(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物、植物部分、または植物細胞から所望のタンパク質を取得するための方法であって、該方法は：
（ａ）該植物、該植物部分、または該植物細胞からタンパク質の抽出物を調製する工程であって、該植物、該植物部分、または該植物細胞は、該所望のタンパク質を、所望のタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかまたはそれらの両方において、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）ドメインおよびインテインスプライシングエレメント（インテイン）を含むＥＬＰ−インテインタグを含む融合タンパク質として生成し、該インテインは、該所望のタンパク質のＮ末端および／もしくはＣ末端またはそれらの両方と該ＥＬＰドメインとの間にある、工程；
（ｂ）該抽出物から不溶性の物質を除去する工程；
（ｃ）該融合タンパク質を凝集させ、そして該融合タンパク質を該抽出物の残りから分離する工程；
（ｄ）該融合タンパク質を水溶液に再可溶化する工程；
（ｅ）該融合タンパク質の切断を行う工程；ならびに
（ｆ）該所望のタンパク質を該タグから分離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
工程（ｅ）の前に工程（ｃ）および（ｄ）を繰り返す工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＬＰドメインが、少なくとも１つのＥＬＰユニットを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記融合タンパク質が、前記所望のタンパク質と前記インテインとの間、および／または該インテインと前記ＥＬＰとの間、および／またはＥＬＰユニットの間に、１つまたはそれより多いリンカー配列をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
組換えタンパク質がレクチンまたはサイトカインである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）が、適用される温度、ｐＨ、溶媒含量および／または装置の１回またはそれより多い調整を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｃ）における分離が、遠心分離または微細濾過を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｄ）が、凝集物を含む水性混合物の温度、ｐＨ、塩および／または他の成分の改変を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｅ）が、前記水溶液のｐＨ、温度および成分を調整することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｆ）が、前記ＥＬＰ−インテインタグを凝集させ、そして分離することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
融合タンパク質をコードする核酸であって、該融合タンパク質は、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれかまたはそれらの両方において、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）ドメインおよびインテインスプライシングエレメント（インテイン）を含むＥＬＰ−インテインタグと結合した所望のタンパク質を含み、該インテインは、該所望のタンパク質のＮ末端および／もしくはＣ末端またはそれらの両方と該ＥＬＰドメインとの間にあり、
該核酸は、植物細胞内で該融合タンパク質を発現させるために作動可能である、核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含む、植物、植物細胞、または植物部分。
【請求項１３】
所望のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にＥＬＰ−インテインタグを有する融合タンパク質を含む融合タンパク質を生成するための方法であって、該方法は、請求項１２に記載の植物、植物細胞、または植物部分を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
前記ＥＬＰドメインが、少なくとも１つのＥＬＰユニットを含む、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１５】
前記融合物が、前記所望のタンパク質と前記インテインとの間、および／または該インテインと前記ＥＬＰとの間、および／またはＥＬＰユニットの間に、１つまたはそれより多いリンカー配列をさらに含む、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１６】
組換えタンパク質が、レクチンまたはサイトカインである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１７】
前記インテインが、前記所望のタンパク質のＮ末端と前記ＥＬＰドメインとの間にある、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１８】
前記インテインが、前記所望のタンパク質のＣ末端と前記ＥＬＰドメインとの間にある、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１９】
所望のタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかまたはそれらの両方において、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）ドメインおよびインテインスプライシングエレメント（インテイン）を含むＥＬＰ−インテインタグを含む融合タンパク質を含む、植物、植物細胞、または植物部分であって、該インテインは、該所望のタンパク質のＮ末端および／もしくはＣ末端またはそれらの両方と該ＥＬＰドメインとの間にある、植物、植物細胞、または植物部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１０年１２月２１日に出願された米国仮出願第６１／４２５，７０３号からの優先権を主張する。この書類の内容は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、トランスジェニック植物において組換えタンパク質を発現および精製するための、費用効果が高く、そして有効な方法を提供する。その組換えタンパク質を、ＥＬＰ−インテインタグとの融合物として発現し、そして医薬品、抗体鎖、および他の有用タンパク質を含む。それらを、葉、種子、根、塊茎、果実および細胞培養物のような、様々な植物部分において生成し得る。
【背景技術】
【０００３】
薬学的タンパク質の大規模生成のためにトランスジェニック植物を使用することは、従来の微生物および哺乳動物バイオリアクターと比較して、低コスト、高収率、容易な回収、および健康上のリスクの低減の利点を有する魅力的なシステムとして示され、そして概念実証および実現可能性実証として、多くの価値ある組換え治療的タンパク質を、トランスジェニック植物において発現した（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。植物バイオリアクターのさらなる開発のために、治療タンパク質の場合、生成コストの８０％を占めると推定される（Ｗａｌｔｅｒ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｉｎ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｇ（編）  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、第Ｉ巻：４６５−４９６（１９９８））、植物サンプルからの標的タンパク質の下流の精製が、植物に基づくバイオリアクターによる組換えタンパク質の大規模な工業的生成において最も重要な因子である。
