(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞又は生物におけるＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ及びＨＢＶ抗原の量を低減するために使用されるアンチセンス化合物であって、該アンチセンス化合物が連続ヌクレオシド配列を有する１６ヌクレオチドからなる一本鎖修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドのヌクレオチドがヌクレオチド間結合によって結合され、該アンチセンスオリゴヌクレオチドがヌクレオシド糖の２’と４’原子との間に化学結合を有する少なくとも１つのＬＮＡ核酸モノマーを含み、かつ該ヌクレオシド配列が配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２からなる群から選択される、前記アンチセンス化合物、又はその塩。
【請求項２】
ヌクレオシドが結合されることにより、オリゴマーが１つ以上のホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｈ−ホスホネート又はアルキルホスホネート結合を含む、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項３】
前記化学結合が２’Ｏ−アルキル−４’Ｃ化学結合であり、且つ該アルキルが置換されてもよいか、又は非置換である、請求項１又は２に記載のアンチセンス化合物。
【請求項４】
ＨＢＶ抗原がＨＢｓＡｇである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物。
【請求項５】
ＨＢＶ抗原がＨＢｅＡｇである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物。
【請求項６】
哺乳類におけるＢ型肝炎ウイルス感染症を治療するための医薬製剤であって、有効量の請求項１〜５のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物、又はその薬学上許容可能な塩と、薬学上許容可能な希釈剤とを含む、前記医薬製剤。
【請求項７】
薬学上許容可能な担体を更に含む、請求項６に記載の哺乳類におけるＢ型肝炎ウイルス感染症を治療するための医薬製剤。
【請求項８】
Ｂ型肝炎ウイルス感染症又はＢ型肝炎ウイルスに関連する病態を治療するための請求項１〜５のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物。
【請求項９】
ヒトＢ型肝炎ウイルスに関連する病態が、黄疸、肝臓癌、肝炎、肝臓繊維症、肝硬変、肝不全、びまん性肝細胞炎症性疾患、血球貪食症候群又は血清肝炎のいずれかから選択される、請求項８に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１０】
ＨＢＶ剤、ＨＣＶ剤、化学療法剤、抗生物質、鎮痛剤、非ステロイド性抗炎症（ＮＳＡＩＤ）剤、抗真菌剤、駆虫剤、制嘔吐剤、止痢剤、及び免疫抑制剤から選択される更なる治療剤と併用される請求項１〜５のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１１】
更なるＨＢＶ剤が、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａ及びインターフェロンアルファコン−１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン、ＨＢＶ  ＲＮＡ複製阻害剤、第２のアンチセンスオリゴマー、ＨＢＶ治療ワクチン、ＨＢＶ予防ワクチン、ラミブジン（３ＴＣ）、エンテカビル、テノホビル、テルビブジン（ＬｄＴ）、アデホビル、及びＨＢＶモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体から選択される、請求項１０に記載の更なる治療剤と併用される請求項１〜５のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１２】
更なるＨＣＶ剤が、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａ及びインターフェロンアルファコン−１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製阻害剤、ＨＣＶアンチセンス剤、ＨＣＶ治療ワクチン、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＣＶヘリカーゼ阻害剤、及びＨＣＶモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体から選択される、請求項１０に記載の更なる治療剤と併用される請求項１〜５のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現を調節し、それによって疾患を治療するために有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、ヒトを含む動物におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＢ型肝炎ウイルスに関連する病態を治療するためのアンチセンスオリゴマーに関する。より具体的には、本発明の実施形態は、動物におけるＨＢＶを治療するための修飾ヌクレオシドを含むアンチセンスオリゴマー、より具体的には、動物におけるＨＢＶ、より具体的にはヒトにおけるＨＢＶを治療するための、ロックド核酸（ＬＮＡ）としても知られている２’Ｏ−４’Ｃ−メチレン−架橋糖を含むヌクレオシド及び本明細書に更に記載される他の架橋糖を含むヌクレオシドを含むアンチセンスオリゴマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎は、血液及び血液製剤等の汚染物質、汚染針によって非経口的に、性的に、並びに感染者又は保菌者の母から子供に垂直に伝搬されるウイルス疾患である。世界の前記疾患が一般的である地域では、若年齢における垂直伝播によって、Ｂ型肝炎の慢性保菌者になる感染個体が高い比率で生じる。世界保健機関は、世界中で２０億人以上が感染したことがあり、そのうち１年当たり約４００万人が急性の症例であり、１年当たり１００万人が死亡し、３．５〜４億人が慢性保菌者であると推測している。保菌者の約２５％は慢性肝炎、肝硬変又は肝臓癌で死亡し、慢性保菌者のほぼ７５％はアジア人である。Ｂ型肝炎ウイルスは、タバコに次いで２番目に重大な発癌物質であり、全ての原発性肝臓癌の６０％から８０％を引き起こす。ＨＢＶは、ＨＩＶよりも１００倍伝染性が強い。
【０００３】
任意の急速に複製される感染因子のように、ＨＢＶの幾つかの亜母集団が現在の治療レジメンに対して耐性を有するようになるのを促進する持続的な突然変異が存在するので、Ｂ型肝炎ウィルス感染は継続中の医学的問題である。現在、身体においてウイルスに対するセロコンバージョンが生じるか、又はＢ型肝炎ウィルス感染症に罹患しているヒトにおいて治療前のベースライン数と比較して抗原を９０％減少させる、ＨＢＶ感染症に感染しているヒトを治療するための有効な治療剤は存在しない。現在、米国肝臓病学会（ＡＡＳＬＤ）及びヨーロッパ肝臓学会（ＥＡＳＬ）が慢性ＨＢＶ感染症について推奨している治療法としては、インターフェロンアルファ（ＩＮＦα）、ペグ化インターフェロンアルファ−２ａ（Ｐｅｇ−ＩＦＮ２ａ）、エンテカビル及びテノホビルが挙げられる。しかし、典型的なインターフェロン療法は４８週間であるが、重篤且つ不快な副作用が生じ、また、治療を終えた２４週間後におけるＨＢｅＡｇセロコンバージョンは僅か２７〜３６％程度である。ＨＢｓＡｇのセロコンバージョンは更に低く、治療を終えた直後に観察されるのは３％のみであり、５年後には１２％以上に増加する。
【０００４】
ヌクレオシド及びヌクレオチド療法であるエンテカビル及びテノホビルは、ウイルス量の低減には成功するが、ＨＢｅＡｇセロコンバージョン及びＨＢｓＡｇ喪失の割合はＩＦＮα療法を使用して得られるものより更に低い。ラミブジン（３ＴＣ）、テルビブジン（ＬｄＴ）及びアデホビルを含む他の類似する療法も使用されるが、ヌクレオシド／ヌクレオチド療法は、一般的に、耐性の発生によって治療効力が限定される。
【０００５】
したがって、新規抗ウイルス療法を発見し、開発することが当技術分野において必要とされている。より具体的には、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇのセロコンバージョン率を増加させることができる新規抗ＨＢＶ療法が必要とされている。これら血清マーカーは、ＨＢＶ感染症の免疫学制御の指標であり、予後の改善、すなわち肝臓疾患及び肝硬変への進行の予防、肝不全の予防、肝細胞癌（ＨＣＣ）の予防、肝臓疾患に関連する移植の予防、及び死の予防を導く。
【０００６】
最近の臨床研究で、ＨＢｅＡｇのセロコンバージョン及び減少（Ｆｒｉｅｄら（２００８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４７：４２８）と、ＨＢｓＡｇの減少（Ｍｏｕｃａｒｉら（２００９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４９：１１５１）との間に相関が見出されている。高濃度の抗原が免疫寛容を誘導すると考えられるので、抗原濃度の低下は、ＨＢＶ感染症の免疫学的制御を可能にすることができる。ＨＢＶのための現在のヌクレオシド療法は、ＨＢＶの血中濃度を劇的に低下させることができるが、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇの濃度にはほとんど影響を及ぼさない。アンチセンス療法は、抗原の転写物を直接標的とすることができ、それによって、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇの血清濃度を低下させることができる点でヌクレオシド療法とは異なる。ＨＢＶが感染した際には複数の重複する転写物が産生されるので、単一のアンチセンスオリゴマーがＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇの両方に加えてＨＢＶ  ＤＮＡも低減できる見込みがある。
【０００７】
アンチセンス療法は、遺伝的障害又は感染症の治療の一形態である。特定の遺伝子の遺伝子配列が特定の疾患の原因であることが知られている場合、その遺伝子がオリジナルの哺乳類遺伝子であろうと、癌遺伝子であろうと、細菌種由来の遺伝子、真菌由来の遺伝子、寄生虫由来の遺伝子又はウイルス由来の遺伝子等の感染性微生物由来の遺伝子であろうと、その遺伝子によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ又は化学類似体）の鎖を合成して、前記遺伝子を不活性化し、有効に前記遺伝子を「オフにする」ことが可能である。これは、ｍＲＮＡを翻訳するためには一本鎖でなければならないためである。或いは、前記鎖は、ｍＲＮＡ前躯体のスプライシング部位に結合し、ｍＲＮＡ［１］のエキソンの内容を改変することを標的とすることもできる。
【０００８】
（ＤＮＡにおけるＴがＲＮＡにおけるＵであることを除いて）同じ配列を有するＲＮＡバージョンがタンパク質に翻訳されるか、又は翻訳可能である場合のＤＮＡ一本鎖配列はセンス鎖（又はプラス（＋）センス鎖）と呼ばれることが多く、それに対して相補的な鎖はアンチセンス鎖（又はマイナス（−）センス鎖）と呼ばれることが多い。
【０００９】
ＤＮＡの二本鎖内の幾つかの領域が遺伝子をコードしており、前記遺伝子は、通常、調節配列、スプライシング部位、非コードイントロン及び他の領域と共に、発現又は翻訳されたタンパク質におけるアミノ酸の順序を指定する指示である。細胞がＤＮＡによってコードされているタンパク質を発現するために、ＤＮＡの１本の鎖は、ＲＮＡの相補鎖の合成用の鋳型として機能する。この鋳型ＤＮＡ鎖は転写鎖と呼ばれ、その配列は、オリジナルの二本鎖ＤＮＡのセンス配列と同じ配列を有するｍＲＮＡ転写物に対してアンチセンスであるか、又は相補的である。ＤＮＡは二本鎖であるので、アンチセンス配列に対して相補的な鎖は非転写鎖、すなわちセンス鎖と呼ばれ、（ＤＮＡ塩基配列におけるＴ核酸塩基がＲＮＡ配列におけるＵ核酸塩基に置き換わることを除いて）ｍＲＮＡ転写物と同じ配列を有する。
【００１０】
その塩基配列順序が遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、すなわち「センス」配列に対して相補的であるので、ＤＮＡから転写されたＲＮＡに対して相補的な核酸は、「アンチセンス」オリゴヌクレオチドと呼ばれる。したがって、５’−ＡＡＧＧＴＣ−３”のセンス配列を有するコードＤＮＡ領域は、転写されて５’−ＡＡＧＧＵＣ−３’のセンス配列を有するｍＲＮＡを生成するので、前記センス配列に対するアンチセンスオリゴマーは、ＲＮＡ核酸塩基を含む場合は３’−ＵＵＣＣＡＧ−５’の配列を有し、アンチセンスオリゴマーがＤＮＡ核酸塩基を含む場合は３’−ＴＴＣＣＡＧ−５’を含む。
【００１１】
現在、アンチセンス療法では、標的タンパク質の発現又は翻訳に関与している特定の（５’から３’方向の）「センス」ＤＮＡ又はｍＲＮＡ配列に相補的であるように合成される、長さ約２０ヌクレオチド／ヌクレオシドのオリゴマー又はオリゴヌクレオチドの使用が主に注目されている。
【００１２】
細胞へ導入されると、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ワトソンクリック型結合によって対応するｍＲＮＡ配列にハイブリダイズして、ヘテロ二重鎖を形成する。二重鎖が形成されると、結合しているｍＲＮＡの配列がコードするタンパク質の翻訳が阻害される。オリゴヌクレオチド／ｍＲＮＡ二重鎖がその後の翻訳を妨害することができるのには、幾つかの機序が存在する。幾つかの異なるアンチセンス剤について最も広く受け入れられている説明は、ユビキタスな酵素ＲＮａｓｅ  Ｈがヘテロ二重鎖におけるｍＲＮＡを分解するというものである。ＲＮａｓｅ  Ｈはヘテロ二重鎖に誘引され、結合しているｍＲＮＡを切断するが、オリゴヌクレオチド配列は未変化な状態で残すので、前記オリゴヌクレオチドは対応するｍＲＮＡ配列を探し、そして結合し続けることができる。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性とは別個に又は関連して生じる可能性のある、アンチセンス療法による翻訳阻害に関する他の受け入れられている幾つかの説明としては、リボソーム複合体の翻訳能力を不能にする適切なリボソームアセンブリのブロッキング、ＲＮＡのスプライシングのブロッキング、及び／又はｍＲＮＡの適切な輸送の妨害が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
翻訳を制限することによって遺伝子発現を制御するために生物が用いる明らかに別の手段は、遺伝子干渉として知られており、これは、標的遺伝子を「サイレンシングする」短いＲＮＡ配列を配置させることを含む。これらの短いＲＮＡ配列は、低分子干渉ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡｓとして知られている。ＲＮＡ干渉は、特定のタンパク質を産生するための青写真である標的遺伝子をオフにすることができる古代から存在する遺伝プロセスである。
【００１４】
ダイサーとして知られている酵素は、ＲＮＡ干渉において重要な役割を果たすことが知られている。ダイサーは、二本鎖ＲＮＡ分子を認識し、通常３’末端に２塩基のオーバーハングを有する約２０〜２５のヌクレオチド長の短いｄｓＲＮＡに切断するリボヌクレアーゼである。次いで、ダイサーによって作製された低分子ｄｓＲＮＡ断片は、ｄｓＲＮＡ分子を細胞内の目的地へ導く高分子多タンパク質複合体に同化し、そこで標的ｍＲＮＡ配列に結合し、遺伝子をオフにする。この複合体は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られている。ＲＩＳＣは、ｍＲＮＡがｓｉＲＮＡガイド鎖に対して相補的な配列を有する場合にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解することができるエンドヌクレアーゼである、触媒成分アルゴノートを有する。したがって、ダイサー、ＲＩＳＣ及びｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンシング系は、ゲノムの再配列、幹細胞の分化、脳の発生及びウイルス防御を含む多くの基本的な生物学的事象における必須工程である。
【００１５】
興味深いことに、低分子ｄｓＲＮＡ、すなわちｓｉＲＮＡのサイズが、その機能の決定要因であることが見出されている。ｄｓＲＮＡが大きすぎるか又は小さすぎる場合、前記ｄｓＲＮＡはＲＩＳＣ複合体を作製しないので、遺伝子サイレンシングは生じない。
【００１６】
アンチセンスオリゴマーは、幾つかの点でｓｉＲＮＡとは異なり、最も重要なことは、アンチセンスオリゴマーが一本鎖である点である。また、アンチセンスオリゴマーは合成オリゴマーであり、典型的には、リン酸骨格に沿って、そして多くの場合核酸塩基の選択された位置において修飾されている。
【００１７】
