(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己切断ペプチドをコードする配列を介して相互に接続されたＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧの５種の核初期化因子をコードする遺伝子の各コード領域を含み、かつＭＹＣファミリー遺伝子のコード領域を含まない核酸又は該核酸を含むベクターを、フィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントの存在下で体細胞に導入する工程を包含することを特徴とする、多能性幹細胞の製造方法。
【請求項２】
核酸が、５’末端より順に、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧ遺伝子の各コード領域を含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
自己切断ペプチドが、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ由来２Ａペプチド及びｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ由来２Ａペプチドからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の細胞への分化能力を保持した多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を製造するための核酸、及び当該核酸を使用する多能性幹細胞の製造方法に関する。
なお、本願は、２００９年１２月３日出願の日本国特許出願第２００９−２７５０３２号に対して優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２００９−２７５０３２号の全内容を本願に組み込むものである。
【背景技術】
【０００２】
生物体のすべての細胞系列に分化可能な多能性幹細胞は、任意のタイプの細胞に分化し、また、任意のタイプの組織、器官等を生みだす潜在的能力を有している。そのため、当該細胞を使用して、生物体において失われた細胞を再生し補うという新しい治療法（再生医療）に応用することが期待されている。更に、発生学、分子生物学、薬学分野における研究ツールとしても利用可能性を有している。【０００３】
多能性幹細胞として、胚盤胞と呼ばれる段階の初期胚の内部細胞塊から樹立される細胞株である胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）が知られている。しかしながら、ヒト胚を破壊して作製されるヒトＥＳ細胞は、倫理的観点からの反対も多く、その研究が制限されるケースも少なくない。【０００４】
これらＥＳ細胞の問題点を解消するため、胚を使用することなく体細胞に人為的に遺伝子を導入して誘導される細胞株である多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞：例えば非特許文献１）が開発された。当該細胞は、細胞の全能性の獲得又は維持に関与する遺伝子を人為的に体細胞に導入することにより作製される。現在、その作製手法及び利用方法に関して、盛んに研究が進められている。【０００５】
前記の非特許文献１には、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ及びＫＬＦ４の４種のポリペプチドをそれぞれコードする遺伝子を導入し、これらポリペプチドを細胞内で個別に発現させることによってヒトｉＰＳ細胞を作製する方法が開示されている。また、他の研究者からは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８の４種のポリペプチドをコードする遺伝子を用いた同様の操作によって、ヒトｉＰＳ細胞を作製したとの報告がなされている（非特許文献２）。しかし、これらの遺伝子を導入されたすべての体細胞がｉＰＳ細胞に誘導されることはなく、実際にはその一部のみ（総細胞数の０．０２％以下）がｉＰＳ細胞へと誘導されるに過ぎない。この効率を向上させるため、ＤＮＡのメチル化を阻害する薬剤を培地に添加することが試みられている（非特許文献３）。また、ｃ−ＭＹＣはがん遺伝子であり、医療への応用を行う際には、導入された細胞のがん化のリスクが不可避である。そのため、ｃ−ＭＹＣを除いてｉＰＳ細胞を誘導する試みがなされているが、その場合、誘導効率はさらに低下する（総細胞数の０．００１％以下）。このように、ｉＰＳ細胞作製技術は未だ確立したとはいえない状況にある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】セル（Ｃｅｌｌ）、第１３１巻、８６１−８７２頁、２００７年
【非特許文献２】サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第３１８巻、１９１７−１９２０頁、２００７年
【非特許文献３】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７０５６、２００８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
多能性幹細胞の利用を図るためには、当該細胞を効率よく製造する手法の開発が急務である。本発明の目的は、多能性幹細胞を効率よく製造するための方法を提供し、当該細胞の研究ならびに利用を促進することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、多くの核初期化因子の候補の中から、ＥＳ細胞様の細胞、すなわち多能性を保持した幹細胞を高頻度でかつ安全に誘導し、多能性幹細胞を高効率で安定して製造できる核初期化因子の組合せを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち本発明を概説すれば、
［１］自己切断ペプチドをコードする配列を介して相互に接続されたＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＬＩＮ２８の４種の核初期化因子をコードする遺伝子の各コード領域を含み、かつＭＹＣファミリー遺伝子のコード領域を含まない核酸、
［２］５’末端より順に、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＬＩＮ２８遺伝子の各コード領域を含む、［１］記載の核酸、
［３］自己切断ペプチドをコードする配列を介して接続されたＮＡＮＯＧ遺伝子のコード領域をさらに含む、［１］記載の核酸、
［４］５’末端より順に、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧ遺伝子の各コード領域を含む、［３］記載の核酸、
［５］自己切断ペプチドが、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ由来２Ａペプチド及びｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ由来２Ａペプチドからなる群より選択される、［１］〜［４］のいずれかに記載の核酸、
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載の核酸を含むベクター、
［７］［１］〜［５］のいずれかに記載の核酸又は［６］記載のベクターを含む細胞、
［８］［１］〜［５］のいずれかに記載の核酸又は［６］記載のベクターを体細胞に導入する工程を包含することを特徴とする、多能性幹細胞の製造方法、ならびに
