(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の複製性ｓＴＴＶの存在の検出方法であって、該方法が、
ａ）配列番号４に記載されているオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ａに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するフォワードプライマーまたは配列番号５に記載されているオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するフォワードプライマーと、配列番号６に記載されているオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−１、配列番号７に記載されているオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−２または配列番号８に記載されているオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−３に結合する連続的な少なくとも１４個の５’末端ヌクレオチドの区間の長さを有する少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマーセットを使用して該サンプルの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、
ｂ）工程（ａ）のＲＴ−ＰＣＲ増幅結果を検査する工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
該フォワードプライマーが、配列番号４に記載されているオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ａに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有することを特徴とする、請求項１記載の複製性ｓＴＴＶの存在の検出方法。
【請求項３】
該方法が、配列番号５に記載されているオリゴヌクレオチドに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するプローブを使用して工程（ａ）のＰＣＲ増幅結果を検査する工程を更に含むことを特徴とする、請求項２記載の複製性ｓＴＴＶの存在の検出方法。
【請求項４】
サンプル中の複製性ｓＴＴＶの存在の検出方法であって、該方法が、
ａ）配列番号１に記載されているオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するフォワードプライマーと、配列番号３に記載されているオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２に結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するリバースプライマーとを含むプライマーセットを使用して該サンプルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、
ｂ）配列番号４に記載されているオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ａに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するフォワードプライマーと、配列番号６に記載されているオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−１、配列番号７に記載されているオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−２または配列番号８に記載されているオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−３に結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有する少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマーセットを使用して該サンプルの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、
ｃ）工程ａ）およびｂ）の（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅結果を検査する同時工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項５】
サンプル中の複製性ｓＴＴＶの存在の検出方法であって、該方法が、
ａ）配列番号１に記載されているオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するフォワードプライマーと、配列番号２に記載されているオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１に結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するリバースプライマーとを含むプライマーセットを使用して該サンプルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、
ｂ）配列番号５に記載されているオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するフォワードプライマーと、配列番号６に記載されているオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−１、配列番号７に記載されているオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−２または配列番号８に記載されているオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−３に結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有する少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマーセットを使用して該サンプルの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、
ｃ）工程ａ）およびｂ）の（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅結果を検査する同時工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項６】
該方法のＰＣＲおよび／またはＲＴ−ＰＣＲ反応を行う工程が、少なくとも１つの追加的な非ＴＴＶ関連プライマーセットおよび少なくとも１つの追加的な非ＴＴＶ関連鋳型を更に含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
該方法が工程ａ）の前にＲＮＡおよび／またはＤＮＡ精製工程を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
配列番号４に記載されているオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ａに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するフォワードプライマーまたは配列番号５に記載されているオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するフォワードプライマーと、配列番号６に記載されているオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−１、配列番号７に記載されているオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−２または配列番号８に記載されているオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−３に結合する連続的な少なくとも１４個の５’末端ヌクレオチドの区間の長さを有する少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマーセット。
【請求項９】
少なくとも請求項８記載のプライマーセットを含むことを特徴とする、複製性ｓＴＴＶの存在の検出のための診断試験キット。
【請求項１０】
サンプル中のｓＴＴＶ  ｓｓＤＮＡおよびｓＴＴＶウイルス複製の存在の同時検出のための診断試験キットであって、該キットが、配列番号１に記載されているオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するフォワードプライマーと、配列番号３に記載されているオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２に結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するリバースプライマーとを含むプライマーセット、および配列番号４に記載されているオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ａに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するフォワードプライマーと、配列番号６、配列番号７または配列番号８に記載されているオリゴヌクレオチドＲＲＮＡに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有する少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマーセットを含むことを特徴とする、診断試験キット。
【請求項１１】
サンプル中のｓＴＴＶ  ｓｓＤＮＡおよびｓＴＴＶウイルス複製の存在の同時検出のための診断試験キットであって、該キットが、配列番号１に記載されているオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するフォワードプライマーと、配列番号２に記載されているオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１に結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するリバースプライマーとを含むプライマーセット、および配列番号５に記載されているオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するフォワードプライマーと、配列番号６、配列番号７または配列番号８に記載されているオリゴヌクレオチドＲＲＮＡに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有する少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマーセットを含むことを特徴とする、診断試験キット。
【請求項１２】
該試験キットが少なくとも１つの追加的な非ＴＴＶ関連プライマーセットおよび少なくとも１つの追加的な非ＴＴＶ関連鋳型を含むことを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項記載の診断試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中のブタトルクテノウイルスの存在の検出方法、サンプル中のブタトルクテノウイルスの複製の検出方法、トルクテノウイルス（ＲＴ）−ＰＣＲプライマーおよびプローブ、ならびにサンプル中のブタトルクテノウイルスの存在および複製の検出のための診断試験キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
トルクテノウイルス（ＴＴＶ）は、環状マイナスセンス一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを含有する小さな非包膜ウイルスである。それらはアネロウイルス（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属する。最初のＴＴＶは１９９７年にＮｉｓｈｉｚａｗａ  Ｔ．らにより特徴づけられた。該ウイルスは、輸血後肝炎を罹患しており異常な肝酵素レベルを示しているが古典的な肝炎ウイルスを有さない患者の血液中で特定された。ＴＴＶは後に、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ツパイアス（ｔｕｐａｉａｓ）およびブタのような多数の非ヒト種において検出された（Ｌｅａｒｙら，１９９９，Ｍａｒｔｉｎｅｚら，２００６）。トルクテノスス（Ｔｏｒｑｕｅ  ｔｅｎｏ  ｓｕｓ）ウイルス１（ＴＴＳｕＶ１）およびトルクテノススウイルス２（ＴＴＳｕＶ２）は、共に家畜ブタおよびイノシシに感染し（したがって、ブタＴＴＶまたは単にＴＴＶとも称される）、イオタトルクエウイルス（Ｉｏｔａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）属に属するものとして分類されている。ＴＴＶは、血液または組織内に存在することにより、幾つかの疾患の発生に影響を及ぼし、または更には疾患の結末を変化させうると考えられている（Ｏｋａｍｏｔｏ，２００９）。現在のところ、ＴＴＶの明らかな病原的役割は示されておらず、他の病原体との同時感染中のその役割が特にブタサーコウイルス（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）疾患（ＰＣＶＤ）に関して議論されているところである（Ｋｅｋａｒａｉｎｅｎら，２００６，Ｅｌｌｉｓら，２００８，Ｔａｉｒａら，２００９）。ＴＴＶは、ブタおよび家禽の経済的に重要な環状ｓｓＤＮＡウイルス、すなわち、家禽サーコウイルス２（ＰＣＶ２）およびニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）（共にサーコウイルス科のメンバーである）と、保存ゲノム領域および保存機能を共有している。ｓＴＴＶは、ヒトに感染するＴＴＶに類似したゲノム構成を有し、それらは４５％未満のヌクレオチド配列同一性を有する（Ｎｉｅｌら，２００５；Ｏｋａｍｏｔｏら，２００２）。最近の研究はまた、ｓＴＴＶ１およびｓＴＴＶ２のような種々のｓＴＴＶの間で高度の遺伝的変異性を示した（Ｈｕａｎｇら，２０１０，Ｃｏｒｔｅｙら，２０１０）。ＴＴＶのゲノムは約２．８ｋｂｐの長さであり、該ヌクレオチド配列から、２つの主要潜在的タンパク質コード遺伝子であるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１およびＯＲＦ２が推定されうる。関連ｓｓＤＮＡウイルスに対する類推により、ＯＲＦ１はウイルスカプシドタンパク質をコードしていると考えられた。ＯＲＦ２は、ウイルス複製に関与すると考えられる非構造タンパク質をコードしている（Ｈｉｊｉｋａｔａら，１９９９；Ｈｕａｎｇら，２０１０）。ＴＴＶ  ＯＲＦ２はまた、ＮＦ７８  ＫＢ経路の抑制に関連づけられている（Ｚｈｅｎｇら，２００７）。ｓＴＴＶヌクレオチド配列の分析は、ＲＮＡスプライシングにより生じる追加的なＯＲＦ、すなわちＯＲＦ３の存在を示しており、その５’末端はＯＲＦ２と共有している。ＯＲＦ３は、未知機能を有する非構造タンパク質をコードしていると考えられている（Ｏｋａｍｏｔｏら，２０００；Ｂｉａｇｉｎｉら，２００１）。アネロウイルスに関する研究は、ほとんど全て、ＰＣＲ技術に基づいてい��。最近、非効率的な増殖ではあるがヒトＴＴＶ複製を支持するとされている組織培養系が報告された（Ｋａｋｋｏｌａら，２００７；Ｌｅｐｐｉｋら，２００７）。しかし、ｓＴＴＶに関しては、ｓＴＴＶの増殖および複製を支持する組織培養系は公知ではない。
