(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液中にて分散しランダムに運動する蛍光粒子を検出する方法であって、
（ａ）蛍光粒子と、前記蛍光粒子に対して三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質とを含む試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中に存在する蛍光粒子の分子数を算出する工程と、
を有し、
前記工程（ｂ）における蛍光粒子の分子数の算出は、
共焦点顕微鏡及び多光子顕微鏡の一方の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記蛍光粒子から放出される光信号を検出して、前記蛍光粒子を個別に検出する工程と、
前記個別に検出された蛍光粒子の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記蛍光粒子の数を計数する工程と、
により行い、
前記光検出領域中の前記蛍光粒子から放出される光信号の検出及び前記蛍光粒子の検出を、
検出された光の時系列の光強度データを生成し、生成された時系列光信号データに対してスムージング処理をした後に時間についての一次微分値を演算してピーク存在領域を特定し、前記特定されたピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して釣鐘型関数のフィッティングを行い、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの蛍光粒子に対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号を、一つの蛍光粒子に対応する信号であると判定することによって、一つの蛍光粒子を検出することにより行う、
蛍光粒子の検出方法。
【請求項２】
前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、０．１ｍＭ〜２０ｍＭである請求項１に記載の蛍光粒子の検出方法。
【請求項３】
前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、０．３ｍＭ〜１０ｍＭである請求項１に記載の蛍光粒子の検出方法。
【請求項４】
前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、０．５ｍＭ〜５ｍＭである請求項１に記載の蛍光粒子の検出方法。
【請求項５】
前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質がヨウ化カリウム及びシステアミンから選択される１種以上である請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛍光粒子の検出方法。
【請求項６】
前記光検出領域の位置を移動する工程は、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動されることを含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛍光粒子の検出方法。
【請求項７】
前記光検出領域の位置を移動する工程は、前記光検出領域の位置が、前記蛍光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の蛍光粒子の検出方法。
【請求項８】
前記検出された光から、個々の前記蛍光粒子からの光信号を検出して、前記蛍光粒子を個別に検出する工程は、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの前記蛍光粒子が前記光検出領域に入ったことが検出されることを含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の蛍光粒子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、蛍光粒子を検出する方法に関する。
本願は、２０１１年８月１２日に、日本に出願された特願２０１１−１７６６９９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出及び測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ。例えば、特許文献１、２、非特許文献１〜３参照）に於いては、レーザ共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子からの蛍光強度の測定が為される。その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値が決定される。微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が達成される。なお、前記微小領域とは、顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、蛍光強度分布分析(Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献３)やフォトンカウンティングヒストグラム（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｈｉｓｔｏｇｒａｍ：ＰＣＨ。例えば、特許文献４）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成される。そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定される。これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。更に、特許文献５、６に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献７は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光を、フォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。【０００３】
特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学及び生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６号公報
【特許文献２】特開２００８−２９２３７１号公報
【特許文献３】日本国特許第４０２３５２３号公報
【特許文献４】国際公開第０８／０８０４１７号
【特許文献５】特開２００７−２０５６５号公報
【特許文献６】特開２００８−１１６４４０号公報
【特許文献７】特開平４−３３７４４６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】金城政孝、蛋白質核酸酵素、１９９９年、第４４巻、第９号、第１４３１〜１４３８ページ。
【非特許文献２】メイヤー−アルムス（Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、第２０４〜２２４ページ。
【非特許文献３】加藤則子、他４名、遺伝子医学、２００２年、第６巻、第２号、第２７１〜２７７ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術では、概して述べれば、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出され、そのゆらぎの大きさに基づいて試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術に於いて有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように調整されていることが好ましい。好適には、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい。典型的には、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、蛍光分子等の濃度は、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であることが好ましい。換言すれば、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るときには、例えば、１ｎＭを大幅に下回るときには、観測対象物が微小領域内に計測時間のうちに稀にしか進入してこない状態が発生し、蛍光強度の計測結果に於いて、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれる。これと共に、有意な蛍光強度の観測量が少なくなるので、上記の如き蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果を望むことができなくなる。【０００７】
特許文献５、６に記載された共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記の如き蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行うことなく、数秒間に亘る計測時間に於ける有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中に於ける観測対象となる蛍光分子等の有無が特定でき、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数とに相関が得られることが開示されている。特に、特許文献６では、試料溶液中を攪拌するランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。しかしながら、これらの方法に於いても、拡散により又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出することに留まっており、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することができず、例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７に記載された技術は、フローサイトメータに於けるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出するものである。特許文献７に記載された技術は、試料溶液中に通常の状態にて溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子、即ち、試料溶液中にてランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではない。そのため、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献７の技術は、フローサイトメータに於ける計測或いは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含むため、検査に必要な試料量は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合に比して大幅に多くなるとともに、実施者に於いて複雑で高度な操作技術が要求されると考えられる。【０００８】
かくして、本発明の態様は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術にて実行されている如き、統計的処理を含まない。従って、観測対象粒子の濃度又は数密度がそれらの光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能な新規な光分析技術により、蛍光粒子をより高感度に検出するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、試料溶液中にて分散しランダムに運動する蛍光粒子検出する場合において、蛍光粒子の検出を、走査分子計数法を用いて行うことにより、試料溶液中の観測対象の粒子の濃度が非常に低い場合であっても感度よく蛍光粒子を検出することができること、さらには、走査分子計数法による計測を、三重項励起状態消光剤の存在下で行うことにより、より高感度に蛍光粒子を検出可能であることが見出された。
