(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トレプロスチニル、シカプロストまたはベラプロストから選択される少なくとも１種類のプロスタサイクリン類似体またはそれらの医薬的に許容できる塩および少なくとも１種類のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）４阻害剤を含む、線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）によるクロライドのコンダクタンスを改善することによる嚢胞性線維症の予防または処置における使用のための組成物。
【請求項２】
前記ＰＤＥ４阻害剤が、ＲＯ２０−１７２４、イブジラスト、ロフルミラストおよびそのＮ−オキシド、シロミラスト、ＢＡＹ１９−８００４、ＣＣ３、ＡＷＤ１２−２８１、ＳＣＨ３５１５９１、シクラミラスト、ピクラミラスト、ＣＧＨ２４６６、メセンブリン、ロリプラム、ルテオリンおよびドロタベリンの群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
トレプロスチニル、ならびにＲＯ２０−１７２４、ロフルミラストおよびイブジラストの群から選択されるＰＤＥ４阻害剤を含む、組成物。
【請求項４】
ＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤またはＰＤＥ８阻害剤の群から選択されるさらなるＰＤＥ阻害剤が含有されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＰＤＥ５阻害剤が、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、クエン酸シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィルまたはウデナフィルから選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＰＤＥ７阻害剤およびＰＤＥ８阻害剤が、ジピリダモール、ＢＲＬ５０４８１およびＰＦ−４９５７３２５から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
医薬組成物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
吸入のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
静脈内もしくは皮下投与用の、または持続放出形態、錠剤およびカプセルの群から選択される、経口的に利用可能な形態用の、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
トレプロスチニルまたはその医薬的に許容できる塩の有効量が少なくとも１．０ｎｇ／ｋｇ体重である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
トレプロスチニル、シカプロストまたはベラプロストから選択される少なくとも１種類のプロスタサイクリン類似体またはそれらの医薬的に許容できる塩、
少なくとも１種類のＰＤＥ４阻害剤、並びに
ＰＤＥ７阻害剤およびＰＤＥ８阻害剤の群から選択される少なくとも１種類の阻害剤、
を含む療法的組み合わせであって、
該プロスタサイクリン類似体またはそれらの医薬的に許容できる塩、ＰＤＥ４阻害剤、並びにＰＤＥ７阻害剤およびＰＤＥ８阻害剤の群から選択される少なくとも１種類の阻害剤が、それらを合わせた上で嚢胞性線維症と関係する少なくとも１種類の症状を処置および／または予防するのに十分である量で提供される、前記療法的組み合わせ。
【請求項１２】
請求項１１に記載の療法的組み合わせであって、プロスタサイクリン類似体またはそれらの医薬的に許容できる塩、ＰＤＥ４阻害剤、並びにＰＤＥ７阻害剤およびＰＤＥ８阻害剤の群から選択される少なくとも１種類の阻害剤が吸入による投与のために配合される、前記療法的組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嚢胞性線維症の予防または処置における使用のための、プロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体をホスホジエステラーゼ阻害剤４との組み合わせで含む組成物、ならびに特異的な組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン、エポプロステノール、ＰＧＩ２）は、シクロオキシゲナーゼおよびＰＧＩシンターゼ酵素の順次の活性により酵素的に形成されるアラキドン酸の酸素化代謝産物である。それは血管内皮細胞および平滑筋細胞により構成的に産生され、炎症条件下で血管細胞およびマクロファージにおいて誘導される。
【０００３】
ＰＧＩ２は強力な血管拡張剤および抗血栓剤であり、その作用はＩプロスタノイド（ＩＰ）４受容体と呼ばれる独特の７回らせん状（ｈｅｐｔａｈｅｌｉｃａｌ）Ｇタンパク質共役型受容体への結合の結果としてもたらされる。この受容体はＧＳに共役し、アデニル酸シクラーゼを活性化し、結果として細胞内ｃＡＭＰの急性のバースト（ｂｕｒｓｔ）をもたらす。ＣＦＴＲおよび変異型ＣＦＴＲの発現はｃＡＭＰ依存性であるため、ｃＡＭＰの細胞内レベルを高める物質はＣＦの処置のための薬物の開発において関心が持たれている。しかし、これらの物質のほとんど、例えばフォルスコリンは、かなり非特異的なｃＡＭＰの上昇を誘導し、それは炎症のような非常に有害な作用も有する可能性がある。従って、肺上皮細胞におけるｃＡＭＰの特異的増進剤の未だ満たされてない必要性が存在する。
【０００４】
トレプロスチニル（Ｔｒｅｐｒｏｓｔｉｎｉｌ）は強力なＩＰ受容体作動薬であるが、この受容体に関するその特異性は未知である。Sprague R.S. et al., Microcirculation 2008 Jul;15(5):461-71は、プロスタサイクリン類似体（ＵＴ−１５、Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎ）がウサギおよびヒトの赤血球からの受容体に媒介されるｃＡＭＰ合成およびＡＴＰの放出を刺激することを示した。
【０００５】
核のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、ｃＡＭＰおよび環状３’，５−グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の不活性な５’−ヌクレオチド産物への加水分解を触媒する酵素である。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、主として多基質タンパク質キナーゼへのそれらの刺激作用により媒介される多くの細胞内作用を示す。ＰＤＥを阻害することにより、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのレベルが増大し、結果として気道平滑筋の弛緩および炎症細胞活性化の阻害をもたらす。ＰＤＥ４、ＰＤＥ７およびＰＤＥ８はｃＡＭＰに特異的である。
【０００６】
ホスホジエステラーゼ阻害剤は酵素ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）の亜型の１種類以上を遮断し、従って細胞内の二次メッセンジャーである環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）および環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）のそれぞれのＰＤＥ亜型（単数または複数）による不活性化を防ぐ。環状３’，５’−ヌクレオチドＰＤＥのイソ酵素は、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）シグナル伝達経路の決定的に重要な構成要素である。１１のＰＤＥファミリーが同定されている。ＰＤＥイソ酵素のスーパーファミリーは、少なくとも９の遺伝子ファミリー（型）、ＰＤＥ１〜ＰＤＥ１１からなる。いくつかのＰＤＥファミリーは非常に多様であり、いくつかの亜型および多数のイソ型−スプライスバリアントからなる。
【０００７】
非特異的ＰＤＥ阻害剤の例は、テオフィリンおよび関連するキサンチン化合物、カフェイン、アミノフィリン等である。ビンポセチンはＰＤＥ１選択的阻害剤である。既知のＰＤＥ２選択的阻害剤はＥＨＮＡまたはアナグレリドであり、ＰＤＥ３選択的阻害剤はエノキシモンまたはミルリノンである。
【０００８】
ＰＤＥ４は炎症および免疫細胞中にある主なｃＡＭＰ代謝酵素である。ＰＤＥ４阻害剤は、特に炎症性肺疾患、例えば喘息、ＣＯＰＤ、および鼻炎における抗炎症薬としての証明された能力を有する。それらはサイトカイン類および他の炎症性シグナルの放出を抑制し、活性酸素種の生成を阻害する。既知のＰＤＥ４阻害剤は、例えばメセンブリン、ロリプラム、イブジラスト等である。
【０００９】
ＰＤＥ５阻害剤は、主にシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ３Ａ４により代謝される。ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、ケトコナゾール、イトラコナゾール、および他の抗高血圧薬、例えばニトロスプレーを含むＣＹＰ３Ａ４を阻害または誘導する他の薬物との有害な薬物相互作用に関する可能性が存在する。ＰＤＥ５阻害剤の例は、シルデナフィル（Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）、タダラフィル（Ｔａｄａｌａｆｉｌ）、バルデナフィル（Ｖｅｒｄｅｎａｆｉｌ）またはウデナフィル（Ｕｄｅｎａｆｉｌ）である。
【００１０】
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、上皮膜において塩素イオンチャンネルの役目を果たす嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）として知られる１４８０アミノ酸ポリペプチドをコードする７番染色体上の２３０ｋｂの遺伝子中の変異の結果として起こる遺伝病である。１０００を超える変異対立遺伝子が現在までに同定されている。最も共通した変異であるΔＦ５０８は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質中のコドン５０８におけるフェニルアラニン残基の欠失である。この変異は結果としてＣＦＴＲの機能における重度の低減をもたらし、汗中の塩化物の上昇のような外分泌腺機能における異常、気管支拡張を伴う再発性の呼吸器感染症、および膵不全の早期発症を特徴とする古典的な嚢胞性線維症の表現型をもたらす。
【００１１】
