(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）に罹患している個体において変形性関節症を治療するための医薬の製造における、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結合性蛋白質の使用であって、前記結合性蛋白質が、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合し変形性関節症を治療する二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）結合性蛋白質である、前記使用。
【請求項２】
ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する前記結合性蛋白質が、医薬的に許容可能な担体を含有する医薬組成物として製剤化されている、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する前記結合性蛋白質が結晶化されている、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記結晶化結合性蛋白質が、成分とポリマー担体を含有する組成物として製剤化されている、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
第２の作用剤を更に含み、前記第２の作用剤が、ブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸塩、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体、抗ＩＬ−６モノクローナル抗体、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニルイミダゾール化合物；ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ及びＰＤＧＦの抗体；ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０又はそのリガンドの抗体；メトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、コルチコステロイド、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬；ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ阻害剤；ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ｐ５５ＴＮＦ受容体、可溶性ｐ７５ＴＮＦ受容体；ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ；抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３及びＴＧＦβから構成される群の１種以上の化合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記ポリマー担体が、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（酸無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、乳酸・グリコール酸コポリマーないしＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ［（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、マレイン酸無水物・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、並びにそのブレンド及びコポリマーから構成される群の１種以上から選択されるポリマーである、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記成分が存在する場合、それがアルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールから構成される群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
前記変形性関節症が変形性関節症病変を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記変形性関節症が前十字靱帯への傷害を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
変形性関節症が軟骨変性及びＩＬ−６発現を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
軟骨変性が大腿骨軟骨変性又は脛骨軟骨変性を含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
結合性蛋白質が抗侵害受容効果をもたらす、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
結合性蛋白質が更に疼痛を治療する、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
疼痛がアロディニア、痛覚過敏、及びアロディニアと痛覚過敏の併発から構成される群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は変形性関節症及び疼痛の治療に関し、より具体的には変形性関節症及び疼痛の治療用としての、ＩＬ−１α及び／又はＩＬ−１βと結合する蛋白質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
健康な脊椎動物（ヒト及び他の哺乳動物を含む）の関節軟骨ないし「硝子軟骨」は主にプロテオグリカンとＩＩ型コラーゲンと水から構成される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の中に円柱状増殖パターンの軟骨細胞を含むことを特徴とする半透明な乳白色の結合組織である。関節軟骨は関節内の相対向する骨の接触を防ぐための有効な荷重支持クッションを提供するため、関節の正常な機能に不可欠である。関節軟骨は関節外傷による損傷のみならず、緩やかな侵食プロセスも受ける。初期には、このような侵食はすり減った硝子軟骨の領域が軟骨下骨部に完全に到達していない無症候の「部分的厚み欠損」に止まる場合もある。このような部分的厚み欠損は通常では無痛であり、一般に関節鏡検査中にしか検出されない。しかし、侵食プロセスを治療せずにいると、部分的厚み欠損の基部が摩耗し続け、欠損の直径が増大し、欠損が最終的に「完全な厚み欠損」まで進行し、下部の骨に達する場合がある。このような完全な厚み欠損が拡大し、関節の相対向する骨の表面が接触して相互に侵食し始めると、炎症、疼痛及び他の変性変化、即ち変形性関節症（ＯＡ）の古典的症状に繋がる場合がある。従って、変形性関節症は関節変形、不安定性、損傷及び疼痛をもたらす進行性の身体障害性変性疾患である。最終的に、ある程度の可動性を少なくとも部分的に個体に回復するための実際的な手段は関節置換術しかないと思われる。
【０００３】
ＩＬ−１スーパーファミリーは発熱、（例えば線維芽細胞、筋肉細胞及び内皮細胞における）プロスタグランジン合成、Ｔリンパ球活性化及びインターロイキン２産生を含む多様な生物学的及び生理的作用をもつ炎症プロセスのメディエーターから構成される。ＩＬ−１スーパーファミリーの当初のメンバーはＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ，ＩＬ−１ＲＡ，ＩＬ−１ｒａ，ＩＬ−１Ｒα）である。ＩＬ−１α及びＩＬ−βは感染に対する免疫防御に関与する炎症誘発性サイトカインである。ＩＬ−１Ｒαは受容体結合に関してＩＬ−１α及びＩＬ−１βと競合し、免疫活性化におけるそれらの役割を妨害する。ＩＬ−１スーパーファミリーの他のメンバーとしては、ＩＬ−１８（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ（１９９４）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．８（１５）：１３１４−３２２５；Ｈｕｉｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（５）：３９５−４１３参照）や、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β又はＩＬ−１ＲＡに対して構造相同性をもつ他の６種類の遺伝子（ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９及びＩＬ１Ｆ１０と呼ばれる）が挙げられる。これに伴い、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−１ＲＡは夫々ＩＬ−１Ｆ１、ＩＬ−１Ｆ２及びＩＬ−１Ｆ３と改名されるようになった（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１０）：５３６−５３７；Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１０）：５３３−５３６参照）。ＩＬ−３３又はＩＬ−１Ｆ１１と呼ばれるＩＬ−１ファミリーの別の推定メンバーも記載されているが、この名称はＨＧＮＣ遺伝子ファミリー名称データベースで公式に採用されていない。
【０００４】
ＩＬ−１α及びＩＬ−１βはいずれもマクロファージ、単球及び樹状細胞により産生される。これらは感染に対する生体の炎症応答の重要な部分を形成する。これらのサイトカインは内皮細胞上の接着因子の発現を亢進し、白血球を感染部位に移動させ、視床下部体温調節中枢をリセットさせ、発熱として発現される体温上昇をもたらす。従って、ＩＬ−１は内因性発熱物質と呼ばれる。体温上昇は生体の免疫系が感染と戦うのに役立つ。ＩＬ−１は造血の調節にも重要である。末梢組織におけるＩＬ−１β産生も発熱を伴う痛覚過敏（疼痛感受性亢進）に関係があるとされている（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１０２２（１−２）：９６−１００）。ＩＬ−１は疼痛に関連するシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の発現をアップレギュレートする。大半の場合、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは同一の細胞受容体と結合する。この受容体は所定の他の受容体とほぼ共通の経路を介して細胞内シグナルを伝達する同一ではないが、近縁の２つのサブユニットから構成される。これらはＴｏｌｌファミリーの先天性免疫受容体とＩＬ−１８受容体である。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは更に同様の生物学的性質をもち、発熱、徐波睡眠及び好中球増加症の誘導、Ｔリンパ球及びＢリンパ球活性化、線維芽細胞増殖、所定細胞に対する細胞傷害性、コラゲナーゼの誘導、肝臓における急性期蛋白質の合成、並びにコロニー刺激因子及びコラーゲンの産生亢進が挙げられる。
【０００５】
ＩＬ−１αとＩＬ−１βをコードするｃＤＮＡは単離・発現されており、これらのｃＤＮＡはＩＬ−１α（Ｌｏｍｅｄｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：４５８）及びＩＬ−１β（Ａｕｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７９０９）と呼ばれる２種類の異なる遺伝子産物に相当する。８種類のインターロイキン１ファミリー遺伝子が染色体２上にサイトカイン遺伝子クラスターを形成する。ＩＬ−１βはｍＲＮＡレベル及び蛋白質レベルの両者でヒト単球により産生される主要な形態である。これらの２種類のヒトＩＬ−１はアミノ酸相同度が２６％に過ぎない。これらの２種類のＩＬ−１はポリペプチド配列が異なるが、構造類似性があり（Ａｕｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１６９）、アミノ酸相同性はＩＬ−１分子の不連続領域に限定される。
【０００６】
ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは前駆体ペプチドとして産生される。換言するならば、これらは長い蛋白質として産生された後、プロセシングされ、成熟蛋白質と呼ばれる短い活性分子を放出する。ＩＬ−１αはプロ蛋白質として産生され、カルパインにより蛋白質分解プロセシングされ、未だ十分に研究されていないメカニズムで放出される。例えば成熟型ＩＬ−１βはカスパーゼ１又はインターロイキン１変換酵素（ＩＣＥ）と呼ばれるカスパーゼファミリー蛋白質の所定のメンバーによる開裂後にＰｒｏ−ＩＬ−１βから放出される。ヒトＩＬ−１スーパーファミリーの各メンバーの成熟形態の三次元構造は樽型蛋白質を産生する１２〜１４本のβ鎖から構成される。
【０００７】
ＩＬ−１αは軟骨吸収の亢進に効果があることから当初は「カタボリン」と呼ばれたが、滑膜細胞でコラゲナーゼとプロスタグランジンに刺激作用を与えることから「単核球細胞因子」（ＭＣＦ）とも呼ばれ、急性期反応に刺激作用を与える「白血球内因性因子」（ＬＥＭ）とも呼ばれる。ＩＬ−１αは単球、マクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞及びリンパ球等の多数の異なる細胞により合成され、多くの細胞はＩＬ−１αに特異的な受容体をもつため、ＩＬ−１αは広範な生物学的活性をもつ。ＩＬ−１αはＩＬ−２放出、Ｂ細胞成熟及び増殖、並びに線維芽細胞増殖因子活性を誘導することにより胸腺細胞増殖を刺激する。ＩＬ−１α蛋白質は内因性発熱物質とみなされ、滑膜細胞からのプロスタグランジンとコラゲナーゼの放出を刺激すると報告されている。従って、ＩＬ−１αは更に各種障害及び障害の症状の誘因として中心的な位置を占める。これらの障害は治療法が殆ど又は全く存在しない重度の障害が大半である。これらの遺伝子の多型は関節リウマチとアルツハイマー病に関係があることが示唆されている。ＩＬ−１全般は関節炎、肺線維症、中枢神経系疾患、糖尿病及び所定の心血管疾患を含む多数のヒト疾患に関係があるとされている。ＩＬ−１αの望ましくない作用については、例えばＯｐｐｅｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ７：４５−５６、Ｄｕｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：２６３−２８７及びＳｙｎｎｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．８：３６５−３７２に記載されている。
【０００８】
ＯＡの発症、持続及び進行はＩＬ−１が中枢的な役割を果たす機械的及び生化学的経路の複雑なカスケードにより媒介される。ＩＬ−１αとＩＬ−１βは単球、マクロファージ及び好中球のみならず、軟骨細胞、滑膜線維芽細胞及び破骨細胞等の関節組織の細胞によっても産生される（例えばＤｉｎａｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５１９−５５０参照）。インビトロにおいて、ＩＬ−１は軟骨細胞と滑膜細胞を刺激し、ＯＡに繋がる軟骨破壊に関与するプロテイナーゼを産生させる（例えばＤａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９５：１８１−１８３；Ｄａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３３：２８９３−２８９９；ＭｃＧｕｉｒｅ−Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２７：６５４−６６２参照）と共に、正常な硝子軟骨の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の主成分であるプロテオグリカンとＩＩ型コラーゲンの合成を阻害することができる（例えばＧｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６７２４−１６７２９；Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．８２：２０２６−２０３７参照）。前臨床試験と臨床試験の結果、ＩＬ−１がＯＡの病因に関与していることも分かっている。例えば、ＩＬ−１を動物の膝に関節内（ｉａ）注射すると、白血球浸潤と軟骨減少を生じた（Ｐｅｔｔｉｐｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８７４９−８７５３）。他方、ＩＬ−１アンタゴニストをｉａ注射すると、実験的ＯＡの進行が有意に抑制された（例えばＰｅｌｌｅｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４０：１０１２−１０１９；Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３９：１５３５−１５４４；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４：１１５９０−１１６９０；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４１：２０２−２０８参照）。更に、ＩＬ−１ノックアウト（ＫＯ）マウスはその野生型対照に比較した場合に外科的に誘発した軟骨損傷に対して耐性であることが判明した（Ｇｌａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，１８：５７２−５８０）。
【０００９】
ＩＬ−１αとＩＬ−１βはいずれもヒトＯＡ患者の滑膜、軟骨及び滑液で発現される（例えばＦａｒａｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５２：８７０−８７５参照）。ＩＬ−１アンタゴニストとしてＩＬ−１受容体アンタゴニストであるアナキンラと、ＩＬ−１受容体モノクローナル抗体であるＡＭＧ−１０８はＯＡ試験において症状と軟骨保護に関して多少の効果を示した（“Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＡＭＧ  １０８（ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＩＬ−１Ｒ  ｔｙｐｅ  Ｉ）ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｎｅｅ”Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＲ２００７）。提案されたこれらの治療薬はいずれも明白で確実な効果を立証するべく今後の研究が待たれている。
【００１０】
変形性関節症に罹患した個体を治療するための新規で有効な方法及び組成物が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ（１９９４）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．８（１５）：１３１４−３２２５
【非特許文献２】Ｈｕｉｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（５）：３９５−４１３
【非特許文献３】Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１０）：５３６−５３７
【非特許文献４】Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１０）：５３３−５３６
【非特許文献５】Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１０２２（１−２）：９６−１００
【非特許文献６】Ｌｏｍｅｄｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：４５８
【非特許文献７】Ａｕｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７９０９
【非特許文献８】Ａｕｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１６９
【非特許文献９】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ７：４５−５６
【非特許文献１０】Ｄｕｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：２６３−２８７
【非特許文献１１】Ｓｙｎｎｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．８：３６５−３７２
【非特許文献１２】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５１９−５５０
【非特許文献１３】Ｄａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９５：１８１−１８３
【非特許文献１４】Ｄａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３３：２８９３−２８９９
【非特許文献１５】ＭｃＧｕｉｒｅ−Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２７：６５４−６６２
【非特許文献１６】Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６７２４−１６７２９
【非特許文献１７】Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．８２：２０２６−２０３７
【非特許文献１８】Ｐｅｔｔｉｐｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８７４９−８７５３
【非特許文献１９】Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４０：１０１２−１０１９
【非特許文献２０】Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３９：１５３５−１５４４
【非特許文献２１】Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４：１１５９０−１１６９０
【非特許文献２２】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４１：２０２−２０８
【非特許文献２３】Ｇｌａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，１８：５７２−５８０
【非特許文献２４】Ｆａｒａｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５２：８７０−８７５
【非特許文献２５】Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＡＭＧ  １０８（ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＩＬ−１Ｒ  ｔｙｐｅ  Ｉ）ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｎｅｅ”ＡＣＲ２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は変形性関節症（ＯＡ）と疼痛の治療方法を提供する。このような方法はＩＬ−１α及びＩＬ−１βと結合する１種以上の結合性蛋白質を個体（ヒト又は他の哺乳動物）に投与する段階を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の１側面において、個体（ヒト又は他の哺乳動物）における変形性関節症の治療方法は、ＩＬ−１αと結合する結合性蛋白質をＩＬ−１βと結合する結合性蛋白質と共に（例えば混合物、順次投与、又は同時投与により）前記個体に投与する段階、又はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含む。
【００１４】
１態様において、個体における変形性関節症の治療方法はＩＬ−１αと結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含み、前記結合性蛋白質はＩＬ−１αに対する抗体、例えばＩＬ−１αに対するモノクローナル抗体である。別の態様において、個体における変形性関節症の治療方法はＩＬ−１βと結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含み、前記結合性蛋白質はＩＬ−１βと結合する抗体、例えばＩＬ−１βと結合するモノクローナル抗体である。
【００１５】
本発明の別の側面において、個体（ヒト又は他の哺乳動物）における変形性関節症の治療方法は、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含む。好ましくは、前記結合性蛋白質はＩＬ−１αと結合する少なくとも１個の結合部位と、ＩＬ−１βと結合する少なくとも１個の結合部位を含む二重可変ドメイン免疫グロブリン結合性蛋白質（本願では「ＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）」ないし「ＤＶＤ−Ｉｇ」結合性蛋白質又は分子と言う場合もある）である。より好ましくは、前記ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質はＩＬ−１αと結合する２個の結合部位と、ＩＬ−１βと結合する２個の結合部位を含む。
【００１６】
別の態様において、本発明による個体における変形性関節症の治療方法は、ＩＬ−１αと結合する結合性蛋白質、ＩＬ−１βと結合する結合性蛋白質、ＩＬ−１αと結合する結合性蛋白質とＩＬ−１βと結合する結合性蛋白質の組合せ、又はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結合性蛋白質と、医薬的に許容可能な担体を含有する医薬組成物を前記個体に投与する段階を含む。
【００１７】
本発明の１態様において、変形性関節症の治療方法は、ＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質と、ＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質、又はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質を個体に投与する段階を含む。本発明で有用なこのような結晶化結合性蛋白質としては、限定されないが、ＩＬ−１αに対する結晶化抗体、ＩＬ−１βに対する結晶化抗体、並びにＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結晶化ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質が挙げられる。
【００１８】
本発明の個体における変形性関節症の治療方法で有用な組成物としては、ＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質、ＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質、ＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質とＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質の組合せ、又はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質の放出用組成物が挙げられる。
【００１９】
１態様において、本発明による変形性関節症の治療方法で有用な組成物は、
（ａ）ＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質、ＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質、ＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質とＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質の組合せ、又はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質と、場合により成分を含有する製剤と；
（ｂ）少なくとも１種のポリマー担体
を含有する。
【００２０】
１態様において、上記組成物はＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質とＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質の両方の組合せを含有する。別の態様において、ＩＬ−１αと結合する前記結晶化結合性蛋白質は結晶化抗体、例えばＩＬ−１αと結合する結晶化モノクローナル抗体であり、ＩＬ−１βと結合する前記結晶化結合性蛋白質は結晶化抗体、例えばＩＬ−１βと結合するモノクローナル抗体である。
【００２１】
１態様において、上記組成物はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質を含有する。別の態様において、前記結晶化結合性蛋白質はＩＬ−１α及びＩＬ−１β−Ｉｇの両方と結合する結晶化二重可変ドメイン（ＤＶＤ−Ｉｇ）結合性蛋白質である。
【００２２】
別の態様において、個体における変形性関節症の治療方法は、ＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質、ＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質、ＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質と、ＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質の両方の組合せ、又はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質を含有する組成物を前記個体に投与する段階を含み、前記少なくとも１種のポリマー担体はポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（酸無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、乳酸・グリコール酸コポリマーないしＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ［（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、マレイン酸無水物・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、並びにそのブレンド及びコポリマーから構成される群の１種以上から選択されるポリマーである。
【００２３】
１態様において、上記組成物中に前記非必須成分が存在する場合、前記成分はアルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールから構成される群から選択される。
【００２４】
１態様において、上記変形性関節症の治療方法は第２の作用剤を前記個体に投与する段階を更に含み、前記第２の作用剤は前記方法又は前記方法で使用される組成物に別の望ましい特性を提供する。このような第２の作用剤はブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸塩、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体、抗ＩＬ−６モノクローナル抗体、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニルイミダゾール化合物；ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ及びＰＤＧＦの抗体；ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０又はそのリガンドの抗体；メトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、コルチコステロイド、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬；ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ阻害剤；ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ｐ５５ＴＮＦ受容体、可溶性ｐ７５ＴＮＦ受容体；ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ；抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３及びＴＧＦβから構成される群の１種以上の分子とすることができる。
【００２５】
本発明の別の側面において、本願に記載する変形性関節症の治療方法は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、関節包内、軟骨内、体腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱腔内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻腔内及び経皮から選択される少なくとも１種の方法により、本願に記載する１種以上の結合性蛋白質又は本願に記載する組成物を個体に投与する段階を含む。
【００２６】
本発明の１側面において、個体（ヒト又は他の哺乳動物）における疼痛の治療方法は、ＩＬ−１αと結合する結合性蛋白質をＩＬ−１βと結合する結合性蛋白質と共に（例えば混合物、順次投与、又は同時投与により）前記個体に投与する段階、又はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含む。
【００２７】
本発明の方法及び組成物は任意形態の疼痛をもつ個体における疼痛を治療するために使用することができ、癌性疼痛、神経障害性疼痛、筋肉痛、関節痛、骨折痛、創傷痛、術後疼痛、頭痛、偏頭痛、並びにアロディニア（異痛症）、痛覚過敏及びアロディニアと痛覚過敏の併発等の疼痛状態が挙げられる。
【００２８】
１態様において、個体における疼痛の治療方法はＩＬ−１αと結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含み、前記結合性蛋白質はＩＬ−１αに対する抗体、例えばＩＬ−１αに対するモノクローナル抗体である。別の態様において、個体における疼痛の治療方法はＩＬ−１βと結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含み、前記結合性蛋白質はＩＬ−１βと結合する抗体、例えばＩＬ−１βと結合するモノクローナル抗体である。
【００２９】
本発明の別の側面において、個体における疼痛の治療方法は、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含む。好ましくは、前記結合性蛋白質はＩＬ−１αと結合する少なくとも１個の結合部位と、ＩＬ−１βと結合する少なくとも１個の結合部位を含む二重可変ドメイン免疫グロブリン結合性蛋白質（本願では「ＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）」ないし「ＤＶＤ−Ｉｇ」結合性蛋白質又は分子と言う場合もある）である。好ましくは、前記ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質はＩＬ−１αと結合する２個の結合部位と、ＩＬ−１βと結合する２個の結合部位を含む。
【００３０】
別の態様において、本発明による個体における疼痛の治療方法は、ＩＬ−１αと結合する結合性蛋白質、ＩＬ−１βと結合する結合性蛋白質、ＩＬ−１αと結合する結合性蛋白質とＩＬ−１βと結合する結合性蛋白質の組合せ、又はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結合性蛋白質と、医薬的に許容可能な担体を含有する医薬組成物を前記個体に投与する段階を含む。
【００３１】
本発明の１態様において、疼痛の治療方法は、ＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質と、ＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質、又はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含む。本発明で有用なこのような結晶化結合性蛋白質としては、限定されないが、ＩＬ−１αに対する結晶化抗体、ＩＬ−１βに対する結晶化抗体、並びにＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結晶化ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質が挙げられる。
【００３２】
本発明の個体における疼痛の治療方法で有用な組成物としては、ＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質、ＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質、ＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質とＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質の組合せ、又はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質の放出用組成物が挙げられる。
【００３３】
１態様において、本発明による疼痛の治療方法で有用な組成物は、
（ａ）ＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質、ＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質、ＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質とＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質の組合せ、又はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質と、場合により成分を含有する製剤と；
（ｂ）少なくとも１種のポリマー担体
を含有する。
【００３４】
１態様において、上記組成物はＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質とＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質の両方の組合せを含有する。別の態様において、ＩＬ−１αと結合する前記結晶化結合性蛋白質は結晶化抗体、例えばＩＬ−１αと結合する結晶化モノクローナル抗体であり、ＩＬ−１βと結合する前記結晶化結合性蛋白質は結晶化抗体、例えばＩＬ−１βと結合するモノクローナル抗体である。
【００３５】
１態様において、上記組成物はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質を含有する。別の態様において、前記結晶化結合性蛋白質はＩＬ−１α及びＩＬ−１β−Ｉｇの両方と結合する結晶化二重可変ドメイン（ＤＶＤ−Ｉｇ）結合性蛋白質である。
【００３６】
別の態様において、個体における疼痛の治療方法は、ＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質、ＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質、ＩＬ−１αと結合する結晶化結合性蛋白質と、ＩＬ−１βと結合する結晶化結合性蛋白質の両方の組合せ、又はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質を含有する組成物を前記個体に投与する段階を含み、前記少なくとも１種のポリマー担体はポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（酸無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、乳酸・グリコール酸コポリマーないしＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシブチレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ［（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、マレイン酸無水物・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、並びにそのブレンド及びコポリマーから構成される群の１種以上から選択されるポリマーである。
【００３７】
１態様において、上記組成物中に前記非必須成分が存在する場合、前記成分はアルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールから構成される群から選択される。
【００３８】
１態様において、上記疼痛の治療方法は第２の作用剤を前記個体に投与する段階を更に含み、前記第２の作用剤は前記方法又は前記方法で使用される組成物に別の望ましい特性を提供する。このような第２の作用剤はブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸塩、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体、抗ＩＬ−６モノクローナル抗体、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニルイミダゾール化合物；ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ及びＰＤＧＦの抗体；ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０又はそのリガンドの抗体；メトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、コルチコステロイド、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬；ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ阻害剤；ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ｐ５５ＴＮＦ受容体、可溶性ｐ７５ＴＮＦ受容体；ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ；抗炎症性サイトカイン；ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３及びＴＧＦβから構成される群の１種以上の分子とすることができる。
【００３９】
本発明の別の側面において、本願に記載する疼痛の治療方法は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、関節包内、軟骨内、体腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱腔内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻腔内及び経皮から選択される少なくとも１種の方法により、本願に記載する１種以上の結合性蛋白質又は本願に記載する組成物を個体に投与する段階を含む。
