(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カビのＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させ、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
前記標的領域として、ＩＴＳ領域、及び、β−チューブリン遺伝子の両方を用い、
前記標的領域の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液において、β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットを使用して、
前記ＰＣＲ用反応液における前記β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと前記ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットの濃度比を、１：０．５〜１：０．１とし、
一又は二以上のカビの種類毎に、前記標的領域の両方を同時に増幅させる
ことを特徴とするカビの検出方法。
【請求項２】
前記標的領域の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液において、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用い、かつ、β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いる
ことを特徴とする請求項１記載のカビの検出方法。
【請求項３】
前記標的領域の増幅を行うための前記ＰＣＲ用反応液に、クラドスポリウム属菌のβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号５に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットをさらに用いる
ことを特徴とする請求項２記載のカビの検出方法。
【請求項４】
前記カビが、ユーロチウム属菌（Eurotium  sp.）、アスペルギルス  ペニシリオイデス種菌（Aspergillus  penicillioides）、アスペルギルス  ヴィトリコラ種菌（Aspergillus  vitricola）、アスペルギルス  リストリクティ節菌（Aspergillus  Section  Restricti）、アスペルギルス  ニデュランテス節菌（Aspergillus  Section  Nidulantes）、アスペルギルス  フミガティ節菌（Aspergillus  Section  Fumigati）、アスペルギルス  フラヴィ節菌（Aspergillus  Section  Flavi）、ペニシリウム属菌（Penicillium  sp.）、スタチボトリス  チャルタラム種菌（Stachybotrys  chartarum）、フザリウム  ソラニ種菌（Fusarium  solani）、クラドスポリウム属菌（Cladosporium  sp.）の少なくともいずれかである
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のカビの検出方法。
【請求項５】
一又は二以上のカビの種類毎に、ＤＮＡにおけるＩＴＳ領域、及び、β−チューブリン遺伝子の標的領域の両方を同時に増幅させるために用いられるＰＣＲ用反応液であって、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットと、β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットと、を含み、前記β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと前記ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットの濃度比が、１：０．５〜１：０．１である
ことを特徴とするＰＣＲ用反応液。
【請求項６】
クラドスポリウム属菌のβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号５に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットをさらに含む
ことを特徴とする請求項５記載のＰＣＲ用反応液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カビの検出方法に関し、特に広範囲の種類のカビを精度高く特異的に検出するためのカビの検出方法、ＰＣＲ用反応液、及びカビ検出用担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品製造現場や臨床現場、文化財保護環境等において、カビなどの微生物が存在するか否かを検査して安全性を確認するとともに、その繁殖を防止することが重要となっている。
このようなカビの検査では、一般的に、環境中から試料を採取して前培養し、次いで菌種ごとに最適な培地で２０日程度の培養を行った後に、形態的特徴を観察することで、カビを同定する形態観察法（培養法）が行われている（特許文献１参照）。【０００３】
しかしながら、この方法では、カビ種ごとに分離培養することが必要であるため、検査工程が煩雑になるという問題があった。また、培養に長期間を要するため、例えばヒトが生活する屋内の検査や食物の検査など、迅速性が要求される検査には不適切であるという問題があった。さらに、形態的特徴を表す胞子が形成されないと同定ができず、労力が無駄になってしまう場合があるという問題もあった。【０００４】
また、最近は、カビの検査において遺伝子を用いた同定法も行われている。例えば、環境中から採取した試料を培養した後、培養細胞からＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によりターゲット領域を増幅し、その増幅産物を解析することで、試料中のカビを同定することが行われている。増幅産物を解析する方法としては、例えば電気泳動によって増幅産物のサイズを分析する方法や、増幅産物と相補的に結合するプローブを固定化したＤＮＡチップを用いて、試料中に存在するカビを同定する方法などが提案されている（特許文献２〜６参照）。【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１９５４５４号公報
【特許文献２】特開２００８−３５７７３号公報
【特許文献３】特開２００８−２７８８４８号公報
【特許文献４】特開２００８−２７８８６１号公報
【特許文献５】特開２０１０−４８７９号公報
【特許文献６】特開２００９−２８４８３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、このような遺伝子を用いた同定法によっても、カビ種内の類似性が高い場合には、単一の標的遺伝子の有無やサイズだけで種を特定することは極めて困難であり、例えば種レベルの同定確度が要求される検査には適さないという問題があった。
ここで、特許文献２〜４では、各種カビの遺伝子におけるＩＴＳ（Internal  Transcribed  Spacer）領域を増幅対象領域として、同定が行われている。このようなＩＴＳ領域にもとづくカビの同定では、カビの種類が増加するにしたがって、偽陽性反応も増加し、検査精度が低下してしまうという問題があった。【０００７】
一方、特許文献５，６には、β−チューブリン遺伝子を増幅対象領域として同定を行うことが記載されている。これらの文献には、β−チューブリン遺伝子を増幅対象領域とすることで、特定の種類のカビを検出できることが示されている。
しかしながら、β−チューブリン遺伝子のみを増幅対象領域とすると、ＩＴＳ領域のみを増幅対象領域とする場合と同様に、偽陽性反応が生じる場合があるという問題があった。【０００８】
そこで、本発明者らは鋭意研究した結果、ＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子の両方を増幅対象領域として用いることで、広範囲の種類のカビを精度高く検出することを見いだし、本発明を完成させた。また、ＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子を同時反応系で効率的に増幅させ得るための条件も見いだした。【０００９】
ところで、上記の通り、形態同定を行う方法には、形態的特徴を発現させるため、菌種ごとに最適な培地と長期間の培養が必要となり、さらに同定には熟練が必要となることから、迅速な検査や検査の簡易化に適するものではないという問題があった。
また、ＰＣＲ及び配列解析による方法でも、菌種ごとに個別に培養するため、１４日程度の比較的長い検査期間が必要となり、また菌種ごとに個別に解析することが必要であることから、多検体処理が要求される場合に適するものではないという問題があった。【００１０】
これに対して、ＤＮＡチップによる新たな検出方法によれば、理論上、複数種類のカビを一括して検出することが可能であり、迅速かつ簡易な検査方法として期待されている。【００１１】
一方、カビは生育に適する湿度にもとづいて、好乾性カビ（乾燥状態を好む）、耐乾性カビ（乾燥に耐えうる）、及び好湿性カビ（湿潤状態を好む）に分けられ、これらはそれぞれに適した異なる培地によって培養する必要があった。また、上述した従来一般的に行われている第一及び第二の方法では、菌種ごとに培養することが必要であったことから、複数のカビを混合して培養し、さらにその上で、それぞれのカビを個別に検出するという概念は存在していなかった。このため、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを同時に培養して、それぞれのカビを特異的に検出可能にする技術は、従来は存在していなかった。【００１２】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、試料中のカビのゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域及びβ−チューブリン遺伝子を増幅し、その増幅産物の有無を確認することにより、カビの同定を行うカビの検出方法、並びにこれに用いるＰＣＲ用反応液、及びカビ検出用担体の提供を目的とする。
また、複数種類のカビを分離培養することなく、同じ培地で同時に培養すると共に、これらを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップにより各カビを特異的に検出可能にするカビの検査方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するため、本発明のカビの検出方法は、カビのＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させ、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、標的領域として、ＩＴＳ領域、及び、β−チューブリン遺伝子を用いる方法としてある。
このように増幅の標的領域として、ＩＴＳ領域、及び、β−チューブリン遺伝子を併用すれば、これらのいずれか一方のみを標的領域として用いた場合に比較して、偽陽性反応を低減させることができる。このため、広範囲のカビをより精度高く検出することが可能となる。【００１４】
また、本発明のカビの検出方法において、標的領域の増幅をＰＣＲ法により行う場合、ＰＣＲ用反応液におけるβ−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとの濃度比を、１：０．９〜１：０．１とすることが好ましい。
