(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質であって、
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質
但し、前記ニッキング酵素活性が、二重鎖デオキシリボ核酸中の下記式１：
【化１】
0005935382.tif 000006
（式中、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｓはグアニンまたはシトシン、Ｙはシトシンまたはチミン、Ｒはアデニンまたはグアニンを表す）で表される塩基配列に特異的であり、かつ、式１中のＴ／Ｇミスマッチに対するニッキング酵素活性であることを特徴とする、タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｃ）のＤＮＡを含む遺伝子であって、
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡと同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
但し、前記ニッキング酵素活性が、二重鎖デオキシリボ核酸中の下記式１：
【化２】
0005935382.tif 000007
（式中、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｓはグアニンまたはシトシン、Ｙはシトシンまたはチミン、Ｒはアデニンまたはグアニンを表す）で表される塩基配列に特異的であり、かつ、式１中のＴ／Ｇミスマッチに対するニッキング酵素活性であることを特徴とする、タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項２または３に記載の遺伝子を含む組換ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換ベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からニッキング酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１記載のニッキング酵素活性を有するタンパク質を、無細胞タンパク質合成法を用いて合成し、反応液より該ニッキング酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学試薬として有用な新規ヌクレアーゼ、該酵素タンパク質をコードする遺伝子、及び該酵素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレアーゼ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）は核酸の糖とリン酸の間のホスホジエステル結合を加水分解してヌクレオチドとする酵素である。分解の型式により、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼに分類できる。
【０００３】
エキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）は核酸配列の外側（ｅｘｏ−）から、すなわち核酸の５’端または３’端から削るように分解する。一方エンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）は核酸配列の内部（ｅｎｄｏ−）で核酸を切断する酵素であり、制限酵素は代表的なエンドヌクレアーゼである。
【０００４】
分子生物学、または生化学等の発展により、ＤＮＡが遺伝子を司る本体であることが明らかになって以来、ヌクレアーゼは遺伝子操作等の遺伝子工学技術において現在幅広く用いられている有用な酵素である。
【０００５】
ニッキング酵素（Ｎｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅあるいはＮｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）は、二本鎖ＤＮＡのうち一方の鎖だけホスホジエステル結合が切断されたニックを生じさせるエンドヌクレアーゼであるが、その特性を利用して核酸増幅に用いられている。たとえば、ニッキング酵素を用いて二本鎖ＤＮＡの片方にニックを形成させ、生じたニックをプライミングサイトとして、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより、１５塩基程度の短い核酸を恒温増幅する方法が知られている（非特許文献１）。また、この改良技術として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとニッキング酵素を用いて、２１塩基以上の核酸を恒温増幅する方法も開発されている（特許文献１）。
【０００６】
これまでにニッキング酵素は４００種以上が報告されているが、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌において、ニッキング酵素は４例が報告されているに過ぎない（非特許文献２）。
【０００７】
発明者らは、これまでロドコッカス属ロドクロウスＪ−１株から制限酵素と、これに対応する修飾酵素を単離しているが、この制限酵素にはニッキング酵素活性はない（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−１３６４５１号公報
【特許文献２】特開２００７−２５９８５３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ，ｅｔ  ａｌ.，（２００３）“Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  Ｖｏｌ.１００,  Ｎｏ.８,  ４５０４−４５０９
【非特許文献２】Ｌｅｔｅｋ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）”Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  ａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ：  ｃｏｏｐｔｉｖｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｕｎｄｅｒｐｉｎｎｅｄ  ｂｙ  ｋｅｙ  ｇｅｎｅ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｓ” ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．２０１０  Ｓｅｐ  ３０；６（９）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、遺伝子工学の分野で有用な新規なヌクレアーゼとその遺伝子を提供するとともに、これを利用した前記ヌクレアーゼの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ロドコッカス属に属する細菌：ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株より、新規なヌクレアーゼＲｒｈＪ１ＩＩを単離した。
【００１２】
すなわち、本発明は、ロドコッカス属微生物由来の新規ヌクレアーゼに関する。
本発明の新規ヌクレアーゼタンパク質は、以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質である。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と相同性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質
【００１３】
