(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｆ）の条件でのＨＰＬＣ分析において、保持時間９.２分にピークを有する成分（II）、保持時間２０.８分にピークを有する成分（IV）、及び保持時間２１.６分にピークを有する成分（V）から成る群より選択される１種以上の成分を含有し、前記成分（II）、（IV）及び（V）がキュウリグサに由来する、ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物：
（Ａ）ＨＰＬＣカラム：オクタデシル化シリカゲル担体（粒子径３μｍ）を充填した内径４.６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのカラム
（Ｂ）ＨＰＬＣカラムオーブン温度：４０℃
（Ｃ）流速：０.８ｍｌ／分
（Ｄ）検出：１９０〜４００ｎｍ
（Ｅ）移動相：（ａ）メタノール及び（ｂ）２.５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
（Ｆ）グラジエント条件：８５％の（ａ）と１５％の（ｂ）との混合溶媒を５分間保持し、その後１５分かけて混合溶媒中の（ａ）の濃度を８５％から１００％に直線的に上昇させ、その後（ａ）の濃度を１００％に維持。
【請求項２】
ＰＳＦ１遺伝子発現抑制剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
がんの予防又は治療剤である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
がんが、脳腫瘍、乳がん、呼吸器がん、消化器がん、泌尿器系腫瘍、女性性器腫瘍、及び血液腫瘍から成る群より選択される１種以上である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
キュウリグサを低級アルコール若しくは含水低級アルコールで抽出し、得られた抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーに供することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物の製造方法。
【請求項６】
下記（１）〜（３）を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物の製造方法：
（１）キュウリグサを、低級アルコール若しくは含水低級アルコールで抽出し、抽出液を回収すること、
（２）（１）で得られた抽出液をヘキサンとの液々分配に供し、下層を回収すること、
（３） （２）で得られた下層をクロロホルムとの液々分配に供し、クロロホルム画分を回収すること。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物が濃縮された食品。
【請求項８】
PSF1遺伝子を発現抑制させるための請求項１〜４のいずれかに記載の組成物の使用(但し、ヒトに対する医療行為を除く)。
【請求項９】
下記（Ａ）〜（Ｆ）の条件でのＨＰＬＣ分析において、保持時間７．８分にピークを有する成分（I）、保持時間９.２分にピークを有する成分（II）、保持時間１２.５分にピークを有する成分（III）、保持時間２０.８分にピークを有する成分（IV）、及び保持時間２１.６分にピークを有する成分（V）から成る群より選択される１種以上の成分を含有し、前記成分（I）〜（V）がウワバミソウに由来する、ＰＳＦ１遺伝子発現抑制剤：
（Ａ）ＨＰＬＣカラム：オクタデシル化シリカゲル担体（粒子径３μｍ）を充填した内径４.６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのカラム
（Ｂ）ＨＰＬＣカラムオーブン温度：４０℃
（Ｃ）流速：０.８ｍｌ／分
（Ｄ）検出：１９０〜４００ｎｍ
（Ｅ）移動相：（ａ）メタノール及び（ｂ）２.５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
（Ｆ）グラジエント条件：８５％の（ａ）と１５％の（ｂ）との混合溶媒を５分間保持し、その後１５分かけて混合溶媒中の（ａ）の濃度を８５％から１００％に直線的に上昇させ、その後（ａ）の濃度を１００％に維持。
【請求項１０】
がんの予防又は治療剤である、請求項９に記載のＰＳＦ１遺伝子発現抑制剤。
【請求項１１】
がんが、脳腫瘍、乳がん、呼吸器がん、消化器がん、泌尿器系腫瘍、女性性器腫瘍、及び血液腫瘍から成る群より選択される１種以上である、請求項１０に記載のＰＳＦ１遺伝子発現抑制剤。
【請求項１２】
タンパク質 糖化抑制活性を有さない、請求項９〜１１のいずれかに記載のＰＳＦ１遺伝子発現抑制剤。
【請求項１３】
ウワバミソウを低級アルコール若しくは含水低級アルコールで抽出し、得られた抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーに供することを含む、請求項９〜１２のいずれかに記載のＰＳＦ１遺伝子発現抑制剤の製造方法。
【請求項１４】
下記（１）〜（３）を含む、請求項９〜１２のいずれかに記載のＰＳＦ１遺伝子発現抑制剤の製造方法：
（１）ウワバミソウを、低級アルコール若しくは含水低級アルコールで抽出し、抽出液を回収すること、
（２）（１）で得られた抽出液をヘキサンとの液々分配に供し、下層を回収すること、
（３） （２）で得られた下層をクロロホルムとの液々分配に供し、クロロホルム画分を回収すること。
【請求項１５】
下記（Ａ）〜（Ｆ）の条件でのＨＰＬＣ分析において、保持時間７．８分にピークを有する成分（I）、保持時間９.２分にピークを有する成分（II）、保持時間１２.５分にピークを有する成分（III）、保持時間２０.８分にピークを有する成分（IV）、及び保持時間２１.６分にピークを有する成分（V）から成る群より選択される１種以上の成分を含有し、前記成分（I）〜（V）がウワバミソウに由来する、ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物が濃縮された食品：
（Ａ）ＨＰＬＣカラム：オクタデシル化シリカゲル担体（粒子径３μｍ）を充填した内径４.６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのカラム
（Ｂ）ＨＰＬＣカラムオーブン温度：４０℃
（Ｃ）流速：０.８ｍｌ／分
（Ｄ）検出：１９０〜４００ｎｍ
（Ｅ）移動相：（ａ）メタノール及び（ｂ）２.５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
（Ｆ）グラジエント条件：８５％の（ａ）と１５％の（ｂ）との混合溶媒を５分間保持し、その後１５分かけて混合溶媒中の（ａ）の濃度を８５％から１００％に直線的に上昇させ、その後（ａ）の濃度を１００％に維持。
【請求項１６】
PSF1遺伝子を発現抑制させるための下記組成物の使用(但し、ヒトに対する医療行為を除く)：
下記（Ａ）〜（Ｆ）の条件でのＨＰＬＣ分析において、保持時間７．８分にピークを有する成分（I）、保持時間９.２分にピークを有する成分（II）、保持時間１２.５分にピークを有する成分（III）、保持時間２０.８分にピークを有する成分（IV）、及び保持時間２１.６分にピークを有する成分（V）から成る群より選択される１種以上の成分を含有し、前記成分（I）〜（V）がウワバミソウに由来する、ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物：
（Ａ）ＨＰＬＣカラム：オクタデシル化シリカゲル担体（粒子径３μｍ）を充填した内径４.６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのカラム
（Ｂ）ＨＰＬＣカラムオーブン温度：４０℃
（Ｃ）流速：０.８ｍｌ／分
（Ｄ）検出：１９０〜４００ｎｍ
（Ｅ）移動相：（ａ）メタノール及び（ｂ）２.５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（Ｆ）グラジエント条件：８５％の（ａ）と１５％の（ｂ）との混合溶媒を５分間保持し、その後１５分かけて混合溶媒中の（ａ）の濃度を８５％から１００％に直線的に上昇させ、その後（ａ）の濃度を１００％に維持。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗がん剤、より詳細には、がん幹細胞の増殖抑制に効果的な抗癌剤及びその利用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、がん組織は、性質が一様ながん細胞集団によって構成されると考えられていた。しかし、近年、がん細胞の中には、他のがん細胞と比較して、高い浸潤能、転移能、及び放射線療法や化学療法に対する抵抗性を示す細胞が存在することが判明してきた。このような特徴を有するがん細胞は、胚性幹細胞のような未分化細胞と同様の遺伝子を発現し、遺伝子発現が異なる分化したがん細胞を産生することから、がん幹細胞と呼ばれるようになってきた（非特許文献１及び２）。
