(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１】
0006010052.tif 000026
（式中、
Ａ1、Ａ2、Ａ3、．．．、Ａi、．．．、Ａnは、ペプチド断片であり、
Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3、．．．、Ｃi-1、．．．、Ｃn-1は、チオール官能基を有するアミノ酸残基であり、
ｎは、３〜５０の間を含み、
ｉは、２及びｎの間を含む整数である）
で表される、ｎ断片及びチオール官能基を有するｎ−１アミノ酸のペプチドアッセンブリを調製するための方法であって、
ビス（２‐スルファニルエチル）アミノペプチド：Ａ1‐ＳＥＡｏｆｆ
（式中、ＳＥＡｏｆｆは、以下：
【化２】
0006010052.tif 000027
の環状ビス（２‐スルファニルエチル）アミノ基である）
から出発し、
環状ジスルフィド還元剤の存在下、チオールＲ‐ＳＨの作用により、
以下の式：
【化３】
0006010052.tif 000028
（式中、Ａ1は、ペプチド断片であり、及びＳＲは、アルキルチオエステル残基であり、Ｒは、非置換の又は置換されたアルキルラジカルでもよい）
のペプチド‐チオエステルの調製を実施し、
続いて、以下の構造：
【化４】
0006010052.tif 000029
（式中、Ｃ1、Ａ2及びＳＥＡｏｆｆは、上で定義された通りであり、及び（ＳＲ’）は、アミノ酸Ｃ1のチオール上のジスルフィド残基を表す）
のペプチド断片と、芳香族チオールＡｒＳＨの存在下、前記ペプチドチオエステル（ＩＩ）とを縮合して得られた、以下の構造：
【化５】
0006010052.tif 000030
（式中、Ａ1、Ｃ1、Ａ2及びＳＥＡｏｆｆは、上で定義された通りである）
の新たなペプチド断片を、
以下の式：
【化６】
0006010052.tif 000031
（式中、Ａ1、Ｃ1、Ａ2及びＲは、上で定義された通りである）
のペプチド‐チオエステルに、環状ジスルフィド還元剤の存在下、チオールＲ‐ＳＨの作用により、変換し、
そして、以下の構造：
【化７】
0006010052.tif 000032
（式中、ＳＥＡｏｆｆ及びＲ’及びＣ2及びＡ3は、上で定義された通りである）
のペプチド断片と、芳香族チオールＡｒＳＨの存在下、前記ペプチドチオエステル（ＩＩ’）とを縮合して、以下の構造：
【化８】
0006010052.tif 000033
（式中、Ａ1、Ｃ1、Ａ2、Ｃ2、Ａ3及びＳＥＡｏｆｆは、上で定義された通りである）
のペプチド断片を生成し、
そして、ｎ‐２回までこれらの２つの操作を繰り返して、以下の構造：
【化９】
0006010052.tif 000034
（式中、Ａ1、Ａ2、Ａ3、．．．、Ａi、．．．、Ａn-1、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3、．．．、Ｃi-1、．．．、Ｃn-1及びＳＥＡｏｆｆは、上で定義された通りである）
のペプチド断片を得て、
続いて、前記得られたペプチド断片（ＩＶm）と、以下の式：
【化１０】
0006010052.tif 000035
（式中、Ｃn-1及びＡnは、上で定義された通りである）
とを、環状ジスルフィド還元剤の存在下、還元により、天然型ライゲーション反応を実施して、一般式（Ｉ）の複数のペプチドアッセンブリを生成する
ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
３又は４つの断片のペプチドアッセンブリが、Ａ1‐Ｃ1‐Ａ2‐Ｃ2‐Ａ3又はＡ1‐Ｃ1‐Ａ2‐Ｃ2‐Ａ3‐Ｃ3‐Ａ4の構造を調製することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
３つの断片のペプチドアッセンブリが、「ワンポット（ｏｎｅ ｐｏｔ）」反応で調製されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3、．．．、Ｃi-1、．．．、Ｃn-1が、Ｃｙｓ残基を表すことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ペプチド断片Ａ2、．．．、Ａi、．．．、Ａn-1の１つ以上が、１つ以上の修飾アミノ酸を有することができることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチド‐チオエステルと、構造（ＩＩＩ）のペプチド断片との前記縮合が、４‐メルカプトフェニル酢酸の存在下で行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
医薬組成物を製造するための方法であって、以下：
請求項１〜５のいずれか１項に記載の式（Ｉ）のポリペプチドを製造するための方法に従ってポリペプチド又はペプチドを製造し、及び
上記のように調製したポリペプチド又はペプチドを、純品又は１つ以上の適合するそして医薬的に許容されるアジュバントと組み合わせて含む医薬組成物を調製する
ことを含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドの天然型ライゲーションを使用する、複数のペプチド断片をアッセンブルすることによるペプチド又はポリペプチドを調製するための方法に関する。本発明は、本方法中で使用される中間体の調製及び本方法によって調製される前記中間体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチド合成を大規模で行った場合、従来の固相法によるペプチドの合成（アミノ酸を用いてアミノ酸を）は、低収率に制限される。この制限を克服するために、化学ライゲーションによって２つのポリペプチドをアッセンブルして、より長いポリペプチドを生成することが知られている。
【０００３】
ポリペプチドの全合成は、明確に定義されたタンパク質の調製にますます有用である。化学ライゲーション方法は、この要求への対応を提供するが、しかしながらそれらは、それらの使用及び産業上の利用が限られていることを示す。
【０００４】
一般的に、これらの方法において、ライゲーションによってアッセンブルされたポリペプチドの間の結合は、天然型、すなわち、ポリペプチドの天然構造に一致することが望まれる。
【０００５】
既存の主要な天然型ライゲーション方法は、例えば、国際公開第９６／３４８７８号及び国際公開第９８／２８４３４号に記載されたＫｅｎｔ及びＤａｗｓｏｎの方法である。この方法は、チオエステルペプチド（Ｃ末端）及びシステイニルペプチドの間の化学選択的反応に基づく。それにもかかわらず、この方法の主な欠点は、複雑な化学プロセスを必要とするチオエステルペプチドの製造である。特に、Ｓ．Ｋｅｎｔによって報告されたアッセンブリ方法（速度論的制御（ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ）ライゲーション（ＫＣＬ））によれば、Ａ‐ＳＡｒ、Ｈ‐Ｃｙｓ‐Ｂ‐ＳＡｌｋ及びＨ‐Ｃｙｓ‐Ｃ断片を合成する必要がある。しかしながら、Ａ‐ＳＡｒ型断片は、製造するのが困難であり、そして加水分解の影響を受け易いことが分かる。さらに、この方法は、３つの断片のアッセンブリ以上のことはできない。
【０００６】
代替方法は、国際公開第０１／６８５６５号及び国際公開第０１／８７９２０号に記載された、いわゆるＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションである。これは、ホスフィノチオエステルとアジドとの反応、そしてアミド結合を形成するための結合した試薬の加水分解を含む。しかしながら、この方法は、工業規模で応用することが困難である。
【０００７】
国際公開第２００７／０３７８１２号で記載される別の方法は、脱炭酸縮合反応におけるα‐ケト酸とアルコキシアミンとの反応に基づく。しかしながら、ケト酸は、製造及びペプチド内に組み込むことが困難な分子である。また、この第三の方法は、複雑な有機合成を行う手段を有しないペプチド合成実験室で適用することが困難である。
【０００８】
刊行物（D. Bang, B.L. Pentelute及びS.B.H. Kent, Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 3985-3988）では、ペプチド‐（チオフェニルエステル）とＣｙｓ‐ペプチド‐チオエステルとに関連する合成経路を提案し、そして、刊行物（W. Houら、Org Lett., (2010), 22 December 2010）では、ペプチド合成のためのペプチド‐チオエステルの形成を提案する。しかしながら、これらの方法は、異なるチオエステルの反応間の競争を防ぐことができず、必然的に分離することが困難である混合物となり、従って、得られる最終産物の純度に影響を及ぼし、そして収率の低下が避けられない。
【０００９】
最終的に、刊行物（O. Melnyk et al., Org. Lett., 12(22), 5238-41 (2010)）では、ペプチド‐ビス（スルファニルエチル（ｓｕｌｐｈａｎｙｌｅｔｈｙｌ））アミノ断片を用いたペプチドの天然型ライゲーションを開示する。しかしながら、この方法は、複数の断片を有するペプチドの合成のために、これまで使用されていない。
