(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−３シグナルを阻害せず、かつヒトＩＬ−３Ｒα鎖のＢドメインに結合し、Ｃドメインには結合しないヒトＩＬ−３Ｒα鎖に対する抗体をコードするＤＮＡを宿主細胞へ導入する工程、該細胞を培養する工程、及び培養した培養上清から抗体を精製する工程を含む抗体の製造方法。
【請求項２】
抗体が、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を有する抗体である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
抗体のＡＤＣＣが、ＩＬ−２で培養したＰＢＭＣを用いたＣｏｌｏｎ−２６／ｈＣＤ１２３ＡＤＣＣ測定法において、抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬ以下で特異的溶解率１０％のＡＤＣＣである、請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
抗体が、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択された重鎖のＣＤＲと軽鎖のＣＤＲのアミノ酸配列を有する抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
（ａ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１１３〜１１５で示されるアミノ酸配列および軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１３１〜１３３で示されるアミノ酸配列
（ｂ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１１６〜１１８で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１３４〜１３６で示されるアミノ酸配列
（ｃ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１１９〜１２１で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１３７〜１３９で示されるアミノ酸配列
（ｄ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１２２〜１２４で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１４０〜１４２で示されるアミノ酸配列
（ｅ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１２５〜１２７で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１４３〜１４５で示されるアミノ酸配列
【請求項５】
抗体が、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
（ａ）配列番号５３で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５５で示されるアミノ酸配列の２３番目のバリン（Ｖ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｂ）配列番号５７で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５９で示されるアミノ酸配列の２３番目のバリン（Ｖ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｃ）配列番号６１で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６３で示されるアミノ酸配列の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｄ）配列番号６５で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６７で示されるアミノ酸配列の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｅ）配列番号６９で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３８番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号７１で示されるアミノ酸配列の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｆ）（ａ）から（ｅ）で示される重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域に１から３個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域。
【請求項６】
抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる抗体である請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
抗体が、ＩｇＧクラスの抗体である請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
抗体が、ヒトＦｃ領域を有する抗体である請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
抗体が、ヒト定常領域を有する抗体である請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
宿主細胞が、チャイニーズハムスター由来卵巣（ＣＨＯ）細胞である請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択された重鎖のＣＤＲと軽鎖のＣＤＲのアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−３Ｒα鎖に結合する抗体。
（ａ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１１３〜１１５で示されるアミノ酸配列および軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１３１〜１３３で示されるアミノ酸配列
（ｂ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１１６〜１１８で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１３４〜１３６で示されるアミノ酸配列
（ｃ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１１９〜１２１で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１３７〜１３９で示されるアミノ酸配列
（ｄ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１２２〜１２４で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１４０〜１４２で示されるアミノ酸配列
（ｅ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１２５〜１２７で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１４３〜１４５で示されるアミノ酸配列
【請求項１２】
抗体が、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する請求項１１に記載の抗体。
（ａ）配列番号５３で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５５で示されるアミノ酸配列の２３番目のバリン（Ｖ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｂ）配列番号５７で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５９で示されるアミノ酸配列の２３番目のバリン（Ｖ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｃ）配列番号６１で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６３で示されるアミノ酸配列の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｄ）配列番号６５で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６７で示されるアミノ酸配列の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｅ）配列番号６９で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３８番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号７１で示されるアミノ酸配列の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｆ）（ａ）から（ｅ）で示される重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域に１から３個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域。
【請求項１３】
抗体が、キメラ抗体及びヒト抗体から選ばれる抗体である請求項１１又は１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
抗体が、ＩｇＧクラスの抗体である請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
抗体が、ヒトＦｃ領域を有する抗体である請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
抗体が、ヒト定常領域を有する抗体である請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の抗体。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＩＬ−３Ｒα蛋白質（別名：ヒトＣＤ１２３）に対する抗体に関する。
本発明はまた、ヒトＩＬ−３Ｒα抗体を有効成分とする、骨髄性悪性腫瘍、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対する治療薬および診断薬の発明に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍について
悪性腫瘍（癌）は、わが国における死亡原因の第一位を占め、さらに患者数は年々増加してきており、有効性及び安全性の高い薬剤や治療法の開発が強く望まれている。悪性腫瘍を形成する原因として、放射線、紫外線や各種発癌性物質によるＤＮＡの変異がある。悪性腫瘍に関する研究は、これら遺伝的な変化を分子生物学的に同定することに注力されてきた。その結果、多数の変異の蓄積などにより腫瘍化が引き起こされると考えられている。いくつかの決定的な変異については細胞株のモデルなどにより腫瘍化に直結することが示されてきている。本発明の対象疾患の一つである白血病においては、染色体異常が多く認められ、分類されている。その多くが染色体転座であり、おもな染色体転座についてはすでに転座関連遺伝子が同定されている。転座関連遺伝子の機能解析により、その遺伝子が白血病の発症に関与する例が知られている。
癌幹細胞について
一方、細胞生物学的な見地から、正常組織同様に幹細胞が悪性腫瘍の起源であるとする、いわゆる癌幹細胞仮説が古くから提唱されてきている。幹細胞は、自己複製能と多分化能を有する細胞であると定義され、一般に全能性幹細胞と組織幹細胞に大別される。組織幹細胞は、血液系、肝臓、神経系など特定の組織・臓器の起源であり、極めて低い頻度で存在する。中でも造血幹細胞はもっとも研究が進んでいる。致死量の放射線照射により造血系を破壊したマウスに対し、１個の造血幹細胞を移植することで長期にわたって造血系を再建できることが報告されている（非特許文献１）。癌幹細胞は、正常幹細胞と異なり、長い間その実体を捉えられず、研究が遅れていた。しかし、１９９７年にＤｉｃｋらにより、急性骨髄性白血病においてはじめて癌幹細胞が同定された。以後、様々な悪性腫瘍において癌幹細胞の存在が報告されている。総合すると、腫瘍全体の数％以下の頻度で存在し、正常幹細胞同様に希少な細胞である。腫瘍を形成する残りの細胞は増幅能力の制限された腫瘍前駆細胞または腫瘍細胞であると考えられる。
【０００３】
これらの報告により、腫瘍においても正常組織同様にヒエラルキーが存在し、その頂点（起源）にある癌幹細胞が強い腫瘍形成能を有することが示された。
癌幹細胞の特性と治療上の問題
多くの報告を総合すると、癌幹細胞は正常幹細胞の持つ様々な特性を保持していると考えられる。たとえば、希少な細胞であること、微小環境（ｎｉｃｈｅ）に存在すること、多剤耐性遺伝子を発現すること、細胞周期が止まっていること、などに関する類似性が挙げられる。
【０００４】
なかでも、正常幹細胞同様に多剤耐性遺伝子群を発現することと、細胞周期の休止期に存在するという特性は治療上の大きな問題点となりうる。多剤耐性遺伝子ＢＣＲＰは様々な抗癌剤を細胞外に排出することで薬効を減弱させるポンプであり、その活性を利用した幹細胞の採取法が報告されている（非特許文献２）。また、細胞周期の休止期に存在し「冬眠」状態にあること（非特許文献３）は、癌の早い細胞増殖に着目した多くの抗癌剤や放射線に対する感受性の低下を招いている（非特許文献４及び５）。
【０００５】
以上のこれらの特性により、治療に抵抗性を示す癌幹細胞が腫瘍再発の原因と考えられている。
分子標的薬について
悪性腫瘍の治療は、抗癌剤療法、放射線療法、外科的切除の３つが主な方針となる。血液腫瘍においては、抗癌剤療法と放射線療法に限られ、癌幹細胞がこれらの治療に対する抵抗性を持ちうることは前述したとおりである。もう一つの問題は、この二つの治療は影響が全身に及ぶため、副作用が大きいことである。この問題に対する解決手段と期待されるのが分子標的医薬である。標的分子が発現している細胞でのみ薬効を発揮することにより、副作用が軽減できる可能性を有する。
【０００６】
分子標的医薬の血液疾患領域における代表的な薬剤として、イマチニブとリツキシマブが挙げられる。イマチニブは、ＣＭＬ患者の９５％に観察される染色体異常（フィラデルフィア染色体）により産生される、Ｂｃｒ−Ａｂｌという白血病化因子を標的とするものである。Ｂｃｒ−Ａｂｌの機能を阻害することにより、白血病細胞の自殺を誘導する低分子医薬品である。リツキシマブは、Ｂ細胞上の表面分子であるＣＤ２０を認識する抗体医薬品で、Ｂ細胞の悪性腫瘍（非ホジキンリンパ腫など）に対して、抗腫瘍効果を有する。一方、ＡＭＬに対する分子標的薬は少なく、ＡＭＬ細胞表面抗原として知られるＣＤ３３に対するモノクローナル抗体に抗生物質カリケアマイシンを結合させた薬剤ゲムツズマブ・オゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）のみである。しかしながらＭｙｌｏｔａｒｇは、カリケアマイシンに由来すると考えられる毒性が強く、治療範囲が狭いことと相まって利用が制限されているのが現状である。以上のことから、新たな標的遺伝子の発見とそれに対する治療薬の開発は、治療の可能性と選択肢の拡大に直結する重要な発明であるといえる。
【０００７】
分子標的薬の形態として、抗体医薬品、低分子医薬品をはじめとし、ペプチド医薬品、サイトカインなど生体内蛋白製剤、ｓｉＲＮＡ、アプタマーなど、様々なものが研究・開発されている。治療薬としての抗体の使用は、その特異性から、疾患細胞が特異的抗原を発現する病態の治療に有用である。抗体は、細胞表面に発現する蛋白質を抗原として結合し、結合した細胞に有効に作用する。抗体は、血中半減期が長く、抗原への特異性が高いという特徴を持ち、抗腫瘍剤としても非常に有用である。例えば、腫瘍特異的な抗原を標的とした抗体であれば、投与した抗体は腫瘍に集積し、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）や抗体依存的細胞性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を介した腫瘍細胞への攻撃が期待できる。また、抗体に放射性物質や細胞毒性物質などを結合させることで、薬剤を効率よく腫瘍部位に送達し作用させることが可能となる。同時に、非特異的な他組織への薬剤到達量を減少でき、副作用の軽減も期待できる。腫瘍特異的抗原が細胞死を誘導するような活性を有する場合は、アゴニスティックな活性を持つ抗体を投与することで、また、腫瘍特異的抗原が細胞の増殖及び生存に関与する場合は中和活性を持つ抗体を投与することで、腫瘍の増殖停止又は退縮が期待できる。抗体は、上記のその特徴から抗腫瘍剤として利用するのに適していると考えられる。
抗体医薬品について
当初の抗体作製は、免疫対象動物としてマウスが使用された。しかしながら、多数の理由によりマウス抗体の医薬品としての使用は制限される。ヒト体内において外来物と認識されうるマウス抗体は、いわゆる「ヒト抗マウス抗体」すなわち「ＨＡＭＡ」応答を惹起させうる（非特許文献６）。さらに、マウス抗体のＦｃ部分は、ヒト補体またはヒト免疫細胞を介した疾患細胞の攻撃に有効ではない。
【０００８】
このような問題を回避するためのアプローチのひとつとしてキメラ抗体が開発された（特許文献１及び２）。キメラ抗体は、２つまたはそれ以上の種由来の抗体の一部（マウス抗体の可変領域及びヒト抗体の定常領域など）を含む。このようなキメラ抗体の利点はマウス抗体の特徴は保持するが、ヒトＦｃを持つためヒト補体またはヒト免疫細胞を活性化することができる。しかし、このようなキメラ抗体も依然として「ヒト抗キメラ抗体」すなわち「ＨＡＣＡ」応答を惹起することが知られている（非特許文献７）。
【０００９】
さらに、置換された抗体の一部のみが相補性決定領域（「ＣＤＲ」）である組換え抗体が開発された（特許文献３及び４）。ＣＤＲ移植技術を使用し、マウスＣＤＲ、ヒト可変部フレームワーク及びヒト定常領域からなる抗体、所謂「ヒト化抗体」が作製可能となっている（非特許文献８）。さらに、ヒト抗体産生マウスの使用、或いはヒト抗体ライブラリーを用いたスクリーニングにより、完全ヒト抗体の作製に関しても、汎用性のある技術が提供されている（非特許文献９及び１０）。
ＩＬ−３Ｒαについて
ＩＬ３Ｒαは、ＩＬ−３受容体のα鎖で、サイトカイン受容体ファミリーに属し、リガンドであるＩＬ−３と弱い結合性を示す。β鎖（ＣＤ１３１、以後、ＩＬ−３Ｒβとも表現する）とヘテロ受容体を形成することで強い結合を有するＩＬ−３受容体となり、β鎖の細胞内部位を通じて増殖・分化等のシグナルを細胞内に伝達する。β鎖は、ＩＬ−５受容体α鎖、ＧＭ−ＣＳＦ受容体α鎖と共有している。
【００１０】
ＩＬ−３Ｒαは１回膜貫通のＩ型膜タンパクで、膜外領域には、ＩＬ−３結合部位、フィブロネクチンタイプＩＩＩ部位が存在することが配列上から知られている。膜内領域にはシグナルを伝達し得る構造はないことが知られている。ＩＬ−３Ｒαの立体構造は解読されていないが、サイトカイン受容体はファミリー間で、構造上重要なＳ−Ｓ結合を形成するＣｙｓｔｅｉｎｅ残基の位置は多くは保存されており、構造は類似していると推定できる。同じサイトカイン受容体の中では、ＩＬ−１３受容体α鎖、ＩＬ−４受容体α鎖、ＧＭ−ＣＳＦ受容体α鎖の結晶構造が解析されている。これらのサイトカイン受容体ファミリーの情報より、ＩＬ−３Ｒαの膜外領域は大きく３ドメイン（Ａ−Ｂ−Ｃドメイン）に分かれていることが推定できる。ヒトＩＬ−３ＲαのＡドメインを認識する抗体７Ｇ３はＩＬ−３シグナルをブロックすることが知られている（非特許文献１１）。さらに、Ａドメインを欠損したＩＬ−３Ｒα分子が発現していることが報告されており（非特許文献１２）、当然ながらＡドメインを認識する抗体はＡドメイン欠損型ＩＬ−３Ｒαを認識することはできない。また、Ｃドメインは、ＩＬ−３Ｒα分子の根元であり、ＩＬ−３ＲβとＩＬ−３Ｒαの会合を立体的に阻害する可能性が高いと考えられる。
【００１１】
ＩＬ−３Ｒαのリガンドとして唯一知られているのは、ＩＬ−３である。ＩＬ−３は、以下のコロニー形成を促進することが知られている造血因子である：赤血球、巨核球、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、単球系細胞。ＩＬ−３は、多分化能を有する前駆細胞を刺激することも知られているが、どちらかというと、自己複製能を有する未熟な幹細胞ではなく、分化方向の定められた（Ｃｏｍｍｉｔｉｎｇな）前駆細胞の分化を促進すると言われている。
【００１２】
ＩＬ−３Ｒαは、β鎖とヘテロダイマーを形成してＩＬ−３シグナルをＳｅｒｉｎｅ／Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅリン酸化経路を介して細胞内に伝達し、骨髄系の細胞の増殖・分化に関わっていることが知られている。ＩＬ−３Ｒαの発現は、造血前駆細胞の中でもＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ＭａｃｒｏｐｈａｇｅＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒ（ＧＭＰ）或いはＣｏｍｍｏｎ  ＭｙｅｌｏｉｄＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒ（ＣＭＰ）に発現していることが知られており、ＩＬ−３シグナルを介して好中球、マクロファージ系への増殖・分化を誘導する。一方、ＣＭＰの下流にあるＭｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ（ＭＥＰ）は、同じくＣＭＰの下流にあるＧＭＰとは異なり、ＩＬ−３Ｒαの発現がないことが報告されている。
【００１３】
ＡＭＬ幹細胞に関しては、ＢｏｎｎｅｔとＤｉｃｋはＡＭＬ幹細胞がＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性の画分に存在することを報告し（非特許文献１３）。さらに、Ｊｏｒｄａｎらは、正常幹細胞の同じ画分（ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性）と比較することで、ＩＬ−３ＲαがＡＭＬ幹細胞に高発現していることを見出した（非特許文献１４）。以後の複数の論文でも、ＡＭＬ幹細胞のみならず、白血病幹細胞のマーカーとしてのＩＬ−３Ｒαの高いポテンシャルは報告されている（非特許文献１５及び１６）。白血病を含む癌治療においては、正常細胞をできるだけ傷害せずに、がん細胞のみを除去することが重要であり、このＩＬ−３Ｒαの正常幹細胞と白血病幹細胞の発現の差は、白血病幹細胞をターゲティングする治療に有用であると考える。
【００１４】
ＩＬ−３Ｒαとヘテロダイマーを形成するＩＬ−３Ｒβに関しては、白血病幹細胞において高発現している報告は存在せず、実際に白血病幹細胞と正常幹細胞のｍＲＮＡ発現を比較したマイクロアレイにおいても、白血病幹細胞において発現が亢進している分子として同定されていない（非特許文献１７）。
【００１５】
ＩＬ−３に依存する白血病細胞の存在は古くから知られているが、古い研究では白血病細胞の殆どを占める芽球に着目した研究である。今日の白血病幹細胞の研究においては、白血病幹細胞は増殖を極力控えることで抗癌剤耐性を獲得するといわれている。また、ＩＬ−３反応性の芽球は増殖性が高いと考えられ、それらの細胞は通常の抗癌剤治療が有効であると推測される。
【００１６】
ＩＬ−３Ｒ受容体をターゲットとした薬剤の候補としては、古くはＩＬ−３そのものが造血不全の患者に投与されたが、結果的に医薬品になっていない。ＩＬ−３にジフテリア毒素を付加した融合タンパクが、白血病を対象疾患として臨床試験実施中である。ＩＬ−３及びジフテリア毒素付加ＩＬ−３に関しては、ＩＬ−３の性質から、ＩＬ−３Ｒα単独のタンパクに対してではなく、ＩＬ−３Ｒαとβのヘテロタンパクに強く結合するため、ＩＬ−３Ｒαが特異的に発現上昇している細胞をターゲットとしている薬剤としては適していない。一方、ＩＬ−３Ｒαをターゲットとする薬剤候補としては、ＩＬ−３Ｒαのヒトマウスキメラ抗体７Ｇ３が第１相の結果が報告されている（非特許文献１８）。７Ｇ３キメラ抗体は、ＩＬ−３シグナルをブロックすることをＡＭＬ治療のメカニズムとしており、ＩＬ−３Ｒα陽性細胞の除去を目的とした薬剤ではない。また、その他にもＩＬ−３Ｒα抗体はいくつか知られている（９Ｆ５（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）、６Ｈ６（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）、ＡＣ１４５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ社））ものの、ＩＬ−３Ｒα高発現細胞の除去能を有していはいない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１２０６９４号
【特許文献２】欧州特許出願公開第１２５０２３号
【特許文献３】英国特許出願公開第ＧＢ２１８８６３８Ａ号
【特許文献４】米国特許第５５８５０８９号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｏｓａｗａ  Ｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７３：２４２−５（１９９６）
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｅｌｌ  ＭＡら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８３：１７９７−８０６（１９９６）
【非特許文献３】Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．２５：３５１５−２３（２００６）
【非特許文献４】Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｆら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：１３１５−２１．（２００７）
【非特許文献５】Ｂａｏ  Ｓら，Ｎａｔｕｒｅ．４４４：７５６−６０（２００６）
【非特許文献６】Ｓｃｈｉｆｆら，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．，４５，８７９−８８５（１９８５）
【非特許文献７】Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７０：２１５３−２１５７（１９８９）
【非特許文献８】Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）
【非特許文献９】Ｉｓｈｉｄａ  Ｉら，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．４：９１−１０２（２００２）
【非特許文献１０】Ｗｕら，ＪＭｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９：１５１−６２（１９９９）
【非特許文献１１】Ｓｕｎら，Ｂｌｏｏｄ，８７：８３（１９９６）
【非特許文献１２】Ｃｈｅｎら，ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８４：５７６３（２００９）
【非特許文献１３】Ｂｏｎｎｅｔら，ＮａｔＭｅｄ，１９９７；３：７３０
【非特許文献１４】Ｊｏｒｄａｎら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０００；１４：１７７７
【非特許文献１５】Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２００１；８６：１２６１
【非特許文献１６】、ＬｅｕｋＬｙｍｐｈｏｍａ，２００６；４７：２０７
【非特許文献１７】Ｍａｊｅｔｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００９；１０６：３３９６
【非特許文献１８】Ｂｌｏｏｄ，２００８１１２（１１）：Ａｂｓｔｒａｃｔ２９５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、白血病幹細胞のみを除去することが可能で、かつ正常細胞に悪影響を及ぼしにくい（副作用の少ない）治療薬を提供することである。具体的にはＩＬ−３シグナルを阻害せず、かつヒトＩＬ−３Ｒα鎖のＢドメインに結合し、Ｃドメインには結合しない、ヒトＩＬ−３Ｒα鎖に対する抗体、該抗体を含む組成物、該抗体を用いた治療方法、または、検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は以下の（１）〜（９）に関する。
（１）ＩＬ−３シグナルを阻害せず、かつヒトＩＬ−３Ｒα鎖のＢドメインに結合し、Ｃドメインには結合しない、ヒトＩＬ−３Ｒα鎖に対する抗体。
（２）さらに高い抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を有する、上記（１）記載の抗体。
（３）高い抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）が、ＩＬ−２で培養したＰＢＭＣを用いたＣｏｌｏｎ−２６／ｈＣＤ１２３ＡＤＣＣ測定法において、抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬ以下で特異的溶解率１０％となる、上記（１）または（２）記載の抗体。
（４）以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択された重鎖のＣＤＲと軽鎖のＣＤＲのアミノ酸配列を有する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗体。
（ａ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１１３〜１１５で示されるアミノ酸配列および軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１３１〜１３３で示されるアミノ酸配列
（ｂ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１１６〜１１８で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１３４〜１３６で示されるアミノ酸配列
（ｃ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１１９〜１２１で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１３７〜１３９で示されるアミノ酸配列
（ｄ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１２２〜１２４で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１４０〜１４２で示されるアミノ酸配列
（ｅ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１２５〜１２７で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１４３〜１４５で示されるアミノ酸配列
（５）以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体。
（ａ）配列番号５３で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５５で示されるアミノ酸配列の２３番目のバリン（Ｖ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｂ）配列番号５７で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５９で示されるアミノ酸配列の２３番目のバリン（Ｖ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｃ）配列番号６１で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６３で示されるアミノ酸配列の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｄ）配列番号６５で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６７で示されるアミノ酸配列の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｅ）配列番号６９で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３８番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号７１で示されるアミノ酸配列の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
（ｆ）（ａ）から（ｅ）で示される重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域に１から３個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域。
（６）（１）から（５）のいずれかに記載のＩＬ−３Ｒα抗体を有効成分として含むことを特徴とする、被検体において、骨髄または末梢血にＩＬ−３Ｒαが発現している細胞が認められる血液腫瘍を予防又は治療するための組成物。
（７）（１）から（５）のいずれかに記載のＩＬ−３Ｒα抗体を有効成分とする組成物を被検体に対して投与することを含む骨髄または末梢血にＩＬ−３Ｒαが発現している細胞が認められる血液腫瘍の治療方法。
（８）（１）から（５）のいずれかに記載のＩＬ−３Ｒα抗体を含むことを特徴とする、被験体からの生物学的検体において、骨髄または末梢血にＩＬ−３Ｒα発現している細胞が認められる血液腫瘍を検出するための組成物。
（９）上記血液腫瘍が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、（１）から（５）のいずれかに記載の組成物又は方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、ＩＬ−３シグナルを阻害せず、かつヒトＩＬ−３Ｒα鎖のＢドメインに結合し、Ｃドメインには結合しない、ヒトＩＬ−３Ｒα鎖に対する抗体、該抗体を含む組成物、該抗体を用いた治療方法、検出方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ラベル化抗ＩＬ−３Ｒα抗体を用いたＩＬ−３Ｒα／ＧＭ−ＣＳＦＲαキメラタンパク発現細胞のフローサイトメトリー解析の結果である。
【図２】図２は、ラベル化抗ＩＬ−３Ｒα抗体を用いたＩＬ−３Ｒα／ＧＭ−ＣＳＦＲαキメラタンパク発現細胞のフローサイトメトリー解析の結果である。
【図３】図３は、ラベル化抗ＩＬ−３Ｒα抗体を用いたＩＬ−３Ｒα／ＧＭ−ＣＳＦＲαキメラタンパク発現細胞のフローサイトメトリー解析の結果である。
【００２３】
【図４】図４は、ヒトＩＬ−３Ｒα分子のＡ及びＢドメインの核酸及びアミノ酸配列のうち、分子の外側に配置された領域１〜７をＧＭ−ＣＳＦＲα配列に置換した領域部分を点線で示した図である。
【図５】図５は、ＩＬ−３シグナルのブロッキング能を検討した細胞株増殖試験の結果である。縦軸に細胞増殖阻害率（％）、横軸に各種ＩＬ−３Ｒα抗体名を示す。
【図６】図６は、ＩＬ−３シグナルのブロッキング能を検討したコロニーアッセイ試験の結果である。ＧＭはＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ系、ＥはＥｒｙｔｈｒｏｉｄ系コロニー、ＧＥＭＭは混合コロニーによる結果を示す。
【００２４】
【図７】図７は、担ガンモデルにおける各種ヒト抗体の抗腫瘍効果を検討した結果である。縦軸は、ＭＯＬＭ１３細胞数、横軸に各種抗ＩＬ−３Ｒα抗体名をそれぞれ示している。
