(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子と、
ＤＮＡ結合分子及び分枝状リンカーを含むＤＮＡ結合部分とを含むコンジュゲートであって、ＤＮＡ結合分子が副溝バインダー、主溝バインダー、ＤＮＡ介入剤、ＤＮＡアルキル化剤、又はそれらの組合せであり、コンジュゲートが次の構造：
ナノ粒子−リンカー−ＤＮＡ結合分子
を有し、
ＤＮＡ結合分子が
0005943943.tif 000022
である、コンジュゲート。
【請求項２】
ナノ粒子が、量子ドット、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子又は遷移金属複合体ナノ粒子を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
ＤＮＡ結合部分が、４',６-ジアミジノ-２-フェニルインドール(ＤＡＰＩ)、ビス-ベンズイミド染料、ソラレン、又はナフタレンジイミドから選択されるＤＮＡ結合分子を含む、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
分枝状リンカーが、１〜３０炭素原子長さの脂肪族鎖又はｎが２〜１５である(-ＯＣＨ２ＣＨ２-)ｎを含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
分枝状リンカーが多官能性リンカーを含み、複数のＤＮＡ結合分子が多官能性リンカーに結合している請求項１〜４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
固定された組織試料における核を可視化する方法において、
組織試料をプロテアーゼで前処理して前処理された組織試料を形成し；
前処理された組織試料を、請求項１から５の何れか一項に記載のコンジュゲートと共に、コンジュゲートが前処理された組織試料内に核を挿入させるのに十分な条件下でインキュベートし、ここでコンジュゲートは核内においてＤＮＡに結合しており；
ナノ粒子を可視化させ、よって核を可視化させる
ことを含む方法。
【請求項７】
ナノ粒子が量子ドットを含み、ナノ粒子の可視化が、量子ドットの光安定性蛍光の可視化を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
コンジュゲートが、少なくとも２０ｎＭの濃度で組織試料と共にインキュベートされる請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
核の特性を定量的に測定するコンピューター画像解析技術を使用することをさらに含む請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
核の特性が、染色体分布、倍数性、形状、サイズ、テクスチャ特性、コンテクスチャ特性、又はそれらの組合せを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組織試料がプロテアーゼで４〜８分間前処理され、組織試料がプロテアーゼでの前処理前に固定される請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
コンジュゲートと共に前処理された組織試料をインキュベートする前に、組織試料内の標的にハイブリダイズ可能なプローブを提供し；
プローブが組織試料内の標的にハイブリダイズするのに十分な条件下でプローブを組織試料と共にインキュベートし；
プローブを検出する
ことをさらに含む請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
プローブの検出が、プローブと結合した量子ドットの可視化を含み、コンジュゲートのナノ粒子が、プローブと結合した量子ドットとは異なる波長で蛍光を発光可能な量子ドットを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
組織試料について蛍光インサイツハイブリダイゼーション法を実施することをさらに含む請求項６〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
蛍光インサイツハイブリダイゼーション法が、ＨＥＲ２アッセイ、ＴＭＰＲＳＳ２-ＥＲＧアッセイ、Ｃｈｒ１７アッセイ、又はそれらの組合せを含む請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、組織試料における核染色のためのシステム及び方法に関する。定量的核測定値を蛍光顕微鏡検査下の病理試料から得ることができる。ある実施態様では、本発明は、同じスライド上で他のマルチプレックステストを用いて核の形態及びテクスチャを同時に測定するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
自動化画像解析による核の特徴の測定は、様々な疾患状態の検出、診断及び予後における強力なアプローチ法である。これらの特徴は、伝統的に、形態、倍数性、テクスチャ及びコンテクスチャ（周囲の状況：contextual）特性を含む。この技術の最も成功した一実施態様は、HologicＴＭ(ThinPrep(登録商標) Imaging System) 及び Becton、Dickinson and Company (FocalPointＴＭ)からの市販の画像システムの形で 腫瘤性子宮頸癌のスクリーニングに適用されている。他の市販のシステムは、口腔癌と肺癌のそれぞれの初期検出のためのPerceptronix Medical Inc. LaboratoriesのOralAdvanceＴＭ及びLungSignＴＭを含む。
【０００３】
核の形態は、一般的に、形状及びサイズの測定；例えば、周囲の丸みを記述するものに関係している。倍数性は、異数性と呼ばれる異常な染色体数を測定するために、化学量論的染色プロトコル(例えば、Thionin-Feulgen)を介して一般的に適用され、核領域を通って、積分された光学密度の測定を含む。テクスチャ分析法は、一般的に、統計学的又は構造学的に考慮される。双方のアプローチにより、核の内部構造の空間的及び強度的変動又はクロマチンパターンの記述的測定がなされる。最後に、コンテクスチャ特性は、組織構造内における核間配置の空間的分布を測定する。
【０００４】
これらの方法の全ては、様々な組織型において正常な状態と異常な病態を成功裏に識別するために個々にまた組合せて適用されている。この研究の焦点は一般に明視野像に適用されており、また蛍光顕微鏡に対するそのようなアプローチ法の評価についていくつかの研究が実施されている。
【０００５】
しかしながら、伝統的なフルオロフォアは、この様式に対するそのような技術の適用におけるその有用性を低減せしめるいくつかの問題に悩まされている。光退色（フォトブリーチング）は、経時的に、また画像保存に必要な時間枠においてさえも、試料のシグナルを低減させる重要な問題である。標的分子(例えば、ＤＮＡ)に対する感度及び特異性は、伝統的な染色方法の限定因子でもある。例えば、広く使用されているＤＡＰＩ(４',６-ジアミジノ-２-フェニルインドール)核対比染色は、細胞核の位置及び形状を見出すのに有用であるが、核テクスチャを説明可能にするように特異的には結合しない。ＤＮＡ対比染色及びマーカーとして使用される他の蛍光染料はヘキスト染色(例えば、ヘキスト３３２５８及びヘキスト３３３４２)及びヨウ化プロピジウムを含む。しかしながら、これらの物質は、光ルミネセンス強度及びスペクトルシフトの光誘発性劣化を被る。
【０００６】
ＤＮＡ対比染色及びマーカーとしての蛍光染料の使用における既存の従来技術は、小分子の有機及び無機複合体を利用する。ナノ物質ベースの対比染色システムの適用は、その光安定な光学的特性のため、小分子フルオロフォアの使用における固有の欠点を克服する手段を提供する。ＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー転移)又はＰＥＴ(光誘起電子移動)ベースのシステムを使用してＤＮＡを検出するために量子ドットナノ物質が普通は使用されている。(Dubertret, Nature Materials (2005), 4(11): 797-798.)ナノ物質を使用する他の適用は、それらの相補的ＤＮＡ配列標的にハイブリダイズ可能な核酸ベースのプローブにコンジュゲートした量子ドットの使用である。(Bentolilaら, Cell Biochemistry and Biophysics (2006), 45(1):59-70.)。量子ドットは、標的配列に対する可視レポーターとして作用する。しかしながら、このような染色の適用は、一般的にＤＮＡ分子に結合可能な標識化ＤＮＡプローブが標的遺伝子にハイブリダイズし、よって標的遺伝子プローブのハイブリダイゼーションが防止され、標的遺伝子の存在がマスキングされるため、ＴＭＰＲＳＳ-ＥＲＧ及びＨＥＲ２ ＦＩＳＨ(蛍光インサイツハイブリダイゼーション)アッセイと両立しない。固定された細胞及び組織において核ＤＮＡを染色するためにＤＮＡ相互作用分子と共に量子ドットを使用することは科学文献には報告されていない。
【発明の概要】
【０００７】
ナノ粒子／ＤＮＡ結合部分コンジュゲート及び核を可視化するためにコンジュゲートを使用する方法の実施態様が開示される。本方法を実施するためのキットがまた開示される。
【０００８】
コンジュゲートの実施態様は、ナノ粒子(例えば、量子ドット、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、遷移金属複合体ナノ粒子)とＤＮＡ結合分子を含むＤＮＡ結合部分とを含む。特に開示される実施態様は、粒子ドットとＤＮＡ結合分子を含むＤＮＡ結合部分とを含むコンジュゲートに関する。ＤＮＡ結合分子は、副溝バインダー、主溝バインダー、ＤＮＡ介入物、ＤＮＡアルキル化剤、又はそれらの組合せでありうる。いくつかの実施態様では、ＤＮＡ結合分子は、４',６-ジアミジノ-２-フェニルインドール(ＤＡＰＩ)、ビス-ベンズイミド染料、ソラレン、又はナフタレンジイミドである。
【０００９】
いくつかの実施態様では、ＤＮＡ結合部分は、コンジュゲートがナノ粒子-リンカー-ＤＮＡ結合分子の構造を有するようにリンカー(例えば、脂肪族鎖又はポリアルキレングリコール)をさらに含む。特に開示された実施態様では、コンジュゲートは、量子ドット-リンカー-ＤＮＡ結合分子の構造を有する。特定の実施態様では、ＤＮＡ結合部分は、多官能性リンカーと複数の副溝バインダー、ＤＮＡ介入物、ＤＮＡアルキル化剤、又はその組合せを含む。例えば、多官能性リンカーは、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステルに結合した２のポリエチレングリコール鎖を含み、ＤＮＡ結合分子は、各ポリエチレングリコール鎖に結合している。特定の実施態様では、ＤＮＡ結合部分は、
0005943943.tif 000002
から選択される。
【００１０】
核は組織試料、例えば固定化組織試料を、核を透過処理するプロテアーゼで前処理し、ついで、前処理された組織試料をナノ粒子／ＤＮＡ結合分子コンジュゲートと共にインキュベートすることにより可視化される。コンジュゲートは核に入り、核内でＤＮＡに結合する。ついで、ナノ粒子は可視化され、よって核が可視化される。いくつかの実施態様では、ナノ粒子は量子ドットであり、量子ドット蛍光が検出されて核が可視化される。
【００１１】
コンジュゲートは、少なくとも５ｎＭ、例えば少なくとも２５ｎＭ、又は少なくとも５０ｎＭの濃度で組織試料と共にインキュベートされる。ナノ粒子が可視化されたときに核の画像が得られ、コンピュータ及び画像解析技術を使用して、核の特性、例えば染色体分布、倍数性、形状、サイズ、テクスチャ特性(例えば、表面積)、コンテクスチャ特性(例えば、核境界までの距離)、及びそれらの組合せを定量的に測定することができる。
【００１２】
ある実施態様では、一又は複数の付加的な手順が組織試料について実施される。例えば、組織試料内の一又は複数の標的にハイブリダイズ可能なもの又はプローブが組織試料に適用されて検出されうる。いくつかの例において、ハイブリダイズしたプローブは、プローブと結合した量子ドットを可視化することにより検出される。ナノ粒子／ＤＮＡ結合分子コンジュゲートが量子ドットを含むならば、プローブの量子ドットは、コンジュゲートの量子ドットとは異なる波長で蛍光を発するように選択される。特定の実施態様では、付加的な手順は蛍光インサイツハイブリダイゼーション手順である。
【００１３】
本方法の実施態様を実施するためのキットは、プロテアーゼ酵素組成物、ナノ粒子／ＤＮＡ結合分子コンジュゲート、及び反応バッファーを含む。プロテアーゼ酵素組成物は、プロテアーゼ酵素がタンパク質分解活性を示すことができる程度に十分な塩濃度及びｐＨを有するバッファー中にプロテアーゼ酵素を含む。反応バッファーは、プロテアーゼ酵素組成物で前処理された組織試料内においてコンジュゲートが核に入るのを可能にするのに十分な塩濃度及びｐＨを有する。
