(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＩ６以上を有する組換えタンパク質をグラム陰性細菌宿主細胞のバッチ又はその抽出物から精製するための方法であって、前記宿主細胞が、組換えタンパク質及び組換えジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣを発現し、
ａ．宿主細胞のバッチ又はその抽出物のｐＨをｐＨ５〜３に調整して、組換えジスルフィドイソメラーゼを沈殿させるステップ、及び
ｂ．沈殿した組換えジスルフィドイソメラーゼを組換えタンパク質から分離して、組換えタンパク質試料を生産するステップ
を含む上記方法。
【請求項２】
宿主細胞のバッチ又はその抽出物のｐＨがｐＨ４．５から３．０に調整される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ジスルフィドイソメラーゼがヒスチジンタグを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
グラム陰性細菌宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞がＦｋｐａ及び／又はＳｋｐを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）において、宿主細胞試料のバッチ又はその抽出物のｐＨが、氷酢酸を用いてｐＨ５〜３に調整される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞のバッチ又はその抽出物がｐＨ５〜３で１時間以下にわたり保持される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）における分離が遠心分離及び／又は濾過を含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）の後に、組換えタンパク質をクロマトグラフィーに供するさらなる精製ステップを含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
クロマトグラフィーがイオン交換クロマトグラフィーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｂ）の後に、組換えタンパク質のｐＨがｐＨ５から７に調整される、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップａ）の前に、抽出緩衝液が宿主細胞のバッチ又はその抽出物に添加され、宿主細胞のバッチ又はその抽出物が熱処理ステップに供される、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
組換えタンパク質がｐＩ６から９を有する、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
組換えタンパク質がｐＩ８から９を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組換えタンパク質が組換え抗体である、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
組換え抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、若しくはキメラ抗体、又はその断片、例えばその結合断片である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
組換え抗体がＦａｂ断片又はＦａｂ’断片である、請求項１５又は請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
組換え抗体がヒトＴＮＦαに特異的である、請求項１５から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
抗体が、可変ドメインがＣＤＲＨ１について配列番号１、ＣＤＲＨ２について配列番号２、及びＣＤＲＨ３について配列番号３で示される配列を有するＣＤＲを含む重鎖、並びに可変ドメインがＣＤＲＬ１について配列番号４、ＣＤＲＬ２について配列番号５、及びＣＤＲＬ３について配列番号６で示される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗体が、配列番号７で示される軽鎖可変領域配列及び配列番号８で示される重鎖可変領域を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗体がＦａｂ断片であり、配列番号１０で示される配列を有する重鎖及び配列番号９で示される配列を有する軽鎖を含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質をグラム陰性宿主細胞試料又はその抽出物から精製するためのプロセスに関する。より具体的には、グラム陰性宿主細胞試料又はその抽出物を低いｐＨに調整して、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼの沈殿を行う。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技術は急速に発展しており、抗体、特に治療的抗体の生産において有用である。組換え遺伝子を発現させるための系は、当業者に周知である。これらには、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞、並びにトランスジェニック動物及びトランスジェニック植物における発現が含まれる。発現系の選択は、コードされるタンパク質の特徴、例えば翻訳後修飾に応じる。他の考慮事項には、所望の量の所要の質の材料の生産に伴う時間、及び特にコストが含まれる。これらの後者の考慮事項は、規制認可に必要な質の、且つ多くの患者の治療に必要な量の治療的抗体の生産において特に重要である。
【０００３】
組換えタンパク質の生産に広く用いられている系は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発現に基づく。大腸菌の使用において直面する固有の問題は、治療に必要な量の、所要の質の材料を生産することの困難性である。特に、伴う時間及びコストは、桁違いであり得る。注目すべき１つの固有の問題は、大腸菌から抗体を精製する間の、抗体の収量において生じるロスである。
【０００４】
比例的に、精製コストは治療的抗体生成物の全コストの一部であるが、精製コストの割合は、上流の生産コストが安くなるほど増大する。したがって、抗体の回収及び精製の向上は、生産手段に関わらず、生産コストをさらに低下させることになる（Humphreys & Glover, Curr. Opin. Drug Discovery & Development, 2001, 4:172-185）。したがって、例えば生成物の回収の増大及び／又は生成物流の質の向上によって、時間及び／又はコストの削減を治療的抗体の生産、特に精製に導入する方法が必要とされている。
【０００５】
低い生成物収量は、下流の精製ステップの間に見られる特有の問題であることが多い。下流の精製における固有の問題は、治療的抗体が宿主細胞から抽出される際に放出される宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の分離に関連する。この問題に対処するために、多くのプロセス変更が試されてきた。このようなプロセスの例には、以下のものが含まれる。
【０００６】
目的のタンパク質は、沈殿し、次いで他のＨＣＰ汚染物質から分離され得る。しかし、治療的抗体の沈殿は、抗体に対して不可逆的なダメージを生じさせ得る。目的のタンパク質を特異的に沈殿させる技術は、非タンパク性の汚染物質を沈殿物内に閉じ込めて分離を無効にする結果となることが多い。
【０００７】
或いは、ＨＣＰは、治療的抗体から沈殿除去され得る。ＵＳ７１６９９０８は、宿主細胞不純物を沈殿させるためのエタクリジンラクテート溶液の添加を記載している。しかし、エタクリジンラクテートなどの作用物質の使用は、これらが中絶剤として用いられており、且つこれが完全に除去されない場合は患者にとって有害であり得ることから、治療的タンパク質の生産には適していない。ＣＨＯ細胞培養物に由来するＨＣＰは、タンパク質を精製するために、小分子及びｐＨ調整を用いて沈殿されている（Arunakumari A. et al. Advances in Non-Protein A Purification Processes for Human Monoclonal Antibodies Supplement to BioPharm International March 2009 p 22-26）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような方法は、宿主細胞汚染物質からの治療的抗体の精製の促進に寄与しているが、下流のプロセシングをさらに促進するために、治療的抗体の特性に負の影響を与えることなく、微生物宿主細胞系に由来するＨＣＰの量を低減させるための改善された方法を提供する必要性が、依然として存在する。
【０００９】
さらに本発明者らが見出したことは、宿主による、特定のシャペロンタンパク質、例えばジスルフィドイソメラーゼ、例えばＤｓｂＣの発現が、抗体又はその断片の発現レベルの増大に有用であり得るということである。しかし、シャペロンタンパク質は有意なレベルで発現し、除去を必要とする大量のプロセス副産物となる。
【００１０】
大量の汚染物質の除去は困難であり得、それは、カラムクロマトグラフィーなどの方法によって、カラムのファウリング及び大量の試薬又は溶媒を用いる必要性に起因して、大量のタンパク質汚染物質の除去が困難であることが明らかになるためである。
【００１１】
単離されたＤｓｂＣを試験すると、これは、ｐＨ３などの低いｐＨで可溶性である。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、５以下のｐＨ調整を用いて、組換えジスルフィドイソメラーゼをグラム陰性細菌宿主細胞から沈殿させることができ、それによって治療的抗体などの目的の組換えタンパク質のさらなるプロセシングが促進されることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの態様において、組換えタンパク質を、宿主細胞、例えば、組換えタンパク質及び組換えジスルフィドイソメラーゼを発現するグラム陰性細菌宿主細胞試料又はその抽出物から精製するための方法であって、
ａ．宿主細胞試料又はその抽出物のｐＨをｐＨ５以下に調整して、組換えジスルフィドイソメラーゼを沈殿させるステップ、及び
ｂ．沈殿した組換えジスルフィドイソメラーゼを組換えタンパク質から分離して、組換えタンパク質試料を提供するステップ
を含む方法が提供される。
【００１３】
本発明はまた、組換えタンパク質をコードする発現ベクターで形質転換されたグラム陰性細菌宿主細胞試料又はその抽出物のｐＨをｐＨ５以下に調整して、宿主細胞組換えジスルフィドイソメラーゼを沈殿させ、その後、沈殿した宿主細胞組換えジスルフィドイソメラーゼを組換えタンパク質から分離し、精製された組換えタンパク質試料を提供するステップの使用を提供する。
【００１４】
１つの実施形態において、組換え抗体又はその結合断片をグラム陰性細菌宿主細胞試料又は前記宿主細胞の抽出物から精製するための方法であって、前記宿主細胞が、組換え抗体又はその結合断片及び組換えジスルフィドイソメラーゼＤｓｂＣを発現し、
ａ．宿主細胞試料又はその抽出物のｐＨをｐＨ範囲３．５から５に調整して、組換えＤｓｂＣを沈殿させるステップ、及び
ｂ．沈殿した組換えＤｓｂＣを分離して、精製された組換え抗体又はその断片を含有する試料を提供するステップ
を含む方法が提供される。
【００１５】
驚くべきことに、このｐＨ調整ステップは、かなりの量の宿主細胞組換えジスルフィドイソメラーゼを溶液から沈殿させ、それによって、目的の組換えタンパク質からの宿主細胞組換えジスルフィドイソメラーゼの分離を可能にする。これによって、クロマトグラフィーカラム上の結合部位について組換えタンパク質と競合する溶液内の宿主細胞ジスルフィドイソメラーゼを低減させることによって、下流のプロセシング、特にあらゆるその後のクロマトグラフィーステップ、例えば非アフィニティークロマトグラフィー捕捉が促進される。したがって、クロマトグラフィーカラムへのＨＣＰのロードは最少になり、目的の組換えタンパク質の収量は、同一のサイズ及び数のクロマトグラフィーカラムを用いる場合、向上する。これによって、さらなる下流の精製の時間及びコストが低減する。
【００１６】
興味深いことに、純粋なＤｓｂＣは、ｐＨ範囲３．０から５では沈殿しない（図４を参照されたい）。しかし、抗体又はその結合断片を発現するグラム陰性細胞の複雑な環境に存在する場合、或いは前記細胞の内容物の一部又は全ての存在下では、ＤｓｂＣは沈殿する。理論に縛られることは望まないが、通常、ＤｓｂＣなどのジスルフィドイソメラーゼはｐＨ範囲３．５から５で可溶性であっても、宿主細胞又はその抽出物の複雑なマトリクス環境は、前記タンパク質の沈殿をそのｐＨ範囲で触媒すると仮定される。おそらく、沈殿が開始すると、それは継続し、高まる。
【００１７】
したがって、本開示に従った方法は、大規模での使用に適しており、したがって、抗体などのタンパク質の商業的なプロセシングにおいて非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】対照ｐＨ６．９と比較した、ｐＨがｐＨ５．０、ｐＨ４．５、又はｐＨ３．０に調整された後の宿主細胞溶液の観察された沈殿を示す図である。
【図２】対照ｐＨ７と比較した、ｐＨ５、ｐＨ４．５、又はｐＨ３にｐＨ調整した後の宿主細胞溶液についての、時間（Ｔ）＝０での逆相ＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを示す図である。
【図３】対照ｐＨ７と比較した、ｐＨ５、ｐＨ４．５、又はｐＨ３にｐＨ調整した後の宿主細胞溶液についての、Ｔ＝０での逆相ＨＰＬＣ分析の個別のクロマトグラムを示す図である。
【図４】対照ｐＨ７と比較した、異なる時間間隔後の、ｐＨ３にｐＨ調整した後のＤｓｂＣを含む溶液についての、逆相ＨＰＬＣ分析の個別のクロマトグラムを示す図である。
【図５】対照ｐＨ７と比較した、ｐＨ５、ｐＨ４．５、又はｐＨ３にｐＨ調整した後の宿主細胞溶液についての、様々な時点での逆相ＨＰＬＣ分析からの、ＤｓｂＣについての全ピーク領域を示す図である。
【図６】対照ｐＨ７と比較した、ｐＨ５、ｐＨ４．５、又はｐＨ３にｐＨ調整した後の宿主細胞溶液についての、様々な時点での逆相ＨＰＬＣ分析からの、ＤＢＰについての全ピーク領域を示す図である。
【図７】対照ｐＨ６．９と比較した、ｐＨ５、ｐＨ４．５、又はｐＨ３にｐＨ調整した後の宿主細胞溶液についての、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析ゲルを示す図である。
【図８】配列番号１から１６の配列を示す図である。
