(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を減少させた目標タンパク質調製物を、目標タンパク質及び少なくとも１種のＨＣＰを含む試料混合物から生成するための方法であって、前記方法は、
（ａ）前記試料混合物のラマン分光分析を実施するステップ；
（ｂ）親和性クロマトグラフィー樹脂がこの飽和結合容量の約５０％−１００％までローディングされるように、前記試料混合物を該樹脂に接触させるステップ；
（ｃ）クロマトグラフィー試料を回収するステップ；及び
（ｄ）前記クロマトグラフィー試料のラマン分光分析を実施して、前記クロマトグラフィー試料がＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物であることを確認するステップであって、該目標タンパク質が抗体又はその抗原結合部分であるステップ
を含む方法。
【請求項２】
試料混合物を、イオン交換クロマトグラフィー樹脂及び疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される追加的なクロマトグラフィー樹脂にかける、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目標タンパク質が、ポリクローナル抗体；ヒトモノクローナル抗体；ヒト化モノクローナル抗体；キメラモノクローナル抗体；一本鎖抗体；Ｆａｂ抗体フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント；Ｆｄ抗体フラグメント；Ｆｖ抗体フラグメント；及びダイアボディーからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
クロマトグラフィー樹脂が、入口及び出口バルブを含む流体管により分離された一連の流体接続されたカラムに充填されており、ここで、流体接続されたカラムの数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２本のカラムからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
最長０．５、最長１、最長２、最長３、最長４、最長５、最長６、最長７、最長８、最長９、最長１０、最長１１及び最長１２分からなる群から選択される滞留時間を得るように、試料混合物をクロマトグラフィー樹脂に接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
試料混合物との接触前にクロマトグラフィー樹脂を平衡化するステップ及び試料混合物との接触後にクロマトグラフィー樹脂を洗浄するステップをさらに含み、ここで、平衡化緩衝液及び洗浄緩衝液は同一の緩衝液である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）の後、及びステップ（ｃ）の前に、クロマトグラフィー樹脂洗浄ステップ、溶離ステップ及び再生ステップをさらに含み、ここで、試料をクロマトグラフィー樹脂に接触させるステップが方法の時間の２０％から８０％であるように保つために、クロマトグラフィー樹脂洗浄ステップ、溶離ステップ及び再生ステップを計算及びプログラムすることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
親和性クロマトグラフィー樹脂がタンパク質Ａを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗体又はその抗原結合部分がアダリムマブである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容全体を参照により本明細書に組み込む、２０１１年９月２０日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６１／３８４，６２０の出願日の利益を主張する。
【０００２】
１．序文
本発明は、改善された疑似移動床（「ＳＭＢ」）分離ストラテジー、及び特定の実施形態においてはラマン分光法を使用する、抗体、例えばモノクローナル抗体（「ｍＡｂｓ」）のクロマトグラフィー精製のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
2．発明の背景
タンパク質精製ストラテジーは、最終精製タンパク質調製物から宿主細胞タンパク質（「ＨＣＰ」）を排除するために、１つ又は複数のクロマトグラフィー分離ステップを一般的に使用する。このようなクロマトグラフィー分離ステップは、伝統的に、「バッチモード」で実施されており、これは、特定のクロマトグラフィー支持体を充填した単一カラムが、逐次的に、平衡化され、ローディングされ、洗浄され、溶離され、次いで再生される。バッチモードクロマトグラフィーは、カラムをこの飽和容量までローディングするのではなくカラムの動的容量までしかローディングしないことに依存しており、ローディング及び分離の各サイクルは、カラムの実際の結合容量のわずか３０％から５０％の使用しかしていない。従って、バッチモード分離は、カラムがこれらの飽和容量で操作された場合に必要とされるであろうよりも２倍から３倍の容量を有するカラムの使用を必要とする。従って、カラムの実際の結合容量の３０％−５０％しか利用しないことによって、バッチモードクロマトグラフィーは、著しく大量のクロマトグラフィー分離支持体の使用を必要とし、ローディング及び分離の各サイクルを完了するために必要な時間を延ばし、これは、タンパク質精製に関連するコストを実質的に増加させる。さらに、分離が飽和容量で実施された場合に必要であろうよりも２から３倍の容量を有するカラムの使用は、単一の分離サイクルに使用される平衡化緩衝液、洗浄緩衝液及び溶離緩衝液の量の著しい増加をもたらし、追加のコスト及び時間非効率をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前述のことの観点から、治療抗体を含むタンパク質をより効率的に精製するための改善された方法の当技術分野におけるニーズが存在する。本発明は、タンパク質の精製に改善された疑似移動床分離ストラテジーを組み込むことによって、このニーズに取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
３．発明の要旨
特定の実施形態において、本発明は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を減少させた目標タンパク質調製物を、目標タンパク質及び少なくとも１種のＨＣＰを含む試料混合物から生成する方法を対象とする。特定の実施形態において、本発明の方法は、樹脂が、この飽和結合容量の約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超及び約９０％超を含む約５０％−１００％までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含み、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記ＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物を含む。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる１種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び／又は決定するために使用される。
【０００６】
本発明の特定の実施形態は、樹脂が、この飽和結合容量の約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超及び約９０％超を含む約５０％−１００％までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含むＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成を対象とし、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記ＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物並びに親和性クロマトグラフィー樹脂、イオン交換クロマトグラフィー樹脂及び疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂からなる群から選択されるクロマトグラフィー樹脂を含む。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる１種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び／又は決定するために使用される。
【０００７】
本発明の特定の実施形態は、樹脂が、この飽和結合容量の約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超及び約９０％超を含む約５０％−１００％までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含むＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成を対象とし、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記ＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物を含み、目標タンパク質は、酵素；ペプチドホルモン；ポリクローナル抗体；ヒトモノクローナル抗体；ヒト化モノクローナル抗体；キメラモノクローナル抗体；一本鎖抗体；Ｆａｂ抗体フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント；Ｆｄ抗体フラグメント；Ｆｖ抗体フラグメント；単離ＣＤＲ；ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）；ＤＶＤ；及び免疫接着物質からなる群から選択される。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる１種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び／又は決定するために使用される。
【０００８】
本発明の特定の実施形態は、樹脂が、この飽和結合容量の約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超及び約９０％超を含む約５０％−１００％までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含むＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成を対象とし、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記ＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物を含み、クロマトグラフィー樹脂は、流体管により分離された一連の流体接続されたカラムに充填されており、ここで、流体接続されたカラムの数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２本の個別カラムからなる群から選択される。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる１種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び／又は決定するために使用される。
【０００９】
本発明の特定の実施形態は、樹脂が、この飽和結合容量の約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超及び約９０％超を含む約５０％−１００％までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含むＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成を対象とし、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記ＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物を含み、クロマトグラフィー樹脂は、流体管により分離された一連の少なくとも２個の流体接続されたカラムに充填されており、ここで、カラムは、緩衝液、例えば平衡化緩衝液、洗浄緩衝液及び溶離緩衝液の導入並びに溶離液の回収を可能にする流体管により分けられている。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる１種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び／又は決定するために使用される。
【００１０】
本発明の特定の実施形態は、樹脂が、この飽和結合容量の約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超及び約９０％超を含む約５０％−１００％までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ、並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含むＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成を対象とし、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記ＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物を含み、試料混合物を、約０．５から約１２分の範囲から選択される滞留時間を得るためにクロマトグラフィー樹脂と接触させ、一実施形態において、これは、最長約０．５、最長約１、最長約２、最長約３、最長約４、最長約５、最長約６、最長約７、最長約８、最長約９、最長約１０、最長約１１及び最長約１２分からなる群から選択することができる。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる１種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び／又は決定するために使用される。
【００１１】
本発明の特定の実施形態は、樹脂が、この飽和結合容量の約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超及び約９０％超を含む約５０％−１００％までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含むＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成を対象とし、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記ＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物を含み、該方法は、試料混合物との接触前にクロマトグラフィー樹脂を平衡化するステップ及び試料混合物との接触後にクロマトグラフィー樹脂を洗浄するステップをさらに含み、ここで、平衡化緩衝液及び洗浄緩衝液は、同一の緩衝液である。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる１種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び／又は決定するために使用される。
【００１２】
本発明の特定の実施形態は、樹脂が、この飽和結合容量の約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超及び約９０％超を含む約５０％−１００％までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含むＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成を対象とし、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記ＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物を含み、該方法は、クロマトグラフィー樹脂洗浄及び再生ステップをさらに含み、ここで、このようなステップは、試料をクロマトグラフィー樹脂に接触させるステップが、方法の時間の約２０％から約８０％であるように維持するために計算及びプログラミングすることができ、一つの特定の実施形態において、これは約５０％である。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる１種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び／又は決定するために使用される。
