(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フロリジンが富化された抽出物の調製方法であって、
（ａ）乾燥ポリフェノール抽出物を食品グレードの溶媒で抽出する工程と、
（ｂ）（ａ）からの前記抽出物をアルカリ化する工程と、
（ｃ）（ｂ）からの結果として生じる溶液を酸化する工程と、
（ｄ）（ｃ）の混合物を濾過または遠心分離する工程と、
（ｅ）任意選択で、（ｄ）の結果として生じる溶液をエバポレートして残留溶媒を除去し、乾燥物を水に可溶化する工程と、
（ｆ）結果として生じる抽出物を乾燥させる工程と
を含み、前記乾燥ポリフェノール抽出物が、リンゴペクチン製造プロセスから得られるものである、方法。
【請求項２】
工程（ａ）が、純粋な食品グレードの溶媒、水、または水−溶媒混合物を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶媒が、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、メタノール、エタノール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、３−メチル−１−ブタノール、プロパン−１−オール、２−メチル−１−プロパノール、イソプロパノール、１−ペンタノール、酢酸メチル、酢酸エチル、ギ酸エチル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、アセトン、エチルメチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、エチルエーテル、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、アニソール、クメンから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）で使用される前記溶媒が、メタノール、エタノール、およびイソプロパノールから選択される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）において、溶媒と乾燥ポリフェノール抽出物との比が、５００／１〜１０／１  リットル／Ｋｇの間に含まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）の前記アルカリ化が、ｐＨがｐＨ７〜ｐＨ１４の間に含まれるまでの塩基の添加により行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記酸化工程（ｃ）が、前記溶液中に大気空気を通気することによって行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）において、タンパク質が、清澄剤として前記酸化された溶液に添加され、前記タンパク質は、前記酸化された溶液のｐＨにおいて正に荷電するものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）において、リジンおよび／またはシステインに富むタンパク質が、前記酸化された溶液に添加される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｃ）において、前記酸化された溶液のｐＨが、前記タンパク質の等電点に調整される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記乾燥工程（ｆ）が、噴霧乾燥により行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、工業的リンゴ加工から生じる乾燥ポリフェノール画分から出発する、ジヒドロカルコンが富化された、かつより特定的にはフロリジンが富化された抽出物の、改善された調製方法に関する。本発明はまた、当該方法により得ることができるジヒドロカルコン抽出物に関する。
【０００２】
