(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロプレートのウェル内の磁気ビーズを洗浄液で洗浄する洗浄装置において、
下端から前記ウェル内の洗浄液を吸引し上端部の管口から排出する排出ノズルと、
前記排出ノズルの上端部を内部に収容し、前記内部に陰圧を発生することのできる洗浄液吸引部と、を有し、
前記排出ノズルは、前記洗浄液吸引部の底壁部に固定されたノズルガイドと、前記ノズルガイド内に上下動可能に挿入され、内部を洗浄液が流通するノズル芯を備え、
前記排出ノズルの前記上端部の管口は下方を向いていることを特徴とする洗浄装置。
【請求項２】
請求項１記載の洗浄装置において、
前記ノズル芯は、内径が０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍであることを特徴とする洗浄装置。
【請求項３】
請求項１記載の洗浄装置において、
前記排出ノズルは、モリブデンが添加されたオーステナイト系ステンレスからなることを特徴とする洗浄装置。
【請求項４】
請求項１記載の洗浄装置において、
前記洗浄液吸引部の下に配置された洗浄液注入部を有し、
前記洗浄液注入部は、内部に洗浄液槽を有し、前記洗浄液槽に貯留された洗浄液を下方に吐出するノズルと、前記洗浄液槽の上壁部と底壁部に上下の端部を液密に固定された中空細管とを有し、
前記排出ノズルは、前記中空細管を貫通するようにして配置されていることを特徴とする洗浄装置。
【請求項５】
請求項１記載の洗浄装置において、
前記ノズルガイドは上端部に切欠き部を有し、前記ノズル芯の上端部は前記切欠き部から側方に突出していることを特徴とする洗浄装置。
【請求項６】
請求項１記載の洗浄装置において、
前記ノズル芯を下方に押圧する弾性体が設けられていることを特徴とする洗浄装置。
【請求項７】
内部に洗浄液槽を有し、前記洗浄液槽に貯留された洗浄液を下方に吐出するノズルと、前記洗浄液槽の上壁部と底壁部に上下の端部を液密に固定された中空細管が設けられた洗浄液注入部と、
前記洗浄液注入部の上に配置された洗浄液吸引部と、
複数のウェルを備えるマイクロプレートを保持するマイクロプレートホルダと、を有し、
前記洗浄液吸引部は内部に、下端から吸引した洗浄液を上端の管口から排出する排出ノズルの上端部を収容し、
前記排出ノズルは、前記洗浄液吸引部の底壁部に固定されたノズルガイドと、前記ノズルガイド内に上下動可能に挿入され、内部を洗浄液が流通するノズル芯を備え、
前記排出ノズルは、前記中空細管を貫通するようにして配置されており、
前記排出ノズルの前記上端部の管口は下方を向いていることを特徴とする洗浄装置。
【請求項８】
請求項７記載の洗浄装置において、
前記マイクロプレートホルダは、正方状に隣接する４つのウェルを一組として各組の中心位置に相当する裏面位置に磁石が配置され、
前記ノズルガイドは上端部に切欠き部を有し、前記ノズル芯の上端部は前記切欠き部から側方に突出しており、
前記ノズル芯の下端は開口面が前記上端部の突出方向と反対方向を向くように斜めにカットされており、
前記一組のウェルに対応する４つの排出ノズルは、上端部がその中心方向に集合するように配置されていることを特徴とする洗浄装置。
【請求項９】
請求項７記載の洗浄装置において、
前記ノズル芯を下方に押圧する弾性体が設けられていることを特徴とする洗浄装置。
【請求項１０】
請求項７記載の洗浄装置において、
前記ノズル芯は、内径が０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍであることを特徴とする洗浄装置。
【請求項１１】
請求項７記載の洗浄装置において、
前記洗浄液注入部に弁を介して陽圧源が接続され、
前記洗浄液吸引部に廃液タンクを介して吸引ポンプが接続されていることを特徴とする洗浄装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子解析の際に用いる洗浄装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内に発現している遺伝子を高精度に定量解析する方法として、定量ＰＣＲ解析法が知られている。この方法は、例えば、遺伝子を鋳型としてｃＤＮＡを合成し、関心のある遺伝子に特異的な増幅用プローブセット及び検出用蛍光標識プローブを準備し、対象ｃＤＮＡを増幅しながらその増幅量を検出用プローブで検出する技術である。この方法は、ＤＮＡチップなど他の検出方法と比較し、定量精度が良いことが特徴であるが、１つの解析試料について、１種類の遺伝子しか解析できないため、多種の遺伝子解析に課題があった。しかし、我々は、この課題を解決するため、細胞から得る遺伝子を鋳型とするｃＤＮＡライブラリを、磁気ビーズ等の微小担体上に合成し、そのｃＤＮＡライブラリを利用して、第一の遺伝子に関する定量ＰＣＲを実施、その後、洗浄して上記ｃＤＮＡライブラリを第二、第三の遺伝子に関する定量解析に、繰り返し利用する遺伝子解析方法を開発した（特許文献１）。この技術により、細胞１個について、複数種類の遺伝子の定量解析を実現した（非特許文献１）。
【０００３】
