(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体内において、配列番号２に示されるアミノ酸配列から構成される転写因子の機能を阻害する工程を包含する、凍結耐性を有している植物体の生産方法であって、
上記転写因子の機能を阻害する工程が、上記転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとが融合している転写抑制因子を植物体において産生させることによって行われる、生産方法。
【請求項２】
請求項１に記載の生産方法により生産された、植物体。
【請求項３】
成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルスおよび種子からなる群より選択されることを特徴とする請求項２に記載の植物体。
【請求項４】
凍結耐性を有している植物体を生産するためのキットであって、
配列番号２に示されるアミノ酸配列から構成される転写因子をコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに
任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項５】
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとがインフレームで連結されている、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
第１のポリヌクレオチドが、配列番号１に示される塩基配列から構成されるポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項４または５に記載のキット。
【請求項７】
凍結耐性を有している植物体を生産するためのキットであって、
配列番号３に示される塩基配列から構成される第１のオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に示される塩基配列から構成される第２のオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット、ならびに
任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項８】
目的のポリペプチドを植物体内にて発現させるための発現ベクターをさらに備えていることを特徴とする請求項４〜７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９】
上記発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群をさらに備えていることを特徴とする請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
植物体内において、配列番号２に示されるアミノ酸配列から構成される転写因子の機能を阻害する工程を包含する、植物体に凍結耐性を付与する方法であって、
上記転写因子の機能を阻害する工程が、上記転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとが融合している転写抑制因子を植物体において産生させることによって行われる、方法。
【請求項１１】
植物体に凍結耐性を付与するためのキットであって、
配列番号２に示されるアミノ酸配列から構成される転写因子をコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに
任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド
を備えていることを特徴とするキット。
【請求項１２】
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとがインフレームで連結されている、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
植物体に凍結耐性を付与するためのキットであって、
配列番号３に示される塩基配列から構成される第１のオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に示される塩基配列から構成される第２のオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット、ならびに
任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド
を備えていることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体に凍結耐性を付与し得る新たな技術に関するものであり、より詳細には、凍結耐性が付与された植物体の生産方法およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物体に凍結耐性を付与し得る新たな技術の開発は、寒冷地において各種作物を生育させるために重要である。【０００３】
これまで、植物体に凍結耐性を付与する遺伝子として、適合溶質合成に関わる遺伝子およびストレス応答遺伝子が知られている。非特許文献１には、適合溶質であるプロリンの蓄積を誘導するＬ−１−Ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−５−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅが記載されている。非特許文献２には、低温応答機構そのものに関与する遺伝子であり、凍結耐性増大因子を誘導する転写因子であるＤＲＥＢ１Ａ転写因子が記載されている。非特許文献３には、細菌Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来の外来の遺伝子であって、適合溶質であるトリメチルグリシンの合成および蓄積を誘導するｃｏｄＡ遺伝子が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２００１−２６９１７７号公報（平成１３年１０月２日公開）」
【特許文献２】日本国公開特許公報「特開２００１−２６９１７８号公報（平成１３年１０月２日公開）」
【特許文献３】日本国公開特許公報「特開２００１−２９２７７６号公報（平成１３年１０月２日公開）」
【特許文献４】日本国公開特許公報「特開２００１−２９２７７７号公報（平成１３年１０月２３日公開）」
【特許文献５】日本国公開特許公報「特開２００１−２６９１７６号公報（平成１３年１０月２日公開）」
【特許文献６】日本国公開特許公報「特開２００１−２６９１７９号公報（平成１３年１０月２日公開）」
【特許文献７】日本国公開特許公報「特開２００５−１３２１４号公報（平成１７年１月２０日公開）」
【特許文献８】日本国公開特許公報「特開２００５−２７６５４号公報（平成１７年２月３日公開）」
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J. Biol. Chem. (2009) 284(39): 26482-92
【非特許文献２】Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) 250(1): 161-70
【非特許文献３】Plant J. (1997) 12(1): 133-42
【非特許文献４】Nature (2003) 426: 181-186
【非特許文献５】The Plant Cell (2001) 13: 1959-1968
【非特許文献６】FEBS Letters (2002) 514: 351-354
【非特許文献７】The Plant Cell (2008) 20(6): 1494-503
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、凍結耐性の付与が可能であり、従来技術にはない利点を有する新規な技術を提供することは有用である。【０００７】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、凍結耐性の付与が可能である新規な技術を提供することを主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはこれまでに、転写因子を転写抑制因子に変換する技術を開発している。この技術は、いろいろな植物遺伝子について、生体内でその機能を解析するに有用である。本技術は、任意の遺伝子を標的（ターゲット遺伝子）とし、例えば、上記エフェクタープラスミドを植物細胞に導入することによりターゲット遺伝子の転写を抑制し、その結果、エフェクタープラスミドが導入された植物では、ターゲット遺伝子の機能が抑制される。そのため、形質転換された植物に現れる表現型を観察することで、ターゲット遺伝子の機能を解析することができる。このような技術に用いられ得る機能性ペプチドについては、特許文献１〜８および非特許文献５〜６等を参照のこと。なお、これらの文献は、その全てが本明細書中において参考として援用される。【０００９】
