(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的検出装置を製造する方法であって、
ＣＭＯＳ装置の上方にマイクロウェルを形成する工程であって、該マイクロウェルが底表面及び側壁を含む、工程と；
該マイクロウェルの底表面に選択的に付着させるための第１の化学物質を塗布する工程であって、該第１の化学物質が、ホスフェート、ホスホネート、カテコール、ニトロカテコール、ボロネート、フェニルボロネート、イミダゾール、またはシラノールを含む、工程と；
該マイクロウェルの側壁に選択的に付着させるための第２の化学物質を塗布する工程であって、該第２の化学物質が、該第１の化学物質に対する親和性を欠いており、かつ、該第２の化学物質が、式：Ｒ−［（ＣＨ２）ｎ］−Ｓｉ−［Ｘ１Ｘ２Ｘ３］（式中、Ｒは、有機官能基であり、［（ＣＨ２）ｎ］は、炭化水素リンカー（ｎ＝１〜２０）であり、Ｓｉは、ケイ素原子であり、［Ｘ１Ｘ２Ｘ３］は、１つ以上の独立した加水分解性基を含む）を有するか、または式：Ｒ−［（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ］−Ｓｉ−［ＸｌＸ２Ｘ３］（式中、Ｒは、有機官能基であり、［（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ］（ｎ＝１〜１００）は、ポリエーテルリンカーであり、Ｓｉは、ケイ素原子であり、［Ｘ１Ｘ２Ｘ３］は、１つ以上の加水分解性基を含む）を有するシランを含む、工程と
を含む、方法。
【請求項２】
Ｒが、メチル、メチレン、フェニル、ベンジル、アニリノ、アミノ、アミド、ヒドロキシル、アルデヒド、アルコキシ、ハロ、メルカプト、カルボキシ、アシル、ビニル、アリル、スチリル、エポキシ、イソシアナト、グリシドキシ、またはアクリルオキシである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
加水分解性基が、アルコキシまたはハロゲン基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の化学物質がｐＨ検知基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＭＯＳ装置が、フローティングゲートターミナルを有する電荷敏感トランジスタを備え、且つ前記マイクロウェルの底表面が、該フローティングゲートターミナルの上にパッシベーション層を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
底表面及び側壁を有するマイクロウェルであって、該マイクロウェルの底部が、ＣＭＯＳ装置のフローティングゲートターミナルの上にパッシベーション層を含み、該パッシベーション層が、１層以上の他の金属酸化物層の上にあり、該底表面が、第１の化学物質によって被覆されており、該側壁が、第２の化学物質によって被覆されており、該第２の化学物質が、該第１の化学物質に対する親和性を欠いている、マイクロウェルと；
該マイクロウェルの底部の下に配置されたＣＭＯＳ装置と
を備える、化学的検出装置であって、
前記第１の化学物質が、ホスフェート、ホスホネート、カテコール、ニトロカテコール、ボロネート、フェニルボロネート、イミダゾール、またはシラノールを含み、前記第２の化学物質が、式：Ｒ−［（ＣＨ２）ｎ］−Ｓｉ−［Ｘ１Ｘ２Ｘ３］（式中、Ｒは、有機官能基であり、［（ＣＨ２）ｎ］は、炭化水素リンカー（ｎ＝１〜２０）であり、Ｓｉは、ケイ素原子であり、［Ｘ１Ｘ２Ｘ３］は、１つ以上の独立した加水分解性基を含む）を有するか、または式：Ｒ−［（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ］−Ｓｉ−［ＸｌＸ２Ｘ３］（式中、Ｒは、有機官能基であり、［（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ］（ｎ＝１〜１００）は、ポリエーテルリンカーであり、Ｓｉは、ケイ素原子であり、［Ｘ１Ｘ２Ｘ３］は、１つ以上の加水分解性基を含む）を有するシランを含む、
化学的検出装置。
【請求項７】
Ｒが、メチル、メチレン、フェニル、ベンジル、アニリノ、アミノ、アミド、ヒドロキシル、アルデヒド、アルコキシ、ハロ、メルカプト、カルボキシ、アシル、ビニル、アリル、スチリル、エポキシ、イソシアナト、グリシドキシ、またはアクリルオキシである、請求項６に記載の化学的検出装置。
【請求項８】
加水分解性基が、アルコキシまたはハロゲン基を含む、請求項６に記載の化学的検出装置。
【請求項９】
前記第１の化学物質がｐＨ検知基を含む、請求項６に記載の化学的検出装置。
【請求項１０】
前記マイクロウェルがＳｉＯ２側壁を有する、請求項６に記載の化学的検出装置。
【請求項１１】
ＣＭＯＳ装置の上方にマイクロウェルを形成する工程であって、該マイクロウェルが、底表面及び側壁を含み、且つ該マイクロウェルが、複数の検体が付着している固相支持体を受容するように構成される、工程と；
該マイクロウェルの底表面に選択的に付着させるための第１の化学物質を塗布する工程であって、該第１の化学物質が、ホスフェート、ホスホネート、カテコール、ニトロカテコール、ボロネート、フェニルボロネート、イミダゾール、またはシラノールを含む、工程と；
該マイクロウェルの側壁に選択的に付着させるための第２の化学物質を塗布する工程であって、該第２の化学物質が、該第１の化学物質に対する親和性を欠いており、該ＣＭＯＳ装置が、該マイクロウェルの底表面における電荷を検知するように構成され、該電荷が、該複数の検体との少なくとも１つの化学反応によって生成される１つ以上の副産物に起因し、該１つ以上の副産物が、該第２の化学物質に起因して該マイクロウェルの側壁に対する親和性を欠いており、かつ、該第２の化学物質が、式：Ｒ−［（ＣＨ２）ｎ］−Ｓｉ−［Ｘ１Ｘ２Ｘ３］（式中、Ｒは、有機官能基であり、［（ＣＨ２）ｎ］は、炭化水素リンカー（ｎ＝１〜２０）であり、Ｓｉは、ケイ素原子であり、［Ｘ１Ｘ２Ｘ３］は、１つ以上の独立した加水分解性基を含む）を有するか、または式：Ｒ−［（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ］−Ｓｉ−［ＸｌＸ２Ｘ３］（式中、Ｒは、有機官能基であり、［（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ］（ｎ＝１〜１００）は、ポリエーテルリンカーであり、Ｓｉは、ケイ素原子であり、［Ｘ１Ｘ２Ｘ３］は、１つ以上の加水分解性基を含む）を有するシランを含む、工程と
を含む、方法。
【請求項１２】
Ｒが、メチル、メチレン、フェニル、ベンジル、アニリノ、アミノ、アミド、ヒドロキシル、アルデヒド、アルコキシ、ハロ、メルカプト、カルボキシ、アシル、ビニル、アリル、スチリル、エポキシ、イソシアナト、グリシドキシ、またはアクリルオキシである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
加水分解性基が、アルコキシまたはハロゲン基を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の化学物質が、前記固相支持体を受容する前に正に帯電して、該固相支持体の堆積を促進する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記固相支持体が、マイクロ粒子、ナノ粒子、ビーズ、固体、及び、ゲルを含む多孔体のうちの１つである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の検体が、ＤＮＡサンプルの複数のコピーである、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、既に出願されている２０１０年８月１８日出願の米国仮特許出願第６１／３７４，６７６号に対する優先権の利益を主張し、参照することによりその全文を組み込むものとする。
【０００２】
また、本願は、２０１０年５月２４日出願の米国特許出願第１２／７８５，７１６号を参照することによりその全文を組み込むものとする。
【背景技術】
【０００３】
背景
