(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（ＣＴＰ）−グリシンリンカー（Ｘ）−ＩＦＮα−システインリンカー（Ｙ）−ＰＥＧで表されるインターフェロン−α融合タンパク質であって、
前記ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙのアミノ酸配列は、配列番号１８で表され、
前記ＰＥＧは、線形ポリエチレングリコールであることを特徴とするインターフェロン−α融合タンパク質。
【請求項２】
前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量は、２０ｋＤａ〜６０ｋＤａであることを特徴とする請求項１に記載のインターフェロン−α融合タンパク質。
【請求項３】
（ａ）請求項１から２のいずれかに記載のインターフェロン−α融合タンパク質の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む肝疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項４】
前記肝疾患は、肝癌または肝炎であることを特徴とする請求項３に記載の薬剤学的組成物。
【請求項５】
前記肝炎は、ＨＣＶ肝炎によるＣ型肝炎であることを特徴とする請求項４に記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターフェロン−α（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α、ＩＦＮα）タンパク質に、細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＴＰ）とポリエチレングリコールとが共に結合されたインターフェロン−α融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロンは、肝炎治療剤として使われており、インターフェロン−α製剤（Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ：Ｓｃｈｅｒｉｎｇ、Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ：Ｒｏｃｈｅ）及びインターフェロン−α製剤よりも投与回収を減らしたＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ＩＦＮ製剤（ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ：Ｓｃｈｅｒｉｎｇ、Ｐｅｇａｓｙｓ：Ｒｏｃｈｅ）などで販売されている。
【０００３】
インターフェロン−α治療の初期副作用として、発熱、悪寒、全身無力感、食欲不振、悪心、及び筋肉痛があり、このような症状は、ほとんどの患者において投与容量に比例して表われるが、治療初期に最も激しく、一般的に治療を中断すれば消える。また、肝炎患者において、ＰＥＧ−インターフェロン−α治療中の副作用の頻度と重症度は、インターフェロン−α治療と類似していると知られている（非特許文献１）。
【０００４】
前記のように、インターフェロンの投与容量による副作用が知られることによって、治療剤としてインターフェロンの使用において、副作用を最小化するための投与量の減少が要求されている。
【０００５】
従来、前記のような問題を解決するために、細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（ＣＴＰ）をインターフェロンに融合させることによって、インターフェロンの肝移動性を改善させることによって、インターフェロンα治療の副作用を解決するための手段が提示されている。しかし、前記融合タンパク質のマウスモデルへの投与時に、初期活性が急減して、約６時間後には、活性が半減して、融合タンパク質の肝移動及び残留特性を改善せねばならない必要性が高まっている。
【０００６】
本明細書の全般に亘って多数の特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｗａｎ  Ｓｉｋ  Ｌｅｅ，ＤｏｎｇＪｏｏｎ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ，Ｔｈｅ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．１３：４４７−４８８，（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、外来ペプチドとポリエチレングリコールとの結合のようなタンパク質変形を通じて、従来のインターフェロンの薬学的効能を向上させたインターフェロン−α融合タンパク質を開発するために研究した。その結果、インターフェロン−αタンパク質のＮ末端に、細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（ＣＴＰ）を、リンカーを通じて結合させると共に、Ｃ末端にリンカーを通じて、ポリエチレングリコールを結合させれば、インターフェロンの固有活性が高く保持されながら、生体内の半減期が延び、肝移動能が向上するということを実験的に証明して、本発明を完成した。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、既存のインターフェロン融合タンパク質の肝移動及び滞留特性が改善されることによって、結果的に、インターフェロン投与量の減少を期待することができるインターフェロン−α融合タンパク質を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記インターフェロン−α融合タンパク質をコードする核酸分子を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記核酸分子を含むベクターを提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記ベクターを含む形質転換体を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、インターフェロン−α融合タンパク質の製造方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、肝疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の目的及び長所は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一様態によれば、本発明は、ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙ−ＰＥＧで表されるインターフェロン−α融合タンパク質であって、前記ＣＴＰは、細胞質残留性細胞膜透過ペプチドであり、前記Ｘは、１〜１０個のグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）からなるペプチドリンカーであり、前記Ｙは、１〜１００個のシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、グリシン、またはグリシン及びシステインからなるペプチドリンカーであり、前記ＩＦＮαは、インターフェロン−α２ａまたはインターフェロン−α２ｂであり、前記ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）であることを特徴とするインターフェロン−α融合タンパク質を提供する。
【００１７】
本発明者らは、外来ペプチドとポリエチレングリコールとの結合のようなタンパク質変形を通じて、従来のインターフェロンの薬学的効能を向上させたインターフェロン−α融合タンパク質を開発するために研究した。本発明の一実施例を通じて、インターフェロン−αタンパク質とＣＴＰとの間にリンカーを導入させた後、インターフェロン−αタンパク質の構造を変形させないリンカーを選別し、前記の融合タンパク質のＣ末端にポリエチレングリコールを融合させた後、その活性を分析した。
【００１８】
その結果、インターフェロン−αタンパク質のＮ末端に、細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（ＣＴＰ）を、リンカーを通じて結合させると共に、Ｃ末端にリンカーを通じて、ポリエチレングリコールを結合させれば、インターフェロンの固有活性が高く保持されながら、生体内の半減期が延び、肝移動能が向上するということを実験的に確認した。すなわち、前記結果は、リンカーを通じてインターフェロン−α融合タンパク質にＣＴＰ及びＰＥＧをそれぞれＮ及びＣ末端に連結することによって、融合タンパク質の生体内移動及び残留効果が改善されることを最初に立証するものであって、従来のＰＥＧまたはＰＥＧ及びＣＴＰが連結された融合タンパク質の治療効果を改善したものである。具体的に、このような効果は、１）リンカーを通じてインターフェロン−αタンパク質とＣＴＰとが連結されることによって、ＣＴＰの機能が最適化され、２）ポリエチレングリコールがインターフェロン−αタンパク質のＣ末端に融合されることによって、生体内の半減期を延長させ、３）線形（ｌｉｎｅａｒ  ｆｏｒｍ）ポリエチレングリコールをインターフェロン−αタンパク質のＣ末端に連結させることで達成された。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の利点及び効果を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明は、ＩＦＮαタンパク質に、細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（ＣＴＰ）とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とが結合されたＩＦＮα融合タンパク質に関するものである。
