(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれの分子が２つのＮ−グリコシル化部位を示す遺伝子組み換えあるいは形質転換因子ＶII（ＦＶII）の組成物において、その組成物のすべてのＦＶＩＩ分子の中でのＧａｌα１、３Ｇａｌグリカン部分の割合が０−４％の範囲内であって、更にその組成物のＦＶＩＩ分子が、ヒト血漿が取り除かれたＦＶＩＩ分子とは異なるＮ−グリコシル化特性を有し、前記ＦＶＩＩのシアル酸のすべてがα２−６結合にバインドされていることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記組成物のＦＶＩＩのすべてのグリカン部分のうちで、少なくとも４０％が２つの触角をもった形状のモノシアル化されたグリカン形状であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＦＶＩＩの２つの触角をもった形状のモノシアル化されたグリカン形状が過半数であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＦＶＩＩの２つの触角をもった形状のモノシアル化されたグリカン形状のうちで、グリカン形状の過半数がフコース化されていないことを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記因子ＶＩＩのフコース化の割合が２０％−５０％の範囲であることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記因子ＶＩＩが活性化されることを特徴とする請求項１−５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
医薬品として使用するための、請求項１−６のいずれか１項に記載の遺伝子組み換えあるいは形質転換因子ＶＩＩの組成物。
【請求項８】
血友病患者の治療のための医薬品製造のための、請求項１−６のいずれか１項に記載の遺伝子組み換えあるいは形質転換因子ＶＩＩの組成物の使用。
【請求項９】
多重出血性外傷治療のための医薬品製造のための、請求項１−６のいずれか１項に記載の遺伝子組み換えあるいは形質転換因子ＶＩＩの組成物の使用。
【請求項１０】
外科手術に伴う制御不能な大量出血を措置するための医薬品を製造するための、請求項１−６のいずれか１項に記載の遺伝子組み換えあるいは形質転換因子ＶＩＩの組成物の使用。
【請求項１１】
抗凝固剤の過剰投与による出血あるいは大量出血を措置するための医薬品製造のための、請求項１−６のいずれか１項に記載の遺伝子組み換えあるいは形質転換因子ＶＩＩの組成物の使用。
【請求項１２】
請求項１−６のいずれか１項に記載の因子ＶＩＩと薬学的に受け入れ可能な賦形剤及び／又は基質を含む医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はそれぞれの分子が明確なグリカン単位を含む２つのＮ−グリコシル化部位を有する組成物の形状で得られる遺伝子組み換えあるいは形質転換因子ＶＩＩと、医薬品としてのその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）は、活性化された状態（ＦＶＩＩａ）で、カルシウム及び繊維因子の存在下で因子Ｘ及び因子ＩＸを活性化する凝固プロセスに関与するビタミンＫ依存糖蛋白質である。ＦＶＩＩは４０６の残基で構成される単一ペプチド鎖の形状で分泌され、その分子量は約５０ｋＤａである。ＦＶＩＩは４つの明確な構造領域を有しており、それはＮ末端γカルボキシル領域（Ｇｌａ）、２つの『表皮成長因子（ＥＧＦ）状』領域、そして１つのセリン・プロテアーゼ領域である。ＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの活性化は、Ａｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３領域（アルギニン１５２−イソロイシン１５３）結合の切断によって特徴付けられている。従って、ＦＶＩＩａは分子量が約２０ｋＤａの１５２個のアミノ酸で構成される軽鎖と分子量が約３０ｋＤａの２５４個のアミノ酸で構成される重鎖が１つのジスルフィド架橋で連結された１つの化合物（Ｃｙｓ１３５−Ｃｙｓ２６２）である。
血漿ＦＶＩＩａはいくつかの翻訳後修飾を含んでおり、最初の１０個のグルタミン酸はγカルボキシル化されており、Ａｓｐ６３は部分的に水酸化されており、Ｓｅｒ５２（セリン５２）とＳｅｒ６０（セリン６０）はＯグリコシル化されていてそれぞれグルコース（キシロース）０−２及びフコース・パターンを担持しており、そしてＡｓｎ１４５（アスパラギン１４５）とＡｓｎ３２２（アスパラギン３２２）は主に２つの触角部分でバイシアル化された複雑な構造によってＮグリコシル化されている。
ＦＶＩＩは、例えば先天的なＦＶＩＩ欠乏症など、その他の凝固因子の欠乏症を示す患者の場合と同様に因子ＶＩＩＩの欠乏（Ａ型血友病）あるいは因子ＩＸ  の欠乏（Ｂ型血友病）を示す血友病患者の措置に用いられる。従って、注射可能なＦＶＩＩａの濃縮物を利用できるようにすることが必要である。
ＦＶＩＩａ濃縮物を得るための最も古い方法は、分留によってもたらされる結晶淡白からのＦＶＩＩａを精製するステップを含んでいた。
【０００３】
その目的のために、文献ＥＰ０，３４６，２４１はＦＶＩＩ及びＦＶＩＩａと、因子ＩＸ（ＦＩＸ）、Ｘ（ＦＸ）及びＩＩ（ＦＩＩ）、特にＰＰＳＢ（Ｐ＝プロトロンビンあるいはＦＩＩ、Ｐ＝プロコンバーチンあるいはＦＶＩＩ、Ｓ＝スチュアート因子あるいはＦＸ、そしてＢ＝抗血友病因子ＢあるいはＦＩＸ）の前段階溶出液などのその他の蛋白質を含んでいる血漿タンパク質の分留の二次性生物の吸着と溶出後に得られるＦＶＩＩａを多量に含んだ画分の調製について述べている。このプロセスの欠陥は、得られたＦＶＩＩが依然として微量の他の凝固因子を含んでいることである。
【０００４】
同様に、文献ＥＰ０，５４７，９３２はビタミンＫ依存因子及びＦＶＩＩＩをほとんど含んでいない高純度ＦＶＩＩａ濃縮物の製造プロセスについて述べている。このプロセスで得られるＦＶＩＩは、その純度にも拘らず、残留血栓形成性活性を示す。
【０００５】
従って、これらのプロセスの重大な欠陥のひとつは、それらのプロセスが少量の生成物だけをもたらす点である。さらに、血漿内に存在している他の蛋白質をまったく含まない生成物を得ることはさらに難しい。最後に、ウイルスやバクテリアに関する安全性を確保するために血漿凝固因子調製のすべての段階で多数の予防措置が取られているにも拘らず（献血者の追跡調査、公知のウイルスやバクテリアによる汚染を検出するためのテスト、厳格な精製、そして、血液に含まれる病原性作用因子放出の危険性をできるだけ減らすためのウイルス非活性化措置）、病原性作用因子による汚染のすべての危険性は必ずしも排除されていない。
加えて、新しいタイプのクロイツフェルド・ヤコブ病の出現が血液製剤によるこれまでに知られていない病原性作用因子の放出の懸念を抱かせている。さらに、献血者から集められる血漿の量も依然として限られたものである。
【０００６】
従って、１９８０年代以後、ヒトの因子ＶＩＩをコードするＤＮＡが単離され（Ｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ；  Ａｐｒ  ８３（８）：  ２４１２−６）、哺乳動物ＢＨＫ細胞（生まれたばかりのハムスターの腎臓）で発現された（文献ＥＰ０，２００，４２１）。ＦＶＩＩを製造するこの方法が必要な蛋白質がつくられる培養液の管理制御に利点を有しているとしても、ハムスターの細胞がそれらが発現する蛋白質にＧａｌα１，３Ｇａｌ部位を混入させてしまい（Ｓｐｉｒｏ  ＲＧ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ，  １９８４，  ｖｏｌ．２５９，  Ｎｏ  １５，  ９８５８及びＦｕｒｕｋａｗａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ，  １９９２，  ｖｏｌ．  ２６７，  Ｎｏ．  １２，  ８０１２）、その免疫原性が実証されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＥＰ０，３４６，２４１
【特許文献２】ＥＰ０，５４７，９３２
【特許文献３】ＥＰ０，２００，４２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
循環しているヒトＢ型リンパ球の１％がエピトープＧａｌα１，３Ｇａｌに対する抗体を発生させることが分かった〈Ｇａｌｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ，  １９９３，  ｖｏｌ．８２，２４８５〉。このエピトープと抗体がその捕体を活性化させて生体移植後の急性移植拒絶反応などの重大な免疫反応につながる。ハムスター細胞でつくられたＦＶＩＩで措置を受けた血友病患者の１５−２０％が免疫反応を示すことが示された（Ｐｒｏｗｓｅ  Ｃ．Ｖ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １９８８，  ｖｏｌ．  １２，  ９９）。このタイプの免疫反応は血友病患者においては悲劇的な結果をもたらす。というのは、ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩは免疫原性に変化すると、出血を引き起こし、対処することが非常に困難だからである。
従って、免疫原性をできるだけ低下させ、好ましくはウイルスに関する安全性が増大した遺伝子組み換えあるいは形質転換ＦＶＩＩａの組成物を得る必要性は依然として存在している。
従って、本出願人は好ましくはウイルスに対する安全性が増大し、免疫原性が非常に低減されたＦＶＩＩの組成物の開発を目的として研究を行った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、それぞれの分子が２つのＮ−グリコシル化部位を示す遺伝子組み換えあるいは形質転換因子ＶII（ＦＶII）の組成物において、その組成物のすべてのＦＶＩＩ分子の中でのＧａｌα１、３Ｇａｌグリカン部分の割合が０−４％の範囲内であって、更にその組成物のＦＶＩＩ分子が、ヒト血漿が取り除かれたＦＶＩＩ分子とは異なるＮ−グリコシル化特性を有し、前記ＦＶＩＩのシアル酸のすべてがα２−６結合にバインドされていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、ウイルスに対する安全性が増大し、免疫原性が非常に低減されたＦＶＩＩの組成物を開発することができた。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】雌のウサギの母乳内でつくられた本発明による形質転換ＦＶＩＩの抽出及び精製／活性化プロセスの一例の概要図である
【図２】Ｎ−グリコシル部分を担持するペプチドの解析された質量分光スペクトルＥＳＩを示す図である
【図３】ＰＮＧａｓｅ  ＦによるＦＶＩＩの脱グルコシル化後の電気泳動写真ＨＰＣＥ−ＬＩＦを示す図である  書き込み：  中央の２つの電気泳動写真：    ＦＶＩＩ−ｔｇ；  （△）  フコース、（■）  ＧｌｃＮＡｃ  （Ｎ−アセチルグリコサミン）、（●）マンノース、（●）ガラクトース、（▲）  シアル酸  電気泳動写真（上）：ＦＶＩＩ−ｐｄ  電気泳動写真（中央：２）：ＦＶＩＩ−ｔｇ  電気泳動写真（下）：  ＦＶＩＩ−ｒｅｃ
【図４】ＮＰ−ＨＰＬＣによるＦＶＩＩ−ｔｇ（電気泳動写真：中央）、ＦＶＩＩ−ｐｄ（電気泳動写真：中央）、及びＦＶＩＩ−ｒｅｃ（クロマトグラフィ写真：下）の特徴づけを示す図である。糖残基についての書き入れ：図３参照。
【図５】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによるＦＶＩＩ−ｔｇのグリカン形態の大多数の表示を示す図である。糖残基についての書き入れ：図３参照。
【図６】サイログロブリンのオリゴ糖のＨＰＣＥ−ＬＩＦによる分析を示す図である。糖残基についての書き入れ：図３参照。
【図７】形質転換ＦＶＩＩのオリゴ糖のＨＰＣＥ−ＬＩＦによる分析を示す図である。糖残基についての書き入れ：図３参照。
【図８】Ｇａｌα１、３Ｇａｌ構造の定量を示す図である。
【図９】ＦＶＩＩ抽出メカニズムの例を示す図である。
【図１０】Ｏ−グリコシル部分を担持するペプチドの解析された質量分光スペクトルＥＳＩを示す図である。これらのペプチドはトリプシンによる消化、そしてＬＣ−ＳＥＩＭＳ分析後に得られたものである。Ｆｕｃ：フコース；Ｇｌｃ：グルコース；Ｘｙｌ：キシロース。
