(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおけるガンを治療するための、またはヒトにおけるガンまたは感染への免疫応答を増大させるための医薬組成物であって、組成物が、
（ａ）精製ＩＬ−１５ポリペプチドおよび精製可溶型インターロイキン−１５レセプターアルファＩＬ−１５Ｒａポリペプチド；
（ｂ）ＩＬ−１５ポリペプチドが可溶型ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドに連結した精製キメラポリペプチド；
（ｃ）精製ＩＬ−１５ポリペプチド、および抗体のＦｃ部分に共有結合した可溶型ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドを含む精製キメラポリペプチド；
（ｄ）可溶型ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドに結合したＩＬ−１５ポリペプチドを含む精製複合体；
（ｅ）抗体のＦｃ部分に共有結合した可溶型ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドを含む精製キメラポリペプチドに結合したＩＬ−１５ポリペプチドを含む精製複合体；
（ｆ）ＩＬ−１５ポリペプチドを含む精製融合タンパク質、および精製可溶型ＩＬ−１５Ｒａポリペプチド；
（ｇ）ＩＬ−１５ポリペプチドを含む精製融合タンパク質、および抗体のＦｃ部分に共有結合した可溶型ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドを含む精製キメラポリペプチド；
（ｈ）ＩＬ−１５ポリペプチドを含む融合タンパク質に結合した可溶型ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドを含む精製複合体；
（ｉ）抗体のＦｃ部分に共有結合した可溶型ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドを含む精製キメラポリペプチドに結合した融合タンパク質を含む精製複合体、ここで融合タンパク質はＩＬ−１５ポリペプチドを含む；
（ｊ）可溶型ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドを含む精製キメラポリペプチドに結合したＩＬ−１５ポリペプチドを含む精製複合体；
（ｋ）精製ＩＬ−１５ポリペプチド、および可溶型ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドを含む精製キメラポリペプチド；
（ｌ）精製キメラポリペプチドに結合した融合タンパク質を含む精製複合体、ここで融合タンパク質はＩＬ−１５ポリペプチドを含み、そして精製キメラポリペプチドは可溶型ＩＬ−１５Ｒａポリペプチドを含む；または
（ｍ）精製融合タンパク質および精製キメラポリペプチド、ここで融合タンパク質はＩＬ−１５ポリペプチドを含み、そして精製キメラポリペプチドは可溶型ＩＬ−１５Ｒポリペプチドを含む、
を含む、医薬組成物。
【請求項２】
さらに別の有効成分の使用を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
有効成分が、ＮＳＡＩＤＳ、免疫抑制剤、抗ヒスタミン剤、抗腫瘍原性剤、抗生物質、またはスルホンアミドである、請求項２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
この出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下に、２００５年５月１７日に出願されたU.S.Provisisional Patent Application No.60/681,663の利益を主張する資格を与えられている。その開示はそのまま参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
合衆国が支援している研究に関する供述
合衆国政府は、National Institutes of Health(NIH)により与えられた、Grant No.:R01-AI51583 Role of IL-15 in CD8T Cell Development and Responseに従う本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
配列リスト
本願は、生物における免疫モデュレーションのための組成物および方法と題する、２００５年５月１７日に出願されたU.S.Provisisional Patent Application No.60/681,663と共に合衆国特許および商標庁に先に提出した配列リストおよび配列リストの同一ＣＲＦを、参照によりそのまま本明細書に組みこむ。ＣＲＦは、ファイル：“IL-15_LLefrancois.txt;”作出：２００５年５月１７日；ＯＳ：MS Windows XP；サイズ：３１ＫＢにおいて、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列、配列番号１〜１６を含有する。３７ＣＦＲ  １．８２１（ｅ）に従って、本願のためのコンピューター読み取り可能な形態として、その出願で提出された以前に提出されたコンピューター読み取り可能な形態をどうか使用ください。該配列リストの同じペーパーコピーを、本願においてそれと共に提出する。
【０００４】
技術分野