【０００３】
ｓＴＴＶをインビトロで増殖させることができないことはｓＴＴＶの研究を著しく妨げている。その理由により、現在のところ、研究は、主として、種々のヒトＴＴＶ遺伝子型の分子ウイルス学、転写および発現法に焦点が合わされている。ＣＯＳ−１細胞における、推定プロモーターにより駆動されるＴＴＶ遺伝子型１ゲノムを含有するプラスミドでのトランスフェクションの後、３つのｍＲＮＡが産生された（Ｋａｍａｈｏｒａら，２０００）。更に、選択的スプライシングおよび選択的翻訳プロセシングの後の、遺伝子型６からの６個の異なるタンパク質および分離体Ｐ／１Ｃ１（遺伝子型１）からの７個の異なるタンパク質が記載されている（Ｑｉｕら，２００５；Ｍｕｅｌｌｅｒら，２００８）。リンパ腫由来およびＴ細胞白血病細胞系において、追加的なスプライシング事象およびゲノム内再構成が特定された（Ｌｅｐｐｉｋら，２００７）。ヒトＴＴＶタンパク質の局在化に関してはごく少数の研究しか行われておらず、それらの結果は著しく矛盾したものである。ＴＴＶ遺伝子型６  ＯＲＦ１およびＯＲＦ２タンパク質はトランスフェクト化細胞の細胞質内に局在化された（Ｑｉｕら，２００５）。これに反して、より最近の研究においては、ＯＲＦ１タンパク質は核内（特に核仁）に局在化され、一方、ＯＲＦ３は核内に観察されたが、核仁内では観察されなかった。同じ研究において、ＯＲＦ２タンパク質は、既に記載されているとおり、細胞質内で見出された（Ｍｕｅｌｌｅｒら，２００８）。研究間で観察された矛盾は、ＴＴＶ分離体において見出されるゲノム多様性が、ウイルスタンパク質の発現および局在化の、異なる方法に関連づけられうることを示唆している（Ｍｕｅｌｌｅｒら，２００８）。ｓＴＴＶの転写プロファイルは、ヒトＴＴＶにおいて見出されるものに類似している可能性があることが示唆されているが（Ｏｋａｍｏｔｏら，２００２）、実験的な証拠は尚も得られていない。
【０００４】
細胞培養内でｓＴＴＶを増殖させることができないため、ｓＴＴＶの検出および診断は、現在のところ、通常のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法に基づいたものである。同じ特異的宿主または宿主群に感染する亜群内でさえも非常に可変性のゲノムを有するＴＴＶのようなｓｓＤＮＡウイルスの検出の場合には特に、適当なＰＣＲプライマー結合部位および所望によりプローブ結合部位の選択は決定的に重要である。ｓＴＴＶ検出のためのＰＣＲプライマーの一般的な問題は、それらは、同じ地理的起源のｓＴＴＶ株に対しては高い特異性を有しうるものの、それらは、異なる地理的起源または別の遺伝子型のｓＴＴＶ株とは到底反応し得ないことである。結果として、ブタ集団および生物学的物質における幾つかのｓＴＴＶ株は気づかれないままとなりうる。
【０００５】
動物におけるｓＴＴＶの存在または非存在を検出するためだけであっても、ブタ集団におけるｓＴＴＶの検出のための信頼しうる普遍的診断手段が不可欠であることは明らかである。そのような手段は、ｓＴＴＶの地理的広がりを監視するためにも不可欠であろう。これは、とりわけ、異なる地理的位置のブタにおける或る地理的起源または或る遺伝子型のｓＴＴＶ株の存在または非存在を示しうるであろう。また、ワクチン製造の分野における信頼しうる診断手段も必要とされている。ブタウイルスワクチンの多く（そしてブタワクチンだけでない）は細胞培養内で製造される。ある細胞培養培地成分および細胞系はブタ由来である。したがって、これらの細胞培養における及びこれらの細胞培養を使用して製造されたワクチンにおけるｓＴＴＶの非存在を確認することが重要である。種々のタイプのサンプル物質のｓＴＴＶの存在だけでなく量をも示しうる定量的方法および診断手段がより一層必要とされている。これは、とりわけ、ｓＴＴＶの病理学に関する研究を著しく促進するであろう。
【０００６】
そして最も重要なことに、ｓＴＴＶは、組織内での複製を伴って又は伴わないで、組織内に存在しうるであろう。ＴＴＶは実質的に全ての組織および器官に存在することが公知であるが、それが血液によりその組織に移されたためにそれらにおいて見出されるだけなのか、あるいはそれがそこにおいて活発に複製されているのかは公知でない。したがって、例えば組織内のｓＴＴＶの単なる存在と、その組織における該ウイルスの活発な複製とを区別しうる試験が大いに必要とされている。そのような試験は更に、細胞培養内の微量のｓＴＴＶが非複製形態であるのか否かを検出することを可能にするであろう。これは細胞培養内のｓＴＴＶワクチン製造をより一層安全なものとするであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉａｇｉｎｉ，  Ｐ．，  Ｇａｌｌｉａｎ，  Ｐ．，  Ａｔｔｏｕｉ，  Ｈ．，  Ｔｏｕｉｎｓｓｉ，  Ｍ．，  Ｃａｎｔａｌｏｕｂｅ，  Ｊ．−Ｆ．，  ｄｅ  Ｍｉｃｃｏ，  Ｐ．  ＆  ｄｅ  Ｌａｍｂａｌｌｅｒｉｅ，  Ｘ．  （２００１）．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ＴＴ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｍｉｎｉ  ｖｉｒｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｏｌａｔｅｓ．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８２，  ３７９−３８３．
【非特許文献２】Ｃｏｒｔｅｙ，  Ｍ．，  Ｍａｃｅｒａ，  Ｌ．，  Ｓｅｇａｌｅｓ，  Ｊ．  ＆  Ｋｅｋａｒａｉｎｅｎ，  Ｔ．  （２０１０）．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  ｏｆ  Ｔｏｒｑｕｅ  ｔｅｎｏ  ｓｕｓ  ｖｉｒｕｓ  １  （ＴＴＳｕＶｌ）  ａｎｄ  ２  （ＴＴＳｕＶ２）  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ．  Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １４８，  １２５−３１．
【非特許文献３】Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ＆  Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；  ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−４４７−５  （１９９５）
【非特許文献４】Ｅｌｌｉｓ，  Ｊ．  Ａ．，  Ａｌｌａｎ，  Ｇ．  ＆  Ｋｒａｋｏｗｋａ，  Ｓ．  （２００８）．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ  １  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｏｒｑｕｅ  ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ  ｏｎ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃ  ｐｉｇｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ  ６９，  １６０８−１４．
【非特許文献５】Ｈｉｊｉｋａｔａ，  Ｍ．，  Ｉｗａｔａ，  Ｋ．，  Ｏｈｔａ，  Ｙ．，  Ｎａｋａｏ，  Ｋ．，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  ４４３  ｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｈ．，  Ｋａｎａｉ，  Ｋ．，  Ｂａｂａ，  Ｋ．，  Ｓａｍｏｋｈｖａｌｏｖ，  Ｅ．  Ｉ．  ＆  Ｍｉｓｈｉｒｏ，  Ｓ．  （１９９９）．  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ＴＴ  ｖｉｒｕｓ  （ＴＴＶ）  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｌａ  ａｎｄ  ｌｂ  ｔｙｐｅｓ  ｆｒｏｍ  ｏｔｈｅｒｓ＊．  Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １４４，  ２３４５−５４．
【非特許文献６】Ｈｏｆｆｍａｎｎ，  Ｂ．，  Ｋ．  Ｄｅｐｎｅｒ，  Ｈ．  Ｓｃｈｉｒｒｍｅｉｅｒ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｂｅｅｒ．  ２００６．  Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｄｕｐｌｅｘ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ａ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １３６：２００−２０９．
【非特許文献７】Ｈｕａｎｇ，  Ｙ．  Ｗ．，  Ｎｉ，  Ｙ．  Ｙ．，  Ｄｒｙｍａｎ，  Ｂ．  Ａ．  ＆  Ｍｅｎｇ，  Ｘ．  Ｊ．  （２０１０）．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｔｏｒｑｕｅ  ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｉｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  Ｕ．Ｓ．  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ＰＴＴＶ  ｓｔｒａｉｎｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ＰＴＴＶ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９６，  ２８９−９７．
【非特許文献８】Ｋａｋｋｏｌａ，  Ｌ．，  Ｔｏｍｍｉｓｋａ，  Ｊ．，  Ｂｏｅｌｅ，  Ｌ．  Ｃ．  Ｌ．，  Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ，  Ｓ．，  Ｂｌｏｍ，  Ｔ．，  Ｋｅｋａｒａｉｎｅｎ，  Ｔ．，  Ｑｉｕ，  Ｊ．，  Ｐｉｎｔｅｌ，  Ｄ．，  Ｈｏｅｂｅｎ，  Ｒ．  Ｃ，  Ｈｅｄｍａｎ，  Ｋ．  ＆  Ｓｏｄｅｒｌｕｎｄ−Ｖｅｎｅｒｍｏ，  Ｍ．  （２００７）．  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔｏｒｑｕｅ  ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ  （ＴＴＶ）  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ６．  ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７４，  ４７１９−  ４７３０．
【非特許文献９】Ｋａｍａｈｏｒａ，  Ｔ．，  Ｈｉｎｏ，  Ｓ．  ＆  Ｍｉｙａｔａ，  Ｈ．  （２０００）．  Ｔｈｒｅｅ  Ｓｐｌｉｃｅｄ  ｍＲＮＡｓ  ｏｆ  ＴＴ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎ  ＣＯＳ１  Ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４，  ９９８０−９９８６．
【非特許文献１０】Ｋｅｋａｒａｉｎｅｎ，  Ｔ．，  Ｓｉｂｉｌａ，  Ｍ．，  Ｓｅｇａｌｅ  ＆  ｅｓ，  Ｊ．  （２００６）．  Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｗｉｎｅ  Ｔｏｒｑｕｅ  ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐｏｓｔ  ｗｅａｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  （ＰＭＷＳ）−ａｆｆｅｃｔｅｄ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ＰＭＷＳ−ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｐｉｇｓ  ｉｎ  Ｓｐａｉｎ．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７，  ８３３−８３７．