【００１３】
４．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】通常のクロマトグラフィー流れ図対疑似移動床クロマトグラフィー流れ図である。
【図２】通常のクロマトグラフィー流れ図である。
【図３】疑似移動床クロマトグラフィー流れ図である。
【図４】ｍＡｂ  Ｘの疑似移動床クロマトグラフィー事例研究の結果を表すクロマトグラムである。
【図５】ｍＡｂ  Ｘの疑似移動床クロマトグラフィー事例研究の生成物回収及び生成物品質分析である。
【図６】ｍＡｂ  Ｙの疑似移動床クロマトグラフィー事例研究の結果を表すクロマトグラムである。
【図７】ｍＡｂ  Ｙの疑似移動床クロマトグラフィー事例研究の生成物回収及び生成物品質分析である。
【図８】ｍＡｂ  Ｘの疑似移動床クロマトグラフィー事例研究に関係するｍＡｂ  Ｘ％ブレイクスルー分析である。
【図９】ｍＡｂ  Ｙの疑似移動床クロマトグラフィー事例研究に関係するｍＡｂ  Ｙ％ブレイクスルー分析である。
【図１０】パイロット規模の疑似移動床クロマトグラフィー流れ図である。
【図１１】アミノ酸、ｐＨ緩衝液種及び糖を含む３成分（アルギニン／クエン酸／トレハロース）緩衝液系のラマンスペクトルである。プロットは、Ｕｍｅｔｒｉｃｓ  ＳＩＭＣＡ  Ｐ＋Ｖ  １２．０．１．０．を使用して作製した。Ｘ軸は、データポイント番号である。各データポイントは、ラマンシフト波数である。これは、Ｘ軸上にラマンシフト波数（ｃｍ−１）を用いて再プロットすることができる。データは、波数１８００（＝Ｎｕｍ  ０）で始まり８００（＝Ｎｕｍ  １０００）で終わる。ラマンスペクトル生データは、（散乱光子の数に関しての）強度の単位で示されている。この図は、（水中の）三つの個別成分の平均を中心としたスペクトルデータを示している。スペクトルの平均値は、０である。他の値は、これとの比較であり、平均からの標準偏差内にある。
【図１２】ランダムな値を用いた３成分緩衝液系（アルギニン／クエン酸／トレハロース）についての実測対予測濃度の比較である。この図は、新しい溶液の濃度を予測するために既存モデルを使用して作った。ｘ軸及びｙ軸は濃度（ｍＭ）である。
【図１３】個別成分による３成分緩衝液系（アルギニン／クエン酸／トレハロース）についての実測対予測濃度の比較である。
【図１４】４成分緩衝液系（マンニトール／メチオニン／ヒスチジン／Ｔｗｅｅｎ（商標））の純粋成分生スペクトルである。ｙ軸は、スペクトル強度であり、ｘ軸は、波数ｃｍ−１である。
【図１５】４成分緩衝液系（マンニトール／メチオニン／ヒスチジン／Ｔｗｅｅｎ（商標））の純粋成分生スペクトルである。ｙ軸は、スペクトル強度であり、ｘ軸は、波数ｃｍ−１である。図５は、図４に示されたスペクトルのより詳細な見方であり、ここで、「指紋」領域は、拡張されている。
【図１６】４成分緩衝液系（マンニトール／メチオニン／ヒスチジン／Ｔｗｅｅｎ（商標））の純粋成分ＳＮＶ／ＤＹＤＸ／平均中心スペクトルである。図６に示されたデータは、全ての前処理：強度正常化のための標準正常変量（ＳＮＶ）、基線正常化のための一次誘導体及びスケーリングのための平均中心化の後の図４−５に示された同一データに基づく。
【図１７】ランダムな値を用いた４成分緩衝液系（マンニトール／メチオニン／ヒスチジン／Ｔｗｅｅｎ（商標））の実測対予測濃度の比較である。これは、新しい溶液の濃度を予測するために既存モデルを使用して作った。
【図１８】個別成分による３成分緩衝液系（マンニトール／メチオニン／ヒスチジン／Ｔｗｅｅｎ（商標））についての実測対予測濃度の比較である。
【図１９】タンパク質を含む３成分緩衝液系（マンニトール／メチオニン／ヒスチジン／アダリムマブ）の純粋成分生スペクトルであり、生スペクトルは、ラマン強度を示す。
【図２０】指紋領域（８００−１７００ｃｍ−１）が詳細に示されたタンパク質を含む３成分緩衝液系（マンニトール／メチオニン／ヒスチジン／アダリムマブ）の純粋成分生スペクトルである。
【図２１】タンパク質を含む３成分緩衝液系の純粋成分ＳＮＶ／ＤＹＤＸ／平均中心である。図１１に示されたデータは、全ての前処理：強度正常化のための標準正常変量（ＳＮＶ）、基線正常化のための一次誘導体及びスケーリングのための平均中心化の後の図９−１０に示された同一データに基づく。
【図２２】個別成分によるタンパク質を含む３成分緩衝液系についての実測対予測濃度の比較である。
【図２３】プロセス及び／又は品質管理の一部としてラマン分光法を使用するアダリムマブ精製プロセスである。
【図２４】緩衝液、糖及びアミノ酸（メチオニン／マンニトール／ヒスチジン）の３成分混合物を含むダイアフィルトレーションプロセスのオンラインラマン濃度予測である。
【図２５】緩衝液、糖及びアミノ酸（メチオニン／マンニトール／ヒスチジン）の３成分混合物を含む反復ダイアフィルトレーションプロセスである。追加のデータポイントは、解像度増加のために含まれた。
【図２６】糖（マンニトール）／タンパク質（アダリムマブ）溶液のラマン検定である。
【図２７】水中の抗体が、糖／タンパク質（マンニトール／アダリムマブ）溶液を提供するためにマンニトール溶液で置き換えられるダイアフィルトレーション緩衝液交換プロセスのオンラインラマン濃度予測である。交換された緩衝液にタンパク質濃縮が行われる。
【図２８】図２７に記載された実験の反復であり、ここで、タンパク質濃縮相は、１８０ｇ／Ｌに拡張された。
【図２９】ヒスチジン及びアダリムマブ溶液のラマン検定である。
【図３０】水中のタンパク質が、ヒスチジン溶液で置き換えられるダイアフィルトレーション緩衝液交換プロセスのオンラインラマン濃度予測である。交換されたヒスチジンにアダリムマブ濃縮が行われる。
【図３１Ａ】個別成分：Ａ．トリスの濃度；Ｂ．アセテートの濃度；及びＣ．アダリムマブの濃度によるタンパク質を含む２成分緩衝液系についての実測対予測濃度の比較である。
【図３１Ｂ】個別成分：Ａ．トリスの濃度；Ｂ．アセテートの濃度；及びＣ．アダリムマブの濃度によるタンパク質を含む２成分緩衝液系についての実測対予測濃度の比較である。
【図３１Ｃ】個別成分：Ａ．トリスの濃度；Ｂ．アセテートの濃度；及びＣ．アダリムマブの濃度によるタンパク質を含む２成分緩衝液系についての実測対予測濃度の比較である。
【図３２Ａ】個別成分：Ａ．Ｔｗｅｅｎ（商標）の濃度；及びＢ．アダリムマブの濃度によるタンパク質を含む１成分緩衝液系についての実測対予測濃度の比較である。
【図３２Ｂ】個別成分：Ａ．Ｔｗｅｅｎ（商標）の濃度；及びＢ．アダリムマブの濃度によるタンパク質を含む１成分緩衝液系についての実測対予測濃度の比較である。
【図３３】２種の抗体（Ｄ２Ｅ７及びＡＢＴ−８７４）が、非修飾タンパク質（ＰＩＣＵＰ）の光誘起架橋を使用して別々に集合された場合に使用された条件である。抗体は、０−４時間、集合光源に曝した。
【図３４】図３３に概要が記載された架橋のサイズ排除クロマトグラフィー結果である。
【図３５】Ｄ２Ｅ７試料の主成分分析を使用して模擬実験したラマン分光法及びスペクトルであり、集合試料は、明確な主成分の根拠を有し、ラマン分光法を使用して集合体から識別し得ることを示している。
【図３６】ＡＢＴ−８７４試料の主成分分析を使用して模擬実験したラマン分光法及びスペクトルであり、集合試料は、明確な主成分の根拠を有し、ラマン分光法を使用して集合体から識別し得ることを示している。
【図３７Ａ】（Ａ）Ｄ２Ｅ７試料及び（Ｂ）ＡＢＴ−９７４試料の部分的最小二乗解析を使用して模擬実験したラマン分光法及びスペクトルであり、ラマン分光法の結果及びＳＥＣ測定の間のいくつかの相関関係を示している。
【図３７Ｂ】（Ａ）Ｄ２Ｅ７試料及び（Ｂ）ＡＢＴ−９７４試料の部分的最小二乗解析を使用して模擬実験したラマン分光法及びスペクトルであり、ラマン分光法の結果及びＳＥＣ測定の間のいくつかの相関関係を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
５．発明の詳細な説明
本発明は、改善された疑似移動床分離ストラテジーを使用する抗体、例えばモノクローナル抗体などのクロマトグラフィー精製のための組成物及び方法に関する。明確にするためにまた限定するものでなく、この詳細な説明は、以下の下位部分に分けられる。
５．１．定義；
５．２．抗体の作製；
５．３．抗体の生成；
５．４．抗体の精製；
５．５．例示的精製ストラテジー；及び
５．６．ラマン分光法
【００１６】
５．１．定義
用語「抗体」には、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子が含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＨＣＶＲ又はＶＨと短縮される）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３種のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＬＣＶＲ又はＶＬと短縮される）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１種のドメイン、ＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域がちりばめられている相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに再分割することができる。各ＶＨ及びＶＬは、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配列された３種のＣＤＲ及び４種のＦＲからなる。
【００１７】
抗体の用語「抗原結合部分」（又は「抗体部分」）は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体のフラグメントを含む。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって果たされ得ることが示された。抗体の用語「抗原結合部分」に包含される結合フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２種のＦａｂフラグメントからなる二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（その全体の教示を参照により本明細書に組み込むＷａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖフラグメントの二つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、その中でＶＬ及びＶＨ領域が一対になって一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてこれらが作られることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用して、これらは、結合することができる（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、それらの全体の教示を、参照により本明細書に組み込むＢｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３を参照されたい。）。このような一本鎖抗体は、同様に、抗体の用語「抗原結合部分」に包含されるよう意図されている。一本鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディーなども、同様に包含される。ダイアボディーは、それらの中で、ＶＨ及びＶＬドメインが、単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同一鎖上の２種のドメインの間で一対になることを可能にするには短すぎるリンカーを使用するので、従って、該ドメインが別の鎖の補足ドメインと一対になり、２種の抗原結合部位を生成するよう強制される、二価の二重特異性抗体である（例えば、それらの全体の教示を参照により本明細書に組み込むＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照されたい。）。さらに、抗体又はこの抗原結合部分は、抗体又は抗体部分の１種又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有結合によって形成される、より大きな免疫接着分子の部分であってもよい。このような免疫接着分子の例は、四量体ｓｃＦｖ分子を生成するためのストレプトアビジンコア領域の使用（その全体の教示を、参照により本明細書に組み込むＫｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）及び二価及びビオチン化ｓｃＦｖ分子を生成するためのシステイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（その全体の教示を、参照により本明細書に組み込む��ｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）を含む。抗体部分、例えばＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントなどは、通常の技術、例えば全抗体のそれぞれパパイン又はペプシン消化などを使用して全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は、本明細書に記載された標準の組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる。一態様において、抗原結合部分は、完全ドメイン又は完全ドメインの対である。
【００１８】
用語「カバットナンバリング（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）」、「カバット定義（Ｋａｂａｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）」及び「カバット標識（Ｋａｂａｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）」は、本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、当技術分野で認められているが、抗体又はこの抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域における他のアミノ酸残基に比べてより可変である（すなわち、超可変である）アミノ酸残基に番号付与するシステムを意味する（Ｋａｂａｔら（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１及びＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、これらの全体の教示を、参照により本明細書に組み込む。）。重鎖可変領域について、超可変領域は、ＣＤＲ１についてアミノ酸位置３１から３５、ＣＤＲ２についてアミノ酸位置５０から６５及びＣＤＲ３についてアミノ酸位置９５から１０２の範囲に及ぶ。軽鎖可変領域について、超可変領域は、ＣＤＲ１についてアミノ酸位置２４から３４、ＣＤＲ２についてアミノ酸位置５０から５６及びＣＤＲ３についてアミノ酸位置８９から９７の範囲に及ぶ。
【００１９】
用語「ヒト抗体」には、Ｋａｂａｔらによって記載されたヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変及び定常領域を有する抗体が含まれる（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい。）。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ及び特にＣＤＲ３に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異によって又はインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含んでもよい。突然変異は、選択的突然変異アプローチを使用して導入することができる。ヒト抗体は、少なくとも１個の位置を、アミノ酸残基、例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされない活性増強アミノ酸残基で置換させることができる。ヒト抗体は、最大２０個の位置を、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の一部ではないアミノ酸残基で置換させることができる。他の実施形態において、最大１０個、最大５個、最大３個又は最大２個の位置が置換される。一実施形態において、これらの置換は、ＣＤＲ領域内である。しかし、本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、他の哺乳類種、例えばマウスなどの生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むよう意図されていない。
