(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂ          （式Ｉ）
の二価結合剤であって、該二価結合剤は、ポリペプチド二量体に結合することができ、該二量体は２個の会合したポリペプチド鎖からなり、
ａ）ここでＡは、前記の二量体中に含まれる第１標的ポリペプチドの単一のエピトープに結合する第１一価結合剤であり、Ｂは、前記の二量体中に含まれる第２標的ポリペプチドの単一のエピトープに結合する第２一価結合剤であり、
ｂ）ここで一価結合剤の両方がモノクローナル抗体に由来し、Ｆａｂ断片、またはＦａｂ’断片、またはＦａｂ断片およびＦａｂ’断片であり、そして５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、
ｃ）ここでａ’：ａならびにｂ：ｂ’はそれぞれ、独立して結合対であり、ａ’：ａおよびｂ：ｂ’は異なり、Ｓはスペーサーであり、−は共有結合を表し、
ｄ）ここでａ−Ｓ−ｂは、６〜１００ｎｍの長さを有するリンカーであり、
ｅ）ここで結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’のメンバーは、ハイブリダイズする核酸配列であり、そして
ｆ）ここで該二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有する；
前記二価結合剤。
【請求項２】
前記の二価結合剤が１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有する、請求項１に記載の二価結合剤。
【請求項３】
前記リンカーがＬ−ＤＮＡリンカーである、請求項１または２に記載の二価結合剤。
【請求項４】
前記ポリペプチド二量体がホモ二量体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二価結合剤。
【請求項５】
両方の一価結合剤が重複するエピトープに結合する、請求項４に記載の二価結合剤。
【請求項６】
両方の一価結合剤が同じエピトープに結合する、請求項４に記載の二価結合剤。
【請求項７】
前記ポリペプチド二量体がヘテロ二量体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二価結合剤。
【請求項８】
ポリペプチド二量体に特異的に結合する二価結合剤を形成する方法であって、該二量体は２個の会合したポリペプチド鎖からなり、該方法は以下の工程：
ａ）前記の二量体中に含まれる第１標的ポリペプチドの単一エピトープに５×１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合する、第１一価結合剤を選択し、ここで、該第１一価結合剤はモノクローナル抗体に由来し、Ｆａｂ断片、またはＦａｂ’断片、またはＦａｂ断片およびＦａｂ’断片であり、
ｂ）前記の二量体中に含まれる第２標的ポリペプチドの単一エピトープに５×１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合する、第２一価結合剤を選択し、ここで、該第２一価結合剤はモノクローナル抗体に由来し、Ｆａｂ断片、またはＦａｂ’断片、またはＦａｂ断片およびＦａｂ’断片であり、
ｃ）該第１一価結合剤をハイブリダイズするＤＮＡ配列の第１結合対のメンバーに連結させ、そして該第２一価結合剤をハイブリダイズするＤＮＡ配列の第２結合対のメンバーに連結させ、ここで該第１及び第２結合対は、互いに干渉せず、並びに、６〜１００ｎｍの長さを有し、そしてスペーサー及び該第１及び第２結合対それぞれに対する相補的な結合対のメンバーを含むリンカーは一緒に保温され、それにより二価結合剤が形成され、
ｄ）３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓ値を有する二価結合剤を選択し、それによりポリペプチド二量体に特異的に結合する二価結合剤を形成する；
を含む、前記方法。
【請求項９】
前記のリンカーがＬ−ＤＮＡである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに二価結合剤を単離する工程ｅ）を含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチド二量体がホモ二量体である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
両方の一価結合剤が重複するエピトープに結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
両方の一価結合剤が同じエピトープに結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチド二量体がヘテロ二量体である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチド二量体に関する組織染色法であって、以下の工程：
ａ）細胞または組織試料を提供し、
ｂ）前記の試料を請求項１〜３のいずれか１項に記載の二価結合剤と共に保温し、そして
ｃ）該二価結合剤を検出し、それにより前記の試料をポリペプチド二量体に関して染色する；
を含む、前記方法。
【請求項１６】
細胞または組織試料の染色における、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二価結合剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド二量体に結合することができる二価結合剤に関し、その結合剤はリンカーを介して互いに連結されている２個の一価結合剤からなり、ここでその第１一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第１標的ポリペプチドのエピトープに結合し、ここでその第２一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第２標的ポリペプチドのエピトープに結合し、ここでそれぞれの一価結合剤は５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有する。そのような二価結合剤を作製する方法および組織染色手順におけるそのような二価薬剤の使用も開示する。
【背景技術】
【０００２】
多くのタンパク質、特に多くの膜結合型受容体分子は単量体としては不活性であり、ホモおよび／またはへテロ二量体化により活性化される。そのような受容体分子のホモまたはヘテロ二量体の、単独の二量体化していない分子のバックグラウンドに対する特異的検出は、とても大変な課題である。
【０００３】
驚くべきことに、ここで、ホモまたはヘテロ二量体に結合し、かつ同時にそのホモ二量体中に含まれる１個のポリペプチドの単量体型に、またはそのヘテロ二量体中に含まれる２個のポリペプチドのいずれにも有意な結合を示さないことができる二価結合剤を提供することができることが分かっている。
【発明の概要】
【０００４】
１態様において、本発明はポリペプチド二量体に結合することができる二価結合剤に関し、その結合剤はリンカーを介して互いに連結されている２個の一価結合剤からなり、ここでその第１一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第１標的ポリペプチドのエピトープに結合し、ここでその第２一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第２標的ポリペプチドのエピトープに結合し、ここでそれぞれの一価結合剤は５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のｋｄｉｓｓを有し、ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有する。
【０００５】
ポリペプチド二量体に特異的に結合する二価結合剤を得るための方法も開示し、その方法は、第１標的ポリペプチドに５×１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合する第１一価結合剤を選択し、第２標的ポリペプチドに５×１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合する第２一価結合剤を選択し、両方の一価結合剤をリンカーにより連結し、そして３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓ値を有する二価結合剤を選択する工程を含む。
【０００６】
新規の二価結合剤の、特に免疫組織化学的手順における使用も記述および特許請求する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１  抗ｐＩＧＦ１−Ｒ二重結合剤の組み立ての効率を評価する分析的ゲル濾過実験。線図ａ、ｂおよびｃは、個々の二重結合剤構成要素（フルオレセイン−ｓｓＦａｂ’  １．４．１６８、Ｃｙ５−ｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびリンカーＤＮＡ（Ｔ＝０）；ｓｓＦａｂ’は一本鎖オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたＦａｂ’断片を意味する）の溶離プロフィールを示す。線図ｄは、二価結合剤を形成するのに必要な３種類の構成要素を１：１：１のモル比で混合した後の溶離プロフィールを示す。より太い（一番下の）曲線は、ｓｓＦａｂ’タンパク質またはリンカーＤＮＡそれぞれの存在を示す２８０ｎｍにおいて測定された吸光度を表す。ｂ）およびｄ）におけるより細い一番上の曲線（４９５ｎｍにおける吸光度）はフルオレセインの存在を示し、ａ）におけるより細い一番上の曲線およびｄ）における中央の曲線（６３５ｎｍにおける吸光度）は、Ｃｙ５の存在を示す。単一の二重結合剤の構成要素の溶離体積（ＶＥｓｓＦａｂ’  １．４．１６８  約１５ｍｌ；ＶＥｓｓＦａｂ’  ８．１．２  約１５ｍｌ；ＶＥリンカー  約１６ｍｌ）の反応混合物の溶離体積（ＶＥ混合物  約１２ｍｌ）との比較は、二重結合剤組み立て反応が成功であったことを示す（収率：約９０％）。溶離された二重結合剤に相当する主な２８０ｎｍのピークは、４９５ｎｍおよび６３５ｎｍのチャンネルにおける主なピークとうまく重なっており、二価結合剤に相当するピーク中にｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８の両方が存在することを証明している。
【図２】図２  Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）実験のスキーム。模式的および例示的に、溶液中の２種類の結合分子を示す：Ｔ０−Ｔ−Ｄｉｇ（リンカー１６）、二価結合剤およびＴ４０−Ｔ−Ｄｉｇ（リンカー１５）、二価結合剤。これら両方の二価結合剤はそれらのリンカーの長さにおいてのみ異なる（２個のハイブリダイズする核酸配列の間に追加のＴを有しない中心のジゴキシゲニン化された（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｙｌａｔｅｄ）Ｔ対４０個の追加のＴ（中心のＴ−Ｄｉｇのそれぞれの側に２０個）を有する中心のジゴキシゲニン化されたＴ）。さらに、ｓｓＦａｂ’断片８．１．２および１．４．１６８を用いた。
【図３】図３  １００ｎＭ二価結合剤（Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ  ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる）の固定されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒとの相互作用を、１００ｎＭ  ｓｓＦａｂ’  １．４．１６８または１００ｎＭ  ｓｓＦａｂ’  ８．１．２の同じペプチドに対する結合特性と比較して示す、３つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）。最も高い結合性能は二重結合剤コンストラクトを用いて得られ、これはその二重結合剤の協同的結合作用が標的ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒに対する親和性を増大させることを明確に示している。
【図４】図４  Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ  ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる二価結合剤の固定されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒ（リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒ）、ＩＧＦ−１ＲまたはｐＩＲ（リン酸化されたインスリン受容体）との相互作用を示す３つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。最も高い結合性能はｐＩＧＦ−１Ｒペプチドで得られ、これは二重結合剤の協同的結合作用が標的ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒに対する特異性を例えばリン酸化されたインスリン受容体ペプチド（ｐＩＲ）と比較して増大させることを明確に示している。
【図５】図５  Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ  ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる１００ｎＭ二価結合剤ならびにリンカーＤＮＡを有しない１００ｎＭ  ｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８の混合物の相互作用を示す２つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。最高の結合性能は二価結合剤を用いてのみ得られ、一方でリンカーを有しないｓｓＦａｂ’の混合物は、これらのｓｓＦａｂ’の合計濃度が２００ｎＭであったという事実にも関わらず、観察可能な協同的結合作用を示さない。
【図６】図６  Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）サンドイッチアッセイの概略図。このアッセイは、両方の抗体のリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドへのエピトープ接近可能性を調べるために用いられた。＜ＭＩｇＧＦｃｙ＞Ｒはマウス抗体Ｍ−１．４．１６８を捕捉するために用いられたウサギ抗マウス抗体を示す。次いでＭ−１．４．１６８を用いてｐＩＧＦ−１Ｒペプチドを捕捉する。Ｍ−８．１．２が最終的にＭ−１．４．１６８、ペプチドおよびＭ−８．１．２からなるサンドイッチを形成する。
【図７】図７  二次抗体８．１．２のｐＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する、これがＢｉａｃｏｒｅ（商標）チップ上で抗体１．４．１６８により捕捉された後の結合シグナル（太線）を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。その他のシグナル（細い線）は対照シグナルである：一番上から一番下に向かって、それぞれ５００ｎＭの８．１．２、５００ｎＭの１．４．１６８；５００ｎＭの標的と無関係の抗体＜ＣＫＭＭ＞Ｍ−３３−ＩｇＧ；および５００ｎＭの標的と無関係の対照抗体＜ＴＳＨ＞Ｍ−１．２０−ＩｇＧの線を示す。これらの対照にいずれにおいても結合事象を検出することはできなかった。
【図８】図８  センサー表面上のビオチン化二重結合剤を示す、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイの概略図。フローセル１（＝ＦＣ１）（示していない）上で、アミノ−ＰＥＯ−ビオチンを捕捉させた。ＦＣ２、ＦＣ３およびＦＣ４上で、増大するリンカーの長さを有する二価結合剤を固定した（ＦＣ２上の二重結合剤（Ｔ０−ｂｉ＝１個の中央のＴ−Ｂｉのみ）およびＦＣ４上の二重結合剤（Ｔ４０−ｂｉ＝１個の中央のＴ−Ｂｉならびに上流および下流それぞれの２０個のＴ）をそれぞれ示す）。分析物１：そのペプチドの右側の末端においてＭ−１．４．１６８  ｓｓＦａｂ’エピトープを含有するＩＧＦ−１Ｒペプチド（一番上の線）−このペプチドはリン酸化されていないため、Ｍ−８．１．２  ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープは存在しない；分析物２：Ｍ−８．１．２  ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープ（Ｐ）およびＭ−１．４．１６８  ｓｓＦａｂ’エピトープを含有するｐＩＧＦ−１Ｒペプチド（２番目の線）；分析物３：交差反応するＭ−８．１．２  ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープを含有するがＭ−１．４．１６８  ｓｓＦａｂ’に関するエピトープは含有しない、ｐＩＲペプチド（３番目の線）。
【図９】図９  二重結合剤実験の速度論データ。ｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８を有するＴ４０−Ｔ−Ｂｉリンカー二重結合剤（＝図中のＴ４０）は、ｐＩＧＦ−１Ｒに対して、ｐＩＲ（ｋｄ＝３．７０Ｅ−０２／ｓ）と比較した場合に１３００倍低い解離速度（ｋｄ＝２．７９Ｅ−０５／ｓ）を示す。
【図１０】図１０  Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のｐＩＧＦ−１Ｒペプチド（リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ｐＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３０ｎＭ、１０ｎＭ、２×３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０．４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９の表において示されている。
【図１１】図１１  Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のＩＧＦ−１Ｒペプチド（リン酸化されていないＩＧＦ−１Ｒペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３００ｎＭ、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９の表において示されている。
【図１２】図１２  Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のｐＩＲペプチド（リン酸化されたインスリン受容体ペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ｐＩＲペプチドの濃度系列は、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９として示した表中に示されている。
【図１３】図１３  ＩＧＦ−１受容体に結合する二重結合剤。２個のｍＡｂ  １．４．１６８のＦａｂ’断片を一本鎖ＤＮＡとコンジュゲートし、アダプターＤＮＡおよびリンカーＤＮＡとハイブリダイズさせる。示したように、そのリンカーＤＮＡはビオチン標識を有し、それは免疫組織化学染色において検出することができる。
【図１４】図１４  その二重結合剤によるＩＧＦ１受容体のＩＨＣ検出。その二重結合剤（１μｇ／ｍＬ）はＩＧＦ１受容体を発現している安定導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を染色する（Ａ）。アダプターＤＮＡなしの陰性（一価）対照（Ｆａｂ’−ｓｓＤＮＡ）は洗い流され、その細胞を染色しない（Ｂ）。
【図１５】図１５  ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体検出のための二重結合剤。その二重結合剤は２個のＦａｂ断片からなり、１個はＨＥＲ２を認識し（＝図中の＜Ｈｅｒ２＞）、１個はＨＥＲ３を認識する（＝図中の＜Ｈｅｒ３＞）。そのＦａｂ断片はヘマグルチニンタグ（ＨＡ）および複数単位のGly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)アミノ酸残基モチーフからなるペプチドリンカーにより連結されている。二量体検出のためにＦａｂ断片の間の距離を最適化するため、そのリンカーの長さをいくつかのG4S単位（ｘ＝１、２、３、４...）の導入により容易に変更することができる。実施例４において用いられた二重結合剤は、２個のG4S単位を有する（ｘ＝１）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
１態様において、本発明はポリペプチド二量体に結合することができる二価結合剤に関し、その結合剤はリンカーを介して互いに連結されている２個の一価結合剤からなり、
ａ）ここでその第１一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第１標的ポリペプチドのエピトープに結合し、
ｂ）ここでその第２一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第２標的ポリペプチドのエピトープに結合し、
ｃ）ここでそれぞれの一価結合剤は５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、
ｄ）ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有する。
【０００９】
時々、単独のポリペプチドはそのタンパク質が活性であるのに十分である。しかし、上記で示したように、タンパク質がその特定の機能を果たすことを可能にするために、しばしば２個以上のポリペプチドが相互作用することが必要である。この場合、例えば２個のポリペプチド鎖が互いに会合している場合のタンパク質またはポリペプチドについて言及している。その二量体形成は２個のポリペプチド鎖の間の相互作用に由来し、および／またはそれはリガンドの結合により誘発され得る。二量体は、水素結合、イオン結合、ならびにより一般的でないが疎水性界面および鎖間ジスルフィド結合により一緒の状態を保たれている。
【００１０】
受容体のホモおよび／またはへテロ二量体化は、細胞活性および生理的および／または病理的プロセスの制御において極めて重要な機構である。
本発明の意味における二量体は、２個のポリペプチド鎖が会合しており、生物学的に関連する複合体を形成する場合に存在する。その二量体は膜結合型二量体であってよく、またはそれは循環中に存在する二量体、すなわち生理的条件下で安定である２個のポリペプチドの複合体であってよい。１態様において、（それらが天然に存在するような）二量体中の２個のポリペプチド鎖は共有結合的に連結されているのではなく、タンパク質間相互作用により、例えばイオン架橋（ｉｏｎ  ｂｒｉｄｇｅｓ）またはファンデルワールス（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｓ）力に基づいて一緒の状態を保たれている。
【００１１】
本発明に従う二価結合剤は、正確に２個の一価結合剤を含む結合剤である。
好ましい態様において、それぞれの一価結合剤の、および二価結合剤の動態学的速度特性は、実施例において詳細に記述されるようなＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ技術により特性付けられる。
【００１２】
当業者は理解するであろうように、本発明において記述される二価結合剤は、望まれるように単離および精製することができる。１態様において、本発明は本明細書において開示されるような単離された二価結合剤に関する。“単離された”二価結合剤は、同定され、例えばそのような二価結合剤の合成において用いられる試薬混合物から分離および／または回収された二価結合剤である。そのような反応混合物の望まれない構成要素は、例えば最終的にその望まれる二価結合剤にならなかった一価結合剤である。１態様において、その二価結合剤は８０％より大きい純度まで精製される。一部の態様において、その二価結合剤はそれぞれ９０重量％、９５重量％、９８重量％または９９重量％より大きい純度まで精製される。両方の一価結合剤がポリペプチドである場合、純度は例えば還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質検出において例えばクーマシーブルーまたは銀染色を用いて容易に決定される。純度を核酸レベルで評価する場合、サイズ排除クロマトグラフィーを適用して二価結合剤を副産物から分離し、２６０ｎｍにおけるＤＯを監視してその純度を評価する。
【００１３】
冠詞“ａ”および“ａｎ”は、本明細書において、その冠詞の文法上の目的語の１個を、または１個より多くを（すなわち少なくとも１個を）指して用いられる。例として、“抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は１個の抗体または１個より多くの抗体を意味する。
【００１４】
用語“オリゴヌクレオチド”または“核酸配列”は、本明細書で用いられる際、一般に短い、一般に一本鎖の、少なくとも８ヌクレオチドを、最大で約１０００ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも９、１０、１１、１２、１５、１８、２１、２４、２７または３０ヌクレオチドの長さを有するであろう。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５または３０ヌクレオチドより長くない長さを有するであろう。下記でポリヌクレオチドに関して示す記述は、オリゴヌクレオチドに等しく、かつ完全に適用可能である。
【００１５】
オリゴヌクレオチドという用語は広く理解されるべきであり、ＤＮＡおよびＲＮＡならびにそれらの類似体および修飾を含む。
オリゴヌクレオチドは、例えば標準的な塩基であるデオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシシトシン（ｄＣ）、デオキシチミジン（ｄＴ）、デオキシウラシル（ｄＵ）において置換基を有する置換されたヌクレオチドを含有していてよい。そのような置換された核酸塩基の例は次のものである：５−置換ピリミジン類、例えば５メチルｄＣ、アミノアリルｄＵまたはｄＣ、５−（アミノエチル−３−アクリルイミド）−ｄＵ、５−プロピニル−ｄＵまたはｄＣ、５ハロゲン化−ｄＵまたはｄＣ；Ｎ置換ピリミジン類、例えばＮ４−エチル−ｄＣ；Ｎ置換プリン類、例えばＮ６−エチル−ｄＡ、Ｎ２−エチル−ｄＧ；８置換プリン類、例えば８−［６−アミノ）−ヘキサ−１−イル］−８−アミノ−ｄＧまたはｄＡ、８ハロゲン化ｄＡまたはｄＧ、８−アルキルｄＧまたはｄＡ；および２置換ｄＡ、例えば２アミノｄＡ。
【００１６】
オリゴヌクレオチドはヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体を含有していてよい。すなわち、天然存在核酸塩基を以下のような核酸塩基類似体を用いることにより交換することができる：５−ニトロインドール  ｄ  リボシド；３ニトロピロール  ｄ  リボシド、デオキシイノシン（ｄＩ）、デオキシキサントシン（ｄｅｏｙｘａｎｔｈｏｓｉｎｅ）（ｄＸ）；７デアザ−ｄＧ、−ｄＡ、−ｄＩまたは−ｄＸ；７−デアザ−８−アザ−ｄＧ、−ｄＡ、−ｄＩまたは−ｄＸ；８−アザ−ｄＡ、−ｄＧ、−ｄＩまたは−ｄＸ；ｄホルマイシン；プソイドｄＵ；プソイドイソｄＣ；４チオｄＴ；６チオｄＧ；２チオｄＴ；イソｄＧ；５−メチル−イソ−ｄＣ；Ｎ８−結合型８−アザ−７−デアザ−ｄＡ；５，６−ジヒドロ−５−アザ−ｄＣ；およびエテノ−ｄＡまたはピロロ−ｄＣ（ｐｙｒｏｌｌｏ−ｄＣ）。当業者には明らかであるように、相補鎖中の核酸塩基は二本鎖形成が特異的であるような様式で選択されなければならない。例えば、５−メチル−イソ−ｄＣが一方の鎖（例えば（ａ））において用いられるならば、イソｄＧがその相補鎖（例えば（ａ’））中になければならない。
【００１７】
そのオリゴヌクレオチド主鎖は、置換された糖残基、糖類似体、ヌクレオシド間ホスフェート部分における改変を含有するように改変されてよく、および／またはＰＮＡであってよい。
【００１８】
オリゴヌクレオチドは、例えば２’−メトキシ、２’−フルオロ、２’−メチルセレノ、２’−アリルオキシ、４’−メチルｄＮ（ここでＮは核酸塩基、例えばＡ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵである）のような置換されたデオキシリボースを有するヌクレオチドを含有していてよい。
【００１９】
糖類似体は、例えばキシロース；（２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン）−（ＬＮＡとして知られるオリゴマー）または（２’−Ｏ，４’−Ｃエチレン）−（ＥＮＡとして知られるオリゴマー）のような２’，４’架橋リボース；Ｌ−リボース、Ｌ−ｄ−リボース、ヘキシトール（ＨＮＡとして知られるオリゴマー）；シクロヘキセニル（ＣｅＮＡとして知られるオリゴマー）；アルトリトール（ＡＮＡとして知られるオリゴマー）；Ｃ３’およびＣ５’原子がエチレン架橋により連結されており、それが縮合してシクロプロパン環になっている三環式リボース類似体（トリシクロＤＮＡとして知られるオリゴマー）；グリセリン（ＧＮＡとして知られるオリゴマー）；グルコピラノース（ホモＤＮＡ（Ｈｏｍｏ  ＤＮＡ）として知られるオリゴマー）；カルバリボース（ｃａｒｂａｒｉｂｏｓｅ）（テトラヒドロフラン小単位の代わりにシクロペンタンを有する）；ヒドロキシメチル−モルホリン（モルホリノＤＮＡとして知られるオリゴマー）である。
【００２０】
多数のヌクレオシド間ホスフェート部分の改変もハイブリダイゼーション特性に干渉しないことが分かっており、そのような主鎖の改変は置換されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と組み合わせることもできる。例はホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートおよびメチルホスホネートオリゴヌクレオチドである。
【００２１】
ＰＮＡ（ホスフェートおよびｄ−リボースなしの主鎖を有する）もＤＮＡ類似体として用いることができる。
上記で言及した修飾されたヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ならびにオリゴヌクレオチド主鎖の改変は、本発明の意味でのオリゴヌクレオチド中で望まれるように組み合わせることができる。
【００２２】
用語“ポリペプチド”および“タンパク質”は互換的に用いられる。本発明の意味でのポリペプチドは、アルファアミノペプチド結合により連結された少なくとも５個のアミノ酸からなる。
【００２３】
“標的ポリペプチド”は、それに関して決定または測定のための方法が求められている対象のポリペプチドである。本発明の標的ポリペプチドは、ホモまたはヘテロ二量体型ポリペプチド複合体を形成することが既知である、または疑われるポリペプチドである。
【００２４】
本発明に従う“一価結合剤”は、標的ポリペプチドと単一の結合部位において５×１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで相互作用する分子である。動態学的結合速度特性の生物物理学的特性付け、それぞれラングミュアモデルに従う解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）の決定は、好ましくはバイオセンサーに基づく表面プラズモン共鳴分光法により分析される。好ましくは、実施例の節において詳細に記述されるようなＢｉａｃｏｒｅ（商標）技術が用いられる。
【００２５】
