(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で所定の非天然標的に結合することができ、ヒトリポカリン２（Ｌｃｎ２、ｈＮＧＡＬ）に由来する突然変異タンパク質の生成方法であって、
ヒトＬｃｎ２タンパク質をコードする核酸分子を、配列番号４４のヒトＬｃｎ２の直鎖状ポリペプチド配列における配列位置９６、１００、及び１０６に対応する配列位置をコードするヌクレオチドトリプレットで突然変異誘発させ、さらに、前記核酸分子を、ｈＬｃｎ２の直鎖状ポリペプチド配列における配列位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、１０３、１２５、１２７、１３２及び１３４のいずれかをコードする少なくとも１２、１３、１４、１５、１６又は１７全てのヌクレオチドトリプレットで突然変異誘発させて、１つ又はそれ以上の突然変異タンパク質核酸分子を生じるステップ（ａ）と、
前記ステップ（ａ）で得られた１つ以上の突然変異タンパク質核酸分子を適切な発現系で発現させるステップ（ｂ）と、
所定の標的に対して検出可能な結合親和性を有する１つ又はそれ以上の突然変異タンパクを、選択及び／又は単離によって濃縮するステップ（ｃ）と、を備えている方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、
前記突然変異タンパク質は、ヒトＬｃｎ２の直鎖状ポリペプチド配列における配列位置１３７及び１４５に対応する配列位置のいずれかで突然変異したアミノ酸残基を備えていない方法。
【請求項３】
ヒトＬｃｎ２タンパク質由来の突然変異タンパク質において、
配列番号３９（Ｓ１−Ａ４）、配列番号４１（ＵＳ７）、配列番号４３（Ｈ１−Ｇ１）、配列番号５０（Ｈ１ＧＡ）又は配列番号５２（Ｈ１ＧＶ）の配列を有する突然変異タンパク質。
【請求項４】
ヒトＬｃｎ２タンパク質由来の突然変異タンパク質において、
配列番号２０（Ｎ７Ａ）又は配列番号２２（Ｎ７Ｅ）又は配列番号２４（Ｎ９Ｂ）又は配列番号２６（Ｎ１０Ｄ）の配列を有する突然変異タンパク質。
【請求項５】
請求項３又は４の突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を備えている核酸分子。
【請求項６】
請求項５の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項７】
請求項３又は４の突然変異タンパク質の産生方法であって、
前記突然変異タンパク質、前記突然変異タンパク質のフラグメント、又は前記突然変異タンパク質と他のポリペプチドとの融合タンパク質は、遺伝子工学的方法によって、前記突然変異タンパク質をコードする核酸から産生される方法。
【請求項８】
請求項３又は４の突然変異タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項９】
医薬組成物の製造のための配列番号３９（Ｓ１−Ａ４）、配列番号４１（ＵＳ７）又は配列番号５０（Ｈ１ＧＡ）の配列を有する突然変異タンパク質の使用。
【請求項１０】
請求項９の使用において、
前記医薬組成物は、神経変性疾患の治療に用いられる突然変異タンパク質の使用。
【請求項１１】
請求項３又は４の突然変異タンパク質を含む診断又は分析キット。
【請求項１２】
配列番号３９（Ｓ１−Ａ４）、配列番号４１（ＵＳ７）又は配列番号５０（Ｈ１ＧＡ）の配列を有する突然変異タンパク質の有効量を非ヒト哺乳類に投与することを含む神経変性疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、突然変異タンパク質を生成するための新規ライブラリに関し、さらにヒトリポカリン２（Ｌｃｎ２、ｈＮＧＡＬ）及び検出可能な親和性で所定の標的に結合する関連タンパク質に由来する新規突然変異タンパク質に関する。また、本発明は、そのような突然変異タンパク質のコードに対応するする核酸分子に関し、さらにそれらを生成する方法に関する。本発明は、さらにそのような突然変異タンパク質を製造する方法に関する。さらに、本発明は、リポカリン突然変異タンパク質を含む医薬組成物に関するとともに、その突然変異タンパク質の様々な使用に関する。
【０００２】
本発明によるＬｃｎ２突然変異タンパク質は、それぞれの疾患領域において治療及び／又は診断試薬としての可能性を示す。例えば、それらは、アルツハイマー病におけるアミロイドベータペプチドのような天然生体分子の病理学的な形に結合して枯渇するのに役立つ可能性がある。他の例において、それらは、腫瘍新生血管と関連するフィブロネクチンのエキストラドメインＢのような疾患関連細胞表面マーカーを様々なラベル又は毒素の特異的な標的にすることに用いられる。本発明によって得られるＬｃｎ２突然変異タンパク質の特有な利点に従って、様々な他の応用又は例が可能である。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、高齢者人口おける認知症の中で最もよくある疾患である。ＡＤに関連付けると、アミロイド前駆体タンパクの不完全な処理によって、４０−４２残基が含まれるアミロイドベータペプチド（Ａβ）の潜在的な神経毒を生じさせる。その後、Ａβのオリゴマー及び長い原線維への凝集は、老人斑の形成に至る疾患の経過に極めて重要な影響を与える（非特許文献１）。ＡＤがますます重要となるにもかかわらず、認知症の効果的な治療、予防、治癒、又は軽減に対する要求は依然として満たされていない。
【０００４】
現在の抗アミロイドのアプローチは、（ｉ）Ａβの形成を予防することと、（ｉｉ）Ａβの凝集を遮断することと、（ｉｉｉ）脳における可溶性Ａβレベルを減少させることと、（ｉｖ）既存のアミロイド斑を分解させることとを目的とする。これまで、ＡＤ患者の能動免疫付与及び受動免疫付与を含む免疫療法は、この分野で最も有望になっている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。しかし、ＡＤ患者の能動免疫付与による最近の臨床試験は、６％の患者に髄膜脳炎を発症するために中止された。これらのＦｃ−介在の免疫学的機能による潜在的副作用のために、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）のような非免疫グロブリン（ｎｏｎ−Ｉｇ）結合試薬は、別の代替薬として提供されている。アミロイドベータに対して特異性を有するアフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子の同定は、遺伝子工学的ｎｏｎ−Ｉｇ結合タンパク質の将来性を説明するための一例である（非特許文献５、非特許文献６）。
【０００５】
しかし、アフィボディの細菌起源は、ヒト患者における免疫原性の問題を引き起こす可能性がある。
【０００６】
フィブロネクチン（ＦＮ）は、細胞の接着、移動、増殖、及び分化に極めて重要な役割を果たす。ＦＮは、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型の多重ドメインを有する、大規模なモジュラー二量体の糖タンパク質である。ＦＮの代替スプライスバリアント、例えばＦＮｉｎ７とＦＮｉｎ８ドメインの間に組み込まれるＦＮのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）は、組織特異的に且つ発達段階依存的に表現される（非特許文献７）。
【０００７】
ＥＤ−Ｂは、創傷治癒及び腫瘍性血管新生の期間を除いて、正常成人組織に存在していない。従って、ＥＤ−Ｂを含有するフィブロネクチンは、新血管形成を誘導し、且つ、異常血管形成を受ける多くの異なる腫瘍型において多量に発現される。血管形成におけるＥＤ−Ｂの実際的な生物学的機能は依然として分かりにくい一方、そのＦＮへの取り込みは腫瘍形成のための優れるマーカーとして機能する。一般的に、悪性組織と健全組織との差別は、薬物を腫瘍組織に直接運ぶ選択的な標的として、局所薬物濃度の増加につながる有利な治療方針である。
【０００８】
特異的に検出してＥＤ−Ｂを標的にするために、ファージディスプレイ抗体テクノロジーを用いて、組み換え抗体を増加させる。単離抗体フラグメントの１つとして、Ｌ１９一本鎖Ｆｖがある（非特許文献８、非特許文献９）。効果的な細胞毒性薬と組み合わせてＬ１９でＥＤ−Ｂをアドレスすることは、現在、癌の治療及び診断への見込みを示している（非特許文献１０、非特許文献１１）。
【０００９】
しかし、Ｌ１９のｓｃＦｖフラグメントは、オリゴマー化される傾向がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈａａｓｓ ａｎｄ Ｓｅｌｋｏｅ （２００７） Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８， １０１−１１２
【非特許文献２】Ｄｏｄｅｌ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２， ２１５−２２０
【非特許文献３】Ｌｉｃｈｔｌｅｎ ａｎｄ Ｍｏｈａｊｅｒｉ （２００７） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． １０４， ８５９−８７４
【非特許文献４】Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｈｏｌｔｚｍａｎｎ （２００８） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ３１， １７５−１９３
【非特許文献５】Ｇｒｏｎｗａｌｌ ｅｔ ａｌ （２００７） Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２８， １６２−１８３
【非特許文献６】Ｈｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０５， ５０９９−５１０４
【非特許文献７】Ｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ ６， ２３３７−２３４２
【非特許文献８】Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６８, ３９７−４０５
【非特許文献９】Ｅｂｂｉｎｇｈａｕｓ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｃｕｒｒ． Ｐｈａｒｍ． Ｄｅｓ． １０, １５３７−１５４９
【非特許文献１０】Ｓｃｈｌｉｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｎｅｒｉ （２００７） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １７７６, １７５−１９２
【非特許文献１１】Ｋａｓｐａｒ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １１８, １３３１−１３３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記のようにアルツハイマー病の治療、及び腫瘍の診断又は治療に存在する問題により、本発明の目的は、アルツハイマー病の治療、及び腫瘍の診断又は治療に用いられる代替方法及び化合物を提供することにある。
【００１２】
本発明者らは、リポカリン２に由来するタンパク質による特異的な突然変異タンパク質は、そのより高い安定性及びより小さいサイズにより魅力的な化合物になることを発見した。本発明者らは、例えば、ＥＤ−Ｂに対する高い親和性及び特異性を示す特異的な位置に突然変異性があるリポカリン２突然変異タンパク質の特異的なグループを同定した。そのようなＬｃｎ２突然変異タンパク質は、ヒト細胞にＥＤ−Ｂ含有フィブロネクチンを高感度で特異的に認識するので、腫瘍疾患の診断及び治療のための治療試薬とする見込みを示す。
【００１３】
本発明者らは、また、Ａβペプチドに対して高い親和性及び特異性を有する特異的なＬｃｎ２突然変異タンパク質を識別することができる。このようなＬｃｎ２突然変異タンパク質は、さらにＡβの凝集を抑制することができるので、更なる改善及び修飾の上で、ＡＤを治療するための治療試薬とする可能性の見込みを示す。
【００１４】
さらに、本発明は、またヒトＬｃｎ２骨格に基づく新たなランダムライブラリを説明する。そのランダムライブラリは、一般的に所定の標的に対して高い親和性及び特異性を有する本発明にかかる突然変異タンパク質のような突然変異タンパク質の効果的な生成を可能にする。そのようなライブラリ又はそのセクションの例は、図１及び図２に示される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
１つの実施形態において、ｈＬｃｎ２の直鎖状ポリペプチド配列における任意の配列位置３６、４０、４１、４９、５２６８、７０、７２７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２、及び１３４をコードする少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０のヌクレオチドトリプレットでは、ヌクレオチドトリプレットのサブセットによってこの位置における置換を可能にすることでランダム突然変異誘発を行う。ヌクレオチドトリプレットのサブセットは、（ａ）ヌクレオチドＮＮＮ（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの場合、４ｘ４ｘ４＝６４の可能なトリプレットということになる）によってコードされる６４の可能なトリプレット以内、（ｂ）ヌクレオチドＮＮＫ又はＮＮＳによってコードされる３２の可能なトリプレット以内、（ｃ）全ての２０天然タンパク質を構成するアミノ酸をコードするための必需トリプレット以内を参照することができるが、これに限定されるものではない。もう１つの実施形態において、システインをコードするヌクレオチドトリプレットは、突然変異誘発時の置換に用いられない。突然変異誘発は、すでに元の突然変異しない配列に含まらなかった新たなシステインを持つ突然変異タンパク質につながるものではないことを意味する。従って、この実施形態において、この段落に特定される突然変異しようとする位置に導入すべきヌクレオチドトリプレットがどのように見えるかということは特定される（また、実施例１及び図２を参照）。
【００１６】
従って、本発明の第１の態様には、ヒトリポカリン２（Ｌｃｎ２、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ｈＮＧＡＬ、又はシデロカリンとしても知られている）に由来する突然変異タンパク質の生成方法を対象にする。この方法で得られる突然変異タンパク質は、検出可能な親和性を有する非天然標的に結合することができる。この方法は、ヒトリポカリン２（Ｌｃｎ２、ｈＮＧＡＬ）をコードする核酸分子を、ヒトリポカリン２の直鎖状ポリペプチド配列における配列位置９６、１００、及び１０６に対応する配列位置のうちのいずれかの少なくとも１つをコードするヌクレオチドトリプレットで、突然変異誘発させることを含み、結果として１つ又はそれ以上の突然変異タンパク質核酸分子となる方法である。
【００１７】
上述に従って、「ヒトリポカリン２」又は「ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）」という用語は、約６０％以上のアミノ酸配列相同性又は配列同一性を有する、他の種由来の、既に同定された又はまだ単離されていない構造的ホモログを含む。好ましくは、上述のこれらのヒトリポカリンは、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列における配列位置３３、３６、４０、４１、４２４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２５４、５５、５９、６５、６８、７０、７２７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８６、８７、９８、９６、９９、１００、１０３、１０６、１０７、１１０、１１１、１２５、１２７、１３２、１３４、１３６、及び１３８に対応する配列位置のいずれか１つにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２１３、１４、１５、１６、又は１７の突然変異したアミノ酸残基を含む。「相同性」という用語は本明細書に使用される場合、その通常の意味であり、また、互いに比較される２つのタンパク質の直鎖状アミノ酸配列における同等の位置における、同一のアミノ酸、及び同類置換と見なされるアミノ酸（例えば、グルタミン酸残基のアスパラギン酸残基による置換）を含む。「配列同一性」又は「同一性」という用語は本発明に使用される場合、問題になっている配列と本発明のポリペプチドの配列の相同性アラインメントに従った、これら２つの配列のより長いものにおける残基数について、ペアワイズ同一残基の割合を意味する。
【００１８】
配列相同性又は配列同一性の割合は、本明細書ではプログラムＢＬＡＳＴＰ、ｖｅｒｓｉｏｎ ｂｌａｓｔｐ ２．２．５（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １６、２００２、 ｃｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５、３３８９−３４０２を参照）を用いて決定される。相同性の割合は、ペアワイズ比較の参照としてヒトポカリン２を用いた、プロペプチド配列を含む全ポリペプチド配列のアラインメントに基づく（マトリックス:ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップコスト:１１．１、切り捨て値を１０〜３に設定）。それは、ＢＬＡＳＴＰプログラムアウトプットでの結果として示される「陽性」（相同アミノ酸）の数を、アラインメントのためにプログラムによって選択されたアミノ酸の総数で除した割合として計算される。これに関して、この選択されたアミノ酸の総数はヒトリポカリン２の長さとは異なり得ることに注意すべきである。
【００１９】
ヒトリポカリン２以外のタンパク質が本発明に使用される場合、ヒトリポカリン２に対して与えられた突然変異した配列位置の定義は、公開されている配列アラインメント又は当業者に利用可能なアラインメント方法を用いて、他のリポカリンに割り当てることができる。配列アラインメントは、例えば、Ｒｅｄｌ， Ｂ． （２０００） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４８２， ２４１−２４８の図１におけるもののように、公開されているアラインメントを用いて、ＷＯ９９／１６８７３（その中の図３を参照）に説明されるように実施され得る。リポカリンの三次元構造が利用可能な場合、本発明の突然変異誘発の対象となるべきこれらの配列位置の決定のために、構造の重ね合わせもまた使用され得る。多次元核磁気共鳴分光法のような他の構造解析の方法もまた、この目的のために使用され得る。
【００２０】
ヒトリポカリン２のホモログはまた、アミノ酸置換が本発明において選択された位置以外の位置に導入されたヒトリポカリン２自体の突然変異タンパク質であり得る。例えば、このような突然変異タンパク質は、タンパク質の溶解性又は安定性を増加させるために、β−バレルの溶媒に露出した表面の位置がヒトリポカリン２の野生型配列と比較して突然変異されたタンパク質であり得る。
【００２１】
一般的に、「ヒトリポカリン２」という用語は、ヒトヒトリポカリン２と比較して６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％以上の配列相同性又は配列同一性を有するすべてのタンパク質を含む。好ましくは、上述のこれらのヒトリポカリンは、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列における配列位置３３、３６、４０、４１、４２４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２５４、５５、５９、６５、６８、７０、７２７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８６、８７、９８、９６、９９、１００、１０３、１０６、１０７、１１０、１１１、１２５、１２７、１３２、１３４、１３６及び１３８に対応する配列位置のいずれか１つにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２１３、１４、１５、１６、又は１７の突然変異したアミノ酸残基を含む。
【００２２】
従って、更なる態様において、本発明はヒトリポカリン２（例えば、ヒトリポカリン突然変異タンパク質又は突然変異したヒトリポカリン、突然変異した成熟ｈＮＧＡＬがあり、ここで、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ データ Ｂａｎｋ受入番号Ｐ８０１８８、さらに好ましくは配列番号４４に示すアミノ酸配列を有する上記成熟ｈＮＧＡＬがある）に由来する突然変異タンパク質を提供している。この突然変異タンパク質は、ヒトＬｃｎ２の直鎖状ポリペプチド配列における配列位置９６、１００、及び１０６に対応する配列位置のいずれか１つでの少なくとも１つ又は二つの突然変異したアミノ酸残基を含み、ここで、その突然変異タンパク質は検出可能な親和性を有する所定の非天然標的に結合する。
【００２３】
本明細書に使用される場合、「突然変異タンパク質」、「突然変異した」実体（タンパク質か核酸か）又は「突然変異体」は、それぞれ、天然に存在する（野生型）核酸又はタンパク質「参照」骨格と比べて、１つ又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を言及する。好ましくは、置換、欠失、又は挿入されるヌクレオチド又はアミノ酸の数は、それぞれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上の２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０。
【００２４】
「ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン」、「ｈＮＧＡＬ」、「リポカリン２」、又は「Ｌｃｎ２」という用語は本発明に使用される場合、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ データ Ｂａｎｋ受入番号Ｐ８０１８８（ここで、配列番号４４として例示される）で供託された成熟ｈＮＧＡＬを言及する。
【００２５】
この状況において、本発明は、既定の標的に対して十分な親和結合を有する突然変異タンパク質を提供するこれらの上記３つの配列位置における１つ又はそれ以上の位置において、ヒトリポカリン２、ラット２−ミクログロブリン−関連タンパク質（Ａ２ｍ）、及びマウス２４ｐ３／ｕｔｅｒｏｃａｌｉｎ（２４ｐ３）を突然変異誘発をさせるという大変驚くべき発見に基づくことが知られている。ここで、上記既定の標的は、ペプチド、タンパク質、タンパク質のフラグメント又はドメイン、及び有機小分子が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
所定の標的は、任意の所望非天然標的／リガンドであってもよい。一実施形態において、「非天然リガンド」という用語は、生理的条件下で天然成熟ｈＮＧＡＬに結合しない化合物を言及する。
【００２７】
「有機分子」又は「有機小分子」という用語は、非天然標的のために本明細書に使用される場合、少なくとも２の炭素原子、好ましくは７又は１２以下の回転可能な炭素結合を含み、１００ダルトン〜２０００ダルトン、好ましくは１００ダルトン〜１０００ダルトンの範囲に分子量を有し、選択的に１又は２の金属原子を含む有機分子を意味する。
【００２８】
「ペプチド」という用語は、非天然標的のために本明細書に使用される場合、２〜４５のアミノ酸を有するジペプチド又はオリゴペプチドをいう。一実施形態において、このペプチドは、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０のアミノ酸残基を有する。このペプチドは、天然に存在するペプチド又は合成ペプチドであってもよく、また、２０の天然に存在するＬ−アミノ酸を除いて、Ｄ−アミノ酸、非天然に存在するアミノ酸、及びアミノ酸類似体を含んでもよい。一実施形態において、このペプチドはアミロイドベータペプチド（Ａｂｅｔａ又はＡβ）である。もう１つの実施形態において、このアミロイドベータペプチドはＡβ４０ペプチド又はＡβ４２ペプチドである。
【００２９】
一実施形態において、この有機小分子は、免疫学的ハプテンの特性を示す化合物である。
【００３０】
一実施形態において、タンパク質であるこの非天然標的は、フィブロネクチン又はそのドメインであり、例えば、ＥＢ−ドメイン又はＥＢ−ドメインのフラグメントである。
【００３１】
本発明にかかるヒトリポカリン２突然変異タンパク質は、突然変異したアミノ酸配列位置の外側に野生型（天然）アミノ酸配列を含んでもよい。他方、本明細書に開示されるリポカリン突然変異タンパク質は、さらにその突然変異が突然変異タンパク質の結合親和性及び折り畳みを妨げない限り、突然変異誘発を受ける配列位置の外側にもアミノ酸の突然変異を含んでもよい。このような突然変異は、確立された標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ クローニング: Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照）を用いてＤＮＡレベルで非常に容易に達成されることができる。可能なアミノ酸配列の改変は、挿入又は欠失並びにアミノ酸置換である。このような置換は保存的であってもよく、すなわち、アミノ酸残基は化学的に類似したアミノ酸残基で置換される。保存的置換の例としては、以下の群のメンバー間、すなわち、１）アラニン、セリン、及びトレオニン、２）アスパラギン酸及びグルタミン酸、３）アスパラギン及びグルタミン、４）アルギニン及びリジン、５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びバリン、ならびに６）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンの間での置換である。他方では、アミノ酸配列に非保存的な改変を導入することも可能である。さらに、単一アミノ酸残基を置換する代わりに、ヒトリポカリン２の一次構造の１又はそれ以上の連続的なアミノ酸を挿入するか、それとも欠失させることは、さらに、この欠失又は挿入が安定して折り畳まれた／機能的な突然変異タンパク質を生じさせる限りにおいては可能である。
【００３２】
概説として、アミノ酸配列のこのような修飾は、特定の制限酵素に対し切断部位を組み込むことによって、突然変異したリポカリン遺伝子又はその一部のサブクローン化を単純化するために、単一アミノ酸位置の定方向の突然変異誘発を含む。さらに、これらの突然変異は所定の標的に対するリポカリン突然変異タンパク質の親和性をさらに改善するために、さらに組み込まれることができる。さらに、突然変異は必要に応じて、折り畳みの安定性、血清安定性、タンパク質の耐性、若しくは水溶解性を改善する目的、又は凝集傾向を低減する目的のような突然変異タンパク質の特定の特徴を調節する目的で導入されることができる。例えば、ジスルフィド架橋を防止するために、天然に存在するシステイン残基を他のアミノ酸に突然変異してもよい。しかしながら、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ビオチン、ペプチド又はタンパク質のような化合物に接合する目的、又は非天然に存在するジスルフィド結合を形成する目的で新しい反応基を導入するために、他のアミノ酸配列位置をシステインに意図的に突然変異させることはさらに可能である。システイン残基をヒトリポカリン２突然変異タンパク質の変異タンパク質におけるアミノ酸配列に導入するための、このような突然変異の例示的な可能性は、少なくともｈＮＧＡＬの野生型配列における配列位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６又は１５８に対応する配列位置の１つにシステイン（Ｃｙｓ）残基を導入することを含む。アミノ酸位置アミノ酸位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６、及び／又は１５８のいずれかの側で産生されたチオール部分は、変異タンパク質をＰＥＧ化又はＨＥＳ化するために、例えば各々のヒトリポカリン２突然変異タンパク質の血清半減期を増加させるために用いてもよい。
【００３３】
一実施形態において、本発明にかかる突然変異タンパク質は、ヒトリポカリン２の直鎖状ポリペプチド配列における配列位置９６、１００、及び１０６に対応する配列位置のいずれか二つ又は三つにおいて突然変異したアミノ酸残基を含む。
【００３４】
本発明の更なる実施形態において、突然変異タンパク質は、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列における配列位置３３、３６、４０、４１、４２４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２５４、５５、５９、６５、６８、７０、７２７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８６、８７、９８、９６、９９、１００、１０３、１０６、１０７、１１０、１１１、１２５、１２７、１３２、１３４、１３６、及び１３８に対応する配列位置のいずれかにおいて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７の突然変異したアミノ酸残基を含む。更なる実施形態において、突然変異タンパク質は、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列における配列位置３３、３６、４０、４１、４２４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２５４、５５、５９、６５、６８、７０、７２７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８６、８７、９８、９６、９９、１００、１０３、１０６、１０７、１１０、１１１、１２５、１２７、１３２、１３４、１３６、及び１３８の少なくとも１つにおいて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７の突然変異したアミノ酸残基を含む。また、更なる実施形態において、突然変異タンパク質は、直鎖状ポリペプチド配列における配列位置３３、３６、４０、４１、４２４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２５４、５５、５９、６５、６８、７０、７２７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８６、８７、９８、９６、９９、１００、１０３、１０６、１０７、１１０、１１１、１２５、１２７、１３２、１３４、１３６、及び１３８の少なくとも１つにおいて、ヒトリポカリン２１８、１９、又は２０の突然変異したアミノ酸残基を含む。
