(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルスＪ６ＣＦ株のゲノムの５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列及びＮＳ５Ｂタンパク質コード配列を含むウイルスタンパク質コード領域と、３’非翻訳領域と、を５’側から３’側に向かってこの順番で含み、
前記ＮＳ４Ａタンパク質コード配列は、配列番号３０に示されるＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に、第１６８０番目のアラニンがグルタミン酸に置換する変異を有する、核酸。
【請求項２】
前記ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を基準とした場合に、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸置換を引き起こす変異を有し、
前記３’非翻訳領域は、配列番号２９に示される塩基配列を基準とした場合に、第９４５８番目のシトシンがグアニンに塩基置換されている、請求項１記載の核酸。
（ｉ）  第２８９２番目のアラニンのセリンへのアミノ酸置換
（ｉｉ）  第２９５９番目のアルギニンのリジンへのアミノ酸置換
（ｉｉｉ）  第３００３番目のチロシンのフェニルアラニンへのアミノ酸置換
【請求項３】
前記ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列の第１番目〜第５１５番目のアミノ酸配列と、配列番号２８に示されるアミノ酸配列の第５１６番目〜第５９１番目のアミノ酸配列と、がこの順番で連結されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に置換され、かつ
前記３’非翻訳領域は、配列番号３１に示される塩基配列（ただし、該核酸がＲＮＡの場合は、配列番号３１に示される塩基配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えるものとする）に置換されている、
請求項１記載の核酸。
【請求項４】
外来遺伝子及びＩＲＥＳ配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の核酸。
【請求項５】
配列番号１又は４に示される塩基配列からなる、請求項４記載の核酸（ただし、該核酸がＲＮＡの場合は、配列番号１又は４に示される塩基配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えるものとする）。
【請求項６】
前記ウイルスタンパク質コード領域は、ＮＳ３タンパク質コード配列の５’側に、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムのＣｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列及びＮＳ２タンパク質コード配列を５’側から３’側に向かってこの順番でさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸。
【請求項７】
Ｃ型肝炎ウイルスゲノムのＣｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列及びＮＳ２タンパク質コード配列は、Ｃ型肝炎ウイルスＪ６ＣＦ株のゲノムのＣｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列及びＮＳ２タンパク質コード配列である、請求項６記載の核酸。
【請求項８】
配列番号２又は５に示される塩基配列からなる核酸（ただし、該核酸がＲＮＡの場合は、配列番号２又は５に示される塩基配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えるものとする）。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項記載の核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのサブゲノムレプリコンＲＮＡ。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれか一項記載の核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのフルゲノムレプリコンＲＮＡ。
【請求項１１】
請求項６〜８のいずれか一項記載の核酸をウイルスゲノムとして含有する、Ｃ型肝炎ウイルス粒子。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項記載の核酸が導入されている、細胞。
【請求項１４】
請求項１１記載のＣ型肝炎ウイルス粒子を含有する、Ｃ型肝炎ウイルスワクチン。
【請求項１５】
被験物質の存在下及び非存在下の双方で、請求項１３記載の細胞、又は、請求項１１記載のＣ型肝炎ウイルス粒子とＣ型肝炎ウイルス感受性細胞との混合物、を培養する培養ステップと、
前記培養ステップで得られた培養物中のサブゲノムレプリコンＲＮＡ、フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量を定量する定量ステップと、
前記定量ステップの結果、被験物質の存在下で定量されたサブゲノムレプリコンＲＮＡ、フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量が、それぞれ被験物質の非存在下で定量したサブゲノムレプリコンＲＮＡ、フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量より少ない場合に、前記被験物質は、抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を有すると評価する評価ステップと
を備える、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスＪ６ＣＦ株ゲノム由来の変異体レプリコンに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ；以下、ＨＣＶ）は、フラビウイルス科に属する、一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡをゲノムとするウイルスであり、Ｃ型肝炎の原因となることが知られている。近年の研究により、ＨＣＶは遺伝子型又は血清型により多数の型に分類されることがわかってきた。ＳｉｍｍｏｎｄｓらによるＨＣＶ株の塩基配列を用いた系統解析法によると、ＨＣＶの遺伝子型は６タイプに分類され、さらにそれらはいくつかのサブタイプに分類されている（非特許文献１）。現在では、ＨＣＶの複数の遺伝子型についてゲノム全長の塩基配列が決定されている（非特許文献２〜６）。【０００３】
近年まで、ＨＣＶを培養細胞に感染させることや、ＨＣＶゲノムを培養細胞中で複製させることはできなかったため、ＨＣＶの複製機構や感染機構について研究するためには、チンパンジーを実験動物として用いたｉｎ  ｖｉｖｏ実験をする必要があった。しかし、遺伝子型１ｂのＨＣＶであるＣｏｎ１株、ＨＣＶ−Ｎ株及びＨＣＶ−Ｏ株、並びに遺伝子型１ａのＨＣＶであるＨ７７株から、サブゲノムレプリコンＲＮＡが作製されたことにより、ＨＣＶの複製機構の研究については、培養細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験をすることが可能となった（特許文献１及び非特許文献７〜１０）。ここで、ＨＣＶのサブゲノムレプリコンＲＮＡとは、ＨＣＶの複製に必要なゲノム部分を含み、培養細胞に導入した場合にＨＣＶゲノム由来のＲＮＡを自律複製できるが、感染性ＨＣＶ粒子の産生能は有しないＲＮＡのことである。【０００４】
さらに、遺伝子型２ａのＨＣＶであるＪＦＨ−１株から、サブゲノムレプリコンＲＮＡ及び、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨｕｈ７細胞に導入することで感染性ＨＣＶ粒子の産生をもたらすフルゲノムレプリコンＲＮＡが作製され、ＨＣＶの感染機構の研究についても、培養細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験をすることが可能となった（非特許文献１１及び１２）。ここで、ＨＣＶのフルゲノムレプリコンＲＮＡとは、ＨＣＶゲノムの全長、すなわち、５’非翻訳領域、構造遺伝子、非構造遺伝子及び３’非翻訳領域を含むＲＮＡであり、培養細胞に導入した場合にＨＣＶゲノム由来のＲＮＡを自律複製できるＲＮＡのことである。【０００５】
Ｊ６ＣＦ株は、ＪＦＨ−１株と同じ遺伝子型２ａのＨＣＶである。Ｊ６ＣＦ株とＪＦＨ−１株の相同性は、核酸レベルで約９０％、アミノ酸レベルで９１％と高い。しかしながら、Ｊ６ＣＦ株はサブゲノムレプリコンＲＮＡとしての複製能力を欠いており、またＨｕｈ７細胞を用いた培養細胞系でウイルス粒子を産生する能力もない。【０００６】
近年、Ｊ６ＣＦ株のゲノムのＮＳ３タンパク質コード領域、ＮＳ５Ｂタンパク質コード領域及び３’非翻訳領域をＪＦＨ−１株の同じ領域の配列に置き換えると、Ｈｕｈ７細胞で自律複製が可能であることが示された（非特許文献１３）。また、Ｊ６ＣＦ株のゲノムのＮＳ３タンパク質コード領域及び３’非翻訳領域をＪＦＨ−１株の同じ領域の配列に置換し、さらにＮＳ５Ｂタンパク質コード領域内の３つの適応変異を導入して作製したサブゲノムレプリコンＲＮＡ及びフルゲノムレプリコンＲＮＡが、自律複製能及びウイルス粒子産生能を有することも示されている（非特許文献１４）。【０００７】
ＨＣＶの研究及び抗ＨＣＶ薬の研究開発にはウイルスを効率よく増幅できる実験系が必要不可欠である。さらに、培養細胞においてＨＣＶを増幅させる系、又は培養細胞においてＨＣＶの増殖を評価する系があれば、抗ＨＣＶ薬の効率的なスクリーニングが可能となるだけでなく、ウイルスの増殖の仕組みが理解され、抗ＨＣＶ薬の新たなターゲットも明らかにされることから、見出されたターゲットに対する革新的な抗ＨＣＶ薬の創出が期待できる。Ｊ６ＣＦ株についても、培養細胞での自律複製やウイルス粒子産生が可能なレプリコンＲＮＡの作製が期待されている。【０００８】
しかしながら、従来、感染性ＨＣＶ粒子産生能を有するフルゲノムレプリコンＲＮＡは、ウイルスの複製に必須な非構造遺伝子としてＪＦＨ−１株由来の配列を含む必要があるとされている。これまでに得られている、培養細胞系で自律複製し、かつＨＣＶ粒子を産生するＪ６ＣＦ株由来のフルゲノムレプリコンＲＮＡも、Ｊ６ＣＦ株ゲノム中の非構造遺伝子のかなりの部分をＪＦＨ−１株由来の同じ領域の配列に置換したキメラ核酸からなるもののみである。Ｊ６ＣＦ株の研究に必要な、Ｊ６ＣＦ株のゲノムをバックボーンとした、感染性ＨＣＶ粒子産生能を有するフルゲノムレプリコンＲＮＡは得られていない。【０００９】
このように、遺伝子型２ａのＨＣＶ由来のサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はフルゲノムレプリコンＲＮＡでは、ＪＦＨ−１株以外のＨＣＶ株の複製機構又は複製効率を反映するものがこれまで存在しない。このため、新たな抗ＨＣＶ薬のターゲットとなるＨＣＶ複製に必要な因子の同定や、複製機構又は複製効率に非依存的に薬効を発揮し得る抗ＨＣＶ薬のスクリーニングは困難であった。また、人工的に製造可能な、ＨＣＶワクチンの原料となるＨＣＶ粒子の種類も限定されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００１−１７１８７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９４年、第１０巻、ｐ．１３２１−１３２４
【非特許文献２】Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年、第２４４巻、ｐ．３５９−３６２
【非特許文献３】Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９２年、第６４巻、ｐ．３３４−３３９
【非特許文献４】Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、１９９２年、第７３巻、ｐ．６７３−６７９
【非特許文献５】Ｙｏｓｈｉｏｋａら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９２年、第１６巻、ｐ．２９３−２９９
【非特許文献６】Ｍｏｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９２年、第１８３巻、ｐ．３３４−３４２
【非特許文献７】Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、第２８５巻、ｐ．１１０−１１３
【非特許文献８】Ｂｌｉｇｈｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年、第２９０巻、ｐ．１９７２−１９７４
【非特許文献９】Ｆｒｉｅｂｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００１年、第７５巻、ｐ．１２０４７−１２０５７
【非特許文献１０】Ｉｋｅｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００２年、第７６巻、ｐ．２９９７−３００６
【非特許文献１１】Ｋａｔｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００３年、第１２５巻、ｐ．１８０８−１８１７
【非特許文献１２】Ｗａｋｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００５年、第１１巻、ｐ．７９１−７９６
【非特許文献１３】Ｍｕｒａｙａｍａら、  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００７年、第８１巻、ｐ．８０３０-８０４０
【非特許文献１４】Ｍｕｒａｙａｍａら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．、２０１０年、第６巻、ｅ１０００８８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスＪ６ＣＦ株ゲノムをバックボーンとする自律複製能を有するレプリコンＲＮＡを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、Ｊ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第１６８０番目のアラニンのグルタミン酸へのアミノ酸置換が、Ｊ６ＣＦ株ゲノムに自律複製能を付与する上で重要であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］  Ｃ型肝炎ウイルスＪ６ＣＦ株のゲノムの５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、及びＮＳ５Ｂタンパク質コード配列を含むウイルスタンパク質コード領域と、３’非翻訳領域とを５’側から３’側に向かってこの順番で含み、
上記ＮＳ４Ａタンパク質コード配列は、配列番号３０に示されるＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に、第１６８０番目のアラニンがグルタミン酸に置換する変異を有する、核酸。
［２］  上記ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を基準とした場合に、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のアミノ酸置換を引き起こす変異を有し、
上記３’非翻訳領域は、配列番号２９に示される塩基配列を基準とした場合に、第９４５８番目のシトシンがグアニンに塩基置換されている、上記［１］の核酸。
（ｉ）  第２８９２番目のアラニンのセリンへのアミノ酸置換
（ｉｉ）  第２９５９番目のアルギニンのリジンへのアミノ酸置換
（ｉｉｉ）  第３００３番目のチロシンのフェニルアラニンへのアミノ酸置換
［３］  上記ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列の第１番目〜第５１５番目のアミノ酸配列と、配列番号２８に示されるアミノ酸配列の第５１６番目〜第５９１番目のアミノ酸配列と、がこの順番で連結されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に置換され、かつ
上記３’非翻訳領域は、配列番号３１に示される塩基配列に置換されている、上記［１］の核酸。
［４］  外来遺伝子及びＩＲＥＳ配列を含む、上記［１］〜［３］の核酸。
［５］  上記ウイルスタンパク質コード領域が、ＮＳ３タンパク質コード配列の５’側に、Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムのＣｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、及びＮＳ２タンパク質コード配列を５’側から３’側に向かってこの順番でさらに含む、上記［１］〜［４］の核酸。
［６］  上記［１］〜［４］の核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのサブゲノムレプリコンＲＮＡ。
［７］  上記［５］の核酸を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのフルゲノムレプリコンＲＮＡ。
［８］  上記［５］の核酸をウイルスゲノムとして含有する、Ｃ型肝炎ウイルス粒子。
［９］  上記［１］〜［５］のいずれかの核酸を含む、発現ベクター。
［１０］  上記［１］〜［５］の核酸が導入されている、細胞。
［１１］  上記［８］のＣ型肝炎ウイルス粒子を含有する、Ｃ型肝炎ウイルスワクチン。
［１２］  被験物質の存在下及び非存在下の双方で、上記［１０］の細胞、又は、上記［８］のＣ型肝炎ウイルス粒子とＣ型肝炎ウイルス感受性細胞との混合物、を培養する培養ステップと、
上記培養ステップで得られた培養物中のサブゲノムレプリコンＲＮＡ、フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量を定量する定量ステップと、
上記定量ステップの結果、被験物質の存在下で定量されたサブゲノムレプリコンＲＮＡ、フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量が、それぞれ被験物質の非存在下で定量したサブゲノムレプリコンＲＮＡ、フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＣ型肝炎ウイルス粒子の量より少ない場合に、上記被験物質は、抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を有すると評価する評価ステップと
を備える、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法。【００１５】
本明細書は本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願2011-122795号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、Ｃ型肝炎ウイルスＪ６ＣＦ株のゲノムをバックボーンとして用いて、培養細胞において自律複製能を有するレプリコンＲＮＡを作製できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＪＦＨ−１株由来サブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクター、Ｊ６ＣＦ株由来サブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクター、２つのＪ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構造図である。
【図２】ＪＦＨ−１株由来フルゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクター、Ｊ６ＣＦ株由来フルゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクター、３つのＪ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構造図である。
【図３】Ａは、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡであるＳＧＲ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ、ＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃ、ＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ又はＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃを導入したＨｕｈ７．５．１細胞でのＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製量を示す相対ルシフェラーゼ活性を示す。Ｂは、Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡであるＦＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１又はＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１を導入したＨｕｈ７．５．１細胞の培養上清中のＣｏｒｅタンパク質の量（ウイルス産生能を示す）を示す。
【図４】Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡである、ＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１又はＦＧＲ−Ｊ６／５Ｂ−ＪＦＨ１を導入したＨｕｈ７．５．１細胞を繰り返し継代した際の培養上清中のＣｏｒｅタンパク質の量（ウイルス産生能）の経時的変化を示す。
【図５】Ａ１６８０Ｅ変異を含む、Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ及びＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構造を示す。ｐＪＦＨ１は、ＪＦＨ−１株の全長ゲノム配列をＴ７プロモーター下流にクローニングしたＪＦＨ−１株由来ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターである。ｐＪ６ＣＦは、Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノム配列をＴ７プロモーター下流にクローニングしたＪ６ＣＦ株由来ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターである。
【図６】ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡであるＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ、ＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ／Ｌｕｃ又はＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃを導入したＨｕｈ７．５．１細胞での相対ルシフェラーゼ活性（レプリコンＲＮＡ複製レベルを示す）を示す。
【図７】ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡであるＦＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１、ＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ又はＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１を導入したＨｕｈ７．５．１細胞の培養上清中のＣｏｒｅタンパク質の量（ウイルス産生能）を示す。
【図８】Ｊ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ及びＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構造図である。
【図９】ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡであるＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ、ＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ／Ｌｕｃ、ＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃ又はＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃを導入したＨｕｈ７．５．１細胞での相対ルシフェラーゼ活性（レプリコンＲＮＡ複製レベルを示す）を示す。
