(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をエクスビボ培養する方法であって、該方法は、ＮＫ細胞を含む細胞の集団を、ＩＬ−２，ＩＬ−１５、または、ＩＬ−２およびＩＬ−１５の両方、ならびに、２〜２０ｍＭの濃度のニコチンアミドおよび／またはニコチンアミドアナログとともに少なくとも７日間培養することを含み、ただし、前記ＮＫ細胞を培養することにより、下記の少なくとも１つがもたらされる、方法：
（ａ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／またはニコチンアミドアナログとともに培養されたＮＫ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌの上昇した発現；
（ｂ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／またはニコチンアミドアナログとともに培養されたＮＫ細胞と比較して、上昇した遊走応答；
（ｃ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／またはニコチンアミドアナログとともに培養されたＮＫ細胞と比較して、上昇したホーミングおよびインビボ保持；
（ｄ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／またはニコチンアミドアナログとともに培養されたＮＫ細胞と比較して、より大きい増殖；および
（ｅ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／またはニコチンアミドアナログとともに培養されたＮＫ細胞と比較して、増大した細胞傷害活性。
【請求項２】
前記ＮＫ細胞は、少なくともＩＬ−２とともに、前記ＮＫ細胞を含む細胞の集団の播種から、約２週間〜約３週間培養され、前記ニコチンアミドおよび／またはニコチンアミドアナログの前記濃度が５ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ニコチンアミドおよび／またはニコチンアミドアナログの前記濃度が、約２ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＫ細胞を培養することが、約２週間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＫ細胞を含む細胞の集団が、臍帯血、骨髄および末梢血からなる群から選択される供給源から得られる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＮＫ細胞を含む細胞の集団は、ＮＫ細胞画分およびＣＤ３＋細胞画分を含む不均一な細胞集団である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＤ３＋細胞画分は前記ＮＫ細胞画分よりも大きい、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＮＫ細胞画分は前記ＣＤ３＋細胞画分よりも大きい、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＫ細胞を含む細胞の集団は、ＣＤ３＋細胞が枯渇化された単核細胞集団または総有核細胞集団である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＫ細胞を含む細胞の集団は、ＣＤ３＋細胞およびＣＤ１９＋細胞が枯渇化された単核細胞集団または総有核細胞集団である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
エクスビボ培養されたＮＫ細胞をエキソジーンにより形質導入する方法であって、
（ａ）ＮＫ細胞の集団を請求項１〜１０のいずれかに記載の方法に従ってエクスビボ培養すること；および
（ｂ）前記ＮＫ細胞の培養された集団をエキソジーンにより形質導入すること
を含む方法。
【請求項１２】
前記ニコチンアミドおよび／またはニコチンアミドアナログはニコチンアミドである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記培養することが８または９日間行われる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のエクスビボ培養に関連し、より具体的には、しかし、限定ではなく、ＮＫ細胞の生長および／または機能性を、ＮＫ細胞の増殖をもたらすサイトカインとの組合せで当該細胞をニコチンアミドにより処理することによって高めるための組成物および方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー細胞（以降、これはまた「ＮＫ」細胞と略記される）は、免疫反応に関与するリンパ系細胞である。これらの細胞は様々な機能を有しており（とりわけ、腫瘍細胞、発ガン性形質転換を受けている細胞、および、他の異常な細胞を生体内において殺すこと）、また、生来的な免疫学的監視機構の重要な構成成分である。ＮＫ細胞を用いた養子免疫療法による臨床経験では、ＮＫ細胞集団を効果的かつ効率的に拡大培養し、同時に、それらの機能性（殺傷能、輸送、局在化、持続および増殖）をインビボにおいて維持し、また、強化さえするためのより良好な方法の必要性が強調されている。
【０００３】
ＮＫ細胞は、表現型および機能の両方の点で、リンパ球の明確な集団を表す。ＮＫ細胞は、大きい顆粒リンパ球の形態学を有しており、特徴的なＮＫ細胞表面受容体を発現し、ＴＣＲ再編成と、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球および／またはマクロファージの細胞表面マーカーとの両方を有していない。ＮＫ細胞は、標的細胞にアポトーシスによる死を生じさせるタンパク質（パーフォリンおよびグランザイム）の小さい細胞質顆粒を放出することによって殺傷する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩ様分子、およびＭＨＣ非関連分子を巻き込む多数の阻害性受容体および活性化受容体を介して、潜在的な「標的」細胞と、健全な細胞とを識別する機構を有する（Ｃａｌｉｇｕｉｒｉ  Ｂｌｏｏｄ、２００８、１１２：４６１〜６９）。阻害性のＮＫ細胞受容体には、ＨＬＡ−Ｅ（ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ）；ＨＬＡ−Ｃ（グループ１またはグループ２）、ＫＩＲ２ＤＬ；ＫＩＲ３ＤＬ（ＨＬＡ−Ｂ  Ｂｗ４）、および、ＨＬＡ−Ａ３＋またはＨＬＡ−Ａ４＋のペプチドが含まれる。活性化するＮＫ細胞受容体には、ＨＬＡ−Ｅ（ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ）；ＫＩＲ２ＤＳ（ＨＬＡ−Ｃ）およびＫＩＲ３ＤＳ（ＨＬＡ−Ｂｗ４）が含まれる。他の受容体には、ＮＫ細胞受容体タンパク質−１（これはマウスではＮＫ１．１と呼ばれる）、および、ＩｇＧのＦｃ部分に対する低親和性受容体（ＦｃγＲＩＩＩ；ＣＤ１６）が含まれる。特異的なＮＫ細胞活性化因子、すなわち、ＵＬ結合タンパク質（ＵＬＢＰ）、および、それらの潜在的な治療的使用が、米国特許出願公開第２００９０２３４６９９号（Ｃｏｓｍａｎ他）に詳しく記載される（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。「活性化」表面受容体および「阻害性」表面受容体により、ＮＫ細胞の細胞傷害活性が制御される。治療の検討のために重要であるが、ＮＫ細胞の阻害が、「活性化された」ＮＫ細胞による正常な宿主組織の破壊を防止するために必要であり、しかし、ＮＫ細胞における阻害性シグナル伝達の方が活性化シグナルよりも強いようである。
【０００４】
無傷の骨髄がＮＫ細胞の作製のために必要である。ヒト骨髄由来のＮＫ細胞は、ＣＤ２＋ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋の表現型を有し、ＣＤ３を有しておらず、それにもかかわらず、Ｔ細胞受容体ζ鎖［ゼータ（ζ）−ＴＣＲ］を含有する大きい顆粒リンパ球（ＬＧＬ）である。ＮＫ細胞が、血液、脾臓、肝臓、肺、腸および脱落膜を含めて、様々なリンパ系組織および非リンパ系組織に見出され得る。ＮＫ細胞が、腫瘍では抗腫瘍活性を発揮しているかもしれないが、腫瘍において著しい数で見出されている。
【０００５】
ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞に対する自発的なＭＨＣ非拘束の細胞傷害活性を示し、ウイルス感染およびガン発達に対する抵抗性をインビボにおいて媒介する。したがって、ＮＫ細胞は先天性免疫の重要なエフェクター細胞を表す。加えて、ＮＫ細胞は、サイトカインを分泌することができること、また、適応免疫応答および造血を調節することができることを含めて、様々な他の機能を有する。ＮＫ細胞は、必要不可欠なインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）をいくつかの実験的動物モデルにおける感染の初期段階の期間中にもたらす。
【０００６】
ほとんどのガンは、ＨＬＡに関連した特定可能な腫瘍特異的抗原を有しておらず、したがって、抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球によって殺すことができない。広範囲の様々なガン細胞がＮＫ細胞傷害性に対して感受性であるので、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の移植を、移植片対宿主病を恐れることなく、同種状況ではガン細胞に対して用いることができる。
【０００７】
近年の研究では、ＮＫ細胞治療のこの潜在的可能性が強調されている。移植の動物モデルにおいて、ドナーのＮＫ細胞は、非造血系組織に影響を及ぼすことなく、白血病細胞および宿主のリンパ球造血系細胞を溶解する。ＮＫ細胞は、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）に結合する自己ＨＬＡ分子によって阻害されるので、これらの知見は、ＮＫ細胞の活性化に有利であるＨＬＡ・ＫＩＲタイプ（ＨＬＡ・ＫＩＲミスマッチ）を有する造血幹細胞移植片ドナーを選択するという臨床診療に至っており、したがって、抗白血病効果を促進させることが期待され得る。しかしながら、「最良」ドナーの選択は、２つ以上の潜在的ドナーを有する患者に限定され、また、ＮＫ細胞がリンパ系細胞を溶解する能力は一般に低く、予測困難である。自己免疫状態におけるＮＫの分布および機能の調査では、ＮＫ細胞集団の低下した数および機能性が多くの自己免疫疾患（例えば、ＳＬＥ、シェーグレン症候群、硬化症、乾癬、ＲＡ、潰瘍大腸炎など）において示されている。したがって、ＮＫ細胞を用いた処置は、骨髄移植後の炎症性応答を媒介し得る潜在的に病原性の自己免疫Ｔ細胞を積極的に抑制し、これにより、自己免疫記憶Ｔ細胞の活性化を、臨床的寛解を維持し、かつ、ＧＶＨ影響を防止するために抗原非特異的な様式で調節しているかもしれない。
【０００８】
臨床使用のために、ＮＫ細胞は通常、白血球アフェレーシスによって患者またはドナーから採取される。しかしながら、低体重の患者については、最大のＮＫ細胞用量が限定され、大きいＮＫ細胞用量が得られるだけであるかもしれず、このことが小児をＮＫ細胞治療のための最良の候補者にしている。重要なことは、ＮＫ細胞の総数および活性がウイルス感染および／またはガンでは実質的に低下するかもしれず、このことが、内因性ＮＫ細胞の活性化に基づく免疫療法を有効でないものにしている。さらに、不応性再発が細胞輸血における大きな合併症であり、多くの臨床プロトコルが白血球集団の反復注入を必要とする。
【０００９】
これに関して、Ｖｅｒｎｅｒｉｓ他（Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２００９、１４７：１８５〜９１）は、臍帯血ＮＫ細胞の臨床使用についての見通しを検討して、近年、新鮮な臍帯血ＮＫ細胞集団は、さらなる操作が、その完全な機能的（細胞傷害性、運動性）潜在能力を発現するために必要であるかもしれないことを示している。様々な生物的応答修飾物質（具体的には、ＩＬ−２）を用いた全身的処置のとき、活性化されたＮＫ細胞の数ならびにそれらの抗ウイルス活性および転移抑制活性が様々な組織で劇的に増大することが見出されている。この証拠に基づいて、ＩＬ−２（およびＩＬ−１５）とともにＮＫ細胞の活性化および拡大を伴う治療方針が、受血者へのＩＬ−２の同時投与と同様に試みられている。しかしながら、今日まで、結果は、注入されたＮＫ細胞のほんの限定されたホーミングおよび一時的な生着を示すだけで、失望させるものであった。さらに、ＩＬ−２は毒性があり、臨床状況では細心の注意を払って使用されなければならない。
【００１０】
ＮＫ細胞のエクスビボでの濃縮および増殖のための実現可能な臨床プロトコルを開発する試みにおいて、磁石による細胞選択技術で、常磁性のＣＤ５６マイクロビーズおよび細胞選別カラムを使用する細胞選択技術が、増殖研究を開始するために、ＣＤ３−／５６＋のＮＫ  Ｔ細胞（６０．６±１０．８％）およびＣＤ３＋／５６＋のＮＫ  Ｔ細胞（３０．４±８．６％）の両方を含有するＣＤ５６＋集団を単離するために使用されている。組換えヒトＩＬ−１５に加えての組換えヒトＩＬ−２またはＩＬ−２の添加により、細胞拡大の相当の変動性が、ドナーに依存して、また、同じドナーが種々の場合に試験されたときにさえ認められた。選択され、生長させられたＣＤ５６＋細胞の低いＥ：Ｔ比率での細胞傷害性が、開始集団よりも有意に大きかったが、同じ条件のもとで２週間培養された非分離ＰＢＭＣと同程度であった。新鮮な非選択ＰＢＭＣ培養物では、（ＩＬ−２との組合せでの）ＩＬ−１５は、１：１のＥ：Ｔ比率で、ＩＬ−２単独よりも大きい殺傷性を誘導した。注目すべきことに、ＣＤ３＋細胞が培養前に枯渇化されなかったので、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞の増殖が、ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増殖の２倍〜３倍であった。ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞の中程度にすぎない増殖が生じただけであり、得られた細胞の大部分がＣＤ５６＋／ＣＤ３＋ＮＫＴ細胞であった。
【００１１】
異なる取り組みにおいて、ヒトＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞が、骨髄間質細胞および／または免疫細胞によって産生される様々なサイトカイン（例えば、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＩＬ−２およびＩＬ−１５など）の存在下で培養されるＢＭ由来のＣＤ３４＋造血始原体細胞（ＨＰＣ）から培養される。幹細胞因子をこれらの培養物に加えることは、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞傷害性エフェクター細胞の分化に対する影響が全くなく、しかし、培養におけるそれらの増殖が大きく高められる。これらの細胞の大部分はＣＤ２およびＣＤ１６を有していないが、ゼータ−ＴＣＲを発現する。末梢血に見出されるＮＫ細胞と同様に、ＩＬ−１５の存在下で成長させられた骨髄由来のＣＤ２−ＣＤ１６−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞は、単球由来のサイトカインに応答して、ＩＦＮ−ガンマの強力な産生者であることが見出された。ＩＬ−１５は、ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞に分化するようにＣＤ３４＋ＨＰＣを誘導することができ、ＫＬはそれらの数を増幅することができる。しかしながら、ＮＫ細胞の収量が、ＣＤ３４＋細胞集団の中の潜在的なＮＫ始原体の数が少ないことによって制限される。
【００１２】
ＮＫ細胞を生長させるための他の方法が記載されている。Ｆｒｉａｓ他（Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２００８、３６：６１〜６８）は、血清非含有培地を用いて間質細胞層上で臍帯血から選択されたＮＫ始原体（ＣＤ７＋ＣＤ３４−Ｌｉｎ−ＣＤ５６−）を成長させ、これにより、ＳＣＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＦＬおよびＩＬ−２によるＮＫ分化を誘導し、増大した数の細胞傷害性の培養ＮＫ細胞を産生させた。Ｈａｒａｄａ他（Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．、２００４、３２：６１４〜２１）は、ＮＫ細胞をウィルムス腫瘍細胞株由来の細胞の上で成長させた。Ｗａｌｄｍａｎｎ他（米国特許出願公開第２００７０１６０５７８号）は、望まれないサイトカイン産生を低下させるために、ＩＬ−１５／Ｒ−リガンド活性化因子の複合体を使用する培養における、全血、骨髄または脾臓の細胞からのＮＫ細胞およびＣＤ８−Ｔ細胞の高まった増殖を記載する。Ｃａｍｐａｎａ他（米国特許出願公開第２００９００１１４９８号）は、ＩＬ−１５および４−１ＢＢを発現し、かつ、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩの発現が弱いか、または存在しない白血病細胞の存在下において、ＮＫ細胞を移植のためにエクスビボで培養および活性化することを記載する。Ｃｈｉｌｄｓ他（米国特許出願公開第２００９０１０４１７０号）は、ＮＫ細胞を、ＩＬ−２の存在下、放射線照射されたＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞との共培養によってエクスビボで増殖させ、また、活性化することを記載する。他の取り組みを使用して、Ｔｓａｉ（米国特許出願公開第２００７００４８２９０号）は、研究適用および可能性のある治療適用のために、継続的なＮＫ細胞株を、放射線照射された３Ｔ３由来ＯＰ−９Ｓ細胞との不死化ＮＫ始原体のエクスビボ培養によって造血幹細胞から産生させた。（上記参考文献のすべてが参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００１３】
しかしながら、ＮＫ細胞培養のための確立された方法はまた、Ｔ細胞の増殖を支援し、そして、Ｔ細胞が枯渇化された後でさえ、残存するＴ細胞が典型的には、刺激後に数を増大させ、このことが、拡大された細胞集団の臨床使用を潜在的な移植片対宿主病のために不可能にする。このことはさらに、もう１回のＴ細胞枯渇化を輸血前に必要とし、そのため、準備手順を、時間および費用がかかり、かつ、相当のＮＫ細胞喪失を常に生じさせるものにしている。
【００１４】
拡大後のＴ細胞混入を減らすために、ＮＫ拡大プロトコルでは、精製されたＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞が、拡大培養において播種されるための最初の集団として使用され続けている。ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞の高度精製画分を得るためには、２工程の精製手順が必要である：ＣＤ５６細胞の正の選択、その後、ＣＤ３＋細胞の枯渇化、または、最初にＣＤ３細胞の枯渇化、その後、ＣＤ５６細胞の正の選択。しかしながら、この手順は費用がかかり、また、２回の精製サイクルの期間中に相当の細胞喪失を伴う。精製されたＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞を用いて開始される培養においてさえ、Ｔ細胞が混入するＮＫ産物が依然として拡大される。
【００１５】
サイトカインがＮＫ細胞の拡大のためにだけ使用されるプロトコルでは、かなり控えめな効果が示され、また、相当の拡大を得るためには、さらなる刺激がサイトカインに加えて要求されることが示される（Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ、２００９、２９：８９〜９６；Ｋｏｅｈｌ  Ｕ他、Ｋｌｉｎ  Ｐａｄｉａｔｒ、２００５、２１７：３４５〜３５０）。放射線照射されたフィーダー細胞（例えば、末梢血単核細胞、エプスタイン・バールウイルス形質転換のリンパ芽球様系統（ＡＢＶ−ＬＣＬ）、Ｋ５６２骨髄性白血病細胞株で、膜結合型形態のインターロイキン−１５と、共刺激分子４−１ＢＢのためのリガンドとを発現させるために遺伝子改変されたもの）などが、さらなる刺激としてＮＫ細胞の拡大のために一般に使用される。ほとんどのＮＫ細胞拡大プロトコルでは、精製されたＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞が最初の集団として使用される一方で、いくつかのプロトコルでは、単核細胞が、放射線照射された間質または抗ＣＤ３抗体との組合せで最初の播種用集団として使用される（Ｂｌｏｏｄ、２００８年３月１５日、第１１１巻、第６号、３１５５頁〜３１６２頁）。拡大後、これらの培養物は、ＣＤ３＋細胞およびＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞がひどく混入しており、したがって、ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞が注入前に精製される必要がある。
【００１６】
Ｍｉｌｌｅｒ他（Ｂｌｏｏｄ、１９９２、８０：２２２１〜２２２９）は、抗体被覆のプラスチックフラスコでのパンニングによってＣＤ５およびＣＤ８から枯渇化される精製されたＣＤ１４＋細胞またはＭＮＣとの組合せでＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞を含む、ＮＫ始原体および単球について濃縮された画分を使用する培養において１８日で、ＮＫ細胞の３０倍の拡大を得た。Ｖｅ’ｒｏｎｉｑｕｅ  Ｄｅｃｏｔ他（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２０１０、３８：３５１〜３６２）は、単核細胞をＴ細胞およびＢ細胞から枯渇化することによって、放射線照射されたＴ細胞およびＢ細胞の上でのＮＫ細胞の約２０倍の拡大を報告し、枯渇化後の混入集団が主として単球であることを見出した。しかしながら、この培養モデルでは、拡大がサイトカインだけまたはフィーダー細胞だけの存在下では全く認められなかったので、フィーダー細胞およびサイトカインが、ＮＫ細胞の増幅を得るために必要であった。したがって、Ｍｉｌｌｅｒとは対照的に、たとえ単球が播種用集団において濃縮されたとしても、ＮＫ細胞の拡大が、照射線照射されたＴ間質細胞およびＢ間質細胞の非存在下では全く認められなかった（Ｄｅｃｏｔ他、Ｅｘｐｅｒ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２０１０、３８：３５１〜３６２）。
【００１７】
それにもかかわらず、さらに、エクスビボ培養されたＮＫ細胞は多くの場合、かなりの活性（例えば、細胞傷害性）を非関連の標的細胞に対して明らかにする一方で、より臨床的に関連した腫瘍細胞およびガン細胞に対する活性はインビトロおよびインビボの両方で多くの場合、失望させてきており、活性化を高めるための方法が提案されている。Ｚｉｔｖｏｇｅｌ他（米国特許第６８４９４５２号）（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）は、誘発された樹状細胞と接触させることによるＮＫ細胞のエクスビボ活性化またはインビボ活性化を教示する。他の研究者は、活性化の強化が、ＮＫ細胞を、ＭＨＣ−Ｉ分子を有さず、かつ、ＩＬ−１５を発現するために遺伝子改変された細胞とともに培養すること（Ｃａｍｐａｎａ他、米国特許出願公開第２００９０１１４９８号）によって、または、プロテアソーム阻害剤によるＮＫ細胞レシピエントの前処理（Ｂｅｒｇ他、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２００９、１１：３４１〜５５）（この参考文献は参照によって本明細書中に組み込まれる）によってもたらされることを示唆している。しかしながら、これらのプロトコルのどれも、移植後の適切な宿主標的器官における生存および拡大（恒常性増殖）が可能である著しく拡大されたＮＫ細胞集団をもたらしておらず、また、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞を用いた免疫治療は依然として、臨床プロトコルでの使用のために好適な、十分な数の高度に精製された機能的適確なＮＫ細胞を得ることができないことによって制限される（Ｂａｃｈａｎｏｖａ他、Ｃａｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２０１０、５９：７３９〜４４；Ｇｕｖｅｎ、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、２００５；Ｓｃｈｕｓｔｅｒ他、Ｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００９、３４：２９８１〜９０；Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｉ他、Ｂｌｏｏｄ、２００８、１１１：３６２６〜３４を参照のこと）。したがって、単離されたＮＫ細胞として、または、ＣＤ３＋細胞からの単核細胞（枯渇化単核細胞または非枯渇化単核細胞のどちらであれ）の混合集団からＮＫをエクスビボで優先的に生長させるための簡略化された費用効果的な方法が求められている。
【００１８】
ニコチンアミドが細胞の運命および機能を調節し得ることが示された（例えば、国際公開ＷＯ２００３／０６２３６９、同ＷＯ２００５／００７７９９、同２００５／００７０７３、同ＷＯ２００６／０３０４４２、同ＷＯ２００７／０６３５４５および同ＷＯ２００８／０５６３６８を参照のこと。これらのすべてが、本明細書により、それらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【発明の概要】
【００１９】
臨床適用（例えば、白血病および他のガンのための細胞治療など）のためのより多数の治療適確なＮＫ細胞がますます必要であることを考えると、臨床状況における使用のために好適なナチュラルキラー細胞の高まったエクスビボでの増殖および活性化のための改善および簡略化された費用効果的な方法が求められている。
【００２０】
したがって、ＮＫ細胞をエクスビボ培養において拡大し、その機能性を注入後に高めることが、養子免疫療法におけるその臨床適用可能性にとって非常に重要である。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をエクスビボ培養する方法が提供され、この場合、この方法は、ＮＫ細胞を含む細胞の集団を、少なくとも１つの増殖因子、ならびに、効果的な濃度、効果的な暴露時期および効果的な暴露継続期間のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養することを含み、ただし、ＮＫ細胞を、少なくとも１つの増殖因子、ならびに、効果的な濃度、効果的な暴露時期および効果的な暴露継続期間のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養することにより、下記の少なくとも１つがもたらされる：
（ａ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌの上昇した発現；
（ｂ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞と比較して、上昇した遊走応答；
（ｃ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞と比較して、上昇したホーミングおよびインビボ保持；
（ｄ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞と比較して、より大きい増殖；および
（ｅ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞と比較して、増大した細胞傷害活性。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態のさらに別の局面によれば、本発明の方法に従って培養されるＮＫ細胞の集団が提供される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態のさらに別の局面によれば、下記の少なくとも１つによって特徴づけられるＮＫ細胞の集団が提供される：
（ａ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞の集団と比較して、ＣＤ６２Ｌの上昇した発現；
（ｂ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞の集団と比較して、上昇した遊走応答；
（ｃ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞の集団と比較して、上昇したホーミングおよびインビボ保持；
（ｄ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞の集団と比較して、より大きい増殖；
（ｅ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞の集団と比較して、増大した細胞傷害活性；
