(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｅ）を備えた、イメージサイトメーターによって、細胞集団における、染色体多倍性を示し、かつ、細胞増殖能を有する細胞の有無を判定する方法であって、工程（ａ）の細胞試料における細胞数が１０００〜１０００００００である方法。
（ａ）ＤＮＡを標的とした蛍光物質と、スライドグラス又はカバーグラスに固定化された細胞集団由来の細胞試料とを接触させる工程；
（ｂ）イメージサイトメーターを用いて、細胞試料中の各細胞のＤＮＡ含量を測定する工程；
（ｃ）イメージサイトメーターを用いて、細胞周期Ｇ２／Ｍ期に相当する細胞よりもＤＮＡ含量が多い細胞を、染色体多倍性細胞として選択する工程；
（ｄ）イメージサイトメーターを用いて、工程（ｃ）で選択した染色体多倍性細胞の細胞増殖の有無を検出する工程；
（ｅ）染色体多倍性細胞の細胞増殖が認められた場合、前記細胞集団に、染色体多倍性を示し、かつ、細胞増殖能を有する細胞が含まれていると判定する工程；
【請求項２】
細胞試料が、５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）存在下で培養した細胞由来の試料であり、かつ、工程（ｄ）が、イメージサイトメーターを用いてＢｒｄＵを検出し、ＢｒｄＵのシグナルの有無を指標にして、染色体多倍性細胞の細胞増殖の有無を検出する工程であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｄ）が、イメージサイトメーターを用いて細胞コロニー形成を検出し、細胞コロニー形成の有無を指標にして、染色体多倍性細胞の細胞増殖の有無を検出する工程であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）が、ＤＮＡを標的とした蛍光物質に加えて、ＦＩＳＨプローブを細胞集団由来の細胞試料に接触させる工程であり、かつ、工程（ｃ）〜（ｅ）の間に、イメージサイトメーターを用いてＦＩＳＨプローブを検出し、ＦＩＳＨプローブのシグナル数を基に染色体多倍性を測定する工程（ｐ）をさらに備えたことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＦＩＳＨプローブがセントロメアを検出するプローブであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
染色体多倍性が染色体４倍性であることを特徴とする請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
細胞集団が、多能性幹細胞集団であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イメージサイトメーターによって、細胞集団における、染色体多倍性を示し、かつ、細胞増殖能を有する細胞の有無を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）はヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞であり、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を維持したまま長期にわたって培養することができるという特徴を有している。この性質を利用してヒトＥＳ細胞は再生医療への応用が期待されているが、分化させたＥＳ細胞の移植により、拒絶反応が惹起してしまうという問題がある。
【０００３】
近年、山中らのグループにより、マウス体細胞用いて４因子（Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、Klf4遺伝子、及びc-myc遺伝子）の発現により脱分化を誘導し、ＥＳ細胞に近い多能性や増殖能を有する細胞（誘導多能性幹細胞）、いわゆるｉＰＳ細胞の開発が報告された（非特許文献１）。その後、ヒトの分化細胞からもｉＰＳ細胞を作製できることが報告され（非特許文献２）、治療対象となる患者由来の細胞を用いてｉＰＳ細胞を作製できる点から、ヒトｉＰＳ細胞は、拒絶反応のない人工臓器作製のためのツールとして期待されている。しかしながら、ｉＰＳ細胞のin vivoでの挙動を解析すると、ｉＰＳ細胞は必ずしもＥＳ細胞と同じ性質を有する細胞ではない可能性が示唆されている。例えば、ｉＰＳ細胞を用いてキメラマウスを作製したところ、約２０％の個体において腫瘍形成が観察された。これはＥＳ細胞を用いた同様の実験よりも有意に高い数値である。
【０００４】
この腫瘍形成リスクが高いという問題を解決するため、マウス及びヒトにおいて、c-myc遺伝子を用いずにOct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、Klf4遺伝子の３つの遺伝子を導入することによりｉＰＳ細胞を作製し、かかるｉＰＳ細胞を用いてキメラマウスを作製すると、腫瘍形成リスクを抑制できることが報告された（非特許文献３、４）。しかしながら、ヒトｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を臨床応用する場合、腫瘍形成リスクは限りなくゼロに近いことが求められる。このため、多能性幹細胞集団において、腫瘍形成する細胞の有無を高感度に判定できる方法が必要とされていた。
【０００５】