【非特許文献１１】Ｌｅａｒｙ，  Ｔ．  Ｐ．，  Ｅｒｋｅｒ，  Ｊ．  Ｃ，  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，  Ｍ．  Ｌ．，  Ｄｅｓａｉ，  Ｓ．  Ｍ．  ＆  Ｍｕｓｈａｈｗａｒ，  Ｉ．  Ｋ．  （１９９９）．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ＴＴ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｈｉｇｈ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ，  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｎｄ  ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌｓ．  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８０，  ２１１５−２１２０．
【非特許文献１２】Ｌｅｐｐｉｋ，  Ｌ．，  Ｇｕｎｓｔ，  Ｋ．，  Ｌｅｈｔｉｎｅｎ，  Ｍ．，  Ｄｉｌｌｎｅｒ，  Ｊ．，  Ｓｔｒｅｋｅｒ，  Ｋ．  ＆  ｄｅ  Ｖｉｌｌｉｅｒｓ，  Ｅ．  Ｍ．  （２００７）．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｔｒａｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＴＴ  ｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１，  ９３４６−５６．
【非特許文献１３】Ｍａｎｋｅｒｔｚ，  Ａ．  ＆  Ｈｉｌｌｅｎｂｒａｎｄ，  Ｂ．  （２００１）．  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐ  ｇｅｎｅ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７９，  ４２９−３８．
【非特許文献１４】Ｍａｃｋａｙ，  Ｉ．Ｍ．，  Ｋ．Ｅ．  Ａｒｄｅｎ，  Ａ．  Ｎｉｔｓｃｈｅ．  ２００２  “Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ”．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０  （６）：  １２９２−３０５．
【非特許文献１５】Ｍａｎｋｅｒｔｚ，  Ａ．，  Ｃａｌｉｓｋａｎ，  Ｒ．，  Ｈａｔｔｅｒｍａｎｎ，  Ｋ．，  Ｈｉｌｌｅｎｂｒａｎｄ，  Ｂ．，  Ｋｕｒｚｅｎｄｏｅｒｆｅｒ，  Ｐ．，  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｂ．，  Ｓｃｈｍｉｔｔ，  Ｃ，  Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄｔ，  Ｔ．  ＆  Ｆｉｎｓｔｅｒｂｕｓｃｈ，  Ｔ．  （２００４）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ：  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９８，  ８１−８．
【非特許文献１６】Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｌ．，  Ｋｅｋａｒａｉｎｅｎ，  Ｔ．，  Ｓｉｂｉｌａ，  Ｍ．，  Ｒｕｉｚ−Ｆｏｎｓ，  Ｆ．，  Ｖｉｄａｌ，  Ｄ．，  Ｇｏｒｔａｚａｒ，  Ｃ．  ＆  Ｓｅｇａｌｅｓ，  Ｊ．  （２００６）．  Ｔｏｒｑｕｅ  ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ  （ＴＴＶ）  ｉｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｒｅｖａｌｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｗｉｌｄ  ｂｏａｒ  （Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）．  Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １１８，  ２２３−２２９．
【非特許文献１７】Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｂ．，  Ｍａｅｒｚ，  Ａ．，  Ｄｏｂｅｒｓｔｅｉｎ，  Ｋ．，  Ｆｉｎｓｔｅｒｂｕｓｃｈ，  Ｔ．  ＆  Ｍａｎｋｅｒｔｚ，  Ａ．  （２００８）．  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  Ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅ  Ｐ／１Ｃ１．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．
【非特許文献１８】Ｎｉｅｌ，  Ｃ，  Ｄｉｎｉｚ−Ｍｅｎｄｅｓ，  Ｌ．  ＆  Ｄｅｖａｌｌｅ，  Ｓ．  （２００５）．  Ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｒｑｕｅ  ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ  （ＴＴＶ）  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｓｗｉｎｅ  ｓｅｒａ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｗｉｎｅ  ＴＴＶ  ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８６，  １３４３−７．
【非特許文献１９】Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  Ｔ，  Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｈ，  Ｋｏｎｉｓｈｉ  Ｋ，  Ｙｏｓｈｉｚａｗａ  Ｈ，  Ｍｉｙａｋａｗａ  Ｙ，  Ｍａｙｕｍｉ  Ｍ．  （１９９７）．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２４１  ：  ９２−９７
【非特許文献２０】Ｏｋａｍｏｔｏ，  Ｈ．，  Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，  Ｔ．，  Ｔａｗａｒａ，  Ａ．，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｍ．，  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｊ．，  Ｓａｉ，  Ｔ．  ＆  Ｓｕｇａｉ，  Ｙ．  （２０００）．  ＴＴ  Ｖｉｒｕｓ  ｍＰｖＮＡｓ  Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｎ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２７９，  ７００−７０７．
【非特許文献２１】Ｏｋａｍｏｔｏ，  Ｈ．，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｍ．，  Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，  Ｔ．，  Ｔａｗａｒａ，  Ａ．，  Ｆｕｋａｉ，  Ｋ．，  Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，  Ｕ．，  Ｎａｉｔｏ，  Ｙ．  ＆  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，  Ａ．  （２００２）．  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＴ  ｖｉｒｕｓｅｓ  （ＴＴＶｓ）  ｉｎ  ｐｉｇｓ，  ｃａｔｓ  ａｎｄ  ｄｏｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＴＶｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｕｐａｉａｓ．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８３，  １２９１−７．
【非特許文献２２】Ｏｋａｍｏｔｏ，  Ｈ．  （２００９）．  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＴＴ  ｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３３１，  １−２０．
【非特許文献２３】Ｑｉｕ，  Ｊ．，  Ｋａｋｋｏｌａ，  Ｌ．，  Ｃｈｅｎｇ，  Ｆ．，  Ｙｅ，  Ｃ，  Ｓｏｄｅｒｌｕｎｄ−Ｖｅｎｅｒｍｏ，  Ｍ．，  Ｈｅｄｍａｎ，  Ｋ．  ＆  Ｐｉｎｔｅｌ，  Ｄ．  Ｊ．  （２００５）．  Ｈｕｍａｎ  Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  ＴＴ  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ６  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ  Ｓｉｘ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ  Ｃｌｏｎｅ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９，  ６５０５−６５１０．
【非特許文献２４】Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｅｄｉｔｏｒ：  Ｊｕｌｉｅ  Ｌｏｇａｎ，  Ｋｉｒｓｔｉｎ  Ｅｄｗａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｎｉｃｋ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ，  Ｌｏｎｄｏｎ，ＩＳＢＮ：  ９７８−１−９０４４５５−３９−４
【非特許文献２５】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ．  ＩＳＢＮ  ０−  ８７９６９−３０９−６，
【非特許文献２６】Ｔａｉｒａ，  Ｏ．，  Ｏｇａｗａ，  Ｈ．，  Ｎａｇａｏ，  Ａ．，  Ｔｕｃｈｉｙａ，  Ｋ．，  Ｎｕｎｏｙａ，  Ｔ．  ＆  Ｕｅｄａ，  Ｓ．  （２００９）．  Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｗｉｎｅ  Ｔｏｒｑｕｅ  ｔｅｎｏ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｇｒｏｕｐｓ  １  ａｎｄ  ２  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｓｗｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ  ｐｏｓｔ−ｗｅａｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３９，  ３４７−５０．
【非特許文献２７】Ｚｈｅｎｇ，  Ｈ．，  Ｙｅ，  Ｌ．，  Ｆａｎｇ，  Ｘ．，  Ｌｉ，  Ｂ．，  Ｗａｎｇ，  Ｙ．，  Ｘｉａｎｇ，  Ｘ．，  Ｋｏｎｇ，  Ｌ．，  Ｗａｎｇ，  ５１５  ｎｇ，  Ｗ．，  Ｚｅｎｇ，  Ｙ．，  Ｙｅ，  Ｌ．，  Ｗｕ，  Ｚ．，  Ｓｈｅ，  Ｙ．  ＆  Ｚｈｏｕ，  Ｘ．  （２００７）．  Ｔｏｒｑｕｅ  Ｔｅｎｏ  Ｖｉｒｕｓ  （ＳＡＮＢＡＮ  Ｉｓｏｌａｔｅ）  ＯＲＦ２  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ＮＦ−  ｛ｋａｐｐａ｝Ｂ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｖｉａ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｉ｛ｋａｐｐａ｝Ｂ  Ｋｉｎａｓｅｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１，  １１９１７−１１９２４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、ｓＴＴＶ株を、それらのｓＴＴＶ株の地理的起源および遺伝子型に無関係に検出しうる信頼しうる方法および診断手段が明らかに必要とされている。そしてまた、そのようなｓＴＴＶ株のウイルス複製活性を検出しうる信頼しうる方法および診断手段も必要とされている。
【０００９】
そのような方法および診断手段を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
驚くべきことに、ｓＴＴＶ株の存在または非存在を、それらのＴＴＶ株の地理的起源または遺伝子型に無関係に検出しうる特異的プライマーセット（所望により特異的プローブと組合されたもの）が、本発明において見出された。
【００１１】
本発明の方法においては、以下の方法工程を行うことにより、サンプル内のＴＴＶの検出が行われうる：
ａ）配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号２に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するリバースプライマーまたは配列番号３に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するリバースプライマーとを含むプライマーセットを使用して、該サンプルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、
