(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５と、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体とを含む培地中で単核球を培養する第１の工程と、
前記第１の工程後に、単核球を優先的に細胞傷害性Ｔ細胞に分化させる条件下で培養を行う第２の工程と、を含む免疫細胞含有組成物の製造方法。
【請求項２】
前記第２の工程後に、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５と、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体とを含む培地中で培養を行う第３の工程を含む請求項１に記載の免疫細胞含有組成物の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の製造方法で製造された免疫細胞含有組成物を含む癌治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫細胞含有組成物の製造方法及び癌治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌の治療において、様々な方法が開発されており、特に、患者の体内の免疫力を強化する免疫療法が着目されている。免疫療法としては、例えば、細胞免疫療法等が挙げられる。【０００３】
細胞免疫療法は、患者由来の免疫細胞を、生体外で活性化及び増殖等させた後に、再びその患者の体内に戻すことで当該患者の免疫力を高めるものであり、養子免疫療法等とも呼ばれる。例えば、細胞免疫療法のひとつであるＬＡＫ療法は、患者から採取した血液から単核球を分離し、これを主に細胞傷害性Ｔ細胞等に分化させて患者の体内に戻すものである。また、その他の細胞免疫療法として、ＮＫ細胞等の細胞を使用する方法が知られていた（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１１−５２９３４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
他方、本発明者らは、従来の細胞免疫療法のように、単核球を細胞傷害性Ｔ細胞等の単一の免疫細胞へ分化させ、これを増殖させて得られた培養物を生体内に戻しても、生体内の免疫力を必ずしも強化できない点を見出した。従って、本発明は、単核球を複数の免疫細胞（特にＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞及びＴ細胞）へバランス良く分化させ、これらの細胞を増殖させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、免疫細胞の製造方法において、所定の細胞培養工程を組み合わせることで上記課題を解決できる点を見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、具体的には、以下のようなものを提供する。【０００７】
（１）  ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５と、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体とを含む培地中で単核球を培養する第１の工程と、
上記第１の工程後に、単核球を優先的に細胞傷害性Ｔ細胞に分化させる条件下で培養を行う第２の工程と、を含む免疫細胞含有組成物の製造方法。【０００８】
（２）  上記第２の工程後に、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５と、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体とを含む培地中で培養を行う第３の工程を含む（１）に記載の免疫細胞含有組成物の製造方法。【０００９】
（３）  （１）又は（２）に記載の製造方法で製造された免疫細胞含有組成物を含む癌治療用組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、単核球をＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞及びＴ細胞へバランス良く分化させ、これらの細胞を増殖させる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（Ａ）は、６人の健常人から回収したＰＢＭＣの細胞数を示す。（Ｂ−１）及び（Ｂ−２）は、得られたＰＢＭＣについてのＦＡＣＳ分析の代表的な結果を示す。
【図２】健常人から回収したＰＢＭＣについてのＦＡＣＳ分析の代表的な結果を示す。
【図３】本発明の実施例において得られた免疫細胞含有組成物についてのＦＡＣＳ分析の代表的な結果を示す。
【図４】本発明の実施例において得られた免疫細胞含有組成物についてのＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図５】本発明の実施例において得られた免疫細胞含有組成物についての細胞傷害活性の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明を限定することを意図するものではない。