【図９】システイン残基を介してリシルマレイミドリンカーに共有結合している修飾された抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’断片を含む、ＣＤＰ８７０と呼ばれる化合物の構造を示す図であり、化合物中、リシル残基上の各アミノ基には、ｎが約４２０であるメトキシＰＥＧ残基が共有結合で付着している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＣＤＰ８７０のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列を示す。
【００２０】
配列番号２は、ＣＤＰ８７０のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列を示す。
【００２１】
配列番号３は、ＣＤＰ８７０のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を示す。
【００２２】
配列番号４は、ＣＤＰ８７０のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列を示す。
【００２３】
配列番号５は、ＣＤＰ８７０のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列を示す。
【００２４】
配列番号６は、ＣＤＰ８７０のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を示す。
【００２５】
配列番号７は、ＣＤＰ８７０の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列及び予測されるアミノ酸配列を示す。
【００２６】
配列番号８は、ＣＤＰ８７０の重鎖可変領域のヌクレオチド配列及び予測されるアミノ酸配列を示す。
【００２７】
配列番号９は、グラフト化された抗ＴＮＦαＦａｂ  ＣＤＰ８７０軽鎖のアミノ酸配列を示す。
【００２８】
配列番号１０は、グラフト化された抗ＴＮＦαＦａｂ  ＣＤＰ８７０重鎖のアミノ酸配列を示す。
【００２９】
配列番号１１は、ヒスタグ化されたＤｓｂＣのヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号１２は、ヒスタグ化されたＤｓｂＣのアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号１３は、最初の２６アミノ酸残基であるシグナル配列を含む野生型ｓｐｒ遺伝子の配列である。
【００３２】
配列番号１４は、シグナル配列を有さない野生型ｓｐｒ遺伝子の配列である。
【００３３】
配列番号１５は、開始コドンの上流の６つのヌクレオチドＡＴＧＡＡＴを含む突然変異したノックアウトＴｓｐ遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００３４】
配列番号１６は、大腸菌Ｆａｂの発現のための遺伝子間配列２（ＩＧＳ２）をコードするオリゴヌクレオチドカセットを示す。
【００３５】
本発明をここでより詳細に説明する。
【００３６】
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、文脈により別段の指示がない限り、本明細書において区別せずに用いられる。「ペプチド」は、１０以下のアミノ酸を言うものとする。
【００３７】
用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡが含まれる。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、本明細書の文脈における用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と解釈されるべきである。
【００３９】
表現「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、及び「株」は、区別せずに用いられる。
【００４０】
本明細書において用いられる宿主細胞抽出物（その抽出物）は、宿主細胞内容物の一部又は全て、すなわち、
・  細胞から一部若しくは全ての化学的物質を抽出するための部分的又は全細胞溶解から得られる材料、又は
・  細胞から発現されるタンパク質の１つ又は複数が液相内に放出されるように細胞をプロセシングすることから得られる材料
を言うために用いられる。
【００４１】
本明細書において用いられる、宿主細胞の内容物を形成する化学的物質及び材料は、液体、タンパク質、脂質、糖、リポ多糖、ペプチドグリカン、プラスミドＤＮＡ及び染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子、例えばアミノ酸、金属イオン、レドックス活性分子、ｔＲＮＡ、並びに細胞内からの上記全ての断片を言う。
【００４２】
細胞から１つ又は複数のタンパク質を放出させるための方法には、熱処理、及び／又は細胞を非溶解圧力に晒すこと、及び／又は緩衝液、キレート剤、洗剤を含む化学物質、物理的崩壊の使用、及び／又は音波エネルギーの使用、及び／又は機械的せん断の使用が含まれる。
【００４３】
本明細書において用いられるグラム陰性細胞試料は、グラム陰性細胞の集団、例えば少なくとも２つのグラム陰性細胞を言うが、より具体的には、発酵プロセス、特に商業的な発酵プロセスにおいて用いられるバッチを言う。
【００４４】
本明細書において用いられる精製された組換え抗体又はその結合断片は、対応するプロセシングされていない形態よりも不純物及び汚染物質が少ない、抗体又は断片の形態を言うものとする。抗体又は断片は依然としてさらなる精製ステップを要し得るため、これは必ずしも絶対的な用語であるものではない。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明に従った方法によって提供される精製された組換え抗体又はその結合断片は、実質的に純粋である。
【００４６】
本明細書において用いられる、実質的に純粋は、抗体又はその結合断片が９０％の純度を超える、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の純度、特に９５％の純度以上である場合を言う。
【００４７】
本明細書において記載される本発明は、組換えタンパク質分子をコードする発現ベクターで形質転換された宿主細胞試料を培養した後に、ｐＨを５以下に調整するステップを用いて組換えジスルフィドイソメラーゼを沈殿させ得、且つ、これが、タンパク質の精製に対して顕著な有利な影響を与えるという、驚くべき且つ予想外の観察に基づく。
【００４８】
本発明のステップａ）は、宿主細胞試料又はその抽出物をｐＨ５以下、ｐＨ５未満、ｐＨ４．５以下、又はｐＨ３以下に調整することを要する。好ましい実施形態において、宿主細胞試料又はその抽出物のｐＨは、ｐＨ４．５以下に、より好ましくはおよそｐＨ４．５に調整される。本発明者らは、ｐＨ４．５が、組換えＤｓｂＣを沈殿させるため、及びその分離を可能にするために特に有利であることを見出した。
【００４９】
１つの実施形態において、宿主細胞試料又はその抽出物のｐＨは、ｐＨ３未満、或いはｐＨ３．５未満のｐＨに調整されない。したがって、宿主細胞試料又はその抽出物のｐＨは、好ましくは、ｐＨ３から４．９、ｐＨ３．５から４．９、ｐＨ３から４．５、又はｐＨ３．５から４．５に調整される。
【００５０】
１つの実施形態において、宿主細胞試料又はその抽出物のｐＨは、ｐＨ３以下に、より好ましくはおよそｐＨ３に調整される。本発明者らは、ｐＨ３以下が、組換えＤｓｂＣ及びまた宿主細胞ジペプチド結合タンパク質を沈殿させるため、及びその分離を可能にするために有利であることを見出した。
【００５１】
しかし、ｐＨ３以下は、ＤｓｂＣタンパク質を宿主細胞又は抽出物から沈殿させるために適切であるが、低いｐＨは、抗体又はその結合断片のフォールディングした立体構造を改変させ得、したがって、プロセスの全てのパラメータを考慮すると、最適ではない可能性がある。
【００５２】
したがって、宿主細胞タンパク質を沈殿させるための最適なｐＨは、細胞により発現される特異的な抗体又は抗体断片に、特に、関連するｐＨ範囲におけるそれらの安定性に応じる。
【００５３】
少なくとも１つのジスルフィドイソメラーゼ、例えば少なくともＤｓｂＣは、このプロセスを用いて沈殿する。１つの実施形態において、１つ又は複数の他の宿主細胞タンパク質もまた、このプロセスを用いて沈殿する。
【００５４】
本発明の方法のステップａ）において、宿主細胞溶液又はその抽出物は、あらゆるさらなる精製ステップ、例えば遠心分離及び／若しくは濾過を行う前に、並びに／又は典型的には溶液のｐＨを上昇させるためのさらなるｐＨ調整の前に、より低いｐＨ、例えばｐＨ５以下で、あらゆる適切な時間にわたり保持され得る。通常、宿主細胞溶液又はその抽出物は、２４時間以下、１２時間以下、６時間以下、５時間以下、２時間以下、１時間以下、３０分以下、１０分以下、又は７分以下にわたり保持される。
【００５５】
本発明の方法を用いた後、ｐＨは、さらなるプロセシング、すなわちその後のプロセシング、例えばさらなる精製、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる精製が行われる前に、例えば、ｐＨ６、６．５、又は７まで上昇し得る。
【００５６】
本発明の方法のステップａ）は、あらゆる適切な温度で、例えば、２０〜２３℃などの室温で、又は１〜１０℃などの低温で行うことができる。したがって、本方法を行うための適切な温度範囲には、少なくとも１から３０℃が含まれる。
【００５７】
宿主細胞試料又はその抽出物のｐＨの調整は、ｐＨを変化させ得るあらゆる適切な作用物質を用いて行うことができる。適切な作用物質の例は、氷酢酸、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、又はトリス塩基、及びその組み合わせである。作用物質は、３０又は６０％（ｖ／ｖ）の氷酢酸、１Ｍの水酸化ナトリウム、１Ｍの酢酸ナトリウム、及び２Ｍ又は３Ｍのトリス塩基などの、あらゆる適切な濃度であり得る。
【００５８】
これらの作用物質の１つ又は複数は、これらが無毒であるため、本開示に従った方法における使用に特に有利であり、例えば、治療的タンパク質の精製における組換えジスルフィドイソメラーゼの沈殿及び除去を可能にする。
【００５９】
ジスルフィドイソメラーゼは、タンパク質がフォールディングする際の、タンパク質内のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成及び破壊を触媒する酵素である。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、組換えタンパク質の抽出の際に宿主細胞から放出される。本発明の方法において用いられる宿主細胞は、組換えジスルフィドイソメラーゼを生産し、したがって、組換えジスルフィドイソメラーゼは、汚染宿主細胞タンパク質の大部分を構成する。本発明は、組換えジスルフィドイソメラーゼを組換えタンパク質から除去するための、時間及びコストの削減手段を提供している。ＤｓｂＣなどの組換えジスルフィドイソメラーゼは、Ｎ末端及び／又はＣ末端にヒスチジンタグ（ヒスタグ）を含み得る。
【００６０】
ヒスチジンタグは、ＤｓｂＣ汚染が抗体又はその結合断片から除去されていることを示すための効果的なモニタリングを可能にするため、有利である。このことは重要であり、それは、標準的なポリクローナル血清はＤｓｂＣに対して反応性が乏しいか又は非反応性である傾向があり、したがって、ＤｓｂＣが高レベルで過剰発現していてもＤｓｂＣを検出することが不可能であるため、野生型大腸菌に由来する細胞内容物に対するポリクローナル血清を用いる場合にはＤｓｂＣの存在を検出することが困難であり得るためである。ポリヒスなどの検出タグの存在によって、豊富に過剰発現しているＤｓｂＣの除去を、感度の高い免疫検出方法を用いて確実にモニタリング／確認することができる。
【００６１】
好ましい実施形態において、組換えジスルフィドイソメラーゼはＤｓｂＣである。ＤｓｂＣは、大腸菌におけるジスルフィド結合の形成を触媒する、大腸菌のペリプラズムで見られる原核生物タンパク質である。ＤｓｂＣは、２３６のアミノ酸配列長（シグナルペプチドを含む）及び２５．６ＫＤａの分子量を有する（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０ＡＥＧ６）。ＤｓｂＣは、１９９４年に最初に同定された（Missiakas et al. The Escherichia coli dsbC (xprA) gene encodes a periplasmic protein involved in disulfide bond formation, The EMBO Journal vol 13, no 8, p2013-2020, 1994、及びShevchik et al. Characterization of DsbC, a periplasmic protein of Erwinia chrysanthemi and Escherichia coli with disulfide isomerase activity, The EMBO Jounral vol 13, no 8, p2007-2012, 1994）。ＤｓｂＣタンパク質は、Ｎ末端及び／又はＣ末端にヒスチジンタグ（ヒスタグ）を含み得る。
【００６２】
ＤｓｂＣの予測されるｐＩは５．７であり、ヒスタグ化されたＤｓｂＣの予測されるｐＩは６．３である。タンパク質のｐＩは、様々な市販及び公開されているソフトウェア並びにＥｘＰＡＳｙ  ＰｒｏｔＰａｒａｍなどのオンラインｐＩ予測設備を用いて予測することができる。
【００６３】
タンパク質は、溶液のｐＨがタンパク質のｐＩを通過すると沈殿することが予想され得る。しかし、図４から、ＤｓｂＣの量がｐＨ調整の後に低減しないことから、宿主細胞又は宿主細胞抽出物を有さないＤｓｂＣ（ヒスタグ化された）溶液が、ｐＨ３に調整された場合に沈殿しないことが観察され得る。驚くべきことに、図３において示されるように、ＤｓｂＣは、組換えＤｓｂＣを含む宿主細胞試料又はその抽出物をｐＨ５未満にｐＨ調整すると沈殿し、かなりの量のＤｓｂＣが、沈殿し、目的の組換えタンパク質から分離され得ることが見出された。したがって、ＤｓｂＣなどのタンパク質の予測されるｐＩから、どのｐＨが宿主細胞試料又はその抽出物からの沈殿を可能にするために必要であるかを予測することは不可能である。
【００６４】
本明細書において用いられる場合、「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築又は生産されたタンパク質を言う。ジスルフィドイソメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、細菌細胞において見られる、ジスルフィドイソメラーゼをコードする内因性配列と同一であり得る。或いは、ジスルフィドイソメラーゼをコードする組換えポリヌクレオチド配列は、例えば制限部位が除去された、野生型ジスルフィドイソメラーゼ配列の突然変異型である。ジスルフィドイソメラーゼがＤｓｂＣである実施形態において、制限部位ＥｃｏＲＩが除去され得、且つ／又はヒスタグをコードする配列が付加され得る。本発明において用いるための、一例の修飾されたＤｓｂＣヌクレオチド配列は配列番号１１で示され、これは、配列番号１２で示されるヒスタグ化されたＤｓｂＣアミノ酸配列をコードする。
【００６５】
１つの実施形態において、突然変異ＤｓｂＣは、−ＣＸＸＣ−によって表される突然変異した活性部位を有するＤｓｂＣタンパク質からなり、式中、ＸＸは、ＴＦ、ＧＦ、ＨＨ、ＮＹ、ＳＦ、ＭＦ、ＶＨ、ＳＨ、ＲＦ、ＦＡ、ＧＡ、ＭＡ、ＧＩ、ＡＶ、ＰＳ、ＱＡ、ＳＶ、ＰＲ、ＰＰ、ＡＬ、ＰＬ、ＦＬ、ＴＲ、ＬＬ、ＶＬ、ＱＬ、ＬＱである。