ｂ）工程（ａ）のＰＣＲ増幅結果を検査する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ブタＴＴＶに関する広スペクトルｑＰＣＲの増幅曲線（図１ａ）および標準曲線（図１ｂ）の図。該増幅図においては、灰色の曲線は標準希釈系列を表し、黒色の曲線はサンプルを表す。該標準曲線図においては、小さな丸印は標準希釈系列を表し、バツ印はサンプルを表す。
【図２】アンプリコンの融解ピーク。灰色の曲線は標準希釈系列を表し、黒色の曲線はサンプルを表す。全てのサンプルが、８５．０℃〜８６．５℃の融解温度を有する１つのピークを示した。このことは、測定された蛍光が該ＰＣＲ産物のみに由来することを示している。
【図３】ｓＴＴＶ遺伝子型２（ｓＴＴＶ２）ウイルスの３２３塩基対を含むプラスミドＴＴＶ００８の概要図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
「プライマー」なる語は、相補的ポリヌクレオチドを認識し、それに結合し、相補鎖に沿った核酸合成または複製のための開始点として作用しうるオリゴヌクレオチドを示すために用いられる。
【００１４】
「相補的ポリヌクレオチドに結合しうる」なる語は、そのポリヌクレオチドとの二重らせん構造をハイブリダイゼーション条件下で形成しうることを意味する。
【００１５】
「プローブ」なる語は、関心のあるポリヌクレオチドに相補的であり、そのポリヌクレオチドとの二重らせん構造をハイブリダイゼーション条件下で形成しうるオリゴヌクレオチドを意味する。「プローブ」なる語は、基本的には、特異的マーカーを追加的に運ぶプライマーポリヌクレオチドの特性を有する。そのようなマーカーは、とりわけ、蛍光体、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ（後記を参照されたい）において使用される蛍光体でありうる。
【００１６】
「オリゴヌクレオチド」なる語は、本明細書においては、短い核酸重合体を示すために用いられる。そのような短い重合体は、通常、１０〜１００核酸の長さを有する。
【００１７】
「ハイブリダイゼーション条件」なる語は、関心のあるポリヌクレオチドにプライマーまたはプローブがアニールするのを可能にする条件を意味する。これらの条件は、ハイブリダイゼーションを行おうとする溶液の温度およびイオン強度に左右される。ハイブリダイゼーション反応および条件は当技術分野でよく知られており、とりわけ、Ｍａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（３４）による標準的な実験マニュアルに記載されている。ハイブリダイゼーション条件の決定のためには、基本的には、以下の式が用いられる。１３ヌクレオチドより長い配列に関する基本的な融解温度（Ｔｍ）の計算のためには、以下の式が用いられうる：
Ｔｍ＝６４．９＋４１＊（ｙＧ＋ｚＣ−１６．４）／（ｗＡ＋ｘＴ＋ｙＧ＋ｚＣ）
（式中、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ、該配列内の塩基Ａ、Ｔ、ＧおよびＣの数である）（Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ．およびＤｏｔｙ，Ｐ．（１９６２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５：１０９−１１８）。更なる情報はＷａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．，Ｓｈａｆｆｅｒ，Ｊ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｆ．，Ｂｏｎｎｅｒ，Ｊ．，Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ．およびＩｔａｋｕｒａ，Ｋ．（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ６：３５４３−３５５７ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。該式は、５０ｎＭ  プライマー、５０ｍＭ  Ｎａ＋およびｐＨ７．０の標準的な条件下でアニーリングが生じることを前提としている。基本的な塩補正融解温度（Ｔｍ）の計算のためには、以下の式が用いられうる：
Ｔｍ＝１００．５＋（４１＊（ｙＧ＋ｚＣ）／（ｗＡ＋ｘＴ＋ｙＧ＋ｚＣ））−（８２０／（ｗＡ＋ｘＴ＋ｙＧ＋ｚＣ））＋１６．６＊ｌｏｇ１０（［Ｎａ＋］）（式中、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ、該配列内の塩基Ａ、Ｔ、ＧおよびＣの数である）。項１６．６＊ｌｏｇ１０（［Ｎａ＋］）が塩濃度の変化に関してＴｍを補正する（更なる情報はＨｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ；Ｉｓｒａｅｌ，Ｍ．Ｆ．；Ｌａｗ，Ｍ−Ｆ．；およびＭ．Ａ．Ｍａｒｔｉｎ“Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ＤＮＡｓ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，４８７６−４８８３，１９７９に記載されている）。
【００１８】
ＰＣＲ技術も同様に当技術分野でよく知られており、それらは、標準的な実験マニュアル、例えば“Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，“ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”およびＭａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（後記に一覧されている文献における参考文献を参照されたい）に更に詳細に記載されている。
【００１９】
不完全な相補性であるにもかかわらずアニーリングが生じうるようなハイブリダイゼーション条件である限り、プライマーまたはプローブは、関心のあるポリヌクレオチドに完全に相補的である必要がない、と当業者は認識している。原則として、１以上のヌクレオチドのミスマッチは、Ｔｍを低下させることにより、または例えば前記の式もしくは前記で引用された文献における十分な情報を用いて塩濃度を変化させることにより、相補されうる。
【００２０】
ミスマッチを有するプライマーの使用は通常、それほどストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件の使用を必要とする、と認識されるべきである。そしてこれは時には、より低い特異性を招きうる。ＴＴＶゲノムの小さいサイズを考慮すると、これは必ずしも問題となるわけではない。ミスマッチを有するプライマーが非特異的ＴＴＶ配列に結合する確率は非常に小さい。それでも、配列番号１、２または３に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に対して１００％の相補性マッチを含むプライマーが好ましいことは明らかである。
【００２１】
本発明のプライマーおよびプローブは、とりわけ、動物またはその動物のサンプルにおけるｓＴＴＶの検出のために使用されうる。
【００２２】
「サンプル」なる語は、本明細書においては、ｓＴＴＶを含有する疑いのあるいずれかの生物学的物質を示すために用いられる。該生物学的物質は、とりわけ、ブタの肝臓、脾臓、骨または筋肉組織でありうるが、それは体液、例えば血液、尿、便物質、羊水であることも可能である。該物質は排泄腔、口腔もしくは鼻腔スワブまたは例えば破壊細胞でありうる。言うまでもなく、被検物質は非ブタ由来であることも可能である。非ブタ種はｓＴＴＶを保持する疑いがあり、またはそれらがｓＴＴＶを保持することを排除するために試験されるのももっともである。
【００２３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲとも称される）は、ＤＮＡ分子を、融解温度を超える温度までプライマーの存在下で加熱し、ついで、該プライマーセットのプライマーがそれぞれの相補的ＤＮＡ鎖に結合することを可能にするために冷却する工程を含む。該ＤＮＡ−プライマー複合体は、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の形態の４種のＤＮＡビルディングブロックであるＡ、Ｔ、ＧおよびＣの存在下で酵素ＤＮＡポリメラーゼを用いる相補的ＤＮＡ鎖の合成のための開始点を形成する。これらのビルディングブロックを用いて、ＤＮＡポリメラーゼは新たなＤＮＡ鎖を合成する。サンプル中のｓＴＴＶ−ＤＮＡの量に応じて（それが存在する場合）、検出されるべき十分な物質が存在するようになるまでに幾つかのＰＣＲサイクルを行う必要がある。平均して３０〜４５サイクルが珍しくないであろう。当業者は、プライマーおよびプローブの配列に基づいて、例えば前記の又は標準的な実験マニュアル（前記を参照されたい）における式を用いてＰＣＲサイクルの種々の工程のための最適な温度条件を決定しうるであろう。
【００２４】
「配列番号に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するプライマー」なる語は、該プライマーが、少なくとも、その配列番号に記載されているオリゴヌクレオチドに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間の長さを有するべきであることを意味する。単なる例示に過ぎないが、ＦＤＮＡ−ＴＴＶは、配列番号１に示されている配列ｃｇａａｔｇｇｃｔｇａｇｔｔｔａｔｇｃｃｇｃを有していたであろう。したがって、「配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するプライマー」は、少なくとも、ヌクレオチドｃｇａａｔｇｇｃｔｇａｇｔｔｔａｔｇｃｃｇｃからの、その順序の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間からなるべきである。しかし、それは、例えば、ヌクレオチドｃｇａａｔｇｇｃｔｇａｇｔｔｔａｔｇｃｃｇｃを含む、そして５’末端および／または３’末端に１以上の追加的なヌクレオチドを有する、より長いプライマーであることが可能であろう。プローブにも同じことが言える（しかし、プローブは、クエンチャー分子が蛍光体をもはや消光しないような長さを有するべきではないことは明らかである；後記を参照されたい）。配列番号２に示されているオリゴヌクレオチドは１７核酸の長さを有するが、この場合もまた、本発明のプライマーまたはプローブのオリゴヌクレオチドは、配列番号２に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの最小長を有するべきである。５’末端および／または３’末端に追加的なヌクレオチドを有するプライマー（またはプローブ）が選択される場合、そのようなヌクレオチドは、該プライマーが結合する相補鎖の３’および／または５’フランキング領域に相補的であっても相補的でなくてもよい。幾つかの場合には、種々のＲＴ−ＰＣＲサイクルの温度は、プライマーの増加した長さに、そして追加的ヌクレオチドの１以上が相補的であることに適合化されるべきである。そしてこの場合も、当業者は、プライマーおよびプローブの配列に基づいて、例えば前記の又は本明細書に記載されているＰＣＲのテキスト（前記を参照されたい）における式を用いてＰＣＲサイクルの種々の工程のための最適な温度条件を決定しうるであろう。
【００２５】
配列番号１〜８に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドの連続的な１５、１６、１７、１８、１９または更には２０以上（配列番号２に関しては最大で１７）のヌクレオチドの区間に結合するプライマーが、後の順序のものほど好ましい。なぜなら、それらはｓＴＴＶ配列に、より一層選択的にアニールするからである。
【００２６】
配列番号２および５に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドの連続的な１５、１６、１７、１８、１９または更には２０以上（配列番号２に関しては最大で１７）のヌクレオチドの区間に結合するプローブは後の順序のものほど好ましい。なぜなら、それらもｓＴＴＶ配列に、より一層選択的にアニールするからである。
【００２７】
原則として、本発明の方法の工程ａ）の後、工程ｂ）を行うための種々の方法が現在存在する。該ＰＣＲ工程は、例えば通常のアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動により長さおよび量が検査されうるＰＣＲ産物を与える。ｓＴＴＶ  ＤＮＡがサンプル中に存在する場合、該プライマーペアがアニールし、したがって、工程ａ）の後、予想される長さのＰＣＲ産物がゲル上で検出されるであろう。ｓＴＴＶ  ＤＮＡがサンプル中に存在しない場合、該プライマーペアまたは該プライマーの少なくとも一方はアニールできず、したがって、予想される長さのＰＣＲ産物は検出されないであろう。
【００２８】
認識されるとおり、配列番号１、２、３、４および５に示されているオリゴヌクレオチドはこれらの領域内の個々のウイルスの配列における（非常に少数の）相違を反映している。プライマーの開発に関する考えられうる結果を後記で説明する（後記を参照されたい）。表１は６９個の公知ｓＴＴＶ配列の配列アライメントを示し、この表において１〜５の番号が付された矢印は、配列番号１、２、３、４および５が大体どのあたりに位置するのかを示している。表１から認められうるとおり、ＦＤＮＡ−ＴＴＶに結合する本発明のフォワードプライマーと、ＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１に結合する本発明のリバースプライマーとを含むプライマーセット、またはＦＤＮＡ−ＴＴＶに結合する本発明のフォワードプライマーと、ＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２に結合する本発明のリバースプライマーとを含むプライマーセットは、全ての場合に、すなわち、試験された全ての野生分離体に関して、それらの地理的起源またはそれらの遺伝子型に無関係に、ＰＣＲ産物を与えうる。