（ｆ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞の集団と比較して、ＣＤ３＋細胞対ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞の低下した比率。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態のなおさらに別の局面によれば、移植されたとき、高まったホーミング、生着および保持によって特徴づけられるＮＫ細胞の集団が提供され、ただし、この場合、当該ＮＫ細胞集団の少なくとも１５×１０６個を放射線照射されたＳＣＩＤマウス宿主に注入することにより、少なくとも２５％のドナー由来のＮＫ細胞が、免疫検出およびフローサイトメトリーによって検出されるように、注入後４日で宿主のリンパ組織においてもたらされる。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞の集団はさらに、免疫検出およびフローサイトメトリーによって検出されるように、注入時において前記細胞集団の少なくとも３０％におけるＣＤ６２Ｌの発現によって特徴づけられる。本発明のさらに他の実施形態によれば、ＮＫ細胞の集団はさらに、ＣＤ３＋細胞対ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞の比率が注入時において１：１００以下であることによって特徴づけられる。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態のなおさらに別の局面によれば、腫瘍成長をその必要性のある対象において阻害する方法であって、治療有効量の本発明のＮＫ細胞の集団を当該対象に投与することを含む方法が提供される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態のなおさらに別の局面によれば、ウイルス感染症をその必要性のある対象において処置または防止する方法であって、治療有効量の本発明のＮＫ細胞のエクスビボ培養された集団を当該対象に投与することを含む方法が提供される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態の別の局面によれば、移植片対宿主病をその必要性のある対象において処置または防止する方法であって、治療有効量の本発明のＮＫ細胞のエクスビボ培養された集団を当該対象に投与することを含む方法が提供される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態の別の局面によれば、自己免疫性の疾患または状態をその必要性のある対象において処置または防止する方法であって、治療有効量の本発明のＮＫ細胞のエクスビボ培養された集団を当該対象に投与することを含む方法が提供される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態の別の局面によれば、白血病性の疾患または状態をその必要性のある対象において処置または防止する方法であって、治療有効量の本発明のＮＫ細胞のエクスビボ培養された集団を当該対象に投与することを含む方法が提供される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞の集団は宿主に対して自己由来または同種由来である。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、投与することが、ＮＫ細胞集団の単回注入または反復注入によって行われる。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は、ＮＫ細胞集団を投与することに付随して少なくとも１つの増殖因子により処置されている。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つの増殖因子は、ＩＬ−２、または、ＩＬ−２およびＩＬ−１５である。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態の別の局面によれば、エクスビボ培養されたＮＫ細胞をエキソジーンにより形質導入する方法が提供され、この場合、この方法は、
（ａ）ＮＫ細胞の集団を本発明の方法に従ってエクスビボ培養すること；および
（ｂ）ＮＫ細胞の培養された集団をエキソジーンにより形質導入すること
を含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの増殖因子がＩＬ−２であり、暴露時期が、ＮＫ細胞を含む細胞の集団の播種からであり、暴露継続期間が約２週間〜約３週間であり、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分の濃度が５ｍＭである。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分の効果的な濃度が、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または、約１．０ｍＭ〜約２５ｍＭ、または、約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、あるいは、約２．５ｍＭ、約５．０ｍＭまたは約７．５ｍＭである。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、暴露時期が、播種から培養後の約５週間まで、または、播種後の約１時間から培養後の約３週間まで、または、播種後の約２４時間から培養後の約３週間まで、または、播種後の約２日から培養後の約２週間まで、または、前記培養における前記ＮＫ細胞を含む細胞の集団の播種からである。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、暴露継続期間が、約２時間〜約５週間、または、約３０時間〜約４週間、または、約２日〜約３週間、あるいは、約１週間、約２週間、約３週間、約１日、約２日、約３日、約５日、約１０日、約１２日、約１５日、約１７日または約２０日である。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記ＮＫ細胞を含む細胞の集団が、臍帯血、骨髄および末梢血からなる群から選択される供給源から得られる。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記ＮＫ細胞を含む細胞の集団は、ＮＫ細胞画分およびＣＤ３＋細胞画分を含む不均一な細胞集団である。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤ３＋細胞画分は前記ＮＫ細胞画分よりも大きい。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞画分は前記ＣＤ３＋細胞画分よりも大きい。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記ＮＫ細胞を含む細胞の集団は、ＣＤ３＋細胞が枯渇化された単核細胞集団または総有核細胞集団である。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記ＮＫ細胞を含む細胞の集団は、ＣＤ３＋細胞およびＣＤ１９＋細胞が枯渇化された単核細胞集団または総有核細胞集団である。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記ＮＫ細胞を含む細胞の集団は、非選択のＮＫ細胞集団である。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞はＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞を含む。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞はＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＣＤ３−細胞を含む。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、前記ＮＫ細胞を含む細胞の集団を培養することが、フィーダー層またはフィーダー細胞を伴うことなく行われる。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの増殖因子は、ＳＣＦ、ＦＬＴ３、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２およびＩＬ−２１からなる群から選択される増殖因子を含む。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの増殖因子は、ＩＬ−２、または、ＩＬ−２およびＩＬ−１５である。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの増殖因子はＩＬ−２だけである。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤ６２Ｌの発現が、フローサイトメトリー、免疫検出、定量的ｃＤＮＡ増幅およびハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法によって求められる。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤ６２Ｌの発現が蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって求められる。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤ６２Ｌの発現が、蛍光性の抗ヒトＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体を使用して求められる。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上昇した遊走応答が、移行アッセイまたは隙間閉鎖アッセイによって求められる。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上昇した遊走応答が移行アッセイによって求められる。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、移行が、ＳＤＦ１による刺激に応答してアッセイされる。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上昇したホーミングおよびインビボ保持がＦＡＣＳによって求められ、注入後の標的器官におけるパーセント生着ＮＫ細胞として表される。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、標的器官が、脾臓、骨髄およびリンパ節からなる群から選択される。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ホーミングおよび生着が、ＮＫ細胞注入後の約１日から約２週間までで求められる。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、増殖速度が、クローン産生アッセイ、機械的アッセイ、代謝アッセイおよび直接的増殖アッセイによって求められる。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、増殖速度が、ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞百分率のＦＡＣＳ分析によって求められ、経時的な増大倍数として表される。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞傷害活性が、細胞殺傷アッセイを使用してアッセイされる。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞殺傷アッセイの標的細胞が、ガン細胞株、初代ガン細胞、固形腫瘍細胞、白血病性細胞またはウイルス感染細胞である。
【００６６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミド成分はニコチンアミドである。
【００６７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミド成分はニコチンアミドのアナログまたは誘導体である。
【００６８】
本発明の他の実施形態によれば、ニコチンアミドのアナログまたは誘導体は、置換ベンズアミド化合物、置換ニコチンアミド化合物、ニコチンチオアミド化合物、Ｎ−置換ニコチンアミド化合物、ニコチンチオアミド化合物、３−アセチルピリジンまたはニコチン酸ナトリウムである。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００７０】
【図１Ａ】図１Ａは、ニコチンアミドの非存在下（サイトカイン）またはニコチンアミドの増大する濃度（示されるように、０．５ｍＭ〜５ｍＭの「ＮＡＭ」）の存在下で培養した後における臍帯血由来の精製されたＮＫ細胞画分の用量依存的増殖を示すヒストグラムである。培養を、ＣＤ５６＋表現型について免疫磁石ビーズで精製された臍帯血ＮＫ細胞を用いて開始し、サイトカイン（Ｆｌｔ−３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）とともに３週間までの間維持した。図１Ａは、１４日培養したときのＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増殖（０日目（培養開始）に対する増大倍数または「細胞拡大」）を示す。コントロール（サイトカイン）と比較して、ニコチンアミド処理培養物のＣＤ５６＋細胞成分における劇的な用量依存的増大が全培養期間を通して続くことに留意すること。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ニコチンアミドの非存在下（サイトカイン）またはニコチンアミドの増大する濃度（示されるように、０．５ｍＭ〜５ｍＭの「ＮＡＭ」）の存在下で培養した後における臍帯血由来の精製されたＮＫ細胞画分の用量依存的増殖を示すヒストグラムである。培養を、ＣＤ５６＋表現型について免疫磁石ビーズで精製された臍帯血ＮＫ細胞を用いて開始し、サイトカイン（Ｆｌｔ−３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）とともに３週間までの間維持した。図１Ｂは、３週間の培養の後におけるＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増大倍数を示す。コントロール（サイトカイン）と比較して、ニコチンアミド処理培養物のＣＤ５６＋細胞成分における劇的な用量依存的増大が全培養期間を通して続くことに留意すること。
【００７１】
【図２Ａ−２Ｃ】図２Ａ−２Ｃは、ニコチンアミドの非存在下（サイトカイン）または存在下で維持される、臍帯血由来単核細胞画分全体を用いて開始された培養物において細胞表面マーカー（ＣＤ５６、ＣＤ４５、ＣＤ３）に従って分類された種々のリンパ球サブセットの割合を示すヒストグラムである。培養物を、増大する濃度（０．５ｍＭ〜５ｍＭ）のニコチンアミド（「ＮＡＭ」）の存在下または非存在下、サイトカイン（Ｆｌｔ−３、ＩＬ−１５およびＩＬ−２を含む）とともに３週間維持し、表面マーカーに対する特異的抗体と反応させ、その後、特定の表現型についてＦＡＣＳによって分析した。図２Ａ＝ＣＤ５６＋／ＣＤ４５＋細胞（ＮＫ細胞およびＮＫ−Ｔ細胞）；図２Ｂ＝ＣＤ５６＋／ＣＤ３−（ＮＫ）細胞；図２Ｃ＝ＣＤ３＋／ＣＤ５６−（Ｔ）細胞。ニコチンアミド処理培養物でのＮＫ細胞集団（ＣＤ５６＋／ＣＤ４５＋およびＣＤ５６＋／ＣＤ３−の表現型）における用量依存的増大およびＴリンパ球集団（ＣＤ３＋／ＣＤ５６−の表現型）における付随する低下に留意すること。
【００７２】
【図３】図３は、２．５ｍＭのニコチンアミドの非存在下（サイトカイン）または存在下で培養した後における精製骨髄由来の精製されたＣＤ５６＋細胞画分の増殖を示すヒストグラムである。培養を、免疫磁石ビーズで骨髄から精製されたＣＤ５６＋細胞（ＮＫおよびＮＫ−Ｔ）を用いて開始し、サイトカイン（Ｆｌｔ−３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）とともに、２．５ｍＭのニコチンアミドの存在下（暗い陰影）または非存在下（サイトカイン、明るい陰影）で３週間までの間維持した。コントロール（サイトカイン、明るい陰影）と比較して、ニコチンアミド処理培養物のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞成分における劇的増大が全培養期間を通して続くことに留意すること。
【００７３】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ−４Ｂは、ニコチンアミドの非存在下（サイトカイン）または存在下で培養した後における、精製された骨髄ＣＤ５６＋細胞からの骨髄ＮＫ細胞対骨髄ＮＫＴ細胞の増殖を示すヒストグラムである。培養を、免疫磁石ビーズで精製された骨髄由来のＣＤ５６＋細胞を用いて開始し、２．５ｍＭのニコチンアミドの存在下または非存在下で、サイトカイン（Ｆｌｔ−３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）とともに３週間維持した。図４Ａおよび図４Ｂは２つの独立した例示的実験の結果を表す。コントロール（サイトカイン）と比較して、播種細胞におけるＮＫ細胞対ＮＫＴ細胞の初期割合に関係なく、ニコチンアミド処理培養物のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞（暗い陰影）の割合における劇的な増大およびＣＤ５６＋ＣＤ３＋ＮＫＴ細胞成分（明るい陰影）の低下に留意すること。
【００７４】
【図５】図５は、ニコチンアミドの非存在下（サイトカイン）または存在下で培養した後における、精製された骨髄ＣＤ５６＋細胞からのＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞表現型を呈示する細胞の増大した百分率を示すヒストグラムである。培養を、図４Ａおよび図４Ｂにおいて記載されるような骨髄由来の免疫磁石精製されたＣＤ５６＋細胞を用いて開始し、２．５ｍＭのニコチンアミドの存在下または非存在下、サイトカイン（Ｆｌｔ−３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）とともに３週間までの間維持した。１４日（明るい陰影）でのＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫの割合における増大が、コントロール（サイトカイン）におけるＣＤ５６＋ＣＤ１６＋細胞画分の低下と比較して、ニコチンアミド処理培養物では２１日（暗い陰影）でも依然として続くことに留意すること。
【００７５】
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａ−６Ｃは、骨髄ＮＫ細胞サブセットおよび骨髄ＮＫＴ細胞サブセットの増殖に対する、ニコチンアミドとの短期培養の影響を示すヒストグラムである。培養を、骨髄由来の免疫磁石精製されたＣＤ５６＋細胞を用いて開始し、サイトカイン（Ｆｌｔ−３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）とともに、ニコチンアミドの非存在下（サイトカイン）またはニコチンアミドの増大する濃度（「ＮＡＭ」、１ｍＭ、２．５ｍＭおよび５ｍＭ）の存在下で７日間維持し、表面マーカーに対する特異的抗体と反応させ、特定の表現型についてＦＡＣＳによって分析した。図６ＡはＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞集団のパーセントをニコチンアミドの関数として表し、図６ＢはＮＫＴ細胞ＣＤ５６＋ＣＤ３＋集団における低下を培養におけるニコチンアミドの関数として示し、図６ＣはＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞サブセットの増殖をニコチンアミドの関数として表す（いずれも、コントロール（サイトカイン）と比較して）。
【００７６】
【図７】図７は、増大する濃度（１．０ｍＭ〜５ｍＭ）のニコチンアミドの存在下で３週間培養される精製された臍帯血由来のＣＤ５６＋細胞の阻害性ＮＫ細胞ＣＤ５６＋／ＮＫＧ２Ａ＋サブセットにおける低下を示すヒストグラムである。免疫磁石精製された臍帯血由来のＣＤ５６＋細胞を、サイトカイン（Ｆｌｔ−３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）とともに、増大する濃度（１．０ｍＭ〜５ｍＭ）のニコチンアミド（「ＮＡＭ」）の存在下または非存在下（サイトカイン）で培養した。３週間後、細胞を表面マーカーに対する特異的抗体と反応させ、ＣＤ５６＋／ＮＫＧ２Ａ＋の表現型についてＦＡＣＳによって分析した。コントロール（サイトカイン）と比較して、ニコチンアミド処理培養物におけるＣＤ５６＋ＮＫＧ２Ａ＋細胞の劇的な低下により、ニコチンアミド暴露によるＮＫ細胞の高まった活性化が示唆される。
【００７７】
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａは、増大する濃度のニコチンアミドとともに培養される精製された臍帯血由来のＮＫ細胞の高まった遊走能を示すヒストグラムである。免疫磁石精製された臍帯血由来のＣＤ５６＋細胞を、サイトカイン（Ｆｌｔ−３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）とともに、２．５ｍＭまたは５ｍＭのニコチンアミドの非存在下（サイトカイン）または存在下で培養した。２週間後、細胞を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌアッセイにおいて２５０ｎｇ／ｍｌのＳＤＦに応答したエクスビボ遊走についてアッセイした。底部チャンバーにおける細胞をＦＡＣＳによって計数した。コントロール（サイトカイン）と比較して、ＳＤＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下（暗い陰影）および非存在下（明るい陰影）での高まった遊走により、ニコチンアミドによるＮＫ細胞の高まった運動性および方向性をもった遊走が示唆される。図８Ｂは、２．５ｍＭまたは５ｍＭのニコチンアミドの存在下で３週間培養される臍帯血由来のＣＤ５６＋細胞の表面における遊走受容体（ＣＸＣＲ４）、接着受容体（ＣＤ４９ｅ）および輸送受容体（ＣＤ６２Ｌ）の発現における増大を示す表である。培養を、免疫磁石ビーズで精製された臍帯血由来のＣＤ５６＋細胞を用いて開始し、サイトカイン（Ｆｌｔ−３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）とともに、または、サイトカインおよびニコチンアミド（２．５ｍＭおよび５ｍＭ）とともに維持した。３週間後、培養細胞を、指定された表面マーカーに対する特異的抗体と反応させ、その後、ＦＡＣＳによってモニターした。コントロール（サイトカインのみ）と比較して、ニコチンアミドの存在下で培養された細胞では、ＣＸＣＲ４およびＣＤ６２Ｌの劇的に高まった発現、ならびに、ＣＤ４９ｅの上昇した発現に留意すること。
【００７８】
【図９】図９は、増大する濃度のニコチンアミドとともに培養される臍帯血由来のＣＤ５６＋細胞の高まった殺傷能を示すヒストグラムである。免疫磁石ビーズで精製された臍帯血由来のＣＤ５６＋細胞を、２．５ｍＭのニコチンアミドの存在下（暗い陰影）または非存在下（明るい陰影）、サイトカイン（Ｆｌｔ−３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）とともに培養した。２週間後、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ分析は、すべての細胞がＣＤ５６＋／ＣＤ３−の表現型を有することを示した。臍帯血ＮＫ細胞を、５：１、１０：１および２０：１のＮＫ細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）で、アッセイあたり５×１０３個のＫ５６２標的細胞を用いてエクスビボ殺傷能についてアッセイした。Ｋ５６２細胞の死をＰＩ陽性のＣＦＳＥ標識細胞の百分率としてＦＡＣＳによってモニターした。コントロール（サイトカイン）、および、新鮮な、培養されていない臍帯血由来のＣＤ５６＋細胞（陰影なし）と比較して、高まった標的細胞殺傷により、ニコチンアミドによるＮＫ細胞殺傷能の高まった活性化が強く示唆される。
【００７９】
【図１０】図１０は、ニコチンアミドとの３週間の培養にわたるヒト末梢血ＮＫ細胞の拡大を例示するヒストグラムである。新鮮なユニットの単核細胞画分のＴ細胞（ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ１９＋）枯渇化［ＭｉｄｉＭＡＣＳ単離（ＭＡＣＳ分離カラム、カタログ番号１３０−０４２−９０１）またはＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ３＋細胞枯渇化カクテル（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＲｏｓｅｓｔｔｅＳｅｐ、カタログ番号１５６６１）］によって調製される末梢血ＮＫ細胞をＦＡＣＳ分析によって特徴づけし、示された濃度のニコチンアミド（ＮＡＭ  ２．５（明るい陰影）、および、ＮＡＭ  ５ｍＭ（暗い陰影））の存在下、ＶｕｅＬｉｆｅバッグで培養した。コントロール＝サイトカインのみ（ＮＡＭ  ０、陰影なし）。培養培地は、ＭＥＭα、ヒト血清（１０％ｖ／ｖ）およびサイトカイン（２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５および５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２、または、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２のみ）を含有した。培養体積を１週間後および２週間後に２倍にし、細胞を、７日後、１４日後および２１日後、ＦＡＣＳ分析のために計数し、染色した。サイトカインのみ（ＮＡＭ  ０）のコントロールは、時間とともに自己再生能を失う傾向を示す一方で、ニコチンアミドの存在下での大きく増大した拡大（０日目に対する増大倍数）に留意すること。
【００８０】
【図１１】図１１は、３週間の培養にわたるヒト末梢血ＮＫ細胞に対するニコチンアミドおよび播種密度の影響を示すヒストグラムである。末梢血ＮＫ細胞を、図１０において詳述されるような単核細胞のＴ細胞（ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ１９＋）枯渇化によって調製し、２×１０５細胞／ｍｌ、５×１０５細胞／ｍｌまたは１０×１０５細胞／ｍｌで、１０ｍｌをそれぞれの培養バッグに入れて播種した。その後、細胞を、示された濃度（ＮＡＭ  ２．５（明るい陰影）、および、ＮＡＭ  ５ｍＭ（暗い陰影））のニコチンアミド、または、サイトカインのみ（サイトカイン、陰影なし）の存在下で拡大した。ＮＫ細胞の増殖がニコチンアミドによって高まることがすべての播種密度で明白である。
【００８１】
【図１２】図１２は、ヒト末梢血ＮＫ細胞の２１日間の培養におけるＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞の百分率を示すヒストグラムである。末梢血ＮＫ細胞を、図１０において詳述されるような単核細胞のＴ細胞（ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ１９＋）枯渇化によって調製し、５×１０５細胞／ｍｌで、１０ｍｌをそれぞれの培養バッグに入れて播種した。その後、細胞を、示された濃度（ＮＡＭ  ２．５、および、ＮＡＭ  ５ｍＭ）のニコチンアミド、または、サイトカインのみ（サイトカイン）の存在下で拡大した。ＮＫ細胞の百分率が培養において２１日後のすべての群においてより大きかったとしても、ニコチンアミドにさらされた培養物では、ＮＫ百分率がコントロール培養物の場合よりも一層大きいことに留意すること。
【００８２】
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３Ａ−１３Ｂは、ニコチンアミドにさらされたヒト末梢血ＮＫ細胞の培養物における遊走受容体ＣＤ６２Ｌの増大した発現を示すヒストグラムである。末梢血ＮＫ細胞を、図１０において詳述されるような単核細胞のＴ細胞（ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ１９＋）枯渇化によって調製し、示された濃度（ＮＡＭ  ２．５、および、ＮＡＭ  ５ｍＭ）のニコチンアミド、または、サイトカインのみ（サイトカイン）の存在下で拡大した。７日後（１３Ａ）および１４日後（１３Ｂ）、培養細胞を、指定された表面マーカーに対する特異的抗体と反応させ、その後、ＦＡＣＳによってモニターした。コントロール（サイトカインのみ）と比較して、ニコチンアミドの存在下で培養された細胞では、ＣＤ６２Ｌの発現が劇的に高まり、暴露継続期間とともに増大したことに留意すること。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ニコチンアミドにさらされたヒト末梢血ＮＫ細胞の培養物における遊走受容体ＣＤ６２Ｌの増大した発現を示すヒストグラムである。末梢血ＮＫ細胞を、図１０において詳述されるような単核細胞のＴ細胞（ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ１９＋）枯渇化によって調製し、示された濃度（ＮＡＭ  ２．５、および、ＮＡＭ  ５ｍＭ）のニコチンアミド、または、サイトカインのみ（サイトカイン）の存在下で拡大した。２１日後（１３Ｃ）、培養細胞を、指定された表面マーカーに対する特異的抗体と反応させ、その後、ＦＡＣＳによってモニターした。コントロール（サイトカインのみ）と比較して、ニコチンアミドの存在下で培養された細胞では、ＣＤ６２Ｌの発現が劇的に高まり、暴露継続期間とともに増大したことに留意すること。
【００８３】
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａ−１４Ｂは、ニコチンアミドにさらされたヒト末梢血ＮＫ細胞の培養物における単球および顆粒球の増殖の阻害を示すヒストグラムである。末梢血ＮＫ細胞を、図１０において詳述されるような単核細胞のＴ細胞（ＣＤ３＋またはＣＤ３＋ＣＤ１９＋）枯渇化によって調製し、示された濃度（ＮＡＭ  ２．５、および、ＮＡＭ  ５ｍＭ）のニコチンアミド、または、サイトカインのみ（サイトカイン）の存在下で拡大した。２週間後、培養細胞を単球マーカーＣＤ１４（図１４Ａ）または顆粒球マーカーＣＤ１５（図１４Ｂ）に対する特異的抗体と反応させ、その後、ＦＡＣＳによってモニターした。コントロール（サイトカインのみ）と比較して、ニコチンアミドの存在下で培養された細胞でのＣＤ１４＋細胞またはＣＤ１５＋細胞における劇的に高まった低下に留意すること。
【００８４】