本発明者らは、上述した技術を用いて、植物における師部の分化促進および木部の分化抑制の役割を果たしていることが知られている配列番号２に示されるアミノ酸配列から構成される転写因子（Ａｔ１ｇ７９４３０。非特許文献４および７を参照のこと）の機能をさらに調べたところ、驚くべきことに、上記転写因子が、凍結耐性に関与していることを見出し、発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明に係る凍結耐性を有している植物体の生産方法は、植物体内において、配列番号２に示されるアミノ酸配列から構成される転写因子またはそのオーソログの機能を阻害する工程を包含することを特徴としている。【００１１】
植物における師部の分化促進および木部の分化抑制と、凍結耐性とは全く関連しない。また、上記転写因子は、これまで知られている凍結耐性を付与する技術において用いられたような、適合溶質合成に関わるものでも、ストレス応答性の転写因子でもない。したがって、凍結耐性に関与するという上記転写因子の属性は未知であり、かつ当業者が容易に予測し得るものでもなかった。【００１２】
また、後述する実施例に示すように、本発明にかかる生産方法で生産された植物体では、低温馴化されていないときの凍結耐性が向上しているだけでなく、脱馴化過程を経た後における凍結耐性も向上している。これまで、脱馴化過程を経た後における凍結耐性に関与する遺伝子は全く知られておらず、本発明によって初めて提供される。【００１３】
また、後述する実施例に示すように、本発明にかかる生産方法で生産された植物体では、凍結耐性とともに、乾燥耐性も向上している。乾燥耐性は、凍結耐性とは全く関連しておらず、凍結耐性とともに乾燥耐性を付与し得ることは、本発明独自の効果である。なお、寒冷地では、寒害および凍害だけでなく、乾燥によっても被害を受ける場合がある。そのため、凍結耐性とともに乾燥耐性を付与し得るという本発明の効果は、寒冷地において植物体を生育させるために非常に有用である。【００１４】
本発明に係る植物体は、上記生産方法によって生産されたことを特徴としている。【００１５】
本発明に係るキットは、凍結耐性を有している植物体を生産するために、配列番号２に示されるアミノ酸配列から構成される転写因子またはそのオーソログをコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。【００１６】
本発明に係る植物体の生産方法は、植物体に凍結耐性を付与する方法でもあり得る。また、本発明に係るキットは、植物体に凍結耐性を付与するためのキットでもあり得る。【００１７】
また、上述したように、本発明に係る植物体の生産方法は、乾燥耐性を有している植物体の生産方法でもあり得、植物体に乾燥耐性を付与する方法でもあり得る。また、本発明に係るキットは、乾燥耐性を有している植物体を生産するためのキットでもあり得、植物体に乾燥耐性を付与するためのキットでもあり得る。【００１８】
また、本発明に係る植物体の生産方法は、凍結耐性および乾燥耐性を有している植物体の生産方法でもあり得、植物体に凍結耐性および乾燥耐性を付与する方法でもあり得る。また、本発明に係るキットは、凍結耐性および乾燥耐性を有している植物体を生産するためのキットでもあり得、植物体に凍結耐性および乾燥耐性を付与するためのキットでもあり得る。
【発明の効果】
【００１９】
本発明を用いれば、凍結耐性の機能を植物体に付与することができる。これにより、寒害および凍害に強い機能性植物を作製することができるので、幅広い地域で所望の穀物を作出することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】野生型（ＷＴ）および形質転換体（ＨＲ０２１１）の低温馴化していない植物体における凍結耐性の評価結果を示すグラフである。
【図２】野生型（ＷＴ）および形質転換体（ＨＲ０２１１）の低温脱馴化した植物体における凍結耐性の評価結果を示すグラフである。
【図３】野生型（ＷＴ）および形質転換体（ＨＲ０２１１）の植物体の乾燥耐性の評価結果を示し、（ａ）は乾燥期間後の植物体の様子を示す写真であり、（ｂ）は乾燥期間後の各植物体の生存率を示すグラフである。
【図４】野生型（ＷＴ）および形質転換体（ＨＲ０２１１）の葉脈密度の測定結果を示すグラフであり、（ａ）は、乾燥処理前に測定した結果を示し、（ｂ）は乾燥処理７日目に測定した結果を示す。
【図５】野生型（ＷＴ）および形質転換体（ＨＲ０２１１）の乾燥処理前および乾燥処理中の光合成活性を測定した結果を示すグラフである。
【図６】野生型（ＷＴ）および形質転換体（ＨＲ０２１１）の気孔密度の測定結果を示すグラフであり、（ａ）は、乾燥処理前に測定した結果を示し、（ｂ）は乾燥処理７日目に測定した結果を示す。
【図７】野生型（ＷＴ）および形質転換体（ＨＲ０２１１）の水分損失率を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、凍結耐性を有している植物体の生産方法を提供する。本発明に係る生産方法は、植物体内において特定の転写因子の機能を阻害する工程を包含することを特徴としている。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「凍結耐性」は０℃以下の環境温度に対する耐性が意図される。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「転写因子（転写因子等）」は転写因子または転写因子のＤＮＡ結合ドメインが意図され、好ましくは植物の転写因子であり得る。「転写因子」は、転写あるいはその開始反応を正あるいは負に調節するポリペプチド（転写調節因子）が意図され、好ましくは、正に調節するポリペプチドが意図される。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【００２５】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００２６】
「ポリペプチド」は、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、「ポリペプチド」は、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、「ポリペプチド」はまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００２７】
「ポリペプチド」は、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されず、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００２９】
ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００３０】
「転写因子の機能を阻害する」とは、転写調節因子としての機能を失わせることが意図される。転写調節因子としての機能喪失としては、例えば、タンパク質−タンパク質間の相互作用能の消失、ＤＮＡ結合能の消失、ならびに転写調節機能の消失および／または逆転などが挙げられ、これらのような機能が失われている状態の転写因子は、機能が阻害されているということを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。このように、転写因子の機能が阻害されることによって、転写因子の標的遺伝子の発現が抑制される。あるいは、転写因子の機能が阻害されることによって、転写因子の下流遺伝子の発現が抑制され、その結果、下流遺伝子の機能が抑制される。すなわち、本明細書中において、「転写因子の機能を阻害する」は、「転写因子の標的遺伝子の発現を抑制する」、「転写因子の下流遺伝子の発現を抑制する」および「下流遺伝子の機能を抑制する」と交換可能に用いられる。
【００３１】
転写因子の機能を阻害する手法は、植物体内における目的の転写因子の遺伝子またはタンパク質の発現を抑制することであっても、ＲＮＡの合成阻害であってもタンパク質の合成阻害であってもよい。なお、タンパク質の発現を阻害する方法は、当該分野において周知の技術が用いられればよく、ノックアウト法またはＲＮＡｉ法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