（ｉｉ）本発明のＩＦＮα融合タンパク質は、インターフェロンの固有活性が高く保持される。
（ｉｉｉ）本発明のＩＦＮα融合タンパク質は、生体投与時に半減期が延び、肝移動能が向上する。
（ｉｖ）本発明のＩＦＮα融合タンパク質は、各種のウイルス性感染などを含む肝疾患の予防または治療に効果的なタンパク質医薬品の開発に使われる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＣＴＰがリンカーを通じて結合された本発明のＩＮＦα融合タンパク質の構造を示す。ＣＦＮ７（ＣＴＰ−ＧＧＧＧＧＧ−ＩＦＮα、配列番号３２）、ＣＦＮ８（ＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮα、配列番号３３）、Ｈｅｐｓｉｎ  Ｃｌｅａｖａｇｅリンカーが挿入されたＣＦＮ１１（配列番号３４）、ＣＦＮ１２（配列番号３５）、ＣＦＮ１３（配列番号３６）の構造を表わした。
【図２】図２は、リンカーを結合させて製作した本発明のＩＦＮα融合タンパク質の２次構造をＣＤ分光光度計（Ｊａｓｃｏ−８１５）を用いて分析した結果である。
【図３】図３は、ＣＴＰ−ＩＦＮα融合タンパク質にＰＥＧが多様な形態で結合されたＣＴＰ−ＩＦＮα−ＰＥＧ融合タンパク質を示す。
【図４】図４は、本発明のＩＦＮα融合タンパク質４０１Ｃ及びＰＥＧＡＳＹＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ  ＬａＲｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．）の猿を用いた前臨床薬物動力学の測定結果を比較して示す。実験に用いた試料は、ＰＥＧＡＳＹＳとＩＦＮα融合タンパク質４０１Ｃをそれぞれ３００μｇ／ｋｇ体重の容量で投与した。試料を１回投与した後、６日間活性を測定した。本発明のＩＦＮα融合タンパク質４０１Ｃは、ＩＦＮα活性が高く、６日までＰＥＧＡＳＹＳよりも優れるか、同等な活性を保持したことを確認した。
【図５ａ】図５ａは、本発明の融合タンパク質と対照群薬物との肝移動能を比較した結果を示す。マウスに本発明のインターフェロン−α融合タンパク質と対照群薬物ＰＥＧＡＳＹＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ  ＬａＲｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．）とを投与した後、血液での経時的な抗ウイルス活性を測定した結果を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、本発明の融合タンパク質と対照群薬物との肝移動能を比較した結果を示す。マウスに本発明のインターフェロン−α融合タンパク質と対照群薬物ＰＥＧＡＳＹＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ  ＬａＲｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．）とを投与した後、肝での経時的な抗ウイルス活性を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書で、使われる前記用語“インターフェロン−α（ＩＦＮα）融合タンパク質”は、インターフェロン−αタンパク質にＣＴＰのみが結合されたタンパク質またはＣＴＰとＰＥＧとが同時に結合されたタンパク質を意味する。本明細書で、インターフェロン−αタンパク質にＣＴＰのみが結合された融合タンパク質を意味する場合、“ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙ”とも記載する。
【００２２】
本明細書で、使われる用語“細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（ＣＴＰ）”は、本発明者によって最初に導入された用語であって、細胞膜透過能を保有しながらも、細胞質に残留する特性、すなわち、核内への移動が抑制される特性を有するペプチドを意味する。
【００２３】
本発明のＩＦＮα融合タンパク質に含まれるＣＴＰは、本発明者によってＰＴＤの問題点を解決するために、世界最初に開発された伝達ペプチド（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ）であって、これを出願して特許登録され（大韓民国特許第０６０８５５８号、米合衆国特許第７１０１８４４、及び日本特許第４１８８９０９号）、前記特許文献に開示されているＣＴＰに関する内容は、本発明の内容として挿入される。
【００２４】
本発明のＩＦＮα融合タンパク質に含まれるＣＴＰにおいて、ペプチドの長さは、当業者に収容される一般的な長さに該当するものであり、望ましくは、９〜２０アミノ酸、より望ましくは、９〜１５アミノ酸、最も望ましくは、１１アミノ酸である。
【００２５】
本発明の望ましい実施例によれば、本発明のＩＦＮα融合タンパク質に含まれるＣＴＰは、配列番号１ないし配列番号１４で表わされる配列で構成された群から選択されるアミノ酸配列を含む。望ましくは、本発明で、ＣＴＰは、配列番号１の配列を含む。
【００２６】
ＣＴＰは、細胞膜透過能に優れ、細胞内に導入された後にも、核への移動が抑制される特性を有することによって、生体内で他の伝達体［特に、ＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ）またはポリアルギニン（ｐｏｌｙａｒｇｉｎｉｎｅ）］に比べて、細胞毒性が低く、融合されたタンパク質を肝に移動させる独特な性質を有しており、肝をターゲットとする疾患治療のための効果的な薬物伝達ペプチドである。
【００２７】
本明細書で、使われる用語“インターフェロン−α（ＩＦＮα）”は、ウイルスの複製及び細胞増殖を抑制し、免疫反応を調節する同質性が大きく、種特異的なタンパク質群を意味する。
【００２８】
本発明のＩＦＮα融合タンパク質に含まれるインターフェロン−α（ＩＦＮα）は、組換えＩＦＮα２ｂ、組換えＩＦＮα２ａ、組換えＩＦＮα２ｃ、天然α−インターフェロンの精製された混合物であるＩＦＮα−ｎ１、コンセンサスα−インターフェロン（米合衆国特許第４，８９７，４７１号、及び第４，６９５，６２３号参照）または天然α−インターフェロンの混合物であるＩＦＮα−ｎ３であり、より望ましくは、ＩＦＮα２ａまたはＩＦＮα２ｂ、最も望ましくは、ＩＦＮα２ｂである。ＩＦＮα２ｂの製造方法は、米合衆国特許第４，５３０，９０１号に詳しく記載されている。
【００２９】
本発明の望ましい実施例によれば、本発明のＩＦＮα融合タンパク質に含まれるＩＦＮαは、配列番号２１で表わされるアミノ酸配列を含む。
【００３０】
本発明のＩＦＮα融合タンパク質で、前記Ｘは、１〜１０個のグリシン残基からなるペプチドリンカーである。このペプチドリンカーを通じてＣＴＰがＩＦＮαのＮ末端に結合される。
【００３１】
ＣＴＰとＩＦＮαとの間をペプチドリンカーＸで連結させることによって、ＣＴＰペプチドに柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）と自在な回転能（ｆｒｅｅ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）とを付与して、ＣＴＰが本来の機能を円滑に行わせる。
【００３２】
また、ＣＴＰが結合された融合タンパク質の発現及び精製時に、疎水性を有するＣＴＰによって発生する融合タンパク質の沈澱を最小化することによって、精製収率を増大させることができる。
【００３３】
本発明の具体的な一実施例によれば、ＣＦＮ１タンパク質（ＣＴＰ−ＩＦＮα）を精製する場合、沈澱が発生したが、ペプチドリンカーが結合されたＣＦＮ８タンパク質（ＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮα）の場合、沈澱が発生していない。
【００３４】
望ましくは、前記ペプチドリンカーＸは、１〜１０個のグリシン残基、望ましくは、１〜８個のグリシン残基、より望ましくは、１〜７個のグリシン残基、これよりさらに望ましくは、１〜５個であり、さらに望ましくは、３〜５個のグリシン残基であり、４個であり得る。
【００３５】
本発明のＩＦＮα融合タンパク質で、前記Ｙは、１〜１００個のシステイン残基、グリシン残基、またはグリシン及びシステイン残基からなるペプチドリンカーである。このペプチドリンカーを通じてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がＩＦＮαのＣ末端に結合される。前記ペプチドリンカーＹは、０〜１０個のグリシン残基及び１〜８０個のシステイン残基からなり、より望ましくは、０〜１０個のグリシン残基及び１〜６０個のシステイン残基、さらに望ましくは、１〜１０個のグリシン残基及び１〜１０個のシステイン残基、これよりさらに望ましくは、１〜５個のグリシン残基及び１〜５個のシステイン残基からなりうる。また、前記ペプチドリンカーＹは、０〜１０個のグリシン残基または１〜８０個のシステイン残基からなり、より望ましくは、１〜１０個のグリシン残基または１〜６０個のシステイン残基からなり、さらに望ましくは、１〜１０個のグリシン残基または１〜１０個のシステイン残基、これよりさらに望ましくは、１〜５個のグリシン残基または１〜５個のシステイン残基からなり、最も望ましくは、３〜５個のグリシン残基または３〜５個のシステイン残基からなりうる。
【００３６】
本発明の望ましい実施例によれば、本発明のインターフェロン−α（ＩＦＮα）融合タンパク質内の“ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙ”で表されるペプチド部分（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｉｅｔｙ）は、配列番号１５ないし配列番号２０で表わされる配列で構成された群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、より望ましくは、配列番号１８のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００３７】
