(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンキリン反復ドメインおよびポリエチレングリコール部分を含むリコンビナント結合タンパク質であって、該アンキリンドメインが、ＶＥＧＦ−Ａ１６５と結合し、ＶＥＧＦＲ−２に結合するＶＥＧＦ−Ａ１６５を阻害し、
前記アンキリン反復ドメインは、（１）配列番号：１のアミノ酸１ないし１５９と、（２）配列番号：２のアミノ酸１ないし１５９と、（３）配列番号：３のアミノ酸１ないし１２６と、（４）配列番号：４のアミノ酸１ないし１２６と、（５）配列番号：５のアミノ酸１ないし１２６と、（６）配列番号：６のアミノ酸１ないし１２６と、（７）配列番号：７のアミノ酸１ないし１５９とからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ポリエチレングリコール部分は１kDaないし１００kDaの分子量を有する、リコンビナント結合タンパク質。
【請求項２】
アンキリン反復ドメインが、そのＣ末端でペプチド結合を介してポリペプチドリンカーおよびＣ末端Ｃｙｓ残基にコンジュゲーションしている結合タンパク質であって、該Ｃ末端Ｃｙｓのチオールが、ポリエチレングリコール部分にコンジュゲーションしており、該ポリエチレングリコール部分はマレイミド結合ポリエチレングリコールである、請求項１記載の結合タンパク質。
【請求項３】
マレイミド結合ポリエチレングリコールが、α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−メトキシ−ポリオキシエチレンである、請求項２記載の結合タンパク質。
【請求項４】
配列番号：２、３、５、６または７のアンキリン反復タンパク質から成る群より選択されるアンキリン反復タンパク質を含む、請求項１記載の結合タンパク質。
【請求項５】
ポリエチレングリコール部分が、１０ないし４０kDaの分子量を有する、請求項２〜４のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項６】
配列番号：３のアンキリン反復タンパク質を含み、該アンキリン反復タンパク質のＣ末端Ｃｙｓのチオールが、ポリエチレングリコール部分にコンジュゲーションしており、該ポリエチレングリコール部分はマレイミド結合ポリエチレングリコールである、請求項１記載の結合タンパク質。
【請求項７】
マレイミド結合ポリエチレングリコールが、α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−メトキシ−ポリオキシエチレンであり、ポリエチレングリコール部分が、少なくとも１０kDaの分子量を有する、請求項６記載の結合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載の結合タンパク質の有効量と、場合により薬学的に許容されうる担体および／または希釈剤とを含む、病的血管新生の処置に使用するための薬学的組成物。
【請求項９】
眼疾患の処置に使用するための、請求項８記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
硝子体内注射による眼疾患の処置に使用するための、請求項８記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
病的血管新生処置用医薬を製造するための請求項１〜７のいずれか一項記載の結合タンパク質の使用であって、該結合タンパク質の有効量がそれを必要とする患者に投与される、使用。
【請求項１２】
配列番号：３のアミノ酸１ないし１２６を含むアンキリン反復ドメインおよびポリエチレングリコール部分を含むリコンビナント結合タンパク質であって、該ポリエチレングリコール部分は２ないし４０kDaの分子量を有し、前記アンキリン反復ドメインは、そのＣ末端でペプチド結合を介してＣ末端Ｃｙｓ残基を有するポリペプチドリンカーにコンジュゲーションしており、該Ｃ末端Ｃｙｓのチオールが、ポリエチレングリコール部分にコンジュゲーションし、該ポリエチレングリコール部分はマレイミド結合ポリエチレングリコールであり、該マレイミド結合ポリエチレングリコールは、α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−メトキシ−ポリオキシエチレンである、リコンビナント結合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号：３のアミノ酸１ないし１２６を含むアンキリン反復ドメインおよびポリエチレングリコール部分を含むリコンビナント結合タンパク質であって、該ポリエチレングリコール部分は２ないし４０kDaの分子量を有し、配列番号：３のアミノ酸配列は、そのＣ末端Ｃｙｓ残基のチオールを介してポリエチレングリコール部分にコンジュゲーションしており、該ポリエチレングリコール部分はマレイミド結合ポリエチレングリコールであり、該マレイミド結合ポリエチレングリコールが、α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−メトキシ−ポリオキシエチレンである、リコンビナント結合タンパク質。
【請求項１４】
ポリエチレングリコール部分は１５ないし３０kDaの分子量を有する、請求項１３記載のリコンビナント結合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１３記載の結合タンパク質の有効量と、場合により薬学的に許容されうる担体および／または希釈剤とを含む、病的血管新生の処置に使用するための薬学的組成物。
【請求項１６】
眼疾患の処置に使用するための、請求項１５記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
硝子体内注射による眼疾患の処置に使用するための、請求項１５記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１２記載の結合タンパク質の有効量と、場合により薬学的に許容されうる担体および／または希釈剤とを含む、病的血管新生の処置に使用するための薬学的組成物。
【請求項１９】
眼疾患の処置に使用するための、請求項１８記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
病的血管新生処置用医薬を製造するための請求項１２記載の結合タンパク質の使用であって、該結合タンパク質の有効量がそれを必要とする患者に投与される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＶＥＧＦ−Ａに特異的な改変リコンビナント結合タンパク質、そのようなタンパク質を含む薬学的組成物ならびに腫瘍および眼疾患の処置におけるそのようなタンパク質の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
既存の脈管系からの新しい血管の成長である血管新生は、腫瘍成長および眼疾患を含めたいくつかの病的状態、特に加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）または糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）などの眼の新生血管形成疾患における重要な過程である（Carmeliet, P., Nature 438, 932-936, 2005）。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、内皮細胞においてＶＥＧＦレセプター（ＶＥＧＦＲ）チロシンキナーゼを活性化することによって血管新生およびリンパ管新生を刺激する（Ferrara, N., Gerber, H. P. and LeCouter, J., Nature Med. 9, 669-676, 2003）。
【０００３】
哺乳類ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ（ＦＩＧＦとしても知られている）および胎盤成長因子（ＰｌＧＦ、ＰＧＦとしても知られている）と呼ばれる５種の糖タンパク質から成る。ＶＥＧＦ−Ａは、抗血管新生療法のための有効なターゲットであることが示されている（Ellis, L. M. and Hicklin, D. J., Nature Rev. Cancer 8, 579-591, 2008）。ＶＥＧＦ−Ａリガンドは、ＶＥＧＦＲ−１（ＦＬＴ１としても知られている）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲとしても知られている）およびＶＥＧＦＲ−３（ＦＬＴ４としても知られている）と呼ばれる、構造が類似した３種のＩＩＩ型レセプター型チロシンキナーゼに結合して活性化させる。ＶＥＧＦリガンドは、これらチロシンキナーゼレセプターのそれぞれに対して別個の結合特異性を有し、そのことがそれらの機能多様性の原因となる。リガンドの結合に応答して、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼは、別個の下流のシグナル伝達経路のネットワークを活性化する。ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２は、主に血管内皮上から見出され、一方でＶＥＧＦＲ−３は、大部分はリンパ管内皮上から見出される。これらのレセプターは、全て、細胞外ドメイン、１回膜貫通領域、およびキナーゼ挿入ドメインによって割り込まれたコンセンサスチロシンキナーゼ配列を有する。最近になって、本来セマフォリン／コラプシンファミリーのニューロンガイダンスメディエーターに対するレセプターとして同定されたニューロピリン（ＮＲＰ−１）が、ＶＥＧＦ−Ａに対するアイソフォーム特異的レセプターとして作用することが示された。
【０００４】
ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子内の８個のエクソンからの選択的スプライシングによって生成する様々なアイソフォームのＶＥＧＦ−Ａが知られている。全てのアイソフォームは、エクソン１〜５および末端エクソンであるエクソン８を有する。ヘパリン結合ドメインをコードするエクソン６および７は、含まれることがあるし、含まれないこともある。これにより、それらのアミノ酸の数に応じてＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１２１、ＶＥＧＦ−Ａ１８９などと名付けられるタンパク質ファミリーが生じる。しかしながら、エクソン８は、ヌクレオチド配列中に２個の３’スプライス部位を有し、その部位が細胞によって使用されて、同一の長さであるがＣ末端アミノ酸配列が異なる２種のファミリーのアイソフォームを生成する可能性がある（Varey, A.H.R. et al., British J. Cancer 98, 1366-1379, 2008）。血管新生促進ファミリーのアイソフォームであるＶＥＧＦ−Ａｘｘｘ（「ｘｘｘ」は成熟タンパク質のアミノ酸の数を示す）は、エクソン８中の最も近位の配列の使用によって生成する（エクソン８ａが含まれるようになる）。最近になって記載された抗血管新生性ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘｂアイソフォームは、近位のスプライス部位から遺伝子に沿って６６bp離れた遠位のスプライス部位の使用によって生成する。これは、スプライシングによるエクソン８ａの切り出しおよびＶＥＧＦ−ＡｘｘｘｂファミリーをコードするｍＲＮＡ配列の産生を招く。ＶＥＧＦ−Ａ１６５は、主な血管新生促進アイソフォームであり、一般に多様なヒト固形腫瘍に過剰発現している。ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂは、最初に同定された、エクソン８ｂをコードするアイソフォームであり、抗血管新生効果を有することが示された（Varey et al.、上記引用文中; Konopatskaya, O. et al., Molecular Vision 12, 626-632, 2006）。それは、内因性阻害型のＶＥＧＦ−Ａであり、ＶＥＧＦ−Ａが誘導する内皮細胞の増殖および移動を減少させる。それは、ＶＥＧＦＲ−２に結合することができるが、ＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂの結合は下流のシグナル伝達経路のレセプターのリン酸化も活性化も招かない。
【０００５】
抗体によるリガンドまたはレセプターの中和を含めたＶＥＧＦ−Ａシグナル伝達阻害ならびにチロシンキナーゼ阻害剤を用いたＶＥＧＦ−Ａレセプターの活性化およびシグナル伝達遮断のためのいくつかのアプローチがある。ＶＥＧＦ−Ａターゲティング療法は、ＡＭＤ、ＤＭＥ、腎細胞ガンおよび肝細胞ガンに単剤として有効であるが、一方で転移性結腸直腸ガン、非小細胞肺ガンおよび転移性乳ガンを有する患者に対しては化学療法と組み合わせた場合にのみ有益であることが示されている（Narayanan, R. et al., Nat Rev. Drug Discov. 5, 815-816, 2005; Ellis and Hicklin、上記引用文中）。
【０００６】
