(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザワクチンを調製するためのプロセスであって、
（ｉ）インフルエンザウイルス血球凝集素を含む液体組成物における該血球凝集素の濃度を増加させて、＞１５ｍｇ／ｍｌの血球凝集素含有量を有する濃縮された抗原を提供するステップ、および
（ｉｉ）該濃縮された抗原からインフルエンザワクチンを処方するステップ
を含む、プロセスであって、
ここで、該血球凝集素抗原濃度が、ステップ（ｉ）とステップ（ｉｉ）との間、または、ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）において凍結乾燥または噴霧乾燥することなく、ステップ（ｉ）において接線流濾過により増加される、プロセス。
【請求項２】
請求項１に記載のプロセスであって、該プロセスは、ｎ個の異なるインフルエンザウイルス株由来の血球凝集素を含むワクチンを調製するためのプロセスであり、
（ｉ）ｎ個の別個の液体組成物であって、それぞれが異なる株由来のインフルエンザウイルス血球凝集素を含む、ｎ個の別個の液体組成物における、血球凝集素の濃度を増加させて、ｎ個の別個の濃縮された抗原を提供するステップ、および
（ｉｉ）該ｎ個の別個の濃縮された抗原から多価インフルエンザワクチンを処方するステップ
を含み、該ｎ個の別個の血球凝集素抗原すべての濃度が、ステップ（ｉ）とステップ（ｉｉ）との間、または、ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）において凍結乾燥または噴霧乾燥することなく、ステップ（ｉ）において接線流濾過により増加される、プロセス。
【請求項３】
前記液体組成物が、外因性糖アルコールおよび／または外因性二糖を実質的に含まない、請求項１〜２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項４】
ステップ（ｉ）が抗原濃度を少なくとも１０倍に増加させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記液体組成物が界面活性剤を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記界面活性剤がイオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤である、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記イオン性界面活性剤がＣＴＡＢである、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート８０である、請求項６に記載のプロセス。
【請求項９】
前記界面活性剤がステップ（ｉ）において濃縮される、請求項５〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記界面活性剤が、前記抗原が濃縮される程度より低い程度まで濃縮される、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記界面活性剤がステップ（ｉ）において濃縮されない、請求項５〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
ステップ（ｉｉ）が固形ワクチン形態を調製する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
ステップ（ｉｉ）が蒸発による乾燥を含む、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
ステップ（ｉｉ）が、前記濃縮された抗原から固形生分解性マイクロニードルを調製する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１５】
ステップ（ｉｉ）が、固形マイクロニードルを前記濃縮された抗原でコーティングする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記マイクロニードルが金属またはプラスチックである、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
ステップ（ｉｉ）が、前記濃縮された抗原を１つまたは複数の固形マイクロニードルの表面に適用して、前記ワクチンの注入用のコーティング型マイクロニードルデバイスを提供する、請求項１５または請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記マイクロニードルが１００〜２５００μｍの長さである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１９】
ステップ（ｉｉ）が前記濃縮された抗原から薄型フィルムを調製する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２０】
ステップ（ｉｉ）が、
前記濃縮された抗原を１つまたは複数の口腔内溶解性ポリマーと混合するステップ、次に、
該混合物を用いてフィルムを形成して、前記ワクチンの頬側投与に適した薄型フィルムを提供するステップ
を含む、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
ステップ（ｉｉ）が、
前記濃縮ワクチン抗原を１つまたは複数の局所溶解性ポリマーと混合するステップ、次に、
該混合物を用いてフィルムを形成して、前記ワクチンの経皮投与に適した薄型フィルムを提供するステップ
を含む、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記フィルムが１０〜５００μｍの厚さである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記フィルムが７５〜１５０μｍの厚さである、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記抗原が前記フィルム内の微粒子の内部へカプセル化される、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２５】
（ｉ）請求項１２〜２４のいずれか一項に記載のプロセスによって固形ワクチンを調製するステップ、次に、
（ｉｉ）固形ワクチンを個々の単位用量小袋の中へパッケージングするステップ
を含む、パッケージングされたワクチンを調製するためのプロセス。
【請求項２６】
前記抗原がインフルエンザ血球凝集素を含み、
血球凝集素含有量が、ＳＲＩＤを用いることによって前記処方するステップの前に測定される、
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記抗原がインフルエンザ血球凝集素を含み、
血球凝集素含有量が、ＳＲＩＤを用いることによって前記処方するステップの後に測定される、
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国仮出願第６１／３９６，７１９号（２０１０年６月１日出願）および米国仮出願第６１／４６５，４０５号（２０１１年３月１８日出願）の利益を主張し、両方の上記米国仮出願の全容は、全ての目的について参考として本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、ワクチンに用いるための抗原溶液の処理の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
ワクチン製造中、製造バルクにおける抗原の濃度が、最終の患者処方物における濃度を超える場合が多く、それゆえ、プロセスは、バルクが希釈されるステップを含む。しかしながら、状況によっては、水性バルクにおける抗原濃度を増加させることが必要であり、本発明は、抗原を濃縮するためのプロセスに関する。有用なプロセスは、抗原の濃度を、その免疫原性を破壊することなく増加させるべきである。
【０００４】
抗原濃縮が必要とされる一つの状況は、ほんの少量の材料が送達される新しい送達技術に関する状況である。例えば、ワクチンは、マイクロニードル（ｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅ）［２、３（非特許文献２、３）］により、または薄型フィルムもしくはストリップ［１（非特許文献１）、１４〜１７（非特許文献４、５、特許文献１、２）］により送達することができる。これらの技術は、０．５ｍｌの典型的な筋肉内注射よりもはるかに小さい容積を送達するが、それらは、同量の抗原を必要とする場合があり、このことは、より濃縮されたバルク抗原を必要とすることが多い。
【０００５】
１２５〜５００μｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌまで個々のインフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）の濃度を増加させることができる一つの現行の濃縮プロセスは、水性材料の出発容積の１０ｍｇ／ｍｌの濃度への接線流濾過（ＴＦＦ）、その後、凍結乾燥、その後、出発容積より小さい水性容積における凍結乾燥物の再構成を含む。このプロセスは、３つの異なる一価ＨＡバルクに実施することができ、単一の三価水性組成物としてのそれらの再構成により、４２ｍｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度がもたらされ得る。
【０００６】
ワクチン製造、特にインフルエンザワクチン製造（筋肉内注射によって送達されないインフルエンザワクチンなど）に用いるために、材料における抗原の濃度を増加させるためのさらなる改善されたプロセスを提供することが本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０２／０５１３８２号
【特許文献２】国際公開第２０１０／００２４１８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍａｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｏｎａｔｏｌｏｇｙ．  （２０１０）  Ｖｏｌ  １１，  ｎｕｍｂｅｒ  ２．
【非特許文献２】Ｋｏｕｔｓｏｎａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  （２００９）  ４（ｅ）：  ｅ４７７３．
【非特許文献３】Ｑｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  （２００９）  ４（９）：ｅ７１５２．
【非特許文献４】Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．  （２００９）  ３（１１）：３７１９−２９．
【非特許文献５】Ｃｕｉ  ＆  Ｍｕｍｐｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （２００２）  １９：９４７−５３．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
抗原濃縮を、大きな水性容積の凍結乾燥、その後の、より小さな水性容積における凍結乾燥物の再構成に頼る既存のプロセスとは対照的に、本発明は、バルク抗原の凍結乾燥を、最終処方および／または送達の前に含まない抗原濃縮手順を提供する。本発明者らは、凍結乾燥手順が、所望の濃縮を達成しながら、抗原の保存期間を増強することができるとはいえ、それは抗原を損傷し得、そのため、再構成後に回復する機能性抗原の量は予想より低いことを見出した。さらに、凍結乾燥した抗原は、可溶性抗原を用いて確立された標準アッセイ（例えば、血球凝集素定量化についてのＳＲＩＤアッセイ）においてうまく機能しない場合が多い。したがって、凍結乾燥を含まない濃縮手順は、最終のワクチン製造物を改善し、標準アッセイの使用を可能にし、最終ワクチンへリオプロテクタント（スクロースなど）を加える必要性も回避することができる。
【００１０】
したがって、本発明は、（ｉ）抗原を含む液体組成物における抗原の濃度を増加させて、濃縮された抗原を提供するステップ、および（ｉｉ）前記濃縮された抗原からワクチンを処方するステップを含み、前記濃縮された抗原がステップ（ｉ）とステップ（ｉｉ）との間、またはそれらのステップ中に凍結乾燥されない、ワクチンを調製するためのプロセスを提供する。
【００１１】
本発明はまた、このプロセスによって調製されたワクチンを提供する。本発明は、固形ワクチン形態を調製するのに特に有用である。
【００１２】
本発明はまた、（ｉ）インフルエンザウイルス血球凝集素を含む液体組成物における血球凝集素の濃度を増加させて、濃縮された抗原を提供するステップ、および（ｉｉ）前記濃縮された抗原からインフルエンザワクチンを処方するステップを含み、前記濃縮された抗原がステップ（ｉ）とステップ（ｉｉ）との間、またはそれらのステップ中に凍結乾燥されない、インフルエンザワクチンを調製するためのプロセスを提供する。
【００１３】
本発明はまた、（ｉ）それぞれが異なる株由来のインフルエンザウイルス血球凝集素を含むｎ個の別個の液体組成物における、インフルエンザウイルス血球凝集素の濃度を増加させて、ｎ個の別個の濃縮された抗原を提供するステップ、および（ｉｉ）前記ｎ個の別個の濃縮された抗原から多価インフルエンザワクチンを処方するステップを含み、前記ｎ個の別個の濃縮された抗原のいずれもが、ステップ（ｉ）とステップ（ｉｉ）との間、またはそれらのステップ中に凍結乾燥されない、ｎ個の異なるインフルエンザウイルス株由来の血球凝集素を含むワクチンを調製するためのプロセスを提供する。ｎの値は２以上（例えば、２、３、４、または５）であるが、典型的には、３（すなわち、三価インフルエンザワクチン）または４（すなわち、四価インフルエンザワクチン）である。
【００１４】
本発明はまた、インフルエンザウイルス血球凝集素を含むバルク液体ワクチンであって、（ａ）前記血球凝集素の濃度が少なくとも１２ｍｇ／ｍｌであり、（ｂ）前記ワクチンがスクロースを実質的に含まない、バルク液体ワクチンを提供する。
【００１５】
本発明はまた、少なくとも２株のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素を含むバルク液体ワクチンであって、（ａ）前記血球凝集素の濃度が少なくとも２ｍｇ／ｍｌ／株であり、（ｂ）前記ワクチンがスクロースを実質的に含まない、バルク液体ワクチンを提供する。
【００１６】
抗原
本発明は、様々な供給源由来の抗原を濃縮するのに有用である。抗原は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生生物由来であってもよい。したがって、ワクチンは、細菌、ウイルス、真菌、および／または寄生生物によって引き起こされる疾患から防御し得る。
【００１７】
本発明に関して用いられる典型的な細菌には、以下が挙げられるが、それらに限定されない：
・Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓなどのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ。
・Ｃ．ｔｅｔａｎｉおよびＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍなどのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ。
・Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ。
・Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅなどのＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ。
・Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｓｉ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、および弱毒Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  ＧｕｅｒｉｎなどのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ。
・Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅなどのＮｅｉｓｓｅｒｉａ。
・Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓなどのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ。
・Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、およびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ。
【００１８】
本発明に関して用いられる典型的なウイルスには、以下が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１９】
・インフルエンザＡ型、Ｂ型、またはＣ型ウイルスなどのオルトミクソウイルス。インフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスは、パンデミック間期（例年／季節性）の株であってもよいし、またはパンデミック発生を引き起こす可能性をもつ株由来であってもよい（すなわち、現在広まっている株における血球凝集素と比較して新しい血球凝集素を有するインフルエンザ株、またはトリ被験体において病原性であり、かつヒト集団において水平方向に伝染する可能性を有するインフルエンザ株、またはヒトにとって病原性であるインフルエンザ株）。特定の季節および株の性質に依存して、インフルエンザＡ型ウイルスは、１つまたは複数の以下の血球凝集素亜型に由来し得る：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６。より詳細には下記に示されている。
【００２０】
・肺炎ウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、およびモルビリウイルス（麻疹）などのパラミクソウイルス科ウイルス。
【００２１】
・肺炎ウイルスまたはメタ肺炎ウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、例えば、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウイルス、マウス肺炎ウイルス、および七面鳥鼻気管炎ウイルス。好ましくは、肺炎ウイルスは、ＲＳＶまたはヒトメタ肺炎ウイルス（ＨＭＰＶ）である。
【００２２】
・パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）１型、２型、３型、または４型、ムンプス、センダイウイルス、サルウイルス５、ウシパラインフルエンザウイルス、およびニューカッスル病ウイルスなどのパラミクソウイルス属。好ましくは、パラミクソウイルス属はＰＩＶまたはムンプスである。
【００２３】
・エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルス、およびアフトウイルスなどのピコルナウイルス科。エンテロウイルスには、ポリオウイルス１型、２型、または３型、コクサッキーＡウイルス１型〜２２型、および２４型、コクサッキーＢウイルス１型〜６型、エコーウイルス（ＥＣＨＯウイルス）１型〜９型、１１型〜２７型、および２９〜３４型、ならびにエンテロウイルス６８型〜７１型が挙げられる。好ましくは、エンテロウイルスは、ポリオウイルス、例えば、ＭａｈｏｎｅｙもしくはＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓなどの１型株、ＭＥＦ−１などの２型株、またはＳａｕｋｅｔｔなどの３型株である。ヘパルナウイルス（ヘパトウイルスとも名付けられている）の例はＡ型肝炎ウイルスである。
【００２４】
・ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルスなどのトガウイルス科。風疹ウイルスなどのルビウイルスが好ましい。不活性化のための有用なアルファウイルスには、サケ膵臓病ウイルスおよび睡眠病ウイルスなどの水生のアルファウイルスが挙げられる。
【００２５】
・ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）、デング（１型、２型、３型、または４型）、黄熱病、日本脳炎、ウエストナイル脳炎、セントルイス脳炎、ロシア春夏脳炎、ポワッサン脳炎などのフラビウイルス属。
【００２６】
・Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）。
【００２７】
・ウシウイルス性下痢症（ＢＶＤＶ）、ブタコレラ（ＣＳＦＶ）、またはボーダー病（ＢＤＶ）などのペスチウイルス。
【００２８】
・Ｂ型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルス。
【００２９】
・リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ）などのラブドウイルス。
【００３０】
・ノーウォークウイルス、ならびにハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスなどのノーウォーク様ウイルス、ならびにブタ小水疱性発疹ウイルスなどのベシウイルスなどのカリシウイルス科。
【００３１】
・ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器コロナウイルス、トリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）などのコロナウイルス。
【００３２】
・オンコウイルス、レンチウイルス、またはスプマウイルスなどのレトロウイルス。オンコウイルスは、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、またはＨＴＬＶ−３であってもよい。レンチウイルスは、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１、またはＨＩＶ−２であってもよい。
【００３３】
・オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルスなどのレオウイルス属。
【００３４】
・パルボウイルスＢ１９またはボカウイルスなどのパルボウイルス属。
【００３５】
・単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）などのヒトヘルペスウイルス。
【００３６】
・パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスなどのパポバウイルス。パピローマウイルスには、ＨＰＶ血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３、および６５が挙げられる。
【００３７】
・ヒトアデノウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧのいずれかを含むアデノウイルス科。
【００３８】
本発明は、ウイルス用ワクチン、特に、ワクチン抗原がウイルス表面糖タンパク質であるウイルス用ワクチンを調製するのに理想的である。したがって、本発明は、下でより詳細に記載されているように、インフルエンザワクチンを調製するためにインフルエンザウイルス血球凝集素を濃縮するのに理想的である。濃縮ステップは、＞５ｍｇ／ｍｌ、＞１０ｍｇ／ｍｌ、＞１５ｍｇ／ｍｌ、＞２０ｍｇ／ｍｌ、＞２５ｍｇ／ｍｌ、およびさらに＞３０ｍｇ／ｍｌのＨＡ含有量を有するインフルエンザワクチン抗原を提供することができる。
【００３９】
液体組成物
本発明のプロセスは、液体組成物における抗原の濃度を増加させ、それにより、処方物を目的とした濃縮された抗原を提供する。
【００４０】
好ましい液体組成物は、凍結乾燥されたことがないものである。
【００４１】
好ましい液体組成物は、リオプロテクタント（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を実質的に含まない。したがって、組成物は、外因性糖アルコール（特に：ソルビトール、マンニトール、マルチトール、エリスリトール、キシリトール）および／または外因性二糖（特に：スクロース、トレハロース、マルトース、ラクツロース、ラクトース、セロビオース）を実質的に含まなくてもよい。したがって、液体組成物における（ソルビトール、マンニトール、マルチトール、エリスリトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクツロース、ラクトース、セロビオース）の合わせた濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ未満（すなわち、１％未満）であってもよいが、理想的には、１ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ未満である。
【００４２】
典型的な液体組成物は、例えば、少なくとも５００回のワクチンの別個のヒト単位用量についての十分な抗原を含有する、バルクワクチンである。
【００４３】
液体組成物は、一価（すなわち、１つだけの病原体から防御するためのワクチン抗原を含有する）でも、多価（すなわち、１つより多い病原体から防御するためのワクチン抗原を含有し、１つより多い様々な非交差防御性病原体（例えば、複数の髄膜炎菌血清型または複数のインフルエンザＡ型ウイルス血球凝集素型）が存在する場合を含む）でもよい。それは、好ましくは、一価である。
【００４４】
本発明は、様々なワクチン抗原濃度を有する液体試料に関して用いることができる。典型的には、液体試料は、ワクチン抗原を少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で含む。
【００４５】
濃縮ステップ
本発明のプロセスは、抗原の濃度が増加するステップを含む。この濃縮ステップに様々な技術を用いることができ、それらには、遠心濾過、限外濾過、または接線流濾過（交差流濾過としても知られている）が挙げられるが、それらに限定されない。凍結乾燥を必要としないのにもかかわらず、良好な濃縮を達成することができるので、好ましい方法は、ＴＦＦを用いる。
【００４６】
遠心濾過は、液体のフィルターを通しての遠心分離を含む。フィルターは、抗原を保持して濃縮するが、溶媒または小さい溶質を保持しない。濾液の容積が増加するにつれて、保持分（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）における抗原の濃度もまた増加する。この技術は、典型的には、固定角ローターを用いる。種々の適切な遠心濾過デバイスが市販されており、例えば、商標Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（商標）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標）、およびＳｐｉｎｔｅｋ（商標）として販売されている製品である。フィルターのカットオフは、目的の抗原が保持分中に保持されるように選択される。
【００４７】
限外濾過は、液体を半透膜に対して押す静水圧の使用を含む。フィルターは、抗原を保持して濃縮するが、溶媒または小さい溶質を保持しない。静水圧の連続的な適用によって、濾液の容積が増加し、それにしたがって、保持分における抗原の濃度もまた増加する。多くの限界濾過膜が市販されている。限外濾過膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は、どの溶質が膜を通過することができるか（すなわち、濾液へ）、およびどれが保持されるか（すなわち、保持分中）を決定する。本発明に関して用いられるフィルターのＭＷＣＯは、目的の抗原の実質的に全部が保持分に留まるように選択される。
【００４８】
接線流濾過（ＴＦＦ）は、液体をフィルター膜にわたって接線方向に通すことを含む。試料側は、典型的には、濾液側に対して陽圧で保たれる。液体がフィルターの上を流れるとき、その中の成分は、膜を通って濾液へと通過することができる。連続流は、濾液の容積を増加させ、それにしたがって、保持分における抗原の濃度は増加する。ＴＦＦは、デッドエンド濾過と対照をなし、そのデッドエンド濾過において、試料は、膜に対して接線方向ではなく、膜を貫いて通る。多くのＴＦＦシステムが市販されている。ＴＦＦ膜のＭＷＣＯは、どの溶質が膜を通って通過することができるか（すなわち、濾液中）、およびどれが保持されるか（すなわち、保持分中）を決定する。本発明に関して用いられるＴＦＦフィルターのＭＷＣＯは、目的の抗原の実質的に全部が保持分に留まるように選択される。
【００４９】
これらの３つの濃縮技術は相互排他的ではなく、例えば、本発明は、接線流限外濾過を用いることができる。
【００５０】
どの技術が選択されようと、それは、好ましくは、目的の抗原の濃度を少なくともｎ倍（ｎは５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、またはそれ以上である）増加させる。
【００５１】
処方ステップ
抗原濃縮後、本発明のプロセスは、任意の中間の凍結乾燥なしで、濃縮された抗原をワクチンとして処方する。処方ステップもまた、抗原の凍結乾燥を含まない。理想的には、処方後の凍結乾燥もなく、すなわち、ワクチン抗原は、濃縮の開始から患者投与まで、凍結乾燥を回避する。
【００５２】
本発明は、様々なワクチン処方物を調製するために用いることができる。濃縮ステップを用いるということは、本発明が、患者への少量の材料の送達に関わる技術にとって理想的であることを意味する。例えば、本発明は、（例えば、皮内注射用の）０．１ｍｌ以下の単位用量容積を有する液体ワクチン処方物を調製するのに有用である。本発明はまた、固形（しかし、凍結乾燥されていない）ワクチン処方物を調製するのに有用であり、なぜならば、それは、高い抗原濃度を必要とし得るためである。下でより詳細に記載されているように、適切な固形処方物には、固形生分解性マイクロニードル、コーティング型マイクロニードル、および薄型フィルムが挙げられるが、それらに限定されない。したがって、本発明のプロセスにおける処方ステップは、濃縮された抗原から固形ワクチン形態を調製することを含んでもよい。このステップは、乾燥を含んでもよいが、凍結乾燥を含まず、例えば、それは蒸発を含んでもよい［１１］。
【００５３】