一方、本発明に関わる他の背景技術として、特開２００５−３０７６９（特許文献２）がある。この技術は、洗浄装置の一般的構造を開示している。また、磁気ビーズを利用する排液装置として、特開２００２−１０９２号公報（特許文献３）がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−３１９０２８号公報
【特許文献２】特開２００５−３０７６９号公報
【特許文献３】特開２００２−１０９２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nature Methods 6, 503-506 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載の技術は、定量ＰＣＲ装置により遺伝子発現量を比較するため、一度に多数の試料について、並列に解析することができる。一般的な定量ＰＣＲ装置は、９６穴のマイクロプレート、あるいは３８４穴のマイクロプレートを用いており、そのウェル数だけ同時に定量ＰＣＲ解析を実施することが可能である。ただし、一部のウェルには、濃度検定用のコントロール試料及び、目的に応じてネガティブコントロールを同時に評価するため、その分、評価可能な試料数は限られる。その結果、多数の試料について、複数種類の遺伝子の発現量を、定量的に解析することが実現されている。
【０００７】
しかし、複数の遺伝子について、繰り返し定量ＰＣＲを実施するためには、特許文献１に記載の通り、複数回の洗浄工程が必要となる。例えば、細胞から得る遺伝子を鋳型とするｃＤＮＡライブラリを磁気ビーズ等の微小担体（以下、簡単のため、単に磁気ビーズと記載する）上に合成し、その磁気ビーズのｃＤＮＡライブラリをマイクロプレートのウェルに分注した後には、定量ＰＣＲを実施するために、磁気ビーズの入ったウェル内のバッファーを、定量ＰＣＲ測定用のバッファーに交換する必要がある。また、第一の遺伝子に関する定量ＰＣＲの実施後には、第二の遺伝子に関する定量ＰＣＲを実施するために、同様にバッファー交換が必要となる。以降、定量ＰＣＲを繰り返すためには、その都度、バッファー交換が必要となる。
【０００８】
これらのバッファー交換では、交換前のバッファーの残留を極力排除する必要がある。交換前のバッファーの残留は、定量ＰＣＲ解析の結果に大きく影響を及ぼし、時には検定量の数倍の誤差を発生してしまう。また、バッファー交換には、磁気ビーズの流失等のリスクを伴うため、厳密で慎重な操作が求められる。また、外部からの遺伝子や他の物質の混入など、定量ＰＣＲの測定精度に大きく影響を与える物質の混入も防ぐ必要がある。これらのことから、このバッファー交換をウェル毎にマニュアルで実施するには、非常に多くの時間と厳密な操作が必要となり、煩雑な作業となっていた。また、作業の水準がそのまま解析精度に影響を与えるため、実験者の技量差が実験誤差に影響する問題が発生する。
【０００９】
この課題には、特許文献２に記載された技術を用い、マイクロプレートを一括で洗浄することが、解決につながると考えた。しかし、公知技術を用いた実験では、以下の課題が発生した。
【００１０】
(1) 前述の通り、定量ＰＣＲの繰り返しに際しての洗浄のため、複数回の熱サイクル工程から、マイクロプレートの熱変形（ねじれ、ゆがみ）が発生し、プレートの各ウェルの底面位置にばらつきが発生する。その結果、バッファーを完全に吸引することが出来ないウェルが発生した。
(2) バッファー吸引作業後に、排出ノズルからのバッファーの還流が、微少であるが発生した。その結果、続く定量ＰＣＲ解析で、異常な背景発光の発生や、ポリメラーゼ伸長阻害が発生した。
(3) 一部、磁気ビーズの流失が発生した。
(4) 装置を繰り返し使用していると、排出ノズルの汚染に由来する異常な背景発光の発生や、ポリメラーゼ伸長阻害が発生した。
(5) 排出ノズルの磁化が発生した。
【００１１】
これらの問題のうち、マクロプレートの熱変形に対応した、排液ノズルの高さ調整技術が、特許文献３に開示されている。また、特許文献３は、磁気ビーズを用いた洗浄を具体的に開示している。
【００１２】
しかし、この開示技術では、排液ノズルのメンテナンス性の問題が解決されておらず、汚染に敏感な定量ＰＣＲでの利用が難しかった。これは、本発明の対象が、特許文献１及び非特許文献１に記載の通り、遺伝子数として、数コピーからの定量を目的とした解析であるため、高い精度の清浄が必要であり、排液の逆流やノズルの汚染のキャリーオーバーが重大な問題を発生することによる。また、特許文献３の構造では、我々の利用形態で必要な洗浄液の供給の余地が、空間的に得られない。特許文献２のように、洗浄液供給を実現しつつ、上下のゆがみを解消する技術が必要である。さらに、排液ノズルの簡便な交換、遺伝子レベルでの汚染を無くすための洗浄と、それに対応した構造や素材、排液の逆流などを完全に除去する対策などが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記のうち特に重大な課題は、排出ノズルを通じて発生する、微少量のバッファーの還流であった。このバッファー還流の原因は、排出ノズルの廃液容器側のノズル先端にバッファーの液滴が付着し、それがノズルに還流することであった。そのため、排出ノズルの先端構造を、バッファーの付着液滴量が最小となる構造にする。具体的には、排出ノズルの先端をＵ字状に１８０度反転させることにより、先端を鉛直下向きに設計し、さらにその状態で付着する液滴の最大量が、ノズルの全容量を超えないように設計することにより、バッファーの環流を防止する。