細胞あたりの染色体数（染色体倍数性）が変わると、細胞が腫瘍化することが数多く報告されている。例えば、アポトーシスを抑制するｐ５３のノックアウトマウス細胞株において、染色体４倍性（テトラソミー）細胞は腫瘍化する頻度が上昇することが報告されている（非特許文献５）。染色体倍数性の異常を含めた染色体異常を調べる方法としては、例えば、有糸分裂（Ｍ）期の細胞を用いて、Ｍ期特有の凝縮した染色体を解析し、核型（カリオタイプ）を調べる方法（カリオタイピング）や、全ゲノムを網羅するＤＮＡマイクロアレイを用いて、染色体数異常を検出する方法（Comparative Genomic Hybridization［ＣＧＨ］法）や、染色体ＤＮＡをシーケンシングすることにより、直接に調べる方法などが知られている。しかし、これらの従来の方法を、多能性幹細胞の臨床応用に用いた場合、費用対効果や時間対効果の面でネックとなる上に、染色体倍数性の異常を示す細胞が細胞集団中にごく少量である場合に、染色体倍数性の異常を示す細胞を検出することは困難であると考えられていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Takahashi, K. et al., Cell. 126: 663-676 (2006)
【非特許文献２】Takahashi, K. et al., Cell. 131: 861-872 (2007)
【非特許文献３】Nakagawa, M. et al., Nat Biotechnol26: 101-106 (2008)
【非特許文献４】Wering, M. et al., Cell Stem Cell 2: 10-12 (2008)
【非特許文献５】Fujiwara, T. et al., Nature 13: 1043-1047 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、細胞集団における、染色体多倍性を示し、かつ、細胞増殖能を有する細胞を検出することができる、イメージサイトメーターを用いて高感度にかかる細胞の有無を判定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
正常な染色体倍数性を有する細胞集団において、細胞分裂が正常になされないなど何らかの原因により染色体多倍性を示す細胞がごくまれに生じることがある。この分野の多くの研究者は、そのような染色体多倍性を示す細胞（以下、「染色体多倍性細胞」ということもある）の多くは、異常な染色体本数を有するため、細胞増殖能を失い、最終的にはアポトーシス機構により細胞死すると考えていた。そのため、たとえ染色体多倍性を示す細胞の中に細胞増殖能を有する細胞が含まれていたとしても、そのようなごく少数の細胞を細胞集団の中から検出するのは困難とされていた。本発明者らは、イメージサイトメーターを用いて細胞周期Ｇ２／Ｍ期に相当する細胞よりもＤＮＡ含量が多い細胞を染色体多倍性細胞としてスクリーニングした後、５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）による細胞染色法や細胞コロニー形成の有無による解析を駆使し鋭意検討する中で、染色体多倍性細胞の中に細胞増殖能を有する細胞があることを見いだした。さらにＦＩＳＨ（Fluorescent in situ hybridization）法を用いて染色体多倍性細胞の染色体倍数性を解析したところ、染色体４倍性を示すことが確認された。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、（１）（ａ）ＤＮＡを標的とした蛍光物質と細胞集団由来の細胞試料とを接触させる工程；（ｂ）イメージサイトメーターを用いて、細胞試料中の各細胞のＤＮＡ含量を測定する工程；（ｃ）イメージサイトメーターを用いて、細胞周期Ｇ２／Ｍ期に相当する細胞よりもＤＮＡ含量が多い細胞を、染色体多倍性細胞として選択する工程；（ｄ）イメージサイトメーターを用いて染色体多倍性細胞の細胞増殖の有無を検出する工程；（ｅ）染色体多倍性細胞の細胞増殖が認められた場合、前記細胞集団に、染色体多倍性を示し、かつ、細胞増殖能を有する細胞が含まれていると判定する工程；の工程（ａ）〜（ｅ）を備えた、イメージサイトメーターによって、細胞集団における、染色体多倍性を示し、かつ、細胞増殖能を有する細胞の有無を判定する方法や、（２）細胞試料が、５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）存在下で培養した細胞由来の試料であり、かつ、工程（ｄ）が、イメージサイトメーターを用いてＢｒｄＵを検出し、ＢｒｄＵのシグナルの有無を指標にして、染色体多倍性細胞の細胞増殖の有無を検出する工程であることを特徴とする上記（１）に記載の方法や、（３）工程（ｄ）が、イメージサイトメーターを用いて細胞コロニー形成を検出し、細胞コロニー形成の有無を指標にして、染色体多倍性細胞の細胞増殖の有無を検出する工程であることを特徴とする上記（１）に記載の方法や、（４）工程（ａ）が、ＤＮＡを標的とした蛍光物質に加えて、ＦＩＳＨプローブを細胞集団由来の細胞試料に接触させる工程であり、かつ、工程（ｃ）〜（ｅ）の間に、イメージサイトメーターを用いてＦＩＳＨプローブを検出し、ＦＩＳＨプローブのシグナル数を基に染色体多倍性を測定する工程（ｐ）をさらに備えたことを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法や、（５）ＦＩＳＨプローブがセントロメアを検出するプローブであることを特徴とする上記（４）に記載の方法や、（６）染色体多倍性が染色体４倍性であることを特徴とする上記（４）又は（５）に記載の方法や、（７）細胞集団が、多能性幹細胞集団であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、染色体多倍性を示し、かつ、細胞増殖能を有する細胞が、細胞集団に対してごく少数でも検出可能となった。かかる細胞は、将来腫瘍化する可能性が考えられるため、本発明の方法を用いると、染色体倍数性が正常な多能性幹細胞集団などの細胞集団の中に将来腫瘍化する細胞が含まれているかどうかを判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（ａ）本発明のイメージサイトメーターを用いて、Ｃａｌ５１細胞試料中の各細胞のＤＮＡ含量を測定し、ＤＮＡ解析データを取得し、４種類（Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期、及び染色体多倍性）の細胞に分類した結果を示す図である。（ｂ）本発明のイメージサイトメーターを用いて、図１（ａ）で分類した染色体多倍性細胞をＤＮＡ蛍光画像で選択し、かかるＤＮＡ蛍光画像を用いて染色体多倍性細胞からなる細胞コロニー形成を検出した結果を示す図である。図中、左側及び右側の丸で囲んだ部分は、それぞれ１６つ及び９つの染色体多倍性細胞からなる、細胞コロニー形成を示す。