【０００４】
従来のタンパク質の精製法は、Ｈｉｓタグ、グルタチオンＳ−転移酵素タグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ｓｔｒｅｐＩＩエピトープ、カルモジュリン結合ペプチド、およびマルトース結合タンパク質のような、アフィニティータグとの融合物として標的タンパク質を発現することを含む（Ｄｅｓａｉ，Ｕ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．（２００２）２５：１９５−２０２；Ｗｉｔｔｅ，Ｃ．Ｐ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４）５５：１３５−１４７；Ｒｕｂｉｏ，Ｖ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（２００５）４１：７６７−７７８；Ｖａｌｄｅｚ−Ｏｒｔｉｚ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００５）１１５：４１３−４２３；Ｓｔｒｅａｔｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｊ．、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．（２００７）５：２−１５）。これらは、必要なアフィニティークロマトグラフィーのスケールアップの困難および高コストを経験する。下流のタンパク質精製を単純化するためのいくつかの新しい戦略が現れた。オレオシン融合物（Ｐａｒｍｅｎｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９５）２９：１１６７−１１８０；Ｂｈａｔｌａ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ．（２０１０）２８：２９３−３００）は、所望のタンパク質をオイルボディに標的化し、このオイルボディは水溶性画分から容易に分離され得る。ヒドロホビン（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ）融合物（Ｌａｈｔｉｎｅｎ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．（２００８）５９：１８−２４）は、融合タンパク質の疎水性を変化させ、そして次いで界面活性剤に基づく水性２相システムによる精製を促進する。γ−ゼインドメインとの融合（Ｔｏｒｒｅｎｔ，Ｍ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２００９）４８３：１９３−２０８）は、組換えタンパク質が、高濃度の所望のタンパク質を含む、密な、ＥＲに局在化したタンパク粒を形成することを可能にし、それを密度に基づく分離方法を用いて、細胞物質から容易に単離し得る。しかし、融合タグは組換えタンパク質の生物活性に影響を与え得るので、それらを除去する必要があり、そしてこのことは一般的にプロテアーゼによるタンパク質分解性切断に依存する。このさらなる切断工程は、非特異的タンパク質切断が起こる可能性に加えて、その除去におけるプロテアーゼおよび余分の工程のコストのために、より高いコストを生じる。従って、単純かつ費用効果の高い下流の組換えタンパク質精製システムの開発が非常に望ましい。
【０００５】
エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）−インテインシステムは、Ｅ．ｃｏｌｉからタンパク質を精製するための単純かつ有効な方法である（Ｋａｎｇ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００７）１７：１７５１−１７５７；Ｌｉｍ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２００７）８：１４１７−１４２４；Ｆｌｏｓｓ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）２８：３７−４５；Ｈｕ，Ｆ．ら、Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）１６０：２３７７−２３８７）。ＥＬＰタンパク質は、反復するペンタペプチドＶ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｇ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る）から成り、そして温度感受性相転移の魅力的な性質を有する：温度がその転移温度（Ｔｔ）まで上昇した場合、可溶性ＥＬＰは不溶性の相に凝集し、それは遠心分離によって容易にペレットに沈殿し得る；しかし、冷たい緩衝液を加えた場合、凝集したＥＬＰは再び可溶化し、そして可溶性の相に戻り得る。Ｔｔを塩濃度、温度、および反復ペンタペプチドの長さおよび成分によって制御し得る。ＥＬＰは、低コストおよび容易なスケールアップの利点を有する。
【０００６】
インテインは、自己切断を触媒する１種のタンパク質スプライシングエレメントであり、そしてそのアミノ酸のいくつかの置換によって、インテインを、ｐＨシフトまたはチオール試薬に応答してそのＮ−および／またはＣ−末端で切断するよう制御し得る。インテインは多くのタンパク質に存在し、そして「前駆（ｐｒｏ）」形式から成熟タンパク質への自己切断を触媒する。多くのインテインが同定され、そしてそのような配列のカタログを、ウェブサイト「ｎｅｂ．ｃｏｍ」において、「ｎｅｂ／ｉｎｔｅｉｎｓ」の名称で見出し得る。従ってインテインの自己切断性質を、タンパク質溶解切断を置換するために適用し得る。多くのインテインタンパク質の説明も公開されている：（Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９９）２７：３４６−３４７）、およびＥＬＰまたは他のアフィニティータグの融合パートナーとして使用されている（Ｆｏｎｇ，Ｂ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ（２００９）６６：１９８−２０２；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ａ．Ｒ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００９）４９８：１７３−１８３；Ｓｒｉｎｉｖａｓａ  Ｂａｂｕ，Ｋ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ（２００９）３１：６５９−６６４；Ｈｏｎｇ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）２０：３５０−３５５；Ｍａ，Ｃ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．（２０１０）１７：１２４５−１２５０）。
【０００７】
従って、ＥＬＰ−インテイン（Ｅｉ）融合戦略は、タンパク質精製のための魅力的な方法である。数回のＥＬＰ相転移の後、その融合タンパク質を、温度シフトおよび遠心分離によって他のタンパク質から分離する。次いでインテインの切断を、ｐＨシフトまたは化学物質添加によって引き起こして、所望のタンパク質をＥｉタグから切断し得、続いてもう一度ＥＬＰの相転移によって所望のタンパク質の上清およびペレットとしてのＥｉタグを分離する。全手順においてさらなるプロテアーゼも特別な装置も必要とされず、従って精製コストを低減し、そして操作を大幅に単純にする。特許文献１（Ｗｏｏｄ）は、ＥＬＰ−インテイン融合システムによる、組換えタンパク質のＥ．ｃｏｌｉ細胞からの精製を開示している。
