する規定もしくは未規定標的ＲＮＡ分子の構造を模倣する核酸分子、例えばＲＮＡフラグメント、を同定するための方法が記載されている。例えば、国際公開第９８／１８９４７号パンフレット及びその中に言及された参考文献を参照されたい。これらの核酸分子は、医薬上重要な未知の化合物を同定するため、及び疾患を治療する際に使用するために未知のＲＮＡ標的を同定するために使用できる。これらの方法及び組成物は、ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２の発現レベルを減少させるために有用な化合物を同定するために使用できる。
【００４５】
本発明の方法にしたがって試験及び同定できる化合物は、発現ライブラリー、例えばｃＤＮＡ発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、低分子有機化合物、ホルモン、ペプチドミメティック、ＰＮＡなどであってよい。さらにＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２の推定調節因子をコードする、及び／又はＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２の上流もしくは下流でそれらの作用を発揮する遺伝子は、例えば、当該技術分野において公知の遺伝子標的化ベクターを使用する挿入突然変異誘因を使用して同定できる。前記化合物は、さらにまた公知の阻害剤、基質もしくは調節因子の官能的誘導体又はアナログであってよい。そのような有用な化合物は、例えばＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２又はそれをコードする遺伝子の調節配列に結合するトランス作用因子であってよい。トランス作用因子の同定は、当該技術分野における標準方法を使用して実施できる。タンパク質が該タンパク質自体もしくは調節配列に結合するかどうかを決定するために、標準自然ゲルシフト分析を実施できる。タンパク質もしくは調節配列に結合するトランス作用因子を同定するために、該タンパク質もしくは調節配列は、標準タンパク質精製法における親和性試薬として、又は発現ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用できる。ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２と相互作用するポリペプチドをコードする核酸分子の同定は、さらにまた例えば、いわゆる酵母「ツーハイブリッド系」を使用することによっても達成できる。この系では、ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２はＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合している。この融合ポリペプチドを発現して、ＧＡＬ４転写因子によって認識される適切なプロモーターによって駆動されるｌａｃＺレポーター遺伝子を含む酵母株は、活性化ドメインに融合する植物タンパク質もしくはそれらのペプチドを発現するｃＤＮＡのライブラリーを用いて形質転換される。そこで、ｃＤＮＡの１つによってコードされたペプチドがＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２のペプチドを含む融合ペプチドと相互作用できる場合、該複合体は該レポーター遺伝子の発現を指示できる。この方法で、ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２及びＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２をコードする遺伝子は、ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２と相互作用するペプチド及びタンパク質を同定するために使用できる。当業者には、この系及び類似の系は、次に阻害剤を同定するためにさらに活用できることが明らかである。
【００４６】
最後に、本発明は、上記に特徴付けた疾患に罹患した患者のために治療様式を選択する方法であって、
（ａ）前記患者からサンプルを得る工程、及び
（ｂ）ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２のレベル及び／又は活性を決定する工程を含み、それにより該治療様式がＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２の該レベル及び／又は活性に左右される方法に関する。
【００４７】
好ましくは、ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２のレベルは、該タンパク質レベルについて、ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２に特異的に結合する抗体を使用して、又は該タンパク質の生物活性を決定する工程によって決定される。
【００４８】
患者のための治療様式の選択に関する本発明の方法では、用語「治療様式」もしくは「治療の様式」は、ＡＤＰＧＫ及びＧＰＤ２のレベル／活性に作用を有する化合物の適時の順次もしくは同時の投与に関するが、ただし本発明の方法の結果は該疾患がＡＤＰＧＫ及び／又はＧＰＤ２の異常レベル／活性と関連することを示すことを前提とする。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。
（実施例１）
材料及び方法
（Ａ）化学薬品
異なることを記載しない場合、使用した全ての試薬及び酵素は、Sigma-Aldrich社（独国ミュンヘン）によって供給されたものである。ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡ）は、Invitrogen社（米国カリフォルニア州カールズバッド）から入手した。Ｉｏｎｏは、Merck社（独国ダルムシュタット）から購入した。ウエスタンブロット（ＷＢ）のための一次抗体は、Sigma-Aldrich社（独国ミュンヘン）から−マウスモノクローナル抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）、ウサギポリクローナル抗ＦＬＡＧ、マウスモノクローナル抗γチューブリン、ウサギポリクローナル抗ＧＰＤ２（Human Protein Atlas Antibodies）、Cell Signaling社（米国マサチューセッツ州デンバース）から−ウサギポリクローナル抗ＨＫ１及びウサギポリクローナル抗ＨＫ２、Abcam社（英国ケンブリッジ）から−マウスモノクローナル抗ヒトＡＤＰＧＫ（１Ｅ４）、Santa Cruz Biotechnology社（米国カリフォルニア州サンタクルーズ）から−ヤギポリクローナル抗ＳＯＤ１、Milipore社（独国ダルムシュタット）から−ウサギポリクローナル抗ＳＯＤ２、ＡＢＲ社（米国コロラド州ゴールデン）から−ウサギポリクローナル抗カルレチキュリン、GeneTex社（米国カリフォルニア州アーヴィン）から−ウサギポリクローナル抗β−アクチン、及びThermo Scientific社（独国ボン）から−マウスモノクローナル抗ＰＨＢ１抗体であった（ＩＩ−１４−１０）。ミトコンドリア呼吸複合体の含量は、Mito Sciences社（米国オレゴン州ユージーン）からのTotal OXPHOS WB抗体カクテルを使用して分析した。ＦＩＴＣコンジュゲート抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２０抗体は、Becton Dickinson社（独国ハイデルベルク）から購入した。架橋結合ポリクローナルヤギ抗マウス抗体（ＧＡＭ）は、Southern Biotech社（米国アラバマ州バーミンガム）から入手した。ヒトＣＤ３に対するモノクローナルマウス抗体（ＯＫＴ３）は、記載されたとおりに調製した（１）。