【図２】（ａ）本発明のイメージサイトメーターを用いて、Ｃａｌ５１細胞試料中の各細胞のＤＮＡ含量を測定し、ＤＮＡ解析データを取得し、Ｇ２／Ｍ期に相当する細胞よりもＤＮＡ含量が多い細胞を、染色体多倍性細胞として分類した結果を示す図である。（ｂ）本発明のイメージサイトメーターを用いて、図１（ａ）で分類した染色体多倍性細胞を３種類の蛍光画像（ＤＮＡ蛍光画像、ＢｒｄＵ蛍光画像［ｃ］、及びＦＩＳＨ蛍光画像［ｄ］）で選択し、かかる３種類の蛍光画像を用いて細胞増殖能を有する４倍性細胞を検出した結果を示す図である。なお、図中、矢印は、コントロールとしてＳ期細胞を示す。
【図３】（ａ）骨髄間葉系細胞集団を２週間培養した後、細胞試料を調製し、本発明のイメージサイトメーターを用いて、各細胞のＤＮＡ含量を測定し、ＤＮＡ解析データを取得した結果を示す図である。（ｂ）図３（ａ）のＤＮＡ解析データを基に、骨髄間葉系細胞集団を４種類（Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期、及び染色体多倍性）の細胞に分類した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のイメージサイトメーターによって、細胞集団における、染色体多倍性を示し、かつ、細胞増殖能を有する細胞の有無を判定する方法としては、ＤＮＡを標的とした蛍光物質と細胞集団由来の細胞試料とを接触させる工程（ａ）；イメージサイトメーターを用いて、細胞試料中の各細胞のＤＮＡ含量を測定する工程（ｂ）；イメージサイトメーターを用いて、細胞周期Ｇ２／Ｍ期に相当する細胞よりもＤＮＡ含量が多い細胞を、染色体多倍性細胞として選択する工程（ｃ）；イメージサイトメーターを用いて染色体多倍性細胞の細胞増殖の有無を検出する工程（ｄ）；染色体多倍性細胞の細胞増殖が認められた場合、前記細胞集団に、染色体多倍性を示し、かつ、細胞増殖能を有する細胞が含まれていると判定する工程（ｅ）；を備えた方法であれば特に制限されないが、工程（ｃ）〜（ｅ）の間に、イメージサイトメーターを用いてＦＩＳＨプローブを検出し、ＦＩＳＨプローブのシグナル数を基に染色体多倍性を測定する工程（ｐ）をさらに備えることが好ましく、かかる工程（ｐ）をさらに備えた場合、上記工程（ａ）の実施の形態として、ＤＮＡを標的とした蛍光物質に加えて、ＦＩＳＨプローブを細胞集団由来の細胞試料に接触させる工程を挙げることができる。
【００１３】
本発明において、染色体多倍性を示す細胞とは、ヒト、マウスなどの動物細胞等の２倍体（２ｎ）を示す細胞の倍数性が増加した、２倍体より多い倍数性を示す細胞のことを意味する。染色体多倍性を示す細胞は、例えば、染色体が複製（Ｓ）期に複製した後、有糸分裂（Ｍ）期において何らかの原因により正常に娘細胞へ分配されず、細胞あたりの染色体数が増えた場合、ごくまれに生じ得る。染色体多倍性を示す細胞の多くは、細胞周期チェックポイント機構やアポトーシス機構により細胞増殖が停止したり、或いは細胞死に至るが、中には細胞増殖できる細胞がごく一部生じることもあり、かかる染色体多倍性を示し、かつ、細胞増殖能を有する細胞は、本発明の判定する方法を用いることにより、検出することができる。
【００１４】
本発明のイメージサイトメーターは、顕微鏡による蛍光画像の取得と取得された蛍光画像の解析とを自動的に行うことができる画像解析装置であって、蛍光画像を基にして得られた解析データから、蛍光画像を呼び出す手段を有するものをいう。また、本発明のイメージサイトメーターとしては、例えば、レーザー走査型イメージサイトメーターやこれを適宜改良したイメージサイトメーター等を挙げることができ、具体的にはレーザー走査型サイトメーター（ＬＳＣ：Laser Scanning Cytometer）（オリンパス社製）、ＬＳＣ２（オリンパス社製）、ＣＥＬＡＶＩＥＷ  ＲＳ１００（オリンパス社製）などを挙げることができる。
【００１５】
本発明の細胞集団としては、細胞増殖能を有する細胞の集団であれば特に制限されないが、例えば、複数系統の細胞に分化できる能力（多分化能）と、細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力（自己複製能）とを有する多能性幹細胞集団を挙げることができ、多能性幹細胞集団としては、全ての種類の細胞に分化することができる能力（全能性）を有するＥＳ細胞や、造血幹細胞、皮膚幹細胞、肝幹細胞など、生体内の各組織における幹細胞集団（成体幹細胞集団）を挙げることができ、この中には、体細胞などの分化した細胞へ数種類の遺伝子を導入することにより人工的に作製された人工多能性幹細胞、いわゆるｉＰＳ細胞集団も含まれる。ｉＰＳ細胞は、例えば３つの遺伝子（Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、Klf4遺伝子）を体細胞へ導入し、非特許文献３、４に記載の技術に基づいて作製することができる。
【００１６】
