(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出装置であって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記単一粒子の各々の存在を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
前記光検出部により検出される前記光検出領域からの光が実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子が前記背景光よりも高い発光強度を有する第一の単一粒子と前記背景光よりも低い発光強度を有する第二の単一粒子とを含み、前記第一の単一粒子の前記信号が前記第一の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記光検出部にて検出される光強度の増大であり、前記第二の単一粒子の前記信号が前記第二の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記光検出部にて検出される光強度の低下であることを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１の装置であって、前記信号処理部が、個別に検出された前記第一及び第二の単一粒子の存在を表す信号の数をそれぞれ計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記第一及び第二の単一粒子の数を計数することを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１又は２の装置であって、単位体積当たりの前記第一の単一粒子から放出される発光強度が前記単位体積当たりの前記光検出領域内から発せられる背景光強度を上回っており、単位体積当たりの前記第二の単一粒子から放出される発光強度が前記単位体積当たりの前記光検出領域内から発せられる背景光強度を下回っていることを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記背景光が、前記試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光若しくは散乱光、又は照明光であることを特徴とする装置。
【請求項５】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出方法であって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、
前記時系列光強度データに於いて前記単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する過程と
を含み、
前記検出される前記光検出領域からの光が実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子が前記背景光よりも高い発光強度を有する第一の単一粒子と前記背景光よりも低い発光強度を有する第二の単一粒子とを含み、前記第一の単一粒子の前記信号が前記第一の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記検出される光強度の増大であり、前記第二の単一粒子の前記信号が前記第二の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記検出される光強度の低下であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５の方法であって、更に、個別に検出された前記第一及び第二の単一粒子の存在を表す信号の数をそれぞれ計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記第一及び第二の単一粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５又は６の方法であって、単位体積当たりの前記第一の単一粒子から放出される発光強度が前記単位体積当たりの前記光検出領域内から発せられる背景光強度を上回っており、単位体積当たりの前記第二の単一粒子から放出される発光強度が前記単位体積当たりの前記光検出領域内から発せられる背景光強度を下回っていることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項５乃至７のいずれかの方法であって、前記背景光が、前記試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光若しくは散乱光、又は照明光であることを特徴とする方法。
【請求項９】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出用コンピュータプログラムであって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
前記時系列光強度データに於いて前記単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する手順と
をコンピュータに実行させ、
前記検出される前記光検出領域からの光が実質的に一定の背景光を含み、前記単一粒子が前記背景光よりも高い発光強度を有する第一の単一粒子と前記背景光よりも低い発光強度を有する第二の単一粒子とを含み、前記第一の単一粒子の前記信号が前記第一の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記検出される光強度の増大であり、前記第二の単一粒子の前記信号が前記第二の単一粒子が前記光検出領域内へ進入した際に生ずる前記検出される光強度の低下であることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１０】
請求項９のコンピュータプログラムであって、更に、個別に検出された前記第一及び第二の単一粒子の存在を表す信号の数をそれぞれ計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記第一及び第二の単一粒子の数を計数する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１１】
請求項１０のコンピュータプログラムであって、単位体積当たりの前記第一の単一粒子から放出される発光強度が前記単位体積当たりの前記光検出領域内から発せられる背景光強度を上回っており、単位体積当たりの前記第二の単一粒子から放出される発光強度が前記単位体積当たりの前記光検出領域内から発せられる背景光強度を下回っていることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項１２】
請求項９乃至１１のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記背景光が、前記試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光若しくは散乱光、又は照明光であることを特徴とするコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な単一粒子検出技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の粒子の存在に依る光強度の変化を計測して単一粒子を検出し、種々の分析を可能にする単一粒子検出装置、単一粒子検出方法及び単一粒子検出用コンピュータプログラムに係る。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う光分析技術が種々提案されている。そのような光分析技術としては、例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３、非特許文献１−３参照）、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity  Distribution  Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon  Counting  Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）などが知られている。また、特許文献６〜８には、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。【０００３】
更に、本願出願人は、特許文献９〜１１に於いて、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いた光分析技術であって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術とは異なる原理による新規な光分析技術を提案した。上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合、端的に述べれば、試料溶液内に於ける光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）に浮遊する蛍光分子からの光を連続的に計測することにより得られた光強度データに対して統計的な演算処理が実行されて、蛍光分子の濃度及び／又はその他の特性が検出される。これに対し、特許文献９〜１１に於いて提案された新規な光分析技術では、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（発光粒子）を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を個別に検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子を一つずつ検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。この光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）、更に、観測対象となる粒子の濃度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の良好に測定可能なレベル（１ｎＭ程度）よりも低い試料溶液に於いて、発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。かくして、「走査分子計数法」は、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行でき、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等を良好に実行できない程度のより低い濃度の粒子の濃度及び／又は特性の検出が可能な強力なツールとして期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６
【特許文献２】特開２００８−２９２３７１
【特許文献３】特開２００９−２８１８３１
【特許文献４】特許第４０２３５２３号
【特許文献５】国際公開２００８−０８０４１７
【特許文献６】特開２００７−２０５６５
【特許文献７】特開２００８−１１６４４０
【特許文献８】特開平４−３３７４４６号公報
【特許文献９】国際公開第２０１１／１０８３６９
【特許文献１０】国際公開第２０１１／１０８３７０
【特許文献１１】国際公開第２０１１／１０８３７１
【特許文献１２】国際公開２０１０−１１９０９８
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】金城政孝、蛋白質  核酸  酵素  Vol.４４、No.９、１４３１−１４３８頁  １９９９年
【非特許文献２】エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４−２２４頁
【非特許文献３】加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１−２７７頁