本発明は、治療ポリペプチド組成物およびそれを必用としている生物に投与して免疫機能をモデュレーションするための方法に関する。特に、本発明は、生物に投与されたとき改良されたインビボ半減時間および有効性を示す、リンホカインポリペプチド部分およびリンホカインレセプター部分を含む有効量の治療タンパク質の投与に関する。
【０００５】
背景
リンパ球は、免疫システム調節に関与するタイプの白血球である。２つの広い種類のリンパ球、即ちＴ細胞およびＢ細胞がある。Ｔ細胞は細胞性免疫の責任を担い。これに対して、Ｂ細胞は体液性免疫（抗体に関する）の責任を担っている。Ｔ細胞は、これらのリンパ球が胸腺で成熟するのでこのように名付けられ、そしてＢ細胞は骨髄で成熟するのでこのように名付けられる。リンパ球は、リンパ系システムにおいてはるかに多く行き渡っておりそしてＢ細胞、Ｔ細胞、キラーＴ細胞およびナチュラルキラー細胞を含む。Ｂ細胞は、病原体に結合して病原体を破壊することができる抗体を作る。ＣＤ４＋（ヘルパー）Ｔ細胞は免疫応答を調整する（それらはＨＩＶ感染において欠損するものである）。ＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ウイルスにより感染されているかまたは抗原性配列を示す身体の細胞を殺すことができる。
【０００６】
ナチュラルキラー細胞は、ヒト自然免疫応答の重要な成分を構成するＣＤ５６（＋）ＣＤ３（−）大型顆粒リンパ球である。その強力な細胞溶解活性のほかに、ＮＫ細胞は、病原体除去において極めて重大な役割を果たす多数の免疫調節性サイトカインおよびケモカインを発現する。更に、ＮＫと他の免疫細胞との相互作用は、適応免疫応答または抗原特異的免疫応答をトリガーすることに関係している。
【０００７】
免疫細胞と炎症性細胞との相互作用は、主に、サイトカインタンパク質、例えば、細胞成長、分化および機能的活性化を促進することができるリンホカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）により媒介される。現在、少なくとも２３種のインターロイキンおよびそれらの種々のスプライス変異体が記載されている。これらのサイトカインのいくらかは、異なる生物学的効果を媒介するが、重なり合う活性を有することができる。インターロイキンの構造および機能の理解は、免疫および炎症の基本的生物学の新規な且つ重要な洞察をもたらした。例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）およびＩＬ−１５は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の発生、ホメオスタシスおよび機能に関係している部分的に重なり合う性質を有する２つの別のサイトカインである。
【０００８】
以前にＴ細胞成長因子と呼ばれたＩＬ−２は、抗原で活性化されたＴ細胞により産生される強力な免疫調節性リンホカインである。それは、刺激された時成熟Ｔリンパ球により産生されるが、ある種のＴ細胞リンパ腫細胞により構成的にも産生される。ＩＬ−２は、Ｔ細胞分化の分子的性質の研究に有用でありそして、それはナチュラルキラー細胞活性を増化させるので、癌、ウイルスもしくはバクテリア感染に対する免疫応答をモデュレーションするのに有用でありうる。ＩＬ−２は、ＢおよびＴリンパ球の両方のための成長ホルモンとして作用することもでき、そしてこれらのリンパ球のクローンエクスパンションおよび成熟を刺激することもできる。ＩＬ−２は、ＩＬ−２Ｒα（「ＩＬ−２Ｒａ」）、ＩＬ−２Ｒβ（「ＩＬ−２Ｒｂ」）および−γ（「ｇＣ」）鎖からなるそのレセプター（Ｒ）複合体に結合し、そして第２メッセンジャー、最終的に遺伝子発現を刺激する主としてチロシンキナーゼを介してその効果を及ぼす。
【０００９】
レセプター鎖のヘテロトリマー化は、Ｉｌ−２に対する高いアフィニティー結合をもたらす。造血細胞システムにおけるＩＬ−２Ｒａの機能的重要性は周知である。しかしながら、ＩＬ−２Ｒａが腫瘍形成において演じる潜在的役割は、まだ十分には解明されていない。ＩＬ−２Ｒａ発現は、白血病、リンパ腫、肺癌、乳癌、頭部および頚部癌および前立腺癌を含む多くのタイプの癌において見出された。腫瘍におけるＩＬ−２Ｒａの高い発現は、患者の劣悪な予後と相関している。
【００１０】
ＩＬ−１５は、リンホカインの４つのαヘリックスバンドルファミリー（four α-helix bundle families）のメンバーでありそしてそのｍＲＮＡは、非造血性細胞系統および造血性細胞系統の両方の広範な組織内に検出され得るが、Ｔ細胞によっては産生されない。ＩＬ−１５は、多分短いタンパク質半減時間および厳しい転写および翻訳コントロールによりインビボでタンパク質レベルで検出することは困難である。ＩＬ−１５は、免疫システムの発達（development）において重要な役割を果たす身体における多くの細胞により作られる可溶性タンパク質である。ＩＬ−１５は、細胞傷害性Ｔ細胞リンパ球細胞系（ＣＴＬＬ）および末梢血Ｔ細胞増殖を刺激することができそして末梢血単核細胞をエフェクター機能を示すように誘導することができる１４ｋＤａ〜１６ｋＤａタンパク質として、成人Ｔ細胞白血病細胞系およびサル腎臓上皮細胞系において同時に発見された。
【００１１】