臨床的に、ＣＦは、通常１種類以上の典型的なＣＦの表現型の特徴が対象に存在する場合に疑われる。これは、単独の慢性肺疾患、または胃腸の異常および栄養的な異常（例えば膵不全および再発性膵炎）、塩喪失症候群（ｓａｌｔ  ｌｏｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）ならびに男性泌尿生殖器異常（すなわち閉塞性無精子症）と極めて頻繁に関係する慢性肺疾患である可能性がある。ヒトの肺において、濃厚な粘り強い分泌物がＣＦＴＲを発現する末梢気道および粘膜下の腺を塞ぐ。（粘液による閉塞と関係する）これらの腺の小管の拡張、および濃厚な粘着性の好中球が支配的である（ｄｏｍｉｎａｔｅｄ）粘液膿性の残骸による気道表面の上塗り（ｐｌａｓｔｅｒｉｎｇ）は、その疾患の病理学的特徴に含まれる。肺炎症は嚢胞性線維症を有する対象における呼吸機能の低下の別の主な原因であり、慢性感染の発症に先行する可能性がある。膵管内の粘液性の嵌入および太い結石は、以前の特発性もしくはアルコール性膵炎の診断を有する対象の大きな亜集団において、慢性線維症、腺の脂肪置換、または両方につながる。
【００１２】
嚢胞性線維症はコーカサス人種における最も一般的な致死的遺伝病であり、子供１０，０００人中約４人を冒す。米国では、死亡年齢の中央値は１９６９年における８．４歳から１９９８年における１４．３歳まで上がった。平均死亡年齢は、１９６９年における１４歳から２００３年における３２．４歳まで上がった（嚢胞性線維症基金（Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ））。１９９０年代に産まれた子供に関して、生存の中央値は４０歳を超えると予測されている。期待寿命の著しい増大に対する主な寄与因子は、ＣＦの対象における向上した慢性呼吸器管感染症の処置および粘液の排除ならびに向上した栄養およびより早期の診断である。
【００１３】
嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）が喪失すると、気道上皮の頂端膜からの陰イオンコンダクタンスが気道表面の液体層の制御を崩壊させる。これは嚢胞性線維症（ＣＦ）に特徴的な欠陥的粘液線毛クリアランス、気道感染、および炎症をもたらす。一般的なＣＦＴＲのΔＦ５０８変異はＣＦ患者の９０％より大きい割合において少なくとも１個の対立遺伝子上に存在し、患者の５０％より大きい割合はΔＦ５０８に関してホモ接合性であり、残りは複合ヘテロ接合性である。ＣＦ疾患における中心となる問題は、この共通のＣＦＴＲ変異体が、小胞体（ＥＲ）から出て上皮細胞頂端膜に移動するであろう天然の折り畳まれた状態を達成することができないことである。
【００１４】
天然の立体構造の獲得が遅れる場合、ＣＦＴＲは分子シャペロンとの過剰な、または延長された相互作用を維持すると考えられ、次いでそれは、誤って折り畳まれた、または不完全に複合体形成したタンパク質に関してＥＲを監視する機構によりそのタンパク質を分解の標的とする。ＥＲと関連する分解（ＥＲＡＤ）には、異常なタンパク質のユビキチン化および消化のためのそれらのプロテアソームへの送達が関わっている。ＥＲＡＤがタンパク質合成の速度より遅れる場合、またはプロテアソーム阻害剤による処置の間に、変異体タンパク質の凝集物が蓄積する。ＣＦＴＲはユビキチン−プロテアソームに媒介される分解に関する基質として同定された最初の哺乳類の内在性膜タンパク質であり、それは多様な一連の病理学的病因を説明するタンパク質の立体構造の疾患の増大しているリストに関するモデルとして役立ってきた。
【００１５】
細胞により生成されるΔＦ５０８  ＣＦＴＲの本質的に全てはＥＲＡＤにより破壊される。また、その複雑な折り畳みパターンのため、野生型（ｗｔ）タンパク質の６０〜７０％が同様に分解される可能性があるが、これは細胞型の間で異なり得る。ｗｔの未成熟な形態およびΔＦ５０８のＣＦＴＲのタンパク質分解的切断パターンは類似しており、一方で成熟したｗｔのＣＦＴＲの消化パターンは異なる。この所見は、ＥＲで保持される変異体ＣＲＴＲの少なくとも一部は、変異型タンパク質構造の形成とは対照的に、正常なＣＦＴＲの折り畳み経路の途中で形成される中間的な立体構造で存在しているという概念を支持する。ΔＦ５０８  ＣＦＴＲに関して、この中間的な立体構造はその折り畳みプロセスにおける決定的な段階を越えて進むことができないが、これはこの段階を促進することができるならばΔＦ５０８  ＣＦＴＲをレスキューすることができるであろうことを暗示している。
【００１６】
様々な実験条件、例えば下げられた温度、化学シャペロンとの保温、または薬理学的修正剤（ｃｏｒｒｅｃｔｏｒｓ）は、ΔＦ５０８  ＣＦＴＲのＥＲからの脱出を促進し、細胞表面において機能する陰イオンチャンネルをもたらし得る。加えて、研究者らはｗｔのＣＦＴＲからの様々な部分的なＣＦＴＲコンストラクトまたはサブドメインの同時発現によるΔＦ５０８  ＣＦＴＲの機能の回復を報告してきた。しかし、どのＣＦＴＲのサブドメインが変異体タンパク質のレスキューにおいて有効であるかに関するコンセンサスは明らかではなく、この作用の機構は依然としてはっきりしないままである。加えて、ＣＦＴＲ断片に誘導されるレスキューは主にそのＣＦＴＲ断片および完全長ΔＦ５０８  ＣＦＴＲの両方を外因的に過剰発現する細胞において観察されてきた。
【００１７】
国際公開第０８／０９８１９６号は、トレプロスチニルを用いた肺線維症の処置を記述している。しかし、肺線維症は肺におけるコラーゲン線維の蓄積により引き起こされる間質性肺疾患であり；これは肺の空気を吸い込む能力を制限し：肺はそのコンプライアンス（ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）を失い、気道抵抗が増大する（コンプライアンス＝１／抵抗）。疾患が進行するに従って、血管抵抗における増大も存在する。肺線維症におけるトレプロスチニルの作用の部位は、脈管系および肺胞中の間質空間である。
【００１８】
Tissieresらは、嚢胞性線維症および二次性肺高血圧を有する患者の処置に関するイロプロストを用いた研究を記述している。気化された（ａｅｒｏｌｉｓｅｄ）イロプロストが肺動脈圧の低下において有効であったことが開示されている（The annals of thoracic surgery, vol, 78, no.3, E48-E50）。
【００１９】
米国特許出願公開第２００１／００６９７９号Ａ１は、線維性疾患の処置のためのイロプロストまたはシカプロストのようなプロスタサイクリン誘導体の使用を記述している。
【００２０】
嚢胞性繊維症は、それは気管支上皮に由来する疾患であるため、肺線維症とは無関係である。ＣＦＴＲが存在しないため、気管支上皮を覆う粘液中の水が少なすぎ；従って線毛が濃厚な粘液を動かすことができず、粘液線毛クリアランスが崩壊する（粘液線毛クリアランスはコンベアベルトのように作動し、そこで線毛は粘液を動かして気管および咽頭へと戻すために集中した様式でリズミカルに脈打ち、そこからそれは嚥下または咳等により取り除かれ得る）。粘液線毛が壊れると、気管支から細菌を除去することができず、気管支に細菌がコロニー形成し、肺を破壊する肺感染症の発作が繰り返される。その状況は、気管支上皮へのＣｌ流動を回復させることにより治療することができる。従って、嚢胞性繊維症においては、作用部位は気管支の気道上皮である。作用部位は解剖学的に明確であり（肺間質対気管支の気道）、異なる一連の細胞（線維芽細胞、血管平滑筋細胞、内皮対吸収および分泌性気管支上皮細胞）を含み、且つ恐らく異なる受容体も含む（プロスタサイクリン受容体対多分ＥＰ２受容体）。
【００２１】
独国特許出願公開第１０２００５０１６３４５号Ａ１および米国特許出願公開第２００５１０１６０８号Ａ１は、肺高血圧の処置のためのＰＤＥ５阻害剤の使用を記述している。
【００２２】
米国特許出願公開第２００９３２５９７６号Ａ１は、肺動脈高血圧の処置における使用のための、ＰＤＥ５阻害剤と組み合わせて用いることもできる新規プロスタサイクリン誘導体を開示している。
【００２３】
臨床的に用いられるＰＤＥ阻害剤は、Cobb B.R.らにより記述されたように（Am J Respir Cell Mol Biol. 2003 Sep;29(3 Pt 1):410-418）、低ｃＡＭＰレベルの設定において塩化物分泌を活性化するために試験された。
【００２４】
ＰＤＥ５阻害剤であるシデルナフィルおよびバルデナフィルならびに嚢胞性線維症における塩化物輸送におけるそれらの役割がLubamba B.らにより記述されている（Am J Respir Crit Care Med. 2008 Mar 1;177(5):506-515）。
【００２５】
ＰＤＥ５阻害剤およびΔＦ５０８  ＣＦＴＲチャンネルの機能におけるそれらの役割がClarke Lane Lにより記述されている（J Respir Crit Care Med. 2008 Mar 1;177(5):469-70）。
【００２６】
国際公開第２０１０１０６４９４号Ａ１において、障害を処置するための既知の弱いＰＤＥ４阻害剤であるメセンブリンＨＣｌの使用が開示されている。
【００２７】
米国特許出願公開第２００７０２４９６６８号は、赤血球におけるＡＴＰ含有量を増大させるためのＰＤＥ阻害剤およびプロスタサイクリン類似体を含有する組成物を記述している。
【００２８】
現在、患者の生活の質をより長い期間にわたって著しく改善する利用可能な嚢胞性繊維症の処置はない。従って、肺の上皮細胞におけるΔＦ５０８  ＣＦＴＲの発現および／または塩素イオンチャンネルの機能を高めることができる処置のための組成物を提供することは、本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】国際公開第０８／０９８１９６号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００１／００６９７９号Ａ１
【特許文献３】独国特許出願公開第１０２００５０１６３４５号Ａ１
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５１０１６０８号Ａ１
【特許文献５】米国特許出願公開第２００９３２５９７６号Ａ１
【特許文献６】国際公開第２０１０１０６４９４号Ａ１
【特許文献７】米国特許出願公開第２００７０２４９６６８号
【非特許文献】
【００３０】
【非特許文献１】Sprague R.S. et al., Microcirculation 2008 Jul;15(5):461-71
【非特許文献２】The annals of thoracic surgery, vol, 78, no.3, E48-E50
【非特許文献３】Am J Respir Cell Mol Biol. 2003 Sep;29(3 Pt 1):410-418
【非特許文献４】Am J Respir Crit Care Med. 2008 Mar 1;177(5):506-515
【非特許文献５】J Respir Crit Care Med. 2008 Mar 1;177(5):469-70
【発明の概要】
【００３１】
本発明の目的は、嚢胞性線維症の予防または処置における使用のための、少なくとも１種類のプロスタサイクリンまたはその類似体、誘導体、もしくは医薬的に許容できる塩を少なくとも１種類のＰＤＥ４阻害剤との組み合わせで含む組成物を提供することにより達成される。代わりの態様において、前記の組成物はさらに少なくとも１種類のＰＤＥ５阻害剤および／またはＰＤＥ（ＰＤ）７阻害剤および／またはＰＤＥ８阻害剤を含むことができる。