【図１０】ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡであるＦＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１、ＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ、ＦＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３又はＦＧＲ−Ｊ６ＣＦを導入したＨｕｈ７．５．１細胞の培養上清中のＣｏｒｅタンパク質の量（ウイルス産生能）を示す。
【図１１】変異「４Ａｍｕｔ」、「ＳＫＦ」、及び「ＶＲｍ３」のうち１つを導入したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構造図である。
【図１２】変異「４Ａｍｕｔ」、「ＳＫＦ」、及び「ＶＲｍ３」のうち２つを導入したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構造図である。
【図１３】変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターであるｐＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃ発現ベクター及びｐＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋Ｙ３００３Ｆ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃ発現ベクターの構造図である。
【図１４】ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡであるＳＧＲ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ及びＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃ、変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡであるＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃ、ＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋Ｙ３００３Ｆ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃ、ＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ／Ｌｕｃ、ＳＧＲ−Ｊ６／ＳＫＦ／Ｌｕｃ、ＳＧＲ−Ｊ６／ＶＲｍ３／Ｌｕｃ、ＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ／Ｌｕｃ、ＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃ及びＳＧＲ−Ｊ６／ＳＫＦ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃを導入したＨｕｈ７．５．１細胞での相対ルシフェラーゼ活性（レプリコンＲＮＡ複製レベルを示す）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書で使用される科学用語、技術用語及び命名法は、特に定義されない限り、当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。また、分子生物学及び免疫学の分野における一般的技術及び学術用語については、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）及びＥｄ  ＨａｒｌｏｗらのＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）に記載された手法及び定義に基づくものである。さらに、本明細書中に引用されている全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が本明細書に参考として援用されるものである。
【００１９】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡをゲノムとするウイルスである。ＨＣＶのゲノムは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列からなる領域、すなわち、ウイルスタンパク質コード領域と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）からなる。ＨＣＶゲノム（ＨＣＶ全長ゲノム）は、５’側から３’側に順番に、５’ＵＴＲと、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’ＵＴＲを配置してなるＲＮＡである。ＨＣＶ全長ゲノムの例として、Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムのｃＤＮＡ配列を配列番号２９に示した。ＨＣＶゲノムの一部からなる核酸と区別するために、その全長からなるＨＣＶゲノムを、「ＨＣＶ全長ゲノム」、「全長ＨＣＶゲノム」、「ＨＣＶ全長ゲノムＲＮＡ」、「全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ」又は「全長ゲノムＲＮＡ」ともいう。
【００２０】
ＨＣＶは、その実態としては、ウイルス粒子として存在する。ＨＣＶのウイルス粒子（ＨＣＶ粒子）は、ＨＣＶの構造タンパク質から構成されるウイルスの殻の内部にＨＣＶゲノムを含有している。
【００２１】
ＨＣＶのＣｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質は、ＨＣＶ粒子を形成する「構造タンパク質」であり、この構造タンパク質をコードする核酸を、「構造遺伝子」という。ＨＣＶのＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質は、ＨＣＶ粒子を形成しない「非構造タンパク質」であり、この非構造タンパク質をコードする核酸を、「非構造遺伝子」という。非構造タンパク質は、ＨＣＶゲノムの複製、ＨＣＶタンパク質のプロセッシング等に関与する機能を有している。
【００２２】
ＨＣＶの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は、タンパク質翻訳のための内部リボソーム進入部位（以下、ＩＲＥＳ）及び複製に必要なエレメントを提供する。ＨＣＶの５’ＵＴＲは、ゲノムの５’末端から約３４０ヌクレオチドの領域である。
【００２３】
ＨＣＶの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は、ＨＣＶの複製を補助する。ＨＣＶの３’ＵＴＲは可変領域、ポリＵ領域、及び約１００ヌクレオチドの追加領域（Ｘ領域）を含む。
【００２４】
ＨＣＶは１０種類のウイルスタンパク質（Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質）がこの順番で連結した１つの前駆体タンパク質（ポリプロテイン）として翻訳され、その後、細胞内及びウイルスのプロテアーゼにより切断されて、それぞれ、１０種類の成熟したウイルスタンパク質（Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質）となる。ＨＣＶの前駆体タンパク質の例として、Ｊ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３０に示した。この前駆体タンパク質は、配列番号２９に示されるＪ６ＣＦ株の全長ゲノム配列によってコードされている。
【００２５】
ＨＣＶには各種遺伝子型が知られているが、各種遺伝子型のＨＣＶのゲノムが同様の遺伝子構造を有することが知られている。本発明において、ＨＣＶの「遺伝子型」とはＳｉｍｍｏｎｄｓらによる国際分類に従って分類される遺伝子型を意味する。
【００２６】
Ｊ６ＣＦ株は遺伝子型２ａに属するＨＣＶであり、Ｊ６ＣＦ株の全長ＨＣＶゲノムの塩基配列（配列番号２９）及び前駆体タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３０）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１７７０３６に示されている。配列番号２９で表される配列は、Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ配列であるが、該塩基配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えたものがＲＮＡ配列である。
【００２７】
Ｊ６ＣＦ株の５’ＵＴＲは、配列番号２９の塩基番号第１番目〜第３４０番目の配列からなり、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列は、配列番号２９の塩基番号第３４１番目〜第９１３番目の配列からなり、Ｅ１タンパク質コード配列は、配列番号２９の塩基番号第９１４番目〜第１４８９番目の配列からなり、Ｅ２タンパク質コード配列は、配列番号２９の塩基番号第１４９０番目〜第２５９０番目の配列からなり、ｐ７タンパク質コード配列は、配列番号２９の塩基番号第２５９１番目〜第２７７９番目の配列からなり、ＮＳ２タンパク質コード配列は、配列番号２９の塩基番号第２７８０番目〜第３４３０番目の配列からなり、ＮＳ３タンパク質コード配列は、配列番号２９の塩基番号第３４３１番目〜第５３２３番目の配列からなり、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列は、配列番号２９の塩基番号第５３２４番目〜第５４８５番目の配列からなり、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列は、配列番号２９の塩基番号第５４８６番目〜第６２６８番目の配列からなり、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列は、配列番号２９の塩基番号第６２６９番目〜第７６６６番目の配列からなり、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列は、配列番号２９の塩基番号第７６６７番目〜第９４４２番目（終止コドン含む）の配列からなり、３’ＵＴＲは、配列番号２９の塩基番号第９４４３番目〜第９７１１番目の配列からなる。なおＪ６ＣＦ株のＮＳ５Ｂタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２７に示す。
【００２８】
ＪＦＨ−１株は遺伝子型２ａに属するＨＣＶであり、ＪＦＨ−１株の全長ＨＣＶゲノムの塩基配列及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４７６３９に示されている。ＪＦＨ−１株のＮＳ５Ｂタンパク質アミノ酸配列を、配列番号２８に示す。ＪＦＨ−１株のＮＳ５Ｂタンパク質コード配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４７６３９に示される塩基配列の５’末端の第１塩基を塩基番号第１番目とした場合に、その塩基番号第７６６７番目〜第９４４２番目（終止コドン含む）の配列からなる。ＪＦＨ−１株の３’ＵＴＲは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４７６３９に示される塩基配列の塩基番号第９４４３番目〜第９６７８番目の配列からなる。ＪＦＨ−１株の３’ＵＴＲの塩基配列を配列表の配列番号３１に示す。
【００２９】
本発明は、このようなＨＣＶゲノムを利用して、自律複製能を付与する変異を導入した遺伝子型２ａのＨＣＶ株（好ましくは、Ｊ６ＣＦ株）のサブゲノム配列又はフルゲノム配列を含む、高効率に自律複製可能なレプリコンＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡを始めとする核酸を提供する。
【００３０】
本発明においてレプリコンＲＮＡに導入する、遺伝子型２ａのＨＣＶ株（好ましくは、Ｊ６ＣＦ株）のサブゲノムＲＮＡ又はフルゲノムＲＮＡに自律複製能を付与することができる適応変異は、Ｊ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列の第１６８０番目のアラニンのグルタミン酸へのアミノ酸置換（Ａ１６８０Ｅ）である。
【００３１】
本発明では、このＡ１６８０Ｅ変異を、Ｊ６ＣＦ株のサブゲノムＲＮＡ又はフルゲノムＲＮＡに、単独で又は他の適応変異と組み合わせて導入することにより、培養細胞中で高い自律複製能を有するＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを作製できる。
【００３２】
Ａ１６８０Ｅ変異と共に導入する適応変異としては、限定するものではないが、Ｊ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列のＡ２８９２Ｓ（第２８９２番目のアラニンのセリンへの置換）、Ｒ２９５９Ｋ（第２９５９番目のアルギニンのリジンへの置換）及びＹ３００３Ｆ（第３００３番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換）のアミノ酸置換を引き起こす塩基変異、並びに、ｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）の塩基変異（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの第９４５８番目のシトシンのグアニンへの変異）が挙げられる。好ましくは、レプリコンＲＮＡには、Ａ１６８０Ｅ変異と共に、Ａ２８９２Ｓ変異、Ｒ２９５９Ｋ変異及びＹ３００３Ｆ変異、並びにｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）の塩基変異を全て導入する。
【００３３】
本発明では、上記のＡ１６８０Ｅ変異を、Ｊ６ＣＦ株ゲノムＲＮＡのＮＳ５Ｂタンパク質コード配列の一部（ＮＳ５Ｂタンパク質の第５１６番目から第５９１番目に相当）と３’非翻訳領域がＪＦＨ−１株由来の同じ領域の配列に置換されたキメラレプリコンＲＮＡ（Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラレプリコンＲＮＡ）に導入することにより、培養細胞中で高い自律複製能を有するＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを作製することもできる。
【００３４】
ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、上記の変異のみを含むレプリコンＲＮＡと同等の自律複製能を有する限り、上記のＡ１６８０Ｅ、Ａ２８９２Ｓ、Ｒ２９５９Ｋ、Ｙ３００３Ｆ、ｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）の変異以外の変異を有していてもよい。そのような他の変異は、１又は複数個（例えば１〜５０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜５個）の塩基の置換であってよい。そのような他の変異を有するレプリコンＲＮＡは、ＨＣＶ  Ｊ６ＣＦ株のゲノム配列と比較して９２％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上（例えば９９．５％以上）の塩基配列同一性を有する。あるいはＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、上記のＡ１６８０Ｅ、Ａ２８９２Ｓ、Ｒ２９５９Ｋ、Ｙ３００３Ｆ、ｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）のみの変異を有することも好ましい。
【００３５】
本発明において「レプリコンＲＮＡ」とは、培養細胞（典型的にはＨＣＶ感受性細胞）内で自律複製する能力を有するＲＮＡをいう。細胞に導入されたレプリコンＲＮＡは、自律複製し、そのＲＮＡコピーが細胞分裂後に娘細胞に分配されるため、レプリコンＲＮＡを用いれば細胞への安定的な導入が可能である。
【００３６】
ＨＣＶのレプリコンＲＮＡ（ＨＣＶレプリコンＲＮＡ）とは、ＨＣＶゲノムＲＮＡの一部又は全長を含む、自律複製するＲＮＡのことをいう。ＨＣＶゲノムＲＮＡの一部を含む自律複製するＲＮＡを、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡと呼び、ＨＣＶゲノムＲＮＡの全長を含む自律複製するＲＮＡを、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡと呼ぶ。「ＨＣＶレプリコンＲＮＡ」は、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡとＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの両方を包含する。
【００３７】
本発明における「ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ」は、ＨＣＶの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を、５’から３’の順に向かってこの順番で含むことが好ましい。また、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、その検出のために、外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子）とＩＲＥＳ配列を含むことが好ましく、そのような場合、外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子）とＩＲＥＳ配列は、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのＮＳ３タンパク質コード配列の５’側に含むことが好ましい。本発明における好適な「ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ」の例は、ＨＣＶの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、Ｃｏｒｅタンパク質コード領域の５’末端の３６ヌクレオチドの配列と、外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子）と、ＩＲＥＳ配列と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を、５’側から３’側に向かってこの順番で含むものである。
【００３８】
本発明における「ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ」は、ＨＣＶの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を、５’から３’の順に向かってこの順番で配置してなるものが好ましい。
【００３９】
ＨＣＶ全長ゲノムが自律複製能を有する場合、該ゲノムはレプリコンＲＮＡである。ＨＣＶ全長ゲノムを含むレプリコンＲＮＡを、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡと呼ぶ。ＨＣＶ全長ゲノム配列からなるＲＮＡ（ＨＣＶ全長ゲノムＲＮＡ）が自律複製能を有する場合、それはＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡである。
【００４０】
本発明に係る核酸は、基本的には、ＪＦＨ−１株以外の遺伝子型２ａのＨＣＶ株（好ましくは、Ｊ６ＣＦ株）のゲノム配列をバックボーンとし、かつ、培養細胞での自律複製能を付与する変異を有する核酸である。この核酸は、典型的には、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ若しくはＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ、又はそれらをコードするＤＮＡである。
【００４１】
一実施形態では、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスＪ６ＣＦ株のゲノムの、５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、及びＮＳ５Ｂタンパク質コード配列を含むウイルスタンパク質コード領域と、３’非翻訳領域とを５’側から３’側に向かってこの順番で含む核酸であって、上記ＮＳ４Ａタンパク質コード配列内に、配列番号３０に示されるＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第１６８０番目のアラニンがグルタミン酸に置換する変異（当該アラニンのグルタミン酸へのアミノ酸置換を引き起こす塩基変異）を有する、核酸に関する。この核酸がウイルス性配列（ここで言うウイルス性配列とは、ＨＣＶゲノム由来の塩基配列のことを示す。）として全長ゲノム配列を含む場合、上記ウイルスタンパク質コード領域は、ＮＳ３タンパク質コード配列の５’側に、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、及びＮＳ２タンパク質コード配列を５’側から３’側に向かってこの順番でさらに含む。
【００４２】
好ましい一実施形態では、この核酸は、Ｃ型肝炎ウイルスＪ６ＣＦ株のゲノムの５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列及びＮＳ５Ｂタンパク質コード配列を含むウイルスタンパク質コード領域と、３’非翻訳領域と、を５’側から３’側に向かってこの順番で含み、上記ＮＳ４Ａタンパク質コード配列は、配列番号３０に示されるＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に、第１６８０番目のアラニンがグルタミン酸に置換する変異を有し、かつ、上記ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を基準とした場合に、（ｉ）  第２８９２番目のアラニンのセリンへのアミノ酸置換、（ｉｉ）  第２９５９番目のアルギニンのリジンへのアミノ酸置換及び（ｉｉｉ）  第３００３番目のチロシンのフェニルアラニンへのアミノ酸置換、を引き起こす変異を有し、上記３’非翻訳領域は、配列番号２９に示される塩基配列を基準とした場合に、第９４５８番目のシトシンがグアニンに塩基置換されている核酸であってよい。
【００４３】
この核酸は、ウイルス性配列（ＨＣＶゲノム由来の塩基配列）としてサブゲノム配列（ＨＣＶ全長ゲノムの一部からなる配列）を含むものであってよく、例えばサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡでありうる。この核酸は、外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子）とＩＲＥＳ配列とを含む場合、Ｃｏｒｅタンパク質コード領域の５’末端の部分断片（例えば５’末端の３６ヌクレオチドの配列）を外来遺伝子の５’側に含んでもよい。この場合、この核酸は、ＨＣＶの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、Ｃｏｒｅタンパク質コード領域の５’末端の３６ヌクレオチドの配列と、外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子）と、ＩＲＥＳ配列と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を、５’側から３’側に向かってこの順番で含む。この核酸は、例えば配列番号４に示される塩基配列を含むサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡ（ＲＮＡの場合には、塩基配列中のチミン（ｔ）はウラシル（ｕ）に読み替える）であってよい。
【００４４】
あるいはこの核酸は、ウイルス性配列としてフル（全長）ゲノム配列を含むものであってよく、例えばフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡでありうる。ウイルス性配列として全長ゲノム配列を含む上記核酸においては、上記ウイルスタンパク質コード領域は、ＮＳ３タンパク質コード配列の５’側に、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、及びＮＳ２タンパク質コード配列を５’側から３’側に向かってこの順番でさらに含む。この核酸は、例えば配列番号５に示される塩基配列を含むフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡ（ＲＮＡの場合には、塩基配列中のチミン（ｔ）はウラシル（ｕ）に読み替える）であってよい。
【００４５】
本発明に係るこの核酸は、ＨＣＶのＪ６ＣＦ株のゲノムの５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域とを含む核酸であってその塩基配列に変異を有する核酸であり、かつ、ＨＣＶのＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第１６８０番目のアラニンのグルタミン酸への置換、第２８９２番目のアラニンのセリンへの置換、第２９５９番目のアルギニンのリジンへの置換、及び、第３００３番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換、を引き起こす変異、並びに、Ｊ６ＣＦ株のゲノムの塩基配列を基準とした場合に第９４５８番目のシトシンのグアニンへの変異を有する核酸でありうる。この核酸は、好ましくは、Ｊ６ＣＦ株のサブゲノム由来レプリコンＲＮＡに上記５つの変異が導入されたＪ６ＣＦ株由来変異体サブゲノムレプリコンＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡである。この核酸は、配列番号４に示される塩基配列を含む核酸であってよい。
