(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドであって、
配列番号３の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）および５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦ酸）を、２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）に酸化する能力を有する
ポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）請求項１に定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に定義されるヌクレオチド配列の相補鎖であるヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
【請求項４】
請求項２に記載のポリヌクレオチド配列または請求項３に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項５】
オキシドレダクターゼをコードするヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含む細胞であって、
前記オキシドレダクターゼが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有しており、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、
前記オキシドレダクターゼのその発現が、前記発現構築物を含まない、対応する野生型細胞と比較して、ＨＭＦおよびＨＭＦ酸のうちの少なくとも１つをＦＤＣＡに酸化する能力を細胞に与え、または細胞における前記能力を向上させる、
細胞。
【請求項６】
前記細胞が、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アナベーナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、コーロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシェラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、もしくはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；またはバチルス・スブチリス種（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス種（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス種（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プンチス種（Ｂ．ｐｕｎｔｉｓ）、バチルス・メガテリウム種（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ハロデュランス種（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・プミルス種（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、グルコノバクター・オキシダンス種（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）、コーロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＣＢ１５種、メチロバクテリウム・エキストロクエンス種（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ロドバクター・スフェロイデス種（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、シュードモナス・プチダ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス種（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パラコッカス・デニトリフィカンス種（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、大腸菌種（Ｅ．ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム種（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、スタフィロコッカス・カルノーサス種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトミセス・リビダンス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、シノリゾビウム・メリオティ種（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｏｔｉ）、およびリゾビウム・ラジオバクター種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）の群から選択される細菌である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記細胞が、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、もしくはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）；またはクリベロミセス・ラクチス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・セルビシエ種（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリティカ種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびピチア・パストリス種（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からなる群からの酵母細胞、あるいはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、もしくはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）；または、アスペルギルス・ニガー種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソジェ種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロミセス・エメルソニ種（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリゼ種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス種（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、トリコデルマ・リーゼイ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、もしくはペニシリウム・クリゾゲヌム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の群からの糸状菌細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項８】
請求項１に定義されたオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドを製造するための方法であって、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、請求項５〜７のいずれか一項に記載の細胞を培養することを含む方法。
【請求項９】
ＦＤＣＡを生成するための方法であって、
オキシドレダクターゼ触媒の存在下でのオキシダントとの反応によって、ＦＤＣＡの１つまたは複数のフラン前駆体がＦＤＣＡに変換され、
前記ＦＤＣＡのフラン前駆体が、ＦＤＣＡに酸化され得るフラン基を有する化合物であり、
前記オキシドレダクターゼ触媒が請求項１に記載のポリペプチドを含む方法。
【請求項１０】
ＦＤＣＡの前記フラン前駆体が、ＨＭＦ、２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＨＭＦアルコール）、およびＨＭＦ酸からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記フラン前駆体がＨＭＦである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＭＦが、酸の存在下で加熱することにより１つまたは複数のヘキソース糖から得られる、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つまたは複数のヘキソース糖がバイオマスから得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＭＦ酸を生成するための方法であって、
ＨＭＦおよびＨＭＦアルコールのうちの少なくとも１つが、オキシドレダクターゼ触媒の存在下でのオキシダントとの反応によってＨＭＦ酸に変換され、前記オキシドレダクターゼ触媒が請求項１に記載のポリペプチドを含む方法。
【請求項１５】
オキシダントとの反応が、オキシドレダクターゼ触媒ならびにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ピロロキノリンキノロン（ＰＱＱ）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）からなる群から選択される１または複数の補酵素の存在下で行われる、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記オキシドレダクターゼ触媒が、請求項５〜７のいずれか一項に記載の細胞の無細胞抽出物である、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記オキシドレダクターゼ触媒が、請求項５〜７のいずれか一項に記載の細胞である全細胞生体触媒である、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
１つまたは複数のＦＤＣＡモノマーからポリマーを生成するための方法であって、
ａ）請求項９〜１３および１５〜１７のいずれか一項に記載の方法によって、ＦＤＣＡモノマーを製造するステップ、および
ｂ）ａ）で得られた前記ＦＤＣＡモノマーからポリマーを製造するステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドに関し、このポリペプチドをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド配列に関する。本発明は、さらに２，５−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）の生成に関する。さらに、これらのポリペプチドを生成するのに適した、本発明によるポリヌクレオチドによって形質転換された細胞も、本発明に含まれ、これらの細胞はまた、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）のＦＤＣＡへの生体内変換のために使用することもできる。
【０００２】
［背景技術］
２，５−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）は、ＰＥＴなどのポリエステルの生成においてテレフタレートの生体ベースの代替物になる可能性が大きい。そのため、また他の理由から、ＦＤＣＡは、バイオマスからの高付加価値化学物質（Ｔｏｐ  Ｖａｌｕｅ−Ａｄｄｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に関するＤＯＥレポートにおいてトップ１２優先化学物質の１つと選定された（Ｔｏｐ  Ｖａｌｕｅ−Ａｄｄｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｍａｓｓ、Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ−Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｕｇａｒｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ、  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ（ＵＳＡ）、２００４）。この化合物は、酸性条件下でヘキソース糖を加熱することにより生成され得る５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）の酸化によって得ることができる。ＤＯＥレポートの２７ページに、ＦＤＣＡのいくつかの潜在的な有用性が開示されている。これらの有用性には、コハク酸、２，５−ビス（アミノメチル）−テトラヒドロフラン、２，５−ジヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン、２，５−ジヒドロキシメチルフラン、および２，５−フランジカルバルデヒドを生成する基質としての役割が含まれる。Ｃ６糖の化学的酸化脱水によるＦＤＣＡの生成およびＦＤＣＡの用途はよく知られており、２６ページの表１３には技術的な障害も提示されているが、生体内変換（おそらく酵素的変換）については、その状況は不明であった。
【０００３】
ＦＤＣＡの酵素的調製の方法は、国際公開２００９／０２３１７４号パンフレットに開示されている。この開示では、ヒドロキシメチルフルフラール類がクロロペルオキシドレダクターゼにより酸化され、ヒドロキシメチルフルフラールのＣ１位置にカルボン酸基を有する生成物、具体的にはホルミルフランカルボン酸すなわちＦＦＣＡが過酸化水素により酸化された。その結果を、例えば図１に示す。別の実施形態では、酸化基質の存在下でＨＭＦをオキシドレダクターゼと接触させ、それによってＨＭＦをジホルミルフランまたはホルミルフランカルボン酸の少なくとも１つに酸化する。
【０００４】
