(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｒｄ４を阻害する作用物質を含んでなる、被験体における白血病を治療するための医薬組成物であって、該作用物質が、以下の構造式：
【化１】
0005935030.tif 000060
のいずれか１つで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩である、医薬組成物。
【請求項２】
前記白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、毛様細胞性白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ｂｒｄ４を阻害する作用物質を含んでなる、白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させるための医薬組成物であって、該作用物質が、以下の構造式：
【化２】
0005935030.tif 000061
のいずれか１つで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩である、医薬組成物。
【請求項４】
Ｂｒｄ４を阻害する作用物質を含んでなる、白血病細胞における細胞死または最終分化を誘導するための医薬組成物であって、該作用物質が、以下の構造式：
【化３】
0005935030.tif 000062
のいずれか１つで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩である、医薬組成物。
【請求項５】
細胞が被験体中にある、請求項３または４記載の医薬組成物。
【請求項６】
細胞が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、毛様細胞性白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症または骨髄増殖性障害に由来する、請求項３〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
Ｂｒｄ４を阻害する作用物質を含んでなる、被験体において急性骨髄性白血病を治療するための医薬組成物であって、該作用物質が、以下の構造式：
【化４】
0005935030.tif 000063
のいずれか１つで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩である、医薬組成物。
【請求項８】
被験体が哺乳類である、請求項１、３、４または７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
被験体がヒト患者である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ヒト患者が成人である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ヒト患者が小児である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、被験体中で白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させる、請求項１または７に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１に規定されるＢｒｄ４を阻害する作用物質の治療有効量、および
該作用物質の投与のための指示書
を含んでなる、白血病を治療するためのキット。
【請求項１４】
少なくとも１つの作用物質が、以下の構造式：
【化５】
0005935030.tif 000064
のいずれか１つで表される化合物あるいはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１、３、４または７記載の医薬組成物。
【請求項１５】
該化合物が、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて投与される、請求項１、３〜７、８〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／３３４，９９１号明細書、２０１０年８月４日に出願された米国仮特許出願第６１／３７０，７４５号明細書、２０１０年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／３７５，８６３号明細書、２０１１年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／４６７，３７６号明細書、および２０１１年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／４６７，３４２号明細書の優先権を主張する。これらの特許出願の内容は、その全体を参照によって本明細書に援用する。
【０００２】
連邦により支援された研究開発の下でなされた発明の権利への宣言
この研究は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈ）からの補助金番号Ｋ０８ＣＡ１２８９７２によって支援された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、協調する遺伝的およびエピジェネティックな変化の複雑なパターンが、どのようにして腫瘍形成をもたらすかを理解するための模範例である。この複雑性は標的療法の開発に難題をもたらす一方、多様なＡＭＬ遺伝子突然変異は、類似した中核細胞過程を調節解除する上で、概して機能的に収束する。ＡＭＬの始まりにおける１つの重要事象は、異常に自己再生し、それによって疾患を維持して伝播する白血病幹細胞（ＬＳＣ）を生成する、細胞運命プログラムの破損である。完全には理解されていないもの、この過程は、その遺伝子発現への影響が十分に特徴づけられた調節クロマチン修飾の変化に関連づけられている。したがって、ＡＭＬ１−ＥＴＯおよびＭＬＬ融合タンパク質などのＡＭＬにおける共通の発がん遺伝子は、少なくとも部分的にはエピジェネティックな経路の再プログラミングを通じて、自己複製プログラムを誘導する。いくつかのエピジェネティックな調節因子は、体細胞変異の標的である。エピジェネティックな変化によって誘導される発がん性刺激は、潜在的に可逆的であるため、クロマチン調節因子は、薬剤標的候補として調査されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、白血病および関連障害（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群）を検出して治療するための組成物、方法、およびキットを提供する。
【０００５】
一態様では、本発明は、概して、Ｂｒｄ４を阻害する作用物質（例えば、Ｂｒｄ４、ＪＱ１を標的とする阻害性核酸）またはその誘導体の有効量を対象に投与するステップを伴う、対象において、白血病または関連障害（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群）を治療する方法を提供する。
【０００６】
別の態様では、本発明は、細胞をＢｒｄ４を阻害する作用物質またはその誘導体の有効量に接触させるステップと、それによって白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させるステップを伴う、白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させる方法を提供する。
【０００７】
さらに別の態様では、本発明は、細胞をＢｒｄ４を阻害する作用物質またはその誘導体の有効量に接触させるステップと、それによって白血病細胞中で細胞死または最終分化を誘導するステップを含んでなる、白血病細胞中で細胞死または最終分化を誘導する方法を提供する。
【０００８】
さらに別の態様では、本発明は、Ｂｒｄ４を阻害する作用物質の有効量をそれを必要とする対象に投与するステップと、それによって対象において急性骨髄性白血病を治療するステップを伴う、対象において急性骨髄性白血病を治療する方法を提供する。
【０００９】
さらに別の態様では、本発明は、治療効果のある賦形剤中に、Ｂｒｄ４を阻害する作用物質またはその誘導体の治療的有効量を含有する、医薬組成物を提供する。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、Ｂｒｄ４を阻害する作用物質の治療的有効量と、請求項８に記載の方法で使用される化合物投与のための書面による指示を包含する、白血病を治療するためのキットを提供する。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は白血病細胞をＢｒｄ４阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、細胞中でマクロファージ特異的分化マーカーの発現を検出するステップを伴う、白血病細胞の臨床応答性を検出する方法を提供し、マクロファージ特異的分化マーカーの発現増大は、細胞が作用物質に対して応答性であることを示す。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、対象の白血病細胞をＢｒｄ４阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、細胞中でマクロファージ特異的分化マーカーの発現を検出するステップを伴う、白血病を有すると同定された対象のために、治療計画を選択する方法を提供し、マクロファージ特異的分化マーカーの発現増大は、その作用物質を含む治療計画を対象のために選択すべきであることを示す。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は、白血病細胞をＢｒｄ４阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、細胞中でｍｙｃの発現を検出するステップを含んでなる、白血病細胞の臨床応答性を検出する方法を提供し、ｍｙｃの発現低下は、細胞が作用物質に対して応答性であることを示す。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、白血病細胞をＢｒｄ４阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、ｍｙｃの発現を検出するステップを含んでなる、対象のために治療計画を選択する方法を提供し、ｍｙｃの発現低下は、その作用物質を含む治療計画を対象のために選択すべきことを示す。
【００１５】
本明細書に記述される本発明の上記態様または任意のその他の態様のいずれかの様々な実施形態では、作用物質は、小型化合物（例えば、ＪＱ１またはその誘導体）または阻害性核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンス核酸分子）である。上記態様の別の実施形態では、対象は哺乳類（例えば、ヒト患者）である。別の実施形態では、対象は成体哺乳類（例えば、成人患者）である。別の実施形態では、対象は幼若哺乳類（例えば、小児患者）である。上の態様の別の実施形態では、方法は、対象において、白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させる。上記態様のいずれかの様々な実施形態において、作用物質は本明細書に記載される式Ｉ〜ＸＸＩＩのいずれかのまたは任意のその他の式の化合物である。上記態様の特定の実施形態では、細胞は対象中にある。上記態様の別の実施形態では、白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症または骨髄増殖性障害である。上記態様の別の実施形態では、白血病細胞は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症または骨髄増殖性障害に由来する。別の態様では、本発明は、概して、Ｂｒｄ４を阻害する作用物質（例えば、Ｂｒｄ４、ＪＱ１を標的とする阻害性核酸）またはその誘導体の有効量を対象に投与するステップを含んでなる、対象において、白血病または関連障害（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群）を治療する方法を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、細胞をＢｒｄ４を阻害する作用物質またはその誘導体の有効量に接触させるステップと、それによって白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させるステップを含んでなる、白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させる方法を提供する。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は、細胞をＢｒｄ４を阻害する作用物質またはその誘導体の有効量に接触させるステップと、それによって白血病細胞中で細胞死または最終分化を誘導するステップを含んでなる、白血病細胞中で細胞死または最終分化を誘導する方法を提供する。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明は、Ｂｒｄ４を阻害する作用物質の有効量をそれを必要とする対象に投与するステップと、それによって対象において急性骨髄性白血病を治療するステップを含んでなる、対象において急性骨髄性白血病を治療する方法を提供する。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は、治療効果のある賦形剤中に、Ｂｒｄ４を阻害する作用物質またはその誘導体の治療的有効量を含んでなる、医薬組成物を提供する。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、Ｂｒｄ４を阻害する作用物質の治療的有効量と、請求項８に記載の方法で使用される化合物投与のための書面による指示を含んでなる、白血病を治療するためのキットを提供する。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、白血病細胞をＢｒｄ４阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、細胞中でマクロファージ特異的分化マーカーの発現を検出するステップを含んでなる、白血病細胞の臨床応答性を検出する方法を提供し、マクロファージ特異的分化マーカーの発現増大は、細胞が作用物質に対して応答性であることを示す。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、対象の白血病細胞をＢｒｄ４阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、細胞中でマクロファージ特異的分化マーカーの発現を検出するステップを含んでなる、白血病を有すると同定された対象のために治療計画を選択する方法を提供し、マクロファージ特異的分化マーカーの発現増大は、その作用物質を含む治療計画を対象のために選択すべきであることを示す。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、白血病細胞をＢｒｄ４阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、細胞中でｍｙｃの発現を検出するステップを含んでなる、白血病細胞の臨床応答性を検出する方法を提供し、ｍｙｃの発現低下は、細胞が作用物質に対して応答性であることを示す。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、白血病細胞をＢｒｄ４阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、ｍｙｃの発現を検出するステップを含んでなる、対象のために治療計画を選択する方法を提供し、ｍｙｃの発現低下は、その作用物質を含む治療計画を対象のために選択すべきことを示す。
【００２５】
上記態様のいずれかの、または本明細書に記述されるあらゆるその他の本発明の態様の様々な実施形態において、作用物質は、小型化合物（例えば、ＪＱ１またはその誘導体）または阻害性核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンス核酸分子）である。上記態様の別の実施形態では、対象は哺乳類（例えば、ヒト患者）である。上の態様の別の実施形態では、方法は、対象において、白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させる。上記態様のいずれかの様々な実施形態において、作用物質は、式Ｉ〜ＸＸＩＩのいずれかの、または本明細書に記載される任意のその他の式の化合物である。上記態様の特定の実施形態では、細胞は対象中にある。上記態様の別の実施形態では、白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症または骨髄増殖性障害である。上記態様の別の実施形態では、白血病細胞は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症または骨髄増殖性障害に由来する。
【００２６】
本発明のその他の利点および新規な特徴は、添付図と併せて検討することで、以下の本発明の様々な非限定的実施形態の詳細な説明から明らかになるであろう。本明細書および参照によって援用する文献が、矛盾するおよび／または一貫性のない開示を含む場合は、本明細書が優先するものとする。
【００２７】
本発明によって規定される組成物および物品は、下に提供される実施例との関連で、分離されており、さもなければ製造されている。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明から、および特許請求の範囲から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、Ｂｒｄ４阻害に対して感受性のクロマチン調節因子を示す。図１Ａは、クロマチン修飾に関与する遺伝子分布を示すパイ図表を含み、グラフは、１４日間の培養中における１０７２個の情報提供ｓｈＲＮＡの表現の変化を表す、ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病におけるプールされた負の選択スクリーニングを示す（図１Ｂ）。数字は、各カテゴリー中の遺伝子数を示す。ＢＩＯＰＲＥＤｓｉアルゴリズム（Ｈｕｅｓｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２００５；２３：９９５−１００１）を使用して、各遺伝子につき６つのｓｈＲＮＡをデザインして、ｍｉＲ３０コンテクストに適応させた。大規模オンチップオリゴヌクレオチド合成を使用してライブラリーを構築し、プールＰＣＲクローニングおよび個々のクローンの配列検証がそれに続き、合計１０９５個のｓｈＲＮＡ（遺伝子あたり３〜６個）を得た。図１Ｂは、１４日間の培養における１０７２個の情報提供ｓｈＲＮＡの表現の変化を示す、プロットを含む。ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞に対して、プールされた負の選択スクリーニングを実施し、１４日間のドキシサイクリン投与後の読み取り数（Ｔ１４）をドキシサイクリン投与前の読み取り数（Ｔ０）で除して、ｓｈＲＮＡの存在比を計算した。結果を二連の平均として、昇順でプロットした。完全消耗したｓｈＲＮＡ（Ｔ１４においてゼロの読み取り、ｎ＝７１）を１０−５の比率でプロットした；．このグループ内で強調表示されるｓｈＲＮＡは、アルファベット順に均一間隔で示される。正のスコアのｓｈＲＮＡ（双方の複製中で２０倍を超える消耗がある、ｎ＝１７７）は、濃い灰色で示される。陽性対照は、Ｒｐａ１、Ｒｐａ３、Ｐｃｎａ、またはＰｏｌｒ２ｂを標的にするｓｈＲＮＡを含む。陰性対照ｓｈＲＮＡは、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（Ｒｅｎ）またはＢｒａｆを標的とする。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、Ｔｅｔ−ＯｎコンピテントＡＭＬモデルにおけるＲＮＡｉスクリーニングを示す。図２Ａは、ＲＮＡｉスクリーニングストラテジーを描写する概略図である。スクリーニングは、造血幹および始原細胞（ＨＳＰＣ）に、ｒｔＴＡ３−ＩＲＥＳ−ＭＬＬ−ＡＦ９およびルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＮｒａｓＧ１２Ｄをコードするベクターをレトロウイルス同時形質導入して生成された、Ｔｅｔ−Ｏｎコンピテント急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）モデルで実施した。末期症状のマウスから取得された白血病細胞を培養して、スクリーニングのために使用した。オンチップオリゴヌクレオチド合成を使用して、クロマチン調節遺伝子を標的にする、カスタマイズされたｓｈＲＮＡライブラリーを合成し、プール形式でクローンした。１０９５個の配列検証されたｓｈＲＮＡのライブラリープールをＴＲＭＰＶ−Ｎｅｏにサブクローニングして（Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１；２９：７９−８３）、白血病細胞に形質導入し、Ｇ４１８の選択がそれに続いた。次に細胞をドキシサイクリンで１４日間処理し（１２回の細胞継代に相当）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）がそれに続いて、ｄｓＲｅｄ陽性／ｓｈＲＮＡ発現細胞を単離した。ソートされた（Ｔ１４）、ならびに前処理された（Ｔ０）白血病細胞からゲノムＤＮＡを調製して、ｓｈＲＮＡガイド鎖のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用し、それを大規模シークエンシングにかけてライブラリー中の各ｓｈＲＮＡの相対存在量を定量化した。トップヒットは、スクリーニング中に、少なくとも２つのｓｈＲＮＡが、２０倍を超える消耗を示す遺伝子と定義された。３８個の遺伝子がこれらの基準を満たし、異なるＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ誘導性ＡＭＬ細胞系、および構成的ｓｈＲＮＡ発現ベクター（ＬＭＮ）を使用して、一つずつ検証した。図２Ｂは、薬剤選択（Ｔ０）に続く、プラスミドプールと、ライブラリー形質導入白血病細胞の２つの複製との間のｓｈＲＮＡ毎に正規化した読み取りの相関を図解する、散布図である。相関は、レトロウイルス形質導入および薬剤選択によって、ライブラリー表現がほとんど影響を受けないことを検証する。図２Ｃは、１試験における、Ｔ１４と比較した、Ｔ０のｓｈＲＮＡ毎に正規化した、読み取り散布図である。低い相関は、ｓｈＲＮＡ表現のかなりの変化を示唆する。図２Ｄは、２つの独立した複製中のＴ１４における、ｓｈＲＮＡ毎に正規化した読み取りの相関を図解する、散布図である。高い相関は、ｓｈＲＮＡ存在量の変化が、特異的効果に起因することを示す。ｒ、ピアソン相関係数。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、スクリーニングストラテジーを検証する。図３Ａは、ＲＮＡｉスクリーニング検証ストラテジーを描写する、概略図である。一次プールスクリーニングにおいて正にスコア付けされる各遺伝子（基準：２つの独立した複製中で、少なくとも２つのｓｈＲＮＡが２０倍を超えて消耗する）を一つずつ検証した。その遺伝子を標的とするようデザインされたｓｈＲＮＡを、構成的ＬＴＲプロモーター制御下でｍｉＲ３０−ｓｈＲＮＡを発現し、ＧＦＰおよびＮｅｏＲレポーターを特徴とする、ＬＭＮベクターにサブクローニングした。独立に由来するＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞系に、ＬＭＮ−ｓｈＲＮＡを平均感染効率２０％で形質導入した。フローサイトメトリーによってＧＦＰ％の相対変化を１０日間にわたりモニターし、細胞成長阻害の読み取りとして使用して、消耗倍数［ＧＦＰ％（ｄ１２）で除したＧＦＰ％（ｄ２）］としてプロットした。図３Ｂは、一次スクリーニングにおける３８個の同定されたヒットを標的にする、全ＬＭＮ−ｓｈＲＮＡの消耗倍数を示す、棒グラフである。一次スクリーニングにおける３８個の同定されたヒットを標的にする、全ＬＭＮ−ｓｈＲＮＡの消耗倍数。いくつかの遺伝子は検証できず、これは（ｉ）一次スクリーニングにおける真の偽陽性、（ｉｉ）独立した白血病系中の変動する効果、または（ｉｉｉ）ｓｈＲＮＡ発現系間の差異に起因するかもしれない。最大消耗（２５倍）を呈する同定されたｓｈＲＮＡの総数に基づいて、スクリーニングにおけるトップヒットとしてＢｒｄ４を同定した。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｅは、白血病、ＭＥＦ、およびＧ１Ｅ細胞における、Ｂｒｄ４−ｓｈＲＮＡ効果の比較を示す。示される実験のそれぞれで、ＴｔＴＭＰＶベクター内のドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡをＴｅｔ−Ｏｎコンピテント細胞に形質導入し、Ｇ４１８選択がそれに続いた。図４Ａは、４８時間のｄｏｘ処理に続く、Ｂｒｄ４  ｍＲＮＡレベルのＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示すチャートを含む。（ｎ＝４）。図４Ｂは、競合増殖アッセイからの結果を示す、チャートを含む。選択された細胞を非形質導入細胞と８：１の比率で混合し、引き続いてドキシサイクリンと共に培養した。Ｖｅｎｕｓ陽性／ＴｕｒｂｏＲＦＰ陽性（すなわちｓｈＲＮＡ発現）細胞の相対百分率を示される時点で求め、変化を使用して成長阻害効果を読み取った（ｎ＝３）。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【図４−２】図４Ｃは、５日間のドキシサイクリン投与に続いて、図４Ｂでアッセイされた細胞の細胞周期分析（ＢｒｄＵ／７−ＡＡＤ二重染色）からのフローサイトメトリープロットを含む。図４Ｄは、５日間のドキシサイクリン投与に続いて、図４Ａでアッセイされた細胞のアネキシンＶ／ＤＡＰＩ二重染色を使用したアポトーシス測定を示す、プロットを含む。ゲーティングを最初に生細胞（ＦＳＣ／ＳＳＣ）に施し、それに続いてＲＦＰ＋／ｓｈＲＮＡ＋細胞をゲーティングした。これが、蓄積した死（アネキシンＶ＋／ＤＡＰＩ＋）細胞が欠如している理由である。
【図４−３】図４Ｅは、図３Ａに描写されるように、Ｇ１Ｅ中で実施されたＬＭＮ−ｓｈＲＮＡのＧＦＰ消耗の程度を示す、チャートを含む。（ｎ＝３）。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｄは、ＢＲＤ４のｓｈＲＮＡノックダウンが、ヒトＡＭＬ細胞系ＴＨＰ−１およびＭＯＬＭ−１３の成長を阻害するのに十分であることを示す。ヒトＢＲＤ４を標的にするｓｈＲＮＡをＴＲＭＰＶ−Ｎｅｏベクターにクローンし、Ｅｃｏ−受容体＋／Ｔｅｔ−ＯｎコンピテントヒトＡＭＬ細胞系ＴＨＰ−１およびＭＯＬＭ−１３のレトロウイルス形質導入がそれに続いた細胞は、Ｇ４１８で１週間にわたり選択された。図５Ａは、条件的ＲＮＡｉ抑制時のＢＲＤ４のノックダウン効率を示す、グラフを含む。ＴＲＭＰＶ−ＭＯＬＭ−１３系に対して、４８時間のｄｏｘ処理に続いてＲＴ−ｑＰＣＲを実施した（ｎ＝３）。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。図５Ｂは、ＭＯＬＭ−１３およびＴＨＰ−１の競合増殖アッセイからの結果を示す、グラフを含む。
【図５−２】図５Ｃは、ＭＯＬＭ−１３およびＴＨＰ−１の競合増殖アッセイからの結果を示す、グラフを含む。選択された細胞を非形質転換細胞と混合した、引き続いてｄｏｘ上で培養した。ｄｓＲｅｄ＋／ｓｈＲＮＡ＋細胞の相対的百分率を示される時点で求め、変化を使用して成長阻害効果を測定した。結果は、２つの独立した実験の平均である。全ての結果は、対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲｅｎ．７１３）に対して正規化した。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。図５Ｄは、５日間のｄｏｘ処理後の図５Ｂおよび５Ｃからの細胞の細胞周期分析（ＢｒｄＵ／ＤＡＰＩ二重染色）からのフローサイトメトリーを含む。事象は、ｄｓＲｅｄ＋／ｓｈＲＮＡ＋細胞上でゲートした。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｅは、ＡＭＬ成長が、Ｂｒｄ４阻害に対して感受性であることを示す。図６Ａは、（上側パネル）示されるＴｔＴＭＰＶ−ｓｈＲＮＡで形質導入されドキシサイクリンで５日間誘導された、マウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）培養物から調製された、ホールセル溶解産物の代表的ウエスタンブロットを含む。図６Ａは、（下側パネル）ＬＭＮ−ｓｈＲＮＡによるＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病培養物の形質導入に続く、ＧＦＰ％の相対的変化を呈示する。
【図６−２】図６Ｂ〜６Ｅは、ＪＱ１での処置時のマウス（図６Ｂおよび６Ｄ）およびヒト（図６Ｃおよび６Ｅ）細胞における、細胞増殖阻害を示す。図６Ｂおよび６Ｃは、ＪＱ１処理細胞の増殖率を示す、グラフを含む。曲線は、３日間の培養後に、生存細胞数増大を測定し、データを対数増殖曲線に適合させて作成された。１と設定された対照細胞増殖速度と比較して、結果をプロットした（ｎ＝３）。１と設定されたビヒクル／ＤＭＳＯ処理細胞の増殖速度に対して、結果を正規化した。（ｎ＝３）。ＣＭＬ−ＢＣという用語は、慢性骨髄性白血病急性転化を示す。Ｔ−ＡＬＬという用語は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病を示す。図６Ｄおよび６Ｅは、示される濃度で４８時間のＪＱ１処理後に定量化したＳ相（ＢｒｄＵ陽性）百分率を示す、チャートを含む（ｎ＝３）。ＢｒｄＵは、示される全ての実験で３０分間パルスした。全ての誤差棒は、ｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【図６−３】図６Ｂ〜６Ｅは、ＪＱ１での処置時のマウス（図６Ｂおよび６Ｄ）およびヒト（図６Ｃおよび６Ｅ）細胞における、細胞増殖阻害を示す。図６Ｂおよび６Ｃは、ＪＱ１処理細胞の増殖率を示す、グラフを含む。曲線は、３日間の培養後に、生存細胞数増大を測定し、データを対数増殖曲線に適合させて作成された。１と設定された対照細胞増殖速度と比較して、結果をプロットした（ｎ＝３）。１と設定されたビヒクル／ＤＭＳＯ処理細胞の増殖速度に対して、結果を正規化した。（ｎ＝３）。ＣＭＬ−ＢＣという用語は、慢性骨髄性白血病急性転化を示す。Ｔ−ＡＬＬという用語は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病を示す。図６Ｄおよび６Ｅは、示される濃度で４８時間のＪＱ１処理後に定量化したＳ相（ＢｒｄＵ陽性）百分率を示す、チャートを含む（ｎ＝３）。ＢｒｄＵは、示される全ての実験で３０分間パルスした。全ての誤差棒は、ｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【図７−１】図７Ａおよび７Ｂは、ＪＱ１が、多様なヒト白血病細胞系において、幅広い抗白血病活性を呈示することを示す。図７Ａおよび７Ｂは、ＪＱ１処理細胞系の増殖速度を示す、グラフを含む。曲線は、３日間の培養後に、生存細胞数増大を測定し、データを対数増殖曲線に適合させて作成された。１と設定された対照（ＤＭＳＯ処理）細胞の増殖速度と比較して、結果をプロットした。（ｎ＝３）。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。ヒト骨髄性白血病細胞系の大部分は、ＩＣ５０＜５００ｎＭを呈示する。
【図７−２】図７Ａおよび７Ｂは、ＪＱ１が、多様なヒト白血病細胞系において、幅広い抗白血病活性を呈示することを示す。図７Ａおよび７Ｂは、ＪＱ１処理細胞系の増殖速度を示す、グラフを含む。曲線は、３日間の培養後に、生存細胞数増大を測定し、データを対数増殖曲線に適合させて作成された。１と設定された対照（ＤＭＳＯ処理）細胞の増殖速度と比較して、結果をプロットした。（ｎ＝３）。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。ヒト骨髄性白血病細胞系の大部分は、ＩＣ５０＜５００ｎＭを呈示する。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｄは、患者由来成人ＡＭＬサンプルのＪＱ１感受性を示す。図８Ａは、ＡＭＬ標本分析に関する臨床および病理学的情報の表を含む。図８Ｂは、増殖（３Ｈ−チミジン取り込み）、アポトーシス（ギムザ染色）、および細胞成熟（ライト・ギムザ染色）に対するＪＱ１の影響を要約する、表を含む。増殖アッセイは、図７で用いたものとは異なるので、ＨＬ−６０およびＭＯＬＭ−１３系を含めて、ＩＣ５０測定が他の知見と一致することを確実にした。
【図８−２】図８Ｃは、サイトカイン存在下における、ＪＱ１処理ＡＭＬ標本の増殖曲線を示す、グラフを含む。（ｎ＝３）。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。図８Ｄは、マクロファージ分化の形態学的特徴を実証する、ＡＭＬサンプル＃４のライト・ギムザサイトスピンの画像を含む。
【図９−１】図９Ａ〜９Ｃは、患者由来小児白血病サンプルのＪＱ１感受性を示す。図９Ａは、ＪＱ１実験からの患者白血病サンプル情報および感受性データを要約する、表を含む。ＭＶ４−１１細胞系を対照として含め、ＷＳＴ１アッセイによる増殖測定が、図７で示される結果と比較できることを確実にした。サンプルをＪＱ１で７２時間処理し、ＷＳＴ−１試薬による分析、またはアネキシンＶ染色による分析がそれに続いた。２５０ｎＭのＪＱ１で４８時間処理された標本に、サイトスピンのライト・ギムザ染色を実施した。図９Ｂは、増殖曲線を示す、グラフを含む。ＤＭＳＯ処理された対照細胞に対して、結果を正規化した。（ｎ＝３）。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【図９−２】図９Ｃは、リンパ球分化の特徴を実証する、サンプルＰＥＤ０２５のライト・ギムザサイトスピン画像を含む。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、ＪＱ１処理が、白血病細胞のアポトーシスをもたらすことを示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、マウス細胞（図１０Ａ）およびヒト細胞（図１０Ｂ）の細胞死定量化を示す、グラフを含む。細胞を２５０ｎＭのＪＱ１で４８時間処理し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による染色がそれに続いた。ＰＩ染色陽性の細胞をＦＡＣＳによって定量化した；ｎ＝３。全ての誤差棒は、ｓ．ｅ．ｍ．に相当する。図１０Ｃは、ＪＱ１で４８時間処理されたＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞のアポトーシス測定を示す、プロットを含む。（ｎ＝３）。代表的実験からの結果を示す。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｆは、ドキシサイクリンのｓｈＲＮＡ発現誘導時に、クローンＴＲＭＰＶ−Ｎｅｏ白血病系が頑強な疾患抑制を呈示することを示す。ＴＲＭＰＶ−Ｎｅｏクローンは、限界段階希釈法を行って作成した。図１１Ａは、生体内ＲＮＡｉおよびＪＱ１実験を描写する、概略図を含む。ＴＲＭＰＶ−Ｎｅｏ−ｓｈＲＮＡでＴｅｔ−Ｏｎコンピテント白血病細胞を形質導入し、Ｇ４１８選択がそれに続き、引き続いて亜致死的照射受容マウスに移植した。疾患発生時に（典型的に５または６日後に生物発光イメージングを使用して判定した）、飲料水および飼料へのドキシサイクリン補給によって、ｓｈＲＮＡ発現を誘導した。次に生物発光イメージング、全生存、およびｄｓＲｅｄ陽性細胞定量化を使用して、動物の疾病負荷を評価した。図１１Ｂは、ドキシサイクリン処理白血病クローンのＦＡＣＳプロットを含む。結果は、これらの細胞集団中の高いＶｅｎｕｓ＋／ｄｓＲｅｄ＋細胞百分率を実証した。同定されたクローンは＞９９．９％陽性であったが、ＴＲＭＰＶ−Ｎｅｏプールは典型的に約８５％Ｖｅｎｕｓ＋／ｄｓＲｅｄ＋であった（図１２参照）。図１１Ｃは、白血病負荷の生物発光画像を含む。疾患発生に続いて、ドキシサイクリンを投与した（移植の５〜６日後）。