【０００８】
最近２０年間において、トランスジェニック植物における代替的なＥＬＰまたはインテインの適用が研究されてきた（Ｍｏｒａｓｓｕｔｔｉ，Ｃ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ（２００２）５１９：１４１−１４６；Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，Ｊ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．（２００６）４：２４３−２４９；Ｌａｏ，Ｕ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００７）９８：３４９−３５５；Ｐａｔｅｌ，Ｊ．ら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．（２００７）１６：２３９−２４９；Ｃｏｎｌｅｙ，Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ（２００９ａ）１０３：５６２−５７３；Ｃｏｎｌｅｙ，Ａ．Ｊ．ら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｌ（２００９ｂ）７：４８；Ｆｌｏｓｓら、前出（２０１０））。
【０００９】
ＥＬＰ融合物は、トランスジェニック種子および葉における組換えタンパク質の発現を増強することが報告され（Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，Ｊ．ら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ（２００６）１３：５１−５７；Ｐａｔｅｌら、前出（２００７））、そしてＥＬＰの長さは、組換えタンパク質の蓄積および逆転移サイクルの間のタンパク質回収に異なる影響を有することが示された（Ｃｏｎｌｅｙら、前出（２００９ａ））。それに加えて、Ｃｏｎｌｅｙら、前出（２００９ｂ）は、ＥＬＰ融合物の、細胞質、葉緑体、アポプラストおよび小胞体（ＥＲ）に標的化したＧＦＰの蓄積に対する影響を評価した。
【００１０】
Ｍｏｒａｓｓｕｔｔｉ，Ｃ．ら、前出（２００２）は、インテインに媒介される自己切断メカニズムを採用することによって、トランスジェニック植物における組換えタンパク質生成の最初の証拠を提供した。
【００１１】
しかし、これらの報告は全て、融合タグとして代替的にＥＬＰまたはインテインのどちらかを使用した。出願人らは、トランスジェニック植物においてＥＬＰおよびインテインを組み合わせて使用した報告を知らない。
【００１２】
ＥＬＰ融合タンパク質は、タバコの葉においてタンパク粒を形成することが報告された（Ｃｏｎｌｅｙ，Ａ．Ｊ．ら、前出（２００９ｂ））。本発明者らはまた、ＥＬＰ−インテインタグと融合した組換えタンパク質は、イネ種子においてＥＲ由来のタンパク粒を形成することを見出した（Ｔｉａｎ，Ｌ．ら、未発表）。ＥＬＰの疎水性性質を考慮すると、ＥＬＰ融合タンパク質は、おそらくタンパク粒を形成し、さらなる精製のための可溶性ＥＬＰ融合タンパク質の抽出において困難を生じる。ＥＬＰ−インテインシステムによって、植物サンプルから標的タンパク質を精製するために、抽出緩衝液、抽出方法、および精製操作のような、抽出および精製手順の慣例的な最適化が必要であり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０２６３８５５号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｇｉｄｄｉｎｇｓ，Ｇ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０００）１８：１１５１〜１１５５
【非特許文献２】Ｔｗｙｍａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）２１：５７０〜５７８
【非特許文献３】Ｋｏ，Ｋ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００９）３３２：５５〜７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
植物における組換えタンパク質のＥＬＰ融合発現についての多くの以前の報告が、ＥＬＰ融合タンパク質を精製し得ることを示したが、これらの実験のほとんどは、一過性の遺伝子発現によってタバコの葉において行われ、それは一時的に異種タンパク質の高い蓄積を引き起こし得る。しかし、本発明者らが最初に安定に形質転換したタバコの葉由来のＥＬＰ−インテインタグに融合した組換えタンパク質、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）を発現および精製することを試みた時、その発現は非常に低く、そして精製は有意な量の標的タンパク質を回収することにおいて大きな困難に直面した（Ｔｉａｎ，Ｌ．ら、未発表）。従ってＥＬＰ融合発現は、ＥＬＰ−インテイン融合とかなり異なるようであり、そして安定な植物形質転換体におけるＥＬＰ−インテイン融合発現および精製の状況は、より複雑なようである。再び、条件の慣例的な最適化を採用するべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、植物から組換えタンパク質を発現および精製するための、費用効果が高く、有効であり、かつ拡張性のある方法を提供する。本発明はまた、ＥＬＰ−インテイン融合タンパク質、その生成および植物形質転換体のための組換え材料および方法にも向けられる。
【００１７】
本発明は、植物サンプルから組換えタンパク質を精製するために、ＥＬＰ−インテイン融合発現および精製システムを利用する。そのような組換えタンパク質は、医薬品、抗体鎖、工業用酵素、および任意の他の有用なタンパク質を含む。これらを、任意の植物およびカルス、葉、種子、根、塊茎、果実および細胞培養物のような、様々な植物部分において生成し得る。その方法は、アフィニティークロマトグラフィーおよび特別な装置の必要なく、ＥＬＰの温度感受性の逆相転移（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）によって、簡単に行われ、そして工業的な生成のために容易にスケールアップし得る。植物において適用される融合発現戦略の従来の精製方法と比較して、本発明の方法は、自己切断インテインタンパク質を利用して、望ましい組換えタンパク質を融合タグから放出し、従って融合タグ切断のためのプロテアーゼの使用を回避する。
【００１８】
１つの局面において、本発明は、植物、植物部分、または植物細胞から所望のタンパク質を得るための方法に関し、その方法は、以下：
（ａ）当該所望のタンパク質を、所望のタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかまたはそれらの両方に、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）ドメインおよびインテインスプライシングエレメント（インテイン）を含むＥＬＰ−インテインタグを含む融合タンパク質として生成する、当該植物、植物部分または植物細胞からタンパク質の抽出物を調製する工程であって、ここでインテインは、所望のタンパク質のＮおよび／またはＣ末端またはそれらの両方とＥＬＰドメインとの間にある、工程；
（ｂ）必要に応じて、当該抽出物から不溶性の物質を除去する工程；
（ｃ）融合タンパク質を凝集させ、そして融合タンパク質を抽出物の残りから分離する工程；
（ｄ）融合タンパク質を水溶液に再度可溶化する工程；
必要に応じて、工程（ｃ）および（ｄ）を繰り返す工程；
（ｅ）融合タンパク質の切断を行う工程；および
（ｆ）所望のタンパク質をタグから分離する工程
を包含する。
【００１９】