【００１４】
また、排出ノズルの高さ位置調整機能を有することにより、定量ＰＣＲの繰り返し計測において、マイクロタイタプレートの熱変形が発生する場合でも、洗浄バッファーの残留の発生を防止した。さらに、廃液の接する排出ノズルの交換を簡便とする構造を実現することにより、排出ノズルの汚染や変形などが発生した場合に簡便に交換可能とした。
【００１５】
また、長期間の使用において、排出ノズルや廃液槽が汚染することについては、次亜塩素酸による流路の洗浄が有効であった。この場合、排出ノズルを耐食性のあるステンレス材で作製することが有効であった。また、排出ノズルの磁化を防止するために、オーステナイト系ステンレスの使用が有効であった。この両方の特性を有するものとして、ニッケルの他に、モリブデンを添加したオーステナイト系ステンレスを使用した。具体的には、ＳＵＳ３１６及びＳＵＳ３１６Ｌが、好適であった。
【００１６】
本発明による洗浄装置は、マイクロプレートのウェル内の磁気ビーズを洗浄液で洗浄する洗浄装置であり、下端からウェル内の洗浄液を吸引し上端部の管口から排出する排出ノズルと、排出ノズルの上端部を内部に収容し、内部に陰圧を発生することのできる洗浄液吸引部と、を有し、排出ノズルの上端部の管口は下方を向いていることを特徴とする。
【００１７】
排出ノズルは、洗浄液吸引部の底壁部に固定されたノズルガイドと、ノズルガイド内に上下動可能に挿入され、内部を洗浄液が流通するノズル芯を備える。
【００１８】
また、洗浄液吸引部の下に配置された洗浄液注入部を有し、洗浄液注入部は、内部に洗浄液槽を有し、洗浄液槽に貯留された洗浄液を下方に吐出するノズルと、洗浄液槽の上壁部と底壁部に上下の端部を液密に固定された中空細管とを有し、排出ノズルは、中空細管を貫通するようにして配置されている。
【００１９】
また、本発明による洗浄装置は、内部に洗浄液槽を有し、洗浄液槽に貯留された洗浄液を下方に吐出するノズルと、洗浄液槽の上壁部と底壁部に上下端部を液密に固定された中空細管が設けられた洗浄液注入部と、洗浄液注入部の上に配置された洗浄液吸引部と、複数のウェルを備えるマイクロプレートを保持するマイクロプレートホルダと、を有し、洗浄液吸引部の内部には、下端から吸引した洗浄液を上端の管口から排出する排出ノズルの上端部が配置され、排出ノズルは、洗浄液吸引部の底壁部に固定されたノズルガイドと、ノズルガイド内に上下動可能に挿入され、内部を洗浄液が流通するノズル芯を備え、排出ノズルは、中空細管を貫通するようにして配置されており、排出ノズルの上端部の管口は下方を向いていることを特徴とする。
【００２０】
マイクロプレートホルダは、正方状に隣接する４つのウェルを一組として各組の中心位置に相当する裏面位置に磁石が配置され、ノズルガイドは上端部に切欠き部を有し、ノズル芯の上端部は切欠き部から側方に突出しており、ノズル芯の下端は開口面が上端部の突出方向と反対方向を向くように斜めにカットされており、一組のウェルに対応する４つの排出ノズルは、上端部がその中心方向に集合するように配置されて。
更に、ノズル芯を下方に押圧する弾性体が設けられている。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、従来はウェルごと、マニュアルで実施していた洗浄バッファーによる磁気ビーズの洗浄を、マイクロプレートの全ウェルについて、一括で行うことができる。その所要時間は、一回の洗浄工程が約３０秒程度であり、従来の１／１０以下である。また、その際、洗浄バッファーの残留や逆流による汚染が生じないため、解析精度は劣化しない。
【００２２】
上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明による洗浄装置の全体構成例を示す概略正面図。
【図２】装置側面を示す概略図。
【図３】洗浄液注入部、洗浄液吸引部、及びマイクロプレートホルダの部分を示す概略図。
【図４】洗浄液注入部の断面模式図。
【図５】マイクロプレートホルダの上面図。
【図６】マイクロプレートホルダにマイクロプレートを装着した際の断面図。
【図７】洗浄液吸引部の排出ノズルの説明図。
【図８】洗浄液吸引部の説明図。
【図９】洗浄液吸引部の断面図。
【図１０】洗浄液注入部、洗浄液吸引部、マイクロプレートホルダ、マイクロプレートを設置した場合の断面図。
【図１１】排出ノズルに付着する液滴の説明図。
【図１２】排出ノズルの端面に付着する液滴の説明図。
【図１３】排出ノズルの高さ調整機能を説明する模式図。
【図１４】洗浄液注入部と洗浄液吸引部の分解組立図。
【図１５】細管の配置を説明する詳細模式図。
【図１６】排出ノズルのノズル芯の交換方法を示す模式図。
【図１７】ノズル芯の他の実施例を説明する図。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。以下では、９６穴のマイクロプレートの９６個のウェルにそれぞれ収容された磁気ビーズを洗浄する洗浄装置について説明する。しかし、本発明は、３８４穴のマイクロプレートなど、他の形式のマイクロプレートにも当然に適用可能である。