【図１１−２】図１１Ｄは、ｄｏｘ処理に続く生物発光イメージング応答の定量化を示す、グラフを含む。各処理アーム中のマウス数が示され、誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。図１１Ｅは、示されるＴＲＭＰＶ−ｓｈＲＮＡ白血病クローンを移植された受容マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す、グラフを含む。ｄｏｘ処理の間隔は、矢印で示される。クローンｓｈＢｒｄ４疾患の全体的延命効果が９〜１０日間であったのに対し、非クローンプール生存期間中央値は４日間であった。図１１Ｆは、末期症状ｄｏｘ処理マウス中のドナー由来（ＣＤ４５．２＋）骨髄細胞のフローサイトメトリープロットを含む。示されるゲートは、ｄｓＲｅｄ＋／ｓｈＲＮＡ＋細胞を含む。
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｉは、生体内の白血病進行にＢｒｄ４が必要であることを示す。図１２Ａは、疾患発生時、すなわち移植６日後のドキシサイクリン投与マウスの生物発光画像を含む。０日目は、ドキシサイクリン投与の初日である。図１２Ｂは、ドキシサイクリン投与に続く生物発光イメージング応答の定量化を示す、グラフを含む。４匹の複製マウスの平均値が示される。
【図１２−２】図１２Ｃは、示されるＴＲＭＰＶ−ｓｈＲＮＡ白血病細胞系を移植された、受容マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す、グラフを含む。ドキシサイクリンの投与期間は、矢印で示される。ログランク検定を使用し、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）（ｓｈＲｅｎ）を標的とするｓｈＲＮＡと比較して、統計的有意性を計算した；＊ｐ＝０．０００１、＊＊ｐ＜０．０００１。図１２Ｄは、末期症状ドキシサイクリン投与マウス中のドナー由来（ＣＤ４５．２陽性）骨髄細胞のフローサイトメトリーを含む。示されるゲートは、ｄｓＲｅｄ陽性／ｓｈＲＮＡ陽性細胞を含む。
【図１２−３】図１２Ｅは、ＣＤ４５．２陽性末期白血病負荷における、ｄｓＲｅｄ陽性／ｓｈＲＮＡ陽性百分率の定量化を示す、グラフを含む。図１２Ｆは、ＪＱ１（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）またはＤＭＳＯキャリアで処理されたＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病受容マウスの生物発光画像を含む。図１２Ｇは、ＪＱ１処理に対する生物発光イメージング応答定量化を示す、グラフを含む。６匹のＤＭＳＯ処理、および７匹のＪＱ１処理マウスの平均値が示される。ｐ値は、両側スチューデント対応ｔ検定を使用して計算した。
【図１２−４】図１２Ｈは、対照およびＪＱ１処理マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す、グラフを含む。統計的有意性は、ログランク検定を使用して計算した。１２Ｆ、１２Ｇ、および１２Ｈでは、５０，０００個の白血病細胞の移植に続いて、１日目にＪＱ１処理を開始した。図１２Ｉは、確立した疾患における、ＪＱ１処理に対する生物発光イメージング応答定量化を示す、グラフを含む。マウスに５００，０００個の白血病細胞を移植し、それに続いて疾患が最初に造影できた移植６日後に、処理を開始した。６匹のＤＭＳＯ処理、および７匹のＪＱ１処理マウスの平均値が示される。ｐ値は、両側スチューデント対応ｔ検定を使用して計算した。示される全ての誤差棒は、ｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｅは、確立されたＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病において、１００ｍｇ／ｋｇ／ｄおよび５０ｍｇ／ｋｇ／ｄのＪＱ１処理が、単一作用物質活性を呈示することを示す。図１３Ａは、１００ｍｇ／ｋｇ／ｄのＪＱ１で処理された白血病マウスの生物発光画像を含む。マウスに百万個の白血病細胞を移植し、それに続いて４日目に（疾患がイメージングで見えるようになったら）処理を開始した。図１３Ｂは、生物発光画像の定量化を示す、グラフを含む。（各群でｎ＝８）。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。図１３Ｃは、対照およびＪＱ１処理マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す、グラフを含む。処理は、（横線によって示される）移植の４日後に開始した。統計的有意性は、ログランク検定を使用して計算した。
【図１３−２】図１３Ｄは、５０ｍｇ／ｋｇ／ｄのＪＱ１で処理された白血病マウスの生物発光画像を含む。マウスに５００，０００個の白血病細胞を移植し、それに続いて６日目に（疾患がイメージングで見えるようになったら）処理を開始した。定量化を図１２Ｉに示す。図１３Ｅは、図１３Ｄで示される対照およびＪＱ１処理マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す、グラフを含む。処理は、（横線によって示される）移植の６日後に開始した。統計的有意性は、ログランク検定を使用して計算した。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、ＪＱ１が、ＡＭＬ１−ＥＴＯ９ａ／ＮｒａｓＧ１２Ｄ／ｐ５３−／−ＡＭＬマウスモデルにおいて、単一作用物質抗白血病活性を呈示することを示す。図１４Ａは、実験的ストラテジーを示す概略図である。ＡＭＬ１−ＥＴＯ９ａおよびルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ＮｒａｓＧ１２Ｄコンストラクトでｐ５３−／−ＨＳＰＣを同時形質導入し、亜致死的照射受容マウスへの細胞移植がそれに続いた。先に記載されているように、高浸透度ではマウスはＡＭＬによって死亡した（Ｄｉｃｋ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２：４７９３−８０７）。瀕死マウスに由来する脾臓白血病材料を二次受容動物に移植した。生物発光イメージングによって確認された５日間の疾患発生に続いて、５０ｍｇ／ｋｇ／ｄのＪＱ１処理を開始した。図１４Ｂは、示される時点における白血病マウスの生物発光画像を含む。図１４Ｃは、ＪＱ１処理に対する生物発光イメージング応答定量化を示す、グラフを含む。各処理群の８匹のマウスの平均値が示され、誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当し、ｐ値は両側スチューデント対応ｔ検定を使用して計算した。
【図１５】末梢造血細胞カウントに対するＪＱ１処理の効果を示すグラフを含む。健康なＣ５７Ｂｌ／６マウスをどちらも腹腔内注射によって２０日間にわたり投与される、ＪＱ１（５０または１００ｍｇ／ｋｇ／ｄ）またはＤＭＳＯキャリア（４００μｌ／ｄ）のどちらかで処理した。顎下出血により末梢血を採取し、Ｈｅｍａｖｅｔ  ９５０分析器（Ｄｒｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分析した。値は、３匹の複製マウスの平均値に相当する；誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図１６】２０日間のＪＱ１投与が、正常な骨髄造血にわずかな影響しか及ぼさないことを示す、細胞染色を含む。骨髄分析に先だって、健康なＣ５７ＢＬ／６マウスを２０日間にわたり、毎日５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのＪＱ１の腹腔内注射で処理した。ビヒクルまたはＪＱ１で処理されたマウスからの胸骨骨髄のＨ＆Ｅ染色組織病理学は、正常な細胞充実性および正常な混合造血を示した。各処理群あたりｎ＝３〜５匹のマウス。代表的画像が示される。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、毎日のＪＱ１投与が、正常な造血に対してわずかな影響しか及ぼさないことを示す。骨髄ＦＡＣＳ分析に先だって、健康なＣ５７ＢＬ／６マウスを２０日間にわたり、毎日５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのＪＱ１の注射で処理した。図１７Ａは、Ｌｉｎ−、ｃｋｉｔ＋細胞（ＬＫ前駆細胞）およびＬｉｎ−Ｓｃａ１＋ｃｋｉｔ＋（ＬＳＫ幹細胞）百分率を判別して定量化するのに使用されるゲーティングを実証する、骨髄細胞の代表的ＦＡＣＳプロットを含む。図１７Ｂは、示される抗体の全骨髄細胞染色の百分率を示す、グラフを含む。（ｎ＝３）。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図１８−１】図１８Ａ〜１８Ｉは、Ｂｒｄ４の阻害が、骨髄分化と白血病幹細胞の消耗をもたらすことを示す。図１８Ａおよび１８Ｂは、２日間のｄｏｘ誘導性ｓｈＲＮＡ発現または２日間の１００ｎＭのＪＱ１処理に続いて、メイ・グリュンワルド／ギムザ染色したＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞の光学顕微鏡画像を含む。ｓｈＲＮＡ発現は、ＴＲＭＰＶ形質導入白血病細胞中で誘導された。イメージングは、４０Ｘ対物レンズで実施した。図１８Ｃは、４日間のｓｈＲＮＡ発現後のまたは２日間の１００ｎＭのＪＱ１処理に続く、Ｍａｃ−１およびｃ−ｋｉｔ表面発現のＦＡＣＳプロットを含む。
【図１８−２】図１８Ｄは、４日間のｓｈＲＮＡ発現後のまたは２日間の１００ｎＭのＪＱ１処理に続く、Ｍａｃ−１およびｃ−ｋｉｔ表面発現のＦＡＣＳプロットを含む。図１８Ｅ〜１８Ｈは、Ｂｒｄ４阻害時のマクロファージおよびＬＳＣ遺伝子シグネチャーの変化を評価する、遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）プロットを含む。図１８Ｅおよび１８Ｇは、ｄｏｘ誘導の２日後に、ソートされたｄｓＲｅｄ＋／ｓｈＲＮＡ＋細胞から得られた（Ｒｅｎ対３種の異なるＢｒｄ４  ｓｈＲＮＡ）発現アレイのためのＲＮＡである。図１８Ｆは、ＤＭＳＯまたは１００ｎＭのＪＱ１で２日間処理された白血病細胞から得られたマイクロアレイデータである。
【図１８−３】図１８Ｈは、ＤＭＳＯまたは１００ｎＭのＪＱ１で２日間処理された白血病細胞から得られたマイクロアレイデータである。ＮＥＳ＝正規化濃縮スコア。ＦＤＲ  ｑ−ｖａｌ＝誤検出率ｑ値、これは所与のＮＥＳがある遺伝子セットが擬陽性検出を表す確率である。
【図１８−４】図１８Ｉは、ＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示すグラフを含む。２日間のｄｏｘ誘導ｓｈＲＮＡ発現または２日間の１００ｎＭのＪＱ１処理に続いてＲＴ−ｑＰＣＲを実施し、マクロファージ機能に関与する遺伝子を解析した。ＴＲＭＰＶベクターを使用して、ｓｈＲＮＡ発現を誘導した。ｓｈＲＮＡ実験では、ｄｓＲｅｄ＋／ｓｈＲＮＡ＋細胞をＦＡＣＳソートしてＲＮＡを調製した。示されるＢｒｄ４  ｓｈＲＮＡデータは、Ｂｒｄ４．５５２、１４４８、および２０９７  ｓｈＲＮＡサンプルの平均である。対照サンプルを１と設定して、シグナルをＧＡＰＤＨに対して正規化した。（ｎ＝３）。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図１９】ＪＱ１が、ＴＨＰ−１ヒトＡＭＬ細胞において、マウスＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２ＤＡＭＬモデルで見られたのと同様のパターンの遺伝子発現変化を引き起こすことを示す、ＧＳＥＡプロットを含む。ＴＨＰ−１細胞は、ＲＮＡの収集４８時間前に２５０ｎＭのＪＱ１で処理した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒト遺伝子ＳＴ  １．０アレイを使用して、発現アレイを実施した。Ｂｒｄ４阻害時のマクロファージ、ＬＳＣ、およびＭｙｃ遺伝子シグネチャーの変化を評価するために実施されたＧＳＥＡを示す。
【図２０−１】図２０Ａ〜２０Ｈは、ＪＱ１が白血病細胞中でＭｙｃ経路を抑制することを示す。図２０Ａおよび２０Ｂは、ＪＱ１処理の４８時間後における、マウス（図２０Ａ）またはヒト（図２０Ｂ）細胞中の相対的Ｍｙｃ  ＲＮＡレベルのＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示す、グラフを含む。未処理細胞のＲＮＡレベルを１と設定し、結果をＧＡＰＤＨに対して正規化した（ｎ＝３）。
【図２０−２】図２０Ｃは、ＤＭＳＯまたは２５０ｎＭのＪＱ１で４８時間処理されたＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞から調製された、ホールセル溶解産物のウエスタンブロットを含む。図２０Ｄは、ＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示す、グラフを含む。２５０ｎＭのＪＱ１によるＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞の処理に続いて、示される時点でＲＴ−ｑＰＣＲを実施した。未処理細胞のｍＲＮＡレベルを１と設定し、結果をＧＡＰＤＨに対して正規化した（ｎ＝３）。図２０Ｅは、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲの結果を示す、グラフを含む。ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞中で、示される抗体およびプライマー位置においてＣｈＩＰ−ｑＰＣＲを実施した（ＤＭＳＯではｎ＝６；ＪＱ１処理ではｎ＝４）。ＴＳＳ＝転写開始部位。
【図２０−３】図２０Ｆは、空ベクターまたはＭｙｃ  ｃＤＮＡ含有ＭＳＣＶレトロウィルスで形質導入されたＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞から調製された、ホールセル溶解産物のウエスタンブロットを含む。細胞は、ＤＭＳＯまたは２５０ｎＭのＪＱ１で４８時間処理した。図２０Ｇは、空の対照ベクターまたはＭｙｃ−ｃＤＮＡで形質導入されたＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞中における、３０分間のパルス後のＢｒｄＵ組み込みの定量化を示すグラフを含む。細胞をＪＱ１によって、示される濃度で５日間処理した。（ｎ＝３）。図２０Ｈは、空ベクターで形質導入された、またはＭｙｃ  ｃＤＮＡを含有する、メイ・グリュンワルド／ギムザ染色されたＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞の光学顕微鏡画像を含む。細胞は、５０ｎＭのＪＱ１で５日間処理した。４０倍の対物レンズで撮影された代表的画像を示す。示される全ての誤差棒は、ｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【図２１−１】図２１Ａ〜２１Ｄは、ｓｈＲＮＡを介したＢｒｄ４ノックダウンが、Ｍｙｃレベルの下方制御、およびＭｙｃ標的遺伝子発現の下方制御をもたらすことを示す。図２１Ａおよび２１Ｂは、示されるＴｔＴＭＰＶ−ｓｈＲＮＡコンストラクトで形質導入された、ソートされたＴｕｒｂｏＲＦＰ＋（ｓｈＲＮＡ発現）白血病細胞から調製された、Ｂｒｄ４（図２１Ａ）およびＭｙｃ（図２１Ｂ）ｍＲＮＡレベルのＲＴ−ｑＰＣＲ分析の結果を示す、グラフを含む。細胞は、ｄｏｘで３日間処理した。結果をＧＡＰＤＨに対して正規化した。図２１Ｃは、Ｂｒｄ４−ｓｈＲＮＡ発現細胞から調製された抽出物のウエスタンブロットを含む。ＴＲＭＰＶで形質導入された、ＭＬＬ−ＡＦ９／Ｎｒａｓ白血病クローンを使用した。細胞は、ｄｏｘで３日間処理した。
【図２１−２】図２１Ｄは、Ｍｙｃ下流標的遺伝子発現の変化を評価する、ＧＳＥＡプロットを含む。マイクロアレイデータは、図２１Ａに記載されるＲＮＡサンプルから得られた。Ｍｙｃ標的遺伝子セットについては、先に記載されている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１０；１４３：３１３−２４；およびＳｃｈｕｈｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００１；２９：３９７−４０６）。
【図２２】ＪＱ１がＭｙｃ標的遺伝子発現の下方制御を引き起こすことを示す。図２２は、Ｍｙｃ下流における遺伝子シグネチャーのＪＱ１誘導性変更を評価する、ＧＳＥＡプロットを含む。マイクロアレイデータは、ＤＭＳＯまたは１００ｎＭＪＱ１で４８時間処理されたＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞から得られた。
【図２３】図２３Ａおよび２３Ｂは、４８時間のＪＱ１処理が、白血病細胞中でＭｙｃの発現を選択的に抑制することを示す。図２３Ａおよび２３Ｂは、ＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示すグラフを含む。ＲＴ−ｑＰＣＲを実施して、マウス（図２３Ａ）またはヒト（図２３Ｂ）細胞系におけるＭｙｃ  ＲＮＡのレベルを判定した。未処理細胞のＲＮＡレベルを１と設定し、結果をＧＡＰＤＨに対して正規化した（ｎ＝３）。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図２４−１】図２４Ａ〜２４Ｄは、ＪＱ１に対する白血病細胞の感受性に対する、レトロウイルスＭｙｃ過剰発現の影響を示す。図２４Ａは、Ｍｙｃ過剰発現のために使用される、レトロウイルスベクターの概略図を含む。図２４Ｂは、ＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示す、グラフを含む。Ｍｙｃまたは空ベクター対照を過剰発現する白血病細胞を５日間ＪＱ１処理してＲＴ−ｑＰＣＲを実施し、マクロファージ関連遺伝子を評価した。ｎ＝３。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。図２４Ｃは、５０ｎＭのＪＱ１またはＤＭＳＯキャリア対照の存在下における、対照およびＭｙｃ形質導入ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞中の累積細胞数を示す、グラフを含む。
【図２４−２】図２４Ｄは、４日目における、ＪＱ１処理細胞の細胞死定量化を示す、グラフを含む。ＰＩ＋細胞は、ＦＡＣＳによって定量化した（ｎ＝３）。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【図２５−１】図２５Ａ〜２５Ｄは、Ｍｙｃの過剰発現が、Ｂｒｄ４  ｓｈＲＮＡ誘導性細胞周期停止およびマクロファージ分化を妨げることを示す。図２５Ａは、ＴｔＴＭＰＶ条件的ｓｈＲＮＡベクターと一緒に、ＭＳＣＶ−Ｍｙｃまたは空ベクターで同時形質導入され、引き続いてピューロマイシンおよびＧ４１８によって選択された、ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病培養の細胞周期分析（ＢｒｄＵ／ＤＡＰＩ二重染色）を示す、代表的フローサイトメトリープロットを含む。細胞をｄｏｘで３日間処理して、ｓｈＲＮＡ発現を誘導した。事象は、ｄｓＲｅｄ＋／ｓｈＲＮＡ＋細胞上でゲートした。図２５Ｂは、ｓｈＲＮＡ＋／ｄｓＲｅｄ＋集団中へのＢｒｄＵ組み込みの定量化を示す、グラフを含む。ｎ＝３。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。図２５Ｃは、メイ・グリュンワルド／ギムザ染色されたＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞の光学顕微鏡画像を含む。Ｄｏｘ処理は、２日間にわたり投与された。画像は、４０倍の対物レンズで撮影した。
【図２５−２】図２４Ｄは、ＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示す、グラフを含む。ＭＳＣＶ−Ｍｙｃまたは空のＭＳＣＶベクターで形質導入されたＴｅｔ−Ｏｎコンピテント白血病細胞における、ｄｏｘ誘導性Ｂｒｄ４−ｓｈＲＮＡ発現の２．５日後にＲＴ−ｑＰＣＲを実施して、マクロファージ関連遺伝子を評価した。ｓｈＲＮＡは、ＴｔＴＭＰＶベクターを使用して発現された。ｎ＝３。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【図２６−１】図２６Ａ〜２６Ｃは、ＪＱ１誘導性遺伝子発現変化の大部分が、Ｍｙｃ阻害の二次効果であることを示す。ＭＳＣＶ−Ｍｙｃまたは空ベクター対照で形質導入されたＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞を１００ｎＭのＪＱ１で４８時間処理し、それに続いて発現マイクロアレイ分析のためにＲＮＡを収集した。図２６Ａは、ＪＱ１処理に続いて、それらが空ベクター対照白血病細胞中で２倍の上方制御（左）または下方制御（右）をするかどうかに基づいて選択された、ｍＲＮＡをコードする遺伝子の相対存在量の列正規化したヒートマップ表現を含む。ここで使用されるＭｙｃ過剰発現の控えめなレベルは、ＪＱ１処理に先だつ遺伝子発現に影響を及ぼす。
【図２６−２】図２６Ｂは、示される遺伝子セットの遺伝子発現変化に対する、Ｍｙｃ過剰発現の影響を実証する、ヒートマップ表現を含む。図２６Ａおよび２６Ｂのカラースケールは、列正規化発現値を示す。
【図２６−３】図２６Ｃは、Ｍｙｃ発現との関係性に基づく、ＪＱ１誘導性遺伝子発現変化の分類を示す、チャートを含む。対照細胞のＪＱ１処理に続いて発現が２倍変化する遺伝子は、ＭＳＣＶ−Ｍｙｃで形質導入された白血病細胞中の発現において、それらがなおも２倍変化できればＭｙｃ非依存性に分類された。遺伝子は、ＪＱ１処理ＭＳＣＶ−Ｍｙｃ細胞中の発現において、それらが２倍変化できなければＭｙｃ依存性に分類された。
【図２７−１】図２７Ａ〜２７Ｄは、ＭｙｃのｓｈＲＮＡノックダウンが、ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病成長を阻害し、最終骨髄分化を引き起こすことを示す。図２７Ａは、ＬＭＮ−ｓｈＲＮＡをＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞系に形質導入した際の細胞成長阻害を示す、グラフを含む。フローサイトメトリーによってＧＦＰ％の相対変化を６日間モニターし、細胞成長阻害の尺度として使用した。図２７Ｂは、感染４日後における、ＬＭＮ形質導入白血病細胞のｃ−ｋｉｔおよびＭａｃ−１表面発現を示す、ＦＡＣＳプロットを含む。全事象は、ＧＦＰ＋／ｓｈＲＮＡ＋細胞上でゲートした。
【図２７−２】図２７Ｃは、２日間のドキシサイクリン誘導性ＴＲＭＰＶ−ｓｈＲＮＡ発現に続いて、メイ・グリュンワルド／ギムザ染色した、クローンＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞の光学顕微鏡画像を含む。図２８Ｄは、ＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示す、グラフを含む。２日間のｄｏｘ誘導性ｓｈＲＮＡ発現に続いて、ＲＴ−ｑＰＣＲを実施し、マクロファージ機能に関与する遺伝子を分析した。ＴＲＭＰＶベクターを使用して、ｓｈＲＮＡ発現を誘導した。対照サンプルを１と設定し、シグナルをＧＡＰＤＨに対して正規化した。（ｎ＝３）。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【図２８】図２８Ａおよび２８Ｂは、Ｂｒｄ４が、その他の細胞型と比較して、ＡＭＬ中では必ずしも一貫して過剰発現されないことを示す。図２８Ａおよび２８Ｂは、ＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示す、グラフを含む。示されるマウス（図２８Ａ）またはヒト（図２８Ｂ）細胞系において、ＲＴ−ｑＰＣＲを実施した。結果をＧＡＰＤＨに対して正規化した。ｎ＝３。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【図２９】図２９Ａおよび２９Ｂは、マウスにおける（＋）−ＪＱ１の薬物動態学的研究からの結果を示す。図２９Ａは、薬物動態学的データおよび測定パラメータの表を含む。提示される事前指定時間における成体Ｃ１オスマウスへの（＋）−ＪＱ１（５０ｍｇ／ｋｇ）の単回腹腔内注射に続いて、三連四重極ＬＣＭＳ−ＭＳ（ＡＰＩ−２０００）によって血漿薬物濃度を測定した。この用量における（＋）−ＪＱ１の投与は、優れたピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ＞２０μＭ）および完全な薬剤曝露（ＡＵＣ＞２０，０００ｈ＊ｎｇ／ｍＬ）をもたらす。ＢＱＬは、（＋）−ＪＱ１が薬物動態学的検出アッセイの数量化可能限界（１．００ｎｇ／ｍＬ）を超えるサンプルを示す。図２９Ｂは、図２９Ａに列挙されるデータを使用して、（＋）−ＪＱ１の血漿濃度−時間プロフィールを示す、グラフを含む。データは平均測定に相当し、誤差棒は標準偏差を示し、どちらも三連の独立測定から得られた。生体外で観察された生物学的活性濃度（１００ｎＭ；水平赤線）を超える薬剤の血漿濃度は、外挿によって１０時間を超えて観察される。
【図３０−１】図３０Ａ〜３０Ｃは、３つの要素のいずれかの抑制時における、Ｍｙｃ下方制御によるＢｒｄ４、Ｍｙｂ、およびＭＬＬ−ＡＦ９の抑制時に引き起こされる、幅広く重複する転写効果を示す。図３０Ａは、ＭＬＬ−ＡＦ９およびＭｙｂ下流の転写シグネチャーを評価する、ＧＳＥＡプロットを含む。ＭＬＬ−ＡＦ９＿５００およびＭｙｂ＿５００は、それぞれＴｅｔ−Ｏｆｆ媒介ＭＬＬ−ＡＦ９下方制御またはＭｙｂｓｈＲＮＡノックダウンのどちらかに際して、倍数変化に基づいてトップ５００下方制御遺伝子として、ＲＭＡを使用して定義された。５００遺伝子カットオフは、ＭＬＬ−ＡＦ９では−１．１７、およびＭｙｂでは−１．７７のＬｏｇ２倍数変化に相当する。
【図３０−２】図３０Ｂは、示されるマイクロアレイ複製中のＭｙｃ発現のヒートマップ表現を含む。Ｌｏｇ２倍数変化およびａｄｊ．Ｐ．Ｖａｌは、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒを使用して実装されるＬｉｍｍａアルゴリズムを使用して計算された。図３０Ｃは、ＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示す。グラフを含む。ＲＴ−ｑＰＣＲを実施して、ＪＱ１処理が、ＭＬＬ−ＡＦ９の直接標的であることが確立されている、Ｈｏｘａ７、Ｈｏｘａ９、およびＭｅｉｓ１発現の発現に影響しないことを検証した。これはＢｒｄ４阻害が、ＭＬＬ−ＡＦ９の全体機能を中和しないが、その代わりに例えばＭｙｃなどのその他の下流標的の大きなサブセットを抑制することを示す。ｎ＝３。誤差棒はｓ．ｅ．ｍ．に相当する。
【００２９】
定義
「作用物質」は、あらゆる小分子化合物、抗体、核酸分子、またはポリペプチド、またはその断片を意味する。
【００３０】
本明細書の用法では、「アルキル」という用語は、典型的に１〜１０個の炭素原子を有する、飽和直鎖または分枝非環式炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、およびｎ−デシルが挙げられ；一方、飽和分枝アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、２−メチルヘキシル、３−メチルヘキシル、４−メチルヘキシル、５−メチルヘキシル、２，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルペンチル、２，４−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルヘキシル、２，４−ジメチルヘキシル、２，５−ジメチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，２−ジメチルヘキシル、３，３−ジメチルペンチル、３，３−ジメチルヘキシル、４，４−ジメチルヘキシル、２−エチルペンチル、３−エチルペンチル、２−エチルヘキシル、３−エチルヘキシル、４−エチルヘキシル、２−メチル−２−エチルペンチル、２−メチル−３−エチルペンチル、２−メチル−４−エチルペンチル、２−メチル−２−エチルヘキシル、２−メチル−３−エチルヘキシル、２−メチル−４−エチルヘキシル、２，２−ジエチルペンチル、３，３−ジエチルヘキシル、２，２−ジエチルヘキシル、３，３−ジエチルヘキシルなどが挙げられる。本発明の化合物に含まれるアルキル基は、非置換であってもよく、またはアミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アルコキシ、アルキルチオ、オキソ、ハロ、アシル、ニトロ、ヒドロキシル、シアノ、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、カルボシクリル、カルボシクリルオキシ、カルボシクリルチオ、カルボシクリルアミノ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルアミノ、ヘテロシクリルチオなどの１つまたは複数の置換基で任意選択的に置換されていてもよい。本発明の化合物では、低級アルキルが典型的に好まれる。
【００３１】
「変更」は、本明細書に記載されるような当該技術分野において公知の標準的な方法によって検出される、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化（増大または低下）を意味する。本明細書の用法では、変更としては、発現レベルの１０％の変化、好ましくは２５％の変化、より好ましくは４０％の変化、最も好ましくは発現レベルの５０％以上の変化が挙げられる。
【００３２】
「改善する」は、疾患の発症または進行を低下させ、抑制し、減衰させ、縮小させ、停止させ、または安定化することを意味する。
【００３３】
「アナログ」は、同一でないが、類似した機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えばポリペプチドアナログは、天然ポリペプチドと比較してアナログの機能を高める特定の生化学的修飾を有しながら、対応する天然ポリペプチドの少なくともいくらかの生物学的活性を保つ。このような生化学的修飾は、例えばリガンド結合を変更することなく、アナログのプロテアーゼ耐性、メンブラン透過度、または半減期を増大させ得る。アナログとしては、非天然アミノ酸が挙げられる。
【００３４】
本明細書の用法では、「芳香族環」または「アリール」という用語は、炭素および水素原子を含んでなる単環または多環式芳香族環または環遊離基を意味する。適切なアリール基の例としては、フェニル、トリル、アントラセニル、フルオレニル、インデニル、アズレニル、およびナフチル、ならびに５，６，７，８−テトラヒドロナフチルなどのベンゾ融合炭素環式部分が挙げられるが、これに限定されるものではない。アリール基は非置換であり得て、または例えば本明細書でアルキル基について記載される置換基（制限なしにアルキル（好ましくは低級アルキルまたは１つまたは複数のハロ置換アルキル）、ヒドロキシ、アルコキシ（好ましくは低級アルコキシ）、アルキルチオ、シアノ、ハロ、アミノ、ボロン酸（−Ｂ（ＯＨ）２、およびニトロをはじめとする）などの１つまたは複数の置換基で、任意選択的に置換され得る。特定の実施形態では、アリール基は単環であり、環は６個の炭素原子を含んでなる。
【００３５】
「ブロモドメイン」は、アセチル化リジン残基を認識するポリペプチド部分を意味する。一実施形態では、ＢＥＴファミリーメンバーポリペプチドのブロモドメインはおよそ１１０個のアミノ酸を含んでなり、クロマチンと相互作用する多様なループ領域によって結合する、４本のαらせんの左巻きの束を含んでなる、保存された折り畳みを共有する。
【００３６】
「ＢＥＴファミリーポリペプチド」は、２つのブロモドメインと、転写調節因子活性またはアセチル化リジン結合活性を有する末端外（ｅｘｔｒａｔｅｒｍｉｎａｌ）（ＥＴ）ドメインまたはその断片を含んでなるポリペプチドを意味する。例示的なＢＥＴファミリーメンバーとしては、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、およびＢＲＤＴが挙げられる。
【００３７】
「ＢＲＤ２ポリペプチド」は、ＮＰ＿００５０９５と少なくとも８５％の同一性を有し、クロマチン結合または転写調節ができる、タンパク質またはその断片を意味する。
【００３８】
例示的なＢＲＤ２ポリペプチドの配列を下に示す。
ＭＬＱＮＶＴＰＨＮＫＬＰＧＥＧＮＡＧＬＬＧＬＧＰＥＡＡＡＰＧＫＲＩＲＫＰＳＬＬＹＥＧＦＥＳＰＴＭＡＳＶＰＡＬＱＬＴＰＡＮＰＰＰＰＥＶＳＮＰＫ
ＫＰＧＲＶＴＮＱＬＱＹＬＨＫＶＶＭＫＡＬＷＫＨＱＦＡＷＰＦＲＱＰＶＤＡＶＫＬＧＬＰＤＹＨＫＩＩＫＱＰＭＤＭＧＴＩＫＲＲＬＥＮＮＹＹＷＡＡＳＥ
ＣＭＱＤＦＮＴＭＦＴＮＣＹＩＹＮＫＰＴＤＤＩＶＬＭＡＱＴＬＥＫＩＦＬＱＫＶＡＳＭＰＱＥＥＱＥＬＶＶＴＩＰＫＮＳＨＫＫＧＡＫＬＡＡＬＱＧＳＶＴ
ＳＡＨＱＶＰＡＶＳＳＶＳＨＴＡＬＹＴＰＰＰＥＩＰＴＴＶＬＮＩＰＨＰＳＶＩＳＳＰＬＬＫＳＬＨＳＡＧＰＰＬＬＡＶＴＡＡＰＰＡＱＰＬＡＫＫＫＧＶＫ
ＲＫＡＤＴＴＴＰＴＰＴＡＩＬＡＰＧＳＰＡＳＰＰＧＳＬＥＰＫＡＡＲＬＰＰＭＲＲＥＳＧＲＰＩＫＰＰＲＫＤＬＰＤＳＱＱＱＨＱＳＳＫＫＧＫＬＳＥＱＬ
ＫＨＣＮＧＩＬＫＥＬＬＳＫＫＨＡＡＹＡＷＰＦＹＫＰＶＤＡＳＡＬＧＬＨＤＹＨＤＩＩＫＨＰＭＤＬＳＴＶＫＲＫＭＥＮＲＤＹＲＤＡＱＥＦＡＡＤＶＲＬ
ＭＦＳＮＣＹＫＹＮＰＰＤＨＤＶＶＡＭＡＲＫＬＱＤＶＦＥＦＲＹＡＫＭＰＤＥＰＬＥＰＧＰＬＰＶＳＴＡＭＰＰＧＬＡＫＳＳＳＥＳＳＳＥＥＳＳＳＥＳＳ
ＳＥＥＥＥＥＥＤＥＥＤＥＥＥＥＥＳＥＳＳＤＳＥＥＥＲＡＨＲＬＡＥＬＱＥＱＬＲＡＶＨＥＱＬＡＡＬＳＱＧＰＩＳＫＰＫＲＫＲＥＫＫＥＫＫＫＫＲＫＡ
ＥＫＨＲＧＲＡＧＡＤＥＤＤＫＧＰＲＡＰＲＰＰＱＰＫＫＳＫＫＡＳＧＳＧＧＧＳＡＡＬＧＰＳＧＦＧＰＳＧＧＳＧＴＫＬＰＫＫＡＴＫＴＡＰＰＡＬＰＴＧ
ＹＤＳＥＥＥＥＥＳＲＰＭＳＹＤＥＫＲＱＬＳＬＤＩＮＫＬＰＧＥＫＬＧＲＶＶＨＩＩＱＡＲＥＰＳＬＲＤＳＮＰＥＥＩＥＩＤＦＥＴＬＫＰＳＴＬＲＥＬＥ
ＲＹＶＬＳＣＬＲＫＫＰＲＫＰＹＴＩＫＫＰＶＧＫＴＫＥＥＬＡＬＥＫＫＲＥＬＥＫＲＬＱＤＶＳＧＱＬＮＳＴＫＫＰＰＫＫＡＮＥＫＴＥＳＳＳＡＱＱＶＡ
ＶＳＲＬＳＡＳＳＳＳＳＤＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＤＴＳＤＳＤＳＧ
【００３９】
