(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
位置２におけるＸ1がＭ、Ｉ又はＬであり、位置３９におけるＸ2がＳ又はＣである、アミノ酸配列ＥＸ1ＲＮＡＹＷＥＩＡ ＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫ ＲＡＦＩＲＫＬＹＤＤ ＰＳＱＳＳＥＬＬＸ2Ｅ ＡＫＫＬＮＤＳＱ（配列番号１）を含むＨＥＲ２結合ポリペプチド。
【請求項２】
位置５におけるＸ1がＭ、Ｉ又はＬであり、位置４２におけるＸ2がＳ又はＣである、アミノ酸配列ＹＡＫＥＸ1ＲＮＡＹＷ ＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮ ＱＱＫＲＡＦＩＲＫＬ ＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬ ＬＸ2ＥＡＫＫＬＮＤＳ Ｑ（配列番号２）を含む、請求項１に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド。
【請求項３】
ＡＥＡＫＹＡＫＥＸ1Ｒ ＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰ ＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱ ＳＳＥＬＬＸ2ＥＡＫＫ ＬＮＤＳＱ（配列番号３）、及び
ＥＳＥＫＹＡＫＥＸ1Ｒ ＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰ ＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱ ＳＳＥＬＬＸ2ＥＡＫＫ ＬＮＤＳＱ（配列番号４）、
から選択され、ここでいずれも位置９におけるＸ1がＭ、Ｉ又はＬであり、位置４６におけるＸ2がＳ又はＣである、アミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド。
【請求項４】
ＡＥＡＫＹＡＫＥＭＲ ＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰ ＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱ ＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ ＬＮＤＳＱＡＰＫＶＤ Ｃ（配列番号５）、及び
ＥＳＥＫＹＡＫＥＭＲ ＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰ ＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱ ＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ ＬＮＤＳＱＡＰＫ（配列番号６）、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド。
【請求項５】
そのＮ末端にカップリングしたメルカプトアセチルを更に含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチドであって、Ｎ3Ｓキレート剤モチーフによって構成されるキレート環境が、メルカプトアセチルのＳＨ基と一緒になってＮ末端からの最初の３つの連続したペプチド結合の窒素原子によって与えられるＨＥＲ２結合ポリペプチド。
【請求項６】
配列中に既に存在するか、又は更なるアミノ酸残基として存在するか、又はＨＥＲ２結合に関与しない表面に露出したアミノ酸残基を置換することによって存在するいずれかのシステイン残基を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド。
【請求項７】
請求項６に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチドであって、システイン残基が配列番号５のＣ末端に位置するものか又は更なるシステインが配列番号１〜４若しくは６〜７のいずれか１つのＣ末端に位置しており、ここでシステイン残基には、場合により１つ又はそれ以上の他のアミノ酸残基が続き、そしてここでＮ3Ｓキレート剤モチーフによって構成されるキレート環境が、システイン残基のＳＨ基と一緒になって、システインによって構成されるアミノ酸残基及び２つの先行するアミノ酸残基の広がりの中の３つの連続したペプチド結合の窒素原子によって与えられる、ＨＥＲ２結合ポリペプチド。
【請求項８】
チオール基を介して、ポリペプチドにカップリングしたポリアミノポリカルボキシラートのキレート剤によって与えられるキレート環境を含む、請求項６に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド。
【請求項９】
ポリアミノポリカルボキシラートのキレート剤が、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸又はその誘導体、及び、ジエチレントリアミンペンタ酢酸又はその誘導体、から選択される、請求項８に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸配列が配列番号５で表される、請求項９に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチド。
【請求項１１】
ＨＥＲ２結合ポリペプチドと放射性核種との放射性キレートから成る放射性標識化ポリペプチドであって、該放射性キレートが、
・請求項５または７に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチドと、99mＴｃである医用画像に適した放射性核種とのものか、又は、86Ｒｅ及び188Ｒｅから成るグループから選択される治療に適した放射性核種とのもの；
・請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチドと、61Ｃｕ、64Ｃｕ、66Ｇａ、67Ｇａ、68Ｇａ、110mＩｎ、111Ｉｎ、44Ｓｃ及び86Ｙから成るグループから選択される医用画像に適した放射性核種とのものか、又は225Ａｃ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、67Ｃｕ、166Ｈｏ、177Ｌｕ、212Ｐｂ、149Ｐｍ、153Ｓｍ、227Ｔｈ及び90Ｙから成るグループから選択される治療に適した放射性核種とのもの、ここで、放射性核種は、キレート環境を介してＨＥＲ２結合ポリペプチドと錯体を形成する；及び
・請求項６に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチドと、211Ａｔ、76Ｂｒ、18Ｆ及びヨウ素同位体から成るグループから選択される医用画像及び／又は治療に適した放射性核種が、リンカー分子を介して結合しているもの；
から選択される、上記放射性標識化ポリペプチド。
【請求項１２】
18Ｆとリンカー分子を介して結合している配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の放射性標識化ポリペプチド。
【請求項１３】
放射性核種が診断に用いるための画像化に適する、請求項１１又は１２に記載の放射性標識化ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載の診断に用いるための放射性標識化ポリペプチドであって、診断が以下の工程：
・放射性核種が画像化に適する請求項１１又は１２に記載の放射性標識ポリペプチドを、哺乳類対象の体内に投与すること；及び
・放射性標識ポリペプチドの投与の１〜７２時間以内に、医用画像機器を使用して、対象の体の少なくとも１部分の１つ又はそれ以上の画像、ここで、該画像は体の内部の放射性核種の存在を指示する、を取得すること；
を含む、上記放射性標識化ポリペプチド。
【請求項１５】
治療に使用するための、放射性核種が治療に適する請求項１１に記載の放射性標識化ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチドから成る少なくとも１つの第一の部分、及び、連鎖球菌のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメインから成る少なくとも１つのさらなる部分、を含む、融合ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチドから成る少なくとも１つの第一の部分、及び、治療への適用のための少なくとも１つの部分、を含む、融合ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１〜４及び６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（Human Epidermal Growth Factor Receptor
2）（以下、ＨＥＲ２と称す）に結合する新規なポリペプチドに関連する。本発明は、診断用薬及び／又は薬物としてのＨＥＲ２結合ポリペプチドの使用、より詳しくは、ＨＥＲ２の過剰発現によって特徴付けられるがんの形態の診断及び／又は治療のための診断用薬及び／又は薬物としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＥＲ２とがんの疾病における役割
ＨＥＲ２がん原遺伝子は、ＨＥＲ２タンパク質又は受容体（非特許文献１）として知られている１８５ｋＤａ細胞表面受容体タンパク質の産生をコードする。この遺伝子は、また、しばしばneu、ＨＥＲ２／neu又はc-erbB-2と呼ばれる。neuは、最初はエチルニトロソ尿素で処理されていたラット中で発見され、そしてこの遺伝子の変異を示した（非特許文献２）。neuの変異バージョンは、構成的に活性な形態の受容体の産生をもたらし、低コピー数で細胞を形質転換できる強力ながん遺伝子を構成する（上記の非特許文献１を参照）。
【０００３】
正常細胞は、組織特異性のパターンにおけるそれらの細胞膜上で小量のＨＥＲ２タンパク質を発現する。ＨＥＲ２に対する一切の既知リガンドは解明されていない；しかしながら、ＨＥＲ２は、これらの受容体に対するリガンドと複合したＨＥＲ１（上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ））、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４とヘテロ二量体を形成することが示されている。そのようなヘテロ二量体形成は、活性化されたＨＥＲ２受容体が増殖シグナルを細胞外から核へ伝達し、従って正常な細胞の成長と分裂の状況を制御することにつながる（非特許文献３）。
【０００４】
腫瘍細胞では、ＤＮＡ複製系でのエラーが、単一の染色体での遺伝子の複数のコピーの存在をもたらす可能性があり、それは遺伝子増幅として知られる現象である。ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、この遺伝子の転写の増加をもたらす。これは、ＨＥＲ２ｍＲＮＡレベルが上昇し、ＨＥＲ２タンパク質の随伴合成を増加し、これらの腫瘍細胞の表面でのＨＥＲ２タンパク質の過剰発現をもたらす。この過剰発現は、隣の正常細胞に見られるものより１０倍から１００倍大きいＨＥＲ２タンパク質レベルをもたらすことができる。このことが、ひいては細胞分裂の増加と付随的に高い細胞増殖の速度をもたらす。ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、がん表現型への正常細胞の形質転換に関与している（上記の非特許文献１；上記の非特許文献３を参照）。
【０００５】
ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現は、ＨＥＲ２のホモダイマーの形成をもたらすと考えられ、それはひいては構成的に活性な受容体をもたらす（非特許文献４）。これらの条件下では、成長促進シグナルは、リガンドが無い状態で連続的に細胞に伝達され得る。その結果として、複数の細胞内シグナル伝達経路が活性化されるようになり、無秩序な細胞増殖、及び、ある場合には、がん遺伝子形質転換をもたらす（上記の非特許文献１を参照)。このように、増殖因子受容体によって仲介されるシグナル伝達機構は、細胞複製及び腫瘍増殖を抑制する重要な標的である。
【０００６】
乳がんは、合衆国の女性の中で最も一般的な悪性腫瘍であり、２００１年には１９万２，２００の新規症例が発生したと推定されている（非特許文献５）。全ての乳がん患者の約２５％に、その増幅によるＨＥＲ２遺伝子の過剰発現がある（非特許文献６）。ＨＥＲ２タンパク質のこの過剰発現は、エストロゲン受容体陰性状態を含む、いくつかの陰性の予後変数、高いＳ期分画、陽性結節状態、変異ｐ５３、及び高い核異型度と相関する（上記の非特許文献７を参照）。非特許文献６によれば、ＨＥＲ２遺伝子の増幅は、リンパ節陽性患者の短縮した無病生存及び短縮した全生存と強く相関することが分かった。
【０００７】
このような理由で、乳がんの病因及び治療におけるＨＥＲ２の役割への研究をさらに進めることは、重要な目標であったし、依然として然りである。
ＨＥＲ２と相互作用する分子の特定は、この取り組みの１部分を形成する。
【０００８】
前臨床のインビトロの検討は、ＨＥＲ２活性の抑制が腫瘍細胞増殖に影響する可能性があったかどうかを調べている。対照モノクローナル抗体による投与に比較し、４Ｄ５、いくつかのマウス抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体の１つ、によるＨＥＲ２タンパク質を過剰発現しているＳＫ−ＢＲ−３乳がん細胞の治療は、本当に腫瘍細胞増殖を抑制した。ＨＥＲ２を過剰発現するヒト乳がん及び卵巣がん（異種移植片）を有するマウスへの４Ｄ５の投与は、腫瘍の無い生存期間を延長した。同様の検討は、マウスにおけるヒト胃がん異種移植片で抗ＨＥＲ２ヒト化モノクローナル抗体の増殖抑制を実証した（非特許文献８）。
【０００９】
腫瘍細胞表面に豊富に存在するＨＥＲ２タンパク質を抗体で抑制する試みの中で、１つの療法は、ここ数年の間に市販されるようになった。このように、モノクローナル抗体４Ｄ５のヒト化変異体、又はトラスツズマブ（trastuzumab）は、Herceptin（登録商標）の商標名のもと、F Hoffman-La Roche 及び Genentechによってこの目的で市販されている。
【００１０】
このように、ＨＥＲ２の過剰発現が乳がんについて記載されている。それは、また、とりわけ卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺がん、肺がん（非特許文献９）及び食道におけるがん（非特許文献１０）につながっている。
【００１１】
ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現によって特徴付けられるがんに対する抗体療法によって示される明らかな優位性にもかかわらず、種々のファクターには抗体の有効性（非特許文献１１を参照）を減らす可能性があるという事実は残る。それらには以下のものがある：（１）大きい固形腫瘍又は脳のような生命の維持に必要な領域への抗体の制限的浸透；（２）血管透過性の減少により、標的部分への抗体の溢血の減少；（３）健常組織に対する交差反応性及び抗体の非特異的結合で、標的効果が低減する；（４）不均質な腫瘍取り込みが未治療区域をもたらす；（５）注入した抗体の代謝の増加で、治療効果が低減する；及び（６）ＨＡＭＡ及びヒト抗ヒト抗体の急速生成で、治療抗体を不活性化する。
【００１２】