電気化学的検出は、高感度であり、小規模であり、低コストであり、応答が早く、且つ微細加工技術に適合しているので、魅力的である。（例えば、Ｈｕｇｈｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：７４−８０（１９９１年）（非特許文献１）；Ｍｉｒら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，３０：３３８６−３３９７（２００９年）（非特許文献２）；Ｔｒｏｊａｎｏｗｉｃｚ，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ，Ａｃｔａ，６５３：３６−５８（２００９年）（非特許文献３）；及び、Ｘｕら，Ｔａｌａｎｔａ，８０：８−１８（２００９年）（非特許文献４）を参照されたい）。これら特徴によって、電流測定シグナル、電位差シグナル、又はインピーダンスシグナルに基づく様々なセンサが開発され、それを用いて化学的用途、生化学的用途、及び細胞用途のためのアレイが組立てられた。（例えば、Ｙｅｏｗら，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  ４４：４３４−４４０（１９９７年）（非特許文献５）；Ｍａｒｔｉｎｏｉａら，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１６：１０４３−１０５０（２００１年）（非特許文献６）；Ｈａｍｍｏｎｄら，ＩＥＥＥ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  Ｊ，４：７０６−７１２（２００４年）（非特許文献７）；Ｍｉｌｇｒｅｗら，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  １０３：３７−４２（２００４年）（非特許文献８）；Ｍｉｌｇｒｅｗら，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，１１１−１１２：３４７−３５３（２００５年）（非特許文献９）；Ｈｉｚａｗａら，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，１１７：５０９−５１５（２００６年）（非特許文献１０）；Ｈｅｅｒら，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，２２：２５４６−２５５３（２００７年）（非特許文献１１）；Ｂａｒｂａｒｏら，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，１１８：４１−４６（２００６年）（非特許文献１２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，１２９：７９−８６（２００８年）（非特許文献１３）；Ｒｏｔｈｂｅｒｇら、米国特許出願公開第２００９／０１２７５８９号（特許文献１））；及びＲｏｔｈｂｅｒｇら、英国特許出願ＧＢ２４６１１１２７（特許文献２））を参照されたい）。典型的に、このようなシステムにおいて、検体は、マイクロウェル（本明細書では「ウェル」とも呼ばれる）又は反応チャンバ等の閉じ込め領域のアレイにランダムに分布しており、また、試薬は、センサアレイを含むフローセルを通して前記試薬の流れを導く流体光学システムによってこのような領域に送達される。反応が生じるマイクロウェル、及び反応が生じない空ウェルは、各マイクロウェルに関連する１つ以上の電子センサによってモニタすることができる。
【０００４】
電気化学的検出の１種では、基礎反応産物、すなわち「シグナル」は、ｐＨの変化である。ｐＨの変化は、ウェルの底部における表面電荷の変化を測定することにより検出される。ウェルの底部における表面は、生物学的反応の結果として生じるｐＨの変化を緩衝する。生物学的反応に起因して生じる表面電荷の変化は、ウェルの底部と、表面の下方の化学的感応型電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍＦＥＴ）のフローティングゲートとの容量結合によって検知される。しかし、ウェルの側壁は、ｃｈｅｍＦＥＴから遠く離れすぎていて、ｃｈｅｍＦＥＴシグナルには寄与しない。残念なことに、現在の実施では、ウェルの側壁は、ウェルの底部における表面と同様に緩衝する。例えば、図２Ａは、底部及び側壁の両方に自然金属の酸化物、窒化物、又は酸窒化物の表面を備える先行技術のマイクロウェル構造を示す。したがって、側壁の緩衝が、ウェルの底部において検出されるシグナルを減少する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０１２７５８９号
【特許文献２】ＧＢ２４６１１１２７
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｕｇｈｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：７４−８０（１９９１年）
【非特許文献２】Ｍｉｒら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，３０：３３８６−３３９７（２００９年）
【非特許文献３】Ｔｒｏｊａｎｏｗｉｃｚ，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ，Ａｃｔａ，６５３：３６−５８（２００９年）
【非特許文献４】Ｘｕら，Ｔａｌａｎｔａ，８０：８−１８（２００９年）
【非特許文献５】Ｙｅｏｗら，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  ４４：４３４−４４０（１９９７年）
【非特許文献６】Ｍａｒｔｉｎｏｉａら，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１６：１０４３−１０５０（２００１年）
【非特許文献７】Ｈａｍｍｏｎｄら，ＩＥＥＥ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  Ｊ，４：７０６−７１２（２００４年）
【非特許文献８】Ｍｉｌｇｒｅｗら，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  １０３：３７−４２（２００４年）
【非特許文献９】Ｍｉｌｇｒｅｗら，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，１１１−１１２：３４７−３５３（２００５年）
【非特許文献１０】Ｈｉｚａｗａら，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，１１７：５０９−５１５（２００６年）
【非特許文献１１】Ｈｅｅｒら，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，２２：２５４６−２５５３（２００７年）
【非特許文献１２】Ｂａｒｂａｒｏら，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，１１８：４１−４６（２００６年）
【非特許文献１３】Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，１２９：７９−８６（２００８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記観点から、側壁の緩衝を減少するマイクロウェル構造、及びマイクロウェルの側壁のコンフォーマルコーティング及び選択的エッチングの方法を利用可能にすることが有利であり、これらによって、現在のアプローチの欠点が克服される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
記載する実施形態は、改善されたシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）を有する化学的検出装置を提供することができる。化学的検出装置は、マイクロウェルの底部に結合し且つイオンの結合を促進する化学物質でコーティングされたマイクロウェルと、該マイクロウェルの底部の下に配置されたＣＭＯＳ装置とを備えてもよい。異なる実施形態では、マイクロウェルの側壁は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）又はプラスチックで作製されてよい。１つの実施形態では、マイクロウェルの側壁は、溶液中のプロトンの緩衝を減少するシラン基でコーティングされていてよい。ＳＮＲは、側壁によるプロトンの緩衝の減少により改善することができる。
【０００９】
１つの実施形態は、改善されたシグナル対ノイズ比を有する化学的検出装置を製造する方法を提供することができる。該方法は、ＣＭＯＳ装置の上にプラスチック層を形成する工程と、該プラスチック層の上に金属酸化物の層を形成する工程と、異方性プラスチックエッチングにより該ＣＭＯＳ装置の上の該プラスチック層上にマイクロウェルを形成する工程と、該マイクロウェルの底部に結合するが、プラスチックの側壁には結合しない化学物質を塗布する工程とを含んでよい。
【００１０】
別の実施形態は、改善されたシグナル対ノイズ比を有する化学的検出装置を製造する方法を提供することができる。該方法は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）層の上の金属酸化物層上にマイクロウェルの開口部を形成する工程を含んでよい。ＳｉＯ２層は、ＣＭＯＳ装置の上に存在してよい。該方法は、マイクロウェルの開口部の縁部の下のＳｉＯ２層上に円形のアンダーカット部を形成する工程と、異方性ＳｉＯ２エッチングによりＣＭＯＳ装置の上のＳｉＯ２層上にマイクロウェルを形成する工程と、該マイクロウェルの側壁及び底部に結合する１つの化学物質を塗布する工程と、該マイクロウェルの底部における該化学物質を不活性化する工程と、該マイクロウェルの底部に位置し且つイオンの結合を促進する別の化学物質を塗布する工程とを更に含んでよい。