本発明で、“ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙ”で表されるペプチド部分のアミノ酸配列は、前記配列番号１５ないし配列番号２０のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して実質的な同一性を表わすアミノ酸配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、前記本発明のアミノ酸配列と任意の他の配列とを最大限対応してアラインし、当業者に通用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも８０％の同一性、より望ましくは、少なくとも９０％の同一性、最も望ましくは、少なくとも９５％の同一性を表わすアミノ酸配列を意味する。
【００３８】
本発明のＩＦＮα融合タンパク質のＣ末端には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合される。
【００３９】
本発明で、ＰＥＧがＩＦＮα融合タンパク質のＮ末端に結合される場合、ＣＴＰの細胞膜透過性と肝移動性とを阻害して望ましくない。すなわち、下記の本発明の具体的な一実施例で立証されるように、ＰＥＧがＩＦＮα融合タンパク質のＮ末端に結合すれば、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）抗ウイルス活性及び血液内での安定性は優れるが、肝移動性が著しく低下する。
【００４０】
ＰＥＧは、腎臓クリアランス機作を減少させて血液内半減期を延長させることによって、本発明の融合タンパク質の投与量を減少させる効果を有する。
【００４１】
本発明の望ましい実施例によれば、前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量は、２０〜６０ｋＤａであり、より望ましくは、２０〜５０ｋＤａであり、これよりさらに望ましくは、３０〜４５ＫＤａであり、さらに望ましくは、３５〜４５ＫＤａであり、最も望ましくは、４０〜４５ｋＤａであり得る。４０〜４５ＫｄＤａのＰＥＧを使う場合、肝移動性の増大効果が最も大きい。
【００４２】
本発明の他の望ましい実施例によれば、前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、線形ＰＥＧ（ｌｉｎｅａｒ  ＰＥＧ）または枝形ＰＥＧ（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＰＥＧ）であり得る。
【００４３】
本明細書で、前記用語“線形ＰＥＧ”は、ＰＥＧが枝のない一本鎖（ｃｈａｉｎ）からなるＰＥＧ形態を意味し、用語“枝形ＰＥＧ”は、２〜１０本のＰＥＧ鎖が中心コアグループ（ｃｅｎｔｒａｌ  ｃｏｒｅ  ｇｒｏｕｐ）から分岐されて伸びた形態を意味する。
【００４４】
本発明のＰＥＧは、線形ＰＥＧであって、インターフェロン−αタンパク質の特定アミノ酸残基に特異的に結合されるので、最終生成されたＰＥＧ−インターフェロン−α融合タンパク質の分離及び精製が容易であり、タンパク質の品質管理でも利点がある。
【００４５】
本発明のＩＦＮα融合タンパク質に前記ＰＥＧを結合させるペギレーション反応は、当業者に公知の方法を通じて行われる［Ｍ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｄ．Ｂｅｎｔｌｅｙｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ＰＲｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：４５９４７６（２００２）；Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ｍ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２：４０５−４１７（２００１）］。
【００４６】
本発明の他の様態によれば、本発明は、前述した本発明のインターフェロン−α（ＩＦＮα）融合タンパク質内の“ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙ”で表されるペプチド部分をコードする核酸分子を提供する。
【００４７】
本明細書で、用語“核酸分子”は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、そして、ＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子で基本構成単位であるヌクレオチドは、天然のヌクレオチドだけではなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０））。
【００４８】
本発明の望ましい実施例によれば、前記本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質内の“ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙ”で表されるペプチド部分をコードする核酸分子は、配列番号１５ないし配列番号２０のうちいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチドをコードする核酸分子であり、より望ましくは、配列番号１８のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする核酸分子であり、最も望ましくは、配列番号２２のＤＮＡ塩基配列を有する核酸分子である。
【００４９】
本発明の他の一様態によれば、本発明は、ＩＦＮ−α融合タンパク質内の“ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙ”で表されるペプチド部分をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。
【００５０】
本発明のベクターシステムは、当業者に公知の多様な方法を通じて構築され、これについての具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＰＲｅｓｓ（２００１）に開示されており、この文献は、本明細書に参照として挿入される。
【００５１】
本発明のベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されうる。また、本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築されうる。本発明のヌクレオチド配列が原核細胞由来であり、培養の便宜性などを考慮して、原核細胞を宿主とすることが望ましい。
【００５２】
本発明のベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター、及びＴ７プロモーターなど）、翻訳の開始のためのリボソーム結合位置及び転写／翻訳終結配列を含むことが一般的である。宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉが利用される場合、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：１０１８−１０２４（１９８４））、そして、ファージλの左向きプロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．ａｎｄ  Ｈａｇｅｎ，Ｄ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１４：３９９−４４５（１９８０））が、調節部位として利用されうる。
【００５３】
一方、本発明に利用されるベクターは、当業者で度々使われるプラスミド（例：ｐＳＣ１０１、ＣｏｌＥ１、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＨＣ７９、ｐＵＣ１９、ｐＥＴなど）、ファージ（例：λｇｔ４λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１、及びＭ１３など）またはウイルス（例：ＳＶ４０など）を操作して製作することができる。
【００５４】
一方、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）由来のプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、及びＨＳＶのｔｋプロモーター）が利用され、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【００５５】
本発明のベクターで、ベクターから発現される本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質の“ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙ”で表されるペプチドの精製を容易にするために、必要に応じて他の配列と融合され、融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ−トランスフォラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）、及び６×Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などが利用されるが、これに制限されるものではない。