リオプロテクタントは、凍結乾燥には関係のない理由で（例えば、コーティングを増強するために）、処方物に加えられる場合が多いが、本発明の処方ワクチンは、リオプロテクタントを実質的に含まない場合がある。それゆえに、いくつかの実施形態において、本発明の処方ワクチンは、糖アルコール（特に、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、エリスリトール、キシリトール）および／または二糖（特に、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクツロース、ラクトース、セロビオース）を実質的に含まなくてもよい。したがって、処方ワクチンにおける（ソルビトール、マンニトール、マルチトール、エリスリトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクツロース、ラクトース、セロビオース）の合わせた濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ未満（すなわち、１％未満）、例えば、１ｍｇ／ｍｌ未満または０．１ｍｇ／ｍｌ未満であってもよい。
【００５４】
処方ステップは、理想的には、濃縮された抗原が適切な効力を保持することを保証するために、濃縮ステップの４週間以内（例えば、２週間以内）に実施される。
【００５５】
本発明のワクチンは、理想的には、イヌリンを含まない。また、本発明のワクチンは、理想的には、ウイルス抗原をカプセル化する表面活性物質ベシクルを含まない。
【００５６】
固形生分解性マイクロニードル
本発明を用いて調製することができる一つの有用な固形処方物は、固形生分解性マイクロニードルである。これらは、典型的には、単独で投与されず、むしろ、複数のニードルが同時に、例えば、複数のマイクロニードルを含む皮膚パッチとして、投与される。
【００５７】
マイクロニードルは、固形であって、保存中、構造的完全性を保持し、かつパッチが適用される場合、被験体の皮膚に貫入することができるような、固形である。皮膚貫入に必要とされる力学特性は、問題になっている生物体に依存するが、それらは、通常、ヒト皮膚に貫入するのに十分な強度を有する。適切な固形ニードルを形成するための材料は、容易に入手可能であり、これらを、任意の特定のニーズのために、試験して、適当な濃度などを決定することができる。
【００５８】
マイクロニードルは生体溶解性（ｂｉｏｓｏｌｕｂｌｅ）かつ生分解性である。したがって、固形材料は、参考文献２および３（下記参照）に用いられたコーティング型マイクロニードルとは対照的に、パッチが適用された後、皮膚において溶解する。溶解して、その後、材料は、代謝されて、無害な最終生成物が生成される。パッチを適用した後の溶解のタイムスケールは様々であり得るが、溶解は、典型的には、パッチを適用した後すぐに（例えば、１０秒以内に）、開始し、例えば、最高１分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、１時間、５時間、１０時間、または２４時間、マイクロニードルが完全に溶解するまで、続き得る。適切なインビボ溶解動態をもつ材料は、容易に入手可能であり、これらは様々であり得、任意の所望の溶解プロフィールのために試験して、適当な濃度などを決定することができる。
【００５９】
マイクロニードルを形成するための適切なマトリックス材料は、典型的には、生体溶解性かつ生分解性ポリマーであり、これらは、１つまたは複数の炭水化物を含んでもよい。例えば、材料は、セルロース、デキストリン、デキストラン、二糖、キトサン、キチンなど、またはそれらの混合物を含んでもよい。他のＧＲＡＳ材料もまた用いてもよい。
【００６０】
適切なセルロースには、セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられるが、それらに限定されない。適切なデキストリンには、マルトデキストリン、シクロデキストリン、アミロデキストリン、イコデキストリン、黄色デキストリン、および白色デキストリンが挙げられるが、それらに限定されない。適切な二糖には、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、およびセロビオースが挙げられるが、それらに限定されない。生体溶解性かつ生分解性マイクロニードルを形成するための一つの適切な材料は、デキストリン／トレハロース混合物である。
【００６１】
マイクロニードルは、皮膚に貫入することができる。それらは、表皮に貫入して、真皮へ材料を送達する（すなわち、皮内送達）のに十分な長さであるべきであるが、理想的には、それらが皮下組織の中へ、またはそれを越えて、貫入することができるほど長くはない。それらは、典型的には、長さが１００〜２５００μｍ、例えば、長さが１２５０〜１７５０μｍ、または約１５００μｍである。送達時点において、先端は、真皮に貫入していてもよいが、ニードルの基部は、表皮に留まったままであってもよい。
【００６２】
マイクロニードルは、様々な形および幾何学的配置をもち得る。それらは、典型的には、皮膚接触（ｓｋｉｎ−ｆａｃｉｎｇ）点で先細になっており、例えば、角錐または円錐としての形をとる。＜５００μｍの最大直径をもつ先細のマイクロニードルが典型的である。
【００６３】
単一のパッチは、典型的には、複数のマイクロニードル、例えば、パッチあたり≧１０個、≧２０個、≧３０個、≧４０個、≧５０個、≧６０個、≧７０個、≧８０個、≧９０個、≧１００個、≧２００個、≧３００個、≧４００個、≧５０個、≧７５０個、≧１０００個、またはそれより多い個数を含む。パッチが複数のマイクロニードルを含む場合、それは、マイクロニードルの全部が付着しているバッキング層を含んでもよい。≧２０個の突出したマイクロニードルを有する単一のバッキング層が典型的である。パッチが複数のマイクロニードルを含む場合、これらを、規則的な反復パターンもしくはアレイで配置することができ、または不規則に配置されてもよい。
【００６４】
パッチは、典型的には、３ｃｍ２以下、例えば、＜２ｃｍ２または＜１ｃｍ２の面積を有する。０．５ｃｍ〜１．５ｃｍの直径を有する円形パッチが有用である。
【００６５】
パッチ上のマイクロニードルの密度は、様々であり得るが、≧１０個ｃｍ−２、≧２０個ｃｍ−２、≧３０個ｃｍ−２、≧４０個ｃｍ−２、≧５０個ｃｍ−２、≧６０個ｃｍ−２、≧７０個ｃｍ−２、≧８０個ｃｍ−２、またはそれより大きい密度であってもよい。
【００６６】
本発明のパッチは、皮膚接触内面および環境接触外面を有する。内面は、被験体の皮膚への接着性を促進するために接着剤を含んでもよい。存在する場合、それは、好ましくは、マイクロニードル自体に存在せず、すなわち、マイクロニードルは接着剤を含まない。内面上に接着剤を有するのではなく、パッチは、例えば、絆創膏またはニコチンパッチに見られるような、パッチを皮膚に接着させるための接着性外側縁を提供する追加のバッキングを有してもよい。
【００６７】
上記のようなパッチは、参考文献４〜８における技術およびガイダンスに従うことによって作製することができる。例えば、１．５ｍｍの長さのマイクロニードルの空洞を有する型を調製することができる。デキストリンおよびトレハロースのマトリックス材料を、インフルエンザワクチンと混合することができ、この水性材料を、遠心力で型に入れ、固形マイクロニードルのアレイを形成することができる。その後、セルロースゲルを、マトリックス／ワクチン混合物（例えば、その混合物はフィルムを形成している）の上に入れ、パッチの上にバッキング層を形成することができる。この層が乾燥したならば、それを取り出し、固形マイクロニードルが突出するパッチが、生み出され得る。したがって、本発明のプロセスにおける処方ステップは以下のステップを含んでもよい：（ａ）生体溶解性かつ生分解性マトリックス材料を濃縮ワクチン抗原と混合するステップ；および（ｂ）マイクロニードルを形成するためにステップ（ａ）からの混合物を、空洞を含有する型に加えるステップ。それはさらに以下のステップを含んでもよい：（ｃ）前記混合物を型において固化させて（ｓｅｔ）、固形マイクロニードルが形成されるステップ；（ｄ）任意で、固化マイクロニードルに材料を適用して、バッキング層を提供するステップ；および（ｅ）マイクロニードル（および任意のバッキング層）を型から取り出すステップ。
【００６８】
パッチを、個々の小袋の中へパッケージングし、例えば、窒素下で密閉し、その後、熱密閉してもよい。それらは、マイクロニードルへの損傷を避けるために注意深く保存されるべきである。
【００６９】
コーティング型マイクロニードル
本発明を用いて調製することができる別の有用な固形処方物は、コーティング型マイクロニードルである。これらは、典型的には、単独で投与されず、むしろ、複数のニードルが同時に、例えば、複数のマイクロニードルにより、投与される。一つの適切な製造物は、Ｍａｃｒｏｆｌｕｘ（商標）（Ｚｏｓａｎｏ）の商標として販売されている。
【００７０】
マイクロニードルは、保存中、構造的完全性を保持し、かつ被験体の皮膚に貫入することができるような、固形である。皮膚貫入に必要とされる力学特性は、問題になっている生物体に依存するが、それらは、通常、ヒト皮膚に貫入するのに十分な強度を有する。マイクロニードルは固形であり、患者の皮膚への挿入後、（上記で論じられた生分解性マイクロニードルとは対照的に）無傷のままである。適切な固形ニードルを形成するための材料は、容易に入手可能であり、これらを、任意の特定のニーズのために、試験し、選択することができ、例えば、金属（ステンレススチールなど）またはポリマー（ポリカーボネートなど、理想的には医療グレード）である。金属ニードルは、レーザーカッティングおよび電解研磨を用いて製作することができる［９］。ポリマーニードルは、マイクロ複製（ｍｉｃｒｏｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）および／またはマイクロ成形（ｍｉｃｒｏｍｏｌｄｉｎｇ）（射出成形を含む）によって製作することができる。適切なマイクロニードルは、参考文献２、３、および９〜１３に開示されている。
【００７１】
本発明の濃縮された抗原を、マイクロニードル上にコーティングすることができる。このコーティングは、例えば、浸漬ステップ、その後の、（例えば、蒸発による）乾燥ステップ（必要に応じてそれらのステップを繰り返す）を含む、浸漬コーティング（ｄｉｐ−ｃｏａｔｉｎｇ）などの簡単なプロセスによって達成することができる。他の有用なコーティング技術は、参考文献１１に開示されている。したがって、本発明のプロセスにおける処方ステップは、以下のことを含んでもよい：濃縮ワクチン抗原を１つまたは複数の固形マイクロニードルの表面へ適用して、ワクチンの注入用のコーティング型マイクロニードルデバイスを提供すること。
【００７２】
ニードルに適用するためのコーティング溶液は、１つまたは複数の生体溶解性かつ生分解性マトリックス材料を含むことができ、これらは、１つまたは複数の炭水化物を含んでもよい。例えば、材料は、セルロース、デキストリン、デキストラン、二糖、キトサン、キチンなど、またはそれらの混合物を含んでもよい。他のＧＲＡＳ材料もまた用いてもよい。適切なセルロース、デキストリン、および二糖は上記に列挙されている。したがって、本発明のプロセスにおける処方ステップは以下のステップを含んでもよい：（ａ）生体溶解性かつ生分解性マトリックス材料を濃縮ワクチン抗原と混合するステップ；および（ｂ）ステップ（ａ）からの混合物を、１つまたは複数の固形マイクロニードルの表面に適用し、ワクチンの注入用のコーティング型マイクロニードルデバイスを提供するステップ。コーティングを、参考文献１１に記載されているように、１つまたは複数の「沈着増強成分」を用いることによって増強させてもよい。
【００７３】
上記で論じられた適用ステップは、適用サブステップ、続く乾燥サブステップを含んでもよく、この対のサブステップは、１回、または１回より多く、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはより多い回数、実施することができる。
【００７４】
デバイスにおけるマイクロニードルは、適用された場合、皮膚に貫入することができる。それらは、表皮に貫入して、真皮へ材料を送達する（すなわち、皮内送達）のに十分な長さであるべきであるが、理想的には、皮下組織の中へ、またはそれを越えて、貫入することができるほど長くはない。それらは、典型的には、長さが１００〜２５００μｍ、例えば、長さが２５０〜７５０μｍ、または約１５００μｍである。送達時点において、先端は、真皮に貫入していてもよいが、ニードルの基部は、表皮に留まったままであってもよい。ニードルを、患者の皮膚に、３０秒間〜３０分間、適用し、その後、取り除くことができる。
【００７５】
マイクロニードルは、様々な形および幾何学的配置をもち得る。それらは、典型的には、皮膚接触点で先細になっており、例えば、角錐または円錐としての形をとる。＜５００μｍの最大直径をもつ先細のマイクロニードルが典型的である。
【００７６】
マイクロニードルデバイスは、典型的には、複数のマイクロニードル、例えば、デバイスあたり≧１０個、≧２０個、≧３０個、≧４０個、≧５０個、≧６０個、≧７０個、≧８０個、≧９０個、≧１００個、≧２００個、≧３００個、≧４００個、≧５０個、≧７５０個、≧１０００個、≧１５００個、≧２０００個、またはそれより多い個数を含む（例えば、デバイスあたり３００〜１５００個）。デバイスが複数のマイクロニードルを含む場合、これらは全て、典型的には、単一のバッキング層に付着している。デバイスが複数のマイクロニードルを含む場合、これらを、規則的な反復パターンもしくはアレイで配置することができ、または不規則に配置されてもよい。
【００７７】
マイクロニードルデバイスは、典型的には、３ｃｍ２以下、例えば、＜２ｃｍ２または＜１ｃｍ２の面積を有する。０．５ｃｍ〜１．５ｃｍの直径を有する円形デバイスが有用である。
【００７８】
マイクロニードルの密度は、様々であり得るが、≧１０個ｃｍ−２、≧２０個ｃｍ−２、≧３０個ｃｍ−２、≧４０個ｃｍ−２、≧５０個ｃｍ−２、≧６０個ｃｍ−２、≧７０個ｃｍ−２、≧８０個ｃｍ−２、またはそれより大きい密度であってもよい。各マイクロニードル間が２ｍｍで、１４個のマイクロニードル／ｃｍ２の密度をもつデバイスが有用である。
【００７９】
マイクロニードルデバイスは、皮膚接触内面および環境接触外面を有する。内面は、被験体の皮膚への接着性を促進するために接着剤を含んでもよい。存在する場合、それは、好ましくは、マイクロニードル自体に存在せず、すなわち、マイクロニードルは接着剤を含まない。内面上に接着剤を有するのではなく、デバイスは、デバイスを皮膚に接着させるための接着性外側縁を提供する追加のバッキングを有してもよい。
【００８０】
マイクロニードルデバイスを、個々の小袋の中へパッケージングし、例えば、窒素下で密閉し、その後、熱密閉してもよい。それらは、マイクロニードルへの損傷を避けるために注意深く保存されるべきである。
【００８１】
薄型フィルム
本発明を用いて調製することができる別の有用な固形処方物は、薄型経口フィルムなどの薄型フィルムである。これらのフィルムは、唾液および頬組織との接触で、湿り、迅速に溶解し、それゆえに、口の中でワクチン抗原を放出する。これらの薄型フィルムの主要な成分は、典型的には、１つまたは複数の親水性ポリマー（複数可）であり、そのポリマーは、良好な粘膜接着特性を有し得、完全に溶解するまで頬組織への強い接着を与える。同じようなフィルムは、非経口送達、例えば、参考文献１４に開示されているような経皮投与に用いることができる。
【００８２】