【００１３】
本発明の免疫細胞含有組成物の製造方法は、所定の条件下で培養を行う第１の工程と、第２の工程とを含む。以下、各工程について説明する。なお、本発明において「免疫細胞含有組成物」とは、少なくともＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞及びＴ細胞を含む組成物を指す。
【００１４】
＜第１の工程（ＮＫ細胞増殖工程）＞
本発明における第１の工程は、後述する培地中で単核球を培養し、単核球をＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞等に分化させ、かつＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞等を増殖させる工程である。この工程においては、単核球を、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞のみならず、γδＴ細胞等に選択的に分化させて、増幅させ得る。ＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞）、ＮＫＴ細胞（ナチュラルキラーＴ細胞）、γδＴ細胞とは、それぞれリンパ球の一種であり、癌細胞を攻撃する作用を有することが知られる。なお、本発明において「ＮＫ細胞等」とは、少なくともＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞を指す。
【００１５】
（単核球）
単核球とは、リンパ球及び単球の総称である。単核球は、体液（末梢血、骨髄、臍帯血等の血液等）から、遠心分離、磁気ビーズ、フローサイトメトリー等の公知の方法を使用して得られる。単核球としては、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞及び体細胞幹細胞等の幹細胞から誘導されたものであってもよい。本発明においては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）等を単核球として好ましく使用できる。
【００１６】
細胞免疫療法において必要な単核球を採取するための従来の方法としては、成分採血装置を使用して血液中の白血球を分離する方法（この方法を「アフェレーシス」と言う）が知られている。しかし、アフェレーシスは、装置の運用に費用がかかる上に、装置の操作のために高度な技術が要求される。
【００１７】
さらに、細胞免疫療法によって所望の治療効果を得るためには、患者の体内に戻す全免疫細胞数は、例えば、リンパ球を用いる場合、１０億個以上であることが望ましい。しかし、血液中に存在する単核球の割合は少ないため、１０億個以上もの細胞数を確保するためには、通常、同一の対象から間隔をあけて複数回のアフェレーシスが行うことが必要となる。しかし、複数回のアフェレーシスは、体力的また時間的に非常に大きい負担を患者に与える。また、アフェレーシスで採取可能な単核球の数は患者の血液状態等によって変動する。
【００１８】
他方、本発明の製造方法においては、単核球を効率的に免疫細胞に分化させ、免疫細胞を増殖させることができるため、単核球を得るための血液の量が少なくて済み（例えば、１〜１００ｍＬ、好ましくは１〜５０ｍＬ）、かつ、１回の採血で十分であり得る。従って、本発明は、従来使用されてきたアフェレーシス等の方法と比較して、単核球を得るための患者に対する負担（費用、時間等）を著しく低減できる。ただし、本発明における単核球は、アフェレーシスによって得られたものであってもよい。
【００１９】
（培地）
第１の工程における培地はＩＬ−２（インターロイキン−２）及び／又はＩＬ−１５（インターロイキン−１５）と、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体とを含む。ＩＬ−２、ＩＬ−１５及び抗ＣＤ１６モノクローナル抗体を含む培地は、単核球を特に選択的にＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞等に分化させることができる点で好ましい。該培地により、単核球をＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞等に分化させ、これらの免疫細胞を増殖させることができる。
【００２０】