【００１０】
全合成によってペプチド合成を実施することができる方法の工業規模への移行は、単純で安価な、産業衛生要件を満たす高純度品質製品を製造する方法を見つける必要がある。
【００１１】
上述の理由により、全合成方法を見つけることは必須であり、そしてそれは分かり易く、所望する長さ及び性質のペプチド鎖形成を合成することができ、工業規模で使用することができる。特に、Ｎ末端からＣ末端へと向かうアッセンブリに関する方法は、製造の容易さの質及びペプチド又は得られたポリペプチドの純度の品質を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の課題を形成する、ペプチド‐チオエステル及び天然型ライゲーションの形成などの単純な方法に関するワンポット（ｏｎｅ‐ｐｏｔ）方法における複数のペプチド断片のアッセンブルは、全合成方法をもたらし、そしてそれは、収束的であり、工業規模で使用でき、必要な純度基準に合致する。
【００１３】
本発明によれば、アッセンブリ方法は、ペプチド‐チオエステルの合成、以下の一般式：
【００１４】
【化１】
0006010052.tif 000002
【００１５】
（式中、
Ａiは、以下の環状ビス（２‐スルファニルエチル）アミノ基：
【００１６】
【化２】
0006010052.tif 000003
【００１７】
（以下「ＳＥＡｏｆｆ」という。）を有するＣ末端を有するペプチド断片を表し、及び
Ｃi‐1は、チオール官能基を有するアミノ酸残基を表す）
に対応する、環状ジスルフィド状態においてビス（２‐スルファニルエチル）アミノ官能基を有するペプチド（又はポリペプチド）とのそれらの縮合反応、並びに得られたポリペプチドの、Ｃ末端での、還元媒体における天然型化学ライゲーションに関する。
【００１８】
用語ＳＥＡｏｆｆは、反応性ジスルフィドの構造‐Ｎ［（ＣＨ2）2‐ＳＨ］2（以下「ＳＥＡｏｎ」という。）とは対照的に、非反応性環状ジスルフィドを意味することが理解される。
【００１９】
Ｃi-1で表されるチオール官能基を有するアミノ酸は、特に、システイン、ホモシステインから選択され、そしてこれらのアミノ酸は、ペプチド‐チオエステルとの反応の実施において、アミノ酸のチオール上のジスルフィド残基（ＳＲ’）を有することが理解される。
【００２０】
本発明によれば、本方法は、チオール官能基を有するアミノ酸残基を含む複数のペプチドアッセンブリ、すなわち、ｎ断片及びチオール官能基を有するｎ−１アミノ酸のペプチドアッセンブリの調製につながり、以下の式：
【００２１】
【化３】
0006010052.tif 000004
【００２２】
（式中、
Ａ1、Ａ2、Ａ3、．．．、Ａi、．．．、Ａnは、ペプチド断片であり、
Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3、．．．、Ｃi-1、．．．、Ｃn‐1は、チオール官能基を有するアミノ酸残基であり、
ｎは、３〜５０の間、好ましくは３〜２０の間、又はより好ましくは３〜１０の間を含み、及び
ｉは、２〜ｎの間を含む任意の整数である）
で表される。
【００２３】
ｎ＝３の場合、Ｃn‐1‐Ａnが、Ｃ2‐Ａ3を表し、そしてＣi‐1‐Ａiが、Ｃ1‐Ａ2を表すことが理解される。この場合、式（Ｉ）のペプチドアッセンブリは、Ａ1‐Ｃ1‐Ａ2‐Ｃ2‐Ａ3の構造を有する。
【００２４】
本発明による方法は、以下の式のペプチド‐チオエステル：
【００２５】
【化４】
0006010052.tif 000005
【００２６】
（式中、Ａ1は、ペプチド断片であり、及びＳＲは、アルキル化チオエステル残基であり、Ｒは、任意により置換されたアルキルラジカルでもよい）
を、環状ジスルフィド還元剤の存在下、チオールＲ‐ＳＨの作用により、ビス（２‐スルファニルエチル）アミノペプチドであるＡ1‐ＳＥＡｏｆｆ（ＳＥＡｏｆｆは、上で定義された通りである）から調製し、
続いて、以下の構造のペプチド断片：
【００２７】
【化５】
0006010052.tif 000006
【００２８】
（式中、Ｃ1、Ａ2、及びＳＥＡｏｆｆは、上で定義された通りであり、及び（ＳＲ’）は、アミノ酸Ｃ1のチオール上のジスルフィド残基を表す）
と、芳香族チオールＡｒＳＨの存在下、上記ペプチドチオエステル（ＩＩ）とを縮合して得られた、以下の構造の新しいペプチド断片：
【００２９】
【化６】
0006010052.tif 000007
【００３０】
（式中、Ａ1、Ｃ1、Ａ2及びＳＥＡｏｆｆは、上で定義された通りである）
を、以下の式のペプチド‐チオエステル：
【００３１】
【化７】
0006010052.tif 000008
【００３２】
（式中、Ａ1、Ｃ1、Ａ2及びＲは、上で定義された通りである）
に、環状ジスルフィド還元剤の存在下、チオールＲ‐ＳＨの作用により、変換し、
続いて、以下の構造のペプチド断片：
【００３３】
【化８】
0006010052.tif 000009
【００３４】
（式中、ＳＥＡｏｆｆ、Ｒ’、Ｃ2及びＡ3は、上で定義された通りである）
と、芳香族チオールＡｒＳＨの存在下、上記ペプチドチオエステル（ＩＩ’）とを縮合して、以下の構造のペプチド断片：
【００３５】
【化９】
0006010052.tif 000010
【００３６】
（式中、Ａ1、Ｃ1、Ａ2、Ｃ2、Ａ3及びＳＥＡｏｆｆは、上で定義された通りである）
を生成し、
次に、以下の構造のペプチド断片：
【００３７】
【化１０】
0006010052.tif 000011
【００３８】
（式中、Ａ1、Ａ2、Ａ3、．．．、Ａｉ、．．．、Ａn‐1、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3、．．．、Ｃi‐1、．．．、Ｃn‐2及びＳＥＡｏｆｆは、上で定義された通りである）
を得るために、ｎ‐２回までこれら２つの操作を繰り返し、並びに
この得られたペプチド断片（ＩＶm）と、以下の式のペプチド：
【００３９】
【化１１】
0006010052.tif 000012
【００４０】
（式中、Ｃn‐1及びＡnは、上で定義された通りである）
との天然型ライゲーション反応を、一般式（Ｉ）の複数のペプチドアッセンブリを生成するために、環状ジスルフィド還元剤の存在下、還元により、行うこと
からなる。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
発明の詳細な説明
本発明を以下の説明においてより詳細にそして非限定的に述べる。
【００４２】
本明細書の文脈において、「ペプチド又はポリペプチド（peptides or polypeptides）」は、ペプチド結合によって結合したアミノ酸の直鎖（２つ以上のアミノ酸数）を意味する。本願の意味の範囲内で、「ペプチド又はポリペプチド」は、従って、例えば、これらの用語の通常許容される意味に照らして、オリゴペプチド、ペプチド又はタンパク質であってもよい。本発明によるポリペプチド中に存在するアミノ酸残基は、タンパク質構成又は非タンパク質構成アミノ酸残基から選択することができる。好ましくは、それらは、２０のタンパク質を構成するアミノ酸残基から選択される。
【００４３】
ポリペプチド表記は、Ｎ末端からＣ末端までである。ポリペプチド鎖に従って示すアミノ酸は、通常の１文字又は３文字表記に従って示す。アミノ酸残基は、式‐ＮＨ‐（ＣＨ‐Ｒ）‐（Ｃ＝Ｏ）‐（式中、Ｒは、側鎖を表し、そしてそれは、アミノ酸ごとに異なる）のポリペプチド断片である。
【００４４】
「ペプチド断片（peptide fragment）」は、本明細書の文脈において、少なくとも１つのアミノ酸残基を含むポリペプチド部分を意味する。本願の意味の範囲内で、ペプチド断片は、従って、例えば、仮にペプチド断片が、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端のいずれも含まない場合、アミノ酸残基の配列（例えば、‐ＡＨＧ‐又は‐Ａｌａ‐Ｈｉｓ‐Ｇｌｙ‐）でもよく；又は仮にペプチド断片が、ポリペプチドのＮ末端を含む場合、そのＮ末端の基を有するアミノ酸残基の配列（例えば、Ｈ‐ＡＨＧ‐又はＨ‐Ａｌａ‐Ｈｉｓ‐Ｇｌｙ‐）でもよく；仮にペプチド断片が、ポリペプチドのＣ末端を含む場合、そのＣ末端の基を有するアミノ酸残基の配列（例えば、‐ＡＨＧ‐ＯＨ又は‐Ａｌａ‐Ｈｉｓ‐Ｇｌｙ‐ＯＨ）であってもよい。
【００４５】
