(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然物に由来するリグニン及び／又はリグニン関連物質を含むバイオマスに、ＮＡＤ及び還元型グルタチオンの存在下で、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）  ＭＢＥＳ０４（国際寄託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７９７）に由来する酵素を作用させることにより、フェニルプロパン系化合物を得る工程
を含む、フェニルプロパン系化合物の製造方法。
【請求項２】
前記フェニルプロパン系化合物が、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノン、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３、５−ジメトキシフェニル）−１−プロパノン及び３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノンからなる群から選ばれる一種である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記フェニルプロパン系化合物が、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記酵素が、下記（１）及び（２）、並びに（３）及び／又は（４）に記載の酵素の組み合わせである、請求項１〜３に記載の製造方法。
（１）Ｒｏｓｓｍａｎｎ−ｆｏｌｄ  ＮＡＤ（Ｐ）（＋）結合タンパク質スーパーファミリーに属し、かつ、ＰＲＫ０６１９４のマルチドメインを有する、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化するＳｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
（２）Ｇｓｔ並びにＮ末端側にＰＲＫ１５１１３及びｍａｉＡのマルチドメインを有する、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
（３）Ｇｓｔ及びＮ末端側にＰＲＫ１０３８７及びｍａｉＡのマルチドメインを有する、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
（４）Ｇｓｔ、ＰＲＫ１１７５２、ＰＲＫ１５１１３及びｍａｉＡのマルチドメインを有する、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
【請求項５】
前記（１）の酵素が、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００６９又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００９３であり；
前記（２）の酵素が、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００７６又は配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００７７であり；
前記（３）の酵素が、配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００７８であり；及び
前記（４）の酵素が、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００７５である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
天然物に由来するリグニン及び／又はリグニン関連物質を含むバイオマスに、ＮＡＤの存在下で、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）  ＭＢＥＳ０４（国際寄託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７９７）に由来する下記（１）の酵素を作用させることにより、カルボニルフェニル系化合物を得る工程
を含む、カルボニルフェニル系化合物の製造方法。
（１）Ｒｏｓｓｍａｎｎ−ｆｏｌｄ  ＮＡＤ（Ｐ）（＋）結合タンパク質スーパーファミリーに属し、かつ、ＰＲＫ０６１９４のマルチドメインを有する、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化するＳｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
【請求項７】
前記（１）の酵素が配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する Ｃ１０Ｇ００６９又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００９３である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）  ＭＢＥＳ０４（国際寄託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７９７）に由来する、Ｒｏｓｓｍａｎｎ−ｆｏｌｄ  ＮＡＤ（Ｐ）（＋）結合タンパク質スーパーファミリーに属し、かつ、ＰＲＫ０６１９４のマルチドメインを有する、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化するＳｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ。
【請求項９】
前記Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認できる分子量が３４ｋＤａであり；最適ｐＨが８．５〜９．５であり；かつ、最適温度が１０〜１５℃である、請求項８に記載のＳｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ。
【請求項１０】
前記Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認できる分子量が３４ｋＤａであり；最適ｐＨが８．５〜１０．５であり；かつ、最適温度が２５〜３０℃である、請求項８に記載のＳｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ。
【請求項１１】
前記Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅが、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００６９又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００９３である、請求項８に記載のＳｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を利用してリグニンやリグニン関連物質を含むバイオマスからフェニルプロパン構造を有する化合物を特異的に生産する方法及びそのための酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
リグニンは植物の維管束細胞壁成分として存在する無定形高分子物質であって、フェニルプロパン系の構成単位が複雑に縮合したものであり、メトキシ基を含有することが化学構造上の大きな特徴になっている。リグニンは木質化した植物細胞を相互に膠着し、組織を強化する働きをしており、木材中に１８〜３６％、草本中には１５〜２５％存在する。そこで、木材を有効利用するために、リグニンを分解し、有用化合物を得ようとする試みが種々なされている。
【０００３】
一方、フェニルプロパン系化合物としては、例えば、クマル酸、ケイ皮酸、コーヒー酸（３，４−ジヒドロキシケイ皮酸）、オイゲノール、アネトール、コニフェリルアルコール、シナピルアルコール、フェルラ酸などが知られている。フェニルプロパン系化合物は、工業分野においては、香水、香料、精油、殺菌剤、麻酔薬、抗酸化剤などの医薬品や機能性食品及びそれらの合成中間体となる有用な化合物群である。
【０００４】
例えば、木材、イナワラなどのリグノセルロース物質に含まれるリグニンを、高温高圧処理によりガス化する方法（特許文献１及び２を参照）、加圧熱水法（特許文献３を参照）などの物理化学的な方法によって、非特異的に低分子化する方法が知られている。しかしながら、これらの手法では、リグニンから特定の化合物を製造することは非常に困難である。これらの方法を採用すると、リグニンの持つ単位構造であり、ベンゼン環骨格に直接結合する炭素側鎖の炭素数が３個であるフェニルプロパン系化合物はさらに低分子化される。すなわち、グアイヤコール、シリンゴールなどのベンゼン環骨格に直接結合する炭素側鎖の炭素数が０個のフェノール類や、バニリン、シリンガアルデヒドなどのベンゼン環骨格に直接結合する炭素側鎖の炭素数が１個のフェニルメタン化合物などに非特異的に変換される。また、分解生成物は多種多様な成分が混在しており、フェニルプロパン系化合物のみを取得することは非常に困難であり、特異的に製造することができない。また、これらの物理化学的な方法を採用する場合、これらの方法を実施するためには多くのエネルギーや特別な装置が必要である。
【０００５】
そこで、リグニンを生物学的に処理してリグニン分解物を得ようとする試みがなされている。例えば、リグノセルロース物質に白色腐朽菌を接種及び培養することによってリグニンを分解する方法が知られている（特許文献４を参照）。
【０００６】
ところで、天然リグニン中にはβ−アリールエーテル型結合が約５０％存在していることから、β−アリールエーテル型結合を分解し得るか否かは、天然リグニンの分解において重要な意義をもつ。このβ−アリールエーテル型結合の特異的な分解酵素を生産する微生物としては、スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌（特許文献５及び非特許文献１を参照；ただし、非特許文献１には「シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌」として記載されている）、ブレバンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属細菌（特許文献６を参照）及びシュードモナス属細菌（非特許文献２を参照）が知られている。
【０００７】
特許文献４〜６及び非特許文献１〜２には、スフィンゴビウム属細菌、ブレバンディモナス属細菌及びシュードモナス属細菌並びにこれらの微生物によって生産されるβ−アリールエーテル切断酵素によって、リグニンのモデル化合物であるグアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテル又は３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）−１−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノンのβ−アリールエーテル切断によってフェニルプロパン系化合物を生産する方法が記載されている。
【０００８】
また、非特許文献３には、スフィンゴビウム属細菌由来のβ−アリールエーテル型結合分解酵素を用いて、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルからフェニルプロパン系化合物を生産しようとする場合、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子及び該炭素原子に結合するアルコール性ヒドロキシ基に作用してカルボニル基を形成する第１の反応；生じたカルボニル化合物内に存在するβ−Ｏ−４位のエーテル結合を開裂させる第２の反応；並びに、第２の反応で生じたグルタチオン含有中間体からグルタチオンを除去する第３の反応の３段階の酵素逐次反応を経ることによって、フェニルプロパン系化合物を製造することができることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１２−１４０３４６号公報
【特許文献２】特開２０１２−５０９２４号公報
【特許文献３】特開２０１０−２３９９１３号公報
【特許文献４】特開昭５０−４６９０３号公報
【特許文献５】特開平５−３３６９７６号公報
【特許文献６】特開２００２−３４５５７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２４９（２），１９８９，ｐｐ．３４８−３５２
【非特許文献２】Ｍｏｋｕｚａｉ  Ｇａｋｋａｉｓｈｉ，Ｖｏｌ．３１（１１），１９８５，ｐｐ．９５６−９５８
【非特許文献３】Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１１；７５（１２）：２４０４−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特許文献４に記載の方法によれば、微生物の作用によってリグニンを分解し得る可能性がある。しかし、特許文献４に記載の白色腐朽菌や白色腐朽菌が産生するリグニン分解酵素をリグノセルロース物質に作用させた場合、これらのリグニン分解反応の特異性が非常に低いことから、構造に統一性がない生成物ができるばかりか、主として生成物による重合反応が進行する。したがって、特許文献４に記載の方法は、反応生成物が工業原料としての利用性に欠けるという問題を有する。
【００１２】
特許文献５〜６及び非特許文献１〜３に記載の方法は、リグニンのモデル化合物から、微生物やその生産酵素を利用して、フェニルプロパン系化合物を製造する方法である。しかし、これらの文献には、天然のバイオマスから、微生物や酵素を作用させることによって、フェニルプロパン系化合物を得たとする記載はない。特に、特許文献５に記載の酵素だけでは、フェニルプロパン系化合物を生産することはできない。また、非特許文献１に記載の微生物はグアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルを完全に分解して資化する、すなわちＣＯ２にまで分解することから、フェニルプロパン系化合物を生産することはできない。
【００１３】
グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのように、β−アリールエーテル型結合のうちα位の炭素にＯＨ基が結合した構造は天然のバイオマスに多く見られることから、特許文献６に記載の微生物やその生産酵素を用いて天然のバイオマスを分解することは非常に困難なことである。すなわち、ブレバンディモナス属細菌由来のβ−アリールエーテル型結合分解酵素を用いても、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルからはフェニルプロパン系化合物を生産することができない。よって、特許文献６に記載の酵素は、β−アリールエーテル型結合のうち、Ｃα位の炭素がカルボニル基を構成しない場合が多い天然のバイオマスにはほとんど作用することができないという問題がある。
【００１４】
さらに、特許文献６には、ブレバンディモナス属細菌由来のβ−アリールエーテル型結合分解酵素は、１−（４−ベンジロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンのアリールグリセロール−β−アリールエーテル型結合（特許文献６に記載の化合物ＩＸ）を特異的かつ還元的に切断し、β−アリールエーテル型結合におけるアリールグリセロール部分の遊離フェノール性水酸基の有無に関わらず、β−アリールエーテル型結合を切断するという記載がある。しかし、その活性は１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンに対する活性の１００分の１であり、到底十分な活性とはいえない。
【００１５】
また、特許文献６に記載の酵素を培養によって生産するためには、誘導物質を添加するなど、煩雑な培養条件設定が必要である。該酵素を一般的な組み換え宿主を使用して大量生産するための酵素遺伝子情報は得られていない。特許文献６において、ブレバンディモナス属細菌由来のβ−アリールエーテル型結合分解酵素が作用する１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オン及びその誘導体である１−（４−ベンジロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンには２種の光学異性体が存在するところ、各光学異性体に対する酵素活性についてはなんら記載がない。
【００１６】
また、非特許文献２に記載の微生物は、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルを代謝することが可能であるとしても、生成されるフェニルプロパン系化合物がさらに代謝され、別の化合物へと変換されるため、生成物の収率は非常に低くなる。
【００１７】
非特許文献３に記載の酵素は、４種類の光学異性体（αＳ，βＲ；αＲ，βＳ；αＲ，βＲ；αＳ，βＳ）が存在するグアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのうち、αＲ，βＳ体及びαＳ，βＳ体のグアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのみを出発原料とすることができるが、αＳ，βＲ体及びαＲ，βＲ体を出発原料とすることはできない。その結果として、得られるフェニルプロパン系化合物の収量が低くなるという問題がある。さらに非特許文献３に記載の酵素が作用する基質については、遊離フェノール性水酸基を有する化合物の分解のみが知られており、遊離フェノール性水酸基を有しない化合物については非特許文献３において記載がない。