加えて、毒性作用は、がんのための治療抗体の開発の大きな障害である（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４）。健常組織との交差反応性は、非抱合型の（裸の）抗体に対してかなりの副作用を起こす可能性があり、その副作用が毒素又はラジオアイソトープを有する抗体の抱合で高められる可能性がある。免疫介在性合併症は、肺毒性作用、時折の中枢及び末梢神経系合併症、並びに肝及び腎機能の減少からの呼吸困難を含む。時として、ＨＥＲ２ターゲッティング抗体のトラスツズマブに関連している心毒性作用のような、予想外の毒性合併症が見られる（非特許文献１５）。同位体抱合型抗体による放射免疫療法は、また、骨髄抑制を引き起こす可能性がある。
【００１３】
現在使用されている抗がん抗体の最近の臨床的及び商業的成功にもかかわらず、このように相当な数の重要な疑問が、抗体の使用の将来に関して残っている。結果として、ＨＥＲ２に対して匹敵する親和性のある試薬の継続的な提供は、疾患の診断と治療におけるそのような分子の利用の提供と同様に、この分野での相当な関心事として残る。
【００１４】
ＨＥＲ２結合のＺ変異分子
ブドウ球菌プロンテインＡ（ＳＰＡ）のドメインＢから誘導された、タンパク質Ｚに関連する分子（非特許文献１６）は、異なる相互作用ターゲットを使用している無作為化されたそのような分子のライブラリーから選択されている（例えば、特許文献１、非特許文献１７、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５を参照）。
【００１５】
特許文献６には、相当な数のＨＥＲ２と相互作用する能力のあるＺの変形が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開公報第９５／１９３７４号
【特許文献２】国際公開公報第２００５／０００８８３号
【特許文献３】国際公開公報第２００５／０７５５０７号
【特許文献４】国際公開公報第２００６／０９２３３８号
【特許文献５】国際公開公報第２００７／０６５６３５号
【特許文献６】国際公開公報第２００５／００３１５６号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Hynes NE et al (1994), Biochim Biophys Acta1198: 165-184
【非特許文献２】Shih C et al (1981), Nature 290: 261-264)
【非特許文献３】Sundaresan S, et al (1999), Curr Oncol Rep1: 16-22)
【非特許文献４】Sliwkowski MX et al (1999), Semin Oncol, 26 (4 Suppl12): 60-70)
【非特許文献５】Greenlee R, et al (2001), CA Cancer J Clin 51: 15-36
【非特許文献６】Slamon DJ, et al (1989), Science 244: 707-712
【非特許文献７】Sjogren S, et al (1998), J Clin Oncol, 16(2): 462-469
【非特許文献８】Pietras RJ, et al (1994), Oncogene 9: 1829-1838
【非特許文献９】Holbro, et al, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2004. 44: 195-217
【非特許文献１０】Ekman, et al, Oncologist 2007 ; 12 : 1165-1177; see, in particular, pages 1170-1171
【非特許文献１１】Reilly RM, et al (1995), Clin Pharmacokinet 28: 126-142
【非特許文献１２】Carter P (2001), Nat Rev Cancer 1: 118-129
【非特許文献１３】Goldenberg DM (2002), J Nucl Med 43: 693-713
【非特許文献１４】Reichert JM (2002), Curr Opin Mol Ther 4: 110-118
【非特許文献１５】Schneider JW, et al (2002), Semin Oncol 29 (3 suppl 11): 22-28
【非特許文献１６】Nilson B, et al (1987), Protein Engineering 1: 107-133
【非特許文献１７】Nord K, et al (1997), Nature Biotechnology 15:  772-777
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、ＨＥＲ２への特異的結合によって特徴付けられるポリペプチドの提供を通して、ＨＥＲ２に対する親和性を有する試薬の継続的提供の要望を満たすことにある。
【００１９】
本発明の関連する目的は、殆ど又は全く非特異的結合を示さない、ＨＥＲ２結合ポリペプチドである。
【００２０】
本発明の別の目的は、容易に融合ポリペプチドの部分として使用できる、ＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することにある。
【００２１】
別の目的は、既存の抗体試薬で経験する１つ又はそれ以上の公知の問題を解決する、ＨＥＲ２結合ポリペプチドの提供である。
【００２２】
本発明の更なる目的は、治療用途での使用を可能にするＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することである。
【００２３】
本発明の更なる目的は、診断用途での使用を可能にするＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することにである。
【００２４】
関連する目的は、ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現によって特徴付けられるがん疾患の臨床状況における、治療、阻害及び／又はターゲッティングの新規な形態を見出すことである。
【００２５】
本発明の別の目的は、化学的ペプチド合成によって簡単に合成されるＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することにある。
【００２６】
関連する目的は、公知のＨＥＲ２結合剤に対する改良された安定性を示す、ＨＥＲ２結合ポリペプチドを見出すことである。
【００２７】
本発明の更に別の目的は、インビボで哺乳動物に使用する場合、低抗原性を示すＨＥＲ２結合ポリペプチドを得ることである。
【００２８】
本発明の別の目的は、哺乳動物への投与時に改善された生体内分布を有する、ＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
これらの及び他の目的は、添付の特許請求の範囲に記載されるように、本発明のさまざまの態様によって明らかになる。このように、第１の態様では、本発明は、以下の式：
ＥＸ1ＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＸ2ＥＡＫＫＬＮＤＳＱ
式中、位置２におけるＸ1はＭ、Ｉ又はＬであり、位置３９におけるＸ2はＳ又はＣである；
（配列番号１）
又は、ある場合にはより好ましくは
ＹＡＫＥＸ1ＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＸ2ＥＡＫＫＬＮＤＳＱ
式中、位置５におけるＸ1はＭ、Ｉ又はＬであり、位置４２におけるＸ2はＳ又はＣである；
（配列番号２）
又は、ある場合にはより好ましくは
ＡＥＡＫＹＡＫＥＸ1ＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＸ2ＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱ
式中、位置９におけるＸ1はＭ、Ｉ又はＬであり、位置４６におけるＸ2はＳ又はＣである；
（配列番号３）
又は、ある場合にはより好ましくは
ＥＳＥＫＹＡＫＥＸ1ＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＸ2ＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱ，
式中、位置９におけるＸ1はＭ、Ｉ又はＬであり、位置４６におけるＸ2は、Ｓ又はＣである；
（配列番号４）
を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
これらに従って、本発明者は、配列番号配列番号１〜４の何れか１つを含むポリペプチドが、先に述べられたそれらのポリペプチドの標的ＨＥＲ２に結合する能力を保持しながら、例えば、特許文献６に開示されたＨＥＲ２結合ポリペプチドに比べて、驚くべき優位性を示すことを見出した。本発明のポリペプチドの１つ又はそれ以上の実施態様によって示された、そのような優位性の非限定的な例は、以下のとおりである：
・本発明のポリペプチドは、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸及びメチオニンのようなポリペプチド配列の化学合成において、低い収率及び成功率のような問題を引き起こす可能性があったアミノ酸残基を殆ど含まない。
・本発明のポリペプチドは、表面の疎水性を付与する、従って先に述べた、関連のＨＥＲ２結合ポリペプチドより親水性の特性を持っているアミノ酸残基を殆ど含まない。このことは、低い溶解性及び凝集性に伴う問題が殆どないことを意味する。理論にこだわることを望むわけではないが、より親水性の特性が、肝胆道経路（肝臓を経由した排泄）からより望ましい腎臓経路（腎臓を経由した排泄）に向けて、投与時のポリペプチドの生体内分布を宿主にシフトするように作用することは、現在も同じように信じられている。
・本発明のポリペプチドは、メチオニン、アスパラギン及びジペプチドのアスパラギンープロリンのようなポリペプチドの安定性の問題に関連するアミノ酸残基を殆ど含まない。メチオニンは酸化を受けやすく、アスパラギンは脱アミド化を受けやすく、そしてアスパラギン−プロリン結合は分裂を受けやすく、それ故に、それらは最終製品の不均一性に寄与する。
・本発明のポリペプチドは、同様の配列構成において、ＶＨ３からの重鎖可変領域を含んでいる免疫グロブリンとの相互作用を高めることが分かっているアミノ酸残基を欠いている（Silverman G.J., Int. Rev. Immunol. 1992;9(1):57-78）。理論にこだわることを望むわけではないが、本発明のポリペプチド中のそのようなアミノ酸残基の置換が、同じものの投与時のポリペプチドの宿主に対する抗原性を減らすことは、今では信じられている。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、さまざまな適用におけるＨＥＲ２に対する抗体の代替物としての応用を見出す。非限定的な例として、それらは、ＨＥＲ２過剰発現で特徴付けられるがんの治療に、細胞表面のＨＥＲ２に結合することによって細胞シグナリングを抑制することに、インビボ及びインビトロの両方におけるＨＥＲ２過剰発現で特徴付けられるがんの診断に、ＨＥＲ２を過剰発現している細胞に試薬のターゲッティングを行うことに、ＨＥＲ２の検出の組織化学的方法に、及び分離方法及び他の適用に有用である。本発明のポリペプチドは、試薬のＨＥＲ２に対する親和性に頼るいかなる方法にも有用であることを立証することができる。このように、本ポリペプチドは、そのような方法における検出試薬、捕捉試薬又は分離試薬として、インビボ又はインビトロの診断用の診断薬として、又はそれ自体で治療薬として、又は他の治療薬若しくは診断用薬をＨＥＲ２タンパク質にターゲットする方法として、使用することができる。インビトロで本発明のポリペプチドを用いる方法は、マイクロタイタープレート中で、プロテインアレイ中で、バイオセンサー表面上で、組織切片上で等のさまざまな型式で実施することができる。
【００３２】
本発明の範囲を逸脱しないで、ポリペプチドを意図する特定用途に合わせるために、本発明にに記載のポリペプチドのさまざまな修飾及び／又は付加が実施されてもよい。そのような修飾及び付加は、以下により詳細に記載されており、同じポリペプチド鎖に含まれる更なるアミノ酸、又は本発明のポリペプチドに化学的に共役する若しくは別の様式で結合する標識及び／又は治療薬を含んでもよい。
【００３３】
「ＨＥＲ２に対する結合親和性」、「ＨＥＲ２結合」等のような発現とは、例えば、Biacore（登録商標）機器（GE Healthcare）におけるような、表面プラズモン共鳴技術を用いて試験され得るポリペプチドの性質を意味する。ＨＥＲ２結合親和性は、ＨＥＲ２又はその断片、例えば、細胞外ドメイン又はその融合タンパク質が装置のセンサーチップ上に固定化され、検査されるポリペプチドを含む試料がそのチップ上を移動するような実験で試験することができる。或いはまた、検査されるポリペプチドが装置のセンサーチップ上に固定され、そしてＨＥＲ２を含む試料、又はその断片、例えば、細胞外ドメインが、そのチップ上を通過する。次いで、当業者は、少なくともＨＥＲ２に対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的測定を達成するために得られるセンサーグラム（sensorgrams）を解釈することができる。もし、例えば、相互作用の特定のＫＤ値を確立する目的を持って定量的測定が求められる場合は、再び表面プラズモン共鳴方法を使用することが可能である。結合値は、例えば、Biacore（登録商標）2000装置（GE Healthcare）で定義することができる。ＨＥＲ２、又はその断片、例えば、細胞外ドメインは、装置のセンサーチップ上に固定され、親和性が決定されるべきポリペプチドの試料は連続希釈によって調製され、無作為の順序で注入される。次いで、ＫD値は、例えば、装置メーカーによって提供されるBIAevaluation 3.2ソフトウェアの１：１ラングミュア結合モデルを用いて、その結果から計算することができる。
【００３４】
本発明は、また、上記のＨＥＲ２結合ポリペプチドが、更なるアミノ酸残基がどちらかの末端に付加している、ＨＥＲ２結合ドメインとして存在するポリペプチドを包含する。これらの更なるアミノ酸残基は、ポリペプチドによりＨＥＲ２の結合における役割を果たし得るが、同様に、例えば、ポリペプチドの産生、精製、安定化、カップリング又は検出の１つ又はそれ以上に関連する、他の目的をもよく果たし得る。そのような更なるアミノ酸残基は、化学カップリングのために追加される１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。この１つの例は、ポリペプチド鎖の中の一番最初の又は一番最後の位置、即ち、Ｎ又はＣ末端におけるシステイン残基の付加である。化学カップリングに使用されるシステイン残基は、また、タンパク質ドメイン上で、好ましくは標的結合に関与しない表面の部分の上で、別のアミノ酸の置換によって導入され得る。そのような更なるアミノ酸残基は、タグに固有の抗体との相互作用用のヘキサヒスチジル （Ｈｉｓ6）タグ、若しくは「ｍｙｃ」タグ又は「ＦＬＡＧ」タグのようなポリペプチドの精製又は検出のための「タグ」を含み得る。当業者は、他の選択肢を知っている。
【００３５】
更なるアミノ酸残基を有するポリペプチドの具体的実施態様において、本発明は、下記のアミノ酸配列：
ＡＥＡＫＹＡＫＥＭＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ ＬＮＤＳＱＡＰＫＶＤＣ
（配列番号５）
を含むＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供する。
【００３６】
更なるアミノ酸残基を有するポリペプチドの別の具体的実施態様において、本発明は、下記のアミノ酸配列：