【図１１】γ−カルボキシル化箇所を示す図である。これらのペプチドはＡｓｐ−Ｎによる消化とＬＣ−ＳＥＩＭＳ分析後に得られたものである。得られた結果はＦＶＩＩ−ｔｇのそれぞれのバッチと非常に類似している。それぞれのペプチドの質量はモノアイソトピック質量である。Ｇｌａ：γ−カルボン酸
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、それぞれの分子が２つのＮ−グリコシル化部位を示す遺伝子組み換えあるいは形質転換因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）の組成物で、その組成物のすべてのＦＶＩＩ分子の中でのＧａｌα１、３Ｇａｌグリカン部分の割合が０−４％の範囲であることを特徴とする組成物に関するものである。
驚くべき事に、本出願人は本発明のＦＶＩＩ組成物内のグリカン部位Ｇａｌα１，  ３Ｇａｌの割合が患者の治療に用いられた場合に免疫原性とはならなことを発見した。
本発明によるＦＶＩＩは組成物の形状をしている。実際、血漿からのものであれ、遺伝子組み換え、あるいは形質転換されたものであれ、すべてのＦＶＩＩ  はＦＶＩＩのいくつかの蛋白質の混合物の形状をとっており、これらの蛋白質は特にそれらが同じ翻訳後修飾を示さないという点で異なっている。この翻訳後の処理は異なった細胞部位内にＦＶＩＩ蛋白質を移入すると細胞の生物物質のより行われる。これらの生化学的修飾はその蛋白質を大幅に修飾して、最終的に得られる蛋白質はその遺伝子によって直接コードされるものとはかなり違ったものとなる。これらの化学的修飾はその蛋白質の活性の調節に影響を及ぼすと同時に、その局所化にも影響を及ぼす。したがって、本発明においては、ＦＶＩＩという表現とＦＶＩＩの組成物は同じ意味を持っている。
【００１３】
『遺伝子組み換えあるいは形質転換ＦＶＩＩ』とは、遺伝子工学によって得られ、特に上に述べたグルコシル化という翻訳後修飾の特徴、つまり、ＦＶＩＩの背生物においてＧａｌα１、３Ｇａｌの割合がゼロかあるいは非常に低くて免疫原性を示さない２つのグリコシル化部位を有しているという特徴を示すすべてのＦＶＩＩを意味している。対照的に、本発明によるＦＶＩＩは血漿性ＦＶＩＩではない。つまりヒトや動物の血漿から精製された生成物ではない。
より具体的に言えば、活性化されたＦＶＩＩとは上述の翻訳後修飾の特徴と明確なグリコシル化部分を有する２つのＯ−グリコシル化部位、１つのγ−カルボキシル化及び固有のジスルフィド架橋を有する遺伝子工学で得られたすべての活性化ＦＶＩＩを意味している。
Ｇａｌα１，３Ｇａｌ部分とは２つのαｌ，３−結合ガラクトースで構成された構造である。これは、Ｎ結合構造のオリゴ糖性触角部分の末端上に位置している。この部分は免疫原性であることが知られている。実際、その合成を誘発する酵素をコードする遺伝子（α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ）が非活性化されているので、このグリカン部分はヒト及び一部のサルでは欠失している。従って、こうした部分を示す蛋白質をヒトに投与すると、そのようにグルコシル化された蛋白質に対する抗体の発生が誘発される。
従って、そうした免疫原性部分が医薬用蛋白質内で見つからないことが非常に望ましい。
この組成物は存在している因子ＶＩＩのすべての分子でグリカン部分、Ｇａｌα１，３Ｇａｌが欠失しているのが好ましい。
なお、このことはＦＶＩＩの場合、構造Ｇａｌα１，３Ｇａｌの割合がゼロかあるいは非常に低くて、現在利用できる分析装置を用いて測定したバックグランドと区別がつかないこと、あるいは、その割合が特に４−クロロ−１−ナフトールの存在下で着色することによるレクチン−ブロット検出法によっても検出できないことを意味している。この定量方法は実施例の箇所で詳しく述べる。この表現は、同様の意味で、Ｇａｌα１，３Ｇａｌの割合が血漿性ＦＶＩＩのそれと近いすべての組み換えあるいは形質転換ＦＶＩＩにも適用される。いずれの場合であれ、本発明によるＦＶＩＩの組成物におけるＧａｌα１，３Ｇａｌの割合はヒトに対しては免疫原性を示さない。
逆に、市販されている組み換えＦＶＩＩは検出可能なレベルのＧａｌα１，３Ｇａｌの割合を示し、従って、分析装置を用いてバックグランド・ノイズから区別することができる。
このように、用いられる定量方法に応じて、Ｇａｌα１，３Ｇａｌ部分はまったくないか、あるいは４％未満、あるいは３．５％未満、さらには３％未満などとなるが、これらの量はバックグランド・ノイズとは区別することができない。好適に、Ｇａｌα１，３Ｇａｌ部分は血漿ＦＶＩＩの場合とまったく同じかほぼ同じ割合で存在している。
【００１４】
本発明によるＦＶＩＩはポリペプチドで、そのペプチド配列は天然のヒトＦＶＩＩのそれと同じであってもよいが、ヒトの体内に存在する配列はＦＶＩＩに関連した不規則さは示さない。そうした配列は、例えば、文献ＥＰ０，２００，４２１に示されている配列１ｂによってコードすることができる。
好適に、本発明によるＦＶＩＩの配列は配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１である。
別の実施の形態で、本発明によるＦＶＩＩはその免疫原性が天然のＦＶＩＩのそれより高くなければ、天然のヒトＦＶＩＩの変種であってもよい。従って、この変種のペプチド配列は天然のヒトＦＶＩＩの配列の少なくとも７０％、好適には８０％か９０％、そしてより好適には９９％以上の一致度を示しており、こうした変種は天然のＦＶＩＩと同様の生物学的活性を有している。
さらに、本発明によるＦＶＩＩは天然のＦＶＩＩと比較して同じかあるいはそれより低い生物学的活性を有するすべてのＦＶＩＩも含んでいる。例として、血栓症の治療あるいは予防に用いられてきた組み換えヒト非活性化ＦＶＩＩ、ＦＦＲ−ＦＶＩＩａなどをあげることが出来る〈Ｈｏｌｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ．Ｊ．  Ｖａｓｃ．  Ｅｎｄｏｖａｓｃ．  Ｓｕｒｇ．，  １９９８  Ｊｕｎ，  １５（６）：  ５１５−５２０〉。こうしたＦＶＩＩは１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、あるいは置換によって天然のＦＶＩＩの配列とは異なったアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
最後に、さらに別の実施の形態で、本発明によるＦＶＩＩは活性化されていてもよい（ＦＶＩＩａ）。ＦＶＩＩａはＦＶＩＩが繊維因子と相互作用して活性化される場合の凝固活性と比較して２５−１００倍も高い発生を凝固活性を示す。ＦＶＩＩの活性化はジスルフィド架橋によって結合されている２つの鎖内の異なったプロテアーゼ（ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＶＩＩａ）によるチモーゲンの切断によってもたらされる。ＦＶＩＩａは例えば循環性抗体を有する血友病患者における止血に関与する凝固因子である。本発明によるＦＶＩＩは特に好適な形態で完全に活性化される。
【００１５】
本発明によるＦＶＩＩａは以下のようないくつかの翻訳後修飾を含むことができ、それは、最初の９−１０個のＮ末端グルタミン酸がγ−カルボキシル化されていたり、Ａｓｐ６３が部分的に水酸化されていたり、Ｓｅｒ５２とＳｅｒ６０がＯ−グリコシル化されていてそれぞれグルコース（キシロース）０−２及びフコース部分を担持していたり、Ａｓｎ１４５とＡｓｎ３２２が主に２つの触角部分のモノシアル化複合構造によってＮ−グリコシル化されている、などのことである。
本発明によるＦＶＩＩの生物学的活性は、例えば、米国特許弟５，９９７，８６４に述べられているように、ＦＶＩＩを含まない血漿及びトロンボプラスチンによる血液凝固を開始するＦＶＩＩ組成物の能力を測定することによって定量することができる。この特許で述べられている評価テストで、その生物学的活性は比較対象サンプルと比較して凝固活性が何分の一に低下したかによって示されており、１ユニット／ｍｌのＦＶＩＩ活性を含んでいるヒト血清〈プール〉の基準と比較しての『ＦＶＩＩのユニット数』に換算されている。
本発明による遺伝子組み換えＦＶＩＩは生物系内で蛋白質の発現を可能にするようは当業者に知られている標準技術を用いて得ることが出来る。
本発明によるＦＶＩＩは上に述べたようなグリコシル化の特徴、つまりＦＶＩＩの祖部内でＧａｌα１，３Ｇａｌの割合が低いかあるいはゼロであるという条件に合致するどんな微生物、植物、あるいは動物でも発現させることができる。微生物とはすべてのバクテリア、菌類、ウイルスあるいは細胞系を意味しており、その細胞は植物性でも哺乳動物のものであってもよい。哺乳動物の細胞は動物の細胞であってもヒトの細胞であってもよい。αｌ，３ガラクトシルトランスフェラーゼに関してノックアウトされたいずれの細胞を用いてもよい。
本発明によるＦＶＩＩは、それらの動物や植物がＦＶＩＩ組成物に上に述べたような特徴、つまり、ＦＶＩＩ組成物内でＧａｌα１，３Ｇａｌが存在していないか、存在していてもその割合が非常に低いという特徴をＦＶＩＩに付与するものである限り、形質転換された動物や植物内でもつくりだすことができる。これらの動物としてはウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、牛肉、ひよこ、あるいはαｌ，３ガラクトシルトランスフェラーゼに関してノックアウトされたいずれの動物であってもよく、これら以外の動物を用いてもよい。
本発明によるＦＶＩＩは、ヒトのＦＶＩＩの場合と同様に、位置１４５と３２２に２つのＮグリコシル化部位を持っており、位置５２と６０に２つのＯ−グルコシル化部位を有している。１つのＮグリコシル化部位で、オリゴ糖鎖がアスパラギン（Ｎ結合）に結合されている。Ｏ−グリコシル化部位では、オリゴ糖鎖はセリンに結合されている。これらのアミノ酸に結合された部分はその組成物の各蛋白質とは通常異なっている。しかしながら、その組成物全体に関して、グリカン部分毎、あるいは糖毎に定量することが可能である。
本発明で与えられる異なったグリカンの割合（パーセント）にはＯ−グリコシル化は考慮されない。
【００１６】
好ましくは、ＦＶＩＩ組成物は、そのＦＶＩＩ組成物のすべてのグリカン部分の中で、少なくとも４０％が２つの触角部分を有するモノシリアリル化されたグリカン形態である。さらに別の実施の形態では、このモノシリアリル化されたグリカン形態の割合が少なくとも５０％である。さらに別の実施の形態では、このモノシリアリル化されたグリカン形態の割合が少なくとも６０％である。
好適に、ＦＶＩＩのグリカン形態はその大半が２つの触角部分を有するモノシアル化グリカン形態である。
このＦＶＩＩ組成物は因子ＶＩＩの少なくとも一部のシアル酸がα２−６結合である可能性を示している点に特徴がある。
好適に、ＦＶＩＩのシアル酸の少なくとも６５％がα２−６結合である可能性を示めしている。より好適には、このＦＶＩＩのシアル酸の少なくとも７０％、あるは８０％、さらには少なくとも９０％がα２−６結合である可能性を示している。
本発明の１つの実施の形態によれば、因子ＶＩＩのすべてのシアル酸がα２−６結合である可能性、つまり、すべてのシアル酸がα２−６結合でガラクトースに結合されている可能性が示されている。本発明によるＦＶＩＩ組成物はさらにα２−３結合の可能性を示すシアル酸を含むこともできる。
ＦＶＩＩ組成物のシアル酸の少なくとも６５％がα２，６分岐である可能性を示しているという事実は、穂名によるＦＶＩＩの利点の１つである。事実、市販されている遺伝子組み換えＦＶＩＩのシアル酸の場合はα２，３結合だけの可能性を示唆するだけである。それに対して、血漿性ＦＶＩＩはこれら２つの異性体の混合物である。しかしながら、後者はα２，６結合をより多く含んでおり、このことは本発明のＦＶＩＩを血漿性ＦＶＩＩにより近づけている。本発明によれば、ＦＶＩＩのシアル酸の６５％から１００％がα２，６結合である可能性を示唆している。いくつかの実施の形態では、ＦＶＩＩのシアル酸の７０％あるいは８０％から１００％がａ２，６結合である可能性を示唆している。
好適に、このＦＶＩＩの２つの触角ぶぶんを有するモノシアル化された形状のうちで、その過半数はフコース化されていない。  
好ましくは、これらの２つの触角部分を有するモノシアル化されているがフコース化されていないグリカン形態は本発明によるＦＶＩＩ組成物内に２０％以上の割合で存在している。好適には、この割合は２５％、あるいは４０％より高い方が好ましい。
特に好適な方法で、本発明によるこのＦＶＩＩ組成物のフコース化の割合は２０％から５０％の範囲である。本発明の１つの実施の形態では、この割合は１５％未満であってもよい。