単核球からＮＫ細胞等への分化及び増殖のために好適な培地中のＩＬ−２の濃度は特に限定されないが、１〜２０００００ＩＵ／ｍＬ、好ましくは１００〜２０００００ＩＵ／ｍＬ、最も好ましくは１０００〜２０００００ＩＵ／ｍＬであってもよい。また、単核球からＮＫ細胞等への分化及び増殖のために好適な培地中のＩＬ−１５の濃度は特に限定されないが、１〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１〜５０ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは１〜３０ｎｇ／ｍＬであってもよい。また、単核球からＮＫ細胞等への分化及び増殖のために好適な培地中の抗ＣＤ１６モノクローナル抗体の濃度は特に限定されないが、１〜１０００００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜１０００００ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは１００〜１０００００ｎｇ／ｍＬであってもよい。ＩＬ−２、ＩＬ−１５及び抗ＣＤ１６モノクローナル抗体は、上記濃度範囲で第１の工程における培地中に配合できる。
【００２１】
本発明における培地には、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５、ならびに、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体に加えて、公知のＮＫ細胞刺激剤（抗ＮＫｐ４６抗体等）、ＮＫＴ細胞刺激剤（抗ＴＣＲＶａ２４抗体、抗ＴＣＲＶｂ１１抗体、アルファガラクトシルセラミド等）、γδＴ細胞刺激剤（抗ＴＣＲγ／δ抗体、ゾレドロン酸等）等が含まれていてもよい。これらの成分の培地中の配合量は、得ようとする細胞量等に応じて適宜調整できる。
【００２２】
本発明における培地には、単核球を培養可能とするための栄養成分や、ｐＨ調整剤等が含まれていてもよい。かかる成分を含む培地としては、特に限定されないが、リンパ球用無血清合成培地（ＫＢ５５０、ＫＢ５７０等）、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＣ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｘ−ＶＩＶＯ培地等が挙げられる。また、本発明における培地の形態は特に限定されず、調製前の成分混合物（粉体であるもの等）、調製済みの形態（液体であるもの等）等であってもよい。
【００２３】
本発明における培地には、細胞培養において通常使用される試薬が含まれていてもよい。このような試薬として、抗生物質（ゲンタマイシン、カナマイシン等）、アルブミン、血清（ヒト血清、ウシ胎仔血清等）、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、インスリン等の増殖因子、Ｌ−グルタミン、トランスフェリン等が挙げられる。
【００２４】
ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５と、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体とを含む培地は、公知の培地の製造方法によって調製でき、例えば、上記の培地成分にＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５と、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体とを添加することによって調製できる。また、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体を含む培地は、フラスコに抗ＣＤ１６モノクローナル抗体を予めプレコートしておき、該フラスコに抗ＣＤ１６モノクローナル抗体以外の培地成分を添加することによって、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体を含む培地を調製することもできる。
【００２５】
第１の工程における培養条件は特に限定されず、通常の細胞培養において使用する条件を使用できる。例えば、３０〜３８℃、５〜１０％ＣＯ２で培養してもよい。培養期間は単核球が活性化及び増殖し、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞等に分化及び増殖するために十分な期間でよく、３日間以上、好ましくは５日間であってもよい。また、長期間にわたって培養すると、単核球やＮＫ細胞等の活性が低減する可能性があるため、培養期間は１４日間以下であってもよい。しかし、１４日間以上の培養を行っても、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞等の増殖は進み得るため、例えば、２１日間の培養で、５０億以上もの細胞数を得ることも可能である。培養期間中、公知の方法で適宜培地交換を行うことで、長期間（例えば２１日間）の培養を行っても、細胞の活性を維持し得る。
【００２６】
＜第２の工程（Ｔ細胞増殖工程）＞