それぞれのペプチド断片は、好ましくは、２０のタンパク質を構成するアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基のみを含むことが理解される。しかしながら、特定の実施態様によれば、配列中の内部の位置におけるペプチド断片Ａiは、１つ以上の非タンパク質構成アミノ酸残基を、また含むことができ、１つ以上のペプチド断片Ａ2．．．Ａi．．．Ａn‐1は、１つ以上の修飾アミノ酸（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）を有することができる、修飾は、本方法の実施の前に行なうことができる。非限定的な例として、アミノ酸の修飾は、特に、カルボン酸残基（ビオチン、アセチル基、アミノオキシ酢酸残基、フルオロフォア、例えば、テトラメチルローダミン、金属キレート剤、例えば、１，４，７，１０‐テトラアザシクロドデカン‐１，４，７，１０‐四酢酸（ＤＯＴＡ）、脂質、例えば、パルミチン酸、ポリマー、例えば、α‐メトキシ‐オメガ‐カルボキシポリ（エチレングリコール）など）から選択されるラジカルから選択することができる。又は当業者に知られたタンパク質構成アミノ酸の翻訳後修飾（メチル化、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、硫酸化、ヒドロキシル化、カルボキシメチル化、固相の取り込みのための適切な保護の担持など）、又は任意により薬剤（ベクターとして働くタンパク質）から選択されてもよい。
【００４６】
考慮する断片の固相合成の間に修飾を導入するために、修飾を非タンパク質構成アミノ酸、特にタンパク質構成アミノ酸誘導体を使用することによって簡単に導入することができる。例として、断片の合成を実施するために、Ｆｍｏｃ‐Ｌ‐Ｌｙｓ（ビオチン）‐ＯＨ、すなわち、その側鎖上にビオチンを担持するリジンを使用することができる。この断片は、その後、タンパク質構成アミノ酸断片を使用するものと同じ方法でアッセンブリに関与する。
【００４７】
本発明の実施態様によれば、ペプチド断片Ａiは、２〜３００の間のアミノ酸残基、好ましくは、５〜１００の間のアミノ酸残基、より特に好ましくは、８〜５０の間のアミノ酸残基を含む。
【００４８】
Ｒで表されるアルキルラジカルは、直鎖又は分岐の１〜１２の炭素原子のアルキル原子のアルキルラジカルであり、任意によりハロゲン原子（例えば、Ｆ）、又はＣＯ2Ｈ、ＳＯ3Ｈ、ＣＯＮＨ2、ＯＨ、ＳＨ、アルキルオキシ、アルキルチオ、メルカプトアルキルチオラジカル、エステルラジカル又はポリエチレングリコールラジカルから選択される１つ以上の基で置換されるか、又は任意により置換フェニル、又は行われる反応を妨げない他の有機基によって置換される。チオールの一般式Ｒ‐ＳＨは、例えば、ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＳＯ3Ｈ、ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＳＣＨ2ＣＨ2ＳＨ、又はＨＳＣＨ2Ｐｈであってもよい。
【００４９】
芳香族チオールは、有利には、ジスルフィド結合還元化合物から選択され、好ましくは、チオフェノール及び／又は芳香族環の置換によって得られる誘導体、例えば、４‐カルボキシメチルチオフェノール、４‐メルカプトフェニル酢酸、ジチオトレイトール、ベンジルメルカプタン及びそれらの混合物から選択される。
【００５０】
ＳＥＡｏｆｆ還元剤は、環状ジスルフィド還元剤から選択することができる。特に、ホスフィン（例えば、トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン）、又は任意の他の環状ジスルフィド還元剤、例えば、チオール（例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ））から選択することができる。
【００５１】
ペプチドＡ1‐ＳＥＡｏｆｆの例は、以下の式：
【００５２】
【化１２】
0006010052.tif 000013
【００５３】
で表すことができ、この例において、ペプチド断片Ａ1は、Ｈ‐ＧＦＧＱＧＦＧＧである。
【００５４】
ペプチド断片Ａnは、本発明の方法によれば、上記の一連の操作によって事前に調製されてもよい。
【００５５】
本発明によれば、複数のペプチド断片をアッセンブルするための方法は、以下の図１に従って表すことができる。
【００５６】
【化１３】
0006010052.tif 000014
【００５７】
すべての複数のペプチドアッセンブリ調製反応は、インサイチュで、「ワンポット（ｏｎｅ ｐｏｔ）」反応において、行うことができ、特にペプチド断片ｎが、３に相当する場合、形成された中間体を分離する必要がないという大きな利点を有する。
【００５８】
本発明に従った方法は、下記のように、そして以下の例において説明するように行うことができる。
【００５９】
式（ＩＩ）のペプチド‐チオエステルの調製は、環状ジスルフィド還元剤、例えば、特にホスフィン、例えば、トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィンの存在下、任意によりビス（２‐スルファニルエチル）アミノペプチド上に置換されたアルキル部分のアルキルチオール：Ａ1‐ＳＥＡｏｆｆの反応によって有利に行われる。反応は、不活性雰囲気下（例えば、アルゴン下）、ｐＨが１〜８の間で、好ましくはｐＨ４で、そして２０℃〜５０℃の間の温度で有利に行われる。有利には、３‐メルカプトプロピオン酸が使用される。
【００６０】
式（ＩＩ）のチオエステルと一般式（ＩＩＩ）のペプチド断片：Ｈ‐Ｃ1（ＳＲ’）‐Ａ2‐ＳＥＡｏｆｆとの縮合は、芳香族チオール（特に、４‐メルカプトフェニル酢酸）の存在下、不活性雰囲気下（例えば、アルゴン下）、２０℃〜６０℃の間の温度で操作することにより、有利に行われる。得られたペプチド断片は、次の反応において使用するために、分離する必要がない。
【００６１】
ペプチド断片（ＩＶm）（Ａ1‐Ｃ1‐Ａ2‐Ｃ2‐Ａ3‐．．‐Ｃi‐1‐Ａi‐．．‐Ｃn‐2‐Ａn‐1‐ＳＥＡｏｆｆ）とペプチド（Ｖn）（Ｈ‐Ｃn‐1Ａn）との天然型ライゲーション反応は、不活性雰囲気下（例えば、アルゴン下）、２０℃〜６０℃の間の温度、好ましくは、３７℃の温度で操作することにより、環状ジスルフィド還元剤、そしてそれは好ましくは、ホスフィン（例えば、トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））、チオール化合物、例えば４‐メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、チオフェノール（及びその誘導体）、アルキルチオール（特に、ベンジルメルカプタン）又はこれらの化合物のいくつかの混合物、例えば、ＭＰＡＡ及びＴＣＥＯの作用によって行われてもよい。反応は、特に、水性媒体、例えば、リン酸緩衝液中で行われる。好ましくは、ｐＨが５．５〜８．５の間、より好ましくは、ｐＨが６〜８の間、そして理想的には、ｐＨが約７で行われる。反応継続時間は、使用する試薬に依拠し、液体クロマトグラフィー分析の結果に従って監視されそして調節される。天然型ライゲーション反応において、得られたペプチド断片（ＩＶm）を使用するために、それを分離する必要がない。環状ジスルフィド還元剤の反応は、式（Ｖn）のペプチドとの反応の前又は同時に式（ＩＶm）のペプチド断片上で行うことができる。
【００６２】
特定の実施態様によれば、式（ＩＶm）及び（Ｖn）のペプチド断片は、１つ以上の非タンパク質構成アミノ酸残基を含む。
【００６３】
式（ＩＶm）及び（Ｖn）のポリペプチドのアミノ酸残基は、任意により、側鎖保護基によって保護することができる。保護ラジカルの保護及び除去は、分子の残りを変えない公知の方法に従って行うことができる。より特に、T. Greene及びP. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd edition, John Wiley & Sons, Inc.に記載された方法に従って行う。
【００６４】
ビス（２‐スルファニルエチル）アミノペプチド：Ａ1‐ＳＥＡｏｆｆの調製は、Melnyk, O.ら、Bis(2-sulphanylethyl)amino native peptide ligation., Org. Lett., 12(22), 5238-41 (2010)に記載された方法に従って行うことができる。この方法の手順によれば、アミノ酸とポリマー樹脂担体との結合は、ポリマー樹脂をアミノ酸ハロゲン化物又はアミノ酸及び、好ましくは、ＰｙＢＯＰ（登録商標）（ベンゾチアゾール‐１‐イル‐オキシトリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート）、ＢＯＰ、ＰｙＢｒｏＰ（登録商標）（ブロモ‐トリス‐ピロリジノ‐ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート）、又はＨＡＴＵ（２‐（１Ｈ‐７‐アザベンゾチアゾール‐１‐イル）‐１，１，３，３‐テトラメチル ウロニウム ヘキサフルオロホスフェート メタンアミニウム）及びより特に好ましくは、ＰｙＢｒｏＰから選択される活性化剤と接触することを含む。この手順は、以下、開始ペプチド断片の調製例において、より詳細に記載する。
【００６５】
特に、対応するペプチド‐Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）2（ＳＥＡｏｎペプチド）は、撹拌下、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム溶液において、周囲温度で空気によって酸化される。有利なことに、それらは、ヨウ素又はジアミド、（ＣＨ3）2ＮＣＯＮ＝ＮＣＯＮ（ＣＨ3）2の存在下、酸化によってまた得ることができる。