【００１１】
更なる実施形態は、改善されたシグナル対ノイズ比を有する化学的検出装置を製造する方法を提供することができる。該方法は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）層の上に金属酸化物層を形成する工程を含んでよい。ＳｉＯ２層は、ＣＭＯＳ装置の上に存在してよい。該方法は、ＣＭＯＳ装置の上のＳｉＯ２層上にマイクロウェルを形成する工程と、該マイクロウェルの側壁及び底部に結合する化学物質を塗布する工程と、該マイクロウェルの底部における該化学物質をエッチングにより除去する工程とを更に含んでよい。
【００１２】
別の実施形態は、改善されたシグナル対ノイズ比を有する化学的検出装置を製造する方法を提供することができる。該方法は、ＣＭＯＳ装置の上の二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）層にマイクロウェルを形成する工程と、該マイクロウェルの底部に選択的に付着させるための化学物質を塗布する工程と、該マイクロウェルの頂縁部上及び側壁上に金属酸化物層を形成する工程と、該マイクロウェルの頂縁部及び側壁に選択的に付着させるための別の化学物質を塗布する工程とを含んでよい。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
化学的検出装置を製造する方法であって、
マイクロウェルが底表面及び側壁を含む、ＣＭＯＳ装置の上方に該マイクロウェルを形成する工程と；
該マイクロウェルの底表面に選択的に付着させるための第１の化学物質を塗布する工程と；
該マイクロウェルの側壁上に金属酸化物層を形成する工程と；
第２の化学物質が、該第１の化学物質に対する親和性を欠いている、該マイクロウェルの側壁に選択的に付着させるための該第２の化学物質を塗布する工程と
を含む、方法。
［２］
前記マイクロウェルが１つ以上の頂縁部を含み、該頂縁部もまた前記金属酸化物層によって被覆されており、該金属酸化物層が単分子層である、［１］に記載の方法。
［３］
前記金属酸化物層が、中性のＰＥＧホスフェート又はＰＥＧホスホネートによってコーティングされている、［２］に記載の方法。
［４］
前記金属酸化物層が、酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）の溶剤ベースの堆積物である、［２］に記載の方法。
［５］
前記第２の化学物質がシラン基を含む、［１］に記載の方法。
［６］
前記第１の化学物質が、ホスフェート、ホスホネート、カテコール、ニトロカテコール、ボロネート、フェニルボロネート、イミダゾール、シラノールを含む、［１］に記載の方法。
［７］
前記第１の化学物質がｐＨ検知基を含む、［１］に記載の方法。
［８］
前記ＣＭＯＳ装置が、フローティングゲートターミナルを有する電荷敏感トランジスタを備え、且つ前記マイクロウェルの底表面が、該フローティングゲートターミナルの上にパッシベーション層を含む、［１］に記載の方法。
［９］
底表面及び側壁を有し、該底表面が、第１の化学物質によって被覆されており、該側壁が、金属酸化物層及び該金属酸化物層の上の第２の化学物質によって被覆されており、該第２の化学物質が、該第１の化学物質に対する親和性を欠いている、マイクロウェルと；
該マイクロウェルの底部の下に配置されたＣＭＯＳ装置と
を備える、化学的検出装置。
［１０］
前記ＣＭＯＳ装置が、フローティングゲートターミナルを有する電荷敏感トランジスタを備える、［９］に記載の化学的検出装置。
［１１］
前記マイクロウェルの底部が、前記フローティングゲートターミナルの上にパッシベーション層を含む、［１０］に記載の化学的検出装置。
［１２］
前記パッシベーション層が、１層以上の他の金属酸化物層の上にある金属酸化物層である、［１１］に記載の化学的検出装置。
［１３］
前記第１の化学物質が、ホスフェート、ホスホネート、カテコール、ニトロカテコール、ボロネート、フェニルボロネート、イミダゾール、シラノールを含む、［９］に記載の化学的検出装置。
［１４］
前記第１の化学物質がｐＨ検知基を含む、［９］に記載の化学的検出装置。
［１５］
前記マイクロウェルがＳｉＯ２側壁を有する、［９］に記載の化学的検出装置。
［１６］
前記側壁を被覆している金属酸化物層が単分子層である、［９］に記載の化学的検出装置。
［１７］
前記マイクロウェルの頂縁部もまた、前記金属酸化物層によって被覆されている、［１６］に記載の化学的検出装置。
［１８］
前記金属酸化物層が、１つの酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）の溶剤ベースの堆積物である、［１７］に記載の化学的検出装置。
［１９］
前記第２の化学物質が、中性のＰＥＧホスフェート又はＰＥＧホスホネートである、［９］に記載の化学的検出装置。
［２０］
マイクロウェルが、底表面及び側壁を含み、且つ該マイクロウェルが、複数の検体が付着している固相支持体を受容するように構成される、ＣＭＯＳ装置の上方に該マイクロウェルを形成する工程と；
該マイクロウェルの底表面に選択的に付着させるための第１の化学物質を塗布する工程と；
該マイクロウェルの側壁上に金属酸化物層を形成する工程と；
第２の化学物質が、該第１の化学物質に対する親和性を欠いており、該ＣＭＯＳ装置が、該マイクロウェルの底表面における電荷を検知するように構成され、該電荷が、該複数の検体との少なくとも１つの化学反応によって生成される１つ以上の副産物に起因し、該１つ以上の副産物が、該第２の化学物質に起因して該マイクロウェルの側壁に対する親和性を欠いている、該マイクロウェルの側壁に選択的に付着させるための該第２の化学物質を塗布する工程と
を含む、方法。
［２１］
前記第１の化学物質が、前記固相支持体を受容する前に正に帯電して、該固相支持体の堆積を促進する、［２０］に記載の方法。
［２２］
前記固相支持体が、マイクロ粒子、ナノ粒子、ビーズ、固体、及び、ゲルを含む多孔体のうちの１つである、［２０］に記載の方法。
［２３］
前記複数の検体が、ＤＮＡサンプルの複数のコピーである、［２０］に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本教示の実施形態に係るフローセルの断面図を示す図である。
【図２】図２Ａは、自然金属の酸化物の表面を備える先行技術のウェル構造を示す図である。図２Ｂは、本教示の実施形態に係るコンフォーマルシラン処理表面を備えるウェル構造を示す図である。図２Ｃは、本教示の実施形態に係る、コンフォーマルシラン処理表面を備え、且つ全ての水平表面がエッチングされてオリジナルの金属酸化物になっているウェル構造を示す図である。
【図３】図３Ａは、本教示の実施形態に係るマイクロウェルのコンフォーマルコーティングプロセスに用いることができるシランの１種のＰＥＧ−シランの分子構造を示す図である。図３Ｂは、本教示の実施形態に係るマイクロウェルのコンフォーマルコーティングプロセスに用いることができるシランの別の種類の分子構造を示す図である。図３Ｃは、本教示の実施形態に係るマイクロウェルのコンフォーマルコーティングプロセスに用いることができる両性イオン性種のシランの分子構造を示す図である。
【図４】本教示の実施形態に係るウェル構造の製造の様々な段階を示す図である。
【図５】本教示の実施形態に係る図４Ｃのウェル構造を製造するプロセスを示す図である。
【図６】本教示の実施形態に係る別のウェル構造の製造の様々な段階を示す図である。
【図７】本教示の実施形態に係る図６Ｆのウェル構造を製造するプロセスを示す図である。
【図８】本教示の別の実施形態に係るウェル構造を示す図である。
【図９】本教示の別の実施形態に係るウェル構造の製造の様々な段階を示す図である。
【図１０】本教示の実施形態に係る図９Ｅのウェル構造を製造するプロセスを示す図である。
【図１１】本教示の実施形態に係る化学的検知プロセスを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
図１は、フローセル１００の拡大断面図であり、マイクロウェルの開口端部の上方を、試薬流１０８がマイクロウェルアレイ１０２の表面を横断しているフローチャンバ１０６の一部を示す。マイクロウェルアレイ１０２及びセンサアレイ１０５は、フローセル１００の底壁部又は床部を形成する一体化ユニットを共に形成し得る。１つの実施形態では、基準電極１０４は、フローチャンバ１０６と流体連通し得る。マイクロウェル１０１及びセンサ１１４を拡大図で示す。マイクロウェル１０１は、任意の従来の微細加工技術によってバルク材料１１０に形成され得る。マイクロウェルの容積、形状、アスペクト比（基部の幅対ウェルの深さの比等）、及び他の寸法的特徴は、生じる反応の性質に加えて、試薬、副産物、及び（使用される場合は）使用される標識技術を含む具体的な用途に依存する設計上の選択であってよい。センサ１１４は、パッシベーション層１１６によってマイクロウェルの内部から分離されている、センサプレート１２０を有するフローティングゲート１１８を備えるｃｈｅｍＦＥＴであってよい。センサ１１４は、主に、センサプレート１２０の反対側のパッシベーション層１１６上に存在する電荷１２４の量に応答し得る（そして、前記量に関連する出力シグナルを生じさせる）。電荷１２４の変化は、ＦＥＴのソース１２１とドレイン１２２との間の電流に変化をもたらし得、この電流の変化を直接使用して電流に基づく出力シグナルを提供してもよく、更なる回路と共に間接的に用いて電力に基づく出力シグナルを提供してもよい。反応物質、洗浄溶液、及び他の試薬は、主に拡散１４０によってフローチャンバ１０６からマイクロウェルに移動し得る。