「ＢＲＤ２核酸分子」は、ＢＲＤ２ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００４０】
「ＢＲＤ３ポリペプチド」は、クロマチン結合または転写調節ができるＮＰ＿０３１３９７．１と少なくとも８５％の同一性を有する、タンパク質またはその断片を意味する。
【００４１】
例示的なＢＲＤ３ポリペプチドの配列を下に示す。
１  ｍｓｔａｔｔｖａｐａ  ｇｉｐａｔｐｇｐｖｎ  ｐｐｐｐｅｖｓｎｐｓ  ｋｐｇｒｋｔｎｑｌｑ  ｙｍｑｎｖｖｖｋｔｌ  ｗｋｈｑｆａｗｐｆｙ
６１  ｑｐｖｄａｉｋｌｎｌ  ｐｄｙｈｋｉｉｋｎｐ  ｍｄｍｇｔｉｋｋｒｌ  ｅｎｎｙｙｗｓａｓｅ  ｃｍｑｄｆｎｔｍｆｔ  ｎｃｙｉｙｎｋｐｔｄ
１２１  ｄｉｖｌｍａｑａｌｅ  ｋｉｆｌｑｋｖａｑｍ  ｐｑｅｅｖｅｌｌｐｐ  ａｐｋｇｋｇｒｋｐａ  ａｇａｑｓａｇｔｑｑ  ｖａａｖｓｓｖｓｐａ
１８１  ｔｐｆｑｓｖｐｐｔｖ  ｓｑｔｐｖｉａａｔｐ  ｖｐｔｉｔａｎｖｔｓ  ｖｐｖｐｐａａａｐｐ  ｐｐａｔｐｉｖｐｖｖ  ｐｐｔｐｐｖｖｋｋｋ
２４１  ｇｖｋｒｋａｄｔｔｔ  ｐｔｔｓａｉｔａｓｒ  ｓｅｓｐｐｐｌｓｄｐ  ｋｑａｋｖｖａｒｒｅ  ｓｇｇｒｐｉｋｐｐｋ  ｋｄｌｅｄｇｅｖｐｑ
３０１  ｈａｇｋｋｇｋｌｓｅ  ｈｌｒｙｃｄｓｉｌｒ  ｅｍｌｓｋｋｈａａｙ  ａｗｐｆｙｋｐｖｄａ  ｅａｌｅｌｈｄｙｈｄ  ｉｉｋｈｐｍｄｌｓｔ
３６１  ｖｋｒｋｍｄｇｒｅｙ  ｐｄａｑｇｆａａｄｖ  ｒｌｍｆｓｎｃｙｋｙ  ｎｐｐｄｈｅｖｖａｍ  ａｒｋｌｑｄｖｆｅｍ  ｒｆａｋｍｐｄｅｐｖ
４２１  ｅａｐａｌｐａｐａａ  ｐｍｖｓｋｇａｅｓｓ  ｒｓｓｅｅｓｓｓｄｓ  ｇｓｓｄｓｅｅｅｒａ  ｔｒｌａｅｌｑｅｑｌ  ｋａｖｈｅｑｌａａｌ
４８１  ｓｑａｐｖｎｋｐｋｋ  ｋｋｅｋｋｅｋｅｋｋ  ｋｋｄｋｅｋｅｋｅｋ  ｈｋｖｋａｅｅｅｋｋ  ａｋｖａｐｐａｋｑａ  ｑｑｋｋａｐａｋｋａ
５４１  ｎｓｔｔｔａｇｒｑｌ  ｋｋｇｇｋｑａｓａｓ  ｙｄｓｅｅｅｅｅｇｌ  ｐｍｓｙｄｅｋｒｑｌ  ｓｌｄｉｎｒｌｐｇｅ  ｋｌｇｒｖｖｈｉｉｑ
６０１  ｓｒｅｐｓｌｒｄｓｎ  ｐｄｅｉｅｉｄｆｅｔ  ｌｋｐｔｔｌｒｅｌｅ  ｒｙｖｋｓｃｌｑｋｋ  ｑｒｋｐｆｓａｓｇｋ  ｋｑａａｋｓｋｅｅｌ
６６１  ａｑｅｋｋｋｅｌｅｋ  ｒｌｑｄｖｓｇｑｌｓ  ｓｓｋｋｐａｒｋｅｋ  ｐｇｓａｐｓｇｇｐｓ  ｒｌｓｓｓｓｓｓｅｓ  ｇｓｓｓｓｓｇｓｓｓ
７２１  ｄｓｓｄｓｅ
【００４２】
「Ｂｒｄ３核酸分子」は、ＢＲＤ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００４３】
「ＢＲＤ４ポリペプチド」は、ＮＰ＿０５５１１４と少なくとも８５％の同一性を有して、クロマチン結合または転写調節ができる、タンパク質またはその断片を意味する。
１  ｍｓａｅｓｇｐｇｔｒ  ｌｒｎｌｐｖｍｇｄｇ  ｌｅｔｓｑｍｓｔｔｑ  ａｑａｑｐｑｐａｎａ  ａｓｔｎｐｐｐｐｅｔ  ｓｎｐｎｋｐｋｒｑｔ
６１  ｎｑｌｑｙｌｌｒｖｖ  ｌｋｔｌｗｋｈｑｆａ  ｗｐｆｑｑｐｖｄａｖ  ｋｌｎｌｐｄｙｙｋｉ  ｉｋｔｐｍｄｍｇｔｉ  ｋｋｒｌｅｎｎｙｙｗ
１２１  ｎａｑｅｃｉｑｄｆｎ  ｔｍｆｔｎｃｙｉｙｎ  ｋｐｇｄｄｉｖｌｍａ  ｅａｌｅｋｌｆｌｑｋ  ｉｎｅｌｐｔｅｅｔｅ  ｉｍｉｖｑａｋｇｒｇ
１８１  ｒｇｒｋｅｔｇｔａｋ  ｐｇｖｓｔｖｐｎｔｔ  ｑａｓｔｐｐｑｔｑｔ  ｐｑｐｎｐｐｐｖｑａ  ｔｐｈｐｆｐａｖｔｐ  ｄｌｉｖｑｔｐｖｍｔ
２４１  ｖｖｐｐｑｐｌｑｔｐ  ｐｐｖｐｐｑｐｑｐｐ  ｐａｐａｐｑｐｖｑｓ  ｈｐｐｉｉａａｔｐｑ  ｐｖｋｔｋｋｇｖｋｒ  ｋａｄｔｔｔｐｔｔｉ
３０１  ｄｐｉｈｅｐｐｓｌｐ  ｐｅｐｋｔｔｋｌｇｑ  ｒｒｅｓｓｒｐｖｋｐ  ｐｋｋｄｖｐｄｓｑｑ  ｈｐａｐｅｋｓｓｋｖ  ｓｅｑｌｋｃｃｓｇｉ
３６１  ｌｋｅｍｆａｋｋｈａ  ａｙａｗｐｆｙｋｐｖ  ｄｖｅａｌｇｌｈｄｙ  ｃｄｉｉｋｈｐｍｄｍ  ｓｔｉｋｓｋｌｅａｒ  ｅｙｒｄａｑｅｆｇａ
４２１  ｄｖｒｌｍｆｓｎｃｙ  ｋｙｎｐｐｄｈｅｖｖ  ａｍａｒｋｌｑｄｖｆ  ｅｍｒｆａｋｍｐｄｅ  ｐｅｅｐｖｖａｖｓｓ  ｐａｖｐｐｐｔｋｖｖ
４８１  ａｐｐｓｓｓｄｓｓｓ  ｄｓｓｓｄｓｄｓｓｔ  ｄｄｓｅｅｅｒａｑｒ  ｌａｅｌｑｅｑｌｋａ  ｖｈｅｑｌａａｌｓｑ  ｐｑｑｎｋｐｋｋｋｅ
５４１  ｋｄｋｋｅｋｋｋｅｋ  ｈｋｒｋｅｅｖｅｅｎ  ｋｋｓｋａｋｅｐｐｐ  ｋｋｔｋｋｎｎｓｓｎ  ｓｎｖｓｋｋｅｐａｐ  ｍｋｓｋｐｐｐｔｙｅ
６０１  ｓｅｅｅｄｋｃｋｐｍ  ｓｙｅｅｋｒｑｌｓｌ  ｄｉｎｋｌｐｇｅｋｌ  ｇｒｖｖｈｉｉｑｓｒ  ｅｐｓｌｋｎｓｎｐｄ  ｅｉｅｉｄｆｅｔｌｋ
６６１  ｐｓｔｌｒｅｌｅｒｙ  ｖｔｓｃｌｒｋｋｒｋ  ｐｑａｅｋｖｄｖｉａ  ｇｓｓｋｍｋｇｆｓｓ  ｓｅｓｅｓｓｓｅｓｓ  ｓｓｄｓｅｄｓｅｔｇ
７２１  ｐａ
【００４４】
「Ｂｒｄ４核酸分子」は、ＢＲＤ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００４５】
「ＢＲＤＴポリペプチド」は、ＮＰ＿００１７１７と少なくとも８５％の同一性を有して、クロマチン結合または転写調節ができる、タンパク質またはその断片を意味する。
１  ｍｓｌｐｓｒｑｔａｉ  ｉｖｎｐｐｐｐｅｙｉ  ｎｔｋｋｎｇｒｌｔｎ  ｑｌｑｙｌｑｋｖｖｌ  ｋｄｌｗｋｈｓｆｓｗ  ｐｆｑｒｐｖｄａｖｋ
６１  ｌｑｌｐｄｙｙｔｉｉ  ｋｎｐｍｄｌｎｔｉｋ  ｋｒｌｅｎｋｙｙａｋ  ａｓｅｃｉｅｄｆｎｔ  ｍｆｓｎｃｙｌｙｎｋ  ｐｇｄｄｉｖｌｍａｑ
１２１  ａｌｅｋｌｆｍｑｋｌ  ｓｑｍｐｑｅｅｑｖｖ  ｇｖｋｅｒｉｋｋｇｔ  ｑｑｎｉａｖｓｓａｋ  ｅｋｓｓｐｓａｔｅｋ  ｖｆｋｑｑｅｉｐｓｖ
１８１  ｆｐｋｔｓｉｓｐｌｎ  ｖｖｑｇａｓｖｎｓｓ  ｓｑｔａａｑｖｔｋｇ  ｖｋｒｋａｄｔｔｔｐ  ａｔｓａｖｋａｓｓｅ  ｆｓｐｔｆｔｅｋｓｖ
２４１  ａｌｐｐｉｋｅｎｍｐ  ｋｎｖｌｐｄｓｑｑｑ  ｙｎｖｖｋｔｖｋｖｔ  ｅｑｌｒｈｃｓｅｉｌ  ｋｅｍｌａｋｋｈｆｓ  ｙａｗｐｆｙｎｐｖｄ
３０１  ｖｎａｌｇｌｈｎｙｙ  ｄｖｖｋｎｐｍｄｌｇ  ｔｉｋｅｋｍｄｎｑｅ  ｙｋｄａｙｋｆａａｄ  ｖｒｌｍｆｍｎｃｙｋ  ｙｎｐｐｄｈｅｖｖｔ
３６１  ｍａｒｍｌｑｄｖｆｅ  ｔｈｆｓｋｉｐｉｅｐ  ｖｅｓｍｐｌｃｙｉｋ  ｔｄｉｔｅｔｔｇｒｅ  ｎｔｎｅａｓｓｅｇｎ  ｓｓｄｄｓｅｄｅｒｖ
４２１  ｋｒｌａｋｌｑｅｑｌ  ｋａｖｈｑｑｌｑｖｌ  ｓｑｖｐｆｒｋｌｎｋ  ｋｋｅｋｓｋｋｅｋｋ  ｋｅｋｖｎｎｓｎｅｎ  ｐｒｋｍｃｅｑｍｒｌ
４８１  ｋｅｋｓｋｒｎｑｐｋ  ｋｒｋｑｑｆｉｇｌｋ  ｓｅｄｅｄｎａｋｐｍ  ｎｙｄｅｋｒｑｌｓｌ  ｎｉｎｋｌｐｇｄｋｌ  ｇｒｖｖｈｉｉｑｓｒ
５４１  ｅｐｓｌｓｎｓｎｐｄ  ｅｉｅｉｄｆｅｔｌｋ  ａｓｔｌｒｅｌｅｋｙ  ｖｓａｃｌｒｋｒｐｌ  ｋｐｐａｋｋｉｍｍｓ  ｋｅｅｌｈｓｑｋｋｑ
６０１  ｅｌｅｋｒｌｌｄｖｎ  ｎｑｌｎｓｒｋｒｑｔ  ｋｓｄｋｔｑｐｓｋａ  ｖｅｎｖｓｒｌｓｅｓ  ｓｓｓｓｓｓｓｓｅｓ  ｅｓｓｓｓｄｌｓｓｓ
６６１  ｄｓｓｄｓｅｓｅｍｆ  ｐｋｆｔｅｖｋｐｎｄ  ｓｐｓｋｅｎｖｋｋｍ  ｋｎｅｃｉｌｐｅｇｒ  ｔｇｖｔｑｉｇｙｃｖ  ｑｄｔｔｓａｎｔｔｌ
７２１  ｖｈｑｔｔｐｓｈｖｍ  ｐｐｎｈｈｑｌａｆｎ  ｙｑｅｌｅｈｌｑｔｖ  ｋｎｉｓｐｌｑｉｌｐ  ｐｓｇｄｓｅｑｌｓｎ  ｇｉｔｖｍｈｐｓｇｄ
７８１  ｓｄｔｔｍｌｅｓｅｃ  ｑａｐｖｑｋｄｉｋｉ  ｋｎａｄｓｗｋｓｌｇ  ｋｐｖｋｐｓｇｖｍｋ  ｓｓｄｅｌｆｎｑｆｒ  ｋａａｉｅｋｅｖｋａ
８４１  ｒｔｑｅｌｉｒｋｈｌ  ｅｑｎｔｋｅｌｋａｓ  ｑｅｎｑｒｄｌｇｎｇ  ｌｔｖｅｓｆｓｎｋｉ  ｑｎｋｃｓｇｅｅｑｋ  ｅｈｑｑｓｓｅａｑｄ
９０１  ｋｓｋｌｗｌｌｋｄｒ  ｄｌａｒｑｋｅｑｅｒ  ｒｒｒｅａｍｖｇｔｉ  ｄｍｔｌｑｓｄｉｍｔ  ｍｆｅｎｎｆｄ
【００４６】
「ＢＲＤＴ核酸分子」は、ＢＲＤＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００４７】
キラル中心の命名法に関して、「ｄ」および「ｌ」立体配置という用語は、ＩＵＰＡＣ勧告によって定義される通りである。ジアステレオマー、ラセミ体、エピマー、および鏡像異性体という用語の使用については、これらは調製品の立体化学について記述するそれらの通常の文脈で使用される。
【００４８】
「化合物」は、任意の小分子化合物、抗体、核酸分子、またはポリペプチド、またはその断片を意味する。
【００４９】
本開示では、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含んでなる）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでなる）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」、および「ｈａｖｉｎｇ（有する）」などは、米国特許法でそれらに帰するとされる意味を有し得て、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」などを意味し得る；同様に「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から本質的になる）」または「ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ（本質的になる）」は、米国特許法で帰するとされる意味を有し、用語には制約がなく、列挙事項を超える存在によって、列挙事項の基礎的または新規特性が無変化でありさえすれば、列挙事項を超える存在を許すが、先行技術実施形態は除外する。
【００５０】
「コンピュータによるモデル化」は、以下の１つまたは複数を求めるための計算プログラムの応用を意味する：結合部分に対するリガンドの位置および結合近接性、結合リガンドの占有空間、結合部分とリガンド間の相補的接触面積、結合部分への所与のリガンドの結合の変形エネルギー、および水素結合強度のある程度の推定、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および／またはリガンドと結合部分間の静電相互作用エネルギー。コンピュータモデル化はまた、モデル系と候補化合物の特徴間の比較を提供し得る。例えばコンピュータによるモデル化実験は、本発明のファーマコフォアモデルを候補化合物と比較して、候補化合物とモデルの適合を評価し得る。
【００５１】
「コンピュータ可読媒体」は、媒体が上述のコンピューターシステムで使用するのに適するように、例えばコンピュータによって直接読み取られアクセスされ得るあらゆる媒体を意味する。媒体としては、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープなどの磁気記憶媒体；光ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭなどの光学式記憶媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭなどの電気記憶媒体；および磁気／光学式記憶媒体などのこれらのカテゴリーのハイブリッドが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５２】
「コンピューターシステム」は、原子の座標データ分析のために使用される、ハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段を意味する。本発明のコンピュータベースシステムの最小ハードウェア手段は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、およびデータ記憶手段を含んでなる。望ましくは、構造データを視覚化するモニターが提供される。データ記憶手段は、ＲＡＭ、または本発明のコンピュータ可読媒体にアクセスする手段であってもよい。このようなシステムの例は、Ｕｎｉｘベース、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＮＴまたはＩＢＭ  ＯＳ／２オペレーティングシステムが作動する、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄおよびＳｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓから入手できる、マイクロコンピュータワークステーションである。
【００５３】
「検出」は、検出される分析物の存在、不在または量を同定することを指す。
【００５４】
「検出可能な標識」は、対象分子に結合した際に、関心のある分子を分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段を介して検出可能にする、組成物を意味する。例えば有用な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡで通常使用されるものなど）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが挙げられる。
【００５５】
「ジアステレオマー」という用語は、２つ以上の不斉中心があり、その分子が互いに鏡像でない立体異性体を指す。
【００５６】
「疾患」は、細胞、組織、または臓器の正常機能を損ないまたは妨げる、任意の病状または障害を意味する。本明細書に記述される化合物による治療の影響を受けやすい疾患の例としては、白血病および関連障害（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群）が挙げられる。
【００５７】
「有効量」は、未治療患者と比較して、疾患症状を改善するのに必要な作用物質の量を意味する。疾患治療のために本発明を実施するのに使用される活性化合物の有効量は、投与様式、対象の年齢、体重、および総体的な健康に応じて変動する。究極的に、主治医または獣医が、適切な量および投薬計画を決定する。このような量は、「有効」量と称される。
【００５８】
「鏡像異性体」という用語は、互いに重ね合わせることができない鏡像である、化合物の２つの立体異性体を指す。２つの鏡像異性体の等モル混合物は、「ラセミ混合物」または「ラセミ体」と称される。
【００５９】
「適合」は、自動または半自動手段によって、作用物質分子の１つまたは複数の原子と、ＢＥＴファミリーメンバーの１つまたは複数の原子または結合部位（例えばＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、およびＢＲＤＴのブロモドメイン）の間の相互作用を測定し、このような相互作用が安定である度合いを判定することを意味する。適合のための様々なコンピュータベースの方法については、本明細書でさらに記載される。
【００６０】
「断片」は、ポリペプチドまたは核酸分子の部分を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含有する。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有してもよい。
【００６１】
「ハロアルキル」という用語は、例えばフルオロメチルおよびトリフルオロメチルなどのハロゲンで一置換、二置換または多置換された、上で定義されるアルキル基を含むことが意図される。
【００６２】
「ハロゲン」という用語は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉを指す。
【００６３】
「ヘテロアリール」という用語は、単環系の場合は１〜４環ヘテロ原子、二環系の場合は１〜６個のヘテロ原子、三環系の場合は１〜９個のヘテロ原子を有する、芳香族５〜８員環単環系、８〜１２員環二環系、または１１〜１４員環三環系を指し、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され、残りの環原子は炭素である。ヘテロアリール基は、例えば本明細書でアリール基について記載される置換基などの１つまたは複数の置換基によって、任意選択的に置換されていてもよい。ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、フラニル、ベンゾジオキソリル、チエニル、ピロリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、キノリニル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、トリアゾリル、チアジアゾリル、イソキノリニル、インダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾフリル、インドリジニル、イミダゾピリジル、テトラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、およびインドリルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
「ヘテロ原子」という用語は、本明細書の用法では、炭素または水素以外の任意の元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、イオウ、およびリンである。「異性体」または「立体異性体」という用語は、同一化学構成を有するが、空間内の原子または基の配置が異なる化合物を指す。
【００６５】
「複素環式」という用語は、本明細書の用法では、炭素以外の少なくとも少なくとも１つの原子（例えばＳ、Ｏ、Ｎ）を環構造内に含有する有機化合物を指す。これらの有機化合物中の環構造は、芳香族または特定の実施形態では非芳香族のどちらかであり得る。複素環式部分のいくつかの例としては、ピリジン、ピリミジン、ピロリジン、フラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、およびジオキサンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００６６】
「ハイブリダイゼーション」は水素結合を意味し、それは相補的核酸塩基間における、ワトソン・クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であってもよい。例えばアデニンとチミンは、水素結合の形成を通じて対合する、相補的核酸塩基である。
【００６７】
「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨを意味する。
【００６８】
「阻害性核酸」は、哺乳類細胞に投与されると、（例えば、１０％、２５％、５０％、７５％、または９０〜１００％にさえ至る）標的遺伝子の発現低下をもたらす、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡ、またはその一部、またはその模倣剤を意味する。典型的に、核酸阻害剤は、標的核酸分子の少なくとも一部、またはそのオルソログを含んでなり、または標的核酸分子の相補鎖の少なくとも一部を含んでなる。例えば、阻害性核酸分子は、本明細書に記述される核酸のいずれかまたは全ての少なくとも一部を含んでなる。
【００６９】
「単離ポリヌクレオチド」は、本発明の核酸分子が由来する生物の天然ゲノム中で遺伝子側面に位置する遺伝子が、含まれない核酸（例えばＤＮＡ）を意味する。したがって本用語は、例えば、ベクター中に、自己複製プラスミドまたはウイルス中に、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた組換えＤＮＡ；またはその他の配列から独立して別個の分子（例えばｃＤＮＡまたはＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されるゲノムまたはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。これに加えて、本用語は、ＤＮＡ分子から転写されるＲＮＡ分子を含み、ならびに追加的ポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。
【００７０】
「単離ポリペプチド」は、天然でそれに付随する構成要素から分離された、本発明のポリペプチドを意味する。典型的に、ポリペプチドは、それが少なくとも６０％重量であり、それが天然に結合するタンパク質または天然有機分子が不在であれば、単離されている。好ましくは、調製品は、少なくとも７５重量％、より好適には少なくとも９０重量％、最も好適には少なくとも９９重量％が、本発明のポリペプチドである。本発明の単離ポリペプチドは、例えば天然原料からの抽出によって；このようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；またはタンパク質の化学的合成によって、得られてもよい。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析などの任意の適切な方法によって測定し得る。
【００７１】
「異性体」または「立体異性体」という用語は、同一化学構成を有するが、空間内の原子または基の配置が異なる化合物を指す。
【００７２】
「同位体誘導体」という用語は、その中で化合物中の１つまたは複数の原子が、原子の対応する同位体で置換されている、化合物の誘導体を含む。例えば、炭素原子（Ｃ１２）を含有する化合物の同位体誘導体は、その中で化合物の炭素原子がＣ１３同位体で置換されているものである。
【００７３】
「白血病細胞」は、白血病に由来する細胞を意味する。
【００７４】
「マーカー」は、疾患または障害と関連付けられている発現レベルまたは活性が変更されている、任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。
【００７５】
がん細胞の「成長を阻害する」という言語は、その成長および転移の遅延、中断、抑止または停止を含み、必ずしも新生物の成長の完全な排除を示唆しない。
【００７６】
本発明の方法で有用な核酸分子としては、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする、あらゆる核酸分子が挙げられる。このような核酸分子は、内在性核酸配列と１００％同一でなくてもよいが、典型的にかなりの同一性を呈示する。内在性配列と「かなりの同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的に、二本鎖核酸分子の少なくとも１本の鎖とハイブリダイズできる。本発明の方法で有用な核酸分子としては、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする、任意の核酸分子が挙げられる。このような核酸分子は、内在性核酸配列と１００％同一でなくてもよいが、典型的にかなりの同一性を呈示する。内在性配列と「かなりの同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的に、二本鎖核酸分子の少なくとも１本の鎖とハイブリダイズできる。「ハイブリダイズ」は、様々なストリンジェンシー条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば本明細書に記載される遺伝子）またはその部分間で二本鎖分子を形成する対合、を意味する。（例えばＷａｈｌ，Ｇ．Ｍ．および  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。
【００７７】
本明細書の用法では、「光学異性体」という用語は、キラル分子としてもまた知られている分子を含み、これらは互いに重ね合わせることができない正確な鏡像である。
【００７８】
「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、本明細書の用法では、制限なしに、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内注射および輸液を含む、通常は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味する。
【００７９】
「ポリシクリル」または「多環式基」という用語は、二環式以上の遊離基（例えばシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／またはヘテロシクリル）を指し、その中では２つ以上の炭素が２つの隣接する環で共有され、例えば環は「融合環」である。非隣接原子を通じて結合する環は、「架橋」環と称される。多環式環のそれぞれは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、スルフェート、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を含む。
【００８０】
「多形体」という用語は、本明細書の用法では、本発明の化合物の固体結晶形態またはその複合体を指す。同じ化合物の異なる多形体は、異なる物理的、化学的および／または分光学的特性を呈示し得る。異なる物理的特性としては、安定性（例えば熱または光に対する）、圧縮率および密度（製剤および製品製造で重要）、および溶出速度（生物学的利用能に影響し得る）が挙げられるが、これに限定されるものではない。安定性の差異は、化学反応性変化（例えば剤形が１つの多形体からなる場合、別の多形体からなる場合よりも迅速に変色するような差異的酸化）または機械的特性変化（例えば動力学的に好まれる多形体が熱力学的により安定した多形体に転換するにつれて、錠剤が貯蔵中に崩壊する）または双方（例えば高湿では、１つの多形体の錠剤は破壊をより被りやすい）から帰結し得る。多形体の異なる物理的特性は、それらの加工に影響を及ぼし得る。
【００８１】
「プロドラッグ」という用語は、生体内で代謝され得る部分がある化合物を含む。一般に、プロドラッグは生体内でエステラーゼによって、またはその他の機構によって活性薬剤に代謝される。プロドラッグの例およびそれらの使用は、当該技術分野で周知である（例えばＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）。プロドラッグは、化合物の最終的な単離および精製中に原位置で調製し得て、または精製化合物の遊離酸形態またはヒドロキシルを個別に適切なエステル化剤と反応させることにより調製し得る。ヒドロキシル基は、カルボン酸による処理を介してエステルに転換し得る。プロドラッグ部分の例としては、置換および非置換の、分枝または非分枝の低級アルキルエステル部分（例えばプロピオン酸エステル）、低級アルケニルエステル、ジ低級アルキルアミノ低級アルキルエステル（例えばジメチルアミノエチルエステル）、アシルアミノ低級アルキルエステルが挙げられる（例えばアセチルオキシメチルエステル）、アシルオキシ低級アルキルエステル（例えばピバロイルオキシメチルエステル）、アリールエステル（フェニルエステル）、アリール低級アルキルエステル（例えばベンジルエステル）、置換（例えばメチル基、ハロ、またはメトキシ置換基による）アリールおよびアリール低級アルキルエステル、アミド、低級アルキルアミド、ジ低級アルキルアミド、およびヒドロキシアミドが挙げられる。好ましいプロドラッグ部分は、プロピオン酸エステルおよびアシルエステルである。生体内でその他の機構を通じて活性形態に転換されたプロドラッグもまた、含まれる。
【００８２】
さらに炭素−炭素二重結合全体の立体化学の指標もまた、一般化学分野と対立し、その中で「Ｚ」は「ｃｉｓ」（同側）コンフォメーションと称されることが多いものを指す一方、「Ｅ」は「ｔｒａｎｓ」（反対側）コンフォメーションと称されることが多いものを指す。ｃｉｓ／ｔｒａｎｓおよび／またはＺ／Ｅのどちらの立体配置も、本発明の化合物に包含される。
【００８３】
「低下させる」または「増大させる」は、参照と比較して、それぞれ少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％のマイナスまたはプラスの変化を意味する。
【００８４】
「細胞生存を低下させる」は、参照細胞と比較して、細胞生存を阻害し、または細胞死を誘導することを意味する。
【００８５】
「参照」は、標準または対照条件を意味する。
【００８６】
「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、例えば、完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列の断片、または完全ｃＤＮＡまたは遺伝子配列など、指定された配列のサブセットまたは全体であってもよい。ポリペプチドについては、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に少なくとも約１６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸、より好適には少なくとも約２５個のアミノ酸、そしてなおもより好ましくは約３５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、または約１００個のアミノ酸である。核酸については、参照核酸配列の長さは、一般に少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、より好適には少なくとも約７５ヌクレオチド、そしてなおもより好ましくは約１００ヌクレオチドまたは約３００ヌクレオチドであり、またはそれらの前後またはそれらの間の任意の整数である。
【００８７】
「根平均二乗偏差」は、平均からの偏差の平方の算術平均の平方根を意味する。
【００８８】
配列同一性は、典型的に、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および／またはその他の修飾に相同性の程度を割り当てることで、同一または類似配列をマッチさせる。保存的置換としては、典型的に、グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン群中の置換が挙げられる。同一性の程度を判定する例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムを使用してもよく、ｅ．ｓｕｐ．−３とｅ．ｓｕｐ．−１００の間の確率スコアは、近縁関係にある配列を示唆する。
【００８９】
「ｓｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡを意味する。任意選択的に、ｓｉＲＮＡは、長さが１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチドであり、その３’末端に２塩基のオーバーハングを有する。これらのｄｓＲＮＡは、個々の細胞にまたは動物全体に導入し得る；例えば、それらは血流を介して全身的に導入してもよい。このようなｓｉＲＮＡを使用して、ｍＲＮＡレベルまたはプロモーター活性を下方制御する。
【００９０】
「特異的に結合する」は、本発明のポリペプチドを認識して結合するが、例えば本発明のポリペプチドを天然に含む生物学的サンプルなどのサンプル中で、その他の分子を実質的に認識せず結合しない、化合物または抗体を意味する。
【００９１】
「対象」は、ヒト、またはウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコなどの非ヒト哺乳類をはじめとするが、これに限定されるものではない、哺乳類を意味する。
【００９２】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれ１つか）、または核酸配列（例えば本明細書に記載される核酸配列のいずれか１つ）と、少なくとも８５％の同一性を呈示するポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列は、比較のために使用される配列に対して、アミノ酸または核酸レベルで、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％または１００％同一である。
【００９３】
「スルフヒドリル」または「チオール」という用語は、−ＳＨを意味する。
【００９４】
本明細書の用法では、「互変異性体」という用語は、互変異性化によって容易に相互転換する有機分子の異性体を指し、その中では、水素互変異性体原子またはプロトンが反応中に移動して、場合によっては、単結合と隣接する二重結合との交替が伴う。
【００９５】
本発明は、本明細書で記述される方法によって特性解析される障害を治療するための高度に特異的な薬剤開発に有用な、いくつかの標的を提供する。これに加えて、本発明の方法は、対象にとって安全な治療法を同定する容易な手段を提供する。これに加えて、本発明の方法は、多量のスループット、高感度、および低複雑度で、本明細書に記載される疾患に対する影響について、実質的に任意の数の化合物を分析する手段を提供する。
【００９６】
本明細書の用法では、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」「予防的治療（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、障害または病状を有さないが、リスクがあるまたは発症しやすい対象中で、障害または病状が発症する確率を低下させることを指す。
【００９７】
「有効量」は、治療対象に治療効果もたらす化合物の量を指す。治療効果は、客観的（すなわちある種の試験またはマーカーで測定可能）または主観的（すなわち対象に効果の徴候があり、または対照が効果を感じる）であってもよい。本明細書に記載される化合物の有効量は、約１ｍｇ／Ｋｇ〜約５０００ｍｇ／Ｋｇ体重の範囲であってもよい。有効量はまた、投与経路、ならびにその他の作用物質の同時使用可能性に応じて変動する。
【００９８】
本明細書で提供される範囲は、範囲内の全ての値で省略表現であることが理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分的範囲を含むものと理解される。
【００９９】
本明細書の用法では「ｔｒｅａｔ（治療する）」、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療する）」、「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」などの用語は、障害および／またはそれに伴う症状を低下させまたは改善することを指す。「改善する」は、疾患の発症または進行を低下させ、抑制し、減衰させ、縮小させ、停止させ、または安定化することを意味する。除外はされないもの、障害または病状を治療することは、障害とそれに伴う症状または病状を完全に排除することを要さないことが理解されるであろう。
【０１００】
特に断りのない限り、または文脈から明らかな場合を除き、本明細書の用法では、「または」という用語は包括的であると理解される。特に断りのない限り、または文脈から明らかな場合を除き、本明細書の用法では、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、単数または複数であると理解される。
【０１０１】
特に断りのない限り、または文脈から明らかな場合を除き、本明細書の用法では、「約」という用語は、例えば平均の２標準偏差以内など、当該技術分野の通常の許容差の範囲内と理解される。約は、記載値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解され得る。文脈から明らかである場合を除き、本明細書で提供される全ての数値は、約という用語によって修飾される。
【０１０２】
本明細書の任意の変数の定義における化学基一覧の列挙は、任意の単一群または列挙された群の組み合わせとしての変数の定義を含む。本明細書の変数または態様に関する実施形態の列挙は、任意の単一実施形態としてのその実施形態、または任意のその他の実施形態またはその部分と組み合わさったその実施形態を含む。