プライマーセットの濃度比をこのようにすれば、これらのプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を用いてＰＣＲ反応を行うことにより、ＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子の両方を共に効率的に増幅することができる。このため、これらを同時に検出することで、カビの検査をより高い精度で行うことが可能となる。なお、β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、及び、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットの濃度比を、１：０．５〜１：０．２５とすれば、これら両方の増幅効率を最も効率的にすることができるため、より好ましい。【００１５】
また、本発明のＰＣＲ用反応液は、標的領域の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液であって、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットと、β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットとを含むものとしてある。
ＰＣＲ用反応液をこのようにすれば、各種カビにおけるＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子の両方を増幅させることができる。このため、これら両方の増幅産物にもとづきカビの有無を判定することができ、より広範囲のカビを精度高く検出することが可能となる。【００１６】
また、本発明のＰＣＲ用反応液を、クラドスポリウム属菌を特異的に増幅させるためのフォワードプライマーとして、配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーをさらに含むものとすることも好ましい。
ＰＣＲ用反応液をこのようにすれば、配列番号１〜４に示す塩基配列からなるプライマーを含むＰＣＲ用反応液を用いただけでは、効率的に増幅できないクラドスポリウム属菌のＤＮＡ断片を増幅することができ、当該菌を適切に検出することが可能となる。【００１７】
また、本発明のカビ検出用担体は、一又は二以上のカビの種類毎に、ＩＴＳ領域から選択された塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された塩基配列を有するプローブを固定化したものとしてある。
カビ検出用担体をこのようにすれば、ＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子を同時に増幅して得られた増幅産物を、このカビ検出用担体に滴下することで、プローブの塩基配列と相補的に結合するＤＮＡを有するカビを検出することができる。このカビ検出用担体には、カビの種類毎に、ＩＴＳ領域から選択された塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された塩基配列を有するプローブの両方が固定化されているため、これらの両方にもとづきカビの存否確認を行うことができる。そして、ＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子の両方に検出があった場合にカビが存在すると判定することで、偽陽性にもとづいて存在するとの判定が行われることを低減することができ、より高い精度のカビ検出を行うことが可能となる。【００１８】
また、本発明のカビの検査方法は、複数種類のカビを培養し、この培養された複数種類のカビを混合して、一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出する方法としてある。
本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、カビを菌種ごとに個別に分けることなく、混在したまま培養しても、培養された菌種を特異的に検出することができる。すなわち、培養された複数種類のカビが混合された状態で、それぞれのカビのゲノムＤＮＡの抽出をまとめて行っても、ＤＮＡチップにより、各カビを検出することができる。【００１９】
なお、抽出されたゲノムＤＮＡを、ＤＮＡチップを用いて検出する方法としては、一般的な手法を用いることが可能である。
具体的には、例えば検出対象カビの特定領域を増幅するためのプライマーセットを含むＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲ法によりゲノムＤＮＡの特定領域を増幅する。このプライマーセットによる増幅領域から予め選択されたプローブをＤＮＡチップに固定化しておく。このとき、プライマーセット及びプローブは、検出対象カビの特定領域ごとに予め作成しておく必要がある。そして、ＰＣＲ法により得られた増幅産物を当該ＤＮＡチップに滴下し、プローブに結合した増幅産物を検出することで、混合物に含まれる各種カビをそれぞれ特異的に検出することが可能である。【００２０】
また、上記の本発明のカビの検査方法において、少なくとも好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビからなる群から選択される２種類以上のカビを所定の一の培地で同時に培養し、この培養したカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出する方法とすることも好ましい。
本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、通常は個別に培養される、異なる湿度環境を要求するカビを所定の一の培地で同時に培養することができる。そして、これらの混合物からそれぞれのカビを特異的に検出することができる。このため、カビの性質等を考慮することなく、一括して同時に培養して検出を行うことができ、カビの検査の簡易化を図ることが可能となる。【００２１】
また、上記の本発明のカビの検査方法において、複数種類のカビを、水分活性値が１．０未満、０．９０以上で、且つ、糖濃度は、５〜５０％、さらには、１０％〜４０％とすることが好ましい。糖の種類として、具体的には、グルコース、シュークロースが好適に使用される。
このような水分活性値、糖濃度の固形培地によれば、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビのいずれをも好適に培養することができ、あらゆるカビを一括して同時に培養し、その検出を行うことが可能となる。【００２２】
さらに、上記の本発明のカビの検査方法において、複数種類のカビを、２５℃±２℃の温度で培養する方法とすることも好ましい。
このような温度範囲であれば、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビのいずれをも十分に繁殖させることが可能となる。【００２３】
また、上記の本発明のカビの検査方法において、培養した複数種類のカビを、カビの細胞壁を物理的に破砕するためのビーズを収容した容器に入れて混合し、一括してゲノムＤＮＡを抽出することも好ましい。
本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、同時に培養された複数種類のカビからまとめてゲノムＤＮＡを抽出することが可能となる。【００２４】
さらに、上記の本発明のカビの検査方法において、複数種類のカビが、大気中に浮遊もしくは付着したカビ胞子及び菌糸であることも好ましい。
本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、環境中におけるカビを採取して培養し、これらを簡易に同時に検出することが可能となる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、広範囲の種類のカビを精度高く検出することが可能となる。
また、本発明によれば、複数種類のカビを同じ培地で同時に培養すると共に、これらを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップにより各カビを特異的に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】配列番号３と配列番号４からなるプライマーセットでＰＣＲ増幅したβ−チューブリン遺伝子内における種或いは属特異的領域及びカビ共通領域を示す図である。
【図２】本発明のカビの検出方法において用いるプライマーを示す図である。
【図３】本発明のカビの検出方法において用いるプローブを示す図である。
【図４】施設環境より採取したサンプルＡ〜Ｈにそれぞれ含まれる菌種を示す図である。
【図５】同時反応系において、ＩＴＳ領域とβ-チューブリン遺伝子の両方を検出可能なプライマーセット濃度の範囲を探るための試験１の結果（サンプルＡ）を示す図である。
【図６】同時反応系において、ＩＴＳ領域とβ-チューブリン遺伝子の両方を検出可能なプライマーセット濃度の範囲を探るための試験１の結果（サンプルＢ）を示す図である。
【図７】同時反応系において、ＩＴＳ領域とβ-チューブリン遺伝子の両方を検出可能なプライマーセット濃度の範囲を探るための試験１の結果（サンプルＣ）を示す図である。
【図８】同時反応系において、ＩＴＳ領域とβ-チューブリン遺伝子の両方を検出可能なプライマーセット濃度の範囲を探るための試験１の結果（サンプルＤ）を示す図である。
【図９】試験１のサンプルＡについて、プライマーセット濃度比毎及びプローブ毎の蛍光強度を示す図である。
【図１０】試験１のサンプルＢについて、プライマーセット濃度比毎及びプローブ毎の蛍光強度を示す図である。
【図１１】試験１のサンプルＣについて、プライマーセット濃度比毎及びプローブ毎の蛍光強度を示す図である。
【図１２】試験１のサンプルＤについて、プライマーセット濃度比毎及びプローブ毎の蛍光強度を示す図である。
【図１３】ＤＮＡチップ解析における蛍光強度とＰＣＲによる増幅産物量の相関関係を確認するための試験２の結果を示す図である。
【図１４】同時反応系において、ＩＴＳ領域とβ-チューブリン遺伝子の両方を検出可能なプライマーセット濃度の範囲を探るための試験３の結果を示す図である。
【図１５】施設環境から採取したサンプルＡ〜Ｈに含まれていなかった各種カビがマルチプレックスＰＣＲを用いたＤＮＡチップ解析で検出可能かどうかを確認するための試験４の結果を示す図である。
【図１６】試験４のサンプルについて、プライマーセット濃度比毎及びプローブ毎の蛍光強度を示す図である。
【図１７】クラドスポリウム属菌がマルチプレックスＰＣＲを用いたＤＮＡチップ解析で検出可能かどうかを確認するための試験５の結果を示す図である。
【図１８】クラドスポリウム属菌特異的フォワードプライマーのＰＣＲ用反応液への添加が他の菌種の検出に与える影響を確認するための試験６の結果を示す図である。
【図１９】各種培地組成による培養試験の培養評価を示す図である。
【図２０】好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを、各種培地で培養したときのコロニーの直径を示す図である。
【図２１】好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを、各種温度で培養したときのコロニーの直径を示す図である。
【図２２】好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを、各種温度で培養したときのコロニーの写真を示す図である。
【図２３】検体１−２０における菌種のＤＮＡチップ解析及び配列解析結果を示す図である。
【図２４】検体２１−４０における菌種のＤＮＡチップ解析及び配列解析結果を示す図である。