国際公開２００９／０２３１７４号パンフレットにある公知の方法の欠点は、この反応が過酸化水素を必要とすること、および形成される生成物がＦＤＣＡと２つの混入副産物、ヒドロキシメチルフランカルボン酸（ＨｍＦＣＡ）およびホルミルフランカルボン酸（ＦＦＣＡ）との混合物であることである。その結果、ＨＭＦからＦＤＣＡへの収率は低下し、実質的に精製された形でＦＤＣＡを得るために回収ステップを追加する必要がある。
【０００５】
データベースＥＢＩにおいて、「バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰｓＪＮの第１染色体の完全配列」の中で、グルコース−メタノール−コリンオキシドレダクターゼとの相同性から推定されたＵｎｉｐｒｏｔ  Ｂ２Ｔ４Ｒ９、５７７個のアミノ酸配列が同定された。
【０００６】
データベースＥＢＩにおいて、「バークホルデリア・フィマツム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｍａｔｕｍ）ＳＴＭ８１５のプラスミド１の完全配列」の中で、グルコース−メタノール−コリンオキシドレダクターゼとの相同性から推定された、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｂ２ＪＳＺ０、５７６個のアミノ酸配列が同定された。
【０００７】
Ｄｅｕｒｚｅｎ，Ｍ．Ｐ．Ｊら、Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６（３）、２９９〜３０９（１９９７）では、５−ヒドロキシメチルフルフラールのクロロペルオキシダーゼ触媒による酸化が開示されている。この反応では、フラン−２，５−ジカルボキサルデヒド（ＦＤＣ）への選択性が６０〜７４％である。副産物は、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＦＣＡ）および５−ホルミルフラン−２−カルボン酸（ＦＦＣＡ）であった。
【０００８】
［発明の概要］
本発明の目的は、分子状酸素をレドックス反応に使用することができるオキシドレダクターゼを提供することである。別の目的は、幅広い反応スペクトルを有するオキシドレダクターゼを提供することである。別の目的は、高い部位特異性を有するオキシドレダクターゼを提供することである。本発明のさらなる目的は、実質量の副生成物を回避することができる、ＦＤＣＡを生成するための方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、実質量の副生成物を回避することができる、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦ酸）を生成するための方法を提供することである。本発明によってこれらの目的の１つまたは複数が達成される。
【０００９】
本発明は、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、オキシドレダクターゼ活性、具体的にはＨｍｆＨオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドを通常はコードする。
【００１０】
したがって、本発明によれば、配列番号３に示されるアミノ酸配列もしくは配列番号４のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列もしくは配列番号３の配列と４５％以上の配列同一性もしくは４５％超の配列同一性を有するその変異体ポリペプチドを含む、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドが提供される。
【００１１】
これらのオキシドレダクターゼポリペプチドは、付加価値化合物ＦＤＣＡを生成するための、化学的酸化ルートの代わりとなる酵素的代替ルートを提供し、温和な反応条件（３０℃、ｐＨ７）を可能にして、かつ無用な生成物を少なくする。このオキシドレダクターゼは、真正のオキシダーゼである。すなわち、分子状酸素のみがこの酸化反応に必要であり、高価な補因子を再生する必要がない。この酵素は幅広い反応特異性および部位特異性を示し、アルコール基およびアルデヒド基の両方を、これらの基がフラン骨格のＣ２位置またはＣ５位置のいずれにあるかにかかわらず、最終的にカルボン酸へ酸化する。
【００１２】
さらに、本発明によれば、本発明のポリヌクレオチド配列を組み込んでいる発現ベクターなどのベクター、および本発明によるポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターを含む細胞が提供される。
【００１３】
本発明は、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドを製造するための方法をさらに提供し、この方法は、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で本発明の細胞を培養すること、ならびに場合によっては、この発現ポリペプチドおよびこのような方法によって得られるポリペプチドを回収することを含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、強健な全細胞生体触媒を使用して、フルクトースリッチな（リッチにされた）流加からＦＤＣＡを生成する統合的方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＨｍｆＨオキシドレダクターゼによって触媒される酸化の反応スキームを示す図である。
【図２】ＨｍｆＨ発現ベクターｐＪＴ’ｈｍｆＨのプラスミドマップを示す図である。Ｐｔａｃ’、ｔａｃプロモーター；ｒｅｐ、ｐＲＯ１６００複製タンパク質をコードする遺伝子；ｇｍＲ、ゲンタマイシン耐性遺伝子；ｂｌａ、β‐ラクタマーゼ；ｐＲＯ１６００−ｏｒｉ、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）のための複製開始点；ｐＵＣ  ｏｒｉ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のための複製開始点。
【図３Ａ】Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４（Ａ）ならびにフルフラールおよび／またはＨＭＦを利用する可能性があると同定された他種（Ｂ）における、フルフラールおよびＨＭＦの代謝関連遺伝子の遺伝子構成を示す概略図である。
【図３Ｂ】Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４（Ａ）ならびにフルフラールおよび／またはＨＭＦを利用する可能性があると同定された他種（Ｂ）における、フルフラールおよびＨＭＦの代謝関連遺伝子の遺伝子構成を示す概略図である。
【図３Ｃ】Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４（Ａ）ならびにフルフラールおよび／またはＨＭＦを利用する可能性があると同定された他種（Ｂ）における、フルフラールおよびＨＭＦの代謝関連遺伝子の遺伝子構成を示す概略図である。
【図３Ｄ】Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４（Ａ）ならびにフルフラールおよび／またはＨＭＦを利用する可能性があると同定された他種（Ｂ）における、フルフラールおよびＨＭＦの代謝関連遺伝子の遺伝子構成を示す概略図である。
【図４】Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２  ｐＪＴ’ｈｍｆＨの粗細胞抽出物中でのＨＭＦからのＦＤＣＡ、ＨＭＦ−アルコール（Ｈ−ｏｈ）、およびＨＭＦ−酸（Ｈ−酸）の形成を示す図である。
【図５】Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）＿ｐＪＴ’ｈｍｆＨの流加回分培養法におけるＨＭＦ酸およびＦＤＣＡの形成を示す図である。左側矢印は、ＨＭＦ流加の開始を示す；右側矢印は、流加へのグリセロールの追加を示す。
【図６】Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）＿ｐＪＴ’ｈｍｆＨの流加回分培養法におけるＨＭＦ酸およびＦＤＣＡの形成を示す図である。矢印は、ＨＭＦとグリセロールを合わせた流加の開始を示す。
【図７Ａ】７ａは、実施例ＶＩＩＩの流加回分発酵におけるＨＭＦ酸、ＦＤＣＡ、およびバイオマスの濃度を示す図である。７ｂは、実施例ＶＩＩＩの流加回分発酵におけるグリセロールおよびＨＭＦの流加速度を示す図である。
【図７Ｂ】７ａは、実施例ＶＩＩＩの流加回分発酵におけるＨＭＦ酸、ＦＤＣＡ、およびバイオマスの濃度を示す図である。７ｂは、実施例ＶＩＩＩの流加回分発酵におけるグリセロールおよびＨＭＦの流加速度を示す図である。
【００１６】
［配列リストの簡単な説明］
配列番号１は、プライマーＦＮ２３のＤＮＡ配列：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＧＡＣＣＧ−３’を示す。下線の配列は、ＥｃｏＲＩ制限部位を示す。
配列番号２は、プライマーＦＮ２４のＤＮＡ配列：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＴＴＣＧＧＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＧＧＡＴＧ−３’を示す。下線の配列は、ＥｃｏＲＩ制限部位を示す。
配列番号３は、ＨｍｆＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、ｈｍｆＨのコード配列を示す。
【００１７】
［発明の詳細な説明］
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの語尾変化語は、包含的であると解釈されるべきである。すなわち、これらの単語には、文脈の枠内で、具体的に列挙されない他のエレメントまたは整数も包含され得ることを示す意図がある。
【００１８】
本明細書において使用する冠詞「ａ」および「ａｎ」は、この冠詞の文法上の目的語が１つまたは２以上である（すなわち１つまたは少なくとも１つである）ことを指す。例として、「１つのエレメント（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１つのエレメントまたは２つ以上のエレメントを意味することができる。
【００１９】
本明細書における幅広い反応スペクトルとは、オキシドレダクターゼが多くの様々な基質、例えばＨＭＦ、ＨＭＦ酸、ＨＭＦアルコール、フルフラール、フルフリルアルコールに対して触媒として作用することができることを意味する。部位特異性とは、オキシドレダクターゼが特定のＣ原子のみを酸化することを意味する。
【００２０】
オキシドレダクターゼポリペプチド
オキシドレダクターゼ活性を有する本発明によるポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列もしくは配列番号４のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列または配列番号３に示される配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するその変異体ポリペプチドを含む。
【００２１】
一実施形態では、変異体核酸分子は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列に少なくとも６６％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の相同性の実質的に相同なヌクレオチド配列を含む、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、変異体タンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列に少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の相同性の実質的に相同なアミノ酸配列を含む。
【００２２】
本発明の一実施形態は、（ａ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号４の逆相補鎖であるポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも６６％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｄ）少なくとも約１００ヌクレオチド長である、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）で定義されるヌクレオチド配列のフラグメント；（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のいずれか１つに定義される配列に、遺伝子コードの結果として縮重した配列；（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、もしくは（ｅ）に定義されるヌクレオチド配列の逆相補鎖であるヌクレオチド配列、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および関連ポリペプチドに対するポリヌクレオチドである。
【００２３】
一実施形態は、ＧＣ含量が５６％以上、５８％以上、または５８〜６５％であり得るこのポリヌクレオチドを含む核酸構築物である。さらなる実施形態は、このポリヌクレオチド配列を組み込んでいるベクター、または核酸構築物である。
【００２４】
用語「相同性」、「配列同一性」などは、本明細書では互換的に使用される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間または２つの核酸配列間で共通する配列同一性の程度を決定するために、最適な比較を目指した配列アライメントが本明細書において定義される（例えば第２のアミノ酸配列または核酸配列との最適アライメントのために、第１のアミノ酸配列または核酸配列の配列の中にギャップを導入することができる）。このようなアライメントは、比較される配列の全長にわたって実行することができる。あるいは、このアライメントは、より短い比較鎖長、例えば約２０、約５０、約１００以上の核酸／塩基またはアミノ酸にわたって実行することができる。
【００２５】
次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合に、これらの分子はその位置において同一である。配列間で共通する同一性の程度は、２つの配列間の同一率によって通常表現され、配列間で共通する同一位置の数の関数である（すなわち、同一率（％）＝同一位置の数／位置（すなわち、重なり位置）の総数×１００）。比較される２つの配列は同じまたは実質的に同じ長さであることが好ましい。