【００４０】
別の態様において、本発明はＩＬ−１発現に伴う疾患ないし障害に罹患している個体における疼痛の治療方法を提供する。前記個体におけるこのようなＩＬ−１発現は前記個体の血漿及び／又は局所組織におけるＩＬ−１濃度上昇をもたらす可能性がある。
【００４１】
１態様において、本願に記載する方法及び組成物は変形性関節症、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、敗血症性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応、臓器移植に伴う急性又は慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェグナー肉芽腫症、シェーンライン・ヘノッホ紫斑病、腎臓の顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染症、寄生虫症、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、散発性Ｉ型多腺性内分泌不全症、ＩＩ型多腺性内分泌不全症（シュミット症候群）、成人（急性）呼吸窮迫症候群、脱毛症、先天性脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎性関節症、腸病性滑膜炎、クラミジア関連関節症、エルシニア関連関節症、サルモネラ関連関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患／動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、特発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全症関連疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、分類不能型免疫不全症（分類不能型低ガンマグロブリン血症）、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣不全、早発卵巣不全、線維性肺疾患、特発性線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織病関連間質性肺疾患、混合性結合組織病関連肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス関連肺疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、ショーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、薬物誘発性間質性肺疾患、線維症、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、通風性関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性肝炎ないしルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）、自己免疫介在性低血糖症、黒色表皮腫を伴うＢ型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、１型乾癬、２型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患ＮＯＳ、糸球体腎炎、腎臓の顕微鏡的血管炎、ライム病、円板状エリテマトーデス、特発性ないしＮＯＳ男性不妊症、精子自己免疫、多発性硬化症（全サブタイプ）、交感性眼炎、結合組織病続発性肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、ショーグレン症候群、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫性自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑、急性肝疾患、慢性肝疾患、アルコール性肝硬変、アルコール誘発性肝傷害、胆汁鬱滞症、特異体質性肝疾患、薬物誘発性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、アレルギー、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）感染症、精神障害（例えば鬱病及び統合失調症）、Ｔｈ２型及びＴｈ１型細胞介在性疾患、急性及び慢性疼痛（各種疼痛）、癌（例えば肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌及び直腸癌）及び血液悪性疾患（白血病及びリンパ腫）、無βリポ蛋白血症、先端チアノーゼ、急性及び慢性寄生虫又は感染プロセス、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性又は慢性細菌感染症、急性膵炎、急性腎不全、腺癌、心房異所性拍動、エイズ痴呆合併症、アルコール誘発性肝炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性鼻炎、同種移植片拒絶反応、α１アンチトリプシン欠損症、筋萎縮性側索硬化症、貧血、狭心症、前角細胞変性、抗ＣＤ３抗体療法、抗リン脂質抗体症候群、抗受容体過敏反応、大動脈及び末梢動脈瘤、大動脈解離、動脈性高血圧、動脈硬化症、動静脈瘻、運動失調症、心房細動（持続性又は発作性）、心房粗動、房室ブロック、Ｂ細胞リンパ腫、骨移植拒絶反応、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶反応、脚ブロック、バーキットリンパ腫、火傷、心不整脈、心臓性失神症候群、心臓腫瘍、心筋症、心肺バイパス炎症反応、軟骨移植拒絶反応、小脳皮質変性、小脳障害、無秩序型ないし多源性心房頻拍、化学療法関連障害、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性アルコール依存症、慢性炎症性疾患、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性サリチル酸中毒、結腸直腸癌、鬱血性心不全、結膜炎、接触皮膚炎、肺性心、冠動脈疾患、クロイツェルフェルト・ヤコブ病、培養陰性敗血症、嚢胞性線維症、サイトカイン療法関連障害、拳闘家痴呆、脱髄疾患、デング出血熱、皮膚炎、皮膚疾患、糖尿病、糖尿病性動脈硬化症、びまん性レビー小体病、拡張型鬱血性心筋症、基底核障害、中高年ダウン症候群、ＣＮＳドーパミン受容体を遮断する薬物により誘発される薬物誘発性運動障害、薬物過敏症、湿疹、脳脊髄炎、心内膜炎、内分泌障害、喉頭蓋炎、エプスタイン・バールウイルス感染症、肢端紅痛症、錐体外路及び小脳障害、家族性血球貪食リンパ組織球症、胎児胸腺移植拒絶反応、フリードリヒ運動失調症、機能性末梢動脈障害、真菌性敗血症、ガス壊疽、胃潰瘍、糸球体腎炎、任意臓器又は組織の移植片拒絶反応、グラム陰性菌敗血症、グラム陽性菌敗血症、細胞内生物による肉芽腫、ヘアリー細胞白血病、ハレルフォルデン・スパッツ病、橋本甲状腺炎、花粉症、心臓移植拒絶反応、ヘモクロマトーシス、血液透析、溶血性尿毒症症候群／血栓性血小板減少性紫斑病、出血、Ａ型肝炎、ヒス束不整脈、ＨＩＶ感染症／ＨＩＶ神経障害、ホジキン病、運動過多性運動障害、過敏反応、過敏性肺��、高血圧、運動低下性運動障害、視床下部−下垂体−副腎軸評価、特発性アジソン病、特発性肺線維症、抗体介在性細胞傷害、無力症、小児脊髄性筋萎縮症、大動脈炎症、Ａ型インフルエンザ、電離放射線被爆、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、虚血再潅流傷害、虚血性脳卒中、若年性関節リウマチ、若年性脊髄性筋萎縮症、カポジ肉腫、腎移植拒絶反応、レジオネラ症、リーシュマニア症、ハンセン病、皮質脊髄系傷害、脂肪性浮腫、肝移植拒絶反応、リンパ水腫、マラリア、悪性リンパ腫、悪性組織球症、悪性メラノーマ、髄膜炎、髄膜炎菌血症、代謝性偏頭痛、特発性偏頭痛、ミトコンドリア多系統疾患、混合性結合組織病、モノクローナル免疫グロブリン血症、多発性骨髄腫、多系統変性症（Ｍｅｎｚｅｌ，Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ，Ｓｈｙ−Ｄｒａｇｅｒ及びＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）、重症筋無力症、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ菌感染症、ヒト型結核菌感染症、骨髄異形成症候群、心筋梗塞、心筋虚血障害、上咽頭癌、新生児慢性肺疾患、腎炎、ネフローゼ、神経変性疾患、神経原性筋委縮症、好中球減少時の発熱、非ホジキンリンパ腫、腹部大動脈とその分枝の閉塞、閉塞性動脈障害、ＯＫＴ３（登録商標）療法、精巣炎／副睾丸炎、精巣炎／精管切除再吻合術、臓器腫大、骨粗鬆症、膵臓移植拒絶反応、膵臓癌、腫瘍随伴症候群／悪性腫瘍による高カルシウム血症、副甲状腺移植拒絶反応、骨盤内炎症性疾患、通年性鼻炎、心膜疾患、末梢アテローム性動脈硬化性疾患、末梢血管障害、腹膜炎、悪性貧血、ニューモシスチス・カリニ肺炎、肺炎、ＰＯＥＭＳ症候群（多発ニューロパシー、臓器腫大、内分泌障害、モノクローナル免疫グロブリン血症及び皮膚変化症候群）、潅流後症候群、ポストポンプ症候群、ＭＩ心膜切開後症候群、子癇前症、進行性核上性麻痺、原発性肺高血圧症、放射線療法、レイノー現象、レイノー病、レフサム病、規則的で狭いＱＲＳ幅の頻拍、腎血管性高血圧症、再潅流傷害、拘束型心筋症、肉腫、強皮症、老人性舞踏病、レビー小体型老人性痴呆症、血清反応陰性関節症、ショック、鎌状赤血球貧血、皮膚同種移植片拒絶反応、皮膚変化症候群、小腸移植拒絶反応、充実性腫瘍、特異的不整脈、脊髄性運動失調症、脊髄小脳変性症、連鎖球菌性筋炎、小脳の構造傷害、亜急性硬化性汎脳炎、失神、心血管系梅毒、全身性アナフィラキシー、全身性炎症反応症候群、全身型発症若年性関節リウマチ、Ｔ細胞性ないしＦＡＢ  ＡＬＬ、毛細血管拡張症、閉塞性血栓性血管炎、血小板減少症、中毒症、移植、外傷／出血、ＩＩＩ型過敏反応、ＩＶ型過敏反応、不安定狭心症、尿毒症、尿路性敗血症、蕁麻疹、心臓弁膜症、静脈瘤、血管炎、静脈疾患、静脈血栓症、心室細動、ウイルス及び真菌感染症、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎、ウイルス関連血球貪食症候群、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ウィルソン病、任意臓器又は組織の異種移植片拒絶反応、急性冠症候群、急性特発性多発性神経炎、急性炎症性脱髄性多発根神経炎、急性虚血、成人スティル病、円形脱毛症、アナフィラキシー、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、動脈硬化症、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、自己免疫性皮膚炎、連鎖球菌感染に伴う自己免疫疾患、自己免疫性腸症、自己免疫性聴力低下、自己免疫性リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性早発卵巣不全、眼瞼炎、気管支拡張症、水疱性類天疱瘡、心臓血管疾患、劇症型抗リン脂質抗体症候群、セリアック病、頸椎症、慢性虚血、瘢痕性類天疱瘡、多発性硬化症の危険を伴う最初のエピソードからなる症候群（ＣＩＳ）、小児期発症型精神障害、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、涙嚢炎、皮膚筋炎、糖尿病網膜症、椎間板ヘルニア、椎間板脱出、薬物誘発性免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜炎、眼内炎、上強膜炎、多形性紅斑、重症多形性紅斑、妊娠性類天疱瘡、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、花粉症、ヒューズ症候群、特発性パーキンソン病、特発性間質性肺炎、ＩｇＥ介在型アレルギー、免疫性溶血性貧血、封入体筋炎、感染性眼炎症性疾患、炎症性脱髄疾患、炎症性心疾患、炎症性腎疾患、ＩＰＦ／ＵＩＰ、虹彩炎、角膜炎、乾性角結膜炎、クスマウル病ないしクスマウル・マイヤー病、ランドリー麻痺、ランゲルハンス細胞組織球症、網状皮斑、黄斑変性症、顕微鏡的多発血管炎、ベヒテレフ病、運動ニューロン障害、粘膜類天疱瘡、多臓器不全、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、心筋炎、神経根障害、神経障害、非Ａ非Ｂ肝炎、視神経炎、骨溶解症、卵巣癌、少関節型ＪＲＡ、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、静脈炎、結節性多発動脈炎（ないし結節性動脈周囲炎）、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛症、白毛症、多関節型ＪＲＡ、多腺性内分泌不全症候群、多発性筋炎、リウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、ポストポンプ症候群、原発性パーキンソン病、前立腺癌及び直腸癌及び血液悪性疾患（白血病及びリンパ腫）、前立腺炎、純赤血球形成不全症、原発性副腎不全、再発性視神経脊髄炎、再狭窄、リウマチ性心臓病、ＳＡＰＨＯ（滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨化症及び骨炎）、続発性アミロイドーシス、ショック肺、強膜炎、座骨神経痛、続発性副腎不全、シリコン関連結合組織病、スネッドン・ウィルキンソン皮膚病、強直性脊椎炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、全身性炎症反応症候群、側頭動脈炎、トキソプラズマ性網膜炎、中毒性表皮壊死、横断性脊髄炎、ＴＲＡＰＳ（腫瘍壊死因子１型受容体（ＴＮＦＲ）関連周期性症候群）、１型アレルギー反応、ＩＩ型糖尿病、蕁麻疹、通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）、血管炎、春季カタル、ウイ
ルス性網膜炎、フォークト・小柳・原田症候群（ＶＫＨ症候群）、滲出型黄斑変性症、並びに創傷治癒から構成される群から選択される疾患ないし障害に罹患している個体における疼痛を治療するために使用される。
【００４２】
１態様において、本願に記載する方法及び組成物は原発性癌、転移性癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、結腸癌、尿管癌、腎臓癌、膀胱癌、尿路上皮癌、女性生殖管癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、絨毛癌、妊娠性絨毛性疾患、男性生殖管癌、前立腺癌、精嚢癌、精巣癌、胚細胞腫瘍、内分泌腺癌、甲状腺癌、副腎癌、下垂体癌、皮膚癌、血管腫、黒色腫、肉腫、骨癌、軟部組織癌、カポジ肉腫、脳腫瘍、神経癌、眼の癌、髄膜癌、星状細胞腫、神経膠腫、膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、血液悪性疾患に起因する充実性腫瘍、白血病、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫から構成される群から選択される疾患に罹患している個体における疼痛を治療するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ】二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）コンストラクトの模式図であり、２種類の親抗体に由来するＤＶＤ−Ｉｇ分子を作製するためのストラテジーを示す。
【図１Ｂ】ＤＶＤ１−Ｉｇ、ＤＶＤ２−Ｉｇ、並びに２種類のキメラ単一特異性モノクローナル抗体２Ｄ１３．Ｅ３（抗ＩＬ−１α）及び１３Ｆ５．Ｇ５（抗ＩＬ−１β）の遺伝子コンストラクトの模式図を示す。「ＶＨβ」及び「ＶＬβ」はＩＬ−βと結合する１３Ｆ５．Ｇ５抗体の抗原結合部位の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を夫々示す。「ＶＨα」及び「ＶＬα」はＩＬ−１αと結合する３Ｄ１２．Ｅ３抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を夫々示す。「Ｌ」はリーダー配列を示す。ＤＶＤ２−Ｉｇの遺伝子コンストラクトの図中、「ＶＨβ」と「ＶＨα」の間、及び「ＶＬβ」と「ＶＬα」の間の横縞部分はリンカー配列の存在を表す。
【図２】変形性関節症の関節不安定性モデル（ＪＩＭ）のマウスの関節軟骨の組織学的スコアの棒グラフを示す。各組の棒グラフはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ビヒクル単独投与群（「ＰＢＳ」）、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体投与群（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ」）、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体投与群（「抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ」）、並びに抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体併用投与群（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ」）の４種類の投与群におけるマウスの膝の関節軟骨のスコアを示す。各組内の個々の棒グラフは合計組織学的スコアと３個の別個のゾーンのスコアを示し、各ゾーンは内側脛骨軟骨の面積の３分の１である（ゾーン１：内側ゾーン、ゾーン２：中央ゾーン、ゾーン３：外側ゾーン）。左から右に向かって、内側脛骨ゾーン１、２及び３の合計スコアの棒グラフ；内側脛骨ゾーン１のスコアの棒グラフ；内側脛骨ゾーン２のスコアの棒グラフ；並びに内側脛骨ゾーン３のスコアの棒グラフである。実施例３．３．１参照。
【図３】変形性関節症の関節不安定性モデル（ＪＩＭ）のマウスの関節軟骨の組織学的スコアの棒グラフを示す。各組の棒グラフはＰＢＳビヒクル単独投与群（「ビヒクル」）、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体の併用投与群（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）」）、ｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質（６ｍｇ／ｋｇ）投与群（「ＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ（６ｍｇ／ｋｇ）」）、及びｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質（１２ｍｇ／ｋｇ）投与群（「ＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ（１２ｍｇ／ｋｇ）」）の４種類の投与群におけるマウスの膝の関節軟骨のスコアを示す。各組内の個々の棒グラフは合計組織学的スコアと３個の別個のゾーンのスコアを示し、各ゾーンは内側脛骨軟骨の面積の３分の１である（ゾーン１：内側ゾーン、ゾーン２：中央ゾーン、ゾーン３：外側ゾーン）。左から右に向かって、内側脛骨ゾーン１、２及び３の合計スコアの棒グラフ；内側脛骨ゾーン１のスコアの棒グラフ；内側脛骨ゾーン２のスコアの棒グラフ；並びに内側脛骨ゾーン３のスコアの棒グラフである。実施例３．３．２参照。
【図４】変形性関節症の関節不安定性モデル（ＪＩＭ）におけるマウスの関節軟骨の組織学的スコアの棒グラフを示す。各組の棒グラフはＰＢＳビヒクル単独投与群（「ビヒクル」）、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）の併用投与群（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）」）、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（１２ｍｇ／ｋｇ）投与群（「抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（１２ｍｇ／ｋｇ）」）、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）投与群（「抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）」）、及び抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（３ｍｇ／ｋｇ）投与群（「抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（３ｍｇ／ｋｇ）」）の４種類の投与群におけるマウスの膝の関節軟骨のスコアを示す。各組内の個々の棒グラフは合計組織学的スコアと３個の別個のゾーンのスコアを示し、各ゾーンは内側脛骨軟骨の面積の３分の１である（ゾーン１：内側ゾーン、ゾーン２：中央ゾーン、ゾーン３：外側ゾーン）。左から右に向かって、内側脛骨ゾーン１、２及び３の合計スコアの棒グラフ；内側脛骨ゾーン１のスコアの棒グラフ；内側脛骨ゾーン２のスコアの棒グラフ；並びに内側脛骨ゾーン３のスコアの棒グラフである。実施例３．３．３参照。
【図５】変形性関節症の関節不安定性モデルの動物においてザイモサンにより誘発したＩＬ−６産生レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示し、ＰＢＳビヒクル単独（「ビヒクル」）、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）の併用（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）」）、ｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質（６ｍｇ／ｋｇ）（「ＩＬ−１α／β  ＤＶＤ（６ｍｇ／ｋｇ）」）、及びｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質（１２ｍｇ／ｋｇ）（「ＩＬ−１α／β  ＤＶＤ（１２ｍｇ／ｋｇ）」）を投与した場合を示す。実施例３．３．４参照。
【図６】ＰＢＳビヒクル（「ビヒクル」）、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）の併用（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）」）、及びｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質（６ｍｇ／ｋｇ）（「ＩＬ−１α／β  ＤＶＤ（６ｍｇ／ｋｇ）」）を投与した変形性関節症の内側半月板不安定化（ＤＭＭ）モデルの動物における軟骨変性の総合計スコアを示す。実施例３．３．５参照。
【図７】変形性関節症の内側半月板不安定化（ＤＭＭ）モデルの動物における軟骨変性に及ぼす８週間各種投与試験の結果を示す。各棒グラフはＰＢＳビヒクル単独（「ビヒクル」）、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ  ６ｍｇ／ｋｇ」）、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）（「抗ＩＬ−１β  ６ｍｇ／ｋｇ」）、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）の併用（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）」）、ｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質（１．５ｍｇ／ｋｇ）（「ＩＬ−１α／β  ＤＶＤ  １．５ｍｇ／ｋｇ」）、ｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質（３ｍｇ／ｋｇ）（「ＩＬ−１α／β  ＤＶＤ  ３ｍｇ／ｋｇ」）、又はｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質（６ｍｇ／ｋｇ）（「ＩＬ−１α／β  ＤＶＤ  ６ｍｇ／ｋｇ」）を投与した動物における軟骨変性の平均合計スコアを示す。実施例３．３．６参照。
【図８】変形性関節症の内側半月板不安定化（ＤＭＭ）モデルの動物にビヒクル単独（「ビヒクル」）、ドキシサイクリン（３０ｍｇ／ｋｇ）（「ドキシサイクリン（３０ｍｇ／ｋｇ）」）、又は抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）の併用（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）」）を投与した４週間試験の結果を示す。実施例３．３．７参照。
【図９】ＤＭＭ手術を施したマウスの足における７日目、１４日目、２１日目、２８日目、及び３５日目の足引っ込め閾値（グラム、「ｇ」）の棒グラフを示す。ＤＭＭの足（「ＤＭＭ」）の足引っ込め閾値は対側（無手術）の足（「対側」）及び偽手術の足（「偽手術」）と比較して有意に低下した。ＤＭＭの足は７日目という早期にアロディニア症状を示し、３５日目までこの疼痛反応を示した。実施例４参照。
【図１０】ビヒクル単独（「ＰＢＳ対照」）、ＩｇＧアイソタイプ対照（慢性化疾患及び疼痛の陽性対照「ＩｇＧ対照」）、又は抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体の併用（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）」）を５週間（３５日）後に投与後のＤＭＭマウスにおける足引っ込め閾値（グラム、「ｇ」）を対側（無手術）の足（「対側」）及び偽手術の足（「偽手術」）と比較した棒グラフを示す。データから明らかなように、ＩＬ−１αとＩＬ−１βを同時に中和させると、アロディニアの発現が有意に予防された。１週間後に投与した動物でも同様の効力が認められた（図示せず）。実施例４参照。
【図１１】ＩｇＧアイソタイプ対照（慢性化疾患及び疼痛の陽性対照）を予め３５日間投与した後に抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を併用投与し、３６日目に２４時間後の足引っ込め閾値（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β（６ｍｇ／ｋｇ）（投与後２４時間）」）を試験したＤＭＭマウスにおける足引っ込め閾値（グラム、「ｇ」）の棒グラフを示す。比較のために、５週間後（３５日目）の対側（無手術）の足（「対側」）、偽手術の足（「偽手術」）、手術した足のビヒクル単独投与群（「ＰＢＳ対照」）、ＩｇＧアイソタイプ投与群（「ＩｇＧ対照」）、並びに抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体の併用投与群（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）」）について３５日目の足引っ込め閾値を示す。データから明らかなように、ＩＬ−１αとＩＬ−１βを同時に中和させると、慢性化疼痛に罹患したマウスにおけるアロディニアが有意に改善された。実施例４参照。
【図１２】ＰＢＳビヒクル単独（「ビヒクル」）、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）」）、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）（「抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）」）、又は抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）の併用（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）」）を週２回ずつ４週間腹腔内（ｉｐ）投与したＤＭＭマウスにおける足引っ込め閾値（グラム、「ｇ」）の棒グラフを示す。２８日目に動物をアロディニアについて試験した。「対側」棒グラフは代表的な無手術（対側）の足の足引っ込め閾値を示す。ビヒクル投与群の動物の同側（手術）の足は対側（無手術）の足（「対側」）又は偽手術を施した動物（「偽手術」）と比較してアロディニア（疼痛）症状を示した。実施例５参照。
【図１３】ＰＢＳビヒクルを単独投与（「ビヒクル」）又は抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を１ｍｇ／ｋｇ（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（１ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（１ｍｇ／ｋｇ）」）、３ｍｇ／ｋｇ（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（３ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（３ｍｇ／ｋｇ）」）もしくは６ｍｇ／ｋｇ（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）」）ずつ４日おきに４週間腹腔内（ｉｐ）併用投与したＤＭＭマウスにおける足引っ込め閾値（グラム、「ｇ」）の棒グラフを示す。２８日目に動物を試験した。ＰＢＳビヒクル単独投与群における動物の同側（手術）の足は対側（無手術）の足（「対側」）又は偽手術を施した動物（「偽手術」）と比較してアロディニア（疼痛）症状を示した。以上の結果から明らかなように、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を併用投与すると、ＤＭＭマウスにおけるアロディニア発現が用量依存的に予防される。実施例６参照。
【図１４】慢性化変形性関節症及び機械的アロディニアに罹患したＤＭＭマウスに２８日目のアロディニア試験の２４時間前の２７日目に抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を１ｍｇ／ｋｇ（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（１ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（１ｍｇ／ｋｇ）」）、３ｍｇ／ｋｇ（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（３ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（３ｍｇ／ｋｇ）」）、又は６ｍｇ／ｋｇ（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）」）ずつ腹腔内（ｉｐ）併用投与した場合の足引っ込め閾値（グラム、「ｇ」）の棒グラフを示す。ビヒクル投与群（「ビヒクル」）の動物の同側（手術）の足は対側（無手術）の足（「対側」）又は偽手術を施した動物（「偽手術」）と比較してアロディニア（疼痛）症状を示した。以上の結果から明らかなように、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を併用投与すると、慢性化疾患に罹患したＤＭＭマウスにおける慢性化アロディニアが用量依存的に改善される。実施例７参照。
【図１５Ａ】マウスカラギ−ナン誘発性炎症性疼痛（痛覚過敏）モデルの動物における足引っ込め潜時（秒、「ｓ」）の棒グラフを示す。足底内カラギ−ナン注射から３０時間後にマウスに抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体単独（９００μｇ）（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ」）、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体単独（９００μｇ）（「抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ」）、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（９００μｇ）と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（９００μｇ）の併用（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ」）、ＰＢＳビヒクル（「ＰＢＳ」）、又はＩｇＧアイソタイプ対照（「ＩｇＧ」）を投与した。別の群にカラギ−ナンの足底内投与から４７時間後と９５時間後に１用量（３０ｍｇ／ｋｇ）のジクロフェナク（非ステロイド性抗炎症鎮痛薬対照）を投与した。カラギ−ナンの足底内投与から４８時間後（図１５Ａ）と９６時間後（図１５Ｂ）に輻射熱刺激を使用した熱痛覚過敏試験を実施した。黒の棒は対照足（カラギ−ナン非投与）の足引っ込め潜時を示す。白の棒はカラギ−ナンを投与した足の足引っ込め潜時を示す。実施例８参照。
【図１５Ｂ】マウスカラギ−ナン誘発性炎症性疼痛（痛覚過敏）モデルの動物における足引っ込め潜時（秒、「ｓ」）の棒グラフを示す。足底内カラギ−ナン注射から３０時間後にマウスに抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体単独（９００μｇ）（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ」）、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体単独（９００μｇ）（「抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ」）、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（９００μｇ）と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（９００μｇ）の併用（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ」）、ＰＢＳビヒクル（「ＰＢＳ」）、又はＩｇＧアイソタイプ対照（「ＩｇＧ」）を投与した。別の群にカラギ−ナンの足底内投与から４７時間後と９５時間後に１用量（３０ｍｇ／ｋｇ）のジクロフェナク（非ステロイド性抗炎症鎮痛薬対照）を投与した。カラギ−ナンの足底内投与から４８時間後（図１５Ａ）と９６時間後（図１５Ｂ）に輻射熱刺激を使用した熱痛覚過敏試験を実施した。黒の棒は対照足（カラギ−ナン非投与）の足引っ込め潜時を示す。白の棒はカラギ−ナンを投与した足の足引っ込め潜時を示す。実施例８参照。
【図１６Ａ】マウスカラギ−ナン誘発性炎症性疼痛（痛覚過敏）モデルにおける足引っ込め潜時（秒、「ｓ」）の棒グラフを示す。足底内カラギ−ナン注射から３０時間後にマウスにビヒクル（「ＰＢＳ」）、ＩｇＧアイソタイプ対照（「ＩｇＧ」）、又は３種類の用量のうちの１種の抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体の併用、即ち各モノクローナル抗体１００μｇ（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（１００μｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（１００μｇ）」）、３００μｇ（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（３００μｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（３００μｇ）」）、又は９００μｇ（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（９００μｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（９００μｇ）」）を投与した。別の群にカラギ−ナンの足底内投与から４７時間後と９５時間後に１用量（３０ｍｇ／ｋｇ）のジクロフェナク（非ステロイド性抗炎症鎮痛薬陽性対照）を投与した。カラギ−ナンの足底内投与から４８時間後（図１６Ａ）と９６時間後（図１６Ｂ）に輻射熱刺激を使用した熱痛覚過敏試験を実施した。黒の棒は対照足（カラギ−ナン非投与）の足引っ込め潜時を示す。白の棒はカラギ−ナンを投与した足の足引っ込め潜時を示す。実施例９参照。
【図１６Ｂ】マウスカラギ−ナン誘発性炎症性疼痛（痛覚過敏）モデルにおける足引っ込め潜時（秒、「ｓ」）の棒グラフを示す。足底内カラギ−ナン注射から３０時間後にマウスにビヒクル（「ＰＢＳ」）、ＩｇＧアイソタイプ対照（「ＩｇＧ」）、又は３種類の用量のうちの１種の抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体の併用、即ち各モノクローナル抗体１００μｇ（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（１００μｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（１００μｇ）」）、３００μｇ（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（３００μｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（３００μｇ）」）、又は９００μｇ（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（９００μｇ）＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（９００μｇ）」）を投与した。別の群にカラギ−ナンの足底内投与から４７時間後と９５時間後に１用量（３０ｍｇ／ｋｇ）のジクロフェナク（非ステロイド性抗炎症鎮痛薬陽性対照）を投与した。カラギ−ナンの足底内投与から４８時間後（図１６Ａ）と９６時間後（図１６Ｂ）に輻射熱刺激を使用した熱痛覚過敏試験を実施した。黒の棒は対照足（カラギ−ナン非投与）の足引っ込め潜時を示す。白の棒はカラギ−ナンを投与した足の足引っ込め潜時を示す。実施例９参照。
【図１７Ａ】ＣＦＡ（「完全フロイントアジュバント）炎症性疼痛マウスモデルにおける抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体併用投与の試験結果を示す。足底内ＣＦＡ注射から３０時間後に、マウスに抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（９００μｇ）と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（９００μｇ）の併用、ＰＢＳビヒクル（「ＰＢＳ」）、又はＩｇＧアイソタイプ対照（「ＩｇＧ」）を投与した。別の群にＣＦＡの足底内投与から４７時間後に１用量（３０ｍｇ／ｋｇ）のジクロフェナク（非ステロイド性抗炎症鎮痛薬陽性対照）を投与した。ＣＦＡ投与から４８時間後にフォン・フライ・モノフィラメントを使用した動物の機械的アロディニア試験を実施した。図１７Ａは足引っ込め閾値（グラム、「ｇ」）の棒グラフを示す。黒の棒は対側（ＣＦＡ非投与）の対照足の足引っ込め閾値を示す。白の棒は投与群の動物でＣＦＡを投与した足の足引っ込め閾値を示す。実施例１０参照。
【図１７Ｂ】ＣＦＡ（「完全フロイントアジュバント）炎症性疼痛マウスモデルにおける抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体併用投与の試験結果を示す。足底内ＣＦＡ注射から３０時間後に、マウスに抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（９００μｇ）と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（９００μｇ）の併用、ＰＢＳビヒクル（「ＰＢＳ」）、又はＩｇＧアイソタイプ対照（「ＩｇＧ」）を投与した。別の群にＣＦＡの足底内投与から４７時間後に１用量（３０ｍｇ／ｋｇ）のジクロフェナク（非ステロイド性抗炎症鎮痛薬陽性対照）を投与した。ＣＦＡ投与から４８時間後にフォン・フライ・モノフィラメントを使用した動物の機械的アロディニア試験を実施した。図１７Ｂは投与群の動物の効力の強さ（％ＭＰＥ）の棒グラフを示す。実施例１０参照。
【図１８Ａ】神経障害性疼痛のＬ５／Ｌ６脊髄神経結紮（ＳＮＬ）マウスモデルの動物における足引っ込め閾値（グラム、「ｇ」）の棒グラフを示す。ＳＮＬ手術から６日後に動物に抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（９００μｇ）と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（９００μｇ）の併用（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ」）、ＰＢＳビヒクル（「ＰＢＳ」）、又はＩｇＧアイソタイプ対照（「ＩｇＧ」）を投与した。ＳＮＬ手術から２４時間後（図１８Ａ）と７２時間後（図１８Ｂ）にフォン・フライ・モノフィラメントを使用した動物の機械的アロディニア試験を実施した。別の群に陽性対照として試験の１時間前にガバペンチンを投与した（１００ｍｇ／ｋｇ，「ガバペンチン」）。実施例１１参照。
【図１８Ｂ】神経障害性疼痛のＬ５／Ｌ６脊髄神経結紮（ＳＮＬ）マウスモデルの動物における足引っ込め閾値（グラム、「ｇ」）の棒グラフを示す。ＳＮＬ手術から６日後に動物に抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（９００μｇ）と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（９００μｇ）の併用（「抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ＋抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ」）、ＰＢＳビヒクル（「ＰＢＳ」）、又はＩｇＧアイソタイプ対照（「ＩｇＧ」）を投与した。ＳＮＬ手術から２４時間後（図１８Ａ）と７２時間後（図１８Ｂ）にフォン・フライ・モノフィラメントを使用した動物の機械的アロディニア試験を実施した。別の群に陽性対照として試験の１時間前にガバペンチンを投与した（１００ｍｇ／ｋｇ，「ガバペンチン」）。実施例１１参照。