【図１５Ａ−１５Ｄ】図１５Ａ−１５Ｄは、ニコチンアミドにさらされたヒト末梢血ＮＫ細胞のニコチンアミドとともに培養されたＮＫ細胞の高まった殺傷能を例示するヒストグラムである。末梢血ＮＫ細胞を、図１０において詳述されるような単核細胞のＣＤ３＋枯渇化またはＣＤ３＋ＣＤ１９＋枯渇化によって調製し、示された濃度（ＮＡＭ  ２．５（明るい陰影）のニコチンアミド、および、ＮＡＭ  ５ｍＭ（暗い陰影））、または、サイトカインのみ（サイトカイン、陰影なし）の存在下で拡大した。末梢血ＮＫ細胞を、示されるように、Ｋ５６２またはＢＬ２の標的細胞（１５Ａ）、初代二形質性白血病の標的細胞（１５Ｂおよび１５Ｃ）およびＣｏｌｏ２０５結腸ガンの標的細胞（１５Ｄ）を、１：１、２．５：１、５：１または１０：１のＮＫ細胞対標的細胞のＥ：Ｔ比率で用いてエクスビボ殺傷能についてアッセイした。細胞株の標的細胞の死をＰＩ陽性およびＣＦＳＥ陽性の二重標識細胞の百分率としてＦＡＣＳによってモニターした。初代白血病の標的細胞の死をＣＦＳＥ標識された標的細胞の百分率における低下としてＦＡＣＳによってモニターした。培養されたコントロール（サイトカインのみ、ＮＡＭ  ０、陰影なし）、および、新鮮な、培養されていないＮＫ細胞（コントロール、斜線）と比較して、高まった標的細胞殺傷により、ニコチンアミドによるＮＫ細胞殺傷能の高まった活性化が強く示唆される。
【００８５】
【図１６】図１６は、ニコチンアミドの存在下で拡大されたＮＫ細胞の増大したインビボ機能性（ホーミングおよび生着）を示すヒストグラムである。末梢血ＮＫ細胞を、図１０において詳述されるような単核細胞のＣＤ３＋枯渇化またはＣＤ３＋ＣＤ１９＋枯渇化によって調製し、示された濃度（２．５ｍＭ  ＮＡＭ、明るい陰影；５ｍＭ  ＮＡＭ、暗い陰影）のニコチンアミド、または、サイトカインのみ（ＮＡＭ  ０、陰影なし）の存在下で拡大した。培養において２週間〜３週間の後、それぞれの実験群からの１５×１０６個のＮＫ細胞を放射線照射（３５０Ｒａｄ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注入した。マウスを注入後４日で屠殺し、脾臓、骨髄および末梢血からのサンプルをヒトＮＫ（ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋）細胞の生着について分析した。ニコチンアミドを伴うことなく培養されたＮＫ細胞のインビボでのホーミング／保持／生着と比較して、ニコチンアミドとともに培養されたＮＫ細胞の著しくより大きいインビボでのホーミング／保持／生着に留意すること。
【００８６】
【図１７】図１７は、ニコチンアミドの非存在下（サイトカイン）または増大する濃度（ＮＡＭ  １ｍＭ〜７．５ｍＭ）のニコチンアミドの存在下で培養されるときの、臍帯血由来のＣＤ５６＋の精製されたＮＫ細胞画分の用量依存的増殖を示すヒストグラムである。培養を、ＣＤ５６＋表現型について免疫磁石ビーズで精製された臍帯血ＮＫ細胞を用いて開始し、サイトカイン（Ｆｌｔ−３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）とともに３週間までの間維持した。図１７は、培養における７日（陰影なし）、１４日（明るい陰影）および２１日（暗い陰影）でのＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増殖（０日目（培養開始）に対する増大倍数）を示す。コントロール（サイトカイン）と比較して、ニコチンアミド処理培養物の拡大における劇的な用量依存的増大が全培養期間を通して続くことに留意すること。
【００８７】
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａ−１８Ｂは、部分的にＣＤ３が枯渇化された末梢血を用いて開始され、ニコチンアミドの非存在下（サイトカイン、０  ＮＡＭ、陰影なし）または存在下で維持される培養物におけるＴ（ＣＤ３＋）細胞およびＮＫＴ（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋）細胞の増殖の阻害を示す。培養物を、増大する濃度（２．５、暗い陰影；５ｍＭ、明るい陰影；および７．５ｍＭ、非常に明るい陰影）のニコチンアミドの存在下または非存在下、サイトカイン（Ｆｌｔ−３、ＩＬ−１５およびＩＬ−２を含む）とともに３週間維持し、表面マーカー（５６ＦＩＴＣおよび３ＡＰＣ）に対する特異的抗体と反応させ、特定の表現型についてＦＡＣＳによって分析した（１８Ｂ）。ニコチンアミドにさらされたＮＫ培養物におけるＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞の劇的な低下に留意すること。
【００８８】
【図１９Ａ−１９Ｂ】図１９Ａ−１９Ｂは、ニコチンアミドによるＣＤ６２Ｌ輸送受容体発現の強化を示す。図１９Ａは、サイトカインのみのコントロール（０「ＮＡＭ」、陰影なし）と比較して、２．５ｍＭ（明るい陰影）および５ｍＭ（暗い陰影）のニコチンアミドでの３週間の培養のためにさらされるＩＬ−２との培養における活性化の前（非常に明るい陰影）および活性化の後での、末梢血から精製されたＣＤ５６＋細胞の表面におけるＣＤ６２Ｌ輸送受容体発現レベルを示すヒストグラムである。図１９Ｂは、（２．５ｍＭ〜７．５ｍＭの）ニコチンアミドまたはコントロール（ＮＡＭ  ０）において３週間培養される精製された末梢血ＣＤ５６＋細胞の表面におけるＣＤ６２Ｌ発現のＦＡＣＳ分析である。コントロール（サイトカインのみ）と比較して、ニコチンアミドの存在下で培養された細胞におけるＣＤ６２Ｌの劇的に高まった発現に留意すること。
【００８９】
【図２０】図２０は、ＣＤ３枯渇化、それに続いて、ＣＤ５６＋細胞の選択によって末梢血由来の単核細胞画分から精製されたＣＤ５６＋細胞の増殖（増大倍数）に対するニコチンアミドの影響を示すヒストグラムである。精製されたＣＤ５６＋細胞を、培養（ニコチンアミド（２．５ｍＭおよび５ｍＭ）を伴って、または伴うことなく、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＦｌｔ−３）において、また、同じ血液ユニットからの末梢血単核細胞に由来する放射線照射された間質とともに播種した（Ｃｙｔ＋Ｉｒｒ、ＮＡＭ  ２．５＋Ｉｒｒ、および、ＮＡＭ  ５＋Ｉｒｒ）。放射線照射された末梢血細胞と、ＣＤ５６＋選択細胞との比率が１０：１であった。コントロール（サイトカインのみ）と比較して、ニコチンアミドにより処理された場合における劇的に高まった増殖に留意すること。
【００９０】
【図２１】図２１は、図２０において記載されるように、サイトカインおよび放射線照射された間質細胞により処理された培養物におけるＣＤ５６＋細胞の表面におけるＣＸＣＲ４の発現に対するニコチンアミドの影響を示すヒストグラムである。
【００９１】
【図２２】図２２は、図２０において記載されるように、サイトカインおよび放射線照射された間質細胞により処理された培養物におけるＣＤ５６＋細胞の表面におけるＣＤ６２Ｌの発現に対するニコチンアミドによる培養の影響を示すヒストグラムである。
【００９２】
【図２３】図２３は、１：１、２．５：１および５：１のＣＤ５６＋細胞対標的細胞のＥ：Ｔ比率における、Ｋ５６２標的細胞のＣＤ５６＋細胞エクスビボ殺傷能に対するニコチンアミドとの培養の影響を示すヒストグラムである。標的細胞の死を、ＰＩ陽性のＣＦＳＥ標識されたＫ５６２細胞の百分率としてＦＡＣＳによってモニターした。コントロール（サイトカインのみ、ＮＡＭ  ０＋Ｉｒｒ、陰影なし）と比較して、細胞が示された濃度（ＮＡＭ  ２．５＋Ｉｒｒ、明るい陰影；ＮＡＭ  ５＋Ｉｒｒ、暗い陰影）のニコチンアミドで培養された場合の高まった標的細胞殺傷により、放射線照射された細胞の影響に関連づけられない、ニコチンアミドによるＮＫ細胞殺傷能の高まった活性化が強く示唆される。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を生長させ、一方、同時に、当該細胞の機能をエクスビボおよび／またはインビボにおいて維持または強化する方法に関する。１つの実施形態において、ＮＫ細胞をニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分ならびにＮＫ細胞増殖因子とともにエクスビボ培養することにより、機能的なＮＫ細胞の生長させられた集団を含み、ただし、ＣＤ３＋細胞の増殖が阻害され、一方、ＮＫ細胞の増殖が優先的に高められる治療用のエクスビボ培養された細胞調製物として使用されるＮＫ細胞集団の製造が容易になる。具体的にはこの点に関して、本発明は、機能的なＮＫ細胞のロバストな集団を提供するために使用することができ、そのような集団は、ガンおよび他の疾患を処置するための細胞移植片における適用、および、細胞遺伝子治療のために使用され得る、遺伝子操作に好適なＮＫ細胞の作製における適用のために使用することができる。さらなる、限定されない適用には、移植片対宿主病の処置（例えば、骨髄再建において）、同種由来および自己由来の養子免疫療法、自己免疫疾患の処置、感作剤と、ＮＫ細胞における遺伝子移入とを伴う混合療法が含まれ得る。本発明はさらに、輸血のために有用なＮＫ細胞調製物、および、そのようなＮＫ細胞調製物を調製するための製造物に関連する。
【００９４】
本発明の原理および操作が、実施例および付随する説明を参照してより良く理解され得る。
【００９５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、または実施例において例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【００９６】
ナチュラルキラー細胞（以降、これはまた「ＮＫ」細胞と略記される）は、免疫反応に関与するリンパ系細胞である。これらの細胞は様々な機能を有しており（とりわけ、腫瘍細胞、発ガン性形質転換を受けている細胞、および、他の異常な細胞を生体内において殺すこと）、また、生来的な免疫学的監視機構の重要な構成成分である。ＮＫ細胞は、自発的なＭＨＣ非拘束の細胞傷害活性をウイルス感染細胞および腫瘍細胞に対して示し、ウイルス感染およびガン発達に対する抵抗性をインビボにおいて媒介する。したがって、ＮＫ細胞の数を効果的に増大させるための方法は、腫瘍の処置、および、腫瘍発生の潜在的起源であると見なされるウイルス感染細胞の排除のために有用であり得る。
【００９７】
したがって、生長可能なＮＫ細胞の数を効果的に拡大し、かつ、リンパ節にホーミングするそれらの機能および可能性、ならびに、それらの恒常的増殖を注入後のインビボにおいて高めるための臨床規格のプロトコル（例えば、間質層非含有、最小限のサイトカイン）を開発することにより、固形腫瘍、造血系悪性腫瘍、ウイルス性障害および自己免疫性障害などを処置するための、ＮＫ細胞を用いた養子免疫療法の成功が改善され得ると考えられる。
【００９８】
本発明は、ＮＫ細胞を、培養期間中、本明細書中にさらに詳述されるように特定の濃度を超えるニコチンアミドにエクスビボで暴露することにより、機能適確なＮＫ細胞の増殖および／または機能性が効果的に高められ、培養物のＴ細胞画分における著しい減少がもたらされるという発見に基づく。そのようなものとして、その１つの実施形態において、本発明は、機能的に成熟しているＮＫ細胞の増殖および／または機能を、非ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３＋）の増殖を同時に誘導することなく、エクスビボおよびインビトロにおいて効率的に誘導することができる臨床的に適切な培養条件を提供する。
【００９９】
したがって、本発明の１つの実施形態の１つの局面によれば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をエクスビボ培養する方法が提供され、この場合、この方法は、ＮＫ細胞を含む細胞の集団を、少なくとも１つの増殖因子、ならびに、効果的な濃度、効果的な暴露時期および効果的な暴露継続期間のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養することを含み、ただし、ＮＫ細胞を、少なくとも１つの増殖因子、ならびに、効果的な濃度、効果的な暴露時期および効果的な暴露継続期間のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養することにより、下記の少なくとも１つがもたらされる：
（ａ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌの上昇した発現；
（ｂ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞と比較して、上昇した遊走応答；
（ｃ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞と比較して、上昇したホーミングおよびインビボ保持；
（ｄ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞と比較して、より大きい増殖；および
（ｅ）他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞と比較して、増大した細胞傷害活性。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の用語は、生来的免疫応答に関与する大きい顆粒リンパ球を示す。機能的には、ＮＫ細胞は、細胞傷害活性を、様々なタンパク質（パーフォリンおよびグランザイムプロテアーゼを含む）を含有する細胞質顆粒のエキソサイトーシスにより様々な標的に対して示す。殺傷が、抗原への事前の感作を必要としない接触依存的な非貪食性プロセスで誘発される。ヒトのＮＫ細胞が、細胞表面マーカーであるＣＤ１６およびＣＤ５６の存在、ならびに、Ｔ細胞受容体（ＣＤ３）の非存在によって特徴づけられる。ヒトの骨髄由来ＮＫ細胞はさらに、Ｔ細胞受容体ゼータ鎖［ゼータ（ζ）−ＴＣＲ］をさらに含有するので、ＣＤ２＋ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＣＤ３−の表現型によって特徴づけられ、また、多くの場合、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０またはＮＫｐ４４によって特徴づけられる。非ＮＫ細胞、例えば、ＮＫＴ細胞またはＣＤ８ＮＫＴなどは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方の特徴および細胞表面マーカーを有する。１つの実施形態において、本発明の方法は、成熟ＮＫ細胞を細胞の集団からエクスビボ生長させるために用いられる。本明細書中で使用される場合、用語「成熟ＮＫ細胞」は、特徴的な表面マーカーおよびＮＫ細胞機能を有し、かつ、さらなる分化のための能力を有しない系譜決定されたＮＫ細胞として定義される。本明細書中で使用される場合、成熟ＮＫ細胞には、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞（これは増殖し、多量のサイトカインを産生することができる）、ＣＤ５６ｄｉｍ細胞（これは、ロバストな細胞傷害性を示す）、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ９４ｈｉｇｈ細胞およびＣＤ５６ｄｉｍＣＤ９４ｈｉｇｈ細胞が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、ＮＫ始原体細胞、または、ＮＫ始原体細胞および成熟ＮＫ細胞の混合集団が生長させられる。ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ９４および他のマーカーの細胞表面発現を、例えば、ＦＡＣＳ分析または免疫組織学的染色技術により明らかにすることができる。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、用語「始原体」は、１つまたは複数の成熟エフェクター細胞に分裂すること、および／あるいは、１つまたは複数の成熟エフェクター細胞への分化を受けることができる未成熟な細胞を示す。リンパ球始原体には、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＮＫの各系譜の成熟細胞を生じさせることができる多能性造血幹細胞が含まれる。Ｂ細胞系譜において（すなわち、成熟Ｂ細胞を生じさせる発達経路において）、始原体細胞にはまた、免疫グロブリン遺伝子の再編成および発現によって特徴づけられるプロＢ細胞およびプレＢ細胞が含まれる。Ｔ細胞およびＮＫ細胞の系譜において、始原体細胞にはまた、骨髄由来の両能性のＴ／ＮＫ細胞始原体［例えば、ＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（ｈｉ）ＣＤ７（＋）細胞およびＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（ｈｉ）Ｌｉｎ（−）ＣＤ１０（＋）細胞］、同様にまた、胸腺内の始原体細胞（これには、二重陰性（ＣＤ４およびＣＤ８に関して）および二重陽性の胸腺細胞（Ｔ細胞系譜）、ならびに、系譜決定されたＮＫ細胞始原体が含まれる）が含まれる。造血始原体には、ＣＤ３４＋および初期始原体（例えば、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞およびＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞など）が含まれる。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、用語「エクスビボ」は、細胞が生体から取り出され、当該生物の体外（例えば、試験管）で生長させられるプロセスを示す。本明細書中で使用される場合、用語「インビトロ」は、インビトロでのみ生長することが知られている細胞（例えば、様々な細胞株など）が培養されるプロセスを示す。
【０１０３】
ＮＫ細胞のエクスビボ拡大を、本発明のこの局面によれば、ＮＫ細胞に細胞増殖のための条件をエクスビボで与え、ＮＫ細胞をニコチンアミド成分とともにエクスビボ培養し、それにより、ＮＫ細胞の当該集団をエクスビボ生長させることによって行うことができる。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、「培養する」には、ＮＫ細胞の維持のために要求される化学的条件および物理的条件（例えば、温度、ガス）、ならびに、増殖因子を与えることが含まれる。１つの実施形態において、ＮＫ細胞を培養することには、ＮＫ細胞に増殖のための条件を与えることが含まれる。ＮＫ細胞の増殖を支援し得る化学的条件の例には、典型的には成長培地（すなわち、培養培地）で与えられる緩衝液、栄養分、血清、ビタミンおよび抗生物質、同様にまた、サイトカインおよび他の増殖因子が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、ＮＫ培養培地には、１０％のＦＣＳを含むＭＥＭα、または、５％のヒト血清／ＬｉｆｏｒＣｅｌｌ（登録商標）ＦＢＳ代替物（Ｌｉｆｅｂｌｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を含むＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ（Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｉｘ）が含まれる。本発明との使用のために好適な他の培地には、Ｇｌａｓｃｏｗ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｂａｄ、ＣＡ）、ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）が含まれるが、これらに限定されない。これらの培養培地の多くがニコチンアミドをビタミン補充物として含有することに気づくであろう（例えば、ＭＥＭα（８．１９μＭのニコチンアミド）、ＲＰＭＩ（８．１９μＭのニコチンアミド）、ＤＭＥＭ（３２．７８μＭのニコチンアミド）およびＧｌａｓｃｏｗ培地（１６．３９μＭのニコチンアミド））。しかしながら、本発明の方法は、培地の処方に含まれる何らかのニコチンアミドおよび／またはニコチンアミド成分を補う外部添加されたニコチンアミド、あるいは、培地成分濃度の全体的調節に起因する外部添加されたニコチンアミドに関連する。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞を増殖因子とともに培養することは、当該細胞に、栄養分と、少なくとも１つの増殖因子とを与えることを含む。いくつかの実施形態において、そのような少なくとも１つの増殖因子には、サイトカインおよび／またはケモカインが含まれ、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）およびインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）など（これらに限定されない）が含まれる。他のサイトカインおよび増殖因子の使用が意図される（例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αなどの添加）。サイトカインおよび他の増殖因子が典型的には、０．５ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌにまで及ぶ濃度で、または、１．０ｎｇ／ｍｌから８０ｎｇ／ｍｌにまで及ぶ濃度で与えられ、より典型的には、５ｎｇ／ｍｌから７５０ｎｇ／ｍｌにまで及ぶ濃度で、さらにより典型的には、５．０ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌにまで及ぶ濃度で与えられる（１０倍までのそのような濃度が意図され得る）。サイトカインおよび他の増殖因子が、例えば、Ｐｅｒｐｏ  Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）から市販されている。１つの実施形態において、上記少なくとも１つの増殖因子はＩＬ−２である。別の実施形態において、上記増殖因子はＩＬ−１５である。さらに別の実施形態において、ＮＫ細胞がＩＬ−２およびＩＬ−１５とともに培養される。
【０１０６】
さらに、新規なサイトカインが途切れることなく発見され、そのうちのいくつかは本発明のＮＫ細胞増殖の方法において使用が見出されるかもしれないことが、これに関連して理解される。細胞がヒト対象に導入（または再導入）される適用については、血清非含有配合物、例えば、リンパ球培養のためのＡＩＭ  Ｖ．（登録商標）血清非含有培地、または、ＭＡＲＲＯＷＭＡＸ．（登録商標）骨髄培地などを使用することが多くの場合、好ましい。そのような培地配合物および補充物が商業的供給源から入手可能である（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＧＩＢＣＯ）（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ）など）。培養には、最適な生存性、増殖、機能性および／または生存を促進させるために、アミノ酸、抗生物質および／またはサイトカインが補充される。
【０１０７】
１つの実施形態によれば、細胞は、増殖因子ならびにニコチンアミドおよび／またはニコチンアミド成分とともに培養される。本明細書中で使用される場合、用語「ニコチンアミド成分」は、ニコチンアミド、同様にまた、ＮＫ細胞の増殖および／または活性化を効果的かつ優先的に高めることができる、ニコチンアミド、その誘導体、アナログおよび代謝産物に由来する生成物（例えば、ＮＡＤ、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨなど）を示す。ニコチンアミドの誘導体、アナログおよび代謝産物を、本明細書中下記のように維持されるＮＫ培養物に加えることによって、または、機能的アッセイ（例えば、殺傷アッセイおよび運動性アッセイ（実施例の節を参照のこと）など）によって、または、この分野では広く知られているハイ・スループット・アッセイのために設計される自動化されたスクリーニングプロトコルにおいて、培養におけるエクスビボＮＫ増殖に対するそれらの影響についてスクリーニングし、評価することができる。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、表現「ニコチンアミドアナログ」は、上記アッセイまたは類似したアッセイにおいてニコチンアミドと同様に作用することが知られている分子であれば、どのようなものも示す。ニコチンアミドアナログの代表的な例には、限定されないが、ベンズアミド、ニコチンチオアミド（ニコチンアミドのチオールアナログ）、ニコチン酸およびα−アミノ−３−インドールプロピオン酸が含まれ得る。
【０１０９】
表現「ニコチンアミド誘導体」はさらに、ニコチンアミド自体の、または、ニコチンアミドのアナログの構造的誘導体であれば、どのようなものも示す。そのような誘導体の例には、限定されないが、置換されたベンズアミド化合物、置換されたニコチンアミド化合物およびニコチンチオアミド化合物、ならびに、Ｎ−置換されたニコチンアミド化合物およびニコチンチオアミド化合物、３−アセチルピリジンおよびニコチン酸ナトリウムが含まれる。本発明の１つの具体的な実施形態において、ニコチンアミド成分はニコチンアミドである。
【０１１０】
本明細書中で使用される場合、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分の、表現「効果的な濃度」は、培養におけるニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分への効果的な暴露継続期間にわたって、かつ、培養におけるニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分への効果的な暴露時期で、培養されているＮＫ細胞の集団に与えられるとき、当該ＮＫ細胞のＣＤ６２Ｌの上昇した発現、上昇した遊走応答、上昇したホーミングおよびインビボ保持、より大きい増殖および増大した細胞傷害活性のうちの１つまたは複数が、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分を伴うことを除いて同一条件のもとで培養されたＮＫ細胞と比較してもたらされるニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分のそのような濃度として定義される。本発明のいくつかの実施形態における使用のために好適なニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分の濃度は典型的には、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１．０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約５．０ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲である。下記の実施例Ｉ〜ＶＩＩは、ニコチンアミド成分（ニコチンアミド）の例示的な効果的な濃度が、増殖およびＮＫ細胞の機能に対するニコチンアミドのこれらの濃度の影響に基づいて約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭであり、典型的には２．５ｍＭまたは５．０ｍＭであることを明らかにする。本発明のいくつかの実施形態によれば、約０．５ｍＭ、約０．７５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．２５ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．７５ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．２５ｍＭ、約２．５ｍＭ、約２．７５ｍＭ、約３．０ｍＭ、約３．２５ｍＭ、約３．５ｍＭ、約３．７５ｍＭ、約４．０ｍＭ、約４．２５ｍＭ、約４．５ｍＭ、約４．７５ｍＭ、約５．０ｍＭ、約５．２５ｍＭ、約５．５ｍＭ、約５．７５ｍＭ、約６．０ｍＭ、約６．２５ｍＭ、約６．５ｍＭ、約６．７５ｍＭ、約７．０ｍＭ、約７．２５ｍＭ、約７．５ｍＭ、約７．７５ｍＭ、約８．０ｍＭ、約８．２５ｍＭ、約８．５ｍＭ、約８．７５ｍＭ、約９．０ｍＭ、約９．２５ｍＭ、約９．５ｍＭ、約９．７５ｍＭ、約１０．０ｍＭ、約１１．０ｍＭ、約１２．０ｍＭ、約１３．０ｍＭ、約１４．０ｍＭ、約１５．０ｍＭ、約１６．０ｍＭ、約１７．０ｍＭ、約１８．０ｍＭおよび約２０．０ｍＭの範囲（ｍＭ）におけるニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分の濃度、ならびに、すべての効果的な中間の濃度が意図される。
【０１１１】
ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分の効果的な濃度を、ＮＫの増殖および／または活性の任意のアッセイに従って、例えば、下記の実施例Ｉ〜ＶＩにおいて詳述されるような細胞培養プロトコルまたは細胞機能プロトコルに従って求めることができる。１つの実施形態によれば、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分の効果的な濃度は、培養におけるその使用が、同じアッセイにおいて、かつ、類似する培養条件（ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分への暴露継続期間、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分への暴露時期）のもとで、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分を有し、かつ、同じ臍帯血調製物、骨髄調製物または末梢血調製物から試験される「コントロール」培養と比較して、培養されているＮＫ細胞の増殖および／または機能を「高める」か、あるいは、培養されているＮＫ細胞の増殖および／または機能の正味の増大をもたらす濃度である。
【０１１２】