一価結合剤の例は、ペプチド、ペプチド模倣物、アプタマー、ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ、ｄａｒｐｉｎ、レクチン、アンキリンリピートタンパク質、Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン、単一ドメイン抗体（Hey, T. et al., Trends Biotechnol 23 (2005) 514-522参照）および抗体の一価断片である。
【００２６】
当業者には明らかであるように、本発明に従うそれぞれの一価結合剤は標的ポリペプチド上の単一のエピトープにのみ結合する。
特定の好ましい態様において、その一価結合剤は一価抗体断片、好ましくはモノクローナル抗体に由来する一価断片である。
【００２７】
一価抗体断片には下記で提供するようなＦａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ（Ｆａｂ’）、単一ドメイン抗体、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ断片が含まれるが、それらに限定されない。
好ましい態様において、その一価結合剤のすくなくとも一方は、単一ドメイン抗体、モノクローナル抗体のＦａｂ断片またはＦａｂ’断片である。
【００２８】
本明細書で開示される二価結合剤においてその一価結合剤の両方がモノクローナル抗体に由来し、Ｆａｂ断片である、またはＦａｂ’断片である、またはＦａｂ断片およびＦａｂ’断片であることも、好ましい態様である。
【００２９】
モノクローナル抗体の技法は、特異的なモノクローナル抗体またはその断片の形態の極めて特異的な結合剤の製造を可能にする。当技術で特に周知であるのは、マウス、ウサギ、ハムスター、またはあらゆる他の哺乳類を目的のポリペプチドで免疫することによりモノクローナル抗体またはその断片を作り出すための技法である。モノクローナル抗体またはその断片を作り出す別の方法は、ｓＦｖ（単鎖可変領域）、特にヒトのｓＦｖのファージライブラリーの使用である（例えば、Griffiths et al.，米国特許第5,885,793号；McCafferty et al.，国際公開第92/01047号；Liming et al.，国際公開第99/06587号を参照）。
【００３０】
抗体断片は伝統的な手段、例えば酵素消化により、または組み換え技法により生成されてよい。特定の抗体断片の総説に関して、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照。
【００３１】
Ｆｖは完全な抗原結合部位を含有する最小限の抗体断片であり、定常領域を欠いている。１態様において、２鎖Ｆｖ種は堅固に非共有結合的に会合した１個の重鎖可変ドメインおよび１個の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種の１態様において、１個の重鎖可変ドメインおよび１個の軽鎖可変ドメインが、その軽鎖および重鎖が２鎖Ｆｖ種における二量体構造に類似した二量体構造で会合することができるように、柔軟なペプチドリンカーにより共有結合的に連結されていることができる。ｓｃＦｖの総説に関して、例えばPlueckthun, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (編者), Springer-Verlag, ニューヨーク(1994), pp. 269-315を参照；国際公開第93/16185号ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号も参照。一般に、６個の超可変領域（ＨＶＲ）が抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変領域（または抗原に特異的な３個のＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえも抗原を認識して結合する能力を有する。
【００３２】
Ｆａｂ断片は重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１個以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における少数の残基の追加によりＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、その定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が遊離のチオール基を有するＦａｂ’に関する本明細書における名称である。
【００３３】
抗体断片の生成のために様々な技法が開発されてきた。伝統的に、抗体断片は完全な抗体のタンパク質分解による消化により得られた(例えばMorimoto, K. et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24 (1992) 107-117;およびBrennan et al., Science 229 (1985) 81-83を参照)。例えば、抗体のパパイン消化は、“Ｆａｂ”断片と呼ばれそれぞれが単一の抗原結合部位を有する２個の同一の抗原結合断片および残りの“Ｆｃ”断片を生成し、その名前は容易に結晶化するその能力を反映している。
【００３４】
抗体断片は組み換え宿主細胞により直接生成することもできる。Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖ抗体断片は全て大腸菌中で発現させてそれから分泌させることができ、従ってこれらの断片の容易な大量生産が可能である。抗体断片は、標準的な手順に従って抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができる(Carter, P. et al., Bio/Technology 10 (1992) 163-167)。哺乳類細胞系も、抗体断片を発現させる、そして望まれるならば分泌させるために用いることができる。
【００３５】
特定の態様において、本発明の一価結合剤は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む単一のポリペプチド鎖である。特定の態様において、単一ドメイン抗体はヒトの単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば米国特許第6,248,516 B1号を参照）。１態様において、単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部からなる。
【００３６】
２個の一価結合剤の１つである第１一価結合剤は、第１（標的）ポリペプチド上のエピトープに結合する。
本発明に従う“エピトープ”−対応する一価結合剤により結合される標的ポリペプチド上の結合部位−は、アミノ酸からなる。そのアミノ酸は天然存在アミノ酸であり、または１個以上の二次修飾を有して（ｃａｒｙ）いてよい。１態様において、そのアミノ酸は二次修飾されていない。１態様において、その一価結合剤は線状エピトープ、すなわち一続きの５〜１２個の連続したアミノ酸からなるエピトープに結合するか、またはその一価結合剤はその標的ポリペプチドの空間的配置により形成される三次構造に結合するかのどちらかである。結合剤により、例えば抗体の抗原認識部位またはパラトープにより認識される三次エピトープは、抗原分子の三次元表面特徴であると考えることができ；これらの特徴はその結合剤の対応する結合部位（中）に正確に納まり、それにより結合剤および標的ポリペプチドの間の結合が促進される。
【００３７】
本明細書で開示されるような二価結合剤において、第１一価結合剤は第１ポリペプチド上のエピトープに結合し、第２一価結合剤は第２ポリペプチド上のエピトープに結合する。ポリペプチド二量体中の第１および第２ポリペプチドは同一の配列を有することができ、すなわちこの二量体はホモ二量体であり、または第１および第２ポリペプチドは異なっていることができ、すなわちこの二量体はヘテロ二量体である。
【００３８】
上記で言及したように、多くの受容体分子に関して、ポリペプチドホモまたはヘテロ二量体それぞれの形成は細胞シグナル伝達およびタンパク質活性の制御への鍵である。これは膜結合型受容体、特にいわゆる受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に関して特に知られており、当てはまる。名称が既に示唆しているように、そのＲＴＫの細胞内シグナル伝達の少なくとも一部はそのようなＲＴＫの細胞内ドメインの特定のチロシンのリン酸化状態により媒介される。従って、１つの好ましい態様において、本発明は受容体ポリペプチド二量体に結合する二価結合剤に関する。明らかに、そのような二価結合剤は活性なホモまたはヘテロ二量体型受容体ポリペプチドの検出において非常に有用である。
【００３９】
１つの好ましい態様において、本発明は本明細書において上記で開示したような二価結合剤に関し、ここでその標的ポリペプチド二量体は、膜結合型受容体分子からなる群から、好ましくは２個の受容体型チロシンキナーゼポリペプチドの会合により形成されるホモまたはヘテロ二量体から選択される。
【００４０】
一部の態様において、ホモまたはヘテロ二量体の一部であるＲＴＫポリペプチドは以下のものからなる群から選択される：ＡＬＫ、接着関連キナーゼ受容体（例えばＡｘｌ）、ＥＲＢＢ受容体（例えばＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４）、エリスロポエチン産生肝細胞性（ＥＰＨ）受容体（例えばＥｐｈＡ１；ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ５、ＥｐｈＢ６）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体（例えばＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ５）、Ｆｇｒ、ＩＧＦＩＲ、インスリンＲ、ＬＴＫ、Ｍ−ＣＳＦＲ、ＭＵＳＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体（例えばＰＤＧＦＲ−Ａ、ＰＤＧＦＲ−Ｂ）、ＲＥＴ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＯＳ、ＲＹＫ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体（例えばＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、ＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ１、ＶＥＧＦ３）、免疫グロブリン様およびＥＧＦ様ドメインを有するチロシンキナーゼ（ＴＩＥ）の受容体（例えばＴＩＥ−１、ＴＩＥ−２／ＴＥＫ）、Ｔｅｃ、ＴＹＲＯ１０、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体（例えばＩＮＳ−Ｒ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＲ−Ｒ）、ジスコイジンドメイン（ＤＤ）受容体（例えばＤＤＲ１、ＤＤＲ２）、ｃ−Ｍｅｔに関する受容体（ＭＥＴ）、マクロファージ刺激１受容体（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）としても知られているｒｅｃｅｐｔｅｕｒ  ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ  ｎａｎｔａｉｓ（ＲＯＮ）、Ｆｌｔ３  ｆｉｎｓ関連チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ３）、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）受容体、ｃ−ｋｉｔに関する受容体（ＫＩＴ、ＳＣＦＲ）およびインスリン受容体関連（ＩＲＲ）受容体。
【００４１】
１態様において、ホモまたはヘテロ二量体の一部であるＲＴＫは以下のものからなる群から選択される：ＥＲＢＢ受容体（例えばＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体（例えばＰＤＧＦＲ−Ａ、ＰＤＧＦＲ−Ｂ）ならびに血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体および補助受容体（例えばＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、ＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ１、ＶＥＧＦ３、ニューロピリン−１、ニューロピリン−２）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体（例えばＩＮＳ−Ｒ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＲ−Ｒ）、ならびにインスリン受容体関連（ＩＲＲ）受容体。
【００４２】
１態様において、ホモまたはヘテロ二量体の一部であるＲＴＫは以下のものからなる群から選択される：ＥＲＢＢ受容体（例えばＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体（例えばＰＤＧＦＲ−Ａ、ＰＤＧＦＲ−Ｂ）ならびに血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体および補助受容体（例えばＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、ＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ１、ＶＥＧＦ３、ニューロピリン−１、ニューロピリン−２）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体（例えばＩＮＳ−Ｒ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＲ−Ｒ）、ならびにインスリン受容体関連（ＩＲＲ）受容体。
【００４３】
１態様において、本発明は、ポリペプチド二量体に結合することができる二価結合剤に関し、その結合剤はリンカーを介して互いに連結されている２個の一価結合剤からなり、ここでその第１一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第１標的ポリペプチドのエピトープに結合し、ここでその第２一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第２標的ポリペプチドのエピトープに結合し、ここでそれぞれの一価結合剤は５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有し、ここで前記の二量体はＥＲＢＢ受容体（例えばＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体および補助受容体（例えばＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、ＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ１、ＶＥＧＦ３、ニューロピリン−１、ニューロピリン−２）からなる群から選択される。
【００４４】
１態様において、受容体のホモおよび／またはヘテロ二量体化はＶＥＧＦシグナル伝達に関わるポリペプチドに関する。それには血管内皮成長因子およびそれらの対応する受容体が１つの具体例として含まれる（完全な詳細に関して、Otrock, Z. et al., Blood Cells, Molecules and Diseases: 38 (2007) 258-268を参照）。
【００４５】
ＶＥＧＦシグナル伝達は、しばしば生理的血管新生における重要な律速段階である。血管新生は既存の血管からの新しい血管の出芽（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）である。このプロセスは、胎児発生および組織修復の間の新しい血管の成長に関して重要である；しかし、制御されない血管新生は新生物疾患および他の障害を促進する。このプロセスの実行の成功は、成長促進因子および成長抑制因子の釣り合いに依存する。血管新生の最も特異的かつ重要な制御因子の１つがＶＥＧＦである。
【００４６】
ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）およびＶＥＧＦ−Ｆと呼ばれる７種類の分泌糖タンパク質を含む。そのＶＥＧＦファミリーのメンバーはそれらの同族の受容体に結合する。今までに同定された受容体は、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３およびニューロピリン類（ＮＰ−１およびＮＰ−２）と呼ばれている。
【００４７】
ＶＥＧＦ−Ａはその生物学的作用を細胞表面受容体との相互作用を通して及ぼす。これらの受容体は膜貫通型チロシンキナーゼ受容体であり、それらには血管内皮細胞上で選択的に発現しているＶＥＧＦ受容体−１（ＶＥＧＦＲ−１；Ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ−２（キナーゼ挿入ドメイン含有受容体／Ｆｌｋ−１）、ならびに血管内皮およびニューロン上で発現しているニューロピリン受容体（ＮＰ−１およびＮＰ−２）が含まれる。ＶＥＧＦ−Ａのその受容体の細胞外ドメインへの結合の際、その細胞内受容体型チロシンキナーゼの二量体化および自己リン酸化の後、下流のタンパク質のカスケードが活性化される。ＶＥＧＦＲ−２はＶＥＧＦ−Ａの血管新生促進作用の媒介に寄与する主な受容体であるようである。
【００４８】
ＶＥＧＦＲ−１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ；Ｆｌｔ−１）は７個の細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）相同ドメイン、単一の膜貫通領域および細胞内チロシンキナーゼドメインからなる。ＶＥＧＦＲ−１はＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＢおよびＰＩＧＦに高い親和性で結合する。
【００４９】
ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ、ヒト；Ｆｌｋ−１、マウス）は１９９１年に最初に単離され、キナーゼ挿入ドメイン含有受容体（ＫＤＲ）と名付けられた。ＶＥＧＦＲ−１のように、ＶＥＧＦＲ−２は７個の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを有する細胞外領域、膜貫通ドメインおよび約７０アミノ酸の挿入を有するチロシンキナーゼドメインを有する。ＶＥＧＦＲ−２はＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＶＥＧＦ−Ｅに結合する。
【００５０】
内皮細胞受容体型チロシンキナーゼのメンバーであるＶＥＧＦＲ−３（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ４、Ｆｌｔ４）は６個のみのＩｇ相同ドメインを有する［１２１］。ＶＥＧＦＲ−３はＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄに優先的に結合する。
【００５１】
ＶＥＧＦ受容体１、２および３はリガンド結合の際にホモ二量体を形成することができ、それは活性であり、細胞内チロシンキナーゼドメインを介してそれらの作用を及ぼす。しかし、ホモ二量体の形成は作用の唯一の方式ではなく、いわゆる（ｓｏ−ａｃｌｌｅｄ）ニューロピリン類が補助受容体として重要な役割を果たす。
【００５２】
ニューロピリンＮＰ−１は最初に、軸索およびニューロンの発生における反発性誘導シグナルの役目を果たす分泌型および膜貫通タンパク質の大きなファミリーであるセマフォリン／コラプシン類に関する受容体の役目を果たす１３０〜１４０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質として同定された。ＮＰ−１はＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＢおよびＰＩＧＦに結合し、一方でＮＰ−２はＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＰＩＧＦに結合する。
【００５３】
ＮＰ−１はＶＥＧＦ−Ａ−ＶＥＧＦＲ−２の相互作用を増進する補助受容体として作用し、ＶＥＧＦＲ−１と複合体を形成し、生体内で腫瘍の血管新生を増強する。この経路を調べるため、ＶＥＧＦＲ−２／ＮＰ−１ヘテロ二量体の特異的な検出が必要である。
【００５４】
最近の研究は、ＮＰ−２をリンパ管の発生に結びつけた。
上記で指摘したように、ＶＥＧＦファミリーの受容体のメンバーはそれらが単量体である限り活性でないが、リガンドが結合してホモおよび／またはヘテロ二量体化すると、異なる作用様式につながる一連の異なる生化学経路が誘導される。（不活性な）単量体および様々なホモおよび／またはヘテロ二量体を区別する能力は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体系の生理学的作用様式およびこの系の１個以上のメンバーを標的とする薬物の作用の解明において極めて重要である。１態様において、本発明は、ポリペプチド二量体に結合することができる二価結合剤に関し、その結合剤はリンカーを介して互いに連結されている２個の一価結合剤からなり、ここでその第１一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第１標的ポリペプチドのエピトープに結合し、ここでその第２一価結合剤は前記の二量体中に含まれる第２標的ポリペプチドのエピトープに結合し、ここでそれぞれの一価結合剤は５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有し、ここでホモおよび／またはヘテロ二量体はＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体系の一部である。そのような結合剤において、１態様において、一方の一価結合剤はＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）およびＶＥＧＦ−Ｆからなる群から選択されるＶＥＧＦに結合し、他方の一価結合剤はＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３およびニューロピリン類（ＮＰ−１およびＮＰ−２）からなる群から選択される受容体に結合する。または、そのような受容体は、１態様において、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３からなる群から選択される受容体ポリペプチドに結合する一方の一価結合剤およびニューロピリン（ＮＰ−１またはＮＰ−２）に結合する他方の一価結合剤を有する。
【００５５】
論じられたように、本明細書で開示されるような二価結合剤の構築における使用のための一価結合剤は、５×１０−３／秒から１０−４／秒までのＫｄｉｓｓを有していなければならない。
【００５６】
好ましくは、その第１一価結合剤は第１ポリペプチド上のエピトープに特異的に結合している。すなわち、この結合剤はヘテロ二量体二価結合剤に関する場合のように第２標的ポリペプチド上に存在しないエピトープに結合するか、またはそれはホモ二量体二価結合剤に関する場合のように第２標的ポリペプチド上に存在する（ｐｅｒｓｎｔ）エピトープと重複する、もしくは同一であるエピトープに結合するかのどちらかである。
【００５７】
ポリペプチドエピトープへの特異的な結合は、前記の結合剤がその標的ポリペプチド上のエピトープに関してあらゆる他のペプチド上の（例えば第１および第２標的ポリペプチドが異なる場合に第２標的ポリペプチド上の）あらゆる（類似の、または完全に無関係の）エピトープと比較して少なくとも２０倍低いＫｄｉｓｓを有する場合に認められる。ヘテロ二量体中のポリペプチドは、一価結合剤がそのポリペプチドの一方のみに特異的に結合する場合に、異なると認められる。第１一価結合剤の第１標的ポリペプチド上のエピトープに対するＫｄｉｓｓがあらゆる他のポリペプチド上のあらゆるエピトープと比較して少なくとも３０、４０、５０、８０、９０、９５または少なくとも１００倍低いことも好ましい。
【００５８】
１つの好ましい態様において、本明細書で開示する二価結合剤は、２個の異なるポリペプチドを含むヘテロ二量体に結合する。この場合、第２一価結合剤は好ましくはその第１ポリペプチドに関してそれの第２標的ポリペプチドへの結合に関するＫｄｉｓｓと比較して少なくとも２０倍低いＫｄｉｓｓを有するように選択される。第２一価結合剤の第２標的ポリペプチドに対するＫｄｉｓｓが第１標的ポリペプチド上のあらゆるエピトープに関するＫｄｉｓｓと比較して少なくとも３０、４０、５０、８０、９０、９５または少なくとも１００倍低いことも好ましい。
【００５９】
上記で言及したように、本発明に従う二価結合剤は最大で３×１０−５／秒の、またはより低い、すなわちより良いＫｄｉｓｓを有するであろう。
この発明に従う二価結合剤における１態様において、それぞれの一価結合剤は２×１０−３／秒から１０−４／秒までのＫｄｉｓｓを有する。
【００６０】
この発明に従う二価結合剤における１態様において、それぞれの一価結合剤は１０−３／秒から１０−４／秒までのＫｄｉｓｓを有する。
Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（ツーソン）が流通させている自動免疫組織化学染色機械は、かなりストリンジェントな洗浄条件を用いる。ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）分析器シリーズにおいて用いられる抗体は、適当な染色強度を与えるために最大で５×１０−５／秒のＫｄｉｓｓを有するべきである。Ｋｄｉｓｓがより低いほど、染色強度もより良いであろう。本明細書で開示するような二価結合剤は、最大で３×１０−５／秒のＫｄｉｓｓを有する。さらなる態様において、本明細書で開示するような二価結合剤は２×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有し、または１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓも好ましい。
【００６１】
１態様において、それぞれの一価結合剤の、およびその二価結合剤の動態学的速度特性は、実施例において詳細に記述されるようなＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ技術により特性付けられる。
【００６２】
本発明に従う二価結合剤はリンカーを含有する。そのリンカーがその２個の一価結合剤を共有結合的に連結することもでき、またはそのリンカーおよびその一価結合剤が２個の異なる特異的な結合対ａ：ａ’およびｂ：ｂ’により結合していることもできる。
【００６３】
そのリンカーは、例えば一緒に、およびその２個の一価結合剤に共有結合により連結された適切な単量体で構成されていてよい。好ましくは、そのリンカーは糖部分、ヌクレオチド部分、ヌクレオシド部分および／またはアミノ酸を含有するであろう。特定の好ましい態様において、そのリンカーは本質的にヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはアミノ酸からなるであろう。
【００６４】
好ましくは、その２個の一価結合剤を結合対により共有結合的に連結している、または結合させているリンカーは、６〜１００ｎｍの長さを有する。そのリンカーが６〜５０ｎｍの、または６〜４０ｎｍの長さを有することも好ましい。やはり好ましい態様において、そのリンカーは１０ｎｍ以上の、または１５ｎｍ以上の長さを有するであろう。１態様において、本発明に従う二価結合剤中に含まれるリンカーは１０ｎｍ〜５０ｎｍの長さを有する。
【００６５】
理論上の、および複合的な方法による、所与のリンカー（ａ−Ｓ−ｂ）の非ヌクレオシド構成要素の長さは、その非ヌクレオシド構成要素に化学的に類似した化合物の既知の結合距離および結合角を用いることにより計算することができる。そのような結合距離は、標準的な教本：CRC Handbook of Chemistry and Physics, 第９１版, 2010-2011, 第９節においていくつかの分子に関して要約されている。しかし、正確な結合距離はそれぞれの化合物に関して異なる。その結合角においても変動性が存在する。
【００６６】
従って、そのような計算において平均のパラメーター（分かりやすい近似値）を用いることがより実際的である。
スペーサーまたはリンカーの長さの計算において、以下の近似値が適用される：ａ）非ヌクレオシド構成要素の長さの計算に関して、連結された原子の性質とは無関係に、１８０°の結合角を伴う１３０ｐｍの平均結合長が用いられ；ｂ）一本鎖中の１個のヌクレオチドは５００ｐｍで計算され、そしてｃ）二本鎖中の１個のヌクレオチドは３３０ｐｍで計算される。
【００６７】
１３０ｐｍの値は、２個のＣ（ｓｐ３）の間の結合角が１０９°２８’および距離が１５３ｐｍであるＣ（ｓｐ３）−Ｃ（ｓｐ３）−Ｃ（ｓｐ３）鎖の２個の末端の炭素原子の距離がおおよそ２５０ｐｍであり、それは１８０°の仮定された結合角および１２５ｐｍの２個のＣ（Ｓｐ３）の間の結合距離に換算されるという計算に基づく。ＰおよびＳのような複素原子ならびにｓｐ２およびｓｐ１のＣ原子もそのスペーサーの一部であり得ることを考慮して、１３０ｐｍの値が採用される。スペーサーがシクロアルキルまたはアリールのような環構造を含む場合、その距離は類似の方法で、その距離を定めている原子鎖全体の一部である前記の環構造の結合の数を数えることにより計算される。
【００６８】
上記で言及したように、そのリンカーがその２個の一価結合剤を共有結合的に連結することもでき、またはそのリンカーおよびその一価結合剤が２個の異なる特異的な結合対ａ：ａ’およびｂ：ｂ’により結合していることもできる。従って、ポリペプチド二量体に結合する本発明に従う二価結合剤は、下記の式Ｉにより表すこともでき：
Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂ、
ここでＡは前記の第１標的ポリペプチドのエピトープに結合する第１一価結合剤であり、ここでＢは前記の第２標的ポリペプチドのエピトープに結合する第２一価結合剤であり、ここでそれぞれの一価結合剤ＡおよびＢは５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、ここでａ’：ａならびにｂ：ｂ’は独立して結合対であり、またはａ’：ａおよび／またはｂ：ｂ’は共有結合しており、ここでａ’：ａおよびｂ：ｂ’は異なり、ここでＳはスペーサーであり、ここで−は共有結合を表し、ここでそのリンカーａ−Ｓ−ｂは６〜１００ｎｍの長さを有し、ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有する。
【００６９】
ａ−Ｓ−ｂからなるリンカーＬは、６〜１００ｎｍの長さを有する。好ましくは、ａ−Ｓ−ｂからなるリンカーＬは６〜８０ｎｍの長さを有する。そのリンカーが６〜５０ｎｍの、または６〜４０ｎｍの長さを有することも好ましい。やはり好ましい態様において、そのリンカーは１０ｎｍ以上の長さを、または１５ｎｍ以上の長さを有するであろう。１態様において、そのリンカーは１０ｎｍ〜５０ｎｍの長さを有する。１態様において、ａおよびｂはそれぞれ結合対のメンバーであり、それぞれ少なくとも２．５ｎｍの長さを有する。
【００７０】
スペーサーＳは、例えば望まれる長さを、ならびに他の望まれる特性を提供するために必要であると解釈することができる。そのスペーサーは、例えば完全または部分的に天然存在または非天然存在アミノ酸で、ホスフェート−糖単位、例えば核酸塩基なしのＤＮＡ様主鎖で、グリコペプチド性（ｇｌｙｃｏ−ｐｅｐｔｉｄｉｃ）構造で、または少なくとも部分的に糖単位で、または少なくとも部分的にグリコール類もしくはアクリルアミドのような重合可能な小単位で構成されていることができる。
【００７１】
