(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水銀ポロシメータによる気孔率が５％以下の結晶構造を有し、緻密質セラミックスからなる癌細胞の培養に用いられる細胞培養担体であって、
上面に複数のウェルが形成されており、前記ウェルの開口部の直径は１００μｍ以上４００μｍ以下、最大深さは５０μｍ以上４００μｍ以下であり、前記上面の２乗平均粗さ（Ｒｑ）は、０．５ｎｍ以上４５ｎｍ以下、前記ウェル底面の２乗平均粗さ（Ｒｑ）は、５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、かつ、前記上面の結晶粒子径の最大幅は、２μｍ以上１０μｍ以下であることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
前記上面から前記ウェル底面までの最大深さは、前記上面における開口部の直径の５０％以上であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養担体。
【請求項３】
前記ウェル底面は半球状であり、かつ、その曲率半径は、５０μｍ以上２００μｍ以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養担体。
【請求項４】
前記緻密質セラミックスは、アルミナからなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、均一なサイズの癌細胞の細胞凝集塊を得るのに好適な細胞培養担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
主に、抗癌剤や放射線治療等の効果確認試験に用いられる癌細胞は、癌組織が生体内で塊状で存在している、スクリーニング試験結果等のばらつき抑制のため、可能な限り、均一なサイズの細胞凝集塊を有していることが望まれている。
癌細胞の培養にあたっては、コラーゲンゲルを細胞培養担体（以下、単に、担体ともいう）として用いる方法（非特許文献１）や、純水に合成高分子や細胞増殖因子を分散してなるコーティング液を支持基材に塗布し乾燥して得られる基材を担体として用いる方法（特許文献１）が知られている。
【０００３】
しかしながら、非特許文献１記載の担体は、ある程度の株化癌細胞の細胞形態の誘導作用は認められるものの、癌細胞として均一なサイズの細胞凝集塊を維持しつつ培養するのは困難であった。また、特許文献１記載の担体は、接着依存性（足場依存性）により、癌細胞と正常細胞が混在する細胞のうち、癌細胞を選択的に増殖させる効果を奏するものであるが、癌細胞として均一なサイズの細胞凝集塊を維持しつつ培養する点とは効果が異なるため、その効果の程度は不明であった。
【０００４】
特許文献２には、癌細胞ではないヒトＥＳ細胞等の未分化細胞コロニーを、均一なサイズに効率的に培養する方法として、基材がセラミックス又はガラスからなり、未分化細胞を撒種して培養する表面が多孔体からなる複数の凹部（ウェル）が基材表面にマトリックス状に配列されている担体を用いることが開示されている。
また、特許文献３には、担体の培養面に細胞を接着させて固定化する方法として、培養面の表面粗さ（Ｒａ）を２．０〜７．０ｎｍとする方法が開示されている。
さらに、特許文献４には、上面に複数のウェルが形成されており、前記上面は、２乗平均粗さＲｑが１００〜２８０ｎｍ、かつ、長さ１μｍあたりの線密度が１．６〜３．０である細胞培養担体が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】西山敏夫ら、組織培養研究（１９９１），９：８７
【特許文献１】特開平７−３１４７０号公報
【特許文献２】特開２００８−３０６９８７号公報
【特許文献３】特開２００５−２４５２２４号公報
【特許文献４】特開２０１２−５０４２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、癌細胞は、担体との接着性や剥離性が他の細胞（ＥＳ細胞等）とは異なり、また、他の細胞（ＥＳ細胞等）よりも接着力が強いため、これら特許文献２、３、４に記載の技術のみでは、癌細胞として均一なサイズの細胞凝集塊を維持しつつ培養することは困難であった。
【０００７】
本発明は、上記技術的課題を解決するためになされたものであり、癌細胞として均一なサイズの細胞凝集塊を維持しつつ培養することができる細胞培養担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る細胞培養担体は、水銀ポロシメータによる気孔率が５％以下の結晶構造を有し、緻密質セラミックスからなる癌細胞の培養に用いられる細胞培養担体であって、上面に複数のウェルが形成されており、前記ウェルの開口部の直径は１００μｍ以上４００μｍ以下、最大深さは５０μｍ以上４００μｍ以下であり、前記上面の２乗平均粗さ（Ｒｑ）は、０．５ｎｍ以上４５ｎｍ以下、前記ウェル底面の２乗平均粗さ（Ｒｑ）は、５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、かつ、前記上面の結晶粒子径の最大幅は、２μｍ以上１０μｍ以下であることを特徴とする。