本発明のＤＮＡを標的とした蛍光物質としては、ＤＮＡに結合できる蛍光物質であれば特に制限されず、ＤＮＡ結合性の化合物やタンパク質などに、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ２、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、Alexa−４８８、Alexa−５４６、Alexa−５９４等のＤＮＡ結合性のない蛍光物質（以下、単に「蛍光物質」という）で標識させたものも含まれるが、簡便性を考慮すると、ＤＮＡの２本鎖の間にインターカレートするインターカレーター蛍光物質が好ましい。インターカレーター蛍光物質としては、例えば、ヘキスト（Hoechest）３３３４２、Hoechest３３２５８、4',6'-ジアミノ-2-フェニルインドール（4',6-diamino-2-phenylindole；ＤＡＰＩ)、ヨウ化プロピジウム（Propidium Iodide；ＰＩ）などを挙げることができ、これらの中でもＰＩを好適に例示することができる。
【００１７】
本発明の細胞試料としては、本発明の細胞集団由来の各細胞のＤＮＡ含量を測定することができる細胞試料であれば特に制限されず、例えば、本発明の細胞集団からサンプリングした細胞を、ホルマリンやエタノールなどを用いてスライドグラスやカバーグラス上に固定したものを挙げることができる。本発明の細胞集団からサンプリングする細胞の数としては、本発明の判定する方法により、染色体多倍性を示し、かつ、細胞増殖能を有する細胞の有無を判定するために十分な細胞数あればよく、例えば、１０００〜１０００００００、１０００〜１００００００、１０００〜１０００００、１０００〜１００００、１００００〜１０００００００、１０００００〜１０００００００、１００００００〜１０００００００、１００００〜１００００００などを例示することができる。
【００１８】
本発明の判定する方法における工程（ａ）において、ＤＮＡを標的とした蛍光物質と細胞集団由来の細胞試料とを接触させる方法としては、ＤＮＡを標的とした蛍光物質の特性を考慮して接触時間、接触時の温度、接触に用いる溶媒などの条件は適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡを標的とした蛍光物質がインターカレーター蛍光物質である場合、接触時間としては、１分〜２時間の範囲から選択することができ、接触時の温度としては、０〜４０℃の範囲から選択することができ、接触に用いる溶媒としては、リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline；ＰＢＳ）、トリス緩衝食塩水（Tris buffered saline；ＴＢＳ）、脱イオン水（Deionized Water；ＤＷ）などから選択することができる。またＤＮＡを標的とした蛍光物質がＰＩである場合、ＰＩはＤＮＡに加えてＲＮＡにも結合性があるため、ＤＮＡを標的とした蛍光物質と細胞集団由来の細胞試料とを接触させる前又は接触させた後に、ＲＮａｓｅ処理により細胞試料中の各細胞におけるＲＮＡを分解処理することが好ましい。
【００１９】
本発明の判定する方法における工程（ｂ）において、イメージサイトメーターを用いて、細胞試料中の各細胞のＤＮＡ含量を測定する方法としては、イメージサイトメーターを用いて、細胞試料中の各細胞で検出される、ＤＮＡを標的とした蛍光物質の蛍光量を測定する方法であれば特に制限されず、かかる測定する方法のより具体的な形態としては、イメージサイトメーターにより、細胞試料中の各細胞が発するＤＮＡを標的とした蛍光物質の蛍光量を検出し、ＤＮＡ蛍光画像として取得することや、かかるＤＮＡ蛍光画像を基にして得られた、各細胞の全蛍光量や最大蛍光量などの蛍光量に関する値をヒストグラムやドットプロットなどで表示したＤＮＡ解析データを取得することを、自動的に行う方法を例示することができる。
【００２０】
本発明の判定する方法における工程（ｃ）において、イメージサイトメーターを用いて、細胞周期Ｇ２／Ｍ期に相当する細胞よりもＤＮＡ含量が多い細胞を、染色体多倍性細胞として選択する方法としては、上記工程（ｂ）で取得したＤＮＡ解析データで細胞周期Ｇ２／Ｍ期に相当する細胞よりもＤＮＡ含量が多い細胞を分類し、イメージサイトメーターを用いて、細胞周期Ｇ２／Ｍ期に相当する細胞よりもＤＮＡ含量が多い細胞を、上記工程（ｂ）で取得したＤＮＡ蛍光画像で選択する方法であればよい。ＤＮＡ蛍光画像とＤＮＡ解析データとは対応しているので、上記ＤＮＡ解析データでＧ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期、多倍性などの細胞に分類すると、イメージサイトメーターを用いて、ＤＮＡ蛍光画像でＧ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期、多倍性などの細胞を自動的に選択することができる。選択した各細胞は、分類したカテゴリーごとにImage・J（http://rsb.info.nih.gov/ij/）、Photoshop（Adobe社製）、After Effect（Adobe社製）、G-Count（株式会社ジーオングストローム社製）等の画像解析ソフトを用いて、色分けなどの画像処理をしてもよい。
【００２１】
上記細胞周期Ｇ２／Ｍ期に相当する細胞は、ＤＮＡ解析データを基に適宜分類することができ、例えば、各細胞におけるＤＮＡを標的とした蛍光物質の全蛍光量と細胞数とをパラメーターとしてヒストグラムで表示したＤＮＡ解析データの場合、かかる全蛍光量が異なる２つのピークが検出されるが、ここで全蛍光量がより少ない方のピークをＧ１期の細胞由来のものとして、また全蛍光量がより多い方のピークをＧ２／Ｍ期の細胞由来のものとしてイメージサイトメーターを用いて分類することができる。かかるピークは、測定誤差などからある割合のピーク幅を有するため、ピーク幅を含めたものをＧ２／Ｍ期の細胞由来の細胞として分類してもよく、例えば、Ｇ１期の細胞由来のピークにおけるＤＮＡ含量を１とした場合、Ｇ２／Ｍ期の細胞のＤＮＡ含量は、ＤＮＡ複製によりＧ１期の細胞と比べ２倍となることから、Ｇ２／Ｍ期の細胞由来のピークにおけるＤＮＡ含量は２となるが、ピーク幅を含めるために、例えば、１．７〜２．３、１．８〜２．２、１．９〜２．１などのピーク幅を含めたものをＧ２／Ｍ期の細胞由来の細胞として分類してもよい。