適切な薄型フィルムは、典型的には、最初に適用される場合、厚さが１０〜５００μｍ、例えば、厚さ７５〜１５０μｍである。患者の口に、例えば、ヒト成人の口に、またはヒト幼児の口に適合するそれらの他の寸法が適し得る。
【００８３】
一つの適切な型のフィルムは、参考文献１５に開示されている。このフィルムは、（ｉ）粘膜接着性層としてＮｏｖｅｏｎおよびＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ−１００、および（ｉｉ）不透過性バッキング層として医薬品ワックスを有する粘膜接着性二層フィルムを含む。これらのフィルムのさらなる詳細は参考文献１６にある。
【００８４】
別の適切な型のフィルムは参考文献１７に開示されている。このフィルムは以下を含む：（ａ）１つまたは複数の水溶性ポリマー；（ｂ）１つまたは複数の粘膜接着性ポリマー；（ｃ）微粒子内にカプセル化されたワクチン抗原。適切な水溶性ポリマーには、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、キサンタンガム、トラガカントゴム、グアーガム、アカシアゴム、アラビアゴム、ポリアクリル酸、メタクリル酸メチルコポリマー、カルボキシビニルポリマー、アミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）、高アミラーゼスターチ、ヒドロキシプロピル化高アミラーゼスターチ、デキストリン、ペクチン、キチン、レバン、エルシナン、コラーゲン、ゼラチン、ゼイン、グルテン、大豆タンパク質分離物、乳漿タンパク質分離物、およびカゼインが挙げられるが、それらに限定されない。適切な粘膜接着性ポリマーには、キトサン、ヒアルロン酸塩、アルギン酸塩、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（Ｌ−リシン）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、およびそれらの誘導体またはコポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。有用な微粒子は、口の中でなお存在しているが、カプセル化された粒子の内容物（すなわち、ワクチン抗原）を放出する材料でできている。
【００８５】
参考文献１４におけるフィルムは、経皮送達のために、陽イオン性ポリ（β−アミノエステル）を含む。
【００８６】
本発明に関して有用な経口フィルムは、ワクチンを、投与中、より美味にさせる矯味矯臭薬を含んでもよい。
【００８７】
薄型フィルムは、様々なプロセスによって作製することができ、そのプロセスには、溶媒キャスティング（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｃａｓｔｉｎｇ）；ホットメルト押し出し成形；固形分散押し出し成形；および圧延が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８８】
本発明のプロセスにおける処方ステップは、以下のステップを含んでもよい：（ａ）濃縮ワクチン抗原を１つまたは複数の口腔内溶解性ポリマーと混合するステップ；および（ｂ）ステップ（ａ）からの混合物を用いてフィルムを形成して、ワクチンの頬側投与に適した薄型フィルムを提供するステップ。
【００８９】
本発明のプロセスにおける処方ステップは、以下のステップを含んでもよい：（ａ）濃縮ワクチン抗原をポリ（β−アミノエステル）などの１つまたは複数の局所溶解性ポリマーと混合するステップ；および（ｂ）ステップ（ａ）からの混合物を用いてフィルムを形成して、ワクチンの経皮投与に適した薄型フィルムを提供するステップ。
【００９０】
これらのフィルムを、個々の単位用量の小袋の中へパッケージングし、例えば、窒素下で密閉し、その後、熱密閉してもよい。小袋は、保存中、フィルムを乾燥状態に保つために防水であるべきである。
【００９１】
処置およびワクチンの投与の方法
本発明の処方ワクチンを、被験体に、例えば、皮膚を通して、頬組織を通して、送達することができる。したがって、本発明は、本発明の処方ワクチンを被験体に投与するステップを含む、被験体において免疫応答を起こす方法を提供する。これは、例えば、マイクロニードルが被験体の真皮に貫入するように、マイクロニードルパッチまたはデバイスを被験体の皮膚に適用すること、または薄型フィルムを被験体の頬組織もしくは舌に適用することを含んでもよい。
【００９２】
本発明はまた、被験体にワクチン接種する方法に用いる濃縮された非凍結乾燥抗原を提供する。本発明はまた、被験体において免疫応答を起こすための薬物の製造における濃縮された非凍結乾燥抗原の使用を提供する。
【００９３】
ワクチン製造物は、ヒトまたは非ヒト動物の被験体にワクチンを投与するのに適している。
【００９４】
これらの方法および使用によって起こされた免疫応答は、一般的に、抗体応答、好ましくは、防御抗体応答を含む。
【００９５】
マイクロニードルパッチまたはデバイスは、（例えば、絆創膏または公知の皮膚パッチについてのように）簡単な手による適用により皮膚に適用されてもよいし、バネ駆動式注入器を用いて適用されてもよい。
【００９６】
本発明により調製されるワクチンは、小児と成人のどちらも処置するのに用いることができる。
【００９７】
処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールによることができる。複数回投与は、一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて用いられてもよい。複数回投与は、典型的には、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）離して、投与される。
【００９８】
インフルエンザワクチン接種
本発明のプロセスは、インフルエンザワクチンを調製するのに理想的である。様々な形態のインフルエンザウイルスワクチンが現在利用可能であり（例えば、参考文献１８の１７章および１８章を参照）、現在のワクチンは、不活性化ウイルスかまたは弱毒化生ウイルスかのいずれかに基づいている。不活性化ワクチン（全ウイルス、スプリットビリオン、または表面抗原）は、筋肉内または皮内注射によって投与されるが、生ワクチンは鼻腔内に投与される。本発明は、これらのワクチン形態の全部に関して用いることができる。
【００９９】
本発明のいくつかの実施形態は、表面抗原インフルエンザワクチン（不活性化型）を用いる。そのようなワクチンは、スプリットビリオンワクチンまたは全ビリオンワクチンより少ないウイルス成分を含有する。それらは、表面抗原血球凝集素、および典型的には、ノイラミニダーゼも含む。これらのタンパク質をインフルエンザウイルスから精製された形態で調製するためのプロセスは、当技術分野においてよく知られている。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）、およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）製品は、表面抗原インフルエンザワクチンの例である。
【０１００】
本発明が表面抗原インフルエンザワクチンを用いる場合、このウイルスは、卵内で成長していてもよいし、または細胞培養で成長していてもよい（下記参照）。ワクチン用のインフルエンザウイルス成長のための現在の標準方法は、孵化ＳＰＦ鶏卵を用い、ウイルスは、卵内容物（尿膜腔液）から精製される。卵に基づいたウイルス成長が用いられる場合には、１つまたは複数のアミノ酸が卵の尿膜腔液へウイルスと共に導入されてもよい［２４］。ウイルスはまず、卵内で成長する。その後、それは感染した卵から採取される。ビリオンは、尿膜腔液から様々な方法によって採取することができる。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊する界面活性剤を含む線形スクロース勾配溶液を用いるゾーン遠心分離を含んでもよい。その後、抗原は、任意の希釈後、ダイアフィルトレーションによって精製されてもよい。ウイルスを不活性化するための化学的手段には、有効量の１つまたは複数の以下の作用物質での処理を含む：界面活性剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはそれらの組み合わせ。ウイルス不活性化の非化学的方法は、例えば、ＵＶ光またはγ線照射など、当技術分野において知られている。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態は、全ウイルス、スプリットウイルス、ビロソーム、弱毒化生ウイルス、または組換え血球凝集素を用いることができる。これらのワクチンは、それらの抗原を、例えば、余分のインフルエンザウイルスタンパク質の存在について、試験することによって、表面抗原ワクチンと容易に区別することができる。
【０１０２】
不活性化全ウイルスは、（例えば、卵または培地から得られた）ウイルス含有液からビリオンを採取し、その後、上記のようにそれらを処理することによって、得ることができる。
【０１０３】
スプリットビリオンは、精製されたビリオンを界面活性剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルリン酸、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９など）で処理し、サブビリオン調製物を生じることによって得られる（例えば、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリッティングプロセス）。例えばインフルエンザウイルスを、スプリットする方法は、当技術分野においてよく知られており、例えば、参考文献１９〜２４などを参照されたい。ウイルスのスプリッティングは、典型的には、感染性か非感染性かにかかわらず、全ウイルスを破壊濃度のスプリッティング剤で破壊または断片化することによって行われる。破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的可溶化を生じ、ウイルスの完全性を変化させる。好ましいスプリッティング剤は、非イオン性およびイオン性（例えば、陽イオン性）表面活性物質、例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレン−アルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルリン酸、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチルフェノキシポリオキシエタノールまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ表面活性物質）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ表面活性物質）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。一つの有用なスプリッティング手順は、デオキシコール酸ナトリウムとホルムアルデヒドの連続効果を用い、スプリッティングは、最初のビリオン精製中に（例えば、スクロース密度勾配溶液中で）起こり得る。したがって、スプリッティングプロセスは、（非ビリオン材料を除去するための）ビリオン含有材料の清澄、（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着などの吸着方法を用いる）採取されたビリオンの濃縮、全ビリオンの非ビリオン材料からの分離、（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどのスプリッティング剤を含有するスクロース勾配を用いる）密度勾配遠心分離ステップにおけるスプリッティング剤を用いるビリオンのスプリッティング、およびその後の、望ましくない材料を除去するための濾過（例えば、限外濾過）を含み得る。スプリットビリオンは、有用には、リン酸ナトリウム緩衝等張塩化ナトリウム溶液中に再懸濁することができる。スプリットワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）、ＩΝΤΑΝΖΑ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）、およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）製品である。
【０１０４】
ビロソームは、核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子である［２５］。それらは、ウイルスの界面活性剤での可溶化、続いて、ヌクレオカプシドの除去、およびウイルス糖タンパク質を含有する膜の再構成によって調製することができる。ビロソームを調製するための代替方法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に加えて、膜内にウイルスタンパク質を有するリポソームを生じさせることを含む。
【０１０５】
弱毒化生ウイルスは、（卵内または細胞培養で成長した）ウイルスから得られるが、ウイルスは不活性化されていない。そうではなく、ウイルスは、例えば、ヒトインフルエンザ感染のフェレットモデルにおいてインフルエンザ様病気を生じさせないように、弱毒化（「ａｔｔ」）されている。それはまた低温に適応した（「ｃａ」）株であってもよく、すなわち、それは、２５℃（多数の野生型インフルエンザウイルスの複製について制限的である温度）で効率的に複製することができる。それはまた、温度感受性（「ｔｓ」）であってもよく、すなわち、それの複製は、多くの野生型インフルエンザウイルスが効率的に成長する温度（３７〜３９℃）において制限される。ｃａ、ｔｓ、およびａｔｔ表現型の累積的効果は、以下である：弱毒化ワクチンにおけるウイルスは、鼻咽頭で複製して、典型的なヒト患者において防御免疫を誘導することができるが、それは疾患を引き起こさない。すなわち、それは標的ヒト集団への一般的な投与について安全であるということである。これらのウイルスは、ビリオン含有液からビリオンを精製すること、例えば、その液体の遠心分離による清澄後、（例えば、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸一ナトリウムを含有する）緩衝液での安定化によって調製することができる。生ワクチンは、ＦＬＵＭＩＳＴ（商標）製品を含む。生ワクチンは本発明に関して用いることができるが、非生ワクチンを用いることが好ましい。
【０１０６】
ビリオンから得られた抗原を用いることの代替として、血球凝集素を組換え宿主（例えば、バキュロウイルスベクターを用いる、Ｓｆ９などの昆虫細胞系）において発現させ、精製された形態で［２６〜２８］、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ；例えば、参考文献２９および３０を参照）の形態で用いることができる。
【０１０７】