【図２５】検体４５−６０における菌種のＤＮＡチップ解析及び配列解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明のカビの検出方法、ＰＣＲ用反応液、及びカビ検出用担体の一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の本実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
【００２８】
［カビの検出方法］
本実施形態のカビの検出方法は、カビのＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させ、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、標的領域として、ＩＴＳ領域、及び、β−チューブリン遺伝子を用いることを特徴とする。
【００２９】
カビの種類は、特に限定されるものではないが、例えばユーロチウム属菌（Eurotium  sp.），アスペルギルス  ペニシリオイデス種菌（Aspergillus  penicillioides），アスペルギルス  リストリクティ節菌（Aspergillus  Section  Restricti），ワレミア  セビ種菌（Wallemia  sebi），アスペルギルス  ヴィトリコラ種菌（Aspergillus  vitricola），ペニシリウム属菌（Penicillium  sp.），アスペルギルス  フミガティ節菌（Aspergillus  Section  Fumigati），アスペルギルス  フラヴィ節菌（Aspergillus  Section  Flavi），アスペルギルス  ニデュランテス節菌（Aspergillus  Section  Nidulantes），アスペルギルス  ニグリ節菌（Aspergillus  Section  Nigri），スタチボトリス  チャルタラム種菌（Stachybotrys  chartarum），フザリウム  ソラニ種菌（Fusarium  solani），クラドスポリウム属菌（Cladosporium  sp.）等のカビを、本発明のカビの検出方法、ＰＣＲ用反応液、及びカビ検出用担体による検出対象カビとすることができる。また、その他にもフザリウム  オキスポラム種菌（Fusarium  oxysporum），フザリウム  グラミニアラム種菌（Fusarium  graminiarum），フザリウム  バーティシリオイデス種菌（Fusarium  verticillioides），ピシウム  ウルティマム種菌（Pythium  ultimum），コレトトリカム  グロエオスポリオイデス種菌（Colletotrichum  gloeosporioides），コレトトリカム  アキュテイタム種菌（Colletotrichum  acutatum），バーティシリウム  ダリエ種菌（Verticillium  dahiae），バーティシリウム  アルボ  アトラム種菌（Verticillium  albo-atrum），アルタナリア  アルタナータ種菌（Alternaria  alternate），トリコフィトン  ルブラム種菌（Trichophyton  rubrum），トリコフィトン  トンズランス種菌（Trichophyton  tonsurans），トリコデルマ  ビリデ種菌（Trichoderma  viride）等のカビを、検出対象とすることができる。
【００３０】
本実施形態のカビの検出方法における標的領域とは、カビのＤＮＡにおける増幅対象領域であり、特定のスペーサーや遺伝子などをそのような領域として用いることができる。本発明では、この標的領域として、ＩＴＳ（Internal  Transcribed  Spacer）領域とβ−チューブリン遺伝子の両方を同時に用いている。
【００３１】
標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させる方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を好適に用いることができる。
ＰＣＲ法では、標的領域を増幅させるためのプライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いて、カビのＤＮＡにおける特定領域を増幅する。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができ、例えば以下のような反応条件で、ＰＣＲを行うことができる。
（ａ）９５℃  １０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程）  ３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程）  ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程）  ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃  １０分
【００３２】
増幅産物の有無を確認する方法としては、電気泳動による方法やＤＮＡチップを用いて検出する方法などを好適に用いることができる。
電気泳動による方法は、例えばＭｕｌｔｉＮＡ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を用いて、マイクロキャピラリー電気泳動により、ＰＣＲの増幅産物を泳動させ、バンドの位置にもとづきその大きさを確認することで、正しい増幅産物が得られているか否かを判定することができる。
【００３３】
ＤＮＡチップによる方法は、標的領域に特異的にハイブリダイズするプローブを予めＤＮＡチップに固定化し、このＤＮＡチップにＰＣＲの増幅産物を滴下して、増幅産物の標識を検出することなどにより、正しい増幅産物が得られているか否かを判定することができる。標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴを用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。
また、標識は蛍光に限定されず、その他のものを用いても良い。
【００３４】
本実施形態では、プライマーとして、カビのＤＮＡにおけるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットと、β−チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを使用する。
ＩＴＳ領域は、ＲＮＡに転写後にスプライシングされる部分である。このため、コーディング領域に比べると保存性が低く、変化に富んでいるが、カビ種間の類似性が高く、偽陽性反応が生じる場合が比較的多い。このため、ＤＮＡチップに数多くの種類のカビのプローブを固定化してカビの識別に用いる場合には、そのプローブとしてＩＴＳ領域から選択されたもののみを使用すると、検出精度の低下を招くおそれがある。
【００３５】
一方、複数種類のカビにおけるβ−チューブリン遺伝子の類似性を検証すると、図１に示すように、カビ種毎にユニークな配列が比較的多く存在しており、これらの領域は特異性の高いプローブ設計に最適であると考えられる。
そこで、ＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子の両方を標的領域として用いて、広範囲の種類のカビを対象として検証したところ、これらの領域を組み合わせて用いることにより、偽陽性反応を適切に低減できることが明らかとなった。
本実施形態のカビの検出方法では、このように標的領域として、ＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子の両方を用いることで、広範囲の種類のカビを精度高く検出することを可能としている。
【００３６】
［ＰＣＲ用反応液］
本実施形態のＰＣＲ用反応液は、上述したカビの検出方法において、標的領域を含むＤＮＡ断片の増幅をＰＣＲ法により行う場合に使用される。このＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、標識成分（Ｃｙ５−ｄＣＴＰなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの容量分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することが可能である。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を用いることができる。
【００３７】
本実施形態のＰＣＲ用反応液におけるプライマーセットとしては、カビのＤＮＡにおけるＩＴＳ領域を増幅させることが可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーとからなるプライマーセット、及び、カビのＤＮＡにおけるβ−チューブリン遺伝子を増幅させることが可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーとからなるプライマーセットが用いられる。
【００３８】
本実施形態のＰＣＲ用反応液におけるプライマーセットは、このようにＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとβ−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとを有するものであれば特に限定されないが、具体的には例えば以下のものを用いることができる。すなわち、図２に示すように、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとして、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを好適に用いることができる。また、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとして、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを好適に用いることができる。
【００３９】
また、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの濃度比を、１：０．９〜１：０．１とすることが好ましい。プライマーセットの濃度比をこのようにすれば、これらの増幅対象領域を共に好適に増幅できるためである。
【００４０】
ここで、カビのＤＮＡにおいて、ＩＴＳ領域は１００コピー以上存在しているのに対し、β−チューブリン遺伝子は１コピーしか存在していない。また、前者のＰＣＲ法による増幅産物のサイズは約２５０ｂｐであるのに対し、後者のＰＣＲ法による増幅産物のサイズは３５０〜５５０ｂｐである。
したがって、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの濃度をＰＣＲ用反応液において同じにすると、β−チューブリン遺伝子の増幅産物が十分に得られず、検出精度が低くなるという問題があった。
これに対して、ＰＣＲ用反応液におけるＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの濃度を下げすぎると、今度はＩＴＳ領域の増幅効率が低くなってしまう。
このため、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの濃度比として、最適な条件を探す必要があった。
【００４１】
そこで、本発明者らは種々の濃度比を検証することで、上記の濃度比であれば、ＩＴＳ領域及びβ−チューブリン遺伝子の両方を好適に増幅できることを見いだした。特に、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの濃度比を１：０．５〜１：０．２５とすれば、増幅産物を蛍光標識して蛍光強度にもとづきカビの検出を行う場合、ＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子の蛍光が共に大きな強度で得られるため、より好ましい。