【００１８】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、特許文献５〜６及び非特許文献１〜３に記載の方法と比較して、酵素を作用させることにより、リグニンを含む天然バイオマスからフェニルプロパン構造を有する化合物を特異的かつ効率的に生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を積み重ね、深海沈木から単離したリグニン分解微生物であるノボスフィンゴビウム・エスピー  ＭＢＥＳ０４株のゲノム配列情報を解読し、その情報からリグニンを含む天然バイオマスからフェニルプロパン構造を有する化合物を特異的に生産することに関与する一連の酵素の遺伝子群を取得することに成功した。さらに取得した遺伝子群から組換え酵素群を作製し、リグニン含有バイオマスを基質としてこれらの酵素群の分解様式を解析した結果、フェニルプロパン系化合物を特異的かつ高収率で生産することができる酵素６種を見出した。本発明はこのような成功例や知見に基づいて完成するに至った発明である。
【００２０】
したがって、本発明によれば、リグニン及び／又はリグニン関連物質を含むバイオマスに、ＮＡＤ及び還元型グルタチオンの存在下で、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属微生物に由来する酵素を作用させることにより、フェニルプロパン系化合物を得る工程を含む、フェニルプロパン系化合物の製造方法が提供される。
【００２１】
好ましくは、本発明の製造方法において、前記フェニルプロパン系化合物が、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノン、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３、５−ジメトキシフェニル）−１−プロパノン及び３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノンからなる群から選ばれる一種である。
【００２２】
好ましくは、本発明の製造方法において、前記フェニルプロパン系化合物が、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンである。
【００２３】
好ましくは、本発明の製造方法において、前記ノボスフィンゴビウム属微生物が、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）  ＭＢＥＳ０４（国際寄託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７９７）である。
【００２４】
好ましくは、本発明の製造方法において、前記酵素が、下記（１）及び（２）、並びに（３）及び／又は（４）に記載の酵素の組み合わせである。
（１）Ｒｏｓｓｍａｎｎ−ｆｏｌｄ  ＮＡＤ（Ｐ）（＋）結合タンパク質スーパーファミリーに属し、かつ、ＰＲＫ０６１９４のマルチドメインを有する、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化するＳｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
（２）Ｇｓｔ並びにＮ末端側にＰＲＫ１５１１３及びｍａｉＡのマルチドメインを有する、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
（３）Ｇｓｔ及びＮ末端側にＰＲＫ１０３８７及びｍａｉＡのマルチドメインを有する、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
（４）Ｇｓｔ、ＰＲＫ１１７５２、ＰＲＫ１５１１３及びｍａｉＡのマルチドメインを有する、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
【００２５】
好ましくは、本発明の製造方法において、前記（１）の酵素が、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００６９又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００９３であり；前記（２）の酵素が、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００７６又は配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００７７であり；前記（３）の酵素が、配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００７８であり；及び、前記（４）の酵素が、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００７５である。
【００２６】
本発明の別の側面によれば、リグニン及び／又はリグニン関連物質を含むバイオマスに、ＮＡＤの存在下で、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属微生物に由来する下記（１）の酵素を作用させることにより、カルボニルフェニル系化合物を得る工程を含む、カルボニルフェニル系化合物の製造方法が提供される。
（１）Ｒｏｓｓｍａｎｎ−ｆｏｌｄ  ＮＡＤ（Ｐ）（＋）結合タンパク質スーパーファミリーに属し、かつ、ＰＲＫ０６１９４のマルチドメインを有する、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化するＳｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
【００２７】
好ましくは、本発明の製造方法において、前記（１）の酵素が配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する Ｃ１０Ｇ００６９又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００９３である。
【００２８】
本発明の別の側面によれば、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属微生物に由来する、Ｒｏｓｓｍａｎｎ−ｆｏｌｄ  ＮＡＤ（Ｐ）（＋）結合タンパク質スーパーファミリーに属し、かつ、ＰＲＫ０６１９４のマルチドメインを有する、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化するＳｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅが提供される。
【００２９】
好ましくは、本発明の酵素において、前記Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認できる分子量が３４ｋＤａであり；最適ｐＨが８．５〜９．５であり；かつ、最適温度が１０〜１５℃である。
【００３０】
好ましくは、本発明の酵素において、前記Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認できる分子量が３４ｋＤａであり；最適ｐＨが８．５〜１０．５であり；かつ、最適温度が２５〜３０℃である。
【００３１】
好ましくは、本発明の酵素において、前記Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅが、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する Ｃ１０Ｇ００６９又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＣ１０Ｇ００９３である。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の製造方法や酵素によれば、農業廃棄物や木材などの天然物に由来するリグニンやリグニン関連物質を含むバイオマスからフェニルプロパン構造を有する有用化合物を特異的かつ効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、本発明の製造方法で用いられる酵素群の一態様と、作用する基質の光学異性体との関係を模式化した図である。
【図２】図２は、ｃ１０ｇ００６９遺伝子がコードするアミノ酸配列をクエリーとしてＤＥＬＴＡ−ＢＬＡＳＴサーチを行った結果を示した図である。
【図３】図３は、ｃ１０ｇ００９３遺伝子がコードするアミノ酸配列をクエリーとしてＤＥＬＴＡ−ＢＬＡＳＴサーチを行った結果を示した図である。
【図４】図４は、ｃ１０ｇ００７６遺伝子がコードするアミノ酸配列をクエリーとしてＤＥＬＴＡ−ＢＬＡＳＴサーチを行った結果を示した図である。
【図５】図５は、ｃ１０ｇ００７７遺伝子がコードするアミノ酸配列をクエリーとしてＤＥＬＴＡ−ＢＬＡＳＴサーチを行った結果を示した図である。
【図６】図６は、ｃ１０ｇ００７８遺伝子がコードするアミノ酸配列をクエリーとしてＤＥＬＴＡ−ＢＬＡＳＴサーチを行った結果を示した図である。
【図７】図７は、ｃ１０ｇ００７５遺伝子がコードするアミノ酸配列をクエリーとしてＤＥＬＴＡ−ＢＬＡＳＴサーチを行った結果を示した図である。
【図８】図８は、Ｃ１０Ｇ００６９の最適温度を評価した結果を示した図である。
【図９】図９は、Ｃ１０Ｇ００６９の最適ｐＨを評価した結果を示した図である。
【図１０】図１０は、Ｃ１０Ｇ００９３の最適温度を評価した結果を示した図である。
【図１１】図１１は、Ｃ１０Ｇ００９３の最適ｐＨを評価した結果を示した図である。
【図１２】図１２は、Ｃ１０Ｇ００７６の最適温度を評価した結果を示した図である。
【図１３】図１３は、Ｃ１０Ｇ００７６の最適ｐＨを評価した結果を示した図である。
【図１４】図１４は、Ｃ１０Ｇ００７７の最適温度を評価した結果を示した図である。
【図１５】図１５は、Ｃ１０Ｇ００７７の最適ｐＨを評価した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明の詳細について説明する。
本発明の製造方法は、リグニン及び／又はリグニン関連物質を含むバイオマスに、ＮＡＤ及び還元型グルタチオンの存在下で、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属微生物に由来する酵素を作用させることにより、フェニルプロパン系化合物を得る工程を含む、フェニルプロパン系化合物の製造方法である。
【００３５】
本発明の製造方法では、バイオマス中のリグニン及びリグニン関連物質が、ノボスフィンゴビウム属微生物に由来する酵素の作用を受けることにより、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノン、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３、５−ジメトキシフェニル）−１−プロパノン、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノンなどのフェニルプロパン系化合物が生成される。
【００３６】
本発明の製造方法で得られるフェニルプロパン系化合物は、フェニルプロパン構造を有する化合物であれば特に限定されず、例えば、下記一般式（Ａ）
【化１】
0005935225.tif 000002
（Ａ）
（式中、Ｒは１個又は２個以上の炭素数が１〜５であるアルキル基、アルコキシ基又は水素原子を示す。）
で表わされる、１位の位置にカルボニル基を有し、かつ、３位及びフェニル基の４位にヒドロキシ基を有する化合物であり、より具体的には３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノン、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３、５−ジメトキシフェニル）−１−プロパノン又は３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノンであり、好ましくは３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンである。
【００３７】
これらのうち、例えば、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンは、下記式（Ｉ）の構造からなる。
【化２】
0005935225.tif 000003
（Ｉ）
【００３８】
３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンは、例えば、逆相ＨＰＬＣにより、定性及び定量的に分析できる。逆相ＨＰＬＣの条件は、例えば、オクタデシルシリル基修飾シリカゲルカラム（ＯＤＳカラム）を用いて、溶離液Ａ（２ｍＭ  酢酸アンモニウム、０．０５％Ｖ／Ｖ  ギ酸）及び溶離液Ｂ（１００％Ｖ／Ｖ  メタノール）を用いて、カラム温度を４０℃、流速を１．２ｍｌ／ｍｉｎと設定して、溶離液Ａ  ９０％Ｖ／Ｖ及び溶離液Ｂ  １０％Ｖ／Ｖの混合液を１分間送液した後、溶離液Ｂを１０％Ｖ／Ｖ〜９５％Ｖ／Ｖのグラジェントで７分間送液する。この条件により、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンは、ＵＶ検出器（２７０ｎｍ）を用いることにより、保持時間４．５分付近のピークとして検出できる。３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンの標準品を用いれば、検量線法や内標準法などにより、定量することが可能である。
【００３９】
本発明の製造方法では、リグニン、リグニン関連物質又はこの両方を含むバイオマスを原料として用いる。リグニンは、当業界において通常知られるものであれば特に限定されないが、例えば、植物の維管束に存在し、主として下記式（Ｂ）〜（Ｄ）として示す３種のフェニルプロパノイドを構成単位として複雑に重合した樹枝状構造を有するものとして知られているものである。
【化３】
0005935225.tif 000004
（Ｂ）
【化４】
0005935225.tif 000005
（Ｃ）
【化５】
0005935225.tif 000006
（Ｄ）
【００４０】
リグニン関連物質は、リグニンから誘導される物質であれば特に限定されず、例えば、リグニンの分解物やリグニンを処理して得られる物質に加えて、リグニンのモデル化合物とされている物質、例えば、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルなどを含む。バイオマスは、リグニン、リグニン関連物質又はこの両方を含むものであれば特に限定されず、例えば、草や木などの天然物、これら天然物に処理を加えて得られるもの、農業廃棄物などが挙げられる。
【００４１】
リグニン及び／又はリグニン関連物質を含むバイオマス（以下、リグニン含有バイオマスともよぶ。）は、前処理の有無などによって、例えば、固体状、懸濁状、液体状などであり得る。例えば、リグニン含有バイオマスを粉砕したものを液体に加えて得られる懸濁液とすることもできる。
【００４２】
また、リグニン含有バイオマスは、リグニン抽出物であってもよい。リグニン抽出物としては、例えば、リグニン含有バイオマスの粉末化したものを、０．１％Ｗ／Ｖ〜５０％Ｗ／Ｖ、好ましくは１％Ｗ／Ｖ〜２０％Ｗ／Ｖとなるように、リグニンの抽出に適した溶媒中に懸濁して懸濁液とし、この懸濁液を１０℃〜１５０℃、好ましくは２０℃〜１３０℃、より好ましくは２０℃〜８０℃で、数時間〜数日間、好ましくは１時間〜６日間の抽出処理に供し、次いで抽出処理液から固形分を除いた液体状のリグニン抽出物、又は液体状のリグニン抽出物から溶媒を留去し、乾固することにより得られる固体状のリグニン抽出物などが挙げられる。
【００４３】
リグニンの抽出に適した溶媒は特に限定されず、例えば、水、ジオキサン、メタノール、イソプロパノールなどの低分子アルコール類、ジメチルホルムアミドなどが挙げられ、好ましくは水及びジオキサンである。
【００４４】
本発明の製造方法では、リグニン含有バイオマスからフェニルプロパン系化合物を得るために、ノボスフィンゴビウム属微生物に由来する酵素を用いる。ノボスフィンゴビウム属微生物は、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属、別名としてスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に属する、０．３〜０．８×２〜３μｍのグラム陰性桿菌であれば特に限定されないが、例えば、各種芳香族化合物を分解することが知られているノボスフィンゴビウム属微生物である。本発明の製造方法において用いられるノボスフィンゴビウム属微生物の好ましい具体例は、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）  ＭＢＥＳ０４（以下、ＭＢＥＳ０４株ともよぶ。）である。
【００４５】
ＭＢＥＳ０４株は、微生物の識別の表示を「Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＭＢＥＳ０４」とし、かつ、国際寄託番号を「ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７９７」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２０１４年１月３０日付けで国内寄託されたものに基づいて国際寄託されている。
【００４６】
本発明の製造方法では、ノボスフィンゴビウム属微生物に由来する２種以上の酵素を組み合わせて用いることが好ましい。具体例として、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化する酵素；１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンのβ位の炭素原子におけるアリールグリセロール−β−アリールエーテル型結合を還元的に切断する酵素；及びβ位の炭素原子に還元部位を有する３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンの該還元部位を脱離する酵素の３種類の酵素の組み合わせが挙げられる。