上述したように、本発明者らはこれまでに、転写因子を転写抑制因子に変換する技術を開発している。本明細書中で使用される場合、「転写抑制因子」は「転写因子」および「機能性ペプチド」から構成される融合タンパク質であり、「キメラリプレッサー」と交換可能に使用され得る。すなわち、本発明において、転写因子の機能を阻害するために、目的の転写因子と任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとの融合タンパク質（キメラリプレッサー）を植物体内で発現させてもよい。なお、目的のタンパク質を植物体内で発現させるためには、そのタンパク質をコードする遺伝子を植物体内に導入すればよい。このように、キメラリプレッサー技術を適用することによって、転写因子の標的遺伝子の発現が抑制される。あるいは、キメラリプレッサー技術を適用することによって、転写因子の下流遺伝子の発現が抑制され、その結果、下流遺伝子の機能が抑制される。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「から構成される」は、実質的に含んでいる状態が意図され、「からなる」であってもよいが「のみからなる」に限定されない。すなわち、用語「からなる」もまた付加的な部分を含んでいる状態を包含し得る。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子が導入された」または「遺伝子が導入されている」は、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されていること（すなわち、形質転換体）が意図される。従って、本明細書において、形質転換体は、キメラリプレッサー遺伝子を含む組換え発現ベクターを各種生物に導入したものであり得る。「形質転換体」は、細胞だけでなく、各種生物の組織、器官、植物もしくは動物の個体をも包含される。対象となる生物としては、特に限定されない。実験用に用いられる生物としては、植物であればシロイヌナズナ等を、動物であれば、マウス、ラット、ショウジョウバエ、線虫等を挙げることができる。
【００３５】
あるいは、植物を用いた産業分野に本発明を適用する場合は、生物としては、各種作物（農林水産業で生産される植物、農作物）が挙げられる。具体的には、例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ等の穀物；各種野菜・花卉類；マツ、スギ、ヒノキ等の材木類；等が挙げられる。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、植物への遺伝子導入法は特に限定されないが、目的の遺伝子が発現ベクターに組み込まれていることが好ましい。発現ベクターとしては、公知の植物形質転換用ベクター（例えば、バイナリーベクター（ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩＧなど））が用いられ得るが、特許文献７に記載されるように、公知の植物形質転換用ベクターを用いた場合は、その用途によっては、十分な効率を得ることができない場合があるので、特許文献７に記載の発現ベクター構築用ベクターを用いることが好ましい。なお、好ましい発現ベクターは、植物用のプロモーターおよびターミネーターと、その間に配置される目的遺伝子とを有しており、植物を宿主として上記目的遺伝子にコードされているタンパク質を発現するものであり得る。
【００３７】
このような発現ベクターを用いた植物の形質転換方法については特に限定されるものではなく、宿主の種類に応じた適切な形質転換方法を用いて、組換え発現ベクターを宿主に導入されればよい。本発明では、宿主として特に植物を好ましく用いることができるが、この場合の形質転換方法も特に限定されるものではなく、パーティクルガンによる方法、プロトプラスト／スフェロプラスト法、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。本発明を実施するためには、アグロバクテリウムを用いた減圧浸潤法が好ましい。
【００３８】
目的の遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと目的の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から目的の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、目的のタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、目的のタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。さらに、組換え発現ベクターには、形質転換植物における発現部位を可視化してモニターするための遺伝子を導入することもできる。このような遺伝子の一例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を挙げることができる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、植物体に凍結耐性を付与するために機能が阻害されるべき転写因子を、第１のポリペプチドともいう。第１のポリペプチドは、植物における師部の分化促進および木部の分化抑制の役割を果たしていることが報告されている転写因子である（非特許文献４）。
【００４０】
一実施形態において、第１のポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列から構成されるポリペプチドもしくはそのオーソログ、またはその機能を保持した変異体であり得る。第１のポリペプチドの機能とは、阻害されることによって植物体に凍結耐性を付与することが意図される。
【００４１】
後述する実施例において示すように、転写因子Ａｔ１ｇ７９４３０（配列番号１および２）が凍結耐性に関与する転写因子であることがわかった。すなわち、転写因子Ａｔ１ｇ７９４３０の機能を抑制することにより、凍結耐性を有している植物体を作製することができる。
【００４２】
転写因子Ａｔ１ｇ７９４３０は、「ＡＬＴＥＲＥＤ  ＰＨＬＯＥＭ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ（ＡＰＬ）」とも称され、植物における師部の分化促進および木部の分化抑制の役割を果たしていること、さらに詳しくは、維管束形成に関与し、その発現部位も維管束形成に特化したものであることが報告されている（非特許文献４参照）。しかし、植物体内においてその機能を阻害することによって、植物体に凍結耐性を付与し得ることは記載も示唆もされていない。
【００４３】
そして、植物における師部の分化促進および木部の分化抑制または維管束形成と、凍結耐性とは全く関連しない。転写因子Ａｔ１ｇ７９４３０およびそのオーソログは、これまで知られている凍結耐性を付与する技術において用いられたような、適合溶質合成に関わる遺伝子（非特許文献１記載のＬ−１−Ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−５−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、非特許文献３記載のｃｏｄＡ遺伝子）、およびストレス応答遺伝子（非特許文献２記載のＤＲＥＢ１Ａ）がコードするポリペプチドとは、全く異なるものである。したがって、凍結耐性に関与するという上記転写因子の属性は未知であり、かつ当業者が容易に予測し得るものでもなかった。
【００４４】
また、後述する実施例に示すように、本発明にかかる生産方法で生産された植物体は、低温馴化されていないときの凍結耐性が向上しているだけでなく、脱馴化過程を経た後における凍結耐性も向上している。これまで、脱馴化過程を経た後における凍結耐性に関与する遺伝子は全く知られておらず、本発明によって初めて提供される。
【００４５】
また、後述する実施例に示すように、本発明にかかる生産方法で生産された植物体では、凍結耐性とともに、乾燥耐性も向上している。乾燥耐性は、凍結耐性とは全く関連しておらず、凍結耐性とともに乾燥耐性を付与し得ることは、本発明独自の効果である。なお、寒冷地では、寒害および凍害だけでなく、乾燥によっても被害を受ける場合がある。そのため、凍結耐性とともに乾燥耐性を付与し得るという本発明の効果は、寒冷地において植物体を生育させるために非常に有用である。なお、本明細書において、「乾燥耐性」とは、土壌からの水分吸収が困難な状態に対する耐性が意図される。
【００４６】
また、これまで知られている凍結耐性に関与する遺伝子は、適用し得る植物が限定的である。例えば、非特許文献２に記載のＤＢＥＲ１Ａは、双子葉類の植物にのみ存在するため、イネなどの単子葉類の植物に対しては、ＤＢＥＲ１Ａを利用しても凍結耐性を向上させることは困難であると考えられる。また、テンサイ、ホウレンソウ等のアサガオ科の植物およびコムギ等の低温耐性が元来高い植物は、非特許文献３に記載のｃｏｄＡ遺伝子を導入しなくとも、トリメチルグリシンを合成し蓄積しているため、ｃｏｄＡ遺伝子導入による凍結耐性の向上効果は薄いと考えられる。
【００４７】
一方、転写因子Ａｔ１ｇ７９４３０は、単子葉類、双子葉類を問わず、幅広い植物において保存されていることが知られており、それぞれの植物においてオーソログが存在する。そのため、ＤＲＥＢ１Ａ、ｃｏｄＡ遺伝子に比べ、幅広い植物種に適用することができる。Ａｔ１ｇ７９４３０のオーソログとしては、例えば、イネにおけるＯｓ０６ｇ０６６４９００、Ｏｓ０２ｇ０１７４０００、Ｏｓ０６ｇ０６６４８００およびＯｓ０８ｇ０４３４７００が挙げられる。
【００４８】
本明細書中において使用される場合、変異体の一例としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド（タンパク質）が挙げられる。ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変し得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００４９】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、ランダム変異によっても目的は達成される。