【００５０】
（Ｂ）ヒト末梢Ｔ細胞及びＢ細胞の単離
一般に、ヒト末梢血Ｔリンパ球は、以前に記載されたとおりに精製した（１）。ヒト末梢血Ｂリンパ球は、ネガティブＭＡＣＳソーティング（「Ｂ細胞単離キットＩＩ」、Miltenyi社、独国ベルギッシュグラートバハ）によってフィコール勾配相間環（Ficoll gradient inter-phase ring）から調製した。調製したＴ及びＢ細胞の均質性は、ＦＩＴＣ結合抗−ＣＤ３もしくは抗−ＣＤ２０抗体を用いた染色、及びその後のＦＡＣＳ分析によって検証し、＞９３％（Ｂ細胞）及び＞９０％（Ｔ細胞）であると推定された。
【００５１】
（Ｃ）患者
試験に参加する前に全対象体からインフォームドコンセントを入手した。患者１０例中９例は、本療法の前に治療を受けていなかった。患者データ（年齢、性別及びＣＬＬサンプルの遺伝分析）は、表１に見いだすことができる。ＣＬＬ患者からのＢ細胞は、Ficoll-Paque遠心分離（GE Healthcare社、英国チャルフォントセントジャイルズ）によって単離した。純度は＞９０％と推定された。本試験は、ドイツ癌研究センター（ＤＫＦＺ、ハイデルベルク）の倫理指針及びヘルシンキ宣言に従って実施し、ハイデルベルクのルプレヒト・カールス大学（独国）の治験審査委員会によって承認された。
【００５２】
（Ｄ）細胞培養
Ｔ細胞系のジャーカットＪ１６−１４５細胞、Ｊ１６サブクローン（２）は、ＲＰＭＩ  １６４０（＋Ｌ−グルタミン）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中で培養した。GaussiaルシフェラーゼＮＦ−κＢレポーターＪ１６−１４５細胞は、ＩＭＤＭ、１０％のＦＣＳ中で培養した。新鮮単離（「静止」）もしくはフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）活性化及び６〜８日間イン ヴィトロ拡張（「予め活性化された」）末梢ヒトＴ細胞は、ＲＰＭＩ  １６４０（＋Ｌ−グルタミン）、１０％のＦＣＳ中において２×１０６細胞／ｍｌの初期濃度で培養した。予め活性化された誘導性拡張のために、「静止」Ｔ細胞は１μｇ／ｍｌのＰＨＡを用いて１６時間にわたり処理し、洗浄し、引き続いて２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で６〜８日間にわたり培養した。これらの細胞は、本文書では、異なることが明示されていない場合は「Ｔ細胞」と呼ぶ。
【００５３】
（Ｅ）ＲＯＳ生成の決定
細胞は、Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡ（５μＭ）を用いて３０分間にわたり染色した。次に、細胞を分割し、プレート結合ＣＤ３抗体（３０μｇ／ｍｌ）もしくはＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて１時間刺激した。処理は氷温ＰＢＳによって停止させ、ＲＯＳ生成はＦＡＣＳ分析によって決定した（Canto II、Becton Dickinson社）。ＲＯＳ生成は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加として定量し、以下の式、ＭＦＩ（％）の増加＝［（ＭＦＩ刺激−ＭＦＩ未刺激）／ＭＦＩ未刺激］×１００（３）にしたがって計算した。
【００５４】
（Ｆ）ジギトニン透過性細胞
イン ヴィトロ拡張Ｔ細胞（少なくとも０．５×１０８）は液体窒素中で瞬間冷凍し、引き続いてＥＴＣ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５０ｍＭのスクロース、５０ｍＭのＫＣ１、５ｍＭのＭｇＣｌ２）中の氷上で、わずかな改変を施したChretien他（４）に従って、３０分間にわたり０．０１５％ジギトニンとともにインキュベートした。その後、細胞は氷温ＥＴＣ緩衝液を用いて２回洗浄し、アッセイにかけた。
【００５５】
（Ｇ）細胞内分画の調製
細胞は、２７×１／２’’ニードルを使用して氷温ＥＴＣ緩衝液中で破壊させ、ホモジネートを６００×ｇ、４℃で１０分間にわたり遠心した。良好なサイトゾル（上清）分画としての「高ｇ」ミトコンドリア（ペレット）を調製するために、６００×ｇの上清を１１，０００×ｇ、４℃で２０分間にわたり遠心した。「ミトコンドリア濃縮」分画を調製するために、６００×ｇの上清を１０分間にわたり４℃、３，５００×ｇで遠心した（ペレット）。引き続いて、「ＥＲ濃縮分画」を調製するために、３，５００×ｇの上清を１１，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心した。マウス心筋ミトコンドリアは、記載されたように（５）、「ミトコンドリア濃縮」分画の手順にしたがって調製した。
【００５６】
（Ｈ）電子輸送鎖（ＥＴＣ）及び電子流動
ＥＴＣ酵素複合体の定常状態活性は、記載したように（５、６）、二波長モードで作動するコンピュータ調節可能な分光光度計（Spectramax Plus Microplate   Reader、Molecular Devices社、米国カリフォルニア州サニーベール）を使用して決定した。サンプルは最終容量３００μＬの温度調節９６ウエルプレート内で分析した。標準呼吸鎖阻害剤を添加して、酵素アッセイの特異性を確証した。全酵素活性は、タンパク質濃度に正規化した。刺激Ｔ細胞については、ＥＴＣ酵素活性を瞬間冷凍及びジギトニン透過化（以前に記載したように）後に測定した。複合体Ｉもしくは複合体ＩＩから複合体ＩＩＩへの電子流を試験するために、ジギトニン透過性細胞もしくはミトコンドリア分画をＮＡＤＨもしくはコハク酸とともにインキュベートし、ＮａＣＮの存在下でのシトクロムｃの還元を測定した。
【００５７】
（Ｉ）解糖酵素の活性測定
適用した全酵素は、Sigma-Aldrich社から購入し、ウサギ筋肉から調製した。
−ヘキソキナーゼ（ＨＫ）活性は、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのグルコース、０．５ｍＭのＮＡＤＰ、０．０５Ｕ／ｍｌのグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを含有するＥＴＣ緩衝液内でのＮＡＤＰ還元としてアッセイした。
−グリセルアルデヒド−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）活性は、１０ｍＭのＫＰｉ、１ｍＭのＮＡＤ、３．３ｍＭのシステイン、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＤＰを含有する緩衝液中でのＮＡＤ還元として検出された。
−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ２）活性は、５ｍＭのグリセロール３−リン酸、２ｍＭのＮａＣＮ、及び６０μＭのシトクロムｃを含有するＥＴＣ緩衝液中でのシトクロムｃ還元として測定した。
−トリオソ−リン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）活性は、０．２ｍＭのＮＡＤＨ、４．９ｍＭのＤＬ−グリセルアルデヒド３−リン酸、０．４Ｕ／ｍｌのα−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ１）を含有するＥＴＣ緩衝液中でのＮＡＤＨ酸化としてアッセイした。
−ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）活性は、４ｍＭのフルクトース６−リン酸、２ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、０．２Ｕ／ｍｌのアルドラーゼ、０．８Ｕ／ｍｌのＴＰＩ、０．１Ｕ／ｍｌのＧＰＤ１を含有するＥＴＣ緩衝液中でのＮＡＤＨ酸化として検出した。
−ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）活性は、１ｍＭのホスホエノールピルビン酸、１ｍＭのＡＤＰ、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、２Ｕ／ｍｌのＬＤＨを含有するＥＴＣ緩衝液中でのＮＡＤＨ酸化として検出した。
−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性は、１ｍＭのピルビン酸、０．５ｍＭのＮＡＤＨを含有するＥＴＣ緩衝液中でのＮＡＤＨ酸化として記録した。
−エノラーゼ（ＥＮＯ）正反応は、１ｍＭの２−ホスホグリセリン酸、１ｍＭのＡＤＰ、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、２Ｕ／ｍｌのＬＤＨ、２Ｕ／ｍｌのＰＫを含有するＥＴＣ緩衝液中でのＮＡＤＨ酸化として測定した。逆反応は、１ｍＭのホスホエノールピルビン酸、１ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、２Ｕ／ｍｌのＬＤＨ、２Ｕ／ｍｌのＰＫを含有するＥＴＣ緩衝液中でアッセイした。
−ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＭ）活性は、１ｍＭの２−ホスホグリセリン酸、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのホスホエノールピルビン酸、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、２Ｕ／ｍｌのＬＤＨ、２Ｕ／ｍｌのＰＫを含有するＥＴＣ緩衝液中でのＮＡＤＨ酸化として記録した。逆反応は、１ｍＭの３−ホスホグリセリン酸、１ｍＭのＡＤＰ、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、２Ｕ／ｍｌのＬＤＨ、２Ｕ／ｍｌのＰＫを含有するＥＴＣ緩衝液中でアッセイした。
−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）逆反応は、１ｍＭの３−ホスホグリセリン酸、１ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、２Ｕ／ｍｌのＬＤＨ、２Ｕ／ｍｌのＰＫを含有するＥＴＣ緩衝液中でアッセイした。
【００５８】
（Ｊ）フルクトース−６−リン酸流動
ＧＰＤ経路を介してのフルクトース−６−リン酸流動は、１ｍＭのフルクトース６−リン酸、１ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、０．１Ｕ／ｍｌのＧＰＤ１を含有するＥＴＣ緩衝液中でのＮＡＤＨ酸化として測定した。ＧＡＰＤＨブランチを通しての流動は、１ｍＭのＫＰｉ、１ｍＭのフルクトース６−リン酸、１ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍＭのＮＡＤ、０．１Ｕ／ｍｌのＧＡＰＤＨを含有するＥＴＣ緩衝液中で記録した。
【００５９】
（Ｋ）グルコースの取り込み
処理後、細胞（１〜２×１０７細胞）を洗浄し、クレブス−リンガー緩衝液中に懸濁させた。引き続いて、細胞は、１μＣｉ／ｍｌのＤ−［３−３Ｈ］グルコースとともに３７℃で１０分間インキュベートした。その後、細胞は氷温クレブス−リンガー緩衝液を用いて２回洗浄し、細胞内Ｄ−［３−３Ｈ］グルコースはシンチレーションカウンタ（ＬＳ  ６５００液体シンチレーションカウンタ、Beckman Coulter社、米国カリフォルニア州ブレア）を使用して検出した。
【００６０】
（Ｌ）酸素電極
ミトコンドリア呼吸速度は、以前に記載されたプロトコール（７）にしたがってコンピュータ支援高分解能Oroboros １オキシグラフシステム（Paar社、オーストリア国グラーツ）を使用して測定した。イン ヴィトロ拡張Ｔ細胞（５〜１０×１０７細胞）を各電極チャンバ内に配置し、可溶性抗−ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍ、ＧＡＭ（２μｇ／ｍｌ）と架橋結合）もしくはＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて活性化した。実験構成は、以前に記載されたとおりであった（８）。「ミトコンドリア呼吸速度」は、「バックグラウンド酸素消費速度」（５μＭのオリゴマイシンの存在下で参照電極を用いて記録した）を「総酸素消費速度」から減じることによって計算した（（８）に記載したとおり）。
【００６１】
（Ｍ）乳酸の定量
少なくとも２×１０７個の拡張Ｔ細胞を新鮮ＲＰＭＩ  １６４０培地（＋補給物及びＩＬ−２）中に懸濁させ、次にＧＡＭ（２μｇ／ｍｌ）と架橋結合させた可溶性抗−ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）を用いて１時間にわたり活性化させた。培地中の乳酸濃度は、Olympus ＡＵ４００システム（Olympus社、日本国東京）を用いて検出し、各細胞溶解液のタンパク質濃度に標準化した。
【００６２】
（Ｎ）ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＡＤＰＧＫ）活性アッセイ
ＡＤＰＧＫ活性は、ｐＨ６．０及び３７℃もしくは４２℃で１ｍＭのＡＤＰ、１ｍＭのグルコース、０．５ｍＭのＮＡＤＰ、５μＭのジアデノシンペンタリン酸、及び０．０５Ｕ／ｍｌのグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを含有するＥＴＣ緩衝液中のＮＡＤＰの還元としてアッセイした。アッセイは、本質的に組み換えマウスＡＤＰＧＫタンパク質について以前に記載された方法に基づいていた（９）。
【００６３】
（Ｏ）アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）活性アッセイ
ＡＫ活性は、ｐＨ７．５及び３７℃で１ｍＭのＡＤＰ、１ｍＭのグルコース、０．５ｍＭのＮＡＤＰ、１Ｕ／ｍｌのＨＫ及び０．０５Ｕ／ｍｌのグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを含有するＥＴＣ緩衝液中のＮＡＤＰの還元としてアッセイした。
【００６４】
（Ｐ）ＡＴＰ含量の決定
ＡＴＰ濃度は、製造業者の取扱説明書にしたがって「CellTiter Glo」アッセイ（Promega社）及び９６ウエル照度計（Orion L、Berthold社、独国バード・ヴィルトバード）を使用して決定した。結果は、タンパク質濃度に正規化した。
【００６５】
（Ｑ）ユビキノール／ユビキノン含量の決定
少なくとも５×１０７イン ヴィトロ拡張ヒトＴ細胞は、１時間にわたりプレート結合抗−ＣＤ３抗体（３０μｇ／ｍｌ）もしくはＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて処理した。細胞を洗浄し、ペレット化し、液体窒素中で瞬間冷凍し、ドライアイス上に静置した。ユビキノール／ユビキノン抽出は、氷温２００μＬヘキサン：イソプロパノール（２：１）の添加及びその後の０℃での５分間にわたる遠心（１５，０００ｇ）によって実施した。次に、１５０μＬの上清を直ちに注入し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分離した。ＨＰＬＣの分離及び同定条件は、以前に公表された方法に基づいていた（１０、１１）。適用したクロマトグラフィーシステム、プロポーショニングバルブを備えるLachrom  ＬＣ−７１００低圧勾配ポンプ、Ｌ-７３５０／Ｌ-７３５１ Peltier冷却モジュールを備えるＬ-７３５０カラムサーモスタット、Ｌ−７４５０Ａ  ＵＶ／ＶＩＳ−ＤＡＤ−ダイオードアレイ検出器（Merck−Hitachi社、独国ダルムシュタット）、パルス式アンペロメトリック検出器（ＰＡＤ）８１７ Bioscan（Metrohm社、スイス国ヘリザウ）、カラムLiChrospher ＲＰ１８ｅ １２５×４ｍｍ（Merck社、独国ダルムシュタット）、４−チャネル脱ガス装置（Knauer社、独国ベルリン）、メタノール：ヘキサン：イソプロパノール：酢酸（８３：２７．５：１．５：１．５  ｖ／ｖ＋酢酸ナトリウム４．２ｇ／１；ｐＨ＝６）を用いた均一濃度溶出、流量−１ｍｌ／分、温度２５℃。同定は、ＵＶ／ＶＩＳ−ＤＡＤ吸収スペクトルに基づき、電圧アンペロメトリック検出器を用いて検出された酸化還元反応によって促進された。定量は、波長２７５ｎｍ（ユビキノン）及び２８９ｎｍ（ユビキノール）でのＵＶ−ＶＩＳクロマトグラムに基づいて実施した。ＵＶ−ＶＩＳ／ＤＡＤ分析の選択された定性的及び定量的結果は、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＥＳＩ（Agilent社、米国カリフォルニア州サンタクララ）によって確証した。