【０１０３】
本明細書で提供される任意の組成物または方法は、本明細書で提供されるその他の組成物および方法のいずれかの１つまたは複数と組み合わせ得る。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
本発明は、白血病および関連障害（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群）を治療するのに有用な組成物および方法を特徴とする。
【０１０５】
本発明は、Ｂｒｄ４を阻害する作用物質が、急性骨髄性白血病の成長または進行を阻害するのに有用であるという発見に、少なくとも部分的に基づく。この阻害は、Ｍｙｃ活性の抑制を伴い得る。これらの知見はまた、がんにおける直接薬理学的介入に対する、エピジェネティックな脆弱性を明らかにする発見プラットフォームとしてのＲＮＡｉスクリーニングの効用を強調する。
【０１０６】
下で詳細に報告するように、Ｂｒｄ４阻害が白血病の治療に有用であるという発見は、異常なクロマチンと関連付けられている高悪性度造血器腫瘍である急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）において、エピジェネティックな脆弱性をプローブする、不偏アプローチを使用して得られた。遺伝的に定義された白血病における公知のクロマチン調節因子を標的にする、カスタマイズされたｓｈＲＮＡライブラリーをスクリーニングすることで、ＡＭＬ疾患維持の重要な必要条件として、ブロモドメイン含有タンパク質Ｂｒｄ４が同定された。ｓｈＲＮＡまたは小分子阻害剤ＪＱ１を使用するＢｒｄ４抑制は、生体外および生体内で、最終骨髄性分化と白血病幹細胞（ＬＳＣ）排除が付随して起きる、頑強な抗白血病効果をもたらす。これらの効果は、Ｍｙｃ発現の維持と異常な自己再生の促進における、Ｂｒｄ４の要求事項に起因する。
【０１０７】
ブロモドメイン含有タンパク質
遺伝子制御は、基本的に、可逆的な高分子の非共有結合アセンブリーによって支配される。ＲＮＡポリメラーゼへの信号伝達は、クロマチンの翻訳後修飾状態を解釈できるアセンブリー要素によって空間的に制御される、より高次のタンパク質複合体を必要とする。エピジェネティックなリーダーは、ヒストンタンパク質またはＤＮＡの共有結合修飾を認識する、１つまたは複数の進化的に保存されたエフェクターモジュールをそれぞれが保有する、構造的に多様なタンパク質である。ヒストン尾部上のリジン残基（Ｋａｃ）のε−Ｎ−アセチル化は、オープンクロマチン構造および転写活性化と関連付けられている（Ｍａｒｕｓｈｉｇｅ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ７３，３９３７−３９４１，（１９７６））。アセチルリジンのコンテクスト特異的分子認識は、主にブロモドメインによって媒介される。
【０１０８】
ブロモドメイン含有タンパク質は、転写因子複合体（ＴＡＦ１、ＰＣＡＦ、Ｇｃｎ５、およびＣＢＰ）の構成要素、およびエピジェネティックメモリーの決定因子として、生物学的にかなり興味深い（Ｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２０，４８９９−４９０９，（２００９））。合計で５７の多様なブロモドメインを含有する、４１個のヒトタンパク質がある。大きな配列多様性にも関わらず、全てのブロモドメインは、基質特異性を決定する多様なループ領域（ＺＡおよびＢＣループ）によって結合する、４本のαらせん（αＺ、αＡ、αＢ、αＣ）の左巻きの束を含んでなる、保存された折り畳みを共有する。ペプチド性基質との共結晶構造は、アセチルリジンが中心疎水性窩によって認識され、ほとんどのブロモドメイン中に存在するアスパラギン残基との水素結合によってアンカーされることを示した（Ｏｗｅｎ，Ｄ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ４  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｃｎ５ｐ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １９，６１４１−６１４９，（２０００））。ブロモドメインおよびエキストラ末端（ＢＥＴ）ファミリー（ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、およびＢＲＤＴ）は、高レベルの配列保存を呈示する２つのＮ末端ブロモドメインを含んでなる共通ドメイン構造と、より多岐にわたるＣ−末端動員ドメインとを共有する（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５１３、１２４−１２８、（２００２）。
【０１０９】
本発明は、ヒトブロモドメインタンパク質を阻害するのに有用な組成物および方法を特徴とする。
【０１１０】
発明の化合物
本発明は、ＢＥＴファミリーメンバー（例えばＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４）の第１のブロモドメインのａｐｏ結晶構造の結合ポケット中に結合する化合物（例えば、ＪＱ１、および本明細書で記述される式の化合物）を提供する。理論による拘束は望まないが、これらの化合物は、特に、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群をはじめとするが、これに限定されるものではない白血病を抑制するのに効果的であってもよい。１つのアプローチでは、白血病および関連障害の治療に有用な化合物は、ブロモドメイン構造結合ポケットに結合することが予測される化合物を同定する、分子ドッキングプログラムを使用して選択される。特定の実施形態では、本発明の化合物は、ＢＥＴファミリーメンバー（例えばＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ）の生物学的活性を少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％妨げ、阻害し、または妨害し、または低下させて、および／または例えばブロモドメインａｐｏ結合ポケット中の結合部位に結合することにより、このようなタンパク質の細胞内局在化を妨害し得る。
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、約１０００ダルトン未満、８００未満、６００未満、５００未満、４００未満、または、約３００ダルトン未満の分子量を有する小分子である。本発明の化合物の例としては、ＢＥＴファミリーメンバーの第１のブロモドメイン（例えばＢＲＤ４（以下、ＢＲＤ４（１）と称される；ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＯＳＳ）のａｐｏ結晶構造の結合ポケットに結合する、ＪＱ１およびその他の化合物が挙げられる。ＪＱ１は、新規チエノ−トリアゾロ−１，４−ジアゼピンである。本発明は、このような化合物の薬学的に許容可能な塩をさらに提供する。
【０１１２】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、約１０００ダルトン未満、８００未満、６００未満、５００未満、４００未満、または、約３００ダルトン未満の分子量を有する小分子である。本発明の化合物の例としては、ＢＥＴファミリーメンバーの第１のブロモドメイン（例えばＢＲＤ４（以下、ＢＲＤ４（１）と称される；ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＯＳＳ）のａｐｏ結晶構造の結合ポケットに結合する、ＪＱ１およびその他の化合物が挙げられる。ＪＱ１は、新規チエノ−トリアゾロ−１，４−ジアゼピンである。本発明は、このような化合物の薬学的に許容可能な塩をさらに提供する。
【０１１３】
一態様では、本化合物は、式Ｉ、
【化１】
0005935030.tif 000002
式中、
ＸはＮまたはＣＲ５であり；
Ｒ５は、それぞれが任意選択的に置換される、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；
ＲＢは、それぞれが任意選択的に置換される、Ｈ、アルキル、ヒドロキシラルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または−ＣＯＯ−Ｒ３であり；
環Ａはアリールまたはヘテロアリールであり；
各ＲＡは独立して、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；または任意の２つのＲＡはそれにそれぞれが付着する原子と一緒に融合アリールまたはヘテロアリール基を形成し得て；
Ｒは、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；
Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ｌ（式中、ｎは０〜３であり、ＬはＨである）、−ＣＯＯ−Ｒ３、−ＣＯ−Ｒ３、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、Ｎ（Ｒ４）Ｃ（Ｏ）Ｒ３、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり；
Ｒ２はＨ、Ｄ（重水素）、ハロゲン、または任意選択的に置換されるアルキルであり；
各Ｒ３は独立して、
（ｉ）Ｈ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリール；
（ｉｉ）ヘテロシクロアルキルまたは置換ヘテロシクロアルキル；
（ｉｉｉ）Ｏ、Ｓ、またはＮから選択される、０、１、２、または３個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ２〜Ｃ８アルケニルまたは−Ｃ２〜Ｃ８アルキニル；それぞれが任意選択的に置換されていてもよい、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、置換−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル、または置換−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル；および
（ｉｖ）ＮＨ２、Ｎ＝ＣＲ４Ｒ６
からなる群から選択され；
各Ｒ４は独立して、それぞれが任意選択的に置換される、Ｈ、アルキル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；またはＲ３およびＲ４はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒になって４〜１０員環を形成し；
Ｒ６は、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；またはＲ４およびＲ６はそれにそれらが付着する炭素原子と一緒になって４〜１０員環を形成し；
ｍは０、１、２、または３であるが；
ただし
（ａ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｒ２がＨであり、ＲＢがメチルであり、Ｒ１が−（ＣＨ２）ｎ−Ｌ（式中、ｎは１であり、Ｌは−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）である）であれば、次にＲ３およびＲ４はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒にならずモルホリノ環を形成せず；
（ｂ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒが置換フェニルであり、Ｒ２がＨであり、ＲＢがメチルであり、Ｒ１が−（ＣＨ２）ｎ−Ｌ（式中、ｎは１であり、Ｌは−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）である）であり、Ｒ３でＲ４の一方がＨであれば、次にＲ３およびＲ４の他方はメチル、ヒドロキシエチル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、ピリジルまたは置換ピリジルでなく；
（ｃ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒが置換フェニルであり、Ｒ２がＨであり、ＲＢがメチルであり、Ｒ１が−（ＣＨ２）ｎ−Ｌ（式中、ｎは１であり、Ｌは−ＣＯＯ−Ｒ３である）であれば、次にＲ３はメチルでもエチルでもない
化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１１４】
特定の実施形態では、Ｒは、それぞれが任意選択的に置換される、アリールまたはヘテロアリールである。
【０１１５】
特定の実施形態では、ＬはＨ、−ＣＯＯ−Ｒ３、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、Ｎ（Ｒ４）Ｃ（Ｏ）Ｒ３または任意選択的に置換されるアリールである。特定の実施形態では、各Ｒ３は独立して、Ｈ；Ｏ、Ｓ、またはＮから選択される０、１、２、または３個のヘテロ原子を含有する−Ｃ１〜Ｃ８アルキル；またはＮＨ２、Ｎ＝ＣＲ４Ｒ６からなる群から選択される。
【０１１６】
特定の実施形態では、Ｒ２はＨ、Ｄ、ハロゲンまたはメチルである。
【０１１７】
特定の実施形態では、ＲＢは、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、またはアルコキシである。
【０１１８】
特定の実施形態では、ＲＢはメチル、エチル、ヒドロキシメチル、メトキシメチル、トリフルオロメチル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＯＥｔ、またはＣＯＯＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１１９】
特定の実施形態では、環Ａは５または６員環アリールまたはヘテロアリールである。特定の実施形態では、環Ａはチオフラニル、フェニル、ナフチル、ビフェニル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ピリジル、フラニル、インドリル、ピリミジニル、ピリジジニル、ピラジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チエニル、チアゾリル、トリアゾリル、イソオキサゾリル、キノリニル、ピロリル、ピラゾリル、または５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリニルである。
【０１２０】
特定の実施形態では、環Ａはフェニルまたはチエニルである。
【０１２１】
特定の実施形態では、ｍは１または２であり、ＲＡの少なくとも１つの存在はメチルである。
【０１２２】
特定の実施形態では、各ＲＡは独立して、Ｈ、任意選択的に置換されるアルキルであり、または任意の２つのＲＡはそれにそれぞれが付着する原子と一緒にアリールを形成し得る。
【０１２３】
別の態様では、本化合物は、式ＩＩ、
【化２】
0005935030.tif 000003
式中、
ＸはＮまたはＣＲ５であり；
Ｒ５は、それぞれが任意選択的に置換される、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；
ＲＢは、それぞれが任意選択的に置換される、Ｈ、アルキル、ヒドロキシラルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または−ＣＯＯ−Ｒ３であり；
各ＲＡは独立して、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；または任意の２つのＲＡはそれにそれぞれが付着する原子と一緒に融合アリールまたはヘテロアリール基を形成し得て；
Ｒは、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；
Ｒ’１はＨ、−ＣＯＯ−Ｒ３、−ＣＯ−Ｒ３、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり；
各Ｒ３は独立して、
（ｉ）Ｈ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール；
（ｉｉ）ヘテロシクロアルキルまたは置換ヘテロシクロアルキル；
（ｉｉｉ）Ｏ、Ｓ、またはＮから選択される、０、１、２、または３個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ２〜Ｃ８アルケニルまたは−Ｃ２〜Ｃ８アルキニル；それぞれが任意選択的に置換されていてもよい、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、置換−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル、または置換−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニルからなる群から選択され；
ｍは０、１、２、または３であるが；
ただしＲ’１が−ＣＯＯ−Ｒ３であり、ＸがＮであり、Ｒが置換フェニルであり、ＲＢがメチルであれば、次にＲ３はメチルでもエチルでもない
化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１２４】
特定の実施形態では、Ｒは、それぞれが任意選択的に置換される、アリールまたはヘテロアリールである。特定の実施形態では、Ｒは、それぞれが任意選択的に置換される、フェニルまたはピリジルである。特定の実施形態では、Ｒはｐ−Ｃｌ−フェニル、ｏ−Ｃｌ−フェニル、ｍ−Ｃｌ−フェニル、ｐ−Ｆ−フェニル、ｏ−Ｆ−フェニル、ｍ−Ｆ−フェニルまたはピリジニルである。
【０１２５】
特定の実施形態では、Ｒ’１は−ＣＯＯ−Ｒ３、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり；Ｒ３はＯ、Ｓ、またはＮから選択される、０、１、２、または３個のヘテロ原子を含有して任意選択的に置換されていてもよい、−Ｃ１〜Ｃ８アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ’１は−ＣＯＯ−Ｒ３であり、Ｒ３はメチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、またはｔ−ブチルであり；またはＲ’１はＨまたは任意選択的に置換されるフェニルである。
【０１２６】
特定の実施形態では、ＲＢはメチル、エチル、ヒドロキシメチル、メトキシメチル、トリフルオロメチル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＯＥｔ、ＣＯＯＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１２７】
特定の実施形態では、ＲＢはメチル、エチル、ヒドロキシメチル、メトキシメチル、トリフルオロメチル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＯＥｔ、またはＣＯＯＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１２８】
特定の実施形態では、各ＲＡは独立して、任意選択的に置換されるアルキルであり、または任意の２つのＲＡはそれにそれぞれが付着する原子と一緒に融合アリールを形成し得る。
【０１２９】
特定の実施形態では、各ＲＡはメチルである。
【０１３０】
別の態様では、本化合物は、式ＩＩＩ、
【化３】
0005935030.tif 000004
式中、
ＸはＮまたはＣＲ５であり；
Ｒ５は、それぞれが任意選択的に置換される、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；
ＲＢは、それぞれが任意選択的に置換される、Ｈ、アルキル、ヒドロキシラルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または−ＣＯＯ−Ｒ３であり；
環Ａはアリールまたはヘテロアリールであり；
各ＲＡは独立して、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；または任意の２つのＲＡはそれにそれぞれが付着する原子と一緒に融合アリールまたはヘテロアリール基を形成し得て；
Ｒは、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；
各Ｒ３は独立して、
（ｉ）Ｈ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリール；
（ｉｉ）ヘテロシクロアルキルまたは置換ヘテロシクロアルキル；
（ｉｉｉ）Ｏ、Ｓ、またはＮから選択される、０、１、２、または３個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ２〜Ｃ８アルケニルまたは−Ｃ２〜Ｃ８アルキニル；それぞれが任意選択的に置換されていてもよい、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、置換−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル、または置換−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル；および
（ｉｖ）ＮＨ２、Ｎ＝ＣＲ４Ｒ６
からなる群から選択され；
各Ｒ４は独立して、それぞれが任意選択的に置換される、Ｈ、アルキル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；またはＲ３およびＲ４はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒になって４〜１０員環を形成し；
Ｒ６は、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；またはＲ４およびＲ６はそれにそれらが付着する炭素原子と一緒になって４〜１０員環を形成し；
ｍは０、１、２、または３であるが；
ただし
（ａ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒがフェニルまたは置換フェニルであり、ＲＢがメチルであれば、次にＲ３およびＲ４はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒にならずモルホリノ環を形成せず；
（ｂ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒが置換フェニルであり、Ｒ２がＨであり、ＲＢがメチルであり、Ｒ３およびＲ４の一方がＨであれば、次にＲ３およびＲ４の他方はメチル、ヒドロキシエチル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、ピリジルまたは置換ピリジルでない、そして
化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１３１】
特定の実施形態では、Ｒはそれぞれが任意選択的に置換される、アリールまたはヘテロアリールである。特定の実施形態では、Ｒは、それぞれが任意選択的に置換される、フェニルまたはピリジルである。
【０１３２】
特定の実施形態では、Ｒはｐ−Ｃｌ−フェニル、ｏ−Ｃｌ−フェニル、ｍ−Ｃｌ−フェニル、ｐ−Ｆ−フェニル、ｏ−Ｆ−フェニル、ｍ−Ｆ−フェニルまたはピリジニルである。特定の実施形態では、Ｒ３はＨ、ＮＨ２、またはＮ＝ＣＲ４Ｒ６である。
【０１３３】
特定の実施形態では、各Ｒ４は独立して、それぞれが任意選択的に置換される、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールである。
【０１３４】
特定の実施形態では、Ｒ６は、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールである。
【０１３５】
別の態様では、本化合物は、式ＩＶ、
【化４】
0005935030.tif 000005
式中、
ＸはＮまたはＣＲ５であり；
Ｒ５は、それぞれが任意選択的に置換される、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；
ＲＢは、それぞれが任意選択的に置換される、Ｈ、アルキル、ヒドロキシラルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または−ＣＯＯ−Ｒ３であり；
環Ａはアリールまたはヘテロアリールであり；
各ＲＡは独立して、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；または任意の２つのＲＡはそれにそれぞれが付着する原子と一緒に融合アリールまたはヘテロアリール基を形成し得て；
Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ｌ（式中、ｎは０〜３であり、ＬはＨである）、−ＣＯＯ−Ｒ３、−ＣＯ−Ｒ３、−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、Ｎ（Ｒ３Ｒ４）、Ｎ（Ｒ４）Ｃ（Ｏ）Ｒ３、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり；
Ｒ２はＨ、Ｄ、ハロゲン、または任意選択的に置換されるアルキルであり；
各Ｒ３は独立して、
（ｉ）Ｈ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリール；
（ｉｉ）ヘテロシクロアルキルまたは置換ヘテロシクロアルキル；
（ｉｉｉ）Ｏ、Ｓ、またはＮから選択される、０、１、２、または３個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ２〜Ｃ８アルケニルまたは−Ｃ２〜Ｃ８アルキニル；それぞれが任意選択的に置換されていてもよい、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、置換−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル、または置換−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル；および
（ｉｖ）ＮＨ２、Ｎ＝ＣＲ４Ｒ６
からなる群から選択され；
各Ｒ４は独立して、それぞれが任意選択的に置換される、Ｈ、アルキル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；またはＲ３およびＲ４はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒になって４〜１０員環を形成し；
Ｒ６は、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；またはＲ４およびＲ６はそれにそれらが付着する炭素原子と一緒になって４〜１０員環を形成し；
ｍは０、１、２、または３であるが；
ただし
（ａ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒ２がＨであり、ＲＢがメチルであり、Ｒ１が−（ＣＨ２）ｎ−Ｌ（式中、ｎは０であり、Ｌは−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）である）であれば、次にＲ３およびＲ４はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒にならずモルホリノ環を形成せず；
（ｂ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒ２がＨであり、ＲＢがメチルであり、Ｒ１が−（ＣＨ２）ｎ−Ｌ（式中、ｎは０であり、Ｌは−ＣＯ−Ｎ（Ｒ３Ｒ４）である）であれば、Ｒ３およびＲ４の一方はＨであり、次にＲ３およびＲ４の他方はメチル、ヒドロキシエチル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、ピリジルまたは置換ピリジルでなく；
（ｃ）環Ａがチエニルであり、ＸがＮであり、Ｒ２がＨであり、ＲＢがメチルであり、Ｒ１が−（ＣＨ２）ｎ−Ｌ（式中、ｎは０であり、Ｌは−ＣＯＯ−Ｒ３である）であれば、次にＲ３はメチルでもエチルでもない
化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１３６】
特定の実施形態では、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎ−Ｌ（式中、ｎは０〜３であり、Ｌは−ＣＯＯ−Ｒ３、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールである）であり；Ｒ３はＯ、Ｓ、またはＮから選択される、０、１、２、または３個のヘテロ原子を含有して任意選択的に置換されていてもよい、−Ｃ１〜Ｃ８アルキルである。特定の実施形態では、ｎは１または２であり、Ｌはアルキルまたは−ＣＯＯ−Ｒ３であり、Ｒ３はメチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、またはｔ−ブチルであり；またはｎは１または２であり、ＬはＨまたは任意選択的に置換されるフェニルである。
【０１３７】
特定の実施形態では、Ｒ２はＨまたはメチルである。
【０１３８】
特定の実施形態では、ＲＢはメチル、エチル、ヒドロキシメチル、メトキシメチル、トリフルオロメチル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＯＥｔ、ＣＯＯＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１３９】
特定の実施形態では、環Ａはフェニル、ナフチル、ビフェニル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ピリジル、フラニル、インドリル、ピリミジニル、ピリジジニル、ピラジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チエニル、チアゾリル、トリアゾリル、イソオキサゾリル、キノリニル、ピロリル、ピラゾリル、または５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリニルである。
【０１４０】
特定の実施形態では、各ＲＡは独立して、任意選択的に置換されるアルキルであり、または任意の２つのＲＡはそれにそれぞれが付着する原子と一緒にアリールを形成し得る。
【０１４１】
本発明の方法はまた、式Ｖ〜ＸＸＩＩの化合物、および本明細書に記載される任意の化合物に関する。
【０１４２】
別の態様では、化合物は、式、
【化５】
0005935030.tif 000006
によって表される化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１４３】
特定の実施形態では、化合物は（＋）−ＪＱ１、
【化６】
0005935030.tif 000007
またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１４４】
別の態様では、化合物は、式、
【化７】
0005935030.tif 000008
または
【化８】
0005935030.tif 000009
によって表される化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１４５】
別の態様では、化合物は、式、
【化９】
0005935030.tif 000010
または
【化１０】
0005935030.tif 000011
によって表される化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１４６】
別の態様では、化合物は、式、
【化１１】
0005935030.tif 000012
によって表される化合物のいずれか１つ、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１４７】
別の態様では、化合物は、式、
【化１２】
0005935030.tif 000013
によって表される化合物のいずれか１つ、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１４８】
別の態様では、化合物は、以下の構造、
【化１３】
0005935030.tif 000014
【化１４】
0005935030.tif 000015
【化１５】
0005935030.tif 000016
【化１６】
0005935030.tif 000017
【化１７】
0005935030.tif 000018
【化１８】
0005935030.tif 000019
【化１９】
0005935030.tif 000020
によって表される化合物のいずれか１つ、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１４９】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、
【化２０】
0005935030.tif 000021
【化２１】
0005935030.tif 000022
【化２２】
0005935030.tif 000023
【化２３】
0005935030.tif 000024
【化２４】
0005935030.tif 000025
【化２５】
0005935030.tif 000026
の構造の１つによって表され、またはその塩、溶媒和化合物または水和物であり得る。
【０１５０】
一実施形態では、化合物は、構造
【化２６】
0005935030.tif 000027
によって表され、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１５１】
別の実施形態では、化合物は、構造
【化２７】
0005935030.tif 000028
によって表され、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１５２】
別の実施形態では、化合物は、構造
【化２８】
0005935030.tif 000029
によって表され、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１５３】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、本明細書に示される任意の化合物の逆のキラリティーを有し得る。
【０１５４】
特定の実施形態では、本化合物は、式（Ｖ）、（ＶＩ）、または（ＶＩＩ）によって表される化合物、
【化２９】
0005935030.tif 000030
（式中、Ｒ、Ｒ１、およびＲ２およびＲＢは式（Ｉ）中と同じ意味を有し；ＹはＯ、Ｎ、Ｓ、またはＣＲ５であり、Ｒ５は式（Ｉ）中と同じ意味を有し；ｎは０または１であり；式（ＶＩＩ）中の破線の円は芳香族または非芳香族環を示す）、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１５５】
式Ｉ〜ＩＶおよびＶＩ（または本明細書の任意の式）のいずれかの特定の実施形態では、Ｒ６は、下の表Ａで示されるアルデヒドの非カルボニル部分に相当する（すなわち式Ｒ６ＣＨＯのアルデヒドでは、Ｒ６はアルデヒドの非カルボニル部分である）。特定の実施形態では、Ｒ４およびＲ６は、組み合わさって、表Ａで示されるケトンの非カルボニル部分に相当する（すなわち式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｒ４のケトンでは、Ｒ４およびＲ６はケトンの非カルボニル部分である）。