【００２０】
語句「組換えヒト抗体」には、組換え手段によって調製、発現、生成又は単離された抗体、例えば宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換え組合せヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入した動物（例えば、マウス）から単離された抗体（その全体の教示を参照により本明細書に組み込むＴａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照されたい。）或いはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、生成又は単離された抗体が含まれる。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい。）。しかし、特定の実施形態において、このような組換えヒト抗体を、インビトロ突然変異生成にかけ（又は、ヒトＩｇ配列を遺伝子導入した動物が使用される場合、インビボ体細胞変異）、従って、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー中に自然に存在し得ない配列である。しかし、特定の実施形態において、このような組換え抗体は、選択的突然変異アプローチ又は復帰突然変異又は両方の結果である。
【００２１】
「単離抗体」には、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体が含まれる（例えば、特定の標的に特異的に結合し、特定の標的以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない単離抗体）。特定のヒト標的に特異的に結合する単離抗体は、他の種からの同じ標的に結合し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化合物を実質的に含まないこともある。
【００２２】
本明細書で使用される用語「Ｋｏｆｆ」は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離の解離速度定数を意味するよう意図されている。
【００２３】
本明細書で使用される用語「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を意味するよう意図されている。
【００２４】
語句「核酸分子」には、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子が含まれる。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってよいが、一態様において、二本鎖ＤＮＡである。
【００２５】
抗体又は抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関して本明細書で使用される語句「単離核酸分子」は、例えば、特定の標的に結合するものであり、その中で、該抗体又は抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、該特定の標的以外の抗原に結合する抗体又は抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まない核酸を含み、これらの他の配列は、ヒトゲノムＤＮＡにおける核酸を自然にフランクし得る。語句「単離核酸分子」は、同様に、二価の二重特異性抗体、例えば、ＶＨ及びＶＬ領域が、ダイアボディーの配列以外の他の配列を含まないダイアボディーなどをコードする配列を含むよう意図されている。
【００２６】
語句「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）には、組換え発現ベクターが導入されている細胞が含まれる。このような用語は、特定の対象細胞のみならず、このような細胞の子孫も意味するよう意図されていることは理解されるべきである。特定の変更が、突然変異又は環境の影響のいずれかによって後続世代に生じることがあるので、このような子孫は、実際は、親細胞と同一ではないこともあるが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【００２７】
本明細書で使用される用語「約」は、参照値より約１０−２０％大きい又は小さい範囲を意味するよう意図されている。特定の環境において、当業者は、参照値の性質により、用語「約」は、この値からおおよそ１０−２０％の偏差を意味することがあることを理解されよう。
【００２８】
本明細書で使用される「クロマトグラフィー」は、分子の混合物からの興味のある標的分子の分離のために使用される分析技術を意味し、固相への混合物の成分間の選択的引力に依存する。例には、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれる。
【００２９】
混合物における興味のある標的分子に関して「精製された」は、この相対濃度（該混合物における全ての成分又は画分の重量で割った標的の重量）が、少なくとも２０％だけ増加することを示す。一連の実施形態において、相対濃度は、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約７５％、約１００％、約１５０％又は約２００％だけ増加する。興味のある標的分子は、同様に、それらからこれが精製される成分の相対濃度（混合物における全ての成分又は画分の重量で割ったそれからこれが精製される成分又は画分の重量）が、少なくとも約２０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７５％、約８５％、約９５％、約９８％又は約１００％だけ減少する場合に精製されたと言うことができる。別の一連の実施形態において、興味のある標的分子は、少なくとも約５０％、約６５％、約７５％、約８５％、約９０％、約９７％、約９８％又は約９９％の相対濃度に精製される。一実施形態における興味のある標的分子が、他の成分又は画分から「分離される」場合、他の実施形態において、該成分又は画分が、本明細書に提供された濃度に「精製される」ことは理解されよう。
【００３０】
５．２抗体の作製
本節において使用される用語「抗体」は、完全抗体又はこの抗原結合フラグメントを意味する。
【００３１】
本開示の抗体は、興味のある抗原による動物の免疫化及び次いでの通常のモノクローナル抗体方法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準の体細胞交雑技術を含む様々な技術によって作製することができる。体細胞交雑手法は、原則として一般的であるが、モノクローナル抗体を生成するための他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス又は発癌性形質転換を使用することができる。
【００３２】
ハイブリドーマを調製するための一つの典型的な動物システムは、マウスシステムである。ハイブリドーマ生成は、非常に確立された手法である。免疫化プロトコル及び融合のための免疫化脾細胞の単離の技術は、当技術分野で知られている。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合手順も知られている。
【００３３】
抗体は、一般的に、ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体であってよい。本開示のキメラ抗体又はヒト化抗体は、上記に記載されたように調製された非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、興味のある非ヒトハイブリドーマから得て、標準の分子生物学技術を使用して非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むよう作り変えることができる。例えば、キメラ抗体を生成するために、マウスの可変領域を、当技術分野で知られている方法を使用して、ヒトの定常領域に連結することができる（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらへの米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。）。ヒト化抗体を生成するために、マウスのＣＤＲ領域を、当技術分野で知られている方法を使用して、ヒトフレームワークに挿入することができる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒへの米国特許第５，２２５，５３９号及びＱｕｅｅｎらへの米国特許第５，５３０，１０１号；５，５８５，０８９号；５，６９３，７６２号及び６，１８０，３７０号を参照されたい。）。
【００３４】
一つの限定されない実施形態において、本開示の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、マウスシステムではなくヒト免疫システムの部分を有するトランスジェニックマウス又はトランスクロモソミックマウスを使用して作製することができる。これらのトランスジェニックマウス及びトランスクロモソミックマウスには、本明細書でＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）、ＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）及びＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ）と呼ばれるマウスが含まれる。
【００３５】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代わりのトランスクロモソミック動物システムが、当技術分野で利用可能であり、本開示の抗体を培養するために使用することができる。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれるヒト重鎖トランスクロモソーム及びヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を有するマウスを使用することができ、このようなマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７に記載されている。さらに、ヒト重鎖及び軽鎖トランスクロモソームを有するウシが、当技術分野で記載されており（例えば、Ｋｕｒｏｉｗａら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４及びＰＣＴ出願国際公開第２００２／０９２８１２号）、本開示の抗体を培養するために使用することができる。
【００３６】
本発明の組換えヒト抗体は、組換え組合せ抗体ライブラリー、例えば、ヒトリンパ球由来のｍＲＮＡから調製されるヒトＶＬ及びＶＨ  ｃＤＮＡを使用して調製されるｓｃＦｖファージ提示ライブラリーのスクリーニングによって単離することができる。このようなライブラリーを調製及びスクリーニングする方法は、当技術分野で知られている。ファージ提示ライブラリーを作製するための市販キット（例えば、ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．２７−９４００−０１；及びｔｈｅ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰＴＭ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｋｉｔ，ｃａｔａｌｏｇ  ｎｏ．２４０６１２、これらの全体の教示を参照により本明細書に組み込む。）に加えて、抗体提示ライブラリーの作製及びスクリーニングにおける使用に特に適する方法及び試薬の例は、例えば、それらの全体の教示を参照により本明細書に組み込む、Ｌａｄｎｅｒら米国特許第５，２２３，４０９号；ＫａｎｇらＰＣＴ国際公開第９２／１８６１９号；ＤｏｗｅｒらＰＣＴ国際公開第９１／１７２７１号；ＷｉｎｔｅｒらＰＣＴ国際公開第９２／２０７９１号；ＭａｒｋｌａｎｄらＰＣＴ国際公開第９２／１５６７９号；ＢｒｅｉｔｌｉｎｇらＰＣＴ国際公開第９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらＰＣＴ国際公開第９２／０１０４７号；ＧａｒｒａｒｄらＰＣＴ国際公開第９２／０９６９０号；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｒｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；及びＢａｒｂａｓら（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２に見出すことができる。
【００３７】
本開示のヒトモノクローナル抗体は、同様に、その中にヒト免疫細胞が、ヒト抗体応答が、免疫化によって生成され得るように、再構成されているＳＣＩＤマウスを使用して調製することができる。このようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらへの米国特許第５，４７６，９９６号及び５，６９８，７６７号に記載されている。
【００３８】
本発明のさらに別の実施形態において、抗体又はこれらのフラグメントは、該抗体の定常領域が、非修飾抗体に比べて少なくとも一つの定常領域媒介生物エフェクター機能を減少するよう修飾されたものに変更することができる。Ｆｃ受容体への減少した結合を示すように本発明の抗体を修飾するために、該抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）相互作用のために必要な特定領域において突然変異させることができる（例えば、これらの全体の教示を参照により本明細書に組み込むＣａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１；及びＬｕｎｄら（１９９１）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２を参照されたい。）。抗体のＦｃＲ結合能の減少は、ＦｃＲ相互作用に依存する他のエフェクター機能、例えば、オプソニン化及びファゴサイトーシス及び抗原依存性細胞障害なども減少させ得る。
【００３９】
５．３．抗体の生成
本発明の抗体を発現するために、部分又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを、遺伝子が、転写及び翻訳調節配列に操作可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋ）するように１種又は複数の発現ベクターに挿入する。（例えば、その全体の教示を、参照により本明細書に組み込む米国特許第６，９１４，１２８号を参照されたい。）これに関連して、用語「操作可能に連結された」は、抗体遺伝子を、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、該抗体遺伝子の転写及び翻訳を調整することのこれらの意図された機能に役立つようにベクターにライゲートすることを意味するよう意図されている。発現ベクター及び発現調節配列は、使用される発現宿主細胞に適合するよう選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができ又はより一般的には、両方の遺伝子を同一の発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子を、標準の方法で発現ベクターに挿入する（例えば、抗体遺伝子フラグメント及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション又は制限部位が存在しない場合の平滑末端ライゲーション）。抗体又は抗体に関連する軽鎖又は重鎖配列の挿入の前に、発現ベクターが、抗体定常領域配列を既に有する場合がある。例えば、特定のＶＨ及びＶＬ配列を完全長抗体遺伝子に変換する一つのアプローチは、それぞれ、ＶＨセグメントが、該ベクター内のＣＨセグメント（複数可）に操作可能に連結され、ＶＬセグメントが、該ベクター内のＣＬセグメントに操作可能に連結されるように、重鎖定常及び軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクター中にこれらを挿入することである。さらに又は別法として、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレーム単位で連結するようにベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であってよい。