ＩＬ−１５は、免疫系の発達およびコントロールにおいて多方面に関与する役割を演じる。更に詳しくは、ＩＬ−１５は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、キラーＴ細胞、Ｂ細胞、腸上皮内リンパ球（ＩＥＬ）および抗原提示細胞（ＡＰＣ）の機能、発達、生存および増殖に影響を与える。ＩＬ−１５−／−およびＩＬ−１５Ｒａ−／−トランスジェニックマウスの両方共、末梢ＮＫおよびキラーＴ細胞集団、ある種のＩＥＬサブセットおよび大部分のメモリー表現型ＣＤ８＋Ｔ細胞を欠いていることが証明された。更に、抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は上記両タイプのノックアウトマウスにおいて病原体に応答して発達することができるが、得られるメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞プールは、時間と共に劇的な侵食（erosion）を受ける。長期メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞増殖および生存を媒介することにおけるＩＬ−１５の極めて重大な役割を示唆している。
【００１２】
ＩＬ−１５レセプター（Ｒ）は、３つのポリペプチド、タイプ特異的ＩＬ−１５Ｒα（「ＩＬ−１５Ｒａ」）、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβ（「ＩＬ−２Ｒｂ」）および共通γ鎖（多数のサイトカインレセプターにより共有される「ｇＣ」）、からなる。高アフィニティーＩＬ−１５Ｒａ鎖
【数１】
0005918817.tif 000002
は、共有されたＩＬ−２ＲｂおよびｇＣとのヘテロトリマー複合体を形成すると考えられる。ＩＬ−１５と同様に、ＩＬ−１５Ｒａは、広く多様な細胞型により発現されるが、必ずしもＩＬ−２ＲｂおよびｇＣと共にではなく発現されると考えられる。ＩＬ−１５Ｒａ、ＩＬ−２ＲｂおよびｇＣ鎖は、ヘテロトリマーレセプターとして会合すると考えられるけれども、これが生理学的に適切な形態のＩＬ−１５レセプターであるかどうかは、推測の域を出ないままである。例えば、ＩＬ−１５Ｒａ鎖は、ＩＬ−１５の存在下にＩＬ−２Ｒｂ／ｇＣと共沈殿しない。
【００１３】
更に、ＩＬ−２Ｒａ鎖と違って、ＩＬ−１５Ｒａ鎖は、シグナル伝達を明らかに媒介する。ＩＬ−１５Ｒａは、ＩＬ−２Ｒａタンパク質に対する構造的類似性を共有する５８〜６０ｋＤａタンパク質である。ＩＬ−１５ＲａおよびＩＬ−２Ｒａ遺伝子も、同様なイントロン−エキソン構造を共有そしてヒト染色体１０ｐ１４−ｐ１５上で密接に連鎖している。ヒトＩＬ−１５Ｒａは、レセプターのマウス形態と約４５％アミノ酸（ａａ）相同性を共有する。異なるエキソンを含む選択的スプライシング事象から生じるＩＬ−１５ＲａｍＲＮＡの８つのアイソフォームが同定された。エキソン２の排除（ΔＥｘｏｎ２）は、ＩＬ−１５に結合しないＩＬ−１５Ｒａアイソフォームをもたらす。ヒトＩＬ−１５ＲａΔＥｘｏｎ３ｃＤＮＡは、３０アミノ酸シグナル配列、Ｎで連結された１つのグリコシル化部位を含有する１７５アミノ酸細胞外領域、２１アミノ酸膜貫通ドメインおよび４１アミノ酸細胞質テイルを含有する２６７アミノ酸（ａａ）タンパク質をコードする。
【００１４】
ＩＬ−１５シグナリングは、ＩＬ−１５Ｒａ、ＩＬ−２ＲｂおよびｇＣのヘテロトリマー複合体により；ＩＬ−２ＲｂおよびｇＣのヘテロダイマー複合体により；またはマスト細胞上に見出された新規な６０〜６５ｋＤａＩＬ−１５ＲＸサブユニットにより起こりうる。（Anderson, D.M. et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:29862-29869; Waldemann, T.A. and Y.Tagaya, 1999, Ann. Rev. Immunol., 17:19-49; Dubois, S. et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:26978-26984）。最近、ＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒａへの結合は、ＴＲＡＦ２結合についてＴＮＦＲＩと競合することにより繊維芽細胞におけるＴＮＦ−α媒介アポトーシスに拮抗することか報告された（Bulfone-Paus, S. et al., 1999, FASEB 13:1575-1585）。
【００１５】
免疫系に対するＩＬ−１５の既知の効果を考えると、多数のグループが、ＩＬ−１５をターゲティングしてホストの利益となるように免疫系を操作することを提唱した。ＩＬ−１５投与は、免疫応答を強めるためまたは免疫系再構成を増強するために使用されたが、ＩＬ−１５活性の遮断（blockade）は自己免疫応答を抑制することができる。例えば、ＩＬ−１５活性ブロッキング突然変異体ＩＬ−１５Ｆｃタンパク質またはＩＬ−１５Ｒａの可溶性形態の投与は、関節炎および同種移植片生存のマウスモデルにおける治療的潜在力を有する。
【００１６】
反対に、予防接種または感染期間中のアジュバントとして投与されたＩＬ−１５（タンパク質またはＤＮＡ発現ベクター）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を増強し、そしてＩＬ−１５処理は、Mycobacterium tuberclosisおよびEscherichia coliの致死用量からのマウスの保護を高めることができる。更に、ＩＬ−１５治療は、抗ＨＩＶ免疫を刺激しそしてインビトロでＨＩＶ感染患者からのＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の生存を増加させる。ＩＬ−１５は、骨髄移植の後に免疫再構成を促進することもできる。いくつかのグループは、ＩＬ−１５治療は、化学療法、Ｔｏｌｌ様レセプターアゴニストまたは腫瘍反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入と協力して、各治療単独と比較して、マウス腫瘍モデルにおける増加した生存または完全な腫瘍退行をもたらすことができるということを見出した。かくして、ＩＬ−１５活性の操作は、多数の臨床状態における治療様式として潜在力を有する。
