(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ  クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）  Ｈ−６１株の発酵代謝物を有効成分として含有することを特徴とする抗糖化剤の製造方法であって、
前記乳酸菌を含む培地を培養して前記乳酸菌を発酵させ、
前記乳酸菌を含む発酵物を濾過することで、菌体を除去する
抗糖化剤の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の抗糖化剤の製造方法であって、
前記菌体を濾過する工程は、前記発酵物を０．１〜０．５μｍ以下の径を有するフィルターにより濾過する
抗糖化剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗糖化剤の製造方法であって、
前記乳酸菌を含む培地は、豆乳、牛乳、山羊乳及びめん羊乳の少なくともいずれか一つを含む
抗糖化剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の乳酸菌の発酵代謝物を含有する抗糖化剤、寿命延長剤及び老化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会を迎え、健康を促進することで、老化を抑制し、寿命を延長することに関心が集まっている。例えば、特許文献１には、アスタキサンチンを有効成分とする寿命延長剤、抗酸化機能向上剤が記載されている。
【０００３】
また、健康を促進する機能性食品として、プロバイオティクスが知られている。プロバイオティクスは、一般に、「宿主の腸内フローラのバランスを改善することにより宿主動物に有益に働く微生物添加物」と定義されている（非特許文献１参照）。この定義によると、プロバイオティクスは、乳酸菌等の生菌体であって、生きて腸に到達し、腸内フローラに働きかけることで、腸管免疫を高め、有益な作用をもたらすと考えられる。例えば特許文献２には、骨密度減少や皮膚潰瘍発生抑制により老化を抑制する乳酸菌が記載されている。
【０００４】
あるいは、死菌体であっても有益な作用を示すことがあり、プロバイオティクスの定義を広げようとする考えもある（非特許文献２参照）。例えば、特許文献２には、死菌体でも生菌体と同様の効果を有する旨、記載されている。
【０００５】
そこで近年、プロバイオティクスのほか、バイオジェニックスが提唱されている（非特許文献３参照）。バイオジェニックスとは、直接、あるいは腸内フローラを介して免疫賦活、コレステロール低下作用、血圧降下作用、整腸作用、抗腫瘍効果、抗血栓・造血作用などの生体調節、生体防御、疾病予防・回復、老化制御等に働く食品成分と定義されている。すなわちバイオジェニックスは、プロバイオティクスとは異なり、腸内フローラに作用するだけでなく、腸管免疫に直接作用し、健康を向上させることが期待される。上記定義を鑑みれば、死菌体は、バイオジェニックスとして上記の有益な作用をもたらすとも考えられる。
【０００６】
またバイオジェニックスの例としては、死菌等に含まれる乳酸菌の菌体成分のほか、乳酸菌発酵代謝物、及びこれらの混合物等も挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許４６０４２０７号
【特許文献２】特開２０１２−７２１３２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Fuller，(1989)J．Appl．Bacteriol., 66，365-378
【非特許文献２】Salminen et al.,(1999) Trends Food Sci. Technol.,10，107-110
【非特許文献３】光岡知足編  プロバイオティクス・プレバイオティクス・バイオジェニック  財団法人日本ビフィズス菌センター  ２００６年６月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ここで、乳酸菌発酵代謝物は、菌体とは異なる成分を有するため、具体的な作用についての知見が少なかった。
【００１０】