ＥＳＥＫＹＡＫＥＭＲ  ＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰ  ＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ  ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱ  ＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫ
（配列番号６）
を含むＨＥＲ２結合ポリペプチドを提供する。
【００３７】
上で議論された「更なるアミノ酸残基」は、また、第１の、ＨＥＲ２結合ドメイン、又は別の結合機能、又は酵素機能、又は蛍光機能、又はそれらを混合したものと同じ結合機能のような、いかなる所望の機能を有する１つ又はそれ以上のポリペプチドドメインを構成してもよい。
【００３８】
このように、本発明は、配列番号１〜６の何れか１つを含むポリペプチドの多量体を包含する。それは、例えば、がんの診断や治療のために又はＨＥＲ２の精製の方法において、本発明のポリペプチドを使う場合、本発明の１つのポリペプチドで可能であるよりも更に強いＨＥＲ２の結合を得ることに、関心が持たれるかもしれない。この場合、ポリペプチドの、二量体、三量体又は四量体のような、多量体の提供は、必要な結合力効果をもたらし得る。多量体は、本発明に記載の適する数のポリペプチドから成るり得る。本発明の多量体中の結合ポリペプチド「ユニット」は、公知の有機化学の方法を使って共有結合によって連結され得るし、又は、ポリペプチドの組換え発現のシステムにおいて１つ又はそれ以上の融合ポリペプチドとして表現されたり、又はいかなる他の方法ででも、直接に又はリンカー、例えば、アミノ酸リンカーを経由して連結され得る。
【００３９】
さらに、配列番号１〜６の何れか１つを含むポリペプチドが、第１のドメイン、又は第１の部分を構成し、そして第２の部分及び更なる部分が結合性ＨＥＲ２以外の機能を有する「異種遺伝子型の」融合ポリペプチドも意図され、そして本発明の範囲に属する。融合ポリペプチドの第２の部分及び更なる１つ又は複数の部分は、ＨＥＲ２とは別のターゲット分子に対する親和性を有する結合ドメインを含み得る。その結果は、従って、少なくとも１つのＨＥＲ２結合ドメイン及び該他の標的分子に対する親和性を有する少なくとも１つのドメインを有する融合ポリペプチドである。これは、治療剤又は捕捉、検出又は分離試薬として使用されるような、いくつかの生物工学的応用に使われ得る多特異的試薬を作成することを可能にする。少なくとも1つのポリペプチドドメインが配列番号１〜６のいずれか１つの配列を含むような、そのようなポリペプチドの多特異的多量体の製造は、いくつかのＨＥＲ２結合性「ユニット」の多量体に対して上記のように行われ得る。第２の又は更なる１つの又は複数の部分は、「Ｚドメイン」又は「タンパク質Ｚ」の変異体等の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のタンパク質Ａ由来のドメインの変異体であり得る（Nilsson B et al (1987), Protein Engineering 1: 107-133を参照）、又は標的に対する結合親和性を有する無関係の、天然に存在する、又は組み換えのタンパク質（又は天然に存在する又は組み換えの蛋白の結合能力を保持しているその断片）を含む。ヒト血清アルブミンに対する親和性を有し、本発明のポリペプチドとの融合相手として使用され得るそのような結合タンパク質の例は、ＧＡ１、ＧＡ２又はＧＡ３ドメインのような連鎖球菌菌株（Streptococcus strain）Ｇ１４８（Nygren P-A et al (1988), Mol Recogn 1: 69-74）のタンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメインの１つである。プロテインＧのＧＡ３ドメインは、また、ＡＢＤ、即ち、アルブミン結合ドメイン（albumin binding domain）で示される。配列番号１〜６のいずれか１つの配列を含むＨＥＲ２結合ポリペプチドと連鎖球菌タンパク質Ｇのタンパク質結合ドメインの間の融合ポリペプチドは、このように本発明の範囲に属する。本発明のポリペプチドが診断薬、治療薬として、又は標的薬としてヒト被験者に投与される場合、血清アルブミンに結合する部分へのその融合は有益であることを証明することができる。その場合、単離時のＨＥＲ２結合部分の半減期と比較して、そのような融合タンパク質のインビボでの半減期は延びる可能性が高い（この原理については、例えば、国際公開公報第９１／０１７４３号に記載されている）。同様に、国際公開公報第２００５／０９７２０２号で明らかにされた原理に従って、融合ポリペプチドは、単離時のＨＥＲ２結合部分より低い免疫原性を示すようである。
【００４０】
融合ポリペプチドの創出に対する他の可能性が同様に意図される。このように、本発明の第１の態様に記載のポリペプチドは、第２の又は更なる部分等に共有結合的にカップリングすることができ、それは、標的結合に加えて、又は標的結合の代わりに、他の機能を示す。１つの例は、配列番号１〜６のいずれか１つの配列を含む１つ又はそれ以上のポリペプチドと、レポーター又はエフェクター部分として機能している酵素活性のポリペプチドとの間の融合である。融合タンパク質を形成する配列番号１〜６のいずれか１つの配列を含むポリペプチドにカップリングされ得るリポーター酵素の例は、当業者に知られており、そしてβ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、カルボキシペプチダーゼのような酵素を含む。本発明の融合ポリペプチドの、第２の、及び更なる１つ又は複数の部分に対する他のオプションは、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ及びその変異体のような蛍光性ペプチドを含む。
【００４１】
本発明の融合ポリペプチドの、第２の、及び更なる１つの又は複数の部分に対する他のオプションは、治療への適用のための部分等を含む。治療への適用においては、他の分子も、また、他の手段による本発明のポリペプチドに、共有結合で又は非共有結合でカップリングされ得る。非限定的な例は、エフェクター酵素(例えば、カルボキシペプチダーゼ）の方向に本発明のポリペプチドを用いるＡＤＥＰＴ（抗体指向酵素プロドラッグ治療）（antibody-directed enzyme prodrug therapy）適用のための酵素；免疫系のエフェクター細胞及び他のコンポーネントの補充のためのタンパク質；ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＰ−１０のようなサイトカイン；組織因子、フォン・ビルブラント因子のような凝固促進因子；リシンＡ、シュードモナス外毒素、カルケアマイシン、メイタンシノイドのような毒素；アウリスタチアナログ、ドキソルビシンのような毒性の小さな分子；を含む。
【００４２】
本発明に記載のＨＥＲ２結合ポリペプチドを取り込んでいる融合タンパク質の上記の記述に関して、第１の、第２の、更なる部分の命名は、一方ではＨＥＲ２結合部分又は該部分と、他方では他の機能を発揮している部分との間を区別する明快な理由のためになされていることも注目すべきである。これらの命名は、融合タンパク質のポリペプチド鎖の中の、さまざまなドメインの実際の順序を示すよう意図されていない。従って、例えば、該第１の部分が、融合タンパク質のＮ末端に、中央に、又はＣ末端に制約なしに出現する可能性がある。
【００４３】
本発明は、上記のＨＥＲ２結合ポリペプチドが、例えば、ポリペプチドの検出の目的のために、少なくとも１つのフルオロフォア、ビオチン又は放射性同位元素のような標識基を備えているポリペプチドを含む。特に、本発明は、上記のＨＥＲ２結合ポリペプチドの放射性キレート、及び放射性金属のような放射性核種から成る放射性標識ポリペプチドを含む。
【００４４】
放射性核種の大部分は金属の性質を有し、そして金属は、一般的には、タンパク質及びペプチド中に存在する元素との安定な共有結合を形成することができない。このために、標的タンパク質を放射性金属で標識することが、キレート剤、キレートと呼ばれる、金属と非共有化合物を形成する、多座配位子を使って行われる。本発明のポリペプチドの実施態様において、放射性核種の取り込みは、キレート環境の提供によって可能になり、それによって放射性核種はポリペプチドに配位し、キレート化し又は錯体化され得る。
【００４５】
本発明のポリペプチドの１つの具体的実施態様において、Ｎ3Ｓキレート剤として特徴付けられる四座配位子キレート環境を含む。Ｎ3Ｓという用語が意味するように、そのようなキレート剤の４つの付着している基は、３つの窒素原子及び１つの硫黄原子から形成される。Ｎ3Ｓキレート剤では、、Ｎ及びＳ原子は空間的に配置されて、放射性金属の錯体化又は付着のために適する「ポケット」を提供する。
【００４６】
Ｎ3Ｓキレート剤は、ポリペプチドのアミノ酸配列中のアミノ酸残基を好適に選択して提供され得る。
【００４７】
例えば、Ｎ3Ｓキレート環境は、本発明のポリペプチドのＮ末端に、メルカプトアセチ
ルのカップリングを通して供給され得る。この実施態様においては、メルカプトアセチルが必要なＳ原子を与え、一方、ペプチド骨格中の最初の３つのＮ原子が四座配位子キレート剤の３つのＮ原子を構成する。好ましくは、メルカプトアセチルが、最も多くのＮ末端アミノ酸配列である、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドにカップリングされ、その結果、下記のアミノ酸配列：
ｍａＥＳＥＫＹＡＫＥＸ1ＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＸ2ＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱ、
式中、ｍａはメルカプトアセチル、位置９のＸ１はＭ、Ｉ又はＬであり、位置４６のＸ２はＳ又はＣである；
を含むポリペプチドになる。これの特に好ましい実施態様では、ポリペプチドが下記の配列：
ｍａＥＳＥＫＹＡＫＥＭＲ  ＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰ  ＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ  ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱ  ＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫ、
式中、ｍａは、メルカプトアセチルである；
（配列番号７）
を有する。
【００４８】
代わりの実施態様においては、３個のＮ基は、ポリペプチド鎖中の３つの連続したペプチド結合のＮ原子によって提供されることができ、その内、最後のものはシステイン残基であり、その側鎖にＳＨ基を含む。システイン側鎖のＳ原子は、Ｎ3Ｓキレート剤におけるＳ原子を構成する。別の言葉で言えば、Ｎ3Ｓキレート剤がトリペプチド配列ＸＸＣの形で提供され、ここで、Ｘは、いかなるアミノ酸残基であってもよい。そのようなトリペプチド配列は、、１つ又はそれ以上の更なるアミノ酸として、最初に又は追加して、本発明のポリペプチドの中に含まれる。システイン残基が配列番号５のＣ末端に位置しているもの、又は追加のシステインが配列番号１〜４又は６〜７のいずれか１つのＣ末端に正しく位置していることが好ましい。システイン残基は、また、１つ又はそれ以上の他のアミノ酸残基がその後に続いてもよい。
【００４９】
Ｎ３Ｓキレート剤として特徴付けられる四座配位子キレート環境を含み、３つの連続したペプチド結合のＮ末端及び窒素原子にカップリングしたメルカプトアセチルか、ポリペプチドのＣ末端で３つの連続したペプチド結合とシステイン残基の窒素原子のどちらかによって提供される本発明のポリペプチドは、ＨＥＲ２結合ポリペプチドの放射性キレート及び医用画像に適した放射性核種から成る放射性標識ポリペプチドを提供するために使用することができ、そして該放射性核種は99mＴｃ (Engfeldt et al (2007) Eur. J. Nucl.
Med. Mol. Imaging 34(5):722-22; Engfeldt et al (2007) Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 34(11):1843-53)であり、又は治療に適する放射性核種を有しており、該放射性核種は186Ｒｅ及び188Ｒｅから成るグループから選択される。いくつかの実施態様において、放射性核種は、キレート環境を介してＨＥＲ２結合ポリペプチドと錯体を形成する。
【００５０】
本発明のポリペプチドが２つ、３つ又はそれ以上のＸＸＣトリペプチドを含む場合、それは、好ましくは放射性核種を錯体化するのに使われる末端のものである。ポリペプチドがこのような方法で放射性標識される場合、他のＸＸＣトリペプチドは、好ましくは保護されている。
【００５１】
本発明の放射性標識ポリペプチドの１つの特に好ましい実施態様は、アミノ酸配列：
ｍａＥＳＥＫＹＡＫＥＭＲ  ＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰ  ＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ  ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱ  ＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫ
式中、ｍａはメルカプトアセチルである；
（配列番号７）
を有するＨＥＲ２結合ポリペプチドの放射性キレート及び99mＴｃである。
【００５２】
ポリペプチドのＮ末端にあるｍａＥＳＥ又はＣ末端にあるＶＤＣを使用してキレート化した、99mＴｃの仮説の構造は、それぞれ以下のものである。
【化１】
0005913807.tif 000002
【００５３】
本発明のポリペプチドの代替実施態様では、ポリアミノポリカルボキシラート・キレート剤を使用して放射性核種を組み込む。好ましくはその場合、ポリペプチドは少なくとも１つのシステインを含み、最も好ましくはたった  １つのシステインを含む。システインは、本発明のポリペプチドに最初に存在していても、又は１つ又はそれ以上の更なるアミノ酸として後の段階で追加されてもよい。
【００５４】
当業者は、また、ペプチド合成中ポリペプチドに部位特異的に結合できる、又は放射性標識のための公知の共役化学を使って組換え的に産生されるポリペプチドに共役させることができる、「裸の」Ｍｅ、Ｍｅ＝Ｏ、Ｏ＝Ｍｅ＝Ｏ、Ｍｅ≡Ｎ、Ｍｅ（ＣＯ）3のようなコア（core）、又はＨＹＮＩＣ−Ｍｅ−ｃｏ−リガンド・コア（ここで、ＭｅはＴｃ又はＲｅのラジオアイソトープである)をキレートする能力がある、多くの他のキレート剤の予測を行うことができよう。好ましくは、そのようなキレート剤は親水性の特性を有する。そのようなキレート剤の良い概説は、Liu S and Edwards DS (1999) Chem Rev. 99(9):2235-68により提供されている。
【００５５】
誰でもポリアミノポリカルボキシラート・キレート剤の２つのクラス：大環状及び非環式、を区別することができる。
【００５６】
インジウム、ガリウム、イットリウム、ビスマス、放射性アクチニド及び放射性ランタニドのラジオアイソトープ用に最も一般的に使用される大環状キレート剤は、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）（以下を参照）のさまざまな誘導体である。本発明のポリペプチドとのキレート化剤として使用するために適した、いくつかのさまざまのＤＯＴＡベースの化合物は、例えばMacrocyclics Inc., USAから市販されており、例を以下に示す。
【化２】
0005913807.tif 000003
【００５７】
この図式では、ＡはＤＯＴＡであり、Ｂはアミノ反応性の４−イソチオシアナート−ベンジル−ＤＯＴＡ、ＣはＤＯＴＡ−ＴＦＰエステル、そしてＤはチオール反応性のマレイミド−モノ−アミドＤＯＴＡである。