【００６６】
（Ｒ）ＮＦ−κＢ活性化についてのルシフェラーゼレポーターアッセイ
GaussiaルシフェラーゼをベースとするＮＦ−κＢレポーターを用いて安定的にトランスフェクトしたＪ１６−１４５ジャーカットＴ細胞は、Marcus Brechman博士及びRudiger Arnold博士の厚意により提供された。手短に言えば、培地を交換した後に、細胞は、各実験条件に対して３回ずつ６時間にわたりＩｏｎｏ（１０μＭ）及び／又はＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて誘導した。２０μＬの収集培地は、「Gaussia-Juice」（Ｐ．Ｊ．Ｋ．社、独国クラインブリッタースドルフ）及び９６ウエルプレートルミノメータ（Orion L、Berthold社、独国バード・ヴィルバード）を使用して発光の読み取りに適用した。発光シグナルは、トリパンブルー除去法によって評価した生細胞の数に正規化した。
【００６７】
（Ｓ）免疫沈降法及びＷＢ
少なくとも８×１０７個のＦ−ＡＤＰＧＫもしくはＥＶジャーカットＴ細胞は、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する緩衝液中において４５分間にわたり４℃で溶解させた。溶解液は１１，０００ｇ、４℃で１０分間にわたり遠心した。上清は、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（ANTI-FLAG（登録商標）Ｍ２親和性ゲル、Sigma社）と共有的に架橋結合させたアガロースビーズ上に適用した。洗浄工程及びＦＬＡＧペプチドを用いた溶出は、製造業者のプロトコールにしたがって実施した。溶出液を直接的にＡＤＰＧＫ活性アッセイにかけた、又は冷凍してＷＢにより分析した（３）。
【００６８】
（Ｔ）ＡＤＰＧＫ過剰発現実験
ＷＴ−ＡＤＰＧＫの一過性発現のために、ｐＣＭＶ６−ＡＣプラスミド（Origene社から提供、米国メリーランド州ロックビル）又は空コントロールｐＣＭＶ６−ＡＣベクター（Origene社）内にクローニングしたヒトＡＤＰＧＫ転写産バリアント１（UniProtＫＢ正準配列Ｑ９ＢＲＲ６−１）のｃＤＮＡ配列を使用した。Ｊ１６−１４５細胞もしくはＪ１６−１４５  ＮＦ−κＢ  Gaussiaルシフェラーゼレポータークローンは、製造業者の取扱説明書にしたがってＡＭＡＸＡヌクレオフェクション（nucleofection）テクノロジー（「Cell Line Nucelofector（登録商標）Ｖキット」、Lonza社、独国ケルン）を使用して２μｇのプラスミドＤＮＡ／トランスフェクションを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、細胞に該実験方法を適用した。ＦＬＡＧ−ＡＤＰＧＫタンパク質を安定性で発現するＪ１６−１４５細胞（Ｆ−ＡＤＰＧＫジャーカット細胞）のプール又は空ベクター（コントロール細胞）は、Addgene社（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）によって供給されたレトロウイルス発現ベクターを使用して生成した。各々、ｐＷＺＬ−Ｎｅｏ−Ｍｙｒ−Ｆｌａｇ−ＡＤＰＧＫ（Addgene社製プラスミド２０４１７、タンパク質骨格上のＮ末端ＦＬＡＧ−タグ、UniProtＫＢ  Ｑ９ＢＲＲ６−１）もしくはｐＷＺＬ−Ｎｅｏ−Ｍｙｒ−Ｆｌａｇ−ＤＥＳＴ（Addgene社製プラスミド１５３００）（１２）。レトロウイルスベクターは、リン酸カルシウム法によってＰｈｅｎｉｘ−Ａｍｐｆｏ産生細胞（Allele Biotechnology社；米国カリフォルニア州サンディエゴ）内へトランスフェクトした。ウイルス形質導入は、製造業者のプロトコールにしたがってポリブレン及びスピン感染法（spin-infection）を使用して実施した（２時間／２，０００ｇ）。細胞は、選択圧下で、ＲＰＭＩ  １６４０（＋Ｌ−グルタミン）、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸塩（Roth社、独国カールスルーエ）が補給された１０％のＦＣＳ中で培養した。
【００６９】
（Ｕ）リアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ（リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＮＡは、TRIzol試薬（Invitrogen社）（ＣＬＬ細胞及びコントロールＢ細胞）又は「Rneasy Mini」キット（QIAGEN社、独国ヒルデン）を製造業者の取扱説明書にしたがって用いて単離した。全ＲＮＡ（１μｇ）は、「逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲキット」（Applied Biosystems社、米国カリフォルニア州カールスバッド）を用いて逆転写させた。定量的リアルタイムＰＣＲは、「Power ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス」（Applied Biosystems社）を使用して実施した。遺伝子発現は、７５００リアルタイムＰＣＲシステム及び配列検出ソフトウエア（Applied Biosystems社製、v.2.0.2）を使用して分析した。遺伝子発現レベルは、内因性標準物質としてβアクチン発現を使用して正規化した。誘導率（Ｘ）は、式Ｘ＝２-ΔΔＣｔ、ここで、Ｃｔはサイクル閾値を表し、及びΔＣｔ＝Ｃｔ対象遺伝子−Ｃｔ参照遺伝子を使用して計算した。ΔΔＣｔは、「誘導」サンプルのΔＣｔ値と対応する「非誘導」サンプルのΔＣｔとの差である。平均誘導率を計算した。ＣＬＬ患者及び健常ドナー由来のＢ細胞サンプル中の相対ＡＤＰＧＫ基礎発現レベルは、係数Ｙ＝２（Ｃｔ対象遺伝子−Ｃｔ ＧＡＰＤＨ）×１，０００を使用して比較した（１）。実験間変動を補正するために、２つの別個の実験（３例ずつの５ＣＬＬサンプル及び各４もしくは５例の健常ドナーサンプルを含む２枚の別個の９６ウエルプレート）から得た値にｚ-トランスフォーメーションに供した。以下のプライマーを遺伝子発現分析に使用した。βアクチン、センス５−ＡＣＣＧＴＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡ−３’、アンチセンス５’−ＴＣＡＣＣＧＧＡＧＴＣＣＡＴＣＡＣＧＡＴ−３’。ＩＬ−２、センス５’−ＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧ−３’、アンチセンス５’−ＴＣＡＧＴＴＣＴＧＴＧＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧ−３’。ＩＬ−８、センス５’−ＧＡＡＴＧＧＧＴＴＴＧＣＴＡＧＡＡＴＧＴＧＡＴＡ−３’、アンチセンス５’−ＣＡＧＡＣＴＡＧＧＧＴＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＡＡＣ−３’。ＡＤＰＧＫ、センス５’−ＴＣＡＴＴＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＡ−３’、アンチセンス５’−ＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＣＴＴＴＴＡＡＣＴＧ−３’。ＩκＢα、センス５’−ＧＴＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＴ−３’、アンチセンス５’−ＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＧＡＡ−３’。ＧＰＤ２、センス５’−ＡＣＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＣＴ−３’、アンチセンス、５’−ＣＣＣＴＴＴＣＡＣＴＧＣＣＴＴＴＴＧＡＡ３’及び、いずれかの場所（１）で記載されたＩＬ−４プライマー。