【非特許文献４】カスク他３名、米国科学アカデミー紀要  １９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P.  Kask,  K.  Palo,  D.  Ullmann,  K.  Gall  PNAS  96,  13756-13761  (1999)）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、上記の如き走査分子計数法に於いて用いられる共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の場合、通常の光学顕微鏡よりも光軸方向の分解能が高いので、コンフォーカル・ボリューム（光検出領域）から有意な背景光が放出されている場合に、発光しない単一粒子がコンフォーカル・ボリュームの内部を通過すると、コンフォーカル・ボリュームからの光強度の低下が観測される（特許文献１２）。そこで、本願出願人は、特願２０１１−１８４６３５に於いて、観測対象粒子として発光しない単一粒子を用い、実質的に一定の背景光を放出する試料溶液内を光検出領域により走査する「走査分子計数法」と同様の要領にて光の検出を行い、発光しない又は発光強度が背景光よりも低い単一粒子が光検出領域内へ包含された際の単一粒子の光強度の低下を検出して、単一粒子の存在を検出する「反転型走査分子計数法」を提案した。かかる「反転型走査分子計数法」によれば、低濃度の発光しない単一粒子の検出が可能となる。【０００７】
また、本発明の発明者等の研究によれば、上記の「反転型走査分子計数法」の場合の如く、コンフォーカル・ボリュームからの光に有意な背景光が存在していても、発光粒子からの発光強度が背景光よりも高ければ、単一発光粒子の放出する光が個別に検出可能であることが見出された。従って、検出光波長にて発光しない又は発光強度が背景光よりも低い単一粒子（以下、「非発光粒子」と称する。）と、検出光波長に於ける発光強度が背景光よりも高い単一の発光粒子とを含む溶液に於いて、走査分子計数法に従った光計測を行えば、非発光粒子に対応する信号（光強度の変化）は、下に凸に現れ、発光粒子に対応する信号は、上に凸に現れることとなる。即ち、この場合、同一の試料溶液に含まれる非発光粒子と発光粒子とのそれぞれの存在を同時に且つ互いに区別して検出することが可能となる。本発明に於いては、かかる知見が有利に用いられる。【０００８】
かくして、本発明の主な課題は、検出光波長にて発光しない又は発光強度が背景光よりも低い単一粒子（非発光粒子）と検出光波長に於ける発光強度が背景光よりも高い単一粒子（発光粒子）とが同一の試料溶液内に含まれる場合に、走査分子計数法の原理を利用して非発光粒子と発光粒子との存在をそれぞれ識別しながら検出することを可能にする単一粒子検出技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出装置であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて単一粒子の各々の存在を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、光検出部により検出される光検出領域からの光が実質的に一定の背景光を含み、単一粒子が背景光よりも高い発光強度を有する第一の単一粒子と背景光よりも低い発光強度を有する第二の単一粒子とを含み、第一の単一粒子の信号が該第一の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光検出部にて検出される光強度の増大であり、第二の単一粒子の信号が該第二の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光検出部にて検出される光強度の低下であることを特徴とする装置によって達成される。【００１０】
かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などにして、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。）。「前記光検出領域からの光が実質的に一定の背景光を含み、」とは、観測対象となる単一粒子が光検出領域内に存在していないときの検出光（即ち、背景光）の強度値が許容誤差の範囲内に収まる有意な強度値であることを意味している。換言すれば、背景光は、その変動が単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる検出光の強度の変動幅よりも十分に小さくなるよう調節される。なお、本明細書に於いて、「単一粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、単一粒子の存在を表す信号を指すものとする。「単一粒子の各々の存在を表す信号を個別に検出する」とは、即ち、時系列の光強度データ上に於ける単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる光強度の一時的な増大又は低下を一つずつ単一粒子毎に検出することを意図している。また、以下に於いて、背景光よりも高い発光強度を有する単一粒子（第一の単一粒子）を「発光粒子」と称し、背景光よりも低い発光強度を有する単一粒子（第二の単一粒子）を「非発光粒子」と称する。即ち、非発光粒子については、検出光の波長帯域に於ける発光強度は、殆ど０であることが好ましいが、背景光の強度よりも有意に低いレベルであっても許容されてよい。【００１１】
上記から理解される如く、本発明の装置に於いては、基本的には、特許文献９〜１１に記載の「走査分子計数法」と同様に、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。かかる構成に於いて、光検出領域からの光に有意な強度の背景光が含まれている場合には、発光粒子（第一の単一粒子）が光検出領域に進入したときに或いは試料溶液内にて移動する光検出領域が発光粒子を包含したときに、発光粒子の存在によって光検出領域からの光検出部まで到達する光強度又は光量が増大し、非発光粒子（第二の単一粒子）が光検出領域に進入したときに或いは試料溶液内にて移動する光検出領域が非発光粒子を包含したときに、非発光粒子の存在によって光検出領域からの光検出部まで到達する光強度又は光量が低下することとなる。かくして、本発明の装置では、試料溶液中に観測対象粒子である単一粒子として、発光粒子と非発光粒子とが含まれている場合に、光検出領域から有意な（発光粒子の光強度よりも低く非発光粒子の光強度よりも高い値の）背景光強度が検出されるようにした状態にて光検出が行われ、時系列光強度データが生成される。そして、時系列光強度データ上に於いて、光強度又は光量の増大及び／又は低下をそれぞれ第一及び第二の単一粒子の信号として個別に検出して、第一及び第二の単一粒子の存在が互いに識別された態様に検出されることとなる。かかる構成によれば、試料溶液中の互いに異なる粒子、即ち、第一及び第二の粒子がそれぞれ別々に、即ち、種類毎に検出され、種類毎に粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。換言すれば、本発明の装置に於いては、或る検出波長帯域に於ける光の計測に於いて、少なくとも２つの互いに異なる種類の単一粒子を個別に検出することが可能となる。【００１２】
上記の本発明の装置に於いて、光検出領域からの光に含まれるべき背景光としては、試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であってよい。この場合、試料溶液として使用する溶液中に光を放出又は散乱する物質が分散していない場合には、かかる溶液中に積極的に光を放出又は散乱する物質が溶解又は分散されてよい。また、試料溶液として使用する溶液が自家蛍光を発する場合には、その自家蛍光が上記の背景光として利用されてよい。特に、背景光を生ずる物質及び観察対象粒子となる発光粒子が励起光又は照明光を必要とする場合には、顕微鏡装置に於いて照明光用の光源及び光学系が装備される。一方、背景光を生ずる物質が励起光又は照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する物質の場合には、顕微鏡装置に於いて照明光は要しない。更に、背景光は、光検出領域内に非発光粒子が存在する場合に低減するのであれば、透過照明等による照明光であってもよいことは理解されるべきである。【００１３】
また、上記の本発明の装置に於ける発光粒子の発光強度と背景光強度との関係に於いては、発光粒子の発光強度が背景光強度と識別可能であるのに十分大きいことが好ましい。そのためには、好適には、発光粒子の発光強度が、発光粒子が光検出領域内に存在する際の排除体積に相当する体積領域から放出される背景光強度よりも高くなるように、発光粒子の発光強度と背景光強度との関係が調整される。即ち、単位体積当たりの発光粒子（第一の単一粒子）から放出される発光強度が単位体積当たりの光検出領域内から発せられる背景光強度を上回るように、背景光強度と発光粒子の発光強度が調整されることが好ましい。一方、本発明の装置に於ける非発光粒子の発光強度と背景光強度との関係に於いては、非発光粒子が光検出領域内に存在する際の排除体積に相当する体積領域から放出される背景光強度よりも低くなるように、非発光粒子の発光強度と背景光強度との関係が調整されれば、非発光粒子の存在による光強度の低減が生ずる。従って、単位体積当たりの非発光粒子（第二の単一粒子）から放出される発光強度が単位体積当たりの光検出領域内から発せられる背景光強度を下回るように、背景光強度と非発光粒子の発光強度が調整されることが好ましい。特に、非発光粒子の存在による背景光の低減の検出の場合には、背景光の低減の度合は、非発光粒子の寸法と光検出領域の寸法との関係に依存する。この点に関し、後に述べる背景光の変動幅を考慮した見積によれば、非発光粒子の発光強度が実質的に０である場合、好適には、非発光粒子の外径は、光検出領域の直径の１５％以上であり、より好適には、非発光粒子の外径が光検出領域の直径の３５％以上であることが見出されている。（特願２０１１−１８４６３５参照）。発光粒子の場合は、単位体積当たりの発光強度が明るいほど、検出可能な光検出領域の直径に対する発光粒子の外径の比は小さくなる。背景光の調節は、例えば、試料溶液中に任意の発光物質の分散量の調節によって為されてよい。【００１４】
上記の本発明の装置に於ける試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、単一粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよい。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、単一粒子の存在による光強度又は光量の増大／低下の度合が低減することとなるので、単一粒子による光強度又は光量の増大／低下が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更可能となっていることが好ましい。【００１５】
また、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる単一粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、光検出領域が単一粒子の存在位置を通過したときにその単一粒子の存在による光強度又は光量の増大／低下を検出して単一粒子を個別に検出する。しかしながら、単一粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの単一粒子から複数回、その存在を表す信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの単一粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を単一粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの単一粒子を一つの（単一粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、単一粒子の特性によって変わるので、上記の如く、単一粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。【００１６】
試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、或いは、試料溶液の位置を（例えば、顕微鏡のステージを移動するなどして）動かして、光検出領域の試料溶液内に於ける相対的な位置を移動するようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。特に、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更される場合、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる単一粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である点で有利である。【００１７】