アンチセンス療法の分野において、化学的に修飾されているヌクレオシドを核酸分子、特にリボ核酸分子（ＲＮＡ）に導入することは、外因的に送達されたネイティブなＲＮＡ又はＤＮＡ分子に固有のインビボ安定性及び生物学的利用能が制限される可能性を克服する強力なツールを提供する。例えば、化学的に修飾されている核酸分子は血清における半減期がより長い傾向があるので、化学的に修飾されている核酸分子を使用することによって、所与の治療効果を得るための特定の核酸分子の用量をより少なくすることができる可能性がある。更に、特定の化学修飾は、特定の細胞又は組織を標的とすることにより及び／又は核酸分子の細胞内取込みを改善することにより、核酸分子の生物学的利用能を改善することができる。したがって、ネイティブな核酸分子と比較して、例えば、全てのＲＮＡ核酸分子と比較して、化学的に修飾されている核酸分子の活性が低かったとしても、分子の安定性及び／又は送達性が改善されていることにより、修飾核酸分子の全体的な活性はネイティブな分子よりも高くなる場合がある。
【００１８】
ロックド核酸（ＬＮＡ）と呼ばれる１つの有用な化学修飾は、２’Ｏ−４’Ｃ−アルキレン架橋（式中、アルキレン架橋は、Ｃ１−６アルキレン架橋、より具体的には、２’Ｏ−４’Ｃ−メチレン架橋である）を１つ以上のＲＮＡ又はＤＮＡヌクレオシド部分に導入する。ＬＮＡがアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡオリゴマーに組み込まれた場合、前記ＬＮＡはアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子の安定性を大幅に高めることが示されているので、一旦宿主(ホスト)細胞に取り込まれれば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡの生物学的利用能を大幅に高める。アンチセンスオリゴマーの安定性及び生物学的利用能を高めるためにアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡオリゴマーに導入することができる他の有用な化学修飾としては、個々のＲＮＡ又はＤＮＡヌクレオチドの間に天然に存在するホスホジエステル結合の代わりに置き変えられるホスホロチオエート結合又はホスホトリエステル結合が挙げられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の第１の実施形態では、本発明に係るＲＮＡ又はＤＮＡオリゴマーであって、前記ＲＮＡ又はＤＮＡオリゴマー、或いはこれらの薬学上許容可能な塩、水和物、溶媒和物、又はエステルが、参照することによって本明細書に組み込まれるＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧＴＴＣ（配列番号１）；ＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧＧ（配列番号２）；ＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴＴＴＴＡＴＣＡＴ（配列番号３）；ＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴ（配列番号４）；ＣＡＡＧＧＴＡＴＧＴＴＧＣＣＣＧＴ（配列番号５）；ＴＧＴＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＣＡＴＣ（配列番号６）；ＣＣＴＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧ（配列番号７）；ＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＴＡＣＴＡＧＴＧＣ（配列番号８）；ＧＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＴ（配列番号９）；ＴＣＣＴＣＴＧＣＣＧＡＴＣＣＡＴＡＣＴＧＣＧＧＡＡＣＴＣＣＴ（配列番号１０）；ＣＧＣＡＣＣＴＣＴＣＴＴＴＡＣＧＣＧＧ（配列番号１１）；ＧＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＣ（配列番号１２）；又はＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴ（配列番号１３）のＤＮＡ塩基配列に対応するＲＮＡ転写物に対して本質的に相補的であり、前記アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子が、複数の修飾ヌクレオシド及び／又はヌクレオチドを含むＲＮＡ又はＤＮＡオリゴマーと、薬学上許容可能な希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。
【００２０】
本発明の第２の実施形態では、本発明に係るＲＮＡ又はＤＮＡオリゴマーであって、前記ＲＮＡ又はＤＮＡオリゴマー、或いはこれらの薬学上許容可能な塩、水和物、溶媒和物、又はエステルが、参照することによって本明細書に組み込まれるＧＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＣ（配列番号１４）；ＴＧＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡ（配列番号１５）；ＧＡＧＧＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡＧＧ（配列番号１６）；ＴＧＡＧＧＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号１７）；ＧＡＴＧＡＧＧＣＡＴＡＧＣＡＧＣ（配列番号１８）；ＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＡＣ（配列番号１９）；ＧＧＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＴＡＧＧ（配列番号２０）；ＡＧＧＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＴＡＧ（配列番号２１）；又はＣＴＧＡＧＧＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡ（配列番号２２）のＤＮＡ塩基配列に対応するＲＮＡ転写物に対して本質的に相補的であり、前記アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子が、複数の修飾ヌクレオシド及び／又はヌクレオチドを含むＲＮＡ又はＤＮＡオリゴマーと、薬学上許容可能な希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。
【００２１】
１つの実施形態は、哺乳類細胞又は生物におけるＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ及びＨＢＶ抗原の量を低減するために使用されるアンチセンスオリゴマーであって、１０〜２６のヌクレオシド長の連続配列であり、且つ以下の式１：
５’−ＬＮＡｎ−Ｐ−ＬＮＡｐ−Ｐ−Ｎｍ−Ｐ−Ｎｌ−Ｐ−ＬＮＡｒ−Ｐ−ＬＮＡｑ−３’（式１）
（式中、ＬＮＡはロックド核酸であり、Ｐは、式（１）の配列の５’から３’方向に、ＬＮＡと隣接するＮとの間、又はＮと隣接するＮとの間、又はＮと隣接するＬＮＡとの間、又はＬＮＡと隣接するＬＮＡとの間の、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｈ−ホスホネート、又はアルキルホスホネート結合から選択されるヌクレオシド間結合であり、Ｎは、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｕ又はＺヌクレオシド単位から選択され、ｎ及びｒ及びｐ及びｑは、各々独立して、１、２又は３から選択される整数であり、ｌ及びｍは、各々独立して、１〜２２の整数であり、Ｚは、イノシン、Ｎ７−メチルイノシン、Ｎ７−メチルグアニジン、５−メチルウリジン、５−メチル−シチジン、５−フルオロウリジン、５−フルオロチミジン、キサントシン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、７−メチル−７−デアザグアノシン、７−エチル−７−デアザグアノシン、Ｎ４−メチルシチジン、Ｎ４−エチルシチジンから選択される）
に記載される配列を有するアンチセンスオリゴマー、又はその塩、溶媒和物、水和物、若しくはエステルを提供する。
【００２２】
特定の実施形態は、オリゴマーのヌクレオシド単位のうちの少なくとも４つがＬＮＡ単位であってもよい上記アンチセンスオリゴマーを提供する。幾つかの実施形態では、ＬＮＡは、２’−Ｏ−アルキル−４’Ｃ結合（式中、アルキルは、置換又は非置換のＣ１−６アルキルであってよい）を有するロックド核酸単位である。更なる実施形態では、連続ヌクレオシド配列のヌクレオシド単位間に存在するヌクレオシド間結合のうちの少なくとも２つがホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。幾つかの関連する実施形態では、アンチセンスオリゴマーの連続ヌクレオシド配列のヌクレオシド単位間に存在する全てのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であってもよい。
【００２３】
幾つかの特定の実施形態では、ｎ、ｐ、ｒ及びｑは、各々独立して１又は２であり、且つｌ及びｍは、各々独立して２、３、４、５又は６であり、幾つかの特定の実施形態では、ｎ、ｐ、ｒ及びｑは、各々独立して１であり、ｌ及びｍは、各々独立して６である。他の特定の実施形態では、配列が、配列番号１４、１６、１６又は２０のうちの任意の１つであってよいアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
【００２４】
特定の実施形態では、上記アンチセンスオリゴマーは、配列番号１〜１３のうちの任意の１つに対して本質的に相補的であってよく、Ｂ型肝炎ウイルスは、ヒトＢ型肝炎ウイルスであってよく、細胞又は生物はヒトであってよい。関連する特定の実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルスは、以下のヒトの地理的な遺伝子型のうちのいずれかであってよい：Ａ（北西ヨーロッパ、北アメリカ、中央アメリカ）、Ｂ（インドネシア、中国、ベトナム）、Ｃ（東アジア、韓国、中国、日本、ポリネシア、ベトナム）、Ｄ（地中海地域、中東、インド）、Ｅ（アフリカ）、Ｆ（アメリカ先住民、ポリネシア）、Ｇ（アメリカ、フランス）、又はＨ（中央アメリカ）。
【００２５】
特定の実施形態では、上記アンチセンスオリゴマーは、本質的に配列番号１４〜２２のうちのいずれか１つである配列を有してよく、Ｂ型肝炎ウイルスは、ヒトＢ型肝炎ウイルスであってよく、細胞又は生物はヒトであってよい。関連する特定の実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルスは、ヒトの地理的な遺伝子型のうちのいずれか１つであってよい：Ａ（北西ヨーロッパ、北アメリカ、中央アメリカ）、Ｂ（インドネシア、中国、ベトナム）、Ｃ（東アジア、韓国、中国、日本、ポリネシア、ベトナム）、Ｄ（地中海地域、中東、インド）、Ｅ（アフリカ）、Ｆ（アメリカ先住民、ポリネシア）、Ｇ（アメリカ、フランス）、又はＨ（中央アメリカ）。
【００２６】
特定の実施形態は、有効量の上記任意の核酸アンチセンスオリゴマー、又はその薬学上許容可能な塩、溶媒和物、水和物若しくはエステルと、薬学上許容可能な希釈剤とを含む、哺乳類におけるＢ型肝炎ウイルス感染症を治療するための医薬製剤を提供する。このような医薬製剤のアンチセンスオリゴマーは、配列番号１〜１３のうちのいずれか１つに対して本質的に相補的であってもよいか、又は本質的に配列番号１４〜２２のうちのいずれか１つである配列を有してもよく、更に薬学上許容可能な担体を含んでもよい。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、哺乳類におけるＢ型肝炎ウイルス感染症又はＢ型肝炎ウイルスに関連する病態を治療する方法であって、Ｂ型肝炎ウイルス感染症又はＢ型肝炎ウイルスに関連する病態を治療するために、治療有効量の上記任意の医薬組成物をそれを必要としている哺乳類に投与することを含む方法を提供する。関連する実施形態では、哺乳類はヒトであり、Ｂ型肝炎ウイルス感染症又はＢ型肝炎ウイルスに関連する病態は、ヒトＢ型肝炎ウイルスによるＢ型肝炎ウイルス感染症である。より具体的には、ヒトＢ型肝炎ウイルスは、以下のヒトの地理的な遺伝子型のうちのいずれかであってよい：Ａ（北西ヨーロッパ、北アメリカ、中央アメリカ）、Ｂ（インドネシア、中国、ベトナム）、Ｃ（東アジア、韓国、中国、日本、ポリネシア、ベトナム）、Ｄ（地中海地域、中東、インド）、Ｅ（アフリカ）、Ｆ（アメリカ先住民、ポリネシア）、Ｇ（アメリカ、フランス）、又はＨ（中央アメリカ）。
【００２８】
関連する実施形態は、哺乳類におけるＢ型肝炎ウイルス感染症又はＢ型肝炎ウイルスに関連する病態を治療する方法であって、上記の通り、治療有効量の上記任意の医薬組成物をそれを必要としている哺乳類に投与することを含み、前記ヒトＢ型肝炎ウイルスに関連する病態が、黄疸、肝臓癌、肝炎、肝臓繊維症、肝硬変、肝不全、び慢性肝細胞炎症性疾患、血球貪食症候群又は血清肝炎であってよい方法を提供する。
【００２９】
関連する実施形態では、前記方法は、更なる治療剤と組み合わせてアンチセンスオリゴマーを投与することを更に含んでもよく、前記アンチセンスオリゴマー及び更なる治療剤は、単一の製剤で一緒に投与されるか、又は異なる製剤で別々に投与され、前記核酸オリゴマー及び第２の治療剤の投与は、同時に又は連続して行われる。
【００３０】
他の関連する実施形態では、更なる治療剤は、ＨＢＶ剤、ＨＣＶ剤、化学療法剤、抗生物質、鎮痛剤、非ステロイド性抗炎症（ＮＳＡＩＤ）剤、抗真菌剤、駆虫剤、制嘔吐剤、止痢剤又は免疫抑制剤であってよい。
【００３１】
特定の関連する実施形態では、更なるＨＢＶ剤は、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａ及びインターフェロンアルファコン−１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン、ＨＢＶ  ＲＮＡ複製阻害剤、第２のアンチセンスオリゴマー、ＨＢＶ治療ワクチン、ＨＢＶ予防ワクチン、ラミブジン（３ＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、フマル酸テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テルビブジン（ＬｄＴ）、アデホビル、又はＨＢＶ抗体療法（モノクローナル又はポリクローナル）であってよい。
【００３２】
他の特に関連する実施形態では、更なるＨＣＶ剤は、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａ及びインターフェロンアルファコン−１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製阻害剤（例えば、ＶｉｒｏＰｈａｒｍａのＶＰ５０４０６シリーズ）、ＨＣＶアンチセンス剤、ＨＣＶ治療ワクチン、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＣＶヘリカーゼ阻害剤、又はＨＣＶモノクローナル又はポリクローナル抗体療法であってよい。
【００３３】
別の実施形態は、Ｂ型肝炎ウイルスに感染している哺乳類におけるＨＢＶ  ＤＮＡの量及びＨＢＶ抗原の量を低減する方法であって、治療前の哺乳類におけるＨＢＶ  ＤＮＡの量及びＨＢＶ抗原の量に比べてＢ型肝炎ウイルス感染及びＢ型肝炎抗原を低減するために、治療有効量の上記医薬組成物をそれを必要としている哺乳類に投与することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、哺乳類はヒトであってよく、Ｂ型肝炎ウイルスはヒトＢ型肝炎ウイルスであってよい。より具体的には、ヒトＢ型肝炎ウイルスは、以下のヒトの地理的な遺伝子型のうちのいずれかであってよい：Ａ（北西ヨーロッパ、北アメリカ、中央アメリカ）、Ｂ（インドネシア、中国、ベトナム）、Ｃ（東アジア、韓国、中国、日本、ポリネシア、ベトナム）、Ｄ（地中海地域、中東、インド）、Ｅ（アフリカ）、Ｆ（アメリカ先住民、ポリネシア）、Ｇ（アメリカ、フランス）、又はＨ（中央アメリカ）。
【００３４】
特定の実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルスに感染している哺乳類におけるＨＢＶ  ＤＮＡの量及びＨＢＶ抗原の量を低減する方法であって、治療前の哺乳類におけるＨＢＶ  ＤＮＡの量及びＨＢＶ抗原の量に比べてＢ型肝炎ウイルス感染及びＢ型肝炎抗原を低減するために、治療有効量の上記医薬組成物をそれを必要としている哺乳類に投与することを含み、前記ＤＮＡの量が、アンチセンスオリゴマーの投与前の量と比べて９０％減少する方法を提供する。関連する方法では、ＨＢＶ抗原はＨＢｓＡｇであってもよく、ＨＢｅＡｇであってもよく、より具体的には、ＨＢＶ抗原の量は、セロコンバージョンが生じるのに十分な程度減少することができ、これは、市販のＥＬＩＳＡ系の現在利用可能な検出限界によって決定したとき、セロコンバージョンの決定因子としてＨＢｅＡｇをモニタリングする場合、血清ＨＢｅＡｇの欠如及び血清ＨＢｅＡｂの存在として定義され、セロコンバージョンの決定因子としてＨＢｓＡｇをモニタリングする場合、血清ＨＢｓＡｇの欠如として定義される。