【００３２】
具体的には、そのプロスタサイクリン類似体はトレプロスチニル、イロプロスト、シカプロストもしくはベラプロストまたはそれらの誘導体もしくは医薬的に許容できる塩類の群から選択される。本発明の１態様において、そのトレプロスチニル誘導体はトレプロスチニルの酸誘導体、プロドラッグ、多形体または異性体である。
【００３３】
本発明によれば、そのＰＤＥ４阻害剤は具体的にはＲｏ２０−１７２４、イブジラスト、ロフルミラストおよびそのＮ−オキシド、シロミラスト、ＢＡＹ１９−８００４、ＣＣ３、ＡＷＤ１２−２８１、ＳＣＨ３５１５９１、シクラミラスト（Ｃｉｃｌａｍｉｌａｓｔ）、ピクラミラスト（Ｐｉｃｌａｍｉｌａｓｔ）、ＣＧＨ２４６６、メセンブリン、ロリプラム、ルテオリンおよびドロタベリンの群から選択することができる。
【００３４】
本発明によれば、そのＰＤＥ５阻害剤は具体的にはアバナフィル（Ａｖａｎａｆｉｌ）、ロデナフィル（Ｌｏｄｅｎａｆｉｌ）、ミロデナフィル（Ｍｉｒｏｄｅｎａｆｉｌ）、クエン酸シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィルおよびウデナフィルから選択することができ；そのＰＤＥ７阻害剤およびＰＤＥ８阻害剤はジピリダモール（Ｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌ）、ＢＲＬ−５０４８１およびＰＦ−０４９５７３２５から選択することができる。
【００３５】
本発明の特定の態様によれば、その組成物は具体的にはプロスタサイクリン類似体の１タイプおよびＰＤＥ４阻害剤の１タイプからなる。
【００３６】
特定の態様として、その組成物はトレプロスチニルならびにＲＯ２０−１７２４、ロフルミラストおよびイブジラストの群から選択されるＰＤＥ４阻害剤を含む。
【００３７】
本発明のさらなる態様において、その組成物はＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤またはＰＤＥ８阻害剤から選択される追加のＰＤＥ阻害剤を含む。
【００３８】
別の態様において、本発明はインターフェロンを含まない組成物を提供する。
【００３９】
具体的には、本発明の組成物は医薬組成物として配合される。
【００４０】
あらゆる既知の投与形態を本発明の組み合わせを投与するために用いることができ、例えばそれは静脈内もしくは皮下投与もしくは吸入投与であることができ、または持続放出形態、錠剤およびカプセルの群から選択される経口的に利用可能な形態であることができる。
【００４１】
特定の態様によれば、トレプロスチニルまたはその医薬的に許容できる塩の有効量は、好ましくは約１．０ｎｇ／ｋｇ体重の量であり、イブジラストは好ましくは５×３０ｍｇまで、好ましくは２×３０ｍｇまでであり、ＰＤＥ４阻害剤の有効量はおおよそ０．５ｍｇである。加えて、ＰＤＥ５阻害剤およびＰＤＥ７阻害剤の群の１種類以上の阻害剤が、約０．５ｍｇのその阻害剤のそれぞれの有効量で含まれてよい。
【００４２】
本発明は細胞中のｃＡＭＰレベルを増大させるためのインビトロの方法も提供し、ここで前記の細胞を少なくとも１種類のプロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体および少なくとも１種類のＰＤＥ４阻害剤またはその医薬的に許容できる塩と接触させる。加えて、ＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤および／またはＰＤＥ８阻害剤を前記の方法に従ってさらに用いることができる。
【００４３】
具体的には、その細胞は上皮細胞であり、より具体的にはそれは気管支上皮細胞であってよい。
【００４４】
少なくとも１種類のプロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体および少なくとも１種類のＰＤＥ４阻害剤またはその医薬的に許容できる塩を含む療法的組み合わせも提供され、ここでそのプロスタサイクリン類似体およびＰＤＥ４阻害剤は、合わせて嚢胞性線維症と関係する少なくとも１種類の症状を処置および／または予防するのに十分である量で提供される。より具体的には、そのプロスタサイクリン類似体およびＰＤＥ４阻害剤は、吸入による投与のために配合される。
【００４５】
前記の療法的組成物は、代わりの態様によれば、ＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤およびＰＤＥ８阻害剤の群から選択される少なくとも１種類のさらなる阻害剤を含有することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１：トレプロスチニル単独との保温、またはＰＤＥ４阻害剤イブジラスト（１００μＭ）およびシロスタゾール（１００μＭ）との組み合わせでのトレプロスチニルとの保温の後のＩＢ３−１細胞中のｃＡＭＰの蓄積。
【図２】図２：ＰＤＥ４阻害剤ＲＯ−２０−１７２４（１００μＭ）およびロフルミラスト（１０μＭ）との組み合わせでのトレプロスチニルとの保温後のＩＢ３−１細胞中のｃＡＭＰの蓄積。
【図３】図３：ＣＦＴＲ−ｗｔを一過性に発現するヒト気管支上皮ＩＢ３−１細胞株におけるトレプロスチニルによるＣｌ電流の活性化。
【図４】図４：示された濃度のジピリダモール、イブジラスト、ＲＯ２０−１７２４またはロフルミラストの非存在下および存在下で１０μＭのトレプロスチニルにより刺激したＩＢ３−１細胞中のｃＡＭＰの蓄積。細胞を［３Ｈ］アデニンで４時間代謝的に前標識し、続いて示した化合物と共に３０分間保温した。［３Ｈ］ｃＡＭＰの形成を、材料および方法の下で概説するように決定した。データは平均±平均値の標準誤差である（ｎ＝３）。
【図５】図５：ＩＢ３−１細胞中のトレプロスチニルに誘導されるｃＡＭＰの蓄積に関する濃度−反応曲線。細胞を、示された濃度のイブジラスト、ＲＯ２０−１７２４またはロフルミラストの非存在下および存在下で増大する濃度のトレプロスチニルと共に保温した。細胞を［３Ｈ］アデニンで４時間代謝的に前標識し、続いて示した化合物と共に３０分間保温した。［３Ｈ］ｃＡＭＰの形成を、材料および方法の下で概説するように決定した。データは平均±平均値の標準誤差である（ｎ＝３）。
【図６】図６：選択されたホスホジエステラーゼ阻害剤のＩＢ３−１細胞中の基底ｃＡＭＰの蓄積への作用。細胞を［３Ｈ］アデニンで４時間代謝的に前標識し、続いて示した濃度のジピリダモール、Ｒｏ−２０−１７２４またはロフルミラストの非存在下（基底）および存在下で３０分間保温した。［３Ｈ］ｃＡＭＰのレベルを、材料および方法の下で概説するように決定した。データは平均±平均値の標準誤差である（ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
驚くべきことに、本発明者らは、ＰＤＥ４阻害剤との組み合わせでのプロスタサイクリンもしくは類似体またはその医薬的に許容できる塩を嚢胞性線維症を処置するために用いることができることを明らかにした。プロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体およびＰＤＥ４阻害剤の組み合わせは、特に冒されたヒトの気道上皮細胞において、単一の物質の使用と比較して、ｃＡＭＰの増大において相乗作用を有することが示された。前記の作用は、ＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤およびＰＤＥ８阻害剤から選択されるさらなるＰＤＥ阻害剤の存在によりさらに増進され得る。
【００４８】
合成プロスタサイクリン類似体は、例えばトレプロスチニル、イロプロスト、シカプロストまたはベラプロストであることができるが、それらに限定されない。
【００４９】
トレプロスチニルはＲｅｍｏｄｕｌｉｎ（商標）として市場に出されている。トレプロスチニルは（１Ｒ，２Ｒ，３ａＳ，９ａＳ）−［［２，３，３ａ，４，９，９ａ−ヘキサヒドロ−２−ヒドロキシ−１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシオクチル］−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］インデン−５−イル］オキシ］酢酸  一ナトリウム塩である。
【００５０】
イロプロストは“Ｉｌｏｍｅｄｉｎｅ”として市場に出されており、５−｛（Ｅ）−（１Ｓ，５Ｓ，６Ｒ，７Ｒ）−７−ヒドロキシ−６［（Ｅ）−（３Ｓ，４ＲＳ）−３−ヒドロキシ−４−メチル−１−オクテン−６−イニル］−ビ−シクロ［３．３．０］オクタン−３−イリデン｝ペンタン酸である。
【００５１】
ベラプロストは２，３，３ａ，８ｂ−テトラヒドロ−２−ヒドロキシ−１−（３−ヒドロキシ−４−メチル−１−オクテン−６−イニル）−１Ｈ−シクロペンタ（ｂ）ベンゾフラン−５−ブタン酸である。
【００５２】
シカプロストは２−［（２Ｅ）−２−［（３ａＳ，４Ｓ，５Ｒ，６ａＳ）−５−ヒドロキシ−４−［（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−メチルノナ−１，６−ジイニル］−３，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ペンタレン−２−イリデン］エトキシ］酢酸である。
【００５３】
プロスタサイクリン、ＰＤＥ４阻害剤、およびＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤またはＰＤＥ８阻害剤に関して、本発明によれば、用語“プロスタサイクリン類似体”、“阻害剤類似体”または“ＰＤＥ４阻害剤類似体、ＰＤＥ５阻害剤類似体、ＰＤＥ７阻害剤類似体またはＰＤＥ８阻害剤類似体”は前記の物質の誘導体または類似体を意味する。用語“類似体”または“誘導体”は、構造および機能において別の化学物質に類似しており、しばしば単一の元素または基により構造的に異なっている化学分子に関し、それは、それが親化学物質と同じ機能を保持している場合、１個より多くの基（例えば２、３、または４個の基）の修飾により異なっていてよい。そのような修飾は当業者にはルーチン的であり、例えば追加の、または置換された化学的部分、例えば酸のエステルまたはアミド、保護基、例えばアルコールまたはチオールに関するベンジル基、およびアミンに関するｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ）基が含まれる。アルキル側鎖に対する修飾、例えばアルキル置換（例えばメチル、ジメチル、エチル等）、側鎖の飽和または不飽和のレベルに対する修飾、および修飾された基、例えば置換されたフェニルおよびフェノキシの付加も含まれる。誘導体にはコンジュゲート、例えばビオチンまたはアビジン部分、酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ等、および放射標識、生物発光、化学発光、または蛍光部分も含まれ得る。さらに、本明細書で記述される薬剤に、それらの薬物動態特性を変化させるための、例えば数ある望ましい特性の中でも、インビボもしくはエキソビボでの半減期を増大させるための、またはそれらの細胞浸透特性を増大させるための部分を付加することができる。プロドラッグも含まれ、それは医薬の数多くの望ましい特性（例えば可溶性、生物学的利用能、製造等）を高めることが知られている。用語“誘導体”には、その範囲内に、機能的に同等の、または機能的に向上した分子を提供する、付加、欠失、および／または置換が含まれる、親配列に対してなされた変更も含まれる。