【０００３】
がん幹細胞と他のがん細胞との大きな違いは、がん幹細胞は一つの細胞でもがん組織を形成することができるのに対して、がん細胞はがん組織を構築できないことである。よって、多くのがん細胞が治療によって死滅したとしても、がん幹細胞が残存すれば、再発の原因となる。また、がんの薬剤耐性に関して、継続的な治療の過程で、がん細胞は薬剤抵抗性を獲得すると考えられてきた。確かに、治療薬に対する反応として、そのような細胞が出現してくることも考えられる。しかし、近年、がんの原発巣において、予め治療抵抗性を有する細胞が存在することが明らかになり、これががん幹細胞であることが判明してきた（非特許文献３）。
【０００４】
以上のような知見の下、がん幹細胞を効果的に制御するがんの治療法の開発が期待されている。がん幹細胞は、「様々な細胞内生存シグナルを活発にしていること」、「未分化性を維持する機構を有すること」、及び「自己複製能を有すること」という特徴を有する。特に、後者の二つは幹細胞性と呼ばれる。そこで、がん幹細胞を治療可能ながん細胞に分化誘導し、従来の抗がん剤でがん細胞を殺傷する方法や、がん幹細胞の自己複製を抑制して、がんの成長を抑制する方法等が検討されている。
【０００５】
現在開発中のがん幹細胞をターゲットとした治療薬として、例えば、cMyc経路、Stat3経路、βカテニン経路など様々な細胞内シグナルを抑制する、いわゆるマルチキナーゼ阻害剤がある。また、がん幹細胞の未分化性にnotch受容体の活性化が関与しているという知見から、notch受容体活性を抑制して、がん幹細胞をがん細胞に分化させる方法も提案されている（特許文献１）。更に、近年、Sonic hedgehog (shh) が胎児期の器官形成の際に、細胞増殖、分化、生存に関わる細胞シグナル伝達物質であり、様々ながん細胞（例えば、慢性白血病、肺がん、乳がん、膵がん、肝がんモデル、髄様がん）におけるがん幹細胞の維持に寄与していることが示唆され、Shhを阻害する化合物を用いた前立腺がんに対する治療有効性が提案されている（非特許文献４）。しかし、これらの手法によるがん幹細胞への作用は未だ確認されていない。
【０００６】
がん幹細胞に特有な細胞生存に関わる細胞内シグナルは、今のところ見つかっていない。即ち、がん幹細胞で利用されている細胞生存シグナルは、がん幹細胞以外の正常細胞においても幹細胞の細胞生存に重要な分子である。よって、このような生存シグナルを遮断すれば、正常組織の幹細胞も死滅させることが考えられる。幹細胞の未分化性を維持する分子機序についても、がん幹細胞に特異的なものは見つかっていない。よって、がん幹細胞の未分化性維持分子の阻害は、正常組織の幹細胞の分化をも誘導してしまうため、正常の幹細胞の枯渇につながることが懸念される。
【０００７】
ところで、PSF1（partner of sld five 1）は、未分化幹細胞の急速な自己複製に機能していることが報告されており（非特許文献５及び６）、がん組織においてもその発現が報告されている（非特許文献７〜９）。近年、PSF1遺伝子をクローニングし、そのプロモーターの下流にEGFP蛍光蛋白をコードする遺伝子を機能的に連結させた肺癌細胞株(Lewis Lung Carcinoma; LLC)及び大腸がん細胞株(colon26)が作製された（非特許文献１０）。そして、これらの細胞を用いた試験により、（１）PSF1の転写活性の高い高陽性細胞は、マウスに再移植すると、少数細胞でも造腫瘍能を有し、マトリックス成分を溶解して浸潤する能力が高く、強い転移活性を有すること、（２）マウス腫瘍組織のPSF1陽性がん幹細胞と、ヒト腫瘍組織のPSF1陽性がん細胞の局在が、腫瘍内血管の近傍に位置するという共通性があること、（３）ヒト細胞におけるPSF1遺伝子をRNAi法によってノックダウンすると、細胞周期が停止又は遅延すること、及び（４）PSF1転写活性が高い高陽性細胞は、低陽性細胞と比べ、胚性幹細胞に特有な遺伝子の発現が高いことが確認されている（非特許文献１１）。更に、マウスへの抗がん剤の投与試験によって、PSF1高発現細胞が抗がん剤抵抗性を増強してくることが報告されている（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１２−５０１６２６
【特許文献２】特開２０１１−１９５５３０
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ben-Porath I et al., Nat. Genet. 2008; 40: 499-507
【非特許文献２】Somervaille TC et al., Cell Stem Cell 2009; 4: 129-40
【非特許文献３】Visvader JE, Lindeman GJ, Nat Rev Cancer 2008; 8: 755-68
【非特許文献４】Nanta R et al., Oncogenesis  2, e42,2013
【非特許文献５】Ueno M et al., Mol Cell Biol 2005; 25: 10528-32
【非特許文献６】Ueno M et al., Blood 2009; 113: 555-62
【非特許文献７】Obama Kら, Oncol Rep 2005; 14: 701-6
【非特許文献８】Hayashi R et al, Genomics Proteomics Bioinformatics 2006; 4: 156-64；
【非特許文献９】Ryu B et al., PLoS One 2007; 2: e594
【非特許文献１０】Nagahama Y et al., Cancer Res 70, 1215-1224, 2010
【非特許文献１１】Matsui T et al., Am J Pathol 182; 1790-1799, 2013
【非特許文献１２】Lee E B et al., Saengyak Hakhoechi 2013; 44: 230-234
【非特許文献１３】Yang H-J et al., Han’guk Eungyong Sangmyong Hwahakhoeji 2005; 48: 98-102
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記に加え、PSF1陽性細胞の遺伝子発現パターンは、がん幹細胞マーカーといわれているCD44強陽性細胞の遺伝子発現パターンと一致することを本発明者等は確認した。以上から、PSF1遺伝子の発現を抑制することにより、がん細胞の腫瘍形成能、浸潤能、及び転移能といった能力を抑え、がんを効果的に治療することが可能であることが分かる。これは、PSF1遺伝子は、がん細胞の中でもがん幹細胞において高い発現が見られることから、PSF1遺伝子を標的とすることにより、がん細胞の根源であるがん幹細胞の活動を封じ込めることができるためである。ところが、PSF1遺伝子の発現抑制を通じた抗癌剤は未だ報告されていない。そこで、本発明は、PSF1遺伝子の発現抑制活性を通じた、より効果的ながんの治療手段を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、PSF1遺伝子の発現抑制活性を有する物質の探索を行ったところ、キュウリグサ及びウワバミソウの抽出物並びにそれらの各種分画物にその活性があること、また、キュウリグサ及びウワバミソウの抽出物並びにそれらの各種分画物は、PSF1遺伝子発現細胞の細胞死を即時に誘導することなくPSF1遺伝子の発現を抑制することを見出した。このような知見に基づき、本発明者等は更なる試験を重ね、キュウリグサ及びウワバミソウの抽出物並びにそれらの各種分画物ががん幹細胞を含むがん細胞の細胞分裂周期を停止又は遅延させ、休眠させることにより、その腫瘍増殖を抑制することを確認した。更に、本発明者らは、各種分画物に含まれる活性成分をHPLCで同定することに成功した。
【００１２】
一方、キュウリグサの抽出物は、例えば、非特許文献１２〜１３に開示されている。非特許文献１２には、キュウリグサの抽出物に抗酸化作用があり、活性成分としてクエルセチン等が得られたこと、非特許文献１３には、キュウリグサの抽出物から得られたニコチフロリンが、コレステロールのアシルトランスフェラーゼ阻害活性を有することが記載されている。また、特許文献２には、ウワバミソウの抽出物にタンパク質糖化抑制作用があり、それに基づくしわ改善作用又はくすみ改善作用が期待されることが記載されている。
【００１３】
本発明者らは、上述するウワバミソウ抽出物の各種分画物には、特許文献２に記載されるようなタンパク質糖化抑制作用は存在しないことを確認した。即ち、特許文献２に記載される各種作用は、ウワバミソウ抽出物の各種分画物には存在しない成分に起因することを確認した。
【００１４】