【００５０】
本明細書中において使用される場合、変異体の他の例としては、配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列から構成されるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００５１】
本明細書中において使用される場合、変異体の別の例としては、配列番号１に示される塩基配列の相補配列から構成されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００５２】
ハイブリダイゼーションは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版，Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋとＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｌｌ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（２００１）」（本明細書中に参考として援用される）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基から構成されるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「機能性ペプチド」は、転写因子を転写抑制因子に変換することができるペプチドが意図され、「転写抑制転換ペプチド」または「リプレッサードメイン」と交換可能に使用され得る。また、本明細書において、「機能性ペプチド」は第２のポリペプチドともいう。
【００５５】
上述したように、「機能性ペプチド」については、当該分野においてすでによく知られている（特許文献１〜８および非特許文献５〜６等を参照のこと）。よって、当業者は、組換え技術または化学合成などの周知技術を用いて、所望の機能性ペプチドを容易に作製し得る。また、当業者は、所望の転写因子と所望の機能性ペプチドとの融合タンパク質もまた容易に作製し得る。
【００５６】
一実施形態において、上記機能性ペプチドは、以下：
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３；
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３；
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３；または
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｕを表し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表し、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを表し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を表し、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを表し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを表し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を表し、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを表す。）
で表されるアミノ酸配列から構成されることが好ましい。
【００５７】
式（１）の機能性ペプチドにおいて、Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（１）の機能性ペプチドにおいて、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていても、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００５８】
Ｘ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の機能性ペプチドを合成する際の簡便さの観点から、できるだけ短いほうがよい。具体的には、Ｘ１で表されるアミノ酸残基は、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００５９】
同様に、式（１）の機能性ペプチドにおいて、Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個あればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（１）の機能性ペプチドにおいて、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００６０】
式（２）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドのＸ１と同様、Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（２）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドと同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていても、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６１】
Ｙ１で表されるアミノ酸残基は、式（２）の機能性ペプチドを合成する際の簡便さの観点から、できるだけ短いほうがよい。具体的には、Ｙ１で表されるアミノ酸残基は、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００６２】
同様に、式（２）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドのＸ３と同様、Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個あればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（２）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドと同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００６３】
式（３）の機能性ペプチドにおいて、Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものである。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕであり、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕである。
【００６４】
一方、式（３）の機能性ペプチドにおいて、式（１）の機能性ペプチドのＸ１等と同様、Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されない。換言すれば、式（３）の機能性ペプチドにおいて、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていても、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６５】
Ｚ３で表されるアミノ酸残基は、式（３）の機能性ペプチドを合成する際の簡便さの観点から、できるだけ短いほうがよい。具体的には、Ｚ３で表されるアミノ酸残基は、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
また、式（３）で表される機能性ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されないが、合成する際の簡便さの観点から、２０アミノ酸以下であることが好ましい。式（３）で表される機能性ペプチドとして、最も好ましくはペプチドＳＲＤＸ（ＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ：配列番号５）であり得る。
【００６７】
他の実施形態において、上記機能性ペプチドは、以下：
（５）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（但し、式中α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有することが好ましい。なお、式（５）で表したアミノ酸配列を以下の（６）〜（９）にさらに分類することができる：
