(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症状態の処置において使用するための、配列番号４のアミノ酸配列から選択された、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む１２〜１６アミノ酸のポリペプチド。
【請求項２】
配列番号９の配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
配列番号９の配列を含む１２〜１６アミノ酸のポリペプチド。
【請求項４】
請求項２または３に記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含むプラスミド。
【請求項６】
請求項４に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
炎症状態が敗血症である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
治療有効量の請求項１〜３および７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチド、または請求項４に記載の核酸、または請求項５に記載のプラスミド、または請求項６に記載の発現ベクターを、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と共に含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ＴＬＴ−１タンパク質から誘導されたポリペプチドフラグメント、および炎症状態の処置のための、より具体的には敗血症の処置のためのその使用に関する。
【０００２】
発明の背景：
感染に対する有害で傷害性の宿主応答から生じる複雑な臨床症候群である敗血症ショックは、集中治療室における死亡の筆頭原因である。敗血症は、全身性感染に対する初期の適切な宿主応答が調節不全となり、そして炎症と凝固との間の密接なクロストークにより過増幅となった場合に発症する。自然免疫応答の増幅因子として作用する候補の中で、いくつかはTriggering Receptors Expressed on Myeloid cells (TREM)ファミリーに属する[Bouchon, A., et al., 2000; Bleharski, J.R. et al., 2003; Haselmayer, P., et al., 2007; Gibot, S. et al., 2007]。ヒトＴＲＥＭ遺伝子クラスターは染色体６ｐ２１．１に位置し、そして６つの異なるタンパク質、すなわちＴＲＥＭ１〜５およびＴＬＴ−１（ＴＲＥＭ様転写物−１）をコードする。ヒトＴＲＥＭ−１（ｈＴＲＥＭ−１）は、１９４アミノ酸（ａａ）残基の細胞外領域、２９ａａの膜貫通領域、および５ａａの短い細胞質側末端からなる。細胞外Ｉｇ様ドメインは、モチーフＤｘＧｘＹｘＣを含み、これはＶ型Ｉｇドメインに対応する。Ｉｇドメインは、３つのＮ−グリコシル化部位を含む６０ａａ部分によって膜貫通領域に接続されている。貫通領域はＬｙｓ残基を含み、これはＩＴＡＭを含むタンパク質ＤＡＰ１２の膜貫通ドメインのＡｓｐ残基と塩橋を形成し、これにより、ＴＲＥＭ−１とそのアダプタータンパク質との間の会合が可能となる[Bouchon, A., et al., 2000; Kelker, M.S., et Al., 2004; Kelker, M.S. et al., 2004]。ＴＲＥＭの関与は、ＺＡＰ７０およびＳＹＫを含むシグナル伝達経路、および後に続くＧＲＢ２などのアダプター分子の動員およびチロシンリン酸化、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣ−γ、ＥＲＫ−１、−２、およびｐ３８ＭＡＰＫの活性化をトリガーする[Haselmayer, P. et al., 2009; Gibot, S, 2005]。最終的に転写因子ＮＦ−κＢの活性化をもたらすこれらの経路の活性化は、ＣＡＲＤ９−ＢＣＬ１０−ＭＡＬＴ１によって調節される[Hara, H. et al., 2007]。特に、結晶解析は、抗体に等価な相補性決定領域（ＣＤＲ）ループ（例えばＴＣＲｓ、ＣＤ８およびＣＴＬＡ−４）を使用することによってＴＲＥＭ−１の認識を予測することができるが、その天然リガンドは依然として決定されていない。
【０００３】
ＴＲＥＭ−１融合タンパク質を使用して、またはＴＲＥＭ−１の細胞外ドメインのＣＤＲ３および「Ｆ」β鎖に対して設計されたペプチドを使用した遮断実験は、減退した炎症を実証し、これにより、内毒血症および多菌性敗血症のマウスモデルにおける生存率が改善した[Bouchon, A., et al., 2001; Gibot, S. et al., 2006]。
【０００４】
ＴＲＥＭ−１シグナル伝達をモデュレーションする防御効果はまた、他の急性炎症モデル（虚血再灌流、膵炎、出血性ショック）または慢性炎症モデル（炎症性腸疾患、炎症性関節炎）においても明らかである。これら全ての研究は、感染性または無菌性炎症を増幅する上でのＴＲＥＭ−１の役割を示唆する。
【０００５】
ＴＲＥＭ−１に加えて、ＴＲＥＭ遺伝子クラスターは、ＴＲＥＭ様転写物１（ＴＬＴ−１）を含む。ＴＬＴ−１は豊富であり、血小板および巨核球上に専ら発現されており、そして血小板α顆粒中に捕捉される。血小板の活性化時に、ＴＬＴ−１は、血小板の表面へと移動する[Washington, A.V. et al., 2004]。ＴＬＴ−１は、ｖセットでＩｇタイプの細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞質側末端（イムノレセプターチロシンベース阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）およびポリプロリンリッチドメインを含む）を含む。他のＴＲＥＭファミリーメンバーとは異なり、ＴＬＴ−１は、ＤＡＰ１２活性化連鎖には共役しないが、ラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞においてＣａ＋＋シグナル伝達を増強することが示され、ＴＬＴ−１は共活性化レセプターであることを示唆する[Barrow, A.D. et al., 2004]。
【０００６】
血小板上におけるＴＬＴ−１の発現の特異性は、それが止血および／または血栓症において独特な役割を果たすであろうことを示唆した。実際に、ＴＬＴ−１のモデュレーションは、血小板の機能をモデュレーションする上でいくつかの可能性を有し得、従って、炎症に関連した凝固亢進（直接的に炎症を予防しないが）または血小板に関連した疾患（例えば出血性または凝固性疾患）を予防することが示唆されている[Washington AV. et al., 2009]。このモデュレーションは、直接的に（ＴＬＴ−１リガンドと干渉することによって）または間接的に（ＴＬＴ−１細胞内経路をモデュレーションすることによって）媒介され得る。
【０００７】
本発明者らは、初めて本明細書において、ＴＬＴ−１およびＴＬＴ−１から誘導されたペプチドが、ＴＲＥＭ−１活性を特異的に阻害することによって抗炎症特性を示すことを報告する。このようなペプチドは、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達を抑制することができ、従って、天然に存在するＴＲＥＭ−１阻害剤として挙動する。本発明者らはさらに、同ペプチドがまた、ＴＲＥＭ−１およびその細胞内経路の阻害の結果として、感染によってトリガーされた炎症誘発カスケードをin vivoにおいてモデュレーションし、従って、ＴＲＥＭ−１に関連した応答性亢進および続いて起こる敗血症中の臓器損傷および死亡を抑制することを実証する。
【０００８】
発明の要約：
本発明は、ＴＬＴ−１およびＴＬＴ−１から誘導されたペプチドがＴＲＥＭ−１を特異的に阻害することができるという発見に基づく。
【０００９】
本発明者らは初めて、ヒトＴＬＴ−１（ｈＴＬＴ−１）およびｈＴＬＴ−１から誘導されたペプチドが、ヒトＴＲＥＭ−１リガンドを特異的に認識して結合することができることを示した。
【００１０】
本発明者らはまた、ｈＴＲＥＭ−１リガンドへの、ｈＴＬＴ−１およびｈＴＬＴ−１から誘導されたペプチドの結合の結果として、ｈＴＬＴ−１およびｈＴＬＴ−１から誘導されたペプチドは、in vitroおよびin vivoにおいてｈＴＲＥＭ−１により誘導されるヒトＴＲＥＭ−１を発現する細胞の活性化を減少させることができ、これは、細胞内シグナル伝達（リン酸化経路）のモデュレーション、ＣＡＲＤ９−ＭＡＬＴ１−ＢＣＬ１０複合体形成、ＮＦ−κＢ活性化（核移行）、ＲＯＳ産生（活性酸素種）並びにサイトカイン／ケモカイン発現（ｍＲＮＡ）および分泌（タンパク質）によって特徴付けられることを示した。
【００１１】
本発明者らはまた、ＴＬＴ−１から誘導されたペプチドが、ＴＲＥＭ−１に関連した疾患、すなわち、ＴＲＥＭ−１活性化が、急性炎症疾患（敗血症、重度の敗血症または敗血症ショック、出血性ショック、虚血再灌流、膵炎）または慢性炎症疾患（炎症性腸疾患、リウマチ疾病、癌）のような、生理病理学的過程に役割を果たしている疾病を処置することができることを示した。
【００１２】
従って、本発明は、炎症状態の処置において使用するための、配列番号１のアミノ酸配列から選択された少なくとも６つ連続したアミノ酸を含むポリペプチドフラグメント、または機能保存的変異体に関する。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、本明細書において定義したような少なくとも１つのポリペプチド、または代替的には、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む、薬学的組成物にある。
【００１４】
発明の詳細な説明：
定義：
明細書全体を通して、いくつかの用語が使用され、そして以下の段落で定義されている。
【００１５】
本明細書において使用する「Triggering receptor expressed on myeloid cells 1」に対する「ＴＲＥＭ−１」という用語は、ヒトおよびマウスの両方の多形核好中球および成熟単球上に同定されている細胞表面分子を示す。それは免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、そしてＤＡＰ１２と呼ばれるアダプタータンパク質の助けを借りて下流のシグナル伝達経路を活性化する。ＴＲＥＭ−１の発現は、細胞培養液および感染に罹患した患者からの組織試料の両方において、Pseudomonas aeruginosaまたはStaphylococcus aureusなどの細菌の存在下で、好中球および単球上で大きくアップレギュレーションされている。著しく対照的には、ＴＲＥＭ−１は、乾癬、潰瘍性大腸炎、または免疫複合体によって引き起こされる血管炎などの非感染性の炎症疾病に罹患した患者からの試料においてはアップレギュレーションされない。さらに、ＴＲＥＭ−１がそのリガンドに結合すると、ＬＰＳの相乗効果およびＴＮＦαなどの炎症誘発性サイトカインの増幅された合成が、ＩＬ−１０の産生抑制と共に観察される。
【００１６】
本明細書において使用する「ＴＲＥＭ様転写物１」に対する「ＴＬＴ−１」という用語は、ＴＲＥＭファミリーのメンバーを示す。Mcvicarグループの初期の研究[Washington A.V. et al., 2004]は、ＴＬＴ−１は豊富であり、血小板および巨核球の系統に特異的であり、そして血小板α顆粒中に捕捉されることを実証した。トロンビンまたはＬＰＳを用いての血小板の活性化時に、ＴＬＴ−１は、血小板の表面へと移動する。ＴＬＴ−１は、ｖセットでＩｇタイプの細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞質側末端（イムノレセプターチロシンベース阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）およびポリプロリンリッチドメインを含む）を含む。他のＴＲＥＭファミリーメンバーとは異なり、ＴＬＴ−１はＤＡＰ１２活性化連鎖には共役しないが、ラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞においてＣａ＋＋シグナル伝達を増強することが示され、ＴＬＴ−１は共活性化レセプターであることを示唆する。ＴＬＴ−１のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列として記載されている。
【００１７】
本発明のポリペプチドを、以下の表１に記載する。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
本明細書において使用する「機能保存的変異体」という用語は、ポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能を変質させることなく、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基を変化させた、本発明のポリペプチドから誘導されたペプチドを示し、それらに限定されないが、アミノ酸の類似の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するアミノ酸を用いた置換を含む。保存されているとして示されているもの以外のアミノ酸はタンパク質中で異なっていてもよく、よって、類似の機能を有するいずれか２つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸配列の類似率は異なり得、そして、例えば、クラスター法などによるアラインメント法に従って決定したところ７０％〜９９％であり得、類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく。「機能保存的変異体」はまた、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定したところ、少なくとも２０％、好ましくは４０％、より好ましくは６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一率を有し、そして比較する天然タンパク質または親タンパク質と同じまたは実質的に類似した特性または機能を有する、ポリペプチドを含む。