本発明のいくつかの実施形態は、卵内ではなく、細胞培養で成長したウイルスから調製されたインフルエンザワクチンを用いる。細胞培養が用いられる場合、ウイルス成長培養基は、典型的には、哺乳動物起源の細胞系である。適切な起源の哺乳動物細胞には、ハムスター細胞、ウシ細胞、（ヒトおよびサルを含む）霊長類細胞、およびイヌ細胞が挙げられるが、それらに限定されない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などの様々な細胞型を用いてもよい。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名前を有する細胞系である。適切なサル細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞系のように、腎細胞などのアフリカミドリザル細胞である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞系のように腎細胞である。したがって、適切な細胞系には、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８などが挙げられるが、それらに限定されない。インフルエンザウイルスを成長させるための好ましい哺乳動物細胞系には、メイディン・ダービー・イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞［３１〜３４］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓由来のＶｅｒｏ細胞［３５〜３７］；ヒト胚性網膜芽細胞由来のＰＥＲ．Ｃ６細胞［３８］が挙げられる。これらの細胞系は、広く入手可能であり、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクションから、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓから、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６、およびＣＲＬ−１５８７により様々な異なるＶｅｒｏ細胞を供給し、カタログ番号ＣＣＬ−３４によりＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は、ＥＣＡＣＣから寄託番号９６０２２９４０により入手可能である。哺乳動物細胞系のあまり好ましくない代替物として、ウイルスは、トリ細胞系で成長することができ［例えば、参考文献３９〜４１］、それには、アヒル（例えば、アヒル網膜）またはニワトリ由来の細胞系が挙げられる。トリ細胞系の例には、トリ胚性幹細胞［３９、４２］およびアヒル網膜細胞［４０］が挙げられる。適切なトリ胚性幹細胞には、ニワトリ胚性幹細胞由来のＥＢｘ細胞系、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４が挙げられる［４３］。ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）もまた用いてもよい。
【０１０８】
インフルエンザウイルスを成長させるための最も好ましい細胞系はＭＤＣＫ細胞系である。もともとのＭＤＣＫ細胞系は、ＡＴＣＣからＣＣＬ−３４として入手可能であるが、この細胞系の誘導体もまた用いてもよい。例えば、参考文献３１は、懸濁培養での成長に適応したＭＤＣＫ細胞系を開示する（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ  ３３０１６」）。同様に、参考文献４４は、無血清培養において懸濁状態で成長するＭＤＣＫ由来細胞系を開示する（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）。参考文献４５は、非腫瘍原性ＭＤＣＫ細胞を開示し、それらには、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）、および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）が挙げられる。参考文献４６は、感染に対する高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞系を開示し、それらには、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２）が挙げられる。これらのＭＤＣＫ細胞系のいずれもを用いることができる。
【０１０９】
ウイルスが哺乳動物細胞系で成長している場合、本発明の製造物は、有利なことには、卵タンパク質（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、それにより、潜在的なアレルゲン性を低下させる。
【０１１０】
本発明の細胞由来製造物における血球凝集素は、卵由来ウイルスに見られるパターンとは異なるグリコシル化パターンを有し得る。したがって、そのＨＡ（および他の糖タンパク質）は、ニワトリ卵に見られないグリコフォームを含む可能性がある。有用なＨＡには、イヌグリコフォームが挙げられる。
【０１１１】
卵由来材料およびニワトリグリコフォームが存在しないことにより、細胞培養で成長したウイルスから調製されたワクチンを卵由来製造物と区別することができる方法が提供される。
【０１１２】
ウイルスが細胞系で成長している場合、成長のための培養物、およびまた、培養を開始するために用いられるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない（すなわち、それらによる汚染について試験し、陰性の結果が示されている）［４７］。単純ヘルペスウイルスの非存在は特に好ましい。
【０１１３】
ＭＤＣＫ細胞などの細胞系での成長について、ウイルスは、懸濁状態の細胞において成長してもよいし［３１、４８、４９］、接着培養の細胞で成長してもよい。懸濁培養のための一つの適切なＭＤＣＫ細胞系は、（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された）ＭＤＣＫ  ３３０１６である。代替として、マイクロキャリア培養を用いることができる。
【０１１４】
インフルエンザウイルス複製を支援する細胞系は、好ましくは、無血清培養培地および／または無タンパク質培地中で成長する。ヒトまたは動物起源の血清由来の添加物が存在しない培地は、本発明との関連において、無血清培地と呼ばれる。無タンパク質とは、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除しているが、任意で、トリプシンまたはウイルス成長に必要とされる場合がある他のプロテアーゼなどのタンパク質を含むことができる、細胞の増倍が起こる培地を意味すると理解される。そのような培地で成長した細胞は、当然ながら、それ自体のタンパク質を含有する。
【０１１５】
インフルエンザウイルス複製を支援する細胞系は、好ましくは、ウイルス複製中３７℃未満［５０］、例えば、３０〜３６℃、３１〜３５℃、または３３±１℃で成長する。
【０１１６】
培養細胞においてウイルスを増殖させるための方法は一般的に、培養細胞に、培養される株を接種するステップ、例えば、ウイルス力価または抗原発現により決定されるようなウイルス増殖にとって望ましい時間の間（接種後２４〜１６８時間）、感染した細胞を培養するステップ、および増殖したウイルスを収集するステップを含む。培養細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは、１：１００〜１：５、より好ましくは１：５０〜１：１０の（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０により測定される）ウイルス対細胞比で接種される。ウイルスは細胞の懸濁液に加えられるか、または細胞の単層に適用され、ウイルスは、細胞に、２５℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３７℃で、少なくとも６０分間、ただし通常には、３００分間未満、好ましくは９０〜２４０分間、吸着させられる。感染した細胞培養物（例えば、単層）は、採取される培養上清のウイルス含有率を増加させるために凍結融解によるかまたは酵素作用によるかのいずれかで除去されてもよい。その後、採取された液体は不活性化されるか凍結保存されるかのいずれかである。培養細胞を、約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、より好ましくは０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）で感染させてもよい。さらにより好ましくは、細胞を約０．０１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させる。感染した細胞は、感染から３０〜６０時間後、採取することができる。好ましくは、細胞は、感染から３４〜４８時間後、採取される。さらにより好ましくは、細胞は、感染から３８〜４０時間後、採取される。プロテアーゼ（典型的にはトリプシン）は、一般的に、ウイルス放出を可能にするために細胞培養中に加えられ、プロテアーゼは培養中の任意の適切な段階で加えることができる。
【０１１７】
細胞培養から調製されたワクチンを含むワクチン製造物は、好ましくは、用量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含有し、痕跡量の宿主細胞ＤＮＡが存在してもよい。
【０１１８】
任意の残留宿主細胞ＤＮＡの平均の長さは、５００ｂｐ未満、例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満などであることが好ましい。
【０１１９】
汚染ＤＮＡは、標準精製手順、例えば、クロマトグラフィーなどを用いてワクチン調製中に除去することができる。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理、例えば、ＤＮアーゼを用いることにより、増強させることができる。宿主細胞ＤＮＡ汚染を低下させるための便利な方法は、参考文献５１および５２に開示されており、それは、最初にＤＮアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（ウイルス成長中に用いることができる）を用いること、およびその後、陽イオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）（ビリオン破壊中に用いることができる）を用いることの２ステップ処理を含む。β−プロピオラクトンなどのアルキル化剤での処理も宿主細胞ＤＮＡを除去するために用いることができ、有利なことには、ビリオンを不活性化するためにも用いてもよい［５３］。
【０１２０】
本発明のいくつかの実施形態は、一価インフルエンザワクチン（すなわち、それは単一のインフルエンザウイルス株由来の血球凝集素抗原を含む）を用いるが、いくつかの実施形態において、それは、二価ワクチン、三価ワクチン、四価ワクチン、または＞４価ワクチン（すなわち、４つより多い異なるインフルエンザウイルス株由来の血球凝集素を含む）などの多価ワクチンであってもよい。一価ワクチンと多価ワクチンとは、複数のＨＡ型についてアミノ酸シーケンシングなどにより試験することによって容易に区別される。
【０１２１】
一価ワクチンは、パンデミック状況中かまたはパンデミック前の状況のいずれかにおいて、パンデミック株またはパンデミックの可能性がある株に対して免疫化するのに特に有用である。これらの株の特性は以下である：（ａ）それらは、現在広まっているヒト株における血球凝集素と比較して新しい血球凝集素を含有する。すなわち、１０年超の間、ヒト集団において明らかではなかった株（例えば、Ｈ２）、またはこれまでに、ヒト集団において全く見られることがなかった株（例えば、一般的に鳥集団においてのみ見出されているＨ５、Ｈ６、またはＨ９）であり、それゆえに、ヒト集団はその株の血球凝集素に対して免疫学的にナイーブである；（ｂ）それらは、ヒト集団において水平に伝染する能力がある；および（ｃ）それらはヒトに対して病原性である。これらの株は、インフルエンザＡ型  ＨＡ亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のいずれかを有してもよい。Ｈ５血球凝集素型を有するウイルスは、パンデミックインフルエンザに対して免疫化するために好ましく、またはＨ２、Ｈ７、もしくはＨ９亜型も好ましい。本発明は、１つまたは複数のインフルエンザＡ型ウイルスＮＡ亜型Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、またはＮ９から防御し得る。したがって、可能な株には、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、およびＨ７Ｎ７、ならびに任意の他の新たなパンデミックの可能性のある株が挙げられる。
【０１２２】
多価ワクチンは、季節的設定においてより典型的であり、例えば、三価ワクチンが典型的であり、Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型株、Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルス株、およびインフルエンザＢ型ウイルス株由来などの２つのインフルエンザＡ型ウイルスおよび１つのインフルエンザＢ型ウイルス株由来の血球凝集素を含む。四価ワクチンもまた有用であり［５４］、例えば、２つのインフルエンザＡ型ウイルス株と２つのインフルエンザＢ型ウイルス株、または３つのインフルエンザＡ型ウイルス株と１つのインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む。したがって、ワクチンは、二価、三価、四価などであってもよい。一価ワクチンを除いて、インフルエンザＡ型ウイルス株とインフルエンザＢ型ウイルス株の両方由来の血球凝集素を含むことが通例である。２つのインフルエンザＡ型ウイルス株だけを含むワクチンにおいて、これらは、通常、１つのＨ１株（例えば、Ｈ１Ｎ１株）と１つのＨ３株（例えば、Ｈ３Ｎ２株）である。しかしながら、いくつかの実施形態において、１つのパンデミックインフルエンザＡ型ウイルス株と１つのＨ１株、または１つのパンデミックインフルエンザＡ型ウイルス株と１つのＨ３株であってもよい。
【０１２３】
ワクチンが１つより多いインフルエンザ株を含む場合、その異なる株は、典型的には、別々に成長し、ウイルスが採取されかつ抗原が調製された後で混合される。したがって、本発明のプロセスは、１つより多いインフルエンザ株由来の抗原を混合するステップを含んでもよい。
【０１２４】
参考文献５４に記載されているように、例示的な四価ワクチンは、２つのインフルエンザＡ型ウイルス株と２つのインフルエンザＢ型ウイルス株由来（「Ａ−Ａ−Ｂ−Ｂ」）、または３つのインフルエンザＡ型ウイルス株と１つのインフルエンザＢ型ウイルス株由来（「Ａ−Ａ−Ａ−Ｂ」）の血球凝集素を含むことができる。
【０１２５】
インフルエンザＢ型ウイルスは現在、異なるＨＡ亜型を提示していないが、インフルエンザＢ型ウイルス株は、２つの別個の系列に分類される。これらの系列は１９８０年代後半に出現し、お互いに抗原的におよび／または遺伝的に区別することができるＨＡを有する［５５］。現在のインフルエンザＢ型ウイルス株は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様かまたはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様のいずれかである。本発明のワクチンが２つのインフルエンザＢ型株を含む場合、これは通常、１つのＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株と１つのＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株である。これらの株は、通常、抗原的に区別されるが、アミノ酸配列の違いもまた、その２つの系列を区別するために記載されており、例えば、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株は、アミノ酸残基１６４（「Ｌｅｅ４０」ＨＡ配列に対して番号付けられた）において欠失をもつＨＡタンパク質を有する場合が（常にではないが）多い［５６］。