【００６６】
本発明の方法のステップａ）の前に、本方法は、組換えタンパク質及び組換えジスルフィドイソメラーゼをコードする１つ又は複数の発現ベクターで形質転換された宿主細胞試料を培養することを含み得る。試料は、タンパク質の小規模生産から商業目的のためのタンパク質の大規模製造までの、あらゆる適切な規模であり得る。
【００６７】
タンパク質が抗体である１つの実施形態において、宿主細胞から生産される組換え抗体は、機能的抗体及び非機能的抗体の混合物であり得る。
【００６８】
宿主細胞は、細胞内に形質転換された、及び／又は宿主細胞のゲノム内に組み込まれた適切な発現ベクター上に存在し得るジスルフィドイソメラーゼをコードする組換えポリヌクレオチドを含む。好ましくは、ジスルフィドイソメラーゼをコードするポリヌクレオチドは細胞内の発現ベクター内にあり、それによって、宿主細胞のゲノムの破壊が最小になる。組換えタンパク質及び組換えジスルフィドイソメラーゼは、同一の発現ベクター又は個別の発現ベクター上に存在し得る。
【００６９】
本発明において用いられる細胞は、グラム陰性細菌である。最も好ましくは、細胞は大腸菌である。細胞は、遺伝子操作されている組換え細胞である。大腸菌宿主細胞は、組換えタンパク質を生産し得る突然変異株である。組換え大腸菌宿主細胞は、ＭＣ４１００、ＴＧ１、ＴＧ２、ＤＨＢ４、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＢＬ２１、Ｋ１２、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、及びＪＭ１０９を含むあらゆる適切な大腸菌株に由来し得る。１つの例は、組換えタンパク質の発酵のための一般的に用いられる宿主株である、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）である。例にはまた、修飾された大腸菌株、例えば代謝突然変異体及びプロテアーゼ欠損株が含まれる。
【００７０】
宿主細胞は、組換えジスルフィドイソメラーゼを生産するように遺伝子操作されている。組換えジスルフィドイソメラーゼを生産する宿主細胞は、組換えジスルフィドイソメラーゼの存在によって細胞溶解が低減し得、また組換えタンパク質のプロセシングが促進され得るため、特に有利である。
【００７１】
好ましい実施形態において、宿主細胞は、ヒスタグ化されたＤｓｂＣを含む組換えＤｓｂＣをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００７２】
本発明に従った宿主細胞は、１つ又は複数のさらなる遺伝子修飾を含み得る。
【００７３】
１つの実施形態において、宿主細胞はプロテアーゼ活性が低減している可能性があり、ここで、細胞は、プロテアーゼ活性が低減しているＴｓｐタンパク質をコードする突然変異したＴｓｐ遺伝子を含むか、又はノックアウト突然変異したＴｓｐ遺伝子である。
【００７４】
例えば、宿主細胞は、野生型細胞と比較してＴｓｐタンパク質活性が低減している可能性がある。Ｔｓｐ（Ｐｒｃとしても知られている）は、６０ｋＤａのペリプラズム性プロテアーゼである。Ｔｓｐの最初に知られた基質は、ペニシリン結合タンパク質３（ＰＢＰ３）であった（Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli; Nagasawa H, Sakagami Y, Suzuki A, Suzuki H, Hara H, Hirota Y.  J Bacteriol. 1989 Nov;171(11):5890-3、及びCloning, mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3; Hara H, Yamamoto Y, Higashitani A, Suzuki H, Nishimura Y. J Bacteriol. 1991 Aug;173 (15):4799-813）が、Ｔｓｐはまたファージ尾部タンパク質を切断し得ることが後に発見され、したがって、これは尾部特異的プロテアーゼ（Ｔｓｐ）と改名された（Silber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 295-299 (1992)）。
【００７５】
この実施形態において、細胞は、野生型細胞と比較してＴｓｐタンパク質活性が低減している。表現「野生型細胞と比較してＴｓｐタンパク質活性が低減している」は、細胞のＴｓｐ活性が野生型細胞のＴｓｐ活性と比較して低減していることを意味する。細胞は、Ｔｓｐの活性を低減させるためのあらゆる適切な手段によって修飾され得る。１つの実施形態において、Ｔｓｐ活性の低減は、Ｔｓｐをコードする内因性ポリヌクレオチド及び／又は関連する調節性発現配列の修飾から生じる。修飾は、Ｔｓｐ遺伝子の転写及び翻訳を低減若しくは停止させ得るか、又は野生型Ｔｓｐタンパク質と比較してプロテアーゼ活性が低減したＴｓｐタンパク質を発現させ得る。１つの実施形態において、関連する調節性発現配列は、Ｔｓｐ発現を低減させるように修飾される。例えば、Ｔｓｐ遺伝子のプロモーターは、遺伝子の発現を阻害するように突然変異され得る。好ましい実施形態において、本発明に従った細胞は、プロテアーゼ活性が低減しているＴｓｐタンパク質をコードする突然変異したＴｓｐ遺伝子、又はノックアウト突然変異したＴｓｐ遺伝子を有する。好ましくは、染色体Ｔｓｐ遺伝子が突然変異している。
【００７６】
Ｔｓｐ（ｐｒｃ）活性の低減は、目的のタンパク質のタンパク質溶解を低減させるために望ましい。しかし、プロテアーゼｐｒｃを欠いている細胞が低浸透圧で感熱性の成長を示すことが見出された。Ｈａｒａらは、遺伝子外サプレッサー（ｓｐｒ）突然変異を含有する熱耐性の復帰突然変異体を単離した（Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996)）。Ｓｐｒは、１８ｋＤａの膜結合型ペリプラズム性プロテアーゼであり、ｓｐｒの基質は、Ｔｓｐ、及び細胞分裂の間の細胞壁の加水分解に関与する外膜内のペプチドグリカンである。ｓｐｒ遺伝子は、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ０ＡＦＶ４（ＳＰＲ＿ＥＣＯＬＩ）と指定されている。突然変異ｓｐｒ遺伝子を含む、改善したプロテアーゼ欠損株が記載されている。Ｃｈｅｎら（Chen C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Andersen DC, Battersby JE, Champion KM.  Biotechnol Bioeng. 2004 Mar 5;85(5):463-74）は、遺伝子の上流領域及び下流領域を増幅すること、並びにこれらを共に、選択マーカー及びｓｐｒＷ１７４Ｒ突然変異を含むベクター上でライゲーションすることによって生成する、ｐｒｃ（Ｔｓｐ）及び別のプロテアーゼＤｅｇＰ内における突然変異の異なる組み合わせを有する大腸菌株の構築を記載している。大腸菌のペリプラズムにおける組換え抗体断片の高レベルの蓄積には、三重突然変異体（ΔＤｅｇＰ  Δｐｒｃ  ｓｐｒＷ１７４Ｒ）宿主株が必要である。
【００７７】
ｓｐｒタンパク質の野生型アミノ酸配列は、Ｎ末端のシグナル配列を有する配列番号１３及び２６アミノ酸のシグナル配列を有さない配列番号１４で示される（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＡＦＶ４に従う）。本発明におけるｓｐｒタンパク質配列のアミノ酸番号付けには、シグナル配列が含まれる。したがって、ｓｐｒタンパク質のアミノ酸１は、配列番号１３で示される最初のアミノ酸（Ｍｅｔ）である。
【００７８】
さらなる実施形態において、細胞は、突然変異したｓｐｒ遺伝子を含む。ｓｐｒタンパク質をコードする突然変異ｓｐｒ遺伝子は、Ｃ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｈ１４５、Ｇ１４７、Ｈ１５７、及びＷ１７４から選択される１つ又は複数のアミノ酸に突然変異を有し得る。好ましくは、突然変異ｓｐｒ遺伝子は、Ｃ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｈ１４５、Ｇ１４７、及びＨ１５７から選択される１つ又は複数のアミノ酸に突然変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする。好ましくは、突然変異ｓｐｒ遺伝子は、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、及びＧ１４７から選択される１つ又は複数のアミノ酸に突然変異を有するｓｐｒタンパク質をコードする。ｓｐｒ突然変異は、突然変異したＴｓｐ遺伝子を含む細胞の成長表現型を抑制し得る。
【００７９】
アミノ酸Ｃ９４、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、Ｖ１３５、Ｈ１４５、Ｇ１４７、Ｈ１５７、及びＷ１７４の１つ又は複数は、あらゆる適切なアミノ酸に突然変異され得、その結果、突然変異したＴｓｐ遺伝子を含む細胞の表現型を抑制し得るｓｐｒタンパク質を生じさせる。例えば、Ｓ９５、Ｖ９８、Ｙ１１５、Ｄ１３３、及びＶ１３５の１つ又は複数は、Ｇｌｙ又はＡｌａなどの低分子アミノ酸に突然変異され得る。好ましい実施形態において、ｓｐｒタンパク質は、突然変異Ｃ９４Ａ、Ｓ９５Ｆ、Ｖ９８Ｅ、Ｙ１１５Ｆ、Ｄ１３３Ａ、Ｖ１３５Ｄ又はＧ、Ｈ１４５Ａ、Ｇ１４７Ｃ、及びＨ１５７Ａの１つ又は複数を含む。
【００８０】
さらなる実施形態において、突然変異したｓｐｒ遺伝子は、突然変異Ｗ１７４Ｒを有するｓｐｒタンパク質をコードする。代替的な実施形態において、ｓｐｒタンパク質は、突然変異Ｗ１７４Ｒを有さない。
【００８１】
本明細書における置換突然変異体の指定は、文字と、その後の数字と、その後の文字とからなる。最初の文字は、野生型タンパク質におけるアミノ酸を指定する。数字は、アミノ酸置換が生じているアミノ酸位置を言い、２つ目の文字は、野生型アミノ酸を置き換えるために用いられるアミノ酸を指定する。
【００８２】
したがって、好ましい実施形態において、本発明において用いられる細胞は、上記に定義したような、ＤｓｂＣ及び突然変異したｓｐｒ遺伝子をコードする組換えポリヌクレオチドを含む。
【００８３】
さらに好ましい実施形態において、本発明において用いられる細胞は、野生型細胞と比較してＴｓｐタンパク質活性が低減しており、上記に定義したような、ＤｓｂＣ及び突然変異したｓｐｒ遺伝子をコードする組換えポリヌクレオチドを含む。
【００８４】
１つの実施形態において、宿主細胞は、シャペロン活性を有しプロテアーゼ活性が低減しているＤｅｇＰタンパク質をコードする突然変異したＤｅｇＰ遺伝子、及び／又は、プロテアーゼ活性が低減したプロテアーゼＩＩＩタンパク質をコードするか、若しくはノックアウト突然変異したｐｔｒ遺伝子である、突然変異したｐｔｒ遺伝子、及び／又は、プロテアーゼ活性が低減したＯｍｐＴタンパク質をコードするか、若しくはノックアウト突然変異したＯｍｐＴ遺伝子である、突然変異したＯｍｐＴ遺伝子を含む。
【００８５】
１つの実施形態において、宿主細胞は、以下のような１つ又は複数のタンパク質を発現する。
・  ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤなどの、タンパク質のフォールディングを促進し得る１つ又は複数のタンパク質、並びに／又は
・  ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹＥＧ、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＦｔｓＹ、及びＬｅｐなどの、タンパク質の分泌若しくは転位を促進し得る１つ又は複数のタンパク質、並びに／又は
・  ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＤ、ＤｓｂＧなどの、ジスルフィド結合の形成を促進し得る１つ又は複数のタンパク質。
【００８６】
上記のタンパク質の１つ又は複数は、細胞のゲノム内に組み込まれ得、且つ／又は発現ベクター内に挿入され得る。
【００８７】
１つの実施形態において、宿主細胞は、以下のタンパク質の１つ又は複数をコードする組換えポリヌクレオチドを含まない。
・  ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｕｒＡ、ＰＰｉＡ、及びＰＰｉＤなどの、タンパク質のフォールディングを促進し得る１つ又は複数のタンパク質、
・  ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹＥＧ、ＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＦｔｓＹ、及びＬｅｐなどの、タンパク質の分泌若しくは転位を促進し得る１つ又は複数のタンパク質、並びに
・  ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＤ、ＤｓｂＧなどの、ジスルフィド結合の形成を促進し得る１つ又は複数のタンパク質。
【００８８】
１つの実施形態において、本発明において用いられる細胞は、野生型細胞と比較してＴｓｐタンパク質活性が低減しており、上記に定義したような、ＤｓｂＣ及び突然変異したｓｐｒ遺伝子をコードする組換えポリヌクレオチドを含み、上記に定義したような、ＤｓｂＣ及び突然変異したｓｐｒ遺伝子をコードする組換えポリヌクレオチド、並びにＦｋｐＡ及び／又はＳｋｐを含む。
【００８９】
本発明の方法を用いて生産される組換えタンパク質は、典型的には、タンパク質の性質及び生産規模に応じて、大腸菌宿主細胞のペリプラズム又は宿主細胞培養物の上清において発現する。タンパク質をこれらの区画に標的化するための方法は、当技術分野において周知であり、閲覧のためには、Makrides, Microbiological Reviews, 1996, 60, 512-538を参照されたい。タンパク質を大腸菌のペリプラズムに向けるための適切なシグナル配列の例には、大腸菌ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、ＬａｍＢ、及びＯｍｐＦシグナル配列が含まれる。タンパク質は、天然の分泌経路に依存することによって、又は外膜の限られた漏出を誘発してタンパク質の分泌を生じさせることによって、上清に標的化され得、後者の例は、ｐｅｌＢリーダーの使用、タンパク質Ａリーダーの使用、バクテリオシン放出タンパク質の共発現の使用、培地へのグリシンの添加及び膜の透過化のためのｋｉｌ遺伝子の共発現を伴う、マイトマイシン誘発性のバクテリオシン放出タンパク質の使用である。最も好ましくは、本発明の方法において、組換えタンパク質は、宿主大腸菌のペリプラズムにおいて発現する。
【００９０】