【００２６】
２つの配列間の相同性を決定するために、数種類の異なるコンピュータプログラムが入手可能であるという事実は、当業者ならば承知しているであろう。例えば、２つの配列間の配列の比較および同一率の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一率は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／から入手可能）の中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４〜４５３（１９７０））のアルゴリズムによって、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の鎖長重みを使用して決定される。これらすべての異なるパラメータにより、若干異なる結果が得られること、しかし２つの配列の全体的な同一率は、異なるアルゴリズムを用いる場合にもあまり変わらないことは、当業者ならば認識するであろう。
【００２７】
さらに別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一率は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／から入手可能）の中のＧＡＰプログラムによって、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の鎖長重みを使用して決定される。別の実施形態では、２つのアミノ酸配列間またはヌクレオチド配列間の同一率は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（ＧｅｎｅｓｔｒｅａｍサーバーＩＧＨ  Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ  Ｆｒａｎｃｅ  ｈｔｔｐ：／／ｖｅｇａ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｂｉｎ／ａｌｉｇｎ−ｇｕｅｓｓ．ｃｇｉの配列データを用いてＡＬＩＧＮ  Ｑｕｅｒｙから入手可能）の中に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１〜１７（１９８９））のアルゴリズムによって、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用して決定される。
【００２８】
本発明の核酸配列およびタンパク質配列を「クエリー配列」として使用して、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために公開データベースの検索を行うことができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０のＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｘのプログラム（バージョン２．０）を使用して行なうことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）で行って、本発明のオキシドレダクターゼ核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴｘプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）で行って、本発明のオキシドレダクターゼタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためのギャップアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２に記載のＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＢＬＡＳＴｘおよびＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照されたい。
【００２９】
本明細書において使用する用語「選択的にハイブリダイズする（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ，  ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ  ｓｅｌｃｔｉｖｅｌｙ）」および類似の用語は、少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、またはより好ましくは少なくとも９９％の相同性を互いに有するヌクレオチド配列が、通常互いにハイブリダイズした状態を保つハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載する意図がある。すなわち、このようなハイブリダイズする配列は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、またはより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有し得る。
【００３０】
このようなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定例では、約４５℃にて６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーションを行った後、約５０℃、好ましくは約５５℃、好ましくは約６０℃、さらにより好ましくは約６５℃にて、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回または複数回洗浄する。
【００３１】
高ストリンジェント条件としては、例えば、約６８℃にて、５×ＳＳＣ／５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液／１．０％ＳＤＳ中でハイブリダイズし、室温にて、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄することが挙げられる。あるいは、洗浄は４２℃で行ってもよい。
【００３２】
当業者であれば、ストリンジェントおよび高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件として、いずれの条件を適用すべきかを知っていよう。そのような条件に関するさらなる手引きは、当技術分野では容易に入手可能であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編者）、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．）が挙げられる。
【００３３】
もちろん、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクトなど）またはＴ（またはＵ）残基の相補的ストレッチに対してのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補体（例えば、実際には任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含有するいかなる核酸分子にもハイブリダイズするため、本発明の核酸の一部に特異的にハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれない。
【００３４】
典型的なアプローチでは、他の生物、例えば細菌から、具体的には微生物マユハキタケ科（Ｔｒｉｃｈｏｍａｃｅａｅ）から、例えばバークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）などのバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）から構築された遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００３５】
例えば、相同なオキシドレダクターゼポリヌクレオチドについて、サザンブロット分析により、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）株をスクリーニングすることができる。本発明の相同なＤＮＡ制限フラグメントが検出されたなら、当業者にはよく知られた標準的手法を用いて、適切な菌株から同じ大きさの染色体フラグメントを基に遺伝子ライブラリーを構築することができる。あるいは、微生物が真核生物である場合、オキシドレダクターゼＨｍｆＨのｍＲＮＡ転写物はノーザンハイブリダイゼーションによって同定することができ、この転写物が同定されたなら、真核微生物から単離された全ＲＮＡを使用してｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。
【００３６】
相同遺伝子配列は、例えば、本明細書において教示したヌクレオチド配列を基に設計された２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを使用してＰＣＲを行うことにより単離することができる。
【００３７】
この反応のテンプレートは、本発明のポリヌクレオチドを発現すると知られているかまたは推定される菌株由来の全染色体ＤＮＡとすることができる。ＰＣＲ生成物をサブクローニングし、増幅された配列が新規のオキシドレダクターゼの核酸配列またはその機能的等価物の配列であることを確認するために配列を決定することができる。
【００３８】
あるいは、この反応のテンプレートは、本発明のポリヌクレオチドを発現すると知られているかまたは推定される菌株から調製されたｍＲＮＡの逆転写により得られたｃＤＮＡとすることができる。ＰＣＲ生成物をサブクローニングし、増幅された配列が新規のオキシドレダクターゼの核酸配列またはその機能的等価物の配列であることを確認するために配列を決定することができる。
【００３９】
ＰＣＲフラグメントは、その後、様々な公知の方法により、完全長ｃＤＮＡクローンを単離するために使用することができる。例えば、増幅フラグメントを標識し、バクテリオファージまたはコスミドｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。あるいは、ゲノムライブラリーをスクリーニングするために、この標識フラグメントを使用することができる。
【００４０】
ＰＣＲ技術はまた、他の生物から完全長ｃＤＮＡ配列を単離するために使用することができる。例えば、適切な細胞源または組織源から標準的手法によりＲＮＡを単離することができる。第１鎖の合成をプライミングするための、増幅フラグメントのほとんどの５’末端に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＲＮＡ上で逆転写反応を行うことができる。
【００４１】
次いで、得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに、標準ターミナルトランスフェラーゼ反応を使用して「尾」を付け（例えばグアニンで）、そのハイブリッドをＲＮａｓｅ  Ｈにより消化した後、第２鎖の合成を（例えば、ポリ−Ｃプライマーにより）プライミングすることができる。こうして、増幅フラグメントの上流のｃＤＮＡを容易に単離することができる。有用なクローニング戦略のレビューには、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。
【００４２】
本発明の別の態様は、クローニングベクターおよび発現ベクターを含めた、オキシドレダクターゼタンパク質またはその機能的等価物をコードする本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに例えば本発明のポリヌクレオチドの発現が起こる条件下で、適切な宿主細胞においてこのようなベクターを増殖、形質転換または形質移入する方法に関する。本明細書において使用する用語「ベクター」は、別の核酸分子に連結して、その核酸分子を輸送することができる核酸分子を指す。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え複製可能ベクター、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターに組み込むこむことができる。このベクターを使用して、適合性宿主細胞中で核酸を複製してもよい。こうしてさらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能ベクターに導入すること、ベクターを適合性宿主細胞に導入すること、およびベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって、本発明のポリペプチドを作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収してもよい。適切な宿主細胞は以下に記載がある。
【００４４】
本発明の発現カセットまたはポリヌクレオチドが挿入されているベクターは、組換えＤＮＡ手法に便利に供することができる任意のベクターであってもよく、ベクターの選択は、ベクターが導入されることになる宿主細胞に依存することが多い。
【００４５】
本発明によるベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、その複製が染色体の複製に依存しない、染色体外の実体として存在するベクター、例えばプラスミドであってもよい。あるいは、このベクターは、宿主細胞に導入された場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それを組み込んだ染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
【００４６】
ベクターのタイプの１つは「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、このベクターではウイルスゲノムに追加のＤＮＡセグメントを連結することができる。ある種のベクターは、導入された宿主細胞中で自己複製することができる（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると同時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その結果、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。本明細書では、このようなベクターを「発現ベクター」という。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、用語「プラスミド」および「ベクター」は、本明細書において互換的に使用することができる。しかしながら、本発明は、機能的に等価な、コスミド、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）、およびファージベクターなどの他の形態の発現ベクターを包含することが意図される。