【００３５】
より具体的な実施形態では、上記方法は、更なる治療剤と組み合わせてアンチセンスオリゴマーを投与することを更に含んでもよく、前記アンチセンスオリゴマー及び更なる治療剤は、単一の製剤で一緒に投与されるか、又は異なる製剤で別々に投与され、前記核酸オリゴマー及び第２の治療剤の投与は、同時に又は連続して行われる。特定の関連する実施形態では、更なる治療剤は、ＨＢＶ剤、ＨＣＶ剤、化学療法剤、抗生物質、鎮痛剤、非ステロイド性抗炎症（ＮＳＡＩＤ）剤、抗真菌剤、駆虫剤、制嘔吐剤、止痢剤及び免疫抑制剤であってよい。より具体的な関連する実施形態では、更なるＨＢＶ剤は、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａ及びインターフェロンアルファコン−１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン、ＨＢＶ  ＲＮＡ複製阻害剤、第２のアンチセンスオリゴマー、ＨＢＶ治療ワクチン、ＨＢＶ予防ワクチン、ラミブジン（３ＴＣ）、エンテカビル、テノホビル、テルビブジン（ＬｄＴ）、アデホビル、又はＨＢＶ抗体療法（モノクローナル又はポリクローナル）であってよく、更なるＨＣＶ剤は、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａ及びインターフェロンアルファコン−１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製阻害剤（例えば、ＶｉｒｏＰｈａｒｍａのＶＰ５０４０６シリーズ）、ＨＣＶアンチセンス剤、ＨＣＶ治療ワクチン、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＣＶヘリカーゼ阻害剤、又はＨＣＶ抗体療法（モノクローナル又はポリクローナル）であってよい。
【００３６】
別の実施形態は、ＨＢＶに感染した哺乳類におけるＢ型肝炎ウイルスのセロコンバージョンを促進する方法であって、治療有効量の上記医薬組成物をＢ型肝炎に感染している哺乳類に投与する工程と、哺乳類の血清サンプルにおけるＨＢｅＡｇ及びＨＢｅＡｂの存在をモニタリングするか、又は哺乳類の血清サンプルにおけるＨＢｓＡｇの存在をモニタリングする工程であって、その結果、市販のＥＬＩＳＡ系の現在の検出限界によって決定したとき、セロコンバージョンの決定因子としてＨＢｅＡｇをモニタリングする場合は血清サンプル中のＨＢｅＡｇの欠如及びＨＢｅＡｂの存在、又はセロコンバージョンの決定因子としてＨＢｓＡｇをモニタリングする場合は血清サンプル中のＨＢｓＡｇの欠如が哺乳類におけるセロコンバージョンの指標となる工程とを含む方法を提供する。
【００３７】
本明細書に記載される実施形態のいずれについても、Ｂ型肝炎ウイルス感染症又はＢ型肝炎ウイルスに関連する病態を治療する方法、Ｂ型肝炎ウイルスに感染している哺乳類におけるＨＢＶ  ＤＮＡの量及びＨＢＶ抗原の量を低減する方法、或いはＨＢＶに感染している哺乳類におけるＢ型肝炎ウイルスのセロコンバージョンを促進する方法であって、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーを投与することを含み、前記アンチセンスオリゴマーは、単独で投与されようと組合せて投与されようと、医薬製剤中に存在しようと単に希釈剤中に存在しようともよく、前記投与が、経口、頬側、直腸内、非経口、腹腔内、皮内、経皮、又は気管投与であってもよい方法を提供する。
【００３８】
本発明の前述の特徴は、添付図面を参照しながら以下の詳細な明細書に言及することによってより容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、ＨＢＶ感染症の自然史の図である。
【図２】図２は、ＨＢｅＡｇ陽性であるとみなされる代償性疾患に罹患しているＨＢＶ患者の図である。
【図３】図３は、ＨＢｅＡｇ陰性であるとみなされる代償性疾患に罹患しているＨＢＶ患者の図である。
【図４】図４は、ＨＢＶ転写の概略であり、以下を示す：プレコア及びコアタンパク質を含むＨＢＶゲノムにコードされている主要転写物、ＲＮＡ及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素活性）、Ｘタンパク質、及び大、中、及び小Ｓタンパク質に加えて、ポリＡテイル、転写物の相対的長さ、並びに大、中、及び小Ｓタンパク質の転写物の重複。ＨＢＶ  ＤＮＡのプラス鎖及びマイナス鎖も示す。
【図５】図５は、ＨＢＶのゲノム領域によってプロットされた、ＨＢＶの複数の遺伝子型由来のゲノムＤＮＡの配列間の同一性割合を比較するためのコンピュータを利用した生物学分析を示す。
【図６】図６は、同定されている様々なＨＢＶの地理的な遺伝子型の表である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
定義。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、文脈上他の意味を必要としていない限り、以下の用語は指定の意味を有するものとする：
本発明で使用する用語「有効量」は、例えば、研究者又は臨床医によって求められている組織、系、動物、又はヒトの生物学的反応又は医学的反応を誘発する薬物若しくは薬物原料、又は核酸オリゴマーを含む薬剤の量を意味する。更に、用語「治療有効量」は、このような量を投与されていない対応する被験体と比較したとき、疾患、障害又は副作用の治療、治癒、予防又は寛解を改善するか、或いは疾患又は障害の進行速度を低下させる任意の量を意味する。また、この用語は、正常な生理機能を増強するのに有効な量もその範囲に含む。
【００４１】
本発明で使用する用語「本質的に相補的」とは、アンチセンスオリゴマー配列が、標準的なワトソンクリック型塩基対Ａ−Ｔ、Ａ−Ｕ及びＧ−Ｃを使用して、その標的センス配列に対して完全に相補的な配列を有することを意味する。更に、本質的に相補的という用語は、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｕ、Ｉ：Ａ、Ｉ：Ｃ、Ｘ：Ａ、Ｘ：Ｃ、Ｒ：Ｃ、Ｒ：Ｔ、Ｒ：Ｕ、ｍ７Ｉ：Ｕ、ｍ７Ｉ−Ａ、ｍ７Ｉ：Ｃ、ｍ７Ｇ：Ｕ、ｍ７Ｇ：Ｃ、ｍ５Ｕ：Ａ、５−ＦＵ：Ａ、５−ＦＴ：Ａ、ｍ５Ｃ：Ｇ、Ｄ：Ａ、Ψ：Ａ、及びΨ：Ｃが挙げられるが、これらに限定されない非標準的なワトソンクリック型塩基対を使用して、その標的センス配列に対して完全に相補的なアンチセンスオリゴマー配列を含む。本発明で使用するとき、Ｇはグアノシンであり、Ｉはイノシンであり、Ａはアデノシンであり、Ｃはシチジンであり、Ｕはウリジンであり、Ｔはチミジンであり、Ｘはキサントシンであり、Ｒはリバビリンであり、ｍ７ＧはＮ７−メチルグアノシンであり、ｍ７ＩはＮ７−メチルイノシンであり、５ＦＵは５−フルオロウリジンであり、５ＦＴは５−フルオロチミジンであり、Ｄはジヒドロウリジンであり、ｍ５Ｕは５−メチルウリジンであり、ｍ５Ｃは５−メチルシチジンであり、Ψはプソイドウリジンである。
【００４２】
また、用語「本質的に相補的」は、ＤＮＡ又はＲＮＡの標的核酸配列中に天然に存在する核酸塩基に対して偽相補性を示す１つ以上の合成核酸塩基を配列中に有するアンチセンスオリゴマーも含む。天然核酸配列に対して偽相補性が生じる核酸塩基の例としては、２−アミノアデニン又は２−アミノアデノシン（ｎＡ）、２−チオチミン又は２−チオチミジン（ｓＴ）、７−アルキル−７−デアザグアニン又は７−アルキル−７デアザグアノシン（７ａｌ−７ｄａＧ）、及びＮ４−アルキルシトシン又はＮ４−アルキルシチジン（Ｎ４−ａｌＣ、ここで、アルキルはメチル又はエチルである）が挙げられる。非ワトソンクリック型塩基対ｎＡ：Ｔ及びＡ：ｓＴは、安定した塩基対であり、７−アルキル−７−デアザグアニンとＣ（７ａｌ−７ｄａＧ：Ｃ）及びＮ４−アルキルシトシンとＧ（Ｎ４−ａｌＣ：Ｇ）も同様である。所与のＡＳＯに４つの合成核酸塩基ｎＡ、ｓＴ、７ａｌ−７ｄａＧ及びＮ４−ａｌＣが全て組み込まれた場合、生じるＡＳＯ配列は二次構造の大部分がなくなり、偽相補性によって標的核酸に結合する。本発明の実施形態では、１つ以上の合成核酸塩基がＡＳＯ配列中に存在してもよく、それによって、ＡＳＯと標的核酸配列との間に１つ以上の非ワトソンクリック型「偽相補的」塩基対が生じる。１つ以上の偽相補塩基を有して、標的核酸配列中の核酸塩基と１つ以上の偽塩基対を形成するＡＳＯは、標的核酸配列に対して本質的に相補的であるとみなされることは理解される。
【００４３】
語句「配列番号Ｘの配列を本質的に有するオリゴヌクレオシド」で使用される場合等、本発明で使用する用語「本質的に」は、記載されている通り、配列番号Ｘに対して相補的な配列を有する塩基対を形成することができる任意の配列を意味するが、ＤＮＡ又はＲＮＡの標的核酸配列中に天然に存在する核酸塩基に対して偽相補性を示す１つ以上の合成核酸塩基を配列中に含有していてもよい。天然核酸配列に対して偽相補性が生じる核酸塩基の例としては、２−アミノアデニン又は２−アミノアデノシン（ｎＡ）、２−チオチミン又は２−チオチミジン（ｓＴ）、７−アルキル−７−デアザグアニン又は７−アルキル−７デアザグアノシン（７ａｌ−７ｄａＧ）及びＮ４−アルキルシトシン又はＮ４−アルキルシチジン（Ｎ４−ａｌＣ、ここで、アルキルはメチル又はエチルである）が挙げられる。非ワトソンクリック型塩基対ｎＡ：Ｔ及びＡ：ｓＴは、安定した塩基対であり、７−アルキル−７−デアザグアニンとＣ（７ａｌ−７ｄａＧ：Ｃ）及びＮ４−アルキルシトシンとＧ（Ｎ４−ａｌＣ：Ｇ）も同様である。所与のＡＳＯに４つの合成核酸塩基ｎＡ、ｓＴ、７ａｌ−７ｄａＧ及びＮ４−ａｌＣが全て組み込まれた場合、生じるＡＳＯ配列は二次構造の大部分がなくなり、偽相補性によって標的核酸に結合する。本発明の実施形態では、１つ以上の合成核酸塩基がＡＳＯ配列中に存在してもよく、それによって、ＡＳＯと標的核酸配列との間に１つ以上の非ワトソンクリック型「偽相補的」塩基対が生じる。１つ以上の偽相補塩基を有して、標的核酸配列中の核酸塩基と１つ以上の偽塩基対を形成するＡＳＯは、記載されている通り、所与の標的核酸配列を対象とする配列番号Ｘの配列を本質的に有するとみなされることは理解される。
【００４４】
本発明で使用する用語「核酸オリゴマー」は、少なくとも２、多くとも１００の連続的に共有結合で結合されたヌクレオシド又はヌクレオチド単位を含む核酸分子を意味する。個々のヌクレオシド又はヌクレオチド単位はそれぞれ、リボース糖又はデオキシリボース糖を含んでいてもよく、したがって、オリゴマーは、リボース糖とデオキシリボース糖との組合せを含んでいてもよい。核酸オリゴマーにおけるヌクレオチド又はヌクレオシドは、前記オリゴマーが従来のホスホジエステル結合を含むように、或いは、前記オリゴマーが１つ以上のホスホトリエステル結合、ホスホネート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合を含み得るように結合することができる。更に、核酸オリゴマーは、２’Ｏ−４’Ｃ結合されたヌクレオシドを含む１つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでいてもよく、更に又は或いは、核酸オリゴマーは、２’−Ｏ−メチル修飾、２’−Ｏ−エチル修飾、又は他の２’−修飾等の２’−Ｏ−アルキル修飾を含む、２’−位における他の修飾を備えた１つ以上のヌクレオシドを含んでいてもよい。
【００４５】
本発明で使用する用語ＬＮＡ（ロックド核酸）は、ヌクレオシド糖単位の２’−位と４’−位との間に化学結合を有する（すなわち、核酸モノマーのフラノース糖は、２’Ｏ−４’Ｃ結合、又は一般的に許容されている命名法に従ってオリゴヌクレオチドの５’−から３’方向に記載した場合４’Ｃ−２’Ｏ結合を有する）核酸モノマーを含み、例えば、以下に図示するＡ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＬＮＡ、及び（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＬＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【化１】
0005892938.tif 000002
【００４６】
本発明で使用するＬＮＡ化合物としては、糖の４’位と２’位との間に少なくとも１つの架橋を有する化合物であって、前記架橋の各々が独立して、以下から独立して選択される１又は２〜４つの結合基を含む化合物が挙げられるが、これらに限定されない：−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲ１）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ１）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−及び−Ｎ−（Ｒ１）−（式中、ｘは、０、１又は２であり、ｎは、１、２、３、又は４であり、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、置換Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）又はスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり、各Ｊ１及びＪ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル又は保護基である）。
【００４７】
ＬＮＡの定義に包含される４’Ｃ−２’Ｏ架橋の具体例としては、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ１Ｒ２）−Ｎ（Ｒ１）−Ｏ−又は−Ｃ（Ｒ１Ｒ２）−Ｏ−Ｎ（Ｒ１）−架橋が挙げられる。ＬＮＡの定義に包含される他の架橋は、４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ１）−２’及び４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ１）−Ｏ−２’−架橋（式中、各Ｒ１は独立して、Ｈ、保護基又はＣ１−Ｃ１２アルキルである）である。
【００４８】
また、本発明に係るＬＮＡの定義には、リボシル糖環の２’−ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に結合し、それによってメチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）結合を形成して、二環式糖部分を形成するＬＮＡも含まれる。前記結合は、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（ＣＨ２−）基であってもよく、この場合用語メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡが二環式部分について使用され、この位置がエチレン基の場合には、用語エチレンオキシ（４’−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡが使用される。アルファＬ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）、メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡの異性体も、本発明で使用するＬＮＡの意味に包含される。
【００４９】
本発明で使用する用語「２’−Ｏ−アルキル−４’Ｃ結合」は、ロックド核酸（ＬＮＡ）における２’−Ｏ−４’−Ｃ（又は一般的に許容されている命名法に従ってオリゴヌクレオチドの５’−から３’−方向に記載した場合４’Ｃ−２’Ｏ）化学結合、すなわち架橋を指す。アルキル結合は、置換又は非置換のアルキルであってよく、ここで本発明で使用する「アルキル」は、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−（式中ｎは、１、２、３、４、５又は６であり、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）であり、各Ｊ１及びＪ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル又は保護基である）を意味する。
【００５０】
本発明で使用する用語「ＨＢＶ」は、ヒトＢ型肝炎ウイルスを含む哺乳類Ｂ型肝炎ウイルスを意味する。この用語は、Ｂ型肝炎ウイルスの地理的な遺伝子型の変異体株に加えて、Ｂ型肝炎ウイルス、特にヒトＢ型肝炎ウイルスの地理的な遺伝子型を包含する。
【００５１】
本発明で使用する「Ｂ型肝炎に関連する病態」又は「ＨＢＶに関連する病態」は、Ｂ型肝炎の感染、曝露、又は疾病を悪化させるか、引き起こすか、関連するか、同時に生じるか、又は起因する任意の疾患、生物学的状態、医学的状態、又は事象を意味する。Ｂ型肝炎に関連する病態という用語は、黄疸、肝臓癌、肝炎、肝臓繊維症、肝硬変、肝不全、び慢性肝細胞炎症性疾患、血球貪食症候群、血清肝炎、ＨＢＶウイルス血症、及び以下のうちのいずれか又は全てを含み得る病徴を有する病態を含む：Ｂ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス抗原の存在についての試験が陽性であるか、又はＢ型肝炎ウイルス抗原に特異的な抗体の存在についての試験が陽性であることと合わせて、インフルエンザ様疾病、衰弱、疼痛、頭痛、発熱、食欲不振、下痢、黄疸、悪心嘔吐、身体の肝臓領域における疼痛、粘土色又は灰色の便、全身のそう痒感、及び濃い色の尿。