［９］核酸又はベクターを導入する工程がフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントの存在下で実施される、［８］記載の方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の核酸を使用することにより、多能性幹細胞を効率よく製造することが可能であり、当該多能性幹細胞は所望の細胞への分化能を有しており、基礎研究、医療への応用研究において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例において作製した核酸の構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
本明細書において「核初期化因子」とは、ＥＳ細胞などで発現している分化、発生、増殖などに関係する因子のうち、核の初期化（リプログラミング）に関与する因子を意味する。核初期化因子となる候補は、多数報告されている。例えば、セル（Ｃｅｌｌ）、第１２６巻、６６３−６７６頁、２００６年には、２４種の核初期化因子の候補が記載されている。非特許文献２には、１４種の核初期化因子の候補が記載されている。
【００１４】
本明細書において「自己切断ペプチド」とは、ペプチド配列自体の中の２つのアミノ酸残基の間に生じる切断活性を伴うペプチド配列を意味する。例えば、２Ａペプチド又は２Ａ様ペプチドでは、切断はこれらのペプチド上のグリシン残基とプロリン残基との間で生じる。これは、翻訳の間に、グリシン残基とプロリン残基との間の正常なペプチド結合の形成が行われない「リボソームスキップ機構」によって生じ、下流の翻訳には影響することはない。かかるリボソームスキップ機構は当該分野において知られており、そして１分子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によりコードされる複数のタンパク質の発現のために使用される。
【００１５】
本明細書において「コード領域」とは、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果生じるポリペプチドに見られるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をいう。
【００１６】
本明細書において「体細胞」とは、生物を構成する細胞のうち、生殖細胞以外の細胞のことを示す。これら体細胞では、核初期化因子を接触させることにより、リプログラミングが起こり、多能性を獲得する。
【００１７】
（１）本発明の核酸及びベクター
本発明の核酸は、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＬＩＮ２８の４種の核初期化因子をコードする遺伝子の各コード領域を含むが、ＭＹＣファミリー遺伝子のコード領域を含まず、かつ、それぞれの遺伝子のコード領域の間に自己切断ペプチドをコードする配列を含む核酸である。前記４種の核初期化因子をコードする遺伝子の各コード領域の順は、多能性幹細胞を誘導し得る限りにおいて特に限定はないが、例えば、核酸の５’末端から順に、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びＬＩＮ２８遺伝子の各コード領域を含む核酸が好ましい。
【００１８】
本発明の１つの態様として、本発明の核酸はＮＡＮＯＧ遺伝子のコード領域をさらに含み得る。すなわち、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧの５種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域を含み、かつそれぞれの核初期化因子のコード領域の間に自己切断ペプチドのコード領域を含む核酸も、本発明に含まれる。前記５種の核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域の順も、多能性幹細胞を誘導し得る限りにおいて特に限定はないが、例えば、核酸の５’末端から順に、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧ遺伝子の各コード領域を含む核酸が好ましい。
【００１９】
本発明の核酸は、体細胞内で１つのｍＲＮＡとして転写される。転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドは、自己切断ペプチド内において切断される。例えば、自己切断ペプチドが２Ａペプチドである場合、本発明の核酸から転写されたｍＲＮＡが翻訳される時に、リボソームは２Ａペプチド内において特定の１カ所のペプチド結合を連結せず、２Ａペプチド配列の５’末端側にコードされるポリペプチドと３’末端側にコードされるポリペプチドとを別のポリペプチドとして翻訳する。結果、本発明の核酸にコードされる核初期化因子は、別々のポリペプチドとして生じる。
したがって、本発明の核酸がコードする複数の核初期化因子は、１種も欠けることなく、すべてがほぼ同じ分子数（等量）で発現する。
【００２０】
本発明の核酸に使用される核初期化因子をコードする遺伝子の各コード領域は、ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジー情報センター）の登録情報からその塩基配列を入手することができる。当業者であれば、登録情報に含まれる塩基配列に基づき、核初期化因子の成熟タンパク質又はプレプロタンパク質のＮ末端からＣ末端までをコードする塩基配列を入手することができる。次に、前記塩基配列に基づいてプライマーを設計し、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲなどにより核初期化因子をコードするＤＮＡフラグメントを調製することができる。
【００２１】
本発明の核酸に使用される核初期化因子をコードする遺伝子のコード領域には、野生型遺伝子のコード領域が使用できる。更に、前記核初期化因子には複数の変異型（バリアント）の存在が報告されており、これらの変異型遺伝子のコード領域も本発明に使用できる。野生型遺伝子のコード領域の塩基配列に人為的に１個又は数個、好ましくは１〜９個、より好ましくは１〜６個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列であって、野生型がコードする核初期化因子と同様の機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列も使用できる。
【００２２】
ＯＣＴ４は、ＰＯＵファミリーに属する転写因子で、多能性の維持又は未分化マーカーとして報告されている。本発明の核酸に含まれるＯＣＴ４遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２７０１．４に示される。例えば、ＯＣＴ４遺伝子のコード領域は、配列番号８の塩基番号１〜１０８１に示される塩基配列である。
また、マウスＯＣＴ４遺伝子のコード領域には、ｍＲＮＡの分解、及び翻訳の阻害によって標的遺伝子の発現を抑制するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるｍｉＲ−４７０の標的配列が存在し、分化した細胞においてこれらの標的遺伝子の発現を抑制している。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、ヒトＯＣＴ４遺伝子においても保存されていることが報告されている。遺伝子導入後にｍｉＲＮＡによる発現阻害が起こることを防ぐために、ＯＣＴ４遺伝子のコード領域に変異を導入してもよい。例えば、下記実施例の表２に示されるような変異を導入したＯＣＴ４遺伝子のコード領域が使用できる。この変異コード領域は、配列番号８の塩基番号１〜１０８１に示されるＯＣＴ４遺伝子のコード領域のうち、塩基番号３９３〜４１３（配列番号９の塩基配列）が配列番号１０に示される塩基配列に置換されている。
【００２３】