【００３５】
本発明の一実施形態において、突然変異タンパク質は、少なくとも上記に挙げられた配列位置の１０、１４、１５、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３５又は全ての４５いずれかにおいて突然変異したアミノ酸残基を含む。
【００３６】
アミロイドベータペプチドに結合して、Ａβ４０ペプチド又はＡβ４２ペプチドのような本発明の突然変異タンパク質は、図１７（Ｌｃｎ２）に示される成熟ヒトリポカリン２の野生型アミノ酸配列について少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２のアミノ酸置換を含んでもよい。そのアミノ酸置換は、Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ又はＣｙｓ、Ａｌａ４０→Ｔｙｒ又はＬｙｓ又はＶａｌ、Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ又はＳｅｒ又はＬｅｕ、Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ又はＴｒｐ、Ｌｅｕ７０→Ｇｌｙ、Ａｒｇ７２→Ｇｌｙ又はＡｓｐ、Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ又はＴｈｒ又はＡｓｐ、Ａｓｐ７７→Ａｓｎ又はＨｉｓ又はＬｅｕ、Ｔｒｐ７９→Ｌｙｓ、Ａｓｎ９６→Ｈｅ又はＡｒｇ、ＴｙｒｌＯＯ→Ｇｉｎ又はＡｒｇ又はＧｌｕ、Ｌｅｕｌ０３→Ｍｅｔ又はＡｒｇ又はＧｌｙ、Ｔｙｒｌ０６→Ｔｙｒ又はＡｌａ又はＴｒｐ、Ｌｙｓ１２５→Ｔｈｒ又はＶａｌ又はＧｌｕ、Ｓｅｒｌ２７→Ｇｌｙ又はＧｉｎ又はＡｌａ、Ｔｙｒ１３２→Ｍｅｔ又はＳｅｒ又はＴｈｒ、並びに、Ｌｙｓ１３４→Ａｓｎを含むが、これに限定されるものではない。また、このような突然変異タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのＡβ凝集を減少させることができる。上述の突然変異タンパク質は、Ａβ、好ましくはＡβ４０に結合してその凝集を抑制し、より好ましくは実施例１１に定めるような検定条件（好ましくは突然変異タンパク質:Ａβ４０は比率１:１０である）で行うことが分かる。本発明は、さらに突然変異タンパク質ＵＳ７と比べて同等の生物学的機能を有する前記のような突然変異タンパク質に関する。「同等の生物学的機能」は、これらの突然変異タンパク質は、およそ４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、２．５％、２％又は１％以下のＵＳ７に対する凝集阻害活性の偏差で、例えば、実施例１１に設定される条件（好ましくは、突然変異タンパク質:Ａβ４０の比例は１:１０である）と同じ又は一致する条件において、Ａβ、好ましくはＡβ４０に結合して阻害することができることを意味する。本発明は、さらにアルツハイマー病のような神経変性疾患の治療又は予防に用いられる上述の突然変異タンパク質に関する。
【００３７】
一実施形態において、アミロイドベータペプチド、例えばＡβ４０ペプチド又はＡβ４２ペプチドに結合する本発明にかかる突然変異タンパク質は、Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ、Ａｌａ４０→Ｔｙｒ、Ｉｌｅ４１→Ｔｈｒ、Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ、Ｌｅｕ７０→Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７３→Ｌｅｕ、Ａｓｐ７７→Ａｓｎ、Ｔｒｐ７９→Ｌｙｓ、Ａｓｎ９６→Ｈｅ、ＴｙｒｌＯＯ→Ｇｉｎ、Ｌｅｕｌ０３→Ｍｅｔ、Ｌｙｓｌ２５→Ｔｈｒ、Ｓｅｒｌ２７→Ｇｌｙ、Ｔｙｒｌ３２→Ｍｅｔ、及びＬｙｓ１３４→Ａｓｎのアミノ酸置換を含む。そのようなアミノ酸置換が含まれる突然変異タンパク質の例は、図１７に示されるＳ１−Ａ４（配列番号:３９）がある。
【００３８】
更なる実施形態において、アミロイドベータペプチド、例えばＡβ４０ペプチド又はＡβ４２ペプチドに結合する本発明にかかる突然変異タンパク質は、Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ、Ａｌａ４０→Ｌｙｓ、Ｉｌｅ４１→Ｓｅｒ、Ｇｌｎ４９→Ｔｒｐ、Ｌｅｕ７０→Ｇｌｙ、Ａｒｇ７２→Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７３→Ｔｈｒ、Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ、Ｔｒｐ７９→Ｌｙｓ、Ａｓｎ９６→Ａｒｇ、ＴｙｒｌＯＯ→Ａｒｇ、Ｌｅｕｌ０３→Ａｒｇ、Ｔｙｒｌ０６→Ａｌａ、Ｌｙｓｌ２５→Ｖａｌ、Ｓｅｒｌ２７→Ｇｉｎ、Ｔｙｒｌ３２→Ｓｅｒ、及びＬｙｓｌ３４→Ａｓｎのアミノ酸置換を含む。そのようなアミノ酸置換が含まれる突然変異タンパク質の例は、図１７に示されるＵＳ７（配列番号:４１）がある。
【００３９】
本発明は、また本明細書に記載されるように、突然変異した成熟ｈＮＧＡＬリポカリン（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ データ Ｂａｎｋ受入番号Ｐ８０１８８の寄託のように、好ましくは配列番号:４０に示すアミノ酸配列を有する）は、野生型ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列における位置３６、４０、４１、４９、７０、７２７３、７７、７９、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２、１３４に対応する位置に１つ又はそれ以上の突然変異したアミノ酸を含むことが想定される。
【００４０】
もう１つの実施形態において、アミロイドベータペプチド、例えばＡβ４０ペプチド又はＡβ４２ペプチドに結合する本発明にかかる突然変異タンパク質は、Ｌｅｕ３６→Ｃｙｓ、Ａｌａ４０→Ｖａｌ、Ｉｌｅ４１→Ｌｅｕ、Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ、Ｌｅｕ７０→Ｇｌｙ、Ａｒｇ７２→Ａｓｐ、Ｌｙｓ７３→Ａｓｐ、Ａｓｐ７７→Ｌｅｕ、Ｔｒｐ７９→Ｌｙｓ、Ａｓｎ９６→Ａｒｇ、ＴｙｒｌＯＯ→Ｇｌｕ、Ｌｅｕｌ０３→Ｇｌｙ、Ｔｙｒｌ０６→Ｔｒｐ、Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｕ、Ｓｅｒｌ２７→Ａｌａ、Ｔｙｒｌ３２→Ｔｈｒ、及びＬｙｓ１３４→Ａｓｎのアミノ酸置換を含む。そのようなアミノ酸置換が含まれる突然変異タンパク質の例は、図１７に示されるＨｌ−Ｇｌ（配列番号:４３）がある。
【００４１】
もう１つの実施形態において、アミロイドベータペプチド、例えばＡβ４０ペプチド又はＡβ４２ペプチドに結合する本発明にかかる突然変異タンパク質は、Ｌｅｕ３６→Ａｌａ、Ａｌａ４０→Ｖａｌ、Ｉｌｅ４１→Ｌｅｕ、Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ、Ｌｅｕ７０→Ｇｌｙ、Ａｒｇ７２→Ａｓｐ、Ｌｙｓ７３→Ａｓｐ、Ａｓｐ７７→Ｌｅｕ、Ｔｒｐ７９→Ｌｙｓ、Ａｓｎ９６→Ａｒｇ、ＴｙｒｌＯＯ→Ｇｌｕ、Ｌｅｕｌ０３→Ｇｌｙ、Ｔｙｒｌ０６→Ｔｒｐ、Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｕ、Ｓｅｒｌ２７→Ａｌａ、Ｔｙｒｌ３２→Ｔｈｒ、及びＬｙｓ１３４→Ａｓｎのアミノ酸置換を含む。そのようなアミノ酸置換が含まれる突然変異タンパク質の例は、配列番号:５０に示されるＨ１ＧＡがある。
【００４２】
本明細書に記載される上記の突然変異タンパク質は、Ａβ、好ましくはＡβ４０に結合してその凝集を抑制することが好ましく、より好ましくは実施例２３に定める検定条件（好ましくはＡβ４０:Ｈ１ＧＡの比率は１０:２である）で行う。本発明は、さらに突然変異タンパク質Ｈ１ＧＡと比べて同等の生物学的機能を有する前記のような突然変異タンパク質に関する。「同等の生物学的機能」は、これらの突然変異タンパク質は、およそ４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、２．５％、２％又は１％以下のＨ１ＧＡに対する凝集阻害活性の偏差で、例えば、実施例２３に設定される条件（好ましくはＡβ４０:Ｈ１ＧＡの比例は１０:２である）と同じ又は一致する条件において、Ａβ、好ましくはＡβ４０に結合して阻害することができることを意味する。本発明は、さらにアルツハイマー病のような神経変性疾患の治療又は予防に用いられる上述の突然変異タンパク質に関する。
【００４３】
もう１つの実施形態においてアミロイドベータペプチド、例えばＡβ４０ペプチド又はＡβ４２ペプチドに結合する本発明にかかる突然変異タンパク質は、Ｌｅｕ３６→Ｖａｌ、Ａｌａ４０→Ｖａｌ、Ｉｌｅ４１→Ｌｅｕ、Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ、Ｌｅｕ７０→Ｇｌｙ、Ａｒｇ７２→Ａｓｐ、Ｌｙｓ７３→Ａｓｐ、Ａｓｐ７７→Ｌｅｕ、Ｔｒｐ７９→Ｌｙｓ、Ａｓｎ９６→Ａｒｇ、ＴｙｒｌＯＯ→Ｇｌｕ、Ｌｅｕｌ０３→Ｇｌｙ、Ｔｙｒｌ０６→Ｔｒｐ、Ｌｙｓ１２５→Ｇｌｕ、Ｓｅｒｌ２７→Ａｌａ、Ｔｙｒｌ３２→Ｔｈｒ、及びＬｙｓ１３４→Ａｓｎのアミノ酸置換を含む。そのようなアミノ酸置換が含まれる突然変異タンパク質の例は、配列番号:５２に示されるＨＩＧＶがある。
【００４４】
本明細書に記載される上記の突然変異タンパク質は、実施例２１に定める検定条件でＡβ４０に結合することが好ましい本発明は、さらに突然変異タンパク質ＨＩＧＶと比べて同等の生物学的機能を有する前記のような突然変異タンパク質に関する。「同等の生物学的機能」は、これらの突然変異タンパク質は、およそ４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、２．５％、２％又は１％以下のＨＩＧＶに対する凝集阻害活性の偏差で、例えば実施例２１に設定される条件と同じ又は一致する条件において、Ａβ、好ましくはＡβ４０に結合して阻害することができることを意味する。本発明は、さらにアルツハイマー病のような神経変性疾患の治療又は予防に用いられる上述の突然変異タンパク質に関する。
【００４５】
更なる実施形態において、エキストラドメインＢ又はそのフラグメントに結合する本発明にかかる突然変異タンパク質は、Ｌｅｕ３６→Ｌｙｓ、Ａｌａ４０→Ｈｉｓ、Ｉｌｅ４１→Ａｓｐ、Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ、Ｔｙｒ５２→Ｇｉｎ、Ｓｅｒ６８→Ａｓｎ、Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ、Ａｒｇ７２→Ｖａｌ、Ｌｙｓ７３→Ｈｉｓ、Ａｓｐ７７→Ａｓｎ、Ｔｒｐ７９→Ａｒｇ、Ａｒｇ８１→Ｔｒｐ、ＴｙｒｌＯＯ→Ｔｒｐ、Ｔｙｒｌ０６→Ｔｒｐ、Ｌｙｓ１２５→Ａｒｇ、Ｓｅｒｌ２７→Ｔｙｒ、Ｔｙｒｌ３２→Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１３４→Ｇｌｕ、及びＳｅｒｌ４６→Ａｓｎのアミノ酸置換を含む。そのようなアミノ酸置換が含まれる突然変異タンパク質の例は、図１７に示されるＮ７Ａ（配列番号:２０）がある。
【００４６】
もう１つの実施形態において、エキストラドメインＢ又はそのフラグメントに結合する本発明にかかる突然変異タンパク質は、Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ、Ａｌａ４０→Ｍｅｔ、Ｉｌｅ４１→Ａｒｇ、Ｇｌｎ４９→Ａｌａ、Ｔｙｒ５２→Ｖａｌ、Ｓｅｒ６８→Ｌｙｓ、Ｌｅｕ７０→Ｍｅｔ、Ａｒｇ７２→Ｇｉｎ、Ｌｙｓ７３→Ａｒｇ、Ａｓｐ７７→Ｌｙｓ、Ｔｒｐ７９→Ｍｅｔ、Ａｒｇ８１→Ａｓｎ、Ａｓｎ９６→Ａｌａ、ＴｙｒｌＯＯ→Ｐｒｏ、Ｌｅｕｌ０３→Ｐｒｏ、Ｔｙｒｌ０６→Ｔｈｒ、Ｌｙｓｌ２５→Ｈｉｓ、Ｓｅｒｌ２７→Ｐｈｅ、及びＬｙｓｌ３４→Ｈｉｓのアミノ酸置換を含む。そのようなアミノ酸置換が含まれる突然変異タンパク質の例は、図１７に示されるＮ９Ｂ（配列番号:２４）がある。
【００４７】
もう１つの実施形態において、エキストラドメインＢ又はそのフラグメントに結合する本発明にかかる突然変異タンパク質は、Ｌｅｕ３６→Ａｌａ、Ａｌａ４０→Ｔｈｒ、Ｅｅ４１→Ｔｒｐ、Ｇｌｎ４９→Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５２→Ｇｉｎ、Ｓｅｒ６８→Ａｓｎ、Ａｒｇ７２→Ｍｅｔ、Ｌｙｓ７３→Ｓｅｒ、Ａｓｐ７７→Ａｒｇ、Ｔｒｐ７９→Ｍｅｔ、Ａｒｇ８１→Ｈｉｓ、Ａｓｎ９６→Ｓｅｒ、ＴｙｒｌＯＯ→Ｔｒｐ、Ｔｙｒｌ０６→Ｔｒｐ、Ｌｙｓｌ２５→Ａｒｇ、Ｓｅｒｌ２７→Ｔｙｒ、Ｔｙｒｌ３２→Ｐｈｅ、及びＬｙｓｌ３４→Ｇｌｙのアミノ酸置換を含む。そのようなアミノ酸置換が含まれる突然変異タンパク質の例は、図１７に示されるＮ１０（配列番号:２６）がある。
【００４８】
更なる実施形態において、エキストラドメインＢ又はそのフラグメントに結合する本発明にかかる突然変異タンパク質は、Ｌｅｕ３６→Ｇｌｕ、Ａｌａ４０→Ｓｅｒ、Ｉｌｅ４１→Ｌｅｕ、Ｇｌｎ４９→Ａｒｇ、Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ、Ｌｙｓ７３→Ｓｅｒ、Ａｓｐ７７→Ｈｉｓ、Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ、Ａｓｎ９６→Ｌｅｕ、ＴｙｒｌＯＯ→Ｌｙｓ、Ｌｅｕｌ０３→Ｈｉｓ、Ｔｙｒｌ０６→Ｐｈｅ、Ｌｙｓ１２５→Ｔｈｒ、Ｓｅｒｌ２７→Ａｌａ、及びＬｙｓ１３４→Ｐｈｅのアミノ酸置換を含む。そのようなアミノ酸置換が含まれる突然変異タンパク質の例は、図１７に示されるＮ７Ｅ（配列番号：２２）がある。
【００４９】
図１７に示されるような上記の突然変異タンパク質は、さらにアミノ酸置換を含むことができる。その突然変異タンパク質は、さらに、Ｇｌｎ２８→Ｈｉｓ又はＣｙｓ８７→Ｓｅｒが含まれるアミノ酸置換を含むことができるが、当該アミノ酸置換はＧｌｎ２８→Ｈｉｓ及びＣｙｓ８７→Ｓｅｒに限定されない。他の可能なアミノ酸置換は、Ｔｙｒ５２→ＧｉｎやＶａｌ、Ｓｅｒ６８→ＬｙｓやＡｓｎ、又はＡｒｇ８１→ＴｒｐｏｒＡｓｎやＨｉｓを含むことができるが、これに限定されるものではない。
【００５０】
本発明にかかるリポカリン突然変異タンパク質は、検出可能な親和性、例えば少なくとも２００ｎｍの解離定数（ＫＤ）を有する所望の非天然標的に結合することができる。もう１つの実施形態において、この突然変異タンパク質は、１μＭ以下のＫＤ、１００μＭ以下のＫＤ、１μＭ以下のＫＤ、５００ｎｍのＫＤ、２００ｎｍ以下のＫＤ、１００ｎｍ以下のＫＤ、５０ｎｍ以下のＫＤ、１０ｎｍ以下のＫＤ、又は１ｎＭ以下のＫＤを有する所定の非天然標的に結合する。もう１つの実施形態において、リポカリン突然変異タンパク質は、少なくとも１００、２０、１ｎＭ又はそれ以下の所定の標的に対する解離定数で所望の標的に結合する。突然変異タンパク質の所望の標的に対する結合親和性は、蛍光滴定、競合ＥＬＩＳＡ、又は表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）のような多数の方法によって測定することができる。
【００５１】
標的との複合体形成が結合相手の濃度、競合相手の存在、緩衝系のイオン強度などの多くの因子に依存することは、当業者に容易に発見される。選択及び濃縮は、一般的に、リポカリン突然変異タンパク質の分離が所望の標的と複合して、前述のような解離定数を有することが可能な条件下で行われる。しかしながら、洗浄及び溶出のステップは、可変のストリンジェンシ下で行うことができる。動的特性に関連する選択は同様に可能である。例えば、その選択は、標的からの遅い解離、又は言い換えると低いｋｏｆｆ速度が示される突然変異タンパク質と標的との複合体形成を助ける、複数の条件で行うことができる。また、その選択は、突然変異タンパク質と標的との間の速い複合体形成、又は言い換えると高いｋｏｎ速度を助ける複数の条件で行うことができる。
【００５２】
本発明にかかる突然変異タンパク質は、一般的に、単量体タンパク質として存在する。しかし、本発明のリポカリン突然変異タンパク質は自発的に二量化、又はオリゴマー化する可能性もある。安定な単量体を形成するリポカリン突然変異タンパク質の使用は、例えばさらに速い拡散と良好な組織浸透のためのいくつかの用途に好適にできるが、安定な同質二量体又は多量体を形成するリポカリン突然変異タンパク質の使用は、このような多量体が所定の標的に対する親和性及び／又は結合活性の（更なる）増加を提供できるため、その他の場合に有利になり得る。さらに、リポカリン突然変異タンパク質の低重合体の形成は、さらに遅い解離速度、又は長期の血清半減期を有することができる。
【００５３】
各々の突然変異タンパク質とそのリガンドとの間の複合体形成は、また、各々の結合相手の濃度、競合相手の存在、用いられる緩衝系のｐＨ及びイオン強度、及び解離定数ＫＤの測定に用いられる実験的方法（数例だけを挙げると、例えば蛍光滴定、競合ＥＬＩＳＡ、又は表面プラズモン共鳴）、又は実験データの評価に用いられる数学アルゴリズムのような多くの異なる因子によって影響されることは留意されるべきである。
【００５４】
従って、ＫＤ値（各々の突然変異タンパク質とその標的／リガンドとの間に形成される複合体の解離定数）は、特定の実験範囲内で変更してもよく、所定のリガンドに対する特定のリポカリンの突然変異タンパク質の親和性を決定するのに用いられる方法及び実験設定に依存することはさらに、当業者に明らかである。このことは、測定されたＫＤ値にわずかな偏差、若しくは例えば、ＫＤ値が表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって、又は、競合ＥＬＩＳＡによって決定されるかどうかに依存する許容範囲があり得ることを意味する。
【００５５】
一実施形態において、本明細書中に開示された突然変異タンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかで、ペンタヒスチジンタグ、ヘキサヒスチジンタグ、又はＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）という親和性標識に結合できることは留意すべきである。従って、本出願はさらに、このようなタグを有するすべての明確かつ一般的に記載される突然変異タンパク質を含む。
【００５６】
特性リポカリン突然変異タンパク質のフラグメントに関連して、本発明において用いられる用語「フラグメント」は、Ｎ末端及び／又はＣ末端で短縮された、すなわち、Ｎ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸のうちの少なくとも１つを欠失する全長の成熟Ｌｃｎ２から得られたタンパク質又はペプチドに関連する。このようなフラグメントは、成熟Ｌｃｎ２の一次配列である、好適には少なくとも１０個の、より好適には２０個の、最も好適には３０個以上のアミノ酸を含み、成熟Ｌｃｎ２の免疫測定において通常検出可能である。
【００５７】
本発明の範囲にさらに含まれるのが、上記の突然変異タンパク質であり、その免疫原性について変更されてきた。
【００５８】
細胞毒性Ｔ細胞は、ｃｌａｓｓＩの主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子と関連して、抗原呈示細胞の細胞表面でペプチド抗原を認識する。ペプチドのＭＨＣ分子に結合する能力はアレル特異的であり、その免疫原性と相関する。所定のタンパク質の免疫原性を低減するために、タンパク質中のどのペプチドが所定のＭＨＣ分子に結合する可能性を予測する能力は、大きい価値を有する。潜在的なＴ細胞エピトープを同定するために計算機でのスレッディングアプローチを用いたアプローチは、ＭＨＣのｃｌａｓｓＩ分子に対する所定のペプチド配列の結合を予測するために既に述べられている（Ａｌｔｕｖｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２４４−２５０）。
【００５９】
このようなアプローチをさらに用いて、本発明の突然変異タンパク質における潜在的なＴ細胞エピトープを同定し、免疫原性の予測による特異的な突然変異タンパク質の選択をその使用目的に依存させてもよい。さらには、Ｔ細胞エピトープを含むのを予測させるペプチド領域を、更なる突然変異誘発に供して、これらのＴ細胞エピトープを低減又は除去し、ひいては免疫原性を最小化することが可能であってもよい。遺伝子操作された抗体からの両親媒性のエピトープの除去は述べられてきており（Ｍａｔｅｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１９（６）：４６３−４７１）、本発明の突然変異タンパク質に適用されてもよい。
【００６０】
こうようにして得られた突然変異タンパク質は、最小限の免疫原性を有することができ、以下に記載のような治療及び診断用途での使用が望ましい。
【００６１】
いくつかの用途においては、接合形態で本発明の突然変異タンパク質を用いることはさらに有用である。従って、本発明は、また特定の化合物に接合される、リポカリン突然変異タンパク質に関連する。その特定の化合物として、数例のみを挙げると、有機分子、酵素標識、呈色標識、細胞増殖抑制剤、毒素、光力学治療に適用されかつ光活性化され得る標識、蛍光標識、放射性標識、発色標識、発光標識、金属錯体、コロイド金のような金属、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、化学療法用金属（ｃｈｅｍａｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｅｔａｌ）、又は化学療法用金属を含んでもよいが、これに限定されるものではない。その突然変異タンパク質は、また有機薬物分子に接合されてもよい。このような接合は当該技術分野で周知された従来の方法によって行うことができる。
【００６２】
一般的に、適切な化学物質又は酵素で本明細書中に記載のＬｃｎ２突然変異タンパク質を標識することは可能であり、化学的、物理的、光学的又は酵素学的な反応で検出可能な化合物又はシグナルを直接的又は間接的に産生する。物理的反応及び同時の光学的反応／標識の例は、照射での蛍光の放出である。アルカリホスファターゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ、又はβ−ガラクトシダーゼは、発色反応産物の形成を触媒する酵素標識（及び同時の光標識）の例である。一般的に、抗体に通常用いられる総ての標識はさらに（免疫グロブリンのＦｃ部分内の糖部分で排他的に用いられるものを除いて）、本発明の突然変異タンパク質への接合のために用いてもよい。本発明の突然変異タンパク質はさらに、例えば、所定の細胞、組織又は器官への標的送達のために、又は周囲の正常細胞に影響を与えることなく細胞、例えば腫瘍細胞を選択的に標的化するために、このような薬剤の任意の好適な治療用活性剤と接合させてもよい。このような治療用活性剤の例は、放射性核種、毒素、小さな有機分子、及び（細胞表面受容体のアゴニスト／アンタゴニストとして作用するペプチド、又は所定の細胞内標的にタンパク質結合部位に対し競合するペプチドなど）治療用ペプチドを含む。好適な毒素の例は限定しないが、百日咳毒素、ジフテリア毒素、リシン、サポリン、緑膿菌外毒素、カリチアマイシン又はその誘導体、タキソイド、マイタンシノイド、ツブリシン、又はドラスタチンアナログを含む。ドラスタチンアナログは、アウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＰＹＥ、及びアウリスタチンＰＨＥであってもよい。分裂停止剤の例は限定しないが、シスプラチンと、カルボプラチンと、オキサリプラチンと、５−フルオロウラシルと、タキソテール（ドセタキセル）と、パクリタキセルと、アントラサイクリン（ドキソルビシン）と、メトトレキサートと、ビンブラスチンと、ビンクリスチンと、ビンデシンと、ビノレルビンと、ダカルバジンと、シクロホスファミドと、エトポシドと、アドリアマイシンと、カンプトテシンと、コンブレタスタチンＡ−４関連化合物と、スルホンアミドと、オキサジアゾリンと、ベンゾ［ｂ］チオフェンと、合成型スピロケタールピランと、モノテトラヒドロフラン化合物と、クラシン及びクラシン誘導体と、メトキシエストラジオール誘導体と、ロイコボリンとを含む。本発明のリポカリン突然変異タンパク質はさらに、アンチセンス核酸分子、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はリボザイム治療用活性核酸で接合させてもよい。このような接合体は当該技術分野で周知の方法によって産生できる。
【００６３】
一実施形態においては、本発明の突然変異タンパク質は、さらに本発明の突然変異タンパク質を身体内の所望の領域又は区域に送達するために、特異的な身体領域を標的とする標的部分に連結してもよい。このような修飾が所望されうる一実施例は、血液脳関門の通過である。血液脳関門を通過するために、本発明の突然変異タンパク質はこのバリアを通過する能動輸送を促進する部分に連結できる（Ｇａｉｌｌａｒｄ ＰＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ−ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｒａｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＩｎｔｅＲＮＡｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ Ｓｅｒｉｅｓ．２００５ １２７７；１８５−１９８、又はＧａｉｌｌａｒｄ ＰＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００５ ２（２）：２９９−３０９参照）。このような化合物は、例えば、商品名２Ｂ−Ｔｒａｎｓ（登録商標）（オランダ国ライデンのｔｏ−ＢＢＢ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＢＶ５社）で入手可能である。本発明の突然変異タンパク質に結合できる他の例示的な標的分子は、所望の標的分子に対して親和性を有する抗体、抗体フラグメント、又はリポカリン突然変異タンパク質を含む。標的部分の標的分子は、例えば、細胞表面抗原であってもよい。細胞表面抗原は、例えば、癌細胞のような細胞又は組織型に対して特異的であってもよい。このような細胞表面タンパク質の説明に役立つ実例として、ＨＥＲ−２、又はＮＥＵ−２のようなプロテオグリカンがある。
【００６４】
上述のように、本発明の突然変異タンパク質はいくつかの実施形態においては、突然変異タンパク質の血清半減期を延長する化合物に接合されうる（これに関しては、さらに、国際公開第２００６／５６４６４号参照のこと。このような接合ストラテジは、ＣＴＬＡ−４に対する結合親和性を有するヒト好中球ゼラチナーゼ結合性突然変異タンパク質について述べられている）。血清半減期を延長する化合物は数例のみを挙げると、ポリエチレン（ＰＥＧ）又はその活性誘導体のようなポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、パルミチン酸のような脂肪酸分子（Ｖａｊｏ ＆ Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ （２０００） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． ５２１−９）、免疫グロブリンのＦｃ化合物、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン又はそのフラグメント、アルブミン結合ペプチド、又は、アルブミン結合タンパク質であってもよい。アルブミン結合タンパク質は、細菌性のアルブミン結合タンパク質、抗体、ドメイン抗体を含む抗体フラグメント（例えば、米国特許第６，６９６，２４５号参照）、又はアルブミンに対して結合活性を有するリポカリン突然変異タンパク質を含む。従って、本発明のリポカリン突然変異タンパク質の半減期を延長するための好適な接合相手は、アルブミン（Ｏｓｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ３０３， ５４０-５４８）、又は、例えば、連鎖球菌性プロテインＧのもののような細菌性アルブミン結合ドメインのような、アルブミン結合タンパク質（Ｋｏｎｉｇ， Ｔ． ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ， Ａ． （１９９８） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． 方法ｓ ２１８, ７３-８３）を含む。接合相手として用いられうるアルブミン結合ペプチドの別の例は、例えば、Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓの共通配列を有するものであり、米国特許出願第２００３／００６９３９５号又はＤｅｎｎｉｓら（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７， ３５０３５−３５０４３）に記載のように、Ｘａａ１はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｒｐであり、Ｘａａ２はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、又はＬｙｓであり、Ｘａａ３はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒであり、Ｘａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒである。
【００６５】
他の実施形態において、アルブミン自体又はアルブミンの生物学的活性のフラグメントは、突然変異タンパク質の血清半減期を延長する本発明のリポカリン突然変異タンパク質の化合物として用いられうる。用語「アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）」は、ヒト血清アルブミン、又はウシ血清アルブミン、又はラットアルブミンのような総ての哺乳類アルブミンを含む。アルブミン又はそのフラグメントは、米国特許第５，７２８，５５３号、又は欧州特許出願ＥＰ０３３０４５１及びＥＰ０３６１９９１に記載のように組換えて産生されうる。タンパク質安定剤として用いられる組換えヒトアルブミン（Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）は、例えばＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｄｅｌｔａ社（英国、ノッティンガム）から入手できる。
【００６６】