この特徴は本発明によるＦＶＩＩの利点の１つである。実際、市販されている組み換えＦＶＩＩは１００％のフコース化の割合を示すのに対して、血漿性ＦＶＩＩの場合のフコース化の割合は１６％程度である。従って、本発明によるＦＶＩＩのフコース化の程度は血漿性ＦＶＩＩの場合に近く、このことは免疫原性という面で本発明によるＦＶＩＩに利点をもたらしている。
【００１７】
好適に、本発明によるＦＶＩＩは形質転換性ＦＶＩＩである。従って、本発明によるＦＶＩＩは好適に、形質転換でつくられた組み換えＦＶＩＩ生成物である。
本発明の特定の実施の形態で、本発明によるこの形質転換ＦＶＩＩは形質転換された動物の母乳内でつくられる。
こうした蛋白質の生成は問題の蛋白質を母乳蛋白質の合成に関与する遺伝子の１つの規制領域上にコードして、その遺伝子が乳腺内でのその蛋白質の合成と母乳内への分泌を命令する遺伝子を移植することによって行うことができる。
特に好適な態様で、本発明によるＦＶＩＩは形質転換された雌のウサギによってつくりだされる。
ウサギはプリオン、特に人間の健康にとって重大な問題である遺伝性の準急性海綿状脳症に対して感作性をもっていないようなので、この種は特に好適である。
さらに、ウサギとヒトの間の種の壁が重要な意味を持っている。反対にヒトと市販される組み換えＦＶＩＩが体内で作り出されるハムスターとの間の種の壁の重要度は低い。
従って、ウサギでのＦＶＩＩの生成は病原性の作用因子の放出という面で好適である。
本発明の好ましい実施の形態で、本発明によるＦＶＩＩは雌のウサギの乳腺内でつくりだされる。
乳腺から問題の蛋白質を分泌させて形質転換された哺乳動物の母乳に分泌できるようにするのは組織に依存した状態での組み換え蛋白質の発現の制御に関する分野の当業者には公知の技術である。
発現の組織制御は蛋白質の発現をその動物の特定の組織で行わせることを可能にしてくれる配列を利用して行われる。これらの配列とはプロモータ配列とペプチド信号配列である。
乳腺内での問題の蛋白質の発現を促進するプロモータの例としては、ＷＡＰプロモータ（乳漿酸性蛋白質）、カゼイン・プロモータ、例えばβカゼイン・プロモータ、βラクトグロブリンなどで、その他のプロモータも使用可能である。
【００１８】
形質転換された動物の母乳内で組み換え蛋白質をつくりだす方法は以下のステップを含んでいる。つまり、ヒトＦＶＩＩをコードし母乳内に自然に分泌される蛋白質のプロモータに制御される遺伝子を含む合成ＤＮＡ分子をヒト以外の哺乳動物の胚に組み入れる。その後、その胚を同じ種の哺乳動物の雌に入れる。その胚を受け入れた哺乳動物が十分に成長したら、その哺乳動物からの分泌を誘発させて母乳を集める。この母乳が問題の形質転換ＦＶＩＩを含んでいる。
ヒト以外の哺乳動物の雌の母乳内で蛋白質をつくるプロセスの一例が文献ＥＰ０，５２７，０６３に述べられており、この文献が教示している内容を本発明による問題の蛋白質の生成に適用することができるが、それ以外の方法も利用可能である。
ＷＡＰプロモータを含んでいるプラスミドはＷＡＰ遺伝子のプロモータを含む配列を導入することによってつくられ、このプラスミドはそのＷＡＰプロモータに制御される外来遺伝子を受け入れることができるようにつくられる。ヒトＦＶＩＩをコードする遺伝子が組み入れられて、ＷＡＰプロモータの制御下に置かれる。そのプロモータ及び問題のたちをコードする遺伝子を含んだプラスミドが雄のウサギの前核に注入して形質転換された雌ウサギを得るのに用いられる。その後、その胚を元気で生殖力のある雌の卵管に移す。トランス遺伝子の存在は、上に述べたようにして得られた形質転換された若いウサギから抽出されたＤＮＡからのサザーン・ブロットによって示される。そしてそれらの動物からの母乳内での濃度は特殊な放射免疫アッセイによって評価される。
雌のウサギによってその母乳内につくりだされた形質転換ＦＶＩＩは組成物の形態で得られ、この組成物においては、その因子ＦＶＩＩの各分子は２つのＮ−グリコシル化部位を示し、そのＦＶＩＩ組成物のすべての分子内でのＧａｌαｌ，３Ｇａｌグリカン部分の割合が４％未満、あるいはゼロであることを特徴としている。従って、好適に、この雌のウサギによってつくられる形質転換ＦＶＩＩはＧａｌα１，３Ｇａｌグリカン部分を含んでいない。
好ましくは、本発明による雌ウサギによってつくられる形質転換性ＦＶＩＩの組成物は、その組成物のすべてのグリカン部分で、少なくとも４０％が２つの触角部分を有するモノシアル化された形状である。さらに別の実施の形態で、モノシアル化形状は少なくとも５０％の割合で存在している。さらに別の実施の形態では、モノシアル化形状は少なくとも６０％の割合で存在している。
好適に、グリカン形状は２つの触角部分を有するモノシアル化された形状である。
ＦＶＩＩの組成物は、因子ＶＩＩの少なくとも一部のシアル酸がα２−６結合である可能性を示唆している。
好適には、ＦＶＩＩのシアル酸の少なくとも６５％がα２−６結合である可能性を示している。より好適には、シアル酸の少なくとも７０％あるいは８０％、そして特に９０％がα２−６結合である可能性を示している。
【００１９】
本発明の１つの実施の形態によれば、因子ＶＩＩのすべてのシアル酸がα２−６結合である可能性、つまり、すべてのシアル酸がα２−６結合によってガラクトースに結合している可能性を示す。本発明によるＦＶＩＩ組成物は、さらに、α２−３結合である可能性を示すシアル酸を含んでいる場合もある。
好ましくは、上記の２触角形状のモノシアル化グリカン形状で、グリカン形状の過半数はフコース化されていない。好適には、これらの２触角形状のモノシアル化されており、しかもフコース化されていないグリカン形状はこのＦＶＩＩ組成物内に２０％よりは高い割合で存在している。好適には、この割合は２５％より高く、あるいは４０％より高い。
好ましくは、本発明によるＦＶＩＩ組成物におけるフコース化の割合は２０％から５０％の範囲である。
本発明の１つの実施の形態で、この割合は１５％未満であってもよい。
本発明による形質転換ＦＶＩＩａはいくつかの翻訳後修飾を含むことができる。その翻訳後修飾とは、最初の９つあるいは１０個のＮ−末端グルタミン酸がγ−カルボキシル化されていること、Ａｓｐ６３（アスパラギン酸６３）が部分的に水酸化されていること、Ｓｅｒ５２（セリン５２）とＳｅｒ６０（セリン６０）がＯ−グリコシル化されていて、グルコース（キシロース）０−２とフコース部分をそれぞれ担持していること、Ａｓｎ１４５及びＡｓｎ３２２の大部分は２触角形状のモノシリアル化された複合構造によってＮ−グリコシル化されている。
本発明によるＦＶＩＩは当業者に公知の技術を用いて、母乳から精製することができる。例えば、米国特許第６，２６８，４８７に述べられているような、母乳から問題の蛋白質を精製する方法は、以下のようなステップを含むことができる。すなわち、ａ）母乳を保持分と通過分とを形成するのに十分な孔隙率を有する膜上で接線ろ過にかけて、外因性蛋白質を含んだ通過分を得るステップと、ｂ）上記外因性蛋白質を取り出すと共に溶出液を得るために上記通過分をクロマトグラフィによって捕捉装置にかけるステップと、ｃ）その溶出液と保持分を組み合わせるステップと、そしてｄ）脂質、カゼイン・ミセルからＦＶＩＩが分離され、ＦＶＩＩが少なくとも７５％まで回収されるまで、ステップａ）からｃ）までを繰り返すステップ、である。
好適に、本発明によるＦＶＩＩは活性化される。ＦＶＩＩａは、ジスルフィド架橋によって結合された２つの鎖において、異なったプロテアーゼ（ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＶＩＩａ）によってチモーゲンを切断することでｉｎ  ｖｉｖｏで得ることができる。ＦＶＩＩａ自体は非常に低い酵素活性を有しているが、その共因子である組織因子（ＴＦ）と複合化されていて、ＦＸ及びＦＩＸを活性化することで凝固プロセスを開始させる。
従って、本発明によるＦＶＩＩａは分子量が約２０ｋＤａの１５２個のアミノ酸で構成される軽鎖と、分子量が約３０ｋＤａの２５４個のアミノ酸の重鎖によって構成される化合物で、この軽鎖と重鎖は単一のジスルフィド結合で結合されている（Ｃｙｓ１３５−Ｃｙｓ２６２）。
【００２０】
本発明によるＦＶＩＩは活性を有し、血漿性ＦＶＩＩに類似した構造を有する活性化されたＦＶＩＩである。
ＦＶＩＩａは、組織因子（ＴＦ）と反応すると、ＦＶＩＩと比較して２５−１００倍も高い凝固活性を示す。
本発明の１つの実施の形態で、ＦＶＩＩは因子Ｘａ、ＶＩＩａ、ＩＩａ、ＩＸａ及びＸＩＩａによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化される。
本発明のＦＶＩＩは、その精製プロセス中に活性化される場合もある。
本出願人は、驚くべきことに、乳清内で自然につくられた蛋白質のプロモータ、例えばＷＡＰプロモータの制御下に置かれても、ＦＶＩＩが母乳のカルシウム・イオンと、従ってカゼイン・ミセルと結合する傾向を示すことを発見した。
従って、乳清と結びついているか、あるいはカゼイン・ミセルに係合しているかに関係なくこの蛋白質を捕捉できるＦＶＩＩ、母乳のカルシウム・イオンに対する親和性を示すＦＶＩＩを抽出、精製するプロセスを開発することは非常に有益であろう。
例えば、形質転換された動物の母乳内に含まれている形質転換性ＦＶＩＩの抽出及び生成のプロセスは以下のステップを含んでいる。
ａ）  母乳から、前記母乳の有機及び／又は無機塩及び／又はカルシウムの複合体と結合しているＦＶＩＩを、その母乳に添加された可溶性塩を加えることで得られたカルシウム化合物を析出することでＦＶＩＩを抽出するステップで、この可溶性塩の陰イオンが不溶性のカルシウム化合物を形成してその塩及び／又は複合体からこうした方法で因子ＶＩＩを放出できる能力があるかどうかを基準として選択され、その場合因子ＶＩＩは液相内に存在しているステップと、
ｂ）  カルシウム化合物の沈殿物から蛋白質を多量に含む液相を分離して、その液相をさらに脂質相と上記蛋白質を含む水性の非脂質相に分離するステップと、
ｃ）  所定の濃度でリン酸塩に基づく溶出緩衝剤を用いて上記水性の非脂質相を親和性クロマトグラフィにかけるステップと、そして
ｄ）  ステップｃ）で得られた因子ＶＩＩの溶出液を、弱塩基性陰イオン交換カラム上で、そのカラム上に保持された因子ＶＩＩを連続的に溶出させるのに適した緩衝剤を用いて２又は３回クロマトグラフィで処理するステップ。
【００２１】
本出願人は、驚くべきことに、こうしたプロセスが母乳のカルシウムの有機及び／又は無機塩及び／又は複合体と結合したＦＶＩＩをその母乳に不溶性の塩を加えて得られる不溶性のカルシウム化合物を沈殿させることによって抽出するステップを含み、加えられる塩はその陰イオンがカルシウム化合物の沈殿物を形成する能力を有しているかどうかを基準として選択されるにもかかわらず、ＦＶＩＩが前記母乳のカルシウムのこれらの有機及び／又は無機塩及び／又は有機あるいは無機複合体から放出され、液相内に再度見出されることに気付いた。
ＦＶＩＩは前記母乳のカルシウムの有機及び／又は無機塩及び／又は有機あるいは無機複合体に結合しており、このことはＦＶＩＩがカルシウムのこれら塩及び／又は複合体に対する親和性を示すことを意味している。従って、ＦＶＩＩは、全体的にであれ部分的にであれ、これらの塩及び／又は複合体の固定に十分な数の部位を有しているのである。
前記カルシウムの有機及び／又は無機塩及び／又は有機あるいは無機複合体とはコロイド状カゼイン・ミセルと相互作用するリン酸カルシウム塩を示す。異なったカゼインがリン酸三カルシウム、つまりＣａ９（ＰＯ４）６の凝集体（『クラスター』）の形で存在するリン酸塩と共にコロイド状ミセル複合体を形成し、その直径は０．５μｍ程度に達する場合もある。こうしたミセルは疎水性の核を取り囲んでいるカゼインｋを多量に含んだ親水性層で構成されるカゼインのサブユニットから形成され、前記リン酸三カルシウム塩は親水性の相とは静電作用で結合している。これらのリン酸三カルシウム塩はそのカゼインに結合しないでそのミセルの内部に存在している場合もある。これらの塩及び／又は複合体はリン酸一カルシウム及び／又はリン酸二カルシウムなどの形態でも母乳の中に存在しており、それらは行われた化学的及び生化学的相互作用に応じて存在する他のイオン形態と均衡状態にある。これらのカルシウム塩及び／又は複合体はカゼインのミセルの内部に存在する場合もある。
カルシウムのこうした有機及び／又は無機塩及び／又は複合体に対するＦＶＩＩの上に述べたような親和性は、修飾されていない、あるいは例えば翻訳後修飾によってｉｎ  ｖｉｖｏあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏで修飾された蛋白質の相互作用によってもたらされている可能性もある。
本発明によるプロセスにおいては、形質転換ＦＶＩＩとは、特にグリコシル化に関して色々な特性を示すすべての形質転換ＦＶＩＩを意味する。好適に、本発明によるＦＶＩＩも上に定義されている通りである。