（６）α１−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ；
（７）α１−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ；または
（８）α２−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β３−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、上記各式中、α１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを示す。また、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓを示し、β３は、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＧｌｎを示す。さらに、γ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｓｐを示す。）。
【００６８】
機能性ペプチドは、任意の転写因子等と融合させることにより、当該転写因子を転写抑制因子に変換することができる。そのため、特定の標的遺伝子の発現調節領域に結合し得る転写因子等をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いて、植物遺伝子の生体内における機能解析を効率化させることが可能となる。
【００６９】
なお、本明細書中で使用される場合、「標的遺伝子」は、機能性ペプチドと融合させる転写因子等のターゲットとなる任意の遺伝子が意図される。本発明に従って、機能性ペプチドと転写因子等とのキメラ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを植物に導入すれば、キメラ遺伝子より生じたキメラタンパク質が、転写抑制因子として生体中の標的遺伝子の転写を抑制し、その結果、標的遺伝子にコードされるタンパク質の発現が生じない。
【００７０】
このように、機能性ペプチドは、任意の転写因子を転写抑制因子に変換することができる。そのため、特定の標的遺伝子の転写を支配している転写因子等を組み込むことによって、その標的遺伝子の転写抑制を行うことができる。その結果、植物体に変化が見られれば、それから標的遺伝子の機能を解析することができる。
【００７１】
上記機能性ペプチドは、さらに機能的に重複（リダンダント）する他の転写因子の活性に優先して標的遺伝子の発現を抑制する能力を有している。それゆえ、本発明にかかる構築用ベクターに転写抑制転換ポリヌクレオチドが組み込まれていれば、重複する転写因子活性の機能の解析にも利用することができる。
【００７２】
例えば、芽生えの頂芽の形成を制御する転写因子として、ＣＵＣ１タンパク質およびＣＵＣ２タンパク質が知られている。これらタンパク質をコードするＣＵＣ１遺伝子およびＣＵＣ２遺伝子は、両方が変異を有する場合にのみ、その植物体の子葉がカップ状の形態を示し、かつ頂芽の分裂組織の形成が行われないことが知られている。
【００７３】
これら重複した機能を有する遺伝子の一方のみ（例えば、ＣＵＣ１遺伝子）に、上記機能性ペプチドを結合させたキメラ遺伝子を植物体内で発現させた場合であっても、発現したキメラタンパク質は、ＣＵＣ１タンパク質だけでなく、ＣＵＣ２タンパク質の転写活性をも抑制する。
【００７４】
植物は、機能的に重複した複数の転写因子を有する場合が多い。ここで、上記機能性ペプチドを用いて機能変換した転写抑制因子は、優性形質（ドミナント）で作用する。そのため、本発明を利用することで、これまで一遺伝子のノックアウトでは明らかにされなかった転写因子の機能解析が可能となる。また、小麦等のように複２倍体ゲノムを有する植物にも適応することもできる。
【００７５】
第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（本明細書において、第１のポリヌクレオチドともいう。）は、遺伝暗号に基づき、第１のポリペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいれば特に限定されない。また、第１のポリヌクレオチドには、必要に応じて、機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド（本明細書において、第２のポリヌクレオチドともいう。）と連結するための連結部位となる塩基配列が含まれていてもよい。また、第１のポリヌクレオチドの読み枠と第２のポリヌクレオチドの読み枠とが一致しないような場合には、これら読み枠を一致させるための付加的な塩基配列を第１のポリヌクレオチドが含んでいてもよい。さらに、第１のポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側でタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合されていてもよい。
【００７６】
同様に、第２のポリヌクレオチドは、遺伝暗号に基づき、第２のポリペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいれば特に限定されない。また、第２のポリヌクレオチドには、必要に応じて、第１のポリヌクレオチドと連結するための連結部位となる塩基配列が含まれていてもよい。また、第１のポリヌクレオチドの読み枠と第２のポリヌクレオチドの読み枠とが一致しないような場合には、これら読み枠を一致させるための付加的な塩基配列を第２のポリヌクレオチドが含んでいてもよい。さらに、第２のポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側でタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合されていてもよい。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、「転写因子と機能性ペプチドとの融合タンパク質である転写抑制因子をコードする遺伝子」は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとがインフレームで連結されていればよい。よって、用いられる発現ベクターに「第１のポリヌクレオチド」と「第２のポリヌクレオチド」とを別々に挿入しても、「第１のポリヌクレオチド」と「第２のポリヌクレオチド」とを予め連結させて同時に挿入してもよい。また、第２のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターに「第１のポリヌクレオチドを挿入する部位」を設けておき、当該部位に所望の遺伝子を挿入してもよい。
【００７８】
なお、本発明に係る植物体の生産方法は、植物体に凍結耐性を付与する方法でもあり得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、本発明は、植物体に凍結耐性を付与する方法を提供する。本方法は、上記有用形質の発現を調節する転写因子の機能を阻害する工程を包含することを特徴としている。上記転写因子の機能を阻害するためには、上記植物体内で上記転写因子の発現を阻害しても、上記転写因子と任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとの融合タンパク質（キメラリプレッサー）を植物体内で発現させてもよい。なお、タンパク質の発現を阻害する手法としては、当該分野において周知の技術が用いられればよく、ノックアウト法またはＲＮＡｉ法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
さらに、本発明は、凍結耐性を有している植物体を生産するためのキットを提供する。本発明に係るキットは、上述した植物体の生産方法を実施するために必要な物品を備えていればよく、一実施形態において、転写因子をコードする遺伝子（第１のポリヌクレオチド）と機能性ペプチドをコードする遺伝子（第２のポリヌクレオチド）とを少なくとも備えていればよい。本実施形態に係るキットは、これらの遺伝子を融合させた融合遺伝子を備えていてもよく、好ましくは、目的のポリペプチドを植物体内にて発現させるための発現ベクター（植物形質転換用ベクター）をさらに備えている。１つの局面において、本実施形態に係るキットは、凍結耐性を有している植物体を生産するために、配列番号２に示されるアミノ酸配列から構成される転写因子またはそのオーソログをコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを備えていることを特徴としており、好ましくは、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドがインフレームで連結された融合遺伝子を備えている。上記融合遺伝子は、転写因子と機能性ペプチドとの融合タンパク質である転写抑制因子をコードする遺伝子であり得る。また、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列から構成されるポリヌクレオチドであり得る。
【００８０】