【０１５６】
【表１】
0005935030.tif 000031
【０１５７】
【表２】
0005935030.tif 000032
【０１５８】
【表３】
0005935030.tif 000033
【０１５９】
【表４】
0005935030.tif 000034
【０１６０】
一実施形態では、化合物は、式、
【化３０】
0005935030.tif 000035
によって表され、またはその塩、溶媒和化合物、または水和物である。
【０１６１】
特定の実施形態では、化合物は（ラセミ）ＪＱ１であり；特定の実施形態では、化合物は（＋）−ＪＱ１である。特定の実施形態では、化合物は、
【化３１】
0005935030.tif 000036
および
【化３２】
0005935030.tif 000037
からなる群から選択される化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。
【０１６２】
化合物の追加的な例としては、式、
【化３３】
0005935030.tif 000038
【化３４】
0005935030.tif 000039
のいずれかに記載の化合物が挙げられる。
【０１６３】
式ＩＸ〜ＸＸＩＩ中では、ＲおよびＲ’は、例えば、それぞれが任意選択的に置換されていてもよい、Ｈ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、−Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、置換−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル、または置換−Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニルであり得る。式ＸＩＶ中では、Ｘは、本明細書に記載されるようなアリール基のための任意の置換基であり得る。
【０１６４】
本発明の化合物は、そのいくつかが当該技術分野で公知の多様な方法によって調製し得る。例えば、下で提供される化学物質の例は、化合物ＪＱ１（ラセミ体として）および鏡像異性体（＋）−ＪＱ１および（−）−ＪＱ１（スキームＳ１およびＳ２を参照されたい）を調製するための合成スキームを提供する。式（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）の多様な化合物は、適切な出発原料の置換により、類似法によって調製し得る。
【０１６５】
例えば、ＪＱ１から出発して、下のスキーム１に示されるようにして、類似アミンを調製し得る。
【化３５】
0005935030.tif 000040
【０１６６】
スキーム１
スキーム１に示されるように、ＪＱ１のｔ−ブチルエステルの加水分解は、カルボン酸を与え、それはジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ）で処理されて、クルチウス転位条件にさらされてＣｂｚ保護アミンを提供し、次にそれは脱保護されてアミンをもたらす。例えば還元的アミノ化による引き続くアミン基の合成は第二級アミンをもたらし、それをらにアルキル化して三級アミンを提供し得る。
【化３６】
0005935030.tif 000041
【０１６７】
スキーム２
スキーム２は、例えば、（例えば式Ｉの環Ａを異なる芳香族環で置換することで）その中で融合環コアが修飾される、式Ｉの本発明の化合物のさらなる実施例の合成を示す。（例えば後述のスキームＳ１中のアミノジアリールケトンＳ２に代えて）適切な官能性を有するアミノジアリールケトンを使用することで、多様な融合環コアおよび／または付属アリール基（式Ｉの基Ｒに対応する）を有する新しい化合物を提供する。このようなアミノジアリールケトンは市販され、またはそのいくつかが当該技術分野で公知の多様な方法によって調製され得る。
【０１６８】
スキーム３は、さらなる本発明の化合物を調製するための追加的な例示的合成スキームを提供する。
【化３７】
0005935030.tif 000042
【０１６９】
スキーム３
スキーム３で示されるように、融合二環式前駆体（この化合物の合成については後述のスキームＳ１を参照されたい）を部分Ｒ（ＤＡＭ＝ジメチルアミノメチレン保護基）で官能化し、次にヒドラジドとの反応によって合成して、三環式融合コアを形成する。置換基Ｒｘは、適切なヒドラジドの選択によって変化させ得る。
【０１７０】
（本明細書に記載される方法によって調製し得る）本発明の化合物の追加的な実施例としては、以下が挙げられる。
【０１７１】
アミド
アミドは、例えば対応するカルボン酸またはエステルの調製と、それに続く標準条件を使用した適切なアミンでのアミド化によって、調製し得る。特定の実施形態では、アミドは、末端末端窒素含有環（例えばピリジル、ピペリジル、ピペラジニル、イミダゾリル（Ｎ−メチル−イミダゾリルを含む）、モルホリニルなどとの二炭素「リンカー」を提供する。例示的なアミド構造としては、
【化３８】
0005935030.tif 000043
が挙げられる。
【０１７２】
アミド部分と末端窒素含有環の間の二炭素リンカーの使用が好ましい。
【０１７３】
「逆方向アミド」
【化３９】
0005935030.tif 000044
【０１７４】
第二級アミン
【化４０】
0005935030.tif 000045
【０１７５】
ボロン酸
【化４１】
0005935030.tif 000046
【０１７６】
特定の実施形態では、少なくとも１つのキラル中心を有する化合物が、ラセミ形態で存在する。特定の実施形態では、少なくとも１つのキラル中心を有する化合物が、鏡像異性的に濃縮され、すなわち少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９％または１００％の鏡像体過剰率（ｅ．ｅ．）を有する。特定の実施形態では、化合物は、本明細書に記載される化合物（＋）−ＪＱ１（（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾール［４，３−ａ］［１，４］ジアゼパム−６−イル）アセテート）と同一の絶対配置を有する。
【０１７７】
本明細書で開示される式のいずれかの特定の実施形態では、化合物は以下の構造によって表されない。
【化４２】
0005935030.tif 000047
式中、
Ｒ’１はＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ’２は水素、ハロゲン、またはハロゲン原子またはヒドロキシル基で任意選択的に置換されるＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ’３はハロゲン原子、任意選択的にハロゲン原子によって置換されるフェニル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはシアノ；−ＮＲ５−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６（式中、Ｒ５は水素原子またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ｍは０〜４の整数であり、Ｒ６は任意選択的にハロゲン原子によって置換されるフェニルまたはピリジルである）；または−ＮＲ７−ＣＯ−−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ８（式中、Ｒ７は水素原子またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ｎは０〜２の整数であり、Ｒ８は任意選択的にハロゲン原子によって置換されるフェニルまたはピリジルである）であり；
Ｒ’４は−（ＣＨ２）ａ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ９（式中、ａは１〜４の整数であり、Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルである）；Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル；Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ；または任意選択的にＣ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、アミノまたはヒドロキシル基または−（ＣＨ２）ｂ−ＣＯＯＲ１０（式中、ｂは１〜４の整数であり、Ｒ１０はＣ１〜Ｃ４アルキルである）によって置換されるフェニルまたはピリジルである。
【０１７８】
「薬学的に許容可能な塩」という用語はまた、本明細書で開示される化合物（例えばＪＱ１、式Ｉ〜ＸＸＩＩの化合物）または本明細書で記述される任意のその他の化合物から調製されて、カルボン酸官能基などの酸性官能基、および薬学的に許容可能な無機または有機塩基を有する塩を指す。適切な塩基としては、ナトリウム、カリウム、およびリチウムなどのアルカリ金属の水酸化物；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物；アルミニウムおよび亜鉛などのその他の金属の水酸化物；アンモニア、および非置換またはヒドロキシ置換モノ−、ジ−、またはトリアルキルアミンなどの有機アミン；ジシクロヘキシルアミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ−メチル，Ｎ−エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン；モノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）−アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、またはトリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミンなどのモノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシ−低級アルキルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−アミンなどのＮ、Ｎ，−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシ低級アルキル）−アミン、またはトリ−（２−ヒドロキシエチル）アミン）；Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン；およびアルギニン、リジンなどのアミノ酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。「薬学的に許容できる塩」という用語は、本明細書で開示される化合物または本明細書で記述される任意のその他の化合物から調製されて、アミノ官能基などの塩基性官能基、および薬学的に許容可能な無機または有機酸を有する塩も指す。適切な酸としては、硫酸水素、クエン酸、酢酸、シュウ酸、塩酸、臭化水素、ヨウ化水素、硝酸、リン酸、イソニコチン酸、乳酸、サリチル酸、酒石酸、アスコルビン酸、コハク酸、マレイン酸、ベシル酸、フマル酸、グルコン酸、グルカロン酸、糖酸、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、およびｐ−トルエンスルホン酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１７９】
Ｂｒｄ４を阻害する小型化合物に加えて、本発明は、Ｂｒｄ４の発現または生物学的活性を阻害する、その他の作用物質をさらに提供する。
【０１８０】
阻害性核酸
本発明は、Ｂｒｄ４の発現または活性を阻害する阻害性核酸分子と、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害、脊髄形成異常症を治療するためのこのような作用物質の使用とをさらに提供する。このようなオリゴヌクレオチドとしては、Ｂｒｄ４をコードする核酸分子（例えば、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）に結合する一本鎖および二本鎖核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそのアナログ）、ならびにＢｒｄ４に直接結合してその生物学的活性を調節する核酸分子（例えば、アプタマー）が挙げられる。
【０１８１】
リボザイム
本発明のアンチセンスＢｒｄ４配列を含む触媒ＲＮＡ分子またはリボザイムを使用して、生体内でＢｒｄ４核酸分子の発現を阻害し得る。アンチセンスＲＮＡ内へのリボザイム配列の包含は、それらにＲＮＡ切断活性を与え、したがってコンストラクトの活性を増大させる。標的ＲＮＡ特異的リボザイムのデザインおよび使用は、そのそれぞれを参照によって援用する、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８；３３４：５８５−５９１および米国特許出願公開第２００３／０００３４６９Ａ１号明細書に記載される。
【０１８２】
したがって、本発明はまた、８〜１９個の連続核酸塩基を有するアンチセンスＲＮＡを結合アーム中に含む、触媒ＲＮＡ分子を特徴とする。本発明の好ましい実施形態では、触媒核酸分子は、ハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフに形成される。このようなハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １９９２；８：１８３によって記載される。ヘアピンモチーフの例は、１９８８年９月２０日に出願された米国特許出願第０７／２４７，１００号明細書の一部継続出願である、１９８９年９月２０日に出願されたＨａｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“ＲＮＡ  Ｃａｔａｌｙｓｔ  ｆｏｒ  Ｃｌｅａｖｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”、Ｈａｍｐｅｌ  ａｎｄ  Ｔｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８９；２８：４９２９、およびＨａｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９０；１８：２９９に記載される。これらの特異的モチーフは本発明を制限するものではなく、当業者は、本発明の酵素核酸分子で重要なのは、それが標的遺伝子ＲＮＡ領域の１つまたは複数に相補的な特異的基質結合部位を有し、また基質結合部位内または周囲に、分子にＲＮＡ切断活性を与えるヌクレオチド配列を有することだけであると認識する。
【０１８３】
小型ヘアピンＲＮＡは、任意選択の３’ＵＵ−オーバーハングがあるステムループ構造からなる。変動してもよいが、ステムは、２１〜３１ｂｐ（望ましくは２５〜２９ｂｐ）の範囲であり得て、ループは４〜３０ｂｐ（望ましくは４〜２３ｂｐ）の範囲であり得る。細胞内におけるｓｈＲＮＡの発現のためには、ポリメラーゼＩＩＩ  Ｈ１−ＲＮＡまたはＵ６プロモーターのどちらかを含有するプラスミドベクター、ステムループＲＮＡインサートのためのクローニング部位、および４−５チミジン転写終結シグナルを用い得る。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、概して明確に定義された開始および終結部位を有し、それらの転写物にはポリ（Ａ）尾部が欠如している。これらのプロモーターの終結シグナルはポリチミジントラクトによって規定され、転写物は、典型的に第２のウリジンの後で切断される。この位置での切断からは、発現されるｓｈＲＮＡ中の３’ＵＵオーバーハングが生じ、それは合成ｓｉＲＮＡ中の３’オーバーハングと類似する。哺乳類細胞内でｓｈＲＮＡを発現する追加的な方法は、上で引用した参考文献に記載される。
【０１８４】
ｓｉＲＮＡ
短い２１〜２５ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡは、下方制御遺伝子発現に効果的である（参照によって本明細書に援用するＺａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ１０１：２５−３３；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００１；４１１：４９４−４９８）。哺乳類におけるｓｉｒＮＡアプローチの治療有効性は、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００２；４１８：３８−３９によって生体内で実証された。
【０１８５】
標的遺伝子の配列を前提として、ｓｉＲＮＡは、遺伝子を不活性化するようにデザインされてもよい。このようなｓｉＲＮＡは、例えば、罹患組織に直接投与し、または全身投与し得る。Ｂｒｄ４遺伝子の核酸配列を使用して、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をデザインし得る。２１〜２５ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、例えば血管疾患または障害を治療する治療薬として使用してもよい。
【０１８６】
本発明の阻害性核酸分子は、Ｂｒｄ４発現のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）媒介ノックダウンのための二本鎖ＲＮＡとして用いられてもよい。一実施形態では、Ｂｒｄ４発現が、造血細胞または白血病細胞内で低減される。ＲＮＡｉは、関心のある特定タンパク質の細胞発現を低下させる方法である。（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ２００１；２：２３９−２４５；Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．２０００；１５：４８５−４９０；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．２００２；１２：２２５−２３２；およびＨａｎｎｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００２；４１８：２４４−２５１でレビューされる。ｄｓＲＮＡの形質移入による、またはプラスミドベースの発現系を使用したｓｉＲＮＡ発現を通じた、ｓｉＲＮＡの細胞内への導入は、哺乳類細胞において機能喪失表現型を作り出すために、ますます盛んに用いられるようになっている。
【０１８７】
本発明の一実施形態では、本発明の核酸塩基オリゴマーの８〜１９個の連続核酸塩基を含む、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子が作成される。ｄｓＲＮＡは、二重鎖化した２本の個別のＲＮＡ鎖、または自己二重鎖化した単一ＲＮＡ鎖（小型ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ）であり得る。典型的に、ｄｓＲＮＡは約２１または２２塩基対であるが、所望ならばより短くまたはより長くあってもよい（最大２９核酸塩基まで）。ｄｓＲＮＡは、標準的な技術（例えば、化学合成または生体外転写）を使用して作成し得る。例えば、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）およびＥｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのキットが利用できる。ｄｓＲＮＡを哺乳類細胞内で発現させる方法は、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２００２；２９６：５５０−５５３；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ．２００２；１６：９４８−９５８；Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；２０：５０５−５０８；Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２；９９：５５１５−５５２０；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２；９９：６０４７−６０５２；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；２０：４９７−５００；およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；２０：５００−５０５に記載される。
【０１８８】
小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ステムループ構造を有するＲＮＡ配列を含んでなる。「ステムループ構造」は、主に一本鎖ヌクレオチドである領域（ループ部分）によって片側が連結する、二本鎖または二重鎖（ステム部分）を形成することが知られているまたは予測されるヌクレオチド領域を含む、二次構造を有する核酸を指す。「ヘアピン」という用語はまた、本明細書でステムループ構造を指すために使用される。このような構造は、当該技術分野で周知であり、用語は、当該技術分野におけるその公知の意味で、一貫して使用される。当該技術分野で公知であるように、二次構造は正確な塩基対合を要求しない。したがってステムは、１つまたは複数の塩基ミスマッチまたはバルジを含み得る。代案としては、塩基対合は正確であり得て、すなわちいかなるミスマッチも含まない。複数ステムループ構造は、例えば、核酸リンカー、ｍｉＲＮＡフランキング配列、その他の分子、またはその組み合わせなどのリンカーを通じて、互いに連結し得る。
【０１８９】
本明細書の用法では、「小型ヘアピンＲＮＡ」という用語は、前駆型ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）を形成する、従来型ステムループｓｈＲＮＡを含む。範囲がいくらか変動してもよいが、従来のステムループｓｈＲＮＡは、１９〜２９ｂｐの範囲にわたるステムと、４〜３０ｂｐの範囲にわたるループを含んでなり得る。「ｓｈＲＮＡ」は、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ包埋ｓｈＲＮＡ（ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡ）もまた含み、その中ではｍｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖およびパッセンジャー鎖が既存の（または天然）ｍｉＲＮＡ内にまたは修飾または合成（デザインされた）ｍｉＲＮＡ内に組み込まれる。場合によっては前駆体ｍｉＲＮＡ分子は、２つ以上のステムループ構造を含みえる。ＭｉｃｒｏＲＮＡは、約２２ヌクレオチド長の内因性にコードされたＲＮＡ分子であり、概して高度に組織または発達段階特異的な様式で発現され、転写後に標的遺伝子を調節する。２００個を超える別個のｍｉＲＮＡが、植物および動物で同定されている。これらの小型調節ＲＮＡは、（１）標的ｍＲＮＡ翻訳を阻止することで、および（２）ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、すなわちｍＲＮＡの切断および分解を通じて、の２つの支配的な作用様式で、重要な生物学的機能を果たすと考えられる。後者の場合、ｍｉＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に類似して機能する。したがって、既存のｍｉＲＮＡ遺伝子の特徴に基づいて、人工ｍｉＲＮＡをデザインし発現させ得る。
【０１９０】
この点において、短いヘアピンＲＮＡをデザインして、内在性ｍｉＲＮＡを模倣させ得る。多数のｍｉＲＮＡ中間体は、制限なしに、ｍｉＲ−１５ａ、−１６、−１９ｂ、−２０、−２３ａ、−２７ｂ、−２９ａ、−３０ｂ、−３０ｃ、−１０４、−１３２ｓ、−１８１、−１９１、−２２３の主鎖デザインを含んでなるｍｉＲＮＡをはじめとする、ｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡｍｉｒのモデルとして使用し得る（米国特許公開２００５／００７５４９２第号明細書を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡ分子は、ヒトｍｉＲ−３０配列に基づいてデザインされ、ｐｒｉ−ｍｉＲ−３０のステム配列を無関係の塩基対合配列で置換することで再設計して、人工ｓｈＲＮＡを発現できるようにする。（Ｓｉｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：２２７−２３１；Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７：１２８１−１２８８）；Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  ９：１３２７−１３３３）。ｍｉＲ−３０の天然ステム配列を長さ約１６〜約２９ヌクレオチド、特に長さ約１９〜２９ヌクレオチドのステム配列で置換し得る。ループ配列は、長さが約４〜約２３ヌクレオチドになるように改変し得る。一実施形態では、ｓｈＲＮＡ分子のステムは、長さが約２２ヌクレオチドである。別の実施形態では、ステムは、長さが約２９ヌクレオチドである。したがって、本発明は、合成的に生成されたｓｈＲＮＡ、ならびに天然に見られるｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を使用して実施し得て、再構築して短いヘアピンＲＮＡの合成サイレンシングとして機能させ得る。
【０１９１】
ｓｈＲＮＡはＤＮＡベクターから発現して、持続性のサイレンシングおよびほとんどあらゆる細胞型への高収率の送達を提供し得る。いくつかの実施形態では、ベクターはウィルスベクターである。例示的なウイルスベクターとしては、レンチウィルス、アデノウィルス、バキュロウィルスおよび鳥類ウイルスベクターをはじめとするレトロウイルスが挙げられ、安定した単一コピーゲノムの組み込みができるようにするベクターを含む。レトロウイルスプラスミドベクターがそれに由来するレトロウィルスとしては、モロニーマウス白血病ウィルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウィルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。レトロウイルスプラスミドベクターを用いてパッケージング細胞系を形質導入して、産生細胞系を形成し得る。形質移入し得るパッケージング細胞の例としては、その内容全体を参照によって本明細書に援用するＭｉｌｌｅｒ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４（１９９０）に記載されるような、ＰＥ５０ｌ、ＰＡ３ｌ７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞系が挙げられるが、これに限定されるものではない。ベクターは、当該技術分野で公知の任意の手段を通じて、パッケージング細胞に形質導入し得る。産生細胞系は、ＤＮＡ複製タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、感染性レトロウィルスベクター粒子を産出する。次にこのようなレトロウィルスベクター粒子を用いて、生体外または生体内のどちらかで、真核生物細胞を形質導入し得る。形質導入された真核生物細胞は、ＤＮＡ複製タンパク質を発現する。
【０１９２】
本質的に、細胞内に核酸コンストラクトを導入する任意の方法を用い得る。核酸を導入する物理的方法としては、コンストラクト含有溶液の注入、コンストラクトによって被覆された粒子による衝撃、細胞または組織サンプルまたは生物の核酸溶液への浸漬、またはコンストラクト存在下における細胞膜の電気穿孔が挙げられる。ウィルス粒子内にパッケージされたウィルス性コンストラクトを使用して、細胞内への発現コンストラクトの効率的な導入と、コードされたｓｈＲＮＡの転写の双方を達成し得る。脂質媒介キャリア輸送、リン酸カルシウムなどの化学媒介輸送などの核酸を細胞に導入する、その他の当該技術分野で公知の方法を使用し得る。したがってｓｈＲＮＡをコードする核酸コンストラクトを以下の機能の１つまたは複数を果たす構成要素と共に導入し得る：細胞によるＲＮＡ取り込みを高める、二重鎖のアニーリングを促進する、アニールした鎖を安定化する、またはさもなければ標的遺伝子の阻害を増大する。
【０１９３】
細胞内発現のために、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのどちらかを含んでなるプラスミドベクターなどのＤＮＡベクターを用い得る。内在性ｍｉＲＮＡの発現はＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモーターによって制御され、場合によっては、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと比較して、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターによって最も効率的に駆動される（Ｄｉｃｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３９：９１４−９２１）。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡの発現は、制限なしに、ＲＮＡポリメラーゼタイプＩＩプロモーターをはじめとする、誘導性プロモーターまたは条件的発現系によって制御され得る。本発明の文脈で有用なプロモーターの例は、（ＴＲＥ−ｔｉｇｈｔをはじめとする）テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、テトラサイクリントランス活性化因子系、および逆テトラサイクリントランス活性化因子（ｒｔＴＡ）系である。構成的プロモーターもまた使用し得て、細胞特異的または組織特異的プロモーターについても同様である。多数のプロモーターは遍在性であり、それらは任意の細胞および組織型で発現される。特定の実施形態は、生体外および生体内研究における最も効果的な条件的遺伝子発現系の１つである、テトラサイクリン応答性プロモーターを使用する。誘導性ｓｈＲＮＡの説明については、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０９０１（国際公開第２００４−０２９２１９Ａ２号パンフレット）およびＦｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １１：９７５−９８２を参照されたい。
【０１９４】
小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ステムループ構造を有するＲＮＡ配列を含んでなる。「ステムループ構造」は、主に一本鎖ヌクレオチドである領域（ループ部分）によって片側が連結する、二本鎖または二重鎖（ステム部分）を形成することが知られているまたは予測されるヌクレオチド領域を含む、二次構造を有する核酸を指す。「ヘアピン」という用語はまた、本明細書でステムループ構造を指すのに使用される。このような構造は、当該技術分野で周知であり、用語は、当該技術分野におけるその公知の意味で、一貫して使用される。当該技術分野で公知であるように、二次構造は正確な塩基対合を要求しない。したがってステムは、１つまたは複数の塩基ミスマッチまたはバルジを含み得る。代案としては、塩基対合は正確であり得て、すなわちいかなるミスマッチも含まない。複数ステムループ構造は、例えば、核酸リンカー、ｍｉＲＮＡフランキング配列、その他の分子、またはその組み合わせなどのリンカーを通じて、互いに連結し得る。
【０１９５】
本明細書の用法では、「小型ヘアピンＲＮＡ」という用語は、前駆型ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）を形成する、従来型ステムループｓｈＲＮＡを含む。範囲がいくらか変動してもよいが、従来のステムループｓｈＲＮＡは、１９〜２９ｂｐの範囲にわたるステムと、４〜３０ｂｐの範囲にわたるループを含んでなり得る。「ｓｈＲＮＡ」は、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ包埋ｓｈＲＮＡ（ｍｉＲＮＡベースのｓｈＲＮＡ）もまた含み、その中ではｍｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖およびパッセンジャー鎖が既存の（または天然）ｍｉＲＮＡ内にまたは修飾または合成（デザイン）ｍｉＲＮＡ内に組み込まれる。場合によっては前駆体ｍｉＲＮＡ分子は、２つ以上のステムループ構造を含み得る。ＭｉｃｒｏＲＮＡは、約２２ヌクレオチド長の内因性にコードされたＲＮＡ分子であり、概して高度に組織または発達段階特異的な様式で発現され、転写後に標的遺伝子を調節する。２００個を超える別個のｍｉＲＮＡが、植物および動物で同定されている。これらの小型調節ＲＮＡは、２つの支配的な作用様式で、すなわち、（１）標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制することにより、および（２）ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、すなわちｍＲＮＡの切断および分解を通じて、重要な生物学的機能を果たすと考えられる。後者の場合、ｍｉＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に類似して機能する。したがって、既存のｍｉＲＮＡ遺伝子の特徴に基づいて、人工ｍｉＲＮＡをデザインし発現し得る。
【０１９６】
この点において、短いヘアピンＲＮＡをデザインして、内在性ｍｉＲＮＡを模倣し得る。多数のｍｉＲＮＡ中間体は、制限なしに、ｍｉＲ−１５ａ、−１６、−１９ｂ、−２０、−２３ａ、−２７ｂ、−２９ａ、−３０ｂ、−３０ｃ、−１０４、−１３２ｓ、−１８１、−１９１、−２２３の主鎖デザインを含んでなるｍｉＲＮＡをはじめとする、ｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡｍｉｒのモデルとして使用し得る（米国特許公開２００５／００７５４９２第号明細書を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡ分子は、ヒトｍｉＲ−３０配列に基づいてデザインされ、ｐｒｉ−ｍｉＲ−３０のステム配列を無関係の塩基対合配列で置換することで再設計して、人工ｓｈＲＮＡを発現できるようにする。（Ｓｉｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：２２７−２３１；Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７：１２８１−１２８８）；Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ９：１３２７−１３３３）。ｍｉＲ−３０の天然ステム配列を長さ約１６〜約２９ヌクレオチド、特に長さ約１９〜２９ヌクレオチドのステム配列で置換し得る。ループ配列は、長さが約４〜約２３ヌクレオチドになるように改変し得る。一実施形態では、ｓｈＲＮＡ分子のステムは、長さが約２２ヌクレオチドである。別の実施形態では、ステムは、長さが約２９ヌクレオチドである。したがって、本発明は、合成的に生成されたｓｈＲＮＡ、ならびに天然に見られるｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を使用して実施し得て、再構築して短いヘアピンＲＮＡの合成サイレンシングとして機能させ得る。