大腸菌宿主細胞における組換えタンパク質の発現はまた、誘導系の制御下にあり得、これによって、大腸菌における組換えタンパク質の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。大腸菌における使用に適した多くの誘導性プロモーターが、当技術分野において周知であり、プロモーターに応じて、組換えタンパク質の発現は、温度又は成長培地における特定の物質の濃度などの可変因子によって誘発され得る（Baneyx, Current Opinion in Biotechnology, 1999, 10:411-421; Goldstein and Doi, 1995, Biotechnol.Annu.Rev, 105-128）。誘導性プロモーターの例には、ラクトース又は加水分解不可能なラクトース類似体、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導性である大腸菌のｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、及びｔｒｃプロモーター、並びにそれぞれホスフェート、トリプトファン、及びＬ−アラビノースによって誘発されるｐｈｏＡプロモーター、ｔｒｐプロモーター、及びａｒａＢＡＤプロモーターが含まれる。発現は、例えば、誘導因子の添加、又は誘発が温度依存性である場合には温度の変化によって誘発され得る。組換えタンパク質の発現の誘発が培養物への誘導因子の添加によって達成される場合、誘導因子は、発酵系及び誘導因子に応じるあらゆる適切な方法によって、例えば、単一若しくは複数のショット添加によって、又は供給を介する誘導因子の段階的な添加によって、添加され得る。当然のことながら、誘導因子の添加とタンパク質発現の実際の誘発との間には遅延が存在し得、例えば、誘導因子がラクトースである場合、タンパク質発現の誘発が生じる前に遅延が存在し得るが、あらゆる既存の炭素源がラクトースの前に利用される。
【００９１】
大腸菌宿主細胞培養物（発酵物）は、大腸菌の成長及び組換えタンパク質の発現を助けるあらゆる培地内で培養することができる。培地は、本明細書において記載されるような、成長速度を制御するのに適した変更を伴う、Pirt S.J. (1975) Principles of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell Scientific Publicationsにおいて提供されるものなどの、あらゆる化学的に規定された培地であり得る。適切な培地の例は、Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26:309-320によって記載されている「ＳＭ６Ｅ」である。
【００９２】
大腸菌宿主細胞の培養は、所要の生産規模に応じて、振とうフラスコ又は発酵槽などのあらゆる適切な容器内で行うことができる。１，０００リットル超から最大約１００，０００リットルの最大容量を有する様々な大規模発酵槽が利用可能である。好ましくは、１，０００から５０，０００リットルの発酵槽が用いられ、より好ましくは、１，０００から１０，０００又は１２，０００リットルの発酵槽が用いられる。０．５リットルと１，０００リットルとの間の最大容量を有する、より小規模の発酵槽も用いることができる。
【００９３】
大腸菌の発酵は、タンパク質及び所要の収量に応じて、あらゆる適切な系、例えば連続モード、バッチモード、又は流加モードで行うことができる（Thiry & Cingolani, 2002, Trends in Biotechnology, 20:103-105）。バッチモードは、所要の栄養又は誘導因子のショット添加と共に用いることができる。或いは、流加培養を用いることができ、培養物は、発酵槽内に最初から存在している栄養、及び発酵が完了するまで成長速度を制御するために用いられる１つ又は複数の栄養供給レジメを用いて持続され得る、最大の固有の成長速度での、バッチモードの事前誘発で成長している。流加モードもまた、大腸菌宿主細胞の代謝を制御するため、及びより高い細胞密度に達するようにするための事前誘発において用いることができる（Lee, 1996, Tibtech, 14:98-105）。
【００９４】
必要であれば、宿主細胞は、発酵培地から回収することができ、例えば、宿主細胞は、遠心分離、濾過、又は濃縮によって、試料から回収することができる。特に、本発明の方法は、治療的質の抗体の大規模工業生産に適している。
【００９５】
１つの実施形態において、本発明に従った方法は、培養ステップの後の遠心分離ステップを含み、その後、抽出緩衝液を添加することによる細胞の懸濁が行われる。
【００９６】
培養ステップの後、本方法は、組換えタンパク質を宿主細胞から放出させるための抽出ステップを含み得る。抽出は、機械的処理又は加圧処理による細胞溶解、凍結融解処理、浸透圧衝撃、抽出剤処理、又は熱処理などの、あらゆる適切な方法によって行うことができる。このような抽出方法は、当技術分野において周知である。
【００９７】
好ましい実施形態において、抽出緩衝液が試料に添加され、試料は次に、熱処理ステップに供される。熱処理ステップは、好ましくは、ＵＳ５，６６５，８６６（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）において詳細に記載されているものである。熱処理ステップによって、他の抗体関連材料の除去を促進することによって、可溶性で、正確にフォールディングし、且つ組み立てられた抗体の試料を得ることが可能になる。「正確にフォールディングし、且つ組み立てられた」抗体は、非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥでの、組み立てられた重鎖及び軽鎖の予想分子量に対応する単一バンドの存在によって示される。他の抗体関連材料は、典型的には、正確にフォールディングし、且つ組み立てられた抗体の部分的に分解された断片である、遊離した重鎖及び軽鎖又はその一部である。
【００９８】
熱処理ステップは、試料を所望の高温に晒すことによって行われる。最も好ましくは、熱処理ステップは、３０℃から７０℃の範囲内で行われる。温度は、要望通りに選択することができ、また、精製するためのタンパク質の安定性に応じ得る。別の実施形態において、温度は、４０℃から６５℃の範囲内、又は好ましくは４０℃から６０℃の範囲内、より好ましくは４５℃から６０℃の範囲内、さらに好ましくは５０℃から６０℃の範囲内、そして最も好ましくは５５℃から６０℃、５８℃から６０℃又は５９℃である。したがって、最低温度は３０℃、３５℃、又は４０℃であり、最高温度は６０℃、６５℃、又は７０℃である。
【００９９】
熱処理ステップは、好ましくは、長時間にわたり行われる。熱処理の長さは、好ましくは、１時間と２４時間との間、より好ましくは４時間と１８時間との間、さらに好ましくは６時間と１６時間との間、そして最も好ましくは１０時間と１４時間との間又は１０時間と１２時間との間、例えば１２時間である。したがって、熱処理の最短時間は１、２、又は３時間であり、最長時間は２０、２２、又は２４時間である。
【０１００】
特定の実施形態において、熱処理は、５０℃から６０℃で１０から１６時間、より好ましくは５９℃で１０から１２時間行われる。当業者には、温度及び時間が問題の試料及び生産されるタンパク質の特徴に適するように選択され得ることが理解されよう。
【０１０１】
抽出ステップの後、試料は、ｐＨ調整ステップの前の遠心分離及び／又は濾過のステップに供することができる。
【０１０２】
本発明のステップａ）に供される試料は、宿主細胞試料又はその抽出物である。したがって、ステップａ）は、例えば、
・  組換えタンパク質及び組換えジスルフィドイソメラーゼを発現する宿主細胞の集団を含む溶液、
・  宿主細胞を除去するための遠心分離及び／又は濾過の後の、組換えタンパク質及び組換えジスルフィドイソメラーゼを発現する宿主細胞の集団の上清、
・  熱処理などの抽出ステップの後の、組換えタンパク質及び組換えジスルフィドイソメラーゼを発現する宿主細胞の集団の抽出物、或いは
・  熱処理などの抽出ステップ並びに１つ又は複数のその後の遠心分離及び／又は濾過のステップの後の、組換えタンパク質及び組換えジスルフィドイソメラーゼを発現する宿主細胞の集団の抽出物
に対して行うことができる。
【０１０３】
ステップａ）の前に、宿主細胞溶液又はその抽出物は適切なｐＨであり、典型的には、宿主細胞溶液又はその抽出物のｐＨは、ｐＨ５から１０、好ましくはｐＨ６から８、又はおよそｐＨ７である。ステップａ）の前の宿主細胞溶液又はその抽出物のｐＨは、目的の組換えタンパク質のｐＩに応じ得る。タンパク質は、ｐＨがタンパク質のｐＩに調整されるか又はタンパク質のｐIを通過すると沈殿する傾向を有し得る。したがって、ｐＨ調整ステップの前の溶液のｐＨは、ｐＨ調整ステップによって溶液のｐＨが組換えタンパク質のｐＩになるか又は組換えタンパク質のｐIを通過することが絶対にないように、組換えタンパク質のｐＩより低いことが好ましい。例えば、組換えタンパク質のｐＩが約８であれば、組換えタンパク質の沈殿を最少にするためには、溶液のｐＨは好ましくはｐＨ８未満である。ｐＨをｐＨ５未満に低下させるステップもまた、組換えタンパク質のｐＩを好適に避ける。
【０１０４】
タンパク質のｐＩは、それが入っている溶液のイオン強度に応じる。したがって、水又は非常に低いイオン強度の緩衝液内のタンパク質の計算されるｐＩは、緩衝液及びＨＣＰを含む宿主細胞試料又はその抽出物内のタンパク質のｐＩと異なり得る。タンパク質のｐＩは、水又は非常に低いイオン強度の緩衝液内のタンパク質の測定されるｐＩよりも１、１．５、又は２ｐＨ単位低い場合がある。したがって、宿主細胞溶液又はその抽出物のｐＨは、好ましくは、水又は非常に低いイオン強度の緩衝液内で測定される目的の組換えタンパク質のｐＩより１、１．５、又は２ｐＨ単位低いｐＨに維持される。
【０１０５】
本発明に従った方法のステップｂ）において、沈殿した組換えジスルフィドイソメラーゼは、組換えタンパク質から分離されて、組換えタンパク質試料が生じる。ステップｂ）は、典型的には、沈殿した組換えジスルフィドイソメラーゼを分離するための遠心分離及び／又は濾過を含む。
【０１０６】
得られた組換えタンパク質試料は、ステップａ）の前の組換えジスルフィドイソメラーゼの量と比較して、組換えジスルフィドイソメラーゼの量が低減している。好ましくは、ステップｂ）の後の組換えタンパク質試料は、組換えジスルフィドイソメラーゼを実質的に有さない。しかし、一部の組換えジスルフィドイソメラーゼが試料内に残っている可能性があり、これは、後の精製ステップによって除去され得る。当業者は、当技術分野において周知の方法を用いて、組換えジスルフィドイソメラーゼが依然として組換えタンパク質試料内に存在しているかどうかを決定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ分析を用いて、ＤｓｂＣなどの組換えジスルフィドイソメラーゼを検出することができる。ＤｓｂＣなどの組換えジスルフィドイソメラーゼに特異的な抗体を用いることができるか、又は、ＤｓｂＣ−ヒスタグなど、組換えジスルフィドイソメラーゼがヒスタグ化されている場合、抗ヒスタグ抗体を組換えジスルフィドイソメラーゼの検出に用いることができる。
【０１０７】
本明細書において用いられる、実質的に有さないは、５％ｗ／ｗ以下、例えば４、３、２、１、又は０．５％ｗ／ｗ以下を含有することを言うものとする。
【０１０８】
１つの実施形態において、宿主細胞試料又はその抽出物のｐＨがｐＨ３以下（例えばｐＨ３）に調整される場合、宿主細胞タンパク質のジペプチド結合タンパク質（「ＤＢＰ」とも呼ばれる）が、ステップｂ）において組換えタンパク質から沈殿及び分離される。この実施形態において、得られた組換えタンパク質試料はまた、宿主細胞のジペプチド結合タンパク質（ＤＢＰ）の量が低減している。好ましくは、得られた組換えタンパク質試料は、ＤＢＰを実質的に有さない。
【０１０９】
好ましくは、得られた組換えタンパク質試料はまた、ステップａ）の間に同様に沈殿し得る、他の宿主細胞タンパク質の量も低減している。好ましくは、得られた組換えタンパク質試料は、他の宿主細胞タンパク質を実質的に有さない。
【０１１０】
本発明のステップａ）及びｂ）の後の目的の組換えタンパク質の収量は、典型的には７５％以上、８０％以上、８５％以上、又は９０％以上である。
【０１１１】
ステップｂ）の後、組換えタンパク質試料のｐＨは、組換えタンパク質の保管又はクロマトグラフィーなどの下流の精製ステップの実施に適切なｐＨに調整することができる。先に論じたように、溶液のｐＨは、ｐＨが組換えタンパク質のｐＩではないことを確実にすることによって、目的の組換えタンパク質の沈殿が最少になるように調整することができる。好ましくは、組換えタンパク質試料のｐＨは、ｐＨ５から７、より好ましくはｐＨ５から６に調整される。正確な所要のｐＨは、タンパク質のｐＩを含む、組換えタンパク質の特性、及びどの下流の精製ステップが行われるかに応じる。組換えタンパク質試料のｐＨを調整するために、ＮａＯＨ、Ｎａアセテート、又はトリス塩基から選択される塩基などの、あらゆる適切な作用物質を用いることができる。
【０１１２】
或いは、本方法はステップｂ）の後にｐＨ調整ステップを含まない。この実施形態において、組換えタンパク質試料のｐＨは、組換えタンパク質の保管及び／又は１つ若しくは複数のその後の下流の精製ステップに適切であり得る。１つの実施形態において、ステップａ）において、宿主細胞試料又はその抽出物のｐＨはｐＨ４．５に調整され、ステップｂ）は遠心分離及び濾過を含み、ステップｂ）の後の得られた組換えタンパク質溶液は、次に、ｐＨ４．５での陽イオン交換クロマトグラフィーステップに供される。
【０１１３】
或いは、クロマトグラフィーステップは、より高いｐＨ、例えばｐＨ以上、例えば５から８、特に６又は７で行うことができる。
【０１１４】
ステップｂ）の後、組換えタンパク質試料は、汚染物質、及び／又は抗体断片などの望ましくないタンパク質断片を除去するために、１つ又は複数のさらなる精製ステップに供され得る。典型的には、組換えタンパク質試料は、１つ又は複数のクロマトグラフィーステップに供され、ここで、クロマトグラフィーの各ステップの後に、精密濾過、ダイアフィルトレーション、又は限外濾過などの濾過ステップを行うことができる。１つ又は複数のクロマトグラフステップは、アフィニティークロマトグラフィーステップ又は非アフィニティークロマトグラフィーステップであり得る。１つの実施形態において、クロマトグラフは、陽イオン交換クロマトグラフィー又は陰イオン交換クロマトグラフィーなどの非アフィニティークロマトグラフィーステップである。
【０１１５】
１つの実施形態において、ステップａ）において、宿主細胞試料又はその抽出物のｐＨはｐＨ４．５に調整され、ステップｂ）は遠心分離及び濾過を含み、ステップｂ）の後の得られた組換えタンパク質溶液は、次に、ｐＨ４．５での陽イオン交換クロマトグラフィーステップに供される。
【０１１６】
本発明の方法は、非アフィニティークロマトグラフィーステップが下流の精製において用いられる場合に特に有利である。これは、組換えジスルフィドイソメラーゼを含む大量の宿主細胞タンパク質が、これらが事前に分離していない場合に、クロマトグラフィーカラムに結合し得るためである。したがって、クロマトグラフィーカラムの所望の組換えタンパク質に結合する能力は、低減する。組換えジスルフィドイソメラーゼを含む宿主細胞タンパク質の分離は、その後の非アフィニティークロマトグラフィーカラムの能力を増大させ、これにより、組換えタンパク質のより速くより安い精製手段が提供される。
【０１１７】