【図８】図８は、抗ＩＬ−３Ｒα抗体によるＩＬ−３Ｒα発現細胞株に対するＡＤＣＣ試験の結果である。図８はＩＬ−２でｃｕｌｔｕｒｅしていないＰＢＭＣを、図９はＩＬ−２でｃｕｌｔｕｒｅしたＰＢＭＣを使用した。
【図９】図９は、抗ＩＬ−３Ｒα抗体によるＩＬ−３Ｒα発現細胞株に対するＡＤＣＣ試験の結果である。
【図１０】図１０は、抗ＩＬ−３Ｒα抗体をＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体で検出したカニクイザルＩＬ−３Ｒα強制発現細胞のフローサイトメトリー解析の結果である。上段はカニクイザルＩＬ−３Ｒα発現細胞を、下段はヒトＩＬ−３Ｒαの発現細胞をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（特定の好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書に用いられるセクションの見出しは、組織化の目的のためのみであり、記載される主題に限定されると解釈されるべきではない。本出願に引用される全ての引用文献は、任意の目的のために本明細書について参照として明白に援用される。
（概要）
本発明は、ＩＬ−３シグナルを阻害せず、かつヒトＩＬ−３受容体α鎖（以下、ＩＬ−３Ｒαと略記する）のＢドメインに結合し、Ｃドメインには結合しない、ヒトＩＬ−３Ｒα鎖に対する抗体に関する。
【００２６】
白血病幹細胞の細胞表面にはＩＬ−３受容体（以下、ＩＬ−３Ｒと略記する）、とりわけＩＬ−３Ｒαが発現している。通常、ＩＬ−３シグナルを細胞内に伝え増殖・分化を誘導するのはＩＬ−３受容体β鎖（以下、ＩＬ−３Ｒβと略記する）である。
したがって、ＩＬ−３シグナルを阻害することは、正常幹細胞による正常な造血を阻害し得る等の副作用の懸念がある。そこで、白血病幹細胞をターゲットとする新たな治療法としては、ＩＬ−３Ｒαをターゲットとし、さらにＩＬ−３シグナルを阻害しないことが望ましい。
（ＩＬ−３Ｒα）
ＩＬ−３Ｒα遺伝子がコードするタンパク質はサイトカイン受容体ファミリーに属するＩ型膜貫通蛋白質である。ＩＬ−３Ｒα分子は、正常細胞においては、造血前駆細胞の一部、好塩基球、樹状細胞の一部などに発現している。腫瘍においては、造血系の腫瘍・白血病における発現が主に知られている。ＩＬ−３Ｒαを発現している腫瘍の例としては、ＡＭＬや急性転化したＣＭＬの芽球、白血病幹細胞とされる分化マーカー陰性ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性の画分においては、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＭＤＳ、ＡＬＬ、ＳＭにおいて発現していることが知られている。ＩＬ−３Ｒαの既知のリガンドであるＩＬ−３は、血液中では活性化Ｔ細胞、ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ細胞、肥満細胞、巨核球系の一部の細胞が発現している。また、ＩＬ−３Ｒαは、ＣＤ１２３とも呼ばれる。ＩＬ−３Ｒαには、哺乳類（例えば、霊長類、ヒト）型ＩＬ−３Ｒαが含まれる。ヒトＩＬ−３ＲαなどのＩＬ−３Ｒα配列には、多型変異体が含まれる。全長ヒトＩＬ−３Ｒαの具体例としては、以下のアミノ酸配列があげられる。
ＭＶＬＬＷＬＴＬＬＬＩＡＬＰＣＬＬＱＴＫＥＤＰＮＰＰＩＴＮＬＲＭＫＡＫＡＱＱＬＴＷＤＬＮＲＮＶＴＤＩＥＣＶＫＤＡＤＹＳＭＰＡＶＮＮＳＹＣＱＦＧＡＩＳＬＣＥＶＴＮＹＴＶＲＶＡＮＰＰＦＳＴＷＩＬＦＰＥＮＳＧＫＰＷＡＧＡＥＮＬＴＣＷＩＨＤＶＤＦＬＳＣＳＷＡＶＧＰＧＡＰＡＤＶＱＹＤＬＹＬＮＶＡＮＲＲＱＱＹＥＣＬＨＹＫＴＤＡＱＧＴＲＩＧＣＲＦＤＤＩＳＲＬＳＳＧＳＱＳＳＨＩＬＶＲＧＲＳＡＡＦＧＩＰＣＴＤＫＦＶＶＦＳＱＩＥＩＬＴＰＰＮＭＴＡＫＣＮＫＴＨＳＦＭＨＷＫＭＲＳＨＦＮＲＫＦＲＹＥＬＱＩＱＫＲＭＱＰＶＩＴＥＱＶＲＤＲＴＳＦＱＬＬＮＰＧＴＹＴＶＱＩＲＡＲＥＲＶＹＥＦＬＳＡＷＳＴＰＱＲＦＥＣＤＱＥＥＧＡＮＴＲＡＷＲＴＳＬＬＩＡＬＧＴＬＬＡＬＶＣＶＦＶＩＣＲＲＹＬＶＭＱＲＬＦＰＲＩＰＨＭＫＤＰＩＧＤＳＦＱＮＤＫＬＶＶＷＥＡＧＫＡＧＬＥＥＣＬＶＴＥＶＱＶＶＱＫＴ（配列番号１）
ヒトＩＬ−３Ｒα細胞外ドメインの具体例としては、以下のアミノ酸配列があげられる。
ＭＶＬＬＷＬＴＬＬＬＩＡＬＰＣＬＬＱＴＫＥＤＰＮＰＰＩＴＮＬＲＭＫＡＫＡＱＱＬＴＷＤＬＮＲＮＶＴＤＩＥＣＶＫＤＡＤＹＳＭＰＡＶＮＮＳＹＣＱＦＧＡＩＳＬＣＥＶＴＮＹＴＶＲＶＡＮＰＰＦＳＴＷＩＬＦＰＥＮＳＧＫＰＷＡＧＡＥＮＬＴＣＷＩＨＤＶＤＦＬＳＣＳＷＡＶＧＰＧＡＰＡＤＶＱＹＤＬＹＬＮＶＡＮＲＲＱＱＹＥＣＬＨＹＫＴＤＡＱＧＴＲＩＧＣＲＦＤＤＩＳＲＬＳＳＧＳＱＳＳＨＩＬＶＲＧＲＳＡＡＦＧＩＰＣＴＤＫＦＶＶＦＳＱＩＥＩＬＴＰＰＮＭＴＡＫＣＮＫＴＨＳＦＭＨＷＫＭＲＳＨＦＮＲＫＦＲＹＥＬＱＩＱＫＲＭＱＰＶＩＴＥＱＶＲＤＲＴＳＦＱＬＬＮＰＧＴＹＴＶＱＩＲＡＲＥＲＶＹＥＦＬＳＡＷＳＴＰＱＲＦＥＣＤＱＥＥＧＡＮＴＲＡＷＲＴＳＬ（配列番号２）
また、ＩＬ−３Ｒαの細胞外ドメインは、Ａ〜Ｃの３つのドメインに分けられる。
【００２７】
Ａドメインとは、配列番号２のアミノ酸の１８番目のグルタミン（Ｑ）から１００番目のセリン（Ｓ）まで、Ｂドメインとは、配列番号２のアミノ酸の１０１番目のグリシン（Ｇ）から２０３番目のセリン（Ｓ）まで、Ｃドメインとは、配列番号２のアミノ酸の２０４番目のグルタミン（Ｑ）から３０８番目のロイシン（Ｌ）までの領域を有する。
さらに、ＡおよびＢドメインのうち、分子の外側に配置される領域とは、以下の７領域があげられる。
領域１とは、配列番号２のアミノ酸の５５番目のアスパラギン酸（Ｄ）から６１番目のプロリン（Ｐ）まで、領域２とは、配列番号２のアミノ酸の６３番目のバリン（Ｖ）から７０番目のフェニルアラニン（Ｆ）まで、領域３とは、配列番号２のアミノ酸の９１番目のセリン（Ｓ）から９８番目のグルタミン酸（Ｅ）まで、領域４とは、配列番号２のアミノ酸の９７番目のプロリン（Ｐ）から１０４番目のトリプトファン（Ｗ）まで、領域５とは、配列番号２のアミノ酸の１２２番目のシステイン（Ｃ）から１２８番目のプロリン（Ｐ）まで、領域６とは、配列番号２のアミノ酸の１８２番目のイソロイシン（Ｉ）から１８８番目のセリン（Ｓ）まで、領域７とは、配列番号２のアミノ酸の１９２番目のグリシン（Ｇ）から１９８番目のリシン（Ｋ）があげられる。
【００２８】
したがって、本発明の抗体としては、ＩＬ−３Ｒαの細胞外ドメインである、配列番号２記載のアミノ酸において、１０１〜２０３番目のアミノ酸配列に結合し、２０４〜３０８番目のアミノ酸配列には結合しない抗体、さらには配列番号２記載のアミノ酸配列における１８２〜１８８番目および１９２〜１９８番目のアミノ酸配列に結合する抗体があげられる。
本発明の抗体は、ＩＬ−３Ｒαの細胞外ドメインの上述した特定の領域に結合し、ＩＬ−３シグナルを阻害しない。
本発明において「ＩＬ−３シグナルを阻害せず」とは、ＩＬ−３によるＩＬ−３Ｒを介した細胞内シグナルを阻害しないことをいい、ＩＬ−３とＩＬ−３Ｒの会合を阻害しない場合及びＩＬ−３Ｒα鎖とβ鎖の結合を阻害しないことが含まれる。具体的には、実施例８における解析において、図５で示される細胞増殖阻害率が抗体の濃度を１０μｇ／ｍＬとしたときにおいて、４０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上であることをいう。本明細書において、「ＩＬ−３シグナルのブロッキング」と「ＩＬ−３シグナルの阻害」とは同意義に用いられ、区別されるものではなく、ＩＬ−３シグナルのブロッキング能とは、ＩＬ−３シグナルを阻害する能力をいう。
また、本発明の抗体は、上述の性質に加えて、高い抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を有する。
【００２９】
ＡＤＣＣ活性を有するＩＬ−３Ｒα抗体は、ＩＬ−３Ｒαを発現する細胞に結合し、ＮＫ細胞等の細胞傷害活性を有するエフェクター細胞を介してＩＬ−３Ｒα発現細胞を殺傷しうる抗体をいう。
高いＡＤＣＣ活性とは、具体的には実施例１１に記載された、ＩＬ−２培養したＰＢＭＣを用いたＣｏｌｏｎ−２６／ｈＣＤ１２３ＡＤＣＣ測定法により測定したときに、抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬ以下で特異的溶解率が１０％以上のことをいう。
【００３０】
特異的溶解率とは、抗体によるターゲット細胞の溶解度を測定した値であり、具体的には後述の実施例１１により算出される。
ＩＬ−３Ｒαを発現する細胞としては、血液腫瘍細胞（ａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ（ＡＭＬ）細胞、ｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ（ＣＭＬ）細胞、ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅｓ（ＭＤＳ）細胞、ａｃｕｔｅｌｙｍｐｈｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ（ＡＬＬ）細胞、ｃｈｒｏｎｉｃｌｙｍｐｈｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ（ＣＬＬ）細胞、多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅｍｙｅｌｏｍａ：ＭＭ）細胞、ｓｙｓｔｅｍｉｃｍａｓｔｏｃｙｔｏｍａ（ＳＭ）細胞など）、制御性Ｔ細胞（たとえば、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性細胞）、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、単球・マクロファージおよびそれに類する細胞（肝臓星細胞、破骨細胞、ミクログリア細胞、表皮内大食細胞、塵埃細胞（肺胞大食細胞）など））、好塩基球などがあげられる。
【００３１】
また、ＡＭＬ細胞、ＣＭＬ細胞、ＡＬＬ細胞、ＣＬＬ細胞、ＭＤＳ細胞、ＳＭ細胞、ＭＭ細胞、各種リンパ腫細胞にはそれぞれの腫瘍幹細胞を含む。
腫瘍幹細胞とは、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）においてＬｉｎｅａｇｅ（−）ＣＤ３４（＋）ＣＤ３８（−）骨髄細胞に代表される、腫瘍を構成する細胞群の一つである。
したがって、本発明の抗体は、高いＡＤＣＣ活性を有するため、ＩＬ−３Ｒαが発現している細胞の低減または除去を誘導する。
【００３２】
また本発明のＩＬ−３Ｒα抗体には、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される重鎖のＣＤＲ及び軽鎖のＣＤＲを有するＩＬ−３Ｒα抗体が含まれる。
（ａ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１１３〜１１５で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１３１〜１３３で示されるアミノ酸配列
（ｂ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１１６〜１１８で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１３４〜１３６で示されるアミノ酸配列
（ｃ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１１９〜１２１で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１３７〜１３９で示されるアミノ酸配列
（ｄ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１２２〜１２４で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１４０〜１４２で示されるアミノ酸配列
（ｅ）重鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１２５〜１２７で示されるアミノ酸配列かつ軽鎖のＣＤＲ１〜３が配列番号１４３〜１４５で示されるアミノ酸配列
さらに、本発明の抗体には、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有するＩＬ−３Ｒα抗体（カッコ内に、各可変領域配列が由来する後述実施例の抗体の名称を示す。）。
【００３３】
（ａ）配列番号５３で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５５で示されるアミノ酸配列の２３番目のバリン（Ｖ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。（抗体の名称：Ｏｌｄ４）
（ｂ）配列番号５７で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５９で示されるアミノ酸配列の２３番目のバリン（Ｖ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。（抗体の名称：Ｏｌｄ５）
（ｃ）配列番号６１で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６３で示されるアミノ酸配列の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。（抗体の名称：Ｏｌｄ１７）
（ｄ）配列番号６５で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３９番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６７で示されるアミノ酸配列の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。（抗体の名称：Ｏｌｄ１９）
（ｅ）配列番号６９で示されるアミノ酸配列の２０番目のグルタミン（Ｑ）から１３８番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号７１で示されるアミノ酸配列の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）から１２９番目のリジン（Ｋ）までのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。（抗体の名称：Ｎｅｗ１０２）
（ｆ）（ａ）から（ｅ）で示される重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域に１から３個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域。
（抗体）
抗体とは、最も広義に使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及びそれらの所望の生物学的活性を示す限りにおいて抗体断片も含む。
【００３４】
抗体は、成熟重鎖または軽鎖可変領域配列を含む。また、抗体は、成熟重鎖または軽鎖可変領域配列についての、抗体定常領域、相補性決定領域（ＣＤＲ）またはフレームワーク（ＦＲ）領域内部または外部での置換物などの修飾形態および変異形態も含む。特定の態様では、置換には保存的アミノ酸置換が含まれる。
また、抗体は、成熟重鎖または軽鎖可変領域配列の部分配列も含む。特定の態様では、部分配列は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）およびＶＬまたはＶＨから選択される。
【００３５】
また、抗体は異種ドメインも含む。特定の態様では、異種ドメインにはタグ、検出可能な標識または細胞傷害性薬剤が含まれる。
抗体には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、それらのいずれものイソタイプまたはサブクラスが含まれる。特定の態様では、前記抗体はＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤアイソタイプである。「モノクローナル」抗体とは、真核生物クローン、原核生物クローン、またはファージクローンを含む単一クローンに基づき、真核生物クローン、原核生物クローン、またはファージクローンを含む単一クローンから得られあるいは真核生物クローン、原核生物クローン、またはファージクローンを含む単一クローンから誘導される抗体を指す。ゆえに、「モノクローナル」抗体は、構造的に定義されるものであり、それが産生される方法ではない。
【００３６】
ＩＬ−３Ｒα抗体、抗ＩＬ−３Ｒαおよび抗ＩＬ−３Ｒα抗体とは、ＩＬ−３Ｒαと特異的に結合する抗体を指す。特異的結合とは、ＩＬ−３Ｒα中に存在するエピトープに対して選択的であるということである。特異的結合は、当技術分野で公知のアッセイ（例えば、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング）を用いて非特異的結合と区別することができる。
【００３７】
ＩＬ−３Ｒα抗体が特異的に結合する抗原エピトープの全てまたは一部が異なるタンパク質に存在する場合に、この抗体は異なるタンパク質と結合する可能性がある。そのため、ＩＬ−３Ｒα抗体は、ＩＬ−３Ｒαエピトープの配列または構造的相同性の程度に応じて、そのＩＬ−３Ｒαエピトープに対して高い配列または構造的相同性を有する別のタンパク質と特異的に結合可能性がある。よって、ＩＬ−３Ｒα抗体は、異なるタンパク質に、十分な配列または構造的相同性を有するエピトープが存在する場合に、異なるタンパク質と結合する可能性がある。
【００３８】
ＩＬ−３Ｒα抗体には、単離および精製抗体が含まれる。単離または精製ＩＬ−３Ｒα抗体を含む本発明の抗体は、ヒトを含む。
組成物の修飾語として用いられる用語「単離（された）」とは、その組成物が人の手で作られるということ、あるいは天然に存在するｉｎ  ｖｉｖｏ環境にある１種以上の他の成分から、一般に、１以上の操作ステップまたはプロセスにより分離されるということを意味する。一般に、そのように分離された組成物は、そのような組成物が通常自然に結合する１種以上の材料、例えば、１種以上のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的に含まない。そのため、単離組成物は、その組成物が自然に発生する生物の細胞中の他の生体成分から、あるいはその組成物が（例えば、合成によりまたは細胞培養により）産生される人工培地から分離されている。例えば、単離ＩＬ−３Ｒα抗体は、その抗体が産生される動物（例えば、非トランスジェニック哺乳類またはトランスジェニック哺乳類（齧歯類（マウス）または有蹄類（ウシ）動物などの））から得ることができ、他のポリペプチドおよび核酸から分離されている。よって、その動物から得られる抗体を含有する血清は単離されていると考えられる。用語「単離（された）」は、別の物理的形状を排除するものではなく、例えば、単離抗体には、抗体部分配列、キメラ、マルチマー、または誘導体化された形態が含まれ得る。
【００３９】
組成物の修飾語として用いられる用語「精製（された）」とは、その組成物が一般に自然に結合する材料のほとんどまたは実質的に全てを含まない組成物を指す。精製抗体は、一般に、抗体環境に通常存在する成分から取り出されている。そのため、抗体産生ハイブリドーマ細胞培養物から分離された抗体上清は精製されていると考えられる。よって、精製（された）は、絶対純度を要求するものではなく、関係上の比（ｃｏｎｔｅｘｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）である。さらに、「精製（された）」組成物は、１種以上の他の分子と組み合わせることができる。そのため、用語「精製（された）」は、組成物の組合せを排除するものではない。純度は、例えば、ＵＶ分光法、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、気相）、ゲル電気泳動（例えば、銀またはクーマシー染色）および配列解析（ペプチドおよび核酸）などの任意の適切な方法により決定することができる。
【００４０】
「精製（された）」タンパク質および核酸には、標準的な精製法よって得られるタンパク質および核酸が含まれる。また、この用語には、宿主細胞での組換え体発現や化学合成によって得られるタンパク質および核酸も含まれる。また、「精製（された）」は、混入物質のレベルが、ヒトまたは非ヒト動物への投与に関する監督官庁、例えば、食品医薬品局（ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）に承認されるレベルより低い組成物を指すこともある。
【００４１】
ＩＬ−３Ｒα抗体には、ＩＬ−３Ｒαと結合し、ｉｎ  ｖｉｖｏでまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば被験体において）ＩＬ−３Ｒα機能または活性をモジュレートする抗体が含まれる。本明細書において、ＩＬ−３Ｒαの活性または機能に関して用いられる場合の用語「モジュレートする」およびその文法上の変形は、ＩＬ−３Ｒαの活性または機能が検出可能なように影響、改変または変更を受けるが、ＩＬ−３シグナルを阻害することは含まれないことを意味する。よって、ＩＬ−３Ｒαの活性または機能をモジュレートするＩＬ−３Ｒα抗体は、ＩＬ−３Ｒシグナルは阻害せずに１種以上のＩＬ−３Ｒα活性または機能を検出可能なように影響、改変または変更を与える抗体であり、そのようなＩＬ−３Ｒαの活性または機能には、例えば、ＩＬ−３Ｒαリガンド（例えばＩＬ−３）とのＩＬ−３Ｒαの結合、ＩＬ−３Ｒα媒介シグナル伝達またはＩＬ−３Ｒα媒介細胞応答もしくはＩＬ−３Ｒαによりモジュレーション可能な細胞応答、あるいは本明細書に記載されているか、そうでなければ公知であるかもしくは知り得る別のＩＬ−３Ｒα活性または機能を含めることができる。
【００４２】
モジュレートすることができる非限定的な様々なＩＬ−３Ｒα活性および機能には、例えば、ＩＬ−３Ｒα媒介シグナル伝達またはＩＬ−３Ｒα媒介細胞応答もしくはＩＬ−３Ｒαによりモジュレーション可能な細胞応答、細胞増殖または増加（例えば、ＡＭＬ細胞、ＣＭＬ細胞、ＡＬＬ細胞、ＣＬＬ細胞、ＭＤＳ細胞、ＭＭ細胞、ＳＭ細胞、各種リンパ腫細胞、単球、マクロファージ、肥満細胞、好塩基球、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄球系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞など）、細胞生存またはアポトーシス（例えば、ＡＭＬ細胞、ＣＭＬ細胞、ＡＬＬ細胞、ＣＬＬ細胞、ＭＤＳ細胞、ＭＭ細胞、ＳＭ細胞、各種リンパ腫細胞、単球、マクロファージ、肥満細胞、好塩基球、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄球系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞など）、サイトカイン（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２および非Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカイン）およびインターフェロンの発現または産生、抗アポトーシスタンパク質またはプロアポトーシスタンパク質の発現または産生、ならびにそれらの障害、疾患、生理学的状態、病状および症状の処置、抑制または改善が含まれる。モジュレートされる特定のサイトカインとしては、限定されるものではないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＩＬ−２６、ＴＮＦ−α、インターフェロンγ（ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）が挙げられる。特定の抗アポトーシスタンパク質またはプロアポトーシスタンパク質発現としては、限定されるものではないが、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂａｄ、ＢｉｍおよびＭｃｌ−１が挙げられる。
よって、本明細書に記載の例示的なＩＬ−３Ｒα抗体には、１種以上のＩＬ−３Ｒα媒介シグナル伝達またはＩＬ−３Ｒα媒介細胞応答もしくはＩＬ−３Ｒαにより誘導される細胞応答、細胞増殖（例えば、ＡＭＬ細胞、ＣＭＬ細胞、ＡＬＬ細胞、ＣＬＬ細胞、ＭＤＳ細胞、ＭＭ細胞、ＳＭ細胞、各種リンパ腫細胞、単球、マクロファージ、肥満細胞、好塩基球、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄球系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞など）、細胞生存またはアポトーシス（例えば、ＡＭＬ細胞、ＣＭＬ細胞、ＡＬＬ細胞、ＣＬＬ細胞、ＭＤＳ細胞、ＭＭ細胞、ＳＭ細胞、各種リンパ腫細胞、単球、マクロファージ、肥満細胞、好塩基球、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄球系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞など）、サイトカイン（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２および他の非Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカイン、例えば、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３およびＩＬ−２６）およびインターフェロンの発現または産生（Ｔｈ１、Ｔｈ２、非Ｔｈ１／Ｔｈ２、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＩＬ−２６、ＴＮＦ−α、インターフェロンγ、およびＧＭ−ＣＳＦ（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）など）、抗アポトーシスタンパク質またはプロアポトーシスタンパク質の発現（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、Ｂａｄ、ＢｉｍまたはＭｃｌ−１）、ならびにそれらの障害、疾患、病状および症状の処置、抑制または改善をモジュレートする抗体が含まれる。特定の態様では、本発明のＩＬ−３Ｒα抗体は、ＡＭＬ細胞の増殖または生存をモジュレートし、他の血液腫瘍細胞（例えば、ＣＭＬ細胞、ＡＬＬ細胞、ＣＬＬ細胞、ＭＤＳ細胞、ＭＭ細胞、ＳＭ細胞、または各種リンパ腫細胞）の数をモジュレートし、単球、マクロファージ、肥満細胞、好塩基球、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄球系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞など非血液腫瘍細胞の増殖または生存をモジュレートし、あるいはＡＭＬ細胞、ＣＭＬ細胞、ＡＬＬ細胞、ＣＬＬ細胞、ＭＤＳ細胞、ＭＭ細胞、ＳＭ細胞、または各種リンパ腫細胞を減少、消失または枯渇させる。
ＩＬ−３Ｒα抗体には、「変異体」とも呼ばれる置換物（例えば、アミノ酸置換物）、付加物および欠失物（例えば、部分配列またはフラグメント）などの改変形態が含まれる。そのような改変抗体形態および変異体は、本発明で示されるＩＬ−３Ｒα抗体の少なくとも一部の機能または活性、例えばＩＬ−３Ｒαと結合すること、あるいはＩＬ−３Ｒαの活性または機能（例えば、ＩＬ−３Ｒαシグナル伝達）をモジュレートすることを保持する。よって、改変ＩＬ−３Ｒα抗体は、例えば、少なくとも一部のＩＬ−３Ｒα結合あるいは１種以上のＩＬ−３Ｒα機能または活性（例えば、シグナル伝達、細胞応答など）をモジュレートする能力を保持することができる。
【００４３】
本明細書において、用語「改変する」（「修飾する」）およびその文法上の変形は、組成物が参照組成物から外れているということを意味する。改変されたタンパク質、核酸および他の組成物は、非改変の参照タンパク質、核酸または他の組成物よりも高いまたは低い活性を有し、あるいは非改変の参照タンパク質、核酸または他の組成物とは異なる機能を有し得る。
【００４４】
アミノ酸置換を含むそのような抗体は、核酸によってコードされ得る。それゆえ、アミノ酸置換を含む抗体をコードする核酸配列も提供される。
用語「同一性」または「同一の」とは、２つ以上の参照される実体が同じであるということを意味する。よって、２つのタンパク質配列（例えば、ＩＬ−３Ｒα抗体）が同一である場合、それらは少なくとも参照される領域または部分内で同じアミノ酸配列を有する。「同一性領域」とは、２つ以上の参照される実体の同じである部分を指す。よって、２つのタンパク質配列が１つ以上の配列領域で同一である場合、それらはその領域内で同一性を共有する。「実質的同一性」とは、分子が、１種以上の参照分子機能または活性の少なくとも一部の機能または活性、あるいはその分子が同一性を共有する参照分子の関連／対応領域または部分を有するかあるいは有すると予測されるように、構造的にまたは機能的に保存されているということを意味する。よって、実質的同一性を有するポリペプチド（例えば、ＩＬ−３Ｒα抗体）は、参照ポリペプチド（例えば、ＩＬ−３Ｒα抗体）としての少なくとも一部の活性または機能を有するかあるいは有すると予測される。例えば、特定の一実施形態では、非改変ＩＬ−３Ｒα抗体の少なくとも一部の活性または機能を保持する１種以上の改変（例えば、１から３個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入）を有するＩＬ−３Ｒα抗体は、参照ＩＬ−３Ｒα抗体に対して実質的同一性を有すると考えられる。
【００４５】
構造的に関連したタンパク質と機能的に関連したタンパク質との違いから、機能または活性を保持するために必要な配列同一性の量は、タンパク質、領域およびその領域の機能または活性によって異なる。タンパク質ではわずか３０％アミノ酸配列同一性が存在するだけで、ある活性または機能を保持することができるが、一般には、参照配列に対してより高い、例えば、５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、または９８％の同一性が存在する。２配列間の同一性の程度は、当技術分野で公知のコンピュータープログラムや数学アルゴリズムを用いて確かめることができる。配列同一性の割合（相同性）を計算するそのようなアルゴリズムでは、一般に、比較領域にわたる配列ギャップとミスマッチを計上する。例えば、ＢＬＡＳＴ（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）検索アルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）参照，ＮＣＢＩを通じて公的に入手可能）は、以下のような例示的検索パラメーターを有する：ミスマッチ−２；ギャップ開始５；ギャップ伸長２。ポリペプチド配列比較では、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを、一般に、ＰＡＭ１００、ＰＡＭ２５０、ＢＬＯＳＵＭ６２またはＢＬＯＳＵＭ５０．ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）などのスコア行列と組み合わせて用い、ＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムも同一性の程度を定量するために用いられる（Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）；Ｐｅａｒｓｏｎ，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．１３２：１８５（２０００）；およびＳｍｉｔｈら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５（１９８１））。Ｄｅｌａｕｎａｙに基づく位相マッピングを用いてタンパク質構造的類似性を定量するためのプログラムも開発された（Ｂｏｓｔｉｃｋら，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．３０４：３２０（２００３））。
【００４６】
「保存的置換」は、生物学的に、化学的にまたは構造的に類似した残基による１個のアミノ酸の置換である。生物学的的に類似したとは、置換によって生物活性、例えば、ＩＬ−３Ｒα結合活性が破壊されないということを意味する。構造的に類似したとは、アミノ酸が同じくらいの長さの側鎖を有する（例えば、アラニン、グリシンおよびセリン）ということ、または同じくらいのサイズということを意味する。化学的類似性とは、残基が同じ電荷を有するということあるいは親水性または疎水性であるということを意味する。特定の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの一疎水性残基の別のものとの置換、あるいは一極性残基の別のものとの置換、例えば、アルギニンのリジンとの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸との置換、またはグルタミンのアスパラギンとの置換、セリンのトレオニンとの置換などが挙げられる。
【００４７】
また、改変抗体には、Ｌ−アミノ酸（およびそれらの混合物）と置換された１種以上のＤ−アミノ酸、構造的および機能的類似体、例えば、合成もしくは非天然アミノ酸またはアミノ酸類似体を有するペプチドミメティクスおよび誘導体化された形態も含まれる。改変には、環状構造、例えばアミノ末端およびカルボキシ末端の分子間の末端間アミド結合または分子内または分子間ジスルフィド結合が含まれる。
【００４８】
アミノ酸改変の非限定的なさらなる特定の例としては、ＩＬ−３Ｒαの部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）およびフラグメントが挙げられる。例示的なＩＬ−３Ｒαの部分配列およびフラグメントは、本発明の例示的ＩＬ−３Ｒα抗体が結合するＩＬ−３Ｒα配列の一部を含む。また、例示的なＩＬ−３Ｒαの部分配列およびフラグメントは、免疫原性部分、例えば、本発明の例示的ＩＬ−３Ｒα抗体が結合する配列を含むＩＬ−３Ｒαの一部も含む。
【００４９】
本発明によれば、ＩＬ−３Ｒα抗体および非改変または参照ＩＬ−３Ｒα抗体の機能または活性の少なくとも一部を保持するＩＬ−３Ｒα抗体部分配列またはフラグメントをコードする核酸が提供される。本明細書において、用語「部分配列」または「フラグメント」とは、全長分子の一部分を意味する。ＩＬ−３Ｒα抗体の部分配列は、全長ＩＬ−３Ｒα抗体よりも少なくとも１個少ないアミノ酸（例えば、アミノまたはカルボキシ末端のいずれかからの１個以上の内部または末端アミノ酸の欠失）を有する。ＩＬ−３Ｒα抗体の部分配列は、全長ＩＬ−３Ｒα抗体よりも少なくとも１個少ないアミノ酸を有する。核酸部分配列は、全長比較核酸配列よりも少なくとも１個少ないヌクレオチドを有する。よって、部分配列は、全長天然ＩＬ−３Ｒαまでの任意の長さであり得る。
【００５０】
ＩＬ−３Ｒα抗体部分配列およびフラグメントは、全長抗体としての結合親和性、全長抗体としての結合特異性、または全長抗体としての１種以上の活性または機能、例えば、ＩＬ−３Ｒαアンタゴニストまたはアゴニスト抗体の機能または活性を有し得る。抗体に関する場合の用語「機能的部分配列」および「機能的フラグメント」とは、全長参照抗体としての１種以上の機能または活性、例えば、ＩＬ−３Ｒα抗体の機能または活性の少なくとも一部を保持する抗体部分を意味する。例えば、ＩＬ−３ＲαまたはＩＬ−３Ｒαの断片と結合する抗体部分配列またはフラグメントは機能的部分配列と考えられる。
【００５１】
抗体部分配列およびフラグメントは組み合わせることができる。例えば、ＶＬまたはＶＨ部分配列は、リンカー配列によって連結することができ、それによってＶＬ−ＶＨキメラを形成することができる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）部分配列の組合せは、リンカー配列によって連結することができ、それによってｓｃＦｖ−ｓｃＦｖキメラを形成することができる。ＩＬ−３Ｒα抗体部分配列およびフラグメントは、単鎖抗体または可変領域を単独であるいは他のＩＬ−３Ｒα抗体部分配列の全てまたは一部と組み合わせて含む。
【００５２】