また、上記新規ヌクレアーゼタンパク質は、上記ニッキング酵素活性が、二重鎖デオキシリボ核酸中の下記式１：
【化１】
0005935382.tif 000002
（式中、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｓはグアニンまたはシトシン、Ｙはシトシンまたはチミン、Ｒはアデニンまたはグアニンを表す）で表される塩基配列に特異的であり、かつ、式１中のＴ／Ｇミスマッチに対するニッキング酵素活性であることを特徴とするタンパク質であってもよい。
【００１４】
本発明は、上記新規ヌクレアーゼタンパク質をコードする遺伝子も提供する。
具体的には、本発明の新規ヌクレアーゼ遺伝子は、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡを含む。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡと相同性が８０％以上の塩基配列からなり、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１５】
また本発明は、本発明の新規ヌクレアーゼ遺伝子を含む組換ベクター、および前記組換ベクターを含む形質転換体も提供する。
【００１６】
さらに本発明は、本発明の新規ヌクレアーゼタンパク質の製造方法も提供する。前記製造方法は、たとえば、上記した形質転換体を培養し、得られる培養物からニッキング酵素活性を有するタンパク質を採取することにより実施できる。好ましくは、前記製造方法は、細胞を用いない無細胞タンパク質合成法を用いて実施する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、遺伝子工学の分野で有用なニッキング酵素活性を有するエンドヌクレアーゼおよびその遺伝子が提供される。本発明の新規ヌクレアーゼは、前記遺伝子を用いた組換え製造により、簡便かつ大量に生産することができる。
【００１８】
本発明の新規ヌクレアーゼは、ニッキング酵素活性を有するため、鎖置換型恒温核酸増幅や、染色体ＤＮＡの蛍光標識による可視化、生体内遺伝子ターゲティングのための相同組換えを誘発するための一本鎖ＤＮＡ切断反応などに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ロドコッカス属細菌の産生するエンドヌクレアーゼのホモロジー解析結果を示す図である。
【図２】ＲｒｈＪ１ＩＩ発現プラスミドｐＲＲ０１の構造を示す模式図である。
【図３】ＲｒｈＪ１ＩＩ発現プラスミドｐＲＲ０１を含む組換大腸菌から精製したＲｒｈＪ１ＩＩタンパク質に対するＨｉｓ−ｔａｇ特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図４】ＲｒｈＪ１ＩＩ発現プラスミドｐＲＲ０１を含む組換大腸菌から精製したＲｒｈＪ１ＩＩタンパク質のヌクレアーゼ活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定させるものではない。
【００２１】
１．本発明の新規ヌクレアーゼ（ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ）
本発明の新規ヌクレアーゼは、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株から、発明者らにより初めて単離された。ロドコッカス  ロドクロウスＪ−１株（以下、「Ｊ１菌」ともいう）はＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている菌株である。
【００２２】
発明者らは、このＪ１菌由来の新規ヌクレアーゼを「ＲｒｈＪ１ＩＩ」と命名した。本明細書中では、このＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼが有するニッキング酵素活性を「ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ活性」と記載する。
【００２３】
本明細書において、「エンドヌクレアーゼ活性」とは、核酸配列の内部（ｅｎｄｏ−）で核酸を切断する酵素活性を意味し、「ニッキング酵素活性」とは、特定の配列を有する二本鎖ＤＮＡの片方の鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼ活性を意味する。
【００２４】
本明細書において、ニッキング酵素活性は、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼをＤＮＡと接触させ、接触後のＤＮＡの分子量またはＤＮＡ断片数を測定することにより評価することができる。当業者であれば、基質ＤＮＡ、接触時の酵素量、温度、溶液組成または接触時間などの条件は適宜設定することができる。ＤＮＡの分子量は、例えばアガロース電気泳動によって測定することができる。接触前のＤＮＡの分子量と接触後のＤＮＡの分子量、または接触前のＤＮＡの断片数と接触後のＤＮＡ断片数とを比較することで、ニッキング酵素活性を評価することができる。
【００２５】
発明者らは、Ｊ１菌由来のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼが配列番号２に示されるアミノ酸配列を有することを同定した。
【００２６】
しかしながら、本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼタンパク質は、上記配列を有するものに限定されるものではなく、配列番号２記載のアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、さらに特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性あるいは同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質も本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼに含まれる。
【００２７】
また、本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼタンパク質には、配列番号２記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質も含まれる。
【００２８】
具体的には、（ｉ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２記載のアミノ酸配列の１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２記載のアミノ酸配列に１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号２記載のアミノ酸配列に１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列が挙げられる。
【００２９】
アミノ酸置換は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましい。例えばアミノ酸は、その側鎖の性質に基づいて、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）に分類される。各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いことが知られており、そのようなアミノ酸相互の置換が好ましい。例えば、グリシンとプロリン、グリシンとアラニンまたはバリン、ロイシンとイソロイシン、グルタミン酸とグルタミン、アスパラギン酸とアスパラギン、システインとスレオニン、スレオニンとセリン又はアラニン、リジンとアルギニン間での置換を挙げることができる。
【００３０】