【００５８】
高い動力学的不活性、即ちＤＯＴＡからの金属の解離の遅速性は、放射性核種の安定結合に好都合である。しかし、会合遅速性のため、標識のためには高温が必要となる。この理由のために、６０〜９０℃への加熱に比較的敏感でないＤＯＴＡ誘導体が、短いペプチドの標識に広く使用される。
【００５９】
本発明におけるキレート剤として使用するための１つの好ましい誘導体は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミドである。
【００６０】
上に開示したように、本発明のポリペプチドは、例えばアミノ酸配列番号５の配列を含み得る。より格別な実施態様では、ポリペプチドは配列番号５を含み、そしてアミノ酸残基Ｃ６１にカップリングしたテトラアザシクロ化合物を有する。特に好ましい実施態様では、テトラアザシクロ化合物が、残基Ｃ６１のＳＨ基の、テトラアザシクロ化合物のマレイミド部分との反応を通じてポリペプチドにカップリングされている、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミドである。本発明の１つの特に好ましい実施態様は、従って、１，４，７，１０−テトラアザシクロ−ドデカン−１，４，７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミドにカップリングしたアミノ酸配列：
ＡＥＡＫＹＡＫＥＭＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫＶＤＣ
（配列番号５）
を含むＨＥＲ２結合ポリペプチドである。
【００６１】
最も一般的に使用される非環状ポリアミノポリカルボキシラート・キレート剤は、以下の図式に示されるそれらのようなＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）のさまざまの誘導体であり、ここで、ＡはＤＴＰＡであり、Ｂはアミノ反応性誘導体イソチオシアナートベンジル−ＤＴＰＡであり、Ｃはアミノ反応性誘導体半硬質の２−（パラ−イソチオシアナートベンジル）−６−メチル−ＤＴＰＳ（ＩＢ４Ｍ）であり、Ｄはアミノ反応性誘導体ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡである。
【化３】
0005913807.tif 000004
【００６２】
ＤＴＰＡの骨格修飾した半硬質の変異体は、例えば、Zevalin（登録商標）の90Ｙでの標識化にとって適切な安定性を与えることが見出されている。非環式キレート剤が大環状のものより不活性の程度が弱く、従ってより不安定であるけれども、その標識化は周囲温度でも十分に迅速である。このために、それらは、加熱に耐えることができないモノクローナル抗体の標識化には好ましいかもしれない。ポリアミノポリカルボキシラート・キレート剤のターゲッティングタンパク質とペプチドに対するカップリング用の詳細なプロトコルは、Cooper及び共同研究者(Nat.Protoc.1: 314-7.2006)並びにSosabowski及びMather (Nat.Protoc1: 972-6(2006))によって公表されている。
【００６３】
ポリアミノポリカルボキシレート・キレート剤にカップリングした本発明のポリペプチドは、キレート剤及び医用画像に適した放射性核種にカップリングしたＨＥＲ２結合ポリペプチドの放射性キレートから成る放射性標識ポリペプチドを提供するために使用されてもよく、該放射性核種は、61Ｃｕ、64Ｃｕ、66Ｇａ、67Ｇａ、68Ｇａ、110mＩｎ、111Ｉｎ、44Ｓｃ及び86Ｙから成るグループから選択され、又は治療に適した放射性核種とのものでは、該放射性核種は、225Ａｃ、212Ｂｉ、213Ｂｉ、67Ｃｕ、166Ｈｏ、177Ｌｕ、212Ｐｂ、149Ｐｍ、153Ｓｍ、227Ｔｈ及び90Ｙから成るグループから選択され、ここで、放射性核種はキレート環境を介してＨＥＲ２結合ポリペプチドと錯体を形成する。
【００６４】
本発明の放射性標識ポリペプチドの１つの特に好ましい実施態様は、１，４，７，１０−テトラアザシクロ−ドデカン−１，４，７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセト−アミド及び111Ｉｎにカップリングした、アミノ酸配列：
ＡＥＡＫＹＡＫＥＭＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ  ＩＲＫＬＹＤＤ
ＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫＶＤＣ
（配列番号５）
を有する、ＨＥＲ２結合ポリペプチドの放射性キレートである。
【００６５】
本発明の放射性標識ポリペプチドの１つの特に好ましい実施態様は、１，４，７，１０−テトラアザシクロ−ドデカン−１，４，７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセト−アミド及び61Ｃｕ又は64Ｃｕにカップリングした、アミノ酸配列：
ＡＥＡＫＹＡＫＥＭＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ  ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫＶＤＣ
（配列番号５）
を有する、ＨＥＲ２結合ポリペプチドの放射性キレートである。
【００６６】
本発明の放射性標識ポリペプチドの１つの特に好ましい実施態様は、１，４，７，１０−テトラアザシクロ−ドデカン−１，４，７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセト−アミド及び66Ｇａ、67Ｇａ又は68Ｇａにカップリングした、アミノ酸配列：
ＡＥＡＫＹＡＫＥＭＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ  ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫＶＤＣ
（配列番号５）
を有する、ＨＥＲ２結合ポリペプチドの放射性キレートである。
【００６７】
本発明に記載の放射性標識ポリペプチドの１つの特に好ましい実施態様は、１，４，７，１０−テトラアザシクロ−ドデカン−１，４，７−トリス−酢酸−１０−マレイミドエチルアセト−アミド及び86Ｙにカップリングした、アミノ酸配列：
ＡＥＡＫＹＡＫＥＭＲＮＡＹＷＥＩＡＬＬＰＮＬＴＮＱＱＫＲＡＦ  ＩＲＫＬＹＤＤＰＳＱＳＳＥＬＬＳＥＡＫＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫＶＤＣ
（配列番号５）
を有する、ＨＥＲ２結合ポリペプチドの放射性キレートである。
【００６８】
本発明の放射性標識ポリペプチドは、また、前記に示すようなＨＥＲ２結合性ポリペプチドの間接標識化によって得ることができる。好ましくは、ポリペプチドは少なくとも１つのシステインを含有し、最も好ましくはたった１つのシステインを含有する。システインは、本発明のポリペプチドに最初に存在していてもよいし、又は１つ又はそれ以上の更なるアミノ酸として後の段階で付加されてもよい。例えば18Ｆ、76Ｂｒによる非間接標識化のためには、さまざまのヨウ素同位体及び211Ａｔ、中間体「リンカー分子」が標識化のために用いられる。そのようなリンカーは２つの官能性部分を含有し、１つは迅速で効率的な放射性標識化を与え、別のものは、タンパク質への、例えばアミン基への、又は好ましくはユニークシステインのチオール基への、迅速で効率的なカップリングを与える。例えば、マレイミド基は、チオール基と反応して安定なチオエーテル結合を形成する。この考えは、最初に「リンカー分子」を放射性標識と反応させ、続いてタンパク質のチオール基と反応させることである。
【００６９】
いくつかの代替案が放射性ヨウ素化について徹底的に検討されており、そこではリンカー分子の放射標識化が、例えば活性化フェノール環又は適した脱離基を有する芳香環上で為されている。非標識リンカーの製造と、Ｎ−スクシンイミジル３−［*Ｉ］ヨードベンゾアートを使用する間接的放射性ヨウ素化の詳細なプロトコルは、Vaidyanathan et al.(Vaidyanathan G and Zalutsky MR(2006),Nat Protoc. 1(2): 707-13)によって提供されている。Ｎ−スクシンイミジルトリメチルスタンニルベンゾアートを使用する間接放射性ヨウ素化の例は、以下の図式に示される。
【化４】
0005913807.tif 000005
【００７０】
この図式では、リンカー分子は先ず酸性条件下で放射性ヨード化され、それからアルカリ条件下で遊離アミン（リジンのε−アミノ基のＮ末端）にカップリングされる。ベンゾアートのメタとパラヨード誘導体の両方は、文献に記載されている。
【００７１】
リンカー分子は、、放射性標識（例えば、２−、３−又は４−の位置で）をリンクするアリール基を含んでもよい。但し、放射性標識が76Ｂｒである場合は、リンカー分子はフェノール性ＯＨ基を含まない。リンカー分子の非限定的な例は、本発明のポリペプチドにリンクするために使用できる複素環のイミドを含み、そして放射性標識は、Ｎ−［２−ベンズアミドエチル］マレイミド（malemide），４−マレイミドベンゾフェノン（ＢＰＭａｌ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド塩酸塩（ＭＰＢＨ）、及びマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を含む。
【００７２】
Ｎ−［２−ベンズアミドエチル］マレイミドは、18Ｆと反応してＮ−［２−（４−（18Ｆ−フルオロベンズアミド）エチル］マレミドを形成し得る。同様にCai et al. (J. Nucl. Med.47:1172-80(2006))によって記載されているように、76Ｂｒと反応し得る。
【００７３】
本発明は、また、前記ＨＥＲ２結合ポリペプチドの使用の別の態様、並びにポリペプチドがその結合特性故に有用である治療、診断及び検出のためのさまざまの方法、に関する。これらの使用及び方法の以下の説明で「ＨＥＲ２結合ポリペプチド」を言及する場合、この用語は、単独でＨＥＲ２結合ポリペプチドを包含するが、しかしまた、例えば融合タンパク質中の部分としてＨＥＲ２結合ポリペプチドを組み込む、及び／又は標識、キレート剤、治療薬及び／又は診断薬に共役されている、及び／又はタグとして又は他の目的で更なるアミノ酸残基と共に提供される、上記のこのポリペプチドに基づく全てのそれらの分子を包含するものとする。上で説明したように、そのような融合タンパク質、誘導体などは、本発明の一部を構成する。
【００７４】
従って、１つのそのような態様において、本発明は、ＨＥＲ２の過剰発現によって特徴付けられるがんを有する又は疑われるヒトを含む、哺乳動物対象（subject）の体のインビボ画像化の方法を提供し、その方法は下記の工程を含む：
・医用画像に適した放射性核種を含む、前述の放射性標識ポリペプチドを哺乳類対象の体内に投与すること：及び
・医用画像機器を使用して対象の体の少なくとも一部分の画像、該画像は該体の内部の放射性核種の存在を指示する、を得ること。好ましくは、画像は、体への放射性標識ポリペプチドの投与の１〜７２時間、又はある場合にはより好ましくは１〜２４時間内に得られる。投与と画像取得の間の時間は、使用される放射性核種の半減期に依存する。画像を得る工程を２回、３回又はそれ以上繰り返すことが可能であり、それによって画像の系列が取得される。人が標的薬の経時的な体内分布を追跡しようとする場合、これは有用であり、薬物動態学的試験を可能にする。当業者には当然のことながら、そのような試験に必要な程度の時間分解能を達成するために、任意の数の画像を得ることができる。
【００７５】
本発明の画像化方法の１つの実施態様において、本方法は、投与工程の前に、本発明の放射性標識ポリペプチドを製造する準備工程を含み、その工程は、第１の態様に記載のポリペプチドを医用画像に適した放射性核種と混合することを含む。
【００７６】
本発明の画像化方法のより格別な実施態様において、本方法は、投与工程の前に、（ｉ）アミノ酸配列が配列番号７から成るポリペプチド、の放射性標識ポリペプチドを、ｉｉ）99mＴｃ、を用いて製造する準備工程を含み、その工程は、ポリペプチドを、適切な緩衝液中で、適切な還元剤、例えば塩化第一スズ又はフッ化第一スズの存在下で、99mＴｃ−過テクネチウム酸と混合することを含む。これは、また、中間体の弱いキレート剤、例えば酒石酸若しくはクエン酸又はグルコン酸の存在下で実行され得る。
【００７７】
本発明の画像化方法の別の格別な実施態様において、本方法は、投与工程の前に、（ｉ）アミノ酸配列が１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミドに共役した配列番号５から成るポリペプチド、の放射性標識ポリペプチドを、ｉｉ）111Ｉｎを用いて製造する準備工程を含み、その工程は、非溶解性コロイドの生成を防止する適切な緩衝液、例えば酢酸又はクエン酸緩衝液（しかし、これに限定されない）中、共役体を111Ｉｎと混合することを含む。
【００７８】
本発明の画像化方法の別の格別な実施態様において、本方法は、投与工程の前に、（ｉ）アミノ酸配列が１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミドに共役した配列番号５から成るポリペプチド、の放射性標識ポリペプチドを、ｉｉ）61Ｃｕ又は64Ｃｕを用いて製造する準備工程を含み、その工程は、非溶解性コロイドの生成を防止する適切な緩衝液、例えば、酢酸又はクエン酸緩衝液（しかし、これに限定されない）中、共役体を61Ｃｕ又は64Ｃｕと混合することを含む。
【００７９】
本発明の画像化方法の別の格別な実施態様において、本方法は、投与工程の前に、（ｉ）アミノ酸配列が１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリス酢酸−１０−マレイミドエチルアセトアミドに共役した配列番号５から成るポリペプチド、の放射性標識ポリペプチドを、ｉｉ）66Ｇａ、67Ｇａ又は68Ｇａを用いて製造する準備工程を含み、その工程は、非溶解性コロイドの生成を防止する適切な緩衝液、例えば酢酸又はクエン酸緩衝液（しかし、これに限定されない）中、共役体を66Ｇａ、67Ｇａ又は68Ｇａと混合することを含む。
【００８０】
本発明のこの態様のいくつかの実施態様において、前記がんは、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺がん、肺がん及び食道におけるがんから選択される。
【００８１】
別の態様において、本発明は、診断に利用するための上記のような放射性標識ポリペプチドを提供する。「診断」という用語は、本明細書において、患者の病歴、試験及び臨床検査データのレビューの評価を通じて疾患の特質及び原因を同定したり、決定する行為又は方法を記述するために用いられる。
【００８２】
放射性標識ポリペプチドは、頻発するＨＥＲ２の過剰発現によって特徴付けられるがんの群に属しているがんの診断に用いることができる。「頻発する」という用語は、ＨＥＲ２の過剰発現が、特定のがんを有する全ての患者の少なくとも１０％に存在していることを示すために、本明細書で用いられる。このように、放射性標識ポリペプチドは、患者がそのようながんを有するかどうかを決定するプロセスに使用することができる。また、患者の適する治療を決定するプロセスでも使用することができる。特に、ＨＥＲ２過剰発現の検出は、ＨＥＲ２標的の療法、例えばトラスツズマブ(Herceptin（登録商標））での治療に対する患者の層別化に有用であり得る。
【００８３】