抗体部分配列およびフラグメントは、抗体のタンパク質分解による加水分解、例えば、全抗体のペプシンまたはパパイン消化により調製することができる。ペプシンでの酵素的切断によってもたらされた抗体部分配列およびフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２として示される５Ｓフラグメントを与える。このフラグメントは、チオール還元剤を用いてさらに切断することができ、３．５ＳＦａｂ’一価フラグメントを作り出すことができる。あるいは、ペプシンを用いた酵素的切断では、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントとＦｃフラグメントとが直接もたらされる（例えば、米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号；およびＥｄｅｌｍａｎら，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｙｍｏｌ．１：４２２（１９６７）参照）。他の抗体切断方法、例えば一価軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的もしくは化学的な方法も使用してよい。
【００５３】
タンパク質および抗体、ならびにそれらの部分配列およびフラグメントは、遺伝子工学的方法により作り出すことができる。技術は、タンパク質または抗体をコードする遺伝子の全てまたは一部を、Ｃｏｓ細胞または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主細胞中で発現させることを含む。組換え宿主細胞は、全長または部分配列、例えば、ｓｃＦｖを合成する（例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗら，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７（１９９１）、Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３（１９８８）；および米国特許第４，９４６，７７８号参照）。単鎖Ｆｖおよび抗体は、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２０３：４６（１９９１）；Ｓｈｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７９９５（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８（１９８８）、に記載されるとおりの手順で作製することができる。
【００５４】
修飾形態には、誘導体化された配列、例えば、遊離アミノ基がアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基を形成しており；遊離カルボキシ基が塩、メチルおよびエチルエステルを形成しており；遊離ヒドロキシル基（ｆｒｅｅｈｙｄｒｏｘｌ  ｇｒｏｕｐｓ）がＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成しているアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸誘導体、例えば、４−ヒドロキシプロリン（プロリンの誘導体）、５−ヒドロキシリジン（リジンの誘導体）、ホモセリン（セリンの誘導体）、オルニチン（リジンの誘導体）などが含まれる。修飾は、当技術分野で公知の方法（例えば、ＰＣＲに基づく部位特異的、欠失および挿入突然変異誘発、化学修飾および突然変異誘発、架橋など）を用いて行うことができる。
【００５５】
タンパク質（例えば、抗体）、核酸、および他の組成物の修飾形態には、付加物および挿入物が含まれる。例えば、付加は、いずれもの種類の分子の、タンパク質（例えば、抗体）、核酸または他の組成物との共有または非共有結合であり得る。一般に、付加および挿入は異なる機能または活性を与える。
付加物および挿入物には、融合（キメラ）ポリペプチドまたは核酸配列が含まれ、それらは前記配列と共有結合した参照天然（野生型）配列中には通常存在しない１種以上の分子を有する配列である。特定の例は、多機能タンパク質（例えば、多重特異性抗体）を作り出すための別のタンパク質（例えば、抗体）のアミノ酸配列である。
【００５６】
また、本発明の抗体には、異なるまたは補助機能または活性を与えるために、１つ以上の追加ドメインが共有結合しているキメラまたは融合物も含まれる。抗体には、２つ以上のアミノ酸配列が互いに結合されている、自然界では本来存在しないキメラまたは融合物が含まれる。
本発明によれば、異種ドメインを含むＩＬ−３Ｒα抗体およびＩＬ−３Ｒα抗体をコードする核酸が提供される。異種ドメインは、アミノ酸付加物または挿入物であり得るが、アミノ酸残基に限定されない。よって、異種ドメインは、種々の異なる種類の小型または大型機能的部分のいずれかからなり得る。そのような部分には、核酸、ペプチド、炭水化物、脂質または小有機化合物、例えば薬物、金属（金、銀）などが含まれる。
【００５７】
異種ドメインの非限定的な特定例としては、例えば、タグ、検出可能な標識および細胞傷害性薬剤が挙げられる。タグおよび検出可能な標識の特定の例としては、Ｔ７−、Ｈｉｓ−、ｍｙｃ−、ＨＡ−およびＦＬＡＧ−タグ；酵素（セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）；酵素基質；リガンド（例えば、ビオチン）；受容体（アビジン）；放射性核種（例えば、Ｃ１４、Ｓ３５、Ｐ３２、Ｐ３３、Ｈ３、Ｉ１２５およびＩ１３１）；電子密度試薬；エネルギー伝達分子；常磁性標識；フルオロフォア（フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン）；発色団；化学発光剤（イミダゾール、ルシフェラーゼ）；および生物発光剤が挙げられる。細胞傷害性薬剤の特定の例としては、ジフテリア毒素（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ，ｔｏｘｉｎ）、コレラ毒素およびリシンが挙げられる。
【００５８】
タンパク質（例えば、抗体）、核酸、または他の組成物と付加物または挿入物（例えば、異種ドメイン）との間に、２つの実体が異なる機能または活性を少なくとも一部維持するように、リンカー配列を挿入してよい。リンカー配列は、どちらかのドメインを促進することができまたはどちらかのドメインと相互作用することができる１種以上の特性を有していてよく、そのような特性には、フレキシブル構造、秩序二次構造が形成不能であることまたは疎水性もしくは荷電性が含まれる。フレキシブルタンパク質領域において一般に見られるアミノ酸には、グリシン、アスパラギンおよびセリンが含まれる。他の中性に近いアミノ酸、例えばトレオニンおよびアラニンもまた、リンカー配列に用いてよい。リンカー配列の長さは変動し得る（例えば、米国特許第６，０８７，３２９号参照）。リンカーには、化学架橋剤および結合剤（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇａｇｅｎｔｓ）、例えばスルホ−スクシンイミジル誘導体（スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢ）、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）、グルタル酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）および酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）がさらに含まれる。
【００５９】
付加のさらなる例としては、グリコシル化、脂肪酸、脂質、アセチル化、リン酸化、アミド化、ホルミル化、ユビキチン化、および保護または遮断基による誘導体化ならびに数多くの化学修飾のうちのいずれかが挙げられる。他の置換および可能性については当業者ならば容易に分かり、本発明の範囲内であると考えられる。
そのような修飾配列は、細胞発現またはｉｎｖｉｔｒｏ翻訳を介する組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。ポリペプチドおよび核酸配列は、当技術分野で公知の方法、例えば、自動ペプチド合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ参照）を用いた化学合成によっても作り出すことができる。
【００６０】
置換物、部分配列および付加物などの修飾および変異抗体は、ＩＬ−３Ｒα抗体の検出可能な活性を保持することができるものである。一実施形態では、修飾抗体は、ＩＬ−３Ｒα分子への結合活性を有し、エフェクター細胞を中心とした免疫システムによるＩＬ−３Ｒα発現細胞の低減または除去を誘導する。ＩＬ−３Ｒα発現細胞の機能制御に関与し、細胞の生存、増殖、休止、細胞死などを誘導する。細胞死には、アポトーシス、ネクローシス、オートファジーなどを含む。
（ＩＬ−３Ｒαのスクリーニング方法）
本発明によれば、ＩＬ−３Ｒαをスクリーニングし、検出し、同定する無細胞方法（例えば、溶液中で、固相で）および細胞に基づいた方法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏ）がさらに提供される。これらの方法は、溶液中で、ｉｎｖｉｔｒｏで生体材料またはサンプルを用いて、およびｉｎｖｉｖｏで、例えば、動物由来の細胞（例えば、リンパ球）のサンプルにおいて実施することができる。一実施形態では、方法は、生体材料またはサンプルを、ＩＬ−３Ｒαとの抗体の結合を可能にする条件下でＩＬ−３Ｒαと結合する抗体と接触させることと；ＩＬ−３Ｒαとの抗体の結合についてアッセイすることとを含む。抗体をＩＬ−３Ｒαと結合させることによりＩＬ−３Ｒαの存在が検出される。一態様では、ＩＬ−３Ｒαは細胞または組織に存在する。別の態様では、前記生体材料またはサンプルは哺乳類被験体から得られる。
【００６１】
組成物例えばタンパク質（例えば、ＩＬ−３Ｒα抗体）、材料、サンプル、または処置に関して用いられる場合の用語「接触させること」とは、その組成物（例えば、ＩＬ−３Ｒα抗体）と他の参照される実体との直接または間接相互作用を意味する。直接相互作用の特定の例は結合である。間接相互作用の特定の例は、組成物が中間分子に作用し、この中間分子が次に参照される実体に作用するという場合である。従って、例えば、細胞（例えば、リンパ球）をＩＬ−３Ｒα抗体と接触させることには、その抗体を（例えば、ＩＬ−３Ｒαとの結合を通じて）その細胞と結合させること、またはその抗体を中間物に作用させ、この中間物が次にその細胞に作用することが含まれる。
【００６２】
用語「アッセイすること」および「測定すること」ならびにその文法上の変形は、本明細書において同義的に用いられ、定性的測定または定量的測定のいずれか、あるいは定性的測定および定量的測定の両方を指す。これらの用語が結合に関して用いられる場合、本明細書に記載されており、当技術分野で公知の様々な方法を含む、相対量、結合の親和性または特異性を評価するいずれもの手段が意図される。例えば、ＩＬ−３ＲαとのＩＬ−３Ｒα抗体の結合は、フローサイトメトリーアッセイによってアッセイまたは測定することができる。
（抗体の調製）
本発明は、ＩＬ−３Ｒα陽性細胞傷害活性を有するヒトＩＬ−３Ｒα抗体を作製するための方法も提供する。一実施形態では、方法は、ヒトＦｃ組換えタンパク質とコンジュゲートされたヒトＩＬ−３Ｒα細胞外ドメインまたはＩＬ−３Ｒα遺伝子導入細胞を、ヒト免疫グロブリンを発現可能な動物（例えば、トランスジェニックマウスまたはトランスジェニックウシ）に投与すること；該動物をヒトＩＬ−３Ｒα抗体の発現についてスクリーニングすること；ヒトＩＬ−３Ｒα抗体を産生する動物を選択すること；選択された動物から抗体を単離することを含む。
【００６３】
抗体作製に適したＩＬ−３Ｒαタンパク質は、種々の標準的なタンパク質精製または組換え発現技術のうちのいずれかによって作り出すことができる。例えば、ＩＬ−３Ｒα配列は、標準的なペプチド合成技術、例えば固相合成によって作り出すことができる。タンパク質の一部分には、発現または合成されたタンパク質の精製を容易にするために、ＦＬＡＧタグ、Ｔ７タグまたはポリヒスチジン配列などのアミノ酸配列を含んでよい。そのタンパク質は細胞中で発現され、精製され得る。そのタンパク質は、組換え法によってより大きなタンパク質（例えば、融合物またはキメラ）の一部として発現され得る。免疫応答を起こすのに適したＩＬ−３Ｒαの形態には、ＩＬ−３Ｒα部分配列、例えば免疫原性フラグメントが含まれる。さらなる形態のＩＬ−３Ｒαとしては、ＩＬ−３Ｒα発現細胞、ＩＬ−３Ｒα含有調製物または細胞抽出物もしくは画分、部分精製ＩＬ−３Ｒαが挙げられる。
【００６４】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＩＬ−３Ｒαまたはその免疫原性フラグメントは、所望により、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはオボアルブミン（例えば、ＢＳＡ）などの担体とコンジュゲートされ、あるいはフロイント完全または不完全アジュバントなどのアジュバントと混合され、動物を免疫するために使用される。ハイブリドーマ技術を用いて、ＩＬ−３Ｒαに応答する免疫動物由来の脾細胞を単離し、骨髄腫細胞と融合することができる。ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体は、ＩＬ−３Ｒαまたはその免疫原性フラグメントとの反応性についてスクリーニングすることができる。
【００６５】
免疫し得る動物には、霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、またはモルモットが含まれる。初回および任意選択の追加免疫は、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、または皮下経路によるものであってよい。さらに、免疫応答を高めるために、抗原を、オボアルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリンおよび破傷風トキソイドなどの別のタンパク質と結合することができ、あるいはフロイント完全または不完全アジュバントなどのアジュバントと混合することができる。初回および任意選択の追加免疫は、腹腔内経路、筋肉内経路、眼球内経路、または皮下経路によるものであってよい。追加免疫は、同じ濃度または異なる濃度のＩＬ−３Ｒα調製物であってよく、規則または不規則な間隔であってよい。
【００６６】
動物には、ヒト遺伝子座を含むように遺伝子修飾されたものが含まれ、それを用いて、ヒト抗体を作り出すことができる。１種以上のヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック動物については、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号、ＷＯ０２／４３４７８、およびＷＯ０２／０９２８１２に記載されている。従来のハイブリドーマ技術を用いて、抗原に対して高応答物である免疫マウス由来の脾細胞を単離し、骨髄腫細胞と融合することができる。ＩＬ−３Ｒαと結合するモノクローナル抗体を得ることができる。
【００６７】
ヒトポリクローナル抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのさらなる方法は記載されている（例えば、Ｋｕｒｏｉｗａら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：８８９（２００２）；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号参照）。
【００６８】
抗体に関して用いられる場合の用語「ヒト」とは、抗体のアミノ酸配列が完全にヒトアミノ酸配列、すなわちヒト重鎖およびヒト軽鎖可変領域およびヒト定常領域であるということを意味する。よって、アミノ酸の全ては、ヒトアミノ酸でありまたはヒト抗体中に存在するものである。非ヒト抗体である抗体は、非ヒトアミノ酸残基をヒト抗体中に存在するアミノ酸残基と置き換えることによって完全ヒト抗体にし得る。ヒト抗体中に存在するアミノ酸残基、ＣＤＲ領域マップおよびヒト抗体コンセンサス残基については、当技術分野で公知である（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第４版  ＵＳＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ（１９８７）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）参照。２２の既知ヒトＶＨＩＩＩ配列を対象にした調査に基づいたヒトＶＨサブグループＩＩＩのコンセンサス配列、および３０の既知ヒトκＩ配列を対象にした調査に基づいたヒトＶＬ  κ鎖サブグループＩのコンセンサス配列については、Ｐａｄｌａｎ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９（１９９４）；およびＰａｄｌａｎＭｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９（１９９１）に記載されている。よって、ヒト抗体には、１個以上のアミノ酸残基が任意の他のヒト抗体中に存在する１個以上のアミノ酸と置換されている抗体が含まれる。
【００６９】
ＩＬ−３Ｒα抗体には、例えば、ＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ）（ＥＰ２３９，４００；  Ｗ０９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７：８０５（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：９６９（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）などの当技術分野で公知の技術を用いて作り出すことができるヒト化抗体が含まれる。ヒト化抗体を作り出すには、これまでヒトコンセンサス配列（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９（１９９４）；およびＰａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９（１９９１））が用いられてきた（Ｃａｒｔｅｒ  ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２８５（１９９２）；およびＰｒｅｓｔａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３））。
【００７０】
抗体に関して用いられる場合の用語「ヒト化」とは、抗体のアミノ酸配列がアクセプターヒト免疫グロブリン分子中に所望の抗原と特異的に結合する１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）の非ヒトアミノ酸残基（例えば、マウス、ラット、ヤギ、ウサギなど）と、Ｆｖフレームワーク領域（ＦＲ）中に１以上のヒトアミノ酸残基（ＣＤＲにフランキングするアミノ酸残基である）とを有するということを意味する。「霊長類化」と呼ばれる抗体は、アクセプターヒト免疫グロブリン分子およびフレームワーク領域のアミノ酸残基が任意のヒト残基に加えて、任意の霊長類アミノ酸残基（例えば、サル、テナガザル、ゴリラ、チンパンジーオランウータン、マカクザル）であり得るということを除けば、「ヒト化」の意味の範囲内である。免疫グロブリンのヒトＦＲ残基は、対応する非ヒト残基と置き換えることができる。よって、例えば、抗原親和性または特異性を改変する、一般には高めるために、ＣＤＲまたはヒトフレームワーク領域中の残基を、非ヒトＣＤＲまたはフレームワーク領域ドナー抗体由来の対応する残基と置き換えることができる。ヒト化抗体は、ヒト抗体にもドナーＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。例えば、ヒト抗体またはドナー非ヒト抗体には見られない特定位置でのＦＲ置換は、その位置において結合親和性または特異性ヒト抗体を改善すると予測され得る。分子モデリングに基づく抗体フレームワークおよびＣＤＲ置換は、当技術分野では周知であり、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリングや特定位置における異常フレームワーク残基を同定するための配列比較による（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）参照）。
【００７１】
ＩＬ−３Ｒα抗体にはキメラ抗体が含まれる。本明細書において、抗体に関して用いられる場合の用語「キメラ」およびその文法上の変形は、抗体のアミノ酸配列が、２つ以上の異なる種に由来する、２つ以上の異なる種から得られるまたは単離される、あるいは２つ以上の異なる種に基づく１以上の部分を含有するということを意味する。例えば、抗体の一部分はヒト（例えば、定常領域）であり得、抗体の別の部分は非ヒト（例えば、ネズミ重鎖またはネズミ軽鎖可変領域）であり得る。よって、キメラ抗体の例は、抗体の異なる部分が異なる種起源のものである抗体である。キメラ抗体は、ヒト化または霊長類化抗体とは異なり、抗体の任意の領域に異なる種の配列を有し得る。
【００７２】
キメラ抗体を作製するための方法は当技術分野で公知である（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１２５：１９１（１９８９）；ならびに米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号）。例えば、Ｍｕｎｒｏ，Ｎａｔｕｒｅ３１２：５９７（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４（１９８４）；Ｓｈａｒｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：３６４（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ３１２：６４３（１９８４）；Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ３３７：５２５（１９８９）；およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ３３９：６８（１９８９）では、ある種の抗体由来の可変領域が別の種の可変領域と置換されているキメラ抗体が記載されている。
【００７３】
また、ＩＬ−３Ｒα抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組合せを利用しても作製することができる（米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、および同第４，４１１，９９３号参照；ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：ＡＮｅｗＤｉｍｅｎｓｉｏｎｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｓｅｓ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ，およびＢｅｃｈｔｏｌ（編），１９８０年、およびＨａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，第２版１９８８年も参照のこと）。
【００７４】
本発明のヒト抗ヒトＩＬ−３Ｒα抗体は、様々な形態の可溶化型組換えヒトＩＬ−３Ｒαタンパク質またはＩＬ−３Ｒαを発現する細胞株で免疫した染色体導入マウス（ＫＭ  ｍｉｃｅ（商標））を用いて生産された（ＷＯ０２／４３４７８、ＷＯ０２／０９２８１２、およびＩｓｈｉｄａ，ら，ＩＢＣ’ｓ  １１ｔｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｍｅｅｔｉｎｇ．  Ａｂｓｔｒａｃｔ（２０００））。ヒト抗ヒトＩＬ−３Ｒα抗体は、非形質転換親細胞系ではなく、ヒトＩＬ−３Ｒα安定トランスフェクト細胞系、例えばＪｕｒｋａｔ−ＩＬ−３Ｒα細胞およびＬ９２９−ＩＬ−３Ｒα細胞を検出可能なように染色し、その抗体がヒトＩＬ−３Ｒαと特異的に結合することを示した。
【００７５】
本発明の抗体は、κ軽鎖配列またはλ軽鎖配列、天然に存在する抗体にあるような、どちらか一方の全長、それらの混合物（すなわちκ鎖配列とλ鎖配列との融合物）、およびそれらの部分配列／フラグメントを有し得る。天然に存在する抗体分子には、２つのκ軽鎖または２つのλ軽鎖が含まれている。
本発明によれば、ＩＬ−３Ｒαと特異的に結合する抗体を作製する方法がさらに提供される。一実施形態では、ＩＬ−３Ｒα抗体を作製するための方法は、所望により、ヒトＦｃ組換えタンパク質とコンジュゲートされた、ヒトＩＬ−３Ｒα、部分配列またはフラグメント（例えば、ＩＬ−３Ｒα細胞外ドメイン）を、ヒト免疫グロブリンを発現可能な動物（例えば、トランスジェニックマウスまたはトランスジェニックウシ）に投与すること、その動物をヒトＩＬ−３Ｒα抗体の発現についてスクリーニングすること、ヒトＩＬ−３Ｒα抗体を産生する動物を選択すること、及び選択された動物から抗体を単離することを含む。一態様では、この方法によりヒトＩＬ−３Ｒα抗体がＩＬ−３Ｒαアンタゴニストまたはアゴニスト活性を有するかどうかが判定される。
【００７６】
エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）、補体依存性傷害活性（ＣＤＣ活性）や、マクロファージや樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＡＤＰ活性）などが知られている。
本発明の抗ＩＬ−３Ｒαモノクローナル抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα−１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００２／３１１４０、ＷＯ００／６１７３９）や、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。本発明の抗ＩＬ−３Ｒαモノクローナル抗体にはいずれの方法を用いても、エフェクター活性を制御することができる。
【００７７】
抗体のＦｃのＮ結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加または低下させることができる。抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、デフコース化（ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄｏｒ  ｎｏｎ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）が挙げられる。デフコース化とは、α１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現することであり、フコースが結合していない抗体を取得することができる。フコースが結合していない抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。一方、抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合している抗体を取得できる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。
【００７８】
また、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性を増加または低下させることができる。例えば、ＵＳ２００７／０１４８１６５に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。また、ＵＳ６，７３７，０５６、ＵＳ７，２９７，７７５、やＵＳ７，３１７，０９１に記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。更に、上述の方法を組み合わせて、一つの抗体に使用することにより、抗体のエフェクター活性が制御された抗体を取得することができる。
本発明によれば、ベクターなどの本発明の核酸配列がさらに提供される。一実施形態では、ベクターには、ＩＬ−３Ｒα抗体、その部分配列またはフラグメントをコードする核酸配列が含まれる。
【００７９】
核酸は、様々な長さのものであり得る。本発明ＩＬ−３Ｒα抗体またはその部分配列をコードする核酸の長さは、一般に、約１００個ヌクレオチド〜６００個ヌクレオチド、あるいはそのような長さの範囲以内での任意の数値または数値域、１００〜１５０個、１５０〜２００個、２００〜２５０個、２５０〜３００個、３００〜３５０個、３５０〜４００個、４００〜４５０個、４５０〜５００個、５００〜５５０個、または約５５０〜６００個ヌクレオチド長、あるいはそのような長さの範囲以内での任意の数値または数値域または値（ａｎｙｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｖａｌｕｅ  ｏｒ  ｒａｎｇｅ  ｏｒ  ｖａｌｕｅ）に及ぶ。本発明ＩＬ−３Ｒα抗体またはその部分配列をコードする核酸と特異的にハイブリダイズする核酸の長さは、一般に、約１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜５０個、５０〜１００個、１００〜１５０個、１５０〜２００個、２００〜２５０個、２５０〜３００個、３００〜４００個、４００〜５００個、５００〜６００個ヌクレオチド、あるいはそのような長さの範囲以内での任意の数値または数値域に及ぶ。
【００８０】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」とは、リン酸エステル結合または同等物によって結合された少なくとも２つ以上のリボ−またはデオキシ−リボ核酸塩基対（ヌクレオチド）を指す。核酸には、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオシドが含まれる。核酸には、単一分子、二重分子または三重分子、環状分子または線状分子が含まれる。例示的な核酸としては、限定されるものではないが：ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノム核酸、天然に存在する核酸および非天然核酸、例えば、合成核酸が挙げられる。短い核酸およびポリヌクレオチド（例えば、１０〜２０個、２０〜３０個、３０〜５０個、５０〜１００個ヌクレオチド）は、一般に、「オリゴヌクレオチド」または一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡの「プローブ」と呼ばれる。
【００８１】
核酸は、様々な標準的なクローニング技術および化学合成技術を用いて作り出すことができる。技術としては、限定されるものではないが、抗体コード配列とアニーリング可能なプライマー（例えば、縮重プライマー混合物）を用いたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ標的の核酸増幅、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。また、核酸は、化学合成（例えば、固相ホスホアミダイト合成）または遺伝子からの転写によっても作り出すことができる。作り出された配列は、その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳し、またはプラスミドにクローニングし、増殖させた後、細胞（例えば、宿主細胞例えば酵母または細菌、真核生物（動物または哺乳類細胞あるいは植物など））で発現させることができる。
【００８２】
ベクターは、核酸の挿入または取り込みにより操作することができる媒介物である。ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、原核生物（細菌）ベクターおよび真核生物（植物、菌類、哺乳類）ベクターが挙げられる。ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたはｉｎｖｉｖｏでの核酸の発現のために用いることができる。そのようなベクターは、「発現ベクター」と呼ばれ、ＩＬ−３Ｒα抗体、その部分配列およびフラグメントをコードする核酸をはじめとする核酸の導入や、コードされるタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、溶液中でまたは固相において）、細胞においてまたはｉｎｖｉｖｏで被験体においての発現に有用である。
【００８３】
また、ベクターは、核酸の操作にも用いることができる。遺伝子操作では、「クローニングベクター」を使用して、ｉｎｖｉｔｒｏで（例えば、溶液中でまたは固相において）、細胞においてまたはｉｎ  ｖｉｖｏで被験体において、挿入された核酸を転写または翻訳することができる。
ベクターは、一般に、ｉｎｖｉｔｒｏでまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞における増殖のための複製起点を含む。ベクター内に存在する発現制御エレメントなどの制御エレメントは、必要に応じて、転写および翻訳を容易にするために含めることができる。
【００８４】
ベクターは選択マーカーを含む場合がある。「選択マーカー」は、遺伝子を含有する細胞の選択を可能にする遺伝子である。「正の選択」とは、正の選択が起こって、選択マーカーを含有する細胞を選択するプロセスを指す。薬剤耐性が正の選択マーカーの一例であり、マーカーを含有する細胞は薬剤含有培養培地中で生存し、マーカーのない細胞は死滅する。選択マーカーとしては、Ｇ４１８耐性を与えるｎｅｏ；ハイグロマイシン耐性を与えるｈｙｇｒ；およびピューロマイシン耐性を与えるｐｕｒｏなどの薬剤耐性遺伝子が挙げられる。他の正の選択マーカー遺伝子には、マーカーを含有する細胞の同定またはスクリーニングを可能にする遺伝子が含まれる。これらの遺伝子としては、とりわけ、蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびＧＦＰ様発色団、ルシフェラーゼ）遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、アルカリ性ホスファターゼ遺伝子、およびＣＤ８などの表面マーカーが挙げられる。「負の選択」とは、適切な負の選択薬剤に暴露して、負の選択マーカーを含有する細胞を死滅させるプロセスを指す。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子を含有する細胞（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））は薬剤ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）に対して感受性である。同様に、ｇｐｔ遺伝子は細胞を６−チオキサンチン感受性にする。
【００８５】
ウイルスベクターには、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ）（分裂細胞だけでなく非分裂細胞にも感染させるためのレンチウイルス）、泡沫状ウイルス（米国特許第５，６２４，８２０号、同第５，６９３，５０８号、同第５，６６５，５７７号、同第６，０１３，５１６号および同第５，６７４，７０３号；ＷＯ９２／０５２６６およびＷＯ９２／１４８２９）、アデノウイルス（米国特許第５，７００，４７０号、同第５，７３１，１７２号および同第５，９２８，９４４号）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（米国特許第５，６０４，０９０号）、単純ヘルペスウイルスベクター（米国特許第５，５０１，９７９号）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）系ベクター（米国特許第５，５６１，０６３号）、レオウイルス、ロータウイルスゲノム、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）または乳頭腫ウイルス（Ｃｏｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６３４９（１９８４）；ＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｌｕｚｍａｎ編，１９８２年；Ｓａｒｖｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：４８６（１９８１）；米国特許第５，７１９，０５４号）に基づくものが含まれる。アデノウイルスはゆっくりと複製するかつ／または最終分化した細胞に効率よく感染し、このアデノウイルスを用いて、ゆっくりと複製する細胞かつ／または最終分化した細胞を標的にすることができる。発現に有用なさらなるウイルスベクターとしては、パルボウイルス、ノーウォークウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルスおよびラブドウイルス、トガウイルス（例えば、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルス）ならびに水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）が挙げられる。