【００４６】
本発明に係るこの核酸は、ＨＣＶのＪ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基配列に変異を有する塩基配列を含む核酸であり、かつ、ＨＣＶのＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第１６８０番目のアラニンのグルタミン酸への置換、第２８９２番目のアラニンのセリンへの置換、第２９５９番目のアルギニンのリジンへの置換、及び、第３００３番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換、を引き起こす変異、並びに、Ｊ６ＣＦ株のゲノムの塩基配列を基準とした場合に第９４５８番目のシトシンのグアニンへの変異を有する核酸でありうる。この核酸は、好ましくは、Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノム由来レプリコンＲＮＡに上記５つの変異が導入されたＪ６ＣＦ株由来変異体フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡである。この核酸は、配列番号５に示される塩基配列を含む核酸であってよい。
【００４７】
なお、本明細書において、Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ、Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡとは、変異が導入されたＪ６ＣＦ株のサブゲノム配列又はフルゲノム配列を含むレプリコンＲＮＡを指す。この変異体と区別するために、変異が導入されていないＪ６ＣＦ株ゲノム配列を野生型と呼ぶ。
【００４８】
本発明の別の実施形態では、本発明に係る核酸は、Ｃ型肝炎ウイルスＪ６ＣＦ株のゲノムの、５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、及びＮＳ５Ｂタンパク質コード配列を含むウイルスタンパク質コード領域と、３’非翻訳領域とを５’側から３’側に向かってこの順番で含む核酸であって、上記ＮＳ４Ａタンパク質コード配列が、配列番号３０に示されるＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第１６８０番目のアラニンがグルタミン酸に置換する変異（アラニンのグルタミン酸へのアミノ酸置換を引き起こす塩基変異）を有し、さらに、
（ａ）  上記ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列の第１番目〜第５１５番目のアミノ酸配列と、配列番号２８に示されるアミノ酸配列の第５１６番目〜第５９１番目のアミノ酸配列と、がこの順番で連結されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に置換され、かつ
（ｂ）  上記３’非翻訳領域は、配列番号３１に示される塩基配列（ＪＦＨ−１株由来の３’非翻訳領域）に置換されている、核酸であってもよい。
【００４９】
ここで、（ａ）に記載する、配列番号２７に示されるアミノ酸配列の第１番目〜第５１５番目のアミノ酸配列と、配列番号２８に示されるアミノ酸配列の第５１６番目〜第５９１番目のアミノ酸配列と、がこの順番で連結されたアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列である。このタンパク質をコードする塩基配列は、例えば、配列番号３２に示される塩基配列であってよい。
【００５０】
この核酸は、ウイルス性配列としてサブゲノム配列を含むものであってよく、例えばサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡであってよい。この核酸は、外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子）とＩＲＥＳ配列とを含む場合、Ｃｏｒｅタンパク質コード領域の５’末端の部分断片（例えば５’末端の３６ヌクレオチドの配列）を外来遺伝子の５’側に含んでもよい。この場合、この核酸は、ＨＣＶの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、Ｃｏｒｅタンパク質コード領域の５’末端の３６ヌクレオチドの配列と、外来遺伝子（薬剤耐性遺伝子又はレポーター遺伝子）と、ＩＲＥＳ配列と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を、５’側から３’側に向かってこの順番で含む。この核酸は、例えば配列番号１に示される塩基配列を含むサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡ（ＲＮＡの場合には、塩基配列中のチミン（ｔ）はウラシル（ｕ）に読み替える）であってよい。
【００５１】
あるいはこの核酸は、ウイルス性配列として全長ゲノム配列を含むものであってよく、例えばフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡであってよい。ウイルス性配列として全長ゲノム配列を含む上記核酸においては、上記ウイルスタンパク質コード領域は、ＮＳ３タンパク質コード配列の５’側に、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、及びＮＳ２タンパク質コード配列を５’側から３’側に向かってこの順番でさらに含む。この核酸は、例えば配列番号２に示される塩基配列を含むフルゲノムレプリコンＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡ（ＲＮＡの場合には、塩基配列中のチミン（ｔ）はウラシル（ｕ）に読み替える）であってよい。
【００５２】
本発明に係るこの核酸は、ＨＣＶのＪ６ＣＦ株のゲノムの５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質及びＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列と、ＨＣＶのＪ６ＣＦ株のＮＳ５Ｂタンパク質の第１番目から第５１５番目のアミノ酸残基をコードする塩基配列と、ＨＣＶのＪＦＨ−１株のＮＳ５Ｂタンパク質の第５１６番目から第５９１番目のアミノ酸残基をコードする塩基配列と、ＨＣＶのＪＦＨ−１株のゲノムの３’非翻訳領域、を含む核酸の塩基配列に変異を有する核酸であり、かつ、第１６８０番目のアラニンのグルタミン酸への置換を引き起こす変異を有する核酸であってよい。
【００５３】
本発明に係るこの核酸は、また、ＨＣＶのＪ６ＣＦ株のゲノムの５’非翻訳領域と、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質及びＮＳ５Ａタンパク質をコードする塩基配列と、ＨＣＶのＪ６ＣＦ株のＮＳ５Ｂタンパク質（配列番号２７）の第１番目から第５１５番目のアミノ酸残基をコードする塩基配列と、ＨＣＶのＪＦＨ−１株のＮＳ５Ｂタンパク質（配列番号２８）の第５１６番目から第５９１番目のアミノ酸残基をコードする塩基配列と、ＨＣＶのＪＦＨ−１株のゲノムの３’非翻訳領域が、５’側から３’側に向かって、５’非翻訳領域、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列、並びに３’非翻訳領域の順に配置された核酸の塩基配列に変異を有する核酸であり、かつ、第１６８０番目のアラニンのグルタミン酸への置換を引き起こす変異を有する、キメラ型の核酸であってよい。このキメラ型核酸は、Ｊ６ＣＦ株のＨＣＶゲノム配列のうち、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列の一部及び３’非翻訳領域を、ＪＦＨ−１株のゲノム由来の同じ領域の配列に置換し、さらに、Ａ１６８０Ｅのアミノ酸置換を導入することにより作製できる。このＪ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体核酸中のＮＳ５Ｂタンパク質は、Ｊ６ＣＦ株由来とＪＦＨ−１株由来のキメラＮＳ５Ｂタンパク質となっている。好ましくは、この核酸は、配列番号２に示される塩基配列を含む核酸であってよい。ここで、キメラ型の核酸（キメラ核酸）又はキメラ型のＨＣＶゲノム（キメラＨＣＶゲノム）とは、２以上の異なる株のＨＣＶのゲノム配列を含む、核酸又はゲノムのことをいう。
【００５４】
本発明において、「核酸」には、ＲＮＡ及びＤＮＡ、並びにその誘導体が含まれるものとする。また、本明細書における「タンパク質コード領域」、「タンパク質をコードする塩基配列」、「タンパク質をコードする配列」及び「タンパク質コード配列」とは、所定のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のことをいい、開始コドン及び終止コドンは含んでいても含まなくてもよいものとする。
【００５５】
本明細書において、核酸がＲＮＡである場合に配列表の配列番号を引用してＲＮＡの塩基配列又は塩基を特定するときは、その配列番号に示される塩基配列中のチミン（ｔ）はウラシル（ｕ）に読み替えるものとする。
【００５６】
本明細書においては、配列番号で示されるアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸を、「配列番号“Ｘ”に示される…アミノ酸配列を基準とした場合に第“Ｙ”番目の（アミノ酸）」という表現により指定する。例えば「配列番号３０に示されるＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第“Ｙ”番目の（アミノ酸）」という記載は、そのアミノ酸が、配列番号３０に示されるＨＣＶのＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列においてＮ末端の第１アミノ酸（メチオニン）を第１番目としたときに第“Ｙ”番目に位置するアミノ酸残基であることを意味する。「配列番号“Ｘ”に示される…アミノ酸配列を基準とした場合に第“Ｙ”番目の（アミノ酸）」という表現を用いる場合、その指定するアミノ酸が存在するアミノ酸配列中の実際の位置は、その第“Ｙ”番目であってもよいが、第“Ｙ”番目でなくてもよい。具体的には、例えば「配列番号３０に示されるＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第１６８０番目のアラニンがグルタミン酸に置換され、かつレポータータンパク質がＮ末端側に挿入された、配列番号３０に示される前駆体タンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質」と記載する場合、配列番号３０では第１６８０番目に位置しているがレポータータンパク質の挿入によりＮ末端からの位置が第１６８０番目ではなくなったアラニンが、タンパク質中でグルタミン酸に置換されていることを意味する。
【００５７】
Ｊ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列は配列番号３０に示されている。配列番号３０に示されるＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列（翻訳開始部位のメチオニンから数えて第３０３３番目のアルギニン（Ｒ）までの３０３３残基のアミノ酸からなる）は、配列番号２９に示されるＪ６ＣＦ株の全長ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ配列の塩基番号第３４１番目〜第９４４２番目（終止コドンを含む）の配列からなる部分の配列によりコードされる。
【００５８】
配列番号３０に示されるＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第１６８０番目のアミノ酸は、ＮＳ４Ａタンパク質に含まれるアラニン（Ａ）である。アラニン（Ａ）からグルタミン酸（Ｅ）への置換は、Ａ１６８０Ｅと表されるが、１６８０ＡＥ又は１６８０Ａ→Ｅと表すこともできる。他のアミノ酸置換も同様に表記される。
【００５９】
なお、本明細書においてアミノ酸は、生物学分野で通常用いられるアミノ酸の１文字表記（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９年）によって記載されている。本明細書においては、アミノ酸又はアミノ酸残基を、生物学分野で通常用いられるアミノ酸の１文字表記又は３文字表記で記載し、それは水酸化、糖鎖付加、硫酸化等の翻訳後修飾を受けたアミノ酸も包含するものとする。
【００６０】
本明細書において、Ａ１６８０Ｅ等の表記は、特定の位置のアミノ酸の置換を示すが、文脈によりそのアミノ酸置換を引き起こす塩基変異をも意味する。例えば、核酸の塩基が変異し、元の核酸がコードするアミノ酸配列における第１６８０番目のアラニン（Ａ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換された場合、該変異をＡ１６８０Ｅ置換（変異）と称することがある。また、該変異を有するアミノ酸配列をコードする核酸を、Ａ１６８０Ｅ置換（変異）を含む核酸、又はＡ１６８０Ｅ置換（変異）が導入された核酸と称する場合がある。あるいは、そのような変異を、アミノ酸配列におけるＡ１６８０Ｅ置換（変異）を引き起こす塩基変異と称することもある。例えば、Ａ１６８０Ｅ置換（変異）が導入されたＨＣＶレプリコンＲＮＡを、Ａ１６８０Ｅ変異体ＨＣＶレプリコンＲＮＡということがある。同時に複数の変異を有する場合には、例えば、Ａ１６８０Ｅの置換とＡ２８９２Ｓ、Ｒ２９５９Ｋ及びＹ３００３Ｆのアミノ酸置換を有する場合、「Ａ１６８０Ｅ／Ａ２８９２Ｓ／Ｒ２９５９Ｋ／Ｙ３００３Ｆの置換（変異）を含む」と表現することがある。「アミノ酸置換」は「アミノ酸変異」と表現する場合がある。
【００６１】
特定のアミノ酸置換を引き起こす塩基変異は、周知の遺伝暗号表に基づいて選択することができる。例えば、Ａ１６８０Ｅ置換を引き起こす変異は、アラニンをコードするコドン「ＧＣＴ」、「ＧＣＣ」、「ＧＣＡ」、又は「ＧＣＧ」から、グルタミン酸をコードするコドン「ＧＡＡ」又は「ＧＡＧ」への変化をもたらす変異である。Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノム配列（配列番号２９）において、Ａ１６８０Ｅ置換を引き起こす塩基変異は、コドン「ＧＣＧ」（配列番号２９の第５３７８番目〜第５３８０番目）を「ＧＡＡ」又は「ＧＡＧ」に変化させる変異である。これはすなわち、配列番号２９の第５３７９番目〜第５３８０番目の塩基配列を５’−ｃｇ−３’から５’−ａａ−３’に変異させるか、又は第５３７９番目の塩基をシトシン（ｃ）からアデニン（ａ）に変異させるものである。
【００６２】
同様に、配列表の配列番号３０に示されるＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第２８９２番目のアラニンのセリンへのアミノ酸置換は、Ａ２８９２Ｓと表記される。Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノム配列（配列番号２９）において、Ａ２８９２Ｓ置換を引き起こす塩基変異は、アラニンをコードするコドン「ＧＣＧ」（配列番号２９の第９０１４番目〜第９０１６番目）を、セリンをコードするコドン「ＴＣＴ」、「ＴＣＣ」、「ＴＣＡ」、「ＴＣＧ」、「ＡＧＴ」又は「ＡＧＣ」に変化させる変異である。
【００６３】
同様に、配列表の配列番号３０に示されるＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第２９５９番目のアルギニンのリジンへのアミノ酸置換は、Ｒ２９５９Ｋと表記される。Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノム配列（配列番号２９）において、Ｒ２９５９Ｋ置換を引き起こす塩基変異は、アルギニンをコードするコドン「ＡＧＡ」（配列番号２９の第９２１５番目〜第９２１７番目）を、リジンをコードするコドン「ＡＡＡ」又は「ＡＡＧ」に変化させる変異である。
【００６４】
同様に、配列表の配列番号３０に示されるＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列を基準とした場合に第３００３番目のチロシンのフェニルアラニンへのアミノ酸置換は、Ｙ３００３Ｆと表記される。Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノム配列（配列番号２９）において、Ｙ３００３Ｆ置換を引き起こす塩基変異は、チロシンをコードするコドン「ＴＡＴ」（配列番号２９の第９３４７番目〜第９３４９番目）を、フェニルアラニンをコードするコドン「ＴＴＴ」又は「ＴＴＣ」に変化させる変異である。
【００６５】
本明細書においては、配列番号で示される塩基配列中の特定の位置の塩基を、「配列番号“Ｘ”に示される…塩基配列を基準とした場合に第“Ｙ”番目の（塩基）」という表現により指定する。例えば「配列番号２９に示される塩基配列を基準とした場合に第“Ｙ”番目の（塩基）」という記載は、その塩基が、配列番号２９に示されるＨＣＶのＪ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基配列において５’末端の第１塩基を第１番目としたときに第“Ｙ”番目に位置する塩基であることを意味する。「配列番号“Ｘ”に示される…塩基配列を基準とした場合に第“Ｙ”番目の（塩基）」という表現を用いる場合、その指定する塩基が存在する塩基配列中の実際の位置は、第“Ｙ”番目であってもよいが、第“Ｙ”番目でなくてもよい。具体的には、例えば「配列番号２９に示される塩基配列を基準とした場合に第９４５８番目のシトシン（ｃ）がグアニン（ｇ）に置換され、かつレポーター遺伝子が５’末端側に挿入された、配列番号２９に示される全長ゲノム配列を含むレプリコンＲＮＡ」と記載する場合、配列番号２９では第９４５８番目に位置しているがレポーター遺伝子の挿入により５’末端からの位置が第９４５８番目ではなくなったシトシンが、レプリコンＲＮＡ中でグアニンに置換されていることを意味する。
【００６６】
塩基変異を表記する場合は、アミノ酸の置換（変異）と区別するために、塩基変異の位置を示す塩基番号の前にｎｔと付記することができる。塩基変異はまた、小文字のアルファベットを用いて表記する場合がある（アデニンはａ、シトシンはｃ、グアニンはｇ、ウラシルはｕ、チミンはｔ）。例えば、塩基変異ｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）は、第９４５８番目の塩基がシトシン（ｃ）からグアニン（ｇ）へ変異することを意味する。
【００６７】
本発明に係る核酸、例えばＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、Ｊ６ＣＦ株のゲノム配列をバックボーンとするものである。「Ｊ６ＣＦ株のゲノムをバックボーンとする核酸」とは、Ｊ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３０）に対して９７％以上の相同性（好ましくは９９％以上、より好ましくは９９．５％以上、さらに好ましくは９９．８％以上）を示すＨＣＶ前駆体タンパク質をコードする核酸を言う。ウイルス性配列としてサブゲノム配列を含む場合は、前駆体タンパク質中の当該サブゲノム配列に対応する領域のみのアミノ酸配列と比較して相同性を求める。相同性の解析は、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）などの遺伝情報処理ソフトウエアを用いて解析することができる。例えば、ＪＦＨ−１株とＪ６ＣＦ株の前駆体タンパク質のアミノ酸配列の相同性を、ｋ−ｔｕｐｌｅの値を２としてＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）で解析した場合、同一のアミノ酸は全アミノ酸残基数３０３３のうち２７６５個であり、相同性は９１％となる。５つの変異（Ａ１６８０Ｅ、Ａ２８９２Ｓ、Ｒ２９５９Ｋ、及びＹ３００３Ｆ、並びにｎｔ９４５８（ｃ→ｇ））を導入したＪ６ＣＦ株由来フルゲノムレプリコンＲＮＡは、野生型Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノム配列に対し、前駆体タンパク質において９９．８６％の相同性を有しており、Ｊ６ＣＦ株のゲノム配列をバックボーンとするものである。Ｊ６ＣＦ株のゲノム配列をバックボーンとする本発明に係る核酸は、好ましくは、Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ若しくはＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ、又はそれをコードするＤＮＡである。
【００６８】
本発明において、Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ、Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡとは、それぞれ、Ｊ６ＣＦ株のゲノム配列をバックボーンとし、さらにレプリコンＲＮＡに培養細胞での自律複製能を付与又はその複製効率を向上させる適応変異（アミノ酸変異及び／又は塩基変異）を１つ以上含む、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡをいう。
【００６９】
自律複製能を付与又はその複製効率を向上させる適応変異（アミノ酸変異及び／又は塩基変異）を１つ以上含む、Ｊ６ＣＦ株と他のＨＣＶ株（例えば、ＪＦＨ−１株）のゲノムのキメラであるＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はキメラ変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡも、上記基準に基づいてＪ６ＣＦ株のゲノム配列をバックボーンとする限り、Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ、Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの範囲に含まれるものとする。
【００７０】
本発明に係る核酸、例えばＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ、又はＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、さらに選択マーカー遺伝子やレポーター遺伝子等の外来遺伝子、及びＩＲＥＳ配列を含んでいてもよい。
【００７１】
例えば、変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、好ましくは、５’側から３’側に順番に、ＨＣＶの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、外来遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、ＨＣＶのＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列と、ＨＣＶの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）とを含む核酸である。変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡは、５’非翻訳領域と外来遺伝子との間にＪ６ＣＦ株由来のＣｏｒｅタンパク質コード領域の５’末端の３６ヌクレオチドの塩基配列（配列番号２９の第３４１番目〜第３７６番目）を含んでもよい。
【００７２】
例えば、変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、好ましくは、５’側から３’側に順番に、ＨＣＶの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、外来遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、ＨＣＶのＣｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列と、ＨＣＶの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）とを含む。
【００７３】
選択マーカー遺伝子は、その遺伝子が発現した細胞だけが選択されるような選択性を細胞に付与することができるものであり、薬剤耐性遺伝子などがある。本発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、限定するものではないが、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられるが、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子が好ましく、ネオマイシン耐性遺伝子がさらに好ましい。
【００７４】
レポーター遺伝子は、その遺伝子発現の指標となる遺伝子産物をコードする遺伝子である。本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。好ましいレポーター遺伝子の例としては、限定するものではないが、トランスポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβグルクロニダーゼ若しくはβガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のエクオリン遺伝子、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子等が挙げられる。
