(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＭ１９７と個別にコンジュゲートされている肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来の１３の肺炎球菌莢膜多糖からなる多糖−タンパク質コンジュゲートを含み、２−フェノキシエタノール（２−ＰＥ）をさらに含む、複数回投与用多価免疫原性組成物であって、２−ＰＥの濃度が３．５〜５ｍｇ／投与量であり７ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬである、複数回投与用多価免疫原性組成物。
【請求項２】
各多糖４．４μｇ／ｍＬであるが、６Ｂを８．８μｇ／ｍＬ、ＣＲＭ１９７担体タンパク質２０から１００μｇ／ｍＬまで、リン酸アルミニウムの形態で元素アルミニウム０．０２から２ｍｇ／ｍＬまで、塩化ナトリウム０．５から１．２５％まで、ポリソルベート８０  ０．００２から０．２％まで、４から７までのｐＨのコハク酸ナトリウム緩衝液１から１０ｍＭまで、および２−フェノキシエタノール７から１５ｍｇ／ｍＬまでを含む、請求項１に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物。
【請求項３】
１０ｍｇ／ｍＬの濃度で２−ＰＥを含む、請求項２に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物。
【請求項４】
７ｍｇ／ｍＬ以上の２−ＰＥを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物。
【請求項５】
１０ｍｇ／ｍＬ以上の２−ＰＥを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物。
【請求項６】
アジュバントをさらに含み、前記アジュバントが、リン酸アルミニウムである、請求項１に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物。
【請求項７】
免疫原性組成物の抗原性が、１年、１．５年、２年または２．５年以上にわたって安定である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物。
【請求項８】
１つまたは複数の微生物の播種後に、前記微生物の濃度が経時的に減少する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物。
【請求項９】
１つまたは複数の細菌株の播種後に、２４時間で初期微生物数からの少なくとも１．０ｌｏｇの減少を示し、７日で前回測定値からの少なくとも３．０ｌｏｇの減少を示し、および２８日で前回測定値からの０．５ｌｏｇを超える増加を示さない、請求項８に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物。
【請求項１０】
１つまたは複数の細菌株の播種後に、播種後６時間で初期算出数からの少なくとも２．０ｌｏｇの減少、２４時間で前回測定値からの少なくとも３．０ｌｏｇの減少および２８日で回復なしを示す、請求項８に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物。
【請求項１１】
微生物株が、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から選択される１つまたは複数の株である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物。
【請求項１２】
複数回播種される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物。
【請求項１３】
２回目播種が、初回播種の６時間後に行われ、３回目播種が、初回播種の２４時間後に行われ、４回目播種が、初回播種の７日後に行われ、５回目播種が、初回播種の１４日後に行われる、請求項１１または１２に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物。
【請求項１４】
緩衝液、凍結防止剤、塩、二価陽イオン、非イオン性洗剤、およびフリーラジカル酸化の阻害剤のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物。
【請求項１５】
ＣＲＭ１９７と個別にコンジュゲートされている、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来の肺炎球菌莢膜多糖の複数回投与用多価免疫原性組成物製剤であって、前記多価免疫原性組成物が、８．８μｇ／ｍＬの６Ｂを除いて各多糖４．４μｇ／ｍＬ、ＣＲＭ１９７担体タンパク質５８μｇ／ｍＬ、リン酸アルミニウムの形態で元素アルミニウム０．２５ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム０．８５％、ポリソルベート８０  ０．０２％、ｐＨ５．８のコハク酸ナトリウム緩衝液５ｍＭ、および２−フェノキシエタノール１０ｍｇ／ｍＬを含む無菌液体製剤。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物を含有するバイアル。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物を含む、充填済みワクチン送達装置。
【請求項１８】
注射器であるか注射器を含む、請求項１７に記載の充填済みワクチン送達装置。
【請求項１９】
二室もしくは多室の注射器もしくはバイアルまたはそれらの組合せであるか、二室もしくは多室の注射器もしくはバイアルまたはそれらの組合せを含む、請求項１７に記載の充填済みワクチン送達装置。
【請求項２０】
前記複数回投与用多価免疫原性組成物が、筋肉内注射または皮下注射のために製剤化される、請求項１７〜１９に記載の充填済みワクチン送達装置。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物を調製するためのキットであって、（ｉ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物の凍結乾燥形態、および（ｉｉ）水性組成物を提供するために構成成分（ｉ）を再構成するための水性材料を含むキット。
【請求項２２】
バイアル中に４回投与量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物を含む複数回投与ワクチンであって、投与量が、ワクチン０．５ｍＬであるワクチン。
【請求項２３】
１回投与量当たり０．１〜２ｍＬで２回投与量以上の、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物を含む容器。
【請求項２４】
投与量が、０．５ｍＬ投与量である、請求項２３に記載の容器。
【請求項２５】
２〜１０回投与量を含む、請求項２３または２４に記載の容器。
【請求項２６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の複数回投与用多価免疫原性組成物を含むワクチン製剤の効力を測定するための方法であって、試験が、試験組成物に選択微生物集団を播種すること、および経時的なかつ特定の環境条件下での、播種された１つまたは複数の微生物のｌｏｇ減少を、１つまたは複数の試験保存剤を欠く対照組成物におけるｌｏｇ減少と比較することの少なくとも２つのステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【背景技術】
【０００２】
細菌の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎球菌としても知られている）により引き起こされる肺炎球菌疾患は、世界中でより重要な細菌性病原体のうちの１つである。疾患の負担は、ワクチンが入手できない５歳未満の小児で発展途上国において高い。肺炎球菌疾患は、複雑な疾病群であり、菌血症／敗血症、髄膜炎、肺炎および中耳炎などの侵襲的感染を包含し、それらは、小児と成人の両方に影響を及ぼす。プレブナー１３（「プレベナー１３」としても知られており、本明細書では「プレブ（ベ）ナー１３」と称する）は、ＣＲＭ１９７（ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）の変異株由来の交差反応性物質（Ｃｒｏｓｓ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌ））と個別にコンジュゲートされている１３の肺炎球菌血清型（１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆ）由来の多糖の製剤である。プレブ（ベ）ナー１３は、あらゆる肺炎球菌コンジュゲートワクチンのうちで最も幅広い血清型範囲を提供するための乳幼児および幼児の積極的な予防接種に推奨される。特に、プレブ（ベ）ナー１３中の血清型１９Ａは、世界の多くの地域に広まっており、抗生物質抵抗性を伴うことが多い。例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１、ＷＯ２００８／０７９６５３、ＷＯ２００８／０７９７３２、ＷＯ２００８／１４３７０９およびその中に引用されている参考文献を参照されたい。
【０００３】
チメロサール（チオマーサル、メルチオレートとしても知られている）は、１９３０年代の初め頃から、曝露中および複数の対象に投与される場合の潜在的な汚染から製剤を保護するために多くの複数回投与の注射用製剤および局所用液剤に添加されてきたエチル水銀含有保存剤である。チメロサールは、米国および世界のその他の国々における義務化されている予防接種の一部としておよび他の医薬製品中で投与され続けている。チメロサールは、ワクチンの抗原構造および特性との相互作用を最小限にとどめながら、現場における製品の複数回使用中に潜在的な汚染細菌を排除するのに有効な保存剤であると主張されている。乳幼児および若年者における脳の発達に対するエチル水銀の潜在的な安全性の問題および有害作用に関する論争が高まっているため、ある種の機関は、安全性リスクがより低いか無視できる代替保存剤を特定するべきであると提言し始めた。１９９９年、米国議会により委任された米国食品医薬品局の審査により、一部の乳幼児が、ある種の国内指針に従って許容できると考えられているよりも多くの水銀をワクチンから摂取していることが判明した。米国小児科学会（ＡＡＰ）および米国公衆衛生局（ＵＳＰＨＳ）は、ワクチン中のチメロサールに関する共同声明を発表し、次いで、ＡＡＰは、できる限り速やかにワクチンからチメロサールを除去する一方で、安全性に影響を与えずに世界中で高レベルのワクチン接種を引き続き確実に実施する努力を維持することを提言する中間報告書を臨床医に公表した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００６／１１０３８１
【特許文献２】ＷＯ２００８／０７９６５３
【特許文献３】ＷＯ２００８／０７９７３２
【特許文献４】ＷＯ２００８／１４３７０９
【特許文献５】米国特許第４，６７３，５７４号
【特許文献６】米国特許第４，９０２，５０６号
【特許文献７】米国特許第５，６１４，３８２号
【特許文献８】ＷＯ２００４／０８３２５１
【特許文献９】ＷＯ９０／１４８３７
【特許文献１０】米国特許第４，９１２，０９４号
【特許文献１１】米国特許第５，０５７，５４０号
【特許文献１２】米国特許第６，１１３，９１８号
【特許文献１３】米国特許第６，２０７，６４６号
【特許文献１４】ＷＯ００／１８４３４
【特許文献１５】ＷＯ０２／０９８３６８
【特許文献１６】ＷＯ０２／０９８３６９
【特許文献１７】ＷＯ９３／１３３０２
【特許文献１８】ＷＯ９２／１９２６５
【特許文献１９】ＷＯ９４／００１５３
【特許文献２０】ＷＯ９６／３３７３９
【特許文献２１】ＷＯ９５／１７２１０
【特許文献２２】ＷＯ２００７／１２７６６８
【特許文献２３】ＷＯ２００９／１０９５５０
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｒａｉｎら、Ｂｕｌｌ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ  ８１（１０）：７２６〜７３１（２００３）
【非特許文献２】Ｗｉｌｓｏｎ、Ｔｈｅ  Ｈａｚａｒｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ、Ａｔｈｌｏｎｅ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、７５〜７８頁（１９６７）
【非特許文献３】Ｐａｏｌｅｔｔｉら、２００１、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２１１８