【００１７】
ＩＬ−１５は、免疫応答の増加が望ましい多くの研究で現在使用されている。これらは、腫瘍および感染に対するワクチンの有効性を増加させることおよび明白な予防接種の不存在下に癌を除去する身体の能力を増大させることを含む。更に、ＩＬ−１５は、骨髄移植後またはＡＩＤＳにおいて免疫系を再生させるのを助けることができる。しかしながら、インビボでのＩＬ−１５の半減時間は、非常に短く（分〜１時間など）、これは有効性が不十分な１つの理由である。現在では、ＩＬ−１５活性の任意の効果を得るための唯一の方法は、大用量を使用することによるものであり、そしてＩＬ−１５だけでは必ずしも有効ではない。研究は、分子改変を使用してＩＬ−１５の半減時間を増加させようと試みたが、これらは一般に効果がなかった。例えば、ＩＬ−１５のＰＥＧ化（タンパク質半減時間を増化させるためによく行われる技術）は、半減時間を増加させるが、サイトカインの活性の大部分を破壊し、実際、ＰＥＧ−ＩＬ−１５はＩＬ−１５活性のアンタゴニストである。
【００１８】
従って、適当な治療形態のＩＬ−１５であって、免疫をモデュレーションするかまたは増強させる目的でそれを必用としている生物に投与されたとき、より長い半減時間およびより低い投薬量でより高い有効性を示す適当な治療形態のＩＬ−１５を提供するためのまだ満たされていない要求が存在する。このような治療は、ＩＬ−１５単独の効果を超えるホスト免疫系の増強を同時に提供しながら、より少ないサイトカインの投与を可能とするであろう。
【００１９】
我々の研究は、ＩＬ−１５Ｒａは、ＩＬ−１５Ｒａ発現の必要なしにＩＬ−２／１５Ｒｂ／ｇＣ複合体を発現する対抗する細胞（opposing cells）に、ＩＬ−１５を「トランス提示する（transpresent）」ように作用することを示した。更に、インビトロで、抗体Ｆｃ領域に共有結合により連結されたＩＬ−１５Ｒａ（ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ）の可溶性部分からなるキメラに結合したＩＬ−１５（R&D Systems,Inc., Minneapolis, MN）は、両成分単独と対照的に、ＩＬ−１５Ｒａ−／−メモリーＣＤ８Ｔ細胞の生存を支持する。
【００２０】
ＩＬ−１５Ｒａの可溶性部分は、ＩＬ−１５作用の阻害剤であることは当業者により一般に知られている。事実、公表された研究は、ＩＬ−１５ＲａがインビトロおよびインビボでＩＬ−１５活性を阻害することができることを示した。現在、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒａをインビボ処理として投与の前にプレカップリングさせた（precoupled）システムはまだ誰も考案していない。
【００２１】
発明の要約
本発明は、一般に、治療ポリペプチド組成物およびそれを必用としている個体にそれを投与する方法に関する。本発明は、核酸およびそれによりコードされたポリペプチドならびに、本発明の核酸を含有する核酸ベクターを含む関連した組成物、本発明の核酸を含有する細胞系および本発明の治療ポリペプチドに結合する抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ等）に関する。本発明は、少なくとも１つのリンホカインレセプターもしくはその一部とのプレカップリングさせた複合体において少なくとも１つのリンホカインもしくはその一部を含む治療剤を発生させるための方法にも関する。驚くべきことに且つ意外にも、本発明のプレカップリングされた組み合わせは、ＩＬ−１５単独の投与で観察されたよりもインビボでのより長い半減時間および高い治療有効性を示すことが観察された。
【００２２】
本発明は、更に、配列番号１〜４および１３〜１６に示されたヌクレオチド配列に対する少なくとも２５％の相同性を有する核酸分子を包含する。ＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列における変化をもたらすＤＮＡ配列多型が集団（例えば、ヒト集団）内に存在しうることは、当業者により認識されるであろう。ＮＯＶＸ遺伝子におけるこのような遺伝子多型は、自然のアレル変異により集団内の個体間に存在しうる。本明細書で使用された用語「遺伝子」および「リコンビナント遺伝子」は、好ましくは脊椎動物からのインターロイキンおよび／またはインターロイキンレセプターポリペプチドをコードするオープンリーディグフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子を指す。このような自然のアレル変異は、典型的にはヌクレオチド配列における１〜５％分散をもたらすことができる。自然のアレル変異の結果でありそしてポリペプチドの機能的活性を変化させない、任意のおよびすべてのこのようなヌクレオチド変異ならびに、配列番号５〜１２のポリペプチドにおける得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあることを意図する。
【００２３】