【０００９】
前記上面から前記ウェル底面までの最大深さは、前記上面における開口部の直径の５０％以上であることが好ましい。
【００１０】
前記ウェル底面は半球状であり、かつ、その曲率半径は、５０μｍ以上２００μｍ以下であることが好ましい。
【００１１】
前記緻密質セラミックスは、アルミナからなることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、癌細胞として均一なサイズの細胞凝集塊を維持しつつ培養することができる細胞培養担体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明に係る細胞培養担体の一態様を示す上面図である。
【図２】図１をＡ−Ａ’線で切ったときの断面図である。
【図３】「粒子径の最大幅」を説明するためのＳＥＭ画像である。
【図４】担体本体３の上面３ａの表面形状を示す概略断面図であり、（ａ）は本願発明の表面形状、（ｂ）は従来技術の表面形状を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について図面等を参照して詳細に説明する。
図１に本発明に係る細胞培養担体の一態様を示す上面図を、図２に図１をＡ−Ａ’線で切ったときの断面図をそれぞれ示す。
本発明に係る細胞培養担体１は、癌細胞の培養に好適に用いられる細胞培養担体であって、図１及び図２に示すように、担体本体３は、水銀ポロシメータを用いた測定による気孔率が５％以下の結晶構造を有する緻密質セラミックスからなる。また、その上面３ａには複数のウェル５が形成されており、前記上面３ａの２乗平均粗さ（Ｒｑ）は、０．５ｎｍ以上４５ｎｍ以下、前記ウェル５の底面５ａの２乗平均粗さ（Ｒｑ）は、５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、かつ、前記上面３ａの結晶粒子径の最大幅は、２μｍ以上１０μｍ以下である。
上記のような担体を用いれば、ウェル５内で形成される癌細胞スフェロイドのサイズ制御が可能となる。
【００１５】
前記担体本体３は水銀ポロシメータを用いた測定による気孔率が５％以下の結晶構造を有する緻密質セラミックスであることが好ましい。
前記担体本体３の気孔率が５％を越える多孔体で構成されている場合は、ウェル５の底面５ａで増殖した癌細胞が多孔体を構成する気孔内に入り込み、担体からの剥離性が低下するため好ましくない。また、多孔体は表面積が大きくなり、薬剤がセラミックス粒子に吸着されるため、癌細胞スフェロイドに効率的に薬剤が供給されず、薬剤スクリーニング試験が実施不可になる。
【００１６】
前記上面３ａの２乗平均粗さ（Ｒｑ）は、４５ｎｍ以下であることが好ましい。
前記上面３ａのＲｑが４５ｎｍを超える場合は、ウェル５内で増殖した細胞が上面３ａに接着し、それを足場として更に増殖するため、癌細胞として均一なサイズの細胞凝集塊を維持しつつ培養することが難しい。また、培養後の細胞をウェル５内から回収する際、上面３ａに接着した単細胞も回収されるため、均一な形状の細胞凝集塊を回収できず、その回収が困難となる場合がある。更に、表面積が大きいため、薬剤が担体に吸着されやすく、癌細胞スフェロイドに効率的に薬剤が供給できないという問題もある。
前記上面３ａのＲｑの下限値は、製造上の観点から０．５ｎｍ以上であることが好ましい。
【００１７】
前記ウェル５の底面５ａの２乗平均粗さ（Ｒｑ）は、５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。
前記ウェル５の底面５ａのＲｑが５０ｎｍ未満である場合は、底面５ａに細胞を接着させることが難しいため、撒種された細胞が浮遊し、担体を足場として確保することができず、細胞凝集塊の底面５ａとの接着性が低下し、培養しにくいという問題がある。
前記底面５ａのＲｑが１０００ｎｍを超える場合は、細胞と底面５ａとの接着が強くなるため、コラゲナーゼ処理をおこなっても、培養した細胞凝集塊をウェル５から回収しにくくなる。
なお、前述した２乗平均粗さ（Ｒｑ）は、ＪＩＳ Ｂ ０６０１に基づいて測定された値である。
【００１８】
また、前記上面３ａの結晶粒子径の最大幅は、２μｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。
前記最大幅が２μｍ未満である場合は、細胞との接触面積が増加するため、前記上面３ａに細胞が接着しやすくなる。前記最大幅が１０μｍを超える場合は、担体本体３の強度が低下し、培養中、担体本体３が破損するおそれがある。