【非特許文献４】Ｇｅｎｎａｒｏ、２０００、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２
【非特許文献５】Ｓｈａｒｍａら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ３６（１）：６１〜６３（２００８）
【非特許文献６】Ｆｅｒｎｓｔｅｎ  Ｐ、ら、Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ．２０１１年１月１日、７：７５〜８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ワクチンに保存剤を添加する必要性は、単回投与ワクチン製剤のみを製造および使用することにより軽減されるか不要にすることができる。しかし、単回投与保存剤非含有製剤の使用は、ワクチン接種の総経費を押し上げ、発展途上国における予防接種プログラムの効力を脅かす。さらに、複数回投与バイアルから保存剤を完全に除去することは、特に、低温貯蔵が制限され保健医療の基準が最適とはいえない国々において、好ましい選択肢とは見なされない（Ｄｒａｉｎら、Ｂｕｌｌ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ８１（１０）：７２６〜７３１（２００３））。１９２８年、汚染されたジフテリアワクチンを接種された小児２１人のうち１２人が、複数のブドウ球菌性膿瘍および毒素血症で死亡した（Ｗｉｌｓｏｎ、Ｔｈｅ  Ｈａｚａｒｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ、Ａｔｈｌｏｎｅ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、７５〜７８頁（１９６７））。したがって、複数回投与バイアルは、より安価なワクチンの製造に最も適しているように見えるが、少なくとも１つの保存剤と共に複数回投与ワクチンを製剤化し、複数回使用中または１回もしくは複数回の非無菌事象後、ワクチン中に不注意により導入される微生物から対象を保護することが望ましい。しかし、細菌および他の微生物の汚染に抵抗する際の保存剤の効力は、最適な免疫原性組成物中の各々の異なる抗原決定基の免疫原性ならびに長期安定性に対して特定の保存剤が有する効果と釣り合いがとれていなければならない。プレブ（ベ）ナー１３製剤と保存剤との適合性は、これまで取り組まれてこなかった。プレブ（ベ）ナー１３中に存在する肺炎球菌抗原血清型の抗原決定基を保護および／または安定化する少なくとも１つの保存剤を含む最適化された製剤を有することが望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第一の態様において、本発明は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型由来の複数の莢膜多糖および２−フェノキシエタノール（２−ＰＥ）を含む多価免疫原性組成物を提供する。ある種の実施形態において、莢膜多糖は、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型のうちの１つまたは複数由来である。ある種の実施形態において、莢膜多糖は、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型のうちの７つ以上に由来する。ある種の実施形態において、莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに各々由来する。
【０００８】
本発明のある種の実施形態において、組成物は、７ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬの間、約１０ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ以上、１０ｍｇ／ｍＬ以上、または１５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で２−ＰＥを含む。
【０００９】
本発明の免疫原性組成物は、ある種の実施形態において、アジュバント、緩衝液、凍結防止剤、塩、二価陽イオン、非イオン性洗剤、およびフリーラジカル酸化の阻害剤のうちの１つまたは複数をさらに含み得る。ある種の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。
【００１０】
本発明の好ましい多価免疫原性組成物は、ＣＲＭ１９７と個別にコンジュゲートされている、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来の肺炎球菌莢膜多糖の製剤であり、多価免疫原性組成物は、約８．８μｇ／ｍＬの６Ｂを除いて各多糖約４．４μｇ／ｍＬ、ＣＲＭ１９７担体タンパク質約５８μｇ／ｍＬ、リン酸アルミニウムの形態で元素アルミニウム約０．２５ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム約０．８５％、ポリソルベート８０約０．０２％、ｐＨ５．８のコハク酸ナトリウム緩衝液約５ｍＭ、および２−フェノキシエタノール約１０ｍｇ／ｍＬを含むように無菌液体中で製剤化される。
【００１１】
本発明のある種の実施形態において、免疫原性組成物の抗原性は、２〜８℃、２０〜２５℃、または３７℃の温度において１年、１．５年、２年または２．５年以上にわたって安定である。
【００１２】
本発明のある種の実施形態において、１つまたは複数の微生物の免疫原性組成物への播種後、前記微生物の濃度は、経時的に減少する。ある種の実施形態において、１つまたは複数の細菌株の播種後、組成物は、２４時間で初期微生物数からの少なくとも１．０ｌｏｇの減少を示し、７日で前回測定値からの少なくとも３．０ｌｏｇの減少を示し、および２８日後に前回測定値からの０．５ｌｏｇを超える増加を示さない。ある種の実施形態において、１つまたは複数の細菌株の播種後、組成物は、播種後６時間で初期算出数からの少なくとも２．０ｌｏｇの減少、２４時間で前回測定値からの少なくとも３．０ｌｏｇの減少および２８日で回復なしを示す。微生物株は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から選択される１つまたは複数の株を包含する。
【００１３】
ある種の実施形態において、免疫原性組成物は、複数回播種される。ある種の実施形態において、２回目播種は、初回播種の６時間後に行われ、３回目播種は、初回播種の２４時間後に行われ、４回目播種は、初回播種の７日後に行われ、５回目播種は、初回播種の１４日後に行われる。
【００１４】
第二の態様において、本発明は、本発明の多価免疫原性組成物を含有するバイアルも提供する。バイアルは、単回投与量または複数回投与量の免疫原性組成物を含有することができる。本発明は、本発明の多価免疫原性組成物を含む充填済みワクチン送達装置も提供する。ある種の実施形態において、充填済みワクチン送達装置は、注射器であるか注射器を含む。本発明のワクチン送達装置は、二室もしくは多室の注射器もしくはバイアルまたはそれらの組合せを含むことができる。ある種の実施形態において、充填済みワクチン送達装置は、筋肉内注射または皮下注射のために製剤化された多価免疫原性組成物を含む。
【００１５】
第三の態様において、本発明は、本発明の多価免疫原性組成物を調製するためのキットであって、（ｉ）組成物の凍結乾燥形態中の複数の莢膜多糖、および（ｉｉ）水性組成物を提供するために構成成分（ｉ）を再構成するための水性材料を含むキットも提供する。
【００１６】
第四の態様において、本発明は、バイアル中に４回投与量のワクチンを含む複数回投与ワクチンを提供し、各投与量は、２−フェノキシエタノール４から２０ｍｇ／ｍＬまで、好ましくは、１０ｍｇ／ｍＬを含み、投与量は、ワクチン０．５ｍＬである。
【００１７】
第五の態様において、本発明は、ワクチン組成物の免疫原性および非免疫原性の構成成分の一部またはすべての存在下で１つまたは複数の選択保存剤を含むワクチン製剤の効力を測定するための方法であって、試験が、試験組成物に選択微生物集団を播種すること、および経時的なかつ特定の環境条件（例えば、温度）下での、播種された１つまたは複数の微生物のｌｏｇ減少を、１つまたは複数の試験保存剤を欠く対照組成物におけるｌｏｇ減少と比較することの少なくとも２つのステップを含む方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】様々な製剤におけるワクチン保存剤としてのチメロサールの効力を示す図である。
【図２】様々な製剤および様々な濃度におけるワクチン保存剤としての２−フェノキシエタノール（２−ＰＥ）の効力および安定性を示す図である。
【図３】微生物の単回チャレンジ後の２０〜２５℃における保存剤を含まないプレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤における微生物コロニー数減少の時間経過を示す図である（ｔ＝０、６時間、２４時間、７日、１４日および２８日におけるチャレンジ時と比較した平均ｌｏｇ１０変化として表される）。
【図４】微生物の単回チャレンジ後の２０〜２５℃における０．０１％チメロサールを含むプレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤における微生物コロニー数減少の時間経過を示す図である（ｔ＝０、６時間、２４時間、７日、１４日および２８日におけるチャレンジ時と比較した平均ｌｏｇ１０変化として表される）。
【図５】微生物の単回チャレンジ後の２０〜２５℃における０．０２％チメロサールを含むプレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤における微生物コロニー数減少の時間経過を示す図である（ｔ＝０、６時間、２４時間、７日、１４日および２８日におけるチャレンジ時と比較した平均ｌｏｇ１０変化として表される）。
【図６】微生物の単回チャレンジ後の２０〜２５℃における０．０２％チメロサールを含む塩水における微生物コロニー数減少の時間経過を示す図である（ｔ＝０、６時間、２４時間、７日、１４日および２８日におけるチャレンジ時と比較した平均ｌｏｇ１０変化として表される）。
【図７】微生物の単回チャレンジ後の２０〜２５℃における５ｍｇ／０．５ｍＬ  ２−フェノキシエタノールを含むプレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤における微生物コロニー数減少の時間経過を示す図である（ｔ＝０、６時間、２４時間、７日、１４日および２８日におけるチャレンジ時と比較した平均ｌｏｇ１０変化として表される）。
【図８】ｔ＝０、６時間、２４時間、７日および１４日における微生物の複数回チャレンジ後の（Ａ）２２〜２４℃または（Ｂ）２〜８℃における保存剤を含まないプレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤における微生物コロニー数減少の時間経過を示す図である（ｔ＝０、６時間、２４時間、７日、１４日および２８日におけるチャレンジ時と比較した平均ｌｏｇ１０変化として表される）。
【図９】ｔ＝０、６時間、２４時間、７日および１４日における微生物の複数回チャレンジ後の（Ａ）２２〜２４℃または（Ｂ）２〜８℃における０．０１％チメロサールを含むプレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤における微生物コロニー数減少の時間経過を示す図である（ｔ＝０、６時間、２４時間、７日、１４日および２８日におけるチャレンジ時と比較した平均ｌｏｇ１０変化として表される）。
【図１０】ｔ＝０、６時間、２４時間、７日および１４日における微生物の複数回チャレンジ後の（Ａ）２２〜２４℃または（Ｂ）２〜８℃における０．０２％チメロサールを含むプレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤における微生物コロニー数減少の時間経過を示す図である（ｔ＝０、６時間、２４時間、７日、１４日および２８日におけるチャレンジ時と比較した平均ｌｏｇ１０変化として表される）。
【図１１】ｔ＝０、６時間、２４時間、７日および１４日における微生物の複数回チャレンジ後の（Ａ）２２〜２４℃または（Ｂ）２〜８℃における０．０２％チメロサールを含む塩水における微生物コロニー数減少の時間経過を示す図である（ｔ＝０、６時間、２４時間、７日、１４日および２８日におけるチャレンジ時と比較した平均ｌｏｇ１０変化として表される）。
【図１２】様々なチャレンジ試験における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）減衰の非線形回帰分析を示す図である。
【図１３】微生物の単回または複数回チャレンジに対するワクチン保存剤としての２−ＰＥおよびチメロサールの比較を示す図である：ＥＰ５．１．３基準Ｂの合格または不合格。