放射性標識ポリペプチドは、また、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺がん、肺がん及び食道におけるがんより選択されるがんの診断及び／又は分子的特性化に、使用することができる。このような状況において、分子的特性化は、例えばいずれかのＨＥＲ２の発現があるかどうかを決定し、例えば治療の前後での画像を取得することによって達成できる治療の前後でのＨＥＲ２発現の量を決定し、例えば、手術目的のために、ＨＥＲ２発現の程度又は解剖学的含量（content）を決定するためのＨＥＲ２発現の特性化に関する。
【００８４】
また、本発明の別の態様において、ヒトを含む哺乳動物の対象物の体のインビボの画像化の診断薬の製造において、上記のような放射性標識ポリペプチドの使用が提供される。
【００８５】
別の応用の態様において、本発明は、ＨＥＲ２の過剰発現によって特徴付けられるがんを有する、ヒトを含む哺乳類対象の治療方法であって、前記哺乳類対象物の身体に、治療に適する放射性核種を含む上記の放射性標識ポリペプチドを、治療的有効量で投与する工程を含む方法を提供する。
【００８６】
この態様の１つの実施態様において、前記方法は、投与工程の前に、本発明の放射性標識ポリペプチドを製造する準備工程を含み、その工程は、以下を含み得る：
・適切なバッファー中で、第１の態様に記載のポリペプチドを治療に適する金属放射性核種と混合すること；又は
・適切な還元剤の存在下で、第１の態様に記載のポリペプチドを適切な緩衝液中で過レニウム酸塩と混合すること；これは、また、中間体の弱いキレート剤、例えば、酒石酸、又はクエン酸若しくはグルコン酸の存在下でも実行され得る；又は
・第１の態様に記載のポリペプチドをトリカルボニル錯体のようなレニウムの反応性中間体と混合すること；又は
・第１の態様に記載のポリペプチドを適切な緩衝液中で、付着ハロゲン原子を有する反応性中間体と混合すること。この混合は、アスコルピン酸又はゲンチジン酸のようなポリペプチドの放射線分解を抑制するために指定される物質の存在下で実行され得る。
【００８７】
本発明のこの態様のいくつかの実施態様において、前記がんは、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺がん、肺がん及び食道におけるがんから選択される。
【００８８】
別の態様において、本発明は、ＨＥＲ２の過剰発現によって特徴付けられるがんの治療における使用のような、例えば、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺がん、肺がん及び食道におけるがんから選択されるがんの治療における使用のような、治療における使用のための、上記のような放射性標識ポリペプチドを提供する。
【００８９】
また、本発明の別の態様において、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺がん、肺がん及び食道におけるがんから選択されるがんのような、ＨＥＲ２の過剰発現によって特徴付けられるがんの治療のための薬剤の製造における、上記の放射性標識ポリペプチドの使用が提供される。
【００９０】
本発明の別の態様は、上記に示すようなポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子に関する。
【００９１】
本発明の更なる態様は、前記の態様の核酸分子を含む発現ベクター、及び核酸分子の発現を通して、本発明のポリペプチドの産生を可能にする他の核酸エレメントに関する。
【００９２】
本発明の別の態様は、前記の態様の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００９３】
本発明の後者の３つの態様は、本発明のポリペプチドの産生ツールであり、本明細書では発現されることになっているポリペプチドに関する情報を条件に、及びタンパク質の組み換え発現の当業者の最新の技術レベルを条件に、当業者はそれらを得ることができ、それらを必要以上の負担無く実用化できるであろう。
【００９４】
しかしながら、本発明のポリペプチドは、また、植物及びトランスジェニック動物を含む、さまざまな原核生物の又は真核生物の宿主の中での化学的合成又は発現を含む、他の公知の手段によって産生し得る。
【００９５】
さて、本発明を、それに従って実施される実験の説明を通して詳細に説明する。下記の実施例は、限定するものとして解釈されるべきではない。実施例では、添付の図面が参照される。
【００９６】
Affibody（登録商標）分子の配列は、以下の表１に示される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】Ａ：７．８ｎＭ；Ｂ：１．９Ｎｍ及びＣ：０．４９ｎＭのAffibody（登録商標）分子ＩＩを、固定化したＨＥＲ２／Ｆｃキメラ融合タンパク質を有するセンサーチップ上に注入した後に得られたBiacoreセンサーグラムを示す。Ｃ末端システインのＳＨ基は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で遮断された。
【図２】Ａ：６ｎＭ；Ｂ：１．５Ｎｍ及びＣ：０．３８ｎＭのＣ末端のシステインにカップリングしたＤＯＴＡを有するAffibody（登録商標）分子ＩＩ（配列番号５）を、固定化したＨＥＲ２／Ｆｃキメラ融合タンパク質を有するセンサーチップ上に注入した後に得られたBiacoreセンサーグラムを示す。
【図３】Ａ：６ｎＭ；Ｂ：１．５Ｎｍ及びＣ：０．３８ｎＭのAffibody（登録商標）分子Ｘ（配列番号７）を、固定化したＨＥＲ２／Ｆｃキメラ融合タンパク質を有するセンサーチップ上に注入した後に得られたBiacoreセンサーグラムを示す。
【図４】ＢＡＬＢ／ｃ nu／nu マウスＳＫＯＶ−３腫瘍異種移植片中の、ＤＯＴＡと共に111Ｉｎ標識したAffibody（登録商標）分子ＩＩの体内分布を示す。全てのマウスに、１μｇ（１００ｋＢｑ）の111Ｉｎ標識されたAffibody（登録商標）分子ＩＩを注射した。注射後０．５、１．４及び２４時間で、臓器を解剖して、秤量し、そしてその放射能の量をガンマ計数器で測定した。放射能の取り込みは、グラム組織当たり注射した活性のパーセント（％ＩＡ／ｇ）として計算された。
【図５】図４で説明した体内分布の試験で測定された放射能の取込みの腫瘍対臓器比を示す。
【図６】ＳＫＯＶ−３腫瘍異種移植片中、ＤＯＴＡと共に111Ｉｎ標識したAffibody（登録商標）分子ＩＩで、標的化する腫瘍の特異性を示す。全てのマウスに、ＤＯＴＡを有する１μｇ（１００ｋＢｑ）の111Ｉｎ標識したAffibody（登録商標）分子ＩＩを注射した。動物の１つの群は、111Ｉｎ標識したAffibody（登録商標）分子の注射の５０分前に過剰の非標識Affibody（登録商標）分子（保護基）で前処理された。臓器は、注射後４時間で解剖し、秤量し、そして放射能の量をガンマ計数器で測定した。放射能の取り込みは、グラム組織当たり注射した活性のパーセント（％ＩＡ／ｇ）として計算された。
【図７】ＢＡＬＢ／ｃ nu／nu マウス中のＳＫＯＶ−３異種移植片腫瘍を発現するＨＥＲ２（左側の部分、３０分及び４時間ｐ．ｉ．）、及びＨＥＲ２陰性のＡ４３１異種移植片（右側部分、４時間ｐ．ｉ．）のガンマカメラ画像を示す。全てのマウスに、ＤＯＴＡを有する３μｇ（４．５ＭＢｑ）の111Ｉｎ標識したAffibody（登録商標）分子ＩＩを注射した。Ｋ＝腎、Ｔ＝腫瘍。
【図８】注射後４時間のＢＡＬＢ／ｃ nu／nu マウスＳＫＯＶ−３腫瘍異種移植片中の99mＴｃ−標識Affibody（登録商標）分子Ｘの体内分布を示す。全てのマウスに、１μｇ（６５ｋＢｑ）の99mＴｃ標識Affibody（登録商標）分子Ｘを注射した。動物の１つの群は、99mTc標識Affibody（登録商標）分子の注射の５０分前に過剰の非標識Affibody（登録商標）分子（ブロッキング群）で前処理された。臓器は注射後４時間で解剖し、秤量し、そしてその放射能の量をガンマ計数器で測定した。グラム組織当たり注射した活性のパーセント（％ＩＡ／ｇ）として計算された。
【図９】図８に記載の生体内分布の試験で測定された、放射能取り込みの腫瘍対組織比を示す。
【図１０】ＢＡＬＢ／ｃ nu／nu マウス中のＳＫＯＶ−３異種移植片腫瘍を発現するＨＥＲ２（左側の部分、１時間及び４時間ｐ．ｉ.）、及びＨＥＲ２陰性のＡ４３１異種移植片（右側部分、４時間ｐ．ｉ．）のガンマカメラ画像を示す。全てのマウスに、ＤＯＴＡを有する３μｇ（１５ＭＢｑ）の111Ｉｎ標識したAffibody（登録商標）分子ＩＩを注射した。Ｋ＝腎臓、Ｔ＝腫瘍。
【図１１Ａ】アミノ酸１８〜５８の合成の段階でのAffibody（登録商標）分子Ｘについての分析用ＨＰＬＣ溶離プロファイルを示す。Affibody（登録商標）分子は、VydacTP218TP54カラムで分離された。流量：１ｍｌ／分；温度：３５℃；検出：２２０ｎｍ；溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ2Ｏ中１％アセトニトリル；溶離液Ｂ：アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ。  位置２２−２３、４１−４２、４５−４６及び５３−５４に疑似プロリンを使用しているポリスチレン樹脂上で行なった合成。
【図１１Ｂ】アミノ酸１８〜５８の合成の段階でのAffibody（登録商標）分子Ｘについての分析用ＨＰＬＣ溶離プロファイルを示す。Affibody（登録商標）分子は、VydacTP218TP54カラムで分離された。流量：１ｍｌ／分；温度：３５℃；検出：２２０ｎｍ；溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ2Ｏ中１％アセトニトリル；溶離液Ｂ：アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ。  疑似プロリンのないポリスチレン樹脂上での標準ペプチドの合成。
【図１２Ａ】アミノ酸１〜５８（Ａ）及び１０〜５８（Ｂ）の合成の段階でのAffibody（登録商標）分子Ｘに対する分析用ＨＰＬＣ溶離プロファイルを示す。Affibody（登録商標）分子は、VydacTP218TP54カラムで分離された。流量：１ｍｌ／分；温度：３５℃；検出：２２０ｎｍ；溶媒：０．１％ＴＦＡ、Ｈ2Ｏ中１％アセトニトリル；溶媒：アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ。  位置２２−２３、４１−４２、４５−４６及び５３−５４に疑似プロリンを使用しているポリスチレン樹脂上で行なった合成。
【図１２Ｂ】アミノ酸１〜５８（Ａ）及び１０〜５８（Ｂ）の合成の段階でのAffibody（登録商標）分子Ｘに対する分析用ＨＰＬＣ溶離プロファイルを示す。Affibody （登録商標）分子は、VydacTP218TP54カラムで分離された。流量：１ｍｌ／分；温度：３５℃；検出：２２０ｎｍ；溶媒：０．１％ＴＦＡ、Ｈ2Ｏ中１％アセトニトリル；溶媒：アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ。  疑似プロリンのないポリスチレン樹脂上での標準ペプチドの合成。
【図１３Ａ】表１に示されたいくつかのAffibody（登録商標）分子に対する疎水性／親水性プロットを示す。Affibody（登録商標）分子ＩＩ（配列番号５）についてのプロット。図面の上部は、Kyte-Doolittleスケールを使用するプロットを示し、そして下部は、ＨＰＬＣによって決定されたｐＨ３．４での疎水性指標を示す。疎水性アミノ酸は正の値を有し、親水性アミノ酸は負の値を有する。７アミノ酸の移動ウインドウは、両方のプロットに使用された。
【図１３Ｂ】表１に示されたいくつかのAffibody（登録商標）分子に対する疎水性／親水性プロットを示す。配列番号Ｘ（配列番号７）を有するAffibody （登録商標）分子についてのプロット。図面の上部は、Kyte-Doolittleスケールを使用するプロットを示し、そして下部は、ＨＰＬＣによって決定されたｐＨ３．４での疎水性指標を示す。疎水性アミノ酸は正の値を有し、親水性アミノ酸は負の値を有する。７アミノ酸の移動ウインドウは、両方のプロットに使用された。  Affibody（登録商標）分子Ｘ（配列番号７）のアミノ酸配列のみが、即ち、ｍａのないAffibody（登録商標）分子Ｘが、プロットを作成するために使用された。
【図１３Ｃ】表１に示されたいくつかのAffibody （登録商標）分子に対する疎水性／親水性プロットを示す。Affibody（登録商標）分子Z00342、対照としての変異のない親Affibody（登録商標）分子についてのプロット。図面の上部は、Kyte-Doolittleスケールを使用するプロットを示し、そして下部は、ＨＰＬＣによって決定されたｐＨ３．４での疎水性指標を示す。疎水性アミノ酸は正の値を有し、親水性アミノ酸は負の値を有する。７アミノ酸の移動ウインドウは、両方のプロットに使用された。
【図１４】本発明に記載のAffibody（登録商標）分子ＩＩ（黒線）及びAffibody（登録商標）分子Z00342（灰色の破線）についてのＨＰＬＣ溶離プロファイルを示す。Affibody（登録商標）分子は、０．５ｍｌ／分の流量とＴＦＡ、水、アセトニトリル溶剤系を用いるZorbax 300SB C8  １５０×２．１ｍｍ、３．５のμｍのカラム上で分離した。
【実施例】
【００９８】
〔実施例１〕
本発明のポリペプチドの製造
要約
この実施例では、選択されたＨＥＲ２特異的Affibody（登録商標）分子を、下記のプロトコルに従って適切な細菌細胞中で大規模に発現され、精製された、ｐＥＴシステム発現ベクターにサブクローニングした。対応する全長ＨＥＲ２特異的Affibody（登録商標）分子のアミノ酸配列は、Affibody（登録商標）分子Ｉ−ＸＩとして表１に収載されている。
【００９９】
Affibody（登録商標）分子のクローニング
Affibody（登録商標）分子Ｉ−ＶＩＩＩをコード化する遺伝子を、テンプレートとして２つのオリゴヌクレオチド（一緒になってAffibody（登録商標）配列を包含している）を使用することによってＰＣＲ増幅した。各々の構築物について、２８ｂｐの相補的オーバーラップを備えた特定のテンプレート・オリゴヌクレオチド（各々、１０２長い）ペアを使用した。Affibody（登録商標）遺伝子を、NdeI部位及びＡＴＧ開始コドンを含むフォワードプライマー（センス） (Affibody（登録商標）分子Ｉについては、配列をコードするHis6-タグもまたプライマーに含まれた）、並びにＣ末端アミノ酸についてのコドン、終止コドン及びNotI部位を有するリバースプライマー（アンチセンス）で増幅した。
【０１００】
Affibody（登録商標）分子ＩＸ中のAffibody（登録商標）アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）遺伝子融合を、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって生産した。リバースプライマーがＡＢＤ遺伝子のリンカー配列（Ｃｙｓコドンと共に）及び５’末端を含んでいたことを除いては、Affibody（登録商標）分子コード化フラグメントを、Affibody（登録商標）分子Ｉ−ＶＩＩＩについて上述したように作成した。ＡＢＤ遺伝子を、Affibody（登録商標）遺伝子の３’末端及びリンカーの配列及び終止コドンを有するリバースプライマー、及びNotI部位を含むフォワードプライマーで増幅した。続いて、２５ｂｐオーバーラップを有する２つのＰＣＲ産物を、Affibody（登録商標）遺伝子フォワードプライマー及びAffibody（登録商標）ＡＢＤ遺伝子融合を作成するＡＢＤ遺伝子リバースプライマーを用いて、最後のＰＣＲ増幅におけるテンプレートとして使用した。
【０１０１】
ＰＣＲ産物を、制限酵素NdeI及びNotIで消化し、同じ酵素で先に消化したＴ７発現ベクターに連結した。
【０１０２】
【表１】
0005913807.tif 000006
【０１０３】
Affibody（登録商標）分子の発現及び採取