【００４７】
グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテル、１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オン及びβ位の炭素原子に還元部位を有する３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンの構造を下記（Ｅ）〜（Ｇ）に示す。
【化６】
0005935225.tif 000007
（Ｅ）
【化７】
0005935225.tif 000008
（Ｆ）
【化８】
0005935225.tif 000009
（Ｇ）
（式中、Ｒは還元部位を示す。）
【００４８】
グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化する酵素は、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子、該α位の炭素原子に結合するヒドロキシ基又はその両方に作用して、この部位でカルボニル基を形成させて、１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンを生成させることができる酵素である。１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンのβ位の炭素原子におけるアリールグリセロール−β−アリールエーテル型結合を還元的に切断する酵素は、１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンのβ位の炭素原子におけるアリールグリセロール−β−アリールエーテル型結合に作用して、アリールエーテルと還元剤とを置換することにより、β位の炭素原子に還元部位を有する３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンを生成させることができる酵素である。β位の炭素原子に還元部位を有する３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンの該還元部位を脱離する酵素は、β位の炭素原子に存在する還元部位に作用して、この還元部位を脱離することによって、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンを生成させることができる酵素である。
【００４９】
これらの酵素を取得する方法は特に限定されないが、例えば、ノボスフィンゴビウム属微生物から得た酵素抽出液やその分画液を用いて、各酵素の基質に作用させることにより、基質量の減少や生成物の存在を確認することで、上記酵素のいずれか又はその混合物を得ることができる。
【００５０】
グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化する酵素は、上記した作用を有するノボスフィンゴビウム属微生物に由来する酵素であれば特に限定されないが、例えば、Ｒｏｓｓｍａｎｎ−ｆｏｌｄ  ＮＡＤ（Ｐ）（＋）結合タンパク質スーパーファミリーに属し、かつ、ＰＲＫ０６１９４のマルチドメインを有するＳｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅが挙げられる。また、該Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅの具体的な例は、配列表の配列番号１に記載のＣ１０Ｇ００６９及び配列表の配列番号２に記載のＣ１０Ｇ００９３である。ＰＲＫ０６１９４マルチドメインは、ＰＳＳＭ−Ｉｄが１８０４５８である、ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ中によく見出されるアミノ酸配列である。ＰＲＫ０６１９４のＥ−ｖａｌｕｅは、Ｃ１０Ｇ００６９に対して１．３３ｅ−６６、Ｃ１０Ｇ００９３に対して１．３５ｅ−６８である。本明細書で「マルチドメインを有する」とは、マルチドメインそのもののアミノ酸配列を有することに加えて、マルチドメインの一部のアミノ酸配列をＮ末端側又はＣ末端側などに有すること、マルチドメインと近似するアミノ酸配列を有することなどを意味する。
【００５１】
Ｃ１０Ｇ００６９及びＣ１０Ｇ００９３Ｃの理化学的性質は以下のとおりである。すなわち、Ｃ１０Ｇ００６９及びＣ１０Ｇ００９３ＣはＮＡＤ＋の存在下で、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化する。一方、これらの酵素は、ＮＡＤＨ存在下では、１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンのα位のカルボニル残基を還元して、ヒドロキシ基を与え得る。ただし、ＮＡＤＰ＋及びＮＡＤＰＨの存在下では活性を示さない。そこで、本発明の製造方法では、ＮＡＤの存在下で酵素反応が実施される。Ｃ１０Ｇ００６９の最適ｐＨは８．５〜９．５であり；及び、最適温度は１０〜１５℃である。Ｃ１０Ｇ００９３の最適ｐＨは８．５〜１０．５であり；及び、最適温度は２５〜３０℃である。なお、本明細書でいう最適ｐＨ及び最適温度は、後述する実施例にて測定した結果のうち、目的産物の最も高い値から概ね８０％程度以上の値を示すｐＨ及び温度の範囲である。
【００５２】
グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルには、α位及びβ位の炭素原子が不斉炭素であることから、αＳ，βＲ（ＳＲ）；αＲ，βＳ（ＲＳ）；αＲ，βＲ（ＲＲ）；αＳ，βＳ（ＳＳ）という４種類の光学異性体が存在する。これらのうち、Ｃ１０Ｇ００６９は、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＲＳ体及びＲＲ体の２つの光学異性体に特異的に反応し、Ｃ１０Ｇ００９３はそのＳＲ体及びＳＳ体の２つの光学異性体に特異的に反応する。
【００５３】
本発明の製造方法で用いられるグアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化する酵素は、上記したＣ１０Ｇ００６９又はＣ１０Ｇ００９３の理化学的性質を有するものであれば特に限定されず、例えば、配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列を有する、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化する酵素が挙げられる。
【００５４】
このような酵素としては、例えば、配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列を含むグアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化する酵素や配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むグアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化する酵素が挙げられる。
【００５５】
ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加」における「１から数個」の範囲は、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化する作用を示す範囲であれば特に限定されないが、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、好ましくは１、２、３、４又は５程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落若しくは消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていること、及び「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が付け加えられていることをそれぞれ意味する。
【００５６】
「１から数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加」の具体的な態様としては、１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えらた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００５７】
また、アミノ酸配列における「同一性」（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化する作用を示す範囲であれば特に限定されないが、例えば、配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列とアライメントした場合の配列間の同一性が９０％以上であり、好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、さらに好ましくは９８％以上であり、なおさらに好ましくは９９％以上である。アミノ酸配列の同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られる方法を利用して、配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と対象となるアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を計算することにより求められる。
【００５８】
Ｃ１０Ｇ００６９又はＣ１０Ｇ００９３の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥで３４ｋＤａである。なお、本明細書では、分子量は大腸菌組換えタンパク質についての分子量を表わす。そこで、配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列を有する、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化する酵素の分子量は、Ｃ１０Ｇ００６９又はＣ１０Ｇ００９３の分子量と近似する分子量であり、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、３０〜４０ｋＤａであることが好ましく、３２〜３６ｋＤａであることがより好ましく、３３〜３５ｋＤａであることがさらに好ましく、３４ｋＤａ付近であることがなおさらに好ましい。
【００５９】
グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化する酵素を取得する方法は限定されず、例えば、Ｃ１０Ｇ００６９又はＣ１０Ｇ００９３の酵素作用、基質（光学異性体）特異性、理化学的性質、分子量などを指標として、ノボスフィンゴビウム属微生物、例えば、深海（水面下２００ｍ以下の海）において、腐食が進んだ針葉樹沈木に生息するノボスフィンゴビウム属微生物を培養した培養上清中の酵素活性を調べるといったスクリーニング法を挙げることができる。また、例えば、配列表の配列番号１又は２の記載を参照して、物理化学的に合成してもよいし、遺伝子工学的に配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子から作成してもよい。なお、配列表の配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子は、それぞれ配列表の配列番号７及び８に記載したものである。
【００６０】
１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンのβ位の炭素原子におけるアリールグリセロール−β−アリールエーテル型結合を還元的に切断し得る酵素は、上記した作用を有するノボスフィンゴビウム属微生物に由来する酵素であれば特に限定されないが、例えば、Ｇｓｔ並びにＮ末端側にＰＲＫ１５１１３及びｍａｉＡのマルチドメインを有する、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅが挙げられる。また、該ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの具体的な例は、配列表の配列番号３に記載のＣ１０Ｇ００７６及び配列表の配列番号４に記載のＣ１０Ｇ００７７である。Ｇｓｔは、ＰＳＳＭ−Ｉｄが２２２３６９８である、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅによく見出されるアミノ酸配列である。ＰＲＫ１５１１３は、ＰＳＳＭ−Ｉｄが１８５０６８である、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌによく見出されるアミノ酸配列である。ｍａｉＡは、ＰＳＳＭ−Ｉｄが２３３３３３である、ｍａｌｅｙｌａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ中によく見出されるアミノ酸配列である。ＧｓｔのＥ−ｖａｌｕｅは、Ｃ１０Ｇ００７６に対して４．２１ｅ−３８であり、Ｃ１０Ｇ００７７に対して６．３５ｅ−１１である。ＰＲＫ１５１１３のＥ−ｖａｌｕｅは、Ｃ１０Ｇ００７６に対して３．１０ｅ−１６であり、Ｃ１０Ｇ００７７に対して４．５８ｅ−０３である。ｍａｉＡのＥ−ｖａｌｕｅは、Ｃ１０Ｇ００７６に対して８．０１ｅ−１７であり、Ｃ１０Ｇ００７７に対して１．０１ｅ−０５である。Ｃ１０Ｇ００７６は１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンのβＳ体に作用し、Ｃ１０Ｇ００７７は１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンのβＲ体に作用する。なお、配列表の配列番号３及び４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子は、それぞれ配列表の配列番号９及び１０に記載したものである。
【００６１】
β位の炭素原子に還元部位を有する３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンの該還元部位を脱離し得る酵素は、上記した作用を有するノボスフィンゴビウム属微生物に由来する酵素であれば特に限定されないが、例えば、Ｇｓｔ及びＮ末端側にＰＲＫ１０３８７及びｍａｉＡのマルチドメインを有する、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅやＧｓｔ、ＰＲＫ１１７５２、ＰＲＫ１５１１３及びｍａｉＡのマルチドメインを有する、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅが挙げられる。また、Ｇｓｔ及びＮ末端側にＰＲＫ１０３８７及びｍａｉＡのマルチドメインを有する、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの具体的な例は、配列表の配列番号５に記載のＣ１０Ｇ００７８である。Ｇｓｔ、ＰＲＫ１１７５２、ＰＲＫ１５１１３及びｍａｉＡのマルチドメインを有する、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの具体的な例は、配列表の配列番号６に記載のＣ１０Ｇ００７５である。ＰＲＫ１０３８７は、ＰＳＳＭ−Ｉｄが２３６６７９である、ｇｌｕｔａｒｅｄｏｘｉｎ２；Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ中によく見出されるアミノ酸配列である。ＰＲＫ１１７５２は、ＰＳＳＭ−Ｉｄが１８３２９８である、ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ中によく見出されるアミノ酸配列である。ＧｓｔのＥ−ｖａｌｕｅは、Ｃ１０Ｇ００７８に対して２．２６ｅ−１４であり、Ｃ１０Ｇ００７５に対して５．０８ｅ−４４である。ｍａｉＡのＥ−ｖａｌｕｅは、Ｃ１０Ｇ００７８に対して９．２５ｅ−０３であり、Ｃ１０Ｇ００７５に対して４．７３ｅ−０９である。ＰＲＫ１０３８７のＥ−ｖａｌｕｅは、Ｃ１０Ｇ００７８に対して０．０２である。ＰＲＫ１１７５２のＥ−ｖａｌｕｅは、Ｃ１０Ｇ００７５に対して５．４１ｅ−５２である。ＰＲＫ１５１１３のＥ−ｖａｌｕｅは、Ｃ１０Ｇ００７５に対して１．１１ｅ−１２である。Ｃ１０Ｇ００７８は１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンのβＳ体由来物に作用し、Ｃ１０Ｇ００７５は１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンのβＳ体由来物及びβＲ体由来物に作用する。なお、配列表の配列番号５及び６に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子は、それぞれ配列表の配列番号１１及び１２に記載したものである。
【００６２】
ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅであるＣ１０Ｇ００７６及びＣ１０Ｇ００７７は、還元型グルタチオンが共存した場合にβ−Ｏ−４結合のグルタチオン添加開裂の活性を触媒するが、還元型グルタチオンが存在しない場合には活性を示さない。また、Ｃ１０Ｇ００７８及びＣ１０Ｇ００７５は、還元型グルタチオンが共存した場合にβ位の炭素原子に付加したグルタチオンを脱離する活性を触媒するが、還元型グルタチオンが存在しない場合にはその活性を示さない。そこで、本発明の製造方法では、還元型グルタチオンの存在下で酵素反応を実施する。
【００６３】