以上のような知見に基づき、更なる検討と改良を重ね、下記に代表される発明が提供される。
項１．
下記（Ａ）〜（Ｆ）の条件でのＨＰＬＣ分析において、保持時間７．８分にピークを有する成分（I）、保持時間９.２分にピークを有する成分（II）、保持時間１２.５分にピークを有する成分（III）、保持時間２０.８分にピークを有する成分（IV）、及び保持時間２１.６分にピークを有する成分（V）から成る群より選択される１種以上の成分を含有し、前記成分（I）〜（V）がキュウリグサ又はウワバミソウに由来する、ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物：
（Ａ）ＨＰＬＣカラム：オクタデシル化シリカゲル担体（粒子径３μｍ）を充填した内径４.６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのカラム
（Ｂ）ＨＰＬＣカラムオーブン温度：４０℃
（Ｃ）流速：０.８ｍｌ／分
（Ｄ）検出：１９０〜４００ｎｍ
（Ｅ）移動相：（ａ）メタノール及び（ｂ）２.５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
（Ｆ）グラジエント条件：８５％の（ａ）と１５％の（ｂ）との混合溶媒を５分間保持し、その後１５分かけて混合溶媒中の（ａ）の濃度を８５％から１００％に直線的に上昇させ、その後（ａ）の濃度を１００％に維持。
項２．
ＰＳＦ１遺伝子発現抑制剤である、項１に記載の組成物。
項３．
がんの予防又は治療剤である、項１又は２に記載の組成物。
項４．
がんが、脳腫瘍、乳がん、呼吸器がん、消化器がん、泌尿器系腫瘍、女性性器腫瘍、及び血液腫瘍から成る群より選択される１種以上である、項３に記載の組成物。
項５．
タンパク質糖化抑制活性を有さない、項１〜４のいずれかに記載の組成物。
項６．
キュウリグサ又はウワバミソウを低級アルコール若しくは含水低級アルコールで抽出し、得られた抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーに供して得られる画分である、項１〜５のいずれかに記載の組成物。
項７．
前記逆相カラムクロマトグラフィーの移動相として低級アルコール又はアセトニトリルを使用する、項６に記載の組成物。
項８．
下記（１）〜（３）を含む方法によって得られる、項１〜５のいずれかに記載の組成物：
（１）キュウリグサ又はウワバミソウを、低級アルコール若しくは含水低級アルコールで抽出し、抽出液を回収すること、
（２）（１）で得られた抽出液をヘキサンとの液々分配に供し、下層を回収すること、
（３）（２）で得られた下層をクロロホルムとの液々分配に供し、クロロホルム画分を回収すること。
項９．
前記方法が、更に下記（４）を含む、項８に記載の組成物：
（４）（３）で得られたクロロホルム画分を、移動相として低極性溶媒及び低級アルコールの混合液を用い、固定相としてシリカゲルを用いたクロマトグラフィーに供すること。
項１０．
項１〜９のいずれかに記載の組成物が濃縮された食品。
項１１．
PSF1遺伝子を発現抑制させるための項１〜９のいずれかに記載の組成物の使用(但し、ヒトに対する医療行為を除く)。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、PSF1遺伝子の発現を抑制し、がんを効果的に治療することが可能となる。これは、PSF1遺伝子活性を抑制することにより、通常のがん細胞だけでなく、がん幹細胞の増殖を有意に抑制し（又はこれらの細胞を休眠させ）、がんの腫瘍形成能だけでなく、浸潤能及び転移能をも効果的に抑制することができる為である。従って、本発明により、がんの悪性化又は重篤化を予防することができる。また、PSF1遺伝子の発現抑制（特に、中程度の発現抑制）は、細胞増殖を起こさない又は細胞増殖速度が緩やかな正常な細胞には顕著な影響を示さない。それは、がん細胞は細胞の休眠化が誘導されても、細胞周期のチェックポイントが破綻しているために、分裂を休止せず、細胞分裂の為に必要な分子が準備されていなくても分裂を継続しようとするために、次の分裂で分裂死が誘導されるが、正常細胞の場合、休眠化が誘導されても、細胞分裂に十分な分子が準備できてから分裂するために分裂死は誘導されないためである。したがって、本発明は、より安全な、患者にとって負担の少ないがんの治療手段となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】キュウリグサ（Trigonotis peduncularis）抽出物を液々分画して得られたクロロホルム分画物のHPLCクロマトグラフ（Ａ）、クロロホルム分画物をシリカゲル分取薄層クロマトに付して得られたキュウリグサの順相分画物のHPLCクロマトグラフ（Ｂ）、及びキュウリグサ抽出物を逆相中圧カラムクロマトに付して得られたキュウリグサの逆相分画物のHPLCクロマトグラフ（Ｃ）である。縦軸は検出波長（２８０ｎｍ）での吸光度を示し、横軸は保持時間（分）を示す。各図における特徴的なピークの保持時間は次の通りである：（II）保持時間９．２分、（IV）保持時間２０.８分、（V）保持時間２１.６分。
【図２】ウワバミソウ（Elatostema involucratum）抽出物を液々分画して得られたクロロホルム分画物のHPLCクロマトグラフ（Ａ）、クロロホルム分画物をシリカゲル中圧カラムクロマトに付して得られたウワバミソウの順相分画物のHPLCクロマトグラフ（Ｂ）、及びウワバミソウ抽出物を逆相中圧カラムクロマトに付して得られたウワバミソウの逆相分画物のHPLCクロマトグラフ（Ｃ）である。縦軸は検出波長（２８０ｎｍ）での吸光度を示し、横軸は保持時間（分）を示す。各図における特徴的なピークの保持時間は次の通りである：（I）保持時間７．８分、（II）保持時間９.２分、（III）保持時間１２.５分、（IV）保持時間２０.８分、（V）保持時間２１.６分。
【図３】キュウリグサ抽出物及びキュウリグサ抽出物の分画物を、PSF1プロモーター制御下にEGFP蛍光蛋白を発現するLLC細胞に添加して16時間培養した後の、細胞の形態を示す顕微鏡写真（Ａ）、及びEGFPの発現強度及びPI染色強度をフローサイトメトリーで解析した結果（Ｂ）を示す。Ａ、Ｂともに、１はネガティブコントロール（DMSO）、２はキュウリグサ抽出物、３はキュウリグサ抽出物のクロロホルム分画物、４は順相分画物、５は逆相分画物である。
【図４】ウワバミソウ抽出物の分画物を、PSF1プロモーター制御下にEGFP蛍光蛋白を発現するLLC細胞に添加して16時間培養した後の、細胞の形態を示す顕微鏡写真（Ａ）、及びEGFPの発現強度及びPI染色強度をフローサイトメトリーで解析した結果（Ｂ）を示す。Ａ、Ｂともに、１はネガティブコントロール（DMSO）、２はウワバミソウ抽出物のクロロホルム分画物、３は順相分画物、４は逆相分画物である。
【図５】各種抽出物をLLC細胞に添加して16時間培養した後の、細胞の形態を示す顕微鏡写真である。１はネガティブコントロール（DMSO）、２はキュウリグサ抽出物を添加した場合、３はウワバミソウ抽出物を添加した場合、４はポジティブコントロール（Rhus taitensis抽出物を添加した場合）である。
【図６】PSF1プロモーター制御下にEGFP蛍光蛋白を発現するLLC細胞に各種抽出物を添加し、EGFPの発現強度及びPI染色強度をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。１はネガティブコントロール（DMSOの添加）、２はキュウリグサ抽出物を添加した場合、３はウワバミソウ抽出物を添加した場合、４はポジティブコントロール（Rhus taitensis抽出物を添加した場合）である。各チャート内の％は、□で囲まれた範囲内の細胞の全細胞中における割合を示す。
【図７】各種抽出物をLLC細胞に添加し、細胞内のPSF1 mRNAの発現量をリアルタイムPCRで解析した結果を示す。１はネガティブコントロール（DMSOの添加）、２はキュウリグサ抽出物を添加した場合、３はウワバミソウ抽出物を添加した場合である。縦軸は、コントロールを基準としたPSF1 RNAの相対発現量を示す。DMSO添加に比べ、キュウリグサ、ウワバミソウから得られた抽出物を添加した細胞ではPSF1遺伝子の発現が減弱した。
【図８】各種抽出物を種々のヒトがん細胞［glioma (A172), breast cancer (MCF7), lung cancer (RERF-LC-KJ), gastric cancer (HGC-27), colon cancer (HT29), prostate cancer (PC3), cervical cancer (HELA), leukemia (MEG01)［()内は細胞株名を示す］］に添加し、細胞内のPSF1 mRNAの発現量をリアルタイムPCRで解析した結果を示す。１はネガティブコントロール（DMSOの添加）、２はキュウリグサ抽出物を添加した場合、３はウワバミソウ抽出物を添加した場合である。縦軸は、コントロールを基準としたPSF1 RNAの相対発現量を示す。