【００５４】
適切なプロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体の誘導体には、トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロストまたはベラプロストの酸誘導体、プロドラッグ、持続放出形態、吸入される形態および経口形態が含まれるが、それらに限定されない。
【００５５】
本発明の特定の態様によれば、そのトレプロスチニル誘導体は、トレプロスチニルの酸誘導体、プロドラッグ、多形体または異性体の群から選択される。
【００５６】
同様に、イロプロスト、シカプロストまたはベラプロスト誘導体は、それらからの酸誘導体、プロドラッグ、多形体または異性体であることができる。プロスタサイクリン誘導体という用語には、その医薬的に許容できる塩類も含まれる。この発明のプロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体の医薬的に許容できる塩は、酸（ａｃｉｄｉｃ）およびその化合物の塩基性基（例えばアミノ官能基）、または塩基およびその化合物の酸性基（例えばカルボキシル官能基）の間で形成され得る。
【００５７】
具体的には、プロスタサイクリン類似体の生理的に許容できる塩類には塩基に由来する塩類が含まれる。塩基塩類には、アンモニウム塩類（例えば第四級アンモニウム塩類）、アルカリ金属塩類、例えばナトリウムおよびカリウムの塩類、アルカリ土類金属塩類、例えばカルシウムおよびマグネシウムの塩類、有機塩基、例えばジシクロヘキシルアミンおよびＮ−メチル−Ｄ−グルカミンとの塩類、ならびにアミノ酸、例えばアルギニンおよびリシンとの塩類が含まれる。
【００５８】
具体的には、トレプロスチニルの使用が本発明に従って好都合である。トレプロスチニルは、嚢胞性線維症の患者の肺の上皮細胞におけるΔＦ５０８  ＣＦＴＲの発現および／または塩素イオンチャンネルの機能を首尾よく増進することができる。
【００５９】
驚くべきことに、ＰＤＥ４阻害剤との組み合わせでの、ならびに場合によりＰＤＥ５阻害剤および／またはＰＤＥ７阻害剤および／またはＰＤＥ８阻害剤との組み合わせでのプロスタサイクリン類似体は、気管支上皮細胞におけるｃＡＭＰ産生および／またはｃＡＭＰ含有量の増大の相乗的刺激をもたらすことが示されている。
【００６０】
興味深いことに、アナグレリドおよびシロスタゾールのようなＰＤＥ３阻害剤は実験ではｃＡＭＰの蓄積を一切誘導しなかった。
【００６１】
ＩＰ受容体を通してｃＡＭＰの産生を刺激するこの能力、および少数の細胞型（例えば上皮肺細胞）に対するＩＰ受容体の限られた存在を考慮すると、プロスタサイクリンまたはその類似体、例えばトレプロスチニルは、特定の様式でＣＦＴＲおよびｍｕｔＣＦＴＲの発現およびゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）を誘導する可能性があり、それは特に気道上皮内のｃＡＭＰレベルにおける長続きする増大を誘導するために前記のＰＤＥ４阻害剤と組み合わせた場合にＣＦの処置のために用いることができる。
【００６２】
さらなる態様によれば、前記のｃＡＭＰの増大はさらに、ＰＤＥ４阻害剤の、ＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤および／またはＰＤＥ８阻害剤の群からのさらに選択されたＰＤＥ阻害剤との組み合わせにより誘導することができる。
【００６３】
ＰＤＥ４阻害剤はＣＯＰＤおよび喘息の処置に関して承認されており；ＣＯＰＤおよび喘息における主な標的は、気道を覆っている平滑筋細胞の反応亢進を低減することである。平滑筋細胞においてｃＡＭＰレベルを上げることは、ミオシン軽鎖キナーゼへの作用により平滑筋の弛緩を引き起こすことが長い間知られてきた。加えて、ＰＤＥ４阻害剤は単球、好酸球および好塩基球顆粒球、ＢおよびＴ細胞、例えば炎症細胞を標的とすることによりアレルギー性喘息を駆動する免疫応答を低減すると考えられている。これらの２つの機構はいずれも嚢胞性線維症における作用様式としては関連がない。嚢胞性線維症では、全く異なる細胞区画、すなわち気道上皮においてｃＡＭＰレベルを上げなければならない。実際、我々の知識の及ぶ限りでは、ＰＤＥ４が気道上皮内で受容体に媒介されるｃＡＭＰの蓄積を増進する関連のあるイソ型であることを示す科学的な報告はなされていない。
【００６４】
本発明によれば、ＰＤＥ４酵素に対して阻害活性を有するあらゆるＰＤＥ４阻害剤またはその類似体を用いることができる。従って、ＰＤＥ４阻害剤がさらに他のＰＤＥ酵素も阻害することができることは除外されない。
【００６５】
具体的には、そのＰＤＥ４阻害剤は特異的なＰＤＥ４阻害剤であり得る。
【００６６】
本発明のＰＤＥ４阻害剤は、Ｒｏ２０−１７２４、イブジラスト、ロフルミラスト（３−（シクロプロピルメトキシ）−Ｎ−（３，５−ジクロロピリミジン−４−イル）−４−（ジフルオロメトキシ）ベンズアミド）およびそのＮ−オキシド、シロミラスト、ＢＡＹ１９−８００４、ＣＣ３、ＡＷＤ１２−２８１（Ｎ−（３，５−ジクロロ−４−ピリジニル）−２−［１−（４−フルオロベンジル）−５−ヒドロキシ−１Ｈ−インドール−３−イル］−２−オキソアセトアミド）、ＳＣＨ３５１５９１（Ｎ−（３，５−ジクロロ−１−オキシド−４−ピリジニル）−８−メトキシ−２−（トリフルオロメチル）−５−キノリンカルボキサミド）、シクラミラスト、ピクラミラスト、ＣＧＨ２４６６、メセンブリン、ロリプラム、ルテオリンおよびドロタベリンまたはそれらの機能的類似体であることができるが、それらに限定されない。
【００６７】
より具体的には、具体的にはＣＦを患う人の気管支上皮細胞中のｃＡＭＰレベルを上げることによる、ＣＦの予防または処置の使用のための組成物は、具体的にはトレプロスチニルおよびロフルミラストまたはトレプロスチニルおよびイブジラストまたはトレプロスチニルおよびＲｏ−２０−１７２４を含むことができる。ＰＤＥ５阻害剤は、平滑筋細胞における環状ヌクレオチド二次メッセンジャーのレベルを増大させることが示されている。
【００６８】
本発明によれば、ＰＤＥ５酵素に対して阻害活性を有するあらゆるＰＤＥ５阻害剤またはその類似体を用いることができる。従って、ＰＤＥ５阻害剤がさらに他のＰＤＥ酵素も阻害することができることは除外されない。
【００６９】
本発明によれば、そのＰＤＥ５阻害剤は具体的にはアバナフィル（４−［（３−クロロ−４−メトキシベンジル）アミノ］−２−［２−（ヒドロキシメチル）−１−ピロリジニル］−Ｎ−（２−ピリミジニルメチル）−５−ピリミジンカルボキサミド）、ロデナフィル（ビス−（２−｛４−［４−エトキシ−３−（１−メチル−７−オキソ−３−プロピル−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−ベンゼンスルホニル］ピペラジン−１−イル｝−エチル）カーボネート）、ミロデナフィル（５−エチル−３，５−ジヒドロ−２−［５−（［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］スルホニル）−２−プロポキシフェニル］−７−プロピル−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン）、クエン酸シルデナフィル（１−［４−エトキシ−３−（６，７−ジヒドロ−１−メチル−７−オキソ−３−プロピル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）フェニルスルホニル］−４−メチルピペラジン）、タダラフィル（６Ｒ−トランス）−６−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチル−ピラジノ［１’，２’：１，６］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン）、バルデナフィル（４−［２−エトキシ−５−（４−エチルピペラジン−１−イル）スルホニル−フェニル］−９−メチル−７−プロピル−３，５，６，８−テトラザビシクロ［４．３．０］ノナ−３，７，９−トリエン−２−オン）またはウデナフィル（３−（１−メチル−７−オキソ−３−プロピル−４，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−Ｎ−［２−（１−メチルピロリジン−２−イル）エチル］−４−プロポキシベンゼンスルホンアミド）またはそれらのあらゆる機能的類似体から選択することができる。
【００７０】
本発明の特定の態様において、その組成物はトレプロスチニル、ロフルミラストおよび場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤、またはトレプロスチニル、イブジラストおよび場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤、またはトレプロスチニル、Ｒｏ−２０−１７２４および場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤を含んでいてよい。
【００７１】
本発明のさらなる態様において、その組成物はベラプロスト、ロフルミラストおよび場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤、またはベラプロスト、イブジラストおよび場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤、またはベラプロスト、Ｒｏ−２０−１７２４および場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤を含んでいてよい。
【００７２】
本発明のさらなる態様において、その組成物はイロプロスト、ロフルミラストおよび場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤、またはイロプロスト、イブジラストおよび場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤、またはイロプロスト、Ｒｏ−２０−１７２４および場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤を含んでいてよい。
【００７３】