世界的な園芸工業の発展により、大量の果物廃棄物が発生している。こうした残渣は、一般的に、炭水化物、タンパク質、ビタミン、ミネラル、抗酸化物質、および他の生物活性二次代謝産物の、良好な供給源である。リンゴ果実は、様々な種類のアップルケーキ、アップルジュースおよびリンゴ果汁発酵飲料を製造するために食品工業において大規模に使用され、並行して、ともに多量の栄養学的に興味深い代謝産物を含有する、多量のリンゴ絞りかすまたはリンゴ果皮廃棄物流れを発生させている。リンゴ絞りかすは、種子、芯、茎、果皮、および柔組織の不均一混合物の形態を取る。リンゴ絞りかすは、一般的な食品ゲル化剤であるペクチンの主要供給源のうちの１つであり、生物工学的生産のためにも使用され得る。リンゴ中のフェノール化合物は、果実の様々な部分に存在しており、ヒドロキシ桂皮酸誘導体、モノマーおよびオリゴマーのフラバン−３−オール、ジヒドロカルコン、フラボノールなどといった、いくつかのクラスに分類され得る。リンゴ副生物の有効利用は、ますます話題となっており、リンゴ工業における収益性および／または持続可能性の達成に向けた重要なプロセスと考えられ得る。
【０００３】
フロリジン（グルコース、１−［２−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）−４，６−ジヒドロキシフェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノン）；ＣＡＳ  Ｎｏ．：６０−８１−１は、有機化合物のジヒドロカルコンクラスのメンバーである。これは、グルコース部分とアルキルスペーサーにより連結された２個の芳香環とからなるものである。フロリジンは天然物であり、種々の果樹（リンゴ樹木の根、樹皮、シュート、葉および果実を含む）において見出され、それらから単離されており、イチゴ植物体のあらゆる部分からも単離されている。さらに、フロリジンは、非病理的形態の肥満を処置するために使用される（欧州特許第１３３８２７０号明細書）公知の強力なグルコース吸収遮断薬（ｕｐｔａｋｅ  ｂｌｏｃｋｅｒ）（国際公開第２００１／１５７０６号パンフレット）である。
【０００４】
フロリジンおよび／またはフロリジンが富化された天然抽出物は、通常さらなる高価なクロマトグラフィー工程を必要とする、複数の抽出工程（国際公開第２００７／１２４１０２号パンフレット；欧州特許第１２４３５８６号明細書）、または選択的酵素工程（Ｗｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．ＬＷＴ（２００７），４０：１３４４−１３５１）によって調製され得る。しかしながら、これまでの先行技術に記載されている精製技術は、それらは全てクロマトグラフィー工程または酵素工程を有するので、比較的高価であり、時間がかかり、工業廃棄物流れから出発して工業規模で運転することが困難である。
【０００５】
市場におけるフロリジンに対する需要が絶えず増加し続けていることから、本発明の目的は、実施が容易であり、かつ高収率の結果として経済的利益をもたらす、フロリジンの調製方法を提供することであった。さらに、本発明の方法は、より安定で、かつ非常に少ない量の望ましくないオルト−ジヒドロキシフェノール構造物（例えば、ケルセチンおよびその誘導体、フラボノール類、フラバノール類、ならびにヒドロキシ桂皮酸類）を含有する、より純粋な製品をもたらす。このことは、フロリジン調製物中の少量のケルセチンおよびその誘導体が貯蔵の間に酸化する傾向があり、それによってそのフロリジン調製物を茶色く変色させ、これは食品配合物における使用にとって望ましくないので、特に重要である。
【０００６】
驚くべきことに、本発明の方法は、他の技術の使用と比較して非常に低い加工費で、より高いジヒドロカルコン収率およびより少ないオルト−ジヒドロキシフェノール構造物をもたらすことが見出された。さらに、本発明の方法は、抽出および望ましくない副産物の選択的沈殿しか必要とせず、それにより、本方法は、先行技術のどの方法と比較しても著しくより費用効果の高いものとなっている。
【０００７】
したがって、本発明は、ジヒドロカルコンおよびその誘導体が富化された抽出物の調製方法であって、
（ａ）乾燥ポリフェノール抽出物を食品グレードの溶媒で抽出する工程と、
（ｂ）（ａ）からの抽出物をアルカリ化する工程と、
（ｃ）（ｂ）からの結果として生じる溶液を酸化する工程と、
（ｄ）（ｃ）の混合物を濾過または遠心分離する工程と、
（ｅ）任意選択で、（ｄ）の結果として生じる溶液をエバポレートして残留溶媒を除去し、乾燥物を水に可溶化する工程と、