【０１２６】
好ましいＡ−Ａ−Ｂ−Ｂワクチンは、（ｉ）Ｈ１Ｎ１株；（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２株；（ｉｉｉ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株；および（ｉｖ）Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株由来の血球凝集素を含む。
【０１２７】
３つのインフルエンザＡ型ウイルス株を含むワクチンにおいて、これらは通常、１つのＨ１株（例えば、Ｈ１Ｎ１株）と２つのＨ３株（例えば、２つのＨ３Ｎ２株）である。２つのＨ３株は、抗原的に別個のＨＡタンパク質、例えば、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９と交差反応する１つのＨ３Ｎ２株と、Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２と交差反応する１つのＨ３Ｎ２株を有する。２つのＨ３株は、異なるクレイド由来であってもよい（Ｈ３Ｎ２株のクレイドＡ、ＢおよびＣは参考文献５７に開示されている）。しかしながら、いくつかの実施形態において、これらの株の１つ（すなわち、Ｈ１株、または２つのＨ３株のうちの１つ）は、パンデミック株に置き換えられてもよい。
【０１２８】
したがって、一つの好ましいＡ−Ａ−Ａ−Ｂワクチンは、（ｉ）Ｈ１Ｎ１株；（ｉｉ）Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９様Ｈ３Ｎ２株；（ｉｉｉ）Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２様Ｈ３Ｎ２株；および（ｉｖ）Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様またはＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様であり得るインフルエンザＢ型ウイルス株由来の血球凝集素を含む。
【０１２９】
別の好ましいＡ−Ａ−Ａ−Ｂワクチンは、（ｉ）Ｈ１Ｎ１株、（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２株、（ｉｉｉ）Ｈ５株（例えば、Ｈ５Ｎ１株）、および（ｉｖ）インフルエンザＢ型株由来の血球凝集素を含む。
【０１３０】
別の好ましいＡ−Ａ−Ａ−Ｂワクチンは、（ｉ）２つの異なるＨ１株、（ｉｉ）Ｈ３Ｎ２株、および（ｉｉｉ）インフルエンザＢ型株由来の血球凝集素を含む。
【０１３１】
２つ以上のインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原が存在する場合、インフルエンザＢ型ウイルス株の少なくとも２つは、別個の血球凝集素を有し得るが、関連したノイラミニダーゼを有してもよい。例えば、それらは、両方ともＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼを有してもよく［５８］、または両方ともＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼを有してもよい。例えば、２つのＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様ノイラミニダーゼは両方とも、１つまたは複数の以下の配列特性を有してもよい：（１）残基２７においてはセリンではなく、好ましくはロイシンである；（２）残基４４においてはグルタミン酸ではなく、好ましくはリシンである；（３）残基４６においてはスレオニンではなく、好ましくはイソロイシンである；（４）残基５１においてはプロリンではなく、好ましくはセリンである；（５）残基６５においてはアルギニンではなく、好ましくはヒスチジンである；（６）残基７０においてはグリシンではなく、好ましくはグルタミン酸である；（７）残基７３においてはロイシンではなく、好ましくはフェニルアラニンである；および／または（８）残基８８においてはプロリンではなく、好ましくはグルタミンである。同様に、いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼは、残基４３に欠失を有してもよく、またはそれはスレオニンを有してもよい；ＮＡ遺伝子におけるトリヌクレオチド欠失に起因する残基４３における欠失は、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様株の特性として報告されているが、最近の株はＴｈｒ−４３を取り戻している［５８］。逆に、当然ながら、その反対の特性は、２つのＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様ノイラミニダーゼによって共有される可能性がある（例えば、Ｓ２７、Ｅ４４、Ｔ４６、Ｐ５１、Ｒ６５、Ｇ７０、Ｌ７３、および／またはＰ８８）。これらのアミノ酸は、「Ｌｅｅ４０」ノイラミニダーゼ配列に対して番号付けられている［５９］。したがって、本発明のＡ−Ａ−Ｂ−Ｂワクチンは、ＨＡについて抗原的に別個であるが（１つのＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様、１つのＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様）、ＮＡについては関連している（両方ともＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様、または両方ともＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７様）２つのＢ株を用いてもよい。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本発明は、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／０３／２００３（Ｈ３Ｎ２）株、およびＢ／Ｊｉａｎｇｓｕ／１０／２００３株のそれぞれ由来の血球凝集素を含有する三価スプリットワクチンを包含しない。
【０１３３】
抗原を組成物に有用に含めることができる株には、抵抗性パンデミック株［６１］を含む、抗ウイルス治療に抵抗性（例えば、オセルタミビル［６０］および／またはザナミビルに対して抵抗性）である株が挙げられる。
【０１３４】
本発明のいくつかの実施形態において、ワクチンは、少量のチオメルサールまたはメルチオレートなどの水銀に基づいた保存剤を含んでもよい。存在する場合、そのような保存剤は、典型的には、５μｇ／ｍｌ未満の水銀を供給し、より低いレベル、例えば、＜１μｇ／ｍｌ、＜０．５μｇ／ｍｌが可能である。好ましいワクチンは、チオメルサールを含まず、より好ましくは、水銀を含まない［２３、６２］。そのようなワクチンは、非水銀性保存剤を含むことができる。チオメルサールの非水銀性代替物には、２−フェノキシエタノールまたはコハク酸α−トコフェロールが挙げられる［２３］。最も好ましくは、ワクチンは保存剤を含まない。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、安定化量のゼラチンを、例えば、０．１％未満で含んでもよい。しかしながら、他の実施形態において、ワクチンはゼラチンを含まない。ゼラチンの非存在により、ワクチンは、ゼラチン感受性である少ない割合の患者において安全であることが保証され得る［６３、６４］。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、１つまたは複数の抗生物質、例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢを含んでもよい。しかし、好ましい実施形態においては、ワクチンは抗生物質を含まない。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、ワクチンはホルムアルデヒドを含んでもよい。しかし、好ましい実施形態においては、ワクチンはホルムアルデヒドを含まない。
【０１３８】
上記で言及されているように、いくつかの実施形態において、ワクチンは卵成分（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）を含んでもよいが、好ましい実施形態は卵成分を含まない。
【０１３９】
特定の成分および添加物を使用せずにワクチンを調製することは、参考文献６５に開示されており、それにより、これらの材料が残留量でさえも存在しないことを保証する。
【０１４０】
血球凝集素（ＨＡ）は、現在の不活性化インフルエンザワクチンにおいて主要な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的にはＳＲＩＤによって測定される、ＨＡレベルへの参照により標準化される。現行のワクチンは、典型的には、１株あたり約１５μｇのＨＡを含有するが、より低い用量が、例えば、小児用に、またはパンデミック状況において、またはアジュバントを用いる場合、用いることができる。より高い用量（例えば、３×または９×用量［６６、６７］）と同様に、１／２（すなわち、１株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４、および１／８などの分割量も用いられている。これらのワクチンは、０．５ｍｌの用量容積、すなわち、３０μｇ／ｍｌ／株の典型的なＨＡ濃度を有する。三価ＩＮＴＡＮＺＡ（商標）製品は、０．１ｍｌの容積中、１株あたり９μｇのＨＡ、すなわち、９０μｇ／ｍｌ／株のＨＡ濃度を含有し、２７０μｇ／ｍｌの総ＨＡ濃度を示す。
【０１４１】
本発明の製造物は、用量あたりインフルエンザ１株あたり０．１〜５０μｇ、好ましくは０．１〜５０μｇ、例えば、１〜２０μｇのＨＡを含むことができる。理想的には、製造物は、１株あたり≦１６μｇの血球凝集素、例えば、１〜１５μｇ、１〜１０μｇ、１〜７．５μｇ、１〜５μｇなどを有する。１株あたりの特定のＨＡ用量は、例えば、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などを含む。
【０１４２】
表面抗原ワクチンにおいて、ＨＡは、組成物において総タンパク質の５０（重量）％より多く、例えば、免疫原性組成物における総インフルエンザタンパク質の６０〜１００％、６０〜９０％、または６０〜８０％を占めることができる。
【０１４３】
生ワクチンについて、投薬量は、ＨＡ含有量ではなく、５０％組織培養感染量（ｍｅｄｉａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅ（ＴＣＩＤ５０））によって測定され、例えば、用量あたり１株あたり１０６〜１０８（好ましくは１０６．５〜１０７．５）のＴＣＩＤ５０である。
【０１４４】
本発明に関して用いられるインフルエンザ株は、野生型ウイルスに見出されるような天然ＨＡ、または改変型ＨＡを有してもよい。例えば、ウイルスをトリ種において高病原性にさせる決定因子（例えば、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周りの超塩基性領域）を除去するようにＨＡを改変することが知られている。逆遺伝学の使用は、そのような改変を促進する。
【０１４５】
本発明のワクチン製造物は、インフルエンザワクチン抗原に加えて構成要素を含むことができる。上記で論じられているように、例えば、それらは、生体溶解性かつ生分解性マトリックス材料、または経口フィルムポリマーを含むことができる。
【０１４６】
ワクチン製造物は、界面活性剤を含んでもよい。界面活性剤のレベルは、幅広く様々であり得、例えば、１μｇのＨＡあたり０．０１〜５０μｇの界面活性剤（「μｇ／μｇ」）、または０．０５〜５０μｇである。低レベルの、例えば、０．０５〜１μｇ／μｇ、もしくは０．１〜１μｇ／μｇの界面活性剤を用いることができ、または高レベル、例えば、５〜３０μｇ／μｇも用いることができる。界面活性剤は単一の界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０またはＣＴＡＢ）でもよいし、混合物（例えば、ポリソルベート８０とＣＴＡＢの両方）でもよい。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（「Ｔｗｅｅｎ  ８０」）またはオクチルフェノールエトキシレート（「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００」）などの非イオン性である。ポリソルベート８０は、１μｇのＨＡあたり０．０５〜５０μｇのポリソルベート８０、例えば、０．０５〜０．７５μｇ／μｇ、０．１〜１μｇ／μｇ、０．１〜０．８μｇ／μｇ、０．１〜０．５μｇ／μｇ、５〜４０μｇ／μｇ、５〜３０μｇ／μｇ、または８〜２５μｇ／μｇで存在してもよい。ＣＴＡＢは、低量、例えば、０．１μｇ／μｇ未満、０．０５μｇ／μｇ未満で存在してもよい。
【０１４７】
上記で言及されているように、いくつかのワクチン製造物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含んでもよいが、好ましいワクチンは水銀も保存剤も含まない。
【０１４８】
ワクチン製造物は、ナトリウム塩などの生理的塩を含んでもよい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、それは、１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在してもよい。存在してもよい他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【０１４９】
ワクチン製造物は、１つまたは複数の緩衝液を含んでもよい。典型的な緩衝液には、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントと共に）、またはクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【０１５０】
ワクチン製造物は、好ましくは、無菌である。ワクチン製造物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、用量あたり＜１ＥＵ（内毒素単位、標準的尺度）、および好ましくは用量あたり＜０．１ＥＵを含有する。ワクチン製造物は好ましくは、グルテンを含まない。
【０１５１】