【００４０】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中の抗体鎖遺伝子の発現を制御する１種又は複数の調節配列を有し得る。用語「調節配列」は、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御因子（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むよう意図されている。このような調節配列は、例えば、その全体の教示を参照により本明細書に組み込むＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。発現ベクターのデザインは、調節配列の選定を含めて、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要因に依存し得ることは当業者によって理解されよう。哺乳類宿主細胞発現に好適な調節配列には、哺乳類細胞における高濃度のタンパク質発現を指示するウイルス因子、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター及び／又はエンハンサー（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマなどが含まれる。ウイルス調節因子及びこれらの配列のさらなる説明について、例えば、それらの全体の教示を参照により本明細書に組み込むＳｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。
【００４１】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、１種又は複数の追加の配列、例えば、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び／又は選択的マーカー遺伝子を有し得る。選択的マーカー遺伝子は、それらの中にベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、それらの全体の教示を、参照により本明細書に組み込む、全てＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６号、４，６３４，６６５号及び５，１７９，０１７号を参照されたい。）。例えば、一般的に、選択的マーカー遺伝子は、その中にベクターが導入されている宿主細胞に、薬物、例えばＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキセートなどに対する耐性を与える。好適な選択的マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅を用いるｄｈｆｒ−宿主細胞における使用のため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が含まれる。
【００４２】
本発明の抗体又は抗体部分は、宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することができる。組換えで抗体を発現させるために、宿主細胞に、軽鎖及び重鎖が、宿主細胞に発現され、宿主細胞が培養されている培地中に分泌され、この培地から抗体を回収することができるように、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを有する１種又は複数の組換え発現ベクターをトランスフェクトする。標準の組換えＤＮＡ方法を使用して、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を得、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、宿主細胞、例えば、それらの全体の教示を本明細書に組み込むＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９），Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）及び米国特許第４，８１６，３９７号及び６，９１４，１２８号に記載されたものなどに該ベクターを導入する。
【００４３】
軽鎖及び重鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）を、標準の技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、外来性ＤＮＡの原核又は真核宿主細胞への導入に一般的に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含するよう意図されている。本発明の抗体を、原核宿主細胞又は真核宿主細胞のいずれかに発現させることは、理論的に可能であるが、真核細胞、例えば哺乳類宿主細胞における抗体の発現は、このような真核細胞、特に哺乳類細胞が、原核細胞に比べて、適切に折り畳まれた免疫活性な抗体を集め分泌しやすいので好適である。抗体遺伝子の原核細胞発現は、高収率の活性抗体の生成のためには効果のないことが報告されている（その全体の教示を参照により本明細書に組み込むＢｏｓｓ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３）。
【００４４】
本明細書でベクターにＤＮＡをクローニング又は発現させるために好適な宿主細胞は、上記の原核生物細胞、酵母細胞又は高等真核生物細胞である。この目的に好適な原核生物には、真性細菌目（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）、例えば、グラム陰性又はグラム陽性菌、例えば、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクテル属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエッラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネッラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、サルモネッラ・チュピムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セッラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、セッラチア・マルケスカンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）及び赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、同様にバキッリ（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えばＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年、４月１２日に公開されたＤＤ  ２６６，７１０に開示されたＢ．リケニフォルミス４１Ｐ）、プセウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えばＰ．アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）並びにストレプトミュケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。Ｅ．コリＢ、Ｅ．コリＸ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）及びＥ．コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）などの他の菌株は好適であるとはいえ、一つの好適なＥ．コリのクローニング宿主は、Ｅ．コリ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）である。これらの例は、限定的ではなく例示的である。
【００４５】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、ポリペプチドをコードするベクターに好適なクローニング又は発現宿主である。サッカロミュケス・ケレウィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は一般のパン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的使用されている。しかし、多くの他の属、種及び系、例えば、スキゾサッカロミュケス・ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；クルユウェロミュケス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えば、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウィクケラミイイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ワルティイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソピラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．テルモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びＫ．マルクシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）など；ユアッロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ  ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ  １８３，０７０）；カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・レエシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ  ２４４，２３４）；ネウロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；スクワンニオミュケス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、スクワンニオミュケス・オッキデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；及び糸状菌、例えば、ネウロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニキッリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリュポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びアスペルギッルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）が、一般的に利用可能で本明細書において有用である。
【００４６】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物から導かれる。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変種及びスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫）、アエデス・アエギュプティ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、アエデス・アルボピクトゥス（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、ドロソピラ・メラノガステル（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）及びボムビュクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの宿主からの対応する許容状態の昆虫宿主細胞が確認されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、アウトグラパ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変種及びボムビュクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ−５株などが、公的に利用可能であり、このようなウイルスは、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従って本明細書におけるウイルスとして使用することができる。木綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養物も同様に宿主として使用することができる。
【００４７】
本発明の組換え抗体を発現させるために好適な哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（それらの全体の教示を参照により本明細書に組み込む、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されたＤＨＦＲ選択的マーカーと共に使用されるＵｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現又はその中で宿主細胞が培養されている培地への抗体の分泌を可能にするために十分な時間、宿主細胞を培養することによって生成される。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（懸濁培地における培養のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌細胞株（Ｈｅｐ  Ｇ２）であり、これらの全体の教示を参照により本明細書に組み込む。
【００４８】
宿主細胞に、抗体の生成のための上述の発現又はクローニングベクターを形質転換し、プロモーターを誘発すること、形質転換体を選択すること又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅することのために適切に調節された通常の培養液中で培養する。
【００４９】
抗体を生成するために使用される宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（商標）（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞を培養するために好適である。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；４，６５７，８６６号；４，９２７，７６２号；４，５６０，６５５号；又は５，１２２，４６９号；ＷＯ  ９０／０３４３０；ＷＯ  ８７／００１９５；又は米国再発行特許第３０，９８５号に記載された培地のいずれも宿主細胞のための培地として使用することができ、これらの全体の教示を参照により本明細書に組み込む。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン薬など）、微量元素（ミクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される。）及びグルコース又は同等のエネルギー源を、補うことができる。任意の他の必要なサプリメントも当業者に知られている適切な濃度で含まれる場合がある。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞で以前使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
【００５０】