【０１９７】
ｓｈＲＮＡはＤＮＡベクターから発現して、持続性のサイレンシングおよびほとんどあらゆる細胞型への高収率の送達を提供し得る。いくつかの実施形態では、ベクターはウィルスベクターである。例示的なウイルスベクターとしては、レンチウィルス、アデノウィルス、バキュロウィルスおよび鳥類ウイルスベクターをはじめとするレトロウイルスが挙げられ、安定した単一コピーゲノムの組み込みができるようにするベクターを含む。レトロウイルスプラスミドベクターがそれに由来するレトロウィルスとしては、モロニーマウス白血病ウィルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウィルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。レトロウイルスプラスミドベクターを用いてパッケージング細胞系を形質導入して、産生細胞系を形成し得る。形質移入し得るパッケージング細胞の例としては、その内容全体を参照によって本明細書に援用するＭｉｌｌｅｒ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ１：５−１４（１９９０）に記載されるような、ＰＥ５０ｌ、ＰＡ３ｌ７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞系が挙げられるが、これに限定されるものではない。ベクターは、当該技術分野で公知の任意の手段を通じて、パッケージング細胞に形質導入し得る。産生細胞系は、ＤＮＡ複製タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、感染性レトロウィルスベクター粒子を産出した。次にこのようなレトロウィルスベクター粒子を用いて、生体外または生体内のどちらかで、真核生物細胞を形質導入し得る。形質導入された真核生物細胞は、ＤＮＡ複製タンパク質を発現する。
【０１９８】
本質的に、細胞内に核酸コンストラクトを導入する任意の方法を用い得る。核酸を導入する物理的方法としては、コンストラクト含有溶液の注入、コンストラクトによって被覆された粒子による衝撃、細胞または組織サンプルまたは生物の核酸溶液への浸漬、またはコンストラクト存在下における細胞膜の電気穿孔が挙げられる。ウィルス粒子内にパッケージされたウィルス性コンストラクトを使用して、細胞内への発現コンストラクトの効率的な導入と、コードされたｓｈＲＮＡの転写の双方を達成し得る。脂質媒介キャリア輸送、リン酸カルシウムなどの化学媒介輸送などの核酸を細胞に導入する、その他の当該技術分野で公知の方法を使用し得る。したがってｓｈＲＮＡをコードする核酸コンストラクトを以下の機能の１つまたは複数を果たす構成要素と共に導入し得る：細胞によるＲＮＡ取り込みを高める、二重鎖のアニーリングを促進する、アニールした鎖を安定化する、またはさもなければ標的遺伝子の阻害を増大する。
【０１９９】
細胞内発現のために、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのどちらかを含んでなるプラスミドベクターなどのＤＮＡベクターを用い得る。内在性ｍｉＲＮＡの発現はＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーターによって制御され、場合によっては、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと比較して、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターによって最も効率的に駆動される（Ｄｉｃｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３９：９１４−９２１）。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡの発現は、制限なしに、ＲＮＡポリメラーゼタイプＩＩプロモーターをはじめとする、誘導性プロモーターまたは条件的発現系によって制御され得る。本発明の文脈で有用なプロモーターの例は、（ＴＲＥ−ｔｉｇｈｔをはじめとする）テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、テトラサイクリントランス活性化因子系、および逆テトラサイクリントランス活性化因子（ｒｔＴＡ）系である。構成的プロモーターもまた使用し得て、細胞特異的または組織特異的プロモーターについても同様である。多数のプロモーターは遍在性であり、それらは任意の細胞および組織型で発現される。特定の実施形態は、生体外および生体内研究における最も効果的な条件的遺伝子発現系の１つである、テトラサイクリン応答性プロモーターを使用する。誘導性ｓｈＲＮＡの説明については、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０９０１（国際公開第２００４−０２９２１９Ａ２号パンフレット）およびＦｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １１：９７５−９８２を参照されたい。
【０２００】
核酸塩基オリゴマーの送達
裸の阻害性核酸分子、またはそのアナログは、哺乳類細胞に入って、例えばＢｒｄ４などの関心のある遺伝子発現を抑制することができる。それでもなお、オリゴヌクレオチドまたはその他の核酸塩基オリゴマーの細胞への送達を助ける製剤を利用するのが、望ましいことがある。（例えば、それぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，６５６，６１１号明細書、米国特許第５，７５３，６１３号明細書、米国特許第５，７８５，９９２号明細書、米国特許第６，１２０，７９８号明細書、米国特許第６，２２１，９５９、米国特許第６，３４６，６１３号明細書、および米国特許第６，３５３，０５５号明細書を参照されたい）。
【０２０１】
治療薬
別の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して、薬理効果を有することが発見された作用物質（例えばＪＱ１または本明細書に記述される式の化合物）は、薬剤として、または合理的薬物設計による既存化合物の構造的修飾の情報として有用である。治療用途では、本明細書で開示される方法を使用して同定された組成物または作用物質は、例えば生理的食塩水などの薬理的に許容可能な緩衝液中に配合して、全身投与してもよい。好ましい投与経路としては、例えば、患者中で連続的な持続性薬剤レベルを提供する、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または皮内注射が挙げられる。ヒト患者またはその他の動物の治療は、生理学的に許容可能なキャリア中の本明細書で同定された治療薬の治療的有効量を使用して実施される。適切なキャリアおよびそれらの処方については、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載される。投与される治療薬の量は、投与様式、患者の年齢と体重、および白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症、および骨髄増殖性障害）の臨床症状次第で変動する。一般に、量は、白血病と関連付けられているその他の疾患の治療で使用されるその他の作用物質で使用される量の範囲内であるが、場合によっては、化合物の特異性増大のためにより少ない量が必要とされる。化合物は、当業者に知られている方法による測定で、または細胞増殖または生存度を測定するアッセイを使用した測定で、がん細胞の増殖、成長または生存を低下させる投与量で投与される。
【０２０２】
医薬組成物の処方
白血病治療のための化合物投与は、その他の構成要素と組み合わさって、白血病細胞の増殖または生存を低下させるのに効果的な治療薬濃度をもたらす、あらゆる適切な手段によってもよい。化合物は、任意の適切なキャリア物質中に任意の適切な量で含有されてもよく、通常、組成物総重量の１〜９５重量％の量で存在する。組成物は、非経口（例えば皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内）投与経路に適した剤形で提供されてもよい。医薬組成物は、従来の製薬慣行に従って調合してもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００およびＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。特定の一実施形態では、本発明の作用物質は、対象に直接、全身投与される。
【０２０３】
ヒト投与量は、最初に、マウスで使用される化合物量の外挿によって決定し得て、当業者は認識するように、これは動物モデルと比較してヒトのための投与量を変更する、技術分野におけるルーチンである。一実施形態では、本発明の作用物質は、５０ｍｇ／ｋｇで経口または全身投与される。特定の他の実施形態では、投与量が、約１μｇ化合物／Ｋｇ体重〜約５０００ｍｇ化合物／Ｋｇ体重；または約５ｍｇ／Ｋｇ体重〜約４０００ｍｇ／Ｋｇ体重または約１０ｍｇ／Ｋｇ体重〜約３０００ｍｇ／Ｋｇ体重；または約５０ｍｇ／Ｋｇ体重〜約２０００ｍｇ／Ｋｇ体重；または約１００ｍｇ／Ｋｇ体重〜約１０００ｍｇ／Ｋｇ体重；または約１５０ｍｇ／Ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／Ｋｇ体重の間で変動してもよいことが予期される。別の実施形態では、この用量は、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、または５０００ｍｇ／Ｋｇ体重であってもよい。別の実施形態では、用量は、約５ｍｇ化合物／Ｋｇ体重〜約１００ｍｇ化合物／Ｋｇ体重の範囲内であってもよいことが想定される。別の実施形態では、用量は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ｍｇ／Ｋｇ体重であってもよい。もちろん、この投与量は、このような治療プロトコルで慣例的に行われるように、初期臨床試験の結果と特定患者のニーズに応じて、上向きまたは下向きに調節してもよい。
【０２０４】
本発明に従った医薬組成物は、投与時に実質的に即座に、または投与後の任意の所定時間または期間に、活性化合物を放出するように調合してもよい。後者の種類の組成物は、一般に放出制御製剤として知られ、以下が挙げられる（ｉ）体内で長期にわたり実質的に定濃度の薬剤をもたらす製剤；（ｉｉ）所定の遅延時間後に、体内で長期にわたり実質的に定濃度の薬剤をもたらす製剤；（ｉｉｉ）活性物質の血漿レベルのゆらぎ（鋸歯状動態パターン）と関連付けられている望ましくない副作用を同時に最小化しながら、体内で比較的一定した効果的レベルを保つことで、所定期間中に作用を維持する製剤；（ｉｖ）例えば、胸線に隣接しまたは接触する、放出制御組成物の空間配置によって、作用を局在化させる製剤；（ｖ）用量が例えば１週間または２週間毎に投与されるような、便利な投与ができるようにする製剤；および（ｖｉ）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症、および骨髄増殖性障害をはじめとするがこれに限定されるものではない白血病を標的とする製剤。いくつの用途では、放出制御製剤は、日中に血漿レベルを治療レベルに保つための頻繁な投与に対する必要性をなくす。
【０２０５】
放出速度が、問題になっている化合物の代謝率を補って余りある、放出制御を得るために、いくつかのストラテジーを追究し得る。一例では、放出制御は、例えば、様々な種類の放出制御組成物およびコーティングを含む、様々な処方パラメータおよび成分の適切な選択によって得られる。したがって、治療薬は、適切な賦形剤と共に医薬組成物に調合され、それは投与時に、治療薬を制御された様式で放出する。実施例としては、一単位または複数単位の錠剤またはカプセル組成物、油剤、懸濁液、エマルション、マイクロカプセル、微小球、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、およびリポソームが挙げられる。
【０２０６】
非経口組成物
医薬組成物は、投薬形態または製剤での注射、輸液または移植（皮下、静脈内に、筋肉内、腹腔内、など）によって、または従来の無毒の薬学的に許容可能なキャリアおよびアジュバントを含有する適切な送達デバイスまたはインプラントを介して、非経口的に投与してもよい。このような組成物の処方および調製は、製剤処方当業者に周知である。処方は、前出のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙにある。
【０２０７】
非経口用の組成物は、単位用量形態（例えば単回投与アンプル）で、またはその中に適切な保存料が添加されても良い、数回の用量を含有するバイアルで提供されてもよい（下記参照）。組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、輸液用器具、または埋め込み用送達デバイスの形態であってもよく、またはそれは、使用前に水または別の適切なビヒクルで戻される乾燥粉末として提示されてもよい。白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させる活性薬剤の他に、組成物は、適切な非経口的に許容可能なキャリアおよび／または賦形剤を含むこともできる。活性治療薬は、放出制御のために、微小球、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに組み込まれてもよい。さらに、組成物は、懸濁化剤、可溶化剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、浸透圧調節剤、および／または分散剤を含んでもよい。
【０２０８】
上述の通り、本発明に従った医薬組成物は、無菌注射に適した形態であってもよい。このような組成物を調製するために、適切な治療薬を非経口的に許容可能な液体ビヒクルに溶解または懸濁する。用いてもよい許容可能ビヒクルおよび溶剤は、水、適量の塩酸または水酸化ナトリウムまたは適切な緩衝液の添加によって適切なｐＨに調節された水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液、および等張の塩化ナトリウム溶液とデキストロース溶液である。水性製剤は、１つまたは複数の保存料（例えばメチル、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート）もまた含有してもよい。場合によっては、化合物の１つが難溶性またはわずかに水溶性であれば、溶解促進剤または可溶化剤を添加し得て、または溶媒に１０〜６０％ｗ／ｗのプロピレングリコールなどを含めることもできる。
【０２０９】
放出制御非経口組成物
放出制御非経口組成物は、水性懸濁液、微小球、マイクロカプセル、磁性微小球、油剤、油懸濁液、またはエマルションの形態であってもよい。代案としては、活性薬剤は、生体適合性キャリア、リポソーム、ナノ粒子、インプラント、または輸液用器具に組み込まれてもよい。
【０２１０】
微小球および／またはマイクロカプセル調製品で使用するための材料は、例えばポリガラクチン、ポリ−（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）、およびポリ（乳酸）などの生分解性／生体内分解性のポリマーである。放出制御非経口製剤を処方する際に使用してもよい生体適合性キャリアは、炭水化物（例えばデキストラン）、タンパク質（例えばアルブミン）、リポタンパク、または抗体である。インプラントで使用するための材料は、非生分解性（例えばポリジメチルシロキサン）、または生分解性（例えばポリ（カプロラクタム）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）またはポリ（オルトエステル）またはその組み合わせ）であり得る。
【０２１１】
経口使用のための固体剤形
経口使用のための製剤としては、無毒の薬学的に許容可能な賦形剤との混合物中の活性成分を含有する錠剤が挙げられる。このような製剤は、当業者に知られている。賦形剤は例えば、不活性希釈剤または増量剤（例えばスクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶セルロース、ジャガイモデンプンを含むデンプン類、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）；顆粒化剤および崩壊剤（例えば、微結晶セルロースを含むセルロース誘導体、ジャガイモデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩、またはアルギン酸）；結合剤（例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、α化デンプン、微結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはポリエチレングリコール）；および平滑剤、流動促進剤、および粘着防止剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油、または滑石）であってもよい。その他の薬学的に許容可能な賦形剤は、着色剤、着香剤、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤などであり得る。
【０２１２】
錠剤は、未被覆であってもよく、またはそれらは公知の技術によって被覆されて、任意選択的に、胃腸管内における崩壊および吸収を遅延させ、それによってより長期間にわたり持続性作用を提供する。コーティングは、（例えば放出制御製剤を達成するために）所定のパターンで活性薬剤を放出するように適合されてもよく、またはそれは胃通過後まで、活性薬剤を放出しないように適合されてもよい（腸溶コーティング）。コーティングは、糖コーティング、フィルムコーティング（例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレート共重合体、ポリエチレングリコールおよび／またはポリビニルピロリドンベース）、または腸溶コーティング（例えばメタクリル酸共重合体、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、酢酸コハク酸メチルセルロースヒドロキシプロピル、ポリビニルアセテートフタレート、シェラック、および／またはエチルセルロースベース）であってもよい。さらに、例えばモノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料もまた用いてもよい。
【０２１３】
固体錠剤組成物は、望まれない化学変化（例えば活性治療剤の放出前の化学分解）から組成物を保護するように適合されたコーティングを含んでもよい。コーティングは、前出のＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに記載されている様式と同じようにして、固体剤形上に塗布してもよい。
【０２１４】
少なくとも２つの治療薬を錠剤中で一緒に混合してもよく、または分割してもよい。一例では、第２の治療薬のかなりの部分が第１の治療薬の放出前に放出されるように、第１の活性治療薬が錠剤内部に、第２の活性治療薬が外側に含有される。
【０２１５】
経口使用のための製剤は、チュアブル錠として、または活性成分が不活性固体希釈剤（例えばジャガイモデンプン、乳糖、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合される硬質ゼラチンカプセルとして、または活性成分が、例えば、落花生油、流動パラフィン、またはオリーブ油などの水または油媒質と混合される、軟質ゼラチンカプセルとして提示されてもよい。粉末および顆粒は、錠剤およびカプセルについて上述された成分を使用して、例えばミキサー、流動床装置または噴霧乾燥装置を使用して、従来の様式で調製してもよい。
【０２１６】
放出制御経口投薬形態
経口使用のための放出制御組成物は、例えば、活性物質の溶出および／または拡散を制御することで、活性治療薬を放出するように構築されてもよい。溶出または拡散放出制御は、錠剤、カプセル、ペレットの適切なコーティングによって、または化合物の顆粒製剤によって、または化合物を適切なマトリックスに組み込むことによって達成し得る。放出制御コーティングとしては、上述の１つまたは複数のコーティング物質および／または、例えば、シェラック、蜜蝋、グリコワックス、水素化ヒマシ油、カルナウバ蝋、ステアリルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセリン、エチルセルロース、アクリル樹脂、ｄｌ−ポリ乳酸、酢酸酪酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メタクリル酸メチル、２−ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートハイドロゲル、１，３ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレート、および／またはポリエチレングリコールが挙げられる。放出制御マトリックス製剤中では、マトリックス材は、例えば、水和メチルセルロース、カルナウバ蝋およびステアリルアルコール、カルボポル９３４、シリコーン、トリステアリン酸グリセリル、アクリル酸メチル−メタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、および／またはハロゲン化フルオロカーボンもまた含んでもよい。
【０２１７】
１つまたは複数の治療用化合物を含有する放出制御組成物はまた、浮揚性錠剤またはカプセル（すなわち、経口投与時に、一定時間胃内容物上部に浮遊する錠剤またはカプセル）の形態であってもよい。化合物の浮揚性錠剤処方は、化合物と賦形剤の混合物をヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの２０〜７５％ｗ／ｗの親水コロイドと共に顆粒化することで調製し得る。次に得られた顆粒を錠剤に圧縮し得る。胃液との接触時に、錠剤はその表面周辺に、実質的に不透水性のゲルバリアを形成する。このゲルバリアは、１未満の密度の維持に荷担し、それによって錠剤が胃液中で浮揚性のままであるようにする。
【０２１８】
併用療法
任意選択的に、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症、および骨髄増殖性障害をはじめとするがこれに限定されるものではない白血病を治療するための治療薬が、単独で投与され、または当業者に知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載されるがんを治療するためのその他の標準治療法と組み合わせて投与される。所望ならば、本発明の作用物質（例えば、本明細書に記述される式の化合物であるＪＱ１、およびその誘導体）が、がん治療に有用な任意の従来の化学療法薬と組み合わせて投与される。
【０２１９】
キットまたは医薬品システム
本組成物は、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単核白血病（ＣＭＭＬ）、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症、および骨髄増殖性障害）の治療で使用するためのキットまたは医薬品システムに組み立ててもよい。本発明のこの態様に従ったキットまたは医薬品システムは、その中に、バイアル、チューブ、アンプル、ボトルなどの１つまたは複数の収容手段を厳重に密封して有する、箱、カートン、筒などの運搬手段を含んでなる。本発明のキットまたは医薬品システムは、本発明の作用物質を使用するための付属使用説明もまた含んでなってもよい。
【０２２０】
治療法
治療法は、家庭、医院、診療所、病院の外来、または病院など、がん治療法が実施される任意の場所で提供されてもよい。治療は、一般に、医師が治療法の効果を綿密に観察し、必要なあらゆる調節をし得るように、病院で開始される。治療法の持続期間は、治療されるがんの種類、患者の年齢および病状、患者の疾患の病期およびタイプ、および患者の身体が治療にどのように応答するかに左右される。薬剤投与は、異なる間隔（例えば、毎日、毎週、または毎月）で実施してもよい。治療法は、患者の身体が健康な新しい細胞を構築して、その強度を取り戻す機会があるように、休息期間を含む間欠的周期で与えられてもよい。
【０２２１】
上述したように、所望ならば、Ｂｒｄ４を標的とする阻害性核酸分子である本発明の化合物（例えば、ＪＱ１）による治療は、増殖性疾患治療のための治療法（例えば、放射線療法、外科手術、または化学療法）と組み合わせてもよい。本発明の実施は、特に断りのない限り、十分に当業者の技量の範囲内である、従来の（組換え技術をはじめとする）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学技術を用いる。このような技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  “Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）などの文献で詳しく説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に適用でき、したがって本発明の作成および実施で検討し得る。以下の節で、特定の実施形態のために特に有用な技術を考察する。
【０２２２】
以下の実施例は、当業者に、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療法を作成して使用する方法の完全な開示と説明を提供するために提示され、発明者らが彼らの発明と見なす範囲を制限することは意図されない。
【実施例】
【０２２３】
Ｉ．化学物質実施例−合成および調製法
本発明の化合物は、本明細書の説明を考慮して、本明細書に記載される方法によって、および／または当業者に知られている方法に従って、合成し得る。
【０２２４】
スキームＳ１．ラセミブロモドメイン阻害剤（±）−ＪＱ１の合成
【化４３】
0005935030.tif 000048
【０２２５】
（２−アミノ−４，５−ジメチルチオフェン−３−イル）（４−クロロフェニル）メタノン（Ｓ２）
上に示すスキームに従って、化合物ＪＱ１を調製した。
【０２２６】
２３℃のエタノール（２０ｍｌ、０．３５Ｍ）中の４−クロロベンゾイルアセトニトリルＳ１（１．２４ｇ、６．９ｍｍｏｌ、１等量）、２−ブタノン（０．６２ｍｌ、６．９ｍｍｏｌ、１．００等量）、およびモルホリン（０．６０ｍｌ、６．９ｍｍｏｌ、１．００等量）の溶液に、イオウ（２２０ｍｇ、６．９ｍｍｏｌ、１．００等量）を固体として添加した２１。次に混合物を７０℃に加熱した。１２時間後、反応混合物を２３℃に冷却し、鹹水（１００ｍｌ）中に注いだ。水層を酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を鹹水（５０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  ＲＦ  ｓｙｓｔｅｍ、４０グラムのシリカゲル、勾配０〜１００％酢酸エチル−ヘキサン）によって精製し、Ｓ２（１．２８ｇ、７０％）を黄色固体として得た。
【０２２７】
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ］カルボニル｝アミノ）−４−｛［３−（４−クロロベンゾイル）−４，５−ジメチルチオフェン−２−イル］アミノ｝−４−オキソブタノエート（Ｓ３）
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．５ｍｌ、１．０Ｍ）中の９−フルオレニルメトキシカルボニル−アスパラギン酸β−ｔｅｒｔ−ブチルエステル［Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＨ］（８６４ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、２．１０等量）の溶液に、（２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＣＴＵ）（８２７ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ、２．００等量）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．７２ｍｌ、４．０ｍｍｏｌ、４．００等量）を逐次添加した。次に混合物を２３℃で５分間撹拌した。次にＳ２（２６６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、１等量）を固体として添加した。反応混合物を２３℃で撹拌した。１６時間後、酢酸エチル（２０ｍｌ）および鹹水（２０ｍｌ）を添加した。２層が分離し、水層を酢酸エチル（２×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を鹹水（３０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  ＲＦ  ｓｙｓｔｅｍ、４０グラムのシリカゲル、勾配０〜１００％酢酸エチル−ヘキサン）によって精製し、Ｓ３（６２５ｍｇ、９０％）を褐色油として得た。
【０２２８】
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−アミノ−４−（（３−（４−クロロベンゾイル）−４，５−ジメチルチオフェン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタノエート（Ｓ４）
２３℃のＤＭＦ溶液（４．０ｍｌ、０．２２Ｍ）中の２０％ピペリジンに、化合物Ｓ３（５６０ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ、１等量）を溶解した。３０分後、酢酸エチル（２０ｍｌ）および鹹水（２０ｍｌ）を反応混合物に添加した。２層が分離し、水層を酢酸エチル（２×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を鹹水（３×２５ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  ＲＦ  ｓｙｓｔｅｍ、２４グラムのシリカゲル、勾配０〜１００％酢酸エチル−ヘキサン）によって精製し、遊離アミンＳ４（３７０ｍｇ、９０％）を黄色固体として得た。エナンチオマ純度は７５％に下がった（ＡＳ−Ｈカラムを使用して、Ｂｅｒｇｅｒ超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）により測定された）。
【０２２９】
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（５−（４−クロロフェニル）−６，７−ジメチル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−チエノ［２，３−ｅ］［１，４］ジアゼパム−３−イル）アセテート（Ｓ５）
アミノケトン（Ｓ４）（２８０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を１０％酢酸エタノール溶液（２１ｍｌ、０．０３Ｍ）に溶解した。反応混合物を８５℃に加熱した。３０分後、全ての溶剤を減圧下で除去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  ＲＦ  ｓｙｓｔｅｍ、１２グラムのシリカゲル、勾配０〜１００％酢酸エチル−ヘキサン）によって精製し、化合物Ｓ５（２４１ｍｇ、９５％）を白色固体として得た。Ｓ５のエナンチオマ純度は６７％であった（ＡＳ−Ｈカラムを使用して、Ｂｅｒｇｅｒ超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）により測定された）。
【０２３０】
ｔｅｒｔ−ブチル２−（５−（４−クロロフェニル）−６，７−ジメチル−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−チエノ［２，３−ｅ］［１，４］ジアゼパム−３−イル）アセテート（Ｓ６）
ジグリム（１．２５ｍｌ、０．４Ｍ）中のＳ５（２１０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、１等量）溶液に、五硫化リン（２２２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、２．００等量）、炭酸水素ナトリウム（１６８ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ、４．００等量）を逐次添加した。反応混合物を９０℃に加熱した。１６時間後、鹹水（２０ｍｌ）および酢酸エチル（３５ｍｌ）を添加した。２層が分離し、水層を酢酸エチル（３×３０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を鹹水（２ｘ１５ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  ＲＦ  ｓｙｓｔｅｍ、２４グラムシリカゲル、勾配０〜１００％酢酸エチル−ヘキサン）によって精製し、回収されたＳ５（７３ｍｇ、３４％）と共に、Ｓ６（１４１ｍｇ、６５％）を褐色固体として得た。
【０２３１】
ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾール［４，３−ａ］［１，４］ジアゼパム−６−イル）アセテート［（±）ＪＱ１］
０℃のＴＨＦ（２．６ｍｌ、０．１４Ｍ）中のＳ６（１５８ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、１等量）溶液に、ヒドラジン（０．０１５ｍｌ、０．４５ｍｍｏｌ、１．２５等量）を添加した。反応混合物を２３℃に加温して、２３℃で１時間撹拌した。全ての溶剤を減圧下で除去した。得られたヒドラジンを精製なしで直接使用した。次にヒドラジンをオルト酢酸トリメチルとトルエンの２：３混合物（６ｍｌ、０．０６Ｍ）に溶解した。反応混合物を１２０℃に加熱した。２時間後、全ての溶剤を減圧下で除去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  ＲＦ  ｓｙｓｔｅｍ、４ｇのシリカゲル、勾配０〜１００％酢酸エチル−ヘキサン）によって精製し、ＪＱ１（１４０ｍｇ、２段階で８５％）を白色固体として得た。反応条件は、不斉中心をさらにエピマー化して、ラセミ体ＪＱ１がもたらされた。（ＡＳ−Ｈカラムを用いて、Ｂｅｒｇｅｒ超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）により測定された）。
【０２３２】
スキームＳ２．鏡像異性的に濃縮された（＋）−ＪＱ１の合成
【化４４】
0005935030.tif 000049
【０２３３】
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ］カルボニル｝アミノ）−４−｛［３−（４−クロロベンゾイル）−４，５−ジメチルチオフェン−２−イル］アミノ｝−４−オキソブタノエート（Ｓ３）