【００７５】
薬剤耐性遺伝子及びレポーター遺伝子は、ＨＣＶレプリコンＲＮＡ中にどちらか一方のみが含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。薬剤耐性遺伝子やリポーター遺伝子等のマーカー遺伝子は、ＨＣＶレプリコンＲＮＡに１つ含まれていてもよいし、２つ以上含まれていてもよい。
【００７６】
本発明において「ＩＲＥＳ配列」とは、ＲＮＡの内部にリボソームを結合させて翻訳を開始させることが可能な内部リボソーム結合部位を意味する。ＩＲＥＳ配列の好ましい例としては、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）、ＦＭＤＶ ＩＲＥＳ、ＨＣＶ ＩＲＥＳ等が挙げられるが、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ及びＨＣＶ ＩＲＥＳがより好ましく、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳが最も好ましい。
【００７７】
本発明においては、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子が、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡから正しい読み枠（インフレーム）で翻訳されるように、５’非翻訳領域、ウイルスタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域と連結される。
【００７８】
上記のような本発明に係る核酸は、より好ましくは、自律複製能を有するサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はフルゲノムレプリコンＲＮＡである。したがって本発明は、本発明に係る核酸を含むＣ型肝炎ウイルスのサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はフルゲノムレプリコンＲＮＡも提供する。
【００７９】
本発明に係る核酸の作製には、Ｊ６ＣＦ株のゲノムＲＮＡを逆転写して得たｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１７７０３６）をクローン化したＤＮＡ、及びＪＦＨ−１株のゲノムを逆転写して得たｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４７６３９）をクローン化したＤＮＡを用いることができる。
【００８０】
Ｊ６ＣＦ株由来のサブゲノムを含む核酸構築物は、Ｊ６ＣＦ株のゲノムＲＮＡを逆転写して得たｃＤＮＡをクローン化したＤＮＡの一部を、例えば、制限酵素で切り出すか又は相同組換えにより一部を置換することにより、作製することができる。例えば、Ｊ６ＣＦ
ゲノムクローンｐＪ６ＣＦのＣｏｒｅタンパク質コード領域の５’末端から第３７番目〜ＮＳ２タンパク質コード領域までを、外来遺伝子とＩＲＥＳ配列（例えば、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列）からなる塩基配列に置換することにより作製してもよい。
【００８１】
Ａ１６８０Ｅ変異を含まないＪ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶサブゲノム又はフルゲノム（キメラＨＣＶゲノム）を含む核酸構築物は、Ｊ６ＣＦとＪＦＨ−１の各ＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをクローン化したベクターを鋳型にしてＰＣＲを行い、組み合わせる各ＨＣＶゲノム領域を増幅して連結することにより、作製することができる。例えば、Ｊ６ＣＦ株の５’非翻訳領域からＮＳ５Ｂタンパク質アミノ酸配列の第５１５番目までの領域を増幅し、ＪＦＨ−１株のＮＳ５Ｂタンパク質アミノ酸配列の第５１６番目から３’ＵＴＲまでの領域を増幅し、それらの増幅産物を連結することができる。この技法は、例えば、Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、２００５年、第１１巻、ｐ．７９１−７９６；Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ，Ｂ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年、第３０９巻、ｐ．６２３−６２６；Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００７年、第１０３巻、ｐ．７４０８−７４１３に記載されている。
【００８２】
野生型ＨＣＶゲノム配列やキメラＨＣＶゲノム配列に、変異を導入するには、ＰＣＲ法や市販の変異導入キット（例えば、東洋紡社製のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔなど）を用いることができる。ＰＣＲ法としては、例えば、野生型のＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをクローン化したベクターを鋳型とし、該ｃＤＮＡの配列から設計され、目的とする変異を含む正方向及び逆方向プライマーを用いたＰＣＲを実施することによって、変異を含む目的の配列部分を増幅することができる。具体的には、互いに重複配列を有する異なるＰＣＲ産物を複数合成し、それらのＰＣＲ産物を混合し、これを鋳型として、目的核酸の５’端を含む正方向プライマーと、該核酸の相補鎖の５’端を含む逆方向プライマーを用いるＰＣＲを実施することによって該目的核酸を増幅する。合成した核酸の各末端を制限酵素で切断し、同じ酵素で切断した野生型のＨＣＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡをクローン化したベクターに連結することにより、目的の変異を導入できる。このような技法は、例えば、国際公開第０４／１０４１９８号、国際公開第０６／０２２４２２号、Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ら、２００５年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、第１１号、ｐ．７９１−７９６、及びＬｉｎｄｅｎｂａｃｈ，Ｂ．Ｄ．ら、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３０９号、ｐ．６２３−６２６にも記載されている。
【００８３】
野生型ＨＣＶ全長ゲノム配列やキメラＨＣＶ全長ゲノム配列に変異を導入する場合、野生型ＨＣＶ全長ゲノム配列に上記のようにして変異を導入してもよいし、あるいは、野生型ＨＣＶサブゲノム配列に変異を導入した後で野生型ＨＣＶゲノム配列からの不足の配列部分（構造遺伝子など）を連結してフルゲノム配列を作製することもできる。
【００８４】
本発明に係るＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ、又はＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、それをコードするＤＮＡをクローン化した発現ベクターを作製し、それを宿主細胞に導入してＲＮＡを発現させることにより、作製することができる。
【００８５】
これらの変異体ＨＣＶレプリコンＲＮＡの作製に用いる発現ベクターは、常法により作製することができるが、国際公開第０５／０８０５７５号に記載された技術を使用して好適に作製することができる。
【００８６】
具体的には、例えば、Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡに対応するＤＮＡ断片（ｃＤＮＡなど）を、常法により発現ベクター中のプロモーターの下流に挿入して、ＤＮＡクローンを作製する。本発明における発現ベクターは、その制御下の遺伝子又はＲＮＡコード配列の転写を誘導することができるプロモーターを含有するベクターをいう。発現ベクターとしては、プラスミドベクターが好ましい。プロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターなどを用いることができるが、Ｔ７プロモーターが好ましい。ベクターとしては、ｐＵＣ１９（ＴａＫａＲａ社）、ｐＢＲ３２２（ＴａＫａＲａ社）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ、ｐＧＥＭ−３Ｚ（いずれもＰｒｏｍｅｇａ社）、ｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）などを使用することができる。
【００８７】
本発明は、上記のようにして作製される、本願発明に係る核酸を含む発現ベクターも提供する。この発現ベクターは、Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを発現（転写誘導）することができる、本発明においてはこのような発現ベクターを「レプリコンＲＮＡ発現ベクター」と呼ぶ。
【００８８】
クローン化発現ベクターから上記変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又は変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを作製するには、作製された上記ＤＮＡクローンを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成すればよい。Ｔ７プロモーターの制御下にＨＣＶ  ｃＤＮＡをクローン化した核酸を鋳型として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡを作製する場合は、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）などを利用して合成することができる。ＲＮＡ合成は、５’ＵＴＲから、常法により開始させることができる。ＤＮＡクローンがプラスミドクローンの場合には、プラスミドクローンから制限酵素によって切り出したＤＮＡ断片を鋳型として用いてＲＮＡを合成することもできる。なお、合成されるＲＮＡの３’末端がＨＣＶゲノムＲＮＡの３’ＵＴＲの末端と一致しており、他の配列が付加されたり削除されたりしないことが好ましい。
【００８９】
作製したＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ、又はＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、当業者には周知のＲＮＡ抽出法や精製法等により抽出、精製することができる。
【００９０】
上記のようにして作製されるＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、培養細胞中で高効率で自律複製することができる。Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを細胞に導入することにより、レプリコンＲＮＡが自律複製している細胞を得ることができる。本発明は、このようなＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（又は、ＨＣＶサブゲノム配列若しくはフルゲノム配列を含む本発明に係る核酸）が導入されている細胞も提供する。
【００９１】
これらのＨＣＶレプリコンＲＮＡを細胞に導入する方法としては、公知の任意の方法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法を挙げることができるが、好ましくはリポフェクション法及びエレクトロポレーション法が、さらに好ましくはエレクトロポレーション法が挙げられる。
【００９２】
Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡが導入されている細胞での、ＨＣＶレプリコンＲＮＡの自律複製能（複製能）は、例えば、そのＨＣＶレプリコンＲＮＡに含まれる選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子等の外来遺伝子の機能、すなわち発現により得られる外来遺伝子の遺伝子産物の活性に基づいて、評価することができる。
【００９３】
例えば、外来遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合、当該遺伝子が耐性をもたらす薬剤を含有する選択培地で上記細胞を培養し、増殖する細胞数又は細胞のコロニー数を計測することにより、そのＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製能を評価できる。この場合、細胞数又は細胞のコロニー数が多いほど複製能が高いと評価することができる。
【００９４】
外来遺伝子が酵素の場合は、典型的には、当該ＨＣＶレプリコンＲＮＡが導入されている細胞を培養し、その細胞中の酵素活性を計測することにより、ＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製能を評価できる。この場合、酵素活性が高いほど複製能が高いと評価することができる。例えば、Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡがルシフェラーゼ遺伝子を含む場合、細胞中のルシフェラーゼ活性を常法により測定することができる。
【００９５】
また別の方法として、当該ＨＣＶレプリコンＲＮＡを導入した細胞中のＨＣＶレプリコンＲＮＡの量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより定量することにより、レプリコンＲＮＡの複製能を直接評価することもできる。
【００９６】
Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡが培養細胞において経時的な増加傾向を示す場合には、そのレプリコンＲＮＡは自律複製能を有すると判定することができる。なお、当該ＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製レベルが、一時的に（例えば細胞へのトランスフェクションのおよそ２４時間後までに）多少低下したとしても、その後（例えば３０時間以降）継続的に増加する場合にはそのレプリコンＲＮＡは自律複製能を有すると判定できる。これは、トランスフェクション後、複製したレプリコンＲＮＡの量が増えてくるまでに一定の時間を要するからである。
【００９７】
Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、培養細胞におけるＨＣＶ粒子産生能を有する。当該ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、培養細胞に導入されると、培養細胞内で持続的に複製され、さらに、複製されたＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（又はＨＣＶフルゲノム配列を含む本発明に係る核酸）は、細胞中で発現されたＨＣＶ構造タンパク質（Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質及びｐ７タンパク質）から形成されるウイルス殻中にパッケージングされ、ＨＣＶ粒子として細胞外に放出される。
【００９８】
Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの、培養細胞中でのＨＣＶ粒子産生能は、該ＲＮＡを細胞に導入して培養し、得られた培養上清中のＨＣＶ粒子を測定することによって評価することができる。培養上清中のＨＣＶ粒子の測定は、培養上清についてＨＣＶ粒子を構成する構造タンパク質（例えば、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、又はｐ７タンパク質）を検出することによって行うことができる。培養上清中の構造タンパク質の検出は、例えば、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、又はＥ２タンパク質に対する抗体を用いて行うことができる。
【００９９】
培養上清について検出されたＨＣＶ粒子の構造タンパク質が、経時的な増加傾向を示す場合には、その細胞はＨＣＶ粒子を産生し細胞外にＨＣＶ粒子を放出していると判定できる。Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡが、導入した培養細胞中でＨＣＶ粒子の産生をもたらすことができるかどうかは、そのレプリコンＲＮＡの塩基配列やそれにコードされるタンパク質のアミノ酸配列が大きく関係する。したがって、ＨＣＶ粒子の産生が確認できる場合、培養細胞に導入されているＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、培養細胞中でのウイルス粒子産生能を有するものと判定できる。
【０１００】
このようにしてＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（又はＨＣＶフルゲノム配列を含む本発明に係る核酸）が導入された培養細胞から産生され放出されるウイルス粒子は、新たな培養細胞に対する感染能を有する。本発明はこのような感染性ＨＣＶ粒子も提供する。この感染性ＨＣＶ粒子は、Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（又はＨＣＶフルゲノム配列を含む本発明に係る核酸）をウイルスゲノムとして含有する。
【０１０１】
本発明に係るＨＣＶ粒子の感染能の評価は、Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを導入して培養した細胞の培養上清を、培養細胞（例えば、Ｈｕｈ−７又はその派生株）に添加し、一定時間後、例えば４８時間後にその細胞を抗Ｃｏｒｅ抗体で免疫染色して感染細胞数を数えるか、又は細胞の抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ウェスタンブロット法でＣｏｒｅタンパク質を検出することで感染細胞を検出することにより、行うことができる。
【０１０２】
Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを導入させる細胞、又はそのＨＣＶレプリコンＲＮＡが導入された培養細胞で産生された感染性ＨＣＶ粒子を感染させる細胞は、典型的には培養細胞である。この培養細胞は、ＨＣＶレプリコンＲＮＡの自律複製やＨＣＶ粒子の形成・感染を許容する細胞（このような細胞をＨＣＶ感受性細胞と呼ぶ）であることが特に好ましい。
【０１０３】
本発明で用いるＨＣＶ感受性細胞としては、例えば、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞等の肝由来細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、又はそれらの派生株が挙げられる。派生株の例としては、Ｈｕｈ７細胞の派生株であるＨｕｈ７．５細胞、Ｈｕｈ７．５．１細胞等が挙げられる。また、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞又は２９３細胞にＣＤ８１遺伝子及び／又はＣｌａｕｄｉｎ１遺伝子を発現させた細胞も派生株として挙げることができる（Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ，Ｂ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年、第３０９巻、ｐ．６２３−６２６；Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、第４４６巻、ｐ．８０１−８０５；Ａｋａｚａｗａ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００７年、第８１巻、ｐ．５０３６−５０４５）。中でも、Ｈｕｈ７細胞又はＨｕｈ７細胞の派生株（Ｈｕｈ７．５細胞、Ｈｕｈ７．５．１細胞等）が特に好ましく使用される。なお、本発明において所定の細胞の「派生株」とは、当該細胞から誘導された株をいう。
【０１０４】
Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞、及びＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡをウイルスゲノムとして含有するＨＣＶ粒子を感染させた細胞を用いれば、培養によるＨＣＶ粒子の大量生産を可能にすることもできる。
【０１０５】
Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを導入したＨＣＶ感受性細胞から産生され細胞外に放出されたＨＣＶ粒子を新たなＨＣＶ感受性細胞に感染させると、細胞内で当該ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（ゲノムＲＮＡ）が複製され、パッケージングされ、ＨＣＶ粒子が産生され、さらにこのサイクルを繰り返し行うことができる。産生されたＨＣＶ粒子の細胞への感染は、例えば上記ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞の培養上清を、ＨＣＶ感受性細胞に添加することにより実施できる。
【０１０６】
Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（又はＨＣＶフルゲノム配列を含む本発明に係る核酸）をＨＣＶ感受性細胞に導入して得られるＨＣＶ粒子は、ＨＣＶワクチンとしての用途や、抗ＨＣＶ抗体作製のための抗原としての用途に用いることができる。
【０１０７】
具体的には、上記ＨＣＶ粒子は、ワクチンの製造に用いることができる。ワクチン用途では、具体的には、上記の無傷のＨＣＶ粒子若しくはその一部分又はそれらの処理物を抗原としてそのままワクチンとして使用することもできるが、当該分野で既知の方法により弱毒化又は不活化したＨＣＶ粒子処理物として用いることが好ましい。ウイルスの不活化は、ホルマリン，β−プロピオラクトン，グルタルジアルデヒド等の不活化剤を，例えば、ウイルス浮遊液に添加混合し，ウイルスと反応させることにより達成することができる（Ａｐｐａｉａｈｇａｒｉ，Ｍ．Ｂ．＆Ｖｒａｔｉ，  Ｓ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００４年、第２２巻、ｐ．３６６９−３６７５）。あるいはＵＶを照射することでＨＣＶのＲＮＡを分解することによりＨＣＶの感染性を失わせることもできる（特開２００９−５５８９）。
【０１０８】
本発明に係る、上記ＨＣＶ粒子を含むＣ型肝炎ウイルスワクチンは、上記の無傷のＨＣＶ粒子又はそれらの弱毒化又は不活化処理物を抗原として含むものがより好ましい。
【０１０９】
上記ワクチンは、溶液又は懸濁液のいずれかとして、投与可能に調製され得る。あるいは、使用直前に再構成可能なように、液体中の溶解又は懸濁に適した固形物（例えば凍結乾燥調製物）の形態で調製することができる。そのような固形物又は調製物は、乳濁されてもよいし、又はリポソームにカプセル化されてもよい。
【０１１０】
ＨＣＶ粒子などの活性免疫原性成分には、薬学的に許容可能であって、活性成分に適合した賦形剤がしばしば混合され得る。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、又はそれらの混合物がある。
【０１１１】
さらに、所望であれば、上記ワクチンは、少量の補助剤（例えば、加湿剤又は乳化剤）、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの効能を高めるアジュバントを含有し得る。
【０１１２】
アジュバントは、該免疫系の非特異的刺激因子である。それらは、上記ワクチンに対する宿主の免疫応答を増強する。したがって、好ましい形態においては、上記ワクチンはアジュバントを含む。アジュバントの効能は、ＨＣＶ粒子から構成されるワクチンを投与することにより生じる抗体の量を測定することにより決定され得る。
【０１１３】
有効であり得るアジュバントの例は、限定されないが、以下を包含する。水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称せられる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称せられる）及びＲＩＢＩ。ＲＩＢＩは、バクテリアから抽出した３成分、すなわちモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格（ＨＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０エマルジョン中に含有している。
【０１１４】
所望により、アジュバント活性を有する１以上の化合物を上記ワクチンに加えることができる。当技術分野で公知のアジュバントの具体例としては、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロック重合体、ムラミルジペプチド、サポニン、鉱油、植物油及びＣａｒｂｏｐｏｌが挙げられる。粘膜適用に特に適したアジュバントとしては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）又はコレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ）毒素（ＣＴ）が挙げられる。他の適当なアジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、油性乳剤（例えば、Ｂａｙｏｌ（登録商標）又はＭａｒｃｏｌ  ５２（登録商標））、サポニン又はビタミンＥソリュビリゼートが挙げられる。