リガンドまたはレセプターを中和するために、抗体に加えて他の結合ドメインを使用することができる（Skerra, A., J. Mol. Recog. 13, 167-187, 2000; Binz, H. K., Amstutz, P. and Plueckthun, A., Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005）。一つのそのような新規クラスの結合ドメインは、設計された反復ドメインをベースとする（国際公開公報第０２／２０５６５号; Binz, H. K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M. T., Briand, C., Forrer, P., Gruetter, M. G., and Plueckthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004）。国際公開公報第０２／２０５６５号は、大きなライブラリーの反復タンパク質をどのように構築することができるか、およびその一般応用について記載している。それにもかかわらず、国際公開公報第０２／２０５６５号は、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して結合特異性を有する反復ドメインの選択も、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して特異的に結合する反復ドメインの具体的な反復配列モチーフも開示していない。
【０００７】
現在利用可能な治療法でＶＥＧＦ−Ａをターゲティングすることは、全ての患者にも全ての疾患に対しても有効なわけではない（例えばＥＧＦＲ発現ガン）。ＶＥＧＦ−Ａターゲティング療法に関連する治療上の利益は複雑であり、おそらく複数のメカニズムを伴うことが、ますます明らかになりつつさえある（Ellis and Hicklin、上記引用文中）。例えば、ベバシズマブ（Avastin（登録商標））もしくはラニビズマブ（Lucentis（登録商標））（国際公開公報第９６／０３００４６号、国際公開公報第９８／０４５３３１号および国際公開公報第９８／０４５３３２号参照）などの市販の抗ＶＥＧＦ薬、またはVEGF-Trap（登録商標）（国際公開公報第００／０７５３１９号）などの臨床開発中の薬物は、血管新生促進型のＶＥＧＦ−Ａと抗血管新生型のＶＥＧＦ−Ａを区別しないので、両方を阻害する。結果として、それらの薬物は血管新生を阻害するが、健康な組織から不可欠な生存因子、すなわちＶＥＧＦ−Ａｘｘｘｂも欠乏させ、細胞毒性および用量制限性の副作用を生じ、そのことが今度は有効性を制限する。現行の抗ＶＥＧＦ−Ａ療法に共通の副作用は、消化管穿孔、出血、高血圧、血栓塞栓症およびタンパク尿である（Kamba, T. and McDonald, D.M., Br. J. Cancer 96, 1788-95, 2007）。ＡＭＤの処置用の別の市販抗ＶＥＧＦ薬はペガプタニブである（国際公開公報第９８／０１８４８０号；Macugen（登録商標）、Pfizerの登録商標）。ペガプタニブは、ターゲットタンパク質に特異的に結合する単鎖核酸であるＰＥＧ化抗ＶＥＧＦアプタマーである。新生血管ＡＭＤの処置のために、Lucentis（登録商標）を用いた視力の転帰がMacugen（登録商標）よりも優れているという十分な証拠があり、薬物間の安全性の差を示唆する決定的な証拠はない。結果として、Macugen（登録商標）は、この疾患のために一般に使用される治療法ではない。
【０００８】
総じて、ガンおよび他の病的状態を処置するために改善された抗血管新生剤の必要性が存在する。
【０００９】
本発明の根底をなす技術的問題は、ガンおよび他の病的状態、例えばＡＭＤまたはＤＭＥなどの眼疾患の改善された処置用の、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して結合特異性を有する反復ドメインなどの新規な抗血管新生剤を同定することである。この技術的課題の解決は、特許請求の範囲に特徴づけられた態様を提供することによって達成される。
【００１０】
発明の概要
本発明は、アンキリン反復ドメインおよび少なくとも分子量５kDaのポリエチレングリコール部分を含むリコンビナント結合タンパク質に関し、ここで、該アンキリンドメインは、１０−９Ｍ未満のＫｄでＶＥＧＦ−Ａｘｘｘと結合し、ＶＥＧＦＲ−２に結合するＶＥＧＦ−Ａｘｘｘを阻害する。
【００１１】
好ましい一態様では、ポリエチレングリコール部分は、結合ドメインの単一のＣｙｓ残基に結合している。
【００１２】
本発明は、さらに、１種または複数種の上述の結合タンパク質または核酸分子を含む薬学的組成物に関する。
【００１３】
本発明は、さらに、本発明の結合タンパク質を使用した、ガンおよび他の病的状態、例えばＡＭＤまたはＤＭＥなどの眼疾患の処置方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】選択された設計アンキリン反復タンパク質のイヌＶＥＧＦ−Ａ１６４との特異的結合を示す図である。選択されたクローンと、イヌＶＥＧＦ−Ａ１６４（ＶＥＧＦ）および陰性対照タンパク質（ＭＢＰ、Escherichia coliマルトース結合タンパク質）との相互作用を、粗抽出物のＥＬＩＳＡによって示す。ビオチン化イヌＶＥＧＦ−Ａ１６４およびＭＢＰをニュートラアビジン（NeutrAvidin）上に固定化した。数字は、イヌＶＥＧＦ−Ａ１６４または対応するヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５に対するリボソームディスプレイで選択された単一のＤＡＲＰｉｎクローンを表す。Ａ＝吸光度。白棒線は、イヌＶＥＧＦ−Ａ１６４への結合を示し、黒棒線は、ＭＢＰへの非特異的バックグラウンド結合を示す。
【図２ａ】選択されたＤＡＲＰｉｎによるスフェロイドの伸長阻害を示す図である。スフェロイド伸長阻害アッセイにおける発芽の長さを、様々な濃度の（ａ）ＤＡＲＰｉｎ＃３０（配列番号：４のアミノ酸１〜１２６）、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに特異性を有するＤＡＲＰｉｎ、または（ｂ）ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して特異性を有さない陰性対照ＤＡＲＰｉｎであるＤＡＲＰｉｎ  ＮＣの存在下で示す。
【図２ｂ】選択されたＤＡＲＰｉｎによるスフェロイドの伸長阻害を示す図である。スフェロイド伸長阻害アッセイにおける発芽の長さを、様々な濃度の（ａ）ＤＡＲＰｉｎ＃３０（配列番号：４のアミノ酸１〜１２６）、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに特異性を有するＤＡＲＰｉｎ、または（ｂ）ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して特異性を有さない陰性対照ＤＡＲＰｉｎであるＤＡＲＰｉｎ  ＮＣの存在下で示す。
【図３ａ】ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームの特異的認識を示す図である。ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームへの結合タンパク質の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。（ａ）および（ｂ）：Avastin（登録商標）のＳＰＲ分析。イヌＶＥＧＦ−Ａ１６４（ａ）またはイヌＶＥＧＦ−Ａ１６４ｂ（ｂ）が固定化されたフローセルに２５０nM Avastin（登録商標）を１００秒間適用し、続いて緩衝液流で洗浄した。
【図３ｂ】ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームの特異的認識を示す図である。ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームへの結合タンパク質の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。（ａ）および（ｂ）：Avastin（登録商標）のＳＰＲ分析。イヌＶＥＧＦ−Ａ１６４（ａ）またはイヌＶＥＧＦ−Ａ１６４ｂ（ｂ）が固定化されたフローセルに２５０nM Avastin（登録商標）を１００秒間適用し、続いて緩衝液流で洗浄した。
【図３ｃ】ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームの特異的認識を示す図である。ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームへの結合タンパク質の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。（ｃ）および（ｄ）：ＤＡＲＰｉｎ＃２７（配列番号：１のアミノ酸１〜１５９）のＳＰＲ分析。イヌＶＥＧＦ−Ａ１６４（ｃ）またはイヌＶＥＧＦ−Ａ１６４ｂ（ｄ）が固定化されたフローセルに２５０nM ＤＡＲＰｉｎ＃２７を１００秒間適用し、続いて緩衝液流で洗浄した。ＲＵ＝共鳴ユニット。
【図３ｄ】ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームの特異的認識を示す図である。ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームへの結合タンパク質の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。（ｃ）および（ｄ）：ＤＡＲＰｉｎ＃２７（配列番号：１のアミノ酸１〜１５９）のＳＰＲ分析。イヌＶＥＧＦ−Ａ１６４（ｃ）またはイヌＶＥＧＦ−Ａ１６４ｂ（ｄ）が固定化されたフローセルに２５０nM ＤＡＲＰｉｎ＃２７を１００秒間適用し、続いて緩衝液流で洗浄した。ＲＵ＝共鳴ユニット。
【図４】ウサギ眼におけるヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５の効率的な阻害を示す図である。眼におけるヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５の阻害に果たすＤＡＲＰｉｎの有効性をLucentis（登録商標）と比較して示す血管漏出ウサギモデル。１日目にＰＢＳ、ＤＡＲＰｉｎ＃３０またはLucentis（登録商標）のいずれかを各ウサギの一方の眼に硝子体内注射により適用する（処置眼）。４日目または３０日目に各ウサギの両眼をヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５ ５００ngの硝子体内注射により誘発した。ＶＥＧＦ−Ａ１６５注射の４８時間後に、フルオレセインナトリウムの静脈内注射の１時間後に全ての眼の硝子体および網膜中のフルオレセイン含量を測定することによって全ての眼を評価した。Ｒ＝処置眼／未処置眼のフルオレセイン測定値の比。標準偏差をエラーバーによって示す。４−ＰＢＳ＝ＰＢＳ注射の４日後の比（対照）；４−Ｄ＝ＤＡＲＰｉｎ＃３０注射の４日後の比；３０−Ｄ＝ＤＡＲＰｉｎ＃３０注射の３０日後の比；４−Ｌ＝Lucentis（登録商標）注射の４日後の比；３０−Ｌ＝Lucentis（登録商標）注射の３０日後の比。
【００１５】
発明の詳細な説明
哺乳類ＶＥＧＦ−Ａは、二つのファミリーの選択的スプライシングされたアイソフォームとして存在する：（ｉ）エクソン８の近位のスプライシングによって生成した血管新生促進「ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘ」アイソフォームおよび（ｉｉ）エクソン８の遠位のスプライシングによって生成した抗血管新生「ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘｂ」アイソフォーム。好ましくは、本発明による結合ドメインは、イヌ、ウサギ、サルまたはヒト起源の血管新生促進ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して特異的である。より好ましくは、本発明による結合ドメインは、ヒト起源の血管新生促進ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して特異的である。最も好ましくは、本発明による結合ドメインは、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５に対して特異的である。
【００１６】
「タンパク質」という用語は、少なくとも一部のポリペプチドが、そのポリペプチド鎖内および／または鎖間で二次、三次、または四次構造を形成することによって所定の三次元配置を有するかまたは獲得することが可能なポリペプチドを表す。タンパク質が２本以上のポリペプチドを含む場合、個別のポリペプチド鎖は、非共有的または共有的に、例えば２本のポリペプチド間のジスルフィド結合によって連結している場合がある。二次または三次構造を形成することによって所定の三次元配置を個別に有するかまたは獲得することが可能なタンパク質部分は、「タンパク質ドメイン」と名付けられる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。
【００１７】
リコンビナントタンパク質、リコンビナントタンパク質ドメインなどに使用されるような「リコンビナント」という用語は、該ポリペプチドが関連技術分野の専門家に周知のリコンビナントＤＮＡ技法の使用によって産生されることを意味する。例えばポリペプチドをコードする（例えば遺伝子合成によって産生される）リコンビナントＤＮＡ分子を細菌発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、Qiagen）にクローニングすることができる。そのような構築リコンビナント発現プラスミドを細菌（例えばE. coli）に挿入すると、この細菌は、このリコンビナントＤＮＡによってコードされるポリペプチドを産生することができる。それに応じて産生されたポリペプチドは、リコンビナントポリペプチドと呼ばれる。
【００１８】