得られた発現プラスミドを、エレクトロポレーションを使用して大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。細菌含有発現プラスミドを、カナマイシンを有する選択寒天から選び取り、マルチ発酵装置システム（System Greta, Belach Bioteknik AB, Sweden）を使用して、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンで補充された８００ｍｌのＴＳＢ＋ＹＥ培地（３０ｇ／ｌトリプシン大豆ブロス＋５ｇ／ｌ酵母エキス）の中で３７℃で増殖させた。約１の光学密度（ＯＤ600nm）で、Affibody （登録商標）分子の発現を、０．５ｍｍのＩＰＴＧの添加によって自動的に誘導した。誘導剤の添加の５時間後に、培養物を自動的に＜１２℃に冷却した。次いで、培養物を遠心分離（１５９００×ｇで２０分）により採取し、５〜１０ｇの細菌の細胞ペレットを採取し、冷凍庫（−２０℃）で保管した。
【０１０４】
Affibody（登録商標）分子Ｉの精製
細胞ペレット（３ｇ）を、７Ｍの尿素及び１，０００ユニットのBenzonase（Merck）を含むｐＨ８の緩衝液の３０ｍｌ中に再懸濁させた。３０分のインキュベーションの後、溶解物を遠心分離によって清澄化し、His6タグの付いたAffibody（登録商標）分子を含んでいる上清を、１．５ｍｌの Superflow NiNTAカラム（Qiagen）にかけた。カラムを、７Ｍの尿素を含む２０ｍｌのｐＨ６．３の緩衝液で洗浄し、８Ｍの尿素を含むｐＨ４．５の緩衝液で溶離した。最後に、緩衝液を、PD-10カラム（GE Healthcare）を使用することによって、１×ＰＢＳ（２．６８ｍｍＫＣｌ、１３７ｍｍＮａＣｌ、１．４７ｍｍＫＨ2ＰＯ4、８．１ｍｍＮａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４）に交換した。
【０１０５】
Affibody（登録商標）分子ＩＩ−ＶＩＩＩの精製
細胞ペレット（１０ｇ）を、１００ｍｌの２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に再懸濁させ、２，０００ユニットのBenzonase（Merck）を補充して、超音波処理によって破壊し、１０分間７５℃で加熱した。熱処理された溶解物を遠心分離によって清澄化し、そして２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５であらかじめ平衡化した２５ｍｌＱ−セファロースＦＦ（GE Healtcare）を詰めたＸＫ２６カラムにかけた。カラムから流れ出た画分を集め、Ｃ末端システインを有するAffibody （登録商標）分子を、常温で１時間２０ｍＭ  ＤＴＴと共にインキュベートした。ＡＣＮを５％に加え、５％ＡＣＮと０．１％ＴＦＡを含有する水で予め平衡化した３ｍｌのResource 15RPCカラム（GE Healtcare）にかけた。水中の５カラム容積（ＣＶ）の５％ＡＣＮ及び１％ＴＦＡで洗浄した後、水中の２０ＣＶの５〜３２％ＡＣＮ及び０．１％ＴＦＡの直線勾配で、結合したタンパク質を溶離した。Affibody（登録商標）分子を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって同定し、プールした。最後に、緩衝液を、HiPrep 26／10脱塩カラム（GE Healthcare）を使用することによって１×ＰＢＳに交換した。
【０１０６】
Affibody（登録商標）分子ＩＸの精製
細胞ペレット（５ｇ）を、５０ｍｌＴＳＴ緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のTween２０、ｐＨ８．０）に再懸濁させ、超音波処理によって破壊した。遠心分離による清澄化の後、上清を２０ｍｌＨＳＡセファロース(ＣＮＢｒ活性セファロース４ Fast Flow, GE Healtcare上に固定化されたヒト血清アルブミン）を詰めたXK26カラム（GE Healtcare）にかけた。カラムを、１０ＣＶのＴＳＴ緩衝液、次いで、５ＣＶの５ｍＭのＮＨ4Ａｃ、ｐＨ５．６によって洗浄した。結合したＡＢＤタグ付きAffibody（登録商標）分子を、０．５ＭのＨＡｃ、ｐＨ２．８で溶離した。最後に、緩衝液を、HiPrep26／10脱塩カラム（GE Healthcare）を使用することによって１×ＰＢＳに交換した。
【０１０７】
〔実施例２〕
インビトロの本発明のポリペプチドのＨＥＲ２結合特性
要約
この実施例を形成している実験では、Biacore（登録商標）2000システムでの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、本発明のポリペプチドの結合を分析した。ＨＥＲ２標的結合活性は、Ｃ末端のシステイン及びＸ（配列番号７）にカップリングしたAffibody（登録商標）分子ＩＩ（配列番号５）（ＤＯＴＡを有するＩＩ）について示される。
【０１０８】
バイオセンサー分析
Ｃ末端His6タグ（R &D System #1129-ER）でヒトＩｇＧ1（Ｐｒｏ100−Ｌｙｓ330）のＦｃ領域に融合したＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２、Ｍｅｔ1−Ｔｈｒ652）の細胞外ドメインから成る、組み換えヒトＨＥＲ２／Ｆｃ（ＥｒｂＢ２／Ｆｃ）キメラタンパク質を、アミンカップリング化学を使用するＣＭ５センサーチップの表面上に（１，８００のレゾナンスユニット（ＲＵ））固定化した。チップ上の１つの表面は、参照セルとして使用するために活性化され、不活化された。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ−２０、ｐＨ７．４）中希釈したAffibody （登録商標）分子を、被検体として使用した。
【０１０９】
結合速度論の解析に関しては、３つの被検体の濃度を、５０μ／分の一定流量を用いてチップ上に２連で（dupulicate）注入した。会合相は５分で、続いてAffibody（登録商標）分子の遅速性を説明する長い解離相（３０分）であった。解離平衡定数（ＫＤ）、会合速度定数（ｋａ）及び解離速度定数（ｋｄ）は、BIAevaluation 4.1ソフトウェア（GE Healthcare）の質量移動（mass transfer）補正を有する１：１ラングミュア結合モデルを使って計算された。
【０１１０】
システインのＳＨ基のブロッキング
システインのＳＨ基をブロックし、それによって分子の二量化を防ぐために、単一のＣ末端のシステインを有するAffibody（登録商標）分子を、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ、Pierce No.23030）で処理した。Affibody （登録商標）分子ＩＩ（配列番号５）を、１ｍｌ（２．１ｍｇ）のペプチドを１０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５及び４０μｌの０．５Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）で、室温で２時間処理することによって還元した。過剰のＤＤＴは、カップリング緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で平衡化したＮＡＰ５カラム（GE Healthcare）上のゲル濾過によって除去した。０．５ｍｌの還元タンパク質を有するロードカラムは、１ｍｌのカップリング緩衝液でタンパク質を溶離する。
【０１１１】
遊離ＳＨ基のブロッキングは、タンパク質に対して２０倍モル過剰のＮＥＭを使って行われた：水（２００ｍｍ）中１５μｌのＮＥＭ溶液を０．５ｍｌの還元したタンパク質溶液（１ｍｇ／ｍｌ）に加え、そしてヘッド・オーバーヘッド・ミキサー(head-over-head mixer)上、室温で１時間インキュベートする。過剰のＮＥＭは、前記のようにＮＡＰ５−カラム上でのゲル濾過によって、しかし平衡緩衝液としてＰＢＳを用いて、除去した。
【０１１２】
Ｃ末端システインへのマレイミド−ＤＯＴＡのカップリング
３ｍｇのAffibody（登録商標）分子ＩＩ（配列番号５）を、４０℃で３０分間２０ｍＭのＤＴＴで還元した。過剰のＤＴＴは、ＰＤ−１０カラム上での０．２Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ５．５への緩衝液交換によって除いた。カップリングは、３倍モル過剰のキレート剤、水中のマレイミド−モノ−アミドＤＯＴＡ（Mal-DOTA, Macrocyclics No.B-272）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて行った。混合物を、連続振盪しながら４０℃で１時間インキュベートした。非複合化キレート剤からの精製は、セミ分離用ＲＰＣカラム、Zorbax 300SB C18、９．４×２５０ｍｍ、５μｍ上で行った。精製物質のカップリング程度は、Zorbax 300SB C8 １５０×２．１ｍｍ、３．５μｍの分析用カラムの上でＨＰＬＣ−ＭＳによって分析した。マレイミド−ＤＯＴＡ共役Affibody（登録商標）分子のみが、本方法によって検出された。
【０１１３】
Affibody（登録商標）分子ＩＩのＨＥＲ２−結合相互作用を、図１のセンサーグラフに、Ｃ末端のシステインにカップリングしたＤＯＴＡを有するAffibody（登録商標）分子ＩＩを図２に、及びAffibody（登録商標）分子Ｘ（配列番号７）のものを図３に示す。
【０１１４】
ＨＥＲ２標的とのAffibody（登録商標）分子の相互作用についての結合パラメーターを決定するために、動力学的試験を行なった。３つの異なる濃度のAffibody（登録商標）分子を、固定化ＨＥＲ２／Ｆｃのキメラ融合タンパク質でBiacoreチップ表面に注入した。解離平衡定数（ＫD＝ｋd／ｋa）、会合速度定数（ｋa）及び解離速度定数（ｋd）を表２に要約する。Ｃ末端システインへのＤＯＴＡカップリングは、ＮＥＭブロッキングAffibody（登録商標）分子ＩＩに比べてＫＤを有意に変化させなかった。
【０１１５】
【表２】
0005913807.tif 000007
【０１１６】
〔実施例３ａ〕
ポリアミノポリカルボキシラートキレート剤を有する本発明のポリペプチドのインビボのＨＥＲ２結合特性
要約
この実施例を構成している実験では、本発明の放射標識ポリペプチドの結合を、インビボマウス異種移植片モデルで分析した。Ｃ末端のシステインにカップリングしたＤＯＴＡを有するAffibody（登録商標）分子ＩＩを111Ｉｎで放射標識し、ＨＥＲ２を過剰発現するＳＫＯＶ−３腫瘍異種移植片及び対照としてＨＥＲ２陰性Ａ４３１腫瘍異種移植片を担持するマウスに注射した。全動物中でのさまざまな臓器の放射性標識Affibody（登録商標）分子の分布及び局在を分析するために、体内分布及びガンマカメラ画像の試験を行なった。
【０１１７】
111Ｉｎラベル化
実施例Ｎｏ．２に記載したように、Ｃ末端のシステインにモノアミドＤＯＴＡ（Ｍａｌ−ＤＯＴＡ）をカップリングさせてAffibody （登録商標）分子を修飾した。得られた分子は「ＤＯＴＡを有するAffibody（登録商標）分子ＩＩ」と名付けられた。
【０１１８】
111Ｉｎで標識するために、ＤＯＴＡ（３０μｌのｐＨ５．５の酢酸アンモニウム緩衝液）を有する３０μｇのAffibody（登録商標）分子ＩＩを、４０．５μｌの111ＩｎＣｌ3（標識化時１５ＭＢｑ）の保存液と混合した。反応混合液のｐＨは約５．０であった。反応混合物を、６０℃で６０分間インキュベートした。
【０１１９】
標識化効率は、シリカゲル含浸ガラス繊維シート（ITLC SGシート（Gelman Sciences社））上のインスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）により、０．０２Ｍのクエン酸を溶離液として使用して分析した。ＩＴＬＣ片に沿った放射能の分布を可視化し、PhosphorImager（CycloneTM Storage Phosphor System, Packard）を使用して定量化した。放射性標識Affibody（登録商標）分子は、ＩＴＬＣシートの元の場所に残り、一方、遊離の111Ｉｎは溶媒先端に移動した。
【０１２０】
放射化学的純度は９９．８から９９．９％であった、即ち、放射性標識化は殆ど定量的であった。放射性標識化Affibody（登録商標）分子の一切の更なる精製は必要でなかった。反応混合物は、ＰＢＳで１．４ｍｌに希釈し、実験の前に凍結保存した（１〜２日）。
【０１２１】
腫瘍モデル
雌の非近交系のＢＡＬＢ／ｃ nu／nu マウスに、１×１０7ＳＫＯＶ−３（ヒト卵巣腹水腺がん）細胞又は１×１０7ａ４３１（ヒト表皮がん）細胞を、右の後脚中に移植した。ＳＫＯＶ−３細胞はＨＥＲ２を過剰発現し、Ａ４３１細胞はＨＥＲ２について陰性であった。
【０１２２】
腫瘍担持マウスにおける体内分布
体内分布の試験のため、異種移植片腫瘍（１×１０7個のＳＫＯＶ−３細胞移植の３０〜４０日後）担持マウスを、４つの群に無作為に割り付けた。マウスに、１００μｌＰＢＳ中の１μｇ（１００ｋＢｑ）の111Ｉｎ標識Affibody（登録商標）分子を、尾静脈に注射した。全ての注射の忍容性は良好であった。動物の１つの群に、１．５ｍｌ（０．９ｍｇ）の非標識Affibody（登録商標）分子ＩＩを皮下注射し（ここで、Ｃ末端Ｃｙｓが実施例２に記述したようにＮＥＭによってブロックされている）、次いで５０分後に、１μｇ（１００ｋＢｑ）の111Ｉｎ標識Affibody（登録商標）分子を静脈注射した(ブロッキング実験)。
【０１２３】
致死量のKetalarの溶液及びRompun溶液の注射後、マウスを、注射後０．５、１、４及び２４時間後 (h p.i）に心臓穿刺を介して放血により犠牲にした。ブロッキンググループからの動物は、注射後４時間で犠牲にした。臓器を解剖し、秤量し、そしてそれらの放射性含量をガンマ計数器で測定した。放射能の取り込みは、グラム組織当たり注射した活性のパーセントとして計算された（％ＩＡ／ｇ）。
【０１２４】
画像化
ガンマカメラによる画像化のため、異種移植片腫瘍（１×１０7個のＳＫＯＶ−３細胞移植の３０〜４０日後又は１×１０7個のａ４３１細胞移植の１０〜１５日後）担持マウスを使用した。マウスに、１００μｌＰＢＳ中３μｇ（４．５ＭＢｑ）の111Ｉｎ標識Affibody（登録商標）分子ＩＩを、尾静脈に注射した。注射後０．５又は４時間で、動物を致死量のKetalar及びRompunの溶液により安楽死させた。ＭＥＧＰコリメータを装着したMillenium GEガンマカメラを使用し、画像化を行った。Hermesソフトウェア(Nuclear Diagnostics, Stockholm, Sweden）を使用し、シンチグラフィーの結果を、視覚的に評価した。
【０１２５】
結果
ＤＯＴＡを有する111Ｉｎ標識Affibody（登録商標）分子ＩＩを使用した、体内分布の試験からの結果を図４に示す。全ての時点での放射能の取り込みは、腎臓は別として、全ての他の臓器中よりも腫瘍中で高かった。腫瘍の取り込みは、注射後０．５時間で既に１３±２％ＩＡ／ｇであった、注射後１時間で１７±２％ＩＡ／ｇに上昇し、注射後１時間で１５±３％ＩＡ／ｇから注射後２４時間で１１±４％ＩＡ／ｇまでゆっくり減少した。放射能の高い取り込みが、また、腎臓にも見出されたが、腎臓は、Affibody（登録商標）分子のような小さいタンパク質のための主要な排泄経路であるので、それは、予期されたことでもある。注射後１時間で測定された１８６±２４％ＩＡ／ｇを有する最も高い腎臓の取り込みは、注射後２４時間で１４４±１３％ＩＡ／ｇに減少した。このように、腎臓の取り込みは、Ｎ末端にカップリングしたＤＯＴＡを有するAffibody（登録商標）分子Z00342（ZHER2:107として国際公開公報第２００５／００３４５６号に開示され、しばしば、また、ZHER2:342とも呼ばれる）について測定された腎臓の取り込み、即ち注射後１時間で２４３±２２％ＩＡ／ｇ及び注射後２４時間で２３２±３４％ＩＡ／ｇより相当低かった（Orlova, A. et al. (2006), Cancer Research 67: 2178-2186）。加えて、ＤＯＴＡを有する111Ｉｎ標識Affibody（登録商標）分子ＩＩは、Orlova, et al. (2006) によって記述されたＨＥＲ２特異的Affibody（登録商標）分子と比較して、全ての測定時点において全ての臓器でより低い取り込みであった。高い腫瘍の取り込みは、他の臓器での減少した取り込みと共に、先に記述されたAffibody（登録商標）分子について公表された比率を超える腫瘍対組織比をもたらす（図５）。例えば、腫瘍対血液比は、Orlova A. et al. (2006)によって記述されたAffibody（登録商標）分子に対する注射後１時間で８、注射後４時間で１２及び注射後２４時間で４７と比較して、注射後１時間で１６、注射後４時間で８８及び注射後２４時間で２７５であった。