以上のような事情に鑑み、本発明の目的は、所定の乳酸菌の発酵代謝物を含有する抗糖化剤、寿命延長剤及び老化抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明の一形態に係る抗糖化剤は、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ  クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）  Ｈ−６１株の発酵代謝物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１２】
本発明の抗糖化剤は、上記乳酸菌の発酵代謝物を有効成分として含有することで、非常に高い終末糖化産物（Advanced Glycation End-products；ＡＧＥｓ）生成抑制活性を有する。ＡＧＥｓとは、グルコース（ブドウ糖）などの還元糖が、蛋白質のアミノ基と非酵素的に反応（メーラード反応）して生成される物質であって、心筋梗塞や脳梗塞、骨粗しょう症、白内障、糖尿病合併症の原因物質とも言われている。本発明の抗糖化剤は、ＡＧＥｓの生成を抑制するため、これらの疾患を防止することが可能となる。
【００１３】
前記発酵代謝物は、菌体を含まなくてもよい。
【００１４】
本発明の発酵代謝物は、菌体を含まずとも、非常に高い抗糖化作用を有する。
【００１５】
前記発酵代謝物は、豆乳、牛乳、山羊乳及びめん羊乳の少なくともいずれか一方を含む培地で前記乳酸菌を発酵することで生成されてもよい。
【００１６】
本発明の一形態に係る寿命延長剤は、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ  クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）  Ｈ−６１株の発酵代謝物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１７】
本発明の寿命延長剤は、生物の寿命を延長することができ、誕生から固体死に至るまでの期間を増加することができる。
【００１８】
また、寿命延長が、抗糖化に起因してもよい。
【００１９】
上述のように、上記発酵代謝物は、抗糖化作用を有し、心疾患、脳疾患等、死因となり得る疾患を防止することができるため、抗糖化に起因して寿命が延長し得る。
【００２０】
また、前記発酵代謝物は、菌体を含まなくてもよい。
前記発酵代謝物は、豆乳、牛乳、山羊乳及びめん羊乳の少なくともいずれか一方を含む培地で前記乳酸菌を発酵することで生成されてもよい。
【００２１】
本発明の一形態に係る老化抑制剤は、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ  クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）  Ｈ−６１株の発酵代謝物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００２２】
また、上記発酵代謝物は、抗糖化作用を有し、心疾患、脳疾患等、死因となり得る疾患を防止することができるため、老化抑制が、抗糖化に起因してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の発酵代謝物を含む培養液で培養した線虫の寿命曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明について詳細を説明する。
【００２５】
本発明は、発明者らの鋭意検討によって、乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ  クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）  Ｈ−６１株（以下、Ｈ−６１株とする）の発酵代謝産物が、抗糖化作用及び寿命延長作用、並びにこれらに起因する老化抑制作用を有することを見出したことにより、完成された。従来より、乳酸菌の菌体自体についての老化抑制、健康増進に関する知見は得られていた（特許文献２等参照）。しかしながら、菌体が非常に少ない、あるいは菌体を含まない乳酸菌の発酵代謝物に関する知見はほとんど得られていない。本発明は、乳酸菌の発酵代謝物自体に、菌体から予期できない顕著な抗糖化作用、寿命延長作用及びこれらに伴う老化抑制作用を見出したことで、完成に至ったものである。
【００２６】