本明細書中で使用される場合、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分へのＮＫ細胞の暴露の、表現「効果的な継続期間」は、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分が、培養されているＮＫ細胞の集団に、効果的な濃度で、かつ、効果的な暴露時期で与えられるとき、当該ＮＫ細胞のＣＤ６２Ｌの上昇した発現、上昇した遊走応答、上昇したホーミングおよびインビボ保持、より大きい増殖および増大した細胞傷害活性のうちの１つまたは複数が、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分を伴うことを除いて同一条件のもとで培養されたＮＫ細胞と比較してもたらされるニコチンアミドに対する暴露のそのような継続期間として定義される。本発明のいくつかの実施形態における使用のために好適な、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分へのＮＫ細胞集団の暴露継続期間は典型的には、約２時間〜約５週間、約３０時間〜約４週間、約２日〜約３週間、約１週間、約２週間、約３週間の範囲である。下記の実施例Ｉ〜ＩＶは、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分への例示的に効果的な暴露継続期間が、増殖およびＮＫ細胞の機能に対するニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分への暴露の影響に基づいて約１週間〜約３週間であることを明らかにする。本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分への暴露継続期間が、約１．０日、約２．０日、約２．５日、約３．０日、約３．５日、約４．０日、約４．５日、約５．０日、約６．０日、約７．０日、約８．０日、約９．０日、約１０．０日、約１１．０日、約１２．０日、約１３．０日、約１４．０日、約１５．０日、約１６．０日、約１７．０日、約１８．０日、約１９．０日、約２０．０日、約２１．０日、約２５日、約３０日、約３５日であり、また、すべての効果的な中間の継続期間が意図される。ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分への効果的な暴露継続期間を、ＮＫの増殖および／または活性の任意のアッセイに従って、例えば、下記の実施例Ｉ〜ＶＩにおいて詳述されるような細胞培養プロトコルまたは細胞機能プロトコルに従って求めることができる。
【０１１３】
ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分へのＮＫ細胞集団の暴露は細胞培養の確立とともに開始され得るか、または、細胞培養期間中の任意の時間で、それどころか、ＮＫ細胞の使用（例えば、注入）の直前の短い継続期間にわたってでさえ、開始され得ることが理解される。本明細書中で使用される場合、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分へのＮＫ細胞集団の、表現「効果的な暴露時期」は、ＮＫ集団の培養期間中において、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分が、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分の効果的な濃度で、かつ、効果的な継続期間にわたってＮＫ細胞の集団に与えられ、その結果、当該ＮＫ細胞のＣＤ６２Ｌの上昇した発現、上昇した遊走応答、上昇したホーミングおよびインビボ保持、より大きい増殖および増大した細胞傷害活性のうちの１つまたは複数が、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分を伴うことを除いて同一条件のもとで培養されたＮＫ細胞と比較してもたらされる時間として定義される。本発明のいくつかの実施形態のために好適な、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分へのＮＫ細胞集団の暴露時期は典型的には、ＮＫ細胞の播種から培養後の約５時間まで、播種後の約１時間から培養後の約３週間まで、約２４時間から培養後の約３週間まで、および、培養におけるＮＫ細胞集団の播種時からである。本発明のいくつかの実施形態によれば、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分へのＮＫ細胞の暴露時期は、播種時、細胞播種後の約２時間、細胞播種後の約１２時間、細胞播種後の約２４時間、細胞播種後の約２日、細胞播種後の約４日、細胞播種後の約７日、細胞播種後の約８．０日、約９．０日、約１０．０日、約１１．０日、約１２．０日、約１３．０日、約１４．０日、約１５．０日、約１６．０日、約１７．０日、約１８．０日、約１９．０日、約２０．０日、約２１．０日、約２５日、約３０日、約３５日であり、また、すべての効果的な中間の時期が意図される。ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分への効果的な暴露時期を、ＮＫの増殖および／または活性の任意のアッセイに従って、例えば、本明細書中において、例えば、本明細書中下記の実施例Ｉ〜ＶＩにおいて詳述されるような細胞培養プロトコルまたは細胞機能プロトコルに従って求めることができる。
【０１１４】
下記の実施例の節において詳述されるように、ＮＫ細胞集団を、少なくとも１つの増殖因子、ならびに、効果的な暴露時期で、効果的な暴露継続期間にわたって与えられる効果的な濃度のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養することにより、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分での同一条件のもとで培養されたＮＫ細胞と比較された場合、培養細胞の高まった増殖および／または高まったＮＫ細胞機能の少なくとも１つがもたらされる。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、用語「生長」または用語「増殖」は、成長（例えば、細胞成長）、および、細胞数の増加を示す。生長および増殖は、本明細書中で使用される場合、インキュベーション期間の期間中に生じるＮＫ細胞の増大した数に関連する。ＮＫ細胞の表現型を呈示する細胞のインビトロまたはインビボでの生長は、そのような細胞が、例えば、ＩＬ−２、および、エプスタイン・バールウイルス形質転換のリンパ芽球様系統などにより刺激された後における既知の現象である。
【０１１６】
この分野では広く知られている、細胞増殖についてのアッセイには、クローン産生アッセイ（このアッセイでは、細胞が低密度で播種され、成長させられる）、および、コロニー計数、機械的アッセイ［フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ（商標））、ヨウ化プロピジウム］（これは細胞の数を機械的に測定する）、代謝アッセイ（例えば、テトラゾリウム塩（例えば、ＸＴＴ、ＭＴＴなど）の取り込みなど）（これは生細胞の数を測定する）、直接の増殖アッセイ（例えば、ＢＵｄＲ、チミジンの取り込みなど）（これは成長中の集団のＤＮＡ合成を測定する）が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、本発明に従って効果的な濃度のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されるＮＫ細胞の集団の細胞増殖が、培養におけるＮＫ細胞播種後の所定の時間（例えば、約１０時間、１２時間、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、２ヶ月またはそれ以上）で測定され、当該集団のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞画分を特定および定量するために抗ＣＤ５６マーカーおよび抗ＣＤ３マーカーを使用してＦＡＣＳ分析によって求められる。ＮＫ細胞の増殖を、培養前の元のＮＫ細胞画分と比較して、ＮＫ細胞の増大倍数（例えば、拡大または拡大倍数）として表すことができる。いくつかの実施形態において、本発明に従って効果的な濃度のニコチンアミドにさらされたＮＫ細胞の集団は、当該ＮＫ細胞集団の増大倍数が、約５日、約７日、約１２日、約１４日、約１８日、約２１日、約２５日、約３０日またはそれ以上の培養の後では少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２５０倍および少なくとも５００倍またはそれ以上である。別の実施形態において、効果的な濃度のニコチンアミドにさらされたＮＫ細胞の集団の拡大倍数は、ＦＡＣＳ（商標）によって求められる場合、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分を伴う同一条件で培養されたＮＫ細胞の拡大倍数の少なくとも約１．２倍、約１．３倍、約１．５倍、約１．７５倍、約２倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３．０倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍またはそれ以上である。
【０１１７】
本明細書中で使用される場合、用語「機能」または用語「ＮＫ細胞（の）機能」は、ＮＫ細胞に帰する生物学的機能であれば、どのようなものも示す。ＮＫ細胞機能の限定されない列挙には、例えば、細胞傷害性、アポトーシスの誘導、細胞運動性、方向づけられた遊走、サイトカインおよび他の細胞シグナルの応答、サイトカイン／ケモカインの産生および分泌、活性化細胞表面分子および阻害性細胞表面分子のインビトロでの発現、移植を受けた宿主における細胞のホーミングおよび生着（インビボ保持）、ならびに、疾患または疾患プロセスのインビボでの変化が含まれる。いくつかの実施形態において、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分への暴露によって高められるＮＫ細胞機能には、当該ＮＫ細胞のＣＤ６２Ｌ表面マーカーの上昇した発現、上昇した遊走応答、および、より大きい細胞傷害活性、ならびに、注入されたＮＫ細胞の上昇したホーミングおよびインビボ保持のうちの少なくとも１つが含まれる。
【０１１８】
移植における細胞のホーミング／生着および保持のために重要である接着分子および遊走分子（例えば、ＣＤ６２Ｌ、ＣＸＣＲ−４およびＣＤ４９ｅなど）についてのアッセイが、この分野では広く知られている。細胞におけるＣＤ６２Ｌ発現を、例えば、フローサイトメトリー、免疫検出、定量的ｃＤＮＡ増幅およびハイブリダイゼーションなどによってアッセイすることができる。１つの実施形態において、ＣＤ６２Ｌの発現が、細胞を蛍光標識された特異的な抗ヒトＣＤ６２Ｌモノクローナル抗体［例えば、ＣＤ６２Ｌ  ＰＥ、カタログ番号３０４８０６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）］にさらし、細胞を蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって分取することによってＮＫ細胞の種々の集団において検出される。いくつかの実施形態において、効果的な濃度のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分にさらされたＮＫ細胞の集団は、ＦＡＣＳ（商標）によって求められるように、検出された細胞の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％またはそれ以上がＣＤ６２Ｌを発現する。別の実施形態において、本発明に従ってニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分にさらされたＮＫ細胞の集団は、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分を伴う同一条件で培養されたＮＫ細胞と比較されるとき、ＦＡＣＳ（商標）によって求められるように、少なくとも約１．２倍、約１．３倍、約１．５倍、約１．７５倍、約２倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３．０倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍またはそれ以上のＣＤ６２Ｌの発現を有する。
【０１１９】
細胞遊走についてのアッセイがこの分野では広く知られている。細胞の遊走を、例えば、移行アッセイまたは隙間閉鎖アッセイによってアッセイすることができる。移行アッセイ、例えば、ツー・チャンバー技術などでは、細胞が、バリア（例えば、フィルター）によって刺激から隔てられ、細胞の遊走が、元のところからの細胞の喪失、バリアを越えた細胞の蓄積、または、両方を特定の間隔で計数することによって検出される。隙間閉鎖アッセイでは、細胞が、目に見える隙間（刻み目をつけた寒天平板、円の周りなど）の周囲に置かれ、刺激とともにインキュベーションされる。刺激に対する応答における、細胞の運動性によって加えられる細胞間の空間の閉鎖が、細胞数測定、免疫検出、顕微鏡／形態計測学などを使用して可視化される。１つの実施形態において、ＮＫ細胞の種々の集団の遊走能が、ＳＤＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）に対する応答での「Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ」（商標）移行アッセイによって求められる。いくつかの実施形態において、本発明に従って効果的な濃度のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分にさらされたＮＫ細胞の集団は、本明細書中に記載されるＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイによって、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％および少なくとも８０％またはそれ以上が遊走する。別の実施形態において、効果的な濃度のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分にさらされたＮＫ細胞の集団は、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分を伴う同一条件で培養されたＮＫ細胞と比較されるとき、ｔｒａｎｓｗｅｌｌアッセイによって求められるように、少なくとも約１．２倍、約１．３倍、約１．５倍、約１．７５倍、約２倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３．０倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍またはそれ以上の遊走を有する。
【０１２０】
輸血または移植された細胞のホーミングおよびインビボ保持についてのアッセイがこの分野では広く知られている。本明細書中で使用される場合、用語「ホーミング」は、輸血または移植された細胞が宿主の標的器官に到達し、標的器官において生存することが可能であることを示す。例えば、ＮＫ細胞の標的器官はリンパ系組織が可能であり、肝細胞の標的器官は肝臓実質が可能であり、肺胞細胞の標的器官は肺実質が可能である。本明細書中で使用される場合、用語「インビボ保持」（これはまた、「生着」として知られている）は、輸血または移植された細胞が標的器官において増殖し、生存し続けることが可能であることを示す。移植されたＮＫ細胞のホーミングおよびインビボ保持をアッセイするための動物モデルには、免疫欠損の小動物（例えば、ＳＣＩＤマウスおよびＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウスなど）が含まれるが、これらに限定されない。ＳＣＩＤ−Ｈｕマウスモデルは、ヒト胎児の胸腺組織および肝臓組織または胎児ＢＭ組織が移植されたＣ．Ｂ−１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ（ＳＣＩＤ）マウスを用いており、移植されたヒトＮＫ細胞の保持および治療能を評価するための適切なモデルを提供する。移植された細胞のホーミングおよびインビボ保持は、ヒト宿主対象においても同様に評価することができる。１つの実施形態において、ホーミングおよびインビボ保持が、例えば、本発明に従って効果的な濃度のニコチンアミドとともに培養された約１５×１０４個、約１５×１０５個、約１５×１０６個、約１５×１０７個またはそれ以上のヒトＮＫ細胞が輸血され、輸血後の所定の時間（例えば、輸血後の約５時間、１０時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月またはそれ以上）で屠殺される放射線照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいてアッセイされる（下記の実施例ＶＩを参照のこと）。マウスを屠殺したとき、脾臓、骨髄、末梢血および他の器官のサンプルが、ヒト特異的Ａｂを使用してヒトＮＫ細胞（ＣＤＳ５６＋ＣＤ４５＋）の存在についてＦＡＣＳによって評価される。インビボ保持率が、ドナーの表現型（例えば、ヒト細胞についてはＣＤ４５）を呈示する器官の細胞のパーセントとして表される。いくつかの実施形態において、本発明に従って効果的な濃度のニコチンアミドにさらされたＮＫ細胞の集団が輸血された宿主マウスの標的器官（例えば、リンパ系組織、例えば、骨髄、脾臓、胸腺、リンパ節、ＧＡＬＴなど）は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％および少なくとも８０％またはそれ以上のホーミングおよびインビボ保持を有する。１つの具体的な実施形態において、本発明に従って効果的な濃度のニコチンアミドおよび／またはニコチンアミド成分とともに培養された１５×１０６個のＮＫ細胞が放射線照射のＳＣＩＤマウスに輸血され、ドナー特異的系譜（例えば、ＣＤ４５＋）を有する少なくとも２５％のＮＫ細胞が輸血後４日で宿主の脾臓において検出される。別の実施形態において、効果的な濃度のニコチンアミドにさらされたＮＫ細胞の集団は、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分を伴う同一条件で培養されたＮＫ細胞のホーミングおよびインビボ保持と比較されるとき、ＦＡＣＳ（商標）によって求められるように、少なくとも約１．２倍、約１．３倍、約１．５倍、約１．７５倍、約２倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３．０倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍またはそれ以上のホーミングおよびインビボ保持を有する。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合、用語「恒常的増殖」は、注入されたＮＫ細胞の安定した数を長期間（好ましくは数ヶ月間または数年間）維持することができる、標的器官内または標的組織内における増殖を示す。
【０１２２】
現在、患者へのＮＫ細胞の移植を伴う多くの臨床試験が、例えば、しかし、限定ではなく、白血病（ＮＣＴ００７９９７９９およびＮＣＴ００３０３６６７）、血液学的悪性腫瘍（ＮＣＴ００６９７６７１、ＮＣＴ００３５４１７２および同００６４０７９６）、ＡＳＣＴ後（ＮＣＴ００５８６７０３）、神経芽細胞腫（ＮＣＴ００６９８００９）、悪性メラノーマ（ＮＣＴ００８４６８３３）、化学療法との混合治療（ＮＣＴ００６２５７２９）、固形腫瘍（ＮＣＴ００６４０７９６）および鼻咽頭ガン（ＮＣＴ００７１７１８４）を含む様々な状態について、ならびに、多種多様な悪性腫瘍（ＮＣＴ０１１０５６５０）について実施中である。ＮＫ細胞治療についての現在の臨床試験および詳細なプロトコルの完全かつ現在の詳細なリストが、米国国立衛生研究所のＨｅａｌｔｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌのウエブサイトで入手可能である。
【０１２３】
細胞傷害性（「細胞殺傷」）についてのアッセイがこの分野では広く知られている。再指向殺傷アッセイにおいて使用される好適な標的細胞の例が、ガン細胞株、初代ガン細胞、固形腫瘍細胞、白血病性細胞またはウイルス感染細胞である。具体的には、Ｋ５６２細胞、ＢＬ−２細胞、ｃｏｌｏ２５０細胞および初代白血病性細胞を使用することができるが、数多くの他の細胞タイプのどれも使用することができ、また、この分野では広く知られている（例えば、Ｓｉｖｏｒｉ他（１９９７）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８６：１１２９〜１１３６；Ｖｉｔａｌｅ他（１９９８）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８７：２０６５〜２０７２；Ｐｅｓｓｉｎｏ他（１９９８）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８８：９５３〜９６０；Ｎｅｒｉ他（２００１）、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎ．、８：１１３１〜１１３５を参照のこと）。細胞殺傷が、細胞生存性アッセイ（例えば、色素排除、クロム放出、ＣＦＳＥ）、代謝アッセイ（例えば、テトラゾリウム塩）および直接的観察によって評価される。１つの実施形態において、ＮＫ細胞の種々の集団の細胞傷害能が、１：１、２．５：１、５：１または１０：１のＥ：ＴでＮＫ細胞にさらされた細胞におけるＣＦＳＥ保持およびＰＩ取り込みによって求められ、また、本発明に従って好適な濃度のニコチンアミドおよび／またはニコチンアミド成分にさらされたＮＫ細胞の集団は、本明細書中に記載される色素排除によって測定されるように、標的細胞の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％および少なくとも８０％またはそれ以上を殺す。別の実施形態において、好適な濃度のニコチンアミドおよび／またはニコチンアミド成分にさらされたＮＫ細胞の集団は、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分を伴う同一条件で培養されたＮＫ細胞と比較されるとき、色素排除アッセイによって求められるように、少なくとも約１．２倍、約１．３倍、約１．５倍、約１．７５倍、約２倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３．０倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍またはそれ以上の殺傷能を有する。
【０１２４】
ＮＫ細胞を培養することが、フィーダー細胞またはフィーダー細胞層を伴って、あるいは伴うことなく行われ得る。フィーダー層非含有のエクスビボ培養が、ＮＫ細胞を含めて、培養細胞の臨床適用のために非常に好都合である。下記の実施例の節において詳述されるように、ＮＫ細胞のエクスビボ増殖および細胞機能の効果的な強化が、選択された、また、選択されていない臍帯血細胞および骨髄細胞に由来するフィーダー層非含有およびフィーダー細胞非含有の長期および短期のＮＫ細胞培養物において認められた。したがって、１つの実施形態によれば、ＮＫ細胞の集団を培養することが、フィーダー層またはフィーダー細胞を伴うことなく行われる。
【０１２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、また、下記の実施例の節において詳述されるように、ＮＫ細胞集団が、ＩＬ−２および５ｍＭのニコチンアミドとともに培養され、ニコチンアミドへの暴露時期が、ＮＫ細胞を含む細胞の集団の播種からであり、暴露継続期間が約２週間〜約３週間であり、場合により２週間であり、場合により３週間である。
【０１２６】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明に従って効果的な濃度のニコチンアミドおよび／またはニコチンアミド成分にさらされたＮＫ細胞の集団は、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分を伴う同一条件で培養されたＮＫ細胞と比較された場合、当該ＮＫ細胞のＣＤ６２Ｌ表面マーカーの上昇した発現、上昇した遊走応答、および、より大きい細胞傷害活性、ならびに、注入されたＮＫ細胞の上昇したホーミングおよびインビボ保持のうちの少なくともいずれか２つ、場合によりいずれか３つ、場合によりいずれか４つ、場合により５つすべてを有することができる。１つの具体的な実施形態において、本発明に従って効果的な濃度のニコチンアミドおよび／またはニコチンアミド成分にさらされたＮＫ細胞の集団は、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分を伴う同一条件で培養されたＮＫ細胞と比較された場合、より大きい増殖、上昇したＣＤ６２Ｌ発現、ならびに、注入されたＮＫ細胞の上昇したホーミングおよびインビボ保持を有する。
【０１２７】
本明細書中において詳述されるように、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分への暴露によるＮＫ細胞の増殖および細胞機能の強化が、フィーダー細胞の存在下でも同様に認められる。したがって、別の実施形態において、ＮＫ細胞がフィーダー細胞またはフィーダー層の存在下で培養される。典型的には、フィーダー層は、放射線照射された間質細胞、および、不死化された細胞株の細胞などを含む。ＮＫ細胞をフィーダー層上で、または、フィーダー細胞とともに培養するための方法が、例えば、Ｆｒｉａｓ他（Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２００８、３６：６１〜６８）、Ｈａｒａｄａ他（Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２００４、３２：６１４〜２１）、Ｃａｍｐａｎａ他（米国特許出願公開第２００９００１１４９８号）、Ｃｈｉｌｄｓ他（米国特許出願公開第２００９０１０４１７０号）およびＴｓａｉ他（米国特許出願公開第２００７００４８２９０号）に詳しく記載される（これらは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１２８】
本発明のＮＫ細胞は、そのような細胞を含む供給源であれば、どのようなものにも由来することができる。ＮＫ細胞が多くの組織において見出され、ＮＫ細胞を、例えば、リンパ節、脾臓、肝臓、肺、腸、脱落膜から得ることができ、また、ｉＰＳ細胞または胚性幹細胞（ＥＳＣ）からも得ることができる。典型的には、臍帯血、末梢血、動員末梢血および骨髄（これらは不均一なリンパ球細胞集団を含有する）が、研究使用および臨床使用のための非常に多数のＮＫ細胞を提供するために使用される。したがって、本発明の１つの実施形態の１つの局面によれば、上記方法は、臍帯血、末梢血または骨髄の１つに由来するＮＫ細胞の集団を培養することを含む。本明細書中において詳述されるように、リンパ球細胞タイプの割合における著しい違いが、種々の供給源から得られるＮＫ細胞集団の間に見出されることが発見された。例えば、臍帯血から（免疫磁石単離によって）単離されたＣＤ５６＋細胞には典型的には、ＣＤ５６＋ＣＤ３−のＮＫ細胞が、骨髄または末梢血のＣＤ５６＋画分よりも大きい割合で含まれ、ＣＤ５６のＮＫマーカーおよびＣＤ３のＴ細胞マーカーを共発現するＮＫＴ細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ３＋）が骨髄または末梢血のＣＤ５６＋画分よりも少なく含まれる（本明細書中の実施例Ｉ〜ＩＶを参照のこと）。したがって、特定の実施形態において、ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞、ＣＤ３−細胞およびＣＤ３＋細胞を含む不均一な細胞集団から培養される。１つの実施形態において、ＣＤ３＋画分が、骨髄、臍帯血または末梢血では典型的であるように、ＣＤ３−のＮＫ細胞画分よりも大きい。さらに別の実施形態において、ＮＫ細胞集団はＮＫ細胞について選択または濃縮される。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞を新鮮な細胞集団から生長させることができ、一方、他の実施形態では、ＮＫ細胞が、貯蔵された細胞集団（例えば、凍結保存され、解凍された細胞など）から、または、以前に培養された細胞集団から生長させられる。
【０１２９】
ＮＫ細胞には、臍帯血または末梢血または骨髄の単核細胞画分が付随する。１つの実施形態において、前記ＮＫ細胞を含む細胞の集団は、ＣＤ３＋細胞、または、ＣＤ３＋細胞およびＣＤ１９＋細胞が枯渇化された単核細胞集団または総有核細胞集団である。別の実施形態において、前記ＮＫ細胞を含む細胞の集団は非選択のＮＫ細胞集団である。さらに別の実施形態において、細胞はさらに選択され、ＮＫ細胞はＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＣＤ３−細胞および／またはＣＤ５６＋ＣＤ１６−ＣＤ３−細胞を含む。ＮＫ細胞を表現型に従って選択するための方法（例えば、免疫検出およびＦＡＣＳ分析）が、本明細書中に、例えば、下記の方法の節において詳述される。
【０１３０】
最も一般的には、全血サンプルまたは骨髄サンプルが、リンパ球を培養培地（または緩衝液）に入れる前に細胞の集団を得るためにさらに処理される。例えば、血液サンプルまたは骨髄サンプルは、細胞の特定の定義された集団を濃縮するために、または精製するために、または単離するために処理することができる。用語「精製する」および用語「単離する」は、絶対的な純度を必要としない；むしろ、これらは、相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製されたリンパ球集団は、指定された細胞が、そのような細胞がその供給源組織に存在するよりも濃縮される集団である。実質的に純粋なリンパ球の調製物を、所望される細胞が、調製物に存在する総細胞の少なくとも５０％を表すように濃縮することができる。特定の実施形態において、細胞の実質的に純粋な集団は、調製物における総細胞の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％またはそれ以上を表す。
【０１３１】
リンパ球を濃縮および単離するための方法がこの分野では広く知られており、適切な方法を、所望される集団に基づいて選択することができる。例えば、１つの取り組みにおいて、供給源材料が、赤血球を除くことによってリンパ球について濃縮される。その最も簡便な形態において、赤血球の除去は非凝固全血または骨髄の遠心分離を伴い得る。密度に基づいて、赤血球がリンパ球および他の細胞から分離される。その後、リンパ球富化画分を選択的に回収することができる。リンパ球およびそれらの始原体もまた、分離培地（例えば、様々な商業的供給源から入手可能である標準的なリンパ球分離培地（ＬＳＭ）など）を使用する遠心分離によって濃縮することができる。代替的に、リンパ球／始原体を、アフィニティーに基づく様々な手順を使用して濃縮することができる。抗体媒介による数多くのアフィニティー調製方法がこの分野では知られている（例えば、抗体とコンジュゲート化された磁石ビーズなど）。リンパ球の濃縮はまた、望まれない細胞の負の選択を行うための市販の調製物（例えば、全リンパ球、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の濃縮のために配合されるＦＩＣＯＬＬ−ＨＹＰＡＱＵＥ（商標）および他の密度勾配培地など）を使用して行うことができる。
