(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯を欠損した哺乳動物の歯槽骨を回復するための医薬組成物の製造における再生歯ユニットの使用であって、
前記再生歯ユニットは、下記の工程：
（ａ）再生歯胚を作製する工程、
（ｂ）前記再生歯胚を非ヒト哺乳動物の生体内において培養し、再生歯ユニットを作製する工程、
を含む方法によって製造されるものであり、
その際、工程（ｂ）は、非ヒト哺乳動物の生体内に配置されたスペーサー内部において再生歯胚を培養することを含んでおり、
前記スペーサーは、金、銀、鉄、銅、アルミニウム、ポリエチレン、樹脂、歯科用レジン、または歯科用セメントから選択される材質からなる、前記再生歯胚が最大許容値以上に伸長することを防止可能な略円筒状構造物である、使用。
【請求項２】
前記方法が下記の工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用；
（ａ）再生歯胚を作製する工程、
（ｂ）前記再生歯胚を、非ヒト哺乳動物であって顎骨回復の対象とは異なる個体の生体内において培養し、再生歯ユニットを作製する工程。
【請求項３】
請求項１または２に記載の使用であって、
前記再生歯胚は、間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて支持担体内部に配置されて培養・維持されたものであり、間葉系細胞と上皮細胞の少なくともいずれか一方が歯胚由来であることを特徴とする使用。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載の使用であって、
前記（ｂ）工程において、非ヒト哺乳動物の外部から機械的刺激を与えることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生歯ユニットの移植による歯槽骨の回復方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯は、歯の周囲に存在する歯周組織によって支えられている。歯自体は、最外層にエナメル質、その内層に象牙質という硬組織を有し、さらにその内側に象牙質を産生する象牙芽細胞、中心部に歯髄を有する器官である。一方、歯周組織は、歯槽骨という骨を土台として有し、歯槽骨と歯根の接する部分には、歯根の周りにセメント質及び歯根膜を有し、歯根と接する部分以外の歯槽骨の外層を覆うように歯肉が形成されている。これらの歯周組織に発生する疾患として、歯肉に炎症が生じる歯肉炎、歯周組織にまで炎症が生じる歯周炎、さらに歯槽骨が溶けて減ってしまう歯槽膿漏等がある。歯槽骨が溶けてしまうと歯を支えることが困難になり、歯を失ってしまう。また、経年による歯槽骨吸収が進んだ場合にも、歯を支えることは困難になる。
一方で、歯自体の疾患の場合にも、歯を失い、インプラント治療が行われることがしばしばある。この場合、インプラントを移植するためには、インプラントを支える歯槽骨が必要であるが、歯槽骨が十分にない場合には、インプラント治療を行うことができない。また、インプラント治療時には十分な骨組織があったとしても、インプラントの移植後に、歯槽骨の吸収が進行してしまうことも知られている。
そこで、失われた歯槽骨を回復または再生する技術への関心が高まっている。【０００３】
近年では、歯周病治療として、ＧＴＲ法（ｇｕｉｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）やエムドゲイン（商標）等が用いられることがある。ＧＴＲ法は、歯周外科後に、メンブレンを挿入することにより、歯肉上皮の歯槽骨側への侵入を防ぎ、歯根膜・歯槽骨などの歯周組織の垂直的な再生を促そうとする方法である。また、エムドゲイン（商標）は、エナメルマトリックスタンパクを主成分とした薬剤であり、破壊された歯周組織の再生を図る方法である。しかし、いずれの方法も歯槽骨の垂直的再生を促すことは難しく、特に大型の歯槽骨再生にはその効果は十分ではない。【０００４】
本発明者らは、歯の再生に着目し、これまでに、間葉系細胞と上皮系細胞を用いて、これらの細胞のうちの少なくともいずれか一方を歯胚由来の細胞とし、コラーゲンゲルなどからなる支持担体の内部に、間葉系細胞から実質的になる第１の細胞凝集塊と、上皮系細胞から実質的になる第２の細胞凝集塊を接触させて配置し、第１及び第２の細胞凝集塊を支持担体の内部で培養することによって、細胞の分化が効果的に誘導され、特有の細胞配置と方向性を備えた再生歯胚や再生歯ユニットを作製できることを見出した（例えば、特許文献１参照）。【０００５】
さらに、口腔内上皮細胞やその初代培養細胞を上皮系細胞として利用した場合（例えば、特許文献２参照）、羊膜由来細胞を間葉系細胞として利用した場合（例えば、特許文献３参照）、全能性幹細胞を分化誘導した細胞を間葉系細胞として利用した場合（例えば、特許文献４参照）にも、同様に特有の細胞配置と方向性を備えた再生歯胚や再生歯ユニットが得られることを示した。また、これらの再生歯は、咬み合わせや硬度の面において、生来の歯と同様に利用可能なものであることを示した（例えば、特許文献５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２９６７２号パンフレット
【特許文献２】特開２００８−２９７５６号公報
【特許文献３】特開２００８−２０６５００号公報
【特許文献４】特開２００８−２０００３３号公報
【特許文献５】国際公開第２０１０／０２１３４０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、歯を欠損した哺乳動物の、歯槽骨を回復させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、歯を欠損した哺乳動物の歯が欠損した部分に対し、再生歯ユニットを移植することによって、再生歯ユニットの移植前に比べて歯槽骨を回復させることができることを見出した。
即ち、本発明は、歯を欠損した哺乳動物の歯槽骨の回復方法であって、再生歯ユニットを、前記歯を欠損した部位に移植する工程を含む、方法に関する。
ここで、本発明の歯を欠損した哺乳動物の歯槽骨の回復方法の一実施態様においては、前記動物が非ヒト哺乳動物であることを特徴とする。
本発明の歯を欠損した哺乳動物の歯槽骨の回復方法の一実施態様においては、下記の工程；
（ａ）再生歯胚を作製する工程、
（ｂ）前記再生歯胚を哺乳動物の生体内において培養し、再生歯ユニットを作製する工程、
（ｃ）前記再生歯ユニットを哺乳動物の歯を欠損した部位に移植する工程、
を含むことを特徴とする。
本発明の歯を欠損した哺乳動物の歯槽骨の回復方法の一実施態様においては、下記の工程；
（ａ）再生歯胚を作製する工程、
（ｂ）前記再生歯胚を、哺乳動物であって顎骨回復の対象とは異なる個体の生体内において培養し、再生歯ユニットを作製する工程、
（ｃ）前記再生歯ユニットを顎骨回復の対象となる哺乳動物の歯を欠損した部位に移植する工程、
を含むことを特徴とする。
本発明の歯を欠損した哺乳動物の歯槽骨の回復方法の一実施態様においては、前記再生歯胚は、間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて支持担体内部に配置されて培養・維持されたものであり、間葉系細胞と上皮細胞の少なくともいずれか一方が歯胚由来であることを特徴とする。
本発明の歯を欠損した哺乳動物の歯槽骨の回復方法の別の一実施態様においては、
前記（ｂ）工程が哺乳動物の生体内に配置されたスペーサー内部において再生歯胚を培養することを特徴とする。
本発明の歯を欠損した哺乳動物の歯槽骨の回復方法の別の一実施態様においては、
前記（ｂ）工程において、哺乳動物の外部から機械的刺激を与えることを特徴とする。
また、本発明の別の態様によれば、本発明は、前記歯槽骨の回復方法に用いるための、歯槽骨回復用再生歯ユニットに関する。