また、上記の本発明の装置の信号処理部の処理に於いて、逐次的な光検出部からの検出値の信号から１つの粒子が光検出領域に入ったか否かの判定は、光検出部にて検出された時系列の光を表す信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態の一つに於いては、背景光の強度から計って所定の閾値より高い又は低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの単一粒子が光検出領域に入ったと判定されてよい。より具体的には、後の実施形態の欄にて説明される如く、通常、単一粒子の存在を表す信号は、光検出部の時系列の検出値、即ち、光強度データに於いて、或る程度の強度を上回る上に凸の釣鐘型のパルス状の信号として現れ(発光粒子の場合)、又は、或る程度の強度を下回る下に凸の釣鐘型のパルス状の信号として現れ(非発光粒子の場合)、ノイズは、釣鐘型のパルス状ではないか、振幅の小さい信号として現れる。そこで、本発明の装置の信号処理部は、時系列光強度データ上に於いて、背景光の強度から計って所定閾値を上回る上に凸の釣鐘型のパルス状の信号或いは所定閾値を下回る下に凸の釣鐘型のパルス状の信号を単一粒子の存在を表す信号として検出するよう構成されていてよい。「所定閾値」は、実験的に適当な値に設定することが可能である。【００１８】
更に、本発明の装置により得られる光強度は、比較的微弱であり、細かい増減が生じ、かかる光強度の細かい増減は、単一粒子の存在を表す信号の検出精度を悪化させる。そこで、信号処理部は、時系列の光強度データを平滑化し、光強度の細かい増減を無視できるようにデータを加工した後、平滑化された時系列光強度データに於いて背景光の強度から計って所定閾値を上回る上に凸の釣鐘型のパルス状の信号或いは所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号を単一粒子の存在を表す信号として検出するよう構成されていてよい。【００１９】
また更に、もう一つの実施形態に於いて、単一粒子の信号の検出処理は、光強度データ上に於ける光強度の時間変化の、光検出領域内に単一粒子が存在していない状態を仮定した場合に於ける発生確率と、光検出領域内に単一粒子が存在している状態を仮定した場合に於ける発生確率とを算出し、それらの発生確率に基づいて光検出領域内に単一粒子の存在した時間を検出して単一粒子の各々の存在を表す信号を検出する態様にて為されてもよい（特願２０１２−３２４２１参照）。端的に述べれば、走査分子計数法の時系列光強度データに於いては、ノイズは、常にランダムで瞬間的な光強度の増大／低下であるに対して、単一粒子の信号の場合には、時間的に集中した光強度の増大／低下であることが見出されている。即ち、単一粒子の信号とノイズとは、時系列光強度データ上の光強度値の時間変化のパターンが異なるので、時系列光強度データ上の或る部分に於ける光強度値の時間変化のパターンが、光検出領域内に単一粒子がない場合に発生し易いパターンであるときには、その部分は、ノイズのみの部分であると判定でき、光検出領域内に単一粒子がある場合に発生し易いパターンであるときには、その部分は、単一粒子の信号に対応する部分であると判定できることとなる。そこで、時系列光強度データ上に現れた光強度値の時間変化のパターンについての光検出領域内に単一粒子がある場合及びない場合のそれぞれに於いて発生する確率を算出し、その光強度値の時間変化のパターンが光検出領域内に単一粒子がある場合又はない場合のいずれに発生し易いパターンであるかを判別することによって、単一粒子の信号の検出が可能となる。【００２０】
更に又、上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、信号の数を計数して光検出領域に包含された単一粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された単一粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された単一粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、単一粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。特に本発明の場合には、同一の試料溶液中に混在する発光粒子と非発光粒子について、それぞれ、別々にカウンティング及び／又は濃度の算定が可能となる。【００２１】
なお、上記の如き粒子のカウンティングに関し、その典型的な態様に於いては、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数される。しかしながら、その場合、設定された測定時間の長さによって、検出される単一粒子の信号数の変動することとなり、特に、単一粒子濃度が低いときには、検出信号数から算定される単一粒子濃度値のばらつきが大きくなって精度が低下し得る。そこで、上記の本発明の装置に於いては、粒子のカウンティングの別の態様として、単一粒子の信号数が任意に設定された数に到達するまで測定が実行され、測定時間に基づいて単一粒子濃度値が算定されるようになっていてよい。即ち、上記の本発明の装置は、信号処理部が検出した単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域移動部による光学系の光検出領域の位置の移動と、光検出部による光検出領域からの光の検出と、信号処理部による単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の単一粒子の濃度を決定するよう構成されていてよい。この場合、単一粒子の高濃度の試料溶液についての測定時間の短縮が期待され、単一粒子の低濃度の試料溶液についての測定は、十分な時間を費やして実行されることとなる。即ち、上記の構成によれば、単一粒子の濃度に応じて測定時間が最適化される。また、予め定められた数を結果に要求される精度を達成する数に設定しておけば、その予め定められた数の単一粒子の検出に要した時間又はそれから導出される任意の結果に於けるばらつきは、小さく抑制され、結果の精度を満足するものとすることが可能となる。【００２２】
上記の本発明の装置に於いて、発光粒子と非発光粒子が混在する試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら、光検出を背景光の存在下にて行い、光強度又は光量の増大又は低下をそれぞれ発光粒子又は非発光粒子の信号として逐次的に検出する単一粒子検出技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出用コンピュータプログラムであって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、時系列光強度データに於いて単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する手順とをコンピュータに実行させ、検出される光検出領域からの光が実質的に一定の背景光を含み、単一粒子が背景光よりも高い発光強度を有する第一の単一粒子と背景光よりも低い発光強度を有する第二の単一粒子とを含み、第一の単一粒子の信号が、該第一の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる検出される光強度の増大であり、第二の単一粒子の信号が、該第二の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる検出される光強度の低下であることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。なお、コンピュータプログラムは、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体に記憶されて提供される。コンピュータは、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、上記の手順を実現する。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよい。更に、上述のプログラムは、通信回線によってコンピュータへ配信され、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。【００２３】
かかる構成に於いても、背景光は、試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であるか、照明光であってよい。また、好適には、発光粒子の発光強度と背景光強度との関係に於いては、単位体積当たりの発光粒子（第一の単一粒子）から放出される発光強度が単位体積当たりの光検出領域内から発せられる背景光強度を上回るように、且つ、非発光粒子の発光強度と背景光強度との関係に於いては、単位体積当たりの非発光粒子（第二の単一粒子）から放出される発光強度が単位体積当たりの光検出領域内から発せられる背景光強度を下回るように、背景光強度と発光粒子及び非発光粒子の発光強度が調整される。特に、非発光粒子の外径は、好適には、光検出領域の直径の１５％以上であり、より好適には、光検出領域の直径の３５％以上である。【００２４】
また、上記のコンピュータプログラムに於いても、単一粒子の各々の存在を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する手順に於いて、背景光の強度から計って所定の閾値より高い光強度を有する信号が検出されたときに１つの発光粒子が光検出領域に入ったと判定し、背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの非発光粒子が光検出領域に入ったと判定するようになっていてよい。具体的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する手順に於いて、時系列光強度データに於いて背景光の強度から計って所定閾値を上回る強度を有する上に凸の釣鐘型のパルス状信号が発光粒子の存在を表す信号として、背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号が非発光粒子の存在を表す信号として、それぞれ、検出されてよく、その際、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて釣鐘型のパルス状信号が単一粒子の存在を表す信号として検出されてよい。或いはまた、別の単一粒子の各々の存在を表す信号の個別の検出の別の態様として、時系列光強度データ上に現れた光強度値の時間変化のパターンについての光検出領域内に単一粒子がある場合及びない場合のそれぞれに於いて発生する確率を算出し、その光強度値の時間変化のパターンが光検出領域内に単一粒子がある場合又はない場合のいずれに発生し易いパターンであるかを判別することによって、単一粒子の信号の検出が為されてもよい。【００２５】
更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、単一粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる単一粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。【００２６】
更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された単一粒子の信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された単一粒子の数を計数する手順及び／又は検出された単一粒子の数に基づいて、試料溶液中の単一粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。なお、上記のコンピュータプログラムの場合にも、粒子のカウンティングの於いては、典型的には、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数されるが、単一粒子の信号数が任意に設定された数に到達するまで測定が実行され、測定時間に基づいて単一粒子濃度値が算定されるようになっていてよい。従って、上記のコンピュータプログラムも、単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域の位置の移動と、光検出領域からの光の検出と、単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の単一粒子の濃度を決定するよう手順が構成されていてよい。【００２７】
