(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子にポリマーの末端で共有的に結合した１またはこれを超える双性イオンポリマーを含む双性イオンポリマーバイオコンジュゲートであって、前記双性イオンポリマーは、複数の繰り返し単位を含み、それぞれの繰り返し単位は下記式を有するコンジュゲート；
【化１】
0005868862.tif 000011
ここで
Ｒ1は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリール基からなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は、水素、アルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され、および、それらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成し；
Ｌ1は、カチオン中心［Ｎ+(Ｒ２)(Ｒ３)］をポリマー主鎖［−(ＣＨ2−ＣＲ１)n−］に共有的に結合するリンカーであって、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−からなる群から選択され、ここで、ｎは１〜２０であり；
Ｌ2は、アニオン中心［Ａ(＝Ｏ)Ｏ-］をカチオン中心に共有的に結合するリンカーであって、−(ＣＨ2)n−であり、ｎは１〜２０の整数であり；
Ａは、Ｃ，ＳＯ2，またはＰＯであり；
Ｍ+は、（Ａ＝Ｏ）Ｏ-アニオン中心に結合する対イオンであり；
Ｘ-は、カチオン中心に結合する対イオンであり；および
ｎは１〜約１０，０００の整数であり、および
＊は、繰り返し単位が隣に共有的に連結する点を示し、
生体分子は、タンパク質、核酸、炭水化物、糖タンパク質、プロテオグリカン、脂質または低分子である。
【請求項２】
請求項１に記載のコンジュゲートと、医薬的に許容可能なキャリアまたは希釈剤とを含有する組成物。
【請求項３】
ＡがＣである請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記Ｒ1，Ｒ2，およびＲ3は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルからなる群から独立して選択される請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
Ｌ1が、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−であり、ｎが２である請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
Ｌ2が、−(ＣＨ2)n−であり、ｎは１である請求項１に記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２００９年１１月６日に出願された米国出願第６１／２５９，０８８の優先権を主張するものであり、その全体の内容を本明細書の一部として援用する。
【連邦政府の許諾権の陳述】
【０００２】
本発明は、海軍研究事務所により認められ契約番号Ｎ０００１４０９１０１３７のもとで、および全米科学財団により認められ契約番号ＤＭＲ０７０５９０７のもとでの政府の助成を受けてなされたものである。政府は、本発明において正当な権利を有する。
【発明の背景】
【０００３】
タンパク質およびペプチド治療薬剤は、医薬品市場の増加するシェアを含み、生物学的薬剤は、２００８年に約４５億ドルの米国売上げをもたらす。これらの生物学的薬剤のなかには、モノクローン抗体、ホルモン、および治療学的酵素がある。
【０００４】
バイオ医薬品市場の拡大にもかかわらず、治療学的なタンパク質には挑戦的な課題が残る。タンパク質の固有の物理的および化学的な不安定性は、立体配置的な変化、分解、凝集、沈殿、および表面への吸着を導く可能性があり、そのいずれも、タンパク質の活性を減少させ、または完全に不活性にする。
【０００５】
いったん投与されると、治療学的なタンパク質は、半減期の短縮、タンパク質分解、オプソニン作用の影響を受けやすく、免疫原性の反応の原因となり得るものであり、それぞれは望ましくない薬物動態を引き起こすおそれがある。多くの技術は、これらの不足を改善するために開発されてきた。これらの技術の中には、アミノ酸操作、免疫グロブリンドメインまたは血清蛋白質の遺伝子融合、および天然ならびに合成ポリマーとの接合が含まれる。
【０００６】
１つの成功した実施は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、非毒性、非免疫遺伝性のポリマーとの治療学的タンパク質の共有的な接合である。治療学的タンパク質へのＰＥＧの接合プロセスは、一般に、ペグ化と称されている。ペグ化は、生体分子の物理的および化学的特性を変化させることが知られており、コンホメーション、静電気的な結合、および疎水性を含み、薬剤のための改善された薬物動態学的特性をもたらすことができる。ペグ化の利点は、投与されると、薬剤溶解性の改善および免疫原性の減少、高い薬剤安定性および循環寿命、タンパク質分解および腎排泄の減少を含み、これは投薬の頻度減少を可能にする。
【０００７】
ペグ化技術は、治療学的タンパク質およびオリゴヌクレオチドに有利に適用されてきており、米国食品医薬品局により許可された新薬を与える：例えば、アデノシンデアミナーゼ（ペグアデメナーゼ），アスパラギナーゼ（ペグアスパラギナーゼ），Ｇ−ＣＳＦ（ペグフィルグラスチム），インターフェロン−α２ａ（ペグインターフェロン−α２ａ），インターフェロン−α２ｂ（ペグインターフェロン−α２ｂ），ｈＧＨ（ペグビソマント），抗ＶＥＧＦアプタマー（ペグアプタニブ），エリスロポイエチン（ＰＥＧ−ＥＰＯ）、および抗ＴＮＦαＦａｂ’（セルトリズマブ）である。
【０００８】
現在認可され市販されているペグ化された治療学的酵素は、酵素の枯渇を含み、これは、血流からある種のアミノ酸を除去して、成長する腫瘍細胞を餓死させるために用いられる。例は、ＰＥＧ−アスパラギナーゼ、ＰＥＧメチオニナーゼ，およびＰＥＧ−アルギニンデイミナーゼを含む。これらの酵素について、その比較的小さなアミノ酸基質はＰＥＧ層を通して拡散することができ、酵素の活性部位に入って計画通りに効果的に配置される。しかしながら、体内で酵素を維持するために要求されるペグ化のレベルは活性部位を近づき難くするので、ポリマーの保護作用を必要とし、より大きな基質に作用する生体分子は開発することができていない。
【０００９】
ペグ化およびペグ化された生体分子は、その欠点が避けられない。水に対するその強い親和力のために、ＰＥＧはその分子量から予測されるより著しく大きな水力学的な直径をとることが知られている。このバルーニング効果は、生体分子を認識するための身体能力の低下に起因し、生体分子の活性の低下を引き起こす。
【００１０】
１０の５ｋＤａ  ＰＥＧでペグ化されたマウスＡ７モノクローナル抗体は、無修飾の抗体の１０％の活性を有する。同様に、単一の４０ｋＤａ  ＰＥＧでペグ化されたインターフェロン−α２ａは、無修飾のタンパク質の７％の活性を有する。明らかに、ペグ化に起因する生体分子の活性部位の修飾または障害は、バイオ医薬品の開発において避けられるべき深刻な問題である。
【００１１】
ペグ化により与えられるバイオ医薬品開発における進歩にもかかわらず、バイオ医薬品開発をさらに進めること、ペグ化薬剤に関連する欠点を克服すること、および改善された反応物ならびにバイオ医薬品を提供することの必要性が存在している。本発明は、この必要性を満たし、さらなる関連した利点を与えるために探求する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ポリマー生体分子コンジュゲート、コンジュゲートを合成するための反応物ならびに方法、およびコンジュゲートを用いる方法を提供する。
【００１３】
一態様において、本発明は、生体分子に共有的に結合した１またはこれを超える双性イオンポリマーを含む双性イオンポリマーバイオコンジュゲートを提供する。
【００１４】