ここで、走査分子計数法は、特願２０１０−０４４７１４に於いて提案されている新規な光分析技術である。【００１０】
すなわち、本発明の一態様は、
（１） 試料溶液中にて分散しランダムに運動する蛍光粒子を検出する方法であって、
（ａ）蛍光粒子と、前記蛍光粒子に対して三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質とを含む試料溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中に存在する蛍光粒子の分子数を算出する工程と、
を有し、
前記工程（ｂ）における蛍光粒子の分子数の算出は、
共焦点顕微鏡及び多光子顕微鏡の一方の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の蛍光粒子から放出される光信号を検出して、蛍光粒子を個別に検出する工程と、
前記個別に検出された蛍光粒子の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記蛍光粒子の数を計数する工程と、
により行い、
前記光検出領域中の前記蛍光粒子から放出される光信号の検出及び前記蛍光粒子の検出を、
検出された光の時系列の光強度データを生成し、生成された時系列光信号データに対してスムージング処理をした後に時間についての一次微分値を演算してピーク存在領域を特定し、前記特定されたピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して釣鐘型関数のフィッティングを行い、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの蛍光粒子に対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号を、一つの蛍光粒子に対応する信号であると判定することによって、一つの蛍光粒子を検出することにより行う、蛍光粒子の検出方法、
（２） 前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、０．１ｍＭ〜２０ｍＭである前記（１）に記載の蛍光粒子の検出方法、
（３） 前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、０．３ｍＭ〜１０ｍＭである前記（１）に記載の蛍光粒子の検出方法、
（４） 前記試料溶液の前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の濃度が、０．５ｍＭ〜５ｍＭである前記（１）に記載の蛍光粒子の検出方法、
（５） 前記三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質がヨウ化カリウム及びシステアミンから選択される１種以上である前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の蛍光粒子の検出方法、
（６） 前記光検出領域の位置を移動する工程は、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動されることを含む前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の蛍光粒子の検出方法、
（７） 前記光検出領域の位置を移動する工程は、前記光検出領域の位置が、前記蛍光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを含む前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の蛍光粒子の検出方法、
（８） 前記検出された光から、個々の前記蛍光粒子からの光信号を検出して、前記蛍光粒子を個別に検出する工程は、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの前記蛍光粒子が前記光検出領域に入ったことが検出される前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の蛍光粒子の検出方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の態様における蛍光粒子の検出方法において用いられる走査分子計数法は、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されない。そのため、本発明の態様における蛍光粒子の検出方法により、解析対象である蛍光粒子が試料中に極微量にしか存在していない場合であっても、試料中の前記蛍光粒子を検出することができる。さらに、本発明の態様における蛍光粒子の検出方法では、走査分子計数法による計測を三重項励起状態消光剤の存在下で行うため、蛍光粒子を非常に高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】走査分子計数法のための光分析装置の内部構造の模式図である。
【図１Ｂ】コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。
【図１Ｃ】ミラー７の向きを変更して試料溶液内において光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。
【図２Ａ】走査分子計数法のための光分析技術による光検出の原理を説明する模式図である。
【図２Ｂ】走査分子計数法のための光分析技術による光検出において計測される光強度の時間変化の模式図である。
【図３Ａ】観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のモデル図である。
【図３Ｂ】観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。
【図４Ａ】試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のモデル図である。
【図４Ｂ】試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。
【図５】走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順をフローチャートの形式で表した図である。
【図６Ａ】走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。
【図６Ｂ】走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。
【図７】走査分子計数法により計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、ピーク存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。
【図８Ａ】参考例１において、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）を含む各試料溶液中の蛍光分子中の三重項励起状態の割合を示した図である。
【図８Ｂ】参考例１において、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）を含む各試料溶液中の蛍光分子の１分子あたりの明るさを示した図である。
【図９Ａ】参考例１において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含む各試料溶液中の蛍光分子中の三重項励起状態の割合を示した図である。
【図９Ｂ】参考例１において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含む各試料溶液中の蛍光分子中の三重項励起状態の割合、及び蛍光分子の１分子あたりの明るさＣＰＰを示した図である。
【図１０Ａ】参考例２において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含む各試料溶液中の蛍光分子中の三重項励起状態の割合を示した図である。
【図１０Ｂ】参考例２において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含む各試料溶液中の蛍光分子の１分子あたりの明るさを示した図である。
【図１１Ａ】参考例２において、ＴＡＭＲＡ（登録商標）を含む各試料溶液中の蛍光分子中の三重項励起状態の割合を示した図である。
【図１１Ｂ】参考例２において、ＴＡＭＲＡ（登録商標）を含む各試料溶液中の蛍光分子の１分子あたりの明るさＣＰＰを示した図である。
【図１２】実施例１において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含む各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。
【図１３】実施例２において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含む各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。
【図１４】実施例２において、ＴＡＭＲＡ（登録商標）を含む各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。
【図１５】実施例３において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の濃度が１ｐＭの各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。
【図１６】実施例３において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の濃度が１００ｐＭの各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
まず、走査分子計数法について説明する。走査分子計数法は、微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）が微小領域内を横切るときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出する。これにより、走査分子計数法は、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。ＦＩＤＡ等のような光分析技術と同様に、測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短い。しかも、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能となる。
【００１４】
なお、発光粒子は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子を意味する。本実施形態の蛍光粒子の検出方法においては、発光粒子のうちの蛍光粒子を検出対象とする。
【００１５】
本実施形態において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡において光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。なお、この領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。
【００１６】