本発明のＨ−６１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＮＩＴＥ  Ｐ−９２である（特許文献２参照）。また上記Ｈ−６１株は、独立行政法人農業生物資源研究所の農業生物資源ジーンバンクにも、ＭＡＦＦ  Ｎｏ．４００００７として寄託されている。
【００２７】
本発明の発酵代謝物は、Ｈ−６１株を任意の条件で発酵させた後、菌体を除去したものをいい、菌体が非常に少ない、又は菌体を含まないものである。すなわち、本発明の発酵代謝物は、主に乳酸、各種アミノ酸等を含む。「菌体を含まない」発酵代謝物とは、実質的に菌体を含まないことを示し、例えば発酵後、０．１〜０．５μｍ以下の径を有するフィルターによって培養液を濾過した濾過液、及び当該濾過液の処理物をいうものとする。なお、濾過前に、常法により培養液をホモジナイズしたものも含むものとする。
【００２８】
本発明の発酵代謝物の製造に用いる発酵培地は、例えば、牛乳、豆乳、山羊乳、めん羊乳又はこれらを混合させたものを含むことができる。これにより、Ｈ−６１株の発酵効率を高めることができる。
【００２９】
本発明の発酵代謝物は、例えば、上記菌株を常法に従い培養し、発酵させた後、殺菌し、発酵液を濾過することで、製造することができる。発酵条件は特に限定されない。例えば、上記発酵代謝物は、２０℃〜４０℃の発酵温度で発酵されたものとすることができる。また上記発酵代謝物は、７０時間以上、好ましくは７０時間〜７００時間発酵されたものとすることができる。
【００３０】
上記発酵液は、常法により加熱殺菌及び懸濁され、濾過される。濾過には、上述のように、０．１〜０．５μｍ以下の径を有するフィルターが用いられる。なお、径の比較的大きなフィルターで濾過した後、上記フィルターを用いた濾過を行うこともできる。
【００３１】
本発明の発酵代謝物は、上記濾過液に含まれる。なお、上記濾過液には、摂取形態に応じて適宜、エバポレータを用いた脱エタノール処理や、加熱殺菌処理等を施してもよい。上記濾過液を、以下、発酵代謝物含有液と称する。
【００３２】
本発明の抗糖化剤は、上記発酵代謝物を有効成分として含有することを特徴とする。上記抗糖化剤は、非常に高い終末糖化産物（Advanced Glycation End-products；ＡＧＥｓ）生成抑制活性を有することができる。ＡＧＥｓとは、グルコース（ブドウ糖）などの還元糖が、蛋白質のアミノ基と非酵素的に反応（メーラード反応）して生成される物質である。ＡＧＥｓが血管に蓄積すると心筋梗塞や脳梗塞、骨に蓄積すると骨粗しょう症、目に蓄積すると白内障の一因となる。また、ＡＧＥｓは、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症などの糖尿病による合併症の原因物質とも言われている。すなわち、ＡＧＥｓの生成を抑制することで、死因として多い心臓疾患や脳疾患、糖尿病による合併症等を効果的に抑制することが可能となり、老化抑制や、寿命延長につながると考えられる。
【００３３】
本発明の寿命延長剤は、上記発酵代謝物を有効成分として含有することを特徴とする。本発明の寿命延長剤は、生物の寿命を延長することができ、誕生から固体死に至るまでの期間を増加することができる。本発明の寿命延長剤は、生物の平均寿命を、例えば１．１〜１．５倍、増加させることができる。本発明の寿命延長剤における寿命延長は、一つとして抗糖化に起因し得るが、その他、種々の作用に起因するものとも考えられる。
【００３４】
本発明の老化抑制剤は、上記発酵代謝物を有効成分として含有することを特徴とする。上述のように、ＡＧＥｓの蓄積により、老化に関連した病態である血管疾患や脳疾患等を抑制できる。したがって、本発明の老化抑制剤における老化抑制は、一つとして抗糖化に起因し得るが、その他、種々の作用に起因するものと考えられる。
【００３５】
本発明の抗糖化剤、寿命延長剤及び老化抑制剤は、使用目的に応じた手法により製剤化でき、例えば、凍結乾燥粉末、噴霧乾燥粉末、液体への懸濁などの手法を適用することができる。また、製剤化に伴い、適宜添加物を加えてもよい。
【００３６】
本発明の抗糖化剤、寿命延長剤及び老化抑制剤は、上記発酵代謝物含有液を、１日に体重１ｋｇ当たり、０．００１〜２ｍｌ、好ましくは０．０１ｍｌ〜０．２ｍｌ摂取可能に配合することができる。なお、投与量は、投与される人（動物）の年齢、症状の程度、投与形態に応じて調整することができる。なお、本発明の抗糖化剤、寿命延長剤及び老化抑制剤は、牛乳、豆乳等で培養された上記発酵代謝物含有液を用いた発酵乳として供されることも可能である。