（ｆ）結果として生じる抽出物を乾燥させる工程と
を含む方法を提供する。
【０００８】
ジヒドロカルコンおよびその誘導体とは、フロリジン、フロレチン、フロレチン−２’−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシル−（１−６）−β−Ｄ−グルコピラノシド、および他のフロレチングリコシドから選択される、任意の化合物を意味する。
【０００９】
特定の実施形態において、出発材料として使用される原料は、工業的リンゴ加工から得られる乾燥ポリフェノール抽出物である。リンゴという語は、国産および野生のリンゴと解釈されるべきである。原料は、アップルジュースまたはリンゴ果汁発酵飲料製造からの残渣としてのリンゴ絞りかす、またはリンゴ絞りかすから得られるさらに精製されたポリフェノール抽出物、またはリンゴ果皮であり得る。より好ましくは、出発材料として使用される原料は、リンゴペクチン製造プロセスから得られる乾燥ポリフェノール抽出物である。さらにより好ましくは、国際公開第２００１／７８８５９号パンフレットに記載されているようなペクチン製造プロセスの結果として生じる乾燥ポリフェノール抽出物である。さらに、乾燥ポリフェノール抽出物が工業的リンゴ加工から得られる場合、好ましくは、それは、少なくとも１重量％、好ましくは少なくとも５重量％、より好ましくは少なくとも８重量％のフロリジンを含む。当該乾燥ポリフェノール抽出物はまた、５％までのケルセチンおよびその誘導体も含み得る。
【００１０】
別の実施形態において、本発明に従う方法の抽出工程（工程（ａ））は、純粋な食品グレードの溶媒、水、または水−溶媒混合物を用いて行われる。水−溶媒混合物は、１から最大９９体積％の水、好ましくは最大５０体積％、より好ましくは最大３０体積％、さらにより好ましくは最大１０体積％の水を含む。本発明に従う好ましい食品グレードの溶媒は、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、メタノール、エタノール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、３−メチル−１−ブタノール、プロパン−１−オール、２−メチル−１−プロパノール、イソプロパノール、１−ペンタノール、酢酸メチル、酢酸エチル、ギ酸エチル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、アセトン、エチルメチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、エチルエーテル、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、アニソール、クメンから選択される。
【００１１】
さらなる実施形態において、工程（ａ）の抽出溶媒は、メタノール、エタノール、およびイソプロパノールから選択される。さらにより好ましい食品グレードの抽出溶媒は、フロリジンを抽出することにおけるその有効性ならびにケルセチンおよびその誘導体の抽出に不利なその選択性から考えて、１００％イソプロパノールである。
【００１２】
高い収率および迅速な抽出プロセスを確保するためには、本発明に従う抽出工程（工程（ａ））が可能な限り効率的であることが重要である。したがって、別の実施形態において、溶媒添加後の乾燥ポリフェノール抽出物は、粒子の完全な可溶化または分散に至るまで、超音波で処理される。好ましい実施形態において、１００〜１０００ワットのある量の超音波が、１０リットルの水浴中で印加される。次いで、抽出は、当業者に知られている標準的な手順に従って最も良く行われる。これは、使用される温度および圧力に応じて抽出時間を調整しながら、抽出物−溶媒混合物に剪断力を導入する任意の従来の手段により行われ得る。好ましい実施形態において、抽出は、少なくとも１０分間、周囲温度（１８℃〜２５℃の間）で混合しながら行われる。
【００１３】
さらなる実施形態において、工程（ａ）の抽出プロセスは、５００／１〜１０／１  リットル／キログラムの間、好ましくは５００／１〜５０／１  リットル／キログラムの間、より好ましくは３００／１〜８０／１  リットル／キログラムの間に含まれる溶媒と乾燥ポリフェノール抽出物との比を用いて行われる。