他の局面において、本発明は、当該融合タンパク質のための、植物において作動可能な発現システム、および当該融合タンパク質を含む、または当該発現システムを含む植物、植物部分、または植物細胞、および植物、植物部分、または植物細胞において当該融合タンパク質を生成する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１（ａ）−１（ｃ）は、下記で例示される形質転換プラスミドについての情報を示す。
【図２】図２（ａ）−２（ｂ）は、成熟トランスジェニックイネ種子に蓄積したＥＬＰ−インテイン−ＰＡＬ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を示す。
【図３】図３は、ＥＬＰ−インテイン−ＰＡＬ融合タンパク質の、イネ種子からの精製スキームを示す。
【図４】図４は、ＥＬＰ−インテインシステムによる、トランスジェニックイネ種子からの成功したＰＡＬ精製を示す。
【図５−１】図５（ａ）−５（ｅ）は、様々な細胞系統に対する、本発明の方法によって精製されたＰＡＬの効果のグラフ表示を示す。
【図５−２】図５（ａ）−５（ｅ）は、様々な細胞系統に対する、本発明の方法によって精製されたＰＡＬの効果のグラフ表示を示す。
【図６】図６は、タバコにおいてｈＧ−ＣＳＦを含む融合タンパク質を生成するために使用した発現システムのダイアグラムを示す。
【図７】図７（ａ）−７（ｃ）は、タバコ葉における融合タンパク質としてのヒトＧ−ＣＳＦの発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。
【図８】図８は、融合タンパク質として生成した場合の、タバコ種子からのｈＧ−ＣＳＦの精製における工程のダイアグラムを示す。
【図９】図９は、タバコ葉における融合タンパク質発現からのｈＧ−ＣＳＦの精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、組換えタンパク質の植物に基づく生成において、標的遺伝子発現を、下流の精製方法と組み合わせる。植物サンプルは、任意の種類の植物、単子葉植物または双子葉植物、およびカルス、葉、種子、根、塊茎、または細胞培養物のような様々な植物部分に由来し得る。サンプルの性質に基づいて、発現および精製のための戦略は変化し得る。例えば、その簡単な溶解を考慮すれば、抽出およびさらなる精製のために、葉およびカルスのような新鮮なサンプルが好ましくあり得、一方、低いタンパク質分解、高いタンパク質含量、および輸送の簡便さの利点を有する種子のような乾燥サンプルは、抽出および精製のための良い開始サンプルである。
【００２２】
本発明の方法によって生成および精製された組換えタンパク質は、任意のペプチドサイズであり得、哺乳動物、細菌または植物の任意の供給源に由来し得、そしてヒト、動物、または植物に対して行う任意の機能を有し得る。
【００２３】
所望のタンパク質とＥＬＰ−インテインタグとの融合物を発現するために、ＥＬＰ−インテインシステムを採用し、ここでインテインはＥＬＰおよびその組換えタンパク質の間に位置する。ＥＬＰの温度感受性相転移の性質を使用して、融合タンパク質を他の細胞成分から分離し、そしてインテインの自己切断機能が、組換えタンパク質をＥＬＰ−インテインタグから放出する。切断後、ＥＬＰ−インテインタグを、ＥＬＰ相転移によって不溶性の凝集物に変換し得、それを可溶性の組換えタンパク質から容易に分離および除去し得る。
【００２４】
その融合タンパク質は、ＥＬＰをコードする遺伝子配列、インテインをコードする遺伝子配列、および組換えタンパク質をコードする遺伝子配列を含む、連続的なオープンリーディングフレームの配列によってコードされ、ここでインテイン遺伝子は、ＥＬＰ遺伝子配列および組換えタンパク質遺伝子配列の間に挿入される。短いアミノ酸配列をコードする、適当なリンカー配列を、望ましいなら、ＥＬＰとインテインとの間、またはインテインと組換えタンパク質との間、またはさらにはＥＬＰユニットの間にも挿入して、ＥＬＰ、インテインおよび組換えタンパク質の必要なフォールディングを可能にし得る。
【００２５】
１つのＥＬＰタンパク質ドメインは、１つまたはそれより多いＥＬＰユニット、すなわちＶ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｇペプチドを含み得、ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸である。ＥＬＰユニットの反復回数は、ＥＬＰタンパク質の相転移温度に影響を与え得、従ってＥＬＰドメインの長さ（すなわちＥＬＰユニットの数）を、実施上の要求のために調節し得る。ＥＬＰユニットの数は、１から数百まで変動し得る；従って、５、１０、２０、３０、５０、１００、またはそれより多いユニットを有するＥＬＰドメインを採用し得る。中間の数も含まれる。その融合タンパク質は、少なくとも１つのＥＬＰドメインを含むが、１つより多いＥＬＰドメインを含んでもよい。例えば、２つのＥＬＰドメインが、組換えタンパク質のＮ末端およびＣ末端に別々に位置し得、インテインタンパク質が、末端およびＥＬＰドメインの間にある。
【００２６】
インテインは、一般的にＥＬＰおよび組換えタンパク質の間に位置し、そして切断部位、インテインのＮ末端またはＣ末端を、インテインタンパク質のいくつかのアミノ酸の置換によって調整し得る。ｐＨ、チオール試薬の添加および温度の上昇のような、環境条件の変化によって、切断反応をもたらし得る。本発明の１つの実施形態において、組換えタンパク質をＥＬＰ−インテインから放出するための、そのＣ末端におけるインテインの切断を、８．５から６．０−６．５へのｐＨ変化によって行い得る。別の実施形態において、インテインを、チオール試薬の添加によって、そのＮ末端において切断する。
【００２７】
インテインの切断部位に接続された、標的タンパク質の最初のアミノ酸または最後のアミノ酸は、切断反応において一定の役割を有し、そして切断の効率を決定し得る。従って、切断を生じさせるために、標的タンパク質の最初のアミノ酸／最後のアミノ酸を変更するまたは維持する、または別のアミノ酸を加えることを考慮しなければならない。１つの実施形態において、組換えタンパク質、すなわちＰａｎｄａｎｕｓレクチン（ＰＡＬ）のＮ末端に、アミノ酸Ｍｅｔを加える。そのような修飾は、この特定のタンパク質に限らない。それらはその所望のタンパク質の性質に関わらず有益であり得る。もしそのタグがＣ末端にあるなら、Ｃ末端アミノ酸の修飾も望ましくあり得る。
【００２８】
組換えタンパク質の植物における蓄積レベルは、常にその続く下流の精製において重要な役割を果たす。一般的に、精製のためには高い蓄積が好ましい。従って、タンパク質発現を増加させ、そして標的タンパク質の特定の器官、組織、または細胞内位置における蓄積を促進するために、強力なプロモーターの使用、コドン使用の最適化、および／または標的化シグナルによるタンパク質の特定の細胞区画への標的化を介して、プラスミド構築物の任意の成分の最適化を行い得る。発現の最適化の１つの実施形態において、ユビキチン融合戦略を使用する。
【００２９】
融合発現プラスミドを構築するための、融合タンパク質をコードする核酸配列は、ＥＬＰ−インテイン融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、ここでＥＬＰ−インテイン融合タグをコードする配列は、組換えタンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置し得る。ＥＬＰとインテインとの間および／またはインテインと組換えタンパク質との間および／またはＥＬＰユニット自体の間に、任意のリンカー配列が位置し得るが、そのリンカーの配列を、融合タンパク質またはその成分のいずれのフォールディングにも影響しないように選択する。ＥＬＰおよびインテインタンパク質ドメインをコードする配列を、ＥＬＰユニットの数を調節する、およびインテインタンパク質においてアミノ酸置換を行うことによって、組換えタンパク質の発現および精製を改善するために最適化し得る。プロモーター、適用される任意のシグナルペプチドまたは標的化ペプチド、５’ＵＴＲ成分、コドン使用、および他の融合組成物の選択によって影響を受ける、転写、翻訳、および翻訳後レベルおよび標的化位置において発現を最適化し得る。