本発明に従う化合物中のスペーサーＳの長さは、望まれるように異なっていてよい。多様な長さの利用可能なスペーサー（ライブラリー）を容易に作製するために、そのようなライブラリーのスペーサーへの簡単な合成経路（ａｃｃｅｓｓ）を有することが好ましい。スペーサーの組み合わせ固相合成が好ましい。スペーサーは約１００ｎｍの長さまで合成されなければならないため、その合成戦略は、その単量体合成構築ブロックが固相合成の間に高い効率で組み立てられるような方法で選択される。単量体構築ブロックとしてのホスホラミダイトの組み立てに基づくデオキシオリゴヌクレオチドの合成は、完全にこの要求を満たす。そのようなスペーサー中で、スペーサー内の単量体単位は、それぞれの場合においてホスフェートまたはホスフェート類似体部分により連結されている。
【００７２】
そのスペーサーＳは、多官能性アミノカルボン酸の遊離の正または／および負に荷電した基、例えばアミノ、カルボキシレートまたはホスフェートを含有することができる。例えば、その電荷担体は、ａ）１個のアミノ基および２個のカルボキシレート基またはｂ）２個のアミノ基および１個のカルボキシレート基を含有する三官能性アミノカルボン酸に由来することができる。そのような三官能性アミノカルボン酸の例は、リシン、オルニチン、ヒドロキシリシン、α，β−ジアミノプロピオン酸、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸、カルボキシグルタミン酸ならびにEP-A-0 618 192またはUS-A-5,519,142において記述されている合成三官能性カルボン酸のような合成三官能性カルボン酸である。あるいは、その三官能性アミノカルボン酸ａ）中のカルボキシレート基の１つをホスフェート、スルホネートまたはサルフェート基により置き換えることができる。そのような三官能性アミノ酸の例はホスホセリンである。
【００７３】
そのスペーサーＳは、無電荷の親水基も含有することができる。無電荷の親水基の好ましい例は、エチレンオキシドまたは好ましくは少なくとも３個のエチレンオキシド単位を有するポリエチレンオキシド基、スルホキシド、スルホン、カルボン酸アミド、カルボン酸エステル、ホスホン酸アミド、ホスホン酸エステル、リン酸アミド、リン酸エステル、スルホン酸アミド、スルホン酸エステル、硫酸アミドおよび硫酸エステル基である。そのアミド基は、好ましくは第１級アミド基、特に好ましくはアミノ酸（例えばアミノ酸アスパラギンおよびグルタミン）側鎖基中のカルボン酸アミド残基である。そのエステルは好ましくは親水性アルコール類、特にＣ１〜Ｃ３アルコール類またはジオール類またはトリオール類に由来する。
【００７４】
１態様において、そのスペーサーＳは１タイプの単量体からなる。例えば、そのスペーサーは排他的にアミノ酸、糖残基、ジオール類、リン糖酸（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｕｇａｒ）単位からなり、またはそれはそれぞれ核酸であることができる。
【００７５】
１態様において、そのスペーサーはＤＮＡである。１つの好ましい態様において、そのスペーサーは、ベータ−Ｌ−ＤＮＡ、Ｌ−ＤＮＡまたは鏡像ＤＮＡとしても知られているＤＮＡのＬ−立体異性体である。Ｌ−ＤＮＡは、２本のＬ−ＤＮＡの相補的な一本鎖の間でのみ二本鎖が形成され、Ｌ−ＤＮＡの一本鎖および相補的なＤＮＡ鎖の間では二本鎖が形成されないことを意味する直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）ハイブリダイゼーション挙動、ヌクレアーゼ耐性、ならびに長いスペーサーでさえも合成が容易であることのような利点を特徴とする。指摘したように、合成の容易さおよびスペーサーの長さにおける変動可能性は、スペーサーライブラリーに関して重要である。変動可能な長さのスペーサーは、最適な長さのスペーサーを有する本発明に従う二価二重結合剤の同定、従って２個の一価結合剤の間の最適な距離の提供において極めて有用である。
【００７６】
スペーサー構築ブロックは、その名の通り、間隔を空ける部分をスペーサーＳの中に導入するために、またはリンカーａ−Ｓ−ｂのスペーサーＳを構築するために用いることができる。
【００７７】
異なる数および種類の非ヌクレオチド性ならびにヌクレオチド性スペーサー構築ブロックが、間隔を空ける部分を導入するためにすぐに利用できる。
多くの異なる非ヌクレオチド性二官能性スペーサー構築ブロックが文献において既知であり、多種多様なものが商業的に入手可能である。非ヌクレオチド性二官能性スペーサー構築の選択は、そのスペーサー分子の電荷および柔軟性に影響を及ぼす。
【００７８】
二官能性スペーサー構築ブロックにおいて、酸不安定性保護基で保護されたヒドロキシル基がホスホラミダイト基に連結されている。
１態様における二官能性スペーサー構築ブロックは、非ヌクレオシド性化合物である。例えば、そのようなスペーサーはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）炭素鎖であるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）鎖はそのリンカーの親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび／またはアミド部分または四級化された（ｑｕａｒｔｅｒｎｉｚｅｄ）陽イオン性アミン部分により遮られていてよい。場合により１または２個のＣ１〜Ｃ６アルキル基で置換されているＣ５〜Ｃ６−シクロアルキル、Ｃ４Ｎ、Ｃ５Ｎ、Ｃ４Ｏ、Ｃ５Ｏ−ヘテロシクロアルキル、フェニルのような環状部分も、非ヌクレオシド性二官能性スペーサー部分として用いることができる。好ましい二官能性構築ブロックは、Ｃ３〜Ｃ６アルキル部分およびトリ−〜ヘキサ−エチレングリコール鎖を含む。表Ｉは、異なる親水性、異なる剛性および異なる電荷を有するヌクレオチド性二官能性スペーサー構築ブロックのいくつかの例を示す。一方の酸素原子は酸不安定性保護基、好ましくはジメトキシトリチルに連結されており、他方はホスホラミダイトの一部である。
【００７９】
【表１】
0005913363.tif 000002
【００８０】
スペーサーＳを構築する、またはスペーサーＳ中に間隔を空ける部分を導入するための簡単な方法は、標準的なＤまたはＬヌクレオシドホスホラミダイト構築ブロックを用いることである。１態様において、一本鎖の一続きのｄＴが用いられる。ｄＴは塩基保護基を有しないため、これは好都合である。
【００８１】
二本鎖の長さは一本鎖と比較して低減し、二本鎖は一本鎖よりも堅いため、スペーサーの長さ（結合対のメンバーａおよびｂの間の距離）およびスペーサーの柔軟性を変化させるためにハイブリダイゼーションを用いることができる。
【００８２】
ハイブリダイゼーションに関して、１態様において、官能性部分Ｘで修飾されたオリゴヌクレオチドが用いられる。ハイブリダイゼーションのために用いられるオリゴヌクレオチドは、そのスペーサーとハイブリダイズしない１または２個の末端の延長部分を有することができ、および／またはそれは内部で分枝している。そのようなスペーサーとハイブリダイズしない（かつ結合対ａ：ａ’およびｂ：ｂ’に干渉しない）末端の延長部分は、さらなるハイブリダイゼーション事象のために用いることができる。１態様において、末端の延長部分とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは標識されたオリゴヌクレオチドである。この標識されたオリゴヌクレオチドも、さらなるハイブリダイゼーションを可能にするための末端の延長部分を含んでいてよく、または分枝していてよく、それによりポリヌクレオチドの凝集体またはデンドリマーを得ることができる。多数の標識（ｐｏｌｙｌａｂｅｌ）をもたらすために、またはＸの高い局所的濃度を得るために、好ましくはポリオリゴ核酸デンドリマーが用いられる。
【００８３】
１態様において、スペーサーＳは１〜１００ｎｍの主鎖の長さを有する。言い換えると、ここで式Ｉの基ａおよびｂは１〜１００ｎｍ離れている。１態様において、ａおよびｂはそれぞれ結合対のメンバーであり、そのスペーサーＳは１〜９５ｎｍの主鎖の長さを有する。
【００８４】
“ａ’：ａ”ならびに“ｂ：ｂ’”はそれぞれ独立して結合対を表し、またはそれぞれ共有結合したａ’：ａおよび／またはｂ：ｂ’を表す。
“ａ’：ａ”ならびに“ｂ：ｂ’”は異なる。異なるという用語は、ａ対ａ’の結合（結合対内結合または共有結合性カップリング）が他方の対ｂ対ｂ’の結合対内結合または共有結合性カップリングに干渉せず、逆もまた同じであることを示す。
【００８５】
１態様において、ａ’：ａまたはｂ：ｂ’のどちらかは共有結合しており、他方、すなわちそれぞれｂ：ｂ’またはａ’：ａは結合対を表す。
１態様において、ａ’：ａおよびｂ：ｂ’の両方が共有結合している。
【００８６】
ａ’：ａおよびｂ：ｂ’の間のカップリング化学は互いに異なっており、標準的なプロトコルから選択される。結合パートナーの、およびスペーサーの性質に応じて、適切なコンジュゲーション化学が選択される。
【００８７】
（ａ’）の（ａ）へのカップリングにおいて、すなわちＡ−（ａ’）の（ａ）を含むリンカーへのカップリングにおいて用いられる化学は、（ｂ）の（ｂ’）へのカップリングにおいて、すなわち（ｂ’）−Ｂの（ｂ）を含むリンカーへのカップリングにおいて用いられる化学に干渉しない。当業者は理解しているであろうように、それぞれ共有結合ａ’：ａならびにｂ：ｂ’をもたらす反応部位（ａ）、（ａ’）、（ｂ）および（ｂ’）は、それぞれ好ましくは一価結合剤（式ＩのＡおよび／またはＢ）上に存在する可能性のあるあらゆる官能基にも干渉しない。
【００８８】
その一価結合剤の少なくとも一方がタンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物である場合、それはおそらく１個以上のＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２および／またはＳＨ基を有し、それは潜在的に特定のカップリング試薬と反応する可能性がある。そのような（副）反応は、例えば表ＩＩにおいて示したカップリング化学の１つを選択することにより回避することができる。
【００８９】
表ＩＩは、Ａ−（ａ’）および（ｂ’）−Ｂそれぞれを両方ともリンカーに共有結合している（ａ−Ｓ−ｂ）（ａ）および（ｂ）それぞれに結合させるためのルーチン的に用いられる反応基に関する概要を提供する。
【００９０】
【表２】
0005913363.tif 000003
【００９１】
上記の双直交（ｂｉ−ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）カップリング化学は、例えばその一価結合剤の少なくとも一方がポリペプチドである場合に適切である。その２個の結合パートナーが一価結合剤ＡおよびＢとしてそれぞれ特定の反応性官能基を有していない場合、例えば２種類のアプタマーの組み合わせの場合、その反応部位（ａ’）、（ａ）、（ｂ）および（ｂ’）それぞれの選択にはより大きな自由度が存在する。従って、上記の表において示した対応する反応部位の対に加えて、またはそれとの組み合わせで、アミノ／活性エステル（例えばＮＨＳエステル）、およびＳＨ／ＳＨまたはＳＨ／マレインイミドを直交カップリングのために用いることができる。
【００９２】
上記の例から明らかであるように、ａ’：ａ間およびｂ：ｂ’間それぞれの共有結合の少なくとも一方はアルファアミノペプチド結合ではない。両方の共有結合がアルファアミノペプチド結合ではないことも好ましい。
【００９３】
１態様において、ａ’：ａおよびｂ：ｂ’の両方が結合対である。結果的に、１態様において、本発明は式Ｉ：Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂの少なくとも二重特異性の結合剤に関し；ここでＡは第１標的ポリペプチドのエピトープに結合する第１一価結合剤であり、ここでＢは第２標的ポリペプチド上のエピトープに結合する第２一価結合剤であり、ここでそれぞれの一価結合剤ＡおよびＢは５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、ここでａ’：ａならびにｂ：ｂ’は独立して結合対であり、かつ異なっており、ここでＳはスペーサーであり、ここで−は共有結合を表し、ここでそのリンカーａ−Ｓ−ｂは６〜１００ｎｍの長さを有し、ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有する。
【００９４】
この態様において、それぞれａおよびａ’は結合対ａ’：ａのメンバーであり、ｂおよびｂ’は結合対ｂ：ｂ’のメンバーである。好ましくは、結合対のそれぞれのメンバーは１０ｋＤ以下の分子量である。さらなるやはり好ましい態様において、そのような結合対のそれぞれの結合剤の分子量は８、７、６、５または４ｋＤ以下である。
【００９５】
１態様において、ａ’：ａおよびｂ：ｂ’は結合対であり、結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’のメンバーはロイシンジッパードメイン二量体およびハイブリダイズする核酸配列からなる群から選択される。１態様において、両方の結合対はロイシンジッパードメイン二量体を表す。１態様において、両方の結合対はハイブリダイズする核酸配列である。
【００９６】
ａ：ａ’またはｂ’：ｂが結合対を表す場合、そのような結合対に関する（そのような結合対内の）結合親和性は少なくとも１０８ｌ／ｍｏｌである。両方の結合対は異なる。ある結合対に関して、違いは例えば相互結合（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、例えばａならびにａ’のｂまたはｂ’に対する結合に関する親和性が対ａ：ａ’内の親和性の１０％以下である場合に認められる。その相互結合、すなわちａならびにａ’のｂまたはｂ’それぞれに対する結合が対ａ：ａ’内の親和性の５％以下である、またはそれが対ａ：ａ’内の親和性の２％以下である場合も好ましい。１態様において、その違いは、その相互（交差反応性）結合が結合対内の特異的結合親和性と比較して１％以下であるほど顕著である。
【００９７】
用語“ロイシンジッパードメイン”は、一続きのおおよそ３５残基中に７残基ごとにロイシン残基が存在することを特徴とする一般的に認識されている二量体化ドメインを示すために用いられている。ロイシンジッパードメインは、それらがあるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーはいくつかのＤＮＡ結合タンパク質中で最初に同定され(Landschulz, W.H. et al., Science 240 (1988) 1759-1764)、それ以来様々な異なるタンパク質中で見付かってきた。既知のロイシンジッパーの中には、二量体化または３量体化する天然存在ペプチドおよびその誘導体がある。可溶性多量体タンパク質を生成するのに適したロイシンジッパードメインの例がＰＣＴ出願国際公開第94/10308号において記述されており、そのロイシンジッパーはHoppe, H.J. et al., FEBS Lett. 344 (1994) 191-195において記述されている肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来する。
【００９８】
ロイシンジッパードメインは、アルファらせんのコイルドコイルにより一緒の状態を保たれた二量体（結合対）を形成する。コイルドコイルは一周につき３．５残基を有し、それは７残基ごとにそのらせんの軸に関して同等の位置を占めることを意味する。そのコイルドコイルの内側のロイシンの規則的な配列は、疎水性およびファンデルワールス相互作用によりその構造を安定化する。
【００９９】
ロイシンジッパードメインが第１結合対（ａ’：ａ）および第２結合対（ｂ：ｂ’）を形成する場合、両方のロイシンジッパー配列は異なり、すなわち、配列ａおよびａ’はｂおよびｂ’に結合しない。ロイシンジッパードメインは、そのようなドメインを含有することが既知である天然タンパク質、例えば転写因子から単離することができる。１つのロイシンジッパードメインが例えば転写因子ｆｏｓに由来し、第２のロイシンジッパードメインが転写因子ｊｕｎに由来することができる。ロイシンジッパードメインは合成および設計のための当技術で既知の標準的な技法を用いて人工的に設計および合成することもできる。
【０１００】
１つの好ましい態様において、結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’の両方のメンバー、すなわちａ、ａ’、ｂおよびｂ’はロイシンジッパードメインを表し、スペーサーＳはアミノ酸からなる。この態様において、コンストラクトａ−Ｓ−ｂの生成は容易に可能である。そのようなスペーサーＳの長さを望まれるように変えることは、当業者にとって簡単である。そのようなポリペプチドは合成することができ、または組み換えにより生成することができる。
【０１０１】
例えば、Ｎ末端においてロイシンジッパーペプチドに、そしてＣ末端においてロイシンジッパーペプチドに融合したスペーサーポリペプチドを含む組み換え融合タンパク質を、標準的な技法に従って適切な宿主細胞中で発現させることができる。望まれるペプチドスペーサーをコードするＤＮＡ配列を、第１ロイシンジッパードメインａのメンバーをコードする配列および同じ読み枠中で第２ロイシンジッパードメインｂのメンバーをコードするＤＮＡ配列の間に挿入することができる。
【０１０２】
そのスペーサーＳは、そのリンカーａ−Ｓ−ｂがポリペプチドである場合、１態様において、GGGGS (G4S) (SEQ ID NO:13)アミノ酸配列モチーフを１回または数回含む。そのスペーサーＳはタグ配列も含んでいてよい。そのタグ配列は、一般的に用いられるタンパク質認識タグ、例えばYPYDVPDYA(HA-タグ)(SEQ ID NO:14)またはGLNDIFEAQKIEWHE(Avi-タグ)(SEQ ID NO:15)から選択されてよい。
【０１０３】
１つの好ましい態様において、結合対（ａ’：ａ）および（ｂ：ｂ’）の両方がハイブリダイズする核酸配列である。
名称により既に示されているように、ａおよびａ’ならびにｂおよびｂ’はそれぞれ互いにハイブリダイズする。一方でａおよびａ’中に含まれる核酸配列と他方でｂおよびｂ’中に含まれる核酸配列は異なる。言い換えると、結合対ａ’：ａ中の配列はそれぞれ結合対ｂ：ｂ’の配列に結合せず、逆もまた同じである。１態様において、本発明は式Ｉの少なくとも二重の結合剤に関し、ここでその結合対ａ：ａ’およびｂ：ｂ’それぞれは両方ともハイブリダイズする核酸配列であり、ここでその異なる結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’のハイブリダイズする核酸配列は互いとハイブリダイズしない。言い換えると、ａおよびａ’は互いにハイブリダイズするが、ｂまたはｂ’のいずれにも結合せず、それらのハイブリダイゼーションにも干渉せず、逆もまた同じである。ハイブリダイゼーションの速度論およびハイブリダイゼーションの特異性は、融点分析により容易に監視することができる。結合対（例えばａ：ａ’）の特異的なハイブリダイゼーションおよび（例えばｂまたはｂ’への）不干渉は、対ａ：ａ’に関する融解温度がｂまたはｂ’とのあらゆる可能性のある組み合わせそれぞれ（すなわちａ：ｂ；ａ：ｂ’；ａ’：ｂおよびａ’：ｂ’）と比較して少なくとも２０℃高い場合に認められる。
【０１０４】
結合対、例えば（ａ：ａ’）またはあらゆる他の核酸配列に基づく結合対を形成する核酸配列は、あらゆる天然存在核酸塩基またはそれらに対する類似体を弱めて（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）よく、上記で記述したような改変された、もしくは改変されていない主鎖を、それが多数の塩基対合により安定な二本鎖を形成することができる限り、有していてよい。安定は、その二本鎖の融解温度が３７℃より高いことを意味する。好ましくは、その二本鎖は２本の完全に相補的な一本鎖からなる。しかし、３７℃における安定性が与えられる限り、ミスマッチまたは挿入が可能である。
【０１０５】
当業者は理解しているであろうように、核酸二本鎖は鎖間架橋によりさらに安定化され得る。いくつかの適切な架橋法、例えばソラレンを用いる、またはチオヌクレオシドに基づく方法が当業者に既知である。
【０１０６】
結合対のメンバーである核酸配列は、好ましくは１２〜５０ヌクレオチドからなる。そのような核酸配列が１５〜３５ヌクレオチドからなるであろうことも好ましい。
ＲＮアーゼは至る所にあり、ＲＮＡに基づく結合対および／またはスペーサー配列の望まれない消化を避けるために特別な注意を払わなければならない。例えばＲＮＡに基づく結合対および／またはスペーサーを用いることは確かに可能であるが、ＤＮＡに基づく結合対および／またはスペーサーが好ましい態様である。
【０１０７】
直交相補性オリゴヌクレオチドの２つより多くの対を提供するために、適切なハイブリダイズする核酸配列を容易に設計することができ、２つより多くの結合対の容易な生成および使用が可能になる。本発明の二重結合剤においてハイブリダイズする核酸配列を用いることの別の利点は、核酸配列中に容易に修飾を導入することができることである。修飾された構築ブロックは商業的に入手可能であり、それは例えば官能性部分を含むリンカーの容易な合成を可能にする。そのような官能性部分は、あらゆる望まれる位置において、構造ａおよびａ’ならびにｂおよびｂ’および／またはＳのいずれの中にも、それらがオリゴヌクレオチドを表す限り、容易に導入することができる。
【０１０８】
１つの好ましい態様において、式Ｉに従う結合剤中に含まれるスペーサーＳは核酸である。１つの好ましい態様において、両方の結合対がハイブリダイズする核酸配列であり、スペーサーＳも核酸である。この態様において、ａ−Ｓ−ｂからなるリンカーＬはオリゴヌクレオチドである。
【０１０９】
そのスペーサーＳならびに配列ａ、ａ’、ｂおよびｂ’が全てオリゴヌクレオチド配列である場合、Ｓならびに結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’それぞれのメンバーａおよびｂを含むリンカーＬに相当する単一のオリゴヌクレオチドを提供および合成することは、容易に可能である。その一価結合剤ＡおよびＢがそれぞれポリペプチドである場合、それらはそれぞれそのハイブリダイズする核酸配列ａ’およびｂ’それぞれに容易に連結することができる。そのようなコンストラクト中に含まれるスペーサーＳの長さは、あらゆる望まれる方法で容易に変えることができる。３つのコンストラクトａ−Ｓ−ｂ、Ａ−ａ’およびｂ’−Ｂを元にして、式Ｉの結合剤を、標準的な手順に従って、ａ’：ａおよびｂ：ｂ’それぞれの間のハイブリダイゼーションにより最も用意に得ることができる。異なる長さのスペーサーが用いられる場合、結果として得られるコンストラクトは他の点では同一の二重結合剤を提供するが、一価結合剤ＡおよびＢの間において異なる距離を有する。これは最適な距離および／または柔軟性を可能にする。
【０１１０】
１つの好ましい態様において、そのスペーサＳならびに配列ａ、ａ’、ｂおよびｂ’はＤＮＡである。
鏡像異性のＬ−ＤＮＡは、その直交ハイブリダイゼーション挙動、そのヌクレアーゼ耐性に関して、および変動可能な長さのオリゴヌクレオチドの合成の容易さに関して知られている。この適切なスペーサーを設計することによるリンカーの長さの変動の容易さは、本明細書で開示されるような結合剤のその抗原（単数または複数）への結合を最適化するために重要である。
【０１１１】
１つの好ましい態様において、そのリンカーＬ（＝ａ−Ｓ−ｂ）は鏡像異性のＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡである。１つの好ましい態様において、リンカーａ−Ｓ−ｂは鏡像異性のＬ−ＤＮＡである。１つの好ましい態様において、ａ、ａ’、ｂおよびｂ’ならびにそのスペーサーＳは鏡像異性のＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡである。１つの好ましい態様において、ａ、ａ’、ｂおよびｂ’ならびにそのスペーサーＳは鏡像異性のＬ−ＤＮＡである。
【０１１２】
１態様において、そのスペーサーＳはオリゴヌクレオチドであり、互いにハイブリダイズすることができる末端を含む２つの部分で合成される。この場合、そのスペーサーＳはこれらのハイブリダイズすることができる末端の互いとのハイブリダイゼーションにより簡単に構築することができる。結果として得られたスペーサーコンストラクトは、オリゴヌクレオチド二本鎖部分を含む。明らかであるように、そのスペーサーをその方法で解釈した（ｃｏｎｓｔｒｕｅｄ）場合、前記の二本鎖を形成するそのハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド構成要素の配列は、結合対ａ：ａ’およびｂ：ｂ’とのハイブリダイゼーションまたはそれらへの干渉が起こり得ないような様式で選択される。
【０１１３】
上記で示したように、本発明に従う二価結合剤は、１態様において、ポリペプチドホモ二量体に結合する。その２個の標的ポリペプチドがホモ二量体を形成する場合、同じ一価結合剤を２回用いることが好ましい。１態様において、本発明は式Ｉに従うタンパク質ホモ二量体に結合することができる二価結合剤に関し、ここでＳはポリヌクレオチドスペーサーであり、ここでその一価結合剤Ａは第１標的ポリペプチドに結合し、ここでその第２一価結合剤（通常はＢ）もＡであり、第２標的ポリペプチドに結合し、ここでａ’：ａおよびｂ：ｂ’は両方ともポリヌクレオチド結合対を表す。当業者には明らかであるように、その一価結合剤Ａにより結合されるエピトープはその標的ポリペプチド上に１回だけ存在していなければならず、または２個の異なる一価結合剤ＡおよびＢそれぞれにより認識されるエピトープは１回だけ存在していなければならず、かつその２個の一価結合剤が単一の単量体の標的ポリペプチド上に結合することを避けるために重複していなければならない。１態様において、その二価結合剤はホモ二量体に結合し、両方の一価結合剤は重複するエピトープに結合する。１態様において、その二価結合剤はホモ二量体に結合し、両方の一価結合剤が同じエピトープに結合する。
【０１１４】
本発明に従う二価結合剤がポリペプチドホモ二量体に結合する場合、単純化された方法を用いてそのような二価結合剤を構築することもできる。この態様において、その一価結合剤Ａを単一の種のハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド（ａ’）のみに連結することができ、そのリンカーをそれぞれがそのコンストラクトＡ−ａ’にハイブリダイズ可能な２個の末端を提供するように解釈する（ｃｏｎｓｔｒｕｅｄ）ことができる。この態様において、そのリンカーはａ−Ｓ−ａの形態であってよい。本明細書で示す実施例において、そのような特別なリンカーはアプタマーと呼ばれている。
【０１１５】
言及したように、１態様において、そのスペーサーＳはオリゴヌクレオチドであり、互いにハイブリダイズ可能な末端を含む２つの部分で合成される。この場合、そのスペーサーＳはこれらのハイブリダイズ可能な末端の互いとのハイブリダイゼーションにより簡単に構築することができ、その結果として得られるスペーサーコンストラクトはオリゴヌクレオチド二本鎖部分を含む。
【０１１６】
上記で示したように、本発明に従う二価結合剤は、１態様において、ポリペプチドヘテロ二量体に結合する。その２個の標的ポリペプチドがヘテロ二量体を形成する場合、２種類の異なる結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’をそれぞれ用いることが好ましい。１態様において、本発明は式Ｉに従う二価結合剤に関し、ここでＳはポリヌクレオチドスペーサーであり、ここでその一価結合剤Ａは第１標的ポリペプチドに結合し、ここでその第２一価結合剤Ｂは第２標的ポリペプチドに結合し、ここでＡおよびＢはその第１および第２標的ポリペプチドそれぞれに特異的に結合し、ここでａ’：ａおよびｂ：ｂ’は両方ともポリヌクレオチド結合対を表し、ここでａ’：ａおよびｂ：ｂ’は互いに結合も干渉もしない。
【０１１７】
上記で既に記述したように、式Ｉの一価特異的結合剤ＡおよびＢは核酸であってよい。本発明の１態様において、ａ’、ａ、ｂ、ｂ’、Ａ、ＢおよびＳは全てオリゴヌクレオチド配列である。この態様において、式ＩのサブユニットＡ−ａ’、ａ−Ｓ−ｂおよびｂ’−Ｂは標準的な手順に従って容易に、かつ独立して合成することができ、一般に用いられる標準的な手順に従ってハイブリダイゼーションにより組み合わせることができる。
【０１１８】
上記で詳細に論じたように、そのカップリングは共有結合性であることもでき、またはそれは特異的な結合対によることもできる。
当業者は容易に理解するであろうように、本発明に従う二価結合剤は１個以上の官能性部分を有するようにさらに修飾されてよい。そのような官能性部分Ｘは、好ましくは結合基、標識基、エフェクター基および反応基からなる群から選択される。
【０１１９】
１個より多くの官能性部分Ｘが存在する場合、それぞれのそのような官能性部分はそれぞれの場合において独立して結合基、標識基、エフェクター基または反応基であることができる。
【０１２０】
１態様において、その官能性部分Ｘは好ましくは結合基、標識基およびエフェクター基からなる群から選択される。
１態様において、その基Ｘは結合基である。当業者には明らかであるように、その結合基Ｘは対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’に干渉しないように選択されるであろう。
【０１２１】
結合基の例はバイオアフィン（ｂｉｏａｆｆｉｎｅ）結合対のパートナーであり、それはそのバイオアフィン結合対の他方のパートナーと特異的に相互作用することができる。適切なバイオアフィン結合対は、ハプテンまたは抗原および抗体；ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン；糖およびレクチン、オリゴヌクレオチドおよび相補性オリゴヌクレオチド、受容体およびリガンド、例えばステロイドホルモン受容体およびステロイドホルモンである。１態様において、Ｘは結合基であり、式Ｉの化合物のａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１つに共有結合している。好ましくは、バイオアフィン結合対のより小さいパートナー、例えばビオチンもしくはそれに対する類似体、受容体リガンド、ハプテンまたはオリゴヌクレオチドは、上記で定義されたようなａ’、ａ、Ｓ、ｂまたはｂ’の少なくとも（ａｔ  ｌｅｓｔ）１個に共有結合している。
【０１２２】
１態様において、官能性部分Ｘは、ハプテン；ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン；オリゴヌクレオチドおよびステロイドホルモンから選択される結合基である。
【０１２３】
１態様において、その官能性部分Ｘは反応基である。その反応基は、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシレート、ヒドロキシル、アジド、アルキニル（Ａｌｋｉｎｙｌ）またはアルケニルのようなあらゆる既知の反応基から選択することができる。１態様において、その反応基はマレインイミド、スクシンイミジル、ジチオピリジル、ニトロフェニルエステル、ヘキサフルオロフェニルエステルから選択される。
【０１２４】
１態様において、その官能性部分Ｘは標識基である。その標識基はあらゆる既知の検出可能な基から選択することができる。当業者は、最少の消光での最高の感度のために適切であるように標識の数を選択するであろう。
【０１２５】
その標識基はあらゆる既知の検出可能な基から選択することができる。１態様において、その標識基は、色素、例えば発光標識基、例えば化学発光基、例えばアクリジニウムエステル類もしくはジオキセタン類、または蛍光色素、例えばフルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンおよびそれらの誘導体、発光性金属錯体、例えばルテニウムもしくはユーロピウム錯体、ＣＥＤＩＡ（クローン化酵素供与体免疫アッセイ（Ｃｌｏｎｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｄｏｎｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、例えば欧州特許第0 061 888号）に関して用いられるような酵素、微粒子もしくはナノ粒子、例えばラテックス粒子または金属ゾル、ならびに放射性同位体から選択される。