【図１４】５ｍｇ  ２−ＰＥと共に製剤化されたプレブ（ベ）ナー１３中の各血清型由来の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖調製物の抗原性の長期安定性を示す図である。
【図１５】プレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤における２−ＰＥの長期安定性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
百分率濃度は、本出願において使用されている場合、重量対体積（ｗ／ｖ）または重量対重量（ｗ／ｗ）である。
【００２０】
特別の定めのない限り、「投与量」は、０．５ｍＬのワクチン投与量を指す。
【００２１】
「複数回投与」という用語は、異なる投与ステップにおいておよび経時的に１つの対象または複数の対象に投与されることがある、複数回投与量のワクチンを含む組成物を指す。
【００２２】
本発明は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎球菌としても知られている）血清型由来の複数の莢膜多糖および保存剤を含む多価免疫原性組成物を提供する。この組成物は、ワクチンとも呼ばれ、対象、例えば、ヒト対象、好ましくは、ヒトの小児または乳幼児において肺炎球菌に対する免疫応答を誘導し、感染から保護するために使用することができる。
【００２３】
複数の任意の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖は、本発明の組成物に適している。本発明のある種の実施形態において、多価免疫原性組成物は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆから調製される莢膜多糖を含む。ある種の実施形態において、莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆおよび少なくとも１つの追加の血清型から調製される。ある種の実施形態において、莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆから選択される少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、または少なくとも９個の血清型から調製される。ある種の実施形態において、莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから調製される。本発明の莢膜多糖は、知られている技法を使用して肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型から調製される。例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれている国際特許出願ＷＯ２００６／１１０３８１、ＷＯ２００８／０７９６５３、ＷＯ２００８／０７９７３２およびＷＯ２００８／１４３７０９を参照されたい。
【００２４】
本発明のある種の実施形態において、莢膜多糖は、担体タンパク質とコンジュゲートされている。これらの肺炎球菌コンジュゲートは、別々に調製することができる。例えば、一実施形態において、各肺炎球菌多糖血清型は、大豆ベースの培地中で成育される。次いで、個別の多糖を、遠心分離、沈殿、限外濾過およびカラムクロマトグラフィーによって精製する。精製された多糖は、糖質が、選択された担体タンパク質と反応して肺炎球菌コンジュゲートを形成することができるように化学的に活性化される。
【００２５】
活性化されると、各莢膜多糖は、担体タンパク質と別々にコンジュゲートされ、グリココンジュゲートを形成する。ある種の実施形態において、各々の異なる莢膜多糖は、同じ担体タンパク質とコンジュゲートされる。そのような実施形態において、コンジュゲーションは、例えば、還元アミノ化により行うことができる。
【００２６】
多糖の化学的活性化およびその後の担体タンパク質とのコンジュゲーションは、従来の手段により行われる。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４，６７３，５７４号および第４，９０２，５０６号を参照されたい。
【００２７】
担体タンパク質は、無毒性でかつ非反応原性（ｎｏｎ−ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）であり、十分な量および純度で得られるタンパク質であることが好ましい。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適しているべきである。本発明のある種の実施形態において、ＣＲＭ１９７が担体タンパク質として使用される。
【００２８】
ＣＲＭ１９７（Ｐｆｉｚｅｒ、Ｓａｎｆｏｒｄ、ＮＣ）は、カザミノ酸および酵母エキスベースの培地中で成育させたジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）Ｃ７株（ＣＲＭ１９７）の培養物から単離されるジフテリア毒素の無毒性変異体（すなわち、トキソイド）である。ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿、およびイオン交換クロマトグラフィーによって精製される。あるいは、ＣＲＭ１９７は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，６１４，３８２号に従って組換え技術により調製される。他のジフテリアトキソイドも、担体タンパク質として使用するのに適している。
【００２９】
他の適当な担体タンパク質は、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願ＷＯ２００４／０８３２５１に記載されている）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａなどの不活化細菌毒素を包含する。外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）などの細菌外膜タンパク質、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）、Ａ群もしくはＢ群連鎖球菌由来のＣ５ａペプチダーゼ、またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄも使用することができる。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質も担体タンパク質として使用することができる。
【００３０】
莢膜多糖の担体タンパク質とのコンジュゲーションの後に、多糖−タンパク質コンジュゲートは、様々な技法により精製される（すなわち、多糖−タンパク質コンジュゲートの量に関して富化される）。これらの技法は、濃縮／透析濾過操作、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過を包含する。
【００３１】
下記でさらに詳細に議論されるように、本発明の免疫原性組成物は、多価肺炎球菌莢膜多糖−タンパク質コンジュゲートの１つまたは複数の抗原決定基の長期安定性に関する有利な特性を有する複数回投与ワクチン製剤を製造するのに有用であり、それを必要としている対象への投与に先立って１つまたは複数の微生物に対する抵抗性を与えることにより汚染から組成物を有利に保護する少なくとも１つの保存剤を含む。
【００３２】
本発明の保存剤含有免疫原性組成物の追加製剤化は、当技術分野において知られている方法を使用して行うことができる。例えば、１３の個々の肺炎球菌コンジュゲートを、生理学的に許容できるビヒクルと共に製剤化し、組成物を調製することができる。そのようなビヒクルの例は、下記にさらに詳細に記載されているように、水、緩衝塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびブドウ糖溶液を包含するが、それらに限定されるものではない。
【００３３】
本発明の免疫原性組成物は、複数の肺炎球菌莢膜多糖−タンパク質コンジュゲートに加えて１つまたは複数の保存剤を含む。ＦＤＡは、複数回投与（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｄｏｓｅ）（複数回投与（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ））バイアル中の生物学的製品が、ほんのわずかな例外はあるものの、保存剤を含有することを要求している。保存剤を含有するワクチン製品は、塩化ベンゼトニウム（炭疽病）、２−フェノキシエタノール（ＤＴａＰ、ＨｅｐＡ、Ｌｙｍｅ、Ｐｏｌｉｏ（非経口の））、フェノール（Ｐｎｅｕｍｏ、Ｔｙｐｈｏｉｄ（非経口の）、Ｖａｃｃｉｎｉａ）およびチメロサール（ＤＴａＰ、ＤＴ、Ｔｄ、ＨｅｐＢ、Ｈｉｂ、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、ＪＥ、Ｍｅｎｉｎｇ、Ｐｎｅｕｍｏ、Ｒａｂｉｅｓ）を含有するワクチンを包含する。注射薬における使用が認可されている保存剤は、例えば、クロロブタノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、２−フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、フェノール、チメロサールおよび硝酸フェニル水銀を包含する。
【００３４】
プレブ（ベ）ナー１３免疫原性組成物の高められた効力および安定性のために保存剤を含む様々な潜在的に適当な製剤を試験して、本明細書に開示されている発明は、約２．５〜１０ｍｇ／投与量（０．５〜２％）の濃度で２−フェノキシエタノール（２−ＰＥ）を含むそのような肺炎球菌免疫原性組成物を提供する。ある種の実施形態において、２−ＰＥの濃度は、約３．５〜７．５ｍｇ／投与量（０．７〜１．５％）である。ある種の実施形態において、２−ＰＥの濃度は、約５ｍｇ／投与量（１％）である。ある種の実施形態において、２−ＰＥの濃度は、３．５ｍｇ／投与量（０．７％）以上、４．０ｍｇ／投与量（０．８％）以上、４．５ｍｇ／投与量（０．９％）以上、５．０ｍｇ／投与量（１％）以上、５．５ｍｇ／投与量（１．１％）以上、６．０ｍｇ／投与量（１．２％）以上、６．５ｍｇ／投与量（１．３％）以上、７．０ｍｇ／投与量以上、７．５ｍｇ／投与量（１．５％）以上、８．０ｍｇ／投与量（１．６％）以上、９．０ｍｇ／投与量（１．８％）以上または１０ｍｇ／投与量（２％）以上である。
【００３５】
本発明のある種の実施形態において、肺炎球菌免疫原性組成物は、チメロサールおよびホルマリンを包含するがそれらに限定されない１つまたは複数の追加保存剤を含有する。
【００３６】
ある種の実施形態において、免疫原性組成物は、１つまたは複数のアジュバントを含むことができる。本明細書で定義されるように、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を高める役割を果たす物質である。すなわち、アジュバントは、免疫応答を高めるために与えられることが多く、当業者にはよく知られている。組成物の効力を高めるのに適しているアジュバントは、
（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（ミョウバン）、
（２）水中油型エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（下で定義される）または細菌細胞壁構成成分などの他の特異的免疫刺激剤を含むまたは含まない）、例えば、
（ａ）モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）などのマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化された、スクアレン５％、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．５％、およびＳｐａｎ８５  ０．５％（様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有してもよい（下を参照、必要とされないにしても））を含有するＭＦ５９（ＰＣＴ出願ＷＯ９０／１４８３７）、
（ｂ）サブミクロンエマルジョンにマイクロ流動化されるか、より大きい粒径のエマルジョンを作成するためにボルテックスされた、スクアレン１０％、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．４％、プルロニック−ブロックドポリマーＬ１２１  ５％、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下を参照）を含有するＳＡＦ、ならびに