【００２０】
本明細書において使用する「誘導体」という用語は、その他の点で改変されている、本発明のポリペプチドまたはその機能保存的変異体の変異形を指し、すなわち、in vitroまたはin vivoにおけるポリペプチドのコンフォメーション、活性、特異性、効力または安定性を改変するために、ポリペプチドへの任意のタイプの分子の共有結合的付着によって、配列のいずれかのアミノ酸への化合物の付加によって改変されている。
【００２１】
本明細書において使用する「処置する」または「処置」という用語は、このような用語を適用する疾患もしくは状態またはこのような疾患もしくは状態の１つ以上の症状の進行を逆行させる、軽減する、阻害する、または前記を予防することを示す。
【００２２】
本発明による「薬学的に」または「薬学的に許容される」という用語は、適宜、哺乳動物、特にヒトに投与した場合に、有害な、アレルギー性の、または他の望ましくない反応を生じない実体または組成物を示す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、任意のタイプの無毒性固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、封入材料または製剤化補助剤を指す。
【００２３】
本発明によると、処置しようとする「患者」または「個体」という用語は、炎症疾患に罹患または罹患する可能性のあるヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えばげっ歯類（マウス、ラット）、ネコ、イヌ、または霊長類）を意味する。好ましくは、被験体はヒトである。
【００２４】
ポリペプチドおよびその使用
本発明の第１の局面は、配列番号１のアミノ酸配列から選択された少なくとも６つ連続したアミノ酸を含むポリペプチドおよび機能保存的変異体に関する。
【００２５】
好ましい態様において、本発明によるポリペプチドは、６〜２０アミノ酸、または１０〜２０アミノ酸、または１２〜１８アミノ酸、または１４〜１６アミノ酸の長さを有する。
【００２６】
別の態様において、本発明によるポリペプチドは、配列番号６、配列番号７または配列番号８からなる群より選択された６つ連続したアミノ酸配列を含む。
【００２７】
別の好ましい態様において、本発明によるポリペプチドは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２８】
別の好ましい態様において、本発明によるポリペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
別の好ましい態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を有する。
【００３０】
別の態様において、本発明によるポリペプチドは、ＤまたはＬ立体配置を有し得る。
【００３１】
別の態様において、本発明によるポリペプチドのアミノ末端のアミノ酸は、アセチル化末端アミノ基を有し、そしてカルボキシ末端のアミノ酸はアミド化末端カルボキシ基を有する。それ故、本発明はまた、アミノ末端がアセチル化されている、またはカルボキシ末端がアミド化されている、本発明のペプチドの誘導体を含む。
【００３２】
さらに、本発明によるポリペプチドは、そのバイオアベイラビリティ（安定性および脂肪溶解性を含む）および血液脳関門および上皮組織を通過するその能力を増加させるために、可逆的な化学的改変を受け得る。このような可逆的な化学的改変の例としては、グルタミン酸およびアスパラギン酸のアミノ酸のカルボキシ基をアルコールを用いてエステル化して、これによりアミノ酸の負の荷電を除去し、そしてその疎水性を増加させることが挙げられる。形成されたエステル結合は、それを加水分解する細胞内エステラーゼによって認識され、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基に荷電を回復するので、このエステル化は可逆的である。内部移行し脱エステル化したポリペプチドは細胞膜を通過できないので、正味の効果は細胞内ポリペプチドの蓄積である。
【００３３】
このような可逆的な化学的改変の別の例としては、膜透過性の増加を可能とする、ＴＡＴペプチドまたはペネトラチンペプチドなどのさらなるペプチド配列の付加が挙げられる（Charge-Dependent Translocation of the Trojan。A Molecular View on the Interaction of the Trojan Peptide Penetratin with the 15 Polar Interface of Lipid Bilayers. Biophysical Journal, Volume 87, Issue 1, 1 July 2004, Pages 332-343を参照）。
【００３４】
本発明によるポリペプチドを、Ｆｍｏｃおよび／またはＢｏｃに基づいた方法に従って、慣用的な固相化学ポリペプチド合成法を通して得ることができる（Pennington, M.W. and Dunn, B.N. (1994). Peptide synthesis protocols. Humana Press, Totowa参照）。
【００３５】
あるいは、本発明によるポリペプチドを、組換えＤＮＡ技術に基づいた慣用的な方法を通して、例えば、簡潔に言うと、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を適切なプラスミドまたはベクターに挿入し、前記プラスミドまたはベクターのためのコンピテント細胞を形質転換し、そして本発明のポリペプチドの発現を可能とする条件下で前記細胞を増殖させ、そして所望であれば、当業者に公知の慣用的な手段を通して本発明のポリペプチドを単離および（場合により）精製することを含む方法を通して得ることができる。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、アミノ酸と、このようなアミノ酸をコードするヌクレオチドコドンとの間に存在する一致から容易に推定され得る。この場合、本発明のさらなる目的は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸配列である。１つの特定の態様において、前記核酸は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡから選択される。本発明のさらなる目的は、本発明のポリペプチドをコードする前記核酸配列を含むプラスミドおよび発現ベクター、並びに、本発明のポリペプチドを発現する原核細胞および真核細胞である。組換えＤＮＡ技術の原理のレビューは、例えば、「Principles of Gene Manipulation: An 5 Introduction to Genetic Engineering」 R.W. Old & S.B. Primrose, published by Blackwell Scientific Publications, 4th Edition (1989)と題されたテキストブックに見出され得る。
【００３６】
記載したように、本発明はまた、本発明のポリペプチドに対して機能的に等価であるポリペプチドまたは「機能保存的変異体」を含む。本明細書で使用される意味において、「機能的に等価」という表現は、問題のペプチドが、例えば、炎症を減少させる能力などの、本発明のペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを有することを意味する。
【００３７】
本発明のポリペプチドの炎症を減少させる能力は、簡単な試験を実施してポリペプチドに因る炎症の減少を評価することによって当業者に明らかとなろう。例えば、５×１０５個の単離ヒト好中球を、１００ng/mLのＬＰＳおよび１０μg/mLの抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂの存在下、２０μg/mLのポリペプチドの存在下または非存在下において３７℃／５％ＣＯ２で２４時間かけてインキュベーションする。その後、上清を回収し、そしてＴＮＦ−αおよびＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡによって測定する。試験したペプチドがＴＲＥＭ−１を阻害すれば、サイトカイン濃度は、ペプチドを含まないＬＰＳ＋ｍＡｂと比較した場合、３０％以上まで減少するはずである。
【００３８】
核酸、ベクターおよび組換え宿主細胞
本発明の第２の局面は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００３９】
好ましい態様において、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９の配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子。
【００４０】
「コード配列」またはＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質もしくは酵素などの発現産物を「コードする」配列は、発現すると、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列であり、すなわち、ヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質または酵素に対するアミノ酸配列をコードする。タンパク質に対するコード配列は開始コドン（通常ＡＴＧ）および終止コドンを含み得る。
【００４１】
これらの核酸分子を、当業者に周知の慣用的な方法によって、特に天然タンパク質をコードする遺伝子の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。典型的には、前記核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターなどの適切なベクターに含まれ得る、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
【００４２】
よって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸分子が転写（特にプロモーター、エンハンサー、および場合によりターミネーター）および場合により翻訳を制御するための適切なエレメントと会合している、ベクターおよび発現カセット、並びにまた、本発明による核酸分子が挿入されている組換えベクターに関する。これらの組換えベクターは、例えばクローニングベクター、または発現ベクターであり得る。
【００４３】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、ビヒクルを意味し、これにより、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）が宿主細胞に導入され得、よって宿主を形質転換し、そして導入された配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進し得る。
【００４４】
本発明のポリペプチドまたはキメラ誘導体をコードする遺伝子を挿入および発現できる限りにおいて、動物細胞のための任意の発現ベクターを使用し得る。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＧＥ１０３、ｐＨＳＧ２７４、ｐＫＣＲ、ｐＳＧ１βｄ２−４などが挙げられる。
【００４５】
プラスミドの他の例としては、複製起点を含む複製プラスミド、または組込みプラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどが挙げられる。
【００４６】
ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、パッケージング細胞をトランスフェクションすることによって、またはヘルパープラスミドもしくは３０ウイルスを用いての一過性トランスフェクションによってなどの、当技術分野において公知の技術によって産生され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠陥組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコールは、例えば、WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861,719、US 5,278,056およびWO 94/19478に見出され得る。
【００４７】
動物細胞のための発現ベクターに使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Mizukami T. et al. 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Kuwana Y et al. 1987）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Mason JO et al. 1985）およびエンハンサー（Gillies SD et al. 1983）などが挙げられる。
【００４８】