また、本発明の別の態様によれば、本発明は、前記歯槽骨の回復方法に用いるための、再生歯ユニット作製用再生歯胚に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、再生歯ユニットを移植することにより、哺乳動物の歯槽骨を回復することができる。特に、本発明は、その一態様として、従来技術では困難だった、歯槽骨の垂直方向の回復を可能とする。
また、本発明の一態様として、スペーサーを用いて作製した再生歯ユニットを移植する方法によれば、再生歯胚を動物の生体内で培養しても、当該動物の組織等から過剰な圧力を受けることなく、再生歯の周囲に歯周組織が広く発達した再生歯ユニットを得ることができ、当該再生歯ユニットを移植することによって、移植された動物の歯槽骨をよりよく回復することができる。また、本発明の一態様として、スペーサーを用いて作製した再生歯ユニットを移植する方法によれば、歯が必要以上に伸長することを防ぎつつ、歯周組織の発達を促すように長期間培養することができ、当該再生歯ユニットを移植することによって、移植された動物の歯槽骨をよりよく回復することができる。また、本発明の一態様として、歯の欠損部の大きさや形状に合わせてスペーサーの大きさや形状を調整し、当該スペーサーを用いて培養し作製した再生歯ユニットを移植することにより、再生歯ユニットの移植を成功させやすくし、当該再生歯ユニットを移植された動物の歯槽骨をよりよく回復することができる。
さらに、本発明の一態様として、機械的刺激を与えて作成した再生歯ユニットを移植する方法によれば、再生歯胚を動物の生体内で培養しても、十分な歯根膜組織を有する再生歯を得ることができ、当該再生歯ユニットを移植することにより、移植された動物の歯槽骨をよりよく回復することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の一態様として、スペーサーを用いて再生歯ユニットを製造する場合について、マウスの腎皮膜下に配置したスペーサー内で再生歯胚の生体内培養を行う様子を示す写真である。
【図２】図２は、スペーサーを用いて作製した再生歯ユニットのマイクロＣＴ画像である。
【図３】図３は、スペーサーを用いないで作製した再生歯ユニットのマイクロＣＴ画像である。
【図４】図４は、スペーサーを用いて作製した再生歯ユニット（制御）、スペーサーなしで作製した再生歯ユニット（非制御）、及び天然歯の歯冠部の長径／短径比を、ＣＴ画像上で測定・算出した結果を示す。
【図５】図５は、スペーサーを用いて作製した再生歯ユニット（制御）、及びスペーサーなしで作製した再生歯ユニット（非制御）の長さをＣＴ画像上で測定した結果を示す。
【図６】図６は、機械的刺激を与えながら再生歯胚を生体内培養して作製した再生歯ユニットと、刺激を与えずに作製した再生歯ユニットのＨＥ染色像である。
【図７】図７は、機械的刺激を与えながら再生歯胚を生体内培養して作製した再生歯ユニットと、刺激を与えずに作製した再生歯ユニットの歯根膜の幅をＣＴ画像上で測定した結果である。
【図８】図８は、本発明の方法で製造した再生歯ユニットを顎骨移植した様子を示す。
【図９】図９は、本発明の方法で製造した再生歯ユニットを顎骨移植した後、０日、１４日、３０日目のＣＴ画像である。
【図１０】図１０は、本発明の方法で製造した再生歯ユニットを顎骨移植した後、３０日目のＨＥ染色像である。
【図１１】図１１は、スペーサー内に再生歯胚を配置した状態を模式的に示した平面図及び側面図である。
【図１２】図１２は、大型骨欠損モデルに移植する再生歯ユニットの（ａ）実体像、（ｂ）ＣＴ像、及び、（ｃ）ＣＴ断面像である。
【図１３】図１３上段は、大型骨欠損モデルに対し、再生歯ユニットを移植しなかった場合について、下段は、大型骨欠損モデルに対し、再生歯ユニットを移植した場合について、それぞれ、左から順番に、移植後０日、１４日、３０日、及び４０日経過後の欠損部位（移植部位）周辺の写真である。
【図１４】図１４左側は、コントロール、すなわち、大型骨欠損モデルに対し、再生歯ユニットを移植しなかった場合について、右側は、移植例、すなわち、大型骨欠損モデルに対し、再生歯ユニットを移植した場合についての欠損部位（移植部位）周辺の移植４５日後の写真である。写真中、点線は移植時の歯槽骨の上端部のラインを示し、実線は、移植４５日後の歯槽骨の上端部のラインを示す。
【図１５】図１５は、移植後４５日間において再生された歯槽骨量を示したグラフである。グラフの左側は、コントロール、すなわち、大型骨欠損モデルに対し、再生歯ユニットを移植しなかった場合について、グラフの右側は、移植例、すなわち、大型骨欠損モデルに対し、再生歯ユニットを移植した場合について再生された歯槽骨の骨量を示す。
【図１６】図１６上段は、コントロール、すなわち、大型骨欠損モデルに対し、再生歯ユニットを移植しなかった場合について、下段は、移植例、すなわち、大型骨欠損モデルに対し、再生歯ユニットを移植した場合についての欠損部位（移植部位）周辺のＣＴ外観像である。それぞれについて、左側の画像は、移植０日後、中央の画像は、移植４９日後を示す。右側の図は、移植４９日後のＣＴ像の拡大図であり、上段・下段ともに、移植例の移植４９日後の欠損部位（移植部位）の歯槽骨上端を通る水平線を点線で示す。右側上段の図において、コントロールの欠損部位の歯槽骨上端部と、移植例の歯槽骨上端部との垂直方向の差異を模式的に両矢印で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係る顎骨の回復方法の第一の態様は、歯を欠損した動物の歯槽骨の回復方法であって、再生歯ユニットを、前記歯を欠損した部位に移植する工程を含むことを特徴とする。
【００１２】
本明細書において、「歯」とは、内側に象牙質及び外側にエナメル質の層を連続して備えた組織をいい、歯冠や歯根を有する方向性を備えた組織を意味する。歯の方向性は歯冠や歯根の配置によって特定することができる。歯冠や歯根は、形状や組織染色などに基づいて目視にて確認することができる。歯冠とは、エナメル質と象牙質の層構造を有する部分をいい、歯根にはエナメル質の層は存在しない。
【００１３】
象牙質及びエナメル質は、当業者が、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。また、エナメル質は、エナメル芽細胞の存在によって特定することができ、エナメル芽細胞の存在は、アメロジェニンの有無によって確認することができる。一方、象牙質は、象牙芽細胞の存在によって特定することができ、象牙芽細胞の存在は、デンチンシアロプロテインの有無によって確認することができる。アメロジェニン及びデンチンシアロプロテインの確認は、この分野で周知の方法によって容易に実施することができ、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、抗体染色等を挙げることができる。
【００１４】
本明細書において、歯の「欠損」とは、欠損の理由を問わず、歯が存在すべき場所に存在しない状態をいう。歯が歯周病等の疾患により自然に抜けた場合の他、歯科治療のために人為的に抜歯した場合等をも含む。「歯が欠損した部位」、「欠損部位」や「欠損部」とは、抜歯等、歯の欠損により歯肉に設けられた部分を意味し、形状に特に制限はない。また、「歯が欠損した部位」について、歯の欠損自体により生じた孔の他、インプラント治療等のために歯槽骨を削る等の行為により人為的に欠損部位の形状を変化させた場合や、歯槽骨の吸収等により自然に欠損部位の形状等が変化した場合等をも含む。また、再生歯ユニットを埋設可能である限り、欠損場所、目的とする歯の種類は特に限定されない。また、本明細書において、臼歯のような大きな歯が欠損した場合、小さい歯が並んで複数欠損した場合、あるいは、歯の本数を問わず、これらに相当する範囲における欠損が生じている場合を「大型欠損」ないし「広範性欠損」とよぶことがある。欠損部は、通常、顎骨、口腔の歯槽骨などに位置する。
【００１５】
本発明に係る歯槽骨の回復方法において、再生歯ユニットの移植対象、すなわち、歯を欠損した哺乳動物とは、本来歯を有する哺乳動物である限り特に限定されない。歯を欠損した動物は、再生歯の製造に用いた歯胚を摘出した動物と同種とすることが好ましく、歯胚を摘出した個体と同一個体とすることがさらに好ましい。例えば、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス等を挙げることができる。非ヒト哺乳動物とすることも好ましい。