ワクチン製造物は、免疫賦活分子を含むことができる。これらは、パッチを調製する前に抗原と混合することができる。免疫賦活分子の適切なクラスには、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ５アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、およびＣＤ１ｄアゴニストが挙げられるが、それらに限定されない。適切な免疫賦活分子には、イミキモド（「Ｒ−８３７」）［６８、６９］およびレシキモド（「Ｒ−８４８」）［７０］などのイミダゾキノリン、またはそれらの塩（例えば、塩酸塩）；ＲＣ−５２９［７１、７２］などのアミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体；α−ガラクトシルセラミドなどのα−グリコシルセラミド；参考文献７３からの「ＥＲ  ８０４０５７」；Ｅ５５６４［７４、７５］などが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１５２】
インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能、および防御を評価するための方法は当技術分野においてよく知られている。ヒトインフルエンザウイルスの血球凝集素に対する抗体力価は、防御と相関していることが、ヒト研究から示されている（約３０〜４０の血清試料血球凝集阻害力価は、同種ウイルスによる感染から約５０％の防御を示す）［７６］。抗体応答は、典型的には、血球凝集阻害により、マイクロ中和試験により、一元放射状免疫拡散法（ＳＲＩＤ）により、および／または一元放射状溶血反応（ＳＲＨ）により測定される。これらのアッセイ技術は、当技術分野においてよく知られている。好ましいワクチンは、効力についてのＣＰＭＰ評価基準の１、２、または３を満たす。成人（１８〜６０歳）において、これらの評価基準は以下である：（１）≧７０％のセロプロテクション；（２）≧４０％のセロコンバージョン；および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増加。高齢者（＞６０歳）において、これらの評価基準は以下である：（１）≧６０％のセロプロテクション；（２）≧３０％のセロコンバージョン；および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増加。これらの評価基準は、少なくとも５０人の患者についての非盲検研究に基づいている。
【０１５３】
インフルエンザワクチンは、現在、生後６ヶ月から小児および成人の免疫化に用いることが推奨されている。したがって、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であってもよい。そのワクチンを受けるのに好ましい被験体は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは≧６５歳）、幼若者（例えば、≦５歳）、入院中の被験体、医療従事者、軍部関係者および軍人、妊婦、慢性病の免疫不全の被験体、ワクチンを受ける前の７日以内に抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルまたはザナミビル化合物；下記参照）を服用した被験体、卵アレルギーをもつ人々、および海外旅行をする人々である。しかしながら、ワクチンは、これらの群にのみ適しているわけではなく、集団においてより一般的に用いられてもよい。パンデミック株について、全年齢群への投与が好ましい。
【０１５４】
１用量より多い投与（典型的には２用量）は、免疫学的にナイーブな患者において、例えば、以前にインフルエンザワクチンを受けたことがない人々にとって、または新しいＨＡ亜型に対するワクチン接種をするために（パンデミック発生においてのように）、特に有用である。
【０１５５】
バルク液体ワクチン
上記で述べられているように、本発明は、インフルエンザウイルス血球凝集素を含むバルク液体ワクチンであって、（ａ）前記血球凝集素の濃度が少なくとも１２ｍｇ／ｍｌであり、（ｂ）前記ワクチンがスクロースを実質的に含まない、バルク液体ワクチンを提供する。これらのバルクワクチンは、筋肉内ではない（ｎｏｎ−ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）経路による送達用のワクチンの製造の間の有用な中間体であり得る。ＨＡ濃度は、１２ｍｇ／ｍｌ超、例えば、≧１５ｍｇ／ｍｌ、≧２０ｍｇ／ｍｌ、≧２５ｍｇ／ｍｌ、≧３０ｍｇ／ｍｌ、≧３５ｍｇ／ｍｌ、≧４０ｍｇ／ｍｌ、≧４５ｍｇ／ｍｌ、≧５０ｍｇ／ｍｌであってもよい。
【０１５６】
本発明はまた、インフルエンザＡ型ウイルス血球凝集素を含むバルク液体ワクチンであって、（ａ）前記血球凝集素の濃度が少なくとも２ｍｇ／ｍｌであり、（ｂ）前記血球凝集素がＨ１血球凝集素でもＨ３血球凝集素でもない、バルク液体ワクチンを提供する。好ましくは、ワクチンは、（ｃ）スクロースを実質的に含まない。Ｈ１とＨ３の両方のインフルエンザＡ型ウイルス血球凝集素（複数可）を含まないこれらのバルクワクチンは、筋肉内ではない経路による送達用のワクチンの製造の間の有用な中間体であり得る。ＨＡ濃度は、２ｍｇ／ｍｌ超、例えば、≧３ｍｇ／ｍｌ、≧４ｍｇ／ｍｌ、≧５ｍｇ／ｍｌ、≧６ｍｇ／ｍｌ、≧７ｍｇ／ｍｌ、≧８ｍｇ／ｍｌ、≧９ｍｇ／ｍｌ、≧１０ｍｇ／ｍｌ、≧１２ｍｇ／ｍｌ、≧１４ｍｇ／ｍｌ、≧１５ｍｇ／ｍｌ、≧１６ｍｇ／ｍｌ、≧１８ｍｇ／ｍｌ、≧２０ｍｇ／ｍｌ、≧２５ｍｇ／ｍｌ、≧３０ｍｇ／ｍｌ、≧３５ｍｇ／ｍｌ、≧４０ｍｇ／ｍｌ、≧４５ｍｇ／ｍｌ、≧５０ｍｇ／ｍｌであってもよい。血球凝集素はＨ５であってもよい。
【０１５７】
本発明はまた、インフルエンザＢ型ウイルス血球凝集素を含むバルク液体ワクチンであって、（ａ）前記血球凝集素の濃度が少なくとも２ｍｇ／ｍｌであり、（ｂ）前記血球凝集素が、Ｂ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／７／９７血球凝集素ではない、バルク液体ワクチンを提供する。好ましくは、ワクチンは、（ｃ）スクロースを実質的に含まない。Ｈ１とＨ３の両方のインフルエンザＡ型ウイルス血球凝集素（複数可）を含まないこれらのバルクワクチンは、筋肉内ではない経路による送達用のワクチンの製造の間の有用な中間体であり得る。ＨＡ濃度は、２ｍｇ／ｍｌ超、例えば、≧３ｍｇ／ｍｌ、≧４ｍｇ／ｍｌ、≧５ｍｇ／ｍｌ、≧６ｍｇ／ｍｌ、≧７ｍｇ／ｍｌ、≧８ｍｇ／ｍｌ、≧９ｍｇ／ｍｌ、≧１０ｍｇ／ｍｌ、≧１２ｍｇ／ｍｌ、≧１４ｍｇ／ｍｌ、≧１５ｍｇ／ｍｌ、≧１６ｍｇ／ｍｌ、≧１８ｍｇ／ｍｌ、≧２０ｍｇ／ｍｌ、≧２５ｍｇ／ｍｌ、≧３０ｍｇ／ｍｌ、≧３５ｍｇ／ｍｌ、≧４０ｍｇ／ｍｌ、≧４５ｍｇ／ｍｌ、≧５０ｍｇ／ｍｌであってもよい。
【０１５８】
本発明はまた、インフルエンザＢ型ウイルス血球凝集素を含むバルク液体ワクチンであって、（ａ）血球凝集素の濃度が少なくとも２ｍｇ／ｍｌであり、（ｂ）インフルエンザＢ型ウイルスがＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株である、バルク液体ワクチンを提供する。好ましくは、ワクチンは、（ｃ）スクロースを実質的に含まない。Ｈ１とＨ３の両方のインフルエンザＡ型ウイルス血球凝集素（複数可）を含まない、これらのバルクワクチンは、筋肉内ではない経路による送達用のワクチンの製造の間の有用な中間体であり得る。ＨＡ濃度は、２ｍｇ／ｍｌ超、例えば、≧３ｍｇ／ｍｌ、≧４ｍｇ／ｍｌ、≧５ｍｇ／ｍｌ、≧６ｍｇ／ｍｌ、≧７ｍｇ／ｍｌ、≧８ｍｇ／ｍｌ、≧９ｍｇ／ｍｌ、≧１０ｍｇ／ｍｌ、≧１２ｍｇ／ｍｌ、≧１４ｍｇ／ｍｌ、≧１５ｍｇ／ｍｌ、≧１６ｍｇ／ｍｌ、≧１８ｍｇ／ｍｌ、≧２０ｍｇ／ｍｌ、≧２５ｍｇ／ｍｌ、≧３０ｍｇ／ｍｌ、≧３５ｍｇ／ｍｌ、≧４０ｍｇ／ｍｌ、≧４５ｍｇ／ｍｌ、≧５０ｍｇ／ｍｌであってもよい。
【０１５９】
本発明はまた、少なくとも２株のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素を含むバルク液体ワクチンであって、（ａ）前記血球凝集素の濃度が少なくとも２ｍｇ／ｍｌ／株であり、（ｂ）前記ワクチンがスクロースを実質的に含まない、バルク液体ワクチンを提供する。ＨＡ濃度は、２ｍｇ／ｍｌ／株超、例えば、≧３ｍｇ／ｍｌ／株、≧４ｍｇ／ｍｌ／株、≧５ｍｇ／ｍｌ／株、≧６ｍｇ／ｍｌ／株、≧７ｍｇ／ｍｌ／株、≧８ｍｇ／ｍｌ／株、≧９ｍｇ／ｍｌ／株、≧１０ｍｇ／ｍｌ／株、≧１２ｍｇ／ｍｌ／株、≧１４ｍｇ／ｍｌ／株、≧１５ｍｇ／ｍｌ／株、≧１６ｍｇ／ｍｌ／株、≧１８ｍｇ／ｍｌ／株、≧２０ｍｇ／ｍｌ／株、≧２５ｍｇ／ｍｌ／株、≧３０ｍｇ／ｍｌ／株、≧３５ｍｇ／ｍｌ／株、≧４０ｍｇ／ｍｌ／株、≧４５ｍｇ／ｍｌ／株、≧５０ｍｇ／ｍｌ／株であってもよい。このスクロースを含まないバルク多価ワクチンは、理想的には、二価、三価、または四価である。したがって、三価ワクチンにおいて、総ＨＡ濃度は、少なくとも６ｍｇ／ｍｌである。
【０１６０】
これらのバルク液体ワクチンにおけるＨＡ濃度は、好ましくは、例えば、規制認可された標準試薬を用いるＳＲＩＤにより測定される場合の、ＨＡ濃度である。ＳＲＩＤは、バルクワクチンに、処方前に（例えば、コーティング前に、またはフィルム形成前に）実施することができるが、いくつかの実施形態において、それは、すでに処方された製造物から回収された材料に（例えば、コーティングニードルから抗原を回収した後に）実施される。ＳＲＩＤの利点は、単一の試料において異なるＨＡ間を区別できることであり、例えば、三価ワクチンにおける各ＨＡを、並行して分析することができる。したがって、組成物が特定のＨＡを含む場合、その含有量を、他のＨＡの存在下でさえもアッセイすることができる。
【０１６１】
スクロースを実質的に含まないことに加えて、これらのバルクは、マンニトールを実質的に含まない場合がある。バルクはさらに、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクツロース、ラクトース、セロビオース、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、エリスリトール、およびキシリトールを実質的に含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、バルクは二糖および糖アルコールを実質的に含まない。
【０１６２】
一般
用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「包含すること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を網羅し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸからなってもよいし、または追加の何かを包含してもよく、例えば、Ｘ＋Ｙであってもよい。
【０１６３】
語「実質的に」とは、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含まなくてもよい。必要に応じて、語「実質的に」は、本発明の定義から省略される場合がある。
【０１６４】
数値ｘに関する用語「約」は、任意であり、例えば、ｘ±５％を意味する。
【０１６５】
特に記述がない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含むプロセスは、混合のいかなる特定の順序も必要としない。したがって、成分は任意の順序で混合することができる。３つの成分がある場合には、２つの成分をお互いに組み合わせ、その後、その組み合わせに第３の成分を組み合わせてもよいなど。
【０１６６】
動物性（特に、ウシの）材料が細胞の培養に用いられる場合、それらは、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から獲得されるべきである。概して、動物由来材料の完全な非存在下で、細胞を培養することが好ましい。
【０１６７】
本発明は、凍結乾燥を含まない濃縮手順を提供する。これは、本発明が、凍結乾燥されることなく濃縮および処方される抗原を用いることを意味する。保護の範囲は、ワクチン抗原の少なくとも一部が凍結乾燥されることなく濃縮および処方されるのであれば、凍結乾燥抗原がワクチンに加えられる状況を排除することを意図しない。したがって、本発明の凍結乾燥を含まない濃縮手順を実施すると同時に凍結乾燥も用いることは、保護全体の意図された範囲から外れるものではない。
【０１６８】
化合物が組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代替として、適切なプロドラッグに置き換えられてもよい。
したがって本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）  ワクチンを調製するためのプロセスであって、
（ｉ）抗原を含む液体組成物における該抗原の濃度を増加させて、濃縮された抗原を提供するステップ、および
（ｉｉ）該濃縮された抗原からワクチンを処方するステップ
を含み、該濃縮された抗原は、ステップ（ｉ）とステップ（ｉｉ）との間、またはステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）において凍結乾燥されない、プロセス。
（項目２）  上記ワクチンが、細菌、ウイルス、真菌、および／または寄生生物によって引き起こされる疾患から防御するためのものである、項目１に記載のプロセス。
（項目３）  上記ワクチンがインフルエンザワクチンである、項目２に記載のプロセス。
（項目４）  項目３に記載のプロセスであって、該プロセスは、インフルエンザワクチンを調製するためのプロセスであり、
（ｉ）インフルエンザウイルス血球凝集素を含む液体組成物における該血球凝集素の濃度を増加させて、濃縮された抗原を提供するステップ、および
（ｉｉ）該濃縮された抗原からインフルエンザワクチンを処方するステップ
を含む、プロセス。
（項目５）  項目４に記載のプロセスであって、該プロセスは、ｎ個の異なるインフルエンザウイルス株由来の血球凝集素を含むワクチンを調製するためのプロセスであり、
（ｉ）ｎ個の別個の液体組成物であって、それぞれが異なる株由来のインフルエンザウイルス血球凝集素を含む、ｎ個の別個の液体組成物における、血球凝集素の濃度を増加させて、ｎ個の別個の濃縮された抗原を提供するステップ、および
（ｉｉ）該ｎ個の別個の濃縮された抗原から多価インフルエンザワクチンを処方するステップ
を含み、該ｎ個の別個の濃縮された抗原はいずれも、ステップ（ｉ）とステップ（ｉｉ）との間、またはステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）において凍結乾燥されない、プロセス。
（項目６）  上記液体組成物が、外因性糖アルコールおよび／または外因性二糖を実質的に含まない、前述の項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目７）  抗原濃度が、ステップ（ｉ）において遠心濾過により、限外濾過により、または接線流濾過により増加する、前述の項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目８）  抗原濃度が、ステップ（ｉ）において接線流濾過により増加する、項目７に記載のプロセス。
（項目９）  ステップ（ｉ）が抗原濃度を少なくとも１０倍増加させる、前述の項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１０）  上記液体組成物が界面活性剤を含む、前述の項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１１）  上記界面活性剤がイオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）である、項目１０に記載のプロセス。