試料溶液内において光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している粒子に結合又は会合した発光プローブを包含したときには、発光プローブからの光が検出される。これにより、一つの粒子の存在が検出される。実験の態様によっては、発光プローブは、一旦検出されるべき粒子と結合した後、光の検出時には、粒子から解離している場合もあり得る。そして、逐次的に検出された光のうち発光プローブからの光信号を個別に検出する。これにより、粒子又は発光プローブと結合した粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得される。具体的には、例えば、上記の構成において、個別に検出された粒子を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。この構成によれば、粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。また、走査分子計数法においては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液において機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しない。そのため、検出対象となる粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である（試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１μＬ〜数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。
【００１７】
上記の粒子を個別に検出する工程において、逐次的に検出される光信号から、１つの粒子に結合した発光プローブが光検出領域に入ったか否かの判定は、時系列に検出される光信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態において、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出されたときに、１つの粒子に結合した発光プローブが光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。なお本実施形態において、１つの粒子に結合した発光プローブとは、１つの発光プローブが１つの粒子に結合している状態、複数の発光プローブが１つの粒子に結合している状態、及び、実験態様によって１つの粒子に結合した後粒子から解離した発光プローブである状態を含む。
【００１８】
また、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、粒子に結合した発光プローブの特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者において理解される如く、粒子に結合した発光プローブから検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの粒子に結合した発光プローブから得られる光量は低減することとなるので、１つの粒子に結合した発光プローブからの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。
【００１９】
更に、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、走査分子計数法では、光検出領域が１つの粒子に結合した発光プローブの存在位置を通過したときにその発光プローブから発せられる光を検出して、発光プローブを個別に検出する。しかしながら、粒子に結合した発光プローブが溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光プローブから複数回、（検出したい粒子の存在を表す）光信号が検出されてしまい、検出された光信号と１つの検出したい粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの粒子に結合した発光プローブを、１つの（粒子の存在を表す）光信号に対応させることが可能となる。本実施形態においては、具体的には、光検出領域の移動速度を検出対象である蛍光粒子の拡散移動速度よりも速い速度に設定する。なお、拡散移動速度は、粒子に結合した発光プローブによって変わるので、上記の如く、粒子に結合した発光プローブの特性（特に、拡散定数）に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。
【００２０】
光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。
例えば、レーザ走査型光学顕微鏡において採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
【００２１】
走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないので、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。
【００２２】
また、走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出するようになっている。そのため、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子を一つずつ検出するため、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能とる。従って走査分子計数法によれば、従前に比して、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。実際に、蛍光粒子を個別に検出しその数を計数して粒子濃度を決定する本実施形態の蛍光粒子の検出方法によれば、試料溶液中の蛍光粒子の濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度であっても、蛍光粒子を検出することが可能である。
【００２３】
更に、光学系の光路を変更して試料溶液中を光検出領域にて走査する態様によれば、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、試料溶液内を一様に或いは試料溶液が機械的に安定した状態で観測することになる。そのため、例えば、試料に流れを発生させる場合に比して、定量的な検出結果の信頼性が向上し、また、試料溶液中の検出対象となる粒子に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトの無い状態で計測が行えることとなる。なお、試料に流れを与える場合には、常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となる。また、必要な試料量が大幅に増大する。さらに、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子、発光プローブ若しくは結合体又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。
【００２４】
＜走査分子計数法のための光分析装置の構成＞
走査分子計数法は、基本的な構成に於いて、図１Ａに模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図１Ａを参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザ光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡ（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ａｐｅｒｔｕｒｅ）にて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１μＬ〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されている。対物レンズ８から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、前記粒子と結合する発光プローブ、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されている。発光プローブと結合又は会合した粒子（実験の態様によっては、粒子と一旦結合した後に粒子から解離した発光プローブ）が励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されている。これにより、図１Ｂに模式的に示されている如きレーザ光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１Ｂに例示されたレーザ光の焦点領域は、通常、１ｆＬ〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、走査分子計数法では、１つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
【００２５】
更に、上記の光分析装置の光学系においては、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内において焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。この  光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１Ｃに模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザ走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８におけるプログラムにおいて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。
【００２６】
粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブがりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１においては、図１Ａの如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブを励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出できるようになっていてよい。
【００２７】
＜走査分子計数法の光分析技術の原理＞
ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定される。精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、観測対象粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、有意な光強度（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算において、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るための計測時間が長くなる。これに対して、走査分子計数法では、観測対象粒子の濃度がＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出が可能である。
【００２８】
走査分子計数法の光分析技術において、実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２Ａにて模式的に描かれているように、試料溶液内において光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。