本発明のさらなる態様において、その組成物はシカプロスト、ロフルミラストおよび場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤、またはシカプロスト、イブジラストおよび場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤、またはシカプロスト、Ｒｏ−２０−１７２４および場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤を含んでいてよい。
【００７４】
本発明によれば、ＰＤＥ７酵素またはＰＤＥ８酵素に対して阻害活性を有するあらゆるＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤またはその類似体を用いることができる。従って、ＰＤＥ７阻害剤またはＰＤＥ８阻害剤がさらに他のＰＤＥ酵素も阻害することができることは除外されない。
【００７５】
本発明によれば、そのＰＤＥ７阻害剤は具体的にはジピリダモールおよびＢＲＬ５０４８１から選択することができる。
【００７６】
本発明によれば、そのＰＤＥ８阻害剤は具体的には１，５−置換ニペコチン酸アミド類（ｎｉｐｅｃｏｔｉｃ  ａｍｉｄｅｓ）およびＰＦ−４９５７３２５から選択することができる。
【００７７】
本発明の代わりの態様において、その組成物は具体的にはトレプロスチニル、ロフルミラストおよびジピリダモール、またはトレプロスチニル、イブジラストおよびジピリダモール、またはトレプロスチニル、Ｒｏ−２０−１７２４およびジピリダモールを含んでいてよい。
【００７８】
本発明のさらなる代わりの態様において、その組成物は具体的にはベラプロスト、ロフルミラストおよびジピリダモール、またはベラプロスト、イブジラストおよびジピリダモール、またはベラプロスト、Ｒｏ−２０−１７２４およびジピリダモールを含んでいてよい。
【００７９】
本発明のその上さらなる代わりの態様において、その組成物は具体的にはイロプロスト、ロフルミラストおよびジピリダモール、またはイロプロスト、イブジラストおよびジピリダモール、またはイロプロスト、Ｒｏ−２０−１７２４およびジピリダモールを含んでいてよい。
【００８０】
本発明のさらなる態様において、その組成物は具体的にはシカプロスト、ロフルミラストおよびジピリダモール、またはシカプロスト、イブジラストおよびジピリダモール、またはシカプロスト、Ｒｏ−２０−１７２４およびジピリダモールを含んでいてよい。
【００８１】
あるいは、その組成物はトレプロスチニル、ロフルミラストおよびＢＲＬ５０４８１、またはトレプロスチニル、イブジラストおよびＢＲＬ５０４８１、またはトレプロスチニル、Ｒｏ−２０−１７２４およびＢＲＬ５０４８１を含んでいてよい。
【００８２】
あるいは、その組成物は具体的にはトレプロスチニル、ロフルミラストおよびＰＦ−４９５７３２５、またはトレプロスチニル、イブジラストおよびＰＦ−４９５７３２５、またはトレプロスチニル、Ｒｏ−２０−１７２４およびＰＦ−４９５７３２５を含んでいてよい。
【００８３】
本発明によれば、用語“少なくとも１”または“ａ”は、１タイプのプロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体および１タイプのＰＤＥ４阻害剤および場合により１種類以上のＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤またはＰＤＥ８阻害剤が、嚢胞性線維症の処置または予防における使用のために、具体的には気管支上皮細胞中のｃＡＭＰレベルを増大させるための使用のために存在していることを意味する。しかし、あるいは、その組成物は、１タイプより多くのプロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体および１タイプより多くのＰＤＥ４阻害剤および場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤またはＰＤＥ８阻害剤の１つ以上、具体的には２タイプ、３タイプ、４タイプもしくは４タイプより多くの、またはあらゆる組み合わせのプロスタサイクリン類またはプロスタサイクリン類似体ならびにＰＤＥ４阻害剤ならびに場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤および／またはＰＤＥ８阻害剤を含んでいてもよい。
【００８４】
本発明はさらに、トレプロスチニルならびにＲＯ２０−１７２４、ロフルミラストおよびイブジラストの群から選択される１種類以上のＰＤＥ４阻害剤を含む特異的な組成物を提供する。
【００８５】
本発明の組成物は医薬組成物として配合することができる。
【００８６】
本発明の組成物は投与のために用いることができるあらゆる形態中に存在することができる。
【００８７】
療法的または予防的作用を得るためにこの発明に従って投与される化合物の具体的な用量は、当然、例えば投与経路、個々の患者の年齢、体重および応答、処置されている病気ならびにその患者の症状の重症度が含まれる、その症例を取り巻く個々の状況により決定されるであろう。
【００８８】
一般に、本発明の化合物は、最も望ましくは、重大な副作用を一切引き起こすことなく有効な結果を一般にもたらすであろう濃度で投与され、単一の単位用量として投与することができ、または望まれるならばその投与量を一日全体を通して適切な回数で投与される好都合な小単位に分けることもできる。
【００８９】
その組成物は様々な全身用および局所用配合物中で提供することができる。本発明の全身用または局所用配合物は、経口用、頬内用（ｉｎｔｒａｂｕｃｃａｌ）、肺内用、直腸用、子宮内用、皮内用、局所用、皮膚用、非経口用、腫瘍内用、頭蓋内用、肺内用、バッカル用、舌下用、経鼻用、皮下用、脈管内用、髄腔内用、吸入用、呼吸用、関節内用、腔内用、埋め込み式、経皮用、イオン注入用、眼内用、点眼用、腟用、光学的（ｏｐｔｉｃａｌ）、静脈内用、筋内用、腺内用、臓器内用、リンパ管内用（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃ）、徐放性、および腸溶コーティング配合物の群から選択される。これらの様々な配合物の実際の調製および調剤は当該技術で既知であり、本明細書で詳しく述べる必要はない。その組成物は１日に１回または数回投与することができる。
【００９０】
呼吸器、経鼻、肺内、および吸入投与に適した配合物は、局所、経口および非経口用配合物と同様に好ましい。一般に、その配合物は、その有効化合物を均一かつ密接に液体キャリヤー、微細に分割された固体キャリヤー、または両方と会合した状態にして、必要であればその生成物を望まれる配合物へと成形することにより調製される。
【００９１】
経口投与に適した組成物は、それぞれがその組成物を粉末もしくは顆粒として含有する別個の単位、例えばカプセル、カシェ剤（ｃａｃｈｅｔｓ）、ロゼンジ、または錠剤中で；水性もしくは非水性の液体中の溶液もしくは懸濁液として；または水中油もしくは油中水型エマルジョンとして与えられてよい。
【００９２】
非経口投与に適した組成物は、その有効化合物の滅菌水性および非水性注射溶液を含み、その製剤は好ましくは受容者の血液と等張である。これらの製剤は抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤およびその組成物を受容者の血液と等張にする溶質を含有していてよい。水性および非水性滅菌懸濁液には懸濁化剤および増粘剤が含まれていてよい。その組成物は単位用量または多数回用量の容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中で与えられてよく、使用前に滅菌液体キャリヤー、例えば生理食塩水または注射用水の添加のみを必要とする冷凍乾燥または凍結乾燥された状態で保管されてよい。
【００９３】
経鼻および点滴注入用（ｉｎｓｔｉｌｌａｂｌｅ）配合物は、その有効化合物の精製された水溶液を保存剤および等張剤と共に含む。そのような配合物は、好ましくは鼻粘膜と適合性のｐＨおよび等張状態に調節される。
【００９４】
本発明に従って開示される組成物は、あらゆる適切な手段による対象の吸入、呼吸、経鼻投与または（肺中への）肺内点滴注入（ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）のいずれにより呼吸器系中に投与することもでき、そして好ましくは粉末状または液体の経鼻用、肺内用、呼吸用または吸入用粒子からなるエアロゾルまたはスプレーを生成することにより投与される。有効化合物を含む呼吸用または吸入用粒子は、対象により、例えば吸入により、または経鼻投与により、または呼吸器管もしくは肺自体中への点滴注入により吸入される。その配合物は有効化合物の呼吸可能または吸入可能な液体または固体粒子を含んでいてよく、それには、本発明に従って、吸入の際に口および喉頭を通過し、続いて気管支および肺胞内中に入るのに十分に小さい大きさの呼吸可能または吸入可能な粒子が含まれる。一般に、粒子の直径は、約０．０５、約０．１、約０．５、約１、約２から約４、約６、約８、約１０ミクロンまでの範囲である。より詳細には、直径約０．５〜約５μｍ未満が呼吸可能または吸入可能である。エアロゾルまたはスプレー中に含まれる呼吸不能な大きさの粒子は、喉において堆積して飲み込まれる傾向がある。従って、エアロゾル中の呼吸不能な粒子の量は好ましくは最小化される。経鼻投与または肺内点滴注入に関して、鼻腔中での保持を確実にするために、または肺中への点滴注入および直接的な堆積のために、直径約８、約１０、約２０、約２５〜約３５、約５０、約１００、約１５０、約２５０、約５００μｍの範囲の粒径が好ましい。液体配合物は、特に新生児および小児に投与される場合、呼吸器管または鼻および肺中に吹きかける（ｓｑｕｉｒｔｅｄ）ことができる。
【００９５】
有効化合物を含む液体粒子のエアロゾルは、あらゆる適切な手段により、例えばネブライザーを用いて生成することができる。ネブライザーは、有効成分の溶液または懸濁液を、圧縮ガス、典型的には空気または酸素のどちらかの加速により療法用エアロゾルの霧に変換する、商業的に入手可能な装置である。ネブライザーにおける使用のための適切な組成物は液体キャリヤー中の有効成分からなり、その有効成分は組成物の４０重量％までを構成するが、好ましくはキャリヤーの２０重量％未満は典型的には水または希釈水性アルコール溶液であり、それは好ましくは例えば塩化ナトリウムの添加により体液と等張にされている。任意の添加剤には、その組成物が滅菌で調製されていない場合には保存剤、例えばヒドロキシ安息香酸メチル、抗酸化剤、香味剤、揮発性油、緩衝剤および界面活性剤が含まれる。有効化合物を含む固形粒子のエアロゾルは、同様にあらゆる市販されている粒状薬剤エアロゾル発生器を用いて生成することができる。上記で説明したように、固形粒状薬剤を投与するためのエアロゾル発生器は、呼吸可能である粒子を製造し、予め決められた定量の用量の薬剤を含有する量のエアロゾルをヒトへの投与に適した速度で生成する。そのようなエアロゾル発生器の例には、定量用量吸入器および吹入れ器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒｓ）が含まれる。