【００５６】
本発明の望ましい実施例によれば、本発明のベクターによって発現された“ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙ”で表されるペプチドは、陽イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーによって精製される。
【００５７】
一方、本発明の発現ベクターは、選択標識であって、当業者に通用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン、及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
【００５８】
本発明の他の一様態によれば、本発明は、前述した本発明のベクターを含む形質転換体を提供する。
【００５９】
本発明のベクターを安定しながら連続してクローニング及び発現させる宿主細胞は、当業者に公知の如何なる宿主細胞も利用でき、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ  １７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、バシラスサブチリス、バチルス・チューリンゲンシスのようなバシラス属菌株、そして、サルモネラティフィリウム、セラチアマルセッセンス、及び多様なシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがある。
【００６０】
また、本発明のベクターを真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、イースト（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、及びヒト細胞［例えば、ＣＨＯ細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、及びＭＤＣＫ細胞株］などが利用されうる。
【００６１】
本発明のベクターを宿主細胞内に運ぶ方法は、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９：２１１０−２１１４（１９７３））、１つの方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９：２１１０−２１１４（１９７３）；及びＨａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７−５８０（１９８３））、及び電気穿孔方法（Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：６１２７−６１４５（１９８８））などによって実施される。また、宿主細胞が真核細胞である場合には、微小注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ，２２：４７９（１９８０））、リン酸カルシウム沈澱法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１：８４１（１９８２））、リポソーム−媒介形質感染法（Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７（１９８０））、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０（１９８５））、及び遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：９５６８−９５７２（１９９０））などによってベクターを宿主細胞内に注入することができる。
【００６２】
宿主細胞内に注入されたベクターは、宿主細胞内で発現され、このような場合には、多量の“ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙ”ペプチドが得られる。例えば、前記発現ベクターがｌａｃプロモーターを含む場合には、宿主細胞にＩＰＴＧを処理して遺伝子発現を誘導することができる。
【００６３】
以下、本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質の製造方法には、前述した本発明の“ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙ”で表されるペプチドを製造する方法を含んでいるために、この２つの間に共通した内容は、繰り返し記載による明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００６４】
本発明のさらに他の一様態によれば、本発明は、次の段階を含むＩＦＮα融合タンパク質の製造方法を提供する：（ａ）プロモーターに作動的に連結された“ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙ”で表されるペプチド部分をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養する段階；（ｂ）前記段階（ａ）の形質転換体培養液から融合タンパク質を収得する段階；及び（ｃ）前記段階（ｂ）から収得した融合タンパク質のＣ末端にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させる段階。
【００６５】
本発明で、用語“プロモーター”は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を調節するＤＮＡ塩基配列を意味する。
【００６６】
本明細書で、用語“作動的に連結された”は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／またはトランスレーションを調節する。
【００６７】
本発明で、形質転換体の培養は、当業者に公知の通常の原核細胞または真核細胞の培養方法によって行う。例えば、形質転換体培養のための培地は、原核細胞または真核細胞が効率的に利用することができる炭素源、窒素源、無機塩などを含むならば、天然培地または合成培地をいずれも使うことができる。
【００６８】
形質転換体の培養は、通常の振盪培養または回転器による回転によるもののような好気性条件下で行う。培養温度は、望ましくは、１５〜５０℃で行い、培養時間は、一般的に５時間〜７日間行う。培地のｐＨは、培養中で、望ましくは、３．０〜９．０の範囲を保持する。培地のｐＨは、無機または有機酸、アルカリ溶液、ウレア、炭酸カルシウム、アンモニアなどで調節することができる。培養中には、必要な場合、アンピシリン及びテトラサイクリンのような抗生剤を添加することができる。
【００６９】
本発明で培養された形質転換体の細胞から発現された外来組換えタンパク質を分離する方法は、当業者に通用されるタンパク質の分離及び精製方法を用いて行うことができる。例えば、硫酸アンモニウムまたはＰＥＧなどを利用した溶解度による分離（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、分子量による限外濾過分離、多様なクロマトグラフィー（大きさ、電荷、疎水性または親和性による分離のために製作されたもの）による分離など、多様な方法が利用され、通常には、前記方法の組合わせを用いて分離及び精製する。
【００７０】
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、（ａ）前述した本発明のＩＦＮα融合タンパク質の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む肝疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００７１】
本発明の組成物によって予防または治療される肝疾患は、肝癌、肝炎、肝硬変症、及びその他の肝疾患を含み、望ましくは、肝癌及び肝炎を含み、例えば、前記肝炎は、急性ウイルス性肝炎、晩成肝炎、電撃性肝炎などであり、より望ましくは、Ｂ型またはＣ型肝炎であり、最も望ましくは、ＨＣＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ）肝炎によるＣ型肝炎であり得る。
【００７２】
本発明の望ましい実施例によれば、本発明の肝疾患治療用薬剤学的組成物は、望ましくは、非経口投与され、さらに望ましくは、皮下投与される。
【００７３】
本明細書で、用語“薬剤学的有効量”は、前述した本発明の融合タンパク質の効能または活性を果たすのに十分な量を意味する。
【００７４】
本発明の薬剤学的組成物は、必要に応じて、薬剤学的に許容される通常の無毒性担体、補助剤、及び賦形剤を含有する容量単位製剤であって、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、直腸内に、または局所的に投与され、望ましくは、非経口的に投与することができる。局所投与は、また経皮的パッチ剤のような経皮投与またはイオン泳動装置を利用するものを含みうる。
【００７５】
本明細書で、“非経口投与”は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技術を含む。薬物製剤は、例えば、文献（Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９７５）に掲示されている。薬物製剤に対する内容は、また文献［Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．及びＬａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０］で確認することができる。