ＫＬＦ４は、腫瘍抑制因子又は発癌因子として機能する転写因子である。本発明の核酸に含まれるＫＬＦ４遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００４２３５．３に示される。例えば、ＫＬＦ４遺伝子のコード領域は、配列番号８の塩基番号１１４７〜２５５６に示される塩基配列である。
【００２４】
ＳＯＸ２は、Ｓｏｘ（ＳＲＹ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＨＭＧ  ｂｏｘ）遺伝子ファミリーに属し、ＤＮＡ結合能を持つＨＭＧドメイン及び転写活性化ドメインからなる転写因子である。本発明の核酸に含まれるＳＯＸ２遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００３１０６．２に示される。例えば、ＳＯＸ２遺伝子のコード領域は、配列番号８の塩基番号２６２３〜３５７３に示される塩基配列である。
また、マウスＳＯＸ２遺伝子のコード領域には、前記ＯＣＴ４と同様にｍｉＲ−１３４の標的配列が存在する。遺伝子導入後にｍｉＲＮＡによる発現阻害が起こることを防ぐために、ＳＯＸ２遺伝子のコード領域に変異を導入してもよい。例えば、下記実施例の表２に示されるような変異を導入したＳＯＸ２遺伝子のコード領域が使用できる。この変異コード領域は、配列番号８の塩基番号２６２３〜３５７３に示されるＳＯＸ２遺伝子のコード領域のうち、塩基番号３２４２〜３２６３の塩基配列（配列番号１１の塩基配列）が配列番号１２に示される塩基配列に置換されている。
【００２５】
ＬＩＮ２８は、ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡプロセシングを選択的に抑制するＲＮＡ結合タンパク質である。本発明の核酸に含まれるＬＩＮ２８遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０２４６７４．４に示される。例えば、ＬＩＮ２８遺伝子のコード領域は、配列番号８の塩基番号３６４０〜４２６６に示される塩基配列である。
【００２６】
ＮＡＮＯＧは、ホメオボックス転写因子である。本発明の核酸に含まれるＮＡＮＯＧ遺伝子のコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０２４８６５．２に示される。例えば、ＮＡＮＯＧ遺伝子のコード領域は、配列番号８の塩基番号４３３６〜５２５３に示される塩基配列である。
【００２７】
本発明の核酸は、ＭＹＣファミリー遺伝子を含まないことを特徴とする。がん遺伝子であるＭＹＣファミリー遺伝子を含まないので、本発明の核酸から発現する核初期化因子により、体細胞をより安全にリプログラミングすることができる。ＭＹＣファミリー遺伝子は、ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣが含まれる［ジャーナル  オブ  セル  サイエンス（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．）、第１１９巻、２０８−２１６頁、２００６年］。例えば、ｃ−ＭＹＣのコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２４６７、Ｎ−ＭＹＣのコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００５３７８、Ｌ−ＭＹＣのコード領域は、ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００５３７６に示される。
【００２８】
本発明の核酸に使用する自己切断ペプチドは、ウイルスの２Ａ又は２Ａ様配列から得ることが可能である。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）由来の２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）、ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ（ＰＴＶ−１）由来の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）及びＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａｖｉｒｕｓ（ＴａＶ）由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）から成る群から選択することができる。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＴ２Ａ、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＰ２Ａを使用することができる。２Ａペプチドは、エキスパート  オピニオン  オン  バイオロジカル  セラピー、第５巻、６２７−６３８頁、２００５年に総説されている。
【００２９】
本発明の核酸は複数の「自己切断ペプチドをコードする塩基配列」を含み得る。これらは、同じアミノ酸配列の自己切断ペプチドをコードするものであってもよく、異なるアミノ酸配列の自己切断ペプチドをコードするものであってもよい。同じアミノ酸配列の自己切断ペプチドコードするものであっても、塩基配列がそれぞれ異なっていてもよい。更に、本発明の核酸が発現される細胞のコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）に合わせて、塩基配列を改変させてもよい。例えば、配列番号２〜５に示される塩基配列を有するＴ２Ａをコードする配列、配列番号７に示される塩基配列を有するＰ２Ａをコードする配列に改変させてもよい。
【００３０】
更に、本発明の核酸は、核初期化因子の発現を確認するためのマーカーとなりうる遺伝子（例えば、薬剤耐性に関する因子をコードする遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）のコード領域を含みうる。
【００３１】
本発明の核酸は、適当なプロモーターの制御下で発現されるように別の核酸と連結して使用することができる。プロモーターとしては、構成的に発現を促進するもの、薬剤等（例えば、テトラサイクリン又はドキソルビシン）により誘導されるもの等のいずれも用いることができる。また、効率のよい転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列を含む核酸を連結してもよい。また、更に本発明の核酸に加えて、当該核酸の発現を確認するためのマーカーとなりうる遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）を組み込んでもよい。
【００３２】
本発明の核酸は、体細胞に導入するために、ベクターに挿入して使用することができる。本発明の核酸が挿入されるベクターには特に限定はなく、公知のベクターより適切なものを選択して使用することができる。例えば、ウイルスベクターを使用する方法、又は非ウイルスベクターを使用する方法のいずれもが本発明に使用できる。これらのベクターの詳細についてはすでに多くの文献が公表されており、これら多くの文献より適宜選択して使用すればよい。
【００３３】
上記のウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びシュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が使用できる。特に好適には、オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクターが使用できる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