【００３０】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに媒介される形質転換、および遺伝子銃粒子伝達システム（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）のような、ＥＬＰ−インテイン融合タンパク質の一過性または安定な発現を引き起こす様々な形質転換方法を使用し得る。
【００３１】
植物サンプルからの所望のタンパク質の抽出および精製を、以下：
（ａ）抽出緩衝液、適用される装置、抽出温度、サンプル溶解および融合タンパク質の位置に基づく任意の組織のプレ精製を含むがこれに限らない、抽出技術の最適化；
（ｂ）任意の不溶性成分および他の非特異的成分の除去を含む、ＥＬＰ相転移による精製前の、粗製抽出サンプルの前処理；
（ｃ）温度、ｐＨ、塩成分、適用される装置、さらなるＥＬＰタンパク質、または任意の他の成分の添加を含む、ＥＬＰ相転移を引き起こす条件の調整；
（ｄ）微細濾過、遠心分離、または分離をもたらす任意の他の方法のような、凝集したＥＬＰ融合タンパク質を他の混入成分から分離する方法の選択；
（ｅ）温度、緩衝液成分、ｐＨおよび適用される任意の装置を含む、凝集したＥＬＰ融合タンパク質を再び可溶化するための方法の改変；
（ｆ）ＥＬＰ相転移を反復させること、上記で述べた（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）におけるＥＬＰに基づく精製に関連する異なる方法の組み合わせのような、純粋なＥＬＰ−インテイン融合タンパク質を得るためのＥＬＰ相転移の操作の改変；
（ｇ）緩衝液成分、ｐＨ、温度、および化学物質の添加のような、インテイン誘発切断を引き起こすための条件の調整；および
（ｈ）関連するＥＬＰ相転移および任意のさらなる精製のような、インテイン誘発切断の後に、最終的な切断組換えタンパク質を切断されたＥＬＰ−インテインタグから分離するための最適化、
を含む方法によって慣用的に最適化し得る。
【００３２】
時には、インテインの自己切断は、特にｐＨに応答する本来の切断機能のために、インビボで起こり得、それは細胞内位置、または植物の成長環境によっても変動し得る。下記の実施例において、インビボでＥＬＰ−インテイン−ＰＡＬ融合タンパク質の部分的な切断が存在した。しかし、そのインビボ切断は、未切断の融合タンパク質の精製に影響を与えなかった。
【００３３】
その方法を、一過性の発現および安定な発現の両方から組換えタンパク質を精製するために行い得る。形質転換方法をまた、実験条件および宿主植物のような実際的な状況によって調整および実施し得る。
【００３４】
発現後、タンパク質の抽出が、続く精製工程において重要な因子の１つである。緩衝液成分、ｐＨ、温度、細胞を溶解するために適用する装置、および必要な勾配分離を含む、抽出条件の慣例的な最適化を行い得る。抽出方法をまた、当該分野において公知であるように、標的タンパク質の細胞内位置に基づいて調整し得る。本発明の例証となる実施形態において、種子粉末を抽出のために使用し、そして尿素をその抽出緩衝液に加えて、イネ種子のタンパク粒において内因性プロラミンと凝集した融合タンパク質を抽出した。
【００３５】
ＥＬＰ−インテインシステムによる精製の前に、ろ過、遠心分離、または他の可能な手順によって任意の不溶性の組成物を除去するために、前処置を行う必要があり得る。融合タンパク質の溶解度または続くＥＬＰの相転移またはインテイン切断に影響を与えるいくつかの成分が抽出緩衝液中に存在するなら、脱塩、透析、ろ過、およびさらなる遠心分離によって、プレ除去（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を行い得る。本発明の例証となる実施形態において、抽出緩衝液中の尿素を、脱塩または透析によって除去した。
【００３６】
サンプルの抽出後、ＥＬＰ−インテインシステムによる精製を開始する。上記の背景技術において述べたように、ＥＬＰの相転移温度は、ＥＬＰタンパク質の長さおよび成分、ＥＬＰ融合タンパク質の濃度、インテインおよび組換えタンパク質のサイズおよび性質、温度および塩濃度および組成を含む、多くの因子に影響される。ＥＬＰの凝集を行うために、好ましくは穏やかな温度および緩衝液成分によって、条件を調整および最適化し得る。
【００３７】
凝集工程の後、ＥＬＰ−インテイン融合タンパク質凝集物を、再可溶化する。一般的に、低温および冷たい緩衝液が、その凝集した融合タンパク質がその可溶性相に戻るのを助ける。再可溶化緩衝液の成分の調整、氷浴または低温インキュベーションの延長によって、または微細濾過および振とうのような、装置の補助によって、最適化を実行し得る。凝集した融合タンパク質の再可溶化後、任意の不溶性の成分を除去するために、さらなる遠心分離が必要であり得る。本発明の１つの実施形態において、融合タンパク質の回収を促進するために、最初のサイクルの遠心分離を置き換えて、微細濾過を使用し、一方第２および第３のサイクルでは通常の遠心分離を適用する。別の実施形態において、例えば一晩、４℃の撹拌は、ＥＬＰの再可溶化を増強する。
【００３８】
ＥＬＰ融合タンパク質を他の混入タンパク質から分離するための統合された手順において、可溶性ＥＬＰ融合タンパク質の凝集から、凝集した融合タンパク質の可溶性状態への回復までの工程は、１つの分離サイクルとして定義される。純粋な融合タンパク質を得るために、そのサイクルを数回繰り返し得、そしてサイクル中の分離操作を、微細濾過および／または遠心分離によるような、異なる方法によって調整し得る。しかし、広範囲かつより長い分離手順はより高い純度を生じ得るが、融合タンパク質の収率は減少し得る。
【００３９】
望ましい純度を有するＥＬＰ−インテイン融合タンパク質が得られたら、反応ｐＨおよび／または温度を変化させることによって、および／または塩濃度の調整のような他の化学物質を加えることによって、インテインの切断反応を引き起こし得る。切断を加速するために、反応時間の延長および凍結−解凍によるような、さらなる補足的な操作を適用し得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは他の方法によって、切断率を推定し得る。
【００４０】
好ましくは、切断されたＥＬＰ−インテインタグを放出された組換えタンパク質から最終的に分離する前に、完全な切断を達成する。ＥＬＰ−インテインタグおよび組換えタンパク質を、ＥＬＰ−インテイン部分を凝集させ、そしてそれを上清中の可溶性タンパク質から除去することによって、同様の方式で分離する。望ましい組換えタンパク質の最終産物を、さらに透析または脱塩して、適用した緩衝液中のあらゆる望ましくない小さな成分を除去し得る。
【００４１】
下記の１つの実施例において、ＥＬＰ−インテインタグへの融合物として発現した、Ｐａｎｄａｎｕｓレクチン（ＰＡＬ）の生成システムとして、トランスジェニックイネ種子を使用した。ＰＡＬタンパク質は、Ｐａｎｄａｎｕｓ  ａｍａｒｙｌｌｉｆｏｌｉｕｓ由来の単子葉植物マンノース結合レクチンである。約１２．５ｋＤの分子量（Ｍｗ）を有するＰＡＬタンパク質（タンパク質配列を図１（ｃ）に示す）は、いくつかのヒト癌細胞系統の増殖に対して阻害活性を示す（Ｔｉａｎ，Ｌ．ら、未発表）。
【００４２】
本発明の融合タンパク質の発現および精製システムの適用可能性も、下記で述べるようにタバコにおいて示す。
【００４３】
以下の実施例を、本発明を制限するためではなく、説明するために示す。
【実施例】
【００４４】
実施例１
トランスジェニックイネ種子からの組換え抗腫瘍タンパク質の精製