１つの局面では、本発明は、リンホカインまたはその一部をコードする核酸およびポリヌクレオチド分子に関する。更に、本発明は、リンホカインレセプターまたはその一部をコードする核酸およびポリヌクレオチド分子に関する。本発明のこの局面は、実質的に、完全長タンパク質、野生型もしくは突然変異体ポリペプチド；分離したセグメンド（discrete segments）、ドメイン、サブドメイン、フラグメント、欠失もしくは挿入突然変異；キメラ；およびアイソフォームおよびスプライス変異体をコードするポリヌクレオチドの使用を意図する。本発明のこの局面は、単一オープンリーディグフレーム（ＯＲＦ）内に少なくとも１つのリンホカインレセプターもしくはその一部をコードするセグメントと連続した、少なくとも１つのリンホカインもしくはその一部をコードするセグメントを含む核酸も含む。ある態様では、本発明の核酸は、転写調節因子配列（例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、エンハンサー等）；融合タンパク質配列（例えば、Ｈｉｓ−タグ、ＧＳＴ、ＧＦＰ、抗体Ｆｃ部分、抗生物質耐性、シグナルペプチド等）；および／またはポリペプチドコード配列の５’末端、３’末端もしくはポリペプチドコード配列内の位置に配置されたリンカー配列；および／またはその組合わせに相当する少なくとも１つの追加のポリヌクレオチドセグメントを含む。本明細書に記載の態様のいずれかにおいて、本発明のポリヌクレオチドは、真核細胞もしくは細胞抽出物、原核細胞もしくは細胞抽出物および／またはその組合わせにおけるクローニングおよび／または発現のために適当な、適当なウイルスベクター、バクテリアプラスミド、または人工的染色体内に配置されてもよい。
【００２４】
ある局面では、本発明は、インターロイキンレセプターポリペプチド、例えばＩＬ−２Ｒａ（配列番号９および１１）またはＩＬ−１５Ｒａ（配列番号７および８）（その一部および組み合わせを含む）とのプレカップリングされたタンパク質複合体において、インターロイキンポリペプチド、例えばＩＬ−２（配列番号１０および１２）またはＩＬ−１５（配列番号５および６）（その一部および組み合わせを含む）を含む治療組成物に関する。ある態様では、本発明は、配列番号７、８、９、１１に対して少なくとも４０％の相同性を有するポリペプチド、それらの一部または組合わせとのプレカップリングされた複合体における、配列番号５、６、１０、１２に対する少なくとも４０％の相同性を有するポリペプチド、それらの一部または組合わせを含む治療ポリペプチド組成物に関する。ある他の態様では、本発明は、配列番号７、８、９、１１に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド、それらの一部または組合わせとのプレカップリングされたタンパク質複合体における、配列番号５、６、１０、１２に対する少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド、それらの一部または組合わせを含む治療ポリペプチド組成物に関する。
【００２５】
他の局面では、本発明は、本発明のポリペプチド複合体におけるキメラポリペプチドの使用に関する。ある態様では、本発明は、１つ以上のインターロイキン、インターロイキンレセプター、その一部および組合わせを含むキメラポリペプチドを含む。他の態様では、本発明は、抗体のＦｃ部分と共有結合により連結されそして抗体のＦｃ部分と連続した、少なくとも１つのインターロイキンレセプターポリペプチドまたはその一部、例えばインターロイキンレセプターの可溶性部分および／またはリガンド結合ドメインを含むキメラポリペプチドを含む。本発明のキメラ分子は、当業者により認識される任意の数の組合わせにおいて単一ＯＲＦ内に所望のエレメントを含有するポリヌクレオチドを発現することによりリコンビナントに合成されうる。他のキメラポリペプチド、例えばヒトＩＬ−１５Ｒａ（１Ｍｅｔ−９４ＩＬｅ）−Ｋ−（１２９Ｐｒｏ−２０５Ｔｈｒ）−リンカー−Ｆｃポリペプチドは、R&D Systems(Minneapolis,MN)から市販されている。
【００２６】
他の局面では、キメラポリヌクレオチド分子は、真核または原核細胞または生物において使用するのに適当な、サブクローニング、発現、精製または他のルーチンな遺伝子操作のための、核酸ベクター、例えばプラスミドまたはウイルスＤＮＡ構築物内に含有される。更に、キメラポリレヌクレオチド分子は、リンホカインもしくはリンホカインレセプター部分をコードする領域間に遺伝子操作により挿入された、追加のコード配列または非コード配列を場合により含有していてもよい。１つの態様では、インターロイキンまたはその一部をコードする核酸は、インターロイキンレセプター部分とタンデム連結において配置される。なお更なる態様では、リンカー配列は、第１核酸の末端コドンと第２核酸の第１コドンとの間に挿入される。これらのリンカーは、適当な任意の長さおよびタイプであることができ、そして、例えば、ポリペプチド折りたたみにおける立体的拘束を減少させるため、プロテアーゼもしくはヌクレアーゼ開裂部位を導入するため、または化学的改変、コンジュゲーションまたは他の機能的エレメントのための好都合な部位を与えるために使用されうる。
【００２７】