本発明のステップａ）の間、組換えタンパク質は、部分的にアンフォールディングしていて良く、一方、溶液はｐＨ５以下で保持される。しかし、タンパク質の部分的なアンフォールディングは可逆的であり、沈殿したジスルフィドイソメラーゼの分離の後、タンパク質溶液のｐＨは、ｐＨ５より上、好ましくはｐＨ５から７、又はｐＨ５から６に調整され得、タンパク質は次に、その元のフォールディングした立体構造を取り得る。したがって、全面的に、低いｐＨでの保持ステップによって、不純物を除去するための比較的穏やかな条件がもたらされ、最短期間の結果となる。本発明の方法によって提供される組換えタンパク質試料は、機能的タンパク質の大部分を含む。
【０１１８】
宿主細胞によって発現される目的の組換えタンパク質は、好ましくはｐＩ６以上を有し、より好ましくはｐＩ７以上を有する。先に論じられているように、タンパク質が６以上のｐＩを有する場合、試料のｐＨをタンパク質のｐＩより低く、好ましくは水又は非常に低いイオン強度の緩衝液内のタンパク質のｐＩより１、１．５、又は２ｐＨ単位低く維持することによってタンパク質の沈殿を最少にすることはより容易であり、試料のｐＨをｐＨ５以下に調整するステップは、溶液のｐＨをタンパク質のｐＩに調整することはない。
【０１１９】
目的の組換えタンパク質は、好ましくは、組換え抗体である。組換え抗体は、好ましくは、ｐＩ６から１０、７から１０、６から９、７から９、８から９、６、７、８、又は９を有する。試料のｐＨは、抗体の最少の沈殿を確実にするために、ステップａ）の前、間、及び後に、好ましくは、組換え抗体のｐＩより低く、より好ましくは組換え抗体のｐＩより１、１．５、又は２ｐＨ単位低く維持される。
【０１２０】
好ましい実施形態において、組換え抗体はｐＩ７〜９を有し、試料のｐＨは、ステップａ）において、ｐＨ３から４．５、より好ましくはｐＨ４．５に調整される。
【０１２１】
組換え抗体の具体的な例は、本明細書及びWO01/094585において記載されているように、抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’ＣＤＰ８７０であり、これは、ｐＩ８を有する。
【０１２２】
１つの実施形態において、組換え抗体又はその結合断片は、抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’ＣＤＰ８７０である。
【０１２３】
本明細書において用いられる場合、「機能的抗体」には、それが対抗する抗原（同族抗原）、すなわちそれが特異的である抗原を特異的に認識するか又はそれに特異的に結合する能力を保持する、抗体分子が含まれる。機能的抗体の生産は、抗体の予想分子量に対応する非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの単一バンドの存在によって、又は、ＢＩＡｃｏｒｅ若しくは当業者に知られている他の方法、例えば限定はしないがＥＬＩＳＡを用いる直接的な結合アッセイによって示される。非機能的抗体には、その同族抗原を認識しない断片が含まれ、また、不正確にフォールディングした又は不正確に組み立てられた抗体、遊離した重鎖及び軽鎖、並びにその断片が含まれ、当該断片には、その同族抗原を認識しないか又はこれに結合しない、部分的に分解した抗体断片が含まれる。
【０１２４】
抗体の結合断片は、抗体がそれに対して特異的である抗原を結合し得る断片である。
【０１２５】
好ましい例において、組換え抗体分子は、抗体軽鎖の少なくとも一部及び抗体重鎖の少なくとも一部であり、その結果、発現した軽鎖抗体分子及び重鎖抗体分子の少なくともいくつかが結びついて機能的抗体を形成し得る。
【０１２６】
本明細書において用いられる場合、ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００３３３１において記載されているように、「抗体」は、完全長の重鎖及び軽鎖を有する抗体；その機能的に活性な断片、結合断片、誘導体、又は類似体を含み、限定はしないが、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ、改変されたヒンジFａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ断片；軽鎖又は重鎖の単量体又は二量体；単鎖抗体、例えば、重鎖及び軽鎖の可変ドメインがペプチドリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、又は二重特異的抗体、例えばＦａｂ−ｄＡｂであり得る。
【０１２７】
抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二価抗体、三価抗体、若しくは四価抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体であり得る。これらの抗体及びその断片は、天然抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はＣＤＲグラフト化された抗体であり得、標準的な分子生物学的技術を用いて、アミノ酸又はドメインを要望通りに修飾、付加、又は欠失させることができる。ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する、非ヒト種に由来する抗体分子である（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９を参照されたい）。本発明の方法を用いて精製された抗体分子は、あらゆるクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）又はサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。
【０１２８】
これらの抗体分子を生成するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Shrader et al., WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341:544; Orlandi et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86:3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322:323; Bird et al, 1988, Science, 242:423; Queen et al., US 5,585,089; Adair, WO91/09967; Mountain and Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10:1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181を参照されたい）。
【０１２９】
モノクローナル抗体は、当技術分野において知られているあらゆる方法、例えば、ハイブリドーマ技術（Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985）によって調製することができる。
【０１３０】
キメラ抗体は、軽鎖及び重鎖の遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構成されるように遺伝子操作されている免疫グロブリン遺伝子によってコードされる抗体である。これらのキメラ抗体は、あまり抗原性ではないと考えられる。二価抗体は、当技術分野において知られている方法によって作製することができる（Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539; WO 93/08829, Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659）。二価抗体、三価抗体、及び四価抗体は、複数の特異性を含み得るか、又は単一特異的であり得る（例えば、WO 92/22853を参照されたい）。
【０１３１】
抗体配列はまた、Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848によって、及びWO 92/02551において記載されているように、分子クローニングと、特異的抗体の生産のために選択された単一リンパ球から生成した免疫グロブリン可変領域のｃＤＮＡの発現とに基づく、単一リンパ球抗体法を用いて生成することができる。後者の方法は、次いでクローン的に増殖される個別の抗体生産細胞の単離、その後の、その同族抗原を認識する抗体を生産するクローンについてのスクリーニング、並びに、必要に応じて、その可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）の遺伝子の配列のその後の同定に依存する。或いは、その同族抗原を認識する抗体を生産する細胞を共に培養し、その後、スクリーニングすることができる。
【０１３２】
抗体は、あらゆる標的抗原に特異的であり得る。抗原は、細胞関連タンパク質、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、若しくは腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面タンパク質であり得るか、又は、可溶性タンパク質であり得る。目的の抗原はまた、あらゆる医学的に関連のあるタンパク質、例えば、疾患又は感染の間に上方調節されるタンパク質、例えば、受容体及び／又はその対応するリガンドであり得る。細胞表面タンパク質の特定の例には、接着分子、例えばインテグリン、例えばβ１インテグリン、例えば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン、又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＣＳＦ１又はＣＳＦ１受容体、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、ｄｕｄｕｌｉｎ２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ抗原及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＫＤＲ及びＶＥＧＦ、ＰＤ−１、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＴＬ１Ａ、ＩＬ−７受容体Ａ、並びに適切である場合にはその受容体が含まれる。
【０１３３】
可溶性抗原には、インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、又はＩＬ−１７、例えばＩＬ１７Ａ及び／又はＩＬ１７Ｆ、ウイルス抗原、例えば、呼吸器合胞体ウイルス抗原又はサイトメガロウイルス抗原、免疫グロブリン、例えばＩｇＥ、インターフェロン、例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、又はインターフェロンγ、腫瘍壊死因子ＴＮＦ（以前は腫瘍壊死因子−αとして知られており、本明細書においてはＴＮＦ又はＴＮＦαと呼ばれる）、腫瘍壊死因子−β、コロニー刺激因子、例えばＧ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ、及び血小板由来増殖因子、例えばＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−β、ＷＩＳＰ−１、並びに適切な場合にはその受容体が含まれる。他の抗原には、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、ウイルス、例えばインフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ、及びＣ、バイオテロ剤、放射性核種及び重金属、並びにヘビ及びクモの毒液及び毒素が含まれる。
【０１３４】
１つの実施形態において、抗体は、目的の抗原の活性を機能的に改変するために用いることができる。例えば、抗体は、前記抗原の活性を、直接的又は間接的に、中和し得るか、それに拮抗し得るか、又は作動させ得る。
【０１３５】
好ましい実施形態において、抗体は抗ＴＮＦ抗体であり、より好ましくは、WO01/094585（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）において記載されているような、抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’ＣＤＰ８７０である。
【０１３６】
１つの実施形態において、ヒトＴＮＦαに対する特異性を有する抗体は重鎖を含み、その可変ドメインは、ＣＤＲＨ１について配列番号１で示される配列、ＣＤＲＨ２について配列番号２で示される配列、又はＣＤＲＨ３について配列番号３で示される配列を有するＣＤＲを含む。
【０１３７】
１つの実施形態において、抗体は軽鎖を含み、その可変ドメインは、ＣＤＲＬ１について配列番号４で示される配列、ＣＤＲＬ２について配列番号５で示される配列、又はＣＤＲＬ３について配列番号６で示される配列を有するＣＤＲを含む。
【０１３８】
１つの実施形態において、抗体は、可変ドメインがＣＤＲＨ１について配列番号１で示される配列、ＣＤＲＨ２について配列番号２で示される配列、又はＣＤＲＨ３について配列番号３で示される配列を有するＣＤＲを含む重鎖、並びに可変ドメインがＣＤＲＬ１について配列番号４で示される配列、ＣＤＲＬ２について配列番号５で示される配列、又はＣＤＲＬ３について配列番号６で示される配列を有するＣＤＲを含む軽鎖を含む。
【０１３９】
１つの実施形態において、抗体は、ＣＤＲＨ１についての配列番号１、ＣＤＲＨ２についての配列番号２、ＣＤＲＨ３についての配列番号３、ＣＤＲＬ１についての配列番号４、ＣＤＲＬ２についての配列番号５、及びＣＤＲＬ３についての配列番号６を含む。
【０１４０】
抗体は、好ましくは、ＣＤＲグラフト化された抗体分子であり、典型的には、可変ドメインは、ヒトのアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトのドナーＣＤＲを含む。
【０１４１】
好ましくは、抗体は、軽鎖可変ドメインＣＤＰ８７０（配列番号７）及び重鎖可変ドメインＣＤＰ８７０（配列番号８）を含む。
【０１４２】
好ましくは、抗体は、修飾されたＦａｂ断片であり、ここで修飾は、エフェクター分子又はレポーター分子の付着を可能にするための、その重鎖のＣ末端への１つ又は複数のアミノ酸の付加である。好ましくは、さらなるアミノ酸は、エフェクター分子又はレポーター分子が付着し得る、１つ又は２つのシステイン残基を含有する、修飾されたヒンジ領域を形成する。このような修飾されたＦａｂ断片は、好ましくは、配列番号１０で示される配列を含むか又はこれからなる重鎖、及び配列番号９で示される配列を含むか又はこれからなる軽鎖を有する。
【０１４３】
本発明において用いられる宿主細胞は、抗体をコードするＤＮＡ配列を含む。好ましくは、ＤＮＡ配列は、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする。
【０１４４】
１つの好ましい実施形態において、ＤＮＡ配列は軽鎖をコードし、配列番号７若しくは配列番号９で示される配列（ＣＤＰ８７０）又はその縮重同等物を含む。
【０１４５】
代替的な好ましい実施形態において、ＤＮＡ配列は重鎖をコードし、配列番号８若しくは配列番号１０で示される配列（ＣＤＰ８７０）又はその縮重同等物を含む。
【０１４６】