【００１６】
本明細書において「再生歯ユニット」とは、再生歯胚を培養し、再生歯胚に含まれる各種細胞を分化させた結果得られる、歯と歯を支持する歯周組織からなるユニットをいう。
再生歯ユニットにおける歯の部分は、後に説明する歯の発生段階における歯芽から歯の段階の構成を有している。また、歯周組織は、歯根膜と歯槽骨を含む。「再生歯ユニット」とは、再生された歯の部分及び再生された歯周組織の部分を含むものであれば、その製造方法は特に限定されない。再生歯ユニットの一作製方法としては、再生歯胚を哺乳動物の生体内で培養することにより、再生歯ユニットを得ることができる。再生歯ユニットの他の作製方法としては、再生歯胚をある程度の長期間器官培養を行うことにより、再生歯ユニットを得ることができる。
【００１７】
歯槽骨は、当業者が、目視やＣＴ画像などによって形態的に容易に特定することができる。ＣＴ画像やＣＴ断面像も、当業者に公知の器機を用いることにより、容易に撮影することができる。ＣＴ撮影には、例えば、実験動物用３ＤマイクロＸ線ＣＴ  Ｒ  ｍＣＴ（リガク）を用いることができ、例えば、９０ｋＶ，１５０ｍＡ、断層厚１０ｍｍのような条件下で行うことができる。また、当業者であれば、ＣＴ撮影後、適当な画像解析ソフトを用いて画像構築及び解析等を行うことができる。画像解析ソフトとしては、例えば、小動物用画像ファイリングソフトウェア  ｉ−  ＶＩＥＷ  タイプＲ、および高精細３Ｄ／４Ｄ画像解析ソフトウェア  Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を用いることができる。また、当業者であれば、上記例示以外にも、同様の機器を用いて適切な条件を設定し、同様な画像解析ソフトを利用して、ＣＴ撮影及び解析を行うことが可能である。
【００１８】
歯根膜やセメント質も、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。染色方法としては、例えば、通常のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を用いることができる。組織染色を行うにあたり、当業者であれば、例えば、サンプルを４％パラフォルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＰＦＡ）にて固定し、１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）にて脱灰し、パラフィン包埋し、その後、厚さ８マイクロメートルの連続切片を作製するなどの工程を経て、ＨＥ染色を行うことができる。また、当業者であれば、上記例示以外にも、一般的な方法に従って組織染色を行い、組織学的評価を行うことが可能である。
【００１９】
本明細書において「歯胚」とは、将来歯になることが決定付けられた歯の初期胚であり、歯の発生ステージで一般的に用いられる蕾状期（Ｂｕｄ  ｓｔａｇｅ）から鐘状期（Ｂｅｌｌ  ｓｔａｇｅ）までの段階のものを指し、特に歯の硬組織としての特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が認められない組織である。一方、本明細書において「歯芽」とは、「歯胚」の段階より後の組織を指し、歯の硬組織の特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が始まった段階から、歯が歯肉から萌出して一般的に歯としての機能を発現する前の段階の組織をいう。
本明細書において「再生歯胚」とは、細胞培養技術により人工的に形成した歯胚をいう。
【００２０】
本明細書において、「移植」とは、歯を欠損した部位に再生歯ユニットを配置し固定することをいう。移植の際には、再生歯ユニットの歯周組織部位を欠損部に位置させ、歯の歯冠部分を口腔内に向かって位置させることが好ましい。再生歯ユニットを欠損部へ配置した後は、通常の処理に従って、縫合等を行うことが好ましい。また歯の喪失に伴って歯槽骨量が低下している場合には、欠損部位に対してＧＴＲ法（ｇｕｉｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：組織再生誘導法）など、インプラントの埋設のために臨床で用いられる公知の方法を併用してもよい。
【００２１】
本明細書において、歯槽骨の「回復」とは、再生歯ユニットの移植前と比較して、欠損部位の骨量が増大することを意味する。一定範囲における骨量の変化は、例えば、骨量の変化を測定すべき部位を、経時的にマイクロＣＴ撮影し、統合画像処理ソフトによる解析を行うことにより、移植前及び移植後の当該部位の骨の体積を測定する、という方法により測定することができる。本発明の歯槽骨の骨量の変化は、例えば、このような方法を用いて、欠損部位の頬側歯槽骨における移植前後の歯槽骨の体積を測定することにより測定することができる。また、歯槽骨の回復は、形態的に確認することも可能である。すなわち、下顎であれば歯槽骨の上端部分が上顎方向へと向かって成長し、移植前の状態に比べて隆起した状態となること、反対に、上顎であれば歯槽骨の下端部分が下顎方向へと向かって成長し、移植前の状態に比べて隆起した状態となることをいう。歯槽骨の回復は、歯槽骨の再生ということもできる。本明細書において、このような歯槽骨の回復ないし再生を、歯槽骨の垂直方向の回復ないし再生、または、歯槽骨の垂直的な回復ないし再生とよぶこともある。また、歯槽骨は、顎骨の中の歯周辺部位を指す言葉であり、どこまでが歯槽骨であるかは厳密に区別できないことから、本明細書において、歯槽骨の回復は、歯槽骨周辺の顎骨の回復を含んでいてもよい。
【００２２】
次に、本発明の方法に用いられる再生歯ユニットについて説明する。
再生歯ユニットは、再生歯胚を作製し培養することにより、再生歯の周囲に歯周組織を形成させることができる。再生歯胚はどのような方法で作製したものであってもよいが、例えば、間葉系細胞と上皮系細胞を用いて、これらの細胞のうちの少なくともいずれか一方を歯胚由来の細胞とし、間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、第１及び第２の細胞集合体を支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法によって作製することができる。なお、本明細書において、２つの細胞集合体を区別するために、便宜上、間葉系細胞で実質的に構成される細胞集合体の方を第１の細胞集合体と呼んだが、上皮細胞で実質的に構成される細胞集合体の方を第１の細胞集合体と呼ぶこともでき、いずれを第１の細胞集合体と呼ぶか否かは重要ではない。
【００２３】
本発明において「間葉系細胞」は、間葉組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味し、「上皮系細胞」は、上皮組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味する。
また、本発明において「歯周組織」とは、歯の主として外層に形成された歯槽骨及び歯根膜をいう。歯槽骨及び歯根膜は、当業者が、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。
【００２４】
「間葉系細胞で実質的に構成される第１の細胞集合体と、上皮細胞で実質的に構成される第２の細胞集合体を密着させて配置する工程」は、例えば、特許文献１乃至４及び特開２００８−２９７５７号公報に記載されており、それら各文献の開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００２５】
上記第１の細胞集合体と第２の細胞集合体は、それぞれ実質的に間葉系細胞のみ、又は上皮系細胞のみで構成されている。「実質的に間葉系細胞のみで構成されている」とは、本発明において、ある細胞集合体が間葉系細胞のみから構成されている場合と同じ機能を果たすことを意味し、間葉系細胞となる細胞以外のものをできるだけ含まない状態をいう。「実質的に上皮系細胞のみからなる」という場合も同様である。