【００４７】
本発明によるベクターは、例えばＲＮＡの生成のために、または宿主細胞の形質移入もしくは形質転換のためにインビトロで使用してもよい。
【００４８】
本発明のベクターは、２個以上、例えば３個、４個、または５個の本発明のポリヌクレオチドを、例えば過剰発現のために含んでもよい。
【００４９】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中で核酸を発現するのに適した形態で本発明の核酸を含む。このことは、組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づき選択され、発現される核酸配列に作動可能に連結された１つまたは複数の調節配列を含むことを意味する。
【００５０】
発現ベクターなどのベクターにおいて、「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にするように、調節配列に連結されていることを意味することが意図される。すなわち、用語「作動可能に連結された」は、記載の成分がその意図される様式で機能することを可能にする位置関係で並置されることを意味する。コード配列に「作動可能に連結された」プロモーター、エンハンサー、または他の発現調節シグナルなどの調節配列を、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるように位置させるか、または意図した目的のために協調して機能するように、例えば、転写がプロモーターで始まり、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を通って進行するようにその配列を配置する。
【００５１】
用語「調節配列」または「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。
【００５２】
用語「調節配列」または「制御配列」には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的な発現を指示する配列、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示する配列（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。
【００５３】
したがって、所与の宿主細胞に対するベクターまたは発現構築物は、第１の発明のポリペプチドをコードする配列のコード鎖に関して、５’末端から３’末端に向かって連続した順序で互いに作動的に連結された次のエレメントを含んでもよい。（１）所与の宿主細胞において、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の転写を指示することができるプロモーター配列；（２）場合によっては、所与の宿主細胞から培地へのポリペプチドの分泌を指示することができるシグナル配列；（３）セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの成熟型および好ましくは活性型をコードする本発明のＤＮＡ配列；好ましくはさらに（４）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流にある、転写を終結させることができる転写終結領域（ターミネーター）。
【００５４】
本発明によるヌクレオチド配列の下流に、１つまたは複数の転写終結部位（例えば、ターミネーター）を含有する３’非翻訳領域が存在し得る。ターミネーターの起源はそれほど重要ではない。例えば、ターミネーターは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列にとって本来のものにすることができる。しかしながら、酵母宿主細胞の中では酵母のターミネーターを使用すること、また、糸状菌宿主細胞の中では糸状菌のターミネーターを使用することが好ましい。ターミネーターが宿主細胞（この中でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現されることになる）にとって内因性のものであることがより好ましい。転写領域では、翻訳のためのリボソーム結合部位が存在してもよい。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分には、始点には翻訳開始のＡＵＧ、また翻訳されるポリペプチドの終点には適切な場所に終止コドンが含まれる。
【００５５】
さらに、本発明のポリヌクレオチドの発現は、異種の制御領域、例えばプロモーター、分泌リーダー、および／またはターミネーターの領域を選ぶことによって増強し得る。これらの制御領域は、発現の増強、所望の場合には、発現宿主からの目的タンパク質の分泌レベルの増強、および／または本発明のポリペプチド発現の誘導制御の実現を促進させ得る。
【００５６】
発現ベクターの設計は、形質変換される宿主細胞の選択、所望タンパク質の発現レベル等の要因に依存し得ることは、当業者ならば認識されよう。発現ベクターなど、本発明のベクターを宿主細胞に導入し、それによって本明細書に記載の核酸がコードするタンパク質またはペプチド（例えば、オキシドレダクターゼタンパク質、オキシドレダクターゼタンパク質の突然変異形態、オキシドレダクターゼタンパク質のフラグメント、変異体、または機能的等価物、融合タンパク質など）を生成させることができる。
【００５７】
組換え発現ベクターなど、本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞の中でオキシドレダクターゼタンパク質を発現するように設計することができる。例えば、オキシドレダクターゼタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、糸状菌、酵母細胞、または哺乳類細胞の中で発現することができる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、  ＣＡ（１９９０）の中にさらに取り上げられている。適切な宿主の代表例は本明細書の以下に記載がある。
【００５８】
上記宿主細胞のための適切な培地および条件は、当技術分野で知られている。
【００５９】
上述の用語「制御配列」または「調節配列」は、本明細書では、ポリペプチドの発現に必要および／または有利となり得る成分を少なくとも１つ含むと定義される。いずれの制御配列も、ポリペプチドをコードする本発明の核酸配列にとって本来のものであっても、または外来のものであってもよい。このような制御配列としては、プロモーター、リーダー、最適な翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋ、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７〜１９８７０に記載）、分泌シグナル配列、プロペプチド配列、ポリアデニル化配列、転写ターミネーターを挙げ得るが、これらに限定されるものではない。最低限でも、制御配列はプロモーターならびに転写および翻訳の終止シグナルを通常含んでいる。
【００６０】
安定に形質転換された微生物とは、１つまたは複数のＤＮＡフラグメントが導入されており、増殖培養において、その導入分子を維持し、複製し、かつ隔離するような微生物である。安定な形質転換は、多重もしくは単一の染色体組込みまたはプラスミドベクターなどの染色体外エレメントによる可能性がある。プラスミドベクターは、特定のＤＮＡフラグメントによってコードされたポリペプチドの発現を指示することができる。
【００６１】
発現は、構成的であってもよく、または特定のポリペプチドをコードする機能的に関連するＤＮＡフラグメントを高レベルで転写させることができる誘導性（または抑制性）プロモーターによって調節されてもよい。
【００６２】
オキシドレダクターゼの単離
オキシドレダクターゼまたはオキシドレダクターゼを発現するＤＮＡ物質は、生物、好ましくはオキシドレダクターゼを発現する微生物から単離し得る。微生物はＨＭＦを利用できることが好ましいが、これは必須ではない。微生物は、カプリアビダス属（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｈｒｉｚｏｂｉｕｍ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；カプリアビダス・バシレンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｂａｓｉｓｌｉｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｈｒｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、メチロバクテリウム・ラデイオトレランス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カプリアビダス・バシスレンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｂａｓｉｓｌｉｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰｓＪＮ、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｈｒｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＵＳＤＡ１１０、メチロバクテリウム・ラデイオトレランス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＪＣＭ２８３１からなる群から選択されることが好ましい。
【００６３】
本発明において有用な最も好ましいオキシドレダクターゼは、ＨＭＦを利用するものであり、カプリアビダス・バシレンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｂａｓｉｓｌｉｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４から単離されたオキシドレダクターゼである。このオキシドレダクターゼは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）に従ってドイツ細胞バンク（ＤＳＭＺ）に寄託されている：カプリアビダス・バシレンシスＨＭＦ１４＝ＤＳＭ２２８７５、寄託日：２００９年８月１９日、寄託者ＴＮＯ、Ｓｃｈｏｅｍａｋｅｒｓｔｒａａｔ  ９７、２６２８ＶＫ  Ｄｅｌｆｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ。
【００６４】
したがって、我々はＨＭＦ利用細菌であるカプリアビダス・バシレンシス株ＨＭＦ１４を分離し、ＨＭＦ分解経路に関与する遺伝子を同定した。これらの遺伝子の１つ（本明細書における定義はｈｍｆＨ）は、５７９個のアミノ酸からなる６２ｋＤａのＦＡＤ依存性オキシドレダクターゼをコードしており、このオキシドレダクターゼはフルフリルアルコール、フルフラール、ＨＭＦ、および５−ヒドロキシメチルフロン酸を酸化することが見出された。これらの分子中のＣ２およびＣ５のアルコール基／アルデヒド基は、レダクターゼ活性の存在は有利かもしれないが、レダクターゼをコードする核酸構築物の追加を必要とすることなく、酸化された（図１を参照されたい）。
【００６５】
このようにして、本発明は、ポリペプチド、例えばオキシドレダクターゼ（ＥＣ１．１＋ＥＣ１．２の活性）活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書では、酵素はポリペプチドのサブクラスである。
【００６６】
酸化反応
本明細書では、酸化反応は、本発明のオキシドレダクターゼおよび１つまたは複数の補酵素（本明細書の下記に記載）の存在下でのフラン化合物とオキシダントとの１回または複数回の反応である。この酸化反応は、生成物を生じる１回の酸化反応ステップ（例えばＨＭＦ−酸のＦＤＣＡへの酸化）を含むことができる。あるいは、この酸化反応は、２回以上の酸化反応ステップを含むことができ、各ステップで中間体が生まれ、最後の中間体が最終生成物である（例えばＨＭＦのＦＤＣＡへの酸化）。酸化反応の例を図１に示す。
【００６７】
１つの酸化反応は２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）の生成であり、この反応では、オキシドレダクターゼ触媒および１つまたは複数の補酵素の存在下でのオキシダントとの反応によって、ＦＤＣＡの１つまたは複数のフラン前駆体がＦＤＣＡに変換される。ここで、オキシドレダクターゼ触媒は本発明によるポリペプチドを含む。ＦＤＣＡのフラン前駆体は、５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）、２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＨＭＦアルコール）、および５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦ酸）からなる群から選択することができ、好ましくは、フラン前駆体はＨＭＦである。ＨＭＦは、従来の方法で酸の存在下で加熱することにより１つまたは複数のヘキソース糖から得てもよい。ヘキソース糖はバイオマスから得てもよい。この酸化反応はまた、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦ酸）を生成するための方法であってもよく、この反応では、オキシドレダクターゼ触媒および１つまたは複数の補酵素の存在下でのオキシダントとの反応によって、ＨＭＦ酸の１つまたは複数のフラン前駆体がＨＭＦ酸に変換される。ここで、オキシドレダクターゼ触媒は本発明によるポリペプチドを含む。一実施形態では、ＨＭＦ酸のフラン前駆体は、５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）および２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＨＭＦアルコール）から選択される群から選択される。他の酸化方法も可能である。
【００６８】
酸化反応は、比較的温和な温度、すなわち１０〜８０℃、より好ましくは２０〜４５℃、最も好ましくはおよそ２５〜４０℃にて行うことが好ましい。反応中のｐＨは、好ましくはｐＨ３〜８、より好ましくはおよそｐＨ７である。反応時間は、大気中酸素または純酸素を使用して、６〜１８時間であり、酵素はより長時間活性であることが好ましい。