他の実施形態において、本発明に係るキットは、第１のポリヌクレオチドの代わりに、第１のポリヌクレオチドを取得するために必要なプライマーセットを備えていてもよい。本実施形態に係るキットは、凍結耐性を有している植物体を生産するために、配列番号３に示される塩基配列から構成される第１のオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に示される塩基配列から構成される第２のオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット、ならびに任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。本実施形態に係るキットは、ＰＣＲに必要な試薬群をさらに備えていてもよい。
【００８１】
なお、本明細書中で使用される場合、「キット」は複数の物質を別々に併せて包含している形態であることが意図され、例えば、別の容器中に保持されている「転写因子をコードする遺伝子」、「機能性ペプチドをコードする遺伝子」および「植物形質転換用ベクター」とを併せて内包している形態が意図される。本発明に係るキットは、上記発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群をさらに備えていることがより好ましい。
【００８２】
凍結耐性を有している植物体を生産するためのキットにおいて、上述したポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド以外に用いる試薬などは、当該分野において公知の種々の試薬を採用すればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。また、凍結耐性を有している植物体を生産するためのキットを、植物体に凍結耐性を付与するためのキットとして用いることができることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００８３】
さらに、本明細書を読んだ当業者は、凍結耐性を有している植物体を生産するための方法およびキットを用いて生産した植物体、ならびに植物体に凍結耐性を有している植物体を付与するための方法およびキットを用いて得られた植物体もまた、本発明の範囲内に包含されることを、容易に理解する。
【００８４】
（本発明の効果）
本発明に係る生産方法により生産された植物体は、後述する実施例に示すように、低温馴化していない植物体（未馴化植物体）における凍結耐性、低温脱馴化した植物体（脱馴化植物体）における凍結耐性、および乾燥耐性が向上している。
【００８５】
未馴化植物体の凍結耐性の増大は、秋季における寒害および凍害を避ける上で非常に有効であると考えられる。植物の多くは秋季の低温馴化過程を経ることで、寒害や凍害に対しての耐性を増大させ冬季を越せるようになる。しかしながら、秋季に寒波などによって急速に凍結温度に達すると、植物体は低温馴化していないため、結果として初霜などによって生じる凍害の被害は大きくなる。このような凍害は、スギやクリの幼木などでみられる。スギ幼木の基部の凍結耐性と凍害発生時の気温との関係についての１９７６年の堀内の報告では、１１月下旬から１２月初旬において３度凍害が確認されているが、凍害時の温度は、スギ幼木の凍結耐性温度から約１℃程度低いものであった。
【００８６】
これに対し、後述する実施例において、本発明の方法を用いて生産した植物体は、野生型の植物体に比べ、未馴化植物体における半数致死温度が１．６３℃低下していた。したがって、本発明を商業植物に応用した場合、秋季凍害による商業的な損失を回避する上で非常に有効な手段になると考えられる。
【００８７】
また、上述したように、脱馴化植物体の凍結耐性の増大は、春季における寒害や凍害に対して非常に有効であると考えられる。植物の多くは春季に脱馴化過程を経ることで、寒害や凍害に対しての耐性を減少させる。しかしながら、春季に寒波などによって急速に温度が低下すると、植物体はその凍結耐性が減少しているため、結果として晩霜などによって生じる凍害の被害が大きくなる。このような凍害はトドマツの苗木や果樹などでみられる。トドマツ造林地における地形と霜害の関係についての１９５９年の今田・佐々木の報告では、５月中旬−下旬の晩霜害は植栽場所によって大きく異なり、−３℃以下に冷え込まなかった場所では被害がみられなかったが、−５℃以下になった場所では大きな被害を受けたことが確認されている。
【００８８】
これに対し、後述する実施例において、本発明の方法を用いて生産した植物体は、野生型の植物体に比べ、脱馴化植物体における半数致死温度が２．３１℃低下していた。したがって、本発明を商業植物に応用した場合、春季の凍害による商業的な損失を回避する上でも非常に有効な手段になると考えられる。
【００８９】
なお、この効果は、上記転写因子またはそのオーソログの機能を阻害する工程が、上記転写因子またはそのオーソログと、機能性ペプチドとが融合している転写抑制因子を植物体において産生させることによって行われることにより、強化されると考えられる。なぜなら、上記転写抑制因子を用いることにより、上記転写因子と同じサブファミリーに属すし、発現部位および時期が異なる他の転写因子の機能も同時に阻害され、これによって、脱馴化過程における凍結耐性の減少がさらに遅くなる可能性があるからである。
【００９０】
また、日本国内においては、冬季太平洋側では、冷え込みだけでなく異常乾燥が続き、土壌の凍結などによる根からの給水の抑制や、風や日射による蒸散の促進が起こりやすくなる。その結果、越冬植物の含水量は低下しやすくなり、乾燥被害が多発する。例えば、アカエゾマツは冬季に−５０℃まで凍結に対して耐えることが可能である。しかしながら最低気温が−２５℃までしか低下していないにも関わらず、支笏湖に面した高台におけるアカエゾマツは、春になっても萌芽せずに壊死したことが１９６３年に報告されている。この原因については、その後幾つかの研究結果によって、乾燥によるものと結論づけられている。冬季乾燥被害はアカエゾマツだけでなく、スギ、ヒノキ、チャノキなど多くの植物で報告されている。
【００９１】
これに対し、後述する実施例において、本発明の方法を用いて生産した植物体は、凍結耐性が増大しただけでなく、乾燥耐性も増大していることが示された。すなわち、本発明の方法を用いて生産した植物体は、晩秋から早春の低温による作物の被害（寒害）の主要因子である凍結及び乾燥に対して共に耐性が増大していることを示している。ゆえに、本発明を商業植物に応用した場合、春季・秋季の凍害を軽減または回避するだけでなく、冬季に生じやすい乾燥による被害の発生に対しても軽減または回避し、結果として越冬植物の生産性を増大させる有効な手段になると考えられる。
【００９２】
（まとめ）
以上のように、本発明に係る凍結耐性を有している植物体の生産方法は、植物体内において、配列番号２に示されるアミノ酸配列から構成される転写因子またはそのオーソログの機能を阻害する工程を包含することを特徴としている。
【００９３】
植物における師部の分化促進および木部の分化抑制と、凍結耐性とは全く関連しない。また、上記転写因子は、これまで知られている凍結耐性を付与する技術において用いられたような、適合溶質合成に関わるものでも、ストレス応答性の転写因子でもない。したがって、凍結耐性に関与するという上記転写因子の属性は未知であり、かつ当業者が容易に予測し得るものでもなかった。
【００９４】
また、後述する実施例に示すように、本発明にかかる生産方法で生産された植物体では、低温馴化されていないときの凍結耐性が向上しているだけでなく、脱馴化過程を経た後における凍結耐性も向上している。これまで、脱馴化過程を経た後における凍結耐性に関与する遺伝子は全く知られておらず、本発明によって初めて提供される。
【００９５】
また、後述する実施例に示すように、本発明にかかる生産方法で生産された植物体では、凍結耐性とともに、乾燥耐性も向上している。乾燥耐性は、凍結耐性とは全く関連しておらず、凍結耐性とともに乾燥耐性を付与し得ることは、本発明独自の効果である。なお、寒冷地では、寒害および凍害だけでなく、乾燥によっても被害を受ける場合がある。そのため、凍結耐性とともに乾燥耐性を付与し得るという本発明の効果は、寒冷地において植物体を生育させるために非常に有用である。
【００９６】
本発明に係る凍結耐性を有している植物体の生産方法において、上記転写因子またはそのオーソログの機能を阻害する工程は、上記転写因子またはそのオーソログと、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとが融合している転写抑制因子を植物体において産生させることによって行われることが好ましい。
【００９７】
上記機能性ペプチドは、本発明者らによってこれまでに開発されたものであり、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能を有している。このようなペプチドは選抜マーカーとしても用いられ得るので、薬剤を用いることなく所望の植物を選抜することができる。また、上記機能性ペプチドを用いることによって、耐性形質をドミナントに付与することが可能であり、特異的なプロモーターで誘導することも可能である。さらに、ドミナントで作用することから、遺伝子情報の乏しい植物においても適応可能である。