【００２２】
ＤＮＡ解析データにおける細胞周期Ｇ２／Ｍ期に相当する細胞を分類すると、かかる細胞よりもＤＮＡ含量が多い細胞を、染色体多倍性細胞として分類し、イメージサイトメーターを用いて、染色体多倍性細胞をＤＮＡ蛍光画像で自動的に選択することができる。選択する染色体多倍性細胞としては、細胞周期Ｇ２／Ｍ期に相当する細胞の中から任意のものであっても、或いは染色体４倍性、染色体８倍性など、特定の染色体多倍性を示す細胞に照準を合わせてもよい。特定の染色体多倍性を示す細胞に照準を合わせる場合、例えば、染色体４倍性を示す細胞を選択するときは、ＤＮＡ解析データにおいて、Ｇ２／Ｍ期の細胞のＤＮＡ含量〜Ｇ２／Ｍ期の細胞の２倍のＤＮＡ含量の細胞に照準を合わせて分類することが好ましい。なお、ＤＮＡ解析データで細胞周期Ｇ２／Ｍ期に相当する細胞よりもＤＮＡ含量が多い細胞を分類した中には、イメージサイトメーターが誤って複数の細胞が重なったものを染色体多倍性細胞として検出したものが含まれる場合があるが、かかるケースは、ＤＮＡ蛍光画像を基に確認することができる。
【００２３】
本発明の判定する方法における工程（ｄ）において、イメージサイトメーターを用いて染色体多倍性細胞の細胞増殖の有無を検出する方法としては、イメージサイトメーターを用いて染色体多倍性細胞の細胞増殖を検出できる方法であれば特に制限されず、例えば、イメージサイトメーターを用いて、Ｋｉ−６７、ＰＣＮＡ、トポイソメラーゼなどの細胞増殖関連タンパク質の発現を検出し、細胞増殖関連タンパク質のシグナルの有無を指標にして、染色体多倍性細胞の細胞増殖の有無を検出する方法や、イメージサイトメーターを用いてＢｒｄＵを検出し、ＢｒｄＵのシグナルの有無を指標にして、染色体多倍性細胞の細胞増殖の有無を検出する方法や、イメージサイトメーターを用いて細胞コロニー形成を検出し、細胞コロニー形成の有無を指標にして、染色体多倍性細胞の細胞増殖の有無を検出する方法などを挙げることができ、これらの中でも正確性を考慮すると、イメージサイトメーターを用いてＢｒｄＵを検出し、ＢｒｄＵのシグナルの有無を指標にして、染色体多倍性細胞の細胞増殖の有無を検出する方法が好ましく、また簡便性を考慮すると、イメージサイトメーターを用いて細胞コロニー形成を検出し、細胞コロニー形成の有無を指標にして、染色体多倍性細胞の細胞増殖の有無を検出する方法が好ましい。
【００２４】
本発明の判定する方法における工程（ｄ）において、上記イメージサイトメーターを用いて細胞増殖関連タンパク質の発現を検出し、細胞増殖関連タンパク質のシグナルの有無を指標にして、染色体多倍性細胞の細胞増殖の有無を検出する方法を用いる場合、上記工程（ａ）の形態として、ＤＮＡを標的とした蛍光物質に加えて、細胞増殖関連タンパク質に特異的な抗体を細胞集団由来の細胞試料に接触させる工程を挙げることができる。細胞増殖関連タンパク質に特異的な抗体としては、イメージサイトメーターを用いて検出できるものであれば特に制限はないが、蛍光物質で標識した抗体を好適に例示することができる。蛍光物質で標識した抗体としては、蛍光物質で直接的に標識したものや、蛍光物質で標識した２次抗体により間接的に標識したものを挙げることができる。細胞増殖関連タンパク質に特異的な抗体に直接又は間接的に標識した蛍光物質のシグナルは、イメージサイトメーターを用いて検出し、細胞増殖関連タンパク質蛍光画像として取得することができる。かかる細胞増殖関連タンパク質蛍光画像を基に、染色体多倍性細胞における細胞増殖関連タンパク質に特異的な抗体のシグナルの有無を指標にして、染色体多倍性細胞の増殖の有無を検出することができる。
【００２５】
本発明の判定する方法における工程（ｄ）において、上記イメージサイトメーターを用いてＢｒｄＵを検出し、ＢｒｄＵのシグナルの有無を指標にする方法を用いる場合、本発明の細胞試料としては、ＢｒｄＵ存在下の培地で細胞を培養することにより、ＤＮＡ複製中の細胞にＢｒｄＵが取り込まれるため、ＢｒｄＵ存在下で培養した細胞由来の試料を挙げることができる。ＢｒｄＵ存在下の培地としては、細胞培養に適した培地を適宜選択することができる。例えば、培地におけるＢｒｄＵの濃度としては、１〜１００μＭの範囲から選択することができ、培地としては、ウシなどの血清を５〜２０％添加した、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭなどの細胞培養用培地を挙げることができる。ＤＮＡ複製中の細胞がＢｒｄＵを取り込むことができる条件としては、細胞が培養可能な条件であれば適宜選択することができる。例えば、培養温度としては、３０〜４０℃の範囲から選択することができ、培養時間としては、１０分〜２４時間の範囲から選択することができる。また、培養は、５〜１０％の二酸化炭素ガスを満たしたインキュベーター内で行うことができる。細胞に取り込まれたＢｒｄＵは、例えば蛍光物質で標識した抗ＢｒｄＵ抗体と細胞試料とを接触させ、かかる蛍光物質のシグナルを、イメージサイトメーターを用いて検出することにより、検出することができる。蛍光物質で標識した抗ＢｒｄＵ抗体としては、Molecular Probe社製などの直接的に蛍光物質を標識した抗ＢｒｄＵ抗体や、蛍光物質で標識した２次抗体により間接的に標識した抗ＢｒｄＵ抗体を挙げることができる。蛍光物質で標識した抗ＢｒｄＵ抗体と細胞試料とを接触させる方法としては、例えばDolbeare, F., et al. 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:5573-5577、Holm, M., et al. 1998. Cytometry. 32:28-36などに記載の方法や、BrdU Fow Kit（BD Pharmingen社製）、In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などの市販のキットを用いて実施する方法を挙げることができる。上記ＢｒｄＵのシグナルは、イメージサイトメーターを用いてＢｒｄＵ蛍光画像として取得し、かかるＢｒｄＵ蛍光画像を基に、染色体多倍性細胞におけるＢｒｄＵのシグナルの有無を指標にして、染色体多倍性細胞の増殖の有無を検出することができる。