不溶性カルシウム化合物とは母乳への可溶性が０．５％未満のカルシウム塩あるいは複合体を意味する。
ＦＶＩＩの過半数はカゼイン・ミセルのリン酸塩と結合している。ＦＶＩＩはカルシウムに対しては強い親和性を有しており、親和性定数が高く、ＦＶＩＩの少なくとも７０％から９０％はカゼイン・ミセル内に取り込まれている。残りのＦＶＩＩはカルシウムの他の形態の上に述べた有機及び／又は無機塩及び／又は複合体に対する親和性を示す。
【００２２】
観察されたメカニズムに対していろいろな解釈があったとしてもそれには関係なく、本出願人は可溶性の塩を加えるとミセルのリン酸塩の均衡状態が変化して、その破壊とカゼイン・サブユニットの凝集体の沈殿をもたらすのだと考えている。ミセル内及び／又はミセル上に捕捉されたリン酸塩と結合したＦＶＩＩは、この破壊によって培養液内に放出される。加えて、ＦＶＩＩもそれらのリン酸塩から放出あるいは切り離される。何故なら、それらは本発明によるプロセスで用いられる可溶性塩の影響で不溶性カルシウム化合物の形態で沈殿するからである。同様に、カルシウムの可溶性の有機及び／又は無機塩及び／又は複合体も同じタイプの反応で解離される（図９参照）。
本発明の範囲において、上記の可溶性塩とは望ましい効果を得ることを可能にしてくれるすべての塩を意味している。
本発明によるプロセスで用いられる可溶性塩はカルシウムの塩及び／又は複合体からのＦＶＩＩの分離を達成するために当業者によって選ばれた濃度で母乳中に存在することができる。事実上の問題として、この濃度はＦＶＩＩの少なくとも２０％、公的には少なくとも３０％から５０％が分離できれば十分である。特に好適な方法では、その濃度はＦＶＩＩの少なくとも６０％から８０％、あるいは少なくとも９０％を分離させることができるに足るレベルである。
本発明のプロセスはカゼイン・サブユニットの凝集体を簡単に沈殿させる。この沈殿は、上にも述べたようにカゼイン・ミセルが破壊されるので起きる。本発明のプロセスを適用すると、沈殿によって母乳のコロイド状態が不安定になる。
従って、本発明のプロセスは母乳のコロイド状態から液体状態への移行を可能にするプロセスであり、これはコロイド／液体の直接抽出に相当する。
本発明によるプロセスは、最初の状態の母乳より色の薄い乳清を得ることも可能にしてくれる。事実上、これらはその白い色を母乳に移してしまったカゼインである。一度沈殿すると、それらはもはやその白色を母乳に移すことはできない。
【００２３】
本発明による可溶性塩とは、母乳に対してその塩の少なくとも０．５部分（重量ベール）が母乳に対して可溶性を有している塩を意味している。
好適に、このプロセスで用いられる可溶性塩はリン酸塩である。この塩は水に溶かしてから母乳に加えることもできるし、あるいは粉末状態にして直接母乳に加えることもできる。
好ましくは、このリン酸塩はリン酸ナトリウム、リン酸リチウム、リン酸カリウム、リン酸ルビジウム、及びリン酸セシウムで構成される群から選択され、特に好ましいのはリン酸ナトリウムである。
あるいは、本発明によるプロセスで用いられる可溶性塩はアルカリ金属のシュウ酸塩、特にシュウ酸ナトリウムあるいは炭酸カリウムであってもよく、あるいはアルカリ金属の炭酸塩、特に、炭酸ナトリウムあるいは炭酸カリウム、あるいはそれらの混合物であってもよい。
好適に、上記のプロセスを実行するためにつくられた水溶液内での上記可溶性塩の濃度は１００ｍＭから３Ｍの範囲であり、より好ましくは２００ｍＭから５００ｍＭの範囲であり、特に好ましくは２００ｍＭから３００ｍＭの範囲である。
抽出されるべきＦＶＩＩを含んでいる母乳は生のままの母乳であってもよいし、スキム・ミルクであってもよい。本発明によるプロセスをスキム・ミルクに適用することによって得られる利点は、その脂質含有量が低いことである。このプロセスは新鮮な母乳にでもあるいは凍結させた母乳にも適用できる。
このプロセスは脂質相内と上記蛋白質を含んだ水性の非脂質相内で脂質相を分離するステップｂ）を含んでおり、このステップは遠心分離で行われることが好ましい。上記非脂質水性相が実際には乳清である。この分離ステップはカゼイン・ミセル・サブユニットの凝集物とカルシウム化合物の沈殿物の単離も可能にしてくれる。
このプロセスはさらに、分離ステップの後に、空隙率が好ましくは１μｍ、次に０．４５μｍと低下するフィルター上で連続的に行われる非脂質水性相のろ過ステップを含むこともできる。例えばグラス・ファイバーに基づくこれらのフィルターを用いると、母乳内に自然に存在する脂質、脂肪球、そしてリン脂質の含有量を減らすことができる。空隙率が０．５μｍ未満のフィルターを用いることにより、非脂質水性相および後者の精製用基質の微生物学的品質を保持することができる。これらの脂質相は好ましくは母乳の脂肪球を完全に捕捉すしろ過物が清澄であるフィルターを用いて行うのが好ましい。
【００２４】
このステップのすぐ後に、限外ろ過によって濃縮／透析を行うステップを設けることもできる。
濃縮を行うと、保存すべき非脂質水性相の体積を減らすことが可能である。この限外ろ過に用いられる部材は、処理対象の蛋白質の特性によって選択される。一般的には、ＦＶＩＩの分子量以下の孔サイズの空隙率限界であれば問題とするようなロスなしに生成物を濃縮することが可能であろう。例えば、５０ｋＤａの孔サイズを有する膜であれば、５０ｋＤａの分子量のＦＶＩＩをロスを生じさせることなしに濃縮が可能である。
透析は後の精製ステップ、つまりクロマトグラフィ・ステップを含む非脂質水性相の調整を目的とするものである。透析はラクトース、塩、ペプチド、プロテオース−ペプトン、及びその生成物の保持に障害を及ぼすすべての作用因子などの小さな分子サイズの成分を除去できるようにしてくれる。この目的のためには、ＦＶＩＩがその幕を通じてろ過されないようにするために、５０ｋＤａを保持限度とする膜を用いるのが好ましい。
好ましくは、透析用緩衝剤はリン酸ナトリウムの０．０２５−０．０５０Ｍ溶液、ｐＨ
７．５−８．５である。
ろ過及び／又は濃縮／透析ステップ後に得られるものなど、ステップｂ）後に得られる非脂質水性相をその後の精製ステップにかける前に凍結して、−３０度の温度で保存しておいてもよい。
その後、ステップｂ）で得られた非脂質水性相を標準的なクロマトグラフィ装置を用いて行われる親和性クロマトグラフィ（ステップｃ））にかけられるが、このステップは好ましくはヒドロキシアパタイト・ゲル（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）あるいはフロオロアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２）ゲルである基質を用いたクロマトグラフィ・カラムで行われる。従って、水性相のＦＶＩＩが基質上に保持され、保持されない乳酸蛋白質の過半数は取り除かれる。
０．０２５Ｍ―０．０３５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５−８．５に基づく水性緩衝剤Ａと均衡化されたクロマトグラフィ・カラムを用いるのが好ましい。ＦＶＩＩの含有量を高めた水性相をカラムに注入すると、ＦＶＩＩの保持が可能になる。保持されない画分は乳酸蛋白質などの望ましくない化合物が取り除かれたことを示すベースラインに戻るまで（ＲＢＬ）緩衝剤Ａの浸出ろ過を行うことによって除去される。吸着度の測定は、２８０ｎｍの波長（λ）で行われる。
ステップｃ）によるＦＶＩＩの溶出は、リン酸ナトリウムやリン酸カリウム、あるいはその混合物などのリン酸塩に基づく所定の濃度の干渉剤、好ましくは０．２５Ｍ−０．３５Ｍのリン酸ナトリウムに基づく緩衝剤Ｂを用いて行われ、ｐＨは７．５−８．５の範囲である。溶出された画分はＲＢＬまで回収される。吸着度の測定は２８０ｎｍの波長（λ）で行われる。
このステップのおかげで、すべての乳酸蛋白質の９０％以上が除去され、ＦＶＩＩの９０％以上が回収される。この段階でのＦＶＩＩのこの溶出された画分の純度は５％程度である。
この純度は、ＦＶＩＩと対象となるサンプル、画分、あるいは溶出物内に存在しているすべての蛋白質の間の重量比で決められる。
好適に、ＦＶＩＩの比活性度はＦＶＩＩのクロマトグラフィ基質に対する親和性の結果として、１０−２５倍高まる。
【００２５】
その後、ステップｃ）から得られるＦＶＩＩの溶出物を接線ろ過にかけるのが好ましい。
接線ろ過膜はＦＶＩＩの特性に従って、当業者が選択する。一般的に言えば、孔の空隙率限界をＦＶＩＩの分子重量の２倍にすると、そのろ過が可能になる。従って、１００ｋＤａのサイズの孔を有する膜を用いれば、有効な収率でＦＶＩＩをろ過することが可能になる。
このろ過ステップの目的は、特にＦＶＩＩより大きな分子量を有する蛋白質の負荷を減らすこと、特に不規則な形状のＦＶＩＩ（例えば、ポリマー化された形状のＦＶＩＩ）と一定の時間が経過した場合にそれを変質劣化させるプロテアーゼを除去することである。この目的のために、空隙率限界が１００ｋＤａの化合物である膜を使用するのが特に好ましい。
好適に、得られたＦＶＩＩのろ過された溶出液はさらに濃縮され、保持限界が５０ｋＤａの膜による限外ろ過によって透析される。この透析緩衝剤は好ましくは０．１５Ｍ−０．２０Ｍ塩化ナトリウム溶液である。
ステップｃ）の終了時に得られたＦＶＩＩの溶出液は、オプションとしてろ過、濃縮及び透析された後、カラム上で保持された因子ＶＩＩの以後に行われる溶出に適した緩衝剤を用いて、弱塩基性対応の陰イオン交換カラム上での２あるいは３段階のクロマトグラフィ・ステップにかけられる。これらのステップによって、特に乳酸蛋白質に関してＦＶＩＩをさらに精製することが可能になる。これらのステップは標準的なクロマトグラフィ装置を用いて実施される。
最初の陰イオン交換クロマトグラフィ・ステップは好適には、そのステップの後の操作上の優先条件に基づいて、因子ＶＩＩを捕捉するＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦゲル・タイプのクロマトグラフィ基質を用いて実行される。この基質は緩衝剤０．０５Ｍトリス、ｐＨ７．０−７．５を用いて洗浄される。捕捉されない画分は、ベースラインに回帰するまで上記の緩衝剤を用いて除去される。ＦＶＩＩの溶出は０．０５Ｍトリスと０．０２０Ｍ−０．０５Ｍの範囲、好ましくは０．０５Ｍの塩化カルシウムに基づく水性緩衝剤、ｐＨ７．０−８．０を用いて、ＦＶＩＩの最初の溶出液を得るために行われる。吸着度の測定は２８０ｎｍの波長（λ）で行われる。
このステップでのＦＶＩＩの回収は少なくとも７０％で、これによって、結びついている蛋白質、特に母乳蛋白質の８０％程度の除去が可能になる。
【００２６】
その後、上にも述べたように、０．１５Ｍ−０．２０Ｍの塩化ナトリウム溶液を緩衝剤として用いて、このＦＶＩＩの溶出液を透析ステップにかけることができる。
二回目のクロマトグラフィ・ステップは好適にはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦゲル・タイプのクロマトグラフィ基質を用いて実行され、この基質上に最初のクロマトグラフィ・ステップで陰イオン交換器で得られたＦＶＩＩの最初の溶出液を、後に行われれる操作上の優先条件に従って注入する。この基質は０．０５Ｍ、ｐＨ７．０−７．５のトリス緩衝剤を用いて洗浄される。捕捉されない画分はベースラインに回帰するまで、洗浄によって除去される。検出は波長（λ）＝２８０ｎｍでの吸着度測定によって行われる。
基質上に捕捉されたＦＶＩＩの溶出は０．０５Ｍトリス及び０．００５Ｍ塩化カルシウム，ｐＨ７．０−８．０に基づく水性緩衝剤を用いて行われ、純度が９０％以上の高純度因子ＶＩＩの第２の溶出液が得られる。吸着度測定は波長（λ）＝２８０ｎｍで行われる。
二回目のクロマトグラフィ・ステップは起こり得る蛋白質分解性劣化を制限することを意図している。
この段階で、上記溶出液の純度は９０％程度で、捕捉された結合蛋白質の９５％以上が除去される。その後、この溶出液を上に述べたように０．１５−０．２０Ｍ塩化ナトリウムを緩衝剤に用いて透析ステップにかけることができる。
本発明の非常に好ましい実施の形態によれば、このプロセスはそのカラムからの因子ＶＩＩの連続的溶出を行うのに適した緩衝剤を用いて弱酸性タイプの陰イオン交換器を用いて行われる３回のクロマトグラフィ・ステップを含んでいる。従って、上記の２回の陰イオン交換クロマトグラフィ・ステップの後、三回目の陰イオン交換クロマトグラフィが行われる。このステップによって、医学的使用に適した方法で蛋白質を多量に含んだ組成物を調製することができる。
この三回目のクロマトグラフィ・ステップは好適にはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦゲル・タイプのクロマトグラフィ基質を用いて実行され、その基質上に、以下の好ましい操作条件に基づいて、陰イオン交換装置上で上記の二回目のクロマトグラフィ・ステップで得られたＦＶＩＩの二回目の溶出物が注入される。