ＤＮＡ配列は、例えば化学的プロセシングにより生産される合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はあらゆるその組み合わせを含み得る。
【０１４７】
抗体の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提案される機能、特に、所要であり得るエフェクター機能の観点から選択することができる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトのＩｇＡドメイン、ＩｇＤドメイン、ＩｇＥドメイン、ＩｇＧドメイン、又はＩｇＭドメインであり得る。特に、抗体分子が治療的使用を目的とされており、抗体のエフェクター機能が所要である場合には、特にＩｇＧ１アイソタイプ及びＩｇＧ３アイソタイプの、ヒトＩｇＧ定常領域ドメインを用いることができる。或いは、抗体分子が治療目的のものであり、抗体エフェクター機能が所要ではない場合、例えば、ＴＮＦα活性をブロックするだけの場合では、ＩｇＧ２アイソタイプ及びＩｇＧ４アイソタイプを用いることができる。
【０１４８】
組換えタンパク質を発現させるための方法は、当技術分野において周知である。組換え抗体分子を発現させるための宿主細胞の適切な例には、グラム陽性細菌若しくはグラム陰性細菌などの細菌、例えば大腸菌若しくは酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、及び骨髄腫細胞系若しくはハイブリドーマ細胞系、例えばＮＳＯ細胞が含まれる。最も好ましくは、本発明の方法において、組換え抗体は、細菌、例えば大腸菌において生産される（Verma et al., 1988, J. Immunol. Methods 216:165-181; Simmons et al., 2002, J. Immunol. Methods 263:133-147を参照されたい）。
【０１４９】
発現の後、抗体はさらに、例えば、エフェクター分子などの別の実体へのコンジュゲーションによって、プロセシングされ得る。したがって、本発明に従った方法は、エフェクター分子を抗体に付着させるさらなるステップを含み得る。
【０１５０】
本明細書において用いられる用語エフェクター分子には、例えば、抗腫瘍剤、薬剤、毒素（例えば、細菌又は植物由来の酵素的に活性な毒素及びその断片、例えば、リシン及びその断片）、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体断片、合成又は天然のポリマー、核酸及びその断片、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子、及びレポーター基、例えば蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物が含まれる。エフェクター分子は、あらゆる適切な方法によって抗体又はその断片に付着され得、例えば、抗体断片は、WO05/003171又はWO05/003170（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）において記載されているように、少なくとも１つのエフェクター分子を付着するように修飾され得る。WO05/003171又はWO05/003170はまた、適切なエフェクター分子を記載している。
【０１５１】
抗体には、重金属原子又は毒素、例えばリシンをキレート化するための大員環が、共有結合による架橋構造によって付着している。或いは、組換えＤＮＡ技術の手順を用いて、完全な免疫グロブリン分子のＦｃ断片（ＣＨ２、ＣＨ３、及びヒンジドメイン）、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、又はＣＨ３ドメインが、機能的な非免疫グロブリンタンパク質、例えば酵素分子又は毒素分子によって置き換えられているか、又はこれらにペプチド結合によって付着している、抗体分子を生産することができる。抗体が、エフェクター分子又はレポーター分子の付着を可能にするためにその重鎖のＣ末端に１つ又は複数のアミノ酸を有する、修飾されたＦａｂ断片である実施形態において、さらなるアミノ酸は、好ましくは、エフェクター分子又はレポーター分子が付着し得る１つ又は２つのシステイン残基を含有する、修飾されたヒンジ領域を形成する。
【０１５２】
好ましいエフェクター基は、修飾されたＦａｂ断片に付着してインビボでのその半減期を増大させ得るポリマー分子である。
【０１５３】
ポリマー分子は、通常、合成又は天然のポリマー、例えば、任意選択で置換された直鎖又は分岐鎖のポリアルキレンポリマー、ポリアルケニレンポリマー、若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は分岐した若しくは分岐していない多糖、例えばホモ多糖若しくはヘテロ多糖であり得る。
【０１５４】
上記の合成ポリマー上に存在し得る特定の任意選択の置換基には、１つ又は複数のヒドロキシ基、メチル基、又はメトキシ基が含まれる。合成ポリマーの特定の例には、任意選択で置換された直鎖又は分岐鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、又はその誘導体、特に、任意選択で置換されたポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が含まれる。特定の天然ポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン、又はその誘導体が含まれる。本明細書において用いられる「誘導体」は、反応性の誘導体、例えばチオール選択性の反応性基、例えばマレイミドなどを含むものである。反応性基は、直接的に、又はリンカーセグメントを介して、ポリマーに連結し得る。このような基の残基が、場合によって、抗体断片とポリマーとの間の結合基として生成物の一部を形成することが理解されよう。
【０１５５】
ポリマーのサイズは要望通りに変化させ得るが、通常は、５００Ｄａから５０，０００Ｄａ、好ましくは５０００から４０，０００Ｄａ、より好ましくは２５，０００から４０，０００Ｄａの平均分子量範囲である。ポリマーサイズは、特に、生成物の目的の使用に基づいて選択され得る。したがって、例えば、生成物が、例えば腫瘍の治療における使用のために、循環を離れ組織に侵入することを目的としている場合、例えばおよそ５，０００Ｄａの分子量を有する、低分子量ポリマーを用いることが有利であり得る。生成物が循環内に残る適用では、例えば２５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する、高分子量ポリマーを用いることが有利であり得る。
【０１５６】
特に好ましいポリマーには、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）、又は特にメトキシポリ（エチレングリコール）若しくはその誘導体、特に約２５，０００Ｄａから約４０，０００Ｄａの範囲の分子量を有するものが含まれる。
【０１５７】
修飾された抗体断片に付着した各ポリマー分子は、断片内に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合し得る。共有結合は、通常、ジスルフィド結合、又は特に、硫黄−炭素結合である。
【０１５８】
所望であれば、抗体断片には、１つ又は複数のエフェクター分子又はレポーター分子が付着していてよい。エフェクター分子又はレポーター分子は、断片内に位置するあらゆる利用可能なアミノ酸側鎖又は末端のアミノ酸官能基、例えばあらゆる遊離したアミノ基、イミノ基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を介して、抗体断片に付着し得る。１つ又は複数のエフェクター分子又はレポーター分子は、抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＣ末端にあるか又はこれに向いているアミノ酸に付着し得る。
【０１５９】
活性化されたポリマーは、上記のポリマー修飾型抗体断片の調製における出発材料として用いることができる。活性化されたポリマーは、チオール反応性基、例えばα−ハロカルボン酸又はα−ハロカルボン酸エステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン、又はジスルフィドを含有するあらゆるポリマーであり得る。このような出発材料は、商業的に得ることができる（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡから）か、又は、従来の化学的手順を用いて、市販されている出発材料から調製することができる。
【０１６０】
付着しているポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に関して、"Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC、及び"Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New Yorkが参照される。
【０１６１】
エフェクター分子又はレポーター分子に連結した抗体断片を得ることが望ましい場合、これは、抗体断片が、必要に応じて活性化ポリマーとの反応の前又は後に直接的に又はカップリング剤を介してエフェクター分子又はレポーター分子に連結される、標準的な化学的手順又は組換えＤＮＡ手順によって調製することができる。特定の化学的手順には、例えば、WO 93/62331、WO 92/22583、WO 90,195、及びWO 89/1476において記載されているものが含まれる。或いは、エフェクター分子又はレポーター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えばWO 86/01533及びEP-A-0392745において記載されているような組換えＤＮＡ手順を用いて達成され得る。
【０１６２】
好ましくは、本発明の方法によって提供される修飾されたＦａｂ断片は、EP-A-0948544において開示されている方法に従ってペグ化されている（すなわち、ＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））が共有結合によって付着している）。好ましくは、抗体は、図９において示されるように、ペグ化された、修飾されたＦａｂ断片である。図２において示されるように、修飾されたＦａｂ断片は、重鎖の修飾されたヒンジ領域のＣ末端にあるシステイン残基の一つに、リシルマレイミド由来の基を付着しており、ここで、リシル残基の２つのアミノ基のそれぞれには、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基が共有結合しており、その結果、メトキシポリ（エチレングリコール）残基の全平均分子量は約４０，０００Ｄａとなっており、より好ましくは、リシルマレイミド由来の基は、［１−［［［２−［［３−（２、５−ジオキソ−１−ピロリジニル）−１−オキソプロピル］アミノ］エチル］アミノ］−カルボニル］−１、５−ペンタンジイル］ビス（イミノカルボニル）である。リシン残基は、マレイミド基に共有結合している。リシン残基上のアミン基のそれぞれには、およそ２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが付着している。エフェクター分子全体の全分子量は、したがって、およそ４０，０００Ｄａである。
【０１６３】
したがって、本発明に従った方法は、好ましくは、重鎖のＣ末端にあるシステイン残基の１つにリシルマレイミド基を付着させることを含み、ここで、リシル残基の各アミノ基には、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基が共有結合している。
【０１６４】
好ましくは、図９において示される化合物において、抗体部分の重鎖は、配列番号１０で示される配列を有し、軽鎖は配列番号９で示される配列を有する。この化合物は、本明細書においてＣＤＰ８７０と呼ばれる。
【０１６５】
本発明の各実施形態の好ましい特徴は、他の実施形態のそれぞれに関して必要な変更を加えたものである。本明細書において引用される、限定はしないが特許及び特許出願を含む全ての刊行物は、それぞれの個別の刊行物が、本明細書において参照されることによって完全に説明されているかのように具体的に且つ個別に組み込まれることが示されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
本開示は、整数の特定の組み合わせを含む実施形態を明確に開示する。本開示はまた、整数の前記組み合わせからなる又は基本的にこれからなる実施形態にまで拡張される。
【０１６７】
好適例及び／又は実施形態は、技術的に実行可能なものとして組み合わせることができる。
【０１６８】
本発明は、ここで、以下の実施例を参照して記載され、これらの実施例は例示的なものにすぎず、本発明の範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６９】
（例１）
組換えＤｓｂＣ及び組換え抗体を発現する宿主細胞系の生成
全ての実験で、大腸菌細胞系Ｗ３１１０を親野生型細胞系として用いた。
【０１７０】
以下の突然変異を有する細胞系を生成した：
ａ．突然変異したＴｓｐ遺伝子、
ｂ．突然変異したＴｓｐ遺伝子及び運搬組換えＤｓｂＣ、
ｃ．突然変異したＴｓｐ遺伝子及び突然変異したｓｐｒ遺伝子、
ｄ．突然変異したＴｓｐ遺伝子及び突然変異したｓｐｒ遺伝子及び運搬組換えＤｓｂＣ。
【０１７１】
突然変異したＴｓｐ遺伝子ＭＸＥ００１を有する細胞系（ΔＴｓｐ）の生成
ＭＸＥ００１株を以下のように生成した：
Ｔｓｐカセットを、ＳａｌＩ制限断片、ＮｏｔＩ制限断片として、同様に制限されたｐＫＯ３プラスミド内に移動させた。ｐＫＯ３プラスミドは、染色体組み込み事象を起こして選択するためのクロラムフェニコールマーカーと共に、ｐＳＣ１０１複製起点（ＲｅｐＡ）の温度感受性の突然変異体を用いる。レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子は、ショ糖上で成長した大腸菌に対して致死的であり、したがって、（クロラムフェニコールマーカー及びｐＳＣ１０１起点と共に）脱組み込み事象及びプラスミドキュアリング事象を起こして選択するために用いられる。この方法論は、以前に記載されている（Hamilton et al., 1989, Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622、及びBlomfield et al., 1991, Molecular Microbiology, 5, 1447-1457）。ｐＫＯ３系は、挿入された遺伝子を除いて全ての選択マーカーを宿主ゲノムから除去する。
【０１７２】
以下のプラスミドを構築した。
ＥｃｏＲＩ制限マーカー及びＡｓｅＩ制限マーカーを含む、配列番号１５で示されるノックアウト突然変異したＴｓｐ遺伝子を含むｐＭＸＥ１９１。
【０１７３】
プラスミドを次に、Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., "Escherichia coli electrotransformation," in Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995)において見られる方法を用いて調製されたエレクトロコンピテントコンピテント大腸菌Ｗ３１１０細胞内に形質転換した。