【０１３２】
ＮＫ細胞を血液サンプル、骨髄サンプルまたは組織サンプルから選択する方法がこの分野では広く知られている（例えば、米国特許第５７７０３８７号（Ｌｉｔｗｉｎ他）を参照のこと）（これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。最も一般に使用されるのが、通常的には単核細胞の分画化の後でのＣＤ５６＋細胞の単離および精製、そして、非ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ３４＋およびＣＤ１３３＋など）の枯渇化に基づくプロトコルである。２つ以上のプロトコルの組合せを、非ＮＫ混入物からのより大きい純度を有するＮＫ細胞集団を提供するために用いることができる。ＮＫ細胞調製物の純度は、臨床適用のためには非常に重要である。これは、非ＮＫ細胞（例えば、Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞など）は、抗原特異的な反応（例えば、ＧＶＨＤなど）の一因であり、これにより、ＮＫ細胞移植の潜在的な利益を損なうからである。ＮＫ細胞を単離するための市販のキットには、一段階手順（例えば、ＣＤ５６マイクロビーズ、および、ＣＤ５６＋、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋の単離キット、これらは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）から得られる）および多段階手順（ＣＤ３＋の枯渇化または部分的枯渇化、あるいは、Ｔ細胞（例えば、ＯＫＴ−３）、Ｂ細胞、幹細胞、樹状細胞、単球、顆粒球および赤血球系細胞を認識し、これらを除く非ＮＫ細胞抗体による枯渇化を含む）が含まれる。したがって、いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、選択されたＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞集団、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞集団、ＣＤ５６＋ＣＤ１６−ＣＤ３−ＮＫ細胞集団または他の精製されたＮＫ細胞集団である。しかしながら、臨床適用では典型的には、候補細胞集団の操作がより少ないことが有利であることが指摘されるであろう。
【０１３３】
１つの実施形態において、ＮＫ細胞は、短期間または長期間の培養によってエクスビボで生長させられる。実施例Ｉにおいて詳述されるように、ＮＫ細胞を７日間もの少ない期間または３週間もの多くの期間、本発明の方法に従って増殖因子ならびにニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養することにより、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分を伴うことを除いてサイトカインとともに培養された細胞と比較した場合、培養されたＮＫ細胞の高まった優先的増殖および／または機能性がもたらされた。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、ＮＫ細胞集団を培養することは、少なくとも３日間、少なくとも５日間、少なくとも７日間、場合により１０日間、場合により１２日間、場合により１４日間、場合により１６日間、場合により１８日間、場合により２０日間、および、場合により２１日間、あるいは、１週間、２週間または３週間、４週間、５週間、６週間またはそれ以上である。例示的な、限定されない培養継続期間は、実施例Ｉ〜ＩＶにおいて詳述されるように、７日（１週間）および２１日（３週間）である。
【０１３４】
ＮＫ細胞集団は、様々な方法およびデバイスを使用して培養することができる。培養装置の選択は通常、培養の規模および目的に基づく。細胞培養の規模拡大は好ましくは、専用デバイスの使用を伴う。臨床規格のＮＫ細胞を大規模に製造するための装置が、例えば、Ｓｐａｎｈｏｌｔｚ他（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２０１０、５：ｅ９２２１）およびＳｕｔｌｕ他（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１０、Ｅａｒｌｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  １〜１２）に詳述される。
【０１３５】
Ｐｅｌｅｄ他（国際公開ＷＯ０３／０６２３６９、これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）は最近、ＣＤ３４＋細胞の生着能に対するニコチンアミド処理の劇的な効果を開示している。ニコチンアミドのこの効果が、培養において、また、最小限の細胞分裂または細胞分裂が行われないために十分なインキュベーションの短い継続期間にわたって増殖する細胞に関して両方で認められている。したがって、エクスビボ培養におけるＮＫ細胞の増殖を高めることが本発明の重要な目標である一方で、数分、数時間および１日などの期間にわたるニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分へのＮＫ細胞の短期エクスビボ暴露が想定される。増殖のためには十分でない期間にわたるニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分へのＮＫ細胞のそのような短期暴露は潜在的には、例えば、ＮＫ細胞の機能性（細胞傷害性、遊走能、細胞表面分子の発現および生着能など）を高めることができる。ニコチンアミドによる短期処理を、新鮮な細胞、凍結保存・解凍後の細胞、培養中の細胞、精製細胞および混合細胞集団などに施すことができる。１つの実施形態において、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分によるそのような短期処理がＮＫ細胞の使用（移植、注入など）の直前に施される。
【０１３６】
本発明者らは驚くべきことに、ＮＫ（ＣＤ５６＋）細胞および非ＮＫ細胞（例えば、Ｔ（ＣＤ３＋）細胞、ＮＫＴ（ＣＤ５６＋ＣＤ３＋）細胞など）を含む混合細胞集団の、培養培地における効果的な濃度のニコチンアミドの存在下での培養が、ＮＫ細胞の増殖、成長および機能性を高めるだけでなく、同じ培地における非ＮＫ細胞（例えば、Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞）の増殖および成長を阻害することを認めている（本明細書中における実施例Ｖを参照のこと）。したがって、本発明の１つの実施形態において、ＮＫ細胞およびＣＤ３＋細胞の不均一な集団を効果的な濃度のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養することにより、他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞の集団と比較した場合、ＣＤ３＋細胞対ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞の低下した比率を有するＮＫ細胞の集団がもたらされる。さらに別の実施形態において、ＮＫ細胞およびＣＤ３＋細胞の不均一な集団を本発明の方法に従って効果的な濃度のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養することにより、他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞の集団と比較した場合、ＣＤ１４＋細胞およびＣＤ１５＋細胞の低下した数を有するＮＫ細胞の集団がもたらされる。
【０１３７】
ＮＫ細胞集団をエクスビボ培養するための本明細書中上記で記載される方法は、とりわけ、ＮＫ細胞の培養された集団をもたらすことができる。
【０１３８】
したがって、さらに本発明の１つの局面によれば、他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞の集団と比較して、ＣＤ６２Ｌの上昇した発現、上昇した遊走応答、上昇したホーミングおよびインビボ保持、より大きい増殖、増大した細胞傷害活性、ならびに、ＣＤ３＋細胞対ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞の低下した比率のうちの１つによって特徴づけられるＮＫ細胞の集団が提供される。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞の集団は、他の点では同一の培養条件のもと、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともに培養されたＮＫ細胞の集団と比較して、ＣＤ６２Ｌの上昇した発現、上昇した遊走応答、上昇したホーミングおよびインビボ保持、より大きい増殖、増大した細胞傷害活性、ならびに、ＣＤ３＋細胞対ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞の低下した比率のうちの少なくともいずれか２つ、少なくともいずれか３つ、少なくともいずれか４つ、少なくともいずれか５つ、または、６つすべてによって特徴づけられる。
【０１３９】
実施例ＩＶにおいて、本発明者らは、本発明の方法に従って調製されるＮＫ集団が、標的器官（例えば、脾臓、骨髄および末梢血）における局在化およびインビボ保持によって明らかにされるように、増大したインビボでの機能的能力を有することを示している。したがって、本発明のいくつかの実施形態の具体的局面において、移植されたとき、高まったホーミング、生着およびインビボ保持によって特徴づけられるＮＫ細胞の集団が提供され、ただし、この場合、当該ＮＫ細胞集団の少なくとも１５×１０６個を放射線照射された宿主（例えば、ＳＣＩＤマウス）に注入することにより、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％および少なくとも９０％またはそれ以上のドナー由来のＮＫ細胞が、免疫検出およびフローサイトメトリーによって検出されるように、注入後４日で宿主のリンパ系組織においてもたらされる。１つの実施形態において、当該ＮＫ集団の少なくとも１５×１０６個の細胞を注入することにより、少なくとも２５％のドナー由来のＮＫ細胞が、免疫検出およびフローサイトメトリーによって検出されるように、注入後４日で宿主のリンパ系組織においてもたらされる。
【０１４０】
さらなる関連した判定基準が、ＮＫ集団を特徴づけるために適用されるかもしれない。したがって、さらに別の実施形態において、本発明のＮＫ集団はさらに、フローサイトメトリーおよび免疫検出によって検出されるように、宿主への注入時における細胞集団の少なくとも３０％におけるＣＤ６２Ｌの発現によって特徴づけられる。なおさらに別の実施形態において、ＮＫ細胞集団はさらに、ＣＤ３＋細胞による混入から生じる純粋度に従って特徴づけられ得る（例えば、ＣＤ３＋細胞対ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞の比率が注入時において１：１００以下であるＮＫ細胞集団）。
【０１４１】
本発明の関連において、治療用のＮＫ細胞集団は、ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分を含有する培養培地と一緒に提供され、培養培地から単離され、かつ、医薬的に許容され得るキャリアと組み合わされ得ることが理解されるであろう。したがって、本発明の細胞集団は、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤（例えば、無菌の生理的食塩水および緩衝剤水溶液など）において投与することができる。そのようなキャリアおよび希釈剤の使用はこの分野では広く知られている。
【０１４２】
本発明のこの局面の１つの具体的な実施形態において、ＮＫ細胞集団は、効果的な量のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分の存在下でエクスビボ培養されたＮＫ細胞の集団と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む。なおさらに別の実施形態において、エクスビボ培養された集団は、０．１ｍＭ未満のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分において増殖因子とともに培養されたＮＫ細胞の集団と比較されたとき、活性化され、かつ、標的細胞に対する増大した細胞傷害能を有するＮＫ細胞を含む。
【０１４３】
ニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分がＮＫ細胞の増殖および機能性を維持させ得ることはさらに、様々な技術的適用において使用することができる。
【０１４４】
本発明のさらなる局面によれば、ＮＫ細胞を保存する方法が提供される。１つの実施形態において、この方法は、ＮＫ細胞を下記工程の少なくとも１つにおいて取り扱うことによって行われる：効果的な量のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分の存在下における収集、単離および／または貯蔵。
【０１４５】
本発明のなおさらにさらなる局面によれば、ＮＫ細胞回収／培養バッグが提供される。本発明の細胞回収／培養バッグには、効果的な量のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分が補われる。
【０１４６】
本発明によれば、ＮＫ細胞の分離緩衝液および／または洗浄緩衝液もまた提供される。分離緩衝液および／または洗浄緩衝液には、効果的な量のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分が補われる。
【０１４７】
下記においてさらに詳述されるように、ＮＫ細胞は遺伝子改変され得る。
【０１４８】
エクスビボ遺伝子治療において、細胞が患者から取り出され、そして、培養されながら、インビトロで処理される。一般には、機能的な代替遺伝子が、必要に応じて適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入、相同的組換えなど）および発現システムにより細胞に導入され、その後、改変された細胞が培養され、宿主／患者に戻される。これらの遺伝子再移植細胞は、トランスフェクションされた遺伝物質をその場において発現することが示されている。
【０１４９】
したがって、さらに本発明の局面によれば、エクスビボ培養されたＮＫ細胞をエキソジーンにより形質導入する方法が提供される。この方法は、本発明のこの局面によれば、（ａ）ＮＫ細胞の集団を本発明のＮＫ細胞培養の方法に従って培養することによってＮＫ細胞の集団をエクスビボ培養すること、および、（ｂ）ＮＫ細胞の培養された集団の細胞をエキソジーンにより形質導入することによって行われる。工程（ａ）および工程（ｂ）の順序は逆になり得ることが理解されるであろう。培養されたＮＫ細胞の形質導入のための方法がこの分野では知られており、例えば、エクスビボ改変されたＮＫ細胞の使用がＣａｍｐａｎａ他（米国特許出願公開第２００９００１１４９８号）によって開示されている。
【０１５０】
したがって、本発明の培養細胞は、遺伝子産物を発現させるために改変することができる。本明細書中で使用される場合、表現「遺伝子産物」は、タンパク質、ペプチドおよび機能的ＲＮＡ分子を示す。一般には、核酸分子によってコードされる遺伝子産物は、対象に供給されることになる所望される遺伝子産物である。そのような遺伝子産物の例には、レシピエント対象の細胞によって通常的に産生されるタンパク質、ペプチド、糖タンパク質およびリポタンパク質が含まれる。代替的に、コードされた遺伝子産物は、所望される遺伝子産物の細胞による発現を誘導するものである（例えば、導入された遺伝物質は、対象に供給されることになる遺伝子産物の転写を誘導する転写因子をコードする）。例えば、ＮＫ細胞は、細胞表面分子、あるいは、ＮＫ細胞の機能を強化または調節することができる細胞内遺伝子産物、例えば、サイトカイン、接着分子、活性化受容体および／または阻害性受容体などを発現させるために改変することができる。
【０１５１】
真核生物細胞のトランスフェクションのための好適なベクター、構築物およびプロトコルの説明が、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他（編）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９）、第９．２節、および、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）、例えば、第１６．４１節〜第１６．５５，９節、または、他の標準的な実験室マニュアルに見出され得る。
【０１５２】
本明細書中上記で詳しく議論されるように、ＮＫ細胞のエクスビボ生長をＮＫ細胞の移植または埋め込みにおいて都合よく利用することができる。したがって、本発明の別の局面によれば、ＮＫ細胞をレシピエントに移植するか、または埋め込む方法が提供される。本発明のこの局面による方法は、（ａ）ＮＫ細胞の集団を本発明の方法に従って増殖因子ならびに効果的な濃度のニコチンアミドおよび／または他のニコチンアミド成分とともにエクスビボ培養し、治療量の前記培養されたＮＫ細胞を前記対象に投与することによって行われる。
【０１５３】
ドナーおよびレシピエントは、同じ個体または異なる個体（例えば、同種の個体）であり得る。したがって、ＮＫ細胞の集団は対象に対して自己由来または同種由来であり得る。同種移植が実施されるとき、この分野では広く知られているように、移植体拒絶および／または移植片対宿主病を軽減するための治療療法が着手され得る。そのような治療療法が現在、ヒトの治療では実施される。最も進化した治療療法が、Ｓｌａｖｉｎ  Ｓ．他による刊行物（例えば、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００２）、２２：６４、および、Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（２００２）、１１：２６５）、Ｇｕｒ  Ｈ．他による刊行物（Ｂｌｏｏｄ（２００２）、９９：４１７４）、および、Ｍａｒｔｅｌｌｉ  ＭＦ他による刊行物（Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ（２００２）、３９：４８）に開示される（これらは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１５４】
１つの実施形態によれば、ＮＫ細胞集団の移植は、対象において疾患を処置または防止するためである。
【０１５５】
本発明の１つの実施形態のさらに別の実施形態によれば、腫瘍成長をその必要性のある対象において阻害する方法が提供される。本発明のこの局面による方法は、治療有効量の本発明のＮＫ細胞の集団を前記対象に投与することによって行われる。
【０１５６】
「処置する」または「処置」には、疾患の症状、合併症または生化学的徴候の発症を防止するか、または遅延させ、それにより、症状を緩和するか、あるいは、疾患、状態または障害（例えば、ガン、転移ガンまたは転移性固形腫瘍）のさらなる発達を停止させるか、または阻害するために、本発明の、濃縮、活性化または培養されたＮＫ細胞組成物またはＮＫ細胞集団を投与することが含まれるが、これに限定されない。処置は、予防的、すなわち、（疾患の発症を防止するために、または遅延させるために、あるいは、その臨床症状または不顕性症状の発現を防止するために）補助的あり得るか、あるいは、疾患が発現した後における症状の治療的な抑制または緩和であり得る。
【０１５７】
１つの実施形態において、ＮＫ細胞集団が、ガン（例えば、固形腫瘍または悪性腫瘍など）を軽減または排除するために、あるいは、その発生または再発を防止するために効果的な量で投与される。「固形腫瘍を軽減または排除するために、あるいは、その発生または再発を防止するために効果的な量」、または、「過剰増殖性障害を軽減または排除するために、あるいは、その発生または再発を防止するために効果的な量」は、患者の試験データ、生存データ、腫瘍マーカーレベルの上昇または抑制、遺伝子プロフィルまたは環境要因に対する暴露に基づく低下した感受性によって測定されるような、腫瘍疾患状態または過剰増殖性障害について処置した後における患者の結果または生存を改善する治療組成物の量を示す。「ガン成長を阻害する」は、腫瘍のサイズまたは生存性または細胞数を低下させることを示す。「ガン」、「悪性腫瘍」、「固形腫瘍」または「過剰増殖性障害」は同義的用語として使用され、細胞の制御されない異常な増殖、冒された細胞が局所的に、または、血流およびリンパ系を介して身体の他の部分に伝播（すなわち、転移）し得ること、同様にまた、数多くの特徴的な構造的特徴および／または分子的特徴の何らかによって特徴づけられる数多くの疾患のどれも示す。「ガン性」または「悪性細胞」または「固形腫瘍細胞」は、特定の構造的性質を有し、分化することを失い、かつ、侵入および転移することができる細胞として理解される。「ガン」は、ガン腫および肉腫を含めて、哺乳動物において見出されるすべてのタイプのガンまたは新生物または悪性腫瘍を示す。例として、乳房、肺、非小細胞肺、胃、脳、頭部および頸部、髄芽細胞腫、骨、肝臓、結腸、尿生殖器、膀胱、尿路、腎臓、精巣、子宮、卵巣、子宮頸部、前立腺、メラノーマ、中皮腫、肉腫のガンが挙げられる（ＤｅＶｉｔａ他（編）、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第６版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ）を参照のこと。この参考文献は、すべての目的のためにその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１５８】
「ガン関連（の）」は、対象細胞における悪性腫瘍の発生に対する、核酸およびその発現またはその欠乏、あるいは、タンパク質およびその活性もしくはレベルまたはその欠乏の関係を示す。例えば、ガンには、正常な健康細胞では発現しないか、または、より低いレベルで発現する特定の遺伝子の発現が付随し得る。逆に、ガン関連の遺伝子は、悪性細胞において（または、形質転換を受けている細胞において）発現しない遺伝子、または、悪性細胞において、正常な健康細胞で発現するよりも低いレベルで発現する遺伝子である。
【０１５９】
「過剰増殖性疾患」は、細胞が、正常な組織成長よりも急速に増殖する疾患または障害であれば、どのようなものも示す。したがって、過剰増殖細胞は、正常な細胞よりも急速に増殖し続ける細胞である。
【０１６０】
「進行ガン」は、原発性腫瘍部位にもはや局在化していないガン、または、アメリカ癌合同委員会（ＡＪＣＣ）に従ってＩＩＩ期またはＩＶ期であるガンを意味する。
【０１６１】
「十分に寛容される」は、処置の結果として生じ、処置の決定に影響を及ぼすと考えられる健康状態における有害な変化がないことを示す。
【０１６２】
「転移性」は、免疫欠損マウスの乳房脂肪パッドおよび／または循環に注入されたとき、二次的な腫瘍病変を、免疫欠損マウスの肺、肝臓、骨または脳において確立することができる腫瘍細胞（例えば、ヒトの固形腫瘍または尿生殖器悪性腫瘍）を示す。
【０１６３】
「固形腫瘍」には、肉腫、メラノーマ、ガン腫または他の固形腫瘍ガンが含まれるが、これらに限定されない。「肉腫」は、胚性結合組織のような物質から成り、かつ、原線維性物質または均一な物質に埋め込まれる密充填された細胞から一般には構成される腫瘍を示す。肉腫には、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、Ａｂｅｍｅｔｈｙ肉腫、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛ガン、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉種、巨細胞肉腫、顆粒球肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素沈着性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球肉腫、イェンセン肉腫、カポジ肉腫、クプファー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫および毛細血管拡張性肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６４】
「メラノーマ」は、皮膚および他の器官のメラニン形成細胞系から生じる腫瘍を示す。メラノーマには、例えば、末端黒子型黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１メラノーマ、ハーディング・パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫および表在性拡大型黒色腫が含まれる。
【０１６５】
「ガン腫」は、周囲組織に浸潤し、転移物を生じさせる傾向がある上皮細胞から成る悪性の新成長を示す。例示的なガン腫には、例えば、腺房細胞腺ガン、小葉ガン、腺様嚢胞ガン（ａｄｅｎｏｃｙｓｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺様嚢胞ガン（ａｄｅｎｏｉｄ  ｃｙｓｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺様ガン、副腎皮質のガン、肺胞ガン、肺胞細胞ガン、基底細胞ガン（ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、基底細胞様ガン、基底扁平細胞ガン、細気管支肺胞上皮ガン、細気管支ガン、鰓原性ガン、脳様ガン、胆管細胞ガン、絨毛ガン、膠様ガン、コメドガン、子宮体ガン、篩状ガン、鎧状ガン、皮膚ガン、円柱ガン、円柱細胞ガン、管ガン、硬性ガン、胎児性ガン、脳様ガン、類表皮ガン、腺上皮ガン、外方成長ガン、潰瘍ガン、線維ガン、ゼラチン状ガン、粘液性ガン、巨細胞ガン（ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺ガン、顆粒膜細胞ガン、毛母ガン、血様ガン、肝細胞ガン、ヒュルトレ細胞ガン、硝子状ガン、副腎様ガン、乳児胎児性ガン、上皮内ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、上皮内ガン（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、表皮内ガン、クロムペッヘルガン、クルチツキー細胞ガン、大細胞ガン、レンズ状ガン（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫様ガン、リンパ上皮性ガン、髄様ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様ガン（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色ガン、軟性ガン、粘液性ガン、粘液分泌ガン、粘液細胞ガン、粘表皮ガン、粘液ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液ガン（ｍｕｃｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫様ガン、鼻咽頭ガン、燕麦細胞ガン、骨化生ガン、類骨ガン、乳頭状ガン、門脈周囲ガン、侵入前ガン、有棘細胞ガン、髄質様ガン、腎臓の腎細胞ガン、予備細胞ガン、肉腫様ガン、シュナイダーガン、硬性ガン、陰嚢ガン、印環細胞ガン、単純ガン、小細胞ガン、バレイショ状ガン、球状細胞ガン、紡錘形細胞ガン、海綿様ガン、扁平上皮ガン（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮ガン（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、数珠様ガン、毛細血管拡張性ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細血管拡張性ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮細胞ガン、結節ガン（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節ガン（ｔｕｂｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、いぼ状ガンおよび絨毛ガンが含まれる。
【０１６６】
「白血病」は血液形成器官の進行性悪性疾患を示し、一般には、血液および骨髄における白血球およびそれらの前駆体の誤った増殖および発達によって特徴づけられる。白血病は一般に、（１）疾患の継続期間および特性、すなわち、急性または慢性；（２）関与する細胞のタイプ、すなわち、骨髄系（骨髄性）、リンパ系（リンパ性）または単球性；および（３）血液中の異常な細胞の数における増大または非増大、すなわち、白血病性または非白血性（亜白血性）に基づいて分類される。白血病には、例えば、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、無白血球性白血病、好塩基球性白血病、芽球性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胚白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、毛様細胞性白血病、血芽球性白血病（ｈｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、血芽球性白血病（ｈｅｍｏｃｙｔｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ球性白血病（ｌｙｍｐｈｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核芽球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、プラズマ細胞性白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病および未分化細胞白血病が含まれる。さらなるガンには、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳ガン、卵巣ガン、肺ガン、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺ガン、原発性脳腫瘍、胃ガン、結腸ガン、悪性膵臓インスラノーマ、悪性カルチノイド、膀胱ガン、前悪性皮膚病変、精巣ガン、リンパ腫、甲状腺ガン、神経芽腫、食道ガン、尿生殖路ガン、悪性高カルシウム血症、子宮頸ガン、子宮内膜ガン、副腎皮質ガンおよび前立腺ガンが含まれる。