【００２６】
本発明の判定する方法における工程（ｄ）において、上記イメージサイトメーターを用いて細胞コロニー形成を検出し、細胞コロニー形成の有無を指標にする方法を用いる場合、本発明の細胞試料としては、細胞集団からサンプリングし、細胞が複数の細胞クローンを生成するのに十分な期間培養を行った細胞の試料であれば特に制限されない。細胞が複数の細胞クローンを生成するのに十分な期間としては、細胞が１回分裂するのに十分な期間に基づき適宜選択することができ、例えば細胞が１回分裂するのに十分な期間が１日である場合、１日以上の期間であればよく、例えば１週間、２週間、４週間、８週間などを選択することができる。細胞コロニー形成の有無は、細胞を検出した画像、好ましくはＤＮＡ蛍光画像を基に、細胞コロニー形成している染色体多倍性細胞数に基づいて評価することができる。例えば、細胞コロニー形成が有ると評価する、細胞コロニー形成している染色体多倍性細胞数としては、１つの染色体多倍性細胞が、１回分裂して細胞クローンを１つ生成すると、２つの染色体多倍性細胞からなるコロニーが形成されることから、２以上であればよく、好ましくは４以上、より好ましくは１６以上を挙げることができる。
【００２７】
本発明のＦＩＳＨプローブとしては、染色体上の特定の領域にハイブリダイズするプローブであれば特に制限されず、ＲＮＡをベースとしたプローブも含まれるが、安定性の面からＤＮＡをベースとしたプローブが好ましい。染色体上の特定の領域としては、任意の遺伝子、セントロメア、テロメアなどの領域を挙げることができ、これらの中でも検出感度及び特異性が高いため、セントロメアを好適に例示することができる。セントロメアを検出するプローブとしては、任意の染色体セントロメアを検出するプローブを適宜選択することができ、例えば７番染色体セントロメアを検出するプローブや１１番染色体セントロメアを検出するプローブを挙げることができる。また、染色体多倍性をより正確に測定するために、複数の染色体セントロメアを検出するプローブや異なる染色体セントロメアを検出するプローブを複数用いてもよい。
【００２８】
また本発明のＦＩＳＨプローブとしては、イメージサイトメーターを用いて検出できるものであれば特に制限はないが、蛍光物質で標識したＦＩＳＨプローブを好適に例示することができる。蛍光物質で標識したＦＩＳＨプローブとしては、市販のものを購入して用いてもよいし、自ら調製したものを用いてもよい。自ら調製する場合、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ（European Molecular Biology Laboratory）、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）などの公知のＤＮＡデータベースを基に染色体上の特定の領域のヌクレオチド配列を選択し、かかるヌクレオチド配列をオリゴＤＮＡ合成法やゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ法により増幅した後、Nick Translation Kit（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）等のキットによるニックトランスレーション法を用いて、ビオチン（biotin）やジゴキシゲニン（digoxigenin）などで標識したＤＮＡでラベルし、蛍光物質が標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジン（avidin）やジゴキシゲニンを認識する抗体などで間接的に標識したものを調製することができる。
【００２９】
上記ＦＩＳＨプローブを細胞集団由来の細胞試料に接触させる方法としては、ＦＩＳＨプローブが細胞試料中の各細胞の染色体にハイブリダイズできるＦＩＳＨ法であればよく、ＦＩＳＨ法としては、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル（Molecular cloning,A laboratorymanual）などに記載の方法を挙げることができる。例えば、ハイブリダイズする条件のうち、ホルムアミドの濃度としては、３０〜５０％の範囲から選択することができ、温度としては、６５〜７５℃の範囲から選択することができ、時間としては、２〜４８時間の範囲から選択することができる。
【００３０】
上記工程（ｐ）において、イメージサイトメーターを用いてＦＩＳＨプローブを検出し、ＦＩＳＨプローブのシグナル数を基に染色体多倍性を測定する方法としては、イメージサイトメーターを用いて蛍光物質で標識したＦＩＳＨプローブのシグナルを検出し、ＦＩＳＨ蛍光画像として取得した後、かかるＦＩＳＨ蛍光画像を基に、染色体多倍性細胞におけるＦＩＳＨプローブのシグナル数を指標にして、染色体多倍性を測定する方法を挙げることができる。例えば、ＦＩＳＨプローブとして、ある特定の染色体セントロメアを検出するプローブを１つ用いる場合、染色体数に応じたシグナルが検出されるので、１つの細胞あたり２つのシグナルが検出されるが、かかるシグナルが４つ又は８つ検出されるとき、それぞれ染色体４倍性、８倍性を示す細胞が検出されることになる。測定する染色体多倍性としては、染色体４倍性、８倍性などの任意の染色体多倍性を挙げることができるが、染色体４倍性を好適に例示することができる。