【図９】マウス肺がん細胞株（KLN205細胞株）を用いたがん発生モデルにおいて、マウスに各種抽出物を投与した際に、肺に形成される腫瘍塊の数を計算した結果を示す。１はネガティブコントロール（DMSOの投与）、２はキュウリグサ抽出物を投与した場合、３はウワバミソウ抽出物を投与した場合である。縦軸は、１肺表面に確認された腫瘍塊の数を示す。各バーの上に記載した数は、３回の実験の平均値を示す。
【図１０】ウワバミソウ抽出物の分画物が、タンパク質糖化に及ぼす影響を、CML ［カルボキシメチルリジン（carboxymethyllysine）］の発現量により測定した結果を示す。CMLとは、終末糖化産物であるadvanced glycosylation end product (AGEs)のひとつであり、糖化のマーカーである。分画物を添加していないネガティブコントロールを100とした。横軸に関し、１はネガティブコントロール（DMSOの添加）、２はウワバミソウ抽出物のクロロホルム分画物、３は順相分画物、４は逆相分画物を添加した場合である。縦軸は、コントロールを基準としたAGEsの相対産生量を示す。いずれの分画物においても、糖化を促進する効果が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物は、下記（Ａ）〜（Ｆ）の条件でのＨＰＬＣ分析において、保持時間７．８分にピークを有する成分（I）、保持時間９.２分にピークを有する成分（II）、保持時間１２.５分にピークを有する成分（III）、保持時間２０.８分にピークを有する成分（IV）、及び保持時間２１.６分にピークを有する成分（V）から成る群より選択される１種以上の成分を含有することが好ましい。
（Ａ）ＨＰＬＣカラム：オクタデシル化シリカゲル担体（粒子径３μｍ）を充填した内径４.６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのカラム
（Ｂ）ＨＰＬＣカラムオーブン温度：４０℃
（Ｃ）流速：０.８ｍｌ／分
（Ｄ）検出：１９０〜４００ｎｍ
（Ｅ）移動相：（ａ）メタノールと（ｂ）２.５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
（Ｆ）グラジエント条件：８５％の（ａ）と１５％の（ｂ）との混合溶媒を５分間保持し、その後１５分かけて混合溶媒中の（ａ）の濃度を８５％から１００％に直線的に上昇させ、その後（ａ）の濃度を１００％に維持
【００１８】
保持時間に関して「保持時間７．８分」、「保持時間９.２分」、「保持時間１２.５分」、「保持時間２０.８分」、及び「保持時間２１.６分」には、前後数秒（例えば、２０秒、１５秒、１０秒、５秒、３秒、２秒、又は１秒）の範囲が含まれる。これは、同じ条件を採用してＨＰＬＣ分析を行っても、分析の都度、保持時間に若干の実験誤差が生じる為である。
【００１９】
粒子径３μｍのオクタデシル化シリカゲル担体は、商業的に入手可能であり、それらを適宜選択して使用することができるが、次の仕様を満たすことが好ましい。
（ａ）母体：高純度球状シリカゲル（ＥＳシリカ）
（ｂ）表面積：２００ｍ２／ｇ
（ｃ）細孔径：２００Å（２０ｎｍ）
（ｄ）細孔容積：１.００ｍＬ／ｇ
（ｅ）化学結合基：オクタデシル基
（ｆ）エンドキャップ：あり
（ｇ）炭素量：９％
（ｈ）ＵＰＳコード：Ｌ１
上記仕様を満たす単体としては、例えば、後述する製造例２で使用したジーエルサイエンス株式会社製の「InertSustainSwift（登録商標） C18」を挙げることができる。「粒子径３μｍ」とは、平均粒子径が３μｍであることを意味する。  
【００２０】
検出波長は、１９０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲から任意に選択した波長を用いることができる。例えば、検出波長は、２５４ｎｍ、２８０ｎｍ又は３６５ｎｍに設定することができる。
【００２１】
ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物を取得するための手段、及び、原料等は特に制限されない。好適な一実施形態において、ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物は、植物を原料として抽出することによって得ることができる。好ましい植物としては、キュウリグサ及びウワバミソウを挙げることができる。「キュウリグサ（Trigonotis peduncularis）」とは、ムラサキ科（Boraginaceae）キュウリグサ属（Trigonotis）に属する植物であり、日本各地からアジアの温帯及び暖帯に広く分布している草丈１０ｃｍ〜２０ｃｍほどの小さな１年草である。和名は、葉をもむとキュウリのようなにおいがすることに由来する。別名タビラコともいい、若い茎や葉は食用として山菜料理に利用される。また、民間薬として、利尿などに効能があることが知られている。「ウワバミソウ（Elatostema involucratum）」とは、イラクサ科（Urticaceae）ウワバミソウ属（Elatostema）の植物であり、学名シノニウムはElatostema japonicum、Elatostema umbellatumである。高さ５０ｃｍ程度の雌雄異株の多年草で、日本各地の渓流沿い、山地の湿った斜面などに群生している。その若葉、若芽、及び茎は、ミズナ（水菜）、アカミズとして山菜で知られており、また、茎及び根茎は軽い切り傷、虫さされの処置に利用される。一実施形態において、キュウリグサを原料として得られる組成物は、成分（II）、成分（IV）及び／又は成分（V）を含むことが好ましい。一実施形態において、ウワバミソウを原料として得られる組成物は、成分（I）、成分（II）、成分（III）、成分（IV）、及び／又は成分（V）を含むことが好ましい。
【００２２】
抽出に供される植物の部位は、特に限定されず、全草、地上部、葉、樹皮、茎、根、果実、種子、種皮、及び花等から適宜選択することができる。より高いPSF1遺伝子の発現阻害活性を有する抽出物を得るという観点から、キュウリグサの抽出物は、キュウリグサの全草の抽出物であることが好ましい。ウワバミソウの抽出物は、その地上部の抽出物であることが好ましい。植物の採集時期や採集場所（地域）は特に限定されないが、活性成分の種類・含量は、季節の変動や場所の変動の影響を受けることがある。
【００２３】
植物の抽出物は、公知の抽出方法を任意に選択し、組み合わせて実施することにより得ることができる。例えば、植物又はその一部をそのまま又は乾燥後、粉砕又は細切し、溶媒を用いてバッチ式又は連続式で抽出することができる。
【００２４】
抽出溶媒は、任意の溶媒を選択して使用することができる。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール溶媒；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール溶媒；エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル溶媒；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル溶媒；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン溶媒；ジクロロメタン、クロロホルムのようなメタン誘導体、１，１，１−トリクロロエタンのようなエタン誘導体、あるいはテトラクロロエチレンのようなエチレン誘導体である塩化脂肪族炭化水素溶媒等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独、混合、又は組み合わせて用いることができる。ウワバミソウの抽出物を得る為の好ましい溶媒としては、夾雑物含量を低減させ、有効成分濃度を高めるという観点から、低極性溶媒（例えば、酢酸エチル及びクロロホルム等）及びアルコール溶媒が上げられ、より好ましくはエステル溶媒、塩化脂肪族炭化水素溶媒、及び低級アルコール溶媒、更に好ましくは脂肪酸低級アルキルエステル溶媒、塩化脂肪族低級炭化水素溶媒、及びエタノール（特に、７０〜１００％（ｖ／ｖ）エタノール、好ましくは７５〜１００％（ｖ／ｖ）エタノール、より好ましくは８０〜１００％（ｖ／ｖ）エタノール）である。
【００２５】
抽出に使用する溶媒の量は適宜選択することができ、通常、原料に対し、好ましくは１〜１００倍量の抽出溶媒を使用すればよい。抽出温度も適宜、目的に応じて決定すればよいが、水抽出の場合は通常、好ましくは４〜１３０℃、より好ましくは２５〜１００℃である。溶媒中に低級アルコールが含まれる場合は４〜７０℃の範囲が好適である。非アルコール系有機溶媒を用いる場合は、４℃〜還流温度で抽出を行うことが好ましい。
【００２６】