【００１４】
本発明の上述の、また他の目的、特性及び利点は、添付図を参照して記載される以下の詳細な説明からさらに明らかになるであろう。また、その一例として、以下の発明の例が参照され得る。
（１）量子ドットと；
ＤＮＡ結合分子を含むＤＮＡ結合部分を含むコンジュゲートであって、ＤＮＡ結合分子が主溝バインダー、ＤＮＡ介入剤、ＤＮＡアルキル化剤、又はそれらの組合せであるコンジュゲート。
（２）ＤＮＡ結合部分が、４',６-ジアミジノ-２-フェニルインドール(ＤＡＰＩ)、ビス-ベンズイミド染料、ソラレン、又はナフタレンジイミドから選択されるＤＮＡ結合分子を含む、（１）に記載のコンジュゲート。
（３）ＤＮＡ結合部分がリンカーをさらに含み、コンジュゲートが次の構造：
量子ドット−リンカー−ＤＮＡ結合分子
を有する（１）に記載のコンジュゲート。
（４）リンカーが、１〜３０炭素長さの脂肪族鎖又はｎが２〜１５である(-ＯＣＨ２ＣＨ２-)ｎを含む（３）に記載のコンジュゲート。
（５）リンカーが多官能性リンカーであり、複数のＤＮＡ結合分子が多官能性リンカーに結合している（３）に記載のコンジュゲート。
（６）ＤＮＡ結合部分が
0005943943.tif 000003
である（３）に記載のコンジュゲート。
（７）核を可視化する方法において、
組織試料をプロテアーゼで前処理して前処理された組織試料を形成し；
前処理された組織試料を、ａ）ナノ粒子及びｂ）ＤＮＡ結合分子を含むＤＮＡ結合部分を含むコンジュゲートと共に、コンジュゲートが前処理された組織試料内に核を挿入させるのに十分な条件下でインキュベートし、ここでコンジュゲートは核内においてＤＮＡに結合しており；
ナノ粒子を可視化させ、よって核を可視化させる
ことを含む方法。
（８）ナノ粒子が、量子ドット、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、又は遷移金属錯体ナノ粒子を含む（７）に記載の方法。
（９）ナノ粒子が量子ドットを含み、ナノ粒子の可視化が、量子ドットの光安定性蛍光の可視化を含む（７）に記載の方法。
（１０）ＤＮＡ結合分子が副溝バインダー、主溝バインダー、ＤＮＡ介入剤、ＤＮＡアルキル化剤、又はそれらの組合せである（７）に記載の方法。
（１１）ＤＮＡ結合分子が、４',６-ジアミジノ-２-フェニルインドール(ＤＡＰＩ)、ビス-ベンズイミド染料、ソラレン、又はナフタレンジイミドである（１０）に記載の方法。
（１２）ＤＮＡ結合部分がリンカーをさらに含み、コンジュゲートが次の構造：
ナノ粒子−リンカー−ＤＮＡ結合分子
を有する（７）に記載の方法。
（１３）ＤＮＡ結合部分が
0005943943.tif 000004
である（１２）に記載の方法。
（１４）コンジュゲートが、少なくとも２０ｎＭの濃度で組織試料と共にインキュベートされる（７）に記載の方法。
（１５）核の特徴を定量的に測定するコンピューター画像解析技術を使用することをさらに含む（７）に記載の方法。
（１６）核の特性が、染色体分布、倍数性、形状、サイズ、テクスチャ特性、コンテクスチャ特性、又はそれらの組合せを含む（１５）に記載の方法。
（１７）組織試料がプロテアーゼで４−８分前処理され、組織試料がプロテアーゼでの前処理前に固定される（７）に記載の方法。
（１８）コンジュゲートと共に前処理された組織試料をインキュベートする前に、組織試料内の標的にハイブリダイズ可能なプローブを提供し；
プローブが組織試料内の標的にハイブリダイズするのに十分な条件下でプローブを組織試料と共にインキュベートし；
プローブを検出する
ことをさらに含む（７）に記載の方法。
（１９）プローブの検出が、プローブと結合した量子ドットの可視化を含む（１８）に記載の方法。
（２０）コンジュゲートのナノ粒子が、プローブと結合した量子ドットとは異なる波長で蛍光を発光可能な量子ドットを含む（１９）に記載の方法。
（２１）組織試料について蛍光インサイツハイブリダイゼーション法を実施することをさらに含む（７）に記載の方法。
（２２）蛍光インサイツハイブリダイゼーション法が、ＨＥＲ２アッセイ、ＴＭＰＲＳＳ２-ＥＲＧアッセイ、Ｃｈｒ１７アッセイ、又はそれらの組合せを含む（２１）に記載の方法。
（２３）核を可視化するためのキットであって、
プロテアーゼ酵素及びプロテアーゼバッファーを含有し、プロテアーゼバッファーが、プロテアーゼ酵素がタンパク質分解活性を示すのに十分な塩濃度及びｐＨを有するプロテアーゼ酵素組成物、
ａ）ナノ粒子とｂ）ＤＮＡ結合分子を含むＤＮＡ結合部分とを含むコンジュゲート；
プロテアーゼ酵素組成物で前処理された組織試料内にコンジュゲートが核を挿入するのを可能にするのに十分な塩濃度及びｐＨを有する反応バッファー
を含むキット。
（２４）ナノ粒子が、量子ドット、金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、又は遷移金属錯体ナノ粒子を含む（２３）に記載のキット。
（２５）ＤＮＡ結合分子が、副溝バインダー、主溝バインダー、ＤＮＡ介入剤、ＤＮＡアルキル化剤、又はそれらの組合せである（２３）に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＤＮＡに結合したＤＮＡ結合部分-量子ドットコンジュゲートの概略図である。
【図２】プロテアーゼ組織核の対比染色に使用されるＤＮＡ結合部分-量子ドットコンジュゲートの一実施態様の、ＤＡＰＩフィルターを使用したカラー写真である。
【図３Ａ】量子ドット-ＤＡＰＩコンジュゲートで対比染色された細胞核の写真である。
【図３Ｂ】ＤＡＰＩで対比染色された細胞核の写真である。
【図４】量子ドット-ソラレンコンジュゲートで対比染色された上皮組織核を例証する写真である。
【図５】量子ドット-ナフタレンジイミドコンジュゲート(ＱＤ４９０：ヌクＮＤＩ-Ｃ６)で対比染色された前立腺組織核を例証する写真である。
【図６】量子ドットＱＤ５６５及びＱＤ６５５を含むＴＭＰＲＳＳ２プローブを利用するＦＩＳＨアッセイと合わせての、前立腺組織核のＱＤ４９０：ＮＤＩ-Ｃ６コンジュゲート対比染色を例証する写真である。
【図７】量子ドットＱＤ５６５とＱＤ６５５を含むＨＥＲ２-ＣＨＲ１７プローブを利用するＦＩＳＨアッセイと合わせての、前立腺組織核のＱＤ４９０：ＮＤＩ-Ｃ６コンジュゲート対比染色を例証する写真である。
【図８】量子ドットＱＤ５６５、ＱＤ５８５、ＱＤ６０５、及びＱＤ６５５にコンジュゲートしたＴＭＰＲＳＳ２、ＥＲＧ５'３'、ＳＬＣ４５Ａ３、及びＥＴＶ１プローブを利用するＦＩＳＨアッセイと合わせての、前立腺組織核のＱＤ４９０：ＮＤＩ-Ｃ６コンジュゲート対比染色を例証する写真である。
【図９】Ｒ１及びＲ２が独立して、置換又は未置換の脂肪族、置換又は未置換の芳香族、芳香族複素環、又はポリアルキルヘテロ原子鎖、例えばアルキレンオキシド鎖(例えば、ポリアルキレングリコール)であるＤＮＡ結合分子に、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)エステル部分を付加するための合成スキームである。
【図１０】量子ドット上の遊離アミン基とＤＮＡ結合部分のスクシンイミジルエステル間の反応を示すもので、量子ドット-ＤＮＡ結合部分コンジュゲートが生成される。
【図１１】４９０ｎｍ、５６５ｎｍ及び６５５ｎｍで蛍光を発する量子ドットの混合物の蛍光スペクトルである。
【図１２】ＴＭＰＲＳＳ２アッセイ実施後の前立腺組織細胞の写真である。核は２５ｎＭの濃度でＱＤ４９０：ＮＤＩ-Ｃ６コンジュゲートを用いて対比染色される。ＱＤ５６５及びＱＤ６５５量子ドットを利用するＦＩＳＨプローブもまた明確に可視化されている。
【図１３】ＨＥＲ２-Ｃｈｒ１７アッセイ実施後の乳房組織細胞の写真である。核は、２５ｎＭの濃度でＱＤ４９０：ＮＤＩ-Ｃ６コンジュゲートを用いて対比染色される。ＱＤ５６５及びＱＤ６５５量子ドットを利用するＦＩＳＨプローブもまた明確に可視化されている。
【図１４】前立腺組織の暗視野画像である。核はＱＤ４９０：ＮＤＩ-Ｃ６コンジュゲートで対比染色されている。
【図１５】図１４の暗視野画像を転換させることにより作製された擬似明視野ヘマトキシリン及びエオシン組織染色である。
【図１６】ＱＤ４９０：ＮＤＩ-Ｃ６コンジュゲートで染色された肺組織の写真である。
【図１７】ＱＤ４９０：ＮＤＩ-Ｃ６コンジュゲートで染色された頸部組織の写真である。
【図１８】化合物(１１)、スキーム４の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図１９】化合物(１１)、スキーム４の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一般的に、本開示は、蛍光顕微鏡において、核の特徴をレンダリングし、測定するための、改善されたシステム及び方法に関する。特に興味深いのは、予め、明視野モダリティーにおいてのみ可能な方式で、核テクスチャをレンタリングする能力である。さらに、開示されたシステム及び方法の実施態様は、付加的な染色プロトコルと干渉せず、よって、同じ組織からの情報の複数の供給源の同時測定が可能になる。
【００１７】
核テクスチャ測定値は、広くは次の領域に分類されうる：１）クロマチン分布の記述的統計；２）離散的組織特性；３）範囲極値；４）マルコフ(markovian)；５）ランレングス、及び６）フラクタルテクスチャ特性。これらのアプローチの全ては、細胞核内のクロマチン(ヘテロクロマチン及びユークロマチン)パターンの、高度染色感度、特異性及びコントラストを必要とする。これらの方法は、画像強度が空間分布と共に変化する方法を測定し、記述する。例えば、相対的に均質な核染色、例えばＤＡＰＩはほとんど又は全くテクスチャ情報を生じせしめないが、明視野チオニン-フォイルゲン(Thionin Feulgen)染色は、正常と異常な病態を区別するのに使用されうる高レベルのテクスチャ情報を生じる。
【００１８】
核照合のための染色方法のさらに望ましい特性は化学量論であり、これは、ＤＮＡ数と染色強度の間の直接的な相関関係に関連する。化学量論により、強固な倍数性分析が可能になり、異常な染色体セットが検出可能となる。伝統的な蛍光核対比染色、例えばＤＡＰＩの欠点は、それらが本来的に化学量論的ではなく、光退色条件下でさらに色あせし、標的分子と画像強度との間の相関関係を分離させることである。
【００１９】
本開示は、ＤＮＡの構造及び量の優先的な可視化及び測定を可能にする光学的レポーターとＤＮＡ相互作用プローブの組合せを提供する。ナノ物質にコンジュゲートしたＤＮＡ結合部分の実施態様が開示される。ＤＮＡ結合分子は、細胞核においてＤＮＡへナノ物質を向け結合させることを可能にする。図１は、ＤＮＡ結合部分と、ＤＮＡに結合したそのコンジュゲートナノ物質(例えば量子ドット)を示す概略図である。また開示されるのは、核を定め、その境界を描写し、細胞におけるその形態を確立するために、ＤＮＡ結合部分／ナノ物質コンジュゲートを使用する方法の実施態様である。図２は、前立腺組織核を対比染色するために使用されるＤＮＡ結合部分／ナノ物質コンジュゲートのＤＡＰＩフィルター画像である。
【００２０】
開示されたナノ物質、例えば量子ドット、及びＤＮＡ結合部分の実施態様は、組織において核を蛍光的に定め描写する手段を提供する。量子ドットは光安定な蛍光シグナルを提供する。 光安定な発光、広範囲の吸収スペクトル(量子ドットの吸収スペクトルは紫外線領域の上又は下に及んでおり、量子ドットの大きさに応じて、可視領域にも伸長可能)、及び高い量子収率(例えば、＞３０％、＞５０％、又は＞８０％)であるため、量子ドットは、それらの小分子カウンターパートと比較して、優れたフルオロフォアである。これは、ＦＩＳＨアッセイ、例えば蛍光ＨＥＲ２及びＴＭＰＲＳＳ２-ＥＲＧアッセイと合わせて組織における核の蛍光染色を可能にする。
【００２１】
ＤＮＡ結合分子は、主及び／又は副溝結合、インターカレーション、ホスフェート骨格結合、及び／又はＤＮＡアルキル化を介してＤＮＡに結合する有機、無機、及び遷移金属錯体である。様々なＤＮＡ結合剤は、ぞれぞれナノ物質をＤＮＡに指向させるが、各ＤＮＡ結合剤の特定の親和性は、核におけるＤＮＡの染色プロファイルを決定する。ＤＮＡ結合剤のレパートリーが高い分子選択性及び位置選択性を可能にする。
【００２２】
Ｉ．用語及び定義
以下の解釈の用語及び略語が、本開示をより良好に記述し、本開示の実施において当業者の指針となるように提供される。ここで使用される場合、「含む(comprising)」は「含む(including)」を意味し、単数形態「ａ」又は「ａｎ」又は「ｔｈｅ」は、特に明確に示されない限り、複数への言及を含む。「又は」なる用語は、特に明確に示されない限り、言及される代替要素の単一の要素あるいは２以上の要素の組合せを意味する。