また、上記の非ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知の非ウイルスベクター、例えば、プラスミドベクターが使用できる。
【００３４】
（２）本発明の多能性幹細胞の製造方法。
本発明の多能性幹細胞の製造方法は、前記（１）に記載する本発明の核酸又はベクターを体細胞に導入する工程を包含することを特徴とする。当該方法は、従来の複数種の核酸又はベクターを同時に体細胞に導入する方法と比べて、多能性幹細胞を高効率で製造することができ、本発明の核酸又はベクターを導入した細胞の約０．１〜２％が多能性幹細胞に誘導される。更に、本発明の方法で製造される多能性幹細胞は、導入される核酸又はベクターのコピー数が極めて少なく、導入された核酸又はベクターが染色体に組み込まれる場合、その安全性は飛躍的に向上する。また、本発明の方法によれば、少ない核酸量又は少ないベクター量で多能性幹細胞を含有する細胞集団の製造でき、極めて有用である。
【００３５】
本発明の方法に使用される体細胞に特に限定はなく、任意の体細胞を使用することができる。例えば、線維芽細胞、前駆脂肪細胞、肝細胞、血球細胞、皮膚角化細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞等の体細胞を使用することができる。前記の体細胞は生体より採取されたもの、又は細胞株として樹立されたもののどちらでもよい。作製された多能性幹細胞もしくは当該細胞より分化させた細胞を生体に移植することが望まれる場合には、その生体自身から採取された体細胞から多能性幹細胞を誘導することが好ましい。
【００３６】
本発明の方法において、核酸又はベクターを体細胞に導入する工程は、使用する体細胞及びベクターに応じて適宜操作することができる。非ウイルスベクターを使用する場合、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用して導入する方法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などで導入することができる。また、ウイルスベクターを使用する場合、核酸又はベクター導入の際に、導入効率を向上させる物質を用いることもできる。導入効率を向上させる物質としては、ウイルスベクターに結合する活性を有する物質、例えば、フィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントなどの物質が挙げられる。好適には、ヘパリン結合部位を有するフィブロネクチンフラグメント、例えば、レトロネクチン（登録商標、ＣＨ−２９６、タカラバイオ社製）として市販されているフラグメントを用いることができる。更に、本発明を特に限定するものではないが、前記の物質は、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターを使用する遺伝子導入に特に好適である。
【００３７】
従来、多能性幹細胞の誘導を目的としたレトロウイルスベクターによる遺伝子導入では、レトロウイルスの細胞への感染効率を向上させる作用を有する合成ポリカチオンであるポリブレンが使用されてきた。本発明者らは、ポリブレンを使用せず、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質の存在下で、レトロウイルスベクターを使用して本発明の核酸又はベクターを体細胞に導入した場合には、ポリブレンを使用した場合と比較して多能性幹細胞の誘導効率が向上する結果、高頻度で多能性幹細胞を取得できることを見出した。すなわち、本発明の１つの態様として、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質の存在下に本発明の核酸又はベクターを体細胞に導入する工程を包含することを特徴とする、多能性幹細胞の製造方法が提供される。
【００３８】
また、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質としては、当該活性を有する物質であれば特に問題はないが、例えば、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、前記のポリペプチドのフラグメント、ポリリジン、ＤＥＡＥ−デキストラン等が挙げられる。更に、前記物質由来のレトロウイルスに結合部位を有する機能性物質を本発明に使用することができる。フィブロネクチンフラグメントとしては分子内にヘパリン−ＩＩ結合領域を有するものが好適であり、そのようなフラグメントは、例えば国際公開第９７／１８３１８号パンフレットにも記載されている。ヘパリン−ＩＩ結合領域を有する組換えフィブロネクチンフラグメントとしては、レトロネクチン（登録商標、ＣＨ−２９６、タカラバイオ社製）が例示される。また、これらの機能性物質と機能的に同等な物質、例えば、ヘパリン結合性部位を有する機能性物質も使用することができる。また、該機能性物質の混合物、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体、該機能性物質の誘導体等を使用することができる。
【００３９】
更に、レトロウイルスに結合する活性とともに標的細胞、すなわち核酸又はベクターを導入しようとする体細胞への結合活性を有する機能性物質を併用してもよく、レトロウイルスに結合する活性を有する機能性物質及び標的細胞結合活性を有する機能性物質を併用してもよい。標的細胞結合活性を有する機能性物質にも、特に限定はないが、例えば、標的細胞に結合するリガンドを有する物質が挙げられる。該リガンドとしては、細胞接着性のタンパク質（フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン等）もしくはそのフラグメント、ホルモン、サイトカイン、細胞表面の抗原に対する抗体、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、糖タンパク質もしくは糖脂質由来の糖鎖、標的細胞の代謝物等が挙げられる。
【００４０】
本発明の好適な態様において、前記の機能性物質は適切な固相、例えば、細胞培養に使用される容器（プレート、シャーレ、フラスコもしくはバッグ等）又は担体（マイクロビーズ等）に固定化された状態で使用される。
【００４１】
本発明の核酸又はベクターを体細胞に導入する場合、フィーダー細胞上に培養された体細胞に対して導入を行ってもよいが、フィーダー細胞を使用することなく体細胞に導入を行ってもよい。フィーダー細胞としては、ＥＳ細胞の培養に用いられるフィーダー細胞を適宜使用することができるが、例えば、マウス１４〜１５日胚の繊維芽細胞初代培養細胞、繊維芽細胞由来細胞株であるＳＴＯ細胞等をマイトマイシンＣ等の薬剤又は放射線により処理した細胞等を使用することができる。本発明の核酸又はベクターを導入した体細胞の培養はフィーダー細胞上で行うことが好ましいが、フィーダー細胞を使用しないＥＳ細胞の培養方法も報告されており、本発明にて使用することができる。
【００４２】
本発明の核酸又はベクターを導入した体細胞を適切な条件下で培養することにより、自律的に核のリプログラミングが進行し、体細胞から多能性幹細胞を製造することができる。当該培養には、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞に使用可能な公知の培地を使用することができる。本発明の核酸又はベクターを体細胞に導入した後、体細胞が多能性を獲得して増殖するのに十分な時間にわたり細胞を培養することが好ましい。本発明の核酸又はベクターの導入後の体細胞の培養密度は、例えば、細胞培養用ディッシュあたり１×１０４〜１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で培養を継続することが好ましい。
【００４３】