【００２５】
図１は、本発明による洗浄装置の全体構成例を示す概略正面図である。本実施例では、装置本体１００に、空気あるいは窒素等のガスの陽圧源２１１を、送気用チューブ２１２で接続して使用する。装置本体は、洗浄液注入部２００、洗浄液吸引部３００、マイクロプレート５００を保持するマイクロプレートホルダ５１０、廃液タンク４１０、吸引ポンプ４２０などによって構成される。
【００２６】
洗浄液注入部２００は、洗浄液注入用ノズル２１０を有する。また、洗浄液吸引部３００は、排出ノズル３１０を有し、排出ノズル３１０の洗浄液排出端である上端部が洗浄液吸引部３００の内部に収容されている。洗浄液注入部２００と洗浄液吸引部３００は、使用時には結合されて一体となっている。その一体構造は、マイクロプレート５００の出し入れに伴い、上下動する必要があるため、昇降用アーム１１０が備えられている。なお、マイクロプレート５００側に対して洗浄液注入部２００と洗浄液吸引部３００の一体構造を上下動させる構成にしてもよいし、洗浄液注入部２００と洗浄液吸引部３００の一体構造に対してマイクロプレート５００側を上下動させるように構成してもよい。
【００２７】
マイクロプレート５００は、マイクロプレートホルダ５１０に保持されるが、マイクロプレートホルダ５１０は、マイクロプレート５００を装置本体１００から出し入れするために、装置前面へ水平移動する機能を有する。そのためスライド装置５２０を有する。また、廃液４０１を回収する廃液タンク４１０と、廃液吸引のための吸引ポンプ４２０が備わっている。吸引ポンプ４２０を駆動させると、廃液タンク４１０の内部、洗浄液吸引部３００の内部、及び排出ノズル３１０内が陰圧になる。各構成要素は、送気チューブ、送液チューブ、及び各種弁により接続している。
【００２８】
陽圧源２１１からの陽圧ガスは、電磁弁２１３と洗浄液の逆流を防ぐためのリザーバー２１４を介し、洗浄液注入部２００に接続している。洗浄液注入部２００は、それ以外に、洗浄液補充時など、必要に応じて開閉する空気口２１５と、使用後に残った洗浄液を排出する排出口２１６及びその開閉弁２１７を有する。
【００２９】
洗浄液吸引部３００は、吸引ポンプ４２０を駆動させることにより、内部に陰圧を発生して排出ノズル３１０の下端からウェル内の洗浄液を吸引し、吸引した洗浄液を廃液タンク４１０に排出する機能を有し、本実施例では２種の排出口を有する。上部に設けられた排出口３１１は、主に空気を排出する。下部に設けられた排出口３１２は、廃液と空気の混合状態のものを排出する。これは、仮に排出口が下部の１つの場合、廃液を吸引ポンプ４２０で吸引する際に、下部の排出口が廃液で満たされ、廃液の流抵抗から、洗浄液吸引部３００内への吸引力の作用が低下する場合があるためである。ただし、下部の排出口３１２を大きく設計する場合は、排出口を下部の１つとしてもよい。排出口が２つあるため、本実施例では、三方弁３１３を備える。開閉弁２１７と三方弁３１３の排出側はＹ字分岐３１４を介し、廃液タンク４１０に接続する。
【００３０】
図２は、装置側面を示す概略図である。簡略化のため、送液チューブ等は図示していない。装置は、前面の扉１２０が矢印１２１で示すように開閉できる。マイクロプレートホルダ５１０は、実線で示すように、扉１２０の開放により、矢印１２２で示すように装置前面（図２の左側）に引き出すことができ、マイクロプレート５００の出し入れが行われる。破線で図示したマイクロプレートホルダ５１１は、洗浄実施時のマイクロプレートホルダ位置を示している。また、洗浄液注入部２００には、洗浄液注入口２２１が設けられている。洗浄液注入部２００への洗浄液の補充の際は、空気口２１５を開けることにより、洗浄液注入部２００内の空気を逃がすことができ、洗浄液の補充が行い易くなる。
【００３１】
図３は、上記実施例に示した洗浄装置のうち、洗浄液注入部２００、洗浄液吸引部３００、及びマイクロプレートホルダ５１０の部分を取り出して示した概略図である。上述のように、洗浄液注入部２００には、弁２１３を介して、空気あるいは窒素等のガスの陽圧源２１１が接続する。洗浄液吸引部３００には、廃液タンク４１０及び吸引ポンプ４２０が接続されている。マイクロプレートホルダ５１０は、マイクロプレート５００の個々のウェルがそれぞれに割り当てられた洗浄液注入用ノズル２１０及び排出ノズル３１０の下方に位置するようにして、マイクロプレート５００を保持する。
【００３２】
図４は、洗浄液注入部の断面模式図である。洗浄液注入部２００は、洗浄液を貯留するための密封された空間である洗浄液槽２３０と、マイクロプレートの９６個のウェルに一対一で対応するように配置された９６本の洗浄溶液用注入ノズル２１０と、洗浄液吸引部３００の排出ノズル３１０が貫通するための、９６本の中空の細管２５０を有する。細管２５０は、洗浄液槽２３０の密封性に影響を与えないように、上端及び下端が洗浄液槽２３０の上壁部及び底壁部にそれぞれ液密に固定されている。細管２５０は、排出ノズル３１０の外径より大きい内径を有し、排出ノズル３１０が内部を貫通できる仕様とする。また、細管２５０は、マイクロプレートの各ウェルの中心上に位置する必要がある。
【００３３】