【００４２】
さらに、本実施形態のＰＣＲ用反応液に、クラドスポリウム属菌を特異的に増幅させるためのプライマーを含ませることが好ましい。このようなプライマーとしては、例えば図２の配列番号５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーを用いることができる。
ここで、上述したＩＴＳ領域増幅用プライマーセット及びβ−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットを用いた場合、クラドスポリウム属菌のβ−チューブリン遺伝子については、ＰＣＲにより増幅産物は得られるものの、β−チューブリン遺伝子に相補的な配列から選択されたプローブと当該増幅産物とによるハイブリダイゼーションは十分に行われず、クラドスポリウム属菌は適切に検出することができなかった。
【００４３】
そこで、クラドスポリウム属菌については、これを特異的に増幅可能なフォワードプライマーをＰＣＲ用反応液に追加してＰＣＲを行い、新たな増幅産物を得た。そして、実施例において後述するように、この新たな増幅産物を本実施形態のカビ検出用担体に滴下して検査したところ、当該菌種を適切に検出することができた。
すなわち、このクラドスポリウム属菌を特異的に増幅させるためのフォワードプライマーは、β−チューブリン遺伝子を増幅するためのものであり、配列番号４に示されるリバースプライマーと対になって、クラドスポリウム属菌のβ−チューブリン遺伝子を増幅させることができる。
【００４４】
ＰＣＲ用反応液におけるクラドスポリウム属菌特異的フォワードプライマーの終濃度は、０．５μＭ以下とすることが好ましく、０．１２５μＭ〜０．５μＭとすることがより好ましい。クラドスポリウム属菌特異的フォワードプライマーの終濃度の範囲をこのようにすれば、クラドスポリウム属菌を好適に検出することが可能なためである。
また、ＰＣＲ用反応液におけるクラドスポリウム属菌特異的フォワードプライマーの終濃度を０．２５μＭ〜０．５μＭにすれば、クラドスポリウム属菌を一層好適に検出することが可能である。特に、この終濃度を０．２５μＭにすれば、他の菌種の検出に与える影響をほぼ最小にできるため、さらに好ましい。
【００４５】
上記プライマーセットにおける各プライマーの配列は、上記の塩基配列そのものに限定されず、同一の機能を果たす範囲で適宜変更したものを用いることが可能である。すなわち、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたものとすることができる。また、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なものとすることもできる。
【００４６】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、上記プライマーセットに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、上記プライマーセットと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
【００４７】
［カビ検出用担体］
本実施形態のカビ検出用担体は、一又は二以上のカビの種類毎に、ＩＴＳ領域から選択された塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された塩基配列を有するプローブを固定化したことを特徴とし、ＤＮＡチップなどを用いて構成することができる。
このように、カビの種類毎にＩＴＳ領域の増幅産物と結合するプローブと、β−チューブリン遺伝子の増幅産物と結合するプローブの両方を備えたものとし、これら両方のプローブにおいて蛍光が検出されるカビを陽性と判定することで、偽陽性反応にもとづく判定の誤りを適切に排除することが可能となっている。
【００４８】
具体的には、例えば図３に示すように、カビの種類毎に、以下のプローブを用いることができる。
すなわち、ユーロチウム属菌（Eurotium  sp.）を検出するためのプローブとして、ＩＴＳ領域から選択された配列番号６又は７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
【００４９】
また、アスペルギルス  ペニシリオイデス種菌（Aspergillus  penicillioides）を検出するためのプローブとして、ＩＴＳ領域から選択された配列番号９〜１１に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１２に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
【００５０】
また、アスペルギルス  ヴィトリコラ種菌（Aspergillus  vitricola）を検出するためのプローブとして、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１３又は１４に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号１５に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
【００５１】
また、アスペルギルス  リストリクティ節菌（Aspergillus  Section  Restricti）を検出するためのプローブとして、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１６〜２０に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
【００５２】
また、アスペルギルス  ニデュランテス節菌（Aspergillus  Section  Nidulantes）を検出するためのプローブとして、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２２に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２３に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
【００５３】
また、アスペルギルス  フミガティ節菌（Aspergillus  Section  Fumigati）を検出するためのプローブとして、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２４に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２５に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
【００５４】
また、アスペルギルス  フラヴィ節菌（Aspergillus  Section  Flavi）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号２７に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
【００５５】
また、ペニシリウム属菌（Penicillium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２８又は２９に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３０〜３２に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかを用いることができる。
【００５６】
また、スタチボトリス  チャルタラム種菌（Stachybotrys  chartarum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
【００５７】
また、フザリウム  ソラニ種菌（Fusarium  solani）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３５に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３６に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
【００５８】
また、クラドスポリウム属菌（Cladosporium  sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３７に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号３８又は３９に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかを用いることができる。
【００５９】
また、カビ共通のプローブとして、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β−チューブリン遺伝子から選択された配列番号４１に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
【００６０】
そして、本実施形態のカビ検出用担体は、上記の各カビを検出するための各プローブ群を、それぞれ一又は二群以上固定化したものとすることができる。
このように、本実施形態のカビ検出用担体は、各カビのＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子の増幅産物にそれぞれ結合するプローブを固定化することで、偽陽性反応にもとづく判定ミスを低下させ、広範囲のカビを高い精度で検出することが可能になっている。
【００６１】
本実施形態のカビ検出用担体は、通常の方法で使用することができ、その方法は特に限定されるものではないが、例えば以下のように使用することができる。
まず、本実施形態のカビの検出方法により得られたＰＣＲの増幅産物に、緩衝液（３×ＳＳＣ  クエン酸−生理食塩水）に０．３％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を添加したものを混合して、本実施形態のカビ検出用担体に滴下する。
このカビ検出用担体を４５℃で１時間静置した後、ハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物を上記緩衝液を用いてカビ検出用担体から洗い流す。そして、これを標識検出装置にかけて蛍光強度を測定することで、カビの検出を行うことが可能である。
【００６２】
なお、本実施形態のカビ検出用担体に固定化する上記各プローブは、上述したプライマーセットにおける各プライマーの配列の場合と同様に、同一の機能を果たす範囲で適宜変更したものを用いることが可能である。すなわち、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたものとすることができる。また、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なものとすることもできる。
【００６３】
さらに、本実施形態のカビ検出用担体に固定化するプローブとして、上記各プローブや、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたもの、又は、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるものに対して、相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。
【００６４】
ここで、本実施形態のカビの検出方法におけるＰＣＲ法により得られる増幅産物には、上記のプローブとハイブリダイズする核酸断片に対して相補的な塩基配列を有する核酸断片も含まれる。このため、図３に示す配列番号６〜４１に対して相補的な塩基配列、及びこれらと同等の塩基配列からなるプローブは、上記のプローブとハイブリダイズする核酸断片に対して相補的な塩基配列を有する核酸断片とハイブリダイズすることができる。