本発明の核酸又はベクターを体細胞に導入する工程を実施してからＥＳ細胞用の培地に交換するまで、通常の体細胞を培養するための培地を使用して、例えば、１〜１２日間、好ましくは２〜１０日間培養することができる。その後ＥＳ細胞用培地に培地を交換して、例えば、５〜４０日間、好ましくは１０〜３５日間培養してもよい。
【００４４】
本発明の核酸又はベクターを導入した体細胞が多能性を獲得したことは、例えば、未分化細胞に特有のマーカー、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＡＢＣＧ−２、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ等を検出することにより容易に判定することができる。マーカーの種類及び判定手段については、公知文献により具体的かつ詳細に説明されている（例えば、セル、第１２６巻、６６３−６７６頁、２００６年、セル、第１３１巻、８６１−８７２頁、２００７年）。ＥＳ細胞特異的発現遺伝子のプロモーター下流にＧＦＰ等のマーカー遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する体細胞を使用した場合は、当該マーカー遺伝子の発現を指標として多能性幹細胞を特定することが可能である。また、一般的に、多能性の獲得はコロニー形成により判定することもできる。コロニーは通常５００〜１０００ｃｅｌｌｓの細胞集団であり、特徴的な外観を呈することが知られているので、多能性幹細胞が増殖して形成したコロニーを容易に特定することができる。
こうして得られた多能性幹細胞のコロニーを単離してクローニングを実施することにより、多能性を有しない細胞が除去された、多能性幹細胞の細胞株を樹立することができる。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例をもって本発明を更に具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに何ら限定されるものではない。【００４６】
調製例１  ２Ａペプチド連結型ｉＰＳ細胞誘導プラスミドｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳ、ｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＬ、ｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＮ、ｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＬＮ（Ｐ２Ａ）及びｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）プラスミドの構築
ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００４２３５．３（ＫＬＦ４遺伝子）及びＮＭ＿００３１０６．２（ＳＯＸ２遺伝子）の配列情報より、遺伝子増幅用合成プライマーをそれぞれ合成した。ＨｕｍａｎＢｒａｉｎＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社製）より合成したｃＤＮＡを鋳型とし、各核初期化因子の遺伝子に対応するプライマー対を用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＭＡＸ  ＰｒｅＭｉｘ（タカラバイオ社製）によりＰＣＲを行った。反応終了後、反応液を１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、ＫＬＦ４については約１．５ｋｂｐ、ＳＯＸ２については約１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを抽出、精製した。また、ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２７０１．４（ＯＣＴ４遺伝子）、ＮＭ＿０２４６７４．４（ＬＩＮ２８遺伝子）、ＮＭ＿０２４８６５．２（ＮＡＮＯＧ遺伝子）の配列情報により、ＯＣＴ４については約１．１ｋｂｐ、ＬＩＮ２８については約０．７ｋｂｐ、ＮＡＮＯＧについては約１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを化学的に合成した。【００４７】
Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ及びＰｏｒｃｉｎｅ  ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ−１由来の２Ａペプチド配列、Ｔ２Ａ及びＰ２Ａを、公知文献（ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第２２巻、第５号、５８９−９４頁、２００４年）より得た。Ｔ２Ａのアミノ酸配列を配列番号１に示す。Ｔ２Ａのアミノ酸配列に対して、ヒトのコドンに最適化した４種類の異なる塩基配列を設計し、それぞれＴ２Ａ１、Ｔ２Ａ２、Ｔ２Ａ３及びＴ２Ａ４と命名した。それぞれの塩基配列を配列番号２、３、４及び５に示す。また、Ｐ２Ａのアミノ酸配列を配列番号６に、塩基配列を配列番号７に示す。Ｔ２Ａ１、Ｔ２Ａ２、Ｔ２Ａ３、Ｔ２Ａ４及びＰ２Ａの塩基配列を有するＤＮＡフラグメントをそれぞれ合成した。【００４８】
前記の核初期化因子のコード領域由来のＤＮＡフラグメント及び２ＡペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを用いて、ベクターへのサブクローニング、ＰＣＲ、制限酵素消化及びライゲーション反応を繰り返し、核初期化因子のコード領域及び２ＡペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを５’末端から表１に記載される順に含むＤＮＡフラグメントを調製し、レトロウイルスベクターｐＤＯＮ−５  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）に挿入し、それぞれｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳ、ｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＬ、ｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＮ及びｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＬＮ（Ｐ２Ａ）と命名した。更に、ｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＬＮのＰ２ＡフラグメントをＴ２Ａ４フラグメントに置換したｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）を調製した。各挿入ＤＮＡフラグメントの構造を図１に示す。ｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）の挿入フラグメントの塩基配列を配列番号８に示す。【００４９】
【表１】
0005913984.tif 000002
【００５０】
調製例２  マイクロＲＮＡ回避型ｉＰＳ細胞誘導プラスミドの構築