好ましい態様では、候補タンパク質はヒトタンパク質である。他の態様では、候補タンパク質は、真核生物タンパク質、例えば、哺乳動物タンパク質またはマウスタンパク質である。他の局面では、本発明は、インターロイキン、インターロイキンレセプターもしくはその一部、および／またはキメラインターロイキン／インターロイキンレセプターポリペプチドをコードするトランスジーンを含有するトランスジェニック細胞または生物を特徴とする。他の局面では、本発明は、例えば細胞のゲノムＤＮＡへの組込みにより、エピソーム的保持によりまたは人工的染色体の一部として、本発明のポリヌクレオチド構築物を含有する１つ以上の遺伝子的に変更された細胞系に関する。関連した局面では、本発明は、本発明の個々の成分または全体のポリペプチド複合体をコードする核酸の改変されたホスト細胞による発現に関する。ある態様では、トランスジーンは、トランスジェニック細胞に対して通常外因性であるタンパク質をコードする。ある態様では、トランスジーンはヒトタンパク質をコードする。ある態様では、トランスジーンは、異種プロモーターに連結される。他の態様では、トランスジーンはそのネイティブプロモーターに連結される。
【００２８】
他の局面では、本発明は、本発明のポリペプチド複合体またはその成分の別個のエピトープを認識しそして該別個のエピトープに結合する、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはキメラ抗体に関する。ある局面では、本発明は、本発明の複合体の成分、本発明の複合体、他のリンホカイン、他のリンホカインレセプターまたはそれらの組合わせに対して特異的な抗体の投与に関する。１つの態様では、本発明は、インターロイキン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−１５であって、該インターロイキンに対して特異的な抗体にプレカップリングされた、インターロイキン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−１５を含む。他の態様では、本発明の方法は、インターロイキンおよび該インターロイキンに対して特異的に抗体を含む有効量のプレカップリングされた複合体を、それを必用としている個体に投与することを含む、個体における疾患を処置するための方法を含む。
【００２９】
他の局面では、本発明は、少なくとも１種のリンホカインポリペプチドもしくはその一部と少なくとも１つのリンホカインレセプターポリペプチドもしくはその一部とのプレカップリングされた複合体を含む免疫モデュレーション性の治療剤（immunomodulatory therapeutic）を製造するための方法に関する。ある態様では、本発明は、成分ポリペプチドを発現もしくは合成し、該ポリペプチドを単離し、該ポリペプチドを精製および／または濃縮し、そして前記複合体を形成することを含む、インビトロで本発明の複合体を創生するための方法を含む。この局面では、本発明は、ホスト細胞または細胞抽出物から単離されたポリペプチドからの本発明のプレカップリングされたポリペプチド複合体の創生であって、該複合体の各ポリペプチド成分が２つの分離した核酸から発現されるかまたはフレーム内でタンデムで連結されたインターロイキンおよびインターロイキンレセプターを含むキメラを含む単一のオープンリーディグフレームとして発現される、創生に関する。精製は、当業者に知られているクロマトグラフィー手段により行うことができ、そして例えば、アフィニティー精製、サイズ排除、イオン交換、ヒドロキシアパタイト、ＨＰＬＣ等を含むことができる。
【００３０】
他の局面では、本発明は、免疫細胞活性および増殖を誘導し、増強しまたは抑制するための方法であって、有効量のプレカップリングされたポリペプチド複合体を、それを必用としている個体に投与することを含み、該プレカップリングされたポリペプチド複合体が少なくとも１つのリンホカインもしくはその一部および少なくとも１つのリンホカインレセプターもしくはその一部を含む、方法に関する。本発明の関連した局面では、複合体は、抗原、例えば、バクテリア、ウイルス、タンパク質、ペプチド、核酸等に対するホスト生物の免疫または免疫応答を増大させるのに使用することができる。本発明の前述の目的のすべては、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−１５ＲａまたはＩＬ−２Ｒａポリペプチド、その一部および組合わせの使用を意図する。更に他の局面では、本発明は、配列番号１〜４および１３〜１６の１種以上をコードするベクターを生物に投与することを含む、生物を処理する方法を含む。
【００３１】
他の局面では、本発明は、メモリーＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の増殖および生存を増加させるために有用なプレカップリングされたポリペプチド複合体に関する。このようなものとして、本発明の治療剤の投与を使用して、実際のワクチンブースターの必要なしに、予め存在している免疫（例えば、以前に予防接種された個体）を増強させることもできる。ある局面では、例えば、予防接種の増強のため、ＳＣＩＤまたはＡＩＤＳ患者における免疫を増強させるためおよび癌の処置のために、本発明の治療は行われる。
【００３２】
更に他の局面では、本発明のプレカップリングされたポリペプチド複合体は、ホスト生物の免疫応答が生物に対して有害である場合にホスト生物の免疫応答を抑制するのに有用である。例えば、本発明の複合体は、慢性関節リウマチまたはループスのような自己免疫疾患および状態に罹っている個体で観察されるとおり、抗原、例えば自己抗原に対するホスト生物の免疫または免疫応答を抑制するのに使用されうる。本発明のこの局面のある態様では、プレカップリングされたポリペプチド複合体は、免疫細胞を活性化することができないかまたはそれらの増殖を刺激することができないリンホカインおよびリンホカインレセプターポリペプチドまたはその一部を含む。例えば、複合体のポリペプチド成分は、ＩＬ−２もしくはＩＬ−１５経路を介するシグナリングを阻害する突然変異、欠失、挿入または化学的改変を含有することができる。