上記二回目の陰イオン交換クロマトグラフィ・ステップで得られた二回目の溶出物は、好ましくは１−５体積分の精製注入用水（ＷＩＦ）によって希釈した後に、因子ＶＩＩを細くするＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）  ｄｅタイプを充填したカラムに注入される。この基質は、０．０５Ｍとリス緩衝剤、ｐＨ７．０−７．５で洗浄される。捕捉されない画分は洗浄用緩衝剤を用いてＲＬＢまで除去される。吸着度の測定は２８０ｎｍの波長（λ）で行われる。
上記基質上に捕捉されたＦＶＩＩの溶出は、０．０２Ｍとリス及び０．２０―０．３０Ｍ、好ましくは０．２８Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５−７．５に基づく水性緩衝剤を用いて行われる。吸着度の測定は２８０ｎｍの波長（λ）で行われる。
【００２７】
このようにして得られた形質転換ＦＶＩＩの組成物の純度は９５％より高い。非常に好適には、この組成物はＦＶＩＩの濃縮物の形状を呈している。
このプロセスを実施すると累積州立は２０−２５％に達し、処理された母乳１リットルあたり少なくとも２０ｍｇのＦＶＩＩが精製可能である。
その結果、陰イオン交換ゲル上での３枚のクロマトグラフィ・ステップによってＦＶＩＩをさらに精製することが可能になる。さらに、それらのステップによってＦＶＩＩの濃縮とその組成物の調製が可能になる。
ＦＶＩＩの活性化はこのプロセス中に起き、特に最初の陰イオン交換クロマトグラフィ・ステップ中に行われる可能性がある。
最終的な溶出物が回収されたら、その溶出物は０．２２μｍフィルターでのろ過ステップ、容器内での分散ステップにかけ、そして、−３０℃に凍結させて、この温度で保存することができる。
本発明による上記のプロセスはさらに、製剤、ウイルス不活性化、そして滅菌ステップの少なくとも１つを含むことも出来る。一般的に言えば、このプロセスは、親和性クロマトグラフィ・ステップの前に、抗ウィルス処理ステップを含むこともでき、このステップは好適には、溶剤／洗剤によって、特にＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（１％ｗ／ｖ）とＴｎＢＰ（トリ−ｎ−ブチルホスフェート）（０．３％  ｖ／ｖ）の存在下で実行され、被覆されたウイルスの不活性化がもたらされる。さらに、イオン交換装置上での二回目のクロマトグラフィ・ステップから得られたＦＶＩＩの溶出物は、好ましくは、ウイルス、特にパルウイルスＢ１９などの被覆されていないウイルスなどのウイルスを効率的に除去するためにナノろ過ステップにかけることができる。１５ｎｍより大きなサイズのウイルスを保持するＡＳＡＨＩ  ＰＬＡＮＯＶＡ（登録商標）１５フィルターを用いることができる。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、医薬品としての用いるための本発明によるＦＶＩＩの組成物を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、血友病の患者を治療するための医薬品を調製するための本発明によるＦＶＩＩ組成物の利用である。
本発明のさらに別の目的は、多重出血性傷害を治療するための医薬品を調製するための本発明によるＦＶＩＩ組成物の利用である。
本発明のさらに別の目的は、手術による止血での大量の制御不能な出血を措置するための医薬品を調製するための本発明によるＦＶＩＩ組成物の利用である。
本発明のさらに別の目的は、抗凝結剤の過剰投与による出血あるいは大出血を措置するための医薬品を調製するための本発明によるＦＶＩＩ組成物の利用である。
本発明のさらに別の目的は、本発明による因子ＶＩＩを薬学的に許容される賦形剤及び／又は基剤を含む医薬品組成物を提供することである。
この賦形剤は薬学的な使用になじむ、そして当業者の知られた食塩水、生理的、等張性、あるいは緩衝溶液などの溶剤、ゲルあるいは粉末などのいずであってもよい。本発明による組成物はさらに、分散剤、可溶剤、安定剤、界面活性剤、及び保存剤から選択される１つあるいは複数の薬剤あるいは基剤を含むことができる。他方、本発明による組成物はさらに別の薬剤あるいは活性成分を含んでいてもよい。
さらに、この組成物は異なった方法、あるいは異なった形状で投与することができる。投与は特に全身ルート、静脈、皮内、腫瘍内、皮下、腹腔内、筋肉内、あるいは動脈内注射など、こうしたタイプの治療方法のための古典的な経路を用いて行うことができる。例えば、腫瘍内注射や腫瘍に近接した箇所への注射、あるいは腫瘍洗浄などを挙げることができる。
投与量は投与回数、他の有効成分との関係、あるいは病気の程度などに応じて変えることができる。
【００２９】
以下の実施例で、本発明のさらなる態様及び利点について述べるが、これらは本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【００３０】
実施例説明のための略語
ＦＶＩＩ−ｔｇ＝ＦＶＩＩａ−ｔｇ：  本発明による活性化された形質転換ＦＶＩＩ
ＦＶＩＩ−ｒｅｃ＝ＦＶＩＩａ＝ｒｅｃ：  市販されている遺伝子組み換え活性化ＦＶＩＩ
ＦＶＩＩ−ｐｄ＝ＦＶＩＩａ−ｐｄ：  ヒトの血漿から精製された血漿由来の活性化されたＦＶＩＩ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：  マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間
ＨＰＣＥ−ＬＩＦ：  高性能毛細管電気泳動−レーザー誘導蛍光
ＥＳＩ−ＭＳ：  質量分光−電気スプレイ・イオン化
ＬＣ−ＥＳＩＭ：  液体クロマトグラフィ−質量分光−電気スプレイ・イオン化
ＮＰ−ＨＰＬＣ：  正常相液体プロマトグラフィ
ＰＮＧａｓｅ  Ｆ：  ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ
ＬＣ−ＭＳ：  液体クロマトグラフィ−質量分光
【実施例１】
【００３１】
実施例１：  母乳でヒトＦＶＩＩ蛋白質をつくりだす形質転換された雌ウサギの産出
最初に、ｐ−ポリＩＩＩ−Ｉベクター（Ｌａｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  （１９８７）  ５７，  １９３−２０１参照）内で、配列Ｂａｍ  Ｈ１と配列Ｈｉｎｄ  ＩＩＩの間にＷａｐ遺伝子（Ｄｅｖｉｎｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ｖｏｌ．  １６，  Ｎｏ．  １６，  ２５  Ａｕｇｕｓｔ  １９８８，  ｐ．  ８１８０参照）のＷＡＰ遺伝子のＢａｍ  Ｈ１−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ（６．３  Ｋｂフラグメント）を導入することで、調製する。
このクローニング・プロセスで、箇所Ｂａｍ  Ｈ１を抑制し、ベクターｐ１内に存在している箇所Ｃｌａ  Ｉで置換した。従って、このベクターｐ１は６．３Ｋｂ  ＷＡＰプロモータの依存下にある外来遺伝子と受け入れうることができるプラスミドである。外来遺伝子の導入は、例えば、ポリリンカーの箇所Ｓａｌ  Ｉ内に行うことが出来る。
ポリリンカー全体と外来遺伝子を含んだ挿入物はｐ−ｐｏｌｙＩＩＩ−ｌプラスミドのポリリンカーの末端にある２つの箇所Ｎｏｔ  Ｉを切断した後プラスミドから分離できる。
プラスミドｐ１から得たプラスミドｐ２はウサギのＷＡＰ遺伝子のプロモータ〈６．３Ｋｂ〉とヒトＦＶＩＩの遺伝子を含んでいる。形質転換雌ウサギを得るために用いられるフラグメントはこれら２つの箇所Ｎｏｔ１の間に含まれている。
箇所Ｈｉｎｄ  ＩＩＩはクローニング箇所として用いるように、箇所固有突然変異誘発によって遺伝子のリーダー配列内に導入された。
これらの形質転換された雌のウサギは従来の微量注射（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＳＣｉ．  ＵＳＡ  （１９８５）  ８２，  ４４３８−４４４２）によって得られたものである。その遺伝子を５００コピー含んでいる１−２ｐｌがマウス胚の雄前核に注入された。これらの構成物はｐ−ｐｏｌｙＩＩＩ−Ｉベクター（Ｌａｔｈｅ  ｅｔ  ａ，  Ｇｅｎｅ  （１９８７）５７，１９３−２０１）内でつくられた。組み換え遺伝子を含んでいるこのベクターのフラグメントＮｏｔ  １−Ｎｏｔ  １を微量注射した。その後、これらの胚をホルモン的に調製した養子妊娠させるメスの卵管に移した。操作された胚の約１０％が若いウサギを妊娠させ、また操作された胚の２−５％が形質転換された若いウサギを妊娠させた。人為的に導入された遺伝子の存在は、ウサギの尾から抽出されたＤＮＡからのサザーン移動法によって明らかにされた。これらの動物の血液と母乳内のＦＶＩＩの濃度は特殊は放射免疫アッセイによって評価された。
ＦＶＩＩの生物学的活性は細胞あるいはウサギ哺乳類移植片培養液にその母乳を加えることで評価した。その母乳内での本発明によるＦＶＩＩをつくりだす形質転換された雌ウサギを得るために用いられた技術はＥＰＮｏ．０，５２７，０６３により詳細に述べてある。
【実施例２】
【００３２】
実施例２：  得られたＦＶＩＩの抽出及び精製
ａ）  ＦＶＩＩの抽出
生の全乳５００ｍｌを取り出して、９体積分の０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ８．２  で希釈する。室温で３０分間攪拌した後、ＦＶＩＩの含量を多くした水相を１００００ｇで１時間１５℃で遠心分離する（遠心分離Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ＲＣ−６７００ｒｐｍ−ロータＳＬＣ−６０００）。約８３５ｍｌのポット６個が必要。
遠心分離によって３つの相が得られ、その１つはその表面の脂質相（クリーム）、１つは非脂質水性ＦＶＩＩ濃縮相（多数相）、そしてもう１つはペレット上の固体白色相（不溶性カゼインとカルシウム化合物の沈殿物）である。
ＦＶＩＩを含む非脂質水性相はペリスタルティック・ポンプを用いてクリーム相まで集められる。このクリーム層は別個に回収される。固体相（沈殿物）は取り除かれる。
しかしながら、非脂質水性相は未だ非常に少量の脂質を含んでいるので、一連のフィルター（Ｐａｌｌ  ＳＬＫ７００２Ｕ０１０ＺＰ−孔サイズが１μｍのガラス・ファイバー・プレフィルタ−、そしてＰａｌｌ  ＳＬＫ７００２ＮＸＰ−孔サイズ０．４５μｍのＮｙｌｏｎ６６）を通じてろ過される。ろ過が終了したら、脂質相がこのフィルター配列を通過させられて、母乳の脂質小球が完全に取り除かれ、ろ過物は透明になる。
ろ過された非脂質水相は次に限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｘ  ５０  ｋＤａ−０．１ｍ２）で透析され、クロマトグラフィ相と共存できるようにされる。分子量が５０ｋＤａ程度のＦＶＩＩは母乳内の塩類、糖類、及びペプチドとは違ってこの膜を通過することは出来ない。最初に、溶液（約５，０００ｍｌ）が５００ｍｌに濃縮され、限外ろ過で透析が行われ、体積は変わらないので、電解質を取り除き、その生物素材をクロマトグラフィ・ステップのために調整することができる。透析緩衝剤は０．０２５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ８．２である。
ＦＶＩＩを含むこの非脂質水性相はＦＶＩＩ−ｔｇの含量を多くした乳清に順化させることができる。この製剤は以後のプロセスに回される前に−３０℃の温度で保存される。
このステップでのＦＶＩＩの回収の総収率は非常に満足すべきレベル、つまり９０％である（リン酸を用いた抽出で９１％＋９９％透析／濃縮）。
このステップの終了時のＦＶＩＩを含む非脂質水性相は完全に透明で、その後に行われるクロマトグラフィ・ステップで用いることができる。
約９３，０００ＩＵのＦＶＩＩ−ｔｇがこの段階で抽出される。この製剤でのＦＶＩＩの純度は０．２％程度のレベルである。
【００３３】
ｂ）  ＦＶＩＩの精製
１．  ヒドロキシアパタイト・ゲル上でのクロマトグラフィ
アミコン９０（直径：９ｃｍ、断面積：６４  ｃｍ２）にバイオラッド社のセラミック・ヒドロキシアパタイト・タイプ１（ＣＨＴ−Ｉ）ゲルを充填する。
このゲルを０．０２５Ｍリン酸ナトリウムと０．０４Ｍ塩化ナトリウムの混合物に基づく水性緩衝剤Ａ、ｐＨ８．０で均衡させる。この調剤全体を−３０℃で保存して、使用時に氷の塊が完全になくなるまで３７℃の温水槽で解凍して、ゲル上に注入する（線形流速は１００ｃｍ／ｈで、これは１分あたり１０５ｍｌに相当）。捕捉されない画分は０．０２５Ｍリン酸ナトリウムと０．０４Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ８．２）を含む緩衝剤を通過させて除去し、ベースラインに戻す（ＲＢＬ）。吸着度の測定は２８０ｎｍの波長（λ）で行う。