【００６９】
反応器は任意の適切な（通気型）バイオリアクターとすることができる。反応器は、バッチで、連続的に、または好ましくは流加回分形式で操作することができる。
【００７０】
ＦＤＣＡ、ＨＭＦ−酸などのような酸化生成物は、冷却／再結晶および結晶化した酸化生成物、例えば結晶化ＦＤＣＡの分離によって反応混合物から回収することができる。しかしながら、当技術分野で知られているように、酸沈殿および溶媒抽出などの他の回収方法が適切であるが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
場合によっては、反応は補酵素の存在下で行われる。補酵素は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）および／またはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）および／またはピロロキノリンキノロン（ＰＱＱ）であってもよい。デヒドロゲナーゼ活性、例えばその細胞抽出物において酸化反応が起こるかまたは存在する細胞の中に見出される内因性の脱水素活性との相乗効果が本発明の酸化反応で見出された。モノマーの１つが、記載のＦＤＣＡである、１つまたは複数のモノマーからポリマーを生成するための方法。
【００７２】
［オキシダント］
本発明による反応中のオキシダントは、任意のオキシダント、好ましくは酸素であってもよい。酸素の最も経済的な供給源は空気である。このことは、空気が大気から容易に得られ、無料、無毒性、かつ反応後に除去する必要もない点で有利である。あるいは、分子状酸素放出系を利用してもよい。酸素発生系は、当技術分野で開示された様々な酸素発生系から原則として選択し得る。例えば、反応混合物の中にすでに存在するカタラーゼ酵素を利用して、過酸化水素から酸素を発生させ得る。
【００７３】
［フラン化合物］
本明細書では、フラン化合物は、２，５−フラン−ジカルボン酸またはその前駆体に酸化され得るフラン基を有する任意の化合物であると理解される。好ましいフラン化合物としては、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）、ヒドロキシメチルフランカルボン酸（ＨＭＦ酸）、２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＨＭＦアルコール）が挙げられる。フラン環または任意もしくはその置換可能な側鎖は、例えばＯＨ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルキル、アリル、アリール、またはＲＯ−エーテル部分、および環式基により、フラン環の任意の可能な位置で置換されていてもよい。
【００７４】
［オキシドレダクターゼの発現］
酵素の発現のために利用される厳密な手法に関係なく、当技術分野で公知の方法を用いて、これらの酵素をコードする遺伝子を別の宿主細胞に導入して、その発現を移行させることができると考えられる。本明細書において定義する遺伝エレメントには、関連酵素を発現させるかまたはその発現を調節するタンパク質、特に酵素、アポタンパク質、またはアンチセンスＲＮＡなどの生成物のための発現可能コード配列を有する核酸（一般にはＤＮＡまたはＲＮＡ）が含まれる。発現されたタンパク質は、酵素として機能するか、酵素活性を抑制もしくは抑制解除するか、または酵素の発現を制御することができる。これらの発現可能配列をコードする組換えＤＮＡは、染色体にある（例えば相同遺伝子組換えによって宿主細胞染色体へ組み込まれている）か、または染色体外にある（例えば、１つまたは複数のプラスミド、コスミド、および自己複製可能な他のベクターによって保持されている）ことができる。本発明による、宿主細胞を形質転換するために利用される組換えＤＮＡには、構造遺伝子および転写因子に加えて、タンパク質、アポタンパク質、またはアンチセンスＲＮＡのためのコード配列の発現または抑制除去を制御するように作用する、プロモーター、リプレッサー、およびエンハンサーを含む発現調節配列が含まれ得ることが理解される。例えば、このような制御配列は、野生型の宿主細胞に挿入されて、宿主細胞ゲノム中にすでにコードされていた、選択された酵素の過剰発現を促進することができる。あるいは、その代わりに染色体外にコードされた酵素の合成を制御するために使用することができる。
【００７５】
組換えＤＮＡは、宿主細胞への遺伝エレメントの移入を媒介する、プラスミド、コスミド、ファージ、酵母人工染色体、または他のベクターを含むが、これらに限定されない、任意の手段によって宿主細胞へ導入することができる。これらのベクターは、ベクターの複製およびベクターが保持する遺伝エレメントを制御するシス作用性の制御エレメントと一緒に、複製起点を含むことができる。選択可能マーカーは、遺伝エレメントが導入された宿主細胞の同定を助けるためにベクター上に存在させることができる。
【００７６】
遺伝エレメントを宿主細胞に導入する手段（例えばクローニング）は、当業者にはよく知られている。染色体外の多重コピープラスミドベクターを利用して、本発明による遺伝エレメントを挿入することができる。宿主細胞への遺伝エレメントのプラスミド運搬導入には、制限酵素によりプラスミドベクターを最初に切断した後、プラスミドと本発明による標的酵素類をコードする遺伝エレメントとを連結することが含まれる。この連結組換えプラスミドの再環状化と同時に、感染（例えばλファージへのパッケージング）またはプラスミド移入のための他の手法（例えば電気穿孔、ミクロ注入など）が宿主細胞へプラスミドを移入するために利用される。宿主細胞への遺伝エレメントの挿入に適したプラスミドは、当業者にはよく知られている。
【００７７】
他の遺伝子クローニング法には、染色体への遺伝物質の直接的な組込みが含まれるが、これに限定されるものではない。これは、宿主染色体の相同ＤＮＡ配列によって挟まれた非複製プラスミド上に本明細書に記載の遺伝エレメントをクローニングすること、および前記組換えプラスミドを宿主に形質転換すると同時に、ＤＮＡ組換えによって染色体へ遺伝エレメントが導入され得ることを含む様々な手段によって実現できる。組込みＤＮＡフラグメントが抗生物質耐性などの選択可能マーカーを含有している場合に、このような組換え株を回収することができる。あるいは、遺伝エレメントは、非複製プラスミドを使用することなく、宿主細胞の染色体へ直接導入することができる。これは、宿主染色体の相同ＤＮＡ配列も含有する、本発明による遺伝エレメントのＤＮＡフラグメントを合成的に生成することによって達成できる。これらの合成ＤＮＡフラグメントが選択可能マーカーをさらに含有する場合にも、遺伝エレメントを宿主染色体に挿入することができる。
【００７８】
［宿主細胞］
本発明の別の実施形態は、本発明によるポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、またはベクターを含む細胞である。宿主細胞は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、またはベクターが適切に発現され得る細胞である。
【００７９】
オキシドレダクターゼは、宿主細胞中で好都合に発現され得る。本発明による宿主細胞は任意の宿主細胞でよい。この細胞は、原核細胞、真核細胞、植物細胞、または動物細胞であってもよい。このような細胞では、１つまたは複数の遺伝子が、完全もしくは部分的に、欠落、ノックアウト、または破壊されていることがあり、場合によっては、１つまたは複数の遺伝子はプロテアーゼをコードしている。一実施形態によれば、本発明による宿主細胞は真核生物の宿主細胞である。真核細胞は、哺乳類、昆虫、植物、菌類、または藻類の細胞であることが好ましい。好ましい哺乳類細胞としては、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６細胞、およびハイブリドーマが挙げられる。好ましい昆虫細胞としては、例えばＳｆ９細胞およびＳｆ２１細胞ならびにそれらの派生細胞が挙げられる。より好ましくは、真核細胞は、菌類細胞、すなわちカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の菌株等の酵母細胞である。より好ましくは、クリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来の細胞または糸状菌細胞。最も好ましくは、真核細胞は糸状菌細胞である。
【００８０】
「糸状菌」は、真菌亜門および卵菌亜門のすべての糸状形態を含む（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら、Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ、第８版、１９９５、ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫによる定義）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖で構成される菌糸壁を特徴とする。栄養成長は菌糸の伸長によるものであり、炭素異化反応は偏性好気性である。糸状菌株としては、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシディウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトーラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、パネロカエテ属（Ｐａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、プロイロータス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８１】
好ましい糸状菌細胞は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌種、最も好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソジェ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはペニシリウム・クリゾゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の菌種に属する。本発明による宿主細胞がアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞である場合、宿主細胞にはＣＢＳ５１３．８８、ＣＢＳ１２４．９０３、またはその派生細胞が好ましい。
【００８２】
別の実施形態によれば、本発明による宿主細胞は原核細胞である。好ましくは、原核生物の宿主細胞は細菌細胞である。用語「細菌細胞」は、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方を含む。適切な細菌は、例えば大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アナベーナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、コーロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシェラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、またはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から選択することができる。好ましくは、細菌細胞は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．プンチス（Ｂ．ｐｕｎｔｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、コーロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＣＢ１５、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｏｔｉ）、およびリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される。
【００８３】
糸状菌のいくつかの菌株、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ２０４２３、ＩＦＯ４１７７、ＡＴＣＣ１０１１、ＡＴＣＣ９５７６、ＡＴＣＣ１４４８８〜１４４９１、ＡＴＣＣ１１６０１、ＡＴＣＣ１２８９２、Ｐ．クリソゲヌム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＣＢＳ４５５．９５、ペニシリウム・シトリヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ３８０６５、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｐ２、タラロミセス・エメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＣＢＳ１２４．９０２、アクレモニウム・クリソゲヌム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ３６２２５またはＡＴＣＣ４８２７２、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ２６９２１またはＡＴＣＣ５６７６５またはＡＴＣＣ２６９２１、アスペルギルス・ソジェ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）ＡＴＣＣ１１９０６、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ４４００６は、米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ  （ＤＳＭＺ））、オランダ微生物株保存センター（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ  （ＣＢＳ））、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などのいくつかの微生物株保存機関において公的に容易に入手できる。それらの派生株もまた使用し得る。
【００８４】