アルブミン結合タンパク質が抗体フラグメントである場合は、ドメイン抗体であってもよい。ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）は生物物理学的な特性にわたる正確な制御を可能にするように操作され、生体内での半減期は、最適な安全性及び産生効率特性を生成するように設計される。ドメイン抗体は例えば、Ｄｏｍａｎｔｉｓ社（英国ケンブリッジ及び米国マサチューセッツ州）から商業上入手可能である。
【００６７】
本発明の突然変異タンパク質の血清半減期を延長する部分としてトランスフェリンを使用する場合、突然変異タンパク質は非グリコシル化トランスフェリンのＮ又はＣ末端、又はその双方に遺伝学的に融合できる。非グリコシル化トランスフェリンは１４ないし１７日の半減期を有し、トランスフェリン融合タンパク質は延長された半減期を同様に有する。担体であるトランスフェリンはさらに、高いバイオアベイラビリティ、体内分布、及び循環安定性を提供する。この技術はＢｉｏＲｅｘｉｓ（米国ペンシルベニア州のＢｉｏＲｅｘｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）から商業上入手可能である。タンパク質安定剤として用いるための組換えヒトトランスフェリン（ＤｅｌｔａＦｅｒｒｉｎ（登録商標））はさらに、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｄｅｌｔａ社（英国ノッティンガム）から商業上入手可能である。
【００６８】
免疫グロブリンのＦｃ部分が本発明の突然変異タンパク質の血清半減期を延長するために用いられる場合、Ｓｙｎｔｏｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（米国マサチューセッツ州）から商業上入手可能なＳｙｎ融合（登録商標）の技術を用いてもよい。このＦｃ融合技術の使用によって、長時間作用する生物製剤の産生が可能となり、例えば抗体のＦｃ領域に結合される突然変異タンパク質の２のコピーからなり、薬物動態、溶解性、及び産生効率を改善することができる。
【００６９】
本発明の突然変異タンパク質の半減期を延長するためのさらに別の選択肢は、本発明の突然変異タンパク質のＮ又はＣ末端に、長く不定形でフレキシブルなグリシンリッチな配列（例えば、約２０ないし８０個の連続的なグリシン残基を有するポリグリシン）を融合することである。国際公開第２００７／０３８６１９号に公開されたこのアプローチはさらに、例えば、用語「ｒＰＥＧ（組換えＰＥＧ）」等である。
【００７０】
ポリアルキレングリコールが本発明の突然変異タンパク質の血清半減期を延長する化合物として用いられる場合、ポリアルキレングリコールは置換型又は非置換型であってもよい。ポリアルキレングリコールはさらに、活性化したポリアルキレン誘導体にできる。好適な化合物の例はインターフェロンに関連して、国際公開第９９／６４０１６号、米国特許第６，１７７，０７４号、又は米国特許第６，４０３，５６４号に記載のような、又は、ＰＥＧ修飾アスパラギナーゼ、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ（ＰＥＧ−ＡＤＡ）、又はＰＥＧ−スーパーオキシドジスムターゼのような他のタンパク質について記載されたような（例えば、Ｆｕｅｒｔｇｅｓら（１９９０）Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ１１，１３９−１４８参照）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である。このような高分子、好適にはポリエチレングリコールの分子量は、約３００ダルトン〜約７０．０００ダルトンの範囲にでき、例えば約１０．０００、約２０．０００、約３０．０００、又は約４０．０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールを含む。さらに、例えば米国特許第６，５００，９３０号、又は６，６２０，４１３号に記載されるように、デンプン又はヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）のような炭水化物の低重合体及び高分子は血清半減期延長のために本発明の突然変異タンパク質に接合できる。
【００７１】
もう１つの実施形態において、上述の化合物のうちの１つを本発明の突然変異タンパク質に接合すべく好適なアミノ酸側鎖を提供するために、人工アミノ酸は突然変異誘発によって導入してもよい。一般的に、このような人工アミノ酸はより反応性に、ひいては所望の部分への接合を促進するように設計される。人工ｔＲＮＡを介して導入できるこのような人工アミノ酸の一例はパラアセチルフェニルアラニンである。
【００７２】
本明細書中で開示される突然変異タンパク質のいくつかの用途について、融合タンパク質の形態で用いることは有利になりうる。いくつかの実施形態においては、本発明のヒト涙液突然変異タンパク質は、そのＮ末端及び／又はそのＣ末端で、タンパク質、タンパク質ドメイン、又はシグナル配列及び／又は親和性標識のようなペプチドに融合される。
【００７３】
薬学的な用途のために、本発明の突然変異タンパク質は、突然変異タンパク質の生体内での血清半減期を延長する融合パートナーに融合されうる（国際公開第２００６／５６４６４号を再度参照。好適な融合パートナーは、ＣＴＬＡ−４に対し結合親和性を有するヒト好中球ゼラチナーゼ結合性突然変異タンパク質について記載されている）。上述の接合化合物と同様に、融合パートナーは数例のみを挙げると、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン、アルブミン結合ペプチド、又はアルブミン結合タンパク質であってもよい。また、アルブミン結合タンパク質は細菌性のアルブミン結合タンパク質、又はアルブミンに対し結合活性を有するリポカリン突然変異タンパク質であってもよい。従って、本発明のリポカリン突然変異タンパク質の半減期を延長するための好適な融合パートナーはアルブミン（Ｏｓｂｏｒｎ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００２）上記を参照、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０３，５４０−５４８）、例えば、連鎖球菌性プロテインＧのもののような細菌性アルブミン結合ドメインのような、アルブミン結合タンパク質（Ｋｏｎｉｇ，Ｔ．及びＳｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９８）上記を参照、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２１８，７３−８３）を含む。Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓの共通配列を有し、Ｘａａ１はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｒｐであり、Ｘａａ２はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、又はＬｙｓであり、Ｘａａ３はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒであり、Ｘａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒである、Ｄｅｎｎｉｓ（２００２）ら、上記を参照、又は米国特許出願第２００３／００６９３９５号に記載のアルブミン結合ペプチドはさらに、融合パートナーとして用いられうる。本発明のリポカリン突然変異タンパク質の融合パートナーとしてアルブミン自体、又はアルブミンの生物学的な活性フラグメントを用いることはさらに可能である。用語「アルブミン」はヒト血清アルブミン、又はウシ血清アルブミン、又はラット血清アルブミンのような総ての哺乳類アルブミンを含む。アルブミン又はそのフラグメントの組換え産生は当該技術分野の当業者に公知であり、例えば米国特許第５，７２８，５５３号、欧州特許出願ＥＰ０３３０４５１又はＥＰ０３６１９９１に記載されている。
【００７４】
本発明のリポカリン突然変異タンパク質に酵素活性又は他の分子に対する結合親和性などの新たな性質を付与しうる。適切な融合タンパク質の例は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、プロテインＧのアルブミン結合ドメイン、プロテインA、抗体断片、オリゴマー化ドメイン、同一又は異なる結合特異性のリポカリン突然変異タンパク質（その結果、「ｄｕｏｃａｌｉｎ」の形成を引き起こす。Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ，Ｓ．及びＳｋｅｒｒａ，Ａ．（２００１），Ｄｕｏｃａｌｉｎｓ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｆｏｌｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８２，１３３５−１３４２参照。）の突然変異タンパク質、又は毒素である。
【００７５】
特に、得られた融合タンパク質の両方の「成分」がともに特定の治療標的上に作用できるように、本発明のリポカリン突然変異タンパク質を別個の酵素活性部位と融合することが可能でありうる。リポカリン突然変異タンパク質の結合ドメインは、疾患の原因となる標的に結合し、酵素ドメインがその標的の生物学的機能を止めることを可能にする。
【００７６】
融合パートナー、また、組換えタンパク質の容易な検出及び／又は精製を可能にする、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）又はＳｔｌｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ（Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｔ．Ｇ．Ｍ．ら（１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５５， ７５３−７６６）、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓ６タグ又はＨＡタグ、又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼのようなタンパク質などの親和性タグは、好ましい融合パートナーの更なる例である。最後に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの発色特性又は蛍光特性を有するタンパク質は、同様に、本発明のリポカリン突然変異タンパク質に適した融合パートナーである。
【００７７】
本明細書において使用される場合、「融合タンパク質」という用語はまた、シグナル配列を含む本発明のリポカリン突然変異タンパク質を含む。ポリペプチドのＮ末端でのシグナル配列は、このポリペプチドを特定の細胞内区画、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム又は真核細胞の小胞体に指向させる。多数のシグナル配列が当技術分野において知られている。Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムへのポリペプチドの分泌のための好ましいシグナル配列はＯｍｐＡシグナル配列である。
【００７８】
本発明は、また本明細書に記載されるように、突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（ＤＮＡ及びＲＮＡ）に関する。遺伝子コードの縮重はあるコドンを同一のアミノ酸を指定する他のコドンに置換することを許容するので、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする特定の核酸分子に限定されず、機能的な融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むすべての核酸分子を含む。
【００７９】
従って、本発明はさらに、Ｌｃｎ２の直鎖状ポリペプチド配列におけるアミノ酸配列位置９６、１００、及び１０６のいずれかの少なくとも１のコドンに突然変異を有する、本発明により突然変異タンパク質をコード化する核酸配列を含む。
【００８０】
本明細書中に開示される発明はさらに、Ｌｃｎ２突然変異タンパク質をコード化する核酸分子を含み、実験的な突然変異誘発の確定配列位置の外側に更なる突然変異を含む。このような突然変異は、例えば突然変異タンパク質の折り畳み効率、血清安定性、熱安定性、又はリガンド結合親和性の改善に寄与する場合、多くの場合許容されるか、又はさらに有利にもなり得る。
【００８１】
本出願に開示された核酸分子は、この核酸分子の発現を可能にするように、制御配列（又は複数の制御配列）に「動作可能に結合（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」できる。
【００８２】
ＤＮＡのような核酸分子は、転写及び／又は翻訳制御に関する情報を有する配列要素を含む場合、「核酸分子を発現可能である」と見なされるか、又は「ヌクレオチド配列の発現を許容」できると見なされ、このような配列はポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に「動作可能に結合」される。動作可能な結合は、制御配列要素及び発現すべき配列が遺伝子発現を可能にする方法で結合される結合部のことである。遺伝子発現に必要な制御領域の詳細な性質は種の間で変りうるが、一般的にはこれらの領域は、原核生物においてはプロモータ自体、すなわち、転写の開始に関するＤＮＡ要素、並びにＲＮＡに転写されるときに翻訳の開始を伝えるＤＮＡ要素の双方を有するプロモータを含む。このようなプロモータ領域は通常、原核生物における−３５／−１０ボックス及びシャインダルガノ配列、又は真核生物におけるＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴ配列、及び５’キャッピング配列のような、転写及び翻訳に関連する５’非コード配列を含む。これらの領域はさらに、エンハンサ又はリプレッサ配列、並びに宿主細胞の特異的な区画を天然型ポリペプチドが標的にするための翻訳シグナル及びリーダ配列を含みうる。
【００８３】
さらに、３’非コード配列は転写終結又はポリアデニル化に関する制御配列を含んでもよい。しかしながら、これらの終結配列が特定の宿主細胞において十分に機能的ではない場合、その細胞内で機能的な信号と置換されうる。
【００８４】
従って、本発明の核酸分子は制御配列、好適にはプロモータ配列を含むことができる。別の好適な実施形態においては、本発明の核酸分子はプロモータ配列と、転写終結配列とを含む。好適な原核生物のプロモータは例えば、ｔｅｔプロモータ、ｌａｃＵＶ５プロモータ、又はＴ７プロモータである。真核細胞の発現に有用なプロモータの例は、ＳＶ４０プロモータ又はＣＭＶプロモータである。
【００８５】
本発明の核酸分子はさらに、プラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド、又は人工染色体のような、ベクターの一部又は任意のその他のクローニング媒体にできる。
【００８６】
一実施形態において、核酸分子はファスミドに含まれる。ファスミドベクターは、Ｍ１３又はｆ１のような溶原性ファージの遺伝子間領域をコード化するベクターか、又は対象のｃＤＮＡに融合されるその機能的部分を意味する。このようなファージミドベクター、及び好適なヘルパーファージ（例えば、Ｍ１３Ｋ０７、ＶＣＳ−Ｍ１３、又はＲ４０８）での細菌性宿主細胞の重感染後に、無傷のファージ粒子が産生され、これによってファージ表面に表示されたその対応するポリペプチドへの、コード化した異種ｃＤＮＡの物理的結合を可能にする（例えば、Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）ファージ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１ｓｔ Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６，４０１−４２４；又はＲｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．， 及びＭａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，８７−９３に概説）。
【００８７】
このようなクローニング媒体は、上述の制御配列、及び本発明のリポカリン突然変異タンパク質をコード化する核酸配列とは別に、発現用に用いられる宿主細胞と種から得られる互換性のある複製及び制御配列と、形質転換又は形質移入された細胞上に選択可能な表現型を与える選択マーカーとを含みうる。多数の好適なクローニングベクターは当該技術分野で周知であり、商業上利用可能である。
【００８８】
本発明のリポカリン突然変異タンパク質をコード化するＤＮＡ分子、特にこのようなリポカリン突然変異タンパク質を含むクローニングベクターは、遺伝子を発現可能な宿主細胞に形質転換されうる。形質転換は標準的な技術を用いて行われ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）、上記を参照）。
【００８９】
従って、本発明は本明細書中に記載のように、核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【００９０】
形質転換された宿主細胞は本発明の融合タンパク質をコード化するヌクレオチド配列の発現に好適な条件下で培養される。好適な宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は枯草菌のような原核細胞か、又はサッカロマイセスセレビシエ、ピキアパストリス、ＳＦ９若しくはＨｉｇｈ５昆虫細胞、哺乳類の不死化細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞若しくはＣＨＯ細胞）、又は哺乳類の初代細胞のような真核細胞にできる。
【００９１】
本発明はさらに、本発明の突然変異タンパク質の産生方法に関し、突然変異タンパク質、突然変異タンパク質のフラグメント、又は突然変異タンパク質と別のポリペプチドとの融合タンパク質は、遺伝子工学的方法によって、突然変異タンパク質をコードする核酸から産生される。本方法は生体内で行うことができ、突然変異タンパク質は例えば細菌性又は真核の宿主生物で産生し、次いでこの宿主生物又はその培養物から分離できる。生体外、例えば生体外の翻訳系の使用によって、タンパク質を産生することはさらに可能である。
【００９２】
生体内で突然変異タンパク質を産生する場合、本発明の突然変異タンパク質をコード化する核酸は、（上に既に概説したように）組換えＤＮＡ技術によって、好適な細菌性又は真核の宿主生物に導入される。この目的のために、確立した標準的な方法を用いて（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）、上記を参照）、宿主細胞は、本発明の突然変異タンパク質をコード化する核酸分子を含むクローニングベクターで最初に形質転換される。宿主細胞は次いで、複数の条件下で培養され、異種ＤＮＡの発現、ひいては対応するポリペプチドの合成を可能にする。その後、ポリペプチドは細胞から、又は培養培地のいずれかから回収される。
【００９３】
一実施形態において、本発明は、本発明の突然変異タンパク質を生成する方法に関し、その生成方法は、
（ａ）ヒトリポカリン２をコードする核酸分子に、Ｌｃｎ２の直鎖状ポリペプチド配列における配列位置９６、１００、及び１０６に対応する配列位置のうちのいずれかの少なくとも１つをコードするヌクレオチドトリプレットで、突然変異誘発を受けさせることによって、１つ又はそれ以上の突然変異タンパク質核酸分子を生じるステップを含む。
【００９４】
上記の方法はさらに、
（ｂ）（ａ）で得られた１つ以上の突然変異タンパク質核酸分子を適切な発現系で発現させるステップ、及び、
（ｃ）所定の標的に対して検出可能な結合親和性を有する１つ又はそれ以上の突然変異タンパクを、選択及び／又は単離によって濃縮するステップ、を含んでもよい。
【００９５】
「突然変異誘発」という用語は本明細書において用いられる場合、Ｌｃｎ２（ｈＮＧＡＬ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ データ Ｂａｎｋ受入番号Ｐ８０１８８）の特定の配列位置に天然に存在するアミノ酸が、それぞれの天然のポリペプチド配列においてこの特異的な位置に存在しない少なくとも１つのアミノ酸によって置換され得るように、実験条件が選択されることを意味する。「突然変異誘発」という用語はまた、１以上のアミノ酸の欠失又は挿入による配列セグメントの長さの（更なる）改変を含む。従って、例えば、選択された配列位置の１つのアミノ酸が一続きの３つのランダム突然変異によって置換され、野生型タンパク質のそれぞれのセグメントの長さと比較して２アミノ酸残基の挿入を生じることは、本発明の範囲内である。このような挿入又は欠失は、本発明において突然変異誘発の対象となり得る任意のペプチドセグメントにおいて、互いに独立に導入されうる。本発明の１つの例示的な実施形態では、いくつかの突然変異の挿入は、選択されたリポカリン骨格のループＡＢに導入される（それぞれ、実施例２及び２８参照）。「ランダム突然変異誘発」という用語は、所定の単一アミノ酸（突然変異）は特定の配列位置に存在しないが、少なくとも２のアミノ酸が、突然変異誘発の際に、既定の配列位置にある確率で取り込まれうることを意味する。
【００９６】
ヒトリポカリン２は、本発明で選択されるペプチドセグメントの突然変異誘発のための開始点として用いられる。列挙されたアミノ酸位置の突然変異誘発について、当該技術分野の当業者は自由裁量で、部位特異的突然変異誘発のための様々に確立された標準的な方法を有する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）、上記を参照）。通常用いられる技術は、合成オリゴヌクレオチドの混合物を用いた、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による突然変異の導入であり、所望の配列位置に変性した塩基組成物を有する。例えば、コドンＮＮＫ又はＮＮＳ（ここで、Ｎ＝アデニン、グアニン、又はシトシン、又はチミン；Ｋ＝グアニン又はチミン；Ｓ＝アデニン又はシトシン）の使用は、２０の総てのアミノ酸に加え、終止コドンであるアンバーの取り込みを、突然変異誘発中に可能にするが、一方、コドンＶＶＳはアミノ酸Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌがポリペプチド配列の選択された位置に取り込まれるのを排除するために、取り込まれるアミノ酸の最大数を１２に限定し、例えば、コドンＮＭＳ（ここで、Ｍ＝アデニン又はシトシン）の使用は、アミノ酸Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｖａｌが選択された配列位置に取り込まれるのを排除するために、選択された配列位置でのアミノ酸の最大数を１１に限定する。この点において、セレノシステイン又はピロールリジンのような（天然に存在する通常の２０のアミノ酸以外の）アミノ酸用のコドンはさらに、突然変異タンパク質の核酸に取り込んでもよいことは留意すべきである。さらに、Ｗａｎｇ，Ｌ．ら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２，４９８−５００、又はＷａｎｇ，Ｌ．及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１，１−１１に記載されるように、他の特異的なアミノ酸、例えば、ｏ−メチル−Ｌ−チロシン又はｐ−アミノフェニルアラニンを挿入するために、終止コドンとして通常認識される、ＵＡＧのような「人工的な（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ）」コドンを用いることは可能である。
【００９７】
例えば、イノシン、８−オキソ−２’デオキシグアノシン、又は６（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３，４−ジヒドロ−８Ｈ−ピリミド（ｐｙｒｉｍｉｎｄｏ）−１，２−オキサジン−７−オン（Ｚａｃｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５，５８９−６０３）のような、還元型の塩基対特異性を有するヌクレオチド構成要素の使用は、選択された配列セグメントへの突然変異の導入のための、他の選択肢である。
【００９８】
更なる可能性はいわゆる三塩基組での突然変異誘発（ｔｒｉｐｌｅｔ−ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）である。この方法は、別個のヌクレオチドの三塩基組の混合物を用いており、その各々が１のアミノ酸について、コード配列への取り込みのためにコードされる（Ｖｉｒｎｅｋａｓ Ｂ，Ｇｅ Ｌ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＫＣ，Ｗｅｌｌｎｈｏｆｅｒ Ｇ，Ｍｏｒｏｎｅｙ ＳＥ．１９９４ Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ：ｉｄｅａｌ 試薬ｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｉｘｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ２２，５６００−５６０７）。
【００９９】
各ポリペプチドの選択された領域に突然変異を導入するための１の可能なストラテジは、４のオリゴヌクレオチドの使用に基づいており、その各々は、変異導入すべき対応する配列セグメントのうちの１つから部分的に得られる。これらのオリゴヌクレオチドを合成する場合、当該技術分野の当業者は、総ての天然アミノ酸をコード化するコドンがランダムに生じるように、変異導入すべきアミノ酸位置に対応する、ヌクレオチドの三塩基組の合成用の核酸構成要素の混合物を用いることができ、最終的にはリポカリンのペプチドライブラリを産生する。例えば、第１のオリゴヌクレオチドはその配列中において、突然変異した位置から離れ、ペプチドセグメントがリポカリンのポリペプチドの最もＮ末端の位置で変異導入される、コーディング鎖に対応する。従って、第２のオリゴヌクレオチドは、ポリペプチド配列に続く第２の配列セグメント用の非コーディング鎖に対応する。第３のオリゴヌクレオチドはさらに、対応する第３の配列セグメント用のコーディング鎖に対応する。最後に第４のオリゴヌクレオチドは、第４の配列セグメント用の非コーディング鎖に対応する。ポリメラーゼ連鎖反応は、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの各々で実行でき、別個に必要に応じて、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの各々で実行してもよい。
【０１００】
これらの反応の双方の増幅産物は、第１ないし第４の配列セグメントの配列を含む単一核酸に、様々な所定の方法によって結合でき、突然変異は選択された位置で導入されていた。このため、産物の双方は、例えば隣接するオリゴヌクレオチド、並びに１又はそれ以上のメディエータの核酸分子を用いて、新しいポリメラーゼ連鎖反応に供することができ、第２及び第３の配列セグメント間の配列を提供する。突然変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドの配列内の数及び配列の選択において、当該技術分野の当業者は自由裁量で、数多くの選択肢を有する。
【０１０１】
上記に規定された核酸分子は、リポカリンのポリペプチドをコード化する、欠損した核酸の５’−及び３’−配列及び／又はベクターでの核酸連結によって結合でき、周知の宿主生物中でクローン化できる。多数の確立した手順が核酸連結及びクローン化用に利用可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）上記参照）。例えば、クローニングベクターの配列中にさらに存在する制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、合成オリゴヌクレオチドの配列で操作されうる。従って、各々のＰＣＲ産物の増幅及び酵素切断後に、得られたフラグメントは対応する認識配列を用いて容易にクローン化されうる。
【０１０２】
突然変異誘発用に選択されたタンパク質のためにコード化する遺伝子内の長い配列セグメントはさらに、例えば、誤差率の増加条件下でのポリメラーゼ連鎖反応の使用によって、化学的な突然変異誘発によって、又は細菌性の突然変異誘発株を用いることによって、周知の方法を介してランダムな突然変異誘発に供されうる。このような方法はさらに、リポカリン突然変異タンパク質の標的の親和性又は特異性の更なる最適化のために用いられうる。実験的な突然変異誘発のセグメント外部に場合により生じる突然変異は多くの場合許容され、例えばリポカリン突然変異タンパク質の折り畳みの効率又は折り畳みの安定性の改善に貢献する場合、利点にさえなりうる。
【０１０３】
本発明の一実施形態によると、上記の方法は、少なくとも上記に示されるヒトリポカリン２の配列位置のいずれかをコードする２又は３のヌクレオチドトリプレットで、突然変異誘発を受けさせることを含む。
【０１０４】
更なる１つの実施形態において、その方法はさらに、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列における配列位置３３、３６、４０、４１、４２４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２５４、５５、５９、６５、６８、７０、７２７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８６、８７、９８、９６、９９、１００、１０３、１０６、１０７、１１０、１１１、１２５、１２７、１３２、１３４、１３６、及び１３８に対応する配列位置のいずれかをコードする少なくとも１つのヌクレオチドトリプレットで、核酸分子に突然変異誘発を受けさせることを含む。
【０１０５】
更なる１つの実施形態において、その方法は、ヒトリポカリン２の直鎖状ポリペプチド配列における配列位置３３、３６、４０、４１、４２４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２５４、５５、５９、６５、６８、７０、７２７３、７５、７７、７８、７９、８０、８１、８６、８７、９８、９６、９９、１００、１０３、１０６、１０７、１１０、１１１、１２５、１２７、１３２、１３４、１３６、及び１３８に対応する配列位置の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０をコードするヌクレオチドトリプレットで、核酸分子に突然変異誘発を受けさせることを含む。