リグニン含有バイオマスにノボスフィンゴビウム属微生物由来の酵素を作用させることにより、フェニルプロパン系化合物が得られる。ここで、「酵素を作用させる」とは、例えば、各酵素が有する、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化する作用、１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンのβ位の炭素原子におけるアリールグリセロール−β−アリールエーテル型結合を還元的に切断する作用、β位の炭素原子に還元部位を有する３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンの該還元部位を脱離する作用を発揮させることを意味する。
【００６４】
Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７７、Ｃ１０Ｇ００７８及びＣ１０Ｇ００７５は、上記したとおり、基質となる化合物の光学異性体によって使い分けられる。これらの酵素と作用する光学異性体との関係を模式化したものを図１とする。例えば、これらの酵素群の組み合わせとしては、以下の（１）〜（２１）の組み合わせが考えられる。
（１）Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００７６及びＣ１０Ｇ００７８
（２）Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００７６及びＣ１０Ｇ００７５
（３）Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７８及びＣ１０Ｇ００７５
（４）Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００７７及びＣ１０Ｇ００７５
（５）Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７６及びＣ１０Ｇ００７８
（６）Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７６及びＣ１０Ｇ００７５
（７）Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７８及びＣ１０Ｇ００７５
（８）Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７７及びＣ１０Ｇ００７５
（９）Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７７及びＣ１０Ｇ００７８
（１０）Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７７及びＣ１０Ｇ００７５
（１１）Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７７、Ｃ１０Ｇ００７８及びＣ１０Ｇ００７５
（１２）Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７７及びＣ１０Ｇ００７８
（１３）Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７７及びＣ１０Ｇ００７５
（１４）Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７７、Ｃ１０Ｇ００７８及びＣ１０Ｇ００７５
（１５）Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７６及びＣ１０Ｇ００７８
（１６）Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７６及びＣ１０Ｇ００７５
（１７）Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７８及びＣ１０Ｇ００７５
（１８）Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７７及びＣ１０Ｇ００７５
（１９）Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７７及びＣ１０Ｇ００７８
（２０）Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７７及びＣ１０Ｇ００７５
（２１）Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７７、Ｃ１０Ｇ００７８及びＣ１０Ｇ００７５
【００６５】
これらの酵素をリグニン含有バイオマスに作用させるに際して、例えば、これらの酵素の混合物を用いる場合は、Ｃ１０Ｇ００６９及びＣ１０Ｇ００９３を活性化するためのＮＡＤ及びＣ１０Ｇ００７６及びＣ１０Ｇ００７７を活性化するための還元型グルタチオンの存在下で、Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００９３、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７７、Ｃ１０Ｇ００７８及びＣ１０Ｇ００７５が活性を示すｐＨ及び温度に設定することが好ましい。また、これらの酵素を別々に用いてもよいし、ＮＡＤ及び還元型グルタチオンの添加タイミングを変えてもよい。例えば、ＮＡＤの存在下でリグニン含有バイオマスにＣ１０Ｇ００６９及びＣ１０Ｇ００９３を作用させた後、還元型グルタチオンの存在下でＣ１０Ｇ００７６及びＣ１０Ｇ００７７並びにＣ１０Ｇ００７８及びＣ１０Ｇ００７５を順次作用させてもよい。酵素の作用時にｐＨの変動を抑えるために、作用系内に緩衝剤を添加することが好ましい。
【００６６】
酵素を作用させる際のリグニン、リグニン関連物質、緩衝剤、酵素、ＮＡＤ、還元型グルタチオンなどの各成分の濃度や存在量は特に限定されず、適宜設定できる。また、リグニンやリグニン関連物質と酵素との接触頻度を高めるために、これらの混合物を撹拌や振とうなどしてもよい。作用時間はフェニルプロパン系化合物の生成が認められる時間であれば特に限定されず、例えば、数時間〜数日間であり、酵素の力価などによって適宜設定することができる。具体的には、１時間〜３６時間程度又はそれ以上の時間である。
【００６７】
作用系において生成されたフェニルプロパン系化合物は、特別な処理を加えることなくそのままの状態で使用することができるが、例えば、作用後に固相抽出法やクロマトグラム法などの通常知られる芳香族化合物を精製する手段を採用して精製したものとすることができ、さらに溶媒を留去し乾燥させれば固体状のものとして得られる。
【００６８】
本発明の製造方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した酵素作用工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。
【００６９】
本発明の製造方法の具体的態様は、例えば、以下のとおりである。
リグニン含有バイオマスをジオキサンや水などのリグニンを溶解するのに適した溶媒中に懸濁し、２０℃〜８０℃にて数時間〜数日間保温する。保温後の懸濁液から固形分を除去して、リグニン抽出液を得る。リグニン抽出液を乾固し、得られた乾固物を酢酸エチルやＤＭＦなどの有機溶媒又は含水有機溶媒に溶解してリグニン抽出物とする。リグニン抽出物；グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化する酵素；１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンのβ位の炭素原子におけるアリールグリセロール−β−アリールエーテル型結合を還元的に切断する酵素；β位の炭素原子に還元部位を有する３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンの該還元部位を脱離する酵素、緩衝剤、ＮＡＤ塩及び還元型グルタチオンを含む反応液を調製し、ｐＨ７〜１０、２０〜４０℃で、数時間〜数十時間反応させる。反応後の反応液から固相抽出法により精製し、不活性ガス下で乾固して、固体状のフェニルプロパン系化合物を得る。
【００７０】
本発明の製造方法によって得られたフェニルプロパン系化合物は、例えば、樹脂、接着剤、レジスト材料、医薬品などの原料又はその中間体として利用することができる。具体的には、本発明の製造方法によって３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンが得られる場合、該化合物は、１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１，３−プロパンジオールを経由して、医薬品、香料、食品材料などの原料として産業上有用なコニフェリルアルコールなどへと転換することができる。
【００７１】
本発明の別の側面によれば、リグニン及び／又はリグニン関連物質を含むバイオマスに、ＮＡＤの存在下で、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属微生物に由来する下記（１）の酵素を作用させることにより、カルボニルフェニル系化合物を得る工程を含む、カルボニルフェニル系化合物の製造方法が提供される。
（１）Ｒｏｓｓｍａｎｎ−ｆｏｌｄ  ＮＡＤ（Ｐ）（＋）結合タンパク質スーパーファミリーに属し、かつ、ＰＲＫ０６１９４のマルチドメインを有する、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化するＳｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
【００７２】
カルボニルフェニル系化合物の確認方法は、例えば、１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンのＨＰＬＣ分析条件を採用できる。具体的には、１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンは、例えば、逆相ＨＰＬＣにより、定性及び定量的に分析できる。逆相ＨＰＬＣの条件は、例えば、オクタデシルシリル基修飾シリカゲルカラム（ＯＤＳカラム）を用いて、溶離液Ａ（２ｍＭ  酢酸アンモニウム、０．０５％Ｖ／Ｖ  ギ酸）及び溶離液Ｂ（１００％Ｖ／Ｖ  メタノール）を用いて、カラム温度を４０℃、流速を１．２ｍｌ／ｍｉｎと設定して、溶離液Ａ  ９０％Ｖ／Ｖ及び溶離液Ｂ  １０％Ｖ／Ｖの混合液を１分間送液した後、溶離液Ｂを１０％Ｖ／Ｖ〜９５％Ｖ／Ｖのグラジェントで７分間送液する。この条件により、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンは、ＵＶ検出器（２７０ｎｍ）を用いることにより、保持時間６．５分付近のピークとして検出できる。１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンの標準品を用いれば、検量線法や内標準法などにより、定量することが可能である。
【００７３】
上記（１）の酵素の好ましい態様は、配列表の配列番号１に記載のＳｈｏｒｔ―ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｃ１０Ｇ００６９及び配列表の配列番号２に記載のＳｈｏｒｔ―ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｃ１０Ｇ００９３である。
【００７４】
また、本発明の別の側面によれば、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属微生物に由来する、Ｒｏｓｓｍａｎｎ−ｆｏｌｄ  ＮＡＤ（Ｐ）（＋）結合タンパク質スーパーファミリーに属し、かつ、ＰＲＫ０６１９４のマルチドメインを有する、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのＣα位の炭素原子を酸化するＳｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅが提供される。
【００７５】
本発明の酵素の好ましい態様は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認できる分子量が３４ｋＤａであり；最適ｐＨが８．５〜９．５であり；かつ、最適温度が１０〜１５℃であるＳｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認できる分子量が３４ｋＤａであり；最適ｐＨが８．５〜１０．５であり；かつ、最適温度が２５〜３０℃であるＳｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅである。
【００７６】
本発明の具体的態様は、配列表の配列番号１に記載のＳｈｏｒｔ―ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｃ１０Ｇ００６９、及び配列表の配列番号２に記載のＳｈｏｒｔ―ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｃ１０Ｇ００９３である。
【００７７】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例】
【００７８】
［実施例１．ＭＢＥＳ０４株遺伝子の検出］
５ｍＭ  硫酸マグネシウムを添加したＬＢ培地（ベクトンディッキンソン社製）に、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）  ＭＢＥＳ０４株を接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで２４時間振とう培養を行った。得られた培養液から８０００ｒｐｍ、５分間の遠心操作によりＭＢＥＳ０４株菌体を得た。
【００７９】
得られた菌体からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＰｌａｎｔＩＩ  Ｍｉｄｉキット（タカラバイオ社製）を用いて総ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを用いて、８ｋｂ長のメイトペアライブラリーを作成し、ゲノムシークエンサー  ＧＳ  ＦＬＸシステム（ロシュ・ダイアグノティクス社製）を用いて配列の解析を行った。配列解析の結果、リード数１４２，３８９、平均長４４１．６６ｂｐ  総塩基数６２，８８８，１６２の配列データに係る塩基配列を得た。
【００８０】
得られた塩基配列を解析ソフトウエアＮｅｗｂｌｅｒ  ２．６（ロシュ・ダイアグノティクス社製）を用いてアセンブルした結果、平均長６４３４．５ｂｐを持つ７８３個のコンティグが形成された。続いて、８ｋｂのメイトペアライブラリーの両端シーケンス情報から、各コンティグの配列を精査して得られたメイトペア情報に基づきＳｃａｆｆｏｌｄを生成させたところ、総塩基数５，５９６，３０６から成る３７個のＳｕｐｅｒＣｏｎｔｉｇが得られた。さらにサンガー法を用いてゲノム配列の一部を再解析し、ＳｕｐｅｒＣｏｎｔｉｇを３９個とした。得られた３９個のＳｕｐｅｒＣｏｎｔｉｇに含まれる全塩基配列を、ＧｅｎｅＭａｒｋＳ法（非特許文献４を参照）を用いて、３９個のＳｕｐｅｒＣｏｎｔｉｇに含まれる全塩基配列中にコードされる遺伝子領域、すなわちタンパク質をコードするオープンリーディングフレームに相当する領域を推定した。
【００８１】
［実施例２．リグニン分解酵素の探索］
ＳＹＫ−６株がリグニン二量体モデル化合物であるグアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテル（化合物Ｉ）を代謝する際の第一段階の反応、すなわち、化合物ＩのＣα位の炭素原子に結合するヒドロキシ基の酸化を触媒する酵素として、ＬｉｇＤ、ＬｉｇＬ、ＬｉｇＮ及びＬｉｇＯ（非特許文献５及び６を参照）並びにそれらをコードするｌｉｇＤ遺伝子(ＹＰ＿００４８３３９９８)、ｌｉｇＬ遺伝子（ＡＢ４９１２２１）、ｌｉｇＮ遺伝子（ＡＢ４９１２２２）及びｌｉｇＯ遺伝子（ＹＰ＿００４８３６７２０）が知られている。
【００８２】
そこで、実施例１により得られたＭＢＥＳ０４株のゲノム配列情報から検出された全遺伝子をクエリーとして、ＳＹＫ−６株由来のｌｉｇＤ遺伝子、ｌｉｇＬ遺伝子、ｌｉｇＮ遺伝子及びｌｉｇＯ遺伝子に相同性を示す遺伝子を、閾値：Ｃｏｖｅｒａｇｅ  ５０％＜；Ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ２５％＜；Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ５０％＜；及びＥ  ｖａｌｕｅ  ＜ｅ５に基づいてＢＬＡＳＴ相同性検索（ｂｌａｓｔ  ２．２.２６； Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を行った。
【００８３】
その結果、ＭＢＥＳ０４株のゲノム配列情報から、Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅとアノテーションされる配列を有するｃ０１ｇ１１６２遺伝子、ｃ０１ｇ１３２４遺伝子、ｃ１０ｇ００６９遺伝子、ｃ１０ｇ００８０遺伝子、ｃ１０ｇ００９３遺伝子及びｃ１０ｇ００９４遺伝子の計６つの遺伝子が見出された。
【００８４】
ＭＢＥＳ０４株由来の上記６遺伝子とＳＹＫ−６株由来のｌｉｇＤ、ｌｉｇＬ、ｌｉｇＮ及びｌｉｇＯとの相同性に関する情報を表１に示した。
【表１】
0005935225.tif 000010
【００８５】