【００８６】
核酸を含むベクターは、その核酸が発現制御エレメントに機能しうる形で連結されている場合に、発現され得る。用語「機能しうる形で連結された」（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）とは、それに関するエレメント間の物理的または機能的関係によりそれらのエレメントが意図されたように機能することが可能になるということを指す。よって、発現制御エレメントに「機能しうる形で連結された」核酸とは、制御エレメントが核酸転写、必要に応じて、その転写物の翻訳をモジュレートするということを意味する。
【００８７】
「発現制御エレメント」または「発現制御配列」は、機能しうる形で連結された核酸の発現に影響を及ぼすポリヌクレオチドである。プロモーターおよびエンハンサーは、発現制御エレメントおよび配列の非限定的な特定例である。「プロモーター」は、下流（３’方向）核酸配列の転写を開始可能なシス作用ＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列には、転写開始を促進するヌクレオチドが含まれる。エンハンサーも核酸発現を調節するが、それが機能しうる形で連結されている核酸の転写開始部位から離れて作用する。エンハンサーは、核酸の５’または３’末端のいずれかに存在する場合、さらに核酸内（例えば、イントロンまたはコード配列）に存在する場合にも作用する。さらなる発現制御エレメントとしては、リーダー配列および融合パートナー配列、多重遺伝子の作出のための内在性リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）エレメント、またはポリシストロン性メッセージ、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にするための遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、目的の転写物の適切なポリアデニル化をもたらすポリアデニル化シグナル、および停止コドンが挙げられる。
【００８８】
発現制御エレメントには、機能しうる形で連結された核酸の転写がシグナルまたは刺激不在で起こる「構成的」エレメントが含まれる。シグナルまたは刺激に応答して発現を与え、機能しうる形で連結された核酸の発現を増減する発現制御エレメントは、「調節可能である」。シグナルまたは刺激に応答して機能しうる形で連結された核酸の発現を増加する調節可能なエレメントは、「誘導エレメント」と呼ばれている。シグナルまたは刺激に応答して機能しうる形で連結された核酸の発現を減少する調節可能なエレメントは、「抑制エレメント」（すなわち、シグナルは発現を減少し；そのシグナルが除去されまたは存在しない場合に、発現が増加する）と呼ばれている。
【００８９】
細菌の発現では、構成的プロモーターには、Ｔ７、ならびにバクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などの誘導プロモーターが含まれる。昆虫細胞系では、構成的または誘導プロモーター（例えば、エクジソン）が用いられ得る。酵母では、構成的プロモーターには、例えば、ＡＤＨまたはＬＥＵ２およびＧＡＬなどの誘導プロモーターが含まれる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｉｎ：ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第２巻，第１３章，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ編，１９８８年；Ｇｒａｎｔ  ら，Ｉｎ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４（１９８７），Ｗｕ＆Ｇｒｏｓｓｍａｎ編，１９８７年，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，第ＩＩ巻，第３章，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，１９８６年；Ｂｉｔｔｅｒ，Ｉｎ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２：６７３−６８４（１９８７），Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ編，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；および，Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら，ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ編，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（１９８２）参照）。
【００９０】
哺乳類の発現では、ウイルスまたは他の起源の構成的プロモーターが用いられ得る。例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、またはウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）など、または哺乳類細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインＩＩＡプロモーター；熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント）もしくは哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；マウス乳癌ウイルスＬＴＲ）由来の誘導プロモーターが用いられる。
【００９１】
発現制御エレメントには、特定の組織または細胞種において活性なエレメントが含まれ、このようなエレメントは「組織特異的発現制御エレメント」と呼ばれている。組織特異的発現制御エレメントは、一般に、特定の細胞または組織種においてより活性が高いが、これはこの組織特異的発現制御エレメントが、他の細胞または組織種と比べて、その特定の細胞または組織種において活性な転写活性化タンパク質、または他の転写調節因子により認識されるためである。そのような発現制御エレメントの非限定的な特定例は、ヘキソキナーゼＩＩ、ＣＯＸ−２、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＤＥ３／ＭＵＣ１、前立腺特異的抗原、Ｃ−ｅｒＢ２／ｎｅｕ、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）、テロメラーゼ逆転写酵素および低酸素症−応答性プロモーターなどのプロモーターである。
【００９２】
本発明によれば、本発明のＩＬ−３Ｒα核酸またはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。宿主細胞としては、限定されるものではないが、原核細胞および真核細胞、例えば細菌、真菌（酵母）、植物、昆虫、および動物（例えば、霊長類およびヒトなどの哺乳類）の細胞が挙げられる。形質転換細胞の非限定的な例としては、組換えバクテリオファージ核酸、プラスミド核酸またはコスミド核酸発現ベクターで形質転換された細菌；組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させたまたは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞；組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞；および組換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）に感染させた動物細胞、または安定な発現のために操作された形質転換動物細胞が挙げられる。ＩＬ−３Ｒα抗体、その部分配列およびフラグメントを発現する哺乳類宿主細胞の非限定的な例にはＣＨＯ細胞がある。宿主細胞は、初代細胞分離株、単離された二次細胞または継代培養細胞、あるいは株化細胞または不死化細胞培養物由来の複数の細胞または細胞集団であってよい。
【００９３】
細胞（例えば、宿主細胞）または生物に関して用いられる場合の用語「形質転換された」または「トランスフェクトされた」とは、外因性分子、例えば、タンパク質または核酸（例えば、トランスジーン）の細胞への取り込み後の細胞における遺伝子変化を意味する。よって、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」細胞は、外因性分子が人の手で、例えば、組換えＤＮＡ技術により導入されている細胞、またはその後代である。
【００９４】
核酸またはタンパク質は、細胞およびその後代において安定にまたは一時的にトランスフェクトまたは形質転換（発現）することができる。細胞を増殖させ、導入したタンパク質を発現させることができ、または核酸を転写することができる。複製中に起こる突然変異が存在する可能性があるため、トランスフェクトまたは形質転換細胞の後代は、親細胞と同一ではない場合がある。
【００９５】
一般に、細胞トランスフェクションまたは形質転換ではベクターを使用する。ベクターは、ウイルス粒子または小胞内に含めることができ、所望により、標的細胞リガンドまたは受容体と結合するその粒子または小胞表面にタンパク質を含めることによって特定の細胞種に向けることができる。よって、ウイルス粒子または小胞自体、あるいはウイルス表面のタンパク質を作って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｅｘｖｉｖｏでまたはｉｎｖｉｖｏでのトランスフェクションまたは形質転換を目的として細胞を標的にすることができる。従って、ｉｎｖｉｔｒｏで、ｉｎ  ｖｉｖｏでおよびｅｘｖｉｖｏでの細胞、組織または器官へのウイルスおよび非ウイルスベクター送達手法が含まれる。
【００９６】
また、標的細胞（例えば、宿主細胞）への核酸の導入は、浸透圧衝撃（例えば、リン酸カルシウム）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合などのような当技術分野で公知の方法によっても行うことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｅｘｖｉｖｏでおよびｉｎｖｉｖｏでの核酸およびポリペプチドの導入は、他の技術を用いても行うことができる。例えば、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、またはラクチド／グリコリドコポリマー、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、またはエチレン酢酸ビニルコポリマーなどのポリマー物質。核酸は、コアセルベーション技術によりまたは界面重合により、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセル、またはポリ（メチルメタクロレート）（ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｏｌａｔｅ））マイクロカプセルを用いて調製したマイクロカプセル中に、あるいはコロイド系中に封入することができる。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質に基づく系（水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームなど）が含まれる。
【００９７】
様々な組成物を細胞に導入するためのリポソームは、当技術分野で公知であり、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、リポフェクチンおよびＤＯＴＡＰが含まれる（例えば、米国特許第４，８４４，９０４号、同第５，０００，９５９号、同第４，８６３，７４０号、および同第４，９７５，２８２号；ならびにＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ）。遺伝子療法に有用なピペラジンに基づくアムフィリック陽イオン性脂質（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｂａｓｅｄａｍｐｈｉｌｉｃ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ）も知られている（例えば、米国特許第５，８６１，３９７号参照）。陽イオン性脂質系も知られている（例えば、米国特許第５，４５９，１２７号参照）。本明細書において、ポリマー物質、マイクロカプセルおよびコロイド分散系（リポソームなど）をまとめて「小胞」と呼ぶ。
【００９８】
さらに抗体製造方法において使用し得る好適な技術には、ＩＬ−３Ｒαに基づくアフィニティー精製、非変性ゲル精製、ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ、サイズ排除、プロテインＡカラムでの精製、あるいはこれらの技術の任意の組合せが含まれる。ＩＬ−３Ｒα抗体イソタイプは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定することができ、例えば、マウスＩｇ吸収抗ヒトＩｇを用いてヒトＩｇを同定することができる。
【００９９】
結合親和性は、結合（Ｋａ）および解離（Ｋｄ）速度によって決定することができる。平衡親和性定数、ＫＤはＫａ／Ｋｄ比である。結合（Ｋａ）および解離（Ｋｄ）速度は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定することができる（ＲｉｃｈおよびＭｙｓｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１１：５４（２０００）；Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ，Ａｎａｌｙｓｔ．１２３：１５９９（１９９８））。結合速度のリアルタイム検出およびモニタリングについての計装および方法は公知であり、市販されている（ＢｉａＣｏｒｅ２０００，Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ；およびＭａｌｍｑｖｉｓｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２７：３３５（１９９９））。ＫＤ値は、ＩＬ−３Ｒαにおける結合部位の半分（５０％）を飽和させるのに必要なＩＬ−３Ｒα抗体濃度として定義することができる。
（霊長類における交差性）
現在、５００に及ぶ抗体医薬が世界で開発されているが、ヒト抗体は免疫原性の問題を回避できる可能性が高いとされている。しかし、一方ではヒト抗体はげっ歯類では薬効がまったく認められない場合が多い。その場合、毒性試験には霊長類が用いらざるを得ない場合が多く、チンバンジーのみに反応性が認められるという場合も少なくない。チンパンジーにしか薬理反応が認められない場合には、毒性試験の制約はさらに大きくなる。そもそもチンバンジー試験を実施可能な施設が極めて限られ、個体がＨＩＶに感染していることも多く、試験従事者の労働衛生の問題も存在する。また、チンパンジーに関しては、最終投薬後の解剖試験は行えず、生殖毒性試験の実施も不可能であるなど、大きな制約がある。したがって、サル（カニクイザル及び／またはアカゲザル）において薬効を確認できることは、医薬品開発のために必須である毒性試験等を進める観点からも有用である。
【０１００】
サル交差性を確認する方法としては、免疫化学組織染色法、固相酵素免疫測定法（以下、「ＥＬＩＳＡ」）及びフローサイトメトリー（ＦＣＭ）等、公知の方法で確認することができる。
（医薬組成物）
抗体は医薬組成物に含めることができる。一実施形態では、抗体は製薬上許容される担体、安定剤または賦形剤を含んでおり、水溶液の形態又は凍結乾燥製剤として調製される。典型的には、製薬的に許容可能な適当量の塩が製剤の等張化のために用いられる。許容できる担体、安定化剤又は賦形剤は、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸等の緩衝液；低分子量（残基数１０個未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；メチオニン及びアスコルビン酸を含む抗酸化剤；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
（ＩＬ−３Ｒα発現細胞を標的とした抗腫瘍物質の治療的使用）
治療的使用が検討される疾患としては、ＩＬ−３Ｒαを発現する血液腫瘍細胞（ＡＭＬ細胞、ＣＭＬ細胞、ＭＤＳ細胞、ＡＬＬ細胞、ＣＬＬ細胞、多発性骨髄腫細胞、など）、肥満細胞、好塩基球、ヘルパーＴ細胞（たとえば、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ１７細胞）、制御性Ｔ細胞（たとえば、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性細胞）抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、単球・マクロファージおよびそれに類する細胞（肝臓星細胞、破骨細胞、ミクログリア細胞、表皮内大食細胞、塵埃細胞（肺胞大食細胞）など））に結合または標的とすることにより治療が可能な疾患が考えられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
治療的使用が検討される疾患としては、骨髄または末梢血中にＩＬ−３Ｒαの発現が認められる血液疾患が挙げられる。具体的には急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が考えられる。急性骨髄性白血病は、造血幹細胞から種々の血球に分化していく途中の細胞において、それらのどの段階の細胞が腫瘍化したかによるＦＡＢ分類（Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）に基づいてＭ０（微分化型骨髄性白血病）、Ｍ１（未分化型骨髄芽球性白血病）、Ｍ２（分化型骨髄芽球性白血病）、Ｍ３（前骨髄球性白血病）、Ｍ４（骨髄単球性白血病）、Ｍ５（単球性白血病）、Ｍ６（赤白血病）及びＭ７（巨核球性白血病）の病型、およびそれらの亜型に分類される。また、さらなる疾患としては、例えば、急性リンパ性白血病、非定型的白血病、慢性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞性白血病、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、顆粒リンパ球増多症（ＬＧＬ白血病）、真性赤血球増多症、本態性血小板血症、好酸球増多症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫およびＣａｔｓｌｅｍａｎ病が含まれる。
【０１０２】
ＩＬ−３Ｒα抗体あるいはＩＬ−３Ｒα発現細胞を標的とした抗腫瘍物質の投与または送達を含む本発明の方法は、任意の許容される方法（ａｎｙａｃｄｃｅｐｔａｂｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ）により実施することができる。特定の実施形態では、これらは被験体に局所的に、局部的に、または全身的に投与される。
また、上記の疾患を治療するためにＩＬ−３Ｒα抗体あるいはＩＬ−３Ｒα発現細胞を標的とした抗腫瘍物質は、同様の疾患に好適な他の治療剤（典型的には化学療法剤）と組み合わせや放射線療法との併用も考慮することができる。好適な他の治療剤としては、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、アントラサイクリン系の抗腫瘍剤（典型的には、ダウノルビシン（ＤＮＲ）、イダルビシン（ＩＤＡ））等の化学療法剤、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＴＲＡ）、亜ヒ酸やＡｍ８０（タミバロテン）等の分化誘導療法剤、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（オゾガマイシンコンジュゲート抗ＣＤ３３抗体）、トポテカン、フルダラビン、シクロスポリン、ミトキサントロン（ＭＩＴ）、インターフェロン及び、イマチニブが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、臨床上有効とされる治療法との組合せも含まれる。
【０１０３】
本発明により治療可能な被験体には、哺乳類（例えば、ヒト）が含まれる。特定の実施形態では、血液腫瘍の疑いのある被験体であるかあるいは血液腫瘍の治療を受けた被験体；ＩＬ−３Ｒα媒介細胞応答の疑いのある被験体であるかあるいはＩＬ−３Ｒα媒介細胞応答の治療を受けた被験体；骨髄性悪性腫瘍の疑いのある被験体であるかあるいは骨髄性悪性腫瘍の治療を受けた被検体；急性骨髄性白血病の疑いのある被験体であるかあるいは急性骨髄性白血病の治療を受けた被検体。
【０１０４】
本明細書において、用語「治療する」、「治療（すること）」、「処置」およびその文法上の変形は、患者において生理学的効果または転帰を得ることが望ましい各被験体または患者において行われるプロトコール、計画、過程または改善法を意味する。よって、本発明の方法には、とりわけ、特定の被験体の障害、疾患、生理学的状態、病状または症状において測定可能な改善または有益な効果をもたらす処置および治療法が含まれる。測定可能な改善または有益な効果は、障害、疾患、生理学的状態、病状または症状におけるいずれもの他覚的もしくは自覚的、過度的、一時的、または長期的改善、あるいはその障害、疾患、生理学的状態、病状または状態に関連または起因する有害な症状の発症、重症度、期間または頻度の軽減である。本発明方法では必ずしもすぐに効果が現れず、少し遅れて、時間の経過で最終的な改善または有益な効果が認められる可能性があり、特定の被験体において安定化または改善が起こる。
【０１０５】
特に断りのない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する技術分野の業者には一般に明らかなものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験に、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を使用することができるが、本明細書に記載しているものが好適な方法および材料である。
【実施例】
【０１０６】
実施例１  ヒト・カニクイザル・アカゲザルＩＬ−３Ｒα発現細胞の作製
（ＩＬ−３ＲαｃＤＮＡの分子クローニング及び発現ベクターの作製）
ヒトＩＬ−３ＲαｃＤＮＡは血液細胞由来ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨＨｕｍａｎＭＴＣＰａｎｅｌ）よりＥｘＴａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ装置はＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（アプライドバイオシステムズ、以下、本明細書においてＰＣＲ装置は同様である）を用いた。ＰＣＲ反応は９４℃５分間の変性段階につづいて、９４℃３０秒−５５℃３０秒−７２℃２分の３ステップ反応を４０サイクル行った後、９９℃３０秒の反応を行った。用いたＰＣＲプライマーは以下のとおり；
ＩＬ−３Ｒα＿Ｆｗ：５’−ＣＧＧＣＡＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＣＡＣ−３’（配列番号３）
ＩＬ−３Ｒα＿Ｒｅ：５’−ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣＣＴ−３’（配列番号４）
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。１．２ｋｂ付近のバンドを切り出し、ＤＮＡをＪｅｔＳｏｒｂ（Ｇｅｎｏｍｅｄ社）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡをＭｆｅＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで切断したｐＥＧＦＰ−Ｎ１ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）或いはｐＥＦ６／Ｍｙｃ−Ｈｉｓｖｅｃｔｏｒと混合し、ＴａＫａＲａ  ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔを用い連結した。形質転換は、ライゲーションサンプルとＤＨ１０Ｂコンピテント細胞と混合し、ＬＢプレート（カナマイシン含有）へ撒いた。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１  ｖｅｃｔｏｒのインサートチェックは、ＬＡ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲにより行った。ＰＣＲ反応は９４℃５分間の変性段階につづいて、９４℃３０秒−５５℃３０秒−７２℃２分の３ステップ反応を４０サイクル行った後、９９℃３０秒の反応を行った。用いたＰＣＲプライマーはＩＬ−３Ｒα＿Ｆｗ及びＩＬ−３Ｒα＿Ｒｅを用いた。
【０１０７】
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。１．２ｋｂ付近の増幅が得られたコロニーを対象に、ダイレクトシークエンシング法により塩基配列を決定した。シークエンスサンプルの反応はＢｉｇＤｙｅ（Ｒ）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）とＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステムズ）を用いた（本明細書における全てのＤＮＡ配列解析でこれらを使用）。プライマーはＩＬ−３Ｒα＿Ｆｗ、ＩＬ−３Ｒα＿Ｒｅ及び次のプライマーを用いた：
ＩＬ−３Ｒα＿ｓｅｑＦ１：５’−ＧＴＣＴＴＣＡＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＧＡＴ−３’（配列番号５）
シークエンス解析装置はＡＢＩ３７００ＸＬ  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）を用いた。ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ＿００２１７４．１のコーディングリージョンと同一の配列を有するクローンを選定し、ミニプレップ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。ベクター名はそれぞれ、ｐＥＧＦＲ−Ｎ１／ｈＣＤ１２３、ｐＥＦ６／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｈＣＤ１２３とする。
【０１０８】
インサート（ＭｆｅＩからＮｏｔＩまで）の配列は以下のとおり：
ＣＡＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＧＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＣＧＡＡＣＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＴＡＡＣＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣＣＧＡＴＡＴＣＧＡＧＴＧＴＧＴＴＡＡＡＧＡＣＧＣＣＧＡＣＴＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＧＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＴＡＧＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＧＣＡＡＴＴＴＣＣＴＴＡＴＧＴＧＡＡＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＣＣＡＣＣＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＧＣＣＴＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＣＧＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＴＧＧＡＴＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＣＣＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧＡＣＧＴＣＣＡＧＴＡＣＧＡＣＣＴＧＴＡＣＴＴＧＡＡＣＧＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＧＣＧＴＣＡＡＣＡＧＴＡＣＧＡＧＴＧＴＣＴＴＣＡＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＧＡＴＧＣＴＣＡＧＧＧＡＡＣＡＣＧＴＡＴＣＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＣＴＣＴＣＧＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＣＡＡＡＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＧＧＴＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧＴＣＧＴＣＴＴＴＴＣＡＣＡＧＡＴＴＧＡＧＡＴＡＴＴＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＣＡＴＧＡＣＴＧＣＡＡＡＧＴＧＴＡＡＴＡＡＧＡＣＡＣＡＴＴＣＣＴＴＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＣＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＴＧＡＧＣＴＴＣＡＧＡＴＡＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡＴＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＣＧＴＡＣＡＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＡＡＧＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＣＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＡＧＴＧＣＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＣＡＡＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＴＣＴＧＴＧＴＣＴＴＣＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＴＡＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＧＣＡＴＣＣＣＴＣＡＣＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＴＣＧＧＴＧＡＣＡＧＣＴＴＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＣＴＧＡＡＧＴＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号６）
カニクイザル及びアカゲザルＩＬ−３ＲαｃＤＮＡは、カニクイザル骨髄由来ｃＤＮＡ或いはアカゲザル骨髄由来ｃＤＮＡよりＬＡＴａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ装置はＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（アプライドバイオシステムズ）を用いた。ＰＣＲ反応は９５℃１分間の変性段階につづいて、９５℃１５秒−５６℃１５秒−７２℃７０秒の３ステップ反応を４０サイクル行った後、７２℃２分の反応を行った。ｈＩＬ−３ＲＡｃＤＮＡ配列を基に、公共のアカゲザルゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｓｃ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ．ｈｇｓｃ）に対するＢＬＡＳＴ検索により部分配列を取得し、プライマーを設計した。用いたプライマー配列は以下のとおりである：
Ｒｈｅ１２３Ｆｗ１：ＣＧＧＣＡＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧ（配列番号７）
Ｒｈｅ１２３Ｒｖ１：ＴＡＴＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣ（配列番号８）
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。１．２ｋｂ付近のバンドを切り出し、ＤＮＡをＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）と混合し、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い連結した。形質転換は、ライゲーションサンプルとＤＨ１０Ｂコンピテント細胞と混合し、ＬＢプレート（アンピシリン含有）へ撒いた。ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙｖｅｃｔｏｒのインサートチェックは、ＬＡＴａｑ（Ｔａｋａｒａ社）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲにより行った。ＰＣＲ反応は９５℃１分間の変性段階につづいて、９５℃１５秒−５６℃１５秒−７２℃１分の３ステップ反応を３５サイクル行った後、７２℃２分の反応を行った。プライマーは以下を用いた：
Ｔ７：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号９）
ＳＰ６：ＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ（配列番号１０）
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。１．２ｋｂ付近の増幅が得られたコロニーを対象に、ダイレクトシークエンシング法により塩基配列を決定した。ＰＣＲプライマーはＴ７及びＳＰ６を用いた。ＰＣＲによる変異の認められないクローンを選定し、ミニプレップ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡをＭｆｅＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで開裂したｐＥＧＦＰ−Ｎ１ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）と混合し、ＴａＫａＲａＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔを用い連結した。形質転換は、ライゲーションサンプルとＤＨ１０Ｂコンピテント細胞と混合し、ＬＢプレート（カナマイシン含有）へ撒いた。
【０１０９】
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ｖｅｃｔｏｒのインサートチェックは、ＬＡＴａｑ（Ｔａｋａｒａ社）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲにより行った。ＰＣＲ反応は９４℃５分間の変性段階につづいて、９４℃３０秒−５５℃３０秒−７２℃２分の３ステップ反応を４０サイクル行った後、９９℃３０秒の反応を行った。用いたＰＣＲプライマーはＲｈｅ１２３Ｆｗ１及びＲｈｅ１２３Ｒｖ１を用いた。