【００５２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、溶媒和されていない形態及び溶媒和された形態の両方で存在することができる。本発明で使用する用語「溶媒和物」は、本発明の化合物と、１つ以上の薬学上許容可能な溶媒分子、例えばエタノールとを含む分子複合体を説明するものである。前記溶媒が水である場合、用語「水和物」が使用される。薬学上許容可能な溶媒和物としては、水和物及び他の溶媒和物が挙げられ、ここで、結晶化の溶媒は、アイソトープで置換されてもよく、例えばＤ２Ｏ、ｄ６−アセトン、ｄ６−ＤＭＳＯである。
【００５３】
請求される本発明の化合物の範囲内には、２種類以上の異性を示す化合物を含む、式（Ｉ）の化合物の全ての立体異性体、幾何異性体、及び互変異性体、並びにこれらの１つ以上の混合物が含まれる。
【００５４】
本発明のＡＳＯは、プロドラッグとして投与してもよい。したがって、本明細書に記載されるＡＳＯの特定の誘導体は、それ自身が薬理学的活性をほとんど又はまったく有しない場合もあるが、身体内又は身体上に投与されたとき、例えば加水分解によって、配列番号１〜１３に対して本質的に相補的な望ましい活性を有するＡＳＯに変換され得る。このような誘導体を「プロドラッグ」と呼ぶ。
【００５５】
特異的なアンチセンス核酸オリゴマーの性質に依存して、標的細胞における標的ウイルス転写物、ウイルスゲノムの量又は負荷を望ましい程度に減少させることができる任意の便利な手段を使用して、ＡＳＯをホストに投与してもよい。したがって、治療的投与のための様々な製剤にアンチセンスオリゴマーを配合してもよい。より具体的には、本発明のアンチセンスオリゴマーは、適切な薬学上許容可能な担体又は希釈剤と組み合わせることによって医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、果粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤及びエアゾール剤等の固体、半固体、液体、又は気体の形態の調製物に製剤化することもできる。したがって、経口、頬側、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内投与等の様々な方法でアンチセンスオリゴマーの投与を達成することができる。
【００５６】
医薬剤形では、ＡＳＯは、単独で、又は他の薬学的活性剤と適切に会合させ、並びに組み合わせて投与することができる。以下の方法及び賦形剤は、単なる例示であり、決して限定するものではない。本発明に記載するＡＳＯは、従来の薬学的担体、賦形剤等（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、クロスカルメロースナトリウム、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウム等）と組み合わせて投与することができる。必要に応じて、医薬組成物は、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤等（例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、酢酸トリエタノールアミン、オレイン酸トリエタノールアミン等）の少量の無毒な補助剤を含有してもよい。
【００５７】
経口調製物については、ＡＳＯは、単独で使用してもよく、適切な添加剤、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン又はジャガイモデンプン等の従来の添加剤、結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、トウモロコシデンプン又はゼラチン等の結合剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン又はナトリウムカルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、そして、必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤及び香料と組み合わせて、錠剤、散剤、果粒剤、又はカプセル剤を作製してもよい。
【００５８】
ＡＳＯは、必要に応じて、可溶化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤及び保存剤等の従来の添加剤と共に、水性溶媒又は植物油若しくは他の類似する油等の非水性溶媒、合成脂肪族酸グリセリド、高級脂肪族酸のエステル、又はプロピレングリコールに溶解、懸濁、又は乳化することによって注射用調製物に製剤化してもよい。例えば、担体（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノール等）に少なくとも１つのＡＳＯ及び任意の薬学的佐剤を溶解、分散等させて溶液又は懸濁液を形成することにより、液体の薬学上投与可能な組成物を調製することができる。注射剤は、従来の形態で、例えば、液体溶液又は懸濁液として、エマルションとして、又は注射前に液体に溶解若しくは懸濁させるのに適した固体形態で調製することができる。このような非経口組成物に含有されるＡＳＯの割合は、ＡＳＯの活性及び被験体の必要性に加えて、ＡＳＯの特定の性質に大きく依存する。しかし、溶液中０．０１％〜１０％という活性成分の割合が使用可能であり、組成物が、後に上記の割合に希釈される固体である場合は更に高い。特定の実施形態では、組成物は、溶液中に活性剤であるＡＳＯを約０．２〜２％含む。
【００５９】
吸入を介して投与されるエアロゾル製剤でＡＳＯ剤を利用してもよい。本発明のＡＳＯは、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容しうる噴射剤に製剤化することができる。吸入を介する送達については、液体溶液、懸濁液、エアロゾル噴霧体又は乾燥粉末としてＡＳＯを製剤化し、投与に適したディスペンサに充填することができる。幾つかの種類の薬学的吸入装置−噴霧吸入器、計量式吸入器（ＭＤＩ）及び乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）が存在する。噴霧装置は、患者の気道へ運ばれるミストとして（液体形態で製剤化された）治療剤を噴霧させる高速空気流を生じさせる。ＭＤＩは、典型的には、圧縮ガスと共にパッケージ化された製剤である。作動させると、その装置は、一定量の治療剤を圧縮ガスによって放出して規定量の剤を投与する信頼できる方法を提供する。ＤＰＩは、その装置により呼吸中に患者の吸気流中に分散することができる自由流動粉末の形態の治療剤を分配する。自由流動粉末を得るために、ラクトース等の賦形剤と共に治療剤を製剤化する。一定量の治療剤は、カプセル剤形態で保存され、各作動時に分配される。
【００６０】
更に、乳化基剤又は水溶性基剤等の様々な基剤と混合することにより、ＡＳＯ剤を坐剤にしてもよい。本発明のＡＳＯは、坐剤を介して直腸内に投与することもできる。坐剤は、体温で融解するが、室温では固化している、カカオバター、カーボワックス及びポリエチレングリコール等のビヒクルを含んでもよい。
【００６１】
一般的に、提供されるＡＳＯは、類似の有用性を有するＡＳＯ剤について許容されている任意の投与方法により、治療有効量で投与される。実際量のアンチセンスオリゴマー、すなわち、活性成分は、治療される疾患の重篤度、被験体の年齢及び相対的な健康、使用されるＡＳＯの効力、投与の経路及び形態、並びに他の要因等の多数の要因に依存する。医薬組成物は、１日１回又は１日２回等、１日に２回以上投与することができる。特定の実施形態では、ＨＢＶ感染症を有効に治療するために、必要に応じて、２４、３６若しくは４８週間又はそれ以上にわたって１週間に１回又は２回投与され、前記治療としては、ウイルス量の低減、ウイルス抗原の低減、セロコンバージョンの発生、被験体の免疫反応の増強、及び／又はＨＢＶ  ＤＮＡ濃度の低下、並びにアラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度の標準化が挙げられる。
【００６２】
各投薬量単位、例えば、茶さじ量、食さじ量、錠剤、又は坐剤がそれぞれ１つ以上の阻害剤を含有する組成物を所定の量含有するシロップ剤、エリキシル剤及び懸濁剤等の経口又は直腸投与用の単位剤形を提供することができる。同様に、注射又は静脈内投与用の単位剤形は、滅菌水、通常生理食塩水又は別の薬学上許容可能な担体の溶液として組成物中に阻害剤を含んでもよい。
【００６３】
本発明で使用する用語「単位剤形」は、ヒト及び動物の被験体用の１回分の投薬量として適切な物理的に別々の単位であって、各単位が、薬学上許容可能な希釈剤、担体又はビヒクルと協同して所望の効果を生じさせるのに十分な量として計算された所定の量の本発明の化合物を含有する単位を指す。本発明の新規単位剤形の仕様は、使用される特定の化合物及び達成される効力、並びにホストにおける各化合物に関連した薬動力学に依存する。
【００６４】
ビヒクル、佐剤、担体又は希釈剤等の薬学上許容可能な賦形剤は、一般が容易に入手可能である。更に、ｐＨ調整及び緩衝剤、浸透圧調整剤、安定剤、湿潤剤等の薬学上許容可能な補助剤は、一般が容易に入手可能である。
【００６５】
当業者は、特定のＡＳＯ剤、送達ビヒクルの性質等の関数として用量レベルが変化し得ることを容易に認識するであろう。所与のＡＳＯにとって好ましい投薬量は、様々な手段により当業者が容易に決定できる。
【００６６】
本発明に記載するＡＳＯ治療剤を投与するための送達方法の例、並びに医薬製剤、溶媒和物、水和物、塩及びエステルの詳細は、当業者に周知であり、文献に記載されている。
【００６７】
標的細胞にＡＳＯ剤を導入するために任意の便利なプロトコールを使用して、標的細胞に有効量のＡＳＯ阻害剤を導入してもよい。前記方法としては、当技術分野において利用可能な標準的なプロトコールに従って、リポフェクタミン、ポリカチオン性アミン、例えばスペルミン、スペルミジン等の剤を使用する方法、並びにエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソームカプセル化等を含む方法が挙げられる。場合によっては、ＡＳＯを標的細胞に取り込むために外因性の剤を必要としない。有効量のＡＳＯ剤を哺乳類細胞に導入すると、ＨＢＶ標的遺伝子発現が変化、すなわち減少して、ＨＢＶ量の減少、ＨＢＶ  ＤＮＡの減少、ＡＬＴ活性の標準化、セロコンバージョン、治癒、及び免疫反応の改善を導く。
【００６８】
結局、製剤及び投薬量の選択は、薬物の投与モード及び薬物原料の生物学的利用能等の様々な要因に依存する。
【００６９】
本発明の方法は任意の哺乳類細胞で機能し、代表的な対象哺乳類細胞としては、有蹄動物、すなわち、蹄のある動物、例えば、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ等、げっ歯類、例えば、ハムスター、マウス、ラット等、ウサギ目の動物、例えば、ウサギ、霊長類、例えば、サル、ヒヒ、ヒト等の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
ＡＳＯ組成物は、治療剤又は予防剤のいずれかであり、且つ対象化合物とは異なる他の抗ウイルス剤と組み合わせる及び／又は併用する及び／又は交互に用いることが有利である場合がある。また、前記組成物は、抗ＨＣＶ剤又は免疫抑制剤等の、本化合物に対して感受性のあるウイルス感染と関連していることが多い病態を治療する剤と組み合わせられる及び／又は併用することが有利である場合もある。特定の実施形態では、対象組成物と併用投与することによってこのような剤の有効性が増強される。したがって、本化合物は、他の抗ウイルス剤と組み合わせられるか又は併用投与される場合、特定の実施形態では、単独で使用されるときに予測される量よりも少ないか、又は併用療法のために計算された量よりも少ない投薬量で用いることができる。
【００７１】
また、本発明のＡＳＯ及びＡＳＯ組成物は、身体の免疫系を増強する剤と共に使用してもよく、前記剤としては、低用量のシクロホスファミド、サイモスチムリン、ビタミン及び栄養剤（例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｅ、β−カロテン、亜鉛、セレン、グルタチオン、補酵素Ｑ−１０及びエキナシアを含む酸化防止剤）、及びワクチン、例えば、抗原の多量体提示とアジュバントとを組み合わせるワクチン製剤を含む免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。
【００７２】
当業者には理解される通り、投薬は、治療される病状の重篤度及び応答性に依存し、治療期間は、数日間から数ヶ月間持続するか、又は治癒するまで若しくは病状の縮小が達成されるまでである。患者の身体におけるＡＳＯ活性剤の蓄積を測定することによって最適な投薬スケジュールを計算することができる。最適な投薬量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対効力に依存して変化し得る。一般的に、最適な投薬量は、インビトロ及びインビボの動物モデルで有効であることが判明しているＥＣ５０に基いて見積もることができる。一般的に、投薬量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１ｇであり、１日、１週間、１ヶ月、若しくは１年間に１回以上、又は２〜１０年毎に１回、又は数時間から数ヶ月間にわたって連続的に注入することによって投与してよい。測定された滞留時間及び体液又は組織における薬物の濃度に基いて、投薬の反復回数を見積ることができる。治療が成功した後、病状の再発を防ぐために患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合がある。より具体的には、治療期間は、約４８週間続き、約０．０１μｇ／ｋｇ  体重〜約１ｇ／ｋｇ  体重の用量で皮下注射として１週間当たり１回投与される。
【００７３】
本発明の実施形態は、活性成分として本発明の少なくとも１つのアンチセンスオリゴマーを含む医薬組成物に関する。本発明に係る医薬組成物は、希釈剤、及び任意で薬学的担体を含むこと、並びに前記医薬組成物は、化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス性化合物、鎮痛剤、ＮＳＡＩＤ、麻酔剤、抗生物質、抗真菌化合物、駆虫化合物、及び／又は免疫調節化合物等の更なる化合物を任意で含むことを理解すべきである。
【００７４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、「そのまま」で又は様々な薬学上許容可能な塩の形態で使用することができる。本発明で使用する用語「薬学上許容可能な塩」は、本明細書において同定されるオリゴヌクレオチドの望ましい生物活性を保持し、且つ望ましくない毒物学的効果を最低限しか示さない塩を指す。このような塩の非限定的な例は、有機アミノ酸と共に形成されてもよく、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウム等の金属カチオンと共に、又はアンモニア、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレン−ジアミン、Ｄ−グルコサミン、テトラエチルアンモニウム若しくはエチレンジアミンから形成されるカチオンと共に形成される塩基付加塩であってもよい。
【００７５】
本発明の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、プロドラッグの形態であってもよい。天然型の場合通常ホスホジエステル骨格によって結合された個々のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、一般的にｐＨ７で大部分がプロトン脱離しているリン酸酸素と共に存在するので、負に帯電している分子である。細胞膜は、自然界では親油性であるので、中性又は親油性である等価物と比較して、オリゴヌクレオチドの細胞の取込みが少ないことが多い。１つの解決策は、プロドラッグアプローチを使用することである（例えば、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｒ．Ｍ．（１９９８年）のＣｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｖｏｌ．１３１，ｐｐ．１０３−１４０を参照されたい）。
【００７６】
また、薬学上許容可能な結合剤及び佐剤(アジュバント)が、製剤化された薬物の一部を構成してもよい。
【００７７】
本発明の医薬組成物としては、液剤、乳剤及びリポソーム含有製剤が挙げられるが、これらに限定されない。これら組成物は、予め形成されている液体、自己乳化固体、及び自己乳化半固体が挙げられるが、これらに限定されない様々な成分から生成することができる。ＡＳＯ組成物の組織への送達は、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子及びミクロスフェアが挙げられるが、これらに限定されない担体介在送達によって増強することができる（Ｄａｓｓ，Ｃ  Ｒ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００２、５４（１）：３−２７）。医薬品業界において周知である従来の技術に従って、単位剤形で便利に提示することができる本発明の医薬製剤を調製することができる。このような技術は、活性成分を薬学的担体又は賦形剤と会合させる工程を含む。一般的に、前記製剤は、活性成分と液体担体又は微粉固体担体又はこれらの両方とを均一且つ一様に会合させ、次いで、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。本発明の組成物は、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、軟質ゲル剤及び坐剤等であるが、これらに限定されない多くの可能な剤形のいずれかに製剤化することができる。