ＭＢＥＳ０４株由来の６遺伝子：ｃ０１ｇ１１６２遺伝子、ｃ０１ｇ１３２４遺伝子、ｃ１０ｇ００６９遺伝子、ｃ１０ｇ００８０遺伝子、ｃ１０ｇ００９３遺伝子及びｃ１０ｇ００９４遺伝子の塩基配列をクエリーとして相同性検索（ＢＬＡＳＴｎ、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｎ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ、Ｃｏｖｅｒａｇｅ  ５０％＜）を行ったところ、最も配列一致性の高い遺伝子配列としてヒットしたものは、ｃ０１ｇ１１６２遺伝子に対しては７１％の一致性でパエニバシラス・スピーシーズ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ.）ＪＤＲ−２株のゲノム上（ＣＰ００１６５６.1）の４９３５５６２〜４９３６３００番の位置にあるｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅをコードすると推定される遺伝子；ｃ０１ｇ１３２４遺伝子に対しては７５％の一致性でノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.）ＰＰ１Ｙ株のゲノム上（ＦＲ８５６８６２．１）の１１５４５０９〜１１５５３３９番の位置にあるｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓeをコードすると推定される遺伝子；ｃ１０ｇ００６９遺伝子に対しては７８％の一致性でノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.）ＰＰ１Ｙ株のゲノム上（ＦＲ８５６８６２．１）の１２４１１３５〜１２４２０２８番の位置にあるｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓeをコードすると推定される遺伝子；ｃ１０ｇ００８０遺伝子に対しては７６％の一致性でノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.）ＰＰ１Ｙ株のゲノム上（ＦＲ８５６８６２．１）の１２５１６４５〜１２５２５４６番の位置にあるｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓeをコードすると推定される遺伝子；ｃ１０ｇ００９３遺伝子に対しては８０％の一致性でノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）ＤＳＭ  １２４４４株のゲノム上（ＣＰ０００２４８．１）の８４３２８８〜８４４１８０番の位置にあるｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓeをコードすると推定される遺伝子；ｃ１０ｇ００９４遺伝子に対しては７７％の一致性でノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.）ＰＰ１Ｙ株のゲノム上（ＦＲ８５６８６２．１）の１２６６１０３〜１２６６９７４番の位置にあるｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓeをコードすると推定される遺伝子であった。
【００８６】
上記６遺伝子のうち、ｃ１０ｇ００６９遺伝子及びｃ１０ｇ００９３遺伝子がコードするアミノ酸配列を用いてＤＥＬＴＡ−ＢＬＡＳＴサーチ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｄｏｍａｉｎ Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌｏｏｋｕｐ  Ｔｉｍｅ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ＢＬＡＳＴ）（ｈｔｔｐ：//ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｄｅｌｔａＢｌａｓｔ）を行った。その結果、上記２遺伝子がコードするタンパク質は、いずれもＲｏｓｓｍａｎｎ−ｆｏｌｄ  ＮＡＤ（Ｐ）（＋）結合タンパク質スーパーファミリーに属し、かつ、ＰＲＫ０６１９４のマルチドメインを有する、Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅであることがわかった（図２及び図３を参照）。
【００８７】
一方、ＳＹＫ−６株が化合物Ｉを代謝する際の第２段階の反応、すなわち、１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オン（化合物ＩＩ）のβ−Ｏ−４位のエーテル結合を開裂させる反応を触媒する酵素として、ｌｉｇＦ遺伝子（ＹＰ＿００４８３３９９７）（非特許文献７を参照）及びｌｉｇＥ遺伝子（ＹＰ＿００４８３３９９８）（非特許文献８を参照）が知られている。また、上記第２段階の反応で生じたグルタチオン含有中間体からグルタチオンを除去する第３段階の反応を触媒する酵素として、ｌｉｇＧ遺伝子（ＹＰ＿００４８３３９９９）（非特許文献９を参照）が知られている。
【００８８】
そこで、実施例１により検出されたＭＢＥＳ０４株のゲノム配列情報をクエリーとして、ＳＹＫ−６株由来のｌｉｇＥ遺伝子、ｌｉｇＦ遺伝子及びｌｉｇＧ遺伝子に相同性を示す遺伝子を、Ｃｏｖｅｒａｇｅ  ５０％＜、Ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ２５％＜、Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ５０％＜、 Ｅ  ｖａｌｕｅ  ＜ｅ５を閾値としてＢＬＡＳＴ相同性検索した。その結果、ｃ１０ｇ００７６遺伝子がｌｉｇＦに６８％、ｃ１０ｇ００７７遺伝子がｌｉｇＥに８０％、及びｃ１０ｇ００７８遺伝子がｌｉｇＧに７１％のＩｄｅｎｔｉｔｙ（一致性）を示すことがわかった。
【００８９】
ＭＢＥＳ０４株由来の３遺伝子：ｃ１０ｇ００７６遺伝子、ｃ１０ｇ００７７遺伝子及びｃ１０ｇ００７８遺伝子の塩基配列をクエリーとしてＢＬＡＳＴｎ相同性検索（Ｃｏｖｅｒａｇｅ  ５０％＜）を行ったところ、最も一致性の高い遺伝子配列としてヒットしたものは、ｃ１０ｇ００７６遺伝子に対しては８２％の一致性でノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.）ＰＰ１Ｙ株のゲノム上（ＦＲ８５６８６２．１）の１２４７６５５〜１２４８３８１番の位置にあるｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ様タンパク質をコードすると推定される遺伝子；ｃ１０ｇ００７８遺伝子に対しては８０％の一致性でノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.）ＰＰ１Ｙ株のゲノム上（ＦＲ８５６８６２．１）の１２４８４５１〜１２４９１９８番の位置にあるｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ様タンパク質をコードすると推定される遺伝子；ｃ１０ｇ００７９遺伝子に対しては７８％の一致性でノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.）ＰＰ１Ｙ株のゲノム上（ＦＲ８５６８６２．１）の１２４９３２５〜１２５００６４番の位置にあるｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅファミリータンパク質をコードすると推定される遺伝子であった。
【００９０】
また、ｃ１０ｇ００７６遺伝子、ｃ１０ｇ００７７遺伝子及びｃ１０ｇ００７８遺伝子がコードするアミノ酸配列を用いてＤＥＬＴＡ−ＢＬＡＳＴサーチ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｄｏｍａｉｎ Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌｏｏｋｕｐ  Ｔｉｍｅ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ＢＬＡＳＴ）（ｈｔｔｐ：//ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｄｅｌｔａＢｌａｓｔ）を行った（図４〜６を参照）。その結果、上記３遺伝子がコードするアミノ酸配列は、いずれもＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅと推定されるタンパク質に保存されているマルチドメインであるＧｓｔ（ＣＯＧ０６２５）配列を有することが示唆された。また、ｃ１０ｇ００７６遺伝子及びｃ１０ｇ００７７遺伝子がコードするアミノ酸配列は、Ｎ末端側にＰＲＫ１５１１３及びｍａｉＡのマルチドメインを有することがわかった。さらに、ｃ１０ｇ００７８遺伝子がコードするアミノ酸配列は、Ｎ末端側にＰＲＫ１０３８７及びｍａｉＡのマルチドメインを有することがわかった。
【００９１】
ｃ１０ｇ００７６遺伝子、ｃ１０ｇ００７７遺伝子及びｃ１０ｇ００７８遺伝子は、互いに近接した遺伝子である。さらにｃ１０ｇ００７６遺伝子に隣接したｃ１０ｇ００７５遺伝子は、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅと推定されるタンパク質を、ｃ１０ｇ００７６遺伝子、ｃ１０ｇ００７７遺伝子及びｃ１０ｇ００７８遺伝子の３遺伝子がコードする向きとは反対向きにコードするものであった。ｃ１０ｇ００７５遺伝子の塩基配列をクエリーとしてＢＬＡＳＴｎ検索（Ｃｏｖｅｒａｇｅ５０％＜）を行ったところ、最も一致性の高い遺伝子配列としてヒットしたものは、７９％の一致性でノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ.）ＰＰ１Ｙ株のゲノム上（ＦＲ８５６８６２．１）の１２４６７４２〜１２４７３７１番の位置にあるｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードすると推定される遺伝子であった。また、このｃ１０ｇ００７５遺伝子がコードするアミノ酸配列をクエリーとしてＤＥＬＴＡ−ＢＬＡＳＴサーチを行ったところ、ｃ１０ｇ００７５遺伝子がコードするタンパク質は、Ｇｓｔ、ＰＲＫ１１７５２、ＰＲＫ１５１１３及びｍａｉＡといった、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅと推定されるタンパク質に保存されたマルチドメイン配列を有していることが示唆された（図７を参照）。
【００９２】
［実施例３．形質転換体を利用した酵素生産］
Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅとアノテーションされるＭＢＥＳ０４株由来のｃ０１ｇ１１６２遺伝子、ｃ０１ｇ１３２４遺伝子、ｃ１０ｇ００６９遺伝子、ｃ１０ｇ００８０遺伝子、ｃ１０ｇ００９３遺伝子及びｃ１０ｇ００９４遺伝子の６遺伝子にコードされる各タンパク質；並びに、ｃ１０ｇ００７５遺伝子、ｃ１０ｇ００７６遺伝子、ｃ１０ｇ００７７遺伝子及びｃ１０ｇ００７８遺伝子の４遺伝子にコードされる各タンパク質が化合物Ｉの代謝に関与することを確認するために、大腸菌を宿主として、これらの遺伝子がコードするタンパク質を組換え生産する形質転換体を作製した。
【００９３】
ここで、ｃ０１ｇ１１６２遺伝子、ｃ０１ｇ１３２４遺伝子、ｃ１０ｇ００６９遺伝子、ｃ１０ｇ００８０遺伝子、ｃ１０ｇ００９３遺伝子及びｃ１０ｇ００９４遺伝子の６遺伝子にコードされる各タンパク質をＣ０１Ｇ１１６２、Ｃ０１Ｇ１３２４、Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００８０、Ｃ１０Ｇ００９３及びＣ１０Ｇ００９４と表記し；並びに、ｃ１０ｇ００７５遺伝子、ｃ１０ｇ００７６遺伝子、ｃ１０ｇ００７７遺伝子及びｃ１０ｇ００７８遺伝子の４遺伝子にコードされる各タンパク質をＣ１０Ｇ００７５、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７７及びＣ１０Ｇ００７８と表記することにした。
【００９４】
プラスミドｐＲＳＥＴＡ（インビトロジェン社製）を鋳型とし表２に示すプライマーＡとＢを用いてＰＣＲ反応を行った。一方、表２に示すプライマーセット（ＣとＤ、ＥとＦ、ＧとＨ、ＩとＪ、ＫとＬ、ＭとＮ、ＯとＰ、ＱとＲ、ＳとＴ、及びＵとＶ）を用いて、ＭＢＥＳ０４株のゲノムＤＮＡを鋳型として下記に示す条件に従ってＰＣＲ反応を行い、上記各遺伝子断片を増幅したｃＤＮＡを得た。
【表２】
0005935225.tif 000011
【００９５】
ＰＣＲ条件
１× ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ （ＭｇＣｌ２含有）２００ μｍ ｄＮＴＰｓ, ０．６ μｍ ２７ｆ, ０.６ μｍ １５２５ｒ, １．４ Ｕ ｏｆ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ (ポリメラーゼタカラバイオ社製)
サーマルサイクラー温度条件９７℃ ２分、［９７℃３０秒、６０℃１分、７２℃９０秒］×３０サイクル、７２℃ ５分 
【００９６】
表２に示すプライマーセットを用いたＰＣＲ反応により増幅された、ｐＲＳＥＴＡを鋳型として得られたＤＮＡ断片とＭＢＥＳ０４株のゲノムＤＮＡを鋳型として得られたＤＮＡ断片の各１種とを混合し、次いでＩｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤクローニングキット（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドを、遺伝子毎に、大腸菌（Ｓｔｅｌｌaｒ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）に導入することにより、形質転換した。
【００９７】
得られた形質転換体からプラスミドを調製し、プラスミド上の連結断片の塩基配列がＭＢＥＳ０４株のゲノム上の遺伝子配列と完全に一致することを配列解析により確認した。塩基配列解析はＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ、ｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）ＡＢＩ  ３７３０  ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。続いて調製した各プラスミドを用いて、ＢＬ２１ＤＥ３ｐＬｙｓＥ（ライフテクノロジー社製）を形質転換した。各形質転換体を用いて組換え酵素を生産させ、得られた組換え酵素をＮｉ−アガロース担体を用いて精製した。
【００９８】
［実施例４．化合物Ｉ分解酵素の同定］
化合物Ｉの合成は、非特許文献１０に記載の方法に準じて行った。得られた合成物のＮＭＲスペクトルは、ＵＳＤＡ（ＵＳ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）が公開している、化合物Ｉのデータと一致した。また、化合物ＩのＨＰＬＣ分析は、株式会社ダイセル製のキラルパックＩＥ３を用いて、以下のとおりに、（１）αＳ、βＲ、（２）αＲ、βＳのｅｒｉｔｈｒｏ体；（３）αＲ、βＲ、（４）αＳ、βＳのｔｈｒｅｏ体の順で溶出する条件で行った。
【００９９】
キラルＨＰＬＣ分析条件（化合物Ｉの光学異性体分析条件）
カラム；キラルパックＩＥ−３（ダイセル社製）、４．６ ｍｍ Ｉ.ｄ. ｘ ２５０ ｍｍ Ｌ.溶離液；（Ａ）水、（Ｂ）アセトニトリル、送液：２０％Ｖ／Ｖ（Ｂ）、カラム温度；４０℃、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出  フォトダイオードアレイ検出器 ＵＶ２００-５００ｎｍ（ＰＤＡ  モデル２９９８、ウォーターズ製）及び旋光度検出器（キラライザー、システムエンジニアリング社製）
【０１００】
得られた化合物Ｉは、この条件で、ｅｒｉｔｈｒｏ体：ｔｈｒｅｏ体≒３：１であった。なお、上記のＲＳ表示は、非特許文献１１に記載の旋光度データを参考に決定した。
【０１０１】
化合物Ｉを終濃度５ｍＭ、ＮＡＤ＋（ナトリウム塩の形で添加）を終濃度１０ｍＭになるようにトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加した。次いで、この溶液に、実施例３で得られた精製済のＣ０１Ｇ１１６２、Ｃ０１Ｇ１３２４、Ｃ１０Ｇ００６９、Ｃ１０Ｇ００８０、Ｃ１０Ｇ００９３及びＣ１０Ｇ００９４を各一種ずつ添加し、室温で１６時間インキュベートして、反応液を得た。その後、下記条件で反応液中の化合物Ｉの変化をＨＰＬＣ分析した。
【０１０２】
逆相ＨＰＬＣ条件
カラム；Ｘｂｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８（ウォーターズ製）、４．６ｍｍ−Ｉ．ｄ．×１００ｍｍ−Ｌ．溶離液；（Ａ）［２ｍＭ  酢酸アンモニウム、０．０５％Ｖ／Ｖ  ギ酸］、（Ｂ）メタノール、送液；０−１ｍｉｎ  １０％Ｖ／Ｖ（Ｂ）、１−８ｍｉｎ  １０％Ｖ／Ｖ−９０％Ｖ／Ｖ（Ｂ）、カラム温度；４０℃、流速；１．２ｍｌ／ｍｉｎ、検出；フォトダイオードアレイ検出器  ＵＶ２００−５００ｎｍ（ＰＤＡ  モデル２９９８、ウォーターズ製）
【０１０３】
反応液のＨＰＬＣ分析の結果、Ｃ１０Ｇ００６９又はＣ１０Ｇ００９３を作用させた場合にのみ、化合物Ｉが減少し、新たな化合物が生成されていることが分かった。
【０１０４】
ここで生成した化合物を同定するために、反応液を固相抽出法（ＯＡＳＩＳ ＷＡＸ ；ウォーターズ社製）にて精製し、以下の条件で逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析（ＡＣＣＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ―Ｃｌａｓｓ, ＸｅｖoＧ２  ＱＴＯＦ,ウォーターズ社製）に供した。
【０１０５】
逆相ＨＰＬＣ条件（逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析条件）
カラム；ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  Ｃｏｌｕｍｎ，１３０オングストローム，  １．７  μｍ、（ウォーターズ製）、２．１  ｍｍ  Ｉ．ｄ．×１００  ｍｍ  Ｌ．溶離液；（Ａ）［２ｍＭ  酢酸アンモニウム、０．０５％Ｖ／Ｖ  ギ酸］、（Ｂ）９５％Ｖ／Ｖ  アセトニトリル、送液：０−５分  ５％Ｖ／Ｖ−９５％Ｖ／Ｖ（Ｂ）、５−７分  ９５％Ｖ／Ｖ（Ｂ）、カラム温度；４０℃、流速；０．４ｍｌ／ｍｉｎ