【０１２６】
本発明に記載のAffibodyの（登録商標）分子を使用する腫瘍標的の特異性は、ブロッキング実験によって証明され、ここで過剰な非標識Affibody（登録商標）分子の腫瘍担持マウスへの事前注射は、ＤＯＴＡを有する111Ｉｎ標識Affibody（登録商標）分子ＩＩの腫瘍取り込みを８６％だけ減少させたが、他の臓器における取り込みは減少させなかった（図６）。注射後３０分及び４時間で撮られたガンマカメラ画像により、ＤＯＴＡを有する111Ｉｎ標識Affibody（登録商標）分子ＩＩの高い特異的な腫瘍ターゲッティングが確認された（図７）。ＳＫＯＶ−３腫瘍を注射後０．５時間で既に可視化し、注射後４時間で、バックグラウンド放射能を洗い落とした。腫瘍とは別に、明確な取り込みがまた腎臓でも見えた。ＨＥＲ２陰性Ａ４３１異種移植片腫瘍を担持するマウスは、注射後４時間で腫瘍中には無視できる放射線の取り込みしかなかった。
【０１２７】
〔実施例３ｂ〕
Ｎ３Ｓキレート剤を有する本発明に記載のポリペプチドのインビボのＨＥＲ２結合特性
要約
この実施例を構成している実験では、本発明の放射性標識ポリペプチドの結合を、インビボで、マウス異種移植片モデルを用いて分析した。Ｎ末端メルカプトアセチル−グルタミル−セリル−グルタミル（ｍａ−ＥＳＥ）配列を含むAffibody（登録商標）分子Ｘ（配列番号７）を99mＴｃで放射性標識し、ＨＥＲ２を過剰発現するＳＫＯＶ−３腫瘍異種移植片を担持するマウスに注射した。全動物中のさまざまな臓器への放射性標識Affibody（登録商標）分子の分布及び局在を分析するために、体内分布及びガンマカメラ画像の試験を行なった。
【０１２８】
99mＴｃ標識
Affibody（登録商標）分子Ｘを、間接法を用いて99mＴｃで標識した。99mＴｃを用いた標識化については、下記成分を含むキットを製造した：１ｍｌ当たり５０Ｍｇのグルコン酸二水和物、１ｍｇのＥＤＴＡのジナトリウム塩及び０．５ｍｇの錫（ＩＩ）クロリド二水和物。この溶液を１ｍｌを含むアリコートに分割し、アリコートを凍結乾燥した。凍結乾燥標識キットを、使用の前に−２０℃で貯蔵した。
【０１２９】
５０μｌＰＢＳ（２．６８ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１．４７ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、８．１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４）を、５０μｇのＡＢＹ−０２４溶液（脱イオン化した脱気水中２ｍｇ／ｍｌ）に追加した。ボルテックス撹拌後、混合物にテクネチウム標識キットを混ぜ、99mＴｃ発生装置（UltratechneKow FM発生装置、Tyco Healthcare Nordic AB(Mallinckrodt Sweden AB）からの２００μｌの99mＴｃＯ4-含有溶離液を添加した。混合物を、９０℃で６０分間インキュベートした。
【０１３０】
各混合物の２つの小さい（０．８μｌ）アリコートを、２つのＩＴＬＣ・ＳＧ片に適用し、そして１つをＰＢＳ（収量を決定する）で溶離し、他方はピリジン：酢酸：水（５：３：１．５）（還元した加水分解されたテクネチウム（ＲＨＴ）の存在を決定するため）で溶離した。この溶離液では、テクネチウムコロイドは元の場所に残ったが、放射性標識Affibody（登録商標）分子、過テクネチウム酸及び他の99mＴｃの錯体は、溶媒先端に移動した。ＩＴＬＣ片に沿った放射活性の分布を視覚化し、PhosphorImager (CycloneTM Storage Phosphor System, Packard）を使用して定量した。標識化は殆ど定量的であって、それはいかなる追加の精製も不要であった。
【０１３１】
放射性標識Affibody（登録商標）分子を、放射能濃度が１００μｌ当たり６５ｋＢｑであることを確実にするために、ＰＢＳで希釈した。Affibody（登録商標）分子の濃度を、１００μｌ当たり１μｇに調整した。
【０１３２】
腫瘍担持マウスにおける体内分布
雌の非近交系のＢＡＬＢ／ｃ nu／nu マウスに、１×１０7ＳＫＯＶ−３（ヒト卵巣腹水腺がん）細胞を、右の後脚中に移植した。
【０１３３】
体内分布の試験については、異種移植片腫瘍（１×１０7個のＳＫＯＶ−３細胞移植の４０〜４５日後）担持マウスを、４群に無作為に割り付けた。
【０１３４】
マウスに、１００μｌＰＢＳ中の１μｇ（６５ｋＢｑ）の111Ｔｃ標識Affibody（登録商標）分子を、尾静脈に注射した。全ての注射は良好な忍容性を示した。動物の１群に、１００ｍｌ（０．５ｍｇ）の非標識His6-Z00342を皮下注射し、次いで５０分後に、１μｇ（６５ｋＢｑ）の111Ｔｃ標識Affibody（登録商標）分子Ｘを静脈注射した(ブロッキング実験)。
【０１３５】
致死量のKetalarの溶液及びRompun溶液の注射後、マウスを、注射後４時間後に心臓穿刺を介して放血により犠牲にした。ブロッキンググループからの動物は、注射後４時間で犠牲にした。臓器を解剖し、秤量し、そしてそれらの放射能含量をガンマ計数器で測定した。放射能の取り込みは、グラム組織当たり注射した活性のパーセントとして計算された（％ＩＡ／ｇ）。
【０１３６】
画像化
ガンマカメラによる画像化については、異種移植片腫瘍（１×１０7個のＳＫＯＶ−３細胞移植の４０日後又は１×１０7個のａ４３１細胞移植の１０〜１５日後）担持マウスを使用した。
【０１３７】
マウスには、１００μｌＰＢＳ中の３μｇ（１５ＭＢｑ）の99mＴｃ標識Affibody（登録商標）分子Ｘを尾静脈に注入した。注射後１又は４時間で、動物を致死量のKetalar及びRompunの溶液により安楽死させた。ＬＥＨＲコリメータを装着したCam Siemensガンマカメラを使用し、画像化を行った。Hermesソフトウェア（Nuclear Diagnostics, Stockholm, Sweden）を使用し、シンチグラフィーの結果を、視覚的に評価した。
【０１３８】
結果
99mＴｃ標識Affibody（登録商標）分子Ｘを使用した、体内分布の試験からの結果を図８に示す。注射後４時間での放射能の取り込みは、腎臓は別として、全ての他の臓器中よりも腫瘍中で高かった。腫瘍の取り込みは、注射後４時間で１７±４％ＩＡ／ｇであった。放射能の高い取り込みが、また、腎臓にも見出されたが、腎臓がAffibody（登録商標）分子のよな小さいタンパク質のための主要な排泄経路であるので、それは予期されたことでもある。腎臓の取り込みは、注射後４時間で５８±１０％ＩＡ／ｇであった。このように、腎臓の取り込みは、上記実施例３ａに記述されたAffibody（登録商標）分子及びＮ末端にカップリングしたＤＯＴＡを有するZ00342について測定された腎臓の取り込みより相当低かった（Orlova,A. et al. (2006), Cancer Research 67: 2178-2186）。また、腸（３．５２％ＩＡ／ｇ）及び肝臓（１．０６％ＩＡ／ｇ）での低い取り込みは、腎臓でのより高い取り込みと共に、99mＴｃ標識Affibody（登録商標）分子Ｘが主に腎臓の経路によって浄化され、肝胆道の経路によって行われないことを示す。欧州特許第６１２３０９５号は、好ましいｍａ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３キレート成分が１つ又は２つのＳｅｒを含み、残りの２つ又は１つのアミノ酸残基がＧｌｕであるものが、肝胆道系から腎臓クリアランス経路へのシフトをもたらすことを開示している。Affibody（登録商標）分子Ｘは、欧州特許第６１２３０９５号に開示された好ましいキレート剤部分の１つ、即ちｍａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ及びこれらのポリペプチドの親水性の増加をもたらす本発明の実施例１（表１）に記載のアミノ酸交換の両方を含む。このように、本明細書で説明する99mＴｃ−標識Affibody （登録商標）分子Ｘは、高い腎臓クリアランスと低肝胆道系クリアランスを両立させるが、腎臓での再吸収を最小化した、ｍａ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３キレート部分を含んでいるポリペプチドの追加的実施例を示す。
【０１３９】
全ての臓器における99mＴｃ標識Affibody（登録商標）分子Ｘの取り込みは、実施例３ａに記述された111Ｉｎ標識Affibody（登録商標）分子の取り込みと同様であった。
【０１４０】
上述の体内分布実験の腫瘍対組織比を図９に示す。再び高い腫瘍対組織比を得た。特に、99mＴｃ標識Affibody（登録商標）分子Ｘの腫瘍対肝臓比は、注射後４時間で１０の比率の実施例３ａに記述されたＤＯＴＡを有する111Ｉｎ標識Affibody（登録商標）分子ＩＩに比べて、１７であった。腫瘍対血液比は、注射後４時間で４２であった。
【０１４１】
Affibody （登録商標）分子Ｘを使用した腫瘍標的の特異性は、ブロッキング実験によって証明され、その場合、過剰な非標識Affibody（登録商標）分子の腫瘍担持マウスへの事前注射により、99mＴｃ標識Affibody（登録商標）分子Ｘの腫瘍吸収を９０％も減少させたが他の臓器での取り込みでは減少させなかった（図８)。
【０１４２】
注射後１時間及び４時間に撮られたガンマカメラ画像は、本発明に記載の99ｍＴｃ標識Affibody（登録商標）分子の高い特異的な腫瘍ターゲッティングを確認した(図１０)。ＳＫＯＶ−３腫瘍を注射後１時間で既に可視化し、注射後４時間で、バックグラウンド放射能が洗い落とした。腫瘍とは別に、明白な取り込みもまた腎臓に見える、しかしながら、実施例３ａに記述されたＤＯＴＡを有する111Ｉｎ標識Affibody（登録商標）分子ＩＩの腎臓の取り込みに比べて、この取り込みはかなり低かった。ＨＥＲ２陰性Ａ４３１異種移植片腫瘍を担持するマウスは、注射後４時間で腫瘍中の放射能取り込みは無視できるものであった。
【０１４３】
〔実施例４〕
本発明のポリペプチド及びZ00342の化学的合成に関する比較実験
要約
この実施例を形成する実験では、本発明のポリペプチドの固相ペプチド合成が記述される。４つの位置、即ち［Ｎ２３Ｔ］、［Ａ４２Ｓ］、［Ａ４６Ｓ］及び［Ａ５４Ｓ］で導入された変異は、簡略化された略号Ｆｍｏｃ−Ｘｘｘ−Ｙｙｙ−ＯＨを有する疑似プロリン前駆体との代替合成戦略を用いることを可能にした。
上述の４つの位置で疑似プロリンを使うことによって、全体のAffibody（登録商標）分子Ｘ（配列番号７）（即ち、アミノ酸１〜５８）を合成することを可能にしたが、一方、標準的な合成はペプチドを製造できなかった。
【０１４４】
新規なセリン又はトレオニン残基の導入は、また、イソアシルジペプチドの使用を可能にし、それはペプチド合成中凝集を減らすことによって合成効率を高めるための疑似プロリンに対する代替である（Sohma et al., Tetrahedron Lett.47:3013(2006))。いくつかのこのようなビルディングブロックは、Novabiochem of MerckBiosciences AGから入手することができる。
【０１４５】
理論的根拠
このAffibody（登録商標）分子のＮ末端へのＤＯＴＡのカップリングと同様にAffibody（登録商標）分子Z00342（ZHER2:107として国際公開第２００５／００３１５６号に開示され、ときどきZHER2:342とも呼ばれる）のペプチド合成は可能であり、文献（Orlova, A
et al.(2006)，Cancer Research 67:2178-2186）に記述されている。しかしながら、合成後のペプチド収率における大きな変動が観察された。ペプチドを再現よく合成する上での困難は、一次アミノ酸配列と同様にペプチドの長さの両方に関連づけることができる。また、さらに保護されたアミノ酸側鎖の反応基を持った長いペプチドは、好ましくない二次構造、即ち固相ペプチド合成を妨げ得るβシートを生成し得る（Quibell, M. & Johnson, T., in Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach, W.C. Chan, P.D. White Eds, Oxford University Press 2000, 115-135）。ペプチド合成中二次構造形成を防ぐ１つの方法は、疑似プロリンの使用である。もしアミノ酸Ｙｙｙがセリン、トレオニン又はシステインであれば、簡略化された略記Ｆｍｏｃ−Ｘｘｘ−Ｙｙｙ−ＯＨを有する疑似プロリンが使用できる。これらの疑似プロリンは、骨格に結合した側鎖を有する閉環したプロリン状構造を示し、そして酸処理によって正常なアミノ酸の構造に変換できる（Haack, T., & Mutter, M. Tetrahedron Letters (1992), 33(12), 1589-92)。疑似プロリンは、位置Ｙｙｙ中のセリン又はトレオニンと共に、位置Ｘｘｘ（Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｈｉｓ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ，Ｔｈｒを除く）における１４のアミノ酸について市販されている。
【０１４６】
親Affibody（登録商標）分子Z00342は、一次配列に一切のトレオニン及びシステインを持たない。セリンは、単に位置３３、３９及び４１にのみ見出される。疑似プロリン前駆体は、わずかセリン４１（Ｑ40〜Ｓ41）に対してのみ入手できる。２つの他のセリンについては、入手可能な前駆体（Ｒ32〜Ｓ33及びＰ38〜Ｓ39）が一切ないので、位置Ｘｘｘにあるアミノ酸が疑似プロリンの使用を妨げる。
【０１４７】
本発明のポリペプチドに導入される変異は、ペプチド合成を促進することを目標とするが、それに限定されるものではない。特に、位置２３、４２、４６及び５４、即ち［Ｎ２３Ｔ］、［Ａ４２Ｓ］、［Ａ４６Ｓ］及び［Ａ５４Ｓ］での変異は、ＳＰＰＳで確認された問題の２つを解決する能力を有し得る：それらは、疑似プロリンの使用を可能にし、アミノ酸２１〜２６のまわりの臨界領域（critical region）はアスパラギンをスレオニンに置換することによって、位置２３に変化する。
【０１４８】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ)。
Affibody（登録商標）分子Ｘ（配列番号７）のアミノ酸配列は、完全に自動化ペプチド合成機でのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇポリスチレン樹脂に組み立てられた。この樹脂は、Ｆｍｏｃ戦略を持ったペプチドの形成に非常に適している。５７個のアミノ酸（適切な側鎖の保護で）は樹脂上でカップリングされた。最終工程の、Ｓ−トリチル保護メルカプト酢酸のカップリングは手動で行った。
【０１４９】
工程１：固相ペプチド合成