ここでいう結晶粒子径とは、結晶粒と結晶粒との境界、または結晶粒と結晶粒群との境界のことをいう。「粒子径の最大幅」とは、担体本体の上面３ａのウェル５が形成されていない任意で選んだ表面を、ＳＥＭ（scanning
electron microscope）で観察し、観察されるＳＥＭ画像における結晶粒子径の対角線上の最大幅のことをいう（図３中矢印参考）。
【００１９】
図４は、担体本体３の上面３ａの表面形状を示す概略断面図であり、（ａ）は本願発明の表面形状、（ｂ）は従来技術の表面形状を示すものである。
本発明に係る細胞培養担体の上面は、後述するように、細胞培養担体を作製後、当該上面に対して、ダイヤモンドペースト（丸山ストルアス製、例えば、砥粒の平均粒径が１μｍ）を用いて研磨する。従って、図４（ａ）に示すように、本発明に係る細胞培養担体の上面３ａは、該担体を構成する１次粒子Ｐ１の表面の各々に微少な凹凸Ｐ１ａが形成されている。
これに対して、特許文献４に記載の細胞培養担体の上面は、細胞培養担体を作製後、当該上面に対して、ダイヤモンドペーストを用いた研磨を行なっていない。従って、図４（ｂ）に示すように、特許文献４に記載の細胞培養担体の該担体を構成する１次粒子Ｐ１の表面の各々は、微少な凹凸が形成されていない平坦面Ｐ１ｂとなっている。
以上より本発明に係る細胞培養担体の上面は、上記のような微少な凹凸が形成されているため、上記に示すような効果を得ることができる。
なお、前記微少な凹凸は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：Atomic Force Microscope）におけるＰ−Ｖ値が０．２μｍ以上２μｍ以下であることを言う。
【００２０】
前記上面３ａから前記底面５ａまでの最大深さＤ１は、前記上面３ａにおける開口部の直径Ｌ１の５０％以上であることが好ましい。
前記最大深さＤ１が直径Ｌ１の５０％未満である場合には、ウェル５内の空間が小さくなるため、細胞凝集塊がウェル５内に収まらず、担体本体３の上面３ａ方向に２次元的に増殖するおそれがある。
【００２１】
前記直径Ｌ１は、１００〜４００μｍであり、前記最大深さＤ１は、５０〜４００μｍであることが好ましい。
このような範囲とすることで、好適に癌細胞を培養することができる。
【００２２】
前記底面５ａは半球状であり、かつ、その曲率半径は、５０μｍ以上２００μｍ以下であることが好ましい。
同一のウェル開口径で考えた場合、前記曲率半径が２００μｍを超える場合は、該底面５ａが平面に近くなるため、培養した細胞が該底部５ａの中心に集まりにくくなり、細胞凝集塊を形成しないおそれがある。一方、前記曲率半径が５０μｍ未満の場合は、ウェル５の深さが大きくなるため、細胞凝集塊に対して、培地成分や酸素が供給されにくくなるおそれがある。
【００２３】
前記緻密質セラミックスは、アルミナからなることが好ましい。
アルミナは、高接着性の癌細胞であっても、他の素材に比べて接着性が強くないという観点から、癌細胞を効率的に培養することができるため好ましい。
【００２４】
上述した細胞培養担体は、例えば、下記の方法にて製造することができる、
平均粒径が０．１μｍ以下のアルミナ１次粒子を造粒し、担体本体３の成形体（板状体）を作製後、担体本体３の一面側（上面３ａ）に、ステンレス製の針を用いて、直径Ｌ１：１００〜４００μｍ、最大深さＤ１：５０〜４００μｍの複数のウェル５を前記上面３ａの縦方向及び横方向に均一な間隔を有して形成する。その後、ウェル５を形成した成形体を１５〜３７℃で予備乾燥した後、１２００〜１８００℃で１〜８時間焼成する。
このような方法により、前述した本発明に係る細胞培養担体を製造することができる。
【００２５】
本発明に係る細胞培養担体を用いて、癌細胞を培養する場合は、主に、下記の方法にて行う事ができる。
所定の容器内に本発明に係る細胞培養担体の上面３ａを上にして配置し、前記容器内に第１の培養液を供給し、該第１の培養液をウェル５の開口部付近まで満たして、ウェル５内に該第１の培養液を浸透させる。次に、ウェル５内に癌細胞を含む第２の培養液を滴下して、癌細胞をウェル５内に播種する。次に、一定時間経過後、前記容器内に第１の培養液をさらに供給し、前記細胞培養担体全体を前記第１の培養液に浸漬させて、前記ウェル５内で癌細胞の凝集化を進行させる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は下記実施例により制限されるものではない。
（試験１）
平均粒径が０．１μｍ以下のアルミナ１次粒子を造粒し、担体本体となる成形体を作製した後、担体本体３の一面側（上面３ａ）に、ステンレス製の針を用いて、縦方向及び横方向に均一な間隔を有して、複数のウェル（直径３００μｍ、最大深さ３００μｍ、底面の曲率半径１００μｍ）を形成した。その後、室温（２０℃）で乾燥させた後、１６００℃で２時間焼成して、図１に示すような細胞培養担体を作製した。