（ｃ）スクアレン２％、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．２％、ならびに米国特許第４，９１２，０９４号（Ｃｏｒｉｘａ）に記載されている３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つまたは複数の細菌細胞壁構成成分、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ）を含有するＲｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、
（ｄ）ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、
（３）Ｑｕｉｌ ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ  ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）などのサポニンアジュバント（米国特許第５，０５７，５４０号）が使用されることがあり、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などのそれらから作成される粒子、
（４）Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている、細菌性リポ多糖、アミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはそれらの誘導体もしくは類似体などの合成脂質Ａ類似体、１つのそのようなＡＧＰは、５２９（以前は、ＲＣ５２９として知られている）としても知られており、水性形態または安定なエマルジョンとして製剤化される２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル  ２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−β−Ｄ−グルコピラノシド、１つまたは複数のＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドなどの合成ポリヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）であり、
（５）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７−１およびＢ７−２などのサイトカイン、
（６）野生型か、例えば、アミノ酸２９位のグルタミン酸が、公開済み国際特許出願第ＷＯ００／１８４３４号（ＷＯ０２／０９８３６８およびＷＯ０２／０９８３６９も参照）に従って別のアミノ酸、好ましくは、ヒスチジンにより置き換えられている突然変異形態のどちらかのコレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）、特に、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照）などの細菌性ＡＤＰ−リボシル化毒素の無毒化突然変異体、ならびに
（７）カルシウム塩、鉄、亜鉛、アシル化チロシン懸濁液、アシル化糖、誘導体化された糖／糖質、ポリホスファゼン、生分解性ミクロスフェア、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、脂質Ａ誘導体（例えば、軽減毒性の）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ、キルＡ、サポニン、ＱＳ２１、トコール、フロイント不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、メルクアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）、ＡＳ−２（Ｓｍｉｔｈ−Ｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（好ましくは、非メチル化）、生体付着剤および粘膜付着剤、ミクロ粒子、リポソーム、ポリオキシエチレンエーテル製剤、ポリオキシエチレンエステル製剤、およびムラミルペプチドまたはイミダゾキノロン化合物などの、組成物の効力を高めるための免疫刺激剤として作用する他の物質を包含するが、それらに限定されるものではない。ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを包含するが、それらに限定されるものではない。
【００３７】
ある種の実施形態において、アジュバント組成物は、ＴＨ２型サイトカインを超える程度までＴＨ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）を誘導しやすいものであり、投与された抗原に対する細胞性免疫応答を誘導しやすいことがある。主にＴＨ１応答を促進する特定のアジュバント系は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）またはその誘導体などの脂質Ａ誘導体、例えば、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３Ｄ−ＭＰＬ）、ＭＰＬおよび／または３Ｄ−ＭＰＬとアルミニウム塩および／またはサポニン誘導体の組合せ（例えば、ＷＯ９４／００１５３に開示されているような３Ｄ−ＭＰＬとの組合せでＱＳ２１、またはＷＯ９６／３３７３９に開示されているようなＱＳ２１およびコレステロール）、トリテルペノイド、ならびにトコフェロールを含むものなどの水中油型エマルジョン（ＷＯ９５／１７２１０に開示されているような）を包含するが、それらに限定されるものではない。
【００３８】
アジュバントは、任意選択により、本発明の貯蔵ワクチン製剤の免疫原性構成成分のうちの１つまたは複数により吸着されているかそれらと混ぜ合わせられていてもよい。本明細書で使用されるように、「吸着抗原」という用語は、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を超える抗原がアジュバントに吸着されている混合物を指す。ある種の実施形態において、アジュバントは、吸着されたリン酸アルミニウム（Ａｌ＋）またはヒドロキシリン酸アルミニウムである。典型的には、総アルミニウム含有量は、０．５ｍＬ投与量当たりＡｌ＋２００〜１０００μｇ、３００〜９００μｇ、４００〜８００μｇ、５００〜７００μｇ、または約６３０μｇであり、それらは、すべて水酸化アルミニウムまたはすべてリン酸アルミニウムであってよい。あるいは、Ａｌ＋含有量は、様々な比、例えば、リン酸アルミニウム：水酸化アルミニウム１：８〜８：１、１：４〜４：１、３：８〜８：３、１：２〜２：１または１：１で水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの混合物由来であってよい。大部分のアルミニウムは、組合せワクチンを形成するための混合の前に予め吸着された抗原により提供されるが、一部のアルミニウムは、本発明の組合せワクチンの製剤化中に、例えば、本明細書に記載されているｐＨ調整ステップの前に遊離形態で添加することができる。典型的には、０．５ｍＬ投与量当たりの遊離アルミニウム含有量は、Ａｌ３＋０〜３００μｇ、５０〜２５０μｇ、７５〜２００μｇ、１００〜１５０μｇまたは約１２０μｇであってよい。遊離Ａｌ３＋は、すべてＡｌ（ＯＨ）３もしくはすべてＡｌＰＯ４、または様々な比のＡｌ（ＯＨ）３とＡｌＰＯ４の混合物であってよい。
【００３９】
ワクチン抗原構成成分は、混合するのに先立って個別にアルミニウム塩上に予め吸着させることができる。別の実施形態において、抗原のミックスは、さらなるアジュバントと混合するのに先立って予め吸着させることができる。あるいは、本発明のワクチンのある種の構成成分は、アジュバント上に意図的に吸着させるのではなく製剤化することができる。
【００４０】
本発明の製剤は、緩衝液、塩、二価陽イオン、非イオン性洗剤、糖などの凍結防止剤、およびフリーラジカル捕捉剤またはキレート化剤などの抗酸化剤、またはそれらの任意の複数組合せのうちの１つまたは複数をさらに含むことができる。任意の１つの構成成分、例えば、キレート剤の選択は、別の構成成分（例えば、捕捉剤）が望ましいかどうかを決定することができる。投与のために製剤化された最終組成物は、無菌および／またはパイロジェンフリーであるべきである。当業者は、これらおよび他の構成成分のどの組合せが、必要とされる特定の貯蔵および投与条件などの様々な因子に応じて本発明の保存剤含有ワクチン組成物への包含に最適であるかを経験的に決定することができる。
【００４１】
ある種の実施形態において、非経口投与に適合している本発明の製剤は、Ｔｒｉｓ（トリメタミン）、リン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジンおよびコハク酸塩から選択されるがそれらに限定されない１つまたは複数の生理学的に許容できる緩衝液を含む。ある種の実施形態において、製剤は、約６．０〜約９．０、好ましくは、約６．４から約７．４までのｐＨ範囲内に緩衝される。
【００４２】
ある種の実施形態において、本発明の免疫原性組成物または製剤のｐＨを調整することが望ましいことがある。本発明の製剤のｐＨは、当技術分野における標準的な技法を使用して調整することができる。製剤のｐＨは、３．０〜８．０の間であるように調整することができる。ある種の実施形態において、製剤のｐＨは、３．０〜６．０、４．０〜６．０、または５．０〜８．０の間であってよいか、３．０〜６．０、４．０〜６．０、または５．０〜８．０の間であるように調整することができる。他の実施形態において、製剤のｐＨは、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約５．８、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、または約８．０であってよいか、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約５．８、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、または約８．０であるように調整することができる。ある種の実施形態において、ｐＨは、４．５から７．５まで、または４．５から６．５まで、５．０から５．４まで、５．４から５．５まで、５．５から５．６まで、５．６から５．７まで、５．７から５．８まで、５．８から５．９まで、５．９から６．０まで、６．０から６．１まで、６．１から６．２まで、６．２から６．３まで、６．３から６．５まで、６．５から７．０まで、７．０から７．５までまたは７．５から８．０までの範囲であってよいか、４．５から７．５まで、または４．５から６．５まで、５．０から５．４まで、５．４から５．５まで、５．５から５．６まで、５．６から５．７まで、５．７から５．８まで、５．８から５．９まで、５．９から６．０まで、６．０から６．１まで、６．１から６．２まで、６．２から６．３まで、６．３から６．５まで、６．５から７．０まで、７．０から７．５までまたは７．５から８．０までの範囲であるように調整することができる。具体的な実施形態において、製剤のｐＨは、約５．８である。
【００４３】
ある種の実施形態において、非経口投与に適合している本発明の製剤は、約０．１ｍＭから約１０ｍＭまでの範囲であり、最高で約５ｍＭまでが好ましい濃度で、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を包含するがそれらに限定されない１つまたは複数の二価陽イオンを含む。
【００４４】
ある種の実施形態において、非経口投与に適合している本発明の製剤は、非経口投与の際には対象に対して生理学的に許容できるイオン強度で存在し、最終製剤において選択されるイオン強度または容積モル浸透圧濃度を生じる最終濃度で包含される、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸カリウムを包含するがそれらに限定されない１つまたは複数の塩を含む。製剤の最終イオン強度または重量モル浸透圧濃度は、複数の構成成分（例えば、１つまたは複数の緩衝化合物および他の非緩衝塩由来のイオン）により決定されるであろう。好ましい塩、ＮａＣｌは、最高で約２５０ｍＭまでの範囲から存在し、塩濃度は、製剤の最終総容積モル浸透圧濃度が、非経口投与（例えば、筋肉内または皮下注射）に適合しており、様々な温度範囲にわたってワクチン製剤の免疫原性構成成分の長期安定性を促進するように、他の構成成分（例えば、糖）を補完するように選択される。無塩製剤は、望ましい最終容積モル浸透圧濃度レベルを維持するために増加した範囲の１つまたは複数の選択された凍結防止剤を許容するであろう。
【００４５】
ある種の実施形態において、非経口投与に適合している本発明の製剤は、二糖（例えば、ラクトース、マルトース、スクロースまたはトレハロース）およびポリヒドロキシ炭化水素（例えば、ズルシトール、グリセロール、マンニトールおよびソルビトール）から選択されるがそれらに限定されない１つまたは複数の凍結防止剤を含む。