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、メッセンジャーＲＮＡの分解と翻訳の阻害によって標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡである。マウスＯＣＴ４遺伝子のコード領域にはｍｉＲ−４７０の、マウスＳＯＸ２遺伝子のコード領域にはｍｉＲ−１３４の標的サイトがそれぞれ存在し、分化した細胞においてこれらの標的遺伝子の発現を抑制している。これらのｍｉＲＮＡ標的領域はヒトのＯＣＴ４及びＳＯＸ２遺伝子においても保存されていることが報告されている（ネイチャー、第４５５巻、１１２４−８頁、２００８年）。遺伝子導入後にｍｉＲＮＡによる発現阻害が起こることを防ぐために、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２をコードする領域に変異を導入した。変異の導入は、上記のＰＣＲ増幅により得られた１．１ｋｂｐのＯＣＴ４をコードするＤＮＡフラグメント及び約１ｋｂｐＳＯＸ２をコードするＤＮＡフラグメントを含むプラスミドベクターを鋳型とし、変異配列を有する変異導入プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物により大腸菌を形質転換することにより取得した。変異導入後のＤＮＡフラグメントをＯＣＴ４ｍｔ及びＳＯＸ２ｍｔと記載する。ＯＣＴ４ｍｔでは、ＯＣＴ４をコードするＤＮＡフラグメント中の配列番号９に示される塩基配列が、配列番号１０に示される塩基配列に変異している。また、ＳＯＸ２ｍｔではＳＯＸ２をコードするＤＮＡフラグメント中の配列番号１１に示される塩基配列が、配列番号１２に示される塩基配列に変異している。なお、ＯＣＴ４ｍｔ及びＳＯＸ２ｍｔは、本来のＯＣＴ４及びＳＯＸ２と同一のアミノ酸配列のポリペプチド配列をコードしている。変異導入前後の塩基配列を表２に示す。表２中、変異を導入した塩基を小文字で示す。【００５１】
【表２】
0005913984.tif 000003
【００５２】
ＯＣＴ４ｍｔ及びＳＯＸ２ｍｔをコードするＤＮＡフラグメントを使用し、調製例１と同様の方法で、５’末端から表３に記載される順に含むＤＮＡフラグメントを調製し、レトロウイルスベクターｐＤＯＮ−５  ＤＮＡに挿入し、ｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＬｍｔ及びｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＬＮｍｔを構築した。【００５３】
【表３】
0005913984.tif 000004
【００５４】
調製例３  レトロウイルスベクターの調製
（１）レトロウイルスベクターの産生
Ｇ３Ｔｈｉ細胞（タカラバイオ社製）を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ−ＤＭＥＭ［１０％牛胎児血清（インビトロジェン社製）及び５０Ｕ／ｍｌペニシリン／５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（ナカライ社製）含有Ｄ−ＭＥＭ（シグマ社製）］に懸濁し、その４ｍＬを６ｃｍコラーゲンコートディッシュ（イワキ社製）に播種して、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。【００５５】
５００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン社製）に１０μＬのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−２９３（タカラバイオ社製）を混合し、室温で５分放置後、２μｇのｐＧＰプラスミド（タカラバイオ社製）、１μｇのｐＥ−Ａｍｐｈｏプラスミド（タカラバイオ社製）及び２μｇの調製例１及び２で調製した各組換えプラスミドをそれぞれ加えて混合し、更に１５分間室温で放置した。この混合液を上記のＧ３Ｔｈｉ細胞に添加して培養を継続し、２４時間後に４ｍＬの１０Ｆ−ＤＭＥＭ培地に交換した。更に２４時間培養を継続した後、ウイルスを含む培地を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過してレトロウイルスベクターを含むウイルス液を調製した。ウイルス液は−８０℃で凍結保存し、使用時に室温にて溶解した。【００５６】
（２）レトロウイルスベクターの力価測定
得られたレトロウイルスベクターをＤＮａｓｅＩで処理した後、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｔｉｔｅｒ  Ｓｅｔ（ｆｏｒ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）（タカラバイオ社製）を用いて１ｍＬ当たりのウイルスＲＮＡコピー数を算出した。【００５７】
（３）ウイルス液の混合及び希釈
レトロウイルスは、調製例３−（２）で測定した力価に基づいて、特に記載のない限り３．５５×１０９コピー／ｍＬとなるよう１０Ｆ−ＤＭＥＭにて希釈した。なおコントロールとして、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２をＥｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ由来のＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ）を介してポリシストロニックに翻訳させるためのレトロウイルスベクターｐＤＯＮ−５  ＯＣＴ３／４−ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧをＩＲＥＳを介してポリシストロニックに翻訳させるためのレトロウイルスベクターｐＤＯＮ−５  ＬＩＮ２８−ＮＡＮＯＧ、及びＫＬＦ４を発現するレトロウイルスベクターｐＤＯＮ−５  ＫＬＦ４からなるＨｕｍａｎ  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（登録商標）  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｅｔ（タカラバイオ社製）を用いた。コントロールでは、各ウイルスが３．５５×１０９コピー／ｍＬとなるよう混合した。表４にベクター名と各ウイルス液の名称を示す。【００５８】
【表４】
0005913984.tif 000005
【００５９】
実施例１  ｉＰＳ細胞の誘導−１
（１）レトロネクチンの培養プレートへの固定化
ノントリートメント１２穴培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）の各ウェルに２０μｇ／ｍＬとなるように、リン酸緩衝水溶液（ＰＢＳ）で希釈したレトロネクチン（タカラバイオ社製）溶液を１ｍＬずつ添加し、４℃で一晩もしくは室温で２時間固定化を行った。その後、各ウェルより溶液を除去し、ＰＢＳで１回洗浄の後、各実験に供するまで４℃で保存した。【００６０】
（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
実施例１−（１）で調製したレトロネクチン固定化培養プレートの各ウェルに表４に示すウイルス液Ｂ、Ｄ、Ｄｍｔ及びＦを１ｍＬずつ添加し、３２℃、２、０００×ｇで２時間遠心した。その後、各ウェルより上清を除去して、１％ブミネート（献血アルブミン、バクスター社製）を含むＰＢＳで１回洗浄後、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ−ＤＭＥＭで懸濁したヒト成人皮膚繊維芽細胞（Ｌｏｎｚａ社製）を１ｍＬずつ各ウェルに播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養を開始した（培養０日目）。【００６１】
（３）フィーダー細胞上への播種