【０１２６】
１態様において、その標識基は発光性金属錯体であり、その化合物は一般式（ＩＩ）の構造を有し：
［Ｍ（Ｌ１Ｌ２Ｌ３）］ｎ  −  Ｙ  −  ＸｍＡ          （ＩＩ）
式中、Ｍは希土類または遷移金属イオンから選択される二価または三価金属陽イオンであり、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は同じまたは異なっており、少なくとも２個の窒素含有複素環を有するリガンドを示し、ここでＬ１、Ｌ２およびＬ３はその金属陽イオンに窒素原子を介して結合しており、ＸはリンカーＹを介してそのリガンドＬ１、Ｌ２およびＬ３の少なくとも１個に共有結合している反応性官能基であり、ｎは１から１０まで、好ましくは１から４までの整数であり、ｍは１または２、好ましくは１であり、Ａは電荷を等しくするために必要である可能性のある対イオンを示す。
【０１２７】
その金属錯体は好ましくは発光性金属錯体、すなわち適切な励起後に検出可能な発光反応を経る金属錯体である。その発光反応は、例えば蛍光または電気化学発光測定により検出することができる。この錯体中の金属陽イオンは、例えば遷移金属または希土類金属である。その金属は好ましくはルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロムまたはタングステンである。ルテニウム、イリジウム、レニウム、クロムおよびオスミウムが特に好ましい。ルテニウムが最も好ましい。
【０１２８】
リガンドＬ１、Ｌ２およびＬ３は、少なくとも２個の窒素含有複素環を有するリガンドである。芳香族複素環、例えばビピリジル、ビピラジル、ターピリジルおよびフェナントロリルが好ましい。そのリガンドＬ１、Ｌ２およびＬ３は、特に好ましくはビピリジンおよびフェナントロリン環系から選択される。
【０１２９】
その錯体はさらに電荷を等しくするための１個または数個の対イオンＡを含有することができる。適切な負に荷電した対イオンの例は、ハロゲン化物、ＯＨ−、カーボネート、アルキルカルボキシレート、例えばトリフルオロアセテート、サルフェート、ヘキサフルオロホスフェートおよびテトラフルオロボレート基である。ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロアセテートおよびテトラフルオロボレート基が特に好ましい。適切な正に荷電した対イオンの例は、一価陽イオン、例えばアルカリ金属およびアンモニウムイオンである。
【０１３０】
さらに好ましい態様において、その官能性部分Ｘはエフェクター基である。好ましいエフェクター基は療法上有効物質である。
療法上有効物質は、例えば癌の抑制においてそれらが有効である方式が異なる。それらはアルキル化により、架橋により、またはＤＮＡの二本鎖の切断によりＤＮＡ鋳型を損傷することができる。他の療法上有効物質はインターカレーションによりＲＮＡ合成を遮断することができる。一部の薬剤は紡錘体毒、例えばビンカアルカロイド類、または酵素活性を阻害する抗代謝剤、またはホルモン性薬剤および抗ホルモン性薬剤である。エフェクター基Ｘは、アルキル化剤、抗代謝剤、抗腫瘍性抗生物質、ビンカアルカロイド類、エピポドフィロトキシン類、ニトロソ尿素類、ホルモン性薬剤および抗ホルモン性薬剤、ならびに毒素から選択されてよい。
【０１３１】
現在より好ましいアルキル化剤は、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、チオテパ、イホスファミド、ナイトロジェンマスタードにより例示することができる。
【０１３２】
現在より好ましい抗代謝剤は、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、６−チオグアニン、６−メルカプトプリンにより例示することができる。
現在より好ましい抗腫瘍性抗生物質は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イドルビシン（ｉｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ニミトキサントロン（ｎｉｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎ）、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、およびプリカマイシンにより例示することができる。
【０１３３】
現在より好ましい紡錘体毒はメイタンシンおよびメイタンシノイド類により例示することができ、ビンカアルカロイド類およびエピポドフィロトキシン類はビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデスチン（ｖｉｎｄｅｓｔｉｎ）、エトポシド、テニポシドにより例示することができる。
【０１３４】
現在より好ましいニトロソ尿素類は、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシンにより例示することができる。
現在より好ましいホルモン性薬剤および抗ホルモン性薬剤は、アドレノコルチコルチコイド類（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ）、エストロゲン類、抗エストロゲン剤、プロゲスチン類、アロマターゼ阻害剤、アンドロゲン類、抗アンドロゲン剤により例示することができる。
【０１３５】
追加の好ましい無作為な合成薬剤は、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、プロカルバジド（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｄｅ）、シスプラチン、カルボプラチンにより例示することができる。
【０１３６】
官能性部分Ｘは、共有結合的に、または追加の結合対を介してのどちらかで、例えば（ａ’）、（ａ）、（ｂ）、（ｂ’）またはＳの少なくとも１つに結合している。その官能性部分Ｘは１回または数（ｎ）回存在することができる。（ｎ）は整数であり、１または１より大きい。好ましくは、（ｎ）は１〜１００である。（ｎ）が１〜５０であることも好ましい。特定の態様において、ｎは１〜１０、または１〜５である。さらなる態様において、ｎは１または２である。
【０１３７】
官能性部分Ｘのａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１つへの共有結合に関して、あらゆる適切なカップリング化学を用いることができる。当業者はそのようなカップリング化学を標準的なプロトコルから容易に選択することができる。ａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳを合成する際に適切な構築ブロックの使用により官能性部分を組み込むことも可能である。
【０１３８】
１つの好ましい態様において、官能性部分Ｘは式Ｉにより定義されるような結合剤のａ、ｂ、またはＳに結合している。
１つの好ましい態様において、官能性部分Ｘは式Ｉにより定義されるような結合剤のスペーサーＳに結合している。
【０１３９】
１つの好ましい態様において、官能性部分Ｘは式Ｉにより定義されるような結合剤のａ、ｂ、またはＳに共有結合している。
官能性部分Ｘがａ、ａ’、ｂまたはｂ’それぞれに相当するハイブリダイズするオリゴヌクレオチド内に位置する場合、好ましくはそのような官能性部分は修飾されたヌクレオチドに結合しており、またはヌクレオシド間のＰ原子に結合している（国際公開第2007/059816号）。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに干渉しない修飾されたヌクレオチドがそれらのオリゴヌクレオチド中に組み込まれる。そのような修飾されたヌクレオチドは、好ましくはＣ５置換ピリミジン類またはＣ７置換７デアザプリン類である。
【０１４０】
オリゴヌクレオチドは、内部で、または５’もしくは３’末端において、官能性部分の導入のために用いられる非ヌクレオチド性構成要素で修飾することができる。好ましくは、そのような非ヌクレオチド性構成要素はスペーサーＳの内部、すなわち２個の結合対メンバーａおよびｂの間に位置している。
【０１４１】
スペーサーの構築のための多くの異なる非ヌクレオチド性修飾剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）構築ブロックが文献において既知であり、多種多様なものが商業的に入手可能である。官能性部分の導入に関して、非ヌクレオシド性二官能性修飾剤構築ブロックまたは非ヌクレオシド性の三官能性修飾された構築ブロックのどちらも、末端標識のためのＣＰＧとして、または内部標識のためのホスホラミダイトとしてのどちらでも用いられる（Wojczewski, C. et al., Synlett 10 (1999) 1667-1678参照）。
【０１４２】
二官能性修飾剤構築ブロック
二官能性修飾剤構築ブロックは、官能性部分または（必要であれば）保護された官能性部分をホスホラミダイト基に、その構築ブロックを成長しているオリゴヌクレオチド鎖の末端のヒドロキシル基に５’末端において（通常の合成）または３’末端において（逆向きの合成）取り付けるために連結する。
【０１４３】
二官能性修飾剤構築ブロックは、好ましくは非ヌクレオシド性化合物である。例えば、そのような修飾された構築ブロックはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル炭素鎖であるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニル鎖はそのスペーサーの、それによりリンカー構造全体の親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび／またはアミド部分により遮られていてよい。場合により１または２個のＣ１〜Ｃ６アルキル基で置換されているＣ５〜Ｃ６−シクロアルキル、Ｃ４Ｎ、Ｃ５Ｎ、Ｃ４Ｏ、Ｃ５Ｏ−ヘテロシクロアルキル、フェニルのような環状部分も、非ヌクレオシド性の二官能性修飾された構築ブロックとして用いることができる。好ましい修飾された二官能性構築ブロックは、Ｃ３〜Ｃ６アルキル部分およびトリ−〜ヘキサ−エチレングリコール鎖を含む。二官能性修飾剤構築ブロックの限定的でないが好ましい例を、下記の表ＩＩＩにおいて示す。
【０１４４】
【表３】
0005913363.tif 000004
【０１４５】
三官能性修飾剤構築ブロック
三官能性構築ブロックは、（ｉ）官能性部分または（必要であれば）保護された官能性部分、（ｉｉ）レポーターまたは官能性部分または（必要であれば）保護された官能性部分をオリゴヌクレオチド合成の間に成長しているオリゴヌクレオチド鎖のヒドロキシル基に連結するためのホスホラミダイト基、および（ｉｉｉ）酸不安定性保護基で、好ましくはジメトキシトリチル保護基で保護されているヒドロキシル基を連結する。この酸不安定性保護基を除去した後、ヒドロキシル基が解放され、それはさらなるホスホラミダイトと反応することができる。従って、三官能性構築ブロックは官能性部分をオリゴヌクレオチド内のあらゆる位置に配置することを可能にする。三官能性構築ブロックは、固体支持体、例えば制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）を用いる合成にも必須であり、それはオリゴヌクレオチドの３’末端標識のために用いられる。この場合、その三官能性構築ブロックは官能性部分または（必要であれば）保護された官能性部分にＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）炭素鎖を介して連結されるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｙｉｎｙｌ）鎖はそのスペーサーの、それによりリンカー構造全体の親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび／またはアミド部分により遮られていてよく、切断可能なスペーサーを介して固体支持体に結合したヒドロキシル基および酸不安定性保護基で保護されたヒドロキシル基を含む。この保護基の除去の後、ヒドロキシル基が解放され、次いでそれはホスホラミダイトと反応することができるであろう。
【０１４６】
三官能性構築ブロックは非ヌクレオシド性またはヌクレオシド性であってよい。
非ヌクレオシド性三官能性構築ブロックはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル炭素鎖であるが、前記のアルキル、アルケニル、アルキニルはそのスペーサーの、それによりリンカー構造全体の親水性を増大させるために追加のエチレンオキシおよび／またはアミド部分により遮られている。他の三官能性構築ブロックは、場合により１または２個のＣ１〜Ｃ６アルキル基で置換されているＣ５〜Ｃ６−シクロアルキル、Ｃ４Ｎ、Ｃ５Ｎ、Ｃ４Ｏ、Ｃ５Ｏヘテロシクロアルキル、フェニルのような環式基である。環式および非環式基は１個の−（Ｃ１〜Ｃ１８）アルキル−Ｏ−ＰＧ基により置換されていてよいが、前記のＣ１〜Ｃ１８アルキルは（エチレンオキシ）ｎ、（アミド）ｍ部分を含み、ｎおよびｍは互いに独立して０〜６であり、ＰＧは酸不安定性保護基である。好ましい三官能性構築ブロックは、場合により１個のアミド結合を含みＣ１〜Ｃ６アルキルＯ−ＰＧ基で置換されたＣ３〜Ｃ６アルキル、シクロアルキル、Ｃ５Ｏヘテロシクロアルキル部分であり、ここでＰＧは酸不安定性保護基、好ましくはモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ピキシル、キサンチル、最も好ましくはジメトキシトリチルである。
【０１４７】
非ヌクレオシド性三官能性構築ブロックに関する限定的でないが好ましい例が、例えば表ＩＶにおいて要約されている。
【０１４８】
【表４−１】
0005913363.tif 000005
【０１４９】
【表４−２】
0005913363.tif 000006
【０１５０】
ヌクレオシド性修飾剤構築ブロック：
ヌクレオシド性修飾剤構築ブロックは、未修飾のオリゴヌクレオチドと比較してそのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性に影響を及ぼさない必要がある場合に内部標識のために用いられる。従って、ヌクレオシド性構築ブロックは、なお相補的塩基とハイブリダイズすることができる塩基または塩基類似体を含む。本発明の式Ｉに従う結合剤中に含まれるａ、ａ’、ｂ、ｂ’またはＳの１個以上の核酸配列を標識するための標識化合物の一般式は、式ＩＩにおいて与えられる。
【０１５１】
【化１】
0005913363.tif 000007
【０１５２】
式中、ＰＧは酸不安定性保護基、好ましくはモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ピキシル、キサンチル、最も好ましくはジメトキシトリチルであり、ここでＹはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）であり、ここで前記のアルキル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）はエチレンオキシおよび／またはアミド部分を含んでいてよく、ここでＹは好ましくはＣ４〜Ｃ１８アルキル、アルケニルまたはアルキニル（ａｌｋｉｎｙｌ）であり、１個のアミド部分を含有し、ここでＸは官能性部分であり、それに標識を結合させることができる。
【０１５３】
その塩基の具体的な位置は、そのような置換に関してハイブリダイゼーション特性への影響が最小限になるように選択されてよい。従って、以下の位置が置換に関して好ましい：ａ）天然塩基に関して：Ｃ５で置換されたウラシル；Ｃ５で、またはＮ４で置換されたシトシン；Ｃ８で、またはＮ６で置換されたアデニン、およびＣ８で、またはＮ２で置換されたグアニン、ならびにｂ）塩基類似体に関して：Ｃ７で置換された７デアザＡおよび７デアザＧ；Ｃ７で置換された７デアザ８アザＡおよび７デアザ８アザＧ；Ｃ７で置換された７デアザアザ２アミノＡ；Ｎ１で置換されたプソイドウリジンおよびＮ２で置換されたホルマイシン。
【０１５４】
ヌクレオシド性三官能性構築ブロックに関する限定的でないが好ましい例を表Ｖにおいて示す。
【０１５５】
【表５−１】
0005913363.tif 000008
【０１５６】
【表５−２】
0005913363.tif 000009
【０１５７】
【表５−３】
0005913363.tif 000010
【０１５８】
表ＩＩＩ、ＩＶおよびＶにおいて、二官能性部分の末端の酸素原子の１個または三官能性部分の末端の酸素原子の１個はホスホラミダイトの一部であり、それは完全に詳細には示されていないが当業者には明らかである。三官能性構築ブロックの第２の末端の酸素原子は、上記で式ＩＩに関して定義されたように、酸不安定性保護基ＰＧで保護されている。
【０１５９】
合成後修飾は、共有結合した官能性部分をリンカーまたはスペーサー分子中に導入するための別の戦略である。このアプローチにおいて、固相合成の間に二官能性または三官能性構築ブロックを用いることによりアミノ基が導入される。そのアミノ修飾されたオリゴヌクレオチドの支持体からの切断および精製の後、官能性部分の活性化されたエステルと、またはその中の１個の官能基が活性エステルである二官能性試薬と反応させる。好ましい活性エステルはＮＨＳエステルまたはペンタフルオロ（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒ）フェニルエステル類である。
【０１６０】
合成後修飾は、固相合成および脱保護の間に安定でない官能性部分を導入するために特に有用である。例は、シュタウディンガーライゲーションのためのトリフェニルホスフィンカルボキシメチルエステルによる修飾(Wang, C.C. et al., Bioconjugate Chemistry 14 (2003) 697-701)、ジゴキシゲニンによる、または商業的に入手できるスルホＳＭＣＣを用いてマレインイミド基を導入するための修飾である。
【０１６１】
官能性部分Ｘは、１態様において、ａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１個に追加の結合対を介して結合している。
官能性部分Ｘを結合させることができる追加の結合対は、好ましくはロイシンジッパードメインまたはハイブリダイズする核酸である。その官能性部分Ｘがａ’、ａ、ｂ、ｂ’またはＳの少なくとも１個に追加の結合対のメンバーを介して結合している場合、Ｘが結合している結合対のメンバーならびに結合対ａ’：ａおよびｂ：ｂ’それぞれは全て異なる特異性を有するように選択される。その結合対ａ：ａ’、ｂ：ｂ’およびＸが結合している結合対はそれぞれ、その他の結合対のいずれの結合にも干渉せずに、それらのそれぞれのパートナーに結合する（例えばハイブリダイズする）。
【０１６２】
結合対のメンバーの一価結合剤への共有結合性カップリング
その結合剤の生化学的性質に応じて、異なるコンジュゲーション戦略がすぐに利用できる。
【０１６３】
その結合剤が５０〜５００アミノ酸の天然存在タンパク質または組み換えポリペプチドである場合、タンパク質コンジュゲートの合成に関する化学を記述する教本中に標準的な手順があり、当業者は容易にそれに従うことができる(Hackenberger, C.P. and Schwarzer, D., Angew. Chem., Int. Ed., 47 (2008) 10030-10074)。
【０１６４】
１態様において、マレインイミド部分のそのタンパク質内のシステイン残基との反応が用いられる。これは、例えば抗体のＦａｂまたはＦａｂ’断片が一価結合剤として用いられる場合に好ましいカップリング化学である。あるいは、１態様において、結合対のメンバー（式Ｉのａ’またはｂ’それぞれ）のその結合剤ポリペプチドのＣ末端へのカップリングが実施される。タンパク質の、例えばＦａｂ断片のＣ末端修飾は、例えばSunbul, M. et al., Organic & Biomolecular Chemistry 7 (2009) 3361-3371により記述されたように実施することができる。
【０１６５】
一般に、結合対のメンバーの一価ポリペプチド性結合剤への部位特異的反応および共有結合性カップリングは、天然アミノ酸をタンパク質中に存在する他の官能基の反応性に対して直交性である反応性を有するアミノ酸に変換することに基づく。例えば、稀な配列前後関係（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ）内の特定のシステインをアルデヒド中で酵素的に変換することができる（ホルミルグリシンアルデヒドタグ−新規の翻訳後修飾によるタンパク質工学(Frese, M.-A. et al., ChemBioChem 10 (2009) 425-427)を参照)。特定の酵素の所与の配列前後関係中の天然アミノ酸との特異的な酵素反応性を利用することにより望まれるアミノ酸修飾を得ることも可能である（例えば以下の参考文献を参照：Taki, M. et al., Protein Engineering, Design & Selection 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al., Chemistry & Biology 15 (2008) 128-136;プロテアーゼに触媒されるＣ−Ｎ結合の形成がBordusa, F., HighlightsによりBioorganic Chemistry (2004) 389-403において用いられており、ソルターゼ（Ｓｏｒｔａｓｅ）に媒介されるタンパク質ライゲーションがMao, H.らによりJ. Am Chem Soc. 126 (2004) 2670-2671において用いられており、Proft, T.によりBiotechnol. Lett 32 (2010) 1-10において総説されている）。
【０１６６】
結合対のメンバーの一価ポリペプチド性結合剤への部位特異的反応および共有結合性カップリングは、末端のアミノ酸の適切な修飾試薬との選択的反応によっても達成することができる。
【０１６７】
Ｎ末端システインのベンゾニトリル類との反応性(Ren, Hongjun et al., Angewandte Chemie, International Edition 48 (2009) 9658-9662)を、部位特異的共有結合性カップリングを達成するために用いることができる。
【０１６８】
天然型（Ｎａｔｉｖｅ）化学的ライゲーションはＣ末端システイン残基に頼ることもできる(Taylor, E. et al., Nucleic Acids and Molecular Biology 22 (2009) 65-96)。
欧州特許第1 074 563号は、一続きの負に荷電したアミノ酸内のシステインの一続きの正に荷電したアミノ酸中に位置するシステインとのより速い反応に基づくコンジュゲーション法を記述している。
【０１６９】
その一価結合剤は、合成ペプチドまたはペプチド模倣物であってもよい。ポリペプチドが化学的に合成される場合、直交性化学反応性を有するアミノ酸をそのような合成の間に組み込むことができる(de Graaf, A.J. et al., Bioconjugate Chemistry 20 (2009) 1281-1295)。多種多様な直交性官能基が賭かっており（ａｔ  ｓｔａｋｅ）、合成ペプチド中に導入することができるため、そのようなペプチドのリンカー中へのコンジュゲーションは標準的な化学である。
【０１７０】
単一標識された（ｍｏｎｏ−ｌａｂｅｌｅｄ）タンパク質を得るため、１：１の化学量論を有するコンジュゲートをクロマトグラフィーにより他のコンジュゲーション産物から分離することができる。この手順は色素標識された結合対のメンバーおよび荷電したスペーサーを用いることにより促進される。この種類の標識された、および高度に負に荷電した結合対のメンバーを用いることにより、電荷および分子量の違いを分離のために用いることができるため、１コンジュゲート化タンパク質が未標識のタンパク質および１個より多くのリンカーを有するタンパク質から容易に分離される。その蛍光色素は、二価結合剤（ｂｉｎｄｉｇ  ａｇｅｎｔ）を標識された一価結合剤のような未結合の構成要素から精製するために役立つ。
【０１７１】
従って、１態様において、本発明の二価結合剤を形成するために、（例えば合成の間に二官能性または三官能性修飾剤構築ブロックを二官能性スペーサー構築ブロックとの組み合わせで用いて合成された）蛍光色素で標識されている結合対のメンバー（式Ｉのａ’および／またはｂ’それぞれ）を用いることが好ましい。１つの好ましい態様において、そのスペーサーＳならびにその配列ａ、ａ’、ｂおよびｂ’はＤＮＡであり、ａ’またはｂ’それぞれの少なくとも一方は蛍光色素で標識されている。１つの好ましい態様において、そのスペーサーＳならびにその配列ａ、ａ’、ｂおよびｂ’はＤＮＡであり、ａ’およびｂ’それぞれは両方ともそれぞれ異なる蛍光色素で標識されている。
【０１７２】
１態様において、ポリペプチド二量体に特異的に結合する二価結合剤を製造するための方法を開示する。その方法は、以下の工程を含む：（ａ）第１標的ポリペプチドに５×１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合する第１一価結合剤を選択し、（ｂ）第２標的ポリペプチドに５×１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合する第２一価結合剤を選択し、ｃ）両方の一価結合剤をリンカーにより連結し、そしてｄ）３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓ値を有する二価結合剤を選択する。
【０１７３】
本発明において開示されるような方法を用いて、それぞれが異なる長さのリンカーを含む様々な二価結合剤を製造すること、および望まれる結合特性、すなわち３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓ値を有するそれらの二価結合剤を選択することは、今ではかなり容易である。望まれるＫｄｉｓｓを有する二価結合剤の選択は、１態様において、実施例２．８において開示されるようなＢｉａｃｏｒｅ（商標）分析により実施される。
【０１７４】
１態様において、本発明は本発明に従う二価結合剤を形成する方法に関し、ここで、第１標的ポリペプチドに１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合し、第１結合対のメンバーに連結された第１一価結合剤、第２標的ポリペプチドに１０−３／秒〜１０−４／秒のＫｄｉｓｓで結合し、第２結合対のメンバーに連結された第２一価結合剤、ならびにスペーサーならびにその第１および第２結合対のメンバーに対する相補的な結合対のメンバーを含むリンカーそれぞれを一緒に保温し、それにより３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓ値を有する二価結合剤が形成され、ここでその第１および第２結合対は互いに干渉しない。
【０１７５】
当業者は理解しているであろうように、そのＫｄｉｓｓは温度依存性の値である。理論上、両方の一価結合剤の、ならびに本発明に従う二価結合剤のＫｄｉｓｓ値は同じ温度で決定される。理解されるであろうように、好ましくはＫｄｉｓｓ値はその二価結合剤が用いられることになる、例えばアッセイが実施されることになる温度と同じ温度で決定される。１態様において、そのＫｄｉｓｓ値は室温で、すなわち２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃または２５℃それぞれで確立される。１態様において、そのＫｄｉｓｓ値は４または８℃それぞれで確立される。１態様において、そのＫｄｉｓｓ値は２５℃で確立される。１態様において、そのＫｄｉｓｓ値は３７℃で確立される。１態様において、そのＫｄｉｓｓ値は４０℃で確立される。１つの好ましい態様において、Ｋｄｉｓｓの決定、すなわちそれぞれの一価結合剤に関するＫｄｉｓｓの決定および二重結合剤に関するＫｄｉｓｓの決定は３７℃においてなされる。
【０１７６】
１態様において、上記の方法はさらにその二価結合剤を単離する工程を含む。
本発明に従う二価結合剤の形成または組み立てに関する好ましい化学量論比は１：１：１である。
【０１７７】
１つの好ましい態様において、本発明に従う二価結合試薬を製造する方法はＬ−ＤＮＡリンカーを利用する。１つの好ましい態様において、本発明に従う二価結合試薬を製造する方法はＤＮＡ、好ましくはＬ−ＤＮＡからなる２個の特異的な結合対およびＬ−ＤＮＡリンカーを利用する。
【０１７８】
二価結合剤の形成および形成された二価結合剤の化学量論は、現状技術の手順に従うサイズ排除クロマトグラフィーにより分析することができる。望まれるならば、その形成された複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析することもできる。
【０１７９】
免疫組織化学染色手順において用いられる場合、この発明で開示される二価結合剤のみが著しく結合し、それが３×１０−５／秒またはより優れたＫｄｉｓｓを有する場合、そのような手順の様々な保温工程の間に洗い落とされない。このＫｄｉｓｓは、両方の一価結合剤がそれらの対応する結合部位に結合する場合にのみ達成され得る。その２個の標的ポリペプチドの１個の上の１つのエピトープのみが存在する場合、すなわちそのポリペプチドが単量体であり二量体ではない場合、著しい染色は見られないであろう。従って、そしてこれは非常に好都合なことだが、免疫組織化学染色はポリペプチド二量体がその試料中に存在する場合にのみ観察されるであろう。
【０１８０】
従って、好ましい態様において、本発明は組織染色法に関し、その方法は以下の工程を含む：（ａ）細胞または組織試料を提供し、（ｂ）前記の試料をリンカーを介して互いに連結された２個の一価結合剤からなる二価結合剤と共に保温し、ここで第１一価結合剤は第１ポリペプチドに結合し、第２一価結合剤は第２ポリペプチドに結合し、それぞれの一価結合剤は５×１０−３／秒〜１０−４／秒の範囲のＫｄｉｓｓを有し、ここでその二価結合剤は３×１０−５／秒以下のＫｄｉｓｓを有し、そして（ｃ）その二価結合剤を検出し、それにより前記の試料を目的のポリペプチド二量体に関して染色する。
【０１８１】
本発明に従う二価結合剤の免疫組織化学的方法による細胞または組織試料の染色における使用は、さらなる好ましい態様である。
より一般的に言うと、本発明はリンカーを介して互いに連結された２個の一価結合剤からなる二価結合剤に関し、その結合剤は標的ポリペプチド二量体に（自動化された）アッセイ系の要求を満たすＫｄｉｓｓまたはよりよいＫｄｉｓｓで結合し、ここで（ａ）第１一価結合剤は第１標的ポリペプチドにその（自動化された）アッセイ系の要求より少なくとも１０倍上の（より悪い）Ｋｄｉｓｓで結合し、（ｂ）第２一価結合剤は第２標的ポリペプチドにその（自動化された）アッセイ系の要求より少なくとも１０倍上のＫｄｉｓｓで結合し、そして（ｃ）ここでその２種類の一価結合剤（ａ）および（ｂ）のＫｄｉｓｓ値の積は少なくともその（自動化された）系により要求されるＫｄｉｓｓ以下である。
【０１８２】
一般的に言うと、２個の標的ポリペプチドを含むポリペプチド二量体に少なくとも（自動化された）アッセイ系の最小限のアッセイ要求を満たすＫｄｉｓｓまたはよりよいＫｄｉｓｓで特異的に結合する二価結合剤を得るための方法が記述され、その方法は以下の工程を含む：（ａ）第１標的ポリペプチドにその（自動化された）アッセイ系の最小限のアッセイ要求より少なくとも１０倍上のＫｄｉｓｓで結合する第１一価結合剤を選択し、（ｂ）第２標的ポリペプチドにその（自動化された）アッセイ系の最小限のアッセイ要求より少なくとも１０倍上のＫｄｉｓｓで結合する第２一価結合剤を選択し、ここで工程（ａ）および（ｂ）におけるその２種類の一価結合剤のＫｄｉｓｓ値の積は少なくともその（自動化された）系により要求されるＫｄｉｓｓ以下であり、そして（ｃ）両方の一価結合剤をリンカーにより連結する。
【０１８３】