なお、ここで作製した担体を、水銀ポロシメータにより気孔率を測定したところ、０．８％であった。
また、ＳＥＭ観察による結晶粒子径の最大幅は、１０μｍであった。
担体本体上面の１次粒子上の表面粗さを原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：Atomic Force Microscope）にて測定したところ、Ｐ−Ｖ値は、１．０μｍであった。
【００２７】
次に、作製した細胞培養担体の上面について、砥粒の平均粒径が１μｍのダイヤモンドペースト（丸山ストルアス製）を用いて研磨し、上面及びウェルの底面について、表面粗さ（Ｒｑ）を変化させた複数の細胞培養担体を作製した。
【００２８】
次に、上記研磨した表面粗さ（Ｒｑ）の異なる細胞培養担体を各々滅菌処理した後、上述した培養方法により、上面に形成された１０箇所のウェル内部に、Ｈｅｐ−Ｇ２（ヒト肝癌細胞）を１．０×１０５撒種し、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍｕ：ウシ胎児血清）を混合したＤＭＥＭを用いて、５％ＣＯ２インキュベータ内で、３７℃で培養した。
【００２９】
６日間経過後、担体に接着した細胞をグルタルアルデヒドで固定処理した後、ＳＥＭ観察を行って、担体本体の上面のＨｅｐ−Ｇ２の付着の有無、ウェル内部でのＨｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊の均一性を目視で評価した。また、コラゲナーゼ処理によるＨｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊の前記ウェル内部からの剥離性を評価した。
前記担体本体の上面のＨｅｐ−Ｇ２の付着の有無は、上面に１個以上Ｈｅｐ−Ｇ２が確認された場合は「×」とし、１個も確認されなかった場合は「○」とした。前記Ｈｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊の均一性については、前記撒種した１０箇所のウェル内で培養された細胞凝集塊の大きさを評価し、各々のウェル内の細胞凝集塊の大きさのバラツキが１０％以内である場合は「○」と、１０％を超える場合には「×」とした。前記剥離性の評価は、１回のコラゲナーゼ処理により該担体から剥離できた場合には「○」と、２回〜３回の場合は「△」と、３回を超える場合は「×」とした。
表１に、本試験における試験条件及び評価結果を示す。
【００３０】
【表１】
0005868244.tif 000002
【００３１】
表１に示すように、前記担体本体の上面のＲｑが０．５ｎｍ以上４５ｎｍ以下であり、かつ、ウェルの底面のＲｑが５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である場合は、前記担体本体の上面のＨｅｐ−Ｇ２の付着が無く、Ｈｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊が均一であり、剥離性が良いことも認められる。
【００３２】
（試験２）
ＳＥＭ観察による結晶粒子径の最大幅を２μｍとして、その他は試験１と同様な条件で、上面及びウェルの底面について、表面粗さ（Ｒｑ）を変化させた複数の細胞培養担体を作製した。
【００３３】
次に、上記研磨した表面粗さ（Ｒｑ）の異なる細胞培養担体を、試験１と同様に、ＤＭＥＭを用いて、５％ＣＯ２インキュベータ内で、３７℃で培養し、６日間経過後の担体本体の上面のＨｅｐ−Ｇ２の付着の有無、ウェル内部でのＨｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊の均一性を目視で評価し、また、コラゲナーゼ処理によるＨｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊の前記ウェル内部からの剥離性を評価した。
表２に、本試験における試験条件及び評価結果を示す。
【００３４】
【表２】
0005868244.tif 000003
【００３５】
表２に示すように、試験１と同様に、前記担体本体の上面のＲｑが０．５ｎｍ以上４５ｎｍ以下であり、かつ、ウェルの底面のＲｑが５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である場合は、前記担体本体の上面のＨｅｐ−Ｇ２の付着が無く、Ｈｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊が均一であり、剥離性が良いことも認められる。
【００３６】
（比較例１７）
ＳＥＭ観察による結晶粒子径の最大幅を０．５μｍとして、その他は試験１の実施例１と同様な条件で細胞培養担体を作製した。