【００４６】
ある種の実施形態において、製剤の容積モル浸透圧濃度は、約２００ｍＯｓ／Ｌから約８００ｍＯｓ／Ｌまでの範囲であり、好ましい範囲は、約２５０ｍＯｓ／Ｌから約５００ｍＯｓ／Ｌまで、または約３００ｍＯｓ／Ｌ〜約４００ｍＯｓ／Ｌである。無塩製剤は、例えば、スクロース約５％から約２５％まで、好ましくは、スクロース約７％から約１５％まで、または約１０％〜約１２％を含有することができる。あるいは、無塩製剤は、例えば、ソルビトール約３％から約１２％まで、好ましくは、ソルビトール約４％から約７％まで、または約５％〜約６％を含有することができる。塩化ナトリウムなどの塩が添加される場合、スクロースまたはソルビトールの有効範囲は相対的に減少する。これらおよび他のそのような重量モル浸透圧濃度および容積モル浸透圧濃度に対する配慮は、当業者の技術範囲内に十分ある。
【００４７】
ある種の実施形態において、非経口投与に適合している本発明の製剤は、１つまたは複数のフリーラジカル酸化阻害剤および／またはキレート化剤を含む。様々なフリーラジカル捕捉剤およびキレート剤が当技術分野において知られており、本明細書に記載されている製剤および使用方法に当てはまる。例は、エタノール、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ／エタノール組合せ、トリエタノールアミン、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトール六リン酸、トリポリリン酸塩、アスコルビン酸／アスコルビン酸塩、コハク酸／コハク酸塩、リンゴ酸／マレート、デスフェラール、ＥＤＤＨＡおよびＤＴＰＡ、ならびに上のうちの２つ以上の様々な組合せを包含するが、それらに限定されるものではない。ある種の実施形態において、少なくとも１つの非還元性フリーラジカル捕捉剤は、製剤の長期安定性を有効に高める濃度で添加することができる。１つまたは複数のフリーラジカル酸化阻害剤／キレート剤も、捕捉剤と二価陽イオンなどの様々な組合せで添加することができる。キレート剤の選択は、捕捉剤の添加が必要とされるかどうかを決定するであろう。
【００４８】
ある種の実施形態において、非経口投与に適合している本発明の製剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、ポリソルベート−６０（Ｔｗｅｅｎ  ６０）、ポリソルベート−４０（Ｔｗｅｅｎ  ４０）およびポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、Ｂｒｉｊ  ５８、Ｂｒｉｊ  ３５を包含するがそれらに限定されないポリオキシエチレンアルキルエーテル、ならびにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＮＰ  ４０、Ｓｐａｎ  ８５およびＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  １２１）などの他のものを包含するがそれらに限定されない１つまたは複数の非イオン性界面活性剤を含み、好ましい構成成分は、約０．００１％から約２％までの濃度（最高で約０．２５％までが好ましい）のポリソルベート−８０または約０．００１％から１％までの濃度（最高で約０．５％までが好ましい）のポリソルベート−４０である。
【００４９】
ある種の実施形態において、本発明の製剤は、非経口投与に適している１つまたは複数の追加安定化剤、例えば、少なくとも１つのチオール（−ＳＨ）基を含む還元剤（例えば、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、還元グルタチオン、チオグリコール酸ナトリウム、チオ硫酸塩、モノチオグリセロール、またはそれらの混合物）を含む。あるいはまたは場合により、本発明の保存剤含有ワクチン製剤は、貯蔵容器から酸素を除去すること、光から製剤を保護すること（例えば、琥珀色のガラス容器を使用することにより）によりさらに安定化することができる。
【００５０】
本発明の保存剤含有ワクチン製剤は、それ自体が免疫応答を誘導しない任意の賦形剤を包含する１つまたは複数の薬学的に許容できる担体または賦形剤を含むことができる。適当な賦形剤は、タンパク質、糖質、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、スクロース（Ｐａｏｌｅｔｔｉら、２００１、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２１１８）、トレハロース、ラクトースおよび脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）などの高分子を包含するが、それらに限定されるものではない。そのような担体は、当業者によく知られている。薬学的に許容できる賦形剤は、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ、２０００、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２で議論されている。
【００５１】
本発明の組成物は、凍結乾燥されるか、水性形態、すなわち、液剤または懸濁剤であってよい。液体製剤は、それらの包装された形態から直接、有利に投与することができるため、さもなければ本発明の凍結乾燥組成物にとって必要とされるような水性媒体における再構成を必要とすることなく注射にとって理想的である。
【００５２】
本発明の特定の実施形態において、ワクチンは、ＣＲＭ１９７と個別にコンジュゲートされている、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから選択される１つまたは複数の肺炎球菌莢膜多糖を含む多価免疫原性組成物である。ワクチンは、各多糖１から５μｇまで、好ましくは、約４．４μｇ／ｍＬであるが、６Ｂを好ましくは約８．８μｇ／ｍＬ、ＣＲＭ１９７担体タンパク質２０から１００μｇ／ｍＬまで、好ましくは、約５８μｇ／ｍＬ、リン酸アルミニウムの形態で元素アルミニウム０．０２から２ｍｇ／ｍＬまで、好ましくは、０．２５ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム０．５から１．２５％まで、好ましくは、約０．８５％、ポリソルベート８０  ０．００２から０．２％まで、好ましくは、約０．０２％、４から７までのｐＨ、好ましくは、５．８のｐＨのコハク酸ナトリウム緩衝液１から１０ｍＭまで、好ましくは、約５ｍＭ、および２−フェノキシエタノール４から２０ｍｇ／ｍＬまで、好ましくは、約１０ｍｇ／ｍＬを含むように製剤化される。
【００５３】
本発明のある種の好ましい実施形態において、ワクチンは、ＣＲＭ１９７と個別にコンジュゲートされている、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来の肺炎球菌莢膜多糖を含む多価免疫原性組成物である。ワクチンは、約８．８μｇ／ｍＬの６Ｂを除いて、各糖質約４．４μｇ／ｍＬ、ＣＲＭ１９７担体タンパク質約５８μｇ／ｍＬ、リン酸アルミニウムの形態で元素アルミニウム約０．２５ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム約０．８５％、ポリソルベート８０約０．０２％、５．８のｐＨのコハク酸ナトリウム緩衝液約５ｍＭ、および２−フェノキシエタノール約１０ｍｇ／ｍＬを含むように製剤化される。
【００５４】
本発明の組成物が含むことができる材料の多くの量は、重量／投与量、重量／体積、または％濃度（重量／体積または重量／重量として）として表すことができる。これらの値はすべて、次から次に変換することができる。重量／投与量単位へおよび重量／投与量単位からの変換については、投与量の体積が指定される。例えば、０．５ｍＬの投与量を考えると、２−ＰＥ  ５．０ｍｇ／投与量は、１０ｍｇ／ｍＬまたは１．０％（ｇ／１００ｍＬ）の濃度と同等である。
【００５５】
ワクチンの製剤も、多糖：２−ＰＥの比として表すことができる。例えば、８．８μｇ／ｍＬの６Ｂを除いて、各糖質４．４μｇ／ｍＬ、および２−ＰＥ  １０ｍｇ／ｍＬの好ましい製剤の０．５ｍＬ投与量は、多糖３０．８μｇ（２．２μｇ×１２の血清型＋血清型６Ｂの４．４μｇ）および２−ＰＥ  ５０００μｇを有するであろう。したがって、多糖：２−ＰＥの重量比は、３０．８：５０００である。
【００５６】
本発明のある種の実施形態において、ワクチンの多糖：２−ＰＥ重量比は、５：５０００から１００：５０００までである。本発明の好ましい実施形態において、前記多糖：２−ＰＥ重量比は、約３０．８：５０００である。
【００５７】
ワクチン製剤の送達
ヒト対象などの哺乳類対象、好ましくは、小児または乳幼児において肺炎球菌に対する免疫応答を誘導し、それによって、感染から保護するために少なくとも１つの保存剤を含む開示されている医薬組成物および医薬製剤を使用する方法も提供される。本発明のワクチン製剤を使用し、全身経路または粘膜経路を介してワクチンを投与することにより、肺炎球菌感染を起こしやすいヒト対象を保護することができる。これらの投与は、例えば、非経口投与または口道／消化管、気道もしくは尿生殖路への粘膜投与を包含することができる。
【００５８】
対象への本発明のワクチン調製物の直接送達は、非経口投与により（筋肉内に、腹腔内に、皮内に、皮下に、静脈内に、または組織の間質空間へ）、または直腸、経口、膣、局所、経皮、鼻腔内、眼、耳、肺または他の粘膜投与により行うことができる。好ましい実施形態において、非経口投与は、例えば、対象の大腿または上腕への筋肉内注射による。注射は、注射針（例えば、皮下注射針）を介してよいが、代替方法として、無針注射を使用することができる。典型的な筋肉内投与量は、０．５ｍＬである。本発明の組成物は、例えば、液体の液剤か懸濁剤のどちらかとしての注射のため、様々な形態で調製することができる。ある種の実施形態において、組成物は、例えば、吸入器における肺投与のための粉末またはスプレーとして調製することができる。他の実施形態において、組成物は、坐剤もしくは膣坐剤として、鼻、耳もしくは眼投与のために、例えば、スプレー、点滴剤、ゲルもしくは粉末として調製することができる。
【００５９】
一実施形態において、鼻内投与は、肺炎または中耳炎の予防のために使用することができる（肺炎球菌の鼻咽頭保菌をより効果的に予防し、したがってその最初期段階で感染を軽減することができるため）。
【００６０】
各ワクチン投与量におけるコンジュゲートの量は、著しい有害作用なしに免疫防御応答を誘導する量として選択される。そのような量は、肺炎球菌血清型に応じて変わることがある。一般的に、各投与量は、多糖０．１〜１００μｇ、詳細には、０．１〜１０μｇ、より詳細には、１〜５μｇを含むであろう。
【００６１】
特定のワクチンについての構成成分の最適量は、対象における適切な免疫応答の観察が関わる標準的な試験により確定することができる。初回ワクチン播種の後に、対象は、十分に間隔をおいた１回または数回のブースター免疫化を受けることができる。
【００６２】
プレブ（ベ）ナー１３ワクチンに包含される血清型が原因で肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる侵襲性疾患に対する、乳幼児および幼児についての定期スケジュールは、２、４、６および１２〜１５カ月齢である。本発明の組成物は、熟練した専門家により決定されるように、同じまたは異なる定期スケジュールが当てはまり得る年長児、青年、十代および成人での使用にも適している。
【００６３】
包装および剤形
本発明のワクチンは、単位投与量または複数回投与形態（例えば、２投与量、４投与量、またはそれ以上）で包装することができる。複数回投与形態については、バイアルが典型的であるが、必ずしも充填済み注射器より好ましいわけではない。適当な複数回投与フォーマットは、１投与量当たり０．１〜２ｍＬで１容器当たり２〜１０投与量を包含するが、それらに限定されるものではない。ある種の実施形態において、投与量は、０．５ｍＬ投与量である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている国際特許出願ＷＯ２００７／１２７６６８を参照されたい。組成物は、バイアルもしくは他の適当な貯蔵容器で提供することができ、または充填済み送達装置、例えば、注射針の有無に関わらず供給することができる単一または複数構成成分注射器で提供することができる。必ずしも要しないが、注射器は、典型的には、本発明の保存剤含有ワクチン組成物の単回投与量を含有するが、複数回投与充填済み注射器も想定されている。同様に、バイアルは、単回投与量を包含するが、代替方法として、複数回投与量を包含することができる。
【００６４】