「ポリペプチドタグ」という用語は、ポリペプチド／タンパク質に結合したアミノ酸配列であって、該ポリペプチド／タンパク質の精製、検出、もしくはターゲティングに有用なアミノ酸配列、またはポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善するアミノ酸配列、またはエフェクター機能をもつアミノ酸配列を表す。結合タンパク質の個別のポリペプチドタグ、部分および／またはドメインは、直接またはポリペプチドリンカーを介して相互に結合している場合がある。これらのポリペプチドタグは、全てが当技術分野において周知であり、当業者に十分に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、短いポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、もしくはＳｔｒｅｐタグ、または該ポリペプチド／タンパク質の検出を可能にする部分、例えば酵素など（例えばアルカリホスファターゼのような酵素）、またはターゲティングのため（免疫グロブリンもしくはそのフラグメント）および／もしくはエフェクター分子として使用できる部分である。
【００１９】
「ポリペプチドリンカー」という用語は、例えば、２個のタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインとポリエチレングリコールなどの非ポリペプチド部分、または２個の配列タグを連結することが可能なアミノ酸配列を表す。そのような追加的なドメイン、タグ、非ポリペプチド部分およびリンカーは、関連分野の技術者に公知である。一連の例は、特許出願である国際公開公報第０２／２０５６５号の明細書に提供されている。そのようなリンカーの特定の例は、多様な長さのグリシン−セリンリンカーおよびプロリン−トレオニンリンカーであり；好ましくは、該リンカーは２から２４の間のアミノ酸長を有し；より好ましくは、該リンカーは、２から１６の間のアミノ酸長を有する。
【００２０】
本発明に関連して、「ポリペプチド」という用語は、複数の、すなわち２個以上のアミノ酸の１本または複数本の鎖がペプチド結合を介して連結したものから成る分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合を介して連結した８個よりも多いアミノ酸から成る。
【００２１】
「ポリマー部分」という用語は、タンパク質性ポリマー部分または非タンパク質性ポリマー部分のいずれかを表す。「タンパク質性ポリマー部分」は、好ましくは、安定な三次構造を形成しないものの、ＲＴにおいてＰＢＳ中で約０．１mMの濃度で１ヶ月間保存したときに、１０％以下（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定されるとき、好ましくは５％以下；同様に好ましくは２％以下；なおいっそう好ましくは１％以下；最も好ましくは検出不能量）のオリゴマーまたは凝集体を形成するポリペプチドである。そのようなタンパク質性ポリマー部分は、ＳＥＣに関する分子量標準として球状タンパク質を使用した場合に、ＳＥＣにおいてその有効分子量よりも高い見かけの分子量で流れる。好ましくは、ＳＥＣによって決定された該タンパク質性ポリマー部分の見かけの分子量は、それらのアミノ酸配列から計算されたそれらの有効分子量の１．５、２または２．５倍高い。また好ましくは、ＳＥＣによって決定された該非タンパク質性ポリマー部分の見かけの分子量は、それらの分子組成から計算されたそれらの有効分子量の２、４または８倍高い。好ましくは、円偏光二色性（ＣＤ）の測定によって決定するとき、該タンパク質性ポリマー部分のアミノ酸の５０％、７０％または９０％よりも多くでさえ、ＲＴにおいてＰＢＳ中で約０．１mMの濃度で安定な二次構造を形成していない。最も好ましくは、該タンパク質性ポリマーは、ランダムコイルコンフォメーションの典型的な近ＵＶ ＣＤスペクトルを示す。そのようなＣＤ分析は、当業者に周知である。同様に好ましいのは、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００または８００個よりも多いアミノ酸から成るタンパク質性ポリマー部分である。タンパク質性ポリマー部分の例は、XTEN（登録商標）（Amunixの登録商標；国際公開公報第０７／１０３５１５号）ポリペプチド、または国際公開公報第０８／１５５１３４号記載のプロリン、アラニンおよびセリン残基を含むポリペプチドである。そのようなタンパク質性ポリマー部分は、例えば、標準ＤＮＡクローニング技法に続くそれらの標準発現および精製を使用して、遺伝的融合ポリペプチドの生成によって本発明の結合ドメインに共有結合させることができる。ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに結合する反復ドメインおよびそのようなタンパク質性ポリマー部分を含む結合タンパク質の例は、配列番号：１および配列番号：４に示される。配列番号：１のアミノ酸位置１〜１５９は反復ドメインに相当し、配列番号：１のアミノ酸位置１６１〜１，０２５はタンパク質性ポリマー部分に相当する。配列番号：４のアミノ酸位置１〜１２６は反復ドメインに相当し、配列番号：４のアミノ酸位置１３１〜６４０は、タンパク質性ポリマー部分に相当する。
【００２２】
本発明のポリマー部分は、分子量が広く変動する場合がある（すなわち約１kDa〜約１５０kDa）。好ましくは、ポリマー部分は、少なくとも２、５、１０、２０、３０、５０、７０または１００kDaの分子量を有する。
【００２３】
好ましくは、該ポリマー部分は、ポリペプチドリンカーによって結合ドメインに結合している。そのようなポリペプチドリンカーの例は、配列番号：８および配列番号：９のアミノ酸１〜８である。
【００２４】
非タンパク質性ポリマー部分の例は、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。「ＰＥＧ化」という用語は、ＰＥＧ部分が例えば本発明のポリペプチドに共有結合していることを意味する。反復ドメインと、非タンパク質性ポリマー部分を結合させるのに有用なＣ末端Ｃｙｓ残基との間にポリペプチドリンカーを有する反復タンパク質の例は、配列番号：２、３、５、６および７である。
【００２５】
特定の一態様では、ＰＥＧ部分または任意の他の非タンパク質性ポリマーが、例えばマレイミドリンカーを介してシステイン性チオールと結合し、そのシステインがペプチドリンカーを介して本明細書記載の結合ドメインのＮ末端またはＣ末端に結合している場合がある（例えば配列番号：３）。
【００２６】
「結合タンパク質」という用語は、下記にさらに説明されるように１個または複数個の結合ドメインおよび１個または複数個のポリマー部分を含むタンパク質を表す。好ましくは、該結合タンパク質は、最大４個の結合ドメインを含む。より好ましくは、該結合タンパク質は、最大２個の結合ドメインを含む。最も好ましくは、該結合タンパク質は、１個だけの結合ドメインを含む。さらに、任意のそのような結合タンパク質は、結合ドメインではない追加的なタンパク質ドメイン、多量体化部分、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカーおよび／または単一のＣｙｓ残基を含む場合がある。多量体化部分の例は、対になって機能的免疫グロブリンＦｃドメインを提供する免疫グロブリン重鎖定常領域、およびロイシンジッパーまたは２本のポリペプチドの間で分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを含むようなポリペプチドである。例えば当業者に周知のマレイミド化学反応を使用することによって他の部分をポリペプチドにコンジュゲーションするために、単一のＣｙｓ残基を使用することができる。
【００２７】
好ましくは、該結合タンパク質は、最大４個のポリマー部分を含む。より好ましくは、該結合タンパク質は、最大２個のポリマー部分を含む。最も好ましくは、該結合タンパク質は、ポリマー部分を１個だけ含む。
【００２８】
同様に好ましくは、分子量標準として球状タンパク質を使用したＳＥＣによってＲＴにおいてＰＢＳ中に０．１mMの濃度で分析した場合に、該結合タンパク質は、少なくとも７０、１００、２００、３００、５００または８００kDaの見かけの分子量を有する。
【００２９】
「結合ドメイン」という用語は、タンパク質の足場として同じ「フォールド」（三次元配置）を示すタンパク質ドメインであって、下記に定義されるような予め決定された性質を有するタンパク質ドメインを意味する。そのような結合ドメインは、当業界で公知の技法である、合理的技法、または最も一般的にはコンビナトリアルタンパク質工学技法によって得ることができる（Skerra, 2000上記引用文中; Binz et al., 2005、上記引用文中）。例えば、予め決定された性質を有する結合ドメインは、（ａ）下記にさらに定義されるタンパク質足場と同じフォールドを示すタンパク質ドメインの多様な集まりを提供するステップ；ならびに（ｂ）該多様な集まりをスクリーニングすることおよび／または該多様な集まりから選択して、該予め決定された性質を有する少なくとも１個のタンパク質ドメインを得るステップを含む方法によって得ることができる。タンパク質ドメインの多様な集まりは、使用されるスクリーニングシステムおよび／または選択システムによるいくつかの方法によって提供することができ、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイなどの当業者に周知の方法の使用を含みうる。
【００３０】
「タンパク質の足場」という用語は、アミノ酸の挿入、置換または欠失に高度に耐性の表面領域が露出したタンパク質を意味する。本発明の結合ドメインを生成させるために使用することのできるタンパク質の足場の例は、抗体またはそのフラグメント、例えば単鎖ＦｖもしくはＦａｂフラグメントなど、Staphylococcus aureus由来プロテインＡ、Pieris brassicae由来ビリン結合タンパク質または他のリポカリン、アンキリン反復タンパク質または他の反復タンパク質、およびヒトフィブロネクチンである。タンパク質の足場は、当業者に公知である（Binz et al., 2005、上記引用文中; Binz et al., 2004、上記引用文中）。
【００３１】
「予め決定された性質」という用語は、ターゲットへの結合、ターゲットの遮断、ターゲット介在性反応の活性化、酵素活性などの性質、および関連するさらなる性質を表す。所望の性質の種類に応じて、通常の技能を有する者は、所望の性質を有する結合ドメインのスクリーニングおよび／または選択を行うための形式および必要なステップを同定することができる。好ましくは、該予め決定された性質は、ターゲットへの結合性である。
【００３２】
好ましくは、本発明の結合タンパク質は、抗体またはそのフラグメント、例えばＦａｂもしくはｓｃＦｖフラグメントではない。抗体およびそのフラグメントは、当業者に周知である。
【００３３】
同様に好ましくは、本発明の結合ドメインは、抗体中に存在するような免疫グロブリンのフォールドおよび／またはフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含まない。免疫グロブリンのフォールドは、２枚のβシート状に配置された約７個の逆平行β鎖の２層サンドイッチから成る通常のオールβタンパク質のフォールドである。免疫グロブリンのフォールドは当業者に周知である。例えば、免疫グロブリンのフォールドを含むそのような結合ドメインは、国際公開公報第０７／０８０３９２号または国際公開公報第０８／０９７４９７号に記載されている。
【００３４】
さらに好ましくは、本発明の結合ドメインは、ＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２に見出されるような免疫グロブリン様ドメインを含まない。そのような結合ドメインは、国際公開公報第００／０７５３１９号に記載されている。
【００３５】
好ましい結合ドメインは、抗血管新生効果を有する結合ドメインである。結合ドメインの抗血管新生効果は、実施例２に記載されたＨＵＶＥＣスフェロイドの発芽アッセイなどの、当業者に周知のアッセイによって決定することができる。
【００３６】
さらに好ましいのは、７０から３００個の間のアミノ酸、特に１００から２００個の間のアミノ酸を含む結合ドメインである。
【００３７】
さらに好ましいのは、遊離Ｃｙｓ残基を欠如する結合ドメインである。遊離Ｃｙｓ残基は、ジスルフィド結合の形成に関与していない。なおいっそう好ましいのは、Ｃｙｓ残基を全く有さない結合ドメインである。
【００３８】
本発明の好ましい結合ドメインは、反復ドメインまたは設計された反復ドメイン、好ましくは国際公開公報第０２／２０５６５号に記載されたようなものである。
【００３９】
特に好ましい結合ドメインは、設計されたアンキリン反復ドメイン（Binz, H. K. et al., 2004、上記引用文中）、好ましくは国際公開公報第０２／２０５６５号に記載されたようなものである。設計されたアンキリン反復ドメインの例を実施例に示す。
【００４０】
反復タンパク質についての本明細書下記の定義は、特許出願である国際公開公報第０２／２０５６５号における定義に基づく。特許出願である国際公開公報第０２／２０５６５号は、さらに、反復タンパク質の特徴、技法および応用の全般的な説明を包含する。
【００４１】
「反復タンパク質」という用語は、１個または複数個の反復ドメインを含むタンパク質を表す。好ましくは、該反復タンパク質のそれぞれは、最大４個の反復ドメインを含む。より好ましくは、該反復タンパク質のそれぞれは、最大２個の反復ドメインを含む。最も好ましくは、反復タンパク質のそれぞれは、１個だけの反復ドメインを含む。さらに、該反復タンパク質は、追加的な非反復タンパク質ドメイン、ポリペプチドタグおよび／またはポリペプチドリンカーを含む場合がある。
【００４２】
「反復ドメイン」という用語は、２個以上の連続する反復ユニット（モジュール）を構造ユニットとして含むタンパク質ドメインを表し、ここで、該構造ユニットは同じフォールドを有し、密に積み重なって、例えば合同の疎水性コアを有するスーパーヘリックス構造を創成する。