６穴培養プレート（コーニング社製）に終濃度１ｍｇ／ｍＬのゼラチン（シグマ社製）水溶液を各ウェル１ｍＬ添加し、３７℃３０分で固定化した。ここに終濃度１２μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（ナカライテスク社製）で処理したＳＴＯ細胞（ＤＳファーマ社製）を、各ウェル２．５×１０５ｃｅｌｌｓずつ播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで終夜培養することによりフィーダー細胞を調製した。実施例１−（２）で作製した培養６日目の遺伝子導入細胞を回収し１０Ｆ−ＤＭＥＭ培地に懸濁した。各ウェル２００００Ｃｅｌｌｓを前記のフィーダー細胞上に播種し、終夜培養した。翌日、培養７日目に上清を除去し、ＥＳ細胞用培地［８０％  Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（インビトロジェン社製）、２０％  ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）、４ｎｇ／ｍＬ  ｈｕｍａｎ  ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）、１×Ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｏｎｚａ社製）、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔｈａｍｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ社製）、１１０μＭ  ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社製）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン／５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン］を各ウェル２ｍＬ添加し、培養２８日目まで培養を継続した。この間、２日おきに培地を交換した。【００６２】
（４）ｉＰＳ細胞コロニーの計測
培養２８日目にＴＲＡＣＰ＆ＡＬＰ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）によってアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性をもつ細胞を染色した。ＡＰ活性を示しかつヒトＥＳ細胞様の形態を示すｉＰＳ細胞コロニー数を計測した。その結果を表５に示す。【００６３】
【表５】
0005913984.tif 000006
【００６４】
表５に示すように、核初期化因子を２Ａペプチドで接続した融合ポリペプチドをコードする遺伝子を保持するベクター（２Ａベクター）は、ＩＲＥＳを使用するベクターを混合して用いる従来の条件（ＩＲＥＳベクター）と比べ約２倍の効率でｉＰＳ細胞を誘導した（条件ＦとＤとの比較）。また、ｍｉＲＮＡの標的サイトに変異を導入したウイルスでは、本来の配列をもつウイルスと比べｉＰＳ細胞誘導効率が２倍近く上昇した（条件ＤとＤｍｔとの比較）。【００６５】
実施例２  遠心レトロネクチン法とポリブレン法の比較
レトロウイルスベクターによる遺伝子導入に関して、レトロネクチンあるいはポリブレンを使用する条件で多能性幹細胞の誘導を行い、比較した。【００６６】
（１）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入１回目
レトロネクチンの培養プレートへの固定化は、実施例１−（１）と同様の方法により行った。レトロネクチンによる遺伝子導入に関しては、表４に示すウイルス液Ｂ、Ｄ及びＦを用いて実施例１−（２）と同様の方法で行った。このとき、２回目の遺伝子導入のためのウイルスコートプレートも同時に調製し、細胞懸濁液の代わりに１％ブミネートを含むＰＢＳを添加し、４℃で保存した。ポリブレンによる遺伝子導入に関しては、以下の方法で行った。すなわち、培養１日前に１２穴培養プレートに、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０Ｆ−ＤＭＥＭで懸濁したヒト皮膚繊維芽細胞を１ｍＬずつ各ウェルに播種し、１日培養した。その後、細胞培養プレートより上清を除去し、ウイルス液Ｂ、Ｄ及びＦに終濃度８μｇ／ｍＬとなるようにポリブレン（ヘキサジメトリン・ブロミド；アルドリッチ社製）をそれぞれ加えた調製液を各ウェルに１ｍＬ添加し、培養を開始した（培養０日目）。【００６７】
（２）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入２回目
２回目の遺伝子導入を培養１日目に行った。レトロネクチンによる遺伝子導入に関しては、前日遺伝子導入を行った細胞を剥離し、１０Ｆ−ＤＭＥＭに懸濁した後、実施例２−（１）で調製したウイルスコートプレートの各ウェルに播種した。ポリブレンによる感染については、前日遺伝子導入を行った細胞上清を除去し、実施例２−（１）と同様にポリブレンを混合して調製したウイルス液を添加し、培養を継続した。いずれの感染法においても、翌日上清を除去し１０Ｆ−ＤＭＥＭ培地を１ｍＬ添加して培養を継続した。【００６８】
（３）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例１−（３）と同様の方法によりフィーダー細胞上に播種し、培養を継続した。【００６９】
（５）ｉＰＳ細胞コロニーの計測
培養２７日目に実施例１−（４）と同様の方法によりｉＰＳ細胞コロニー数を計測した。その結果を表６に示す。【００７０】
【表６】
0005913984.tif 000007
【００７１】
表６に示すように、いずれのレトロウイルスベクターの組合わせにおいても、レトロネクチン感染法の方がポリブレン感染法に比べ、飛躍的に効率よくｉＰＳ細胞を誘導することが示された。また従来のＩＲＥＳベクターと比べて、２Ａベクターの方が効率よくｉＰＳ細胞を誘導できることが再度確認された。【００７２】
実施例３  ウイルス量の比較
２Ａベクターを用いることによって効率よくｉＰＳ細胞を誘導できることが明らかになったため、更に少量のウイルスによるｉＰＳ細胞誘導を試みた。【００７３】
（１）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
レトロネクチンの培養プレートへの固定化は、実施例１−（１）と同様の方法により行った。レトロネクチンによる遺伝子導入は、表４に示すウイルス液Ｄ又はＦを用い、実施例２−（１）及び（２）と同様の方法により２回行った。ただし、ウイルス量については３．５５×１０９コピー／ｍＬあるいは３．５５×１０８コピー／ｍＬの２条件を設定した。【００７４】
（２）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例１−（３）と同様の方法によりフィーダー細胞上に播種し、培養を継続した。ただし、フィーダーにはＳＮＬ７６／７細胞（ＤＳファーマ社製）を用いた。【００７５】
（３）ｉＰＳ細胞コロニーの計測
培養２６日目に実施例１−（４）と同様の方法によりｉＰＳ細胞コロニー数を計測した。その結果を表７に示す。ただし、Ｎ．Ｔで示す条件については試験を行わなかった。【００７６】
【表７】
0005913984.tif 000008
【００７７】
表７に示すように、ウイルス量を減らしても効率よくｉＰＳ細胞を誘導できることが示された。また、従来のＩＲＥＳベクターと比べて、２Ａベクターの方が効率よくｉＰＳ細胞を誘導できることが再度確認された。【００７８】
実施例４  レトロネクチンとポリブレンの比較−２
実施例２について再試を行うとともに、使用遺伝子の検討を行った。【００７９】
（１）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
レトロネクチンの培養プレートへの固定化は、実施例１−（１）と同様の方法により行った。レトロネクチンもしくはポリブレンによる遺伝子導入は、表４に示すウイルス液Ａ、Ｂ、Ｂｍｔ、Ｃ、Ｄ、Ｄｍｔ及びＦを用い、実施例２−（１）及び（２）と同様の方法により２回行った。【００８０】