２．本発明の新規ヌクレアーゼ遺伝子（ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子）
本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子は、上記したＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼタンパク質をコードする遺伝子である。本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子は、例えば配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含む。
【００３１】
本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子は上記配列に限定されるものではなく、配列番号１記載の塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、さらに特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列を有するＤＮＡも、それがＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼとしての機能（ニッキング酵素活性）を有するタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。
【００３２】
また、前述したアミノ酸配列の欠失、置換または付加に対応して、配列番号１記載の塩基配列において、数個の塩基に欠失、置換または付加等の変異が生じた塩基配列も、それが本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼとしての機能（ニッキング酵素活性）を有するタンパク質をコードする限り、本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子に含まれる。なお、欠失、置換または付加される塩基の個数は、３０個以下、好ましくは１５個以下、特に好ましくは６個以下である。
【００３３】
さらに、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、これがニッキング酵素活性を有するタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。
【００３４】
ここで、ストリンジェントな条件としては、例えばＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコールを含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件を挙げることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このような緩衝液の塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。
【００３５】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））等を参照することができる。
【００３６】
以下に、ハイブリダイゼーションによりＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子を得る方法の一例を示すが、これに限定されるわけではない。
【００３７】
まず、適当な遺伝子源から得たＤＮＡを定法に従ってプラスミドやファージベクターに接続してＤＮＡライブラリを作製する。このライブラリを適当な宿主に導入して得られる形質転換体をプレート上で培養し、生育したコロニーまたはプラークをニトロセルロースやナイロンの膜にうつしとり、変性処理の後にＤＮＡを膜に固定する。この膜をあらかじめ32Ｐ等で標識したプローブを含む上記の組成の溶液中、上記のストリンジェントな条件で保温し、ハイブリダイゼーションを行う。プローブとしては、配列番号２に記載したアミノ酸配列の全部または一部をコードするポリヌクレオチドを使用することができる。
【００３８】
ハイブリダイゼーションの終了後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィ等によりプローブとハイブリッドを形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成クローンが単離できるまで繰り返す。最後に、得られたクローンの中から、目的の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を選択する。遺伝子の単離は、アルカリ法等の公知のポリヌクレオチド抽出法により実施できる。
【００３９】
本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子は、当該酵素を発現する微生物から単離することもできる。例えば、ロドコッカス  ロドクロウスＪ−１株由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、既知のアミノ酸配列情報から遺伝子の縮重を考慮して設計したプライマーもしくはプローブまたは既知の塩基配列情報に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いたＰＣＲまたはハイブリダイゼーション法により、前記微生物のゲノムから目的の遺伝子を単離することができる。
【００４０】
このように種々のＤＮＡが本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子の範囲内に含まれるのは、コドンの縮重に由来する。すなわち、遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類存在することが知られている。従って、あるアミノ酸配列をコードする遺伝子は多数存在しうる。
【００４１】
遺伝子は自然界において安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることは稀ではない。遺伝子上に起こった変異によっては、コードされるアミノ酸配列に変化を与えない変異（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする、異なる遺伝子が生じたと言える。従って、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができて行く可能性は否定できない。
【００４２】
さらに、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパク質の高発現を図ることが行われている。
【００４３】
このように、特定のアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子は人為的に作製可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。従って、本発明中に開示された塩基配列と同一の遺伝子ではなくても、ＲｒｈＪ１ＩＩと同等の活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡである限り、本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子に含まれる。
【００４４】
遺伝子に変異を導入し、人為的にアミノ酸配列を改変する方法としては、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法や、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅTM  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒTM  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ，Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社）等を用いることができる。