ここで、細胞集合体とは、細胞が密着した状態をいい、組織であっても、ばらばらの細胞から調製された細胞凝集塊であってもよい。組織を用いれば、細胞配置や形状の正しい歯が得られやすいという利点があるが、入手できる量に制約がある場合もある。細胞凝集塊は、培養細胞も用いることができるので、比較的入手しやすく好ましい。本発明に係る方法によれば、細胞凝集塊を用いても、細胞配置や形状の正しい再生歯を得ることができる。
【００２６】
細胞集合体を構成する間葉系細胞及び上皮系細胞は、少なくともいずれか一方を歯胚由来とする。これにより、生体内での細胞配置を再現して特有の構造及び方向性を有する歯を効果的に形成することができる。間葉系細胞及び上皮系細胞がいずれも歯胚由来であることがより好ましい。当該歯胚は、細胞の分化段階の幼若性と均質性の観点から、蕾状期から帽状期のものであることが好ましい。
【００２７】
歯胚以外に由来する間葉系細胞として、生体内の他の間葉系組織に由来する細胞を用いることもできる。好ましくは、血液細胞を含まない骨髄細胞や間葉系細胞、さらに好ましくは口腔内間葉系細胞や顎骨の内部の骨髄細胞、頭部神経堤細胞に由来する間葉系細胞、これらの間葉系細胞に分化しうる間葉系前駆細胞やその幹細胞等である。間葉系細胞として、羊膜由来細胞を用いる例が特許文献３に、全能性幹細胞を分化誘導した細胞を用いる例が特許文献４に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００２８】
歯胚以外に由来する上皮系細胞として、生体内の他の上皮系組織に由来する細胞を用いることもできる。好ましくは、皮膚や口腔内の粘膜や歯肉の上皮系細胞、さらに好ましくは皮膚や粘膜などの分化した、例えば角化した、あるいは錯角化した上皮系細胞に分化しうる未熟な上皮系前駆細胞、例えば非角化上皮系細胞やその幹細胞等である。口腔内上皮細胞やその初代培養細胞を上皮系細胞として用いる例が特許文献２に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００２９】
歯胚及び他の組織は、哺乳動物の霊長類（例えばヒト、サルなど）、有蹄類（例えばブタ、ウシ、ウマなど）、小型哺乳類のげっ歯類（例えばマウス、ラット、ウサギなど）のほか、イヌ、ネコなど種々の動物の顎骨等から採取することができる。歯胚及び組織の採取は、通常、組織の採取で用いられる条件をそのまま適用すればよく、無菌状態で取り出し、適当な保存液に保存すればよい。なお、ヒトの歯胚としては、第３大臼歯いわゆる親知らずの歯胚のほか、胎児歯胚を挙げることができるが、自家組織の利用の観点から、親知らずの歯胚を用いることが好ましい。また、マウスの場合、胎児齢１０日から１６日の歯胚を用いることが好ましい。
【００３０】
歯胚からの間葉系細胞及び上皮系細胞の調製は、まず周囲の組織から単離された歯胚を、形状に従って、歯胚間葉組織及び歯胚上皮組織に分離することによって行われる。この際、分離を容易に行うため酵素を用いてもよい。酵素としては、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等を挙げることができる。
【００３１】
本発明における細胞凝集塊は、間葉組織または上皮組織に由来する細胞が凝集したものを意味し、間葉組織又は上皮組織をばらばらに分散させて得た細胞、あるいは当該細胞の初代または継代培養によって得た細胞を凝集させて調製することができる。
【００３２】
細胞を分散させるためには、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等の酵素を用いてもよい。十分な細胞数を得るために、細胞凝集塊を調製する前に分散した細胞の初代または継代培養を行う場合、培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等を用いることができる。細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常１０％前後とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、例えば約３７℃の温度で５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加したものであってもよい。
【００３３】
細胞を凝集させるためには、例えば、細胞懸濁液を遠心処理すればよい。間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞凝集塊は、両者を密着させたときに確実に細胞相互作用するよう、それぞれを高密度の状態にしておくことが好ましい。高密度の状態とは、組織を構成する際の密度と同等程度であることをいい、例えば、５×１０７個／ｍｌ〜１×１０９個／ｍｌ、好ましくは１×１０８個／ｍｌ〜１×１０９個／ｍｌ、最も好ましくは２×１０８個／ｍｌ〜８×１０８個／ｍｌである。細胞凝集塊を高密度にする方法は特に限定されないが、例えば、細胞を遠心処理によって凝集させ沈殿化する方法によって行うことができる。遠心処理は細胞の活性を損なわずに簡便に高密度化できるため好ましい。遠心処理は、３００×ｇ〜１２００×ｇ、好ましくは５００×ｇ〜１０００×ｇの遠心力を与える回転数で３分間〜１０分間行えばよい。３００×ｇよりも低い遠心処理では、細胞密度を十分に高くできなくなる傾向があり、一方、１２００×ｇよりも高い遠心処理では、細胞が損傷を受ける場合がある。
【００３４】
遠心分離によって高密度の細胞凝集塊を調製する場合には、通常、細胞の遠心分離をするために用いられるチューブ等の容器に細胞の懸濁液を調製してから遠心分離を行い、沈殿物としての細胞を残して上清をできるだけ除去すればよい。このとき、目的とする細胞以外の成分（例えば、培養液、緩衝液等）は、細胞の容量と等量以下であることが好ましく、目的とする細胞以外の成分を含まないことが最も好ましい。このような高密度の細胞集合体を後述する方法により支持担体内で密着させれば、細胞が緊密に接触し、細胞間相互作用が効果的に発揮される。
【００３５】
第１及び第２の細胞集合体を培養する目的で用いられる支持担体は、細胞が分散することなく、細胞集合体の密着状態を保持可能な保持力を備えていることが好ましい。密着した状態とは、上述した高密度の間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞集合体が、間葉系細胞と上皮系細胞の接触面付近においても同程度の高さの密度を維持している状態を意味する。密着状態を保持可能な支持担体は、例えば、コラーゲンの場合、最終濃度２ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌの濃度、即ちＪＩＳ−Ｋ６５０３−１９９６に準拠した方法（１２．７ｍｍ径のプランジャーで４ｍｍ押し下げるのに必要な荷重として測定）によって１２０ｇ〜２５０ｇのゼリー強度となる濃度での使用が適切な硬さを提供する。他の種類の支持担体においても、同様の評価方法によって同様の強度があれば本発明の支持担体として好ましく用いられる。また１種又は複数種の支持担体を混合することによって、目的とするゼリー強度に相当する硬さの支持担体を得てもよい。支持担体としては、後述する、スペーサー内に配置される支持担体と同じものを使用することができる。
【００３６】
第１及び第２の細胞集合体を支持担体内に配置する方法は特に限定されないが、細胞集合体が細胞凝集塊である場合は、例えば上述した遠心分離で得られる沈殿物をマイクロシリンジ等で支持担体内に挿入して配置することができる。細胞集合体が組織である場合には、シリンジの針の先端などを用いて支持担体内の任意に位置に配置することができる。
【００３７】