【００７０】
（Ｖ）ｓｉＲＮＡトランスフェクション及びノックダウン
トランスフェクションのために使用したｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは次の通りであった。ノンサイレンシングコントロール（未標識の「AllStars」ノンサイレンシング、確証されたｓｉＲＮＡ、QIAGEN社）、ヒトＡＤＰＧＫ（Ｈｓ＿ＡＤＰＧＫ＿５−８ FlexiTube ｓｉＲＮＡ、QIAGEN社）、若しくはヒトＧＰＤ２（Ｈｓ＿ＧＰＤ２＿１、４−６ FlexiTube ｓｉＲＮＡ、QIAGEN社）に対して特異的。ジャーカットＴ細胞もしくは末梢「静止」ヒトＴ細胞は、製造業者の取扱説明書にしたがって８００ｎＭのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いて実施したヌクレオフェクション（「Cell Line Nucelofector（登録商標）Ｖキット」もしくは「T Cell Nulcleofector（登録商標）キット、Lonza社）によってトランスフェクトした。
【００７１】
（Ｗ）ブルーネイティブ（Blue-native）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＢＮ−ＰＡＧＥ）及びＷＢ
ミトコンドリア濃縮分画のＢＮ−ＰＡＧＥ分析は、改変を施したHaeger他（１３）にしたがって実施した。ミトコンドリア膜のタンパク質複合体は、１．５Ｍの６−アミノカプロン酸、５０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ及びジギトニン（６ｇ／ｇ（タンパク質））の存在下、４℃で３０分間可溶化した。引き続いて、サンプルを１１，０００×ｇ及び４℃で３０分間遠心した。この上清にサンプル緩衝液（１．５Ｍの６−アミノカプロン酸、５０％グリセロール、１％（ｗ／ｖ）クーマシーブルーＧ２５０）を補給し、直ちにＢＮゲル（３〜１３％）上に塗布した。ゲルは１６時間にわたり３５Ｖの一定電流でランさせた。タンパク質は２時間にわたり、０．８ｍＡ／ｃｍ２（膜）へ限定した電流を用いてブロッティングした。ウシ心臓精製複合体ＩＩＩ（ＢＣ１複合体）は、Ulrich Brand教授の厚意により寄贈された。
【００７２】
（実施例２）
ＴＣＲ誘因は予め活性化されたＴ細胞においてワールブルク（Warburg）効果様代謝変化を誘導する
ミトコンドリア呼吸の減少及び解糖の増加がワールブルク効果の中心を成す（１１〜１４）。酸素電極を適用して、無傷ヒトＴ細胞のミトコンドリア呼吸における活性化誘導性変化を測定した。ワールブルク表現型と一致して、作動性抗−ＣＤ３抗体もしくはＰＭＡを用いた処理はミトコンドリア酸素消費の有意な阻害を生じさせたが（図１Ａ及び図７Ａ）、他方、放射標識グルコースの細胞取り込みは、刺激後に急速に上昇した（図１Ｂ）。細胞内ＡＴＰレベルにおける連続的上昇（図１Ｃ）は、酸素正常状態にもかかわらずイン ヴィトロ拡張ヒト末梢Ｔ細胞のＴＣＲ誘因はいっそうより解糖性の表現型に向かう急速な変化を引き起こすことを強調した。
【００７３】
観察された代謝変化と強化されたミトコンドリアＲＯＳ産生との間の原因となる関連を検証するために、グルコース代謝の遮断薬である２−デオキシ−グルコース（ＤＯＧ）及び３−ブロモピルビン酸（ＢｒＰｙｒ）が活性化誘導性ＲＯＳの生成に及ぼす影響を試験した。ＤＯＧ／ピルビン酸との短時間（３０分間）のプレインキュベーション後に、拡張ヒトＴ細胞及びジャーカットＴ細胞は等モル濃度のグルコース（Ｇｌｃ）／ピルビン酸を用いてプレインキュベートした細胞と比較して少ない量の活性化誘導性ＲＯＳを生成した（図１Ｄ）。より強力な阻害剤であるＢｒＰｙｒを用いた処理は、ＴＣＲ誘導性ミトコンドリアＲＯＳ生成ならびに活性化誘導性ＮＦ−κＢ依存性ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩκＢα遺伝子発現の完全な阻害を生じさせた（図１Ｅ及びＦ、図７Ｃ及びＤ）。さらに、どちらの物質も細胞内酸化バックグラウンドを減少させた（図７Ｂ）。そこで、Ｔ細胞活性化誘導性ミトコンドリアＲＯＳ生成は、一般にワールブルク効果として規定された、解糖に向かう急速な代謝変化と関連している。
【００７４】
（実施例３）
酸化シグナルの生成には、ミトコンドリア内の主要なバイオエネルギー及び超微細構造的変化が付随する
ＴＣＲ誘因性ＰＫＣθは、ミトコンドリア呼吸複合体Ｉによる酸化シグナル生成を誘導する（３）。活性化誘導性ワールブルク代謝変化とミトコンドリアＲＯＳ遊離の機序との関係についてのより明確な洞察を得るために、呼吸鎖複合体のバイオエネルギー状態について調査した。このために、瞬間冷凍及びジギトニン透過化イン ヴィトロ拡張ヒトＴ細胞を適用した。図１Ｇに示したように（上方パネル）、ＴＣＲ誘因は複合体Ｉ及びＩＩの酵素活性の有意な減少を生じさせたが、複合体ＩＩＩの活性は増加した。ＰＭＡを用いて処理した細胞において同様のパターンを観察することができた（図１Ｇ、下方パネル）。データは、これらの現象がＴＣＲ誘因ミトコンドリアＣａ２＋取り込みから独立していることを証明している。さらにこれらのデータは、ＤＡＧ／ＰＫＣθ依存性経路が関係していることを示唆している。この前提と一致して、ＰＫＣ及びＴＣＲ誘導性ＲＯＳ生成の阻害剤であるビス−インドリル−マレイミデートＩ（ＢＩＭ）を用いたＴ細胞の前処理は、観察された変化を有意に遮断した（図１Ｈ及びＩ）。
【００７５】
さらに、酵素活性の観察された示差的パターンは各複合体のタンパク質含量の変化（図８Ａ）及びブルーネイティブ（ＢＮ）−ＰＡＧＥゲルにおける移動（図８Ｂ）と対応していなかった。興味深いことに、ミトコンドリアの超微細構造（ultrastructure）は、ＴＣＲもしくはＰＭＡ誘因後に変化した（図２）。クリステの乱れ及び歪みは、特にＴＣＲ活性化細胞のミトコンドリア内で顕著であったが（図２Ｃ）、ＰＭＡ処理は程度の異なる変化を引き起こした（図２Ｂ）。外側及び内側のミトコンドリア膜の破裂は検出できなかった。さらに、これらの変化は急速（１時間）に観察され、細胞の活性化表現型（例、ＡＴＰレベルの上昇、グルコース輸送のアップレギュレーション、及びクロマチン緩和）に依存していることから、それらのアポトーシス起源は除外された。観察された変化は高度に解糖性腫瘍の細胞にとって典型的である変化に密接に似ており、低酸素状態（２４）もしくは呼吸のＩＶ状態（律速低ＡＤＰ含量、高ＲＯＳ産生）への一過性ミトコンドリア代謝適応として発生すると以前に報告された（２５）。そこで、ミトコンドリア電子顕微鏡写真は、活性化Ｔ細胞の強化された解糖表現型に匹敵する低呼吸活性を指示している。
【００７６】