【００４３】
「設計された反復タンパク質」および「設計された反復ドメイン」という用語は、特許出願である国際公開公報第０２／２０５６５号に説明された発明手順の結果として得られた反復タンパク質または反復ドメインをそれぞれ表す。設計された反復タンパク質および設計された反復ドメインは、合成されたものであり、天然由来ではない。それらは、それ相応に設計された核酸の発現によって得られた、それぞれ人造のタンパク質またはドメインである。好ましくは、その発現は、真核細胞もしくは細菌細胞などの原核細胞において、または無細胞in vitro発現系を使用することによって行われる。
【００４４】
「構造ユニット」という用語は、ポリペプチド鎖に沿って相互に近接している２個以上の二次構造セグメントの間の三次構造的な相互作用によって形成された、ポリペプチドの局所的に秩序化された部分を表す。そのような構造ユニットは、構造モチーフを表す。「構造モチーフ」という用語は、少なくとも１個の構造ユニット中に存在する二次構造エレメントの三次元配置を表す。構造モチーフは、当業者に周知である。構造ユニット単独では定義された三次元構造を獲得できないが、例えば反復ドメイン中の反復モジュールとしてそれらを連続的に配置すると、隣接ユニットの相互安定化に繋がり、スーパーヘリックス構造を生じる。
【００４５】
「反復ユニット」という用語は、１種または複数種の天然反復タンパク質の反復配列モチーフを含むアミノ酸配列を表し、ここで、該「反復ユニット」は、複数のコピー中から見出され、該モチーフの全てに共通な定義されたフォールディングトポロジーを示し、タンパク質のフォールドを決定する。そのような反復ユニットの例は、アルマジロ反復ユニット、ロイシンリッチ反復ユニット、アンキリン反復ユニット、テトラトリコ（tetratrico）ペプチド反復ユニット、ＨＥＡＴ反復ユニット、およびロイシンリッチ変異型反復ユニットである。２個以上のそのような反復ユニットを有する天然タンパク質は、「天然反復タンパク質」と呼ばれる。反復タンパク質の個別の反復ユニットのアミノ酸配列は、相互に比較するとかなりの数の突然変異、置換、付加および／または欠失を有する場合があるが、一方で反復ユニットの全般パターンまたはモチーフはまだ実質的に保持されている。
【００４６】
好ましくは、反復配列モチーフの推測のために使用される反復ユニットは、例えば実施例１に記載されたようにターゲットに対して選択された反復ドメインから得られた、同じターゲット特異性を有する相同反復ユニットである。
【００４７】
「反復配列モチーフ」という用語は、１個または複数個の反復ユニットから推定されるアミノ酸配列を表す。好ましくは、該反復ユニットは、同じターゲットに対して結合特異性を有する反復ドメイン由来である。
【００４８】
「フォールディングトポロジー」という用語は、該反復ユニットの三次構造を表す。フォールディングトポロジーは、αヘリックスもしくはβシートの少なくとも部分を形成するアミノ酸のストレッチ、あるいは直鎖ポリペプチドもしくはループ、またはαヘリックス、βシートおよび／もしくは直鎖ポリペプチド／ループの任意の組み合わせを形成するアミノ酸ストレッチによって決定される。
【００４９】
「連続的」という用語は、反復ユニットまたは反復モジュールが縦列配置された配置を表す。設計された反復タンパク質中には、少なくとも２個、通常は約２〜６個、特に少なくとも約６個、往々にして２０個以上の反復ユニットがある。大部分の場合、反復ユニットは、高度の配列同一性（対応する位置に同じアミノ酸残基）または配列類似性（アミノ酸残基は異なるが類似の物理化学的性質を有する）を示し、いくつかのアミノ酸残基は、天然タンパク質から見出される異なる反復ユニット中に強く保存されている主な残基でありうる。しかしながら、共通のフォールディングトポロジーが維持されている限り、アミノ酸の挿入および／もしくは欠失、ならびに／または天然タンパク質中に見出される異なる反復ユニット間の置換により高度の配列変動性が可能である。
【００５０】
Ｘ線結晶分析法、ＮＭＲまたはＣＤ分光法などの物理化学的手段によって反復タンパク質のフォールディングトポロジーを直接決定するための方法は、当業者に周知である。反復ユニットもしくは反復配列モチーフを同定および決定するための方法、または相同性検索（ＢＬＡＳＴ他）などの、そのような反復ユニットもしくはモチーフを含む関連タンパク質のファミリーを同定するための方法は、生物情報学の分野で十分に確立しており、当業者に周知である。最初の反復配列モチーフを精密化するステップは、反復プロセスを含む場合がある。
【００５１】
「反復モジュール」という用語は、天然反復タンパク質の反復ユニットから元々由来する、設計された反復ドメインの反復アミノ酸配列を表す。反復ドメイン中に含まれる各反復モジュールは、天然反復タンパク質のファミリーまたはサブファミリー、例えばアルマジロ反復タンパク質またはアンキリン反復タンパク質のファミリーの１個または複数個の反復ユニットに由来する。
【００５２】
「反復モジュール」は、アミノ酸残基が対応する反復モジュールの全コピー中に存在する位置（「固定位置」）、および異なるまたは「ランダム化」アミノ酸残基を有する位置（「ランダム化位置」）を含みうる。
【００５３】
「キャッピングモジュール」という用語は、反復ドメインのＮ末端またはＣ末端反復モジュールに融合したポリペプチドを表し、ここで、該キャッピングモジュールは、該反復モジュールと密な三次相互作用を形成することによって、連続的な反復モジュールと接触していない側で該反復モジュールの疎水性コアを溶媒から遮蔽するキャップを提供する。該Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングモジュールは、天然反復タンパク質中から見出される、反復ユニットに隣接するキャッピングユニットまたは他のドメインの場合があり、またはそれに由来しうる。「キャッピングユニット」という用語は、天然のフォールディングしたポリペプチドであって、Ｎ末端またはＣ末端が反復ユニットに融合している特定の構造ユニットを定義するポリペプチドを表し、ここで、該ポリペプチドは該反復ユニットと密接な三次構造的な相互作用を形成することによって、一方の側で該反復ユニットの疎水性コアを溶媒から遮蔽するキャップを提供する。そのようなキャッピングユニットは、該反復配列モチーフと配列類似性を有しうる。キャッピングモジュールおよびキャッピング反復は、国際公開公報第０２／０２０５６５号に記載されている。例えば、配列番号：２のＮ末端キャッピングモジュールは、位置１〜３２のアミノ酸によってコードされる。同様に好ましいのは、位置５にグリシンまたはアスパラギン酸残基を有するようなＮ末端キャッピングモジュールである。
【００５４】
「ターゲット」という用語は、核酸分子、ポリペプチドもしくはタンパク質、糖質などの個別の分子、またはそのような個別の分子の任意の部分を含めた任意の他の天然分子、またはそのような分子の２種以上の複合体を表す。ターゲットは、細胞全体または組織試料であってもよく、または任意の非天然分子もしくは部分であってもよい。好ましくは、ターゲットは化学的改変を有する、例えば天然または非天然のリン酸化、アセチル化、またはメチル化によって改変された、天然または非天然のポリペプチドまたはポリペプチドである。本発明の特定の適用では、ターゲットはＶＥＧＦ−ＡｘｘｘまたはＶＥＧＦＲ−２である。
【００５５】
「コンセンサス配列」という用語はアミノ酸配列を表し、ここで、該コンセンサス配列は、複数の反復ユニットの構造および／または配列アライメントを行うことによって得られる。構造および／または配列アライメントを行われた２種以上の反復ユニットを使用し、そしてアライメント中にギャップを見込んで、各位置で最高頻度のアミノ酸残基を決定することが可能である。コンセンサス配列は、各位置で最高頻度であるアミノ酸を含む配列である。２種以上のアミノ酸が単一の位置で平均よりも多い事象では、コンセンサス配列にそれらのアミノ酸サブセットが含まれる場合がある。該２種以上の反復ユニットは、単一の反復タンパク質、または２種以上の異なる反復タンパク質中に含まれる反復ユニットから採用されうる。
【００５６】
コンセンサス配列およびそれを決定する方法は、当業者に周知である。
【００５７】
「コンセンサスアミノ酸残基」は、コンセンサス配列中のある位置に見出されるアミノ酸である。２種以上、例えば３、４または５種のアミノ酸残基が該２種以上の反復ユニットから類似の確率で見出される場合、コンセンサスアミノ酸は、最高頻度で見出されるアミノ酸の１種、または該２種以上のアミノ酸残基の組み合わせでありうる。
【００５８】
さらに好ましいのは、非天然結合タンパク質または結合ドメインである。
【００５９】
「非天然」という用語は、合成であるかまたは天然由来でないことを意味し、より具体的には、この用語は人造であることを意味する。「非天然結合タンパク質」または「非天然結合ドメイン」という用語は、該結合タンパク質または該結合ドメインが合成（すなわちアミノ酸から化学合成によって製造された）またはリコンビナントであり、天然由来ではないことを意味する。「非天然結合タンパク質」または「非天然結合ドメイン」は、それぞれ、それに対応して設計された核酸の発現によって得られる人造のタンパク質またはドメインである。好ましくは、その発現は、真核細胞または細菌細胞において行われるか、または無細胞in vitro発現系を使用することによって行われる。さらに、その用語は、該結合タンパク質または該結合ドメインの配列が配列データベース、例えばGenBank、EMBL-BankまたはSwiss-Protにおける非人工配列の登録配列として存在しないことを意味する。これらのデータベースおよび他の類似の配列データベースは、当業者に周知である。
【００６０】
結合ドメインは、ＶＥＧＦ−ＡｘｘｘとＶＥＧＦＲ−２の間の見かけの解離定数（Ｋｄ）が１０２倍よりも大きく、好ましくは１０３倍よりも大きく、より好ましくは１０４倍よりも大きく、より好ましくは１０５倍よりも大きく、最も好ましくは１０６倍よりも大きく増加するようにＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに結合することまたはＶＥＧＦＲ−２に結合することのいずれかによってＶＥＧＦＲ−２に結合するＶＥＧＦ−Ａｘｘｘを阻害することができる。好ましくは、結合ドメインとＶＥＧＦ−ＡｘｘｘまたはＶＥＧＦＲ−２のいずれかとの相互作用に関するＫｄは、１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、より好ましくは１０−９Ｍ未満、より好ましくは１０−１０Ｍ未満、最も好ましくは１０−１１Ｍ未満である。タンパク質−タンパク質相互作用の解離定数を決定する、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技法などの方法は、当業者に周知である。
【００６１】
好ましい結合ドメインは、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘと結合する。なおいっそう好ましいのは、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５と結合する結合ドメインである。
【００６２】
「ＰＢＳ」という用語は、１３７mM ＮａＣｌ、１０mMリン酸塩および２．７mM ＫＣｌを含有し、ｐＨ７．４を有するリン酸緩衝水溶液を意味する。
【００６３】
好ましいのは、１００mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有するＰＢＳ中で３７℃において１または１０時間インキュベーションしたときにそのネイティブな三次元構造を失わない結合タンパク質および／または結合ドメインである。
【００６４】
特定の一態様では、本発明は、ＶＥＧＦＲ−２に結合するＶＥＧＦ−Ａｘｘｘを阻害する結合ドメインを含み、表示されたまたは好ましい変性中点温度および上記に定義された非凝集性を有する結合タンパク質であって、１００nM未満のＩＣ５０値を有するＨＵＶＥＣスフェロイドの発芽を阻害する結合タンパク質に関する。
【００６５】
「ＨＵＶＥＣ」という用語は、正常なヒト臍帯静脈から単離することができ、ＶＥＧＦ−Ａの刺激に応答性であるヒト臍帯静脈内皮細胞を意味する。実施例２に記載されたような、ＨＵＶＥＣスフェロイドの発芽を測定するアッセイは、当業者に周知である。
【００６６】
ＩＣ５０値は、ＨＵＶＥＣスフェロイドの発芽などの実験的に決定されたパラメーターの５０％のin vitro阻害に必要な、結合タンパク質または結合ドメインなどの物質の濃度である。ＩＣ５０値は、当業者が容易に決定することができる（Korff T. and Augustin H.G., J. Cell Biol. 143(5), 1341-52, 1998）。
【００６７】
好ましいのは、１０nM未満、好ましくは１nM未満、より好ましくは０．１nM未満、最も好ましくは０．０５nM未満のＩＣ５０値でＨＵＶＥＣスフェロイドの発芽を阻害する結合タンパク質および／または結合ドメインである。
【００６８】
さらに好ましいのは、相当するラニビズマブ（Lucentis（登録商標）、Genentechの登録商標）、ベバシズマブ（Avastin（登録商標）、Genentechの登録商標）、アフリベルセプト（VEGF Trap（登録商標）、Regeneronの登録商標）、またはペガプタニブ（Macugen（登録商標）、Pfizerの登録商標）のＩＣ５０値よりも低いＩＣ５０値でＨＵＶＥＣスフェロイドの発芽を阻害するモノマー性結合タンパク質および／または結合ドメインである。
【００６９】
ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦまたはＰＤＧＦとの好ましい結合ドメイン相互作用に関するＫｄは、１nMよりも大きく、好ましくは１０nMよりも大きく、より好ましくは１０２nMよりも大きく、なおいっそう好ましくは１０３nMよりも大きく、最も好ましくは１０４nMよりも大きい。