本発明において第１と第２の細胞集合体を支持担体に密着させて配置する方法は特に限定されないが、例えば、一方の細胞集合体を支持担体内に配置したあと、他方の細胞集合体をそれに押しつけるように配置することによって、両者を密着させることができる。より具体的には、支持担体内において上記シリンジの針の先端の位置を適宜変更することで一方の細胞集合体を他方の細胞集合体に押し付けることが可能である。なお、細胞集合体として上皮系組織又は間葉系組織を用いる場合には、当該組織が元々の歯胚において間葉系組織又は上皮系組織と接触していた面を、他方の細胞集合体に接触するように配置することが好ましい。
また、配置した後に、支持担体を固化する工程を設けることも好ましい。これにより、細胞がさらに凝集して、より高密度な状態とすることができる。例えば、コラーゲンゲルの場合、培養温度下で数分〜数十分間静置することによって固化することができる。このとき、細胞集合体内に細胞以外の成分が少なければ少ないほど、より高密度な状態が実現される。
【００３８】
本発明における、「第１及び第２の細胞集合体を支持担体の内部で培養する工程」は、例えば、特許文献１乃至４及び特開２００８−２９７５７号公報に記載されており、それら各文献の開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００３９】
培養期間は、支持担体内部に配置された細胞数、細胞集合体の状態、培養の条件、動物種等によって異なり、当業者が適宜選択することができる。口腔内に移植した際に機能的な歯として萌出するためには、少なくとも１日培養することが好ましく、３日以上がより好ましい。
培養期間を長くすることによって、象牙質及びエナメル質の蓄積、歯冠の形成、及び歯根の形成のように、再構成歯胚の形成をより進行させることができる。所望の状態を得るために、例えば、６日以上、３０日以上、５０日以上、１００日以上、又は３００日以上培養してもよく、培養の途中で、培地や培養条件を変更することもできる。
【００４０】
支持担体内部における培養工程は、第１及び第２の細胞集合体を内包する支持担体を単独で培養してもよく、他の動物細胞等の存在下で培養してもよい。
支持担体を単独で培養する場合、培養条件は、一般的な動物細胞の培養に用いられる条件とすることができる。また、培養には、哺乳動物由来の血清を添加してもよく、またこれらの細胞の増殖や分化に有効であることが知られている各種細胞因子を添加してもよい。このような細胞因子としては、ＦＧＦ、ＢＭＰ等を挙げることができる。
【００４１】
細胞集合体のガス交換や栄養供給の観点、及び他の動物細胞との接触・混入がなく、且つ全工程をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができるという観点から、支持担体内部における培養を、器官培養とすることが好ましい。器官培養では、一般に、動物細胞の増殖に適した培地上に多孔性の膜をフロートさせ、その膜上に第１及び第２の細胞集合体を内包する支持担体を載置して培養を行う。ここで用いられる多孔性の膜は、０．３〜５μｍ程度の孔を多数有するものであることが好ましく、例えば、セルカルチャーインサート（商品名）やアイソポアフィルター（商品名）を挙げることができる。
【００４２】
本発明に用いる再生歯ユニットの製造方法では、再生歯胚を作製したのち、当該再生歯胚を哺乳動物の生体内においてさらに培養することができる。哺乳動物の生体内における培養により、再生歯の分化誘導及び歯周組織の形成を促し、本発明により適した歯周組織を有する再生歯ユニットを形成することができる。
【００４３】
本発明に係る方法によって得られる歯は、内側に象牙質、外側にエナメル質という歯特有の細胞配置（構造）を有するものであり、好ましくは、歯の先端（歯冠）と歯根を正しい位置に有する方向性も備えたものであり、歯としての機能を十分に果たすものである。従って、歯の代替物として広く利用することが可能である。また、歯の発生過程を解明するための研究に有用なリサーチツールとして用いることもできる。
【００４４】
さらに、培養期間を延長することによって、歯そのものに加え、歯を顎骨上で支持し固定化する歯槽骨や歯根膜などの歯周組織も形成させることができる。これにより、移植後の歯の実用性をさらに高めることができる。また、歯周組織のみを分離して利用することも可能である。
【００４５】
本発明に用いる再生歯ユニットは、欠損部の大きさや再生させる歯の大きさにより、適宜その大きさを調節して作製することができる。例えば、再生歯胚を作製する際に、前記間葉系細胞集合体と前記上皮系細胞集合体とを接触させて配置する際、それぞれの細胞集合体を略柱状に形成することができ、その場合に、その柱の軸方向の接触長さを制御することによって、一方向に所望の長さを有する歯を形成できる。例えば、前記間葉系細胞集合体と前記上皮系細胞集合体との接触長さを、所望の再生歯の歯冠の幅の±２５％とすることによって、当該所望の長さを有する再生歯を作製することができる。
【００４６】
本発明に用いる再生歯ユニットを構成する歯は、内側に象牙質、外側にエナメル質という歯特有の細胞配置（構造）を有するものであり、好ましくは、歯の先端（歯冠）と歯根を正しい位置に有する方向性も備えたものであり、歯としての機能を十分に果たすものである。従って、生来の歯の代替物として広く利用することが可能である。
【００４７】
さらに、本発明に用いる再生歯ユニットは、歯そのものに加え、歯を顎骨上で支持し固定化する歯槽骨や歯根膜などの歯周組織を有するものであり、これにより、移植後の顎骨の回復性をさらに高めることができる。
【００４８】
本発明の別の実施態様に係る顎骨の回復方法に用いる再生歯ユニットは、再生歯胚を哺乳動物の生体内において培養する際、スペーサーを用いて培養することができる。より具体的には、再生歯胚を作製後、再生歯胚をスペーサー内に配置し、再生歯胚を含むスペーサーごと哺乳動物の生体内に移植し、培養することができる。
【００４９】
本明細書において、スペーサーとは、哺乳動物の生体内で再生歯胚を培養する際に、再生歯胚が必要以上に伸長しないことを目的として、再生歯胚を覆うように配置される器具を意味する。また、スペーサーは、例えば、腎皮膜下等の生体内で培養する場合においては、皮膜の圧力や生体内の組織から過剰な圧力を再生歯胚が受けないようにする役割を果たすことができる。スペーサーの形状は、これらの目的が達成される限りどのような形状であってもよい。
【００５０】
すなわち、スペーサーの形状は、所望の再生歯ユニットのサイズ（主には、長さと厚み）を有する再生歯ユニットを発生させることができる内部空間を確保できるものであればよい。再生歯ユニットの長さとは、再生歯ユニットの歯の部分において将来咬合面となる部位から将来根尖となる部位までの長さをいう。将来根尖となる部位のまわりに歯周組織が形成されている場合は、その先端（将来咬合面となる部位から最も遠い部位）までの距離を意味する。再生歯ユニットの長さの略最大許容値とは、哺乳動物の生体内で再生歯胚を培養した後に得られる再生歯ユニットの長さとして許容される最大値程度を意味する。当該略最大許容値は、再生歯胚がその後移植される対象や部位によって当業者が適宜決定することができる。再生歯ユニットの厚みは、一般には、再生歯ユニットの歯冠部の厚みをいうが、将来根尖となる部位のまわりに、歯周組織が形成されている場合には、歯周組織のある部分の厚みをいうこともある。人間の歯がそうであるように、歯冠部の断面は、通常、完全な正方形でも長方形でもなく、むしろ長径と短径によって規定される。
【００５１】
従来の知見から、再生歯胚の伸長の方向は、相当程度、制御可能であるため、スペーサー内部において、再生歯胚組成物を配置する際の再生歯胚組成物自体の方向や、スペーサー内部における相対的位置を、望ましい伸長の方向を意図して、任意に調整することができる。したがって、所望のサイズが得られるように、再生歯胚組成物の伸長の方向を考慮して、スペーサーの３次元の大きさを設計することができる。
一般的には、スペーサーの内部空間は、所望の再生歯ユニットよりも大きいものでなければならない。換言すれば、スペーサーの内部空間は、再生歯ユニットが、最大許容値以上に伸長することを防止する役割を果たすことになる。
【００５２】