【００９８】
本発明に係る凍結耐性を有している植物体の生産方法において、上記転写因子またはそのオーソログの機能を阻害する工程は、上記植物体内での上記転写因子の発現阻害によってもよく、この場合、上記発現阻害は、ノックアウト法またはＲＮＡｉ法によって行われてもよい。
【００９９】
本発明に係る植物体は、上記生産方法によって生産されたことを特徴としており、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかであることが好ましい。
【０１００】
本発明に係るキットは、凍結耐性を有している植物体を生産するために、配列番号２に示されるアミノ酸配列から構成される転写因子またはそのオーソログをコードする第１のポリヌクレオチド、ならびに任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを備えていることを特徴としており、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとがインフレームで連結されていることが好ましい。また、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列から構成されるポリヌクレオチドであることが好ましい。
【０１０１】
本発明に係るキットは、凍結耐性を有している植物体を生産するために、配列番号３に示される塩基配列から構成される第１のオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に示される塩基配列から構成される第２のオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット、ならびに任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド（第２のポリヌクレオチド）を備えていてもよい。
【０１０２】
本発明に係るキットは、目的のポリペプチドを植物体内にて発現させるための発現ベクターをさらに備えていることが好ましく、上記発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群をさらに備えていることがより好ましい。
【０１０３】
本発明に係る植物体の生産方法は、植物体に凍結耐性を付与する方法でもあり得る。また、本発明に係るキットは、植物体に凍結耐性を付与するためのキットでもあり得る。
【０１０４】
また、上述したように、本発明に係る植物体の生産方法は、乾燥耐性を有している植物体の生産方法でもあり得、植物体に乾燥耐性を付与する方法でもあり得る。また、本発明に係るキットは、乾燥耐性を有している植物体を生産するためのキットでもあり得、植物体に乾燥耐性を付与するためのキットでもあり得る。
【０１０５】
また、本発明に係る植物体の生産方法は、凍結耐性および乾燥耐性を有している植物体の生産方法でもあり得、植物体に凍結耐性および乾燥耐性を付与する方法でもあり得る。また、本発明に係るキットは、凍結耐性および乾燥耐性を有している植物体を生産するためのキットでもあり得、植物体に凍結耐性および乾燥耐性を付与するためのキットでもあり得る。
【０１０６】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１０７】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【０１０８】
＜１．ＤＮＡ構築物の作製＞
転写因子をコードする遺伝子（Ａｔ１ｇ７９４３０）のタンパク質コード領域を増幅するためのプライマーを合成した（配列番号３および４）。９４℃で１分間の変性、４７℃で２分間のアニーリング、および７４℃で１分間の伸張を２５サイクルからなるＰＣＲを行った。このＰＣＲ反応によって増幅したＤＮＡ断片を、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位に挿入した。ｐ３５ＳＳＲＤＸＧは、公知のλファージ由来の組換え部位（以下、ａｔｔ部位と称する）を２つ有し、この２つのａｔｔ部位に挟まれた領域にカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと称する）、シロイヌナズナ由来の転写抑制ペプチドＳＲＤＸ（ＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ：配列番号５）およびノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下、ＮＯＳ−ｔｅｒと称する）を有するベクターである。得られた構築物を用いて大腸菌を形質転換した。形質転換された大腸菌を増殖させた後、上記構築物を大腸菌から調製し、その塩基配列を決定した。転写因子をコードする遺伝子が順方向に挿入されたクローンを単離し、転写因子をコードする遺伝子とＳＲＤＸとのキメラ遺伝子を有するＤＮＡ構築物を得た。【０１０９】
＜２．形質転換用ベクターのアグロバクテリウムへの導入＞
上述したＤＮＡ構築物の２つのａｔｔ部位、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、キメラ遺伝子、およびＮＯＳ−ｔｅｒを含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨ（特許文献７を参照のこと）に挿入した。また、この組換え反応には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＧａｔｅ  ｗａｙ（登録商標）およびＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）を用いた。【０１１０】
得られたＤＮＡ構築物１．５μｌ（約３００ｎｇ）およびｐＢＩＧＣＫＨ４．０μｌ（約６００ｎｇ）の混合物に対して、５倍希釈したＬＲ  ｂｕｆｆｅｒ４．０μｌとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７.０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）５．５μｌを加えた。得られた溶液に、ＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ４．０μｌを加えて、２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｋ  ２.０μｌを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。得られた溶液１〜２μｌを導入した大腸菌（ＤＨ５α等）を、カナマイシンを含む培養液において培養することにより、マーカー遺伝子が導入された大腸菌を選択した。この大腸菌より、上記２つのａｔｔおよびこの２つのａｔｔに挟まれた領域を含む上記ＤＮＡ構築物のＤＮＡ断片がｐＢＩＧＣＫＨに首尾よく挿入された植物形質転換用ベクターを調製した。得られた植物形質転換用ベクターを、エレクトロポレーション法を用いて、土壌細菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｅｍｆａｃｉｅｎｓ  Ｓｔｒａｉｎ  ＧＶ３１０１（Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆｒ）ｐＭＰ９０（Ｇｍｒ）（ｋｏｎｃｚ  ａｎｄＳａｈｅｌｌ  １９８６））株に導入した。【０１１１】
＜３．植物の形質転換およびＴ１種子の回収＞
１リットルの、抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５μｇ／ｍｌおよびリファンピシリン（Ｒｉｆ）５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＰ培地またはＬＢ培地を用いて、上記形質転換用ベクターを導入したアグロバクテリウムを培養した。培養液のＯＤ６００が１になるまで培養した後、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ：特許文献７を参照のこと）に懸濁した。この菌体懸濁液に、１４日間以上生育させたシロイヌナズナを２分間浸漬することにより、上記形質転換用ベクターを導入したアグロバクテリウムに菌体を感染させた。形質転換されたシロイヌナズナを生育し、Ｔ１種子を得た。【０１１２】
＜４．形質転換体の選抜およびＴ２種子の回収＞