本実施例では、排出ノズルとして内径０．３１２ｍｍ、外径０．５６６ｍｍ、長さ７０．５ｍｍのものを用い、細管には内径１．３６ｍｍ、外径１．６６ｍｍ、長さ３０ｍｍのものを用いた。なお、排出ノズルの内径は、０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍが好適である。内径が０．０５ｍｍ未満の場合、埃などの異物が混入し、閉塞を起こす可能性が高くなる。また、内径が０．５ｍｍより大きな細管では、空気の流抵抗が低くなるため、いずれかの排出ノズルによるウェルの洗浄液の吸引が完了し、空気が流通し始めた際に、他のウェルにまだ洗浄液が残っている場合に、その洗浄液の吸引力が落ちるという問題が生じる。ただし、吸引ポンプの性能が高ければ、内径０．５ｍｍ以上の細管を用いることも可能である。実際に我々の検討では、内径１ｍｍの排出ノズルを用いた検討も実施し、ポンプ性能を上げることにより、吸引が完了することを確かめている。
【００３４】
洗浄液槽２３０に洗浄液を入れ、陽圧源２１１よりガスを注入すると、注入ノズル２１０より洗浄液が押し出される構造である。陽圧源２１１の圧力が一定になるようにすると、注入ノズル２１０より押し出される洗浄液の液量は、定圧吐出方式により、陽圧源２１１の弁２１３の開放時間に比例する。そのため、弁２１３の開放時間を制御することにより、洗浄液の注入量を簡単に制御できる。
【００３５】
次に、マイクロプレートホルダ５１０について説明する。図５は、マイクロプレートホルダ５１０の上面図である。本実施例では、マイクロプレートホルダ５１０は、９６個の穴５１１を有し、マイクロプレートの９６個のウェルを、その穴５１１に保持することが可能である。また、４つごとのウェルの組５１２について、その中央に磁気ビーズを収集するための磁石５３０を、合計２４個有する。本実施例では、磁石５３０として、直径８ｍｍ、厚さ２．５ｍｍの板状のネオジム磁石（Ｎ４０）を用いた。仕様では、表面磁束密度は３０００Ｇである。
【００３６】
図６は、マイクロプレート５００を装着した状態での、マイクロプレートホルダ５１０の、斜め４５°でウェルの中心を通る面（図５のＡ−Ａ′）での断面図である。マイクロプレート５００は、９ｍｍピッチでウェルを有するため、図の断面では、ウェル間の距離ｄは、約１２．７ミリである。５３０は、磁石である。マイクロプレートのウェル内の磁気ビーズは、磁石により、それぞれ５４１及び５４２の部分に収集・保持される。
【００３７】
次に、洗浄液吸引部３００について説明する。まず、排出ノズル３１０について説明する。排出ノズル３１０は、２本の細管で構成される。図７は、その説明図である。
【００３８】
排出ノズルは、ノズル芯３２１と、ノズルガイド３２２の組で構成される。本実施例のノズルガイド３２２は、内径０．５９２ｍｍ、外径０．８２１ｍｍで、図７（ｂ）に示すように、上部に周方向の半分が切り掛けた切欠き部３２３を６ｍｍの長さだけ有する。ノズル芯３２１は、図７（ａ）に示すように、排出側の上端部３４１がＵ字状に折り返された形状を有する。この構造は、その部分の管口３４２が、ほぼ垂直下方を向いていることが特徴であり、後述の「洗浄液の還流の防止」に重要である。また、もう一方の吸引側の先端３４３は、図示するように斜めになっている。これは、排出ノズルの先端が、ウェルの最低面に届く構造のため、直角の切り口にした場合、ウェルの底面に切り口が密着し、液の排出機能が低下する。そのため、先端がウェルの底面に達している状態で、液が通る空間を確保するために、ノズル芯３２１の下端３４３を斜めの切り口とすることが重要である。また、切り口の方向が、ノズル芯本体に対するＵ字形状の突出方向と逆方向であることは、後述の磁気ビーズの流失防止に有効である。本実施例では、ノズル芯の下端面が水平方向となす角度θが約１５°のものを用いた。
【００３９】
また、排出ノズル３１０の素材は、磁化せず、耐食性・耐酸性に優れた素材である、ニッケルの他にモリブデンを添加したオーステナイト系ステンレスを使用した。具体的には、ＳＵＳ３１６及びＳＵＳ３１６Ｌが好適であった。本実施例では、図７（ｃ）に示すように、ノズルガイド３２２内にノズル芯３２１を挿入して、排出ノズル３１０とする。ノズル芯３２１のＵ字状の上端部３４１は、ノズルガイド３２２の切欠き部３２３によって向きが規制されて側方に突出する。また、ノズルガイド内面とノズル芯外面の間３５０は固定せず、スライド式に上下動が可能な状態とする。ただし、ノズルガイド内面とノズル芯外面間の気体の流動を防ぐために、シリコングリースや潤滑油等のシール材を充填する。洗浄液吸引部３００は、この排出ノズル３１０を、マイクロプレート５００の９６個のウェルに一対一で対応するように、９６本配置している。
【００４０】