（２）フィーダー細胞上への播種
培養７日目に実施例１−（３）と同様の方法によりフィーダー細胞上に播種し、培養を継続した。ただし、フィーダーにはＳＮＬ７６／７細胞（ＤＳファーマ社製）を用いた。【００８１】
（３）ｉＰＳ細胞コロニーの計測
培養３１日目に実施例１−（４）と同様の方法によりｉＰＳ細胞コロニー数を計測した。その結果を表８に示す。【００８２】
【表８】
0005913984.tif 000009
【００８３】
表８に示すように、ポリブレンによる感染と比べ、レトロネクチンを用いた場合に、はるかに効率よくｉＰＳ細胞を誘導できることが再度確認された。使用遺伝子については、５遺伝子を用いた場合に４遺伝子あるいは３遺伝子を用いた条件と比べ効率がよく、４遺伝子の場合ではＬＩＮ２８の方がＮａｎｏｇより重要であることが示唆された。ｍｉＲＮＡ変異については、ｉＰＳ細胞の誘導効率を上昇させることが再度確認された。【００８４】
実施例５  ＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）ベクターの検討
ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧ遺伝子のコード領域を、実施例１から４で用いたＰ２ＡフラグメントではなくＴ２Ａ４フラグメントにて連結したベクターを用いて、多能性幹細胞を誘導した。更に、ウイルス凍結回数についても検討した。【００８５】
（１）レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
レトロネクチンの培養プレートへの固定化は、実施例１−（１）と同様の方法により行った。レトロネクチンもしくはポリブレンによる遺伝子導入は、表４に示すウイルス液Ｄ、Ｅ及びＦを用い、実施例２−（２）と同様の方法により１回行った。同一ロットのウイルス液Ｅは、−８０℃にて１〜５回凍結融解操作を行った。ウイルス液Ｄ及びＦについては、１回凍結させたウイルスを用いた。【００８６】
（２）フィーダー細胞上への播種
培養６日目に実施例１−（３）と同様の方法によりフィーダー細胞上に播種し、培養を継続した。ただし、フィーダーにはＳＮＬ７６／７細胞（ＤＳファーマ社製）を用いた。【００８７】
（３）ｉＰＳ細胞コロニーの計測
培養３０日目に実施例１−（４）と同様の方法によりｉＰＳ細胞コロニー数を計測した。その結果を表９に示す。ただし、Ｎ．Ｔで示す条件については試験を行わなかった。【００８８】
【表９】
0005913984.tif 000010
【００８９】
表９に示すように、ｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）はｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＬＮ（Ｐ２Ａ）と同様に、非常に効率よく多能性幹細胞を誘導した。また、ポリブレンによる感染と比べ、レトロネクチンを用いた場合にはるかに効率よく多能性幹細胞を誘導できることが再度確認された。更に、ｐＤＯＮ５−ｈＯＫＳＬＮ（Ｔ２Ａ）を含むウイルス液は、凍結を５回まで行っても多能性幹細胞の誘導効率を大きく低下させることはなく、非常に実用的であることが示された。【００９０】
実施例６  プロウイルスコピー数の計測
実施例１及び実施例４で誘導した多能性幹細胞のうち、レトロネクチンを使用した条件Ｄ及びＦで誘導された多能性幹細胞コロニーを顕微鏡下でそれぞれ採取し、２４ウェルプレートに継代することでクローン化した。各クローンは拡大培養を行った後で、ゲノムＤＮＡを抽出した。【００９１】
（１）ゲノム抽出
６ウェルプレートの１ウェルにてコンフルエントになった多能性幹細胞クローンを、ＥＳ細胞剥離液（２０％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶ、０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ）で回収し、ＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノム抽出を行った。【００９２】
（２）リアルタイムＰＣＲ
多能性幹細胞クローンのゲノムに挿入されたプロウイルスコピー数は、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ（登録商標）  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲによって算出した。Ｐｒｏｖｉｒｕｓ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ，Ｈｕｍａｎ（ｆｏｒ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）（タカラバイオ社製）に付属のプライマーセット及びＤＮＡコントロール  テンプレートを用いて、実施例６−（１）で抽出したゲノムＤＮＡ２００ｎｇあたりのプロウイルスコピー数及びヒトＩＦＮγコピー数をそれぞれ算出し、（レトロウイルスコピー数）／（ヒトＩＦＮγコピー数）×２によって１細胞あたりの挿入レトロウイルスコピー数を得た。その結果を表１０に示す。【００９３】
【表１０】
0005913984.tif 000011
【００９４】
表１０に示すように、２ＡベクターはＩＲＥＳベクターと比べて、ゲノムへの挿入ＤＮＡフラグメント数が少ないにもかかわらず、多能性幹細胞を誘導できた。ゲノムに組み込まれたＤＮＡフラグメントのコピー数が少ないことは、安全性の面で極めて有用である。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明により、多能性幹細胞を効率よく製造するための核酸が提供される。当該核酸は、多能性幹細胞を効率よくかつ安全に製造する方法に使用され、基礎研究、医療への応用研究分野等において極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
SEQ ID NO:1:T2A peptide fragment
SEQ ID NO:2:Nucleotide sequence of T2A1 DNA fragment
SEQ ID NO:3:Nucleotide sequence of T2A2 DNA fragment
SEQ ID NO:4:Nucleotide sequence of T2A3 DNA fragment
SEQ ID NO:5:Nucleotide sequence of T2A4 DNA fragment
SEQ ID NO:6:P2A peptide fragment
SEQ ID NO:7:Nucleotide sequence of P2A DNA fragment
SEQ ID NO:8:Nucleotide sequence of pDON-hOKSLN(T2A) insertion fragment
SEQ ID NO:9:Nucleotide sequence for a portion of native OCT4 gene.
SEQ ID NO:10:Nucleotide sequence for a portion of mutant OCT4 gene.
SEQ ID NO:11:Nucleotide sequence for a portion of native SOX2 gene.
SEQ ID NO:12:Nucleotide sequence for a portion of mutant SOX2 gene.
【図１】
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【配列表】
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