本発明における第２の工程は、上記の第１の工程の後に行われる。第２の工程においては、単核球を優先的に細胞傷害性Ｔ細胞に分化させる条件下で培養が行われ、第１の工程において刺激されにくかった（又は刺激されなかった）単核球が選択的にＴ細胞に分化し、さらには増殖する。また、第２の工程においては、第１の工程において分化し、さらには活性化及び増殖したＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞等が、第２の工程において活性化されたＴ細胞によって、直接又は間接的に刺激される。その結果、第２の工程は、Ｔ細胞を選択的に刺激する培養条件下で行われるものの、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞も増幅され得る。なお、本発明において「単核球を優先的にＴ細胞に分化させる条件」とは、単核球からＴ細胞に分化させるために一般的に使用される培養条件（例えば、抗ＣＤ３抗体の存在下での培養、抗ＣＤ３抗体及びＩＬ−２の存在下での培養、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２及びＩＬ−１５の存在下での培養、抗ＴＣＲ抗体の存在下での培養等）を指す。
【００２７】
単核球を優先的に細胞傷害性Ｔ細胞に分化させる条件で培養した後に、ＮＫ細胞等への分化を行おうとすると（つまり、第２の工程を第１の工程よりも先に行うと）、Ｔ細胞が多く増幅されるために、ＮＫ細胞等の割合が減少し、Ｔ細胞の割合が過多である免疫細胞含有組成物しか得られないため、単核球を複数の免疫細胞へバランス良く分化させ、これらの免疫細胞を増殖させることが難しい。
【００２８】
第２の工程においては、第１の工程後に培地交換等を行い、単核球からＴ細胞への分化及びＴ細胞の増殖が可能な培地中で細胞を培養する。このような培地としては、単核球からＴ細胞に分化させ、Ｔ細胞を増殖させることができる培地として公知のものを使用できる。具体的には、第１の工程において使用可能な培地（リンパ球用無血清合成培地等）中に１〜１００μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（例えば、抗ＣＤ３εモノクローナル抗体）を添加した培地を使用できる。
【００２９】
第２の工程における培養条件は特に限定されず、通常の細胞培養において使用する条件を使用できる。例えば、３０〜３８℃、５〜１０％ＣＯ２で培養してもよい。培養期間は単核球がＴ細胞に分化するために十分な期間でよく、４８時間以上、好ましくは３日間であってもよい。また、長期間にわたって培養すると、Ｔ細胞の増殖が過多となり、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞及びＴ細胞をバランス良く含む免疫細胞含有組成物が得られにくくなる可能性があるため、培養期間は７日間以下、好ましくは５日間以下、より好ましくは３日間以下であってもよい。また、培養中、従来公知の方法で適宜培地交換を行ってもよい。
【００３０】
第２の工程の後には、さらに、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５と、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体とを含む培地中で培養を行う第３の工程を設けてもよい。これにより、第１の工程で得られたＮＫ細胞等を増殖させることができ、免疫細胞含有組成物中のＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞及びＴ細胞の割合を調整できるため、より効率的に複数の免疫細胞をバランス良く含む免疫細胞含有組成物が得られる。第３の工程の条件としては、上記の第１の工程における条件を使用できる。
【００３１】
＜本発明の製造方法から得られる免疫細胞含有組成物＞
本発明の製造方法から得られる免疫細胞含有組成物には、従来の方法のように、特定の細胞の割合が過度とならずに、複数の免疫細胞がバランス良く含まれる。本発明において「複数の免疫細胞のバランスが良い」とは、免疫細胞含有組成物中の各免疫細胞の割合が生体内における割合に近いことを指す。ただし、免疫力を効率的に強化できるという観点から、免疫細胞含有組成物中のＮＫ細胞の割合が生体内における通常の割合よりも高くても、「複数の免疫細胞のバランスが良い」状態であると言える。複数の免疫細胞のバランスが良い状態としては、例えば、全細胞中、ＮＫ細胞４０〜６０％、ＮＫＴ細胞１５〜２５％、γδＴ細胞２〜５％、Ｔ細胞２０〜３０％、Ｔｒｅｇ細胞０．０１〜０．２％である状態が挙げられる。免疫細胞含有組成物中の各免疫細胞の割合はフローサイトメトリーによって特定できる。しかし、上記に例示した細胞のバランスは、患者の治療方針に応じて、培養条件の調整等によって適宜変更され得る。培養条件の調整の内容としては、例えば、培地中のＮＫ細胞刺激剤の量よりもＮＫＴ細胞刺激剤の量を増やすこと等が挙げられる。
【００３２】
本発明の製造方法によって得られた細胞がＮＫ細胞等であるかどうかは、フローサイトメトリーによって、得られた細胞の細胞表面マーカーを解析することで確認する。例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞及びＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ３−ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ３＋ＣＤ１９−細胞、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞、及びＣＤ３＋γδＴＣＲ＋細胞として特定される。また、Ｔ細胞及びＮＫＴ細胞は、それぞれ、抗ＴＣＲ  ａｌｐｈａ抗体、抗ＴＣＲＶ  ａｌｐｈａ２４抗体等によって特定できる。