本発明は、本発明の核酸分子を含む遺伝子送達システムも含み、これはin vivoまたはex vivoにおいて遺伝子療法に使用され得る。これは、例えば、遺伝子療法に慣用的に使用される、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスから誘導されたものなどのウイルス導入ベクターを含む。これはまた、本発明の核酸分子および非ウイルス性の遺伝子送達ビヒクルを含む、遺伝子送達システムを含む。非ウイルス性の遺伝子送達ビヒクルの例としては、リポソームおよびポリマー、例えばポリエチレンイミン、シクロデキストリン、ヒスチジン／リジン（ＨＫ）ポリマーなどを含む。
【００４９】
本発明の別の目的はまた、本発明による少なくとも１つの核酸分子を用いて遺伝子的に形質転換された原核または真核宿主細胞である。
【００５０】
「形質転換」という用語は、宿主細胞への「外来」（すなわち外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の導入を意味し、よって宿主細胞は、導入された遺伝子または配列を発現して、所望の物質、典型的には導入された遺伝子または配列によってコードされるタンパク質または酵素を産生する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け取りそして発現する宿主細胞は「形質転換」されている。
【００５１】
好ましくは、ポリペプチド、特に本発明によるポリペプチドを発現および産生するために、真核細胞、特に哺乳動物細胞、より具体的にはヒト細胞が選択される。
【００５２】
典型的には、誘導体の正しい翻訳後修飾へプロセスするその能力のために、ＣＨＯ、ＢＨＫ−２１、ＣＯＳ−７、Ｃ１２７、ＰＥＲ．Ｃ６またはＨＥＫ２９３  ２５などの細胞株を使用し得る。
【００５３】
本発明による発現ベクターの構築、宿主細胞の形質転換を、慣用的な分子生物学技術を使用して実施することができる。本発明のＶ−ＡＴＰアーゼｃサブユニット誘導体を、例えば、本発明に従って遺伝子的に形質転換された細胞を培養し、そして前記細胞によって発現される誘導体を培養液から回収することによって得ることができる。それらを、その後、必要であれば、当業者にそれ自体公知である慣用的な手順によって、例えば、分画沈降、特に硫酸アンモニウム沈降、電気泳動、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィーなどによって精製し得る。
【００５４】
特に、組換えタンパク質を調製および精製するための慣用的な方法を、本発明によるタンパク質の産生のために使用し得る。
【００５５】
治療法、使用および薬学的組成物
本発明の第３の目的は、炎症状態の処置において使用するための本発明によるポリペプチドに関する。
【００５６】
アレルギー、喘息、筋障害、癌、炎症性関節炎、炎症性腸疾患、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、トリインフルエンザ、天然痘、および全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、虚血および再灌流症候群、出血性ショックを含むがそれらに限定されない、本発明による炎症状態。
【００５７】
敗血症、重症敗血症、敗血症ショック、出血性ショック、虚血再灌流または膵炎を含むがそれらに限定されない、本発明による炎症状態。
【００５８】
好ましい態様において、炎症状態は敗血症である。
【００５９】
本発明によるポリペプチドは、デコイレセプターのその特性を通して炎症状態を処置することができる。
【００６０】
「デコイレセプター」によって、本発明によるポリペプチドが、ＴＲＥＭ−１リガンドを捕捉し、そしてＴＲＥＭ−１に対するその生理学的効果を防ぐことを意味する。
【００６１】
それ故、本発明によるポリペプチドは、敗血症をより効果的に止めるという目的で、複合した治療法（いくつかの治療標的を目的とした）の一部を形成し得る。
【００６２】
本発明のさらなる目的は、治療有効量の少なくとも１つの本発明によるポリペプチドを、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と共に含む、薬学的組成物である。１つの特定の態様において、前記薬学的組成物はまた１つ以上の（ＣＯＯＨ）ペプチドを含む。あるいは、本発明の薬学的組成物は、本発明のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む治療有効量のベクターを、少なくとも１つの補助剤および／または薬学的に許容される賦形剤と共に含み得る。前記ベクターは遺伝子療法に使用され得る。
【００６３】
「治療有効量」によって、任意の医学的処置に適用できる妥当なベネフィット／リスク比で炎症状態を処置するに十分な量の本発明のキメラ誘導体を意味する。
【００６４】
本発明の化合物および組成物の全１日量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決定されると理解される。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効量レベルは、処置される疾患および疾患の重度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事；使用される具体的な化合物の投与時刻、投与経路、および排泄速度；処置の期間；使用される具体的なポリペプチドと組み合わせてまたは同時に使用される薬物；並びに医学分野において周知の同様な因子を含む、多種多様な因子に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要な用量よりも低いレベルで化合物の用量を開始し、そして所望の効果が達成されるまで次第に用量を増加させることは当技術分野の技能の十分に範囲内である。しかしながら、産物の１日量は、１成人あたり１日あたり０．０１〜１，０００mgまでの幅広い範囲にかけて変動し得る。好ましくは、前記組成物は、処置しようとする患者への症状による用量の調節のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００mgの活性成分を含む。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの活性成分、好ましくは１mg〜約１００mgの活性成分を含む。薬物の有効量は、通常、０．０００２mg/kg（体重）/日〜約２０mg/kg（体重）/日、特に約０．００１mg/kg（体重）/日〜７mg/kg（体重）/日までの用量レベルで供給される。
【００６５】
本発明の活性産物（ポリペプチドまたはベクター）は、例えば発赤、発熱、腫脹、疼痛、および機能低下によって顕現する、炎症状態の処置のために使用され得る。
【００６６】
投与すべき本発明の活性産物［ペプチドまたはベクター（構築物）］の治療有効量、並びに、本発明のペプチドおよび／または薬学的組成物を用いての病的状態の処置のための用量は、患者の年齢および状態、障害または疾患の重度、投与法および投与頻度、並びに使用しようとする特定のペプチドを含む、数多くの因子に依存する。
【００６７】
本発明のペプチドまたはベクター（構築物）を含む薬学的組成物の提示は、投与に適した任意の形状、例えば固体、液体、または半固体、例えばクリーム、軟膏、ゲル、または液剤であり得、そしてこれらの組成物は、任意の適切な手段によって、例えば経口、非経口、吸入、外用で投与され得、よって所望の投与形を作り上げるために必要な薬学的に許容される賦形剤を含む。医薬を投与するための種々の剤形およびそれを得るために必要とされる賦形剤のレビューを、例えば、「Tratado de Farmacia Gal nica」 (Treatise on Galenic Pharmacy), C. Faul i Trillo, 1993, Luz n 5, S.A. Ediciones, Madrid.に見出し得る。
【００６８】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、肺内または直腸投与のための本発明の薬学的組成物において、活性成分を単独でまたは別の活性成分と組み合わせて、単位投与形で、従来の薬学的支持体との混合物として動物およびヒトに投与することができる。適切な単位投与形は、経口経路形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、および経口懸濁剤または液剤、舌下および頬側投与形、エアゾール、インプラント、皮下、経皮、外用、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、くも膜下腔内、および鼻腔内投与形および直腸投与形を含む。
【００６９】
好ましくは、薬学的組成物は、注射することのできる製剤のための薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは特に等張性で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなど、またはこのような塩の混合物）、または、場合に応じて滅菌水または生理学的食塩水の添加時に、注射溶液の構築を可能とする乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であり得る。
【００７０】
注射使用に適した剤形は、無菌水性液剤または分散剤；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および、無菌注射液剤または分散剤の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、そして容易にシリンジが扱える程度まで流動性でなければならない。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して防御されていなければならない。
【００７１】
本発明の化合物を遊離塩基または薬理学的に許容される塩として含む液剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散剤もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物中および油中で調製され得る。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【００７２】
本発明によるポリペプチドは、中性または塩形の組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成）を含み、そしてこれは、例えば塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのこのような有機酸と共に形成される。遊離カルボキシル基と共に形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのこのような有機塩基から誘導され得る。
【００７３】
担体もまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張化剤、例えば糖および塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の延長された吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することによってもたらされ得る。
【００７４】
無菌注射液剤は、必要量の活性ポリペプチドを、必要であれば前記に列挙した他の成分のいくつかと共に適切な溶媒中に取り込み、その後、滅菌濾過することによって調製される。一般的に、分散剤は、基本分散媒体および前記に列挙したものからの必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクルに、種々の滅菌した活性成分を取り込むことによって調製される。無菌注射液剤の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は、活性成分と、以前に滅菌濾過したその溶液からの任意の追加的な所望の成分との粉末を生じる、真空乾燥または凍結乾燥技術である。
【００７５】
製剤化時に、液剤は、投与製剤に適合した様式で、治療的に有効な量で投与される。製剤は、前記した注射液のタイプなどの、多種多様な投与形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。
【００７６】
水性液剤での非経口投与のために、例えば、液剤は必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤をまず十分な食塩水またはグルコースを用いて等張化すべきである。これらの特定の水性液剤は、特に、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与のために適している。これに関連して、使用することのできる無菌水性媒体は、本開示を鑑みて当業者には公知である。例えば、１用量を１mlの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し得、そして１０００mlの皮下点滴療法用液体に加えるか、または提案された注入部位に注射し得る。用量のいくらかの変更は、処置する被験体の状態に応じて必然的になされる。投与責任者は、いずれにしても、個々の被験体のための適切な用量を決定する。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、治療混合物として１用量あたり約０．０００１〜１．０mg、または約０．００１〜０．１mg、または約０．１〜１．０mg、またはさらには約１０mgなどを含むように製剤化され得る。また、複数回の用量を投与してもよい。
【００７８】