【００１５】
１つの実施形態では、マイクロウェル１０１で行われる反応は、対象検体の特徴又は特性を同定又は決定するための分析反応であってよい。このような反応は、センサプレート１２０に隣接する電荷の量に影響を与える副産物を直接又は間接的に生じさせ得る。（間接的な検出は、例えば、対象検体に結合した後にセンサに影響を与える副産物キレート剤もしくは他の結合化合物が用いられる場合、又は結合事象の結果として二次副産物を生じさせ得る酵素等の標識部分を使用する場合等に起こり得る）。このような副産物が少量しか生成されないか、又は急速に崩壊するか、又は他の成分と反応する場合、最終的に生じる出力シグナルを増大させるために、同じ検体の複数のコピーをマイクロウェル１０１において同時に分析してもよい。１つの実施形態では、検体の複数のコピーは、マイクロウェルに堆積する前又は後に、固相支持体１１２に付着し得る。固相支持体１１２は、マイクロ粒子、ナノ粒子、ビーズ、固体、及び、ゲルを含む多孔体等であってよい。核酸検体の場合、複数の連結されているコピーは、固体支持体を必要とすることなく、アンプリコンを生成するためのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、指数的ＲＣＡ、及び同様の技術によって作製することができる。
【００１６】
１つの実施形態では、ゲノミックＤＮＡ断片のシークエンシングの結果として生じる副産物は、ヌクレオチドの組み込みに起因するｐＨの変化である。１つの実施形態では、これは、７．５〜７．８の適切な作用ｐＨで生じ得る。所与の条件下で組み込まれたヌクレオチド１個当たり、約１個のプロトンが放出される。ｐＨの変化は、ウェルの底部における表面の電荷の変化を測定することにより検出される。ウェルの底部及び側部における表面は、典型的に、金属の酸化物又は窒化物からなる。該表面は、帯電反応を受ける多数の表面基を含んでよい。これら帯電反応は、以下の等式を用いて説明することができる。
0005959516.tif 000002
【００１７】
前記多数の表面基は、上記帯電反応に関連する特徴的な平衡定数と共に、表面に緩衝能を付与する。マイクロウェル等の限られたサンプル容積における表面緩衝能は、生物学的組み込み反応に関連するｐＨの変化を緩衝する。帯電反応（上記等式（１）及び（２））に起因する表面電荷の変化は、ウェルの底面の下に位置するｃｈｅｍＦＥＴにウェルの底部を容量結合することにより検知され得る。しかし、背景技術の章で論じた通り、ウェルの側壁は、ｃｈｅｍＦＥＴから遠く離れすぎていて、ｃｈｅｍＦＥＴシグナルには寄与しない。したがって、本発明の実施形態は、ウェルの側壁と底部とを区別するためにコンフォーマルコーティングを用いることにより、側壁の緩衝を減少する。
【００１８】
図２Ｂ及び２Ｃは、自然金属の酸化物、窒化物、又は酸窒化物の表面層をコンフォーマルコーティングし、次いで、全ての水平表面を選択的にエッチングすることにより側壁の緩衝の問題を解決する本発明の１つの実施形態を示す。図２Ｂは、本発明の１つの実施形態に係る、シランによるマイクロウェルの全ての表面のコンフォーマルコーティングを示す。図２Ｂに示す通り、マイクロウェル２０２は、層２０４によって（底部及び側壁の両方が）被覆され得る。層２０４は、例えば、プロトンに対する親和性を欠いている化学物質の層であってよい。コンフォーマルコーティングは、溶液中でプロトンと反応し得る表面基を減少するか又は除去して、前記表面の緩衝能を減少するか又は除去する。例えば、層２０４をマイクロウェル２０２の底部から取り除いた場合、側壁上の層２０４は、マイクロウェルの側壁の緩衝能を減少するか又は除去するのに役立ち得る。図２Ｃは、（ウェルの底部、及び、ウェルとウェルとの間の頂縁部を含む）水平表面のみを選択的にエッチングし、自然金属の酸化物、窒化物、又は酸窒化物の表面を復元して、ウェルの底部において選択的にｐＨ検知が生じるようにした結果を示す。水平表面をエッチングするために様々な技術を用いることができる。１つの実施形態では、エッチングは、水平表面の指向性反応性イオンエッチングを用いて行われる（例えば、Ｂｏｓｃｈプロセス）。
【００１９】
図３Ａ〜３Ｃは、コンフォーマルコーティングプロセスに用いることができる様々な種類のシランを示す。図３Ａは、コンフォーマルコーティングプロセスにおいて用いることができるＰＥＧ−シランの構造を示す。これは、ＮＡＮＯＣＳ．ｃｏｍから入手可能であり（製品コードＰＥＧ６−０  Ｉ  ０２）、ＰＥＧの平均分子量は２０００である。これは、作用ｐＨ付近のｐＨ（例えば、７．５〜７．８のｐＨ範囲）における小さな変化では電荷が変化しない親水性表面を付与し得る。図３Ｂは、コンフォーマルコーティング工程において使用することができるＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−３−（トリメトキシシリル）−Ｉ−プロパンアミニウムクロリドシランの構造を示す。これは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である（製品番号５９５８８８）。これは、全ての垂直表面に親水性の正の電荷を付与し得る。表面上の電荷は、作用ｐＨ付近のｐＨにおける小さな変化には応答しない。図３Ｃは、コンフォーマルコーティングプロセスにおいて用いることができる両性イオン性種のシランの構造を示す。これは、プロパンスルトン及びＡＰＴＭＳを用いて一段反応で入手可能である。これは、高度に親水性であるが全体的に中性であるコーティングを側壁に付与し得る。
【００２０】
図４Ａ〜４Ｃは、本教示の実施形態に係るウェル構造の製造の様々な段階の断面図を示す。図４Ａは、マイクロウェルを形成する前の化学的検知装置４００の一部の断面図を示す。化学的検知装置４００は、金属酸化物層４０２と、マイクロウェル層４０４と、ＣＭＯＳ装置層４０６と、該マイクロウェル層４０４及び該ＣＭＯＳ装置層４０６の間の電荷敏感装置４０８．１及び４０８．２とを備え得る。金属酸化物層４０２は、マイクロウェル層４０４の上に存在し得、そしてまた、マイクロウェル層４０４は、ＣＭＯＳ装置層４０６の上に存在し得る。電荷敏感装置４０８．１及び４０８．２は、それぞれ、ｃｈｅｍＦＥＴの頂部となり得る。例えば、電荷敏感装置４０８．１及び４０８．２は、ｃｈｅｍＦＥＴのパッシベーション層（例えば、図１のパッシベーション層１１６）であってよく、一方、ｃｈｅｍＦＥＴのフローティングゲート構造は、該電荷敏感装置４０８．１及び４０８．２の下に存在し得る（図示せず）。１つの実施形態では、マイクロウェル層４０４は、プラスチックの層（例えば、Ｃｙｔｏｐ、ＴＥＦＬＯＮ、Ｐａｒｙｌｅｎｅ等）であってよい。更に、１つの実施形態では、電荷敏感装置４０８．１及び４０８．２は、それぞれ、２層以上の金属酸化物層を含んでよい。例えば、電荷敏感装置４０８．１及び４０８．２は、それぞれ、五酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）の上層及び酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）の底層を含んでよい。金属酸化物層４０２は、１層以上のＴａ２Ｏ５、二酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）、又はＡｌ２Ｏ３の層を含んでよい。ＣＭＯＳ装置層は、半導体材料（例えば、Ｓｉ）の層であってよい。
【００２１】
図４Ｂは、１対のマイクロウェル４１０を備える化学的検知装置４００の断面図を示す。金属酸化物層４０２及びマイクロウェル層４０４において、マイクロウェル４１０をエッチングしてよい。１つの実施形態では、マイクロウェル４１０をエッチングして、電荷敏感装置４０８．１及び４０８．２の頂部を露出させてよい。マイクロウェル４１０は、例えば、異方性エッチングによってエッチングしてよい。図４Ｃは、化学物質が塗布された後の化学的検知装置４００の断面図を示す。波線４１２として示されている塗布された化学物質は、プラスチックの側壁の不活性特性により、マイクロウェルの底部にのみコーティングされ得る。１つの実施形態では、プラスチックの側壁は、不活性特性によりゼロ緩衝を有し得る。１つの実施形態では、化学物質は、ホスフェート、ホスホネート、又はシランであってよい。
【００２２】