上記Ｔ１種子を、２５％ブリーチ、０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を用いて７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（特許文献７を参照のこと）に播種した。播種したＴ１種子を生育させたシロイヌナズナロゼット葉より、Ｎｕｃｌｅｏｎ  Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。具体的には、凍らせた植物組織を、ドライアイスまたは液体窒素とともに粉末状になるまで破砕した（細胞壁の破壊）。破壊した組織をチューブに移した後、Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｉを添加し、これを懸濁した後、Ｒｅａｇｅｎｔ  ＩＩを添加して転倒混和した（細胞の溶解）。チューブを、ウォーターバス中にて６５℃で１０分間振盪し、次いで、氷上にて２０分間静置した。チューブを氷上から取り出し、クロロホルム、ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ樹脂を添加した後、室温で１０分間振盪した。チューブを１，３００×ｇで１０分間遠心分離した後、上清を回収した（ＤＮＡ抽出）。回収した上清に同量の冷イソプロパノールを添加して転倒混和し、４，０００×ｇで５分間遠心分離した後、上精を除去した。沈殿を冷７０％エタノールで洗浄した後、４，０００×ｇで５分間遠心分離した後、上精を除去した。１０分間風乾した沈殿に適量のＴＥ緩衝液または水を添加してＤＮＡ溶液を得た。ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターのＤＮＡ配列に対するプライマー（ＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧ：配列番号６）およびＮＯＳ−ｔｅｒに対するプライマー（ＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＣＡＧＧＡＴＴＣＡＡＴＣ：配列番号７）を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより増幅が得られたゲノムＤＮＡを有する植物を、目的の形質転換植物として選抜した。選抜した上記形質転換植物よりＴ２種子を取得した。この形質転換植物を、以降、ＨＲ０２１１と称する。【０１１３】
＜５．低温馴化していない植物体における凍結耐性の評価＞
スクロースを含まない１／２ＭＳ寒天培地に、ＨＲ０２１１のＴ２種子および野生型（ＷＴ）植物の種子を播種し、２３℃、長日光条件下で２週間生育させた。５０ｍｌプラスチックチューブに、生育させた子葉をチューブ１本当たり６個体入れ、純水で湿らした１ｃｍ×３ｃｍのキムワイプ片をさらに入れた。上記チューブを、予め−２℃に温度調整しておいたアルコールバスにセットした。１５分間冷却した後、アルコールバスに氷晶を加え、−２℃において２時間保持した。この時点で、一部のチューブをサンプリングし、−２℃処理サンプルとした。続いて、残りのチューブをプログラムフリーザに格納し、１時間当たり２℃温度が低下するように段階的に凍結処理温度を低下させた。１℃温度が低下する毎に、３つのチューブ（１８個体分）をサンプリングした。サンプリングしたサンプルは、氷上で一晩かけて解凍し、土に植え替え、２３℃、長日光条件下で生育させた。そして、各サンプルについて再成長が観察される割合を記録した。【０１１４】
図１に、独立した３回の実験の結果をまとめたものを示す。図中、枠内の数字は、ＨＲ０２１１および野生型植物の各サンプルの半数致死温度を示す。図１に示すように、半数致死温度において、ＨＲ０２１１株は、野生型株の−５．２７℃に対して、−６．９０℃まで凍結耐性が増大していた。【０１１５】
＜６．低温脱馴化した植物体における凍結耐性の評価＞
スクロースを含まない１／２ＭＳ寒天培地に、ＨＲ０２１１のＴ２種子および野生型（ＷＴ）植物の種子を播種し、２３℃、長日光条件下で２週間生育させた。その後、２℃、昼１２時間、夜１２時間の条件下で、４日間低温馴化させた。続いて、低温馴化させた子葉を、２３℃、長日光条件下で１日間生育させ、脱低温馴化させた。５０ｍｌプラスチックチューブに、脱低温馴化させた子葉をチューブ１本当たり６個体入れ、純水で湿らした１ｃｍ×３ｃｍのキムワイプ片をさらに入れた。上記チューブを、予め−２℃に温度調整しておいたアルコールバスにセットした。１５分間冷却した後、アルコールバスに氷晶を加え、−２℃において２時間保持した。この時点で、一部のチューブをサンプリングし、−２℃処理サンプルとした。続いて、残りのチューブをプログラムフリーザに格納し、１時間当たり２℃温度が低下するように段階的に凍結処理温度を低下させた。１℃温度が低下する毎に、３つのチューブ（１８個体分）をサンプリングした。サンプリングしたサンプルは、氷上で一晩かけて解凍し、土に植え替え、２３℃、長日光条件下で生育させた。そして、各サンプルについて再成長が観察される割合を記録した。【０１１６】
図２に、独立した３回の実験の結果をまとめたものを示す。図中、枠内の数字は、ＨＲ０２１１および野生型植物の各サンプルの半数致死温度を示す。図２に示すように、半数致死温度において、ＨＲ０２１１株は、野生型株の−７．３７℃に対して、−９．６８℃まで凍結耐性が増大していた。【０１１７】
＜７．乾燥耐性の評価＞
バーミキュライト：パーライトを２：１の比で混合した土を、ポット毎に８０ｍｌずついれ、十分水分を与えた後、ＨＲ０２１１のＴ２種子および野生型（ＷＴ）植物の種子を各ポット当たり３粒ずつ播種した。播種後、２３℃、長日光条件下で給水しながら２週間生育させた。その後、給水を止め、２３℃、長日光条件下でさらに２週間生育させた。その後、給水を再開し、２３℃、長日光条件下でさらに２日間生育させた。このときの各ポットにおける生存率を測定した。１回の実験において、約３０個体を生育させ、計３回の実験を行った（Ｐ：＜０．００１）。【０１１８】
図３の（ａ）は、給水を再開して２日間生育させたときのＨＲ０２１１株および野生型株の様子を示す写真である。ＨＲ０２１１株は、乾燥期間（給水を停止している間）中、見た目の生長が停止したが、図３の（ａ）に示すように、給水再開後、生長が再開した。一方、野生型株は、給水再開後も生長は再開しなかった。図３の（ｂ）に、独立した３回の実験の結果をまとめたものを示す。図３の（ｂ）に示すように、ＨＲ０２１１株では、９０％以上の個体が、給水再開後に再度生育を開始したが、野生型株は、すべて死滅した。【０１１９】
また、ＨＲ０２１１株および野生型株について、乾燥処理前および乾燥処理７日目における葉脈密度を測定した。測定は、古葉（第１葉〜第４葉）と、新葉（第５葉〜）とを区別して行い、それぞれの平均値を算出した。図４の（ａ）は、乾燥処理前の葉脈密度（ｌｅｎｇｔｈ（μｍ／ｃｍ2））の平均値を示し、図４の（ｂ）は、乾燥処理７日目の葉脈密度（ｌｅｎｇｔｈ（μｍ／ｃｍ2））の平均値を示す。図中において、エラーバーは、標準誤差（ＳＥ、ｎ＝２０〜２５）を示し、＊は、ｔ検定（ｐ＜０．０５）において有意差があることを示す。【０１２０】
図４の（ａ）に示すように、ＨＲ０２１１株は、乾燥処理前において古葉および新葉ともに野生型株に比べて高い葉脈密度を有しており、細胞への水分供給が効率的に行われている。一方、図４の（ｂ）に示すように、乾燥処理７日目には、野生型株およびＨＲ０２１１株の葉脈密度は同水準になる。したがって、乾燥処理前における高い葉脈密度が、ＨＲ０２１１株の乾燥耐性の原因の一つであると考えられる。【０１２１】
また、ＨＲ０２１１株および野生型株について、乾燥処理前および乾燥処理５、７および１０日目における光化学系ＩＩの活性を、Ｆｖ／Ｆｍを用いて測定した。図５は、各時点におけるＦｖ／Ｆｍの平均値を示す。図中において、エラーバーは、標準誤差（ＳＥ、ｎ＝３〜５）を示す。【０１２２】
図５に示すように、ＨＲ０２１１株は、乾燥処理後も、野生型株に比べて高い光合成活性を維持している。葉の色についても、乾燥処理後、野生型株は白く変色していくのに対し、ＨＲ０２１１株は変色が殆どないことが観察された。【０１２３】
また、ＨＲ０２１１株および野生型株について、乾燥処理前および乾燥処理７日目における気孔密度を測定した。測定は、古葉（第１葉〜第４葉）と、新葉（第５葉〜）とを区別して行い、それぞれの平均値を算出した。図６の（ａ）は、乾燥処理前の気孔密度（個／ｃｍ2）の平均値を示し、図６の（ｂ）は、乾燥処理７日目の気孔密度（個／ｃｍ2）の平均値を示す。図中において、エラーバーは、標準誤差（ＳＥ、ｎ＝３６〜４０）を示す。【０１２４】
図６の（ａ）および（ｂ）に示すように、ＨＲ０２１１株と野生型株との間で気孔密度に違いはない。【０１２５】
また、ＨＲ０２１１株および野生型株について、植物体からの水分損出率を、空気中に放置した時間を変化させて測定した。図７は、各時点における水分含有率（ｗａｔｅｒ  ｃｏｎｔｅｎｔ（％））の平均値を示す。図中において、エラーバーは、標準誤差（ＳＥ、ｎ＝７）を示す。【０１２６】
図７に示すように、ＨＲ０２１１株と野生型株との間で水分損出率に違いはない。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明を用いれば、凍結耐性を有している作物を作出し得るので、特に寒冷地における食料生産の向上に大いに寄与し得る。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図３】
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【配列表】
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