【００３３】
また、本発明によれば、少ない血液（例えば、１〜１００ｍＬ、好ましくは１〜５０ｍＬ）から十分量の免疫細胞（例えば、１０６〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上）が得られるため、生体に負担をかけずに、細胞免疫療法において必要な量の免疫細胞を簡便に得ることができる。ここで、本発明において「免疫細胞の量」とは、少なくともＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＴ細胞の合計量（合計細胞数）を指す。さらに、本発明によれば、第１の工程及び第２の工程を合わせて、例えば合計１４日間という短い培養時間で、上記の十分量の免疫細胞を得られる。
【００３４】
本発明の製造方法から得られる免疫細胞含有組成物は、そのまま患者の治療に使用してもよく、従来公知の方法を使用して、凍結保存等で保存してもよい。本発明の製造方法から得られる免疫細胞含有組成物中の免疫細胞（ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞等）は、生理食塩水中等で維持しても、活性状態を維持している。免疫細胞の活性状態は、得られた細胞の細胞表面マーカー（ＣＤ６９等）をフローサイトメトリーによって解析することで確認できる。また、本発明の製造方法から得られる免疫細胞含有組成物に生理食塩水、ヒト血清アルブミン等を添加して癌治療用組成物を調製できる。この癌治療用組成物は、注射剤等として患者の体内に投与できる。
【００３５】
本発明の製造方法から得られる免疫細胞含有組成物中の免疫細胞（ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞等）は、細胞傷害活性を有するため、癌治療等に有効に使用できる。免疫細胞の細胞傷害活性は、５１Ｃｒリリース法等で判断できる。また、本発明の製造方法から得られる免疫細胞含有組成物中の免疫細胞は、抗腫瘍活性を有するＩＦＮ−γも産生し得る。ＩＦＮ−γは公知のＥＬＩＳＡ法等で測定できる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。【００３７】
＜参考試験１：健常人の血液中に含まれる各免疫細胞の割合＞
採血器具（商品名「ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｔｕｂｅ」、ベクトン・ディッキンソン社製）によって、６人の健常人の腕から血液を２４ｍＬ採血した。各血液からヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を回収し、得られたＰＢＭＣから、ヒトＮＫ細胞を得た。【００３８】
図１（Ａ）は、６人の各健常人についての、回収したＰＢＭＣの細胞数を示す。図１（Ｂ−１）は、得られたＰＢＭＣ中の代表的な細胞分布を示す。図１（Ｂ−２）は、得られたＰＢＭＣについての、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１９抗体及びＰＥ標識抗ＣＤ３抗体を使用したＦＡＣＳ分析の代表的な結果を示す。図１（Ｂ−１）中、「ＦＳＣ」とは、前方散乱（Ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ）を指し、「ＳＳＣ」とは側方散乱（Ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）を指す。【００３９】
また、表１及び２に、得られたＰＢＭＣ中の各細胞の割合を示す。なお、以下、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、及びγδＴ細胞は、それぞれ、ＣＤ３−ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ３＋ＣＤ１９−細胞、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞、及びＣＤ３＋γδＴＣＲ＋細胞である。【００４０】
【表１】
0005997296.tif 000002
【００４１】
【表２】
0005997296.tif 000003
【００４２】
＜実施例１：免疫細胞含有組成物の製造−１＞
（ＰＢＭＣの回収）
２４ｍＬの血液を４人の健常人から採取し（この時点を「Ｄａｙ  ０」とする）、ＰＢＭＣを回収した。【００４３】
図２は、得られたＰＢＭＣについての、下記の抗体の組み合わせのいずれかを使用したＦＡＣＳ分析の代表的な結果を示す。
抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ１９抗体
抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ５６抗体
抗ＣＤ３抗体及び抗γδＴＣＲ抗体