【００６６】
式（Ｖn）のポリペプチドは、例えば、通常のペプチド合成方法、特に、固相合成方法によって得ることができる。それは、Org. Lett., 12(22), 5238-41(2010)に記載された、天然型ライゲーションによって得ることができる。
【００６７】
本発明の好ましい実施態様によれば、３つ又は４つの断片のペプチドアッセンブリは、構造Ａ1‐Ｃ1‐Ａ2‐Ｃ2‐Ａ3、又はＡ1‐Ｃ1‐Ａ2‐Ｃ2‐Ａ3‐Ｃ3‐Ａ4を調製する。
【００６８】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、チオール官能基を有するＣiアミノ酸は、システインＣｙｓ残基である。
【００６９】
この場合において、本発明の好ましい実施態様によれば、構造Ａ1‐Ｃｙｓ‐Ａ2‐Ｃｙｓ‐Ａ3、又はＡ1‐Ｃｙｓ‐Ａ2‐Ｃｙｓ‐Ａ3‐Ｃｙｓ‐Ａ4のペプチドアッセンブリが調製される。
【００７０】
これらの好ましい実施態様によれば、ペプチドアッセンブリ調製図は、以下の図２に従って表すことができる。
【００７１】
【化１４】
0006010052.tif 000015
【００７２】
本発明は、また、上記方法に従って、環状ジスルフィド還元剤の存在下、チオールＲ‐ＳＨの反応により、ビス（２‐スルファニルエチル）アミノペプチド：Ａ1‐ＳＥＡｏｆｆからの式（ＩＩ）のペプチド‐チオエステルの調製に関する。本発明は、また、上記のように得たペプチド‐チオエステルに関する。
【００７３】
本発明に従って得られた式（Ｉ）のポリペプチドは、例えば、スクリーニングの目的のために、ポリペプチドライブラリーを作製するために使用することができる。
【００７４】
それらは、また、１つ以上の適合するそして医薬的に許容されるアジュバント又はビヒクルと組み合わせて、医薬組成物の製造のために使用することができる。本発明に従って得ることができる医薬組成物の例として、ヒト及び動物のために使用することができる医薬品、並びにワクチン製剤を挙げることができる。それらは、また、診断キットの製造のために使用することができる。
【００７５】
本発明の他の課題によれば、本発明は、また以下：
‐上記式（Ｉ）のポリペプチドを製造するための方法に従ったポリペプチド又はペプチドの製造、及び
‐上記のように調製したポリペプチド又はペプチドを、純品又は1つ以上の適合するそして医薬的に許容されるアジュバントと組み合わせて含む医薬組成物
を含む医薬組成物を製造するための方法に関する。
【００７６】
本発明は、また、以下：
‐上記式（Ｉ）のポリペプチドを製造するための方法に従ったポリペプチド又はペプチドの製造、及び
‐診断装置のために使用するのに適合した形態での、本ポリペプチドの処方又は形成
を含む診断装置を製造するための方法に関する。
【００７７】
本発明による方法は、全合成において、鎖に沿って配置される、システイン（Ｃｙｓ）又はホモシステイン型のチオール置換を有するアミノ酸単位を含む、所望する長さ及び性質のペプチド鎖構造を合成することを可能にするのに、特に有用である。
【００７８】
本発明は、それが関与する収束的合成のために、工業規模において使用することができるという利点を有し、この合成法は、有利な収率、そして特に、既に開発された製品の収率の少ない損失、既に高い合成コストを提供するので、後の方法の工業化に関して、特に求められる。
【００７９】
本発明によれば、ＳＥＡ断片は、ペプチド断片の連続ライゲーションによって、Ｎ末端からＣ末端のタンパク質の合成を可能にする。
【００８０】
Ｎ末端からＣ末端のアッセンブルは、Ｃ末端からＮ末端のアッセンブルの逆方法と比べて、大きな利点を提供し、実際、この場合、本方法は、工業合成において非常に重要であるペプチド断片の自浄作用（ｓｅｌｆ‐ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を誘導する。
【００８１】
他の利点によれば、本発明の方法は、ペプチド断片の合成のためにタンパク質構成アミノ酸を使用することを可能にする。従って、合成をかなり困難にするアミノ酸誘導体（例えば、ケト酸）の製造を行う必要がない。
【実施例】
【００８２】
実施例１
３つの断片のワン‐ポットアッセンブリ
１‐アルキルチオールＲ‐ＳＨ（Ｒ＝‐（ＣＨ2）2ＣＯＯＨ）及び環状ジスルフィド還元剤の存在下、Ａ1‐ＳＥＡｏｆｆの変換による、Ａ1‐ＳＲ（Ｒ＝アルキル）に相当する、ペプチド１（Ｈ‐ＩＬＫＥＰＶＨＧＡ‐Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯＯＨ）の合成
【００８３】
前駆体ペプチドＨ‐ＩＬＫＥＰＶＨＧＡ‐ＳＥＡｏｆｆを、Ollivier N., Dheur J., Mhidia R., Blanpain A.,及びMelnyk O., Bis(2-sulphanylethyl)amino native peptide ligation., Org. Lett. 12(22), 5238-41 (2010)に記載されたように調製した。
【００８４】
トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩、ＴＣＥＰ，ＨＣｌ（９２１．２ｍｇ）を、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．３）（４０ｍｌ）に溶解する。３‐メルカプトプロパン酸（ＭＰＡ）（２ｍｌ）を、この溶液に添加する。溶液のｐＨを、５Ｎ炭酸（約３ｍｌ）で４に再調節する。
【００８５】
ペプチドＨ‐ＩＬＫＥＰＶＨＧＡ‐ＳＥＡｏｆｆ（４０．３１ｍｇ）を、先の溶液（４０ｍｌ）に溶解する。反応媒体を、３真空／アルゴンサイクルを用いて、不活性雰囲気下に置き、３７℃で恒温槽に置く。
【００８６】
２２時間後、反応媒体を分液漏斗に移す。７％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２０滴）を含む水性溶液を、添加する。ジエチルエーテルで、４回の抽出を行う。７％ＴＦＡを含む水性溶液（１０ｍｌ）を添加し、そしてジエチルエーテルで、新たに３回の抽出を行う。
【００８７】
ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８カラム １２０Å、５μｍ、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む１００％水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、グラジエント：５分で緩衝液Ｂの０〜１０％、次に１５０分で緩衝液Ｂの１０〜１００％、流速６ｍｌ／分、２１５ｎｍ）における精製前に、水相を、アルゴンを通気することによって脱気する。精製ペプチド１（Ｈ‐ＩＬＫＥＰＶＨＧＡ‐Ｓ（ＣＨ2）2ＣＯＯＨ）（１８．７ｍｇ）を得る（収率＝４７．４％）（Ｃ47Ｈ78Ｎ12Ｏ13Ｓ1 ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ［Ｍ＋Ｈ］+ 計算（モノアイソトッピク質量）１０５１．５６；測定１０５１．７０）。
【００８８】
２‐Ｈ‐Ｃ1（ＳＲ）‐Ａ2‐ＳＥＡｏｆｆ（Ｒ＝ｔＢｕ）に相当する、ペプチド２ Ｈ‐Ｃ（ＳｔＢｕ）ＨＨＬＥＰＧＧ‐ＳＥＡｏｆｆの合成
【００８９】
０．２５ｍｍｏｌ規模でのＳＥＡｏｆｆペプチドの標準合成は、Ollivier N., Dheur J., Mhidia R., Blanpain A.,及びMelnyk O., Bis(2-sulphanylethyl)amino native peptide ligation., Org. Lett. 12(22), 5238-41 (2010)に従う。
【００９０】
ジスルフィド残基‐Ｓ‐ｔ．Ｂｕを、以下の実施例２に記載した方法と類似した方法によって、Ｆｍｏｃ‐Ｃｙｓ（Ｓｔ．Ｂｕ）を使用して結合する。
【００９１】
樹脂からのペプチドの最終脱保護及び切断を、ＴＦＡ／ＴＩＳ／ＤＭＳ／Ｈ2Ｏ（９０／２．５／２．５／５／２．５容積、２５ｍｌ）で、１時間３０分行う。ペプチドを、冷ジエチルエーテル／ヘプタン混合物（１／１容積）から沈殿し、最小量の水に溶解し、そして凍結乾燥する。１３２．６ｍｇの粗ペプチドを得る（収率＝３８％）。Ｃ43Ｈ69Ｎ13Ｏ10Ｓ4 ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ［Ｍ＋Ｈ］+ 計算（モノアイソトピック質量）１０５６．４２；測定１０５６．１０。
【００９２】
ペプチド２の一部を、その後、精製前に酸化する。このために、断片２（１２２．６ｍｇ）及びＩ2（２２２．５２ｍｇ、１０当量）を、ＡｃＯＨ／水 ４／１（１２．５ｍｌ）に溶解する。１０分間の撹拌後、希釈した反応媒体（全量＝３７ｍｌ）を、ジエチルエーテル（７５ｍｌ）を含む分液漏斗に移す。ジエチルエーテルで３回の抽出を行う（３×７５ｍｌ）。水相を凍結し、そして凍結乾燥し、９４．３ｍｇの粗ペプチドを製造する。
【００９３】
ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８カラム １２０Å、５μｍ、２１５ｎｍ、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む１００％水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、グラジエント：５分で緩衝液Ｂの０〜１０％、次に１５０分で緩衝液Ｂの１０〜１００％、流速６ｍｌ／分）精製後、４０．５２ｍｇの精製ペプチドを得る（収率＝３３％）。Ｃ43Ｈ67Ｎ13Ｏ10Ｓ4 ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ［Ｍ＋Ｈ］+ 計算（モノアイソトピック質量）１０５４．４；測定１０５４．４。
【００９４】
３‐Ａ1‐ＳＲ（ペプチド１）（Ｒ＝ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）＋Ｈ‐Ｃ1（ＳｔＢｕ）‐Ａ2‐ＳＥＡｏｆｆ（ペプチド２）→Ａ1‐Ｃ1‐Ａ2‐ＳＥＡｏｆｆ
【００９５】
４‐メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ、３３．６４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、芳香族チオール）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）（１ｍｌ）に溶解する。５Ｎの炭酸溶液（８０μｌ）を添加して、溶液のｐＨを７．６４に調節する。ペプチド１（１０．４０ｍｇ、７．５μｍｏｌ）及びペプチド２（１０．４２ｍｇ、７．５μｍｏｌ）を、先の溶液に一緒に溶解する（５３３μｌ）。反応媒体を、不活性雰囲気下、温度制御恒温槽において３７℃で置く。
【００９６】
ライゲーションを、Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、３００Å、５μｍ）（２１５ｎｍ、１ｍｌ／分、３０℃、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、３０分で０〜１００％のＢ）を有するＲＰ‐ＨＰＬＣによって監視する。このために、分析前に、反応媒体のアリコート（５μｌ）を、１０％ＴＦＡ水溶液で酸性化し、ジエチルエーテルで抽出してＭＰＡＡ及びＭＰＡを除去する。
【００９７】
４‐Ｈ‐Ｃ2‐Ａ3に相当する、ペプチド３ Ｈ‐ＣＩＬＫＥＰＶＨＧＶ‐ＮＨ2の合成
【００９８】
ペプチドＨ‐Ｃ2‐Ａ3の調製は、Ollivier N., Dheur J., Mhidia R., Blanpain A.,及びMelnyk O., Bis(2-sulphanylethyl)amino native peptide ligation., Org. Lett. 12(22), 5238-41 (2010)よる刊行物において記載されている。
【００９９】
５‐３つの断片のワン‐ポットライゲーションのためのプロトコール
Ａ1‐Ｃ1‐Ａ2‐Ｃ2‐Ａ3に相当する、ペプチド４ Ｈ‐ＩＬＫＥＰＶＨＧＡＣＨＨＬＥＰＧＧＣＩＬＫＥＰＶＨＧＶ‐ＮＨ２の合成
Ａ1‐Ｃ1‐Ａ2‐ＳＥＡｏｆｆ及びペプチド３（Ｈ‐Ｃ2‐Ａ3）
ＴＣＥＰ（トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン）の存在下、還元によるＡ1‐Ｃ1‐Ａ2‐ＳＥＡｏｆｆのＡ1‐Ｃ1‐Ａ2‐ＳＥＡｏｎへの変換
【０１００】
５時間３０分間の反応後、ＴＣＥＰ，ＨＣｌ（トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）（５７．３４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．３）（１ｍｌ）に溶解する。５Ｎの炭酸溶液（１４０μｌ）を添加して、溶液のｐＨを７．３３に調節する。
【０１０１】
Ａ1‐Ｃ1‐Ａ2‐ＳＥＡｏｎ＋（ペプチド３）Ｈ‐Ｃ2‐Ａ3→Ａ1‐Ｃ1‐Ａ2‐Ｃ2‐Ａ3（ペプチド４）
ペプチド３（１６．１７ｍｇ、１１．２μｍ）を、先の溶液（５３３μｌ）に溶解し、その後、不活性雰囲気下、３７℃で再度置いた先の反応媒体を添加する。
【０１０２】
ライゲーションを、Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、３００Å、５μｍ）（２１５ｎｍ、１ｍｌ／分、３０℃、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、３０分で０〜１００％のＢ）を有するＲＰ‐ＨＰＬＣによって監視する。このために、分析前に、反応媒体のアリコート（５μｌ）を、１０％ＴＦＡ水溶液で酸性化し、ジエチルエーテルで抽出してＭＰＡＡ（４‐メルカプトフェニル酢酸）を除去する。
【０１０３】
反応が完了したとき、反応媒体を、０．０５％ＴＦＡ（３ｍｌ）を含む水で希釈し、そして１０％ＴＦＡ水溶液（１５滴）を添加する。ジエチルエーテルで５回抽出した後（５×８ｍｌ）、水相を、アルゴンを通気することにより１０分間脱気する。Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８カラム １２０Å、５μｍ（２１５ｎｍ、流速６ｍｌ／分、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、グラジエント：５分で緩衝液Ｂの０〜１０％、次に１５０分で緩衝液Ｂの１０〜１００％）を有するＲＰ‐ＨＰＬＣによって精製後、１６．２．ｍｇの精製ペプチド４を得る（５９．２％）。
【０１０４】
実施例２
１‐Ｋ１（断片１）‐ＭＰＡの合成
Ｋ１（断片１）‐ＳＥＡｏｆｆの合成
【０１０５】
【化１５】
0006010052.tif 000016
【０１０６】
ＳＥＡ樹脂（０．５ｍｍｏｌ、０．１７５ｍｍｏｌ／ｇ）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）において調整する。Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＨ（２．３４２ｇ、５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ及び２〜３滴のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解して酸可溶化し、その後、溶液を樹脂に添加する。ＰｙＢｒｏｐ（２．３３１ｇ、５ｍｍｏｌ）を、最小量のＤＣＭに溶解し、その後、樹脂に添加する。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（２．６１３ｍｌ、１５ｍｍｏｌ）を、その後、樹脂に添加し、そして切断を２時間行った（全量＜５ｍｌ）。樹脂を、その後、ＤＣＭで３×２分間洗浄する。樹脂を、その後、１０％Ａｃ2Ｏ／５％ＤＩＥＡ／ＤＣＭ（１０ｍｌ、２分）、次に（１０ｍｌ、２０分）処理する。樹脂を、その後、ＤＣＭで５×２分間洗浄する。
【０１０７】
断片１は、マイクロ波を使用せずに、Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ‐ｂｕｔｙｌ方法を使用して、ペプチド合成機（ＣＥＭ μＷａｖｅｓ，Ｓａｃｌａｙ，Ｆｒａｎｃｅ）で、先の樹脂（０．２５ｍｍｏｌ、０．１７５ｍｍｏｌ／ｇ）の部分上でアッセンブルする。結合を、アミノ酸（０．２Ｍ、４当量）、活性剤ＨＢＴＵ（０．５Ｍ、３．６当量）及び塩基ＤＩＥＡ（２Ｍ、８当量）と伴に行う。最終脱保護及び樹脂からのペプチドの切断を、ＴＦＡ／ＴＩＳ／ＤＭＳ／チオアニソール／Ｈ2Ｏ（９０／２．５／２．５／２．５／２．５容積、２５ｍｌ）で、２時間３０分間行う。ペプチドを、冷ジエチルエーテル／ヘプタン混合物（１／１容積）から沈殿し、最小量の水に溶解し、そして凍結乾燥する。２８８ｍｇの粗ペプチドを得る（収率＝３２％）。Ｃ120Ｈ216Ｎ36Ｏ31Ｓ4 ＬＣ‐ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］+ 計算（平均質量）２７８８．５；測定２７８８．１。
【０１０８】
断片１の一部を、その後、精製前に酸化する。このために、断片１（９５．７ｍｇ）を、ＡｃＯＨ／水 １／４（４７．９ｍｌ）に溶解する。ＤＭＳＯ中の１９７ｍＭ Ｉ2（２７０μｌ、５０μｍｏｌ、２当量）を、先の溶液に添加する。３０秒間の撹拌後、６４．８ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ、８２３μｌ、５０μｍｏｌ、２当量）を添加して、残りのＩ2を消費し、そしてＲＰ‐ＨＰＬＣ内に直接注入する。
【０１０９】