【００２３】
他に説明されないならば、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、この開示が属する分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。ここに開示のものに類似した又は均等な方法及び物質を、本開示の実施又は試験に使用可能であるが、適切な方法及び物質を以下に記載する。物質、方法及び例は、例証のためのものであって、限定を意図するものではない。本開示の他の特徴は、以下の詳細な記載及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２４】
特に示されない限り、明細書又は特許請求の範囲において使用される成分量、分子量、パーセント、温度、時間等を表す全ての数字は、「約」なる用語で修飾されていると理解される。従って、特に示されない限り、暗示的にも明示的にも、記載される数値パラメーターは、標準的な試験条件／方法下での検出限界及び／又は追求される所望の特性に依存しうる概数である。検討された従来技術から実施態様を直接的かつ明示的に区別する場合、「約」なる用語が記載されていないならば、実施態様の数字は概数ではない。
【００２５】
分子生物学で一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes VII, Oxford UniversityPress出版, 2000 (ISBN 019879276X)；Kendrewら (編), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Publishers出版, 1994 (ISBN 0632021829)；及びRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, Wiley, John & Sons, Inc出版., 1995 (ISBN 0471186341)；及び他の同様の文献に見出すことができる。化学における一般的な用語の定義は、例えばRichard J. Lewis, Sr. (編), Hawley's Condensed Chemical Dictionary, John Wiley & Sons, Inc出版., 1997 (ISBN 0-471-29205-2)に見出すことができる。
【００２６】
本開示の様々な実施態様の理解を容易にするために、特定の用語の以下の説明を提供する：
【００２７】
脂肪族：実質的に炭化水素ベースの化合物、又はその基(例えば、ヘキサン基についてはＣ６Ｈ１３)で、アルカン、アルケン、アルキンで、その環状系を含み、さらに直鎖状及び分枝状配置のもの、及び全ての立体及び位置異性体をまた含む。他に明言されない限り、脂肪族基は１から２５の炭素原子；例えば１から１５、１から１０、１から６、又は１から４の炭素原子を含む。「低級脂肪族」なる用語は、１から１０の炭素原子を含む脂肪族基を意味する。脂肪族鎖は置換されていても、未置換であってもよい。「未置換脂肪族」と明示的に称されない限り、脂肪族基が未置換であるか又は置換されうることを意味する。脂肪族基は一又は複数の置換基(脂肪族鎖において、各メチレン炭素については２までの置換基、又は脂肪族鎖において、-Ｃ=Ｃ-二重結合の各炭素については１までの置換基、又は末端メチン基の炭素については１までの置換基)で置換可能である。例示的な脂肪族置換基の例には、例えば、アミン、アミド、スルホンアミド、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、ヒドロキシ、メルカプト、トリフルオロメチル、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、チオアルコキシ、アリールアルキル、ヘテロアリール、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、又は他の官能性が含まれる。
【００２８】
芳香族又はアリール化合物は、典型的には交互の単結合及び二重結合を有する未飽和の環状炭化水素である。ベンゼン、つまり３つの二重結合を含む６炭素環が、典型的な芳香族化合物である。
【００２９】
ビスは、「２回」又は「再び」を意味する接頭辞である。分子において化学基又は基が２回生じていることを示すために化学命名法において使用される。
【００３０】
コンビレキシン：介入物と配列特異的な副溝結合性ポリアミド鎖を組合せる分子。
【００３１】
コンジュゲート：ナノ粒子、例えば量子ドットと、任意の適切な手段を用いて、直接的又は間接的に、ナノ粒子に効果的にカップリングされた分子を有する化合物。例えば、分子は、ナノ粒子に、共有的又は非共有的（例えば静電的）にカップリングされうる。ナノ粒子への分子の間接的結合は、リンカーが、量子ドットの発光性又は分子の官能性に負の影響を及ぼさない限り、例えば「リンカー」を使用することにより、また可能となる。当該技術分野で知られている分子リンカーには、脂肪族化合物、アルキレンオキシド、第１級アミン、チオール類、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ビオチン、又は類似の化合物が含まれる。
【００３２】
コンジュゲート化、連結(joining)、結合又は連結(linking)：第１単位の第２単位へのカップリング。限定されるものではないが、これには、一方の分子から他方の分子への共有結合、一方の分子から他方の分子への非共有結合(例えば、静電気的結合)(例えば、静電気的コンジュゲーション法を開示する米国特許第６９２１４９６号を参照)、水素結合による一方の分子から他方の分子への非共有結合、ファンデルワールス力による一方の分子から他方の分子への非共有結合、及びこのような結合の任意の及び全ての組合せが含まれる。
【００３３】
対比染色は、それらの構造が顕微鏡下で容易に可視化できるように、一又は複数の標的を検出するために薬剤を用いて既に染色した後の試料の後処理方法である。例えば、対比染料が、場合によっては、免疫組織化学染色をより明確にするためにカバースリッピング前に使用される。対比染料は、１次染料とは色が異なる。多くの対比染料、例えばヘマトキシリン、エオシン、メチルグリーン、メチレンブルー、ギムザ、アルシアンブルー、ＤＡＰＩ、及びニュークリアファストレッド(Nuclear Fast Red)がよく知られている。いくつかの例では、対比染色を生じさせるために１より多い染料を混合することができる。これにより、染料選択の順応性及び能力がもたらされる。例えば、第１染料は、特定の特性を有する混合物に対して選択されうるが、異なる所望の特性は有していない。第２染料は、不足した所望の特性を示す混合物に添加されうる。例えば、トルイジンブルー、ＤＡＰＩ、及びポンタミンスカイブルーを互いに混合して対比染料を形成することができる。
【００３４】
検出：薬剤(例えば、単一又は特定の抗原、タンパク質又は核酸)が、例えば試料中に存在するか又は存在しないかを決定すること。いくつかの例では、これは、定量、及び／又は位置決定、例えば細胞又は特定の細胞区画内の位置決定をさらに含みうる。「検出する」とは、存在するかしないかを決定する方法、例えば標的分子が生体試料に存在するかどうかを決定する任意の方法を意味する。例えば、「検出する」は、試料が特定の特徴を示すかどうかを決定するために、視覚又は機械的装置を使用することを含みうる。ある例では、検出は、標的に結合したプローブを視覚的に観察すること、又はプローブが標的に結合しないことを観察することを意味する。例えば、光学顕微鏡及び他の顕微鏡の手段が、ここに記載の方法のために発色性沈殿物を検出するために一般的に使用される。
【００３５】
発光又は発光シグナル：発光源から生じた特定の波長の光。特定の例では、発光シグナルは、フルオロフォアがその励起波長で光を吸収した後にフルオロフォアから発せられる。
【００３６】
励起又は励起シグナル：高エネルギーレベルへの電子遷移を励起させるのに必要な及び／又は十分な特定の波長の光。特定の例では、励起は、フルオロフォアが、励起シグナルからの光の波長とは異なる(例えば、より長い)波長の光を発する状態に、フルオロフォアを励起させるのに必要な及び／又は十分な特定の波長の光である。
【００３７】
蛍光は、原子又は分子が高い電子状態から低い電子状態に通過することによる可視光線の発光であり、エネルギーの吸収と発光の間の時間間隔は１０−８〜１０−３秒である。原子又は分子が、励起源(例えば、紫外線ランプ)からエネルギーを吸収するときに蛍光が生じ、ついで可視光線としてエネルギーを発生する。
【００３８】
蛍光インサイツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)：ＦＩＳＨは、染色体上の特定のＤＮＡ配列を存在又は不在を検出し、その位置を見出すために使用される技術である。ＦＩＳＨは、高い度合いの配列類似性を示す染色体の部分のみに結合する蛍光プローブを使用する。またＦＩＳＨは、組織試料内の特定のｍＲＮＡ配列を検出するために使用することもできる。
【００３９】
官能基は、分子の特徴的な化学反応の原因となる分子内の特定の原子群である。例示的な官能基には、限定されるものではないが、アルカン、アルケン、アルキン、アレーン、ハロ(フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード)、エポキシド、ヒドロキシル、カルボニル(ケトン)、アルデヒド、カーボネートエステル、カルボキシレート、エーテル、エステル、ペルオキシ、ヒドロペルオキシ、カルボキシアミド、アミン(第１級、第２級、第３級)、アンモニウム、イミド、アジド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、ニトレート、亜硝酸塩、ニトリル、ニトロアルカン、ニトロソ、ピリジル、ホスフェート、スルホニル、スルフィド、チオール(スルフヒドリル)、ジスルフィドが含まれる。
【００４０】
ヘテロアリール化合物は、少なくとも１のヘテロ原子を有する、すなわち、環中の一又は複数の炭素原子が、少なくとも１の電子対を有する原子、典型的には窒素、酸素又は硫黄で置き換えられている芳香族化合物である。
【００４１】
介入：他の物質の微小構造中への物質(例えば、イオン又は分子)の挿入を意味する用語。例えば、ソラレンは、２本鎖ＤＮＡヘリックスの副溝に、挿入又は介入可能である。
【００４２】
レキシトロプシン(lexitropsin)：天然抗生物質ネトロプシン及びディスタマイシンのアナログファミリーのメンバー。
0005943943.tif 000005
【００４３】
リンカー：２つの部分間に位置する分子又は原子の群。例えば、量子ドット-ＤＮＡ結合部分コンジュゲートは、量子ドットとＤＮＡ結合分子の間にリンカーを含みうる。典型的には、リンカーは二官能基であり、すなわち、リンカーは各末端に官能基を含み、官能基は２つの部分にリンカーを結合させるために使用される。２つの官能基は、同じ、つまりホモ二官能性リンカーでも、又は異なっている、つまりヘテロ二官能性リンカーでもよい。
【００４４】
部分：部分は分子の断片又はコンジュゲートの一部である。
【００４５】
マルチプレックス、マルチプレックスした、マルチプレックスする：複数の異なるコンジュゲートを使用して、所望に応じて、試料中の複数の標的を、実質的に同時に、又は逐次的に検出すること。マルチプレックスは、核酸一般、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質を個々にまた任意で全ての組合せで、同定し及び／又は定量することをを含みうる。また、マルチプレックスは、その解剖学的意味での細胞内の２又はそれ以上の遺伝子、メッセンジャー及びタンパク質を検出することも含む。
【００４６】
ナノ物質：そのナノスケール寸法から得られる(すなわち、１００ｎｍ未満である一寸法を有する)形態学的特徴及び／又は特定の特性を有する物質。ナノ物質は、典型的には、ナノ粒子からなる。与えられた物質のナノ粒子は、同じ物質のより大きい粒子と比較して、非常に異なった特性を有しうる。例えば、不透明物質は透明になり得(例えば銅)、不活性物質は触媒的になり得(例えば、白金、金)、安定な物質(例えばアルミニウム)は可燃性になり得、絶縁体は導電体(例えばシリコーン)になりうる。
【００４７】