有効用量体積は、ルーチンに定めることができるが、注射のための組成物の典型的な投与量は、０．５ｍＬの体積を有する。ある種の実施形態において、投与量は、ヒト対象への投与のために製剤化される。ある種の実施形態において、投与量は、成人、十代、青年、幼児または乳児（すなわち、１歳以下）のヒト対象への投与のために製剤化され、好ましい実施形態において、注射により投与することができる。
【００６５】
本発明の液体ワクチンは、凍結乾燥形態で提供される他のワクチンを再構成するのにも適している。ワクチンが、そのような即時再構成のために使用されることになる場合、本発明は、２つ以上のバイアル、２つ以上の充填済み注射器、または各々のうちの１つもしくは複数を含むキットを提供し、注射器の内容物を使用し、注射に先立ってバイアルの内容物を再構成するか、その逆とする。
【００６６】
あるいは、本発明のワクチン組成物は、例えば、それらを調製するのに使用される厳密な方法を変えることにより選択および制御することができる平均直径サイズなどの粒子特性を有するミクロペレットまたはミクロスフェアなどの乾燥した規則正しい形状の（例えば、球状の）粒子を形成するための当技術分野においてよく知られている凍結乾燥のための数多くの方法のうちの１つを使用し、凍結乾燥および再構成することができる。ワクチン組成物は、場合により、ミクロペレットまたはミクロスフェアなどの別々の乾燥した規則正しい形状（例えば、球状の）粒子と共に調製するか、それらの中に含有することができるアジュバントをさらに含むことができる。そのような実施形態において、本発明は、場合により本発明の１つまたは複数の保存剤をさらに含む安定化された乾燥ワクチン組成物を包含する第一構成成分、および第一構成成分の再構成のための無菌水溶液を含む第二構成成分を含むワクチンキットをさらに提供する。ある種の実施形態において、水溶液は、１つまたは複数の保存剤を含み、少なくとも１つのアジュバントを場合により含むことができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００９／１０９５５０を参照）。
【００６７】
さらに別の実施形態において、複数回投与フォーマットの容器は、一般的な実験室のガラス器具、フラスコ、ビーカー、メスシリンダー、発酵槽、バイオリアクター、管類、パイプ、袋、広口瓶、バイアル、バイアルクロージャー（例えば、ゴムストッパー、ねじ式キャップ）、アンプル、注射器、二室または多室の注射器、注射器ストッパー、注射器プランジャー、ラバークロージャー、プラスチッククロージャー、ガラスクロージャー、カートリッジおよび使い捨てペンなどからなるがそれらに限定されない群のうちの１つまたは複数から選択される。本発明の容器は、製造の材料により限定されず、ガラス、金属（例えば、スチール、ステンレススチール、アルミニウムなど）およびポリマー（例えば、熱可塑性プラスチック、エラストマー、熱可塑性プラスチック−エラストマー）などの材料を包含する。特定の実施形態において、このフォーマットの容器は、ブチルストッパー付きの５ｍＬ  Ｓｃｈｏｔｔ  １型ガラスバイアルである。当業者は、上に記載されているフォーマットが、決して網羅的リストではなく、単に、本発明に使用可能である様々なフォーマットに関する当業者への指導の役割を果たすことを理解しているであろう。本発明における使用が企図されている追加フォーマットは、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐ．（Ｌｉｍａ、ＯＨ）、ＶＷＲなどの実験装置の販売者および製造者からの公表されたカタログ中に見出すことができる。
【００６８】
ワクチン組成物において保存効力を評価するための方法
本発明は、ワクチン組成物の免疫原性および非免疫原性構成成分の一部またはすべての存在下で１つまたは複数の選択保存剤を含むワクチン製剤の効力を測定するための新規な方法をさらに提供する。保存効力に関するＷＨＯプロトコルは、ＵＳＰおよびＥＰ試験を利用し、ある種の試験を行う場合のＯｐｅｎ  Ｖｉａｌ  Ｐｏｌｉｃｙ条件を包含する。典型的な保存効力試験は、試験組成物に、選択微生物集団を１回播種し、経時的にかつ特定の環境条件（例えば、温度）下で、播種された微生物のｌｏｇ減少を、１つまたは複数の試験保存剤を欠く対照組成物中の播種された微生物のｌｏｇ減少と比較する単回チャレンジ試験である。例えば、下の実施例２および３を参照されたい。しかし、複数の汚染に対して保存効力を対象とする、例えば、複数回同じバイアルに播種することによりバイアルおよびストッパーを対象とする追加試験は必要とされていない。
【００６９】
したがって、本発明は、免疫原性組成物中の１つまたは複数の保存剤の効力を評価するための複数回チャレンジ試験であって、選択微生物集団を試験組成物に播種すること、および経時的にかつ特定の環境条件（例えば、温度）下で、播種された１つまたは複数の微生物の減少を、１つまたは複数の試験保存剤を欠く対照組成物における減少と比較することの少なくとも２つのステップを含む試験を提供する。下の実施例４および５を参照されたい。
【００７０】
保存効力
本発明の保存剤含有ワクチン製剤は、例えば、非経口投与に適合する複数回投与ワクチンのバイアルまたは容器に充填するのに適しており、１つまたは複数の保存剤を欠く同じ製剤と比較した場合、２〜８℃、室温または３７℃において長期間安定なままであり、活性の消失が低減されるか無視できるほどである。
【００７１】
製剤中の保存剤の量は、米国（Ｕ．Ｓ．）、欧州もしくは世界保健機関（ＷＨＯ）薬局方、またはそれらの組合せにより規定されているように、ワクチン安全性についての要件を満たす量であるように選択される。
【００７２】
米国および欧州薬局方（それぞれ、ＵＳＰおよびＥＰ）に従って保存剤レベルを確認するため、ワクチン製剤に、
１．黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（細菌、ＡＴＣＣ＃６５３８、「ＳＡ」）
２．緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（細菌、ＡＴＣＣ＃９０２７、「ＰＡ」）
３．カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（酵母、ＡＴＣＣ＃１０２３１、「ＣＡ」）
４．黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（カビ、ＡＴＣＣ＃１６４０４、「ＡＮ」）
のおおよそ１０５〜１０６ＣＦＵ／ｍｌ（ＣＦＵ＝コロニー形成単位）を時間０にて１回播種する。
【００７３】
複数回投与提示の反復使用中に実際に起きることがある汚染の最悪の妥当なケースを示すため、ＷＨＯは、細菌株、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（「ＰＡ」）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ）（「ＳＡ」）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（「ＥＣ」）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（「ＢＳ」）を使用する複数回汚染事象への計画的曝露による安全性試験を要求している。製剤に、初回チャレンジから０時点、６時間、２４時間、７日および１４日後に各微生物５×１０３ＣＦＵ／ｍｌを添加し、実際に潜在的な貯蔵条件を模倣するために２〜８℃または２２〜２４℃のどちらかにおいて貯蔵する。
【００７４】
ＵＳＰ  ２９  ＮＦ  ２４  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２（ＵＳＰ）は、１つまたは複数の細菌性微生物の播種後に、７日で初期算出数（すなわち、播種時）からの少なくとも１．０ｌｏｇの減少、１４日で前回測定値からの少なくとも３．０ｌｏｇの減少があり、２８日で前回測定値と比較して増加がないことを要求している。表１を参照されたい。酵母および真菌については、ＵＳＰ要件は、播種時から７、１４および２８日まで増加がないことである。
【００７５】
ＥＰ要件は、より厳格である。非経口および点眼用調製物についてのＥＰ第５版５．６（５．１．３）要件は、２つの構成要素：カテゴリーＡおよびカテゴリーＢを有する。カテゴリーＡ（ＥＰ−Ａ）は、細菌について、播種後６時間で初期算出数からの少なくとも２．０ｌｏｇの減少、２４時間で、前回測定値からの少なくとも３．０ｌｏｇの減少および２８日で回復なしを要求している。カテゴリーＢ（ＥＰ−Ｂ）は、細菌について、２４時間で初期算出数からの少なくとも１．０ｌｏｇの減少、前回測定値からの７日で少なくとも３．０ｌｏｇの減少および２８日で前回測定値からの０．５ｌｏｇ以下の増加（すなわち、増加なし）を要求している。表１を参照されたい。酵母および真菌については、カテゴリーＡは、初期算出数からの７日で少なくとも２．０ｌｏｇの減少および前回測定値からの２８日で増加なしを要求しており、カテゴリーＢは、１４日で初期算出数からの少なくとも１．０ｌｏｇの減少および前回測定値からの２８日で増加なしを要求している。
【００７６】
【表１】
0005959161.tif 000002
【００７７】
本発明のある種の実施形態において、本発明の保存剤は、免疫原性製剤における微生物の濃度を低減するのに有効である。本発明のある種の実施形態において、少なくとも１つの保存剤を含むワクチン製剤は、１つまたは複数の保存剤を含まないワクチン製剤と比較して、前記微生物の播種後に１つまたは複数の微生物の濃度を低減する。本発明の特定の実施形態において、製剤は、２４時間で初期微生物数からの少なくとも１．０ｌｏｇの減少を示し、前回測定値からの７日で少なくとも３．０ｌｏｇの減少を示し、および前回測定値からの２８日で０．５ｌｏｇを超える増加を示さない。本発明の別の特定の実施形態において、製剤は、播種後６時間で初期算出数からの少なくとも２．０ｌｏｇの減少、前回測定値からの２４時間で少なくとも３．０ｌｏｇの減少および初期微生物数と比較して、２８日で回復なしを示す。本発明の別の実施形態において、製剤は、非経口および点眼用調製物についての欧州薬局方（ＥＰ）要件、特に、ＥＰ第５版５．６（５．１．３）要件のカテゴリーＡ（ＥＰ−Ａ）および／またはカテゴリーＢ（ＥＰ−Ｂ）を満たす。本発明の別の実施形態において、製剤は、非経口調製物についての米国薬局方（ＵＳＰ）  ２９  ＮＦ  ２４  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２要件を満たす。
【００７８】
本発明のある種の実施形態において、本発明の少なくとも１つの保存剤は、１つまたは複数の保存剤を欠く製剤と比較して、微生物をチャレンジした場合に製剤における微生物の濃度を低減するのに有効である。微生物は、下記の緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などのうちの１つまたは複数であってよいが、それらに限定されるものではない。
【００７９】
本発明のある種の実施形態において、微生物は、様々な間隔で１回または複数回ワクチンに導入または播種することができる。播種は、計画的実験的播種との関連か、複数回投与ワクチン製剤の容器に入る汚染された皮下注射針との関連で行われることがある。播種間の間隔は、１分と１カ月の間であってよい。特定の実施形態において、複数回播種は、初回播種後に、初回播種後６時間、初回播種後２４時間、初回播種後７日および初回播種後１４日に行われる。
【００８０】
ワクチンおよび保存安定性についてのパラメーター
本発明のある種の実施形態において、ワクチン製剤における少なくとも１つの抗原決定基（すなわち、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型由来の多糖調製物）の抗原性は、ある範囲の貯蔵時間および温度にわたって安定である。抗原性は、当技術分野において知られている方法により測定することができる。例えば、総抗原性は、実施例３に記載されているように、型特異的抗血清を使用することにより決定することができる。
【００８１】
本発明のある種の実施形態において、ワクチン製剤における少なくとも１つの抗原決定基の抗原性は、４週以上、６週以上、８週以上、１０週以上、１２週以上、１８週以上、２４週以上、４８週以上、１年以上、１．２５年以上、１．５年以上、１．７５年以上、２年以上、２．２５年以上、または２．５年以上にわたって安定である。好ましくは、製剤におけるワクチン中の抗原決定基のうちの複数の抗原決定基、例えば、少なくとも、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の抗原性は、４週以上、６週以上、８週以上、１０週以上、１２週以上、１８週以上、２４週以上、４８週以上、１年以上、１．２５年以上、１．５年以上、１．７５年以上、２年以上、２．２５年以上、または２．５年以上にわたって安定である。
【００８２】