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。１．２ｋｂ付近の増幅が得られたコロニーを対象に、ダイレクトシークエンシング法により塩基配列を決定した。シークエンスサンプルの反応はＢｉｇＤｙｅ（Ｒ）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）とＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステムズ）を用いた（本明細書における全てのＤＮＡ配列解析でこれらを使用）。プライマーはＲｈｅ１２３Ｆｗ１及びＲｈｅ１２３Ｒｖ１を用いた。ベクター名はそれぞれ、ｐＥＧＦＲ−Ｎ１／ｃｙＣＤ１２３、ｐＥＧＦＲ−Ｎ１／ｒｈＣＤ１２３、とする。
【０１１０】
カニクイザルＩＬ−３Ｒαのインサート（ＭｆｅＩからＮｏｔＩまで）の配列は以下のとおりである：
ＣＡＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＧＣＣＡＣＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＡＣＣＡＡＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＴＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＧＡＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＴＧＴＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＧＧＣＡＡＴＧＡＡＣＡＡＣＡＧＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＴＴＣＧＧＡＧＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＡＴＧＴＧＡＡＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＧＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＧＧＡＣＧＣＣＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＣＧＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＴＧＡＣＧＴＧＧＡＴＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧＴＣＣＡＧＴＡＣＧＡＣＣＴＧＴＡＣＴＴＧＡＡＣＡＡＴＣＣＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＧＧＴＧＣＣＴＴＣＡＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＧＡＴＧＣＴＣＧＧＧＧＡＡＣＡＣＡＧＡＴＣＧＧＧＴＧＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＴＣＧＡＣＴＣＴＣＣＣＧＣＧＧＴＴＣＴＣＡＡＡＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＧＧＧＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＣＣＧＴＣＡＧＴＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＡＣＡＧＡＴＴＧＡＧＡＧＡＴＴＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＣＡＴＧＡＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＴＧＡＧＡＣＡＣＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＣＡＴＴＴＣＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＴＣＣＧＣＴＡＴＧＡＧＣＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡＴＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＡＧＧＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＣＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＣＧＴＡＣＡＣＡＧＴＧＣＡＡＡＴＡＡＧＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＡＧＴＧＣＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＴＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＣＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＴＡＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣＧＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＴＣＧＧＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＡＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号１１）
アカゲザルＩＬ−３Ｒαのインサート（ＭｆｅＩからＮｏｔＩまで）の配列は以下のとおりである：
ＣＡＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＧＣＣＡＣＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＡＣＣＡＡＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＴＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＧＡＡＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＴＧＴＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＧＧＣＡＡＴＧＡＡＣＧＡＣＡＧＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＴＴＣＧＧＡＧＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＡＴＧＴＧＡＡＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＧＧＡＣＧＣＣＴＣＧＧＧＣＡＧＧＣＧＣＧＧＡＧＡＡＴＴＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＴＧＡＣＧＴＧＧＡＴＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＴＡＧＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＣＴＧＡＣＧＴＣＣＡＧＴＡＣＧＡＣＣＴＧＴＡＣＴＴＧＡＡＣＡＡＴＣＣＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＧＧＴＧＣＣＴＴＣＧＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＧＡＴＧＣＴＣＧＧＧＧＡＡＣＡＣＡＧＡＴＣＧＧＧＴＧＴＣＧＧＴＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＴＣＧＡＣＴＣＴＣＣＣＧＣＧＧＴＴＣＴＣＡＡＡＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＧＧＧＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＣＣＧＴＣＡＧＴＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＡＣＡＧＡＴＴＧＡＧＡＧＡＴＴＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＣＡＴＧＡＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＴＡＡＴＧＡＧＡＣＡＣＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＣＡＴＴＴＣＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＣＴＡＴＧＡＧＣＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡＴＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＡＧＧＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＣＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＣＧＴＡＣＡＣＡＧＴＧＣＡＡＡＴＡＡＧＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＴＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＡＧＴＧＣＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＴＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＣＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＴＡＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣＧＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＴＣＧＧＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＡＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号１２）
（ＩＬ−３Ｒα強制発現細胞株の作製）
Ｌ９２９細胞（ＡＴＣＣ製）及びＣｏｌｏｎ−２６細胞（ＡＴＣＣ製）に、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ｖｅｃｔｏｒ／ｈＣＤ１２３またはｐＥＦ６／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  ｖｅｃｔｏｒ／ｈＣＤ１２３をエレクトロポレーション（ＢＴＸ）を用いて感染させた。具体的には、１０−２０μｇのＤＮＡを１０万細胞と混ぜ、３００Ｖ、９５０μＦで反応させた。細胞は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１／ｈＣＤ１２３ではネオマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、ｐＥＦ６／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｈＣＤ１２３ではブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて薬剤耐性細胞を選抜した。選抜した細胞は、さらにフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ、ＦＡＣＳＡｒｉａなど、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によりＧＦＰ陽性細胞或いはＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）の高発現の細胞をソーティングにより選抜し、Ｌ９２９／ｈＣＤ１２３、及びＣｏｌｏｎ−２６／ｈＣＤ１２３と命名した。
【０１１１】
カニクイザルＩＬ−３Ｒα及びアカゲザルＩＬ−３Ｒα強制発現細胞の作製に関しても、ヒトＩＬ−３Ｒα強制発現細胞株と同様にＬ９２９及びＣｏｌｏｎ−２６を用いて作製し、Ｌ９２９／ｃｙＣＤ１２３、Ｃｏｌｏｎ−２６／ｃｙＣＤ１２３、Ｌ９２９／ｒｈＣＤ１２３、Ｃｏｌｏｎ−２６／ｒｈＣＤ１２３と命名した。
実施例２  可溶化型細胞外ＩＬ−３Ｒα蛋白質の作製
（可溶化型細胞膜外ヒトＩＬ−３Ｒα蛋白質発現ベクターの調製）
ヒトＩＬ−３Ｒαの細胞外領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、下流にＦＬＡＧタグを連結した。具体的には、ヒトＩＬ−３Ｒαの細胞外領域をコードするｃＤＮＡはｐＥＦ６／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｈＣＤ１２３プラスミドＤＮＡを鋳型としＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｕ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は９６℃２分間の変性段階につづいて、９６℃２０秒−５５℃３０秒−６８℃６５秒の３ステップ反応を３０サイクル行った。用いたＰＣＲプライマーはＩＬ−３Ｒα＿Ｆｗ及び以下のプライマーを用いた：
ｈＩＬ−３Ｒαｓｏｌ−ＦＬＡＧ−ＮｏｔＩ：５’−ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＧＴＧＴＧＴＴＴＧ−３’（配列番号１３）
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。ＤＮＡをＪｅｔＳｏｒｂ（Ｇｅｎｏｍｅｄ社）を用いて抽出した。精製されたＤＮＡをＭｆｅＩとＮｏｔＩで消化し、再度０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥ  ｂｕｆｆｅｒ）を行った。１．０ｋｂ付近のバンドを切り出し、ＤＮＡを、ＪｅｔＳｏｒｂ（Ｇｅｎｏｍｅｄ社）を用いて抽出した。精製されたＤＮＡと同一酵素で解裂されていたｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ／Ｂｓｄベクターを混合し、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い連結した。形質転換は、ライゲーションサンプルとＤＨ１０Ｂコンピテント細胞と混合し、ＬＢプレート（アンピシリン含有）へ撒いた。インサートチェックは、ＬＡＴａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲにより行った。ＰＣＲ反応は９５℃１分間の変性段階につづいて、９５℃１５秒−５６℃１５秒−７２℃４０秒の３ステップ反応を３５サイクル行った後、７２℃２分間の伸長反応を行った。用いたＰＣＲプライマーはＩＬ−３Ｒα＿Ｆｗ及びＩＬ−３Ｒαｓｏｌ−ＦＬＡＧ−ＮｏｔＩ。
【０１１２】
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。１．０ｋｂ付近の増幅が得られたコロニーからミニプレップ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。精製したｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡはＤＮＡ配列解析によりＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＮＰ＿００２１７４．１の当該領域と同一の配列を有することを確認した。
【０１１３】
インサート（ＭｆｅＩからＮｏｔＩまで）の配列は以下のとおりである：
ＣＡＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＧＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＣＧＡＡＣＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＴＡＡＣＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣＣＧＡＴＡＴＣＧＡＧＴＧＴＧＴＴＡＡＡＧＡＣＧＣＣＧＡＣＴＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＧＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＴＡＧＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＧＣＡＡＴＴＴＣＣＴＴＡＴＧＴＧＡＡＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＣＣＧＴＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＣＣＡＣＣＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＧＣＣＴＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＣＧＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＴＧＧＡＴＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＣＣＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧＡＣＧＴＣＣＡＧＴＡＣＧＡＣＣＴＧＴＡＣＴＴＧＡＡＣＧＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＧＣＧＴＣＡＡＣＡＧＴＡＣＧＡＧＴＧＴＣＴＴＣＡＣＴＡＣＡＡＡＡＣＧＧＡＴＧＣＴＣＡＧＧＧＡＡＣＡＣＧＴＡＴＣＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＣＴＣＴＣＧＡＣＴＣＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＣＡＡＡＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＧＧＧＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＧＧＴＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧＴＣＧＴＣＴＴＴＴＣＡＣＡＧＡＴＴＧＡＧＡＴＡＴＴＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＣＡＴＧＡＣＴＧＣＡＡＡＧＴＧＴＡＡＴＡＡＧＡＣＡＣＡＴＴＣＣＴＴＴＡＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＣＡＡＴＣＧＣＡＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＴＧＡＧＣＴＴＣＡＧＡＴＡＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡＴＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＣＧＴＡＣＡＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＡＡＧＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧＡＧＣＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＡＧＴＧＣＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＣＡＡＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号１４）
（可溶化型ヒトＩＬ−３Ｒα蛋白質の調製）
可溶化ＩＬ−３Ｒα配列を含むｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ発現ベクターのプラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔにより精製した。発現のための宿主細胞には、ＣＨＯｒａｓ１細胞を用いた。ＣＨＯｒａｓ１細胞はＳＦＭ  ＩＩ培地（インビトロジェン社）を用いて振とう培養した（３７℃、５％  ＣＯ２）。
遺伝子導入にはＰＥＩ法を用いた。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ，Ｌｉｎｅａｒ，ＭＷ２５，０００（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を秤量し、ＨＣｌでｐＨ７．０付近に調整しながらＰＢＳ中に溶解させた（１ｇ／Ｌ）。１時間攪拌後、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ミリポア社）でろ過滅菌した。精製したプラスミドＤＮＡ  １ｍｇとＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２０ｍＬを混合し、溶液Ａとした。ＰＥＩ溶液（１ｇ／Ｌ）２．５ｍＬとＯｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２０ｍＬを混合し、溶液Ｂとした。溶液Ａと溶液Ｂを混合し、１０分間静置した後、ＣＨＯｒａｓ１細胞（１ｍＬあたり細胞１００００００個）に添加した。６日後、細胞上清を回収し、蛋白精製に用いた。
【０１１４】
培養上清からの可溶化型ＩＬ−３Ｒα蛋白質の精製は以下の方法で行った。可溶化型ＩＬ−３Ｒα蛋白質を含む培養上清を遺伝子導入から６日後に遠心分離により回収し、フィルターを通過させた。トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で５倍希釈し、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧＭ２ＡｇａｒｏｓｅＡｆｆｉｎｉｔｙＧｅｌ（シグマ社）を用いて作製しＡｎｔｉ−ＦＬＡＧカラムにＨｉＬｏａｄ  Ｐｕｍｐ  Ｐ−５０（ファルマシアバイオテック社）を用いてアプライした。溶出はＦＬＡＧペプチド（シグマ社）を用い、マニュアルに従った。溶出液をフラクションに分画し、各フラクションを還元条件化でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（マルチゲルＩＩミニ１０／２０％グラジエントゲル；コスモバイオ社）後、銀染色およびウェスタンブロッティングを行った。銀染色は銀染色試薬「第一」（第一化学社）を用いた。ウェスタンブロッティングには、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（シグマ社）とアルカリフォスファターゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体を用いた。目的の蛋白質が認められたフラクションをアミコンウルトラ−４  １０Ｋ（ミリポア社）を用いて濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｇｐ（ＧＥヘルスケア社）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。分画し、各フラクションを還元条件化でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（マルチゲルＩＩミニ１０／２０％グラジエントゲル；コスモバイオ社）後、銀染色およびウェスタンブロッティングを行った。銀染色は銀染色試薬「第一」（第一化学社）を用いた。ウェスタンブロッティングには、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（シグマ社）とアルカリフォスファターゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体を用いた。目的の蛋白質が認められたフラクションをアミコンウルトラ−４  １０Ｋ（ミリポア社）を用いて濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ミリポア社）でろ過滅菌し、可溶化型ヒトＩＬ−３Ｒα蛋白質を得た。リムルスＥＳ−ＩＩキットワコー（和光純薬社）を用いたリムルステストの結果、エンドトキシンは検出されなかった。可溶化型ＩＬ−３Ｒα蛋白質の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬを１．４ＯＤとして算出した。
実施例３  ヒト抗体産生マウスを用いた抗ヒトＩＬ−３Ｒαヒト抗体の作製
（ヒト抗体産生マウス）
免疫に用いたマウスは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体の遺伝的背景を有しており、かつ、ヒトＩｇ重鎖遺伝子座を含む１４番染色体断片（ＳＣ２０）及びヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を同時に保持する。このマウスはヒトＩｇ重鎖遺伝子座を持つ系統Ａのマウスと、ヒトＩｇκ鎖トランスジーンを持つ系統Ｂのマウスとの交配により作製された。系統Ａは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウス系統であり、例えば富塚らの報告［Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，２０００  Ｖｏｌ９７：７２２］に記載されている。また、系統Ｂは内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、ヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を保持するマウス系統（トランスジェニックマウス）であり、例えばＦｉｓｈｗｉｌｄらの報告［Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，（１９９６），ｌ１４：８４５］に記載されている。
【０１１５】
系統Ａの雄マウスと系統Ｂの雌マウス、あるいは系統Ａの雌マウスと系統Ｂの雄マウスの交配により得られた、血清中にヒトＩｇ重鎖及びκ軽鎖が同時に検出される個体［Ｉｓｈｉｄａ＆Ｌｏｎｂｅｒｇ，ＩＢＣ’ｓ  １１ｔｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２０００］を、以下の免疫実験に用いた。なお、前記ヒト抗体産生マウス（ＫＭマウスと称する）は、契約を結ぶことによって、協和発酵キリン株式会社より入手可能である。
（ヒトＩＬ−３Ｒαに対するヒトモノクローナル抗体の作製）
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行  １９９１）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。免疫原としてのＩＬ−３Ｒαは、ＩＬ−３Ｒα発現Ｌ９２９細胞（ＣＣＬ−１、ＡＴＣＣ）、ＩＬ−３Ｒα発現Ｃｏｌｏｎ−２６細胞（ＣｅｌｌＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＡｇｉｎｇａｎｄＣａｎｃｅｒＴｏｈｏｋｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）あるいは可溶化型ヒトＩＬ−３ＲαヒトＦｃ融合蛋白質を用いた。被免疫動物として上記のＫＭマウスを用いた。
【０１１６】
ヒトＩＬ−３Ｒαに対するヒトモノクローナル抗体の調製を目的として、ＫＭマウスに、実施例１で作製したＩＬ−３Ｒα発現Ｌ９２９細胞或いはＩＬ−３Ｒα発現Ｃｏｌｏｎ−２６細胞を腹腔内に１週間〜２週間おきに１×１０７細胞／匹の用量で、合計４回免疫した。以下に述べる脾臓の摘出３日前に、可溶化型ヒトＩＬ−３Ｒα蛋白質２０μｇ／マウス個体を尾静脈投与した。
免疫されたマウスから脾臓を外科的に取得し、ＰＢＳ中に入れ、メッシュ（セルストレイナー：ファルコン社）上でシリンジのピストンを用いてつぶした。メッシュを通過した細胞懸濁液を遠心して細胞を沈澱させた後、Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（シグマ社）で再懸濁した。室温で５分間のインキュベーションの後、３５０ｍｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム、５０単位／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む無血清ＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）（以下「無血清ＤＭＥＭ培地」という）を加え、細胞を沈澱させた。再度、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞数を測定した。
【０１１７】
一方、ミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−１５８１）は１０％ＦＣＳ（インビトロジェン社）、５０単位／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）（以下、「血清入りＤＭＥＭ培地」という）にて、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。ＳＰ２／０細胞を同様に無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁して細胞数を測定した。回収した脾臓由来細胞の懸濁液とマウスミエローマ懸濁液とを細胞数５：１で混合し、遠心後、上清を完全に除去した。このぺレットに、融合剤として５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ベーリンガーマンハイム社）を、ピペットの先でぺレットを撹拌しながらゆっくり添加した後、予め３７℃に加温しておいた無血清ＤＭＥＭ培地をゆっくり添加した。さらに適量の無血清ＤＭＥＭ培地をゆっくり添加した。その後、３７℃、５％炭酸ガス存在下で５分間静置した。遠心後、上清を除去して得られた融合細胞を、１０％ＦＣＳ（インビトロジェン社）、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（シグマ社）、ＩＬ−６（５ｎｇ／ｍＬ）、２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社）を含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）（以下、「ＩＬ−６入りＤＭＥＭ培地」という）に懸濁し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。翌日、細胞をピペッティングにより回収し、遠心により沈殿した細胞ペレットをＩＬ−６入りＤＭＥＭ培地に再懸濁した。懸濁した細胞は、９６穴プレートに限界希釈し、７日〜１４日間ほど培養した。その培養上清は下の実施例に示すハイブリドーマスクリーニングに用いた。
（ヒトＩＬ−３Ｒαに結合するヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング）
上の実施例で作製した細胞上清を用いてハイブリドーマのスクリーニングを行った。方法は、簡単には、ヒトＩＬ−３Ｒα安定発現細胞株を利用したフローサイトメトリー法で行った。
【０１１８】
具体的には、ヒトＩＬ−３Ｒα発現Ｌ９２９細胞及び親株Ｌ９２９細胞の組み合わせ、或いはヒトＩＬ３Ｒα発現Ｃｏｌｏｎ−２６細胞及び親株Ｃｏｌｏｎ−２６細胞の組み合わせで、それぞれハイブリドーマの上清と混合し、４℃、３０分間静置した。ステイニングメディウム（２％牛胎児血清、２ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ）で２回洗浄後、二次抗体としてＧｏａｔ  Ｆ（ａｂ’）２Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−ＰＥ（サザンバイオテック社）を加え、４℃、３０分間静置した。ステイニングメディウムで２回洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で解析した。ヒトＩＬ−３Ｒα発現Ｌ９２９細胞のみと反応したハイブリドーマを採取した。
【０１１９】
選抜したハイブリドーマは、限界希釈を行い、その培養上清を用いてスクリーニングを実施した。具体的には、ヒトＩＬ−３Ｒα発現Ｌ９２９細胞及び親株Ｌ９２９細胞を、それぞれハイブリドーマの上清と混合し、４℃、３０分間静置した。ステイニングメディウムで２回洗浄後、二次抗体としてＧｏａｔＦ（ａｂ’）２Ａｎｔｉ−ＨｕｍａｎＫａｐｐａ−ＰＥ（Ｄａｋｏ社）を加え、４℃、３０分間静置した。ステイニングメディウムで２回洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で解析した。ヒトＩＬ−３Ｒα発現Ｌ９２９細胞のみと反応したハイブリドーマを採取した。
実施例４  組み換え抗ヒトＩＬ−３Ｒαヒト抗体の作製
（ハイブリドーマからの抗ヒトＩＬ−３Ｒα抗体遺伝子の取得及び発現ベクターの作製）
実施例３にて取得したハイブリドーマより、クローン名Ｏｌｄ４、Ｏｌｄ５、Ｏｌｄ１７、Ｏｌｄ１９、Ｎｅｗ１０２及びＯｌｄ６を１０ｎｇ／ｍＬＩＬ−６（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社）、１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＳＩＧＭＡ社）含有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社）で培養し、遠心分離により細胞を集めた後ＴＲＩＺＯＬ（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、取扱説明書にしたがってＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抗体ｃＤＮＡの可変領域のクローニングは、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クローンテック社）を用い、添付の説明書にしたがって行った。
【０１２０】
またコントロールとして用いる抗ヒトＩＬ−３Ｒαマウス抗体７Ｇ３を生産するハイブリドーマＡＴＣＣ、ＨＢ１２００９より、可変領域をクローニングし、得られたｃＤＮＡとヒトＩｇＧ１定常領域をコードするＤＮＡとを連結させて、キメラ抗体発現ベクターを作製した。具体的には、凍結保存されたハイブリドーマを遠心分離により細胞を集めた後ＴＲＩＺＯＬ（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、取扱説明書にしたがってＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抗体ｃＤＮＡの可変領域のクローニングは、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クローンテック社）に加え、マウスＩｇＧ抗体特異的なプライマーを用い、添付の説明書にしたがって行った。
【０１２１】
５μｇのｔｏｔａｌＲＮＡを鋳型として、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを作製した。
１）１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  の合成
ＴｏｔａｌＲＮＡ  ５μｇｍ／３μＬ
５’ＣＤＳ  １μＬ
ＳＭＡＲＴｏｌｉｇｏ  １μＬ
上記組成の反応液を７０℃で２分間インキュベートした後、
５×Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ
ＤＴＴ  １μＬ
ＤＮＴＰｍｉｘ  １μＬ
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  １μＬ
を加え４２℃で１．５時間インキュベートした。
【０１２２】