【００６５】
したがって、図３に示す配列番号６〜４１に対して相補的な塩基配列、及びこれらと同等の塩基配列からなるプローブ、すなわち配列番号６〜４１のそれぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたもの、又は、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるものを、本実施形態のカビ検出用担体に固定化した場合にも、それぞれの対象とするカビを検出することが可能である。
【００６６】
次に、本発明のカビの検査方法の一実施形態について詳細に説明する。なお、本実施形態のカビの検査方法は、複数種類のカビを培養し、培養された複数種類のカビを混合して、一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出するものであれば良く、以下の実施形態及び実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
【００６７】
本実施形態のカビの検査方法は、以下の工程を含むものとすることができる。
（１）カビの採取
まず、エアーサンプラーを用いて、食品製造現場や臨床現場、文化財の保護環境等における空気を採取する。次いで、採取した空気をエアーサンプラー用にストリップ形状にした専用培地などに吹き付けて培養する。
【００６８】
その培地としては、実施例において後述するように、好乾性、耐乾性、及び好湿性のいずれのカビでも培養することができるＭ４０Ｙ、ＭＹ１０Ｇ培地、ＭＹ３０Ｇ培地等を用いることが好ましい。このうち、Ｍ４０Ｙ培地を用いると、上記のいずれの性質のカビでも高効率に培養することが可能であるため、特に好ましい。
また、培養条件としては、２３℃〜２７℃の温度の暗所に、２日〜７日程度静置させることが好ましい。
なお、一般的にＭ４０Ｙ培地、ＭＹ１０Ｇ培地、及びＭＹ３０Ｇ培地は、好乾性カビ用のものと考えられており、好湿性カビ培養には適さないと考えられてきた。
【００６９】
次に、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを、個別に分離することなく、一括して採取する。そして、採取された試料を、例えば、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶などに入れ、バイアル瓶ごと液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置等を用いて、カビの細胞を破砕する。なお、細胞の破壊は、ＤＮＡが抽出できるように行われれば良く、その他の方法により行ってもかまわない。
【００７０】
（２）ＤＮＡの抽出
カビの細胞を破壊した試料から、ゲノムＤＮＡを抽出する方法としては、ＣＴＡＢ法（Cetyl  trimethyl  ammonium  bromide）やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法を用いることができる。
【００７１】
（３）ＰＣＲ法によるＩＴＳ領域の増幅
次に、各種カビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域を増幅することができるプライマーセットをＰＣＲ反応液に加えて、ＰＣＲ法により、上記試料中のカビのゲノムＤＮＡにおける特定領域を増幅する。具体的には、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ配列番号４２，４３に示される塩基配列のものを用いることができる。また、ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
【００７２】
本実施形態のＰＣＲ反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP）、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、標識成分（Ｃｙ５−ｄＣＴＰなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの容量分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することが可能である。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所）を用いることができる。
【００７３】
本実施形態のカビの検査方法におけるＰＣＲ反応条件としては、例えば以下のようにすることが好ましい。
（ａ）９５℃  １０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程）  ３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程）  ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程）  ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃  １０分
【００７４】
（４）ＤＮＡチップによる検出
本実施形態のＤＮＡチップは、検出対象のカビのＤＮＡから選択されたプローブを固定化したものであれば良く、その他の点では特に限定されない。例えばスポット型ＤＮＡチップ、合成型ＤＮＡチップなどを用いることが可能である。
具体的には、本実施形態のカビの検査方法のＰＣＲ反応液に含まれるプライマーセットにより増幅される増幅領域と結合するプローブを予め合成し、ＤＮＡチップの基板上に固定化しておく。例えば、アスペルギルス  ヴィトリコラ（Aspergillus  vitricola）検出用のプローブとしては、配列番号４４に示される塩基配列からなるものを用いることができる。また、アスペルギルス  ペニシリオイデス（Aspergillus  penicillioides）検出用のプローブとしては、配列番号４５に示される塩基配列からなるものを用いることができる。さらに、ユーロチウム属菌（Eurotium  sp.）検出用のプローブとしては、配列番号４６に示される塩基配列からなるものを用いることができる。
【００７５】
次に、ＰＣＲ増幅産物をＤＮＡチップ上に滴下して、上記カビ検出用プローブにハイブリダイズしたＰＣＲ増幅産物の標識を検出する。具体的には、例えば次のように行うことができる。
まず、ＰＣＲ増幅産物に所定の緩衝液を混合して、ＤＮＡチップに滴下する。
次に、ＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、その後、所定の緩衝液によりハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流す。
そして、ＤＮＡチップを標識検出装置にかけて標識の検出を行い、検出対象カビが存在するか否かを判定する。なお、標識検出装置としては、例えば、蛍光スキャニング装置など一般的なものを用いることができる。なお、標識及びその検出方法は蛍光に限定されず、その他の方法を用いても良い。
【００７６】
以上説明したように、本実施形態のカビの検査方法によれば、好乾性、耐乾性、及び好湿性のいずれのカビでも培養することができる培地を用いて、複数のカビを同時に培養することができる。そして、培養されたカビを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出することができる。
このため、採取されたカビを分離培養する必要がなく、複数種類のカビを迅速に一括して簡易に検出することが可能である。
【実施例】
【００７７】
以下、本発明のカビの検出方法、ＰＣＲ用反応液、及びカビ検出用担体を用いて行った試験について、具体的に説明する。【００７８】
（試験１）
本発明のカビの検出方法において、マルチプレックスＰＣＲを用いたＤＮＡチップ解析により各種カビを検出するにあたり、ＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子の両方を同時に増幅することを可能にする、ＰＣＲ用反応液における各プライマーセットの濃度範囲を探るため、試験１を行った。
検出対象カビは、施設環境から採取した野生カビを使用した。すなわち、エアーサンプラーを用いて施設環境内の空気を採取し、これをサンプルＡ〜Ｄの各培地に吹き付けて培養した。培養は、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。
次に、サンプルごとに、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーの一部を個別に採取し、それぞれ２５℃の暗所で７〜１０日間分離培養を行い、各コロニーをＤＮＡ配列解析に供して、その菌種を確認した。その結果を図４に示す。なお、ＤＮＡ配列解析は、タカラバイオ株式会社に委託して、ＤＮＡシーケンサーにより行った。以下においても同様である。【００７９】
さらに、サンプルごとに、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを一括して採取して、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。
次いで、サンプルごとに、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子とを同時に増幅した。【００８０】
このとき、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとして、図２に示す配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマー（Ｆプライマー）及び配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー（Ｒプライマー）を用いた。また、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとして、図２に示す配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。なお、いずれもオペロンテクノロジー株式会社により合成したものを使用した。【００８１】
また、ＰＣＲ用反応液として、サンプルＡ〜Ｄのそれぞれについて、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)  4.0μl
３．dNTPmix  1.0μl
４．Cy-5dCTP  0.2μl
５．ITS1-Fw  primer(10μM)  1.0μl
６．ITS1-Rv  primer(10μM)  1.0μl
７．BtF  primer(10μM)  1.0μl
８．BtR  primer(10μM)  1.0μl
９．Template  DNA（サンプルＡ〜Ｄ毎にそれぞれ）  1.0μl
１０．NovaTaq  polymerase  0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）【００８２】
さらに、ＩＴＳ領域増幅用プライマーとして、フォワードプライマー及びリバースプライマーのそれぞれが次の割合で配合され、その他の点は上記と同様の４通りのＰＣＲ用反応液を作成した。
primer(9μM)  0.9μl
primer(8μM)  0.8μl
primer(5μM)  0.5μl
primer(2.5μM)  0.25μl
primer(1.25μM)  0.125μl
primer(1μM)  0.1μl
primer(0.625μM)  0.0625μl【００８３】