【００１４】
さらなる実施形態において、アルカリ化工程（ｂ）は、ｐＨがｐＨ７〜ｐＨ１４の間に含まれる、好ましくはｐＨ８〜ｐＨ１４の間に含まれる、さらにより好ましくはｐＨ９〜ｐＨ１４の間に含まれるまでの塩基の添加により行われる。このアルカリ化工程のために、４．５より小さい、好ましくは２より小さいｐＫｂを有する任意の強塩基が使用され得る。好ましくは、抽出溶媒に多量のアルカリ水溶液を添加するのを避けるために、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）が、可能な限り高い濃度で使用される。任意選択で、アルカリ化工程は、抽出プロセスの開始時に、同じ条件で行われ得る。
【００１５】
さらなる実施形態において、酸化工程（工程（ｃ））は、工程（ｂ）のアルカリ化された抽出物中に大気空気を通気することによって行われる。酸化の程度は、溶媒の体積およびポリフェノールの量に応じて調整される。好ましい実施形態において、１ｇの乾燥ポリフェノール抽出物を含有する溶媒１００ｍｌ当たり、１０〜８０リットルの空気が通気される。酸化の程度は、ＨＰＬＣにより、オルト−ジヒドロキシフェノール構造物の完全な酸化の測定によって、最も良く制御される。
【００１６】
さらなる実施形態において、工程（ｃ）の酸化プロセスの終わりに、タンパク質が、酸化溶液に添加され、ここで、このタンパク質は、酸化溶液のｐＨにおいて正に荷電するものである。この正に荷電するタンパク質は、強力な清澄剤として作用する。任意の正に荷電するタンパク質が使用され得るが、好ましい実施形態においては、ゼラチンが使用される。正に荷電するタンパク質の濃度は、標準的な清澄手順に従って、酸化溶液の組成に応じて最適化されるべきである。
【００１７】
さらなる実施形態において、リジンおよび／またはシステインに富むタンパク質が、酸化溶液に添加される。好ましいリジンおよび／またはシステインに富むタンパク質は、植物由来のタンパク質である。特定の実施形態において、リジンおよび  またはシステインに富むタンパク質は、リジンおよびシステインにより代表されるアミノ酸を少なくとも８％、好ましくは少なくとも１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、または少なくとも２２％含有する。
【００１８】
さらなる実施形態において、タンパク質が添加される場合、酸化された溶液のｐＨは、反応の終わりに酸または塩基を用いて上述のタンパク質の等電点に調整される。
【００１９】
濾過または遠心分離工程（ｄ）は、あらゆる非可溶化粒子を除去するために、標準的な手順に従って行われる。次いで、結果として生じる上清は、任意選択で、溶媒のエバポレーションに供される。これは、任意の標準的なエバポレーション技術により行われ得る。乾燥工程（ｆ）は、凍結乾燥または噴霧乾燥により、標準的な手順に従って行われ得る。
【００２０】
本発明はまた、本発明の方法により得ることができるジヒドロカルコン抽出物を提供する。好ましい実施形態において、ジヒドロカルコン抽出物は、１重量％未満のオルト−ジヒドロキシフェノール構造物を含む。より好ましくは、当該ジヒドロカルコン抽出物は、０．５重量％未満のケルセチンおよび／またはその誘導体を含む。
【００２１】
好ましい実施形態において、本発明に従うジヒドロカルコン抽出物は、１０％より多くのジヒドロカルコン、ならびに１重量％未満のケルセチンおよび／またはその誘導体、より好ましくは、０．５重量％未満のケルセチンおよび／またはその誘導体を含む。
【００２２】
本発明はまた、本発明に従うジヒドロカルコン抽出物を含む、食品または機能性食品製品を提供する。
【００２３】
本発明を、以下の実施例によりさらに説明する。
【００２４】
［実施例］
［実施例１：ポリフェノール抽出物からのジヒドロカルコン、特にフロリジンの富化］
本実験においては、水浴中、１００ｍｌのねじ蓋ガラスフラスコ中で、０．５ｇ（±０．００２５ｇ）の量のポリフェノール抽出物（Ｈｅｒｂｓｔｒｅｉｔｈ＆Ｆｏｘ；Ｎｅｕｅｎｂｕｅｒｇ，ＤＥ）を、５０ｍｌのエタノールと共に、３００ｒｐｍで３０分間撹拌し、この試料を、最初の３０秒以内において超音波に曝露した。全ての実験を、四重反復試験で行った。