以下において、スペーサーの形状を、上下が開いた円筒状（リング状）とする場合について説明する。もっとも、当業者であれば、本明細書の開示等に基づき、所望の形状を有するスペーサーをデザインすることは、容易になし得るであろう。
このような上下が開いた円筒状（リング状）とする場合には、上下の解放部を通じて、スペーサー外部からの栄養供給路も十分に確保され、再生歯ユニットの形成が可能となる。
また、そのような円筒状（リング状）のスペーサーを用いる場合、再生歯胚の伸長方向を円筒リングの横方向（すなわち、円筒の径方向）とすると、円筒の縦方向（すなわち、円筒の高さ）は、所望の再生歯ユニットの咬合面の厚みを得られるように、また、最大許容値を超えないように、設定すればよい。また、この場合、円筒の縦方向（すなわち、円筒の高さ）は、所望の再生歯ユニットの歯周組織の厚みを得られるように、また、最大許容値を超えないように、設定してもよい。この場合の所望の厚みや最大許容値は、対象とする動物の歯の欠損部の大きさや形状に基づいて決定することができる。再生歯ユニットの歯周組織の形状が移植対象となる欠損部の大きさや形状に沿っている方が、移植が成功しやすく、骨が生着しやすくなる点で好ましい。また、リングの内径は、再生歯ユニットが必要以上に伸長するのを防ぐため、再生歯ユニットの長さの略最大許容値を意図して設定すればよい。
このような円筒状のスペーサーを用いる場合に、リングの径方向を伸長方向として、縦方向（高さ方向）を再生歯ユニットの歯冠の幅となるように、再生歯胚を配置する場合には、筒の高さは、例えば、ヒトの歯を培養する場合は３−１５ｍｍ、好ましくは５−１２ｍｍとし、マウスの歯を培養する場合は０．４−２．０ｍｍ、好ましくは０．６−１．８ｍｍとし、その内径（内直径）は、ヒトの歯を培養する場合は１０−３０ｍｍ、好ましくは１５−２６ｍｍとし、マウスの歯を培養する場合は、０．９−２．０ｍｍ、好ましくは１．２−１．９ｍｍとする。
【００５３】
さらに、略円筒状のスペーサーを利用する場合には、再生歯胚の将来咬合面になる部位を、スペーサーの一方の内壁のごく近くに、内壁に面するように配置し、且つ、将来根尖になる部位を筒の径方向に向かうように配置することによって、再生歯胚が、生体内の組織から過剰な圧力を受けず、再生歯胚が必要以上に伸長するのを防ぎ、且つ外部と連通可能で物質供給路を確保できる。
再生歯胚の咬合面は、圧力によってつぶされることなく自然な形状に成長することができ、歯は筒の直径方向に伸長し、一般に、反対側の壁に到達する前に、または、到達後、最大許容値未満の長さで伸長を止めることができる。
再生歯胚は、筒の水平方向からの圧力をスペーサーの壁によって回避することができるとともに、上下方向からの圧力をスペーサーの上端及び下端によってほとんど回避することができる。
【００５４】
当業者であれば、円筒状に限らず、本明細書で規定した所望の目的を達成すべく、または、その他、場合によって必要とされる他の目的を達成すべく、生体内において再生歯ユニットの製造において任意の所望の形状のスペーサーを用いることができる。例えば、円筒の代わりに底面が楕円や多角形のものや、球状のもの等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明において用いることのできるスペーサーは、内部に配置された再生歯胚が、スペーサーの外部と連通可能な構成となっている。再生歯胚は、哺乳動物の生体内の組織から栄養等の供給を受けたり、動物細胞が産生するサイトカインの作用を受けたりするため、これらの物質がスペーサー内の再生歯胚に到達するための供給路を確保する必要があるからである。連通可能であるために、スペーサーの形状として、大小、個数を問わず、物質の供給に足る孔を形成することができる。例えば、筒状のように部分的に大きな孔を有するものであってよく、また、スペーサー全体について、メッシュのように小さな孔を多数有するものであってもよい。また、スペーサーの材質が物質の透過可能なものであれば、孔があるものでなくてもよい。
【００５６】
本発明に用いる再生歯ユニットについて、再生歯ユニットをスペーサーを用いて製造する場合に、再生歯胚を培養する際に用いる哺乳動物は、生体内で再生歯胚を培養することができる限り特に限定されないが、非ヒト哺乳動物であってもよい。例えば、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウスを挙げることができ、好ましくは、ブタ、マウスである。また、歯胚組織と同一の種であることが特に好ましい。歯胚組織と同一の種でない動物に移植して培養する場合は、免疫不全に改変した動物を用いることが好ましい。生体内成育に好適な生体部位としては、動物細胞の器官や組織をできる限り正常に発生させるために、腎皮膜下、腸間膜、皮下等が好ましい。
移植後の培養期間は、移植時の歯の大きさと発生させる歯の大きさによって異なるが、一般に３日〜４００日とすることができる。例えば、腎皮膜下に移植する場合、移植する歯胚の大きさと再生させる歯の大きさによっても異なるが、７日〜６０日程度が好ましい。
【００５７】
スペーサーの材質は特に限定されず、生体内の組織からの圧力に対して十分な硬性を有するものであればよく、例えば、金、銀、鉄、銅、アルミニウム、ポリエチレン、樹脂、歯科用レジン、歯科用セメント等が挙げられる。
【００５８】
また、本発明に用いる再生歯ユニットの製造方法では、スペーサー内に再生歯胚を配置して培養する工程が、スペーサー内を支持担体で満たし、該支持担体内に再生歯胚を配置して行われることが好ましい。
支持担体は、内部で細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ゲル状、繊維状、固体状のものが好ましく、かかる支持担体を用いることによって、さらに生体内で再生歯胚に過剰な圧力がかかるのを防ぐことができる。
本発明に用いる再生歯ユニットの製造において用いられる支持担体としては、例えば、コラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス（商品名）、メビオールゲル（商品名）、マトリゲル（商品名）、エラスチン、フィブリン、ラミニン、細胞外マトリクス混合物、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸／グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等を挙げることができる。中でも、適切な硬さや保持力を有するコラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス、メビオールゲル、マトリゲル、細胞外マトリクス混合物、エラスチン、フィブリン、ラミニンが好ましい。
例えば、支持担体は液状のものを用い、再生歯胚を配置した後に硬化させてもよい。例えば、スペーサー内部をコラーゲン溶液で満たし、コラーゲン溶液内に再生歯胚を配置した後、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で培養することにより、コラーゲンをゲル化させることができる。次いで、再生歯胚をスペーサーごと哺乳動物の生体内に配置して培養を行うことができる。
【００５９】
本発明の別の実施態様において、本発明に用いる再生歯ユニットを、スペーサーを用いて製造する方法によれば、再生歯胚を生体内で培養する際、歯が生体内で圧力を受けてつぶれることがなく、自然な形状に成長させることができるので、欠損部に適合した形状の歯を製造しやすい。また、スペーサーを用いて製造した再生歯ユニットは、歯の部分のみならず、歯周組織の部分も、生体内で圧力を受けてつぶれることがないため、歯周組織が十分に発達することができ、歯槽骨形成がより多量な再生歯ユニットを製造することができる。したがって、スペーサーを用いて製造した再生歯ユニットは、歯槽骨回復により適したものとして用いることができる。
【００６０】
また、本発明の別の態様において、本発明に用いる再生歯ユニットは、哺乳動物の生体内で再生歯胚を培養する工程を含む方法により製造され、再生歯胚を培養する際、哺乳動物の外部から機械的刺激を与えることを特徴とする。