ＲＰ‐ＨＰＬＣ精製（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８カラム １２０Å、５μｍ、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む１００％水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、グラジエント：５分で緩衝液Ｂの０〜２０％、次に４０分で緩衝液Ｂの２０〜４０％、流速６ｍｌ／分、２１５ｎｍ）後、２５．８ｍｇの精製ペプチドを得る（収率＝２７％）。Ｃ120Ｈ214Ｎ36Ｏ31Ｓ4 ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ［Ｍ＋Ｈ］+ 計算（モノアイソトッピク質量）２７８４．５２；測定２７８４．６。
【０１１０】
ｂ‐Ｋ１（断片１）‐ＭＰＡの合成
【０１１１】
【化１６】
0006010052.tif 000017
【０１１２】
トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ，ＨＣｌ、２２９．６３ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．３）（１０ｍｌ）に可溶化する。メルカプトプロパン酸（ＭＰＡ、０．５ｍｌ）を添加する。ＮａＯＨ ５Ｍ（３４０μｌ）を添加して、ｐＨを３．９８に調節する。
【０１１３】
断片１ Ｋ１‐ＳＥＡｏｆｆ（２４．６７ｍｇ、６．９μｍｏｌ）を、先の溶液（１０．３ｍｌ）に溶解する。反応媒体を、アルゴン雰囲気下、３７℃で加熱する。反応の進行を、Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（２１５ｎｍ、１ｍｌ／分、３０℃、溶出液Ａ ０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水、溶出液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、３０分で０〜１００％のＢ）を有するＲＰ‐ＨＰＬＣによって監視する。このために、分析前に、アリコートを、１０％ＴＦＡ水溶液で酸性化し、Ｅｔ2Ｏで抽出してＭＰＡを除去する。
【０１１４】
反応の完了後、反応媒体を、水（１０ｍｌ）で希釈し、そして１０％ＴＦＡ水溶液（５ｍｌ）を添加する。Ｅｔ2Ｏでの３回抽出（３×１５ｍｌ）及び１５分間のアルゴン通気後、ＲＰ‐ＨＰＬＣ精製を、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８カラム １２０Å、５μｍ（２１５ｎｍ、流速６ｍｌ／分、周囲温度、溶出液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む水、溶出液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、５分でＢの０〜１０％、次に１５０分でＢの１０〜１００％）で行い、９．７ｍｇの精製Ｋ１（断片１）‐ＭＰＡを得る（４１％）。
【０１１５】
２‐ＳｔＢｕ‐Ｋ１（断片２）‐ＳＥＡｏｆｆの合成
【０１１６】
【化１７】
0006010052.tif 000018
【０１１７】
樹脂ＳＥＡ（０．５ｍｍｏｌ、０．１７５ｍｍｏｌ／ｇ）を、ＤＣＭにおいて調整する。Ｆｍｏｃ‐Ｔｙｒ‐ＯＨ（２．２９８ｇ、５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（＜５ｍｌ）及び２〜３滴のＤＭＦに溶解して、可溶化を助け、その後、樹脂に添加する。ＰｙＢｒｏｐ（２．３３１ｇ、５ｍｍｏｌ）を、最小量のＤＣＭに溶解し、その後、樹脂に添加する。ＤＩＥＡ（２．６１３ｍｌ、１５ｍｍｏｌ）を、その後、樹脂に添加し、そして結合を２時間行った。樹脂を、その後、ＤＣＭで４×２分間洗浄する。樹脂を、その後、１０％Ａｃ2Ｏ／５％ＤＩＥＡ／ＤＣＭ（１０ｍｌ、２分）、次に（１０ｍｌ、２０分）処理する。樹脂を、その後、ＤＣＭで５×２分間洗浄する。
【０１１８】
断片２は、マイクロ波を使用せずに、Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ‐ｂｕｔｙｌ方法を使用して、ペプチド合成機（ＣＥＭ μＷａｖｅｓ，Ｓａｃｌａｙ，Ｆｒａｎｃｅ）で、先の樹脂（０．５ｍｍｏｌ、０．１７５ｍｍｏｌ／ｇ）上でアッセンブルする。結合を、アミノ酸（０．２Ｍ、４当量）、活性剤ＨＢＴＵ（０．５Ｍ、３．６当量）及び塩基ＤＩＥＡ（２Ｍ、８当量）と伴に行う。洗浄溶媒（ＤＭＦ）及びＦｍｏｃ‐Ｍｅｔ‐ＯＨ溶媒は、配列のメチオニンの酸化の最大限の防止のために、１％チオアニソールを含む。
【０１１９】
樹脂を、位置２において、グルタミンの後、２に分離して（０．２５ｍｍｏｌ）、手動でＦｍｏｃ‐Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）‐ＯＨを結合する。このために、樹脂を、ＤＭＦで４×２分間洗浄し、ＤＭＦ中で秤量し、そして２に分割する。ＨＢＴＵ（３７９．３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１１００μｌ）に溶解する。ＨＯＢｔ（１３５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５００μｌ）に溶解し、ＨＢＴＵに添加する。Ｆｍｏｃ‐Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）‐ＯＨ（４３１．６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５００μｌ）に溶解し、そしてＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ混合物に添加する。ＤＩＥＡ（５２２．７μｌ、３ｍｍｏｌ）を、その後、混合物に添加する。１分間の撹拌後、混合物を樹脂に添加し、そして結合を４５分行う。樹脂を、その後、ＤＭＦで４×２分間洗浄する。Ｆｍｏｃ N末端の脱保護を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで処理することにより行う（１５分、次に5分）。樹脂を、その後、ＤＣＭで４×２分間洗浄し、次に、Ｅｔ2Ｏで、３×２分間洗浄し、そして乾燥する。
【０１２０】
樹脂からのペプチドの最終脱保護及び切断を、ＴＦＡ／ＴＩＳ／ＤＭＳ／チオアニソール／Ｈ2Ｏ（９０／２．５／２．５／２．５／２．５容積、２５ｍｌ）で、２時間３０分間行う。ペプチドを、冷ジエチルエーテル／ヘプタン混合物（１／１容積）から沈殿し、最小量の水に溶解し、そして凍結乾燥する。３６６．１４ｍｇの粗ペプチドを得る（収率＝３５．６％）。Ｃ156Ｈ231Ｎ41Ｏ44Ｓ5 ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ［Ｍ＋Ｈ］+ 計算（モノアイソトッピク分解能）３５４３．６；測定３５４２．２。
【０１２１】
断片２の一部を、その後、精製前に酸化する。このために、断片２（６７ｍｇ）を、ＡｃＯＨ／水 １／４（３５ｍｌ）に溶解し、その後、ＤＭＳＯにおいて１４４ｍＭ Ｉ2（２２３μｌ）を添加する。３０秒間の撹拌後、ＡｃＯＨ／水 １／４において６４．８ｍＭ ＤＴＴ（５０３μｌ）を添加して、過剰のＩ2を消費する。溶液を脱色した後、媒体を、ＲＰ‐ＨＰＬＣ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８カラム １２０Å、５μｍ、２×２８ｃｍ、２１５ｎｍ、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む１００％水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、グラジエント：５分で緩衝液Ｂの０〜１０％、次に１５０分で緩衝液Ｂの１０〜１００％、流速６ｍｌ／分）内に注入し、１１．５ｍｇの精製ペプチドを得る（収率＝１７．２％）。Ｃ156Ｈ229Ｎ41Ｏ44Ｓ5 ＬＣ‐ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］+ 計算（モノアイソトッピク分解能）３５４１．６；測定３５４１．９。
【０１２２】
３‐Ｋ１（断片３）の合成
【０１２３】
【化１８】
0006010052.tif 000019
【０１２４】
断片３を、マイクロ波を使用しないで、Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ‐ｂｕｔｙｌ方法を使用して、ペプチド合成機（ＣＥＭ μＷａｖｅｓ、Ｓａｃｌａｙ、Ｆｒａｎｃｅ）で、Ｎｏｖａｓｙｎ ＴＧＲ樹脂（０．５ｍｍｏｌ、０．２５ｍｍｏｌ／ｇ）上でアッセンブルする。結合を、アミノ酸（０．２Ｍ、４当量）、活性剤ＨＢＴＵ（０．５Ｍ、３．６当量）、そして塩基ＤＩＥＡ（２Ｍ、８当量）で行う。
【０１２５】
最終脱保護及び樹脂からのペプチドの切断を、ＴＦＡ／ＥＤＴ／Ｈ2Ｏ／ＴＩＳ（９４／２．５／１容積、３０ｍｌ）で、２時間３０分間行う。ペプチドを、冷ジエチルエーテル／ヘプタン混合物（１／１容積）から沈殿し、最小量の水に溶解し、そして凍結乾燥する。ＲＰ‐ＨＰＬＣ精製（Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラム ５０ｃｍ×２ｃｍ、２８０ｎｍ、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む１００％水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、グラジエント：１０分で緩衝液Ｂの０〜２０％、次に６０分で緩衝液Ｂの２０〜５０％、流速３０ｍｌ／分）後、２７２ｍｇの精製ペプチドを得る（収率＝１３％）。Ｃ158Ｈ239Ｎ47Ｏ52Ｓ4 ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ［Ｍ＋Ｈ］+ 計算（モノアイソトッピク分解能）３７５５．６；測定３７５５．７．