ナノ粒子：ナノメートルで測定されるサイズを有するナノスケール粒子、例えば、少なくとも１００ｎｍ未満の一寸法を有するナノスケール粒子。ナノ粒子の例には、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、半金属ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、フラーレン様ナノ粒子、無機ナノチューブ、デンドリマー(例えば、共有結合した金属キレートを含むもの)、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノプリズム、ナノロープ、及び量子ドットが含まれる。ナノ粒子は、光子(ラジオ周波数及び可視光子を含む)の吸収及び／又は発光、及びプラズモン共鳴を介して、検出可能なシグナルを生成可能である。
【００４８】
ペプチド核酸：ペプチド骨格により連結された繰り返しＮ-(２-アミノエチル)グリシン単位の骨格を有する人工ポリマー。様々なプリン及びピリミジン塩基Ｂが、メチレンカルボニル結合により、骨格に連結される。
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【００４９】
光退色：光への暴露時に、吸収性、反射性又は蛍光性がほとんどなくなること；光への暴露により、脱色し又は色あせすること。光脱色は、フルオロフォアの光化学的劣化又は破壊を意味する。
【００５０】
光安定性：光化学的変化に対する安定性。ここで使用される場合、光安定性は、検出可能なシグナルが、光に暴露された場合に、経時的に減少しないことを意味する。
【００５１】
プローブ：検出可能な標識又はレポーター分子に結合した、単離核酸、単離合成オリゴヌクレオチド。典型的な標識には、放射性アイソトープ、酵素基質、共因子、リガンド、化学発光又は蛍光剤、ハプテン、及び酵素が含まれる。標識の方法及び様々な目的に適した標識の選択における指針は、例えば、Sambrookら(Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989) 及び Ausubelら(In Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Intersciences, 1992)において検討されている。
【００５２】
当業者であれば、特定のプローブの特異性がその長さと共に増加することを理解するであろう。よって、プローブは、所望の特異性を提供するように選択することができ、所望のヌクレオチド配列の少なくとも１７、２０、２３、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれ以上の連続したヌクレオチドを含みうる。特定の例では、プローブは、所望のヌクレオチド配列の少なくとも１００、２５０、５００、６００又は１０００の連続した核酸でありうる。
【００５３】
量子ドット：量子閉じ込めのためサイズ依存性の電子的及び光学的特性を示すナノスケール粒子。量子ドットは、例えば半導体材料(例えば、セレン化カドミウム及び硫化鉛)、及び晶子(分子ビームエピタキシーを介して成長)等から構成されている。様々な表面化学及び蛍光特性を有する多様な量子ドットは、Invitrogen Corporation, Eugene, ORから商業的に入手可能である(例えば、米国特許第６８１５０６４号、同６６８２５９６号、及び同６６４９１３８号を参照)。また、量子ドットは、Evident Technologies (Troy, NY)からも商業的に入手可能である。他の量子ドットには、合金量子ドット、例えばＺｎＳＳｅ、ＺｎＳｅＴｅ、ＺｎＳＴｅ、ＣｄＳＳｅ、ＣｄＳｅＴｅ、ＳｃＳＴｅ、ＨｇＳＳｅ、ＨｇＳｅＴｅ、ＨｇＳＴｅ、ＺｎＣｄＳ、ＺｎＣｄＳｅ、ＺｎＣｄＴｅ、ＺｎＨｇＳ、ＺｎＨｇＳｅ、ＺｎＨｇＴｅ、ＣｄＨｇＳ、ＣｄＨｇＳｅ、ＣｄＨｇＴｅ、ＺｎＣｄＳＳｅ、ＺｎＨｇＳＳｅ、ＺｎＣｄＳｅＴｅ、ＺｎＨｇＳｅＴｅ、ＣｄＨｇＳＳｅ、ＣｄＨｇＳｅＴｅ、ＩｎＧａＡｓ、ＧａＡｌＡｓ、及びＩｎＧａＮ量子ドットが含まれる(合金量子ドット及び該ドットの合成方法は、例えば、米国特許第２００５／００１２１８２号、及びＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００１８８９に開示されている)。
【００５４】
試料：「試料」なる用語は、標的が存在しうるものの中又は上における任意の液体、半固体又は固体の物質(又は材料)を意味する。特に、試料は、生体試料又は生体物質から得られる試料でありうる。生体試料の例には、組織試料及び細胞試料が含まれる。いくつかの例では、生体試料は、動物の被検体、例えばヒト被検体から得られる。生体試料は、限定されるものではないが、単細胞組織、例えば細菌、酵母、原生動物、及びアメーバ等、多細胞生物(例えば、健康な又は健康に見えるヒト被検体、又は診断もしくは研究された病気又は疾患、例えば癌に罹患していると診断されたヒト患者からの試料を含む、植物又は動物)を含む、任意の生存している生物体から得られ、排泄され、又は分泌された任意の固体又は流動状の試料である。例えば、生体試料は、例えば血液、血漿、尿、胆汁、腹水、唾液、脳脊髄液、眼房水又はガラス体水、又は任意の体分泌物、漏出液、滲出液(例えば、膿瘍、又は感染もしくは炎症の任意の他の部位から得られた体液)、又は関節(例えば、例えば正常な関節又は疾患に罹患した関節)から得られた体液でありうる。また、生体試料は、任意の器官又は組織(バイオプシー又はオートプシー標本、特に腫瘍バイオプシーを含む)から得られた試料であってもよく、又は細胞(初代細胞又は培養細胞)、又は任意の細胞、組織又は器官により条件付けられた培地を含みうる。いくつかの例では、生体試料は核抽出物である。いくつかの例では、生体試料は細菌細胞質である。他の例においては、試料は試験用試料である。例えば、試験用試料は、細胞、組織、又は被検体から得られた生体試料から調製された細胞ペレット切片である。一例では、被検体は、特定の病状又は疾患に罹患する危険性があるか又は罹患したものである。
【００５５】
染料：生体試料の標的分子に適用される場合、分子を顕微鏡検査で検出可能にする任意の生物学的又は化学的実体。染料には、限定されるものではないが、検出可能な核酸プローブ、抗体、染料、及び組合せて、又はそれらだけで発色した最終生成物を生じる他の試薬(明視野又は蛍光検出法において)が含まれる。対比染料は、対照的な色の染料、又は他の染料の効果をより認識しやすくするために適用される染料である。
【００５６】
組織：生物体内で類似の機能を実施する相互連結された細胞の集合体。限定されるものではないが、器官切片、腫瘍切片、体液、スメア、凍結切片、細胞診用調製物、及び細胞株を含む、標準的な顕微鏡用スライドガラスに取り付けられうる細胞の任意の集合体。
【００５７】
ＩＩ．ナノ物質
ナノ物質、例えば量子ドット、ナノ結晶、及びナノ粒子は、それらの構造-及び化学-依存性の電子及び光学特性のために、それらの小分子フルオロフォアカウンターパートに対して独特の利点をもたらす。ナノ物質、例えば半導体性のナノ結晶は、ブロードなスペクトル光学吸収性、大きなストークスシフト、狭い発光スペクトル、及び／又は光安定性の高量子収率等の光学特性を有する。これにより、ナノ物質は、優れた光学レポーターとなる。発光スペクトルが狭いため、ナノ結晶はそれらの光学的シグナチュアにより差別化でき、光ルミネセンスシグナルの回旋がほんんどないか又は全くないマルチプレックス蛍光アッセイに使用することができる。シグナルのスペクトル範囲は、ＵＶから近ＩＲに及びうる。
【００５８】
適切なナノ物質には、量子ドット、金属ナノ粒子、及び金属酸化物ナノ粒子が含まれる。例えば、金属ナノ粒子は、明視野顕微鏡で、核ＤＮＡの光学対比染料を提供する。適切な金属には、限定されるものではないが、金、銀、パラジウム、白金、及び遷移金属合金(例えば、Ａｕ／Ａｇ)が含まれる。遷移金属錯体ベースのナノ粒子、例えばプルシアンブルー型ナノ粒子も適切である。プルシアンブルー型金属錯体は、典型的には、シアノ基と架橋したＮａ-Ｃｌ型ラティスに、２種類の金属原子を含む３次元結晶構造を有し(例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１３３４８７号を参照)、例示的金属には、バナジウム、クロム、モリブデン、タングステン、マンガン、鉄、ルテニウム、コバルト、ニッケル、白金及び銅が含まれる。アルミナ、シリカ、及びチタニアを含む金属酸化物ナノ粒子も適切である。また蛍光ランタニドがドープされた金属酸化物ナノ粒子も蛍光イメージングに使用することができるが、明視野イメージングには適していない。これらの物質の全ては、ＤＮＡ結合部分を担持するように修飾され、核ＤＮＡを検出し染色するために使用することができる。
【００５９】
量子ドットは半導体ナノ結晶性粒子であり、本発明を限定しないで、特定の大きさ、典型的には２−１０ｎｍサイズの粒子光エミッターと共に使用される。量子ドットは、典型的には安定したフルオロフォアであり、多くの場合は、光退色に対して耐性があり、広範囲の励起、波長、及び狭い発光スペクトルを有する。例えば特定の波長での発光のような、特定の発光特性を有する量子ドットは、複数の異なる発光特性を有する複数の異なる量子ドットを、複数の異なる標的を同定するために使用することができるように選択されうる。
【００６０】
いくつかの実施態様では、量子ドットは、水溶解性を誘導するために、介入性の両親媒性ポリマーとトリオクチルホスフィンオキシド(ＴＯＰＯ)の静電気的に結合したシェルにより保護される。このポリマーは、さらなる官能化のために約３０の末端アミノ基を有する。E.W. Williamsら, 「Surface-Modified Semiconductive and Metallic Nanoparticles Having Enhanced Dispersibility in Aqueous Media」、米国特許第６６４９１３８号を参照。末端アミノ基は、ＤＮＡ結合部分に量子ドットをコンジュゲートするために使用することができる。
【００６１】
量子ドットコンジュゲートは、最も明るい伝統的な染料に匹敵する量子収率により特徴付けられる。付加的に、これらの量子ドットベースのフルオロフォアは、伝統的な染料の１０−１０００倍以上の光を吸収する。量子ドットからの発光は狭く対称的であり、これは、他の色調との重複が最小であり、より多くの色調が同時に使用可能であるという事実にかかわらず、隣接する検出チャンネル及び弱化クロストークへのブリードが最小となることを意味する。対称的で調節可能な発光スペクトルは、粒子の大きさ及び物質組成に従い変動し得、これが実質的なスペクトルの重複を伴わないで異なった量子ドットのフレキシブルで密接なスペーシングが可能になる。さらに、それらの吸収スペクトルは広域であり、これが単一の励起波長を同時に使用して全ての量子ドットの色調変異を励起させることを可能にし、よって試料の自動蛍光を最小にする。
【００６２】
標準的な蛍光顕微鏡は、量子ドットコンジュゲートの検出のための安価なツールである。量子ドットコンジュゲートは事実上光安定しているので、顕微鏡で興味ある領域を見つけ試料に十分に焦点を当てるために時間がかかりうる。
【００６３】
ＩＩＩ．ＤＮＡ相互作用分子
核ＤＮＡにナノ物質を向ける能力は、ＤＮＡと相互作用可能な小分子にナノ粒子(例えば、量子ドット)をコンジュゲートさせることによって提供される。ナノ物質を標的にしＤＮＡに向ける小分子は、有機分子、無機分子、又は遷移金属錯体でありうる。これらの薬剤は、水素結合、静電気的相互作用、ファンデルワールス力、及び／又は共有結合を介して、ＤＮＡと相互作用する。それらは、副溝及び主溝バインダー、ホスフェート骨格バインダー、介入剤、及び塩基修正剤／アルキル化剤等、ＤＮＡに対する位置選択性をベースにしたカテゴリーにさらに分類することができる。例示的な小分子には、限定されるものではないが、ＤＮＡ溝バインダー、例えばＤＡＰＩ及びヘキスト染料；介入剤、例えばソラレン、ナフタレンジイミド、及びＳＹＢＲ１０１(Invitrogen Corporationから入手可能な蛍光染料)、及びＤＮＡ塩基修正剤、例えばソラレンが含まれる。いくつかのＤＮＡ相互作用分子は、メカニズムの組み合わせ、すなわち副溝結合と介入、介入とアルキル化等、及び他の組合せを介して相互作用する。例示的な分子には、レキシトロプシン、コンビレキシン、ペプチド核酸、及びトポイソメラーゼＩインヒビター(例えば、インデノイソキノリン)が含まれる(例えば、Pindurら, Current Medicinal Chemistry, 2005, 12:2805-2847.)。
【００６４】
Ａ．副溝バインダー
ＤＮＡの副溝に結合する小分子には、限定されるものではないが、ＤＡＰＩ、ヘキスト染料、ジスタマイシンＡ、ネトロプシン、アクチノマイシンＤ、レキシトロプシン、コンビレキシン、Ｎ-メチルピロール及びＮ-メチルイミダゾールポリアミドが含まれる。ヘキスト染料はビス-ベンズイミド類のファミリーである。ヘキスト染料の一つ、ヘキスト３３３４２の構造を以下に示す：