宿主細胞は、完全抗体の部分、例えばＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖ分子などを産生するためにも使用することができる。上記の手順の変形は、本発明の範囲内であることを理解されたい。例えば、特定の実施形態において、宿主細胞に、本発明の抗体の軽鎖又は重鎖（両方ではなく）のいずれかをコードするＤＮＡをトランスフェクトすることが望ましい場合がある。組換えＤＮＡ技術は、抗原結合のために必要ではない軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするＤＮＡのいくつか又は全てを除去するためにも使用することができる。このような切断ＤＮＡ分子から発現された分子も本発明の抗体に包含される。さらに、１種の重鎖及び１種の軽鎖が本発明の抗体であり、他の重鎖及び軽鎖が元の抗原以外の抗原について特異的である二官能性抗体を、本発明の抗体を、標準の化学架橋法によって第二の抗体に架橋することによって生成することができる。
【００５１】
本発明の抗体又はこの抗原結合部分の組換え発現のために好適なシステムにおいて、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子は、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節因子にそれぞれ操作可能に連結されて、遺伝子の高レベルの転写を駆動する。組換え発現ベクターは、同様に、ＤＨＦＲ遺伝子を有し、これは、メトトレキセート選択／増幅を使用してベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の選択を可能にする。選択された形質転換体宿主細胞を培養して、抗体重鎖及び軽鎖の発現を可能にし、完全抗体を培地から回収する。標準の分子生物学技術を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体に選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収する。
【００５２】
組換え技術を使用する場合、抗体はペリプラスムスペースに細胞内に産生することができ又は培地中に直接分泌することができる。一態様において、抗体が細胞内に産生される場合、第一ステップとして、宿主細胞又は溶解細胞（例えば、ホモジェネートによるもの）のいずれかの粒子片は、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、このような発現系からの上澄みは、最初に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ（商標）又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（商標）限外濾過ユニットを使用して濃縮することができる。
【００５３】
本発明のプロセスの前の、細胞片からの抗体の精製の手順は、当初は、抗体の発現の部位によって決まる。いくつかの抗体は、周囲の培地中に細胞から直接分泌される場合があり、他は細胞内に生成される。後者の抗体について、精製プロセスの第一ステップは、一般的に、細胞の溶解を含み、これは、機械的剪断、浸透圧衝撃又は酵素処理を含む様々な方法によって行うことができる。このような破壊は、細胞の全内容物をホモジェネート中に放出し、加えて、それらの小さなサイズのため除去することが困難である細胞より小さいフラグメントを生成する。これらは、一般的に分画遠心法によって又は濾過によって除去される。抗体が分泌される場合、このような発現系からの上澄みは、一般的に、最初に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ（商標）又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（商標）限外濾過ユニットを使用して濃縮される。抗体が培地中に分泌される場合、組換え宿主細胞は、同様に、例えば、接線流濾過によって細胞培地から分離することができる。抗体は、本発明の抗体精製法を使用して培地からさらに回収することができる。
【００５４】
５．４．抗体の精製
５．４．１  抗体の精製全般
本発明は、抗体及び少なくとも１種のＨＣＰを含む混合物から精製された（又は「ＨＣＰを減少させた」）抗体製剤を生成する方法を提供する。抗体が、上述された方法及び当技術分野における通常の方法を使用して生成される場合、本発明の精製プロセスは、分離ステップにおいて開始する。表１は、精製スキームの一実施形態を要約している。それだけには限らないが、イオン交換ステップの順序が逆転された変形を含む本スキームの変形が想定され、本発明の範囲に含まれる。
【００５５】
【表１】
0006010030.tif 000002
【００５６】
抗体を含む浄化された溶液又は混合物が得られ次第、細胞、例えばＨＣＰなどによって生成された他のタンパク質からの抗体の分離を、親和性分離ステップ（複数可）、イオン交換分離ステップ（複数可）及び疎水性相互作用分離ステップ（複数可）を含む様々な精製技術の組合せを使用して実施する。分離ステップは、それらの結合特性、電荷、疎水性の程度又はサイズに基づいてタンパク質の混合物を分離する。本発明の一態様において、親和性、陽イオン性、陰イオン性及び疎水性相互作用を含むクロマトグラフィーを使用して分離を実施する。いくつかの異なるクロマトグラフィー樹脂が、これらの技術のそれぞれに利用可能であり、関係している特定のタンパク質に対する精製スキームの正確な調整を可能にする。分離方法のそれぞれの本質は、タンパク質は、異なる速度でカラムを下に移動し、これらがカラムをさらに下の方へ通過するにつれて増加する物理的分離を達成し又は分離媒体に選択的に付着し、次いで、異なる溶媒によって差別的に溶出させることができることである。いくつかの場合において、不純物がカラムに特異的に付着し、抗体が付着しない、即ち、抗体がフロー中に存在する場合、抗体が不純物から分離される。
【００５７】
上述のとおり、精製スキームの正確な調整は、精製すべきタンパク質の考察に依存する。特定の実施形態において、本発明の分離ステップが、１種又は複数のＨＣＰから抗体を分離するために使用される。本発明は、一般的にタンパク質の精製を対象としているが、これは、抗体の精製に特異的に適合させることができる。例えば、本明細書に記載された方法を使用して首尾良く精製され得る抗体には、それだけには限らないが、ヒトＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４及びＩｇＭ抗体が含まれる。特定の実施形態において、本発明の精製ストラテジーは、ＩｇＧ３抗体が、非効率的にタンパク質Ａに結合するので、例えば、ＩｇＧ３抗体の精製との関連で、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーの使用を排除する。精製スキームの特異的な調整を可能にする他の因子には、それだけには限らないが、タンパク質ＡがＦｃ領域に結合するのでＦｃ領域の存在又は非存在（例えば、そのＦａｂフラグメントと比較した完全長抗体との関連で）；興味のある抗体の作製に使用される特定の生殖系配列；及び抗体のアミノ酸組成（例えば、抗体の一次配列及び分子の全電荷／疎水性）が含まれる。１種又は複数の特徴を共有する抗体は、この特徴を利用するよう調整された精製ストラテジーを使用して精製することができる。
【００５８】
５．４．２．疑似移動床クロマトグラフィー
上に概要が記載されたとおり、抗体の精製は、一般的に、１つ又は複数のクロマトグラフィー分離ステップを組み込む。このようなクロマトグラフィー分離ステップは、伝統的に、バッチモードで実施されているが、このようなバッチモード分離は、精製プロセスに著しい非効率を持ち込む場合がある。例えば、バッチモードにおけるクロマトグラフィーカラムの使用は、カラムが、これらの動的容量だけローディングされることしか求めないので、バッチモードは、カラムがこれらの飽和容量までローディングされた場合と比べて２倍から３倍多くの樹脂の使用を必要とする。タンパク質クロマトグラフィー樹脂は、しばしば非常に高価であるため、この非効率は、全体コストを大きく増加させ得る。さらに、バッチカラムクロマトグラフィーにおける洗浄及び溶離プロセスは、かなりの流体体積を必要とし、これは、精製プロセスのコストを増加させるのみならず、このような分離を終えるために必要な時間をかなり増加させる。
【００５９】
特定の実施形態において、本発明は、１種又は複数の疑似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフ分離の使用を対象とする。特定の実施形態において、このようなＳＭＢ分離は、１種又は複数の伝統的なバッチモード分離に加えるものであり又はこれらに取って代わる。ＳＭＢクロマトグラフィー分離は、それらの飽和容量近くまでローディングされるカラムの使用を含むので、これらは、より小さい体積のクロマトグラフィー樹脂を必要とする。さらに、ＳＭＢ分離は、より効率的な洗浄及び溶離プロセスを可能にするので、ＳＭＢ分離の使用は、緩衝液のかなり減少した消費及びより時間効率のよい精製プロセスをもたらす。
【００６０】
特定の実施形態において、ＳＭＢシステムは、固相クロマトグラフィー支持体がローディングされた１つ又は複数のモジュールを含む。このような支持体には、それだけには限らないが、親和性クロマトグラフィー樹脂、イオン交換クロマトグラフィー樹脂及び疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂が含まれる。特定の実施形態において、一つの特定のモジュールは、１個又は複数のクロマトグラフィーカラムを含むことができ、但し、該システムは、少なくとも２個のクロマトグラフィーカラムを含むことを条件とする。特定の実施形態において、各モジュール及び多数モジュールシステムにおける各モジュールの様々な態様は、互いに流体連絡している。特定の実施形態において、このような流体連絡は、相互接続した流体管によって達成される。特定の実施形態において、このような管は、流体の導入及び／又は抜き取りを可能にするためのバルブ又は他の手段によって分離されている。
【００６１】
本発明の特定の実施形態において、流体管は、ＳＭＢシステムの上流及び下流末端を相互接続して、それを通って流体混合物が継続的に循環されるループを形成する。特定のポイントにおいて、流体の流れが導入されることがあり、他のポイントにおいて、流出液の流れが抜き取られることがある。特定の実施形態において、供給材料のための入口、溶離緩衝液のための入口、解離された成分のための出口及び結合していない（又はあまり結合していない）成分のための出口を選択的に位置づけるために、管及びバルブの多岐管システムを提供することができる。特定の実施形態において、各入口及び出口ポイントは、別々のモジュール又はカラムに通じている。例えば、特定の実施形態において、供給材料は、指定されたポイントでシステムに入り、連続した内部再循環フローによって固相を通して動かされる。この移動接触は、供給原料の成分のクロマトグラフィー分離をもたらす。結合していない成分は、比較的速い速度で流れるが、最初の洗浄流出液の流れの除去などによって結合していない成分の出口から取り出される。固相から結合した化合物を解離する緩衝液が、結合成分及び結合していない成分のそれぞれの出口バルブ位置の間のこの入口バルブにおいて添加される。
【００６２】
特定の実施形態において、指定された入口及び出口バルブ位置は、次の固相床カラムに対して多岐管上で一つの位置だけ下流に位置がずらされている。ステップ時間は、バルブの指定が、内部の再循環流れと適切に同期化されるよう選択される。これらの条件下で、システムは、最終的に定常状態に到達し、特定の生成物の特性が、各バルブ位置において順々に所定の間隔で出現する。固相が、再循環ループの周りを一定の連続した速度で移動し、各バルブにおいて一定の品質の生成物が生成されるが、このタイプのシステムは、バルブが単一の位置に固定されているように偽装する。特定の実施形態において、バルブ位置は固定されたままであるが、カラムが、手動で又は機械的カルーセルによって物理的に動かされる代わりの装置を使用することができる。
【００６３】
モジュール及びバルブ位置の数が増加するにつれて、ＳＭＢ分離プロセスは、実際の移動床システムの特徴に近づく。特定の実施形態において、モジュールの数は、最大２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、ここで、各モジュールは、１個又は複数の個別のクロマトグラフィーカラムを含む。特定の実施形態において、ＳＭＢシステムは、４又は８個のクロマトグラフィーカラムを含む。
【００６４】
特定の実施形態において、疑似移動床プロセスが親和性クロマトグラフィーとの関連で使用される。特定の実施形態において、クロマトグラフィー材料は、興味のある抗体に選択的に又は特異的に結合し得る。このようなクロマトグラフィー材料の限定されない例には、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、興味のある抗体により結合された抗原を含むクロマトグラフィー材料及びＦｃ結合タンパク質を含むクロマトグラフィー材料が含まれる。特定の実施形態において、親和性クロマトグラフィーステップは、一次回収試料を、好適なタンパク質Ａ樹脂を含むカラムに通すステップを含む。タンパク質Ａ樹脂は、変種抗体イソタイプ、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４の親和性精製及び単離のために有用である。タンパク質Ａは、主としてこのＦｃ領域を通して哺乳類ＩｇＧに結合する細菌細胞壁タンパク質である。その天然状態において、タンパク質Ａは、５個のＩｇＧ結合ドメイン及び未知の機能の他のドメインを有する。
【００６５】
特定の実施形態において、疑似移動床プロセスが、イオン交換クロマトグラフィーとの関連で使用される。イオン交換分離は、それによって２種の物質が、これらのそれぞれのイオン電荷の違いに基づき分離される任意の方法を含み、陽イオン交換材料又は陰イオン交換材料のいずれかを使用し得る。
【００６６】
陽イオン交換材料対陰イオン交換材料の使用は、タンパク質の全電荷に基づく。従って、陽イオン交換ステップの使用の前に陰イオン交換ステップを使用すること又は陰イオン交換ステップの使用の前に陽イオン交換ステップを使用することは、本発明の範囲内である。さらに、陽イオン交換ステップのみを使用すること、陰イオン交換ステップのみを使用すること又は二つの任意の直列組合せを使用することは、本発明の範囲内である。
【００６７】
イオン交換クロマトグラフィーは、イオン交換分離技術としても使用することができる。イオン交換クロマトグラフィーは、分子の全電荷の間の差異に基づき分子を分離する。抗体の精製のために、抗体は、結合するために、イオン交換材料、例えば、樹脂に結合させられた官能基のそれと反対の電荷を有する必要がある。例えば、抗体は、これらのｐＩより小さい緩衝液ｐＨ中で全体として正電荷を一般的に有するが、負に帯電した官能基を含む陽イオン交換材料によく結合する。
【００６８】
イオン交換クロマトグラフィーにおいて、周囲の緩衝液のイオン強度が低いことを条件として、溶質の表面上の帯電したパッチは、クロマトグラフィーマトリックスに付着した反対電荷によって引きつけられる。溶離は、一般的に、イオン交換マトリックスの帯電した部位について溶質と競合するように緩衝液のイオン強度（すなわち、伝導性）を増加させることによって達成される。ｐＨを変化させ、これにより溶質の電荷を変えることは、溶質の溶離を達成するための別の方法である。伝導性又はｐＨの変化は、漸進的（勾配溶離）又は段階的（段階溶離）であってよい。
【００６９】