そうすると、例えば、図２Ａの如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０〜ｔ２）において１つの粒子（図中、発光プローブとして蛍光色素が結合している。）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、図２Ｂに描かれている如く有意な光強度（Ｅｍ）が検出されることとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２Ｂに例示されている如き有意な光強度を一つずつ検出する。これによって、発光プローブの結合した粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の光分析技術の原理においては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、粒子が一つずつ検出される。これにより、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能であることは理解されるべきである。
【００２９】
また、走査分子計数法のように、試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測される蛍光強度から蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合よりも、より低い濃度まで測定することが可能である。蛍光分光光度計やプレートリーダーによって或る蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合、通常、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例すると仮定される。しかしながら、その場合、蛍光標識された粒子の濃度が十分に低くなると、蛍光標識された粒子から発せられた光による信号の量に対するノイズ信号の量が大きくなり（Ｓ／Ｎ比の悪化）、蛍光標識された粒子の濃度と光信号量との間の比例関係が崩れる。その結果、決定される濃度値の精度が悪化することとなる。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、検出結果からノイズ信号が排除され、個々の粒子に対応する信号のみを計数して濃度を算出する。これにより、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも低い濃度まで検出できることとなる。
【００３０】
更にまた、観測対象粒子の１つに複数の発光プローブが結合する場合には、走査分子計数法のように試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定の下に濃度を決定する従前の方法よりも、粒子濃度の高い側での粒子濃度の測定精度も向上する。観測対象粒子の一つに複数の発光プローブが結合する場合で或る量の発光プローブが試料溶液に添加されているとき、観測対象粒子の濃度が高くなると、相対的に粒子に結合する発光プローブの数が低減する。その場合、一つの観測対象粒子当たりの蛍光強度が低減するために、蛍光標識された粒子の濃度と光量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化する。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、一つの粒子当たりの蛍光強度の低減の影響は少なく、粒子数から濃度を算出する。そのため、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも高い濃度まで検出できる。
【００３１】
＜走査分子計数法による試料溶液の光強度の測定＞
走査分子計数法の光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにおける光強度の測定工程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力する。続いてコンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内において光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測を開始する。この計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７は、ミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内において光検出領域の位置の移動を実行する。これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信する。コンピュータ１８は、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器である。よって、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
【００３２】
光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された観測対象粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となる。そのため、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となる。よって、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
【００３３】
ところで、計測された時系列の光強度データからの観測対象粒子の個別の検出、或いは、観測対象粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、光検出領域の位置の移動速度は、観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ、本実施形態においては、蛍光粒子）のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。走査分子計数法の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図３Ａに模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動する。これにより、光強度が図３Ｂの如くランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の観測対象粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。
そこで、好適には、図４Ａに描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切るよう、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。これにより、時系列の光強度データにおいて、図４Ｂに例示の如く、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり、個々の観測対象粒子と光強度との対応が容易に特定できる。粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。
【００３４】
具体的には、拡散係数Ｄを有する観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ    …（１）
から、以下のように示される。
Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ    …（２）
従って、観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、以下のように示される。
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ    …（３）
そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０−１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０−３ｍ／ｓとなる。従って、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
【００３５】
＜走査分子計数法による光強度の分析＞
上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理（検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順）により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。
【００３６】
（ｉ）一つの観測対象粒子の検出
時系列の光強度データにおいて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４Ａに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図６Ａに模式的に描かれている如く、（光学系により決定される）光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル（通常、略釣鐘状）を有する。そこで、観測対象粒子の検出の一つの手法において、光強度に対して閾値Ｉｏが設定され、その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されるようになっていてよい。光強度に対する閾値Ｉｏ及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められる。その具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）の特性によって選択的に決定されてよい。
【００３７】
また、観測対象粒子の検出の別の手法として、光検出領域の光強度分布が、
ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ２／ａ２）    …（４）であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されてよい。強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析において無視されてよい。
【００３８】
（ii）観測対象粒子のカウンティング
観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数することにより為されてよい。しかしながら、粒子の数が大きい場合には、例えば、図５及び図６Ｂに例示された処理により為されてよい。
【００３９】
図５及び図６Ｂを参照して、時系列の光強度（フォトンカウント）データから粒子のカウンティングを行う手法の一つの例は、上記に説明された光強度の測定である。即ち、光検出領域による試料溶液内の走査及びフォトンカウンティングを行って時系列光信号データ（フォトンカウントデータ）を取得する（ステップ１００）。この時系列光信号データ（図６Ｂ、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（ステップ１１０、図６Ｂ中上段「スムージング」）。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブの発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間においてデータ値の欠落が生じ得る。そのため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法において一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光信号データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
【００４０】