図５は、本教示の実施形態に係る図４Ｃのウェル構造を製造するプロセス５００を示す。ブロック５０２では、プロセス５００は、ＣＭＯＳ装置層の上にプラスチック層を形成し得る。図４Ａに示す通り、プラスチック層４０４は、ＣＭＯＳ装置層４０６の上に形成され得る。次いで、ブロック５０４では、プロセス５００は、プラスチック層の上に金属酸化物層を形成し得る。例えば、図４Ａでは、金属酸化物層４０２をプラスチック層４０４の上に形成し得る。プロセス５００は、次いで、ブロック５０６に進行し得る。ブロック５０６では、ＣＭＯＳ装置層の上のプラスチック層上にマイクロウェルを形成し得る。図４Ｂに関して上記した通り、プラスチック層のエッチングは、異方性プラスチックエッチングにより実施してよい。ブロック５０８では、化学物質を塗布してよい。化学物質（例えば、波線４１２）は、例えばプラスチックの側壁の不活性特性により、マイクロウェルの底部にのみ結合し得る。
【００２３】
図６Ａ〜６Ｆは、本教示の別の実施形態に係るウェル構造の製造の様々な段階の断面図を示す。図６Ａは、マイクロウェルを形成する前の化学的検知装置６００の一部の断面図を示す。化学的検知装置６００は、金属酸化物層６０２と、マイクロウェル層６０４と、ＣＭＯＳ装置層６０６と、該マイクロウェル層６０４及び該ＣＭＯＳ装置層６０６の間の電荷敏感装置６０８．１及び６０８．２とを備え得る。金属酸化物層６０２は、マイクロウェル層６０４の上に存在し得、そしてまた、マイクロウェル層６０４は、ＣＭＯＳ装置層６０６の上に存在し得る。電荷敏感装置６０８．１及び６０８．２は、それぞれ、ｃｈｅｍＦＥＴの頂部となり得る。例えば、電荷敏感装置６０８．１及び６０８．２は、ｃｈｅｍＦＥＴのパッシベーション層（例えば、図１のパッシベーション層１１６）であってよく、一方、ｃｈｅｍＦＥＴのフローティングゲート構造は、電荷敏感装置６０８．１及び６０８．２の下に存在し得る（図示せず）。１つの実施形態では、マイクロウェル層６０４は、酸化ケイ素（ＳｉＯ２）の層であってよい。更に、１つの実施形態では、電荷敏感装置６０８．１及び６０８．２は、それぞれ、２層以上の金属酸化物層を含んでよい。例えば、電荷敏感装置６０８．１及び６０８．２は、それぞれ、Ｔａ２Ｏ５の上層及びＡｌ２Ｏ３の底層を含んでよい。金属酸化物層６０２は、１層以上のＴａ２Ｏ５、ＨｆＯ２、ＺｒＯ２又はＡｌ２Ｏ３の層を含んでよい。ＣＭＯＳ装置層６０６は、半導体材料（例えば、Ｓｉ）の層であってよい。
【００２４】
図６Ｂは、１対のマイクロウェル６１０が形成された化学的検知装置６００の断面図を示す。金属酸化物層６０２及びマイクロウェル層６０４の上部において、マイクロウェル６１０の開口部をエッチングしてよい。図６Ｂに示す通り、金属酸化物層６０２の開口縁部の下に、マイクロウェル層６０４の上部をエッチングしてアンダーカット部を形成してよい。１つの実施形態では、アンダーカット部は、等方性ＳｉＯ２エッチングにより作製してよい。図６Ｃは、１対のマイクロウェル６１０が形成されている化学的検知装置６００の断面図を示す。１つの実施形態では、マイクロウェル６１０をエッチングして、電荷敏感装置６０８．１及び６０８．２の頂部を露出させてよい。マイクロウェル６１０は、異方性ＳｉＯ２エッチングにより形成してよい。図６Ｄは、化学物質を塗布した後の化学的検知装置６００の断面図を示す。波線６１２として示されている塗布された化学物質でコーティングして、マイクロウェル６１０の側壁及び底部を被覆してよい。１つの実施形態では、化学物質はシラン基であってよい。
【００２５】
図６Ｅは、１対のマイクロウェル６１０の底部に塗布された化学物質が取り除かれた化学的検知装置６００の断面図を示す。１つの実施形態では、マイクロウェル６１０をエッチングして、塗布された化学物質を取り除き、電荷敏感装置６０８．１及び６０８．２の頂部を露出させてよい。マイクロウェル６１０の底部は、指向性エッチング、反応性イオンエッチング、犠牲層エッチング、又はこれらエッチング技術の組合せによって洗浄してよい。犠牲層エッチングを用いる場合、化学物質を塗布する前に、電荷敏感装置６０８．１及び６０８．２の金属酸化物検知層の上に犠牲層を作製してよい。化学物質が塗布された後、犠牲層をエッチングして、マイクロウェル６１０の底部における化学物質を剥がし、電荷敏感装置６０８．１及び６０８．２の金属酸化物検知層を露出させてよい。別の実施形態では、例えば、被覆したり、化学的に不活性にしたりする等、他の手段によって化学物質を不活性化してよい。
【００２６】
図６Ｆは、別の化学物質を塗布した後の化学的検知装置６００の断面図を示す。他の塗布される化学物質（第１の化学物質と呼ぶこともあり、太い波線６１４で示されている）でコーティングして、マイクロウェル６１０の底部を被覆してよい。１つの実施形態では、他の化学物質は、ホスフェート、ホスホネート、カテコール、ニトロカテコール、ボロネート、フェニルボロネート、イミダゾール、シラノール又は他のｐＨ検知基を含む群より選択される１つ以上の化学物質であってよい。他の化学物質は、正に帯電して、ビーズローディングを補助したり、化学反応によって引き起こされる電荷の蓄積を補助したりすることができる。
【００２７】
１つの実施形態では、他の化学物質が存在しなくてもよい。すなわち、化学的検知装置６００は、１群の化学物質でコーティングされたマイクロウェル６１０の側壁を有してよく、マイクロウェル６１０の底部は、露出させたままであってよい。１群の化学物質で側壁のみをコーティングすることにより、側壁による電荷の緩衝を減少するか又は除去することができ、また、ＳＮＲを改善することができる。
【００２８】
図７は、本教示の実施形態に係る図６Ｆのウェル構造を製造するプロセスを示す。ブロック７０２では、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）層の上の金属酸化物層上にマイクロウェルの開口部を形成してよく、ＳｉＯ２層は、ＣＭＯＳ装置層の上に存在してよい。次いで、ブロック７０４では、マイクロウェルの開口部の縁部の下のＳｉＯ２層上に円形のアンダーカット部を形成してよい。図６Ｂに示す通り、マイクロウェル６１０の開口部及び開口部の周囲のアンダーカット部は、金属酸化物層６０２及びマイクロウェル層６０６に形成してよい。図６Ｂに関連して上記した通り、アンダーカット部は、等方性ＳｉＯ２エッチングにより作製してよい。ブロック７０６では、ＣＭＯＳ装置層の上のＳｉＯ２層上にマイクロウェルを形成してよい。例えば、異方性ＳｉＯ２エッチングを用いて、マイクロウェルをエッチングしてよい。ブロック７０８では、マイクロウェルに化学物質を塗布してよい。化学物質は、マイクロウェルの側壁及び底部に結合し得、また、マイクロウェルの側壁及び底部を被覆し得る。ブロック７１０では、マイクロウェルの底部の化学物質を不活性化してよい。例えば、（例えば、指向性エッチング、反応性イオンエッチング、犠牲層エッチング、又はこれらの組合せによって）化学物質を取り除いてもよく、化学物質によって不活性化してもよく、被覆してもよい。ブロック７１２では、マイクロウェルに別の化学物質を塗布してよい。他の化学物質は、マイクロウェルの底部に結合し、イオンの結合を促進することができる。
【００２９】
図８は、本教示の別の実施形態に係るウェル構造を示す。図８のウェル構造は、金属酸化物層８０２、マイクロウェル層８０４、ＣＭＯＳ装置層８０６、化学的検知装置８０８．１又は８０８．２を含んでよい。金属酸化物層８０２は、マイクロウェル層８０４の上に存在してよく、そしてまた、マイクロウェル層８０４は、ＣＭＯＳ装置層８０６の上に存在してよい。電荷敏感装置８０８．１及び８０８．２は、マイクロウェル８１０において露出していてよい。マイクロウェル８１０の側壁及び底部の周縁部８１６は、第２の化学物質８１２（細い波線）によって被覆されてよい。周縁部８１６は、電荷敏感装置８１８．１及び８０８．２の周囲のマイクロウェル８１０の底部の一部であってよい。化学的検知装置８０８．１及び８０８．２の頂面は、第１の化学物質８１４（太い波線）によって被覆されてよい。１つの実施形態では、図８に示す通り、マイクロウェル８１０は、それぞれ、逆先細り形状を有してよい。すなわち、マイクロウェル８１０の底部は、マイクロウェル８１０の頂部よりも大きな直径を有してよく、したがって、側壁は、逆に傾斜していてよい。１つの実施形態では、金属酸化物層８０２は、１層以上のＴａ２Ｏ５、ＨｆＯ２、ＺｒＯ２、又はＡｌ２Ｏ３の層を含んでよく；マイクロウェル層８０６は、ＳｉＯ２の層であってよく；ＣＭＯＳ装置層８０６は、半導体材料（例えば、Ｓｉ）の層であってよい。マイクロウェル８１０は、指向性エッチング、反応性イオンエッチング、犠牲層エッチング又はこれらの組合せを使用してエッチングしてよい。
【００３０】
図９Ａ〜９Ｅは、本教示の別の実施形態に係るウェル構造の製造の様々な段階の断面図を示す。図９Ａは、任意のマイクロウェルを形成する前の化学的検知装置９００の一部の断面図を示す。化学的検知装置９００は、ＣＭＯＳ装置層９０４の上のマイクロウェル層９０２と、マイクロウェル層９０２及びＣＭＯＳ装置層９０４の間に埋め込まれている電荷敏感装置９０６とを備えてもよい。埋め込み装置９０６は、ｃｈｅｍＦＥＴの頂部となり得る。例えば、埋め込み装置９０６は、ｃｈｅｍＦＥＴのパッシベーション層（例えば、図１のパッシベーション層１１６）であってよく、ｃｈｅｍＦＥＴのフローティングゲート構造が装置９０６の下に存在してよい（図示せず）。１つの実施形態では、マイクロウェル層９０２は、ＳｉＯ２の層であってよい。更に、１つの実施形態では、装置９０６は、２層以上の金属酸化物の層を含んでよい。例えば、装置９０６は、Ｔａ２Ｏ５の上層及びＡｌ２Ｏ３の底層を含んでよい。ＣＭＯＳ装置層は、半導体材料（例えば、Ｓｉ）の層であってよい。