１態様において、その自動化された系はＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（ツーソン）が流通させているようなＢｅｎｃｈｍａｒｋ（登録商標）分析器である。
【０１８４】
以下の実施例、配列リストおよび図は本発明の理解を助けるために提供されており、その正確な範囲は添付された特許請求の範囲において述べられている。述べられた手順において本発明の精神から逸脱することなく修正を行うことができることは理解されている。
【０１８５】
配列リストの記述
１．抗体断片
【０１８６】
【化２】
0005913363.tif 000011
【０１８７】
２．ｓｓＤＮＡの配列
ａ）  １９塩基長ｓｓＤＮＡ（３’末端により抗トロポニンＴ  ＭＡＢ  ｂのＦａｂ’またはリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒに対するＦａｂ’  ８．１．２それぞれに共有結合している）
5’-A GTC TAT TAA TGC TTC TGC-3’(SEQ ID NO:5)
ｂ）１７塩基長ｓｓＤＮＡ（５’末端により抗トロポニンＴ  ＭＡＢ  ａのＦａｂ’またはＩＧＦ−１Ｒに対するＦａｂ’  １．４．１６８それぞれに共有結合している）
5’-AGT TCT ATC GTC GTC CA-3’(SEQ ID NO:6)
ｃ）相補性１９塩基長ｓｓＤＮＡ（リンカーの一部として用いられる）
5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-3’(SEQ ID NO:7)
ｄ）相補性１７塩基長ｓｓＤＮＡ（リンカーの一部として用いられる）
5’-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’(SEQ ID NO:8)
３．トロポニンＴエピトープの配列
SEQ ID NO:9 = ERAEQQRIRAEREKEUUSLKDRIEKRRRAERAEアミド、ここでＵはβアラニンを表す。（抗トロポニン抗体ａに関するエピトープ“Ａ”）
SEQ ID NO:10 = SLKDRIERRRAERAEOOERAEQQRIRAEREKEアミド、ここでＯはアミノ−トリオキサ−オクタン酸を表す。（抗トロポニン抗体ｂに関するエピトープ“Ｂ”）
４．ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲエピトープの配列：
SEQ ID NO:11 = FDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSST; IGF-1R (1340〜1366)
SEQ ID NO:12 = YEEHIPYTHMNGGKKNGRILTLPRSNPS; hIR(1355〜1382)
５．タンパク質リンカーおよびタグ配列：
SEQ ID NO:13 = GGGGS モチーフ（例えばポリペプチドリンカーの一部（ｐｒｔ）として）
SEQ ID NO:14 = YPYDVPDYA （ＨＡ−タグ）
SEQ ID NO:15 = GLNDIFEAQKIEWHE （Ａｖｉ−タグ）
６．ポリペプチドホモ二量体に対する二価結合剤を編集する（ｃｏｍｐｉｌｉｎｇ）ために用いられた配列
SEQ ID NO:16 = ACC TGC TGC TAT CTT GA;このオリゴヌクレオチドは５’末端においてＦＡＭ標識され、カップリングのために３’末端においてマレイミドを有するように修飾された。
【０１８８】
SEQ ID NO:17 = G CAG AAG CAT TAA TAG AC-T(ビオチン)-TGG ACG ACG ATA GAA CT;リンカーオリゴヌクレオチド
SEQ ID NO:18 = GTC TAT TAA TGC TTC TGC - C3 - TGG ACG ACG ATA GAA CT;アダプターオリゴヌクレオチド
７．免疫組織化学における使用のためのＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体に対する二重結合剤において用いられた配列
【０１８９】
【化３】
0005913363.tif 000012
【０１９０】
【化４】
0005913363.tif 000013
【０１９１】
ＨＣ二重結合剤、ｘ＝１、２、３または４であり、アミノ酸配列モチーフ（ｍｏｔｉｖｅ）Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (= GGGGSまたはG4S)が１、２、３または４回存在することを示す。
【０１９２】
SEQ ID NO:25 = WDQDPPERGAPPST;ヒトHER2 (1223〜1236)
SEQ ID NO:26 = PLHPVPIMPTAGTTPDEDYEYMNRQR;ヒトHER3 (1242〜1267)
SEQ ID NO:27 = 5’-(Gly)4-アミノリンカー-(スペーサーC3)3-AGT TCT ATC GTC GTC CA-フルオレセイン-3’; 17塩基長オリゴ
SEQ ID NO:28 = 5’-フルオレセイン-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-(スペーサーC3)3-アミノリンカー-’-(Gly)4-3’; 19塩基長オリゴ
図の説明
図１  抗ｐＩＧＦ１−Ｒ二重結合剤の組み立ての効率を評価する分析的ゲル濾過実験。線図ａ、ｂおよびｃは、個々の二重結合剤構成要素（フルオレセイン−ｓｓＦａｂ’  １．４．１６８、Ｃｙ５−ｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびリンカーＤＮＡ（Ｔ＝０）；ｓｓＦａｂ’は一本鎖オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたＦａｂ’断片を意味する）の溶離プロフィールを示す。線図ｄは、二価結合剤を形成するのに必要な３種類の構成要素を１：１：１のモル比で混合した後の溶離プロフィールを示す。より太い（一番下の）曲線は、ｓｓＦａｂ’タンパク質またはリンカーＤＮＡそれぞれの存在を示す２８０ｎｍにおいて測定された吸光度を表す。ｂ）およびｄ）におけるより細い一番上の曲線（４９５ｎｍにおける吸光度）はフルオレセインの存在を示し、ａ）におけるより細い一番上の曲線およびｄ）における中央の曲線（６３５ｎｍにおける吸光度）は、Ｃｙ５の存在を示す。単一の二重結合剤の構成要素の溶離体積（ＶＥｓｓＦａｂ’  １．４．１６８  約１５ｍｌ；ＶＥｓｓＦａｂ’  ８．１．２  約１５ｍｌ；ＶＥリンカー  約１６ｍｌ）の反応混合物の溶離体積（ＶＥ混合物  約１２ｍｌ）との比較は、二重結合剤組み立て反応が成功であったことを示す（収率：約９０％）。溶離された二重結合剤に相当する主な２８０ｎｍのピークは、４９５ｎｍおよび６３５ｎｍのチャンネルにおける主なピークとうまく重なっており、二価結合剤に相当するピーク中にｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８の両方が存在することを証明している。
【０１９３】
図２  Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）実験のスキーム。模式的および例示的に、溶液中の２種類の結合分子を示す：Ｔ０−Ｔ−Ｄｉｇ（リンカー１６）、二価結合剤およびＴ４０−Ｔ−Ｄｉｇ（リンカー１５）、二価結合剤。これら両方の二価結合剤はそれらのリンカーの長さにおいてのみ異なる（２個のハイブリダイズする核酸配列の間に追加のＴを有しない中心のジゴキシゲニン化された（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｙｌａｔｅｄ）Ｔ対４０個の追加のＴ（中心のＴ−Ｄｉｇのそれぞれの側に２０個）を有する中心のジゴキシゲニン化されたＴ）。さらに、ｓｓＦａｂ’断片８．１．２および１．４．１６８を用いた。
【０１９４】
図３  １００ｎＭ二価結合剤（Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ  ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる）の固定されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒとの相互作用を、１００ｎＭ  ｓｓＦａｂ’  １．４．１６８または１００ｎＭ  ｓｓＦａｂ’  ８．１．２の同じペプチドに対する結合特性と比較して示す、３つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）。最も高い結合性能は二重結合剤コンストラクトを用いて得られ、これはその二重結合剤の協同的結合作用が標的ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒに対する親和性を増大させることを明確に示している。
【０１９５】
図４  Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ  ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる二価結合剤の固定されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒ（リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒ）、ＩＧＦ−１ＲまたはｐＩＲ（リン酸化されたインスリン受容体）との相互作用を示す３つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。最も高い結合性能はｐＩＧＦ−１Ｒペプチドで得られ、これは二重結合剤の協同的結合作用が標的ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒに対する特異性を例えばリン酸化されたインスリン受容体ペプチド（ｐＩＲ）と比較して増大させることを明確に示している。
図５  Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇ  ｓｓＤＮＡリンカー、すなわちリンカー１５上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる１００ｎＭ二価結合剤ならびにリンカーＤＮＡを有しない１００ｎＭ  ｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８の混合物の相互作用を示す２つの速度論を重ねてプロットしたＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。最高の結合性能は二価結合剤を用いてのみ得られ、一方でリンカーを有しないｓｓＦａｂ’の混合物は、これらのｓｓＦａｂ’の合計濃度が２００ｎＭであったという事実にも関わらず、観察可能な協同的結合作用を示さない。
【０１９６】
図６  Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）サンドイッチアッセイの概略図。このアッセイは、両方の抗体のリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドへのエピトープ接近可能性を調べるために用いられた。＜ＭＩｇＧＦｃｙ＞Ｒはマウス抗体Ｍ−１．４．１６８を捕捉するために用いられたウサギ抗マウス抗体を示す。次いでＭ−１．４．１６８を用いてｐＩＧＦ−１Ｒペプチドを捕捉する。Ｍ−８．１．２が最終的にＭ−１．４．１６８、ペプチドおよびＭ−８．１．２からなるサンドイッチを形成する。
【０１９７】
図７  二次抗体８．１．２のｐＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する、これがＢｉａｃｏｒｅ（商標）チップ上で抗体１．４．１６８により捕捉された後の結合シグナル（太線）を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。その他のシグナル（細い線）は対照シグナルである：一番上から一番下に向かって、それぞれ５００ｎＭの８．１．２、５００ｎＭの１．４．１６８；５００ｎＭの標的と無関係の抗体＜ＣＫＭＭ＞Ｍ−３３−ＩｇＧ；および５００ｎＭの標的と無関係の対照抗体＜ＴＳＨ＞Ｍ−１．２０−ＩｇＧの線を示す。これらの対照にいずれにおいても結合事象を検出することはできなかった。
【０１９８】
図８  センサー表面上のビオチン化二重結合剤を示す、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイの概略図。フローセル１（＝ＦＣ１）（示していない）上で、アミノ−ＰＥＯ−ビオチンを捕捉させた。ＦＣ２、ＦＣ３およびＦＣ４上で、増大するリンカーの長さを有する二価結合剤を固定した（ＦＣ２上の二重結合剤（Ｔ０−ｂｉ＝１個の中央のＴ−Ｂｉのみ）およびＦＣ４上の二重結合剤（Ｔ４０−ｂｉ＝１個の中央のＴ−Ｂｉならびに上流および下流それぞれの２０個のＴ）をそれぞれ示す）。分析物１：そのペプチドの右側の末端においてＭ−１．４．１６８  ｓｓＦａｂ’エピトープを含有するＩＧＦ−１Ｒペプチド（一番上の線）−このペプチドはリン酸化されていないため、Ｍ−８．１．２  ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープは存在しない；分析物２：Ｍ−８．１．２  ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープ（Ｐ）およびＭ−１．４．１６８  ｓｓＦａｂ’エピトープを含有するｐＩＧＦ−１Ｒペプチド（２番目の線）；分析物３：交差反応するＭ−８．１．２  ｓｓＦａｂ’ホスホ−エピトープを含有するがＭ−１．４．１６８  ｓｓＦａｂ’に関するエピトープは含有しない、ｐＩＲペプチド（３番目の線）。
【０１９９】
図９  二重結合剤実験の速度論データ。ｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８を有するＴ４０−Ｔ−Ｂｉリンカー二重結合剤（＝図中のＴ４０）は、ｐＩＧＦ−１Ｒに対して、ｐＩＲ（ｋｄ＝３．７０Ｅ−０２／ｓ）と比較した場合に１３００倍低い解離速度（ｋｄ＝２．７９Ｅ−０５／ｓ）を示す。
【０２００】
図１０  Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のｐＩＧＦ−１Ｒペプチド（リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ｐＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３０ｎＭ、１０ｎＭ、２×３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０．４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９の表において示されている。
【０２０１】
図１１  Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のＩＧＦ−１Ｒペプチド（リン酸化されていないＩＧＦ−１Ｒペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ＩＧＦ−１Ｒペプチドの濃度系列は、３００ｎＭ、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９の表において示されている。
【０２０２】
図１２  Ｔ４０−Ｔ−Ｂｉ二重結合剤のｐＩＲペプチド（リン酸化されたインスリン受容体ペプチド）に対する濃度依存的測定を示すＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラム。そのアッセイの構成は図８において示されている通りである。ｐＩＲペプチドの濃度系列は、１００ｎＭ、２×３３ｎＭ、１１ｎＭ、４ｎＭ、０ｎＭで注入された。対応するデータが図９として示した表中に示されている。
【０２０３】
図１３  ＩＧＦ−１受容体に結合する二重結合剤。２個のｍＡｂ  １．４．１６８のＦａｂ’断片を一本鎖ＤＮＡとコンジュゲートし、アダプターＤＮＡおよびリンカーＤＮＡとハイブリダイズさせる。示したように、そのリンカーＤＮＡはビオチン標識を有し、それは免疫組織化学染色において検出することができる。
【０２０４】
図１４  その二重結合剤によるＩＧＦ１受容体のＩＨＣ検出。その二重結合剤（１μｇ／ｍＬ）はＩＧＦ１受容体を発現している安定導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を染色する（Ａ）。アダプターＤＮＡなしの陰性（一価）対照（Ｆａｂ’−ｓｓＤＮＡ）は洗い流され、その細胞を染色しない（Ｂ）。
【０２０５】
図１５  ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体検出のための二重結合剤。その二重結合剤は２個のＦａｂ断片からなり、１個はＨＥＲ２を認識し（＝図中の＜Ｈｅｒ２＞）、１個はＨＥＲ３を認識する（＝図中の＜Ｈｅｒ３＞）。そのＦａｂ断片はヘマグルチニンタグ（ＨＡ）および複数単位のGly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)アミノ酸残基モチーフからなるペプチドリンカーにより連結されている。二量体検出のためにＦａｂ断片の間の距離を最適化するため、そのリンカーの長さをいくつかのG4S単位（ｘ＝１、２、３、４...）の導入により容易に変更することができる。実施例４において用いられた二重結合剤は、２個のG4S単位を有する（ｘ＝１）。
【実施例】
【０２０６】
実施例１
トロポニンＴに対する二価結合剤
１．１  モノクローナル抗体およびＦａｂ’断片
ヒト心臓トロポニンＴに異なる重複しないエピトープ（それぞれエピトープＡ’およびエピトープＢ’）で結合する２種類のモノクローナル抗体を用いた。これらの抗体は両方とも最新のＲｏｃｈｅ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（商標）トロポニンＴアッセイにおいて用いられ、ここでトロポニンＴはサンドイッチ免疫アッセイの形式で検出される。
【０２０７】
モノクローナル抗体の培養上清からの精製は、タンパク質化学の現状技術の方法を用いて実施された。
その精製されたモノクローナル抗体を、予め活性化した（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）パパイン（抗エピトープＡ’  ＭＡｂ）またはペプシン（抗エピトープＢ’  ＭＡｂ）のどちらかを用いてプロテアーゼ消化するとＦ（ａｂ’）２断片が得られ、続いてそれを低濃度のシステアミンを用いて３７℃で還元すると、Ｆａｂ’断片、すなわち式Ｉ（Ａ−ａ’：ａ−Ｓ−ｂ：ｂ’−Ｂ）におけるＡおよびＢそれぞれになる。その反応を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でシステアミンをその試料のポリペプチド含有部分から分離することにより停止する。
【０２０８】
１．２  Ｆａｂ’断片のｓｓＤＮＡ−オリゴヌクレオチドへのコンジュゲーション
そのＦａｂ’断片を、下記で記述する活性化されたｓｓＤＮＡａおよびｓｓＤＮＡｂオリゴヌクレオチドとそれぞれコンジュゲートさせる。
【０２０９】
Ｆａｂ’−断片−ｓｓＤＮＡコンジュゲートＡ”およびＢ”それぞれの調製：
ａ）Ｆａｂ’−抗トロポニンＴ＜エピトープＡ’＞−ｓｓＤＮＡ−コンジュゲート（＝Ａ”）
Ｆａｂ’−抗トロポニンＴ＜エピトープＡ’＞−ｓｓＤＮＡａ−コンジュゲートＡ”の調製のために、SED ID NO:5の誘導体、すなわち5’-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C(=SEQ ID NO:5)-XXX-Y-Z-3’が用いられ、ここでX＝ホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)により導入されたプロピレン−ホスフェートであり、ここでY＝3’-アミノ修飾剤TFAアミノC-6 lcaa CPG (ChemGenes)により導入された3’-アミノ-修飾剤C6であり、ここでZ＝スルホスクシンイミジル 4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)により導入された4[N-マレインイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシである。
【０２１０】
ｂ）Ｆａｂ’−抗トロポニンＴ＜エピトープＢ’＞−ｓｓＤＮＡｂ−コンジュゲート（＝Ｂ”）
Ｆａｂ’−抗トロポニンＴ＜エピトープＢ’＞−ｓｓＤＮＡ−コンジュゲート（Ｂ”）の調製のために、SED ID NO:6の誘導体、すなわち5’-Y-Z-XXX-AGT TCT ATC GTC GTC CA-3’が用いられ、ここでX＝ホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)により導入されたプロピレン−ホスフェートであり、ここでY＝(6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)により導入された5'-アミノ-修飾剤C6であり、Z＝スルホスクシンイミジル 4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)により導入された4[N-マレインイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシである。
【０２１１】
SEQ ID NO:5または6のオリゴヌクレオチドはそれぞれ現状技術のオリゴヌクレオチド合成法により合成された。そのマレインイミド基の導入は、Yのアミノ基のZのスクシンイミジル基との反応により行われ、それは固相オリゴヌクレオチド合成プロセスの間に組み込まれた。
【０２１２】
上記で示した一本鎖ＤＮＡコンストラクトはチオール反応性マレイミド基を有し、それはシステアミン処理により生成されたＦａｂ’のヒンジ領域のシステインと反応する。高い百分率の単一標識されたＦａｂ’断片を得るため、ｓｓＤＮＡのＦａｂ’断片に対する相対的なモル比は低く保たれる。単一標識されたＦａｂ’断片（ｓｓＤＮＡ：Ｆａｂ’＝１：１）の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＭｏｎｏＱ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により行われる。効率的な標識および精製の検証は、分析的ゲル濾過クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより達成される。
【０２１３】
１．３  ビオチン化されたリンカー分子
ｓｓＤＮＡリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３それぞれにおいて用いられるオリゴヌクレオチドは、現状技術のオリゴヌクレオチド合成法により、ビオチン化に関してビオチン化ホスホラミダイト試薬を用いて合成された。
【０２１４】
リンカー１（＝Ｌ１）（スペーサーを有しないビオチン化ｓｓＤＮＡリンカー１）は、以下の組成を有する：
5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T (ビオチン-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’。それはそれぞれSEQ ID NO:7および8のｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、そのスペーサーの中央においてビオチン-dT (=T-Bi) (5’-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3’-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)の使用によりビオチン化された。
【０２１５】
リンカー２（＝Ｌ２）（１１塩基長のチミジンに基づくスペーサーを有するビオチン化ｓｓＤＮＡリンカー２）は、以下の組成を有する：
5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T5-(ビオチン-dT)-T5 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’。それはそれぞれSEQ ID NO:7および8のｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、それぞれ５個のチミジンからなる２回のオリゴヌクレオチドの一続きを含み、そのスペーサーの中央においてビオチン-dT (5’-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3’-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)の使用によりビオチン化された。
【０２１６】
リンカー３（＝Ｌ３）（３１塩基長のチミジンに基づくスペーサーを有するビオチン化ｓｓＤＮＡリンカー３）は、以下の組成を有する：
5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T15-(ビオチン-dT)-T15 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’。それはそれぞれSEQ ID NO:7および8のｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、それぞれ１５個のチミジンからなる２回のオリゴヌクレオチドの一続きを含み、ビオチン-dT (5’-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3’-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)の使用によりビオチン化された。
【０２１７】
１．４  一価トロポニンＴ結合剤ＡおよびＢそれぞれに関するエピトープ
抗トロポニンＴ抗体ａおよびｂそれぞれに由来する対応するＦａｂ’断片に対してそれぞれ中程度の親和性しか有しない合成ペプチドが考えられた（ｃｏｎｓｔｒｕｅｄ）。
【０２１８】
ａ）抗体ａに関するエピトープＡ’は次の配列中に含まれ：
SEQ ID NO:9 = ERAEQQRIRAEREKEUUSLKDRIEKRRRAERAEアミド
ここでUはβアラニンを表す。
【０２１９】
ｂ）抗体ｂに関するエピトープＢ’は次の配列中に含まれ：
SEQ ID NO:10 = SLKDRIERRRAERAEOOERAEQQRIRAEREKEアミド
ここでOはアミノ-トリオキサ-オクタン酸を表す。
【０２２０】
当業者は理解するであろうように、これら２種類のエピトープを含有するペプチドを２通りで組み合わせることが可能であり、両方の変種はエピトープＡ’およびＢ’を線状に組み合わせることにより設計および調製された。両方の変種の配列：エピトープの線状配列Ａ’−Ｂ’（＝ＴｎＴ−１）およびＢ’−Ａ’（＝ＴｎＴ−２）はそれぞれ現状技術のペプチド合成法により調製された。
【０２２１】
エピトープＡ’およびＢ’に関する配列はそれぞれ、ヒトの心臓トロポニンＴの配列（Ｐ４５３７９／ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）上の本来のエピトープと比較してそれらに対するＦａｂのそれぞれに関する結合親和性を低減するために修正されていた。これらの状況下で、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）技術により結合親和性を分析することにより、ヘテロ二価結合の作用の動態をよりよく観察することができる。
【０２２２】
１．５  生体分子相互作用分析
この実験に関して、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、系の中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＡセンサーと共にＴ＝２５℃で用いた。前条件付け（Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）は１００μｌ／分で５０ｍＭ  ＮａＯＨ中の１Ｍ  ＮａＣｌの３×１分間の注入および１分間の１０ｍＭ  ＨＣｌの注入で行われた。
【０２２３】
ＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）をシステム緩衝液として用いた。試料緩衝液はシステム緩衝液と同一であった。
【０２２４】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００システムは制御ソフトウェアＶ１．１．１の下で運転された。フローセル１を７ＲＵのＤ−ビオチンで飽和させた。フローセル２上に１０６３ＲＵのビオチン化ｓｓＤＮＡリンカーＬ１を固定した。フローセル３上に８７９ＲＵのビオチン化ｓｓＤＮＡリンカーＬ２を固定した。フローセル４上に６７４ＲＵのビオチン化ｓｓＤＮＡリンカーＬ３を捕捉させた。
【０２２５】
その後、Ｆａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＡ”を６００ｎＭで注入した。Ｆａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＢ”をシステム中に９００ｎＭで注入した。そのコンジュゲートを２μｌ／分の流速で３分間注入した。そのコンジュゲートを連続的に注入して、それぞれのＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートのそのそれぞれのリンカー上でのそれぞれの飽和シグナルを監視した。Ｆａｂ’の組み合わせは、それぞれのリンカー上に存在する単一のＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＡ”、単一のＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＢ”ならびに両方のＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートＡ”およびＢ”を用いて駆動された（ｄｒｉｖｅｎ）。安定なベースラインはそのリンカーがＦａｂ’断片ＤＮＡコンジュゲートにより飽和された後に生成され、それはさらなる速度論的測定のための必要条件であった。
【０２２６】
人工のペプチド分析物ＴｎＴ−１およびＴｎＴ−２を、溶液中の分析物として、表面に提示されたＦａｂ’断片と相互作用させるためにそのシステム中に注入した。
ＴｎＴ−１を５００ｎＭの分析物濃度で注入し、ＴｎＴ−２を９００ｎＭの分析物濃度で注入した。両方のペプチドを５０μｌ／分で４分間の会合時間で注入した。解離を５分間監視した。全てのフローセルに関して、５０ｍＭ  ＮａＯＨの５０μｌ／分での１分間の注入により再生を行った。
【０２２７】
速度論データをＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｖ．４．１）を用いて決定した。ＴｎＴ−１およびＴｎＴ−２ペプチドのそれぞれの表面に提示されたＦａｂ’断片の組み合わせからの解離速度ｋｄ（１／ｓ）を、線形ラングミュア１：１当てはめ（ｆｉｔｔｉｎｇ）モデルに従って決定した。その複合体の分での半減時間を一次速度方程式：ｌｎ（２）／（６０＊ｋｄ）の解法に従って計算した。
【０２２８】
結果：
表１および２それぞれにおいて示した実験データは、分析物（ＴｎＴ−１またはＴｎＴ−２）それぞれおよび様々なヘテロ二価Ｆａｂ’−Ｆａｂ’二量体Ａ”−Ｂ”の間の複合体の安定性における一価ｄｓＤＮＡ  Ｆａｂ’Ａ”またはＢ”コンジュゲートそれぞれと比較した場合の増大を実証している。この作用はそれぞれの表において２および３行目（ｌｉｎｅ）と比較した１行目において見られる。
【０２２９】
【表６】
0005913363.tif 000014
【０２３０】
【表７】
0005913363.tif 000015
【０２３１】
その結合活性作用はさらにそのリンカーの長さに依存している。表１の下に示した副表（ｓｕｂ−ｔａｂｌｅｓ）において、すなわち人工分析物ＴｎＴ−１に関して、３１塩基長のスペーサーを含むリンカーＬ３は最低の解離速度または最高の複合体安定性を示す。