【図１９】図１８について記載したような２４時間後と７２時間後の投与群の動物の効力の強さ（％ＭＰＥ）の棒グラフを示す。「ビヒクル」はＰＢＳビヒクルを投与したＳＮＬ動物を示す。「ＩｇＧ」はＩｇＧアイソタイプ対照を投与したＳＮＬ動物を示す。「ＩＬ−１αβ」は抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（９００μｇ）と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を併用投与した動物を示す。実施例１１参照。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明はインターロイキン−１（ＩＬ−１）の機能の阻害が個体（ヒト又は他の哺乳動物）における変形性関節症（ＯＡ）を治療するために有効な手段となり得るという発見に基づく。本発明によると、ＯＡを治療するためのＩＬ−１機能の阻害はＩＬ−１α及びＩＬ−１βと結合する１種以上の蛋白質を個体に投与することにより実現することができる。このような「二重特異性」療法はＩＬ−１αと結合する結合性蛋白質（例えば抗体）と、ＩＬ−１βと結合する結合性蛋白質（例えば抗体）をＯＡ患者に投与することにより、又はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する多価及び多重特異性結合性蛋白質を投与することにより実現することができる。本発明で有用なこのような多価多重特異性結合性蛋白質としては、二重可変ドメイン免疫グロブリン結合性蛋白質（本願では「ＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）」ないし「ＤＶＤ−Ｉｇ」結合性蛋白質又は分子と言う場合もある）が挙げられる。例えばＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０２４７１５号及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１１）：１２９０−１２９７参照。ＩＬ−１α及びＩＬ−１β結合性蛋白質の特定の組合せ又はＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合する特異的ＤＶＤ−Ｉｇ分子がＯＡの治療に有用であるか否かはＯＡの関節不安定性モデル（ＪＩＭ）やＯＡの内側半月板不安定化（ＤＭＭ）モデル等のＯＡの動物モデルを使用して評価することができる（Ｇｌａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔ．Ｃａｒｔ．１５（９）：１０６１−９）。
【００４５】
本願で特に定義しない限り、本発明に関連して使用する科学技術用語は当業者に広く理解されている意味である。用語の意味と範囲は明瞭となるはずであるが、潜在的に曖昧な場合には、辞書又は外部の定義よりも本願に記載する定義を優先する。更に、文脈からそうでないと判断される場合を除き、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。本願では、特に指定しない限り、「又は」なる用語は「及び／又は」を意味する。更に、「含む」なる用語と他の語形（例えば「含んでいる」や「含まれる」）の使用は非限定的である。また、特に指定しない限り、「要素」又は「成分」等の用語は１単位からなる要素及び成分と、２以上のサブユニットからなる要素及び成分の両者を包含する。
【００４６】
一般に、本願に記載する細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、蛋白質及び核酸化学並びに核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用する術語とその技術は当分野で周知であり、広く使用されている。特に指定しない限り、本発明の方法及び技術は当分野で周知の慣用方法に従い、本明細書の随所に引用及び説明する各種一般資料及び特定資料に記載されているように一般に実施される。酵素反応及び精製技術は製造業者の指示に従うか、当分野で広く実施されている方法に従うか、又は本願の記載に従って実施される。本願に記載する分析化学、有機合成化学、及び医薬化学に関連して使用する術語とその実験手順及び技術は当分野で周知であり、広く使用されている。化学合成、化学分析、医薬製造、製剤化及び送達並びに患者の治療には標準技術を使用する。
【００４７】
本発明を理解し易くするために、選択用語を以下に定義する。
【００４８】
「ポリペプチド」なる用語はアミノ酸の任意ポリマー鎖を意味する。「ペプチド」及び「蛋白質」なる用語はポリペプチドなる用語と同義に使用し、同様にアミノ酸のポリマー鎖を意味する。「ポリペプチド」なる用語は天然又は人工蛋白質、蛋白質フラグメント及び蛋白質配列のポリペプチドアナログを包含する。ポリペプチドはモノマーでもポリマーでもよい。
【００４９】
「単離蛋白質」又は「単離ポリペプチド」なる用語はその起源又は由来源によりその天然状態でこれに付随する天然会合成分と会合していない蛋白質又はポリペプチド、同一種に由来する他の蛋白質を実質的に含まない蛋白質又はポリペプチド、別の種に由来する細胞により発現される蛋白質又はポリペプチド、あるいは自然界に存在しない蛋白質又はポリペプチドを意味する。従って、化学的に合成されるポリペプチド又はその天然由来源である細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドはその天然会合成分から「単離」される。当分野で周知の蛋白質精製技術を使用して、単離により蛋白質を天然会合成分から実質的に分離することもできる。
【００５０】
「回収」なる用語は例えば当分野で周知の蛋白質精製技術を使用して、単離によりポリペプチド等の化学種を天然会合成分から実質的に分離する方法を意味する。
【００５１】
「ヒトＩＬ−１α」（本願では「ｈＩＬ−１α」又は「ＩＬ−１α」と略称する場合もある）なる用語は各種免疫応答、炎症プロセス及び造血に関与する多面的サイトカインを包含する。例えば、ＩＬ−１αは活性化マクロファージにより産生されるヒトサイトカインを含み、ＩＬ−２放出、Ｂ細胞成熟及び増殖、並びに線維芽細胞増殖因子活性を誘発することにより胸腺細胞を刺激する。「ヒトＩＬ−１α」なる用語は標準組換え発現法により作製することができる組換えヒトＩＬ−１α（「ｒｈＩＬ−１α））を包含するものとする。
【００５２】
「ヒトＩＬ−１β」（本願では「ｈＩＬ−１β」又は「ＩＬ−１β」と略称する場合もある）なる用語は各種免疫応答、炎症プロセス及び造血に関与する多面的サイトカインを包含する。ヒト「ＩＬ−１β」なる用語は標準組換え発現法により作製することができる組換えヒトＩＬ−１β（「ｒｈＩＬ−１β」）を包含する。
【００５３】
ヒトＩＬ−１α及びＩＬ−１βのアミノ酸配列を表１に示す。
【００５４】
【表１】
0005918275.tif 000002
【００５５】
「生物学的活性」なる用語はサイトカインの固有の全生物学的性質を意味する。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの生物学的性質としては限定されないが、ＩＬ−１受容体との結合が挙げられる。
【００５６】
「生物学的活性」とはＩＬ−１αの固有の全生物学的性質を意味する。ＩＬ−１αの生物学的性質としては限定されないが、ＩＬ−１受容体との結合と、ＩＬ−２放出、Ｂ細胞成熟及び増殖、並びに線維芽細胞増殖因子活性を誘発することによる胸腺細胞の刺激が挙げられる。
【００５７】
抗体、蛋白質又はペプチドと第２の化学種の相互作用に関する「特異的結合」又は「特異的に結合する」なる用語は相互作用が化学種上の特定構造（例えば抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味し、例えば、抗体は蛋白質一般ではなく特定蛋白質構造を認識してこれと結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識した「Ａ」と抗体を含有する反応混合物中にエピトープＡ（即ち遊離した未標識のＡ）を含む分子が存在するならば、標識したＡの抗体結合量は減少する。
【００５８】
「抗体」なる用語は２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖から構成される任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、又はＩｇ分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持するその任意の機能的フラグメント、突然変異体、変異体もしくは誘導体を広義に意味する。このような突然変異体、変異体又は誘導体抗体フォーマットは当分野で公知であり、その非限定的な態様について以下に記載する。
【００５９】
全長抗体において、各重鎖は重鎖可変領域（本願ではＨＣＶＲ又はＶＨと略称する）と重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３個のドメインから構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本願ではＬＣＶＲ又はＶＬと略称する）と軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１個のドメインＣＬから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は更に相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域とその間に配置されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存度の高い領域に区分することができる。各ＶＨ及びＶＬはアミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３個のＣＤＲと４個のＦＲから構成される。免疫グロブリン分子は任意型（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスとすることができる。
【００６０】
抗体の「抗原結合部分」なる用語は抗原（例えばｈＩＬ−１α）と特異的に結合する能力を保持する抗体の１個以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は全長抗体のフラグメントにより実施可能である。このような抗体の態様は２種以上の異なる抗原と特異的に結合する複特異性、二重特異性又は多重特異性フォーマットでもよい。抗体の「抗原結合部分」なる用語に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１領域から構成される１価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された２個のＦａｂフラグメントからなる２価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ領域とＣＨ１領域から構成されるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ領域とＶＨ領域から構成されるＦｖフラグメント；（ｖ）単一可変領域から構成されるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０５１４４号）；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、ＦｖフラグメントのＶＬ及びＶＨの２領域は別々の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して合成リンカーにより結合し、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して１価分子を形成する単一蛋白鎖として作製することができる（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と言う；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照）。このような１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）も抗体の「抗原結合部分」なる用語に含むものとする。ダイアボディ等の他の形態の１本鎖抗体も含む。ダイアボディはＶＨ領域とＶＬ領域が１本のポリペプチド鎖上で発現される２価の複特異性抗体であるが、非常に短いリンカーを使用するため、同一鎖上の２領域間で対合することができず、これらの領域は別の鎖の相補性領域と対合し、２個の抗原結合部位を形成する（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。このような抗体結合部分は当分野で公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ  ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）（ＩＳＢＮ  ３−５４０−４１３５４−５））。
【００６１】
「抗体コンストラクト」なる用語はリンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常領域に連結された１個以上の本発明の抗原結合部分を含むポリペプチドを意味する。リンカーポリペプチドはペプチド結合により結合した２個以上のアミノ酸残基を含み、１個以上の抗原結合部分と結合するために使用される。このようなリンカーポリペプチドは当分野で周知である（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。免疫グロブリン定常領域とは重鎖又は軽鎖定常領域を意味する。ヒトＩｇＧ重鎖（γ）及び軽鎖（κ及びδ）定常領域アミノ酸配列は当分野で公知であり、表２に示す。
【００６２】
【表２】
0005918275.tif 000003
【００６３】
更に、抗体又はその抗原結合部分は抗体又はその抗原結合部分と１種以上の他の蛋白質又はペプチドの共有的又は非共有的結合により形成されるより大きな免疫接着分子の一部でもよい。このような免疫接着分子の例としてはストレプトアビジンコア領域を使用して形成される四量体ｓｃＦｖ分子（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）や、システイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグを使用して形成される２価ビオチン化ｓｃＦｖ分子（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が挙げられる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメント等の抗体の抗原結合部分は夫々全長抗体のパパイン又はペプシン消化等の慣用技術を使用して全長抗体から作製することができる。更に、抗体、その抗原結合部分及び免疫接着分子は本願に記載するような標準組換えＤＮＡ技術を使用して取得することができる。
【００６４】
「単離抗体」とは異なる抗原特異性をもつ他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する（例えばｈＩＬ−１αと特異的に結合する単離抗体はｈＩＬ−１α以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ｈＩＬ−１αと特異的に結合する単離抗体は他の抗原（例えば他の種に由来するＩＬ−１α分子）と交差反応性をもつ場合がある。更に、単離抗体は他の細胞材料及び／又は薬品を実質的に含まない場合がある。
【００６５】
「ヒト抗体」なる用語はヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域をもつ抗体を包含する。本発明のヒト抗体はヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えばランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によりインビトロで導入される突然変異又は体細胞突然変異によりインビボで導入される突然変異）を例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に含んでいてもよい。他方、「ヒト抗体」なる用語は別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列に移植した抗体を包含しない。
【００６６】
「組換えヒト抗体」なる用語は組換え手段により作製、発現、創製又は単離された全ヒト抗体を包含し、例えば、宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体（下記セクションＩＩ  Ｃに詳述）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２−７０；Ａｚｚａｚｙ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５−４４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ（２０００）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８−１４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７８）、ヒト免疫グロブリン遺伝子にトランスジェニックな動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えばＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５９３−５９７；Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０参照）、あるいはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングする他の任意手段により作製、発現、創製又は単離された抗体が挙げられる。このような組換えヒト抗体はヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域をもつ。しかし、所定態様において、このような組換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列にトランスジェニックな動物を使用する場合には、インビボ体細胞突然変異誘発）を受け、従って、組換え抗体のＶＨ領域とＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、これらの配列に近縁の配列であるが、天然ではヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内にインビボで存在しない場合もある配列である。
【００６７】
「キメラ抗体」なる用語はある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列と、別の種に由来する定常領域配列を含む抗体（例えばマウス重鎖及び軽鎖可変領域をヒト定常領域に連結した抗体）を意味する。
【００６８】
「ＣＤＲ移植抗体」なる用語はある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ領域のＣＤＲ領域の１個以上の配列を別の種のＣＤＲ配列で置換えた抗体（例えばヒトＣＤＲの１個以上（例えばＣＤＲ３）を例えばヒトＩＬ−１αに対するマウスモノクローナル抗体から得られるようなマウスＣＤＲ配列で置換えたヒト重鎖及び軽鎖可変領域をもつ抗体）を意味する。
【００６９】
本願で使用する「ＣＤＲ」なる用語は抗体可変領域配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖及び軽鎖可変領域の各々に３個のＣＤＲが存在し、可変領域の各々でＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれる。本願で使用する「ＣＤＲセット」なる用語は抗原結合部位の単一可変領域（即ちＶＨ又はＶＬ）に存在する３個１組のＣＤＲを意味する。これらのＣＤＲの厳密な境界は種々のシステムにより種々に定義されている。Ｋａｂａｔにより記載されているシステム（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７，１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ））は抗体の任意可変領域に適用可能な明確な残基ナンバリングシステムを規定するのみならず、３個のＣＤＲを定義する厳密な残基境界を規定する。これらのＣＤＲをＫａｂａｔ  ＣＤＲと言う場合がある。Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３）はＫａｂａｔ  ＣＤＲ内の所定のサブ部分がアミノ酸配列レベルでは多様性に富んでいるにも拘わらず、ほぼ同一のペプチド主鎖構造をとることを見いだした。これらのサブ部分はＬ１、Ｌ２及びＬ３又はＨ１、Ｈ２及びＨ３と呼ばれ、ここで「Ｌ」及び「Ｈ」は夫々軽鎖領域と重鎖領域を表す。これらの領域をＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲと呼ぶ場合があり、その境界はＫａｂａｔ  ＣＤＲとオーバーラップする。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとオーバーラップするＣＤＲを定義する他の境界はＰａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９及びＭａｃＣａｌｌｕｍ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２−７４５に記載されている。上記システムの１種に厳密には従わないとしても、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとオーバーラップする更に他のＣＤＲ境界定義もあり、特定残基もしくは残基群又はＣＤＲ全体が抗原結合に有意に影響を与えないという予想又は実験結果に基づいて短くしたものや長くしたものがある。本願で使用する方法はこれらのシステムのいずれに従って定義されたＣＤＲも使用することができるが、所定態様はＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａの定義によるＣＤＲを使用する。
【００７０】
「Ｋａｂａｔナンバリング」、「Ｋａｂａｔ定義」及び「Ｋａｂａｔラベリング」なる用語を本願では同義に使用する。これらの用語は抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域において他のアミノ酸残基よりも可変度の高い（即ち超可変性）アミノ酸残基のナンバリングシステムを意味する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１及びＫａｂａｔ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。重鎖可変領域では、超可変領域はＣＤＲ１のアミノ酸３１〜３５位、ＣＤＲ２のアミノ酸５０〜６５位、及びＣＤＲ３のアミノ酸９５〜１０２位に位置する。軽鎖可変領域では、超可変領域はＣＤＲ１のアミノ酸２４〜３４位、ＣＤＲ２のアミノ酸５０〜５６位、及びＣＤＲ３のアミノ酸８９〜９７位に位置する。
【００７１】
過去２０年間にわたる重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列の広範な公共データベースの発展と分析の結果、可変領域配列内のフレームワーク領域（ＦＲ）配列とＣＤＲ配列の典型的境界が解明され、当業者はＫａｂａｔナンバリング、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング又は他のシステムに従ってＣＤＲを正確に決定できるようになった。例えばＭａｒｔｉｎ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ，”Ｉｎ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，２００１），ｃｈａｐｔｅｒ  ３１，ｐｐ．４３２−４３３参照。重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列内のＫａｂａｔ  ＣＤＲのアミノ酸配列の有用な決定方法を以下に記載する。
【００７２】
ＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列を同定するためには、
ＶＬ領域のアミノ末端から約２４番目のアミノ酸残基から出発する；
ＣＤＲ−Ｌ１配列の前の残基は常にシステイン（Ｃ）である；
ＣＤＲ−Ｌ１配列の後の残基は常にトリプトファン（Ｗ）残基であり、典型的にはＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ（Ｗ−Ｙ−Ｑ）であるが、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｗ−Ｌ−Ｑ）、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｗ−Ｆ−Ｑ）及びＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（Ｗ−Ｙ−Ｌ）でもよい；
長さは典型的には１０〜１７アミノ酸残基である。
【００７３】
ＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列を同定するためには、
常にＣＤＲ−Ｌ１の末端から１６番目の残基から出発する；
ＣＤＲ−Ｌ２配列の前の残基は一般にＩｌｅ−Ｔｙｒ（Ｉ−Ｙ）であるが、Ｖａｌ−Ｔｙｒ（Ｖ−Ｙ）、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（Ｉ−Ｋ）及びＩｌｅ−Ｐｈｅ（Ｉ−Ｆ）でもよい；
長さは常に７アミノ酸残基である。
【００７４】
ＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を同定するためには、
常にＣＤＲ−Ｌ２の末端から３３番目のアミノ酸から出発する；
ＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列の前の残基は常にシステイン（Ｃ）である；
ＣＤＲ−Ｌ３配列の後の残基は常にＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｆ−Ｇ−Ｘ−Ｇ）（配列番号７）であり、ここでＸは任意アミノ酸である；
長さは典型的には７〜１１アミノ酸残基である。
【００７５】
ＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列を同定するためには、
ＶＨ領域のアミノ末端から約３１番目のアミノ酸残基で常にシステイン（Ｃ）から９番目の残基から出発する；
ＣＤＲ−Ｈ１配列の前の残基は常にＣｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（配列番号１５１）であり、ここでＸは任意アミノ酸である；
ＣＤＲ−Ｈ１配列の後の残基は常にＴｒｐ（Ｗ）であり、典型的にはＴｒｐ−Ｖａｌ（Ｗ−Ｖ）であるが、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ（Ｗ−Ｉ）及びＴｒｐ−Ａｌａ（Ｗ−Ａ）でもよい；
長さは典型的には５〜７アミノ酸残基である。
【００７６】
ＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列を同定するためには、
常にＣＤＲ−Ｈ１の末端から１５番目のアミノ酸残基から出発する；
ＣＤＲ−Ｈ２配列の前の残基は典型的にはＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（Ｌ−Ｅ−Ｗ−Ｉ−Ｇ）（配列番号８）であるが、他の変形でもよい；
ＣＤＲ−Ｈ２配列の後の残基はＬｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａ（Ｋ／Ｒ−Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｔ／Ａ−Ｔ／Ｓ／Ｉ／Ａ）である；
長さは典型的には１６〜１９アミノ酸残基である。
【００７７】
ＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を同定するためには、
常にＣＤＲ−Ｈ２の末端から３３番目のアミノ酸残基で常にシステイン（Ｃ）から３番目の残基から出発する；
ＣＤＲ−Ｈ３配列の前の残基は常にＣｙｓ−Ｘ−Ｘ（Ｃ−Ｘ−Ｘ）（ここでＸは任意アミノ酸である）であり、典型的にはＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｃ−Ａ−Ｒ）である；
ＣＤＲ−Ｈ３配列の後の残基は常にＴｒｐ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｗ−Ｇ−Ｘ−Ｇ）（配列番号９）であり、ここでＸは任意アミノ酸である；
長さは典型的には３〜２５アミノ酸残基である。
【００７８】
本願で使用する「アクセプター」及び「アクセプター抗体」なる用語はフレームワーク領域の１個以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％を提供又はコードする抗体又は核酸配列を意味する。所定態様において、「アクセプター」なる用語は定常領域を提供又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を意味する。更に別の態様において、「アクセプター」なる用語はフレームワーク領域と定常領域の１個以上を提供又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を意味する。特定態様において、「アクセプター」なる用語はフレームワーク領域の１個以上のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％を提供又はコードするヒト抗体アミノ酸又は核酸配列を意味する。この態様によると、アクセプターはヒト抗体の１以上の特定位置に存在しないアミノ酸残基を少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、又は少なくとも１０個含むことができる。アクセプターフレームワーク領域及び／又はアクセプター定常領域は例えば生殖細胞系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば当分野で周知の抗体、開発中の抗体又は市販抗体）から入手又は取得することができる。
【００７９】
本願で使用する「カノニカル」残基なる用語はＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７により定義されているように特定カノニカルＣＤＲ構造を規定するＣＤＲ又はフレームワークにおける残基を意味する。Ｃｈｏｔｈｉａらによると、多くの抗体のＣＤＲの必須部分はアミノ酸配列レベルでは多様性に富んでいるにも拘わらず、ほぼ同一のペプチド主鎖構造をとる。各カノニカル構造はループを形成するアミノ酸残基の連続セグメントについて主に１組のペプチド主鎖ねじれ角を指定する。
【００８０】
本願で使用する「ドナー」及び「ドナー抗体」なる用語は１個以上のＣＤＲを提供する抗体を意味する。１態様において、ドナー抗体はフレームワーク領域の取得源又は入手源である抗体とは異なる種に由来する抗体である。ヒト化抗体に関連して「ドナー抗体」なる用語は１個以上のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を意味する。
【００８１】
本願で使用する「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」なる用語は可変領域からＣＤＲを除いた残りの配列を意味する。ＣＤＲ配列の厳密な定義は種々のシステムにより決定することができるので、フレームワーク配列の意味は相応に種々に解釈される。６個のＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２及びＬ３と重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）は軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域を更に各鎖で４個のサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に位置する。個々のサブ領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４と特定せずに、単にフレームワーク領域と言う場合もあるが、その場合には、１本の天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域内のＦＲ全体を意味する。本願で使用するＦＲとは４個のサブ領域の１個を意味し、ＦＲｓとはフレームワーク領域を構成する４個のサブ領域の２個以上を意味する。
【００８２】
ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は当分野で公知である。本発明の１態様において、ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は表３及び表４に記載する配列から選択される。
【００８３】
【表３】
0005918275.tif 000004
【００８４】
【表４】
0005918275.tif 000005
【００８５】
本願で使用する「生殖細胞系列抗体遺伝子」又は「遺伝子フラグメント」なる用語は特定の免疫グロブリンの発現のために遺伝子再構成と突然変異を誘導する成熟プロセスを受けていない非リンパ細胞によりコードされる免疫グロブリン配列を意味する（例えばＳｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１８３−２００；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４８４：１３−３０参照）。本発明の各種態様により提供される利点の１つは生殖細胞系列抗体遺伝子が成熟抗体遺伝子よりも種における個体に特徴的な必須アミノ酸配列構造を保存する傾向が強く、従ってこの種で治療に使用した場合に外来源に由来するとみなしにくいという認識に基づく。
【００８６】
本願で使用する「キー」残基なる用語は抗体、特にヒト化抗体の結合特異性及び／又は親和性に強く影響する可変領域内の所定の残基を意味する。キー残基としては限定されないが、ＣＤＲに隣接する残基、潜在的グリコシル化部位（Ｎ−グリコシル化部位でもＯ−グリコシル化部位でもよい）、希少残基、抗原と相互作用することが可能な残基、ＣＤＲと相互作用することが可能な残基、カノニカル残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間のコンタクト残基、バーニアゾーン内の残基、及びＣｈｏｔｈｉａの定義による重鎖可変領域ＣＤＲ１とＫａｂａｔの定義による最初の重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域における残基の１種以上が挙げられる。
【００８７】
「ヒト化抗体」なる用語は非ヒト種（例えばマウス）に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部が「ヒト類似性」を増すように、即ちヒト生殖細胞系列可変配列との類似性を増すように改変された抗体を意味する。ヒト化抗体の１例は対応する非ヒトフレームワーク（ＦＲ）配列に置換えるように非ヒトＣＤＲ配列をヒトＶＨ及びＶＬ配列に導入したＣＤＲ移植抗体である。例えば、「ヒト化抗体」は目的抗原と免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列をもつフレームワーク（ＦＲ）領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列をもつ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体又はその変異体、誘導体、アナログもしくはフラグメントである。ＣＤＲに関連して本願で使用する「実質的に」なる用語は非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％一致するアミノ酸配列をもつＣＤＲを意味する。ヒト化抗体はＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部が非ヒト免疫グロブリン（即ちドナー抗体）のＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク領域の全部又は実質的に全部がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である少なくとも１個、典型的には２個の可変領域（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的に全部を含む。１態様において、ヒト化抗体は更に免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。所定態様において、ヒト化抗体は軽鎖と重鎖の少なくとも可変領域を含む。抗体は更に重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４領域を含むことができる。所定態様において、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含む。所定態様において、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみを含む。特定態様において、ヒト化抗体は軽鎖のヒト化可変領域及び／又はヒト化重鎖のみを含む。
【００８８】
ヒト化抗体はＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む任意クラスの免疫グロブリンと、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意アイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は２種以上のクラス又はアイソタイプに由来する配列を含むことができ、当分野で周知の技術を使用して所望エフェクター機能を最適化するように特定定常領域を選択することができる。
【００８９】
ヒト化抗体のフレームワーク領域とＣＤＲ領域は親配列に厳密に対応する必要はなく、例えばその部位のＣＤＲ又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークのいずれにも対応しないように少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失によりドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークを突然変異誘発してもよい。しかし、１態様において、このような突然変異は広範にならない。通常では、ヒト化抗体残基の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、及び少なくとも９５％が親ＦＲ及びＣＤＲ配列に対応する。本願で使用する「コンセンサスフレームワーク」なる用語はコンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を意味する。本願で使用する「コンセンサス免疫グロブリン配列」なる用語は近縁免疫グロブリン配列のファミリーに最高頻度で存在するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を意味する（例えばＷｉｎｎａｋｅｒ（１９８７）Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ参照）。従って、「コンセンサス免疫グロブリン配列」は「コンセンサス可変領域」及び／又は「コンセンサス定常領域」を含むことができる。更に、「コンセンサス可変領域」は１個以上の「コンセンサスフレームワーク領域」及び／又は１個以上の「コンセンサスＣＤＲ」を含むことができる。免疫グロブリンファミリーにおいて、コンセンサス配列における各位置はこのファミリーでこの位置に最高頻度で存在するアミノ酸により占有される。２種類のアミノ酸が同等の高頻度で存在する場合には、どちらをコンセンサス配列に加えてもよい。
【００９０】
本願で使用する「バーニア」ゾーンなる用語はＦｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９に記載されているようにＣＤＲ構造を調整することができ、抗原に合わせて微調整することができるフレームワーク残基のサブセットを意味する。バーニアゾーン残基はＣＤＲの基層を形成し、ＣＤＲの構造と抗体の親和性に影響を与える可能性がある。
【００９１】
「多価結合性蛋白質」なる用語は本明細書では２個以上の抗原結合部位を含む結合性蛋白質の意味で使用する。多価結合性蛋白質は３個以上の抗原結合部位をもつように構築され、一般に天然抗体以外のものである。「多重特異性結合性蛋白質」なる用語は２種以上の近縁又は非近縁ターゲットと結合することが可能な結合性蛋白質を意味する。複可変領域（ＤＶＤ）結合性蛋白質は２個以上の抗原結合部位を含む結合性蛋白質であり、４価以上の多価結合性蛋白質である。このようなＤＶＤ結合性蛋白質は単一特異性、即ち１種類の抗原と結合可能でもよいし、多重特異性、即ち２種類以上の抗原と結合可能でもよい。２本の重鎖ＤＶＤポリペプチドと２本の軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合性蛋白質をＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）分子と言う。ＤＶＤ−Ｉｇ分子の各半分は重鎖ＤＶＤ−Ｉｇポリペプチドと、軽鎖ＤＶＤポリペプチドと、２個の抗原結合部位を含む。各結合部位は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、抗原結合部位当たり合計６個のＣＤＲが抗原結合に関与する。ＤＶＤ結合性蛋白質とＤＶＤ結合性蛋白質の作製方法は本願に援用する米国特許第７，６１２，１８１号に開示されている。
【００９２】
本発明の１側面はヒトＩＬ−１αと結合することが可能な結合性蛋白質を含むＤＶＤ結合性蛋白質に関する。別の側面において、ＤＶＤ結合性蛋白質はＩＬ−１αと第２のターゲットとに結合することが可能である。１態様において、ＤＶＤ結合性蛋白質はＩＬ−１αとＩＬ−１βとに結合することが可能である。
【００９３】
「中和」なる用語は結合性蛋白質がサイトカインと特異的に結合する場合のサイトカインの生物学的活性の中和を意味する。１態様において、中和結合性蛋白質はｈＩＬ−１αと結合することによりｈＩＬ−１αの生物学的活性を阻害する中和抗体である。１態様において、中和結合性蛋白質はｈＩＬ−１αと結合し、ｈＩＬ−１αの生物学的活性を少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約１００％低下させる。中和結合性蛋白質によるｈＩＬ−１αの生物学的活性の阻害は当分野で周知のｈＩＬ−１α生物学的活性の１種以上の指標を測定することにより判定することができる。
【００９４】
「エピトープ」なる用語は免疫グロブリン又はＴ細胞受容体と特異的に結合することが可能な任意ポリペプチド決定基を包含する。所定態様において、エピトープ決定基はアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル等の化学的に活性な表面分子群を含み、所定態様では、特定の三次元構造特徴及び／又は特定の電荷特徴をもつ場合がある。エピトープは抗体と結合する抗原の１領域である。従って、エピトープは特異的結合パートナー上の相補的部位と結合することが分かっている抗原（又はそのフラグメント）の１領域のアミノ酸残基から構成される。抗原フラグメントは２個以上のエピトープを含むことができる。所定態様において、抗体は蛋白質及び／又は巨大分子の複雑な混合物中でそのターゲット抗原を認識するときに抗原と特異的に結合すると言う。抗体が交差競合する（一方が他方の結合又は変調作用を妨害する）場合に抗体は「同一エピトープと結合する」と言う。更に、エピトープの構造定義（オーバーラップ、類似、一致）も有益であるが、機能定義のほうが構造（結合）パラメータと機能（変調、競合）パラメータを含むため、適切であることが多い。
【００９５】
「表面プラズモン共鳴」なる用語は例えばＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの子会社であるＢｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を使用してバイオセンサーマトリックス内の蛋白質濃度の変化の検出によりリアルタイム生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を意味する。更に詳細については、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＢｉｏＴｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；及びＪｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７参照。