次いで、スムージング処理後の時系列光信号データにおいて、有意な信号が存在する時間領域（ピーク存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光信号データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光信号データの時間微分値は、図６Ｂ中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点における値の変化が大きくなる。そのため、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号（ピーク信号）の始点と終点を有利に決定することができる。
【００４１】
しかる後、時系列光信号データ上において、逐次的に、有意な信号（ピーク信号）を検出し、検出されたピーク信号が観測対象粒子に対応する信号であるか否かが判定される。
具体的には、まず、時系列光信号データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのピーク信号の始点と終点とが探索され決定され、ピーク存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのピーク存在領域が特定されると、そのピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行わる（図６Ｂ下段「釣鐘型関数フィッティング」）。これにより、釣鐘型関数のピーク強度Ｉｍａｘ、ピーク幅（半値全幅）ｗ、フィッティングにおける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが光検出領域を通過したときに検出される光信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、ピーク強度、ピーク幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図７左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブに対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの観測対象粒子に対応する信号であると判定される。これにより、一つの観測対象粒子が検出されたこととなり、一つの粒子としてカウントされる（粒子数がカウントアップされる。ステップ１６０）。一方、図７右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったピーク信号は、ノイズとして無視される。
【００４２】
上記のステップ１３０〜１６０の処理におけるピーク信号の探索及び判定は、時系列光信号データの全域に渡って繰り返し実行され、一つの観測対象粒子が検出される毎に、粒子としてカウントされる。そして、時系列光信号データの全域のピーク信号の探索が完了すると（ステップ１７０）、それまで得られた粒子のカウント値が時系列光信号データにおいて検出された観測対象粒子の数とされる。
【００４３】
（iii）観測対象粒子の数密度又は濃度の決定
観測対象粒子のカウンティングが為されると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難である。従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液（参照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。
参照溶液の粒子としては、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体（又は観測対象粒子に結合後遊離した発光プローブ）と同様の発光特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの参照溶液について、その粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、以下の式で与えられる。
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ    …（５）
また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子の数密度ｃは、以下の式によって与えられる。
ｃ＝ｎ／Ｖｔ    …（６）  なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
【００４４】
＜蛍光粒子の検出方法＞
本実施形態の蛍光粒子の検出方法は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する蛍光粒子を検出する方法であって、蛍光粒子を、三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質の存在下で走査分子計数法によって計数することにより検出する。走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、発光粒子を一粒子毎に測定することができる測定方法であることから、ｐＭオーダー以下の比較的低濃度の発光粒子に対しても測定が可能である。このため、本実施形態の蛍光粒子の検出方法により、試料溶液中の解析対象の蛍光粒子の濃度が非常に低い場合であっても、蛍光粒子を高感度に計数することができる。さらに、本実施形態の蛍光粒子の検出方法は、走査分子計数法による測定を、三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質（三重項励起状態消光剤）の存在下で行うことにより、蛍光粒子を非常に高感度に検出することができる。
【００４５】
基底状態にある分子に光を照射すると一重項励起状態になり、その後再び基底状態に戻る。一重項励起状態から基底状態に戻る経路は２つある。１つは、一重項励起状態から直接基底状態に戻る経路であり、この際放出される光が蛍光である。残る１つは、一重項励起状態から三重項励起状態を介して基底状態に戻る経路であり、前記経路によって基底状態に戻る分子からは、蛍光は発されない。蛍光の寿命は、多くの分子においてナノ秒オーダーであることが知られている。一方で、一重項励起状態から三重項励起状態を介して基底状態に戻る（蛍光が発されない）経路では、一般的にマイクロ秒オーダー以上かかる。
つまり、蛍光発光という点からは、一重項励起状態に励起された分子のうちの一部が三重項励起状態を介して基底状態に戻ることによって無駄が発生している。
【００４６】
本実施形態においては、一重項励起状態の寿命と三重項励起状態の寿命の長さの違いによって、三重項励起状態消光剤が一重項励起状態の分子よりも三重項励起状態の分子と高頻度に衝突することを利用して蛍光輝度を向上させている。具体的には、走査分子計数法による測定を三重項励起状態消光剤の存在下で行うことにより、試料溶液中の三重項励起状態にある蛍光粒子は三重項励起状態消光剤によって基底状態に戻される。基底状態に戻された蛍光粒子は、光照射により再び一重項励起状態に励起される。すなわち、蛍光を発しない三重項励起状態を迅速に解消することにより、蛍光輝度が向上する結果、蛍光粒子をより高感度に検出することができる。
【００４７】
本実施形態において用いられる三重項励起状態消光剤としては、三重項励起状態にある分子を基底状態に戻す作用を有する物質であれば特に限定されるものではない。三重項励起状態消光剤として、蛍光粒子の種類、励起光の波長、蛍光の波長等を考慮し、公知の三重項励起状態消光剤の中から適宜選択して用いられる。三重項励起状態消光剤としては、例えば、ヨウ化カリウム（ＰｏｔａｓｓｉｕｍＩｏｄｉｄｅ、ＫＩ）、システアミン（２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ）、シクロオクタテトラエン（Ｃｙｃｌｏ−ｏｃｔａｔｅｔｒａｅｎｅ）等が挙げられる。本実施形態においては、ヨウ化カリウム又はシステアミンを用いることが好ましい。なお、三重項励起状態消光剤は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４８】
例えば、蛍光粒子の検出において、検出蛍光波長が５１０ｎｍ〜５６０ｎｍの少なくとも一部を含む場合、三重項励起状態消光剤としてヨウ化カリウム及びシステアミンから選択される１種以上を用いることが好ましい。蛍光粒子の検出において、検出蛍光波長が５１０ｎｍ〜６２０ｎｍの少なくとも一部を含む場合、三重項励起状態消光剤としてシステアミンを用いることが好ましい。蛍光波長が５１０ｎｍ〜５６０ｎｍの少なくとも一部を含む蛍光粒子としては、例えば、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＦＩＴＣ、５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５−ＦＡＭ）、Ｃｙ２（登録商標）等の蛍光物質、並びにこれらの蛍光物質が結合した粒子等が挙げられる。蛍光波長が５６０ｎｍ〜６２０ｎｍの少なくとも一部を含む蛍光粒子としては、例えば、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｃｙ３（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５等の蛍光物質、並びにこれらの蛍光物質が結合した粒子等が挙げられる。
【００４９】
具体的には、本実施形態の標的粒子の定量方法は、下記工程（ａ）〜（ｂ）を有する。
（ａ）蛍光粒子と、前記蛍光粒子に対して三重項励起状態から一重項基底状態への移行を促進させる物質とを含む試料溶液を調製する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中に存在する蛍光粒子の分子数を算出する工程。
以下、工程ごとに説明する。
【００５０】
本実施形態において、「試料溶液中に分散しランダムに運動する粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの粒子（発光するもの又は発光しないもののいずれであってもよい。）であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子を意味する。
【００５１】
本実施形態の蛍光粒子の検出方法の検出対象となる蛍光粒子は、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されるものではなく、蛍光色素や量子ドット等の蛍光物質等が挙げられる。また、本実施形態の蛍光粒子の検出方法は、蛍光プローブを用いることにより、非蛍光物質を検出することもできる。具体的には、検出対象である標的粒子（非蛍光物質）と特異的又は非特異的に結合又は吸着する部位を有し、かつ標的粒子と結合した状態で蛍光を発する蛍光プローブを用いる。標的粒子が含まれる試料溶液に、蛍光プローブを添加し、両者を結合させる。形成された標的粒子と結合した蛍光プローブは蛍光粒子であり、本実施形態の蛍光粒子の検出方法により検出することができる。
【００５２】
標的粒子は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子であり、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸類似物質、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物又は非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）等が挙げられる。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ  ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。
【００５３】
また、標的粒子と結合させる蛍光プローブとしては、標的粒子に結合した状態と、単独で存在している状態とにおいて、放出される光の発光特性が異なる物質であることが好ましい。標的粒子に結合した状態と単独で存在している状態とにおいて、蛍光プローブの発光特性が異なるとは、標的粒子に結合した状態と単独で存在している状態とで、特定の波長の光の強度が異なることを意味する。蛍光プローブが単独で存在している状態と、標的粒子と結合した状態とで、特定の波長の光の強度を異ならせる（例えば、蛍光強度を異ならせる）ことにより、走査分子計数法において両者を区別して検出することができる。