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他の一般的なヘキスト染料はヘキスト３３２５８であり、エチル基の代わりに水素を有する点がヘキスト３３３４２とは異なる。
【００６５】
ＤＡＰＩ、又は４',６-ジアミジノ-２-フェニルインドールは、他の副溝バインダーである：
0005943943.tif 000008
ＤＡＰＩは２本鎖ＤＮＡの副溝においてＡＴヌクレオチドクラスターと会合し、核対比染料として使用されうる。ＤＡＰＩは青色蛍光を生じるが、他の蛍光染料のように、ＤＡＰＩは、経時的に光ルミネセンス強度の光誘発性劣化を被る。
【００６６】
ＤＮＡの副溝に対するＤＡＰＩの高親和性は、核ＤＮＡに量子ドットを向けるのに利用可能で、固定された細胞及び組織において量子-ドット-染色されたＤＮＡを生じる。顕著なことに、核の染色パターン及び形態は、ＤＡＰＩの染色に類似している(図３Ａ−Ｂ)。染色の分光検査は、量子ドットの簡潔な光学シグナルと、オレンジ色の染料、ＤＡＰＩの広範囲の符号指示の双方を示す。このコンジュゲートの利点は、量子ドットの光安定性シグナルを保持しつつ、ＤＡＰＩに非常に類似した形態及び核染色が提供されることである。
【００６７】
Ｂ．ＤＮＡ介入剤
介入剤は、２本鎖ＤＮＡの塩基の間に挿入されることによって、ＤＮＡと相互作用する分子であり；それらは、ファンデルワールス力により所定位置に保持される。例示的なＤＮＡ挿入剤には、限定されるものではないが、アクチノマイシンＤ、コンビレキシン、ソラレン及びナフタレンジイミド(ＮＤＩ)が含まれる：
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これらの分子に量子ドットがコンジュゲートすることで核染色が生じる。染色強度は、特定の介入剤及び細胞又は組織試料に適用されるコンジュゲートの濃度に少なくとも部分的に依存する。
【００６８】
ソラレン-量子ドットのコンジュゲートは、組織において核ＤＮＡに対して高い親和性を示す。染色は核の形態的特徴を示す。１００ｎＭの濃度で、核は周囲の組織から明確に描写されている(例えば、図４を参照)。
【００６９】
核ＤＮＡに対するより大きな特異性及び親和性が、量子ドットがナフタレンジイミドにコンジュゲートした場合に観察される。明確な核描写及び形態が、５０ｎＭ及びそれ以上の濃度で観察される(例えば、図５を参照)。２５ｎＭ近傍の濃度で、核の周辺境界が適切に染色され、ある程度の核形態が示される。実際、６ｎＭ程度の濃度で核の染色、及び周囲組織との差別化は可能である。よって、量子ドット-ナフタレンジイミドコンジュゲートは、５ｎＭより多い、２０ｎＭより多い、又は５０ｎＭより多い濃度、例えば５ｎＭ〜１００ｎＭ、２０ｎＭ〜７５ｎＭ、又は２５ｎＭ〜５０ｎＭの範囲の濃度で、固定化された組織における核の対比染色に有用である。
【００７０】
量子ドットの狭い発光スペクトルは、異なる波長で蛍光を発する量子ドットを利用する他のプローブと合わせて、核の染色の使用を可能にする。例えば、量子ドット-ナフタレンジイミドプローブを使用し、２５ｎＭの濃度で前立腺組織を染色する場合、２色ＴＭＰＲＳＳ２(３'５'ＥＲＧ)(図６)及び２色ＨＥＲ２-Ｃｈｒ１７(図７)蛍光アッセイの双方からの量子ドットＦＩＳＨプローブもまた可視化される。この量子ドットコンジュゲートは、４つの量子プローブＴＭＰＲＳＳ２(３'５'ＥＲＧ)、ＥＲＧ、ＳＬＣ４５Ａ３、及びＥＴＶ１を用いたＦＩＳＨアッセイにまた使用した(図８)。これらのアッセイのそれぞれにおいて、ＤＮＡ染色は、そのスペクトル安定性及び最小限のスペクトル重複のために、優れた性能を示した。
【００７１】
Ｃ．ＤＮＡアルキル化剤
ソラレンリガンドにより提供される他の利点は、ＤＮＡの塩基に量子ドットを共有的に結合させる能力である。ＵＶ照射下(すなわち＞３５０ｎｍ)、ソラレンは、塩基、チミジンに光誘起された２＋２付加環化を被る。このプロセスにより、ソラレン-量子ドットのコンジュゲートがＤＮＡに共有的に結合される。アルキル化剤である他のＤＮＡバインダーには、限定されるものではないが、レキシトロプシンのアナログ及び誘導体、及びピロール-イミダゾール-ポリアミド(例えば、ナイトロジェンマスタード)が含まれる(Pindurら)。
【００７２】
ＩＶ．ナノ物質／ＤＮＡ結合部分コンジュゲートの調製
ナノ物質、例えば量子ドット、及び少なくとも１のＤＮＡ結合、又は標的分子を有するＤＮＡ結合部分は、ナノ物質及び／又はＤＮＡ-標的分子に、活性化したカルボキシル部分とアミンを利用する標準的な縮合技術と合わせられる。いくつかのＤＮＡ結合分子は修飾なしに使用されて、ナノ物質／ＤＮＡ結合部分コンジュゲートが調製される。例えば、スクシンイミジル-[４-(ソラレン-８-イルオキシ)]ブチラートというソラレン誘導体が商業的に入手可能であり、如何なるさらなる修飾もなく使用可能である。
【００７３】
いくつかの実施態様では、ＤＮＡ結合部分は、ナノ物質、例えば量子ドット又は金属ナノ粒子へのコンジュゲーションが容易になるように修飾される。コンジュゲーションをさらに容易にするために、ナノ物質は、コンジュゲーションに適切な官能基(類)を含むようにまた修飾されうる。例えば、量子ドットは、アミノ基を有する外層の官能化不動態層を含みうる。同様に、金属酸化物も、ＤＮＡ結合分子へのコンジュゲーションに適した官能基(例えば、アミノ、シアノ、チオール、カルボキシル等)を含む外側の官能化層を含みうる。
【００７４】
特定の実施態様では、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル官能基を含めるＤＮＡ結合部分の修飾により、量子ドット上へのＮＨＳエステル部分とアミノ基を介した量子ドットへのＤＮＡ結合分子のコンジュゲーションが可能になる。図９は、ナフタレンジイミド等、ＤＮＡ結合部分へＮＨＳエステル部分を付加するための一般的な合成スキームを例証する。Ｒ１及びＲ２は独立して、置換又は未置換の脂肪族、置換又は未置換の芳香族、ヘテロ芳香族、又はポリアルキルヘテロ原子鎖、例えばアルキレンオキシド鎖(例えば、ポリアルキレングリコール)である。
【００７５】
ＮＨＳエステル部分は、量子ドット表面上の第１級アミン基と反応して、以下に示す量子ドット-ＤＮＡ結合部分コンジュゲートを形成することができ、ここで「ＤＢＭ」はＤＮＡ結合部分を表し、「ＱＤ」は量子ドットを表す。
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図１０に示すように、ソラレンのスクシンイミジルエステルは、量子ドットの表面上の第１級アミン基と反応することができ、量子ドット-ソラレンコンジュゲートを提供する。
【００７６】
他の実施態様では、ＤＮＡ結合部分は、テトラフルオロフェニル(ＴＦＰ)エステル部分を含むように修飾されうる。ＴＦＰエステル部分は、量子ドットの表面上の第１級アミン基と反応することができ、量子ドット-ＤＮＡ結合部分コンジュゲートを形成する。
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【００７７】
他の実施態様では、ＤＮＡ結合部分は、４-スルホ-２,３,５,６-フルオロフェニル(ＳＴＰ)エステル部分を含むように修飾されうる。ＳＴＰエステル部分は、量子ドットの表面上の第１級アミン基と反応し、量子ドット-ＤＮＡ結合部分コンジュゲートを形成することができる。
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【００７８】
さらなる他の実施態様では、ＤＮＡ結合部分は、塩化スルホニル部分を含むように修飾されうる。塩化スルホニル部分は、量子ドットの表面上の第１級アミン基と反応し、量子ドット-ＤＮＡ結合部分コンジュゲートを形成することができる。
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【００７９】
水性環境において適切な他の化学的転換を、また例えばＮＤＩ-Ｃ６(Ｃ６リンカーを持つナフタレンジイミド)と共に使用することができる。他の適切なカップリング方法は、例えばHermanson (Bioconjugate Techniques, 第2版, May 2, 2008)によって記載されている。遊離のＤＮＡ相互作用分子からのコンジュゲートの精製は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて実施することができる。
【００８０】
いくつかの実施態様では、量子ドット-ＤＮＡ結合部分コンジュゲートは、量子ドットとＤＮＡ結合分子との間にリンカーを含む。リンカーにより、量子ドットとＤＮＡ結合分子との間に距離がもたらされ、構造的制約が低減し、ＤＮＡへのコンジュゲートの結合が容易になる。この目的のために現在知られており、又は将来開発される任意のリンカーは、開示されたコンジュゲートの実施態様を形成するために使用されうる。有用なリンカーはホモ-又はヘテロ二官能性でありうる。
【００８１】
適切なリンカーの第１のクラスには、脂肪族化合物、例えば、一又は複数の不飽和部位を有する脂肪族炭化水素鎖、又はアルキル鎖が含まれる。脂肪族鎖は、典型的には,ＤＮＡ結合分子へのナノ粒子のカップリングを容易にする末端官能基を有する。鎖の長さは変化可能であるが、典型的には１−３０の炭素原子の長さである。しかしながら、当業者であれば、特定のリンカーが３０を越える原子を有するならば、ＤＮＡ結合分子にナノ粒子を結合させるのに効果的に作動し、コンジュゲートはなおも所望の如く機能し、よって、このような鎖連結は本開示の範疇に入ることを理解するであろう。
【００８２】
本開示の実施態様を実施するのに有用なリンカーの第２のクラスには、アルキレンオキシドが含まれる。アルキレンオキシドは、ここではグリコール、例えばエチレングリコールを参照して表す。いくつかの実施態様では、リンカーの親水性は、その炭化水素鎖の長さに対して増加している場合に有用である。当業者であれば、酸素原子の数が増加した場合、化合物の親水性がまた増加しうることを理解するであろう。よって、本開示のリンカーは、（-ＯＣＨ２ＣＨ２-)ｎの式を有し、ここでｎは約２〜約１５であり、より詳細には約２〜約８である。本発明の所定の開示された実施態様を実施するのに有用でありうるヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーは、米国特許出願公開第２００６／０２４６５２４号、及び米国特許出願公開第２００７／０１１７１５３号に記載されている。ソラレン及びナフタレンジイミド(ＮＤＩ)を含むリンカー(以下に示す)を合成し、量子ドットにコンジュゲートした。
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【００８３】
いくつかの実施態様では、量子ドット染料の感度及び選択性は、複数のＤＮＡ結合分子が共有的に結合している多官能性分枝状リンカーの使用を介して増加する。いくつかの実施態様では、リンカーは、２つのＤＮＡ結合分子が結合しているビス-リンカーである。ある実施態様では、ビス-リンカーは、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル等、共通の部分に結合した２つのポリエチレングリコール鎖を含む。ポリエチレングリコール鎖は式ＰＥＧｎを有し、ここでｎは１−５０、例えば４又は８である。特定の実施態様では、リンカーは次の化学構造を有する。
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【００８４】
いくつかの実施態様では、量子ドットは、リンカーのＮ-ヒドロキシスクシンイミド部分との縮合反応を介して、多官能性リンカーにコンジュゲートされうる。分枝状リンカーは、ＤＮＡ結合分子の局所的濃度を増加させ、よって、核ＤＮＡに対する親和性を増加させる。ソラレン及びナフタレンジイミド(ＮＤＩ)を含む例示的なビスリンカーは、次の構造を有する。
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【００８５】
ＤＮＡ結合分子への、可視化スペクトルの低波長領域に発光最大値を持つナノ結晶のコンジュゲーションにより、ＤＡＰＩ及びヘキスト核酸染料等の、一般的なＤＮＡ対比染料に対して光安定なナノ物質ベースの代替品が提供される。最終的なコンジュゲートを使用して、２本鎖ＤＮＡにナノ物質を向け結合させることができる。半導体ナノ結晶がナノ物質として使用される場合、量子ドットと場合によってはＤＮＡ結合分子の光ルミネセンスが、ＤＮＡに対するコンジュゲートの結合をシグナル化する。このコンジュゲートが、細胞の核に見出されるＤＮＡに適用される場合、コンジュゲートは、核のクロマチンに選択的に結合し、核内でのＤＮＡの可視化がもたらされる。これにより、核の蛍光検出、描写及び形態が提供される。
【００８６】