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
１．細胞試料における、多倍性細胞のスクリーニングと、かかる多倍性細胞の細胞増殖能の有無の検出
１−１  方法
１−１−１  細胞試料の作製
［１］乳癌由来の培養細胞株（Ｃａｌ５１）をスライドグラス上で一定期間（１週間、２週間、又は４週間）培養する。かかるＣａｌ５１が接着したスライドグラスを基に、以下に示す［２］〜［６］の手順により細胞試料を作製した。
［２］ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。
［３］１００％エタノールで１０分間、固定処理を行った。
［４］ＲＮａｓｅＡ（シグマアルドリッチ社製）（１ｍｇ／ｍｌ in ＰＢＳ］）で３０分間、ＲＮａｓｅ処理を行った。
［５］ＰＩ溶液（０．０３ｍｇ／ｍｌ in ＰＢＳ）中に３０分間浸し、ＤＮＡ染色を行った。
［６］カバーグラスをかけ、周囲をマニキュアでシールした。
１−１−２  ＤＮＡ含量を基にした多倍性細胞のスクリーニング
［１］ＣＥＬＡＶＩＥＷ  ＲＳ−１００（オリンパス社製）を用いて、上記方法で作製した細胞試料における各細胞のＤＮＡ蛍光画像の取得、ＤＮＡ蛍光画像を基にしたＤＮＡ含量の測定、及びＤＮＡ含量を基にしたヒストグラム（ＤＮＡ解析データ）の作成を自動的に行った。
［２］得られたＤＮＡ解析データにおいて、４種類の細胞（Ｇ１期細胞、Ｓ期細胞、Ｇ２／Ｍ期細胞、染色体多倍性細胞）に分類した。
［３］ＤＮＡ蛍光画像において、上記４種類に分類した細胞に対応する細胞を、解析ソフト（RS-100 analyser）を用いてマークした。
［４］マークした細胞について、画像解析ソフト（Photoshop：Adobe社製）を用いて、Ｇ１期細胞を青色で、Ｓ期細胞を緑色で、Ｇ２／Ｍ期細胞を赤色で、染色体多倍性細胞を紫色で示した。
【００３３】
１−２  結果
図１には、スライドグラス上でＣａｌ５１細胞を２週間培養した細胞試料を用いた結果を示す。ヒストグラムで表示したＤＮＡ解析データを基に、Ｃａｌ５１細胞集団における、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期、及び染色体多倍性細胞の割合を分類したところ、それぞれ７９％、８％、１２％及び１％であり（図１［ａ］参照）、本発明の方法により、細胞集団全体で１％程度の染色体多倍性細胞をスクリーニングすることができた。かかるＤＮＡ解析データを基に、ＤＮＡ蛍光画像における各染色体多倍性細胞を解析すると、その多くの細胞は個々に分散していたが、詳細に解析を進めたところ、１６つ及び９つの染色体多倍性細胞からなる、細胞コロニーの形成が認められた（図１（ｂ）、丸で囲んだ部分）。これらの結果は、元々染色体多倍性細胞は細胞数が少ないため、１つずつ分散しているが、その多くは細胞増殖能を有しておらず、したがって、多くの染色体多倍性細胞は細胞コロニーを形成しなかったが、染色体多倍性細胞の一部には、細胞増殖能を有するものがあり、これらが複数の細胞クローンを生成した結果、細胞コロニーが形成されたことを示している。
【００３４】
上記結果をさらにサポートするため、ＢｒｄＵを用いて染色体多倍性細胞の細胞増殖について解析を行った。ＢｒｄＵは、チミジンの誘導体であり、ＤＮＡ複製時に染色体に取り込まれるため、ＢｒｄＵの有無を指標にして、染色体多倍性細胞がＤＮＡ複製しているか、すなわち細胞増殖しているかどうかをリアルタイムに検証することができる。また、細胞増殖能を有する染色体多倍性細胞の倍数性について解析するために、セントロメアを特異的に検出するプローブを用いてＦＩＳＨを行った。
【実施例２】
【００３５】
２．細胞試料における、ＤＮＡ含量の測定、ＦＩＳＨによる染色体倍数性の検出、及びＢｒｄＵによる細胞増殖の検出
１−１  方法
１−１−１  細胞試料の作製とＤＮＡ含量の測定
［１］乳癌由来の培養細胞株（Ｃａｌ５１）をスライドグラス上で一定期間（１週間、２週間、又は４週間）培養する。かかるＣａｌ５１が接着したスライドグラスを基に、以下に示す［２］〜［９］の手順により細胞試料を作製し、ＤＮＡ含量の測定を行った。
［２］ＢｒｄＵ（シグマアルドリッチ社製）を最終濃度が１０μＭになるように培地に添加した。
［３］インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２条件下）に１時間置いた。
［４］ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。
［５］１００％エタノールで１時間、固定処理を行った。
［６］１晩風乾した。
［７］ＲＮａｓｅＡ（シグマアルドリッチ社製）（１ｍｇ／ｍｌ in ＰＢＳ］）で３０分間、ＲＮａｓｅ処理を行った。
［８］ＰＩ溶液（０．０３ｍｇ／ｍｌ in ＰＢＳ）中に３０分間浸し、ＤＮＡ染色を行った。
［９］カバーグラスをかけた後（マニキュアによるシールはせずに）、ＣＥＬＡＶＩＥＷ  ＲＳ−１００（オリンパス社製）を用いて、各細胞のＤＮＡ蛍光画像の取得、ＤＮＡ蛍光画像を基にしたＤＮＡ含量の測定、及びＤＮＡ含量を基にしたヒストグラム（ＤＮＡ解析データ）の作成を自動的に行った。
１−１−２  セントロメアプローブを用いたＦＩＳＨ法
［１］ＣＥＬＡＶＩＥＷ  ＲＳ−１００（オリンパス社製）により解析したスライドグラスからカバーガラスを取り除いた後、ＰＩを細胞核内のＤＮＡから除くため、ＰＢＳ溶液中に１週間浸した。
［２］ハイブリダイゼーション効率を上昇させるために、０．０５％〜０．５％  ペプシン／０．１Ｎ  ＨＣｌ溶液中に３７℃で１２分間処理した。
［３］７０％、８５％及び１００％  エタノールで順次２分間処理した後、風乾した。
［４］細胞のＤＮＡを変性するために、Denaturation solution（７ｍｌ  ２０ｘＳＳＣ［３Ｍ  塩化ナトリウム、０．３Ｍ  クエン酸三ナトリウム、ｐＨ  ７．０］、１４ｍｌ  Ｈ２Ｏ、４９ｍｌ  ホルムアミド）溶液中に、７３℃で５分間処理した。