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与用に製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容される剤形としては、例えば、経口投与用の錠剤または他の固体：リポソーム製剤；時間放出カプセル；および現在使用されている任意の他の剤形が挙げられる。
【００７９】
以前に記載したように、本発明によるペプチドは、より効果的に炎症を停止させる目的のための組合せ療法の一部を形成し得る。この場合、本発明は、本発明の少なくとも１つのペプチドを、別のまたは他の炎症抑制性化合物（群）、例えば非ステロイド抗炎症化合物と共に含む、薬学的組成物を提供する。
【００８０】
本発明のさらなる目的は、アレルギー、喘息、筋障害、癌、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症、トリインフルエンザ、天然痘、および全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を含むがそれらに限定されない炎症状態の処置のための、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドをコードする少なくとも１つの配列を含むベクターに関する。
【００８１】
さらに、本発明は、哺乳動物における炎症状態の処置法を提供し、これは、前記の病理学的疾病に罹患した前記の哺乳動物に、治療有効量の本発明の少なくとも１つのポリペプチド、または本発明のポリペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含むベクターを、好ましくはそれを含む薬学的組成物の形態で投与することからなる。本発明の１つの特定の態様において、前記薬学的組成物は、本発明のペプチドまたはペプチド群に加えて、１つ以上の（ＣＯＯＨ）ペプチドを含む。
【００８２】
スクリーニング法：
本発明の別の目的は、ＴＲＥＭ−１タンパク質を無効にする化合物をスクリーニングするための方法に関する。
【００８３】
特に、本発明は、炎症状態の処置のためのＴＲＥＭ−１タンパク質の阻害剤をスクリーニングするための方法を提供する。
【００８４】
例えば、スクリーニング法は、候補化合物と直接的にまたは間接的に会合した標識を用いて、ＴＲＥＭ−１タンパク質への、またはＴＲＥＭ−１タンパク質またはその融合タンパク質を有する細胞もしくは膜への、候補化合物の結合を測定し得る。あるいは、スクリーニング法は、標識された競合物質（例えばアンタゴニスト）との、レセプターへの候補化合物の結合の競合を、測定、または定性的にもしくは定量的に検出することを含み得る。
【００８５】
特定の態様において、本発明のスクリーニング法は、
ａ）ＴＲＥＭ−１リガンドタンパク質を発現する多数の細胞およびＴＲＥＭ−１タンパク質を発現する細胞を提供すること；
ｂ）前記細胞を候補化合物と共にインキュベーションすること；
ｃ）前記候補化合物が、ＴＲＥＭ−１リガンドタンパク質に結合するかどうかを決定すること；そして
ｄ）ＴＲＥＭ−１／ＴＲＥＭ−１リガンド相互作用を阻害する候補化合物を選択する
ことからなる、工程を含む。
【００８６】
好中球は、ＬＰＳ、抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂまたは血小板（ＴＲＥＭ−１リガンドを恒常的に発現する）の存在下で活性酸素種を産生し、これらの異なる誘導物質の相乗作用は、好中球の膜に結合したＴＲＥＭ−１によって媒介される。本発明者らは、好中球を、ＴＲＥＭ−１／ＴＲＥＭ−１リガンド相互作用を阻害するいくつかのペプチドの存在下でインキュベーションした場合に、ＲＯＳ産生の減少を期待する。
【００８７】
ＲＯＳ産生は、蛍光発生基質（ＤＣＦＤＡ：５−（および−６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（カルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ）＊異性体混合物＊）を使用することによって容易に定量され得る。例えば、２．５×１０５個の単離されたヒト好中球を、２時間、３７℃／５％ＣＯ２で、５μMのＤＣＦＤＡと共に、２０μg/mLの抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂの存在下、１００ng/mLのＬＰＳの存在下または非存在下においてインキュベーションする。従って、ＴＲＥＭ−１活性化によるＲＯＳの産生およびポリペプチドによるそのモデュレーションは、フローサイトメトリーによって定量される：もし試験したペプチドがＴＲＥＭ−１を阻害するならば、平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＴＲＥＭ−１ｍＡｂを含まない条件と比較して減少していなければならない。
【００８８】
この迅速なアッセイにより本発明者らは最善のＴＲＥＭ−１阻害性ペプチドを決定することができ、これによりそれらをＮＦ−κＢ活性化、サイトカイン産生、タンパク質リン酸化などの他の実験においてさらに研究することができる。
【００８９】
一般に、このようなスクリーニング法は、その表面上にＴＲＥＭ−１タンパク質、そのオルソログおよびその誘導体を発現する適切な細胞を準備することを含む。特に、ＴＲＥＭ−１タンパク質をコードする核酸を使用して、細胞をトランスフェクションし、これにより、ＴＲＥＭ−１タンパク質を発現させ得る。このようなトランスフェクションは、当技術分野において周知の方法によって達成され得る。
【００９０】
特定の態様において、細胞は、単球／マクロファージおよび好中球を含むがそれらに限定されない、サイトカインおよび炎症メディエーターの遊離に関与する免疫細胞からなる群より選択される。
【００９１】
本発明のスクリーニング法は、このような細胞を、スクリーニングしようとする化合物と接触させ、そしてこのような化合物がＴＲＥＭ−１タンパク質を無効にするか否かを決定することによって、阻害剤を決定するために使用され得る。
【００９２】
本発明の１つの態様によると、候補化合物は、以前に合成された化合物のライブラリーから、または構造がデータベースで決定されている化合物のライブラリーから、または新規に合成された化合物または天然化合物のライブラリーから選択され得る。
【００９３】
候補化合物は、（ａ）タンパク質またはペプチド、（ｂ）核酸、および（ｃ）有機化合物（天然または非天然）の群から選択され得る。説明すると、予め選択された候補核酸のライブラリーを、ＵＳ５，４７５，０９６およびＵＳ５，２７０，１６３の文書に記載のようにＳＥＬＥＸ法を実施することによって得ることができる。さらに説明すると、候補化合物は、ＰＰ１／ＧＡＤＤ３４複合体に対して向けられる抗体の群から選択され得る。
【００９４】
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例および図面はいずれにしても本発明の範囲を制限するものとは解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１Ａ】ＬＲ１７はＴＲＥＭ−１リガンドに特異的に結合する。これらの実験のために、本発明者らはコントロール無作為化配列ペプチドとしてＬＲ１７スクランブルを使用した。（Ａ）マウス抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂ（ＴＲＥＭ−１アゴニスト）によって明らかとなったｒｈＴＬＴ−１、ｒｈＴＲＥＭ−１、ＬＲ１７およびＬＲ１７スクランブルのイムノブロット。
【図１Ｂ】ＬＲ１７はＴＲＥＭ−１リガンドに特異的に結合する。これらの実験のために、本発明者らはコントロール無作為化配列ペプチドとしてＬＲ１７スクランブルを使用した。（Ｂ）休止またはトロンビン活性化（５ＵＩ/mL）されたヒト血小板上に発現されたＴＲＥＭ−１リガンドに結合しているＦＩＴＣ標識ＬＲ１７（１または５μg/mL）のフローサイトメトリー分析は、標識されていないＬＲ１７、ｓＴＬＴ−１またはＬＰ１７（ＴＲＥＭ−１から誘導されたペプチド）と共に同時インキュベーションすることによって逆行する。
【図１Ｃ】ＬＲ１７はＴＲＥＭ−１リガンドに特異的に結合する。これらの実験のために、本発明者らはコントロール無作為化配列ペプチドとしてＬＲ１７スクランブルを使用した。（Ｃ〜Ｄ）ＬＲ１７の非存在下（Ｃ）または存在下（Ｄ）におけるｒｓＴＲＥＭ−１でコーティングされたセンサーチップへのＬＰＳで刺激された好中球上清の表面プラズモン共鳴アッセイ。
【図１Ｄ】ＬＲ１７はＴＲＥＭ−１リガンドに特異的に結合する。これらの実験のために、本発明者らはコントロール無作為化配列ペプチドとしてＬＲ１７スクランブルを使用した。（Ｃ〜Ｄ）ＬＲ１７の非存在下（Ｃ）または存在下（Ｄ）におけるｒｓＴＲＥＭ−１でコーティングされたセンサーチップへのＬＰＳで刺激された好中球上清の表面プラズモン共鳴アッセイ。
【図２Ａ】ＬＲ１７は、そのリガンドを捕捉することによってＴＲＥＭ−１活性化を特異的に阻害し、デコイレセプターのように作用する。これらの実験のために、単離されたヒト好中球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［αＴＲＥＭ−１＋ＬＲ１７］対［αＴＲＥＭ−１］である。（Ａ）ＴＲＥＭ−１リン酸化経路の活性化：ホスホ（ｐ）−ｐ３８および（ｐ）−ＥＲＫ１/２に対する抗体を用いて分析された、１、３、１０、３０および６０分間かけて刺激した好中球の溶解液のウェスタンブロット。
【図２Ｂ】ＬＲ１７は、そのリガンドを捕捉することによってＴＲＥＭ−１活性化を特異的に阻害し、デコイレセプターのように作用する。これらの実験のために、単離されたヒト好中球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［αＴＲＥＭ−１＋ＬＲ１７］対［αＴＲＥＭ−１］である。（Ｂ）ＣＡＲＤ９−ＭＡＬＴ１−ＢＣＬ１０複合体形成：２０分間かけて刺激した好中球の溶解液の抗ＢＣＬ１０ｍＡｂを用いての免疫沈降後のＭＡＬＴ−１のイムノブロット。
【図２Ｃ】ＬＲ１７は、そのリガンドを捕捉することによってＴＲＥＭ−１活性化を特異的に阻害し、デコイレセプターのように作用する。これらの実験のために、単離されたヒト好中球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［αＴＲＥＭ−１＋ＬＲ１７］対［αＴＲＥＭ−１］である。（Ｃ）ＮＦ−κＢの核移行：２時間かけて処理した好中球の核ｐ５０およびｐ６５ＮＦ−κＢサブユニットのＥＬＩＳＡ。
【図２Ｄ】ＬＲ１７は、そのリガンドを捕捉することによってＴＲＥＭ−１活性化を特異的に阻害し、デコイレセプターのように作用する。これらの実験のために、単離されたヒト好中球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［αＴＲＥＭ−１＋ＬＲ１７］対［αＴＲＥＭ−１］である。（Ｄ）ＲＯＳ産生：２時間刺激した後の好中球のＲＯＳ産生のフローサイトメトリー定量（ＤＣＦＤＡ減少）。
【図２Ｅ】ＬＲ１７は、そのリガンドを捕捉することによってＴＲＥＭ−１活性化を特異的に阻害し、デコイレセプターのように作用する。これらの実験のために、単離されたヒト好中球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［αＴＲＥＭ−１＋ＬＲ１７］対［αＴＲＥＭ−１］である。（Ｅ）サイトカイン発現：６時間かけて刺激した好中球におけるＴＮＦ−αｍＲＮＡレベル。
【図２Ｆ】ＬＲ１７は、そのリガンドを捕捉することによってＴＲＥＭ−１活性化を特異的に阻害し、デコイレセプターのように作用する。これらの実験のために、単離されたヒト好中球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［αＴＲＥＭ−１＋ＬＲ１７］対［αＴＲＥＭ−１］である。（Ｆ）サイトカイン産生：２、６および２４時間かけて処理した好中球におけるＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡ。
【図３Ａ】ＬＲ１７は、ＬＰＳにより誘導されたまたはＬＰＳおよびαＴＲＥＭ−１により誘導された細胞活性化を減少させることによって抗炎症特性を示す。これらの実験のために、単離されたヒト好中球または単球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＬＰＳ（０．１μg/mL）およびＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［ＬＰＳ／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ］または［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１］である。（Ａ）ホスホ（ｐ）−ｐ３８および（ｐ）−ＥＲＫ１/２に対する抗体を用いて分析された、１、３、１０、３０および６０分間かけて刺激した好中球の溶解液のウェスタンブロット。
【図３Ｂ】ＬＲ１７は、ＬＰＳにより誘導されたまたはＬＰＳおよびαＴＲＥＭ−１により誘導された細胞活性化を減少させることによって抗炎症特性を示す。これらの実験のために、単離されたヒト好中球または単球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＬＰＳ（０．１μg/mL）およびＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［ＬＰＳ／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ］または［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１］である。（Ｂ）ＣＡＲＤ９−ＭＡＬＴ１−ＢＣＬ１０複合体形成：２０分間かけて刺激した好中球の溶解液の抗ＢＣＬ１０ｍＡｂを用いての免疫沈降後のＭＡＬＴ−１のイムノブロット。