【００５４】
例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、蛍光プローブは、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに蛍光物質を結合させたもの、蛍光物質を結合させた核酸結合性タンパク質、核酸に結合する蛍光色素分子等が挙げられる。前記オリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。
また、標的粒子がタンパク質である場合には、蛍光プローブとしては、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターを蛍光物質で標識したものを用いることができる。なお、核酸やタンパク質等の標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質への蛍光物質の結合は、常法により行うことができる。
【００５５】
標的粒子と結合させる蛍光プローブは、標的粒子と非特異的に結合等するものであってもよいが、標的粒子の検出や定量の精度の点からは、特異的に結合等するものであることが好ましい。なお、標的粒子と特異的に結合する蛍光プローブとしては、物理的又は化学的性質が標的粒子と類似した他の物質に対する結合よりも、標的粒子と優先的に結合するものであればよく、標的粒子以外の物質と全く結合しないものである必要はない。例えば、標的粒子が核酸である場合には、蛍光プローブとして用いる蛍光物質で標識したオリゴヌクレオチドは、前記標的粒子の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、前記標的粒子の塩基配列とミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。
【００５６】
標的粒子がタンパク質である場合には、タンパク質と結合して周囲環境が変化することにより蛍光強度や蛍光波長が変化する色素（例えば、疎水性プローブＡＮＳ、ＭＡＮＳ、ＴＮＳといった蛍光色素）を、蛍光プローブとして用いることができる。また、蛍光プローブは、それ自体が蛍光を発していなくてもよい。例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、蛍光プローブを前記標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとし、試料溶液中に前記蛍光プローブとともに、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を添加することによっても、発光プローブが単独で存在している状態と、標的粒子と結合した状態とで、発光特性を異ならせることができる。２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質としては、蛍光性インターカレーターや、蛍光物質を結合させたグルーブバインダー等が挙げられる。
【００５７】
その他にも、例えば、蛍光プローブとして、少なくとも二つの構成要素から成る物質であって、標的粒子に結合することにより、前記の少なくとも二つの構成要素の互いの位置が変化して蛍光を発する物質が採用されてもよい。そのような物質の例としては、或る粒子に結合すると、構造変化して強い蛍光を放出するようになる蛍光性タンパク質や、或る粒子に結合すると、集合して蛍光性金属錯体を形成する分子（錯体の配位子）が挙げられる。かかる構成によれば、いずれの場合も、蛍光プローブ単体若しくは標的粒子に結合していない蛍光プローブは、殆ど発光しないか、発光しても、標的粒子及び蛍光プローブの結合体と波長が異なるため、標的粒子及び蛍光プローブの結合体からの光を選択的に検出することが可能となる。
【００５８】
また、蛍光エネルギー移動現象（ＦＲＥＴ）を利用することにより、試料溶液中に於いて単独で存在している蛍光プローブと、標的粒子に結合した状態である蛍光プローブとの発光特性を異ならせることができる。例えば、標的粒子と結合する物質に、ＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質及びエネルギー・アクセプターと成る物質（蛍光物質や消光物質）を、蛍光プローブが単独で存在している状態ではＦＲＥＴが生じ、標的粒子と結合した状態ではＦＲＥＴが生じなくなるように結合させたものを、蛍光プローブとして用いることができる。標的粒子と結合した蛍光プローブからは、ＦＲＥＴが起こらないため、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から蛍光が放出される。一方で、単独で存在している蛍光プローブからは、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光は検出されないか、もしくは減弱している。そこで、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光を検出することにより、蛍光プローブと結合した標的粒子を、単独で存在している蛍光プローブと区別して検出することができる。
【００５９】
例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、１本鎖核酸分子の状態の際に分子内構造体を形成するオリゴヌクレオチドに、ＦＲＥＴにおいてエネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質とを、１本鎖核酸分子の状態ではＦＲＥＴが起こり、他の１本鎖核酸分子とハイブリダイズして形成された会合体の状態ではＦＲＥＴが起こらないように結合させた分子ビーコンプローブを、蛍光プローブとして好ましく用いることができる。本実施形態においては、３’末端側にエネルギー・ドナーと成る蛍光物質又はエネルギー・アクセプターと成る物質が結合されており、５’末端側に残る一方が結合されており、かつ３’末端側の領域と５’末端側とに互いに相補的な塩基配列を有し、これらの塩基配列において塩基対を形成することによって、分子内構造体（いわゆるステム−ループ構造）を形成するものが好ましい。なお、分子ビーコンプローブの分子内塩基対を形成する互いに相補的な領域は、標的粒子とハイブリダイズする領域を挟むようにして存在していればよく、３’末端側の領域及び５’末端側の領域は、それぞれ、３’末端又は５’末端を含んでいる領域であってもよく、含まない領域であってもよい。また、塩基対を形成する領域の塩基数や塩基配列は、形成された塩基対の安定性が、標的粒子との会合体の安定性よりも低く、且つ測定条件下で塩基対を形成し得る程度であればよい。
【００６０】
また、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を用い、前記蛍光性２本鎖核酸結合物質と蛍光プローブを標識した蛍光物質との間にＦＲＥＴを起こすことによっても、単独で存在している蛍光プローブと、標的粒子と結合している蛍光プローブとを区別することができる。すなわち、蛍光性２本鎖核酸結合物質と蛍光プローブを標識する蛍光物質のいずれか一方がＦＲＥＴのエネルギー・ドナーと成り、他方が前記ＦＲＥＴのエネルギー・アクセプターと成る。単独で存在している蛍光プローブからは、前記蛍光プローブを標識する蛍光物質から放出される蛍光が検出される。これに対して、標的粒子と結合している蛍光プローブには蛍光性２本鎖核酸結合物質が結合するため、結合体からは、ＦＲＥＴにより放出される蛍光が検出される結果、単独で存在している蛍光プローブとは区別して検出することができる。
【００６１】
なお、蛍光プローブと標的粒子との会合体の塩基対の間に入り込む蛍光性インターカレーターの量が多すぎる場合には、ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出する際のバックグラウンドが高くなりすぎ、検出精度に影響を及ぼすおそれがある。このため、蛍光プローブと標的粒子との会合体中の２本鎖を形成している領域が、４００ｂｐ以下となるように、発光プローブを設計することが好ましい。
【００６２】
その他、本実施形態においては、蛍光プローブを２種類使用してもよい。例えば、２種類の蛍光プローブを、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合に、標的粒子に対して互いに隣接してハイブリダイズするように設計し、一方の蛍光プローブをＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質で標識し、他方の蛍光プローブを前記ＦＲＥＴにおけるエネルギー・アクセプターと成る物質で標識させる。この場合、単独で存在している蛍光プローブではＦＲＥＴは起こらないが、標的粒子に結合することにより、前記２種類の蛍光プローブは互いに近接し、ＦＲＥＴが起こる。このため、前記ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出することにより、蛍光プローブと結合した標的粒子を検出することができる。
【００６３】
まず、工程（ａ）として、蛍光粒子と、前記蛍光粒子に対する三重項励起状態消光剤に結合する蛍光プローブとを含む試料溶液を調製する。具体的には、蛍光粒子と三重項励起状態消光剤を適当な溶媒に添加して、試料溶液を調製する。該溶媒は、蛍光粒子から放出される光の検出、及び、走査分子計数法による蛍光粒子の検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、前記技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。このバッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。
【００６４】
三重項励起状態消光剤は、三重項励起状態を基底状態へ戻す作用（以下、消光作用）が奏されるために十分な濃度となるように、試料溶液に添加される。消光作用が奏される濃度は、実験的に求めることができる。具体的には、所定量の蛍光粒子（検出対象である蛍光粒子と同種の蛍光物質を含む粒子でもよい。）を含む測定溶液に、三重項励起状態消光剤を様々な濃度で添加し、各測定溶液中の蛍光プローブのうちの三重項励起状態にある分子の割合を計測する。三重項励起状態にある分子の割合が、三重項励起状態消光剤を添加していない測定溶液よりも有意に低下している濃度が、前記三重項励起状態消光剤によって消光作用が奏される濃度である。三重項励起状態にある分子の割合は、ＦＣＳ測定により求められる。
【００６５】
具体的には、三重項励起状態消光剤としてヨウ化カリウム又はシステアミンを用いる場合、走査分子計数法による計測時における試料溶液の三重項励起状態消光剤の濃度は、０．１ｍＭ〜２０ｍＭであることが好ましく、０．３ｍＭ〜１０ｍＭであることがより好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭであることがさらに好ましい。ヨウ化カリウム及びシステアミンを併用する場合には、両者を合わせた濃度が上記範囲内であることが好ましい。
【００６６】
非蛍光性の標的粒子と蛍光プローブとの結合体を蛍光粒子として検出対象とする場合、予め標的粒子と蛍光プローブとを結合させた蛍光粒子が含まれている溶液に、三重項励起状態消光剤を添加することによって試料溶液を調製してもよい。また、標的粒子と蛍光プローブと三重項励起状態消光剤を添加した試料溶液を調製した後、前記試料溶液中で標的粒子と蛍光プローブとを結合させて蛍光粒子を形成させてもよい。
【００６７】
標的粒子と蛍光プローブを同じ溶液中に共存させるだけで、両者を結合させることができる場合には、試料溶液を調製した後、必要に応じて所定時間前記試料溶液をインキュベートするだけで、前記試料溶液中で、標的粒子と蛍光プローブとを結合させることができる。
【００６８】