以上の通り、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの終濃度比として、サンプルＡ〜Ｄごとに、以下の５種類のものを作成し、それぞれについて試験を行った。
（i）０．５μＭ：０．５μＭ
（ii）０．５μＭ：０．４５μＭ
（iii）０．５μＭ：０．４０μＭ
（iv）０．５μＭ：０．２５μＭ
（v）０．５μＭ：０．１２５μＭ
（vi）０．５μＭ：０．０６２５μＭ
（vii）０．５μＭ：０．０５０μＭ
（viii）０．５μＭ：０．０３１２５μＭ【００８４】
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（Ｒ）  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃  １０分
（b）９５℃  ３０秒
（c）５６℃  ３０秒
（d）７２℃  ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃  １０分【００８５】
ＤＮＡチップには、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、図３に示されるプローブのうち、以下のプローブを固定化したものを使用した。
＜ＩＴＳ領域から選択されたプローブ＞
（１）ユーロチウム属菌  配列番号６，７
（２）アスペルギルス  ペニシリオイデス種菌  配列番号９〜１１
（３）アスペルギルス  ヴィトリコラ種菌  配列番号１３
（４）アスペルギルス  リストリクティ節菌  配列番号１６〜２０
（５）アスペルギルス  ニデュランテス節菌  配列番号２２
（７）アスペルギルス  フラヴィ節菌  配列番号２６
（８）ペニシリウム属菌  配列番号２８
（１１）クラドスポリウム属菌  配列番号３７
（１２）カビ共通  配列番号４０【００８６】
＜β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブ＞
（１）ユーロチウム属菌  配列番号８
（２）アスペルギルス  ペニシリオイデス種菌  配列番号１２
（３）アスペルギルス  ヴィトリコラ種菌  配列番号１５
（４）アスペルギルス  リストリクティ節菌  配列番号２１
（５）アスペルギルス  ニデュランテス節菌  配列番号２３
（７）アスペルギルス  フラヴィ節菌  配列番号２７
（８）ペニシリウム属菌  配列番号３０
（１２）カビ共通  配列番号４１【００８７】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、上記ＤＮＡチップに滴下した。
このＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。
次いで、ＤＮＡチップを標識検出装置（GenePix4100A  Molecular  Devices社製）にかけて、各プローブにおける蛍光強度を測定し、プライマーセットの濃度比毎にＩＴＳ領域用プローブにおける蛍光強度、及びβ−チューブリン遺伝子用プローブにおける蛍光強度の平均値を算出した。その結果を図５〜図８に示す。図５はサンプルＡ、図６はサンプルＢ、図７はサンプルＣ、図８はサンプルＤを用いた場合の、プライマーセットの各種濃度比についての蛍光強度を示している。【００８８】
また、図９〜図１２は、それぞれサンプルＡ〜Ｄを用いた場合のプライマーセットの各種濃度比についてのプローブ毎の蛍光強度を示している。なお、図５〜図８における「Ｎ」は、図９〜図１２におけるプローブ数をそれぞれ示している。図１５においても同様である。【００８９】
（試験２）
ＤＮＡチップ解析における蛍光強度と、ＰＣＲによる増幅産物量との相関関係を確認するために試験２を行った。
具体的には、試験１のサンプルＢ，Ｃのそれぞれについて、β−チューブリン遺伝子用プライマーセットの終濃度とＩＴＳ領域用プライマーセットの終濃度の比が、以下のような５種類のＰＣＲ用反応液を用いて、試験１と同様にＰＣＲを行った。
（レーン１）０．５μＭ：０．５μＭ
（レーン２）０．５μＭ：０．２５μＭ
（レーン３）０．５μＭ：０．１２５μＭ
（レーン４）０．５μＭ：０．０６２５μＭ
（レーン５）０．５μＭ：０．０３１２５μＭ【００９０】
そして、得られた増幅産物を、ＭｕｌｔｉＮＡ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を用いて解析した。その結果を図１３に示す。
同図に示されるように、サンプルＢにおいて、β−チューブリン遺伝子については、レーン１のバンドが薄く、レーン２バンドがやや濃く、レーン３〜５のバンドが濃く表示されている。また、ＩＴＳ領域については、レーン１，２のバンドが濃く、レーン３バンドがやや濃く、レーン４，５のバンドが薄く表示されている。この結果は、図６に示されるサンプルＢのＤＮＡチップ解析における蛍光強度と対応している。【００９１】
また、サンプルＣにおいて、β−チューブリン遺伝子については、レーン１，２のバンドが薄く、レーン３〜５のバンドが相対的に濃く表示されている。また、ＩＴＳ領域については、レーン１〜３のバンドが濃く、レーン４，５のバンドが薄く表示されている。この結果は、図７に示されるサンプルＣのＤＮＡチップ解析における蛍光強度と対応している。
以上のことから、ＤＮＡチップ解析における蛍光強度と、ＰＣＲによる増幅産物量との間には、相関関係があることが確認された。【００９２】
（試験３）
ＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子の両方を同時に検出可能なプライマーセット濃度を確認するため、試験１と別個のサンプルを用いて、同様の試験を再度行った。
検出対象カビは、試験１と同様に、施設環境から採取した野生カビをサンプルＥ〜Ｈの各培地に吹き付けて培養したものを使用した。このサンプルＥ〜Ｈの培地に生じた各種カビのコロニーを分離培養し、各コロニーをＤＮＡ配列解析に供して、その菌種を確認した。その結果を図４に示す。【００９３】
そして、サンプルごとに、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを一括して採取し、カビの細胞を破砕してゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により各カビのＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子とを増幅した。
このとき、プライマーには試験１と同様に、図２に示す配列番号１及び配列番号２の塩基配列からなるＩＴＳ領域増幅用プライマーセットと、配列番号３及び配列番号４の塩基配列からなるβ−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットを用いた。【００９４】
また、ＰＣＲ用反応液として、サンプルＥ〜Ｈのそれぞれについて、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)  4.0μl
３．dNTPmix  1.0μl
４．Cy-5dCTP  0.2μl
５．ITS1-Fw  primer(5μM)  0.5μl
６．ITS1-Rv  primer(5μM)  0.5μl
７．BtF  primer(10μM)  1.0μl
８．BtR  primer(10μM)  1.0μl
９．Template  DNA（サンプルＥ〜Ｈ毎にそれぞれ）  1.0μl
１０．NovaTaq  polymerase  0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）【００９５】
また、ＰＣＲ用反応液として、サンプルＥ〜Ｈのそれぞれについて、ＩＴＳ領域増幅用プライマーを次のようにし、その他の組成は上記と同じのものを２０μｌ作成した。
ITS1-Fw  primer(2.5μM)  2.5μM
ITS1-Rv  primer(2.5μM)  2.5μM
このように、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの終濃度比として、サンプル毎に、０．５μＭ：０．２５μＭと、０．５μＭ：０．１２５μＭの２通りのＰＣＲ用反応液を作成し、それぞれについて試験を行った。ＰＣＲの反応条件は、試験１と同様である。【００９６】
また、ＤＮＡチップには、図３に示されるプローブのうち、以下のプローブを固定化したものを使用した。その他の点については、試験１と同様にして、プローブにおける蛍光強度を測定し、プライマーセットの濃度比毎に、ＩＴＳ領域用プローブにおける蛍光強度、及びβ−チューブリン遺伝子用プローブにおける蛍光強度の平均値を算出した。その結果を図１４に示す。なお、同図における「Ｎ」は、プローブ数×３回（試験回数）をそれぞれ示している。【００９７】
＜ＩＴＳ領域から選択されたプローブ＞
（１）ユーロチウム属菌  配列番号６
（２）アスペルギルス  ペニシリオイデス種菌  配列番号９
（８）ペニシリウム属菌  配列番号２９
（１１）クラドスポリウム属菌  配列番号３７
（１２）カビ共通  配列番号４０【００９８】
＜β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブ＞
（１）ユーロチウム属菌  配列番号８
（２）アスペルギルス  ペニシリオイデス種菌  配列番号１２
（４）アスペルギルス  リストリクティ節菌  配列番号２１
（１２）カビ共通  配列番号４１【００９９】
図１４におけるサンプルＥ〜Ｈを参照すると、β−チューブリン遺伝子用プライマーセットの終濃度とＩＴＳ領域用プライマーセットの終濃度の比が、０．５μＭ：０．２５μＭ（１：１／２）の場合よりも０．５μＭ：０．１２５μＭ（１：１／４）の場合の方が、ＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子の両方のプローブの蛍光強度が共に大きくなっている。
したがって、これら両方の検出結果にもとづいてカビの存否を判定するためには、β−チューブリン遺伝子用プライマーセット終濃度とＩＴＳ領域用プライマーセット終濃度の比を０．５μＭ：０．１２５μＭとすることが最適であると考えられる。【０１００】
（試験４）
施設環境から採取したサンプルＡ〜Ｈに含まれる野生カビではない各種カビを対象とした場合にも、本発明のＩＴＳ領域及びβ−チューブリン遺伝子を標的領域とするカビの検出方法により検出できるかを検証した。
検出対象カビとしては、以下の４種類の菌株１〜４を混合して使用した。【０１０１】
１．アスペルギルス  フミガタス（Aspergillus  fumigatus）菌株No.JCM10253
２．フザリウム  ソラニ（Fusarium  solani）菌株No.NBRC5232
３．スタキボトリス  チャータラム（Stachybotrys  chartarum）菌株No.NBRC5369
４．クラドスポリウム  スフェロスパーマム（Cladsoporium  sphaerospermum）菌株No.JCM11787【０１０２】
なお、上記菌株は、以下の機関から入手したものである。
JCM：独立行政法人理化学研究所  バイオリソースセンター  微生物材料開発室（Japan  Collection  of  Microorganisms）
NBRC：独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（NITE  Biological  Resource  Center）【０１０３】
これらの菌株を培地に植えて、２５℃の暗所で７日間静置させて培養した後、各菌株のカビのコロニーを一括して採取し、試験１と同様にカビのゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子とを同時増幅した。