【実施例】
【００３７】
（実施例１）
豆乳を５００ｍｌ容器に加えて常法により加熱滅菌し、冷却して豆乳培地を用意した。Ｈ−６１株は、常法に従い、予め７日間培養した。そして、培養したＨ−６１株を豆乳培地に接種し、約３５℃で一昼夜培養し、菌体を１×１０９ＣＦＵ／ｍｌまで増殖させた。そして、常法により加熱殺菌し、エタノールを加えてホモジナイズ処理し、１次濾過した。この１次濾過液を、さらに０．２μｍ径の中空糸膜を用いて２次濾過した。この２次濾過液を、エバポレータによる脱エタノール処理し、９０％乳酸を加えて、常法により加熱殺菌した。これにより、実施例１に係る発酵代謝物含有液が製造された。
【００３８】
（実施例２）
実施例２は、豆乳に替えて牛乳（脱脂粉乳）を用いた牛乳培地による以外は、実施例１と同様に発酵代謝物含有液を製造した。
【００３９】
（試験例１  ＡＧＥｓ生成抑制活性測定）
実施例１及び実施例２を用いて、ＡＧＥｓ生成抑制活性の測定を行った。
【００４０】
まず、試料を準備した。本試験例の試料として、実施例１及び実施例２各々に係る発酵代謝物含有液（以下、原液とする）、並びに各原液をバッファーを用いて１０倍希釈したもの及び１００倍希釈したものを作製した（後述する表１参照）。バッファーは、リン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いた。
【００４１】
各試料について、蛍光測定法によりＡＧＥｓ生成抑制活性を測定した。すなわち、３６０ｍｇ/ｍＬのグルコース水溶液０．５ｍＬ、４０ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ（Bovine Serum Albumin）水溶液１．０ｍＬ、リン酸バッファー（ｐＨ７．４）２．５ｍＬ及び純水０．５ｍＬに各試料を０．５ｍＬ添加して測定液を生成した。また試料に替えて、純水０．５ｍＬを加えたコントロールも生成した。続いて、各測定液及びコントロールを、６０℃、４０時間インキュベーションした。その後、インキュベーションした測定液及びコントロールについて、蛍光分光光度計にて励起波長２７０ｍｍ、蛍光波長４４０ｍｍにおける蛍光強度を測定した。コントロールの蛍光強度に対する各試料添加時の蛍光強度の減少率を算出し、ＡＧＥｓ生成抑制率とした。
【００４２】
表１は、本試験例の結果を示す表である。同表に示すように、実施例１及び実施例２ともにＡＧＥｓ生成抑制活性が見られた。希釈率が低いほどＡＧＥｓ生成抑制率が高いこと、及び、豆乳を用いて発酵した実施例１と牛乳を用いて発酵した実施例２とで同様の結果が得られていることから、本試験例の抗糖化活性が、本発明のＨ−６１の発酵代謝物によるものであることが確認された。
【００４３】
【表１】
0005935155.tif 000002
【００４４】
特に、実施例１及び実施例２の原液において、ほぼ１００％のＡＧＥｓ生成抑制率を有する。したがって、本発明のＨ−６１の発酵代謝物は、非常に高いＡＧＥｓ生成抑制活性を有することが確認された。
【００４５】
（試験例２  線虫寿命測定）
実施例１及び実施例２を与えた線虫の寿命について測定した。
【００４６】
線虫（Caenorhabditis elegans）は、は寿命が３〜４週間（培養温度２０℃）と短く、全ゲノムが解明されたモデル生物として用いられている。また、老化と酸化ストレスの関係について多くの研究が行われており、寿命に影響を与える物質の探索にも用いられている。本試験例には、fer-15変異株を用いた。fer-15変異株は、２５℃以上で次世代の産生が抑制される特徴を持ち、寿命測定の際に次世代の線虫が混入しないメリットがある。
【００４７】