本発明のある種の実施形態において、ワクチン製剤における少なくとも１つの抗原決定基の抗原性は、約−２５℃〜約３７℃、または−２０〜−１０℃、または２〜８℃、またはほぼ室温、または２２℃〜２８℃、または約３７℃において貯蔵される場合に安定である。本発明の特定の実施形態において、ワクチン製剤における少なくとも１つの抗原決定基の抗原性は、２〜８℃の温度における２．５年以上にわたる貯蔵後に安定である。
【００８３】
本発明のある種の実施形態において、本発明の保存剤の濃度は、上述の期間および貯蔵温度におけるワクチンの貯蔵後に安定である。本発明の特定の実施形態において、ワクチン製剤における保存剤の濃度は、２〜８℃の温度における２．５年以上にわたるワクチンの貯蔵後に安定である。保存剤の濃度は、当技術分野において知られている方法により測定することができる。例えば、チメロサールは、実施例３に記載されているように、冷蒸気原子吸光分析（Ｃｏｌｄ  Ｖａｐｏｒ  Ａｔｏｍｉｃ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＣＶＡＡＳ）を使用して測定することができる。２−ＥＰ濃度は、やはり実施例３に記載されているように、逆相ＨＰＬＣアッセイで測定することができる。逆相ＨＰＬＣアッセイは、下記の方法で行うことができる：サンプルを、ボルテックスして塩水中の５ｍＭコハク酸塩緩衝液中に１：１０に希釈し、遠心分離して塩水中の５ｍＭコハク酸塩緩衝液中に１：１０に再び希釈する（試験サンプルの最終希釈率は、１：１００である）。次いで、サンプルを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８  ＨＰＬＣカラムおよびトリフルオロ酢酸を含有する水とアセトニトリルの直線グラジエントを利用してアッセイする。次いで、保存剤の定量化を、標準曲線と比較する。Ｓｈａｒｍａら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ３６（１）：６１〜６３（２００８）も参照されたい。
【００８４】
上の開示は、本発明について一般的に記載している。より完全な理解は、下記の具体例を参照することにより得ることができる。これらの実施例は、例示の目的のためにのみ記載され、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【実施例１】
【００８５】
予備的保存剤スクリーニング試験
複数回投与プレブ（ベ）ナー１３ワクチンの製剤開発は、プレブ（ベ）ナー１３製剤におけるフェノール（０．２５％）、２−フェノキシエタノール（５ｍｇ／ｍＬ）、メタ−クレゾール（０．３％）、メチルパラベンおよびプロピルパラベン（それぞれ、０．１８％および０．１２％）を包含する保存剤の予備的スクリーニングから始まった。
【００８６】
保存効力について試験するために、ワクチンのアリコートに、下記の微生物
１．黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（細菌、ＡＴＣＣ＃６５３８）
２．緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（細菌、ＡＴＣＣ＃９０２７）
３．カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（酵母、ＡＴＣＣ＃１０２３１）
４．黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（カビ、ＡＴＣＣ＃１６４０４）
を播種した。指示された濃度でチメロサールもしくは２−ＰＥを含むおよび含まない各ワクチン製剤３０ミリリットル（ｍｌ）または０．０２％のチメロサールを含有する塩水に、各試験微生物の懸濁液を三つ組みで播種し、時間０にておよそ１０５〜１０６ＣＦＵ／ｍｌ（ＣＦＵ＝コロニー形成単位）の播種密度を得た。各播種の体積は、各計画的チャレンジ中、製品の体積の１％を超えなかった。サンプルを混合し、チャレンジした微生物の均等な分布を確保した。別の３０ｍｌのワクチン（保存剤を含むおよび含まない）を三つ組みで陰性対照として使用し、培養培地のみを添加し、サンプルまたは培地中に存在する可能性のある固有の汚染を評価した。次いで、ワクチン、ならびに陽性および陰性対照の３シリーズの各々を２０〜２５℃において別々にインキュベートした。チャレンジされたサンプルおよび対照のアリコート（１ｍｌ）（または、それらの適切な連続１０倍希釈液）を、時間０でならびに播種後６時間、２４時間、７日、１４日および２８日の間をおいて二つ組で平板計数により数えた。
【００８７】
ＵＳＰ２９ＮＦ２４Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２（ＵＳＰ）は、１つまたは複数の細菌性微生物の播種後に、７日で初期算出数（すなわち、播種時）からの少なくとも１．０ｌｏｇの減少、１４日で前回測定値からの少なくとも３．０ｌｏｇの減少があり、２８日で前回測定値からの増加がないことを要求している。表１を参照されたい。酵母および真菌について、ＵＳＰ要件は、播種時から７、１４および２８日まで増加がないことである。
【００８８】
ＥＰ要件は、より厳格である。非経口および点眼用調製物についてのＥＰ第５版５．６（５．１．３）要件は、２つの構成要素：カテゴリーＡおよびカテゴリーＢを有する。カテゴリーＡ（ＥＰ−Ａ）は、細菌について、播種後６時間で初期算出数からの少なくとも２．０ｌｏｇの減少、２４時間で前回測定値からの少なくとも３．０ｌｏｇの減少、および２８日で回復なしを要求している。カテゴリーＢ（ＥＰ−Ｂ）は、細菌について、初期算出数からの２４時間で少なくとも１．０ｌｏｇの減少、７日で前回測定値からの少なくとも３．０ｌｏｇの減少および２８日で前回測定値からの０．５ｌｏｇ以下の増加（すなわち、増加なし）を要求している。表１を参照されたい。酵母および真菌については、カテゴリーＡは、７日で少なくとも２．０ｌｏｇの減少および２８日で前回測定値からの増加なしを要求しており、カテゴリーＢは、１４日で少なくとも１．０ｌｏｇの減少および２８日で前回測定値からの増加なしを要求している。
【００８９】
細菌については３００ＣＦＵ未満または酵母またはカビについては１００ＣＦＵ未満を含有するプレートを計数中に使用した。単回チャレンジ試験については、三つ組みで、および希釈した試料を加えた二つ組のプレートにおいて（１時点当たり６つの値）のすべての生存微生物の算術平均数を測定し、ＣＦＵ／ｍｌとして正規化した。結果は、平均ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌ減少（時間０と比較して）として表される。この場合、生存微生物数は、ベースラインとして時間０において評価され、６時間、２４時間、７日、１４日および２８日のインキュベーション時間と比較される。
【００９０】
試験された保存剤は、パラベン（メチルパラベンおよびプロピルパラベン）を除いて、プレブ（ベ）ナー１３結合抗原性の減少を示すプレブ（ベ）ナー１３の安定性に対する明白な影響を示さなかった。さらに、フェノール、メタクレゾール、メチルパラベンおよびプロピルパラベンは、変法ローリータンパク質アッセイを妨害した（ワクチンのタンパク質濃度は、市販の変法ローリータンパク質アッセイにより決定される）。
【００９１】
保存効力試験（ＰＥＴ）結果は、試験した保存剤のすべてが、ＵＳＰ要件を満たすがＥＰ基準（ＥＰ−ＡまたはＥＰ−Ｂ）を満たさないことを示した。表２を参照されたい。２−ＰＥは、より高用量で安全であることが知られている唯一の候補保存剤であった。したがって、より高投与量の２−ＰＥで、保存効力のさらなる試験を続行した。
【００９２】
【表２】
0005959161.tif 000003
【実施例２】
【００９３】
単回チャレンジ方法による保存効力試験：２−ＰＥおよびチメロサール
０．０１％濃度のチメロサールは、米国で認可されている主要なワクチンで一般に使用されている。保存剤としてのチメロサールの効力を、実施例１で上に記載されている同じ単回チャレンジ方法を使用して試験した。０．０１％のチメロサール（０．５ｍＬ投与量当たり水銀２５μｇと同等である）を含有するプレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤は、ＥＰの保存抗菌効力方法により定められている欧州合格基準のＥＰ−ＡもＥＰ−Ｂも満たさなかった。しかし、ＥＰで定められているものに比較して米国薬局方または日本薬局方の公定方法により定められている合格限界があまり厳格でないことから、米国薬局方または日本薬局方により定められている合格限界は合格した。図１を参照されたい。
【００９４】
米国で認可されているワクチンの一部におけるチメロサールの推奨濃度の２倍と同等である０．０２％（１投与量当たり水銀５０μｇを含有する）、または米国で認可されているワクチンの一部におけるチメロサールの推奨濃度の４倍と同等である０．０４％（１投与量当たり水銀１００μｇを含有する）のチメロサールは、ＥＰ合格基準Ｂを満たしたが、より厳格なＡの合格基準を満たさなかった（微生物の単回チャレンジで）。図１を参照されたい。
【００９５】
２−ＰＥは、チメロサールに比べて保存剤としてより有効であった。２．５ｍｇ／投与量の２−ＰＥは、ＥＰ合格基準のＡとＢの両方を満たすことはできなかったが、３．５〜５．５ｍｇ／投与量の濃度の２−ＰＥは、ＥＰ合格基準Ｂを満たした。６．０ｍｇ／投与量より高い濃度で、２−ＰＥは、ＥＰ−ＡとＥＰ−Ｂの抗菌効力合格基準の両方を満たした（図２）。
【実施例３】
【００９６】
２−ＰＥおよびチメロサールによる単回チャレンジ方法：汚染物レベルの変化
プレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤中に保存剤がない場合、２０〜２５℃における２８日のチャレンジ期間にわたって緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は緩慢に増殖し、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）レベルおよび黒麹菌（Ａ．ｎｉｇｅｒ）は変化せず、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）はコロニー形成単位が緩慢に減少した（図３）。
【００９７】
０．０１％チメロサール（１投与量当たり水銀２５μｇを含有する）の存在は、４つすべての播種微生物の汚染レベルを低下させた。しかし、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の阻害は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）および黒麹菌（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の阻害よりも弱いものであった（図４）。プレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤におけるチメロサールの抗菌効果の速度に対する投与量応答関係は、特に、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）に対して見られ、汚染レベルの低下は、０．０２％チメロサールでより顕著であった（図５）。０．０２％チメロサール含有塩水製剤中にプレブ（ベ）ナー１３がない場合、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）に対するチメロサールの増殖阻害効力はわずかに改善した（図６）。
【００９８】
２−ＰＥは、チメロサールに比べて保存剤としてより有効であった。例えば、チメロサールについての黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の緩慢な減少とは対照的に、５．０ｍｇ／投与量２−ＰＥの抗菌効力は、播種後２４時間でベースラインまでの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の減少をもたらした（図７）。２−ＰＥは、黒麹菌（Ａ．ｎｉｇｅｒ）に対して保存剤としてチメロサールよりも有効でなく（図７）、黒麹菌（Ａ．ｎｉｇｅｒ）汚染の減少の速度は、チメロサール（図４および５）と比較してより緩慢であるが、他の株に関する２−ＰＥの優れた効力は、３．５および５ｍｇ／投与量の濃度で保存合格基準ＥＰ−Ｂを満たし（図２）、一方、０．０１％チメロサールは、満たさなかった（図１）。
【００９９】
３．５〜５．０ｍｇ／投与量の２−ＰＥの保存効力は、製剤を、１カ月にわたって３７℃または２年半にわたって２〜８℃にて貯蔵した場合に維持されたままであった（図２）。製剤中の２−ＰＥの濃度は、同様に安定であった（図１５）。プレブ（ベ）ナー１３製剤中に存在する１３の血清型の各々の免疫学的活性（総抗原性）も、これらの貯蔵条件下で安定であった（図１４）。
【０１００】