このとき、試験３と同様に、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの終濃度比として、０．５μＭ：０．２５μＭと、０．５μＭ：０．１２５μＭの２通りのＰＣＲ用反応液を作成した。また、各ＰＣＲ用反応液において、試料のＤＮＡは、菌株１〜４をそれぞれ１．０μｌずつ合計４．０μｌ含有させた。そして、それぞれのＰＣＲ用反応液により各カビのＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子とを増幅した。【０１０４】
また、ＤＮＡチップには、図３に示されるプローブのうち、以下のプローブを固定化したものを使用した。
そして、ＰＣＲによる増幅産物をプローブにハイブリダイズさせ、プローブにおける蛍光強度を測定し、プライマーセットの濃度比毎に、ＩＴＳ領域用プローブにおける蛍光強度、及びβ−チューブリン遺伝子用プローブにおける蛍光強度の平均値を算出した。その他の点については、試験１と同様にして行った。その結果を図１５に示す。また、図１６に、プライマーセットの濃度比毎及びプローブ毎の蛍光強度を示す。【０１０５】
＜ＩＴＳ領域から選択されたプローブ＞
（６）アスペルギルス  フミガティ節菌  配列番号２４
（９）スタキボトリス  チャータラム種菌  配列番号３３
（１０）フザリウム  ソラニ種菌  配列番号３５
（１１）クラドスポリウム属菌  配列番号３７
（１２）カビ共通  配列番号４０【０１０６】
＜β−チューブリン遺伝子から選択されたプローブ＞
（６）アスペルギルス  フミガティ節菌  配列番号２５
（９）スタキボトリス  チャータラム種菌  配列番号３４
（１０）フザリウム  ソラニ種菌  配列番号３６
（１２）カビ共通  配列番号４１【０１０７】
図１５を参照すると、β−チューブリン遺伝子用プライマーセットの濃度とＩＴＳ領域用プライマーセットの終濃度の比が、０．５μＭ：０．２５μＭ（１：１／２）及び０．５μＭ：０．１２５μＭ（１：１／４）のいずれの場合についても、ＩＴＳ領域用プローブとβ−チューブリン遺伝子用プローブの両方における蛍光強度が、検出に十分な値を示している。
したがって、上記４種類の菌株１〜４についても、本発明のＩＴＳ領域及びβ−チューブリン遺伝子を標的領域とするカビの検出方法により検出できることが確認された。【０１０８】
なお、クラドスポリウム  スフェロスパーマムについては、β−チューブリン遺伝子用プローブにおいて蛍光が検出できなかった。そこで、クラドスポリウム属菌の検出を可能にする方法を検討し、以下の試験５，６を行った。【０１０９】
（試験５）
試験４では、上記の通り、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセット（配列番号３，４）を用いた場合に、クラドスポリウム  スフェロスパーマムについては、β−チューブリン遺伝子用プローブにおいて蛍光が検出されなかった。
また、試験４において、ＤＮＡチップにはβ−チューブリン遺伝子に相補的に結合し得るプローブが固定化されており、当該プローブにおいて蛍光が検出されなかった理由は明らかではない。【０１１０】
そこで、クラドスポリウム属菌専用の新たなβ−チューブリン遺伝子増幅用フォワードプライマー（配列番号５）を設計し、このプライマーと上記のリバースプライマー（配列番号４）からなるプライマーセットを用いて、クラドスポリウム  スフェロスパーマムのβ−チューブリン遺伝子を増幅し、β−チューブリン遺伝子用プローブにおいて蛍光が検出されるか否かを確認するための試験を行った。【０１１１】
検出対象カビとしては、試験４と同じ４種類の菌株１〜４を混合して使用した。
また、ＰＣＲ用反応液としては、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの終濃度比が、０．５μＭ：０．２５μＭと０．５μＭ：０．１２５μＭのものを作成し、かつそれぞれについてクラドスポリウム属菌専用のβ−チューブリン遺伝子増幅用フォワードプライマーが終濃度として０μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ、０．１２５μＭとなるように添加した８通りのＰＣＲ用反応液を作成した。【０１１２】
具体的には、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用して、次の組成のものを２０μｌ作成し、試験１と同様にして、各カビのＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子とを増幅した。
１．Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)  4.0μl
３．dNTPmix  1.0μl
４．Cy-5dCTP  0.2μl
５．ITS1-Fw  primer(5μM,2.5μM)  0.5μl,0.25μl
６．ITS1-Rv  primer(5μM,2.5μM)  0.5μl,0.25μl
７．BtF  primer(10μM)  1.0μl
８．BtR  primer(10μM)  1.0μl
９．ClaS-beta2(0μM,10μM,5μM,2.5μM)  0μl,1.0μl,0.5μl,0.25μl
１０．Template  DNA（菌株１〜４各々1.0μl）  4.0μl
１１．NovaTaq  polymerase  0.2μl
１２．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）【０１１３】
ＤＮＡチップには、図３に示されるプローブのうち、クラドスポリウム  スフェロスパーマム特異的プローブ（配列番号３９）のみを固定化したものを使用した。そして、その他の点については、試験１と同様にして、ＰＣＲによる増幅産物をプローブにハイブリダイズさせ、当該プローブにおける蛍光強度を測定した。その結果を図１７に示す。【０１１４】
図１７に示される通り、β−チューブリン遺伝子用プライマーセットの濃度とＩＴＳ領域用プライマーセットの終濃度の比が、０．５μＭ：０．２５μＭ（１：１／２）〜０．５μＭ：０．１２５μＭ（１：１／４）の場合であって、かつ特にクラドスポリウム属菌専用フォワードプライマーの終濃度を０．５μＭ〜０．２５μＭとした場合に、クラドスポリウム属菌について高い蛍光強度が得られることがわかった。【０１１５】
（試験６）
試験５で用いたクラドスポリウム属菌専用フォワードプライマー（配列番号５）が、クラドスポリウム  スフェロスパーマム特異的プローブ（配列番号３９）以外のプローブにおける蛍光強度に与える影響について検証した。
検出対象カビとしては、試験４と同じ４種類の菌株１〜４を混合して使用した。【０１１６】
また、ＰＣＲ用反応液としては、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの終濃度比を０．５μＭ：０．１２５μＭとし、かつクラドスポリウム属菌専用のβ−チューブリン遺伝子増幅用フォワードプライマーを終濃度が０μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭとなるように添加した３通りのＰＣＲ用反応液を作成した。【０１１７】
具体的には、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを２０μｌ作成し、試験１と同様にして、各カビのＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子とを増幅した。
１．Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)  4.0μl
３．dNTPmix  1.0μl
４．Cy-5dCTP  0.2μl
５．ITS1-Fw  primer(2.5μM)  0.25μl
６．ITS1-Rv  primer(2.5μM)  0.25μl
７．BtF  primer(10μM)  1.0μl
８．BtR  primer(10μM)  1.0μl
９．ClaS-beta2(0μM,10μM,5μM)  0μl,1.0μl,0.5μl
１０．Template  DNA（菌株１〜４各々1.0μl）  4.0μl
１１．NovaTaq  polymerase  0.2μl
１２．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）【０１１８】
また、ＤＮＡチップには、図３に示されるプローブのうち、試験４と同じ菌株１〜４のプローブを固定化したものを使用した。その他の点については、試験１と同様にして、ＰＣＲによる増幅産物をプローブにハイブリダイズさせた。
そして、各プローブにおける蛍光強度を測定し、クラドスポリウム属菌専用のβ−チューブリン遺伝子増幅用フォワードプライマーの濃度毎に、ＩＴＳ領域用プローブにおける蛍光強度、及びβ−チューブリン遺伝子用プローブにおける蛍光強度の平均値を算出した。その結果を図１８に示す。【０１１９】
図１８に示されるように、クラドスポリウム属菌専用β−チューブリン遺伝子増幅用フォワードプライマーをマルチプレックスＰＣＲ用反応液に加えることによって、クラドスポリウム  スフェロスパーマム特異的プローブ以外のβ−チューブリンから選択されたプローブにおける蛍光強度は低下している。その蛍光強度の低下の程度は、クラドスポリウム属菌専用β−チューブリン遺伝子増幅用フォワードプライマーの濃度が０．５μＭのものよりも０．２５μＭのものの方が軽微である。したがって、クラドスポリウム属菌専用β−チューブリン遺伝子増幅用フォワードプライマーの濃度は、０．２５μＭの方が適切であることが明らかとなった。【０１２０】
次に、本発明のカビの検査方法によるカビ検出の試験結果について、具体的に説明する。【０１２１】
（試験７：各種培地組成の水分活性値による培養試験）
ＰＤＡ（Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ）培地とＭＹ（Ｍａｌｔ＋Ｙｅａｓｔ）培地に糖などを添加して種々の水分活性値を示す培地組成からなる各種培地を作製し、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを培養して、それぞれの培養結果を評価した。【０１２２】
１．培地の作製方法
（１）ＰＤＡ培地
ＰＤＡ（ＤＩＦＣＯ社製）に、グルコース（和光純薬工業株式会社）、及び／又は、シュークロース（和光純薬工業株式会社）を各種割合で添加し、１Ｌのイオン交換水に懸濁してオートクレーブで融解後、シャーレに分注して作製した。なお、シャーレ分注前に、細菌増殖を防止する目的で、クロラムフェニコール（和光純薬工業株式会社）を最終濃度５０ｐｐｍとなるように加えた。ＭＹ培地についても同様である。【０１２３】
（２）ＭＹ培地
以下のＭＹに、シュークロース（和光純薬工業株式会社）、グルコース、寒天（和光純薬工業株式会社）、及びグリセリンの少なくともいずれかを各種割合で添加し、１００ｍｌのイオン交換水に懸濁し、オートクレーブで融解後、シャーレに分注して作製した。
ＭＹ：麦芽（Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ，ＤＩＦＣＯ社製）＋酵母（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ，ＤＩＦＣＯ社製）【０１２４】
２．培地の水分活性値の測定
実際に培養に使用した培地の所定量について、ロトロニック水分活性測定装置（ＧＳＩクレオス社製）を使用して、その水分活性値を専用密閉容器内で測定した。【０１２５】
３．培養評価
上記作製方法に従って作成した各種培地（図１９の実施例１−１０，参考例１−６）を用いて、好乾性カビ（Eurotium  herbariorum）、耐乾性カビ（A.niger）、好湿性カビ（Fusarium  sp.）を２５℃で暗所にて７２時間培養し、得られたコロニーの直径を測定した。培養後のコロニーの直径が１０ｍｍ以上を○、１０ｍｍ未満を×とした。その結果を図１９に示す。