上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、発光粒子と非発光粒子が混在する試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら、光検出を背景光の存在下にて行い、光強度又は光量の増大又は低下をそれぞれ発光粒子又は非発光粒子の信号として逐次的に検出する新規な方法が実現される。かくして、本発明によれば、更に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する単一粒子を検出する単一粒子検出方法であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列光強度データに於いて単一粒子の各々の存在を表す信号として個別に検出する過程とを含み、検出される光検出領域からの光が実質的に一定の背景光を含み、単一粒子が背景光よりも高い発光強度を有する第一の単一粒子と背景光よりも低い発光強度を有する第二の単一粒子とを含み、第一の単一粒子の前記信号が第一の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる検出される光強度の増大であり、第二の単一粒子の前記信号が第二の単一粒子が光検出領域内へ進入した際に生ずる検出される光強度の低下であることを特徴とする方法が提供される。【００２８】
かかる構成に於いても、背景光は、試料溶液内に分散された物質による蛍光、りん光、化学発光、生物発光又は散乱光であるか、照明光であってよい。また、好適には、発光粒子の発光強度と背景光強度との関係に於いては、単位体積当たりの発光粒子（第一の単一粒子）から放出される発光強度が単位体積当たりの光検出領域内から発せられる背景光強度を上回るように、且つ、非発光粒子の発光強度と背景光強度との関係に於いては、単位体積当たりの非発光粒子（第二の単一粒子）から放出される発光強度が単位体積当たりの光検出領域内から発せられる背景光強度を下回るように、背景光強度と発光粒子及び非発光粒子の発光強度が調整される。特に、非発光粒子の外径は、好適には、光検出領域の直径の１５％以上であり、より好適には、光検出領域の直径の３５％以上である。【００２９】
また、上記の方法に於いても、単一粒子の各々の存在を表す信号の個別の検出は、時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する過程に於いて、背景光の強度から計って所定の閾値より高い光強度を有する信号が検出されたときに１つの発光粒子が光検出領域に入ったと判定し、背景光の強度から計って所定の閾値より低い光強度を有する信号が検出されたときに１つの非発光粒子が光検出領域に入ったと判定するようになっていてよい。具体的には、単一粒子の存在を表す信号を個別に検出する過程に於いて、時系列光強度データに於いて背景光の強度から計って所定閾値を上回る強度を有する上に凸の釣鐘型のパルス状信号が発光粒子の存在を表す信号として、背景光の強度から計って所定閾値を下回る強度を有する下に凸の釣鐘型のパルス状信号が非発光粒子の存在を表す信号として、それぞれ、検出されてよく、その際、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて釣鐘型のパルス状信号が単一粒子の存在を表す信号として検出されてよい。或いはまた、単一粒子の各々の存在を表す信号の個別の検出の別の態様として、時系列光強度データ上に現れた光強度値の時間変化のパターンについての光検出領域内に単一粒子がある場合及びない場合のそれぞれに於いて発生する確率を算出し、その光強度値の時間変化のパターンが光検出領域内に単一粒子がある場合又はない場合のいずれに発生し易いパターンであるかを判別することによって、単一粒子の信号の検出が為されてもよい。【００３０】
更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、単一粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる単一粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。【００３１】
更に、上記の方法に於いても、個別に検出された単一粒子の信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された単一粒子の数を計数する過程及び／又は検出された単一粒子の数に基づいて、試料溶液中の単一粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。なお、上記の方法の場合にも、粒子のカウンティングの於いては、典型的には、任意に設定された測定時間中に得られた単一粒子の信号の数が計数されるが、単一粒子の信号数が任意に設定された数に到達するまで測定が実行され、測定時間に基づいて単一粒子濃度値が算定されるようになっていてよい。従って、上記の方法も、単一粒子の存在を表す信号の数が予め定められた数に達するまで、光検出領域の位置の移動と、光検出領域からの光の検出と、単一粒子の存在を表す信号の検出とを繰り返し、単一粒子の信号の存在を表す数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて試料溶液中の単一粒子の濃度を決定するよう過程が構成されていてよい。【００３２】
上記の本発明の単一粒子検出技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、リポソーム、金属コロイド、ビーズ（磁気ビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ等）、消光剤（アゾベンゼン類（dabcyl,BHQなど）、金属粒子など）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
【発明の効果】
【００３３】
端的に述べれば、本発明の単一粒子検出技術は、溶液中に発光粒子と非発光粒子が分散されている場合にそれらの単一粒子の検出を走査分子計数法に従って行う技術である。理解されるべきことは、本発明の技術によれば、一つの検出光波長帯域に於ける光測定によって同時に発光粒子と非発光粒子の存在の検出が可能となるということである。従って、本発明の技術に於いては、発光粒子と非発光粒子とを別々の種類の観測対象粒子として調製することによって、一度の測定で２種類の観測対象粒子についてそれぞれの種類毎の存在の検出、粒子のカウンティング、濃度検出等が可能となる。【００３４】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１（Ａ）は、本発明による走査分子計数法を実行する単一粒子検出装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の光検出領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。
【図２】図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明に於ける走査分子計数法に於ける単一粒子の存在を検出する原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。
【図３】図３は、本発明に従って実行される走査分子計数法の処理手順の一つの態様（時系列光強度データの平滑化及び釣鐘型関数のフィッティングによる単一粒子信号の検出）のフローチャートの形式で表した図である。
【図４】図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、単一粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を単一粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図４（Ｃ）は、図３の処理に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から単一粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。
【図５】図５は、時系列光強度データに於ける光強度変化の発生確率に基づく単一粒子信号の検出の原理を説明する図である。（Ａ）は、時系列光強度データの模式的な例を示している。（左）輝度が大きい発光粒子が存在している場合。（中）輝度が小さい発光粒子が存在している場合。（右）発光粒子が存在していない場合。（Ｂ）は、本発明に於いて時系列光強度データ上に設定される解析窓を説明する図である。
【図６】図６は、本発明に従って実行される走査分子計数法の処理手順の別の態様（時系列光強度データに於ける光強度変化の発生確率に基づく単一粒子信号の検出）のフローチャートの形式で表した図である。
【図７】図７は、本発明に従って実行される走査分子計数法の処理手順の別の態様（単一粒子信号の検出を所定の粒子数を計数するまで実行する場合）をフローチャートの形式で表した図である。
【図８】図８（Ａ）は、本発明による走査分子計数法に従って得られた時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）の一部を示している。図８（Ｂ）は、（Ａ）のデータに於ける非発光粒子が存在する場合と存在しない場合の各々を仮定して算出された発生確率のオッズ比を示し、図８（Ｃ）は、（Ａ）のデータに於ける発光粒子が存在する場合と存在しない場合の各々を仮定して算出された発生確率のオッズ比を示している。
【図９】図９は、粒子を含まない溶液（０：０）、非発光粒子のみを含む溶液（２：０）、発光粒子のみを含む溶液（０：２）、発光粒子と非発光粒子とを含む溶液（１：１）について、本発明による走査分子計数法に従って検出されたパルス数の平均値（棒グラフ）と標準偏差（エラーバー）とを示している。
【符号の説明】
【００３６】
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００３８】
単一粒子検出装置の構成
本発明による単一粒子検出技術を実現する単一粒子検出装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、単一粒子検出装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。単一粒子検出装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。
【００３９】
対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。なお、試料溶液中には、典型的には、観測対象物である発光粒子と非発光粒子と背景光を生ずる任意の発光物質とが分散又は溶解されており、観測対象粒子が励起領域に進入していないときには、発光物質が励起されて実質的に一定の光が放出されて、背景光となり、非発光粒子が励起領域に進入すると、背景光が低減し、発光粒子が励起領域に進入すると、背景光に発光粒子の放出光が加わり、光強度が増大することとなる。
【００４０】
かくして、励起領域から放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて単一粒子検出のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。
【００４１】
また、本発明では、数分子程度の蛍光色素分子からの微弱光からなる背景光の存在下に於ける単一粒子の存在による光量の増大又は低下を検出するので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
【００４２】