［５］７０％、８５％及び１００％  エタノールで順次２分間処理した後、風乾した。なお、かかる処理において、−２０℃〜４℃のエタノールを使用した。
［６］７番染色体セントロメアを特異的に検出するプローブ溶液（７番染色体セントロメアプローブ  １μｌ、ハイブリダイゼーションバッファー  ７μｌ、脱イオン蒸留水［Deionized distilled Water；ＤＤＷ）］  ２μｌ）（UroVysion Bladder Cancer Kit、Vysis社製）を変性処理した後、細胞が接着したスライドグラス上に接触させ、その後カバーガラスで被せペーパーボンドでシールし、ハイブリダイゼーション処理を３７℃で２〜３日間行った。なお、用いたプローブ溶液の調製及び変性方法は、製品に添付された説明書にしたがって行った。
［７］２ｘＳＳＣ／０．３％  ＮＰ−４０溶液中に室温で１分間洗浄した。
［８］７０％、８５％及び１００％  エタノールで順次２分間処理した後、風乾した。
［９］カバーグラスをかけた後（マニキュアによるシールはせずに）、ＣＥＬＡＶＩＥＷ  ＲＳ−１００（オリンパス社製）を用いて、各細胞のＦＩＳＨ蛍光画像の取得を自動的に行った。
１−１−３  ＢｒｄＵの検出法
［１］ＰＢＳで５〜１０分間、３回洗浄した。
［２］抗ＢｒｄＵ抗体（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）（０．１ｍｇ／ｍｌ）を抗体希釈用緩衝液（コードNO  S3022［ダコ社製］）で１００〜２００倍希釈した溶液中に４℃で１晩、１次抗体反応処理を行った。
［３］ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。
［４］Alexa４８８標識抗ゴートＩｇＧ抗体（Alexa Fluor 488F(ab')2 fragment of Goat anti-Mouse IgGantibody、インビトロジェン社製）を抗体希釈用緩衝液（コードNO  S3022［ダコ社製］）で１００倍希釈した溶液中に室温で１時間、２次抗体反応処理を行った。
［５］ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。
［６］カバーグラスをかけた後（マニキュアによるシールはせずに）、ＣＥＬＡＶＩＥＷ  ＲＳ−１００（オリンパス社製）を用いて、各細胞のＢｒｄＵ蛍光画像の取得を自動的に行った。
【００３６】
上記「１−１−１  細胞試料の作製とＤＮＡ含量の測定」の項目の［９］で取得したＤＮＡ解析データにおいて、各染色体多倍性細胞に対応する３種類の蛍光画像（ＤＮＡ蛍光画像、ＦＩＳＨ蛍光画像、及びＢｒｄＵ蛍光画像）は、解析ソフト（RS-100 analyser）により解析した。
【００３７】
１−２  結果
上記実施例１と同様の方法によりヒストグラムで表示したＤＮＡ解析データを作成し（図２［ａ］）、かかるＤＮＡ解析データを基に、ＤＮＡ蛍光画像（図２［ｂ］）、ＢｒｄＵ蛍光画像（図２［ｃ］）、及びＦＩＳＨ蛍光画像（図２［ｄ］）における各染色体多倍性細胞を解析した。図２には、スライドグラス上でＣａｌ５１細胞を２週間培養した細胞試料を用いた結果を示す。染色体多倍性細胞は、４つの細胞からなる細胞コロニーを形成しており（図２［ｂ］）、この結果は上記実施例１の結果を支持するものである。また、かかる染色体多倍性細胞のＢｒｄＵのシグナルの有無を検証したところ、ＢｒｄＵのシグナルが検出された（図２［ｃ］）。この結果は、染色体多倍性細胞がＤＮＡ複製をしている、すなわち細胞増殖能を有することを示しており、上記実施例１の結果を支持するとともに、細胞集団からサンプリングする直前まで染色体多倍性細胞が細胞増殖能を有していることを示している。さらに、７番染色体セントロメアプローブを用いたＦＩＳＨを行い、染色体倍数性について解析したところ、上記染色体多倍性細胞は、４つのシグナルが認められた（図２［ｄ］）。この結果は、上記染色体多倍性細胞は、染色体を４セット有した染色体４倍性を示す細胞であることを示している。
【実施例３】
【００３８】
さらにがん細胞に加えて正常細胞についても検証するために、骨髄間葉細胞を用いて上記実施例２と同様の方法で解析を行った。上記実施例２と同様の方法によりヒストグラムで表示したＤＮＡ解析データを作成したところ、染色体多倍性細胞が認められた（図３［ａ］）。骨髄間葉系細胞集団における、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期、及び染色体多倍性細胞の割合は、それぞれ７９％、８．７４％、１２．０４％及び０．２％であった（図３［ｂ］）。この結果は、本発明の方法により、細胞集団でわずか０．２％程度の染色体多倍性細胞をもスクリーニングできることを示している。さらに、７番染色体セントロメアプローブを用いたＦＩＳＨを行い、染色体倍数性について解析したところ、かかる染色体多倍性細胞は、染色体４倍性を示す細胞であることが明らかとなった。この結果は、正常細胞を含めたあらゆるタイプの細胞集団において、染色体多倍性を示し、かつ、細胞増殖能を有する細胞が存在している場合、本発明の判定する方法により、かかる細胞を検出できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、正常細胞集団の中に将来腫瘍化する可能性のある細胞が含まれているかどうかを判定する方法を提供するものであり、多能性幹細胞を用いた再生医療などの分野において、多能性幹細胞の安全性を高レベルで担保するための方法として期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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