【００７６】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００７７】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方されうる。望ましくは、本発明の薬剤学的組成物の投与量は、成人基準に０．００１〜１００μｇ／ｋｇ（体重）であり得る。
【００７８】
本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態でもあり得るが、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。
【００７９】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
【実施例】
【００８０】
実施例１：ＣＴＰ融合ＩＦＮα遺伝子のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）合成
ヒト由来インターフェロン−α（ＩＦＮα）のＮ末端にＣＴＰペプチドを挿入し、ＣＴＰとＩＦＮαとの間にグリシン４個または６個で構成されたグリシンリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を挿入した。グリシンリンカーがＣＴＰとＩＦＮαとの間を連結することによって、ＣＴＰペプチドに柔軟性を提供して、その機能を円滑にできるだけではなく、精製する時、疎水性であるＣＴＰによる沈澱を最小化する役割を果たす。また、ＰＣＲ法を通じてＩＦＮα遺伝子のＣ末端にシステインを挿入することによって、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  ＰＥＧとの反応でＰＥＧをＣ末端に付着可能にした。Ｃ末端に線形ＰＥＧを付着することによって、体内半減期を大きく向上させることができた。
【００８１】
まず、ＩＦＮαのＮ末端に付着されたＣＴＰペプチドとＩＦＮαとの間にグリシンリンカーを挿入するために、下記の表１に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００８２】
ＩＦＮαを鋳型とし、ＰＲ２とＰＲ３プライマーを用いて１次ＰＣＲした。生成されたＰＣＲ産物を再び鋳型とし、ＰＲ１とＰＲ２プライマーを用いて２次ＰＣＲした。これにより、グリシン６個で構成されたリンカーが連結されたペプチドＣＴＰ−ＧＧＧＧＧＧ−ＩＦＮαをコードする核酸分子を最終産物として得た。最終産物ＣＴＰ−ＧＧＧＧＧＧ−ＩＦＮαタンパク質をＣＦＮ７（配列番号３２）と名付けた。
【００８３】
ＩＦＮαを鋳型とし、ＰＲ２とＰＲ４プライマーを用いて１次ＰＣＲした。生成されたＰＣＲ産物を再び鋳型とし、ＰＲ１とＰＲ２プライマーを用いて２次ＰＣＲした。これにより、グリシン４個で構成されたリンカーが連結されたＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮαをコードする核酸分子を最終産物として得た。この最終産物ＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮαタンパク質をＣＦＮ８（配列番号３３）と名付けた。
【００８４】
ＩＦＮαのＮ末端に付着されたＣＴＰペプチドとＩＦＮαとの間にｈｅｐｓｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ配列を挿入するために、下記の表１に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＩＦＮαを鋳型とし、ＰＲ２とＰＲ５プライマーを用いて１次ＰＣＲした。生成されたＰＣＲ産物を再び鋳型とし、ＰＲ１とＰＲ２プライマーを用いて２次ＰＣＲした。これにより、ｈｅｐｓｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ配列で構成されたリンカーが連結されたペプチドＣＴＰ−ＫＱＬＲＶＶＮＧ−ＩＦＮαをコードする核酸分子を最終産物として得た。最終産物ＣＴＰ−ＫＱＬＲＶＶＮＧ−ＩＦＮαタンパク質をＣＦＮ１１（配列番号３４）と名付けた。
【００８５】
ＩＦＮαのＮ末端に付着されたＣＴＰペプチドとＩＦＮαとの間にグリシンとｈｅｐｓｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ配列とを共に挿入するために、下記の表１に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＩＦＮαを鋳型とし、ＰＲ２とＰＲ７プライマーを用いて１次ＰＣＲした。生成されたＰＣＲ産物を再び鋳型とし、ＰＲ１とＰＲ２プライマーを用いて２次ＰＣＲした。これにより、ｈｅｐｓｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ配列とその左右にそれぞれグリシン４個とグリシン３個とで構成されたリンカーが連結されたペプチドＣＴＰ−ＧＧＧＧＫＱＬＲＶＶＮＧＧＧＧ−ＩＦＮαをコードする核酸分子を最終産物として得た。最終産物ＣＴＰ−ＧＧＧＧＫＱＬＲＶＶＮＧＧＧＧ−ＩＦＮαタンパク質をＣＦＮ１２（配列番号３５）と名付けた。
【００８６】
ＩＦＮαのＮ末端に付着されたＣＴＰペプチドとＩＦＮαとの間にグリシンとｈｅｐａｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒとを共に挿入するために、下記の表１に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＩＦＮαを鋳型とし、ＰＲ２とＰＲ８プライマーを用いて１次ＰＣＲした。生成されたＰＣＲ産物を再び鋳型とし、ＰＲ１５とＰＲ２プライマーを用いて２次ＰＣＲした。これにより、ｈｅｐａｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒとグリシン３個で構成されたリンカーが連結されたペプチドＣＴＰ−ＡＫＴＫＱＬＲＶＶＮＧＧＧＧ−ＩＦＮαをコードする核酸分子を最終産物として得た。最終産物ＣＴＰ−ＡＫＴＫＱＬＲＶＶＮＧＧＧＧ−ＩＦＮαタンパク質をＣＦＮ１３（配列番号３６）と名付けた。
【００８７】
前記製作したＣＦＮ７、ＣＦＮ８、ＣＦＮ１１、ＣＦＮ１２、及びＣＦＮ１３の構造は、図１に示した。
【００８８】
【表１】
0006010227.tif 000002
【００８９】
次いで、Ｃ末端にシステインを挿入するために、ＰＣＲを行った。４個のグリシンリンカーが連結されたＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮαを鋳型とし、ＰＲ８とＰＲ９プライマーを用いてＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮα遺伝子のＣ末端にシステインが挿入されたＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮα−Ｃをコードする核酸分子を最終産物として得た。この最終産物ＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮα−Ｃタンパク質をＣＦＮ８Ｃ（配列番号１８）と名付けた。
【００９０】
【表２】
0006010227.tif 000003
【００９１】
実施例２：インターフェロン−α融合タンパク質の大腸菌発現ベクターの製造
ＰＣＲを通じて確保されたＣＦＮ７（ＣＴＰ−ＧＧＧＧＧＧ−ＩＦＮα）、ＣＦＮ８（ＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮα）、ＣＦＮ８Ｃ（ＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮα−Ｃ）、ＣＦＮ１１（ＣＴＰ−ＫＱＬＲＶＶＮＧ−ＩＦＮα）、ＣＦＮ１２（ＣＴＰ−ＧＧＧＧＫＱＬＲＶＶＮＧＧＧＧ−ＩＦＮα）、及びＣＦＮ１３（ＣＴＰ−ＡＫＴＫＱＬＲＶＶＮＧＧＧＧ−ＩＦＮα）をコードするそれぞれの遺伝子を大腸菌で発現するために、大腸菌発現ベクターであるｐＣＦＭ５３６にそれぞれの遺伝子をクローニングして、ｐＣＦＭ５３６−ＣＦＮ７、ｐＣＦＭ５３６−ＣＦＮ８、ｐＣＦＭ５３６−ＣＦＮ８Ｃ、ｐＣＦＭ５３６−ＣＦＮ１１、ｐＣＦＭ５３６−ＣＦＮ１２、及びｐＣＦＭ５３６−ＣＦＮ１３発現ベクターを製作した。
【００９２】
まず、ＣＦＮ７（ＣＴＰ−ＧＧＧＧＧＧ−ＩＦＮα）、ＣＦＮ８（ＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮα）、ＣＦＮ８Ｃ（ＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮα−Ｃ）、ＣＦＮ１１（ＣＴＰ−ＫＱＬＲＶＶＮＧ−ＩＦＮα）、ＣＦＮ１２（ＣＴＰ−ＧＧＧＧＫＱＬＲＶＶＮＧＧＧＧ−ＩＦＮα）、及びＣＦＮ１３（ＣＴＰ−ＡＫＴＫＱＬＲＶＶＮＧＧＧＧ−ＩＦＮα）ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクターにそれぞれクローニングし、塩基配列を分析して、所望のアミノ酸配列が変形なしに合成された、ｐＧＥＭ−ＣＦＮ７、ｐＧＥＭ−ＣＦＮ８、ｐＧＥＭ−ＣＦＮ８Ｃ、ｐＧＥＭ−ＣＦＮ１１、ｐＧＥＭ−ＣＦＮ１２、及びｐＧＥＭ−ＣＦＮ１３組換えベクターを得た。このような組換えｐＧＥＭ−ＣＦＮ７、ｐＧＥＭ−ＣＦＮ８とｐＧＥＭ−ＣＦＮ８ＣベクターからＰＣＲ時に、プライマーに含まれたＸｂａＩとＢａｍＨＩ制限酵素を用いてインサート（ｉｎｓｅｒｔ）を得て、これらをｐＣＦＭ５３６ベクターに導入して発現ベクターｐＣＦＭ５３６−ＣＦＮ７、ｐＣＦＭ５３６−ＣＦＮ８、ｐＣＦＭ５３６−ＣＦＮ８Ｃ、ｐＣＦＭ５３６−ＣＦＮ１１、ｐＣＦＭ５３６−ＣＦＮ１２、及びｐＣＦＭ５３６−ＣＦＮ１３をそれぞれ完成した。
【００９３】
実施例３：大腸菌でインターフェロン−α融合タンパク質の発現及び確認