約４９０ｎｍの発光最大を有する商業的に入手可能な量子ドットは、一般的なＤＮＡ染料のスペクトル最大に密に一致する適切なナノ物質となる。ナフタレンジイミド誘導体及びソラレン等、ＤＮＡ相互作用分子にコンジュゲートしたこれらのナノ結晶は、ＤＡＰＩ及びヘキスト対比染料の性能に一致し上回る組織においてＤＮＡのための核染料を提供する。半導体性ナノ結晶系の利点は、ナノ物質の光物理性をベースにしている。例えば、４９０ｎｍの量子ドットの光ルミネセンススペクトルは狭く、５６５ｎｍの量子ドット又は任意の他の低周波数の量子ドットのスペクトルと実質的に重複せず(図１１)、よって、有機ＤＮＡ染料に固有の蛍光スペクトルの重複を克服する。逆に、ＤＮＡ結合部分と共に、より長い波長で発光する量子ドットを、固定組織における核を描写するために使用することができる。よって、ＦＩＳＨ(蛍光インサイツハイブリダイゼーション)染料の発光スペクトルの外側で光ルミネセンス特性を有する量子ドットは、ＦＩＳＨシグナルを回旋することなく利用可能である。
【００８７】
他の利点は、光ルミネセンスシグナルの安定性である。一般的なフルオロフォアは光退色に屈することが知られており、強度が減退し、数秒から数分の間に、スペクトルシグナチュアに変化する。しかしながら、いくつかの実施態様では、量子ドット-ＤＮＡ結合分子コンジュゲートは、３０分を超えても、連続した励起下において、発光の頻度又は強度に変化がみられない。この利点は、量子ドットＴＭＰＲＳＳ２前立腺アッセイ等、スペクトル的に相補的な量子ドットを使用するアッセイと合わせて、完全に実現化される(図１２)。この技術は、乳房組織における量子ドットベースのＨＥＲ２遺伝子検出を含む、様々な光ルミネセンス暗視野アッセイに利用性を有する(図１３)。コンジュゲートシグナルの安定性により、可視化された核を有する固定組織試料の保存用スライドの調製が可能になり、よってＤＡＰＩに固有の不具合が克服される。
【００８８】
また量子ドットベースの核染色は、擬似ヘマトキシリン及びエオシンイメージング技術と合わせて使用可能な蛍光核マーカーとなる。ここで、ＱＤ４９０、又は他の半導体性ナノ結晶は、ヘマトキシリンの染色等価物を提供する。これにより、蛍光ＦＩＳＨアッセイの暗視野画像の擬似明視野が提供される(図１４−１５)。
【００８９】
Ｖ．試料調製
ここに記載の組織試料を、当該技術分野で知られ、又は今後開発される任意の方法を使用して調製することができる。一般的に、組織試料は、培地に組織を固定し包埋することにより調製される。
【００９０】
いくつかの例では、包埋培地が使用される。包埋媒体は、組織及び／又は細胞が、将来の分析に対して、それらを保存する補助となるように包埋される不活性物質である。包埋により、組織切片を薄切片にスライスすることができる。包埋媒体には、限定されるものではないが、パラフィン、セロイジン、ＯＣＴＴＭ化合物、寒天、プラスチック、又はアクリルが含まれる。
【００９１】
多くの包埋媒体は疎水性であり；よって、不活性物質は、主として親水性試薬を利用する、組織学的又は細胞学的分析の前に除去される必要がある場合がある。脱パラフィン又は脱ロウなる用語は、生体試料から任意の種類の包埋媒体を部分的又は全体的に除去することを意味するためにここでは広く使用されている。いくつかの実施態様では、パラフィン包埋組織切片は、水性洗剤及び熱を使用して脱ロウされる。
【００９２】
試料を固定化する方法は変わりうる。組織試料の固定により、可能な限り生存した状態に近いように、細胞及び組織成分が保存され、有意な変化なしに、調製手順を受けることが可能になる。固定化は、細胞死のときに始まる自己融解及び細菌分解プロセスを停止させ、それらが、例えばＩＨＣ又はＩＳＨ等、組織処理の後続段階に耐えるように細胞及び組織成分を安定化させる。
【００９３】
組織は、固定液に浸漬することにより又はパーフュージョンを含む任意の適切なプロセスにより、固定化することができる。固定液は架橋剤(例えば、アルデヒド類、例えばホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒド、並びに非アルデヒド架橋剤)、酸化剤(例えば、金属イオン及び錯体、例えば四酸化オスミウム及びクロム酸)、タンパク質変性剤(例えば、酢酸、メタノール、及びエタノール)、未知のメカニズムの固定液(例えば、塩化第二水銀、アセトン、及びピクリン酸)、組み合わせ試薬(例えば、カルノア固定液、メタカーン(methacarn)、ブアン固定液、Ｂ５固定液、ロスマン液、及びジャンドル液)、マイクロ波、及び様々な固定液(例えば、排除体積固定及び蒸気固定)として分類可能である。また、固定液に添加剤、例えばバッファー、洗浄剤、タンニン酸、フェノール、金属塩(例えば、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、及びリチウム塩)、及びランタンを含有せしめてもよい。
【００９４】
ＩＨＣ用の試料の調製において最も一般的に使用される固定液は、一般的にホルマリン溶液の形態のホルムアルデヒドである(１０％の緩衝ホルマリンと称される、バッファー溶液中４％のホルムアルデヒド)である。一例では、固定液は１０％の中性緩衝ホルマリンである。
【００９５】
多くの場合、過剰固定(４８時間より長い間固定)された組織は、〜２４時間固定された組織よりも、バックグラウンド自己蛍光の量が多い。量子ドット核染色のシグナル強度は、２４−４８時間固定された組織と比較して、４８時間を超える固定時間の試料において有意に(約３０−５０％)低下している。
【００９６】
量子ドットコンジュゲートのサイズのため、固定された細胞及び組織における核は、通常利用しやすくはない。量子ドットが核に進入し、ＤＮＡを染色することを可能にするためには、組織はプロテアーゼで事前処理されなければならない。量子ドットコンジュゲート濃度と合わせて、プロテアーゼ処理の持続時間及び濃度は、核の染色の度合いを決定する。ほとんどの組織において、４−８分のプロテアーゼ(例えば、プロテアーゼＩＩＩ)での処理は、固定組織における量子ドット対比染色を用いた核の描写を可能にするのに十分である。
【００９７】
トンシルに加えて、乳房異種移植、及び前立腺組織、頸部及び肺組織は、ＱＤ４９０：ＮＤＩ-Ｃ６コンジュゲートで染色された。双方の組織は、最小量のバックグラウンドで、優れた染色性を示す(図１６−１７)。
【００９８】
ＶＩ．テクスチャ測定
細胞の核における染色体又はＤＮＡの分布は、コンピュータ及び画像解析技術を使用して、定性的及び／又は定量的に測定することができる。(例えば、Rodenackerら, Analytical Cellular Pathology (2003) 25:1-36を参照)。これらの測定、又は特徴は、異常な細胞挙動の初期兆候を検出し、及び／又は癌を診断し、また患者の成績及び予後を予測するために、使用することができる。
【００９９】
最も強い差別化力を有すると思われる特性は、テクスチャ特性である。このような特性は、細胞核のクロマチンパターンの強度変化を定量的に記述するものである。最も幅広く使用されているクロマチンテクスチャ特性は、作成された顕微鏡画像におけるグレーレベルの統計的又は確率的評価に基づいている。
【０１００】
近年、新規なクラスのテクスチャ特性は、クロマチン凝集の構造的区分化に基づいて導入されている(例えば、米国特許第７５７４３０４号を参照)。このアプローチにおいて、特性は、核画像の明及び暗粒子について演算される。画像物体の大きさ、形状、境界及びテクスチャを特徴付けるための多くの特性が文献に見出される。これらの特徴は、細胞核を特徴化する目的で開発されたが、区分された核粒子を含む任意の画像物体に、より一般的に適用することができる。
【０１０１】
本開示の実施態様に適用されうるいくつかの特性は、形態的特性(例えば、面積、周囲長、Ｇ因子)、濃度測定特性(例えば、体積、平均グレー値、領域の最小動力学)、テクスチャ特性(例えば、表面積)及びコンテクスチャ特性(例えば、核境界までの距離)を含む。後者の場合に関し、コンテクスチャ特性は、(ｉ)暗粒子において定められた近傍グラフ；(ｉｉ)明粒子上に定められた近傍グラフ；及び／又は(ｉｉｉ)明及び暗粒子の双方に定められた近傍グラフから算出される。好ましいタイプの近傍グラフはデラウナイ(Delaunay)グラフである。与えられたグラフに対して、共起マトリックスは、各粒子の特性、及びデジタル化した２次元空間上の関連近傍に対して定めることができる。例えば、暗粒子領域のヒストグラム、及びこれらの粒子に定められた近傍グラフから、第ｉ横列と第ｊ縦列における記入が、領域ｉの粒子が、領域ｊの粒子に隣接している回数を表すように、マトリックスを構成することができる。マトリックスサイズを扱いやすく保持し、及び／又は低密度のマトリックスを有することを回避するために、考慮下にある特性のヒストグラムにおけるビンの数を減らすことができる。各共起マトリックスについて、共起マトリックスの特性は算出可能で、核特性として使用される。このような特性の全てが算出されるとすぐ、標準的なパターン認識アルゴリズムを、特性の選択及び分類指標トレイニングに使用する。アルゴリズム、例えば差別分析、人工の神経ネットワーク及び／又はサポートベクトルマシンを、当業者によく知られている標準化された検査／トレイン／検証ルーチーンにおける問題点に適用してもよい。このような分類指標設計の結果は、一般的にシステムに利用可能な感度及び特異性のトレードオフを要約するレシーバー動作特性(ＲＯＣ)曲線である。本開示の一つの利点は、このようなパターン認識システムへのインプットである特性の測定が、より低いコントラストと特異性が少ない核対比染色で過去に可能であったものよりも遙かに高い品質であることである。これはより正確な測定、より良好なＲＯＣ感度及び特異性、よってより強力な診断、予測及び／又は予後試験に翻訳される。
【０１０２】
ＶＩＩ．キット
核の可視化を実施するためのキットの実施態様は、ナノ物質／ＤＮＡ結合部分コンジュゲート、及びプロテアーゼ酵素組成物で前処理された組織試料内においてコンジュゲートが核に入るのに十分な塩濃度及びｐＨを有する反応バッファーを含む。いくつかの実施態様では、ナノ物質はナノ粒子、例えば金属ナノ粒子又は量子ドットである。ＤＮＡ結合分子は副溝バインダー、主溝バインダー、介入剤、ＤＮＡアルキル化剤、又はその組合せでありうる。
【０１０３】
いくつかの実施態様では、キットは、プロテアーゼ酵素、及び、プロテアーゼ酵素がタンパク質分解活性を示すのに十分な塩濃度及びｐＨを有するプロテアーゼバッファーをさらに含む。プロテアーゼ酵素及びプロテアーゼバッファーは組合せられて、プロテアーゼ組成物として提供されてもよい。またキットは、典型的には、核可視化法を実施するための使用説明シートを含む。
【実施例】
【０１０４】
実施例１
ＮＤＩ-Ｃ６-ＮＨＳ合成
0005943943.tif 000017
【０１０５】
化合物(１)
攪拌棒を具備する１０ｍＬのＣＥＭマイクロ波反応容器において、１,４,５,８-ナフタレンテトラカルボン酸二無水物５０ｍｇ(０．１８６ｍｍｏｌ、１当量、シグマ(Sigma)Ｎ１８１)、Ｎ,Ｎ-ジメチルエチレンジアミン２０．３μＬ(０．１８６ｍｍｏｌ、１当量、シグマ３９０３０)及びトリエチルアミン２５μＬ(０．１８６ｍｍｏｌ、１当量、シグマＴ０８８６)を、無水ＤＭＦ３ｍＬ(EMD biosciences)に溶解させた。ＣＥＭディスカバー(Discover)マイクロ波で混合物を１４０℃まで加熱し、５分、１４０℃の温度を保持するために、照射中に冷却した。６-アミノカプロン酸２４ｍｇ(０．１８６ｍｍｏｌ、１当量、シグマＡ２５０４)及びトリエチルアミン５０μＬ(０．３７２ｍｍｏｌ、２当量、シグマＴ０８８６)を反応物に添加し、１４０℃まで加熱し、さらに５分冷却した。粗反応物を分取逆相ＨＰＬＣ(１０：９０のＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏに０．０５％のＴＦＡから９０：１０の勾配まで、６０分以上かけて、３６０ｎｍでモニタリング)によって精製した。６３％の収率で、茶色の粉末が分離された。分析用ＨＰＬＣの保持時間、５．０６分。１Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ、ｄ６-ＤＭＳＯ)δ９．５４(ｓ，１Ｈ)、８．６９(ｓ，４Ｈ)、４．４３(ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ)、４．０６(ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ)、３．４９(ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，３Ｈ)、２．９２(ｓ，６Ｈ)、２．２４(ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ)、１．７５−１．６３(ｍ，２Ｈ)、１．６３−１．５１(ｍ，２Ｈ)、１．３９(ｄｄ，Ｊ＝１５．０，８．０Ｈｚ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ(１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１７４．８９、１６３．６５、１６３．０６、１３０．９８、１３０．９０、１２６．９５、１２６．７４、１２６．６６、１２６．５８、５５．１４、４３．２１、３５．９０、３３．９４、２７．６１、２６．４８、２４．６７。ＭＳ(ＴＯＦ ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ４５２．１(Ｍ＋Ｈ）。