【００７０】
好ましくは、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘは、イヌＶＥＧＦ−Ａ１６４またはサルＶＥＧＦ−Ａ１６５またはヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５のいずれかであり、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘｂは、イヌＶＥＧＦ−Ａ１６４ｂまたはサルＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂまたはヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂのいずれかである。
【００７１】
別の好ましい態様は、ＶＥＧＦＲ−２に結合するＶＥＧＦ−Ａｘｘｘを阻害する結合ドメインを含むリコンビナント結合タンパク質であり、ここで、該結合ドメインは、反復ドメインまたは設計された反復ドメインである。そのような反復ドメインは、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘへの結合に関与する１、２、３個またはそれよりも大きい内部反復モジュールを含みうる。好ましくは、そのような反復ドメインは、Ｎ末端キャッピングモジュール、２〜４個の内部反復モジュール、およびＣ末端キャッピングモジュールを含む。好ましくは、該結合ドメインは、アンキリン反復ドメインまたは設計されたアンキリン反復ドメインである。
【００７２】
好ましいリコンビナント結合タンパク質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分とコンジュゲーションした本明細書記載の結合ドメインを含み、ここで好ましくは、該ＰＥＧ部分は該結合ドメインの単一のＣｙｓ残基に結合している。好ましくは、該Ｃｙｓ残基は、該結合ドメインのＣ末端に遺伝的に導入される。次に、ＰＥＧ部分は、化学的手段によって、例えば、当業者に周知のマレイミド化学反応を使用することによって結合させることができる。単一のＣｙｓ残基にコンジュゲーションしているＰＥＧ部分を含むそのような結合タンパク質の例を実施例に示す。
【００７３】
本発明の好ましい一態様は、本明細書記載の結合ドメインを含むリコンビナント結合タンパク質を含み、ここで、該結合ドメインは、そのＣ末端でペプチド結合を介して配列番号：８にコンジュゲーションしており、配列番号：８は、今度はＣ末端システイン性チオールでα−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン（ＮＯＦ、Sunbright ME-200MA（２０kD）またはSunbright ME-400MA（４０kD））などのマレイミド結合型ＰＥＧにコンジュゲーションしている。一態様では、α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−メトキシ−ポリオキシエチレンは、少なくとも約２、５、１０、２０、３０、４０、５０、７０、または１００kDの分子量を有する。ある態様では、α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−メトキシ−ポリオキシエチレンは、少なくとも約２０または少なくとも約４０kDの分子量を有する。
【００７４】
別の好ましい態様は、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して結合特異性を有する少なくとも１個の反復ドメインを含む、上記に定義されたようなリコンビナント結合タンパク質であり、ここで、該反復ドメインは、配列番号：１〜７の反復ドメインの群より選択される反復ドメインとＶＥＧＦ−Ａｘｘｘへの結合を競合する。好ましくは、該反復ドメインは、配列番号：１または３の反復ドメインとＶＥＧＦ−Ａｘｘｘへの結合を競合する。より好ましくは、該反復ドメインは、配列番号：３の反復ドメインとＶＥＧＦ−Ａｘｘｘへの結合を競合する。
【００７５】
「結合を競合する」という用語は、本発明の２種の異なる結合ドメインが同じターゲットに同時には結合できないが、両方が個別には同じターゲットに結合可能なことを意味する。したがって、そのような２種の結合ドメインは、該ターゲットへの結合を競合する。２種の結合ドメインがターゲットへの結合を競合するかどうかを判定するための競合ＥＬＩＳＡまたは競合ＳＰＲ測定（例えばBioRad製Proteon装置を使用することによる）などの方法は、当業者に周知である。
【００７６】
選択された反復タンパク質とＶＥＧＦ−Ａｘｘｘへの結合を競合するリコンビナント結合タンパク質は、競合酵素結合性免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの当業者に周知の方法によって同定することができる。
【００７７】
別の好ましい態様は、配列番号：１〜７の反復ドメインから成る群より選択される、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して結合特異性を有する反復ドメインを含むリコンビナント結合タンパク質である。好ましくは、該反復ドメインは、配列番号：２または３の反復ドメインより選択される。より好ましくは、該反復ドメインは配列番号：３の反復ドメインである。
【００７８】
１個または複数個のポリエチレングリコール部分が、結合タンパク質中の異なる位置に結合している場合があり、そのような結合は、アミン、チオールまたは他の適切な反応基との反応によって成し遂げることができる。ポリエチレングリコール部分の結合（ＰＥＧ化）は、部位特異的な場合があり、ここで、適切な反応基は、ＰＥＧ化が優先的に起こる部位を創出するためにタンパク質中に導入されるか、または結合タンパク質中に元々存在する。チオール基は、システイン残基中に存在することがあり、アミン基は、例えばポリペプチドのＮ末端に見出される一級アミン、またはリシンもしくはアルギニンなどのアミノ酸の側鎖中に存在するアミン基でありうる。好ましい一態様では、結合タンパク質は、所望の位置にシステイン残基を有するように改変され、例えばマレイミド官能基を担持するポリエチレングリコール誘導体との反応によって、システイン上での部位特異的ＰＥＧ化を可能にする。ポリエチレングリコール部分は、分子量が広く変動する可能性があり（すなわち約１ｋＤａ〜約１００kDa）、分岐型または直鎖型でありうる。好ましくは、ポリエチレングリコールは、約１〜約５０kDa、好ましくは約１０〜約４０kDa、なおいっそう好ましくは約１５〜約３０kDa、もっとも好ましくは約２０kDaの分子量を有する。
【００７９】
さらなる一態様では、本発明は、特定のリコンビナント結合タンパク質をコードする核酸分子に関する。さらに、該核酸分子を含むベクターが考慮される。
【００８０】
さらに、１種または複数種の上述の結合タンパク質、特に反復ドメインを含む特定のリコンビナント結合タンパク質、または特定のリコンビナント結合タンパク質をコードする核酸分子と、場合により薬学的に許容されうる担体および／または希釈剤とを含む薬学的組成物が考慮される。薬学的に許容されうる担体および／または希釈剤は、当業者に公知であり、以下にさらに詳細に説明される。さらになお、１種または複数種の上述のリコンビナント結合タンパク質、特に反復ドメインを含む結合タンパク質を含む診断組成物が考慮される。
【００８１】
本発明の結合タンパク質は、ＶＥＧＦが誘導する病的血管新生、血管漏出（浮腫）、肺高血圧、腫瘍形成および／または炎症障害を抑制または予防する。「抑制」で、リコンビナントタンパク質が、言及された病態をある程度、例えば１０％もしくは２０％、より好ましくは５０％、特に７０％、８０％もしくは９０％、または９５％までも予防することが理解される。
【００８２】
「浮腫」という用語は、血管漏出によって引き起こされる状態を意味する。炎症時の血管拡張および透過性増加は、支配的な病原メカニズムでありうる。例えば、浮腫は、脳卒中後の梗塞拡大の原因となり、ガン患者に重篤な頭蓋内高血圧を引き起こすおそれがある。さらに、血漿タンパク質の血管外滲出は、潜在腫瘍の転移拡大に有利に働き、気道のうっ血は致命的な喘息発作を引き起こすおそれがある。炎症時に起こる血管漏出の増加は、呼吸困難、腹水、腹膜硬化症（透析患者の場合）、癒着形成（腹部手術）および転移性拡大につながりうる。
【００８３】
「血管新生」という用語は、新しい血管が形成される基本プロセスを意味する。ヒトにおける血管新生の第一期は、胚発生の最初の３ヶ月間に行われるが、血管新生は、また、筋肉または脂肪の増加などの組織成長期に、および月経周期および妊娠時に、正常な生理学的プロセスとしても起こる。
【００８４】
「病的血管新生」という用語は、いくつかの病的状態の維持および進行時の血管の形成および成長を表す。病的血管新生の特定例は、血管（アテローム性動脈硬化、血管腫、血管内皮腫）、骨および関節（関節リウマチ、滑膜炎、骨軟骨破壊、骨髄炎、パンヌス成長、骨棘形成、新生物および転移）、皮膚（いぼ、化膿性肉芽腫、発毛、カポジ肉腫、瘢痕ケロイド、アレルギー性浮腫、新生物）、肝臓、腎臓、肺、耳および他の上皮（肝炎、糸球体腎炎、肺炎を含めた炎症過程および感染過程；ならびに喘息、鼻茸、耳炎、移植障害、肝再生障害、新生物および転移）、子宮、卵巣および胎盤（子宮内避妊具による不正子宮出血、卵胞嚢胞形成、卵巣過剰刺激症候群、子宮内膜症、新生物）、脳、神経および眼（未熟児網膜症、糖尿病網膜症、脈絡膜および他の眼内障害、白質軟化症、新生物および転移）、心臓および作業過負荷による骨格筋、脂肪組織（肥満）、内分泌器官（甲状腺炎、甲状腺腫脹、膵臓移植障害）、造血（ＡＩＤＳでのカポジ症候群）、血液悪性腫瘍（白血病）、ならびにリンパ管（腫瘍転移、リンパ増殖性障害）において見出される。
【００８５】
「網膜虚血性疾患」という用語は、網膜の血液供給および酸素が減少しており、網膜の末梢部がその栄養源を失い、適正に機能することを停止することを意味する。網膜虚血性疾患の特定の例は網膜症である。網膜症につながる日常病は、糖尿病網膜症、網膜中心静脈閉塞、頸動脈狭窄、および鎌状赤血球網膜症である。糖尿病網膜症は、糖尿病患者における失明の主因である。虚血網膜では、新生血管の成長が起こる（新生血管形成）。これらの血管は、しばしば、網膜表面上、視神経、または虹彩表面の眼前部で成長する。新生血管は、必要な栄養の流れに取って代わることはできず、その代わりに硝子体出血、網膜剥離、およびコントロール不能の緑内障などの多くの問題を引き起こすおそれがある。新生血管が脆弱で出血しやすいことから、これらの問題が生じる。その初期段階になった場合、時に汎網膜光凝固術で増殖糖尿病網膜症を抑えることができる。しかしながら、場合により、硝子体切除術が唯一の選択肢である。
【００８６】
これらの網膜症に加えて、眼の血管疾患には、また、黄斑変性および糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）などの眼内新生血管形成疾患が含まれる。黄斑変性は、黄斑の真下の脈絡膜血管の新生血管成長に起因する。非滲出型と滲出型の２種類の黄斑変性がある。滲出型黄斑変性が全ての黄斑変性の１５％だけを構成し、ほぼ全ての滲出型黄斑変性が失明につながる。加えて、滲出型黄斑変性は、ほぼ常に非滲出型黄斑変性に起因する。ひとたび一方の眼が滲出型黄斑変性を患うと、その状態はほぼ常にもう一方の眼を冒す。滲出型黄斑変性は、主に高齢者に見出されることから、しばしば、滲出型加齢黄斑変性ｗｅｔ−ＡＭＤと呼ばれる。
【００８７】
糖尿病網膜症（ＤＲ）およびＤＭＥは、先進国の労働年齢の集団における失明の主因である。世界的に増えつつある糖尿病の個体数から、ＤＲおよびＤＭＥが失明および後年の関連機能障害の主要な誘因であり続けるであろうと示唆される。プロテインキナーゼＣ−β活性化、血管内皮成長因子の産生増加、酸化ストレスならびに細胞内ソルビトールおよび終末糖化産物の蓄積を含めたいくつかの生化学的メカニズムは、ＤＲ／ＤＭＥを特徴付ける血管破裂の原因となるおそれがある。これらの経路の阻害は、ＤＲおよびＤＭＥに対する介入として有望である。
【００８８】
「肺高血圧」という用語は、肺動脈の血圧が異常に高い障害を意味する。心臓または肺の他の疾患の不存在下では、それは原発性肺高血圧と呼ばれる。肺細動脈のびまん性狭細は、病的動脈新生に続く血流抵抗の増加に対する応答としての肺高血圧の結果として起こる。発生率は、１００，０００人に対して８人である。しかしながら、肺高血圧は、また、気腫、慢性気管支炎またはびまん性間質性線維症などの慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の合併症として、および喘息型（asthmatiform）ＣＯＰＤを有する患者において起こることがある。ＣＯＰＤの発生率は、１０，０００人に対して約５人である。
【００８９】
さらに、本発明の結合タンパク質は、炎症、より具体的には炎症障害を処置するために使用することができる。
【００９０】
本明細書で使用される「炎症」という用語は、生体組織の損傷に対する局所反応、特に小血管、その内容物およびそれらの関連した構造の局所反応を意味する。血液成分の血管壁を通った組織への通過は、炎症の特徴であり、そのように形成された組織収集物は、滲出物または浮腫と呼ばれる。生体組織を損傷する任意の有害なプロセス、例えば細菌感染、過剰な熱、寒冷、粉砕などの機械的損傷、酸、アルカリ、照射、またはウイルス感染が、関与する器官または組織にかかわりなく炎症を引き起こすおそれがある。「炎症性疾患」として分類された疾患、ならびに熱傷から肺炎、らい病、結核および関節リウマチに至る組織反応が、全て「炎症」であることは明らかであろう。
【００９１】