前記実施例２から製造されたＣＦＮ７、ＣＦＮ８、ＣＦＮ８Ｃ、ＣＦＮ１１、ＣＦＮ１２、及びＣＦＮ１３遺伝子がクローニングされたｐＣＦＭ５３６ベクターをＰＯＰ２１３６コンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）に形質転換して、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が添加された固体培地に塗抹した。固体培地で育ったコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を得て、ＬＢ培地（ｂｒｏｔｈ）に接種した後、３０℃で１８時間培養した。６００ｎｍ波長での吸光度が０．４〜０．６になった時、４２℃に温度を高めて発現を誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）した。さらに４時間さらに培養した後で、培養した細胞からＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を通じてタンパク質の発現を確認した。
【００９４】
実施例４：インターフェロン−α融合タンパク質の量産
ＩＦＮα融合タンパク質を大量確保するために、５Ｌ醗酵槽を用いて大量培養及び精製を実施した。
【００９５】
１．  ５Ｌ醗酵槽を利用した大量培養
生産菌株を培養して、ＩＦＮα融合タンパク質を大量に確保するために、５Ｌ醗酵槽（Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｂ、Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて大量培養を実施した。まず、ＩＦＮα融合タンパク質の発現が確認された菌株をそれぞれＭＣＢ（Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）とＷＣＢ（Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）とで製作して、−８０℃に保管した。本培養一日前に、１００ｍｌの２ｘＹＴ培地（トリプトン１６ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ）にアンピシリン濃度が５０μｇ／ｍｌになるように添加した後に保管されたＷＣＢを接種して、３０℃で１６時間培養した。本培養のために、３Ｌの２ｘＹＴ培地（トリプトン１６ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ）にアンピシリン濃度が５０μｇ／ｍｌになるように添加して、培養培地を準備した。本培養開始時に、条件は、温度３０℃、ｐＨ６．８、ｖｖｍ  １、ＤＯ  ５０％以下に落ちないようにした。１時間間隔でＯＤ値を測定し、ＯＤ値が１０になった時、培地をさらに添加し、培養温度を４２℃に上げて発現を誘導した。発現誘導後にも、１時間間隔でＯＤ値を測定して、ＯＤ値がこれ以上増加しない区間で培養を終了した。
【００９６】
２．  凝集体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）分離及びリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）
前記で細胞培養液から細胞を回収し、該回収された細胞をＰＢＳで洗浄した。凝集体洗浄液１［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００］に浮遊させた後、細胞破砕機を用いて破砕した後、遠心分離して不溶性の凝集体分画を回収した。凝集体洗浄液１−４［洗浄液１：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、洗浄液２：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）、洗浄液３：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．２Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）、洗浄液４：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．３Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）］を順次に用いて細胞浮遊、撹拌、洗浄、遠心分離の順に洗浄過程を進行して、不溶性の凝集体分画を回収した。
【００９７】
構造的に活性を有したＩＦＮα融合タンパク質を得るために、分離された凝集体を種類別に最適化された可溶化（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）緩衝液にそれぞれ溶かし、これを再びそれぞれのリフォールディング緩衝液で撹拌してリフォールディングを実施した。各ＩＦＮの凝集体の可溶化及びリフォールディングに用いた緩衝液及び条件を、次の表３に表わした：
【００９８】
【表３】
0006010227.tif 000004
【００９９】
タンパク質回収は、３次蒸溜水を０．５ｍｌを入れ、細胞を浮遊した後、可溶化緩衝液［６Ｍグアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ９．５）］を１ｍｌずつ添加し、最終濃度６Ｍグアニジンになるように凝集体を溶解した。４時間以上撹拌して、凝集体が完全に溶解された後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、３０分）して、上澄み液を０．２μｍフィルターで濾過した。
【０１００】
完全に溶解された凝集体を希釈方法でリフォールディングを進行した。リフォールディング緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＧＳＨ、０．２ｍＭ  ＧＳＳＧ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％Ｓｕｃｒｏｓｅ、ｐＨ８．０）に最終グアニジン濃度が１．５Ｍになるようにして、４℃で２４時間徐々に混合して反応させた。反応完了後、この試料に酢酸（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を添加して、ｐＨを４．０に合わせた。２時間以上追加反応後、０．２μｍフィルターで濾過した。ＲＰ−ＨＰＬＣを用いてリフォールディング有無を確認した。
【０１０１】
３．  クロマトグラフィーを通じる高純度精製
前記方法によってリフォールディングを実施した後、構造的に正常リフォールディングされたＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙタンパク質を高純度に精製するために、脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）と陽イオン交換クロマトグラフィーとを行った。
【０１０２】
リフォールディングが完了したＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙタンパク質をカラム結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ−Ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ４．０）で１６時間透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）して、１．５Ｍグアニジンを除去した。１０ｍｌのセファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）陽イオンクロマトグラフィー樹脂をカラムに充填して、ＦＰＬＣに装着した。カラム結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ−Ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ４．０）でカラムを平衡化（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）させた後、サンプルをカラムに結合させた。濃度勾配緩衝液（５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ−Ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）を用いてカラムに結合されたサンプルを分離した。ＨＰＬＣ分析法を用いて分離、精製されたタンパク質を確認した。分離された試料は、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）とＵＶ吸光光度計とを用いて５９５ｎｍで濃度を測定した。
【０１０３】
実施例５：インターフェロン−α融合タンパク質の構造分析
前記実施例で説明されたところによってリンカーを結合させて製作したＩＦＮα融合タンパク質の２次構造を分析した。２次構造の分析は、対照群としてＩＦＮα（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α）と、ＣＦＮ１（ＣＴＰ−ＩＦＮα）、ＣＦＮ７（ＣＴＰ−ＧＧＧＧＧＧ−ＩＦＮα）、ＣＦＮ８（ＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮα）、Ｈｅｐｓｉｎ  Ｃｌｅａｖａｇｅリンカーが挿入されたＣＦＮ１１、ＣＦＮ１２、ＣＦＮ１３を対象にして実施した。タンパク質の２次構造分析は、ＣＤ分光光度計（Ｊａｓｃｏ−８１５）を用いて行った。分析しようとするタンパク質を５０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ−Ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ４．０）内で最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるようにして、２５℃、０．２ｎｍの分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）、１．０ｎｍの帯域幅、及び５０ｎｍ／ｍｉｎのスキャン速度を有し、経路長が０．１ｃｍである石英セルを用いて１９０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲でスペクトルを得た。