【００３１】
図９Ｂは、マイクロウェル９０８を備えた化学的検知装置９００の断面図を示す。マイクロウェル層９０２においてマイクロウェル９０８をエッチングしてよい。１つの実施形態では、マイクロウェル９０８をエッチングして、装置９０６の頂部を露出させてよい。マイクロウェル９０８は、異方性ＳｉＯ２エッチングによりエッチングされてよい。図９Ｃは、化学物質を塗布した後の化学的検知装置９００の断面図を示す。太い波線９１０によって示されている塗布された化学物質は、電荷敏感装置９０６の表面の化学的特性により、マイクロウェル９０８の底部のみをコーティングし得る。例えば、電荷敏感装置９０６の表面は、ホスフェート、又はホスホネート、又はシラン基の選択的親和性を有する。１つの実施形態では、化学物質は、ホスフェート、ホスホネート、カテコール、ニトロカテコール、ボロネート、フェニルボロネート、イミダゾール、シラノール、又は他のｐＨ検知基であってよい。
【００３２】
図９Ｄは、マイクロウェル９０８の側壁及び水平頂部９１６（本明細書では「頂縁部」又は「側壁の頂縁部に隣接する水平表面」とも呼ばれる）を金属酸化物層９１２で被覆した後の化学的検知装置９００の断面図を示す。１つの実施形態では、金属酸化物層９１２は、単分子層であってよい。例えば、単分子層は、ウェルの壁の酸化物（二酸化ケイ素等）とジルコニウムアルコキシドとを化学選択的に反応させ、次いで、反応後に加水分解することによって形成される金属酸化物であってよい。すなわち、金属酸化物層９１２は、ＺｒＯ２の溶剤ベースの堆積物の層であってよい。金属酸化物層９１２は、本教示の実施形態に従って、金属酸化物層９１２と化学物質９１０との間の親和性を欠いているため、図９Ｄに示す通り、ウェルの底部に沿って堆積する。実際、化学物質９１０は、金属酸化物層９１２がマイクロウェルの底部に沿って堆積するのを防ぐ「マスク」又は保護／バリア層として機能し得る。図９Ｅは、別の化学物質を塗布した後の化学的検知装置９００の断面図を示す。細い波線９１４で示される他の化学物質は、金属酸化物層９１２の表面の化学的特性により、マイクロウェル９０８の側壁及び水平頂部をコーティングし得る。１つの実施形態では、他の化学物質は、ＰＥＧのホスフェート又はホスホネートであってよい。上述の実施形態との整合性をとるために、マイクロウェル９０８の底部にコーティングされた化学物質を第１の化学物質と呼ぶ場合があり、側壁にコーティングされた化学物質を、第２の化学物質と呼ぶ場合がある。
【００３３】
マイクロウェル９０８の側壁における中性ＰＥＧ表面は、側壁におけるプロトン緩衝を減少するか又は除去することができる。更に、マイクロウェルの底部にコーティングされたホスフェート又はホスホネートは、正電荷を付与して、ビーズローディング又はＤＮＡプライマーを改善し、シークエンシングのシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）を更に上げることができる。
【００３４】
図１０は、本教示の実施形態に係る図９Ｅのウェル構造を製造するプロセス１０００を示す。ブロック１００２では、マイクロウェルは、ＣＭＯＳ装置の上の二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）層に形成してよい。図９Ｂに示す通り、マイクロウェル９０８は、ＳｉＯ２層９０２に形成してよい。次いで、ブロック１００４では、化学物質を塗布して、マイクロウェルの底部に選択的に付着させてよい。例えば、第１の化学物質を塗布し、マイクロウェル９０８における電荷敏感装置９０６の頂面に選択的に付着させてよい。ブロック１００６では、マイクロウェルの側壁及び水平頂部上に金属酸化物層を形成してよい。図９Ｄに関して上記した通り、ＺｒＯ２単分子層の溶剤ベースの堆積物を、マイクロウェル９０８の側壁及び水平頂部に作製してよい。ブロック１００８では、マイクロウェルの側壁及び水平頂部に選択的に付着する第２の化学物質を塗布してよい。第２の化学物質（例えば、図９Ｅの細い波線９１４）は、例えば、他の化学物質及び金属酸化物層９１２の化学的特性により、側壁及び水平頂部においてマイクロウェルの金属酸化物層９１２にのみ結合し得る。
【００３５】
１つの実施形態では、マイクロウェルは、ＣＭＯＳ装置層の上に配置された金属の層上に作製されてよい。すなわち、例えば、マイクロウェル層９０２は、Ａｌ、Ｃｕ、又はＴｉ等の金属の層であってよい。この実施形態では、マイクロウェルの底部は、第１の化学物質によってコーティングされてよいか、又はマイクロウェルの側壁は、第２の化学物質によってコーティングされてよいか、又はこれら両方であってもよい。更に、この実施形態では、マイクロウェルの頂縁部を、五酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、二酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、又は酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）の１層以上の層等の金属酸化物層によって被覆されてよい。金属マイクロウェルの製造には、ダマシンプロセス又はデュアルダマシンプロセスを使用してよい。例えば、フォトリソグラフィーを使用してネガ型ピラーパターンを作製し、シード層を堆積させ、金属電気メッキを実施し、金属を研磨し、次いで、前記ネガ型ピラーパターンをエッチングして、金属マイクロウェルを形成する。例えば、参照することによりその内容が本明細書に組み込まれるＯｈｍｏｒｉら，Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ４９  ０５ＦＤ０１：１−４（２０１０年）を参照されたい。
【００３６】
１つの実施形態では、第２の化学物質のためのシラン基は、Ｒ−［（ＣＨ２）ｎ］−Ｓｉ−［Ｘ１Ｘ２Ｘ３］（式中、Ｒは、有機官能基であり、［（ＣＨ２）ｎ］は、炭化水素リンカー（ｎ＝１〜２０）であり、Ｓｉは、ケイ素原子であり、［Ｘ１Ｘ２Ｘ３］は、アルコキシ又はハロゲン基を含む１つ以上の独立した加水分解性基を含む）であってよい。別の実施形態では、第２の化学物質のためのシラン基は、Ｒ−［（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ］−Ｓｉ−［ＸｌＸ２Ｘ３］（式中、Ｒは、有機官能基であり、［（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ］（ｎ＝１〜１００）は、ポリエーテルリンカーであり、Ｓｉは、ケイ素原子であり、［Ｘ１Ｘ２Ｘ３］は、アルコキシ又はハロゲン基を含む１つ以上の加水分解性基を含む）であってよい。いずれの実施形態でも、有機官能基Ｒは、メチル、メチレン、フェニル、ベンジル、アニリノ、アミノ、アミド、ヒドロキシル、アルデヒド、アルコキシ、ハロ、メルカプト、カルボキシ、アシル、ビニル、アリル、スチリル、エポキシ、イソシアナト、グリシドキシ及びアクリルオキシを含むが、これらに限定されない。
【００３７】
第２の化学物質のためのシラン基の例は、以下を含んでよい。
・Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノメトルトリエトキシシラン
・（メルカプトメチル）メチルジエトキシシラン
・クロロメチルトリエトキシシラン
・（イソシアナトメチル）メチルジメトキシシラン
・Ｎ−フェニルアミノメチルトリエトキシシラン
・トリエトキシシリルウンデカナル
・１１−メルカプトウンデシルトリメトキシシラン
・１０−ウンデセニルトリメトキシシラン
・Ｎ−（２−アミノエチル）−１１−アミノウンデシルトリメトキシシラン
・１１−ブロモウンデシルトリメトキシシラン
・ｎ−オクチルトリエトキシシラン
・２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン
・３−メトキシプロピルトリメトキシシラン
・メトキシトリエチレンオキシプロピルトリシラン
・メトキシシラン
・メトキシエトキシウンデシルトリクロロシラン
・２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］−トリクロロシラン
【００３８】
図１１は、本教示の実施形態に係る化学的検知プロセス１１００を示す。ブロック１１０２では、複数の検体が付着している固相支持体をマイクロウェルに堆積させてよい。例えば、複数の検体を固相支持体１１２に付着させてよく、固相支持体１１２をマイクロウェル１０１に堆積させてよい。マイクロウェルは、底表面及び側壁を有してよい。１つの実施形態では、底表面は、ｐＨ検知を促進する第１の化学物質で被覆されてよく、側壁は、溶液中のプロトンの緩衝を減少する第２の化学物質で被覆されてよい。ブロック１１０４では、マイクロウェルの底表面における電荷を検知してよい。等式（１）及び（２）に関して記載した通り、電荷は、複数の検体との少なくとも１つの化学反応によって生成する１つ以上の副産物に起因するものであってよい。１つの実施形態では、化学的検知プロセス１１００は、ＤＮＡ配列検知プロセスであってよい。すなわち、複数の検体はそれぞれ、サンプルＤＮＡ断片であってよい。次いで、マイクロウェル１０１に様々な試薬を供給し、化学反応の副産物を検出することによってＤＮＡ配列を決定することができる。