抽出時間は、抽出効率を考慮して設定することができる。例えば、数分〜数日、好ましくは３０分〜１日の範囲となるように、原料、抽出溶媒、抽出温度を設定することができる。抽出操作は、例えば、攪拌しながら又は静置して行えばよく、必要に応じて数回繰り返してもよい。更に、必要に応じて、ろ過、遠心分離、濃縮、限外ろ過等の処理を組み合わせて、PSF1遺伝子発現阻害活性を有する抽出物を得ることができる。
【００２７】
上述する抽出物をそのままＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物とすることができるが、必要に応じて、抽出物を濃縮、乾固した物を水、極性溶媒、又は非極性溶媒に再度溶解してＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物とすることもできる。ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物は、生理作用を損なわない範囲で、抽出物を脱色、脱臭、脱塩、液々分配、及びカラムクロマトグラフィー（順相及び／又は逆相等のクロマトグラフィー）等による分画・精製処理を行って得られる精製物（又は分画物）として得ることが好ましい。
【００２８】
一実施形態において、ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物は、上述する抽出物を液々分配に供して得ることが好ましい。液々分配は、ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル、n-ブタノール、及び水等から選択される互いに混じり合わない２種類以上の液体溶媒を用いて、使用した溶媒により形成される上下２層の各溶媒に転溶する成分ごとに分画する方法である。これを繰り返すことにより、例えば、ヘキサン可溶画分、クロロホルム可溶画分、酢酸エチル可溶画分、n-ブタノール可溶画分、水可溶画分に分画することができる。好ましい使用溶媒は、ヘキサン、クロロホルム、含水アルコール（例えば、80％メタノール、80％エタノール）、及び水である。一実施形態において、ヘキサンと水（又は含水アルコール）とを用いて液々分配に供し、下層である水層（又は含水アルコール層）を回収し、更にクロロホルムを用いた液々分配に供し、下層であるクロロホルム層を回収することが好ましい。得られたクロロホルム層は水を用いて洗浄するのが好ましい。各液々分配は、複数回繰り返すことができ、例えば、２〜５回繰り返すことができる。
【００２９】
一実施形態において、ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物は、上述する抽出物を順相クロマトグラフィーに供して得ることが好ましい。順相クロマトグラフィーでは、固定相にシリカゲルを用いることが好ましい。移動相（溶出溶媒）としては、低極性溶媒（例えば、トルエン、ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル、等）、アセトン及び低級アルコール（例えば、メタノール等）等の有機溶媒を用いることができる。単一溶媒、又は、２〜３種の混合溶媒を適宜使用し、低極性溶媒から高極性溶媒へと使用溶媒の極性を上げることにより、シリカゲルに吸着させた物質（抽出物等）を低極性物質から順次溶出して分画することができる。移動相としては、クロロホルム−メタノール系溶媒、又は、酢酸エチル−メタノール系溶媒の使用が好ましい。順相クロマトグラフィーを用いてＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物を得る場合、上述する液々分配によって得られた画分（例えば、クロロホルム画分）をその試料として用いることが好ましい。
【００３０】
一実施形態において、ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物は、上述する抽出物を逆相クロマトグラフィーに供して得ることが好ましい。逆相クロマトグラフィーでは、固定相に低極性のもの（例えば、シリカゲルに炭素鎖数８のオクチル基、又は炭素鎖数１８のオクタデシル基を結合させたもの。後者はＯＤＳと呼ばれる）を用いることが好ましい。移動相（溶出溶媒）としては、高極性のもの（例えば、水又は塩類含有水溶液、低級アルコール、及びアセトニトリル等の有機溶媒）を単一若しくは混合溶媒として用いることができる。例えば、移動相として、水−アルコール系を使用する場合、アルコール含量を順次上げることにより、高極性の物質から順に溶出し始め、分画物を得ることができる。移動相としては、水−メタノール系溶媒、又は、水−エタノール系溶媒の使用が好ましい。
【００３１】
順相クロマトグラフィーのバリエーションとして、親水性相互作用クロマトグラフィー等を用いることができる。固定相に表面を極性基（ジオール、アミド、スルホベタインなど）で修飾したシリカゲルを用い、移動相に水を含む溶媒を用いることにより、逆相クロマトグラフィーでは分離が困難な極性化合物を分離することが可能である。その他、混合物をその分子サイズにより分離する、分子ふるいクロマトグラフィーや、無機イオンや高極性分子をその電荷を利用して分離するイオン交換クロマトグラフィー等を利用してＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物を得ることも可能である。
【００３２】
PSF1遺伝子発現の抑制活性は、任意の手法で測定することができるが、例えば、後述する実施例に示すように、PSF1遺伝子プロモーター制御下にEGFPを発現するように構築された株化細胞（例えば、LLC細胞）を用いて測定することができる。
【００３３】
一実施形態において、ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物は、タンパク質糖化抑制活性を有さないことが好ましい。タンパク質糖化抑制活性は、後述する試験例９に記載される方法で測定することができる。
【００３４】
一実施形態において、ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物は、成分（Ｉ）〜（V）から成る群より選択される１種以上の成分を含み、他の任意の成分を含むことができるが、実質的に成分（Ｉ）〜（V）から成る群より選択される１種以上の成分のみを含むことが好ましい。他の実施形態において、ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物は、成分（II）又は成分（III）を含むことが好ましい。
【００３５】
キュウリグサ及びウワバミソウの抽出物並びにそれらの各種分画物は、PSF1遺伝子発現抑制活性を有するため、PSF1遺伝子発現抑制剤、或いは、がんの予防又は治療剤として利用することが出来る。PSF1遺伝子発現抑制剤は、キュウリグサ及び／又はウワバミソウの抽出物並びにそれらの各種分画物自体(例えば、生薬)であっても、キュウリグサ及び／又はウワバミソウの抽出物並びにそれらの各種分画物と他の成分とを組み合わせた製剤（例えば、漢方薬）であっても良い。また、PSF1遺伝子発現抑制剤は、食品の形態であってもよい。食品には、一般食品及び機能性食品（例えば、健康食品、健康補助食品、病者用食品、栄養補助食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品等）が含まれる。
【００３６】
PSF1遺伝子発現抑制剤をがんの予防又は治療剤として利用する場合、がんの種類は特に制限されず、任意に選択することができる。例えば、がんは、脳腫瘍（例えば、神経膠腫）、乳がん、呼吸器がん（例えば、肺がん）、消化器がん（例えば、大腸がん、胃がん）、泌尿器系腫瘍（例えば、前立腺がん）、女性性器腫瘍（例えば、子宮頸がん）、及び血液腫瘍（例えば、白血病）から成る群より選択される１種以上であり得る。一実施形態において、予防又は治療の対象として好ましいがんの種類は、乳がん、肺がん、胃がん、大腸がん、前立腺がん及び白血病である。
【００３７】
PSF1遺伝子発現抑制剤、或いは、がんの予防又は治療剤の形態は特に制限されず、例えば、液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等の任意の形態とすることが出来る。使用目的に応じて、キュウリグサ及びウワバミソウの抽出物並びにそれらの各種分画物は薬学的に許容可能な各種の担体と配合し、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。
【００３８】
薬学的に許容可能な担体は、特に制限されないが、例えば、デンプン、乳糖、ショ糖、マンニトール、コーンスターチ、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストリン、ペクチン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、水、エチルアルコール、エチレングリコール、グリセリン等を挙げることが出来る。これらの１種又は２種以上の組合せを適宜選択して使用することが出来る。