同図に示されている通り、実施例１−１０の各種培地を用いた場合は、好乾性カビ、耐乾性カビ及び好湿性カビのいずれもが十分に繁殖していることがわかる。一方、参考例１−６の各種培地を用いた場合は、十分に繁殖していない菌種が存在していることがわかる。このため、複数の菌種を同時に培養するためには、水分活性値が１．０未満、０．９０以上で、且つ、糖濃度５％〜５０％の範囲とすることが好適であることがわかる。【０１２６】
（試験８：各種培地による培養試験）
図１９に示す参考例１，２，４−６、及び実施例７の６種類の培地を用いて、各種のカビを２５℃で暗所にて１６８時間培養し、得られたコロニーの直径を測定した。【０１２７】
供試菌種としては、以下の１４種類のものを使用した。結果を図２０に示す。このうち、１−４の供試菌種は好乾性のカビであり、５−１０の供試菌種は耐乾性のカビであり、１１−１４の供試菌種は好湿性のカビである。なお、これらの供試菌種は環境中から独自に採取し、同定して得たものであり、その番号は便宜上付したものである。【０１２８】
１．アスペルギルス  ペニシリオイデス（A.penicillioides，K-7-4）
２．アスペルギルス  リストリクタス（A.restrictus，I-2-1）
３．ユーロチウム  ヘルバリオルム（Eurotium  herbariorum，イ2-1）
４．ワレミア  セビ（Wallemia  sebi，KSS-1127）
５．アスペルギルス  フラバス（A.flavus，B-3-3）
６．アスペルギルス  フミガタス（A.fumigatus，KSS-1126）
７．アスペルギルス  ニガー（A.niger，A-1-1）
８．アスペルギルス  バーシカラー（A.versicolor，イ3-1）
９．ペニシリウム  グラブラム（Penicillium  glabrum，B-4-3）
１０．ペニシリウム  ルグロサム（P.rugulosum，E-2-3）
１１．クラドスポリウム  サファエロスペルマ（Cladosporium.sphaerospermum，I-4-2）
１２．クラドスポリウム  クラドスポリオイデス（C.cladosporioides，A-2-1）
１３．フザリウム属菌（Fusarium  sp.，Ｂ５−３−Ｃ）
１４．スタキボトリス属菌（Stachybotrys  sp.，KSS-1125）【０１２９】
図２０に示される通り、実施例７の培地（Ｍ４０Ｙ）によれば、生育に適する湿度が異なる複数の種類のカビのコロニーができ、上記１−１４の全ての菌種が、十分に繁殖していることがわかる。
このように、実施例７の培地を用いれば、最適湿度についての性質が異なる複数のカビを、同じ培地で同時に培養可能であることが明らかとなった。【０１３０】
（試験９：各種温度による培養試験）
実施例７で使用したＭ４０Ｙ培地を用いて、各種温度で培養を行い、得られたコロニーの直径を測定した。供試菌種は、試験１と同様に好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを含む１４種類を用い、暗所にて１６８時間培養を行った。その結果を図２１に示す。また、３，８，１３の菌種について、図２２にコロニーの写真を示す。【０１３１】
図２１の実施例１１−１３に示される通り、培養温度が２３℃〜２７℃の範囲では、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビのいずれもが十分に繁殖していることがわかる。一方、参考例７−９に示される通り、培養温度が３０℃〜３５℃の範囲では、生育できない菌種が存在することがわかる。このため、複数の菌種を同時に培養するためには、培養温度を２５℃±２℃の範囲とすることが好適であることがわかる。【０１３２】
（試験１０：ＤＮＡチップ解析試験）
実施例７で使用したＭ４０Ｙ培地を用いて各種カビを培養し、得られたコロニーを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＩＴＳ１領域をＰＣＲ法により増幅して検出対象カビが増幅産物に含まれているか否かをＤＮＡチップにより検査した。また、ＤＮＡチップによる検査結果を検証するために、ＤＮＡ配列解析を行った。具体的には、以下のようにして行った。【０１３３】
まず、実施例７で使用したＭ４０Ｙ培地を用いた検体として、Ｎｏ．１からＮｏ．６０までの６０個の検体を準備した。次に、エアーサンプラーを用いて、一般環境中から空気を採取し、上記各検体に吹き付けて培養した。培養は、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。【０１３４】
次に、検体ごとに、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを、ＤＮＡ配列解析に供するために、各コロニーの一部を個別に採取し、それぞれ２５℃の暗所で７−１０日間分離培養を行った。
さらに、検体ごとに、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを一括して採取して、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。【０１３５】
次いで、検体ごとに、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域を増幅した。
具体的には、ＰＣＲ反応液として、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ（Ｇ／Ｃｒｉｃｈ）  ４．０μｌ
２．Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（ａｄｄｉｔｉｏｎ−４）  ４．０μｌ
３．ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ  １．０μｌ
４．Ｃｙ５−ｄＣＴＰ  ０．２μｌ
５．ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー（１０μＭ，配列番号４２，シグマアルドリッチ社により合成）  １．０μｌ
６．ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマー（１０μＭ，配列番号４３，シグマアルドリッチ社により合成）  １．０μｌ
７．試料のゲノムＤＮＡ  １．０μｌ
８．ＮｏｖａＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．２μｌ
９．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）【０１３６】
このＰＣＲ反応液を使用して核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（Ｒ）  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
１．９５℃  １０分
２．９５℃  ３０秒
３．５６℃  ３０秒
４．７２℃  ６０秒（２〜４を４０サイクル）
５．７２℃  １０分【０１３７】
ＤＮＡチップには、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、これに配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６に示される塩基配列からなるプローブを固定化したものを使用した。これらは、それぞれアスペルギルス  ヴィトリコラ（Aspergillus  vitricola）検出用のプローブ、アスペルギルス  ペニシリオイデス（Aspergillus  penicillioides）検出用のプローブ、及びユーロチウム属菌（Eurotium  sp.）検出用のプローブである。【０１３８】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、上記ＤＮＡチップに滴下した。
このＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をマイクロアレイから洗い流した。
次いで、ＤＮＡチップを標識検出装置（ジーンシリコン専用スキャナー  BIOSHOT東洋鋼鈑株式会社製）にかけて、各プローブの蛍光強度を測定した。その結果を図２３−２５に示す。【０１３９】
また、検体ごとに含まれる菌種のＤＮＡ配列解析を行うため、上記のようにコロニーごとに分離培養して得られた菌種からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により増幅産物を得た。
このとき、プライマーセットは、配列番号４２及び４３に示される塩基配列からなるものを用いるとともに、核酸合成酵素には、TAKARA  ExTaq  ポリメラーゼを使用した。また、核酸増幅装置には、ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（Ｒ）  Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、その他は上記と同様にしてＰＣＲ反応を行った。
このＰＣＲ反応により得られた増幅産物と、配列番号４７及び４８に示される塩基配列からなるプライマーセットをシーケンス用プライマーとして、タカラバイオ株式会社に委託し、ＤＮＡシーケンサーによりＩＴＳ１領域の配列解析を行った。その結果、図２３−２５に示すように、各検体から最大で４菌種が確認された。【０１４０】
図２３−２５の「ＤＮＡチップ解析（プローブ蛍光強度）」において、陽性と考えられる部分を太枠で囲っている。これらは、それぞれ「ＩＴＳ配列解析により確認された検体中に含まれる菌種」において、同じ菌種が示されている。
なお、ＩＴＳ配列解析により耐乾性カビ（Penicillium  sp.）、及び好湿性カビ（Cladosporium  sp.）が含まれていることが判明した検体Ｎｏ．３につき、Penicillium  sp検出用プローブ及びCladosporium  sp検出用プローブを固定化したＤＮＡチップを用いて、上記と同様にして、標識検出装置により蛍光強度を測定したところ、これらの菌種（Penicillium  sp.，Cladosporium  sp.）の検出が確認された。
したがって、本発明のカビの検査方法により、複数種類のカビを同じ培地で同時に培養した場合に、各カビを特異的に検出できることが分かった。【０１４１】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記の試験のＰＣＲ用反応液におけるＩＴＳ領域増幅用プライマーセット及びβ−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセット以外の成分については、適宜変更することができる。また、これらの増幅産物を用いて対象カビの検出を行う方法であれば、上記のようなＤＮＡチップを用いて蛍光検出を行うのではなく、電気泳動による検出や、電流検出方式など他の検出方式のＤＮＡチップにより増幅産物を検出することなどが可能である。
また、上記実施例では、培地としてＭ４０Ｙなどを用いているがこれらに限定されるものではなく、水分活性値が１．０未満、０．９０以上で、且つ、糖濃度５％〜５０％の固形培地のその他の固形培地を用いるなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明は、環境検査、食品検査、疫学的環境検査、臨床試験、家畜衛生等において、複数のカビを特異的且つ多重に検出する場合に好適に利用することが可能である。また、食品製造現場や臨床現場、文化財の保護環境等におけるカビの検査に好適に利用することが可能である。
【図２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２２】
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【配列表】
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