この実施例において、生成システムとして、トランスジェニックイネ種子を使用し、そして標的タンパク質として、約１２．５ｋＤの分子量（Ｍｗ）を有するＰａｎｄａｎｕｓレクチン（ＰＡＬ）（タンパク質配列を図１ｃに示す）を使用した。ＰＡＬは、いくつかのヒト癌細胞系統（ＨｅｐＧ２、Ａ５４９、ＤＬＤ−１、Ｕ８７およびＣａｐａｎ−２）の増殖に対して阻害活性を示す。ＰＡＬを、ＥＬＰ−インテインタグへの融合物で発現し、ここでＥＬＰは６０回反復の「ＶＰＧＸＧ」ペプチドを含み、そしてそのインテインタンパク質は、低ｐＨに応答してそのＣ末端において切断される。ＥＬＰ−インテインタグを、ＰＡＬのＮ末端に挿入し、そしてＥＬＰ−インテイン−ＰＡＬ融合タンパク質のイネ種子からの精製後、インテインの切断を、緩衝液ｐＨを低下させることによって引き起こして、標的ＰＡＬタンパク質をＥｉタグから分離し得る。
【００４５】
ＥＬＰ−インテイン−ＰＡＬ融合タンパク質に関する図１（ａ）で示す発現カセットを、イネグルテリンＧｌｕＡ（Ｇｔ１）プロモーターおよびシグナルペプチドによって駆動する。この配列を、イネ形質転換のために、Ｔ−ＤＮＡバイナリーベクターｐＳＢ１３０の複数のクローニング部位にクローニングした。その構築物をＳＡと命名した。
【００４６】
Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，Ｊ．ら（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．（２００６）１３：５１−５７）によって記載されたものと同様の方法によって、ＥＬＰ６０ドメインをコードする配列を、図１（ｂ）に示すＥＬＰ１０遺伝子の６回反復から生成した。ＳｓｐＤｎａＢインテイン（インテイン１と呼ばれる）およびリンカー遺伝子を、ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔＮ６９５２．ａｓｐにおいてワールドワイドウェブにおいて見出される、ＮＥＢから購入したｐＴＷＩＮ２ベクター（リンカー遺伝子に関して５９０２−５９４０ｂｐおよびインテイン遺伝子に関して５９４１−６４０２ｂｐ）から得た。ＥＬＰ１０およびインテイン遺伝子の両方を、イネの好ましいコドン使用に関して最適化し、そしてＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって合成した。
【００４７】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換を、イネ品種９９８３を用いて、上記で述べたベクター構築物によって行った。イネ種子カルス誘導、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換、セレクションおよびイネ植物の再生を、ｃａｍｂｉａ．ｏｒｇ／ｄａｉｓｙ／ｃａｍｂｉａ／４２１４．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブにおいてＣＡＭＢＩＡによって提供されるプロトコールに従って行った。再生したトランスジェニックイネ小植物を、土壌に移し、そしてＣｈｉｎｅｓｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇのトランスジェニック植物のための施設で育てた。再生したイネ植物に対するＰＣＲによる一次スクリーニングの後、イネ植物のゲノムへの導入遺伝子の組み込みを、さらにサザンブロッティングによって確認した。１から２コピーの導入遺伝子を含む、いくつかのトランスジェニック植物を得た。成熟陽性トランスジェニックイネ種子を、Ｔ１種子として回収した。陽性Ｔ１植物から生成したＴ２種子を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングによるタンパク質分析のために使用した。
【００４８】
トランスジェニックイネ種子におけるＰＡＬタンパク質発現を、図２に示し、そして下記で説明するように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗−ＰＡＬ抗体を用いたウェスタンブロット分析によって検出した。
【００４９】
成熟イネ種子を、ブレンダーによって粉末に粉砕した。全タンパク質抽出緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のＳＤＳ、４Ｍの尿素、５％のβ−メルカプトエタノール）を２０μｌ／ｍｇで種子粉末に加え、そして激しく振とうしながら２〜４時間、３５〜３７℃でインキュベートした。ホモジネート全体を、２０，０００×ｇで１０分間、室温で２回遠心分離した。上清を、発現分析のために種子からの全抽出タンパク質（ＴＥＰ）として回収した。ウェスタンブロッティングのために、ＴＥＰを、ローディングバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、２％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、０．０２％のブロモフェノールブルー）を用いた１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてＰＶＤＦ膜に移した。ウサギ由来の抗ＰＡＬ一次抗体および抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ウェスタンブロッティングを行った。Ｅ．ｃｏｌｉによって生成された組換えＰＡＬを、ポジティブコントロールとして使用した。
【００５０】
ＳＡ形質転換イネ種子において、予測されるＭｗ（５６ｋＤ）を有する融合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において観察し得た。いくつかの融合タンパク質は、ＳＡ種子においてインビボで自己切断され、遊離ＰＡＬを生じ、そしてグリコシル化ＰＡＬが検出された。独立したイネ系統由来の全種子タンパク質に対するウェスタンブロット分析を、図２（ａ）および２（ｂ）に示す。ウェスタンブロッティングによって決定された、インビボの未切断ＥｉＰ融合タンパク質にのみ注目した場合、ＳＡトランスジェニックイネ種子におけるＥｉＰタンパク質の蓄積レベルは、平均で乾燥種子１ｇあたり１．４０ｍｇに達した。
【００５１】
全タンパク質抽出から最終的な精製までの手順を、図３で模式的に示す。一般的に、純粋なＥｉＰタンパク質を得るために、２または３サイクルのＥＬＰの相転移が必要であり、そしてこれらの工程の２つにおける一晩のインキュベーションのために、約２〜３日が必要であった。
【００５２】
より詳細には、全タンパク質を、Ｂｔ緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５；５０ｍＭのＮａＣｌ；６Ｍの尿素；０．５％のＴｗｅｅｎＴＭ−２０）によって抽出した。その抽出サンプル（ＥＸ）をろ過して、あらゆる破片を除去し（ＥＸＦ）、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって脱塩する（ＤＳ）か、またはＢｐ緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５；５０ｍＭのＮａＣｌ）で透析して尿素を除去し、そして次いで２０，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離してあらゆる不溶性の破片を除去した（ＤＳＣ）。その上清を精製のために回収した。
【００５３】
ＥＬＰの温度感受性逆相転移を引き起こすために、５ＭのＮａＣｌを１：１（ｖ／ｖ）の比でサンプルに加え、そしてその混合物を、４５℃で１０分間インキュベートした。１回目の精製サイクルを、いくらか改変して、Ｇｅら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ（２００６）９５：４２４−４３２）によって記載されたように行った。ＮａＣｌ処理サンプルを、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＴＭフィルター（ＰＥＳ膜、０．２２μｍ）を備えたシリンジに移し、そしてろ液を廃棄し、一方凝集したＥＬＰ−インテイン−ＰＡＬ融合タンパク質はフィルターに残った。１ｍｌの冷却Ｂｓ緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５；５０ｍＭのＮａＣｌ；０．１％のＴｗｅｅｎＴＭ−２０）を迅速に通過させて、さらなるＮａＣｌをフィルターから除去し、そして一部の融合タンパク質が可溶性状態に戻って、そしてフィルターを通過したかもしれないので、洗浄液を回収した。さらに１−３ｍｌ（またはもとのＴＥＰサンプルの１／１０容積）の冷却Ｂｓ緩衝液を、プランジャー無しのシリンジに加え、そしてそのシステム全体を、溶出液（可溶性ＥｉＰ）を重力によって回収するために、フィルターの下にチューブを置いて、４℃で一晩維持した。あらゆる残った溶液を、プランジャーで押して、残りの可溶性ＥｉＰを回収した。溶出液および洗浄液を、１ＣＳサンプルとして合わせた。