図８は、洗浄液吸引部３００の内部を上方から見た図である。排出ノズルの上端部３４１、すなわちＵ字部分は、図に四角の破線３６０で囲んで示す通り、それぞれの管口が互いに近づくようにして４本が集まるように配置される。この４つの管口が近づく位置は、先に述べたマイクロプレートホルダ５１０に固定された磁石５３０の鉛直方向上方位置に相当する。なお、破線５０１は、マイクロプレート５００の各ウェルの位置を示している。この配置により、先に述べた排出ノズル３１０のノズル芯３２１の下端部３４３の斜めの切り口は、常に磁石５３０と反対の方向を向くことが分かる。磁気ビーズは磁石５３０側に収集されているため、磁石側にノズル芯３２１の切り口が位置すると、洗浄液を吸引する際に、磁気ビーズの流失が発生しやすい。しかし、本実施例のように、ウェル内の洗浄液が磁石の反対側から排出ノズルに吸引される構造とすることにより、磁気ビーズの流失を防ぐことができる。また、溝３０１は、排出ノズル３１０によって吸引されて上端のＵ字部分から出てくる廃液を、矢印の方向に流す溝である。この溝は、廃液の流れる方向に鉛直方向下向きに傾いており、廃液を排出しやすくしている。矢印は、廃液の流れる方向を示している。
【００４１】
図８の斜め方向Ｂ−Ｂ′における断面図を、図９に示す。まず、ノズルガイド３２２は、洗浄液吸引部３００の底壁部に固定される。ノズルガイド３２２は、ノズル芯３２１の上端部３４１のＵ字形の突出部が４つのウェルの組の中心に向かうように、切欠き部３２３の向きを調整して固定される。排出ノズル３１０の上部には、バネ３７１やゴム等からなる弾性体を設置し、ノズル芯３２１を下方に押し出している。その限界は、切欠き部３２３の最下点にＵ字部分が到達している状態である。ノズル芯３２１の下端は、常にマイクロプレートのウェル内面の最低面に届くように設計されており、ウェルに到達した上で、ノズル芯３２１はウェルにより上方に押し上げられる。その際、バネ３７１により、その押し上げ量を吸収する。ノズル芯３２１はどこにも固定されていないため、ウェルの底面とバネ機構により、最適な位置に保持される。
【００４２】
この構造では、仮にノズル芯の内部が閉塞したり、ノズルが変形したりした場合、ノズル芯を交換すればよい。また、Ｏリング等も用いずに、上下動機能を具現化しているため、洗浄液吸引部３００と排出ノズル３１０の接合部分での液漏れ等が発生しない。また、ノズル芯のＵ字部分の先端に位置する管口がノズルガイドの切欠きの最下点より上に来ないように、Ｕ字部分の頂点から先端管口までの部分の長さを十分長くすることにより、ノズル芯とノズルガイドの間に、廃液等が流入しない構造とすることが重要である。
【００４３】
次に、実際の装置の使用方法について説明する。図１０は、洗浄液注入部２００と、洗浄液吸引部３００と、マイクロプレート５００と、マイクロプレートホルダ５１０を設置した状態の装置断面図である。断面方向は、図９と同様に図８の線Ｂ−Ｂ′に沿う斜め４５°の方向である。排出ノズル３１０の下端は、洗浄液注入部２００に設置された細管を通り、マイクロプレート５００のウェルに到達している。ウェル内の磁気ビーズは、磁石により、位置５４２に収集されている。この状態で判るとおり、排出ノズル３１０は、磁石５３０に近接する。そのため、一部のステンレス材など、磁化しやすい材料を排出ノズルとして用いた場合、排出ノズルが磁化するため、磁気ビーズがノズルに付着する問題が発生する。ステンレス材では、オーステナイト系ステンレスが磁化しにくい材料として有名であり、排出ノズルには、オーステナイト系ステンレスの使用が重要である。
【００４４】
図１０の状態で、マイクロプレート５００の各ウェルに洗浄液を注入し、一定時間保持した後、磁気ビーズを洗浄した洗浄液を、排出ノズル３１０により吸引してウェルより排出する。吸引は、洗浄液吸引部３００に接続するポンプ４２０を駆動し、洗浄液吸引部３００を陰圧とし、洗浄液を吸い上げることにより行う。洗浄液吸引部３００に到達した洗浄液は、そのまま、接続する液管を通り、廃液タンク４１０に溜まる。本実施例では、洗浄液としてwashing buffer（０．１％  Tween20，１０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ８．０））を用いた。
【００４５】
洗浄液注入の陽圧を約０．１２ＭＰａ、洗浄液注入時間を約５秒とすると、約１００μＬの洗浄溶液を、マイクロプレートの各ウェルに注入することができる。この状態で、約６０秒保持した後、吸引ポンプ４２０を駆動すると、洗浄液吸引部３００が陰圧条件となるため、ウェル内の洗浄液が排出ノズル３１０により吸い上げられる。吸い上げられた洗浄液は、そのまま吸引ポンプの力により、最終的には廃液タンク４１０に廃棄される。この一連の動作を繰り返すことにより、磁気ビーズの洗浄が実施できる。通常、１回の定量ＰＣＲを実施後、次の定量ＰＣＲを実施するための洗浄は、上記工程を３回実施すればよい。また、必要により、洗浄液の注入量を、３回目の洗浄時のみ、約１２０μＬとすることにより、高い洗浄性能を確保することも有効である。
【００４６】
ここで重要なのは、吸引した洗浄液の一部が、排出ノズル３１０に液滴として付着する事象が発生することである。この排出ノズル３１０に付着した液滴が、吸引終了後に排出ノズル３１０を通ってマイクロプレートのウェルにまで逆流することが、そう多くない頻度ではあるが、発生する。廃液には、定量ＰＣＲにて用いた蛍光標識や、その他、次回の定量ＰＣＲ解析の精度に著しく影響を与える物質が含まれており、逆流の影響は多大である。また、逆流量は微量であるため、目視できない場合が多く、次回の定量ＰＣＲの数値自身の信頼度を低下させる。そのため逆流防止が重要である。
【００４７】