【００９６】
１態様において、その送達装置はその組成物の１回量または多数回用量を送達する乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）を含む。１回量吸入器は１回の適用のための十分な配合物を滅菌的に予め装填した（ｐｒｅｌｏａｄｅｄ）使い捨てキットとして提供することができる。その吸入器は加圧型吸入器として提供することができ、その配合物は穿孔可能な（ｐｉｅｒｃａｂｌｅ）、または開封可能な（ｏｐｅｎａｂｌｅ）カプセルまたはカートリッジ中で提供することができる。そのキットは場合により、別個の容器中に、様々な配合物のための数ある適切な添加剤の中でも、他の療法化合物、賦形剤、界面活性剤（療法剤ならびに配合物成分として意図される）、抗酸化剤、香味および着色剤、充填剤、揮発性油、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、抗酸化剤、香味剤、増量剤、噴射剤および保存剤のような薬剤も含んでいてよい。
【００９７】
トレプロスチニルのようないくつかのプロスタサイクリン類似体の高い代謝安定性のため、またはそのプロスタサイクリン類もしくはプロスタサイクリン類似体に基づく脂質として、もしくはペグ化された形態として提供される場合、その物質はデポー薬剤として投与することもできる。
【００９８】
ＰＤＥ４阻害剤、ＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤およびＰＤＥ８阻害剤は代謝的に安定でもあり、従ってそのプロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体ならびに場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤またはＰＤＥ８阻害剤の１つ以上と一緒であるＰＤＥ４阻害剤の組み合わせは、デポー薬剤として配合することもできる。
【００９９】
その組成物のエアロゾル化された送達は、結果としてその薬剤の肺中でのより均一な分布をもたらし、従って肺の深部への送達が得られる可能性がある。それにより、その薬剤の肺中での作用部位における持続的な存在のため、適用の投与量を低減することができる。
【０１００】
その組成物は、例えばネブライザーにより与えることができる。ネブライザー送達法の利点は、全身循環に達する物質がより少ないことである。その組成物は１日に数回、例えば１日に５〜１０回与えることができるが、プロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体ならびに場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤および／またはＰＤＥ８阻害剤の１つ以上との組み合わせでのＰＤＥ４阻害剤の相乗作用により、その投与頻度を一般に低減することができる。
【０１０１】
その組成物は、当該技術で既知であるようなあらゆる医薬的に許容できる物質またはキャリヤーまたは賦形剤と共に投与することができる。これらは例えば水、ＮａＯＨ、ＫＯＨのような中和剤、安定剤、ＤＭＳＯ、生理食塩水、ベタイン、タウリン等であることができるが、それらに限定されない。
【０１０２】
用語“医薬的に許容できる”は、連邦政府もしくは州政府の規制当局により認可されていること、または米国において列挙されていることを意味する。
【０１０３】
用語“キャリヤー”は、それを用いて医薬組成物を投与する、希釈剤、補助剤、賦形剤またはビヒクルを指す。生理食塩水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注射用の溶液のための液体キャリヤーとして用いることができる。適切な賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。適切な医薬的キャリヤーの例がＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Remington's Pharmaceutical Sciences”において記述されている。その配合は投与方式に応じて選択されるべきである。
【０１０４】
あらゆる当業者は本発明の組成物の量を選択することができ、具体的にはプロスタサイクリン類もしくはプロスタサイクリン類似体またはそれらの医薬的に許容できる塩類の量、具体的にはトレプロスチニルの量は、少なくとも１．０ｎｇ／ｋｇ体重である。当業者はＰＤＥ４阻害剤またはＰＤＥ５阻害剤の量も容易に選択することができる。具体的には、ＰＤＥ４阻害剤またはＰＤＥ５阻害剤またはＰＤＥ７阻害剤またはＰＤＥ８阻害剤の量は、ロフルミラストに関して約０．５ｍｇまたはイブジラストに関して約３０ｍｇであり、１日あたり少なくとも１回、具体的には少なくとも２回／日である。
【０１０５】
本発明はさらに、細胞中のｃＡＭＰレベルを増大させるための方法を提供し、ここで前記の細胞は、少なくとも１種類のプロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体、および少なくとも１種類のＰＤＥ４阻害剤、および場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤またはＰＤＥ８阻害剤の少なくとも１つと接触される。前記の細胞中のｃＡＭＰの増大は、プロスタサイクリン、またはＰＤＥ４阻害剤、および／またはＰＤＥ５阻害剤もしくはＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤による単独処置と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％であることができる。
【０１０６】
少なくとも１種類のプロスタサイクリン類似体、ならびに少なくとも１種類のＰＤＥ４阻害剤、ならびに場合により少なくとも１種類のＰＤＥ５阻害剤および／またはＰＤＥ７阻害剤および／またはＰＤＥ８阻害剤を含む療法的組み合わせも提供され、ここでそのプロスタサイクリン類似体、ならびにＰＤＥ４阻害剤、および／またはＰＤＥ５阻害剤および／またはＰＤＥ７阻害剤および／またはＰＤＥ８阻害剤は、合わせて嚢胞性線維症と関係する少なくとも１種類の症状を処置および／または予防するのに十分である量で提供される。具体的には、ＣＦ患者の肺の上皮細胞中のｃＡＭＰレベルの増大は、本発明の療法的組み合わせ製剤を投与することにより達成され得る。具体的には、プロスタサイクリン類似体の少なくとも１種類、およびＰＤＥ４阻害剤、および場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤またはＰＤＥ８阻害剤の１つ以上が吸入による投与のために配合される。
【０１０７】
本発明の特定の態様において、嚢胞性線維症を処置するための併用療法が開示される。具体的な態様によれば、ＣＦを有する患者の気管支上皮細胞中の低減したｃＡＭＰレベルと関係する症状を、本発明の併用療法を用いることにより処置または予防することができる。おそらく、１種類以上の追加の薬剤を投与することもできる。
【０１０８】
そのプロスタサイクリンもしくはプロスタサイクリン類似体、およびＰＤＥ４阻害剤、および場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤は、例えば単一の錠剤もしくはカプセルもしくは吸入用配合物中で一緒に投与することができ、または本発明のＰＤＥ４阻害剤および場合により他のＰＤＥ阻害剤ならびに任意の追加の薬剤をそのプロスタサイクリンもしくはプロスタサイクリン類似体とは別に投与することができる。
【０１０９】
本発明はさらに、以下：（ｉ）有効量のプロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体、（ｉｉ）ＰＤＥ４阻害剤、具体的にはロフルミラスト、Ｒｏ−２０−１７２４またはイブジラスト、ならびに場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤およびＰＤＥ８阻害剤の群から選択される１種類以上の化合物、（ｉｉｉ）１種類以上の医薬的に許容できるキャリヤーおよび／または添加剤、ならびに（ｉｖ）対象、好ましくはヒトにおける嚢胞性線維症の処置または予防における使用のための説明書を含む、対象において嚢胞性線維症と関係する病気を処置または予防するためのキットおよびその使用を提供する。
【０１１０】
前記の構成要素（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、静脈内投与に、吸入に、または経口投与に適した形態であることができる。
【０１１１】
本明細書で記述される実施例は本発明の説明に役立つものであり、それに限定されることを意図していない。本発明の様々な態様が本発明に従って記述されてきた。多くの修正および変更を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書で記述および説明された技法に対して行うことができる。従って、その実施例は単に説明に役立つものであり、本発明の範囲に対する限定的なものではないことは理解されるべきである。
【実施例】
【０１１２】
実施例１：
ＩＢ３−１細胞を完全増殖培地（ＬＨＣ−８＋５％ＦＣＳ）中で６ウェルプレート（図１において０．２*１０６細胞／ウェル；図２において０．４*１０６細胞）上に蒔いた。次の日に、アデニンヌクレオチドのプールを、アデノシンデアミナーゼ（１単位／ｍｌ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で［３Ｈ］アデニン（１μＣｉ／ウェル）と共に４時間培養することにより、代謝的に標識した。その後、その培地を新しい培地と取り替え；細胞を（０．１から３０μＭまでの範囲の対数的に間隔を空けた濃度での）トレプロスチニルの単独添加または示した濃度のＰＤＥ阻害剤との組み合わせでのトレプロスチニルの添加により刺激した。３０分間保温した後、細胞を過塩素酸の添加により溶解させた。
【０１１３】
［３Ｈ］ｃＡＭＰの形成を、Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ−４および中性アルミナカラム上での順次のクロマトグラフィー、続いて溶離液の液体シンチレーション計数により決定した。そのアッセイを３通りで（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）実施した。
【０１１４】
その結果を図１および２において示す。図１および図２における最大応答の間の違いは、主に図２における細胞数／ウェルが図１において用いられた細胞数／ウェルの約２倍の高さであるという事実によるものである。
【０１１５】
実施例２：