【０１２６】
４‐ワン‐ポットライゲーションプロトコール
ペプチド４Ｋ１（１２５‐２０９）の合成
グアニジンＨＣｌ（５７３．２４ｍｇ、６ｍｍｏｌ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．３）（１ｍｌ）に溶解する。４‐メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ、３３．６８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、後の溶液（１ｍｌ）に溶解する。ＮａＯＨ ５Ｍ（１５０μｌ）を添加して、溶液のｐＨを７．５３に調節する。
【０１２７】
Ｋ１（断片１）‐ＭＰＡ（９．７１ｍｇ、２．８μｍｏｌ）及びＳｔＢｕ‐Ｋ１（断片２）‐ＳＥＡ（１０．６５ｍｇ、２．６μｍｏｌ）を、先の溶液（１８５μｌ）に一緒に溶解する。反応媒体を、グローブボックスにおいて、温度制御恒温槽に３７℃で置く。
【０１２８】
ライゲーションを、Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、３００Å、５μｍ）（２１５ｎｍ、１ｍｌ／分、３０℃、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、３０分で０〜１００％のＢ）を有するＲＰ‐ＨＰＬＣによって監視する。このために、分析前に、反応媒体のアリコート（１μｌ）を、１０％ＴＦＡ水溶液で酸性化し、Ｅｔ2Ｏで抽出してＭＰＡＡ及びＭＰＡを除去する。
【０１２９】
２０時間の反応後、グアニジンＨＣｌ（５７３．１５ｍｇ、６ｍｍｏｌ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．３）（１ｍｌ）に溶解する。トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ，ＨＣｌ、５７．５９ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、後の溶液（１ｍｌ）に溶解する。５Ｍ ＮａＯＨを添加して、溶液のｐＨを７．２７に調節する。
【０１３０】
Ｋ１（断片３）（１６．４６ｍｇ、３．９μｍｏｌ）を、先の溶液（１８５μｌ）に溶解し、その後、不活性雰囲気下、３７℃で、再度置いた先の反応媒体に添加する。
【０１３１】
ライゲーションを、Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、３００Å、５μｍ）（２１５ｎｍ、１ｍｌ／分、３０℃、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、６０分で０〜１００％のＢ）を有するＲＰ‐ＨＰＬＣによって監視する。このために、分析前に、反応媒体のアリコート（１μｌ）を、１０％ＴＦＡ水溶液で酸性化し、Ｅｔ2Ｏで抽出してＭＰＡＡ及びＭＰＡを除去する。Ｃ418Ｈ648Ｎ122Ｏ127Ｓ7 ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ［Ｍ＋Ｈ］+（平均質量）計算９６４０．０１、見かけ９６３９。
【０１３２】
反応が完了したとき、反応媒体を、水（４ｍｌ）で希釈し、そして１０％ＴＦＡ水溶液（１ｍｌ）を添加する。Ｅｔ2Ｏでの４回抽出（４×８ｍｌ）後、水相を、アルゴンを通気することにより、１０分間脱気し、水（３６ｍｌ）で希釈し、そして濾過する。フリットを、ＡｃＯＨ（１ｍｌ）で洗浄し、そして水（２０ｍｌ）で洗浄する。混合物を、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８カラム ３００Å、５μｍ（２１５ｎｍ、２０ｍｌ／分、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、５分で緩衝液Ｂの０〜２０％、次に８０分で緩衝液Ｂの２０〜６０％）を有するＲＰ‐ＨＰＬＣで精製し、１１．４６ｍｇの精製Ｋ１（１２５‐２０９）を得る（収率＝３９．４％）。
【０１３３】
５‐Ｋ１（１２５‐２０９）のフォールディング
Ｋ１（１２５‐２０９）（３．９９ｍｇ、０．３５５μｍｏｌ）を、１０容積％のグリセロール、１ｍＭの還元型グルタチオン、０．２ｍＭの酸化型グルタチオンを含む、１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ＝７．４）（１０ｍｌ）に溶解する。反応媒体を４℃に置く。
【０１３４】
フォールディングを、Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、３００Å、５μｍ）（２１５ｎｍ、１ｍｌ／分、３０℃、緩衝液Ａ ０．１％ＴＦＡを含む水、緩衝液Ｂ ０．１％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、６０分で０〜１００％のＢ）を有するＬＣ‐ＭＳによって監視する。
【０１３５】
６５時間後、反応媒体を、４℃で１５分間、８０００ｒｃｆで、次に４℃で１５分間、９０００ｒｃｆで超遠心分離して、いくつかの凝集体を除去する。
【０１３６】
反応媒体（７．６ｍｌ）を、その後、複数回移し、３０００のＭＷＣＯを有する２ｍｌのＶｉｖａｓｐｉｎ限外濾過システムに入れ、そして１２℃で３時間２０分の間、１２０００ｒｃｆで超遠心する。一度濃縮し、反応媒体は、約８００μｌである。
【０１３７】
次にそれを、３５００のＭＷＣＯカット‐オフを有する透析カセットにおいて、４℃で、１０容積％グリセロールを含む１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ＝７．４）（１Ｌ）で、終夜透析する。
【０１３８】
フォールディングしたＫ１（１２５‐２０９）を、ＢＳＡ標準レンジを作製し、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、５６２ｎｍでアッセイする。
【０１３９】
実施例３
１‐Ｋ１（断片３）‐ビオチンの合成
【０１４０】
【化１９】
0006010052.tif 000020
【０１４１】
Ｆｍｏｃ‐Ｌｙｓ（ビオチン）‐ＯＨ（２×８９ｍｇ、２×０．１５ｍｍｏｌ）を、ＰＡＬ‐ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（０．１ｍｍｏｌ、０．４３ｍｍｏｌ／ｇ）上で、ＴＢＴＵ（２×３０．５ｍｇ、２×０．１５ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２×５０μｌ、２×０．４５ｍｍｏｌ）を使用して、ＮＭＰにおいて2時間、２回結合する。ＮＭＰ（３×２分）及びＤＭＦ（３×２分）で洗浄後、３‐ビオチン断片を、Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ‐ｂｕｔｙｌ方法を使用して、ペプチド合成機（ＩＮＴＡＶＩＳ）で、２つの５０μｍｏｌカラム上でアッセンブルする。
【０１４２】
結合を、４当量のそれぞれのアミノ酸、３．６当量のＨＢＴＵ、及び８当量のＤＩＥＡを使用して行う。キャップ形成の段階を、それぞれのＡｃ2Ｏ／ＤＩＥＡとの結合後行う。合成の完了時に、樹脂をＣＨ2Ｃｌ2、ジメチルエーテルで洗浄し（２×２分）、そして真空下で乾燥する。
【０１４３】
最終脱保護及び樹脂からのペプチドの切断を、ＴＦＡ／ＥＤＴ／Ｈ2Ｏ／ＴＩＳ（９４／２．５／２．５／１容積、２×５ｍｌ）で２時間行う。ペプチドを、冷ジエチルエーテル／ヘプタン（１／１容積）から沈殿し、最小量の水に溶解し、そして凍結乾燥する。ＲＰ‐ＨＰＬＣ精製（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８カラム ５０ｃｍ×２ｃｍ、２１５ｎｍ、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む１００％水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、グラジエント：５分で緩衝液Ｂの０〜１５％、次に６０分で緩衝液Ｂの１５〜３５％、流速６ｍｌ／分）後、３６．７５ｍｇの精製ペプチドを得る（収率＝８％）。Ｃ174Ｈ265Ｎ51Ｏ55Ｓ5 ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ［Ｍ＋Ｈ］+ 計算（平均質量）４１１２．６８；測定４１１４．３。
【０１４４】
２‐ワン‐ポットライゲーションプロトコール
４Ｋ１（１２５‐２０９）Ｋ‐ビオチンペプチドの合成
