(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ショットキー型電子銃を有する環境制御型走査電子顕微鏡を用いて、飽和水蒸気圧下、０℃〜５℃の温度範囲で、加速電圧2kV以上5kV以下、作動距離5mm以上8mm以下の条件で、微生物試料を観察することを特徴とする微生物試料の観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物試料の観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の表面形態、分裂様式、増殖様式、物体表面への付着の仕方、集合形式を明らかにするために、走査電子顕微鏡（以下、ＳＥＭと称す）を用いて微生物観察が行われる。そして、このような走査電子顕微鏡（以下、ＳＥＭと称す）を用いた微生物観察は、生物学上の研究、開発に必須の手法となっている。通常、ＳＥＭ観察では微生物試料を真空中に設置するため、微生物等の生体試料を観察する場合には、真空内でも微生物試料の構造が変化しないように前もって微生物試料に対して固定、脱水等の処理をする必要がある。ＳＥＭ観察のための一般的な微生物試料の標準的工程は、固定、脱水、置換、凍結乾燥、染色、金属コーティング等、その微生物試料の特性に応じて数多くの工程があり、すべての工程を終了するためには最低でも２〜３日の時間を要する。微生物試料の固定処理、脱水処理、置換処理、凍結乾燥は、以下の１〜６工程を順次行う方法が知られている（非特許文献１〜３）。
１）前固定工程：微生物試料をグルタールアルデヒド溶液（２．５質量％〜５質量％）に数時間〜２４時間浸漬する。
２）洗浄工程：微生物試料をリン酸緩衝液で数回洗浄する。
３）後固定工程：微生物試料を四酸化オスミウム溶液（１〜２質量％）に数時間浸漬する。
４）洗浄工程：微生物試料をリン酸緩衝液で数回洗浄する。
５）脱水工程：微生物試料を５０、７０、８５、９５質量％のエタノールに各１５分間浸漬し、さらに無水エタノールに１５分間、３回繰り返し、浸漬する。
６）置換工程、乾燥工程：微生物試料を酢酸イソアミルに１５分間浸漬後、臨界点乾燥を行う。
【０００３】
上記前固定工程において、固定液としてグルタールアルデヒドを使用する場合は、高い溶存酸素を保ったまま、固定操作途中でｐＨをアルカリ性に変化させることで最もよい観察結果が得られることが知られている。しかし、採取したばかりの生きた微生物は呼吸を行うため、固定の最中に固定液の溶存酸素やｐＨを低下させ、微生物試料の固定が上手くいかない場合がある。そのため、一般には、微生物試料を浸漬する固定液の量を増やす、固定途中で新鮮な固定液に交換する、曝気する等の措置を講じる必要がある（非特許文献４）。
【０００４】
また、植物上の細菌、歯垢や環境中の微生物の集合体（バイオフィルム）等の観察では、微生物以外の生体や、構造や構成成分の異なる微生物の集合体について、それぞれの構造と位置関係を維持したまま一度に固定する必要があるため、熟練した技術とより複雑な工程が必要となる（非特許文献１〜３）。
【０００５】
このように微生物のＳＥＭ観察用試料の作製は煩雑で時間がかかる。観察するに際しては、熟練した技術を要する。またタンパク変性剤である固定液や揮発性溶剤等も多量に使用することから、作業者の安全性や廃棄物の環境への配慮に十分な注意が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】医学生物学の走査電子顕微鏡、監修：宮澤七郎  医学出版センター
【非特許文献２】電子顕微鏡試料作製法、関西電子顕微鏡応用技術研究会編  ＫＩＮＰＯＤＯ
【非特許文献３】走査電子顕微鏡、日本電子顕微鏡学会関東支部編
【非特許文献４】医学生物学電子顕微鏡学会、第２２回学術講演会及び総会要旨集