更に、上記の単一粒子検出装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。また、光検出領域の絶対的な位置を移動する方式と試料溶液の絶対的な位置を移動する方式とを組み合わせて、試料溶液の位置を動かしつつ、光検出領域の絶対的な位置の移動が実行されてよい。この場合、短時間のうちの光検出領域が同一の領域を通過することにより同一の単一粒子を繰り返し検出することが回避される。或いは、光検出領域の絶対的な位置を移動する方式により、意図的に光検出領域に同一の領域を繰り返し通過させ、同一の単一粒子を複数回に亘って周期的に検出し、信号の精度の向上が図られてもよい。この場合、光検出領域の絶対的な位置の移動を所定時間に亘って実行した後に、試料溶液の位置が間歇的に移動して、試料溶液内の別の場所にて、同一の単一粒子の繰り返し検出を実行し、検出される単一粒子の数の増大が図られてよい。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されて、光検出領域の位置の軌跡が、試料溶液内にて三次元的に展開されるようになっていてもよい。
【００４３】
観測対象粒子である発光粒子及び背景光を生成する発光物質が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、背景光を生成する発光物質が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。背景光を生成する発光物質がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、背景光は、照明光により与えられてもよい。その場合、対物レンズの上方から透過照明（ケーラー照明であってよい。）により試料溶液が照明される。
【００４４】
また更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子又は背景光を与える物質の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。また、光検出器１６も複数個備えられ、各々の光検出器１６が光検出領域からの光のうちの互いに異なる成分を別々に検出するよう構成されていてよい。その場合には、ピンホール１３の通過後の検出光光路に於いては、光路を任意の態様にて分割するための機構が設けられる。例えば、検出光光路の部位１４ａに、検出光光路に特定の波長帯域の光を反射し、別の波長帯域を透過するダイクロイックミラー１４ａが挿入されることにより、互いに異なる波長帯域の光成分が別々に検出可能となる。
【００４５】
コンピュータ１８は、ＣＰＵおよびメモリを備え、ＣＰＵが各種演算処理を実行することにより、本発明の手順を実行する。なお、各手順は、ハードウェアにより構成するようにしてもよい。本実施形態で説明される処理の全て或いは一部は、それらの処理を実現するプログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を用いて、コンピュータ１８により実行されてよい。即ち、コンピュータ１８は、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、本発明の処理手順を実現するようになっていてよい。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよく、或いは、上記のプログラムを通信回線によってコンピュータに配信し、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。
【００４６】
本発明の単一粒子検出技術の原理
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の単一粒子検出技術に於いては、端的に述べれば、試料溶液中に発光粒子と非発光粒子とが含まれている場合に、光検出領域の光を背景光の存在下にて走査分子計数法に従って計測して時系列光強度データを得て、かかる時系列光強度データに於いて、光強度の有意な増大を発光粒子の信号として検出し、光強度の有意な低下を非発光粒子の信号として検出する。かかる構成によれば、一つの検出光波長帯域に於ける一度の光計測に於いて、観測対象粒子として、２種類の互いに異なる粒子の検出、それらの粒子の計数、或いは、試料溶液中の濃度に関する情報の取得等が可能となる。以下、本発明による走査分子計数法の原理について説明する。
【００４７】
「走査分子計数法」（特許文献９〜１１）では、基本的には、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。その際、特に本発明の場合には、光検出領域から背景光を放出させ（或いは、光検出領域を照明光にて照明し）、これにより、光検出領域ＣＶの移動中（図中、時間ｔｏ〜ｔ３）、背景光が略一様に検出される。そして、光検出領域ＣＶが１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、背景光に加えて、発光粒子から光が放出されるので、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に釣鐘型のパルス状の有意な光強度の増大が出現することとなる。また、光検出領域ＣＶが１つの非発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ２）には、光検出領域ＣＶからの光量が低減することとなるので、図２（Ｂ）に描かれている如く、時系列の光強度データ上に、釣鐘型のパルス状の有意な光強度の低下が出現することとなる。そこで、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度の増大及び低下）を一つずつ検出することによって、発光粒子と非発光粒子が個別に、しかも、それぞれが識別されながら、検出され、発光粒子と非発光粒子のそれぞれの数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報と、非発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。
【００４８】
上記の如く、背景光の存在下に於ける発光粒子の信号及び非発光粒子の信号の検出を達成するためには、発光粒子の発光強度と背景光強度との関係並びに非発光粒子の発光強度と背景光強度との関係とが適切に調整されている必要がある。発光粒子の発光強度と背景光強度との関係については、端的に述べれば、光検出領域中に発光粒子が存在するとき、即ち、光検出領域内の空間の一部を発光粒子が占有しているときの光検出領域内全体の検出光波長帯域に於ける光強度が、光検出領域中に発光粒子が存在しないときの光検出領域内全体の検出光波長帯域に於ける光強度よりも大きければ良いので、検出光波長帯域に於いて、単位体積当たりの発光粒子の発光量が単位体積当たりの背景光の光量よりも大きくされる。しかしながら、実際には、背景光強度は完全に一定にはならないので、単位体積当たりの発光粒子の発光量が単位体積当たりの背景光の光量よりも十分に大きくなるように、発光粒子の発光強度及び／又は背景光強度が調整される。（具体的には、実験的に両者の光強度が調整されてよい。）
【００４９】
一方、非発光粒子の発光強度と背景光強度との関係については、光検出領域中に非発光粒子が存在するとき、即ち、光検出領域内の空間の一部を非発光粒子が占有しているときの光検出領域内全体の検出光波長帯域に於ける光強度が、光検出領域中に非発光粒子が存在しないときの光検出領域内全体の検出光波長帯域に於ける光強度よりも小さければ良い。従って、非発光粒子については、検出光波長帯域に於けるその単位体積当たりの発光量が単位体積当たりの背景光の光量よりも小さくなるように非発光粒子の発光強度と背景光強度とが調整される。（即ち、非発光粒子は、検出光波長帯域に於ける発光強度が背景光よりも低ければよく、完全に発光しない粒子でなくてもよいことは理解されるべきである。）
【００５０】
なお、非発光粒子について、光強度の低下の度合は、非発光粒子の径と光検出領域の径との関係から概算することが可能である。典型的には、光検出領域内の光強度分布は、中心にて最大強度Ｉｍａｘを有し、半径ｒ方向に向かって低減する釣鐘型のプロファイルｆ（ｒ）を有している（図５（Ｃ）参照）。従って、ｆ（ｒ）が略０になる光検出領域の半径ａを用いて、光検出領域内に非発光粒子が存在していないときの光検出領域内から放出される光の総量αは、
α＝４π∫ｒ２ｆ（ｒ）ｄｒ  ［積分区間は、０〜ａ］
にて与えられる。一方、光検出領域内に、半径ｂの非発光粒子が進入し、光検出領域の中心に位置するとき、その領域の背景光を与える空間（以下、「発光空間」と称する。）が排除されることとなるので、排除された発光空間に相当する光量が低減することとなる。その排除された発光空間に相当する光量、つまり低下量βは、
β＝４π∫ｒ２ｆ（ｒ）ｄｒ  ［積分区間は、０〜ｂ］
にて与えられる。かくして、光強度の低下の割合は、β／αにより概算することが可能となる。ここで、ｆ（ｒ）がガウス関数であり、α＝１、ａ＝１となるとき、
ｆ（ｒ）＝０．６８４ｅｘｐ（−２ｒ２）
となる。典型的には、背景光の変動率が１％程度であり、非発光粒子による光強度の低下の割合が１％以下であると、信号の検出が不可能となるので、上記の式にて演算すると、光検出領域の半径に対する非発光粒子半径の比ｂ／ａは、０．１５以上とすべきである。また、非発光粒子による光強度の低下の割合を１０％以上とする場合には、光検出領域の半径に対する検出可能な非発光粒子半径の比ｂ／ａは、０．３５となる。なお、観測されるべき非発光粒子が消光剤や蛍光エネルギー移動のアクセプタである場合、非発光粒子が周囲（例えば、１０ｎｍ）の光を吸収するので、検出可能な非発光粒子半径は、上記に例示の半径よりも低減し得る。また、非発光粒子が発光する場合には、検出可能な非発光粒子半径は、上記に例示の半径よりも増大し得る。
【００５１】
かくして、上記の如き本発明の単一粒子検出技術に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、粒子が一つずつ検出されるので、従前のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。また、特に、有意な背景光が存在していることによれば、迷光やラマン散乱光の影響が低減されるという利点を有する。更に、重要なことは、本発明の単一粒子検出技術では、一つの検出光波長帯域の光強度データ（１ｃｈの光強度データ）に於いて、発光粒子の信号と非発光粒子の信号との識別が可能であるので、二つに互いに異なる種類の粒子の検出が同時に且つ種類を識別した態様に達成されるということである。かかる利点は、分子の相互作用等の分析に於いて極めて有利である。
【００５２】
走査分子計数法の処理操作過程
図１（Ａ）に例示の単一粒子検出装置１を用いた本発明に従った走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、（１）単一粒子と背景光を生成する発光物質とを含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定処理、及び（３）測定された光強度の分析処理が実行される。図３は、実施形態の一つに於ける処理をフローチャートの形式にて示している。
【００５３】
（１）試料溶液の調製
本発明の光分析技術の観測対象物となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。発光粒子については、観測対象粒子が、元来、光を発する粒子でない場合には、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。非発光粒子については、発光粒子の場合と同様に任意のものであってよい。また、背景光は、蛍光、自家蛍光、散乱（ラマン散乱（溶媒（水）二硫化炭素、イソプレン、遷移金属錯体）、発光物質による光であってよく、或いは、均一光源による照明光であってもよい。背景光を発光物質の分散によって与える場合、発光物質は、任意の発光分子、例えば、蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子であってよく、光検出領域内に常に数分子以上存在する濃度にて試料溶液中に溶解又は分散される。なお、背景光の光量は、上記の如く、単位体積当たりに於いて、観測対象である発光粒子の光量よりも少なく、観測対象である非発光粒子の光量よりも多くなるよう適宜調整される。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。
【００５４】
（２）試料溶液の光強度の測定（図３−ステップ１００）
本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。光検出器１６は、典型的には、一光子の到来の有無を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
【００５５】