【００７８】
水性、非水性又は混合媒体の懸濁剤として本発明の組成物を製剤化してもよい。水性懸濁液は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストランを含む懸濁剤の粘性を上昇させる物質を更に含有してもよい。また、懸濁剤は、安定剤を含有してもよい。また、本発明の化合物は、活性薬物原料、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌物質又は抗生物質、及び抗癌薬原料にコンジュゲートさせてもよい。更に、本発明のＡＳＯ配列は、癌、炎症、疼痛、細菌、真菌及び／又は寄生虫感染症、アルコール中毒、物質乱用、糖尿病等の治療に有用な薬物原料に加えて、ＨＩＶ、ＨＣＶ等の他のウィルス感染症を治療するのに有用な薬物原料と共に併用療法として、又は同時ではあるが別々に投与してもよい。
【００７９】
Ｂ型肝炎ウィルス感染症には、急性及び慢性の２つの一般的な種類が存在する。また、ＨＢＶ感染症を経験した被験体は、回復することができ、無病態保菌者になる。急性肝炎Ｂは、Ｂ型肝炎ウイルスに曝露されたヒトがウイルス性肝炎の徴候及び病徴を発現し始めるときに生じる。潜伏期と呼ばれるこの期間は、平均９０日間であるが、最短４５日間又は最長６か月である場合がある。大部分のヒトについては、この感染症によって軽度から中程度の不快が引き起こされるが、身体の免疫反応がウイルスとの戦いに勝利するので自然に治る。しかし、一部の人々、特にＡＩＤＳに罹患していたり、化学療法を受けていたり、免疫抑制剤を服用していたり、又はステロイドを服用していたりする人々等の免疫系が損なわれている人々は、急性ＨＢＶ感染症の結果、非常に重大な問題が生じ、劇症肝不全等のより重篤な病態に進行する。
【００８０】
慢性Ｂ型肝炎は、ヒトが最初に急性感染症に罹患するが、その後、感染症を撃退することができないときに生じる。その疾患が慢性になるか、完全に回復するかは、感染したヒトの年齢に大きく依存する。出生時に感染した乳児の約９０％は慢性病に進行する。しかし、ヒトが年を重ねるとともに慢性感染症のリスクは減少し、小児では２０％〜５０％、、年長小児又は成人では１０％未満しか急性感染症から慢性感染症に進行しない。慢性ＨＢＶ感染症が本発明の実施形態の主な治療目標であるが、本発明のＡＳＯ組成物は、炎症、繊維症、肝硬変、肝臓癌、血清肝炎等のＨＢＶに関連する病態を治療することもできる。
【００８１】
図１に示されている通り、ＨＢＶ感染症の自然史の概要は、患者が幼児期にＨＢＶに罹患した場合、小児は免疫寛容を発現し、病態が慢性肝炎に進行する可能性が９５％存在するが、患者が成人としてＨＢＶに罹患した場合、病態が慢性になる可能性は５％だけである。
【００８２】
慢性のＨＢＶ感染症には４つの相が存在する。第１の相は、免疫寛容相であり、これは高濃度のＨＢＶ  ＤＮＡ及び正常濃度のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）と共に、微小な繊維症及び肝臓の炎症を示す場合である。第２の相は、免疫クリアランス相であり、これは肝臓の活動性炎症が組織学検査において観察可能である場合であり、またＡＬＴ活性レベルの変動及びＨＢＶ  ＤＮＡ濃度の変動を含む場合がある。第３の不活性保菌者状態相は、これに続く相であり、感染した被験体が、組織学的検査において軽症の肝炎及び微小な繊維症を示す場合がある。第４の相も報告されており、ＨＢＶの再活性化と呼ばれている。この最後の相は、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）陰性であり且つ抗ＨＢｅＡｇ陽性であるにもかかわらず、生検によって観察されるように、肝臓の活動性炎症を特徴とする。
【００８３】
慢性ＨＢＶ疾患には、幾つかの種類が存在する。１番目は、ＨＢｅＡｇ陽性、又は「野性型」ＨＢＶ感染症として知られており、抗ＨＢｅＡｇ陰性であり、且つＨＢＶ  ＤＮＡ量が＞２０，０００ＩＵ／ｍＬ（＞１０５コピー／ｍＬ）であることを特徴とする。２番目は、ＨＢｅＡｇ陰性、又は「突然変異型コア」ＨＢＶ感染症として知られており、抗ＨＢｅＡｇ陽性であり、且つＨＢＶ  ＤＮＡ量が＞２，０００ＩＵ／ｍＬ（＞１０４コピー／ｍＬ）であることを特徴とする。これら２種類の慢性ＨＢＶ感染症、及び歴史上推奨されている治療アプローチを図２及び３に示す。
【００８４】
図２は、ＨＢｅＡｇ陽性又は「野性型」ＨＢＶ感染を示す患者の分類、及び歴史上推奨されている治療を示す。左側は、２０，０００ＩＵ／ｍＬ未満（１ｍＬ当たり１０５コピー未満）のＨＢＶウィルスＤＮＡ濃度を有する患者であり、ＨＢＶ  ＤＮＡ濃度が増加しないようにモニターすること以外の治療は推奨されない。右側は、２０，０００ＩＵ／ｍＬ以上のＨＢＶウィルスＤＮＡ濃度を有する患者である。これらの患者については、正常なアラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を有する患者は、３〜１２ヶ月毎にＡＬＴ活性の任意の変化についてモニターし、年齢によっては生検を検討する。高いＡＬＴ活性を示す患者は、セロコンバージョンさせる治療を行うが、実際には、現在のＨＢＶ療法でセロコンバージョンを達成するのは患者の２０〜３０％未満である。現在推奨されているＨＢＶ療法としては、主な選択肢として、エンテカビル（ＥＴＶ）及びフマル酸テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）及びｐｅｇ−インターフェロンが挙げられる。
【００８５】
図３は、ＨＢｅＡｇ陰性又は「突然変異型コア」ＨＢＶ感染症を示す患者の分類、及び歴史上推奨されている治療を示す。左側は、２０，００ＩＵ／ｍＬ未満（１ｍＬ当たり１０４コピー未満）のＨＢＶウィルスＤＮＡ濃度を有する患者であり、ＨＢＶ  ＤＮＡ濃度が増加しないようにモニターすること以外の治療は推奨されない。右側は、２，０００ＩＵ／ｍＬ以上のＨＢＶウィルスＤＮＡ濃度を有する患者である。これらの患者については、正常なアラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を有する患者は、ＡＬＴ活性の任意の変化についてモニターし、生検を検討する。高いＡＬＴ活性を示す患者は、主な選択肢としてエンテカビル（ＥＴＶ）及びフマル酸テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）及びｐｅｇ−インターフェロンを含む、現在推奨されているＨＢＶ療法を用いて、可能な場合、ＨＢｓＡｇセロコンバージョンさせる治療を行う。
【００８６】
急性ＨＢＶ感染症に罹患している患者は、ウイルス抗原に対する激しく、ポリクローナルで、且つ多特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を示すが、慢性的に感染している患者は、弱い、すなわち検出できないＣＴＬ応答しか示さない。肝炎は、ＨＢＶ感染肝細胞を破壊するのに十分な程度強い、弱いＨＢＶ特異的免疫応答が活性化されるときに生じる。Ｔ細胞低応答性又は寛容性に関与する機序に関してはほとんど知られていないが、以下の機序が関与している可能性があると考えられている：ネガティブセレクション（新生児）、免疫学的無視、末梢アネルギー又は共刺激分子、例えば調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の喪失、枯渇（ＰＤ−１のアップレギュレーション）。これら提案された機序の全てに共通する因子は、患者に持続的に存在する高濃度の抗原である。
【００８７】
ＨＢＶ抗原ＨＢｅＡｇは、ＨＢＶコアタンパク質の分泌された非微粒子の形態である。ＨＢＶ抗原ＨＢｅＡｇ及びＨＢｃＡｇは、一次アミノ酸配列を共有しているので、Ｔ細胞レベルで交差反応性を示す。ＨＢｅＡｇは、ウイルスの集合又は複製に必要ではないが、慢性感染症の確立に必要である可能性が実験から示唆されている。
【００８８】
新生児がＨＢｅＡｇ陰性突然変異体に感染すると、慢性ＨＢＶ感染症ではなく劇症の急性ＨＢＶ感染症が生じることが多いが（Ｔｅｒｅｚａｗａら（１９９１年）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．２９：５）、ＷＨｅＡｇ陰性突然変異体が若年のウッドチャックに感染しても遥かに低い割合の慢性ＷＨＶ感染症しか生じない（Ｃｏｔｅら（２０００年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３１：１９０）。ＨＢｅＡｇは、欠失又はクローンアネルギーを通してコア特異的なＴ細胞を不活性化することによりトレラゲンとして機能する可能性がある（Ｍｉｌｉｃｈら（１９９８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：８１０２）。抗ウイルス療法及びＨＢｅＡｇセロコンバージョンの際に、ＨＢＶウイルス量及び抗原の減少と、活性化Ｔ細胞の負の調節因子である抑制性受容体ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１、ＰＤＣＤ１としても知られている）のＴ細胞による発現低下との間には正の相関が存在する（Ｅｖａｎｓら（２００８年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４８：７５９）。
【００８９】
ＨＢＶ表面抗原、すなわちＨＢｓＡｇは、感染性ＨＢＶウィルス粒子のエンベロープタンパク質であるが、ＨＢＶウィルス粒子よりも１０００倍高い血中濃度で非感染性粒子としても分泌される。感染したヒト又は動物におけるＨＢｓＡｇの血清濃度は、最高１０００μｇ／ｍＬにもなる場合がある（Ｋａｎｎ及びＧｅｈｒｌｉｃｈ（１９９８年）Ｔｏｐｌｅｙ＆Ｗｉｌｓｏｎ’ｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，第９版，７４５）。急性ＨＢＶ感染症では、血清中におけるＨＢｓＡｇの半減期、すなわち血清ｔ１／２は、８．３日である（Ｃｈｕｌａｎｏｖら（２００３年）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６９：３１３）。骨髄樹状細胞によるＨＢｓＡｇの内在化は、共刺激分子（すなわちＢ７）のアップレギュレーションを阻害し、Ｔ細胞刺激能を阻害し（ｄｅｎ  Ｂｒｏｕｗら（２００８年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２６：２８０）、慢性的に感染している患者に由来する樹状細胞も、共刺激分子の発現、ＩＬ−１２の分泌、及びＨＢｓＡｇの存在下におけるＴ細胞の刺激が欠損する（Ｚｈｅｎｇら（２００４年）Ｊ．Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  １１：２１７）。
【００９０】
ＣＨＢ患者に由来するＨＢｓＡｇ特異的ＣＤ８細胞は、四量体結合の変化を示す。これらのＣＤ８細胞は、アネルギーではなく、部分寛容又は無視を生じさせるＴＣＲトポロジーを有する場合がある（Ｒｅｉｇｎａｔら（２００２年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５：１０８９）。更に、２４週間目における１ｌｏｇ超の血清ＨＢｓＡｇの減少は、Ｐｅｇ−ＩＦＮα２ａ療法中の持続性ウイルス陰性化（ＳＶＲ−治療の１年後にＨＢＶ  ＤＮＡをＰＣＲで検出することができないと定義される）について高い予測値（９２％）を有する（Ｍｏｕｃａｒｉら（２００９年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ４９：１１５１）。
【００９１】
伝染経路が重複しているので、多くの人々がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）の両方に曝露されており、特にＨＢＶが風土病であるアジア等の地域では、より低い人々のヒトが両方のウイルスに慢性的に感染している。ＨＣＶに感染しているヒトのうちの最高１０％がＨＢＶにも感染している可能性があり、一方、ＨＢＶに感染しているヒトのうちの恐らく２０％がＨＣＶにも同時感染していることが推定値から示唆されている。しかし、ＨＢＶ−ＨＣＶ同時感染個体におけるＢ型肝炎又はＢ型肝炎の治療についてはそれほど研究されていない。
【００９２】
ＨＣＶ及びＨＢＶが互いの複製を阻害するようであるという事実が治療を複雑化している（全ての研究においてこの相互作用が観察された訳ではないが）。したがって、完全にＨＢＶを抑制する治療は、場合によってはＨＣＶを再発生させる可能性があり、逆もまた同様である。
【００９３】
したがって、ＨＢＶ及びＨＣＶの両方に感染している患者を治療するために本発明のＡＳＯ化合物を使用することが有利である場合がある。Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）に対する代表的な治療の選択肢としては、インターフェロン、例えば、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａ、及びインターフェロンアルファコン−１が挙げられる。それほど頻繁でないが、ペグ化インターフェロン（その薬物動態プロファイルを著しく改善するポリエチレングリコール部分が結合しているインターフェロン）を使用してインターフェロン投薬を行うこともできる。（ペグ化及び非ペグ化）インターフェロンアルファ−２ｂとリバビリンとの併用療法も、一部の患者集団に対して効果的であることが示されている。現在開発されている他の剤としては、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製阻害剤（例えば、ＶｉｒｏＰｈａｒｍａのＶＰ５０４０６シリーズ）、ＨＣＶアンチセンス剤、ＨＣＶ治療ワクチン、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＣＶヘリカーゼ阻害剤、及びＨＣＶ抗体療法（モノクローナル又はポリクローナル）が挙げられる。
【００９４】
本発明の実施形態は、ＨＢＶ及びＨＣＶに感染している被験体を治療するための配列番号１〜１３のいずれかに対して本質的に相補的なＡＳＯ化合物であって、ＨＣＶ剤と組み合わせて投与されるＡＳＯ化合物を提供する。ＡＳＯ化合物と同じ薬物製剤でＨＣＶ剤を投与してもよく、別々の製剤で投与してもよい。更に、ＨＢＶ  ＡＳＯ化合物及びＨＣＶ剤の各々の用量が患者の体内でいずれ重複するように、ＨＣＶ化合物をＡＳＯ  ＨＢＶ化合物と同時に投与してもよく、別々に投与してもよい。関連する実施形態では、更なるＨＣＶ剤は、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａ及びインターフェロンアルファコン−１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製阻害剤（例えば、ＶｉｒｏＰｈａｒｍａのＶＰ５０４０６シリーズ）、ＨＣＶアンチセンス剤、ＨＣＶ治療ワクチン、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＣＶヘリカーゼ阻害剤、及びＨＣＶ抗体療法（モノクローナル又はポリクローナル）から選択することができる。
【００９５】
別の実施形態では、第２のＨＢＶ治療剤と組み合わせて、ＨＢＶに感染している患者に本発明のＨＢＶ  ＡＳＯ化合物を投与してもよく、ここで前記第２のＨＢＶ治療剤は、ＨＢＶ  ＡＳＯ化合物と同じ薬物製剤で投与されてもよく、別々の製剤で投与されてもよい。ＨＢＶ  ＡＳＯ化合物及びＨＢＶ治療剤の各々の用量が患者の体内でいずれ重複するように、第２のＨＢＶ治療剤をＡＳＯ  ＨＢＶ化合物と同時に投与してもよく、別々に投与してもよい。関連する実施形態では、前記ＨＢＶ治療剤は、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａ、及びインターフェロンアルファコン−１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン、ＨＢＶ  ＲＮＡ複製阻害剤、第２のＨＢＶアンチセンス化合物、ＨＢＶ治療ワクチン、ＨＢＶ予防ワクチン、ラミブジン（３ＴＣ）、エンテカビル、テノホビル、テルビブジン（ＬｄＴ）、アデホビル、及びＨＢＶ抗体療法（モノクローナル又はポリクローナル）から選択することができる。
【００９６】
図４は、ＨＢＶ転写の概略であり、以下を示す：プレコア及びコアタンパク質を含むＨＢＶゲノムにコードされている主要転写物、ＲＮＡ及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素活性）、Ｘタンパク質、及び大、中、及び小Ｓタンパク質に加えて、ポリＡテイル、転写物の相対的長さ、並びに大、中、及び小Ｓタンパク質の転写物の重複。ＨＢＶ  ＤＮＡのプラス鎖及びマイナス鎖も示す。
【００９７】
図５は、ＨＢＶのゲノム領域によってプロットされた、ＨＢＶの複数の遺伝子型由来のゲノムＤＮＡの配列間の同一性割合を比較するためのコンピュータを利用した生物学分析を示す。図５から分かるように、特にポリメラーゼ、並びに大、中、及び小Ｓタンパク質の転写領域について、配列中に１００％同一である複数の領域が同定された。