【００５４】
２回目のサイクルを、Ｗｕら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃ．（２００６）１：２２５７−２２６２）によって報告されたように、逆相転移手順によって行った。ＮａＣｌ（５Ｍ）を、１：１ｖ／ｖの比で加え、そしてその混合物を、４５℃で１０分間インキュベートし、続いてすぐに遠心分離した。ペレットを冷却Ｂｓ緩衝液にもとの容積の１／５で再懸濁し、そして穏やかに撹拌しながら氷上に１時間維持した。４℃で遠心分離したあと、その上清を２ＣＳサンプルとして回収した。３回目のサイクルを、ペレットを再可溶化するために５０ｍＭのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を使用した以外は２回目のサイクルと同様に行った。その上清を３ＣＳサンプルとして回収した。
【００５５】
インテインによる切断反応を引き起こすために、１／１０容積の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ４．５）を、６．０−６．５の最終ｐＨ値まで、３ＣＳサンプルに加えた。サンプルを室温で２時間、そして次いで４℃で一晩切断した（完全な切断のため）。ＮａＣｌを加えることによってもう一度相転移を行い、続いて遠心分離した。その上清を、最終的な精製標的タンパク質（ＦＳ）として回収し、そしてペレットを、最終的なＥＬＰ−インテインタグ（ＦＰ）として再懸濁した。
【００５６】
精製ＥｉＰ融合タンパク質を、２または３回のサイクル後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察し得た。切断工程において、低いｐＨのＴｒｉｓ緩衝液を加えることによって達成したｐＨシフトは、インテイン切断反応を開始したが、４℃で２４から３６時間のような、より長いインキュベーションを、完全な切断のために使用する。切断を促進するために、凍結−解凍処理を使用し得る。ＰＡＬの最終的な上清に、ＥＬＰ−インテインタグは残っていなかったので、その切断および続く精製工程は有効であった（図４、レーンＦＳ）。この高度に最適化された方法によって、純粋なＰＡＬタンパク質の収量は、乾燥種子１ｇあたり約３０μｇ〜８０μｇであった。
【００５７】
ＰＡＬは、単子葉植物マンノース結合レクチンに属し、そしてヒト癌細胞の増殖に対して阻害活性を示す（図５、サンプルＰＨ）。本発明者らは、いくつかの異なるヒト癌細胞系統、ＨｅｐＧ２（肝臓）、Ａ５４９（肺）、ＤＬＤ−１（結腸）、Ｕ８７（神経膠芽腫）およびＣａｐａｎ−２（膵臓）に対する、増殖阻害活性分析を用いて、イネ種子からＥＬＰ−インテインシステムによって精製したＰＡＬタンパク質の生物活性を試験した。結果は、ＥＬＰ−インテインシステムによって精製されたＰＡＬが、Ｅ．ｃｏｌｉから精製されたＰＡＬタンパク質と同様の用量依存性阻害活性を示し（図５に示すように）、ＥＬＰ−インテイン融合発現および精製システムは、組換えタンパク質の生物活性を減少させなかったことを示す。
【００５８】
実施例２
トランスジェニックタバコからの組換えヒトＧ−ＣＳＦの精製
この実施形態において、トランスジェニックタバコ葉を生成システムとして使用し、一方、腫瘍学および感染保護において広く使用されている重要なヒトサイトカインである、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）を、標的タンパク質として使用した。
【００５９】
バイナリーベクターｐＢＩ１２１のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを、ｈＧ−ＣＳＦ融合発現キメラを構築するために使用し、そして発現した融合タンパク質を植物細胞分泌経路へ向けるために、ファセオリンシグナルペプチドを導入した。その発現カセットを図６に示す。標的タンパク質の発現を改善するためにユビキチンを導入し、そして内因性ユビキチン特異的プロテアーゼ（Ｕｂｐｓ）によって融合タンパク質から正確にプロセシングした（Ｔｉａｎ，Ｌ．およびＳｕｎ，Ｓ．Ｓ．Ｍ．、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１１）１１：９１）。図６は、カッコによって示されるｈＧ−ＣＳＦ−インテイン２−ＥＬＰ１１０融合タンパク質をコードする配列を示し、そして矢印は、ＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールの添加によって引き起こされるインテイン２の切断部位を意味する。
【００６０】
ｈＧ−ＣＳＦを、そのＣ末端でのインテイン−ＥＬＰ（ＩＥ）タグとの融合物で発現し、それをｈＧ−ＣＳＦ−インテイン−ＥＬＰまたは「ＧＩＥ」として示し（図６）、ここでＥＬＰは１１０回反復「ＶＰＧＸＧ」ペプチドを含み、一方インテインタンパク質（インテイン２と呼ばれる）は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはβ−メルカプトエタノールのようなチオール試薬の添加に応答してそのＮ末端で切断される。タバコ葉からのそのＧＩＥ融合タンパク質の精製後、インテインの切断を、β−メルカプトエタノールの添加によって引き起こして、標的ｈＧ−ＣＳＦタンパク質をＩＥタグから放出した。
【００６１】
ＥＬＰ１１０遺伝子を、上記で記載したものと同様の方法によって、ＥＬＰ１０遺伝子（図１（ｂ））の１１回反復から生成した。ＭｔｈＲＩＲ１インテインおよびリンカー遺伝子を、ワールドワイドウェブでｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔＮ６９５２．ａｓｐにおいてＮＥＢから購入した、ｐＴＷＩＮ２ベクターから得た（インテイン遺伝子に関しては６４４５−６８４６ｂｐ、およびリンカー遺伝子に関しては６８４７−６８８８ｂｐ）。
【００６２】
ｐＢＩ１２１発現ベクター中のキメラ遺伝子を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４に、エレクトロポレーションによって形質転換し、そしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる形質転換を、以前に記載されたように、若いタバコ葉を用いて行った（Ｔｉａｎ，Ｌ．およびＳｕｎ，Ｓ．Ｓ．Ｍ．、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１１）１１：９１）。植物の再生後、個々の植物を、ｈＧ−ＣＳＦ特異的プライマーを用いてＰＣＲスクリーニングし、そして１５個のトランスフェクトした植物のうち１１個が陽性の結果を示した。
【００６３】
トランスフェクトした植物においてＧＩＥタンパク質の発現を検出するために、全可溶性タンパク質を、抽出緩衝液［０．１Ｍのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２；１ｍＭのＥＤＴＡ；０．１％のＴｗｅｅｎＴＭ−２０；１００ｍＭのアスコルビン酸；２％のポリビニルピロリドン；完全プロテアーゼ阻害剤（カクテル錠剤、Ｒｏｃｈｅ）］によって、２１日齢のトランスジェニック植物の新鮮な若い葉から抽出した。新鮮な葉（１ｇ）を、乳鉢で液体窒素によって粉末に粉砕し、そして１ｍｌの抽出緩衝液を加えた。ホモジネート全体を２ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、氷上で１５分間インキュベートし、そして２０，０００×ｇで、４℃で１０分間遠心分離した。上清を回収し、そしてさらに１０分間遠心分離した。最終的な上清を、葉からの全可溶性タンパク質として回収した。