陰イオン又は陽イオン置換基を、クロマトグラフィーに陰イオン又は陽イオン支持体を形成するためにマトリックスに結合させることができる。陰イオン交換置換基の限定されない例には、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）及び第四級アミン（Ｑ）基が含まれる。陽イオン置換基には、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）及びスルホネート（Ｓ）が含まれる。ＤＥ２３（商標）、ＤＥ３２（商標）、ＤＥ５２（商標）、ＣＭ−２３（商標）、ＣＭ−３２（商標）及びＣＭ−５２（商標）などのセルロースイオン交換樹脂は、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｌｔｄ  Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ，Ｕ．Ｋ．から市販されている。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ベース及び架橋イオン交換体も知られている。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−及びＳＰ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）及びＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−及びＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）及びＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗは、全てＰｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢから市販されている。さらに、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＤＥＡＥ−６５０Ｓ又はＭ及びＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＣＭ−６５０Ｓ又はＭなどの両方ともＤＥＡＥ及びＣＭ誘導体化エチレングリコール−メタクリレートコポリマーは、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａから市販されている。
【００７０】
イオン交換ステップは、ＨＣＰなどの不純物を減少させながら興味のある抗体の捕捉を促進する。特定の態様において、イオン交換カラムは、陽イオン交換カラムである。例えば、限定するものではなく、このような陽イオン交換カラムに適する樹脂は、ＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ（商標）樹脂である。これらの樹脂は、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎなどの商業供給源から市販されている。この陽イオン交換手順は、室温において又はこの周辺で実施することができる。
【００７１】
特定の実施形態において、疑似移動床プロセスは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）との関連で使用される。イオン交換クロマトグラフィーは、それらを単離するために抗体の電荷に依存するが、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、抗体の疎水性を使用する。抗体上の疎水性基は、カラム上の疎水性基と相互に作用する。タンパク質がより疎水性であれば、これは、それだけ強くカラムと相互に作用する。従って、ＨＩＣステップは、宿主細胞由来の不純物（例えば、ＤＮＡ及び他の高及び低分子量生成物関連種）を除去する。
【００７２】
疎水性相互作用は、高いイオン強度において最も強く、従って、この形態の分離は、塩析沈殿又はイオン交換手順に続いて好都合に実施される。抗体のＨＩＣカラムへの吸着は、高い塩濃度が好ましいが、実際の濃度は、抗体及び特定の選択されるＨＩＣリガンドの性質に応じて広範囲に変わり得る。様々なイオンを、これらが、疎水性相互作用（塩析効果）を促進し又は水の構造を崩壊（カオトロピック効果）させ、疎水性相互作用の低下をもたらすかに応じていわゆる疎溶媒性系列（ｓｏｌｕｐｈｏｂｉｃ  ｓｅｒｉｅｓ）に並べることができる。陽イオンは、塩析効果を増すことの観点からＢａ＋＋；Ｃａ＋＋；Ｍｇ＋＋；Ｌｉ＋；Ｃｓ＋；Ｎａ＋；Ｋ＋；Ｒｂ＋；ＮＨ４＋と準位付けされるが、陰イオンは、カオトロピック効果を増すことの観点からＰ０−−−；Ｓ０４−−；ＣＨ３ＣＯ３−；Ｃｌ−；Ｂｒ−；ＮＯ３−；ＣｌＯ４−；Ｉ−；ＳＣＮ−と準位付けすることができる。
【００７３】
一般的に、Ｎａ、Ｋ又はＮＨ４硫酸塩は、ＨＩＣにおいてリガンド−タンパク質相互作用を有効に促進する。次の関係：（ＮＨ４）２ＳＯ４＞Ｎａ２ＳＯ４＞ＮａＣｌ＞ＮＨ４Ｃｌ＞ＮａＢｒ＞ＮａＳＣＮで与えられるように相互作用の強度に影響を与える塩を表すことができる。一般的に、約０．７５及び約２Ｍの硫酸アンモニウムの間又は約１及び４ＭのＮａＣｌの間の塩濃度が有用である。
【００７４】
ＨＩＣカラムは、通常、それに対して、疎水性リガンド（例えば、アルキル又はアリール基）が結合しているベースマトリックス（例えば、架橋アガロース又は合成コポリマー材料）を含む。好適なＨＩＣカラムは、フェニル基で置換されたアガロース樹脂（例えば、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラム）を含む。多くのＨＩＣカラムは市販されている。例には、それだけには限らないが、低又は高置換されたＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  Ｐｒｏｐｙｌ又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）Ｍｅｈｙｌ又はＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ｔ−Ｂｕｔｙｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（商標）カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）；及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）エーテル、フェニル又はブチルカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ，ＰＡ）が含まれる。
【００７５】
５．５．例示的な精製ストラテジー
特定の実施形態において、ＳＭＢ分離プロセスは、一連のタンパク質Ａカラムを使用する。一つの特定の限定されない例において、ＳＭＢ分離プロセスは、４個のタンパク質Ａカラムを使用する。特定の実施形態において、４個のタンパク質Ａカラムは、１．６ｃｍの直径及び５ｃｍの高さを有し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔタンパク質Ａ樹脂が充填されている。代わりの実施形態において、追加のカラム、例えば、５、６、７、８、９又は１０個のカラムを使用することができ、カラムは、実質的により大きな直径及び高さのもので、最大約２、最大約３、最大約４、最大約５、最大約６、最大約７、最大約８、最大約９、最大約１０、最大約１１、最大約１２、最大約１３、最大約１４、最大約１５、最大約１６、最大約１７、最大約１８、最大約１９、最大約２０、最大約２５、最大約３０、最大約４０、最大約５０、最大約６０、最大約７０、最大約８０、最大約９０、最大約１００リットル又はこれより大きいローディングカラム体積となるものであってよい。
【００７６】
特定の実施形態において、特定のＳＭＢ分離スキームに使用される各タンパク質Ａカラムは、試料のローディング前に好適な緩衝液で平衡化させることができる。好適な緩衝液の限定されない例は、約７．２のｐＨのトリス緩衝液である。好適な平衡化条件の限定されない例は、約７．２のｐＨの３５０ｍＭトリス緩衝液である。この平衡化に続いて、試料をカラムにローディングすることができる。カラムのローディングに続いて、カラムを、例えば、平衡化緩衝液を使用して１又は複数回洗浄することができる。カラムを溶離する前に、異なる緩衝液を使用する洗浄を含めて他の洗浄を使用することができる。例えば、１又は複数のカラム容積の約７．２のｐＨの２５ｍＭトリスを使用して、カラムを洗浄することができる。場合によって、この洗浄に続いて、平衡化緩衝液を使用する１又は複数回の洗浄を行うことができる。次いで、タンパク質Ａカラムを、適切な溶離緩衝液を使用して溶離することができる。好適な溶離緩衝液の限定されない例は、約３．５のｐＨの酢酸／ＮａＣｌ緩衝液である。好適な条件は、例えば、約３．５のｐＨの０．１Ｍ酢酸である。溶離液は、当業者によく知られている技術を使用して監視することができる。例えば、ＯＤ２８０における吸収を追跡することができる。約０．５ＡＵの初期動揺で開始し、溶離ピークの立ち下がりにおける約０．５ＡＵの読み取りまでカラム溶離液を回収することができる。次いで、興味のある溶離画分（複数可）を、さらなる処理のために準備することができる。例えば、回収した試料は、約１０のｐＨのトリス（例えば、１．０Ｍ）を使用して約５．０のｐＨに滴定することができる。場合によって、この滴定した試料を、濾過し、さらに処理することができる。
【００７７】
特定の実施形態において、試料のローディング量は、特定の目標滞留時間をもたらすように計算される。特定の実施形態において、試料のローディング量は、約０．５から約１２分の範囲にわたる目標滞留時間をもたらすように計算され、特定の実施形態において、これは、最大約０．５、最大約１、最大約２、最大約３、最大約４、最大約５、最大約６、最大約７、最大約８、最大約９又は最大約１０分からなる群から選択される。特定の実施形態において、目標滞留時間は、３分である。特定の実施形態において、試料のローディング量も、同様に、カラムの飽和結合容量の最大約５０、最大約６０、最大約７０、最大約８０、最大約９０又は最大約１００％をもたらすように計算する。
【００７８】
特定の実施形態において、ＳＭＢ分離プロセスは、平衡化緩衝液、ローディング緩衝液、洗浄緩衝液、溶離緩衝液、再生緩衝液及び貯蔵緩衝液の導入のための一つの特定のプログラムを含む。特定の実施形態において、上記プログラムは、３部：第１運転、第２から第（ｎ−１）運転及び最終運転から構成される。このようなプログラムの限定されない例は以下の通りである。
【００７９】
【表２】
0006010030.tif 000003
【００８０】
特定の実施形態において、第一洗浄ステップは、平衡化緩衝液と同一の緩衝液を使用する。特定の実施形態において、第一洗浄ステップは、試料ローディングステップに統合することができる。特定の実施形態において、ローディング時間が運転の約５０％となるように保つために、洗浄、溶離及び再生ステップを計算しプログラムすることができる。
【００８１】
５．５．ラマン分光法
ラマン分光法は、物質への単色の入射光は、固有の様式で、反射、吸収又は散乱され、これは、放射を受ける特定の分子又はタンパク質によって決まるという原理に基づく。大部分のエネルギーは同じ波長で散乱されるが（Ｒａｙｌｅｉｇｈ散乱）、少量（例えば１０−７）の放射が、いくらか異なる波長で散乱される（Ｓｔｏｋｅｓ及びＡｎｔｉｓｔｏｋｅｓ散乱）。この散乱は、回転、振動及び電子準位遷移と関係がある。散乱光子の波長の変化は、化学的及び構造的な情報を提供する。
【００８２】
特定の実施形態において、ラマン分光法は、本明細書に記載されたＳＭＢ技術との関連で使用されるものなどの多成分混合物に実施して、成分の高度に特異的な「指紋」を提供することができる。混合物のラマン分光分析からもたらされるスペクトル指紋は、各個別成分の重ね合わせである。帯域の相対強度は、特定の成分の相対濃度と関係がある。従って、特定の実施形態において、ラマン分光法は、成分の混合物を定性的及び定量的に特徴付けるために使用することができる。従って、このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法は、本発明のＨＣＰを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関与する１種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び／又は決定するために使用することができる。
【００８３】
ラマン分光法は、非常に短いシグナル収集時間で、固体、液体、スラリー、ゲル、フィルム、粉末及び気体を含む大部分の試料を特徴付けるために使用することができる。一般的に、試料は、特別な調製技術を必要とせず、問題のバイオプロセスから直接採取することができる。また、入射光及び散乱光は、長距離にわたって伝送することができ、遠隔監視が可能になる。さらに、水は、弱いラマン散乱しか与えないので、水性試料は、水からの著しい干渉を受けずに特徴付けることができる。
【００８４】
本明細書に記載された適用可能なプロセス及び組成物は、市販のラマン分光分析器に基づいて分析することができる。例えば、Ｋａｉｓｅｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から市販されているＲａｍａｎＲＸ２（商標）分析器又は他の分析器を使用することができる。代わりに、ラマン分析器は、例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ），Ｒｅｎｉｓｈａｗ（Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）及びＰｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｔｒｅｎｔｏｎ，ＮＪ）から市販されている。市販のラマン分光分析器のための技術的詳細及び操作パラメーターは、それぞれの供給メーカーから得ることができる。
【００８５】
好適な曝露時間、試料サイズ及びサンプリング頻度は、例えば、ラマン分光分析器及びこれが（例えば、ＵＦ／ＤＦバイオプロセス処理のリアルタイムモニタリングを提供するプロセスにおいて）使用されるプロセスに基づいて決定することができる。同様に、適切なプローブ配置も、分析器及び分析器が使用されるプロセスに基づいて決定することができる。例えば、浸漬プローブが適切なシグナルを提供するための試料サイズは、２０ｍＬ未満又は１０ｍＬ未満（例えば、８ｍＬ以下）であってよい。適切なシグナルを提供するための曝露時間は、２分未満又は１分未満（例えば、３０秒）であってよい。
【００８６】
量子化が望まれる成分及び２以上のｐＨ依存性イオン化形態で存在する成分（例えば、ヒスチジン）について、ラマン分光法の較正を、成分（例えば、ヒスチジン）の測定がｐＨ依存性にならないように、変動する濃度及び／又は様々なｐＨにおいて実施して、所与のｐＨ範囲にわたる濃度を予想することができる。例えば、様々なｐＨ依存性形態のヒスチジンのための較正モデルを、様々なイオン化形態のヒスチジンを測定及び定量化するために使用することができるので、溶液の性質を確かめることができる。シグナル処理を実施することができ、これは、強度補正（例えば、標準正常変量（ＳＮＶ））及び／又は基線補正（例えば、一次導関数）を含み得る。
【００８７】
代表の試験溶液のＣＣＤ飽和を測定し、これらが許容される機器の範囲（例えば４０−８０％）であることを確実にすることによって、曝露時間を決定することができる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ｐＨ制御又はｐＨ範囲モデリングを特定の成分（例えば、ヒスチジンなどの緩衝液）のために使用する。いくつかの実施形態において、入射光を最小化し、これは、例えば、周囲の光源が分光に干渉することを阻止する覆い（例えば、アルミニウムホイル）の使用によって達成することができる。
【００８９】
例えば、（抗体などの）タンパク質が帯電していない種で濃縮される特定の実施形態において、タンパク質は、溶液の著しい体積を占め、著しい量の溶質を排除する。これは、帯電していない種の濃度の純減少をもたらす。この効果は、「体積排除」と呼ばれ、これは、タンパク質濃度と比例する。
【００９０】
特定の実施形態、例えば帯電した成分のアッセイを伴う実施形態などにおいて、より高い濃度において、タンパク質の電荷は溶液中の全体の帯電種に著しい寄与となるので、Ｄｏｎｎａｎ効果が生じる。平衡が薄膜の両側に確立されると予想されるので、電気的中性の要件は、薄膜の濃縮水側の正帯電種（例えば、緩衝液種）における純減少をもたらす。この現象はＤｏｎｎａｎ効果と呼ばれる。
【００９１】
本出願の特定の実施形態によれば、ＲａｍａｎＲＸ２（商標）分析器が使用される。この分析器及び他の市販のラマン分析器は、同時の完全スペクトル範囲を有する最大４つのチャンネルを測定する能力を提供する。特定の実施形態において、標準のＮＩＲレーザー励起が試料適合性を最大化するために使用される。例えば、ＲａｍａｎＲＸ２（商標）分析器によるプログラム可能な連続モニタリングフォーマットを使用することができ、該装置は、プロセス光学素子に適合し、一つの分析器のタイプが発見段階から生産段階まで使用されることを可能にする。携帯用筐体及び光ファイバーサンプリングインターフェースは、分析器が多様な場所で使用されることを可能にする。
【００９２】
本開示の主題の特定の実施形態において、所定量の知られている成分を含む少なくとも１種の多成分混合物標準（すなわち、多成分混合物標準）は、未知の成分及び／又は未知の濃度の既知若しくは未知の成分を有する混合物での使用のためのモデル（例えば、較正曲線）を得るためにラマン分光法によって特徴付けられる。好ましくは、所定量の既知の成分を有する一連の多成分混合物標準は、モデルを得る目的でラマン分光法によって特徴付けられる。