光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された単一粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
【００５６】
ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの単一粒子の個別の検出、或いは、単一粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、単一粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の単一粒子検出技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図４（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の単一粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図４（Ｃ）の最上段に例示の如く、個々の単一粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（単一粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布を反転したプロファイルと略同様となる。）、個々の粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
【００５７】
具体的には、拡散係数Ｄを有する粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ
となるので、粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０−１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
【００５８】
（３）光強度の分析
上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、単一粒子の信号の検出、単一粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。
【００５９】
（ｉ）時系列光強度データの平滑化と釣鐘型関数フィッティングによる単一粒子信号の個別検出
時系列の光強度データに於いて、一つの粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。図４（Ｃ）最上段を参照して、特に、非発光粒子（α）が光検出領域を通過した場合には、光強度の変化は、下に凸となり、発光粒子（β）が光検出領域を通過した場合には、光強度の変化は、上に凸となる。かくして、単一粒子信号の個別検出の一つの態様に於いては、基本的には、背景光から計った適宜設定される閾値を下回る光強度の低下が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、そして、背景光から計った適宜設定される閾値を上回る光強度の増大が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、それぞれの光強度の低下又は増大のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されるようになっていてよい。また、光検出領域の光強度分布が、背景光Ｉｂｇから下に凸の又は上に凸ガウス分布：
Ｉ＝Ｉｂｇ−Ａ−・ｅｘｐ（−２ｔ２／ａ２）      …（α）
Ｉ＝Ｉｂｇ＋Ａ＋・ｅｘｐ（−２ｔ２／ａ２）      …（β）
であると仮定できるときには、有意な光強度の低下又は増大のプロファイル（背景光のゆらぎではないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式α又は式βをフィッティングして算出された強度Ａ−、Ａ＋及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ−、Ａ＋及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
【００６０】
時系列光強度データからの単一粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図４（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図３−ステップ１１０、図４（Ｃ）中上段「スムージング」）。観測対象粒子である発光粒子及び背景光を与える物質等の発する光は確率的に放出されるものであり、また、その光強度は、比較的微弱であるので、細かい増減が生じるところ、かかる光強度の細かい増減（ゆらぎ）は、単一粒子の存在を表す信号の検出精度を悪化させる。スムージング処理は、かかるデータ上の細かい増減を無視できるようにすることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法（例えば、隣接平均法、サビンスキー-ゴレイ(Savinsky-golay)法のアルゴリズム）、パーセンタイルフィルタ法、ＦＦＴフィルタ法により為されてよい。スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ  ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。例えば、移動平均法等により為されてよい。
【００６１】
次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図４（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
【００６２】
しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が単一粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、上に凸の光強度変化の領域に於いては、上に凸の釣鐘型関数のフィッティングが行われ、下に凸の光強度変化の領域に於いては、下に凸の釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図４（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピークの強度（背景光からの最大低下量）Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。また、パルス存在領域に於ける光強度変化の向きは、時間微分値による始点と終点に於ける増減の順序にて識別される。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの単一粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度（式αのＡ−又は式βのＡ＋、背景光の低下分又は増大分の最大値）、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か、例えば、
下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞４．０［ｐｃ／１０μｓ］        …（Ａ）
相関係数＞０．９５
を満たすか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの粒子に対応する信号であると判定される。一方、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。
【００６３】
上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。特に、本実施形態に於いては、パルス信号の探索及び判定の際に、信号が上に凸であるか下に凸であるかが逐次識別され、それぞれ、別々にパルス信号の数が計数されてよい。
【００６４】
（ii）時系列光強度データに於ける光強度変化の発生確率に基づく単一粒子信号の個別検出
単一粒子信号の個別検出の別の態様として、時系列光強度データに出現した光強度変化（光子数変化）のパターンの発生確率を算出し、かかる発生確率に基づいて単一粒子の信号の存在の検出が為されてもよい（特願２０１２−３２４２１参照）。図５（Ａ）を参照して、一般に、時系列光強度データがフォトンカウントデータである場合に於いて、光強度値は、ビンタイム当たりの検出光子数となる。従って、図示の如く、光強度値は、時間軸方向に離散的に分布する。その場合、輝度が大きい粒子信号は、ノイズ信号の影響が少なく、略釣鐘状のプロファイル（左図）を有するが、輝度の小さい粒子信号は、強度値がノイズ信号と略同様となり、更に、ノイズ信号が重畳するので（中図）、略釣鐘状のプロファイルを抽出することが困難となり、粒子のないノイズ信号のみが存在する時間領域（右図）との識別が困難となる。しかしながら、輝度の小さい粒子信号の存在する時間領域とノイズ信号のみが存在する時間領域とでは、光子が検出される事象（光子数が１以上となる事象）の発生頻度とパターンに違いを有する。同様の現象は、非発光粒子の信号と背景光のゆらぎとの間にも観察される。そこで、時系列光強度データ上の所定の時間幅毎の光強度値の時間変化（光子数列）について、光検出領域内に粒子が存在していたと仮定した場合に前記の光強度値の時間変化が発生する確率（発生確率（粒子存在時））と、光検出領域内に粒子が存在していなかったと仮定した場合に前記の光強度値の時間変化が発生する確率（発生確率（粒子不在時））とが算出され、高い発生確率を与える状態が実際の状態であると推定される。
【００６５】
より具体的には、まず、図５（Ｂ）を参照して、時系列光強度データに於いて、任意の時間幅の区間（以下、解析窓と称する。）が設定される。この解析窓は、単位時間（通常は、ビンタイムであってよい。）ｔｉ（ｉ＝１，２，…  以下、同様）毎に、検出された光子数Ｃｉを有する。ところで、各単位時間内に於いて生ずる光子検出の事象の数は、その単位時間に於ける期待値を有するポアソン分布に従うと考えられるので、任意の単位時間ｔｉに於いて、検出光子数Ｃｉとなる確率（単位時間発生確率）は、
【数１】
0006010114.tif 000002
により与えられる。ここで、Ｅｉは、単位時間ｔｉに於ける光子数の期待値である。そして、解析窓にｎ＋１個の単位時間が含まれるとき、解析窓内に於ける検出光子数列Ｃｉが発生する確率Ｐ（発生確率）は、
【数２】
0006010114.tif 000003
により与えられる。
【００６６】
上記の各単位時間ｔｉに於ける光子検出事象の発生数の期待値Ｅｉは、光計測中の解析窓に対応する時間領域に於ける光検出領域内の粒子の有無によって決定される。かくして、光検出領域内に粒子が存在していない場合、光子検出の事象は、常にランダムに生ずるので、各計測単位時間ｔｉに於ける期待値Ｅｎｉは、
Ｅｎｉ＝Ｂｇ      …（３）
と設定されてよい。ここで、Ｂｇは、背景光の時間平均値である。従って、式（３）の値を式（１）に代入して、各計測単位時間ｔｉに於ける単位時間発生確率Ｐｎｉが時系列に算定され、更に、式（２）により、光検出領域内に粒子が存在していない状態を仮定した場合に実際の検出光子数列が発生する確率Ｐｎが算出される。
【００６７】
一方、光検出領域内に粒子が存在していた場合、光検出領域ＣＶの位置は移動しているので、粒子は、図４（Ｂ）に模式的に描かれている如く、光検出領域ＣＶ内を通過することとなる。かかる過程に於いて、光検出領域に於ける粒子から放出され検出される光の強度値又は光検出領域内に粒子が存在することによって低減する背景光の低減量は、図５（Ｃ）に示されている如く、粒子の位置が光検出領域の略中心から離れるほど低下する。従って、光検出領域内に粒子が存在していた場合の各単位時間ｔｉに於ける期待値Ｅｐｉも、時間を変数とする釣鐘状の関数として表される。ここで、その釣鐘状の関数がガウス関数で近似されるとすると、期待値Ｅｐｉは、
【数３】
0006010114.tif 000004
により与えられる。ここで、ガウス関数は、解析窓内の任意の時間ｔｃ（例えば、解析窓の中心）にてピーク強度Ｑを有すると仮定されている。また、式（４）のガウス関数の半値全幅は、図５（Ｃ）に例示されている如き、光検出領域に於ける粒子から放出され検出される光の強度値又は光検出領域内に粒子が存在することによって低減する背景光の低減量の半径ｒ方向の分布の半値全幅ｄを、移動速度ｖの光検出領域が通過する時間ｄ／ｖに等しく、この条件から、ｗは、