さらに、１００μＬのＴｒｉｃｉｎｅＢｕｆｆｅｒを加えた後、７２℃で７分間インキュベートし、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを取得した。
２）ＰＣＲによる重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の増幅及び組換え抗体発現ベクターの構築
ｃＤＮＡの増幅には、Ｔａｋａｒａ社のＺ−Ｔａｑを用いた。
ｃＤＮＡ  ２μＬ
１０ｘＺ−Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ
ｄＮＴＰｍｉｘ  ４μＬ
Ｚ−Ｔａｑ  １μＬ
プライマー１
プライマー２
上記組成の反応液を再蒸留水にて最終容量５０μＬとし、ＰＣＲに供した。
【０１２３】
重鎖の増幅には、ＵＰＭ（ＳＭＡＲＴＲＡＣＥｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ；クローンテック社）とｈｈ−６プライマー（５’−ＧＧＴＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＴＣＣＴＴ−３’）（配列番号１５）を用い、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返した。さらに、この反応液１μＬを鋳型とし、ＮＵＰ（ＳＭＡＲＴＲＡＣＥｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ；クローンテック社）とｈｈ−３プライマー（５’−ＧＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＴ  ＧＧＴ  ＣＡＧＧＧＣＧＣＣＴＧ−３’）（配列番号１６）を用いて、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを２０回繰り返した。この後、増幅したＰＣＲ産物をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社）により精製し，ｈｈ−４（５’−ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＧＡＴ  ＧＧ−３’）（配列番号１７）をプライマーとして、塩基配列の決定を行った。配列情報を基に、以下の特異的プライマーを合成し、このプライマーを用いて反対方向からも配列を決定した。
Ｏｌｄ４重鎖特異的プライマーＦｗ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＧ  Ｔ  −３’）（配列番号１８）
Ｏｌｄ４重鎖特異的プライマーＲｖ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＧＴＣＣＣ  −３’）（配列番号１９）
Ｏｌｄ５重鎖特異的プライマーＦｗ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴ  ＴＴＧ  Ｔ  −３’）（配列番号２０）
Ｏｌｄ５重鎖特異的プライマーＲｖ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＧＴＣＣＣ  −３’）（配列番号２１）
Ｏｌｄ１７重鎖特異的プライマーＦｗ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴ  ＴＴＧ  Ｔ  −３’）（配列番号２２）
Ｏｌｄ１７重鎖特異的プライマーＲｖ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＡＡＧＧＧＴＴＣＣＣ−３’）（配列番号２３）
Ｏｌｄ１９重鎖特異的プライマーＦｗ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴ  ＴＴＧ  Ｔ  −３’）（配列番号２４）
Ｏｌｄ１９重鎖特異的プライマーＲｖ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣ−３’）（配列番号２５）
Ｎｅｗ１０２重鎖特異的プライマーＦｗ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＧ  Ｔ−３’）（配列番号２６）
Ｎｅｗ１０２重鎖特異的プライマーＲｖ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴ−３’）（配列番号２７）
Ｏｌｄ６重鎖特異的プライマーＦｗ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＧＣＴＧ−３’）（配列番号２８）
Ｏｌｄ６重鎖特異的プライマーＲｖ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣ−３’）（配列番号２９）
マウス抗体７Ｇ３の重鎖の増幅には、ＵＰＭ（ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；クローンテック社）とｍＨ＿Ｒｖ１プライマー（５’−ＡＴＴＴＴＧ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  ＫＹＧ  ＧＴＳ  ＹＴＧ  ＣＴＧ  ＧＣＹ  ＧＧＧＴＧ−３’）（配列番号３０）を用い、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返した。さらに、この反応液１μＬを鋳型とし、ＮＵＰ（ＳＭＡＲＴＲＡＣＥｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ；クローンテック社）とｍＨ＿Ｒｖ２プライマー（５’−ＧＣＡＣＡＣＹＲＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣ−３’）（配列番号３１）を用いて、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを２０回繰り返した。この後、増幅したＰＣＲ産物をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社）により精製し、ｍＨ＿Ｒｖ２プライマー（配列番号３１）をプライマーとして、重鎖可変領域の塩基配列の決定を行った。配列情報を基に、以下の特異的プライマーを合成し、このプライマーを用いて反対方向からも配列を決定した。
７Ｇ３重鎖特異的プライマーＦｗ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＣ−３’）（配列番号３２）
７Ｇ３重鎖特異的プライマーＲｖ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣ−３’）（配列番号３３）
上記の特異的プライマーを用いてＰＣＲを行い（９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒）、重鎖増幅ｃＤＮＡ断片をＳａｌＩ、ＮｈｅＩで消化し、同一酵素で解裂されていたＮ５ＫＧ１−Ｖａｌ  Ｌａｒｋベクター（ＩＤＥＣＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎ５ＫＧ１（ＵＳｐａｔｅｎｔ  ６００１３５８）の改変ベクター）、に導入した。挿入された配列がｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅによって決定されたものと同一であることを、ベクターを鋳型として配列を決定することにより確認した。
【０１２４】
軽鎖は、ＵＰＭ（ＳＭＡＲＴＲＡＣＥｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ；クローンテック社）とｈｋ−２（５’−ＧＴＴ  ＧＡＡＧＣＴ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＧＣ−３’）（配列番号３４）プライマーを使って、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返して増幅した。さらに、この反応液１μＬを鋳型とし、ＮＵＰ（ＳＭＡＲＴＲＡＣＥｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ；クローンテック社）とｈｋ−６（５’−ＴＧＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＧ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  Ｇ−３’）（配列番号３５）を用いて、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを２０回繰り返した。この後、増幅したＰＣＲ産物をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社）により精製し、ｈｋ−６プライマーを用いて塩基配列を決定した。配列情報を基に、以下の特異的プライマーを合成し、反対方向からも配列を決定した。
Ｏｌｄ４軽鎖特異的プライマーＦｗ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  −３’）（配列番号３６）
Ｏｌｄ４軽鎖特異的プライマーＲｖ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣ  ＣＣＴ  Ｇ−３’）（配列番号３７）
Ｏｌｄ５軽鎖特異的プライマーＦｗ（５’−ＡＧＡ  ＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧ  ＣＴＣ  ＡＧＣ−３’）（配列番号３８）
Ｏｌｄ５軽鎖特異的プライマーＲｖ  （５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣ  ＣＣＴ  Ｇ−３’）（配列番号３９）
Ｏｌｄ１７軽鎖特異的プライマーＦｗ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＡＧ−３’）（配列番号４０）
Ｏｌｄ１７軽鎖特異的プライマーＲｖ  （５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣ  ＣＣＴ  Ｇ−３’）（配列番号４１）
Ｏｌｄ１９軽鎖特異的プライマーＦｗ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＡＧ−３’）（配列番号４２）
Ｏｌｄ１９軽鎖特異的プライマーＲｖ  （５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣ  ＣＴＴ  ＧＧＣ−３’）（配列番号４３）
Ｎｅｗ１０２軽鎖特異的プライマーＦｗ  （５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＡＧ−３’）（配列番号４４）
Ｎｅｗ１０２軽鎖特異的プライマーＲｖ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧ  ＴＣＣ  ＣＣＴ  Ｇ−３’）（配列番号４５）
Ｏｌｄ６軽鎖特異的プライマーＦｗ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣ−３’）（配列番号４６）
Ｏｌｄ６軽鎖特異的プライマーＲｖ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＡＧＧＧＣ−３’）（配列番号４７）
マウス抗体７Ｇ３の軽鎖は、ＵＰＭ（ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；クローンテック社）とｍＫ＿Ｒｖ１（５’−ＴＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＡＡＴ  ＧＧＧ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＴＧＡＴ−３’）（配列番号４８）プライマーを使って、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを３０回繰り返して増幅した。さらに、この反応液１μＬを鋳型とし、ＮＵＰ（ＳＭＡＲＴＲＡＣＥｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ；クローンテック社）とｍＫ＿Ｒｖ２（５’−ＧＴＡＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＴ−３’）（配列番号４９）を用いて、９８℃１秒、６８℃３０秒のサイクルを２０回繰り返した。この後、増幅したＰＣＲ産物をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社）により精製し、ｍＫ＿Ｒｖ２プライマーを用いて塩基配列を決定した。配列情報を基に、以下の特異的プライマーを合成し、反対方向からも配列を決定した。
７Ｇ３軽鎖特異的プライマーＦｗ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＣ−３’）（配列番号５０）
７Ｇ３軽鎖特異的プライマーＲｖ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＧＴＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＣＣＣ−３’）（配列番号５１）
上記の特異的プライマーを用いてＰＣＲを行い（９８℃１秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒）、軽鎖増幅ｃＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ、ＢｓｉＷＩで消化し、同一酵素で解裂されていたＮ５ＫＧ１−Ｖａｌ  Ｌａｒｋベクターに導入した。挿入された配列がｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅによって決定されたものと同一であることを、ベクターを鋳型として配列を決定することにより確認した。
【０１２５】
Ｏｌｄ４の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
＜Ｏｌｄ４  重鎖可変領域＞
ＧＡＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＴＡＴＧＣＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＧＡＴＣＡＴＣＣＣＴＡＴＣＴＴＴＧＧＴＡＴＡＧＴＡＡＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＣＴＣＧＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡ（配列番号５２）
＜Ｏｌｄ４  重鎖可変領域＞
ＭＤＷＴＷＲＦＬＦＶＶＡＡＡＴＧＶＱＳＱＶＱＬＬＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＩＶＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＧＳＧＰＤＶＬＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＸ（配列番号５３）
重鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号５２の５’末端から１６番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４３２番目のアデニン（Ａ）と４３３番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。重鎖アミノ酸配列において、重鎖可変領域は配列番号５３のＮ末端から１３９番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４０番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、重鎖のシグナル配列は配列番号５３のＮ末端より１９番目のセリン（Ｓ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号５３の２０番目のグルタミン（Ｑ）であるものと考えられる。
＜Ｏｌｄ４  軽鎖可変領域＞
ＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＴＣＡＴＣＴＧＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＴＧＴＣＧＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＧＡＧＴＴＡＴＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡＴＡＧＴＴＴＣＣＣＧＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧ（配列番号５４）
＜Ｏｌｄ４  軽鎖可変領域＞ 
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＶＩＷＭＴＱＳＰＳＬＬＳＡＳＴＧＤＲＶＴＩＳＣＲＭＳＱＧＩＲＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＥＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＳＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＸ（配列番号５５）
軽鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号５４の５’末端から１６番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４０２番目のアデニン（Ａ）と４０３番目のシトシン（Ｃ）間に位置する。軽鎖アミノ酸配列において、軽鎖可変領域は配列番号５５のＮ末端から１２９番目のリジン（Ｋ）残基までであり、１３０番目のアルギニン（Ｒ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、軽鎖のシグナル配列は配列番号５５のＮ末端より２２番目のシステイン（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号５５の２３番目のバリン（Ｖ）であるものと考えられる。
【０１２６】
Ｏｌｄ５の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
＜Ｏｌｄ５  重鎖可変領域＞
ＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＡＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＴＡＴＧＣＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＡＴＣＣＣＴＡＴＣＴＴＴＧＡＴＡＴＡＧＡＡＡＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＴＴＣＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＧＣ（配列番号５６）
＜Ｏｌｄ５  重鎖可変領域＞
ＭＤＷＴＷＲＦＬＦＶＶＡＡＡＴＧＶＱＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＴＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＬＩＰＩＦＤＩＥＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＧＧＳＧＰＤＶＬＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳ（配列番号５７）
重鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号５６の５’末端から１１番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４２７番目のアデニン（Ａ）と４２８番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。重鎖アミノ酸配列において、重鎖可変領域は配列番号５７のＮ末端から１３９番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４０番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、重鎖のシグナル配列は配列番号５７のＮ末端より１９番目のセリン（Ｓ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号５７の２０番目のグルタミン（Ｑ）であるものと考えられる。
＜Ｏｌｄ５軽鎖可変領域＞
ＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＴＣＡＴＣＴＧＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＴＧＴＣＧＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＧＡＧＴＴＡＴＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡＴＡＧＴＴＴＣＣＣＧＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧ（配列番号５８）
＜Ｏｌｄ５  軽鎖可変領域＞ 
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＶＩＷＭＴＱＳＰＳＬＬＳＡＳＴＧＤＲＶＴＩＳＣＲＭＳＱＧＩＲＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＥＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＳＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＸ（配列番号５９）
軽鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号５８の５’末端から１６番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４０２番目のアデニン（Ａ）と４０３番目のシトシン（Ｃ）間に位置する。軽鎖アミノ酸配列において、軽鎖可変領域は配列番号５９のＮ末端から１２９番目のリジン（Ｋ）残基までであり、１３０番目のアルギニン（Ｒ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、軽鎖のシグナル配列は配列番号５９のＮ末端より２２番目のシステイン（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号５９の２３番目のバリン（Ｖ）であるものと考えられる。
【０１２７】
Ｏｌｄ１７の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
＜Ｏｌｄ１７  重鎖可変領域＞
ＧＡＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＧＡＴＣＡＴＣＣＣＴＡＴＣＴＴＴＧＧＴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＡＣＧＣＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＴＴＡＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣ（配列番号６０）
＜Ｏｌｄ１７  重鎖可変領域＞
ＭＤＷＴＷＲＦＬＦＶＶＡＡＡＴＧＶＱＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＧＴＦＳＮＦＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＳＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＮＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＤＫＹＧＰＹＹＦＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳ（配列番号６１）
重鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号６０の５’末端から１６番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４３２番目のアデニン（Ａ）と４３３番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。重鎖アミノ酸配列において、重鎖可変領域は配列番号６１のＮ末端から１３９番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４０番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、重鎖のシグナル配列は配列番号６１のＮ末端より１９番目のセリン（Ｓ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号６１の２０番目のグルタミン（Ｑ）であるものと考えられる。
＜Ｏｌｄ１７  軽鎖可変領域＞
ＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡＧＴＡＴＡＡＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴ（配列番号６２）
＜Ｏｌｄ１７  軽鎖可変領域＞
ＭＤＭＲＶＬＡＱＬＬＧＬＬＬＬＣＦＰＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＥＫＡＰＫＳＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＸ（配列番号６３）
軽鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号６２の５’末端から１９番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から３９９番目のアデニン（Ａ）と４００番目のシトシン（Ｃ）間に位置する。軽鎖アミノ酸配列において、軽鎖可変領域は配列番号６３のＮ末端から１２９番目のリジン（Ｋ）残基までであり、１３０番目のアルギニン（Ｒ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、軽鎖のシグナル配列は配列番号６３のＮ末端より２２番目のシステイン（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号６３の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）であるものと考えられる。
【０１２８】
Ｏｌｄ１９の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
＜Ｏｌｄ１９  重鎖可変領域＞
ＴＣＧＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＧＧＡＴＣＡＴＣＣＣＴＡＴＣＴＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＴＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧ（配列番号６４）
＜Ｏｌｄ１９  重鎖可変領域＞
ＭＤＷＴＷＲＦＬＦＶＶＡＡＡＴＧＶＱＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＶＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＨＫＹＧＰＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫ（配列番号６５）
重鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号６４の５’末端から９番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４２５番目のアデニン（Ａ）と４２６番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。重鎖アミノ酸配列において、重鎖可変領域は配列番号６５のＮ末端から１３９番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１４０番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、重鎖のシグナル配列は配列番号６５のＮ末端より１９番目のセリン（Ｓ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号６５の２０番目のグルタミン（Ｑ）であるものと考えられる。
＜Ｏｌｄ１９  軽鎖可変領域＞
ＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡＧＴＡＴＡＡＴＡＧＴＴＡＣＣＣＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴ（配列番号６６）
＜Ｏｌｄ１９  軽鎖可変領域＞
ＭＤＭＲＶＬＡＱＬＬＧＬＬＬＬＣＦＰＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＥＫＡＰＫＳＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＳＹＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡ（配列番号６７）
軽鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号６６の５’末端から１３番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から３９９番目のアデニン（Ａ）と４００番目のシトシン（Ｃ）間に位置する。軽鎖アミノ酸配列において、軽鎖可変領域は配列番号６７のＮ末端から１２９番目のリジン（Ｋ）残基までであり、１３０番目のアルギニン（Ｒ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、軽鎖のシグナル配列は配列番号６７のＮ末端より２２番目のシステイン（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号６７の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）であるものと考えられる。
【０１２９】
Ｎｅｗ１０２の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
＜Ｎｅｗ１０２  重鎖可変領域＞
ＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＧＣＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＡＧＡＴＣＡＴＣＣＣＴＡＴＣＴＴＴＧＧＴＡＴＡＧＴＡＡＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＡＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＧＧＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧ（配列番号６８）
＜Ｎｅｗ１０２  重鎖可変領域＞
ＭＤＷＴＷＲＦＬＦＶＶＡＡＡＴＧＶＱＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＭＡＳＧＧＴＶＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＩＰＩＦＧＩＶＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＥＴＡＶＡＧＩＬＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫ（配列番号６９）
重鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号６８の５’末端から９番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４２３番目のアデニン（Ａ）と４２４番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。重鎖アミノ酸配列において、重鎖可変領域は配列番号６９のＮ末端から１３８番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１３９番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、重鎖のシグナル配列は配列番号６９のＮ末端より１９番目のセリン（Ｓ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号６９の２０番目のグルタミン（Ｑ）であるものと考えられる。
＜Ｎｅｗ１０２  軽鎖可変領域＞
ＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡＧＴＡＴＡＡＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡ（配列番号７０）
＜Ｎｅｗ１０２軽鎖可変領域＞
ＭＤＭＲＶＬＡＱＬＬＧＬＬＬＬＣＦＰＧＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＥＫＡＰＫＳＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡ（配列番号７１）
軽鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号７０の５’末端から１３番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から３９９番目のアデニン（Ａ）と４００番目のシトシン（Ｃ）間に位置する。軽鎖アミノ酸配列において、軽鎖可変領域は配列番号７１のＮ末端から１２９番目のリジン（Ｋ）残基までであり、１３０番目のアルギニン（Ｒ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、軽鎖のシグナル配列は配列番号７１のＮ末端より２２番目のシステイン（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号７１の２３番目のアスパラギン酸（Ｄ）であるものと考えられる。
【０１３０】
Ｏｌｄ６の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
＜Ｏｌｄ６重鎖可変領域＞
ＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＴＴＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＣＡＴＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＴＣＣＡＴＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＴＡＣＡＴＡＴＡＴＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＧＧＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣ（配列番号７２）
＜Ｏｌｄ６重鎖可変領域＞ 
ＭＥＬＧＬＲＷＶＦＬＶＡＩＬＥＧＶＱＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＨＮＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＤＷＧＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫ（配列番号７３）
重鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号７２の５’末端から１０番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４１７番目のアデニン（Ａ）と４１８番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。重鎖アミノ酸配列において、重鎖可変領域は配列番号７３のＮ末端から１３６番目のセリン（Ｓ）残基までであり、１３７番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、重鎖のシグナル配列は配列番号７３のＮ末端より１９番目のシステイン（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号７３の２０番目のグルタミン酸（Ｅ）であるものと考えられる。
＜Ｏｌｄ６軽鎖可変領域＞
ＡＧＡＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＴＣＣＡＧＴＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＴＧＡＴＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＡＡＴＡＧＴＴＡＣＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴ（配列番号７４）
＜Ｏｌｄ６軽鎖可変領域＞ 
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＤＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＮＳＹＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡ（配列番号７５）
軽鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号７４の５’末端から１３番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から３９９番目のアデニン（Ａ）と４００番目のシトシン（Ｃ）間に位置する。軽鎖アミノ酸配列において、軽鎖可変領域は配列番号７５のＮ末端から１２９番目のリジン（Ｋ）残基までであり、１３０番目のアルギニン（Ｒ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、軽鎖のシグナル配列は配列番号７５のＮ末端より２３番目のシステイン（Ｃ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号７５の２４番目のアラニン（Ａ）であるものと考えられる。
【０１３１】
７Ｇ３の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
＜７Ｇ３重鎖可変領域＞
ＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＧＴＧＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＡＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＴＡＴＴＡＴＴＣＣＴＡＧＣＡＡＴＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＴＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＣＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＴＣＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＣＴＧＧＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＣ（配列番号７６）
＜７Ｇ３重鎖可変領域＞ 
ＭＧＷＳＷＩＦＬＦＬＶＳＧＴＧＧＶＬＳＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＫＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＤＩＩＰＳＮＧＡＴＦＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＲＳＳＳＴＡＹＭＨＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲＳＨＬＬＲＡＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳ（配列番号７７）
重鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号７６の５’末端から１６番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４２７番目のアデニン（Ａ）と４２８番目のグアニン（Ｇ）間に位置する。重鎖アミノ酸配列において、重鎖可変領域は配列番号７７のＮ末端から１３９番目のアラニン（Ａ）残基までであり、１４０番目のアラニン（Ａ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、重鎖のシグナル配列は配列番号７７のＮ末端より１９番目のセリン（Ｓ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号７７の２０番目のグルタミン酸（Ｅ）であるものと考えられる。
＜７Ｇ３軽鎖可変領域＞
ＡＧＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＴＴＡＡＡＣＡＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＴＴＧＴＴＧＡＴＣＴＡＴＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＡＡＴＧＡＴＴＡＴＡＧＴＴＡＴＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴ（配列番号７８）
＜７Ｇ３軽鎖可変領域＞
ＭＥＳＱＴＱＶＬＭＳＬＬＦＷＶＳＧＴＣＧＤＦＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＬＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号７９）
軽鎖ＤＮＡの翻訳開始点は、配列番号７８の５’末端から１１番目のアデニン（Ａ）からはじまるＡＴＧコドンであり、抗体可変領域と定常領域の境界は５’末端から４０９番目のアデニン（Ａ）と４１０番目のシトシン（Ｃ）間に位置する。軽鎖アミノ酸配列において、軽鎖可変領域は配列番号７９のＮ末端から１３３番目のリジン（Ｋ）残基までであり、１３４番目のアルギニン（Ｒ）以降が定常領域である。遺伝子配列予測ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ｖｅｒ．２）により、軽鎖のシグナル配列は配列番号７９のＮ末端より２２番目のグリシン（Ｇ）までと予測された。成熟体のＮ末端は配列番号７９の２２番目のアスパラギン酸（Ｄ）であるものと考えられる。
（組換え型抗体の作製）
構築した６種類の組換え型抗体発現ベクターを宿主細胞に導入し、組換え型抗体発現細胞を作製した。発現のための宿主細胞には、ＨＥＫ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。
２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＨＥＫ２９３Ｆに発現ベクターを導入した。ＨＥＫ２９３Ｆは、シェーカーを用いてＣＯ２５％、３７℃の環境下で培養し、約５日後に培養上清を回収した。回収した培養上清をｒｍｐＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（アマシャムファルマシアバイオテク社）及び精製量に応じて０．８×４０ｃｍカラム（バイオラッド社）などを用い、吸着緩衝液としてＰＢＳ、溶出緩衝液として０．０２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は１ＭＴｒｉｓ  （ｐＨ９．０）を添加してｐＨ７．２付近に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜（１００００カット、ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いてＰＢＳに置換し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ミリポア社）でろ過滅菌し、精製ヒト抗ＩＬ−３Ｒαモノクローナル抗体を得た。精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬを１．４ＯＤとして算出した。
各ヒト抗体のＣＤＲ（相補性決定部位；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列および配列番号の一覧を表１に示す。
【０１３２】
【表１】
0005913657.tif 000002
【０１３３】
実施例５  ハイブリドーマ培養上清から抗ＩＬ−３Ｒαヒト抗体の精製
ハイブリドーマは実施例３で用いられたＩＬ−６入りＤＭＥＭ培地より、Ｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬）に馴化させ培養した後、該培養上清より抗体を精製した。抗体精製は、実施例４に記載の方法に従って実施した。
まずヒト抗ＩＬ−３Ｒαモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−６、１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ：ＳＩＧＭＡ社）含有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社）に馴化した。次に、ウシインシュリン（５μｇ／ｍＬ、ギブコ・ビーアールエル社）、ヒトトランスフェリン（５μｇ／ｍＬ、ギブコ・ビーアールエル社）、エタノールアミン（０．０１ｍＭ、シグマ社）、亜セレン酸ナトリウム（２．５ｘ１０−５ｍＭ、シグマ社）、１％  Ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社）含有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社）に馴化した。この馴化したハイブリドーマをフラスコにて培養し、培養上清を回収した。回収した上清は、１０μｍと０．２μｍのフィルター（ゲルマンサイエンス社）に供し、ハイブリドーマ等の雑排物を除去した。回収した培養上清より、実施例４と同様の方法により、抗体を精製した。
実施例６  精製した抗ＩＬ−３Ｒαヒト抗体を用いた解離定数の算出
精製した抗ＩＬ−３Ｒα抗体の解離定数を、表面プラズモン共鳴の原理による解析装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社、以下ＧＥ社）を用いて解析した。簡単には、抗ヒト抗体或いは抗マウス抗体をＣＭ５センサーチップに固相化し、次に抗ＩＬ−３Ｒαヒト或いはマウス抗体を流して結合させ、次いで実施例２で作製した可溶化ＩＬ−３Ｒαタンパク質を流し、結合解離をＢｉａｃｏｒｅ２０００を用いて観察した。全実験工程を通して、基本的にはＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社の解離定数算出のための実験方法を参照した。
【０１３４】
具体的には、センサーチップはＣＭ５（リサーチグレード）を用いた（何れもＧＥ社）。まず、ＣＭ５チップを４００ｍＭＥＤＣ（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）と１００ｍＭ  ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を等量混合したものをＣＭ５チップに流して活性化させた。次に、ＨｕｍａｎＡｎｔｉｂｏｄｙ  ＣａｐｔｕｒｅＫｉｔ（ＧＥ社）付属のヒト抗体に対する抗体（以下、抗ヒト抗体抗体と称す）をキット付属の溶液に希釈して流し、ＣＭ５チップに抗ヒト抗体抗体を必要量固相化させた。対照となるマウス抗体に関しては、ＭｏｕｓｅＡｎｔｉｂｏｄｙＣａｐｔｕｒｅＫｉｔ（ＧＥ社）付属のマウス抗体に対する抗体（以下、抗マウス抗体抗体と称す）をキット付属の溶液に希釈して流し、ＣＭ５チップに必要量固相化させた。次に、１Ｍｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを流し、活性化したチップ表面をブロッキングし不活化させた。ここまでの工程で、解離定数ＫＤを測定可能なＣＭ５センサーチップの準備が完成した。
【０１３５】
次に、抗ＩＬ−３Ｒα抗体を１フローセルに１種類ずつＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＧＥ社）に５μｇ／ｍＬに希釈して流し、固相化された抗ヒト抗体抗体或いは抗マウス抗体抗体に結合させた。次に、可溶化ＩＬ−３Ｒαタンパク質を流した。結合した抗ＩＬ−３Ｒα抗体及び可溶化ＩＬ−３Ｒαタンパク質を解離させるため、Ｈｕｍａｎ  ＡｎｔｉｂｏｄｙＣａｐｔｕｒｅＫｉｔ付属の３Ｍ  ＭｇＣｌ２、或いはＭｏｕｓｅＡｎｔｉｂｏｄｙＣａｐｔｕｒｅＫｉｔ付属のｐＨ１．７Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌをキット付属の量を流した。ここまでの工程を１ステップとし、同様の工程を可溶化ＩＬ−３Ｒαタンパク質を複数の濃度で繰り返すことで、結合解離定数を算出するためのデータ（センサーグラム）を取得した。
【０１３６】
アナライトとして流した可溶化型ヒトＩＬ−３Ｒα蛋白質の濃度は実施例２記述のように、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬを１．４ＯＤとして算出した。可溶化型ヒトＩＬ−３Ｒα蛋白質の分子量は以下のように算出した。ヒトＩＬ−３Ｒα蛋白質の分子量は、アミノ酸３６０残基で、６箇所のＮ型糖鎖結合部位を有し、分子量は７０ＫＤａと報告されている（ＴｈｅＣｙｔｏｋｉｎｅ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ第二版、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）。よって、可溶化型ヒトＩＬ−３Ｒα蛋白質の分子量は、文献情報の７０ｋＤａより、膜貫通部位及び膜内領域のアミノ酸の分子量を引き、Ｆｌａｇ配列のアミノ酸を足し、約６３ｋＤａと算出した。
【０１３７】
解析は、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフト（ＧＥ社）を用い、ＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅＨａｎｄｂｏｏｋを参照した。具体的には、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ解析の同時解析を実施し、基本的に１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇの反応モデルを採用してフィッティングし、結合速度定数（Ｋａ）及び解離速度定数（Ｋｄ）を算出し、Ｋｄ／Ｋａの計算により解離定数ＫＤ値を算出した。
結果を以下の表２に示す。
【０１３８】
【表２】
0005913657.tif 000003
【０１３９】
実施例７  抗ヒトＩＬ−３Ｒαヒト抗体のエピトープ解析
（ＩＬ−３Ｒα／ＧＭ−ＣＳＦＲαキメラタンパク発現細胞の作製）
ＩＬ−３Ｒα抗体のエピトープ解析を実施するため、ＩＬ−３Ｒαの膜外領域の一部をＧＭ−ＣＳＦＲαと置き換えたキメラタンパクを細胞に発現させ、その細胞に対する各抗ＩＬ−３Ｒα抗体の結合性を解析した。簡単には、第一に、ＩＬ−３Ｒα分子およびＧＭ−ＣＳＦＲα分子を３領域に区分けし（上述のＮ末端よりＡ、Ｂ、Ｃドメイン）、第二に、ＩＬ−３Ｒα分子のＡ、Ｂ、Ｃドメインの１つずつをＧＭ−ＣＳＦＲαの該当するドメインと置き換えた分子を発現させるベクターをそれぞれ構築し、第三にＨＥＫ２９３Ｆ細胞に強制発現させ、第四としてフローサイトメトリーにて蛍光色素でラベルした各抗ＩＬ−３Ｒα抗体が結合するか観察した。
（ＧＭ−ＣＳＦＲ／ｐＥＦ６／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣプラスミドＤＮＡの作製）
ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体α鎖（ＧＭ−ＣＳＦＲα、ＣＤ１１６）のｃＤＮＡは脾臓由来ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨＨｕｍａｎＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ）よりＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２（東洋紡績株式会社）を用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ装置はＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステムズ）を用いた。ＰＣＲ反応は９４℃２分間の変性段階につづいて、９８℃１０秒−５５℃３０秒−６８℃７５秒の３ステップ反応を３５サイクル行った。用いたＰＣＲプライマーは以下のとおりである：
ｈＣＤ１１６Ｆｗ−ＭｆｅＩ：５’−ＣＧＧＣＡＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＴ−３’（配列番号８０）
ｈＣＤ１１６Ｒｖ−ＮｏｔＩ：５’−ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＴＡＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＣＧＧ−３’（配列番号８１）
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥ  ｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。１．２ｋｂ付近のバンドを切り出し、ＤＮＡをＪＥＴｓｏｒｂキット（Ｇｅｎｏｍｅｄ、Ｂａｄ  Ｏｅｙｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出した後、ＮｏｔＩおよびＭｆｅＩで消化した。ｐＥＦ６／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣプラスミドＤＮＡ（インビトロジェン社）をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化した。それぞれのＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動し、１．２ｋｂ付近と６ｋｂ付近のバンドを切り出し、ＤＮＡをＪＥＴｓｏｒｂキット（Ｇｅｎｏｍｅｄ、Ｂａｄ  Ｏｅｙｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出した。ｐＥＦ６／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣプラスミドＤＮＡ由来ＤＮＡ溶液０．５ｕＬとＰＣＲ産物由来ＤＮＡ溶液４ｕＬを混合し、ＴａＫａＲａＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用い連結した。形質転換は、ライゲーションサンプルとＤＨ５ａｌｐｈａコンピテント細胞と混合し、ＬＢプレートへ撒いた。インサートチェックは、ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲにより行った。ＰＣＲ反応は９４℃５分間の変性段階につづいて、９４℃３０秒−５５℃３０秒−７２℃２分の３ステップ反応を４０サイクル行った後、９９℃３０分間の処理を行った。
【０１４０】
用いたＰＣＲプライマーは以下のとおりである：
ｈＣＤ１１６Ｆｗ−ＭｆｅＩ：５’−ＣＧＧＣＡＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＴ−３’（配列番号８２）
ｈＣＤ１１６Ｒｖ−ＮｏｔＩ：５’−ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＴＡＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＣＧＧ−３’（配列番号８３）
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。１．２ｋｂ付近の増幅が得られたコロニーを対象に、ダイレクトシークエンシング法により塩基配列を決定した。シークエンスサンプルの反応はＢｉｇＤｙｅ（Ｒ）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）とＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステムズ）を用いた（本明細書における全てのＤＮＡ配列解析でこれらを使用）。用いたＰＣＲプライマーは以下のとおりである：
ｈＣＤ１１６Ｆｗ−ＭｆｅＩ：５’−ＣＧＧＣＡＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＴ−３’（配列番号８４）
ｈＣＤ１１６Ｒｖ−ＮｏｔＩ：５’−ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＴＡＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＣＧＧ−３’（配列番号８５）
ｈＣＤ１１６ＳｅｑＦｗ１：５’−ＴＧＡＡＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＧ−３’（配列番号８６）
ｈＣＤ１１６ＳｅｑＦｗ２：５’−ＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＡＡＡＣＣＴＡＣＴＧ−３’（配列番号８７）
ｈＣＤ１１６ＳｅｑＲｖ１：５’−ＣＣＴＧＡＡＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡＧＣＡＧ−３’（配列番号８８）
シークエンス解析装置はＡＢＩ３７００ＸＬ  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）を用いた（本明細書における全てのＤＮＡ配列解析でこれを使用）。ＰＣＲによるアミノ酸配列の変異がおこっていないクローンを選定し、ラージプレップ法（キアゲン社）によりプラスミドＤＮＡを抽出した。
（ＩＬ−３ＲＡ−ＦＬＡＧ／ｐＥＧＦＰ−Ｎ１の作製）
ヒトＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）の全長ｃＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、下流にＦＬＡＧタグを連結した（ＩＬ−３ＲＡ−ＦＬＡＧ／ｐＥＧＦＰ−Ｎ１）。
【０１４１】
ヒトＩＬ−３ＲＡのｃＤＮＡはｈＣＤ１２３／ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドＤＮＡを鋳型としＬＡＴａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は９５℃３０秒の変性段階に続いて、９５℃１５秒−５６℃１５秒−７２℃６０秒の３ステップ反応を１０サイクル行った後、２分間の伸長反応を行った。用いたＰＣＲプライマーは以下のとおりである：
Ｔ７：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ  −３’（配列番号８９）
ｈＣＤ１２３−Ｃ−ＦＬＡＧ−Ｒ１：５’−ＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＡＧＴＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣＣＴＧＴＡ−３’（配列番号９０）
得られたＰＣＲ産物２ｕＬを鋳型に、ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は９５℃１分間の変性段階につづいて、９５℃１５秒−５６℃１５秒−７２℃６０秒の３ステップ反応を１５サイクル行った後、７２℃２分間の伸長反応を行った。用いたＰＣＲプライマーは以下のとおりである：
ＩＬ−３Ｒα＿Ｆｗ：５’−ＣＧＧＣＡＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＣＡＣ−３’（配列番号９１）
Ｃ−ＦＬＡＧ−ＮｏｔＲ２：５’−ＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣ−３’（配列番号９２）
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。１ｋｂ付近のバンドを切り出し、ＤＮＡをＷｉｚａｒｄＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて抽出した。抽出したＤＮＡ全量をＭｆｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。１ｋｂ付近のバンドを切り出し、ＤＮＡをＷｉｚａｒｄＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵｐＳｙｓｔｅｍを用いて抽出した。抽出したＩＬ−３ＲＡ−ＦＬＡＧｃＤＮＡ５ｕＬとＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで開裂したｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドＤＮＡ  ＤＮＡ  １ｕＬを混合し、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用い連結した。形質転換は、ライゲーションサンプルとＤＨ１０Ｂコンピテント細胞と混合し、ＬＢプレート（カナマイシン含有）へ撒いた。インサートチェックは、ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲにより行った。ＰＣＲ反応は９５℃１分間の変性段階につづいて、９５℃１５秒−５６℃１５秒−７２℃６０秒の３ステップ反応を３５サイクル行った後、７２℃２分間の伸長反応を行った。用いたＰＣＲプライマーは以下のとおりである：
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｆｗ：５’−ＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡ−３’（配列番号９３）
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｒｅ：５’−ＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧ−３’（配列番号９４）
０．８ｋｂ付近の増幅が得られたコロニーから、ミニプレップ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。
【０１４２】
精製したＩＬ−３ＲＡ−ＦＬＡＧ／ｐＥＧＦＰ−Ｎ１  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡはＤＮＡ配列解析によりＰＣＲによる変異が入っていないこととＦＬＡＧタグの存在を確認した。ＤＮＡ配列解析に用いたプライマーは以下のとおりである：
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｆｗ：５’−ＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡ−３’（配列番号９５）
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｒｅ：５’−ＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧ−３’（配列番号９６）
（ＩＬ−３Ｒαのドメインマッピング）
ＢＬＡＳＴＰ  ｓｅａｒｃｈ（ｄａｔａｂａｓｅ：ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋｐｒｏｔｅｉｎｓ（ｐｄｂ））の結果、ＩＬ−１３受容体ａｌｐｈａ鎖（ＩＬ−１３Ｒα）が最も高いスコアでヒットした（ＰＤＢ：３ＢＰＮＣ；ＣｈａｉｎＣ，ＣｒｙｓｔａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅＯｆＴｈｅＩｌ４−Ｉｌ４ｒ−Ｉｌ１３ｒａＴｅｒｎａｒｙＣｏｍｐｌｅｘ）。ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋからダウンロードしたＰＤＢファイルとグラフィックソフトであるＲａｓＭｏｌを用いてＩＬ−１３Ｒα蛋白質の立体構造を可視化し、細胞外領域を構成する３つのドメイン（上述のＡ、Ｂ及びＣドメイン）を分割した。Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＡｌｉｇｎｍｅｎｔソフトであるＭＵＳＣＬＥを用いてＩＬ−３Ｒαアミノ酸配列とＩＬ−１３Ｒαアミノ酸配列を比較し、ＩＬ−３Ｒα細胞外領域も３つのドメインに区分した。さらに、ＧＭ−ＣＳＦＲαとＩＬ−３Ｒαを同様に比較し、ＧＭ−ＣＳＦＲα細胞外領域も３つのドメインに区分した。
【０１４３】
抗ヒトＩＬ−３Ｒαヒト抗体のエピトープを特定するため、上記のように区分したＩＬ−３Ｒαの３ドメインを１つずつＧＭ−ＣＳＦＲαの該当ドメインに置換したタンパクを作製し、細胞膜上に発現させ、抗体の結合の有無を確認した。
ＩＬ−３ＲＡ−ＦＬＡＧ／ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドＤＮＡを鋳型としＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ）  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社）を用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は９８℃１０秒−６８℃６分の２ステップ反応を２５サイクル行った。用いたＰＣＲプライマーは以下のとおりである：
Ａドメイン欠損；
ＣＤ１２３Ｒ１１ｐＥＧＦＰＮ１：ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣＴＣ（配列番号９７）
ＣＤ１２３Ｆ１１：ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＧＧＧＡＡＧＣＣＴＴＧＧＧＣＡＧＧＴ（配列番号９８）
Ｂドメイン欠損；
ＣＤ１２３Ｒ１２−２：ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴ（配列番号９９）
ＣＤ１２３Ｆ１２−２：ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＣＡＧＡＴＴＧＡＧＡＴＡＴＴＡＡＣＴＣＣ（配列番号１００）
Ｃドメイン欠損；
ＣＤ１２３Ｒ１３：ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＡＡＧＡＣＧＡＣＡＡＡＣＴＴ（配列番号１０１）
ＣＤ１２３Ｆ１３：ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＴＣＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＧＣＧＣＴＧ（配列番号１０２）
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。増幅を確認後、ＷｉｚａｒｄＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵｐＳｙｓｔｅｍを用いて精製した。得られたＤＮＡをＫｐｎＩとＤｐｎＩで消化後、ＷｉｚａｒｄＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて精製し、ＴａＫａＲａＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔを用いて連結した。形質転換は、ライゲーションサンプルとＤＨ１０Ｂコンピテント細胞と混合し、ＬＢプレート（カナマイシン含有）へ撒いた。インサートチェックは、ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲにより行った。ＰＣＲ反応は９５℃１分間の変性段階につづいて、９５℃１５秒−５６℃１５秒−７２℃４０秒の３ステップ反応を３８サイクル行った後、７２℃２分間の伸長反応を行った。用いたＰＣＲプライマーは以下のとおりである：
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｆｗ：５’−ＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡ−３’（配列番号１０３）
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｒｅ：５’−ＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１０４）
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。１ｋｂ付近の増幅が得られたコロニーからミニプレップ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。
【０１４４】
ＧＭ−ＣＳＦＲ／ｐＥＦ６／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣプラスミドＤＮＡを鋳型としＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ）  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社）を用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は９８℃１０秒−６８℃３０秒の２ステップ反応を２５サイクル行った。用いたＰＣＲプライマーは以下のとおりである：
Ａドメイン挿入；
ＧＭ−ＣＳＦＲＦ１１：ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡ（配列番号１０５）
ＧＭ−ＣＳＦＲＲ１１：ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡＧＣＡＧ（配列番号１０６）
Ｂドメイン挿入；
ＧＭ−ＣＳＦＲＦ１２：ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＧＧＡＡＧＧＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＣＴ（配列番号１０７）
ＧＭ−ＣＳＦＲＲ１２：ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＡＡＡＡＧＴＧＡ（配列番号１０８）
Ｃドメイン挿入；
ＧＭ−ＣＳＦＲＦ１３：ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＡＡＡＴＡＧＡＡＣＧＡＴＴＣＡＡＣ（配列番号１０９）
ＧＭ−ＣＳＦＲＲ１３：ＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＡＴＧＴＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＧＡＧ（配列番号１１０）
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。増幅を確認後、ＷｉｚａｒｄＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵｐＳｙｓｔｅｍを用いて精製した。