【００６４】
葉から抽出された全可溶性タンパク質を、４×ローディングバッファー（０．２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８；０．８ｇのＳＤＳ；４０％のグリセロール；５％のβ−メルカプトエタノール；５０ｍＭのＥＤＴＡ；８ｍｇのブロモフェノールブルー）で希釈し、５分間沸騰させ、そして１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１０μｇ〜５０μｇのタンパク質／レーンで分離し、続いてクーマシー（登録商標）ブリリアントブルー染色でタンパク質を可視化した。イムノブロッティングに関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した全タンパク質を、染色無しに直接ＰＶＤＦ膜に移した。ウサギポリクローナル抗ｈＧ−ＣＳＦ抗体（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）および抗ＥＬＰ抗体を一次抗体として、および抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ抗体（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として用いてウェスタンブロッティングを行い、そしてＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏ．、Ｂｕｃｋｓ、ＵＫ）を用いて現像した。Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈから購入した組換えｈＧ−ＣＳＦおよびＥ．ｃｏｌｉによって生成されたＥＬＰ６０タンパク質を、ポジティブコントロールとして使用した。
【００６５】
図７（ａ）に示すように、予測される分子量（８０ｋＤ）を有するＧＩＥ融合タンパク質を、トランスジェニックタバコ葉において、インビボで自己切断無しに合成したが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介しては、野生型（ＷＴ）およびトランスジェニック植物の間に、タンパク質バンド形成パターンの明確な差は観察されなかった。個々の植物由来の全可溶性タンパク質に対するウェスタンブロット分析を、図７（ｂ）および７（ｃ）に示す。トランスジェニックタバコ葉におけるＧＩＥタンパク質の蓄積レベルは、平均で、新鮮重量（ＦＷ）１ｇあたり１２６μｇに達した。
【００６６】
全可溶性タンパク質抽出から開始して最終的な精製まで、精製標的タンパク質を得るための手順を、図８に模式的に示す。一般的に、純粋なＧＩＥタンパク質を得るために３回以上のサイクルのＥＬＰの相転移が必要であり、この工程のうちの２つにおける一晩のインキュベーションのために、２日以上続くものである。
【００６７】
この実施例において、本発明者らは、ＥＬＰ相転移の効率を改善するために、１１０個のＶＰＧＸＧ反復から成るＥＬＰを使用した。タバコ葉におけるＧＩＥ融合タンパク質の蓄積レベルが低いので、精製中のＧＩＥの凝集を引き起こすために、同じ容積の３Ｍ  ＮａＣｌの添加および３７℃で１−３時間のインキュベーションを使用した。ＧＩＥタンパク質の凝集、続く遠心分離の後、最初のサイクルにおける標的融合タンパク質の再可溶化を、懸濁緩衝液（５０ｍＭのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２；０．１％のＴｗｅｅｎＴＭ−２０；完全プロテアーゼ阻害剤）を加え、そして４℃で一晩撹拌することによって行った。その懸濁液を２０００×ｇで、４℃で２０分間遠心分離し、そして上清をサンプル１ＣＳとして回収した。
【００６８】
２回目および３回目のサイクルにおいて、３回目のサイクルにおいて凝集したＧＩＥ融合タンパク質を再可溶化するためにプレ切断緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５；５０ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ）を使用した以外は、同様の精製方法を使用した。精製手順と共に、抽出物中の色素も、徐々に除去した。
【００６９】
インテインの切断を引き起こすために、３回のサイクル後に、β−メルカプトエタノールを１０ｍＭの最終濃度までサンプルに加え、そして切断を完了するために、サンプルを室温で３０分間、および４℃で２時間維持した。切断反応をモニタリングするために、部分的なサンプルを、室温で１０分間インキュベートした後に回収した（サンプルＣＬ）。切断後、もう一度ＥＬＰの相転移サイクルを、上記で記載したように行い、そして上清中の最終的な切断ｈＧ−ＣＳＦ（サンプルＦＳ）およびペレット中のインテイン−ＥＬＰタグ（サンプルＦＰ）を回収した。図９を参照のこと。
【００７０】
３回のサイクル後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、精製ＧＩＥ融合タンパク質が明確に観察され得、そしてインテイン切断を引き起こしてｈＧ−ＣＳＦをインテイン−ＥＬＰタグから放出し得た。図９に示すように、ｈＧ−ＣＳＦの最終的な上清（レーンＦＳ）にＩＥタグは残っていなかったので、切断および続く精製工程は有効であった。最終的なｈＧ−ＣＳＦの回収は、新鮮な葉１ｇあたり１０ｎｇ〜２０ｎｇであり、そして発現レベルは、新鮮な葉１ｇあたり１２６μｇの標的タンパク質であった。
【００７１】
ヒトＧ−ＣＳＦは、重要な薬学的タンパク質であり、それを、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、肺炎、糖尿病性足感染症、白血病、および発熱性好中球減少症（ｆｉｂｒｉｌｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ）を有する患者において免疫系を強化するために、および化学療法を受けている癌患者を処置して、細胞毒性治療薬によって生じる白血球レベルの減少を軽減するために使用し得る。
【００７２】
ｈＧ−ＣＳＦの最終的な上清（上記で記載したサンプルＦＳ）を、脱塩し、凍結乾燥し、そしてｈＧ−ＣＳＦ依存性ＮＦＳ−６０細胞系統の増殖を促進する能力を測定することによって行った生物活性試験のために検出緩衝液（５０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．２）に再懸濁した。この細胞系統は、ｈＧ−ＣＳＦまたは他の公知の増殖因子の存在下でのみ増殖する。７２時間のインキュベーション後、検出緩衝液で処理した細胞は、未処理のサンプルと同様のベースライン増殖レベルを示した。１ｎｇの市販のｈＧ−ＣＳＦで処理した場合、ＮＦＳ−６０細胞の増殖は、未処理サンプルＣＴより２６０％促進され、一方タバコ葉由来の１ｎｇの精製ｈＧ−ＣＳＦを添加した検出緩衝液を含むサンプルは、ＮＦＳ−６０細胞の増殖を促進する同様の能力（ｃａｐｔｉｖｉｔｙ）を示し、精製ｈＧ−ＣＳＦは、市販のｈＧ−ＣＳＦと同様に生物活性であることを示した。精製ＧＩＥタンパク質も試験し、そして生物学的活性を示したが、細胞増殖活性において対応する減少があり、インテイン−ＥＬＰタグは、標的ｈＧ−ＣＳＦの生物活性を破壊しなかったことを示唆する。これらの結果は、ＥＬＰ−インテイン融合発現および精製システムが、組換えタンパク質の生物活性を減少させないことを確認する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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