グアニジンＨＣｌ（５７３．２８ｍｇ、６ｍｍｏｌ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．３）（１ｍｌ）に溶解する。４‐メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ、３３．５９ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、後の溶液（１ｍｌ）に溶解する。ＮａＯＨ ５Ｍ（８０μｌ）を添加し、溶液のｐＨを７．４０に調節する。
【０１４５】
Ｋ１（断片１）‐ＭＰＡ（２．７６ｍｇ、０．８μｍｏｌ）及びＳｔＢｕ‐Ｋ１（断片２）‐ＳＥＡ（３．３０ｍｇ、０．８μｍｏｌ）を、先の溶液と一緒に溶解する（５７μｌ）。反応媒体を、グローブボックスにおいて、温度制御恒温槽で、３７℃で置く。
【０１４６】
ライゲーションを、Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、３００Å、５μｍ）（２１５ｎｍ、１ｍｌ／分、３０℃、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、３０分で０〜１００％のＢ）を有するＬＣ‐ＭＳによって監視する。このために、分析前に、反応媒体のアリコート（１μｌ）を、１０％ＴＦＡ水溶液で酸性化し、Ｅｔ2Ｏで抽出してＭＰＡＡ及びＭＰＡを除去する。
【０１４７】
２４時間４０分の間の反応後、グアニジン，ＨＣｌ（５７３．１８ｍｇ、６ｍｍｏｌ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．３）（１ｍｌ）に溶解する。トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ，ＨＣｌ、５７．８０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、後の溶液に溶解する（１ｍｌ）。５Ｍ ＮａＯＨを添加して、溶液のｐＨを７．４０に調節する。
【０１４８】
Ｋ１（断片３）（５．５０ｍｇ、１．２μｍｏｌ）を、先の溶液（５７μｌ）に溶解し、次に、３７℃で、不活性雰囲気下に再度置いた先の反応媒体に添加する。
【０１４９】
ライゲーションを、Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、３００Å、５μｍ）（２１５ｎｍ、１ｍｌ／分、３０℃、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１、６０分で０〜１００％のＢ）を有するＲＰ‐ＨＰＬＣによって監視する。このために、分析前に、反応媒体のアリコート（１μｌ）を、１０％ＴＦＡ水溶液で酸性化し、Ｅｔ2Ｏで抽出してＭＰＡＡ及びＭＰＡを除去する。Ｃ434Ｈ674Ｎ126Ｏ130Ｓ8［Ｍ＋Ｈ］＋ 予測（平均質量）９９９４．４９、測定９９９４．４１。
【０１５０】
反応完了時、反応媒体を水及び１０％ＴＦＡを含む水溶液で希釈した。Ｅｔ2Ｏでの抽出後、水相を、アルゴンを通気することにより脱気し、水で希釈し、濾過し、そしてＶｙｄａｃ Ｃ１８カラム ３００Å、５μｍ（２１５ｎｍ、２０ｍｌ／分、緩衝液Ａ ０．０５％ＴＦＡを含む水、緩衝液Ｂ ０．０５％ＴＦＡを含むＣＨ3ＣＮ／水 ４／１）を有するＲＰ‐ＨＰＬＣによって精製した。
【０１５１】
断片１及び断片２：Ｋ１（断片１）‐ＭＰＡ及びＳｔＢｕ‐Ｋ１（断片２）‐ＳＥＡを、上記実施例２の通り調製する。
【０１５２】
開始ペプチド断片の調製例
Ａ）ＳＥＡｏｎペプチド断片の合成を、Ollivier N., Dheur J., Mhidia R., Blanpain A.,及びMelnyk O., Bis(2-sulphanylethyl)amino native peptide ligation., Org. Lett. 12(22), 5238-41 (2010)に従って行う。
【０１５３】
例示の目的で、以下のペプチド断片：
【０１５４】
【化２０】
0006010052.tif 000021
【０１５５】
の調製を、固相中で行う。
ペプチド断片（１ａ）を、グリシンで調製したプライマーサポートから得る。
ペプチド断片（１ｂ）を、アラニンで調製したプライマーサポートから得る。
ペプチド断片（１ｃ）を、バリンで調製したプライマーサポートから得る。
ペプチド断片（１ｄ）を、チロシンで調製したプライマーサポートから得る。
【０１５６】
ポリペプチドの合成を、以下：
【０１５７】
【化２１】
0006010052.tif 000022
【０１５８】
に要約する。
【０１５９】
上記のように得たペプチド断片は、以下の一般式：
【０１６０】
【化２２】
0006010052.tif 000023
【０１６１】
を有する。
【０１６２】
異なったポリペプチドの固相合成を、Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ‐ｂｕｔｙｌ方法を使用して、樹脂（０．１ｍｍｏｌ規模）上で、マイクロ波ペプチド合成機（ＣＥＭ μＷＡＶＥＳ、Ｓａｃｌａｙ、Ｆｒａｎｃｅ）において行う。結合を、それぞれのアミノ酸の５倍モル過剰を使用して行い、活性剤ＨＢＴＵを４．５倍モル過剰で使用し、そして塩基ＤＩＥＡを１０倍モル過剰で使用する。
【０１６３】
最終脱保護及び樹脂からのポリペプチドの切断を、１０ｍｌのＴＦＡ／ＴＩＳ／ＤＭＳ／Ｈ2Ｏ混合物（９２．５／２．５／２．５／２．５容積）で１時間行った。ポリペプチドを、その後、１００ｍｌのジエチルエーテル／ヘプタン混合物（１／１容積）から沈殿することによって得て、Ｈ2Ｏに溶解し、その後、凍結乾燥する。
【０１６４】
それぞれのペプチド断片の純度を、ＨＰＬＣによって決定する（グリシンを有するペプチド断片（１ａ）に関して９１％、ペプチド断片（１ｂ）に関して８３％、（１ｃ）に関して８０％、及び（１ｄ）に関して８８％）。ペプチド断片のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分析は、予測したペプチド断片の構造と一致する（ペプチド断片（１ａ）Ｃ47Ｈ81Ｎ13Ｏ11Ｓ2［Ｍ＋Ｈ］+ 計算１０６８．６Ｄａ、測定１０６８．５、ペプチド断片（１ｂ）Ｃ48Ｈ83Ｎ13Ｏ11Ｓ2［Ｍ＋Ｈ］+ 計算１０８２．６Ｄａ、測定１０８２．４、ペプチド断片（１ｃ）Ｃ50Ｈ87Ｎ13Ｏ11Ｓ2［Ｍ＋Ｈ］+ 計算１１１０．６Ｄａ、測定１１１０．５、ペプチド断片（１ｄ）Ｃ54Ｈ87Ｎ13Ｏ12Ｓ2［Ｍ＋Ｈ］+ 計算１１７４．６Ｄａ、測定１１７４．６）。
【０１６５】
ポリペプチドの精製を、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８カラムおいて、ＴＦＡにおけるアセトニトリル‐Ｈ2Ｏ（８０−２０）で、ペプチド断片（１ａ）に関して３０分で０〜３０％のグラジエント、そしてペプチド断片（１ｂ）及び（１ｃ）に関して５分で０〜１０％、次に２５分で１０〜２５％のグラジエントで行う。
【０１６６】
ＨＰＬＣによって決定した純度は、ペプチド断片（１ａ）に関して９６％（全収率＝３５％）、ペプチド断片（１ｂ）に関して９７％（全収率＝３１％）、そしてペプチド断片（１ｃ）に関して９９％（全収率＝２７％）である。
【０１６７】
Ｂ）ペプチド断片（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）及び（１ｄ）のジチアゼパン（ｄｉｔｈｉａｚｅｐａｎｅ）への酸化
先に得られたペプチド断片（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）及び（１ｄ）を、以下の一般的な図：
【０１６８】
【化２３】
0006010052.tif 000024
【０１６９】
に従って酸化する。
【０１７０】
それぞれのペプチド断片を、固相担体から、ＴＦＡ／ＤＭＳ／Ｔｉｓ／Ｈ2Ｏ溶液（９２．５／２．５／２．５／２．５；ｖ／ｖ）の作用によって切断する。ペプチド断片を、その後、大量のジエチルエーテル／ヘプタン混合物（１／１；ｖ／ｖ）から沈殿し、そしてこの溶液を使用して２回洗浄する。切断段階後凍結乾燥した粗ペプチド断片を、その後、先に窒素を通気することにより１０分間脱気した０．１Ｍ重炭酸アンモニウム溶液に溶解する。
【０１７１】
その後、混合物を、周囲温度で激しく撹拌しつつ放置する。反応の進行を、ポリペプチドの還元型の完全な消失が認められるまで、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析によって追跡する。ポリペプチドを、最終的に、ＲＰ‐ＨＰＬＣ（グラジエント 溶出液Ａ（Ｈ2Ｏ／０．０５％ＴＦＡ）／溶出液Ｂ（８０％アセトニトリル／２０％Ｈ2Ｏ／０．０５％ＴＦＡ）：１０分で０〜１０％、次に２５分で１０％〜２５％）で精製し、その後、凍結し、そして凍結乾燥する。以下の表に、得られた結果（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分析）を要約する。
【０１７２】
【表１】
0006010052.tif 000025
【配列表】
0006010052000001.app