【０１０６】
本発明の方法によると、突然変異タンパク質はｈＮＧＡＬをコード化する核酸から得られる。このような核酸は突然変異誘発に供されて、組換えＤＮＡ技術によって、好適な細菌性又は真核性の宿主生物に導入される。ヒトリポカリン２の核酸ライブラリを得ることは、抗体様の特性を有するリポカリン突然変異タンパク質、すなわち、所定の標的に対する親和性を有する突然変異タンパク質を産生するのに好適な、当該技術分野の当業者に周知の任意の技術を用いて行われることができる。このような組合せ型の方法の実施例は例えば、開示内容全体が本明細書中に引用によって取り込まれる、国際公開第９９／１６８７３号、国際公開第００／７５３０８号、国際公開第０３／０２９４７１号、国際公開第０３／０２９４６２号、国際公開第０３／０２９４６３号、国際公開第２００５／０１９２５４号、国際公開第２００５／０１９２５５号、国際公開第２００５／０１９２５６号、又は国際公開第２００６／５６４６４号に詳細に記載されている。これらの特許出願の各々の内容は参照によりその全体において本明細書に組み込まれている。適切な宿主中で突然変異誘発に供された核酸配列の発現後、複数の各リポカリン突然変異タンパク質用の遺伝情報を保有するクローンは、所定の標的を結合し、得られたライブラリから選択されることができる。ファージディスプレイ（Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）上記を参照；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．（１９９７）上記を参照；又はＲｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．及びＭａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９）上記参照；に概説）、コロニースクリーニング（Ｐｉｎｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．５，５０３−５１０；に概説）、リボソームディスプレイ（Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２，４００−４０５；に概説）、又はＷｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８，３７５０−３７５５；に報告されるようなｍＲＮＡディスプレイ、又は、開示内容全体が本明細書中に引用によって取り込まれる、国際公開第９９／１６８７３号、国際公開第００／７５３０８号、国際公開第０３／０２９４７１号、国際公開第０３／０２９４６２号、国際公開第０３／０２９４６３号、国際公開第２００５／０１９２５４号、国際公開第２００５／０１９２５５号、国際公開第２００５／０１９２５６号、又は国際公開第２００６／５６４６４号に記載される公知の技術は、これらのクローンの選択用に用いられることができる。
【０１０７】
この開示によると、ステップ（ｃ）はさらに、上記の方法の別の実施形態において、
（ｉ）所定の標的／リガンドとして、免疫学的ハプテンの特性が示される遊離型又はコンジュゲート型の化学化合物、ペプチド、タンパク質、又は、例えば多糖、核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、若しくは全ウイルス粒子やウイロイド等の他の高分子からなる群より選択される化合物を提供するステップと、
（ｉｉ）上記標的／リガンドと、当該標的／リガンドに対し結合親和性を有する突然変異タンパク質との間で複合体の形成を可能にするように、複数の突然変異タンパク質を上記リガンドと接触させるステップと、
（ｉｉｉ）結合親和性を有さない、又は実質的に有さない突然変異タンパク質を除去するステップと、
を備える。
【０１０８】
本発明の特異的な実施形態において、標的／リガンドは非天然標的を含み、その非天然標的はペプチド、タンパク質、タンパク質のフラグメント若しくはドメイン、又は有機小分子含むが、これに限定されるものではない。一実施形態において、その有機小分子は、免疫学的ハプテンの特性が示される化合物である。更なる実施形態において、そのペプチドは、Ａβ４０ペプチドやＡβ４２ペプチドのようなアミロイドベータペプチドである。また、更なる実施形態において、その非天然標的は、ＥＢ−ドメインやＥＢ−ドメインのフラグメントのような、フィブロネクチン又はそのドメインである。
【０１０９】
本明細書中で用いられるような競合条件は、突然変異タンパク質及びヒトリポカリン２の所定の非天然型リガンド（標的）が更なるリガンドの存在時に接触する少なくとも１のステップを、突然変異タンパク質の選択が含みうることを意味し、それは突然変異タンパク質の標的への結合と競合する。この更なるリガンドは、標的の生理学的リガンド、標的そのものの過剰、又は本発明の突然変異タンパク質を認識するエピトープに、重複するエピトープを少なくとも結合し、ひいては突然変異タンパク質の標的結合と干渉する標的のその他の非生理学的リガンドであってもよい。また、この更なるリガンドは、アロステリック効果により、突然変異タンパク質の標的への結合部位と異なるエピトープを複合体化することによって、突然変異タンパク質の結合と競合する。
【０１１０】
溶原性のＭ１３ファージを用いた、ファージディスプレイ技術の、ある実施形態（Ｋａｙ，Ｂ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）上記を参照；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）上記を参照；又は、Ｒｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．及びＭａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９）上記を参照；に概説）は、本発明で用いられうる選択方法のある実施例として提供される。本発明の突然変異タンパク質の選択に用いられうるファージディスプレイ技術の別の実施形態は、Ｂｒｏｄｅｒｓによって記載のようなハイパーファージ（ｈｙｐｅｒファージ）のファージ技術である（Ｂｒｏｄｅｒｓら（２００３）“Ｈｙｐｅｒファージ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ファージ ｄｉｓｐｌａｙ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２０５：２９５−３０２）。ｆ１のような他の溶原性ファージ、又はＴ７のような溶菌性ファージは同様に用いてもよい。例示的な選択方法について、Ｎ末端でシグナル配列、好適にはＯｍｐＡシグナル配列を有し、かつ、Ｃ末端でファージカプシドに組み込まれうる、ファージＭ１３のカプシドタンパク質ｐＩＩＩ、又はそのフラグメントを有するシグナル配列融合タンパク質として、変異導入されるリポカリンの核酸配列の発現を可能にするＭ１３ファージミドが産生される。野生型の配列のアミノ酸２１７ないし４０６を含むファージカプシドタンパク質のＣ末端のフラグメントΔｐＩＩＩは、融合タンパク質を産生するのに好適に用いられる。一実施形態において特に好適であるのは、ｐＩＩＩのＣ末端のフラグメントであり、位置２０１でのシステイン残基は欠損しているか、又は別のアミノ酸に置換される。
【０１１１】
従って、本発明の方法の更なる実施形態は、ヒトリポカリン２の複数の突然変異タンパク質をコード化する核酸を動作可能に融合するステップと、所定のリガンドの結合用の少なくとも１の突然変異タンパク質を選択するように、Ｍ１３ファミリの線維状ファージのコートタンパク質ｐＩＩＩか、又はこのコートタンパク質のフラグメントをコード化する遺伝子で、３’末端での突然変異誘発を生じさせるステップとを含む。
【０１１２】
融合タンパク質は親和性標識のような更なる成分を含んでもよく、融合タンパク質又はその一部分の固定化、検出、及び／又は精製を可能にする。さらに、終止コドンは、リポカリン又はその突然変異タンパク質をコード化する配列領域と、ファージカプシド遺伝子又はそのフラグメントとの間に配置でき、終止コドン、好適にはアンバーの終止コドンは、好適なサプレッサー株における翻訳時に、アミノ酸に少なくとも部分的に翻訳される。
【０１１３】
例えば、本明細書に記載のように、ｐＴｌｃ２７とも呼ばれるファスミドベクターｐＴＬＰＣ２７は、ヒトリポカリン２突然変異タンパク質をコード化するファージミドライブラリの調製に用いられうる。ｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質をコード化する本発明の核酸分子は、２のＢｓｔＸＩ制限部位を用いてベクターに挿入される。核酸連結後、大腸菌のＸＬ１−Ｂｌｕｅのような好適な宿主株は、多数の別個のクローンを産生するために、得られた核酸混合物で形質転換される。各ベクターは必要に応じて、ハイパーファージミド（ｈｙｐｅｒファージミド）ライブラリの調製のために産生できる。
【０１１４】
得られたライブラリはその後、機能的なファージミドを産生するために、液体培養中に適切なＭ１３ヘルパーファージ又はハイパーファージに重感染する。組換え型ファージミドは、コートタンパク質ｐＩＩＩ又はそのフラグメントを有する融合物としてその表面上にリポカリン突然変異タンパク質を表示する一方、融合タンパク質のＮ末端のシグナル配列は通常切断される。他方、ヘルパーファージによって供給される天然型カプシドタンパク質ｐＩＩＩの１又はそれ以上のコピーをさらに有し、従ってレシピエント、一般的にはＦ−又はＦ’−プラスミドを保有する菌種を感染させることができる。ハイパーファージディスプレイの場合において、ハイパーファージミドは感染性のコートタンパク質ｐＩＩＩを有するが、天然型カプシドタンパク質を有しない融合物として、その表面にリポカリン突然変異タンパク質を表示する。ヘルパーファージ又はハイパーファージの感染中又はその後に、リポカリン突然変異タンパク質とカプシドタンパク質との間での融合タンパク質の遺伝子発現が、例えばアンヒドロテトラサイクリンの添加によって誘発できる。誘発条件は、実質的に一部分の得られたファージミドが、その表面上に少なくとも１のリポカリン突然変異タンパク質を表示するように選択される。ハイパーファージディスプレイの場合においては、誘発条件は、リポカリン突然変異タンパク質とカプシドタンパク質ｐＩＩＩとからなる、３ないし５の融合タンパク質を保有するハイパーファージミドの集団を生じさせる。様々な方法がポリエチレングリコールでの沈殿のようなファージミドを分離することで知られる。分離は一般的に、６時間〜８時間のインキュベーション期間後に生じる。
【０１１５】
分離されたファスミドはその後、所望の標的とのインキュベーションによって選択に供することができ、標的はそれらのコート中の融合タンパク質として、所望の結合活性を有する突然変異タンパク質を保有する、そのファージミドの少なくとも一時的な固定化を可能にする形態で示される。当該技術分野の当業者に周知の様々な実施形態の間で、標的は例えば、血清アルブミンのような担体タンパク質と接合され、この担体タンパク質を介してタンパク質結合面、例えばポリスチレンに結合されうる。ＥＬＩＳＡ技術に好適なマイクロタイタープレート、又はいわゆる「イムノスティック」は好適には、このような標的の固定化のために用いられうる。また、ビオチンのような他の結合基での標的の接合が用いられうる。標的はその後、例えばマイクロタイタープレート、又はストレプトアビジン、ニュートラアビジン、若しくはアビジンでコーティングされた常磁性粒子のような、この群を選択的に結合する表面に固定化できる。標的が免疫グロブリンのＦｃ部分に融合される場合、固定化はさらに、例えばマイクロタイタープレート又は常磁性粒子のような、プロテインＡ又はプロテインＧでコーディングされた表面で得られうる。
【０１１６】
表面にある非特異的なファージミド結合部位は、ＥＬＩＳＡ法で知られるようにブロッキング溶液で飽和できる。ファージミドは次いで、一般的には、生理学的バッファーの存在下で表面に固定化される標的と接触する。結合されないファージミドは複数の洗浄によって除去される。表面上に残ったファージミド粒子はその後溶出される。溶出では、いくつかの方法が可能である。例えば、ファージミドはプロテアーゼの添加によって、又は酸、塩基、界面活性剤、若しくはカオトロピック塩の存在下で、又は適度な変性条件下で溶出できる。好適な方法は、ｐＨ２．２のバッファーを用いた溶出であり、溶出物はその後中和される。また、遊離型の標的の溶液は、ファージミドへの結合用に固定化された標的と競合するように添加でき、標的特異性のファージミドは、対象の標的に特異的に結合する免疫グロブリン又は天然型リガンドのタンパク質との競合によって溶出できる。
【０１１７】
その後、大腸菌細胞は溶出されたファージミドに感染する。また、核酸は溶出されたファージミドから抽出でき、別の方法においては細胞の配列解析、増幅、又は形質転換のために用いられうる。この方法で得られた大腸菌クローンから、新しいファージミド又はハイパーファージミドが上述の方法によって、Ｍ１３ヘルパーファージ又はハイパーファージでの重感染によってさらに産生され、この方法で増幅されたファージミドは再度、固定化された標的の選択に供される。複数の選択サイクルは多くの場合、十分に濃縮された形態での本発明の突然変異タンパク質で、ファージミドを得るために必要である。選択サイクルの数は、その後の機能解析において、少なくとも０．１％の調査されたクローンが所定の標的に対する検出可能な親和性を有する突然変異タンパク質を産生するように、好適に選択される。用いられるライブラリの大きさ、すなわち、複雑度に依存して、２ないし８のサイクルが一般的にはこのために要求される。
【０１１８】
選択された突然変異タンパク質の機能解析では、大腸菌株は、選択サイクルから得られるファージミドによって感染され、対応する二本鎖のファスミドＤＮＡが分離される。このファスミドＤＮＡから、又はさらにファージミドから抽出される単鎖ＤＮＡから、本発明の選択された突然変異タンパク質の核酸配列は、当該技術分野に周知の方法によって決定でき、アミノ酸配列はそれから推定されうる。変異導入された領域、又はｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質全体の配列は、別の発現ベクターでサブクローン化され、好適な宿主生物で発現されうる。例えば、現在ｐＴｌｃ２６とも呼ばれるｐＴｌｃ２６は、大腸菌ＴＧ１のような大腸菌株中の発現のために用いられうる。このように産生されたヒトリポカリン２突然変異タンパク質は、様々な生化学的方法によって調製されうる。例えばｐＴｌｃ２６で産生されたｈＮＧＡＬ突然変異タンパク質は、そのＣ末端で親和性ペプチドのＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．上記参照）を保有し、従ってストレプトアビジン親和性クロマトグラフィよって好適に調製されることができる。
【０１１９】
その選択はさらに、他の方法によって行われうる。多くの対応する実施形態が当該技術分野の当業者に周知であるか、又は文献中に記載されている。さらに、方法の組合せが適用されうる。例えば、「ファージディスプレイ」によって選択されるか、又は少なくとも濃縮されるクローンはさらに、「コロニースクリーニング」に供されうる。この手順は、標的に対する検出可能な結合親和性を有するヒトリポカリン２突然変異タンパク質の産生に対して、直接的に分離されうるのような利点を有する。
【０１２０】
「ファージディスプレイ」技術又は「コロニースクリーニング」法における宿主生物としての大腸菌の使用に加えて、他の菌種、酵母、又はさらに昆虫細胞又は哺乳類細胞はこの目的に用いられうる。上述のようなランダムのライブラリからの、ヒトリポカリン２突然変異タンパク質の選択に加えて、突然変異誘発の限定を含む発展的方法はさらに、標的に対する親和性又は特異性について、標的に対する結合活性を既に有する突然変異タンパク質を最適化するために適用できる。
【０１２１】
所定の標的に対して親和性を有する突然変異タンパク質は一度選択されると、さらに高い親和性の変異体、又は、高い熱安定性、血清安定性の改善、熱力学的安定性、溶解性の改善、単量体の挙動の改善、熱変性、化学変性、タンパク質分解、若しくは界面活性剤に対する耐性の改善等のような改善された特性を有する変異体を次に選択するために、このような突然変異タンパク質を別の突然変異誘発に供することがさらに可能である。この更なる突然変異誘発は、高親和性を目的とする場合においては生体内での「親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」とみなしうるが、合理的設計に基づく部位特異的な突然変異、又はランダムな突然変異によって得られる。より高い親和性又は改善された特性を得るための別の可能なアプローチは、エラープローンＰＣＲの使用であり、リポカリン突然変異タンパク質の配列位置の選択した範囲にわたる点突然変異が生じる。エラープローンＰＣＲはＺａｃｃｏｌｏら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５，５８９−６０３：で記載されるもののような任意の周知のプロトコルによって行われうる。この目的に好適な他のランダムな突然変異誘発方法は、Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，７６−８１：で記載のようなランダムな挿入／欠失（ＲＩＤ）か、又はＢｉｔｔｋｅｒ，Ｊ．Ａら（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，１０２４−１０２９：で記載のような非相同性のランダムな組換えを含む。必要に応じて、親和性成熟はさらに、国際公開第００／７５３０８号、又はＳｃｈｌｅｈｕｂｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９７，１１０５−１１２０：に記載の手順によって行うことができ、ジゴキシゲニンに対し高親和性を有するビリン結合型のタンパク質の突然変異タンパク質が得られた。親和性を改善する更なるアプローチは、位置的な飽和突然変異誘発を行うことである。このアプローチにおいて、「小さな」核酸ライブラリは、アミノ酸交換／突然変異が任意の４のループセグメント内の単一位置にのみ導入されて産生されうる。これらのライブラリはその後、更なるパニングのラウンドなしに、選択ステップ（親和性スクリーニング）に直接的に供される。このアプローチによって、所望の標的の結合の改善に寄与する残基の同定が可能となり、結合に重要な「ホットスポット（ｈｏｔ ｓｐｏｔ）」の同定が可能となる。
【０１２２】
一実施形態において、突然変異タンパク質を改良するための上記方法は、さらに、ヒトリポカリン２の野生型配列における配列位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６、又は１５８に対応する配列位置のいずれかの少なくとも１つでＣｙｓ残基を導入すること、及びｈＮＧＡＬの野生型配列における配列位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６、又は１５８に対応する配列位置のいずれかの少なくとも１つで導入されたＣｙｓ残基のチオール基によって、上記突然変異タンパク質の血清半減期を改良できる部分を接合することを含む。上記突然変異タンパク質の血清半減期を改良できる部分は、ポリアルキレングリコール分子、及びヒドロキシエチルデンプンからなる群より選ばれてもよい。
【０１２３】
更なる実施形態においては、本発明はヒトリポカリン２の所定の非天然リガンド対して検出可能な結合親和性を有するヒトリポカリン２の突然変異タンパク質に関し、上に詳述した本発明の方法によって取得可能であるか、又は取得される。
【０１２４】
いくつかの本発明のヒトリポカリン２突然変異タンパク質においては、Ｃｙｓ７６とＣｙｓ１７５との間に天然に存在するジスルフィド結合が除去される。従って、このような突然変異タンパク質（又は分子内ジスルフィド結合を含まないその他のヒトリポカリン２突然変異タンパク質）は、還元した酸化還元環境を有する細胞区画中、例えばグラム陰性菌の細胞質中に産生できる。
【０１２５】
本発明のリポカリン突然変異タンパク質が分子内ジスルフィド結合を含む場合、適切なシグナル配列を用いて、酸化した酸化還元環境を有する細胞区画に新生ポリペプチドを向けることが好ましい。このような酸化環境は、グラム陽性菌の細胞外環境において、又は真核細胞の小胞体の内腔において、大腸菌のようなグラム陰性菌のペリプラズムによって提供してもよく、通常、構造的なジスルフィド結合の形成を支持する。
【０１２６】
しかしながら、宿主細胞、好適には大腸菌の細胞質ゾルにおいて本発明の突然変異タンパク質を産生することはさらに可能である。この場合においては、ポリペプチドは溶解可能及び折り畳まれた状態で直接的に得られるか、又は封入体の形態で回収して、その後生体外で復元するかのいずれかにできる。更なる選択肢は酸化した細胞内環境を有する特異的な宿主株の使用であり、このように細胞質ゾル中のジスルフィド結合の形成を可能にする（Ｖｅｎｔｕｒｉ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３１５， １−８．）。
【０１２７】
しかしながら、本発明の突然変異タンパク質は、遺伝子工学の使用のみによって産生又は生成されるとは限らない。逆に、リポカリン突然変異タンパク質はさらに、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相ポリペプチド合成のような化学合成によって、又は生体外での転写及び翻訳によって得ることができる。例えば、有望な突然変異は分子モデリングを用いて同定され、その後、生体外で所望の（設計された）ポリペプチドを合成し、所定の標的に対する結合活性を検討することが可能である。タンパク質の固相及び／又は溶液相合成のための方法は当該技術分野に公知である（例えば、Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．及びＣｏｌｏｗｉｃｋ，Ｓ．Ｐ．（１９９７）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；又はＢｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５，２９−４３に概説）。
【０１２８】
もう１つの実施形態において、本発明の突然変異タンパク質は、当該技術分野の当業者に周知の確立した方法を用いて、生体外での転写／翻訳によって産生してもよい。
【０１２９】
本発明は、さらに請求項に示される本発明の突然変異タンパク質の少なくとも１つ又はその融合タンパク質若しくはその接合体と、選択的に、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【０１３０】
１２９
本発明によるリポカリン突然変異タンパク質は、タンパク薬剤で治療上有効である任意の非経口的又は非経口的ではない（腸内）経路を介して投与できる。非経口的な適用方法は例えば、注射液、輸液、又はチンキ剤の形態のような皮内、皮下、筋肉内、又は静脈内の注射及び注入技術と、煙霧混合物、噴霧、又は粉末の形態でのような煙霧導入及び吸入とを含む。非経口ではない送達モードは、例えば経口的に、丸剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、若しくは懸濁剤のような形態、又は直腸的に坐剤のような形態である。本発明の突然変異タンパク質は、従来の非毒性で薬学的に許容可能な、所望されるような賦形剤又は担体、添加剤、及び媒体を含む剤形で全身的又は局所的に投与できる。
【０１３１】
本発明の一実施形態においては、医薬品は哺乳類、特にヒトに非経口的に投与される。対応する投与方法は限定しないが、例えば、注射液、輸液、又はチンキ剤の形態のような皮内、皮下、筋肉内、又は静脈内の注射及び注入技術と、煙霧混合物、噴霧、又は粉末の形態のような煙霧導入及び吸入とを含む。静脈内及び皮下の注入及び／又は注射の組合せは、比較的短い血清半減期を有する化合物の場合に最も好都合になりうる。医薬組成物は水溶液、水中油型乳剤、又は油中水型乳剤であってもよい。
【０１３２】
１３１
１１（４）：３１２−３１６；に記載の、例えばイオン導入、超音波導入、又はマイクロニードル式の経皮送達技術はさらに、本明細書中に記載の突然変異タンパク質の経皮送達に用いられうることは留意すべきである。非経口ではない送達モードは例えば経口的に、丸剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、若しくは懸濁剤のような形態の経口投与、又は坐剤のような形態の直腸投与である。本発明の突然変異タンパク質は、従来の非毒性で薬学的に許容可能な、種々の賦形剤又は担体、添加剤、及び媒体を含む剤形で全身的又は局所的に投与できる。
【０１３３】
１３２
適用される突然変異タンパク質の用量は、所望の予防効果又は治療反応を得るために、の突然変異タンパク質とリガンドとの間の複合体の半減期とに依存する。さらに、最適な用量は突然変異タンパク質又はその融合タンパク質若しくはその接合体の体内分布と、投与モードと、治療中の疾患／障害の重症度と、患者の医学的状態とに依存する。例えば、局所塗布用に軟膏で用いられる場合、高濃度のヒトリポカリン２突然変異タンパク質が用いられうる。しかしながら所望される場合、突然変異タンパク質はさらに、例えば、ＰｏｌｙＡｃｔｉｖｅ（登録商標）又はＯｃｔｏＤＥＸ（登録商標）（ｃｆ． Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｂｒｉｅｆｉｎｇ: Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ ２００３: １-６）のような、リポソーム分散液又はヒドロゲルを基剤とした高分子ミクロスフェアなどの徐放性製剤で提供してもよい。
【０１３４】
従って、本発明の突然変異タンパク質は、薬学的に許容可能な成分ならびに確立された調整方法を用いた組成物に調剤できる（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｌ．及びＧｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。医薬組成物を調製するために、薬学的に不活性な無機又は有機賦形剤が用いられうる。例えば、丸剤、粉末、ゼラチンカプセル剤、又は坐剤を調製するために、例えばラクトース、滑石、ステアリン酸及びその塩、脂肪、ろう、固体又は液体ポリオール、天然及び硬化油は用いることができる。使用前に溶剤又は煙霧混合物に再構成するための溶剤、懸濁剤、乳剤、煙霧混合物、又は粉末の産生に好適な賦形剤は、水、アルコール、グリセロール、及びその好適な混合物、ならびに植物油を含む。
【０１３５】
医薬組成物はさらに、例えば充填剤、結合剤、湿潤剤、流動促進剤、安定剤、保存剤、乳化剤のような添加剤と、更なる溶剤若しくは可溶化剤、又は畜性効果を得るための薬剤とを含んでもよい。後者は、リポソーム及びマイクロカプセルのような緩効系若しくは徐放系又は標的送達系に取り込まれてもよいものである。
【０１３６】
製剤は細菌保持性フィルタを通した濾過を含む多数の手段によって、又は、使用の直前に滅菌水若しくは他の滅菌手段で溶解又は分散できる無菌の固体組成物の形態で、滅菌剤を組み込むことによって滅菌できる。
【０１３７】
本発明の突然変異タンパク質、又はその融合タンパク質若しくは接合体は、多くの用途に用いられうる。一般的に、このような突然変異タンパク質は、Ｆｃ部分の糖鎖付加に特異的に依拠するものを除いて、抗体が用いられる総ての用途で用いられうる。
【０１３８】
従って、本発明の別の態様においては、本発明のヒトリポカリン２の突然変異タンパク質は、ヒトリポカリン２の所定の非天然リガンドの結合及び／又は検出に用いられる。このような使用は、好適な条件下で所定のリガンドを有するとされるサンプルと突然変異タンパク質を接触させて、これによって、突然変異タンパク質と所定のリガンドとの間の複合体の形成を可能にして、好適なシグナルによって複合体化された突然変異タンパク質を検出するステップを具えてもよい。
【０１３９】
検出可能なシグナルは、上に説明されるような標識によって、さらに結合、すなわち複合体形成そのものによる物理的特性の変化によって生じうる。一例は表面プラズモン共鳴であり、その値は、一方が金箔のような表面上に固定される結合相手の結合時に変更される。
【０１４０】
本明細書中に開示されるヒトリポカリン２の突然変異タンパク質はさらに、ヒトリポカリン２の所定の非天然リガンドの分離に用いられてもよい。このような使用は、好適な条件下で前記リガンドを含むとされるサンプルと突然変異タンパク質を接触させ、これによって、突然変異タンパク質と所定のリガンドとの間で複合体の形成を可能にし、サンプルから突然変異タンパク質／リガンドの複合体を分離するステップを具えてもよい。
【０１４１】
本発明のヒトリポカリン２突然変異タンパク質はさらに、事前選択された部位を化合物が標的とするように用いてもよい。このような一実施形態においては、ヒトヒトリポカリン２突然変異タンパク質は、生物又は組織中の事前選択された部位を薬学的に能動的な化合物が標的にするのに用いられ、
ａ）突然変異タンパク質を前記化合物と接合するステップと、
ｂ）突然変異タンパク質／化合物の複合体を事前選択された部位に送達するステップと、
を備える。
【０１４２】
このような目的のために、突然変異タンパク質は複合体形成を可能にするように所望の化合物と接触する。次いで、突然変異タンパク質と、対象の化合物とを含む複合体は事前選択された部位に送達される。これは、例えば、所望の標的に対して結合親和性を有する抗体、抗体フラグメント、又はリポカリン突然変異タンパク質若しくはリポカリン突然変異タンパク質のフラグメントのような、標的部分に突然変異タンパク質を接合することによって実現できる。
【０１４３】
この使用は限定しないが、薬剤で治療されることとなる、感染した身体部分、組織又は器官のような、生物における事前選択された部位に（選択的に）薬剤を送達するのに特に好適である。突然変異タンパク質と対象の化合物との間での複合体の形成の他に、突然変異タンパク質はさらに所定の化合物と反応させて、突然変異タンパク質と化合物との接合体を提供できる。上の複合体と同様に、このような接合体は化合物を事前選択された標的部位に送達するのに好適であってもよい。突然変異タンパク質と化合物とのこのような複合体はさらに、突然変異タンパク質と化合物とを相互に共有結合するリンカを含んでもよい。選択的に、このようなリンカは血流中で安定であるが、細胞内環境においては切断可能である。
【０１４４】
本明細書中で開示される突然変異タンパク質及びその誘導体は従って、抗体又はそのフラグメントと同様、多くの分野で用いられうる。担体に結合させる使用に加えて、所定の突然変異タンパク質の標的、又はこの標的の接合体若しくは融合タンパク質を固定化又は分離するのが可能であるため、突然変異タンパク質は酵素、抗体、放射性物質、又は生化学的活性若しくは規定される結合特性を有するその他の群で標識されるように用いられうる。そのようにすることによって、各々の標的、又はその接合体若しくは融合タンパク質は検出又は接触できる。例えば、本発明の突然変異タンパク質は確立した分析方法（例えば、ＥＬＩＳＡ又はＷエステルｎ Ｂｌｏｔ）によって、又は顕微鏡若しくは免疫センサによって、化学的構造を検出するのに役立つ。ここで検出シグナルは、好適な突然変異タンパク質、接合体又は融合タンパク質の使用によって直接的に、又は抗体を介して結合された突然変異タンパク質の免疫化学的検出によって間接的に、のいずれかで産生できる。