【００９６】
「Ｋｏｎ」なる用語は当分野で公知の通り、結合性蛋白質（例えば抗体）が抗原と会合して例えば抗体／抗原複合体を形成する会合速度定数を意味する。「Ｋｏｎ」は「会合速度定数」又は「ｋａ」の用語でも呼ばれ、本願では同義に使用する。抗体とその標的抗原の結合速度ないし抗体と抗原の間の複合体形成速度を表すこの数値は式：
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）→Ａｂ−Ａｇ
でも示される。
【００９７】
「Ｋｏｆｆ」なる用語は当分野で公知の通り、結合性蛋白質（例えば抗体）が例えば抗体／抗原複合体から解離する解離速度定数を意味する。「Ｋｏｆｆ」は「解離速度定数」又は「ｋｄ」の用語でも呼ばれ、本願では同義に使用する。この数値は下式：
Ａｂ＋Ａｇ←Ａｂ−Ａｇ
により示されるように、抗体がその標的抗原から解離する速度ないしＡｂ−Ａｇ複合体が経時的に遊離抗体及び抗原に分離する速度を表す。
【００９８】
「平衡解離定数」又は「ＫＤ」なる用語は本願では同義に使用し、平衡状態における滴定測定で得られる数値又は解離速度定数（ｋｏｆｆ）を会合速度定数（ｋｏｎ）で割ることにより得られる数値を意味する。会合速度定数、解離速度定数及び平衡解離定数は抗原に対する抗体の結合親和性を表すために使用される。会合速度定数と解離速度定数の測定方法は当分野で周知である。蛍光技術を使用すると、高感度が得られ、平衡状態の生理的緩衝液中のサンプルを試験することができる。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（生体分子相互作用分析）アッセイ等の他の実験アプローチ及び機器（例えばＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの子会社であるＢｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから市販されている機器）も使用できる。更に、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）から市販されているＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（結合平衡除外法）も使用することができる。
【００９９】
本願で使用する「標識結合性蛋白質」なる用語は結合性蛋白質を識別できるようにラベルを付加した蛋白質を意味する。１側面において、ラベルは検出可能なマーカーであり、例えば放射性標識アミノ酸を付加する方法や、標識アビジン（例えば蛍光マーカー又は光学的方法もしくは比色法により検出可能な酵素活性を付加したストレプトアビジン）により検出可能なビオチニル部分をポリペプチドに結合する方法が挙げられる。ポリペプチドのラベルの例としては限定されないが、放射性同位体ないし放射性核種（例えば３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、及び１５３Ｓｍ）、蛍光ラベル（例えばＦＩＴＣ、ローダミン及びランタニド蛍光体）、酵素ラベル（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定ポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン及びエピトープタグ）及び磁性物質（例えばガドリニウムキレート）が挙げられる。
【０１００】
「抗体コンジュゲート」なる用語は第２の化学部分（例えば治療剤や細胞傷害性物質）と化学的に結合した結合性蛋白質（例えば抗体）を意味する。「作用剤」なる用語は本願では化合物、化合物の混合物、生体巨大分子又は生体物質から作製された抽出物の意味で使用する。１側面において、治療剤又は細胞傷害性物質としては限定されないが、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにそのアナログ又はホモログが挙げられる。
【０１０１】
「結晶」及び「結晶化」なる用語は結晶形態で存在する抗体又はその抗原結合部分を意味する。結晶は物質の固体状態の１形態であり、非晶質固体状態や液体結晶状態等の他の形態から区別される。結晶は原子、イオン、分子（例えば抗体等の蛋白質）、又は分子集合体（例えば抗原／抗体複合体）の規則的な繰り返し三次元配列から構成される。これらの三次元配列は当分野で周知の特定の数学的関係に従って配置されている。結晶中で繰り返している基本単位ないし構成単位を非対称単位と言う。所定の明確な結晶対称性に一致する配置で非対称単位が繰り返すことにより、結晶の「単位格子」を構成する。単位格子が全３方向に規則的並進により繰り返すことにより、結晶を構成する。Ｇｉｅｇｅ  ａｎｄ  Ｄｕｃｒｕｉｘ（１９９９）Ｃｈａｐｔｅｒ  １，Ｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｎｄ  ｅｄ．，（Ｄｕｃｒｕｉｘ  ａｎｄ  Ｇｉｅｇｅ，ｅｄｓ．）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）ｐｐ．１−１６参照。
【０１０２】
「ポリヌクレオチド」なる用語はリボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか又はこれらのいずれかの型のヌクレオチドの修飾物である２個以上のヌクレオチドのポリマー形態を意味する。この用語は１本鎖形態と２本鎖形態のＤＮＡ又はＲＮＡを含むが、１態様では２本鎖ＤＮＡである。
【０１０３】
「単離ポリヌクレオチド」なる用語は自然界で会合しているポリヌクレオチド、自然界で機能的に連結しているポリヌクレオチド、又はより長い配列の一部として自然界に存在するポリヌクレオチドの全部又は一部と会合していない（例えばゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成由来又はその組合せの）ポリヌクレオチドを意味する。
【０１０４】
「ベクター」なる用語はこれに連結した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を意味する。ベクターの１例は別のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状２本鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」である。ベクターの別の例は別のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができるウイルスベクターである。所定のベクターはこれらのベクターを導入する宿主細胞で自律複製することができる（例えば細菌複製起点をもつ細菌ベクターやエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）も宿主細胞に導入後に宿主細胞のゲノムに組込むことができ、宿主ゲノムと共に複製される。更に、所定のベクターはこれらのベクターを機能的に連結した遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターを本願では「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と言う。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはプラスミド形態であることが多い。プラスミドは最も広く使用されている形態のベクターであるので、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」を同義に使用する場合がある。しかし、本発明はウイルスベクター（例えば複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）等の同等機能をもつこのような他の形態の発現ベクターも包含するものとする。
【０１０５】
「機能的に連結」なる用語は成分をその目的通りに機能できるように配置することを意味する。コーディング配列と「機能的に連結」された制御配列は制御配列に適合可能な条件下でコーディング配列の発現が実現されるようにライゲーションされている。「機能的に連結」された配列としては、目的遺伝子に隣接する発現制御配列、イントランスで作用する発現制御配列、即ち目的核酸とは異なる核酸分子に配置されているが、目的核酸を制御する発現制御配列、及び目的核酸と同一の核酸分子上ではあるが、目的核酸から距離を隔てて配置された発現制御配列が挙げられる。本願で使用する「発現制御配列」なる用語はこの配列がライゲーションされたコーディング配列の発現とプロセシングを行うために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列としては、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列及びエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（例えばスプライシングシグナルやポリアデニル化シグナル）；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を強化する配列（即ちコザックコンセンサス配列）；蛋白質安定性を強化する配列；更には所望により、蛋白質分泌を強化する配列が挙げられる。このような制御配列の種類は宿主生物により異なり、原核生物では、このような制御配列としては一般にプロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列が挙げられ、真核生物では、一般にこのような制御配列としてはプロモーターと転写終結配列が挙げられる。「制御配列」なる用語はその存在が発現とプロセシングに必須である成分を包含するものとし、更に存在していると有利である別の成分（例えばリーダー配列や融合パートナー配列）も包含することができる。
【０１０６】
「形質転換」とは外来ＤＮＡが宿主細胞に導入される任意プロセスを意味する。形質転換は外来核酸配列を例えば原核又は真核宿主細胞に挿入するために当分野で周知の各種方法を使用して天然又は人工条件下に実施することができる。方法は形質転換する宿主細胞に基づいて選択され、限定されないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション及び粒子撃ち込みが挙げられる。このような「形質転換」細胞としては、挿入されたＤＮＡが自律複製プラスミド又は宿主染色体の一部として複製できる安定型形質転換細胞が挙げられる。更に、挿入されたＤＮＡ又はＲＮＡを限定期間だけ一過的に発現する細胞も挙げられる。
【０１０７】
本願で使用する「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）なる用語は外来ＤＮＡが導入された細胞を意味する。このような用語は特定対象細胞のみならず、このような細胞の子孫も意味する。後続世代には突然変異又は環境影響により所定の変異が生じる場合があるので、このような子孫は実際には親細胞と同一でない場合もあるが、本願で使用する「宿主細胞」なる用語の範囲に含まれる。１側面において、宿主細胞としては生物界の任意のものから選択される原核細胞と真核細胞が挙げられる。真核細胞としては原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞及び動物細胞が挙げられる。別の態様において、宿主細胞としては限定されないが、原核細胞株である大腸菌；哺乳動物細胞株であるＣＨＯ、ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ；昆虫細胞株であるＳｆ９；並びに真菌細胞であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが挙げられる。
【０１０８】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換（例えばエレクトロポレーション及びリポフェクション）には標準技術を使用することができる。酵素反応及び精製技術は製造業者の指示に従うか、当分野で広く実施されている方法に従うか、又は本願の記載に従って実施することができる。上記技術及び手順は当分野で周知の慣用方法に従い、本明細書の随所に引用及び説明する各種一般資料及び特定資料に記載されているように一般に実施することができる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９）参照。
【０１０９】
「トランスジェニック生物」なる用語は細胞にトランスジーンを導入した生物を意味し、生物（又は生物の祖先）に導入されたトランスジーンはこの生物で天然には発現されないポリペプチドを発現する。「トランスジーン」はトランスジェニック生物の発生源である細胞のゲノムに安定的且つ機能的に組込まれ、トランスジェニック生物の１種以上の細胞種又は組織においてコードされる遺伝子産物の発現を誘導するＤＮＡコンストラクトである。
【０１１０】
「調節」及び「変調」なる用語は同義に使用し、目的分子の活性（例えばｈＩＬ−１αの生物学的活性）の変更又は改変を意味する。変調は目的分子の所定活性又は機能の強さの増減とすることができる。分子の典型的な活性及び機能としては限定されないが、結合特性、酵素活性、細胞受容体活性化及びシグナル伝達が挙げられる。
【０１１１】
これに対応して、「モジュレーター」なる用語は目的分子の活性又は機能（例えばｈＩＬ−１αの生物学的活性）を変更又は改変することが可能な化合物である。例えば、モジュレーターはモジュレーターの不在下で観察される活性又は機能の強さに比較して分子の所定活性又は機能の強さを増減させることができる。所定態様において、モジュレーターは分子の少なくとも１種の活性又は機能の強さを低下させる阻害剤である。典型的な阻害剤としては限定されないが、蛋白質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、糖質又は有機低分子が挙げられる。ペプチボディは例えばＰＣＴ公開第ＷＯ０１／８３５２５号に記載されている。
【０１１２】
「アゴニスト」なる用語は目的分子と接触した場合に、アゴニストの不在下で観察される活性又は機能の強さに比較して分子の所定活性又は機能の強さを増加させるモジュレーターを意味する。特定の有用なアゴニストとしては限定されないが、ポリペプチド、核酸、糖質、又はＩＬ−１α及び／もしくはＩＬ−１βと結合する他の任意分子が挙げられる。
【０１１３】
「アンタゴニスト」又は「阻害剤」なる用語は目的分子と接触した場合に、アンタゴニストの不在下で観察される活性又は機能の強さに比較して分子の所定活性又は機能の強さを低下させるモジュレーターを意味する。アンタゴニストとしては、ＩＬ−１α及び／又はＩＬ−１βの生物学的活性又は免疫活性を阻害又は変調させるものが挙げられる。ＩＬ−１αのアンタゴニスト及び阻害剤としては限定されないが、ポリペプチド、核酸、糖質、又はＩＬ−１αと結合する他の任意分子が挙げられる。ＩＬ−１βのアンタゴニスト及び阻害剤としては限定されないが、ポリペプチド、核酸、糖質、又はＩＬ−１βと結合する他の任意分子が挙げられる。
【０１１４】
「有効量」なる用語は障害又はその１種以上の症状の重篤度及び／又は持続期間を低減又は改善するため、障害の進行を予防するため、障害の軽減を誘導するため、障害に伴う１種以上の症状の再発、発現、発症又は進行を予防するため、障害を検出するため、あるいは別の療法（例えば予防剤又は治療剤）の予防又は治療効果を強化又は改善するために十分な療法の量を意味する。
【０１１５】
「サンプル」なる用語はその最も広義な意味で使用する。「生体サンプル」としては限定されないが、生体又はかつての生体に由来する任意量の物質が挙げられる。このような生体としては限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギ及び他の動物が挙げられる。このような物質としては限定されないが、血液、血清、尿、滑液、細胞、臓器、組織、骨髄、リンパ節及び脾臓が挙げられる。
【０１１６】
「親和性成熟」抗体とは１個以上のＣＤＲ又はそのフレームワークの１カ所以上の改変の結果、このような改変をもたない親抗体に比較して抗体の抗原親和性が改善された抗体である。好ましい親和性成熟抗体は標的抗原に対する親和性値がナノモル又はピコモルとなる。親和性成熟抗体は当分野で公知の方法により生産される。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３はＶＨ及びＶＬ領域シャフリングによる親和性成熟について記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発はＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３；Ｓｃｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−３３１９；及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６に記載されている。
【０１１７】
疼痛の初期原因が消滅した後も個体に持続する疼痛はもはや症状ではなく、それ自体が認定された疾患となる。本願で使用する「アロディニア」なる用語は個体が皮膚のブラシ擦過等の典型的には機械的な種類の一般に無害な刺激に対する疼痛反応を生じる状態を意味する。アロディニア疼痛は侵害受容器を介さないので、「非侵害受容性」疼痛と言う場合もある。本願で使用する「痛覚過敏」なる用語は有害な刺激、特に疼痛性の機械的、熱的又は化学的刺激等の侵害受容器を活性化させる刺激に起因する疼痛に対して個体の感受性が亢進している状態を意味する。侵害受容器を活性化させる刺激は疼痛の原因となる。痛覚過敏は通常では有害な刺激に対して個体の疼痛反応が亢進している状態である。個体はアロディニア、痛覚過敏、又はアロディニアと痛覚過敏の併発を生じる場合がある。
【０１１８】
Ｉ．ＩＬ−１α及びＩＬ−１βと結合するＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）結合性蛋白質の作製
１以上の標的抗原（又はエピトープ）と結合することが可能な二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標））結合性蛋白質の設計と作製については記載されている（例えば公開第ＷＯ２００７／０２４７１５号参照）。本願に記載する変形性関節症の治療方法及び組成物で有用なＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質はＩＬ−１α及びＩＬ−１βと結合する。１態様において、ＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）結合性蛋白質は少なくとも２本のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、前記式中、ＶＤ１は第１の重鎖可変領域であり、ＶＤ２は第２の重鎖可変領域であり、Ｃは重鎖定常領域であり、Ｘ１はリンカーであり、但し、ＣＨ１以外のものであり、Ｘ２はＦｃ領域であり；第２のポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、前記式中、ＶＤ１は第１の軽鎖可変領域であり、ＶＤ２は第２の軽鎖可変領域であり、Ｃは軽鎖定常領域であり、Ｘ１はリンカーであり、但しＣＨ１以外のものであり、Ｘ２はＦｃ領域を含まず；ｎは０又は１である。第１及び第２のポリペプチド鎖から構成されるＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）結合性蛋白質は２個の抗原結合部位をもつ。
【０１１９】
別の態様において、ＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）結合性蛋白質は４本のポリペプチド鎖を含み、第１の２本の各ポリペプチド鎖は夫々ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、前記式中、ＶＤ１は第１の重鎖可変領域であり、ＶＤ２は第２の重鎖可変領域であり、Ｃは重鎖定常領域であり、Ｘ１はリンカーであり、但しＣＨ１以外のものであり、Ｘ２はＦｃ領域であり；第２の２本の各ポリペプチド鎖は夫々ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−Ｃ−（Ｘ２）ｎを含み、前記式中、ＶＤ１は第１の軽鎖可変領域であり、ＶＤ２は第２の軽鎖可変領域であり、Ｃは軽鎖定常領域であり、Ｘ１はリンカーであり、但しＣＨ１以外のものであり、Ｘ２はＦｃ領域を含まず；ｎは０又は１である。このようなＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）結合性蛋白質は４個の抗原結合部位をもつ。
【０１２０】
例えば、個体における変形性関節症を治療するための本願に記載する方法及び組成物で有用なＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質は前記２本のポリペプチド（第１及び第２のポリペプチド）のＶＤ１可変領域の会合により形成されるＩＬ−１βの結合部位と、前記２本のポリペプチド（第１及び第２のポリペプチド）のＶＤ２可変領域の会合により形成されるＩＬ−１αの結合部位をもつように構築することができる。代替構成において、個体における変形性関節症を治療するための本願に記載する方法及び組成物で有用なＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質は前記２本のポリペプチド（第１及び第２のポリペプチド）のＶＤ１可変領域の会合により形成されるＩＬ−１αの結合部位と、前記２本のポリペプチド（第１及び第２のポリペプチド）のＶＤ２可変領域の会合により形成されるＩＬ−１βの結合部位をもつものでもよい。
【０１２１】
Ａ．親モノクローナル抗体の作製
ＤＶＤ結合性蛋白質の可変領域は目的抗原と結合することが可能なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む親抗体から得ることができる。これらの抗体は天然に存在するものでもよいし、組換え技術により作製したものでもよい。
【０１２２】
モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術、組換え技術及びファージディスプレイ技術又はその組合せの使用を含む当分野で公知の多様な技術を使用して作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は例えばＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１），ｐａｇｅｓ  ５６３−５８１（前記文献はその内容全体を本願に援用する）に教示されている当分野で公知の技術等のハイブリドーマ技術を使用して産生させることができる。本願で使用する「モノクローナル抗体」（略称「ｍＡｂ」）なる用語はハイブリドーマ技術により産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」なる用語は任意の真核、原核又はファージクローン等の単一クローンに由来する抗体を意味し、その産生方法に限定されない。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、標準方法を使用して活発なハイブリドーマ増殖、高い抗体産生及び望ましい抗体特性を含む望ましい特性について更にスクリーニングする。ハイブリドーマを培養し、同系動物、免疫系を欠損する動物（例えばヌードマウス）でインビボ増殖させるか、あるいは細胞培養でインビトロ増殖させる。ハイブリドーマの選択、クローニング及び増殖方法は当業者に周知である。好ましい態様において、ハイブリドーマはマウスハイブリドーマである。別の態様において、ハイブリドーマは非ヒト非マウス種（例えばラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ又はウマ）で産生される。別の態様において、ハイブリドーマはＩＬ−１αやＩＬ−１β等の特定の望ましい抗原と結合することが可能な抗体を発現するヒト細胞にヒト非分泌型骨髄腫細胞を融合したヒトハイブリドーマである。
【０１２３】
米国特許第５，６２７，０５２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０２５５１号及びＢａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−７８４８に記載されているように、選択的リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）と当分野で呼ばれる方法を使用して単一の単離リンパ球から組換えモノクローナル抗体を作製してもよい。この方法では、目的抗体を分泌する単一細胞（例えば免疫した動物に由来するリンパ球）を同定し、重鎖及び軽鎖可変領域ｃＤＮＡを逆転写酵素−ＰＣＲにより細胞からレスキューした後、これらの可変領域をＣＯＳ又はＣＨＯ細胞等の哺乳動物宿主細胞で適切な免疫グロブリン定常領域（例えばヒト定常領域）のコンテキストにおいて発現させることができる。インビボ選択したリンパ球に由来する増幅後の免疫グロブリン配列をトランスフェクトした宿主細胞をその後、例えばトランスフェクトした細胞をパンニングして目的抗原に対する抗体を発現する細胞を単離することにより、更にインビトロ解析及び選択することができる。増幅後の免疫グロブリン配列をＰＣＴ公開第ＷＯ９７／２９１３１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ００／５６７７２号に記載されている方法等のインビトロ親和性成熟法等により更にインビトロ操作することができる。
【０１２４】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部又は全部を含む非ヒト動物に目的抗原を免疫することによりモノクローナル抗体を産生させてもよい。１態様において、非ヒト動物はヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きなフラグメントを含み且つマウス抗体産生を欠損する遺伝子組換えマウス系列であるＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスである。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３  ２１並びに米国特許第５，９１６，７７１号；５，９３９，５９８号；５，９８５，６１５号；５，９９８，２０９号；６，０７５，１８１号；６，０９１，００１号；６，１１４，５９８号及び６，１３０，３６４号参照。更にＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１０７４１号；ＷＯ９４／０２６０２号；ＷＯ９６／３４０９６号；ＷＯ９６／３３７３５号；ＷＯ９８／１６６５４号；ＷＯ９８／２４８９３号；ＷＯ９８／５０４３３号；ＷＯ９９／４５０３１号；ＷＯ９９／５３０４９号；ＷＯ００／０９５６０号；及びＷＯ００／３７５０４号も参照。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは全長ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトヒトモノクローナル抗体を産生する。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスはヒト重鎖遺伝子座とχ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖細胞系列構成ＹＡＣフラグメントの導入によりヒト抗体レパートリーの約８０％を含む。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６及びＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５参照。
【０１２５】
抗体ライブラリーをスクリーニングして所望の結合特異性をもつ抗体を同定するインビトロ法を使用して親抗体を作製することもできる。組換え抗体ライブラリーのこのようなスクリーニング方法は当分野で周知であり、例えば米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号、ＷＯ９１／１７２７１号、ＷＯ９２／２０７９１号、ＷＯ９２／１５６７９号、ＷＯ９３／０１２８８号、ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９２／０９６９０号、ＷＯ９７／２９１３１号；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３６９−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２及び米国特許公開第２００３／０１８６３７４号に記載されている方法が挙げられる。
【０１２６】
本発明で有用な親抗体は当分野で公知の各種ファージブィスプレイ法を使用して作製することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子表面にこれらの抗体ドメインを提示させる。特に、このようなファージを利用してレパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒト又はマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示させることができる。抗原（例えば標識抗原又は固体表面もしくはビーズに固定化もしくは捕捉した抗原）を使用して、目的抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを選択又は同定することができる。これらの方法で使用されるファージは典型的にはファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩ蛋白質と組換え融合したＦａｂ、Ｆｖ又はジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインをもつファージから発現されるｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含む線維状ファージである。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０；Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０２８０９号；ＷＯ９１／１０７３７号；ＷＯ９２／０１０４７号；ＷＯ９２／１８６１９号；ＷＯ９３／１１２３６号；ＷＯ９５／１５９８２号；及びＷＯ９５／２０４０１号；並びに米国特許第５，６９８，４２６号；５，２２３，４０９号；５，４０３，４８４号；５，５８０，７１７号；５，４２７，９０８号；５，８２１，０４７号；５，５７１，６９８号；５，４２７，９０８号；５，５１６，６３７号；５，７８０，２２５号；５，６５８，７２７号；５，７３３，７４３号及び５，９６９，１０８号に開示されている方法が挙げられる。
【０１２７】
上記文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージに由来する抗体コーディグ領域を単離し、これを使用してヒト抗体又は他の任意の所望抗原結合フラグメントを含む全長抗体を作製し、例えば本願に詳述するように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌等の任意の所望宿主で発現させることができる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９；Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：２６−３４；及びＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３に開示されている方法等の当分野で公知の方法を使用してＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え作製するための技術を利用することもできる。１本鎖Ｆｖ及び抗体を作製するために使用することができる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号及び５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：４６−８８；Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７９９５−７９９９；並びにＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４１に記載されている技術が挙げられる。
【０１２８】
ファージディスプレイ法により組換え抗体ライブラリーをスクリーニングする代わりに、大規模コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当分野で公知の他の方法を親抗体の同定に適用することもできる。代替発現システムの１例はＳｚｏｓｔａｋ  ａｎｄ  ＲｏｂｅｒｔｓのＰＣＴ公開第ＷＯ９８／３１７００号及びＲｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２に記載されているように、組換え抗体ライブラリーをＲＮＡ−蛋白質融合体として発現させるシステムである。このシステムでは、ペプチドアクセプター抗生物質であるピューロマイシンをその３’末端に付加した合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳により、ｍＲＮＡとこのｍＲＮＡによりコードされるペプチド又は蛋白質の共有結合的融合体を作製する。従って、コードされるペプチド又は蛋白質（例えば抗体又はその部分）の特性（例えば二重特異性抗原と抗体又はその部分の結合）に基づいてｍＲＮＡの複雑な混合物（例えばコンビナトリアルライブラリー）から特定のｍＲＮＡを集積させることができる。このようなライブラリーのスクリーニングから回収された抗体又はその部分をコードする核酸配列を上記のような組換え手段により（例えば哺乳動物宿主細胞で）発現させることができ、更に、当初に選択した配列に突然変異を導入したｍＲＮＡ−ペプチド融合体のスクリーニングラウンドの追加又は上記のような組換え抗体の他のインビトロ親和性成熟法により更に親和性成熟させることができる。
【０１２９】
別のアプローチでは、当分野で公知の酵母ディスプレイ法を使用して親抗体を作製することもできる。酵母ディスプレイ法では、遺伝子法を使用して抗体ドメインを酵母細胞壁に結合した後に酵母表面に提示させる。特に、このような酵母はレパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒト又はマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示させるために利用することができる。親抗体を作製するために使用することができる酵母ディスプレイ法の例としては、米国特許第６，６９９，６５８号に開示されている方法が挙げられる。
【０１３０】
上記抗体を更に改変し、ＣＤＲ移植ヒト化親抗体を作製することもできる。ＣＤＲ移植抗体はヒト抗体に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含み、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１個以上が目的抗原と結合することが可能なマウス抗体のＣＤＲ配列で置換されている。任意ヒト抗体に由来するフレームワーク配列をＣＤＲ移植の鋳型として使用することができる。しかし、このようなフレームワークに直接鎖置換すると、抗原に対する結合親和性が多少低下することが多い。元のマウス抗体に対するヒト抗体の相同性が高いほど、マウスＣＤＲとヒトフレームワークの結合によりＣＤＲに歪みが導入されて親和性が低下する可能性は低くなる。従って、ＣＤＲ以外のマウス可変領域フレームワークに置換するために選択されるヒト可変領域フレームワークはマウス抗体可変領域フレームワークに対して少なくとも約６５％の配列一致度をもつことが好ましい。ＣＤＲ以外のヒト及びマウス可変領域は少なくとも約７０％の配列一致度をもつことがより好ましい。ＣＤＲ以外のヒト及びマウス可変領域は少なくとも約７５％の配列一致度をもつことが更に好ましい。ＣＤＲ以外のヒト及びマウス可変領域は少なくとも約８０％の配列一致度をもつことが最も好ましい。このような抗体の作製方法は当分野で公知であり（ＥＰ２３９，４００号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；５，５３０，１０１号；及び５，５８５，０８９号参照）、更にベニアリング又はリサーフェシング（ＥＰ５９２，１０６号及びＥＰ５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６９−９７３）やチェーンシャフリング（米国特許第５，５６５，３５２号）も記載されている。
【０１３１】
ヒト化抗体は目的抗原と結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子であり、非ヒト種に由来する１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域をもつ。公知ヒトＩｇ配列は例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ−／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ−０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｍ−ｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏ−ｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．−ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｌ／；ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ−；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃｊｐ／．ａｂｏｕｔ．ｙａｓｕｈｉｔｏ−／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎ−ｋｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／．ａｂｏｕｔ．ｒｅｋ／ＡＥＰ−Ｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／．ａｂｏｕｔ．ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓｌ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕ−ｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／．ａｂｏｕｔ．ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍ−ｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｕｂｃｇ０７ｓ／；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃ７／ｈ−ｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏ−ｕｔ．ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ−ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒ  ｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）に開示されており、各々その開示内容全体を本願に援用する。当分野で公知の通り、このようなインポート配列を使用して免疫原性を低下させたり、結合、親和性、会合速度、解離速度、アビディティ、特異性、半減期、又は任意の他の適切な特性を低下、増加又は改変することができる。
【０１３２】
抗原結合を改変、好ましくは改善するためには、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基をＣＤＲドナー抗体に由来する対応する残基で置換すればよい。これらのフレームワーク置換は当分野で周知の方法により同定され、例えばＣＤＲ残基とフレームワーク残基の相互作用のモデル化により抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定し、配列比較により特定位置の異常なフレームワーク残基を同定する。例えば米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３参照。三次元免疫グロブリンモデルは広く入手可能であり、当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元配座構造を図解表示するコンピュータープログラムも入手可能である。これらの表示を精査すると、候補免疫グロブリン配列の機能に残基が果たす可能性のある役割を分析することができ、即ち候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響を与える残基を分析することができる。こうして、標的抗原に対する親和性の増加等の所望の抗体特性が得られるようにコンセンサス配列とインポート配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は抗原結合への影響に直接且つ最も実質的に関与している。当分野で公知の各種技術を使用して抗体をヒト化することができ、限定されないが、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３；Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６９−９７３；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０９９６７号、ＷＯ９０／１４４４３号、ＷＯ９０／１４４２４号、ＷＯ９０／１４４３０号、ＷＯ９９／０６８３４号（ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６２８０）、ＷＯ９７／２００３２号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１８９７８）、ＷＯ９２／１１２７２号（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０９６３０）、ＷＯ９２／０３４６１号（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５９３９）、ＷＯ９４／１８２１９号（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３４）、ＷＯ９２／０１０４７号（ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４）及びＷＯ９３／０６２１３号（ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５）；ＥＰ０５９２１０６号、ＥＰ０５１９５９６号、ＥＰ０２３９４００号；米国特許第５，５６５，３３２号；５，７２３，３２３号；５，９７６，８６２号；５，８２４，５１４号；５，８１７，４８３号；５，８１４，４７６号；５，７６３，１９２号；５，７２３，３２３号；５，７６６，８８６号；５，７１４，３５２号；６，２０４，０２３号；６，１８０，３７０号；５，６９３，７６２号；５，５３０，１０１号；５，５８５，０８９号；５，２２５，５３９号；及び４，８１６，５６７号に記載されている技術が挙げられる。