【０１０６】
化合物(２)
(１）４４ｍｇ(０．０９７ｍｍｏｌ、１当量)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド１２．３ｍｇ(０．１０７ｍｍｏｌ、１．１当量、シグマ１３０６７２)、トリエチルアミン６８μＬ(０．４８５ｍｍｏｌ、５当量、シグマＴ０８６６）、及びＮ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド１０７μＬ(ジクロロメタンに入った１．０Ｍ溶液、０．１０７ｍｍｏｌ、１．１当量、シグマ３７９１１５)を、２ｍＬのジクロロメタン(Sigma）に溶解させた。反応体を２時間攪拌し、焼結ガラス漏斗を通して濾過し、真空で濃縮した。残留物を２５ｍＬの酢酸エチルに溶解させ、２部の脱イオン水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、褐色の油になるまで濃縮したところ、収率９０％であった。分析用ＨＰＬＣの保持時間、６．６５分。１Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３)δ８．７７(ｓ，４Ｈ)、４．３８(ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ)、４．２９−４．１６(ｍ，２Ｈ)、２．８３(ｓ，４Ｈ)、２．７４(ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ)、２．６６(ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ)、２．３９(ｓ，６Ｈ)、１．８４(ｔｔ，Ｊ＝１５．４、７．７Ｈｚ，４Ｈ)、１．５７(ｄｄ，Ｊ＝１５．０，７．２Ｈｚ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ(１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６９．１４、１６８．４６、１６２．９９、１６２．８４、１３１．０２、１３０．９８、１２６．７８、１２６．７１、１２６．６２、５６．８６、４５．６８、４０．４９、３８．４７、３０．７８、２７．５２、２６．１４、２５．５８、２４．２３。ＭＳ(ＴＯＦ ＥＳＩ＋）５４９．１(Ｍ＋Ｈ)。
【０１０７】
実施例２
ＮＤＩ-ＰＥＧ４-ＮＨＳ合成
0005943943.tif 000018
【０１０８】
化合物(３)
攪拌棒を具備する１０ｍＬのＣＥＭマイクロ波反応容器において、１,４,５,８-ナフタレンテトラカルボキシル二無水物５０ｍｇ(０．１８６ｍｍｏｌ、１当量、シグマ(Sigma)Ｎ１８１)、Ｎ,Ｎ-ジメチルエチレンジアミン２０．３μＬ(０．１８６ｍｍｏｌ、１当量、シグマ３９０３０)及びトリエチルアミン２５μＬ(０．１８６ｍｍｏｌ、１当量、シグマＴ０８８６)を、無水Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド３ｍＬ(EMD biosciences)に溶解させた。ＣＥＭディスカバー(Discover)マイクロ波にて、混合物を１４０℃まで加熱し、５分冷却した。アミノ-ｄＰＥＧ４-ＣＯＯＨ４９．４ｍｇ(０．１８６ｍｍｏｌ、１当量、クアンタバイオデザイン(QuantaBioDesign)１０２４４)及びトリエチルアミン５０μＬ(０．３７２ｍｍｏｌ、２当量、シグマＴ０８８６)を反応体に添加し、１４０℃まで加熱し、さらに５分冷却した。粗反応体を分取逆相ＨＰＬＣ(１０：９０のＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏに０．０５％のＴＦＡから９０：１０の勾配まで、６０分以上かけて、３６０ｎｍでモニタリング)。６３％の収率で、茶色の粉末が分離された。分析用ＨＰＬＣの保持時間、５．６９分。ＭＳ(ＴＯＦ ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ５８６．２(Ｍ＋Ｈ）。
【０１０９】
化合物(４)
(１）６９ｍｇ(０．１１８ｍｍｏｌ、１当量)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド１４．２ｍｇ(０．１２４ｍｍｏｌ、１．０５当量、シグマ１３０６７２)、及びＮ-(３-ジメチルアミノプロピル)-Ｎ'-エチルカルボジイミドヒドロクロリド２４．８ｍｇ(０．１３０ｍｍｏｌ、１．１当量、シグマ３７９１１５)を、２ｍＬのジクロロメタン(Sigma）に溶解させた。反応体を一晩攪拌し、真空で濃縮した。残留物を２５ｍＬの酢酸エチルに溶解させ、２部の脱イオン水で洗浄し、濃縮した。定量的収率で褐色の油が分離された。分析用ＨＰＬＣの保持時間、６．０３分。ＭＳ(ＴＯＦ ＥＳＩ＋）６８３．１(Ｍ＋Ｈ)。
【０１１０】
実施例３
(ＮＭｅ３)＋-ＮＤＩ-Ｃ６-ＮＨＳ合成
0005943943.tif 000019
【０１１１】
化合物(５)
攪拌棒を具備する、１０ｍＬのＣＥＭマイクロ波反応容器において、１,４,５,８-ナフタレンテトラカルボキシル二無水物５０ｍｇ(０．１８６ｍｍｏｌ、１当量、シグマＮ１８１)、(２-アミノエチル)トリメチルアンモニウムクロリドヒドロクロリド３２．６ｍｇ(０．１８６ｍｍｏｌ、１当量、シグマ２８４５５６)、及びトリエチルアミン７８μＬ(０．５５８ｍｍｏｌ、３当量、シグマＴ０８８６)を、無水ＤＭＦ３ｍＬ(EMD biosciences)に溶解させた。ＣＥＭディスカバー(Discover)マイクロ波にて、混合物を１４０℃まで加熱し、５分冷却した。６-アミノカプロン酸２４ｍｇ(０．１８６ｍｍｏｌ、１当量、シグマＡ２５０４)及びトリエチルアミン７８μＬ(０．５５８ｍｍｏｌ、３当量、シグマＴ０８８６)を反応体に添加し、１４０℃まで加熱し、さらに５分冷却した。粗反応体を分取逆相ＨＰＬＣ(１０：９０のＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏに０．０５％のＴＦＡから９０：１０の勾配まで、６０分以上かけて、３６０ｎｍでモニタリング)。９１％の収率で、緑／茶色の油性固形物が分離された。ＨＰＬＣの保持時間、６．０９分。
【０１１２】
化合物(６)
(５）７９ｍｇ(０．１６９ｍｍｏｌ、１当量)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド２３．４ｍｇ(０．２０３ｍｍｏｌ、１．２当量、シグマ１３０６７２)、トリエチルアミン７０．８μＬ(０．５５８ｍｍｏｌ、３当量、シグマＴ０８８６)及びＮ-(３-ジメチルアミノプロピル)-Ｎ'-エチルカルボジイミドヒドロクロリド３８．９ｍｇ(０．２０３ｍｍｏｌ、１．２当量、シグマ３７９１１５)を、２ｍＬのジクロロメタン(Sigma）に溶解させた。反応体を一晩攪拌し、真空で濃縮した。残留物を２５ｍＬの酢酸エチルに溶解させ、脱イオン水で洗浄した(２ｘ２５ｍＬ)、濃縮した。水層を２５ｍＬのジクロロメタンで抽出した。有機層を組合せ、濃縮した。定量的収率で褐色の油が分離された。分析用ＨＰＬＣの保持時間、６．９４分。
【０１１３】
実施例４
ビスリンカー含有ＮＤＩ-Ｃ６の合成
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0005943943.tif 000021
【０１１４】
化合物(７)
３,５-ジヒドロキシ安息香酸３ｇ(１９．５ｍｍｏｌ、１当量、ＴＣＩ Ｄ２５５４)、アミノヘキサン酸メチル３．８９ｇ(２１．４ｍｍｏｌ、１．１当量、フルカ(Fluka)０７２７０)、トリエチルアミン８．１４ｍＬ(５８．４ｍｍｏｌ、３．０当量、シグマＴ０８８６）、及びＮ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド２９．２ｍＬ(１．０Ｍ溶液、２９．２ｍｍｏｌ、１．５当量ｓ、シグマ３７９１１５）を、１００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、一晩攪拌した。粗反応体を濾過し、真空で濃縮した。残留物を酢酸エチル(２００ｍＬ)で希釈し、１ＭのＨＣｌ(２００ｍＬ)、飽和ＮａＨＣＯ３(２００ｍＬ)及びブライン(２００ｍＬ)で洗浄した。溶液を真空で濃縮し、０．２μｍのシリンジフィルターを通過させ、３３０ｇのRedisep(登録商標)(Teledyne Isco, Inc., Lincoln, NE)シリコンゲルカラム(酢酸エチル：ヘキサン  ５：９５勾配から１００：０）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収率２３％で白色の粉末。分析用ＨＰＬＣの保持時間、４．０８分。１Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ６．７１(ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，２Ｈ)、６．４２(ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ)、４．９２(ｓ，３Ｈ)、３．６６(ｓ，３Ｈ)、３．４１−３．２９(ｍ，３Ｈ)、２．３５(ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ)、１．６４(ｄｄｔ，Ｊ＝１８．４、１４．９、７．４Ｈｚ，４Ｈ)、１．４７−１．３３(ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ(１０１ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１７４．５３、１６９．１９、１５８．４３、１３６．６７、１０５．２９、１０５．０５、５０．６１、３９．３１、３３．２８、２８．７１、２６．０９、２４．２９。ＭＳ(ＴＯＦ ＥＳＩ＋）２８２．４(Ｍ＋Ｈ)。
【０１１５】
化合物(８)
(７）６９５  ｍｇ(２．４７ｍｍｏｌ、１当量)、tert-ブチル ３-ブロモプロピルカルバマート１．７６５  ｇ(７．４１ｍｍｏｌ、３当量）、及び炭酸カリウム１．３６６ｇ(９．８８ｍｍｏｌ、４当量、シグマ３１０２６３)を、１２ｍＬのＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミドで希釈し、５０℃まで、一晩加熱した。溶媒を真空で除去し、残留物を酢酸エチルに溶解させ、ブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、白色の固形物になるまで濃縮した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィー(５０ｇのBiotage(登録商標)SNAPカラム(Biotage, LLC, Charlotte, NC)、酢酸エチル：ヘキサン１２：８８勾配から１００：０）により精製した。収率７３％で白色の固形物が得られた。分析用ＨＰＬＣの保持時間、１０．３４分。１Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．８９(ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，２Ｈ)、６．５３(ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ)、６．４９(ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ)、４．８４(ｓ，２Ｈ)、４．０１(ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，４Ｈ)、３．６６(ｓ，３Ｈ)、３．４４(ｄｄ，Ｊ＝１３．１、６．９Ｈｚ，２Ｈ)、３．３１(ｄｄ，Ｊ＝１２．３、６．１Ｈｚ，４Ｈ)、２．３３(ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ)、１．９６(ｐ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，４Ｈ)、１．６５(ｔｔ，Ｊ＝１５．２、７．５Ｈｚ，４Ｈ)、１．５１−１．３５(ｍ，２０Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ(１０１  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７４．１２、１６７．２４、１５９．９５、１５６．０３、１３６．９５、１０５．６１、１０４．２８、７９．２６、６５．８６、５１．５５、３９．７８、３７．７８、３３．８４、２９．４７、２９．２１、２８．４１、２６．３９、２４．４４。ＭＳ(ＴＯＦ ＥＳＩ＋）５９６．８  (Ｍ＋Ｈ)。