【０１０４】
図２に示したスペクトルの分析結果、インターフェロンαと最も類似した２次構造を保持している候補物は、グリシンリンカーが挿入されているＣＦＮ７、ＣＦＮ８であり、Ｈｅｐｓｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅリンカーが挿入されたＣＦＮ１１、ＣＦＮ１２、ＣＦＮ１３の場合、α−ヘリックス（α−ｈｅｌｉｘ）が減少した変形された２次構造を示した。したがって、あるＣＦＮ７及びＣＦＮ８ＩＦＮα融合タンパク質が、ＩＦＮαと類似した活性を有すると予測された。
【０１０５】
実施例６：インターフェロン−α融合タンパク質のペギレーション
分子量３０ｋＤａまたは４０ｋＤａの線形ＰＥＧまたは枝形ＰＥＧをＮ末端、Ｃ末端または内部にペギレーションした。Ｎ末端ペギレーションは、ＩＦＮα融合タンパク質のＣＴＰの前にＰＥＧが付着された形態であり、内部ペギレーション（ランダムペギレーション）は、ＩＦＮα融合タンパク質内部のリシン（ｌｙｓｉｎｅ）残基にランダムにＰＥＧを付着した形態である。また、Ｃ末端ペギレーションは、線形ＰＥＧまたは枝形ＰＥＧをＩＦＮα融合タンパク質のＣ末端に付着した形態である（図３参照）。
【０１０６】
Ｎ末端ペギレーションのために、ＩＦＮα融合タンパク質ＣＦＮ８（ＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮα、配列番号３３）を５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ４．５）バッファに取り替えた。ＩＦＮα融合タンパク質ＣＦＮ８とＡｌｄｅｈｙｄｅ−ＰＥＧとを１：１０で混合した。この混合液に１Ｍ  ＮａＢＨ３ＣＮを還元剤として添加して、最終濃度が２０ｍＭになるようにした後、常温で２時間反応させた。ペギル化程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、ペギレーションされたタンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを実施して最終分離した。ペギレーション収率は、約４０％であった。
【０１０７】
内部ペギレーションは、ＩＦＮα融合タンパク質ＣＦＮ８（ＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮα、配列番号３３）を５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）バッファに取り替えた。ＰＥＧ−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒを１：１０で混合した。この混合液に１Ｍ  ＮａＢＨ３ＣＮを還元剤として添加して、最終濃度が２０ｍＭになるようにした後、常温で２時間反応させた。２Ｍグリシンを添加して反応を中止させた後、ペギル化程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。ペギレーションされたタンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを実施して最終分離した。ペギレーション収率は、約１７％であった。
【０１０８】
Ｃ末端ペギレーションは、ＩＦＮα融合タンパク質中でＩＦＮαのＣ末端にシステインを添加したＣＦＮ８Ｃ（ＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮα−Ｃ、配列番号１８）タンパク質に対して進行した。ＣＦＮ８Ｃ（ＣＴＰ−ＧＧＧＧ−ＩＦＮα−Ｃ）のＣ末端に生成されたシステインと結合するように、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧを用いてＰＥＧを付着した。この際、タンパク質とＰＥＧとの比率を１：１０で混合し、１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）バッファを最終濃度が１００ｍＭになるように添加して、２時間反応した。ペギル化程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、ペギレーションされたタンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを実施して最終分離した。ペギレーション収率は、約２５％であった。
【０１０９】
下記の表４にペギレーション方法によるそれぞれの製造収率を表示した。
【０１１０】
【表４】
0006010227.tif 000005
【０１１１】
実施例７：インターフェロン−α融合タンパク質の抗ウイルス活性の測定
１．  抗ウイルス活性の測定方法
製造したインターフェロン−α融合タンパク質の抗ウイルス活性を試験管内実験（ｉｎｖｉｔｒｏ）で測定した。抗ウイルス活性は、ＭＤＢＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ）細胞（韓国細胞株銀行）にＶＳＶ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（韓国細胞株銀行）を感染させた時、発生する細胞病変効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）をインターフェロン−α融合タンパク質がどれほど緩和させることができるかを確認することで測定した。
【０１１２】
まず、ＭＤＢＫ細胞をＤＭＥＭ培地で１．０Ｘ１０５細胞／ｍｌになるように希釈した後、９６ウェルプレート各ウェルごとに２００μＬずつ分周して、３７℃、５％ＣＯ２培養器で約１８時間培養する。タンパク質の場合、５０００ｐｇ／ｍｌ濃度のインターフェロン−α融合タンパク質、１／５０に希釈した血液、１／１０に希釈した肝サンプルを準備した後、１／２ずつ連続希釈して、１００μＬずつ細胞に処理した。３７℃、５％ＣＯ２で４時間反応を誘導した後、あらゆるウェルにＶＳＶを０．０１ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）になるように希釈して、９６ウェルプレート各ウェルごとに１００μＬずつ入れた。ＶＳＶを感染させ、約１８時間追加培養して、細胞病変効果を誘発した。培養終了した細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄後、４％ホルムアルデヒドを２００μＬずつ各ウェルに入れて、３０分間細胞を固定した。ＰＢＳを用いて２回洗浄後、０．０５％クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）を１００μＬずつ各ウェルに入れて、３０分間染色した。ＰＢＳを用いて２回洗浄後、約３０分間乾燥した。８０％エタノールを１００μＬずつ各ウェルに加えて染色薬を溶かし出し、５７０ｎｍで吸光度を測定した。感染させていない対照群に比べて、５０％の細胞病変効果が表われたウェルを基準に活性度を測定した。
【０１１３】
２．  インターフェロン−α融合タンパク質形態による抗ウイルス活性の測定結果
前記測定方法によって、インターフェロン−α融合タンパク質ＣＦＮ７、ＣＦＮ８、ＣＦＮ１１、ＣＦＮ１２、ＣＦＮ１３の活性を測定し、その結果は、下記の表５に表わした。
【０１１４】
【表５】
0006010227.tif 000006
【０１１５】
３．  インターフェロン−α融合タンパク質のペギレーションによる抗ウイルス活性の測定結果
前記測定方法によって、ＰＥＧサイズ及びペギレーション方法の差によるインターフェロン−α融合タンパク質の抗ウイルス活性を測定した。
【０１１６】
抗ウイルス活性の測定は、ＣＴＰ及びＰＥＧが付着されていないインターフェロン−αタンパク質として標準品ＩＦＮα；Ｎ末端にＣＴＰが付着されたが、ＰＥＧが付着されていないＩＦＮα融合タンパク質（ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙタンパク質）；ＣＴＰ−Ｘ−ＩＦＮα−Ｙタンパク質のＮ末端またはＣ末端に多様な形態でＰＥＧが付着されたＩＦＮα融合タンパク質であるＤｉ−ＰＥＧ、２０２Ｋ、［２＋４］Ｋ、４０１Ｃ、２０２Ｃに対して行った。
【０１１７】
前記Ｄｉ−ＰＥＧ融合タンパク質は、２個の線形ＰＥＧ（３０ｋＤａ）がＣＦＮ８タンパク質Ｎ末端アミノ酸のアミン基（ＮＨ２）とタンパク質内部リシン残基のアミン基（ＮＨ２）とにそれぞれ結合されている形態のＩＦＮα融合タンパク質であり、前記２０２Ｋ融合タンパク質は、２個の線形ＰＥＧ（２０ｋＤａ）がＣＦＮ８タンパク質内部リシンのアミン基（ＮＨ２）に同時に結合されている形態のＩＦＮα融合タンパク質であり、前記［２＋４］Ｋ融合タンパク質は、２個の線形ＰＥＧ（５ｋＤａ）と４個の線形ＰＥＧ（７．５ｋＤａ）とがＣＦＮ８タンパク質の内部リシン残基のアミン基（ＮＨ２）に同時に結合されている形態のＩＦＮα融合タンパク質であり、前記４０１Ｃ融合タンパク質は、１個の線形ＰＥＧ（４０ｋＤａ）がＣＦＮ８Ｃタンパク質のＣ末端システイン残基のスルフヒドリル（ＳＨ）基に結合されている形態のＩＦＮα融合タンパク質であり、前記２０２Ｃ融合タンパク質は、２個の線形ＰＥＧ（２０ｋＤａ）がＣＦＮ８Ｃタンパク質のＣ末端システインのスルフヒドリル（ＳＨ）基に同時に結合されている形態のＩＦＮα融合タンパク質である（図３参照）。
【０１１８】