【０２３２】
表２の下に示した副表において、１１塩基長のスペーサーを含むリンカーＬ２は人工分析物ＴｎＴ−２に関して最低の解離速度または最高の複合体安定性を示す。
これらのデータをまとめると、本発明において与えられるアプローチに本来備わっているようなリンカーの長さにおける柔軟性は非常に有用かつ好都合であることを実証している。
【０２３３】
実施例２
リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒに対する二価結合剤
２．１  モノクローナル抗体の開発（ｍＡｂ  ８．１．２およびｍＡｂ  １．４．１６８）
ａ）マウスの免疫処置
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを０、３、６および９週目においてそれぞれ免疫する。免疫処置あたり１００μｇのリン酸化されたペプチドｐＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）(SEQ ID NO:11)を含むコンジュゲートを用いる。このペプチドは、チロシン１３４６においてリン酸化され（＝１３４６−ｐＴｙｒ）、Ｃ末端のシステインを介してＫＬＨに連結されて（＝Ａｏｃ−Ｃｙｓ−ＭＰ−ＫＬＨ−１３４０）、免疫処置のために用いられるコンジュゲートがもたらされた。０および６週目それぞれにおいて腹腔内に、３および９週目それぞれにおいてマウスの体の様々な部分において皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｕｏｓｌｙ）免疫処置を実施する。
【０２３４】
ｂ）融合およびクローニング
免疫したマウスの脾臓細胞を、Galfre G., and Milstein C., Methods in Enzymology 73 (1981) 3-46に従って骨髄腫細胞と融合させる。このプロセスにおいて、免疫したマウスの約１×１０８個の脾臓細胞を２×１０７個の骨髄腫細胞ａ（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８６５３、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）と混合し、遠心分離する（２５０ｇおよび３７℃において１０分間）。次いでその細胞をウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含まないＲＰＭＩ  １６４０培地で１回洗浄し、５０ｍｌコニカルチューブ中で２５０ｇで再度遠心分離する。上清を廃棄し、細胞沈降物をタッピングにより穏やかにほぐし、１ｍｌのＰＥＧ（分子量４０００、Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット）を添加し、ピペット操作により混合する。３７℃の水浴中で１分間保温した後、５ｍｌのＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０を室温で４〜５分の期間内に滴加する。この工程をさらに１０ｍｌのＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０を用いて繰り返す。その後、２５ｍｌの１０％  ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０を添加し、続いて３７℃、５％ＣＯ２において３０分間の保温工程を行う。２５０ｇおよび４℃において１０分間の遠心分離の後、その沈降した細胞を１０％  ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０中に回収し、ヒポキサンチン−アザセリン選択培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＦＣＳ中１００ｍｍｏｌ／ｌヒポキサンチン、１μｇ／ｍｌアザセリン）中で蒔く。１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン６をその培地に増殖因子として添加する。７日後、その培地を新しい培地と交換する。１０日目に、その初代培養物を特異的な抗体に関して試験する。陽性の初代培養物を、蛍光活性化セルソーターにより、９６ウェル細胞培養プレートにおいてクローニングする。
【０２３５】
ｃ）細胞培養上清からの免疫グロブリンの単離
得られたハイブリドーマ細胞をＣＥＬＬｉｎｅ  １０００  ＣＬフラスコ（Ｉｎｔｅｇｒａ）中で１×１０７細胞の密度で蒔く。ＩｇＧを含有するハイブリドーマ細胞上清を週２回収集する。収量は典型的には１ｍｌの上清あたり４００μｇ〜２０００μｇのモノクローナル抗体の範囲である。抗体の培養上清からの精製は、タンパク質化学の一般的に用いられる方法を用いて（例えばBruck, C., Methods in Enzymology 121 (1986) 587-695に従って）実施した。
【０２３６】
２．２  ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの合成
それぞれSEQ ID NO: 5および6において示した配列を含む、以下のアミノ修飾された前駆体を、標準的な方法に従って合成した。下記で示したオリゴヌクレオチドは、いわゆるアミノリンカーだけでなく蛍光色素も含む。当業者はすぐに理解するであろうように、この蛍光色素はオリゴヌクレオチド自体の、ならびにそれらを含む構成要素の精製を促進するために非常に好都合である。
【０２３７】
ａ）  5’-フルオレセイン-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-(スペーサーC3)3-C7アミノリンカー-;
ｂ）  5’-Cy5 AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-(スペーサーC3)3-C7アミノリンカー-;
ｃ）  5’-アミノリンカー-(スペーサーC3)3-AGT TCT ATC GTC GTC CA-フルオレセイン-3’;
ｄ）  5’-フルオレセイン-(ベータL AGT CTA TTA ATG CTT CTG C)-(スペーサーC3)3-C7アミノリンカー-;（ベータLはこれがＬ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドであることを示す）および
ｅ）  5’-アミノリンカー-(スペーサーC3)3-(ベータL-AGT TCT ATC GTC GTC CA)-フルオレセイン-3’（ベータLはこれがＬ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドであることを示す）。
【０２３８】
合成はＡＢＩ  ３９４合成装置上で１０μｍｏｌスケールで、（５’アミノ修飾に関して）トリチルオンまたは（３’アミノ修飾に関して）トリチルオフモードで、固体支持体として商業的に入手可能なＣＰＧを、ならびに標準的なｄＡ（ｂｚ）、ｄＴ、ｄＧ（ｉＢｕ）およびｄＣ（Ｂｚ）ホスホラミダイト（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて実施された。
【０２３９】
オリゴヌクレオチド合成の間に以下のアミダイト類、アミノ修飾剤およびＣＰＧ支持体を用いてＣ３スペーサー、色素およびアミノ部分をそれぞれ導入した：
スペーサーホスホラミダイトC3(3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
5’アミノ修飾剤は、5’-アミノ-修飾剤C6(6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)を用いることにより導入した;
5’-フルオレセインホスホラミダイト  6-(3',6'-ジピバロイルフルオレセイニル-6-カルボキサミド)-ヘキシル-1-O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research);
Cy5（商標）ホスホラミダイト  1-[3-(4-モノメトキシトリチルオキシ)プロピル]-1'-[3-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピルホスホラミジチル]プロピル]-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニンクロリド(1-[3-(4-monomethoxytrityloxy)propyl]-1'-[3-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl phosphoramidityl]propyl]-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine chloride)(Glen Research);
LightCyclerフルオレセインCPG 500 A (Roche Applied Science);および
3’-アミノ修飾剤TFAアミノC-6 lcaa CPG 500 A (Chemgenes)。
【０２４０】
Cy5標識されたオリゴヌクレオチドに関して、dA(tac)、dT、dG(tac)、dC(tac)ホスホラミダイト(Sigma Aldrich)を用いて、３３％アンモニアによる脱保護を室温で２時間実施した。
【０２４１】
Ｌ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ベータ-L-dA(bz)、dT、dG(iBu)およびdC(Bz)ホスホラミダイト(Chemgenes)を用いることにより合成された。
フルオレセイン修飾されたハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの精製は、２工程の手順により実施された：まず、そのオリゴヌクレオチドを逆相HPLC(Merck-Hitachi-HPLC; RP-18カラム;勾配系[A: 0.1 M (Et3NH)OAc (pH 7.0)/MeCN 95:5; B: MeCN]: 3分間のA中20% B、12分間のA中20〜50% Bおよび25分間のA中20% B、1.0 ml/分の流速、260 nmにおいて検出)上で精製した。望まれる生成物を含有する画分（分析的RP HPLCにより監視した）を合わせ、蒸発させて乾燥させた（５’末端においてモノメトキシトリチル保護されたアルキルアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドは、２０％酢酸と共に２０分間保温することにより脱トリチル化する）。フルオレセインを標識として含有するオリゴマーは、HPLC上でのIEXクロマトグラフィー[Mono Qカラム：緩衝液A：水酸化ナトリウム(10 mM/l; pH約12)；緩衝液B：水酸化ナトリウム(10 mM/l; pH約12)中で溶解させた1M塩化ナトリウム；勾配：３０分間で100%緩衝液Aから100%緩衝液Bまで、流速1 ml/分、260 nmにおいて検出]により再度精製した。その生成物を透析により脱塩した。
【０２４２】
Cy5標識されたオリゴマーは、逆相ＨＰＬＣ上での最初の精製(Merck-Hitachi-HPLC; RP-18カラム;勾配系[A: 0.1 M (Et3NH)OAc (pH 7.0)/MeCN 95:5; B: MeCN]:3分間のA中20% B、12分間のA中20〜50% Bおよび25分間のA中20% B、1.0 ml/分の流速、260 nmにおいて検出)の後に用いられた。そのオリゴマーを透析により脱塩し、Speed-Vacエバポレーター上で凍結乾燥させると固体が得られ、それを-24℃で凍結させた。
【０２４３】
２．３  ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの活性化
実施例２からのアミノ修飾されたオリゴヌクレオチドを0.1 Mホウ酸ナトリウム緩衝液(pH 8.5)中で溶解させ(c= 600 μmol)、DMF中で溶解させた１８倍モル過剰量のThermo ScientificからのスルホSMCC (スルホスクシンイミジル 4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート) (c= 3mg/100μl)と反応させた。その反応生成物を、スルホSMCCの加水分解分解産物である4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレートを除去するために、水に対して完全に透析した。
【０２４４】
その透析物を蒸発により濃縮し、チオール基を含む一価結合剤とのコンジュゲーションのために直接用いた。
２．４  両端においてハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含むリンカーオリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、標準的な方法により、ＡＢＩ  ３９４合成装置上で１０μｍｏｌスケールで、トリチルオンモードで、固体支持体として商業的に入手可能なｄＴ−ＣＰＧを用いて、標準的なｄＡ（ｂｚ）、ｄＴ、ｄＧ（ｉＢｕ）およびｄＣ（Ｂｚ）ホスホラミダイト（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて合成された。
【０２４５】
Ｌ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、固体支持体として商業的に入手可能なベータＬ−ｄＴ−ＣＰＧを、ならびにベータ−Ｌ−ｄＡ（ｂｚ）、ｄＴ、ｄＧ（ｉＢｕ）およびｄＣ（Ｂｚ）ホスホラミダイト（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）を用いることにより合成された。
【０２４６】
オリゴヌクレオチドの精製を、実施例２．３の下で記述したように逆相ＨＰＬＣ上で実施した。望まれる生成物を含有する画分（分析的ＲＰ  ＨＰＬＣにより分析／監視した）を合わせ、蒸発させて乾燥させた。脱トリチル化を、８０％酢酸と共に１５分間保温することにより実施した。酢酸を蒸発により除去した。残留物（ｒｅｍｉｎｄｅｒ）を水中で溶解させ、凍結乾燥した。
【０２４７】
オリゴヌクレオチド合成の間に以下のアミダイト類およびＣＰＧ支持体を用いてＣ１８スペーサー、ジゴキシゲニンおよびビオチン基を導入した：
スペーサーホスホラミダイト18  (18-O-ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
ビオチン-dT  (5'-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
ビオチンホスホラミダイト  1-ジメトキシトリチルオキシ-2-(N-ビオチニル-4-アミノブチル)-プロピル-3-O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイトならびに
ジゴキシゲニン-N-ヒドロキシル-スクシンイミジルエステルによるアミノ修飾および後標識に関して、5'-ジメトキシトリチル-5-[N-(トリフルオロアセチルアミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン、3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト。
【０２４８】
以下の架橋コンストラクトまたはリンカーを合成した：
リンカー1: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー2: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(T40)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー3: 5’-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(ビオチン-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー4: 5’-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T5-(ビオチン-dT)-T5-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー5: 5’-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T20-(ビオチン-dT)-T20-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー6: 5’-[B-L] G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T30-(ビオチン-dT)-T30-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー7: 5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T5-(ビオチン-dT)-T5 TG GAC GAC GAT AGA ACT-3’
リンカー8: 5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T10-(ビオチン-dT)-T10 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー9: 5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T15-(ビオチン-dT)-T15 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー10: 5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T20-(ビオチン-dT)-T20 TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー11: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-スペーサーC18-(ビオチン-dT)-スペーサーC18-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー12: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(スペーサーC18)2-(ビオチン-dT)-(スペーサーC18)2-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー13: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(スペーサーC18)3-(ビオチン-dT)-(スペーサーC18)3-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー14: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(スペーサーC18)4-(ビオチン-dT)-(スペーサーC18)4-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー15: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T20-(Dig-dT)-T20-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー16: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(Dig-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
リンカー17: 5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(ビオチン-dT)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’
上記の架橋コンストラクトの実施例は、少なくとも第１のハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドおよび第２のハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含む。リンカー３〜１７は、そのハイブリダイズ可能な核酸の一続きに加えて、中央のそれぞれビオチン化もしくはジゴキシゲニン化されたチミジンまたは上記で示した長さのチミジン単位からなるスペーサーを含む。
【０２４９】
その5’ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:7に、その3’ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO:8にそれぞれ対応する。SEQ ID NO:7のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:5のオリゴヌクレオチドに容易にハイブリダイズするであろう。SEQ ID NO:8のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO:6のオリゴヌクレオチドに容易にハイブリダイズするであろう。
【０２５０】
上記の架橋コンストラクトの実施例において、[B-L]はＬ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列が示されていることを示し；スペーサーＣ１８、ビオチンおよびビオチンｄＴはそれぞれ上記で示した構築ブロックに由来するようなＣ１８スペーサー、ビオチンおよびビオチン−ｄＴを指し；そして数を伴うＴは示した位置においてそのリンカー中に組み込まれたチミジン残基の数を示す。
【０２５１】
２．５  二重結合剤コンストラクトの組み立て
Ａ）ＩｇＧの切断およびＦａｂ’断片のｓｓＤＮＡによる標識
精製したモノクローナル抗体をペプシンプロテアーゼの助けにより切断するとＦ（ａｂ’）２断片が得られ、続いてそれを３７℃での低濃度のシステアミンでの処理により還元するとＦａｂ’断片になる。その反応を、ＰＤ  １０カラム上でのシステアミンの分離により停止する。そのＦａｂ’断片を、実施例３に従って生成されるような活性化されたオリゴヌクレオチドにより標識する。この一本鎖ＤＮＡ（＝ｓｓＤＮＡ）はチオール反応性マレイミド基を有し、それはＦａｂ’のヒンジ領域のシステインと反応する。高い百分率の単一標識されたＦａｂ’断片を得るため、ｓｓＤＮＡのＦａｂ’断片に対する相対的なモル比は低く保たれる。単一標識されたＦａｂ’断片（ｓｓＤＮＡ：Ｆａｂ’＝１：１）の精製は、イオン交換クロマトグラフィー（カラム：Ｓｏｕｒｃｅ  １５  Ｑ  ＰＥ  ４．６／１００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＧＥ）により行われる。効率的な精製の検証は、分析的ゲル濾過およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより達成される。
【０２５２】
Ｂ）抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤の組み立て
抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤は、ＩＧＦ−１Ｒの細胞内ドメインの異なるエピトープを標的とする２種類のＦａｂ’断片に基づいている：Ｆａｂ’  ８．１．２は前記の標的タンパク質のリン酸化部位（ｐＴｙｒ  １３４６）を検出し、Ｆａｂ’  １．４．１６８は前記の標的タンパク質の非ホスホ部位を検出する。そのＦａｂ’断片は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に共有結合的に連結されている：Ｆａｂ’  １．４．１６８はSEQ ID NO:6を含みフルオレセインを蛍光マーカーとして含有する１７塩基長のｓｓＤＮＡに、そしてＦａｂ’  ８．１．２はSEQ ID NO:5を含みＣｙ５を蛍光マーカーとして含有する１９塩基長のｓｓＤＮＡに共有結合的に連結されている。以下、共有結合した１７塩基長または１９塩基長のｓｓＤＮＡを有するこれらのＦａｂ’をそれぞれｓｓＦａｂ’  １．４．１６８およびｓｓＦａｂ’  ８．１．２と呼ぶ。二重結合剤の組み立ては、そのｓｓＦａｂ’断片の対応するｓｓＤＮＡにハイブリダイズする２種類の相補性ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（それぞれSEQ ID NO:7および8）を含むリンカー（すなわち架橋コンストラクト）により媒介される。その二重結合剤の２個のｓｓＦａｂ’断片の間の距離は、スペーサー、例えばＣ１８スペーサーまたは異なる長さのＤＮＡをそれぞれ用いることにより修正することができる。
【０２５３】
組み立て評価のために、その二重結合剤構成要素ｓｓＦａｂ’  ８．１．２、ｓｓＦａｂ’  １．４．１６８ならびにリンカーコンストラクト（Ｉ）（＝実施例２．４のリンカー１７）5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT T(-Bi)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’および（ＩＩ）（＝実施例２．４のリンカー１０）5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(T20)-T(-Bi)-(T20)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’を室温で等モル量で混合した。１分間の保温工程の後、その反応混合物を分析的ゲル濾過カラム(Superdex（商標）200、10/300 GL、GE Healthcare)上で分析した。単一の二重結合剤構成要素の溶離体積（ＶＥ）のその反応混合物のＶＥとの比較は、その二重結合剤がうまく形成されたことを実証している（図１）。（そのリンカーの両方の中央にあるビオチン化チミジン(T-(Bi))は、これらの実験において機能を有しない。）
２．６  抗ｐＩＧＦ−１Ｒ二重結合剤の固定されたＩＧＦ−１ＲおよびＩＲペプチドへの結合を評価するＢｉａｃｏｒｅ（商標）実験
この実験に関して、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、系の中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＡセンサーと共にＴ＝２５℃で用いた。前条件付けは１００μｌ／分で５０ｍＭ  ＮａＯＨ中の１Ｍ  ＮａＣｌの３×１分間の注入および１分間の１０ｍＭ  ＨＣｌの注入で行われた。
【０２５４】
ＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）をシステム緩衝液として用いた。試料緩衝液はシステム緩衝液と同一であった。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００システムは制御ソフトウェアＶ１．１．１の下で運転された。
【０２５５】
続いてビオチン化されたペプチドをそれぞれのフローセル中のＳＡ表面上に捕捉させた。１６ＲＵのＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）［１３４６−ｐＴｙｒ；Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ−１３４０］アミド（すなわち、１３４６位のチロシンがリン酸化されており、位置１３４０に対応するグルタミン酸を介して結合したＰＥＧリンカーを含み、そのリンカーの他方の末端においてビオチン化されている、SEQ ID NO:11のペプチド）をフローセル２上に捕捉させた。１８ＲＵのＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）；Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ−１３４０］アミド（すなわち、１３４６位のチロシンがリン酸化されておらず、位置１３４０に対応するグルタミン酸を介して結合したＰＥＧリンカーを含み、そのリンカーの他方の末端においてビオチン化されている、SEQ ID NO:11のペプチド）をフローセル３上に捕捉させた。２０ＲＵのｈＩＲ（１３５５〜１３８２）［１３６１−ｐＴｙｒ；Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ−１３５５］アミド（すなわち、１３６１位のチロシンがリン酸化されており、ヒトインスリン受容体の位置１３５５に対応するグルタミン酸を介して結合したＰＥＧリンカーを含み、そのリンカーの他方の末端においてビオチン化されている、SEQ ID NO:12のペプチド）をフローセル４上に捕捉させた。最後に、全てのフローセルをｄ−ビオチンで飽和させた。
【０２５６】
二重結合剤の形成に関して、実施例２．５において記述したような組み立てプロトコルを用いた。２種類のｓｓＦａｂ’の一方のみを用いて個々の運転を実施した際、リンカーＤＮＡの非存在または存在は会合または解離曲線に影響を及ぼさなかった（データは示していない）。
【０２５７】
１００ｎＭの溶液中の分析物（これらの実験では二価二重結合剤）を５０μｌ／分で２４０秒の会合時間の間に注入し、解離を５００秒間監視した。８０ｍＭ  ＮａＯＨを用いた５０μｌ／分での１分間の注入工程を用いることにより、効率的な再生が達成された。フローセル１は基準の役目を果たした。抗原の注入の代わりにブランク緩衝液の注入を用いて、緩衝液のシグナルを引くことによりそのデータを二重に参照した。
【０２５８】
それぞれの測定サイクルにおいて、溶液中の以下の分析物の１つを４つのフローセル全てにわたってそれぞれ注入した：１００ｎＭのｓｓＦａｂ’  ８．１．２、１００ｎＭのｓｓＦａｂ’  １．４．１６８、１００ｎＭのｓｓＦａｂ’  ８．１．２および１００ｎＭのｓｓＦａｂ’の混合物、リンカー（ＩＩＩ）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(20)-T(-Dig)-(T20)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’（＝実施例２．４のリンカー１５））上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる１００ｎＭの二価結合剤、ならびにリンカー（ＩＶ）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(-Dig)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’（＝実施例２．４のリンカー１６））上にハイブリダイズしたｓｓＦａｂ’  ８．１．２およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８からなる１００ｎＭの二価結合剤。（上記のリンカー中の中央のチミジンのジゴキシゲニン化(T(-Dig))は、これらの実験に関連しない。）
そのシグナルは、時間依存性Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）センサーグラムとして監視された。
【０２５９】
報告の時点は、それぞれの相互作用の応答単位シグナルの高さを監視するため、分析物の会合段階の終了時（結合末期（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｌａｔｅ）、ＢＬ）に、および分析物の解離段階の終了時（安定性末期（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｌａｔｅ）、ＳＬ）に設定された。解離速度ｋｄ（１／ｓ）をＢｉａｃｏｒｅ（商標）評価ソフトウェア４．１を用いて線形１：１ラングミュア当てはめに従って計算した。その複合体の分での半減時間を式ｌｎ（２）／（６０＊ｋｄ）に基づいて計算した。
【０２６０】