【０１１６】
化合物(９)
(８）５８７ｍｇ(０．９９ｍｍｏｌ、１当量)を、ジクロロメタンにトリフルオロ酢酸が溶解した２０％溶液５ｍＬに溶解させ、室温で２．５時間攪拌した。溶媒を真空で除去し、残留物をトルエン／メタノールで共沸した。任意のさらなる精製をすることなく、物質を先に進めた。分析用ＨＰＬＣの保持時間、４．７７分。１Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ６．７７(ｓ，２Ｈ)、６．５９(ｓ，１Ｈ)、４．０２(ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，４Ｈ)、３．２２−３．１４(ｍ，５Ｈ)、３．０８  (ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，４Ｈ)、２．２０(ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ)、２．０２(ｄｔ，Ｊ＝１２．７，６．４Ｈｚ，４Ｈ)、１．４４(ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，４Ｈ)、１．１９(ｄｄ，Ｊ＝１４．６，７．４Ｈｚ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ(１０１ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ１７８．７６、１７７．３４、１６９．７３、１６９．７１、１６２．８９、１６２．５４、１５９．２４、１３６．１８、１１７．６５、１１４．７５、１０６．０６、１０４．７５、６５．７９、５１．９３、４８．７７、３９．６９、３７．３２、３３．５５、３３．４２、２７．９２、２７．８７、２６．３０、２５．５２、２５．４７、２３．８３。ＭＳ(ＴＯＦ ＥＳＩ＋）４１８．５(Ｍ＋Ｎａ)。
【０１１７】
化合物(１０)
(９）６６０．４ｍｇ(１．０６ｍｍｏｌ、１当量)、Ｆｍｏｃ-ｄＰＥＧ４-ＮＨＳ１．５４８ｇ(２．６５ｍｍｏｌ、２．５当量）及びジイソプロピルアミン５５３μＬ(３．１８ｍｍｏｌ、３当量、フルカ０３４４０）を５．３ｍＬのジクロロメタンに溶解させ、室温で一晩攪拌した。粗反応体をフラッシュクロマトグラフィー(Biotage SNAP  ５０ｇのシリカゲルカラム、１００：０ 酢酸エチル：メタノールの勾配から８５：１５)。分離された５７７ｍｇの淡褐色の油−４１％。分析用ＨＰＬＣの保持時間、１０．５１分。１Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．７５(ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ)、７．６０  (ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ)、７．５０−７．３５(ｍ，３Ｈ)、７．３０  (ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ)、６．９７(ｓ，１Ｈ)、６．５０(ｓ，１Ｈ)、４．３２(ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ)、４．２１(ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ)、３．９８(ｓ，２Ｈ)、３．６２(ｄ，Ｊ＝１９．２Ｈｚ，２０Ｈ)、３．４２(ｄｄ，Ｊ＝３１．９，４．０Ｈｚ，１１Ｈ)、３．１２(ｓ，２Ｈ)、２．５３(ｄ，Ｊ＝２３．４Ｈｚ，４Ｈ)、２．２９(ｓ，１Ｈ)、１．９４(ｓ，２Ｈ)、１．６２(ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ)、１．４１(ｄｄ，Ｊ＝１７．６，５．６Ｈｚ，１１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ(１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７４．２０、１６７．３４、１６１．８５、１６１．５１、１５９．９１、１５７．３４、１４３．９３、１４１．２２、１３６．８０、１２７．７０、１２７．０８、１２５．１６、１１９．９４、１１５．３９、１０５．８２、７０．０５、６９．８０、６７．５５、６６．７９、６５．９０、５３．６２、５１．５０、５０．６２、４７．１２、４１．９８、４０．６１、３９．９０、３６．６０、３３．８８、２９．１３、２８．７４、２６．４７、２５．２８、２４．５４、１８．５３、１７．４０、１１．８０。ＭＳ(ＴＯＦ ＥＳＩ＋)１３３４．８(Ｍ＋Ｈ)。
【０１１８】
化合物(１１)
(１０）５７７ｍｇ(０．４３２ｍｍｏｌ、１当量)及びＤＢＵ１３５μＬ(０．９ｍｍｏｌ、２．１当量)を、２ｍＬのＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミドに溶解させ、一晩攪拌した。溶媒を真空で除去した。残留物を水(５０ｍＬ)に溶解させ、ジクロロメタン(５０ｍＬ)及び酢酸エチル(５０ｍＬ)で洗浄した。粗物質を調製用逆相ＨＰＬＣ(１０：９０のＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏに０．０５％のＴＦＡから９０：１０の勾配まで、６０分以上かけて)。分離された収率２３．４％。分析用ＨＰＬＣの保持時間、５．３７分。ＭＳ(ＴＯＦ ＥＳＩ＋）８９０．６(Ｍ＋Ｈ）。図１８及び図１９は、それぞれ化合物(１１)の１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。
【０１１９】
化合物(１２)
(１１）８９．９ｍｇ(０．０８ｍｍｏｌ、１当量)、(２)１１０．３ｍｇ(０．２０１ｍｍｏｌ、２．５当量)及びジイソプロピルエチルアミン４２μＬ(０．２４１ｍｍｏｌ、３当量）を３ｍＬのジクロロメタンに溶解させ、室温で一晩攪拌した。粗物質を調製用ＨＰＬＣ(３０：７０のＣＨ３ＣＮ：０．０５％ＴＦＡのアイソクラチック。１Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７０(ｄ，Ｊ＝４８．５Ｈｚ，７Ｈ)、７．５０(ｓ，１Ｈ)、６．９１(ｓ，２Ｈ)、６．５１(ｓ，１Ｈ)、３．９８(ｓ，４Ｈ)、３．８５−３．４９(ｍ，３４Ｈ)、３．３８(ｓ，６Ｈ)、３．１３(ｓ，３Ｈ)、２．５１(ｓ，３Ｈ)、２．３２(ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ)、１．９５(ｓ，４Ｈ)、１．７１−１．５６(ｍ，４Ｈ)、１．４４−１．３３(ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ(１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７４．２３、１７２．４８、１６７．９６、１６１．２９、１６０．９２、１６０．５５、１６０．１８、１６０．０１、１３６．５０、１２０．３３、１１７．４５、１１４．５６、１１１．６８、１０５．６９、１０４．７０、７０．１２、７０．０６、６９．９３、６９．８５、６９．７１、６９．６０、６７．４６、６６．８２、６５．７９、５３．４６、５１．４９、４０．０１、３９．５３、３６．５１、３６．０８、３３．８４、２８．９６、２８．７０、２６．４１、２４．４８。ＭＳ(ＴＯＦ ＥＳＩ＋）１７５６．９(Ｍ＋Ｈ)。
【０１２０】
化合物１３は、十分に確立された方法、例えば水酸化リチウムを使用し、アルカリ条件下で、化合物１２のメチルエステルを加水分解することにより合成することができる。化合物１３は、化合物２、４及び６を合成するのに使用した、同じ条件及び試薬を使用し、化合物１４に転換させることもできる。
【０１２１】
実施例５
ＱＤ４９０：ＮＤＩ-Ｃ６を使用する、ＨＥＲ２ ３-イン-１における、染色体１７プローブとＨＥＲ２ ＤＮＡプローブの評価
染色プロトコル：
以下に提示するＤＮＡ染色プロトコルは、ＱＤ４９０：ＮＤＩ-Ｃ６と合わせて、ＨＥＲ２ ３-イン-１異種移植(ＶＭＳＩカタログ番号７８３-４３３２)へのものを称するが、全ての遺伝子プローブアッセイを含むことを一般的とすることができる。プロトコルは、必要ならば、遺伝子プローブ及び組織型に応じて変えることができる。以下、自動化されたVMSI Benchmark(登録商標)XT機器からの手順に適合させたものである。
１．スライド上の、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織を７５℃まで４分加熱し、EZPrepＴＭ(１０Ｘ、ＶＭＳＩ ＃９５０−１０２)で２回処理し、７５℃で容量を調節し、その後、Liquid CoverslipＴＭ(ＶＭＳＩ  ＃６５０−０１０）を適用した。ついで、スライドを７６℃まで４分加熱し、スライドをすすぎ、EZPrepＴＭ容量を調節し、組織の脱パラフィン化のために、Liquid CoverslipＴＭを用いた。スライドを３７℃まで冷却し、４分インキュベートし、反応バッファー(１０Ｘ、ＶＭＳＩ＃９５０−３００)ですすいだ。
２．ついで、スライドを９５℃まで加熱し、８、１２、８分の３サイクルで、Cell Condition #2(ＣＣ２  ＶＭＳＩ＃９５０−１２３)で前処理し、ついで、各サイクル後に、短いLiquid CoverslipＴＭを適用した。ついで、スライド用ヒーターを停止させ、スライドを反応バッファーで３回すすぎ、各時にLiquid CoverslipＴＭを適用した。
３．スライドを３７℃まで加熱し、４分インキュベートし、反応バッファーで１回すすいだ。ＩＳＨ-プロテアーゼ３を８分適用し、反応バッファーで２回すすいだ。
４．スライドをＳＳＣ(１０Ｘ、ＶＭＳＩ＃９５０−１１０)で２回すすいだ。
５．１滴の銀インサイツハイブリダイゼーション(ＳＩＳＨ)検出溶液(ＶＭＳＩ ＳＩＳＨ検出キット＃７８０−００１)を適用し、４分インキュベートした。
６．２滴のＤＮＰ標識されたＨＥＲ２ ＤＮＡプローブ(ＶＭＳＩ＃７８０−４３３２)又はＤＮＰ標識された染色体１７プローブ(ＶＭＳＩ＃７８０−４３３１)を適用し、４分インキュベートし、ついで、核酸変性のためにスライドを９５℃まで１２分加熱した(ＤＮＰ＝２,４-ジニトロフェノール)。
７．１２分インキュベートした後、短いLiquid CoverslipＴＭを適用し、スライドを、ＨＥＲ２ＤＮＡプローブを使用する場合は５２℃で２時間、又は染色体１７プローブを使用する場合は４４℃で２時間ハイブリダイゼーションした。
８．プローブをハイブリダイゼーションした後、スライドをＳＳＣで２回すすぎ、７２℃で８分、スライドを冷却した後に、２．０ｘＳＳＤの緊縮洗浄を３回受容した。
９．スライドを反応バッファーですすぎ、３７℃まで４分温めた。ついで、１滴のＱＤ６５５：マウス抗-ＤＮＰを、Liquid CoverslipＴＭを有する双方のプローブスライドに適用し、３７℃で３２分インキュベートした。
１０．ついで、スライドを反応バッファーで３回すすぎ、ＱＤ４９０：ＮＤＩ Ｃ６を、室温でLiquid CoverslipＴＭと共に３２分、スライドにおいてインキュベートした。
１１．スライドを機器から取り外し、反応バッファーで２回洗浄した。ついで、配列有するライドを階級的アルコールとキシレンで脱水し、カバースリップを手作業で適用した。
【０１２２】
開示された本発明の原則が適用される多くの可能な実施態様に照らし、例証された実施態様は単に本発明の好ましい実施例であり、本発明の範囲を限定するものと考えてはいけないことが認識されるべきである。さらに、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲により定まる。よって、我々はこれらの特許請求の範囲の範囲及び精神内に入る全てを我々の発明として請求する。
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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