別の実施形態によれば、本発明による宿主細胞は原核細胞である。好ましくは、原核宿主細胞は細菌細胞である。用語「細菌細胞」は、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方を含む。適切な細菌は、例えば大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アナベーナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、コーロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシェラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、またはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から選択することができる。好ましくは、細菌細胞は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．プンチス（Ｂ．ｐｕｎｔｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｇ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）、コーロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＣＢ１５、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｏｔｉ）、およびリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される。
【００８５】
本発明による宿主細胞中で生成される化合物の特定用途のために、その用途に応じて宿主細胞の選択がなされ得る。例えば、本発明による宿主細胞中で生成される化合物が、食品用途で使用されることになる場合、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの食用生物から選択してもよい。特定用途には、食品、（動物）飼料、医薬、作物保護などの農業、および／またはパーソナルケアの用途が含まれるが、これらに限定されものではない。
【００８６】
さらに、本発明は、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドを製造するための方法であって、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、本発明による細胞を培養すること、および場合によっては、発現されたポリペプチドを回収することを含む方法に関し、その方法によって得られるポリペプチドに関する。
【００８７】
［流加原料］
フルクタンが本来豊富な農業作物（例えばトビナンブールまたはチコリルート）は、従来の加水分解および熱化学（の組合せ）処理によってＨＭＦに富んだ流加原料に変換し得る。フルクトースからＨＭＦを生成する技術は確立しており、確固としたものである。さらにグルコースに富んだ流加原料も利用することができるが、ＨＭＦの熱化学的形成はフルクトースからの方がより効率的に起こる。したがって、グルコースイソメラーゼを使用してグルコースをフルクトースに変換するために、追加の酵素ステップを含むことができる。後者のプロセスは、加水分解されたデンプンから高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を生成するために食品産業において確立されている。食品用途との競合を回避するならば、リグノセルロース水解物が、ＨＭＦ／ＦＤＣＡを生成するための好ましい流加原料になるであろう。
【００８８】
［生体内変換］
ＨＭＦのＦＤＣＡへの生体内変換については、本明細書において前述したカプリアビダス・バシレンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦオキシドレダクターゼを発現する強健な全細胞生体触媒（遊離細胞または固定化細胞）を使用する。このプロセスでは、全細胞生体触媒は酵素触媒にまさるいくつかの利点を有している。すなわち、ＨＭＦオキシドレダクターゼが高反応性基質による化学的不活性化から保護され、かつＨＭＦから（おそらく）対応する一塩基酸に導き、次いでこの一塩基酸がＨｍｆＨによって二価酸に変換される最初の２つの酸化ステップにおいて、宿主固有のデヒドロゲナーゼが、ＨＭＦオキシドレダクターゼを助けることができる。補因子再生を確実にするために、追加の処置を要求し得ることが好ましい。全細胞生体触媒は、ＨＭＦ流加を最小限で処理できるものであるべきである。すなわち、低ｐＨ、高温、および流加原料の加水分解／熱化学による変換中に生成される有毒化合物（その中に基質がある）に対する耐性があることが好ましい。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２は、種々の化学的ストレス要因に対する耐性、比較的広いｐＨ領域、およびＨＭＦオキシドレダクターゼを助けてＨＭＦのＦＤＣＡへのより効率的な生体内変換を生じさせる固有な（ｉｎｄｉｇｉｎｏｕｓ）デヒドロゲナーゼの存在の観点から、適切な宿主生物としての資格があると見なし得る。
【００８９】
全細胞生体触媒の代わりに、全細胞生体触媒と同様に、細胞溶解物、精製酵素、または単独もしくは酵素混合物としての固定化（ｉｍｍｏｂｏｌｉｚｅｄ）酵素を使用してもよい。
【００９０】
［生成物およびバイオマスの回収］
生体内変換の後、細胞は確立した方法によってブロスから分離し、再使用してもよい。ＦＤＣＡは酸沈殿によって無細胞ブロスから回収し、適切な有機溶媒中に高温で再溶解してもよい。溶解後に、ＦＤＣＡは、酸沈殿および溶媒抽出、または当技術分野で公知の他の精製法によって、所望の場合には二価酸の形態にて高純度で回収してもよい。
【００９１】
［ＦＤＣＡの用途］
ＦＤＣＡはポリエステルの製造において、テレフタレート（ｔｅｒｅｐｈｔａｌａｔｅ）の代わりとして使用し得る。ＦＤＣＡはまた、極めて多様な高価値化合物のための基質として使用し得る。例えば、コハク酸、２，５−ビス（アミノメチル）−テトラヒドロフラン、２，５−ジヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン、２，５−ジヒドロキシメチルフラン、および２，５−フランジカルバルデヒドを製造するための公知の基質である。ＦＤＣＡは、コーティングの製造において、例えばアルキド樹脂および熱可塑性コーティングの中に使用してもよい。ＦＤＣＡはまた、バイオ燃料におけるキシレン等価物として、また溶媒として使用してもよい。
【００９２】
ＦＤＣＡはエステル化してもよく、このエステルは可塑剤として使用し得る。ＦＤＣＡはそのジオールに変換してもよく、このジオールはＰＥＴ様ポリエステルおよびポリウレタンの中に使用し得る。さらに、ＦＤＣＡはそのジアミンに変換してもよく、このジアミンは連鎖延長剤として使用し得る。またこのジアミンはジイソシアネートに変換してもよく、このジイソシアネートはポリウレタンの製造に使用することができる。本発明による方法によって、ＦＤＣＡおよびＦＤＣＡから製造される生成物は、リグノセルロースバイオマスを含むバイオマスから生体内変換を介して作ることができる。
【００９３】
［実施例］
［一般的方法］
菌株およびプラスミド  カプリアビダス・バシレンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４は、ＤＳＭＺ：カプリアビダス・バシレンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４＝ＤＳＭ２２８７５、寄託日：２００９年８月１９日に寄託されており、唯一の炭素源としてフランを使用することができる土壌分離菌である。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２（ＡＴＣＣ７００８０１）をＨＭＦオキシドレダクターゼ発現のための宿主として使用した。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を一般のクローニング目的に使用した。ｐＵＣＰ２２由来の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）シャトルプラスミドｐＪＴ’ｍｃｓ（未公表）を、構成的ｔａｃプロモーターの制御下でＨＭＦオキシドレダクターゼを発現させるために使用した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製については、ｐＵＣ複製起点を使用する；Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）における複製については、ｐＲＯ１６００複製起点を使用する。ｈｍｆＨ遺伝子の発現は構成的ｔａｃプロモーターにより促進される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の抗生物質選択（アンピシリン抵抗性）のために、β―ラクタマーゼマーカー遺伝子（ｂｌａ）を使用する。Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）の抗生物質選択のために、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼマーカー遺伝子（ｇｍＲ）を使用する。
【００９４】
ＨｍｆＨ発現ベクターｐＪＴ’ｈｍｆＨのプラスミドマップを図２に示す。Ｐｔａｃ’、ｔａｃプロモーター；ｒｅｐ、広範囲の宿主領域複製起点；ｇｍＲ、ゲンタマイシン耐性遺伝子；ｂｌａ、β‐ラクタマーゼ；ｐＵＣ  ｏｒｉ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のための複製起点。
【００９５】
培地および培養条件  ミネラル塩培地（ＭＭ）を特定培地として使用した。ＭＭには次のものが含有されていた（脱イオン水１リットル当たり）：指定の炭素源と共に添加された、Ｋ２ＨＰＯ４  ３．８８ｇ、ＮａＨ２ＨＰＯ４  １．６３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２．０ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ、ＥＤＴＡ  １０ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ５ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．４ｍｇ、およびＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １ｍｇ。ルリアブロス（Ｌ−ブロス：１０ｇ／ｌバクトトリプトン（Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ）（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社）、５ｇ／ｌ酵母抽出物（ディフコ社）、５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）を、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２および派生菌株、Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａおよび派生菌を調製するための完全培地として使用した。固体のＬ−ブロスは２％（ｗ／ｖ）寒天（ディフコ社）を使用して凝固させた。
【００９６】
流加回分培養実験では、最初の回分段階は、次の組成を有する適合ミネラル塩培地１ｌ中で行なわれた：Ｋ２ＨＰＯ４  ３．８８ｇ、ＮａＨ２ＨＰＯ４  １．６３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２．０ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ、ＥＤＴＡ  ２０ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ４ｍｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．４ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．４ｍｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．８ｍｇ、ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ、１０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、および１００ｍＭグリセロール。最初のグリセロールが枯渇した後、流加を開始し、培養物中に制限基質としてグリセロールを維持しながら、最大の増殖が得られるように制御した。流加溶液には、（１ｌ当たり）：グリセロール３６８．４ｇおよび１０ｇ／ｌ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ならびに１２．６ｇ／ｌ  ＨＭＦが含有されていた。
【００９７】
抗生物質：アンピシリン（ａｍｐ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して１００μｇ／ｍｌ添加した。ゲンタマイシン（ｇｍ）をＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２に対して、ルリアブロス中に３０μｇ／ｍｌ、ミネラル塩培地中に１０μｇ／ｍｌ添加した。抗生物質はシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社から購入した。
【００９８】