【０１３３】
親モノクローナル抗体はＩＬ−１α又はＩＬ−１βと結合することが可能な各種モノクローナル抗体から選択することができる。
【０１３４】
親モノクローナル抗体は臨床試験又は臨床用開発での使用に認可されている各種治療用抗体から選択することもできる。
【０１３５】
Ｂ．ＤＶＤ−Ｉｇ分子の構築
二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）分子は２種類の異なる親モノクローナル抗体に由来する２個の異なる軽鎖可変領域（ＶＬ）を組換えＤＮＡ技術により直接又は短いリンカーを介してタンデムに連結した後、軽鎖定常領域を連結するように設計される。同様に、重鎖はタンデムに連結された２個の異なる重鎖可変領域（ＶＨ）と、それに続く定常領域ＣＨ１とＦｃ領域を含む。ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０２４７１５号参照。
【０１３６】
可変領域は上記方法の任意１種により作製した親抗体から組換えＤＮＡ技術を使用して取得することができる。好ましい１態様において、可変領域はマウス重鎖又は軽鎖可変領域である。より好ましくは、可変領域はＣＤＲ移植又はヒト化重鎖又は軽鎖可変領域である。最も好ましくは、可変領域はヒト重鎖又は軽鎖可変領域である。
【０１３７】
１態様では、組換えＤＮＡ技術を使用して第１の可変領域と第２の可変領域を相互に直接連結する。別の態様では、リンカー配列を介して前記可変領域を連結する。２個の可変領域を連結することが好ましい。３個以上の変領域を直接又はリンカー配列を介して連結してもよい。可変領域は同一抗原と結合するものでもよいし、異なる抗原と結合するものでもよい。本発明のＤＶＤ−Ｉｇ分子は１個の免疫グロブリン可変領域と１個の非免疫グロブリン可変領域（例えば受容体のリガンド結合領域、酵素の活性領域）を含むものでもよい。ＤＶＤ−Ｉｇ分子は２個以上の非Ｉｇ領域を含むものでもよい。
【０１３８】
リンカー配列は単一アミノ酸でもよいし、ポリペプチド配列でもよい。本願に記載する方法及び組成物で有用なＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質を設計及び作製するのに使用することができるリンカー配列の例としては、限定されないが、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号５９）；ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号６０）；ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号６１）；ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号６２）；ＳＡＫＴＴＰ（配列番号６３）；ＲＡＤＡＡＰ（配列番号６４）；ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号６５）；ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（配列番号６６）；ＲＡＤＡＡＡＡ（Ｇ４Ｓ）４（配列番号６７）；ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号６８）；ＡＤＡＡＰ（配列番号６９）；ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（配列番号７０）；ＴＶＡＡＰ（配列番号７１）；ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号７２）；ＱＰＫＡＡＰ（配列番号７３）；ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号７４）；ＡＫＴＴＰＰ（配列番号７５）；ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（配列番号７６）；ＡＫＴＴＡＰ（配列番号７７）；ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号７８）；ＡＳＴＫＧＰ（配列番号７９）；ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号８０）；ＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号８１）；  ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８２）；ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（配列番号８３）；ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号８４）；ＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（配列番号８５）；ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号８６）；及びＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号８７）が挙げられる。リンカー配列の選択は数個のＦａｂ分子の結晶構造に基づいて行われる。Ｆａｂ又は抗体分子構造では可変領域とＣＨ１／ＣＬ  定常領域の天然のフレキシブルな連結が存在する。この天然の連結はＶ領域のＣ末端からの４〜６残基とＣＬ／ＣＨ１領域のＮ末端からの４〜６残基を含む約１０〜１２アミノ酸残基を含む。１態様において、本発明で有用なＤＶＤ−Ｉｇ分子はＤＶＤ−Ｉｇ分子の夫々軽鎖及び重鎖のリンカーとしてＣＬ又はＣＨ１のＮ末端５〜６アミノ酸残基又は１１〜１２アミノ酸残基を使用して作製される。ＣＬ又はＣＨ１領域のＮ末端残基、特に最初の５〜６アミノ酸残基は強い二次構造をもたないループ配置をとるため、２個の可変領域間のフレキシブルなリンカーとして機能することができる。ＣＬ又はＣＨ１領域のＮ末端残基は免疫グロブリン配列の一部であるので可変領域の天然の延長であり、従って、リンカーと結合部に起因する可能性のある免疫原性を最小限にすることができる。
【０１３９】
他のリンカー配列としては、ＣＬ／ＣＨ１領域の全残基ではない任意長さのＣＬ／ＣＨ１領域の任意配列が挙げられ、例えばＣＬ／ＣＨ１領域の最初の５〜１２アミノ酸残基が挙げられ、軽鎖リンカーはＣκ又はＣλに由来することができ、重鎖リンカーはＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε及びＣμを含む任意アイソタイプのＣＨ１に由来することができる。リンカー配列はＩｇ様蛋白質（例えばＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、Ｇ／Ｓ由来配列（例えばＧ４Ｓ（配列番号８８）反復配列）、ヒンジ領域由来配列、及び他の蛋白質に由来する他の天然配列等の他の蛋白質に由来するものでもよい。
【０１４０】
１態様では、組換えＤＮＡ技術を使用して２個の連結された可変領域に定常領域を連結する。連結された重鎖可変領域を含む配列を重鎖定常領域と連結し、軽鎖可変領域を含む配列を軽鎖定常領域と連結することが好ましい。ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質をヒトで使用する場合には、好ましくは、前記定常領域は夫々ヒト重鎖定常領域及び軽鎖定常領域である。ＤＶＤ−Ｉｇ重鎖を更にＦｃ領域と連結することが好ましい。Ｆｃ領域は天然配列Ｆｃ領域でもよいし、変異体Ｆｃ領域でもよい。最も好ましくは、前記Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域である。好ましい態様において、Ｆｃ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤに由来するＦｃ領域を含む。
【０１４１】
１態様では、２本の重鎖ＤＶＤ−Ｉｇポリペプチドと２本の軽鎖ＤＶＤ−Ｉｇポリペプチドを結合し、ＤＶＤ−Ｉｇ分子を形成する。特定標的と結合することが可能な特定のＤＶＤ−Ｉｇ分子の例と、その作製方法の詳細については従来記載されている。例えばＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０２４７１５号参照。
【０１４２】
Ｃ．ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の作製
ＩＬ−１α及びＩＬ−１βと結合し、本願に記載する変形性関節症の治療方法及び組成物で有用なＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質は当分野で公知の多数の技術の任意のものにより作製することができる。例えばＰＣＴ公開第２００７／０２４７１５号参照。例えば、ＤＶＤ−Ｉｇ重鎖とＤＶＤ−Ｉｇ軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術により宿主細胞にトランスフェクトして宿主細胞から発現させる。「トランスフェクション」なる用語の各種語形は原核又は真核宿主細胞に外来ＤＮＡを導入するために広く使用されている多様な技術（例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等）を包含するものとする。原核宿主細胞でも真核宿主細胞でもＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質を発現させることは可能であるが、真核細胞（特に哺乳動物細胞）のほうが原核細胞よりも正しく折り畳まれた免疫学的に活性なＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質を組立・分泌し易いので、真核細胞でＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質を発現させることが好ましく、哺乳動物宿主細胞で発現させることが最も好ましい。
【０１４３】
本発明の組換え抗体を発現させるのに好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようなＤＨＦＲ選択マーカーと併用されるＵｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。ＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合には、宿主細胞でＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質を発現させるために十分な時間、又はより好ましくは宿主細胞を増殖させる培養培地中にＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質を分泌させるために十分な時間にわたって宿主細胞を培養することによりＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質を産生させる。標準蛋白質精製法を使用して培養培地からＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質を回収することができる。
【０１４４】
本発明で有用なＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質の好ましい組換え発現システムでは、ＤＶＤ−Ｉｇ重鎖とＤＶＤ−Ｉｇ軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターをリン酸カルシウムトランスフェクション法によりｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、ＤＶＤ−Ｉｇ重鎖及び軽鎖遺伝子は遺伝子の高レベル転写を誘導するように各々ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントと機能的に連結されている。組換え発現ベクターは更に、メトトレキサート選択／増幅を使用してベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にするＤＨＦＲ遺伝子を保持する。選択された形質転換宿主細胞を培養し、ＤＶＤ−Ｉｇ重鎖及び軽鎖を発現させ、無傷のＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質を培養培地から回収する。標準分子生物学技術を使用して組換え発現ベクターを作製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換細胞を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地からＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質を回収する。更に、本発明は本発明のＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質が合成されるまで適切な培養培地で本発明の宿主細胞を培養することにより本発明のＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質を合成する方法を提供する。本方法は更に培養培地からＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質を単離する段階を含むことができる。
【０１４５】
ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の１つの重要な特徴は従来の抗体と同様に産生・精製できる点である。ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の産生の結果、定常領域の配列改変又は任意種類の化学的改変を伴わずに、所望の二重特異性活性をもつ均質で単一の主要産物が得られる。「二重特異性」、「多重特異性」及び「多重特異性多価」全長結合性蛋白質の作製方法として従来記載されている他の方法では単一の主要産物が得られず、不活性な単一特異性、多重特異性の寄せ集めの多価全長結合性蛋白質と、種々の結合部位の組合せを含む多価全長結合性蛋白質の混合物が細胞内又は分泌により産生される。１例として、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔａ（ＰＣＴ公開第ＷＯ２００１／０７７３４２号）に記載されているデザインによると、重鎖と軽鎖の１６通りの異なる組合せが存在する。従って、望ましい活性形態となる可能性があるのは６．２５％の蛋白質に過ぎない。大規模製造で一般に使用される標準クロマトグラフィー技術を使用して蛋白質の不活性形態及び部分的に活性な形態から蛋白質の完全に活性な形態を分離する方法も立証されていない。
【０１４６】
驚くべきことに、「二重特異性多価全長結合性蛋白質」であるＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質のデザインによると、二重可変領域軽鎖と二重可変領域重鎖が結合され、主に望ましい「二重特異性多価全長結合性蛋白質」、即ち機能的なＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質が得られる。ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０２４７１５号参照。
【０１４７】
ＩＩ．結晶性誘導体化結合性蛋白質
本発明は結合性蛋白質が結晶である変形性関節症の治療方法及び組成物を包含する。１態様において、結晶化結合性蛋白質は可溶性の前記結合性蛋白質よりもインビボ半減期が長い。別の態様において、前記結合性蛋白質は結晶化後に生物学的活性を維持する。
【０１４８】
本発明で有用な結晶化結合性蛋白質は本願に援用するＰＣＴ公開第ＷＯ０２０７２６３６号に開示されているような当分野で公知の方法により作製することができる。
【０１４９】
本発明の別の態様は結合性蛋白質又はその抗原結合部分が１個以上の糖質残基を含むグリコシル化結合性蛋白質を利用する。初期インビボ蛋白質産生は更に翻訳後修飾と呼ばれるプロセシングを受ける場合がある。特に、糖（グリコシル）残基が酵素により付加される場合があり、このプロセスをグリコシル化と言う。その結果として得られる蛋白質は共有結合したオリゴ糖側鎖をもち、グリコシル化蛋白質又は糖蛋白質と呼ばれる。抗体はＦｃ領域と可変領域に１以上の糖質残基を含む糖蛋白質である。Ｆｃ領域の糖質残基はＦｃ領域のエフェクター機能に重要な影響を与え、抗体の抗原結合又は半減期に与える影響は最小限である（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２１：１１−１６）。他方、可変領域のグリコシル化は抗体の抗原結合活性に影響を与える可能性がある。可変領域のグリコシル化は恐らく立体障害により、抗体結合親和性に負の影響を与える可能性（Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１３６１−１３６７）や、抗原に対する親和性の増加を生じる可能性（Ｗａｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１０９９−１１０９；Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２７１７−２７２３）がある。
【０１５０】
結合性蛋白質のＯ又はＮ結合型グリコシル化部位が突然変異されているグリコシル化部位突然変異体を作製することも可能である。当業者は標準技術を使用してこのような突然変異体を作製することができる。本願に記載する変形性関節症の治療方法及び組成物では生物学的活性を維持しながら結合活性が増加又は低下したグリコシル化部位突然変異体を使用してもよい。
【０１５１】
本発明の方法及び組成物で有用な結合性蛋白質又はその抗原結合部分のグリコシル化を改変してもよい。例えば非グリコシル化抗体を作製することができる（即ち、抗体はグリコシル化を欠損している）。例えば、抗原に対する抗体の親和性を増すようにグリコシル化を改変することができる。このような糖鎖改変は例えば抗体配列内の１カ所以上のグリコシル化部位を改変することにより行うことができる。例えば、１カ所以上のアミノ酸置換の結果、１カ所以上の可変領域グリコシル化部位を除去することにより、この部位のグリコシル化を欠損させることができる。このような非グリコシル化は抗原に対する抗体の親和性を増すことができる。このようなアプローチはＰＣＴ公開第ＷＯ２００３／０１６４６６号並びに米国特許第５，７１４，３５０号及び６，３５０，８６１号に更に詳細に記載されている。
【０１５２】
上記に加え、又は上記の代わりに、フコシル残基数の少ない低フコシル化抗体や、バイセクトＧｌｃＮＡｃ構造の多い抗体等のグリコシル化型を改変させた本発明で有用な改変型結合性蛋白質を作製することもできる。このような改変グリコシル化パターンは抗体のＡＤＣＣ能を亢進することが分かっている。このような糖鎖改変は例えばグリコシル化機序を改変させた宿主細胞で前記結合性蛋白質を発現させることにより実施することができる。グリコシル化機序を改変させた細胞は文献に記載されており、グリコシル化を改変させた抗体を産生させるために本発明の組換え抗体を発現させる宿主細胞として使用することができる。例えば，Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８１、ヨーロッパ特許第ＥＰ１，１７６，１９５号；並びにＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０３５８３５号及びＷＯ９９／５４３４２８０号参照。
【０１５３】
蛋白質グリコシル化は目的蛋白質のアミノ酸配列と、蛋白質が発現される宿主細胞に依存する。生物によって異なるグリコシル化酵素（例えばグリコシルトランスフェラーゼやグリコシダーゼ）が産生され、利用可能な基質（ヌクレオチド糖）も異なる場合がある。このような因子により、蛋白質グリコシル化パターンとグリコシル残基の組成は特定蛋白質が発現される宿主系により異なる場合がある。本発明で有用な結合性蛋白質のグリコシル残基としては限定されないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミン及びシアル酸が挙げられる。好ましくは、グリコシル化結合性蛋白質はグリコシル化パターンがヒトであるようなグリコシル残基を含む。
【０１５４】
蛋白質グリコシル化の相違の結果、蛋白質特性が相違することは当業者に知られている。例えば、酵母等の微生物宿主で産生され、酵母内在経路を利用してグリコシル化された治療用蛋白質の効力はＣＨＯ細胞株等の哺乳動物細胞で発現される同一蛋白質の効力に比較して低いと思われる。このような糖蛋白質はヒトでも免疫原性の可能性があり、投与後のインビボ半減期が短いと思われる。ヒト及び他の動物における特定受容体は特定グリコシル残基を認識し、血流からの蛋白質の迅速なクリアランスを促進する場合がある。他の有害な作用としては、蛋白質フォールディング、溶解度、プロテアーゼ感受性、トラフィキング、輸送、区画化、分泌、他の蛋白質もしくは因子による認識、抗原性又はアレルゲン性の変化が挙げられる。従って、医師は特定のグリコシル化組成及びパターン（例えばヒト細胞又は所期対象動物の種特異的細胞で産生されるものと同一又は少なくとも同様のグリコシル化組成及びパターン）をもつ治療用蛋白質を選択すると思われる。
【０１５５】
異種グリコシル化酵素を発現するように宿主細胞を遺伝子改変することにより、宿主細胞と異なるグリコシル化蛋白質を発現させることができる。当分野で公知の技術を使用して医師はヒト蛋白質グリコシル化を示す抗体又はその抗原結合部分を作製することができる。例えば、酵母株で産生されるグリコシル化蛋白質（糖蛋白質）が動物細胞、特にヒト細胞と同一の蛋白質グリコシル化を示すように、酵母株が非天然グリコシル化酵素を発現するように遺伝子改変されている（米国特許公開第２００４／００１８５９０号及び２００２／０１３７１３４号並びにＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１００５８４号）。
【０１５６】
更に、当業者に自明の通り、ライブラリーのメンバー宿主細胞が変異グリコシル化パターンをもつ目的蛋白質を産生するように、各種グリコシル化酵素を発現するように遺伝子改変した宿主細胞ライブラリーを使用して目的蛋白質を発現させることもできる。その後、医師は特定の新規グリコシル化パターンをもつ目的蛋白質を選択・単離することができる。好ましくは、特に選択された新規グリコシル化パターンをもつ蛋白質は改善又は改変された生物学的性質を示す。
【０１５７】
ＩＶ．医薬組成物
本発明の方法は個体における変形性関節症又は疼痛の治療用医薬組成物として、ＩＬ−１α及び／又はＩＬ−１βと結合する１種以上の結合性蛋白質を含有する組成物を利用する。このような組成物は更に、医薬的に許容可能な担体、希釈剤及び／又は賦形剤、あるいは１種以上の結合性蛋白質のＩＬ−１α及び／又はＩＬ−１β結合活性以外の望ましい治療的、医薬的又は薬理的利点を組成物に提供する他の任意化合物を含有することができる。１態様において、本発明による個体における変形性関節症又は疼痛の治療に有用な組成物はＩＬ−１αと結合する結合性蛋白質（例えば抗ＩＬ−１α抗体）と、ＩＬ−１βと結合する結合性蛋白質（例えば抗ＩＬ−１β抗体）又はＩＬ−１α及び／又はＩＬ−１βの両方と結合する結合性蛋白質（例えばＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質）を含有する。
【０１５８】
本発明の方法で有用な結合性蛋白質は対象に投与するのに適した医薬組成物に配合することができる。典型的には、医薬組成物はＩＬ−１α及び／又はＩＬ−１βと結合する１種以上の結合性蛋白質と、医薬的に許容可能な担体を含有する。本願で使用する「医薬的に許容可能な担体」とは生理的に適合可能な全溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を広く包含する。医薬的に許容可能な担体の例としては水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等の１種以上とその組み合わせが挙げられる。多くの場合には、例えば糖類、多価アルコール（例えばマンニトール、ソルビトール）、又は塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に加えることが好ましい。医薬的に許容可能な担体は更に抗体又は抗体部分の保存期間又は効力を増す微量の助剤（例えば湿潤剤、乳化剤、防腐剤又は緩衝剤）を含有していてもよい。
【０１５９】
各種送達システムが公知であり、本発明で有用な１種以上の結合性蛋白質あるいは１種以上の結合性蛋白質と個体における変形性関節症又は疼痛を予防、管理、治療又は改善するために有用な予防剤又は他の治療剤の併用剤を投与するために使用することができ、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセル封入、結合性蛋白質又はフラグメントを発現することが可能な組換え細胞、受容体介在型エンドサイトーシス（例えばＷｕ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２参照）、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築等が挙げられる。ＩＬ−１α及び／又はＩＬ−１βと結合する結合性蛋白質を個体に投与する方法としては限定されないが、非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内及び皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与及び粘膜投与（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられる。更に、例えばインヘラー又はネブライザーの使用やエアゾール化剤の配合により、肺投与を利用することもできる。例えば米国特許第６，０１９，９６８号；５，９８５，３２０号；５，９８５，３０９号；５，９３４，２７２号；５，８７４，０６４号；５，８５５，９１３号；及び５，２９０，５４０号；並びにＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１９２４４号；ＷＯ９７／３２５７２号；ＷＯ９７／４４０１３号；ＷＯ９８／３１３４６号；及びＷＯ９９／６６９０３号参照。１態様では、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（登録商標）薬物肺送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）を使用して本発明で有用な結合性蛋白質を投与する。１特定態様では、本発明で有用な結合性蛋白質を筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、鼻腔内、肺又は皮下投与する。結合性蛋白質は任意の適切な経路、例えば輸液又はボーラス注射、上皮又は皮膚粘膜内壁（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）吸収により投与してもよく、他の生物学的活性剤と共に投与してもよい。投与は全身でも局所でもよい。
【０１６０】
特定態様では、処置を必要とする領域に結合性蛋白質を局所投与すること、例えば関節領域に直接投与することが望ましい場合がある。これは限定されないが、例えば局所輸液、注射又はインプラントにより実施することができ、インプラントは多孔性材料でも無孔性材料でもよく、例えばシラスチック膜、ポリマー、繊維性マトリックス（例えばＴｉｓｓｕｅｌ（登録商標））又はコラーゲンマトリックス等の膜及びマトリックスが挙げられる。１態様では、疼痛を含む変形性関節症で発生するような軟骨変性を治療、管理、改善及び／又は進行予防するために有効な量の１種以上の結合性蛋白質を患部関節に局所投与する。別の態様では、変形性関節症又はその１種以上の症状（疼痛を含む）を予防、治療、管理及び／又は改善するために有効な量の１種以上の結合性蛋白質を前記結合性蛋白質以外の有効量の１種以上の療法（例えば１種以上の予防剤又は治療剤）と患部に局所併用投与する。
【０１６１】
別の態様では、ＩＬ−１α及びＩＬ−１β結合性蛋白質を制御放出又は持続放出システムで送達することができる。１態様では、制御又は持続放出を実現するためにポンプを使用してもよい（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，１４：２０１−２４０；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｓｕｒｇｅｒｙ，８８：５０７−５１６；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２１：５７４−５７９参照）。別の態様では、本発明で有用な結合性蛋白質の制御又は持続放出を実現するためにポリマー材料を使用することができる（例えばＭｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，（Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ，ｅｄｓ．）（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９８４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，（Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ，ｅｄｓ．）（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４）；Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ（１９８３）Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２３：６１−１２６参照；更にＬｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０−１９２；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１−３５６；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５−１１２；米国特許第５，６７９，３７７号；５，９１６，５９７号；５，９１２，０１５号；５，９８９，４６３号；及び５，１２８，３２６号；並びにＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１５１５４号及びＷＯ９９／２０２５３号も参照）。持続放出製剤で使用されるポリマーの例としては限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、エチレン・酢酸ビニルコポリマー、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ラクチド・グリコリドコポリマー（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステルが挙げられる。１態様において、持続放出製剤で使用されるポリマーは不活性であり、浸出性不純物を含まず、保存安定性であり、無菌であり、生分解性である。更に別の態様では、制御又は持続放出システムを予防又は治療ターゲットに近接して配置し、全身投与量のごく一部で済ますことができる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ６，Ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｖｏｌ．ＩＩ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，（Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ，ｅｄｓ．）（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９８４），ｐｐ．１１５−１３８参照）。
【０１６２】
制御放出システムはＬａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７−１５３３（１９９０）に記載されている。１種以上の本発明の治療剤を含有する持続放出製剤を製造するためには、当業者に公知の任意技術を使用することができる。例えば米国特許第４，５２６，９３８号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０５５４８号及びＷＯ９６／２０６９８号；Ｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌ．，３９：１７９−１８９；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＰＤＡ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，５０：３７２−３７７；Ｃｌｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３−８５４；並びにＬａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２４：７５９−７６０参照。
【０１６３】
本発明で有用な組成物がＩＬ−１α及び／又はＬ−１βと結合する蛋白質をコードする核酸である特定態様では、適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築し、例えばレトロウイルスベクターの使用（例えば米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は直接注射、又は微粒子撃ち込みの使用（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）、又は脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤のコーティングにより細胞内に取込むように投与するか、あるいは核に侵入することが知られているホメオボックス様ペプチド（例えばＪｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８参照）に結合して投与することにより、そのコードされる予防剤又は治療剤の発現を促進するように核酸をインビボ投与することができる。あるいは、核酸を細胞内に導入し、相同組換えにより発現させるために宿主細胞ＤＮＡ内に組込むこともできる。
【０１６４】
本発明で有用な変形性関節症又は疼痛の治療用医薬組成物はその所期投与経路に適合可能に製剤化される。投与経路の例としては限定されないが、非経口（例えば静脈内、皮内、皮下）、経口、鼻腔内（例えば吸入）、経皮（例えば局所）、経粘膜及び直腸投与が挙げられる。特定態様において、組成物はヒトに静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻腔内又は局所投与するのに適した医薬組成物として常法に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用組成物は滅菌等張水性緩衝液に溶解した溶液である。必要に応じて、溶解補助剤や、注射部位の痛みを緩和するための局所麻酔剤（例えばリドカイン）を組成物に更に添加してもよい。
【０１６５】
本発明で有用な変形性関節症又は疼痛の治療用組成物を局所投与する場合には、組成物は軟膏剤、クリーム、経皮パッチ、ローション、ジェル、シャンプー、スプレー、エアゾール、溶液剤、乳剤又は当業者に周知の他の剤形に製剤化することができる。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９５）参照。非スプレー型の局所剤形には、局所塗布に適合可能な担体又は１種以上の賦形剤を含有しており、好ましくは水よりも動粘度の高い粘性〜半固体又は固体剤形が典型的に利用される。他の適切な製剤としては限定されないが、懸濁剤、散剤、リニメント剤、膏剤等が挙げられる。１態様では、このような製剤を滅菌するか又は各種性質（例えば浸透圧）に作用するための助剤（例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤又は塩）と混合する。他の適切な局所剤形としては、活性成分を例えば固体又は液体不活性担体と共に加圧揮発性物質（例えばＦＲＥＯＮ（登録商標）等のガス噴射剤）との混合物又はスクイーズボトルにパッケージングしたスプレー式エアゾール製剤が挙げられる。所望により、モイスチャライザーやヒューメクタントも医薬組成物及び製剤に添加してもよい。このような補助成分の例は当分野で周知である。
【０１６６】
本発明の変形性関節症又は疼痛の治療方法が組成物の鼻腔内投与を含む場合には、組成物はエアゾール形態、スプレー、ミスト又は滴剤として製剤化することができる。特に、本発明に従って使用する結合性蛋白質は適切な噴射剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガス）を利用して加圧パック又はネブライザーからエアゾールスプレー製剤として簡便に送達することができる。加圧エアゾールの場合には、一定量を送達するためのバルブを配置することにより用量単位を配量することができる。化合物と適切な粉末基剤（例えばラクトースや澱粉）の粉末混合物を充填したインヘラー又はインサフレーター用の（例えばゼラチンから構成される）カプセル及びカートリッジとして製剤化することもできる。
【０１６７】
本発明の変形性関節症又は疼痛の治療方法が経口投与を含む場合には、錠剤、カプセル剤、カシェ剤、ゲルカップ剤、溶液剤、懸濁剤等の剤形に組成物を経口製剤化することができる。錠剤又はカプセル剤は結合剤（例えばプレゲル化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増量剤（例えばラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）、崩壊剤（ジャガイモ澱粉又は澱粉グリコール酸ナトリウム）、又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等の医薬的に許容可能な賦形剤と共に慣用手段により製造することができる。錠剤は当分野で周知の方法によりコーティングしてもよい。経口投与用液体製剤は限定されないが、溶液剤、シロップ剤又は懸濁剤の形態をとることができ、あるいは使用前に水又は他の適切な溶媒で再構成する乾燥製剤の形態でもよい。このような液体製剤は懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化食用脂肪）、乳化剤（例えばレシチン又はアラビアガム）、非水性溶媒（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分留植物油）、及び防腐剤（例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル又はソルビン酸）等の医薬的に許容可能な添加剤と共に慣用手段により製造することができる。製剤には更に緩衝塩類、着香剤、着色剤及び甘味剤を適宜添加してもよい。経口投与用製剤は変形性関節症又は疼痛の治療用として本発明で有用な結合性蛋白質の遅延放出、制御放出又は持続放出に適するように製剤化すると適切な場合がある。
【０１６８】
本発明の変形性関節症の治療方法又は疼痛の治療方法は例えばインヘラー又はネブライザー、エアゾール化剤を配合した組成物の使用による肺投与を含むことができる。例えば米国特許第６，０１９，９６８号；５，９８５，３２０号；５，９８５，３０９号；５，９３４，２７２号；５，８７４，０６４号；５，８５５，９１３号；及び５，２９０，５４０号；並びにＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１９２４４号、ＷＯ９７／３２５７２号、ＷＯ９７／４４０１３号、ＷＯ９８／３１３４６号及びＷＯ９９／６６９０３号参照。特定態様では、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（登録商標）薬物肺送達技術（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して変形性関節症の治療用のＩＬ−１α及び／又はＩＬ−１βと結合する結合性蛋白質又は併用治療剤を投与する。
【０１６９】
本発明の方法は（例えばボーラス注射又は連続輸液による）注射による非経口投与用に製剤化されたＩＬ−１α及び／又はＩＬ−１βと結合する結合性蛋白質を含有する組成物の投与を含むことができる。注射用製剤は防腐剤を添加した単位用量形態（例えばアンプル又はマルチドーズ容器）でもよい。組成物は油性又は水性媒体中の懸濁液、溶液又は乳剤等の形態でもよく、懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤等の助剤を添加してもよい。あるいは、結合性蛋白質は使用前に適切な溶媒（例えば滅菌パイロジェンフリー水）で再構成する粉末状でもよい。
【０１７０】
本発明の方法は更にデポー製剤として製剤化された組成物の投与も含むことができる。このような長時間作用型製剤は（例えば皮下又は筋肉内）移植又は筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、組成物は（例えば許容可能な油中の乳剤としての）適切なポリマーもしくは疎水性材料又はイオン交換樹脂を使用して製剤化してもよいし、難溶性誘導体として（例えば難溶性塩として）製剤化してもよい。
【０１７１】
本発明の方法は中性又は塩形態として製剤化された組成物の投与を含む。医薬的に許容可能な塩としては塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸等から誘導される塩等のアニオンと共に形成される塩と、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導される塩等のカチオンと共に形成される塩が挙げられる。
【０１７２】
一般に、組成物の成分は単位用量形態（例えば活性剤の量を指示するアンプルやサシェット等の密封容器に収容した乾燥凍結乾燥粉末又は無水濃縮物）で別々又は混合物として提供される。投与方法が輸液の場合には、滅菌医薬グレードの水又は生理食塩水を充填した輸液ボトルにより組成物を分配することができる。投与方法が注射の場合には、成分を投与前に混合できるように注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１７３】
本発明は更に薬剤の量を指示するアンプルやサシェット等の密封容器にパッケージングされたＩＬ−１α及び／もしくはＩＬ−１βと結合する１種以上の結合性蛋白質又はこのような結合性蛋白質を含有する医薬組成物も提供する。１態様では、ＩＬ−１α及び／もしくはＩＬ−１βと結合する１種以上の結合性蛋白質又はこのような結合性蛋白質を含有する医薬組成物を密封容器に収容した乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として提供し、関節炎又は疼痛を治療するために対象に投与するのに適した濃度まで（例えば水又は生理食塩水で）再構成することができる。１態様では、ＩＬ−１α及び／もしくはＩＬ−１βと結合する１種以上の結合性蛋白質又はこのような結合性蛋白質を含有する医薬組成物を少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約１５ｍｇ、少なくとも約２５ｍｇ、少なくとも約３５ｍｇ、少なくとも約４５ｍｇ、少なくとも約５０ｍｇ、少なくとも約７５ｍｇ、又は少なくとも約１００ｍｇの単位用量で密封容器に収容した乾燥滅菌凍結乾燥粉末として提供する。凍結乾燥結合性蛋白質又はこのような結合性蛋白質を含有する医薬組成物はその当初の容器に約２℃〜約８℃で保存すべきであり、結合性蛋白質又はこのような結合性蛋白質を含有する医薬組成物は再構成後１週間以内、５日以内、７２時間以内、４８時間以内、２４時間以内、１２時間以内、６時間以内、５時間以内、３時間以内、又は１時間以内に投与すべきである。代替態様では、薬剤の量と濃度を指示する密封容器にＩＬ−１α及び／もしくはＩＬ−１βと結合する１種以上の結合性蛋白質又はこのような結合性蛋白質を含有する医薬組成物を液体形態で提供する。１態様では、投与する液体形態の組成物を密封容器に少なくとも約０．２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｍｇ／ｍｌ又は少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌで提供する。液体形態はその当初の容器に約２℃〜約８℃で保存すべきである。