【００３３】
上記した局面のいずれかにおいて、プレカップリングされたポリペプチド複合体は、任意の適当な経路（例えば、静脈内、経口、非経口、皮下、局所、尻、鼻等）を介しそして場合により任意の薬学的に許容され得る賦形剤、担体と共に、および／または他の有効成分（例えば、ＮＳＡＩＤＳ、免疫抑制剤、抗ヒスタミン剤、抗腫瘍原性剤（Anti-oncogenics）、抗生物質、スルホンアミド等）と組み合わせて、任意の薬学的に許容され得る形態（例えば、液剤、散剤、丸剤、コントロールされた放出処方等）において投与されうる。前記は、非限定的例として与えられそして特定の処方は、当業者により認識されうる多数の因子に依存して、本明細書に明白に組み込まれている任意の数の方法で変えることができる。
【００３４】
更に他の局面では、本発明は、適当な容器、その中に配置された薬学的に許容され得る形態にある本発明のプレカップリングされたポリペプチド複合体またはその成分およびその使用のためのインストラクションを含むキットに関する。
【００３５】
他の局面では、本発明は、説明された方法において使用するための突然変異されたおよび改変された核酸を含有するライブラリーおよびそこに同定された核酸の産生に関する。
【００３６】
他の局面では、本発明は、サンプル中のリンホカイン−リンホカインレセプターポリペプチド複合体の存在を検出する方法に関する。この方法では、サンプルを、ポリペプチド間の複合体の形成を可能とする条件下に選択的に結合する化合物または抗体と接触させる。複合体は、もし存在するならば、検出され、それによりサンプル内のポリペプチド複合体を同定する。サンプルをリンホカインもしくはリンホカインレセプター核酸プローブもしくはプライマーと接触させ、核酸プローブもしくはプライマーがサンプル中のリンホカイン−リンホカインレセプターキメラ核酸分子に結合したかどうかを検出することにより、サンプル中のリンホカイン−リンホカインレセプターキメラ核酸分子の存在を検出する方法も本発明内に含まれる。
【００３７】
本発明のシステム、方法およびプロセスと関連した追加の有利な特徴および機能性は、下記する詳細な説明から明らかになるであろう。本発明の背景を説明するために、特に実施に関する追加の詳細を与えるために本明細書で使用される刊行物および他の資料は、参照により組み込まれそして便宜上添付した参考文献に列挙されている。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】プレカップリングされたＩＬ−１５＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃの共投与は、外因性ＩＬ−１５に対するＣＤ８＋Ｔ細胞増殖応答を増強させる。−１日目にマウスは約１×１０７のコンジェニックな、ＣＦＳＥ標識された、ＣＤ８濃縮されたリンパ球（congenic CFSE-labeled,CD8-enriched lymphocytes）を腹腔内に受け取り、そして０日目にＰＢＳ；ＩＬ−１５（約２．５μg）：またはＩＬ−１５（２．５μg）を伴うＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約１５μg）で腹腔内処理された。ＣＤ８＋脾細胞をＣＦＳＥ蛍光およびＣＤ４５．１発現（上部パネル）についてフローサイトメトリーにより４日目に解析し；またはＣＤ４５．１＋ＣＤ８＋細胞をＣＦＳＥ蛍光およびＣＤ４４発現（中部パネル）について解析した。下部パネル：−１日目に、マウスは、約６．５×１０５テトラマー＋ＯＶＡ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を含有するＣＦＳＥ標識されたＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮された脾細胞を受け取り、そして０日目にＰＢＳ、ＩＬ−１５（約２．５μg）またはＩＬ−１５（約２．５μg）を伴うＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約１５μg）で処理された。ドナーテトラマー＋脾細胞を、ＣＦＳＥ蛍光について４日目にフローサイトメトリーにより解析した。ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ処理単独は、増殖に対する効果を持たなかった（データは示されていない）。データは、３マウス／グループで３つの同様な実験の代表値である。
【図２】ＮＫ細胞は、プレカップリングされたＩＬ−１５＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃに対して高度に応答性である。−１日目に、マウスは、約１．５×１０７のコンジェニックなＣＦＳＥ標識されたリンパ球を静脈内に受け取り、そして０日目に、ＰＢＳ；ＩＬ−１５（約２．５μg）：またはＩＬ−１５（約２．５μg）＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約１５μg）で腹腔内処理された。脾細胞を４日目にフローサイトメトリーにより解析した。サンプルは、ドナー集団における指示されたことに対してゲーティングされた。データは３マウス／グループで２つの実験の代表値である。