【図３Ｃ】ＬＲ１７は、ＬＰＳにより誘導されたまたはＬＰＳおよびαＴＲＥＭ−１により誘導された細胞活性化を減少させることによって抗炎症特性を示す。これらの実験のために、単離されたヒト好中球または単球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＬＰＳ（０．１μg/mL）およびＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［ＬＰＳ／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ］または［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１］である。（Ｃ）ＮＦ−κＢの核移行：２時間かけて処理した好中球の核ｐ５０およびｐ６５ＮＦ−κＢサブユニットのＥＬＩＳＡ。
【図３Ｄ】ＬＲ１７は、ＬＰＳにより誘導されたまたはＬＰＳおよびαＴＲＥＭ−１により誘導された細胞活性化を減少させることによって抗炎症特性を示す。これらの実験のために、単離されたヒト好中球または単球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＬＰＳ（０．１μg/mL）およびＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［ＬＰＳ／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ］または［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１］である。（Ｄ）ＲＯＳ産生：２時間刺激した後の好中球のＲＯＳ産生のフローサイトメトリー定量（ＤＣＦＤＡ減少）。
【図３Ｅ】ＬＲ１７は、ＬＰＳにより誘導されたまたはＬＰＳおよびαＴＲＥＭ−１により誘導された細胞活性化を減少させることによって抗炎症特性を示す。これらの実験のために、単離されたヒト好中球または単球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＬＰＳ（０．１μg/mL）およびＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［ＬＰＳ／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ］または［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１］である。（Ｅ）E.coliによって誘導された好中球ファゴサイトーシスおよび酸化バーストの定量的決定をフローサイトメトリーによって実施した。ｓＴＬＴ−１／ＬＲ１７はＰＭＡまたはｆＭＬＰにより誘導される酸化バーストに対して全く作用を示さなかった（示さず）。データ（平均±ＳＤ）は６回の異なる実験の代表である。
【図３Ｆ】ＬＲ１７は、ＬＰＳにより誘導されたまたはＬＰＳおよびαＴＲＥＭ−１により誘導された細胞活性化を減少させることによって抗炎症特性を示す。これらの実験のために、単離されたヒト好中球または単球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＬＰＳ（０．１μg/mL）およびＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［ＬＰＳ／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ］または［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１］である。（Ｆ）サイトカイン発現：６時間かけて刺激した好中球におけるＴＮＦ−αｍＲＮＡレベル。
【図３Ｇ】ＬＲ１７は、ＬＰＳにより誘導されたまたはＬＰＳおよびαＴＲＥＭ−１により誘導された細胞活性化を減少させることによって抗炎症特性を示す。これらの実験のために、単離されたヒト好中球または単球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＬＰＳ（０．１μg/mL）およびＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［ＬＰＳ／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ］または［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１］である。（Ｇ〜Ｈ）サイトカイン産生：２、６および２４時間かけて処理した好中球におけるＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡ。
【図３Ｈ】ＬＲ１７は、ＬＰＳにより誘導されたまたはＬＰＳおよびαＴＲＥＭ−１により誘導された細胞活性化を減少させることによって抗炎症特性を示す。これらの実験のために、単離されたヒト好中球または単球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＬＰＳ（０．１μg/mL）およびＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［ＬＰＳ／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ］または［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１］である。（Ｇ〜Ｈ）サイトカイン産生：２、６および２４時間かけて処理した好中球におけるＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡ。
【図３Ｉ】ＬＲ１７は、ＬＰＳにより誘導されたまたはＬＰＳおよびαＴＲＥＭ−１により誘導された細胞活性化を減少させることによって抗炎症特性を示す。これらの実験のために、単離されたヒト好中球または単球を、指定された時間においてＬＲ１７（３０μg/mL）またはコントロールＬＲ１７スクランブルペプチド（３０μg/mL）の存在下または非存在下においてＬＰＳ（０．１μg/mL）およびＴＲＥＭ−１アゴニスト（αＴＲＥＭ−１、５μg/mL）を用いて刺激した。データは少なくとも５回の異なる実験の代表である。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は＊＊＊ｐ＜０．００１＊＊ｐ＜０．０１＊ｐ＜０．０５［ＬＰＳ／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ］または［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１／ＬＲ１７］対［ＬＰＳ＋αＴＲＥＭ−１］である。（Ｉ）天然またはＴｒｅｍ−１サイレンスヒト単球によって産生されたＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡ。
【図４Ａ】ＬＲ１７に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、内毒血症マウスを死亡および全身応答から防御する。雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）を無作為にグループ分けし（１群あたり１５匹）、そしてＬＰＳのＬＤ５０を用いて処置した。ＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μgまたは２５０μg）、スクランブルＬＲ−１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、または０．２mLのＮａＣｌ０．９％をＬＰＳの６０分前または６０分後に投与した。１群あたり４〜６匹の動物を、ＬＰＳ注射から２および４時間後にペントタール過剰投与により屠殺し、そして血液を心穿刺を通してサンプリングした。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は、コントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。（Ａ）ＬＲ１７処置は、生存曲線（ログランク検定、Ｐ＝０．００３２）によって示されるように生存利点を付与し、ＬＲ１７の用量または注射時間の間にはまったく差異はない。
【図４Ｂ】ＬＲ１７に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、内毒血症マウスを死亡および全身応答から防御する。雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）を無作為にグループ分けし（１群あたり１５匹）、そしてＬＰＳのＬＤ５０を用いて処置した。ＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μgまたは２５０μg）、スクランブルＬＲ−１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、または０．２mLのＮａＣｌ０．９％をＬＰＳの６０分前または６０分後に投与した。１群あたり４〜６匹の動物を、ＬＰＳ注射から２および４時間後にペントタール過剰投与により屠殺し、そして血液を心穿刺を通してサンプリングした。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は、コントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。（Ｂ〜Ｅ）血漿中ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびｓＴＲＥＭ−１のＥＬＩＳＡ。
【図４Ｃ】ＬＲ１７に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、内毒血症マウスを死亡および全身応答から防御する。雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）を無作為にグループ分けし（１群あたり１５匹）、そしてＬＰＳのＬＤ５０を用いて処置した。ＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μgまたは２５０μg）、スクランブルＬＲ−１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、または０．２mLのＮａＣｌ０．９％をＬＰＳの６０分前または６０分後に投与した。１群あたり４〜６匹の動物を、ＬＰＳ注射から２および４時間後にペントタール過剰投与により屠殺し、そして血液を心穿刺を通してサンプリングした。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は、コントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。（Ｂ〜Ｅ）血漿中ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびｓＴＲＥＭ−１のＥＬＩＳＡ。
【図４Ｄ】ＬＲ１７に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、内毒血症マウスを死亡および全身応答から防御する。雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）を無作為にグループ分けし（１群あたり１５匹）、そしてＬＰＳのＬＤ５０を用いて処置した。ＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μgまたは２５０μg）、スクランブルＬＲ−１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、または０．２mLのＮａＣｌ０．９％をＬＰＳの６０分前または６０分後に投与した。１群あたり４〜６匹の動物を、ＬＰＳ注射から２および４時間後にペントタール過剰投与により屠殺し、そして血液を心穿刺を通してサンプリングした。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は、コントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。（Ｂ〜Ｅ）血漿中ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびｓＴＲＥＭ−１のＥＬＩＳＡ。
【図４Ｅ】ＬＲ１７に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、内毒血症マウスを死亡および全身応答から防御する。雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）を無作為にグループ分けし（１群あたり１５匹）、そしてＬＰＳのＬＤ５０を用いて処置した。ＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μgまたは２５０μg）、スクランブルＬＲ−１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、または０．２mLのＮａＣｌ０．９％をＬＰＳの６０分前または６０分後に投与した。１群あたり４〜６匹の動物を、ＬＰＳ注射から２および４時間後にペントタール過剰投与により屠殺し、そして血液を心穿刺を通してサンプリングした。結果は平均±ＳＤである。ｐ値は、コントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。（Ｂ〜Ｅ）血漿中ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびｓＴＲＥＭ−１のＥＬＩＳＡ。