【００３７】
次に、上記細胞培養担体を、試験１と同様に、ＤＭＥＭを用いて、５％ＣＯ２インキュベータ内で、３７℃で培養し、６日間経過後の担体本体の上面のＨｅｐ−Ｇ２の付着の有無、ウェル内部でのＨｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊の均一性を目視で評価し、また、コラゲナーゼ処理によるＨｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊の前記ウェル内部からの剥離性を評価した。
その結果、剥離性は良好であった（評価「○」）ものの、上面にＨｅｐ−Ｇ２の付着が確認され（評価「×」）、Ｈｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊の均一性が悪かった（評価「×」）ことが認められた。
【００３８】
（比較例１８）
ＳＥＭ観察による結晶粒子径の最大幅を１５μｍとして、その他は試験１の実施例１と同様な条件で細胞培養担体を作製した。
【００３９】
次に、上記細胞培養担体を、試験１と同様に、ＤＭＥＭを用いて、５％ＣＯ２インキュベータ内で、３７℃で培養し、６日間経過後の担体本体の上面のＨｅｐ−Ｇ２の付着の有無、ウェル内部でのＨｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊の均一性を目視で評価し、また、コラゲナーゼ処理によるＨｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊の前記ウェル内部からの剥離性を評価した。
その結果、上面にＨｅｐ−Ｇ２の付着が確認されず（評価「○」）、剥離性も良好（評価「○」）であったものの、Ｈｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊の形成が確認されなかった。
【００４０】
（試験５）
平均粒径が０，１μｍ以下のハイドロキシアパタイト１次粒子を造粒し、担体本体となる成形体を作製した後、担体本体の一面側（上面３ａ）に、ステンレス製の針を用いて、縦方向及び横方向に均一な間隔を有して、複数のウェル（直径３００μｍ、最大深さ３００μｍ、底面の曲率半径１００μｍ）を形成した。その後、室温（２０℃）で乾燥させた後、１０００℃で２時間焼成して、図１に示すような細胞培養担体を作製した。
なお、ここで作製した担体を、水銀ポロシメータにより気孔率を測定したところ、０．８％であった。
【００４１】
次に、作製した細胞培養担体の上面及びウェル底面について、砥粒の粒径が１μｍのダイヤモンドペースト（丸山ストルアス製）を用いて研磨し、上面及びウェルの底面について、表面粗さ（Ｒｑ）を変化させた複数の細胞培養担体を作製した。
【００４２】
次に、上記研磨した表面粗さ（Ｒｑ）の異なる細胞培養担体を試験１と同様な方法でＨｅｐ−Ｇ２の培養及びその評価（前記担体本体の上面のＨｅｐ−Ｇ２の付着の有無、前記Ｈｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊の均一性及び前記剥離性）を行った。
表３に、本試験における試験条件及び評価結果を示す。
【００４３】
【表３】
0005868244.tif 000004
【００４４】
表３に示すように、試験１と同様に、前記担体本体の上面のＲｑが４５ｎｍ以下であり、かつ、ウェルの底面のＲｑが４５ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である場合は、前記担体本体の上面のＨｅｐ−Ｇ２の付着が無く、Ｈｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊が均一であり、剥離性が良いことが認められる。但し、試験１と比べると、剥離性が若干程度低下する傾向が認められる。
【００４５】
（比較例２７）
気孔率を２０％とするように細胞培養担体を作製して、その他は、剥離性が最も高いと考えられる試験１の実施例１と同様な方法でＨｅｐ−Ｇ２の培養及びその評価（前記担体本体の上面のＨｅｐ−Ｇ２の付着の有無、前記Ｈｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊の均一性及び前記剥離性）を行った。
【００４６】
その結果、前記担体本体の上面にＨｅｐ−Ｇ２の付着が認められ（「×」）、前記Ｈｅｐ−Ｇ２の細胞凝集塊の均一性も無く（「×」）、かつ、剥離性も悪かった（「×」）。
【符号の説明】
【００４７】
１  細胞培養担体
３  担体本体
３ａ  上面
５  ウェル
５ａ  底面
【図１】
0005868244.tif 000005
【図２】
0005868244.tif 000006
【図３】
0005868244.tif 000007
【図４】
0005868244.tif 000008