【０１６７】
本発明のこの局面の別の具体的な実施形態において、上記方法は、前記対象への造血細胞移植、造血始原体細胞移植または造血幹細胞移植と同時に、またはその後で、またはその前に行われる。さらにさらなる実施形態において、対象は、輸血されたＮＫ細胞のインビボ機能をさらに高める感作剤または強化剤（例えば、プロテアソーム阻害剤、ＩＬ−２、ＩＬ−１５など）により同時に処置されている（詳細については、例えば、米国特許出願公開第２００９０１０４１７０号（Ｃｈｉｌｄｓ他）を参照のこと）。
【０１６８】
自己免疫患者におけるＮＫ細胞の低下した数および機能性がこれまでに認められており、このことは、様々な自己免疫性の疾患および状態におけるＮＫ細胞治療の可能性を示している（Ｓｃｈｌｅｉｎｉｔｚ他、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１０、１３１：４５１〜５８、また、ＦｒｅｎｃｈおよびＹｏｋｏｈａｍａ、Ａｒｔｈｒｉｔ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ、２００４、６：８〜１４を参照のこと）。したがって、本発明のなおさらに別の実施形態において、自己免疫性の疾患または状態をその必要性のある対象において処置する方法が提供される。本発明のこの局面による方法は、治療有効量の本発明のＮＫ細胞の集団を前記対象に投与することによって行われる。
【０１６９】
本発明の方法によって処置され得る自己免疫性疾患には、心臓血管疾患、リウマチ様疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経学的疾患、筋疾患、腎疾患、生殖関連疾患、結合組織疾患および全身性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７０】
自己免疫性心臓血管疾患の例には、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、血栓症、ヴェーゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、川崎症候群、抗第ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ−ストラウス症候群、寡免疫巣状壊死性糸球体腎炎および半月体性糸球体腎炎、抗リン脂質症候群、抗体誘導心不全、血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、シャーガス病における心臓自己免疫、および、抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７１】
自己免疫性リウマチ様疾患の例には、リウマチ様関節炎および強直性脊椎炎が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７２】
自己免疫性腺疾患の例には、膵臓疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーヴズ病、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣自己免疫、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎およびＩ型自己免疫性多腺性症候群が含まれるが、これらに限定されない。疾患には、膵臓の自己免疫疾患、１型糖尿病、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴズ病、自発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣自己免疫、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎およびＩ型自己免疫性多腺性症候群が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７３】
自己免疫性胃腸疾患の例には、慢性炎症性腸疾患、セリアック病、大腸炎、回腸炎およびクローン病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７４】
自己免疫性皮膚疾患の例には、自己免疫性水疱性皮膚疾患（例えば、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡および落葉性天疱瘡など、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７５】
自己免疫性肝疾患の例には、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変および自己免疫性肝炎が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
自己免疫性神経学的疾患の例には、多発性硬化症、アルツハイマー病、重症筋無力症、ニューロパチー、運動ニューロパチー；ギラン−バレー症候群および自己免疫性ニューロパチー、筋無力症、ランバート−イートン無筋力症症候群；腫瘍随伴性神経学疾患、小脳萎縮症、腫瘍随伴性の小脳萎縮症およびスティッフマン症候群；腫瘍非随伴性スティッフマン症候群、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群および自己免疫性多内分泌腺症；異常免疫ニューロパチー；後天性神経性筋硬直症、先天性多発性関節拘縮症、神経炎、視神経炎および神経変性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７７】
自己免疫性筋疾患の例には、筋炎、自己免疫性筋炎および原発性シェーグレン症候群および平滑筋自己免疫疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
自己免疫性腎疾患の例には、腎炎および自己免疫性間質性腎炎が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７９】
生殖関連の自己免疫性疾患の例には、繰り返される胎児喪失が含まれるが、これに限定されない。
【０１８０】
自己免疫性結合組織疾患の例には、耳疾患、自己免疫性耳疾患、および、内耳の自己免疫疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８１】
自己免疫性全身性疾患の例には、全身性エリテマトーデスおよび全身性硬化症が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８２】
本発明のさらに別の実施形態において、ウイルス感染症をその必要性のある対象において阻害する方法が提供される。本発明のこの局面による方法は、（ａ）ＮＫ細胞の集団をＮＫ細胞の増殖因子および効果的な濃度のニコチンアミドとともにエクスビボ培養すること（ただし、前記効果的な濃度のニコチンアミドにより、前記ＮＫ細胞の増殖が、前記濃度のニコチンアミドを伴うことなく増殖因子とともに培養された細胞の前記集団と比較した場合、高められる）、および、（ｂ）治療的量の前記培養されたＮＫ細胞を前記対象に投与することによって行われる。本発明のＮＫ細胞またはＮＫ細胞組成物による処置のために好適なウイルス感染症には、ＨＩＶ、リンパ脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルスおよびパラインフルエンザウイルス、肝炎（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、非Ａ非Ｂ型などを含む）、単純ヘルペスウイルス、帯状疱疹ウイルス、タイラーウイルスおよびＨＳＶ−１が含まれるが、これらに限定されない。本発明のＮＫ細胞またはＮＫ細胞調整物による処置のために好適な他の感染性疾患には、寄生虫感染症（例えば、プラスモジウム感染症、リーシュマニア感染症およびトキシプラズマ感染症など）および細菌感染症（例えば、ミコバクテリアおよびリステリアなど）が含まれるが、これらに限定されない（ウイルス性疾患、細菌性疾患および原虫性疾患の処置におけるＮＫ細胞の総説については、Ｚｕｃｃｈｉｎｉ他、Ｅｘｐ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｅｃｔ  Ｔｈｅｒ、２００８、６：８６７〜８５を参照のこと。そのような参考文献は本書とともに参照によって組み込まれる）。
【０１８３】
造血細胞の移植はこれまで、様々な遺伝性疾患または悪性疾患のための最上の処置になっている。しかしながら、造血細胞の組成物は多くの場合、移植片対宿主病の一因となるＴリンパ球が多い。血液学的悪性腫瘍に苦しむ患者は多くの場合、ＮＫ細胞の数および機能が不十分であるので、造血細胞移植と一緒でのＮＫ細胞の外因性投与が現在、高まった長期生着および移植片対宿主病の防止のために研究中である。したがって、本発明のさらに別の実施形態において、移植片対宿主病をその必要性のある対象において処置または防止する方法が提供される。したがって、本発明のなおさらに別の実施形態において、自己免疫性の疾患または状態をその必要性のある対象において処置する方法が提供される。本発明のこの局面による方法は、治療量の本発明のＮＫ細胞の集団を前記対象に投与することによって行われる。
【０１８４】
ＮＫ細胞を用いた処置、ならびに、ＮＫ細胞集団およびＨＳＣ細胞集団を用いた混合処置のための臨床プロトコルが、この分野では広く知られている。例えば、最近の報告では、ＮＫ細胞の注入は安全であり、ＧＶＨＤをレシピエントにおいて引き起こさないことが立証されている。１つのそのようなプロトコルは、骨髄機能除去、ＩＬ−２により活性化されたＮＫ濃縮（非ＮＫ枯渇化）ＨＬＡミスマッチ臍帯血の注入、その後、ＨＳＣ再増殖のための２倍の臍帯血注入を伴う［Ｍｉｌｌｅｒ他、Ｂｌｏｏｄ、２００６、１０８：３１１１（アブストラクト）を参照のこと］。著者らは、臍帯血ＨＳＣと一緒でのＮＫ細胞の移植により、ＨＳＣの改善された長期生着がもたらされたことを報告した。
【０１８５】
処置療法
本発明のいくつかの実施形態のいくつかの局面によれば、医薬的に許容され得るキャリアと一緒に配合される、疾患（例えば、転移ガン、固形腫瘍、自己免疫疾患、過剰増殖性障害またはウイルス感染症）を処置するためのＮＫ細胞集団を含む医薬組成物が提供される。いくつかの組成物は、多数（例えば、２つ以上）の本発明のＮＫ細胞集団の組合せを含む。
【０１８６】
予防的適用において、医薬組成物または医薬品が、過剰増殖性疾患または固形腫瘍の再発の危険性を排除または軽減するために、あるいは、疾患の重篤度を和らげるために、あるいは、疾患発達期間中に現れる疾患の生化学的症状、組織学的症状および／または行動的症状、その合併症および中間的な病理学的表現型を含めて、疾患の発症を遅らせるために十分な量で、疾患または状態に罹りやすいか、あるいは、他の場合にはその危険性がある患者に投与される。治療的適用において、組成物または医薬品が、疾患の発達におけるその合併症および中間的な病理学的表現型を含めて、疾患の症状（生化学的、組織学的および／または行動的）を治癒させるために、あるいは、少なくとも部分的に停止させるために十分な量で、そのような疾患が疑われるか、または、そのような疾患に既に苦しんでいる患者に投与される。治療的処置または予防的処置を達成するために適切な量が、治療効果的用量または予防効果的用量として定義される。予防的療法および治療的療法の両方において、薬剤が通常、十分な抗増殖応答が達成されるまで数回の投薬で投与される。典型的には、抗増殖応答がモニターされ、そして、抗増殖応答が弱まり始めるならば、反復した投薬が与えられる。
【０１８７】
効果的な投薬量
本明細書中に記載される疾患（例えば、転移ガン、固形腫瘍または過剰増殖性障害）を処置するためのＮＫ細胞集団の組成物の効果的な用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるか、施される他の薬物治療、および、処置が予防的または治療的であるかを含めて、多くの異なる要因に依存して変化する。通常、患者はヒトであり、しかし、非ヒト哺乳動物（遺伝子組換え哺乳動物を含む）もまた処置することができる。処置投薬量は、安全性および効力を最適化するために力価測定する必要がある。
【０１８８】
治療的なＮＫ細胞集団が投与される場合、投薬量は、患者あたり約１×１０６個のＮＫ細胞から約１×１０９個のＮＫ細胞にまで及ぶ。ＮＫ細胞集団が投与される場合、投薬量は、レシピエントの体重１キログラムあたり約１×１０５個のＮＫ細胞から約１×１０９個のＮＫ細胞にまで及ぶか、または、投薬量は、レシピエントの体重１キログラムあたり約５×１０５個のＮＫ細胞から約１×１０８個のＮＫ細胞にまで及ぶ。例示的な処置療法は、２週間毎につき１回、または、１ヶ月に１回、または、３ヶ月〜６ヶ月毎に１回での投与を伴う。いくつかの方法において、２つ以上のＮＫ細胞集団が同時に投与され、そのような場合、投与されるそれぞれのＮＫ細胞集団の投薬量は、示された範囲の範囲内である。ＮＫ細胞集団の多数回の投与を行うことができる。それぞれの投与の間隔は、毎週、毎月または毎年が可能である。間隔はまた、患者におけるＮＫ細胞集団の血中レベルを測定することによって示されるように不定期であることも可能である。代替的に、ＮＫ細胞集団は持続放出配合物として投与することができ、そのような場合、より少ない頻度での投与が要求される。投薬量および頻度は、患者におけるＮＫ細胞集団の半減期に依存して変化する。投薬量および投与頻度は、処置が予防的または治療的であるかに依存して変化し得る。予防的適用では、比較的少ない投薬量が長期間にわたって比較的少ない頻度の間隔で投与される。一部の患者はその後の生涯にわたって処置を受け続ける。治療的適用では、比較的短い間隔での比較的大きい用量が、疾患の進行が軽減または停止されるまで、また、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで要求されることがある。その後、患者には予防的療法を施すことができる。
【０１８９】
投与経路
疾患（例えば、転移ガン、固形腫瘍または過剰増殖性障害）を処置するための治療的なＮＫ細胞集団の組成物は、静脈内、小胞内、クモ膜下腔内、非経口、局所的、皮下、経口、鼻腔内、動脈内、頭蓋内、腹腔内または筋肉内の手段によって投与することができる。予防剤／補助剤として、または、疾患の処置のために、治療的なＮＫ細胞集団は、過剰増殖性障害もしくは固形腫瘍（例えば、尿生殖器悪性腫瘍）、および／または、治療的処置を標的とする。免疫原性薬剤を投与する最も典型的な経路が皮下であるが、他の経路も同等に効果的であり得る。その次の最も一般的な経路が筋肉内注射である。このタイプの注射は最も典型的には、腕または脚の筋肉に行われる。いくつかの方法において、薬剤が、沈着物が蓄積している特定の組織に直接に注入される（例えば、頭蓋内注射）。筋肉内注射または静脈内注入がＮＫ細胞集団の投与のために好ましい。いくつかの方法において、特定の治療的なＮＫ細胞集団が嚢内に直接に注入される。
【０１９０】
配合物
疾患（例えば、転移ガン、固形腫瘍、ウイルス感染症または過剰増殖性障害）を処置するためのＮＫ細胞集団の組成物。
【０１９１】
疾患（例えば、転移ガン、固形腫瘍または過剰増殖性障害）を処置するための治療的なＮＫ細胞集団の組成物は多くの場合、活性な治療剤、すなわち、本発明のＮＫ細胞集団、および、様々な他の医薬的に許容され得る成分を含む医薬組成物として投与される。例えば、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（以前のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第２０版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００３）を参照のこと（これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。好ましい形態は、意図された投与様式および治療的適用に依存する。組成物はまた、所望される配合物に依存して、医薬的に許容され得る非毒性のキャリアまたは希釈剤を含むことができ、これらは、動物またはヒトに投与されるための医薬組成物を配合するために一般に使用されるビヒクルとして定義される。希釈剤は、組合せの生物学活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の一例が、１０％の熱不活化ヒトＡＢ血清または１０％の自己血清を含有するＸ−ｖｉｖｏ２０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）である。そのような希釈剤のさらなる例が、蒸留水、生理学的なリン酸塩緩衝化生理的食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス溶液である。加えて、医薬組成物または配合物はまた、他のキャリア、補助剤、または、非毒性で、非治療的な非免疫原性安定剤などを含むことができる。
【０１９２】
医薬組成物はまた、大きい、ゆっくり代謝される高分子を含むことができる：例えば、タンパク質、多糖（例えば、キトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えば、ラテックスより機能化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、アガロースおよびセルロースなど）など）、ポリマー状アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソームなど）など。加えて、これらのキャリアは、免疫刺激剤（すなわち、アジュバント）として機能することができる。
【０１９３】
非経口投与のために、本発明の組成物は、無菌の液体（例えば、水、オイル、生理的食塩水、グリセロールまたはエタノールなど）であり得る医薬用キャリアを伴う生理学的に許容され得る希釈剤における物質の溶液または懸濁物の注射可能な投薬物として投与することができる。加えて、補助物質、例えば、湿潤化剤または乳化剤、界面活性剤およびｐＨ緩衝化物質などを組成物に存在させることができる。医薬組成物の他の成分が、石油起源、動物起源、植物起源または合成起源のものである（例えば、ピーナッツ油、ダイズ油および鉱油）。一般に、グリコール（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）が、特に注射可能な溶液については好ましい液体キャリアである。治療的なＮＫ細胞集団は、有効成分の持続した放出を可能にするような様式で配合され得るデポー剤注射またはインプラント調製物の形態で投与することができる。例示的な組成物は治療的なＮＫ細胞集団を５ｍｇ／ｍｌで含み、５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌからなる水性緩衝液において配合され、ＨＣｌによりｐＨ６．０に調節される。
【０１９４】
典型的には、組成物は、液体の溶液または懸濁物のどちらであれ、注射剤として調製される；注射に先立つ液体ビヒクルにおける溶解または懸濁のために好適な固体形態物もまた調製することができる。調製物はまた、上記で議論されるように、リポソームまたはマイクロ粒子（例えば、強化されたアジュバント効果のためのポリラクチド、ポリグリコリドまたはコポリマーなど）において乳化またはカプセル化することができる。Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７、１９９０；Ｈａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２８：９７〜１１９、１９９７（これらはそれらの全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。本発明の薬剤は、有効成分の持続した放出またはパルス的放出を可能にするような様式で配合され得るデポー剤注射またはインプラント調製物の形態で投与することができる。他の投与様式のために好適なさらなる配合物には、経口配合物、鼻腔内配合物および肺用配合物、坐薬、ならびに、経皮適用が含まれる。
【０１９５】
坐薬のために、結合剤およびキャリアには、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる；そのような坐薬を、有効成分を０．５％〜１０％（好ましくは１％〜２％）の範囲で含有する混合物から形成することができる。経口配合物は賦形剤を含む（例えば、医薬規格のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなど）。これらの組成物は、溶液、懸濁物、錠剤、ピル、カプセル、持続放出配合物または粉末の形態を取り、１０％〜９５％の有効成分（好ましくは２５％〜７０％）を含有する。
【０１９６】
医薬組成物は一般に、患者への投与のために好適な形態での治療的ＮＫ細胞集団の組成物を含む。医薬組成物は一般に、無菌かつ実質的に等張性として、また、米国食品医薬品局のすべての優良製造基準（ＧＭＰ）規則に完全に準拠して配合される。
【０１９７】
毒性
好ましくは、本明細書中に記載されるＮＫ細胞集団の組成物の治療効果的な用量は、実質的な毒性を引き起こすことなく、治療上の利益を提供する。
【０１９８】
本明細書中に記載される治療的なＮＫ細胞集団の毒性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）またはＬＤ１００（集団の１００％に対して致死的な用量）を求めることによって、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって求めることができる。毒性影響と、治療効果との用量比が、治療指数である。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用について毒性を示さない投薬量範囲を定める際に使用することができる。本明細書中に記載される治療的なＮＫ細胞集団の投薬量は好ましくは、毒性をほとんど有しないか、または全く有しない効果的な用量を含む循環濃度の範囲の範囲内にある。投薬量は、用いられる投薬形態物および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変化させることができる。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第１章、１９７５）を参照のこと；これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１９９】
キット
本発明の範囲に同様に含まれるものが、本発明の組成物（例えば、治療的ＮＫ細胞集団）と、使用のための説明書とを含むキットである。キットはさらに、少なくとも１つのさらなる試薬、あるいは、本発明の１つまたは複数のさらなるヒト抗体（例えば、第１のヒト抗体とは異なる抗原におけるエピトープに結合する相補的活性を有するヒト抗体）を含有することができる。キットは典型的には、キットの内容物の意図された使用を示すラベルを含む。ラベルの用語には、キットに関して、または、キットとともに供給されるか、あるいは、他の場合にはキットに付随する文書または記録物であれば、どのようなものも含まれる。
【０２００】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０２０１】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。この用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を包含する。
【０２０２】
表現「から本質的になる」は、さらなる成分および／または工程が、特許請求される組成物または方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物または方法がさらなる成分および／または工程を含み得ることを意味する。
【０２０３】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０２０４】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０２０５】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０２０６】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０２０７】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０２０８】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０２０９】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０２１０】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０２１１】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０２１２】
材料および実験手順
臍帯血サンプル
細胞を、（インフォームドコンセントが得られた）正常な満期分娩の後の臍帯血から得た。サンプルを分娩後２４時間以内に集め、凍結した。簡単に記載すると、臍帯血を分娩後の胎盤から重力によって集め、白血球富化画分を密度勾配遠心分離によって分離し、細胞をＤＭＳＯ（１０％）と混合し、その後、−８０℃で凍結した。使用前に、細胞を、２．５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．、Ｅｌｋｈａｒｔ、ＩＮ、ＵＳＡ）を含有するデキストラン緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）において解凍し、凍結保護剤を除いた。
【０２１３】
ＢＭおよび末梢血のサンプル
骨髄（ＢＭ）細胞および末梢血（ＰＢ）細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（１．０７７ｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）に重層し、８００ｘｇで３０分間遠心分離した。境界層における単核細胞を集め、０．５％のＨＳＡを含有するリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）で３回洗浄した
【０２１４】
ＣＤ５６＋細胞の濃縮
臍帯血（ＣＢ）細胞、骨髄（ＢＭ）細胞または抹消血（ＰＢ）細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（１．０７７ｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）に重層し、８００ｘｇで３０分間遠心分離して、単核細胞を分離した。境界層における単核細胞を集め、０．５％のＨＳＡを含有するリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）で３回洗浄した。ＣＤ５６＋細胞を精製するために、単核細胞画分を、「ＭｉｎｉＭＡＣＳまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ５６始原体細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を製造者の推奨法に従って使用して２回の免疫磁石ビーズ分離に供した。簡単に記載すると、ＣＤ５６＋細胞をＣＤ５６＋特異的な磁石免疫ビーズと反応させ、磁石分離器を用いて分離し、洗浄によって非結合細胞から精製した。このようにして得られたＣＤ５６＋集団の純度は、フローサイトメトリーによって評価された場合、およそ９２％である。
【０２１５】
場合により、細胞はＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配で分離されるのでなく、０．５％のＨＳＡを含有するリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で３回洗浄される（「総単核画分」）。最後の洗浄において、細胞を５０μｇ／ｍｌのｒＨｕ−ＤＮＡｓｅと１０分間インキュベーションした。ＣＤ５６＋細胞を精製するために、細胞を、「ＭｉｄｉＭＡＣＳ  ＣＤ５６始原体細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を製造者の推奨法に従って使用して２回の免疫磁石ビーズ分離に供した。このようにして得られたＣＤ５６＋集団の純度は、フローサイトメトリーによって評価された場合、およそ９２％である。
【０２１６】
場合により、骨髄細胞は、ＣＤ１３３＋細胞またはＣＤ３４＋細胞が、「ＭｉｄｉＭＡＣＳまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ１３３細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用して免疫磁石ビーズ分離によって枯渇化され、その後、ＣＤ１３３−またはＣＤ３４陰性の画分が、細胞を、「ＭｉｄｉＭＡＣＳまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ５６始原体細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を製造者の推奨法に従って使用して２回の免疫磁石ビーズ分離に供することによってＮＫ細胞についてさらに濃縮される。
【０２１７】
ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞の濃縮