一実施形態において、双性イオンポリマーは複数の繰り返し単位を含み、それぞれの繰り返し単位は下記式を有する：
【化１】
0005868862.tif 000002
【００１５】
ここで
Ｒ1は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、およびＣ６−Ｃ１２アリール基からなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は、アルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され、または、それらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成し；
Ｌ1は、カチオン中心［Ｎ+(Ｒ5)(Ｒ6)］をポリマー主鎖［−(ＣＨ2−ＣＲ4)n−］に共有的に結合するリンカーであり；
Ｌ2は、アニオン中心［Ａ(＝Ｏ)Ｏ-］をカチオン中心に共有的に結合するリンカーであり；
Ａは、Ｃ，ＳＯ，ＳＯ2，またはＰＯであり；
Ｍ+は、Ａ(＝Ｏ)Ｏ-に結合する対イオンであり；
Ｘ-は、カチオン中心に結合する対イオンであり；および
ｎは、１〜約１０，０００の整数である。
【００１６】
他の態様において、本発明は、生体分子に共有的に結合した１またはこれを超える混合電荷ポリマーを含む混合電荷コポリマーコンジュゲートを提供する。
【００１７】
一実施形態において、混合電荷コポリマーは複数の繰り返し単位を含み、それぞれの繰り返し単位は下記式を有する：
【化２】
0005868862.tif 000003
【００１８】
ここで
Ｒ4およびＲ5は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、およびＣ６〜Ｃ１２アルキル基から独立して選択され；
Ｒ6，Ｒ7，およびＲ8は、アルキルまたはアリールから独立して選択され、または、それらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成し；
Ａ(＝Ｏ)−ＯＭ）は、アニオン中心、ここでＡはＣ、ＳＯ、ＳＯ2またはＰＯであり、Ｍは金属または有機対イオンである、であり；
Ｌ3は、カチオン中心［Ｎ+(Ｒ6)(Ｒ7)(Ｒ8)］をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーであり；
Ｌ4は、アニオン中心［Ａ(＝Ｏ)−ＯＭ］をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーであり；
Ｘ-は、カチオン中心に結合する対イオンであり；
ｎは、１〜約１０，０００の整数であり；および
ｐは、１〜約１０，０００の整数である。
【００１９】
上述のコンジュゲートについて、代表的な生体分子は、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、および低分子を含む。ある実施形態において、生体分子は、その未接合形態よりも高い熱安定性を有する。ある実施形態において、コンジュゲートはカオトロープによる変性に抵抗し、アニオン（例えば、I125-およびI135-）の放射性治療でのタンパク質負荷に適切である。
【００２０】
他の態様において、本発明は、１またはこれを超える本発明のコンジュゲートと、医薬的に許容可能なキャリアまたは希釈剤とを含有する組成物を提供する。
【００２１】
以上の態様および本発明に付随する特徴の多くは、添付した図面に関連した以下の詳細な説明を参照することによって、よりよく理解されるのと同様に、より容易に認識されるようになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明の代表的な双性イオンポリマータンパク質コンジュゲートの合成の模式図である。代表的なＮＨＳ−エステル終端された双性イオンポリマーは、代表的な双性イオンモノマー（ＣＢＭＡ）とＮＨＳ−エステル開始剤とを用いた原子移動ラジカル重合により合成される。ＮＨＳ−エステル終端された双性イオンポリマーは、アミノ基（例えば、リジン残基のアミノ基）でＮＨＳ−エステルを反応させることによりタンパク質に接合される。
【図２Ａ】図２Ａは、ＣＴ−ＰＥＧ（ＬＤ，ＭＤ，およびＨＤ）についてのゲル浸透クロマトグラフの比較である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の代表的な双性イオンポリマー−タンパク質コンジュゲート、ＣＴ−ｐＣＢ（ＬＤ，ＭＤ，およびＨＤ）についてのゲル浸透クロマトグラフの比較である。ＣＴ−ｐＣＢコンジュゲートはｐＣＢはＭn  Ｅｑ．である。比較のために、未接合のＣＴが含まれている。
【図３Ａ】図３Ａは、ＣＴ−ＰＥＧ（ＬＤ，ＭＤ，およびＨＤ）、および本発明の代表的な双性イオンポリマー−タンパク質コンジュゲートＣＴ−ｐＣＢ（ＬＤ，ＭＤ，およびＨＤ）の熱的安定性の比較である。ＣＴ−ｐＣＢコンジュゲートは、ｐＣＢ  Ｍn  Ｅｑ．である。比較のために、未接合のＣＴが含まれている。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＣＴ−ＰＥＧ（ＬＤ，ＭＤ，およびＨＤ）、および本発明の代表的な双性イオンポリマー−タンパク質コンジュゲートＣＴ−ｐＣＢ（ＬＤ，ＭＤ，およびＨＤ）の熱的安定性の比較である。ＣＴ−ｐＣＢコンジュゲートは、ｐＣＢ  Ｒh  Ｅｑ．である。比較のために、未接合のＣＴが含まれている。
【図４】図４は、ＣＴ−ＰＥＧ（ＬＤ，ＭＤ，およびＨＤ）、および本発明の代表的な双性イオンポリマー−タンパク質コンジュゲートＣＴ−ｐＣＢ（ＬＤ，ＭＤ，およびＨＤ）についての尿素中での培養の化学的安定性の比較である。ＣＴ−ｐＣＢコンジュゲートは、ｐＣＢ  Ｍn  Ｅｑ．およびｐＣＢ  Ｒh  Ｅｑ．である。比較のために、未接合ＣＴが含まれている。
【図５】図５は、ＣＴ−ＰＥＧ（ＬＤ，ＭＤ，およびＨＤ）、および本発明の代表的な双性イオンポリマー−タンパク質コンジュゲートＣＴ−ｐＣＢ（ＬＤ，ＭＤ，およびＨＤ）についての１００％血清中での７日間にわたる安定性の比較である。比較のために、未接合ＣＴが含まれている。
【図６Ａ】図６Ａは、ペプチドベースの基質についてのｋcatに及ぼす、ポリマーのタイプおよび接合の程度の影響の比較である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、低分子基質についてのｋcatに及ぼす、ポリマーのタイプおよび接合の程度の影響の比較である。
【図７Ａ】図７Ａは、ペプチドベースの基質についてのミカエリス定数（ｋm）に及ぼす、ポリマーのタイプおよび接合の程度の影響の比較である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、低分子基質についてのミカエリス定数（ｋm）に及ぼす、ポリマーのタイプおよび接合の程度の影響の比較である。
【図８Ａ】図８Ａは、ペプチドベースの基質についての触媒作用効率（ｋcat／ｋm）に及ぼす、ポリマーのタイプおよび接合の程度の影響の比較である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、低分子基質についての触媒作用効率（ｋcat／ｋm）に及ぼす、ポリマーのタイプおよび接合の程度の影響の比較である。
【発明の詳細な説明】
【００２３】
本発明は、ポリマー−生体分子コンジュゲート、コンジュゲートを合成するための反応物ならびに方法、およびコンジュゲートを用いる方法を提供する。
【００２４】
一態様において、本発明は、双性イオンポリマー−生体分子コンジュゲートを提供する。ここで用いられる際、用語「双性イオンポリマー−生体分子コンジュゲート」または「双性イオンポリマーバイオコンジュゲート」は、双性イオンポリマーへの接合によって修飾された生体分子をさす。
【００２５】
他の態様において、本発明は、混合電荷コポリマー生体分子コンジュゲートを提供する。ここで用いられる際、用語「混合電荷コポリマー生体分子コンジュゲート」または「混合電荷コポリマーバイオコンジュゲート」は、混合電荷コポリマーに接合することによって修飾された生体分子をさす。
【００２６】