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．０ｍｌ、１．０Ｍ）中の９−フルオレニルメトキシカルボニル−アスパラギン酸β−ｔｅｒｔ−ブチルエステル［Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＨ］（４１１ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ、１．０等量）溶液に、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシル）トリピロリジノホスホニウム（ＰｙＢＯＰ）（４９４ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ、０．９５等量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．５０ｍｌ、２．８ｍｍｏｌ、２．７５等量）を逐次した。次に混合物を２３℃で５分間撹拌した。次にＳ２（２６６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、１等量）を固体として添加した。反応混合物を２３℃で撹拌した。４時間後、酢酸エチル（２０ｍｌ）および鹹水（２０ｍｌ）を添加した。２層が分離し、水層を酢酸エチル（２×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を鹹水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  ＲＦ  ｓｙｓｔｅｍ、４０グラムのシリカゲル、勾配０〜１００％酢酸エチル−ヘキサン）によって精製し、Ｓ３（４５２ｍｇ，７２％）を褐色油として得た。
【０２３４】
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−アミノ−４−（（３−（４−クロロベンゾイル）−４，５−ジメチルチオフェン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタノエート（Ｓ４）
２３℃のＤＭＦ溶液（２．２ｍｌ、０．２２Ｍ）中の２０％ピペリジンに、化合物Ｓ３（３１０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ、１等量）を溶解した。３０分後、酢酸エチル（２０ｍｌ）および鹹水（２０ｍｌ）を反応混合物に添加した。２層が分離し、水層を酢酸エチル（２×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を鹹水（３×２５ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  ＲＦ  ｓｙｓｔｅｍ、２４グラムのシリカゲル、勾配０〜１００％酢酸エチル−ヘキサン）によって精製し、遊離アミンＳ４（１８４ｍｇ、９０％）を黄色固体として得た。エナンチオマ純度は、９１％であった。（ＡＳ−Ｈカラムを使用して、Ｂｅｒｇｅｒ超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）によりチェックした）。
【０２３５】
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（５−（４−クロロフェニル）−６，７−ジメチル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−チエノ［２，３−ｅ］［１，４］ジアゼパム−３−イル）アセテート（Ｓ５）
アミノケトン（Ｓ４）（１８４ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍｌ、０．０４Ｍ）に溶解した。シリカゲル（３００ｍｇ）を添加して、反応混合物を９０℃に加熱した。３時間後、反応混合物を２３℃に冷却した。シリカゲルを濾過して、酢酸エチルで洗浄した。合わせた濾液を濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  ＲＦ  ｓｙｓｔｅｍ、１２グラムのシリカゲル、勾配０〜１００％酢酸エチル−ヘキサン）によって精製し、化合物Ｓ５（１６８ｍｇ、９５％）を白色固体として得た。エナンチオマ純度は９０％であった（ＡＳ−Ｈカラムを使用して、Ｂｅｒｇｅｒ超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）により測定された）。
【０２３６】
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾール［４，３−ａ］［１，４］ジアゼパム−６−イル）アセテート［（＋）ＪＱ１］
−７８℃のＴＨＦ（１．８ｍｌ、０．１５Ｍ）中のＳ５（１１４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１等量）溶液に、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ＴＨＦ中の１．０Ｍ溶液、０．３ｍｌ、０．３０ｍｍｏｌ、１．１０等量）を添加した。反応混合物を−１０℃に加温して、２３℃で３０分間撹拌した。反応混合物を−７８℃に冷却した。クロロリン酸ジエチル（０．０４７ｍｌ、０．３２ｍｍｏｌ、１．２０等量）を反応混合物に添加した２２。得られた混合物を−１０℃で４５分間加温した。酢酸ヒドラジド（３０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ、１．５０等量）を反応混合物に添加した。反応混合物を２３℃で撹拌した。１時間後、９０℃に加熱された反応混合物に、１−ブタノール（２．２５ｍｌ）を添加した。１時間後、全ての溶剤を減圧下で除去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  ｓｙｓｔｅｍ、４ｇシリカゲル、勾配０〜１００％酢酸エチル−ヘキサン）で精製し、（＋）−ＪＱ１（１１４ｍｇ、９２％）を白色固体として９０％のエナンチオマ純度で得た（ＡＳ−Ｈカラム、８５％ヘキサン−メタノール、２１０ｎｍ、ｔＲ（Ｒ−鏡像異性体）＝１．５９分、ｔＲ（Ｓ−鏡像異性体）＝３．６７分を使用して、Ｂｅｒｇｅｒ超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）によって測定した）。キラル分取ＨＰＬＣ（ＯＤ−Ｈカラムを使用したＡｇｉｌｅｎｔ高圧液体クロマトグラフィー）によって生成物をさらに精製し、９９％ｅｅ以上でＳ鏡像異性体を得た。
１ＨＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２５℃）δ７．３９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．５４（ｔ，Ｊ＝６．６ＭＨｚ，１Ｈ），３．５４−３．５２（ｍ，２Ｈ），２．６６（ｓ，３Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），１．６７（ｓ，３Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）．
１３ＣＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２５℃）δ１７１．０，１６３．８，１５５．７，１５０．０，１３６．９，１３１．１，１３０．９，１３０．６，１３０．３，１２８．９，８１．２，５４．１，３８．１，２８．４，１４．６，１３．５，１２．１．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値Ｃ２１Ｈ２４ＣｌＮ２Ｏ３Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋：４５７．１４６０，実測値４５７．１４５１ｍ／ｚ．
ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）、Ｒｆ：０．３２（ＵＶ）
［α］２２Ｄ＝＋７５（ｃ０．５、ＣＨＣｌ３）
【０２３７】
Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＨを出発原料として用いて、同様にして（−）−ＪＱ１を合成し、キラル分取ＨＰＬＣ（ＯＤ−Ｈカラムを使用したＡｇｉｌｅｎｔ高圧液体クロマトグラフィー）によってさらに精製して、９９％ｅｅを超えるＲ鏡像異性体を得た。［α］２２Ｄ＝−７２（ｃ０．５、ＣＨＣｌ３）
【０２３８】
追加的な化合物の合成
スキームＳ３で図示されるようにして、追加的な本発明の化合物を調製した。
【０２３９】
スキームＳ３．ヒドラジン誘導体の合成
【化４５】
0005935030.tif 000050
【０２４０】
スキームＳ３で示されるようにして、（＋）−ＪＱ１のｔ−ブチルエステル（１）を切断して遊離酸（２）をもたらし、それをヒドラジンと結合してヒドラジド（３）をもたらした。４−ヒドロキシベンズアルデヒドとの反応は、ヒドラゾン（４）を生じた。
【０２４１】
ヒドラジド（３）およびヒドラゾン（４）のどちらも、少なくとも１つの生物学的アッセイで活性を示した。
【０２４２】
ヒドラジド（３）と多様なカルボニル含有化合物との反応によって、化合物のライブラリーを調製した（上の表Ａ参照）。
【０２４３】
例えばアッセイ開発のためのプローブとして使用するために、追加的な化合物を調製した。例示的な合成を下のスキームＳ４に示す。
【０２４４】
スキームＳ４．プローブとして有用な誘導体の合成
【化４６】
0005935030.tif 000051
【０２４５】
追加的な化合物を下の表で示すようにして調製した。
【０２４６】
【表５】
0005935030.tif 000052
【０２４７】
【表６】
0005935030.tif 000053
【０２４８】
【表７】
0005935030.tif 000054
【０２４９】
【表８】
0005935030.tif 000055
【０２５０】
【表９】
0005935030.tif 000056
【０２５１】
【表１０】
0005935030.tif 000057
【０２５２】
【表１１】
0005935030.tif 000058
【０２５３】
【表１２】
0005935030.tif 000059
【０２５４】
各化合物のスペクトルデータは、割り当てられた構造に一致した。
【０２５５】
生物学的活性および処理法
実施例１：Ｂｒｄ４は、急性骨髄性白血病細胞の増殖のために、決定的かつ特異的に必要とされる。
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の維持に必要なエピジェネティックな経路を体系的に探索するために、ｓｈＲＮＡスクリーニングを行った。このためには、２４３個の公知のクロマチン調節因子を標的とする、特定用途向けｓｈＲＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーは、エピジェネティックなマークの大部分の「ｗｒｉｔｅｒ」、「ｒｅａｄｅｒ」、および「ｅｒａｓｅｒ」を含んだ（図１Ａ）。この１，０９５個のｓｈＲＮＡ（遺伝子あたり３〜６個）のライブラリーは、負の選択ＲＮＡｉスクリーニング向けに最適化させたベクターであるＴＲＭＰＶ中で構築した。一次スクリーニングでは、ＭＬＬ−ＡＦ９およびＮｒａｓＧ１２Ｄ融合遺伝子を含む確立されたＴｅｔ−ＯｎコンピテントＡＭＬマウスモデル細胞系に、ライブラリーを１つのプールとして形質導入した（Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１；２９：７９−８３）。薬剤選択に続いて、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）の添加によってｓｈＲＮＡ発現を誘導した。ゲノムＤＮＡから増幅されたｓｈＲＮＡｇｕｉｄｅ鎖の大規模シークエンシングを使用して、１４日間の培養後のライブラリー表現の変化をモニターした（図１Ｂおよび２Ａ〜２Ｄ）。２つの独立した複製のそれぞれで、１７７個のｓｈＲＮＡが、２０倍を超える消耗を呈示し、それをスコア付基準として使用した。必須遺伝子（Ｒｐａ１、Ｒｐａ３、Ｐｃｎａ、Ｐｏｌｒ２ｂ）を標的とする８つの陽性対照ｓｈＲＮＡの全てで、ならびに２つの公知のＭＬＬ−ＡＦ９補助因子（Ｍｅｎ１およびＰｓｉｐ１）を標的とするいくつかのｓｈＲＮＡで、正のスコアを得た。一次スクリーニングでスコア付基準を達成した少なくとも２つの独立したｓｈＲＮＡを有する遺伝子には、独立したＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２ＤＡＭＬ系およびベクターシステムを使用して、詳細な一つずつの検証を行った（図３Ａ）（追加的な詳細については、国際公開第２０１０／１１１７１２号パンフレットを参照されたい）。一次スクリーニングおよび検証段階の双方で、転写因子Ｂｒｄ４を標的とするｓｈＲＮＡは、最も強く消耗した１つである。全体的に、Ｂｒｄ４は、このｓｈＲＮＡスクリーニングの実験条件に対する最も応答性の遺伝子として同定された（図１Ｂおよび３Ｂ）。
【０２５６】
Ｂｒｄ４は、アセチル化ヒストンに結合して転写に影響を及ぼす、ブロモドメイン含有タンパク質のＢＥＴファミリー構成員である。ＢＲＤ４はまた、稀な形態の扁平上皮がんにおいて、染色体転座を介して突然変異するプロトオンコジーンでもある。白血病におけるＢｒｄ４の役割については、記載されていない。小分子ＢＥＴブロモドメイン阻害剤の最近の進歩（Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０；４６８：１０６７−７３）は、上述のｓｈＲＮＡスクリーニングにおける最も応答性の高い遺伝子としてのＢｒｄ４の同定と相俟って、Ｂｒｄ４がＡＭＬ療法の新規薬剤標的であることを示唆した。５つの独立したＢｒｄ４  ｓｈＲＮＡが、ノックダウン効率と成長阻害の間の密接な対応を示し、標的化効果が示唆される（図６Ａおよび６Ｂ）。Ｂｒｄ４抑制が白血病細胞の細胞周期停止およびアポトーシスをもたらしたのに対し、不死化マウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）における同等のノックダウンは、細胞毒性のない控えめな細胞周期阻害のみをもたらした（図４Ａ−４Ｄ）。Ｂｒｄ４ノックダウンはまた、非形質転換Ｇ１Ｅ赤芽球細胞の成長に影響を及ぼせなかった（図４Ｅ）。これに加えて、ＢＲＤ４を標的にするｓｈＲＮＡはまた、２つのＭＬＬ−ＡＦ９＋ヒトＡＭＬ系において細胞周期停止を誘導するのに十分であった（図５Ａ〜５Ｄ）。総合して、これらの結果は、Ｂｒｄ４が、ＭＬＬ−ＡＦ９＋ＡＭＬにおいて重要な必要条件であることを示唆した。
【０２５７】
実施例２：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞増殖は、ブロモドメインタンパク質阻害剤ＪＱ１によって特異的にブロックされる。
Ｂｒｄ４の第１のブロモドメインに対する最も高い親和性がある、ＢＥＴブロモドメインのファースト・イン・クラス小分子阻害剤（Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）である、ＪＱ１の効果を多様な白血病細胞型に対して試験した。マウスＭＬＬ融合白血病細胞の増殖は、これらの異なる細胞型の増殖に対するＢｒｄ４−ｓｈＲＮＡの相対的影響に合致して、線維芽細胞およびＧ１Ｅ（図６Ｂ）と比較して、マイクロモル以下のＪＱ１濃度に対して著しく感受性であった。成人および小児の原発性白血病サンプルなど、一連の確立されたヒト白血病細胞系におけるＪＱ１の成長阻害効果もまた試験した。多様な遺伝子サブタイプにわたり、１３／１４のＡＭＬ細胞系（図６Ｃおよび７Ａ）および１２／１５の原発性ＡＭＬ（図８および９）において、ＪＱ１（ＩＣ５０＜５００ｎＭ）の広範な成長抑制活性が観察された。これに加えて、３／３の試験された原発性ＭＬＬ再構成型小児白血病は、ＪＱ１（図９Ａおよび９Ｂ）に高度に感受性であったのに対し、その他の試験された非ＡＭＬ白血病および固形腫瘍細胞系は、化合物に対して最小の感受性しか示さなかった（図６Ｃおよび７Ｂ）。全ての試験されたＡＭＬ系で、ＪＱ１処理は、ｓｈＲＮＡ媒介Ｂｒｄ４ノックダウン後に見られた効果と同様に、細胞周期停止およびアポトーシスを普遍的に引き起こした（図６Ｄ、６Ｅ、８Ａ〜８Ｄ、９Ａ〜９Ｃ、１０Ａ〜１０Ｃ）。総合して、これらのデータは、Ｂｒｄ４がＡＭＬの生体外成長にとって重要であり、それはブロモドメイン阻害剤ＪＱ１を使用して、効果的に標的にし得ることを示す。
【０２５８】
実施例３：生体内の白血病の進行は、Ｂｒｄ４の抑制によって阻害される。
生体内のＡＭＬの進行に対するＢｒｄ４の妥当性を調査した。マウス中の確立されたＡＭＬにおいてＢｒｄ４を阻害するために、Ｔｅｔ−ＯｎコンピテントＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞を抗Ｂｒｄ４  ｓｈＲＮＡ含有または対照ｓｈＲＮＡ含有ＴＲＭＰＶコンストラクトで形質導入した。次にこれらの細胞をあらかじめ亜致死的に照射された二次受容マウスに移植した。生物発光イメージングによって確認された疾患発症に続いて、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）投与によってｓｈＲＮＡ発現を誘導した（図１１Ａ〜１１Ｆ）。引き続くモニタリングは、Ｂｒｄ４の抑制が白血病の進行に著しい遅延をもたらし、著しい延命効果を提供したことを明らかにした（図１２Ａ〜１２Ｃ）。ＴＲＭＰＶベクター中のｓｈＲＮＡ発現と連動するｄｓＲｅｄレポーター（Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１；２９：７９−８３）を活用して、フローサイトメトリー分析は、対照と比較して、Ｂｒｄ４−ｓｈＲＮＡ陽性細胞が末期白血病負荷内で消耗したことを確認した。このデータは、試験マウスにおける致死性が、Ｂｒｄ４−ｓｈＲＮＡ陰性細胞成長の帰結であったことを示す（図１２Ｄおよび１２Ｅ）。総合して、これらのデータは、Ｂｒｄ４のＲＮＡｉ媒介抑制が、生体内で白血病拡大を阻害することを示す。
【０２５９】
実施例４：ＪＱ１処理は、生体内で確立されたＡＭＬを阻害する。
ＪＱ１が、ＡＭＬ中で単一作用物質活性を有するかどうかを試験するために、ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞を移植したマウスを毎日注射されるＪＱ１（５０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルのどちらかで処理した。ＪＱ１投与は、疾患進行の著しい遅延と、顕著に伸びた生存期間（図１２Ｆ〜１２Ｈ）をもたらした。ＪＱ１はまた、そのどちらも従来の化学療法に対して非感受性であることが知られている（Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２００９；２３：８７７−８９）ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２ＤおよびＡＭＬ１−ＥＴＯ９ａ／ＮｒａｓＧ１２Ｄ／ｐ５３−／−ＡＭＬモデル（図１２Ｉ、１３Ａ〜１３Ｅ、および１４Ａ〜１４Ｃ）で見られるように、確立された疾患状況において単一作用物質活性を示した。先の知見（Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０；４６８：１０６７−７３）と一致して、ＪＱ１処理はマウスで良好に耐えられて、正常な造血にはたとえあったとしても極わずかな影響しか及ぼさなかった（図１５、１６、１７Ａ、および１７Ｂ）。これらの知見は、ＪＱ１が生体内で単一作用物質として、強力かつ白血病特異的な効果を有することを実証する。
【０２６０】
実施例５：ｓｈＲＮＡまたはＪＱ１によるＢｒｄ４阻害は、幹細胞の白血病細胞可能性を低下させ、それらの分化を誘導する。
ＡＭＬは、最終骨髄分化完了の不能と結びついた、拡大された自己再生能力によって特徴付けられる。したがって、Ｂｒｄ４の存在が、白血病細胞の分化状態に影響を及ぼすかどうかを次に考察した。Ｂｒｄ４  ｓｈＲＮＡ発現およびＪＱ１処理のどちらも、ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞の形態を骨髄単核芽球から、マクロファージ様外観を有する細胞に改変させた（図１８Ａおよび１８Ｂ）。ｓｈＲＮＡまたはＪＱ１処理のどちらかによるＢｒｄ４阻害時に、マクロファージ機能に関与する遺伝子と、骨髄性分化マーカーであるＭａｃ−１とが上方制御された。Ｂｒｄ４阻害は、そのレベルがＭＬＬ再構成型白血病における白血病幹細胞（ＬＳＣ）頻度と相関する、ｃ−ｋｉｔを下方制御した（図１８Ｃおよび１８Ｄ）。これに加えて、ＪＱ１処理は、程度は様々であるが、試験された原発性白血病サンプルの大部分において、成熟表現型の形態学的徴候を誘導した（図８および９）。
【０２６１】
Ｂｒｄ４の抑制が、ＬＳＣ区画を根絶するかどうかをさらに検証するために、Ｂｒｄ４−ｓｈＲＮＡおよびＪＱ１処理白血病細胞から得られた発現マイクロアレイ上で、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を行った（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００５；１０２：１５５４５−５０）。ＧＳＥＡは、Ｂｒｄ４阻害に続くマクロファージ特異的遺伝子発現の著しい上方制御（図１８Ｅおよび１８Ｆ）と、非自己再生型白血病細胞サブセットからＬＳＣを識別することが先に示されている、遺伝子発現シグネチャーの全体的損失（図１８Ｇおよび１８Ｈ）（Ｓｏｍｅｒｖａｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００９；４：１２９−４０）とを明らかにした。図１８Ｉは、ＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示すグラフを含む。遺伝子発現変化の同様のプロフィールは、ＪＱ１処置ヒトＡＭＬ細胞系ＴＨＰ−１で見られた（図１９）。重要なことには、これらのアッセイにおける、ｓｈＲＮＡを介したＢｒｄ４ノックダウンと、薬理学的ＢＥＴブロモドメイン阻害の間の強力な表現型の類似点は、Ｂｒｄ４がＪＱ１の標的であることを確立する。したがって、これらの結果は、Ｂｒｄ４が白血病幹細胞集団の維持と、それらの最終分化の防止に必須であることを明らかにする。
【０２６２】
実施例６：マウスおよびヒト白血病細胞内で、ＪＱ１は、白血病幹細胞自己再生と関連付けられている経路であるＭｙｃ経路を抑制する。
Ｍｙｃ経路は白血病幹細胞自己再生と関連付けられており、ＭｙｃはＢｒｄ４の下流標的であるように見えるので、Ｍｙｃレベルに対するＢｒｄ４阻害の効果を調べた。マウスＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞において、ｓｈＲＮＡまたはＪＱ１処理を介したＢｒｄ４阻害は、Ｍｙｃ  ｍＲＮＡレベルおよびＭｙｃタンパク質レベルに劇的な低下をもたらし；対照的に、Ｂｒｄ４阻害は、ＭＥＦまたはＧ１Ｅ細胞には最小の効果しか及ぼさなかった（図２０Ａ〜２０Ｃ、２１Ａ、および２１Ｂ）。Ｍｙｃ  ｍＲＮＡレベルの下方制御はＪＱ１曝露の６０分間以内に起き、Ｃｄ７４などのマクロファージ分化に関連した遺伝子発現増大に定性的に先行する（図２０Ｄ）。直接転写調節をさらに支持するために、クロマチン免疫沈降法実験によって、ＪＱ１への曝露に続いて排除される、Ｍｙｃプロモーターの約２キロベース上流の局所的Ｂｒｄ４占有領域が同定された（図２０Ｅ）。予期されたように、ｓｈＲＮＡによるまたはＪＱ１によるＢｒｄ４阻害のＲＮＡｉまたはＪＱ１が誘導する抑制は、Ｍｙｃ標的遺伝子発現の全体的低下もまたもたらした（図２１Ｃおよび２２）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１０；１４３：３１３−２４；およびＳｃｈｕｈｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００１；２９：３９７−４０６もまた参照されたい）。著しいことに、ＪＱ１処理は、検査された広範囲のマウスおよびヒト白血病細胞系でＭｙｃ下方制御を引き起こし（図２０Ａ〜２０Ｃ、図２３Ａおよび２３Ｂ）、ＪＱ１がＭｙｃ経路を白血病サブタイプの範囲に抑える手段を提供することを示唆する。図２１Ｄは、Ｍｙｃ下流標的遺伝子発現の変化を評価するＧＳＥＡプロットを含む。
【０２６３】
実施例７：Ｂｒｄ４は、Ｍｙｃ非依存性経路を通じて細胞生存を調節する。
次に、実験を行って、Ｍｙｃ活性の抑制を介して、ＪＱ１処理の抗増殖効果が生じるかどうかをさらに評価した。ここでは、Ｍｙｃ  ｃＤＮＡがレトロウイルスプロモーターから異所性に発現されるように、ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病培養を作成し、ＪＱ１誘導性転写抑制に対して完全に抵抗性である、わずかであるが構成的なＭｙｃ過剰発現をもたらした（図２０Ｆ、２４Ａ、および２４Ｂ）。特に、異所性Ｍｙｃは、ＪＱ１、Ｂｒｄ４  ｓｈＲＮＡ誘導性細胞周期停止、およびマクロファージ分化に対して、ほぼ完全な抵抗性を与えた（図２０Ｇ、２０Ｈ、および２５Ａ〜Ｄ）。さらに、全体的発現プロファイリングは、ＪＱ１誘導性転写変化の大部分が、事実上Ｍｙｃ下方制御の二次効果であることを明らかにした（図２６Ａ〜２６Ｃ）。Ｍｙｃそれ自体のｓｈＲＮＡノックダウンもまた、Ｂｒｄ４阻害と似ている成長停止および骨髄性分化のパターン引き起こし（図２７Ａ〜Ｄ）、ＪＱ１誘導性効果の重要媒介物としてのＭｙｃをさらに支持する。重要なことには、異所性Ｍｙｃ発現はＪＱ１誘導性細胞死を阻止できず、細胞生存の調節における、Ｂｒｄ４の追加的なＭｙｃ非依存性役割が示唆された（図２４Ｃおよび２４Ｄ）。これらの知見は、Ｍｙｃ活性化を保ち、白血病における未分化細胞状態を維持する上で、Ｂｒｄ４が重要な役割を有することを示す。
【０２６４】
エピジェネティックな調節因子を標的にする不偏スクリーニングアプローチをとることにより、ＡＭＬ疾患の維持に必要な決定的因子としてＢｒｄ４を同定した。Ｂｒｄ４は、ＡＭＬ（図２８Ａおよび２８Ｂ）において、明白に突然変異したり過剰発現されたりしてはいないので、Ｂｒｄ４阻害に対する白血病細胞の強い感受性は、単にこの疾患の遺伝的または転写特性解析を通じては、明らかにならない。これに加えて、本明細書に記載される結果は、ブロモドメイン阻害剤ＪＱ１が、異なるＡＭＬのコンテクストにおいて幅広い活性を有することを実証し、その効果をＢｒｄ４−ｓｈＲＮＡによって誘導される効果と比較することで、Ｂｒｄ４が、ＪＱ１の抗白血病活性の妥当な標的であるという証拠を提供する。ＪＱ１は、齧歯類における半減期が約１時間の頑強な抗白血病分子である（図２９）。このような効果はまた、生体内でＢｒｄ４  ｓｈＲＮＡについても観察され、がんを標的とする新規薬剤を明らかにする上でのＲＮＡｉスクリーニングの効用を明白に強調する。
【０２６５】
アセチルリジン結合領域の競合的阻害剤として、ＪＱ１は、Ｂｒｄ４が、転写活性化を促進するヒストンアセチル化標識を「読み取る」能力に干渉する（Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。白血病細胞に適用されると、ＪＱ１は自己再生を支持する転写回路に干渉し；それにより、ＪＱ１は白血病幹細胞（ＬＳＣ）の最終分化を誘導する。Ｍｙｂは、ＭＬＬ−ＡＦ９誘導性転写プログラムの中心的な媒介物であり、異常な自己再生状態に重要であるので、Ｍｙｂの阻害が疾患を根絶するのに十分である（Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，提出済み）。興味深いことに、Ｂｒｄ４の遺伝的または薬理学的阻害に続いて生じた遺伝子発現の変化は、ＭＬＬ−ＡＦ９またはＭｙｂの抑制時に観察されたものと顕著に類似している（図３０Ａ〜３０Ｃ）。しかし、ＪＱ１処理は、ＭＬＬ−ＡＦ９の確立された直接標的であるＨｏｘａ７、Ｈｏｘａ９、またはＭｅｉｓ１の発現に影響を与えない。これはＢｒｄ４阻害が、ＭＬＬ−ＡＦ９の全体機能を中和しないが、その代わりに例えばＭｙｃの阻害を介して、その他の下流標的の大きなサブセットを抑制することを示す。総合して、ＭＬＬ−ＡＦ９、Ｍｙｂ、およびＢｒｄ４は、悪性自己再生に必須の共通転写回路内で機能的に交差するようである。このプログラムの重要な作動体は、魅力的な治療標的として検証されているが、従来の薬理学的阻害を受け入れにくい腫瘍性タンパク質Ｍｙｃ（Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，提出済み）である。
【０２６６】
上述の例は、Ｂｒｄ４を標的にすることが、白血病コンテクストに対する選択性を持って、Ｍｙｃの発現を根絶して、自己再生を制限し、それにより全身性Ｍｙｃ阻害に潜在的に付随する造血毒性を回避することを間違いなく実証する。その結果、ＲＮＡｉノックダウンまたはＪＱ１処理を介したＢｒｄ４阻害は、エピジェネティックな機構の直接調節を通じて、マウスおよびヒト白血病に関連した捕らえにくい発がん経路を安全化するための特異的かつ効果的ストラテジーを規定する。
【０２６７】
本明細書の上の実施例で報告された結果は、以下の材料と方法を使用して得られた。
【０２６８】
プラスミド
条件的ＲＮＡｉ実験のために、先に記載されているＴＲＭＰＶ−ＮｅｏベクターまたはＴｔＴＭＰＶ−Ｎｅｏベクターのどちらかから、ｓｈＲＮＡを発現させた（Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１１；２９：７９−８３）。スクリーニング検証のために、ＰｕｒｏＲ導入遺伝子をＮｅｏＲカセットで置換することにより、ＬＭＰ３をベースとして作成されたＬＭＮ（ＭＳＣＶ−ｍｉＲ３０−ＰＧＫ−ＮｅｏＲ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）に、ｓｈＲＮＡをクローンした。Ｍｙｃレスキュー実験のためには、野生型マウスＭｙｃ  ｃＤＮＡをＭＳＣＶ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ＭＳＣＶ−ＰＩＧ）にサブクローニングした（Ｈｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２００３；３３：３９６−４００）。
【０２６９】
プールされた負の選択ＲＮＡｉスクリーニング
先に記載されたようにして（Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、ｍｉＲ３０適応ＢＩＯＰＲＥＤｓｉ予測を使用して、２４３個のクロマチン調節マウス遺伝子を標的にする特定用途向けｓｈＲＮＡライブラリーをデザインし（Ｈｕｅｓｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００５；２３：９９５−１００１）（６個のｓｈＲＮＡ／遺伝子）、ＰＣＲ−クローニングによって、５５ｋの特定用途向けアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）上で、オリゴヌクレオチドのプールを構築した。配列検証に続いて、１０９５個のｓｈＲＮＡ（３〜６個／遺伝子）をいくつかの陽性および陰性対照ｓｈＲＮＡと一緒に、等濃度で１つのプールに合わせた。単一レトロウイルス組み込みを優勢にもたらし、計算された＞５００個の細胞数あたり１個のｓｈＲＮＡに相当する（感染時に総計３千万個の細胞、２％の形質導入効率）条件を使用して、このプールをＴＲＭＰＶ−Ｎｅｏにサブクローニングし、Ｔｅｔ−ＯｎＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞に形質導入した。１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、形質導入された細胞を５日間にわたり選択し；各継代培養時に＞２千万個の細胞を維持して、実験全体を通じてライブラリー表現を保った。薬剤選択に続いてＴ０サンプルが得られ（複製あた約２千万個の細胞）、引き続いて０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８および１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン添加の下で細胞を培養し、ｓｈＲＮＡの発現を誘導した。１４日後（＝１２回の継代培養、Ｔ１４）に、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ(商標)（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）を使用して、各複製について約１．５千万個のｓｈＲＮＡ発現（ｄｓＲｅｄ＋／Ｖｅｎｕｓ＋）細胞をソートした。ＰｈａｓｅＬｏｃｋ(商標)チューブ（５ｐｒｉｍｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、２回のフェノール抽出と、それに続くイソプロパノール沈殿によって、Ｔ０およびＴ１４サンプルからゲノムＤＮＡを単離した。先に記載されたようにして、ｓｈＲＮＡガイド鎖のＰＣＲ増幅によって、大規模シークエンシングテンプレートライブラリーを作成した（Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ゲノム分析器（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）上で、８ｐＭの最終濃度で、ライブラリーを分析し；ガイド鎖内へ逆方向読み取りするプライマーを使用して、１８個のｎｔを配列決定した（ｍｉＲ３０ＥｃｏＲＩＳｅｑ、ＴＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＧＣＡＧＴＡＧＧＣＡ。実験的サンプル中のｓｈＲＮＡ消耗を検出するための十分なベースラインを提供するために、Ｔ０サンプル中のｓｈＲＮＡあたり＞５００の読み取り得ることが望ましく、プールされたプラスミド調製品に固有の、またはＰＣＲバイアスによって導入された、ｓｈＲＮＡ表現の格差を代償するために、それはサンプルあたり＞１千万の読み取りを必要とした。これらの条件で、１０７２（全部の９７％）個のｓｈＲＮＡについての＞５００の読み取りのＴ０ベースラインを得た。カスタマイズされたＧａｌａｘｙプラットフォームを使用して、配列プロセッシングを実施した���Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，Ｕｎｉｔ  １０  ５（２００７））。各ｓｈＲＮＡおよび条件について、レーンあたりライブラリー特異的読み取り総数に対して、マッチング読み取り数を正規化し、さらなる分析のためにデータベースにインポートした。
【０２７０】
細胞培養
全てのマウスＭＬＬ白血病細胞系は、末期症状の受容マウスから得られた骨髄に由来し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ１６４０内で培養された。ＭＬＬ−ＡＦ９（単独）、ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ、Ｔｅｔ−ＯｎＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ、およびＭＬＬ−ＥＮＬ／ＦＬＴ３ＩＴＤ細胞培養は、先に記載されているようにして誘導された（Ｚｕｂｅｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２００９；２３：８７７−８９およびＺｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。Ｔｅｔ−Ｏｎ不死化ＭＥＦ培養については先に記載されている（Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。Ｇ１Ｅ細胞は、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｗｅｉｓｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）によって親切にも提供された。ＭＥＦ細胞は、１０％ＦＢＳおよび１％グルタミン添加ＤＭＥＭ中で培養した（ＧＩＢＣＯ（登録商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。Ｇ１Ｅ細胞は１５％ＦＢＳ、２Ｕ／ｍｌエリスロポエチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｄｒｉｃｈ）、および１０％キットリガンド条件培地添加ＩＭＤＭ中で培養した。全ヒト白血病細胞系はＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ内で培養したが、ＫＡＳＵＭＩ−１細胞のみ２０％ＦＢＳ内で培養した。ＮＯＭＯ−１およびＭＯＬＭ−１３は、ＤＳＭＺから購入された。ＫＡＳＵＭＩ−１、ＨＬ−６０、およびＩＭＲ−９０は、ＡＴＣＣから得られた。Ｋ−５６２およびＴＨＰ−１は、Ｍａｒｔｉｎ  Ｃａｒｒｏｌｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）によって親切にも提供された。Ｕ２ＯＳ、ＨｅＬａ、およびＪｕｒｋａｔは、ＣＳＨＬ組織培養サービスによって提供された。