【図５Ａ】ＬＲ１７に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、多菌性敗血症からマウスを防御する。成体雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）をイソフラン麻酔下で盲腸結紮および穿刺にかけ、そして無作為にグループ分けし（１群あたりｎ＝５〜１０）、１回のＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、スクランブル−ＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、または０．２mLのＮａＣｌ０．９％の腹腔内注射を受けた。２４時間後、動物を麻酔下で殺滅した。結果は平均±ＳＤである。ｐ値はコントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。（Ａ）血漿、腹腔および肺胞洗浄液中のＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０のＥＬＩＳＡ。
【図５Ｂ】ＬＲ１７に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、多菌性敗血症からマウスを防御する。成体雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）をイソフラン麻酔下で盲腸結紮および穿刺にかけ、そして無作為にグループ分けし（１群あたりｎ＝５〜１０）、１回のＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、スクランブル−ＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、または０．２mLのＮａＣｌ０．９％の腹腔内注射を受けた。２４時間後、動物を麻酔下で殺滅した。結果は平均±ＳＤである。ｐ値はコントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。（Ｂ）肺および肝臓におけるＩＬ−６およびＴＮＦ−αのｑ−ＰＣＲｍＲＮＡ定量。
【図５Ｃ】ＬＲ１７に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、多菌性敗血症からマウスを防御する。成体雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）をイソフラン麻酔下で盲腸結紮および穿刺にかけ、そして無作為にグループ分けし（１群あたりｎ＝５〜１０）、１回のＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、スクランブル−ＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、または０．２mLのＮａＣｌ０．９％の腹腔内注射を受けた。２４時間後、動物を麻酔下で殺滅した。結果は平均±ＳＤである。ｐ値はコントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。（Ｃ）血漿および肺胞洗浄液ＴＡＴｃのＥＬＩＳＡ。
【図５Ｄ】ＬＲ１７に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、多菌性敗血症からマウスを防御する。成体雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）をイソフラン麻酔下で盲腸結紮および穿刺にかけ、そして無作為にグループ分けし（１群あたりｎ＝５〜１０）、１回のＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、スクランブル−ＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、または０．２mLのＮａＣｌ０．９％の腹腔内注射を受けた。２４時間後、動物を麻酔下で殺滅した。結果は平均±ＳＤである。ｐ値はコントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。（Ｄ）全血中の血小板数。
【図５Ｅ】ＬＲ１７に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、多菌性敗血症からマウスを防御する。成体雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）をイソフラン麻酔下で盲腸結紮および穿刺にかけ、そして無作為にグループ分けし（１群あたりｎ＝５〜１０）、１回のＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、スクランブル−ＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、または０．２mLのＮａＣｌ０．９％の腹腔内注射を受けた。２４時間後、動物を麻酔下で殺滅した。結果は平均±ＳＤである。ｐ値はコントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。（Ｅ）腹腔および肺胞洗浄液中の細胞数。
【図５Ｆ】ＬＲ１７に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、多菌性敗血症からマウスを防御する。成体雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）をイソフラン麻酔下で盲腸結紮および穿刺にかけ、そして無作為にグループ分けし（１群あたりｎ＝５〜１０）、１回のＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、スクランブル−ＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、または０．２mLのＮａＣｌ０．９％の腹腔内注射を受けた。２４時間後、動物を麻酔下で殺滅した。結果は平均±ＳＤである。ｐ値はコントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。（Ｆ）ＣＬＰの２４時間後の肺の病理組織学的検査。肺胞内出血、タンパク質沈降、および肺胞への白血球の浸潤、および血管周囲空間の浮腫性肥厚は、ＬＲ１７で処置したマウスにおいて減弱した。典型的な図（×１０）をここに示す。
【図５Ｇ】ＬＲ１７に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、多菌性敗血症からマウスを防御する。成体雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）をイソフラン麻酔下で盲腸結紮および穿刺にかけ、そして無作為にグループ分けし（１群あたりｎ＝５〜１０）、１回のＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、スクランブル−ＬＲ１７（０．２mLのＮａＣｌ０．９％中１００μg）、または０．２mLのＮａＣｌ０．９％の腹腔内注射を受けた。２４時間後、動物を麻酔下で殺滅した。結果は平均±ＳＤである。ｐ値はコントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。（Ｇ）ＣＬＰの２４時間後に得られた脾臓および血液からの細菌数。
【図６Ａ】ＬＲ１７に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、ＣＬＰにより誘導される死亡からマウスを防御する。（Ａ〜Ｂ）成体雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）をイソフラン麻酔下で盲腸結紮および穿刺にかけ、そして無作為にグループ分けし（１群あたりｎ＝２５〜４０）、指定された時間においてＬＲ１７、スクランブルＬＲ１７、または０．２mLのＮａＣｌ０．９％の腹腔内注射を受けた。生存率を１週間かけてモニタリングし、そしてログランク検定によって分析した。ＬＲ１７は、敗血症の発症から２４時間後に投与した場合でさえも有意な防御を付与した。
【図６Ｂ】ＬＲ１７に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、ＣＬＰにより誘導される死亡からマウスを防御する。（Ａ〜Ｂ）成体雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２３ｇ）をイソフラン麻酔下で盲腸結紮および穿刺にかけ、そして無作為にグループ分けし（１群あたりｎ＝２５〜４０）、指定された時間においてＬＲ１７、スクランブルＬＲ１７、または０．２mLのＮａＣｌ０．９％の腹腔内注射を受けた。生存率を１週間かけてモニタリングし、そしてログランク検定によって分析した。ＬＲ１７は、敗血症の発症から２４時間後に投与した場合でさえも有意な防御を付与した。
【図７Ａ】ＬＲ１２に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、多菌性敗血症に対してマウスを防御する。（ａ）血漿およびＢＡＬ中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６濃度。結果は平均±ＳＥＭとして表現される。ｐ値はコントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図７Ｂ】ＬＲ１２に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、多菌性敗血症に対してマウスを防御する。（ｂ）肺および肝臓のＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０ｍＲＮＡの定量。結果は平均±ＳＥＭとして表現される。ｐ値はコントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図７Ｃ】ＬＲ１２に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、多菌性敗血症に対してマウスを防御する。（ｃ）全血中の血小板数。結果は平均±ＳＥＭとして表現される。ｐ値はコントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図７Ｄ】ＬＲ１２に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、多菌性敗血症に対してマウスを防御する。（ｄ）ＣＬＰから２４時間後の肺の病理組織学的検査。結果は平均±ＳＥＭとして表現される。ｐ値はコントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図７Ｅ】ＬＲ１２に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、多菌性敗血症に対してマウスを防御する。（ｅ〜ｆ）ＣＬＰから２４時間後に得られた脾臓および血液中の細菌数。結果は平均±ＳＥＭとして表現される。ｐ値はコントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図７Ｆ】ＬＲ１２に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、多菌性敗血症に対してマウスを防御する。（ｅ〜ｆ）ＣＬＰから２４時間後に得られた脾臓および血液中の細菌数。結果は平均±ＳＥＭとして表現される。ｐ値はコントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図７Ｇ】ＬＲ１２に関連したＴＲＥＭ−１モデュレーションは、多菌性敗血症に対してマウスを防御する。（ｇ）ログランク検定によって分析されるＣＬＰ後の生存曲線。結果は平均±ＳＥＭとして表現される。ｐ値はコントロール動物と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【００９６】
実施例：
材料および方法
表面プラズモン共鳴。ＬＰＳにより刺激された好中球の上清におけるＴＲＥＭ−１リガンドの検出は、５μL/分の流速で２５℃でＢＩＡｃｏｒｅＸ装置を用いてＣＭ５センサーチップ上にコーティングされたＴＲＥＭ−１の組換え可溶形（ｒｓＴＲＥＭ−１）への結合によって評価された。結合特異性は、可溶性ｒｓＴＲＥＭ−１との競合を通して確認された。ＬＲ１７によるＴＲＥＭ−１リガンド結合の阻害を評価した。
【００９７】
ペプチド。ＧｅｎＢａｎｋ｜ＥＭＢＬ｜ＤＤＢＪにおけるＴＬＴ−１およびＴＲＥＭ−１配列（アクセッションナンバーＡＹ０７８５０２、ＡＦ５３４８２２、ＡＦ２４１２１９およびＡＦ２８７００８）に基づいて、その細胞外ドメインの種々の部分を模倣した、ＴＬＴ−１ペプチドを設計した：ＴＬＴ−１−ＣＤＲ２（SAVDRRAPAGRR、配列番号２）、ＴＬＴ−１−ＣＤＲ３（CMVDGARGPQILHR、配列番号３）、およびＴＲＥＭ−１とＴＬＴ−１との間でよく保存された配列：ＴＬＴ−１−ＬＲ１７（LQEEDAGEYGCMVDGAR、配列番号４）、ＴＬＴ−１−ＬＲ１２（LQEEDAGEYGCM、配列番号９）、ＬＲ６−１（LQEEDA）、ＬＲ６−２（EDAGEY）およびＬＲ６−３（GEYGCM）。それらはin vitroおよびin vivoアッセイのためにＣＯＯＨ末端アミド化ペプチドとして化学合成され（Pepscan Presto BV, Lelystad, The Netherland）、そしてフローサイトメトリー実験のためにＦＩＴＣ標識された。正しいペプチドが９９％を超える収率で得られ、そして分取的精製後に均一であり、これは、質量分析および分析用逆相高速液体クロマトグラフィーによって確認された。これらのペプチドは内毒素を含まなかった。ＴＬＴ−１−ＬＲ１７と同じアミノ酸を含むが、完全に異なる配列順序で含む、スクランブルペプチドを合成し、そしてコントロールペプチドとして役立てた（ＴＬＴ−１−ＬＲ１７スクランブル：GAEREVCMDEYGALQDG、配列番号５）。