【００２９】
表１から分かるとおり、ＦＤＮＡ−ＴＴＶおよびＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２に結合するプライマーセットにより得られるＰＣＲ産物は約８３〜８８ヌクレオチドの長さを有するであろう。これは、もちろん、それらの２つのプライマーの間の領域の厳密な長さに左右される。そしてそれらのプライマーの間の領域における可変性が高いため、ｓＴＴＶ群内でさえも、厳密な長さを予測することは可能ではない。しかし、ＰＣＲ産物の厳密な長さは重要ではなく、ＰＣＲ産物の非存在または存在のみが重要であり、その厳密なサイズは重要ではない。
【００３０】
通常のアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動による潜在的ＰＣＲ産物の長時間を要する分析の代替手段はＳＹＢＲグリーン系（前記および後記を参照されたい）の利用である。ＳＹＢＲグリーンは、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡにインターカレートする色素である。このインターカレーションはＳＹＢＲグリーンの蛍光を生じさせる。したがって、ＳＹＢＲグリーンの存在下でＰＣＲ反応を行うと、それぞれの新たなｄｓＤＮＡコピーは或る量のＳＹＢＲグリーンを拾い上げ、それに蛍光を生じさせる。リアルタイムＰＣＲ装置はこの蛍光を検出することが可能であり、該蛍光の強度から専用ソフトウェアがＣｔ値を計算しうる。これは、生じたｃＤＮＡの量の直接的定量を可能にする（しかし、ＳＹＢＲグリーンの使用は、予想どおりに反応工程が進行したかどうかを示す内部対照の存在を許容しない）。ＳＹＢＲ−グリーンに基づくＲＴ−ＰＣＲ法はＭａｃｋａｙ，Ｉ．Ｍ．らにより記載されている。
【００３１】
したがって、前記方法は、ＴＴＶ株の地理的起源または遺伝子型に無関係に、サンプル中のｓＴＴＶの存在または非存在を選択的に検出する方法を提供する。
【００３２】
したがって、本発明の第１の実施形態は、サンプル中のブタトルクテノウイルス（ｓＴＴＶ）の存在の検出方法に関するものであり、該方法は、ａ）配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号２に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するリバースプライマーまたは配列番号３に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するリバースプライマーとを含むプライマーセットを使用して該サンプルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ｂ）工程（ａ）のＰＣＲ増幅結果を検査する工程を含むことを特徴とする。
【００３３】
この実施形態の好ましい形態においては、該プライマーセットの一方のプライマーは、配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶの完全長に結合し、該プライマーセットの他方のプライマーは、配列番号２に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の完全長または配列番号３に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２の完全長に結合する。
【００３４】
単なる一例に過ぎないが、配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶの完全長に結合するプライマーセットのプライマーは、例えば、２２ヌクレオチドの長さを有し配列ｃｇａａｔｇｇｃｔｇ  ａｇｔｔｔａｔｇｃｃ  ｇｃを有するプライマーである。
【００３５】
例えば配列番号１においては、２位のヌクレオチドはＳ（すなわち、ＧまたはＣでありうる）であると認識されるであろう。２位のＳは、適当なプライマーの開発の場合にはそれほど大きな影響を及ぼさない。それは、プライマー伸長が生じる点から比較的遠くに位置する。プライマーは、その位置において、Ｇを有するＤＮＡおよびＣを有するＤＮＡの両方にアニールするであろう。したがって、配列ｃｇａａｔｇｇｃｔｇ  ａｇｔｔｔａｔｇｃｃ  ｇｃを有するプライマー、および配列ｃｃａａｔｇｇｃｔｇ  ａｇｔｔｔａｔｇｃｃ  ｇｃを有するプライマーの両方が好適である。考えられうるミスマッチを補償するためにＰＣＲ工程の温度を矯正するための方法は当業者に公知であろう。あるいは、配列ｃｇａａｔｇｇｃｔｇ  ａｇｔｔｔａｔｇｃｃ  ｇｃを有するプライマーおよび配列ｃｃａａｔｇｇｃｔｇ  ａｇｔｔｔａｔｇｃｃ  ｇｃを有するプライマーの両方を含む縮重プライマーが使用されうる。もう１つの例示に過ぎないが、１８位のヌクレオチドＲはより重要である。なぜなら、それは、プライマー伸長が生じる点の近くに位置するからである。したがって、例えばｃｇａａｔｇｇｃｔｇ  ａｇｔｔｔａｔのような、より短いプライマーを使用すること、または１８位にＧを有するプライマーとＡを有するプライマーとを含む縮重プライマーを使用することが望ましいであろう。
【００３６】
配列番号１、２、３、４および５に示されている配列のそれぞれに関しては、明らかなコンセンサス配列が存在する。これは表１から直ちに判明しうる。配列番号１のコンセンサス配列はｃｇａａｔｇｇｃｔｇａｇｔｔｔａｔｇｃｃｇｃである。配列番号２のコンセンサス配列はｃｔｇｇｇｃｇｇｇｔｇｃｃｇｇａｇである。配列番号３のコンセンサス配列はｃｇｇａｇｔｃａａｇｇｇｇｃｃｔａｔｃｇｇｇｃａｇｇである。配列番号４のコンセンサス配列はｔｇｔｃｔａｇｃｃｇｃｃｔｇｇｇｃｇｇｇｔｇｃｃｇｇａｇである。配列番号５のコンセンサス配列はｃｇｇａｇｔｃａａｇｇｇｇｃｃｔａｔｃｇｇｇｃａｇｇである。
【００３７】
コンセンサス配列は、これらの配列に結合するプライマーを設計する場合に好ましい配列である。
【００３８】
以下の点に注目すべきである。分析された、表１に示されているｓＴＴＶ配列のうちの３８個においては、配列番号４の配列はｙｇｔｃｔａｒｃｍｇｍｃｔｇｇｇｃｇｇｇｔｇｃｃｇｖａｇである。しかし、分析された、表１に示されているｓＴＴＶ配列のうちの３１個においては、配列番号４の配列は、１個のヌクレオチドのギャップにより、ｙｇｔｃｔａｒｃｇｍｃｔｇｇｇｃｇｇｇｔｇｃｃｇｖａｇである。該ギャップは、プライマー伸長が生じる点から比較的遠くに位置し、したがって、適当なプライマーを設計する場合に、それは必ずしも考慮される必要はない。
【００３９】
ＰＣＲ産物の存在を検出するための、より効率的かつ選択的な方法は、プローブに基づくリアルタイムＰＣＲである。この方法は基本的には前記ＰＣＲ法に基づいているが、それは、前記ＰＣＲ反応の選択性を超えるレベルの選択性を有する。それは、本発明の、配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号３に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するリバースプライマーとを含むプライマーセット、および配列番号２に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するプローブの使用に基づいている。オリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するプローブは、そのようなプローブが、それに結合している蛍光体およびクエ
ンチャー分子を有するオリゴヌクレオチドである点で、オリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するプライマーとは異なる。使用される蛍光体もしくはクエンチャー、またはプローブ／クエンチャーの組合せの根拠となる作用メカニズムに関しては、そのようなプローブの幾つかの形態が存在する。単なる一例ではあるが、そのようなプローブはＴａｑＭａｎ（タックマン）プローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ（スコルピオンズ）プローブおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ（モレキュラービーコンズ）プローブ（後記を参照されたい）として商業的に入手可能である。
【００４０】
プローブを使用するこの方法においては、該検出は、例えば本発明のプローブを使用することにより行われうる。このプローブは、前記のとおり、例えば本発明のＦＤＮＡ−ＴＴＶ／ＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２結合プライマーセットを使用するＰＣＲ反応において生じたｃＤＮＡの内部配列に選択的に結合する。例えば、株ＴＴＶ２ （ＨＭ６３３２３９．１）／１−２７９７（表１を参照されたい）においては、該プローブは、例えば、工程ｂ）において、アライメントの３８０〜３９６位のｃＤＮＡ  ＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２領域にアニールするであろう。しかし、これは、増幅ＤＮＡが実際にｓＴＴＶ由来である場合においてのみ生じる。そのような２つの選択的プライマーが非ＴＴＶ  ＤＮＡを増幅するという考えにくい場合において、該プローブはそれにアニールしないため、これは、工程ｂにおいて認識されるであろう。したがって、本発明のプローブはｓＴＴＶの検出を、単なるＰＣＲ反応より一層特異的なものにする。更に、プローブの使用は、ＰＣＲ産物の検出のためのゲルの使用を回避する。そして最後に、リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラーにおいて検出される蛍光のレベルは、遊離した蛍光体に正比例し、したがって、ＰＣＲにおいて存在するＤＮＡ鋳型の量に正比例する（後記を参照されたい）。したがって、この方法はリアルタイムＰＣＲ反応において非常に好適である。
【００４１】
ＴａｑＭａｎに基づくリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（８５０  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ  ９４４０４，ＵＳＡ）による開発品である。ＴａｑＭａｎに基づくリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、とりわけ、参考文献８、１０および３３に記載されている。ＳｃｏｒｐｉｏｎｓおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓに基づくリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、ＰＲＥＭＩＥＲ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，３７８６  Ｃｏｒｉｎａ  Ｗａｙ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ  ９４３０３−４５０４，ＵＳＡから入手可能である。
【００４２】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓに基づくリアルタイムＰＣＲの使用は、とりわけ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．５４：ｐ．２９５−３１０，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｔ．ＰａｒｉｓｈおよびＮ．Ｇ．Ｓｔｏｋｅｒ編（著作権））Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪにおける、Ｍａｎｇａｎｅｌｌｉ，Ｒ．，Ｔｙａｇｉ，Ｓ．およびＳｍｉｔｈ，Ｉ．によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ；Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｏｏｌ  ｔｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｐｏｉｎｔ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｏ  Ａｎａｌｙｚｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに詳細に記載されている。
【００４３】
ＴａｑＭａｎプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に共有結合している蛍光体および３’末端におけるクエンチャーからなる。幾つかの異なる蛍光体（例えば、６−カルボキシフルオレセイン、頭字語：ＦＡＭ、またはテトラクロロフルオレセイン、頭字語：ＴＥＴ）およびクエンチャー（例えば、テトラメチルローダミン、頭字語：ＴＡＭＲＡ、またはジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド小溝結合物質、頭字語：ＭＧＢ）が入手可能である。クエンチャー分子は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）によりサイクラ―の光源により励起された場合に蛍光体により放出された蛍光を消光する。蛍光体およびクエンチャーが接近している限り、消光は発光シグナルを抑制する。ＴａｑＭａｎプローブは、特定のプライマーセットにより増幅されたＤＮＡ内にそれがアニールするように設計される。Ｔａｑポリメラーゼがプライマーを伸長させ、新生鎖を合成するにつれて、該ポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性が、鋳型にアニールしたプローブを分解する。該プローブの分解は蛍光体をそれから遊離させ、クエンチャーの近傍部を破壊して、消光効果を軽減し、蛍光体の蛍光を可能にする。したがって、リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラーにおいて検出される蛍光は、遊離した蛍光体に正比例し、該ＰＣＲにおいて存在するＤＮＡ鋳型の量に正比例する。