ＦＶＩＩ−ｔｇ  を含む画分の溶出は、０．２５Ｍリン酸ナトリウムと０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝剤Ｂ（ｐＨ８．０）を用いて行われる。溶出された画分はベースラインに戻るまで集められる。吸着度の測定は２８０ｎｍの波長（λ）で行う。
このクロマトグラフィを行うことで、ＦＶＩＩ−ｔｇの９０％以上を回収すると同時に、乳酸蛋白質の９５％以上を除去することができる。比活性（Ｓ．Ａ）は２５倍に増大する。この段階で、純度４％のＦＶＩＩ−ｔｇが約８５，０００ＩＵ回収される。
【００３４】
２．  １００ｋＤａ接線ろ過と５０ｋＤａ濃縮／透析
前のステップで得られた溶出物全体を１００ｋＤａ限外ろ過膜（Ｐａｌｌ  ＯＭＥＧＡ  ＳＣ  １００Ｋ−０．１ｍ２）で接線ろ過する。このＦＶＩＩは１００ｋＤＡ膜でろ過されるが、分子量が１００ｋＤＡ異常の蛋白質はろ過することができない。
その後、ろ過された画分を約５００ｍｌに濃縮して、上に述べた５０ｋＤａ限外フィルターで透析する。この透析緩衝剤は０．１５Ｍ塩化ナトリウムである。
プロセスのこの段階で、生成物を−３０℃で保存しておいて、その後、イオン交換クロマトグラフィにかける。
この段階の処理によって、分子量が１００ｋＤａ以上の蛋白質、特に酵素前駆体の負荷を減らすことができる。１００ｋＤａ膜で処理することで、蛋白質の５０％程度を捕捉するすることができ、これは高分子量蛋白質で、同時にＦＶＩＩ−ｔｇの９５％がろ過され、８２，０００のＦＶＩＩ−ｔｇが得られる。  
この処理によって、それ以後のステップでの蛋白質分解のリスクが低減される。
【００３５】
３．  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦゲルでのクロマトグラフィ
イオン交換ゲルＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ（Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）〈ＱＳＦＦ〉上で３回連続でクロマトグラフィを行って、活性成分を精製し、ＦＶＩＩを活性化されたＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）へと活性化し、そして最後に、濃縮してＦＶＩＩの組成物を作成する。この化合物の検出はλ＝２８０ｎｍでの吸着度測定によって行われる。
【００３６】
３．１    Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ１ステップ−溶出『高カルシウム』
直径２．６ｃｍ（断面積：５．３ｃｍ３）のカラムにＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦゲル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１００ｍｌ充填する。
このゲルを０．０５Ｍトリス緩衝剤、ｐＨ７．５  で均衡させる。
画分全体を−３０℃で保存して、使用時には氷塊が完全になくなるまで、３７℃の水槽で溶かす。この画分を均衡化緩衝剤で１／２（体積比）に希釈して、その後、ゲル上に注入し（流量：１３ｍｌ／分、これは１５０ｃｍ／時間の線形流速に相当）、そして、捕捉されない画分をＲＢＬまでその緩衝剤内を通過させて除去する。
ＦＶＩＩの含有量が低い最初の蛋白質画分を０．０５Ｍトリス及び０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝剤、ｐＨ７．５  で９ｍｌ／分（つまり、１００ｃｍ／時間）で溶出させ、そのあと除去する。
第二のＦＶＩＩを多量に含んだ画分は０．０５Ｍトリス及び０．０５Ｍ塩化ナトリウム、そして０．０５  Ｍ塩化カルシウム緩衝剤（ｐＨ７．５）を用いて、９ｍｌ／分（つまり、１００ｃｍ／時間）で溶出される。
この第二の画分は上に述べた５０ｋＤａ限外フィルターで透析される。この透析緩衝剤は０．１５Ｍ塩化ナトリウムである。この画分は一昼夜＋４℃で保存され、その後、陰イオン交換クロマトグラフィで二度目の処理にかけられる。
この段階によって、７３％のＦＶＩＩ（つまり、６０００ＩＵのＦＶＩＩ−ｔｇ）を回収することができると同時に、関連する蛋白質の８０％を除去することができる。さらに。ＦＶＩＩを活性化してＦＶＩＩａとすることができる。
【００３７】
３．２    Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ２  ２  ステップ−溶出『低カルシウム』
直径２．５ｃｍ（断面積：４．９ｃｍ２）カラムに３０ｍｌのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ〈ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ〉ゲルを充填する。
このゲルを０．０５Ｍトリス緩衝剤、ｐＨ７．５で均衡化させる。
＋４℃の温度で保存されている前に溶出させた画分（第二の画分）を希釈してから、ゲルに注入する（流量：９ｍｌ／分、つまり、線形流速：１００ｃｍ／時間）。
この第二の画分を注入した後、捕捉されない画分を除去するために、ＲＬＢまで均衡化緩衝剤で洗浄する。
非常に高い純度のＦＶＩＩを含んでいる画分は０．０５Ｍトリス、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、及び０．００５Ｍ塩化ナトリウムに基づく緩衝剤、ｐＨ７．５内で４．５ｍｌ／分（つまり５０ｃｍ／時間）で溶出させる。
２３，０００ＩＵのＦＶＩＩ−ｔｇが精製され、これは１２ｍｇのＦＶＩＩ−ｔｇに相当する。
このステップによって、関連蛋白質（ウサギ母乳蛋白質）の９５％以上が除去できる。
この溶出物は９０％以上の純度を有し、天然のヒトＦＶＩＩ分子のものに近い構造的及び機能的特徴を示す。イオン交換クロマトグラフィの三回目の処理で濃縮、製剤化される。
【００３８】
３．３    Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ３  ステップ−『ナトリウム』溶出
直径２．５ｃｍ（断面積：４．９ｃｍ２）のカラムにＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦゲル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）１０ｍｌを充填する。
このゲルを０．０５Ｍトリス緩衝剤（ｐＨ７．５）を用いて均衡化させる。
前のステップで溶出された精製画分を注入用の純水（ＰＷＩ）で５倍に希釈してから、ゲルに注入する（流量：４．５ｍｌ／分、線形流速：５０ｃｍ／時間）。
上記画分を注入した後、このゲルを均衡化緩衝剤を用いてＲＬＢまで洗浄して、捕捉されていない画分を除去する。
その後、ＦＶＩＩ−ｔｇを０．０２Ｍトリス及び０．２８Ｍ塩化ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）を用いて、流量３ｍｌ／分で溶出させる。
濃縮物の形状のＦＶＩＩ−ｔｇの組成物は純度が９５％以上である。この生成物は静脈注射に使用できる。このプロセスは累積収率が２２％に達し、用いられる母乳の１リットルあたり少なくとも２０ｍｇの精製が可能になる。
さらに、ＦＶＩＩ−ｔｇの組成物は以下の実施例で述べられるような種々の構造分析に処せられる。
【実施例３】
【００３９】
実施例３：  一次配列の調査
１．  ペプチド・マップ
ＦＶＩＩ−ｐｄ、ＦＶＩＩ−ｒｅｃ、及びＦＶＩＩ−ｔｇのサンプルのトリプシンとＡｓｐ−Ｎによる消化後にＬＣ−ＭＳ及びＵＶ検出クロマトグラムを得る。
トリプシン消化後に得られるペプチド・マップの分析によれば、それらは６５分間の保持時間ではほぼ同様である。それ以上の時間が経過すると、重鎖のペプチド・フラグメントに対応する種がＦＶＩＩ−ｒｅｃとＦＶＩＩ−ｔｇには認められるが、ＦＶＩＩ−ｐｄでは認められない。質量が大きな（４５００Ｄａ−８０００Ｄａ）これらのペプチドは、不全分裂に対応している。これらのペプチドは他のＦＶＩＩ−ｐｄバッチでも見出され、従って、それらの存在を異なったトリプシン感作性に関係付けることはできない。
Ａｓｐ−Ｎ消化後に得られるペプチド・マップはＦＶＩＩタイプ相互で非常に類似しており、この傾向は保持時間全体を通じて認められる。強度において認められる相違は注入量によるだけで、構造的な違いとは関係ない。
【００４０】
２．  配列のカバーリング
ＭＳ及び／又はＭＳ／ＭＳによって示されるペプチドから配列の重複を計算する。表１は異なったサンプルで得られた結果を示す。トリプシン及びＡｓｐ−Ｎ消化を考慮に入れると、一次配列の９５％以上が確認され、得られた結果は文献（Ｔｈｉｍ  Ｌ．  ｅｔ．  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９８８，  ２７，  ７７８５−７７９３）に述べられているのと同様の傾向を示している。
【００４１】
【表１】
0005943536.tif 000002
【００４２】
ペプチドの強度を確認するために、ＨＰＬＣ画分をＭＡＬＤＩ及びＥｄｍａｎ配列決定法で分析する。
Ｅｄｍａｎ配列決定法で分析されるＨＰＬＣ画分のすべてで、８０％の配列重複が得られる。ＬＣ−ＭＳでＦＶＩＩ−ｔｇ及びＦＶＩＩ−ｒｅｃに関して行われた配列確認では、一次配列の重複度が９５％を上回っていた。
【実施例４】
【００４３】
実施例４：  グリコシル化箇所及び糖ペプチドのＥＳＩ−ＭＳによる特徴づけ
ＦＶＩＩ−ｔｇのＮ−グリコシル化箇所をＬＣ−ＥＳＩＭＳ（／ＭＳ）で同定し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで確認し、そして、その微少異種性をＬＣ−ＥＳＩＭＳによって判定した。
図２は、２つのグリコシル化Ａｓｎ残基を含む糖ペプチドの解析ＥＳＩスペクトルを示している。グリコシル化箇所の位置はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）とＥｄｍａｎ配列決定法で確認した。
Ｎ−グリコシル化箇所Ａｓｎ１４５及びＡｓｎ３２２をそれぞれ有する血漿ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ−ｐｄ）の糖ペプチド質量スペクトル［Ｄ１２３−Ｒ１５２］と［Ｋ３１．６−Ｒ３５３］を分析した結果、２つの触覚を持ち、バイシアル化され、フコース化はされていない構造（Ａ２）（糖ペプチドの観察質量：５５６３．８Ｄａ）及びフコース化された構造（Ａ２Ｆ）（観察質量：５７０９．８Ｄａ）の存在が明らかになった。また、３つの触覚を持ち、トリシアル化され、フコース化されていない構造（Ａ３）（観察質量：６２２０．０Ｄａ）とフコース化された構造（Ａ３Ｆ）（観察質量：６３６６．１Ｄａ）の存在も示された。形質転換されたＦＶＩＩ（ＦＶＩＩ−ｔｇ）の場合、Ａｓｎ１４５上に存在しているオリゴ糖の大多数は２つの触覚を有し、モノシリアル化サレ、フコース化されていないかフコース化されているもの（Ａ１、Ａ１Ｆ）、及びＡ２、Ａ２Ｆタイプのものである。３つの触覚部を有する形状はあまり存在していない。
Ａｓｎ３２２糖形状の過半数に関して言えば、同じグリカン構造が異なった割合で観察される。図２は、Ａｓｎ１４５ほど処理されていない形状（つまり、触覚部及びシアル化の程度がより低い形状）の存在を示している。例えば、３つの触覚部を有する構造は血漿生成物の場合Ａｓｎ３２２とＡｓｎ１４５ではそれほど存在しておらず、ＦＶＩＩ−ｔｇ上では存在していない。さらに、Ａｓｎ３２２とＡｓｎ１４５は１００％グリコシル化されている点についても注意すべきである。半定量的ではあるが、これらの結果はＨＰＣＥ−ＬＩＧＨＴ  ＩＮＣＯＭＩＮＧ  ＦＡＣＥ及びＮＰ−ＨＰＬＣで得られる数値と一致している。
【実施例５】
【００４４】
実施例５：  ＨＰＣＥ−ＬＩＦによるＮ−グリカンの定量
Ｎ結合されたオリゴ糖の同定及び定量を、ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる脱グリコシル化後にＨＰＣＥ−ＬＩＦによって実行する。ＦＶＩＩサンプルをエグゾグリコシダーゼ（シアリダーゼ（酵素／基質（ＦＶＩＩ）比率：１ｍｇ／１０μｇ）、ガラクトシダーゼ、ヘクスナカーゼ（キット：プロザイム）、フコシダーゼ（比率Ｅ／Ｓ：１  ｍＩＵ／１０μｇ）で処理して、それぞれの単離された構造の同定と定量を確実にできるようにする。得られたグリカンをフルオロクロームでラベルして、その質量と電荷で分離する。２つの標準（グルコース・ホモポリマーとオリゴ糖）を用いることで、構造の同定が可能になる。定量は定量されたオリゴ糖全体と各ピークとの組み合わせでおこなわれる。