生体分子は修飾することができ、１またはこれを超える双性イオンポリマー、または１またはこれを超える混合電荷ポリマーを含み、これらは生体分子に共有的に結合する。
【００２７】
＜双性イオンポリマー＞
双性イオンポリマーバイオコンジュゲートは、生体分子に共有的に結合した１またはこれを超える双性イオンポリマーを含む。
【００２８】
一実施形態において、双性イオンポリマーは、複数の繰り返し単位を含み、それぞれの繰り返し単位は式（Ｉ）を有する：
【化３】
0005868862.tif 000004
【００２９】
ここで
Ｒ1は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、およびＣ６〜Ｃ１２アリール基からなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は、アルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され、またはそれらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成し；
Ｌ1は、カチオン中心［Ｎ+(Ｒ5)(Ｒ6)］をポリマー主鎖［−(ＣＨ2−ＣＲ4)n−］に共有的に結合するリンカーであり；
Ｌ2は、アニオン中心［Ａ(＝Ｏ)−Ｏ-］をカチオン中心に共有的に結合するリンカーであり；
Ａは、Ｃ、ＳＯ、ＳＯ2、またはＰＯであり；
Ｍ+は、(Ａ＝Ｏ)Ｏ-アニオン中心に結合する対イオンであり；
Ｘ-は、カチオン中心に結合する対イオンであり；
ｎは、１〜約１０，０００の整数であり；および
＊は、繰り返し単位が隣に共有的に連結する点を示す。
【００３０】
＜混合電荷コポリマー＞
混合電荷コポリマーコンジュゲートは、生体分子に共有的に結合した１またはこれを超える混合電荷コポリマーを含む。
【００３１】
ここで用いられる際、用語「混合電荷コポリマー」は、ポリマー主鎖、正の電荷をもつ複数の繰り返し単位、および負の電荷をもつ複数の繰り返し単位を有するコポリマーをさす。本発明の実施において、これらのコポリマーは、イオン対コモノマーの重合により合成することができる。
【００３２】
混合電荷のコポリマーは、正の電荷を有する複数の繰り返し単位と、負の電荷を有する複数の繰り返し単位とを含む。一実施形態において、混合電荷コポリマーは、実質的に電気的に中性である。ここで用いられる際、用語「実質的に電気的に中性」は、コポリマーに有利な非ファウリング特性を与えるコポリマーをさす。一実施形態において、実質的に電気的に中性なコポリマーは、実質的にゼロの正味の電荷を有するコポリマー（すなわち、正の電荷を有する繰り返し単位と負の電荷を有する繰り返し単位とがほぼ同数のコポリマー）である。一実施形態において、負の電荷を有する繰り返し単位の数に対する正の電荷を有する繰り返し単位の数の比は、約１：１．１〜約１：０．５である。一実施形態において、負の電荷を有する繰り返し単位の数に対する正の電荷を有する繰り返し単位の数の比は、約１：１．１〜約１：０．７である。一実施形態において、負の電荷を有する繰り返し単位の数に対する正の電荷を有する繰り返し単位の数の比は、約１：１．１〜約１：０．９である。
【００３３】
＜イオン対コモノマー＞  一実施形態において、コポリマーは、適切な重合性イオン対コモノマーの共重合により合成される。
【００３４】
本発明に有用な代表的なイオン対コモノマーは、式（II）および（III）を有する：
【化４】
0005868862.tif 000005
【００３５】
本実施形態において、架橋したポリマー（例えばヒドロゲル）は、式（IV）を有する繰り返し単位を有する：
【化５】
0005868862.tif 000006
【００３６】
ここで
Ｒ4およびＲ5は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、およびＣ６〜Ｃ１２アリール基から独立して選択され；
Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8は、アルキルおよびアリールから独立して選択され、または、それらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成し；
Ａ(＝Ｏ)−ＯＭ）は、アニオン中心、ここでＡはＣ，ＳＯ，ＳＯ2，またはＰＯであり、Ｍは金属または有機対イオンである、であり；
Ｌ3は、カチオン中心［Ｎ+(Ｒ6)(Ｒ7)(Ｒ8)］をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーであり；
Ｌ4は、アニオン中心［Ａ(＝Ｏ)−ＯＭ］をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーであり；
Ｘ-は、カチオン中心に結合する対イオンであり；
ｎは、１〜約１０，０００の整数であり；
ｐは、１〜約１０，０００の整数であり、そして
＊は繰り返し単位が隣に共有的に連結する点を表わす。
【００３７】
一実施形態において、Ｒ7およびＲ8はＣ１〜Ｃ３アルキルである。
【００３８】
Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は、アルキルおよびアリールから独立して選択され、またはそれらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成する。一実施形態において、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。
【００３９】
ある実施形態において、Ｌ3は−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−からなる群から選択され、ここでｎは１〜２０の整数である。ある実施形態において、Ｌ3は−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜６である。
【００４０】
ある実施形態において、Ｌ4はＣ１〜Ｃ２０アルキレン鎖である。代表的なＬ4基は、-(ＣＨ2)n−を含み、ここでｎは１〜２０（例えば１，３，または５）である。
【００４１】
ある実施形態において、ＡはＣまたはＳＯである。
【００４２】
ある実施形態において、ｎは５〜約５，０００の整数である。
【００４３】
一実施形態において、Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7，およびＲ8はメチルであり、Ｌ3は−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)2−であり、Ｌ4は−ＣＨ2−であり、Ａ1はＣまたはＳＯであり、ｎは５〜約５，０００の整数である。
【００４４】
上記式において、ポリマー主鎖は、ビニルモノマー（例えば、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、スチレン）から誘導されるビニル主鎖（すなわち、−Ｃ(Ｒ')(Ｒ”)−Ｃ(Ｒ''')(Ｒ'''')−、ここで、Ｒ'，Ｒ”，Ｒ'''，およびＲ''''は、水素、アルキル、およびアリールから独立して選択される）を含む。
【００４５】
上記式において、Ｎ+はカチオン中心である。ある実施形態において、カチオン中心は、４価のアンモニウム（例えば、Ｌ1，Ｒ2，Ｒ3，およびＬ2に結合したＮ）である。アンモニウムに加えて、他の有用なカチオン中心（例えば、Ｒ2およびＲ3がＮとともに）は、イミダゾリウム、トリアゾリウム、、ピリジニウム、モルフォリニウム、オキサゾリジニウム、ピラジニウム、ピリダジニウム、ピリミジニウム、ピペラジニウム、およびピロリジニウムを含む。
【００４６】
Ｒ1〜Ｒ8は、水素、アルキル基およびアリール基から独立して選択される。代表的なアルキル基は、Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖および分岐したアルキル基を含む。ある実施形態において、アルキル基は、例えばアリール基（例えば、−ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ベンジル）を含む１またはこれを超える置換基でさらに置換される。一実施形態において、Ｒ2ならびにＲ3、およびＲ6、Ｒ7、ならびにＲ8はメチルである。一実施形態において、Ｒ1〜Ｒ8はメチルである。代表的なアリール基は、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基を含み、例えばフェニルを含む。上記式のある実施形態について、Ｒ2ならびにＲ3、および／またはＲ6、Ｒ7、ならびにＲ8は、Ｎ+とともにカチオン中心を形成する。