【００９３】
未知の成分及び／又は未知の濃度の既知若しくは未知の成分を有する混合物での使用のためのモデルを得るための方法は、当業者が決定することができる。例えば、多成分試験混合物に存在することが予想される主要成分に基づく部分的最小二乗回帰分析。また、ラマン分光法供給メーカーから入手できるソフトウェアプログラムを、多成分混合物標準を設計するために使用することができ、これは、同様に、多成分試験混合物での使用のためのモデルを開発するために使用することができる。
【００９４】
「所定量の既知の成分を有する多成分混合物標準を提供すること」及び「多成分混合物標準にラマン分光分析を実施すること」及びより一般的に、未知の成分又は未知の濃度の成分を有する多成分混合物を特徴付けるためのモデルを開発することは、平行分析（すなわち、「現場」で得られるデータ）並びに多成分混合物標準、すなわち、既知の成分、既知の濃度を有する多成分混合物のための以前に得られた又は以前に記録された結果（例えば、ラマンスペクトル指紋）への参照の両方を含むことは理解されたい。例えば、供給メーカーの製品文献から得られるラマンスペクトル結果への参照は、「所定量の既知の成分を有する多成分混合物標準を提供すること」及び「多成分混合物標準にラマン分光分析を実施すること」によって包含される。
【００９５】
本出願の特定の実施形態は、それだけには限らないが、ＳＭＢ処理を含むバイオプロセス処理に使用される成分（例えば、多成分混合物）を特徴付けるためにラマン分光法技術を使用する。例えば、特定の実施形態において、ラマン分光法がＳＭＢ分離との関連で生物活性剤（例えば、モノクローナル抗体）と混合されるよう意図されている製剤を特徴付けるために使用される。これらの製剤は、しばしば「製剤緩衝液」と呼ばれるが、一般的に、生物製剤中の添加剤濃度を決定する多成分混合物である。例えば、このような製剤は、一般的に、以下のもの：ｐＨ緩衝液（例えば、クエン酸塩、トリス、酢酸塩又はヒスチジン化合物）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）、糖又は糖アルコール（例えば、マンニトール）及び／又はアミノ酸（例えば、Ｌ−アルギニン又はメチオニン）の１種又は複数を含む。製剤緩衝液における誤りは、しばしば、不合格バッチをもたらし、これらは、同様に、著しい損失をもたらす。本明細書に開示された技術の使用は、このような非効率を低減又は排除し得る。
【００９６】
特定の実施形態において、ラマン分光法技術は、タンパク質集合、例えば、それだけには限らないが、ＳＭＢ処理中に形成することがあるものを同定するために使用することができる。例えば、制限を目的とするものではないが、本発明のラマン分光法技術は、特定の実施形態において、それだけには限らないが、抗体製剤原料試料及び抗体製剤試料を含む、タンパク質製剤試料及び製剤試料の集合を同定することができる。
【００９７】
特定の実施形態において、ラマン分光法は、それだけには限らないが、ＳＭＢ処理と共に実施される処理を含む、濾過処理（例えば、限外濾過／ダイアフィルトレーション処理）、例えば、生物活性剤、例えばモノクローナル抗体が精製される濾過処理などに存在する製剤を試験及び特徴付けるために使用することができる。例えば、限定を目的とするものではないが、本発明のラマン分光法技術は、オンライン又はオフラインで得られる試料を得、１回の読み取りで、存在する成分の同定及び量の両方を確かめるために使用することができる。特定の実施形態において、タンパク質濃度を、添加剤濃度に加えて測定することができる。このような実施形態のいくつかにおいて、０から１５０ｍｇ／ｍｌの範囲のタンパク質濃度を分析することができる。
【００９８】
特定の実施形態において、ラマン分光法は、バイオプロセス処理、例えば、それだけには限らないが、ＳＭＢ処理と共に実施されるものなどを測定、検証、試験及び従って制御するために使用することができる。バイオプロセス処理と共に使用される単位処理、例えば、クロマトグラフィー、濾過、ｐＨ変更、成分の添加又は溶液の希釈による組成変化は、全て、有機又は無機成分及び生体分子からなる混合物をもたらす。従って、例えば、ラマン分光法を使用することによって、中間体の組成を迅速に正確に測定することは、処理及び生物学的生成物の一貫性及び品質を改善及び維持するための機会を提供する。
【００９９】
特定の実施形態において、ラマン分光法による混合物中の個別成分の組成の測定は、生体分子が存在するまた存在しないこのような混合物の正確な調製を可能にする。例えば、特定の実施形態において、このような測定は、バイオプロセス処理に広範囲に使用される緩衝溶液の調製において有用であり、調製の一貫性を改善し又は緩衝溶液のほぼリアルタイムの調製を提供する利益をもたらす。特定の実施形態において、これは、緩衝溶液の調製、保持及び配送のための複雑な装置の必要性を排除する。特定の実施形態において、ラマン分光法の使用は、緩衝液配合における潜在的誤り（例えば、化学成分濃度、薬品の間違いなど）が、簡単な機器の使用でリアルタイムに検知される緩衝溶液の試験及び使用許可を可能にする。試験し得る製剤には、それだけには限らないが、タンパク質を含まない３成分製剤（緩衝液＋糖＋アミノ酸）、タンパク質及び糖製剤、タンパク質及び界面活性剤製剤並びにタンパク質及び緩衝液製剤が含まれる。
【０１００】
特定の実施形態において、溶液組成の正確な測定は、添加剤（陰イオン、陽イオン、疎水性、溶媒など）の正しい目標組成を達成することができるような生物学的溶液の調節を可能にする。現在、このような測定は、面倒であり、リアルタイムの使用の実現に適さない巧みな分析法を必要とする。ラマン分光法の使用は、規制産業の期待である文書化を伴う非常に高度な確実さを提供する測定を可能にする。
【０１０１】
特定の実施形態において、本発明の技術は、化学的、物理的又は生物学的手段によって達成されるタンパク質−タンパク質反応、タンパク質−小分子反応及び／又はタンパク質修飾を監視及び制御することを可能にする。このような実施形態のいくつかにおいて、反応物質（その起源状態において生物学的）及び生成物（その最終状態において生物学的）及び性質が化学的又は生物学的のいずれかである他の反応物質／触媒の独特の生化学的な痕跡が、ラマン分光法を使用して監視される。このようなやり方で反応物質（複数可）及び生成物（複数可）を監視することは、とりわけ、反応条件及び反応物質量のフィードバック制御を可能にする。特定の実施形態において、生成物品質又はこのようなシステムの性能を最適化、改善又は維持するために、反応副生成物及び／又は生成物を継続的に取り出すシステムを設計することも可能である。
【０１０２】
特定の実施形態において、ラマン分光法は、それだけには限らないが、ＳＭＢ処理を含む、クロマトグラフィー処理において生物学的生成物の単離及び精製も可能にする。このような実施形態のいくつかにおいて、生成物／生成物変種／生成物イソ型又は不純物の溶離液を監視することができ、カラム流出液の分別を所望の生成物品質又はプロセス性能に基づいて実施することができる。特定の実施形態において、他の単位処理、例えば、それだけには限らないが、濾過及びクロマトグラフィーではない分離などにおいて画分の単離／濃縮にラマン分光法を適用することも可能である。
【０１０３】
特定の実施形態において、ラマン分光法は、非侵襲的手段として配置され得る。例えば、限定を目的とするものではないが、ラマン分光法測定は、シグナルに干渉しない材料を通して行うことができる。これは、それらの混合物を収容する入れ物／容器の完全性を保つことが重要であるバイオプロセス処理において追加の独特の利点を提供する。
【０１０４】
特定の実施形態において、ラマン分光法は、他の成分による溶液の「汚染」を検知する極めて有用な手段であり得る。このような実施形態のいくつかにおいて、一つの精製ステップから他へのクロマトグラフィー支持体又はこの一部の繰り越しが検知される。特定の実施形態において、このような繰り越しには、それだけには限らないが、タンパク質Ａクロマトグラフィー支持体から滲出されるタンパク質Ａが含まれる。このような実施形態のいくつかにおいて、汚染された溶液から得られたラマン分光法データは、統計的又はスペクトル比較技術を使用して予想されるスペクトルと比較し、異なる場合、これらがバイオプロセスで使用される前に、これらの溶液の配合の誤りの迅速な検知を可能にすることができる。
【０１０５】
特定の実施形態において、コンセプトの証明として以下の実施例を通して示されるとおり、宿主細胞、タンパク質、ＤＮＡ、脂質などを含む細胞培養回収材料からの不純物を含む混合物中の抗体の濃度を、ラマン分光法を使用して定量的に測定することができる。このような実施形態において、前記方法を、未精製混合物を含むバイオプロセス処理からの流入液及び流出液を監視するために使用することができる。例には、それだけには限らないが、カラム、フィルター及びクロマトグラフィーではない分離デバイス（膨張床、流動床、二相抽出など）のためのローディング及び溶離処理が含まれる。提供された例は、０．１から１ｇ／Ｌの抗体濃度は、化学的に定義された培地に基づく細胞培養プロセスから調製された浄化された回収物溶液がローディングされたタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーカラムからの非結合画分を含むマトリックスにおいて定量化することができることを示している。ラマン分光法がインラインに組み込まれる場合、このような測定は、カラムローディングの直接の監視及び制御を可能にし、動的結合容量又は静的（平衡）容量の百分率を表す予め定義された結合容量においてカラムの一貫した最適なローディングを可能にする。当業者は、このような技術は、上述された様々な他の処理に適用し得ることを理解されよう。
【０１０６】
特定の実施形態において、ラマン分光法は、バイオプロセス精製処理において品質管理及び／又はフィードバック制御のために使用することができる（例えば、治療抗体精製プロセスのためにインライン緩衝液の希釈を制御すること）。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法を、その全体を参照により本明細書に組み込むＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７７：１２２８−１２３６（２００５）に記載されたタンパク質接合反応又は他の化学反応（例えば、液相Ｈｅｃｋ反応）を伴うプロセスにおいて品質管理及び／又はフィードバック制御のために使用することができる。
【実施例】
【０１０７】
６．実施例
６．１．事例研究：ｍＡｂ  Ｘ
供給流れとしてｍＡｂ  Ｘプロセス中間体及び親和性クロマトグラフィー樹脂として一般的なアガロースベースの親和性タンパク質Ａクロマトグラフィー媒体を使用して、事例研究を実施した。合計８サイクルを４個のカラムを用いて実施した。カラムをそれぞれ飽和までローディングし、図４は得られたクロマトグラムを示している。偶数のＵＶピークは溶離を示し、奇数のＵＶピークはローディング直後の洗浄１を示している。
【０１０８】
次の緩衝液を全てのＳＭＢ運転のために使用した。
【０１０９】
【表３】
0006010030.tif 000004
【０１１０】
次の表は、ｍＡｂ  ＸのためのＳＭＢ精製プログラムの概略を記す。プログラムの３部分：第１運転、第２から第（ｎ−１）運転及び最終運転が存在する。ロード２ブロックを、飽和結合容量（ＳＢＣ）研究の曲線下面積（ＡＵＣ）によって計算した（以下を参照されたい。）。次の分離プロセスは、実際のＳＢＣに比べて２０％少なく実施したことに留意されたい。第１分離プロセスを、１分の滞留時間で実施し、第２を３分の滞留時間で実施した。
【０１１１】
【表４】
0006010030.tif 000005
0006010030.tif 000006
【０１１２】
図８のデータは、ｍＡｂ  Ｘの飽和結合容量（ＳＢＣ）研究を示している。カラムの貫流を、カラムに結合していない生成物の量を測定するためにＰｏｒｏｓ  Ａ  ＨＰＬＣアッセイによって分析した。７３  ｇ／Ｌの飽和結合容量までの曲線下面積（ＡＵＣ）は、４０  ｇ／Ｌの一般的な結合（「動的結合」）に対してのＳＭＢによって達成された改善を示している。ＡＵＣは、第２サイクルから最終サイクルまでのローディング量を計算するために、飽和結合容量から差し引いた（図８を参照されたい。）。
【０１１３】
６．２．事例研究：ｍＡｂ  Ｙ
供給流れとしてｍＡｂ  Ｙプロセス中間体及び親和性クロマトグラフィー樹脂として一般的なアガロースベースの親和性タンパク質Ａクロマトグラフィー媒体を使用して、事例研究を実施した。合計８サイクルを４個のカラムを用いて実施した。カラムをそれぞれ飽和までローディングし、図６は得られたクロマトグラムを示している。偶数のＵＶピークは溶離を示し、奇数のＵＶピークはローディング直後の洗浄１を示している。
これらの緩衝液を全てのＳＭＢ運転のために使用した。
【０１１４】
【表５】
0006010030.tif 000007
【０１１５】
次の表は、ｍＡｂ  ＹのためのＳＭＢ精製プログラムの概略を記す。プログラムの３部分：第１運転、第２から第（ｎ−１）運転、及び最終運転が存在する。ローディング２ブロックを、飽和結合容量（ＳＢＣ）研究の曲線下面積（ＡＵＣ）によって計算した（以下を参照されたい。）。ローディング時間が運転の５０％となるよう保つために、洗浄１、洗浄２及び再生ステップを計算し、３分の滞留時間をもたらすよう、ローディングステップを計算した。次の分離プロセスは、実際のＳＢＣに比べて２０％少なく実施したことに留意されたい。
【０１１６】
【表６】
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0006010030.tif 000009
【０１１７】
図８のデータは、ｍＡｂ  Ｙの飽和結合容量（ＳＢＣ）研究を示している。カラムの貫流を、カラムに結合していない生成物の量を測定するためにＰｏｒｏｓ  Ａ  ＨＰＬＣアッセイによって分析した。８６ｇ／Ｌの飽和結合容量までのＡＵＣは、４５ｇ／Ｌの一般的な結合（「動的結合」）に対してのＳＭＢによって達成された改善された結合容量を示している。このＡＵＣは、第２サイクルから最終サイクルまでのローディング量を計算するために、飽和結合容量から差し引いた（図９を参照されたい。）。
【０１１８】
６．３．事例研究ｍＡｂ  Ｘ、不純物繰り越しの検知
第２のＳＭＢ分離をｍＡｂ  Ｘを使用して実施した。この分離において、ｍＡｂ  Ｘは、化学的に定義された培地に存在した。合計８サイクルを４個のカラムを用いて実施した。カラムは、それぞれ飽和までローディングした。次の緩衝液を全てのＳＭＢ運転のために使用した。
【０１１９】
【表７】
0006010030.tif 000010
【０１２０】
次の表は、ｍＡｂ  ＸのためのＳＭＢ精製プログラムの概略を記す。プログラムの３部分：第１運転、第２から第（ｎ−１）運転及び最終運転が存在する。ロード２ブロックを、飽和結合容量（ＳＢＣ）研究の曲線下面積（ＡＵＣ）によって計算した。次の分離プロセスは、実際のＳＢＣに比べて２０％少なく実施したことに留意されたい。第１分離プロセスは、１分の滞留時間で実施し、第２は、３分の滞留時間で実施した。
【０１２１】
【表８】
0006010030.tif 000011
【０１２２】
このＳＭＢ分離の全体収率は８５％であった。実施された分析アッセイは、ｍＡｂ濃度及び各溶離運転後の繰り越されたタンパク質Ａの存在を決めるためのタンパク質Ａ浸出物（ｌｅａｃｈａｂｌｅ）ＥＬＩＳＡを測定するためのＰｏｒｏｓ  Ａアッセイを含んだ。後者は、タンパク質Ａ浸出物は、第１サイクル（溶離運転１−４）に比べて第２サイクル（溶離運転５−８）についてより高いことを示し、この不純物についてのいくらかの繰り越し効果を示した。
【０１２３】
６．４．パイロット規模におけるｍＡｂ  Ｚ事例研究
上記のタンパク質Ａプロセスをパイロット規模に拡大し、ｍＡｂ  Ｚ分離との関連で使用した。３個のカラム（各直径１０ｃｍ×高さ８ｃｍ、７８５ｍＬ）にタンパク質Ａクロマトグラフィー支持体を充填した。上記に概略が記された小規模の分離と同様に、カラムの切り替えは、手動で操作した。３個のカラムのみを用いて、ワークフローを図１０に描いたとおり実施することができる。
【０１２４】
ｍＡｂ  Ｚ細胞培養回収物を酸性にして細胞及び細胞片を沈殿させた。このような不純物の沈殿は、後続の遠心分離の有効性を改善し、デプスフィルター及び薄膜フィルターの能力を増加させた。回収物を浄化することは、簡単な洗浄ステップでタンパク質Ａカラムへの試料ローディングを可能にし、クリーニング手順を簡易化した。インラインフィルターをカラムの前に追加して、これを細胞片から保護し、空気トラップをカラムの前に追加して、これを空気から保護した。
【０１２５】