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇポリスチレン樹脂を、撹拌機を備えたＳＰＰＳ反応器中に移した。次いで、合成は樹脂のＦｍｏｃ脱保護から始め、続いて以下に示される概要に記載のＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを有するカップリング手順を続けた。この工程の後、再度、Ｆｍｏｃ脱保護及びその後手順に従ってアミノ酸誘導体のカップリングを続けた。イソプロピルエーテル（ＩＰＥ）での樹脂の最終洗浄の後、ペプチド樹脂を減圧下のデシケーターで乾燥した。
【０１５０】
標準的なＦｍｏｃペプチド合成と、４つの位置で疑似プロリンを使用する合成の両方が行われた。標準的なペプチド合成については、Ｆｍｏｃアミノ酸しか使用されなかった。Ｆｍｏｃアミノ酸は別として代替ペプチド合成については、以下の疑似プロリンが使用された：位置２２〜２３でのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ、位置４１〜４２でのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＯＨ、位置４５〜４６でのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−ＯＨ、及び位置５３〜５４でのＦｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−ＯＨ。
【０１５１】
Ｆｍｏｃ脱保護手順
Ｎ−α−Ｆｍｏｃ保護基の開裂を達成するために、樹脂を、また、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンで処理した。次いで樹脂の洗浄をＮＭＰで行った。
【０１５２】
カップリング手順
Ｇｌｕ１へのアミノ酸誘導体Ｐｒｏ５７の自動化カップリング。最大３当量のＦｍｏｃ−ＡＡ誘導体をＮＭＰ中に溶解した。カップリングのために、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）及びＮＭＰ中のｓｙｍ．−コリジン（２，４，６−トリメチルピリジン）を添加した。生成溶液を、樹脂上に注ぐ前に室温で混合した。ＮＭＰを溶媒として使用した。６０℃で少なくとも１５分のカップリング時間の後で、樹脂をＮＭＰで洗浄した。
【０１５３】
各カップリング手順の後、試薬としてのＤＭＦ及び溶媒としてのジクロルエタン中の２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＡＴＵ）でのカップリングを自動的に繰り返し、引き続いて無水酢酸キャッピングを行った。
【０１５４】
工程２メルカプト酢酸のカップリング
アシル化は、５モル当量のアミノ酸、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及び１０当量のＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＥＡ、Lancaster Synthesis, Morecambe, England製）によって行なった。Ｓ−トリチルメルカプト酢酸は、AnaSpec Inc（San Jose, CA, USA)製であった。
【０１５５】
工程３：残りの保護基の開裂を含む樹脂からの開裂
ペプチド樹脂を、純水、エタンジチオール（ＥＤＴ）及びトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）の存在下にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）処理した。室温で約２時間の開裂後に、反応混合物を約０℃に冷却した。ヨウ化アンモニウム及びジメチルサルファイドを添加して、酸化メチオニンを還元した。約０℃で更に６０分の開裂の後に、形成したヨウ素をアスコルビン酸で還元した。生成物を濾別した後、冷却しながらＩＰＥ中に沈殿させ、再度濾別し、ＩＰＥで洗浄し、減圧下で乾燥した。
【０１５６】
ＨＰＬＣによる純度分析
５８個のアミノ酸の長いペプチド及びいくつかの中間体の純度は、Vydac 218 TP54(５μｍ、２５０×４．６ｍｍ）カラムを使用し、０．１％のＴＦＡ及び１％のアセトニトリルを含有する水、０．１％のＴＦＡを含有するアセトニトリル溶液をそれぞれ溶媒Ａ及びＢとして、逆相ＨＰＬＣによって決定した。カラムオーブン温度は３５℃に設定した。カラムを、３０分で溶媒Ｂを１５〜４５％にするグラジエント、又は３０分でＢを２０〜５０％にするグラジエントのどちらかで溶離した。ＵＶ検出は２２０ｎｍで行った。純度は、面積正規化によって計算した。
【０１５７】
結果
疑似プロリンを使用して又はしないで合成された、Affibody（登録商標）分子Ｘ（配列番号７）の収率及び純度は、分析用逆相クロマトグラフィーによって分析した。合成の進行をフォローするために、少量の合成樹脂を、いくつかのカップリング工程後に抜き取り、所望のペプチド中間体の存在、純度及び収率を分析した。図１１は、４１のアミノ酸の長さのペプチド中間体（アミノ酸１８〜５８）の分析を示す。ペプチド合成のこの段階では、正しい配列を有する１つの明確な及び主たるペプチドピーク（保持時間＝１５．３３分、収率４９％）が、疑似プロリンを使用して合成が行われたかどうかを同定した（図１１Ａ）。しかしながら、標準的なＦｍｏｃ合成は、同じサイズを有する膨大な数の小さなペプチドピーク及び２つのメインピークをもたらしたが、低収率であった。この２つのピーク（保持時間＝２０．８２分）の１つは、正しい配列（ａａ１８〜５８）を有するペプチド中間体として同定された（図１１Ｂ）。全長ペプチド（アミノ酸１〜５８）は、合成が疑似プロリンを使用して行われた場合に限り得られた。図１２Ａは、２６％の最終的なペプチドの収率を有する単一の生成物ピークを示す。しかしながら、標準的なＦｍｏｃ合成は、最終的なペプチド生成物を生成できなかた。標準的な合成からの４９個のアミノ酸の長さの中間体（アミノ酸１０〜５８）の分析は、所望の中間体が検出できなかったこと及び合成は中止されたことを明らかにした（図１２Ｂ）。
【０１５８】
〔実施例５〕
本発明のポリペプチド及びZ00342の親水性の比較試験
要約
この実施例を形成している実験では、２つの方法：１）タンパク質の疎水性／親水性プロット；及び２）逆相ＨＰＬＣ溶離プロフィール；を使用し、本発明のポリペプチドの親水性の増加が記述される。
【０１５９】
１）タンパク質の疎水性／親水性プロット
疎水性／親水性プロットは、タンパク質の配列に沿った極性及び無極性の残基の分布を表示するために作成される。高度に疎水性の領域、例えば膜貫通部分又は親水性の配列、即ちタンパク質の表面に曝されやすい領域を予測するために、これらのプロットは一般に使用される。
【０１６０】
プロットは、分析の目的に適合できる移動ウインドウ付きのタンパク質配列を走査することによって作成される。例えば、７アミノ酸の移動ウインドウは、推定表面露出領域を見つけるためのよい値であると示唆されている。各位置では、ウインドウ中のアミノ酸の平均の疎水性指数が算出される。この値は、ウインドウの中間点としてプロットされる。この実施例を構成している疎水性／疎水性プロットのため、以下の２つの疎水性スケールが使われた：１）Kyte-Doolittleスケールは、正の値を達成するためのハイドロパティック（Hydropathic）領域であった（Kyte J., Doolittle R.F. (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132)、そして２）ＨＰＬＣによって求められるｐＨ３．４での疎水性指標（Cowan R., Whittaker R.G. (1990) Peptide Research 3:75-80)。プロットは、Vector NTI Suite 9.0.0の構成要素であるプログラムBioAnnotatorwo（Invitrogen）を使用して作成された。
【０１６１】
E.coliにおける発現のため及び放射性核種での標識化のために配列を最適化するために、１０〜１２個のアミノ酸のAffibody（登録商標）分子、即ち分子の標的結合活性に関与しないアミノ酸（１つのＭｅｔ9は別として）は、可能な場合は、より親水性アミノ酸及び／又は全体的な抗原性を低減するアミノ酸に変更された。
【０１６２】
本発明のポリペプチドに対する疎水性／親水性プロットの２つの実施例は、図１３Ａ及びＢに示される。比較のために、親Affibody（登録商標）分子Z00342用の図が、図１３Ｃに示される。
【０１６３】
Affibody （登録商標）分子ＩＩ（配列番号５）の配列では、以下のアミノ酸の変更がなされた：
・これらの変異の４つは、非極性疎水性アミノ酸を極性アミノ酸［Ｆ５Ｙ］、［Ａ４２Ｓ］、［Ａ４６Ｓ］及び［Ａ５４Ｓ］に交換した；
・その２つは、極性アミノ酸を無極性疎水性アミノ酸［Ｎ３Ａ］及び［Ｎ６Ａ］に変更した；
・その１つは、未変化の極性アミノ酸を正に荷電した極性アミノ酸［Ｓ３３Ｋ］に変更した；
・その１つは、極性アミノ酸を負に荷電したアミノ酸（Ｎ４３Ｅ）に変更した；
・その１つは、極性アミノ酸をより小さい極性アミノ酸（Ｎ２３Ｔ）に変更した；
・その１つは、非極性疎水性アミノ酸をより小さい疎水性アミノ酸（Ｖ１Ａ）に変更した；
・その１つは、負に荷電したアミノ酸を別の負に荷電したアミノ酸（Ｄ２Ｅ）に変更した。
【０１６４】
親Affibody（登録商標）分子Z00342に比べて、図１３ＡのAffibody（登録商標）分子ＩＩ用のプロットは、αヘリックス２及び３及びＣ末端(アミノ酸２４〜５８の間)を構成しているAffibody（登録商標）分子の領域における親水性を高めた（図１３Ｃ）。
【０１６５】
Affibody （登録商標）分子Ｘ（配列番号７）の配列では、Affibody（登録商標）分子ＩＩに関しては同一のアミノ酸の変更が行われたが、最初の３つのアミノ酸は、変更した場合はより親水性のアミノ酸に変わった：
・これらの変異の１つは、非極性疎水性アミノ酸を負に荷電したアミノ酸（Ｖ１Ｅ）に交換した；
・その１つは、負に荷電したアミノ酸を極性アミノ酸（Ｄ２Ｓ）に変更した；
・その１つは、荷電していない極性アミノ酸を負に荷電したアミノ酸（Ｎ３Ｅ）に変更した。
【０１６６】
図１３Ｂ中のAffibody（登録商標）（配列番号７）分子Ｘに対するプロットは、親Affibody（登録商標）分子Z00342と比較すると、αへリックス２及び３（アミノ酸２４〜５８の間）及び親水性Ｎ末端でも、同じ親水性の増加を示す（図１３Ｃ）。
【０１６７】
２）逆相ＨＰＬＣ溶離プロフィール
逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーによって効率的にタンパク質を分離することができる。タンパク質の親水性／疎水性の違いは、より親水性のタンパク質がより疎水性タンパク質よりも早く、即ち低濃度のアセトニトリル溶離液で溶離するＲＰカラム、例えばＣ８又はＣ１８カラム上で分析することができる。Affibody （登録商標）分子ＩＩ（配列番号５）及び親Affibody（登録商標）分子Z00342の溶離を比較するために、以下の条件を使用した：ＨＰＬＣ機器：アジレント１１００(Agilent)；カラム：Zorbax 300SB C8 １５０×２．１ｍｍ、３．５μｍ(Agilent)；温度：３０℃；ロード：２０μｌの２．２ｍｇ／ｍｌを有するタンパク質溶液；流量０．５ｍｌ／分；溶媒Ａ：０．５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液；溶媒Ｂ：９０％アセトニトリル＋０．５％ＴＦＡの水溶液；グラジエント；０〜２分は１０％のＢ、２〜１７分は１０〜７０％のＢ、１７〜１８分は７０〜１００％のＢ、１８〜２１分は１００％のＢ、２１〜２２分は１００〜１０％のＢ、２２〜２５分は１０％のＢ。分析結果を図１４に示す。保持時間におけるシフトは、親Affibody（登録商標）分子Z00342と比較して、Affibody（登録商標）分子ＩＩの親水性の増加を示している。上述の全ての変異を有するこのAffibody（登録商標）分子は、親Affibody（登録商標）分子Z00342での９．８６０と比較すると、９．６１４分の保持時間で溶離する。
【０１６８】
実施例６
−本発明のポリペプチド及びZ00342の抗原性（ＩｇＧ結合）の比較試験
要約
本発明に記載のＨＥＲ２特異的ポリペプチドの１つの望ましい性質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）との低い相互作用の可能性を示すことを意味する、低抗原性プロファイルを持つことである。この実施例では、インビトロで抗原性（ＩｇＧ結合）を測定する方法が記述されており、行われたアミノ酸の変更による影響を評価するために、Ｃ末端システインに共役したAffibody（登録商標）分子Ｉ、ＩＩ、ＤＯＴＡを有するＩＩ及び内部のシステイン（位置４２）上で共役したＤＯＴＡを有するＸＩを、標準的なＨＥＲ２特異的Affibody（登録商標）分子Z00342と比較した。使用されたアッセイは、インビトロの抗原性（ＩＶＡ）ＥＬＩＳＡと呼ばれている。
【０１６９】
インビトロの抗原性（ＩＶＡ）ＥＬＩＳＡ
ＩＶＡ  ＥＬＩＳＡでは、９６ウェルのプレートを、２μｇ／ｍｌの標準コーティング試験として選ばれたＨＥＲ２特異的Affibody（登録商標）分子Z00342でコーティングした。また、プレートを、２μｇ／ｍｌのＨＥＲ２特異的Affibody（登録商標）分子Ｉ、ＩＩ、ＤＯＴＡを有するＩＩ及びＤＯＴＡを有するＸＩでコーティングした。５０μｌのコーティング溶液をウェル毎に添加し、そして半面積のプレートを＋４oＣで一夜インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを水道水で２回洗浄し、１００μｌのブロッキング溶液（０．５％のカゼインを有するリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４）を各ウェルに添加した。プレートを、その後室温（ＲＴ）で１時間インキュベートして空にし、続いて、１から開始して１００倍希釈の２倍希釈系列で、５０μｌ／ウェルのさまざまな霊長類の血清を加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、その後ＰＢＳ＋０．０５％のTween(ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄した。検出には、ヤギ抗ヒトＩｇ−ＨＲＰ抗体を、１／５０００に希釈して使用した(Southern Biotechnology)。プレートを、室温で５０分間インキュベートし、その後ＰＢＳ−Ｔを使用して５回洗浄工程にかけた。発色については、５０μｌのImmunoPureTMB基質（Pierce）を添加し、プレートを室温で１２分間暗所でインキュベーションした。停止液（２ＭのＨ2ＳＯ4）を加えて呈色反応を止め、吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【０１７０】
ＩＶＡ値の計算
上記に示すように、続いてＩＶＡ・ＥＬＩＳＡを行った。得られた滴定曲線を、ＸＹ非線形回帰式を使用してグラフにプロットし、ＯＤ０．３での希釈値を求めた。ＯＤ０．３での標準希釈液値を１００に設定し、それを基準に関連付けることによって、各サンプルのＩＶＡ値を算出した。従って、１００以下のＩＶＡ値は、標準的なZ00342と比較して、その特別のＨＥＲ２特異的ポリペプチドについては、より低い程度の霊長類Ｉｇ結合を反映している。４つの異なるＨＥＲ２特異的ポリペプチド、即ち、Affibody（登録商標）分子Ｉ、ＩＩ、ＤＯＴＡを有するＩＩ及びＸＩを有するＤＯＴＡについて、インビトロ抗原性を評価した。標準的なタンパク質と比較して、これらのポリペプチドは低いインビトロの抗原性プロファイルを有することを示した。結論は、行われたアミノ酸変更は、免疫グロブリンとの相互作用の可能性の減少をもたらしたということである。
【０１７１】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【配列表】
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