【０１１５】
上記ＨＣＶワクチンは、通常、非経口的に、例えば皮下注射又は筋肉内注射のような、注射により投与される。他の投与態様に適切な別の処方としては、坐薬、及び、ある場合には経口処方薬が挙げられる。
【０１１６】
皮下、皮内、筋肉内、静脈内に投与する注射剤において、上記ＨＣＶワクチンと医薬上許容される担体又は希釈剤の具体例としては、安定化剤、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン）、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、ウシ血清又は脱脂乳などのタンパク質含有物質、及びバッファー（例えば、リン酸バッファー）が挙げられる。
【０１１７】
坐薬に使用される従来の結合剤及び担体としては、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが含まれ得る。このような坐薬は、活性成分を０．５％〜５０％までの範囲で、好ましくは１％〜２０％までの範囲で含有する混合物から形成され得る。経口処方薬は、通常用いられる賦形剤を含有する。この賦形剤としては、例えば、薬学的なグレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。
【０１１８】
上記ＨＣＶワクチンは、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出処方剤、又は粉末剤の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分（ＨＣＶ粒子又はその一部分）を含有する。
【０１１９】
上記ＨＣＶワクチンは、投与剤形に適した方法で、そして予防及び／又は治療効果を有するような量で投与される。投与されるべき抗原量は、通常投与当たり０．０１μｇ〜１００，０００μｇまでの範囲であるが、これは、投与される患者、その患者の免疫系での抗体合成能、及び所望の防御の程度に依存する。また、経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内投与経路などの投与経路にも依存する。また、上記ＨＣＶワクチンは、単独投与スケジュールで又は複合投与スケジュールで与えられ得る。好ましくは、複合投与スケジュールである。複合投与スケジュールでは、接種の開始時期に１〜１０の個別の投与を行い、続いて免疫応答を維持する及び／又は強化するのに必要とされる時間間隔で、例えば２回目の投与として１〜４ヵ月後に、別の投与を行い得る。必要であれば、数ヶ月後に引き続き投与を行い得る。投与のレジメもまた、少なくとも部分的には、個体の必要性により決定され、医師の判断に依存する。
【０１２０】
また、上記ＨＣＶワクチンは、健常人に投与し、健常人にＨＣＶに対する免疫応答を誘導し、新たなＨＣＶ感染に対して予防的に使用する方法がある。さらに、ＨＣＶに感染した患者に投与し、生体内にＨＣＶに対する強い免疫反応を誘導することにより、ＨＣＶを排除する治療的ワクチンとしての使用方法がある。
【０１２１】
本発明は、上記ＨＣＶワクチンをも提供する。このＨＣＶワクチンはＨＣＶ感染の予防及び、Ｃ型肝炎の治療に用いることができる。
【０１２２】
さらに、上記ＨＣＶ粒子は、抗ＨＣＶ抗体作製のための抗原として有用である。上記ＨＣＶ粒子を、哺乳類又は鳥類に投与することにより、抗体を作製することができる。哺乳類動物として、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、モルモット、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、ラマなどを挙げることができる。ヒトコブラクダ、フタコブラクダ及びラマはＨ鎖のみからなる抗体を作製するには好適である。鳥類動物としては、ニワトリ、ガチョウ、ダチョウなどを挙げることができる。上記ＨＣＶ粒子を投与された動物の血清を採取して、既知の方法に従って抗体を取得することができる。
【０１２３】
本発明はこれらの抗ＨＣＶ抗体も提供する。特に好ましい抗ＨＣＶ抗体は、ＨＣＶを不活化し得る中和抗体として利用できる。
【０１２４】
上記ＨＣＶ粒子を投与して免疫した動物の細胞を用いて、モノクローナル抗体産生細胞を産生するハイブリドーマを作製することができる。ハイブリドーマを製造する方法は周知であり、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年）に記載された方法を用いることができる。
【０１２５】
モノクローナル抗体産生細胞は、細胞融合により作製してもよく、また癌遺伝子ＤＮＡの導入やＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスの感染によりＢリンパ球を不死化させるような他の方法で作製してもよい。
【０１２６】
これらの方法によって得られたモノクローナル抗体や、ポリクローナル抗体はＨＣＶの診断やＣ型肝炎の治療、予防に有用である。
【０１２７】
上記ＨＣＶ粒子を抗原として用いて作製された抗体は、医薬として、医薬上許容される溶解剤、添加剤、安定剤、バッファーなどとともに投与され得る。投与経路はいずれの投与経路でもよいが、好ましくは、皮下、皮内、筋肉内投与であり、より好ましくは、静脈内投与が好ましい。
【０１２８】
本発明に係るＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ若しくはＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（又は、ＨＣＶサブゲノム配列若しくはフルゲノム配列を含む本発明に係る核酸）を導入した細胞、又はＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（又はＨＣＶフルゲノム配列を含む本発明に係る核酸）をウイルスゲノムとして含むＨＣＶ粒子は、ＨＣＶ感染を阻害する中和抗体やＨＣＶの感染や複製を阻害する化合物等の物質のスクリーニング用途に好適に用いることができる。例えば、被験物質の存在下又は非存在下で、上記レプリコンＲＮＡが導入されレプリコンＲＮＡを複製する細胞を培養するか、上記フルゲノムレプリコンＲＮＡが導入されＨＣＶ粒子を産生する細胞を培養するか、又は上記ＨＣＶ粒子をＨＣＶ感受性細胞と培養するか、あるいは、上記ＨＣＶ粒子を感染させたＨＣＶ感染細胞を培養し、得られる培養物中のＨＣＶレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶ粒子を検出して、被験物質の影響を評価する方法が挙げられる。ここで、培養物とは培養上清、及び細胞又は細胞破砕物を含む。検出は、細胞又は細胞破砕物中のＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は培養上清中のＨＣＶ粒子の量の定量が好ましい。被験物質の存在下で培養物中にＨＣＶレプリコンＲＮＡ及びＨＣＶ粒子が存在しないか、又は、被験物質の非存在下に比べて少ない場合に、用いた被験物質がＨＣＶの感染や複製を阻害し得ると評価することができる。
【０１２９】
本発明では、例えば、被験物質の存在下及び非存在下で、本発明に係るＨＣＶ粒子とともにＨＣＶ感受性細胞を培養し、得られる培養物中のＨＣＶ粒子又はＨＣＶレプリコンＲＮＡを検出し、その被験物質がＨＣＶ粒子の産生（感染・形成・放出を含む）又はＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製を抑制するかどうかを判定することにより抗ＨＣＶ物質をスクリーニングすることができる。
【０１３０】
例えば、本発明は、（ｉ）被験物質の存在下及び非存在下の双方で、本発明に係るレプリコンＲＮＡを導入した細胞を培養するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得た培養物中のレプリコンＲＮＡ（又はＨＣＶ粒子）の量を定量するステップと、（ｉｉｉ）被験物質の存在下で測定されたレプリコンＲＮＡ（又はＨＣＶ粒子）量を、被験物質の非存在下で測定したレプリコンＲＮＡ（又はＨＣＶ粒子）と比較して、被験物質のレプリコンＲＮＡの複製阻害活性（又はＨＣＶ粒子産生阻害活性）を評価するステップと、を備える、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１３１】
本発明に係るスクリーニング方法の一実施形態は、被験物質の存在下及び非存在下の双方で、Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ若しくはＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（又は、ＨＣＶサブゲノム配列若しくはフルゲノム配列を含む本発明に係る核酸）が導入されている細胞、又はＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（又はＨＣＶフルゲノム配列を含む本発明に係る核酸）をウイルスゲノムとして含有するＨＣＶ粒子とＨＣＶ感受性細胞との混合物、を培養する培養ステップと、
上記培養ステップで培養物中に得られた当該サブゲノムレプリコンＲＮＡ、当該フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶ粒子の量を定量する定量ステップと、
上記定量ステップの結果、被験物質の存在下で定量されたサブゲノムレプリコンＲＮＡ、フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶ粒子の量が、それぞれ被験物質の非存在下で定量したサブゲノムレプリコンＲＮＡ、フルゲノムレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶ粒子の量より少ない場合に、上記被験物質は抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を有すると評価する評価ステップと、
を備える、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法である。
【０１３２】
培養物中のＨＣＶレプリコンＲＮＡは、ＨＣＶレプリコンＲＮＡ中の外来遺伝子の機能、すなわち該遺伝子の発現により現れる機能に基づく測定により検出することができる。例えば、外来遺伝子が酵素の場合は、その酵素活性を計測することにより、ＨＣＶレプリコンＲＮＡを検出できる。また別の方法として、定量的ＲＴ−ＰＣＲにて培養物中の複製したＲＮＡの量を定量することによっても、ＨＣＶレプリコンＲＮＡを検出することができる。
【０１３３】
培養物中のＨＣＶ粒子は、培養上清に放出されたＨＣＶ粒子を構成するタンパク質（例えば、Ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質又はＥ２タンパク質）に対する抗体を用いて検出することができる。培養物中のＨＣＶ粒子は、細胞中の非構造タンパク質の存在を非構造タンパク質に対する抗体を用いた免疫染色を行って検出することもできる。培養上清中のＨＣＶ粒子が含有するＨＣＶレプリコンＲＮＡを、特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により増幅して検出することによって、ＨＣＶ粒子の存在を間接的に検出することもできる。
【０１３４】
抗ＨＣＶ物質のスクリーニングには、本発明に係る上記変異を有するＪ６ＣＦ株変異体ゲノム又はＪ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体ゲノムに外来遺伝子及びＩＲＥＳ配列を挿入したＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（５’ＵＴＲ、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列の５’末端の３６ヌクレオチド、ルシフェラーゼ遺伝子、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列、Ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ｐ７タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列及び３’ＵＴＲが、５’から３’の方向に順に連結されたＲＮＡからなる）も有利に使用することができる。なお、各領域の連結の際に、連結部位には制限酵素部位などの付加配列を含みうる。このＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡをＨｕｈ７細胞に導入し、ＨＣＶ粒子を得て、該ＨＣＶ粒子をＨＣＶ感受性細胞に感染させると同時に、被験物質を添加し、４８〜７２時間後にルシフェラーゼの活性を測定する。被験物質無添加の場合（被験物質不在下）と比較してルシフェラーゼ活性を抑制する効果が示された被験物質は、ＨＣＶの感染を抑制する作用があると判定できる。
【０１３５】
同様に、配列番号１又は配列番号４に示される核酸からなる本発明に係るＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡをＨｕｈ７細胞に導入し、引き続いて、被験物質を添加し、４８〜７２時間後にルシフェラーゼの活性を測定する。被験物質未添加と比較してルシフェラーゼ活性を抑制し得る被験物質は、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの複製を抑制する作用があると判定できる。
【０１３６】
上記スクリーニング方法で得られる抗ＨＣＶ物質は、好ましくは、ウイルス感染又は複製を抑制可能なものである。
【実施例】
【０１３７】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。【０１３８】
まず、本発明者らは、公知文献（Ｍｕｒａｙａｍａら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．、２０１０年、第６巻、ｅ１０００８８５）記載の、Ｊ６ＣＦ株のＮＳ３ヘリカーゼ領域、ＮＳ５Ｂタンパク質領域の一部及び３’非翻訳領域をＪＦＨ−１株のそれに置き換えて作製したＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（ＦＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１）の構造において、ＪＦＨ−１株由来のＮＳ３ヘリカーゼ領域をＪ６ＣＦ株由来の配列に戻したＲＮＡ、すなわち、Ｊ６ＣＦ株のＮＳ５Ｂの一部及び３’非翻訳領域をＪＦＨ−１株のそれに置き換えたＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（ＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１）を作製し、これを培養細胞に導入した。ＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１は自律複製能を持たなかったが、継代を繰り返し、高い自律複製能を獲得した変異体を取得し、レプリコンＲＮＡの自律複製能を顕著に高める変異が、ＮＳ４Ａタンパク質領域中に１箇所存在することを見出した。この変異は、Ｊ６ＣＦ株の前駆体タンパク質（ＨＣＶ前駆体ポリプロテイン）のアミノ酸配列（配列番号３０）上の第１６８０番目のアラニンがグルタミン酸に置換するものである。さらに、野生型のＪ６ＣＦ株のゲノムに、その１箇所の変異（ＮＳ４Ａタンパク質領域中）と、公知文献（Ｍｕｒａｙａｍａら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．、２０１０年、第６巻、ｅ１０００８８５）記載の４箇所の変異（ＮＳ５Ｂタンパク質領域及び３’非翻訳領域中）を導入し、計５箇所の変異とすることで、高い自律複製能を有し、かつ感染性ＨＣＶ粒子産生能を有するＪ６ＣＦ株由来フルゲノムレプリコンＲＮＡを作製することにも成功した。以下ではより具体的に説明する。【０１３９】
（実施例１）Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ及びＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ）発現ベクターの構築
本実施例では、後述の実施例において変異体レプリコンの作製に用いる、Ｊ６ＣＦ株とＪＦＨ−１株のゲノム配列に由来するキメラ型（Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ）のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ（Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ）及びＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ）をそれぞれ合成するための発現ベクターを構築した。【０１４０】
なお、以下で言及する塩基番号は、各ＨＣＶ株の全長ゲノムの５’末端の第１塩基を第１番目とした場合の塩基の番号である。また、制限酵素で消化して得られたＤＮＡ断片について、元のＤＮＡ配列での位置を塩基番号で示す場合は、その制限酵素の認識配列の開始位置の塩基番号で示す。例えば、ＪＦＨ−１株の全長ゲノムをＣｌａＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで消化した場合、ＣｌａＩの認識配列はＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第３９２９番目から始まり、ＣｌａＩにより第３９３０番目と第３９３１番目の塩基の間で切断され、また、ＥｃｏＴ２２Ｉの認識配列はＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第５２９３番目から始まり、ＥｃｏＴ２２Ｉにより第５２９７番目と第５２９８番目の塩基の間で切断されるが、ＣｌａＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで消化して得られたＤＮＡ断片は「ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第３９２９番目〜第５２９３番目の塩基配列である（に相当する）」と記載する。【０１４１】
ｐＪＦＨ１は、公知文献（Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２００５年、第１１巻、ｐ．７９１−７９６）記載のプラスミドＤＮＡである。ｐＪＦＨ１は、ＨＣＶ  ＪＦＨ−１株の全長ゲノムＲＮＡを逆転写して得たゲノムｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４７６３９）をｐＵＣ１９プラスミド中に挿入されたＴ７  ＲＮＡプロモーター配列の下流にクローニングして作製された。【０１４２】
ｐＪ６ＣＦは、公知文献（Ｙａｎａｇｉ，Ｍ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９９年、第２６２巻、ｐ．２５０−２６３）記載のプラスミドから作製されたプラスミドＤＮＡである。ｐＪ６ＣＦは、ＨＣＶ  Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムＲＮＡを逆転写して得たゲノムｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１７７０３６）をｐＵＣ１９プラスミドのＴ７  ＲＮＡプロモーター配列の下流にクローニングして作製された。【０１４３】
ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターであるｐＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ（図１Ｃ）は、公知文献（Ｍｕｒａｙａｍａ，Ａ．ら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．、２０１０年、第６巻、ｅ１０００８８５）にも記載されたプラスミドＤＮＡである。ｐＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃの作製においては、ｐＪＦＨ１をＣｌａＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで制限消化して得たＤＮＡ断片（ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第３９２９番目〜第５２９３番目の塩基配列であり、ＮＳ３タンパク質の一部分に相当する）により、公知文献（Ｍｕｒａｙａｍａ，Ａ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００７年、第８１巻、ｐ．８０３０−８０４０）記載のプラスミドｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃ（Ｃｏｒｅタンパク質の５’末端の３６ヌクレオチド、ルシフェラーゼ遺伝子及びＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを含み、Ｊ６ＣＦ株のサブゲノムレプリコンＲＮＡをコードする；図１Ｂ）の同じ領域の配列を置換し、さらに、そのプラスミドのＪ６ＣＦ株の全長ゲノム（配列番号２９）の塩基番号第９２１２番目〜第９７１１番目（Ｊ６ＣＦ株ゲノムの３’末端）に相当する塩基配列を、ＪＦＨ−１株の全長ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４７６３９）の塩基番号第９２１２番目〜第９６７８番目（ＪＦＨ−１株ゲノムの３’末端）の塩基配列で置換した。【０１４４】
具体的なｐＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ（図１Ｃ）の作製方法は以下のとおりである。まず、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃに、ＣｌａＩ（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第３９２９番目から認識配列が始まり、ＣｌａＩにより第３９３０番目と第３９３１番目の塩基の間で切断される）及びＥｃｏＴ２２Ｉ（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第５２９３番目から認識配列が始まり、ＥｃｏＴ２２Ｉにより第５２９７番目と第５２９８番目の塩基の間で切断される）の制限酵素部位をＰＣＲで導入した後、それをＣｌａＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで切断した。ｐＪＦＨ１をＣｌａＩ及びＥｃｏＴ２２Ｉで消化して得たＤＮＡ断片（ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第３９２９番目〜第５２９３番目の塩基配列）を、上記ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃ切断断片に挿入することによりＣｌａＩ〜ＥｃｏＴ２２Ｉの領域を置換した。この結果、Ｊ６ＣＦ株のＮＳ３へリカーゼ領域（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第３９２９番目〜第５２９３番目）が、ＪＦＨ−１株の同じ領域の配列で置換された（図１Ｃ中の「Ｎ３Ｈ」領域）。こうして得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃと呼ぶ。【０１４５】
次に、１ｓｔ  ＰＣＲ−１として、ｐＪ６ＣＦを鋳型として、センスプライマー８６８０Ｓ−２ａ（５’−ＣＣＴＴＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡ−３’（配列番号７））とアンチセンスプライマー９１９１Ｒ−２ａ（５’−ＣＣＡＣＧＧＧＡＧＡＴＧＡＧＧＧＡＣＧＣ−３’（配列番号８））を用いてＰＣＲを行った。また、１ｓｔ  ＰＣＲ−２として、ｐＪＦＨ１を鋳型として、センスプライマー９１９１Ｓ−２ａ（５’−ＧＣＧＴＣＣＣＴＣＡＴＣＴＣＣＣＧＴＧＧ−３’（配列番号９））とアンチセンスプライマー９４４０Ｒ−ＩＨ（５’−ＧＴＧＴＡＣＣＴＡＧＴＧＴＧＴＧＣＣＧＣＴＣＴＡ−３’（配列番号１０））を用いてＰＣＲを行った。さらに、２ｎｄ  ＰＣＲとして、上記１ｓｔ  ＰＣＲ−１と１ｓｔ  ＰＣＲ−２で増幅した２種類の増幅断片の混合物を鋳型として、センスプライマー８６８０Ｓ−２ａ（配列番号７）とアンチセンスプライマー９４４０Ｒ−ＩＨ（配列番号１０）を用いてＰＣＲを行った。得られたＪ６ＣＦ株とＪＦＨ−１株のキメラからなる増幅産物をＳｆｉＩ及びＡｓｃＩで消化したＤＮＡ断片（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第８７９４番目〜第９２１１番目の領域とＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第９２１２番目〜第９２９１番目の領域に相当）と、ｐＪＦＨ１をＡｓｃＩ及びＸｂａＩで消化したＤＮＡ断片（ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第９２８９番目〜３’末端に相当）とを、上記のｐＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ−ＪＦＨ１／ＬｕｃのＳｆｉＩ−ＸｂａＩ部位（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第８７８９番目〜３’末端に相当）に挿入することにより、プラスミド中のＪ６ＣＦ株のＮＳ５Ｂタンパク質の第５１６番目〜第５９１番目のアミノ酸配列をコードする領域と３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の配列を、ＪＦＨ−１株由来の配列へと置換した（図１Ｃ中の「５ＢＳＬＸ」領域）。このようにして得られたプラスミドＤＮＡが、ｐＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ（図１Ｃ）である。すなわち、ｐＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃは、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／ＬｕｃのＮＳ３へリカーゼ領域（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第３９２９番目〜第５２９３番目）と、ＮＳ５Ｂタンパク質の第５１６番目〜第５９１番目のアミノ酸配列をコードする領域及び３’非翻訳領域からなる５ＢＳＬＸ領域とを、ＪＦＨ−１株由来の塩基配列（ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第３９３１番目〜第５２９７番目及び第９２１２番目〜第９６７８番目）へと置換したものである。【０１４６】