【００４７】
Ｌ1は、カチオン中心をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーである。ある実施形態において、Ｌ1は、Ｌ1の残りをポリマー主鎖（またはモノマーのための重合性部分）に結合する官能基（例えば、エステルまたはアミド）を含む。官能基に加えて、Ｌ1はＣ1〜Ｃ２０のアルキレン鎖を含むことができる。代表的なＬ1は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−を含み、ここでｎは１〜２０（例えば、ｎ＝２）である。
【００４８】
Ｌ2は、カチオン中心をアニオン基に共有的に結合するリンカーである。Ｌ2は、Ｃ１〜Ｃ２０のアルキレン鎖とすることができる。代表的なＬ2基は、−(ＣＨ2)n−を含み、ここでｎは１〜２０（例えば、１，３，または５）である。
【００４９】
Ｌ3は、カチオン中心をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーである。ある実施形態において、Ｌ3はＬ3の残りをポリマー主鎖（またはモノマーのための重合性部分）に結合する官能基（例えば、エステルまたはアミド）を含む。官能基に加えて、Ｌ3はＣ１〜Ｃ２０のアルキレン鎖を含むことができる。代表的なＬ3基は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−を含み、ここでｎは１〜２０（例えば、ｎ＝２）である。
【００５０】
Ｌ4は、アニオン基をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーである。Ｌ4は、Ｃ１〜Ｃ２０のアルキレン鎖とすることができる。代表的なＬ4基は、−(ＣＨ2)n−を含み、ここでｎは１〜２０（例えば、１，３，または５）である。
【００５１】
代表的なアルキル基は、Ｃ１〜Ｃ３０の直鎖および分岐したアルキル基を含む。ある実施形態において、アルキル基は、１またはこれを超える置換基、例えばアリール基（例えば、−ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ベンジル）でさらに置換される。
【００５２】
代表的なアリール基は、Ｃ６〜Ｃ１２アリール基を含み、例えば、置換されたフェニル基（例えば安息香酸）を含む。
【００５３】
Ｘ-は、カチオン中心に結合する対イオンである。対イオンは、カチオン性のポリマーまたはモノマーの合成に起因した対イオン（例えば、Ｃｌ-、Ｂｒ-，Ｉ-）とすることができる。対イオンは、他の適切な対イオンとも交換可能なカチオン中心の合成から初期に生じる。代表的な疎水性の対イオンは、カルボキシレートを含み、例えば、安息香酸および脂肪酸アニオン（例えば、ＣＨ3(ＣＨ2)nＣＯ2-、ここでｎ＝１〜１９）；アルキルスルホネート（例えば、ＣＨ3(ＣＨ2)nＳＯ3-、ここでｎ＝１〜１９）；サリシレート；ラクテート；ビス（トリフルオロメチルスルホニル）アミドアニオン（Ｎ-(ＳＯ2ＣＦ3)2）；およびそれらの誘導体などである。他の適切な対イオンもまた、クロライド、ブロマイド、アイオダイド、サルフェート；ナイトレート；パークロレート（ＣｌＯ4）；テトラフルオロボレート（ＢＦ4）；ヘキサフルオロホスフェート（ＰＦ6）；トリフルオロメチルスルフォネート（ＳＯ3ＣＦ3）；およびそれらの誘導体から選択することができる。他の適切な対イオンは、サリシル酸（２−ヒドロキシ安息香酸）、ベンゾエート、およびラクテートを含む。
【００５４】
生体分子に接合した双性イオンポリマーのサイズ（例えば、ｎまたはＭn）は、変えることができ、生体分子の性質に依存する。
【００５５】
本発明に有用なポリマーについて、重合の程度（ＤＰまたはｎ）、数平均分子量（Ｍn）、および重量平均と数平均との分子量の比（Ｍw／Ｍn）、これは多分散指数としても知られている、は変えることができる。一実施形態において、ポリマーは１〜約１０，０００の重合の程度（ｎ）を有する。一実施形態において、ｎは約１０〜約５，０００である。他の実施形態において、ｎは約１００〜約３，５００である。一実施形態において、ポリマーは約２００〜約２，０００，０００Ｄａの数平均分子量（Ｍn）を有する。一実施形態において、Ｍnは約２，０００〜約１００，０００Ｄａである。他の実施形態において、Ｍnは、約２０，０００〜約８０，０００Ｄａである。一実施形態において、ポリマーは、約１．０〜約２．０の重量平均と数平均との分子量の比（Ｍw／Ｍn）を有する。一実施形態において、Ｍw／Ｍnは約１．１〜約１．５である。他の実施形態において、Ｍw／Ｍnは約１．２〜約２．０である。
【００５６】
＜生体分子＞
上述したように、双性イオンポリマーバイオコンジュゲートは、生体分子に共有的に結合した１またはこれを超える双性イオンポリマーを含む。適切な生体分子は、生体高分子（例えば、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、多糖類）、脂質、および低分子を含む。
【００５７】
本発明に用いることができる代表的な生体分子は、タンパク質（多量体タンパク質、タンパク質複合体、ペプチド）、核酸、脂質、炭水化物、および低分子を含む。
【００５８】
＜タンパク質作用物質＞  いくつかの実施形態において、生体分子はタンパク質またはペプチドである。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、交換可能に用いることができる。ある実施形態において、ペプチドは、約５〜約５０００、５〜約１０００、約５〜約７５０、約５〜約５００、約５〜約２５０、約５〜約１００、約５〜約７５、約５〜約５０、約５〜約４０、約５〜約３０、約５〜約２５、約５〜約２０、約５〜約１５、または約５〜約１０のアミノ酸の範囲の大きさである。
【００５９】
ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または両方とすることができ、種々のアミノ酸修飾または当業者に知られている類似物を含むことができる。有用な修飾は、例えば末端のアセチル化、アミド化を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ここで述べられたように、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、およびそれらの組み合わせを含むことができる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、治療的作用物質は、ホルモン、エリスロポエチン、インシュリン、サイトカイン、ワクチン接種のための抗原、成長因子とすることができる。いくつかの実施形態において、治療的作用物質は、抗体および／またはその特徴的な部分とすることができる。いくつかの実施形態において、抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ（すなわち、“ヒト化の”）、または単鎖（組換え型の）抗原を含むことができるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体は低下したエフェクター機能および／または二重特異性分子を含むことができる。いくつかの実施形態において、抗体は、Ｆａｂ断片および／またはＦａｂ発現ライブラリにより生じた断片（例えば、Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２，ｓｃＦｖ，Ｆｖ，ｄｓＦｖ二重特異性抗体，およびＦｄ断片）を含むことができる。
【００６１】