【０２７１】
ウエスタンブロット
Ｂｒｄ４ウエスタンブロットでは、３０μｇのホールセル溶解産物ＲＩＰＡ抽出物（２５ｍＭのＴｒｉｓｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ，１％のＮＰ−４０、１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）を各レーンに装入した。Ｍｙｃウエスタンブロットでは、細胞をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液に直接溶解した。およそ５０，０００個の細胞相当量を各レーンに装入した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によってタンパク質抽出物を分離して、ブロッティングのためにニトロセルロースに転写した。
【０２７２】
増殖アッセイ
７２時間にわたる生存細胞数の増大を計数することで、増殖アッセイを実施した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含めることで、死細胞を排除した。前方／側方散乱／ＰＩ細胞を使用して、生存細胞のみをゲーティングして、Ｇｕａｖａ  Ｅａｓｙｃｙｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上で細胞濃度の測定を実施した。式、を使用して増殖速度を計算した。ｌｎ（細胞濃度７２ｈ／細胞濃度０ｈ）／７２。相対増殖速度は、ＤＭＳＯ処理細胞の速度を正規化することで計算した。
【０２７３】
メイ・グリュンワルド・ギムザサイトスピン染色
ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞を１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで処理してＴＲＭＰＶ  ｓｈＲＮＡを誘導し、または１００ｎＭのＪＱ１で２日間処理した。５０，０００個の細胞を１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳ、ＰＢＳ中の０．０５％ＮａＮ３）中に再懸濁し、Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｃｙｔｏｓｐｉｎ  ２  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを使用して５００ｒｐｍで５分間、スライドガラス上にサイトスピンした。製造会社のプロトコルに従って、メイ・グリュンワルド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃０１９Ｋ４３６８）およびギムザ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃０１０Ｍ４３３８）染色を実施した。４０倍の対物レンズでＺｅｉｓｓ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して、画像を収集した。
【０２７４】
ＢｒｄＵ細胞周期分析およびアネキシンＶフローサイトメトリー
製造業者のプロトコルに従って（ＢＤ、ＡＰＣ  ＢｒｄＵ  Ｆｌｏｗ  Ｋｉｔ、＃５５２５９８）、ＢｒｄＵ組み込みアッセイを実施し、細胞はＢｒｄＵで３０分間パルスされた。ＤＮＡ含量測定のために、細胞を７−ＡＡＤまたはＤＡＰＩで共染色した。全ての条件的ｓｈＲＮＡ実験で、分析は、ｓｈＲＮＡ＋／ｄｓＲｅｄ＋細胞集団上でゲートした。製造会社のプロトコル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＡＰＣアネキシンＶ、＃５５０４７５）に従って、アポトーシスのアネキシンＶ染色を実施した。図４ｅでは、生細胞（ＦＳＣ／ＳＣＣ）およびｄｓＲｅｄ＋／ｓｈＲＮＡ＋集団上で、アネキシンＶゲーティングを実施して、ｓｈＲＮＡ効果の明瞭な読み取りを確保した。このゲーティング法は、初期アポトーシス細胞（アネキシンＶ＋、ＤＡＰＩ−）を選択的に視覚化し、したがって一見するとプロット中に蓄積した死細胞（アネキシンＶ＋、ＤＡＰＩ＋）が欠如している。全分析は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して実施した。
【０２７５】
ヒトＡＭＬ細胞系におけるｓｈＲＮＡ実験
ヒトｓｈＲＮＡをＴＲＭＰＶ−Ｎｅｏベクターにクローンし、ＴＨＰ−１およびＭＯＬＭ−１３細胞のレトロウイルス形質導入がそれに続き、ＭＳＣＶ−ＲＩＥＰプラスミド（ｒｔＴＡ−ｉｒｅｓ−ＥｃｏＲ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ）を使用して、Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ受容体およびｒｔＴＡ３を発現するよう修飾した。細胞は、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８によって１週間にわたり選択された。細胞を１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで処理して、ｓｈＲＮＡ発現を誘導した。ＦＡＣＳを使用したｄｓＲｅｄ＋／ｓｈＲＮＡ＋細胞の相対変化を使用して、成長阻害をモニターした。ＢｒｄＵ細胞周期分析は、上述したように実施した。
【０２７６】
成人原発性白血病サンプル分析（図８）
原発性白血病細胞は、診断時（ｎ＝１０）または再発時（ｎ＝２）にＡＭＬがある、１２人の（未治療）患者の末梢血（ＰＢ）または骨髄（ＢＭ）吸引サンプルから得られた。診断は、Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｔｉｓｈ（ＦＡＢ）Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ（Ｄｅｌｈｏｍｍｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００９；３６０：２２８９−３０１；およびＬｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１０；３６３：２４２４−３３）、および世界保健機関（ＷＨＯ））（Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０１１；２９：７９−８３）によって提供される基準に従って確立した。Ｆｉｃｏｌｌを使用して単核細胞（ＭＮＣ）を調製し、使用時まで液体窒素内で保存した。いずれの場合にも、献血またはＢＭ穿刺に先だって、インフォームドコンセントを得た。  研究はＭｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＶｉｅｎｎａのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって認可された。ＨＬ６０およびＭＯＬＭ１３細胞系を対照として含めた（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。解凍後、ＡＭＬ細胞の生存度は、トリパンブルー排除による評価で、７０％〜９９％の範囲であった。
【０２７７】
原発性細胞（解凍ＭＮＣ、５−１０×１０４細胞／ウェル）および細胞系（１〜５×１０４細胞／ウェル）を、ＪＱ１（１０〜５，０００ｎＭ）不在または存在下で、３７℃（５％ＣＯ２）で４８時間にわたり、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）中で、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＴＰＰ，Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で培養した。選択実験では、以下の増殖誘導サイトカインカクテルの存在または不在下において、原発性ＡＭＬ細胞をＪＱ１と共に培養した：１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒト（ｒｈ）Ｇ−ＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、および１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−３（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）。４８時間後、０．５μＣｉ３Ｈチミジンを添加した（１６時間）。次に細胞をＦｉｌｔｅｒｍａｔｅ  １９６ハーベスター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）内のフィルター膜上に収集した。フィルターを風乾し、β−ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｔｏｐ−Ｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ，Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）内で結合放射能を測定した。全実験は、三連で実施した。増殖は、対照のパーセント（対照培地内に維持された細胞）として計算し、ＪＱ１の阻害効果はＩＣ５０値として表した。７／１２人の患者で、サイトスピンスライドのライト・ギムザ染色によって、薬剤曝露細胞を分化の形態学的徴候について分析した。
【０２７８】
小児原発性白血病サンプル分析（図９）
施設内審査委員会認可プロトコルの下で、新たに診断された急性白血病がある小児から診断骨髄サンプルを収集した。Ｈｅｌｓｉｎｋｉプロトコルに従って、インフォームドコンセントを得た。収集時に、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して密度遠心分離によって、原発性白血病胞を濃縮し、引き続いて液体窒素内で保存した。冷凍保存細胞のバイアルを解凍し、培地に再懸濁して、生白血病細胞を密度遠心分離によって濃縮した。細胞を２０％ウシ胎仔血清補給培地中に維持した。全白血病細胞を５％ＣＯ２内で３７℃で培養した。
【０２７９】
原発性白血病サンプルを９６ウェルプレート内で７２時間にわたり、一連の用量範囲のＪＱ１およびビヒクル対照で処理した。アネキシン結合アッセイでは、細胞を収集してアネキシンＶ−ＰＥおよび７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ上で読み取って、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で分析した。ＷＳＴ−１アッセイでは、ＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を培養液（１：１０希釈）に添加し、Ｂｉｏ−Ｒａｄモデル６８０マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、吸光度を４５０ｎｍで測定した。ＷＳＴ−１アッセイは三連で実施した。
【０２８０】
原発性白血病サンプルを９６ウェルプレート内で４８時間にわたり、２５０ｎＭのＪＱ１およびビヒクル対照で処理した。サイトスピンを２４時間および４８時間のベースラインで調製し、ライト・ギムザ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００顕微鏡システムを使用して、画像を得た。
【０２８１】
骨髄の組織学的分析
パラフィン包埋切片をヘマトキシリン＆エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｆ２．３０ソフトウェアを使用して、２５６０×１９２０の解像度で、Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｉｇｈｔカメラ付きＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ顕微鏡上で写真を撮影した。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ２を使用して、画像をサイズ変更し、解像度を３００ピクセル／インチに設定して、自動コントラストを適用し、アンシャープマスクを使用して画像の明確さを改善した。
【０２８２】
正常造血のＦＡＣＳ評価（図１７）
ヒトｓｈＲＮＡをＴＲＭＰＶ−Ｎｅｏベクターにクローンし、ＴＨＰ−１およびＭＯＬＭ−１３細胞のレトロウイルス形質導入がそれに続き、ＭＳＣＶ−ＲＩＥＰプラスミド（ｒｔＴＡ−ｉｒｅｓ−ＥｃｏＲ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏ）を使用して、Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ受容体およびｒｔＴＡ３を発現するよう修飾した。細胞は、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８によって１週間にわたり選択された。細胞を１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで処理して、ｓｈＲＮＡ発現を誘導した。ＦＡＣＳを使用したｄｓＲｅｄ＋／ｓｈＲＮＡ＋細胞の相対変化を使用して、成長阻害をモニターした。ＢｒｄＵ細胞周期分析は、上述したように実施した。
【０２８３】
発現マイクロアレイ
ＣＳＨＬ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｈａｒｅｄ  ｒｅｓｏｕｒｃｅによって、マイクロアレイが実施された。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ、＃７４１０４）を使用して、１０７個の細胞からＲＮＡを単離した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ，ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  Ｃｈｉｐｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）上で、ＲＮＡの質を評価した。ＲＩＮスコアによって、サンプルを評価した（２．０以上は合格）。修正Ｅｂｅｒｗｉｎｅ技術によってＲＮＡを増幅し、次にＡｍｂｉｏｎ（登録商標）ＷＴ発現キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して、ａＲＮＡをｃＤＮＡに転換した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  Ｃｈｉｐｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、３’バイアスについて評価されたａＲＮＡおよびｃＤＮＡの粒度分布を全サンプルで実施した。次にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＷＴ末端標識キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、ｃＤＮＡを断片化して末端をビオチンで標識した。次にハイブリダイゼーションのためにサンプルを調製し、ハイブリダイズして洗浄し、マウス遺伝子ＳＴ  １．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）上で製造会社の使用説明書に従ってスキャンした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  ＱＣ測定基準を使用して、画像データを通過させた。ＲベースＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ中のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘおよびＬｉｍｍａパッケージによって、生データを処理した。
【０２８４】
図２５に示されるヒートマップは、ＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎソフトウェアを使用して作成された（Ｙｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００８；１４：３６−４６）。簡単に述べると、ＲＭＡ処理マイクロアレイデータをｌｏｇ２基準に変換した。次に選択された遺伝子リストを列正規化し、ＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎ上のＨｅａｔ  ｍａｐＩｍａｇｅモジュールを通じて実行した。
【０２８５】
遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）分析
ＧＳＥＡ  ｖ２．０７ソフトウェア（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して、１０００個の表現型置換で、遺伝子セット濃縮分析（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００５；１０２：１５５４５−５０）を実施した。白血病幹細胞およびＭｙｃ遺伝子セットは、示される出版物（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ２０１０；１４３：３１３−２４、Ｓｃｈｕｈｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００１；２９：３９７−４０６、およびＳｏｍｅｒｖａｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００９；４：１２９−４０）から得られた。マクロファージ発生遺伝子セットは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェア（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ，Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から得られた。Ｍｙｂシグネチャー遺伝子セット（ｓｈＭｙｂ  ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞中のトップ５００下方制御遺伝子）およびＭＬＬ−ＡＦ９シグネチャー遺伝子セット（ＭＬＬ−ＡＦ９  Ｔｅｔ−ＯＦＦ  ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞中のトップ５００下方制御遺伝子）は、Ｌｏｗｅ／Ｖａｋｏｃ研究所からの未発表研究からのマイクロアレイデータから得られた（Ｚｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，提出済み）。
【０２８６】
図１９では、ヒトマイクロアレイデータ上でＧＳＥＡを実施するために、ｂｉｏＤＢＮｅｔ  ｄｂ  Ｗａｌｋモジュール（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｄｂｎｅｔ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／ｄｂ／ｄｂＷａｌｋ．ｐｈｐ）を使用して、または手動でＮＣＢＩデータベースを使用して、最初にマウス遺伝子セットをヒト遺伝子名に転換した。ＧＳＥＡ技法および解釈の詳細な説明は、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｄｏｃ／ＧＳＥＡＵｓｅｒＧｕｉｄｅＦｒａｍｅ．ｈｔｍｌ）に提供される。手短に言えば、Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｓｃｏｒｅ（ＮＥＳ）が、「遺伝子のランク付けリストの上部または下部で、遺伝子セットが大きな比率を占める程度」を提供する。Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ  ｑ値（ＦＤＲｑ値）」は、「所与のＮＥＳがある遺伝子セットが、偽陽性検出に相当する推定確率である」。「一般に、ほとんどの発現データセットにおける首尾一貫性の欠如、および分析される比較的少数の遺伝子セットを考えると、２５％のＦＤＲカットオフが適切である。」
【０２８７】
クロマチン免疫沈降法
ＣｈＩＰアッセイを正確に記載される通りに（Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．）実施した。逐次ＥＧＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）／ホルムアルデヒドで、架橋を実施した（Ｎｉｃｏｄｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０；４６８：１１１９−２３）。全ての結果は、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ上でＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ（ＡＢＩ）を使用して実施されたｑＰＣＲによって、定量化した。各ＩＰシグナルを入力標準曲線希釈シリーズ（ＩＰ／入力）に対して参照し、出発細胞数の差とプライマー増幅効率について正規化した。
【０２８８】
ＲＴ−ｑＰＣＲ
Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ＲＮＡを調製した。ｑＳｃｒｉｐｔ(商標)ｃＤＮＡＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ、＃１０１４１４−１０６）を使用して、ｃＤＮＡ合成を実施した。Ｓｙｂｒ  ｇｒｅｅｎ（ＡＢＩ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、＃４３６４３４４）によりＡＢＩ(商標)７９００ＨＴ上で、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を実施した。全てのシグナルは、デルタＣｔ法を使用して定量化した。全てのシグナルは、ＧＡＰＤＨのレベルに対して正規化した。
【０２８９】
プライマー
マウスＲＴ−ｑＰＣＲプライマー（５’から３’方向に記載）
Ｂｉｍ：ＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＴＴＴおよびＣＣＣＣＡＣＣＣＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＴＡ
Ｂｒｄ４：ＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＣＡＣＡＡＴＣおよびＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＡＴＣＧＧＡＣＡ
Ｃｃｌ４：ＣＣＣＧＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧおよびＣＣＡＣＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡ
Ｃｄ７４：ＣＣＡＡＣＧＣＧＡＣＣＴＣＡＴＣＴＣＴＡＡおよびＡＧＧＧＣＧＧＴＴＧＣＣＣＡＧＴＡ
Ｇａｐｄｈ：ＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣおよびＣＣＣＴＴＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＣＴ
Ｈｏｘａ７：ＡＧＴＴＣＡＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＡおよびＣＡＧＧＴＡＧＣＧＧＴＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡ
Ｈｏｘａ９：ＣＣＧＡＡＡＡＣＡＡＴＧＣＣＧＡＧＡＡおよびＣＣＧＧＧＴＴＡＴＴＧＧＧＡＴＣＧＡＴ
Ｉｔｇａｘ：ＣＣＡＧＧＴＴＧＣＣＣＡＧＴＧＡＧＡＡおよびＣＴＣＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＧＴＴＣＡ
Ｍｍｐ９：ＣＡＴＴＣＧＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＧＡＧＴおよびＴＣＡＣＡＣＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＴＴＴＧ
Ｍｙｃ：ＧＣＣＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡおよびＧＴＣＧＴＣＡＧＧＡＴＣＧＣＡＧＡＴＧＡＡＧ
【０２９０】
ヒトＲＴ−ｑＰＣＲプライマー（５’から３’方向に記載）
ＢＩＭ：ＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧおよびＣＴＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧ
ＢＲＤ４：ＣＣＣＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧおよびＧＣＴＣＧＣＴＧＣＧＧＡＴＧＡＴＧ
ＧＡＰＤＨ：ＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＡおよびＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣ
ＭＹＣ：ＡＧＧＧＡＴＣＧＣＧＣＴＧＡＧＴＡＴＡＡおよびＴＧＣＣＴＣＴＣＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＴ
【０２９１】
マウスＭｙｃＣｈＩＰプライマー（５’から３’方向に記載）
Ｍｙｃ−３．８ｋｂ：ＴＧＴＧＧＣＴＴＴＣＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴおよびＡＧＧＧＧＡＣＡＴＣＣＣＣＡＴＴＴＴＡＣ
Ｍｙｃ−２．２ｋｂ：ＡＴＴＣＡＴＴＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡおよびＴＴＧＣＡＡＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＴＡＧＡ
Ｍｙｃ−１．９ｋｂ：ＡＣＡＡＡＴＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＡＣおよびＡＡＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＴＣ
Ｍｙｃ−１．８ｋｂ：ＧＧＴＧＧＣＴＣＴＴＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧおよびＴＣＧＡＧＣＴＣＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＴＣ
Ｍｙｃ−１．７ｋｂ：ＣＡＡＣＴＴＴＧＡＡＣＡＡＴＧＡＧＣＡＣＣＴおよびＣＴＣＴＣＡＣＴＧＣＴＡＣＣＣＧＧＴＴＴ
Ｍｙｃ−１．５ｋｂ：ＣＧＡＧＧＡＧＴＣＣＧＧＡＡＴＡＡＧＡＡおよびＴＣＴＴＴＴＧＣＴＣＴＧＴＧＣＡＴＴＧＧ
Ｍｙｃ−１ｋｂ：ＧＣＣＴＣＴＴＧＴＧＡＡＡＡＣＣＧＡＣＴおよびＣＣＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＴＡＣＡＣ
Ｍｙｃ＋１ｋｂ：ＴＧＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧＧＴＣＴＴＴＧＧおよびＣＡＧＡＡＡＴＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡ
Ｍｙｃ＋１．５ｋｂ：ＣＣＣＴＣＣＣＣＴＴＴＴＡＴＴＴＣＧＡＧおよびＧＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣＣＧＡＴＴＧＣＴＧ
Ｍｙｃ＋３．７ｋｂ：ＴＧＣＴＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＧおよびＣＴＣＣＣＡＧＡＡＡＧＧＣＡＧＡＡＣＡＧ
【０２９２】
抗体
ウエスタンブロット法で使用した抗Ｂｒｄ４抗体はＧｅｒｄ  Ｂｌｏｂｅｌから贈与され、ＣｈＩＰで使用した抗Ｂｒｄ４抗体はＳｉｇｍａ（＃ＨＰＡ０１５０５５）から購入された。抗Ｍｙｃ抗体は、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ（＃１４７２−１）から購入された。ＦＡＣＳで使用される抗体：ＡＰＣ抗マウスＣＤ１１７／ｃｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃１０５８１１）、ＡＰＣ抗マウスＣＤ１１ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃１０１２１１）、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ抗マウスＣＤ４５．２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃１０９８２０）、マウス造血系ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃８８−７７７２−７２）、ＡＰＣ抗マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃１０３２１２）、ＡＰＣ抗マウスＴＥＲ−１１９／Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  Ｃｅｌｌｓ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃１１６２１２）、ＡＰＣ抗マウスＬｙ−６Ｇ／Ｇｒ−１（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃１７−５９３１）、ＰＥ−Ｃｙ７抗マウスＣＤ１１７／ｃｋｉｔ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃２５−１１７１−８２）、およびＡＰＣ抗マウスＳｃａ−１（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃１７−５９８１−８１）。抗β−アクチンＨＲＰ抗体は、Ｓｉｇｍａ（＃Ａ３８５４）から購入された。
【０２９３】
抗Ｂｒｄ４抗体はＧｅｒｄ  Ｂｌｏｂｅｌから贈与された。抗Ｍｙｃ抗体（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ、＃１４７２−１）。ＦＡＣＳで使用された抗体、ＡＰＣ抗マウスＣＤ１１７／ｃｋｉｔ（＃１０５８１１）、ＡＰＣ抗マウスＣＤ１１ｂ（＃１０１２１１）、およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ抗マウスＣＤ４５．２（＃１０９８２０）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入された。抗β−アクチンＨＲＰ抗体は、Ｓｉｇｍａ（＃Ａ３８５４）から購入された。
【０２９４】
動物実験
生体内条件的ＲＮＡｉ実験では、Ｔｅｔ−Ｏｎ  ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞をＴＲＭＰＶ−ｓｈＲＮＡコンストラクトで形質導入した。亜致死的に（５．５Ｇｙ）照射されたＢ６／ＳＪＬ（ＣＤ４５．１）受容マウスへの１×１０６個の細胞の尾静脈注射によって、白血病細胞を移植した。
【０２９５】
全身生物発光イメージングのために、マウスに５０ｍｇ／ｋｇＤ−ルシフェリン（Ｇｏｌｄｂｉｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を腹腔内注射し、１０分後に、ＩＶＩＳ（登録商標）スペクトルシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して分析した。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、マウスの体躯と四肢をカバーする関心のある長方形領域を標準化して、定量化を実施した。
【０２９６】
ｓｈＲＮＡ誘導では、飲料水（２％スクロース添加２ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および飼料（６２５ｍｇ／ｋｇ、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の双方の中のドキシサイクリンで動物を処理した。ＪＱ１処理の試行では、ボルテックス下で、１０％２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）キャリアを滴下添加して、ＤＭＳＯ中の１００ｍｇ／ｍｌのＪＱ１の原液を２０倍希釈し、５ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。ＭＬＬ−ＡＦ９／ＮｒａｓＧ１２Ｄ白血病細胞を移植したマウスに、新鮮に調製したキャリア希釈ＪＱ１（１００ｍｇ／ｋｇ）または４００μｌのキャリア（５％ＤＭＳＯ含有）を毎日腹腔内注射（ＩＰ）した。
【０２９７】
マイクロアレイ分析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＴ  １．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓを使用して、発現マイクロアレイを実施した。ＧＳＥＡｖ２．０７ソフトウェアを使用して、１０００の表現型置換により経路分析を実施した（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．）。
【０２９８】
その他の実施形態
前述の説明から、本明細書に記載される発明に変更および修正を加えて、様々な用途と条件に適合させてもよいことは明らかである。このような実施形態もまた、以下の請求項の範囲内である。
【０２９９】
本明細書の任意の変数の定義における要素一覧の列挙は、任意の単一要素または列挙された要素の組み合わせとしての変数の定義を含む。本明細書の実施形態の列挙は、任意の単一実施形態としての、または任意のその他の実施形態またはその部分と組み合わさった、その実施形態を含む。
【０３００】
本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、あらゆる目的のために特許および刊行物がそれぞれが具体的に独立して個々に援用されたかのように、参照によって本明細書に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【配列表】
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