逆流の要因となる液滴の付着は、付着する場所の大きさや濡れ性や、洗浄液自身の表面張力により変わる。本実施例で排出ノズルに用いているステンレス材の場合、一般的に濡れ角は８０度程度であり、液滴が付着しやすい。また、界面活性剤であるTween20を０．１％有する洗浄液の表面張力は、およそ４０ｄｙｎ／ｃｍと仮定できる（水の表面張力は、約７２ｄｙｎ／ｃｍ、２５℃時）。
【００４８】
ここで、排出ノズルの上端が垂直下向きに折り返しておらず、鉛直方向上向きや横向きの場合、液滴の付着する領域は、排出ノズルの先端から、ノズルの表面全体に及ぶため、大きい液滴が発生する可能性がある。図１１（ａ）は排出ノズルの上端が鉛直方向上向きの場合に、排出ノズルに付着した液滴６０１の例を示し、図１１（ｂ）は排出ノズルの上端が横向きの場合に、排出ノズルに付着した液滴６０２の例を示す。このように、排出ノズルの上端が鉛直方向上向きや横向きの場合、ノズルの側面に液滴の付着しうる大きな領域が存在することになる。そのため、ノズルに対して大きな液滴が付着しうる。これらの大きな液滴の還流が発生すると、ウェルの汚染が発生する。
【００４９】
一方、本実施例のように、ノズル芯の先端を鉛直方向下向きに折り返した構造とすると、液滴の付着する表面は、ノズル管の断面だけである。図１２（ａ）及び図１２（ｂ）により説明する。図１２（ａ）は、ノズル芯の先端を下から見た模式図、図１２（ｂ）は横からみた模式図である。今回、用いているノズル芯３２１は、内径が０．３１２ｍｍ、外径が０．５６６ｍｍであることから、肉厚は約０．１２７ｍｍである。ここで、液滴の付着のメカニズムを考慮すると、本実施例で想定される最大の液滴量は、以下のように考えられる。まず、排出ノズルの管内３８１は吸引ポンプにより吸引されているため、洗浄液がなくなった後は、空気が通じることになる。そのため、液滴は、ノズル全体に渡って液滴として付着することは出来ないため、ノズルの肉厚部分３８２に付着することが精々である。したがって、付着する液滴量は、肉厚の数値である０．１２７ｍｍについて、０．１２７ｍｍを直径（半径ｒ＝０．０６３５ｍｍ）とする円に付着可能な液滴６０３と考えることが出来る。
【００５０】
付着して、安定に存在しうる液滴とは、液滴の重力より、液滴と表面とで発生する吸着力が勝っている条件が成り立つ場合である。半径ｒにおいて、液滴に作用する吸着力Ｆは、液滴の表面張力をＳとすると、
Ｆ＝２πｒＳ    （１）
であるため、約１．６０ｄｙｎである。単純化のため、洗浄液の比重を１とすると、この吸引力が発揮される際に維持される液滴量の最大は、約１．６３μＬとなる。そこで、１本の排出ノズルに逆流する洗浄液の最大量が１．６３μＬであると想定できるため、排出ノズルの容積を、それ以上のもので設計すれば、仮に液滴の逆流が発生しても、その液滴の総量がノズル内に収まるため、ノズルの下端からの流出が生じない。つまり、逆流による汚染を防ぐことが可能となる。本実施例では、排出ノズルの内径が０．３１２ｍｍであるため、長さを約２１．３ｍｍ以上とすれば、逆流による汚染を防ぐことができる。
【００５１】
式（１）から得られるとおり、液滴の付着が可能な面積が、そのまま、最大の液滴量となる。このように、液滴の付着が可能な面積を小さくする構造及び設計が重要である。
【００５２】
以上の通り、液滴の逆流を防ぐ構造により、解析精度の劣化を招かない洗浄が実現できるが、装置の使用に伴い、排出ノズルの汚染が問題となる場合がある。具体的には、排出ノズルの閉塞により、排出力の低下や完全な目詰まり等が発生することがある。その対策として、エタノール等の有機溶媒を用いた定期的な洗浄を実施することが有効である。しかし、有機溶媒を用いた洗浄では、一部、閉塞を引き起こす場合があることがわかった。これは、閉塞の要因となる物質が一部の油脂などの場合など、有機溶媒により硬化する場合が見られるためである。そこで、次亜塩素酸を用いた洗浄を実施することにより、排出ノズルの閉塞を防ぐことが可能であることが判った。ただし、次亜塩素酸は、塩素が多量に含まれる酸であるため、ＳＵＳ３０４等のステンレス材は、耐久性に劣る。このような場合、ニッケルの他にモリブデン等を添加し、耐酸性を強化した材料の活用が有効である。本実施例では、ＳＵＳ３１６或いは、ＳＵＳ３１６Ｌが好適であった。こうして、排出ノズ３１０ルや廃液槽２３０を、定期的に次亜塩素酸で洗浄することにより、汚染の拡大を防御できる。
【００５３】
図１３は、排出ノズルの高さ調整機能を説明する模式図である。３０４及び３０５は、それぞれ、洗浄液吸引部３００の上壁部及び底壁部を示している。洗浄液吸引部の下に位置する洗浄液注入部は、図示を省略している。ノズルガイド３２２は、洗浄液吸引部３００の底壁部３０５と結合しており、ノズルガイド３２２内にノズル芯３２１がスライド可能に差し込まれている。ノズルガイド３２２の切欠き部３２３は、バネ押さえ３７２の下部の穴に挿入され、バネ押さえ３７２は、バネ３７１を洗浄液吸引部の上壁部３０４に設けられたバネ受け穴３７５の中央に押し付けている。バネ受け穴３７５の内径は、バネ押さえ３７２の外径より大きい。
【００５４】