【０１７４】
１日目  ４０μｌの大腸菌細胞を、冷蔵されたＢｉｏＲａｄ０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベット内で（１０ｐｇの）１μｌのｐＫＯ３  ＤＮＡと混合し、その後、２５００Ｖ、２５μＦ、及び２００Ωでエレクトロポレーションした。１０００μｌの２×ＰＹを直ちに添加し、細胞を、インキュベーター内で３０℃で１時間、２５０ｒｐｍで振とうすることによって回収した。細胞を２×ＰＹ内で１／１０連続希釈し、その後、１００μｌのアリコートを取り出して、３０℃及び４３℃で事前に温められた２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する２×ＰＹ寒天プレート上にプレーティングした。プレートを３０℃及び４３℃で一晩インキュベートした。
【０１７５】
２日目  ３０℃で成長したコロニーの数によって、エレクトロポレーション効率を推定し、一方、４３℃での成長を生き抜いたコロニーは、潜在的な組み込み事象に相当する。４３℃のプレートから単一コロニーを採取し、１０ｍｌの２×ＰＹ内に再懸濁した。これを１００μｌ取り出して、３０℃に事前に温められた５％（ｗ／ｖ）ショ糖を含有する２×ＰＹ寒天プレート上にプレーティングし、単一コロニーを生成させた。プレートを、３０℃で一晩インキュベートした。
【０１７６】
３日目  コロニーはここで、潜在的な同時の脱組み込み事象及びプラスミドキュアリング事象に相当する。脱組み込み事象及びキュアリング事象が成長の初期に生じた場合、コロニー塊のバルクはクローン性である。単一コロニーを採取し、２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール又は５％（ｗ／ｖ）のショ糖を含有する２×ＰＹ寒天上にレプリカプレーティングした。プレートを、３０℃で一晩インキュベートした。
【０１７７】
４日目  ショ糖上で成長し、クロラムフェニコール上で死んだコロニーは、潜在的な染色体置き換え事象及びプラスミドキュアリング事象に相当する。これらを採取し、突然変異特異的なオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによってスクリーニングした。正確なサイズの陽性ＰＣＲバンドを生じさせたコロニーを排除して、５％（ｗ／ｖ）ショ糖を含有する２×ＰＹ寒天上に単一コロニーを生成させ、プレートを、３０℃で一晩インキュベートした。
【０１７８】
５日目  ＰＣＲ陽性の、クロラムフェニコール感受性の、及びショ糖耐性の大腸菌の単一コロニーを用いて、化学的にコンピテントな細胞であるグリセロールストックを作製し、５’及び３’隣接オリゴを用いるＰＣＲ反応のためのＰＣＲ鋳型として用いて、Ｔａｑポリメラーゼを用いる直接的なＤＮＡ配列決定のためのＰＣＲ産物を生成させた。
【０１７９】
細胞株ＭＸＥ００１を、オリゴヌクレオチドプライマーを用いる非天然ＡｓｅＩ制限部位を含むＴｓｐ遺伝子の領域のＰＣＲ増幅による、突然変異したＴｓｐ遺伝子を有するゲノムＤＮＡの修飾の成功を確認するために試験した。ＤＮＡの増幅された領域を次に、ＡｓｅＩ制限酵素とのインキュベーションの前及び後にゲル電気泳動によって分析して、突然変異した遺伝子における非天然ＡｓｅＩ制限部位の存在を確認した。
【０１８０】
溶解物を、細胞の単一コロニーを２０ｕｌの１×ＰＣＲ緩衝液内で９５℃で１０分間にわたり加熱することによって調製した。混合物を室温まで冷却させ、次に、１３，２００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上清を除去し、「細胞溶解物」とラベル付けした。
【０１８１】
各株を、Ｔｓｐオリゴ対を用いて増幅した。
【０１８２】
ＤＮＡを、標準的なＰＣＲ手順を用いて増幅した。
５ｕｌ  緩衝液×１０（Ｒｏｃｈｅ）
１ｕｌ  ｄＮＴＰミックス（Ｒｏｃｈｅ、１０ｍＭミックス）
１．５ｕｌ  ５’オリゴ（５ｐｍｏｌ）
１．５ｕｌ  ３’オリゴ（５ｐｍｏｌ）
２ｕｌ  細胞溶解物
０．５ｕｌ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  ５Ｕ／ｕｌ）
３８．５ｕｌ  Ｈ２Ｏ
ＰＣＲサイクル
９４℃  １分
９４℃  １分）
５５℃  １分）３０サイクル反復
７２℃  １分）
７２℃  １０分
【０１８３】
反応が完了したら、２５ｕｌを新たな微量遠心管に取り出して、ＡｓｅＩで消化した。２５ｕｌのＰＣＲ反応物に、１９ｕｌのＨ２Ｏ、５ｕｌの緩衝液３（ＮＥＢ）、１ｕｌのＡｓｅＩ（ＮＥＢ）を添加し、混合し、３７℃で２時間インキュベートした。
【０１８４】
残りのＰＣＲ反応物に、５ｕｌのローディングバッファー（×６）を添加し、２０ｕｌを、０．８％ＴＡＥ  ２００ｍｌアガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にエチジウムブロマイド（５ｕｌの１０ｍｇ／ｍｌストック）を加えたものにロードし、１００ボルトで１時間泳動した。１０ｕｌのサイズマーカー（Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＤＮＡマーカー０．１〜１２Ｋｂ、Ｎｏｖａｇｅｎ）を、最終レーンにロードした。
【０１８５】
ＡｓｅＩ消化が完了したら、１０ｕｌのローディングバッファー（×６）を添加し、２０ｕｌを、０．８％ＴＡＥアガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にエチジウムブロマイド（５ｕｌの１０ｍｇ／ｍｌストック）を加えたものにロードし、１００ボルトで１時間泳動した。１０ｕｌのサイズマーカー（Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＤＮＡマーカー０．１〜１２Ｋｂ、Ｎｏｖａｇｅｎ）を最終レーンにロードした。両ゲルを、ＵＶトランスイルミネーターを用いて視覚化した。
【０１８６】
増幅されたゲノム断片は、Ｔｓｐについて２．８Ｋｂの正確なサイズのバンドを示した。ＡｓｅＩで消化した後、これによって、Ｔｓｐ欠損株ＭＸＥ００１において導入されたＡｓｅＩ部位の存在が確認されたが、Ｗ３１１０対照においては確認されなかった。
【０１８７】
ＭＸＥ００１: Ｔｓｐプライマーセットを用いて増幅されたゲノムＤＮＡ及び得られたＤＮＡをＡｓｅＩで消化して、２．２及び０．６Ｋｂｐのバンドを生じさせた。
【０１８８】
Ｗ３１１０のＰＣＲ増幅されたＤＮＡは、ＡｓｅＩ制限酵素によって消化されなかった。
【０１８９】
突然変異したｓｐｒ遺伝子を有する細胞系並びに突然変異したＴｓｐ遺伝子及び突然変異したｓｐｒ遺伝子を有する細胞系の生成
ｓｐｒ突然変異を生じさせ、相補性アッセイの使用に選択した。
【０１９０】
ｓｐｒ遺伝子を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）ランダム突然変異生成多様性ＰＣＲキットを用いて突然変異させ、これによって、１０００ｂｐ当たり１から２個の突然変異が導入された。突然変異したｓｐｒＰＣＲ  ＤＮＡを、ｓｐｒ突然変異体と共にＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’を発現する誘導性発現ベクター［ｐＴＴＯ  ＣＤＰ８７０］内にクローニングした。このライゲーションを次に、Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., "Escherichia coli electrotransformation," in Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995)において見られる方法を用いて調製された大腸菌株ＭＸＥ００１（ΔＴｓｐ）内に電気的形質転換した。以下のプロトコルを用い、４０ｕｌのエレクトロコンピテントＭＸＥ００１、２．５ｕｌのライゲーション（１００ｐｇのＤＮＡ）を０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに添加し、電気的形質転換を、２５００Ｖ、２５μＦ、及び２００Ωという条件でＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌを用いて行った。電気的形質転換の後、１ｍｌのＳＯＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（３７℃まで事前に温められた）を添加し、細胞を、穏やかに撹拌しながら３７℃で１時間、回収のために放置した。
【０１９１】
細胞を、低張寒天（５ｇ／Ｌの酵母抽出物、２．５ｇ／Ｌのトリプトン、１５ｇ／Ｌの寒天（全てＤｉｆｃｏ））上にプレーティングし、４０℃でインキュベートした。コロニーを形成した細胞をＨＬＢ上に４３℃で再びプレーティングして、高温の低浸透圧条件下でＭＸＥ００１株に成長する能力の回復を確認した。プラスミドＤＮＡを、選択されたクローンから調製し、配列決定して、ｓｐｒ突然変異を同定した。
【０１９２】
この方法を用いて、以下の、ΔＴｓｐ表現型を補完した、ｓｐｒタンパク質における５つの単一突然変異及び１つの二重突然変異を単離した。
１．Ｖ９８Ｅ
２．Ｄ１３３Ａ
３．Ｖ１３５Ｄ
４．Ｖ１３５Ｇ
５．Ｇ１４７Ｃ
６．Ｓ９５Ｆ及びＹ１１５Ｆ
【０１９３】
ｓｐｒの上記で同定された個別の突然変異及び３つの触媒性の三つ組突然変異（Ｃ９４Ａ、Ｈ１４５Ａ、Ｈ１５７Ａ）及びＷ１７４Ｒを用いて、新たな株が生成され、野生型Ｗ３１１０Ｅ大腸菌株（遺伝子型：Ｆ−ＬＡＭ−ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）１ｒｐｈ１（ＡＴＣＣ番号２７３２５））を用いてｓｐｒ突然変異株を生成させるか、又は例１のＭＸＥ００１株を用いて、組み合わされたΔＴｓｐ／突然変異ｓｐｒ株を作製した。
【０１９４】
以下の突然変異大腸菌細胞株を、ＭＸＥ００１の生成について例１において記載されているように、ｐＫＯ３相同組換え／置き換えプラスミドを用いる遺伝子置き換えベクター系を用いて生成した（Link et al., 1997, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237）。
【０１９５】
【表１】
0005935222.tif 000002
【０１９６】
突然変異ｓｐｒ組み込みカセットを、ＳａｌＩ制限断片、ＮｏｔＩ制限断片として、同様に制限されたｐＫＯ３プラスミド内に移動させた。
【０１９７】
このプラスミドは、染色体組み込み事象を起こして選択するためのクロラムフェニコールマーカーと共に、ｐＳＣ１０１複製起点（ＲｅｐＡ）の温度感受性の突然変異体を用いる。レバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子は、ショ糖上で成長した大腸菌に対して致死的であり、したがって、（クロラムフェニコールマーカー及びｐＳＣ１０１起点と共に）脱組み込み事象及びプラスミドキュアリング事象を起こして選択するために用いられる。この方法論は、以前に記載されている（Hamilton et al., 1989, Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622、及びBlomfield et al., 1991, Molecular Microbiology, 5, 1447-1457）。ｐＫＯ３系は、挿入された遺伝子を除いて全ての選択マーカーを宿主ゲノムから除去する。
【０１９８】
クローンの同定のために、ＳａｌＩ制限部位を除去するｓｐｒ配列内でのサイレント突然変異を含む突然変異したｓｐｒ遺伝子を含む、以下に列挙するｐＫ０３ベクターを構築した。
ｐＭＸＥ３３６、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｓ９５Ｆ（−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３３７、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｙ１１５F（−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３３８、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｇ１４７Ｃ（−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３３９、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｄ１３３Ａ（−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３４０、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｖ１３５Ｄ （−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３４１、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｖ１３５Ｇ（−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３４２、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｖ９８Ｅ（−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３４３、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｃ９４Ａ（−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３４４、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｈ１４５Ａ（−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３４５、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｈ１５７Ａ（−ＳａｌＩ）
ｐＭＸＥ３４６、ｐＫ０３  ｓｐｒ  Ｗ１７４Ｒ（−ＳａｌＩ）
【０１９９】
これらのプラスミドを、次に、Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., "Escherichia coli electrotransformation," in Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995)において見られる方法を用いて調製された化学的にコンピテントな大腸菌Ｗ３１１０細胞内に、又は例１のＭＸＥ００１株内に形質転換して、表１において示されるような組み合わされたΔＴｓｐ／突然変異ｓｐｒ株を作製した。
【０２００】