＜核酸作用物質＞  本発明のいくつかの実施形態において、生体分子は核酸である（例えば、ＤＮＡ，ＲＮＡ、それらの誘導体）。いくつかの実施形態において、核酸作用物質は機能性ＲＮＡである。一般的に、「機能性ＲＮＡ」は、タンパク質をコードしないが、代わりに、その構成が１以上の異なる機能または活性を細胞内に特徴的に有するＲＮＡ分子の分類に属するＲＮＡである。異なる配列を有する機能性ＲＮＡ分子の相対的な活性は異なるものとすることができ、その中にＲＮＡが存在する特定の細胞のタイプの少なくとも一部に依存することができる。それゆえ、用語「機能性ＲＮＡ」は、ＲＮＡ分子の分類をさしてここで用いられ、分類の全構成が任意の特定の条件のもとで、その分類に特徴的な活性を実際に示すことを意味することは意図されない。いくつかの実施形態において、機能性ＲＮＡは、ＲＮＡｉ−誘発物質（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ）、リボザイム、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、三重らせん形成のために有用なＲＮＡを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、核酸作用物質はベクターを含む。ここで用いられる際、用語「ベクター」は、それに連結した他の核酸を輸送できる核酸分子（典型的には、ＤＮＡ分子であるが必ずしもこれである必要ではない）をさす。ベクターは、染色体外の複製および／または宿主細胞内でそれが連結した核酸の発現を達成することができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、宿主細胞のゲノム内への組み込みを達成することができる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ベクターは、タンパク質および／またはＲＮＡの発現に直接用いることができる。いくつかの実施形態において、発現するタンパク質および／またはＲＮＡは細胞によって正常に発現しない。いくつかの実施形態において、発現するタンパク質および／またはＲＮＡは細胞によって正常に発現しないが、ベクターが細胞に与えられない場合に発現するより低いレベルである。いくつかの実施形態において、ベクターは、ここで述べられる何れの機能性ＲＮＡ、例えば、ＲＮＡｉ誘発物質、リボザイムなどの発現を方向付ける。
【００６４】
＜炭水化物作用物質＞  いくつかの実施形態において、生体分子は炭水化物である。ある実施形態において、炭水化物は、タンパク質（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン）に結合する炭水化物である。炭水化物は、天然または合成のものとすることができる。炭水化物は、誘導された天然炭水化物とすることもできる。ある実施形態において、炭水化物は単糖または複合糖とすることができる。ある実施形態において、炭水化物は単糖類であり、グルコース、フラクトース、ガラクトース、およびリボースを含むがそれに限定されない。ある実施形態において、炭水化物は二糖類であり、ラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、およびセロビオースを含むがそれらに限定されない。ある実施形態において、炭水化物は、多糖類であり、セルロース、微結晶性のセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、ブドウ糖、デキストラン、グリコーゲン、キサンタンガム、ゲランガム、デンプン、およびプルランを含むがそれらに限定されない。ある実施形態において、炭水化物は糖アルコールであり、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マリトール、およびラクチトールを含むがそれらに限定されない。
【００６５】
＜脂質作用物質＞  いくつかの実施形態において、生体分子は脂質である。ある実施形態において、脂質は、タンパク質（例えばリポタンパク質）に結合する脂質である。本発明に関連して使用され得る典型的な脂質は、油、脂肪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、必須脂肪酸、シス脂肪酸、トランス脂肪酸、グリセリド、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ホルモン、ステロイド（例えば、コレステロール、胆汁酸)、ビタミン（例えば、ビタミンＥ）、リン脂質、スフィンゴ脂質、およびリポタンパク質を含むが、それに限定されない。
【００６６】
いくつかの実施形態において、脂質は１またはこれを超える脂肪酸基またはその塩を含むことができる。いくつかの実施形態において、脂肪酸基は、消化可能な長鎖（例えば、Ｃ８−Ｃ５０）の置換または非置換の炭化水素を含むことができる。いくつかの実施形態において、脂肪酸基は、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、またはリグノセリン酸の１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態において、脂肪酸基は、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、アルファ−リノール酸、ガンマ−リノール酸、アラキドン酸、ガドレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、またはエルカ酸の１つ以上を含むことができる。
【００６７】
＜低分子作用物質＞  いくつかの実施形態において、治療的作用物質は、薬学的活性を有する低分子および／または有機化合物である。いくつかの実施形態において、治療的作用物質は臨床的に用いられる薬剤である。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗がん剤、抗生物質、抗ウィルス剤、抗ＨＩＶ剤、抗寄生虫剤、抗原虫剤、麻酔薬、抗凝血剤、酵素阻害剤、ステロイド性作用物質、ステロイド性または非ステロイド性抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、免疫抑制剤、抗腫瘍性作用物質、抗原、ワクチン、抗体、鬱血除去剤、鎮静剤、オピオイド、鎮痛薬、解熱剤、避妊薬、ホルモン、プロスタグランジン、プロゲステロン作用薬、抗緑内障剤、眼科薬、抗コリン作用薬、鎮痛薬、抗抑制剤、抗精神病薬、ノイトロキシン、抗睡眠剤、精神安定薬、抗痙攣薬、筋弛緩薬、抗パーキンソン剤、抗痙攣薬、筋収縮剤、チャネルブロッカー、縮瞳剤、抗分泌剤、抗血栓剤、抗凝血剤、抗コリン作用剤、β−アドレナリン作用遮断剤、利尿剤、心血管活性剤、血管作動剤、血管拡張剤、抗高血圧剤、血管形成剤、細胞−細胞外マトリックス相互作用の修飾物質(例えば、細胞成長抑制剤および抗接着分子)、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質合成の阻害剤である。
【００６８】
ある実施形態において、低分子作用物質は任意の薬剤とすることができる。いくつかの実施形態において、薬剤は、適切な政府機関または規制機関によって、ヒトまたは動物における使用のために安全かつ効果的とされてきたものである。例えば、ヒトの使用のために許可された薬剤は、米国食品医薬品局によって２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§３３０．５のもと、３３１〜３６１、および４４０〜４６０に挙げられており、これは本明細書の一部として援用される、獣医学的な使用のための薬剤は、米国食品医薬品局によって２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§５００〜５８９に挙げられており、これは本明細書の一部として援用される。収載された全ての薬剤は、本発明に関連する使用に受け入れられると考えられる。
【００６９】