臍帯血（ＣＢ）細胞、骨髄（ＢＭ）細胞または抹消血（ＰＢ）細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（１．０７７ｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）に重層し、８００ｘｇで３０分間遠心分離して、単核細胞を分離した。境界層における単核細胞を集め、０．５％のＨＳＡを含有するリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）で３回洗浄した。ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞を精製するために、単核細胞画分を、「ＭｉｎｉＭＡＣＳまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ５６始原体細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を製造者の推奨法に従って使用して免疫磁石ビーズ分離に供した。簡単に記載すると、ＣＤ５６＋細胞をＣＤ５６＋特異的な磁石免疫ビーズと反応させ、磁石分離器を用いて分離し、洗浄によって非結合細胞から精製した。精製されたＣＤ５６＋細胞画分を、「ＭｉｎｉＭＡＣＳまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３始原体細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を製造者の推奨法に従って使用して、さらなる免疫磁石ビーズ分離に供した。簡単に記載すると、ＣＤ５６＋細胞をＣＤ３＋特異的な磁石免疫ビーズと反応させ、磁石分離器を用いて分離し、ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞を非結合細胞画分において回収する。このようにして得られたＣＤ５６＋ＣＤ３−集団の純度は、フローサイトメトリーによって評価された場合、およそ８５％〜９７％である。
【０２１８】
場合により、細胞はＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配で分離されるのではなく、０．５％のＨＳＡを含有するリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で３回洗浄される（「総単核画分」）。最後の洗浄において、細胞を５０μｇ／ｍｌのｒＨｕ−ＤＮＡｓｅと１０分間インキュベーションした。ＣＤ５６＋細胞を精製するために、細胞を、「ＭｉｄｉＭＡＣＳ  ＣＤ５６始原体細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を製造者の推奨法に従って使用して２回の免疫磁石ビーズ分離に供する。このようにして得られたＣＤ５６＋集団の純度は、フローサイトメトリーによって評価された場合、およそ９２％である。ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞を精製するために、細胞を、「ＭｉｎｉＭＡＣＳまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ５６始原体細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を製造者の推奨法に従って使用して免疫磁石ビーズ分離に供する。簡単に記載すると、ＣＤ５６＋細胞をＣＤ５６＋特異的な磁石免疫ビーズと反応させ、磁石分離器を用いて分離し、洗浄によって非結合細胞から精製する。精製されたＣＤ５６＋細胞画分を、「ＭｉｎｉＭＡＣＳまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３始原体細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を製造者の推奨法に従って使用して、さらなる免疫磁石ビーズ分離に供した。簡単に記載すると、ＣＤ５６＋細胞をＣＤ３＋特異的な磁石免疫ビーズと反応させ、磁石分離器を用いて分離し、ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞を非結合細胞画分において回収する。このようにして得られたＣＤ５６＋ＣＤ３−集団の純度は、フローサイトメトリーによって評価された場合、およそ８５％〜９７％である。
【０２１９】
場合により、骨髄細胞は、ＣＤ１３３＋細胞またはＣＤ３４＋細胞が、「ＭｉｄｉＭＡＣＳまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ１３３細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用して免疫磁石ビーズ分離によって枯渇化され、その後、ＣＤ１３３−またはＣＤ３４陰性の画分が、細胞を、「ＭｉｄｉＭＡＣＳまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ５６始原体細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を製造者の推奨法に従って使用して２回の免疫磁石ビーズ分離に供することによってＮＫ細胞についてさらに濃縮される。ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞を精製するために、ＣＤ１３３−またはＣＤ３４陰性の画分を、「ＭｉｎｉＭＡＣＳまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ５６始原体細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を製造者の推奨法に従って使用して免疫磁石ビーズ分離に供した。簡単に記載すると、ＣＤ５６＋細胞をＣＤ５６＋特異的な磁石免疫ビーズと反応させ、磁石分離器を用いて分離し、洗浄によって非結合細胞から精製する。精製されたＣＤ５６＋細胞画分を、「ＭｉｎｉＭＡＣＳまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３始原体細胞単離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を製造者の推奨法に従って使用して、さらなる免疫磁石ビーズ分離に供した。簡単に記載すると、ＣＤ５６＋細胞をＣＤ３＋特異的な磁石免疫ビーズと反応させ、磁石分離器を用いて分離し、ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞を非結合細胞画分において回収する。このようにして得られたＣＤ５６＋ＣＤ３−集団の純度は、フローサイトメトリーによって評価された場合、およそ８５％〜９７％である。
【０２２０】
培養前におけるＣＤ３＋細胞またはＣＤ３＋ＣＤ１９＋細胞の枯渇化
枯渇化手順のために、臍帯血（ＣＢ）細胞、骨髄（ＢＭ）細胞または抹消血（ＰＢ）細胞から得られる総有核細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（１．０７７ｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）に重層し、８００ｘｇで３０分間遠心分離して、単核細胞を分離した。境界層における細胞を集め、０．５％のＨＳＡを含有するリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）で３回洗浄した。場合により、細胞はＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配で分離されるのではなく、０．５％のＨＳＡを含有するリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）で３回洗浄される（「総単核画分」）。ＣＤ３細胞を、ＣＤ３細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用して枯渇化し、ＣＤ３陰性細胞画分全体を培養した。場合により、ＣＤ１９細胞もまた、ＣＤ１９細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用して枯渇化し、ＣＤ３／ＣＤ１９陰性（ＣＤ３／ＣＤ１９枯渇化）細胞画分を培養した。場合により、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ３＋細胞枯渇化カクテル（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＲｏｓｅｓｔｔｅＳｅｐ、カタログ番号１５６６１）をＣＤ３枯渇化のために使用し、ＣＤ３陰性細胞画分全体を培養した。陰性枯渇後、細胞を計数し、ＦＡＣＳ分析によって特徴づけた。
【０２２１】
エクスビボ培養：
１．総単核細胞画分を、０．５〜２×１０６細胞／ｍｌの濃度で、培養バッグ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ  Ｃｏ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）、Ｔ−フラスコまたは２４ウエルプレートにおいて、ＯＫＴ−３（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）を伴って、または伴うことなく、ニコチンアミド（０．５〜１０ｍＭ）を伴って、または伴うことなく、下記のヒト組換えサイトカインを含有する、１０％のＦＣＳを含むＭＥＭα、または、５％〜１０％のヒト血清／ＬｉｆｏｒＣｅｌｌ（登録商標）ＦＢＳ代替物（Ｌｉｆｅｂｌｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を含むＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ（Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｉｘ）において培養した：インターロイキン−２（ＩＬ−２）（５〜５０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン７（ＩＬ７）、インターロイキン２１（ＩＬ２１）、ＦＬＴ−３またはＳＣＦあるいはＦＬＴ３およびＳＣＦ（Ｐｅｒｐｏ  Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）。インキュベーションを空気における５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で行った。ＯＫＴ−３が培養で使用されたとき、培養物を５日後〜７日後に遠心分離し、細胞を、ＯＫＴ−３を除く同じ培地により再懸濁した。すべての培養物には、毎週または週に２回、ニコチンアミドを伴って、または伴うことなく増殖因子を含有する同じ体積の新鮮な培地が加えられる。計数のために、細胞をトリパンブルーにより染色した。様々な時点で、サンプルを採取して、ＮＫ細胞、ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞、ＣＤ５６＋ＣＤ３＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋細胞および／またはＣＤ５６＋ＮＫＧ２Ａ細胞の相対的割合をアッセイした。細胞形態学を、メイ−グリュンワルド／ギムザ溶液により染色されたサイトスピン（Ｓｈａｎｄｏｎ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）調製塗沫標本で求めた。
【０２２２】
２．総有核細胞または総単核細胞から得られる、あるいは、ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ１３３＋細胞から枯渇化された画分から得られる精製されたＣＤ５６＋細胞またはＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞を、１〜１００×１０４細胞／ｍｌの濃度で、培養バッグ、Ｔ−フラスコまたは２４ウエルプレートにおいて、ニコチンアミドを伴って、または伴うことなく、下記のヒト組換えサイトカインを含有するＭＥＭα／１０％ＦＣＳ、または、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ（Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｉｘ）／５％ヒト血清／ＬｉｆｏｒＣｅｌｌ（登録商標）ＦＢＳ代替物（Ｌｉｆｅｂｌｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）において培養した：インターロイキン−２（ＩＬ−２）（５〜５０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、ＦＬＴ−３またはＳＣＦ、あるいは、ＦＬＴ３およびＳＣＦ、あるいは、ＩＬ−２およびＩＬ−１５、あるいは、ＩＬ−２のみ（Ｐｅｒｐｏ  Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）。インキュベーションを空気における５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で行った。培養物には、毎週または週に２回、ニコチンアミドを伴って、または伴うことなく増殖因子を含有する同じ体積の新鮮な培地が加えられた。最終的には、培養には、ＩＬ−２、ならびに／または、ＩＬ−２およびＩＬ−１５が週に１回または数回補充され得る。培養されている細胞の数を推定するために、細胞サンプルを計数のためにトリパンブルーにより染色した。様々な時点で、サンプルをＦＡＣＳ分析のために採取して、ＮＫ細胞、ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞、ＣＤ５６＋ＣＤ３＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋細胞および／またはＣＤ５６＋ＮＫＧ２Ａ細胞の相対的割合をアッセイした。
【０２２３】
３．ＰＢ、ＢＭおよびＣＢから得られるＣＤ３＋枯渇化またはＣＤ３＋／ＣＤ１９＋枯渇化の単核細胞画分を、１〜１０００×１０４細胞／ｍｌの濃度で、培養バッグ、Ｔ−フラスコまたは２４ウエルプレートにおいて、ニコチンアミドを伴って、または伴うことなく、下記のヒト組換えサイトカインを含有するＭＥＭα／１０％ＦＣＳ、または、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ（Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｉｘ）／５％ヒト血清／ＬｉｆｏｒＣｅｌｌ（登録商標）ＦＢＳ代替物（Ｌｉｆｅｂｌｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）において培養した：ＦＬＴ−３またはＳＣＦ、あるいは、ＦＬＴ３およびＳＣＦ（５〜５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｒｐｏ  Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）を伴って、または伴うことなく、インターロイキン−２（ＩＬ−２）または／およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）（すべての組合せ）。インキュベーションを空気における５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で行った。培養物には、毎週または週に２回、ニコチンアミドを伴って、または伴うことなく増殖因子を含有する同じ体積の新鮮な培地が加えられた。培養には、その後、ＩＬ−２、ならびに／または、ＩＬ−２およびＩＬ−１５が週に１回または数回補充された。培養されている細胞の数を推定するために、細胞サンプルをトリパンブルーによる染色の後で計数した。様々な時点で、サンプルをＦＡＣＳ分析のために採取して、ＮＫ細胞、ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞、ＣＤ５６＋ＣＤ３＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋細胞および／またはＣＤ５６＋ＮＫＧ２Ａ細胞の相対的割合をアッセイする。
【０２２４】
４．ＰＢ細胞、ＢＭ細胞およびＣＢ細胞から得られる総単核細胞画分、総有核細胞または総単核細胞からの、または、ＣＤ３４＋またはＣＤ１３３＋から枯渇化された画分からの精製されたＣＤ５６＋細胞またはＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞、および、ＣＤ３＋枯渇化またはＣＤ３＋／ＣＤ１９＋枯渇化の単核細胞画分もまた、１〜１００００×１０４細胞／ｍｌで、バイオリアクター（例えば、ＧＥ  Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒバッグ、または、Ｇａｓ  Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｗａｒｅフラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ））において培養することができる。培養培地は、ニコチンアミドとともに、ＭＥＭα、ヒト血清（１０％ｖ／ｖ）、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２、場合により５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２、場合によりＩＬ−１５を含有した。培養物には、毎週または週に２回、ニコチンアミドを伴って、または伴うことなく増殖因子を含有する同じ体積の新鮮な培地が加えられた。培養には、その後、ＩＬ−２、ならびに／または、ＩＬ−２およびＩＬ−１５が週に１回または数回補充された。細胞を、１週間後、２週間後および３週間後に計数し、ＦＡＣＳ分析のために染色した。
【０２２５】
放射線照射された間質とのＮＫ細胞培養
ＰＢ、ＢＭおよびＣＢから得られる総単核細胞画分からのＮＫ細胞、総有核細胞または総単核細胞からの、または、ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ１３３＋細胞から枯渇化された画分からの精製されたＣＤ５６＋細胞またはＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞、あるいは、ＣＤ３＋枯渇化またはＣＤ３＋／ＣＤ１９＋枯渇化の単核細胞画分を、放射線照射された間質とともに培養することができる。放射線照射された間質（フィーダー細胞）を調製するために、単核細胞に３０００ｒａｄの放射線照射を行った。ＣＤ５６またはＣＤ５６＋ＣＤ３−の選択あるいはＣＤ３枯渇化の後、細胞を、本明細書中上記で記載されるように計数し、ＦＡＣＳ分析によって特徴づけた。細胞を、ニコチンアミドを伴って、または伴うことなく、放射線照射された間質を伴って、または伴うことなく、２０×１０５細胞／ｍｌの放射線照射細胞の濃度で、本明細書中上記で記載されるように培養した。
【０２２６】
ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析のために、細胞を下記の蛍光性抗体により染色した：ＣＤ１５  ＦＩＴＣ（カタログ番号３３２７７８）、ＣＤ１４  ＦＩＴＣ（カタログ番号３４５７８４）、ＣＤ３  ＡＰＣ（カタログ番号３４５７６７）（すべてが、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得られる）、ＣＤ６２Ｌ  ＰＥ（カタログ番号３０４８０６）（これはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得られる）、ＣＤ５６  ＦＩＴＣ（カタログ番号１１−０５６９−４２、これはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得られる）、および、ＣＤ４５  ＰＥ（カタログ番号Ｒ７８０７、これはＤａｋｏ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）から得られる）。
【０２２７】
ＮＫ細胞はまた、ＣＸＣＲ４、ＫＩＲ３、ＤＬ１／２、ＤＬ２／２、ＤＬ１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＲＡＩＬ、Ｆｃ−ガンマ受容体ＩＩＩｂ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、Ｆａｓ−Ｌ、Ｌ−セレクチン、フィコエリトリン、ＩＬ−２受容体γ鎖（ＣＤ１６）、ＶＬＡ−５α鎖およびＣＤ８によっても特徴づけられた。
【０２２８】
０日目に播種されたＮＫ細胞の数の計算
０日目でのＮＫ細胞の数を計算するために、０日目に播種されたＮＫ細胞の総数に、０日目にＦＡＣＳによって測定されるＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞のパーセントを乗じた。
【０２２９】
培養されているＮＫ細胞数の計算、ならびに、播種後７日、１４日および２１日での増大倍数
７日目、１４日目および２１日目における細胞の総数を求めるために、細胞カウント数／ｍｌに培養培地の体積を乗じた。培養されているＮＫ細胞の数を求めるために、培養されている細胞の総数に、７日目、１４日目または２１日目にＦＡＣＳにより測定されるＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞のパーセントを乗じた。拡大倍数を見積もるために、７日目、１４日目および２１日目におけるＮＫ細胞の総数を、０日目に培養において播種されたＮＫ細胞の総数によって除算した。
【０２３０】
表面抗原分析
細胞を、１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液により洗浄し、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）とコンジュゲート化された抗体あるいはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）により染色した（４℃で３０分間）。その後、細胞を上記緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分析した。細胞を１０００細胞／秒までの割合で通過させ、４８８ｎｍまたは６６１ｎｍのアルゴンレーザービームを励起用光源として使用した。１０４個の細胞の放射を、対数増幅を使用して測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。ＦＩＴＣコンジュゲート化、ＰＥコンジュゲート化およびＡＰＣコンジュゲート化のイソ型コントロール抗体により染色された細胞を使用して、バックグラウンド蛍光を求めた。
【０２３１】
ＮＫ細胞の機能性の測定
「殺傷」アッセイ：ＮＫ細胞（エフェクター細胞＝Ｅ）をＫ５６２またはＢＬ２（標的細胞＝Ｔ）あるいは二形質性白血病細胞と種々のＥ対Ｔ比（Ｅ：Ｔ）で一緒にする。ＰＢＳにおけるＢＬ２またはＫ５６２あるいは二形質性白血病細胞の標的細胞を１ｎｇ／ｍｌのＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により３７℃で１５分間標識した。子ウシ血清を細胞に１５分間加え、その後、細胞をＲＰＭＩ培地において洗浄し、再懸濁した。１００μＬの二形質性白血病細胞、ＢＬ２細胞またはＫ５６２細胞をウエルあたり５×１０３細胞の濃度で９６丸底プレートに入れた。１００μＬの非染色ＮＫ細胞を、１：１、２．５：１、５：１、１０：１または２０：１のＥ：Ｔ比で、二形質性白血病細胞、ＢＬ２細胞またはＫ５６２細胞に加えた（示されるように、それぞれ、５×１０３細胞／ウエル、１．２５×１０４細胞／ウエル、２．５×１０４細胞／ウエル、５×１０４細胞／ウエルおよび１×１０５細胞／ウエル）。その後の２時間〜４８時間の間で、細胞株における標的細胞（例えば、Ｋ５６２およびＢＬ−２など）の殺傷を、プロピジウム−ヨウ素（ＰＩ）陽性（死）のＣＦＳＥ標識細胞の百分率としてＦＡＣＳによって求めた。初代白血病細胞の殺傷を、ＮＫ細胞とのそれらの培養の後で培養液に留まったＣＦＳＥ染色細胞の数をＦＡＣＳにより計数することによって求めた。より少ない数のＣＦＳＥ＋細胞により、より大きい殺傷レベルが示される。
【０２３２】
走化性（「遊走」）アッセイ：ヒトＮＫ細胞の遊走応答（走化性）を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ遊走アッセイ（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；６．５ｍｍの直径、５μｍの細孔サイズ）によってアッセイした。簡単に記載すると、２×１０５個のＮＫ細胞を含有する１００μＬの走化性緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０、１％ＦＣＳ）を上部チャンバーに加え、そして、２５０ｎｇ／ｍｌの間質由来因子ＣＸＣＬ１２（「ＳＤＦ−１」）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を伴うか、または伴わない０．５ｍＬの走化性緩衝液を底部チャンバーに加えた。「トランスウエル」の底部チャンバーに４時間以内に遊走する細胞を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して６０秒間計数した。
【０２３３】
「インビボ」でのホーミングおよび生着：
ＮＫ細胞を、上記で記載されるように、２．５ｍＭまたは５．０ｍＭのニコチンアミドを用いて、または用いることなく拡大した。培養において２週間〜３週間の後、類似する数（１５×１０６個）の細胞を放射線照射（３５０Ｒａｄ）されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注入した。マウスを注入後４日で屠殺した。脾臓、骨髄および末梢血を、ヒトＮＫ（ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋）細胞を内因性細胞から区別するために、免疫磁石ビーズを使用してヒトＮＫ（ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋）細胞のホーミングおよび生着について分析した。生着が、抗ヒト特異的抗体を使用して、組織において特定されるマウス内因性細胞の総数からの、移植された系譜（ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋）を有するＮＫ細胞の％として表される。
【０２３４】
ＮＫ細胞表面におけるＣＤ６２Ｌ発現のアッセイ
培養を、免疫磁石ビーズにより精製され、ニコチンアミド（２．５ｍＭ、５ｍＭおよび７．５ｍＭ）を伴って、または伴うことなくサイトカイン（ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）により活性化された末梢血由来のＣＤ５６＋細胞を用いて開始した。ＮＫ細胞を、培養における活性化の前、および、ニコチンアミドとの３週間のインキュベーションの後、指定された表面マーカー（例えば、ＣＤ６２Ｌ）に対する特異的抗体により染色し、その後、ＦＡＣＳによってモニターした。
【０２３５】
結果
実施例Ｉ：ニコチンアミドはＮＫ細胞のエクスビボ生長を高める
ＮＫ細胞のエクスビボ成長に対する添加ニコチンアミドの影響を評価するために、臍帯血細胞または骨髄細胞を、フィーダー細胞またはフィーダー層を伴うことなく、増殖因子（サイトカイン）および増大する濃度のニコチンアミドとともにインキュベーションし、ＮＫ細胞画分および非ＮＫ（例えば、ＣＤ３＋）細胞画分を種々の時点で測定した。
【０２３６】
臍帯血由来のＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−のＮＫ細胞集団に富むことが見出されたが、比較的少数のＣＤ５６＋ＣＤ３＋のＮＫＴ細胞を含有する。精製された臍帯血ＮＫ細胞（ＣＤ５６＋）を、ＩＬ−２およびＩＬ−１５の存在下、ニコチンアミドとともにインキュベーションしたとき、ＮＫ細胞の著しく高まった増殖が、培養の１４日もの初期において、また、試験されたすべての濃度で明白であった。図１Ａは、１４日における２．５ｍＭのニコチンアミドによるＮＫ細胞の増殖が、増殖因子（「サイトカイン」）（ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）だけとともにインキュベーションされた細胞の増殖の４倍を超え、５ｍＭのニコチンアミドではさらに一層大きかったことを示す。より広い範囲のニコチンアミド濃度が試験されたとき（図１Ｂ）、０．５ｍＭから５ｍＭまでのニコチンアミドのすべての濃度による３週間の培養はＮＫ細胞の増殖を高め、増殖因子（「サイトカイン」）（ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）だけとともにインキュベーションされた同じ細胞の増殖の最大で２．５倍であったことが見出された。
【０２３７】
ニコチンアミドはまた、混在した非選択の臍帯血単核細胞集団からのＮＫ細胞の増殖を高めることができた。非選択の臍帯血単核細胞の培養物には、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭおよび５ｍＭのニコチンアミドを伴って、または伴うことなく、１０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３、２０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、５ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２）が補充された。エクスビボでのＮＫ細胞の増殖に対するニコチンアミドの特異的な影響をさらに評価するために、生長細胞の分析を、増大する濃度のニコチンアミドを伴うか、または伴うことなく培養において３週間後に行った。図２Ａおよび図２Ｂは、単核画分からのＣＤ５６＋／ＣＤ４５＋細胞およびＣＤ５６＋／ＣＤ３−ＮＫ細胞の培養における増殖の明らかに用量依存的なニコチンアミド誘導による強化を示す。図２Ｃは、ＣＤ３＋ＣＤ５６−Ｔ細胞の成長が、これもまた用量依存的様式であるが、ニコチンアミド処理培養において阻害されたことを明瞭に示しており、一方、ニコチンアミドを伴わないコントロール培養で成長させたＣＤ３＋細胞はＮＫ細胞よりも数が多かった。したがって、ＮＫ細胞およびＣＤ３＋（例えば、ＴおよびＮＫＴ）細胞の混合細胞集団をニコチンアミドとともに培養することにより、ＮＫ細胞区分のさらなる増強がもたらされ、一方、ニコチンアミドを伴わない、サイトカインのみによる培養はＮＫ細胞の増殖をほとんど支援せず、むしろ、ＣＤ３＋細胞の増殖を高める。