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、かかる事情に鑑みてなされたものであって、微生物試料を煩雑な前処理をすることなく容易に観察する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、通常のＳＥＭ観察で微生物試料を観察する際に煩雑な試料処理を必要とするのはひとえに微生物試料を真空中に設置しなければならないことに起因すると考えた。そして、上記を踏まえ、雰囲気下で微生物試料の観察が可能となる環境制御型走査電子顕微鏡（以降、ＥＳＥＭと称す）に着目し、ＥＳＥＭを特定条件下で利用すれば、微生物試料を前処理することなくそのまま観察できるのではないかと考えた。具体的には、飽和水蒸気圧下で微生物試料を観察することができれば、微生物試料を乾燥させることなく、前処理無しでそのまま観察することが可能であると考えられる。しかしながら、微生物試料を観察する場合、μｍオーダーかμｍオーダー以下の構造を観察する必要がある。ＥＳＥＭを用いてこのようなレベルの構造を観察するための空間分解能で観察するには、次のような課題がある。ＥＳＥＭでは雰囲気中を電子ビームが通過するため、低エネルギーの電子ビームでは電子が雰囲気ガスとの衝突で散乱し良好な画像を得ることができない。従って、雰囲気による電子の散乱を抑制するために、ＥＳＥＭでは一般に１５ｋＶもしくはそれ以上の高い加速電圧を使用する。高加速電圧で生じた高エネルギーの電子ビームを用いれば雰囲気中での電子の散乱を抑制することはできる。一方、微生物試料中での電子ビームの拡散領域が大きくなってしまい十分な空間分解能を得ることができなくなる。微生物は主に軽元素から構成されるため、微生物試料観察に高エネルギービームを用いた時の拡散領域は大きく、空間分解能の劣化は著しい。
【０００９】
そこで、上記課題を解決するべく鋭意検討した。その結果、ショットキー型電子銃の輝度が高く且つ微小なプローブ径を有するビームを用いると共に、微生物試料中での電子の拡散を抑制するために加速を低加速化する、そして、作動距離を短くして雰囲気による電子の散乱を抑制することで、微生物試料を乾燥させることなく、飽和蒸気圧下で微生物試料の微細構造をＥＳＥＭで観察できることを見出した。
【００１０】
本発明は、このような知見に基づきなされたもので、その要旨は以下の通りである。
［１］ショットキー型電子銃を有する環境制御型走査電子顕微鏡を用いて、飽和水蒸気圧下、０℃〜５℃の温度範囲で、加速電圧2kV以上5kV以下、作動距離5mm以上8mm以下の条件で、微生物試料を観察することを特徴とする微生物試料の観察方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、微生物試料を煩雑な前処理をすることなく観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】微生物試料を観察した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明では、微生物試料を飽和蒸気圧下で観察するためにＥＳＥＭを用いることとする。そして、ＥＳＥＭを用いて微生物試料を観察するに際し、ＥＳＥＭは、ショットキー型電子銃を有することとする。さらに、観察する際の条件は、飽和水蒸気圧下、０℃〜５℃の温度範囲で、加速電圧2kV以上5kV以下、作動距離5mm以上8mm以下の条件とする。以下、詳細に説明する。
本発明では、ショットキー型電子銃を用いる。ショットキー型電子銃の輝度が高く且つ微小なプローブ径を有するビームを用いることで、十分な電子ビームの輝度を保ったまま細径のビームが得られ、μｍオーダーもしくはμｍオーダーよりも微細な構造を観察することが可能となる。
【００１４】
そして、飽和水蒸気圧下で観察することにより、微生物が干からびるのを防ぐことができる。
【００１５】
上述したように、ＥＳＥＭで微生物試料を観察しようとした場合、雰囲気による電子の散乱と、微生物試料中でのビームの拡散領域が大きくなり十分な空間分解能を得ることができなくなる、の２つの問題がある。この問題に対して、本発明では、まず、加速電圧を5kV以下とすることで、微生物試料中での電子ビームの拡散を抑制する。加速電圧を低下させると雰囲気による電子ビームの散乱が問題となる場合があるため、下限は2kVとする。