本発明における使用に適切な分類のより完全なリストおよび特異的な薬剤は、Ａｘｅｌ  ＫｌｅｅｍａｎｎおよびＪｕｒｇｅｎ  ＥｎｇｅｌによるＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｒｕｇｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，  Ｐａｔｅｎｔｓ，  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｔｈｉｅｍｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  １９９９）、およびＢｕｄａｖａｒｉらによるｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ：  Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，  Ｅｄ．（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６）にみることができ、そのいずれも、本明細書の一部として援用される。
【００７０】
１またはこれを超える双性イオンポリマーと有利に接合した生体分子は、使用が許可されてきたバイオ医薬品を含む。ペグ化された生体分子およびバイオ医薬品は、１またはこれを超える双性イオンポリマーとの接合に適切なバイオ医薬品の分類の例となり、本発明の双性イオンポリマーバイオコンジュゲートを与える。
【００７１】
＜接合方法＞
双性イオンポリマーは、天然生体分子または適切な反応基（例えば、タンパク質のための天然リジン残基のアミノ基、またはタンパク質またはオリゴヌクレオチドに取り込まれたアミノ基）を含むように修飾された生体分子での、適切な反応性ポリマー（例えば、活性エステル）の共有的な結合により生体分子に接合させることができる。双性イオンポリマーの反応性エステル（ＮＨＳ）を一般的なタンパク質に接合させることによる（例えば、有用なリジン基を介して）、代表的な双性イオンタンパク質コンジュゲートの合成は、図１に模式的に示される。代表的な生体分子（酵素ＣＴ）への代表的な双性イオンポリマー（ポリカルボキシベタインの末端ＮＨＳエステル）の結合は、図１に示される。
【００７２】
あるいは、双性イオンポリマーバイオコンジュゲートは、１またはこれを超える重合開始剤を生体分子に共有的に結合させ、次いで、適切な双性イオンモノマーを用いた重合により、生体分子からポリマーをグラフトさせること（すなわち、ｉｎ  ｓｉｔｕ重合）によって合成することができる。この方法においては、１またはこれを超える重合開始剤は、上述した生体分子へのポリマーの直接接合の場合と同様にして、生体分子に結合する。ｉｎ  ｓｉｔｕ重合法は、重合のために必要とされる反応条件に安定な生体分子についてのみ、用いることができる。
【００７３】
＜医薬品組成物＞
他の態様においては、本発明は、本発明の双性イオンポリマーバイオコンジュゲートと医薬的に許容可能なキャリアまたは希釈剤とを含む組成物を提供する。適切なキャリアおよび希釈剤は、当業者に知られているものを含み、例えば、生理食塩水およびブドウ糖などである。
【００７４】
＜投与／治療の方法＞
本発明の他の態様においては、投与および治療のための方法が提供される。
【００７５】
一実施形態においては、本発明は、本発明の双性イオンポリマーバイオコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することを含む双性イオンポリマーバイオコンジュゲートの投与方法を提供する。
【００７６】
一実施形態においては、本発明は、生体分子の投与により治療可能な疾病または状態を治療するための方法を提供する。方法においては、生体分子の双性イオンポリマーコンジュゲートは、それを必要とする対象に投与される。
【００７７】
以下は、本発明の代表的な双性イオンポリマーバイオコンジュゲートの合成および性質に関する説明である。以下の説明において、生体分子は酵素、アルファ−キモトリプシン（ＣＴ）によって例証される。バイオコンジュゲートのある性質は、対応するペグ化されたコンジュゲートと比較される。
【００７８】
＜安定性＞  熱的安定性試験を行なって、酵素活性に及ぼす温度の影響を測定した。活性を測定するために、Ｎ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ  ｐ−ニトロアニリド、６２５Ｄａのペプチドベースの基質を用いた。図３Ａ中のデータから、ｐＣＢおよびＰＥＧは、いずれも高い温度において安定した効果を有することがわかる。ＰＥＧは安定化剤として知られているものの、ｐＣＢ  Ｍn  Ｅｑ．のコンジュゲートは、さらなる改善を与えることがわかる。図３Ｂにおいては、以前の２つのコンジュゲートと比較して著しい熱的安定性をｐＣＢ  Ｒh  Ｅｑ．にみることができる。
【００７９】
尿素は変性剤として、タンパク質の主鎖に相互作用するということが理論化されており、タンパク質の変性を引き起こして機能を損失することが知られている。合成されたコンジュゲートの安定性を十分に強調するために、ほとんど飽和した尿素溶液を用いて酵素活性をインサイチュー（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で測定した。結果は、図４にみることができる。２，８および３２時間の時点が選ばれた。初期の時点においては、有意な差はみられなかった。８および３２時間において、より大きな不安定性が、ＣＴ対照およびより低い接合のＰＥＧサンプルにみられた。全てのｐＣＢコンジュゲートは、接合の程度がより低い対照と比較しても、高い安定性を示した。高度に接合したＰＥＧサンプル（ＨＤ）のみは、他のｐＣＢコンジュゲートの全てに匹敵する活性を有した。これは、ＣＴ−ｐＣＢコンジュゲートが、非常に少量で結びついたポリマーを有するときであってさえ、タンパク質を化学的に安定にする非常に独特の能力を有することを示す。
【００８０】
図５は，１週間の期間にわたるＣＴコンジュゲートの血清安定性を示す。７日で、全てのｐＣＢコンジュゲートは、未接合の対照を含むＰＥＧコンジュゲートの全てよりも、より高く保持された活性を有することが示される。
【００８１】
＜速度論および親和性＞  速度論分析のために、ＣＴ−ＰＥＧコンジュゲートを、等しい分子量（ｐＣＢ  Ｍn  Ｅｑ．）および等しい水力学的サイズ（ｐＣＢ  Ｒh  Ｅｑ．）のＣＴ−ｐＣＢコンジュゲートと比較した。ポリマーの速度効果を評価するために２つの基質を用いた：すなわち、Ｎ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ  ｐ−ニトロアニリド、６２５Ｄａのペプチドベースの基質、およびレゾルフィンブロモアセテート、より小さい（３３５Ｄａ）非ペプチドベースの基質である。レゾルフィンブロモアセテートは、陰性対照として含まれ、小さく、より疎水性の基質は、接合されたポリマーによる酵素との複合化を少なく阻害することが知られている。
【００８２】
図６は、試験された全てのコンジュゲートについてのｋcat値を示す。ｋcatは、生成物への基質の変換の最大率である。これは、活性部位に接近する基質の能力、これはＫmで表わされる、に無関係である。ｋcatはポスト結合を生じる。これは、基質濃度が非常に高いときに観察することができる。ｋcatにおける増加は、酵素−基質複合体に固有な差異を表わす。図６から、全てのＰＥＧおよびｐＣＢ  Ｍn  Ｅｑ．コンジュゲートは、ｋcatにおいて有意な変化を示さないことがみられる。これらのコンジュゲートについて、ポリマーは消極的に作用する。しかしながら、ｐＣＢ  Ｒh  Ｅｑ．サンプルについては、ｋcatにおける増加が現れている。これは、ポリマーが酵素−基質複合体に直接作用することの証拠である。ペプチド基質について、ｋcatにおける増加はより明白であり、接合の程度により相関性が大きくなる。これは、基質アミドの化学的性質に起因すると仮定され、酵素およびペプチド基質に及ぼすポリマーの効果が相加的であることを示す。
【００８３】