【００３９】
本発明の幾つかの実施形態を、本明細書に具体的に例証し、説明する。しかし、本発明の変更及び変形も上記教示によって網羅されていることが理解されるであろう。他の例では、周知の操作、コンポーネント、及び回路は、実施形態を不明瞭にしないように詳細に記載されてはいない。本明細書に開示される具体的な構造及び機能に関する詳細は、例示的なものであり、実施形態の範囲を必ずしも限定するものではないことが理解され得る。例えば、幾つかの実施形態は、ＣＭＯＳ技術を用いて説明される。当業者であれば、ＣＭＯＳ装置を用いて純粋なＰＭＯＳ装置もしくは純粋なＮＭＯＳ装置、又はＰＭＯＳ装置とＮＭＯＳ装置との組合せに言及することができると理解するであろう。
【００４０】
当業者は、前述の記載から、本発明が、様々な形態で実施され得、様々な実施形態が単独で又は組合せて実施され得ることを理解することができる。したがって、本発明の実施形態は、その具体的な実施例に関連して記載されるが、本発明の実施形態及び／又は方法の真の範囲は、それに限定されるべきではない。なぜならば、図面、明細書、及び特許請求の範囲を検討すれば、他の変形例が当業者に明らかになるためである。
【００４１】
様々な実施形態は、ハードウェアエレメント、ソフトウェアエレメント、又は両方の組合せを用いて実施され得る。ハードウェアエレメントの例は、プロセッサ、マイクロプロセッサ、回路、回路素子（例えばトランジスタ、抵抗器、キャパシタ、インダクタ等）、集積回路、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、プログラム可能論理回路（ＰＬＤ）、デジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、ロジックゲート、レジスタ、半導体装置、チップ、マイクロチップ、チップセット等を含んでよい。ソフトウェアの例は、ソフトウェアコンポーネント、プログラム、アプリケーション、コンピュータプログラム、アプリケーションプログラム、システムプログラム、マシンプログラム、オペレーティングシステムソフトウェア、ミドルウェア、ファームウェア、ソフトウェアモジュール、ルーチン、サブルーチン、関数、メソッド、手順、ソフトウェアインタフェース、アプリケーションプログラムインターフェイス（ＡＰＩ）、指示セット、コンピューティングコード、コンピュータコード、コードセグメント、コンピュータコードセグメント、言葉、値、記号又はこれらの任意の組合せを含んでよい。実施形態がハードウェアエレメント及び／又はソフトウェアエレメントを用いて実行されるかどうかの判定は、所望の計算速度、電力レベル、耐熱性、加工サイクル予算、入力データ速度、出力データ速度、メモリ資源、データバス速度及び他の設計又は性能上の制約等の任意の数の要因に従って変動し得る。
【００４２】
例えば、幾つかの実施形態は、マシンによって実行する場合、実施形態に係る方法及び／又は操作をマシンに実施させ得る指示又は指示のセットを格納し得るコンピュータ可読媒体又はアーティクルを使用して実行することができる。このようなマシンは、例えば、任意の適切な処理プラットフォーム、コンピューティングプラットフォーム、コンピューティングデバイス、処理装置、コンピューティングシステム、処理システム、コンピュータ、プロセッサ等を含んでもよく、ハードウェア及び／又はソフトウェアの任意の適切な組合せを使用して実行し得る。コンピュータ可読媒体又はアーティクルは、例えば、任意の適切なタイプのメモリユニット、メモリデバイス、メモリアーティクル、メモリ媒体、ストレージデバイス、ストレージアーティクル、ストレージ媒体、及び／又はストレージユニット、例えばメモリ、取外し可能な媒体又は取り外し不可能な媒体、消去可能な媒体又は消去不可能な媒体、書き込み可能な媒体又は再書き込み可能な媒体、デジタル媒体又はアナログ媒体、ハードディスク、フロッピーディスク、コンパクトディスク読出し専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、書き込み可能なコンパクトディスク（ＣＤ−Ｒ）、再書き込み可能なコンパクトディスク（ＣＤ−ＲＷ）、光ディスク、磁気媒体、磁気発電気光学媒体、取外し可能なメモリカード又はディスク、様々な型のデジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、テープ、カセット等を含んでよい。命令は、任意の適切な高水準、低水準、オブジェクト指向型、ビジュアル型、コンパイラ型及び／又はインタープリタ型のプログラミング言語を用いて実行されるソースコード、コンパイル済コード、解釈されたコード、実行可能なコード、静的コード、動的コード、暗号化されたコード等任意の適切な種類のコードを含んでよい。
【００４３】
「アンプリコン」は、ポリヌクレオチド増幅反応産物を意味する。すなわち、一本鎖であっても二本鎖であってもよい、１つ以上の出発配列から複製されるポリヌクレオチドのクローン集団である。１つ以上の出発配列は、同じ配列の１つ以上のコピーであっても、又は、増幅される共通領域、例えば、サンプルから抽出されたＤＮＡ断片の混合物中に存在する特定のエキソン配列を含む様々な配列の混合物であってよい。アンプリコンは、単一の出発配列の増幅により形成される。アンプリコンは、１つ以上の出発核酸又は標的核酸の複製物を生成する様々な増幅反応によって生成され得る。１つの態様では、アンプリコンを生成する増幅反応は、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである反応物質の塩基対合が、反応産物の作製に必要なテンプレートポリヌクレオチドの相補体を有する「テンプレート駆動型」である。１つの態様では、テンプレート駆動型反応は、核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長、又は核酸リガーゼによるオリゴヌクレオチドのライゲーションである。このような反応は、参照することにより本明細書に組み込まれる以下の参照文献に開示されている、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、線状ポリメラーゼ反応、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅等を含むが、これらに限定されない：Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許第４，６８３，１９５号、同第４．９６５，１８８号、同第４，６８３，２０２号、及び同第４，８００，１５９号（ＰＣＲ）；Ｇｅｌｆａｎｄら，米国特許第５，２１０，０１５号（「ｔａｑｍａｎ」プローブを用いるリアルタイムＰＣＲ）；Ｗｉｔｔｗｅｒら，米国特許第６，１７４，６７０号；Ｋａｃｉａｎら，米国特許第５，３９９，４９１号（「ＮＡＳＢＡ」）；Ｌｉｚａｒｄｉ，米国特許第５，８５４，０３３号；Ａｏｎｏら，日本国特許公報ＪＰ４−２６２７９９（ローリングサークル増幅）等。１つの態様では、アンプリコンは、ＰＣＲによって生成される。本発明で使用する用語「増幅する」は、増幅反応を実施することを意味する。「反応混合物」は、反応を実施するために必要な反応物質を全て含有する溶液を意味し、反応中に選択されたレベルでｐＨを維持するための緩衝剤、塩、補因子、スカベンジャー等を含んでよいが、これらに限定されない。「固相アンプリコン」は、核酸配列のクローン集団が付着している粒子又はビーズ等の固相支持体を意味し、これは、エマルションＰＣＲ又は同様の技術等のプロセスによって作製することができる。
【００４４】
「検体」は、マイクロウェル等のサンプル保持領域における電子センサに直接影響を与えるか、又はマイクロウェル等のサンプル保持領域又は反応閉じ込め領域内に位置する分子又は生物学的細胞を含む反応から生じる副産物によって電子センサ等に間接的に影響を与える対象分子又は生物学的細胞を意味する。１つの態様では、検体は、電子センサに影響を与える水素イオン等の反応副産物を生じさせるシークエンシング反応に供される核酸テンプレートである。また、用語「検体」は、ビーズ又は粒子等の固体支持体に付着しているタンパク質、ペプチド、核酸等の検体の複数のコピーを含む。１つの実施形態では、用語「検体」は、核酸アンプリコン又は固相アンプリコンを意味する。
【００４５】