一方で、標的粒子や蛍光プローブが二本鎖構造の核酸又は核酸類似物質である場合には、試料溶液中の核酸等を変性させた後、両者を会合させることが好ましい。なお、「核酸又は核酸類似物質を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、分子ビーコンプローブ中の互いに相補的な塩基配列によって形成された塩基対を解離させ、分子内構造を解いて１本鎖構造にすることや、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。蛍光プローブがＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、標的粒子が二本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、前記蛍光プローブと標的粒子とからなる会合体を形成することができる場合がある。
【００６９】
変性処理としては、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性等が挙げられる。中でも、蛍光物質への影響が比較的小さく、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、前記試料溶液を、高温処理をすることにより、前記試料溶液中の核酸等を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、標的粒子の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、この温度に限定するものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、前記試料溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
【００７０】
必要に応じて変性させた後、前記試料溶液中の標的粒子と蛍光プローブを会合させる。
熱変性を行った場合には、高温処理後、前記試料溶液の温度を、標的粒子と蛍光プローブとが特異的にハイブリダイズできる温度にまで低下させることにより、前記試料溶液中の両者を適宜会合させることができる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、前記試料溶液の塩濃度を、標的粒子と蛍光プローブとが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、前記試料溶液中の両者を適宜会合させることができる。
【００７１】
なお、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、両者からなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、両者のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、前記溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した２本の１本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、両者が特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。
【００７２】
２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、蛍光プローブの塩基配列情報から、標的粒子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。
【００７３】
また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、会合体形成させる際に、試料溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、試料溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、前記試料溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。
【００７４】
また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め試料溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。
【００７５】
その後、工程（ｂ）として、調製された試料溶液中に存在する蛍光粒子の分子数を算出する。具体的には、蛍光粒子及び三重項励起状態消光剤を含む試料溶液を、前記の走査分子計数法のための光分析装置に設置し、前記の手法により、蛍光粒子から放出される光を検出し解析することにより、蛍光粒子の数を計数する。計数された粒子数が、測定試料中に含まれている蛍光粒子の数である。
【実施例】
【００７６】
次に実施例等を示して本発明の態様をさらに詳細に説明するが、本発明の態様は以下の実施例に限定されるものではない。【００７７】
［参考例１］
ヨウ化カリウム（ＫＩ）が消光作用を有することを、ＦＣＳ計測により確認した。
＜Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）の場合＞
Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）に対してヨウ化カリウム（ＫＩ）が消光作用を有することを、ＦＣＳ計測により確認した。
具体的には、１ｎＭ  ＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ（登録商標）（ＡｎａＳｐｅｃ社製）にＫＩが終濃度で０ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．３ｍＭ、３ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液に対して、１分子あたりの蛍光強度と三重項励起状態の割合が測定可能な１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を使ってＦＣＳ計測を行った。ＦＣＳ計測条件は、励起波長を４８８ｎｍとし、レーザ強度を１ｍＷとし、計測時間を１０秒間とした。測定は各試料について５回行い、その平均と標準偏差を算出した。【００７８】
測定結果を図８Ａ及び図８Ｂに示す。図８Ａは、各試料溶液中のＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ分子の三重項励起状態の割合（Ｆｒａｃ．Ｔｒｉｐｌｅｔ（％））を示した図である。図８Ｂは、各試料溶液中のＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ分子の１分子あたりの明るさＣＰＰ（Ｃｏｕｎｔｒａｔｅ  Ｐｅｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ）を示した図である。図８Ａに示されるように、ＫＩ濃度が３ｍＭの試料溶液において、三重項励起状態の割合が最も低かった。この結果から、ＫＩがＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎに対して三重項励起状態消光剤として働くことが確認できた。また、ＫＩ濃度が３ｍＭの試料溶液においては、ＫＩ無添加の試料溶液と比べてＣＰＰが１．３倍程度明るくなっていた（図８Ｂ参照。）。このことから、三重項励起状態消光剤の添加によって蛍光輝度が向上することが確認された。一方で、ＫＩ濃度が３０ｍＭの試料溶液では、三重項励起状態の割合がＫＩ無添加の試料溶液よりも低くなっているが、ＣＰＰはほとんど変化していなかった。これは、ＫＩを高濃度で添加したために、ＫＩと蛍光色素が近接する頻度が高まり、一重項励起状態のものまで基底状態に戻されたためと推察される。【００７９】
＜Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の場合＞
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８に対してヨウ化カリウム（ＫＩ）が消光作用を有することを、ＦＣＳ計測により確認した。
具体的には、ＲｈｏｄａｍｉｎｅＧｒｅｅｎ（登録商標）（ＡｎａＳｐｅｃ社製）に代えてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた以外は、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）の場合と同様にして、ＫＩが終濃度で０ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．３ｍＭ、３ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を含む試料溶液に対してＦＣＳ計測を行った。【００８０】
測定結果を図９Ａ及び図９Ｂに示す。図９Ａは、各試料溶液中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８分子の三重項励起状態の割合を示した図である。図９Ｂは、各試料溶液中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８分子の１分子あたりの明るさを示した図である。図９Ａに示されるように、ＫＩ濃度が０．３ｍＭ及び３ｍＭの試料溶液において、三重項励起状態の割合がＫＩ無添加の試料溶液と比べて明らかに低かった。この結果から、ＫＩがＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８に対して三重項励起状態消光剤として働くことが確認できた。また、最も三重項励起状態の割合が低かったＫＩ濃度が３ｍＭの試料溶液においては、ＫＩ無添加の試料溶液と比べてＣＰＰが１．８倍程度になっており、非常に大きな効果がでていた（図９Ｂ参照。）。
これらの結果から、ＫＩが様々な蛍光物質に対して消光作用を有しており、蛍光輝度の向上効果があることが確認できた。【００８１】
［参考例２］
システアミンが消光作用を有することを、ＦＣＳ計測により確認した。
＜Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の場合＞
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８に対してシステアミンが消光作用を有することを、ＦＣＳ計測により確認した。
具体的には、１ｎＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にシステアミン（Ｓｉｇｍａ社製）が終濃度で０ｍＭ、０．３ｍＭ、３ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液に対して、１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を使ってＦＣＳ計測を行った。ＦＣＳ計測条件は、励起波長を４８８ｎｍとし、レーザ強度を１ｍＷとし、計測時間を１０秒間とした。測定は各試料について５回行い、その平均を算出した。【００８２】
測定結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。図１０Ａは、各試料溶液中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８分子の三重項励起状態の割合を示した図である。図１０Ｂは、各試料溶液中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８分子の１分子あたりの明るさを示した図である。図１０Ａに示されるように、システアミン濃度が３ｍＭの試料溶液において、三重項励起状態の割合が最も低かった。この結果から、システアミンがＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８に対して三重項励起状態消光剤として働くことが確認できた。また、システアミン濃度が３ｍＭの試料溶液においては、システアミン無添加の試料溶液と比べてＣＰＰが１．５倍程度明るくなっていた（図１０Ｂ参照。）。このことから、システアミンの添加によって蛍光輝度が向上することが確認された。【００８３】