【００４５】
ＤＮＡの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００４６】
塩基配列の決定は、プラスミドベクターを用いて作製された形質転換体の場合、宿主がエシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であれば試験管等で培養を行い、定法に従ってプラスミドを調製する。得られたプラスミドをそのまま鋳型とするか、あるいは挿入断片を取り出してＭ１３ファージベクター等にサブクローニングした後に、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。ファージベクターで作製された形質転換体の場合も基本的に同様な操作により塩基配列を決定することができる。これら培養から塩基配列決定までの基本的な実験法については、例えば前述のＴ．ＭａｎｉａｔｉｓらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ等に記載されている。
【００４７】
得られた遺伝子が目的のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼをコードする遺伝子であるかどうかの確認は、決定された塩基配列を配列番号１に記載の塩基配列と比較して行うことができる。あるいは決定された塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号２に記載のアミノ酸配列と比較して行うことができる。
【００４８】
３．本発明の新規ヌクレアーゼ遺伝子を含む組換えベクター
本発明は、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子を含む組換えベクターも提供する。本発明の組換えベクターは、上記酵素をコードする遺伝子の上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することにより作製することができる。あるいは、発現ベクターに転写プロモーターおよび／またはターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターおよび／またはターミネーターを利用して、その間に当該酵素をコードする遺伝子を挿入すればよい。
【００４９】
本明細書において、プロモーターは、例えば、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなどをあげることができるが、これに限定されるわけではない。
本明細書において、ターミネーターは、例えば、ｔｒｐオペロンターミネータをあげることができるが、これに限定されるわけではない。
【００５０】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入することもできる。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。
【００５１】
本発明において使用されるベクターは、本発明の遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス）、ｐＡＣＹＣ１８４（ニッポンジーン）、ｐＭＷ１１８（ニッポンジーン）などを挙げることができる。また、必要に応じて、これらのベクターを改変したものを用いることもできる。
【００５２】
４．本発明のベクターを導入した形質転換体
本発明の組換えベクターを宿主に導入することで、本発明の形質転換体を作製することができる。
【００５３】
形質転換体に使用する宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的の制限酵素または修飾酵素を発現することができる限り、特に限定されるものではない。宿主としては、例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ）、枯草菌（バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ロドコッカス菌（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、放線菌などの細菌、酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、カビ、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。本発明において、宿主は好ましくは大腸菌である。
【００５４】
本発明において、大腸菌は、例えば、大腸菌Ｋ１２株やＢ株、あるいはそれらの野生株由来の派生株であるＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’）、Ｋ８０２株、Ｃ６００株などを挙げることができる。
【００５５】
宿主への組換えベクターの導入方法としては、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではなく、当業者であれば公知技術から適宜選択することができる。このような方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００５６】
５．本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼの製造方法
５−１  細胞系による製造
本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼは、形質転換体を培養して、培養物中よりＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼの特徴（例えば、ニッキング酵素活性）を有する活性を有するタンパク質を採取することによりＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼを製造することができる。
【００５７】
本発明において「培養物」とは、菌体、培養液、無細胞抽出液、細胞膜などの培養により得られるものを意味する。無細胞抽出液は、培養後の菌体を、例えばリン酸ナトリウム緩衝液を加えてホモジナイザーなどで物理的に破砕した後、遠心（15,000rpm, 10min, 4℃）し、破砕できない菌体（細胞）が存在しないように上清を回収して得ることができる。細胞膜は、上記遠心で得られたペレットとして得ることができ、また、ペレットを溶解バッファーで懸濁することにより得ることもできる。
【００５８】
本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼは、培養物をそのまま用いてもよいし、透析や硫安沈殿などの公知の方法、あるいは公知の方法を単独または適宜組み合わせることによって、培養物から濃縮、精製したものを用いてもよい。この場合、酵素活性、分子量、等電点などを指標に濃縮、精製することができる。
【００５９】
たとえば、形質転換体の培養物からＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼを採取するにあたっては、培養物より菌体を集菌後、超音波破砕、超遠心分離等により酵素を抽出し、ついで除核酸法、塩析法、アフィニティクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ法等を組み合わせて精製すればよい。この方法により、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼを大量に得ることができる。
【００６０】