ＣＤ５６抗体及びγδＴＣＲ抗体
ＣＤ４抗体及びＣＤ２５抗体【００４４】
図２（Ａ）は、得られたＰＢＭＣにおけるリンパ球サブセットのパターンを示し、図２（Ｂ）は、得られたＰＢＭＣにおける単球のパターンを示す。【００４５】
（第１の工程）
次いで、得られたＰＢＭＣを、１７５ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２及び２５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−１５を添加した５０ｍＬの培地（ＫＢＭ５５０、コージンバイオ株式会社製）中で懸濁させ、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体でプレコートされた７５ｃｍ２フラスコ中で５日間培養した（この工程は「第１の工程」に相当し、最終培養日を「Ｄａｙ５」とする）。なお、以下、１７５ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２及び２５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−１５を添加し、プレコートされた抗ＣＤ１６モノクローナル抗体に接触させた培地を、「ＮＫ細胞増殖培地」と言う。該ＮＫ細胞増殖培地には、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及び抗ＣＤ１６モノクローナル抗体が含まれる。【００４６】
（第２の工程）
Ｄａｙ５において、細胞をフラスコから回収し、ＮＫ細胞増殖培地中で懸濁させ、ＮＫ細胞増殖培地（１５０ｍＬ）を入れ、抗ＣＤ３εモノクローナル抗体でプレコートされた、滅菌済みのガス透過性の細胞培養バッグ（２５０ｍＬ、コージンバイオ株式会社製）中で２日間培養した（この工程は「第２の工程」に相当し、最終培養日を「Ｄａｙ７」とする）。この培養物は、本発明の製造方法から得られる免疫細胞含有組成物に相当する。【００４７】
（第３の工程）
Ｄａｙ７において、培養後の細胞培養バッグを、ＮＫ細胞増殖培地（１０００ｍＬ）を入れた滅菌済みガス透過性の細胞培養バッグ（１Ｌ、コージンバイオ株式会社製）に連結し、さらに３７℃、５％  ＣＯ２での湿度環境下で７日間培養して（この工程は「第３の工程」に相当する）培養物を得た。この培養物は、本発明の製造方法から得られる免疫細胞含有組成物に相当する。【００４８】
図３は、上記の第１乃至３の工程を経て得られた免疫細胞含有組成物中の免疫細胞についてのＦＡＣＳ分析の代表的な結果を示す。図３の通り、培養後の各細胞の割合は、ＮＫ細胞＝７５．１％、ＮＫＴ細胞＝７．７％、γδＴ細胞＝４．９％、Ｔ細胞＝１６．７％、ＣＤ５６陰性γδＴ細胞＝１．１％、細胞傷害性γδＴ細胞＝３．８％、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）＝０．０５％、ヘルパーＴ細胞＝４．２％であった。つまり、本発明によれば、Ｔ細胞の割合が過度となることなく、ＮＫ細胞等をバランス良く増殖させることができる。【００４９】
＜実施例２：免疫細胞含有組成物の製造−２＞
実施例１と同様に「第１の工程」及び「第２の工程」を行い、培養前（「第１の工程」の前）及び培養後（「第１の工程」及び「第２の工程」の後）の各免疫細胞の割合を検討した。その結果を表３〜５に示す。【００５０】
【表３】
0005997296.tif 000004
【００５１】
【表４】
0005997296.tif 000005
【００５２】
【表５】
0005997296.tif 000006
【００５３】
表３〜５に示される通り、本発明によれば、Ｔ細胞の割合が過度となることなく、ＮＫ細胞等をバランス良く含む免疫細胞含有組成物が得られる。【００５４】
＜実施例３：免疫細胞含有組成物中の免疫細胞の活性＞
実施例１と同様に得た免疫細胞含有組成物を、１Ｌの培養培地（ＫＢＭ５５０、コージンバイオ株式会社製）で回収し、０．２％ヒト血清アルブミン（日本製薬株式会社製）を添加した１００ｍＬの医薬品グレードの生理食塩水（テルモ株式会社製）、又は、医薬品グレードの生理食塩水のみの中で再懸濁した。次いで、細胞を４℃で２４時間維持し、ＦＡＣＳで分析した。その代表的な結果を図４に示す。【００５５】
図４（１）及び（２）の通り、本発明の製造方法によって得られた免疫細胞含有組成物中の各免疫細胞は、２４時間の生理食塩水中の維持後においても、ＣＤ６９を発現していることが分かる。ＣＤ６９は細胞の活性化マーカーであるため、本発明の製造方法によって得られた免疫細胞含有組成物中の各免疫細胞は活性状態を維持できることが分かる。このような免疫細胞は、調製後、遠隔地等に輸送しても、輸送中に生じ得る活性の低減が抑えられていることが期待できる。【００５６】
＜実施例４：免疫細胞含有組成物の製造−３＞
実施例２と同様の試験を、培地を「ＫＢＭ５５０」の代わりに表６〜８に記載のものを使用して行った。なお、「ＫＢＭ５７０」はコージンバイオ株式会社製、「ＡＩＭ−Ｖ」はインビトロジェン社製、「Ｍｉｌｔｅｎｉ」はミルテニーバイオテク株式会社製である。表６〜８に、得られた免疫細胞含有組成物中の各免疫細胞の割合等を示す。なお、表６中、「培養開始時」とは「第１の工程」を行う前を指し、「培養後」とは「第１の工程」及び「第２の工程」を行った後を指す。【００５７】