この例では、毛管電気泳動用Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ  ＰＡ８００装置（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｔｅｒ社製）を用い、その毛管は長さ５０ｃｍ、内径５０μｍでＮ−ＣＨＯ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｔｅｒ社製）によって被覆されている。『ゲル緩衝剤−Ｎ』（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｔｅｒ社製）と呼ばれる分離緩衝剤も用いられる。実験は２５ｋＶ、２０℃の条件下で２０分間行われる。検出はレーザーを用いて行われる（励起λ＝４８８ｎｍ、放出λ＝５２０ｎｍ）で行われる。
シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、ヘクスナカーゼによる同時脱グリコシル化の後、『コア』とフコース化された『コア』に対応するピーク・エリア間の比率に基づいて計算される。
ＦＶＩＩ−ｐｄのグリカンの大部分は２つの触覚部を有するバイシリアル化されたタイプのもの（Ａ２）と、２つの触覚部を有し、モノシリアリル化され、さらにフコース化されたタイプのもの（Ａ２Ｆ）であった。ＦＶＩＩ−ｔｇのグリカン形状（図３参照）は、２つの触覚部を有し、モノシリアリル化され、さらにフコース化された、あるいはフコース化されていないタイプ（Ａ１Ｆ、Ａ１）、及び２つの触覚部を有し、バイシリアル化され、フコース化されてない、あるいはフコース化されたタイプ（Ａ２、Ａ２Ｆ）の存在を示している。ＦＶＩＩ−ｒｅｃの形状は種々の観察された構造（Ａ１Ｆ、Ａ２Ｆ）に対して非定型的移行期があることを示している。
【００４５】
【表２】
0005943536.tif 000003
【００４６】
種々のグリカン構造の定量分析（表２）の結果では、ＦＶＩＩ−ｐｄの場合シアル化された構造が優勢で、約５１％がバイシアル化されたグリカン（Ａ２及びＡ２Ｆ）で３０％が３つの触覚部分をち、シアル化され、フコース化されていない、あるいはフコース化された形状のもの（Ｇ３及びＧ３Ｆ）であることが示されている。ＦＶＩＩ−ｔｇ（バッチＡとバッチＢ）はＦＶＩＩ−ｐｄと比較するとシアル化の程度が低く、３５％が２つの触覚部分を有し、バイシアル化された形状のもので、６％だけが３つの触覚部分を有するシアル化された形状のものである。これらの形状の過半数はモノシアル化されており、５０％は構造Ａ１とＡ１Ｆである。ＦＶＩＩ−ｒｅｃもＦＶＩＩ−ｐｄと比較するとシアル化の程度が低く、４５％がＡ２Ｆ構造であり、３つの触覚部をもち、シアル化されたグリカンが６％だけである（結果は示さず）。
ＦＶＩＩ−ｒｅｃの場合、フコース化されていない構造の割合が低い点が注目される。
【００４７】
【表３】
0005943536.tif 000004
【００４８】
定量的な分析の結果は、ＦＶＩＩ−ｐｄのフコース化の割合が低く（１６％），
ＦＶＩＩ−ｔｇの場合はフコース化の割合が２４〜４２％、そしてＦＶＩＩ−ｒｅｃの場合はフコース化の割合が１００％であることを示している。
【実施例６】
【００４９】
実施例６：  ＮＰ−ＨＰＬＣによるＮ−グリカンの定量
ＦＶＩＩ−ｐｄとＦＶＩＩ−ｔｇのＮ−グリコシル化の定量及び定性分析をＮＰ−ＨＰＬＣで行った。蛋白質の脱塩及び乾燥後に、この蛋白質を変性させ、当業者に公知の手順で還元する。そして、グリカンが酵素経路で放出され（エンドグリコシダーゼＰＮＧａｓｅ  Ｆ）、エタノール沈殿で精製される。このようにして得られるグリカンを蛍光プローブ：２−アミノベンズアミドでラベルする。ラベルされたグリカンをＮＰ−ＨＰＬＣ（アミド−８０、カラム−４，６／２５０ｍｍ−Ｔｏｓｏｈａａｓ）を用いて、その親水性を利用して分離する。注入を行う前に、カラムを８０％アセトニトリルで均衡化させる。オリゴ糖類は１４０分以上の時間をかけて、蟻酸アンモニウム５０ｍＭ（ｐＨ４．５）の増大勾配を用いて溶出させる。検出は蛍光光度法で行われる。（励起λ＝３３０ｎｍ；放出λ＝４２０ｎｍ）。
ＦＶＩＩ−ｐｄのクロマトグラフィ的特徴（図４）は、グリカンの大多数が２つの触覚部分を有し、バイシアル化されたタイプ（Ａ２）で、その割合は最大３９％である。２つの触覚部分を有し、バイシアル化され、フコース化されたタイプ（Ａ２Ｆ）、モノシアル化されたタイプ（Ａ１）、及び３つの触覚部分を持ち、フコース化された、及びフコース化されていない形状（Ａ３Ｆ及びＡ３）も、より少量ではあるが観察される。
ＦＶＩＩ−ｔｇで行われるＮＰ−ＨＰＬＣによる分析で、タイプＡ１のオリゴ糖が最大２７％の割合で存在していることが確認される。構造Ａ１Ｆ、Ａ２、及びＡ２Ｆの割合はそれほど高くなく、３つの触覚部をもつ形状は微量しか存在しない。このことは、ＦＶＩＩ−ｐｄとシアル化の程度が低い因子ＦＶＩＩ−ｔｇとの間のシアル化の程度の違いを示している。
【実施例７】
【００５０】
実施例７：  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの同定
質量分光分析ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  （Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｏｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｏｒｙ）はペプチド類、蛋白質、グリカン類、オリゴ糖類、そしてほとんどのイオン化可能なポリマーの分子量を高い精度で測定することを可能にしてくれる技術である。
分析対象のペプチド、蛋白質、及びグリカンは用いられるレーザーのナ長で吸収する基質に混合される。主要な基質はペプチドを分析するためのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ）、蛋白質を分析するためのシナピン酸（ＳＡ）、そしてオリゴ糖類を分析するための２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）である。
この方法では、基質／検体共結晶体をパルス化レーザーで照射して、基質及び検体分子を共脱着させる。気相をイオン化させると、検体分子が飛行時間検出器を横断する。質量と飛行時間とは直接の相関性を有していることを考えれば、後者を測定することで標的検体の質量を判定することができる。同定は質量理論値と観察された質量測定値との比較を通じて行われる。配列決定は、得られたイオン・フラグメントに基づいて、ＭＳ／ＭＳモードで行うことができる。用いられる装置はＢｒｕｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ２で、これはＴＯＦ及びＴＯＦ／ＴＯＦモードで作動する。
ＦＶＩＩ−ｔｇ内に存在しているグリカン構造を同定するために、予備的なＮＰ−ＨＰＬＣ（図５）で得られた溶出画分上で、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を行った。
ＦＶＩＩ−ｔｇのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析でＮＰ−ＨＰＬＣによって分離されたグリカンの素性、つまりその大部分がモノシアル化されたＡ１構造であり、少部分がＡ１Ｆ、Ａ２Ｆ、及びＡ２タイプであることが確認できた。
この研究で、３つの触覚部分をもち、バイシアル化及びトリシアル化された少数形状と、複合形状、それにタイプＭａｎ５及びＭａｎ６−Ｐ−ＨｅｘＮＡｃタイプのオリゴマンノースも同定できた。
さらに別のグリカン形状を同定するために、脱シアル化後に因子ＦＶＩＩ−ｔｇのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を行った。
脱シアル化後、２つの少数形状Ｇ２とＧ２Ｆの存在が認められ、その割合はそれぞれ３５％と２８％（ＮＰ−ＨＰＬＣによる定量）であった。これらの結果は（脱シアル化されていない）『天然』生成物の構造の同定結果と一致している。
他の同定された形状も少量ではあるが存在しており、それらは、実質的に、オリゴマンノース、Ｍａｎ６−ｐ−ＨｅｘＮＡＣ及び、Ｍａｎ７−ｐ−ＨｅｘＮＡＣ、そして水素化物タイプである。バイフコース化形状の存在も観察された。
【実施例８】
【００５１】
実施例８：  シアル酸−ガラクトース結合のＨＰＣＥ−ＬＩＦ分析
シアル酸−ガラクトース結合（『ブランチング』）の研究に関連する実験手順は実施例５ですでに述べたものと類似している。ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる脱グリコシル化の後、オリゴ糖類を特殊なエグゾシアリダーゼで処理して、各探知された構造を同定、定量できるようにする。用いられるシアリダーゼは肺炎連鎖球菌（ａ２−３結合を特徴とし、０．０２ＩＵ、Ｅ／Ｓ＝０．４Ｗ／Ｗ）、ウェルシュ菌（ａ２−３及びａ２−６結合を特徴とし、０．０４ＩＵ、Ｅ／Ｓ＝０．１Ｗ／Ｗ）、及びアルスロバスター・ウレアファシエンス（ａ２−３、ａ２−６、ａ２−８及びａ２−９結合を加水分解させることができ、０．０１ＩＵ、Ｅ／Ｓ＝０．０５Ｗ／Ｗ）からの遺伝子組み換え酵素である。
分析によって、ＦＶＩＩ−ｒｅｃは２つの触覚部分を有し、シアル化され、フコース化されたグリカン構造を有しており、その大部分はＡ２Ｆで、２つの触覚部分を有するモノシアル化され、フコース化された（Ａ１Ｆ）形状ももっていることが示された。  これらＡ２Ｆ及びＡ１Ｆ構造に関しては、通常こうした構造に見られるのとは違った不規則な移行時間が観察される。つまり、これらのオリゴ糖シアル化構造は、ＦＶＩＩ−ｔｇのものと比較してＨＰＣＥ−ＬＩＦ及びＮＰ−ＨＰＬＣにおいて不規則な移行時間を示す。一方、単糖類におけるその組成物の分析では、Ｎｅｕ５Ａｃと異なった特別のシアル酸は見つからず、質量分光分析の結果では、質量がバイシアル化されたタイプのものとほぼ同じグリカンが見つかっている。最後に、ＦＶＩＩ−ｒｅｃのグリカンの脱シアル化を行うと、ＦＶＩＩ−ｔｇ及びＦＶＩＩ−ｐｄのオリゴ糖のものと同様のクロマトグラフィ及び電気泳動挙動を再度確認することができる。
これら電気泳動及びクロマトグラフィ挙動におけるこれらの違いは、シアル酸の異なったブランチングによって説明することができる。この仮定は、いろいろな手法のＨＰＣＥ−ＬＩＦ及びＭＳでも裏づけられている。
これらの結果を表４に示す。
【００５２】
【表４】
0005943536.tif 000005
【００５３】
これらの結果は３つのＦＶＩＩのシアル酸レベルでそれぞれ特徴のある等長性を示す。実際、ＦＶＩＩ−ｒｅｃのシアル酸はａ２−３結合の存在を示唆しており、タグの方は分岐ａ２−６を示し、ＦＶＩＩ−ｐｄがこれら２つのアイソマーの混合物であることを示している。
ＨＰＣＥ−ＬＩＦとＨＰ−ＨＰＬＣで、ＦＶＩＩ−ｒｅｃのグリカンのＦＶＩＩ−ｔｇとＦＶＩＩ−ｐｄに対する挙動の違いはシアル酸レベルでのこれら等長性の違いに関係している。
【実施例９】
【００５４】
実施例９：  Ｏ−グリコシル化に関する研究
ＦＶＩＩはＳｅｒ５２とＳｅｒ６０レベルで２つのＯ−グリコシル化箇所を示す。これらの残基はグルコース−（キシロース）０−２及びフコース部位をそれぞれ含んでいる。この研究の枠組みでは、Ｏ−グリコシル化について、ＬＣ−ＥＳＩＭＳ（／ＭＳ）によって、そして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）の場合と同様の方法で研究が行われた（結果は示さず）。
図１０はサンプルＦＶＩＩ−ｐｄ、ＦＶＩＩ−ｒｅｃ、及びＦＶＩＩ−ｔｇのＯ−グリカンの構造を示している。ｍ／ｚ３２９７．４でのピークはＳｅｒ５２  上のグルコース−（キシロース）２部位とＳｅｒ６０のフコース分を含むペプチド［Ｌｅｕ３９−Ｌｙｓ６２］に対応している。ｍ／ｚ３１６５．４及び３０３３．３でのピークはこのグリコペプチド上での１及び２キシロースのロスとそれぞれ対応している。これら３つのタイプのＦＶＩＩは均等にフコース化及びグリコシル化されているが、キシロース残基の数と、対応する糖形状の割合において異なっている。従って、ＦＶＩＩ−ｐｄにおいてはキシロースが０、１及び２の形状がほぼ同じ割合で存在しているが、ＦＶＩＩ−ｒｅｃとＦＶＩＩ−ｔｇはキシロースが０と２の形状を含むだけである。