【０１４５】
本発明の突然変異タンパク質について可能な多数の用途がさらに医学に存在する。生体外での診断及び薬剤送達における使用に加えて、本発明の変異ポリペプチドは、例えば組織特異型又は腫瘍特異型の細胞表面分子を結合して産生されることができる。このような突然変異タンパク質は、例えば接合形態で、又は融合タンパク質として、「腫瘍イメージング」に又は直接に癌治療に用いられてもよい。
【０１４６】
従って、本発明は、また本発明にかかるヒトリポカリン２突然変異タンパク質の、所定の非天然リガンド又は標的と複合体を形成するための使用を含む。
【０１４７】
更なる実施形態において、本発明はまた、本発明による突然変異タンパク質の、医薬組成物の製造への使用を含む。このようにして得られた医薬組成物は、アルツハイマー病のような神経変性疾患の治療に適用されてもよい。その医薬組成物は、また癌の治療、線維症の治療、又は炎症の治療に用いられることができる。その医薬組成物は、単剤療法又は併用療法として用いられてもよい。
【０１４８】
また、他の実施形態において、本発明は本発明による突然変異タンパク質が含有される診断又は分析キットを特徴とする。
【０１４９】
本発明の他の実施形態において、神経変性疾患、癌、線維症、又は炎症を患う対象者を治療するために、各々の本発明の突然変異タンパク質、又は本発明の突然変異タンパク質が含有される医薬組成物を必要に応じて対象者投与することを含む方法に関する。
【０１５０】
治療を必要とする対象者はいくつかの例示のみを挙げると、ヒト、イヌ、マウス、ラット、ブタ、カニクイザルのようなサルなどの哺乳類であってもよい。、
また、他の実施形態において、本発明は、対象者において生体内撮像を行うために、本発明の突然変異タンパク質又は本発明の突然変異タンパク質が含まれる医薬組成物を、上記対象者に投与することを含む方法を特徴とする。その対象者は、上記のように定義されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
本発明は以下の限定されない実施例及び添付の図面によってさらに例示される。
【図１】図１は、成熟Ｌｃｎ２のアミノ酸配列における２０のアミノ酸位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２、及び１３４（下線付き及び番号付き）の同時ランダム突然変異誘発のためのＰＣＲ組み立て法を示す。これらの２０の位置は４つの配列サブセットに分かれる。各サブセットにおけるアミノ酸のランダム化のために、ヌクレオチドのＮＮＫ混合物が突然変異したコドンで採用されたオリゴデオキシヌクレオチドは合成された（配列番号:１、配列番号:２、配列番号:３、配列番号:４）。Ｎは全ての４つの塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴの混合物を意味する一方、Ｋは２つの塩基Ｇ及びＴの混合物を意味する。それ故に、このようなトリプレットは、全ての２０の天然アミノ酸だけでなく、ファージミド生産及び遺伝子発現に用いられるＥ．ｃｏｌｉ ｓｕｐＥ−ｓｔｒａｉｎｓ ＸＬｌ−ｂｌｕｅ（Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５ （１９８７）， ３７６−３７８）又はＴＧＩ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ クローニング． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）においてグルタミンとして翻訳されるアンバー終止コドンＴＡＧもコードした。４つの追加のオリゴデオキシヌクレオチド（配列番号:５、配列番号:６、配列番号:７、配列番号:８）は、また、集合反応に用いられる。その４つの追加のオリゴデオキシヌクレオチドは、非コード鎖（ＤＮＡ二本鎖配列の３′−５′方向において記入される）に対応して上記のオリゴデオキシヌクレオチド同士の間のギャップをフィリングする固定のヌクレオチド配列を有する。過剰に添加してかつビオチングループを運ぶ２つの短い隣接オリゴデオキシヌクレオチド（配列番号:９及び配列番号:１０）は、組立てされ、かつ完全に合成された遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーとしての機能を果たす。その２つの隣接プライマーは、それぞれＢｓｔＸＩ制限酵素認識部位（ＣＣＡＮＮＮＮＮＮＴＧＧ）を包み、酵素消化物の上に互換性のないオーバーハングを生じさせた。制限酵素認識部位のこの特別配置は、合成遺伝子の特に効果的なライゲーション及びクローニングを可能にする。最初のＬｃｎ２配列に対してアミノ酸Ｇｌｎ２８のＨｉｓへの置換は、第一のＢｓｔＸＩ部位を導入することが必要である一方、第二のＢｓｔＸＩ部位がＬｃｎ２のcＤＮＡにおいて自然に発生した。さらに、不対残基Ｃｙｓ８７は、遺伝子組立ての間にＳｅｒによって置換された。ワンポットＰＣＲの後、得られた遺伝子フラグメントは、Ｌｃｎ２構造遺伝子の欠落部分を提供するベクターに挿入した。この図面はまた、二本鎖ＤＮＡシークエンシングに役立つ２つのＢｓｔＸＩ制限酵素認識部位によって挟まれたカセットの上流及び下流のそれそれにおける２つの短いプライマー（配列番号:４５及び配列番号:４６）を示す。
【図２】図２は、合成Ｌｃｎ２遺伝子（図１に示すように、中央のカセットのみを２つのＢｓｔＸＩ制限酵素認識部位によって挟まれる）のライブラリにおけるヌクレオチド配列を示す。この遺伝子フラグメントは、Ｓｌｏｎｉｎｇ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＧｍｂＨによって製造された。図１に示すＤＮＡライブラリと比べて、２つの相違点がある。第一は、いつでもＥ．ｃｏｌｉ発現に最適化可能なコドンが非突然変異したアミノ酸位置にわたって用いられることである。第二は、Ｃｙｓを除く異なるアミノ酸をそれぞれコードする１９の異なるトリプレット（ＧＡＣ、ＴＴＣ、ＣＴＧ、ＣＡＣ、ＡＡＴ、ＡＧＣ、ＡＣＣ、ＧＣＡ、ＡＴＧ、ＣＣＴ、ＧＴＴ、ＴＧＧ、ＧＡＧ、ＣＡＡ、ＡＴＣ、ＧＧＡ、ＣＧＴ、ＧＣＡ、ＴＡＣ）の混合物は、図１に示すものと同じである２０のランダム化位置で採用されることである。アミノ酸の番号付けはここでＳｌｏｎｉｎｇ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＧｍｂＨに採用される内部方式に対応することで、ＧｌｙＮＯ．１は直接に上流のＢｓｔＸＩ制限酵素認識部位に従う第一のアミノ酸コドンとする。
【図３】図３は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された後の組み換え型Ａβ融合タンパク質Ｔｒｘ−Ａβ２８（Ａ）及びＭＢＰ−Ａβ４０（Ｂ）のＳＥＣ溶出プロフィールを示す。合成型Ａβ４０と組み換え型Ａβ融合タンパク質両方の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Ｃ）によって評価される。両方の融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３の細胞質で発現された。Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｅｌｌで細胞を破壊された後、タンパク質はＨｉｓ６-タグ親和性クロマトグラフィーによって精製された。その後、さらに、Ｔｒｘ−Ａβ２８の場合はＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ１０／３０ｃｏｌｕｍｎに適用し、ΜΒΡ−Ａβ４０の場合はＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０ｃｏｌｕｍｎに適する。両方のタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて主に単量体として溶出し、精製した後で本質に均質になる。Ａβ４０はＫｅｃｋ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎから得られ、ＨＦＩＰで処理され、ＳｐｅｅｄＶａｃで蒸発し、最後に蒸留水に溶解された。１５％ゲルはＨＦＩＰ処理された後のＡβ４０、Ｔｒｘ−Ａβ２８、並びにＩＭＡＣ精製及びＳＥＣで処理された後のＭＢＰ-Ａβ４０のサンプルを示す。Ｍはゲルの左側に表示されたｋＤａで対応するバンドのサイズを有する分子量マーカーを示す。
【図４】図４は、Ｌｃｎ２突然変異タンパク質Ｈｌ−Ｇｌ、Ｓ１−Ａ４、及びＵＳ７（Ａ）のＳＥＣ溶出プロフィールのオーバーレイと、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）によって精製されたタンパク質の分析とを示す。その３つのＬｃｎ２突然変異タンパク質Ｈｌ−Ｇｌ、Ｓ１−Ａ４、及びＵＳ７は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３又はＴＧｌ−Ｆのペリプラズムにおいて発現し（ここに示すように）、且つＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ親和性クロマトグラフィーによって精製された。全ての３つの突然変異タンパク質は、主に単量体タンパク質としてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ１０／３０ｃｏｌｕｍｎから１０ｍｌ〜１１ｍｌの保持容量で溶出した。ピーク強度は所定の突然変異タンパク質の発現量によって異なる。（Ｂ）はＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ親和性精製及びＳＥＣで処理された、組み換え型野生型Ｌｃｎ２（ｌａｎｅｓ１、５）及び突然変異タンパク質ＵＳ７（ｌａｎｅｓ２、６）、Ｈｌ−Ｇｌ（ｌａｎｅｓ３、７）、並びにＳ１−Ａ４（ｌａｎｅｓ４、８）の１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。Ｌａｎｅｓ１〜４は２-メルカプトエタノールで還元されたＬｃｎ２突然変異タンパク質を示し、ｌａｎｅｓ５〜８は非還元条件におけるタンパク質を示す。Ｍはゲルの左側に表示されたｋＤａで対応するバンドのサイズを有する分子量マーカーを示す。
【図５】図５は、Ｌｃｎ２突然変異タンパク質Ｈｌ−Ｇｌ、Ｓ１−Ａ４、及びＵＳ７がキャプチャーＥＬＩＳＡｓにおいて異なるビオチニル化Ａβ標的との結合活性を示す。１０ｇ／ｍｌのＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｉｍｍｏはマイクロタイタープレートに固定され、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩによって１μＭＬｃｎ２突然変異タンパク質の獲得に用いられる。図Ａ〜図Ｃには、Ｌｃｎ２突然変異タンパク質Ｓ１−Ａ４及びＵＳ７の、（Ａ）ビオチニル化Ａβ４０、（Ｂ）ビオチニル化ＴｒｘＡβ２８、及び（Ｃ）ビオチニル化ΜΒΡ−Ａβ４０への結合が示される。その結合は、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ／ＡＰによる培養及び後続のｐＮＰＰとの発色反応によって検出された。オボアルブミン（Ｏｖａ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は陰性対照として用いられる。さらに、野生型（ｗｔ）リポカリンの結合は試験された。そのデータは一価結合モデルに適合される。図Ｄはターゲットとして、Ｌｃｎ２Ｈｌ−Ｇｌ、ビオチニル化Ａβ４０、及びＴｒｘ−Ａβ２８で行われる同じＥＬＩＳＡセットアップを示す。Ａβ４０に対して決定されるＫＤ値は、Ｓ１−Ａ４の場合は２.７ｎＭ、ＵＳ７の場合は６.８ｎＭ、及びＨｌ−Ｇｌの場合は１６.２ｎｍであり、Ｔｒｘ−Ａβ２８に対応する値はそれぞれ１.９ｎＭ、２.４ｎＭ及び２４.３ｎＭである。ＭＢＰ−Ａβ４０への結合は、Ｓ１−Ａ４の場合は４.７ｎＭのＫＤ値、及びＵＳ７の場合は１１.４ｎＭのＫＤ値が示される。従って、Ａβ１６〜２７の場合のＫＤ値は２.６ｎＭ及び２.１ｎＭである。
【図６】図６は、直接ＥＬＩＳＡにおいてＬｃｎ２突然変異タンパク質Ｓ１−Ａ４とＵＳ７との結合活性を示す。Ａβ標的Ｔｒｘ−Ａβ２８及びＭＢＰ−Ａβ４０は、制御タンパク質マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と同様に、２μＭでＰＢＳに一晩固定された。結合したＬｃｎ２突然変異タンパク質は、ＮＰＰによる発色反応の後でストレプトアビジン／ＡＰを用いてこれらのＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩによって検出された。コントロールとして、野生型（ｗｔ）リポカリンの結合は試験された。そのデータは一価結合モデルに適合される。Ｔｒｘ−Ａβ２８に対して決定されるＫＤ値は、Ｓ１−Ａ４の場合は１６.２ｎｍ、ＵＳ７の場合は９.６ｎＭであり、ＭＢＰ-Ａβ４０に対応する値は１４９ｎＭ及び４９.７ｎＭである。
【図７】図７は、競合ＥＬＩＳＡにおいてＬｃｎ２突然変異タンパク質Ｓ１−Ａ４（Ａ）とＵＳ７（Ｂ）との結合活性を示す。ＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｉｍｍｏは１０ｇ／ｍｌでマイクロタイタープレートに固定され、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩによって１μΜＬｃｎ２突然変異タンパク質の獲得に用いられる。競合のために、トレーサーとして定濃度のビオチニル化Ｔｒｘ−Ａβ２８は種々の濃度の非標識Ｔｒｘ−Ａβ２８と混合された。結合したビオチニル化Ｔｒｘ−Ａβ２８は、続いて、ＮＰＰによる発色反応の後でＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ／ＡＰによる培養によって検出された。データはシグモイドの式を用いて適合される。ＫＤ値は、Ｓ１−Ａ４の場合は２１.７ｎＭ、ＵＳ７の場合は７６.９ｎＭである。
【図８】図８は、Ｂｉａｃｏｒｅ計測器によって１０μｌ／ｍｉｎの流量で測定されたＬｃｎ２突然変異タンパク質Ｓ１−Ａ４（Ａ）及びＵＳ７（Ｂ）の動態実時間解析を示す。ＭＢＰ-Ａβ４０融合タンパク質は、アミン化学によってＣＭＤ２００Ｉチップ（ＡＲＵ＝１４５５）に連結され、精製されたＬｃｎ２突然変異タンパク質のそれぞれは一連の異なる濃度で適用された。いずれの場合にも、測定信号はグレイラインとして示されるのに対して、曲線適合はブラックラインとして示される。両方の突然変異タンパク質のｋｏｎ及びｋｏｆｆ速度は有意差がある（ｋｏｎ（Ｓｌ−Ａ４）＝０.４８・１０５Ｍ−１Ｓ−１、ｋｏｎ（ＵＳ７）＝２.０２・１０５Ｍ−１Ｓ−１、ｋｏｆｆ（Ｓｌ−Ａ４）＝８.３６・１０-５Ｓ−１、ｋｏｆｆ（ＵＳ７）＝２５.２・１０-５Ｓ−１）。しかし、全体のＫＤ値は、Ｓ１−Ａ４の場合は１.７４ｎＭ及びＵＳ７の場合は１.２５ｎＭとして非常に類似している。
【図９】図９は、チオフラビンＴ凝集アッセイで試験されたＬｃｎ２突然変異タンパク質Ｓ１−Ａ４及びＵＳ７の機能活性を示す。１００μＭのＡβ４０は、３７℃において振とうせずに、１０μＭのＵＳ７、Ｓ１−Ａ４、及び野生型（ｗｔ）リポカリンで、又はＰＢＳで培養された。指定された時点でそれぞれ採取した２０μｌの各サンプルは、１８０μｌの５μΜチオフラビンＴと混合され、蛍光が４５０ｎｍの励起波長及び４８２ｎｍの発光波長で測定された。Ｌｃｎ２突然変異タンパク質ＵＳ７は、１:１０の比率（ＵＳ７:Ａ４０）で凝集の強力な抑制作用を示す。Ｓ１−Ａ４はこの比例で凝集を著しく抑制できないが、１:２の比率（８１-Ａ４:Ａβ４０）で（図示せず）明確な抑制作用を発揮した。野生型Ｌｃｎ２は、Ａβ凝集に対する抑制効果を解明しなかった。
【図１０】図１０は、イオン交換クロマトグラフィーで処理された組み換え型ＥＤ−Ｂ（ｌａｎｅ１）、ＦＮ７Ｂ８（ｌａｎｅ２）クマシーブリリアントブルー、及びＦＮ７８９（ｌａｎｅ３）の、クマシーブリリアントブルーで染色した後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。すべてのサンプルは、２-メルカプトエタノールによって還元された。Ｍ:分子量マーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【図１１】図１１は、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ親和性精製したＬｃｎ２突然変異タンパク質Ｎ７Ａ（ｌａｎｅ１）、Ｎ７Ｅ（ｌａｎｅ２）、Ｎ９Ｂ（ｌａｎｅ３）、及びＮ１０Ｄ（ｌａｎｅ４）の、クマシーブリリアントブルーで染色した後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。すべてのサンプルは、２-メルカプトエタノールによって還元された。Ｍ:分子量マーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｓｔ． Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【図１２】図１２は、ＥＬＩＳＡにおける結合活性を示す。マイクロタイタープレートは、精製したタンパク質ＦＮ７Ｂ８及びＦＮ７８９でコーティングされ、選択したＬｃｎ２突然変異タンパク質の希釈系列で培養され、続いてストレプトアビジン−アルカリ−ホスファターゼ結合及びｐＮＰＰ基質で検出された。組み換え型Ｌｃｎ２突然変異タンパク質Ｎ７Ａ、Ｎ９Ｂ、及びＮ１０Ｄは、ＥＤ−Ｂが欠失して、且つ陰性対照として機能することで、このアッセイにおいてＦＮ７８９に対して無視できるシグナルを解明した。
【図１３】図１３は、Ｂｉａｃｏｒｅ計測器で測定されたＬｃｎ２突然変異タンパク質Ｎ９Ｂの動態実時間解析を示す。ＦＮ７Ｂ８は、アミン化学によってＣＭＤ２００ｍセンサーチップ（ＡＲＵ＝５００）に連結され、精製されたＬｃｎ２突然変異タンパク質は種々の濃度で適用された。いずれの場合にも、測定信号はグレイラインとして示されるのに対して、曲線適合はブラックラインとして示される。この一連の曲線から決定された速度定数は表２（実施例１７）に記載される。
【図１４】図１４は、Ｂｉａｃｏｒｅ計測器で測定されたＬｃｎ２突然変異タンパク質Ｎ７Ｅの動態実時間解析を示す。ＦＮ７Ｂ８は、アミン化学によってＣＭＤ２００ｍセンサーチップ（ＡＲＵ＝５００）に連結され、精製されたＬｃｎ２突然変異タンパク質は種々の濃度で適用された。いずれの場合にも、測定信号はグレイラインとして示されるのに対して、曲線適合はブラックラインとして示される。この一連の曲線から決定された速度定数は表２（実施例１７）に記載される。
【図１５】図１５は、Ｂｉａｃｏｒｅ計測器で測定されたＬｃｎ２突然変異タンパク質Ｎ７Ａの動態実時間解析を示す。ＦＮ７Ｂ８は、アミン化学によってＣＭＤ２００ｍセンサーチップ（ＡＲＵ＝５００）に連結され、精製されたＬｃｎ２突然変異タンパク質は種々の濃度で適用された。いずれの場合にも、測定信号はグレイラインとして示されるのに対して、曲線適合はブラックラインとして示される。この一連の曲線から決定された速度定数は表２（実施例１７）に記載される。
【図１６】図１６は、Ｂｉａｃｏｒｅ計測器で測定されたＬｃｎ２突然変異タンパク質Ｎ１０Ｄの動態実時間解析を示す。ＦＮ７Ｂ８は、アミン化学によってＣＭＤ２００ｍセンサーチップ（ＡＲＵ＝５００）に連結され、精製されたＬｃｎ２突然変異タンパク質は種々の濃度で適用された。いずれの場合にも、測定信号はグレイラインとして示されるのに対して、曲線適合はブラックラインとして示される。この一連の曲線から決定された速度定数は表２（実施例１７）に記載される。
【図１７】図１７は、ヒトＬｃｎ２突然変異タンパク質に指定された、Ｓｌ−Ａ４（配列番号:３９）、ＵＳ７（配列番号：４１）、Ｈｌ−Ｇｌ（配列番号:４３）、Ｎ７Ａ（配列番号:２０）、Ｎ７Ｅ（配列番号:２２）、Ｎ９Ｂ（配列番号:２４）、及びＮ１０Ｄ（配列番号:２６）とＬｃｎ２との配列アラインメントを示す。配列の下方における最後の一列は、リポカリンの二次構造特性（Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０６， ８１９８−８２０３）を示す。
【図１８】図１８は、Ｌｃｎ２突然変異タンパク質ＨＩＧＡ及びＨＩＧＶ（Ａ）のＳＥＣ溶出プロフィールのオーバーレイと、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）によって精製されたタンパク質の分析とを示す。その２つのＬｃｎ２突然変異タンパク質ＨＩＧＡ及びＨＩＧＶは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３において発現し、且つＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ親和性クロマトグラフィーによって精製された。両方の突然変異タンパク質は、主に単量体タンパク質としてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ１０／３０ｃｏｌｕｍｎから１０ｍｌ〜１１ｍｌの保持容量で溶出した。ピーク強度は突然変異タンパク質の発現量によって異なる。（Ｂ）はＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ親和性精製及びＳＥＣで処理された、組み換え型Ｌｃｎ２突然変異タンパク質Ｈｌ−Ｇｌ、ＨＩＧＡ及びＨＩＧＶの１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。全ての３つのＬｃｎ２突然変異タンパク質は、２-メルカプトエタノールで還元条件において示される。Ｍは分子量マーカーを表す。
【図１９】図１９は、Ｌｃｎ２突然変異タンパク質ＨＩＧＡ、ＨＩＧＶ、及びＨｌ−ＧｌがキャプチャーＥＬＩＳＡｓにおいてビオチニル化Ａβ標的Ａβ４０（Ａ）及びＴｒｘ−Ａβ２８（Ｂ）との結合活性を示す。ＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｉｍｍｏは１０ｇ／ｍｌをマイクロタイタープレートに固定され、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩによって１μＭＬｃｎ２突然変異タンパク質の獲得に用いられる。希釈系列に適用されたビオチニル化標的の結合は、その後、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ／ＡＰによる培養及び後続のｐＮＰＰとの発色反応によって検出された。ビオチニル化オボアルブミン（Ｏｖａ）及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）は陰性対照として用いられ、Ｌｃｎ２突然変異タンパク質との結合がないと示される（図示せず）。そのデータは一価結合モデルに適合される。Ａβ４０に対して決定されるＫＤ値は、ＨＩＧＡの場合は４.２ｎｍ、Ｈ１ＧＶの場合は４.９ｎＭ、Ｈｌ−Ｇｌの場合は２１.５ｎＭであり、Ｔｒｘ−Ａβ２８に対応する値はそれぞれ３.８ｎＭ、４.２ｎｍ、及び２４.４ｎＭである。
【図２０】図２０は、ＢｉａｃｏｒｅＸ計測器によって２０μｌ／ｍｉｎの流量で測定されたＬｃｎ２突然変異タンパク質ＨＩＧＡ（Ａ）及びＨ１ＧＶ（Ｂ）の動態実時間解析を示す。ＭＢＰ-Ａβ４０融合タンパク質は、アミン化学によってＣＭＤ２００Ｉチップ（ＡＲＵ＝１３１６）に連結され、精製されたＬｃｎ２突然変異タンパク質のそれぞれは一連の様々な濃度で適用された。いずれの場合にも、測定信号はグレイラインとして示されるのに対して、曲線適合はブラックラインとして示される。両方の突然変異タンパク質のｋｏｎ及びｋｏｆｆ速度は以下のように計算される。即ち、ｋｏｎ（ＨｌＧＡ）＝５.７７・１０４Ｍ−１Ｓ−１、ｋｏｎ（ＨｌＧＶ）＝６.８４・１０４Ｍ−１Ｓ−１、ｋｏｆｆ（ＨｌＧＡ）＝２.７５・１０-５Ｓ−１、ｋｏｆｆ（ＨｌＧＶ）＝７.２６・１０-５Ｓ−１。全体のＫＤ値は、ＨＩＧＡの場合は０.４７６ｎＭ、Ｈ１ＧＶの場合は１.０６ｎＭである。
【図２１】図２１は、高濃度で測定されたトレースのために延長した解離時間を用いて固定されたＡβ４０によって、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００計測器で測定されたＬｃｎ２突然変異タンパク質ＨＩＧＡの動態実時間解析を示す。標的ペプチドＡβ４０は、アミン化学によってＢｉａｃｏｒｅＣＭ５チップ（ＡＲＵ＝３２５）に連結され、精製されたＬｃｎ２突然変異タンパク質ＨＩＧＡは３０μｌ／ｍｉｎの流量で適用された。低いｋｏｆｆ速度を正確に測定するため、解離は試験された最高濃度で７２００s行われ、ｋｏｎ速度はＬｃｎ２突然変異タンパク質ＨＩＧＡの希釈系列を用いて３００sの会合及び解離時間で測定された。ＨＩＧＡの動態値は以下のように決定される。即ち、ｋｏｎ＝１.２５・１０５Ｍ−１Ｓ−１、ｋｏｆｆ＝１.１８・１０-５Ｓ−１、ＫＤ＝０.０９５ｎＭ。
【図２２】図２２（Ａ）は、チオフラビンＴ凝集アッセイで試験されたＬｃｎ２突然変異タンパク質ＨＩＧＡの機能活性を示す。５００μｌの１ｍｇ／ｍｌ単量体Ａβは、異なるモル比のＬｃｎ２突然変異タンパク質ＨＩＧＡの欠失又は存在下で、３７℃にて０.５ｘＰＢＳにおいて攪拌しながら培養された。凝集反応は３連で調製された。蛍光測定のために定期的な間隔で採取した２０μｌのサンプルは、それぞれ０.５ｘＰＢＳにおいて５０μＭの終末濃度で１８０μｌＴｈＴと混合され、４５０ｎｍの励起波長及び４８２ｎｍの発光波長で分析された。Ｌｃｎ２突然変異タンパク質ＨＩＧＡは、等モル比で凝集の強力阻害作用を示す。１０：２（Ａβ４０：Ｈ１ＧＡ）のサブモル比で、凝集は依然として大幅に減少した。（Ｂ）は対照的に、陰性対照として等モル量のＢＳＡもＬｃｎ２もないものは、Ａβ４０の凝集に対する抑制作用を持っている。
【図２３】図２３は、異なるＥＬＩＳＡセットアップ及びＬｃｎ２突然変異タンパク質ＨＩＧＡ及びＨ１ＧＶに対する表面プラズモン共鳴測定で検出されたＫＤ値をまとめた図である。
【図２４】図２４は、Ｌｃｎ２突然変異タンパク質Ｓ１−Ａ４（配列番号:３９）、ＵＳ７（配列番号：４１）、Ｈｌ−Ｇｌ（配列番号：４３）、Ｈ１ＧＡ（配列番号：５０）、Ｈ１ＧＶ（配列番号：５２）、Ｎ７Ａ（配列番号：２０）、Ｎ７Ｅ（配列番号：２２）、Ｎ９Ｂ（配列番号：２４）、及びＮ１０Ｄ（配列番号：２６）とＬｃｎ２（配列番号：４４）との配列アラインメントを示す。
【図２５】図２５は、突然変異タンパク質Ｈ１ＧＡ（配列番号：５０）及びＨ１ＧＶ（配列番号：５２）とそれらの前駆体Ｈｌ−Ｇｌ（配列番号：４３）及びｗｔＬｃｎ２（配列番号：４４）との相互配列アラインメント。
【図２６】図２６は、ＥＬＩＳＡにおいてＬｃｎ２変異Ｎ７ＥのＦＮ７Ｂ８に対する特異的な結合活性を示す。マイクロタイタープレートは、ＦＮ７Ｂ８、ＦＮ７８９、ＢＳＡ又はオボアルブミンでコーティングされ、Ｎ７Ｅの希釈系列によって培養され、続いてストレプトアビジン−アルカリ−ホスファターゼ結合及びｐＮＰＰ基質で検出された。Ｌｃｎ２変異Ｎ７Ｅは、このアッセイにおいてＦＮ７８９、ＢＳＡ、及びオボアルブミンに対して無視できるシグナルを解明した。
【図２７】図２７は、ＢｉａｃｏｒｅＸ計測器によって測定されたＬｃｎ２変異Ｎ７Ａ（Ａ）、Ｎ７Ｅ（Ｂ）、Ｎ９Ｂ（Ｃ）、及びＮ１０Ｄ（Ｄ）の動態実時間解析を示す。単一のフィブロネクチンドメインＥＤ−Ｂは、アミン化学によってＣＭＤ２００ｍセンサーチップ（ＡＲＵ＝１８０）に連結され、精製されたＬｃｎ２変異は、種々の濃度で適用された。測定信号は、曲線適合とともにトレースとして示される。これらのセンサーグラムから決定された速度定数は表３（実施例２４）に記載される。
【図２８】図２８は、Ｌｃｎ２変異Ｎ７Ａ（Ａ）、Ｎ１０Ｄ（Ｂ）、Ｎ９Ｂ（Ｃ）、及びＮ７Ｅ（Ｄ）の分析用サイズ排除クロマトグラフィーを示す。アフィニティー精製したタンパク質は、ＴＢＳと平衡されてスーパーデックスＳ７５ １０／３０ カラムに適用された。矢印は、カラムの排除体積（６.７ｍｌ）を示す。分析用ゲルろ過は、４つのＬｃｎ２変異のそれぞれに対して顕著なピークを生じさせる。そのタンパク質の見掛け分子量は、Ｎ７Ａの場合は２１.０ｋＤａ、Ｎ１０Ｄの場合は２１.３ｋＤａ、Ｎ９Ｂの場合は２１.７ｋＤａ、Ｎ７Ｅの場合は２１.７ｋＤａであり、単量体形態のみ存在することが示される。
【発明を実施するための形態】
【０１５２】
（実施例１）
突然変異体Ｌｃｎ２ファージディスプレイライブラリの構造
Ｌｃｎ２変異のコンビナトリアルライブラリは、クローン化cＤＮＡ（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １７６４， １６１−１７３）に基づいて生成された。そのクローン化cＤＮＡは、シングル不対チオール側鎖（Ｇｏｅｔｚ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９， １９３５−１９４１）を除去するためにアミノ酸置換Ｃｙｓ８７Ｓｅｒを運ぶとともに、第２のＢｓｔＸｌ制限酵素認識部位を導入するためにアミノ酸置換Ｇｌｎ２８Ｈｉｓを運んだ。この領域の突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アセンブリは、基本的に（Ｂｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６， １８９８−１９０３、 Ｓｋｅｒｒａ （２００１） Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４， ２５７−２７５）に公開された方法に従って行っており、このとき、図１に示すように、オリゴデオキシヌクレオチド（配列番号:１-１０）とのワンポット増幅反応を使用した。オリゴデオキシヌクレオチドは、配列番号:１-４のプライマーがコード鎖に対応してかつそれぞれアミノ酸位置３６、４０、４１、４９、５２、６８、７０、７２、７３、７７、７９、８１、９６、１００、１０３、１０６、１２５、１２７、１３２、又は１３４で縮重したコドンを運ぶ一方、配列番号:５-８のプライマーが非コード鎖に対応して且つ縮重したコドンやアンチコドンを運ばないように設計された。配列番号:９及び配列番号:１０の２つの隣接するプライマーは、過剰に使用され、組み立てられたランダム化遺伝子フラグメントの増幅に役立つ。上記のように（Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９７， １１０５−１１２０）、全てのＰＣＲステップは、Ｇｏ−ＴａｑホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。
【０１５３】