【００９８】
図６は、同定されている様々なＨＢＶの地理的な遺伝子型の表である。表から分かるように、分類されたＨＢＶの８つの異なる地理的な遺伝子型が存在し、これらはゲノムＤＮＡにおいておよそ８％異なっている。これらの地理的分布が異なることに加えて、ＨＢＶ遺伝子型は、病歴及びインターフェロン療法に対する応答においても異なる場合がある。
【００９９】
広く計算生物学分析を使用することによって、図５に例証されているものと同様に、約２３００個の配列を分析したところ、驚くべきことに、様々な遺伝子型にわたって９５％超の同一性を有する１３の配列が同定された。この分析によって、遺伝子型を横断して、ＨＢＶゲノムの複数の転写産物及び領域の中で９５％超の同一性を有する保存配列をそれぞれ標的とする個々のアンチセンスオリゴマー配列を設計することが可能になった。したがって、本発明者らは、驚くべきことにそして予想外にも、個々のＡＳＯ配列が複数の転写産物をシャットダウンする手段を見出し、また、同じ個々のＡＳＯが、ＨＢＶの全ての地理的な遺伝子型にわたって活性を増加させることを明らかにした。このようなアプローチによって、活性化合物として単一のＡＳＯ配列を含む医薬組成物が可能になり、前記組成物は、既存のＨＢＶ療法よりも大きな効果を有し、ＨＢＶ株が耐性を発現する能力を厳しく限定し、且つＨＢＶ  ＤＮＡ及びＨＢＶ抗原ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇの存在によって証明される通りウイルス量を９０％以上低減する。したがって、本発明の医薬組成物は、慢性ＨＢＶ感染症に罹患している患者に完全なセロコンバージョンを提供することができ、最終的には慢性ＨＢＶ感染症を完全に治癒させることができる改善された療法的治療をもたらす。また、このようなアプローチは、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）、並びに繊維症及び炎症等のＨＢＶに関連する肝臓病態を低減して、肝臓移植の必要性を減少させ、肝臓疾患による死を防ぐのに役立つ。
【０１００】
更に、ウイルス量の低減が大きく改善されることに加えて、本発明のＡＳＯは他の利点を提供する。ＨＢｅＡｇは、免疫抑制性の役割を有すると考られ、ＨＢｓＡｇは、Ｔ細胞枯渇の一因となると考えられる。したがって、本発明のＡＳＯを用いる治療は、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇの濃度を低下させることにより患者の免疫反応を増強して、免疫系がより十分に感染を制御できるようにする。また、肝臓におけるＨＢＶ抗原提示の減少がＨＢＶ感染症の再発の程度を最小化するのに役立つと予測され、免疫系回復の結果、これらの全てが慢性ＨＢＶ感染症を完全に治癒させる可能性を高める。
【０１０１】
標的細胞におけるＢ型肝炎ウイルスのゲノム量を低減する方法及び組成物が提供される。対象方法において、幾つかの特異的なＨＢＶ標的タンパク質のいずれかの発現は、標的細胞におけるウイルスのゲノムの量を低減するのに十分な方法で、例えば、標的細胞にアンチセンスＲＮＡ阻害剤を導入することによって阻害される。また、対象方法の実施において使用するための医薬組成物が提供される。対象発明の実施形態は、ウイルス介在疾患病態、例えば、ＨＢＶ介在疾患病態に罹患している被験体の治療を含む様々な用途で利用される。このような病態としては、肝臓の繊維症及び炎症、肝硬変、並びに肝細胞癌（肝臓癌）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
本発明の１つの実施形態は、ヒトを含む哺乳類におけるＨＢＶ感染症を治療するためのアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であって、前記ＡＳＯが配列番号１〜１３のいずれか１つに対して本質的に相補的であり、且つウイルス量又は抗原濃度を少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは８０％、最も好ましくは９０％低減するのに有効であるＡＳＯを提供する。前記ＡＳＯは、ロックド核酸（ＬＮＡ）単位を含む少なくとも２つの修飾ヌクレオシドを含んでもよく、この場合、前記ＬＮＡ単位は２’Ｏ−アルキル−４’Ｃ結合を有しているので、修飾ＬＮＡヌクレオシドがＡＳＯ配列に組み込まれているＡＳＯの位置に二環式糖が生じる。
【０１０３】
本発明のアンチセンスオリゴマーは、ＬＮＡ等のヌクレオシド類似体、又はホスホロチオエート等のヌクレオチド類似体を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続する核酸配列の一部を形成する。アンチセンスオリゴマーの配列は、連続するヌクレオチド又はヌクレオシド配列からなる。
【０１０４】
本発明で使用する用語「アンチセンス」は、５’−末端から３’−末端方向にみたとき、核酸オリゴヌクレオチド配列が、ＤＮＡのセンス鎖に対して本質的に相補的な配列を含むことを意味する、すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−から３’−に、コード鎖としても知られているＤＮＡのセンス鎖と反対の配列配向を有するので、アンチセンスオリゴマーは、所与のＤＮＡコード領域又は遺伝子のセンス鎖に対して本質的に相補的である。
【０１０５】
用語「オリゴヌクレオチド」（又は単に「オリゴ」）は、用語「オリゴマー」と互換的に用いられ、本発明の状況では、２つ以上のヌクレオチドの共有結合によって形成される分子を指す。本発明のオリゴヌクレオチド（一本鎖オリゴヌクレオチドとも呼ばれる）の状況において使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、１つの実施形態では、例えば、１０〜２６ヌクレオチドを有してもよく、より具体的には、本発明のオリゴヌクレオチドは、１２〜２０ヌクレオチド、又はより具体的には１４〜１８ヌクレオチドを有してもよい。
【０１０６】
用語「ヌクレオチド」は、３つの構成要素、すなわち、時に核酸塩基とも呼ばれるピリミジン及びプリン塩基を含む複素環式窒素含有塩基、五炭糖（リボース又はデオキシリボース）及びホスホリル基（ホスフェート、ホスホロチオエート、ホスホネート等）を有する分子を指す。例としては、ＤＮＡヌクレオチド、例えば、デオキシアデノシン−５’−一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン−５’−二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシチミジン−５’−三リン酸（ｄＴＴＰ）、及びデオキシシチジン−５’−三リン酸（ｄＣＴＰ）、並びにＲＮＡヌクレオチド、例えば、アデニン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、シチジン−５’−二リン酸（ＣＤＰ）、イノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）、ウリジン−５’−三リン酸（ＵＴＰ）及びグアノシン−５’−三リン酸（ＧＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
本発明で使用するヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホネート、Ｈ−ホスホネート又はアルキルホスホネート類似体等のホスフェート類似体を含む。幾つかの態様では、用語核酸塩基は、天然に存在してもよく天然に存在しなくてもよいヌクレオチドを指すために用いることができ、この点で、用語核酸塩基及びヌクレオチドは、本発明で互換的に使用することができる。核酸塩基としては、特に、グアニン、シトシン、チミン、アデニン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６−ジヒドロウラシル、５−フルオロウラシル、５−フルオロチミン、Ｎ７−メチルグアニン、Ｎ７−メチルチロシン、５−メチルシトシン及び５−メチルウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本発明で提供されるオリゴマー化合物は、修飾糖部分を有する、ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む１つ以上のモノマーを含んでもよい。例えば、ヌクレオチドのフラノシル糖環は、置換基を付加する、２つの非ジェミナルな環原子を架橋してロックド核酸（ＬＮＡ）を形成する等が挙げられるが、これらに限定されない多数の方法で修飾することができる。
【０１０９】
特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、ＬＮＡである１つ以上のモノマーを含む。このような特定の実施形態では、ＬＮＡとしては、下記のような（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ２’）ＬＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＬＮＡ、及び（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＬＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【化２】
0005892938.tif 000003
【０１１０】
特定の実施形態では、ＬＮＡ化合物としては、糖の４’位と２’位との間に少なくとも１つの架橋を有する化合物であって、前記架橋の各々が独立して、以下から独立して選択される１又は２〜４つの結合基を含む化合物が挙げられるが、これらに限定されない：−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲ１）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ１）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−及び−Ｎ−（Ｒ１）−
（式中、
ｘは、０、１又は２であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、置換Ｃ５−Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）又はスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり、
各Ｊ１及びＪ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、置換Ｃ５−Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル又は保護基である）。
【０１１１】
１つの実施形態では、ＬＮＡ化合物の架橋の各々は、独立して、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ１Ｒ２）−Ｎ（Ｒ１）−Ｏ−又は−Ｃ（Ｒ１Ｒ２）−Ｏ−Ｎ（Ｒ１）−である。別の実施形態では、前記架橋の各々は、独立して、４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ１）−２’、及び４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ１）−Ｏ−２’−（式中、各Ｒ１は、独立して、Ｈ、保護基又はＣ１−Ｃ１２アルキルである）である。
【０１１２】
科学論文に加えて特許文献でも特定のＬＮＡが調製され、開示されている（例えば、参照することによって全文が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０５３，２０７号、同第６，２６８，４９０号、同第６，７７０，７４８号、同第６，７９４，４９９号、同第７，０３４，１３３号、同第６，５２５，１９１号、同第７，６９６，３４５号、同第７，５６９，５７５号、同第７，３１４，９２３号、同第７，２１７，８０５号、同第及び７，０８４，１２５号を参照されたい）。
【０１１３】
本発明では、リボシル糖環の２’−ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に結合し、それによってメチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）結合を形成して、二環式糖部分を形成するＬＮＡも提供される（Ｅｌａｙａｄｉら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ，２００１年，２，５５８−５６１、Ｂｒａａｓｃｈら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００１年，８  １−７、及びＯｒｕｍら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１年，３，２３９−２４３に概説されている。また、米国特許第６，６７０，４６１号も参照されたい）。前記結合は、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（ＣＨ２−）基であってもよく、この場合用語メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡが二環式部分について使用され、この位置がエチレン基の場合には、用語エチレンオキシ（４’−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡが使用される（Ｓｉｎｇｈら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６：Ｍｏｒｉｔａら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，１１，２２１１−２２２６）。メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ及び他の二環式糖類似体は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡとの非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３℃〜＋１０℃）、３’−エキソヌクレアーゼによる分解に対する安定性、及び優れた溶解特性を示す。ＬＮＡを含む強力且つ無毒なアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８）。
【０１１４】
また既に論じられているメチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡの異性体としては、３’−エキソヌクレアーゼに対して優れた安定性を有することが示されているアルファ−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡがある。アルファ−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡは、アンチセンスギャップマー及びキメラに組み込まれて、強力なアンチセンス活性を示した（Ｆｒｉｅｄｅｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。
【０１１５】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡモノマーであるアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン及びウラシルの合成及び調製については、これらのオリゴマー化及び核酸認識特性と共に記載されている（Ｋｏｓｈｋｉｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０）。また、ＬＮＡ及びその調製は、参照することによって本明細書に組み込まれる国際特許公開第９８／３９３５２号パンフレット及び同第９９／１４２２６号パンフレットにも記載されている。
【０１１６】
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、ホスホロチオエート−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ及び２’−チオ−ＬＮＡの類似体も調製されている（Ｋｕｍａｒら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼの基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖を含むロックドヌクレオシド類似体の調製についても記載されている（Ｗｅｎｇｅｌら、国際特許公開第９９／１４２２６号パンフレット）。更に、２’−アミノ−ＬＮＡの合成、新規の立体配置的に制限されている高親和性オリゴヌクレオチド類似体が当技術分野において記載されている（Ｓｉｎｇｈら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９）。更に、２’−アミノ−及び２’−メチルアミノ−ＬＮＡが調製されており、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ鎖との二重鎖の熱安定性も既に報告されている。