培養：Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）およびＣ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）は３０℃にて培養した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は３７℃にて培養した。ＭＭ上での振とうフラスコ実験は、水平振とうインキュベーター中でボストンボトル（Ｂｏｓｔｏｎ  ｂｏｔｔｌｅ）（Ａｌｌｔｅｃｈ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＢＶ；Ｂｒｅｄａ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて行った。Ｌ−ブロス上の振とうフラスコ実験は、水平振とうインキュベーター中で、綿栓を詰めたエルレンマイヤーフラスコを用いて行った。流加回分実験は、ＢｉｏＦｌｏ１１０コントローラーを使用して、１ｌ発酵槽（ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社）中で行った。最初の回分発酵は、４０ｍＭグリセロールおよび２ｍＭグルコースを添加したＭＭ１００ｍｌ中での一晩前培養物から得られた洗浄細胞で開始した。最初の撹拌速度を２００ｒｐｍに設定し、Ｍ＋Ｗ  Ｉｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｄ−５１１１マスフローコントローラを使用して空気を１ｌｍｉｎ−１でヘッドスペースに供給した。ＩｎＰｒｏモデル６９００プローブ（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＢＶ；Ｔｉｅｌ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して溶存酸素圧（ＤＯ）を連続的にモニターし、最大１０００ｒｐｍまで撹拌速度を自動調整することによって３０％空気飽和を維持した。最大撹拌速度に達したとき、０．２ｌｍｉｎ−１の流量で空気を精製酸素と交換し、最大撹拌速度を８００ｒｐｍに設定した。最初の回分段階の間は、２５％ＮＨ４ＯＨの自動添加によってｐＨを７．０に維持し、流加段階の間は、１０ｍＭ  ＮａＯＨの自動添加によってｐＨを一定に保った。温度は３０℃に保った。
【００９９】
アッセイおよび分析法：細菌培養の細胞乾燥重量（ＣＤＷ）は、平底９６穴マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を使用し、Ｂｉｏｗａｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｍｅｔｅｒ（ＷＰＡ社）またはμＱｕａｎｔ  ＭＱＸ２００汎用マイクロプレート分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ）を用いて、６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学密度を測定することにより決定した。ＯＤ６００  １．０は、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）については、０．５６ｇ  ＣＤＷ／Ｌ（Ｂｉｏｗａｖｅ）または１．４ｇ  ＣＤＷ／Ｌ（μＱｕａｎｔ）に相当する。
【０１００】
ＨＰＬＣ分析：ＦＤＣＡ、ＨＭＦ、ＨＭＦ−アルコール、およびＨＭＦ−酸は、２３０ｎｍに設定されたダイオードアレー検出器を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００システム）により分析した。使用したカラムは、Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８（孔径８０Å、表面積１８０ｍ２／ｇ、Ａｇｉｌｅｎｔ）であり、２５℃で操作した。溶離液として、１％アセトニトリルと共に２０ｍＭ  ＫＨ２Ｐ０４（ｐＨ２またはｐＨ６）中のアセトニトリルにグラディエントをかけて使用し、流量１．２ｍｌ／分で、アセトニトリルを３．５分で０〜５％まで、２．５分で５〜４０％まで増加させた。
【０１０１】
細胞抽出物の調製：ＨＭＦオキシドレダクターゼを発現する、野生型Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４またはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２の形質転換細胞の細胞抽出物は、１２ｍＭコハク酸（Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４、ＯＤ６００およそ１．５）または２０ｍＭグルコース（Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２、ＯＤ６００およそ４）のいずれかを添加したＭＭを使用した、指数増殖期後半の培養物５０ｍｌから調製した。培養物を遠心分離によって採取し、アッセイ緩衝液３ｍｌ中に再懸濁した。細胞は、Ｂｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ（パルスモードでのマイクロチップ、出力設定３、およびパーセントデューティー（ｄｕｔｙ）サイクル設定４０％；３サイクルの超音波処理：４５秒パルスおよび１５秒休止）またはＳｏｎｉｃｓ  Ｖｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ（Ｓｏｎｉｃｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、ＵＳＡ）（５ｍｍ先細マイクロチップ；パルスモード設定１分（０，５秒パルス、２秒休止）のいずれかを使用して、超音波処理により破壊した。超音波処理の後、８２２８×ｇにて４℃で３分間遠心分離してデブリを除去した。上清は、ＰＤ１０ゲル濾過カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して脱塩し、ＨＭＦオキシドレダクターゼアッセイのための細胞抽出物として使用した。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ試薬（シグマアルドリッチ社）を使用して測定した。
【０１０２】
ＨＭＦオキシドレダクターゼアッセイ：ＨＭＦオキシドレダクターゼアッセイは、Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４  ＨＭＦオキシドレダクターゼを発現する、野生型Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４またはＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２の形質転換細胞の細胞抽出物で行った。ネガティブ対照として、ｈｍｆＨ遺伝子にトランスポゾン挿入がある、野生型Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２またはＣ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４変異体を使用した。細胞抽出物を、酸素負荷条件下で３０℃にてフルフラール、フルフリルアルコール、ＨＭＦ、またはＨＭＦ−酸と共にインキュベートした。反応混合物は、細胞抽出液１ｍｌ、酸素飽和ＭＭ９７６μｌ、２ｍＭフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）溶液２０μｌ、および基質（フルフラール、フルフリルアルコール、ＨＭＦ、またはＨＭＦ酸）の０．５Ｍストック４μｌを含有した。サンプルを設定間隔で抜き取り、最終濃度１ＭまでＨＣｌを添加して反応を直ちに停止させた。サンプル中の基質および生成物の濃度はＨＰＬＣによって測定した。酸素欠乏対照として、連続窒素ガス流によって反応混合物の様々な成分を酸素欠乏状態にし、同反応混合物を、ゴム栓付きヘッドスペースバイアル中で窒素ガス下インキュベートした。
【０１０３】
試薬：分析用標準のＦＤＣＡは、Ｉｍｍｕｎｏｓｏｕｒｃｅ  Ｂ．Ｖ．（Ｈａｌｌｅ−Ｚｏｅｒｓｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入した。５−ヒドロキシメチル−フロン酸（ＨＭＦ酸）は、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ＳＣ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）から購入した。この化合物は高度にエステル化されていることが見出された。使用の直前に、エステル化されたＨＭＦ酸の１０ｍＭ溶液を２Ｍ  Ｈ２Ｓ０４中で２時間沸騰させて冷却し、５０ｍＭリン酸緩衝液を加えた後、ＮａＯＨによりｐＨ  ７．０に調整した。他のすべての試薬は、シグマアルドリッチＣｈｅｍｉｅ  Ｂ．Ｖ．（Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。
【０１０４】
分子および遺伝子の手法：ゲノムＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離した。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離した。アガローストラップＤＮＡフラグメントは、ＱＩＡＥＸＩＩ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離した。
【０１０５】
ＰＣＲ反応は、製造業者の説明書に従ってＡｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４のゲノムＤＮＡからＨＭＦオキシドレダクターゼを増幅するために使用したプライマーは、ＦＮ２３：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＧＡＣＣＧ−３’（配列番号１）およびＦＮ２４：５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＴＴＣＧＧＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＧＧＡＴＧ−３’（配列番号２）であった。下線の配列はＥｃｏＲＩ制限部位を示す。
【０１０６】
プラスミドＤＮＡは、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーションデバイス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞へ導入した。
【０１０７】
トランスポゾンに隣接する染色体ＤＮＡは、当技術分野で公知の標準的方法｛Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；１９８７）｝によって同定し、完全遺伝子座の配列をプライマーウォーキング（ｐｒｉｍｅｒ  ｗａｌｋｉｎｇ）によって得た。オリゴヌクレオチド合成およびＤＮＡ塩基配列決定は、ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって行った。
【０１０８】
他の標準分子生物学手法は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ｛Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ；ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：２００１）に従って行った。
【０１０９】
［実施例Ｉ］
［Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４の細胞抽出物におけるＦＤＣＡ生成］
１２ｍＭコハク酸および３ｍＭ  ＨＭＦが添加されたＭＭ上で増殖した、対数増殖期後半の前培養物（ＯＤ６００およそ１．５）から得られたＣ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）の細胞抽出物を、ＨＭＦまたはＨＭＦ酸のいずれかと共にインキュベートすると、ＦＤＣＡの形成が観察された。
【０１１０】
基質としてＨＭＦを使用すると、ＨＭＦ−酸およびＨＭＦ−アルコールの迅速な一時的蓄積がＦＤＣＡ形成と同時に観察された。脱塩細胞抽出物中では、粗細胞抽出物中と比較して、ＨＭＦ−酸濃度の減少速度は低下し、ＦＤＣＡ生成は遅くなった。ＦＤＣＡが粗細胞抽出物中と同様に脱塩細胞抽出物中でも生成したので、ＨＭＦのＦＤＣＡへの変換には補因子は関与していないと考えられた。しかしながら、粗細胞抽出物由来の補因子または他の低分子量成分が、ＦＤＣＡ形成に関して相乗効果を有するように見えた。基質としてＨＭＦ−酸を加えると、ＦＤＣＡの即時形成が粗細胞抽出物中および脱塩細胞抽出物中の両方で観察された。さらに、ＦＤＣＡが嫌気条件下で生成しなかったので、酸素の存在がＦＤＣＡ形成には必要であることが実証された。ＨＭＦ酸のＦＤＣＡへの化学量論的変換が観察された。
【０１１１】
［実施例ＩＩ］
［ＨＭＦオキシドレダクターゼをコードするｈｍｆＨ遺伝子の単離および特徴づけ］
ｈｍｆＨ遺伝子は、ＦＡＤ依存性グルコース−メタノール−コリン（ＧＭＣ）オキシドレダクターゼファミリーに属する６２  ３１７  Ｄａのタンパク質をコードすることが見出された。この酵素にはフラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）へＨＭＦ−酸を酸化する能力があることが示された。さらに、この酵素は、基質としてＨＭＦも受け入れ、ＨＭＦをＨＭＦ−酸を介してＦＤＣＡに酸化した。非重複性ＮＣＢＩデータベース中でＨｍｆＨと最も高い相同性を有するものが、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰｓＪＮのＧＭＣオキシドレダクターゼであることがわかった（座位タグＢｐｈｙｔ＿２１８０；５６２個のアミノ酸ストレッチにわたって６８％の同一性）。Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４のＨＭＦ／フルフラールオペロンの配列データに基づいて、他の潜在的なＨＭＦ／フルフラールディグレーダー（ｄｅｇｒａｄｅｒ）が同定された。選択された菌株は、唯一の炭素源としてＨＭＦまたはフルフラールのいずれかを含むミネラル塩培地上での増殖について試験された。ＨＭＦ上で増殖できた菌株は、ＨｍｆＨと４５〜６８％の同一性があるオキシドレダクターゼをコードするｈｍｆＨオルソログを有していた。１菌株（バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ  ＬＢ４００）は、そのオキシドレダクターゼがＨｍｆＨと４４％の同一性があったが、ＨＭＦを利用することができなかった。
【０１１２】
図３に、Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４（Ａ）ならびにフルフラールおよび／またはＨＭＦを利用する可能性があると同定された他種（Ｂ）における、フルフラールおよびＨＭＦの代謝関連遺伝子の遺伝子構成の概略図を示す。色は図１における酵素活性に対応する。矢印の下の太数字（ｘ／ｙ）は、ｙアミノ酸ストレッチ中の対応するＣ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４タンパク質との同一性（ｘ）の割合を示す。オルソロガス遺伝子は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎの非重複性タンパク質データベースに対するＢＬＡＳＴｘホモロジー検索によって同定された。ＨｍｆＡと少なくとも５０％の同一性がある酵素をコードするｈｍｆＡオルソログがあると同時に、ｈｍｆＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥに対するオルソログが単一ゲノム中にある場合に、フルフラールクラスターに対するヒットは妥当であると定めた。同じ基準をｈｍｆＦおよびｈｍｆＧのオルソログを定義するために用いたが、他方ｈｍｆＨオルソログに対する基準としてはＨｍｆＨとの４０％の同一性を用いた。イタリック体の数字は、指定菌株のゲノム座位タグを示す。白矢印は、代謝機能を有しない遺伝子を示す。Ｃ：唯一の炭素源としてフルフラールまたはＨＭＦ（３ｍＭ）のいずれかを含むミネラル塩培地上での試験菌株の増殖表現型の概要。ＮＤ：測定していない。