「マイクロ流体装置」は、相互に連結され且つ流体連通している１つ以上のチャンバ、ポート、及びチャネルの一体化システムであり、単独で、あるいはサンプル導入、流体及び／又は試薬の駆動手段、温度制御、検出システム、データ収集、及び／又は積分システム等の支援機能を提供する器具又は機器と連携して分析反応又はプロセスを実行するために設計されているものを意味する。マイクロ流体装置は、例えば、サンプルの成分又は反応物質の吸収を防いだり、電気浸透による試薬の移動を促進したりするために、バルブ、ポンプ、及び内壁上の特殊な機能のコーティングを更に含んでもよい。このような装置は、通常、固体基材において又は固体基材として製造され、該固体基材は、ガラス、プラスチック、又は他の固体高分子材料であってよく、特に光学的又は電気化学的な方法を介してサンプル及び試薬の移動を検出及びモニタリングする場合のために典型的に平面形状を有する。マイクロ流体装置の特徴としては、通常、数百平方マイクロメートル未満の断面寸法を有し、通路は、典型的に、例えば、約０．１μｍ〜約５００μｍの最大断面寸法を有するキャピラリー寸法を有する。マイクロ流体装置は、典型的に、数ｎＬ、例えば、１０〜１００ｎＬから１μＬの範囲の容積容量を有する。マイクロ流体装置の製造及び操作は、参照することにより本明細書に組み込まれる以下の参照文献によって例証される通り、当技術分野において周知である：Ｒａｍｓｅｙ，米国特許第６，００１，２２９号、同第５，８５８，１９５号、同第６，０１０，６０７号、及び同第６，０３３，５４６号；Ｓｏａｎｅら，，米国特許第５，１２６，０２２号、及び同第６，０５４，０３４号；Ｎｅｌｓｏｎら，米国特許第６，６１３，５２５号；Ｍａｈｅｒら，米国特許第６，３９９，９５２号；Ｒｉｃｃｏら，国際特許公報国際公開公報第０２／２４３２２号；Ｂｊｏｒｎｓｏｎら，国際特許公報国際公開公報第９９／１９７１７号；Ｗｉｌｄｉｎｇら，米国特許第５，５８７，１２８号；同第５，４９８，３９２号；Ｓｉａら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２４：３５６３−３５７６（２００３年）；Ｕｎｇｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８：１１３−１１６（２０００年）；Ｅｎｚｅｌｂｅｒｇｅｒら，米国特許第６，９６０，４３７号。
【００４６】
「マイクロウェル」は、「反応チャンバ」と互換的に使用され、「反応閉じ込め領域」の特殊な例を意味する、すなわち、対象反応を局所化させる固体基材の物理的又は化学的属性である。反応閉じ込め領域は、基材の表面に共有結合しているオリゴヌクレオチド又は抗体を含む別個の領域等の、対象検体と特異的に結合する基材の表面の別個の領域であってよい。通常、反応閉じ込め領域は、基材に製造される明確に画定された形状及び容積を有する窪み又はウェルである。これら後者の種類の反応閉じ込め領域を、本明細書ではマイクロウェル又は反応チャンバと呼び、例えば、以下の参照文献に開示されている通り、従来の微細加工技術を用いて製造することができる。Ｄｏｅｒｉｎｇ及びＮｉｓｈｉ編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第２版（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００７年）；Ｓａｌｉｔｅｒｍａｎ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  ＢｉｏＭＥＭＳ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ（ＳＰＩＥ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００６年）；Ｅｌｗｅｎｓｐｏｅｋら，Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００４年）等。マイクロウェル又は反応チャンバの構成（例えば、間隔、形状、及び容積）は、参照することにより組み込まれるＲｏｔｈｂｅｒｇら，米国特許出願公開第２００９／０１２７５８９号；Ｒｏｔｈｂｅｒｇら，英国特許出願ＧＢ２４６１１１２７に開示されている。マイクロウェルは、正方形、矩形、又は八角形の断面を有してよく、表面上に直線アレイとして配置されてよい。また、マイクロウェルは、六角形の断面を有してよく、六角形のアレイとして配置されてよい。これによって、直線アレイに比べて単位面積当たりのマイクロウェルの密度をより高くすることができる。マイクロウェルの例示的な構成は、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、又は１０７個の反応チャンバを有する。
【００４７】
本発明で使用する「アレイ」は、センサ又はウェル等の構成要素の平面配置である。アレイは、一方向であっても二方向であってもよい。一方向アレイは、第１の方向に１つの段（又は列）の構成要素を有し、第２の方向に複数の段（又は列）を有するアレイである。第１及び第２の方向の段（又は列）の数は、同じであっても異なっていてもよい。アレイは、例えば、少なくとも１００，０００個のチャンバを含んでよい。更に、各反応チャンバは、例えば、約１：１以下のアスペクト比の水平方向幅及び垂直方向深さを有する。反応チャンバ間のピッチは、例えば、約１０マイクロメートル以下である。簡潔に述べると、１つの実施形態では、マイクロウェルアレイは、センサアレイの半導体構造が形成された後に製造することができ、この場合、半導体ダイ上のこのような構造にマイクロウェル構造が適用される。すなわち、マイクロウェル構造は、ダイ上に形成されてもよいか、又は別々に形成して、次いで、ダイに実装してもよい。
【００４８】
ダイ上にマイクロウェル構造を形成するために、様々な製造プロセスを用いてよい。例えば、ＭｉｃｒｏｃｈｅｍのＳＵ−８  ２０１５等のネガ型フォトレジスト、又はＨＤ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＨＤ８８２０等のポジ型レジスト／ポリイミドで、ダイ全体をマイクロウェルの所望の高さまでスピンコーティングしてよい。フォトレジスト層における所望のウェルの高さ（例えば、１ウェル当たり１ピクセルの場合約３〜１２μｍであるが、一般的な事項としてこれに限定されるものではない）は、１つ以上の層において、所定の速度（文献及び製造業者の説明書を参照することにより、又は経験的に見出すことができる）で適切なレジストをスピニングすることにより得ることができる。（ウェルの高さは、典型的に、公称１：１〜１．５：１のアスペクト比、高さ：幅、又は直径について、センサピクセルの横方向寸法に一致するように選択してよい）。あるいは、異なるフォトレジストの複数の層を塗布しても、又は別の形態の絶縁性材料を堆積させてもよい。また、様々な種類の化学蒸着を用いて、マイクロウェルを形成するのに適した材料の層を構築することができる。１つの実施形態では、マイクロウェルは、テトラ−メチル−オルト−シリケート（ＴＥＯＳ）の層に形成される。本発明は、反応チャンバの少なくとも１つの二方向アレイを含む装置を包含し、各反応チャンバが化学的感応型電界効果トランジスタ（「ｃｈｅｍＦＥＴ」）に結合され、且つ各反応チャンバの容積が１０３μｍ３（すなわち、１ｐＬ）以下である。各反応チャンバの容積は、０．３４ｐＬ以下、及び０．０９６ｐＬ以下、又は更には０．０１２ｐＬである。反応チャンバは、場合により、頂部の断面積が０．５２、１、２２、３２、４２、５２、６２、７２、８２、９２、又は１０２平方マイクロメートルであってよい。アレイは、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９個、又はそれ以上の反応チャンバを有してよい。反応チャンバは、ｃｈｅｍＦＥＴに容量的に結合され得る。
【００４９】
「プライマー」は、ポリヌクレオチドテンプレートと二本鎖を形成するとき、核酸合成の開始点として作用することができ、且つ伸長二本鎖が形成されるようにテンプレートに沿って３'末端から伸長することができる天然又は合成のオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は、通常、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリメラーゼ等の核酸ポリメラーゼを用いて実施される。伸長プロセスにおいて付加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは、通常、１４〜４０ヌクレオチドの範囲、又は１８〜３６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーは、例えば、単一プライマーを用いる線状増幅反応、又は２つ以上のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応等の様々な核酸増幅反応において使用される。特定の用途のためのプライマーの長さ及び配列を選択するための指針は、参照することにより組み込まれる以下の参照文献によって証明されている通り、当業者に周知である。Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ編，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３年）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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