ＩＢ３−１細胞は変異したＣＦＴＲ−ΔＦ５０８のみを内因的に発現し、それは細胞内で保持される。適切な操作（例えば薬理学的シャペロン（ｐｈａｒｍａｃｏ−ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ）または低温培養）を用いて、その変異体ＣＦＴＲ−ΔＦ５０８を小胞体からＥＲに移動させることが可能であり；細胞表面において挿入された場合、ｃＡＭＰを高めることによりＣｌ−コンダクタンスを刺激することができる。しかし、結果として生じるＣｌ−コンダクタンスは小さい。トレプロスチニルにより誘導されるｃＡＭＰの蓄積がＣＦＴＲの活性化へと変換されることを明確に証明するために、我々は野生型ＣＦＴＲのＧＦＰタグ化版を一過性に発現させた（そのＧＦＰタグは、細胞表面におけるそのタンパク質を発現する細胞の同定を可能にした）。図３から理解できるように、トレプロスチニルは−４０ｍＶの保持電位から＋６０ｍＶへの脱分極により誘導される電流の強い活性化を引き起こした。その最大の作用は遅延し、すなわち、それはその化合物のウォッシュイン（ｗａｓｈ−ｉｎ）の数秒後にようやく観察された。同様に、オフになる（ｔｕｒｎ−ｏｆｆ）反応におけるヒステリシスもあり；その電流はウォッシュアウトの約１００秒後にようやく基底へと減衰した。これらの遅延した応答は、（ｉ）シグナル伝達カスケード（すなわち、受容体依存性のＧｓの活性化、Ｇαｓ依存性のｃＡＭＰ形成の活性化、および続いて起こるプロテインキナーゼＡ依存性のＣＦＴＲのリン酸化）への干渉および（ｉｉ）ホスホジエステラーゼ類による増大したｃＡＭＰの非活性化の遅延を反映している。類似の遅延は、細胞を陽性対照として用いられたアデニリルシクラーゼの直接的な活性化剤であるフォルスコリンで刺激した場合にも見られた。
【０１１６】
これらの観察は、トレプロスチニルが気管支上皮細胞においてＣＦＴＲを活性化することができることを証明している。
【０１１７】
方法：
電気生理学
ホールセルパッチクランプ技法を利用して、Ａｘｏｃｌａｍｐ  ２００Ｂパッチクランプ用増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて２２±１．５℃で電流の記録を実施した。ピペットは、記録ピペット溶液（組成：１１０ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  Ｋ２．ＡＴＰ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨをＣｓＯＨを用いて７．２に調整した）を充填した際、１〜２ＭΩの抵抗を有した。電圧固定プロトコルおよびデータ取得を、ｐｃｌａｍｐ  ６．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて実施した。データは２ｋＨｚ（−３ｄＢ）で低域フィルタをかけられ、１０〜２０ｋＨｚでデジタル化された。細胞を連続的に外部溶液で灌流した（組成：１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、４．５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  グルコース、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨをＮａＯＨを用いて７．４に調整した）。示されている場合、その外部溶液はトレプロスチニル（１０μＭ）またはフォルスコリン（５μＭ）を含有し、溶液間の切り替えは電子制御式圧力弁により達成された。
【０１１８】
実施例１の結果に基づいて、トレプロスチニルをＰＤＥ４阻害剤またはＰＤＥ５阻害剤、例えば１０μＭロフルミラストまたは１００μＭイブジラストまたは１０〜１００μＭタダラフィルもしくはシルデナフィルもしくはバルデナフィルと組み合わせた場合、持続的な応答が期待される。
【０１１９】
細胞培養：
ＩＢ３−１細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＬＨＣ−８培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、フィブロネクチン（１０μｇ／ｍＬ）、ラットコラーゲンＩ（３０μｇ／ｍＬ）、およびＢＳＡ（１０μｇ／ｍＬ）で覆われたディッシュ（Ｎｕｎｃ、直径３．５ｃｍ）上で増殖させた。細胞を、ヒトのＧＦＰタグ化野生型ＣＦＴＲの発現を駆動するプラスミドで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｐｌｕｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って用いることにより、一過性に形質移入した。
【０１２０】
代表的な電流の振幅を、＋６０ｍＶでのホールセルパッチクランプ構成において記録した。ＧＦＰタグ化野生型ＣＦＴＲを発現する一過性に形質移入されたＩＢ３−１細胞を蛍光灯下で選択し、−４０ｍＶにおける保持電圧に固定した。＋６０ｍＶへの５０ミリ秒間の電圧段階により脱分極を誘導し、電流振幅を記録した。トレプロスチニル（１０μＭの終濃度、ＴＰ）のウォッシュインを５０秒の時点で開始し、１２５秒の時点で終了させた。フォルスコリンを２７５秒の時点でウォッシュインし、３７５秒の時点で除去した。結果を図３において示す。
【０１２１】
実施例３
導入
以前の観察は、ヒトの気道上皮細胞において、トレプロスチニルに誘導されるｃＡＭＰの蓄積がホスホジエステラーゼ−４（ＰＤＥ４）イソ型の阻害剤により特異的に増進されることを示した。
【０１２２】
材料および方法
細胞株および細胞培養：
以下のヒト気管支上皮細胞株をＡＴＣＣにより得た：ＢＥＡＳ−２Ｂ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６０９）、ＮｕＬｉ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−４０１１）、ＩＢ３−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２７７７）、ＣｕＦｉ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−４０１３）。細胞をＡＴＣＣの推奨において概説されている培養条件を用いて増殖させ、例えばＩＢ３−１細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＬＨＣ−８培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、フィブロネクチン（１０μｇ／ｍＬ）、ラットコラーゲンＩ（３０μｇ／ｍＬ）、およびＢＳＡ（１０μｇ／ｍＬ）でコートされたディッシュ上で、３７℃において、５％ＣＯ２の加湿した雰囲気中で維持した。ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、３７℃において、５％ＣＯ２の加湿した雰囲気中で、ＢＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ）中で、コラーゲンＩＶ（０．２５％酢酸中６０μｇ／ｍｌ）で予めコートされたディッシュ上で維持し；そのＢＥＧＭキットと共に提供されたＧＡ−１０００（ゲンタマイシン−アンホテリシンＢ混合物）はその培地に添加しなかった。ＣＦＴＲの内因性発現のレベルは低すぎて、信頼できるシグナルを得られなかった。従って、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、ヒトのＧＦＰタグ化野生型ＣＦＴＲの発現を駆動するプラスミドで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｐｌｕｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って用いることにより、一過性に形質移入した。このＧＦＰタグ化ＣＦＴＲを発現する細胞を蛍光顕微鏡法により同定し、それに対して下記で概説するようなパッチクランプ記録を行った。
【０１２３】
ｃＡＭＰ蓄積アッセイ：
ＩＢ３−１細胞を完全増殖培地（ＬＨＣ−８＋５％ＦＣＳ）中で６ウェルプレートのＰＤＬでコートされたウェル上に蒔いた（２〜２．５*１０５細胞／ウェル）。次の日に、細胞のアデニンヌクレオチドのプールを、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でアデノシンデアミナーゼ（５μｇ／ｍｌ）の存在下で［３Ｈ］アデニン（１μＣｉ／ウェル）と共に４時間培養することにより、代謝的に標識した。その後、その培地を新しいＤＭＥＭと取り替え、ｃＡＭＰの形成を、異なる濃度の以下のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤：イブジラスト（０．３〜１０００μＭ）、Ｒｏ−２０−１７２４（０．０３〜３００μＭ）、ロフルミラスト（１ｎＭ〜１０μＭ）、ジピリダモール（０．０１〜１００μＭ）、アムリノン（１、１０、１００μＭ）、アナグレリド（１、１０、１００μＭ）、エノキシモン（１、１０、１００μＭ）、ミルリノン（１、１０、１００μＭ）およびシロスタゾール（０．１〜１００μＭ）の非存在下および存在下で、５μＭのフォルスコリン（アデニリルシクラーゼの直接的な活性化剤）または１０μＭのトレプロスチニルの添加により、３７℃で２０分間刺激した。一部の場合において、これらの阻害剤の基底ｃＡＭＰ蓄積への作用は、細胞を一切の追加の刺激の非存在下で、増大する濃度のＰＤＥ阻害剤（すなわち、１、１０および１００μＭでのジピリダモール、イブジラストおよびＲｏ−２０−１７２４；０．１、１および１０μＭでのロフルミラスト）と共に培養することにより調べた。トレプロスチニルに関する濃度反応曲線は、トレプロスチニル（０．１〜３０μＭ）を単独で、または１００μＭのＲｏ−２０−１７２４、１００μＭのイブジラストもしくは５μＭのロフルミラストとの組み合わせで添加することにより得られた。その３通りで実施された反応を、２．５％過塩素酸を０．１ｍＭの（未標識の）ｃＡＭＰと一緒に添加することにより停止した。［３Ｈ］ｃＡＭＰを、Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ−４および中性アルミナカラム上での順次のクロマトグラフィーにより単離した。［３Ｈ］ｃＡＭＰの形成を、液体シンチレーション計数により定量化した。
【０１２４】
電気生理学−パッチクランプ記録：
ホールセルパッチクランプ技法を利用して、Ａｘｏｃｌａｍｐ  ２００Ｂパッチクランプ用増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて２２±１．５℃で電流の記録を実施した。ピペットは、記録ピペット溶液（組成：１１０ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  Ｋ２．ＡＴＰ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨをＣｓＯＨを用いて７．２に調整した）を充填した際、１〜２ＭΩの抵抗を有した。電圧固定プロトコルおよびデータ取得を、ｐｃｌａｍｐ  ６．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて実施した。データは２ｋＨｚ（−３ｄＢ）で低域フィルタをかけられ、１０〜２０ｋＨｚでデジタル化された。細胞を連続的に外部溶液で灌流した（組成：１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、４．５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  グルコース、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨをＮａＯＨを用いて７．４に調整した）。示されている場合、その外部溶液はトレプロスチニル（１０μＭ）またはフォルスコリン（５μＭ）を含有し、溶液間の切り替えは電子制御式圧力弁により達成された。