用いる発現系によっては、形質転換体中で発現された酵素タンパク質が不溶物［封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ）］として蓄積される場合がある。この場合にはこの不溶物を回収し、穏和な変性条件、たとえば尿素等の変性剤存在下で可溶化した後に変性剤を除くことによって活性型のタンパク質を得ることができる。さらに上記のようなクロマトグラフィー操作を行って目的とする酵素タンパク質を精製することができる。
【００６１】
５−２  無細胞タンパク質合成系による製造
本発明においては、無細胞タンパク質合成系を用いて、本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子または本発明のベクターから、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼを製造することも可能である。
【００６２】
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内でタンパク質を合成する系である。すなわち、無細胞タンパク質合成系は、生物を用いた組換えタンパク質発現とは異なり、細胞を使用せずに試験管内で転写・翻訳という一連のタンパク質合成の流れを行う合成系であるため、細胞にとって毒性となるタンパク質を生産できるという利点がある。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系にはＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。
【００６３】
無細胞タンパク質合成系の細胞抽出液としては、真核細胞由来または原核細胞由来の抽出液、例えば小麦胚芽、大腸菌等の抽出液を使用することができる。これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されていないものであってもよい。
【００６４】
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳTM（東洋紡）、ＴＮＴTM  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅTM（東洋紡）、ＲＴＳ（ロシュ  ダイアグノスティクス）等が挙げられる。
【００６５】
こうした細胞抽出液に代えて、タンパク質合成に関与するすべての因子を精製し、それらをリボソーム、ＡＴＰ、ｔＲＮＡ、アミノ酸などとともに再構成して作成された「再構成された無細胞タンパク質合成系」を用いることもできる。
【００６６】
通常の無細胞タンパク質合成系に用いられる細胞抽出液には、ＡＴＰを加水分解する酵素などの混在によりタンパク質合成以外に無駄に消費されるエネルギー量が多く、エネルギー効率が低く、また細胞抽出液中に存在するプロテアーゼやヌクレアーゼなどの阻害因子によりンパク質合成の効率が低下する場合がある。
【００６７】
「再構成された無細胞タンパク質合成系」は、こうした阻害的要因の問題がなく、また構成成分を自由に操作することができるため、目的や標的タンパク質に応じた自由なシステム設計が可能である。また系の自由度が高く、反応系を微小化したり、自動化装置と組み合わせてハイスループットにすることも可能である。
【００６８】
「再構成された無細胞タンパク質合成系」の一例としてＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）を挙げることができる。ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）は大腸菌から再構成されているが、無細胞タンパク質合成系で用いられる他の公知の細胞、昆虫細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球のいずれを用いても、同様の系は構成可能である。
【００６９】
上記のように無細胞タンパク質合成系によって得られる本発明のヌクレアーゼは前述のように適宜クロマトグラフィを選択して、濃縮、精製することができる。
【００７０】
６．ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ活性の解析
６．１  ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼの認識配列
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼの認識配列を調べるために、たとえば前述のような方法で配列番号１に示される遺伝子を発現可能に組み込んだベクターで宿主細胞を形質転換し、その培養物からＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ活性を有するタンパク質を得る。得られたタンパク質を、片方の鎖の５'末端に蛍光標識を持ち、配列内に種々のＴ／Ｇミスマッチを持つ二本鎖オリゴＤＮＡを合成して活性測定用の試料と接触させた後、変性剤と加熱によりＤＮＡを一本鎖に変性させてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、化学発光による検出を行って、切断パターンを解析すると、Ｊ１菌ヌクレアーゼの認識配列を決定することができる。本発明のＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼは、以下の二重鎖デオキシリボ核酸中の下記式１
【化２】
0005935382.tif 000003
（式中、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｓはグアニンまたはシトシン、Ｙはシトシンまたはチミン、Ｒはアデニンまたはグアニンを表す）で表される塩基配列を特異的に認識し、かつ、囲み文字で示した位置のＴ／Ｇミスマッチに対するニッキング酵素活性を示すことを特徴としている。ここで、「Ｔ／Ｇミスマッチ」とは、チミジン（Ｔ）とグアニン（Ｇ）との間で水素結合が形成されたミスマッチ塩基対をいう。
【００７１】
式１中、Ｓ，Ｙ，Ｒで表記される部分の配列は、上記説明文中に示される塩基である限り特に限定されないが、囲み文字で示した位置のＴ／Ｇミスマッチが解消し、リード鎖のＴがＣとなった場合に回文配列となることが好ましい。たとえば、下記式２〜４を挙げることができる。
【化３】
0005935382.tif 000004
【実施例】
【００７２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。以下は本発明の例示であって本発明を限定する趣旨ではない。
【００７３】
［実施例１］
Ｊ１菌染色体ＤＮＡの調製
ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株を１００ｍｌのＭＹＫＧ培地中、３０℃にて７２時間振盪培養した。
【００７４】
培養後、集菌し、集菌された菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ  ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍｌに懸濁した。懸濁液にリゾチーム４０ｍｇを加えて３７℃で１〜２時間振盪した後、−２０℃で凍結した。
【００７５】
次に、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１%ＳＤＳ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼＫ（メルク社）（１０ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ加えて３７℃で１時間振盪した。
【００７６】