＜ＴＡＭＲＡ（登録商標）の場合＞
ＴＡＭＲＡ（登録商標）に対してシステアミンが消光作用を有することを、ＦＣＳ計測により確認した。
具体的には、１ｎＭ  ＴＡＭＲＡ（登録商標）（ＡｎａＳｐｅｃ社製）にシステアミン（Ｓｉｇｍａ社製）が終濃度で０ｍＭ、０．３ｍＭ、３ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液に対して、１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を使ってＦＣＳ計測を行った。ＦＣＳ計測条件は、励起波長を５４３ｎｍとし、レーザ強度を０．５ｍＷとし、計測時間を１０秒間とした。測定は各試料について５回行い、その平均を算出した。【００８４】
測定結果を図１１Ａ及び図１１Ｂに示す。図１１Ａは、各試料溶液中のＴＡＭＲＡ分子の三重項励起状態の割合を示した図である。図１１Ｂは、各試料溶液中のＴＡＭＲＡ分子の１分子あたりの明るさを示した図である。図１１Ａに示されるように、システアミン濃度が３ｍＭの試料溶液において、三重項励起状態の割合が最も低かった。この結果から、システアミンがＴＡＭＲＡに対して三重項励起状態消光剤として働くことが確認できた。また、システアミン濃度が３ｍＭの試料溶液においては、システアミン無添加の試料溶液と比べてＣＰＰが１．４倍程度明るくなっていた（図１１Ｂ参照。）。このことから、システアミンの添加によって蛍光輝度が向上することが確認された。
これらの結果から、システアミンが様々な蛍光物質に対して消光作用を有しており、蛍光輝度の向上効果があることが確認できた。【００８５】
［実施例１］
三重項励起状態消光剤としてＫＩを用いて、走査分子計数法により蛍光粒子を検出した。
まず、１０ｐＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＫＩが終濃度で０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液について、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用いて走査分子計数法による計測を行い、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、４８８ｎｍのレーザ光を用いて１ｍＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて５１０ｎｍ〜５６０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ  ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は２秒間とした。また、測定は各試料について５回行い、その平均と標準偏差を算出した。光強度の測定後、各試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータから、時系列データ中にて検出された光信号を計数した。データの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は９個とし、移動平均処理を５回繰り返した。また、フィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、ピーク幅（半値全幅）、相関係数を決定した。更に、ピークの判定処理では、下記の条件:
２０μ秒＜ピーク幅＜４００μ秒、
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）、
相関係数＞０．９５、
を満たすピーク信号のみを観測対象分子に対応する光信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないピーク信号はノイズとして無視し、観測対象分子に対応する光信号であると判定された信号の数を「ピーク数」として計数した。【００８６】
図１２は、各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。この結果、ＫＩ濃度が０．１ｍＭ〜１０ｍＭでは、ＫＩ無添加の試料溶液よりもピーク数が増大しており、蛍光粒子の検出能が向上したことが確認された。より詳細には、ＫＩ濃度が０．１ｍＭ〜３ｍＭでは、ＫＩの添加量が多くなるにつれて計数されたピーク数も多くなった。最もピーク数が多かったＫＩ濃度が３ｍＭの試料溶液では、ＫＩ無添加の試料溶液と比較して、３０％以上増加していた。これは、ＫＩによって蛍光輝度が高くなったＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８が新たに検出されるようになったためと推察される。
これらの結果から、走査分子計数法による蛍光粒子の計数をＫＩ存在下で行うことによって、蛍光粒子の検出能が向上し、より高感度に蛍光粒子を検出できることが明らかである。【００８７】
［実施例２］
三重項励起状態消光剤としてシステアミンを用いて、走査分子計数法により蛍光粒子を検出した。
＜Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の場合＞
まず、１０ｐＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にシステアミン（Ｓｉｇｍａ社製）が終濃度で０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液について実施例１と同様にして走査分子計数法による計測を行い、時系列のフォトンカウントデータを取得し、蛍光粒子の数を計数した。
図１３は、各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。この結果、システアミン濃度が０．３ｍＭ〜３ｍＭでは、システアミンの添加量が多くなるにつれて計数されたピーク数も多くなった。最もピーク数が多かったシステアミン濃度が３ｍＭの試料溶液では、システアミン無添加の試料溶液と比較して、２０％以上増加していた。【００８８】
＜ＴＡＭＲＡ（登録商標）の場合＞
まず、１０ｐＭ  ＴＡＭＲＡ（登録商標）（ＡｎａＳｐｅｃ社製）にシステアミン（Ｓｉｇｍａ社製）が終濃度で０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液について、励起光は、５４３ｎｍのレーザ光を用いて０．５ｍＷで照射し、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて５６０ｎｍ〜６２０ｎｍとした以外は実施例１と同様にして走査分子計数法による計測を行い、時系列のフォトンカウントデータを取得し、蛍光粒子の数を計数した。
図１４は、各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。この結果、システアミン濃度が０．３ｍＭ〜３ｍＭでは、システアミンの添加量が多くなるにつれて計数されたピーク数も多くなった。最もピーク数が多かったシステアミン濃度が３ｍＭの試料溶液では、システアミン無添加の試料溶液と比較して、１０％以上増加していた。【００８９】
これらの結果から、走査分子計数法による蛍光粒子の計数をシステアミン存在下で行うことによって、蛍光粒子の検出能が向上し、より高感度に蛍光粒子を検出できることが明らかである。【００９０】
［実施例３］
蛍光粒子の濃度と三重項励起状態消光剤が消光作用を有する濃度との関係を調べた。具体的には、蛍光粒子の濃度が１ｐＭの場合と１００ｐＭの場合とにおいて、三重項励起状態消光剤が消光作用を奏する濃度を調べた。
まず、１ｐＭ又は１００ｐＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＫＩが終濃度で０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭとなるように添加した試料溶液を調製した。各試料溶液について、測定時間を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８の濃度が１ｐＭの試料溶液については２０秒間とし、１００ｐＭの試料溶液については２秒間とした以外は実施例１と同様にして走査分子計数法による計測を行い、時系列のフォトンカウントデータを取得し、蛍光粒子の数を計数した。
図１５は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８の濃度が１ｐＭの各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図であり、図１６は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８の濃度が１００ｐＭの各試料溶液のピーク数を計数した結果を示した図である。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８の濃度が１ｐＭの試料溶液と１００ｐＭの試料溶液のいずれにおいても、実施例１（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８の濃度が１０ｐＭの試料溶液の場合）と同様にＫＩを添加することによって、走査分子計数法による計測時のピーク検出能（蛍光粒子の検出能）が向上した。また、いずれもＫＩ濃度が１ｍＭ〜３ｍＭにおいて検出されたピーク数が最大となったことから、ＫＩが消光作用を有する濃度は、蛍光粒子の濃度にさほど影響を受けず、終濃度が０．１ｍＭ〜２０ｍＭとなるように試料溶液中にＫＩを添加することにより、より高感度に蛍光粒子を検出できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明の態様における蛍光粒子の検出方法により、試料溶液中の非常に低濃度にしか存在していない標的粒子の濃度を、走査分子計数法により非常に高感度に検出することができる。そのため、本発明の態様における蛍光粒子の検出方法は、臨床検体等の解析対象物質の濃度が微量である試料の解析や検査等の分野で利用が可能である。
【符号の説明】
【００９２】
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
【図１Ａ】
0006010029.tif 000002
【図１Ｂ】
0006010029.tif 000003
【図１Ｃ】
0006010029.tif 000004
【図２Ａ】
0006010029.tif 000005
【図２Ｂ】
0006010029.tif 000006
【図３Ａ】
0006010029.tif 000007
【図３Ｂ】
0006010029.tif 000008
【図４Ａ】
0006010029.tif 000009
【図４Ｂ】
0006010029.tif 000010
【図５】
0006010029.tif 000011
【図６Ａ】
0006010029.tif 000012
【図６Ｂ】
0006010029.tif 000013
【図７】
0006010029.tif 000014
【図８Ａ】
0006010029.tif 000015
【図８Ｂ】
0006010029.tif 000016
【図９Ａ】
0006010029.tif 000017
【図９Ｂ】
0006010029.tif 000018
【図１０Ａ】
0006010029.tif 000019
【図１０Ｂ】
0006010029.tif 000020
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
0006010029.tif 000022
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
0006010029.tif 000025
【図１５】
0006010029.tif 000026
【図１６】
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