そのセンサーグラム（図２−５）は、ｓｓＦａｂ’  １．４．１６８およびｓｓＦａｂ’  １．４．１６８が二重結合剤（＝二価結合剤）の形態で用いられた際の、おそらく基礎になっている協同的結合作用による、ｐＩＧＦ−１Ｒ結合における特異性および複合体の安定性の両方における増大を示している。Ｆａｂ’  １．４．１６８単独ではｐＩＲペプチドに関する交差反応性を示さないが、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化型および非リン酸化型を識別しない（両方の場合においてＴ１／２  ｄｉｓ＝３分）。しかし、Ｆａｂ’  ８．１．２はＩＧＦ１−Ｒペプチドのリン酸化版にのみ結合するが、リン酸化されたインスリン受容体とのいくらかの望まれない交差反応性を示す。その二重結合剤はｐＩＧＦ−１Ｒペプチドおよび両方の他のペプチドを十分に識別し（図４参照）、従って非特異的結合の問題の克服を助ける。その特異性における増大は、両方のＦａｂ’がリンカーＤＮＡなしで適用された場合には失われることを特筆する（図５）。その二重結合剤のｐＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する親和性における増大は、個々のＦａｂ’およびそのリンカーＤＮＡを抜かしたＦａｂ’混合物と比較して増大した解離半減時間において示される（図３および図５）。試験した２種類の異なるＤＮＡリンカーの長さを有する二重結合剤は標的結合特異性および親和性への全体的なプラスの作用を共有しているが、より長いリンカー（Ｔ４０−Ｔ−Ｄｉｇをスペーサーとして有する（ＩＩＩ））（すなわち実施例２．４のリンカー１５）が両方の基準に関して好都合であるように思われる。
【０２６１】
２．７  Ｍ−１．４．１６８−ＩｇＧおよびＭ−８．１．２−ＩｇＧのＢｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイサンドイッチ
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をシステム中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５センサーと共に用いた。そのセンサーは、０．１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１０ｍＭ  ＨＣｌおよび１００ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４の１００μｌ／分での１分間の注入により前条件付けされた。
【０２６２】
システム緩衝液はＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）であった。試料緩衝液はシステム緩衝液であった。
【０２６３】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００システムは制御ソフトウェアＶ１．１．１の下で運転された。１０ｍＭ酢酸Ｎａ（ｐＨ４．５）中で３０μｇ／ｍｌのポリクローナルウサギＩｇＧ抗体＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を、１００００ＲＵでフローセル１、２、３、および４それぞれの上に、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学により、製造業者の説明書に従って固定した。最後に、そのセンサー表面を１Ｍエタノールアミンでブロッキングした。全部の実験を１３℃で運転した。
【０２６４】
５００ｎＭの一次ｍＡｂ  Ｍ−１．００４．１６８−ＩｇＧを＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ表面上に１０μｌ／分で１分間捕捉させた。ブロッキング溶液を含有する３μＭの（ＩｇＧクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３の）ＩｇＧ断片混合物を３０μｌ／分で５分間注入した。ペプチドＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）［１３４６−ｐＴｙｒ；Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ−１３４０］アミドを３００ｎＭで３０μｌ／分において３分間注入した。３００ｎＭの二次抗体Ｍ−８．１．２−ＩｇＧを３０μｌ／分で注入した。１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．７）を５０μｌ／分で３分間用いてセンサーを再生させた。
【０２６５】
図６はそのアッセイの構成を説明している。図７において、その測定の結果を示す。その測定は、両方のモノクローナル抗体がそれらのそれぞれの標的ペプチド上の２つの別個の無関係なエピトープに同時に結合することができることを明確に示している。これは、協同的結合事象を生じさせる目的を有するあらゆる後の実験のための必要条件である。
【０２６６】
２．８  センサー表面上の二重結合剤のＢｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をシステム中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＡセンサーと共にＴ＝２５℃で用いた。そのシステムは、１００μｌ／分での５０ｍＭ  ＮａＯＨ中１Ｍ  ＮａＣｌの３×１分間の注入および１分間の１０ｍＭ  ＨＣｌの注入により前条件付けされた。
【０２６７】
システム緩衝液はＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）であった。試料緩衝液はシステム緩衝液であった。
【０２６８】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）３０００システムは制御ソフトウェアＶ４．１の下で運転された。
１２４ＲＵのアミノ−ＰＥＯ−ビオチンを基準フローセル１上に捕捉させた。１５９５ＲＵのビオチン化された１４．６ｋＤａのＴ０−Ｂｉ  ３７塩基長ｓｓＤＮＡ−リンカー（Ｉ）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(-Bi)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’）（＝実施例２．４のリンカー１７）および１０４２ＲＵのビオチン化された２３．７ｋＤａのＴ４０−Ｂｉ  ７７塩基長ｓｓＤＮＡ−リンカー（ＩＩ）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(20)-(ビオチン-dT)-(T20)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’＝実施例２．４のリンカー１０）を、異なるフローセル上に捕捉させた。
【０２６９】
３００ｎＭのｓｓＦａｂ’  ８．１．２および３００ｎＭのｓｓＦａｂ’  １．００４．１６８をそのシステムの中に５０μｌ／分で３分間注入した。それぞれのｓｓＦａｂの速度論的寄与を試験するため、対照として３００ｎＭのｓｓＦａｂ’  ８．１．２または３００ｎＭのｓｓＦａｂ’  １．００４．１６８のみを注入した。対照として、緩衝液をｓｓＦａｂの代わりに注入した。ペプチドｐＩＲ（１３５５〜１３８２）［１３６１−ｐＴｙｒ］アミドおよびＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）アミドそれぞれ（溶液中で遊離している（ｆｒｅｅ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ））をシステム中に０ｎＭ、４ｎＭ、１１ｎＭ、３３ｎＭ（２回）、１００ｎＭおよび３００ｎＭの濃度段階で５０μｌ／分で４分間注入した。ペプチドｐＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）［１３４６−ｐＴｙｒ］アミドに対する親和性を測定するための実験の別のセットにおいて、０ｎＭ、０．４ｎＭ、１．１ｎＭ、３．３ｎＭ（２回）、１０ｎＭおよび３０ｎＭの濃度段階を用いた。
【０２７０】
解離を５０μｌ／分で５．３分間監視した。それぞれの濃度工程の後、２５０ｍＭのＮａＯＨの１２秒間のパルスによりシステムを再生し、ｓｓＦａｂ’リガンドを再装填した（ｒｅｌｏａｄｅｄ）。
【０２７１】
図８はＢｉａｃｏｒｅ（商標）機器上のアッセイ構成を模式的に説明している。図９で示した表は、このアプローチからの定量の結果を示す。図１０、１１および１２はＴ４０二重結合剤を用いたこのアッセイ構成からの典型的なＢｉａｃｏｒｅ（商標）の結果を示す。
【０２７２】
図９における表は、二重結合剤の概念の利益を実証している。Ｔ４０二重結合剤（実施例２．４のリンカー１０、すなわちＴ２０−ビオチン−ｄＴ−Ｔ２０のスペーサーを有するリンカーを有する二重結合剤）は結果として、それぞれ１９２分および３０ｐＭであるＴ０二重結合剤（すなわち実施例２．４のリンカー１６を有する二重結合剤）と比較した場合に、２倍向上した抗原複合体の半減時間（４１４分）および３倍向上した親和性（１０ｐＭ）をもたらす。これは最適な協同的結合作用をもたらすためにリンカーの長さを最適化する必要性を強調する。
【０２７３】
Ｔ４０二重結合剤（すなわちＴ４０−Ｔ−Ｂｉリンカー（実施例２．４のリンカー１０）を含む二重結合剤）は、リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する１０ｐＭの親和性を示す（図９、図１０における表）。これはリン酸化されたインスリン受容体ペプチド（２４ｎＭ）に対する２４００倍の親和性の向上であり、リン酸化されていないＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する１００倍の向上である。
【０２７４】
従って、２種類の別個の分離された結合事象の組み合わせにより特異性および親和性を増大させる目的は達成されている。
協同的結合作用は特にリン酸化されたＩＧＦ−１Ｒペプチドに対する解離速度から明らかになり、ここで二重結合剤は、一価結合剤８．１．２単独による０．５分および一価結合剤１．４．１６８単独による３分それぞれに対して４１４分の抗原複合体半減時間を示す。
【０２７５】
さらに、完全に組み立てられたコンストラクトは、単独でＦａｂ’がハイブリダイズしたコンストラクトと比較した場合に、その解離速度ｋｄ（１／ｓ）をおおよそ掛け合わせる（図１０、１１、１２および図９中の表）。興味深いことに、会合速度ｋａ（１／Ｍｓ）も単独のＦａｂ’の相互作用事象と比較した場合にわずかに増大し、これはそのコンストラクトの分子の柔軟性の増大によるものである可能性がある。
【０２７６】
強い洗浄手順を用いる診断系は、個々の（一価の）Ｆａｂ’分子とは対照的に、そのＴ４０二重結合剤の高い性能を確実に促進するはずである。そのハイブリダイズしたコンストラクト、すなわち本発明に従う二価結合剤は特異的かつ極めて安定な結合事象をもたらすが、一価結合剤はより急速に解離し、例えばそれらはより急速に洗い流される。
【０２７７】
実施例３：
インスリン様成長因子１のホモ二量体型に結合する二価結合剤
インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１−Ｒ）はチロシンキナーゼ受容体のファミリーに属し、それはＩＧＦ１により活性化される。その受容体はホモ二量体である。
【０２７８】
ＩＧＦ１−Ｒ単量体は、膜貫通βサブユニットにジスルフィド架橋を介して共有結合的に連結された１個の細胞外αサブユニットからなる。２個の単量体が２個の単量体のαサブユニット間のジスルフィド架橋により共有結合的に連結される。ＩＧＦ１受容体は癌、加齢およびインスリンシグナル伝達において重要な役割を果たしている。
【０２７９】
我々が開発した二量体結合剤は、２個の同一のＦａｂ’断片を含む。これらのＦａｂ’断片は両方とも（個々に用いられた場合）それらの標的ペプチド（ＩＧＦ１−Ｒ）に低い複合体安定性でしか結合しない。二価結合剤を生成するため、そのＦａｂ’断片をハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにコンジュゲートする。リンカーＤＮＡならびにこのオリゴヌクレオチドの両方とハイブリダイズすることができるアダプターＤＮＡを、そのＦａｂ’−ＤＮＡおよびリンカーＤＮＡとハイブリダイズするための架橋として用いて、用いた２個の（ｔｏ）一価結合剤に関する適切な距離も特徴とする安定な二価結合剤を提供する（模式図を図１３において示す）。この抗ＩＧＦ１−Ｒ二重結合剤を、自動化された免疫組織化学染色システム（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ）において試験した。
【０２８０】
３．１  ＩＧＦ１受容体に対する低親和性モノクローナル抗体の開発
ａ）マウスの免疫処置
Ｂａｌｂ／ｃマウスをＩＧＦ１Ｒ（１３４０〜１３６６）［１３４６−ｐＴｙｒ；Ａｏｃ−Ｄｙｓ−ＭＰ−ＫＬＨ−１３４０］アミドのペプチドで免疫した。（そのリン酸化されていないアミノ酸（ａｍｉｎｏ  ｃｉｄ）配列をSEQ ID NO:11として示す。）最初の免疫用量は１００μｇであった。４、８および１２週間後にそのマウスを１００μｇの免疫原でさらに免疫した。
【０２８１】
ｂ）融合およびクローニング
前記のマウスの脾臓細胞を、Galfre, G. and Milstein, C. Methods in Enzymology 73 (1981) 3-46に従って骨髄腫細胞と融合させた。このプロセスにおいて、免疫したマウスの１×１０８個の脾臓細胞を２×１０７個の骨髄腫細胞（Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８−６５３、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）と混合し、２５０ｇおよび３７℃において１０分間遠心分離した。その上清を廃棄し、細胞のペレットをタッピングによりほぐした。１ｍＬのＰＥＧ（分子量４０００、Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット）を一滴ずつ、３７℃において水浴中で１分以内に添加した。その後、５ｍｌのＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０を５分以内に一滴ずつ添加し、続いてさらに１０ｍＬのＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０を１０分以内に一滴ずつ添加した。次の工程として、１０％  ＦＣＳ、１００ｍｍｏｌ／ｌヒポキサンチン、１μｇ／ｍｌアザセリンおよび５０ｕのＩＬ−６を含む２５ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０を添加し、その細胞を３７℃、５％ＣＯ２において６０分間保温し、次いで２５０ｇで１０分間遠心分離した。その細胞のペレットを１０％  ＦＣＳ、１００ｍｍｏｌ／ｌヒポキサンチン、１μｇ／ｍｌアザセリンおよび５０ｕのＩＬ−６を含む３０ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０中で再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【０２８２】
ｃ）細胞培養上清からの免疫グロブリンの単離
約１０日後、その初代培養物を抗原特異性に関して試験した。陽性初代培養物を蛍光活性化セルソーターにより９６ウェル細胞培養プレートにおいてクローニングした。それに続く２４ウェルプレート、６ウェルプレートおよびＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）におけるＮｕｔｒｉｄｏｍａ栄養補助剤（Ｒｏｃｈｅ）を含むＨｙｃｌｏｎｅ培地（Ｔｈｅｒｏｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中での増殖の後、望まれる低親和性抗体を発現するハイブリドーマ細胞を最終的にＣＥＬＬｉｎｅバイオリアクター（Ｉｎｔｅｇｒａ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で製造業者の説明書に従って培養した。最も有望な抗体をｍＡｂ  １．４．１６８と名付けた。
【０２８３】
ｄ）ｍＡｂ  １．４．１６８の生物物理学的特性付け
ｍＡｂ  １．４．１６８およびＩＧＦ１受容体の間の相互作用の速度論的特性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）技術を用いた表面プラズモン共鳴により調べた。
【０２８４】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をシステム中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５センサーと共にＴ＝２５℃で用いて、それを０．１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１０ｍＭ  ＨＣｌおよび１００ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４の１００μｌ／分での１分間の注入により前条件付けした。システム緩衝液はＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）であった。試料緩衝液はシステム緩衝液であった。
【０２８５】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００システムは制御ソフトウェアＶ１．１．１の下で運転された。１０ｍＭ酢酸Ｎａ（ｐＨ４．５）中で３０μｇ／ｍｌのポリクローナルウサギＩｇＧ抗体＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を、８０００ＲＵでフローセル１、２、３、４上に、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学により、製造業者の説明書に従って固定した。最後に、そのセンサー表面を１Ｍエタノールアミンでブロッキングした。
【０２８６】
２５０ｎＭ  ｍＡｂ  Ｍ−１．００４．１６８−ＩｇＧをその＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ表面上に１０μｌ／分で１分間捕捉させた。
９００ｎＭ、３００ｎＭ、１５０ｎＭ、５０ｎＭ、１７ｎＭ、６ｎＭ、および０ｎＭのペプチドＩＧＦ−１Ｒ（１３４０〜１３６６）［１３４６−ｐＴｙｒ；Ｇｌｕ（Ｂｉ−ＰＥＧ−１３４０］アミドの濃度系列を溶液中の分析物として用いて、それを１００μｌ／分で３分間の会合時間の間注入した。解離を１００μｌ／分で１０分間監視した。そのアッセイの再現性を確実にするため、対照として１つの濃度段階を２回分析した。フローセル１は参照セルの役目を果たした。抗原の注入の代わりにブランク緩衝液の注入を用いて、緩衝液のシグナルを引くことによりそのデータを二重に参照した。その捕捉系を、１０ｍＭグリシン（ｐＨ  １．７）の１０μｌ／分での３分間の注入を用いて再生させた。
【０２８７】
そのデータを、会合速度定数ｋａ［１／Ｍｓ］、解離速度定数ｋｄ［１／ｓ］および結果として得られる親和性定数ＫＤ［Ｍ］を計算するため、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００評価ソフトウェアＶ１．１．１を用いて１：１二成分ラングミュア相互作用モデルに従って評価した。ｍＡｂ  １．４．１６８に関する解離速度定数は３．６×１０−３１／ｓであり、従って我々の二重結合剤アプローチに必要な低い複合体安定性を有する抗体の範囲内であった。
【０２８８】
さらに、表面プラズモン共鳴を用いて抗原特異性を決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、系の中に取り付けられたＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＡセンサーと共にＴ＝２５℃で用いて、それを１００μｌ／分で５０ｍＭ  ＮａＯＨ中の１Ｍ  ＮａＣｌの３×１分間の注入および１分間の１０ｍＭ  ＨＣｌの注入により前条件付けした。システム緩衝液はＨＢＳ−ＥＴ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）であった。試料緩衝液はシステム緩衝液＋１ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン，Ｓｉｇｍａ）であった。
【０２８９】
続いて、ビオチン化されたペプチドをそれぞれのフローセル中のＳＡ表面上に捕捉させた。フローセルを最終的に２μＭのｄ−ビオチンで飽和させた。ハイブリドーマクローンの培養上清を１：２希釈し、それを５０μｌ／分で２分間注入し、解離を５分間監視した。１０ｍＭ  Ｇｌｙ／ＨＣｌ（ｐＨ  １．７）の３０μｌ／分での１．５分間の注入で再生させた。フローセル１は基準の役目を果たした。抗原の注入の代わりにブランク緩衝液の注入を用いて、緩衝液のシグナルを引くことによりそのデータを二重に参照した。そのデータを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）評価ソフトウェア１．１．１に従って評価した。シグナルの高さを注入時間の終了時（結合末期（ＲＵ））に測定した。下記の表３は、ｍＡｂ  １．４．１６８はリン酸化された、およびリン酸化されていないＩＧＦ−１Ｒペプチド（SEQ ID NO:11）を同等に十分に認識したが、それはリン酸化されたインスリン受容体ペプチド（SEQ ID NO:12）とは相互作用しなかったことを明確に示している。
【０２９０】
【表８】
0005913363.tif 000016
【０２９１】
ＦＣ＝フローセル、リガンド＝それぞれＳＡコートされたチップ上に捕捉されたビオチンおよびビオチン化されたペプチド、ＲＵ＝共鳴（ｒｅｓｏｎａｃｅ）単位（リガンドとしてＳＡ表面上に捕捉されたｂｉ−ペプチドの質量に相関する）、分析物＝溶液中のｍＡｂ  １．４．１６８、結合末期（ＲＵ）＝分析物注入期の終了時におけるシグナルの高さ。
【０２９２】
３．２  抗体の精製、Ｉｇの切断およびＦａｂ’断片の生成
ａ）精製
ｍＡｂ  １．４．１６８をまず最終ｐＨ４．７５への２Ｎ酢酸による酸沈殿により精製した。１５分の保温時間ならびに４℃および１３，０００ｒｐｍでの遠心分離の後、その上清を１Ｍ  Ｋ３ＰＯ４によりｐＨ  ７．０に緩衝した。その後、その抗体を硫酸アンモニウム沈殿（３０．５ｇ／１００ｍＬ）によりさらに精製した。９０００ｒｐｍで４℃において３０分間の遠心分離の後、上清を廃棄し、ペレットを１０ｍＭクエン酸Ｎａ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ５．５）中で再懸濁した。次いでその抗体を１０ｍＭクエン酸Ｎａ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ５．５）に対して透析し、４℃、１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、細胞のペレットを廃棄した。その抗体を、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ５．５）中で平衡化したＳＰセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのイオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。その抗体を、６カラム体積にわたる２０ｍＭから２５０ｍＭまでのＮａＣｌの勾配で溶離した。その溶離液をフラクションコレクターで集め、タンパク質を含有する画分をＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析してその抗体を確実に（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ）同定した。その抗体を含有する画分をプールし、製造業者の説明書に従って限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）により濃縮し、５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．５）に対して透析した。
【０２９３】
ｂ）Ｆａｂ’２分子を生成するためのパパイン消化
その精製された抗体を、２５ｍＵパパイン／ｍｇ  ＩｇＧで３７℃において８０分間切断した。その反応を、反応体積の０．１倍の２７０ｍＭヨウ素アセトアミド（ｉｏｄｉｎｅ  ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、７５ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡの添加により停止した。その後、その反応混合物を１０ｍＭリン酸カリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．０）に対して透析した。次いでそのＦａｂ’２をＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。そのＤＥＡＥカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１０ｍＭリン酸カリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．０）で平衡化し、その透析された反応混合物を装填（ｌｏａｄｉｎｇ）した後、そのＦａｂ’２を１０ｍＭリン酸カリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．０）で溶離した。さらに、そのＦａｂ’２を免疫親和性クロマトグラフィーにより、ポリクローナル抗パパイン抗体を装填したカラム、続いてＭ−Ｆｃγに対するポリクローナル抗体を装填したカラムの素通り画分として精製した。ＰＢＳを運転緩衝液として用いた。その最終的な素通り画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １０ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心式フィルターを用いて濃縮し、その純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。
【０２９４】
Ｆａｂ’２の還元およびＦａｂ’断片の生成
そのＦａｂ’２を３７℃においてｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で１５ｍＭシステアミン、２５ｍＭリン酸カリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ６．５）中で６０分間還元した。その反応を、１００ｍＭリン酸カリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ６．３）中で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５  Ｐ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーゲル濾過におけるＦａｂ’のシステアミンからの分離により停止した。そのＦａｂ’を、２５ｍＭ  ＫＰＯ４、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ６．５）で溶離した。
【０２９５】
３．３  Ｆａｂ’断片のＤＮＡ標識
実施例３．２で得られたＦａｂ’断片を、ｓｓＤＮＡ−マレイミド誘導体(SEQ ID NO:16)と１；１のモル比で２０分間コンジュゲートした。このｓｓＤＮＡ配列は、リンカーおよびアダプターオリゴヌクレオチドそれぞれの上にある相補配列にハイブリダイズすることができる。その反応を過剰量のシステイン−ＨＣｌの添加（コンジュゲートしていないＤＮＡ−マレイミドの停止（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）のため）、続いて過剰量のＮ−メチルマレイミドの添加（遊離のシステイン−ＳＨ基の停止）により停止した。その後、そのＦａｂ’を２０ｍＭトリス（ｐＨ  ７．６）に対して透析した。次いで単一標識されたＦａｂ’を多標識されたＦａｂ’から、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーで分離した。そのカラムを２０ｍＭトリス（ｐＨ  ７．６）中で平衡化し、そのＦａｂ’−ＤＮＡコンジュゲートをＮａＣｌ勾配で溶離した。流速は２ｍｌ／分であり、そのＦａｂ’−ＤＮＡコンジュゲートは４００〜７００ｍＭ  ＮａＣｌの塩濃度で溶離された。単一標識されたＦａｂ’−ＤＮＡコンジュゲートをフラクションコレクターで集め、限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）により濃縮し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ  ７．４）に対して透析した。
【０２９６】
３．４  ２個の抗ＩＧＦ１−Ｒ  Ｆａｂ’断片を含む二価結合剤の形成
実施例３．３からのｓｓＤＮＡリンカーで標識されたＦａｂ’断片、リンカーＤＮＡ(SEQ ID NO:17)およびアダプターＤＮＡ(SEQ ID NO:18)を等モル量で室温において混合し、二価ホモ二量体結合剤を形成させた（図１３参照）。１分間の保温工程の後、その反応混合物を分析的ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）  ２００，１０／３００  ＧＬ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で分析した。そのＦａｂ’−ＤＮＡコンジュゲートの濃度は２．５μＭであり、そのＤＮＡ−リンカーおよびＤＮＡアダプターの濃度はそれぞれ１．２５μＭであった。
【０２９７】
３．５  二重結合剤の形成を調べるための分析的サイズ排除クロマトグラフィー
分析的サイズ排除クロマトグラフィーを、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬ分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いて、０．５ｍｌ／分の流速で実施した。ＰＢＳを運転緩衝液として用いて、１００μＬの試料をそれぞれの運転において注入した。ＤＮＡハイブリダイゼーションによる二重結合剤の形成は、Ｆａｂ’−ＤＮＡコンジュゲートならびにＦａｂ’−ＤＮＡ、リンカー−ＤＮＡおよびアダプターＤＮＡの三元複合体の間の保持時間の違いにより確証された（表４）。最も効率的な二重結合剤の形成は、２：１：１のＦａｂ’−ＤＮＡ、リンカーＤＮＡおよびアダプターＤＮＡの比率で観察された。
【０２９８】
保持時間は２８０ｎｍ（芳香族の吸光度）および４９５ｎｍ（フルオレセインの吸光度）における吸光度の変化により監視された。
【０２９９】
【表９】
0005913363.tif 000017
【０３００】
保持時間はそれぞれの運転の溶離プロフィールにおける結果としてもたらされたピークの最大吸光度（２８０ｎｍ）として測定された。Ｆａｂ’−ＤＮＡコンジュゲート、リンカーＤＮＡおよびアダプターＤＮＡの三元複合体は、個々の構成要素単独ならびにＦａｂ’−ＤＮＡおよびリンカー−ＤＮＡの複合体よりも短い保持時間で溶離され、これはより高い分子量を示しており、従って三元複合体の形成を示している。
【０３０１】
３．６  免疫組織化学染色