【０１４５】
得られたＤＮＡをＫｐｎＩで消化後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製し、対応するドメインを欠損したＩＬ−３ＲＡ−ＦＬＡＧ／ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドＤＮＡ（ＫｐｎＩで開裂、精製済）と混合し、ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて連結した。形質転換は、ライゲーションサンプルとＤＨ１０Ｂコンピテント細胞と混合し、ＬＢプレート（カナマイシン含有）へ撒いた。インサートチェックは、ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲにより行った。ＰＣＲ反応は９５℃１分間の変性段階につづいて、９５℃１５秒−５６℃１５秒−７２℃４０秒の３ステップ反応を３８サイクル行った後、７２℃２分間の伸長反応を行った。用いたＰＣＲプライマーは以下のとおりである：
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｆｗ：５’−ＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡ−３’（配列番号１１１）
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｒｅ：５’−ＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１１２）
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。１ｋｂ付近の増幅が得られたコロニーからミニプレップ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。
（抗ＩＬ−３Ｒα抗体の蛍光色素のラベル化）
抗ヒトＩＬ−３Ｒαヒト抗体が結合するか確認するため、各ヒト抗体を蛍光色素ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でラベルした。ラベル方法は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社頒布のマニュアルに従い、検出はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）のＦＬ１にて蛍光を検出した。
【０１４６】
具体的には、ＰＢＳに溶解している抗体溶液に、１／１０量の１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を添加した。次に、ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ（ＴＦＰ）が付加されたＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８の粉末が含まれる容器にマニュアル記載の所定量の抗体溶液を添加し、攪拌させながら１時間暗所室温にて反応させた。次に、ゲルろ過カラム（ＮＡＰ−１０など、ＧＥヘルスケア社）をＰＢＳで十分置換した後に、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８で反応させた抗体の溶液を添加し、黄緑色を呈した抗体画分を取得しつつ、抗体溶液のバッファーをＰＢＳに置換した。以上のように取得したＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８をラベルした抗ヒトＩＬ−３Ｒα抗体は、吸光度計にて２８０ｎｍ及び４９４ｎｍの波長の吸光度（それぞれＡ２８０、Ａ４９４）を測定し、次の計算式にて、抗体濃度を算出した。
抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝（Ａ２８０−Ａ４９４×０．１１）／１．４
（ラベル化抗ＩＬ−３Ｒα抗体を用いたＩＬ−３Ｒα／ＧＭ−ＣＳＦＲαキメラタンパク発現細胞のフローサイトメトリー解析）
ＩＬ−３Ｒα／ＧＭ−ＣＳＦＲαキメラタンパク発現細胞の作製には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １２６８）を用いた。２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔに上記で取得したプラスミドＤＮＡを発現ベクターとして導入した。発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔは、シェーカーを用いてＣＯ２５％、３７℃の環境下で培養し、導入２日後にフローサイトメトリー解析に用いた。
【０１４７】
キメラタンパク発現細胞を１００，０００〜１，０００，０００個に対して、１μｇ／ｍＬの濃度のＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８ラベルヒト抗体或いは市販のＦＩＴＣラベルされた抗ＩＬ−３Ｒαマウス抗体（７Ｇ３、９Ｆ５：何れもＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、６Ｈ６：ＡｃｒｉｓＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社、ＡＣ１４５：ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社、１０７Ｄ２．０８：Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｓ社）を、３０分間氷上にて反応させた。抗体及び細胞の希釈には、ステイニングメディウム（２％牛胎児血清、２ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ）を用いた。次に、抗体と反応させた細胞をステイニングメディウムにて３回洗浄し、フローサイトメトリーにて細胞にラベルされた抗体が結合したかを確認した。
【０１４８】
その結果を図１及び２に示す。７Ｇ３、９Ｆ５、６Ｈ６、ＡＣ１４５抗体はＡドメインをＧＭ−ＣＳＦＲαに置換させたタンパク発現細胞のみにおいて、反応が消失した。一方、Ｏｌｄ４、Ｏｌｄ５、Ｏｌｄ１９、Ｎｅｗ１０２、抗体は、ＢドメインをＧＭ−ＣＳＦＲαに置換させたタンパク発現細胞への反応が消失した。Ｏｌｄ１９に関しては、ＡドメインをＧＭ−ＣＳＦＲαに置換させたタンパク発現細胞への反応も消失した。Ｏｌｄ６、１０７Ｄ２．０８は、Ｂドメイン、Ｃドメインを置換させたタンパク発現細胞への反応が消失した。
【０１４９】
以上より、７Ｇ３、９Ｆ５、６Ｈ６、ＡＣ１４５はＡドメイン、Ｏｌｄ４、Ｏｌｄ５、Ｎｅｗ１０２はＢドメイン、Ｏｌｄ１９はＡドメインとＢドメイン、Ｏｌｄ６、１０７Ｄ２．０８はＢドメインとＣドメイン、をそれぞれ認識する可能性が示された。したがって、各種抗ＩＬ−３Ｒα抗体のＩＬ−３ＲαのＡ〜Ｃドメインへの反応性は以下の表３の通りであった。
【０１５０】
【表３】
0005913657.tif 000004
【０１５１】
実施例８  抗ＩＬ−３Ｒα抗体のＩＬ−３シグナルのブロッキング能の解析
得られたＩＬ−３Ｒα抗体がＩＬ−３シグナルを阻害しないか検討するため、ＩＬ−３又はＧＭ−ＣＳＦ依存性に増殖する細胞株ＴＦ−１（ＤＭＳＺ  ｎｏ．ＡＣＣ３４４）を用いた。
具体的には、ＴＦ−１細胞を、ＩＬ−３を１ｎｇ／ｍＬ及び１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培地（ＴＦ−１培地）に希釈し、９６穴プレートに撒いた。さらに、各種ＩＬ−３Ｒα抗体および陰性コントロール抗体としてヒト血清由来ＩｇＧをＴＦ−１培地に希釈し９６穴プレートに移し、抗体の最終濃度が１０及び１００μｇ／ｍＬの最終濃度になるように添加した。対照として、細胞なしの培地のみのウェル、ＴＦ−１細胞が添加されたウェルを設けた。３日間３７℃５％ＣＯ２環境下で培養し、ＣｅｌｌｔｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を培地と同量添加した。３０分静置した後、プレートリーダ（ＡＲＢＯ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて発光量を定量した。
増殖の阻害率は、以下の計算を行った：
（サンプルの発光量−細胞なしのウェル）／（ＴＦ−１細胞のみ添加したウェル−細胞なしのウェル）ｘ１００（％）
市販抗体９Ｆ５、６Ｈ６、１０７Ｄ２．０８に関しては、バッファーをＰＢＳに置換するため、ＮＡＰ−５カラムを利用した。具体的には、ＰＢＳにて十分に置換したＮＡＰ−５カラムに０．５ｍＬの抗体溶液を添加した。次に１．０ｍＬのＰＢＳを添加し、カラムより出てきた溶液を回収した。溶液は、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ミリポア社）でろ過滅菌し、ＰＢＳを溶媒とした抗体を得た。抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬを１．４ＯＤとして算出した。
結果を図５に示す。Ｏｌｄ４抗体、Ｏｌｄ５抗体、Ｏｌｄ１７抗体、Ｏｌｄ１９抗体、Ｎｅｗ１０２抗体、９Ｆ５抗体、６Ｈ６抗体はＩＬ−３シグナルを阻害しないことが判明し、一方７Ｇ３抗体、Ｏｌｄ６抗体、１０７Ｄ２．０８抗体はＩＬ−３シグナルを阻害することが判明した。
実施例９  抗ＩＬ−３Ｒαヒト抗体を用いたコロニー形成能への影響の検討
各種ＩＬ−３Ｒα抗体が造血前駆細胞によるコロニー形成能に影響しないか、コロニーアッセイを行った。
【０１５２】
簡単には、エリスロポエチン、ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ、を添加したＭｅｔｈｏｃｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社）に、臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社）を４００ｃｅｌｌｓ／ｍＬで添加し、１４日から１６日後にコロニー数を測定した。コロニーは、Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ系コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）、Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ系コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）、混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ又はＣＦＵ−ＧＥＭＭ）に分類して計測した。コロニーの種類の分類方法に関しては、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社のマニュアル或いは各種血液学教科書を参照した。
【０１５３】
抗体は、実施例８においてＩＬ−３シグナルのブロッキング能が認められた抗体としてキメラ７Ｇ３抗体、ブロッキング能が認められない抗体としてＮｅｗ１０２抗体をそれぞれ用いた。
結果を図６に示す。エリスロポエチン、ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒを添加したコロニーアッセイにおいて、ＩＬ−３シグナルのブロッキング能を有する７Ｇ３抗体の添加により、コロニー数の減少およびコロニーサイズの減少が認められた。一方Ｎｅｗ１０２抗体添加によるコロニー数の変化は認められなかった。この結果より、ＩＬ−３シグナルを阻害またはブロッキングしないほうが、正常の造血機能に与える影響は小さく、副作用が少ないことが推測される。
実施例１０  抗ＩＬ−３Ｒαヒト抗体を用いたマウス担ガンモデルにおける抗腫瘍効果
得られた抗ＩＬ−３Ｒα抗体をマウス担ガンモデルに投与し、その抗腫瘍効果を検討した。簡単には、マウスに白血病細胞を尾静脈より移入し、翌日に抗体を投与し、約３週間後にマウスの骨より採取した骨髄細胞中の白血病細胞の数を計測した。
【０１５４】
具体的には、ｓｃｉｄマウス（日本クレア）に抗アシアロＧＭ１抗血清（和光純薬）を０．０１ｍＬ相当を生理食塩水に希釈して投与した（Ｄａｙ−１）。翌日に、急性骨髄性白血病の細胞株であるＭＯＬＭ１３（ＡＴＣＣ）を５０万個尾静脈より移植した（Ｄａｙ０）。さらにその翌日（Ｄａｙ１）に、抗ＩＬ−３Ｒα抗体１０μｇを腹腔内投与した。Ｄａｙ２１にマウスを屠殺し、大腿骨・脛骨より骨髄を採取し、骨髄細胞をＦＩＴＣ標識ヒトＣＤ４５抗体及びＰＥ標識抗ＩＬ−３Ｒα抗体（何れもＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。具体的には１００万個程度の骨髄細胞に、最終濃度が各１μｇ／ｍＬになるように抗体を添加し、３０分氷上にて遮光で静置した。その後、ステイニングメディウム（ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）に２％牛胎児血清、０．０５％アジ化ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した溶液）を用いて、抗体で染色した細胞を３回洗浄し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、ヒトＣＤ４５陽性且つヒトＩＬ−３Ｒα陽性の細胞を検出した。また、マウス骨髄を採取時に、骨髄細胞数をチュルク液を用いて計測した。さらに、定量された蛍光ビーズ（Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を上記の抗体染色時に同時に添加することで、大腿骨１本あたりに含まれるＭＯＬＭ１３細胞の絶対数を計測した。
【０１５５】
結果を図７に示す。抗体を投与した群は、何れも抗体を投与していないＶｅｈｉｃｌｅ群に比して大腿骨骨髄内のＭＯＬＭ１３細胞数が著しく減少していることが確認された。この結果は、抗ＩＬ−３Ｒα抗体は、白血病に対する治療薬としての可能性を示唆している。
実施例１１  抗ＩＬ−３Ｒα抗体によるＩＬ−３Ｒα発現細胞株傷害性試験
抗体を介した細胞傷害活性［抗体依存性細胞性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＣｅｌｌｕｌａｒＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）以下、ＡＤＣＣと略記する］を測定するために、抗体の存在下でエフェクターとしてヒト末梢血由来単核球（ＰｅｒｉｐｈｅｒａｌＢｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ以下、ＰＢＭＣ）を用い実施した。
【０１５６】
健康なボランティアより末梢血を採取し、抗凝固財を添加した。血液をＦｉｃｏｌｌ−ＰｌａｑｕｅＰｌｕｓ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）の上に静置し、界面を乱さないように大型遠心機（ＣＦ９ＲＸ、日立など）を用いて２０００ｒｐｍ２０分遠心分離した。細胞が含まれる中間層を集めＰＢＳを用いて洗浄し、９００ｒｐｍ２０分の遠心により血小板を除き、末梢血由来単核細胞（ＰＢＭＣ）をＡＤＣＣを発揮するエフェクターとして用いた。
【０１５７】
さらに、ヒトＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を最終濃度４ｎｇ／ｍＬ（４０ＩＵ／ｍＬ以上）で添加した１０％ウシ胎児血清入りＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２環境下で１晩培養したＰＢＭＣについてもＡＤＣＣアッセイのエフェクターとして用いた。
方法は簡単には、ターゲット細胞を抗体及びＰＢＭＣ存在下で培養し、抗体による特異的なターゲット細胞の溶解率を計測するものである。
【０１５８】
溶解率の測定には、以下の「Ｃｏｌｏｎ−２６／ｈＣＤ１２３ＡＤＣＣ測定法」を用いた。具体的にはターゲット細胞としてＩＬ−３Ｒα強制発現Ｃｏｌｏｎ−２６細胞を放射性同位元素５１Ｃｒでラベルされたクロム酸ナトリウム（Ｎａ２５１ＣｒＯ４、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ＮＥＺ０３０Ｓ）と３７℃、５％ＣＯ２存在下で１時間培養することでターゲット細胞を５１Ｃｒでラベルした。ラベルしたターゲット細胞は、３回洗浄し余分な５１Ｃｒを除いた後に培地に懸濁し、あらかじめ各種濃度で抗体が添加された９６穴プレートに移した。ＰＢＭＣを培地に懸濁し、ターゲット細胞および抗体が添加されたプレートに移した（エフェクター／ターゲット率＝１００）。抗体としては、実施例４で精製した抗ＩＬ−３Ｒα抗体、陰性コントロールとしてヒト血清由来ＩｇＧ（シグマ社）を用いた。各種対照として、培地とターゲット細胞のみのウェル、ＰＢＭＣとターゲットのみのウェル、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘが添加されたウェルを準備した。混合液が入った９６穴プレートは、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間培養した。
【０１５９】
プレートを遠心した後、上清をシンチレータ入り９６穴プレート（Ｌｕｍａｐｌａｔｅ−ＴＭ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に５０ｕＬ移し、５６℃、２時間で乾燥させた。プレートをシールし（ＴｏｐＳｅａｌ−Ａ、Ｐａｃｋａｒｄ社）、マイクロプレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。
ターゲット細胞の溶解度は、細胞が溶解し培地中に放出されたクロム酸ナトリウム中の５１Ｃｒ量を測定した。すなわち、各ウェルの値から抗体が添加されていないウェルの値を差し引いた値を、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えたウェル（特異的溶解率１００％とする）の値から抗体が添加されていないウェルの値を差し引いた値で割ることにより、「特異的溶解率」を算出した。
【０１６０】
その結果を図８および９に示す。各種ＩＬ−３Ｒα抗体は、濃度依存的にターゲット細胞に対するＡＤＣＣ活性が認められた。また、対照となるキメラ７Ｇ３抗体に比して、高いＡＤＣＣ能を発揮した。このことは、ＩＬ−３Ｒα抗体はＩＬ−３Ｒα発現細胞に対して高いＡＤＣＣ能を発揮し、ＩＬ−３Ｒα陽性細胞除去を薬効とした治療の可能性を示すものである。
実施例１２  抗ＩＬ−３Ｒα抗体のサルＩＬ−３Ｒα蛋白質への結合性試験
取得した抗ヒトＩＬ−３Ｒα抗体のサルＩＬ−３Ｒαへの結合の有無は、実施例１で作製したカニクイザルＩＬ−３Ｒα強制発現細胞に、実施例７で作製した抗ヒトＩＬ−３Ｒα抗体が結合するかをフローサイトメトリーを用いて解析した。
【０１６１】
具体的には、２ｘ１０５個のサルＩＬ−３Ｒα強制発現Ｌ９２９細胞を抗ヒトＩＬ−３Ｒα抗体の最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるように１００μＬで４℃、３０分で反応させた。抗体は、陰性コントロールとして抗ジニトロフェノール（ＤＮＰ）ヒトＩｇＧ１抗体（自社製）、Ｏｌｄ４、Ｏｌｄ５、Ｏｌｄ１７、Ｏｌｄ１９、Ｎｅｗ１０２、キメラキメラ７Ｇ３抗体を用いた。その後、ステイニングメディウム（２％牛胎児血清、２ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ）で３回洗浄した。次に、ＰＥ標識抗ヒト抗体γ鎖特異的抗体（サザンバイオ社）を最終濃度１μｇ／ｍＬでステイニングメディウム中で反応させ、同様に３回ステイニングメディウムで洗浄した。最後に、ステイニングメディウムで細胞を混合し、フローサイトメトリーにてＰＥの陽性の有無を解析した。
【０１６２】
その結果を図１０に示す。抗ヒトＩＬ−３Ｒαヒト抗体であるＯｌｄ４、Ｏｌｄ５、Ｏｌｄ１７、Ｏｌｄ１９、Ｎｅｗ１０２、及びキメラ７Ｇ３抗体はカニクイザルＩＬ−３Ｒαに反応することが確認された。
実施例１３  抗ヒトＩＬ−３Ｒαヒト抗体の詳細なエピトープ解析
（ＩＬ−３Ｒα／ＧＭ−ＣＳＦＲαキメラタンパク発現細胞の作製）
ＩＬ−３Ｒα抗体のより詳細なエピトープ解析を実施するため、ＩＬ−３Ｒαの膜外領域のドメインより小さい領域をＧＭ−ＣＳＦＲαと置き換えたキメラタンパクを細胞に発現させ、その細胞に対する各抗ＩＬ−３Ｒα抗体の結合性を解析した。簡単には、第一に、ＩＬ−３Ｒα分子の立体的な構造予測から外側に位置していると考えられる領域を決定し、第二に、その小さい領域をＧＭ−ＣＳＦＲαに置き換えたＩＬ−３Ｒα分子を発現させるベクターをそれぞれ構築し、第三に、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に強制発現させ、第四としてフローサイトメトリーにて蛍光色素でラベルした各抗ＩＬ−３Ｒα抗体が結合するか観察した。
（ＩＬ−３Ｒαのドメインマッピング）
実施例７より区分した３ドメインのうち、取得した抗体Ｏｌｄ１９及びＮｅｗ１０２が認識するＡ、Ｂドメインに絞り、詳細に解析した。ＩＬ−４受容体ａｌｐｈａ鎖（ＩＬ−４Ｒα、ＣＤ１２４）（ＰＤＢ：３ＢＰＮＣ；ＣｈａｉｎＣ，ＣｒｙｓｔａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅＯｆＴｈｅＩｌ４−Ｉｌ４ｒ−Ｉｌ１３ｒａＴｅｒｎａｒｙＣｏｍｐｌｅｘ）の立体構造を元に、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／／ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ．ｈｔｍｌ）を用いてＩＬ−３Ｒα蛋白質の立体構造をホモロジーモデリングした。予測されたＩＬ−３Ｒα蛋白質構造をグラフィックソフトＲａｓＭｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｒａｓｍｏｌ．ｏｒｇ／）を用いて可視化し、ＩＬ−３Ｒα分子の外側に位置すると考えられるアミノ酸領域７箇所を決定した（図４）。
【０１６３】
抗ヒトＩＬ−３Ｒαヒト抗体のエピトープを特定するため、上記のように区分したＩＬ−３Ｒαのアミノ酸領域の１及び３から７の６箇所をそれぞれＧＭ−ＣＳＦＲαの該当領域に置換したタンパクを作製し、細胞膜上に発現させ、抗体の結合の有無を確認した。
ＩＬ−３ＲＡ−ＦＬＡＧ／ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドＤＮＡを鋳型としＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ）  ＨＳ  ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社）を用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は９８℃１０秒−６８℃５分の２ステップ反応を２５サイクル行った。用いたＰＣＲプライマーは以下のとおりである：
領域１欠損；
ＣＤ１２３−Ｆｗ２１：ＣＧＴＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＴＡＧＣＴＡＴＴ（配列番号１４９）
ＣＤ１２３−Ｒｅ２１：ＡＣＴＣＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＡＡＣＡＣＡＣＴＣＧＡＴＡＴＣＧ（配列番号１５０）
領域２欠損；
ＣＤ１２３−Ｆｗ２２：ＣＴＴＴＡＴＣＣＡＡＡＴＡＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＧＣＣＴＴＧ（配列番号１５１）
ＣＤ１２３−Ｒｅ２２：ＣＡＧＴＴＴＣＴＧＴＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＧＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴ（配列番号１５２）
領域３欠損；
ＣＤ１２３−Ｆｗ２３：ＡＧＧＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＣＧＧＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴ（配列番号１５３）
ＣＤ１２３−Ｒｅ２３：ＴＣＣＴＧＡＡＴＴＴＧＧＡＴＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＣＧＴＧＧ（配列番号１５４）
領域４欠損；
ＣＤ１２３−Ｆｗ２４：ＧＧＴＣＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧＡＣＧＴＣＣＡＧＴＡ（配列番号１５５）
ＣＤ１２３−Ｒｅ２４：ＣＣＴＣＧＣＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＣＧＴ（配列番号１５６）
領域５欠損；
ＣＤ１２３−Ｆｗ２５：ＡＣＧＧＡＡＣＣＡＧＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＧＧＴＡＴＣＣＣＣＴ（配列番号１５７）
ＣＤ１２３−Ｒｅ２５：ＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧＧＧＡＡＣＴＴＴＧＡＧＡＡＣＣ（配列番号１５８）
領域６欠損；
ＣＤ１２３−Ｆｗ２６：ＴＣＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＧＴＣＴＴＴＴＣＡＣＡ（配列番号１５９）
ＣＤ１２３−Ｒｅ２６：ＡＴＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＡＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＣＣ（配列番号１６０）
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲル電気泳動（１３５Ｖ、１５分、ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を行った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により可視化した。増幅を確認後、ＷｉｚａｒｄＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵｐＳｙｓｔｅｍを用いて精製した。得られたＤＮＡをＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｋｉｎａｓｅ（Ｎｅｗ  ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）でリン酸化し、エタノール沈殿の後、一部をＴａＫａＲａ  ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔを用いて反応させた。形質転換は、ライゲーションサンプルとＤＨ１０Ｂコンピテント細胞と混合し、ＬＢプレート（カナマイシン含有）へ撒いた。得られたコロニーからＭｉｎｉｐｒｅｐ法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、インサートを確認した。
（ラベル化抗ＩＬ−３Ｒα抗体を用いたＩＬ−３Ｒα／ＧＭ−ＣＳＦＲαキメラタンパク発現細胞のフローサイトメトリー解析）
ＩＬ−３Ｒα／ＧＭ−ＣＳＦＲαキメラタンパク発現細胞の作製の作製には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。リポフェクション法を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔに上記で取得したプラスミドＤＮＡを発現ベクターとして導入した。発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔは、ＣＯ２５％、３７℃の環境下で培養し、導入２日後にフローサイトメトリー解析に用いた。
【０１６４】
キメラタンパク発現細胞を１００，０００〜１，０００，０００個に対して、１μｇ／ｍＬの濃度のＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８ラベルヒト抗体或いは市販のＦＩＴＣラベルされた抗ＩＬ−３Ｒαマウス抗体（７Ｇ３、９Ｆ５：何れもＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、６Ｈ６：ＡｃｒｉｓＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）を、３０分氷上にて反応させた。抗体及び細胞の希釈には、ステイニングメディウム（２％牛胎児血清、２ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ）を用いた。次に、抗体と反応させた細胞をステイニングメディウムにて３回洗浄し、フローサイトメトリーにて細胞にラベルされた抗体が結合したかを確認した。
【０１６５】
その結果を図３に示す。ｃ７Ｇ３抗体は、領域１をＧＭ−ＣＳＦＲαに置換させたタンパク発現細胞のみにおいて、反応が消失した。Ｏｌｄ１９は、Ａドメイン内の領域２及び領域３、Ｂドメイン内の領域５及び領域６をＧＭ−ＣＳＦＲαに置換させたタンパク発現細胞への反応が消失した。Ｎｅｗ１０２は、Ｂドメインの領域５及び領域６をＧＭ−ＣＳＦＲαに置換させたタンパク発現細胞への反応が消失した。
【０１６６】
以上より、Ｏｌｄ１９抗体はＡ及びＢドメインの領域２〜３及び領域５〜６を、Ｎｅｗ１０２抗体はＢドメインの領域５〜６を、それぞれ認識する可能性が示された。
以上の結果を表４としてまとめた。
【０１６７】
【表４】
0005913657.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【０１６８】
本発明によれば、ヒトＩＬ−３Ｒα蛋白（別名：ヒトＣＤ１２３）に対する抗体、ならびに、ヒトＩＬ−３Ｒα抗体を有効成分とする、骨髄性悪性腫瘍、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対する治療薬および診断薬を提供する
【配列表フリーテキスト】
【０１６９】
配列番号３：ＩＬ−３Ｒα＿Ｆｗプライマー
配列番号４：ＩＬ−３Ｒα＿Ｒｅプライマー
配列番号５：ＩＬ−３Ｒα＿ｓｅｑＦ１プライマー
配列番号６：インサート（ＭｆｅＩからＮｏｔＩまで）
配列番号７：Ｒｈｅ１２３Ｆｗ１プライマー
配列番号８：Ｒｈｅ１２３Ｒｖ１プライマー
配列番号９：Ｔ７プライマー
配列番号１０：ＳＰ６プライマー
配列番号１１：カニクイザルＩＬ−３Ｒαのインサート（ＭｆｅＩからＮｏｔＩまで）
配列番号１２：アカゲザルＩＬ−３Ｒαのインサート（ＭｆｅＩからＮｏｔＩまで）
配列番号１３：ｈＩＬ−３Ｒαｓｏｌ−ＦＬＡＧ−ＮｏｔＩプライマー
配列番号１４：インサート（ＭｆｅＩからＮｏｔＩまで）
配列番号１５：ｈｈ−６プライマー
配列番号１６：ｈｈ−３  プライマー
配列番号１７：ｈｈ−４プライマー
配列番号１８：Ｏｌｄ４重鎖特異的プライマーＦｗ
配列番号１９：Ｏｌｄ４重鎖特異的プライマーＲｖ
配列番号２０：Ｏｌｄ５重鎖特異的プライマーＦｗ
配列番号２１：Ｏｌｄ５重鎖特異的プライマーＲｖ
配列番号２２：Ｏｌｄ１７重鎖特異的プライマーＦｗ
配列番号２３：Ｏｌｄ１７重鎖特異的プライマーＲｖ
配列番号２４：Ｏｌｄ１９重鎖特異的プライマーＦｗ
配列番号２５：Ｏｌｄ１９重鎖特異的プライマーＲｖ
配列番号２６：Ｎｅｗ１０２重鎖特異的プライマーＦｗ
配列番号２７：Ｎｅｗ１０２重鎖特異的プライマーＲｖ
配列番号２８：Ｏｌｄ６重鎖特異的プライマーＦｗ
配列番号２９：Ｏｌｄ６重鎖特異的プライマーＲｖ
配列番号３０：ｍＨ＿Ｒｖ１プライマー
配列番号３１：ｍＨ＿Ｒｖ２プライマー
配列番号３２：７Ｇ３重鎖特異的プライマーＦｗ
配列番号３３：７Ｇ３重鎖特異的プライマーＲｖ
配列番号３４：ｈｋ−２プライマー
配列番号３５：ｈｋ−６プライマー
配列番号３６：Ｏｌｄ４軽鎖特異的プライマーＦｗ
配列番号３７：Ｏｌｄ４軽鎖特異的プライマーＲｖ
配列番号３８：Ｏｌｄ５軽鎖特異的プライマーＦｗ
配列番号３９：Ｏｌｄ５軽鎖特異的プライマーＲｖ
配列番号４０：Ｏｌｄ１７軽鎖特異的プライマーＦｗ
配列番号４１：Ｏｌｄ１７軽鎖特異的プライマーＲｖ
配列番号４２：Ｏｌｄ１９軽鎖特異的プライマーＦｗ
配列番号４３：Ｏｌｄ１９軽鎖特異的プライマーＲｖ
配列番号４４：Ｎｅｗ１０２軽鎖特異的プライマーＦｗ
配列番号４５：Ｎｅｗ１０２軽鎖特異的プライマーＲｖ
配列番号４６：Ｏｌｄ６軽鎖特異的プライマーＦｗ
配列番号４７：Ｏｌｄ６軽鎖特異的プライマーＲｖ
配列番号４８：ｍＫ＿Ｒｖ１プライマー
配列番号４９：ｍＫ＿Ｒｖ２プライマー
配列番号５０：７Ｇ３軽鎖特異的プライマーＦｗ
配列番号５１：７Ｇ３軽鎖特異的プライマーＲｖ
配列番号８０：ｈＣＤ１１６Ｆｗ−ＭｆｅＩプライマー
配列番号８１：ｈＣＤ１１６Ｒｖ−ＮｏｔＩプライマー
配列番号８２：ｈＣＤ１１６Ｆｗ−ＭｆｅＩプライマー
配列番号８３：ｈＣＤ１１６Ｒｖ−ＮｏｔＩプライマー
配列番号８４：ｈＣＤ１１６Ｆｗ−ＭｆｅＩプライマー
配列番号８５：ｈＣＤ１１６Ｒｖ−ＮｏｔＩプライマー
配列番号８６：ｈＣＤ１１６ＳｅｑＦｗ１プライマー
配列番号８７：ｈＣＤ１１６ＳｅｑＦｗ２プライマー
配列番号８８：ｈＣＤ１１６ＳｅｑＲｖ１プライマー
配列番号８９：Ｔ７プライマー
配列番号９０：ｈＣＤ１２３−Ｃ−ＦＬＡＧ−Ｒ１プライマー
配列番号９１：ＩＬ−３Ｒα＿Ｆｗプライマー
配列番号９２：Ｃ−ＦＬＡＧ−ＮｏｔＲ２プライマー
配列番号９３：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｆｗプライマー
配列番号９４：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｒｅプライマー
配列番号９５：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｆｗプライマー
配列番号９６：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｒｅプライマー
配列番号９７：ＣＤ１２３Ｒ１１ｐＥＧＦＰＮ１プライマー
配列番号９８：ＣＤ１２３Ｆ１１プライマー
配列番号９９：ＣＤ１２３Ｒ１２−２プライマー
配列番号１００：ＣＤ１２３Ｆ１２−２プライマー
配列番号１０１：ＣＤ１２３Ｒ１３プライマー
配列番号１０２：ＣＤ１２３Ｆ１３プライマー
配列番号１０３：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｆｗプライマー
配列番号１０４：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｒｅプライマー
配列番号１０５：ＧＭ−ＣＳＦＲＦ１１プライマー
配列番号１０６：ＧＭ−ＣＳＦＲＲ１１プライマー
配列番号１０７：ＧＭ−ＣＳＦＲＦ１２プライマー
配列番号１０８：ＧＭ−ＣＳＦＲＲ１２プライマー
配列番号１０９：ＧＭ−ＣＳＦＲＦ１３プライマー
配列番号１１０：ＧＭ−ＣＳＦＲＲ１３プライマー
配列番号１１１：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｆｗプライマー
配列番号１１２：ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−Ｒｅプライマー
配列番号１４９：ＣＤ１２３−Ｆｗ２１プライマー
配列番号１５０：ＣＤ１２３−Ｒｅ２１プライマー
配列番号１５１：ＣＤ１２３−Ｆｗ２２プライマー
配列番号１５２：ＣＤ１２３−Ｒｅ２２プライマー
配列番号１５３：ＣＤ１２３−Ｆｗ２３プライマー
配列番号１５４：ＣＤ１２３−Ｒｅ２３プライマー
配列番号１５５：ＣＤ１２３−Ｆｗ２４プライマー
配列番号１５６：ＣＤ１２３−Ｒｅ２４プライマー
配列番号１５７：ＣＤ１２３−Ｆｗ２５プライマー
配列番号１５８：ＣＤ１２３−Ｒｅ２５プライマー
配列番号１５９：ＣＤ１２３−Ｆｗ２６プライマー
配列番号１６０：ＣＤ１２３−Ｒｅ２６プライマー
【図１】
0005913657.tif 000006
【図２】
0005913657.tif 000007
【図３】
0005913657.tif 000008
【図４】
0005913657.tif 000009
【図５】
0005913657.tif 000010
【図６】
0005913657.tif 000011
【図７】
0005913657.tif 000012
【図８】
0005913657.tif 000013
【図９】
0005913657.tif 000014
【図１０】
0005913657.tif 000015
【配列表】
0005913657000001.app