【０１７４】
本願に記載する方法及び組成物で有用な結合性蛋白質は非経口投与に適した医薬組成物に配合することができる。１側面では、抗体約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５０ｍｇ／ｍｌを含有する注射溶液として結合性蛋白質を製造する。注射溶液はフリント又はアンバーバイアル、アンプル又はプレフィルドシリンジに収容した液体又は凍結乾燥剤形から構成することができる。緩衝液はＬ−ヒスチジン（約１ｍＭ〜約５０ｍＭ）とすることができ、最適値約５ｍＭ〜約１０ｍＭ，ｐＨ５．０〜７．０（最適値約ｐＨ６．０）とすることができる。他の適切な緩衝液としては限定されないが、琥珀酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムが挙げられる。約０〜約３００ｍＭ（液体剤形では最適値約１５０ｍＭ）の濃度の溶液の毒性を調節するためには塩化ナトリウムを使用することができる。凍結乾燥剤形には凍害保護剤として主に約０％〜約１０％スクロース（最適値約０．５％〜約１．０％）を添加することができる。他の適切な凍害保護剤としてはトレハロースとラクトースが挙げられる。凍結乾燥剤形にはバルク剤として主に約１〜約１０％マンニトール（最適値約２％〜約４％）を添加することができる。液体及び凍結乾燥剤形の両者で安定剤として主に約１ｍＭ〜約５０ｍＭ  Ｌ−メチオニン（最適値約ｍＭ５〜約１０ｍＭ）を使用することができる。他の適切なバルク剤としてはグリシン、アルギニンが挙げられ、約０％〜約０．０５％ポリソルベート８０（最適値約０．００５％〜約０．０１％）として添加することができる。その他の界面活性剤としては限定されないが、ポリソルベート２０及びＢＲＩＪ界面活性剤が挙げられる。
【０１７５】
本発明の変形性関節症又は疼痛の治療に有用な組成物は各種形態を取ることができる。これらの形態としては、例えば液体、半固体及び固体剤形が挙げられ、例えば溶液剤（例えば注射溶液及び輸液溶液）、分散液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム剤及び座剤が挙げられる。特定剤形は所期投与方法及び治療用途により異なる。典型的な組成物は抗体をヒトに受動免疫するために使用されている組成物と同様の組成物等の注射溶液又は輸液溶液の形態である。投与方法は非経口投与（例えば静脈内、皮下、腹膜内、筋肉内）である。１態様では、静脈内輸液又は注射により抗体を投与する。別の態様では、筋肉内又は皮下注射により抗体を投与する。
【０１７６】
治療用組成物は典型的には製造及び保存条件下で無菌安定でなければならない。組成物は溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、又は高薬剤濃度に適した他の注文構造として製剤化することができる。滅菌注射溶液は必要量の活性化合物（即ち抗体又はその抗原結合部分）を必要に応じて上記成分の１種又はその組み合わせと共に適切な溶媒に加えた後に濾過滅菌することにより製造することができる。一般に、分散液は塩基性分散媒と上記から選択される必要な他の成分を含有する滅菌媒体に活性化合物を配合することにより製造される。滅菌注射溶液の調製用滅菌凍結乾燥粉末の場合には、典型的な製造方法は真空乾燥と噴霧乾燥であり、活性成分に乾燥前の滅菌濾過溶液からの任意の他の所望成分を加えた粉末を得る。例えばレシチン等のコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒度の維持及び界面活性剤の使用により、溶液の適正な流動性を維持することができる。吸収を遅らせる物質（例えばモノステアリン酸塩やゼラチン）を組成物に加えることにより、注射用組成物の長期吸収を実現できる。
【０１７７】
本発明の変形性関節症又は疼痛の治療に有用な結合性蛋白質は当分野で公知の各種方法により投与することができるが、典型的な投与経路／方法は皮下注射、静脈内注射又は輸液である。当業者に自明の通り、投与経路及び／又は方法は所望結果により異なる。所定態様では、結合性蛋白質の迅速な放出を防止する担体を結合性蛋白質に配合することができ、例えばインプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル送達システム等の制御放出製剤が挙げられる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の多数の製造方法が特許登録されており、あるいは一般に当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８）参照。
【０１７８】
所定態様では、本発明で有用な結合性蛋白質を例えば不活性希釈剤又は同化性可食性担体と共に経口投与することができる。前記結合性蛋白質（及び所望により他の成分）をハード又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよいし、錠剤に圧縮してもよいし、対象の食事に直接添加してもよい。経口治療投与には、化合物に賦形剤を添加し、内服錠、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、ウェハース剤等の形態で使用してもよい。本発明の化合物を非経口投与以外の方法で投与するためには、その不活性化を防止するための材料を化合物にコーティングしたり、化合物と併用投与することが必要な場合がある。
【０１７９】
補助活性化合物も組成物に添加することができる。所定態様では、変形性関節症又は疼痛の治療に有用な１種以上の別の治療剤と本発明で有用な結合性蛋白質（例えば抗体）又はその抗原結合部分を合剤化及び／又は併用投与する。例えば、ｈＩＬ−１α及び／もしくはｈＩＬ−１βと結合する結合性蛋白質又はその抗原結合部分を他のターゲットと結合する１種以上の別の抗体（例えば他のサイトカインと結合する抗体又は細胞表面分子と結合する抗体）と合剤化及び／又は併用投与してもよい。更に、１種以上の結合性蛋白質を１種以上の他の治療剤と併用してもよい。このような併用療法は治療剤の投与用量を減らし、各種単独療法に伴う可能性のある毒性や合併症を避けることができるという利点がある。
【０１８０】
所定態様では、ＩＬ−１α及び／もしくはＬ−１βと結合する蛋白質又はその結合部分を当分野で公知の半減期延長用ビヒクルと連結する。このようなビヒクルとしては、限定されないが、Ｆｃ領域、ポリエチレングリコール及びデキストランが挙げられる。このようなビヒクルは例えば米国特許第６，６６０，８４３号に記載されている。
【０１８１】
特定態様では、遺伝子治療により変形性関節症を治療、予防、管理又は改善するために、結合性蛋白質の１種以上のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与する。遺伝子治療とは、発現された核酸又は発現可能な核酸を対象に投与することにより実施される治療を意味する。本発明のこの態様において、核酸はこれらの核酸によりコードされ、ＩＬ−１α及び／又はＬ−１βと結合して変形性関節症又は疼痛に関する予防効果又は治療効果をもたらす結合性蛋白質の結合性ポリペプチドを産生する。
【０１８２】
本発明によると、当分野で入手可能な任意の遺伝子治療法を使用することができる。遺伝子治療法の一般論については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．１２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９９１）Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２；Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；及びＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｃ．（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１（５）：１５５参照。組換えＤＮＡ技術分野で広く知られており、使用することができる方法はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）；及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）に記載されている。各種遺伝子治療法の詳細な記載は米国特許出願公開第２００５／００４２６６４号に開示されている。
【０１８３】
ＩＬ−１α及び／又はＬ−１βと結合する結合性蛋白質は単独で使用することもできるし、変形性関節症又は疼痛の治療に有用な１種以上の別の作用剤と併用することもできる。例えば、別の作用剤は変形性関節症の１種以上の症状を治療するため、又は疼痛に関連するＩＬ−１以外のターゲットに作用するために有用であるとして当分野で認められている治療剤とすることができる。別の作用剤は治療用組成物に有益な属性を付与する作用剤でもよく、例えば個体に投与する組成物の粘性に作用する作用剤が挙げられる。
【０１８４】
更に当然のことながら、本発明に含まれる併用剤はその所期目的に有用な併用剤である。以下に挙げる作用剤は例証を目的とし、限定的なものではない。本発明に含まれる併用剤はＩＬ−１α及び／又はＬ−１βと結合する結合性蛋白質と、望ましい特性を提供する少なくとも１種の別の作用剤とすることができる。形成される組成物がその所期機能を発揮できるような併用剤であるならば、併用剤は２種以上の別の作用剤、例えば２種又は３種の別の作用剤を含有することもできる。変形性関節症又は疼痛を治療するのに好ましい併用剤は、非ステロイド性抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤ」とも言う）を含有しており、イブプロフェン等の薬剤が挙げられる。他の好ましい併用剤はプレドニゾロン等のコルチコステロイドを含有する抗炎症剤であり、患者にＩＬ−１α及び／又はＬ−１βと結合する結合性蛋白質と併用投与する際に必要なステロイド用量を徐々に減らすことによりステロイドの周知の副作用を減らすか又はなくすことができる。変形性関節症又は疼痛に罹患している個体の治療用治療剤の非限定的な例としては、限定されないが、ブデソニド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸塩、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体、抗ＩＬ−６モノクローナル抗体、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニルイミダゾール化合物；ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ又はＰＤＧＦの抗体；ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０又はそのリガンドの抗体；メトトレキサート、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ、イブプロフェン、コルチコステロイド、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬；ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８、ＭＡＰキナーゼ阻害剤；ＩＬ−１β変換酵素阻害剤、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性ｐ５５ＴＮＦ受容体、可溶性ｐ７５ＴＮＦ受容体；ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ；抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３及びＴＧＦβの１種以上が挙げられる。
【０１８５】
本発明の医薬組成物は「治療有効量」又は「予防有効量」のＩＬ−１α及び／又はＬ−１βと結合する１種以上の結合性蛋白質を含有することができる。「治療有効量」とは、必要な用量と期間で所望治療結果を達成するために有効な量を意味する。前記結合性蛋白質の治療有効量は当業者が決定することができ、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重や、前記結合性蛋白質が個体に所望の反応を誘発する能力等の因子により変動し得る。治療有効量は前記結合性蛋白質又はその部分の治療上有益な作用が毒性又は有害作用を上回る量でもある。「予防有効量」とは、必要な用量と期間で所望予防結果を達成するために有効な量を意味し、変形性関節症の患部関節における関節軟骨の後続変性もしくは減少の予防、又は疼痛の発症もしくは激化の予防が挙げられる。一般に、予防用量は初期疾患ステージ又はそれ以前の対象で使用するので、予防有効量は治療有効量よりも少なくなる。
【０１８６】
１態様では、個体の疼痛の治療方法が提供され、前記個体はＩＬ−１蓄積に伴う疾患ないし障害に罹患している。個体におけるこのようなＩＬ−１蓄積はＩＬ−１の発現低下又はＩＬ−１の代謝低下の結果であり得る。ＩＬ−１の蓄積は個体の血液（血漿、血清を含む）又は局所組織中で生じ得る。
【０１８７】
１態様において、本発明は個体の疼痛の治療方法を提供し、前記個体はＩＬ−１蓄積に伴う疾患ないし障害に罹患している。
【０１８８】
１態様において、本願に記載する組成物及び方法は変形性関節症、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、敗血症性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応、臓器移植に伴う急性又は慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェグナー肉芽腫症、シェーンライン・ヘノッホ紫斑病、腎臓の顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染症、寄生虫症、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、散発性Ｉ型多腺性内分泌不全症、ＩＩ型多腺性内分泌不全症（シュミット症候群）、成人（急性）呼吸窮迫症候群、脱毛症、先天性脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎性関節症、腸病性滑膜炎、クラミジア関連関節症、エルシニア関連関節症、サルモネラ関連関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患／動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、特発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全症関連疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、分類不能型免疫不全症（分類不能型低ガンマグロブリン血症）、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣不全、早発卵巣不全、線維性肺疾患、特発性線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織病関連間質性肺疾患、混合性結合組織病関連肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス関連肺疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、ショーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、薬物誘発性間質性肺疾患、線維症、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、通風性関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性肝炎ないしルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）、自己免疫介在性低血糖症、黒色表皮腫を伴うＢ型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、１型乾癬、２型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患ＮＯＳ、糸球体腎炎、腎臓の顕微鏡的血管炎、ライム病、円板状エリテマトーデス、特発性ないしＮＯＳ男性不妊症、精子自己免疫、多発性硬化症（全サブタイプ）、交感性眼炎、結合組織病続発性肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、ショーグレン症候群、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫性自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑、急性肝疾患、慢性肝疾患、アルコール性肝硬変、アルコール誘発性肝傷害、胆汁鬱滞症、特異体質性肝疾患、薬物誘発性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、アレルギー、Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）感染症、精神障害（例えば鬱病及び統合失調症）、Ｔｈ２型及びＴｈ１型細胞介在性疾患、急性及び慢性疼痛（各種疼痛）、癌（例えば肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌及び直腸癌）及び血液悪性疾患（白血病及びリンパ腫）、無βリポ蛋白血症、先端チアノーゼ、急性及び慢性寄生虫又は感染プロセス、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性又は慢性細菌感染症、急性膵炎、急性腎不全、腺癌、心房異所性拍動、エイズ痴呆合併症、アルコール誘発性肝炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性鼻炎、同種移植片拒絶反応、α１アンチトリプシン欠損症、筋萎縮性側索硬化症、貧血、狭心症、前角細胞変性、抗ＣＤ３抗体療法、抗リン脂質抗体症候群、抗受容体過敏反応、大動脈及び末梢動脈瘤、大動脈解離、動脈性高血圧、動脈硬化症、動静脈瘻、運動失調症、心房細動（持続性又は発作性）、心房粗動、房室ブロック、Ｂ細胞リンパ腫、骨移植拒絶反応、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶反応、脚ブロック、バーキットリンパ腫、火傷、心不整脈、心臓性失神症候群、心臓腫瘍、心筋症、心肺バイパス炎症反応、軟骨移植拒絶反応、小脳皮質変性、小脳障害、無秩序型ないし多源性心房頻拍、化学療法関連障害、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性アルコール依存症、慢性炎症性疾患、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性サリチル酸中毒、結腸直腸癌、鬱血性心不全、結膜炎、接触皮膚炎、肺性心、冠動脈疾患、クロイツェルフェルト・ヤコブ病、培養陰性敗血症、嚢胞性線維症、サイトカイン療法関連障害、拳闘家痴呆、脱髄疾患、デング出血熱、皮膚炎、皮膚疾患、糖尿病、糖尿病性動脈硬化症、びまん性レビー小体病、拡張型鬱血性心筋症、基底核障害、中高年ダウン症候群、ＣＮＳドーパミン受容体を遮断する薬物により誘発される薬物誘発性運動障害、薬物過敏症、湿疹、脳脊髄炎、心内膜炎、内分泌障害、喉頭蓋炎、エプスタイン・バールウイルス感染症、肢端紅痛症、錐体外路及び小脳障害、家族性血球貪食リンパ組織球症、胎児胸腺移植拒絶反応、フリードリヒ運動失調症、機能性末梢動脈障害、真菌性敗血症、ガス壊疽、胃潰瘍、糸球体腎炎、任意臓器又は組織の移植片拒絶反応、グラム陰性菌敗血症、グラム陽性菌敗血症、細胞内生物による肉芽腫、ヘアリー細胞白血病、ハレルフォルデン・スパッツ病、橋本甲状腺炎、花粉症、心臓移植拒絶反応、ヘモクロマトーシス、血液透析、溶血性尿毒症症候群／血栓性血小板減少性紫斑病、出血、Ａ型肝炎、ヒス束不整脈、ＨＩＶ感染症／ＨＩＶ神経障害、ホジキン病、運動過多性運動障害、過敏反応、過敏性肺��、高血圧、運動低下性運動障害、視床下部−下垂体−副腎軸評価、特発性アジソン病、特発性肺線維症、抗体介在性細胞傷害、無力症、小児脊髄性筋萎縮症、大動脈炎症、Ａ型インフルエンザ、電離放射線被爆、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、虚血再潅流傷害、虚血性脳卒中、若年性関節リウマチ、若年性脊髄性筋萎縮症、カポジ肉腫、腎移植拒絶反応、レジオネラ症、リーシュマニア症、ハンセン病、皮質脊髄系傷害、脂肪性浮腫、肝移植拒絶反応、リンパ水腫、マラリア、悪性リンパ腫、悪性組織球症、悪性メラノーマ、髄膜炎、髄膜炎菌血症、代謝性偏頭痛、特発性偏頭痛、ミトコンドリア多系統疾患、混合性結合組織病、モノクローナル免疫グロブリン血症、多発性骨髄腫、多系統変性症（Ｍｅｎｚｅｌ，Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ，Ｓｈｙ−Ｄｒａｇｅｒ及びＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）、重症筋無力症、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ菌感染症、ヒト型結核菌感染症、骨髄異形成症候群、心筋梗塞、心筋虚血障害、上咽頭癌、新生児慢性肺疾患、腎炎、ネフローゼ、神経変性疾患、神経原性筋委縮症、好中球減少時の発熱、非ホジキンリンパ腫、腹部大動脈とその分枝の閉塞、閉塞性動脈障害、ＯＫＴ３（登録商標）療法、精巣炎／副睾丸炎、精巣炎／精管切除再吻合術、臓器腫大、骨粗鬆症、膵臓移植拒絶反応、膵臓癌、腫瘍随伴症候群／悪性腫瘍による高カルシウム血症、副甲状腺移植拒絶反応、骨盤内炎症性疾患、通年性鼻炎、心膜疾患、末梢アテローム性動脈硬化性疾患、末梢血管障害、腹膜炎、悪性貧血、ニューモシスチス・カリニ肺炎、肺炎、ＰＯＥＭＳ症候群（多発ニューロパシー、臓器腫大、内分泌障害、モノクローナル免疫グロブリン血症及び皮膚変化症候群）、潅流後症候群、ポストポンプ症候群、ＭＩ心膜切開後症候群、子癇前症、進行性核上性麻痺、原発性肺高血圧症、放射線療法、レイノー現象、レイノー病、レフサム病、規則的で狭いＱＲＳ幅の頻拍、腎血管性高血圧症、再潅流傷害、拘束型心筋症、肉腫、強皮症、老人性舞踏病、レビー小体型老人性痴呆症、血清反応陰性関節症、ショック、鎌状赤血球貧血、皮膚同種移植片拒絶反応、皮膚変化症候群、小腸移植拒絶反応、充実性腫瘍、特異的不整脈、脊髄性運動失調症、脊髄小脳変性症、連鎖球菌性筋炎、小脳の構造傷害、亜急性硬化性汎脳炎、失神、心血管系梅毒、全身性アナフィラキシー、全身性炎症反応症候群、全身型発症若年性関節リウマチ、Ｔ細胞性ないしＦＡＢ  ＡＬＬ、毛細血管拡張症、閉塞性血栓性血管炎、血小板減少症、中毒症、移植、外傷／出血、ＩＩＩ型過敏反応、ＩＶ型過敏反応、不安定狭心症、尿毒症、尿路性敗血症、蕁麻疹、心臓弁膜症、静脈瘤、血管炎、静脈疾患、静脈血栓症、心室細動、ウイルス及び真菌感染症、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎、ウイルス関連血球貪食症候群、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ウィルソン病、任意臓器又は組織の異種移植片拒絶反応、急性冠症候群、急性特発性多発性神経炎、急性炎症性脱髄性多発根神経炎、急性虚血、成人スティル病、円形脱毛症、アナフィラキシー、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、動脈硬化症、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、自己免疫性皮膚炎、連鎖球菌感染に伴う自己免疫疾患、自己免疫性腸症、自己免疫性聴力低下、自己免疫性リンパ球増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性早発卵巣不全、眼瞼炎、気管支拡張症、水疱性類天疱瘡、心臓血管疾患、劇症型抗リン脂質抗体症候群、セリアック病、頸椎症、慢性虚血、瘢痕性類天疱瘡、多発性硬化症の危険を伴う最初のエピソードからなる症候群（ＣＩＳ）、小児期発症型精神障害、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、涙嚢炎、皮膚筋炎、糖尿病網膜症、椎間板ヘルニア、椎間板脱出、薬物誘発性免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜炎、眼内炎、上強膜炎、多形性紅斑、重症多形性紅斑、妊娠性類天疱瘡、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、花粉症、ヒューズ症候群、特発性パーキンソン病、特発性間質性肺炎、ＩｇＥ介在型アレルギー、免疫性溶血性貧血、封入体筋炎、感染性眼炎症性疾患、炎症性脱髄疾患、炎症性心疾患、炎症性腎疾患、ＩＰＦ／ＵＩＰ、虹彩炎、角膜炎、乾性角結膜炎、クスマウル病ないしクスマウル・マイヤー病、ランドリー麻痺、ランゲルハンス細胞組織球症、網状皮斑、黄斑変性症、顕微鏡的多発血管炎、ベヒテレフ病、運動ニューロン障害、粘膜類天疱瘡、多臓器不全、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、心筋炎、神経根障害、神経障害、非Ａ非Ｂ肝炎、視神経炎、骨溶解症、卵巣癌、少関節型ＪＲＡ、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、静脈炎、結節性多発動脈炎（ないし結節性動脈周囲炎）、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛症、白毛症、多関節型ＪＲＡ、多腺性内分泌不全症候群、多発性筋炎、リウマチ性多発筋痛症（ＰＭＲ）、ポストポンプ症候群、原発性パーキンソン病、前立腺癌及び直腸癌及び血液悪性疾患（白血病及びリンパ腫）、前立腺炎、純赤血球形成不全症、原発性副腎不全、再発性視神経脊髄炎、再狭窄、リウマチ性心臓病、ＳＡＰＨＯ（滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨化症及び骨炎）、続発性アミロイドーシス、ショック肺、強膜炎、座骨神経痛、続発性副腎不全、シリコン関連結合組織病、スネッドン・ウィルキンソン皮膚病、強直性脊椎炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、全身性炎症反応症候群、側頭動脈炎、トキソプラズマ性網膜炎、中毒性表皮壊死、横断性脊髄炎、ＴＲＡＰＳ（腫瘍壊死因子１型受容体（ＴＮＦＲ）関連周期性症候群）、１型アレルギー反応、ＩＩ型糖尿病、蕁麻疹、通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）、血管炎、春季カタル、ウイ
ルス性網膜炎、フォークト・小柳・原田症候群（ＶＫＨ症候群）、滲出型黄斑変性症、並びに創傷治癒から構成される群から選択される疾患ないし障害に罹患している個体における疼痛を治療するために使用することができる。
【０１８９】
本願に記載する方法及び組成物は原発性及び転移性癌から構成される群から選択される疾患に罹患している個体における疼痛を治療するために使用することができ、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢及び胆管癌、小腸癌、尿管癌（腎臓癌、膀胱癌及び尿路上皮癌を含む）、女性生殖管癌（子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、絨毛癌及び妊娠性絨毛性疾患を含む）、男性生殖管癌（前立腺癌、精嚢癌、精巣癌及び胚細胞腫瘍を含む）、内分泌腺癌（甲状腺癌、副腎癌及び下垂体癌を含む）、及び皮膚癌、血管腫、黒色腫、肉腫（骨癌、軟部組織癌及びカポジ肉腫に起因するものを含む）、脳腫瘍、神経癌、眼の癌、髄膜癌（星状細胞腫、神経膠腫、膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン細胞腫及び髄膜腫を含む）、白血病等の血液悪性疾患に起因する充実性腫瘍、並びにリンパ腫（ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）が挙げられる。
【０１９０】
最適所望応答（例えば治療又は予防応答）が得られるように投与レジメンを調整することができる。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、時間をかけて数回に分けて投与してもよいし、治療状況の緊急性に応じて用量を相対的に増減してもよい。投与し易さと用量の均等性の点から非経口組成物を用量単位形態に製剤化すると特に有利である。本願で使用する用量単位形態とは、治療する哺乳動物対象に単位用量として投与するのに適した物理的に別個の単位を意味し、各単位は所望治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を必要な医薬担体と共に含有する。本発明の用量単位形態の仕様は（ａ）ＩＬ−１α及び／又はＬ−１βと結合する結合性蛋白質の固有特性及び達成すべき特定治療又は予防効果と、（ｂ）個体の治療用としてこのような蛋白質を配合する技術に内在する問題により決定され、これらに直接依存する。
【０１９１】
変形性関節症又は疼痛の治療に有用な結合性蛋白質の治療有効量又は予防有効量の非限定的な範囲の１例は０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。当然のことながら、用量値は緩和しようとする病態の種類と重篤度により変動し得る。任意特定対象の特定投与レジメンは個体の必要と組成物の投与者又は投与監理者の専門的判断に従って経時的に調整すべきであり、本願に記載する用量範囲は例示に過ぎず、特許請求の範囲に記載する組成物の範囲又は実施を制限するものではない。
【０１９２】
当業者に容易に理解される通り、本願に記載する本発明の方法及び組成物の他の適切な変形及び応用も自明であり、本発明の範囲又は本願に開示する態様から外れない限り、適切な等価物を使用して実施することができる。以上、本発明を詳細に説明したが、以下の実施例を参照することにより更に明瞭に理解されよう。なお、以下の実施例は単に例証を目的とし、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１９３】
実施例１．二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）蛋白質の作製
２種類の異なる親ｍＡｂに由来する２個の異なる軽鎖可変領域（ＶＬ）を組換えＤＮＡ技術により直接又は短いリンカーを介してタンデムに連結した後、軽鎖定常領域を連結するように二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）分子を設計する。同様に、重鎖は直接又は短いリンカーを介してタンデムに連結された２個の異なる重鎖可変領域（ＶＨ）と、それに続く定常領域ＣＨ１とＦｃ領域を含む。図１Ａ参照。親モノクローナル抗体からのＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の設計と作製は従来記載されており、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βと結合するＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の例として、親抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体と親抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体から作製されるものも記載されている。本願に援用するＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０２４７１５  Ａ２号及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２５（１１）：１２９０−１２９７（２００７）参照。本願では、選択された抗ＩＬ−１α及びＩＬ−１βモノクローナル抗体と、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方と結合するＤＶＤ−Ｉｇ分子の作製用の親モノクローナル抗体としてのその使用について記載する。関節リウマチと変形性関節症の公知動物モデルを使用してＤＶＤ−Ｉｇ分子を可能な治療活性について特性決定した。
【０１９４】
実施例１．１．ＩＬ−１α及びＩＬ−１βに対するマウスモノクローナル抗体の作製
標準ハイブリドーマ技術を使用してＩＬ−１α及びＩＬ−１βに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を以下のように作製した。
【０１９５】
実施例１．１．Ａ．マウスの免疫
精製組換えヒトＩＬ−１α及びマウスＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を力価アッセイ及びスクリーニングＥＬＩＳＡで免疫原及びコーティング抗原として使用した。免疫量は一次免疫とブースター免疫のいずれも全抗原で１匹注射１回当たり５．０〜２０．０μｇとした。ＩｍｍｕｎＥａｓｙアジュバントをＱｉａｇｅｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入し、抗原１０．０μｇ当たりＩｍｍｕｎＥａｓｙアジュバント２０ｍｌのアジュバント／抗原比で使用した。各群の被免疫動物は岩倉洋一郎博士（東京都港区、東京大学）から入手したＩＬ−１αβ  ＫＯマウス５匹とした。下記投与スケジュールに従ってマウスに免疫した。ＭＲＣ−５細胞をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、ＩＬ−１バイオアッセイに使用した。ヒトＩＬ−８  ＥＬＩＳＡキットと対照マウス抗ｈＩＬ−１α及び抗ｈＩＬ−１β抗体（ＭＡＢ２００及びＭＡＢ２０１）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。
【０１９６】
要約すると、先ずボルテックスを使用してバイアル中でアジュバントを静かに混合することによりアジュバント−抗原混合物を調製した。所望量のアジュバントをバイアルから取出し、オートクレーブ滅菌済み１．５ｍＬマイクロ遠心管に入れた。抗原をＰＢＳ又は生理食塩水で０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。次にアジュバントを入れたマイクロ遠心管に計算量の抗原を加え、得られた溶液を上下に５回静かにピペッティングすることにより混合した。アジュバント−抗原混合物を室温で１５分間インキュベート後、上下に５回静かにピペッティングすることにより再び混合した。アジュバント−抗原溶液を動物注射用の適切なシリンジに吸引した。合計５〜２０μｇの抗原を５０〜１００μｌの容量で注射した。各動物に免疫後、力価に応じて２〜３回ブースター免疫した。力価が良好な動物にはハイブリドーマの融合と作製前に最終静脈内ブースター注射した。
【０１９７】
実施例１．１．Ｂ．ハイブリドーマのスクリーニング
上記のように作製したハイブリドーマをスクリーニングし、ＥＬＩＳＡを使用して抗体力価を測定した。標準ＥＬＩＳＡ法を使用して特異抗体を検出するために蛋白質抗原をＥＬＩＳＡプレートに直接コーティングした。要約すると、ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌのｒｈＩＬ−１α又はｒｈＩＬ−１β（ＰＢＳ中１．０μｇ／ｍｌ）を４℃にて一晩コーティングした。プレートを２５０μｌのＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ブロッキングバッファー（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ中２％ＢＳＡ）２００μｌでブロッキングした。希釈した血清又はハイブリドーマ上清（１００μｌ）を各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧを検出に使用し、結合ＯＤを４５０ｎｍで観測した。ＥＬＩＳＡで高い特異的結合活性を示した抗体を産生するハイブリドーマクローンをサブクローニングし、精製し、前記抗体の親和性（Ｂｉａｃｏｒｅ）と力価（ＭＲＣ−５バイオアッセイ）を以下のように特性決定した。
【０１９８】
実施例１．１．Ｃ．ＩＬ−１α及びＩＬ−１βに対するマウスモノクローナル抗体の特性決定
実施例１．１．Ｂに記載したハイブリドーマにより産生された抗体を特性決定するために以下のアッセイを使用した。
【０１９９】
実施例１．１．Ｃ．１．表面プラズモン共鳴法
製造業者の指示と標準手順に従ってＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によりヤギ抗マウスＩｇＧを介してバイオセンサーマトリックスに捕捉された抗体（マウス抗組換えｍＩＬ−１抗体）とｒｍＩＬ−１の間のリアルタイム結合相互作用を測定した。要約すると、ｒｍＩＬ−１をＨＢＳランニングバッファー（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）で希釈し、５０μｌアリコートを固定化蛋白質マトリックスに流速５ｍｌ／分で注入した。利用したｒｈＩＬ−１の濃度は、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、１８７．５ｎＭ、２５０ｎＭ、３７５ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１０００ｎＭ、１５００ｎＭ及び２０００ｎＭとした。解離定数（解離速度）、会合定数（会合速度）を求めるために、ＢＩＡｃｏｒｅ動態評価ソフトウェア（バージョン３．１）を使用した。
【０２００】
実施例１．１．Ｃ．２．抗ＩＬ−１バイオアッセイ
ＭＲＣ−５細胞株はヒトＩＬ−１α及びＩＬ−１βに応答して用量依存的にＩＬ−８を産生するヒト肺線維芽細胞細胞株である（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｍｕｅｇｇｅ，ａｎｄ  Ｄｕｒｕｍ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１参照）。ＭＲＣ−５細胞を１０％ＦＢＳ完全ＭＥＭで培養し、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて増殖させた。組換えヒトＩＬ−１α又はＩＬ−１βに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の中和力価を求めるために、種々の濃度（０〜１０μｇ／ｍｌ）のｍＡｂ（５０μｌ）を９６ウェルプレートに加え、ｒｈＩＬ−１α又はｒｈＩＬ−１β（１０〜５０ｐｇ／ｍｌ）５０μｌと共に１時間３７℃にてプレインキュベートした。上清を採取し、希釈し、標準ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＥＬＩＳＡによりＩＬ−８濃度を測定した。ＭＲＣ−５細胞によるＩＬ−８産生を阻害するその能力により抗体力価を求めた。
【０２０１】
Ｂｉａｃｏｒｅ及びＭＲＣ−５バイオアッセイに基づき、下表１に示すように、親和性と力価の高い多数のマウス抗ｈＩＬ−１α及び抗ｈＩＬ−１β抗体を同定した。
【０２０２】
【表５】
0005918275.tif 000006
【０２０３】
実施例１．１．Ｄ．ＩＬ−１α及びＩＬ−１βに対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のクローニングと配列決定
製造業者の指示に従ってＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して各ハイブリドーマ細胞株から全ＲＮＡの単離・精製後に表１（上記）に記載した全抗ＩＬ−１α／β  ｍＡｂと他の抗体の可変領域重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）遺伝子のクローニングと配列決定を行った。製造業者に提案されているようにＭｏｕｓｅ  Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＩｇＧＶＨ及びＩｇκＶＬオリゴヌクレオチドとＯｎｅ−ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＶＨ及びＶＬ両者の遺伝子の増幅を行った。効率的増幅により得られたＤＮＡフラグメントを製造業者の指示に従ってｐＣＲ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。次にＡＢＩ  ３０００シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用してジデオキシチェーンターミネーション法により複数のＶＨ及びＶＬクローンを配列決定した。全ｍＡｂ  ＶＬ及びＶＨ遺伝子の配列を表２に示す。
【０２０４】
【表６】
0005918275.tif 000007
0005918275.tif 000008
【０２０５】
実施例１．２．マウス−ヒトキメラ抗体の作製と特性決定
上記全ｍＡｂを（ヒト定常領域をもつ）キメラ抗体に変換し、発現させ、精製し、特性決定し、活性を確認した。その後のＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質分析用対照にもこれらの抗体を使用した。３Ｄ１２．Ｅ３をキメラ形に変換するために、プライマーＰ１及びＰ２を使用して３Ｄ１２．Ｅ３−ＶＬをＰＣＲ増幅し、プライマーＰ３及びＰ４を使用してヒトＣκ遺伝子（Ａｂｂｏｔｔ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡで社内作製したｐＢＯＳベクターに担持したもの）を増幅した。どちらのＰＣＲ反応も標準ＰＣＲ技術及び手順に従って実施した。２種類のＰＣＲ産物をゲル精製し、標準ＰＣＲ条件下でプライマーＰ１及びＰ４を使用する後続オーバッラップＰＣＲ反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終ＰＣＲ産物であるキメラ軽鎖３Ｄ１２．Ｅ３−ＶＬ−ｈＣκを製造業者の指示に従ってＴＯＰＯクローニングによりｐＥＦ６  ＴＯＰＯ哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。表３はこの手順で使用した各ＰＣＲプライマーの配列を示す。
【０２０６】
【表７】
0005918275.tif 000009
【０２０７】
３Ｄ１２．Ｅ３  重鎖をキメラ形に変換するために、プライマーＰ５及びＰ６を使用して３Ｄ１２．Ｅ３−ＶＨをＰＣＲ増幅し、プライマーＰ７及びＰ８を使用してヒトＣγ１遺伝子（ＡＢＣで社内作製したｐＢＯＳベクターに担持したもの）を増幅した。どちらのＰＣＲ反応も標準ＰＣＲ技術及び手順に従って実施した。２種類のＰＣＲ産物をゲル精製し、標準ＰＣＲ条件下でプライマーＰ５及びＰ８を使用する後続オーバッラップＰＣＲ反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終ＰＣＲ産物であるキメラ軽鎖３Ｄ１２．Ｅ３−ＶＨ−ｈＣγ１を製造業者の指示に従ってｐｃＤＮＡ３．１  ＴＯＰＯ哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。表４はこの手順で使用した各ＰＣＲプライマーの配列を示す。