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ヒトＩＧＦ１受容体を過剰発現するように安定形質移入した。その形質移入された細胞を固定し、標準的な手順に従ってパラフィンブロック中に包理した。ミクロトーム（ＨＭ３５５Ｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてそのブロックの３μｍの切片を生成し、Ｖｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴシステムにおける自動化されたＩＨＣ染色のためにスライドガラス上に移した。その染色手順は、商業的に入手できるＶｅｎｔａｎａからの試薬を用いて実施された。その細胞を脱パラフィン処理し、抗原の回復のために標準的なＣＣ１緩衝液（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いて処理した。１００μＬの抗体希釈緩衝液（Ｖｅｎｔａｎａ）中１μｇ／ｍｌの二重結合剤またはアダプターＤＮＡなしの二重結合剤をそのスライドガラスの上に手作業で滴定し（ｔｉｔｒａｔｅｄ）、３２分間保温した。その細胞を１００μＬのヘマトキシリンＩＩ（Ｖｅｎｔａｎａ）で４分間および１００μＬの青色染色試薬（ｂｌｕｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｖｅｎｔａｎａ）で８分間対比染色した。その二重結合剤の検出は、キットのｉｖｉｅｗ  ＤＡＢビオチン化二次抗体の代わりに反応緩衝液（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いたことを除き、ＸＴ  ｉｖｉｅｗ  ＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ）に基づいており、従ってそのキットのストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートはビオチン化されたリンカー−ＤＮＡのみを認識した。その染色を光学顕微鏡により分析した。二重結合剤のみが細胞を染色し、一方でアダプターＤＮＡなしのＦａｂ’−ＤＮＡ／ＤＮＡリンカー複合体（ハイブリダイズして二重結合剤になることができない）は洗い流され、ＩＧＦ１受容体陽性細胞を染色しなかった（図１４）。
【０３０２】
論考：マウスを抗体発現のためにＩＧＦ１受容体抗原で免疫した。最も有望な抗体ｍＡｂ  １．４．１６８を、速度論的特性および特異性に関して表面プラズモン共鳴により特性付けした。次いでその抗体を精製し、切断し、１７塩基長のＤＮＡ配列で標識した。Ｆａｂ’−ＤＮＡ、リンカー−ＤＮＡおよびアダプターＤＮＡの間のハイブリダイゼーションを分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより確かめ、次いでその二重結合剤を、安定導入された細胞に対する自動化されたＩＨＣ染色（Ｖｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ）において用いた。二重結合剤のみがその細胞を陽性に染色し、一方で（アダプターＤＮＡなしの）Ｆａｂ’−ＤＮＡ／リンカーＤＮＡ複合体単独は洗い流され、従って染色しなかった。そのホモ二量体性受容体に対する二重結合剤の両方の結合要素の協同的結合が結果としてそのＩＨＣ機器におけるストリンジェントな洗浄に耐えるための十分に高い複合体安定性をもたらした可能性が最も高く、それは単一の結合要素のみではそうではなかった（図１４参照）。
【０３０３】
実施例４：
免疫組織化学における二重結合剤によるＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体の検出
Ｈｅｒ受容体の受容体型チロシンキナーゼファミリーは４つのメンバー：ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなる。リガンド結合の際、その受容体は様々な方法でホモまたはヘテロ二量体として二量体化し、そのリガンドおよびその４つのファミリーのメンバーのそれぞれの発現レベルに依存して異なるシグナル伝達経路の引き金を引く。例えば、ＨＥＲ３はそれがそのリガンドであるニューレグリン１（ＮＲＧ１）またはニューレグリン２（ＮＲＧ２）それぞれに結合した際に立体構造変化を経て、ＨＥＲ３二量体化ドメインが露出し、それは他のＨｅｒ受容体と相互作用することができる。その二量体化ドメインはＨＥＲ２ＨＥＲ２において構成的に露出しており、従ってそれはそれの二量体化を誘導するために特定のリガンドにより活性化される必要はない。従って、ＨＥＲ３のＮＲＧ１またはＮＲＧ２による刺激はそれのＨＥＲ２ＨＥＲ２とのオリゴマー化を誘発することができる。二量体化の際、ＨＥＲ２の構成的に活性なチロシンキナーゼドメインは、機能するチロシンキナーゼドメインを欠くＨＥＲ３をリン酸化する。
【０３０４】
ＨＥＲ２／ＨＥＲ３のヘテロ二量体を検出するための二重結合剤を提供することができる。添付された特許請求の範囲において定義された範囲内の解離速度定数を有する、ＨＥＲ３およびＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体を開発する。さらに、その抗体を免疫組織化学において癌細胞株、異種移植片および腫瘍組織における標的認識に関して検証する。選択された抗体を標準的な分子生物学の方法を用いて配列決定し、組み換えタンパク質発現を用いて二重結合剤のライブラリーを生成する。次いで異なる長さのリンカーを有する二重結合剤をホルマリン固定されパラフィン包理された癌細胞においてスクリーニングする。包理の前に、その細胞を飢餓状態にしておくか、またはＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化を誘導するためにヒトＮＲＧ１で刺激しておくかのどちらかで処理する。ヘテロ二量体化の検出を、自動化された免疫組織化学染色システム（Ｖｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ）において評価する。そのスクリーニングにおける陽性のヒットは、刺激された細胞（ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体が存在する）を染色するが飢餓状態の細胞（ヘテロ二量体なし）は染色しない二重結合剤として定義される。
【０３０５】
定められた解離速度定数の範囲内のＨＥＲ３およびＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体の開発
ａ）マウスの免疫処置
ＳＪＬ、Ｂａｌｂ／ｃおよびＮＭＲＩマウスをＨＥＲ３（１２４２〜１２６７）［ＫＬＨ−ＭＰ−Ｃｙｓ−ＵＺＵ−１２４３］アミドおよびＨＥＲ２（１２２３〜１２３６）［ＫＬＨ−ＭＰ−Ｃｙｓ−ＵＺＵ］アミドで免疫する。最初の免疫用量は１００μｇである。そのマウスを６および１０週間後に１００μｇのその免疫原でさらに免疫する。
【０３０６】
ｂ）融合およびクローニング
前記のマウスの脾臓細胞を、Galfre, G. and Milstein, C. Methods in Enzymology 73 (1981) 3-46に従って骨髄腫細胞と融合させる。このプロセスにおいて、免疫したマウスの１×１０８個の脾臓細胞を２×１０７個の骨髄腫細胞（Ｐ３ｘ６３−Ａｇ８−６５３、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）と混合し、２５０ｇおよび３７℃において１０分間遠心分離する。その上清を廃棄し、細胞のペレットをタッピングによりほぐす。１ｍＬのＰＥＧ（分子量４０００、Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット）を一滴ずつ、３７℃において水浴中で１分以内に添加する。その後、５ｍＬのＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０を５分以内に一滴ずつ添加し、続いてさらに１０ｍＬのＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０を１０分以内に一滴ずつ添加する。次の工程として、１０％  ＦＣＳ、１００ｍｍｏｌ／ｌヒポキサンチン、１μｇ／ｍｌアザセリンおよび５０ｕのＩＬ−６を含む２５ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０を添加し、その細胞を３７℃、５％ＣＯ２において６０分間保温し、次いで２５０ｇで１０分間遠心分離する。その細胞のペレットを１０％  ＦＣＳ、１００ｍｍｏｌ／ｌヒポキサンチン、１μｇ／ｍｌアザセリンおよび５０ｕのＩＬ−６を含む３０ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０中で再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。次いでその細胞懸濁液を９６ウェルプレートに移し、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。
【０３０７】
ｃ）細胞培養上清からの免疫グロブリンの単離
約１０日後、その初代培養物を抗原特異性に関して試験する。陽性初代培養物を蛍光活性化セルソーターにより９６ウェル細胞培養プレートにおいてクローニングする。それに続く２４ウェルプレート、６ウェルプレートおよびＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）におけるＮｕｔｒｉｄｏｍａ栄養補助剤（Ｒｏｃｈｅ）を含むＨｙｃｌｏｎｅ培地（Ｔｈｅｒｏｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中での増殖の後、望まれる低親和性抗体を発現するハイブリドーマ細胞を最終的にＣＥＬＬｉｎｅバイオリアクター（Ｉｎｔｅｇｒａ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で製造業者の説明書に従って培養する。
【０３０８】
ｄ）モノクローナル抗体の生物物理学的特性付け
そのモノクローナル抗体およびＨＥＲ２またはＨＥＲ３の間の相互作用の速度論的特性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）技術を用いた表面プラズモン共鳴での速度論的スクリーニングにより調べる。
【０３０９】
ソフトウェアバージョンＶ１．１の制御下にあるＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ａ１００機器を用いる。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップがその機器の中に取り付けられており、それは製造業者の説明書に従って水力学的に処理され（ａｄｄｒｅｓｓｅｄ）、条件付けされる。運転緩衝液として、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いる（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｐ２０）。ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ捕捉抗体を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中３０μｇ／ｍｌでフローセル１、２、３および４中のスポット１、２、４および５に１０，０００ＲＵで固定する。その抗体はＮＨＳ／ＥＤＣ化学により共有結合的に固定される。その後、そのセンサーを１Ｍエタノールアミン溶液で不活性化する。スポット１および５は決定のために用いられ、スポット２および４は基準として用いられる。センサーチップへの適用の前に、ｍＡｂを含有するハイブリドーマ上清をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で１：２希釈する。その希釈された溶液を３０μｌ／分の流速で１分間適用する。その後すぐに分析物である個々にストレプトアビジン上に移植された（ｇｒａｆｔｅｄ）ヒト＿ＨＥＲ３（１２４２〜１２６７）−Ｂｉ−ＰＥＧ−アミド(SEQ ID NO:26)またはヒト＿ＨＥＲ２（１２２３〜１２３６）−Ｂｉ−ＰＥＧ−アミド(SEQ ID NO:25)を３０μｌ／分の流速で２分間注入する。その後、シグナルを５分間の解離時間の間記録する。そのセンサーを、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ溶液（ｐＨ１．７）を３０μｌ／分の流速で２分間注入することにより再生させる。解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）を、ラングミュアモデルに従って、評価ソフトウェアを用いて製造業者の説明書に従って計算する。選択されたモノクローナル抗体は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３それぞれと、特許請求の境界内にある解離速度定数で相互作用する。その抗体はそれらのエピトープに特異的に結合しなければならず、すなわち、抗ＨＥＲ２抗体はＨＥＲ３と相互作用せず、逆もまた同じである。
【０３１０】
選択されたＨＥＲ３に対して向けられた抗体を７．２．３２と名付け（それぞれSEQ ID NO:19において示されている可変領域重鎖およびSEQ ID NO:20において示されている可変領域軽鎖）、その解離速度定数は２．３×１０−３１／ｓであると決定され、それは結果的に二重結合剤アプローチに関して要求される範囲内である。選択されたＨＥＲ２に対して向けられた抗体は４．１．４３と呼ばれ（それぞれSEQ ID NO:21において示されている可変領域重鎖およびSEQ ID NO:22において示されている可変領域軽鎖）、その解離速度定数は９．６３×１０−４１／ｓであり、従ってそれも二重結合剤アプローチに関して要求される範囲内であった。
【０３１１】
選択されたモノクローナル抗体の免疫組織化学における特性付け
その選択されたＨＥＲ２およびＨＥＲ３に対するモノクローナル抗体は、特定の解離速度定数の範囲内でそれらの標的に結合しなければならないだけでなく、それらはその二重結合剤の基礎として適していることを免疫組織化学において十分に特性付けられなければならない。まず、両方のモノクローナル抗体が免疫組織化学においてなおそれらの抗原を認識することを確実にしなければならない。これは、一過性導入後に組み換えＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４を過剰発現するホルマリン固定されパラフィン包理されたＨＥＫ２９３を染色することにより達成することができる。その染色は、Ｖｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）自動免疫組織化学プラットフォームにより、抗ＨＥＲ２および抗ＨＥＲ３抗体に関するプロトコルと同じプロトコルを用いて実施される必要がある。例えば、その染色は、ｕｌｔｒａｖｉｅｗ  ＤＡＢキットにより、ＣＣ１Ｓｔａｎｄａｒｄを用いて、３７℃において３２分間の抗体保温時間で、ｕｌｔｒａＷａｓｈオプションならびにヘマトキシリンＩＩで４分間および青色染色試薬で８分間の対比染色を用いて実施することができるであろう。さらに、その抗体は既知のＨＥＲ２およびＨＥＲ３発現レベルを有する異種移植片および腫瘍組織において同じ染色プロトコルを用いて検証されるべきである。加えて、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、標準的な分子生物学の手順を用いてそのハイブリドーマクローンから得る。
【０３１２】
ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を認識する二重結合剤の開発
ａ）ペプチドリンカーを用いた二重結合剤の開発
我々は、グリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリン（Ｇ４Ｓ）単位およびヘマグルチニンタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）のリンカーにより連結されている２個のＦａｂ断片からなる二重結合剤を開発する（図１５）。そのリンカーの長さは、異なる数のＧ４Ｓ単位をリンカー中に組み込むことにより容易に変更することができる。そのリンカーは２〜８個のＧ４Ｓ単位を含有することができる。その二重結合剤は、Ｆａｂ＿７．２．３２−リンカー−Ｆａｂ＿４．１．４３重鎖の融合タンパク質（SEQ ID NO:24において示されている）をコードするプラスミド（ＨＣ二重結合剤）およびそのＦａｂの軽鎖をコードする２種類のプラスミドを用いたＨＥＫ２９３細胞中での一過性発現の後に発現される。全てのプラスミドは、抗体をコードする配列の上流に細胞外輸送のためのシグナル伝達配列もコードしている。コドン使用頻度は組み換え真核細胞発現のために最適化されており、次いで対応するＤＮＡが合成され（Ｇｅｎｅａｒｔ）、ｐＵＣベクター中にＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ制限部位を用いてクローニングされる。そのリンカー配列には、そのプラスミドのリンカー配列を標準的な分子生物学の方法を用いて容易に交換することを可能にするために、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ制限部位が隣接している。
【０３１３】
懸濁状態のＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を、その組み換え二重結合剤の一過性発現のためのプラスミドを用いて形質移入する。合計で、９０％より大きい生存度を有する５０ｍＬの１×１０６細胞／ｍｌを、１：１：１の比率のＨＣ−二重結合剤（SEQ ID NO:24において示したタンパク質配列をコードしている）、ＬＣ＿７．２．３２（SEQ ID NO:20において示したタンパク質配列をコードしている）およびＬＣ＿４．１．４３（SEQ ID NO:22において示したタンパク質配列をコードしている）のプラスミドにより、２９３−Ｆｒｅｅ（商標）形質移入試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って用いて形質移入する。形質移入の後、そのＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を１３０ｒｐｍ、３７℃および８％  ＣＯ２で７日間培養する。次いでその細胞を４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。二重結合剤を含有する上清を０．２２μｍ  ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）真空濾過システムを用いてさらに濾過し、分割量に分け（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）、液体窒素中で急速冷凍し、２０℃で保管する。
【０３１４】
ｂ）ＤＮＡに基づくリンカーを用いた二重結合剤の開発
ＤＮＡリンカーを介したハイブリダイゼーションに基づく二重結合剤を生成するため、組み換えＦａｂ断片をソルターゼ切断認識配列(SEQ ID NO:23)をコードする融合タンパク質として発現させる。次に、その組み換えタンパク質を部位特異的に１７塩基長のオリゴ分子（SEQ ID NO:27で示した４．１．４３標識のためのオリゴ）および１９塩基長のオリゴ分子（SEQ ID NO:28で示した７．２．３２標識のためのオリゴ）で標識し、次いでそれを利用可能なリンカーＤＮＡのライブラリーとハイブリダイズさせることができる。
【０３１５】
酵素ソルターゼをトランスペプチダーゼ反応において用いるＤＮＡ−オリゴコンジュゲーション
酵素ソルターゼはトランスペプチダーゼ活性も有する原核生物のタンパク質分解酵素である(Ton-That et al, PNAS 1999)。ここで、その酵素はＬＰＸＴＧモチーフおよびＤＮＡ−オリゴに結合したグリシン残基の間のトランスペプチダーゼ反応を触媒する。
【０３１６】
７．２．３２および４．１．４３の組み換えＦａｂ断片をＨＥＫ２９３細胞中で発現させる。９０％より大きい生存度を有する４００ｍＬの１×１０６ＨＥＫ２９３細胞／ｍｌを、７．２．３２または４．１．４３の重鎖および軽鎖をコードするプラスミドで１：１の比率で、２９３−Ｆｒｅｅ（商標）形質移入試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って用いて形質移入した。
【０３１７】
そのタンパク質は融合タンパク質として発現され、そのＦａｂ断片の軽鎖においてＣ末端の６×ＨＩＳタグおよび重鎖においてＣ末端のソルターゼ切断配列を有する。さらに、７．２．３２はそのソルターゼ切断タグの上流にＨＡタグを有する。
【０３１８】
形質移入の後、そのＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を１３０ｒｐｍ、３７℃および８％  ＣＯ２で７日間培養する。次いでその細胞を４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。その組み換えタンパク質を含有する上清を、０．２２μｍ  ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）真空濾過システムを用いてさらに濾過する。
【０３１９】
そのＦａｂ断片を、ＡＫＴＡエクスプローラーＦＰＬＣシステムを用いるニッケル親和性カラムクロマトグラフィーおよび分取ゲル濾過により、標準的な精製法を用いて精製する。純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析的ゲル濾過により評価した。
【０３２０】
その標識は、５０ｍＭトリス（ｐＨ  ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２の緩衝液中で、１０μＭ組み換えソルターゼ、５０μＭ  Ｆａｂ断片および２００μＭオリゴを用いて３７℃で一夜実施された。次に、その標識反応物を２０ｍＭトリス（ｐＨ  ８．０）中で１０倍希釈し、２０ｍＭトリス（ｐＨ  ８．０）中で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑイオン交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用する。その強く負に荷電したオリゴおよびオリゴ−Ｆａｂ断片を２０ｍＭトリス（ｐＨ  ８．０）および１Ｍ  ＮａＣｌの高い塩勾配で溶離し、そうして低い塩濃度で溶離するソルターゼおよび未標識のＦａｂ断片から分離する。溶離を４９５ｎｍにおける吸光度を追跡して監視し、オリゴの蛍光標識を検出する。オリゴおよびＦａｂ−オリゴを含有する溶離された画分をプールし、２０ｍＭトリス（８．０）、２００ｍＭ  ＮａＣｌを平衡化および運転緩衝液として用いるＨｉＬｏａｄ  １６／６０カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での分取ゲル濾過により、Ｆａｂ−オリゴをコンジュゲートしていないオリゴから分離する。最終生成物の純度を分析的ゲル濾過およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて評価し、純度が９０％より大きい最終生成物のみが二重結合剤の組み立てにおいて用いられるであろう。
【０３２１】
二重結合剤の組み立てを、分析的ゲル濾過により調べる。
等モル比での７．２．３２−Ｆａｂ−１９塩基長および４．１．４３−Ｆａｂ−１７塩基長コンジュゲートを、個々の実験において、リンカー分子（実施例２．４において示されているリンカー３〜１４）のそれぞれの１種類と混合する。次いでその二重結合剤の組み立てを、分析的ゲル濾過を用いて調べる。
【０３２２】
分析的サイズ排除クロマトグラフィーを、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬ分析的サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いて、０．５ｍｌ／分の流速で実施する。２０ｍＭトリス（ｐＨ  ８．０）、２００ｍＭ  ＮａＣｌを運転緩衝液として用いて、１００μＬの試料をそれぞれの運転において注入する。Ｆａｂ−オリゴコンジュゲートおよびリンカーの濃度は２．５μＭである。保持時間を２８０ｎｍ（芳香族の吸光度）および４９５ｎｍ（フルオレセインの吸光度）における吸光度の変化により監視する。ＤＮＡハイブリダイゼーションによる二重結合剤の形成は、Ｆａｂ−オリゴコンジュゲート、Ｆａｂ−オリゴおよびリンカーの複合体、ならびに２個のＦａｂ断片およびリンカーの三元複合体の間の保持時間の違いにより確証される。
【０３２３】
ホルマリン固定されパラフィン包理されたＭＣＦ−７細胞の生成
ＭＣＦ−７癌細胞株は、中間的なレベルのＨＥＲ２およびＨＥＲ３を発現するがＨＥＲ１は発現しないことが知られており(DeFazio et al, Int. J. Cancer,87, 487-498 (2000))、従ってそれはＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化の誘導を検出するための好ましい研究モデルである。さらに、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体は刺激されたＭＣＦ−７細胞において他の方法を用いて既に検出されている(Mukherjee et al, PLOS One 6(1),2011)。
【０３２４】
ＭＣＦ−７細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および１０％  ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ）を用いて培養し、それらをＴ１７５ｃｍ２フラスコ中で最適な培養密度まで増殖させる。そのコンフルエントな細胞をＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン中でおおよそ１８時間飢餓状態にする。次いでその細胞を２０ｎＭのＮＲＧ１−β１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で３７℃において１５分間刺激する。陰性対照として、細胞をＦＣＳを含まない新しい細胞培養培地中で３７℃において１５分間刺激なしのままにする。その細胞を、記述されたようにホルマリンで固定し、パラフィン中に包理する(Defazio-Eli et al, Breast Cancer Res 13(2):R44 (2011)。
【０３２５】
ＨＥＲ３のリン酸化はリガンド結合の後にのみ起こるため、リン酸化されたＨＥＲ３の染色は処理されたＭＣＦ−７細胞および未処理のＭＣＦ−７細胞の間のＨＥＲ３の活性化状態の違いを示すはずであり、それはＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化の異なるレベルも示す可能性がある。ＮＲＧ１−β１によるＨＥＲ３の刺激を、ホルマリン固定されパラフィン包理されたＭＣＦ−７細胞において、リン酸化されたＨＥＲ３に特異的な２１Ｄ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体を用いる免疫組織化学染色により検証する。その手作業での免疫組織化学染色は、抗原回復のためにＥＤＴＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＤＡＢ＋色素原（Ｄａｋｏ）による抗原検出のためにＵｌｔｒａ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＬＰ  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、標準的なプロトコルに従って実施される。ＮＲＧ１−β１により刺激されたＭＣＦ−７細胞のみがリン酸化されたＨＥＲ３に関して陽性に染色され、未刺激の細胞は陰性に染色される。
【０３２６】
ＭＣＦ−７細胞におけるＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体の検出
免疫組織化学染色をＶｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴシステム上で実施する。ペプチドリンカーを有する二重結合剤の検出は、“架橋抗体（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）”抗ＨＡタグ抗体Ｃ２９Ｆ４（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）により行われる。その抗ＨＡタグ抗体のＦｃ部分を、Ｏｐｔｉｖｉｅｗ  ＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いて検出する。その検出シグナルはＯｐｔｉｖｉｅｗ増幅キット（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いて増幅することができる。ＤＮＡに基づくリンカーを有する二重結合剤の検出は、記述された“架橋抗体”抗ＨＡタグ抗体Ｃ２９Ｆ４（７．２．３２重鎖のＣ末端におけるＨＡタグを標的とする）によるか、またはストレプトアビジンに基づくｉＶＩＥＷ  ＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ）に関する検出タグの役目を果たすことができるそのリンカー分子のビオチン標識によるかのどちらかで行われる。二重結合剤のライブラリーは、個々の実験において、その７．２．３２−Ｆａｂ−１９塩基長および４．１．４３−Ｆａｂ−１７塩基長を等モル比で実施例２．４で示されているリンカー（リンカー３〜１４）のそれぞれと混合することにより調製される。
【０３２７】
ミクロトーム（ＨＭ３５５Ｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＭＣＦ−７細胞のブロックの３．５μｍの切片を生成し、スライドガラス上に移す。自動化されたＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ染色システムにおいて、その細胞を脱パラフィン処理し、抗原の回復のためにＣＣ１緩衝液を用いて３２分間処理する。スクリーニングのため、それぞれの二重結合剤をＶｅｎｔａｎａ抗体希釈液中で１：１〜１：１０００の異なる希釈率で希釈し、１００μＬを手作業でスライドガラスに適用し、３７℃で１６分間保温する。抗ＨＡタグ抗体Ｃ２９Ｆ４（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）をＶｅｎｔａｎａ抗体希釈液中で１：４００希釈し、ディスペンサー中に移す。その抗ＨＡ抗体は、それがその二重結合剤のＨＡタグに結合し、同時にそのＦｃ部分をＶｅｎｔａｎａ  Ｏｐｔｉｖｉｅｗ  ＤＡＢ検出キットの抗ウサギ検出系を用いて検出することができるため、“架橋抗体”の機能を有する。後固定剤（ｐｏｓｔ  ｆｉｘａｔｉｖｅ）として、１００μＬのその架橋抗体を適用し、３２分間保温する。次に、Ｏｐｔｉｖｉｅｗ検出および増幅試薬を製造業者の推奨に従って適用する。その染色を明視野顕微鏡法で分析する。
【０３２８】
そのスクリーニングの陽性のヒットは、ＮＲＧ１−β１で処理され、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化が誘導されたＭＣＦ−７細胞のみを染色し、未処理のＭＣＦ−７細胞（ＨＥＲ２およびＨＥＲ３の単量体のみ）の陰性対照を染色しない二重結合剤である。さらに、その染色は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体はその二重結合剤の両方の腕が自由に接近可能である場合にのみ検出可能であるはずであるため、その二重結合剤の２個の結合部位の１個を阻害するためのエピトープのペプチド：２５μｇ／ｍｌのSEQ ID NO:25で示したＨＥＲ２（１２２３〜１２３６）、または２５μｇ／ｍｌのSEQ ID NO:26で示したＨＥＲ３（１２４２〜１２６７）の添加により阻害される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図６】
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【図８】
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【図１３】
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【配列表】
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