【００３９】
PSF1遺伝子発現抑制活性を有するキュウリグサ及びウワバミソウの抽出物並びにそれらの各種分画物を医薬とする場合の配合量は、疾患の程度、患者年齢等によって相違し、実験的に定めることが好ましい。例えば、PSF1遺伝子発現抑制活性を有する抽出物を有効成分とする経口製剤の場合は、大人一人（６０ｋｇ体重）当たり一日量として、５ｍｇ〜３０ｇ程度であり、２０ｍｇないし１０ｇ程度とすることが好ましく、１日１回ないし数回に分けて投与することができる。また、血管内投与の場合は、０．５ｍｇ〜３ｇ程度、又は２ｍｇ〜１ｇ程度とすることが好ましく、この場合も１日１回ないし数回に分けて注射により、または輸液とともに投与することができる。
【００４０】
PSF1遺伝子発現抑制活性を有するキュウリグサ及びウワバミソウの抽出物並びにそれらの各種分画物は、それを食品に配合することにより、当該抽出物またはその各種分画物が濃縮された食品とすることが出来る。食品中に濃縮した状態で配合される当該抽出物またはその各種分画物の量は、目的に応じて適宜設定することができ、例えば、抽出物またはその各種分画物の乾燥重量換算で、大人1日の摂取量が、０．１〜３０ｇとなるように設定することが出来る。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００４２】
製造例１：キュウリグサ、ウワバミソウの抽出物の調製
高知県（日本）で採集したキュウリグサの全草の乾燥物（2.0グラム）に80％エタノール20mLを加え、50℃で8時間時々振盪し、室温で一晩静置した。これを自然濾過し、濾液の一部10mLを50℃で窒素パージを用いて乾燥させ、次いで一晩凍結乾燥させて、キュウリグサの抽出物（129mg）を得た。同様の手順で、80％エタノール20mLを用い、高知県（日本）で採集したウワバミソウの地上部の乾燥物（2.0グラム）から得られた濾液の一部10mlを乾固させ、抽出物（123mg）を得た。
【００４３】
製造例２：キュウリグサ抽出物からのクロロホルム分画物及び順相分画物の調製
広島県（日本）で採集したキュウリグサの全草の乾燥物（12.5グラム）を細断し、80％エタノール125mLを加え、50℃で8時間時々振盪し、室温で一晩静置した。これを吸引濾過し、濾液の一部65mLを、15mLのヘキサンを用い合計3回液々分配に付した。なお、製造例３で用いる抽出濾液35mLを除き、残りの抽出濾液を濃縮乾固し、キュウリグサ抽出物（597mg）を得た。下層を、105mL、及び9mLのクロロホルムを用い合計2回液々分配に付した。得られたクロロホルム層を合し、水20mLを用いて洗浄、次いで濾紙濾過後減圧濃縮し、キュウリグサのクロロホルム分画物（91.0mg）を得た。本クロロホルム分画物の一部（55.7mg）を、次の条件で分取TLCに付した。TLCプレート：シリカゲル60F254、厚さ1mm、20ｘ20cm。展開溶媒：クロロホルム：メタノール=95：5。Rf0.11〜0.30のバンドをかきとり、40mLのクロロホルム：メタノール=92：8で抽出し、減圧濃縮、減圧乾燥し、キュウリグサの順相分画物（3.2mg）を得た。
【００４４】
このようにして得られたキュウリグサのクロロホルム分画物及び順相分画物は、HPLC分析において、各々図１-Ａ及び図1-Ｂのクロマトグラムを示した。いずれのクロマトグラムにおいても、特徴的なピーク（II）（保持時間９.１６分（Ａ）、８．９７分（Ｂ））、（IV）（保持時間２０.８５分（Ａ））、及び／又は（V）（保持時間２１.６６分（Ａ））が確認された。HPLC測定条件は以下通りである。
カラム：InertSustainSwift C18（ 3μｍ、4.6φＸ150mm）（ジーエルサイエンス株式会社製）
LCシステム：Shimadzu LC-6A system（株式会社 島津製作所製）
カラムオーブン温度：40℃
流量：0.8 mL/min
検出：UV280nm
移動相：メタノール（Ａ）、2.5mMギ酸アンモニウム溶液（Ｂ）
グラジエントプログラム：０→５min  Ａ（８５％）、Ｂ（１５％）、
５→２０min  Ａ（８５→１００％）、Ｂ（１５→０％）、
２０→４０min  Ａ（１００％）、Ｂ（０％）、
【００４５】
製造例３：キュウリグサ抽出物の逆相分画物（２）の調製  製造例２で得られた抽出濾液の一部35mLを、ODSカラムを用いた中圧カラムクロマトに付した。カラム（YAMAZEN UNIVERSAL COLUMN ODS-SM、50μm、120Å、3.0ｘ16.5cm、37g）を80％メタノールで予め浸潤させた後、上記濾液をプレカラムに充填し、次いで、移動相として80％メタノールを240mL、90％メタノールを60mL流した後、100％メタノールで溶出を続けた。各30mLづつ分画し、画分６〜１７を合して濃縮乾固し、キュウリグサの逆相分画物（53ｍｇ）を得た。
【００４６】
このようにして得られたキュウリグサの逆相分画物は、HPLC分析の結果、図1-Ｃのクロマトグラムを示した。上述のクロロホルム分画物及び順送分画物と同様に、特徴的なピーク（II）（保持時間９.０９分）が確認された。HPLC条件は上記製造例２における分析条件と同じである。
【００４７】
製造例４：ウワバミソウ抽出物からのクロロホルム分画物及び順相分画物の調製
製造例１と同じ方法で得たウワバミソウ抽出物（20.14ｇ）を、メタノール1280mLに溶解（不溶物あり）させ、水320mLを追加し、撹拌し、ほぼ溶解させた。180mL、180mL、及び150mLのヘキサンを用い合計3回液々分配に付した。下層を、1200mL、及び 100mLのクロロホルムを用い合計2回液々分配に付した。得られたクロロホルム層を合し、水230mLを用いて洗浄、次いで減圧濃縮し、ウワバミソウのクロロホルム分画物（1.85g）を得た。本クロロホルム分画物の一部（1.79g）を、クロロホルムに少量のメタノールを加えた溶媒に溶解し、珪藻土約15mLを加え、濃縮乾固した。本分画物担持珪藻土を25mLの注射筒に入れ、下記カラムの手前に連結し、次の条件で中圧カラムクロマトに付した。カラム：Biotage ZIPTM 80g Si (40-63μｍ)  （シリカゲル80ｇ、容積102mL）（バイオタージ・ジャパン株式会社製）、
流速：50ml/min、分画容量：25mL、検出：UV254nm
タイムモード：W 3分  クロロホルム：メタノール=99：1  （Fr.1〜6）
G 21分  クロロホルム：メタノール=99：1 → 90：10  （Fr.7〜48）
T 10分  クロロホルム：メタノール=90：10  （Fr.49〜68）
Fr.11〜25を合し、減圧濃縮し、ウワバミソウの順相分画物（222mg）を得た。
【００４８】
このようにして得られたウワバミソウのクロロホルム分画物及び順相分画物は、HPLC分析において、各々図２−Ａ及び図２−Ｂのクロマトグラムを示した。いずれのクロマトグラムにおいても、特徴的なピーク（I）（保持時間７．９４分（Ａ）、７．６６分（Ｂ））、（II）（保持時間９.４６分（Ａ）、９．３３分（Ｂ））、及び（III）（保持時間１２.５４分（Ａ）、１２．５６分（Ｂ））が確認され、クロロホルム分画物においては、さらに（IV）（保持時間２０.７９分（Ａ））、及び（V）（保持時間２１.６３分（Ａ））が確認された。HPLC条件は上記製造例２における分析条件と同じである。
【００４９】
製造例５：ウワバミソウ抽出物の逆相分画物の調製  製造例１と同じ方法で得たウワバミソウ抽出物（3.33ｇ）を、メタノール190mLに溶解（不溶物あり）させ、水47mLを追加し、50℃で8時間時々振盪し、次いで室温で一晩静置した。これを濾過し、得られた濾液をODSカラムを用いた中圧カラムクロマトに付した。カラム（YAMAZEN UNIVERSAL COLUMN ODS-SM、50μm、120Å、3.0ｘ16.5cm、37g）を80％メタノールで予め浸潤させた後、上記濾液を全量カラムに流し入れ、分画を開始した。次いで、移動相として80％メタノールを60mL 、90％メタノールを120mL流した後、100％メタノールで溶出を続けた。各30mLづつ分画し、画分１２〜２３を合して濃縮乾固し、ウワバミソウの逆相分画物（354mg）を得た。
【００５０】
このようにして得られたウワバミソウの逆相分画物は、HPLC分析の結果、図２−Ｃのクロマトグラムを示した。上述のクロロホルム分画物と同様に、特徴的なピーク（I）（保持時間７．６６分）、（II）（保持時間９.４２分）、（III）（保持時間１２.４２分）、（IV）（保持時間２０.８２分）、及び（V）（保持時間２１.６６分）が確認された。HPLC条件は上記製造例２における分析条件と同じである。
【００５１】
試験例１：キュウリグサ分画物による細胞形態に基づく細胞死誘導性の検討