また、プラスミドｐＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ（図１Ｄ）も作製した。ｐＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃは、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／ＬｕｃのＪ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第９２１２番目〜第９７１１番目（Ｊ６ＣＦ株の３’末端）に相当する塩基配列を、ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第９２１２番目〜第９６７８番目（ＪＦＨ−１株の３’末端）に相当する塩基配列により置換したものである。【０１４７】
具体的なｐＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ（図１Ｄ）の作製方法は以下のとおりである。ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃを用いた上記のｐＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃの作製過程において調製された上記２ｎｄ  ＰＣＲの増幅産物のＳｆｉＩ−ＡｓｃＩ切断断片（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第８７８９番目〜第９２１１番目の領域とＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第９２１２番目〜第９２８９番目の領域に相当）と、ｐＪＦＨ１をＡｓｃＩ及びＸｂａＩで消化したＤＮＡ断片（ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第９２８９番目〜３’末端）とを、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／ＬｕｃのＳｆｉＩ−ＸｂａＩ部位（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第８７８９番目〜３’末端）に挿入することにより、プラスミド中のＪ６ＣＦ株のＮＳ５Ｂタンパク質の第５１６番目〜第５９１番目のアミノ酸配列をコードする領域と３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を、ＪＦＨ１株由来の同じ領域の配列へと置換した（図１Ｄ中の「５ＢＳＬＸ」領域）。このようにして得られたプラスミドＤＮＡが、ｐＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ（図１Ｄ）である。すなわち、ｐＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃは、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／ＬｕｃのＮＳ５Ｂタンパク質の第５１６番目〜第５９１番目のアミノ酸配列をコードする領域及び３’非翻訳領域からなる５ＢＳＬＸ領域を、ＪＦＨ−１株由来の塩基配列（ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第９２１２番目〜第９６７８番目）へと置換したものである。【０１４８】
これらＪ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構造は図１にまとめて示している。図中、「Ｔ７」はＴ７プロモーターを意味する。Ｔ７プロモーターは、それぞれの発現ベクターからＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを転写させるために必要な配列エレメントである。「Ｌｕｃ」はルシフェラーゼ遺伝子、「ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ」は脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位を示す。「ＮＳ３」はＮＳ３タンパク質コード領域、「４Ａ」はＮＳ４Ａタンパク質コード領域、「４Ｂ」はＮＳ４Ｂタンパク質コード領域、「ＮＳ５Ａ」はＮＳ５Ａタンパク質コード領域、「ＮＳ５Ｂ」はＮＳ５Ｂタンパク質コード領域を示す。また、図中の「ＥｃｏＲＩ」、「ＡｇｅＩ」、「ＣｌａＩ」、「ＥｃｏＴ２２Ｉ」、「ＢｓｒＧＩ」、「ＳｔｕＩ」及び「ＸｂａI」は制限酵素部位を示す。【０１４９】
なお、Ｊ６ＣＦ株及びＪＦＨ−１株のＮＳ５Ｂタンパク質コード領域は、いずれも、Ｊ６ＣＦ株及びＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第７６６７番目〜第９４４２番目（終止コドンを含む）の塩基配列に相当し、５９１アミノ酸残基からなるＮＳ５Ｂタンパク質をコードする。Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第７６６７番目〜第９２１１番目の領域は、Ｊ６ＣＦ株のＮＳ５Ｂタンパク質の第１番目〜第５１５番目のアミノ酸配列をコードする。ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第９２１２番目〜第９４４２番目（終止コドンを含む）の領域は、ＪＦＨ−１株のＮＳ５Ｂタンパク質の第５１６番目〜第５９１番目のアミノ酸配列をコードする。Ｊ６ＣＦ株のＮＳ５Ｂタンパク質全体のアミノ酸配列を配列番号２７、ＪＦＨ−１株のＮＳ５Ｂタンパク質全体のアミノ酸配列を配列番号２８に示す。【０１５０】
続いて、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターであるｐＦＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１を、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃの代わりにｐＪ６ＣＦを用いて、上記と同様の方法により、ＮＳ３へリカーゼ領域（図２Ｃ中の「Ｎ３Ｈ」領域）（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第３９２９番目〜第５２９３番目の領域）と５ＢＳＬＸ領域（図２中の「５ＢＳＬＸ」領域）を、ＪＦＨ−１株由来の同じ領域の配列（ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第９２１２〜第９６７８番目の領域）へと置換することにより作製した（図２Ｃ）。【０１５１】
またｐＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１を、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃの代わりにｐＪ６ＣＦ（図２Ｂ）を用いて、上記と同様の方法により、５ＢＳＬＸ領域（ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第９２１２〜第９６７８番目の領域）を、ＪＦＨ−１株由来の同じ領域の配列へと置換することにより作製した（図２Ｄ）。【０１５２】
さらに、ｐＪ６ＣＦのＢｓｒＧＩ部位（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第７７８１番目から認識配列が始まり、ＢｓｒＧＩにより第７７８１番目と第７７８２番目の塩基の間で切断される）〜ＳｔｕＩ部位（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第９４１５番目から認識配列が始まり、ＳｔｕＩにより第９４１７番目と第９４１８番目の塩基の間で切断される）の配列を、ｐＪＦＨ１の同じ領域の配列へと置換することにより、プラスミドベクターｐＦＧＲ−Ｊ６／５Ｂ−ＪＦＨ１を作製した（図２Ｅ）。【０１５３】
具体的なｐＦＧＲ−Ｊ６／５Ｂ−ＪＦＨ１の具体的な作製方法は下記のとおりである。まずｐＪ６ＣＦに、ＢｓｒＧＩの制限酵素部位を、Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第７７８１番目から始まる位置にＰＣＲで導入した。次に、ＢｓｒＧＩ制限酵素部位を導入したｐＪ６ＣＦを、ＢｓｒＧＩ及びＳｔｕＩで消化した。ｐＪＦＨ１をＢｓｒＧＩ部位（ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第７７８１番目から認識配列が始まり、ＢｓｒＧＩにより第７７８１番目と第７７８２番目の塩基の間で切断される）及びＳｔｕＩ部位（ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第９４１５番目から認識配列が始まり、ＳｔｕＩにより第９４１７番目と９４１８番目の塩基の間で切断される）で消化したＤＮＡ断片（ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第７７８２番目〜第９４１７番目に相当する、ＮＳ５Ｂ断片）を用いて、上記のｐＪ６ＣＦのＢｓｒＧＩ−ＳｔｕＩ切断断片（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第７７８２番目〜第９４１７番目に相当）を置換した。このようにして得られたプラスミドＤＮＡが、ｐＦＧＲ−Ｊ６／５Ｂ−ＪＦＨ１である。【０１５４】
これらのＪ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターを図２にまとめて示す。図中、「Ｔ７」はＴ７プロモーターを意味する。「Ｃ」はＣｏｒｅタンパク質コード領域、「Ｅ１」はＥ１タンパク質コード領域、「Ｅ２」はＥ２タンパク質コード領域、「ｐ７」はｐ７タンパク質コード領域、「ＮＳ３」はＮＳ３タンパク質コード領域、「４Ａ」はＮＳ４Ａタンパク質コード領域、「４Ｂ」はＮＳ４Ｂタンパク質コード領域、「ＮＳ５Ａ」はＮＳ５Ａタンパク質コード領域及び「ＮＳ５Ｂ」はＮＳ５Ｂタンパク質コード領域を示す。また、図中の「ＥｃｏＲＩ」、「ＣｌａＩ」、「ＥｃｏＴ２２Ｉ」、「ＢｓｒＧＩ」、「ＳｔｕＩ」及び「ＸｂａI」は制限酵素部位を示す。【０１５５】
（実施例２）ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ及びＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ）の作製
公知文献（Ｋａｔｏ,Ｔ．ら、ＪＣＭ  Ｎｏｖ．、２００５年、第４３巻、ｐ．５６７９−５６８４）記載の発現ベクターｐＳＧＲ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ遺伝子及びＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを含み、ＪＦＨ−１株のサブゲノムレプリコンＲＮＡをコードする；図１Ａ）、実施例1に開示した、上記発現ベクターｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃ、ｐＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ及びｐＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃを、それぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断した。【０１５６】
次いで、これらのＸｂａＩ切断ＤＮＡ断片のそれぞれ１０〜２０μｇに、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ２０Ｕを加えて（トータル反応液量  ５０μＬ）、３０℃で３０分間インキュベートした。Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅは、二本鎖ＤＮＡ中の一本鎖部分を選択的に分解して平滑化する反応を触媒する酵素である。通常、上記ＸｂａＩ切断ＤＮＡ断片をそのまま鋳型ＤＮＡとして用いてＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写を行うと、ＸｂａＩの認識配列の一部であるＣＵＡＧの４塩基が３’末端に余分に付加されたレプリコンＲＮＡが合成されてしまう。そこで本実施例では、ＸｂａＩ切断ＤＮＡ断片をＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅで処理することにより、ＸｂａＩ切断ＤＮＡ断片からＣＴＡＧの４塩基を除去した。【０１５７】
この後、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理後のＸｂａＩ切断ＤＮＡ断片を含む溶液について、常法に従ったタンパク質除去処理により、ＣＴＡＧの４塩基が除去されたＸｂａＩ切断ＤＮＡ断片を精製し、これを次の反応で用いる鋳型ＤＮＡとした。この鋳型ＤＮＡから、ＲＮＡ転写キットであるＡｍｂｉｏｎ社のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）を用いて、鋳型ＤＮＡを０．５〜１．０μｇ含むＲＮＡ転写反応液２０μＬを製造業者の使用説明書に基づいて調製し、３７℃で３時間〜１６時間反応させた。【０１５８】
ＲＮＡ合成終了後、反応溶液にＤＮａｓｅＩ（２Ｕ）を添加して、３７℃で１５分間反応させた後、さらに酸性フェノールによるＲＮＡ抽出を行い、鋳型ＤＮＡを除去した。このようにしてＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを合成した。なお、発現ベクターｐＳＧＲ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃ、ｐＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ及びｐＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃから合成したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを、それぞれ、ＳＧＲ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ、ＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃ、ＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ及びＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃと呼ぶ。【０１５９】
ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡの合成は、実施例１で構築した発現ベクターｐＦＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１、ｐＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１及びｐＦＧＲ−Ｊ６／５Ｂ−ＪＦＨ１を用いて、上記のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの合成と同じ方法で行った。なお、発現ベクターｐＦＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１、ｐＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１及びｐＦＧＲ−Ｊ６／５Ｂ−ＪＦＨ１から合成したＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを、それぞれ、ＦＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１、ＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１及びＦＧＲ−Ｊ６／５Ｂ−ＪＦＨ１と呼ぶ。【０１６０】
（実施例３）ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ及びＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ）の細胞への導入
実施例２で作製したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（ＨＣＶレプリコンＲＮＡ）をそれぞれ、Ｈｕｈ７．５．１細胞（Ｚｈｏｎｇ  Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００５年、第１０２巻、ｐ．９２９４−９２９９）にエレクトロポレーション法（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｆｆ  ＭＪら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９２年、第２０巻、ｐ．２９０２）にて導入（トランスフェクション）した。具体的には、下記に示す通りである。【０１６１】
トリプシン処理を行ったＨｕｈ７．５．１細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で数回洗浄した後、４００μＬのＣｙｔｏｍｉｘ溶液（１２０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＡＴＰ、５０ｍＭグルタチオン）に懸濁し、３×１０６細胞／ｍＬの懸濁液とした。４ｍｍキュベットに細胞懸濁液を移した後、そこにＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ又はＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ  ５μｇを添加し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、２６０Ｖ、９５０μＦの条件でパルスし、Ｈｕｈ７．５．１細胞へのＨＣＶレプリコンＲＮＡのエレクトロポレーション（トランスフェクション）を行った。ＨＣＶレプリコンＲＮＡを導入した細胞をＤＭＥＭ培地に懸濁し、１２ウェルプレートに播種した。【０１６２】
（実施例４）ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞内でのＲＮＡ複製
実施例３でＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入したＨｕｈ７．５．１細胞を、１２ウェルプレートに播種し、トランスフェクション４時間後、２４時間後及び４８時間後に細胞を回収した。回収した細胞を、２５０μＬの溶解バッファーＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で溶解し、遠心して得られた上清を試料とした。ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）及びルミノメーターＬＢ９５０７（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を用いて、試料中のルシフェラーゼ活性を測定した。【０１６３】
図３Ａにその結果を示す。図の横軸はトランスフェクション後の時間を示し、縦軸はトランスフェクション４時間後のルシフェラーゼ活性の値を基準とした時の各時点におけるルシフェラーゼ活性の相対値を示す。図３ＡはＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡのＲＮＡ複製レベルの経時的変化を示している。図３Ａに示すように、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ  ＳＧＲ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ及びＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃを導入した細胞ではルシフェラーゼ活性が経時的に上昇したことから、ＳＧＲ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ及びＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃは自律複製することが確認された。ＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃに導入したＪＦＨ−１株由来Ｎ３Ｈ配列がＪ６ＣＦ株由来サブゲノムレプリコンＲＮＡに自律複製能を付与したと考えられた。【０１６４】
（実施例５）ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ）導入細胞からのウイルス（ウイルス粒子）産生
実施例３でＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを導入したＨｕｈ７．５．１細胞を、１２ウェルプレートに播種して培養し、トランスフェクション１日後、２日後及び３日後に培養上清を回収した。回収した培養上清を、０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に通して夾雑物を除き、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質の測定の試料とした。ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質の測定はＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストキット（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社）を用いて行った。【０１６５】
図３Ｂにその測定結果を示す。図３Ｂの横軸はトランスフェクション後の日数（１日後、２日後、３日後）を示し、縦軸は培養上清中のＣｏｒｅタンパク質量（ｆｍｏｌ／Ｌ）を示す。図３ＢはＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを導入した培養細胞により産生された培養上清中のウイルスレベルを示唆する。図３Ｂに示すように、ＦＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１を導入した細胞の培養上清中のＣｏｒｅタンパク質量は経時的に増加したが、ＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１を導入した細胞の培養上清中のＣｏｒｅタンパク質量は増加しなかった。したがって、ＦＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１を導入した細胞はウイルスを産生することが示された。ＦＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１に導入したＪＦＨ−１株由来Ｎ３Ｈ配列が、Ｊ６ＣＦ株由来フルゲノムレプリコンＲＮＡにウイルス産生能を付与したと考えられた。【０１６６】
（実施例６）Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ）導入細胞の継代培養を通じた変異体の取得
Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡであるＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１及びＦＧＲ−Ｊ６／５Ｂ−ＪＦＨ１を、実施例３と同様の方法でＨｕｈ７．５．１細胞に導入（トランスフェクション）した。ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞を３〜５日間隔で継代しながら培養し、その間の培養上清中のＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質量をモニターした。なお、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質の測定は、実施例５と同様の方法で実施した。【０１６７】