簡易化した緩衝システムを全ての処理ステップに使用した。平衡化緩衝液、全ての洗浄緩衝液、溶離緩衝液は、２種の成分：トリス及び酢酸からなった。確定した量の各成分を用いて、ｐＨは、各成分のモル濃度によって制御することができる。従って、ｐＨ調節は、全ての緩衝液に必要ではなく、緩衝液の調製において著しく時間を節約した。以下はパイロット処理に使用された緩衝液である。
【０１２６】
【表９】
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【０１２７】
全ての３個のカラムを、クリーニングの間、直列に接続し、これは、使用した清浄剤の量を節約する。３個のカラムに増加した圧力降下を提供するために、流速を２００ｃｍ／時に減少させた。
【０１２８】
このプロセスの全収率は９１％であり、ｍＡｂ  Ｚ細胞培養回収物は、酸性化、続いての遠心分離／デプスフィルター濾過によって浄化し、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーによって捕捉することができ、単純なｍＡｂ捕捉プロセスをもたらすことを示した。
【０１２９】
６．５  ３成分製剤緩衝液の試験
アルギニン、クエン酸及びトレハロースの所定の混合物を含む製剤緩衝液を、水溶媒を用いて調製した。成分は０から１００ｍＭまで多様であった。
【０１３０】
８００から１７００ｃｍ−１の範囲にわたるラマンスペクトルを、ＲＡＭＡＮＲＸＮ２（商標）分析器（２スペクトル／混合物）を使用して各混合物の１５ｍＬアリコートから得た。分光フィルタリングパラメーターを、標準正常分散（ＳＮＶ）強度正常化、１５ポイント補正による一次導関数（ｇａｐ）基線補正、平均強度値＝０である平均中心差スペクトルに設定した。これは、分光フィルターではなくデータ位取りであると考えられる。試料当たり３０秒の曝露時間で浸漬プローブを使用して、スペクトルを収集した。
【０１３１】
主成分方法を、モデルを開発するために使用した。ＰＬＳ（潜在構造に対する部分的最小二乗予測）モデルを、成分間の相関関係を求めるために３成分のそれぞれに適用した。この結果は、スペクトル強度（例えば、１７００−８００ｃｍ−１）を濃度（ａｘ１＋ｂｘ２＋……＋ｚｘ９００＝濃度）に翻訳する線形モデルである。本明細書に示された較正結果に使用されたソフトウェアは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｇａｌａｃｔｉｃ製のＰＬＳｐｌｕｓ／ＩＱアドインを有するＧＲＡＭＳ／ＡＩ  Ｖ  ７．０２であった。ＳＩＭＣＡ  Ｐ＋を、グラフ及び実験モデル生成の多くに使用した。試料は、２つの試料を動かすことによってクロス確認した。相関関係及びクロス確認のための試験のステップを、成分間の相関関係が２％の誤差限界値を下回るまで繰り返すように、データ分析を行った。緩衝液成分の正確な量子化（例えば、２％以内）を、１回の読み取りで提供することができる。
【０１３２】
較正曲線は、Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｄｅｓｉｇｎを使用して得ることができる。上記に開発された３成分モデルを、アルギニン、クエン酸及びトレハロースのランダム混合物のスペクトルについての予測を生成するために使用した（図１１）。モデルが±２％の所定の許容範囲限界に入ることを確かめるために、これらの予測を実測スペクトルに対して比較した。結果を図１２及び１３に示す。モデルが、測定を行うために使用することができることを確かめるために、ランダム混合物の単独の測定を得た。
【０１３３】
６．６  ４成分製剤緩衝液の試験
実施例６．５の方法を、４成分を含む製剤緩衝液に適用し、ここで、成分は、マンニトール、メチオニン、ヒスチジン及びＴｗｅｅｎ（商標）（ポリソルベート８０）であった。所定の混合物の測定したスペクトルを図１４−１６に示す。波数は、Ｆａｒ−ＩＲ領域からＭｉｄ−ＩＲ領域の範囲に及ぶ。サファイアカバーによる制限のために、１００−８００ｃｍ−１の範囲を、この特定の例において無視してよく、較正は、８００−１８００ｃｍ−１で行う。
【０１３４】
実施例６．５において得られた３成分モデルと同様に４成分緩衝システムのためのモデルを得た。得られたモデルに基づく予測を、ランダム混合物の実測スペクトルに対して比較して、モデルは十分に正確であることを確認した。結果を図１７及び１８に示す。
６．７  タンパク質を含む３成分製剤緩衝液の試験
実施例６．６の方法を、０から１００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度におけるタンパク質と共に３成分を含む製剤緩衝液に適用した。成分は、マンニトール、メチオニン、ヒスチジン及びＤ２Ｅ７（アダリムマブ）であった。所定の混合物の測定したスペクトルを図１９−２１に示す。
【０１３５】
実施例６．６において得られた４成分モデルと同様にタンパク質を含む３成分緩衝システムのためのモデルを得た。得られたモデルに基づく予測を、ランダム混合物の実測スペクトルに対して比較して、モデルは十分に正確であることを確認した。結果を図２２に示す。測定（Ｒ２）の係数及び実測対予想スペクトルのクロス確認（ＳＥＣＶ）値の標準誤差を、以下の表２に示す。
【０１３６】
【表１０】
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【０１３７】
６．８  アダリムマブＵＦ／ＤＦプロセス
アダリムマブの溶液に添加剤を導入するために、図２３に示された限外濾過／ダイアフィルトレーションプロセス（ＵＦ／ＤＦ）を確立する。フィードポンプ（１００）は、接線流濾過薄膜を通る直交流を提供し、容器中のアダリムマブ含有溶液を薄膜に通す。ダイアフィルトレーション緩衝液（メチオニン、マンニトール及びヒスチジンを含む製剤緩衝液）を、薄膜の濾過速度に適合させるために容器にポンプで注入する（薄膜の透過水側を流れる液体）（１１０）。フィードタンクを出る供給流れ（１２０）は、ポンプ（１３０）によって薄膜モジュール（１４０）に向けられる。比較的より小さな分子サイズを有する水、緩衝液成分などを含む透過水流れ（１５０）は、薄膜モジュールを通過する。濃縮されたアダリムマブを含む濃縮水流れ（１６０）は、濃縮水バルブ（１７０）によって制御されて、再びフィードタンクに向けられる。
【０１３８】
Ｋａｉｓｅｒ  Ｏｐｔｉｃａｌｓ製のＲａｍａｎＲＸ２（商標）分析器（１９０）に適合するラマンプローブ（１８０）を、定期的にタンクの内容物を特徴付ける能力を提供するためにフィードタンク内に置く。得られたスペクトルを較正ファイルを使用して成分濃度に変換し、従って、ダイアフィルトレーションプロセスの進行を監視することができる。さらに、（Ｄｏｎｎａｎ及び電荷排除効果に起因する）タンパク質の濃度の増加によって起こる添加剤濃度の変化を監視し、場合によって制御することができる。ＲａｍａｎＲＸ２（商標）分析器以外の他のラマンシステムも、アダリムマブ精製プロセスの品質管理の一環として定期的に限外濾過／ダイアフィルトレーションプロセスからのオンライン試料を特徴付けるために使用することができる。例えば、ラマン分析からの結果を、ダイアフィルトレーションプロセスの完了及び最終添加剤濃度を評価するために使用することができる。
【０１３９】
ヒスチジン、マンニトール及びメチオニンの混合物を、ＵＦ／ＤＦ薄膜を通してダイアフィルターした。ラマンプローブを濃縮水容器中に置いた。ラマンスペクトルを、特定の間隔で得、各読み取りは、３０秒の曝露、１０回の繰り返し（１０回の走査）からなった。図２４−２５は、ダイアフィルトレーション中の濃度の変化を示している。個別の成分の予想された濃度は、ダイアフィルトレーション中に増加し、水平域に達する。
【０１４０】
図２４−２５は、ダイアフィルトレーションプロセスのオンラインモニタリングからの結果を提供する。図２４において、糖、緩衝液及びアミノ酸濃度が、様々なダイアフィルトレーション時間について提供されている。図２４及び２５に示されたとおり、アミノ酸は、メチオニンであり、濃度（ｍＭ）を、ｙ軸にプロットし、糖は、マンニトールであり、ｗ／ｖ％を、ｙ軸にプロットし、緩衝液は、ヒスチジンであり、濃度（ｍＭ）を、ｙ軸に沿ってプロットする。図２４−２５におけるプロットのそれぞれについてのｘ軸は、滞留時間であり、ここで、０から８１分までの濃度を測定しｘ軸に沿ってプロットした。
【０１４１】
次に、水中に約４０ｍｇ／ｍｌで存在するアダリムマブを、５キロダルトンＵＦ／ＤＦ薄膜（０．１平方メートル）を通して７ダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）にわたって糖溶液にダイアフィルターした。ラマンプローブを濃縮水容器中に置いた。ラマンスペクトルを、特定の間隔で得、各読み取りは、３０秒の曝露時間、繰り返し１０回（１０回の走査）からなった。続いて、タンパク質を１４０ｇ／Ｌに濃縮した。
【０１４２】
図２６は、ＵＦ／ＤＦシステムで使用され、上記のとおり測定された糖／タンパク質システム（マンニトール／アダリムマブ）から得られた較正データを提供している。図２６からの較正曲線は、図２７及び２８におけるマンニトール及びアダリムマブ濃度を確かめるために使用した。図２７及び２８は、糖のダイアフィルトレーション中の濃度の変化を示している。右のプロットは、ダイアフィルトレーション及び続いての限外濾過中のタンパク質濃度を示している。図２７及び２８において、糖濃度（％）を滞留体積（ゼロから６）に対してプロットし、アダリムマブ濃度（ｇ／Ｌ）を滞留体積（ゼロから６）に対してプロットする。
【０１４３】
予想のとおり、糖の濃度は、ダイアフィルトレーション中に増加し、水平域に達する。タンパク質は目標濃度に達する。図２７において、５０ｇ／Ｌに較正されたモデルを使用した。図２８は、１２０ｇ／Ｌのタンパク質及び糖混合物で得られた較正を使用して計算された糖及びタンパク質濃度を示している。
【０１４４】
水中に約２０ｍｇ／ｍｌで存在するアダリムマブを、５キロダルトンＵＦ／ＤＦ薄膜（０．１平方メートル）を通して７ダイアボリュームにわたってヒスチジン溶液（５０ｍＭ）にダイアフィルターした。ラマンプローブを濃縮水容器中に置いた。ラマンスペクトルを、特定の間隔で得、各読み取りは、３０秒の曝露、繰り返し１０回（１０回の走査）からなった。続いて、タンパク質を５０ｇ／Ｌに濃縮した。図２９は、緩衝液（ヒスチジン）／タンパク質（アダリムマブ）系から得られた較正データを提供している。これは、５０ｇ／Ｌのタンパク質までのヒスチジン／アダリムマブ混合物の較正モデルである。図３０は、緩衝液／タンパク質系中の緩衝液及びタンパク質の低濃度についてのダイアフィルトレーション体積（０から６ダイアフィルトレーション体積）対ヒスチジン濃度（ｎＭ）及びアダリムマブ濃度（ｇ／ｌ）のプロットを提供している。
【０１４５】
プロットは、ヒスチジン（ｎＭ）のダイアフィルトレーション中の濃度の変化を示している。右のプロットは、ダイアフィルトレーション及び続いての限外濾過中のタンパク質濃度（ｇ／ｌ）を示している。予想のとおり、糖の濃度は、ダイアフィルトレーション中に増加し、水平域に達する。タンパク質は、目標濃度に達する。このプロット（図２９）において、５０ｇ／Ｌに較正したモデルを使用した。プロットにおける濃度は、モデルの制限によって予想より低く、これは、ヒスチジンのイオン化に関係することが後に確認された。モデルは、ヒスチジンのイオン化状態を、実測の合計ヒスチジン濃度及び溶液特性と相互に関連付けることができる。
【０１４６】
データは、タンパク質及び追加の単一成分を含む低及び高濃度ＵＦ／ＤＦ処理を監視する能力を示している。濃度を、３分毎に読むことができ、従ってリアルタイム（又はほぼリアルタイム）で濃度を監視する能力が提供される。糖／タンパク質系において、非常に高い精度が、全ての濃度のタンパク質について糖で得られた。緩衝液／タンパク質系において、高い緩衝精度が、より高い緩衝液濃度及びより低いタンパク質濃度において得られた。体積排除効果及びＤｏｎｎａｎ効果を検知及び測定する能力も、リアルタイム（又はほぼリアルタイム）で提供される。従って、ラマン分光法は、タンパク質溶液中の添加剤濃度測定のための手段として有用であり、プロセス制御を提供するために添加剤濃度に加えてタンパク質濃度を測定する能力も提供する。
【０１４７】
６．９  タンパク質を含む２成分製剤緩衝液の試験
実施例６．５の方法を、２成分、トリス及びアセテート及びタンパク質、アダリムマブを含む製剤緩衝液に適用した。成分を、次の範囲：トリス５０−１６０ｍＭ；アセテート３０−１３０ｍＭ；及びアダリムマブ４−１５ｇ／Ｌで含んだ。
【０１４８】
較正曲線を、実施例６．５に概略が記されたとおりに得ることができる。上記で開発されたモデルを、表３の濃度に従って調製された試料において、トリス、アセテート及びアダリムマブの混合物のスペクトルについての予測を生成するために使用した。
【０１４９】
【表１１】
0006010030.tif 000014
【０１５０】
これらの予測を、実測スペクトルに対して比較して、モデルが所定の許容範囲に入ることを確認した。結果を図３１Ａ−Ｃに示す。
【０１５１】
６．１０  タンパク質を含む細胞培養回収物の試験
実施例６．５の方法を、成分、Ｔｗｅｅｎ（商標）及びタンパク質、アダリムマブを含む化学的に定義された細胞培養培地回収物に適用した。細胞培養培地を、細胞培養バッチから回収し、濾過し、タンパク質Ａカラムにローディングした。タンパク質Ａカラムの貫流を集め、次いで貯蔵及び試験の前に除菌濾過した。
【０１５２】
この方法は、タンパク質Ａカラムローディングの終点を決定するために使用する。濾過した細胞培養回収物を、捕捉カラム（一般的にタンパク質Ａ）に適用する。カラムローディングアウトプットを監視するための現在の方法は、Ａ２８０吸収を使用する。しかし、培養回収物は、２８０ｎｍにおいて光を吸収する多くの構成要素を含む。Ａ２８０吸収は、通常、飽和され、Ａ２８０法でカラムローディング段階に抗体のブレイクスルーを測定することを困難にする。
【０１５３】
ラマン分光法は、捕捉カラムローディングアウトプット流れ（カラム貫流）中の抗体のための特定の測定を提供する。この試験は、様々な濃度の生成された抗体ＡＰＩ製剤原料（例えば、アダリムマブ）を、タンパク質Ａ貫流のプールにスパイクすることによって、提案されたオンライン抗体測定の模擬実験をする。スパイキング実験に使用されるＡＰＩ試料は、０．１％のＴｗｅｅｎ（商標）を含んだ。直接スパイキング実験の間、Ｔｗｅｅｎ（商標）の濃度は、抗体との直接の割合で変化し、ラマンスペクトル較正中に抗体と間違えられることがある。これを回避するために、Ｔｗｅｅｎ（商標）を追加の成分とみなし、抗体の濃度と無関係にスパイクした。従って、成分は、次の範囲：Ｔｗｅｅｎ（商標）０．１％−１．０％及びアダリムマブ０．１−１．０ｇ／Ｌに含まれた。
【０１５４】
較正曲線を、実施例６．５に概略を記したとおりに得ることができる。上記に開発されたモデルを、表４の濃度に従って調製された試料において、Ｔｗｅｅｎ（商標）及びアダリムマブの混合物のスペクトルについての予測を生成するために使用した。
【０１５５】
【表１２】
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【０１５６】
これらの予測を、モデルが所定の許容範囲に入ることを確認するために、実測スペクトルに対して比較した。結果を図３２Ａ−Ｂに示す。
【０１５７】
６．１１  抗体集合体検知の試験
２種の抗体（Ｄ２Ｅ７及びＡＢＴ−８７４）を、非修飾タンパク質の光誘起架橋（ＰＩＣＵＰ）を使用して別々に集合させた。抗体を、０−４時間（図３３及び３４）、集合を起こす光源に曝露し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって集合体を定量化した。試料を、ラマン分光法によって測定し、スペクトルを、主成分分析（ＰＣＡ）（図３５及び３６）及び部分的最小二乗解析ＰＬＳ（図３７Ａ及び３７Ｂ）を使用して模擬実験した。図３５及び３６は、集合した試料が明確な主成分の痕跡を有し、ラマン分光法を使用して集合体から分別することができることを示している。図３７Ａ及び３７Ｂは、ラマン分光法の結果とＳＥＣ測定の間のいくらかの相関関係を示している。
【０１５８】
様々な刊行物が本明細書に引用されているが、これらの内容は、これらの全体を本明細書に組み込む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
0006010030.tif 000050
【図３３】
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【図３４】
0006010030.tif 000052
【図３５】
0006010030.tif 000053
【図３６】
0006010030.tif 000054
【図３７Ａ】
0006010030.tif 000055
【図３７Ｂ】
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