（項目１２）  上記界面活性剤がステップ（ｉ）において濃縮される、項目１０または項目１１に記載のプロセス。
（項目１３）  上記界面活性剤が、上記抗原が濃縮される程度より低い程度まで濃縮される、項目１２に記載のプロセス。
（項目１４）  上記界面活性剤がステップ（ｉ）において濃縮されない、項目１０または項目１１に記載のプロセス。
（項目１５）  ステップ（ｉｉ）が固形ワクチン形態を調製する、前述の項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１６）  ステップ（ｉｉ）が蒸発による乾燥を含む、項目１５に記載のプロセス。
（項目１７）  ステップ（ｉｉ）が、上記濃縮された抗原から固形生分解性マイクロニードルを調製する、前述の項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１８）  ステップ（ｉｉ）が、固形マイクロニードルを上記濃縮された抗原でコーティングする、項目１〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１９）  上記マイクロニードルが金属またはプラスチックである、項目１８に記載のプロセス。
（項目２０）  ステップ（ｉｉ）が、上記濃縮された抗原を１つまたは複数の固形マイクロニードルの表面に適用して、上記ワクチンの注入用のコーティング型マイクロニードルデバイスを提供する、項目１８または項目１９に記載のプロセス。
（項目２１）  上記マイクロニードルが１００〜２５００μｍの長さである、項目１７〜２０のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２２）  ステップ（ｉｉ）が上記濃縮された抗原から薄型フィルムを調製する、項目１〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２３）  ステップ（ｉｉ）が、
上記濃縮された抗原を１つまたは複数の口腔内溶解性ポリマーと混合するステップ、次に、
該混合物を用いてフィルムを形成して、上記ワクチンの頬側投与に適した薄型フィルムを提供するステップ
を含む、項目２２に記載のプロセス。
（項目２４）  ステップ（ｉｉ）が、
上記濃縮ワクチン抗原を１つまたは複数の局所溶解性ポリマーと混合するステップ、次に、
該混合物を用いてフィルムを形成して、上記ワクチンの経皮投与に適した薄型フィルムを提供するステップ
を含む、項目２２に記載のプロセス。
（項目２５）  上記フィルムが１０〜５００μｍ（例えば、７５〜１５０μｍ）の厚さである、項目２２〜２４のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２６）  上記抗原が上記フィルム内の微粒子の内部へカプセル化される、項目２２〜２５のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２７）
（ｉ）項目１５〜２６のいずれか一項に記載のプロセスによって固形ワクチンを調製するステップ、次に、
（ｉｉ）固形ワクチンを個々の単位用量小袋の中へパッケージングするステップ
を含む、パッケージングされたワクチンを調製するためのプロセス。
（項目２８）
上記抗原がインフルエンザ血球凝集素を含み、
血球凝集素含有量が、ＳＲＩＤを用いることによって上記処方ステップの前に測定される、
前述の項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２９）
上記抗原がインフルエンザ血球凝集素を含み、
血球凝集素含有量が、ＳＲＩＤを用いることによって上記処方ステップの後に測定される、
前述の項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目３０）  前述の項目のいずれか一項に記載のプロセスにより調製されるワクチン。
（項目３１）  被験体において免疫応答を起こす方法であって、項目３０に記載のワクチンを該被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目３２）  インフルエンザウイルス血球凝集素を含む液体ワクチンであって、
（ａ）該血球凝集素の濃度が少なくとも１２ｍｇ／ｍｌであり、
（ｂ）該ワクチンがスクロースを実質的に含まない、
液体ワクチン。
（項目３３）  インフルエンザＡ型ウイルス血球凝集素を含む液体ワクチンであって、
（ａ）該血球凝集素の濃度が少なくとも２ｍｇ／ｍｌであり、
（ｂ）該血球凝集素がＨ１血球凝集素でもＨ３血球凝集素でもない、
液体ワクチン。
（項目３４）  インフルエンザＢ型ウイルス血球凝集素を含む液体ワクチンであって、
（ａ）該血球凝集素の濃度が少なくとも２ｍｇ／ｍｌであり、
（ｂ）該インフルエンザＢ型ウイルスがＢ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８様株である、
液体ワクチン。
（項目３５）  スクロースを実質的に含まない、項目３３または項目３４に記載の液体ワクチン。
（項目３６）  少なくとも２株のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素を含む液体ワクチンであって、
（ａ）該血球凝集素の濃度が少なくとも２ｍｇ／ｍｌ／株であり、
（ｂ）該ワクチンがスクロースを実質的に含まない、
液体ワクチン。
（項目３７）  マンニトールを実質的に含まない、項目３２、項目３５、または項目３６に記載の液体ワクチン。
（項目３８）  二糖および糖アルコールを実質的に含まない、項目３２、項目３５、項目３６、または項目３７に記載の液体ワクチン。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１Ａ】図１は、一価インフルエンザＢ型ウイルスバルク抗原のＳＥＣクロマトグラフを示す。バルクは、（Ａ）凍結乾燥前、（Ｂ）スクロースの存在下での凍結乾燥後、または（Ｃ）スクロースおよびマンニトールの存在下での凍結乾燥後に分析された。ｘ軸は保持時間（分）を示し、ｙ軸は吸光度単位を示す。
【図１Ｂ】図１は、一価インフルエンザＢ型ウイルスバルク抗原のＳＥＣクロマトグラフを示す。バルクは、（Ａ）凍結乾燥前、（Ｂ）スクロースの存在下での凍結乾燥後、または（Ｃ）スクロースおよびマンニトールの存在下での凍結乾燥後に分析された。ｘ軸は保持時間（分）を示し、ｙ軸は吸光度単位を示す。
【図１Ｃ】図１は、一価インフルエンザＢ型ウイルスバルク抗原のＳＥＣクロマトグラフを示す。バルクは、（Ａ）凍結乾燥前、（Ｂ）スクロースの存在下での凍結乾燥後、または（Ｃ）スクロースおよびマンニトールの存在下での凍結乾燥後に分析された。ｘ軸は保持時間（分）を示し、ｙ軸は吸光度単位を示す。
【図２Ａ】図２は、（Ａ）Ｈ１Ｎ１  Ｂｒｉｓｂａｎｅ、（Ｂ）Ｈ３Ｎ２  Ｂｒｉｓｂａｎｅ、（Ｃ）Ｂ  Ｆｌｏｒｉｄａについての血清ＨＩ力価を示す。４つの対の棒は、左から右へ、アジュバント添加されていない三価；アジュバント添加された三価；アジュバント添加されていない一価；およびＰＢＳ陰性対照である。各対における左側の棒は、非濃縮一価バルクである；右側の棒はＴＦＦ濃縮された抗原である。
【図２Ｂ】図２は、（Ａ）Ｈ１Ｎ１  Ｂｒｉｓｂａｎｅ、（Ｂ）Ｈ３Ｎ２  Ｂｒｉｓｂａｎｅ、（Ｃ）Ｂ  Ｆｌｏｒｉｄａについての血清ＨＩ力価を示す。４つの対の棒は、左から右へ、アジュバント添加されていない三価；アジュバント添加された三価；アジュバント添加されていない一価；およびＰＢＳ陰性対照である。各対における左側の棒は、非濃縮一価バルクである；右側の棒はＴＦＦ濃縮された抗原である。
【図２Ｃ】図２は、（Ａ）Ｈ１Ｎ１  Ｂｒｉｓｂａｎｅ、（Ｂ）Ｈ３Ｎ２  Ｂｒｉｓｂａｎｅ、（Ｃ）Ｂ  Ｆｌｏｒｉｄａについての血清ＨＩ力価を示す。４つの対の棒は、左から右へ、アジュバント添加されていない三価；アジュバント添加された三価；アジュバント添加されていない一価；およびＰＢＳ陰性対照である。各対における左側の棒は、非濃縮一価バルクである；右側の棒はＴＦＦ濃縮された抗原である。
【発明を実施するための形態】
【０１７０】
インフルエンザウイルス血球凝集素への凍結乾燥の影響
一価インフルエンザウイルスバルク抗原を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析し、その後、凍結乾燥および再構成後、再び分析した。以下の２つの異なる凍結乾燥手順を試験した：リオプロテクタントとしてスクロースのみを用いる手順およびスクロースとマンニトールの両方を用いる手順。図１における結果は、５分における顕著なピーク（図１Ａ）が再構成された材料において消失している（図１Ｂおよび１Ｃ）ことを示す。したがって、この処理は、ワクチン抗原を明らかに変化させるので、抗原濃縮は凍結乾燥を避けるべきである。
【０１７１】
抗原濃縮技術の比較
出発ＨＡ濃度は、一価インフルエンザウイルスバルクにおいて約０．５ｍｇ／ｍｌであった。様々なバルクの濃縮について、以下の３つの異なる方法を用いた：遠心濾過；限外濾過；およびＴＦＦ。遠心濾過については、１０ｋＤａのカットオフを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）デバイスを用いて、５０００ｒｐｍで４５分間行った。限外濾過については、再生セルロースでできている１０ｋＤａカットオフの膜を有するＡｍｉｃｏｎ（商標）撹拌細胞濃縮器を用いて、加圧窒素下で１時間行った。ＴＦＦについては、３０ｋＤａカットオフを有する改変ポリエーテルスルホン中空繊維フィルターを用いて、４５ｍｌの出発容積を１．５ｍｌまで濃縮するように行った。達成することができる濃度を増加させるために、遠心分離方法および限外濾過方法をまた、凍結乾燥と組み合わせた。
【０１７２】
遠心濾過は、それ単独で約１０倍の濃縮を達成した。続いて凍結乾燥した場合には、追加のＳＥＣピークが出現し、再構成された試料は、目に見える凝集物を含有した。
【０１７３】
限外濾過、続いて凍結乾燥、その後、出発容積へと戻す再構成により、出発材料に匹敵するＨＡ濃度（ＳＲＩＤによって測定された場合の）を有する材料が得られ、機能性抗原の損失がないことを示した。再構成された材料は＞２週間、安定であった。
【０１７４】
これらの２つの方法は高濃度（例えば、３０倍）を達成するために凍結乾燥を必要としたが、これは、ＴＦＦを用いる場合、単一のステップで達成することができた。さらに、濃縮材料は＞２週間、安定であった。したがって、凍結乾燥を必要とすることなく、高い抗原濃度を達成するために、ＴＦＦは好ましい技術である。
【０１７５】
ＴＦＦおよび凍結乾燥
インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスの卵内で成長した３株の一価バルクを以下によって処理した：（ｉ）スクロースの添加；（ｉｉ）スクロースの存在下において凍結乾燥し、最初の容積に再構成する；（ｉｉｉ）（ｉｉ）と同様に凍結乾燥するが、最初の容積の半分に再構成する；（ｉｖ）ＴＦＦによる濃縮；または（ｖ）（ｖ）のようなＴＦＦによる濃縮、続いて（ｉｉ）のような凍結乾燥および再構成。それぞれの場合において、ＨＡ含有量は、ＳＲＩＤによって評価され、絶対値として、さらに、それぞれの出発バルク（３１１〜４３７μｇ／ｍｌの範囲のＨＡ濃度を有した）に対する濃縮率（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）として下記に示されている。（ｉ）または（ｉｉ）における濃縮率が１未満である場合には、リオプロテクタントおよび／または凍結乾燥は、ＨＡ結合に干渉している；同じことは、（ｉｉｉ）における率が２未満である場合、または（ｖ）における率が（ｉｖ）より小さい場合に当てはまる。
【０１７６】
１組の実験からの結果は以下のとおりであった：
【０１７７】
【表１】
0005959508.tif 000002
したがって、全ての場合において、処理（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、検出可能なＨＡにおける低下をもたらしたが、株２の処理（ｉ）の影響は非常に小さかった。さらに、リオプロテクタントの添加のみは、ＨＡにおける低下をもたらしたが、再構成後の低下はさらにより大きく、すなわち、ＨＡレベルにおける低下は、常に、処理（ｉ）後より処理（ｉｉ）後に大きかった。したがって、凍結乾燥は検出可能なＨＡにおいて大きな下落をもたらす。株２を例外として、同様の効果は、ＴＦＦ後に見られ、すなわち、凍結乾燥はＳＲＩＤ検出可能なＨＡ含有量を低下させた。
【０１７８】
処理（ｉｖ）および（ｖ）のみを用いる別の組の実験からの結果は以下のとおりであった：
【０１７９】
【表２】
0005959508.tif 000003
したがって、ＴＦＦのみは＞５０倍の濃縮を達成することができる。しかしながら、上記からわかるように、凍結乾燥の追加のステップは常に、ＳＲＩＤ測定されたＨＡ含有量における低下をもたらした。
【０１８０】
免疫原性研究
２００８年／２００９年の季節性由来のインフルエンザ一価バルクをＴＦＦによって濃縮した。濃縮インフルエンザ抗原を、インビボでそれらの免疫原性について評価し、最初の一価バルク材料に対して比較した。抗原を、Ｂａｌｂ／Ｃ雌性マウスに、３週間隔てた２回の免疫化を用いて筋肉内に投与した。抗原を、一価ワクチン（０．３μｇのＨＡ）として、三価ワクチン（０．３μｇのＨＡ）として、またはアジュバント添加された三価ワクチン（ＭＦ５９水中油型エマルジョンアジュバントと共に０．３μｇのＨＡ）として、投与した。陰性対照としてＰＢＳを用いた。機能性抗インフルエンザ抗体力価を、血球凝集阻害（ＨＩ）によって評価した。
【０１８１】
インフルエンザ一価バルクを、ＴＦＦによって２９ｍｇ／ｍｌ、２８ｍｇ／ｍｌ、および２０ｍｇ／ｍｌのＨＡまで濃縮した。全ての３つの濃度は、０．６〜０．８（１μｇのタンパク質あたりのＨＡのμｇ）の範囲での総タンパク質に対するＨＡの比率を有した。Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリソルベート８０）を抗原と共に濃縮し、８〜１４ｍｇ／ｍｌと見積もった。濃縮された抗原についてのＨＡに対するＴｗｅｅｎ  ８０の比率は、１μｇのＨＡあたり０．１〜０．２μｇであり、それは、典型的な一価バルクにおいてと同じである。Ｔｗｅｅｎ  ８０とは対照的に、ＣＴＡＢはそのプロセス中に濃縮されず、未処理の一価バルクに存在するレベルをはるかに下回った（１μｇのＨＡあたり＜０．０１μｇの界面活性剤）。濃縮された抗原は、４℃で溶液中、ＳＲＩＤにより３〜４週間、安定であった。
【０１８２】
２回目の免疫化から２週間後のＨＩ力価は、図２に示されている。全ての３つの株（Ｈ１Ｎ１  Ｂｒｉｓｂａｎｅ；Ｈ３Ｎ２  Ｂｒｉｓｂａｎｅ；Ｂ  Ｆｌｏｒｉｄａ）について、濃縮された抗原の免疫原性は、非濃縮一価バルクに匹敵した。
【０１８３】
本発明は、例としてのみ記載されているのであって、本発明の範囲および精神の内に留まりながら、改変され得ることは理解されているであろう。
【０１８４】
【数１】
0005959508.tif 000004
【０１８５】
【数２】
0005959508.tif 000005
【０１８６】
【数３】
0005959508.tif 000006
【図１Ａ】
0005959508.tif 000007
【図１Ｂ】
0005959508.tif 000008
【図１Ｃ】
0005959508.tif 000009
【図２Ａ】
0005959508.tif 000010
【図２Ｂ】
0005959508.tif 000011
【図２Ｃ】
0005959508.tif 000012