その結果を図４に示す。図４の横軸はトランスフェクション後の日数を示し、縦軸は培養上清中のＣｏｒｅタンパク質量（ｆｍｏｌ／Ｌ）を示す。図４に示すように、ＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１を導入した細胞については、１ヶ月を過ぎた頃から培養上清中のＣｏｒｅタンパク質量は増加していき、ウイルスの産生が認められたが、ＦＧＲ−Ｊ６／５Ｂ−ＪＦＨ１についてはウイルスの産生は認められなかった。【０１６８】
次に、培養上清中のＣｏｒｅタンパク質量が最大となったＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１導入細胞の４９日目の培養上清（図４）から、ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（ニッポンジーン社）を用いてウイルスゲノムＲＮＡを抽出した。このウイルスゲノムＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素Ｓｕｐｅｒ  ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成し、シークエンスした。【０１６９】
その結果、ＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１のＮＳ４Ａタンパク質コード領域中において、Ｊ６ＣＦ株の前駆体タンパク質（ポリプロテイン）の第１６８０番目に当たるアミノ酸アラニン（Ａ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換される変異（Ａ１６８０Ｅ）を生じる塩基変異（アラニンをコードするコドン「ＧＣＧ」の第２塩基のシトシンからアデニンへの変異）を有したウイルスゲノム変異体の同定に成功した。【０１７０】
（実施例７）Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ及びキメラ変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ）の作製
Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体ＨＣＶレプリコンＲＮＡ発現ベクターとして、発現ベクターｐＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ及びｐＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１に、実施例６で同定したＮＳ４Ａタンパク質領域中のアミノ酸置換（変異）Ａ１６８０Ｅを導入した核酸構築物を作製した。ｐＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／ＬｕｃにＡ１６８０Ｅ置換を引き起こす塩基変異を導入した発現ベクターをｐＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ／Ｌｕｃと呼び、ｐＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１にＡ１６８０Ｅ置換を引き起こす塩基変異を導入した発現ベクターをｐＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔと呼ぶ。ここで、「４Ａｍｕｔ」とは、アミノ酸置換Ａ１６８０Ｅを引き起こす変異を意味する。【０１７１】
具体的には、下記のようにして４Ａｍｕｔを各発現ベクターに導入した。まず１ｓｔ  ＰＣＲ−１として、ｐＪ６ＣＦを鋳型として、センスプライマー３４７１Ｓ−２ａ（５’−ＴＧＧＧＣＡＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＧＡＧ−３’（配列番号１１））とアンチセンスプライマーＡ１６８０Ｅａｓ（５’−ＣＡＣＣＣＧＧＴＣｔＣＣＡＧＧＣＡＡＴＡＣＧＣＧＧＣＧＡＣＧ−３’（配列番号１２））（プライマー配列中の小文字の塩基は、導入する塩基変異を示す）を用いてＰＣＲを行った。次に、１ｓｔ  ＰＣＲ−２として、ｐＪ６ＣＦを鋳型にして、センスプライマーＡ１６８０Ｅｓ（５’−ＡＴＴＧＣＣＴＧＧａＧＡＣＣＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＧＣＡＴＣＡ−３’（配列番号１３））（プライマー配列中の小文字の塩基は、導入する塩基変異を示す）とアンチセンスプライマー６５４２Ｒ−ＩＨ（５’−ＣＧＣＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＡ−３’（配列番号１４））を用いてＰＣＲを行った。さらに２ｎｄ  ＰＣＲとして、上記１ｓｔ  ＰＣＲ−１と１ｓｔ  ＰＣＲ−２で増幅した２種類の増幅断片の混合物を鋳型として、センスプライマー３４７１Ｓ−２ａ（配列番号１１）とアンチセンスプライマー６５４２Ｒ−ＩＨ（配列番号１４）を用いてＰＣＲを行った。得られた増幅産物を制限酵素ＢｂｖＣＩ及びＥｃｏＲＩで消化したＤＮＡ断片（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第３６６２番目〜第６００６番目の領域に相当）により、ｐＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ及びｐＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１中のＢｂｖＣＩ〜ＥｃｏＲＩの領域（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第３６６２番目〜第６００６番目の領域）を置換することによって、それぞれ、ｐＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ／Ｌｕｃ及びｐＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔを作製した。【０１７２】
作製したこれらの変異体レプリコン発現ベクターの構造を図５Ｃ及びＤに示す。図中の「Ａ１６８０Ｅ」は、Ｊ６ＣＦ株の前駆体タンパク質（ポリプロテイン）の第１６８０番目に当たるアラニン（Ａ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換（Ａ１６８０Ｅ）を引き起こす変異（４Ａｍｕｔ）が導入されている位置を模式的に示す。なお、図中の他の記号は図１及び図２と同様のものを指す。【０１７３】
これらＪ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターｐＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ／Ｌｕｃ、及びＪ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターｐＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔから、実施例２と同様の方法で、各ＨＣＶレプリコンＲＮＡを合成した。【０１７４】
発現ベクターｐＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ／Ｌｕｃ及びｐＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔから合成される各ＨＣＶレプリコンＲＮＡを、それぞれ、ＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ／Ｌｕｃ及びＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔと呼ぶ。これらは、Ｊ６ＣＦ株とＪＦＨ−１株のゲノム由来のキメラゲノムであってＡ１６８０Ｅ変異を有する、キメラ変異体レプリコンＲＮＡである。【０１７５】
配列番号１に、Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡであるＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ／Ｌｕｃの塩基配列を示す。配列番号２には、Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡであるＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔの塩基配列を、配列番号３にはその塩基配列によってコードされるＨＣＶ前駆体タンパク質全長のアミノ酸配列を示す。なお、配列番号１及び２に示す塩基配列はＤＮＡ配列として記載されているが、該配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えた配列が対応するＲＮＡ配列であり、したがってレプリコンＲＮＡの配列も配列番号４及び５に基づいて特定することができる。【０１７６】
（実施例８）Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞内でのＲＮＡ複製
実施例３と同様の方法で、実施例２及び実施例７で作製したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ  ５μｇをＨｕｈ７．５．１細胞に導入（トランスフェクション）した。ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞を１２ウェルプレートに播種して培養し、トランスフェクション４時間後、２４時間後及び４８時間後に細胞を回収した。回収した細胞を、２５０μＬの溶解バッファーＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で溶解し、遠心して得られた上清を試料とした。ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）及びルミノメーターＬＢ９５０７（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を用いて、試料中のルシフェラーゼ活性を測定した。【０１７７】
図６にその結果を示す。図の横軸はトランスフェクション後の時間を示し、縦軸はトランスフェクション４時間後のルシフェラーゼ活性の値を基準とした時の各時点におけるルシフェラーゼ活性の相対値を示す。図６に示すように、Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡであるＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ／Ｌｕｃを導入した細胞は、ルシフェラーゼ活性が経時的に上昇した。したがって、ＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ／Ｌｕｃは自律複製することが示された。Ｊ６ＣＦのゲノムを細胞内で効率よく複製させる上で、ＮＳ４Ａタンパク質領域中のＡ１６８０Ｅ変異の存在が重要であることが示された。【０１７８】
ＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ／Ｌｕｃのルシフェラーゼ活性の上昇は、ＪＦＨ−１株由来のＮ３Ｈ配列を導入したＪ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡであるＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃでの結果とよく類似していた（図６）。Ａ１６８０Ｅ変異は、Ｊ６ＣＦ株由来レプリコンＲＮＡにおいて、ＪＦＨ−１株由来のＮ３Ｈ配列と同様に自律複製能付与効果を有すると言うことができる。【０１７９】
（実施例９）Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ）導入細胞からのウイルス産生
実施例３と同様の方法で、実施例２及び実施例７で作製したＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ  ５μｇをＨｕｈ７．５．１細胞に導入（トランスフェクション）した。ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞を１２ウェルプレートに播種して培養し、トランスフェクション１日後、２日後及び３日後に培養上清を回収した。回収した培養上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に通して夾雑物を除き、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質の測定の試料とした。ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質量の測定はＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストキット  （オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社）を用いて行った。【０１８０】
図７にその結果を示す。図７の横軸はトランスフェクション後の日数を示し、縦軸は培養上清中のＣｏｒｅタンパク質量（ｆｍｏｌ／Ｌ）を示す。図７に示すように、ＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔを導入した細胞の培養上清中のＣｏｒｅタンパク質量は経時的に増加した。したがって、ＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔを導入した細胞はウイルスを産生することが示された。【０１８１】
（実施例１０）Ｊ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ及びＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ）の作製
Ｊ６ＣＦ株由来の変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ（５箇所変異導入；Ａ１６８０Ｅ／Ａ２８９２Ｓ／Ｒ２９５９Ｋ／Ｙ３００３Ｆ／ｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）の置換（変異）導入）を合成するための発現ベクターを作製した。まず、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃに、実施例６で見出されたＮＳ４Ａタンパク質領域内のＡ１６８０Ｅアミノ酸置換（Ｊ６ＣＦ株の前駆体タンパク質の第１６８０番目のアラニンのグルタミン酸への置換）を引き起こす塩基変異に加えて、ＮＳ５Ｂタンパク質領域内のＡ２８９２Ｓ（同第２８９２番目のアラニンのセリンへの置換）、Ｒ２９５９Ｋ（同第２９５９番目のアルギニンのリジンへの置換）及びＹ３００３Ｆ（同第３００３番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換）のアミノ酸置換を引き起こす塩基変異、並びにＨＣＶゲノムの３’末端の非翻訳領域内に存在する可変領域（ＶＲ）中のｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）塩基変異（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノム配列の第９４５８番目のシトシンのグアニンへの変異）を導入した核酸構築物を作製した。ここで、Ａ２８９２Ｓ、Ｒ２９５９Ｋ、Ｙ３００３Ｆ、ｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）変異は、公知文献（Ｍｕｒａｙａｍａら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｎｓ．、２０１０年、第６巻、ｅ１０００８８５）に記載されている変異である。【０１８２】
得られたＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターを、ｐＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃと呼び、このベクターから実施例２と同様にして作製される変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡをＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃと呼ぶ。なお、「ＳＫＦ」はＡ２８９２Ｓ、Ｒ２９５９Ｋ及びＹ３００３Ｆのアミノ酸置換（変異）を指し、「ＶＲｍ３」はゲノム３’末端の非翻訳領域内の可変領域のｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）の塩基変異を指す。【０１８３】
同様に、Ｊ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡを合成するための発現ベクターを作製した。まずｐＪ６ＣＦに、ＮＳ４Ａタンパク質領域内のＡ１６８０Ｅアミノ酸置換、ＮＳ５Ｂタンパク質領域内のＡ２８９２Ｓアミノ酸置換、Ｒ２９５９Ｋアミノ酸置換及びＹ３００３Ｆアミノ酸置換をそれぞれ引き起こす塩基置換、並びにＨＣＶゲノムの３’末端の非翻訳領域内に存在する可変領域中のｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）塩基変異を導入した核酸構築物を作製した。このＪ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターを、ｐＦＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３と呼び、このベクターから実施例２と同様にして作製される変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡをＦＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３と呼ぶ。【０１８４】
ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃ及びｐＪ６ＣＦへのＡ１６８０Ｅ変異の導入は、実施例７と同様に行った。さらに、Ａ１６８０Ｅ変異を導入した発現ベクターへのＮＳ５Ｂタンパク質領域内の３つの変異（アミノ酸置換Ａ２８９２Ｓ、Ｒ２９５９Ｋ及びＹ３００３Ｆ；ＳＫＦ）を引き起こす塩基変異とＨＣＶゲノムの３’末端の可変領域内の塩基変異（ｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）塩基変異）の導入は、公知文献（Ｍｕｒａｙａｍａら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｎｓ．、２０１０年、第６巻、ｅ１０００８８５）に記載の、アミノ酸置換ＳＫＦを伴うＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターｐＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋３’ＵＴＲ−ＪＦＨ１／ＳＫＦのＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩ消化ＤＮＡ断片（ＮＳ４Ｂコード領域の一部〜ＮＳ５Ｂコード領域のほぼ全体を含む）、及び公知文献（Ｍｕｒａｙａｍａら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｎｓ．、２０１０年、第６巻、ｅ１０００８８５）記載の、ＶＲｍ３を有するＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターｐＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／ＶＲ−Ｊ６ｍ３のＳｔｕＩ／ＸｂａＩ消化ＤＮＡ断片（ＮＳ５Ｂコード領域の３’側の一部と３’非翻訳領域を含む）により、Ａ１６８０Ｅ変異を導入した上記発現ベクター中の同じ領域の配列を置換することによって作製した。【０１８５】
図８に発現ベクターｐＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃ及びｐＦＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３の構造を示す。図中の「Ａ１６８０Ｅ」、「Ａ２８９２Ｓ」、「Ｒ２９５９Ｋ」、「Ｙ３００３Ｆ」及び「ｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）」は、これら変異が導入されている位置を模式的に示す。なお、図中の他の記号は図１及び図２と同様のものを指す。【０１８６】
なお、ｐＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋３’ＵＴＲ−ＪＦＨ１／ＳＫＦは、公知文献（Ｍｕｒａｙａｍａら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｎｓ．、２０１０年、第６巻、ｅ１０００８８５）に記載の方法により作製した。【０１８７】
なお、ここでは、Ａ２８９２Ｓ、Ｒ２９５９Ｋ及びＹ３００３Ｆ変異導入方法の例として、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／ＬｕｃにＡ２８９２Ｓ、Ｒ２９５９Ｋ及びＹ３００３Ｆ変異をそれぞれ導入したベクターを作製した際の方法を示す。この作製に用いた手順を以下に示す。【０１８８】
まずＡ２８９２Ｓ（ＳＫＦのＳ）の導入については、まず、１ｓｔ  ＰＣＲ−１として、ｐＪ６ＣＦを鋳型として、センスプライマー７２４４Ｓ−ＲＩ（５’−ＡＣＣＧＣＴＴＧＴＧＧＡＡＴＣＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１５））とアンチセンスプライマーＪ６５ＢＡ４５０Ｓａｓ（５’−ＧＧＡＧＴＡＣＡＣｔＧａＴＣＣＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＡＡＧＴＴＧＡＧＧ−３’（配列番号１６））を用いてＰＣＲを行った。次に、１ｓｔ  ＰＣＲ−２として、ｐＪ６ＣＦを鋳型として、センスプライマーＪ６５ＢＡ４５０Ｓｓ（５’−ＴＧＴＡＣＧＧＡｔＣａＧＴＧＴＡＣＴＣＣＧＴＧＡＧＴＣＣＣＴＴＧ−３’）（配列番号１７））とアンチセンスプライマー９４５４Ｒ−ＩＨ（５’−ＧＴＧＴＧＴＧＣＣＧＣＴＣＴＡＣＣＧＡＧＣＧＧＧＧＡＧＴＡＧ−３’（配列番号１８））を用いてＰＣＲを行った。なお、プライマーの配列中の小文字の塩基は、導入する塩基変異を示す。さらに、２ｎｄ  ＰＣＲとして、上記１ｓｔ  ＰＣＲ−１と１ｓｔ  ＰＣＲ−２で増幅した２種類の増幅断片の混合物を鋳型として、センスプライマー７２４４Ｓ−ＲＩ（配列番号１５）とアンチセンスプライマー９４５４Ｒ−ＩＨ（配列番号１８）を用いてＰＣＲを行った。得られた増幅産物を制限酵素ＸｈｏＩ及びＳｔｕＩで消化したＤＮＡ断片（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第７５２３番目〜第９４１５番目に相当）、及びｐＪＦＨ１株をＳｔｕＩ及びＸｂａＩで消化したＤＮＡ断片（ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第９４１５番目〜３’末端）により、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／ＬｕｃのＸｈｏＩ〜ＸｂａＩの領域（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第７５２３番目〜３’末端）を置換した。Ｒ２９５９Ｋ（ＳＫＦのＫ）の導入については、まず、１ｓｔ  ＰＣＲ−１として、ｐＪ６ＣＦを鋳型として、センスプライマー７２４４Ｓ−ＲＩ（５’−ＡＣＣＧＣＴＴＧＴＧＧＡＡＴＣＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１５））とアンチセンスプライマーＪ６５ＢＲ５１７Ｋａｓ（５’−ＡＣＧＧＣＣＧＣＴｔＴＣＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＧＡＴＧＡＧ−３’（配列番号１９））を用いてＰＣＲを行った。次に１ｓｔ  ＰＣＲ−２として、ｐＪ６ＣＦを鋳型として、センスプライマーＪ６５ＢＲ５１７Ｋｓ（５’−ＧＴＧＧＧＧＧＧＡａＡＧＣＧＧＣＣＧＴＴＴＧＣＧＧＴＣＧＡ−３’（配列番号２０））とアンチセンスプライマー９４５４Ｒ−ＩＨ（５’−ＧＴＧＴＧＴＧＣＣＧＣＴＣＴＡＣＣＧＡＧＣＧＧＧＧＡＧＴＡＧ−３’（配列番号１８））を用いてＰＣＲを行った。なお、プライマーの配列中の小文字の塩基は、導入する塩基変異を示す。さらに２ｎｄ  ＰＣＲとして、上記１ｓｔ  ＰＣＲ−１と１ｓｔ  ＰＣＲ−２で増幅した２種類の増幅断片の混合物を鋳型として、センスプライマー７２４４Ｓ−ＲＩ（配列番号１５）とアンチセンスプライマー９４５４Ｒ−ＩＨ（配列番号１８）を用いてＰＣＲを行った。得られた増幅産物を制限酵素ＸｈｏＩ及びＳｔｕＩで消化したＤＮＡ断片（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第７５２３番目〜第９４１５番目）、及びｐＪＦＨ１をＳｔｕＩ及びＸｂａＩで消化したＤＮＡ断片（ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第９４１５番目〜３’末端）を用いて、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／ＬｕｃのＸｈ���Ｉ〜ＸｂａＩの領域（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第７５２３番目〜３’末端を置換した。Ｙ３００３Ｆ（ＳＫＦのＦ）の導入については、まず、１ｓｔ  ＰＣＲ−１として、ｐＪ６ＣＦを鋳型として、センスプライマー７２４４Ｓ−ＲＩ（５’−ＡＣＣＧＣＴＴＧＴＧＧＡＡＴＣＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１５））とアンチセンスプライマーＪ６５ＢＹ５６１Ｆａｓ（５’−ＣＡＣＧＣＴＧＴＧＡａＡＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＧＧ−３’（配列番号２１））を用いてＰＣＲを行い、次に１ｓｔ  ＰＣＲ−２として、ｐＪ６ＣＦを鋳型として、センスプライマーＪ６５ＢＹ５６１Ｆｓ（５’−ＧＧＣＧＡＣＡＴＴＴｔＴＣＡＣＡＧＣＧＴＧＴＣＧＣＧＴＧＣ−３’（配列番号２２））とアンチセンスプライマー９４５４Ｒ−ＩＨ（５’−ＧＴＧＴＧＴＧＣＣＧＣＴＣＴＡＣＣＧＡＧＣＧＧＧＧＡＧＴＡＧ−３’（配列番号１８））を用いてＰＣＲを行った。なお、プライマーの配列中の小文字の塩基は、導入する塩基変異を示す。さらに２ｎｄ  ＰＣＲとして、上記１ｓｔ  ＰＣＲ−１と１ｓｔ  ＰＣＲ−２で増幅した２種類の増幅断片の混合物を鋳型として、センスプライマー：７２４４Ｓ−ＲＩ（配列番号１５）とアンチセンスプライマー９４５４Ｒ−ＩＨ（配列番号１８）を用いてＰＣＲを行った。得られた増幅産物を制限酵素ＸｈｏＩ及びＳｔｕＩで消化したＤＮＡ断片（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第７５２３番目〜第９４１５番目）、及びｐＪＦＨ１をＳｔｕＩ及びＸｂａＩで消化したＤＮＡ断片（ＪＦＨ−１株の全長ゲノムの塩基番号第９４１５番目〜３’末端）を用いて、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／ＬｕｃのＸｈｏＩ〜ＸｂａＩの領域（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第７５２３番目〜３’末端）を置換した。【０１８９】
ｐＳＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１／ＶＲ−Ｊ６ｍ３は、公知文献（Ｍｕｒａｙａｍａら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｎｓ．、２０１０年、第６巻、ｅ１０００８８５）に記載の方法により作製した。なお、ここでは、３’非翻訳領域内の可変領域にｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）変異を導入する方法の例として、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃにｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）変異を導入したベクターを作製した際の方法を示す。まず、１ｓｔ  ＰＣＲ−１として、ｐＪ６ＣＦを鋳型として、センスプライマー９２５４Ｓ−ＩＨ（５’−ＧＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＡＡＣＴＣＡＣＴＣＣ−３’（配列番号２３））とアンチセンスプライマーＪ６ＶＲｍ３ａｓ（５’−ＴＡＴＧＧＡＧＴＧＴＡｃＣＴＡＡＴＧＴＧＴＧＣＣＧＣＴＣＴＡＣ−３’（配列番号２４））を用いてＰＣＲを行い、次に、１ｓｔ  ＰＣＲ−２として、ｐＪ６ＣＦを鋳型として、センスプライマーＪ６ＶＲｍ３ｓ（５’−ＣＡＣＡＣＡＴＴＡＧｇＴＡＣＡＣＴＣＣＡＴＡＧＣＴＡＡＣＴＧＴＣ−３’（配列番号２５））とアンチセンスプライマーＭ１３Ｒ（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号２６））を用いてＰＣＲを行った。なお、プライマーの配列中の小文字の塩基は、導入する塩基変異を示す。さらに、２ｎｄ  ＰＣＲとして、上記１ｓｔ  ＰＣＲ−１と１ｓｔ  ＰＣＲ−２で増幅した２種類の増幅断片の混合物を鋳型として、センスプライマー９２５４Ｓ−ＩＨ（配列番号２３）とアンチセンスプライマーＭ１３Ｒ（配列番号２６）を用いてＰＣＲを行った。得られた増幅産物を制限酵素ＳｇｒＡＩ及びＸｂａＩで消化したＤＮＡ断片（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第９３２８番目〜３’末端）を用いて、ｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／ＬｕｃのＳｇｒＡＩ〜ＸｂａＩの領域（Ｊ６ＣＦ株の全長ゲノムの塩基番号第９３２８番目〜３’末端）を置換した。この結果ｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）変異を含むＪ６ＣＦ株変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターを作製できた。【０１９０】
次いで、Ｊ６ＣＦ株変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ及びＪ６ＣＦ株変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、上記で作製したＪ６ＣＦ株変異体ＨＣＶレプリコンＲＮＡ発現ベクターから実施例２と同様の方法で合成した。【０１９１】
配列番号４に、Ｊ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡであるＳＧＲ−Ｊ６＋４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃの塩基配列を示す。配列番号５には、Ｊ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡであるＦＧＲ−Ｊ６＋４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３の塩基配列を、配列番号６にはその塩基配列によってコードされる変異体ＨＣＶ前駆体タンパク質全長のアミノ酸配列を示す。なお、配列番号４及び５に示す塩基配列はＤＮＡ配列として記載されているが、該配列中のチミン（ｔ）をウラシル（ｕ）に読み替えた配列が対応するＲＮＡ配列であり、したがってレプリコンＲＮＡの配列も配列番号４及び５に基づいて特定することができる。【０１９２】
（実施例１１）Ｊ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞内でのＲＮＡ複製
実施例３と同様の方法で、実施例１０で作製したＪ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ  ５μｇをＨｕｈ７．５．１細胞に導入（トランスフェクション）した。ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞を１２ウェルプレートに播種して培養し、トランスフェクション４時間後、２４時間後及び４８時間後に細胞を回収した。回収した細胞を、２５０μＬの溶解バッファーＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社）で溶解し、遠心して得られた上清を試料とした。ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）及びルミノメーターＬＢ９５０７（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を用いて、試料中のルシフェラーゼ活性を測定した。【０１９３】
図９にその結果を示す。図の横軸はトランスフェクション後の時間を示し、縦軸はトランスフェクション４時間後のルシフェラーゼ活性の値を基準とした時の各時点におけるルシフェラーゼ活性の相対値を示す。図９に示すように、Ｊ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡであるＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃを導入した細胞は、ルシフェラーゼ活性が経時的に上昇した。したがって、ＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃは自律複製することが示された。Ａ１６８０Ｅ、Ａ２８９２Ｓ、Ｒ２９５９Ｋ、Ｙ３００３Ｆ及びｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）の５箇所の変異が、キメラではないＪ６ＣＦゲノムを細胞内で複製させるために重要であることが明らかとなった。【０１９４】
（実施例１２）Ｊ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ）導入細胞からのウイルス産生
実施例３と同様の方法で、実施例２、７及び１０で作製したＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ  ５μｇをＨｕｈ７．５．１細胞に導入（トランスフェクション）した。ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞を１２ウェルプレートに播種して培養し、トランスフェクション１日後、２日後及び３日後に培地を回収した。回収した培養上清を０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に通して夾雑物を除き、ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質の測定の試料とした。ＨＣＶ  Ｃｏｒｅタンパク質量の測定はＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストキット（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社）を用いて行った。【０１９５】
図１０にその結果を示す。図１０の横軸はトランスフェクション後の日数を示し、縦軸は培養上清中のＣｏｒｅタンパク質量（ｆｍｏｌ／Ｌ）を示す。図１０に示すように、ＦＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３を導入した細胞の培養上清中のＣｏｒｅタンパク質量は経時的に増加した。したがって、ＦＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３を導入した細胞はウイルスを産生することが示された。【０１９６】
（実施例１３）Ｊ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ（全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ）導入細胞から産生されたウイルス（ウイルス粒子）の感染性
実施例１２で得られたＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞の培養上清は産生されたウイルス（ウイルス粒子）を含むと考えられることから、その培養上清の感染力価を測定した。感染力価の測定は、トランスフェクション３日後の培養上清を用いて行った。新たなＨｕｈ７．５．１細胞をポリ−Ｄ−リシンコーティング９６ウェルプレート（ＢＤ社）に１ｘ１０４／ウェルとなるように播種し、翌日、この細胞に、希釈した上記培養上清を添加して細胞にウイルスを感染させた。感染処理３日後に細胞をメタノールで固定し、感染した細胞を、抗Ｃｏｒｅ抗体及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８−コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて免疫染色した。蛍光顕微鏡下で感染フォーカス数を計測した。培養上清の感染力価は、ｆｆｕ／ｍＬ（培地１ｍＬ当たりの感染フォーカス形成数（ｆｆｕ；ｆｏｃｕｓ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ））で表した。
その結果を表１に示す。【０１９７】
【表１】
0005927185.tif 000002
【０１９８】
その結果、ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡである、ＦＧＲ−Ｊ６／Ｎ３Ｈ＋５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１、ＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ、及びＦＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３をそれぞれ導入した細胞の培養上清について高い感染力価が測定された。【０１９９】
この結果、Ｊ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡであるＦＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３を導入した細胞から産生されたウイルス粒子も高い感染性を有することが示された。【０２００】
一方、Ｊ６ＣＦ株ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡであるＦＧＲ−Ｊ６ＣＦ導入細胞では培養上清の感染力価は０となり、Ｊ６ＣＦ株ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡは、それ単独では、感染性ウイルス粒子の産生をもたらさないことが示された。【０２０１】
（実施例１４）異なる組み合わせの変異を導入したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡの作製
実施例１０で変異体に導入した５箇所の変異を、異なる組み合わせでＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡに導入し、その効果を調べた。具体的には、まず、ＮＳ４Ａタンパク質領域内のＡ１６８０Ｅ変異（４Ａｍｕｔ変異）、ＮＳ５Ｂタンパク質領域内のＡ２８９２Ｓ、Ｒ２９５９Ｋ及びＹ３００３Ｆの３つの置換（ＳＫＦ変異）、３’非翻訳領域の可変領域内のｎｔ９４５８（ｃ→ｇ）の変異（ＶＲｍ３変異）の３種の変異のうち、１種又は２種を組み合わせて導入したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを作製した。【０２０２】
これらＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを合成するための発現ベクターは、実施例１０に記載した方法に従ってベクターｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃに各変異を導入することにより作製した（図１１及び１２）。図１１には、１種の変異を導入したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクター、図１２には、２種の変異を導入したＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構造を示す。図１１及び１２中の記号は、図１、２及び８と同様のものを指す。【０２０３】
さらに、４Ａｍｕｔ変異及びＶＲｍ３変異に加えてＹ３００３Ｆ変異を単独でｐＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃに導入した核酸構築物も同様にして作製した。ここで得られた発現ベクターをｐＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋Ｙ３００３Ｆ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃと呼ぶ。このＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターの構造を図１３に示す。図中の記号は、図１、２及び８と同様のものを指す。【０２０４】
次いで、実施例２と同様の方法で、上記ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターからＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを作製した。なお、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ発現ベクターｐＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ／Ｌｕｃから作製されたＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡをＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ／Ｌｕｃと呼び、他のＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡについても同様に名づけた。【０２０５】
（実施例１５）異なる組み合わせの変異を含む各種変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞内でのＲＮＡ複製
実施例３と同様の方法で、実施例１０及び実施例１４で作製した各Ｊ６ＣＦ株由来変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ  ５μｇをＨｕｈ７．５．１細胞に導入（トランスフェクション）した。ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ導入細胞を１２ウェルプレートに播種して培養し、トランスフェクション４時間後、２４時間後及び４８時間後に細胞を回収した。回収した細胞を、２５０μＬの溶解バッファーＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で溶解し、遠心して得られた培養上清を試料とした。ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）及びルミノメーターＬＢ９５０７（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を用いて、試料中のルシフェラーゼ活性を測定した。対照として、変異を有しないＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ  ＳＧＲ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ及びＳＧＲ−Ｊ６ＣＦ／Ｌｕｃを同様に細胞に導入して培養し、培養上清のルシフェラーゼ活性を測定した。【０２０６】
図１４にその結果を示す。図の横軸は各ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを示し、縦軸はトランスフェクション４時間後のルシフェラーゼ活性の値を基準とした時の各時点（２４時間後、４８時間後）におけるルシフェラーゼ活性の相対値を示す。図１４に示すように、陽性対照のＳＧＲ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃと同様に、Ｊ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡであるＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃを導入した細胞では、ルシフェラーゼ活性が経時的に上昇した。一方、他の組み合わせの変異を有するＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡを導入した細胞ではルシフェラーゼ活性は経時的に減少した。したがって、ＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３／Ｌｕｃのみが自律複製することが示された。Ｊ６ＣＦ株ゲノム由来レプリコンを細胞内で効率良く複製させるためには、上記５箇所の変異が全て重要であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０２０７】
本発明によれば、培養細胞において自律増幅が可能な、遺伝子型２ａであるＪ６ＣＦ株の感染性ＨＣＶ粒子を産生するフルゲノムレプリコンＲＮＡを提供できる。これは例えば、遺伝子型２ａであるＪ６ＣＦ株のＨＣＶの感染及び複製を阻害する抗ＨＣＶ薬のスクリーニング、ＨＣＶの複製機構を解明するための研究、ＨＣＶワクチンの開発などに有利に利用できる。また、培養細胞において高い複製能を有するＪ６ＣＦ株由来のサブゲノムレプリコンＲＮＡも提供でき、これは例えば、Ｊ６ＣＦ株のＨＣＶの複製を阻害する抗ＨＣＶ薬のスクリーニングに利用できる。【０２０８】
また本発明では、Ｊ６ＣＦ株のゲノムをバックボーンとし、自律複製能及び感染性ＨＣＶ粒子産生能を有するフルゲノムレプリコンＲＮＡを用いて、培養細胞系で感染性ＨＣＶ粒子を作製することができる。これにより、ＪＦＨ−１株及びそのキメラ株のみであった感染性ＨＣＶ粒子に加え、新たなＨＣＶ株の感染性ＨＣＶ粒子が提供されることになる。本発明に係るこの感染性ＨＣＶ粒子は、ＨＣＶ株の違いによる、インターフェロンの治療効果の違いの解明や、ＨＣＶ感染後の変異の起こり方の解析に利用することができ、引いては、薬剤耐性のメカニズムの解明に利用することができる。さらに本発明に係るＨＣＶ粒子を用いた抗ＨＣＶ薬をスクリーニングは、より治療効果の高い治療薬の開発に利用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体を参照により本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０２０９】
配列番号１：Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡであるＳＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔ／ＬｕｃのｃＤＮＡ配列
配列番号２：Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡであるＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４ＡｍｕｔのｃＤＮＡ配列
配列番号３：Ｊ６ＣＦ／ＪＦＨ−１キメラ変異体ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡであるＦＧＲ−Ｊ６／５ＢＳＬＸ−ＪＦＨ１＋４Ａｍｕｔによりコードされた前駆体タンパク質
配列番号４：Ｊ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡであるＳＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３／ＬｕｃのｃＤＮＡ配列
配列番号５：Ｊ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡであるＦＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３のｃＤＮＡ配列
配列番号６：Ｊ６ＣＦ株由来変異体（５箇所変異導入）ＨＣＶフルゲノムレプリコンＲＮＡであるＦＧＲ−Ｊ６／４Ａｍｕｔ＋ＳＫＦ＋ＶＲｍ３によりコードされた前駆体タンパク質
配列番号７：センスプライマー８６８０Ｓ−２ａ
配列番号８：アンチセンスプライマー９１９１Ｒ−２ａ
配列番号９：センスプライマー９１９１Ｓ−２ａ
配列番号１０：アンチセンスプライマー９４４０Ｒ−ＩＨ
配列番号１１：センスプライマー３４７１Ｓ−２ａ
配列番号１２：アンチセンスプライマーＡ１６８０Ｅａｓ
配列番号１３：センスプライマーＡ１６８０Ｅｓ
配列番号１４：アンチセンスプライマー６５４２Ｒ−ＩＨ
配列番号１５：センスプライマー７２４４Ｓ−ＲＩ
配列番号１６：アンチセンスプライマーＪ６５ＢＡ４５０Ｓａｓ
配列番号１７：センスプライマーＪ６５ＢＡ４５０Ｓｓ
配列番号１８：アンチセンスプライマー９４５４Ｒ−ＩＨ
配列番号１９：アンチセンスプライマーＪ６５ＢＲ５１７Ｋａｓ
配列番号２０：センスプライマーＪ６５ＢＲ５１７Ｋｓ
配列番号２１：アンチセンスプライマーＪ６５ＢＹ５６１Ｆａｓ
配列番号２２：センスプライマーＪ６５ＢＹ５６１Ｆｓ
配列番号２３：センスプライマー９２５４Ｓ−ＩＨ
配列番号２４：アンチセンスプライマーＪ６ＶＲｍ３ａｓ
配列番号２５：センスプライマーＪ６ＶＲｍ３ｓ
配列番号２６：アンチセンスプライマーＭ１３Ｒ
配列番号２７：Ｃ型肝炎ウイルスＪ６ＣＦ株のＮＳ５Ｂタンパク質
配列番号２８：Ｃ型肝炎ウイルスＪＦＨ−１株のＮＳ５Ｂタンパク質
配列番号２９：Ｃ型肝炎ウイルスＪ６ＣＦ株の全長ゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ配列
配列番号３０：Ｃ型肝炎ウイルスＪ６ＣＦ株の全長ゲノムＲＮＡによりコードされた前駆体タンパク質
配列番号３１：Ｃ型肝炎ウイルスＪＦＨ−１株のゲノムＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のｃＤＮＡ配列
配列番号３２：Ｊ６ＣＦ株のＮＳ５Ｂタンパク質の第１番目から第５１５番目のアミノ酸残基及びＪＦＨ−１株のＮＳ５Ｂタンパク質の第５１６番目から第５９１番目のアミノ酸残基からなるキメラＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＤＮＡ配列
配列番号３３：Ｊ６ＣＦ株のＮＳ５Ｂタンパク質の第１番目から第５１５番目のアミノ酸残基及びＪＦＨ−１株のＮＳ５Ｂタンパク質の第５１６番目から第５９１番目のアミノ酸残基からなるキメラＮＳ５Ｂタンパク質
【図１】
0005927185.tif 000003
【図２】
0005927185.tif 000004
【図３】
0005927185.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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