図１３（ａ）に示すように、マイクロプレートのウェル５０５がノズル芯３２１の先端に接していない場合、バネ３７１の反発力により、ノズル芯３２１は、ノズルガイド３２２の切欠き部３２３の最下部まで押し付けられている。しかし、図１３（ｂ）のように、マイクロプレートのウェル５０５が上昇し、ノズル芯３２１の最下点位置で接し、さらに図中の距離Ｌだけノズル芯３２１を上側に押し上げる場合、ノズル芯３２１は上昇し、その結果、バネ押さえ３７２を距離Ｌ分だけ上昇させる。この際、ノズルガイド３２２は移動する必要が無く、ノズル芯３２１の上昇だけで、ウェル５０５の押し付け分を吸収できる。これが、マイクロプレートにおけるウェル底部の上下のバラツキを吸収する排出ノズル３１０の高さ調節機能である。
【００５５】
図１４（ａ）は、図１０に示した状態から、洗浄液吸引部３００を上方に引き離した状態を示す図である。本実施例では、洗浄液注入部２００と洗浄液吸引部３００を簡単に分離できる構造としたため、片方に不具合が発生した際のメンテナンスが簡便になる。特に、洗浄液吸引部３００は汚染が発生しやすいため、洗浄液吸引部３００だけを複数準備し、必要に応じて入れ替える等の使用方法が有効である。
【００５６】
また、図１４（ｂ）に示すように、洗浄液注入部２００は底壁部２０５と上壁部２０４に分離でき、洗浄液吸引部３００は底壁部３０５と上壁部３０４に分離できるため、ゴミの混入や洗浄液内成分の析出など、内部において不具合が発生した場合のメンテナンスも簡便である。特に、洗浄液注入部２００内のメンテナンスを実施する場合、洗浄液吸引部３００と吸引ノズル３１０を外して、その後に上壁部２０４を外すことにより、洗浄液吸引部３００から生じる可能性のある汚染された廃液の混入を、極力防ぐことができる。
【００５７】
図１５は、本実施例の細管の配置を説明する詳細模式図である。ただし、図面の明確化のため、横方向に２倍拡大して図示した。底壁部２０５と上壁部２０４を有する洗浄液注入部２００と、底壁部３０５と上壁部３０４を有する洗浄液吸引部３００が図示されている。洗浄液注入部２００の洗浄液注入ノズル２１０と細管２５０は、注入管ユニット２４０で一体化されており、洗浄液注入部２００の底壁部２０５に設けられた穴に挿入され、固定されている。また、洗浄液注入部２００の底壁部２０５と上壁部２０４が組み立てられることにより、細管２５０と上壁部２０４が結合し、洗浄液槽２３０が気密化する。なお、注入ノズル２１０や細管２５０に閉塞などの不具合が発生した場合は、注入管ユニット２４０を交換することにより解消できる。洗浄液吸引部３００は、排出ノズル３１０のうち、ノズルガイド３２２が底壁部３０５に結合している。ノズル芯３２１は、ノズルガイド３２２内を上下動自在に貫通している。この排出ノズル３１０は、洗浄液注入部２００に固定された細管２５０を貫通している。そのため、図中のＡの部分は、３本の管で構成されていることがわかる。３本の管のうち外側の細管２５０は洗浄液注入部２００に固定され、真ん中に位置するノズルガイド３２２は洗浄液吸引部３００の底壁部３０５に固定されている。そして、一番内側に位置するノズル芯３２１は、上端部にバネによる押圧力を受けながら、ノズルガイド３２２中を上下にスライド可能になっている。
【００５８】
図１６は、排出ノズルのノズル芯の交換方法を示す模式図である。ノズル芯３２１は、異物の吸い込みや洗浄液内成分などの物質の析出などで、閉塞する可能性がある。その場合、図のように、洗浄液吸引部３００の上壁部３０４を開けることにより、ノズル芯３２１を交換することが可能である。ノズル芯３２１は、ノズルガイド３２２とバネ押さえ３７２により挟まれており、バネ３７１及びバネ押さえ３７２を外すことにより、ノズルガイド３２２から簡単に抜き出すことかできる。また、新しいノズル芯３２１を挿入後、バネ押さえ３７２及びバネ３７１を設置し、上壁部３０４を装着すれば、すぐに利用を再開できる。このように、排出ノズルの交換を簡便に実施できるため、定期的な排出ノズルの交換が可能となる。
【００５９】
図１７は、ノズル芯の他の実施例を説明する図である。ノズル芯の管口３４２は、例えば図１７（ａ）や図１７（ｂ）に示すように、切り口の面を水平方向から角度φだけ傾けて斜めにすることも可能である。この場合、液滴の発生に関わる部分の面積を小さくすることができる。また、Ｕ字折り返しの半径Ｒの最小値としては、ノズル芯３２１の直径程度とすることも可能である。最大値は、本実施例の９ｍｍピッチの反応ウェルを有するマイクロプレートへの応用の場合、斜めに隣接するウェルのノズル芯と干渉しないように設計することが必要である。具体的には、約３ｍｍが最大となる。
【００６０】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【００６１】
１００  装置本体
１１０  昇降用アーム
２００  洗浄液注入部
２１０  洗浄液注入ノズル
２１１  陽圧源
２４０  注入管ユニット
２５０  細管
３００  洗浄液吸引部
３１０  排出ノズル
３２１  ノズル芯
３２２  ノズルガイド
３２３  切欠き部
３７１  バネ
３７２  バネ押さえ
４１０  廃液タンク
４２０  吸引ポンプ
５００  マイクロプレート
５０５  ウェル
５１０  マイクロプレートホルダ
５３０  磁石
６０３  液滴
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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