【０２３８】
骨髄細胞および末梢血細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３＋のＮＫＴ細胞集団およびＣＤ５６＋ＣＤ３−のＮＫ細胞集団の両方を含有するＣＤ５６＋細胞の不均一な集団を含有することが見出された。骨髄由来ＮＫ細胞の増殖が、ニコチンアミドとのインキュベーションによって同様に高められた。接種された骨髄由来の精製されたＣＤ５６＋細胞の特徴づけにより、約２０％〜６０％の細胞がＮＫＴ細胞の表現型（ＣＤ５６＋ＣＤ３＋）を呈示し、４０％〜８０％がＮＫ細胞の表現型（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）を呈示することが示される（種々のＢＭサンプルの間で変動する）。したがって、ＢＭ由来のＣＤ５６＋細胞は、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞の混合集団を含む。増殖因子（「サイトカイン」）（ＦＬＴ３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）だけとともにインキュベーションされた骨髄由来のＣＤ５６＋細胞におけるＮＫ細胞の増殖は、培養において１４日後、ほとんど増大しなかったが、増殖因子および２．５ｍＭのニコチンアミドとともにインキュベーションされたＣＤ５６＋細胞におけるＮＫ細胞の増殖は、１４日の培養（増大倍数＝８）と、２１日の培養（増大倍数＝１２）との間で５０％増大した（図３）。２１日における培養細胞のＣＤ５６＋ＣＤ３−サブセットおよびＣＤ５６＋ＣＤ３＋サブセットのさらなる分析では、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞がニコチンアミド処理培養ではＣＤ５６＋ＣＤ３＋ＮＫＴ細胞を圧倒的に上回り（８０％を超え）、一方、増殖因子（「サイトカイン」）（ＦＬＴ３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）だけとともにインキュベーションされた骨髄由来のＣＤ５６＋細胞は主としてＮＫＴ細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ３＋）であり、ＮＫ細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）でなかったことが明らかにされた（図４Ａおよび図４Ｂ）。したがって、不均一なＮＫ＋ＮＫＴの細胞集団の、ニコチンアミドとの培養は、ＮＫＴ細胞の最小限の増殖を伴って、ＮＫ細胞区分のさらなる生長および濃縮をもたらし、一方、ニコチンアミドを伴わない、サイトカインのみとの培養はＮＫ細胞の優先的な増殖を支援しない。
【０２３９】
ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋の細胞傷害性ＮＫ細胞集団は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）が可能であることが明らかにされている。培養において１４日後および２１日後での、２．５ｍＭのニコチンアミドを伴って、または伴うことなく、増殖因子とともに培養された骨髄ＣＤ５６＋細胞由来のＣＤ５６＋ＣＤ１６＋細胞の分析では、増殖因子（「サイトカイン」）（ＦＬＴ３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）だけとともにインキュベーションされた骨髄由来のＣＤ５６＋細胞を上回る、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋の表現型を呈示するＮＫ細胞の割合における著しい増大が明らかにされた（図５を参照のこと）。
【０２４０】
骨髄由来のＣＤ５６＋細胞が、増殖因子（「サイトカイン」）（ＦＬＴ３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）およびニコチンアミドとともに７日間、エクスビボ培養されたとき、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞サブセットの増殖の強化（図６Ａ）およびＣＤ５６＋ＣＤ３＋ＮＫＴ細胞の低下した増殖（図６Ｂ）が、１ｍＭ、２．５ｍＭおよび５ｍＭのニコチンアミドにおいて明白であった。７日におけるＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の増殖は、２．５ｍＭおよび５ｍＭのニコチンアミドにより最も高められた（図６Ｃ）。
【０２４１】
ニコチンアミドおよび培養された末梢血ＮＫ細胞の自己再生能：
末梢血単核細胞が、ＣＤ３＋集団またはＣＤ３＋／ＣＤ１９＋集団の枯渇化に供されるとき、ＮＫ細胞が濃縮された集団が得られ、これは２％〜１０％のＮＫ細胞を含み、播種された細胞の大部分が骨髄系の細胞系譜に属する。しかしながら、ニコチンアミドとの培養において２週間〜３週間の後、培養されている細胞の９０％超がＮＫ（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）細胞であった。
【０２４２】
図１０は、規模拡大された培養（培養バッグにおける１０ｍｌの体積）において、サイトカイン（ＩＬ−２、または、ＩＬ−２＋ＩＬ−１５）の存在下での３週間の培養期間の期間中における末梢血ＮＫ（Ｔ細胞枯渇化）細胞の拡大を例示する。拡大が、培養において最初の７日の期間中はすべての群でより遅かった。１４日後および２１日後、ＮＫの拡大が、ニコチンアミドを伴うことなく成長させられたコントロール培養（ＮＡＭ  ０）と比較して、２．５ｍＭおよび５ｍＭの両方のニコチンアミドにより処理された培養において著しくより大きかった。興味深いことに、ニコチンアミドとともに成長させられたＮＫ細胞は１４日目から２１日目まで増殖し続け、一方、ＮＡＭを伴うことなく処理されたＮＫ細胞は増殖を停止した。
【０２４３】
培養が所与の範囲の播種密度とともに開始されたとき（２×１０５個、５×１０５個および１０×１０５個の細胞が播種されたとき）、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞の増殖の非常に大きい強化が、２１日後、２．５ｍＭおよび５ｍＭの両方で認められた（図１１）。播種後２１日におけるＮＫ細胞培養物のＦＡＣＳ分析では、２．５ｍＭおよび５ｍＭの両方でのニコチンアミドを伴う培養の、ＮＫ（ＣＤ５６＋／ＣＤ３−）集団についての明瞭な利点が示される。ＮＫ細胞の百分率がたとえ、すべての群で増大したとしても、ニコチンアミドにより処理された培養物における非ＮＫ細胞画分は、ニコチンアミドを伴わないコントロール培養物と比較して、より小さいことに留意すること（図１２）。
【０２４４】
ニコチンアミド濃度および臍帯血由来の精製されたＣＤ５６＋ＮＫ細胞の拡大
臍帯血由来のＮＫ細胞画分（これはＣＤ５６＋表現型について免疫磁石ビーズで精製されていた）が、最大で３週間、サイトカイン（ＦＬＴ３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）だけ（サイトカイン）とともに、または、増大する濃度（ＮＡＭ  １ｍＭから７．５ｍＭまで）のニコチンアミドの存在下で培養されたとき、試験されたニコチンアミドのすべての濃度が、サイトカインのみのコントロールと比較して、臍帯血由来のＮＫ細胞においてＮＫの増幅を高めることにおいて効果的であることが認められた（図１７を参照のこと）。コントロール（サイトカイン）と比較して、全培養期間を通して続く、ニコチンアミドにさらされた培養物の拡大における用量依存的増大に留意すること。したがって、ＮＫ細胞増殖のニコチンアミド増強は、長期間と同様に、短期間のエクスビボＮＫ培養のために効果的であり、フィーダー層またはフィーダー細胞を必要とせず、所与の範囲のニコチンアミド濃度にわたって明らかであり、かつ、どちらのＮＫリッチ物も、すなわち、ＮＫ細胞および非ＮＫ細胞（ＣＤ３＋、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞など）の混合物、または、非常に不均一な単核細胞集団を供給源として使用することができる（これらは様々な開始細胞集団（例えば、末梢血、臍帯血）から得られ、すべてが、治療的使用のための非常に多数のＮＫ細胞を提供するために重要である）。
【０２４５】
実施例ＩＩ−ニコチンアミドへのエクスビボ暴露はＮＫ細胞の機能を高める
ＮＫ細胞が阻害性刺激および活性化刺激の両方に対する応答によって特徴づけられ、また、効果的であり、それにもかかわらず、特異的な細胞傷害性を有する機能的ＮＫ細胞の産生が、エクスビボＮＫ細胞培養のどのような検討にとっても非常に重要である。ＮＫ細胞の機能に対するニコチンアミドの影響を細胞マーカーに対するその影響によって評価し、走化性「Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ」遊走アッセイおよび標的細胞「殺傷」アッセイを使用して試験した。阻害性ＮＫ細胞画分および活性化ＮＫ細胞画分の存在率における変化を検出するために、精製された臍帯血由来のＣＤ５６＋細胞を、１ｍＭ、２．５ｍＭおよび５ｍＭのニコチンアミドを伴って、または伴うことなく、増殖因子［１０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３、２０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）および５ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２）］とともにウエルにおいて培養した。３週間の培養の後、ＮＫ細胞の中の阻害性ＣＤ５６＋ＮＫＧ２Ａ細胞画分の存在率における著しい用量依存的減少が、増殖因子（ＦＬＴ３、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）だけとともにインキュベーションされた臍帯血由来のＮＫ細胞と比較した場合、すべてのニコチンアミド濃度で検出された（図７）。このことは、ニコチンアミドによるＮＫ細胞の高まった活性化を示唆している。
【０２４６】
機能適格なＮＫ細胞をそれらの走化性および細胞傷害能によって特徴づけることができる。ＮＫ細胞の機能に対するニコチンアミドの影響を評価するために、インビトロでの遊走アッセイ（走化性）および殺傷アッセイ（細胞傷害性）を行った。
【０２４７】
増殖因子および２．５ｍＭまたは５ｍＭのニコチンアミドとともに培養された、免疫磁石精製された臍帯血由来のＣＤ５６＋細胞の、２５０ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ刺激に対する応答における遊走が、増殖因子だけとともに培養されたＣＤ５６＋細胞の遊走と比較して非常に高められた（図８Ａ）。加えて、ニコチンアミドとともに培養されたＣＤ５６＋細胞は、高まった運動性をＳＤＦ刺激の非存在下で示した。
【０２４８】
機能的に関連づけられる細胞表面受容体に対するニコチンアミドの影響を調べた。培養された臍帯血由来のＮＫ細胞における遊走受容体（ＣＸＣＲ４）、接着受容体（ＣＤ４９ｅ）および輸送受容体（ＣＤ６２Ｌ）の発現を、特異的抗体およびＦＡＣＳ分析を使用して分析したとき、コントロール（サイトカインのみ）と比較して、ニコチンアミドの存在下で培養された細胞におけるＣＸＣＲ４およびＣＤ６２Ｌの強く高まった発現、ならびに、ＣＤ４９ｅの上昇した発現（図８Ｂ）により、骨髄、リンパ系器官および他の器官に遊走およびホーミングするニコチンアミド処理細胞の増大した能力が示唆され、また、ニコチンアミドとともに培養されたＮＫ細胞の優れたインビボでのホーミングおよび活性が予想され得る。
【０２４９】
ニコチンアミドの存在下で培養されるＴ細胞枯渇化（ＣＤ３枯渇化またはＣＤ３／ＣＤ１９枯渇化）された末梢血ＮＫ細胞集団の表面における輸送受容体（ＣＤ６２Ｌ）の発現が分析されたとき、コントロール細胞（サイトカイン）と比較して、この受容体の上昇した発現が認められた。２．５ｍＭおよび５ｍＭの両方のニコチンアミドにおいて、ＮＫ細胞の中のＣＤ６２Ｌ陽性細胞の増大した百分率が、培養において７日後（図１３Ａ）、１４日後（図１３Ｂ）および２１日後（図１３Ｃ）に認められ、一方、サイトカインのみのコントロールにおける、ＣＤ６２Ｌを発現するＮＫ細胞のパーセントが、培養において７日後の２０％から、２１日後の１０％未満にまで低下した。
【０２５０】
図２０は、ＩＬ−２との培養における活性化の前における、末梢血由来の免疫ビーズ精製されたＣＤ５６＋細胞でのＣＤ６２Ｌ輸送受容体発現のレベル、ＩＬ−２による活性化の後でのＣＤ６２Ｌ発現のレベルにおける劇的な減少、ならびに、ＩＬ−２および増大する濃度のニコチンアミド（２．５ｍＭ〜７．５ｍＭ）との培養における活性化の後でのＣＤ６２Ｌの発現における顕著な増大を示す。培養を、免疫磁石ビーズ精製された末梢血由来のＣＤ５６＋細胞を用いて開始し、サイトカインのみ（ＩＬ−２およびＩＬ−１５を含む）の存在下（図２０の欄「０」を参照のこと）、または、サイトカイン＋ニコチンアミド（２．５ｍＭ、５ｍＭおよび７．５ｍＭ）の存在下で維持した。培養前、および、培養において３週間後、ＮＫ細胞を特異的なＣＤ６２Ｌ抗体により染色し、その後、ＦＡＣＳによってモニターした。コントロール（サイトカインのみ、「０」）と比較して、ニコチンアミドの存在下で培養された細胞におけるＣＤ６２Ｌの劇的に高まった発現に留意すること。挿入図はＦＡＣＳデータであり、ＣＤ５６の分布に対してプロットされるＣＤ６２Ｌの分布を示す。
【０２５１】
ＣＦＳＥ標識されたＫ５６２標的細胞を使用してアッセイされるＮＫ細胞の殺傷能を、ニコチンアミドを伴うか、または伴うことなく増殖因子とともに培養された臍帯血由来のＣＤ５６＋細胞について評価した。１：５、１：１０および１：２０のＮＫ細胞対標的のＥ：Ｔ比率において、増殖因子およびニコチンアミドとともに培養された臍帯血由来のＮＫ細胞の殺傷（細胞傷害）能は、増殖因子のみにおいて培養された同じ数の細胞の殺傷（細胞傷害）能よりもはるかに大きかった（図９）。新鮮な非培養細胞は殺傷能をほとんど示さなかった。
【０２５２】
末梢血ＮＫ細胞の殺傷能を、ＣＦＳＥ標識されたＫ５６２標的細胞およびＢＬ２標的細胞を使用してアッセイし、２．５ｍＭまたは５．０ｍＭのニコチンアミドを伴うか、または伴うことなく増殖因子とともに３週間培養された末梢血由来のＣＤ５６＋細胞について評価した。標的細胞の死を、ＰＩ陽性のＣＦＳＥ標識細胞の百分率としてＦＡＣＳによってモニターした。１：１から１０：１までのＮＫ細胞対標的のＥ：Ｔ比率において、増殖因子およびニコチンアミドとともに培養される拡大された末梢血由来のＮＫ細胞の殺傷（細胞傷害）能は、増殖因子のみにおいて培養される同じ数の細胞の殺傷（細胞傷害）能よりもはるかに大きかった（図１５Ａ）。
【０２５３】
末梢血由来の拡大されたＮＫ細胞の細胞傷害能もまた、ヒト初代二形質性白血病細胞（９０％超の細胞がＣＤ３＋のＴ細胞である）を標的細胞として使用して明らかにされた。図１５Ｂおよび図１５Ｃは、２名の別個のドナー（ドナーＡおよびドナーＢ）のＮＫ細胞を使用する２４時間後の結果を示す。結果は、ニコチンアミドとともに培養することによるＮＫ細胞の殺傷能の増大した活性化を示している。殺傷能がドナーＡ由来の培養されたＮＫコントロール細胞において何ら認められないことは、ＮＫ細胞に対するニコチンアミドの強い活性化効果をさらに示すものである。
【０２５４】
重要な治療標的である固形腫瘍細胞に対する、ニコチンアミドとともに拡大された末梢血由来のＮＫ細胞の細胞傷害能が、ｃｏｌｏ２０５結腸直腸腺ガン細胞株の細胞を標的細胞として使用して明らかにされた。図１５Ｄは、試験されたＥ：Ｔ比率（１：１〜１０：１）のすべてにおいて、５ｍＭのニコチンアミドを用いたＮＫ細胞の培養による増大した殺傷能を示す。
【０２５５】
まとめると、これらの結果は、ニコチンアミドへのＣＤ５６＋細胞の暴露は、ＮＫ細胞の増殖を、具体的にはＣＤ５６＋ＣＤ６２Ｌ細胞集団の増殖を増大させるだけでなく、ニコチンアミドの存在下で生長させられた細胞は、ニコチンアミドを伴うことなく、増殖因子だけとともに培養された類似する細胞よりも大きい運動性、方向づけられた遊走および細胞傷害能を有することを示している。さらに、本明細書中に示される結果は、ニコチンアミドが、ＮＫ細胞の増殖および機能性を高めるために効果的であることを示している（この場合、ＮＫ細胞は、精製されたＮＫ細胞または総単核細胞画分に由来するＮＫ細胞であるかにかかわらず、また、様々な供給源（例えば、末梢血、骨髄または臍帯血など）に由来する）。
【０２５６】
実施例ＩＩＩ−フィーダー細胞とともに培養されたＮＫ細胞の増殖に対するニコチンアミドの影響
ＮＫ細胞はまた、フィーダー細胞とともに培養することができる。ＮＫ細胞の増殖および機能性に対するニコチンアミドの影響を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）フィーダー細胞との共培養において評価した。
【０２５７】
一般に、フィーダー細胞との培養は下記のように行われる：ＮＫ含有細胞集団（例えば、臍帯血、末梢血、骨髄）が、放射線照射された同種由来または自己由来のＰＢＭＣフィーダー細胞の存在下、１０：１〜１００：１のフィーダー：培養細胞の比率で、ＦＬＴ３、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を含むサイトカインと、増大する濃度のニコチンアミド（０．５ｍＭ〜１０ｍＭ）との組合せとともに培養される。培養は２週間〜５週間維持され、フィーダー細胞培養におけるニコチンアミドの影響が、ＮＫおよび非ＮＫの細胞およびサブセット（例えば、ＣＤ５６＋、ＣＤ３＋、ＣＤ５６＋ＣＤ３−、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋）の分布、ならびに、ＮＫ細胞の機能（例えば、走化性、細胞傷害性）に基づいて評価される。フィーダー細胞培養においてニコチンアミドとともに培養されたＮＫ細胞の増大した増殖および機能性により、培養におけるＮＫ細胞の生長のためのニコチンアミドのさらなる有用性が示される。
【０２５８】
フィーダー細胞を伴うＮＫ細胞培養に対するニコチンアミドの影響を評価するために、末梢血ＮＫ細胞画分を、ニコチンアミドを伴うか、または伴わない、放射線照射された間質細胞との共培養において拡大し、拡大倍数、表面マーカー（ＣＤ５６、ＣＸＣＲ４）および機能的成績についてアッセイした。
【０２５９】
末梢血由来の単核細胞画分をＣＤ３枯渇化し、その後、免疫ビーズ精製によってＣＤ５６＋細胞について選択した。同じ血液ユニットからの単核細胞の一部が、放射線照射された単核細胞を提供するために常に保持され、３０００ｒａｄで放射線照射された。ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を、放射線照射された末梢血由来の単核細胞画分と一緒に、１０：１の放射線照射末梢血単核細胞対ＣＤ５６選択細胞の比率で播種した。培養には、ニコチンアミド（２．５ｍＭおよび５ｍＭ）を伴って、または伴うことなく、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＦｌｔ−３が補充された。
【０２６０】
放射線照射されたフィーダー細胞との培養において２１日後、ニコチンアミド補充の培養に対する明瞭な利点が認められた。２．５ｍＭおよび５ｍＭの両方のニコチンアミドの存在下で培養されたＮＫ細胞の２１日目での増大倍数が、０日目に対して、コントロール（サイトカイン＋放射線照射単核細胞）の増大倍数の少なくとも４倍であった（図２０を参照のこと）。放射線照射単核細胞とのＮＫ細胞の共培養は、ニコチンアミドの存在下ではまた、表面マーカーの発現における顕著な増大をもたらした：ＣＸＣＲ４（図２１を参照のこと）およびＣＤ６２Ｌ（図２２を参照のこと）。したがって、ニコチンアミドとともに拡大されたＮＫ細胞は、放射線照射単核細胞およびサイトカインの存下では、高まった遊走能（ＣＸＣＲ４）および輸送能（ＣＤ６２Ｌ）が明らかにされた。
【０２６１】
拡大されたＮＫ細胞がＫ５６２標的細胞のエクスビボ殺傷能についてアッセイされたとき、増大した細胞傷害能が、５：１、２．５：１および１：１のＮＫ細胞対標的細胞において認められた（図２３を参照のこと）。標的細胞の死が、ＰＩ陽性のＣＦＳＥ標識細胞の百分率としてＦＡＣＳによってモニターされた。コントロール（サイトカインのみ）と比較して、増大した標的細胞殺傷能は、ニコチンアミドおよび放射線照射単核細胞との培養によるＮＫ細胞の殺傷能の高まった活性化を強く示唆する。したがって、増殖および機能性の同じ強化が、ＮＫ細胞が、さらなるフィーダー細胞を伴って、または伴うことなくニコチンアミドの存在下で培養されたときに認められた。
【０２６２】
まとめると、これらの結果は、ニコチンアミドにより処理されたＮＫ細胞培養物において認められる効果は明確であり、ＮＫ細胞をフィーダー細胞とともに培養することの効果よりも大きいことを示している。ＮＫ細胞を、フィーダー細胞を伴って、または伴うことなくニコチンアミドとともに培養することにより、ＮＫ細胞の増大したエクスビボ増殖がもたらされただけでなく、拡大されたＮＫ細胞の高まった機能的能力（例えば、ＣＤ６２ＬおよびＣＸＣＲ４の発現）がもたらされた。これらは、ＮＫ細胞を用いた移植のために、また、ＮＫ細胞を用いた養子免疫療法処置の臨床効力のために重要である。
【０２６３】
実施例ＩＶ−ＣＤ３−枯渇化またはＣＤ３ＣＤ１９−枯渇化のＭＮＣを用いて開始されたＮＫ細胞培養における非ＮＫ細胞の増殖に対するニコチンアミドの影響
ＮＫ細胞を培養において拡大するための方法は、臨床状況での使用のためには、混入する非ＮＫ細胞もまた細胞培養条件に起因して増殖することがないように、ＮＫ細胞集団について幾分か特異的でなければならない。非ＮＫ細胞に対するニコチンアミドの影響を、２．５ｍＭ、５ｍＭおよび７．５ｍＭのニコチンアミドにさらされたＮＫ細胞培養における単球集団および顆粒球集団をモニターすることによって評価した。
【０２６４】
図１４Ａおよび図１４Ｂは、混入する単球細胞（ＣＤ１４＋、図１４Ａ）および顆粒球細胞（ＣＤ１５＋、図１４Ｂ）の百分率をＮＡＭ非処理培養におけるそれらの百分率と比較した場合、ニコチンアミドにより処理された１４日のＮＫ細胞培養において低下させることにおけるニコチンアミドの影響を例示する。驚くべきことに、ニコチンアミドとのＮＫ細胞の培養は、１４日の培養においてＣＤ１４およびＣＤ１６の増殖の５０％超の抑制をもたらした。
【０２６５】
ＣＤ５６＋の精製された抹消血ＮＫ細胞を用いて開始され、ニコチンアミドの非存在下（サイトカイン、「ＮＡＭ  ０」）または存在下（ＮＡＭ  ２．５、ＮＡＭ  ５．０）で維持された培養物に存在する種々のリンパ球サブセット（これらは細胞表面マーカー（ＣＤ５６、ＣＤ３）に従って分類される）の割合が開始後３週間でアッセイされたとき、非ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３＋のＴ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ５６＋のＮＫＴ細胞など）の割合における減少が、増大するニコチンアミド濃度とともに認められた（図１８および図１８Ｂ（挿入図）を参照のこと）。ニコチンアミドとともに培養されたＮＫ細胞は、ニコチンアミドにさらされないＮＫ細胞よりも大きい効率でＣＤ３＋細胞を阻害した。培養を、増大する濃度（２．５ｍＭ〜７．５ｍＭ）のニコチンアミドを伴って、または伴うことなくサイトカイン（Ｆｌｔ−３、ＩＬ−１５およびＩＬ−２を含む）とともに３週間維持し、表面マーカーに対する特異的抗体と反応させ、その後、特定の表現型についてＦＡＣＳによって分析した。
【０２６６】
ＣＤ１４細胞およびＣＤ１５細胞（これらは多くの場合、移植片対宿主病に関連する；ＮＫＴ細胞およびＴ細胞）からの混入のこの低下は、移植前の広範なＴ細胞枯渇化、単球枯渇化および顆粒球枯渇化の必要性を軽減させ得るので、また、移植片対宿主病および関連した合併症を宿主においてさらに低下させ得るので、ＮＫ細胞を培養において拡大するためのどのような臨床的有用なプロトコルであれ、その臨床的有用なプロトコルの重要な側面であり得る。
【０２６７】
実施例Ｖ−精製された造血幹細胞／始原体細胞を用いて開始される培養におけるＮＫの増殖および機能に対するニコチンアミドの影響
造血由来細胞におけるＮＫ細胞の増殖および機能性のニコチンアミド強化を、ニコチンアミド処理された造血細胞集団を培養においてニコチンアミドおよび適切な増殖因子にさらにさらすことによって評価することができる。
【０２６８】
培養が、精製された造血幹細胞および／または始原体細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ１３３＋細胞）を用いて開始され、その後、培養には、増大する濃度のニコチンアミド（０．５ｍＭ〜１０ｍＭ）を伴って、または伴うことなく、ＴＰＯ、ＦＬＴ３、ＳＣＦおよび／またはＩＬ７および／またはＩＬ１５を含むサイトカインの組合せが１週間または２週間補充される。この期間の後、培養には、増大する濃度のニコチンアミド（０．５ｍＭ〜１０ｍＭ）を伴って、または伴うことなく、ＦＬＴ３、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２１および／またはＩＬ−２を含むサイトカインの組合せがさらなる期間（例えば、２週間〜３週間）補充される。培養された造血由来ＮＫ細胞の増殖および機能性に対するニコチンアミドの影響を評価するために、ＮＫおよび非ＮＫの細胞およびサブセット（例えば、ＣＤ５６＋、ＣＤ３＋、ＣＤ５６＋ＣＤ３−、ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋）の分布、ならびに、ＮＫ細胞の機能（例えば、走化性、細胞傷害性）が、培養された細胞集団においてモニターされる。
【０２６９】
実施例ＶＩ−ニコチンアミド培養されたＮＫ細胞の生着および治療能
ニコチンアミドの存在下で拡大されたＮＫ細胞を、ＮＫ細胞を生体宿主に移植した後のインビボにおける標的器官への局在化および標的器官内への生着について試験した。
【０２７０】
放射線照射（３５０Ｒａｄ）されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスが、ニコチンアミドを伴って（ＮＡＭ、２．５ｍＭ、および、ＮＡＭ、５ｍＭ）、または伴うことなく（ＮＡＭ  ０）、最大で３週間維持されたヒト抹消血ＮＫ（Ｔ細胞枯渇化）培養からの１５×１０６個の細胞を受けた。マウスを注入後４日で屠殺したとき、脾臓、骨髄および抹消血のサンプルを、ヒト特異的Ａｂを使用してヒトＮＫ細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ４５＋）の存在についてＦＡＣＳによって評価した。図１６は、ニコチンアミドとともに拡大されたＮＫ細胞の、適切な標的組織への増大した局在化および生着を示す（示された器官から得られる総ＮＫ細胞の百分率として表される）。ニコチンアミドのより高い濃度により、より強い影響が明らかにされる。したがって、ニコチンアミドとのＮＫ細胞の培養はＮＫ細胞の数を増大させるだけでなく、標的器官（例えば、脾臓、骨髄および抹消血）内への局在化および生着によって明らかにされるように、ＮＫ細胞のインビボでの機能的能力を増大させるために役立つ。
【０２７１】
さらなる研究において、新鮮な非培養のヒトＮＫ細胞またはＣＤ５６＋細胞と同様に、培養されたヒトＮＫ細胞またはＣＤ５６＋細胞の輸血を、準最適な移植、および、マウスまたはそれらの一部分の子孫におけるその後の非生着を達成するために意図される用量の範囲にわたって行うことができる。ヒトＮＫ細胞のホーミングおよび保持を、例えば、ヒトのＣＤ４５抗原またはＣＤ４５ＣＤ５６抗原に従って、移植後４時間および最大で４週間で評価することができる。準最適な用量を使用して、ニコチンアミド培養のＮＫ細胞を投与することができ、レシピエントのＰＢ、ＢＭおよびリンパ器官におけるホーミングおよび保持に対する影響を記録することができ、そして、ニコチンアミドを伴うことなく（サイトカインのみで）培養されたＮＫ細胞、または、新鮮なＮＫ細胞のホーミングおよび保持と比較することができる。
【０２７２】
ニコチンアミドとともに培養されたＮＫ細胞のインビボ抗腫瘍能を、数多くの動物腫瘍モデル（例えば、骨髄性白血病（Ｋ５６２）、バーキットリンパ腫（ＢＬ−２）、ヒト膵臓ガン（ＢｘＰＣ−３およびＰａｎｃ−１）、ヒト乳ガンおよび結腸直腸ガンの異種移植片など）を使用して評価することができる。異種移植された固形腫瘍の成長が、本発明のＮＫ細胞集団を注入した後の種々の時点でモニターされる。異種移植された腫瘍の転移能もまた、ＮＫ細胞注入後に評価される。白血病および骨髄異形成症候群のモデルに対するＮＫ細胞の影響を、マウス１ｋｇあたり１×１０３個、１×１０４個、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個またはそれ以上の培養ＮＫ細胞の注入を使用して直接に評価することができ、あるいは、造血始原体、骨髄および幹細胞などと一緒に注入されたときにはアブレーション後の骨髄再増殖の効率を改善することについて評価することができる。
【０２７３】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０２７４】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【０２７５】
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【図１２】
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【図１３Ａ−１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ−２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１５Ａ−１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１９Ａ−１９Ｂ】
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【図２３】
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