PSF1遺伝子プロモーター制御下にEGFPを発現する肺がん細胞株 LLC （Cancer Res 70, 1215-1224, 2010）を、大阪大学から入手した。この細胞株を１０％胎仔牛由来血清（FCS）、100 units/mLのペニシリン、100 μg/mLのストレプトマイシンを添加したDMEM中で、5% CO2、37℃の条件下で培養した。このようにして培養したLLCを10４細胞ずつ6well培養皿に播種し、2mLの上記培養液中で24時間培養した。上記製造例２及び３で得たキュウリグサ抽出物、キュウリグサ抽出物のクロロホルム分画物、順相分画物、及び逆相分画物をdimethyl sulfoxide (DMSO; ナカライ  テスク社製)に溶解し、最終濃度が100μg／mLとなるようにLLCを培養したウェルに添加した。ネガティブコントロールには、DMSOのみを２μl添加した。その後、前記培養条件で16時間培養し、細胞の形態を顕微鏡で観察した。結果を図３Ａに示す。ネガティブコントロール（図３Ａの１）の細胞像と同様に、キュウリグサ抽出物、キュウリグサ抽出物のクロロホルム分画物、順相分画物、及び逆相分画物を添加した細胞の形態は特に変化なく、細胞死が誘導されていないことが示された（図３Ａの２、３、４、及び５）。
【００５２】
試験例２：キュウリグサ分画物によるPSF1遺伝子発現抑制作用の検討
試験例１と同じ条件で培養したLLC細胞を5%FCSを含むリン酸緩衝液（PBS）で１回洗浄した後、500μLの5%FCSを含むPBSに分散させた。そこに、propidium iodide（PI：ＢＤ  Bioscience社製）を２μL加えて穏やかに混和し、室温、暗所で１５分間反応させた。その後、細胞をフローサイトメーター（FACS  Calibur：Becton  Dickinson社製）に供し、GFP蛍光強度及びPI蛍光強度についてフローサイトメトリー法を用いて解析した（図３Ｂ）。ネガティブコントロールの細胞及びキュウリグサ抽出物ではほとんどがGFP陽性PI陰性である（図３Ｂの１及び２）。これは、細胞が生存しており、PSF1の遺伝子が転写され続けていることを意味する。これと比較して、キュウリグサ抽出物のクロロホルム分画物、順相分画物、及び逆相分画物においては、若干PI強度は高くなったが、103を越えるまでには至らず、GFP強度は低下することが確認された(図３Ｂの３、４、及び５)。これらの結果から、キュウリグサ抽出物のクロロホルム分画物、順相分画物、及び逆相分画物によって、16時間という培養時間内では細胞死は誘導されないがPSF1遺伝子のプロモーター活性が抑制されることが判明した。
【００５３】
試験例３：ウワバミソウ分画物による細胞形態に基づく細胞死誘導性の検討
試験例１と同じ条件で培養したLLCを10４細胞ずつ6well培養皿に播種し、2mLの上記培養液中で24時間培養した。上記製造例４及び５で得たウワバミソウ抽出物のクロロホルム分画物、順相分画物及び逆相分画物をdimethyl sulfoxide (DMSO; ナカライ  テスク社製)に溶解し、最終濃度が100μg／mLとなるようにLLCを培養したウェルに添加した。ネガティブコントロールには、DMSOのみを２μL添加した。その後、前記培養条件で16時間培養し、細胞の形態を顕微鏡で観察した。結果を図４Ａに示す。ネガティブコントロール（図４Ａの１）の細胞像と同様に、ウワバミソウ抽出物のクロロホルム分画物、順相分画物、及び逆相分画物を添加した細胞の形態は特に変化なく、細胞死が誘導されていないことが示された（図４Ａの２、３、及び４）。
【００５４】
試験例４：ウワバミソウ分画物によるPSF1遺伝子発現抑制作用の検討
試験例２と同様にして、細胞をフローサイトメーター（FACS  Calibur：Becton  Dickinson社製）に供し、GFP蛍光強度及びPI蛍光強度についてフローサイトメトリー法を用いて解析した（図４Ｂ）。ネガティブコントロールの細胞ではほとんどがGFP陽性PI陰性である（図４Ｂの１）。これは、細胞が生存しており、PSF1の遺伝子が転写され続けていることを意味する。これと比較して、ウワバミソウ抽出物のクロロホルム分画物、順相分画物及び逆相分画物においては、若干PI強度は高くなったが、103を越えるまでには至らず、GFP強度は低下することが確認された(図４Ｂの２、３、及び４)。これらの結果から、ウワバミソウ抽出物のクロロホルム分画物、順相分画物、及び逆相分画物によって、16時間という培養時間内では細胞死は誘導されないがPSF1遺伝子のプロモーター活性が抑制されることが判明した。
【００５５】
なお、図１及び図２のクロマトグラムで確認された２つのピーク（II）と（III）の化合物は、それぞれ、単独で３μg／mLの濃度で細胞障害性を与えることなく、PSF1遺伝子発現抑制作用（80〜90％抑制）を示し、他の３つのピーク（I）、（IV）と（V）の化合物は、それぞれ、単独で10μg／mLの濃度で細胞障害性を与えることなく、PSF1遺伝子発現抑制作用（50〜90％抑制）を示すことが確認された。
【００５６】
試験例５：キュウリグサ、ウワバミソウ抽出物による細胞形態に基づく細胞死誘導性の検討
試験例１と同じ条件で培養したLLCを10４細胞ずつ6well培養皿に播種し、2mlの上記培養液中で24時間培養した。上記製造例１で得た各抽出物を、最終濃度がキュウリグサでは1000μg／mLとなるように、ウワバミソウでは100μg／mLとなるようにdimethyl sulfoxide (DMSO; ナカライ  テスク社製)に溶解し、２μLをLLCを培養したウェルに添加した。ネガティブコントロールには、DMSOのみを２μL添加した。ポジティブコントロールには、製造例１と同様の方法でRhus taitensisの葉から得た抽出物を最終濃度が100μg／mLとなるように添加した。その後、前記培養条件で16時間培養し、細胞の形態を顕微鏡で観察した。結果を図５に示す。ネガティブコントロールの細胞像（図５の１）と同様に、キュウリグサ（図５の２）及びウワバミソウ（図５の３）の抽出物を添加した細胞の形態は特に変化なく、細胞死が誘導されていないことが示された。一方、Rhus taitensisの抽出物を添加した細胞では、球状に変化し、培養液中に浮いていたため、細胞死の誘導が確認された（図５の４）。
【００５７】
試験例６：キュウリグサ、ウワバミソウ抽出物によるPSF1遺伝子発現抑制作用の検討
試験例５と同じ条件で培養したLLC細胞を５％FCSを含むリン酸緩衝液（PBS）で１回洗浄した後、500μLの５％FCSを含むPBSに分散させた。そこに、propidium iodide（PI：BD  Bioscience社製）を２μL加えて穏やかに混和し、室温、暗所で１５分間反応させた。その後、細胞をフローサイトメーター（FACS  Calibur：Becton  Dickinson社製）に供し、GFP蛍光強度（横軸）及びPI蛍光強度（縦軸）についてフローサイトメトリー法を用いて解析した（図６）。ネガティブコントロールの細胞ではほとんどがGFP陽性PI陰性である（図６の１）。これは、細胞が生存しており、PSF1の遺伝子が転写され続けていることを意味する。一方、ポジティブコントロールであるRhus taitensisの抽出物を添加した細胞では、PI強度が上昇し、細胞死が誘導されたことが確認された（図６の４）。これらと比較して、キュウリグサ（図６の２）及びウワバミソウ（図６の３）の抽出物を添加した細胞では、PIの強度はさほど上昇せず、GFP強度は低下することが確認された。この結果から、キュウリグサ及びウワバミソウの抽出物によって、細胞死は誘導されないがPSF1遺伝子のプロモーター活性が抑制されることが判明した。
【００５８】
試験例７：キュウリグサ、ウワバミソウ抽出物によるリアルタイムPCRを用いたPSF1発現抑制作用の検討
定量リアルタイムPCR を用いて、上記製造例１で調製した各抽出物の、LLC細胞，ヒトglioma細胞 (A172), breast cancer細胞 (MCF7), lung cancer細胞 (RERF-LC-KJ), gastric cancer細胞 (HGC-27), colon cancer細胞 (HT29), prostate cancer細胞 (PC3), cervical cancer細胞 (HELA),及びleukemia細胞 (MEG01)におけるPSF1遺伝子の発現に対する影響を検討した。これらの細胞を試験例１と同様の条件で培養し、各抽出物で処理したがん細胞から、kit (Qiagen社製)を用いて、トータルRNAを得た。尚、LLC細胞以外の細胞については、各抽出物を最終濃度が500μg／mLとなるように10μL添加し、その際のネガティブコントロールにおいてはDMSOのみを10μL添加した。次に、ExScript RT reagent Kit（タカラ社製）を用いて、回収した各全RNAからcDNAをそれぞれ合成し、得られたcDNAを用いて、PSF1の発現をリアルタイムPCR法によって解析した。比較対照として解糖系酵素であるGAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）のmRNAの発現量も測定した。リアルタイムPCRは、Stratagene Mx300P (Stratagene社製)を用いて実施した。マウスPSF１をPCRで合成する際のプライマーとして、以下の配列を用いた。