図７は、全てのポリマータンパク質コンジュゲートについてのミカエリス定数（Ｋm）を示す。Ｋmは、５０％最大活性（ｋcat）に達され、酵素のための基質の親和性に近似する基質濃度である。ペプチドベースの基質について予測されるように、ＰＥＧは、ますます反対の効果を有し、これはＫmにおける増加により示され、ポリマーのますます多くの取り込みを伴なう。しかしながら、両方のＣＴ−ｐＣＢコンジュゲートは、何等の抑制効果を有さないことが示された。事実、ｐＣＢ  Ｒh  Ｅｑ．コンジュゲートについてのＫmは、より多くのポリマーがタンパク質に取り込まれている際に減少することがみられた。Ｋmは、接合したポリマーのサイズおよび化学的性質に大きく影響される。陰性対照に示されるように、並べてみると低分子基質に小さな傾向がある。より疎水性の低分子基質は、酵素−ポリマーコンジュゲートのポリマーシェルの内外に、より容易に拡散することが知られている。
【００８４】
図８は、全てのポリマータンパク質コンジュゲートについての触媒作用効率（ｋcat／Ｋm）を示す。これは、基質に触媒作用する系全体の効率を定義する一般的な用語である。これらは、基質での複合化のための酵素の能力を考慮して、生成物へ効率的に変換する。上述した理由の組み合わせに起因して、Ｋmにおける増加はＰＥＧ接合のための低い触媒作用効率をもたらす。対照的に、ｐＣＢ  Ｒh  Ｅｑ．については、Ｋmにおける減少およびｋcatにおける増加は、触媒作用効率における大きな増加をもたらす。特筆すると、高度に接合したＰＥＧコンジュゲートは、触媒作用効率において４７．６％の減少を有することがみられ、一方、高度に接合したｐＣＢ  Ｒh  Ｅｑ．は、活性において２２０．４％の増加を有することがみられた。
【００８５】
以下の例は、例示の目的のために与えられ、本発明を限定しない。
【００８６】
例
＜例１＞
＜代表的な双性イオンポリマータンパク質コンジュゲートの合成および特徴付け＞
この例においては、本発明の代表的な双性イオンポリマータンパク質コンジュゲート、ｐＣＢ−ＣＴの合成および特徴付けを述べる。
【００８７】
＜ＮＨＳ終端されたカルボキシベタインポリマーの合成＞  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．２６ｇ，１９．６ｍｍｏｌ）および２−ブロモプロピオン酸（１．４５ｍｌ，１６．４ｍｍｏｌ）を、マグネティックスターラーで攪拌しつつ丸底フラスコ中で５００ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解した。フラスコを０℃に冷却し、ＤＣＭ（２５ｍｌ）に溶解したＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（３．３５ｇ，１６．３４ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。室温で一晩攪拌した後の反応混合物をろ過し、減圧下で溶媒を除去して黄色固体を得た。生成物は、フラッシュクロマトグラフィでさらに精製した。２．４ｇの白色固体（９．６３ｍｍｏｌ，収率＝５９％）が得られた。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）（ｐｐｍ）：１．９７（ｄ，３Ｈ，ＣＨ(ＣＨ3)Ｂｒ），２．８８（ｓ，４Ｈ），４．６２（ｑ，１Ｈ，ＣＨ(ＣＨ3)Ｂｒ）。
【００８８】
原子移動ラジカル重合は、Ｃｕ（１）Ｂｒ／ＨＭＴＥＴＡ触媒を用いて、無水ジメチルホルミアミド（ＤＭＦ）中で行なった（図１Ａ）。典型的な重合において、ＤＭＦおよび液体ＨＭＴＥＴＡリガンドは、窒素でのバブリングにより別々に酸素をパージした。１ｇ（３．６７ｍｍｏｌ）のＣＢＭＡ−１−ｔＢｕｔモノマーおよび１２５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）のＮＨＳ−開始剤をシュレンク管に加えた。第２のシュレンク管に７１．７ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）のＣｕ（１）Ｂｒを加えた。いずれの管も、窒素と真空とを３回繰り返すことにより脱酸素化した。８および２ｍＬの脱酸素化ＤＭＦを、モノマー／開始剤の管およびＣｕ（１）Ｂｒの管にそれぞれ加えた。Ｃｕ（１）Ｂｒを含む溶液に１３６μＬ（０．５ｍｍｏｌ）の脱酸素化ＨＭＴＥＴＡを加え、窒素保護の下で３０分間攪拌した。触媒溶液（Ｃｕ（１）／ＨＭＴＥＴＡ）をモノマー／開始剤溶液に、その後全て加えて反応を開始した。反応は、ＮＭＲにより監視しつつ室温で完了させた。有機溶媒中での制御された重合のための保護された双性イオンモノマーが使用されたことから、ポリマー合成は独特である。エステルの非活性化がより多くの水性溶媒（例えば、水およびメタノール）中で起こり得るので、これは、反応性エステル終端されたポリマーの処理に重要である。ポストポリマー修飾は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の保護モノマー基を除去するためであるが、活性エステルの加水分解も行なわれない。他の双性イオンは、有機溶媒中に可溶性のままであることができない。この保護方法は、こうした問題への解決策を与える。
【００８９】
重合後、反応はエチルエーテル中で完全に沈殿した。沈殿物は、その後、真空下で乾燥し、少量のＤＭＦ（３〜５ｍＬ）に再溶解した。この溶液は、完全に溶解するまでボルテックス撹拌し、アセトン中で沈殿させて可溶性の触媒および微量のモノマーを除去した。これは、触媒を完全に除去するまで計３回繰り返した。残りのエステルポリマーは、真空下で一晩乾燥し、ＮＭＲにより分析した。
【００９０】
ｔｅｒｔ−ブチル基を加水分解するために、５００ｍｇのＮＨＳ−ｐＣＢＭＡ−１−ｔＢｕｔを５ｍＬのトリフルオロ酢酸に溶解した（図１Ｂ）。これは、２時間放置した。溶液は、その後、エチルエーテルで沈殿させ、真空下で一晩乾燥し、次いでＮＭＲおよびＧＰＣにより分析した。
【００９１】
＜カルボキシベタイン−タンパク質コンジュゲートの合成および分析＞  これらの実験について、ＰＥＧおよびｐＣＢの効果の比較に用いるために、分子量５ｋＤａを選択した。ｐＣＢとＰＥＧとの間の異なる溶液コンフォメーションに起因して、ＧＰＣにより決定された分子量は、ＮＭＲで決定された分子量と比較すると大きく変動する。ＰＥＧは、溶液中でより膨張したコンフォメーションをとり、一方のｐＣＢはより凝縮していることが知られている。これは、表１および２中の“ＰＥＧ”および“ｐＣＢ  Ｍn  Ｅｑ”のＧＰＣ分子量の間に見ることができる。ｐＣＢ  Ｍn  Ｅｑは、ＰＥＧに等しい分子量であり、熱的な尿素および血清安定性試験において用いられる。しかしながら、より大きなｐＣＢポリマーを伴なうｐＣＢコンジュゲート（“ｐＣＢ  Ｒh  Ｅｑ”）もまた合成され、動力学的な分析のためのＧＰＣにより決定された対応するサイズを有する、ｐＣＢ  Ｒh  Ｅｑのみが安定性の研究に用いられ、合成された２つのｐＣＢポリマーのうちのより小さいものが、５ｋＤａ  ＰＥＧと比較してより優れた効果を有することが分かった。
【００９２】
表１  ＴＮＢＳ測定法により測定された酵素毎に接合されたポリマーの数。さらなるｐＣＢポリマーは、水力学的なサイズがＰＥＧに等しいもの（ｐＣＢ  Ｒh  Ｅｑ）として合成した。
【表１】
0005868862.tif 000007
【００９３】
表２  ＧＰＣおよびＮＭＲにより決定された分子量（*Ｍnそのまま）。さらなるｐＣＢポリマーは、水力学的サイズがＰＥＧに等しいもの（ｐＣＢ  Ｒh  Ｅｑ）として合成した。
【表２】
0005868862.tif 000008
【００９４】
表面への接合は、ｐＣＢおよびＰＥＧポリマーで活性化されたＮＨＳを有するＣＴのリジンε−アミノ基を露出した。ＣＴは、ｐＨ８．０における２００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中で、５ｍｇ／ｍＬに調製した（図１Ｃ）。乾燥したポリマーは、酵素溶液に直接加えた。接合の程度（ポリマー／ＣＴタンパク質の数）を制御するために、タンパク質に対するポリマーの原料比を調節した。反応溶液は、氷上で２時間攪拌し、その後、冷凍室内に一晩配置した。コンジュゲートは、ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水での数回の緩衝交換によって、限外ろ過（３０，０００Ｄａ  ＭＷＣＯ）を用いて未反応のポリマーから精製した。グリセロールは、最後のろ過の後に４０％で加え、−２０℃で保管した。修飾の程度（ポリマー／ＣＴタンパク質の数）は、ＴＮＢＳ測定法により決定した。タンパク質毎のポリマーの数を表１にまとめる。コンジュゲートは、ＧＰＣクロマトグラムで確認した（図２）。