これらの現象をより明確に理解するために、複合体Ｉ／ＩＩから複合体ＩＩＩへの電子流量を透過性細胞もしくは単離ミトコンドリアのいずれかを用いて分析した（図１Ｊ）。最初の場合、Ｔ細胞活性化は、図１Ｇに提示した結果と一致して、複合体ＩもしくはＩＩと複合体ＩＩＩとの間の電子流量の減少を引き起こした。ミトコンドリア単離は、これらの作用を無効にし、Ｔ細胞活性化後の複合体ＩＩＩに向かう強化された電子流を生じさせた（図１Ｊ）。これらの結果は、不安定物質の関与に起因する複合体Ｉ／ＩＩ活性の活性化誘導性減少の一時的特性を示唆している。強化された複合体ＩＩＩ活性がミトコンドリア単離方法によって損なわれないという事実は、複合体ＩＩＩの安定性修飾を意味している。
【００７７】
観察されたバイオエネルギー変化は、複合体Ｉ／ＩＩ及び複合体ＩＩＩの間の電子担体であるユビキノンの過剰還元状態に帰せることができよう（２６、２７）。減少したユビキノン（ユビキノール）の蓄積は、電子流を遮断することによる無傷細胞における複合体Ｉ及びＩＩの活性を減少させる可能性が高い。この作用は、ユビキノールの酸化に起因するミトコンドリアの単離後には失われるであろう（図１Ｊ）。さらに、複合体Ｉを介してのミトコンドリアＲＯＳ生成の主要機序である逆電子移動（ＲＥＴ）は、高度に減少したユビキノンのプールによって媒介される（２６、２７）。ユビキノールの蓄積は、高血糖性／低酸素状態誘導性ミトコンドリアＲＯＳ遊離にとっても極めて重要である（１８〜２１）。
【００７８】
Ｔ細胞活性化後のユビキノン酸化還元状態に関するより明確な洞察を得るために、１組の呼吸鎖阻害剤が酸化シグナル生成に及ぼす影響を試験した。文献によると、複合体Ｉ遮断薬であるロテノン及びメトホルミン（１、３）による観察された阻害、ならびに複合体ＩＩ遮断薬であるＴＴＦＡによる中等度の阻害は、活性化誘導性ミトコンドリアＲＯＳ遊離のＲＥＴに基づく機序を示唆している（図９Ａ）（２６）。ＲＯＳシグナルは、複合体ＩＶ阻害剤であるＮａＮ３及びＡＴＰシンターゼ阻害剤であるオリゴマイシンによっては遮断されなかった（図９Ａ）。著しくも、Ｔ細胞活性化誘導性ミトコンドリアＲＯＳ生成は、マトリックス部位へ結合する複合体ＩＩＩ阻害剤であるアンチマイシンによって増加したが、複合体ＩＩＩの膜間間隙部と相互作用する阻害剤であるミキソチアゾールによっては増加しなかった（図９Ａ）。これらの結果は、低酸素状態誘導性ミトコンドリアＲＯＳ遊離としての複合体ＩＩＩ内ユビキノンサイクリングの重要性を示唆している（２０）。注目すべきことに、ヒトＴ細胞では、検出された内因性複合体ＩＶ活性は、ユビキノンを再生するための障害を形成する複合体ＩＩＩ活性の約８分の１である（図９Ｂ）。そこで、Ｔ細胞活性化後のユビキノン酸化還元状態の変化を調査した。瞬間冷凍活性化Ｔ細胞からの抽出物についてのＨＰＬＣに基づく分析は、ユビキノンに比したユビキノール含量における有意な上昇を明らかにし、ＴＣＲ媒介性誘因後には３０％、ＰＭＡ媒介性誘因後には５７％に達した（図１Ｋ）。得られたデータは、Ｔ細胞活性化後のユビキノンプールの過剰還元状態を証明しており、酸化シグナルの生成におけるＲＥＴの原因となる役割を強力に示唆している。
【００７９】
（実施例４）
偏向された解糖流はＧＰＤ２媒介性ミトコンドリアＲＯＳ遊離をもたらす
過剰還元ユビキノンによって誘導されたミトコンドリアＲＯＳ産生は、高血糖性もしくは低酸素性細胞における糖代謝の増加と関連することは公知である（１８〜２１）。ＴＣＲ誘因直後の解糖代謝流をアッセイするために、全主要解糖酵素の活性を測定した（図３Ａ及びＢ）。興味深いことに、ＴＣＲ後に有意に変化した唯一の酵素活性は、エノラーゼ（ＥＮＯ）の逆反応であった（図３Ｂ）。使用したアッセイはＮＡＤＨの存在下でのピルビン酸の還元を監視することによるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）特異的ＡＴＰ加水分解しか検出しないので、阻害剤を使用して検出した酵素活性をさらに特徴付けた。ＥＮＯ阻害剤であるＮａＦは、検出された逆ＥＮＯ活性を遮断した。興味深いことに、ヒスチジンリン酸化の阻害剤であるＮａＶＯ３（２８）は、該活性を減少させたが、遮断はしなかった。第一に、それは、その誘導性増加を無効にした（データは示していない）。注目すべきことに、ＰＥＰ依存性ヒスチジンリン酸化によって媒介されたホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＭ）活性化は、近年、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）アイソフォームＭ２（ＰＫ−Ｍ２）を発現する急速に増殖する正常細胞及び癌細胞において記載されてきた（２９、３０）。ＰＫ−Ｍ２は活性化Ｔ細胞内で高度に発現するので（３１）、逆ＥＮＯ様活性において検出された上昇は、最近記載された未知のＰＥＰ利用ヒスチジンキナーゼによって媒介されるのであろう（２９）。これはさらに、観察されたＥＮＯ様活性が部分的にのみＡＴＰ依存性である、及びその活性化誘導性増加がＡＴＰ非依存性であるという所見によって支持されている。
【００８０】
ＰＧＭヒスチジンリン酸化はＧＡＰＤＨによって開始されるより低い解糖経路を通して流動を逆転させると示唆されたので（２９）、サイトゾルグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ１／２）経路を通しての選択的流動へ再方向付けることができよう。実際に、ＴＣＲ誘因はＧＰＤ１の方向におけるフルクトース−６−リン酸の代謝を明確に強化したが、他方ＧＡＰＤＨ媒介性フルクトース−６−リン酸の代謝回転はわずかに減少した（図３Ｃ）。さらに、ＧＡＰＤＨ経路の最終生成物である乳酸の産生は、上昇したグルコース取り込みにもかかわらず減少した（図３Ｄ及び１Ｂ）。そこで、本発明者らは、ＧＰＤのミトコンドリアアイソフォームであるＧＰＤ２の活性状態について調査した。ＧＰＤ２活性は、ＴＣＲ誘因後に有意にアップレギュレートされた（図３Ｅ）。ＢＩＭによるＰＫＣ阻害は、ＴＣＲ誘導性ＧＰＤ２活性化を有意に遮断した（図３Ｅ）。さらに、以前の報告書（３２）と一致して、ＰＭＡ処理はさらに予め活性化されたヒトＴ細胞のミトコンドリア濃縮膜分画においてＧＰＤ２活性を中等度にアップレギュレートした（図３Ｅ）。ＧＰＤ２はＣａ２＋結合酵素であるので、細胞内Ｃａ２＋濃度における抗−ＣＤ３誘因誘導性上昇は、報告されたＰＭＡ（ＤＡＧ）依存性活性化に収束する（３２、３３）。
【００８１】
ＧＰＤ２はユビキノンの還元を介して電子を呼吸鎖へ移動させる。このため、その酵素活性のアップレギュレーションは過剰還元ユビキノンに起因してＲＥＴ媒介性ＲＯＳ遊離を生じさせることができた（２６、２７、３４〜３６）。この可能性を調査するために、ＧＰＤ２発現のダウンレギュレーションが活性化依存性酸化シグナル生成、ＮＦ−κＢ誘因及び遺伝子発現に及ぼす効果を分析した。ＧＰＤ２発現のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンは、酸化シグナルの減少した生成を生じさせた（図３Ｆ及びＧ）。これに対応して、ＧＰＤ２存在量における減少は、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターのＰＭＡもしくはＰＭＡ／ｉｏｎｏ誘導性活性化ならびにジャーカットＴ細胞におけるＩＬ−２発現を阻害した（図３Ｈ及びＩ）。
【００８２】
さらに、ＢＮ−ＰＡＧＥをベースとするＷＢは、ＧＰＤ２と呼吸複合体ＩＩＩとの関連を強力に示唆した（図８Ｂ）。ＧＰＤ２と呼吸鎖超複合体との直接的相互作用は、ＴＣＲ誘因もしくはＰＭＡ処理後の複合体ＩＩＩ活性において観察された増加を部分的には説明することができる（図１Ｇ、Ｊ）。結論として、Ｔ細胞活性化は、ＧＰＤ２に向かう解糖流動の偏向、ＧＰＤ２活性化、ユビキノンの過剰還元及びＲＥＴ媒介性ＲＯＳ遊離を生じさせる。
【００８３】
（実施例５）
Ｔ細胞活性化誘導性ＡＤＰＧＫ酵素活性は解糖流動をアップレギュレートする