縮重したコドンを運ばないオリゴデオキシヌクレオチドは、ＨＰＬＣグレードでＭｅｔａｂｉｏｎ（Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入された。ＮＮＫ含有オリゴデオキシヌクレオチドは、同じベンダーから脱塩して得られ、さらに尿素ＰＡＧＥによって精製された。得られたＤＮＡライブラリは、ＢｓｔＸＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で切断され、ファージミドベクターｐｈＮＧＡＬ１０２（配列番号:１１）にクローニングされた。ここで、ファージミドベクターｐｈＮＧＡＬ１０２は、遺伝子発現ベクターｐＡＳＫｌ ｌ ｌ（Ｖｏｇｔ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ （２００１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇｎｉｔ． １４ （１）， ７９-８６）に基づいて、ＯｍｐＡシグナルペプチド、アンバーコドンに続く変性された成熟Ｌｃｎ２、及び糸状バクテリオファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩ外被タンパク質におけるＣ末端フラグメントからなる融合タンパク質、即ち、上記のようなビリン結合タンパク質（Ｂｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ、 Ｓｋｅｒｒａ， ｓｕｐｒａ）に類似する融合タンパク質をコードした。８．４μｇの消化ＰＣＲ産物と９４μｇの消化プラスミドＤＮＡとのライゲーション混合物によってＥ．ｃｏｌｉ ＸＬｌ−Ｂｌｕｅ（Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９８７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５，３７６−３７８）をエレクトロポレーションした後、１ｘ１０１０の形質転換細胞を得た。
【０１５４】
また、図２に示されるクローニングされた合成Ｌｃｎ２ランダムライブラリは、Ｓｌｏｎｉｎｇ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＧｍｂＨ（Ｐｕｃｈｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られた。その２つのＢｓｔＸＩ制限酵素認識部位に挟まれた中央遺伝子カセットは、適切なプライマー（配列番号:９及び配列番号:１０）を用いて２０サイクルでＰＣＲを介して増幅するとともに、１．７ｘ１０１０の独立した形質転換細胞に対応して複雑性を有するライブラリが得られるｐｈＮＧＡＬ１０８（配列番号:１２）にサブクローニングした。遺伝子発現ベクターｐＡＳＫ７５（Ｓｋｅｒｒａ （１９９４） 遺伝子 １５１、１３１〜１３５）に基づくｐｈＮＧＡＬ１０８は、ＯｍｐＡシグナルペプチド、変性した成熟Ｌｃｎ２、及びアンバーコドンに続くＳｔｒｅｐ−ｔａｇ、及び糸状バクテリオファージＭ１３（Ｖｏｇｔ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ （２００４） ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ５， １９１−１９９）の全長の遺伝子ＩＩＩ外被タンパク質からなる融合タンパク質をコードした。
【０１５５】
ライブラリ生成に次のステップは、Ｌｃｎ２ライブラリの両方に対して同様に行われた。ファージ錠剤の融合タンパク質としてリポカリン突然変異タンパク質ライブラリをそれぞれコードするｐｈＮＧＡＬ１０２又はｐｈＮＧＡＬ１０８の基質にナナフシのベクターと形質転換された細胞を含む１００ｍｌの培養物は、無菌三角フラスコに移され、抗生物質選択圧がない２ＹＴ培地において、１６０ｒｐｍ、３７℃で１時間培養した。ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージによって感染する前に、培養物は、対応する抗生物質を添加し、０．６のＯＤ５５０に達するまで同一の条件下でさらに培養することことで、２ＹＴ培地において０．１のＯＤ５５０に希釈した。約１０の感染の多重度でＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＵＳＡ）によって感染された後、その培養物は、３７℃、１００ｒｐｍでさらに３０分間振り混ぜた。その後、培養器温度が２６℃に低下させて且つシェーカー速度が再び１６０ｒｐｍに増加させ、２５μｇ／ｌ（ジメチルホルムアミドに２００μｇ／ｍｌの原液１２５μｌ、培養物１リットル当たりのＤＭＦ）のアンヒドロテトラサイクリン（ＡＣＲＯＳ Ｏｒｇａｎｉｃｓ， Ｇｅｅｌ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）を添加することによって遺伝子発現を誘導した後、１０分間後でカナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を添加した。培養は２６℃、１６０ｒｐｍでさらに１２時間〜１５時間続いた。
【０１５６】
完全培養物からの細胞を遠心分離（３０分間、１８０００ｇ、４℃）によって沈殿させた。ファージミド粒子を含む上清は、滅菌濾過（０.４５μＭ）され、１／４量の２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、１５％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌと混合され、さらに氷上で少なくとも２時間培養した。遠心分離（３０分間、１８０００ｇ、４℃）した後、１リットルの培養物から沈殿したファージミド粒子を、５０ｍＭのベンズアミジン（Ｓｉｇｍａ）及び１μｇ／ｍｌのペファブロック（Ｒｏｔｈ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれる冷ＢＢＳ／Ｅ（２００ｍＭのホウ酸ナトリウム、１６０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０））３０ｍｌに溶解させた。溶液を１時間氷上で培養した。未溶解成分（１０分間、４３０００ｇ、４℃）を遠心分離した後、各上清を新しい反応容器に移した。
【０１５７】
１／４量の２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、１５％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌを加え、ファージミドがアリコートされたまでファージミド粒子を再沈殿させるように氷上で６０分間培養し、さらに貯蔵するために−８０℃で凍結した。最初の選択サイクルファージミドを解凍して遠心分離（３０分間、３４０００ｇ、４℃）させるため、上清を除去し、沈殿したファージミド粒子を５０ｍＭベンズアミジンが含まれるＰＢＳ合計で４００μｌに溶解させ混合した。氷上で３０分間培養した後、残留凝集物を除去するために溶液を遠心分離し（５分間、１８５００ｇ、４℃）、さらに上清をファージディスプレイ選択に直接に用いた。
（実施例２）
異なるフォーマットでＡβ標的の調製
成熟β−アミロイド配列（Ｄｏｄｅｌ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２， ２１５−２２０）のアミノ酸１〜４０に対応するＡβ４０ペプチド（配列番号:２９）は、リジンスペーサ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を介して接続されたＣ末端ビオチン基を有するとともに非標識の形（Ｗ． Ｍ． Ｋｅｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＵＳＡ）で凍結乾燥されたペプチドの合成品として購入された。均一単量体のＡβ４０は５ｍｇ以下のペプチドを０.５ｍｌの１,１,１,３,３,３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ、 Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に室温で少なくとも０.５時間溶解させることによって得られた。その後、ＨＦＩＰをＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器で蒸発させ、Ａβ４０は冷水で１５分間超音波処理（Ｂａｎｄｅｌｉｎ， Ｓｏｎｏｒｅｘ， ＲＫ１００， Ｇｅｒｍａｎｙ）された後、適当量の蒸留水に溶解した。０.２２μＭフィルター（Ｓｐｉｎ−Ｘ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｔｕｂｅ ｆｉｌｔｅｒ、 Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＵＳＡ）ろ過した後、タンパク質の濃度は、１４９０Ｍ−１ｃｍ−１の計算された吸光係数を用いて２８０ｎｍで吸収測定によって検出された（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００３） ＥｘＰＡＳｙ: ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｉｎ−ｄｅｐｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１， ３７８４−３７８８， ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）。
【０１５８】
Ｎ−末端ペプチドＡβ１-１１（配列番号:３０）及び中央ペプチドＡβ１６-２７（配列番号:３１）のようなβ−アミロイドペプチドの短いバージョンは、また、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。これらの短いバージョンは、予めＨＦＩＰ処理されなかった選択のバッファーに溶解した。
【０１５９】
合成ペプチドに加えて、異なる組み換え型Ａβ融合タンパク質をコードする２つのベクターは、細菌発現の目的で構成された。即ち、その１つは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ，ｐＭＢＰ−Ｈｉｓ，配列番号:３２）を有する融合タンパク質はＨｏｒｔｓｃｈａｎｓｋｙら（（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １４， １７５３−１７５９）によって構成され、ｐＡＳＫ７５−ＭＢＰ−Ａｂｅｔａ４０（配列番号:３３）を得た。もう１つは、成熟アミロイド ペプチドのアミノ酸１〜２８がチオレドキシン（Ｔｒｘ， ｐＡＳＫ７５−ＴｒｘＨ６, 配列番号:３５）の活性部位ループに挿入されたｐＡＳＫ７５−ＴｒｘＡｂｅｔａ２８Ｈ６（配列番号:３４）は、Ｍｏｒｅｔｔｏら（（２００７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８２１１４３６−１１４４５）によって構成された。
【０１６０】
マルトース結合タンパク質の遺伝子でフレームに延長したＮ末端を運ぶヒトＡβ４０の連続クローニングは、ベクターｐＡＳＫ７５（Ｓｋｅｒｒａ （１９９４）Ｇｅｎｅ １５１， １３１−１３５）の誘導体である新たなプラスミドｐＡ８Ｋ７５−ＭＢＰ−Ａβ４０を得られた。このベクターは、簡易なタンパク質精製のためのＨｉｓ６−ｔａｇ、融合タンパク質を切断するためのタバコエッチ病ウィルス（ＴＥＶ）認識部位、及びヒトＡβ４０の配列が付けられるマルトース結合タンパク質の融合タンパク質をコードした。そのベクターは、テトラサイクリンプロモーター／オペレーターシステムの厳密な制御下にあり、高収率でＥ．ｃｏｌｉの細胞質に融合蛋白質の発現を可能にする。
【０１６１】
成熟アミロイドペプチド（Ａβ２８）のアミノ酸 １〜２８をコードする配列は、ベクターｐＡＳＫ７５−Ｔｒｘ−Ａｂｅｔａ２８Ｈ６が得られるチオレドキシン（ヌクレオチド位置９９〜１０５、アミノ酸残基３４及び３５に対応する）の活性部位ループにおけるユニークなＣｐｏｌ部位によって、チオレドキシンループに挿入された。
【０１６２】
Ａβ融合タンパク質、Τｒｘ−Ａβ２８、及びＭＢＰ-Ａβ４０は、ともに非融合制御タンパク質Ｔｒｘ 及びＭＢＰと同様に、３７℃でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３ （Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８５）Ｇｅｎｅ ３３， １０３−１１９）において発現した。タンパク質発現は、２００μｇ／ｌのアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ、 Ａｃｒｏｓ， Ｇｅｅｌ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）を加えて無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ, Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に溶解され、さらに攪拌しながら３時間継続的な培養されることによって、０.５の光学濃度ＯＤ５５０で誘導された。細胞は、４２００ｇで４℃ において２０分間遠心分離することによって回収された。２Ｌの培養物からの細胞ペレットを、２０ｍｌの溶解バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、得られた懸濁液をＦｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｅｌｌを介して３つの通路によって均質化させた。不溶性物質を遠心分離（３４５００ｇ、４℃、２０分間）で除去し、上清を０.４５μＭフィルター （Ｆｉｌｔｒｏｐｕｒ Ｓ ０．４５; Ｓａｒｓｔｅｄｔ， Ｎｕｅｍｂｒｅｃｈｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で濾過し、さらに各タンパク質のＨｉｓ６−ｔａｇによって親和性精製に用いた。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）で処理された融合タンパク質を、さらにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。
【０１６３】
タンパク質濃度は、ＭＢＰ（配列番号:３２）用６６３５０ Ｍ−１ｃｍ−１、ΜΒΡ−Ａβ４０（配列番号:３３）用６９３３０Ｍ−１ｃｍ−１、Τｒｘ−Ａβ２８ （配列番号:３４）用１５４７０Ｍ−１ｃｍ−１、及びＴｒｘ （配列番号:３５）用１３９８０Ｍ−１ｃｍ−１（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ）の計算された吸光係数を用いて２８０ｎｍでの吸収測定によって検出された。
【０１６４】
次の実験のためにＡβ融合タンパク質、ＴｒｘＡβ２８、ＭＢＰ-Ａβ４０は、ともに制御タンパク質として機能するオボアルブミン（Ｏｖａ、 Ｓｉｇｍａ− Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｔｒｘ、及びＭＢＰと同様に、モル比２:１（標識試薬: 標的タンパク質）でビオチン又はジゴキシゲニン（ＤＩＧ）によって標識された。
【０１６５】
そのため、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ ; Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ ; Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に溶解されたＤ−ビオチノイル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドエステル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）又はジゴキシゲニン−３−０−メチルカルボニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドエステル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を、タンパク質に対して２倍量モル比でＰＢＳ（４ｍＭ ＫＨ２Ｐ０４、１６ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４、１１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に加えた。その混合物を室温で１時間回転させた。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．０を１０ｍＭの終末濃度まで添加し、残留活性ＮＨＳエステル基を飽和させるように１０分間培養し、さらに標識されたタンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０ ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）でＳＥＣによって精製された。標的としてファージディスプレイ選択に用いられるために、まず、Τｒｘ−Ａβ２８をジゴキシゲニンでで、１時間標識し、その後、任意の不対Ｃｙｓ残基をブロックするするためにモルで５０倍過剰のヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えた後、１時間培養した。その後、変異したタンパク質を、１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．０で処理して上記のように精製した。
（実施例３）
ファージディスプレイによるＡβ４０ペプチドに対する親和性を有するＬｃｎ２突然変異タンパク質の選択
各パニングサイクルのために、ＰＢＳ（４ｍＭ ＫＨ２Ｐ０４、１６ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４、１１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）における約１０１２組み換え型ファージミドは、ＰＢＳ／Ｔ（０.１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０［ポリオキシエチレン ソルビタンラウリン酸モノエステルを含むＰＢＳ、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ］）において２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで１時間ブロッキングされた。５０の部分及び２５μＬのストレプトアビジン被覆電磁ビーズ懸濁液（Ｄｙｎａビーズ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ; Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ; Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）は、それぞれＰＢＳ／Ｔで洗浄され、さらにＰＢＳ／Ｔにおいて２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで１時間ブロックされた。２５のブロックされたビーズは、ビーズの特異的なファージミドを除去するためにブロックされたファージミドの前吸着に用いられ、５０のブロックされたビーズは、その後、選択サイクルに用いられる。
【０１６６】
ブロックされたファージミドを、洗浄され且つブロックされた２５のストレプトアビジン被覆磁気ビーズとともに３０分間培養した。ビーズは、その後、単一チューブ磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で２分間引き下ろされ、ビーズに結合しないファージミドを含有する上清は、全量４００μＬを１００ｎｍの実施例２からのビオチニル化されたＡβ４０で１〜２時間培養された。続いて、ファージミドとペプチド標的との混合物は５０のブロックされたビーズで０.５時間培養された後、単一チューブ磁気スタンで２分間引き下ろされた。非結合ファージミドを含有する上清を捨てた。電磁ビーズに結合した標的／ファージミド複合体は、４００μＬのＰＢＳ／Ｔで１０回洗浄された後、結合したファージミドは３５０μＬの０.１Ｍ、ｐＨ２．２グリシン／ＨＣｌで、１０分間回転しながら溶出し、続いて５５μＬの０.５Ｍトリス塩基で即時中和された。また、溶出は変性条件においてＰＢＳに４００μＬの４Ｍ尿素で３０分間行った後、１ｍｌのＰＢＳで希釈された。変性条件におて酸や尿素でされた溶出は選択サイクル１及び２に適用される一方、選択サイクル３及び４の溶出は、４００μＬの１００μＭ非ビオチニル化されたＡβ４０を結合したファージミドを有するビーズに加えて１時間回転させることによって競争条件において行った。合計で、４回の選択サイクルを行った。
【０１６７】
溶出したファージミドを増幅されるため、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅの指数増殖期培養物を３７℃で３０分間感染させた。残りのビーズに結合したファージミドは、指数増殖期のＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅを直接にそのビーズに加えることによって溶出した。４℃で遠心分離した後、細菌ペレットを適当量の２ｘ ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に再懸濁し、ＬＢ−Ｃａｍ ｐｌａｔｅｓ（１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ、３５ｍｇ／Ｌ クロラムフェニコール、ｐＨ７.５）に播種し、そして、３２℃で１４〜１６時間培養した。 次に、細胞をプレートから掻き取り、組換えファージミドの脱出や再増幅のために用いる。
【０１６８】
濃縮したファージミドプールのスクリーニングは、第４のパニングステップの後でスクリーニングＥＬＩＳＡ（実施例５）によって行った。
（実施例４）
ファージディスプレイによるＴｒｘ−Αβ２８融合タンパク質に対して親和性を有するＬｃｎ２突然変異タンパク質の選択
各パニングサイクルのために、まず、ＰＢＳ（４ｍＭＫＨ２Ｐ０４、１６ｍＭＮａ２ＨＰ０４、１１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４）における約１０１２の組み換え型ファージミドをサイクル１及び２のＰＢＳ／Ｔ（０.１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）に２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡで１時間ブロックした。選択サイクル３以降、ＰＢＳ/Ｔにおける２％（ｗ／ｖ）のスキムミルク（Ｓｕｃｏｆｉｎ， ＴＳＩ， Ｚｅｖｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）をブロッキング試薬として用いた。５０及び２５μＬのａｎｔｉ−ＤＩＧ−ＩｇＧ被覆電磁ビーズ懸濁液（Ｅｕｒｏｐａ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）は、ＰＢＳ/Ｔで洗浄され、ＰＢＳ／Ｔ又はスキムミルクに２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡでそれぞれ１時間ブロックした。
【０１６９】
ブロックされたファージミドを、洗浄され且つブロックされた２５μＬのａｎｔｉ-ＤＩＧ-ＩｇＧ被覆電磁ビーズとともに３０分間培養した。ビーズは、その後、単一チューブ磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で２分間引き下ろされ、ビーズに結合しないファージミドを含有する上清は、Ｔｒｘ特異的なファージミドを除去するために、１５μＭの実施例２からの非標識Ｔｒｘで３０分間培養された。実施例２からの、脱酸素され且つルボキシメチル化したＴｒｘ−Ａβ２８を、１００ｎＭの終末濃度まで加え、混合液を全量４００μＬで１時間〜２時間培養した。その後、ファージミドとＴｒｘとＴｒｘ−Ａβ２８との混合物を、５０μＬ部分からの乾燥且つブロックされたビーズで０.５時間培養した。ビーズ は、その後、単一チューブ磁気スタンドで２分間引き下ろされた。結合しないファージミドを含有する上清を捨てた。結合したファージミドを含有する電磁ビーズは５００μＬのＰＢＳ／Ｔで１０回洗浄された。 その後、結合したファージミドはＰＢＳに４００μＬの４Ｍの尿素で３０分間回転しながら溶出した後、１ｍｌのＰＢＳで希釈された。合計で、６回の選択サイクルを行った。
【０１７０】
溶出したファージミドを増幅されるために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅの指数増殖期培養物を３７℃で３０分間感染させた。残りのビーズに結合したファージミドは、指数増殖期のＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅを直接にそのビーズに加えることによって溶出した。４℃で遠心分離した後、細菌ペレットを適当量の２ｘ ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に再懸濁し、ＬＢ−Ｃａｍ ｐｌａｔｅｓ（１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ、３５ｍｇ／Ｌ クロラムフェニコール、ｐＨ７.５）に播種し、そして、３２℃で１４〜１６時間培養した。次に、細胞をプレートから掻き取り、組換えファージミドの脱出や再増幅のために用いる。
【０１７１】
濃縮したファージミドプールのスクリーニングは、第６のパニングステップの後でフィルタサンドイッチコロニースクリーニングアッセイ（実施例６）によって行った。
（実施例５）
スクリーニングＥＬＩＳＡによるＡβに対して特異性を有するＬｃｎ２突然変異タンパク質の同定
実施例３に示すように、Ａβ４０とファージミド選択の４つのサイクル後、Ｌｃｎ２突然変異タンパク質の濃縮したプールはｐｈＮＧＡＬ９８（配列番号:２７）にサブクローニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉスーパ株ＴＧ１−Ｆの形質転換に用いられ（ａ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＴＧＩ （Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １３１， ３５６５−３５７６）、そして、スクリーニングＥＬＩＳＡに供した。
【０１７２】
このため、濃縮したプールからの単一コロニーは、９６− ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ （Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ ９６ ｒｏｕｎｄ ｂｏｔｔｏｍ ｗｉｔｈ ｌｉｄ、 Ｓａｒｓｔｅｄｔ， Ｎｕｅｍｂｒｅｃｈｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）において、１００μＬのＴＢ−Ａｍｐ培地（１２ｇ／ＬのＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、２４ｇ／Ｌの  、５５ｍＭグリセロール、１７ｍＭのＫＨ２Ｐ０４、７２ｍＭのＫ２ＨＰ０４、１００ ｍｇ／Ｌのアンピシリン）に３７℃で一晩成長した。１００μＬのＴＢ−Ａｍｐ培地を有する新たなプレートに一晩培養した培養物を接種し、２２℃又は３７℃で指数増殖期まで成長させた。Ｌｃｎ２突然変異タンパク質のペリプラズム発現は、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｓｉｇｍａ− Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に溶解して、２０μＬの０.２μｇ／ｍｌアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ、 Ａｃｒｏｓ， Ｇｅｅｌ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって２０℃で１３〜１７時間誘導した。ペリプラズムタンパク質は、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有するＢＢＳ（８００ｍＭのホウ酸ナトリウム、６４０ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）４０μＬで４℃において、７５０ｒｐｍ（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔ， Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で１時間攪拌しながら培養することによって放出された。４０μＬの１０ ％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでＰＢＳ／Ｔ（４ｍＭのＫＨ２Ｐ０４、１６ｍＭのＮａ２ＨＰ０４、１１５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７.４、０.０５ ％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０）に４℃、７５０ｒｐｍで１時間ブロッキングした後、そのプレートを４ ℃、３０００ｇで１０分間遠心分離した。 その上清をＥＬＩＳＡに用いた。
【０１７３】