【０１０６】
質量分析条件（逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析条件）
検出質量範囲１００―１０００  Ｄａ、データ取得スキャン間隔０．１秒、デソルベーションガス温度  ５００℃、イオンソース  ＥＳＩネガティブモード  イオンソース温度１５０℃、コーン電圧３０Ｖ
【０１０７】
逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析の結果、生成化合物の分子量は３１８であり、推定組成式はＣ１７Ｈ１８Ｏ６であることがわかった。化合物ＩのＭＳスペクトルと生成化合物のＭＳスペクトルとを比較した結果、生成化合物は化合物ＩのＣα位で脱水素反応が起こり、アルコール残基（ヒドロキシ基）がカルボニル基へと変化した化合物ＩＩであることが推定された。
【０１０８】
［実施例５．化合物Ｉ分解酵素の特性］
化合物ＩＩの合成は、非特許文献１０に記載の方法に準じて行った。また、化合物ＩＩのＨＰＬＣ分析は、株式会社ダイセル製のキラルパックＩＥ３を用いて、以下のとおりに、（１）βＲ体、（２）βＳ体の順で溶出する条件で行った。
【０１０９】
キラルＨＰＬＣ分析条件（化合物ＩＩの光学異性体分析条件）
カラム；キラルパックＩＥ−３（ダイセル社製）、４．６  ｍｍ  Ｉ．ｄ．×２５０  ｍｍ  Ｌ．溶離液；（Ａ）水、（Ｂ）アセトニトリル、送液：３０％Ｖ／Ｖ（Ｂ）、カラム温度；４０℃、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出  フォトダイオードアレイ検出器  ＵＶ２００−５００ｎｍ（ＰＤＡ  モデル２９９８、ウォーターズ製）及びキラライザー（システムエンジニアリング社製）
【０１１０】
合成した化合物ＩＩは、この条件で、βＲ体：βＳ体≒１：１であった。なお、上記のＲＳ表示は、非特許文献１１に記載の旋光度データを参考に決定した。
【０１１１】
合成した化合物ＩＩを実施例４に記載の条件で、逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析に供したところ、化合物ＩにＣ１０Ｇ００６９及びＣ１０Ｇ００９３を作用させた場合に得られた化合物Ｉ分解物と良く一致するマスクロマト及びスペクトルを得た。このことより、Ｃ１０Ｇ００６９及びＣ１０Ｇ００９３は化合物ＩのＣα位のヒドロキシ基を酸化し、カルボニル基へと変化させるデヒドロゲナーゼ活性を持つタンパク質であることが分かった。
【０１１２】
化合物ＩにＣ１０Ｇ００６９が作用する場合の反応条件を調べた。Ｃ１０Ｇ００６９はＮＡＤ＋が共存した場合に、Ｃα位のヒドロキシ基を酸化した。しかし、ＮＡＤ＋が存在しないときには活性を示さなかった。またＮＡＤＨ存在下では、化合物ＩのＣα位のヒドロキシ基を酸化しなかったが、化合物ＩＩのカルボニル残基を還元して、ヒドロキシ基を与えた。ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ存在下では活性を示さなかった。分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥで３４ｋＤａであることが示された。また、１０ｍｇ／ｌ  Ｃ１０Ｇ００６９、１０ｍＭ  化合物Ｉ、２０ｍＭ  ＮＡＤナトリウム及び５０ｍＭ  （ｐＨ９．２）Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ＮａＯＨ（ＣＨＥＳ）緩衝液（ｐＨ９．５）を含む反応液（１００μｌ）を、５〜４５℃の温度で３０分間反応させることによってＣ１０Ｇ００６９の最適温度を評価した。その結果、図８に示すとおり、最適温度は１０〜１５℃付近であった。さらに、１０ｍｇ／ｌ  Ｃ１０Ｇ００６９、１０ｍＭ  化合物Ｉ、２０ｍＭ  ＮＡＤナトリウム及びｐＨ６．０〜１０．４に調製した５０ｍＭ  緩衝液（ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ及びＣＡＰＳ）を含む反応液（１００μｌ）を、１５℃で３０分間反応させることによってＣ１０Ｇ００６９の最適ｐＨを評価した。その結果、図９に示すとおり、最適ｐＨは８．５〜９．５付近であった。なお、最適温度及び最適ｐＨは、反応後の反応液中に生成した化合物ＩＩの濃度を実施例４に記載の条件の逆相ＨＰＬＣにより分析した値に基づく。
【０１１３】
化合物ＩにＣ１０Ｇ００９３Ｃが作用する場合の反応条件を調べた。Ｃ１０Ｇ００９３はＮＡＤ＋が共存した場合に、Ｃα位のヒドロキシ基を酸化したが、ＮＡＤ＋が存在しないときには活性を示さなかった。またＮＡＤＨ存在下では、化合物ＩのＣα位のヒドロキシ基を酸化しなかったが、化合物ＩＩのカルボニル残基を還元してヒドロキシ基を与えた。ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ存在下でも活性を示さなかった。分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥで３４ｋＤａであることが示された。また、５ｍｇ／ｌ  Ｃ１０Ｇ００９３、１０ｍＭ  化合物Ｉ、２０ｍＭ  ＮＡＤナトリウム及び５０ｍＭ  （ｐＨ９．２）ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．５）を含む反応液（１００μｌ）を、５〜４５℃の温度で３０分間反応させることによってＣ１０Ｇ００６９の最適温度を評価した。その結果、図１０に示すとおり、最適温度は２５〜３０℃付近であった。さらに、５ｍｇ／ｌ  Ｃ１０Ｇ００９３、１０ｍＭ  化合物Ｉ及び２０ｍＭ  ＮＡＤナトリウム及びｐＨ６．０〜１０．４に調製した５０ｍＭ  緩衝液（ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ及びＣＡＰＳ）を含む反応液（１００μｌ）を、３０℃で３０分間反応させることによってＣ１０Ｇ００９３の最適ｐＨを評価した。その結果、図１１に示すとおり、最適ｐＨは８．５〜１０．５付近であった。なお、最適温度及び最適ｐＨは、反応後の反応液中に生成した化合物ＩＩの濃度を実施例４に記載の条件の逆相ＨＰＬＣにより分析した値に基づく。
【０１１４】
化合物Ｉには、αＳ，βＲ（ＳＲ）；αＲ，βＳ（ＲＳ）；αＲ，βＲ（ＲＲ）；αＳ，βＳ（ＳＳ）という４種類の光学異性体が存在する。これらのうち、Ｃ１０Ｇ００６９及びＣ１０Ｇ００９３が基質として作用する化合物Ｉの光学異性体を調べるために、反応の前後に起こる化合物Ｉの光学異性体組成の変化及び産物である化合物ＩＩの光学異性体組成を、以下に示す条件でキラルＨＰＬＣ分析することとした。
【０１１５】
キラルＨＰＬＣ分析条件
カラム；キラルパックＩＥ−３（ダイセル社製）、４．６  ｍｍ  Ｉ．ｄ．×２５０  ｍｍ  Ｌ．溶離液；（Ａ）水、（Ｂ）アセトニトリル、送液：０−１０分  ２０％Ｖ／Ｖ（Ｂ）、１０−１５分  ２０−３０％Ｖ／Ｖ（Ｂ）、１５−３０分  ３０％Ｖ／Ｖ（Ｂ）、カラム温度；４０℃、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出  フォトダイオードアレイ検出器  ＵＶ２００−５００ｎｍ（ＰＤＡ  モデル２９９８、ウォーターズ製）及びキラライザー（システムエンジニアリング社製）
【０１１６】
キラルＨＰＬＣ分析の結果、Ｃ１０Ｇ００６９は、化合物ＩのＲＳ及びＲＲの２つの光学異性体に特異的に反応すること；Ｃ１０Ｇ００９３はＳＲ及びＳＳの２つの光学異性体に特異的に反応することがわかった。
【０１１７】
また、化合物ＩＩをＮＡＤＨ存在下で還元する際に生じる化合物Ｉの光学異性体の大部分（感度補正無のＨＰＬＣクロマト面積値で、＞９０％の光学純度）は、Ｃ１０Ｇ００６９の場合にはαＲ体であり、ＳＣ１０Ｇ００９３の場合にはαＳ体であった。
【０１１８】
［実施例６．化合物ＩＩ分解酵素の同定］
化合物Ｉ又は化合物ＩＩを終濃度５ｍＭ、還元型グルタチオンを終濃度１０ｍＭになるように、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、次いで実施例３で得られた精製済のＣ１０Ｇ００７５、Ｃ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７７及びＣ１０Ｇ００７８をタンパク質毎に添加し、室温で１６時間インキュベートして反応液を得た。その後、実施例４に記載の条件で反応液中の化合物Ｉ又は化合物ＩＩの変化を逆相ＨＰＬＣで分析した。
【０１１９】
その結果、化合物Ｉは変化しなかったが、化合物ＩＩはＣ１０Ｇ００７６又はＣ１０Ｇ００７７と反応させた場合にのみ、別の２つの化合物へ変化することがわかった。逆相ＨＰＬＣ分析では、化合物ＩＩから生じた一方の物質はグアヤコールであることが、グアヤコール標準品とのリテンションタイム及びＵＶ吸収スペクトルとの比較からわかった。反応後に生じた他方の化合物の構造を推定するために、反応液を、固相抽出法（ＯＡＳＩＳ ＷＡＸ ；ウォーターズ社製）にて精製した後に、実施例４に記載の条件で逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析に供した。
【０１２０】
逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析（ネガティブモード）の結果、Ｃ１０Ｇ００７６又はＣ１０Ｇ００７７と化合物ＩＩとの反応によって生じた物質から、ｍ/z５００．２のシグナルが得られた。これは、化合物ＩにＳＹＫ−６株のＬｉｇＥ及びＬｉｇＦを作用させたときに生じると報告されている３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノン（化合物ＩＩＩ）のグルタチオン付加体の分子量５０１．１からプロトンが１つ脱離した値にほぼ相当する。すなわち、Ｃ１０Ｇ００７６及びＣ１０Ｇ００７７は、ＳＹＫ−６株のＬｉｇＥ及びＬｉｇＦと同様に、化合物ＩＩのβ−Ｏ−４結合を切断する活性を持つと判断された。
【０１２１】
［実施例７．化合物ＩＩ分解酵素の分解特性］
化合物ＩＩにＣ１０Ｇ００７６が作用する場合の反応条件を調べた。Ｃ１０Ｇ００７６は、還元型グルタチオンが共存した場合にβ−Ｏ−４結合のグルタチオン添加開裂を触媒したが、還元型グルタチオンが存在しない場合には活性を示さなかった。分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥで３１ｋＤａであることが示された。また、５ｍｇ／ｌ  Ｃ１０Ｇ００７６、５ｍＭ  化合物ＩＩ、１０ｍＭ  還元型グルタチオン及び１００ｍＭ  （ｐＨ８．９）ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．５）を含む反応液（１００μｌ）を、１５〜４５℃の温度で３０分間反応させることによってＣ１０Ｇ００７６の最適温度を評価した。その結果、図１２に示すとおり、最適温度は３０〜３５℃付近であった。さらに、５ｍｇ／ｌ  Ｃ１０Ｇ００７６、５ｍＭ  化合物ＩＩ及び１０ｍＭ  還元型グルタチオン及びｐＨ５．６〜１０．４に調製した５０ｍＭ  緩衝液（ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ及びＣＡＰＳ）を含む反応液（１００μｌ）を、３０℃で３０分間反応させることによってＣ１０Ｇ００７６の最適ｐＨを評価した。その結果、図１３に示すとおり、最適ｐＨは８．５〜９．５付近であった。なお、最適温度及び最適ｐＨは、反応後の反応液中に生成したグアヤコールの濃度を実施例４に記載の条件（保持時間５．５分付近）の逆相ＨＰＬＣにより分析した値に基づく。
【０１２２】
化合物ＩＩにＣ１０Ｇ００７７が作用する場合の反応条件を調べた。Ｃ１０Ｇ００７７は、還元型グルタチオンが共存した場合にβ−Ｏ−４結合のグルタチオン添加開裂を触媒したが、還元型グルタチオンが存在しない場合には活性を示さなかった。分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥで３１ｋＤａであることが示された。また、５ｍｇ／ｌ  Ｃ１０Ｇ００７７、５ｍＭ  化合物ＩＩ、１０ｍＭ  還元型グルタチオン及び１００ｍＭ  （ｐＨ８．９）ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を含む反応液（１００μｌ）を、５〜３５℃の温度で３０分間反応させることによってＣ１０Ｇ００７７の最適温度を評価した。その結果、図１４に示すとおり、最適温度は２５〜３０℃付近であった。さらに、５ｍｇ／ｌ  Ｃ１０Ｇ００７７、５ｍＭ  化合物ＩＩ及び１０ｍＭ  還元型グルタチオン及びｐＨ５．６〜１０．４に調製した５０ｍＭ  緩衝液（ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ及びＣＡＰＳ）を含む反応液（１００μｌ）を、２０℃で３０分間反応させることによってＣ１０Ｇ００７７の最適ｐＨを評価した。その結果、図１５に示すとおり、最適ｐＨは７〜８付近であった。なお、最適温度及び最適ｐＨは、反応後の反応液中に生成したグアヤコールの濃度を実施例４に記載の条件の逆相ＨＰＬＣにより分析した値に基づく。
【０１２３】
化合物ＩＩには、βＲ体、βＳ体という２種類の光学異性体が存在する。これらのうち、Ｃ１０Ｇ００７６及びＣ１０Ｇ００７７が基質として作用する光学異性体を調べるために、反応の前後に起こる化合物ＩＩの光学異性体組成の変化を、キラルカラム  キラルパックＩＥ−３を用いてＨＰＬＣ分析した。その結果、Ｃ１０Ｇ００７６はβＳ体に選択的に作用し、Ｃ１０Ｇ００７７はβＲ体に選択的に作用することがわかった。
【０１２４】
また、Ｃ１０Ｇ００７６及びＣ１０Ｇ００７７が、化合物ＩＩの非フェノール性リグニンモデル２量体化合物に対する反応性を持つことを、ベラトリルグリセロール−β−グアイアシルエーテル（１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１，３−ジオール；化合物Ｖ)を用いて、以下のとおりに確認した。なお、通常のリグニンは非フェノール性の構成単位が多い。そこで、化合物Ｖを分解する活性を有するということは、その酵素は天然のリグニンを分解する活性を有する蓋然性がある。
【０１２５】
化合物Ｖの合成は、非特許文献１０及び非特許文献１２を参考にして、相関移動触媒を用いる代わりにＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を溶媒とし、ＨＣＨＯのアルドール反応条件をＫ２ＣＯ３−ＥｔＯＨ系で行うなどに改良した方法を用いた。生成物のＮＭＲスペクトルは、ＵＳＤＡが公開している化合物Ｖのデータと一致した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルで、β−プロトンの積分値を用いて計算したところ、ｅｒｉｔｈｒｏ体：ｔｈｒｅｏ体の比率は約１．１：１であった。
【０１２６】
Ｃ１０Ｇ００７６  ０．１μｇ、１ｍＭ  化合物Ｖ及び２ｍＭ  還元型グルタチオンを含む、１００ｍＭ（ｐＨ９．５）Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ＮａＯＨ（ＣＨＥＳ）緩衝液（ｐＨ９．５）及び１０％Ｖ／Ｖ  ＤＭＦの混合溶液を、３０℃にて１５分間反応させた。反応後の反応液を逆相ＨＰＬＣ分析に供したところ、化合物Ｖの減少とグアヤコールの生成が見られた。これにより、Ｃ１０Ｇ００７６が非フェノール性リグニンモデル２量体化合物に対する反応性を持つことが明らかとなった。非フェノール性リグニンモデル２量体化合物である化合物Ｖに対する反応の効率は、Ｃ１０Ｇ００７６を用いた場合、フェノール性のリグニンモデル２量体化合物である化合物ＩＩに対する反応効率の１６．２％に相当した。
【０１２７】
一方、Ｃ１０Ｇ００７７  １．０μｇ、１ｍＭ  化合物Ｖ及び２ｍＭ  還元型グルタチオンを含む、１００ｍＭ  ３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ＮａＯＨ（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ８．０）及び１０％Ｖ／Ｖ  ＤＭＦの混合液を、２０℃にて１５分間反応させた。反応後の反応液を逆相ＨＰＬＣ分析に供したところ、Ｃ１０Ｇ００７７を用いた場合も、化合物Ｖの減少とグアヤコールの生成が見られた。これにより、Ｃ１０Ｇ００７７が非フェノール性リグニンモデル２量体化合物に対する反応性を持つことが明らかとなった。非フェノール性リグニンモデル２量体化合物である化合物Ｖに対する反応の効率は、Ｃ１０Ｇ００７７を用いた場合、フェノール性のリグニンモデル２量体化合物である化合物ＩＩに対する反応効率の３８０％に相当した。
【０１２８】
［実施例８．化合物ＩＩＩ生成酵素の同定］
化合物ＩＩを基質として、実施例３で得られたＣ１０Ｇ００７５、Ｃ１０Ｇ００７６及びＣ１０Ｇ００７７の精製タンパク質；又はＣ１０Ｇ００７６、Ｃ１０Ｇ００７７及びＣ１０Ｇ００７８の精製タンパク質の組み合わせで反応させた。その結果、両方の組み合せの反応物から、化合物ＩＩＩが生成されたことがわかった。化合物ＩＩＩは化合物ＩをＭＢＥＳ０４株の培養液に添加した際に得られる代謝物（３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノン）と一致するリテンションタイムを示した。反応液を固相抽出法（ＯＡＳＩＳ ＷＡＸ ；ウォーターズ社製）にて精製し、実施例４に記載の条件で逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析に供したところ、化合物ＩＩＩの分析結果は、化合物Ｉを含む培地でＭＢＥＳ０４株を培養した際に得られた主生成物である３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンの分析結果とよく一致した。