ユビキノン及びミトコンドリアＲＯＳ遊離のグルコース誘導性過剰還元は、アップレギュレートされた解糖流動に依存すると考えられる（１８、１９）。解糖は、ＨＫ、ＰＦＫ、ＧＡＰＤＨ、及びＰＫに主要調節点を備える高度に調節された一連の反応である（図３Ａ）。本実験の結果は、これらの酵素活性のいずれについても変化を示さなかった（図３Ｂ）。結果としてＨＫ生成物阻害の消失を生じさせるＨＫとミトコンドリアＶＤＡＣとの関連は、グルコース流動をアップレギュレートするまた別の機序として作用する（３７）。拡張ヒトＴ細胞のミトコンドリア濃縮膜分画のＷＢ分析は、高いＨＫ１及び低いＨＫ２濃度を明らかにした（図１０Ａ）。それでもなお、ＴＣＲ誘因は、ミトコンドリアとのＨＫ１／２関連の有意な増強、又はミトコンドリア関連性ＨＫ活性のアップレギュレーションを生じさせなかった（図１０Ａ及びＢ）。次に、呼吸媒介性ＡＴＰ生成と共役したミトコンドリア関連性ＨＫ活性について調査した（図４Ａ）。ＴＣＲ誘因は、呼吸基質、ＡＤＰ及びコハク酸の存在下でＨＫ様活性を明確に誘導した（図４Ｂ）。この活性は、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）阻害剤であるジアデノシン五リン酸（Ａｐ５Ａ、５μＭ、４０％までの阻害）によって軽度にのみ遮断されたが、他方Ａｐ５はミトコンドリアＡＫを強力に阻害した（５μＭ、８０〜９０％の阻害）。極めて重要であることに、ＨＫ様活性における活性化誘導性増加はＡｐ５Ａによる影響を受けなかった。驚くべきことに、この強化された酵素活性はコハク酸の添加には非依存性であったが、ＡＤＰの存在には明白に依存性であった。さらに、呼吸鎖阻害剤ＮａＣＮ及び脱共役ＣＣＣＰに対する非感受性は、ミトコンドリアによって生成されたＡＴＰからの実際的独立性を証明した（図４Ｂ）。これらの結果に興味をそそられて、文献を検索し、グルコースをリン酸化できるタンパク質を、ＡＤＰ‐ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＡＤＰＧＫ）を利用することによって同定することができた（３８）。だが好熱性古細菌（thermophilic archaea）にとって典型的であるように、ＡＤＰＧＫは哺乳動物内に存在し、Ｔ細胞を含むヒト造血性細胞内で高度に発現する（図５Ｅ）（３１、３９）。さらに、グルコース−６−リン酸による阻害の報告された欠如は、ＡＤＰＧＫを解糖流動の特に優れた推定活性化因子にさせる（３８）。
【００８４】
実際、強化ＡＤＰＧＫ活性は、抗−ＣＤ３処理ヒトＴ細胞から単離されたミトコンドリア濃縮膜分画（「高ｇ」分画）内で発生した（図４Ｃ）。酵素活性の匹敵するアップレギュレーションは、ヒトＴ細胞もしくはジャーカットＴ細胞のＰＭＡ処理によって達成することができたが（図４Ｃ）、これはＣａ２＋媒介性ＴＣＲシグナリングからの非依存性を示していた。さらに、ＡＤＰＧＫ様酵素活性のＴ細胞活性化誘導性強化は、ＰＫＣ阻害剤であるＢＩＭによって完全に無効にされた（図４Ｃ）。ＴＣＲ刺激後のＡＤＰＧＫ含量のアップレギュレーションを証明することはできなかった（図４Ｄ）。興味深いことに、該ＡＤＰＧＫ配列は、小胞体（ＥＲ）内へ輸送するための推定シグナルペプチドを含有している（図４Ｅ及び図１４）。Ｔ細胞ミトコンドリアは他の組織（例、肝臓）内のＴ細胞ミトコンドリアより小さいので、１１，０００×ｇ遠心工程を利用してミトコンドリア濃縮分画内のミトコンドリアの収率を増加させた（「高ｇ」ミトコンドリア分画）。そのような分画は電子顕微鏡写真及びＷＢにおいて明らかなようにＥＲも含有している（カルレチキュリン（Calreticulin）−ＥＲマーカー）（図４Ｄ）。ＡＤＰＧＫの細胞内局在性に関するより明確な洞察を得るために、Ｔ細胞及びジャーカットＴ細胞内のＡＤＰＧＫタンパク質のＥＲ関連を明確に示している「ミトコンドリア濃縮」及び「ＥＲ濃縮」分画を調製した（実施例１を参照されたい）（図１１）。
【００８５】
「ＥＲ濃縮」分画内のＡＤＰＧＫ活性を、その動態パラメータに関して特徴付けた。酵素は、６．０の顕著なｐＨ最適値及び０．０８６ｍＭのグルコースについてのＫｍを明らかにした（ｐＨ６．０、３７℃）。得られた数値は、マウス組み換えＡＤＰＧＫについて報告された数値に類似しており（３８）、ある範囲内でいわゆる低ＫｍのＨＫ  １〜３に類似している。さらに、ＡＤＰＧＫは、５ｍＭより高いグルコース濃度で基質阻害された。
【００８６】
次に、Ｎ末端ＦＬＡＧタグを備えるＡＤＰＧＫタンパク質を安定性で発現するジャーカットＴ細胞を生成した（Ｆ−ＡＤＰＧＫジャーカット細胞、図４Ｅ）。野生型ＡＤＰＧＫタンパク質（ＷＴ−ＡＤＰＧＫ）については、該ＦＬＡＧ−ＡＤＰＧＫタンパク質（Ｆ−ＡＤＰＧＫ）はＥＲ濃縮及びミトコンドリア濃縮分画内で見いだされたが、サイトゾル分画内では見いだされなかった（図１１Ａ及び図４Ｄ）。Ｆ−ＡＤＰＧＫを発現する細胞は、コントロール細胞と比較して高い基礎（basal）ならびに強化されたＰＭＡ誘導性ＡＤＰＧＫ様活性を証明した（図５Ｅ、下方パネル）。免疫沈降ＦＬＡＧ−ＡＤＰＧＫタンパク質は、コントロール可溶化物からの沈殿物中では測定できなかったＡＤＰＧＫ活性を証明した（図４Ｆ、下方パネル）。これらの結果は、ＷＢによって確証された（図４Ｆ、上方パネル）。そこで初めて、完全活性ヒトＡＤＰＧＫが証明された。結論として、ＴＣＲ誘因はＰＭＡ（ＤＡＧ）におけるＡＤＰＧＫを活性化することによって、及びＰＫＣ依存性方法で解糖流動をアップレギュレートすることが見いだされた。
【００８７】
（実施例６）
ＡＤＰＧＫは酸化シグナルの生成を媒介する
次に、ＡＤＰＧＫ発現を低下させることが活性化誘導性ＲＯＳ生成に及ぼす影響についてアッセイした。ＡＤＰＧＫの減少した発現（図５Ａ）は、ジャーカットＴ細胞内でのＲＯＳのＰＭＡ誘因産生を阻害した（図５Ｂ）。同時に、ＡＤＰＧＫのノックダウンはＰＭＡもしくはＰＭＡ／ｉｏｎｏ誘因性ＮＦ−κＢ活性化（図５Ｃ）及びＩＬ−２、ＩκＢα及びＩＬ−８遺伝子のＮＦ−κＢ依存性発現の阻害を生じさせた（図５Ｄ及び図１２）。「静止」非拡張Ｔ細胞もミトコンドリアからの酸化シグナルを生成する（１）。同様に「静止」Ｔ細胞の活性化はＧＰＤ２及びＡＤＰＧＫ酵素活性における上昇を引き起こした（図５Ｆ）。酵素活性の低誘導は、イン ヴィトロ拡張「予め活性化された」Ｔ細胞と比較して「静止」Ｔ細胞におけるＲＯＳ生成の低い程度に対応する（１）。それでも、「静止」末梢ヒトＴ細胞内のＡＤＰＧＫ発現のｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンも活性化誘導性酸化シグナルの低下を生じさせた（図５Ｇ）。
【００８８】
さらに、Ｆ−ＡＤＰＧＫジャーカットＴ細胞内での強化されたＰＭＡ誘導性ＡＤＰＧＫ活性（図４Ｅ）は、ＲＯＳ産生の増加及びその後のＮＦ−κＢ依存性遺伝子（ＩＬ−２、ＩＬ−８及びＩκＢα）の誘導の強化を生じさせた（図６Ａ、Ｃ）。同様の結果は、ＷＴ−ＡＤＰＧＫを一過性で過剰発現するジャーカットＴ細胞について得られた（図６Ｂ及びＣ）。これらの細胞では、空ベクター（ＥＶ）−トランスフェクトコントロール細胞と比較して強化されたＮＦ−κＢ誘因及びＮＦ−κＢ依存性遺伝子の増強された誘導を生じさせた（図６Ｂ及びＣ）。興味深いことに、これまで未知であった機序に起因して、ＡＤＰＧＫ過剰発現はＮＦ−κＢ依存性遺伝子の基礎転写レベルを減少させる傾向を示す（図１３）。これらをまとめると、本データは、Ｔ細胞活性化のプロセスにおけるＡＤＰＧＫの積極的な調節の役割を証明している。
【００８９】
（実施例７）
ＡＤＰＧＫ活性はより高い炎症促進性温度で上昇する
ＡＤＰＧＫ活性については、主として好熱性古細菌（thermophilic archaea）に関して記載された（３８、４０）。注目すべきことに、哺乳動物ＡＤＰＧＫについての二次構造予測は、低い配列相同性にもかかわらず熱安定性古細菌ＡＤＰＧＫの公知の二次構造との高度の構造的類似性を明らかにしている（図１４）（４０、４１）。このため、ＡＤＰＧＫ活性の温度依存性をヒトＴ細胞内で試験した。図６Ｄに示されたように、ＡＤＰＧＫ触媒反応の速度は生理的温度範囲内で指数関数的に上昇し、３７℃よりも４２℃における方が３．５倍高かった。これとは対照的に、ＨＫ活性における温度駆動上昇は線形のままであった。さらに、４２℃では、ＡＤＰＧＫ媒介性反応はＨＫの速度に匹敵する速度に到達する。これらのデータは、ヒトＡＤＰＧＫの熱安定性を示唆しており、炎症反応及びＮＦ−κＢ誘因において果たす可能性のある役割を強化する。そこで、炎症部位での上昇した温度はＴ細胞活性化及び炎症促進性サイトカインのＮＦ−κＢ依存性発現を促進すると思われる。