Ｃ末端のＳｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ （Ｓｃｈｍｉｄｔ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ （２００７） Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． ２， １５２８−１５３５）を運ぶＬｃｎ２突然変異タンパク質を選択的に獲得するために、９６−ｗｅｌｌＭａｘｉＳｏｒｐ ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ， Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ）は、１０μｇ／ｍｌのＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｉｍｍｏ （ＩＢ Ａ， Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）でＰＢＳに４℃において一晩コーティングされ、３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡでＰＢＳ／Ｔ（０．１ ％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０を有するＰＢＳ）に室温において１時間ブロックした。ＰＢＳ／Ｔで３回の洗浄ステップの後、上記するような１２０μＬの細胞抽出物をそれぞれのウエルに提供して３００ｒｐｍで１.５時間培養した。洗浄した後、実施例２からのビオチニル化されたＡβ４０を０.５μＭの濃度で加えて１時間培養した。コントロールとして、Ａβ４０の代わりにビオチニル化されたＯｖａを用いた。そのウエルを再び洗浄し、結合したビオチニル化ペプチド又はタンパク質 を、１:５０００希釈された５０μＬのＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ／ＡＰ接合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）でＰＢＳ／Ｔに１時間検出した後、１００μＬの０.５ｍｇ／ｍｌパラニトロフェニルリン酸塩（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下で、１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８.８、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２に１時間シグナル形成した。４０５ｎｍでの吸収はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ２５０ ｒｅａｄｅｒ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＳｕｎｎｙＶａｌｅ， ＵＳＡ）に測定された。
【０１７４】
また、実施例２からの０.５μＭの非ビオチニル化されたＡβ４０は、９６−ｗｅｌｌ ＭａｘｉＳｏｒｐポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ， Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で直接に固定されてブロッキングされた。上記のよな細胞抽出物によって培養して洗浄した後、結合したＬｃｎ２突然変異タンパク質は、１:１５００ 希釈されたＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ／ＡＰ接合物（ＩＢ Ａ， Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いるＳｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩによって検出された。コントロールとして、０.５μＭのＯｖａをＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅで固定した。
（実施例６）
フィルターサンドイッチコロニースクリーニングアッセイによるＴｒｘ−Ａβ２８に対して特異性を有するＬｃｎ２突然変異タンパク質の同定
実施例４に示すように、Ｔｒｘ−Ａβ２８とファージミド選択の６つのサイクル後、突然変異したＬｃｎ２遺伝子カセットは、ＢｓｔＸＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｓｔ． Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、プラスミドｐｈＮＧＡＬ１２４（配列番号: ４２）でサブクローニングされた。そのプラスミドｐｈＮＧＡＬ１２４（配列番号: ４２）は、ＯｍｐＡシグナルペプチドの融合物と、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ ＩＩ （Ｓｃｈｍｉｄｔ 及び Ｓｋｅｒｒａ （２００７） Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． ２， １５２８−１５３５）の後にアンバー終止コドンを有するＬｃｎ２コーディング領域と、連鎖球菌性のタンパク質Ｇ（Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ ら． （２０００） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９７， １１０５−１１２０）からのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）のための遺伝子とをコードする。
【０１７５】
その後、フィルターサンドイッチコロニースクリーニングアッセイを行った。ここでは、Ｌｃｎ２−ＡＢＤ融合タンパク質は、親水性フィルター膜（ＰＶＤＦ ｔｙｐｅ ＧＶＷＰ，０．２２μＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播かれたコロニーから放出され、Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら（（２０００） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２９７，１１０５-１１２０） に詳細に記載された手順で、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ， Ｓｉｇｍａ- Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりコートされた基礎の第２の膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ-Ｐ膜，０．４５μＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に機能的に捕獲された。この膜は、実施例２からの１００ｎＭのＤＩＧで標識されたＴｒｘ−Ａβ２８のＰＢＳ／Ｔ溶液を用いて１時間プローブされた。結合した標的接合体は、抗ＤＩＧ  Ｆａｂ／アルカリホスファターゼ（ＡＰ）接合体（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、続いて、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩、４−トルイジン塩（ＢＣＩＰ、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた発色反応により検出された。この膜における強い発色シグナルを用いてスポットを同定して、対応するコロニーが第１のフィルターから回収され、２次的なコロニースクリーンにおける対象比較のための増殖を行った。
【０１７６】
この目的のため、単離された細菌、及び野生型リポカリン等のコントロールＬｃｎ２突然変異タンパク質を発現する細菌は、新しい親水性の膜に点刻され、小さいコロニーが見えるまで増殖される。結合は、ＤＩＧで標識されたＴｒｘ−Ａβ２８、並びにＤＩＧで標識された制御タンパク質であるＴｒｘ及びＯＶａの両方で試験された。この２次的なスクリーンにおけるＴｒｘ−Ａβ２８標的のための特異的なシグナルを起こしたｌｃｎ２突然変異タンパク質は、さらにプラスミドの単離及びその後の配列分析のために増やされた。
（実施例７）
Ａβ及びＥＤ−Ｂに特異的なＬｃｎ２突然変異タンパク質の可溶性物質の生成及びその精製
組み換え型Ｌｃｎ２及びその突然変異タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（Ｓｔｕｄｉｅｒ及びＭｏｆｆａｔ（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９，１１３−１３０），Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ  （１９９０）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５４，１３０−１９７），Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ８３  （Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ  ら．（１９８５）  Ｇｅｎｅ  ３３，１０３−１１９）又はＥ．ｃｏｌｉ  ｓｕｐＥ  ｓｔｒａｉｎ  ＴＧ１−Ｆ（アクリジニウムオレンジを用いてそのエピソームから取り除かれたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＴＧＩの誘導体  ［Ｋｉｍら．  （２００９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３１，３５６５−３５７６］）におけるペリプラズム分泌により産生された。可溶性タンパク質の発現のために、成熟Ｌｃｎ２タンパク質を有するＯｍｐＡシグナルペプチド（配列番号：２８）とＣ末端Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩの融合体をコードするプラスミドｐｈＮＧＡＬ９８（配列番号：２７）が用いられた。そのプラスミドは、突然変異した遺伝子カセットの一方向性サブクローニングのための２つの互換性のないＢｓｔＸＩ制限酵素認識部位を有する。
【０１７７】
可溶性タンパク質は、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ（Ｓｃｈｍｉｄｔ及びＳｋｅｒｒａ  （２００７）  Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２，１５２８−１５３５）により、また、その後のＰＢＳバッファーを用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＨＲ  １０／３０カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりアフィニティー精製された。タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｆｌｉｎｇ及びＧｒｅｇｅｒｓｏｎ  （１９８６）  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １５５，８３−８８）により確認された。タンパク質濃度は、野生型Ｌｃｎ２（配列番号：４４）では３１４００Ｍ−１ｃｍ−１、Ａβ特異的突然変異タンパク質Ｈ１−Ｇ１（配列番号：４３）では２６９３０Ｍ−１ｃｍ−１、Ｓ１−Ａ４（配列番号：３８）では２４４１０Ｍ−１ｃｍ−１、及びＵＳ７（配列番号：４１）では２６９３０Ｍ−１ｃｍ−１の算出された吸光係数を用いた２８０ｎｍの吸収測定により決定された。ＥＤ−Ｂ特異的Ｌｃｎ２突然変異タンパク質の算出された吸光係数は、突然変異タンパク質Ｎ７Ａ（配列番号：２０）では３７９３０Ｍ−１ｃｍ−１、Ｎ７Ｅ（配列番号：２２）では２２９２０Ｍ−１ｃｍ−１、Ｎ９Ｂ（配列番号：２４）では２１４３０Ｍ−１ｃｍ−１、及びＮ１０Ｄ（配列番号：２６）では３９４２０Ｍ−１ｃｍ−１であった（上記Ｇａｓｔｅｉｇｅｒら  ）。
（実施例８）
ＥＬＩＳＡ試験における種々のＡβ標的の結合活性の測定
Ｃ末端Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩを有するＬｃｎ２突然変異タンパク質の選択的捕獲（Ｓｃｈｍｉｄｔ及びＳｋｅｒｒａ  （２００７）  Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２，１５２８−１５３５）のために、９６−ｗｅｌｌ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、１０μｇ／ｍｌ  ＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｉｍｍｏ（ＩＢＡ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）  のＰＢＳ溶液を用いて４℃で一晩中コートされ、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡのＰＢＳ／Ｔ溶液を用いて室温で１時間ブロッキングされた。ＰＢＳ／Ｔを用いた３回の洗浄ステップの後、実施例７からの精製されたＬｃｎ２突然変異タンパク質の１μＭ溶液５０μｌが１時間全てのＷｅｌｌにアプライされた。洗浄後、実施例２からのビオチニル化標的Ａβ４０、ΜΒΡ−Ａβ４０又はＴｒｘ−Ａβ２８の希釈系列の５０μｌが加えられ、１時間インキュベートされた。ここで、実施例２からのＯｖａ、ＭＢＰ及びＴｒｘのビオチニル化型は、陰性対照タンパク質として用いられた。Ｗｅｌｌは、再度洗浄され、結合した接合体は、５０μｌの１：５０００でＰＢＳ／Ｔにより希釈されたＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ／ＡＰ  接合体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１時間検出され、続いて、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．８，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中の０．５ｍｇ／ｍｌパラニトロフェニルリン酸塩（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）１００μｌの存在下でシグナルが生成された。４０５ｎｍでの吸収ΔΑ／Δｔのタイムコースは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ２５０リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＳｕｎｎｙＶａｌｅ，ＵＳＡ）で測定され、データは、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）を用いて以下の方程式に適合された。
ΔΑ＝ΔＡｍａｘｘ［Ｌ］ｔｏｔ／（ＫＤ＋［Ｌ］ｔｏｔ） 
上記式において、［Ｌ］ｔｏｔは、アプライされたリガンド接合体の濃度を表し、ＫＤは解離定数である（Ｖｏｓｓ及びＳｋｅｒｒａ（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０，９７５−９８２）。
【０１７８】
また、「直接」のＥＬＩＳＡのために、実施例２の２μΜ非標識Ａβ４０標的は、９６−ｗｅｌｌ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に吸着され、精製されたＬｃｎ２突然変異タンパク質と共にインキュベートされた。それは、１：１５００の比で希釈したストレプトアビジン／ＡＰ接合体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩを介して検出された。コントロールとして、実施例２の２μΜのＭＢＰがＥＬＩＳＡプレートに吸着された。４０５ｎｍの吸収は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ２５０  ｒｅａｄｅｒ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＳｕｎｎｙＶａｌｅ，ＵＳＡ）により測定された。
【０１７９】
また、「競合」のＥＬＩＳＡは、上記の「キャプチャー」と同様の方法で行われた。さらに、ＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｉｍｍｏの固定及び洗浄の後、実施例７の精製されたＬｃｎ２突然変異タンパク質の１μΜ溶液の５０μｌは、１時間、全てのｗｅｌｌにアプライされた。 洗浄後、実施例２のビオチニル化  標的Ｔｒｘ−Ａβ２８は、競合相手として種々の濃度の遊離非標識Ｔｒｘ−Ａβ２８標的の存在下において、５ｎＭ（Ｓ１−Ａ４）又は４０ｎｍ（ＵＳ７）の固定濃度でアプライされた。１００倍の過剰量を用いて開始して、競合相手の濃度は、３倍の段階希釈がなされた。この場合、そのデータは、下記のシグモイド式に適応された。
【０１８０】
ΔΑ＝（ΔＡｍａｘ−ΔＡｍｉｎ）／（１＋（［Ｌ］ｔｏｔｆｒｅｅＫＤ）ｐ）＋ΔＡｍｉｎ
この式では、更なるパラメータとして曲線の傾きｐ（Ｈｉｌｌ係数）を有する。
【０１８１】
以下の表１は、種々のＥＬＩＳＡ機構及び表面プラズモン共鳴（実施例９を参照）により決定されたＫＤ値をまとめている。
【０１８２】
（表１）
0005913120.tif 000002
（実施例９）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を介したＡβへの結合活性の測定
Ｌｃｎ２突然変異タンパク質のリアルタイム分析は、ランニングバッファーとしてＰＢＳ／Ｔ（０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で行われる。１０ｍＭ  Ｎａ酢酸塩，ｐＨ４．５に溶解した、実施例２のΜΒΡ−Ａβ４０の５０μｇ／ｍｌ溶液は、標準のアミンカップリング化学を用いてＣＭＤ２００Ｉチップ（Ｘａｎｔｅｃ，Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に固定されて、リガンド濃度は１４５５共鳴単位（ＲＵ）であった。実施例７の精製されたＬｃｎ２突然変異タンパク質のＳ１−Ａ４及びＵＳ７は、１０μＬ／ｍｉｎの流速で、２ｎＭから１２５ｎＭまでの濃度範囲でアプライされた。センサーグラムは、エタノールアミンを用いて活性化及び抑制されたコントロールチャンネルで測定された対応する信号を差し引くことにより校正された。キネティクスデータの評価は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアＶ  ３．０を用いてフィッティングすることにより行われた（Ｋａｒｌｓｓｏｎら．（１９９１）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５，２２９−２４０）。このステップの間、ｋｏｎ及びｋ０ｆｆの比率は、全体的にフィットされ、一方、最大反応差Ｒｍａｘは、各曲線に局所的にフィットされる。
（実施例１０）
ＳＰＯＴ膜におけるエピトープマッピングを介したＡβエピトープの決定
Ｌｃｎ２突然変異タンパク質Ｓ１−Ａ４及びＵＳ７のＡβエピトープのマッピングのためのＳＰＯＴ膜（Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧ５００−ＵＣ５４０シート，１００ｘ１５０ｍｍ，  Ｍａｖｉｓ，Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、ＭｕｌｔｉＰｅｐ  ＲＳ計測器（Ｉｎｔａｖｉｓ，Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び同一の販売業者から得た活性化アミノ酸を用いて、Ｆｒａｎｋ（（２００２）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６２１３−２６）に記載されているように、自動化手順で準備された。Ａβ４０のアミノ酸配列（配列番号：２９）は、一連のヘキサマー、デカマー及びペンタデカマーのそれぞれの１アミノ酸を転位して全体の配列をカバーして、膜において合成された。これらのペプチドのＣ末端は、膜に共有結合され、一方、それらのＮ末端は、アセチル化された。固定されたＳｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ  は、検出方法の陽性対照として用いられた。
【０１８３】
側鎖の脱保護は、９５％トリフルオロ酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、３％トリイソプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及び２％蒸留水を用いて２時間行われた。ジクロロメタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて４回、ジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２回、及びエタノールを用いて２回膜を洗浄した後、膜を空気乾燥した。
使用の前に、膜は、エタノールで１回、ＰＢＳ（４ｍＭ  ＫＨ２Ｐ０４，１６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰ０４，１１５ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ  ７．４）で３回洗浄し、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡのＰＢＳ／Ｔ溶液（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で１時間ブロッキングされた。ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した後、膜は、ＰＢＳ／Ｔに溶解されたＬｃｎ２突然変異タンパク質Ｓ１−Ａ４（５０ｎｍ）、ＵＳ７（１００ｎｍ）又は野生型Ｌｃｎ２（１００ｎｍ）と共に１時間インキュベートされ、ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄された。その後、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩを介したタンパク質検出のために、膜は、ＰＢＳ／Ｔが溶媒である１：１５００希釈されたストレプトアビジン／ＡＰ接合体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）と共に１時間インキュベートされた。その後、膜は、ＰＢＳ／Ｔで３回洗浄され、ＡＰバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ  ８．８，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で１回洗浄された後、Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら．（（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９７，１１０５−１１２０）に記載されているように、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩、４−トルイジン塩（ＢＣＩＰ、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＡＰバッファー溶液を用いて発色反応を行った。
【０１８４】
Ｓ１−Ａ４及び野生型Ｌｃｎ２のそれぞれとインキュベートされた膜を比較してＳ１−Ａ４と共に、野生型Ｌｃｎ２の非存在下で膜をインキュベートすることでのみ生じる明確なスポットが得られた。ペンタデカマーＡβ４０フラグメントで、ＬＶＦＦＡＥＤモチーフはＳ１−Ａ４の結合のために本質的であることが明らかとなった。より短ヘキサマー及びデカマーペプチド配列を用いて、Ｓ１−Ａ４に結合する最小のモチーフのＶＦＦＡＥＤ及びＦＦＡＥＤＶが検出された。Ｌｃｎ２突然変異タンパク質ＵＳ７は、このアッセイにおいて、非常に類似のエピトーププロファイルを示した。
（実施例１１）
ＴｈＴ凝集アッセイにおけるＡβへの親和性を有するＬｃｎ２突然変異タンパク質の機能分析
実施例２からの、可溶化され、均質な単量体の非ビオチニル化Ａβ４０に対して、様々なＬｃｎ２突然変異タンパク質の存在下又は非存在下において、チオフラビンＴ凝集アッセイを行った。チオフラビンＴ（ＴｈＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、β−シートリッチのアミロイド原線維及びオリゴマー前駆体に特異的に結合するが、Ａβペプチドに結合せず、それは、ＴｈＴ蛍光の増大を伴う（Ｋｈｕｒａｎａ  ら．（２００５）Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１５１，２２９−２３８）。
【０１８５】
そのため、ＴｈＴは１ｍＭの濃度になるように蒸留水に溶解された。希釈標準溶液は、５ｍＭグリシン／ＮａＯＨ，ｐＨ８．５を用いて１ｍＭ原液を５μΜの終末濃度にまで希釈することにより調製された。５００μｌの蒸留水に溶解された２００μΜ  Ａβ４０（実施例２に従って溶解）と実施例７のＰＢＳに溶解された２０μΜのＬｃｎ２突然変異タンパク質との１：１の混合液は、３７℃で撹拌することなくインキュベートされた。種々の時点における各蛍光測定の前に、サンプルは、短時間で１０回ボルテックスされ、２０μｌの各サンプルは、１８０μｌのＴｈＴ希釈標準溶液と混合された。蛍光強度は、発光分光計（ＬＳ５０Ｂ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）で、４５０ｎｍの励起波長及び４８２ｎｍの発光波長を用いて測定された。
【０１８６】
図９に示すように、Ｌｃｎ２突然変異タンパク質ＵＳ７は、１：１０の比率でＡβ４０の凝集の強力阻害作用を示した。
（実施例１２）
エキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）を含む組み換え型フィブロネクチンフラグメントの調製
ヒトフィブロネクチンの３つの異なる組み換え型フラグメントは、選択のための標的として用いられた：単独のエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂと呼ばれる、Ｚａｒｄｉら．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，６，２３３７−２３４２）、その隣接するドメイン７及び８に関連して同一のドメイン（ＦＮ７Ｂ８と呼ばれる）、並びに従来型ドメイン７、８及び９を含み、ＥＤ−Ｂを欠失しているＦＮ７８９（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａら．  （１９９６），  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６８，３９７−４０５、  Ｌｅａｈｙ  ら．  （１９９４）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９，４８−５４）。
【０１８７】
ＦＮ７Ｂ８、ＦＮ７８９及びＥＤ−Ｂコード配列は、ｐＡＳＫ７５（Ｓｋｅｒｒａ  （１９９４）  Ｇｅｎｅ  １５１，１３１−１３５）又はその誘導体ｐＡＳＧ−ＩＢＡ−３３  （ＩＢＡ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のベクターに基づいて，ｐＡＳＫ７５−ＦＮ７Ｂ８（配列番号：１３）、ｐＡＳＫ７５−ＦＮ７８９（配列番号：１７）、及び  ｐＡＳＧ−ＩＢＡ−３３−ＥＤＢ（配列番号：１５）ベクターのそれぞれを産生するようにクローニングされた。全てのコンストラクトは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＥＶＩＡＣ）を介して精製されるために、カルボキシ末端にＨｉｓ６タグが付けられ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１／Ｆ［Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＴＧＩの誘導体（Ｇｉｂｓｏｎ  （１９８４）  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＥｎｇＬａｎｄ）］  又はＢＬ２１（Ｓｔｕｄｉｅｒ及びＭｏｆｆａｔｔ  （１９８６），  １８９，  １１３−１３０）の細胞質における可溶性タンパク質として産生された。従って、発現プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉの２−Ｌインキュベートは、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地を用いて３７℃において、中間対数期で増殖された。２００μｇ／Ｌアンヒドロテトラサイクリン（Ａｃｒｏｓ，Ｇｅｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）の添加後に、増殖が３７℃で５時間から７時間続けられた。細胞は、遠心分離により濃縮され、３５ｍｌの氷冷クロマトグラフィーバッファー（４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ，  １Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）に再懸濁され、超音波処理（Ｓ２５０Ｄ，Ｂｒａｎｓｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ  ＣＴ，ＵＳＡ）により溶解された。
【０１８８】
以下の精製プロトコルは、３つ全ての組み換え型フィブロネクチンフラグメントにおいて同一である。清澄な溶解液は、１０ｍＭ  ＺｎＳ０４で充填され、４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ，１Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５で平衡化されたＺｎ２＋／ＩＤＡセファロースカラム  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｕｎｉｃｈ  Ｇｅｒｍａｎｙ）にアプライされた。結合したタンパク質は、０から３００ｍＭまでのイミダゾール（ＨＣ１を用いてｐＨが調整された）が溶解したクロマトグラフィーバッファー溶液の勾配を用いて溶出された。組み換え型タンパク質を含む分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定され、ＥＤＴＡを用いて１ｍＭの終末濃度に混合され、一晩中２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４で透析分離された。 その後、そのタンパク質は、２０又は４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ，ｐＨ７．４を用いて平衡化されたイオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にロードされた。結合したフィブロネクチンフラグメントを溶出するために、０から３００ｍＭまでのＮａＣｌ勾配が用いられた。
【０１８９】
最後に、タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びサイズ排除クロマトグラフィーにより確認された。２８０ｎｍにおける吸収の測定によりタンパク質の濃度を決定するために、続いて算出された吸光係数（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ  ら．（２００３）  ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１，  ３７８４−３７８８）が用いられた：ＦＮ７Ｂ８では３１，４００Ｍ−１ｃｍ−１、ＦＮ７８９では２８４２０Ｍ−１ｃｍ−１、及びＥＤ−Ｂでは１１４６０  Ｍ−１ｃｍ−１。通常、約１０から２０ｍｇの精製タンパク質が２−Ｌ振とうインキュベートで得られた。精製タンパク質は、４℃で保存され、全ての試験のために用いられた。