【００２５】
ＵＰＬＣ−ＤＡＤ／ＭＳ分析用に、２ｍｌのアリコートを遠心分離し（１３．２０００ｒｐｍで３分）、次にこれを、メタノール／水（１：１、ｖ：ｖ）で１：６（ｖ：ｖ）に希釈した。残りを、ＮａＯＨを添加することによってｐＨ値１１に調整し、次に、２ｍｌのアリコートを、ＵＰＬＣ−ＤＡＤ／ＭＳ分析用に取り出した。その後、その塩基性抽出物を、１．３リットル／分の流量で空気を通気することによって１５分間酸化し、沈殿物を、遠心分離（３２２０ｒｃｆ、１５分間）により分離した。上清を、５０ｍｌ容量フラスコに移し、エタノールで満たした。これらの溶液の２００μｌのアリコートを、ＵＰＬＣ−ＤＡＤ／ＭＳ分析用に取り出した。さらに、エタノールを、ロータリーエバポレーターを用いて３０℃で除去し、残留物を、重量測定により定量化した。
【００２６】
さらに、全ての試料を凍結乾燥させた。この目的のために、ロータリーエバポレーションにより乾燥させた試料に、それらを溶解させるために５ｍｌの水を添加した後、それらをイソプロパノール−ドライアイス混合物中で凍結させ、続いて凍結乾燥させた。
【００２７】
ＵＰＬＣ−ＤＡＤ／ＭＳによりλｍａｘ＝２８５ｎｍで定量化した酸化前および酸化後のエタノール抽出物のフロリジン含有量に基づき、凍結乾燥物のフロリジン量および凍結乾燥物中のその割合を求めた（表１）。さらに、プロセスの間のケルセチン含有量およびその誘導体の減少を、ＵＰＬＣ−ＤＡＤ／ＭＳによりλｍａｘ＝３７０ｎｍでモニタリングした。
【００２８】
【表１】
0005935127.tif 000002
【００２９】
凍結乾燥後、抽出物重量（４つの実験の平均）は２５６ｍｇであった。凍結乾燥物は、１４．９重量％のフロリジン、および２０３ｍｇの非フロリジン化合物を含有していた。
【００３０】
［実施例２：ポリフェノール抽出物からのジヒドロカルコン、特にフロリジンの富化］
本実験においては、水浴中、１００ｍｌのねじ蓋ガラスフラスコ中で、０．５ｇ（±０．００２５ｇ）の量のポリフェノール抽出物（Ｈｅｒｂｓｔｒｅｉｔｈ  ＆  Ｆｏｘ；Ｎｅｕｅｎｂｕｅｒｇ，ＤＥ）を、５０ｍｌのイソプロパノールと共に、３００ｒｐｍで３０分間撹拌し、この試料を、最初の３０秒以内において超音波に曝露した。全ての実験を、四重反復試験で行った。
【００３１】
ＵＰＬＣ−ＤＡＤ／ＭＳ分析用に、２ｍｌのアリコートを遠心分離し（１３．２０００ｒｐｍで３分）、次にこれを、メタノール／水（１：１、ｖ：ｖ）で１：６（ｖ：ｖ）に希釈した。残りを、１．１ｍｌの１Ｍ  ＮａＯＨを添加することによって１０．５０〜１０．９８の間のｐＨ値に調整し、次に、２ｍｌのアリコートを、ＵＰＬＣ−ＤＡＤ／ＭＳ分析用に取り出した。その後、その塩基性抽出物を、１．３リットル／分の流量で空気を通気することによって１５分間酸化し、沈殿物を、遠心分離（３２２０ｒｃｆ、１５分間）により分離した。上清を、５０ｍｌ容量フラスコに移し、イソプロパノールで満たした。これらの溶液の２００μｌのアリコートを、ＵＰＬＣ−ＤＡＤ／ＭＳ分析用に取り出した。さらに、イソプロパノールを、ロータリーエバポレーターを用いて３０℃で除去し、残留物を、重量測定により定量化した。
【００３２】
さらに、全ての試料を凍結乾燥させた。この目的のために、ロータリーエバポレーションにより乾燥させた試料に、それらを溶解させるために５ｍｌの水を添加した後、それらをイソプロパノール−ドライアイス混合物中で凍結させ、続いて凍結乾燥させた。
【００３３】
ＵＰＬＣ−ＤＡＤ／ＭＳによりλｍａｘ＝２８５ｎｍで定量化した酸化前および酸化後のイソプロパノール抽出物のフロリジン含有量に基づき、凍結乾燥物のフロリジン量および凍結乾燥物中のその割合を求めた（表１）。さらに、プロセスの間のケルセチン含有量およびその誘導体の減少を、ＵＰＬＣ−ＤＡＤ／ＭＳによりλｍａｘ＝３７０ｎｍでモニタリングした。
【００３４】
乾燥ポリフェノール抽出物中のケルセチンおよびその誘導体の量：１０ｍｇ
精製生成物中のケルセチンおよびその誘導体の量：０．２ｍｇ未満
【００３５】
【表２】
0005935127.tif 000003
【００３６】
酸化および凍結乾燥後、抽出物重量（４つの実験の平均）は１１１．７ｍｇであった。凍結乾燥物は、２４．５重量％のフロリジンを含有していた。