総抗原性は、各血清型についてワクチン中に存在する結合多糖と非結合多糖の両方に由来する。型特異的抗原性は、型特異的抗血清を使用することにより決定した。アッセイに先立って、リン酸アルミニウムと共に製剤化された１３価ワクチンをまず可溶化させた。次いで、溶液を中和し、アルカリ誘発性分解を回避した。比濁計を使用し、アッセイは、抗原−抗体複合体形成に由来する光散乱強度の変化速度を測定した。試験サンプルの抗原性は、サンプル分析の直前または直後に測定される標準曲線を使用する線形回帰により決定した。
【０１０１】
プレブ（ベ）ナー１３ワクチンおよび塩水製剤のチメロサール含有量を確認するため、水銀の濃度を、冷蒸気原子吸光分析（ＣＶＡＡＳ）の方法により製剤の一部において決定した。水銀の測定された濃度は、その予測値に極めて近く、これらの製剤におけるチメロサール濃度が、狙い通りであり、過小評価されていないことを示唆した。２−ＰＥの測定された濃度も、その予測値に極めて近く、２〜８℃と３７℃のどちらでも経時的にプレブ（ベ）ナー１３製剤の貯蔵で変化しなかった。２−ＰＥ濃度は、逆相ＨＰＬＣアッセイで測定した。サンプルをボルテックスして塩水中の５ｍＭコハク酸塩緩衝液中に１：１０に希釈し、遠心分離して塩水中の５ｍＭコハク酸塩緩衝液中に１：１０に再び希釈した。試験サンプルの最終希釈率は、１：１００であった。アッセイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８  ＨＰＬＣカラムおよびトリフルオロ酢酸を含有する水とアセトニトリルの直線グラジエントを利用した。１３ｖＰｎＣ複数回投与ワクチンサンプル中の２−ＰＥを、２−ＰＥ標準曲線に対して定量化した。Ｓｈａｒｍａら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ３６（１）：６１〜６３（２００８）も参照されたい。
【実施例４】
【０１０２】
複数回チャレンジ方法による保存効力試験：チメロサール
最長で４週にわたる複数回免疫化セッションにおけるワクチンのＷＨＯ複数回投与Ｏｐｅｎ  Ｖｉａｌ  Ｐｏｌｉｃｙの適切性を評価するため、ＷＨＯにより提供された実験計画を実施した。この試験において、チメロサールの効力は、大部分の米国で認可されているワクチン中に存在する濃度（０．０１％）、ならびに０．０２％のより高濃度において評価した。複数回投与提示の反復使用中に実際に起きる可能性がある汚染の最悪の妥当なケースを示すため、およびＷＨＯ要件を試験するため、０．０１もしくは０．０２％チメロサールまたは２−ＰＥ  ５．０ｍｇ／投与量を含むプレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤を、ＷＨＯ推奨細菌株、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を使用する複数回汚染事象へ計画的に曝露した。製剤に、時間０、初回チャレンジ後６時間、２４時間、７日および１４日に各微生物５×１０３ＣＦＵ／ｍｌを添加し、実際に潜在的な貯蔵条件を模倣するために２〜８℃または２２〜２４℃のどちらかで貯蔵した。０．０２％チメロサールを含有する塩水製剤も対照として使用し、製剤におけるチメロサールの抗菌効力に対するプレブ（ベ）ナー１３の潜在的影響を評価した。
【０１０３】
保存剤がない場合のプレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤の複数回計画的汚染により、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）微生物のレベルは、試験を通して、特に、２２〜２４℃において貯蔵された場合に増加した（図８Ａおよび８Ｂ）。２２〜２４℃において貯蔵された製剤における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のレベルは、単回チャレンジ試験中に観察されたものと同様に、緩慢に低下した（図８Ａを図３と比較されたい）。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の生存率は、さらにより顕著に低下した（図８Ａおよび８Ｂ）。これらの結果は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が、ＷＨＯによるその推奨にも関わらず、保存効力試験におけるそのようなチャレンジ試験のモデルとして使用されるべきこの製剤における頑健な微生物ではないことを示唆している。
【０１０４】
プレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤において、０．０１％チメロサールの抗菌効力は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）と、続いて、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）で最高であった。しかし、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の減少は、特に、製剤が２〜８℃において貯蔵された場合に緩慢であった（図９Ａおよび９Ｂ）。
【０１０５】
図１２に要約されている黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の生存率における減衰の非線形回帰分析に示されているように、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の減衰速度は、２２〜２４℃において貯蔵されたもの（１日当たり−１．３９ｌｏｇ１０の減衰、６．２日で５０％の減衰）と比較して、製剤が２〜８℃において貯蔵された場合に実質的により緩慢であった（１日当たり−５．９８ｌｏｇ１０の減衰、３０．２８日で５０％の減衰）（図１２）。これらの結果は、複数回投与送達中に現場で汚染され、冷蔵温度においてさらに貯蔵されるプレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤中の０．０１％チメロサールが、細菌汚染を軽減するのに有効ではないことを示している。
【０１０６】
チメロサールの効力は、濃度と温度の両方に依存していた（図９および１０）。チメロサールは、０．０２％のより高濃度においてより有効な保存剤であった。チメロサールは、２２〜２４℃のより高い貯蔵温度においてより有効な保存剤であった。しかし、上記で議論されているように、０．０２％濃度および２２〜２４℃貯蔵をもってしても、チメロサールは、そのような基準を複数回チャレンジ試験中に当てはめた場合、ＥＰ−ＡとＥＰ−ＢのどちらのＥＰ要件も満たさなかった（図１）。
【０１０７】
ワクチン自体が、チメロサールの保存作用に影響を及ぼすかどうかを試験するため、複数回チャレンジによる０．０２％チメロサールの効力を、塩水とプレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤の間で比較した。０．０２％チメロサールの存在下で、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の両方の減衰速度は、ワクチン製剤におけるよりも塩水製剤においてより顕著であり（図１１を図１０および図１２と比較されたい）、ワクチンの存在が、ある程度、保存剤としてのチメロサールの効力を阻害することを立証した。しかし、ワクチンを含有しない塩水対照製剤においてさえ、０．０２％チメロサールは、複数回チャレンジされた場合に、ＥＰ−Ａの合格基準もＥＰ−Ｂの合格基準も依然として満たさなかった（図１）。
【実施例５】
【０１０８】
複数回チャレンジ方法による保存効力試験：２−ＰＥ
保存剤としてのチメロサールの効力の欠如とは対照的に、特に、複数回播種されるか２〜８℃において貯蔵された場合、保存剤として２−ＰＥ  ５ｍｇ／投与量を含有するプレブ（ベ）ナー１３ワクチン製剤は、チャレンジ方法（すなわち、単回または複数回）または貯蔵温度に関係なく、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）生存率のより強い不活化をもたらす（図１２）。
【０１０９】
実際、貯蔵温度に関係なく複数回チャレンジ方法について、および試験されたすべての微生物（緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））について、５ｍｇ／投与量２−ＰＥは、０．０１％チメロサールよりも保存剤として優れていた。様々なチャレンジ試験における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）減衰の非線形回帰分析において、２−ＰＥを含むワクチン製剤は、５０％減衰と減衰の平均勾配（ｌｏｇ１０減衰／日）の両方に関してチメロサールを含むものよりも早い微生物汚染物質減衰率を有していた。図１２を参照されたい。さらに、５ｍｇ／投与量２−ＰＥは、複数回チャレンジ下でＥＰ−Ｂ基準を満たし、一方、同じ条件下でＥＰ−Ｂ基準を満たすことができるチメロサールのバージョンはなかった（図１３）。
【０１１０】
チメロサールは、調剤中に導入される可能性のある潜在的汚染に対して複数回投与製剤中のプレブ（ベ）ナー１３を保護する際の有効な保存剤ではない。このことは、汚染が、複数回投与製剤で対象に投与している間に複数回導入される場合にはさらに明らかである。チメロサールは、特に、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して緩慢な不活化速度を有し、一般開業医が、貧弱な衛生条件下で複数回投与バイアルからワクチンを抜き取る可能性がある場合に潜在的な汚染微生物を一掃するための即時効果が遅い。しかし、３．５〜５ｍｇ／投与量の２−ＰＥは、チメロサールと比較してかなり高い率の抗菌効力と共に安定であり、したがって、対象に投与している間の不慮の汚染から製品を保護するであろう。
【実施例６】
【０１１１】
非ヒト霊長類における保存剤としての２−フェノキシエタノールを含むまたは含まないプレベナー１３の免疫化により誘発される免疫応答
免疫応答を誘導するプレベナー１３および２−フェノキシエタノールを含有するプレベナー１３の能力を、カニクイザルで評価する。
【０１１２】
合計２０匹のカニクイザルについて１０匹のカニクイザルの２つの免疫化群を、表３で詳述されているような試験のために使用する。
【０１１３】
【表３】
0005959161.tif 000004
【０１１４】
予めスクリーニングした動物を、それらの体重およびベースライン力価に基づいて群に無作為化する。
【０１１５】
カニクイザルに、保存剤として２−フェノキシエタノール０または５ｍｇを含有する１３ｖＰｎＣの臨床投与量を与える。ワクチンは、各サルの大腿四頭筋中の単一部位において筋肉内で与える。送達される最終体積は、０．５ｍＬである。
【０１１６】
すべてのカニクイザルには、３回投与量を投与し、２、４および８週目にワクチン接種する。
【０１１７】
採血スケジュール：末梢血を、０、６、８、１０、１２および１６週目にサンプリングし、ワクチンに対する免疫応答の誘導をモニターする。
【０１１８】
ワクチン接種により誘発される免疫応答を、試験中に集められた血清に下記のアッセイを行うことによりモニターする。
・インビトロ結合および機能的抗体：
〇  ＥＬＩＳＡによる血清型特異的ＩｇＧ（例えば、Ｆｅｒｎｓｔｅｎ  Ｐ、ら、Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ．２０１１年１月１日、７：７５〜８４を参照）
〇  血清型特異的オプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）（例えば、Ｆｅｒｎｓｔｅｎ  Ｐ、ら、Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ．２０１１年１月１日、７：７５〜８４を参照）
・乳幼児ラットチャレンジモデルにおけるインビボ防御（例えば、Ｆｅｒｎｓｔｅｎ  Ｐ、ら、Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ．２０１１年１月１日、７：７５〜８４を参照）：
〇  プールしたカニクイザル血清を、血清型特異的防御について評価する。
【図１】
0005959161.tif 000005
【図２】
0005959161.tif 000006
【図３】
0005959161.tif 000007
【図４】
0005959161.tif 000008
【図５】
0005959161.tif 000009
【図６】
0005959161.tif 000010
【図７】
0005959161.tif 000011
【図８】
0005959161.tif 000012
【図９】
0005959161.tif 000013
【図１０】
0005959161.tif 000014
【図１１】
0005959161.tif 000015
【図１２】
0005959161.tif 000016
【図１３】
0005959161.tif 000017
【図１４】
0005959161.tif 000018
【図１５】
0005959161.tif 000019