【００４４】
Ｔａｑｍａｎプローブは、本発明の方法および診断手段における使用のための好ましいプローブである。
【００４５】
実際、本明細書に記載されているＴａｑｍａｎプローブであるプローブＴＴＶ−ｒ１は、配列番号２に記載されているＤＮＡ配列に結合するオリゴヌクレオチドであるが、蛍光体およびクエンチャーがそれに結合している。しかし、説明されているとおり（前記を参照されたい）、該プローブはまた、配列番号２に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合する、より短い又はより長いオリゴヌクレオチドでありうる。
【００４６】
この方法においては、該プライマーおよび該プローブのアニーリングは共に、１つのプロセスにおいて生じるため、発色反応の発生はＤＮＡ増幅と実質的に同時に生じる。したがって、そのような反応はリアルタイムＰＣＲと称される。
【００４７】
したがって、この実施形態のもう１つの好ましい形態は、サンプル中のブタトルクテノウイルス（ｓＴＴＶ）の存在の検出方法に関するものであり、該方法は、
ａ）配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号３に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するリバースプライマーとを含むプライマーセットを使用して該サンプルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、
ｂ）配列番号２に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するプローブを使用して工程（ａ）のＰＣＲ増幅結果を検査する工程を含むことを特徴とする。
【００４８】
この実施形態のより好ましい形態においては、該プライマーセットの一方のプライマーは、配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶの完全長に結合し、該プライマーセットの他方のプライマーは、配列番号３に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２の完全長に結合する。
【００４９】
この実施形態のもう１つのより好ましい形態においては、該プローブは、配列番号２に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の完全長に結合する。
【００５０】
前記のとおり、ｓＴＴＶは、組織内での複製を伴って又は伴わないで、組織内に存在しうるであろう。ＴＴＶは実質的に全ての組織および器官に存在することが公知であるが、それが血液によりその組織に移されたためにそれらにおいて見出されるだけなのか、あるいはそれがそこにおいて活発に複製されているのかは公知でない。したがって、例えば組織内のｓＴＴＶの単なる存在と、その組織における該ウイルスの活発な複製とを区別しうる試験が大いに必要とされている。そのような試験は更に、細胞培養内の微量のｓＴＴＶが不活化形態であるのか否かを検出することを可能にし、ｓＴＴＶウイルス複製の欠如に関する確実性は細胞培養内のｓＴＴＶワクチン製造をより一層安全なものとするであろう。
【００５１】
ＴＴＶのゲノム複製はローリングサークルモデルで進行し、複製中、マイナス鎖ゲノムウイルスＤＮＡ鎖を鋳型として用いてプラス鎖ｓｓＤＮＡが生じ、このプラス鎖ＤＮＡが今度は、新たなマイナス鎖ＤＮＡを生成するための鋳型として働く。原則として、プラス鎖ＤＮＡが複製の検出のために使用されることが可能であり、そしてプラスＤＮＡ鎖に特異的に結合するプライマーを使用する鎖特異的ＰＣＲ試験（ｓｓＰＣＲ）が、ＤＮＡ複製を示すために使用されうるであろう。しかし、ＴＴＶが非許容細胞（すなわち、新たなウイルス粒子の形成を含む該ウイルスの完全な生産的複製サイクルを支持しない細胞）に進入する場合には問題が生じる。そのような非許容細胞においては、それでも、細胞メカニズムがウイルスｓｓＤＮＡの複製を開始させ、その結果、プラス鎖ＤＮＡが形成され、これは生産的ウイルス複製を誤って示唆するであろう。したがって、ｓｓＰＣＲは、生産的ウイルス複製を証明するための信頼しうる試験ではない。
【００５２】
ウイルス複製のための、より信頼しうる指標は、ｓＴＴＶ  ｍＲＮＡの存在である。なぜなら、活発なウイルス複製はｍＲＮＡの出現を介して現れるからである。したがって、そのようなｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲとも称される逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により検出されうるであろう。しかし、種々のｓＴＴＶに関するゲノム配列における著しい可変性は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）において使用される普遍的プライマーを特定することを非常に困難にする。
【００５３】
第２の問題は、種々のｓＴＴＶ間でスプライシングパターンにおける有意な可変性が存在するらしいということ以外に、ｓＴＴＶにおけるｍＲＮＡスプライシングパターンに関してほとんど知られていないことにより生じる。ｓＴＴＶウイルス複製のスプライシング特性ゆえに、幾つかのプライマーは、ＲＮＡスプライシングに際して喪失する領域にそれらがアニールするため、使用できないのももっともである。ｍＲＮＡのスプライシング後、そのような領域は失われ、その結果、ＲＴ−ＰＣＲ産物は生じないであろう。そしてこれが今度は、ウイルスｓＴＴＶ複製が生じないという偽指標につながるであろう。
【００５４】
驚くべきことに、ＰＣＲプライマーが結合する領域ＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１およびＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２はｓＴＴＶのｍＲＮＡにおいても存在することが本発明において見出された。より一層驚くべきことに、これらの領域は、ｍＲＮＡスプライシング過程中にスプライシングアウトされる領域の外に位置することが判明した。したがって、これらの領域は、ｓＴＴＶにより取られるｍＲＮＡスプライシングパターンに無関係に、ｓＴＴＶのｍＲＮＡ内に常に存在する。
【００５５】
これは、ｓＴＴＶのウイルス複製中のｍＲＮＡの検出のためのＲＴ−ＰＣＲ反応におけるフォワードプライマーを開発するために、それらの地理的起源またはそれらの遺伝子型に無関係に、領域ＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１およびＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２使用されうることを意味する。したがって、この試験は、組織内のｓＴＴＶ  ｓｓＤＮＡの単なる存在とその組織内の該ウイルスの活発な複製とを識別することを初めて可能にする。
【００５６】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は２つの反応工程を含む。第１工程においては、該プライマーセットのプライマーの一方がＴＴＶ−ＲＮＡに結合し、この複合体は、４種のＤＮＡビルディングブロックＡ、Ｔ，ＧおよびＣの存在下、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によるＲＮＡ鎖のｃＤＮＡ鎖の合成のための開始点を形成する。第２工程において、このようにして形成されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを、該ハイブリッドを変性させるために加熱し、ついで、該プライマーセットの他方のプライマーが該ｃＤＮＡ鎖に結合するのを可能にするために冷却する。ついでこの他方のプライマーは、再び該ＤＮＡビルディングブロックの存在下、ＤＮＡポリメラーゼによる第２ＤＮＡ鎖の合成のための開始点として機能する。サンプル中のｓＴＴＶ−ＤＮＡの量に応じて（それが存在する場合）、検出されるべき十分な物質が存在するようになるまでに幾つかのＰＣＲサイクルを行う必要がある。平均して３０〜４５サイクルが珍しくないであろう。当業者は、プライマーおよびプローブの配列に基づいて、例えば前記の式および前記の標準的なテキスト（前記を参照されたい）における式を用いてＰＣＲサイクルの種々の工程のための最適な温度条件を決定しうるであろう。
【００５７】
前記のとおり、適当なフォワードプライマーはＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１およびＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２に相補的なプライマーである。本発明のそのようなフォワードプライマーは、配列番号４に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ａの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間、または配列番号５に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合する。
【００５８】
リバースプライマーとしては、ｍＲＮＡのポリＡテールに結合するプライマーが使用される。したがって、そのようなプライマーはポリＴ区間を含むであろう。そのようなプライマーは、好ましくは、少なくとも１４個の連続的なＴからなる。ポリＡテールのずれかの部分へのそのようなプライマーのランダムな結合を避けるために、リバースプライマーは、好ましくは、ポリＴ区間の３’末端にヌクレオチドＧ、ヌクレオチドＣまたはヌクレオチドＡを含有する。これはポリＡテールの５’末端への該プライマーの特異的結合を可能にするであろう。ポリＡテールの前の最後のヌクレオチドの特性が該ウイルスの配列から判明している場合には、該ポリＴ区間の３’末端のヌクレオチドはその最後のヌクレオチドに相補的なものとされうる。該特性が不明である場合には、該ポリＴ区間の３’末端にＧ、ＣまたはＡのいずれかをそれぞれが有する３個のポリＴプライマーの混合物が首尾よく使用されうる。したがって、本発明のリバースプライマーは少なくとも、配列番号６に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−１、配列番号７に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−２または配列番号８に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−３の最も５’末端側のヌクレオチドに結合する連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間を含む。
【００５９】
単なる一例に過ぎないが、配列番号６に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−１の少なくとも１４個の連続的な５’末端ヌクレオチドの区間に結合する本発明のリバースプライマーは、例えば、ヌクレオチド配列ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡまたはＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡを有しうるであろう。
【００６０】
Ｔ／Ａ二重らせんの融解温度は比較的低い。したがって、所望により、ポリＡテールに結合するプライマーは、例えば１５ヌクレオチドの既知だがランダムな配列で５’末端において伸長していることが可能である。そのような５’伸長プライマーを使用する場合、該プライマーのポリＴ部分とｍＲＮＡのポリＡテールとの間のアニーリングの成功はただ１つのＰＣＲサイクルにおける成功を要する。後続サイクルにおいては、ポリＴプライマーの５’伸長に相補的な第２プライマーが今や使用可能であることにより、アニーリング反応は遥かに効率的となろう。
【００６１】
したがって、本発明のもう１つの実施形態は、サンプル中の複製性ｓＴＴＶの存在の検出方法に関するものであり、該方法は、
ａ）配列番号４に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ａの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーまたは配列番号５に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号６に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−１、配列番号７に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−２または配列番号８に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−３の少なくとも１４個の連続的な５’末端ヌクレオチドの区間に結合する少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマーセットを使用して該サンプルの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、
ｂ）工程（ａ）のＲＴ−ＰＣＲ増幅結果を検査する工程を含むことを特徴とする。
【００６２】
フォワードプライマーとしては、好ましくは、オリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ａの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するプライマーが使用される。これは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応におけるＲＴ−ＰＣＲ産物の検出のための、オリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するプローブの使用を可能にするであろう。
【００６３】
したがって、この実施形態の好ましい形態は、該フォワードプライマーが、配列番号４に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ａの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合することを特徴とする、本発明による複製性ｓＴＴＶの存在の検出方法に関する。