【０１９０】
精製フィブロネクチンフラグメントは、供給業者の説明書に従って、室温で１時間、過剰（４：１モル比）のジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドエステル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてジゴキシゲニン標識された。遊離ジゴキシゲニンを除去するために、タンパク質溶液は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，１１５  ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ７．５を用いて平衡化されたＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｍｕｎｉｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）にアプライされた。成功したジゴキシゲニン化及びタンパク質の完全性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＥＳＩ質量分析又は抗ジゴキシゲニン−ＡＰ，Ｆａｂフラグメント（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた染色を介したドットブロットにより確認された。
（実施例１３）
ファージディスプレイによるＥＤ−Ｂに対する親和性を有するＬｃｎ２変異体の選択
全部で４つのファージミドディスプレイ選択サイクルは、実施例１に記載されたように、Ｓｌｏｎｉｎｇ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨ  により最初に合成された合成遺伝子コレクションに基づくＬｃｎ２ランダムファージミドライブラリを用いて行われた。第１の選択サイクルのために、３００μｌのＴＢＳ／Ｅ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡに溶解され、５０ｍＭベンズアミジンが添加された約５×１０１２の組み換え型ファージミドは、０．４％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０［ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸モノエステル、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ］）を含むＴＢＳに溶解された８％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１００μｌ加えることにより３０分間ブロッキングされた。その後、この溶液は、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡのＴＢＳ／Ｔ（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）溶液により１時間ブロッキングされた抗ジゴキシゲニンＩｇＧ電磁ビーズ（Ｅｕｒｏｐａ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）と共に１時間インキュベートされ、４００μｌの０，１μΜジゴキシゲニン標識組み換え型ＦＮ７Ｂ８でチャージされた（実施例１２を参照）。
【０１９１】
磁石を用いてビーズを回収し、上清を除去した後、ＴＢＳ／Ｔを用いた１０回の洗浄ステップが行われ、結合維持したファージミドは４００μｌの０．１Ｍトリエチルアミン  （ｐＨ  調整せず）を用いて６分間の第１溶出が行われ、続いて、３５０μｌの０．１Ｍ  グリシン／ＨＣｌ，ｐＨ２．２を用いて８分間の第２溶出が行われた。溶出液は回収され、２Ｍ酢酸又は５０μｌの０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基の適量をそれぞれ組み合わせて用い、すぐに中和され、対数増殖期のＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬｌ−Ｂｌｕｅに移すために用いられた。ファージミドは、以下の公開されたプロトコル（Ｂｅｓｔｅら．（１９９９）ＰＮＡＳ  ９６，  １８９８−９０３、  Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら．（２０００）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９７  １１０９−２０）の次のパニングステップの前に、力価が上げられ、増幅された。
【０１９２】
第２回の選択のために、約２×１０−１２に増幅されたファージミドが用いられ、結合したファージミドの溶出は、４００μｌの２３１ｎｍｏｌ／ｍｌ遊離組み換え型ＥＤ−Ｂを用いた競合により７５分間行われた。
【０１９３】
第３及び第４の選択サイクルにおいて、約２×１０−１２に増幅されたファージミドは、１００ｎｍのジゴキシゲニン標識ＦＮ７Ｂ８を用いて１時間の第１インキュベートされた。 その後、ファージミド−抗原複合体は、抗ジゴキシゲニンＩｇＧ電磁ビーズに２０分間捕獲された。ＴＢＳ／Ｔを用いてビーズを１０回洗浄した後、結合したファージミドは、１４０から２３１ｎｍｏｌ／ｍｌまでの遊離組み換え型ＥＤ−Ｂ４００μｌによる競合により、室温で７５分間溶出された。
（実施例１４）
スクリーニングＥＬＩＳＡによるＥＤ−Ｂに対する親和性を有するＬｃｎ２変異体の選択
実施例１３に記載されたファージディスプレイ選択から生じた、標的タンパク質ＥＤ−Ｂに特異的に結合するＬｃｎ２突然変異タンパク質の濃縮は、スクリーニングＥＬＩＳＡ
により観察された。最後のパニングステップからのファスミドのプールされた調製液を用いて、突然変異遺伝子カセットが発現プラスミドｐｈＮＧＡＬ９８のＢｓｔＸＩを介してサブクローニングされた。それは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるペリプラズム生産のためのＯｍｐＡシグナルペプチドとＣ末端Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩを有するＬｃｎ２コーディング領域との融合体をコードする（Ｓｃｈｍｉｄｔ及びＳｋｅｒｒａ  （２００７）Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．２，１５２８−１５３５）。９６−ｗｅｌｌプレートにおける個々のＬｃｎ２突然変異タンパク質の可溶性発現は、以下のように行われた：１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１００μｌＴＢ培地（Ｔａｒｔｏｆ及びＨｏｂｂｓ（１９８７）Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｆｏｃｕｓ  ９，１２）に、ランダムに選択された単一コロニーが播かれ、３７℃で５時間振とう培養した（５００ｒｐｍから８００ｒｐｍ、  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  ｃｏｍｆｏｒｔ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。各クローンのために、１００μｌの新鮮培地に、この培養液の１０μｌを播き、３７℃で１時間から２時間振とう培養された後、２２℃まで温度を下げられた。２時間から４時間の更なる培養の後に、Ｌｃｎ２突然変異タンパク質の発現が、０．２μｇ／ｍｌアンヒドロテトラサイクリン（Ａｃｒｏｓ，Ｇｅｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を添加して１２時間から１４時間の対数増殖期細胞において誘導された。タンパク質のペリプラズム放出は、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む４０μｌの２×ＢＢＳ（０．２Ｍ  ホウ酸塩／ＮａＯＨ，１６０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）を加えて室温で１時間振とう培養することにより生じた。溶解液は、４０μｌの１０％ｗ／ｖ  ＢＳＡ（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＴＢＳ溶液及び０，５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて１時間ブロッキングされ、細胞破片は、１０分間の遠心分離により粗抽出物から除去された。
【０１９４】
ＦＮ７Ｂ８又はＦＮ７８９を９６−ｗｅｌｌ  Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）の表面に吸着するために、５０μｌのＴＢＳに溶解された１００μｇ／ｍｌタンパク質溶液が各ｗｅｌｌに加えられ、４℃で一晩中インキュベートされた。Ｅ．ｃｏｌｉからの粗抽出物への暴露の前に、ＴＢＳ／Ｔを用いた３回の洗浄ステップの後に、ｗｅｌｌはＴＢＳ／Ｔに溶解された２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて室温で３時間ブロッキングされ、繰り返し洗浄された。ＥＬＩＳＡのために、５０μｌの清澄な溶解液はｗｅｌｌにアプライされ、１時間インキュベートされ、続いて、ＴＢＳ／Ｔを用いて３回洗浄された。結合したＬｃｎ２突然変異タンパク質は、４−ニトロフェニルリン酸塩基質  （ｐＮＰＰ，  ０．５ｍｇ／ｍｌ、  ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ  ＧｍｂＨ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ８．８に溶解されたストレプトアビジン−アルカリ−ホスファターゼ結合体（ＴＢＳ／Ｔで１：１５００希釈、  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて検出された（実施例１６を参照）。
【０１９５】
４つのクローンは、このスクリーニングＥＬＩＳＡで同定された。後続の試験（実施例１６−１８を参照）において、それら４つのＬｃｎ２突然変異タンパク質は、ＥＬＩＳＡ、  ＳＰＲ分析、及び免疫蛍光顕微鏡でのＥＤ−Ｂポジティブヒト結腸癌細胞の観察により、ＦＮ７Ｂ８の特異的な結合活性をも示すことが分かった。これらＬｃｎ２突然変異タンパク質は、Ｎ７Ａ（配列番号：２０）、Ｎ７Ｅ（配列番号：２２）、Ｎ９Ｂ（配列番号：２４）及びＮ１０Ｄ（配列番号：２６）と呼ばれる。
（実施例１５）
Ｌｃｎ２及びその変異体の可溶性タンパク質の産生及び精製
詳細は実施例７を参照。
（実施例１６）
ＥＬＩＳＡにおけるＥＤ−Ｂへの結合活性の測定 
９６−ｗｅｌｌ  Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の表面へのＦＮ７Ｂ８又はＦＮ７８９の吸着のために、ＴＢＳ／Ｅに溶解された５０μｌの１００μｇ／ｍｌタンパク質溶液は、各ｗｅｌｌに加えられ、室温で２時間インキュベートされた。 さらに、コントロールタンパク質を含むために、ブランクｗｅｌｌは１２０μｌのＴＢＳ／ＥＴに溶解された２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に暴露された。３回の洗浄ステップの後に、ＴＢＳ／ＥＴに溶解された１２０μｌの２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて室温で２時間ブロッキングされ、繰り返し洗浄され、５０μｌの精製Ｌｃｎ２突然変異タンパク質の希釈系列が加えられ、１時間インキュベートされた。ｗｅｌｌは再度洗浄され、結合したＬｃｎ２突然変異タンパク質は、ＴＢＳ／Ｔで１：１５００希釈された５０μｌのストレプトアビジン−アルカリ−ホスファターゼ結合体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１時間検出され、続いて、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，１００  ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ  ８．８が溶媒である５０μｌの０．５ｍｇ／ｍｌパラニトロフェニルリン酸塩の存在下でシグナルを生成した。４０５ｎｍにおける吸収ΔΑ／Δｔの経時変化は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ２５０  リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＳｕｎｎｙＶａｌｅ，ＣＡ）で測定され、データはＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアを用いて下記の式に適応させた。 
【０１９６】
ΔΑ＝ΔＡｍａｘｘ［Ｌ］ｔｏｔ／（ＫＤ＋［Ｌ］ｔｏｔ）
この式において、［Ｌ］ｔｏｔはアプライされたリガンド接合体の濃度を表し、ＫＤは解離定数（Ｖｏｓｓ及びＳｋｅｒｒａ（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０，９７５−９８２）を表す。Ｌｃｎ２変異体Ｎ７Ａ、Ｎ９Ｂ及びＮ１０Ｄのそれぞれは、１４．８ｎＭ（Ｎ７Ａ）、４０．１ｎＭ（Ｎ９Ｂ）、３０．０ｎｍ（Ｎ７Ｅ）及び５１．２（Ｎ１０Ｄ）のＫＤ値でＦＮ７Ｂ８に特異的に結合するが、ＦＮ７８９又はＢＳＡに結合しないことが分かった。
（実施例１７）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を介した組み換え型フィブロネクチンＦＮ７Ｂ８への結合活性の測定
Ｌｃｎ２突然変異タンパク質のリアルタイム分析は、ランニングバッファーとして、ＨＢＳ／ＥＴ（０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ  ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いてＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で実行された。１０ｍＭ  Ｎａ酢酸塩，ｐＨ４．０が溶媒である２００μｇ／ｍｌ組み換え型ＦＮ７Ｂ８溶液は、標準のアミンカップリング化学（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ＣＭＤ２００ｍセンサーチップ（ＸａｎＴｅｃ  ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に固定されて、リガンド濃度は約５００共鳴単位（ＲＵ）であった。精製Ｌｃｎ２突然変異タンパク質は、２．５から最大で１６０ｎＭの濃度において、２５μｌ／ｍｉｎの流量でアプライされた。Ｔｈｅセンサーグラムは、コントロールチャンネルのために測定される対応するシグナルを差し引くことにより  校正された。それは、エタノールアミンを用いて活性化又は抑制された。キネティクスデータの評価は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアＶ４．１を用いた全体的なフィッティングにより行われた（Ｋａｒｌｓｓｏｎら．（１９９１）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５，２２９−２４０）。
（表２）表面プラズモン共鳴により測定された、選択したＬｃｎ２突然変異タンパク質のＦＮ７Ｂ８に対するキネティクス結合データ
0005913120.tif 000003
（実施例１８）
ＥＤ−ＢポジティブＣａＣｏ２細胞の免疫染色
ヒト結腸癌細胞（ＣａＣｏ２細胞は、Ｈ．Ｄａｎｉｅｌ，Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ｍｉｉｎｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙにより快く提供された；Ｐｕｊｕｇｕｅｔ  ら．，  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８，５７９−５９２）は、細胞コンフルエンスが約５０から７０％となるまで３７℃の湿気環境で、１０％ウシ胎児血清、１ｘ  ＭＥＭ非必須Ｌアミノ酸及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ）が添加されたＥａｒｌｅ塩及びＬ−グルタミンを含むＭＥＭにおいて、Ｎｕｎｃ  Ｌａｂ−ＴｅｋTM  ＩＩ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅTM  ｓｙｓｔｅｍ（各スライドに４つのチャンバ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で培養された。カバースライドに付着された細胞単層は、ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｃａ２＋及びＭｇ２＋非含有、  ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｐａｓｃｈｉｎｇ，  Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて洗浄され、続いて蒸留水で洗浄され、その後５μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む氷冷メタノールを用いて５分間固定及び対比染色された。
【０１９７】
全ての後続のインキュベーションは、暗室で行われた。固定化細胞は、洗浄され、５００μｌの１μΜ野生型Ｌｃｎ２、Ｌｃｎ２突然変異タンパク質、ＰＢＳ又はＥＤ−Ｂ特異的抗体ｓｃＦｖ−Ｌ１９（Ｐｉｎｉら．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２１７６９−２１７７６）を用いて１時間インキュベートされた。これらの試薬の全ては、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ融合タンパク質として精製された（上記Ｓｃｈｍｉｄｔ及びＳｋｅｒｒａ）。細胞はＰＢＳを用いて洗浄され、非標識抗体ＳｔｒｅｐＭＡＢｉｍｍｏ（ＰＢＳを溶媒として５μｇ／ｍｌ、ＩＢＡ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に１時間インキュベートされ、続いて、２回の洗浄ステップを行った。最後に、ＣａＣｏ２細胞に対する特異的な結合は、２次抗体としてＰＢＳで１：２００希釈された蛍光標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントＤｙｌｉｇｈｔ−４８８接合体  （Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）を用いて検出された。
【０１９８】
Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０  ＣＦＬ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）による観察において、全てのＬｃｎ２変異体及び抗体ｓｃＦｖ−Ｌ１９は、特異的な細胞染色を示した。その一方、組み換え型野生型Ｌｃｎ２及びＰＢＳは、このアッセイにおける無視できるシグナルを示した。
（実施例１９）
Ｈ１−Ｇ１の配列位置３６におけるフリーシステイン残基の置換によるＡβ特異的Ｌｃｎ２突然変異タンパク質Ｈ１ＧＡ及びＨ１ＧＶの生成
Ｃｙｓ３６は、部位特異的突然変異誘発によりＡｌａ又はＶａｌに置換された。そのために、ＰＣＲは縮重したオリゴデオキシヌクレオチドＤＨ−４（配列番号：４５）、第２のオリゴデオキシヌクレオチドＪ０８ｒｅｖ（配列番号：４８）、及び鋳型としてＬｃｎ２突然変異タンパク質Ｈ１−Ｇ１をコードするプラスミドＤＮＡ（配列番号：３７）を用いて行われた。増殖されたフラグメントは、発現プラスミドｐｈＮＧＡＬ９８におけるＢｓｔＸＩを介してサブクローニングされ、個々の置換変異体を同定するために配列決定された。アミノ酸置換の導入により生じたＬｃｎ２変異体は、Ｈ１ＧＡ（配列番号：４９，５０）及びＨ１ＧＶ（配列番号：５１，５２）と名付けられた。
（実施例２０）
高光学濃度を有するＥ．ｃｏｌｉ培養物を用いる新規のＡβ特異的Ｌｃｎ２突然変異タンパク質Ｈ１ＧＡ及びＨ１ＧＶの可溶性物質及びその精製
組み換え型Ｌｃｎ２及びその突然変異タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ８３におけるペリプラズム分泌により産生された。可溶性タンパク質の発現のために、Ｈ１ＧＡ（配列番号：４９）又はＨ１ＧＶ（配列番号：５１）のいずれかをコードする対応するＢｓｔＸＩ挿入を有するプラスミドｐｈＮＧＡＬ９８が用いられた。
【０１９９】
培養体は、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン（Ａｍｐ）を含む２Ｌ  ＬＢ培地により２２℃で振とう培養された。 遺伝子発現は、終末濃度が０．２ｍｇ／Ｌになるようにアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を加えることにより、ＯＤ５５０＝２．５の細胞濃度で誘導された。５時間の培養後、細胞は遠心分離により回収され、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む４０ｍｌ氷冷ペリプラズム分別バッファー（０．５Ｍスクロース，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）に再懸濁され、３０分間氷上でインキュベートされた。生じたスフェロプラストは、遠心分離を繰り返して沈殿され、可溶性  組み換え型タンパク質を含む上清が回収された。
【０２００】
可溶性タンパク質は、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩを用い、その後、ＰＢＳバッファー（４ｍＭ  ＫＨ２Ｐ０４，１６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰ０４，１１５ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を用いたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ１０／３０カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりアフィニティー精製された。タンパク質純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認された。タンパク質濃度は、Ａβ特異的突然変異タンパク質Ｈ１ＧＡ（配列番号：５０）及びＨ１ＧＶ（配列番号：５２）において、２７０５５Ｍ−１ｃｍ−１の算出された吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの吸収測定により決定された。
（実施例２１）
ＢｉａｃｏｒｅＸ計測器での表面プラズモン共鳴を介したΜΒΡ−Ａβ４０に対する結合活性の測定
Ｌｃｎ２突然変異タンパク質Ｈ１ＧＡ又はＨ１ＧＶとΜΒΡ−Ａβ４０（配列番号：３３）との相互作用のリアルタイム分析は、ランニングバッファーとしてＰＢＳ／Ｔ（０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む４ｍＭ  ＫＨ２Ｐ０４，１６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰ０４，  １１５ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ  ｓｙｓｔｅｍで行われた。１０ｍＭ  Ｎａ酢酸塩，ｐＨ４．５を溶媒とした実施例２からの１５μｇ／ｍｌΜΒΡ−Ａβ４０溶液は、標準のアミンカップリング化学を用いてＣＭＤ２００Ｉチップ（Ｘａｎｔｅｃ，Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に固定されて、リガンド濃度は１３１６共鳴単位（ＲＵ）であった。実施例２０の精製Ｌｃｎ２突然変異タンパク質Ｈ１ＧＡ及びＨ１ＧＶは、２０μＬ／ｍｉｎの流量で、４ｎＭから１２８ｎＭまでの濃度範囲でアプライされた。そのデータは、エタノールアミンを用いて活性化及び抑制されたコントロールチャンネルの測定された対応する信号を差し引くこと、及びバッファー注入の平均の測定信号を差し引くことにより２重参照された。キネティクスデータは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアＶ  ３．０を用いて全体的に適合された（Ｋａｒｌｓｓｏｎら．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５，２２９−２４０）。
（実施例２２）
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００計測器測定における表面プラズモン共鳴を介したＡβ４０の結合活性の測定
Ｌｃｎ２突然変異タンパク質Ｈ１ＧＡとＡβ４０（配列番号：２９）との相互作用のリアルタイム分析は、ランニングバッファーとしてＰＢＳ／Ｐ（０．００５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０を含む４ｍＭ  ＫＨ２Ｐ０４，１６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰ０４，１１５ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で行われた。１０ｍＭ酢酸ナトリウム  ｐＨ４．５を溶媒とした実施例２からの１０μｇ／ｍｌ  Ａβ４０溶液は、標準のアミンカップリング化学を用いて、ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に固定化されて、リガンド濃度は３２５ＲＵであった。実施例２０の精製Ｌｃｎ２突然変異タンパク質Ｈ１ＧＡは、３０μｌ／ｍｉｎの流量で、１ｎＭから３２ｎＭまでの濃度範囲でアプライされた。Ｈ１ＧＡの希釈系列は、ｋｏｎの情報を得るために、３００ｓの結合及び解離時間の両方を用いて導入された。低ｋ０ｆｆ比の正確な測定のために、最高濃度は、７２００ｓの解離時間を用いて分析された。そのデータは、実施例２１のように２重参照された。結合反応のｋｏｎ及びｋＱｆｆは、データ処理及びキネティクスフィッティングのためにＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア  Ｖ２．０．３を用いて全体のデータセットから決定された。そのデータは、１：１結合モデルを用いて、全体的に適合された。
（実施例２３）
ＴｈＴ凝集アッセイによるＬｃｎ２突然変異タンパク質Ｈ１ＧＡの機能分析
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）凝集アッセイのために、合成Ａβペプチド（配列番号：２９）は、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に１２時間溶解された。ＨＦＩＰは、真空下で蒸発され、Ａβは適量の蒸留水に溶解され、４℃で１５分間超音波処理され、濾過された（Ｃｏｓｔａｒ  Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルターセルロース酢酸塩膜，０．４５μＭ；Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）。可溶化単量体Ａβは、その後すぐに、凝集アッセイに用いられた。
【０２０１】
５００μｌの１ｍｇ／ｍｌ  Ａβは、種々のモル比の様々なＬｃｎ２突然変異タンパク質又はＢＳＡを含む０．５ｘＰＢＳの非存在又は存在下において、３７℃で撹拌しながらインキュベートされた。凝集反応は、３つ組で準備された。蛍光測定のために、２０μｌの定期的に取られたサンプルは、０．５ｘＰＢＳに含まれる５０μΜの終末濃度で１８０μｌ  ＴｈＴと混合され、ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−３分光蛍光光度計を用いて（ＨＯＲＩＢＡ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ，Ｇｒａｓｂｒｕｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、４５０ｎｍの励起波長及び４８２ｎｍの発光波長で分析された。
（実施例２４）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を介した組み換え型フィブロネクチン単一ドメインＥＤ−Ｂへの結合活性の測定測定
Ｌｃｎ２突然変異タンパク質のリアルタイム相互作用分析は、ランニングバッファーとして、ＨＢＳ／ＥＴ（０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ  ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ計測器で行われた。１０ｍＭ  Ｎａ酢酸塩，ｐＨ４０が溶媒である１００μｇ／ｍｌ組み換え型ＥＤ−Ｂ溶液は、標準のアミンカップリング化学を用いて、ＣＭＤ２００ｍセンサーチップに固定化されて、リガンド濃度は約１８０共鳴単位（ＲＵ）であった。精製Ｌｃｎ２突然変異タンパク質は、２５μｌ／ｍｉｎの流量で、２．５から１６０ｎｍまでの濃度でアプライされた。センサーグラムは、エタノールアミンを用いて活性化及び抑制されたコントロールチャンネルの測定された対応するシグナルを差し引くことにより校正された。キネティクスデータの評価は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア  Ｖ４．１を用いて全体的にフィッティングすることにより行われた（Ｋａｒｌｓｓｏｎら．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５，２２９−２４０）。Ｎ１０Ｄの場合において、異種検体競合反応モデルは、データフィッティングのために用いられ、２つの速度定数を生じた。
（表３）表面プラズモン共鳴により測定されたＬｃｎ２突然変異タンパク質のＥＤ−Ｂに対するキネティクス結合データ
0005913120.tif 000004
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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