次に、等量のＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））飽和フェノールを加え、攪拌後、遠心した。上層を採取し、２倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でＤＮＡを巻き取り、９０％，８０％，７０％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
【００７７】
次に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃，１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫを加え３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
【００７８】
上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に２倍量のエタノールを加え、ガラス棒でＤＮＡを巻き取り回収し、染色体ＤＮＡ標品を得た。
【００７９】
［実施例２］
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子のＰＣＲ
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。
【００８０】
図１はロドコッカス属細菌の産生するヌクレアーゼのアミノ酸ホモロジー解析結果を示す。図１中でホモロジー解析を行ったヌクレアーゼとその由来は以下のとおりである。
Ａ：ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｖｓｒ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ＡＴＣＣ３３７０７）
Ｂ：ＮａｅＩ  ｖｅｒｙ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＳＫ１２１）
Ｃ：Ｖｅｒｙ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ  ＲＨＡ１）
Ｄ：ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  （Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＰＲ４）
Ｅ：ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｏｐａｃｕｓ  Ｂ４）
【００８１】
図１中、特に保存されている２つの領域を選んで配列番号３および配列番号４のデジェネレイトプライマーを設計し、実施例１で調製したＪ１菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてデジェネレイトＰＣＲを以下の条件で実施した。その結果、約３５０ｂのバンドの増幅が確認された。
【００８２】
反応液組成                                                
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１菌染色体ＤＮＡ，実施例１）      １μｌ
１０×Ｅｘ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）    １０μｌ
１５０μＭプライマーＤＧ−０１（配列番号３）    １μｌ
１５０μＭプライマーＤＧ−０２（配列番号４）    １μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                            ８μｌ
ＤＭＳＯ                                      １０μｌ
滅菌水                                        １８μｌ
ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）１μｌ  
総量                                          ５０μｌ
【００８３】
温度サイクル：９４℃：３０秒、６５℃：３０秒および７２℃：１分の反応を３０サイクル
【００８４】
プライマー
ＤＧ−０１：５’−ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＣＣＩＧＣＩＡＣＩＴＣＩＧＣＩＣＧＩＡＴＧ−３’（配列番号３）
ＤＧ−０２：５’−ＣＣＡＩＡＣＩＣＧＩＡＣＩＡＣＩＧＴＣＣＡ−３’（配列番号４）
【００８５】
次に、増幅された配列のダイレクトシークエンシングをＰＣＲで使用したプライマーを用いて実施した。その結果、配列番号５に示す配列が得られ、ホモロジー検索の結果、前述のエンドヌクレアーゼとの相同性が認められた。
【００８６】
［実施例３］
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
（１）ゲノミックサザンハイブリダイゼーション
ＡｐａＬＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，Ｅｃｏ５２Ｉ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＫｐｎＩ，ＭｌｕＩ，ＮｃｏＩ，ＮｏｔＩ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩそれぞれで消化したＪ１菌ゲノムＤＮＡに対し、後述の方法で調製したＲｒｈＪ１ＩＩのプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、Ｅｃｏ５２Ｉで消化した断片から、約１．２ｋｂの単一シグナルが得られた。
【００８７】
なお、ＲｒｈＪ１ＩＩのプローブは以下のようにして調製した。
実施例２で調製したＰＣＲ産物をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物に対してＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を用い、添付のマニュアルにしたがってラベリングを行い、ＲｒｈＪ１ＩＩのプローブとした。
【００８８】
（２）コロニーハイブリダイゼーション
Ｊ１菌ゲノムＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉで分解して０．７％アガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルからＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を使用して約１．２ｋｂの断片を回収した。得られた断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結した。反応条件は以下の通りである。
【００８９】
反応液組成                                                              
ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｇｈｔｙ  ｍｉｘ（タカラバイオ社製）      ５μｌ
Ｊ１菌ゲノムＤＮＡ／Ｅｃｏ５２Ｉ切断断片                        ４μｌ
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）／Ｅｃｏ５２Ｉ切断断片    １μｌ
総量                                                          １０μｌ
【００９０】
反応：
１６℃，１時間
【００９１】