本発明による結合タンパク質は、腫瘍形成を処置するために使用することができる。「腫瘍」という用語は、既存の体細胞から明らかな原因なしに発生し、目的のある機能を持たず、自律的に無制限の成長をする傾向によって特徴付けられる異常な組織塊を意味する。腫瘍中の細胞はその外観および他の特徴が異常なことから、腫瘍は炎症性または他の腫脹とは全く異なる。異常な細胞、即ち一般に腫瘍を構成する種類の細胞は、一つまたは複数の下記の変化：（１）肥大、すなわち個々の細胞のサイズの増加；（２）過形成、すなわち所与のゾーン内の細胞数の増加；（３）退形成、すなわちより原始的または未分化型に向けての細胞の物理的特徴の退行を経る点で正常細胞と異なる。腫瘍は、良性、例えば、脂肪腫、血管腫、骨腫、軟骨腫および腺腫でありうる。悪性腫瘍の例は、ガン腫（例えば乳房腫瘍、呼吸器、消化管、内分泌腺および尿生殖器系のガン腫）、肉腫（線維組織、脂肪組織、筋肉、血管、骨および軟骨を含めた結合組織における）、ガン肉腫（上皮および結合組織の両方における）、白血病およびリンパ腫、神経組織（脳を含む）の腫瘍、およびメラノーマ（色素沈着した皮膚細胞のガン）である。腫瘍に対する本発明の結合タンパク質の使用は、また、照射、光線力学的治療、化学療法または外科手術などの当技術分野で公知の任意の他の腫瘍療法と組み合わせることができる。
【００９２】
薬学的組成物は、上記の結合タンパク質および薬学的に許容されうる担体、賦形剤または安定化剤（Remington’s Phamaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.［1980］）を含む。当業者に公知の適切な担体、賦形剤または安定化剤は、食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、ハンクス液、固定油、オレイン酸エチル、食塩水中の５％ブドウ糖、等張性および化学的安定性を高める物質、緩衝剤ならびに保存料である。他の適当な担体には、組成物を投与される個体に有害な抗体の産生をそれ自体誘導しない任意の担体、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸およびアミノ酸コポリマーなどが含まれる。薬学的組成物は、また、抗ガン剤または抗血管新生剤（例えばヒトＶＥＧＦ−Ａｘｘｘｂ；好ましくはヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ）などの追加的な活性薬剤を含む配合製剤でありうる。
【００９３】
眼疾患の処置のための好ましい薬学的組成物は、上記結合タンパク質、非限定的にポリソルベート２０（例えば約０．０４％）を含めた非イオン性界面活性剤などの界面活性剤、ヒスチジン、リン酸塩または乳酸などの緩衝剤、およびスクロースまたはトレハロースなどの糖を含む。好ましくは、そのような組成物は、上記結合タンパク質およびＰＢＳを含む。該薬学的組成物または本明細書記載の任意の他の薬学的組成物は、眼の一部に局部的に局所投与されるか、または眼内に、例えば結膜下（subconjunctival）腔、眼球周囲腔もしくは眼球後腔に注射されるか、または直接眼内注射されうる。または、該薬学的組成物またはそのような他の薬学的組成物は、非経口投与により全身投与されうる。好ましくは、該薬学的組成物またはそのような他の薬学的組成物は、硝子体内注射により眼に適用される。同様に好ましくは、該薬学的組成物は、点眼薬として眼に局部的に適用される。点眼薬は、角膜（眼の中心の透明部分）に適用することにより、分子を眼内に透過させることができる。眼の後部を冒す疾患の処置には、結膜の下または眼球周囲に注射したときに、結合タンパク質が強膜を透過することが最も望ましい場合がある。眼の表面をモデュレーションして分子の透過を改善する予備ステップの後に、結合タンパク質の投与を行ってもよい。好ましくは、角膜上皮などの上皮層を透過促進剤によってモデュレーションして、例えば上記の分子を十分に迅速に透過させる。眼疾患に対する本発明の結合タンパク質の使用は、また、光線力学的治療などの当技術分野で公知の任意の他の治療と組み合わせることができる。
【００９４】
in vivo投与に使用されるべき製剤は、無菌または滅菌済みでなければならない。これは、無菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【００９５】
徐放性製剤を調製してもよい。本発明の一態様では、本発明の結合タンパク質を提供するために眼内植込剤を使用することができる。徐放性製剤の適切な例には、本発明のポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、造形品、例えばフイルムまたはマイクロカプセルの形態のマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリビニルアルコール、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸−γ−エチル−Ｌ−グルタメートコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニルコポリマー、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリド酢酸塩から構成される注射用ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【００９６】
薬学的組成物は、技術者の知識の範囲内での任意の適切な方法によって投与することができる。好ましい投与経路は非経口である。非経口投与では、本発明の医薬は、上記に定義されたような薬学的に許容されうる賦形剤と共に、液剤、懸濁剤または乳剤などの注射用単位量剤形で製剤化される。投薬量および投与様式は、処置されるべき個体および特定の疾患に依存する。一般に、薬学的組成物は、本発明の結合タンパク質が１μg/kgから２０mg/kgの間、より好ましくは１０μg/kgから５mg/kgの間、最も好ましくは０．１から２mg/kgの間の用量で与えられるように投与される。好ましくは、それはボーラス投与で与えられる。持続注入も使用することができ、持続注入には、浸透圧ミニポンプを介する持続皮下送達が含まれる。その場合、薬学的組成物は、５〜２０μg/kg/minの間、より好ましくは７から１５μg/kg/minの間の用量で注入されうる。特に、薬学的組成物は、本発明の結合タンパク質が注射１回あたり０．１mgから１０mgの間、より好ましくは注射１回あたり０．３mgから６mg、最も好ましくは注射１回あたり１mgから４mgの用量で与えられるように眼内注射により投与される。さらに、薬学的組成物は、１０から１２０mg/mlの間、より好ましくは２０から１００mg/mlの間、最も好ましくは４０から８０mg/mlの間の濃度の本発明の結合タンパク質を含有する溶液の１滴が眼に適用されるように、点眼液によって眼に投与される。
【００９７】
本発明の別の態様では、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘの活性を阻害する上記結合タンパク質は、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘについて上記したのと同じＰＩＧＦの阻害レベルでＰＩＧＦの活性を阻害する結合タンパク質または小分子と組み合わせて使用することができる。この態様は、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘレベルが増加している部位でＰＩＧＦが血管新生性であることが見出されるという事実に基づく。さらに、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘの活性を阻害する上記結合タンパク質は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦファミリータンパク質の他のメンバー、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、デルタ様リガンド（delta-ligand like）４（Ｄｌｌ４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ニューロピリンまたはアンギオポエチン２（Ａｎｇ２）の活性を阻害する結合タンパク質または小分子と組み合わせて使用することができる。
【００９８】
本発明は、さらに、処置方法を提供する。一局面では、網膜症を処置する方法であって、それを必要とする患者に治療有効量の本発明の結合タンパク質、特にヒトＶＥＧＦ−ＡｘｘｘとヒトＶＥＧＦＲ−２の間の相互作用を阻害するが、ヒトＶＥＧＦ−ＡｘｘｘｂとヒトＶＥＧＦＲ−２の相互作用を阻害しない結合タンパク質を投与することを含む方法が提供され、そして、その結合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ−２介在性血管新生を阻害する。
【００９９】
本発明は、さらに、記載された結合タンパク質を使用して、細胞におけるＶＥＧＦ−Ａの生物学的活性を阻害またはＶＥＧＦＲ−２によって仲介される生物学的活性を阻害するための方法に関する。細胞は、in vivoまたはex vivoの状況の場合があり、例えば、生きている生物の細胞、培養細胞または組織試料中の細胞でありうる。この方法は、該細胞を、本明細書に開示されたＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦＲ−２相互作用阻害性結合タンパク質のいずれかと、そのような生物学的活性を阻害するのに十分な量および時間接触させることを含みうる。
【０１００】
本発明は、ＶＥＧＦ−ＡｘｘｘまたはＶＥＧＦＲ−２の阻害に応答する状態を有する対象を処置するための方法を提供する。そのような方法は、該対象に、有効量の本明細書記載の結合タンパク質を投与することを含む。状態は、不適切な血管新生により特徴付けられるものでありうる。状態は、過剰増殖状態でありうる。処置に適する状態（または障害）の例には、自己免疫障害、炎症障害、網膜症（特に増殖網膜症）およびガン、特に上記疾患の一つが含まれる。本明細書記載の任意の結合タンパク質を、そのような障害、特に自己免疫障害、炎症障害、網膜症およびガンから成る群より選択される障害の処置のための医薬を調製するために使用することができる。処置に適する好ましい状態（または障害）は、ファーストライン転移性腎細胞ガン、再発多形性膠芽腫、補助（adjuvant）結腸ガン、補助ＨＥＲ２陰性乳ガン、補助ＨＥＲ２陽性乳ガン、補助非小細胞肺ガン、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ファーストライン進行胃ガン、ファーストラインＨＥＲ２陰性転移性乳ガン、ファーストラインＨＥＲ２陽性転移性乳ガン、ファーストライン転移性卵巣ガン、消化管間質腫瘍、高リスク型カルチノイド、ホルモン不応性前立腺ガン、新たに診断された多形性膠芽腫、転移性頭頸部ガン、再発白金製剤感受性卵巣ガン、セカンドライン転移性乳ガン、進展型小細胞肺ガン、以前に処置されたＣＮＳ転移おび再発多発性骨髄腫を有する非鱗状非小細胞肺ガン、前立腺ガン、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸ガンおよび膵臓ガン、進行卵巣ガン（ＡＯＣ）、症候性悪性腹水を有するＡＯＣ患者ならびに非ホジキンリンパ腫である。
【０１０１】
本発明によるリコンビナント結合タンパク質は、バクテリオファージ（国際公開公報第９０／０２８０９号、国際公開公報第０７／００６６６５号）もしくは細菌細胞（国際公開公報第９３／１０２１４号）表面上でのディスプレイ、リボソームディスプレイ（国際公開公報第９８／４８００８号）、プラスミド上でのディスプレイ（国際公開公報第９３／０８２７８号）などのいくつかの方法によって、または共有結合性ＲＮＡ−反復タンパク質ハイブリッド構築物（国際公開公報第００／３２８２３号）もしくはタンパク質相補アッセイ（国際公開公報第９８／３４１１２０号）などによる細胞内発現および選択／スクリーニングを使用することによって入手および／またはさらに進展させることができる。そのような方法は、当業者に周知である。
【０１０２】
本発明によるリコンビナント結合タンパク質の選択／スクリーニングのために使用されるアンキリン反復タンパク質のライブラリーは、当業者に公知のプロトコールによって得ることができる（国際公開公報第０２／０２０５６５号、Binz, H.K. et al., JMB, 332, 489-503, 2003、およびBinz et al., 2004、上記引用分中）。ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘ特異的ＤＡＲＰｉｎの選択のためのそのようなライブラリーの使用を、実施例１に示す。類似して、上述のアンキリン反復配列モチーフを使用して、アンキリン反復タンパク質のライブラリーを構築することができ、それをＶＥＧＦ−Ａｘｘｘ特異的ＤＡＲＰｉｎの選択またはスクリーニングのために使用することができる。さらに、本発明の反復ドメインは、標準的なリコンビナントＤＮＡ技法（例えば国際公開公報第０２／０２０５６５号、Binz et al., 2003上記引用文中およびBinz et al., 2004、上記引用文中）を使用して、本発明による反復モジュールおよび適切なキャッピングモジュールから（Forrer, P., et al., FEBS letters 539, 2-6, 2003）モジュール方式で組み立てることができる。
【０１０３】
本発明は、実施例に記載された特定の態様に限定されない。他の原料を用いて下記概略にしたがって加工してもよい。
【０１０４】
実施例
下記に開示した全ての出発材料および試薬は、当業者に公知であって、市販されているか、または周知の技法を用いて調製することができる。