【０１２５】
ホスホジエステラーゼ阻害剤の非存在下および存在下におけるＩＢ３−１細胞株中のｃＡＭＰの蓄積：
ＰＤＥイソ型の調査は、ＰＤＥ阻害剤はヒト気管支上皮細胞中のｃＡＭＰの蓄積に対して著しい作用を有するはずであることを予測する。加えて、この分析はホスホジエステラーゼ類の更なるイソ型の存在に関する証拠も提供した。従って、ＰＤＥ−４選択的阻害剤であるロフルミラストおよびイブジラストを試験し、それらの作用を以下のいくつかの更なるＰＤＥ阻害剤の作用と比較した：ＲＯ２０−１７２４、ＰＤＥ４優先性を有する非選択的ＰＤＥ阻害剤；ジピリダモール、それは受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター−１および−２（ＥＮＴ１およびＥＮＴ２）を遮断し、加えてＰＤＥ５、ＰＤＥ７Ａ、ＰＤＥ８Ａ、ＰＤＥ１０ＡおよびＰＤＥ１１を阻害する（Soderling et al., 1998; Hetman et al., 2000a&b; Omori & Kotera, 2007）。アムリノン、ミルリノンおよびシロスタゾール、それらはＰＤＥ３イソ型の選択的阻害剤である；アナグレリド、それはＰＤＥ２およびＰＤＥ３を阻害する。イブジラストはロフルミラストよりも選択性が低く、ＰＤＥ１０イソ型およびＰＤＥ１１イソ型も阻害する。そのアプローチはｃＡＭＰレベルの制御に焦点を合わせた；従って、ｃＧＭＰ特異的酵素ＰＤＥ５、ＰＤＥ６およびＰＤＥ９はそれ以上考慮しなかった（Bender & Beavo, 2006; Omori & Kotera, 2007）。
【０１２６】
細胞は典型的にはアデニリルシクラーゼの多くのイソ型を発現する。多くの場合において、Ｇｓに共役している受容体は細胞のアデニリルシクラーゼ類のプール全体に対するアクセスを有しない。対照的に、フォルスコリンはアデニリルシクラーゼの全てのイソ型を刺激する。ホスホジエステラーゼ阻害の非存在下では、ｃＡＭＰは、それが定常状態において低いレベルまでしか蓄積しないように、急速に加水分解される。ホスホジエステラーゼの阻害は結果としてｃＡＭＰの蓄積をもたらす。ロフルミラスト、イブジラスト、ジピリダモールおよびＲＯ２０−１７２４は、５μＭのフォルスコリンにより誘発されるｃＡＭＰの蓄積を実質的に増進する。ロフルミラストは最も強力な阻害剤であり、ジピリダモールは強さがより低い阻害剤である。イブジラストおよびＲＯ２０−１７２４は、ロフルミラストよりも有効である。まとめると、これらのデータはＰＤＥ４イソ型がｃＡＭＰの加水分解に大きな程度まで寄与していることを示唆した。ｃＡＭＰの蓄積がトレプロスチニルにより誘発された場合、全ての阻害剤に関する濃度反応曲線は左にシフトした。この左へのシフトは、受容体刺激により生成されたｃＡＭＰがホスホジエステラーゼ類による分解に対してより容易にアクセス可能であることを示している。１つの可能性のある説明は、ホスホジエステラーゼ類の受容体の近傍における係留（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）である（Francis et al., 2011）。ジピリダモールのより高い有効性は、ＰＤＥ８またはＰＤＥ１０による寄与の可能性も示唆している。ホスホジエステラーゼ阻害剤の主な作用はｃＡＭＰの蓄積を増進することであり：一方でＥｍａｘ（すなわち、最大作用の増大）、作動薬の見かけ上の親和性（すなわちそのＥＣ５０）はシフトしない。
【０１２７】
外因性に添加された作動薬の（またはフォルスコリンの）非存在下では、ＰＤＥ阻害剤はそれ自体ではｃＡＭＰの蓄積における認識できるほどの増大を一切引き起こさない。これは想定内であり；アデニリルシクラーゼの基底活性は非常に低く、それはｃＡＭＰの形成を触媒するために受容体依存性のＧｓの活性化による入力を必要とする。しかし、細胞培養条件下では−すなわち限定培地中では−作動薬が一切存在しない。
【０１２８】
ＰＤＥ阻害はトレプロスチニルに誘導されるＣＦＴＲを通るＣｌ−電流を増進する：
ＰＤＥ４イソ型の阻害はトレプロスチニルに誘導されるｃＡＭＰの蓄積を増進したため、この操作はトレプロスチニルの嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子／Ｃｌ−チャンネル（ＣＦＴＲ）を通る塩素イオン電流への作用を増進すると予想された。これは事実であり：トレプロスチニルはＣＦＴＲの持続的な活性化を引き起こし；その結果として生じた外向きの電流を−２０から−８０ｍＶへの電圧ジャンプにより検出することができる。ロフルミラストの（ならびに他のＰＤＥ４阻害剤、例えばイブジラストおよびＲＯ２０−１７２４の）添加は、その電流の更なる増大を引き起こした。その電流は、特異的阻害剤により可逆的に遮断されることから、ＣＦＴＲによって運ばれている。
【０１２９】
結論
１）ヒト気道上皮細胞は、トレプロスチニルにより標的化されてｃＡＭＰを上昇させ、それによりヒト気道上皮細胞におけるＣＦＴＲを活性化することができるいくつかの受容体を発現している。
【０１３０】
２）ＰＤＥ４イソ型がヒト気道上皮細胞中に存在し、ＰＤＥ４阻害剤はトレプロスチニ
ルに対する応答を有効に増大させる。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］少なくとも１種類のプロスタサイクリンもしくはプロスタサイクリン類似体またはそれらの医薬的に許容できる塩および少なくとも１種類のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）４阻害剤を含む、嚢胞性線維症の予防または処置における使用のための組成物。
［態様２］前記プロスタサイクリン類似体が、トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロストもしくはベラプロストまたはそれらの医薬的に許容できる塩類の群から選択される、態様１に記載の組成物。
［態様３］前記プロスタサイクリン類似体が、トレプロスチニルの酸誘導体、トレプロスチニルのプロドラッグ、トレプロスチニルの多形体またはトレプロスチニルの異性体の群から選択される、態様１または２に記載の組成物。
［態様４］前記ＰＤＥ４阻害剤が、Ｒｏ２０−１７２４、イブジラスト、ロフルミラストおよびそのＮ−オキシド、シロミラスト、ＢＡＹ１９−８００４、ＣＣ３、ＡＷＤ１２−２８１、ＳＣＨ３５１５９１、シクラミラスト、ピクラミラスト、ＣＧＨ２４６６、メセンブリン、ロリプラム、ルテオリンおよびドロタベリンの群から選択される、態様１〜３のいずれか１に記載の組成物。
［態様５］トレプロスチニル、ならびにＲＯ２０−１７２４、ロフルミラストおよびイブジラストの群から選択されるＰＤＥ４阻害剤を含む、組成物。
［態様６］ＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤またはＰＤＥ８阻害剤の群から選択されるさらなるＰＤＥ阻害剤が含有されている、態様１〜５のいずれか１に記載の組成物。
［態様７］前記ＰＤＥ５阻害剤が、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、クエン酸シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィルまたはウデナフィルから選択される、態様６に記載の組成物。
［態様８］前記ＰＤＥ７阻害剤およびＰＤＥ８阻害剤が、ジピリダモール、ＢＲＬ５０４８１およびＰＦ−４９５７３２５から選択される、態様６に記載の組成物。
［態様９］医薬組成物である、態様１〜８のいずれか１に記載の組成物。
［態様１０］吸入のための、態様１〜９のいずれか１に記載の組成物。
［態様１１］静脈内もしくは皮下投与用の、または持続放出形態、錠剤およびカプセルの群から選択される、経口的に利用可能な形態用の、態様１〜９のいずれか１に記載の組成物。
［態様１２］トレプロスチニルまたはその医薬的に許容できる塩の有効量が少なくとも１．０ｎｇ／ｋｇ体重である、態様１〜１１のいずれか１に記載の組成物。
［態様１３］細胞中のｃＡＭＰレベルを増大させるための方法であって、前記細胞を、少なくとも１種類のプロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体、および少なくとも１種類のＰＤＥ４阻害剤、および場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤もしくはＰＤＥ８阻害剤またはそれらの医薬的に許容できる塩の群から選択される少なくとも１種類の阻害剤と接触させる、前記方法。
［態様１４］少なくとも１種類のプロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体、および少なくとも１種類のＰＤＥ４阻害剤、および場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤またはＰＤＥ８阻害剤の群から選択される少なくとも１種類の阻害剤を含む療法的組み合わせであって、該プロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体、およびＰＤＥ４阻害剤、および場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤およびＰＤＥ８阻害剤の群から選択される少なくとも１種類の阻害剤が、それらを合わせた上で嚢胞性線維症と関係する少なくとも１種類の症状を処置および／または予防するのに十分である量で提供される、前記療法的組み合わせ。
［態様１５］態様１４に記載の療法的組み合わせであって、プロスタサイクリンまたはプロスタサイクリン類似体、およびＰＤＥ４阻害剤、および場合によりＰＤＥ５阻害剤、ＰＤＥ７阻害剤およびＰＤＥ８阻害剤の群から選択される少なくとも１種類の阻害剤が吸入による投与のために配合される、前記療法的組み合わせ。
【０１３１】
参考文献
【０１３２】
【化１】
0005997182.tif 000002
【０１３３】
【化２】
0005997182.tif 000003
【図１】
0005997182.tif 000004
【図２】
0005997182.tif 000005
【図３】
0005997182.tif 000006
【図４】
0005997182.tif 000007
【図５】
0005997182.tif 000008
【図６】
0005997182.tif 000009