【０２０８】
【表８】
0005918275.tif 000010
【０２０９】
同様に、プライマーＰ２１／Ｐ２２（ＶＨ）及びＰ７／Ｐ８（ｈＣγ１）を使用してキメラ１３Ｆ５．Ｇ５−ＶＨ−Ｃγ１を作製し、ｐｃＤＮＡ３．１  ＴＯＰＯベクターにクローニングし、プライマーＰ２３／Ｐ２４（ＶＬ）及びＰ３／Ｐ４（ｈＣκ）を使用してキメラ１３Ｆ５．Ｇ５−ＶＬ−Ｃκを作製し、ｐＥＦ６  ＴＯＰＯベクターにクローニングした。表５はこの手順で使用した各ＰＣＲプライマーの配列を示す。
【０２１０】
【表９】
0005918275.tif 000011
【０２１１】
キメラ抗体を発現させるために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１３Ｆ５．Ｇ５−ＶＬ−Ｃκと１３Ｆ５．Ｇ５−ＶＨ−Ｃγ１をＣＯＳ細胞で７２時間同時発現させ、培地を採取し、プロテインＡクロマトグラフィーによりＩｇＧを精製した。同様に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１３Ｆ５．Ｇ５−ＶＬ−Ｃκと１３Ｆ５．Ｇ５−ＶＨ−Ｃγ１をＣＯＳ細胞で７２時間同時発現させ、培地を採取し、プロテインＡクロマトグラフィーによりＩｇＧを精製した。両方の精製キメラＡｂをＢｉａｃｏｒｅとＭＲＣ−５バイオアッセイにより特性決定し、活性を確認した。その結果、これらのキメラＡｂは元のマウスｍＡｂと同等の親和性と力価を示すことが判明した。
【０２１２】
実施例１．３．ＩＬ−１α／β二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）分子の構築、発現及び精製
ｈＩＬ−１α及びｈＩＬ−１βと結合することが可能なＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質を作製するために使用したコンストラクトを図１Ｂに示す。要約すると、Ｂａｌｂ／ｃマウスに夫々組換えＩＬ−１α蛋白質（ｒｈＩＬ−１α）と組換えＩＬ−１β蛋白質（ｒｈＩＬ−１β）と免疫することにより、抗ｈＩＬ−１α（クローン３Ｄ１２．Ｅ３）と抗ｈＩＬ−１β（クローン１３Ｆ５．Ｇ５）の２種類の高親和性マウス抗体を含む親ｍＡｂを取得した。マウスＩｇ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してこれらの２種類のハイブリドーマクローンのＶＬ／ＶＨ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより単離した。先ずＶＬ／ＶＨ遺伝子を（ヒト定常領域をもつ）キメラ抗体に変換し、活性と力価を確認した。ＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質を作製するために、（図１Ｂに示すように）１３Ｆ５．Ｇ５のＶＨとＶＬを夫々３Ｄ１２．Ｅ３のＶＨとＶＬのＮ末端に直接融合した。軽鎖（リンカー配列はＡＤＡＡＰ）と重鎖（リンカー配列はＡＫＴＴＰＰ）の両者で２個の可変領域間にリンカーを配置した以外は同様にＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質を構築した。これらの配列はマウスＣｋ及びＣＨ１配列のＮ末端から選択した。マウスＣｋ及びＣＨ１のＮ末端から選択したこれらのリンカー配列は可変領域の天然の延長であり、数個のＦａｂ結晶構造の分析によると、顕著な二次構造を含まないフレキシブルな配置を示す。ＰＣＲクローニングの詳細な手順を以下に記載する。
【０２１３】
実施例１．３．Ａ．ｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質の分子クローニング
プライマーＰ２１及びＰ２５を使用して１３Ｆ５．Ｇ５−ＶＨをＰＣＲ増幅した。プライマーＰ１４及びＰ８を使用して３Ｄ１２．Ｅ３−ＶＨ−ｈＣγ１を増幅した。どちらのＰＣＲ反応も標準ＰＣＲ技術及び手順に従って実施した。２種類のＰＣＲ産物をゲル精製し、標準ＰＣＲ条件下でプライマーＰ２１及びＰ８を使用する後続オーバッラップＰＣＲ反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終ＰＣＲ産物であるＤＶＤ１−Ｉｇ重鎖ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ１−ＶＨ−ｈＣγ１を製造業者の指示に従ってｐｃＤＮＡ３．１  ＴＯＰＯ哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。表６はこの手順で使用したＰＣＲプライマーの配列を示す。
【０２１４】
【表１０】
0005918275.tif 000012
【０２１５】
ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ１−Ｉｇ軽鎖を作製するために、プライマーＰ２３及びＰ２６を使用して１３Ｆ５．Ｇ５−ＶＬをＰＣＲ増幅し、プライマーＰ１６及びＰ４を使用して３Ｄ１２．Ｅ３−ＶＬ−ｈＣκを増幅した。どちらのＰＣＲ反応も標準ＰＣＲ技術及び手順に従って実施した。２種類のＰＣＲ産物をゲル精製し、標準ＰＣＲ条件下でプライマーＰ２３及びＰ４を使用する後続オーバッラップＰＣＲ反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終ＰＣＲ産物であるｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ１−Ｉｇ軽鎖ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ１−ＶＬ−ｈＣκを製造業者の指示に従ってｐＥＦ６  ＴＯＰＯ哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。表７はこの手順で使用した各ＰＣＲプライマーの配列を示す。
【０２１６】
【表１１】
0005918275.tif 000013
【０２１７】
実施例１．３．Ｂ．ｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ２−Ｉｇの分子クローニング
プライマーＰ２１及びＰ１７を使用して１３Ｆ５．Ｇ５−ＶＨをＰＣＲ増幅した。プライマーＰ１８及びＰ８を使用して３Ｄ１２．Ｅ３−ＶＨ−ｈＣγ１を増幅した。どちらのＰＣＲ反応も標準ＰＣＲ技術及び手順に従って実施した。２種類のＰＣＲ産物をゲル精製し、標準ＰＣＲ条件下でプライマーＰ２１及びＰ８を使用する後続オーバッラップＰＣＲ反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終ＰＣＲ産物であるＤＶＤ２−Ｉｇ重鎖ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ２−ＶＨ−ｈＣγ１を製造業者の指示に従ってｐｃＤＮＡ３．１  ＴＯＰＯ哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。表８はこの手順で使用した各ＰＣＲプライマーの配列を示す。
【０２１８】
【表１２】
0005918275.tif 000014
【０２１９】
ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ２−Ｉｇ軽鎖を作製するために、プライマーＰ２３及びＰ１９を使用して１３Ｆ５．Ｇ５−ＶＬをＰＣＲ増幅した。プライマーＰ２０及びＰ４を使用して３Ｄ１２．Ｅ３−ＶＬ−ｈＣκを増幅した。どちらのＰＣＲ反応も標準ＰＣＲ技術及び手順に従って実施した。２種類のＰＣＲ産物をゲル精製し、標準ＰＣＲ条件下でプライマーＰ２３及びＰ４を使用する後続オーバッラップＰＣＲ反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終ＰＣＲ産物であるｈＩＬ−１α／βＤＶＤ２−Ｉｇ軽鎖ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ２−ＶＬ−ｈＣκを製造業者の指示に従ってｐＥＦ６  ＴＯＰＯ哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。表９はこの手順で使用した各ＰＣＲプライマーの配列を示す。
【０２２０】
【表１３】
0005918275.tif 000015
【０２２１】
ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ１−Ｉｇ及びｈＩＬ−１α／βＤＶＤ２−Ｉｇの最終配列を表１０に記載する。
【０２２２】
【表１４】
0005918275.tif 000016
0005918275.tif 000017
0005918275.tif 000018
0005918275.tif 000019
【０２２３】
実施例１．３．Ｃ．ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質の発現と精製
各コンストラクトの重鎖と軽鎖を夫々ｐｃＤＮＡ３．１  ＴＯＰＯ及びｐＥＦ６  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）にサブクローニングし、配列決定し、間違いないことを確認した。夫々Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００及び２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬を使用して各コンストラクトの重鎖と軽鎖をコードするプラスミドをＣＯＳ細胞とヒト胚性腎２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で一過性発現させた。一過性トランスフェクションから７２時間後に細胞培養培地を採取し、製造業者の指示に従ってプロテインＡクロマトグラフィー（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して抗体を精製した。抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、Ａ２８０及びＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により定量した。表１１から明らかなように、ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ１−ＩｇとｈＩＬ−１α／βＤＶＤ２−Ｉｇの発現レベルはキメラ抗体の発現レベルと同等であり、ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質を哺乳動物細胞で効率的に発現させることができると判断される。
【０２２４】
【表１５】
0005918275.tif 000020
【０２２５】
実施例１．４．ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の質量分析とＳＥＣ分析
ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の軽鎖と重鎖の分子量（ＭＷ）を測定するために、ＤＶＤ−Ｉｇ分子（０．８μｇ／μＬ）１０μＬを１．０Ｍ  ＤＴＴ溶液（５μＬ）で希釈した。ＰＬＲＰ−Ｓ，８μ，４０００Ａ及び１×１５０ｍｍの蛋白質カラム（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ，Ａｕｂｕｒｎ，ＭＡ）を使用し、ＤＶＤ−Ｉｇ分子の重鎖と軽鎖を分離した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１１００  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌａ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を質量分析計ＱＳＴＡＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と共に使用した。ｖａｌｃｏバルブを１０分に設定し、サンプル脱塩のために流れを廃液からＭＳに切替えた。バッファーＡは０．０２％ＴＦＡ、０．０８％ＦＡ、０．１％ＡＣＮ及び９９．８％ＨＰＬＣ−Ｈ２Ｏとした。バッファーＢは０．０２％ＴＦＡ、０．０８％ＦＡ、０．１％ＨＰＬＣ−Ｈ２Ｏ及び９９．８％ＡＣＮとした。ＨＰＬＣ流速は５０μＬ／分とし、サンプル注入量は８．０ｍＬとした。カラムオーブンの温度は６０℃に設定し、分離勾配は５％Ｂで５分間、５％Ｂ→６５％Ｂで３５分間、６５％Ｂ→９５％Ｂで更に５分間、９５％Ｂ→５％Ｂで５分間とした。ＴＯＦＭＳスキャンは８００〜２５００ａｍｕとし、サイクルは３６００とした。全長ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質のＭＷを求めるために、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭｉｃｒｏＴｒａｐカートリッジ（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ，Ａｕｂｕｒｎ，ＭＡ）をサンプルの脱塩に使用した。ＨＰＬＣ勾配は５％Ｂで５分間、５％Ｂ→９５％Ｂで１分間、９５％Ｂ→５％Ｂで更に４分間とした。ＱＳＴＡＲ  ＴＯＦＭＳスキャンは２０００〜３５００ａｍｕとし、サイクルは８９９とした。Ａｎａｌｙｓｔ  ＱＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して全ＭＳ生データを分析した。ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質のＳＥＣ分析には、精製ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質とキメラＡｂのＰＢＳ溶液をＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  Ｇ２，３００×１０ｍｍカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にアプライした。ＨＰＬＣ機器としてＭｏｄｅｌ  １０Ａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）をＳＥＣに使用した。２８０ｎｍと２１４ｎｍにおけるＵＶ検出を使用して全蛋白質を測定した。溶出は流速０．５ｍＬ／分でアイソクラチックとした。安定性試験では、ＰＢＳ中０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌの濃度範囲のサンプルを−８０℃〜２５℃で３サイクルの凍結−解凍サイクルに供し、あるいは４℃、２５℃又は４０℃で４週間及び８週間インキュベートした後にＳＥＣ分析に供した。
【０２２６】
ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質とキメラ抗体をプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。精製収率（３〜５ｍｇ／Ｌ）は各蛋白質の発現培地のｈＩｇＧ定量に一致した。精製ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質とキメラ抗体の組成と純度を還元条件下と非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。非還元条件下で４種類の蛋白質は各々単一のバンドとして泳動した。ＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質は予想通り、キメラ抗体よりも大きな分子量を示した。非還元条件下で４種類の蛋白質は各々重鎖１本と軽鎖１本の２個のバンドを生じた。この場合も、ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の重鎖と軽鎖はキメラ抗体よりもサイズが大きかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは各ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質が単一種として発現され、重鎖と軽鎖が効率的に対合してＩｇＧ様分子を形成することを示した。２種類のＤＶＤ−Ｉｇ分子の重鎖及び軽鎖及び全長蛋白質のサイズはアミノ酸配列に基づくその分子量計算値と一致する（表１１参照）。
【０２２７】
ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の厳密な分子量を求めるために、質量分析法を利用した。表１に示すように、軽鎖、重鎖及び全長蛋白質を含む各ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の実験的に求めた分子量は推定値とよく一致する。溶液中のＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の物理的性質を更に検討するために、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して各蛋白質を分析した。キメラＡｂとＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質はいずれも単一ピークを示し、モノマー蛋白質として物理的に均質であることが実証された。３Ｄ１２．Ｅ３キメラＡｂは物理的サイズが１３Ｆ５．Ｇ５キメラＡｂよりも小さく、３Ｄ１２．Ｅ３キメラＡｂはよりコンパクトな球形であることが分かった。ＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質は右側に主ピークと肩ピークを示したことから、ＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質の一部は恐らく現在の緩衝液条件下で凝集形であると予想される。
【０２２８】
実施例１．５：ｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質のインビトロ安定性の分析
ＤＶＤ−Ｉｇの物理的安定性を以下のように試験した。ＰＢＳ中０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌの濃度範囲の精製抗体を−８０℃〜２５℃で３サイクルの凍結−解凍サイクルに供し、あるいは４℃、２５℃又は４０℃で４週間及び８週間インキュベートした後にサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析法を使用して分析した（表１２参照）。
【０２２９】
【表１６】
0005918275.tif 000021
【０２３０】
どちらのキメラ抗体も通常のＩｇＧ分子に一般的な低度の凝集と断片化を示した。ＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質は精製後にＳＥＣで多少の凝集を示した。安定性分析でも、ＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質は各種条件下でＰＢＳ中で凝集を示したが、ＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質の凝集形態の百分率は長期保存中又は高温で増加しなかった。ＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質の断片化形態の百分率はキメラ３Ｄ１２．Ｅ３  Ａｂと同等の正常な範囲内であった。他方、ＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質は非常に高い安定性を示した。試験した全条件下でＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質には凝集も断片化も検出されず、ＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質の１００％が無傷のモノマー分子として維持された。
【０２３１】
実施例１．６．ｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の抗原結合親和性の測定
２５℃のＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を使用してＢｉａｃｏｒｅ  ３０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で表面プラズモン共鳴測定によりＤＶＤ−Ｉｇ分子のｒｈＩＬ１−α及びｒｈＩＬ１−βとの結合動態を測定した。全薬品はＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）又は本願に記載する他の業者から入手した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγフラグメントに特異的なポリクローナル抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）約５０００ＲＵを１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で希釈し、製造業者の指示と手順に従って標準アミンカップリングキットを２５ｍｇ／ｍｌで使用してＣＭ５研究グレードバイオセンサーチップに直接固定化した。バイオセンサー表面上の未反応部分をエタノールアミンでブロックした。フローセル２及び４内の修飾カルボキシメチルデキストラン表面を反応表面として使用した。フローセル１及び３内のヤギ抗ヒトＩｇＧを固定化していない未修飾カルボキシメチルデキストランを参照表面として使用した。動態分析のために、１：１ラングミュア結合モデルから導出した速度方程式をＢｉｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．０．１ソフトウェアを使用して（グローバルフィット分析を使用して）全１０回の注入の会合相と解離相に同時にフィットさせた。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異反応表面に捕捉するために精製ＤＶＤ−ＩｇサンプルをＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で希釈し、流速５ｍｌ／分で反応マトリックスに注入した。２５ｍｌ／分の連続流速下で会合速度定数と解離速度定数であるｋｏｎ（Ｍ−１ｓ−１）とｋｏｆｆ（ｓ−１）を求めた。１．２５〜１０００ｎＭの１０種類の異なる抗原濃度で動態結合測定を行うことにより速度定数を求めた。次に次式：ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎにより動態速度定数からＤＶＤ−Ｉｇ分子とｒｈＩＬ１α／βの反応の平衡解離定数（Ｍ）を計算した。ｒｈＩＬ１α／βサンプルのアリコートも同時にブランク参照表面と反応ＣＭ表面に注入し、非特異的結合バックグラウンドがある場合にはこれを記録して差し引き、屈折率変化と注入ノイズの大部分を排除した。次に１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）２５ｍｌを流速５ｍｌ／分で２回注入して表面を再生させた。抗Ｆｃ抗体を固定化した表面は完全に再生され、１２サイクルにわたってその完全捕捉能を維持した。下式：
【０２３２】
【数１】
0005918275.tif 000022
を使用して捕捉されたＤＶＤ−Ｉｇ−ｒｈＩＬ１α／β複合体の見掛けの化学量論比を飽和結合条件（定常状態平衡）下で計算した。
【０２３３】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析の結果、キメラ抗体は結合動態とＩＬ−１に対する親和性が元のハイブリドーマモノクローナル抗体と同等であり、正しいＶＬ／ＶＨ配列が単離されたと判断された（表１３）。２種類のＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質のｈＩＬ−１αに対する総結合パラメーターは同等であり、ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の親和性はキメラ３Ｄ１２．Ｅ３抗体の親和性の僅か２〜３分の１であった。ＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質のｈＩＬ−１βに対する結合親和性はキメラ抗体１３Ｆ５．Ｇ５よりもやや低いが、ＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質の３倍であった。２種類のＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質のｈＩＬ−１に対する親和性をキメラ抗体のｈＩＬ−１に対する親和性と比較すると、ＩＬ−１に対する化学量論比の評価により示されるように同等であった。どちらのキメラ抗体も２価単一特異性であり、夫々化学量論比１．６及び１．７でＢｉａｃｏｒｅ上のＩＬ−１α及びＩＬ−１βと結合した。これは抗体をＢｉａｃｏｒｅセンサーチップに稠密に固定化して化学量論比を１．５〜２．０とする場合に分子間干渉によりＩｇＧに共通である。ｈＩＬ−１α及びｈＩＬ−１βに対する２種類のＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の化学量論比は２種類のキメラ抗体と同等であり、どちらのＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質も各抗原に対して２価結合能をもつことが分かった。
【０２３４】
【表１７】
0005918275.tif 000023
【０２３５】
更に、ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の４価二重特異性抗原結合についてもＢｉａｃｏｒｅにより分析した（表１４）。先ずヤギ抗ヒトＦｃ抗体を介してＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質をＢｉａｃｏｒｅセンサーチップに捕捉し、第１の抗原を注入し、結合シグナルを観測した。ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質は第１の抗原により飽和されたので、次に第２の抗原を注入し、第２のシグナルを観測した。これはＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質では、先ずＩＬ−１βを注入した後にＩＬ−１αを注入するか、又はＩＬ−１αを注入した後にＩＬ−１βを注入することにより実施した。どちらの配列にも二重結合活性が検出された。ＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質でも同様の結果が得られた。即ち、各ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質は二重特異性４価分子として両方の抗原に同時に結合することができた。表１４に示すように、第１の抗原に対する両方のＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質ｈＩＬ−１α又はｈＩＬ−１βの化学量論比は単一特異性２価結合と同様に１．５よりも大きかった。ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質が既に第１の抗原により占有されている間に第２の抗原を注入すると、第２の抗原に対する両方のＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質（即ちｈＩＬ−１α又はｈＩＬ−１β）の化学量論比は１．０〜１．３であった。従って、ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質は２個のＩＬ−１α分子と２個のＩＬ−β分子とに結合することができた。先ずヤギ抗ヒトＦｃ抗体を介してＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質をＢｉａｃｏｒｅセンサーチップ上に捕捉し、第１の抗原を注入し、結合シグナルを観測した後、第２の抗原を注入した。
【０２３６】
【表１８】
0005918275.tif 000024
【０２３７】
実施例１．７．ＤＶＤ−Ｉｇ分子の機能的均質性の判定
ＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質は標的特異的親和性クロマトグラフィーではなくプロテインＡクロマトグラフィーにより精製したので、ミスフォールディング及び／又はミスマッチのあるＶＬ／ＶＨ領域が存在する可能性があるが、その場合には、これらの２種類の抗原に対する結合試験により判定することができる。このような結合アッセイをサイズ排除液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により実施した。ＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質をそのまま、又はＩＬ−１α、ＩＬ−１βもしくは等モル比のＩＬ−１αとＩＬ−１βの存在下で３７℃にて１２０分間インキュベーション後にカラムにアプライした。各抗原も対照として単独で泳動させた。ＳＥＣ結果によると、ＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質は溶液中のＩＬ−１α及びＩＬ−１βと結合することができ、このような結合の結果、どちらの抗原との複合体として存在する場合にもＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質の動的サイズの増加を示すＳＥＣシグナルにシフトした。ＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質シグナルのシフトは一部ではなく、１００％であり、全ＤＶＤ２−Ｉｇ分子が抗原と結合できたと予想された。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βのどちらの存在下でも、ＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質シグナルが更に完全にシフトし、全ＤＶＤ２−Ｉｇ分子が同様に両方の抗原と結合できたと判断された。この実験の結果、ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質は機能的に均質な蛋白質として発現されることが立証された。従来記載されている全ての二重特異性、多重特異性及び多価免疫グロブリン様及び免疫グロブリン由来分子とは異なる均質な単一機能種としてＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質を作製できることが分かったので、これは有意義である。
【０２３８】
実施例１．８．ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の生物学的活性の測定
ＭＲＣ−５バイオアッセイを使用してＤＶＤ−Ｉｇの生物学的活性を測定した。ＭＲＣ−５細胞株はヒトＩＬ−１α及びＩＬ−１βに応答して用量依存的にＩＬ−８を産生するヒト胚線維芽細胞細胞株である。ＭＲＣ−５細胞をＡＴＣＣから入手し、５％ＣＯ２インキュベーターで１０％ＦＢＳ完全ＭＥＭ中で３７℃にて培養した。ヒトＩＬ−１α又はＩＬ−１βに対するＤＶＤ−Ｉｇの中和活性を測定するために、抗体（１×１０−７〜１×１０−１２Ｍ）５０μｌをＭＥＭ／１０％ＦＢＳ溶液として９６ウェルプレートに加え、ｈＩＬ−１又はｈＩＬ−１β（２００ｐｇ／ｍｌ）５０μｌと共に１時間３７℃、５％ＣＯ２にてプレインキュベートした。次にＭＲＣ−５細胞を濃度１×１０５／ｍｌ（１００μｌ）で全ウェルに加え、プレートを５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃にて一晩インキュベートした。上清を採取し、ヒトＩＬ−８産生を標準ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）により測定した。ＩＬ−８産生を阻害するその能力によりＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の中和活性を求めた。
【０２３９】
表１３に示すように、どちらのＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質もｈＩＬ−１αとｈＩＬ−１βを中和させることができた。ｈＩＬ−１αに対する結合親和性と一致し、ｈＩＬ−１αに対するＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質及びＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質の中和活性も同等であり、即ちキメラ抗体の３分の１であった（表１３参照）。ｈＩＬ−１βに対するその結合親和性と一致し、ｈＩＬ−１βに対するＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質の中和活性はキメラＡｂ  １３Ｆ５．Ｇ５よりもやや低いが、ＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質の３倍であった。全体としては、元のモノクローナル抗体と比較してＤＶＤ−Ｉｇ分子の生物学的活性の有意低下はなかった。
【０２４０】
ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質がＩＬ−１αとＩＬ−１βの共存下でＩＬ−８産生を阻害することができたか否かを判定するために、等量のｈＩＬ−１αとｈＩＬ−１βをＭＲＣ−５アッセイの同一培養システムに加えた。ＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質とＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質のどちらもＩＬ−１αとＩＬ−１βの共存下でＭＲＣ−５細胞によるＩＬ−８合成を阻害することができ、活性は一方のサイトカインのみを介在させたモノアッセイの活性と同等であった（表１３）。ＩＬ−１αとＩＬ−１βを共存させたこのアッセイでは、ＤＶＤ２−Ｉｇ結合性蛋白質の二重阻害活性（１．２ｎＭ）はＤＶＤ１−Ｉｇ結合性蛋白質の活性（２．２ｎＭ）よりも高かった。
【０２４１】
実施例２．ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質におけるリンカーサイズと可変領域の向きの分析
表１５に示すような種々の親ｍＡｂ対を使用して他のＤＶＤ−Ｉｇ分子を構築した。ｍＡｂ対毎に４種類の異なるＤＶＤ−Ｉｇコンストラクトを作製し、２種類には短いリンカーを使用し、２種類には長いリンカーを使用し、各々ａ−ｂ−Ｃ（α−β−定常領域）及びｂ−ａ−Ｃ（β−α−定常領域）の２種類の領域の向きとした。リンカー配列はヒトＣｋ又はＣＨ１領域のＮ末端配列に由来するものとし、短いリンカーは軽鎖ＴＶＡＡＰ（配列番号７１）、重鎖ＡＳＴＫＧＰ（配列番号７９）とし、長いリンカーは軽鎖ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号７２）、重鎖ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号８０）とした。
【０２４２】
全重鎖及び軽鎖コンストラクトをｐＢＯＳ発現ベクターにサブクローニングし、ＣＯＳ細胞又はｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞で発現させた。
【０２４３】
新規ＤＶＤ−Ｉｇクローンを構築するために、ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ１−Ｉｇ及びｈＩＬ−１α／βＤＶＤ２−Ｉｇについて記載したようにオーバーラップＰＣＲを使用して先ず２種類のｍＡｂの軽鎖及び重鎖可変領域をタンデムに連結した。次に連結した部分を相同組換えによりｐＢＯＳベクターにサブクローニングした。要約すると、ベクターを制限消化により直鎖化した（ｐＢＯＳ−ｈＣｋベクター２μｇをＯ＋バッファー中でＦｓｐＡＩとＢｓｉＷＩで消化し、ｐＢＯＳ−ｈＣγｚ，ｎｏｎ  ａベクター２μｇをＯ＋バッファー中でＦｓｐＡＩとＳａＩＩで消化した）。消化したサンプルを１％アガロースゲル上で泳動させ、主鎖フラグメントを水５０μｌ中で精製した。相同組換えと形質転換のために、ＤＨ５αコンピテント細胞を氷上で解凍し、連結したＰＣＲ産物２０〜５０ｎｇ及び直鎖化ベクター２０〜５０ｎｇと混合した（ＤＨ５α細胞５０μｌ当たり）。混合物を静かに混合し、氷上で４５分間インキュベート後、４２℃で１分間ヒートショックを与えた。次に、ＳＯＣ培地１００μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。アンピシリンを添加したＬＢ／寒天プレートに形質転換培養物を接種し、３７℃で１８〜２０時間インキュベートした。細菌クローンを単離し、このクローンからＤＮＡを精製し、シーケンシング解析した。配列を確認した最終クローンを従来記載されているように、抗体発現・精製用ＣＯＳ又は２９３細胞にコトランスフェクトした（同一抗体対のＨＶとＬＣをマッチさせた）。
【０２４４】
精製ＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質の特性を表１６に示す。表１６の左側は新規ｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ分子の作製に使用した２対のｍＡｂの特異性、結合親和性及び中和力価を示す。抗体１８Ｆ４．２Ｃ８及び１Ｂ１２．４Ｈ４（実施例１．１．Ｄ参照）を使用してｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ３ａ−Ｉｇ、ｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ４ａ−Ｉｇ、ｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ３ｂ−Ｉｇ及びｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ４ｂ−Ｉｇを作製した。ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ３ａ−ＩｇとｈＩＬ−１α／βＤＶＤ４ａ−Ｉｇは夫々短いリンカーと長いリンカーを介してａ−ｂ−Ｃの向きとした。ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ３ｂ−ＩｇとｈＩＬ−１α／βＤＶＤ４ｂ−Ｉｇは夫々短いリンカーと長いリンカーを介してｂ−ａ−Ｃの向きとした。抗体６Ｈ３．１Ａ４及び６Ｂ１２．４Ｆ６を使用し、ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ５ａ−Ｉｇ、ｈＩＬ−１α／βＤＶＤ６ａ−Ｉｇ、ｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ５ｂ−Ｉｇ及びｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ６ｂ−Ｉｇを作製した。ｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ５ａ−ＩｇとｈＩＬ−１α／βＤＶＤ６ａ−Ｉｇは夫々短いリンカーと長いリンカーを介してａ−ｂ−Ｃの向きとした。ｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ５ｂ−ＩｇとｈＩＬ−１α／βＤＶＤ６ｂ−Ｉｇは夫々短いリンカーと長いリンカーを介してｂ−ａ−Ｃの向きとした。ｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ１−Ｉｇについて上述した手順（実施例１．３参照）を使用し、オーバーラップＰＣＲ法を使用してこれらの他のｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の分子クローニングを実施した。これらの他のｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質のアミノ酸配列を表１５に開示する。
【０２４５】
【表１９】
0005918275.tif 000025
0005918275.tif 000026
0005918275.tif 000027
0005918275.tif 000028
0005918275.tif 000029
0005918275.tif 000030
0005918275.tif 000031
0005918275.tif 000032
0005918275.tif 000033
0005918275.tif 000034
0005918275.tif 000035
0005918275.tif 000036
0005918275.tif 000037
【０２４６】
新規ＤＶＤ−Ｉｇコンストラクトの特性を表１６にまとめる。親和性（Ｋｄ）と生物学的活性（ＩＣ５０）は夫々ＢｉａｃｏｒｅとＭＲＣ−５バイオアッセイにより測定した。全新規ＤＶＤ−Ｉｇ蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は還元条件下と非還元条件下のどちらでも通常の抗体及びＤＶＤ１／２−Ｉｇと同様の正常な泳動パターンを示した。
【０２４７】
【表２０】
0005918275.tif 000038
【０２４８】
新規ＤＶＤ−Ｉｇ分子の機能的特性決定の結果、どちらの向きでも長いリンカーを使用したＤＶＤ−Ｉｇ分子は短いリンカーを使用したものよりも両者抗原との結合及び中和に関して良好に機能することが判明した。長いリンカーを使用したＤＶＤ−Ｉｇ分子については、ｂ−ａ−Ｃの向きのものは両者抗原との良好な結合と中和を示したが、ａ−ｂ−Ｃの向きのＤＶＤ−Ｉｇ分子はＩＬ−１αとの結合及び中和は良好であったが、ＩＬ−１βとの結合及び中和は低下した（例えばＤＶＤ４ｂとＤＶＤ４ａを比較）。ＤＶＤ−Ｉｇ分子のうち、ＤＶＤ４ｂはｎＭ未満のレベルでＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両者と結合して中和し、親ｍＡｂの結合及び中和特性を完全に維持した。
【０２４９】
実施例３．ｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ分子の作製
ＤＶＤ−Ｉｇ分子の薬物動態、インビボ効力、組織浸透性及び免疫原性に関する主要な問題を検討するために、マウス抗マウスＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ分子を以下のように構築した。
【０２５０】
実施例３．１．ｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ分子の構築
ＩＬ−１αβ二重ＫＯマウスから作製した２種類のマウス抗マウスＩＬ−１α／βモノクローナル抗体（９Ｈ１０及び１０Ｇ１１）を使用してマウス抗マウスＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ分子を構築した。ＩＬ−１α／β二重ＫＯマウスに夫々マウスＩＬ−１α又はマウスＩＬ−１βを免疫することによりマウス抗マウスＩＬ−１α及びマウス抗マウスＩＬ−１βモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製した。マウス抗マウスＩＬ−１α  ｍＡｂ１株（クローン９Ｈ１０）とマウス抗マウスＩＬ−１β  ｍＡｂ１株（クローン１０Ｇ１１）を選択及び使用してｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ分子を作製した。種々のリンカーサイズと種々の領域の向きを試験した。最終的な機能的ｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ分子はＶ（抗ｍＩＬ−１β）−リンカー−Ｖ（抗ｍＩＬ−１α）−マウス定常領域（Ｃγ２ａ及びＣκ）の向きで構築した。クローニング、発現及び精製手順はｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質と同様とした。ｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質のクローニングはｈＩＬ−１α／β  ＤＶＤ３−Ｉｇについて記載したように同様のオーバーラップＰＣＲと相同組換えを使用して実施した。ｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の配列を下表１７に示す。