【００９５】
ＰＥＧおよびｐＣＢ  Ｍn  Ｅｑ．コンジュゲートについての例は、図２にみることができる。
【００９６】
この系についてはメンブラン精製を用いたが、他の方法にも向けられる。タンパク質精製のための典型的な方法は、タグアフィニティー、イオン交換、およびサイズ排除クロマトグラフィーを含む。独特の変化を示すものは、ｐＣｂコンジュゲートのイオン交換である。ポリマーのイオン的性質のために、コンジュゲートと未コンジュゲートとの間の分解能は非常に乏しい。ＰＥＧは、無電荷のポリマーであり、非常に高い分解能を有することが示された。タンパク質タギングは、モデル系に用いるのに適切ではなく、それゆえ試験されなかった。ｐＣＢおよびＰｅｇコンジュゲートのいずれについても、サイズ排除はよく作用し、全てのｐＣＢ精製要求のために用いられるべきである。
【００９７】
精製のための独特の方法は、選択的なアンモニウムサルフェートタンパク質精製である。ｐＣＢポリマーの独特なコスモトロピックな特性に起因して、アンモニウムサルフェートタンパク質沈殿による分離は、この系についてよく作用する。ＰＥＧは逆の効果を有することが提案され、この技術により容易に沈殿することができず、他の精製方法を必要とする。
【００９８】
説明的な実施形態を示して述べたが、種々の変更は、本発明の意図や範囲から逸脱しない中で行ない得ることが理解されるであろう。
【００９９】
独占的属性または特権である本発明の実施形態は、以下に限定するように主張される。
以下に、本願出願の当初の請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
生体分子に共有的に結合した１またはこれを超える双性イオンポリマーを含む双性イオンポリマーバイオコンジュゲート。
［２］
［１］に記載のコンジュゲートであって、前記双性イオンポリマーは、複数の繰り返し単位を含み、それぞれの繰り返し単位は下記式を有するコンジュゲート；
【化６】
0005868862.tif 000009
ここで
Ｒ1は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ６−Ｃ１２アリール基からなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は、アルキルおよびアリールからなる群から独立して選択され、または、それらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成し；
Ｌ1は、カチオン中心［Ｎ+(Ｒ5)(Ｒ6)］をポリマー主鎖［−(ＣＨ2−ＣＲ4)n−］に共有的に結合するリンカーであり；
Ｌ2は、アニオン中心［Ａ(＝Ｏ)Ｏ-］をカチオン中心に共有的に結合するリンカーであり；
Ａは、Ｃ，ＳＯ，ＳＯ2，またはＰＯであり；
Ｍ+は、（Ａ＝Ｏ）Ｏ-アニオン中心に結合する対イオンであり；
Ｘ-は、カチオン中心に結合する対イオンであり；および
ｎは１〜約１０，０００の整数である。
［３］
［２］に記載のコンジュゲートであって、前記Ｒ1，Ｒ2，およびＲ3は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルからなる群から独立して選択されるコンジュゲート。
［４］
［２］に記載のコンジュゲートであって、Ｌ1は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−からなる群から選択され、ここで、ｎは１〜２０であるコンジュゲート。
［５］
［２］に記載のコンジュゲートであって、Ｌ2は−(ＣＨ2)n−であり、ｎは１〜２０の整数であるコンジュゲート。
［６］
［１］に記載のコンジュゲートであって、前記生体分子はタンパク質であるコンジュゲート。
［７］
［１］に記載のコンジュゲートであって、前記生体分子は核酸であるコンジュゲート。
［８］
［１］に記載のコンジュゲートであって、前記生体分子は炭水化物であるコンジュゲート。
［９］
［１］に記載のコンジュゲートであって、前記生体分子は脂質であるコンジュゲート。
［１０］
［１］に記載のコンジュゲートであって、前記生体分子は低分子であるコンジュゲート。
［１１］
［１］に記載のコンジュゲートであって、前記生体分子は、その未接合形態よりも高い熱的安定性を有するコンジュゲート。
［１２］
［１］に記載のコンジュゲートであって、カオトロープによる変性に抵抗し、アニオン(例えばI125-およびI135-)の放射線治療でのタンパク質負荷に適切であるコンジュゲート。
［１３］
［１］乃至［１２］のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、医薬的に許容可能なキャリアまたは希釈剤とを含有する組成物。
［１４］
生体分子に共有的に結合した１またはこれを超える混合電荷ポリマーを含有する混合電荷コポリマーバイオコンジュゲート。
［１５］
［１４］に記載のコンジュゲートであって、前記混合電荷コポリマーは複数の繰り返し単位を有し、それぞれの繰り返し単位は下記式を有するコンジュゲート；
【化７】
0005868862.tif 000010
ここで
Ｒ4およびＲ5は、水素、フッ素、トリフルオロメチル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ６〜Ｃ１２アリール基から独立して選択され；
Ｒ6，Ｒ7，およびＲ8は、アルキルまたはアリールから独立して選択され、または、それらが結びついた窒素とともにカチオン中心を形成し；
Ａ(＝Ｏ)−ＯＭ）は、アニオン中心であり、ここでＡはＣ，ＳＯ，ＳＯ2，またはＰＯであり、Ｍは金属または有機対イオンであり；
Ｌ3は、カチオン中心［Ｎ+(Ｒ6)(Ｒ7)(Ｒ8)］をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーであり；
Ｌ4は、アニオン中心［Ａ(＝Ｏ)−ＯＭ］をポリマー主鎖に共有的に結合するリンカーであり；
Ｘ-はカチオン中心に結合する対イオンであり；
ｎは１〜約１０，０００の整数であり；および
ｐは１〜約１０，０００の整数である。
［１６］
［１４］に記載のコンジュゲートであって、Ｒ4〜Ｒ8は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルからなる群から独立して選択されるコンジュゲート。
［１７］
［１４］に記載のコンジュゲートであって、Ｌ3は、−Ｃ(＝Ｏ)Ｏ−(ＣＨ2)n−および−Ｃ(＝Ｏ)ＮＨ−(ＣＨ2)n−からなる群から選択され、ここでｎは１〜２０であるコンジュゲート。
［１８］
［１４］に記載のコンジュゲートであって、Ｌ4は−(ＣＨ2)n−であり、ここでｎは１〜２の整数であるコンジュゲート。
［１９］
［１４］に記載のコンジュゲートであって、前記生体分子はタンパク質であるコンジュゲート。
［２０］
［１４］に記載のコンジュゲートであって、前記生体分子は核酸であるコンジュゲート。
［２１］
［１４］に記載のコンジュゲートであって、前記生体分子は炭水化物であるコンジュゲート。
［２２］
［１４］に記載のコンジュゲートであって、前記生体分子は脂質であるコンジュゲート。
［２３］
［１４］に記載のコンジュゲートであって、前記生体分子は低分子であるコンジュゲート。
［２４］
［１４］に記載のコンジュゲートであって、前記生体分子は、その未接合形態よりも高い熱的安定性を有するコンジュゲート。
［２５］
［１４］に記載のコンジュゲートであって、カオトロープによる変性に抵抗し、アニオンの放射線治療でのタンパク質負荷に適切であるコンジュゲート。
［２６］
［１４］〜［２５］のいずれか１項に記載のコンジュゲートと、医薬的に許容可能なキャリアまたは希釈剤とを含有する組成物。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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