【０１１７】
１つの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも２つのＬＮＡモノマーを含んでもよく、より具体的には、前記アンチセンスオリゴマーは、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のＬＮＡモノマーを含んでもよい。下記の通り、連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡ及びＤＮＡ単位（ホスホロチオエート結合等の連結基を含む）からなってもよく、又はＬＮＡと他のヌクレオシド及びヌクレオチド類似体とからなってもよい。幾つかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個のＤＮＡヌクレオチドを含んでもよく、ヌクレオチドの残りは、ＬＮＡ単位等のヌクレオシド類似体を含む。
【０１１８】
特定の実施形態は、配列に組み込まれたＬＮＡヌクレオチドを含む１０〜１００ヌクレオチド長のＡＳＯを提供する。特定の実施形態は、連続的に５’−から３’−方向に、４つのＬＮＡヌクレオチド、８つの非ＬＮＡギャップヌクレオチド（ｎｔ）、４つのＬＮＡヌクレオチドに対応する４−８−４パターンを有するＡＳＯを提供する。したがって、４ＬＮＡ−８ｎｔ−４ＬＮＡモチーフは、８つの連続的に連結された２’−デオキシヌクレオチドを有する中央ヌクレオチド（ｎｔ）ギャップセグメントを含む。４ＬＮＡ−８ｎｔ−４ＬＮＡ  １６量体のＡＳＯにおけるｎｔギャップセグメントは、ウィングセグメントによって両側（５’及び３’）で隣接している。各ＡＳＯにおける各ウィングセグメントは、４つの連続的に連結されたヌクレオチドを有する。各ＡＳＯにおける各ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）糖修飾を有する。各ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド全体にわたってヌクレオチド間結合は各々ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合であるが、本発明の一部のＡＳＯにおける一部のヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル結合を含むホスホロチオエート以外の結合であり得ることが想定される。また、所与のＡＳＯのＬＮＡモチーフが、４ＬＮＡ−８ｎｔ−４ＬＮＡから、より長いか又はより短い合計ヌクレオチド配列を有するＬＮＡ−ｎｔ−ＬＮＡモチーフの他の組合せを含む他のモチーフまで変化し得ることも本発明の範囲内である。特定の実施形態は、様々な他の「ウィング−ギャップ−ウィング」パターンのＡＳＯを提供する。「ウィング−ギャップ−ウィング」パターンは、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記載されることが多く、ここで、「Ｘ」は、５’ウィング領域の長さを表し、「Ｙ」は、ギャップ領域の長さを表し、「Ｚ」は、３’ウィング領域の長さを表す。幾つかの実施形態では、Ｘ及びＺは同一であり、他の実施形態では、これらは異なる。特定の態様では、Ｘ及びＺは独立して、１〜５ヌクレオシド長である。特定の態様では、Ｙは８〜１２ヌクレオチド長である。また、本発明のＡＳＯは、１０量体、１１量体、１２量体、１３量体、１４量体、１５量体、１６量体、１７量体、１８量体、１９量体又は２０量体（すなわち、それぞれ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドを有するオリゴマー）又はそれ以上、１００以下のヌクレオチド長を有するオリゴマーであってもよい。他の特定の実施形態は、上記のような他の可能な交互パターンの配列に組み込まれたＬＮＡを含む、１０〜１００ヌクレオチド長のＡＳＯを提供する。他の特定の実施形態では、所与の配列中に２以上のＬＮＡ−ｎｔ−ＬＮＡモチーフが存在してもよく、その結果、上記のような一般式５’−ＬＮＡｎ−Ｐ−ＬＮＡｐ−Ｐ−Ｎｍ−Ｐ−Ｎｌ−Ｐ−ＬＮＡｒ−Ｐ−ＬＮＡｑ−３’（式１）が、合計１０〜２０のヌクレオチド長の特定のＡＳＯ内に存在することが可能である。
【０１１９】
特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマー配列のヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｈ−ホスホネート、又はアルキルホスホネート結合から選択される。更なる特定の実施形態では、ヌクレオチド間結合は全てホスホロチオエート結合である。
【０１２０】
より具体的な実施形態では、アンチセンスオリゴマー配列のヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル結合及びホスホロチオエート結合から選択される。
【０１２１】
より具体的な実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも２つの修飾ヌクレオチド、より具体的には、少なくとも２つのロックド核酸（ＬＮＡ）単位を含み、ここで、ＬＮＡ単位は、２’Ｏ−アルキル−４’Ｃ結合を有する。
【０１２２】
特定の実施形態は、ＡＳＯの３’−末端及び５’−末端に向かって配置される少なくとも２つのＬＮＡ単位を含むアンチセンスオリゴマーを提供し、より具体的には、ＡＳＯは、ＡＳＯの３’−末端及び５’−末端に向かって配置される少なくとも３つのＬＮＡ単位を含み、より具体的には、ＡＳＯは、少なくとも４つのＬＮＡ単位を含み、より具体的には前記少なくとも４つのＬＮＡ単位は、ＡＳＯの３’−末端及び５’−末端に向かって配置され、その結果、ＡＳＯは、以下の式１によって表される配列を含む：
５’−ＬＮＡｎ−Ｐ−ＬＮＡｐ−Ｐ−Ｎｍ−Ｐ−Ｎｌ−Ｐ−ＬＮＡｒ−Ｐ−ＬＮＡｑ−３’（式１）
（式中、
ＬＮＡは、２’−Ｏ−Ｍｅ−４’Ｃ結合を有するロックド核酸であり、
Ｐは、式（１）の配列の５’から３’方向に、ＬＮＡと隣接するＮとの間、又はＮと隣接するＮとの間、又はＮと隣接するＬＮＡとの間、又はＬＮＡと隣接するＬＮＡとの間の、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｈ−ホスホネート、又はアルキルホスホネート結合から選択され、
Ｎは、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｕ又はＸヌクレオチド単位から選択され、
ｎ及びｒ及びｐ及びｑは、各々独立して、１、２又は３から選択される整数であり、
ｌ及びｍは、各々独立して、１〜２２の整数であり、
Ｘは、イノシン、Ｎ７−メチルイノシン、Ｎ７−メチルグアニジン、５−メチルウリジン、５−メチル−チミジン、５−フルオロウリジン、５−フルオロチミジンから選択される）。
【０１２３】
関連する特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは少なくとも６つのホスホロチオエート結合を含む。別の関連する特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは全てホスホロチオエート結合を含む。
【０１２４】
別の実施形態では、ヒトを含む哺乳類におけるＨＢＶ感染症を治療する方法であって、前記治療が、有効量の本発明のアンチセンスオリゴマーを投与することを含み、前記アンチセンスオリゴマーが、配列番号１〜１３のいずれかに対して本質的に相補的であり、その結果、ＨＢＶ感染症を治療し、ヒトを含む哺乳類におけるセロコンバージョンを促進する方法が提供される。有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、医師によって決定される通り、２４、３６又は４８週間の間、またはそれ以上の間、１週間に１回又は２回投与される。治療の効力は、ウイルス量の定量、又はＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢＶ  ＤＮＡ濃度、ＡＬＴ活性レベル、血清ＨＢＶ濃度等の測定を通して得られる証拠等の感染の他の証拠を用いて判定することができ、それによって、治療用量、治療頻度、及び治療期間を調整することができる。
【実施例】
【０１２５】
オリゴマーの調製
ＬＮＡモノマー及びオリゴヌクレオチドの合成物は、両方とも参照することによって本明細書に組み込まれる国際特許公開第２００７／１１２７５４号パンフレットにおいて言及されている方法論及び米国特許出願公開第２００９０１４３３２６号に記載されている方法論を含む公開特許出願及び文献に記載されている通り調製されている。ＬＮＡ  ＡＳＯは、本明細書に記載されている通り、例えば、Ｅｘｉｇｏｎから購入することができる。
【０１２６】
参照することによって本明細書に組み込まれる国際特許公開第２００７／１１２７５４号パンフレットに言及されている方法論を用いて、及び本明細書に記載されている通り、インビトロにおいて（ヒトＨＢＶゲノムの配列番号１〜１３を標的とする）ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理することができる。インビトロモデルとインビボの両方のモデルにおける、ＲＮＡ特異的リアルタイム定量ＰＣＲを用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨＢＶ感染症阻害の分析は、参照することによって本明細書に組み込まれる国際特許公開第２００７／１１２７５４号パンフレットに言及されている方法論を用いて、及び本明細書に記載されている通り実施してもよい。更に、ＨＢＶ発現を標的とする（ヒトＨＢＶゲノムの配列番号１〜１３に対する）１０〜１００ヌクレオチド長の本発明のアンチセンスオリゴマーを用いるインビボ実験及びその後の分析は、例えば、全て参照することによって本明細書に組み込まれる国際特許公開第２００７／１１２７５４号パンフレット又はＪ．Ｖｉｒｏｌ（１９９８年）ｖｏｌ．７１，ｐｐ  ２６３０−２６３７、又はＹｏｎｓｅｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９５年），ｃｏｌ．３６，ｐｐ．５２７−５３３に開示されている方法を用いて実施することができる。また、ＨＢＶのウッドチャックモデルも開発されており、これは、ウッドチャック（マーモット）にウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）を感染させて、ヒトＨＢＶ感染の多くの態様をモデル化する慢性又は急性感染症を生じさせることができる［参照することによって本明細書に組み込まれるＭｅｎｎｅ  Ｓ及びＣｏｔｅ  ＰＪ（２００７年）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １３，１０４−１２４及びＭｅｎｎｅ  Ｓら（２００２年）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５，２３７−２５０］。Ｍｅｎｎｅ及びＣｏｔｅの文献、並びにＭｅｎｎｅらの文献に記載されているウッドチャックモデルを用いて、慢性感染症について試験し、サザンブロットハイブリダイゼーションを用いて血清中のウイルスＤＮＡを測定し、またＥＬＩＳＡによって血清中のウイルス抗原を測定することができる。
【０１２７】
生物活性
（Ａ）ヒトＢ型肝炎の結果
実施例１：ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、ＨｅｐＧ２  ２．２．１５細胞におけるＢ型肝炎ウイルス発現のアンチセンス阻害
Ｅｘｉｑｏｎからロックド核酸オリゴヌクレオチドを購入した。試験したＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、全長１６ヌクレオチドであり、各々４ＬＮＡ−８ｎｔ−４ＬＮＡモチーフを有し、且つ８つの連続的に結合された２’−デオキシヌクレオチドを有する中央ヌクレオチド（ｎｔ）ギャップセグメントを各々が含んでいた。各１６量体ＡＳＯにおけるｎｔギャップセグメントは、ウィングセグメントによって両側（５’及び３’）で隣接している。各ＡＳＯにおける各ウィングセグメントは、４つの連続的に結合されたヌクレオチドを有する。各ＡＳＯにおける各ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）糖修飾を有する。各ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド全体にわたって各ヌクレオチド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合であるが、本発明の一部のＡＳＯにおける一部のヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル結合を含むホスホロチオエート以外の結合であり得ることが想定される。また、所与のＡＳＯのＬＮＡモチーフが、４ＬＮＡ−８ｎｔ−４ＬＮＡから、より長いか又はより短い合計ヌクレオチド配列を有するＬＮＡ−ｎｔ−ＬＮＡモチーフの他の組合せを含む本発明に記載する他のモチーフまで変化し得ることも本発明の範囲内である。ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡの濃度を測定することにより判定したときの、ヒト肝芽腫細胞株ＨｅｐＧ２．２．１５におけるＢ型肝炎ウイルスの発現を阻害する能力について１６量体ＬＮＡ  ＡＳＯを評価した。
【０１２８】
オリゴヌクレオチドは全てホスホロチオエート結合を含有しており、１６ヌクレオチド長であり、且つ５’−末端に４ヌクレオチド及び３’−末端に４ヌクレオチドのＬＮＡを含む４−８−４のモチーフのロックド核酸を含有していた。アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列（配列番号１４〜２３として参照することによって本明細書に組み込まれる）を表１に示す。
【表１】
0005892938.tif 000004
【０１２９】
ＨＢＶ遺伝子のヘッドトゥーテールダイマーを有するプラスミドで安定的にトランスフェクトされたＨｅｐＧ２  ２．２．１５細胞（ヒト肝芽腫細胞株）の単層を、３７℃、５％のＣＯ２において、ＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃２２４００−０８９）、１０％のＦＢＳ、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）中で増殖させ、コンフルエントになったら１：３に分割した。
【０１３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの原液を滅菌水で調製し、トランスフェクションのために４．２５μＭの濃度に希釈した。１０μＬのオリゴヌクレオチドを１３０μＬのＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。１００μＬのオリゴヌクレオチド混合物を１００μＬのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温で２０分間インキュベートした。７０μＬを１４０μＬのＯｐｔｉ−Ｍｅｍに希釈することにより、連続希釈を行った。５０μＬの希釈混合物を９６ウェルプレートに添加し、２．８×１０５／ｍＬの濃度のＨｅｐＧ２  ２．２．１５細胞を１００μＬ添加した。トランスフェクトされた細胞を、２日目に培地を交換して４日間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。分泌されたＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡを評価するために４日目に上清を取り出し、製造業者の説明書に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、残りの細胞単層において細胞の生存率を決定した。製造業者の説明書に従って、Ａｂａｚｙｍｅ  ＨＢＶ  ｓ  Ａｇキット（カタログ番号ＥＬ１００１８）を使用してＨＢｓＡｇレベルを測定した。製造業者の説明書に従って、ＢｉｏＣｈａｉｎ  ＨＢＶ  ｅ  Ａｇキット（カタログ番号ＫＯ３１００６０９６）を使用してＨＢｅＡｇレベルを測定した。
【０１３１】
上清中のＨＢＶ  ＤＮＡの分析については、製造業者の説明書に従ってＱｉａＡｍｐ  ９６  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して５０μＬの上清からＤＮＡを抽出した。記載されている通りのプライマー及び条件を使用して、５μＬのＤＮＡをＴａｑＭａｎ分析に使用した［Ｔｈｉｍｍｅ  Ｒら（２００３年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７，６８−７６］。既知量のＨＢＶ  ＤＮＡのプラスミドクローンに基いた標準曲線を使用して、培地に分泌されたＨＢＶゲノム当量を計算した。
【０１３２】
オリゴヌクレオチドが存在しない状態においてトランスフェクション手順を受けた細胞から得られた値を使用して、細胞の生存率、ＨＢＶ  ＤＮＡ及び分泌された抗原の阻害を正規化した。非線形回帰によってデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５を使用して、対数（阻害剤）対応答曲線に適合させた。
【０１３３】