【０２５１】
【表２１】
0005918275.tif 000039
0005918275.tif 000040
【０２５２】
マウスｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質はマウスＩＬ−１α（ｍＩＬ−１α）及びマウスＩＬ−１β（ｍＩＬ−１β）の両方に対する親和性／インビトロ力価を維持した。表１８はｍＡｂ９Ｈ１０（抗ｍＩＬ−１α）、１０Ｇ１１（抗ｍＩＬ−１β）及びｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質の特性を示す。
【０２５３】
【表２２】
0005918275.tif 000041
【０２５４】
実施例３．２．関節リウマチモデルにおけるｍＩＬ−１α／βＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質のインビボ活性
当分野で周知のコラーゲン誘発性関節炎マウスモデルで抗ＩＬ−１α、抗ＩＬ−１β、抗ＩＬ−１α／抗ＩＬ−１β併用、及びマウスＩＬ−１α／β  ＤＶＤ４−Ｉｇの治療効果を評価した。要約すると、雄性ＤＢＡ−１マウスの尾基部にウシＩＩ型コラーゲンのＣＦＡ溶液を投与して免疫した。２１日目にマウスにザイモサンを腹腔内（ｉ．ｐ）ブースター免疫した。２４〜２７日目に疾患発症後にマウスを選択し、１０匹ずつの群に分けた。対照群と抗サイトカイン群の平均関節炎スコアは治療開始時と同等であった。ＩＬ−１を中和させるために、１〜３ｍｇ／ｋｇの抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ、抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ、抗ＩＬ−１αと抗ＩＬ−１β  ｍＡｂの併用、又はマウスＩＬ−１α／β  ＤＶＤ４−Ｉｇを１日おきにマウスに腹腔内注射した。末梢関節における関節炎の目視外観についてマウスを週３回慎重に試験し、疾患活性のスコアを求めた。
【０２５５】
治療モードでＩＬ−１を遮断すると、関節炎重篤度が有効に低下し、抗ＩＬ−１β（対照群に比較して平均関節炎スコアの２４％低下）は抗ＩＬ−１α（１０％低下）よりも高い効力を示す。抗ＩＬ−１αと抗ＩＬ−１βの間には相加効果が認められ、抗ＩＬ−１α  ｍＡｂと抗ＩＬ−１β  ｍＡｂを併用投与したマウスにおける平均関節炎スコアは４０％低下した。驚くべきことに、同一用量レベルでｍＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質を投与すると、平均関節炎スコアは４７％低下を示し、ｍＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質のインビボ治療効果が立証された。この動物モデルでは関節腫脹の測定でも同様の効力が認められた。
【０２５６】
実施例３．３．変形性関節症モデルにおけるマウスＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質のインビボ活性
上記試験の結果、抗マウスＩＬ−１α及びＩＬ−１β抗体の併用とマウス抗マウスＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質でＩＬ−１αとＩＬ−１βを同時に遮断すると、関節リウマチのマウスコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいてどちらか一方の抗体単独よりも有意に効果的であることが分かった（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５（１１）：１２９０１２９７（２００７）も参照）。ＯＡの２種類の動物モデル、即ちマウスの関節不安定性モデル（「ＪＩＭ」）と内側半月板不安定化モデル（「ＤＭＭ」）で変形性関節症（ＯＡ）における抗ＩＬ−１療法の効力を試験した。
【０２５７】
実施例３．３．１．マウスの変形性関節症の関節不安定性モデル（ＪＩＭ）におけるマウス抗マウスＩＬ−１α及び抗マウスＩＬ−１βモノクローナル抗体のインビボ活性
実施例３．３．１．Ａ．試験デザイン
マウスの変形性関節症の関節不安定性モデル（ＪＩＭ）におけるｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ分子のインビボ活性の試験デザインを表１９に示す。全群は体重３０グラム（ＢＷ＝３０ｇ）のマウス２５匹（ｎ＝２５）とした。２１日後に試験を終了した。２．５カ月齢雄性Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（２５匹／群／時点）を５匹ずつケージに入れ、イソフルランで麻酔した。ＯＡ病変を誘発させようとして０日目に左右膝に前十字靱帯（ＡＣＬ）外傷を形成した。ＩＬ−１阻害抗体ＩＬ−１α（９Ｈ１０）及びＩＬ−１β（１０Ｇ１１）の単独又は併用腹腔内（ｉｐ）投与をＡＣＬ外傷日に開始し、４日おき（ｑ４ｄ）に２０日間続けた。非投与対照のビヒクルはＰＢＳとした。左右膝を２１日目に採取し、組織病理学的変化を採点し、特性決定した。不安定性誘発の成功を示す増殖応答のあった関節のみを使用してデータを分析した。増殖応答／不安定性を０〜３で採点し、不安定な関節（スコア１、２又は３）のみを最終分析に使用した。内側及び外側大腿骨及び脛骨軟骨変性を軟骨変性の重篤度について０〜５のスケールで採点した。最後の抗体投与から４日後に、血清採取用に各群の全動物から採血した。体重を毎週記録した。最終日に動物（群１、２、３、４で１０匹ずつ）にザイモサンＡを投与し、４時間後（終了時）にＩＬ−６（ＩＬ−１／ＴＮＦ依存）の血清分析用に採血した。２１日目に動物を屠殺し、左右膝関節を採取し、ホルマリンに浸漬した。
【０２５８】
【表２３】
0005918275.tif 000042
【０２５９】
実施例３．３．１．Ｂ．組織標本作製及び分析
組織標本作製：脱灰固定液（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ  Ｄｅｃａｌｉｆｉｅｒ，Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄ．，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ＶＡ）に２〜３日間浸漬後に、両膝関節から外膜組織を切除し、包埋し、前額面で薄切した。前額面のほぼ中間点で１匹毎に切片１枚を採取した（１ブロック当たり２関節）。全切片は８μｍとし、トルイジンブルー染色した。有資格獣医病理学者が盲検下でスライドを試験して群指定を試験し、以下の方法に従って採点した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して統計分析を行い、９５％の信頼レベルを使用して全投与群を対照群と比較する両側ｔ検定を行った。
【０２６０】
関節の組織病理学的スコアリング：フィブリル化を伴う軟骨細胞及びプロテオグリカン損失の深度／程度に関する以下のシステムを使用して軟骨変性の重篤度について内側及び外側大腿骨及び脛骨の軟骨変性を採点した：
１＝表層損傷、ゾーン表面の５０％以上に及ぶ接線方向の層のコラーゲン不在あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び／又は軟骨細胞の１０％までの減少
２＝ゾーンの５０％以上の面積の上部１／４までに及ぶマトリックス損失あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び／又は軟骨細胞の２５％までの減少
３＝ゾーンの５０％以上で軟骨厚みの１／２に及ぶマトリックス損失あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び／又は軟骨細胞の５０％までの減少
４＝ゾーンの５０％以上で軟骨厚みの３／４に及ぶマトリックス損失あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び／又は軟骨細胞の７５％までの減少
５＝ゾーンの５０％以上で軟骨厚み全体に及ぶマトリックス損失あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び／又は軟骨細胞の１００％までの減少。
【０２６１】
病変のゾーン（内側、中央及び外側）分布に注意してスコアを割り当て、３分の１ずつのスコア（０〜５）を関節の領域毎に合計した後、関節全体について総計した。
【０２６２】
デジタルソフトウェア（ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０）を使用して骨棘（評価対象の脛骨又は大腿骨表面で最大のもの）を測定した。
骨棘評価＝サイズに応じて小、中又は大を１、２又は３とする。
小骨棘＝１（１５０μｍまで）
中骨棘＝２（１５１〜３００μｍ）
大骨棘＝３（＞３０１μｍ）。
【０２６３】
スコアに含まれない滑膜反応が存在する場合には、炎症の型と程度について記載及び記述した。
【０２６４】
１匹毎の各種パラメーターの各々について平均±ＳＥを求め、合計し、合計関節スコアを求めた。
【０２６５】
内側滑膜及び側副靱帯における増殖変化の存在により不安定性誘導の組織学的徴候のある関節を同定した。更に、以下の基準に従って各関節の不安定性スコアを記録した。
０＝不安定性なし
１＝軽度の不安定性（靱帯及び周辺ゾーンにおける最低限〜軽度の増殖変化）
２＝中度の不安定性（靱帯及び周辺ゾーンにおける中度の増殖変化）
３＝重度の不安定性（靱帯及び周辺ゾーンにおける重度の増殖変化）。
【０２６６】
結果：最終データ分析にはスコアが１、２又は３（又は２、３）の不安定な関節のみを使用した。最終的に罹患動物基準ではなく合計罹患関節基準でデータを解析した。本試験の結果、抗ＩＬ−１α又はＩＬ−１βモノクローナル抗体を投与した動物の関節はビヒクルを投与した対照関節で認められた軟骨変性と同様の軟骨変性を示した。他方、マウス抗マウスＩＬ−１α  ｍＡｂ（９Ｈ１０）とマウス抗マウスＩＬ−１β  ｍＡｂ（１０Ｇ１１）による併用療法では、内側脛骨軟骨変性スコアは有意に低下した。図２は各種投与群における動物の関節の軟骨変性スコアの棒グラフを示す。
【０２６７】
実施例３．３．２．マウスの変形性関節症の関節不安定性モデル（ＪＩＭ）におけるｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質のインビボ活性
上記実施例３．３．１に記載したような変形性関節症の関節不安定性モデルを使用し、更にマウス抗ｍＩＬ−１αモノクローナル抗体（９Ｈ１０）とマウス抗ｍＩＬ−１βモノクローナル抗体（１０Ｇ１１）の併用により得られる抗ＩＬ−１療法の効力をこれらの２種類のモノクローナル抗体から作製したｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質により得られる効力と比較した。
【０２６８】
実施例３．３．２．Ａ．試験デザイン
本試験のデザインは上記実施例３．３．１に記載したデザインと同様とした。２．５カ月齢雄性Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（２５匹／群／時点）を５匹ずつケージに入れ、０日目にイソフルランで麻酔し、左右膝領域をクリップで留め、十字靱帯の関節内外傷を形成した。投与（０日に開始、ｉｐ）を４日に１回（Ｑ４Ｄ）行い、２１日目に終了した（群２）。投与（０日に開始、ｉｐ）を週３回行い、２１日目に終了した（群１、３及び４）。最後の抗体投与から４日後に、血清採取用に各群の全動物から採血した。体重を毎週記録した。最終日に動物（群１、２、３、４で１０匹ずつ）にザイモサンＡを投与し、４時間後（終了時）にＩＬ−６（ＩＬ−１／ＴＮＦ依存）の血清分析用に採血した。２１日目に動物を安楽死させ、左右膝関節を採取し、ホルマリンに浸漬した。下記試験デザイン表参照。
【０２６９】
【表２４】
0005918275.tif 000043
【０２７０】
実施例３．３．２．Ｂ．組織標本作製及び分析
上記実施例３．３．１に記載したように各種投与群の動物の関節に由来する関節軟骨の組織標本作製と組織学的スコアリングを実施した。
【０２７１】
結果：その結果、ｍＩＬ−１α／β  １０Ｇ１１−９Ｈ１０  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質をマウスに投与すると、変形性関節症の進行が有意に抑制され（ビヒクルに対してＰ＜０．０５）、親ｍＡｂ  ９Ｈ１０及び１０Ｇ１１の併用と同等の効力であることが分かった。図３は各種投与群の動物の関節における軟骨変性スコアの棒グラフを示す。図３に示すように、ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質６又は１２ｍｇ／ｋｇを投与した結果は変形性関節症病変の予防に関して同等の効力であった（ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質３ｍｇ／ｋｇを使用した治療は軟骨変性に効果がなく、結果はビヒクルを投与した関節と同等であった。下記実施例３．３．３参照。）。この試験の結果、抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を併用投与又はＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質を投与すると、変形性関節症のマウスモデルにおける組織病理学的パラメーターに有意に有益な効果があることが判明した。
【０２７２】
実施例３．３．３．抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体と他の結合性蛋白質の投与を比較するための変形性関節症の関節不安定性モデルにおける追跡試験
変形性関節症の関節不安定性モデルを使用して追跡試験を実施し、他の投与に比較して抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を単独投与した動物における内側脛骨軟骨変性スコアに有意効果があるか否かをより綿密に検討した。抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体投与の効果を２１日試験で評価した。
【０２７３】
実施例３．３．３．Ａ．試験デザイン
本試験のデザインは上記実施例３．３．１に記載したデザインと同様とした。
【０２７４】
【表２５】
0005918275.tif 000044
【０２７５】
実施例３．３．３．Ｂ．組織標本作製及び分析
上記実施例３．３．１に記載したように各種投与群の動物の関節に由来する関節軟骨の組織標本作製と組織学的スコアリングを実施した。
【０２７６】
結果：図４に示すように、先の試験の結果が追認され、抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を併用すると、同等の明白な治療効果が認められ、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を単独投与した場合には試験したどの用量でも軟骨劣化の予防に有効ではなかった。
【０２７７】
実施例３．３．４．関節不安定性モデル試験におけるザイモサン誘発性インターロイキン−６（ＩＬ−６）産生
抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体とｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質が機能的であり、ＩＬ−１αとＩＬ−１βをインビボ中和できたか否かを判定するための薬力学的指標として、インターロイキン６（ＩＬ−６）のザイモサン誘発性（ＩＬ−１α及びＩＬ−１β依存的）産生をＯＡの関節不安定性モデル試験で測定した。
【０２７８】
要約すると、前記モデルで２１日目にザイモサンをＰＢＳビヒクルに懸濁し、沸騰水に３０分間入れた後、使用時まで冷却した。次に５０ｍｇ／ｋｇザイモサンをＰＢＳ０．５ｍｌに懸濁した懸濁液をマウスにｉｐ注射（よく混合してから注射）した。その後、ザイモサン注射から４時間後にマウスから採血した。ＩＬ−６測定用に血清を採取した。
【０２７９】
結果：図５に示すように、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（６ｍｇ／ｋｇ）モノクローナル抗体の併用とｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質（６ｍｇ／ｋｇ又は１２ｍｇ／ｋｇ）はビヒクル投与対照動物と比較してザイモサン誘発性ＩＬ−６産生を有意に中和した。従って、これらの抗体はインビボで機能的活性を示した。
【０２８０】
実施例３．３．５．ＳＶ１２９マウスの内側半月板不安定化（ＤＭＭ）モデルにより誘発した変形性関節症に及ぼすサイトカイン阻害抗体投与の効果
変形性関節症における軟骨変性の進行抑制に及ぼす抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β活性の効果を試験するために代替動物モデルも利用した。変形性関節症のマウス内側半月板不安定化（ＤＭＭ）モデルはＪＩＭ法（上記参照）よりも浸潤性と炎症性が低く、主に内側脛骨上面と大腿骨内側顆の中心荷重領域に病変を生じる。ＤＭＭ後の病変の重篤度と位置はＪＩＭと比較するとより一貫している。
【０２８１】
実施例３．３．５．Ａ．試験デザイン
体重約３０グラムの雄性ＳＶ１２９マウスを５匹ずつケージに入れ、０日目にケタミン／キシラジンカクテルを腹腔内（ｉｐ）投与して麻酔した後、鈍的剥離により内側側副靱帯を露出させ、横に切開し、半月板を大腿骨側に反転させた。関節スペースを８−０  ｖｉｃｒｙｌ縫合糸で縫合した。皮膚を創傷接着剤で閉鎖した。偽手術では、膝の内側に垂直皮膚切開を行い、関節包を切開した。関節包を８−０  ｖｉｃｒｙｌ縫合糸で縫合し、皮膜を創傷接着剤で閉鎖した。次に下記試験デザイン表に従って動物群に抗体又はビヒクルを腹腔内（ｉｐ）注射により投与した。雌雄別と年齢と系統を一致させたナイーブマウス２匹も試験に加えた。８週間投与後に動物を安楽死させ、膝関節を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンに浸漬した。
【０２８２】
【表２６】
0005918275.tif 000045
【０２８３】
実施例３．３．５．Ｂ．組織の試験
ホルマリンに固定したサンプルを脱灰し、標本を前額面で各々１５枚の段階的切片に薄切した。各切片は厚さ６μｍとし、段階的切片の間隔は７０μｍとした。全スライドをトルイジンブルー（Ｔ．Ｂｌｕｅ）染色した。有資格獣医病理学者がスライドをチェンバーズ法（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４４：１４５５−６５）に従って軟骨変性（下記参照）について評価した。大腿骨内側顆（ＭＦＣ）、内側脛骨上面（ＭＴＰ）、大腿骨外側顆（ＬＦＣ）及び外側脛骨上面（ＬＴＰ）の４部分の各軟骨表面を下表の尺度に従って０〜６に採点した。
【０２８４】
【表２７】
0005918275.tif 000046
【０２８５】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン４．０３を使用してマン・ホイットニーのＵ検定により統計分析を行った。
【０２８６】
実施例３．３．５．Ｃ．結果
図６に示すように、抗マウスＩＬ−１αモノクローナル抗体（９Ｈ１０，６ｍｇ／ｋｇ）と抗マウスＩＬ−１βモノクローナル抗体（１０Ｇ１１，６ｍｇ／ｋｇ）又はＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質（６ｍｇ／ｋｇ）による併用療法は変形性関節症のマウスＤＭＭモデルにおける軟骨変性を有意に抑制した。
【０２８７】
実施例３．３．６．変形性関節症の内側半月板不安定化（ＤＭＭ）モデルのマウスにおける抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β活性の力価測定（８週間試験）
単独又は併用下の抗ｍＩＬ−１αモノクローナル抗体（９Ｈ１０  ｍＡｂ）及び抗ｍＩＬ−１βモノクローナル抗体（１０Ｇ１１  ｍＡｂ）と、ｍＩＬ−１α／β  １０Ｇ１１−９Ｈ１０  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質を各種用量で変形性関節症のＤＭＭモデルに投与した場合の軟骨変性に及ぼす効果について８週間試験を実施した。
【０２８８】
実施例３．３．６．Ａ．試験デザイン
体重約３０グラムの雄性ＳＶ１２９マウスを５匹ずつケージに入れ、０日目にケタミン／キシラジンカクテルを腹腔内（ｉｐ）投与して麻酔した後、鈍的剥離により内側側副靱帯を露出させ、横に切開し、半月板を大腿骨側に反転させた。関節スペースを８−０  ｖｉｃｒｙｌ縫合糸で縫合した。皮膚を創傷接着剤で閉鎖した。偽手術では、膝の内側に垂直皮膚切開を行い、関節包を切開した。関節包を８−０  ｖｉｃｒｙｌ縫合糸で縫合し、皮膜を創傷接着剤で閉鎖した。次に下記試験デザイン表（表２４）に従って抗ｍＩＬ−１α及び抗ｍＩＬ−１βモノクローナル抗体（単独又は併用）、ｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質、又はビヒクルを動物群に腹腔内（ｉｐ）注射により投与した。８週間投与後に動物を安楽死させ、膝関節を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンに浸漬した。
【０２８９】
【表２８】
0005918275.tif 000047
【０２９０】
上記表の３列目の括弧内の数字（動物数）はデータセットに含まれる実際の動物数である。除外について以下に簡単に説明する。
【０２９１】
Ｂ群：Ｂ群は９匹のみとした。１匹は組織学的試験時に内側半月板が無傷であると思われ、変形性関節症の変化が実質的になかったのでデータから除外した。
【０２９２】
Ｃ群：Ｃ群は５匹のみとした。５匹は組織学的試験時に内側半月板がほぼ無傷であると思われ、変形性関節症の変化が殆どなかったのでデータから除外した。
【０２９３】
Ｄ群：Ｄ群は８匹のみとした。１匹にはスライドがなかった。別の１匹は組織学的試験時に内側半月板がほぼ無傷であると思われ、変形性関節症の変化が殆どなかったのでデータから除外した。
【０２９４】
Ｅ群：Ｅ群は８匹のみとした。２匹は外れ値とみなされたので除外した。
【０２９５】
Ｆ群：Ｆ群は９匹のみとした。１匹は組織学的試験時に内側半月板が無傷であると思われ、変形性関節症の変化が実質的になかったのでデータから除外した。
【０２９６】
実施例３．３．６．Ｂ．組織標本作製及び試験
上記実施例３．３．５に記載したように組織から標本を作製し、採点した。
【０２９７】
実施例３．３．６．Ｃ．結果
結果を図７に示す。変形性関節症の関節不安定性モデル（ＪＩＭ）で得られた結果（上記）と同様に、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体（９Ｈ１０）又は抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体（１０Ｇ１１）を単独投与すると、軟骨変性が抑制されたが、ビヒクル対照関節で認められた結果と統計的有意差はなかった。他方、両者モノクローナル抗体又はＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質（１．５ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１α／β  ＤＶＤを除く）による併用療法では平均合計チェンバーズスコア（軟骨変性全体を示す）と平均最大チェンバーズスコア（関節の最重篤患部）が有意に低下した。ｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ投与群では平均合計チェンバーズスコアに統計的に有意な用量効果が認められた。従って、本試験では、抗ｍＩＬ−１αモノクローナル抗体と抗ｍＩＬ−１βモノクローナル抗体の両方（各６ｍｇ／ｋｇ）及びｍＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質（３ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇ）を８週間投与すると、変形性関節症のＤＭＭモデルで誘発させた軟骨変性の進行が改善された。
【０２９８】
実施例３．３．７．変形性関節症の内側半月板不安定化（ＤＭＭ）モデルの動物における軟骨変性に及ぼす抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β活性と低分子投与の効果
ドキシサイクリンは変形性関節症のＤＭＭモデル（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎ−ｖｉｖｏ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ，Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｉｖ．Ｍａｓｓ．Ｍｅｄ．Ｓｃｈｏｏｌ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ，Ｔｒａｎｓ  ＯＲＳ  ２００９−要完全引用）及びヒト臨床試験（Ｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｒｔｈｒｉｔ．Ｒｈｅｕｍ．５２（７）：２０１５−２０２５）において軟骨劣化を予防することが示されている。本試験では、ＤＭＭモデルの動物にドキシサイクリンを投与した効果を、抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を動物に併用投与した効果と比較した。
【０２９９】
実施例３．３．７．Ａ．試験デザイン
体重約３０グラムの雄性ＳＶ１２９マウスの内側側副靱帯を鈍的剥離により露出させ、横に切開し、半月板を大腿骨側に反転させた。関節スペースを８−０  ｖｉｃｒｙｌ縫合糸で縫合した。皮膚を創傷接着剤で閉鎖した。偽手術では、膝の内側に垂直皮膚切開を行い、関節包を切開した。関節包を８−０  ｖｉｃｒｙｌ縫合糸で縫合し、皮膜を創傷接着剤で閉鎖した。次に下記試験デザイン表に従って動物群にビヒクル又は治療薬を経口（ｐｏ）投与又は腹腔内（ｉｐ）注射した。雌雄別と年齢と系統を一致させたナイーブマウス３匹も試験に加えた。４週間投与後に動物を安楽死させ、膝関節を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンに浸漬した。
【０３００】
【表２９】
0005918275.tif 000048
【０３０１】
実施例３．３．７．Ｂ．組織標本作製及び試験
上記実施例３．３．５に記載したように組織から標本を作製し、採点した。
【０３０２】
実施例３．３．７．Ｃ．結果
結果を図８に示す。試験条件下で抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を各々１匹当たり１８０μｇの用量で４週間併用投与した処、内側半月板の不安定化により雄性ＳＶ１２９マウスに誘発させた変形性関節炎変化は有意に改善された。平均合計チェンバーズスコアと平均最大チェンバーズスコアは有意に低下し、平均総合計チェンバーズスコアはビヒクル対照群と比較してこの併用投与により著しく低下した。ドキシサイクリン３０ｍｇ／ｋｇを投与した場合も、同等の投与効果が得られたが、抗体併用投与のほうがより効果的であった。
【０３０３】
実施例４．抗ＩＬ−１α／β療法の疼痛効力
ＤＭＭモデルは更にマウスに測定可能な疼痛を生じる。最近、Ｍａｌｆａｉｔら（Ｍａｌｆａｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，１８：５７２−５８０参照）はＤＭＭ後の後足で足引っ込め閾値（疼痛の機械的アロディニア指標）が著しく低下するが、偽手術の場合にはそうではないことを示している。抗ＩＬ−１α／β療法の効力をＤＭＭ動物モデルで試験した。このシリーズの試験で示されるように、ＤＭＭ手術を施したマウスは手術から７日後という早期にアロディニア症状を示し、３５日目までに足引っ込め閾値の低下を示した。
【０３０４】
抗ＩＬ−１療法が疼痛を改善する可能性をＯＡのＤＭＭマウスモデルで機械的アロディニアについて試験した。ＩＬ−１α及びＩＬ−１β  ｍＡｂの併用投与を手術日に開始し、週２回ずつ５週間繰返した。動物にＰＢＳビヒクル単独、ＩｇＧアイソタイプ対照、又は抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β  ｍＡｂの併用（各ｍＡｂ  ６ｍｇ／ｋｇの用量）を投与した。動物の足引っ込め閾値を毎週試験した。ＰＢＳ又はＩｇＧアイソタイプ対照を投与した群の同側（手術）の足は対側（無手術）の足又は偽手術を施した動物と比較してアロディニア（疼痛）を示した。図９参照。他方、抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β  ｍＡｂを併用投与した群は５週（３５日）目にＰＢＳビヒクル又はＩｇＧアイソタイプ投与群と比較して有意に高い足引っ込め閾値を示し、アロディニア（疼痛）の発現低下を示した。図１０参照。この疼痛抑制は投与から１週間後という早期に認められた（データは示さず）。
【０３０５】
慢性化疼痛におけるＩＬ−１療法の効果を評価するために、慢性化ＯＡと機械的アロディニアに罹患したＩｇＧ対照群の動物に３５日目に抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を併用投与し、２４時間後（３６日）に足引っ込め閾値を試験した。データから明らかなように、抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β  ｍＡｂの併用療法は慢性疾患をもつ動物においてアロディニアを改善（ＯＡ疼痛を軽減）した。これらのデータによると、抗ＩＬ−１療法は潜在的疾患緩和効果から独立した鎮痛効果を提供すると判断される。図１１参照。
【０３０６】
実施例５．抗ＩＬ−１α／β併用療法の疼痛効力の追加試験
抗ＩＬ−１療法がＯＡのＤＭＭマウスモデル（上記参照）で機械的アロディニアに関して疼痛を改善する可能性を更に評価した。ＩＬ−１α及びＩＬ−１β  ｍＡｂの併用投与を手術日に開始し、週２回ずつ４週間繰返した。ＤＭＭ動物にＰＢＳビヒクル単独、抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）、抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ），又は抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）と抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ（６ｍｇ／ｋｇ）の併用を週２回ずつ４週間腹腔内（ｉｐ）投与した。２８日目に動物をアロディニアについて試験した。ビヒクル投与群の同側（手術）の足は対側（無手術）の足又は偽手術を施した動物と比較してアロディニア（疼痛）を示した。図１２参照。同様に、抗ＩＬ−１α又は抗ＩＬ−１β  ｍＡｂを単独投与した群はアロディニア（疼痛）を示した。他方、抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β  ｍＡｂを併用投与した群はビヒクル投与群と比較して有意に高い足引っ込め閾値を示し、アロディニア（疼痛）の発現低下が判明した（図１２）。
【０３０７】
実施例６．抗ＩＬ−１α／β併用療法の用量依存的疼痛効力
ＤＭＭマウスモデルの動物に手術を行った当日にＩＬ−１α及びＩＬ−１β  ｍＡｂの併用投与を開始し、週２回ずつ４週間繰返した。動物にＰＢＳビヒクル単独又は抗ＩＬ−１α  ｍＡｂと抗ＩＬ−１β  ｍＡｂを各々１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は６ｍｇ／ｋｇずつ併用し、４日おきに４週間腹腔内（ｉｐ）投与した。２８日目に動物の足引っ込め閾値を試験した。ビヒクル投与群の同側（手術）の足は対側（無手術）の足又は偽手術を施した動物と比較して足引っ込め閾値の有意低下を示し、アロディニア（疼痛）を示した（図１３）。他方、抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β  ｍＡｂを併用投与した群はビヒクル投与群と比較して足引っ込め閾値の用量依存的増加を示し、アロディニア（疼痛）の発現低下を示した（図１３）。
【０３０８】
実施例７．慢性化疼痛における抗ＩＬ−１α／β併用療法
慢性化疼痛における抗ＩＬ−１α／β併用療法の効果を評価するために、慢性化ＯＡと機械的アロディニアに罹患したＤＭＭマウスモデルの動物に２８日目のアロディニア試験の２４時間前の２７日目に抗ＩＬ−１α  ｍＡｂと抗ＩＬ−１β  ｍＡｂを各々１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は６ｍｇ／ｋｇずつ併用して腹腔内（ｉｐ）投与した。結果を図１４に示す。データから明らかなように、抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β  ｍＡｂの併用療法は慢性疾患をもつ動物において機械的アロディニアを用量依存的に改善（ＯＡ疼痛を軽減）した（図１４）。
【０３０９】
実施例８．抗ＩＬ−１α／β併用療法の抗痛覚過敏効果
ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの中和が炎症性疼痛状態に抗侵害受容効果を生じるか否かを評価するために、侵害受容性疼痛のマウスカラギ−ナン足モデルにおける慢性化疼痛を改善する能力について抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β  ｍＡｂを評価した。
【０３１０】
マウスカラギ−ナンモデルで単独又は併用投与した場合の抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β  ｍＡｂの効力を評価した（図１５）。足底内カラギ−ナン注射から３０時間後に９００μｇの抗ＩＬ−１α  ｍＡｂ、抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ、又はその併用を各種マウス群に投与した。カラギ−ナン注射から４８時間後と９６時間後に熱痛覚過敏試験を実施した。先の試験で認められたように、９００μｇ用量を併用投与すると、熱痛覚過敏は有意に緩和された（４８時間でＰＢＳ群のカラギ−ナン足４．９８±０．３４ｓに対して８．１１±０．６２ｓ、ｐ＜０．０１，図１５Ａ；９６時間でＰＢＳ群のカラギ−ナン足４．４５±０．５５ｓに対して７．６２±０．４５ｓ、ｐ＜０．０１，図１５Ｂ）。９００μｇ併用群における抗侵害受容効果は４８時間で５３±７％であり、９６時間で８２±１１％であった。ジクロフェナク（非ステロイド性抗炎症鎮痛薬）陽性対照も熱痛覚過敏の有意緩和を示した（両時点でｐ＜０．０１）。他方、抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β  ｍＡｂを単独投与した場合には両時点で有意な抗侵害受容効果は認められず、マウスカラギ−ナン炎症性疼痛モデルで抗侵害受容効果を得るにはＩＬ−１αとＩＬ−１βの両方の同時中和が必要があると判断された。
【０３１１】
実施例９．抗ＩＬ−１α／β併用療法の用量依存的抗痛覚過敏効果
図１６に示すように、マウス（雌性ＢＡＬＢ／ｃ）に足底内カラギ−ナン注射すると、輻射熱刺激に対する足引っ込め潜時の減少（カラギ−ナン注射から４８時間後と９６時間後に実施した試験；両時点でＰＢＳビヒクル群におけるカラギ−ナン足に対する対照非損傷足ｐ＜０．０１）が認められたことが明らかなように、長期持続性熱痛覚過敏が誘発される。カラギ−ナン注射から３０時間後に各群の動物にビヒクル又は抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β  ｍＡｂの併用（マウス１匹当たり各ｍＡｂ１００μｇ、３００μｇ又は９００μｇ）を投与した。用量依存効果が認められ、抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ９００μｇを併用投与した場合には、熱痛覚過敏が有意に緩和された（４８時間で９００μｇ群のカラギ−ナン足７．８８±０．９３ｓに対してＰＢＳ群の３．２３±０．３４ｓ、ｐ＜０．０１，図１６Ａ；９６時間で９００μｇ群のカラギ−ナン足７．６２±０．４５ｓに対してＰＢＳ群の４．４５±０．５５ｓ、ｐ＜０．０１，図１６Ｂ）。９００μｇ投与群における抗侵害受容効果は４８時間で７０±９％であり、９６時間で６２±４％であった。非ステロイド性抗炎症鎮痛薬であるジクロフェナク（３０ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として試験に加えた処、試験の６０分前にｐ．ｏ．投与した場合に損傷足の平均足引っ込め潜時は４８時間で７．０１±０．５８ｓ、９６時間で７．４８±０．３４ｓまで増加した（両時点でｐ＜０．０１）。ＩｇＧ対照群と低用量１００μｇ  ｍＡｂ群はどの時点でも熱痛覚過敏が緩和されなかった。ｍＡｂとジクロフェナクでは対照非損傷足における足引っ込め潜時値は有意に変化しなかった。
【０３１２】
実施例１０．ＣＦＡ疼痛モデルにおける抗ＩＬ−１α／β併用療法の効力
ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）炎症性疼痛モデルを使用して抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ併用が機械的端点に対して効力を生じるか否かを試験した。従って、動物（雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス）にＣＦＡを足底内注射してから４８時間後にフォン・フライ・モノフィラメントを使用して機械的アロディニアを評価した。図１７Ａから明らかなように、ＣＦＡを注射した足にＰＢＳビヒクルを単独投与した場合の足引っ込め閾値の低下により明らかなように、足底内ＣＦＡは強い機械的アロディニアを生じた（対側非損傷足の０．８６０±０．０９０ｇに対して０．０５２±０．０２８ｇ，ｐ＜０．０１）。別の群の動物にＣＦＡ注射から３０時間後にＩｇＧアイソタイプ対照又は抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ併用（マウス１匹当たり各ｍＡｂ９００μｇ）を投与した。ｍＡｂ投与群は機械的アロディニアの有意緩和を示した（０．４１９±０．１０１ｇ，ＰＢＳビヒクルに対してｐ＜０．０１，図１７Ａ）。効力の強さ（％ＭＰＥ）は６５．５１±１２．３５％であった（図１７Ｂ）。抗炎症鎮痛薬陽性対照ジクロフェナク（３０ｍｇ／ｋｇ，１時間前投与）も足引っ込め閾値を増加することにより機械的アロディニアを緩和し（０．３５９±０．０８８ｇ，ＰＢＳビヒクルに対してｐ＜０．０１）、％ＭＰＥは６４．５１±１０．２０％であった。
【０３１３】
実施例１１．神経障害性疼痛における抗ＩＬ−１α／β併用療法の効力
マウス（雄性ＣＤ１）のＬ５／Ｌ６脊髄神経結紮（ＳＮＬ）モデルで抗ＩＬ−１α及び抗ＩＬ−１β  ｍＡｂ併用療法が神経障害性疼痛状態に効力を生じるか否かを試験した。ＳＮＬ手術から６日後、ｍＡｂ併用投与（マウス１匹当たり各ｍＡｂ９００μｇ）から２４時間後と７２時間後に試験を行った。フォン・フライ・モノフィラメント刺激に対する足引っ込め閾値の低下により明らかなように、ＳＮＬ手術後にＰＢＳビヒクルを単独投与したマウスでは機械的アロディニアが認められた（２４時間で対側足の０．７３５±０．１０９ｇに対して０．０７３±０．０３２ｇ、図１８Ａ；７２時間で対側足の０．７３２±０．１３２ｇに対して０．１２８±０．０４８ｇ、図１８Ｂ；両時点でｐ＜０．０１）。ｍＡｂ投与群は両時点で機械的アロディニアの有意緩和を示した（２４時間で０．４７７±０．１３１ｇ，ＰＢＳビヒクルに対してｐ＜０．０１、図１８Ａ；７２時間で０．５２７±０．１１１ｇ、ＰＢＳビヒクルに対してｐ＜０．０１、図１８Ｂ）。効力の強さ（％ＭＰＥ）は２４時間で７２．２０±１４．３９％であり、７２時間で８０．６２±１２．３３％であった（図１９）。陽性対照ガバペンチン（１００ｍｇ／ｋｇ，１時間前投与）は足引っ込め閾値を有意に増加することにより機械的アロディニアの緩和に完全に有効であった（２４時間で０．８５８±０．０７７ｇ、７２時間で１．１３８±０．０９６ｇ、両時点でＰＢＳビヒクルに対してｐ＜０．０１）。他方、ＩｇＧ対照群は両時点で機械的アロディニアに何ら効果がなかった。
【０３１４】
疼痛治療試験の結論
本願に記載する疼痛試験の結果から明らかなように、本発明による抗ＩＬ−１α／β併用療法は変形性関節症に関連する疼痛だけでなく、任意型の疼痛の治療法として有効である。このような抗ＩＬ−１α／β併用療法は限定されないが、アロディニア、痛覚過敏及びアロディニアと痛覚過敏の併発の疼痛状態を含む任意型の疼痛状態に罹患した個体における疼痛を治療するために使用することができる。抗ＩＬ−１α／β併用療法は抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体と抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体の組合せ等のＩＬ−１α結合性蛋白質とＩＬ−１β結合性蛋白質の組合せ（例えば混合物、同時投与、又は順次投与）を個体に投与することにより、あるいはＩＬ−α及びＩＬ−１βの両方と結合する二重特異性抗体又はＩＬ−１α／β  ＤＶＤ−Ｉｇ結合性蛋白質等のＩＬ−α及びＩＬ−１βの両方と結合する蛋白質を個体に投与することにより実施することができる。
【０３１５】
資料援用
本願の随所に引用する場合がある全引用資料（文献資料、特許、特許出願及びウェブサイトを含む）とその引用資料はその内容全体を特に本願に援用する。特に指定しない限り、本発明の実施には、当分野で周知の薬学、免疫学、分子生物学及び細胞生物学の慣用技術を利用する。
【０３１６】
等価物
本発明はその趣旨又は本質的特徴から外れない限り、他の特定形態で実施することもできる。従って、上記態様はあらゆる点において例証とみなすべきであり、本願に記載する発明を限定するものではない。従って、本発明の範囲は上記記載ではなく、特許請求の範囲により指定され、従って、特許請求の範囲と等価の意味及び範囲内に該当する全変更も本願に含むものとする。
【図１Ａ】
0005918275.tif 000049
【図１Ｂ】
0005918275.tif 000050
【図２】
0005918275.tif 000051
【図３】
0005918275.tif 000052
【図４】
0005918275.tif 000053
【図５】
0005918275.tif 000054
【図６】
0005918275.tif 000055
【図７】
0005918275.tif 000056
【図８】
0005918275.tif 000057
【図９】
0005918275.tif 000058
【図１０】
0005918275.tif 000059
【図１１】
0005918275.tif 000060
【図１２】
0005918275.tif 000061
【図１３】
0005918275.tif 000062
【図１４】
0005918275.tif 000063
【図１５Ａ】
0005918275.tif 000064
【図１５Ｂ】
0005918275.tif 000065
【図１６Ａ】
0005918275.tif 000066
【図１６Ｂ】
0005918275.tif 000067
【図１７Ａ】
0005918275.tif 000068
【図１７Ｂ】
0005918275.tif 000069
【図１８Ａ】
0005918275.tif 000070
【図１８Ｂ】
0005918275.tif 000071
【図１９】
0005918275.tif 000072
【配列表】
0005918275000001.app