【００６４】
配列番号５に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に基本的には結合するプローブはクエンチャー分子および蛍光体を含む。
【００６５】
したがって、この実施形態のより好ましい形態は、該方法が、配列番号５に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するプローブを使用して工程（ａ）のＰＣＲ増幅結果を検査する工程を更に含むことを特徴とする、本発明による複製性ｓＴＴＶの存在の検出方法に関する。
【００６６】
理想的には、ｓＴＴＶ  ＤＮＡの検出のための前記方法およびｓＴＴＶウイルス複製の検出のための前記方法は１つのウイルスにおいて同時に適用されるであろう。これは、ｓＴＴＶ  ＤＮＡおよびｓＴＴＶウイルス複製の存在の両方の同時検出を可能にするであろう。しかし、ＤＮＡおよびＲＮＡの検出のためのプライマーが適切に選択されるように注意すべきである。ＦＤＮＡ−ＴＴＶおよびＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２に結合するプライマーをＤＮＡの検出に使用する場合、ｍＲＮＡの検出のためのＦＲＮＡ−ｂに結合するプライマーの使用は避けるべきである。なぜなら、その場合、ＦＲＮＡ−ｂに結合するプライマーは、ＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２に結合するプライマーにアニールするからである。同じ理由により、ＦＤＮＡ−ＴＴＶおよびＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１に結合するプライマーをＤＮＡの検出に使用する場合、ｍＲＮＡの検出のためのＦＲＮＡ−ａに結合するプライマーの使用は避けるべきである。なぜなら、その場合、ＦＲＮＡ−ａに結合するプライマーは、ＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１に結合するプライマーにアニールするからである。同じ理由により、ＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２に結合するプライマーをＤＮＡの検出に使用し、ＦＲＮＡ−ａに結合するプライマーをＲＮＡの検出に使用する場合、ＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１およびＦＲＮＡ−ｂに相補的なプローブはＤＮＡおよびＲＮＡの検出に使用できない。したがって、それぞれのＰＣＲ産物およびＲＴ−ＰＣＲ産物の同時検出は、本発明のプローブを使用することによっては行えない。したがって、これらの産物はゲル電気泳動にような他の手段により分析されるべきである。
【００６７】
したがって、本発明のもう１つの実施形態は、サンプル中の複製性ｓＴＴＶの存在の検出方法に関するものであり、該方法は、
ａ）配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号３に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するリバースプライマーとを含むプライマーセットを使用して該サンプルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、
ｂ）配列番号４に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ａの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号６、配列番号７または配列番号８に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−１、２または３の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合する少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマーセットを使用して該サンプルの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、
ｃ）工程ａ）およびｂ）のＰＣＲ増幅結果を検査する同時工程を含むことを特徴とする。
【００６８】
そしてまた、本発明のもう１つの実施形態は、サンプル中の複製性ｓＴＴＶの存在の検出方法に関するものであり、該方法は、
ａ）配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号２に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するリバースプライマーとを含むプライマーセットを使用して該サンプルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、
ｂ）配列番号５に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号６、配列番号７または配列番号８に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合する少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマーセットを使用して該サンプルの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、
ｃ）工程ａ）およびｂ）の（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅結果を検査する同時工程を含むことを特徴とする。
【００６９】
それぞれ前記ＦＤＮＡ−ＴＴＶおよびＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２に結合するプライマーセットにより生じたＤＮＡ  ＰＣＲ産物に関して説明されているとおり、例えば、ＦＲＮＡ−ａに結合するフォワードプライマーとＲＲＮＡ−１に結合するリバースプライマーとを含むプライマーセットを使用した場合のＲＴ−ＰＣＲ産物の厳密な長さを得ることはできない。第１に、ｓＴＴＶ群内でさえも、それらのプライマー間の領域における可変性が高いため、これらの産物の厳密な長さを予測することは可能でない。そして更に、ＲＴ−ＰＣＲ産物の場合には、非常に多数のスプライス変異体がＴＴＶに関して公知であるため、これはより一層予測不可能である。しかし、この場合もまた、ＲＴ−ＰＣＲ産物の厳密な長さは重要ではなく、ＲＴ−ＰＣＲ産物の非存在または存在のみが重要であり、その厳密なサイズは重要でない。
【００７０】
ＲＴ−ＰＣＲに基づく本発明の方法は、いわゆる内部対照ＲＮＡ（ＩＣ  ＲＮＡ）を加えることにより、更に改良されうる。実際、該内部対照は、対照ＲＮＡ（ＩＣ−ＲＮＡ）に特異的なプライマーおよびプローブだけでなく或る量の該対照ＲＮＡも試験サンプルに加えられる並行実験である（あるいは、それほど好ましくはないが、該対照ＲＮＡならびに該プライマーおよびプローブは並行ＲＴ−ＰＣＲ試験において別々に試験される）。そのようなプライマーおよびプローブは非ＴＴＶ関連体であるべきであり、それらがＴＴＶ関連体であれば、それらは該方法のＴＴＶ特異的部分を妨げうるであろう。ＴＴＶ特異的蛍光とＩＣ−ＲＮＡ特異的蛍光とを区別するためには、ＴＴＶ−プローブの蛍光体および非ＴＴＶプローブの蛍光体の色が異なる必要があることは明らかである。ＩＣ−ＲＮＡの存在を示す反応の成功のための成分の全てが存在するため、種々のプロセス工程が成功したことを示す特異的蛍光が生じるであろう。好ましくは、ＩＣ−ＲＮＡ試験は、ｓＴＴＶ検出試験と同じ試験管内で行われる。したがって、ＩＣ−ＲＮＡ特異的蛍光体の蛍光が検出されると、該試験自体は信頼しうるものであり、更にＴＴＶ特異的蛍光体の蛍光が検出されると、それはＴＴＶ物質の存在を証明している。ＩＣ−ＲＮＡ特異的蛍光体の蛍光は検出されるが、ＴＴＶ特異的蛍光体の蛍光は検出されない場合には、それはＴＴＶ物質の非存在を証明している。ＩＣ−ＲＮＡ特異的蛍光体の蛍光が検出されない場合には、該試験は信頼しうるものではなく、考慮されるべきではない。したがって、例えば無効なＲＮＡ単離、無効な逆転写反応またはＰＣＲの阻害による偽陰性結果を除外するためには、内部対照の使用は重要である。
【００７１】
原則として、該内部対照のための出発物質として合成ＲＮＡが使用されうる。ＲＮＡの合成断片の代替手段として、宿主の又は異なる病原体からのハウスキーピング遺伝子または種々の遺伝子が内部対照として使用されうる。しかし、それらの未知の及び変化する濃度、不安定性および生物安全性の懸念は該ＰＣＲアッセイにおけるそれらの取り扱い及び組込みをインビトロ転写ＲＮＡの場合より困難にする。この理由により、好ましい内部対照系は、Ｈｏｆｆｍａｎｎらにより設計された普遍的異種内部対照系である。それはＲＮＡに基づくものであり、ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲの成功を確認するためのアッセイに容易に適合化され組込まれうるであろう。
【００７２】
したがって、この実施形態のより一層好ましい形態は、該方法のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応を行う工程が、少なくとも１つの追加的非ＴＴＶ関連プライマーセットおよび少なくとも１つの追加的非ＴＴＶ関連ＲＮＡ鋳型を更に使用することを特徴とする、本発明の方法に関する。
【００７３】
該ＰＣＲ反応の定量が要求される場合には、既知量のＴＴＶ−ＤＮＡまたはＴＴＶ−ｍＲＮＡならびに本発明のプライマーおよびプローブが存在する別の並行試験が行われうる。これは、該並行試験におけるＤＮＡまたはＲＮＡの量と、蛍光検出閾値に達するために必要なサイクル数との関係を示す標準曲線の作成を可能にするであろう。ついでこれらの標準曲線を用いて、サンプル中のＴＴＶ−ＤＮＡまたはＴＴＶ−ｍＲＮＡの未知量を決定することが可能である。したがって、サンプル中のＴＴＶ−ＤＮＡまたはＴＴＶ−ｍＲＮＡの量の定量のために後に用いられる標準曲線を作成するために別々の並行試験が行われる本発明の方法は定量法と称される。
【００７４】
生物学的物質は、好ましくは、更なる精製工程に付されることは明らかである。ｓＴＴＶの検出方法はウイルスｓｓＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡに基づくものであるため、このｓｓＤＮＡおよびＲＮＡは、好ましくは、ある程度までサンプルから精製される。この場合の精製は、サンプルが本発明の方法に付される前に、ＴＴＶ−ＤＮＡまたはｍＲＮＡ以外の、サンプル中の物質が、ある程度まで該サンプルから除去されることを意味する。そのような精製は、例えば、タンパク質除去、細胞残渣の除去、ＤＮＡ抽出、ＲＮＡ抽出などを含みうる。
【００７５】
したがって、本発明のより一層好ましい形態は、該方法が工程ａ）の前にＲＮＡおよび／またはＤＮＡ精製工程を含むことを特徴とする、本発明の方法に関する。
【００７６】
本発明のもう１つの実施形態は、配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号２に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するリバースプライマーまたは配列番号３に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するリバースプライマーとを含むプライマーセットに関する。
【００７７】
本発明のもう１つの実施形態は、配列番号４に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ａの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーまたは配列番号５に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号６に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−１、配列番号７に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−２または配列番号８に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−３の少なくとも１４個の連続的な５’末端ヌクレオチドの区間に結合する少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマーセットに関する。
【００７８】
本発明の更にもう１つの実施形態は、配列番号２に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間、または配列番号５に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するプローブに関する。
【００７９】
また、本発明のもう１つの実施形態はサンプル中のブタトルクテノウイルス（ｓＴＴＶ）の存在の検出のための診断試験キットに関する。そのようなキットは本発明の方法の実施を可能にする。
【００８０】
したがって、この実施形態の第１形態は、サンプル中のブタトルクテノウイルス（ｓＴＴＶ）の存在の検出のための診断試験キットであって、該キットは少なくとも、配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号２に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するリバースプライマーまたは配列番号３に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するリバースプライマーとを含むプライマーセット含むことを特徴とする。
【００８１】
この実施形態の好ましい形態においては、ｓＴＴＶの存在の検出のための診断試験キットは、配列番号２に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するプローブを更に含む。
【００８２】