【００１６】
加速電圧を低下させると雰囲気による電子ビームの散乱が問題となる。そこで、微生物試料を対物レンズに近づけて雰囲気中の電子ビームの経路を短くすることで、雰囲気による電子ビームの散乱を抑制することを考えた。
【００１７】
ここで、本発明では、飽和水蒸気圧下で観察することを前提とするため、観察温度も重要となる。そこで、加速電圧3kVとし、温度と作動距離と電子ビームの散乱抑制すなわち画像との関係について調査した。得られた結果を表１に示す。なお、表1において、画像の評価結果である○△×は、後述する実施例の評価基準と同様である。
【００１８】
【表１】
0005935766.tif 000002
【００１９】
表1より、０℃〜５℃の温度範囲で、作動距離を5mm以上8mm以下とすることで、良好な画像が得られることがわかる。作動距離が短すぎる場合、検出器とサンプルが接触してしまい画像を得ることができない。作動距離が長すぎると電子線の散乱で良好な画像を取得できない。また、温度が高いと飽和水蒸気圧が上昇するため良好な画像を取得できない。
以上より、作動距離は5mm以上8mm以下とする。
【００２０】
また、０℃〜５℃の温度範囲とする。０℃未満では、水が凍結してしまう。一方、５℃超えでは、飽和水蒸気圧が高くなり、雰囲気によって電子ビームが散乱してしまうため、良好な画像を得ることができない。
【００２１】
以上の条件を適用することで、特殊な前処理無しに微生物試料を観察することが可能となる。
【００２２】
具体的な手順は以下の通りである。まず、微生物試料を冷却ホルダーで０℃〜５℃に冷却してＥＳＥＭの試料室へ微生物試料を導入する。次いで、ＥＳＥＭの試料室の雰囲気を水蒸気に置換し、試料室内を飽和水蒸気圧の水蒸気で満たす。ショットキー型電子銃を有するＥＳＥＭを用いる。さらに微生物試料中での電子ビームの拡散を抑制するために加速電圧を２ｋＶ以上５ｋＶ以下とする。次いで、微生物試料を対物レンズに近づけて観察する。
【実施例】
【００２３】
本発明の実施例について説明する。
ＥＳＥＭはＦＥＩ（株）製のＱｕａｎｔａ  ２５０ＦＥＧを用いた。細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を冷却試料ホルダーに設置し、表２、表３に示す条件で細菌（微生物試料）観察を実施した。雰囲気はいずれも水蒸気であり、各温度における飽和水蒸気圧下で観察した。飽和水蒸気圧を上回る圧力では細菌（微生物試料）が結露してしまい、一方飽和水蒸気圧を下回る圧力では細菌（微生物試料）が乾燥してしまい、細菌（微生物試料）を良好な状態に保って観察することができなかった。
図１（ａ）に表２実施例Ｎｏ２５（本発明例）の条件で観察した結果を示す。細菌（微生物試料）を良好な状態に保って観察でき、その結果、細菌（微生物試料）の形態識別が可能となっている。
図１（ｂ）に通常のＳＥＭの真空中へ細菌（微生物試料）を設置した場合の例（参考例）を示す。図１（ｂ）では細菌は原型をとどめていないことがわかる。
図１（ｃ）に表３実施例Ｎｏ７４（比較例）の条件で観察した結果を示す。ＥＳＥＭ観察そのものが困難であり、細菌（微生物試料）は全く可視化されていないことがわかる。
図１（ｄ）に表２実施例Ｎｏ４０（比較例）の条件で観察した結果を示す。細菌（微生物試料）の形態識別が困難であることがわかる。
得られた観察結果を表２、表３に条件と併せて示す。なお、表２、表３において、画像の評価は、図１（ａ）のような画像が得られた場合を○、図１（ｃ）のように観察が困難であった場合を×、図１（ｄ）のように細菌の形態の識別が困難である場合を△とした。
【００２４】
【表２】
0005935766.tif 000003
【００２５】
【表３】
0005935766.tif 000004
【００２６】
表２、表３より、本発明例の観察条件では、前処理無しで細菌（微生物試料）を良好な状態に保って観察できることがわかる。
【図１】
0005935766.tif 000005