【００９８】
ヒトＰＭＮおよび単球の単離および刺激。ヒト末梢血試料を、研究スタッフを起源とする健康なボランティアドナーからＥＤＴＡ上に回収した。
【００９９】
ＰＭＮを、ジアトリゾ酸ナトリウム１３．８％／デキストラン５００ ８．０％密度勾配（polymorphprep, AbCys）によって単離した。単球を、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Miltenyi）によってＰＢＭＮＣのネガティブ細胞選別によって単離した。その後、細胞を２回ＰＢＳ（BioMerieux）で洗浄し、そして完全培地（１００ＵＩ/mLのペニシリン、１００μg/mLのストレプトマイシン、０．２５μg/mLのアムホテリシンＢおよび１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０、Eurobio）に再懸濁し、その後、刺激した。純度は、フローサイトメトリー（抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１４抗体および抗ＣＤ６６ｂ抗体、Beckman Coulter）によって評価した。
【０１００】
血小板の単離。クエン酸デキストロース血液試料を、遠心分離にかけ（１００ｇ、１０分間）、血小板の豊富な血漿（Platelet-Rich Plasma）を得た。その後、ＰＲＰを、３６％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡ勾配にかけて遠心分離し（５５０ｇ、１０分間）、そして血小板を、中間相から回収し、その後、５mM ＥＧＴＡの補充されたタイロード塩緩衝液（Sigma-Aldrich）中で洗浄した。活性化のために、血小板を、５Ｕ/mLのトロンビン（Sigma-Aldrich）または１μg/mLのE.coli LPS（0111:B4, Sigma-Aldrich）と共に３７℃で３０分間インキュベーションし、そして続いて、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒド（PFA, Sigma-Aldrich）を用いて固定した。残留ＰＦＡを、タイロード緩衝液中における２回の追加の洗浄工程によって除去した。活性化を抗ＣＤ６２Ｐ抗体（Beckman Coulter）によって評価した。
【０１０１】
細胞の刺激。実験に依存して、細胞を、９６ウェルプレート（Greiner Bio One）上の、１００ng/mLのE.coli LPS（0111:B4, Sigma-Aldrich）、抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂ（R&Dsystems）およびＴＬＴ−１ペプチドの補充された完全培地中で種々の時間および濃度で刺激した。上清を、サイトカイン測定のために回収し、そして細胞を、フローサイトメトリーにかけるか、またはタンパク質リン酸化分析およびＮＦκＢ活性測定のために溶解した。
【０１０２】
ＦＡＣＳ分析。単離された細胞（好中球、単球または血小板）を氷上で１時間かけて、１０％ヒトＩｇ（Sigma-Aldrich）を用いて非特異的結合について遮断した。細胞を、組換え可溶性ＦＩＴＣ標識ＴＬＴ−１ペプチド、ＦＩＴＣ標識ＬＰ１７（または対応するＦＩＴＣ標識スクランブルペプチド）、ＰＥ標識抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂ（R&Dsystems）、ＣＤ６２Ｐ−ＦＩＴＣ、ＣＤ６６ｂ−ＰＥ、ＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ１４−ＦＩＴＣ（全てBeckman Coulterから）と共にインキュベーションした。
【０１０３】
サイトカイン濃度測定。刺激されたヒト細胞またはマウス血漿の上清中のサイトカインをＥＬＩＳＡ（ヒトおよびマウスＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔｓ、R&Dsystems）およびサイトカインパネルアッセイ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔ、Ｐａｎｅｌ  ＡおよびＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔ、Ｐａｎｅｌ  Ａ、R&Dsystems）によって製造業者の推奨に従って測定した。
【０１０４】
タンパク質リン酸化の分析。刺激されたＰＭＮを、ＰｈｏｓｐｈｏＳａｆｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Novagen)を用いて１、３、１０、３０および６０分後に溶解し、そして１６，０００ｇで４℃で５分間遠心分離にかけて、上清を回収した。タンパク質濃度をブラッドフォード法（Pierce）に従って決定した。その後、溶解液を、ウェスタンブロット（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＸＴ  Ｂis-トリスゲル、４〜１２％、BioradおよびＰＶＤＦ膜、Millipore）によって分析し、抗ホスホ−ｐ３８抗体および抗ｐＥＲＫ１／２抗体並びにセイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした対応する二次抗体（Cell Signaling）並びにＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Pierce）を用いて明らかとした。抗ｐ３８抗体および抗ＥＲＫ１／２抗体を規準化のために使用した。あるいは、ＰＭＮを２０分間の刺激後に複数のリン酸化タンパク質のパネルについてイムノブロット（Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｋｉｎａｓｅ  Ａｒｒａｙ，R&Dsystems）によって分析した。取得および定量シグナル密度分析をＬＡＳ−４０００イメージャーおよびＭｕｌｔｉ−Ｇａｕｇｅソフトウェア（富士フィルム）によって実施した。
【０１０５】
免疫沈降。細胞を、ＣｙｔｏＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Novagen）を用いて溶解した。試料を総タンパク質濃度によって規準化し、そして溶解液を、免疫沈降を実施する前にプレクリアした。その後、プレクリアした溶解液をウサギ抗Ｂｃｌ１０ｍＡｂ（Cell Signaling）またはウサギ抗ＣＡＲＤ９抗体（Antibodies Online）と共に４℃で一晩インキュベーションした。その後、抗ウサギＩｇビーズ（eBioscience）を室温で１時間かけて加えた。その後、ビーズを３回洗浄し、Laemli緩衝液中で９５℃で５分間かけて変性させ、そして１６，０００ｇで１分間遠心分離にかけた。保持されたタンパク質を含む上清をウェスタンブロットによって分析し、そして抗Ｍａｌｔ−１抗体およびＨＲＰのコンジュゲートした対応する二次抗体（Cell Signaling）を用いて明らかとした。
【０１０６】
ＮＦ−κＢ活性測定。刺激された細胞を回収し、核抽出物を核抽出キットによって得、そしてＮＦκＢ活性を、ヒトｐ５０／ｐ６５combo転写因子アッセイキット（Cayman Chemical）を用いて製造業者の指示に従って測定した。
【０１０７】
ＲＯＳ産生の評価。好中球のファゴサイトーシスおよび酸化バーストの定量的決定を、フローサイトメトリーによって、ＰｈａｇｏｔｅｓｔおよびＢｕｒｓｔｔｅｓｔ（Orpegen Pharma, Heidelberg, Germany）を使用して製造業者の推奨に従って実施した。ＦＩＴＣで標識されたオプソニン化E.coliを使用して、全般的なファゴサイトーシス活性（１細胞あたり１つ以上の細菌の摂取）および個々の細胞のファゴサイトーシス活性（１細胞あたりの細菌数）を決定した。酸化バースト活性の評価のために、標識されていないオプソニン化E.coli、ｆＭＬＰ、ＰＭＡ、ＬＰＳ並びに活性化または非活性化血小板（３０：１）を刺激剤として使用し、ＤＣＦＤＡを蛍光発生基質（Invitrogen）として製造業者の指示に従って使用した。
【０１０８】
Ｔｒｅｍ−１ノックダウン単球の調製。ＴＲＥＭ−１サイレンシングを、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Amaxa）を用いて、Qiagenから得られたｓｉＲＮＡ配列を使用して実施した。単離した単球を、ｓｉＲＮＡを用いて電気穿孔し（陰性コントロールとしてｓｉＲＮＡの非存在下およびｓｉＲＮＡの存在下で電気穿孔を行なわない、および陽性コントロールについてはＧＦＰ−リポータープラスミドの存在下）、そしてＨｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｍｅｄｉｕｍ（Amaxa）中で２４時間培養し、その後、刺激した。その後、ＴＲＥＭ−１発現をトランスフェクションから２４時間後に定量ＲＴ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリーによって評価した。培地を交換し、そして単球を２４時間かけてＬＰＳ、抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂおよびＴＬＴ−１ペプチドで刺激した。それ故、培地をサイトカイン測定のために回収した。
【０１０９】
マウスにおいてＬＰＳにより誘導された内毒血症。地域倫理委員会による承認の後、雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（４〜６週令）を無作為にグループ分けし、そしてＬＰＳチャレンジの１時間前または１時間後にＬＲ１７（２５０μLの通常の食塩水中）またはＬＲ１７−スクランブルと組み合わせてＬＰＳを用いて腹腔内処置した。マウスの生存を、毎時間ごとに調べるか、またはマウスを、一定の間隔で殺滅した。血清試料を、心臓穿刺によって回収し、そしてサイトカインおよびｓＴＲＥＭ−１レベルについてＥＬＩＳＡ（R&Dsystems）によってアッセイした。
【０１１０】
盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）による多菌性敗血症モデル。雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（４〜６週令）を、イソフルランを用いて麻酔した。盲腸を、１．０cmの腹部正中切開を通して露出させ、そして遠位半分の結紮を行ない、その後、Ｇ２１針を用いて１回穿刺を行なった。少量の便を穿刺から排出させて、開存性を確実にした。盲腸を腹腔に戻し、そして腹部切開を２つの層で閉じた。手術後、全てのマウスに体液蘇生のために０．５mLの０．９％ＮａＣｌを皮下注射した。動物を無作為にグループ分けし、そして２５０μLの０．９％ＮａＣｌ溶液中におけるＬＲ１７またはコントロールとしてのＬＲ１７−スクランブルで処理し、そして腹腔内投与した。種々の時点におけるＬＲ１７の種々の用量の効果を決定するために、マウスを手術から１時間後に５０、１００または２００μgのＬＲ１７を用いて、またはＣＬＰから２、６および２４時間後に３回の１００μgの注射を用いて、またはＣＬＰから２４時間後の１回の１００μgの注射を用いて処置し、そしてその後、生存率についてモニタリングした。１群あたり５匹の追加の動物を、細菌数およびサイトカインレベルの決定のためにＣＬＰから２４時間後に麻酔下で死滅させた。腹腔洗浄液を、２mLのＲＰＭＩ１６４０（EuroBio）を使用して得、そして血液を、心臓穿刺によって回収した。血漿中サイトカインの濃度をＥＬＩＳＡ（R&Dsystems）によって決定した。細菌数の評価のために、血液および粉砕した脾臓を、連続ｌｏｇ希釈率で、５％ヒツジ血液の補充されたトリプチックソイ寒天プレート上に播種した。播種後、トリプチックソイ寒天プレートを３７℃で好気的に２４時間、そして嫌気的に４８時間インキュベーションした。結果を、血液１mlあたりまたは脾臓１ｇあたりのＣＦＵとして表現する。
【０１１１】
結果
ＬＲ１７はＴＲＥＭ−１リガンドに特異的に結合する
ｓＴＬＴ−１がＴＲＥＭ−１リガンドに特異的に結合し得、従って、ＴＲＥＭ−１／ＴＲＥＭ−１リガンド相互作用に干渉し得るかどうかを決定するために、本発明者らは、そのリガンドによるＴＲＥＭ−１の関与を模倣する、ＴＲＥＭ−１に結合し活性化することが知られる特異的なＴＲＥＭ−１アゴニストを使用した。本発明者らは、コントロールとして、ＴＲＥＭ−１それ自体はそのリガンド（アゴニスト）を認識することができたが、コントロールＬＲ−１７スクランブルペプチドを認識することはできず、そしてｓＴＬＴ−１およびＬＲ１７もまたＴＲＥＭ−１リガンドに結合することができたことを観察した（図１Ａ）。
【０１１２】
ヒト血小板はＴＲＥＭ−１リガンドを恒常的に発現することが知られている。従って、本発明者らは、血小板上へのＬＲ１７の固定を研究する際に、ｓＴＬＴ−１とＴＲＥＭ−１リガンドとの相互作用を直接確認したかった。本発明者らは、ＦＩＴＣで標識されたＬＲ１７が休止血小板およびトロンビン活性化血小板の両方に結合することを観察した。この結合は、ＴＲＥＭ−１リガンドに結合することが知られるＴＲＥＭ−１から誘導されたペプチドであるＬＰ１７との共インキュベーションによって減少した。逆も真実である：血小板へのＦＩＴＣで標識されたＬＰ１７の結合は、ｒｓＴＬＴ−１またはＬＲ１７との共インキュベーションによって減少したが、ＬＲ１７スクランブルによっては減少しなかった。ＬＲ１７は、ＴＲＥＭ−１リガンドを発現しないことが知られている、好中球または単球には結合しなかった（図１Ｂ）。