アンチセンスオリゴマーでＨｅｐＧ２  ２．２．１５細胞を処理した結果を表１に示す。ＨＢＶ配列に対するアンチセンスオリゴマーは全て、対照オリゴマーよりも高い効力でＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの産生及び分泌を阻害した。また、対照オリゴマーも抗原の産生及び分泌を阻害したが、これは、抗原阻害と細胞毒性(細胞傷害性)との間のＩＣ５０値の差が僅か３倍であったので、細胞毒性によるものである可能性がある。ＨＢＶ配列に対するアンチセンスオリゴマーは、抗原阻害と細胞毒性との間のＩＣ５０値の倍数差がより大きかった。アンチセンスオリゴマーＲＨ１、ＲＨ３、ＲＨ４及びＲＨ７が最も大きな倍数差を有しており、更に、分泌されたＨＢＶ  ＤＮＡでも一貫して阻害を示した。ＨＢＶ  ＤＮＡの阻害は５０％超には上昇しなかったので、ＩＣ５０値は計算しなかった。任意のオリゴマーについて細胞毒性が観察されず、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの阻害についてのＩＣ５０値に近い濃度である０．６ｎＭのオリゴマー濃度におけるＨＢＶ  ＤＮＡの阻害割合を表１に示す。
【０１３４】
実施例２：ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、ＨｅｐＡＤ３８（Ｔｅｔ−ＨＢＶ）細胞におけるＢ型肝炎ウイルス又はＳＶ４０  Ｔ抗原発現のアンチセンス阻害
配列番号４に列挙されたＤＮＡ配列及びＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号Ｕ９５５５１．１に対して相補的な配列ＧＡＧＧＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡＧＧ（配列番号：１６）を有する、ＨＢＶを標的とするＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、配列番号１６として本明細書に組み込む。前記ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、４−８−４のＬＮＡモチーフを有する全長１６のヌクレオチドであり、ここでは、ＡＳＯは、８つの連続的に結合された２’−デオキシヌクレオチドを有する中央ギャップセグメントを有する。ギャップセグメントは、ウィングセグメントによって両側（５’及び３’）で隣接する。各ウィングセグメントは、４つの連続的に結合されたヌクレオチドを有する。各ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）糖修飾を有する。前記ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド全体にわたってヌクレオチド間結合は各々ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。前記ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの各シトシンは、５−メチルシトシンである。ＨｅｐＡＤ３８細胞においてＨＢＶ  ｍＲＮＡを減少させる能力について、前記ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを評価した。
【０１３５】
約２４時間の間、エレクトロポレーションを用いて、７４１ｎＭ、２，２２２ｎＭ、６，６６７ｎＭ及び２０，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでＨｅｐＡＤ３８細胞をトランスフェクトした。細胞からＲＮＡを単離し、定量リアルタイムＰＣＲによってＨＢＶ  ｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮによって測定されたときの全ＲＮＡ含量に従ってＨＢＶ  ｍＲＮＡレベルを調整した。プライマープローブセットＲＴＳ３３７２（フォワード配列ＡＴＣＣＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＣＧＧＡＡＡＣＴ、配列番号２４として本明細書に記載される；リバース配列ＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＡＴＴＧＡＧ、配列番号２５として本明細書に記載される；プローブ配列ＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＧ、配列番号２６として本明細書に記載される）を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。未処理細胞と比べたｍＲＮＡレベルの阻害割合として表すデータを表２に示す。ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、用量依存的にＨＢＶ  ｍＲＮＡレベルを低下させた。
【０１３６】
また、プライマープローブセットＲＴＳ３３７３ＭＧＢ（フォワード配列ＣＣＧＡＣＣＴＴＧＡＧＧＣＡＴＡＣＴＴＣＡ、配列番号２７として本明細書に記載される；リバース配列ＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＡＧＴＡＣＡ、配列番号２８として本明細書に記載される；プローブ配列ＴＴＡＡＡＧＡＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧ、配列番号２９として本明細書に記載される）を用いて、同一条件下で前記ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを試験した。未処理の対照細胞に対するＨＢＶの阻害割合として、表３に結果を示す。表３に示すように、ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、用量依存的にＨＢＶ  ｍＲＮＡレベルを低下させた。
【表２】
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【表３】
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【０１３７】
実施例３：ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、ＴＨＴ１細胞における発現におけるＢ型肝炎ウイルス又はＳＶ４０  Ｔ抗原発現のアンチセンス阻害
ＨｅｐＧ２  ２．２．１５細胞としても知られているＴＨＴ１細胞においてＨＢＶ  ｍＲＮＡを減少させる能力について、実施例３に記載のＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを評価した。約２４時間の間、エレクトロポレーションを用いて、７４１ｎＭ、２，２２２ｎＭ、６，６６７ｎＭ及び２０，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでこれら細胞をトランスフェクトした。細胞からＲＮＡを単離し、定量リアルタイムＰＣＲによってＨＢＶ  ｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮによって測定されたときの全ＲＮＡ含量に従ってＨＢＶ  ｍＲＮＡレベルを調整した。未処理細胞と比べたｍＲＮＡレベルの阻害割合として表すデータを表４に示す。表４に示すように、ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、用量依存的にＨＢＶ  ｍＲＮＡレベルを低下させた。
【表４】
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【０１３８】
（Ｂ）動物モデルにおけるアンチセンスオリゴマーの評価
実施例４：トランスジェニックマウスにおけるＨＢＶ量低減に対するＡＳＯの有効性の評価
ＨＢＶトランスジェニックマウス系統１．３．３２（公式名称、Ｔｇ［ＨＢＶ  １．３ゲノム］Ｃｈｉ３２）を使用して、動物モデルにおけるＨＢＶ量の低減に対するアンチセンスオリゴマーの有効性を評価する。トランスジェニックマウスは、細胞病理学的な証拠を全く示すことなく肝臓及び腎臓において高レベルでＨＢＶを複製する。系統１．３．３２は、Ｃ５７ＢＬ／６親株に繰り返し戻し交雑することにより繁殖させ、次いで、Ｂ１０Ｄ２マウスと１世代を交配して一代雑種を生成し、記載する全てのアッセイにおいて使用した。マウスは、年齢（６〜１０週）、性別（雄）、及び血清中のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）レベル（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬから市販されているキットを使用することにより決定された）が一致している。
【０１３９】
（Ａ）静脈内又は皮下投与によって７〜２１日間、ＨＢＶ  ＤＮＡオリゴマーでＨＢＶトランスジェニックマウスを処理し、次いで屠殺する。次いで、ＨＢＶ  ＤＮＡ及びＲＮＡレベルの低下についてマウスの肝臓を分析する。サザンブロット法又はリアルタイムＱＰＣＲを使用してＤＮＡレベルを決定し、ノーザンブロット法又はリアルタイムＱＰＣＲ方法を使用してＨＢＶ  ＲＮＡ転写物レベルを決定する。また、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇ用に市販されているＥＬＩＳＡキットを使用して、ＨＢｅＡｇ及びＨＢｓＡｇの産生レベルについてマウス血清を分析する。
【０１４０】
サザンブロットによってＤＮＡを分析し、以下の手順に従ってＰ３２−標識ＨＢＶ  ＤＮＡプローブでプロービングする。当業者にとって一般的な方法論を用いて、ＨＢＶ感染肝細胞からＤＮＡを抽出し、アガロースゲルにおける電気泳動によって分離し、ニトロセルロースフィルターに転写する。３２Ｐ−ニックトランスレーションされたＨＢＶ  ＤＮＡプローブを使用する。ウイルス対照群では、２、６、８、１０、１４、１８及び２０日目に肝臓を摘出する。薬物処理群では、８、１４及び２０日目に肝臓を摘出する。溶解バッファ含有している微量遠心管内にて、大きさの合う乳棒で肝臓サンプルを粉砕する。室温で５〜１０分間インキュベートした後、保存のために液体窒素中でチューブをスナップ凍結させる。フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を使用してＤＮＡを精製する。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断された（導入遺伝子内は切断されなかった）肝臓ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分画し、次いで、ニトロセルロース又は他の適切なメンブレンで、アルカリ転写法を使用してサザンブロットハイブリダイゼーション用に処理した。
【０１４１】
ノーザンブロットによってＲＮＡを分析し、以下の手順に従ってＰ３２−標識ＨＢＶ  ＤＮＡプローブでプロービングする。製造業者のプロトコールに従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用してＲＮＡ抽出用に肝臓サンプルを処理する。簡潔に述べると、ガラス−テフロン（登録商標）又はパワーホモジナイザー（例えば、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ、ＴｅｋｍａｒのＴＩＳＳＵＥＭＩＺＥＲ）を使用して、組織５０〜１００ｍｇ当たり１ｍＬのＴＲＩＺＯＬ試薬中で組織サンプルをホモジナイズする。ホモジナイズされたサンプルを室温で５分間インキュベートし、次いで、遠心分離して細胞残屑を除去する。新しいチューブに上清を移す。ＴＲＩＺＯＬ試薬１ｍＬ当たり０．２ｍＬのクロロホルムを添加する。サンプルチューブにきつく蓋をする。１５秒間サンプルを激しくボルテックスし、２〜３分間室温でインキュベートする。２〜８℃で１５分間、最高１２，０００×ｇでサンプルを遠心分離する。中間相を乱さないように、上部の水相を慎重に新たなチューブに移す。水相の体積を測定する（水相の体積は、ホモジナイズするために用いられたＴＲＩＺＯＬ試薬の体積の約６０％である）。イソプロピルアルコールと混合することにより水相からＲＮＡを沈殿させる。最初のホモジナイズのために用いられたＴＲＩＺＯＬ試薬１ｍＬ当たり０．５ｍＬのイソプロピルアルコールを使用する。１０分間１５〜３０℃でサンプルをインキュベートし、２〜４℃で１０分間最高１２，０００×ｇで遠心分離する。多くの場合遠心分離前には目に見えないＲＮＡ沈殿物は、チューブの側面及び底面にゲル様ペレットを形成する。上清を完全に除去する。７５％エタノールでＲＮＡペレットを１回洗浄し、最初のホモジナイズのために用いられたＴＲＩＺＯＬ試薬１ｍＬ当たり７５％エタノールを少なくとも１ｍＬ添加する。サンプルをボルテックスすることによって混合し、２〜８℃で５分間、最高７，５００×ｇで遠心分離する。上記洗浄手順をもう一度繰り返す。残存エタノールを全て除去する。５〜１０分間、ＲＮＡペレットを空気乾燥させるか真空乾燥させる。溶液を数回ピペット先端に通すことによって、ＤＥＰＣ処理水にＲＮＡを溶解させる。ホルムアルデヒドアガロースゲルにＲＮＡを溶解させ、ニトロセルロース又は他の適切なメンブレンに転写する。３２Ｐ−ニックトランスレーションされたＨＢＶ  ＤＮＡプローブを使用して、ＨＢＶ転写物を検出する。
【０１４２】
０（活性無し）〜＋＋＋＋（高活性）の尺度で、試験した薬物をスコア付けする。
【０１４３】
実施例５：ＷＨＶに感染したウッドチャックを用いるアンチセンスオリゴマーの評価
ウッドチャック（マーモット）は、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）に感染させて、ヒトＨＢＶ感染症の多くの態様をモデル化する慢性又は急性感染症を生じさせることができる［Ｍｅｎｎｅ  Ｓ及びＣｏｔｅ  ＰＪ（２００７年）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １３，１０４−１２４］。新生児をＷＨＶ７Ｐ１に感染させることにより慢性感染症を確立することができる。ドットブロットサザンハイブリダイゼイションによって血清中のウイルスＤＮＡを測定することができ、ＥＬＩＳＡによって血清中のウイルス抗原を測定することができる［Ｍｅｎｎｅ  Ｓら（２００２年）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５，２３７−２５０］。
【０１４４】
ＷＨＶのＤＮＡ配列はＨＢＶと異なるので、ＷＨＶ用にアンチセンスオリゴマーを最適化する必要がある。ｓｉＲＮＡの評価に既に使用されているインビトロ系がこの目的のために存在する［Ｍｅｎｇ  Ｚら（２００９年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３８４，８８−９６］。
【０１４５】
静脈内又は皮下投与によって、ＷＨＶに慢性的に感染しているウッドチャックをアンチセンスオリゴマーで処理する。投薬レジメンは、既に求められているウッドチャックにおけるアンチセンスオリゴマーの肝臓内半減期に依存するが、１週間に１回又は２回になる。処理期間は、６ヶ月以上になる。ウイルスＤＮＡ、ウイルス抗原及びウイルス抗原に対する抗体の血清レベルを、処理期間中及び処理後少なくとも３ヶ月間、定期的に測定する。フォローアップ期間全体にわたって維持されたウイルスＤＮＡ及びウイルス抗原の減少は、肯定的な成果の指標である。強力なヌクレオシド類似体によってＷＨＶに慢性的に感染しているウッドチャックを長期間処理すると、治療を終えた１〜２ヶ月間以内にウイルスが再発生する。また、ＷＨＶ  ＤＮＡの減少、並びにウイルス抗原の喪失、及び前記抗原に対する抗体の発生として定義されるセロコンバージョンは、肯定的な治療成果の指標である。
【０１４６】
ＨＢＶに感染している患者において試験することを意図したアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、以下に示す配列番号１〜１３のいずれか１つに対して本質的に相補的である。図６に列挙されているように、ＨＢＶのヒトの地理的な遺伝子型Ａ〜Ｈの９５％超にわたってこれらの配列が保存されている。
【０１４７】
ヒトの場合、治療レジメンはＰｅｇ−ＩＦＮ（４８週間、１週間に１回ＳＣ注射）で用いるレジメンと同様に典型的には４８週間であるが、全身性の副作用が観察されなかった（公開されていない結果）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を治療するためのＬＮＡアンチセンスオリゴマーを用いて実施された類似の療法に基づいてＩＮＦ様の全身副作用は生じないと予測される。予測される結果は、ＨＢＶ  ＤＮＡ及び血清抗原の減少、ＨＢｅＡｇ陽性患者におけるＰｅｇ−ＩＦＮを用いた処理でみられるよりも優れたＨＢｅＡｇセロコンバージョン、並びに検出不可能なＨＢＶ  ＤＮＡ及び／又はＨＢｅＡｇ陰性患者におけるＰｅｇ−ＩＦＮを用いた処理でみられるよりも優れたＨＢｓＡｇセロコンバージョンを含む。
【０１４８】
上記本発明の実施形態は、単なる例示であることを意図し、多数の変形例及び変更例は当業者に明らかである。このような全ての変形例及び変更例は、任意の添付の特許請求の範囲中に定義される本発明の範囲内であることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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