【数４】
0006010114.tif 000005
により与えられる。なお、図５（Ｃ）の半値全幅ｄは、光学系から決定可能である。
【００６８】
式（４）中のピーク強度Ｑは、観測対象粒子が発光粒子の場合、解析窓内の光子数の総計が式（４）の期待値の総計に一致すると仮定すると、
【数５】
0006010114.tif 000006
により与えられる。また、観測対象粒子が非発光粒子の場合には、光子数の低減量の絶対値の期待値が式（４）に従うと設定して、ピーク強度Ｑは、
【数６】
0006010114.tif 000007
により与えられる。かくして、式（４）の値を式（１）に代入して、各計測単位時間ｔｉに於ける単位時間発生確率Ｐｐｉが時系列に算定され、更に、式（２）により、光検出領域内に粒子が存在していた状態を仮定した場合に実際の検出光子数列が発生する確率Ｐｐが算出される。そして、粒子が存在していた状態を仮定した場合の検出光子数列の発生確率Ｐｐが粒子が存在していなかった状態を仮定した場合の検出光子数列の発生確率Ｐｎを所定の程度上回るとき、その解析窓に於いて、粒子の信号が存在していると判定される。
【００６９】
なお、実施の態様に於いては、解析窓内に粒子の信号が存在するか否かの判定は、発生確率Ｐｐと発生確率Ｐｎとのオッズ比ＯＲ
ＯＲ＝Ｐｐ（１−Ｐｎ）／（１−Ｐｐ）Ｐｎ      …（８）
を算出し、その大きさが所定値を越えたときに、解析窓内に於ける粒子の信号の存在が判定されてよい。
【００７０】
上記の粒子の信号の検出処理過程に於いて、解析窓は、好適には、単一粒子が光検出領域内を通過するのに要する時間以上に設定される。半径ｒの光検出領域が速度ｖにて移動しているとすれば、解析窓の時間幅は、
２ｒ／ｖ      …（９）
よりも長く設定される。また、解析窓は、好適には、時系列光強度データ上にて単位時間毎に順に設定されてよい。かかる設定によれば、発生確率Ｐｐ、発生確率Ｐｎ及び／又はオッズ比ＯＲが時系列光強度データに沿って算出されることとなる。しかしながら、その場合、演算量が多くなるので、数個の単位時間毎に解析窓が設定されるようになっていてもよい。更に、時系列光強度データ上を解析窓の時間幅にて分割して解析窓を設定してもよい。この場合、解析窓は、互いに重複せずに設定されることとなる。
【００７１】
解析窓が単位時間毎に設定される場合には、一つの粒子信号が存在するとき、粒子の信号の存在の判定が連続する解析窓に於いて継続することとなる。即ち、一つの粒子の信号は、粒子の信号の存在の判定が継続する一つの区間に対応することとなる。従って、粒子の信号の存在の判定が継続する区間の数を計数することにより粒子の信号の計数が可能となる。また、上記の粒子の信号の検出処理過程に於いて、ビンタイムは、単一粒子が光検出領域内を通過するのに要する時間（式９）以下に設定される。これは、単一粒子が通過する際の信号を複数のビンタイムに亘って捉えて、単一粒子が通過する間の光強度値の時間変化のパターンが検出できるようにするためである。（もしビンタイムが式９の時間よりも長いと単一粒子が通過する間の光強度値の時間変化のパターンが捕捉できない。）
【００７２】
図６は、上記の検出光子数列が発生する確率Ｐｐ、Ｐｎを用いて単一粒子信号の検出をする処理をフローチャートの形式にて示している。同図を参照して、まず、時系列光強度データの生成後（ステップ１００）、時系列光強度データ上にて背景光の強度値の算出が行われる（ステップ３１０）。背景光の強度値は、時系列光強度データ上に於いて、粒子の信号が存在していない領域の強度値（光子数）の平均値であってよい。かくして、背景光の強度値の算出の一つの手法に於いては、得られた時系列光強度データ上の光強度値のうち、高い方から所定の割合（例えば、２０％）のデータと、低い方から所定の割合（例えば、２０％）のデータとを除いた全強度値の平均値が背景光の強度値として採用されてよい。これは、光強度値の高い方から所定の割合のデータが発光粒子の信号であり、光強度値の低い方から所定の割合のデータが非発光粒子の信号であると考えられるためである。なお、背景光の強度値は、観測対象の粒子を含まない試料溶液を用いて得られた時系列光強度データ上の光強度値の平均であってもよい。
【００７３】
次に、本実施形態の処理過程に於いては、時系列光強度データ上に於いて解析窓の設定が実行される（ステップ３２０）。既に触れた如く、一つの解析窓の長さは、光検出領域の大きさと移動速度とから決定されてよい（式（９）参照）。また、解析窓は、好適には、ビンタイム毎に時系列に設定されてよい。しかしながら、演算量を低減する目的で、数個のビンタイム毎に設定されてもよく、或いは、解析窓が互いに重複しないように設定されてもよい。
【００７４】
かくして、解析窓の設定が為されると、上記に説明された原理に従って、光検出領域内に粒子が無いと仮定した場合の解析窓内の光強度値列又は光子数列の発生確率Ｐｎ（ステップ１３０）、光検出領域内に粒子が有ると仮定した場合の解析窓内の光強度値列又は光子数列の発生確率Ｐｐ（ステップ１４０）がそれぞれ算出される。この点に関し、特に、本発明に於いては、一つの時系列光強度データ上に、発光粒子の信号と非発光粒子の信号とが存在し得る。従って、光検出領域内に粒子が有ると仮定した場合の発生確率Ｐｐは、光検出領域内に発光粒子が有ると仮定した場合の発生確率Ｐｐ＋と、検出領域内に非発光粒子が有ると仮定した場合の発生確率Ｐｐ−とがそれぞれ算出される（Ｐｐ＋は、式（６）を使用して算出される確率であり、Ｐｐ−は、式（７）を使用して算出される確率である。）そして、算出された発生確率Ｐｐ＋、Ｐｐ−、Ｐｎが互いに比較され、解析窓内に発光粒子又は非発光粒子が存在しているか否かが判定される（ステップ１５０）。かかる判定に於いては、発生確率Ｐｐ＋又はＰｐ−と発生確率Ｐｎのオッズ比が算出され（式（８）参照）、発光粒子のオッズ比が所定値以上のとき、発光粒子が存在していると判定され、非発光粒子のオッズ比が所定値以上のとき、非発光粒子が存在していると判定されてよい。なお、光検出領域内に粒子が有ると仮定した場合の発生確率Ｐｐ＋、Ｐｐ−の算出に於いて、強度値の期待値は、解析窓の中心に強度のピークが存在するものと仮定されてよい。実際には、粒子の信号のピークは、解析窓の中心に存在しないことが殆どであり、実際の粒子の信号のピークの位置が解析窓の中心から離れるほど、発生確率Ｐｐ＋、Ｐｐ−の値が低減するが、実際の粒子の信号が存在していないときの発生確率Ｐｎの値よりは、高い値となる。
【００７５】
上記のステップ１３０〜１５０の処理に於ける解析窓内の発生確率Ｐｐ、Ｐｎの算出及び粒子信号の検出は、光強度データに設定された全ての解析窓に於いて実行されてよい（ステップ１６０）。
【００７６】
（iii）粒子濃度の決定
更に、検出された単一粒子の信号の数を計数して、粒子の数の決定が為されてもよい（粒子のカウンティング）。また、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と粒子の数とから試料溶液中の粒子の数密度又は濃度が決定される（ステップ１７０）。
【００７７】
光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された粒子の数と、対照溶液の粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、粒子濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の単一粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ      …（１０）
により与えられる。また、対照溶液として、単一粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、単一粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子濃度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ      …（１１）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（１０））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が単一粒子検出を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
【００７８】
かくして、光検出領域により試料溶液中にて走査して粒子を個別に検出する反転型走査分子計数法に於いて、上記の処理手順により、試料溶液中の粒子のカウンティング、濃度の決定等が可能となる。特に、本発明の場合に於いては、発光粒子と非発光粒子のカウンティングが別々に為され、それぞれの粒子濃度が決定され、これにより、粒子の種類毎の濃度の決定が可能となる。
【００７９】
（４）一定の信号数を検出する単一粒子検出処理
上記の単一粒子検出処理に於いては、或る設定した時間に亘って光測定を実行した後、得られた光強度データ上にて単一粒子の信号が検出される。その場合、試料溶液中の粒子濃度が未知であるとき、或る固定された測定時間に亘って光強度の測定を行う場合には、粒子の濃度が低い場合に備えて、測定時間は、十分に長く設定されることとなる。一方、試料溶液中の粒子の濃度が高い場合には、濃度等の特性を許容可能な又は満足する精度にて決定するのに必要な時間以上に光強度の測定が継続されることとなる。また、試料溶液中の粒子濃度が実験者の想定した濃度よりも低く、設定された測定時間が足りない場合には、結果の誤差が大きくなってしまう。そこで、単一粒子検出処理の更に別の態様として、光検出領域を移動しながらの光強度の測定と単一粒子の信号の検出とを信号の数が予め定められた数に達するまで繰り返し、信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間が計測され、かかる単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間に基づいて、粒子濃度が決定されてよい。かかる構成によれば、試料溶液中の粒子濃度が高い場合には、光強度の測定に要する時間は短縮され、試料溶液中の粒子濃度が低い場合には、結果（即ち、粒子濃度）に要求される精度を達成する粒子数が得られるまで光強度の測定を継続させることが可能となる。そして、単一粒子の信号の数が達するべき予め定められた数を結果に要求される精度を達成する粒子数に設定しておくことにより、単一粒子の信号の数が予め定められた数に達するのに要した時間には、結果に要求される精度を達成する粒子数が反映されることとなるので、その時間に基づいて決定される粒子の濃度値は、許容可能な又は満足する精度を有していることが期待される。なお、かかる構成に於いても、本発明の場合には、光計測から粒子濃度の算定までが、複数の検出波長毎に実行される。
【００８０】
（ｉ）基本原理
粒子の濃度値と、信号数が予め定められた数に達するのに要した時間とは、以下の如く、関係づけられる。即ち、或る粒子濃度Ｃの試料溶液中に於いて、時間τに亘って、光検出領域を走査速度ｕにて移動させた場合、光検出領域の断面積をＳとすると、検出される粒子信号の数Ｘは、
Ｘ＝ＣＳｕτＮＡ      …（１２）
となる。ここで、ＮＡは、アボガドロ数である。従って、信号数が予め定められた数ＸＥに達するのに時間Ｔを要したとすると、粒子濃度Ｃは、
Ｃ＝ＸＥ／（ＳＴｕＮＡ）      …（１３）
により、時間Ｔの関数として与えられる。なお、単位時間当たりの粒子の検出速度Ｖは、信号数が予め定められた数ＸＥに達するのに要した時間Ｔと粒子検出数ＸＥとに基づいて
Ｖ＝ＸＥ／Ｔ      …（１４）
により与えられるので、粒子濃度Ｃは、
Ｃ＝Ｖ／（ＳｕＮＡ）…（１５）
と表される。この式（１５）に於いては、粒子濃度Ｃが、検出速度Ｖに一次に比例し、粒子濃度Ｃと検出速度Ｖとの対応関係がわかり易いので、実際の実験に於いては、粒子濃度Ｃは、検出速度Ｖを用いて決定されてもよい。
【００８１】
（ii）処理操作手順
一定の信号数を検出する単一粒子検出処理は、例えば、図７のフローチャートに示した処理手順により実行されてよい。同図の例に於いては、端的に述べれば、光検出領域の位置の移動、光検出領域からの光の検出、単一粒子の信号の検出及び検出された粒子信号の計数の一連の処理が、解析時間間隔ｔ（所定の時間間隔）毎に、検出された粒子数Ｘが終了粒子数ＸＥ（単一粒子数が到達すべき予め定められた数）に到達するまで反復して実行される。なお、以下に述べる一連の処理及び構成は、コンピュータ１８の処理作動により実現されることは理解されるべきである。
【００８２】