【０１０５】
材料
化学薬品は、Fluka（Switzerland）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Microsynth（Switzerland）製であった。特に述べない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素および緩衝剤は、New England Biolabs（USA）またはFermentas（Lithuania）製であった。クローニングおよびタンパク質生産株は、E. coli XL1-blue（Stratagene, USA）であった。ＶＥＧＦ変異体は、R&D Systems（Minneapolis, USA）製であるか、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞もしくはPichia pastorisから産生させ、標準プロトコールにしたがって精製した（Rennel, E. S. et al., European J. Cancer 44, 1883-94, 2008; Invitrogen製Pichia発現系）。ビオチン化ＶＥＧＦ変異体は、標準ビオチン化試薬および方法（Pierce, USA）を使用して精製ＶＥＧＦ変異体の一級アミンにビオチン部分を結合させることによって化学的に得た。
【０１０６】
分子生物学
特に述べない限り、記載されたプロトコール（Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory 1989, New York）による方法を行う。
【０１０７】
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー
Ｎ２ＣおよびＮ３Ｃ設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーは、記載されている（国際公開公報第０２／２０５６５号; Binz et al. 2003、上記引用文中; Binz et al. 2004、上記引用文中）。Ｎ２ＣおよびＮ３Ｃ中の数字は、Ｎ末端とＣ末端キャッピングモジュールの間に存在するランダム化反復モジュールの数を説明している。反復ユニットおよびモジュール内の位置を定義するために使用された命名法は、Binzら（2004、上記引用文中）を、反復モジュールおよび反復ユニットの境界が１アミノ酸位置だけ移動するように改変したものに基づく。例えばBinzら（2004、上記引用文中）の反復モジュールの位置１は、本開示の反復モジュールの位置２に相当し、それゆえにBinzら（2004、上記引用文中）の反復モジュールの位置３３は、本開示の後続の反復モジュールの位置１に相当する。
【０１０８】
全てのＤＮＡ配列を、配列決定により確認し、全ての記載されたタンパク質の計算分子量を、質量分析によって確認した。
【０１０９】
実施例１：ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して結合特異性を有する反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ（Hanes, J. and Plueckthun, A., PNAS 94, 4937-42, 1997）を使用して、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して結合特異性を有する多数の設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を、Binzら（2004、上記引用文中）によって記載されたＮ２ＣまたはＮ３Ｃ  ＤＡＲＰｉｎライブラリーから選択した。選択されたクローンの特異的（ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘ）ターゲットおよび非特異的（ＭＢＰ、E. coliマルトース結合タンパク質）ターゲットに対する結合を、粗抽出物のＥＬＩＳＡによって評価したが、そのＥＬＩＳＡは、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘ結合タンパク質がうまく選択されたことを示した（図１）。配列番号：１〜７の反復ドメインは、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対する結合特異性を有する反復ドメインを含む選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。選択されたバインダーの配列分析から、ある選択されたファミリーのバインダーに固有の特異的アンキリン反復配列モチーフが明らかとなった。
【０１１０】
リボソームディスプレイによるＶＥＧＦ−Ａｘｘｘ特異的アンキリン反復タンパク質の選択
ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘ特異的アンキリン反復タンパク質の選択は、ターゲットタンパク質としてイヌＶＥＧＦ−Ａ１６４またはヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５、記載された設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー（国際公開公報第０２／０２０５６５号、Binz et al., 2003、上記引用文中およびBinz et al., 2004、上記引用文中）、および確立されたプロトコール（Zahnd, C., Amstutz, P. and Plueckthun, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007）を使用して、リボソームディスプレイ（Hanes and Plueckthun、上記引用文中）によって行った。リボソームディスプレイの選択ラウンドは、Ｎ２ＣおよびＮ３Ｃの両方のＤＡＲＰｉｎライブラリーを用いてイヌまたはヒトＶＥＧＦ変異体（ニュートラアビジンまたはストレプトアビジン上に固定化されたビオチン化変異体を含む）に関して、確立されたプロトコール（Binz et al. 2004、上記引用文中）を使用して行った。各選択ラウンド後の逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲサイクルの回数を、バインダーの濃縮による収率に合わせて４０回から３０回に常に減らした。単一クローンのＥＬＩＳＡおよびＳＰＲ測定から明らかとなったように、イヌＶＥＧＦに関する最初の４回の選択ラウンドによって、親和性がナノモル濃度のＤＡＲＰｉｎのプールを回収した。さらに改善された親和性のＤＡＲＰｉｎを見出すために、２および３回目の最初のリボソームディスプレイ選択ラウンド後のプールを採用して、ニュートラアビジンまたはストレプトアビジン上に固定化されたビオチン化ヒトまたはイヌＶＥＧＦに関して追加的なオフレート（off-rate）選択を行い、続いてヒトＶＥＧＦに関してオンレート（on-rate）選択ラウンドを行った。
【０１１１】
粗抽出物ＥＬＩＳＡによって示されたように、選択されたクローンは、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに特異的に結合する
ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに特異的に結合する個々の選択されたＤＡＲＰｉｎを、標準プロトコールを用いてＤＡＲＰｉｎ発現細胞の粗Escherichia coli抽出物を使用した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって同定した。選択されたクローンをｐＱＥ３０（Qiagen）発現ベクターにクローニングし、E. coli XL1-Blue（Stratagene）中にトランスフォーメーションし、次に成長培地（１％グルコースおよび１００μg/mlアンピシリンを含有する２ＹＴ）１mlが入っている９６深型ウェルプレート（ウェル１個に各クローン）に入れて３７℃で一晩成長させた。５０μg/mlアンピシリンを含有する新鮮２ＹＴ １mlに新鮮９６深型ウェルプレート中の一晩培養物１００μlを接種した。３７℃で２時間インキュベーション後に、ＩＰＴＧ（１mM終濃度）で発現を誘導し、３時間続けた。細胞を採集し、Ｂ−ＰＥＲＩＩ（Pierce）１００μl中に再懸濁し、振盪しながら室温で１５分間インキュベーションした。次にＰＢＳ−ＴＢ（０．２％ ＢＳＡ、０．１％Tween20を補充されたＰＢＳ，ｐＨ７．４）９００μlを加え、遠心分離によって細胞片を除去した。ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘ変異体または無関係のＭＢＰのいずれかがそのビオチン部分を介して固定化されたものが入っている、ニュートラアビジンコーティング済みMaxiSorpプレートのウェルに各溶解クローン１００μlを適用し、ＲＴで１時間インキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔ（０．１％Tween20を補充されたＰＢＳ、ｐＨ７．４）で徹底的に洗浄した後に、一次抗体として抗ＲＧＳ（Ｈｉｓ）４モノクローナル抗体（34650, Qiagen）および二次試薬としてアルカリホスファターゼとコンジュゲーションしたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（A3562, Sigma）を使用した標準ＥＬＩＳＡ手順を用いてプレートを作り上げた。次に、アルカリホスファターゼに関する基質として４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（４ＮＰＰ、Fluka）を使用することによって結合を検出した。発色を４０５nmで測定した。ＶＥＧＦ−ＡｘｘｘへのＤＡＲＰｉｎの結合を確認するために使用された実施例の粗抽出物ＥＬＩＳＡからの結果を図１に示す。そのような粗細胞抽出物ＥＬＩＳＡによる数百個のクローンのスクリーニングから、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して特異性を有する１００種よりも多くの異なるＤＡＲＰｉｎが明らかとなった。これらの結合タンパク質をさらなる分析のために選択した。ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに特異的に結合する、選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列の例を、配列番号：１〜７に提供する。
【０１１２】
ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して結合特異性を有する選択された反復ドメインから反復配列モチーフを推定する
ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して結合特異性を有する選択された反復ドメインのアミノ酸配列を、さらに、当業者に公知の配列分析ツールによって分析した（国際公開公報第０２／０２０５６５号; Forrer et al., 2003、上記引用文中; Forrer, P., Binz, H.K., Stumpp, M.T. and Plueckthun, A., ChemBioChem, 5(2), 183-189, 2004）。それにもかかわらず、反復配列モチーフを推定するために天然反復モチーフが使用された国際公開公報第０２／０２０５６５号とは対照的に、本明細書では、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して結合特異性を有する選択された反復ドメインの反復ユニットから反復配列モチーフを推定した。それにより、共通の反復配列モチーフを含む選択された反復ドメインのファミリーが決定された。
【０１１３】
ＤＡＲＰｉｎの高レベルの可溶性発現
さらなる分析のために、上記粗細胞抽出物ＥＬＩＳＡにおいて特異的ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘ結合を示す選択されたクローンをE. coli XL1-blue細胞において発現させ、標準プロトコールを用いてそのＨｉｓタグを利用して精製した。静置一晩培養物（ＬＢ、１％グルコース、１００mg/lアンピシリン；３７℃）２５mlを使用して１ｌ培養物（同培地）に接種した。Ａ（６００）＝０．７のときに０．５mM ＩＰＴＧを用いて培養物を誘導し、３７℃で４時間インキュベーションした。培養物を遠心分離し、結果として生じたペレットをＴＢＳ５００（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００mM ＮａＣｌ、ｐＨ８）４０ml中に再懸濁し、超音波処理した。溶解物を再遠心分離し、結果として生じた上清にグリセロール（１０％(v/v)終濃度）およびイミダゾール（２０mM終濃度）を添加した。製造業者の説明書（QIAgen, Germany）にしたがってＮｉ−ニトリロ三酢酸カラム（カラム体積２．５ml）にかけてタンパク質を精製した。ＳＤＳ−１５％ＰＡＧＥから推定された通り、１リットルのE. coli培養物からＶＥＧＦ−Ａｘｘｘへの結合特異性を有する最大２００mgの高溶解性ＤＡＲＰｉｎを、純度＞９５％で精製することができた。そのような精製ＤＡＲＰｉｎをさらなる特徴づけのために使用する。
【０１１４】
実施例２：スフェロイド伸長アッセイにおけるＶＥＧＦ−Ａｘｘｘへの結合特異性を有する選択されたＤＡＲＰｉｎのＩＣ５０値の決定
コラーゲンマトリックス中に包埋されたＨＵＶＥＣスフェロイドへのＶＥＧＦ−Ａｘｘｘの添加は、スフェロイドの発芽につながる。ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘ阻害剤の添加は、発芽形成を遮断し、それは、発芽の数および長さによって統計的に定量することができる。異なる濃度の阻害剤および一定量のＶＥＧＦを添加することによって、ＩＣ５０を決定することができる。