【０１１３】
好中球は膜に結合したＴＲＥＭ−１リガンドを発現しないが、これらの細胞は、その可溶化形態を遊離し得る。表面プラズモン共鳴を使用して、本発明者らは、ＬＰＳ活性化好中球が時間依存的にＴＲＥＭ−１リガンドを分泌することを観察した（図１Ｃ）。ＬＲ１７は、固定されたＴＲＥＭ−１へのＴＲＥＭ−１リガンドの結合を遮断することができ（図１Ｄ）、このことはｓＴＬＴ−１がＴＲＥＭ−１／ＴＲＥＭ−１リガンド相互作用を干渉し得ることを示唆する。
【０１１４】
まとめると、これらの結果は、ＬＲ１７がＴＲＥＭ−１リガンドに特異的に結合および補足することができることを示唆し、このことは、それがデコイレセプターとして作用し得、そしてＴＲＥＭ−１リガンド／ＴＲＥＭ−１相互作用を阻害し得ることを示唆する。
【０１１５】
ＬＲ１７は、ＴＲＥＭ−１の活性化を阻害し、そしてＴＲＥＭ−１により媒介される好中球の活性化を減少させる。
骨髄細胞上におけるＴＲＥＭ−１の関与は、ｐ３８ＭＡＰＫおよびＥＲＫ１／２のリン酸化をもたらす。この作用は、ＬＲ１７によって部分的に消失した（図２Ａ）。リン酸化タンパク質アレイもまた、ＴＲＥＭ−１シグナル伝達に関与するタンパク質のリン酸化（ｍＴＯＲ、Ｌｙｎ、ＡＫＴ、ＭＳＫ１／２、ＭＥＫ１／２、ＧＳＫ３α／β、ＲＳＫ、およびｐ５３）もまた、ＬＲ１７の存在下で減少したことを示した（データは示さず）。ＴＲＥＭ−１は、ＩＴＡＭを含むアダプタータンパク質であるＤＡＰ１２との会合を通してシグナルを伝達する。ＣＡＲＤ９−ＢＣＬ１０−ＭＡＬＴ１の形成が、ＩＴＡＭ共役レセプターを下流のＮＦ−κＢ活性化に連関させる上で必須であることが証明されたので、本発明者らは次にこの複合体アセンブリに対するＬＲ１７の効果を調べたかった。予期した通り、ＴＲＥＭ−１の活性化は、増加したＣＡＲＤ９−ＭＡＬＴ１−ＢＣＬ１０の複合体の形成を伴った。この作用はＬＲ１７によって逆行した（図２Ｂ）。
【０１１６】
ＴＲＥＭ−１シグナル伝達経路は、最終的にＮＦ−κＢの活性化に至る。ここでも、ＬＲ１７は、抗ＴＲＥＭ−１抗体により誘導されるＮＦ−κＢ活性を減少させた（図２Ｃ）。ＴＲＥＭ−１により誘導された細胞活性化のための解読値として、本発明者らはＲＯＳ産生を選択した。ＴＲＥＭ−１アゴニストおよび血小板（ＴＲＥＭ−１リガンドを発現する）の両方が、好中球によるＲＯＳ産生を増加させることが示された。本発明者らは、この産生がＬＲ１７の存在下で一部には防がれることを観察した（図２Ｄ）。最後に、ＬＲ１７は、活性化好中球によるサイトカイン産生を、ＴＮＦ−α（図２ＥおよびＦ）、ＩＬ−６およびＩＬ−８について遺伝子およびタンパク質レベルの両方で減少させることができた（データは示さず）。それ故、これらの結果は、ＬＲ１７が、天然に存在する、ＴＲＥＭ−１の直接的な阻害剤であるという事実をさらに支持する。
【０１１７】
ＬＲ１７は、ＬＰＳによりまたはＬＰＳおよびαＴＲＥＭ−１により誘導された細胞活性化を減少させることによって抗炎症特性を示す。
ＴＲＥＭ−１のモデュレーションは、ＴＬＲにより媒介される好中球の活性化を減少させることが示された。ＬＰＳによる刺激時のＴＬＲ４の関与により、好中球によるＮＦ−κＢ活性化およびＲＯＳ産生に至る。実際に、ＬＲ１７は、ＬＰＳに関連した（αＴＲＥＭ−１の存在下または非存在下）ｐ３８およびＥＲＫ１／２のリン酸化（図３Ａ）、ＣＡＲＤ９−ＭＡＬＴ１−ＢＣＬ１０複合体形成（図３Ｂ）、ＮＦ−κＢ移行（図３Ｃ）、および細胞内ＲＯＳ産生（図３Ｄ）を減少させた。ＬＲ１７はまた、E.coliによって媒介される好中球の酸化バーストも減少させた。これに対し、ｓＴＬＴ−１およびＬＲ１７は、好中球のファゴサイトーシス特性を変化させなかった（図３Ｅ）。
【０１１８】
予期した通り、αＴＲＥＭ−１は、好中球によるＴＮＦ−α産生を誘導した。この作用は、ＬＲ１７の添加によって消失した。抗ＴＲＥＭ−１抗体もまた、サイトカイン産生についてＬＰＳと相乗作用し、ここでも、この相乗作用はＬＲ１７によって遮断された。
【０１１９】
最後に、好中球および単球によるＬＰＳに関連したＴＮＦ−α分泌は、遺伝子およびタンパク質レベルの両方において、ＬＲ１７の存在下で用量依存的に減少した。αＴＲＥＭ−１は、サイトカイン産生の誘導においてＬＰＳと相乗作用し、ここでもこの作用はＬＲ１７の添加によって消失した（図３Ｆ、Ｇ、ＨおよびＩ）。ＩＬ−６およびＩＬ−８についても同じことが当てはまる（示していない）。広範なサイトカインアレイを使用して、本発明者らは、ＬＲ１７による、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−８の減少した産生だけでなく、ＧＲＯ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１６、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳの減少した産生も確認した。これら全ての作用はまた、ヒト単球においてＴＬＲ２（Ｐａｍ３ＳＫ４）（示していない）刺激時に起こると確認された。
【０１２０】
ｓＴＬＴ−１がＴＲＥＭ−１を介してＬＰＳにより誘導される炎症応答をモデュレーションすることを結論的に実証するために、Ｔｒｅｍ−１ｓｉＲＮＡで処理された単球に対するＬＲ１７の効果を調べた。Ｔｒｅｍ−１サイレンシングは、ＲＴ−ｑＰＣＲによって確認したところ、トランスフェクションから２４〜９６時間後に９０％を超える効率で単球において達成された。サイレンスされた単球もまたＬＰＳ／抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂを用いて刺激された：サイレンスされた単球はＬＰＳに対して正常に応答したが、抗ＴＲＥＭ−１ｍＡｂはＴＮＦ−α産生を誘導しなかった。同時に、ＬＲ１７は、サイレンスされた単球によるＴＮＦ−α合成に対して全く効果を示さなかった（図３Ｉ）。これらの結果は、ｓＴＬＴ−１が天然に存在するＴＲＥＭ−１の阻害剤であるという仮説を支持する。
【０１２１】
ＬＲ１７は内毒血症マウスを死亡から防御する
本発明者らは次に、ｓＴＬＴ−１が敗血症中にいくらかの防御効果を有し得るかどうかを解明したかった。成体雄Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＬＰＳ投与（ＬＤ５０、２５mg/kg）の６０分前に、１回量のＬＲ１７、ＬＲ１７スクランブルまたはＮａＣｌ０．９％を腹腔内投与した。全てのＬＲ１７処置動物が生存した（図４ａ）。ＬＲ１７処置を、ＬＰＳ投与後まで遅延させることができるかどうかを調べるために、本発明者らは、ＬＰＳ注射の１時間後にＬＲ１７の注射を開始した。この遅延した処置は有意な防御を与えた（図４ａ）。遅い死亡も１０日間かけて全く起こらず、このことはＬＲ１７がＬＰＳの致死性の開始を単に遅延させただけでなく、持続する防御を提供したことを示す。コントロールマウスは全て死亡前に傾眠、起毛および下痢を発症した。対照的に、ＬＰ処置マウスは毛並みもよく、活動的で、下痢も全くなく、元気であった。ＬＲ１７がＬＰＳの致死性からマウスを防御する機序を明瞭にするために、本発明者らは、２および４時間後に内毒血症マウスのＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびｓＴＲＥＭ−１の血清レベルを決定した。コントロールと比較して、ＬＲ１７による前処置および後処置はサイトカインを減少させた（図４ｂ〜ｅ）。より高用量のＬＲ１７（２５０μg）を使用しても、１００μgの用量を上回る利点を与えなかった。
【０１２２】
ＬＲ１７は多菌性敗血症に対してマウスを防御する
敗血症ショックのより関連したモデルにおけるＬＲ１７の役割を調べるために、本発明者らは、ＣＬＰ実験を実施した。コントロール群は、通常の食塩水またはコントロールペプチド（スクランブルＬＲ１７）を注射されたマウスを含んだ。本発明者らは、最初に手術から２４時間後に血漿中のＩＬ−６およびＩＬ−１０濃度を測定した。ＬＲ１７（手術から２時間後に１００μgを腹腔内に）処置動物においては、両方のサイトカイン濃度が減少した（図５ａ）。ＩＬ−６およびＩＬ−１０もまた、ＬＲ１７処置後に気管支肺胞洗浄液において、並びに腹腔洗浄液において減少していた（図５ａ）。サイトカインアレイを使用した種々のサイトカインの血漿中レベルのスクリーニングは、いくつかの他の重要な炎症サイトカイン（Ｃ５ａ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ１６、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−２）の減少した濃度を示した。凝固活性化は、しばしば敗血症中に炎症応答の一部として起こる。Ｄ−ダイマーおよびＴＡＴｃの血漿中および肺胞中濃度の両方が、ＣＬＰマウスにおいて顕著に上昇していた。これらの凝固異常は、ＬＲ１７によって防止された（図５ｂ）。
【０１２３】
次に、本発明者らは、ＬＲ１７が感染部位（腹膜）および遠位（肺胞空間）の両方における局所的細胞動員に影響を及ぼすかどうかを調べた。実際に、細胞浸潤は両部位においてＬＲ１７処置によって減少した（図５ｃ）。組織学的研究は、敗血症マウスにおける、重度の肺損傷、すなわち肺胞内出血、タンパク質沈降、および肺胞への白血球浸潤、および血管周囲空間の浮腫性肥厚を明らかとした。これらの変化は、ＬＲ１７処置動物においては減弱した（図５ｄ）。それ故、ＬＲ１７は、腹膜炎によって誘導される大量の細胞浸潤および組織学的傷害から防御する。本発明者らは最後に、細菌クリアランスに対するＬＲ１７の効果を研究した。予期された通り、本発明者らは、腹膜炎の発症から２４時間後にＣＬＰマウスの脾臓において非常に高い細菌数を観察した。さらに、全てのコントロール動物に菌血症が見られた。対照的に、ＬＲ１７は細菌クリアランスを改善し、そしてほぼ完全に敗血症を防いだ（図５ｅ）。
【０１２４】
それ故、ＬＲ１７による処置は、局所的および全身的の両方において敗血症により誘導される炎症応答をモデュレーションすることができ、そして細菌クリアランスを改善することができた。
【０１２５】
ＬＲ１７は、ＣＬＰにより誘導される死亡からマウスを防御する
本発明者らは、ＬＲ１７によって付与される炎症応答のモデュレーションが、敗血症中の生存率の改善へと翻訳され得るかどうかを調べた。多菌性敗血症のこのＣＬＰモデルにおいて、ＬＲ１７は、敗血症の発症から２４時間後という遅い時期に投与した場合でさえも、致死性に対して用量依存的で有意な防御を与えた。興味深いことに、ＬＲ１７の複数回の注射は、１回量の投与よりも優れてはいなかった（図６）。
【０１２６】
ＬＲ１２に関連したＴＲＥＭ−１のモデュレーションは、多菌性敗血症に対してマウスを防御する。
ＬＲ１２は、ＬＲ１７のＮ末端の１２アミノ酸からなる、ＬＲ１７から誘導された１２アミノ酸である。ＬＲ１２が敗血症マウスに投与された場合、それは依然として、全身、気管支肺胞および臓器炎症（図７ａおよびｂ）、凝固疾患（図７ｃ）、臓器機能不全（図７ｄ）、細菌クリアランス（図７ｅおよびｆ）に対して有意な防御を付与し、そして最後には生存率を改善した（図７ｇ）。これらの結果は、ＬＲ１２が、ＬＲ１７と同じ防御効果および効力を保持することを示唆する。
【０１２７】
６アミノ酸のペプチド（ＬＲ６−１、ＬＲ６−２およびＬＲ６−３）は多菌性敗血症からマウスを防御する。
ＬＲ６−１、ＬＲ６−２およびＬＲ６−３は、ＬＲ１７から誘導された６アミノ酸である（表１）。前記ペプチドを、ＬＲ１７およびＬＲ１２について記載したように敗血症マウスに投与する（上記参照）。全身、気管支肺胞および臓器炎症、凝固疾患、臓器機能不全、細菌クリアランスおよび生存率に対する防御を評価して、これらのペプチドがＬＲ１２およびＬＲ１７と同じ防御効果および効力を保持するかどうかを調べる。
【０１２８】
参考文献：
本出願全体を通じて、種々の参考文献が、本発明が属する分野の最新の技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２９】
【表２】
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0005918750.tif 000004
【図１Ａ】
0005918750.tif 000005
【図１Ｂ】
0005918750.tif 000006
【図１Ｃ】
0005918750.tif 000007
【図１Ｄ】
0005918750.tif 000008
【図２Ａ】
0005918750.tif 000009
【図２Ｂ】
0005918750.tif 000010
【図２Ｃ】
0005918750.tif 000011
【図２Ｄ】
0005918750.tif 000012
【図２Ｅ】
0005918750.tif 000013
【図２Ｆ】
0005918750.tif 000014
【図３Ａ】
0005918750.tif 000015
【図３Ｂ】
0005918750.tif 000016
【図３Ｃ】
0005918750.tif 000017
【図３Ｄ】
0005918750.tif 000018
【図３Ｅ】
0005918750.tif 000019
【図３Ｆ】
0005918750.tif 000020
【図３Ｇ】
0005918750.tif 000021
【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
0005918750.tif 000036
【図６Ｂ】
0005918750.tif 000037
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
0005918750.tif 000039
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【配列表】
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