まず、表２の組成のS-mediumを調製した。S-medium中のTrace metals solutionの組成は、表３に示す。S-medium にエサとなる大腸菌ＯＰ−５０株を懸濁させ線虫の培養液とした。この培養液を用いて線虫が成虫になるまで培養（２０℃、２００ｒｐｍ）を行った。その後、表４に示すS-bufferにて線虫を回収、洗浄後、ＮａＯＨ溶液および液体塩素系漂白剤（商品名  ハイター、花王株式会社）を用いて線虫の体を溶解させ、体内から卵を回収した。回収した卵は２０℃で１晩培養し孵化させた。孵化させたＬ１幼虫は、培養フラスコを用い２６℃、１００ｒｐｍで大腸ＯＰ−５０株を餌として同調培養を行った。このとき、培養フラスコ１本あたり線虫２０００匹になるように調整した。卵回収後５日目にアンピシリン及び各試料を培養フラスコに加えた。各試料は、実施例１及び実施例２の発酵代謝物含有液（原液）を、培養液中終濃度が１１倍希釈及び１０１倍希釈されるように添加した。また、コントロールとして、純水を添加した。その後、数日ごとに培養液を一定量取得し、線虫の生存数を調べ、５日目の生存数を１００％として生存曲線を描き、平均寿命および最長寿命を算出した。
【００４８】
【表２】
0005935155.tif 000003
【００４９】
【表３】
0005935155.tif 000004
【００５０】
【表４】
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【００５１】
図１は、線虫の寿命曲線を示すグラフであり、表５は線虫の平均寿命、最長寿命及び寿命延長率を示す表である。寿命延長率は、コントロールの平均寿命を１００％とした際の各試料の平均寿命のこれらの図表に示すように、コントロールに対して線虫の寿命が有意に延長し、本発明の各実施例について寿命延長作用が確認された。特に、寿命延長率を参照すると、実施例１を１１倍希釈したものでは３０％以上も平均寿命が延長し、実施例１を１０１倍希釈したもの、及び実施例２を１１倍希釈したものでは、２０％以上平均寿命が延長した。また、実施例２を１０１倍希釈したものは、１０％以上平均寿命が延長した。
【００５２】
【表５】
0005935155.tif 000006
【００５３】
また、培養液中の発酵代謝物含有液の濃度が高いほど寿命が延長する傾向が見られた。これにより、本試験例における寿命延長が、本発明の発酵代謝物によるものと確認された。
【００５４】
加えて、豆乳を含む培地で発酵された実施例１の方が、牛乳を含む培地で発酵された実施例２よりも若干高い寿命延長作用を有することが確認された。
【００５５】
以上より、本発明の発酵代謝物が、非常に高い抗糖化作用及び寿命延長作用があることが確認された。寿命延長作用は、種々の作用機序により実現すると考えられるが、作用機序の一つとして、抗糖化作用が関与していると考えられる。また、その他、抗酸化、チロシナーゼ阻害活性、コラゲナーゼ阻害活性、リパーゼ阻害活性、アンジオテンシン変換酵素阻害活性等が関与していると考えられている。
【００５６】
また、実施例１は豆乳、実施例２は牛乳を含む培地をそれぞれ用いたが、牛乳と同様の組成を有する山羊乳、めん羊乳を含む培地や、他の培地でＨ−６１株を発酵した発酵代謝物であっても、実施例１及び実施例２と同様の結果が得られることは明らかである。
【００５７】
さらに、本発明の発酵代謝物は、寿命延長作用及び抗糖化作用を有することから、これらに関連する老化抑制作用を有すると言える。
【００５８】
（考察）
特許文献１を参照し、上記Ｈ−６１株の生菌体及び死菌体には、骨密度減少抑制作用、皮膚潰瘍発生抑制作用、及びこれらに起因する老化抑制作用があることが報告されていた。この場合には、生菌体及び死菌体に共通して含まれる成分、すなわち、主に菌体を構成する蛋白質、核酸、その他の微量成分が腸管免疫等に作用し、上記作用を発現するものと考えられる。但し、特許文献１に係る骨密度減少抑制剤、皮膚潰瘍発生抑制剤及び老化抑制剤は、培養した上記Ｈ−６１株を集菌し、洗浄した菌体を用いているため（特許文献１  段落［0015］［0018］［0020］参照）、上記Ｈ−６１株が生成した発酵代謝物は実質的に含まれていないものと考えられる。
【００５９】
本発明においては、菌体を除去した発酵代謝物において、非常に高い抗糖化作用及び寿命延長作用が確認された。当然ながら、菌体と発酵代謝物では、含有している成分が大きく異なり、菌体では、主に菌体を構成するタンパク質、脂質等が含まれるのに対し、発酵代謝物では、主に、乳酸、各種アミノ酸が含まれる。したがって、本発明に係る発酵代謝物は、少なくとも菌体とは異なる機序により、顕著な抗糖化作用及び寿命延長作用を発揮するものと考えられる。したがって、本発明は、乳酸菌の発酵代謝物自体が老化抑制作用等を有するという、新たな知見を示すものである。
【図１】
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