１日目  ４０μｌのエレクトロコンピテント大腸菌細胞又はＭＸＥ００１細胞を、冷蔵されたＢｉｏＲａｄ０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベット内で（１０ｐｇの）１μｌのｐＫＯ３  ＤＮＡと混合し、その後、２５００Ｖ、２５μＦ、及び２００Ωでエレクトロポレーションした。１０００μｌの２×ＰＹを直ちに添加し、細胞を、インキュベーター内で３０℃で１時間、２５０ｒｐｍで振とうすることによって回収した。細胞を２×ＰＹ内で１／１０連続希釈し、その後、１００μｌのアリコートを取り出して、３０℃及び４３℃で事前に温められた２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する２×ＰＹ寒天プレート上にプレーティングした。プレートを３０℃及び４３℃で一晩インキュベートした。
【０２０１】
２日目  ３０℃で成長したコロニーの数によって、エレクトロポレーション効率を推定し、一方、４３℃での成長を生き抜いたコロニーは、潜在的な組み込み事象に相当する。４３℃のプレートから単一コロニーを採取し、１０ｍｌの２×ＰＹ内に再懸濁した。これを１００μｌ取り出して、３０℃に事前に温められた５％（ｗ／ｖ）ショ糖を含有する２×ＰＹ寒天プレート上にプレーティングし、単一コロニーを生じさせた。プレートを、３０℃で一晩インキュベートした。
【０２０２】
３日目  コロニーはここで、潜在的な同時の脱組み込み事象及びプラスミドキュアリング事象に相当する。脱組み込み事象及びキュアリング事象が成長の初期に生じた場合、コロニー塊のバルクはクローン性である。単一コロニーを採取し、２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール又は５％（ｗ／ｖ）ショ糖を含有する２×ＰＹ寒天上にレプリカプレーティングした。プレートを、３０℃で一晩インキュベートした。
【０２０３】
４日目  ショ糖上で成長し、クロラムフェニコール上で死んだコロニーは、潜在的な染色体置き換え事象及びプラスミドキュアリング事象に相当する。これらを採取し、ＰＣＲ及び制限消化によって、ＳａｌＩ部位の欠失についてスクリーニングした。正確なサイズの陽性ＰＣＲバンド及びＳａｌＩによる消化に対する耐性を生じさせたコロニーを排除して、５％（ｗ／ｖ）ショ糖を含有する２×ＰＹ寒天上に単一コロニーを生成させ、プレートを、３０℃で一晩インキュベートした。
【０２０４】
５日目  ＰＣＲ陽性の、クロラムフェニコール感受性の、及びショ糖耐性の大腸菌の単一コロニーを用いて、化学的にコンピテントな細胞であるグリセロールストックを作製し、５’及び３’隣接オリゴを用いるＰＣＲ反応のためのＰＣＲ鋳型として用いて、Ｔａｑポリメラーゼを用いる直接的なＤＮＡ配列決定のためのＰＣＲ産物を生成させて、正確な突然変異を確認した。
【０２０５】
Ｆａｂ’及びＤｓｂＣの発現のためのプラスミドの生成
抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’の重鎖配列及び軽鎖配列とＤｓｂＣをコードする配列との両方を含有するプラスミドを構築した。
【０２０６】
ジシストロン性のメッセージは、WO01/94585において記載されている抗ＴＮＦαＦａｂ’断片（ＣＤＰ８７０と呼ばれる）から生じた。上流のシストロンは、抗体の軽鎖（配列番号９）をコードし、一方、下流のシストロンは、抗体の重鎖（配列番号１０）をコードした。ＯｍｐＡシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を、軽鎖及び重鎖のそれぞれをコードするＤＮＡの５’末端に融合して、ペリプラズムへの効率的な分泌を可能にした。配列番号１６で示される遺伝子間配列（ＩＧＳ）２を用いた。
【０２０７】
ＣＤＰ８７０  Ｆａｂ’（抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’）及びＤｓｂＣ（ペリプラズム性ポリペプチド）の発現ベクターである、プラスミドｐＤＰＨ３５８（ｐＴＴＯ  ４０．４  ＣＤＰ８７０  ＩＧＳ２）を、Sambrook et al 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. CSHL press, N.Yにおいて見ることができる従来の制限クローニング方法を用いて構築した。プラスミドｐＤＰＨ３５８は、強力なｔａｃプロモーター配列及びｌａｃオペレーター配列という特徴を含んでいた。このプラスミドは、Ｆａｂ’重鎖のコード領域の後に、固有のＥｃｏＲＩ制限部位を含有し、その後に非コード配列を含有し、次いで、固有のＮｄｅＩ制限部位を含有していた。ＤｓｂＣ遺伝子を、Ｗ３１１０粗染色体ＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲクローニングし、その結果、ＰＣＲ産物は、５’ＥｃｏＲＩ部位と、その後の強力なリボソーム結合と、その後の、Ｃ末端のヒスタグで終結している、ＤｓｂＣの非変性開始コドン、シグナル配列、及び成熟配列と、最後に非コードＮｄｅＩ部位とをコードしていた。ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ  ＰＣＲ断片を制限し、発現ベクター内にライゲーションし、その結果、全ての３つのポリペプチド、すなわちＦａｂ’軽鎖、Ｆａｂ’重鎖、及びＤｓｂＣは、単一のポリシストロン性ｍＲＮＡ上でコードされた。
【０２０８】
Ｆａｂの軽鎖遺伝子、重鎖遺伝子、及びＤｃｂＣ遺伝子を、単一のポリシストロン性メッセージとして転写した。大腸菌ＯｍｐＡタンパク質に由来するシグナルペプチドをコードするＤＮＡを、軽鎖遺伝子配列及び重鎖遺伝子配列の両方の５’末端に融合し、これは、大腸菌ペリプラズムへのポリペプチドの転位を指示した。転写を、二重転写ターミネーターｒｒｎＢ  ｔ１ｔ２を用いて終結させた。ｌａｃＩｑ遺伝子は、構成的に発現したＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードした。これは、脱抑制がアロラクトース又はＩＰＴＧの存在によって誘発されるまで、ｔａｃプロモーターからの転写を抑制した。用いられた複製起点はｐ１５Ａであり、これは、少ないコピー数を維持した。プラスミドは、抗生物質の選択のためのテトラサイクリン耐性遺伝子を含有していた。
【０２０９】
抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’及びＤｓｂＣの発現
ＭＸＥ００８株を、Ｆａｂ’軽鎖、Ｆａｂ’重鎖、及びＤｓｂＣをコードするプラスミドで形質転換した。
【０２１０】
株の形質転換は、Chung C.T et al Transformation and storage of bacterial cells in the same solution. PNAS 86:2172-2175 (1989)において見られる方法を用いて行った。
【０２１１】
抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’の発現
株ＭＸＥ００８を、Sambrook et al 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. CSHL press, N.Y.において見ることができる従来の制限クローニング方法を用いて構築された、ＣＤＰ８７０のＦａｂ’（配列番号９で示される軽鎖配列及び配列番号１０で示される重鎖配列を有する抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’）の発現ベクターである、プラスミドｐＭＸＥ１１７（ｐＴＴＯ  ＣＤＰ８７０又は４０．４  ＩＧＳ２）で形質転換した。プラスミドｐＭＸＥ１１７（ｐＴＴＯ  ＣＤＰ８７０又は４０．４  ＩＧＳ２）は、強力なｔａｃプロモーター配列及びｌａｃオペレーター配列という特徴を含んでいた。Ｆａｂの軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子を、単一のジシストロン性メッセージとして転写した。大腸菌ＯｍｐＡタンパク質に由来するシグナルペプチドをコードするＤＮＡを、軽鎖遺伝子配列及び重鎖遺伝子配列の両方の５’末端に融合し、これは、大腸菌ペリプラズムへのポリペプチドの転位を指示した。転写を、二重転写ターミネーターｒｒｎＢ  ｔ１ｔ２を用いて終結させた。ｌａｃＩｑ遺伝子は、構成的に発現したＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードした。これは、脱抑制がアロラクトース又はＩＰＴＧの存在によって誘発されるまで、ｔａｃプロモーターからの転写を抑制した。用いられた複製起点はｐ１５Ａであり、これは、少ないコピー数を維持した。プラスミドは、抗生物質の選択のためのテトラサイクリン耐性遺伝子を含有していた。
【０２１２】
株の形質転換は、Chung C.T et al Transformation and storage of bacterial cells in the same solution. PNAS 86:2172-2175 (1989)において見られる方法を用いて行った。
【０２１３】
（例２）
組換え抗体抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’を発現する宿主細胞の成長
例１において生産されたＭＸＥ００８株を、抗ＴＮＦαＦａｂ’を発現させるための発酵実験において用いた。
【０２１４】
抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’及びＤｓｂＣを発現するＭＸＥ００８を、標準的な発酵条件及び培地を用いて発酵させた。発酵の後、得られた宿主細胞試料を遠心分離し、細胞ペレットを保存のために凍結した。
【０２１５】
（例３）
大腸菌株からの抗ＴＮＦαＦａｂ’の抽出及びｐＨ調整
例２からの凍結ペレット細胞ペレットを次いで解凍し、抽出緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ／１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）内に再懸濁させた。抽出は、６０℃で一晩行った。
【０２１６】
抽出ステップの後、抽出試料を、４２００ｒｐｍで４℃で１時間、遠心分離した。遠心分離後、試料を、０．４５ｕｍ＋０．２２ｕｍの濾過を介して清澄化した。
【０２１７】
濾過の後、ｐＨ６．９を有する得られた宿主細胞試料抽出物を、３つの１０ｍＬのアリコートに分け、３０％（ｖ／ｖ）の氷酢酸を用いてｐＨ５．０、４．５、又は３．０に調整した。個別のアリコートを、対照試料としてｐＨ６．９で保持した。
【０２１８】
図１において見られるように、ｐＨが低下するにつれて沈殿レベルの増大が観察された。宿主細胞タンパク質のほとんどの沈殿物はｐＨ３．０で見られ、その後ｐＨ４．５で見られ、次にｐＨ５．０で見られた。
【０２１９】
（例４）
逆相ＨＰＬＣによるｐＨ調整の後の宿主細胞試料抽出物の分析
ｐＨ５．０、４．５、若しくは３．０へのｐＨ調整の後の各宿主細胞試料抽出物試料、又は対照試料（ｐＨ調整なし、ｐＨ７）を、時点（Ｔ）＝０、Ｔ＝１時間、Ｔ＝２時間、Ｔ＝４．５時間、Ｔ＝８時間、及びＴ＝２４時間の時間経過にわたって採取し、リアルタイムの分析を、逆相ＨＰＬＣを介して行った。逆相ＨＰＬＣは、疎水性に基づくタンパク質の分離を可能にし、適切なＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ（商標）３００ＳＢ−Ｃ８、５ミクロン、２．１×７５ｍｍ）を用いて行われた。試料を分析の前に濾過した（０．２２ｕｍ）。
【０２２０】
結果を図２、３、５、及び６に示す。図２は、ｐＨ調整後の宿主細胞試料抽出物についての、Ｔ＝０での逆相ＨＰＬＣ分析での、重ね合わせたクロマトグラムを示す（Ｔ＝０は、ｐＨ調整後、分析を行うことが可能な限りすぐを意味し、典型的にはｐＨ調整のおよそ７分後である）。図３は、ｐＨ調整後の宿主細胞試料抽出物についての、Ｔ＝０での逆相ＨＰＬＣ分析での、個別のクロマトグラムを示す。Ｆａｂ’の軽鎖（ＬＣ）、Ｆａｂ’の重鎖（ＨＣ）、Ｆａｂ’全体、ＤｓｂＣ−ヒス（ヒスタグ化されたＤｓｂＣ）、及びジペプチド結合タンパク質（ＤＢＰ）に対応するピークは、ｐＨ７について、並びにｐＨ３．０、ｐＨ４．５、及びｐＨ５．０へのｐＨ調整について示される。図２及び図３から、ＤｓｂＣ−ヒスの量が、ｐＨ７の対照と比較して、ｐＨ５へのｐＨ調整の後に低く、ＤｓｂＣ−ヒスの量が、ｐＨ４．５又はｐＨ３．０へのｐＨ調整の後に有意にさらに低下することが分かる。また、ＤＢＰの量が、ｐＨ３へのｐＨ調整の後に有意に低下することも分かる。ＤＢＰのｐＩは５．７である。したがって、宿主細胞抽出物において、ｐＨは、ＤＢＰの沈殿を生じさせるために、有意に低下しなくてはならなかった。Ｆａｂ’の量は、ｐＨ調整によって有意には影響されない。
【０２２１】
図５は、ｐＨ３．０、４．５、及び５．０へのｐＨ調整の後の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムからのＤｓｂＣ−ヒスの全ピーク領域を示す。図２及び図３において見られるように、ＤｓｂＣの量は、ｐＨ５．０への調整の後に低減し、ｐＨ４．５又は３．０への調整の後にさらに低減する。
【０２２２】
図６は、ｐＨ３．０、４．５、及び５．０へのｐＨ調整の後の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムからのＤＢＰの全ピーク領域を示す。図２及び図３において見られるように、ＤＢＰの量は、ｐＨ３．０への調整の後に低減する。
【０２２３】
精製されたＤｓｂＣ−ヒス溶液を、混合モードの陽イオン交換クロマトグラフィーによって、株ＭＸＥ００８の宿主細胞抽出物から得た。ＤｓｂＣ−ヒスを含むこの精製された溶液の分析は、Ｔ＝０、１、８、及び２４時間の後に、ｐＨ７及びｐＨ３．０で行った。結果を図４に示し、これは、Ｔ＝０、１、８、及び２４時間の後の、ｐＨ７及びｐＨ３．０での、ＤｓｂＣ−ヒスを含む精製された溶液の逆相ＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを示す。図４から、ｐＨ調整が、溶液からのＤｓｂＣ−ヒスの沈殿及び除去に対して影響を有さなかったことが分かる。
【０２２４】
（例５）
試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、ｐＨ７、ｐＨ５．０、ｐＨ４．５、及びｐＨ３．０での長期保存の後に行った。図７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析ゲルを示す。図７から、ＤＢＰの量が、ｐＨ３へのｐＨ調整の後に低減していることが分かる。ＤｓｂＣ及びＦａｂ’の重鎖（ＨＣ）は、ゲル上で同一の分子量を示すが、ＤｓｂＣ及びＨＣのバンドが、ＤｓｂＣの低減に起因して、ｐＨ５、ｐＨ４．５、及びｐＨ３へのｐＨ調整の後に低減していることが分かり、このことにより、ＤｓｂＣ−ヒス及びＤＢＰの量がｐＨ調整後に低減していることが確認される。
【０２２５】
上記の実施例においてｐＨ４．５へのｐＨ調整の後に試験された抗ＴＮＦ  Ｆａｂ’ＣＤＰ８７０が、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって試験され、ＴＮＦに対する親和性を保持していることが分かった（データは示していない）。
【図１】
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【図９】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【配列表】
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