機械的刺激を与えることによって、再生歯ユニットにおける歯根膜の形成が促進される。機械的刺激とは、例えば、振動、圧迫、摩擦等が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、音波程度の周波数（例えば、２００００Ｈｚ〜４００００Ｈｚ程度）の振動を与えることが好ましい。このように、機械的刺激を与えられて歯根膜の形成が促進された再生歯ユニットを移植することにより、歯槽骨のよりよい回復が促されると考えられる。
【００６１】
また、本発明に用いる再生歯ユニットを、上述したスペーサーを用いて製造する方法において、再生歯胚を生体内で培養する際、哺乳動物の外部から機械的刺激を与えることも好ましい。
【００６２】
本発明に係る歯槽骨の回復方法においては、移植する再生歯ユニットの歯の再生段階に応じ、すでに歯冠の形成が認められていれば歯冠が口腔内側となるように配置することが好ましい。歯冠の形成が認められない段階の場合には、歯冠相当部の上皮細胞層又は再成歯胚の上皮細胞層を口腔内側となるように配置することが好ましい。これにより、歯の先端部（歯冠）が、口腔内側となり、周囲の歯と同様の方向性をもたせ、再生歯ユニットの歯周組織部分と顎骨との生着を図ることができる。
【００６３】
本発明に用いる再生歯ユニットは、動物の欠損した歯の修復方法において用いることもできる。動物の欠損した歯の修復方法は、前記再生歯ユニットを歯の欠損部に移植する工程を含む。欠損部の大きさ及び形状に適合する再生歯ユニットを製造し移植することが可能である。
スペーサーを用いて再生歯ユニットを製造する方法によれば、再生歯胚を生体内で培養する際、歯が生体内で圧力を受けてつぶれることがなく、自然な形状に成長させることができるので、欠損部に適合した形状の歯を製造しやすい。
また、欠損部に移植するためには、欠損した歯と同じ長さを有する再生歯を作製することが望ましいところ、本発明に係る歯の製造方法によれば、歯の長さの最大値を制御することができる。歯の長さが最大許容値を超えている場合、その歯をそのまま移植することができないが、最大許容値より短ければ、移植してから成長させて所望の長さの再生歯を得ることが可能である。
【００６４】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【実施例】
【００６５】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
<実施例１：スペーサーを用いた再生歯ユニットの作製>
本発明に用いる再生歯ユニットの作製方法の一例として、再生歯胚を作製した後、哺乳動物の生体内において生体内培養を行い、再生歯ユニットを作製した。腎皮膜下移植において腎皮膜の圧力の影響を回避し、歯の欠損部の形状に適し、かつ、歯周組織が十分に発達した再生歯ユニットを作製する目的で、スペーサーを用いて再生歯胚の生体内培養を行った。
マイクロピペットチップ（ＨＲＩ−１１０ＮＥＷ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を内径（内直径）１．３ｍｍ、高さ１．３ｍｍになるようリング状（筒状）に切断してスペーサーを作製し、内部にコラーゲン溶液を満たして使用した。再生歯胚は、歯根方向への伸長を促すためスペーサーの壁面に歯冠側を近接させるよう配置し、３７℃のＣＯ２インキュベーター（三洋電機，大阪，日本）で培養し、コラーゲンゲルを硬化させた。次に、再生歯胚を含むスペーサーを７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両側腎皮膜下に移植した。腎皮膜下への移植は、腎臓皮膜に２〜３ｍｍの切開を入れ、腎臓皮膜と腎臓実質を剥離し、その間に再生歯胚を含むスペーサーを挿入することにより行った。比較例として、７日間器官培養した再生歯胚を、スペーサーを用いずに腎皮膜下に移植した。移植時の写真を図１に示す。また、移植時のスペーサーと再生歯胚の位置関係の模式図を図１１に示す。
移植３週間後に、マイクロＣＴ撮影を行い、画像データは統合画像処理ソフトを用いて解析した。歯冠部における最大径を長径とし、長径と直交する最大径を短径と定義し、それぞれの長さを計測し、その比率を算出した。
スペーサーを用いて培養した例を図２に、用いないで培養した例を図３に示す。スペーサーを用いて培養した再生歯ユニットは、正常歯に近い形態である一方、スペーサーを用いないで培養した再生歯ユニットは、長径が短径に対して極端に長く、扁平な形状であった。
スペーサーを用いて培養した群（制御群）及びスペーサーを用いないで培養した群（非制御群）の各７例について長径と短径を計測し、長径／短径比を求めた結果を図４（右側）に示す。再生歯ユニットの長径／短径比は、スペーサーを用いて培養した群（制御群：実施例）では１．４６±０．１６ｍｍであり、スペーサーを用いないで培養した群（非制御群：比較例）では２．３０±０．３５ｍｍであった。
図４（左側）には、成獣マウスの下顎第一、第二、第三臼歯（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）の歯冠部における最大径を長径とし、長径と直交する最大径を短径と定義して測定し、長径／短径比を求めた結果も示す。Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３の長径／短径比は、それぞれ、１．６１±０．０５（ｎ＝５）、１．０９±０．０４（ｎ＝５）、１．１２±０．０４（ｎ＝５）であった。
以上より、スペーサーを用いずに生体内培養した再生歯ユニット形状が扁平となるのに対し、スペーサーを用いて生体内培養した再生歯ユニットは、形状が扁平にならず、両者の長径／短径比は有意差があること、また、スペーサーを用いて生体内培養した再生歯ユニットの長径／短径比は天然の歯と同等になることが確認された（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定、＊ｐ<０．０００１）。また、再生歯ユニットの歯冠部分のみならず、再生歯ユニットの歯周組織部分も、スペーサーを用いずに生体内培養した場合に比べ、スペーサーを用いて生体内培養した場合には、形状が扁平にならずに、図中の歯冠の短径方向及び長径方向の両方向に歯周組織が広がった形状の再生歯ユニットが得られることが確認された（図２及び図３の右図を参照）。このように、歯周組織の形状も、スペーサーの形状（本実施例では、スペーサーの円筒の高さ）を変更することにより、コントロールすることができる。スペーサーの大きさや形状を調整することにより、欠損部の形状に沿った歯周組織を有する再生歯ユニットを作製し移植することは、移植を成功させ、ひいては、移植された動物の歯槽骨の回復させることに役立つ。また、スペーサーを用いることにより、歯周組織が、歯冠の長径及び短径の両方向に広がった形状の再生歯ユニットでは、再生歯を歯槽骨によってより強固に支えることが可能になると考えられる。【００６６】
また腎皮膜下移植３０日、６０日目の再生歯ユニットを摘出し、マイクロＣＴ撮影、並びに統合画像処理ソフトによる解析を行って長さを測定した。マイクロＣＴ画像上で形成された歯槽骨の領域を含めず、歯の咬頭から根尖までの長さを計測した。
結果を図５に示す。スペーサーを用いない非制御群においては咬頭−根尖長が３０日目に１．０７±０．２０ｍｍ（ｎ＝６）であったところ、６０日目には１．７０±０．２６ｍｍ（ｎ＝６）となっており、有意に歯の長さが増加していた。一方、スペーサーによる制御群では、３０日目で１．０１±０．１９ｍｍ（ｎ＝１３）、６０日目で１．０２±０．１１ｍｍ（ｎ＝１０）と、移植日数による歯の長さの増加は認められなかった（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定、＊ｐ<０．０００１）。
以上より、スペーサーを用いて再生歯胚を生体内培養すると、再生歯の長さを任意に調節できることが明らかになった。【００６７】
<実施例２：機械的刺激を与えた再生歯胚の生体内培養>