【０１２９】
Ｃ１０Ｇ００７５及びＣ１０Ｇ００７８が基質として反応する化合物に光学異性体特異性があることを、実施例３で得られた精製酵素を以下のように組み合わせて、化合物ＩＩの変換反応を行うことによって確認した。酵素反応は、下記（１）〜（４）の組み合せ酵素（反応液１００μＬあたり、精製酵素Ｃ１０Ｇ００７５：０．５μｇ、精製酵素Ｃ１０Ｇ００７６：０．５μｇ、精製酵素Ｃ１０Ｇ００７７：０．５μｇ、精製酵素Ｃ１０Ｇ００７８：０．５μｇを使用）、１ｍＭ  化合物ＩＩ及び１０ｍＭ 還元型グルタチオンを含む、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ８．０）の混合溶液中で、室温にて１６時間反応させた。
（１）Ｃ１０Ｇ００７６（βＳ体を特異的に認識）＋Ｃ１０Ｇ００７５
（２）Ｃ１０Ｇ００７６（βＳ体を特異的に認識）＋Ｃ１０Ｇ００７８
（３）Ｃ１０Ｇ００７７（βＲ体を特異的に認識）＋Ｃ１０Ｇ００７５
（４）Ｃ１０Ｇ００７７（βＲ体を特異的に認識）＋Ｃ１０Ｇ００７８
【０１３０】
反応後の基質と生成物の変化をキラルＨＰＬＣ分析にて検出した。その結果、（１）、（２）及び（３）の組み合わせでは反応が進行し、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンの生成が見られた。しかし、（４）の組み合わせでは、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンの生成が見られなかった。したがって、Ｃ１０Ｇ００７８はβＳ体のみを特異的に認識するが、Ｃ１０Ｇ００７５はβＲ体及びβＳ体の２種の光学異性体の両方から３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンを生成できることがわかった。
【０１３１】
［実施例９．化合物ＩＩＩ生成酵素の分子量］
Ｃ１０Ｇ００７８の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥで３３ｋＤａであることが示された。Ｃ１０Ｇ００７８の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥで２７ｋＤａであることが示された。
【０１３２】
［実施例１０．化合物Ｉ分解酵素、化合物ＩＩ分解酵素及び化合物ＩＩＩ生成酵素を用いたリグニン分解（１）］
カシオガクズ抽出液からフェニルプロパン構造を有する化合物を以下の手順で製造した。
乾燥カシオガクズ粉末５０ｇをジオキサン３００ｍＬに懸濁し、室温で６日間浸漬した。得られた懸濁液からろ紙で固形分をろ過して除去し、ろ液を得た。ろ液をエバポレーターで減圧乾固し、カシジオキサン抽出物を得た。カシジオキサン抽出物が１０％Ｗ／Ｖ終濃度となるようにＤＭＦに溶解した。得られたカシオガクズ抽出液を用いて、以下の組成の反応液を作成し、室温で２４時間反応させた。
【０１３３】
反応液（０．１ｍＬ）組成（１）：
カシオガクズ抽出液  １/２０容量
(反応液に含まれる乾燥固形物の濃度は５．０ｍｇ／ｍＬ)
ＣＨＥＳ緩衝液  ｐＨ９．２  ５０ｍＭ
精製酵素Ｃ１０Ｇ００６９（タンパク質濃度：０．４１ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量（５μｌ）
精製酵素Ｃ１０Ｇ００９３（タンパク質濃度：０．１６ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量  
精製酵素Ｃ１０Ｇ００７６（タンパク質濃度：０．２９ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量  
精製酵素Ｃ１０Ｇ００７８（タンパク質濃度：０．１０ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量  
還元型グルタチオン  ５ｍＭ
ＮＡＤナトリウム塩  ５ｍＭ
【０１３４】
反応後、反応液５０μＬを固相抽出法（ＯＡＳＩＳ ＷＡＸ ；ウォーターズ社製）にて精製し、窒素ガス下にて乾固した。乾固後の残渣を、０．５ｍＬの２０％Ｖ／Ｖ  アセトニトリルに溶解し、実施例４に記載の条件で逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析に供した。
【０１３５】
逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析の結果、添加酵素の作用により、リテンションタイム２．４分にｍ／ｚ１９５．１のシグナルが得られた。本リテンションタイムとマスシグナルの値は、化合物ＩＩＩのそれらとよく一致した。その生成量は既知濃度の化合物ＩＩＩにおけるシグナル強度から１．１μｇ／ｍＬと算出された。またリテンションタイム２．５分にｍ／ｚ２２５．１のシグナルが得られた。その生成量は、既知濃度の化合物ＩＩＩにおけるシグナル強度で計算した場合、０．８μｇ／ｍＬであった。リテンションタイム２．４分におけるマススペクトルと２．５分におけるマススペクトルとを比較したところ、２．５分に検出された化合物（化合物ＩＶ）は化合物ＩＩＩ中の水素の１つがメトキシ基に置換された化合物であると予測された。
【０１３６】
［実施例１１．化合物Ｉ分解酵素、化合物ＩＩ分解酵素及び化合物ＩＩＩ生成酵素を用いたリグニン分解（２）］
実施例１０で調製したカシオガクズ抽出液を用いて、以下の組成の反応液を作成し、室温で１６時間反応させた。
【０１３７】
反応液（０．１ｍＬ）組成（２）：
カシオガクズ抽出液  １/２０容量
(反応液に含まれる乾燥固形物の濃度は５．０ｍｇ／ｍＬ)
ＴＡＰＳ緩衝液  ｐＨ８．５  １００ｍＭ
下記精製酵素のうち、いずれか表３に示す組み合わせ
精製酵素Ｃ１０Ｇ００６９（タンパク質濃度：０．４１ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量  
精製酵素Ｃ１０Ｇ００９３（タンパク質濃度：０．１６ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量
精製酵素Ｃ１０Ｇ００７６（タンパク質濃度：０．２９ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量
精製酵素Ｃ１０Ｇ００７７（タンパク質濃度：０．２８ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量
精製酵素Ｃ１０Ｇ００７５（タンパク質濃度：０．６２ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量
精製酵素Ｃ１０Ｇ００７８（タンパク質濃度：０．１０ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量
還元型グルタチオン  ５ｍＭ
ＮＡＤナトリウム塩  ５ｍＭ
【０１３８】
反応後、反応液５０μＬを固相抽出法（ＯＡＳＩＳ ＷＡＸ ；ウォーターズ社製）にて精製し、窒素ガス下にて乾固した。乾固後の残渣を、０．５ｍＬの２０％Ｖ／Ｖ  アセトニトリルに溶解し、実施例４に記載の条件で逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析に供した。
【０１３９】
逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析の結果、添加酵素の作用により、生成された化合物ＩＩＩの生成量を表３に示した。表３に示されるように、６種の酵素を添加した場合に化合物ＩＩＩが最も高い濃度で生成された。
【表３】
0005935225.tif 000012
【０１４０】
［実施例１２．化合物Ｉ分解酵素、化合物ＩＩ分解酵素及び化合物ＩＩＩ生成酵素を用いたリグニン分解（３）］
乾燥イナワラ粉末５０ｇを、ジオキサン３００ｍＬ及び水１５ｍＬの混合液に懸濁し、室温で６日間浸漬した。浸漬後、懸濁液からろ紙で不溶物をろ別し、ろ液を得た。ろ液をエバポレーターで減圧乾固、その後デシケーターにて乾燥させ、２．６５ｇの固形物を得た。固形物に酢酸エチル５０ｍｌ及び純水７０ｍＬを添加し、固形物を溶解させた。さらに固形物が１０％Ｗ/ＶとなるようにＤＭＦに溶解した。得られたイナワラ抽出物ＤＭＦ溶液を用いて、以下の組成の反応液を作成し、室温で２４時間反応させた。
【０１４１】
反応液（０．１ｍＬ）組成（３）：
イナワラ抽出物ＤＭＦ液  １/２０容量
(反応液に含まれる乾燥固形物の濃度は５．０ｍｇ／ｍＬ)
ＣＨＥＳ緩衝液  ｐＨ９．２  ５０ｍＭ
精製酵素Ｃ１０Ｇ００６９（タンパク質濃度：０．４１ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量  
精製酵素Ｃ１０Ｇ００９３（タンパク質濃度：０．１６ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量  
精製酵素Ｃ１０Ｇ００７５（タンパク質濃度：０．６２ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量  
精製酵素Ｃ１０Ｇ００７６（タンパク質濃度：０．２９ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量  
精製酵素Ｃ１０Ｇ００７７（タンパク質濃度：０．２８ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量  
還元型グルタチオン  ５ｍＭ
ＮＡＤナトリウム塩  ５ｍＭ
【０１４２】
反応後、反応液５０μＬを固相抽出法（ＯＡＳＩＳ ＷＡＸ ；ウォーターズ社製）にて精製し、窒素ガス下にて乾固した。乾固後の残渣を、０．５ｍＬの２０％Ｖ／Ｖ  アセトニトリルに溶解し、実施例４に記載の条件で逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析に供した。
【０１４３】
逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析の結果、添加酵素の作用により、化合物ＩＩＩ及び化合物ＩＶが生成されていることが確認された。その生成量はそれぞれ８．４μｇ／ｍＬ及び０．７μｇ／ｍＬであった。
【０１４４】
［実施例１３．化合物Ｉ分解酵素、化合物ＩＩ分解酵素及び化合物ＩＩＩ生成酵素を用いたリグニン分解（３）］
シイタケ廃菌床からのフェニルプロパン構造を有する化合物を以下の手順で製造した。乾燥シイタケ廃菌床粉末１０ｇをイオン交換水１００ｍＬに懸濁し、３時間室温で浸漬した。得られた懸濁液からろ紙で固形分をろ別し、ろ液（水洗液１）を得た。残渣をイソプロパノール１００ｍＬに懸濁し３時間室温で浸漬した。浸漬後、ろ紙で固形分をろ別し、ろ液（水洗後イソプロ液１）を得た。一方、乾燥シイタケ廃菌床粉末１０ｇを９０％Ｖ／Ｖ  イソプロパノール水溶液１００ｍＬに懸濁し、３時間室温で浸漬した。ろ紙で固形分をろ過別し、ろ液（９０％イソプロ液１）を得た。
【０１４５】
水洗液１、水洗後イソプロ液１及び９０％イソプロ液１を２５ｍＬずつ抜き取り、エバポレーターで４５℃に加温しながら、減圧乾固した。水洗液１、水洗後イソプロ液１及び９０％イソプロ液１から、それぞれ４６９、５５及び２４７ｍｇの固形物を得た。水洗液１から得られた固形物は水２ｍＬ（２３４.４ｍｇ/ｍＬ）に溶解し、水洗後イソプロ液１(２７．４ｍｇ／ｍＬ)及び９０％イソプロ液１（１２３.５ｍｇ/ｍＬ）から得られた固形物はそれぞれＤＭＦ２ｍＬに溶解した。これらの３種の溶解抽出物を用いて、以下の組成の反応液を作成し、室温で２４時間反応させた。
【０１４６】
反応液組成（４）：
シイタケ廃菌床抽出液（上記３種の抽出物の内のいずれか）  １/２０容量
(反応液に含まれる乾燥固形物の濃度は水洗液１を用いた場合１１．７ｍｇ／ｍＬ、水洗後イソプロ液１を用いた場合１．３７ｍｇ／ｍＬ、９０％イソプロ液１を用いた場合６．１８ｍｇ／ｍＬ)
ＣＨＥＳ緩衝液  ｐＨ９．２  ５０ｍＭ
精製酵素Ｃ１０Ｇ００６９（タンパク質濃度：０．４１ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量  
精製酵素Ｃ１０Ｇ００９３（タンパク質濃度：０．１６ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量
精製酵素Ｃ１０Ｇ００７５（タンパク質濃度：０．６２ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量  
精製酵素Ｃ１０Ｇ００７６（タンパク質濃度：０．２９ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量  
精製酵素Ｃ１０Ｇ００７７（タンパク質濃度：０．２８ｍｇ／ｍＬ）  １/２０容量  
還元型グルタチオン  ５ｍＭ
ＮＡＤナトリウム塩  ５ｍＭ
【０１４７】
反応後、反応液５０μＬを固相抽出法（ＯＡＳＩＳ ＷＡＸ ；ウォーターズ社製）にて精製し、窒素ガス下にて乾固した。乾固後の残渣を、０．５ｍＬの２０％Ｖ／Ｖ  アセトニトリルに溶解し、実施例４に記載の条件で逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析に供した。
【０１４８】
逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析の結果、添加酵素の作用により、化合物ＩＩＩが生成されていることが確認された。その生成量は水洗液１を用いた場合は１．１μｇ／ｍＬ、水洗後イソプロ液１を用いた場合は０．６８μｇ／ｍＬ、及び９０％イソプロ液１を用いた場合は１．３７μｇ／ｍＬであった。化合物ＩＶの生成量は水洗液１を用いた場合は０．６μｇ／ｍＬ、水洗後イソプロ液１を用いた場合は０．３μｇ／ｍＬ、及び９０％イソプロ液１を用いた場合は０．７μｇ／ｍＬであった。
【０１４９】
［参考文献］
上記した非特許文献４〜１２は以下のとおりである：
非特許文献４：Ｂｅｓｅｍｅｒ  Ｊら；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１、vol ２９、p２６０７
非特許文献５：Ｍａｓａｉ，Ｅ．，Ｓ．Ｋｕｂｏｔａ．Ｙ．Ｋａｔａｙａｍａ，Ｓ．Ｋａｗａｉ，Ｍ．Ｙａｍａｓａｋｉ，ａｎｄ  Ｎ．Ｍｏｒｏｈｏｓｈｉ．１９９３．Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：１６５５−１６５９．
非特許文献６：Ｓａｔｏ  Ｙ，Ｍｏｒｉｕｃｈｉ  Ｈ，Ｈｉｓｈｉｙａｍａ  Ｓ，Ｏｔｓｕｋａ  Ｙ，Ｏｓｈｉｍａ  Ｋ，Ｋａｓａｉ  Ｄ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｍ，Ｏｈａｒａ  Ｓ，Ｋａｔａｙａｍａ  Ｙ，Ｆｕｋｕｄａ  Ｍ，Ｍａｓａｉ  Ｅ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００９；７５（１６）：５１９５−２０１．
非特許文献７：Ｍａｓａｉ，Ｅ．，Ｙ．Ｋａｔａｙａｍａ，Ｓ．Ｋｕｂｏｔａ，Ｓ．Ｋａｗａｉ，  Ｍ．Ｙａｍａｓａｋｉ，ａｎｄ  Ｎ．Ｍｏｒｏｈｏｓｈｉ．１９９３．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３２３：１３５−１４０．
非特許文献８：Ｍａｓａｉ，Ｅ．，Ｙ．Ｋａｔａｙａｍａ，Ｓ．Ｋａｗａｉ，Ｓ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．Ｙａｍａｓａｋｉ，ａｎｄ  Ｎ．Ｍｏｒｏｈｏｓｈｉ．１９９１．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：７９５０−７９５５．
非特許文献９：Ｍａｓａｉ  Ｅ，Ｉｃｈｉｍｕｒａ  Ａ，Ｓａｔｏ  Ｙ，Ｍｉｙａｕｃｈｉ  Ｋ，Ｋａｔａｙａｍａ  Ｙ，Ｆｕｋｕｄａ  Ｍ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００３  Ｍａｒ；１８５（６）：１７６８−７５．
非特許文献１０：細谷ら：木材学会誌２６（２）１１８−２１、１９８０
非特許文献１１：Ｈｉｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ５３,８４２−８４５、２０１２
非特許文献１２：Ｋ.Ｉｔｏｈ： Ｍｏｋｕｚａｉ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ ｖｏｌ. ３８,Ｎｏ.６, ５７９−５８４（１９９２）
【０１５０】
配列表に記載の配列は以下のとおりである：
［配列番号１］Ｃ１０Ｇ００６９
MTQVKGRTAFITGGGSGVALGQAKVFARAGCKVAIADIRQDHLDEAMAWFEAENAKGANYEVMAVKLDITDREAYAKVADEVEAKLGPVELLFNTAGVSHFGAIQDATYDDWDWQIDVNLRGVINGVRTFVPRMIERGNGGHVVNTASMSAFVALKGTGIYCTTKMAVRGLTETLALDLEEHGIGVSLLCPGAVNTNIHEALLTRPKHLADTGYYQAGPEMFAHLKNVIECGMEPETLANHVLKAVEENQLYVLAYPEFRKPLEDIHARVMAALANPEDDPDYDRRVAHGVPGGEAKEEEKTA
［配列番号２］Ｃ１０Ｇ００９３
MQDLPGKTAFVTGGASGIGLGIAKALLGAGMNVAIADIRQDHLDDAAAELDGGDKVLALQLDVTDRAAFAAAADATEAKFGKIHILCNNAGVAVVGPTDMATFADWDWVMGVNVGGTINGIVTMLPRMLKHGEGGHIVNTASMSALVPAPGTTIYSSGKAAVTSMMECMRPELESRGIVCSAFCPGAVQSNIAEAGRTRPDALAETGYAEADKGRQAGGSFFHLYQTKEEVGERVLTGILNDELYILTHAEFLIGVQERGEATTAAVQVQLPENEEYKNTFGVLFRNSAITQEIDRQKALRAAQMSEAGVA