【００９０】
（実施例８）
ＡＤＰＧＫ及びＧＰＤ２は悪性慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞内で高度に発現する
多数の癌は、ＮＦ−κＢ経路の構成的活性化に厳密に依存する（１６）。ＲＯＳもしくはワールブルク表現型の高内因性レベルは多数の悪性新生物の特徴である（１１、１４、４２）。このため、癌細胞内のＡＤＰＧＫ発現について調査した。Ｔ細胞を起源とする癌は、Ｂ細胞悪性新生物に比較してヒトでは希である。特に、ＣＬＬは、致死的予後を備える最も一般的な白血病の１つを構成する（４３）。さらに、ＣＬＬ細胞には、強化ＮＦ−κＢ活性、解糖及び高内因性ＲＯＳレベルが付与されている（１５、１７、４３〜４５）。そこで、悪性ＣＬＬ細胞及び正常Ｂ細胞内のＡＤＰＧＫ及びＧＰＤ２発現レベルを比較した（表１）。
【００９１】
【表１】
0005959631.tif 000002
【００９２】
図６Ｅに示したように、ＡＤＰＧＫ及びＧＰＤ２  ｍＲＮＡレベルは、ＣＬＬ細胞内では有意にアップレギュレートされる。これは、ワールブルク効果媒介性ＲＯＳ産生／ＮＦ−κＢ活性化の報告された機序が果たす一般的役割を示唆しており、それが腫瘍形成に及ぼす可能性のある重要性を指示している。
【００９３】
結論
Ｔ細胞活性化には、好気性解糖に向かうミトコンドリア呼吸からの代謝変化が結び付いている（１２）。このいわゆる「ワールブルク表現型」は、急速に増殖する正常細胞に特徴的な特徴であるが、悪性細胞にとっても特徴的である（１１、１４）。以前の研究は、増殖するＴ細胞が高ＴＣＲ誘因ミトコンドリアＲＯＳ産生によって特徴付けられることを証明している（１、３）。このミトコンドリア生成酸化シグナルはＮＦ−κＢ活性化に寄与するので、増殖及び炎症反応を刺激する。興味深いことに、癌細胞は好気性解糖表現型を提示することが多く、高内因性ＲＯＳ産生及びＮＦ−κＢ経路の構成的活性化を伴っている（１４、１６、１８、４２）。さらに、高血糖性もしくは低酸素性条件下での解糖のアップレギュレーションは、ミトコンドリアＲＯＳ生成を増加させることが公知であるが（１８、１９、２１）、他方、Ｔ細胞活性化はグルコース取り込みに依存する（９、１０）。そこで、Ｔ細胞活性化誘導性ミトコンドリアＲＯＳ産生の代謝分析は、シグナリングレベルでのこれらの様々な現象を結び付ける分子リンクを提供できる。
【００９４】
上述した実験では、Ｔ細胞活性化誘導性ミトコンドリアＲＯＳ産生及び遺伝子発現が、これまで真核生物内では未知の機能を備える古細菌タンパク質であるＡＤＰＧの誘因に依存することが証明された。ＡＤＰＧＫ活性化には、急速なグルコース取り込み、ミトコンドリア酸素消費量のダウンレギュレーション及びＧＰＤシャトルに向かう解糖の偏向、即ちワールブルク効果が付随する。同様にして、呼吸鎖関連性ＧＰＤ２の活性化は、ユビキノンの過剰還元及び複合体ＩからのＲＥＴ媒介性ＲＯＳ遊離をもたらす（図６Ｆ）。これにはミトコンドリア生物エネルギー及び超微細構造の主要な変化が平行する。注目すべきことに、全事象はＴＣＲ活性化後の１時間以内に発生する。ＡＤＰＧＫもしくはＧＰＤ２存在量のダウンレギュレーションは、活性化誘導性ＲＯＳ生成及びＮＦ−κＢ依存性遺伝子発現を阻害するが、他方ＡＤＰＧＫの過剰発現がそれらのアップレギュレーションを生じさせる。
【００９５】
驚くことに、高内因性ＲＯＳレベル及び構成的ＮＦ−κＢ活性を備える（１５、１７）ＣＬＬ細胞は、強化されたＡＤＰＧＫ及びＧＰＤ２発現を提示する（図６Ｅ）。さらに、グリセロール−３−リン酸媒介性呼吸及びＧＰＤ２活性化はＲＯＳ産生を引き起こす事が知られている（同様にＲＥＴを介して）（２６、２７、３４）。そこで、ＴＣＲ誘因ＲＯＳ生成においてＧＰＤ２が果たす極めて重要な役割についての所見は、増加したＧＰＤ２活性／発現及び高ＲＯＳレベルの間の癌特異的関連を支持している（３５、３６）。さらに、これは糖尿病性及び肥満性患者におけるＴ細胞の炎症性表現型において新たな光を投じる（９、４６）。ＰＫ−Ｍ２の低親和性の二量体型による代謝性前駆体合成に好都合な解糖流動の再方向付けは、癌代謝における新たな焦点である（４７）。最近の報告は、結果として選択的解糖経路を生じさせる急速に増殖してＰＫ−Ｍ２を発現する細胞におけるＰＥＰ媒介性ＰＧＭ活性化について記載している（２９）。逆説的に言えば、再方向付けられた解糖は、ＡＤＰ媒介性グルコースリン酸化によって克服できるエネルギー面での欠点であるＡＴＰ生成の第１の解糖工程を省略する。そこで、シグナリング及び代謝経路について記載された相互作用は、腫瘍形成に重要な意味を有する可能性がある。
【００９６】
一般に、免疫細胞活性化は炎症シナリオと結び付いている。炎症促進性温度での強化されたＡＤＰＧＫ活性についての所見は、ＮＦ−κＢ媒介性反応におけるこの新規なタンパク質の重要性を強調している。さらに、ヒトＡＤＰＧＫの予測された二次構造と好熱性古細菌（thermophilic archaea）のＡＤＰＧＫタンパク質の結晶構造（図１４）との密接な類似性は、ＡＤＰＧＫの熱安定性についての指標である（４０、４１）。相当に低い配列相同性は、ヒトＡＤＰＧＫの収束進化（convergent evolution）を説明することができた。
【００９７】
ＡＤＰＧＫの細胞内局在性は、興味深いが依然として未解決の問題を表している。以前に、ＡＤＰ媒介性グルコースリン酸化が虚血性もしくは低酸素性状態条件下で細胞内ＡＴＰプールを保存する機序を構成すると示唆されてきた（３８）。しかしＥＲ局在性は、このタンパク質についてのより複雑な役割を指示している。ＡＤＰＧＫは、ヘキソース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｈ６ＰＤ）（４８）もしくはグルコース−６−リン酸ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ３）（４９）によって媒介された代謝経路に関与することができ、これら２つの糖新生酵素もまた肝外組織中で高度に発現した。Ｇ６ＰＣ３によるグルコース−６−リン酸／グルコースのリサイクリングは、最近ヒト好中球の活性化にとって極めて重要であることが証明されている（４９）。又は、ＡＤＰＧＫ生成グルコース−６−リン酸は、Ｈ６ＰＤ駆動ＮＡＰＤＨ生成を刺激してＥＲ酸化還元平衡に影響を及ぼすことができた。さらに、脂肪、肝臓及び筋組織では、Ｈ６ＰＤ生成ＮＡＤＰＨは、グルココルチコイドの１１βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型（ＨＳＤ１１Ｂ１）媒介性の予め活性化された受容体活性化（receptorial activation）に直接的に寄与する（４８）。そこで、ＡＤＰＧＫ／Ｈ６ＰＤ／（ＨＳＤ１１Ｂ１）もしくはＡＤＰＧＫ／Ｇ６ＰＣ３経路は、Ｔ細胞活性化及び分化の調節に関与することができた。
【００９８】
結論として、Ｔ細胞活性化の新規調節因子としてのＡＤＰＧＫに対する予想外の役割についての実験による証拠が提供された。さらに、Ｔ細胞についての解糖流動‐誘導性ミトコンドリアＲＯＳ遊離について同定された機序に基づいて、急速に増殖する癌細胞内でのワールブルク表現型と増加したミトコンドリアＲＯＳレベル及び強化されたＮＦ−κＢシグナリングとを結び付ける仮説を提案する。
【００９９】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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