実施例１の方法に従って、スペーサーを用いて器官培養を行った再生歯胚をスペーサーごと腎皮膜下に移植し、機械的刺激として、腎皮膜下移植後７日目から音波電動歯ブラシ（周波数３１，０００Ｈｚ：Ｄｏｌｔｚ（商標）、パナソニック）をマウス背部皮膚に３．９×１０４Ｐａの圧力にて圧接した（５分間／日）。コントロール群には機械的刺激を与えず、３０日間の移植期間後に摘出して比較対象とした。
摘出した再生歯ユニットは実施例１と同様の方法でマイクロＣＴ撮影を行い、三次元画像解析ソフトウェアを用いて歯根膜腔の幅（単に、「歯根膜の幅」と呼ぶこともある。）を計測した。具体的には、三次元画像上で再生歯ユニットの歯根表面と形成された歯槽骨との距離を歯根膜腔の幅とし、長径・短径における断面において、それぞれ６点ずつ計測した。その後、再生歯を４％パラフォルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＰＦＡ）にて固定し、１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）にて脱灰し、パラフィン包埋した。その後、厚さ８マイクロメートルの連続切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行い、組織学的評価を行った。
組織学的評価の結果を図６に示す。図中、Ｂは歯槽骨、Ｄは象牙質、Ｐは歯根膜を示し、図中のＰの文字の隣のバーが歯根膜の幅を示す。なお、図中の右下のスケールバーは１００μｍを示す。有刺激群の歯根膜は、無刺激群より厚く形成され、歯根膜領域の細胞の規則的な配列が認められた。
またＣＴ画像上で歯根膜の幅を計測した結果を図７に示す。有刺激群の歯根膜の幅は、１０８．５±３０．６μｍ（ｎ＝３３）であり、無刺激群の歯根膜の幅は、６８．７±１４．１μｍ（ｎ＝１２）であった（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ検定、＊ｐ<０．０００１）。
以上の結果から、再生歯胚を生体内培養する際に、外部から機械的な刺激を与えることにより、十分な歯根膜組織を有する再生歯ユニットが得られることが判明した。【００６８】
<実施例３：生体内培養によって得られた再生歯ユニットの顎骨移植>
４週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの下顎第一臼歯を抜歯し、３日間の治癒期間を設けた。その後、同部の歯肉切開・剥離を行い、歯科用マイクロモーター（Ｖｉｖａ−Ｍａｔｅ  Ｐｌｕｓ，ナカニシ，東京，日本）を用いて歯槽骨を切削し、近遠心径１ｍｍ、頬舌径０．８ｍｍの移植窩を形成した。
実施例１に従って、スペーサーを用いて３０日間腎皮膜下で培養し、且つ、実施例２に従って培養中に機械的刺激を加えて作製した再生歯ユニットを、顎骨移植窩に埋入し、８−０ナイロン縫合糸（ベアーメディック，千葉，日本）で歯肉縫合した。
図８に移植窩の形成、及び再生歯ユニットの移植の様子を示す。
再生歯ユニットを移植したマウスは移植０日、１４日、３０日目に前述と同様の方法にてマイクロＣＴ撮影を行い、移植片とレシピエントの歯槽骨における結合を評価した。その後、移植片を含む顎骨を４％ＰＦＡにて固定し、１０％ギ酸‐クエン酸ナトリウム脱灰液にて脱灰し、パラフィン包埋した後に、厚さ８μｍの連続切片を作製し、ＨＥ染色にて組織学的評価を行った。
図９にＣＴ画像、図１０にＨＥ染色像を示す。
図９に示すとおり、移植１４日目には移植片とレシピエントの下顎第二臼歯歯槽骨間に部分的な結合が認められ、移植３０日目にはほぼ全周にわたり骨結合が認められた。図中、矢印は再生歯ユニットを示す。
図１０に示すとおり、移植３０日目の組織像では、再生歯と下顎第二臼歯との槽間中隔歯槽骨が融合しており、再生歯ユニットが骨結合を介して移植部位の歯槽骨に生着している可能性が示された。また組織解析より、移植による偶発症として再生歯歯髄の一部に石灰化が認められた（１６例中３例）ものの、再生歯ユニットの歯根膜は移植後も維持されており、骨性癒着は認められなかった（１６例中０例）。図中、矢印は骨結合による生着を示し、スケールバーは１００μｍを示し、ＢＴは再生歯を、ＮＴは天然下顎第二臼歯を示す。
以上より、本発明の製造方法で製造された再生歯ユニットは、顎骨に移植すると良好に生着することが示された。【００６９】
<実施例４：広範性骨欠損モデルへの再生歯ユニット移植>
４週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの下顎第一臼歯を抜歯し、３日間の治癒期間を設けた。その後、同部の歯肉切開・剥離を行い、歯科用マイクロモーター（Ｖｉｖａ−Ｍａｔｅ  Ｐｌｕｓ，ナカニシ，東京，日本）を用いて歯槽骨を切削し、近遠心径２．５〜３ｍｍ、頬舌径２ｍｍ、深さ３ｍｍの３壁性の広範性骨欠損モデルを作製した。実施例１と同様の方法により、再生歯胚をスペーサー内に配置して５０〜６０日間腎皮膜下移植して作製した再生歯ユニットを、骨欠損部に移植し、８−０ナイロン縫合糸（ベアーメディック，千葉，日本）で歯肉縫合した。図１２に、移植した再生歯ユニットの実体像、ＣＴ外観像及びＣＴ断面像を示す。
再生歯ユニットを移植したマウスは移植０日、１４日、３０日、４０日目にマイクロＣＴ撮影を行い、移植片とレシピエントの歯槽骨における結合、ならびに頬側歯槽骨の垂直的な骨再生を評価した。マイクロＣＴ撮影は、再生歯ユニットおよび、再生歯ユニットを移植した顎骨を、実験動物用３ＤマイクロＸ線ＣＴ  Ｒ＿ｍＣＴ（リガク）を用いて９０ｋＶ，１５０ｍＡ、断層厚１０ｍｍの条件で撮影し、小動物用画像ファイリングソフトウェア  ｉ−  ＶＩＥＷ  タイプＲ、および高精細３Ｄ／４Ｄ画像解析ソフトウェア  Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を用いて画像構築および解析することにより行った。図１３に、コントロール（再生歯ユニットの移植なし）、及び、実施例（再生歯ユニットの移植あり）について、移植０日、１４日、３０日、４０日目のＣＴ画像を示す。
マイクロＣＴ画像を用いて、移植直後および移植４５日後の再生歯ユニットを観察すると、再生歯ユニットを移植しなかったコントロールと比較して、再生歯ユニット移植による頬側歯槽骨量の有意な回復が認められると共に、再生歯ユニットの生着が示された。図１４に、コントロール（再生歯ユニットの移植なし）、及び、実施例（再生歯ユニットの移植あり）について、移植４５日後のＣＴ画像を示す。画像中、移植直後の歯槽骨の上端部を点線により、移植４５日後の歯槽骨の上端部を実線により示す。
さらに、コントロール（再生歯ユニットの移植なし）、及び、実施例（再生歯ユニットの移植あり）について、移植４５日間での歯槽骨再生量を測定した。すなわち、欠損部位または移植部位を、経時的にマイクロＣＴ撮影し、統合画像処理ソフトによる解析を行って、移植前から移植後に増加した頬側歯槽骨の体積を測定することにより、再生された歯槽骨量を測定した。測定した結果を図１５に示す。歯槽骨再生量の測定により、再生歯ユニットを移植した例では、再生歯ユニットを移植していないコントロールに比べて、歯槽骨再生量において有意に増加していることが示された。
さらに、別の実施例において、コントロール（再生歯ユニットの移植なし）、及び、実施例（再生歯ユニットの移植あり）について、移植０日目、移植４９日目におけるＣＴ画像を図１６に示す。図１６の右図において、実施例の移植４９日後の歯槽骨上端部の水平ラインを、コントロール及び実施例の写真中、点線により示す。コントロールのＣＴ写真中、実際の歯槽骨の上端部ラインと、実施例の場合の歯槽骨の上端部ラインとの垂直方向の差を両矢印により示した。この図に示されるように、歯欠損部への再生歯ユニットの移植により、歯槽骨が垂直方法に回復することが示された。
これらのことから、通常ではインプラントや歯胚移植が不可能な広範性骨欠損に対して、再生歯ユニットを移植することにより、欠損部の歯槽骨再生と同時に、骨性結合による歯の再生も可能であることが示唆された。
【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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