ＭＳ分析はＦｕｃ及びＧｌｃ（Ｘｙ１）ｏの構想を担持しているペプチド［Ｌｅｕ３９−Ｌｙｓ６２］に対応するｍ／ｚ１５１６．６に二価のイオンが存在していることを示している。ＭＳ／ＭＳで得られる異なった単糖に連続的な質量ロスは、それぞれ、グルコース及びフコース残基によす修飾を示している。Ｅｄｍａｎ配列によって、修飾箇所に関してこれらの結果を裏づけることができる。
同様に、ｍ／ｚ１６４８．７での二価イオンはＦｕｃ及びＧｌｃ（Ｘｙｌ）２構造を担持するペプチド［Ｌｅｕ３９−Ｌｙｓ６２］に対応している。ＭＳ／ＭＳで得られる異なったイオン・フラグメントは、キシロース部位がグルコースに結合していることを裏づけている。
【実施例１０】
【００５５】
実施例１０：  γ−カルボキシル化の研究
ＦＶＩＩ−ｐｄの最初の１０個のグルタミン酸はγ−カルボキシル化されており、ＦＶＩＩ−ｒｅｃの１０番目のグルタミン酸は部分的にγ−カルボキシルかされているだけである。形質転換されたＦＶＩＩ及びその類似物のγ−カルボキシル化について調べるために、Ａｓｐ−Ｎ及びトリプシン消化後に得られるペプチドをＬＣ−ＭＳで分析した。これら２つの酵素に関する結論は類似しており、Ａｓｐ−Ｎ消化に関するデータだけを示す。
これらの実験的条件で、γ−カルボキシル化の可能性を示す３つのペプチド［Ａｌａ１−Ｌｙｓ３２］、［Ａｓｐ３３−Ｓｅｒ４５］、及び［Ａｓｐ３３−Ｓｅｒ４５］が確認された。ペプチド［Ａｌａ１−Ｌｙｓ３２］は最初の９つのγ−カルボン酸（Ｇｌａ）を含んでおり、他の２つのペプチド［Ａｓｐ３３−Ｓｅｒ４５］と［Ａｓｐ３３−Ｓｅｒ４５］は、１０番目のＧｌａ残基を含んでいるだけである。従って、１０番目の残基の部分的修飾を具体的に研究する方がより簡単である。
ＦＶＩＩ−ｐｄの質量分光分析の結果（図１１）は４２９６．８Ｄａに最初の９個のグルタミン酸（Ｇｌｕ）上での完全にγ−カルボキシル化されたペプチド［Ａｌａ１−Ｌｙｓ３２］に対応する主要ピーク（約９０％）と、１０番目のＧｌｕ３５のレベルに完全にγ−カルボキシル化されたペプチド［Ａｓｐ３３−Ｓｅｒ４５］の特徴を示すピークの存在を示す。これらの結果は、文献（Ｊｕｒｌａｎｄｅｒ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈｅｍｏｓｔ．，  ２００１，  ２７，  ３７３−３８４）に述べられているように、ＦＶＩＩ−ｐｄの最初の１０個のＧｌｕ残基がγ−カルボキシル化されていることを示している。
同じ実験的条件の下で異なったデータが得られたので、ＦＶＩＩの異なったバッチの比較研究が可能である（表５）。
図１１は、ＦＶＩＩ−ｒｅｃとＦＶＩＩ−ｔｇの場合、完全にγ−カルボキシル化されたペプチド［Ａｌａ１−Ｌｙｓ３２］に対応する４２９６．８  Ｄａのピークが主要であることを示している。一方、両方のＦＶＩＩの場合、１６１４．９に主要ピークの存在が認められ、このことはＧｌａ３５上にγ−カルボキシル化されていないペプチド［Ａｓｐ３３−Ｓｅｒ４５］の特徴を示している。この結果は、ＦＶＩＩ−ｒｅｃの場合に約３５−４０％の割合で確認されている１０番目のＧｌａの部分的γ−カルボキシル化を示しており、このことは公開されている数値（Ｔｈｉｍ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９８８，  ２７，  ７７８５−７７９３  ａｎｄ  Ｊｕｒｌａｎｄｅｒ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈｅｍｏｓｔ，  ２００１，  ２７，  ３７３−３８３）と一致している。ペプチド［Ａｌａ１−Ｌｙｓ３２］に８つのＧｌａが無視できない強度で存在していることも報告しておくべきであろう。この最後の点はこのペプチドにおける１つ以上のＧｌａの部分的γ−カルボキシル化を示しており、７つのＧｌａを有する『微量』部分の存在はむしｒｐ単一の残基が関与していることを強く示すものであろう。
【００５６】
【表５】
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【実施例１１】
【００５７】
実施例１１：  ジスルフィド架橋の研究
非還元状況、つまりジスルフィド架橋が維持されている状態で得られたトリプシン加水分解物を用いてＦＶＩＩのジスルフィド架橋の研究を行った。
遊離シスチンの混入を防ぐために、そして、塩基性ｐＨで行われるステップ中のジスルフィド架橋の交換が起きるのを避けるために、ヨードアセトアミドによる反応ステップを含めた。
これらの条件下で、１２個のジスルフィド架橋の存在を確認することと、１０個のシスチンをペアリングすることが可能であった（表６）。しかしながら、強調しなければならないのは、ＦＶＩＩの配列のこの部分に関連して得られた結果は論理的なペアリングと一致している点である。これらの結論は調べられた両方のサンプル、つまり、ＦＶＩＩ−ｐｄとＦＶＩＩ−ｔｇの両方に適用できる。
【００５８】
【表６】
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【００５９】
用いられた実験の基本方針は翻訳後修飾を行っていないペプチド［Ｇｌｓ３５４−Ｓｅｒ３７９］／［Ａｓｐ３３８−Ｌｙｓ３４１］に対して適用される（結果は示さず）。この基本方針は４つの補足的方針の必要性を示唆しており、それはｉ）ＥＳＩ−ＭＳ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳによる実験的質量と観察される質量との間の質量の二重『マッチング』によるジスルフィドを含むジペプチドの同定。ｉｉ）Ｓ−Ｓ架橋の化学的還元による構造の確認ジスルフィドから発生した２つのペプチドのＭＳ同定、及び（ｉｉｉ）ＭＳ／ＭＳと自動的Ｅｄｍａｎ微小配列決定によるジペプチドの配列決定である。
これらの結果は、実験で得られた質量（３２６４．６Ｄａ）と理論質量（３２６４．５Ｄａ）との『マッチング』によって、ジスルフィド架橋Ｃｙｓ３４０−Ｃｙｓ３６８の存在を示唆するジペプチド［Ｇｌｙ３５４−Ｓｅｒ３７９］／［Ａｓｐ３１８−Ｌｙｓ３４１］の最初の同定を示している。
還元後、このジスルフィド架橋Ｃｙｓ３４０−Ｃｙｓ３６８を含むジペプチド［Ｇｌｙ３５４−Ｓｅｒ３７９］／［Ａｓｐ３１８−Ｌｙｓ３４１］に対応するピークが消失することが、Ｃｙｓ３６８を含むペプチド［Ｇｌｙ３５４−Ｓｅｒ３７９］（理論質量：２８１６．３Ｄａ）に特有のｍ／ｚ２８１６．３でのピークのおかげで観察される。ＭＳ／ＭＳ及びＥｄｍａｎ化学反応による配列決定は、ジペプチド［Ｇｌｙ３５４−Ｓｅｒ３７９］／［Ａｓｐ３１８−Ｌｙｓ３４１］とジスルフィド架橋Ｃｙｓ３４０−Ｃｙｓ３６８の同定を裏付けるものである。
【実施例１２】
【００６０】
実施例１２：  アスパラギン酸６３のβ−水酸化の研究
蛋白質のトリプシン『消化』によってペプチド分析を行う。蛋白質はＭＡＬＤＩ−ＭＳで分析する。水酸化されたペプチドの同定は観察された質量をその理論質量と比較することによって行う。用いられる装置はＴＯＦモードで作動するＢｒｕｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ２である。
表７に異なった結果を示す。文献はＦＶＩＩ−ｐｄとＦＶＩＩ−ｒｅｃのβ−水酸化は起きないと述べているが（Ｔｈｉｍ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９８８，  ２７，  ７７５８−７７９３）、これら両方のサンプルで部分的な修飾は観察されたこと、及びその程度はＦＶＩＩ−ｔｇバッチと比較するとやや控えめであったことは強調しておくべきであろう。
【００６１】
【表７】
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【実施例１３】
【００６２】
実施例１３：  Ｇａｌαｌ，３Ｇａｌ構造の存在に関する研究
ＦＶＩＩ−ｔｇにおけるＧａｌαｌ，３Ｇａｌ構造の存在の可能性について調べるために、Ｇａｌα１，３Ｇａｌ構造のポジティブ・コントロールとして仔ウシ・サイログロブリンを用いる。
生成物を、Ｐｎｇａｓｅ  Ｆで脱グリコシル化した後、Ｇａｌα１，３Ｇａｌ分岐に特有の反応を示すシアリダーゼ、フコシダーゼ、及びα−ガラクトシダーゼで処理する。
図６は仔ウシ・サイログロブリン上に天然形状（”Ｎａｔｉｆ”）及び脱アシル化、脱フコース化、そしてα−脱ガラクトース化形状（Ｄｉａｓｉｌ＋Ｄｆｕｃ＋Ｄｇａｌα（１，３，４，６））を重ねておくことで実行される研究を示している。α−脱ガラクトース化後に得られたグリカン形状は、この構造が上記酵素を用いて処理した後完全に消失することを示しており、したがって、用いられたａ−ガラクトシダーゼが完全に活性であることを証明している。得られたＧａｌα１，３Ｇａｌ構造の割合は、予想された割合と一致している。
図７は脱シアル化され脱フコース化されたＦＶＩＩ−ｔｇ生成物（Ｄａｓｉｌ＋Ｄｆｕｃ）と、脱シアル化され脱フコース化され、さらにａ−脱ガラクトース化された生成物（Ｄａｓｉｌ＋Ｄｆｕｃ＋Ｄｇａｌα（１，３，４，６））の電気泳動写真を重ね合わせたものである。
なお、両方の形状とも完全に重ね合わせが可能である。これらの結果は、ＦＶＩＩ−ｔｇにおいてはＧａｌα１，３Ｇａｌ構造が存在していない可能性を示唆している。なお、近接して存在してはいないグリカン・フコースに対応した多少の構造（＊）も存在している。
【実施例１４】
【００６３】
実施例１４：  Ｇａｌα１，３Ｇａｌ糖類部位の定量
ヒト遺伝子組み換え、形質転換ＦＶＩＩ  １０μｇをジスルフィド架橋還元条件に従って処理し、電気泳動ゲル上に沈殿させてから、ニトロセルロース膜状に移した。
エピトープ・アルファ（１，３）ガラクトシルの含有量が高いので、仔ウシ・サイログロブリンのサンプル（仔ウシ甲状腺からのサイログロブリン、Ｔ１００１、Ｓｉｇｍａ社）をポジティブ・コントロールとして用いる。α−Ｇａｌ部位（ガラクトース―アルファ−３ガラクトース−（３）４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ）をアグルチニン・ペロキシダーゼでラベルされ、α−Ｇａｌエピトープに特有の反応を示す精製レクチン・マラスミウス・オレアデス（シバフタケ）（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈ−９００１、ＭＯＡ−ＨＲＰ）を用いて明らかにする。その後、ペロキシダーゼ活性は色発生基質（Ｆｌｕｋａ，  ４−クロロ−１−ナフソール）を用いて検出し、信号デジタル化（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｑｕａｎｔｉｔｙ−ｏｎｅ）によって定量する。信号の特殊性を確認するために、同じ膜をアルファ−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ，  Ｇｒｅｅｎ  ｃｏｆｆｅｅ  ｂｅａｎ）で処理する。  同時に、総蛋白質量もクマシー・ブルーで染色した同じＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって染色することで調べる。
これらの結果は仔ウシ・サイログロブリンに関して観察された強力な信号とアルファ−ガラクトシダーゼで処理した後それが消失することの結果としてのレクチン・マラスミウス・オレアデス（ＭＯＡ）と特殊性を示している。ＭＯＡ信号の強度を分析される蛋白質の量に対応した信号の強度で割った値に関して示されている結果は、ＦＶＩＩ−ｔｇサンプルに対する残留α−Ｇａｌ信号（２，３，ａ，３，７）のレベルを示しており、遺伝子組み換えＦＶＩＩはより高い値を示している。
これらの結果（図８参照）は、ウサギで発現された形質転換ＦＶＩＩ上でのα−Ｇａｌエピトープが存在しないか、例えば、ハムスターの細胞内での遺伝子組み換えＦＶＩＩ生成物と比較して非常にわずかばかり多いことを示している。
表Ａは本発明によるＦＶＩＩの組成物を提供するための本発明の好ましい１つの実施の形態によるプロセス・ステップを示すものであり、各ステップでの異なった収率、純度、及び比活性を示している。
【００６４】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、因子ＶＩＩＩの欠乏（Ａ型血友病）あるいは因子ＩＸの欠乏（Ｂ型血友病）を示す血友病患者の治療に適用することができる。
【図１】
0005943536.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005943536.tif 000019
【図１１】
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【配列表】
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