【００５９】
５´- CCGGTTGCTTCGGATTAGAG -３´（配列番号１）
５´- CTCCCAGCGACCTCATGTAA -３´（配列番号２）
マウスGAPDHをPCRで合成するためのプライマーとして以下の配列を用いた。
５´- AACTTTGGCATTGTGGAAGG -３´（配列番号３）  
５´- GGATGCAGGGATGATGTTCT -３´（配列番号４）  
ヒトPSF1をPCRで合成する際のプライマーとして、以下の配列を用いた。
５´- ACCTGTATGACCGCTTGCTTC -３´（配列番号５）    
５´- TTCATCTCCTCCCAGTGAC-３´（配列番号６）    
ヒトGAPDHをPCRで合成する際のプライマーとして、以下の配列を用いた。
５´- ACCCAGAAGACTGTGGATGG -３´（配列番号７）
５´- CCCTGTTGCTGTAGCCAAAT -３´（配列番号８）
【００６０】
測定結果を図７（マウス）及び図８（ヒト）に示す。図７及び図８に示される結果から、キュウリグサ及びウワバミソウの各抽出物は、マウス及びヒトのがん細胞におけるPSF1の発現を抑制することが確認された。特に、ヒトがん細胞を用いた解析結果から、これら抽出物は、脳腫瘍、乳がん、呼吸器がん、消化器がん、泌尿器系腫瘍、女性性器腫瘍、そして血液腫瘍などへの効果が確認され、あらゆる種類のがん種に対してPSF1発現抑制効果を有することが判明した。この結果は、キュウリグサ及びウワバミソウの各抽出物は、がん細胞及びがん幹細胞においてPSF1の発現を抑制し、細胞周期を停止させることでがんの休眠化を誘導することを意味する。これまでの解析によれば、PSF1の遺伝子はがんの種類に関係なく発現が亢進していることからも、これらのエキスはあらゆるがんの治療に有効であると考えられる。また、がんの悪性化及び重篤化の予防にも有効であることが期待される。
【００６１】
試験例８：キュウリグサ、ウワバミソウ抽出物によるマウス肺がん発生モデルを用いたin vivo抗腫瘍活性評価
KLN205細胞（マウス扁平上皮肺癌細胞）は独立行政法人理化学研究所から入手した。この細胞を、10%FBS (Hyclon社)、Non-Essential Amino Acids (Lonza社)、ペニシリン（100units/mL ;Invitrogen社）、及びストレプトマイシン (100μg/mL; Invitrogen社)を含有するEagle MEM（日水製薬社）を用いて培養した。80%コンフレントまで培養後、Trypsin/EDTA (Invitrogen社)により回収し、PBSにて2.0x106細胞/mLに調製した。
【００６２】
7週齢のDBA/2雌性マウス（日本SLC社製）を清水実験材料株式会社より購入し、3日間予備飼育を行い馴化させた。マウスは、温度22±3℃、湿度55±15%、常時オールフレッシュ方式換気、照明12hr/day（午前6時より午後6時）に設定した飼育室にて、プラスチック製飼育ケージに3匹ずつ収容し飼育した。また、飼料はラボMRストック（日本農産工業）、水は水道水を自動給水装置で自由摂取させた。
【００６３】
ソムノペンチル（共立製薬株式会社）にて麻酔を施したマウスの尾静脈より、調製したKLN205細胞を100μL（2.0x105細胞）注射した。注射5日後からDMSO（コントロール）、又はPBSにて10mg/mLに調製したキュウリグサ若しくはウワバミソウの各抽出物（製造例１で調製したもの）を腹腔内へマウス1匹あたり200μL投与した。なおDMSOの終濃度は5%であった。各抽出物は1日おきに7回投与し、最終投与から2日後にソムノペンチルにて麻酔を施した後、肺を摘出しパラホルムアルデヒド（和光純薬株式会社）にて組織の固定をおこなった。肺がん発症の評価は、固定した肺を実体顕微鏡下で観察し、１肺表面に確認できる腫瘍塊の数を合計することで行った。
【００６４】
評価結果を図９に示す。図９に示される結果から明らかなように、コントロールと比べてすべての抽出物により肺に形成される腫瘍塊の数が減少することが判明した。この解析系は、一個のがん細胞が一つの腫瘍塊を形成する、がん幹細胞による腫瘍形成のモデルと考えられている（T. Kaneko et al., : KLN205 - a murine lung carcinoma cell line. In Vitro, 16 (1980), pp. 884-892）。よって、本試験結果から、PSF1の発現を抑制する抽出物は、がん幹細胞の旺盛な自己複製を抑制し、がんの発症を抑制すると考えられた。また、がんがすでに発症していたとしても、がん幹細胞の自己複製を抑制すればがん細胞の増殖を抑制できるため、がんの予防だけでなくがんの治療にもこれらの抽出物質を利用することができると考えられた。
【００６５】
試験例９：蛋白質の糖化抑制作用の検討
96ウエルプレートにリン酸緩衝生理食塩水（PBS；phosphate buffer saline）で調製した1/6Mグルコース6-リン酸二ナトリウム水和物、10mg/mLヒト血清アルブミンおよびDMSOで調整した試験物質[ウワバミソウ抽出物のクロロホルム分画物、順相分画物、及び逆相分画物] を最終濃度4mg/mlで添加し、11日間、37℃でインキュベートした。インキュベート後、ELISA法により、最終糖化産物のひとつであるCML[Ne-(carboxymethyl)lysine]産生量をCircuLexTM CML/Ne (carboxymethyl) lysine ELISA Kit (CycLex社製)で測定した。試験物質溶液を添加していない対照（コントロール）のCML ［カルボキシメチルリジン（carboxymethyllysine）］を100としたときの各試料溶液のCML量を図１０に示す。ここで、CMLとは、終末糖化産物であるadvanced glycosylation end product (AGEs)のひとつであり、糖化のマーカーとなるものである。
【００６６】
図１０に示される結果から明らかなように、ウワバミソウ抽出物のクロロホルム分画物、順相分画物、及び逆相分画物にはCML産生を抑制する作用はなく、むしろその産生を促進することが判明した。
【００６７】
試験例１０：抽出条件の検討（ウワバミソウ）
下記の表１に示す各種の抽出溶媒10mLを用い、上記製造例１と同様の手順で、ウワバミソウの地上部１ｇ（乾燥重量）から抽出物を調製した。但し、「還流」の記載があるものは、還流温度で１時間還流抽出を行った。各抽出物について、試験例１及び２と同様の試験を行い、細胞死誘導活性はなく、PSF1遺伝子発現抑制活性を有するものについて、活性ありと判断した。その結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
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【要約】
【課題】PSF1遺伝子の発現抑制活性を通じた、より効果的ながんの治療手段を提供すること。
【解決手段】
下記（Ａ）〜（Ｆ）の条件でのＨＰＬＣ分析において、保持時間７．８分にピークを有する成分（I）、保持時間９.２分にピークを有する成分（II）、保持時間１２.５分にピークを有する成分（III）、保持時間２０.８分にピークを有する成分（IV）、及び保持時間２１.６分にピークを有する成分（V）から成る群より選択される１種以上の成分を含有し、前記成分（I）〜（V）がキュウリグサ又はウワバミソウに由来する、ＰＳＦ１遺伝子発現抑制活性を有する組成物：
（Ａ）ＨＰＬＣカラム：オクタデシル化シリカゲル担体（粒子径３μｍ）を充填した内径４.６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのカラム
（Ｂ）ＨＰＬＣカラムオーブン温度：４０℃
（Ｃ）流速：０.８ｍｌ／分
（Ｄ）検出：１９０〜４００ｎｍ
（Ｅ）移動相：（ａ）メタノール及び（ｂ）２.５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
（Ｆ）グラジエント条件：８５％の（ａ）と１５％の（ｂ）との混合溶媒を５分間保持し、その後１５分かけて混合溶媒中の（ａ）の濃度を８５％から１００％に直線的に上昇させ、その後（ａ）の濃度を１００％に維持。
【選択図】なし【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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