【表６】
0005997296.tif 000007
【００５８】
【表７】
0005997296.tif 000008
【００５９】
【表８】
0005997296.tif 000009
【００６０】
表６〜８の通り、本発明によれば、使用する培地の種類に関わらず、Ｔ細胞の割合が過度となることなく、ＮＫ細胞等をバランス良く含む免疫細胞含有組成物が得られることが分かる。【００６１】
＜実施例５：免疫細胞含有組成物の製造−４＞
培地を「ＫＢＭ５５０」の代わりに表９〜１１に記載のものを使用して行い、かつ、ヒトＩＬ−２又はヒトＩＬ−１５のいずれかを添加した培地を使用する以外は、実施例２と同様の試験を行った。表９〜１１に、得られた免疫細胞含有組成物中の各免疫細胞の割合等を示す。なお、表中、「培養開始時」又は「培養前」とは「第１の工程」を行う前を指し、「培養後」とは「第１の工程」及び「第２の工程」を行った後を指す。【００６２】
【表９】
0005997296.tif 000010
【００６３】
【表１０】
0005997296.tif 000011
【００６４】
【表１１】
0005997296.tif 000012
【００６５】
表９〜１１の通り、ヒトＩＬ−２又はヒトＩＬ−１５のいずれかの存在下においても、本発明によれば、Ｔ細胞の割合が過度となることなく、ＮＫ細胞等をバランス良く含む免疫細胞含有組成物が得られる。【００６６】
＜実施例６：細胞傷害活性の測定＞
実施例２と同様に免疫細胞含有組成物を得た。得られた免疫細胞含有組成物を、１５ｍＬ遠心管に入れ、遠心分離（１４００ｒｐｍ、５分）を行い、上清を除去して細胞を得た。得られた細胞について、ヒト赤芽球様白血病細胞（Ｋ５６２）を使用して、５１Ｃｒリリース法（エフェクター細胞（免疫細胞含有組成物中の細胞数）及びターゲット細胞（Ｋ５６２の細胞数）の比（Ｅ：Ｔ）＝２０：１）を行い、細胞傷害活性を算出した。その結果を図５に示す。【００６７】
なお、細胞傷害活性は、下式に基づいて算出した。式中、「ｃｐｍ（ｃｏｕｎｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅｓの略である）」とは１分間あたりの放射線の数を示す。
（（ｍｅａｎ  ｃｐｍ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ  −  ｍｅａｎ  ｃｐｍ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅ）／（ｍｅａｎ  ｃｐｍ  ｍａｘｉｍａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ  −  ｍｅａｎ  ｃｐｍ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅ））  ×  １００【００６８】
図５の通り、本発明によれば、細胞傷害活性の高い免疫細胞が得られることが分かる。【００６９】
＜参考試験２：第１の工程及び第２の工程の順序に関する検討＞
実施例１と同様にしてＰＢＭＣを得た。次いで、１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３モノクローナル抗体をプレコートした７５ｃｍ２フラスコに、５０ｍＬの培地（ＫＢＭ５５０、コージンバイオ株式会社製）を添加し、該培地中で７日間培養した後（この工程は「第２の工程」に相当する）、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体をプレコートした７５ｃｍ２フラスコに、ＩＬ−２及びＩＬ−１５を含む５０ｍＬの培地（ＫＢＭ５５０、コージンバイオ株式会社製）を添加し、該培地中で７日間培養した（この工程は「第１の工程」に相当する）。表１２〜１４は、培養前（「第２の工程」の前）及び培養後（「第２の工程」及び「第１の工程」の後）細胞についてのＦＡＣＳ分析の結果を示す。【００７０】
【表１２】
0005997296.tif 000013
【００７１】
【表１３】
0005997296.tif 000014
【００７２】
【表１４】
0005997296.tif 000015
【００７３】
表１２〜１４の通り、抗ＣＤ３モノクローナル抗体の存在下での培養工程（つまり、第２の工程）が、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及び抗ＣＤ１６モノクローナル抗体の存在下での培養工程（つまり、第１の工程）の前に設けられると、Ｔ細胞の割合が過度となり、ＮＫ細胞等をバランス良く含む免疫細胞含有組成物が得られないことが分かる。
【図１】
0005997296.tif 000016
【図２】
0005997296.tif 000017
【図３】
0005997296.tif 000018
【図４】
0005997296.tif 000019
【図５】
0005997296.tif 000020