【０１１５】
ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘ特異的ＤＡＲＰｉｎによるスフェロイド発芽の阻害
スフェロイド伸長アッセイは、標準プロトコール（Korff et al.、上記引用文中）にしたがって行った。ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して特異性を有するＤＡＲＰｉｎを選択し、実施例１に記載したように純度＞９６％に精製した。ヒト臍帯静脈細胞を単層培養で集密になるまで成長させた。トリプシン処理後に、細胞懸濁物を懸滴中に入れて、スフェロイド、すなわち約５００個の組織化された凝集ＨＵＶＥＣを形成させた。スフェロイドをコラーゲンマトリックス中に包埋し、ＶＥＧＦ−Ａ１６５で刺激して発芽の伸長を開始させた。追加的に発芽阻害剤を添加して、それが発芽阻害に及ぼす作用を観察した。スフェロイド１個あたりの発芽数および発芽長は、グラフィックソフトウェアを使用して定量した。
【０１１６】
２種の例示的なスフェロイド発芽アッセイからの結果を図２ａ（ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対して結合特異性を有するＤＡＲＰｉｎ＃３０）および図２ｂ（ＤＡＲＰｉｎ  ＮＣ、ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに対する結合特異性を有さない陰性対照ＤＡＲＰｉｎ；例えばＤＡＲＰｉｎ  Ｅ３＿５（Binz et al., 2005上記引用文中）に示す。このアッセイで最も性能の良いＤＡＲＰｉｎは、１０〜５０pMの範囲のＩＣ５０値を示したが、Avastin（登録商標）、Lucentis（登録商標）およびMacugen（登録商標）は、並行実験で１５０〜５００pMの範囲のＩＣ５０値を示した。
【０１１７】
実施例３：表面プラズモン共鳴分析によるAvastin（登録商標）と比較したＤＡＲＰｉｎ＃２７のターゲット特異性の決定
イヌＶＥＧＦ−Ａ１６４またはイヌＶＥＧＦ−Ａ１６４ｂをフローセル中に固定化し、ＤＡＲＰｉｎ＃２７（配列番号：１のアミノ酸１〜１５９に相当する反復ドメイン）およびAvastin（登録商標）と固定化ターゲットとの相互作用を分析した。
【０１１８】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
ProteOn装置（BioRad）を使用してＳＰＲを測定した。送液用緩衝液（running buffer）は、２０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０mM ＮａＣｌおよび０．００５％Tween 20であった。約１２００RUのイヌＶＥＧＦ−Ａ１６４またはイヌＶＥＧＦ−Ａ１６４ｂをＧＬＣチップ（BioRad）上に固定化した。流量６０μl/分で緩衝液流５分、濃度２５０nMでのAvastin（登録商標）またはＤＡＲＰｉｎ＃２７のインジェクション１００秒、および緩衝液流で数分のオフレート測定で相互作用を測定した。未コーティング参照細胞のシグナルを測定値から差し引いた。
【０１１９】
結果を図３ａ（AvastinとイヌＶＥＧＦ−Ａ１６４との相互作用）、図３ｂ（AvastinとイヌＶＥＧＦ−Ａ１６４ｂとの相互作用）、図３ｃ（ＤＡＲＰｉｎ＃２７とイヌＶＥＧＦ−Ａ１６４との相互作用）および図３ｄ（ＤＡＲＰｉｎ＃２７とイヌＶＥＧＦ−Ａ１６４ｂとの相互作用）に示す。Avastinが両方の固定化ＶＥＧＦアイソフォームと明らかに相互作用する一方で、ＤＡＲＰｉｎ＃２７は、ＶＥＧＦ−Ａ１６４ｂとではなく、ＶＥＧＦ−Ａ１６４とだけ相互作用を示す。
【０１２０】
実施例４：血管漏出ウサギモデルにおけるＶＥＧＦ−Ａ１６５阻害でのＤＡＲＰｉｎ＃３０のin vivo有効性
ＰＥＧ化ＤＡＲＰｉｎ＃３０（アミノ酸１〜１２６に相当する配列番号：４の反復ドメイン）またはLucentis（登録商標）を硝子体内注射によってウサギ眼内に適用し、続くヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５の硝子体内注射によって誘導される血管漏出をそれらが阻害する有効性を試験した。
【０１２１】
ウサギにおける血管漏出阻害の測定
１日目にＰＢＳ、ＰＥＧ化ＤＡＲＰｉｎ＃３０（１２５μg）または等モル量のLucentis（登録商標）（１６２μg）のいずれかを硝子体内注射によって各ウサギの一方の眼（処置された眼）内に適用する。４日目または３０日目に各ウサギの処置された眼をヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５ ５００ngの硝子体内注射によって誘発した。ＶＥＧＦ−Ａ１６５注射の４８時間後に、フルオレセインナトリウムの静脈内注射（５０mg/kg動物体重、０．９％(w/v)食塩溶液中に１０％(w/v)）の１時間後に全ての眼におけるフルオレセイン含量を測定することによって全ての動物の両眼を評価した。処置された眼および未処置の眼における蛍光量の比を各動物について計算した。１という比は、処置された眼における追加的な蛍光漏出の不在に相当し、１よりも大きな比は、未処置対照の眼よりも処置された眼の方が大きな蛍光漏出であることを示す。
【０１２２】
ＰＥＧ化ＤＡＲＰｉｎの調製
単一のＣｙｓ残基およびマレイミド化学反応を利用することによるタンパク質のＰＥＧ化は、当業者に周知であり、確立されたプロトコール（例えばPierceからのもの）にしたがって行うことができる。標準的なクロマトグラフィー法を用いて、追加的なＣ末端リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＳＣ、配列番号：８）を含むＤＡＲＰｉｎ＃３０を均質付近まで精製した。ＤＴＴを使用してタンパク質を完全に還元し、ゲル濾過により精製してＤＴＴを除去し、緩衝液をＰＢＳに交換した。ＰＢＳに溶解したＰＥＧ−マレイミド（メトキシ−ポリエチレングリコール−オキソプロピルアミノ−プロピルマレイミド；NOF, no. Sunbright ME-200MA）をＰＢＳ中のＤＡＲＰｉｎと、約１５％モル濃度過剰のＰＥＧ−マレイミドとなるように室温で２〜４時間混合する。次に、標準的な陰イオン交換クロマトグラフィーを用いることによってＰＥＧ化ＤＡＲＰｉｎを非反応性ＤＡＲＰｉｎ部分および非反応性ＰＥＧ部分から分離する。
【０１２３】
結果を図４に示す。ＰＥＧ化ＤＡＲＰｉｎ＃３０およびLucentis（登録商標）の両方が、硝子体内注射によって適用された４日後に、ＶＥＧＦ−Ａ１６５が誘導する血管漏出からウサギの眼を保護することができた。しかしながら、Lucentis（登録商標）ではなくＰＥＧ化ＤＡＲＰｉｎ＃３０だけが硝子体内注射の最大３０日後までＶＥＧＦ−Ａ１６５が誘導する血管漏出からウサギの眼を保護することができた。
【０１２４】
他の実験では、本発明の異なる結合タンパク質の硝子体内消失半減期を、ウサギ眼への硝子体内注射後に測定した。追加的なＣ末端リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＳＣ、配列番号：８）を含むＤＡＲＰｉｎ＃３０を、２０kDaおよび４０kDaの非タンパク質性ＰＥＧ部分に、NOF製のそれぞれのマレイミドＰＥＧを使用してコンジュゲーションさせた（実施例５参照）。ＤＡＲＰｉｎ＃３０、２０kDaのＰＥＧ部分にコンジュゲーションしたＤＡＲＰｉｎ＃３０および４０kDAのＰＥＧ部分にコンジュゲーションしたＤＡＲＰｉｎ＃３０について、消失半減期は、３．５日（±０．３日）、６．１日（±１．０日）および５．４日（±０．８日）と決定された。驚くことに、非タンパク質性ＰＥＧ部分の分子量を２０kDaから４０kDaに増加させても消失半減期の増加を招かなかった。配列番号：４の反復ドメインの代わりに配列番号：１（アミノ酸１〜１５９）または配列番号：３（アミノ酸１〜１２６）の反復ドメインを含む結合タンパク質が使用された対応する実験において同じ傾向が観察された。
【０１２５】
実施例５：リコンビナント結合タンパク質
ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘに結合する反復ドメインおよびタンパク質性ポリマー部分を含むリコンビナント結合タンパク質の例は、配列番号：１および４である。配列番号：１の反復ドメインは、アミノ酸１〜１５９に相当し、配列番号：１のタンパク質性ポリマー部分は、アミノ酸１６０〜１，０２４に相当する。配列番号：４の反復ドメインは、アミノ酸１〜１２６に相当し、配列番号：４のタンパク質性ポリマー部分はアミノ酸１２７〜５３６に相当する。
【０１２６】
配列番号：１および４の結合タンパク質を、当業者に公知の標準技法を使用してEscherichia coliの細胞質中に発現させた（例えば、Qiagen(Germany)製ｐＱＥ発現系を参照されたい）。開始Ｍｅｔの後に小さなＧｌｙ残基（すなわち配列番号：１および４の位置１でのアミノ酸）が続いていることから、発現ベクターによって追加的にコードされるＭｅｔ残基は、発現されたポリペプチドからE. coliの細胞質中で効率的に切断された。細胞を溶解させ（例えばフレンチプレスを使用することによる）、当業者に公知の標準的なクロマトグラフィー技法を使用することによって粗細胞抽出物から結合タンパク質を均質付近まで精製した。
【０１２７】
ＶＥＧＦ−Ａｘｘｘと結合する１個の反復ドメインおよび１個の非タンパク質性ポリマー部分を含むリコンビナント結合タンパク質の例を、配列番号：２、３、５、６、および７の反復タンパク質を使用して産生させた。これらの反復タンパク質は、Ｎ末端反復ドメインに続いてポリペプチドリンカーおよびＣ末端Ｃｙｓを含む。それぞれの反復ドメインは、配列番号：２および７についてはアミノ酸１〜１５９に、配列番号：３〜６についてアミノ酸１〜１２６に相当する。当業者に公知の標準技法を使用して、Escherichia coliの細胞質中に配列番号：２、３、５、６、および７の反復タンパク質を発現させた（例えば、Qiagen（Germany）製Expressionist参照）。開始Ｍｅｔの後に小さなＧｌｙ残基（すなわち配列番号：２、３、５、６、および７の位置１でのアミノ酸）が続くことから、発現ベクターによって追加的にコードされるＭｅｔ残基は、発現されたポリペプチドからE. coliの細胞質中で効率的に切断された。細胞を溶解させ（例えばフレンチプレスを使用することによる）、当業者に公知の標準的なクロマトグラフィー技法を使用することによって粗細胞抽出物から結合タンパク質を均質付近まで精製した。
【０１２８】
次に、単一のＣｙｓ残基を含む精製反復タンパク質を、実施例４に概略したような標準的なマレイミド化学反応を使用して非タンパク質性ポリマー部分にコンジュゲーションさせた。それによって、配列番号：２の反復タンパク質および４０kDaの非タンパク質性ＰＥＧ部分（例えばNOF製の４０kDaマレイミド−ＰＥＧ（α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン）、製造番号Sunbright ME-400MA）、配列番号：３の反復タンパク質および２０kDaの非タンパク質性ＰＥＧ部分（例えばNOF製の２０kDaマレイミド−ＰＥＧ（α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン）、製造番号Sunbright ME-200MA）、配列番号：５の反復タンパク質および１２kDaの非タンパク質性ＰＥＧ部分（例えばNOF製の１２kDaマレイミド−ＰＥＧ（α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン）、製造番号Sunbright ME-120MA）、配列番号：６の反復タンパク質および５kDaの非タンパク質性ＰＥＧ部分（例えばNOF製の５kDaマレイミド−ＰＥＧ（α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン）、製造番号Sunbright ME-050MA）ならびに配列番号：７の反復タンパク質および２kDaの非タンパク質性ＰＥＧ部分（例えばNOF製の２kDaマレイミド−ＰＥＧ（α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン）、製造番号Sunbright ME-020MA）を含む本発明の結合タンパク質を製造した。次にさらに、当業者に公知の標準的なクロマトグラフィー技法によって非ＰＥＧ化反復タンパク質および過剰のＰＥＧからＰＥＧ化反復タンパク質を分離した。
【０１２９】
このように、配列番号：２、３、５、６、および７をそのＣ末端システインのチオールでマレイミドＰＥＧ（α−［３−（３−マレイミド−１−オキソプロピル）アミノ］プロピル−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン）にコンジュゲーションさせた。それによって以下の構造：
【０１３０】
【化１】
0006010528.tif 000002
［式中、Ｘは配列番号：２、３、５、６、または７であり；ｎは正の整数である］を製造した。
【図１】
0006010528.tif 000003
【図２ａ】
0006010528.tif 000004
【図２ｂ】
0006010528.tif 000005
【図３ａ】
0006010528.tif 000006
【図３ｂ】
0006010528.tif 000007
【図３ｃ】
0006010528.tif 000008
【図３ｄ】
0006010528.tif 000009
【図４】
0006010528.tif 000010
【配列表】
0006010528000001.app