【０１１３】
これらの図では、ＨＭＦオキシドレダクターゼＨｍｆＨをコードする翻訳領域のヌクレオチド配列（図４）および推定上のアミノ酸配列（図３）が示されている。
【０１１４】
［実施例ＩＩＩ］
［Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２中のｈｍｆＨのクローニングおよびコードされたオキシドレダクターゼの発現］
ＨＭＦオキシドレダクターゼをコードするｈｍｆＨ遺伝子を、発現ベクターｐＪＴ’ｍｃｓにクローニングした。Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４ゲノムＤＮＡ上でプライマーＦＮ２３およびＦＮ２４を用いて得られたＰＣＲフラグメントを、ＥｃｏＲＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）により消化した。この消化フラグメントを、ＥｃｏＲＩ消化およびＦａｓｔＡＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）処理のｐＪＴ’ｍｃｓベクターに連結し、ＨｍｆＨ発現プラスミドｐＪＴ’ｈｍｆＨを得た。ｈｍｆＨ挿入の方向が正しいことを、当技術分野で公知の制御消化およびヌクレオチド配列決定によって確認した。ＨＭＦオキシドレダクターゼの発現は、ＭＭ＋２０ｍＭグルコースおよび１０ｍｇ／ｌゲンタマイシン中で増殖したＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）＿ｐＪＴ’ｈｍｆＨ（ＯＤ６００およそ４）の細胞抽出物において、基質としてＨＭＦまたはＨＭＦ酸を使用したときにＦＤＣＡが形成されたことによって実証された（表１）。
【０１１５】
【表１】
0005868320.tif 000002
【０１１６】
これらの結果により、ＦＤＣＡの形成が酸素存在下でのみ起こり、ｈｍｆＨにコードされたオキシドレダクターゼによって触媒されることが確認された。ＨＭＦを基質として用いた場合には、脱塩細胞抽出物中および粗細胞抽出物中の両方においてＨＭＦ−酸の一時的な蓄積が観察された。脱塩細胞抽出物（低分子量補因子が除去された）中のＨＭＦ−酸の形成により、ＨｍｆＨが、ＨＭＦ−酸をＦＤＣＡへ酸化するだけでなく、ＨＭＦをそのモノカルボン酸形へ酸化できることも示された。
【０１１７】
ＨｍｆＨに加えて、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２に固有で見かけ上非特異的なデヒドロゲナーゼもまた、その還元等量が脱塩によって除去されなければ、ＨＭＦからＨＭＦ酸を形成することができる（表２）。アルデヒドレダクターゼ／アルコールデヒドロゲナーゼ活性はＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋依存であるが、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は２つの人工電子伝達体、ＰＭＳおよびＤＣＰＩＰを組み合せることによって維持することができる。ここで、ＰＭＳは最初の電子担体であり、ＤＣＰＩＰは最終電子受容体である。同様な活性は、Ｃ．バシレンシス（Ｃ．ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４の細胞抽出物中でも観察された。
【０１１８】
【表２】
0005868320.tif 000003
【０１１９】
Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２  ｐＪＴ’ｈｍｆＨの粗細胞抽出物中の、ＨＭＦからＦＤＣＡ、ＨＭＦ−アルコール（Ｈ−ｏｈ）およびＨＭＦ−酸（Ｈ−酸）の形成を図４に示す。図４は、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２  ｐＪＴ’ｈｍｆＨ細胞抽出物中の、内因性デヒドロゲナーゼおよびＨｍｆＨの相乗効果を説明する。最初に、アルデヒドレダクターゼがおそらく触媒したＨＭＦ−アルコールの形成と同時にＨＭＦの迅速な減少が観察された。同時に、ＨＭＦ−酸（おそらくアルデヒドデヒドロゲナーゼを介して）およびＦＤＣＡ（ＨｍｆＨを介して）が蓄積し始めた。ＨＭＦ−アルコールは、形成直後に、おそらくＨＭＦ、ＨＭＦ−酸およびＦＤＣＡへの再酸化を通して消失した。ＨＭＦ−酸のみが、２５時間のタイムスパンの中で、ＦＤＣＡに（ほとんど）完全に酸化される前に顕著な蓄積を示した。これらの結果により、ＨＭＦ−酸のＦＤＣＡへの酸化がこの無細胞系における律速段階であったことが示唆される。
【０１２０】
［実施例ＩＶ］
［ＨｍｆＨを発現するＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２によるＨＭＦのＦＤＣＡへの全細胞変換］
Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２の内因性デヒドロゲナーゼが、ＨＭＦからＨＭＦ−酸を生成する追加の手段となって、ＨＭＦのＦＤＣＡへの酸化においてＨｍｆＨと相乗的に作用することができるので、ＨＭＦのＦＤＣＡへの全細胞生体内変換法には、酵素法にまさる利点がある場合がある。この可能性を調べるために、静止細胞、増殖細胞、および破壊細胞を、ＨＭＦからＦＤＣＡの生成について試験した。
【０１２１】
振とうフラスコ培養を、１ｌエルレンマイヤーフラスコを用いて、１０ｍｇ／Ｌゲンタマイシンを添加したＭＭ＋４０ｍＭグリセロールおよび２ｍＭグルコース１５０ｍｌ中で行った。細胞を対数増殖期の終わり（ＯＤ６００およそ４）に収集して、洗浄し、１９．４ｇ／ｌ  Ｋ２ＨＰ０４、８．１５ｇ／ｌ  ＮａＨ２ＨＰ０４、４０ｍＭグリセロールおよび１０ｍｇ／ｌゲンタマイシンを添加したＭＭ中に濃縮した。濃縮細胞懸濁液（ＣＤＷ１．６５ｇに相当）のアリコート（１０ｍｌ）を、２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中でＨＭＦと共にインキュベートし、ＦＤＣＡの分析のために一定間隔でサンプルを採取した。静止細胞については、グリセロールを再懸濁培地から除去し、破壊細胞は、超音波処理によって得た。
【０１２２】
これまでの観察のように、ＨＭＦがＨＭＦ−アルコールおよびＨＭＦ酸に迅速に変換された後、ＨＭＦ酸の減少およびそれと同時のＦＤＣＡの形成が起こった。試験したＨＭＦの２つの濃度について、ＦＤＣＡの生成速度およびＨＭＦ酸の減少速度の両方を表ＩＶ−ａに示す。
【０１２３】
【表３】
0005868320.tif 000004
【０１２４】
表３では、ＦＤＣＡ生成がＨｍｆＨを発現するＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２の増殖細胞でより効率的であったことが示されている。全体的なＦＤＣＡの生成速度、変換効率、およびＨＭＦ−酸の減少速度は、増殖細胞のインキュベーションにおいてより高いものであった。さらに、ＦＤＣＡの生成速度はＨＭＦの初期濃度に依存しており、この系は飽和していないことが示唆された。
【０１２５】
［実施例Ｖ］
［ＨｍｆＨを発現するＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２を用いた、流加回分によるＨＭＦからのＦＤＣＡの生成］
ＦＤＣＡの生成は、ＨｍｆＨを発現するＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２の増殖細胞で最も効率的であることが見出された。そこで、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２  ｐＪＴ’ｈｍｆＨの全細胞によるＦＤＣＡの生成を実証するために流加回分実験を行った。
【０１２６】
初期段階では、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）＿ｐＪＴ’ｈｍｆＨを、グリセロールの流加を含むＭＭ上で１３ｇＣＤＷ／ｌの細胞密度になるまで培養した。この段階の終わりに、ＨＭＦ流加を開始し、０．８ｍｍｏｌ／ｌ／時の速度でＨＭＦを加えた。グリセロールを一緒に流加しないと、ＨＭＦ−酸およびＦＤＣＡは０．４１ｍｍｏｌ／ｌ／時の同じ速度で形成された（図５を参照されたい）。次いで、０．２１Ｍ  ＨＭＦおよび４Ｍグリセロールを含有する溶液に流加を取り替え、およそ５ｍｌ／時で流加した。このようにグリセロールを一緒に流加すると、ＨＭＦ−酸の濃度は迅速に低下したが、ＦＤＣＡの形成はほぼ同じ速度で続いた（図５）。総量４４，６ｍｍｏｌのＨＭＦが流加回分に加えられた時点で、この実験を停止した。結果はＦＤＣＡへのほとんど完全な変換（すなわち９６．５％の効率）を示した。
【０１２７】
同様な実験で、０．７ｍｍｏｌ／ｌ／時の平均速度でグリセロールをＨＭＦと共に流加した。この流加回転培養では、ＨＭＦ酸中間体の蓄積は観察されず、ＨＭＦはすべてＦＤＣＡに直接変換された（図６）。
【０１２８】
［実施例ＶＩ］
［発酵ブロスからのＦＤＣＡの精製］
ｐＨ１．０でのＦＤＣＡの溶解度は、水中で約１．５ｇ／ｌであることがわかった。この特性を有利に利用して、発酵ブロスからＦＤＣＡ生成物を回収した。遠心分離（９５００×ｇで５分間）により細胞を除去した後に、室温で連続して撹拌しながらｐＨ１になるまで、９６％Ｈ２Ｓ０４約１０ｍｌを透明ブロス１００ｍｌに加え、ＦＤＣＡを沈殿させた。この沈殿を８２２８×ｇで１０分間遠心分離して回収し、風乾したペレットを６０℃でメタノール中に再融解した。予熱された０．２２μｍフィルターでろ過して溶解しないデブリを除去した後すぐに、そのろ液を純度分析のためにＨＰＬＣに供した。上記手順によって発酵ブロスから回収したＦＤＣＡの純度は、約６５％であった。ＦＤＣＡのさらなる精製は当技術分野で公知の方法により行うことができる。
【０１２９】
［実施例ＶＩＩ］
［ＨｍｆＨを発現するＰ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２を用いた、流加回分によるＨＭＦからのＦＤＣＡの生成］
第２の流加回分によるＦＤＣＡ生成実験は、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）Ｓ１２  ｐＪＴ’ｈｍｆＨの全細胞による、ＦＤＣＡのタイターおよび生産性を向上させるために行った。
【０１３０】
最初の回分段階では、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）＿ｐＪＴ’ｈｍｆＨを、最初のグリセロールが２３．２時間の発酵後（ＯＤ６００およそ８）に枯渇するまで、ＭＭ上で培養した。この時点で、バイオマス増加が約０．４５ｇＣＤＷ／ｌ／時になる速度でグリセロール流加を開始した。５０．７時間の発酵後に、バイオマス増加が約０．０４５ｇＣＤＷ／ｌ／時になる速度までグリセロール流加を低下させた。１２３．４時間の発酵後に、バイオマス増加が約０．２５ｇＣＤＷ／ｌ／時になる速度に発酵の終了までグリセロール流加を増加させた。この期間にわたり、ＨＭＦ流加を行った。２６．７時間の発酵後に、０．６５ｍｍｏｌ／時／ｇＣＤＷの速度でＨＭＦ流加を開始し、ＨＭＦ酸およびＦＤＣＡの両方の蓄積をもたらした。３３．３時間の発酵後に、ＨＭＦ流加速度を０．２８ｍｍｏｌ／時／ｇＣＤＷに低下させて、７２．８時間の発酵後に、０．０９ｍｍｏｌ／時／ｇＣＤＷへとさらに低下させ、発酵の１１７．４時間後に停止した。ＨＭＦ流加の減少は、発酵槽中のＨＭＦ酸濃度の漸減をもたらしたが、ＦＤＣＡ濃度の増加は継続した。ＨＭＦ酸がもはや検出できなくなった時点で、発酵を停止した。この時点で、１８８ｍｍｏｌのＨＭＦを発酵槽に加えると、３０．８ｇ／ｌ濃度で約１８２ｍｍｏｌのＦＤＣＡの生成（すなわち９７％の効率）がもたらされた。図７ａに、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）＿ｐＪＴ’ｈｍｆＨの流加回分培養中のバイオマス、ＨＭＦ酸、およびＦＤＣＡの形成を示す。図７ｂに、同じ培養におけるグリセロールおよびＨＭＦの流加速度を示す。
【０１３１】
［実施例ＶＩＩＩ］
［発酵ブロスからのＦＤＣＡの精製］
ｐＨ０．５でのＦＤＣＡの溶解度は、水中で約０．４ｇ／ｌであることがわかった。沈殿の後に、この濃度が溶液中に残るので、実施例ＶＩＩＩで得られるタイターの増加は、沈殿による精製に起因する生成物の損失を顕著に減少させる。
【０１３２】
遠心分離（９５００×ｇで１５分間）による細胞の除去後に、透明ブロス５００ｍｌを３分間沸騰させてタンパク質を沈殿させ、９５００×ｇで２０分間遠心分離した。４℃で連続して撹拌しながらｐＨ０．５になるまで、９６％Ｈ２Ｓ０４約５０ｍｌを透明上清に加え、ＦＤＣＡを沈殿させた。この沈殿を８２２８×ｇで２０分間遠心分離して回収し、水２５０ｍｌで１回洗浄して、再び８２２８×ｇで２０分間遠心分離した。得られたペレットを風乾した後、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）約１２００ｍｌ中に３０℃で溶解した。ろ過により溶解しないデブリを除去した後すぐに、発酵ブロス中で最初７９％純度のＦＤＣＡが高純度（＞９９％）の乾燥ＦＤＣＡ粉末１１．８ｇになるまで透明ＴＨＦ溶液を５０℃で真空蒸発させた。必要があれば、当技術分野で公知の方法を使用して、ＦＤＣＡの精製をさらに最適にすることができる。
【図１】
0005868320.tif 000005
【図２】
0005868320.tif 000006
【図３Ａ】
0005868320.tif 000007
【図３Ｂ】
0005868320.tif 000008
【図３Ｃ】
0005868320.tif 000009
【図３Ｄ】
0005868320.tif 000010
【図４】
0005868320.tif 000011
【図５】
0005868320.tif 000012
【図６】
0005868320.tif 000013
【図７Ａ】
0005868320.tif 000014
【図７Ｂ】
0005868320.tif 000015
【配列表】
0005868320000001.app