（ａ）初期設定
図７を参照して、操作処理に於いて、具体的には、まず、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、光強度の測定と粒子の検出・計数の処理の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、初期設定として、終了粒子数ＸＥの設定（ステップ１０）及び解析時間間隔ｔの設定（ステップ２０）を行う。終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔとは、使用者により任意に設定されてよい。終了粒子数ＸＥは、粒子濃度の結果値に要求される精度を達成できるように粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして適宜決定可能である。解析時間間隔ｔとしては、処理の開始後から粒子数（Ｘ）が終了粒子数（ＸＥ）に到達するまでの時間よりも十分に短い任意の時間間隔が、装置１に於ける処理速度等を考慮して適宜設定されてよい。また、終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔとは、それぞれ、粒子濃度が既知の溶液を用いた予備実験による結果を参考にして予め決定された値が、装置１に於いて記憶され、かかる記憶された値が自動的に又は使用者の選択により使用されるようになっていてもよい。
【００８３】
（ｂ）粒子数の検出
上記の如く終了粒子数ＸＥと解析時間間隔ｔの設定が為されると、以下の如く、解析時間間隔ｔ毎に、解析時間間隔ｔに亘る走査分子計数法による光強度の測定処理及び測定された光強度データからの粒子信号の検出並びに粒子数ｘの検出（ステップ３０）と、ステップ３０にて検出された粒子数ｘを累積して粒子の総数Ｘ（ｔｎ）を算定する処理（ステップ４０）とが粒子の総数Ｘ（ｔｎ）が終了粒子数ＸＥに到達するまで（ステップ５０）、反復して実行される。なお、ステップ３０〜５０の処理の反復実行に先だって、一連の処理の開始時間Ｔｓが記憶されてよい（ステップ２５）。
【００８４】
ステップ３０に於ける光検出・粒子数検出の処理は、図３又は図６に示した処理と同様であってよい。端的に述べれば、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が解析時間間隔ｔに亘って為され、しかる後、得られた解析時間間隔ｔに於ける時系列光強度データに於いて、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、単一粒子の存在を表す信号の検出及び検出数のカウンティングが実行される。
【００８５】
かくして、解析時間間隔ｔに亘る時系列光強度データに於ける粒子数ｘが検出されると、単一粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が
Ｘ（ｔｎ）＝Ｘ（ｔｎ−１）＋ｘ      …（１６）
により算出される（図７−ステップ４０）。なお、Ｘ（ｔｎ−１）は、前回の解析時間間隔ｔまでに検出された粒子の検出総数であり、その初期値は０である。そして、ステップ３０〜４０は、単一粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が終了粒子数ＸＥに到達するまで、即ち、
Ｘ（ｔｎ）≧ＸＥ      …（１７）
が成立するまで（ステップ５０）、解析時間間隔ｔ毎に繰り返される。そして、ステップ３０〜５０を反復しているうちに、式（１７）が成立すると、試料溶液の光強度の測定と粒子の検出・計数との処理が終了する。ステップ３０〜５０の反復処理が終了すると、終了時間ＴＥが記憶されてよい（ステップ６０）。
【００８６】
（ｃ）粒子数と測定終了時間の表示
ところで、解析時間間隔ｔ毎にステップ３０〜５０の反復実行期間に於いて（式（１７）が成立するまで）、コンピュータ１８のモニター上などの表示器に、粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）及び／又は測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示されるようになっていてよい。かかる構成によれば、使用者は、それらの表示を見ることによって、実行中の測定がいつ頃終了するのかを予測することができる点で有利である。
【００８７】
上記の如き表示を実行する場合には、図７のステップ５０の判定に於いて、式（１７）が成立しなかった場合に、図中、点線にて示された各処理が実行される。具体的には、まず、ステップ４０に於いて算定された最新の粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）が表示器上に表示される（ステップ５２）。なお、既にステップ３０〜５０の反復実行が為されている場合には、それまでの粒子の検出総数Ｘ（ｔｎ）の値が更新される。次いで、測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒを算出するために、ステップ３０〜５０の処理の開始後からの粒子の検出速度ｖが算出される（ステップ５４）。現在までの粒子の検出速度ｖは、
ｖ＝Ｘ（ｔｎ）／（Ｔｐ−Ｔｓ）      …（１８）
により与えられてよい。ここで、Ｔｐは、現在の時刻である。かくして、粒子の検出速度ｖを用いて、測定残り時間Ｔｒ（ステップ３０〜５０の処理終了までの時間）が、
Ｔｒ＝（ＸＥ−Ｘ（ｔｎ））／ｖ      …（１９）
により推定され、また、測定終了時間ＴＥ（ステップ３０〜５０の処理が終了する時間）が、
ＴＥ＝Ｔｐ＋Ｔｒ      …（２０）
により推定される（ステップ５６）。そして、推定された測定終了時間ＴＥ若しくは測定残り時間Ｔｒが表示器上に表示される（ステップ５８）。なお、既にステップ３０〜５０の反復実行が為されている場合には、既に表示されている値が更新される。また、Ｘ（ｔｎ）＝０のときは、式（１８）又は（１９）は、演算されずに、Ｔｒ及びＴＥは、不明であると表示されてよい。
【００８８】
上記の図７のステップ３０〜５０の処理は、既に述べた如く、解析時間間隔ｔ毎に繰り返される。この点に関し、図３又は図６のステップ１００の光強度の測定は、測定の開始から終了まで、ステップ１００以外の信号処理ステップの実行中も連続的に実行されてよい。即ち、光検出・粒子数検出の処理に於いては、一つのサイクルの解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定が完了されると、次のサイクルの解析時間間隔ｔに亘る光強度の測定がそのまま連続して実行されると同時に、コンピュータ１８に於いて、完了したサイクルの解析時間間隔ｔに亘って取得された光強度データからの粒子の信号の検出・計数の処理が実行されることとなる。これにより、リアルタイムに粒子の検出・計数が達成されることとなる。
【００８９】
（ｄ）濃度算出等の分析
かくして、粒子数が終了粒子数に到達すると、粒子数が終了粒子数に到達するまでの時間Ｔ（＝ＴＥ−Ｔｓ）或いは検出された粒子の信号から得られるその他の情報を用いて、濃度算出等の分析が実行されてよい（ステップ７０）。粒子濃度は、既に述べた如く、式（１２）を用いて、終了粒子数に到達するまでの時間Ｔと終了粒子数ＸＥとから、粒子の検出速度Ｖを算出し、粒子の検出速度Ｖから、式（１３）の関係を用いて決定される。
【００９０】
なお、式（１２）〜（１５）中の光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、粒子濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出・計数を行うことにより検出された粒子の数と、対照溶液の単一粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの対照溶液について、移動速度ｕｏにて或る時間τｏに亘って実行された光強度の測定に於ける粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過領域の断面積Ｓは、
Ｓ＝Ｎ／（Ｃ・ＮＡ・ｕｏ・τｏ）      …（２１）
により与えられる。また、対照溶液として、粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＳの平均値が光検出領域の断面積Ｓとして採用されるようになっていてよい。
【００９１】
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
【実施例１】
【００９２】
本発明の走査分子計数法による光測定により得られた時系列光強度データに於いて、発光粒子の存在を表す信号と非発光粒子の存在を表す信号とが識別しながら検出可能であることを検証した。【００９３】
試料溶液として、３．２５ｎＭの蛍光色素ＡＴＴＯ４８８を含む２０％ポリエチレングリコール溶液に、非発光粒子として２ｆＭの非蛍光ビーズ（CP-40-10: spherotec(Ｄ:4000nm)）を分散させた溶液、発光粒子として２ｆＭの蛍光ビーズ（FP-4052-2:spherotec(Ｄ:4000nm)）を分散させた溶液及び１ｆＭの非蛍光ビーズと１ｆＭの蛍光ビーズを分散させた溶液を調製した。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の試料溶液の各々について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、５０μＷの４８８ｎｍのレーザー光を用い、バンドパス光学フィルター５３５ＢＰにより、５１０〜５６０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列フォトンカウントデータを生成した。なお、コンフォーカル・ボリュームの直径は、約４μｍに設定した。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、９０００ｒｐｍ（６７．５ｍｍ／秒）とし、ＢＩＮ  ＴＩＭＥを５０μ秒とし、１００秒間の測定を各溶液について３回ずつ行った。【００９４】
単一粒子信号の検出は、図６に関連して説明された光強度変化の発生確率に基づく単一粒子信号の個別検出の態様にて行った。図８（Ａ）は、得られた時系列光強度データの一部であり、図８（Ｂ）は、非発光粒子が存在したと仮定した場合の発生確率のオッズ比であり、図８（Ｃ）は、発光粒子が存在したと仮定した場合のオッズ比を示している。図から理解される如く、（Ａ）に於いて、非発光粒子（α）が通過した考えられる光強度の低下と、発光粒子（β）が通過した考えられる光強度の増加が観察され、これらに対応して、それぞれのオッズ比が増大した。時系列光強度データ全体を観察すると、背景光に対して−８７％〜−２％のピーク強度を有する非発光粒子の信号と、背景光に対して８％〜７２０％のピーク強度を有する発光粒子の信号とが観察された。【００９５】
図９は、粒子を含まない溶液（０：０）、非発光粒子のみを含む溶液（２：０）、発光粒子のみを含む溶液（０：２）、発光粒子と非発光粒子とを含む溶液（１：１）について、上記の処理にて検出された発光粒子の信号数（凸）と非発光粒子の信号数（凹）のそれぞれの平均値（棒グラフ）と標準偏差（エラーバー）とを示している。図から理解される如く、試料溶液中に含まれる粒子の比に対応した数の発光粒子の信号と非発光粒子の信号とがそれぞれ検出された。このことは、本発明の光分析技術、即ち、発光粒子と非発光粒子とが同一の試料溶液に含まれている場合に、適当な背景光の存在下にて走査分子計数法を実行することによれば、試料溶液中の発光粒子と非発光粒子とがそれぞれ識別しながら検出できることを示している。また、各粒子の含有量の見積も可能であることが示された。【００９６】
かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明の教示に従った走査分子計数法によれば、試料溶液中に分散された発光粒子と非発光粒子の検出及びその濃度に関する情報の取得が粒子の種類毎に可能となる。特に、本発明は、単一粒子の信号を個別に検出するので、試料溶液中の粒子濃度がＦＣＳ等の光分析技術で要求される濃度域よりも低くても、粒子の検出が可能であり、かかる特徴は、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合に有利であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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