［配列番号３］Ｃ１０Ｇ００７６
MLTLYSFGPGANSLKPLLALYEKGLEFTPRFVDPTKFEHHEEWFKKINPRGQVPALDHDGNVITESTVICEYLEDAFPDAPRLRPTDPVQIAEMRVWTKWVDEYFCWCVSTIGWERGIGPMARALSDEEFEEKVKRIPIPEQQAKWRSARAGFPKEVLDEEMRKIRVSIDRLEKRLSESTWLAGEDYTLADICNFAIANGMEKGFDDIVNTAATPNLVAWIERINARPACIEMFAKSKSEFAARKPFAKSEEQAQA
［配列番号４］Ｃ１０Ｇ００７７
MAKDNRITLYDLQLASGCTISPFVWRTKYALAHKGFDMDIVPGGFTGIAERTGGRSERAPVIVDDGKWVLDSWKIAEYLDETYPDRPMLFEGPSMKVLTKFLDAWLWKTIIAPWFRCYILDYHDLSLPQDHAYVRESRETMFLGGQKLEDVQAGREDRLPHVPPLLEPLRQLLRDTPWLGGATPNYADYTALAIFLWTGSVCTTPPLTEDDPLRDWLDRGFDLYGGLGRHPGMHTLFGLKLREGDPEPFDRTGLGIEPAPVNQGSAEPATAS
［配列番号５］Ｃ１０Ｇ００７８
MYQIPGCPFSERVELLLDLKGLGDVLVDHEIDISKPRPDWLLKKTRGTTSLPALELENGETLKESMVIMRYIEDRFPEVPVARQDPYEHALEAMLCATDGAYTGAGYRMILNRDKARREELKAEVDAQYARLDDFLRHYSPDGVYLFDRFGWAEVAFAPMFKRLWFLEYYEDYEVPQNLTRVLLWREATLAEPVVQARHGHRELMTLYYDYTQGGGNGRLPEGRSVSSFTLDPPWRARPMPPRDKWGQGASDAELGLIPGITVRSDTVPA
［配列番号６］Ｃ１０Ｇ００７５
MLEELDANYTLRPISLTNREQKEDWYLARNPNGRIPTLIDHEVDAGNGGFAVFESGAILIYLAEKFGRFLPADTMGRSRAIQWVMWQMSGLGPMMGQATVFNRYFEPRLPEVIDRYTRESRRLFEVMDTHLADNEFLAGDYSIADIACFPWVRGHDWACIDMEGLPHLQRWFETIGERPAVQRGLLLPEPPKADEMAEKTTRQGKNILA
［配列番号７］ｃ１０ｇ００６９遺伝子
ATGACACAGGTAAAGGGACGCACCGCGTTCATCACTGGCGGCGGTTCGGGCGTGGCGCTCGGCCAGGCCAAGGTTTTCGCCAGGGCTGGCTGCAAGGTCGCCATTGCCGACATCCGCCAGGATCACCTCGACGAGGCCATGGCCTGGTTCGAGGCCGAGAACGCCAAGGGCGCGAACTACGAGGTGATGGCGGTCAAACTCGACATCACCGACCGCGAGGCTTACGCCAAGGTCGCCGACGAGGTGGAAGCGAAGCTGGGGCCCGTCGAACTGCTGTTCAACACCGCCGGGGTCTCGCACTTCGGCGCGATCCAGGATGCCACTTACGACGACTGGGACTGGCAGATCGACGTCAACCTGCGCGGTGTGATCAACGGCGTGCGCACCTTCGTGCCGCGCATGATCGAGCGCGGCAACGGCGGCCACGTGGTCAACACCGCCTCGATGTCGGCCTTCGTGGCGCTCAAGGGCACGGGCATCTACTGCACCACCAAGATGGCGGTGCGCGGGCTGACCGAGACTCTGGCCCTCGATCTGGAAGAGCATGGCATCGGCGTGTCGCTGCTGTGCCCGGGCGCGGTCAACACCAACATTCACGAAGCGCTGCTGACCCGCCCCAAGCATCTGGCGGACACCGGCTACTACCAGGCCGGGCCGGAGATGTTCGCGCATCTCAAGAACGTGATCGAATGCGGCATGGAGCCCGAGACGCTGGCGAACCACGTCCTGAAGGCCGTGGAGGAGAACCAGCTTTACGTTCTCGCCTATCCGGAATTCCGCAAGCCGCTGGAAGACATCCACGCGCGCGTCATGGCCGCCCTCGCCAATCCCGAGGACGATCCCGACTACGACCGGCGCGTGGCGCACGGCGTACCGGGCGGCGAGGCCAAGGAGGAGGAAAAGACGGCATGA
［配列番号８］ｃ１０ｇ００９３遺伝子
ATGCAGGATCTACCGGGGAAGACCGCCTTTGTGACCGGCGGCGCCAGCGGGATTGGCCTGGGGATAGCCAAGGCCCTGCTGGGGGCGGGCATGAACGTTGCTATCGCCGACATTCGCCAGGACCATCTCGATGACGCCGCAGCCGAACTGGACGGCGGCGACAAGGTGCTCGCGCTCCAGCTCGACGTCACCGATCGCGCTGCCTTTGCCGCCGCCGCCGATGCCACCGAGGCCAAGTTCGGCAAGATCCACATCCTGTGCAACAACGCAGGGGTTGCGGTTGTCGGCCCCACCGACATGGCGACTTTCGCCGACTGGGACTGGGTCATGGGCGTGAACGTGGGCGGCACGATCAACGGCATCGTCACCATGCTGCCGCGCATGTTGAAGCACGGCGAGGGCGGCCACATCGTCAACACCGCCTCGATGTCCGCGCTCGTGCCCGCGCCGGGCACCACGATCTATTCCTCGGGCAAAGCCGCCGTCACCTCGATGATGGAATGCATGCGCCCCGAACTGGAATCGCGCGGCATCGTGTGCTCGGCCTTCTGCCCAGGCGCGGTGCAGTCGAACATTGCCGAAGCCGGGCGCACCCGTCCCGACGCGCTGGCCGAGACCGGCTACGCCGAGGCCGACAAGGGGCGCCAGGCGGGGGGCAGTTTCTTCCACCTCTACCAGACCAAGGAAGAGGTCGGTGAGCGCGTGCTGACGGGCATCCTCAACGATGAACTCTACATCCTCACCCACGCCGAGTTCCTCATCGGCGTGCAGGAGCGCGGCGAGGCGACCACCGCGGCGGTGCAGGTCCAGTTGCCCGAGAACGAGGAGTACAAGAACACCTTCGGCGTGCTCTTCCGCAACTCGGCGATCACCCAGGAGATCGATCGGCAGAAGGCCCTGCGCGCCGCGCAGATGTCCGAAGCCGGCGTCGCGTAA
［配列番号９］ｃ１０ｇ００７６遺伝子
ATGTTGACGCTGTACAGCTTTGGCCCCGGAGCCAATTCGCTTAAGCCCCTGCTGGCCCTTTACGAGAAAGGCCTCGAATTTACGCCGCGCTTCGTCGATCCGACCAAGTTCGAGCATCACGAGGAATGGTTCAAGAAGATCAACCCGCGCGGCCAGGTTCCCGCGCTCGATCACGATGGCAACGTCATCACCGAATCGACGGTGATTTGCGAATACCTCGAAGACGCCTTCCCCGATGCGCCCCGGCTGCGTCCCACCGACCCTGTGCAGATCGCCGAGATGCGGGTCTGGACCAAGTGGGTGGACGAATACTTCTGCTGGTGCGTCTCCACCATCGGCTGGGAGCGCGGCATCGGTCCGATGGCCCGTGCCCTGTCGGACGAGGAGTTCGAGGAAAAGGTCAAACGCATCCCGATCCCTGAGCAGCAGGCCAAGTGGCGCAGCGCCCGCGCCGGCTTCCCCAAGGAGGTTCTGGACGAGGAAATGCGCAAGATCCGCGTCTCGATCGACCGTCTCGAAAAGCGCCTTTCCGAAAGCACCTGGCTGGCGGGCGAGGACTATACGCTTGCCGACATCTGCAACTTCGCCATCGCCAACGGCATGGAGAAGGGCTTTGATGACATCGTCAATACGGCCGCTACGCCCAACCTCGTCGCCTGGATCGAACGCATCAACGCGCGTCCCGCCTGCATCGAGATGTTCGCCAAGTCCAAGAGCGAGTTCGCCGCGCGCAAGCCCTTCGCCAAGAGCGAAGAGCAGGCACAGGCCTGA
［配列番号１０］ｃ１０ｇ００７７遺伝子
ATGGCCAAGGACAACCGCATAACGCTTTACGATCTGCAGCTTGCCTCGGGCTGCACGATCAGCCCCTTCGTGTGGCGCACCAAGTACGCGCTGGCGCACAAGGGCTTCGACATGGATATCGTGCCGGGCGGCTTTACCGGCATTGCCGAGCGCACGGGCGGGCGTTCCGAACGTGCGCCAGTGATCGTCGACGATGGCAAGTGGGTGCTCGACAGCTGGAAGATCGCCGAATACCTCGATGAGACTTATCCCGATCGCCCGATGCTGTTCGAGGGCCCTTCCATGAAGGTGCTCACCAAGTTCCTCGACGCCTGGCTATGGAAGACGATCATCGCGCCGTGGTTCCGCTGCTACATCCTCGACTACCATGATCTGTCGTTGCCGCAGGACCATGCCTACGTGCGCGAATCGCGCGAGACGATGTTCCTGGGCGGGCAGAAGCTGGAGGATGTGCAGGCGGGCCGCGAGGATCGGCTTCCGCACGTGCCGCCGTTGCTGGAGCCGCTGCGCCAGCTGCTGCGCGATACGCCCTGGCTGGGCGGTGCGACACCCAACTACGCGGACTACACCGCGCTCGCCATCTTCCTGTGGACCGGCTCTGTGTGCACCACGCCGCCGCTCACCGAGGATGACCCGTTACGCGACTGGCTCGACCGCGGCTTCGACCTTTACGGCGGGCTGGGGCGTCATCCGGGCATGCACACGCTGTTCGGCCTGAAGCTGCGCGAGGGCGATCCAGAGCCTTTCGACCGCACCGGCCTTGGCATCGAGCCCGCGCCGGTCAACCAGGGCTCGGCCGAGCCGGCTACGGCGAGCTGA
［配列番号１１］ｃ１０ｇ００７８遺伝子
ATGTACCAGATCCCGGGCTGCCCGTTCTCGGAGCGGGTGGAGTTGTTGCTCGATCTCAAGGGGCTGGGCGATGTCCTCGTCGACCACGAGATCGACATTTCCAAACCGCGCCCGGACTGGCTCCTGAAGAAGACGCGGGGGACGACTTCGCTTCCCGCGCTGGAGCTGGAGAACGGGGAGACCTTGAAGGAGAGCATGGTCATCATGCGCTACATCGAGGACCGCTTCCCCGAAGTTCCGGTCGCGCGCCAGGATCCCTACGAGCACGCCCTCGAGGCGATGCTGTGCGCGACCGATGGCGCCTACACCGGGGCGGGCTATCGCATGATCCTGAACCGGGACAAGGCCAGGCGCGAGGAATTGAAGGCCGAAGTCGATGCGCAGTACGCCCGGCTCGACGATTTCCTGCGGCACTACAGCCCGGATGGGGTCTACCTGTTCGACCGTTTCGGCTGGGCCGAAGTGGCCTTTGCGCCGATGTTCAAGCGGCTGTGGTTCCTCGAATACTACGAGGACTACGAGGTGCCGCAGAACCTGACGCGGGTGCTTCTGTGGCGCGAGGCGACACTGGCCGAACCTGTCGTGCAGGCGCGCCACGGCCACCGCGAGCTGATGACGCTCTACTACGACTACACCCAGGGCGGTGGAAACGGACGTCTGCCCGAAGGGCGCAGCGTCTCCAGCTTCACCCTCGATCCGCCGTGGCGCGCGCGGCCCATGCCGCCGCGTGACAAGTGGGGGCAGGGCGCCAGCGATGCCGAGCTCGGGCTGATCCCGGGCATTACCGTCCGTTCGGACACGGTGCCCGCCTGA
［配列番号１２］ｃ１０ｇ００７５遺伝子
ATGCTCGAGGAGCTGGACGCGAACTACACGTTGCGTCCGATCTCGCTGACCAACCGCGAGCAGAAGGAAGACTGGTATCTCGCCCGCAATCCCAACGGGCGTATCCCCACACTGATCGACCATGAGGTCGATGCCGGGAACGGCGGTTTTGCGGTGTTCGAATCGGGTGCGATCCTGATCTACCTTGCCGAGAAGTTCGGCCGTTTCCTGCCAGCCGACACGATGGGCCGCAGCCGCGCGATCCAGTGGGTGATGTGGCAGATGTCGGGCCTCGGCCCCATGATGGGACAGGCGACCGTCTTCAACCGCTACTTCGAGCCCAGGCTGCCCGAGGTCATCGACCGCTACACGCGCGAGAGCCGCCGCCTCTTCGAAGTGATGGACACGCACCTCGCCGACAACGAATTCCTCGCGGGCGACTATTCGATCGCCGACATCGCCTGCTTCCCGTGGGTGCGCGGGCATGACTGGGCCTGCATCGACATGGAGGGGCTGCCCCACCTGCAACGCTGGTTCGAGACCATCGGTGAGCGCCCGGCCGTCCAGCGCGGCCTGCTCTTGCCCGAACCGCCCAAGGCGGACGAGATGGCCGAGAAGACGACCCGCCAGGGCAAGAACATCCTGGCCTGA
［配列番号１３］プライマーＡ
TCTCGAGCTCGGATCC
［配列番号１４］プライマーＢ
CTGGTACCATGGAATTCG
［配列番号１５］プライマーＣ
GGATCCGAGCTCGAGATGATCAAGGGTATCGAAGG
［配列番号１６］プライマーＤ
CGAATTCCATGGTACCAGTCAGAACTCCTGTGCGG
［配列番号１７］プライマーＥ
GGATCCGAGCTCGAGATGACGAACTGGCTTATCAC
［配列番号１８］プライマーＦ
CGAATTCCATGGTACCAGTCAGACCTCGGCGAAG
［配列番号１９］プライマーＧ
GGATCCGAGCTCGAGATGACACAGGTAAAGGGACG
［配列番号２０］プライマーＨ
CGAATTCCATGGTACCAGTCATGCCGTCTTTTCCTC
［配列番号２１］プライマーＩ
GGATCCGAGCTCGAGATGGGAGAGACGACAAAAC
［配列番号２２］プライマーＪ
CGAATTCCATGGTACCAGTCAGGTGAGGTCGGC
［配列番号２３］プライマーＫ
GGATCCGAGCTCGAGATGCAGGATCTACCGGG
［配列番号２４］プライマーＬ
CGAATTCCATGGTACCGCAAGCTGTGTCATGC
［配列番号２５］プライマーＭ
GGATCCGAGCTCGAGATGACGGGCGGGG
［配列番号２６］プライマーＮ
CGAATTCCATGGTACCAGTCAGAGCGCGTTGGC
［配列番号２７］プライマーＯ
GGATCCGAGCTCGAGATGCTGGAACTGTGGACTTC
［配列番号２８］プライマーＰ
CGAATTCCATGGTACCAGGTAGGTGTGCTCATCGTTCA
［配列番号２９］プライマーＱ
GGATCCGAGCTCGAGATGTTGACGCTGTACAGCTTTG
［配列番号３０］プライマーＲ
CGAATTCCATGGTACCAGCTCCTCAGGCCTGTGC
［配列番号３１］プライマーＳ
GGATCCGAGCTCGAGATGGCCAAGGACAACC
［配列番号３２］プライマーＴ
CGAATTCCATGGTACCAGTCAGCTCGCCGTAGC
［配列番号３３］プライマーＵ
GGATCCGAGCTCGAGATGGCATGGGACGATG 
［配列番号３４］プライマーＶ
CGAATTCCATGGTACCAGGATGACGGTGTGCTTCAC
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明の製造方法や酵素によって、天然のリグニンやリグニン関連物質を含むバイオマスから３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンが得られる。３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンは、種々の産業上有用な化合物に変換することができ、例えば、樹脂、接着剤、レジスト材料、医薬品などの原料として利用することが期待できる１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１，３−プロパンジオールなどの製造方法の原料として利用することができる。
【図１】
0005935225.tif 000013
【図２】
0005935225.tif 000014
【図３】
0005935225.tif 000015
【図４】
0005935225.tif 000016
【図５】
0005935225.tif 000017
【図６】
0005935225.tif 000018
【図７】
0005935225.tif 000019
【図８】
0005935225.tif 000020
【図９】
0005935225.tif 000021
【図１０】
0005935225.tif 000022
【図１１】
0005935225.tif 000023
【図１２】
0005935225.tif 000024
【図１３】
0005935225.tif 000025
【図１４】
0005935225.tif 000026
【図１５】
0005935225.tif 000027
【配列表】
0005935225000001.app