また、もう１つの実施形態は、サンプル中の複製性ｓＴＴＶの存在の検出のための診断試験キットに関するものであり、該キットは、配列番号４に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ａの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーまたは配列番号５に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号６に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−１、配列番号７に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−２または配列番号８に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡ−３の少なくとも１４個の連続的な５’末端ヌクレオチドの区間に結合する少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマーセットを含むことを特徴とする。
【００８３】
この実施形態の好ましい形態においては、複製性ｓＴＴＶの存在の検出のための診断試験キットは、配列番号５に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するプローブを更に含む。
【００８４】
これらの種々のプライマーおよびプローブは、該キットにおいて、別々のバイアル内に存在しうる。それらは１つの同じバイアル内に存在することも可能である。取扱いの容易さのために、および不要な汚染リスクを避けるために、それらは、該サンプルが加えられる試験バイアル内に存在することさえも可能であろう。それらは、好ましくは、それらを室内保存条件下で安定に維持するために、乾燥形態で存在するであろう。
【００８５】
更にもう１つの実施形態は、サンプル中のｓＴＴＶ  ｓｓＤＮＡおよびｓＴＴＶウイルス複製の存在の同時検出のための診断試験キットに関するものであり、該キットは、配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号３に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ２の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するリバースプライマーとを含むプライマーセット、および配列番号４に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ａの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号６、配列番号７または配列番号８に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合する少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマーセットを含むことを特徴とする。
【００８６】
更にもう１つの実施形態は、サンプル中のｓＴＴＶ  ｓｓＤＮＡおよびｓＴＴＶウイルス複製の存在の同時検出のための診断試験キットに関するものであり、該キットは、配列番号１に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＤＮＡ−ＴＴＶの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号２に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＤＮＡ−ＴＴＶ−ｒ１の連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するリバースプライマーとを含むプライマーセット、および配列番号５に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＦＲＮＡ−ｂの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合するフォワードプライマーと、配列番号６、配列番号７または配列番号８に示されている配列を有するオリゴヌクレオチドＲＲＮＡの連続的な少なくとも１４ヌクレオチドの区間に結合する少なくとも１つのリバースプライマーとを含むプライマーセットを含むことを特徴とする。
【００８７】
本発明の診断試験キットは逆転写酵素および／または熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを更に含みうる。これらの酵素は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行うのに必要であり、使用の容易化のために、それらは該診断試験キット内に既に組込まれていることが可能であろう。該リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの内部標準が必要な場合には、プライマーおよびプローブの第２のセット、この場合には非ＴＴＶプライマーおよび非ＴＴＶ  ＲＮＡ鋳型および非ＴＴＶプローブ（前記のとおり）ならびにＩＣ−ＲＮＡが診断試験キット内に含まれうる。言うまでもなく、４種のＤＮＡビルディングブロックおよび必要なバッファーも該診断試験キット内に含まれうる。
【００８８】
該（ＲＴ）−ＰＣＲ反応の定量が要求される場合には、既知量のＴＴＶ−ＲＮＡおよび／またはＴＴＶ−ＤＮＡならびに本発明のプライマーおよびプローブが存在する並行試験が行われうる。これは、該並行試験におけるＲＮＡおよび／またはＤＮＡの量と、蛍光閾値に達するために必要なサイクル数との関係を示す標準曲線の作成を可能にするであろう。ついでこれらの標準曲線を用いて、サンプル中のＴＴＶ−ＲＮＡおよび／またはＴＴＶ−ＤＮＡの量を決定することが可能である。したがって、好ましくは、該診断試験キットは、定量が行われるのを可能にする既知量のＴＴＶ−ＲＮＡおよび／またはＴＴＶ−ＤＮＡを更に含む。
【００８９】
以下に、本発明の方法をどのようにして行うかの実施例を示す。言うまでもなく、これらの実施例は本発明の範囲を何ら限定しないと解釈されるべきである。
【実施例】
【００９０】
実施例１
ｓＴＴＶウイルスＤＮＡの検出のための定量リアルタイムＰＣＲ
使用した装置
０．２ｍｌ  サーモストリップ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗｅｓｔｂｕｒｇ）
ハードシェル（Ｈａｒｄ−Ｓｈｅｌｌ）９６ウェルＰＣＲプレート：Ｂｉｏｒａｄ（ｃａｔ  ｎｏ．ＨＳＰ−９６３５）
マイクロシール（Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ）「Ｂ」フィルム：Ｂｉｏｒａｄ（ｃａｔ  ｎｏ．ＭＳＢ１００１）
ＩｓｏＦｒｅｅｚｅ（商標）ＰＣＲ冷却棚：ＩｓｏＦｒｅｅｚｅ
加熱ブロック：Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  ｃｏｍｆｏｒｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
小型遠心機：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１８
マイクロタイタープレート用遠心分離機：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８０４Ｒ
ＰＣＲワークステーション：Ｈｅｒｏｌａｂ  ＣｌｅｎｅＣａｂ
ＣＦＸ  ９６リアルタイムシステム：Ｂｉｏｒａｄ
ＤＮＡの単離
５頭の異なるブタに由来する２００μｌの血清からのＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）ウイルス遠心キット（Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ  ｃａｔ  ｎｏ．５７７０４）を使用して単離した。該キットと共に供給されている説明書において該製造業者により説明されている方法を適用した。プロテアーゼ再懸濁バッファーとしてバッファーＡＶＥを使用し、バッファーＡＷ１を使用する推奨洗浄工程を行った。推奨されている５６℃での膜乾燥は行わなかった。該カラムからＤＮＡを溶出するために、５０μｌのバッファーＡＶＥを使用した。
【００９１】
ＰＣＲ反応
１５個の反応のためのマスター混合物：
１８７．５μｌ  ｉＱ（商標）−ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ，ｃａｔ  ｎｏ．１７０−８８８２）
８２．５μｌ  注射用水
１５．０μｌ  １０μＭ  フォワードプライマー：ＴＴＶａｌｌ−Ｆ１：ＣＧＡＡＴＧＧＣＴＧＡＧＴＴＴＡＴＧＣＣＧＣ
１５．０μｌ  １０μＭ  リバースプライマー：ＴＴＶａｌｌ−Ｒ４：ＣＣＴＧＣＣＣＧＡＴＡＧＧＣＣＣＣＴＴＧ
３００．０μｌ
９６ウェルプレートの１３ウェルに、２０μｌのマスター混合物および５μｌの単離ＤＮＡ、標準希釈系列のプラスミドＤＮＡまたは水を加えた。
【００９２】
標準希釈系列：
標準希釈系列は、５×１０５コピー／μｌ〜５×１００コピー／μｌのプラスミドＴＴＶ００８（ＴＴＳｕＢ２型の５’ＵＴＲの３２０ｂｐ断片を含有する；付録１を参照されたい）の濃度を有する６つのサンプルを含有していた。５μｌの標準物を各ＰＣＲ反応に加え、該ＰＣＲにおける標準希釈曲線は２．５×１０６コピー〜２．５×１０１コピーのＤＮＡの範囲であった。
【００９３】
ＰＣＲ装置の設定
ＣＦＸ９６リアルタイムシステム（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を以下のとおりに設定した。
工程１：９５℃  ５分
工程２：４０×（９５℃  ３０秒、６２℃１５分）
６８℃  ３０秒＜＝蛍光を測定する
工程３：６８℃  ７分
工程４：融解曲線：７０℃〜９５℃、上昇速度０．５℃／５秒
結果
図１は、ブタＴＴＶに関する広スペクトルｑＰＣＲの増幅曲線（図１ａ）および標準曲線（図１ｂ）の図を示す。該増幅図においては、灰色の曲線は標準希釈系列を表し、黒色の曲線はサンプルを表し、鋳型対照を表していない。該標準曲線図においては、小さな丸印は標準希釈系列を表し、バツ印はサンプルを表す。
【００９４】
【表１】
0005997764.tif 000002
図２はアンプリコンの融解ピークを示す。灰色の曲線は標準希釈系列を表し、黒色の曲線はサンプルを表す。全てのサンプルが、８５．０℃〜８６．５℃の融解温度を有する１つのピークを示した。このことは、測定された蛍光が該ＰＣＲ産物のみに由来することを示している。
【００９５】
【表２】
0005997764.tif 000003
結論
全５個のサンプルがＴＴＶ陽性を示した。濃度は１．３４×１０４〜２．３４×１０１コピー／反応の範囲であり、これは６．７１×１０５〜１．１７×１０３コピーのＴＴＶ  ＤＮＡ／ｍｌ血清と同等である。
【００９６】
実施例２
ｓＴＴＶウイルスｍＲＮＡの検出のためのＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを２．５×１０５個のブタ腎（ＰＫ）細胞から抽出する。６００μｌのＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１２０μｌの１−ブロモ−３−クロロプロパン（ＢＣＰ，Ｓｉｇｍａ）を使用して細胞を破壊し、ついで該懸濁液を１２，０００×ｇで４℃で１５分間遠心分離する。水相を得、３００μｌの１００％  イソプロピルアルコールで沈殿させ、ついで１２，０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離する。生じたＲＮＡペレットを１ｍｌの７５％  エタノールで洗浄し、風乾させる。ついでＲＮＡをＲＮアーゼ非含有水に溶解させる。ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、混入ＤＮＡをＲＮＡ調製物から除去する。簡潔に説明すると、１０μｇのＲＮＡ当たり２単位のＤＮアーゼを加え、３７℃で３０分間インキュベートする。ＤＮアーゼを不活性化し、１０．０００×ｇで１，５分間の遠心分離によりＲＮＡサンプルから除去し、ＲＮＡを新たなチューブに移す。該ＲＮＡを定量し、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）分光光度計を使用して純度を確認する。
【００９７】
このようにして得られた５００ナノグラムのＲＮＡを、ポリｄＴプライマー（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３’（Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ））およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐ（商標）ＩＩ逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（ＲＴ）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を該製造業者のプロトコールに従い使用して、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換する。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ  ＲＴの代わりに無菌水を使用して、陰性ＲＴ対照実験を行う。ＴＴＳｕＶｓ  ｍＲＮＡの存在を証明するために、ポリｄＴプライマーおよびＦＷ１（５’−ＣＴＧＧＧＣＧＧＧＴＧＣＣＧ−３’）またはＦＷ２（５’−ＡＧＴＣＡＡＧＧＧＧＣＣＴＡＴＣＧＲＧＣ−３’）を使用してＰＣＲを行う。ついで該増幅産物を１，８％  アガロースゲル上で泳動させ、ＰＣＲ産物をゲルから抽出し、配列決定して、適切な増幅を確認する。
【００９８】
【表３】
0005997764.tif 000004
【図１】
0005997764.tif 000005
【図２】
0005997764.tif 000006
【図３】
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【配列表】
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