下記の表６に記載した結果のように、標準品ＩＦＮαと比較して、ＰＥＧが結合されていないインターフェロン−α融合タンパク質の場合は、抗ウイルス活性が標準品ＩＦＮαの活性とほぼ同等であった。一方、ＰＥＧが結合されたＩＦＮα融合タンパク質は、ＰＥＧ形態と結合方法とによって活性値が多様であったが、ＰＥＧが付着されていない標準品に比べては、活性がいずれも減少した。
【０１１９】
また、本発明のＩＦＮα融合タンパク質である４０１Ｃと現在販売されているＰＥＧ付着ＩＦＮα薬物であるＰＥＧＡＳＹＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ  ＬａＲｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．）との抗ウイルス活性を比較して測定した。ＰＥＧＡＳＹＳは、２０ｋＤａの枝形ＰＥＧがＩＦＮαタンパク質にランダムに結合されたＩＦＮα融合タンパク質である。実験の結果、下記の表６で表われたように、本発明の４０１Ｃ融合タンパク質がＰＥＧＡＳＹＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ  ＬａＲｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．）よりも抗ウイルス活性が３倍さらに高いと確認された。
【０１２０】
【表６】
0006010227.tif 000007
【０１２１】
実施例８：インターフェロン−α融合タンパク質の薬物動力学的特性の測定
１．  マウス薬物動力学データ
マウス３匹を１つの実験群または対照群として、時間別に（４ｈ、８ｈ、１２ｈ、１ｄ、２ｄ、３ｄ、４ｄ、５ｄ）各インターフェロン−α融合タンパク質試料を３０μｇずつマウスの首の後ろに皮下注射した。実験に用いた試料は、試験群として２０２Ｋ、２０２Ｃ、及び４０１Ｃの融合タンパク質を使い、対照群としてＰＥＧ付着ＩＦＮα薬物であるＰＥＧＡＳＹＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ  ＬａＲｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．）を用いた。ＰＥＧＡＳＹＳは、２０ｋＤａの枝形態のＰＥＧがＩＦＮαタンパク質にランダムに結合されたＩＦＮα融合タンパク質である。試料を注射した後、各時間別にマウス目で約１ｍｌを採血して氷に１時間さしておいた後、遠心分離して（１３，０００ｒｐｍ、４℃、０．５ｈ）血清のみ回収し、該回収した血清を１／５０に希釈して抗ウイルス活性を測定した。測定した結果は、下記の表７に記載して表わした。表７の結果で表われたように、４０１Ｃ形態が２０２ＫまたはＰＥＧＡＳＹＳよりも血液内活性、肝内活性、及び血液内活性に比べて、肝内活性の比率がさらに高いことを確認することができた。
【０１２２】
２．  猿の薬物動力学データ
猿２匹を１つの群として、時間別に（４ｈ、８ｈ、１２ｈ、１ｄ、２ｄ、３ｄ、４ｄ、５ｄ、６ｄ）それぞれのサンプルを３００μｇ／ｋｇずつ猿の首の後ろに皮下注射した。サンプルは、試験群としてＰＥＧが付着されたインターフェロン−α融合タンパク質（４０１Ｃ）と対照群としてＰＥＧが付着された販売されているＩＦＮ−α薬物ＰＥＧＡＳＹＳとを用いた。注射前と注射後、時間別に猿の後ろ足の静脈で約２．５ｍｌを採血して氷に１時間さしておいた後、遠心分離して（１３，０００ｒｐｍ、４℃、０．５ｈ）血清のみ回収した。血清を１／５０に希釈して抗ウイルス活性を測定した。測定結果は、図４に示した。
【０１２３】
猿を用いた本発明のインターフェロン−α融合タンパク質４０１Ｃ薬物動力学的によれば、本発明のインターフェロン−α融合タンパク質４０１Ｃを投与した後、３日以内である薬物投与前期では、ＰＥＧＩＮＴＲＯＮ（肝炎治療剤、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ）と類似した程度の薬物投与後、初期活性増加の効果を示し、投与後、４〜７日内の薬物投与後期では、ＰＥＧＡＳＹＳ（肝炎治療剤、Ｈｏｆｆｍａｎ  ＬａＲｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．）と類似した程度の安定性を示した（図４参照）。このような結果は、本発明で製造したインターフェロン−α融合タンパク質４０１Ｃが薬物投与後、初期活性が減少しないながらも、７日まで高い活性が保持されるということを見せる。このような持続力は、本発明の一実施例による融合タンパク質を構成するリンカー、ポリエチレングリコールの種類、位置及び方法を最適化されたことを立証する。
【０１２４】
実施例９：インターフェロン−α融合タンパク質の肝移動性の測定
マウス３匹を１つの群として、時間別に（４ｈ、８ｈ、１２ｈ、１ｄ、２ｄ、３ｄ、４ｄ、５ｄ）それぞれのサンプルを３０μｇずつマウスの首の後ろに皮下注射した。実験に用いた試料は、試験群として２０２Ｋ、２０２Ｃ、及び４０１Ｃの融合タンパク質を使い、対照群としてＰＥＧ付着ＩＦＮα薬物であるＰＥＧＡＳＹＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ  ＬａＲｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．）を用いた。注射後、時間別にマウスの腹部を切開した後、肝の血管に冷蔵保管されたＰＢＳを注入して、肝灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を実施した。肝から血液が除去されれば、肝全体を切断して、１０％スクロースバッファに入れ、肝をＰＢＳで２回洗浄した。肝をタンパク質分解酵素抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）が入っているＰＢＳバッファに入れ、粉砕機で粉砕した。４００μＬの１０ｘＲＩＰＡバッファを入れて、１ｘＲＩＰＡバッファになるようにして混ぜる。サンプル当たり約１．２ｍｌずつを１．５ｍｌチューブ３個で分周して、４℃で１２時間保管した。遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、４℃、０．５ｈ）した後、各チューブ当たり７００μＬの上澄み液のみを回収して、各サンプル当たり約２ｍｌずつを集めた。サンプル１ｍｌをＦＰＬＣ（Ｈｉ−ｔｒａｐ  ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ使用、ｆｌｏｗは、３で固定）で精製した。回収されたタンパク質分画の量を測定するために、ＡＵＣ（Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を計算して、希釈倍数を算出した。［ＥＬＩＳＡ測定値（ｎｇ／ｍｌ）×２×２×粉砕した総体積（ｍｌ）］／［肝重量（ｇ）×（ＦＰＬＣ精製で得たタンパク質の量）／（ＦＰＬＣ精製タンパク質の全体量）］＝ｎｇ／ｇ肝。時間別の肝抽出物を用いてインターフェロン−αの活性度を測定することによって、ＰＥＧが付着されたＩＦＮ−α融合タンパク質と市販薬物であるＰＥＧＡＳＹＳとの間の肝移動性を比較評価した。
【０１２５】
図５ａ及び図５ｂの結果から見られるように、マウスを用いた肝移動性測定の実験結果によれば、本発明のインターフェロン−α融合タンパク質の肝移動性は、ＰＥＧＡＳＹＳに比べて、４０１Ｃは約１３倍、２０２Ｋは約６倍高かった。ＰＥＧＡＳＹＳが自体ＰＥＧによる肝移動性の特性が高いことを勘案すれば、本発明のインターフェロン−α融合タンパク質の肝移動性が著しく高いということが分かる。また、２０２Ｎの場合、肝移動性がほとんど表われないということが分かった。これは、２０２Ｎの形態でＰＥＧがＣ末端のＣＴＰにペギレーションされることによって、ＣＴＰの肝移動能を阻害したためであると見られる。
【０１２６】
下記の表７は、血液と肝とで薬動力学的に最も優れた試験群である４０１Ｃと２０２Ｋとの活性値を対照群であるＰＥＧＡＳＹＳの活性値と比較したものである。結果的に、４０１Ｃが試験群だけではなく、対照群に比べても、血液と肝とで最も卓越した薬動力学的活性を表わした。
【０１２７】
【表７】
0006010227.tif 000008
【０１２８】
総合すれば、本発明は、肝移動及び残留特性を改善したインターフェロン−α融合タンパク質に関するものであって、融合タンパク質を連結するリンカーの種類及び長さによるインターフェロン−α融合タンパク質の構造を基準に、構造的な変化を誘発しないリンカーを選別し、このような融合タンパク質の試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及び生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）特性を通じて、インターフェロン−αタンパク質の活性、肝移動及び残留特性が改善されたことを立証することによって、発明を完成した。また、本発明の一実施例による融合タンパク質は、既存の融合タンパク質に比べて、活性及び半減期が改善されたことだけではなく、品質保持及び製造が容易なので、肝疾患治療用組成物に有用に活用されうる。
【０１２９】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したので、当業者において、このような具体的な技術は、単に望ましい実施例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
【図１】
0006010227.tif 000009
【図２】
0006010227.tif 000010
【図３】
0006010227.tif 000011
【図４】
0006010227.tif 000012
【図５ａ】
0006010227.tif 000013
【図５ｂ】
0006010227.tif 000014
【配列表】
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