上記ライゲーション産物の全量を、後述の方法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル２００μｌに加え、０℃で３０分放置した。続いて、前述コンピテントセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を１ｍｌ添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。培養後の培養液を２００μｌずつ、ＬＢ  ＡＩＸプレート（１００μｇ／ｌアンピシリン、１００μＭ  ＩＰＴＧ，５０μｇ／ｌ  Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地）に塗布し、３７℃で一晩放置した。プレート上に生育した白色の組換コロニーを新しいＬＢ  ＡＩＸプレートに、プレート１枚に付き９４個、プレート１０枚分単離した。各プレートにはインサートを含まないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）で形質転換したＪＭ１０９株を２コロニー／プレート植菌した。コロニー単離したプレートを３７℃で一晩放置した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）膜にコロニーを写し取り、実施例３（１）で調製したＲｒｈＪ１ＩＩのプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った。
【００９２】
検出されたコロニーを培養して得られた培養液を集菌後、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを回収した。キャピラリーＤＮＡシーケンサーＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付のマニュアルに従って、プラスミド中にクローニングされているゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果、配列番号６に示される塩基配列が得られた。配列番号６に示される塩基配列中に、配列番号２に示す４５０ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）を見出した。このＯＲＦ１のコードするアミノ酸配列は、図１中に示したＡ〜Ｅのロドコッカス属細菌由来エンドヌクレアーゼに対して８７％〜８９％の相同性を持っていることから、ＯＲＦ１はエンドヌクレアーゼをコードしていることが推定されたため、ＯＲＦ１のコードするエンドヌクレアーゼをＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼと命名した。また、本実施例３（２）で得られたＯＲＦ１を含むプラスミドをｐＢＲｒｈＪ１ＩＩと命名した。
【００９３】
なお、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルは以下の方法で調製した。
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地１ｍｌに接種し、３７℃で５時間好気的に前培養した。
次に、前培養液０．４ｍｌをＳＯＢ培地４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。得られた培養物を遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０），２００ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２，４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置し、再度遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）して上清を除いた。得られた大腸菌菌体を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルホキシドを加え、０℃で１０分間放置した後、液体窒素を用いて凍結したものをコンピテントセルとした。
【００９４】
［実施例４］
大腸菌組換体によるＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼの生産
（１）ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ発現プラスミドの構築
ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼを得るために、実施例１で得られたＪ１菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用し、以下に示す反応液組成およびプライマーを用いてＰＣＲを行った。この際、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼをＨｉｓ−ｔａｇ融合タンパクとして発現させるため、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ遺伝子上流にＳＤ配列とＨｉｓ−ｔａｇ配列を付加した。
【００９５】
反応液組成                                                      
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１菌染色体ＤＮＡ）                        １μｌ
２×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡）      ２５μｌ
１０μＭプライマーＮ（配列番号７）                  １．５μｌ
１０μＭプライマーＣ（配列番号８）                  １．５μｌ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ                                      １０μｌ
ＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）              １μｌ
総量                                                  ５０μｌ
【００９６】
温度サイクル：９４℃：１２０秒、９８℃：１０秒および６８℃：１分の反応を３０サイクル
【００９７】
プライマー
Ｎ：５'−ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＴＧＧＣＧＴＣＧＴＣＧＧＡＴ−３'（配列番号７）
Ｃ：５'−ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＣＣＣＣＧＣＧＣＣＧＧＴＴＴ−３'（配列番号８）
【００９８】
反応終了後、反応液５μｌを１％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約０．５ｋｂのＰＣＲ産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を確認した後、反応液からＰＣＲ産物をＤＮＡ／ＲＮＡ  ｅｘｔａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＶＩＯＧＥＮＥ社）で精製した。得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した。制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約０．５ｋｂ付近のバンドを回収した。回収したＰＣＲ産物をベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドをｐＲＲ０１と名づけた。図２はプラスミドｐＲＲ０１の構造を示す模式図である。
【００９９】
このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ  ＩＰＴＧ，５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上でコロニーを形成させた。得られた白色のコロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した後Ｍｉｎｉ  Ｐｌｕｓ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＶＩＯＧＥＮＥ社）を使用してプラスミドを回収し、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩによる切断とシークエンス解析を行って目的のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。
【０１００】
（２）精製酵素の調製
（１）で作製したＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ発現ベクターを含む大腸菌組換体（ＪＭ１０９／ｐＲＲ０１）を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地１０ｍｌで３７℃，５時間培養した後、１ｍｌを１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ液体培地１００ｍｌ×１本に植菌し、３７℃，１８時間培養した。培養液を遠心分離によって回収し、回収した菌体を破砕用緩衝液（組成  ２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール、ｐＨ７．４）に懸濁した後４℃で１０分間超音波による破砕を行った。破砕液を遠心分離し、得られた上清を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液をＨｉｓ−ｔａｇ精製カラム（Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ＨＰ：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。精製タンパク質はＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５Ｍ  イミダゾール、２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１０％グリセロール、ｐＨ７．４）にて溶出し、２つのフラクションに分画してフラクション１，フラクション２とした。
【０１０１】
得られた精製サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨｉｓ−ｔａｇ特異的抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたウェスタンブロッティングに供し、目的タンパク質が精製されていることを確認した。結果を図３に示す。図３中、Ａ，Ｂの「１」は分子量マーカー（ＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｒｏａｄ）、「４」はポジティヴコントロール（Ｈｉｓ×６融合タンパク質、１２ｋＤａ）である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、フラクション１（図３Ａ「２」）とフラクション２（図３Ａ「３」）で約２５ｋＤａ付近にバンドが出現し、Ｈｉｓ−ｔａｇ特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、目的タンパク質であることを確認した（図３Ｂ「２」「３」）。
【０１０２】
（３）酵素活性の測定
（２）で調製した精製酵素を用いて、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼ活性を調べた。活性は片方の鎖の５'末端にビオチン標識を持ち、配列内にＴ／Ｇミスマッチを１箇所持つ二本鎖オリゴＤＮＡを用いてそのニッキング活性を測定した。
【０１０３】
反応液組成                                              
１.５μＭ基質ＤＮＡ（配列番号９〜１８）         ２μｌ
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）      ２μｌ
１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2                           ２μｌ
１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ                            ２μｌ
総量                                          ２０μｌ
【０１０４】
【化４】
0005935382.tif 000005
【０１０５】
反応温度：２０℃，６０分
【０１０６】
反応終了後、反応液と等量のフェノールでＤＮＡを抽出し、ホルムアミド（終濃度１Ｍ）の存在下、１００℃で２分間加熱後氷上にて急冷処理し、ＤＮＡを一本鎖に変性させた。変性後の一本鎖ＤＮＡサンプルを、８Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、Ｉｍａｇｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉ  ｋｉｔ（東洋紡）を使用して化学発光による検出を行って泳動パターンを比較した。
【０１０７】
結果を図４に示す。図４中、「１」は２０ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡ，「２」は４０ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡ，「３」はネガティヴコントロール（酵素を含まない反応液でインキュベートと変性処理を行った基質ＤＮＡ０１）である。オリゴヌクレオチド０２、０６、０８は切断され約２０ｍｅｒの１本鎖が生成した（図４  「５」，「９」，「１１」）。一方、０１、０３、０４、０５、０７、０９、１０は切断されなかった（図４  「４」、「６」、「７」、「８」、「１０」、「１２」、「１３」）ことから、ＲｒｈＪ１ＩＩヌクレアーゼはミスマッチを認識してＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ活性を持つことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明の新規ヌクレアーゼおよびその遺伝子は、遺伝子工学の分野で有用であり、鎖置換型恒温核酸増幅や、染色体ＤＮＡの蛍光標識による可視化、生体内遺伝子ターゲティングのための相同組換えを誘発するための一本鎖ＤＮＡ切断反応などに利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０９】
配列番号３：プライマーＤＧ−０１
配列番号４：プライマーＤＧ−０２
配列番号７：プライマーＮ
配列番号８：プライマーＣ
配列番号９：二本鎖オリゴＤＮＡ０１
配列番号１０：二本鎖オリゴＤＮＡ０２
配列番号１１：二本鎖オリゴＤＮＡ０３
配列番号１２：二本鎖オリゴＤＮＡ０４
配列番号１３：二本鎖オリゴＤＮＡ０５
配列番号１４：二本鎖オリゴＤＮＡ０６
配列番号１５：二本鎖オリゴＤＮＡ０７
配列番号１６：二本鎖オリゴＤＮＡ０８
配列番号１７：二本鎖オリゴＤＮＡ０９
配列番号１８：二本鎖オリゴＤＮＡ１０
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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