【図３】ＣＤ８＋Ｔ細胞は、プレカップリングされたＩＬ−１５＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ処理に応答して迅速に分裂する。−１日目に、マウスは、約１×１０７のコンジェニックなＣＦＳＥ標識された、ＣＤ８濃縮されたリンパ球を静脈内に受け取り、そして０日目に、ＰＢＳまたはＩＬ−１５（約２．５μg）＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約１５μg）で処理された。末梢血リンパ球を１〜４日目にフローサイトメトリーにより解析した。示されたサンプルは、生きているドナーＣＤ８Ｔ細胞に対してゲーティングされた。ＰＢＳ処理は細胞分裂に対する効果を持たなかった（データは示されていない）。
【００３９】
発明の詳細な説明
好ましい態様の組成物および方法の例では、治療ポリペプチドの有用な且つ有利な発生が提供される。好ましい態様では、本発明は、リンホカインもしくはその一部およびリンホカインレセプターもしくはその一部を含む治療ポリペプチド複合体に関する。用語「リンホカインレセプター」または「インターロイキンレセプター」は、それぞれのリンホカインまたはインターロイキンに対する膜貫通レセプターを指し、そしてある態様では、該リンホカインまたはインターロイキンに結合することができる抗体を含むことができる。この状況では、抗体は、リンホカインまたはインターロイキンポリペプチドに対する「レセプター」として有効に機能する。
【００４０】
いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、本発明は、本発明の治療の活性は、ポリペプチド複合体のレセプター部分が、シグナリング分子部分をターゲット細胞の表面のそのそれぞれのレセプター（１つまたは複数）に提示するように機能する、「トランス提示（trans-presentation）」と呼ばれるプロセスから生じるということを仮定している。例えば、実験的証拠は、ＩＬ−１５ＲａはＩＬ−１５レセプターのβおよびγ鎖を通じてインビボでＴ細胞および他の細胞にＩＬ−１５をトランス提示することを示す。この理論は、ＩＬ−１５単独は殆ど活性を持たないが、プレカップリングされたＩＬ−１５＋ＩＬ−１５Ｒａ複合体は図１に示されたとおりメモリーＴ細胞増殖を推進すること（ＩＬ−１５活性の特徴の１つ）および腫瘍量（tumor burden）を減少させること表１、に対する実質的な活性を有することを示す、マウスにおけるインビボでの結果により支持される。ＩＬ−１５をＩＬ−１５Ｒａ鎖にプレカップリングさせることにより、ＩＬ−１５の生物学的活性はマウスにおいて顕著に増大した（図１〜８および１０〜１２）。
【００４１】
明白に特記しない限り、下記の定義は、当技術分野で知られた用語の定義を補足する。
【００４２】
用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボ核酸、リボヌクレオチドおよびリボ核酸、およびそのホーリマー形態を指し、そして一本鎖または二本鎖形態を含む。明白に限定されない限り、用語「核酸」は、天然のヌクレオチドの既知のアナログ、例えば、参照核酸と同様な結合性を有するペプチド核酸（「ＰＮＡｓ」）を含む。更に、好ましい態様のいずれかにおいて、特定のヌクレオチドまたは核酸配列は、保存的変異（例えば、縮重コドン置換（degenerate codon substitution）、下記参照）、相補性配列および明白に示された配列を含む。縮重コドン置換は、１つ以上の選ばれたコドンの第３の位置が同じアミノ酸をもたらす任意のヌクレオチドで置換されている、縮重コドン置換である。用語核酸は、用語「遺伝子」、「ＤＮＡ」、「ｃＤＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」、「ＲＮＡ」、「ｍＲＮＡ」、「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」等に対して包括的である。
【００４３】
本明細書で使用された、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌクレオチド残基を指す。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列に基づくことができまたはゲノムまたはｃＤＮＡ配列からデザインされ得、そして特定の細胞または組織において同一の、類似したまたは相補性ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅、確認または示すのに使用される。オリゴヌクレオチドは、約長さが約１０nt、５０nt、または１００nt、好ましくは長さが約１５nt〜３０ntを有する核酸配列を含む。本発明の１つの態様では、長さが１００ntより少ない核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４または１３〜１６の少なくとも６個の連続したヌクレオチドを更に含むであろう。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成されそしてプローブとして使用することもできる。
【００４４】
「リコンビナント」核酸は、インビトロまたは人工的（天然には存在しないことを意味する）方法または２つ以上の核酸の組換えにより産生された任意の核酸である。
【００４５】
用語「遺伝子」は、与えられたＲＮＡまたはタンパク質の発現と関連した核酸の任意のセグメントを指す。従って、遺伝子は、発現されたＲＮＡｓ（典型的にはポリペプチドコード配列を含む）をコードする領域およびしばしばそれらの発現のために必要な調節配列を含む。遺伝子は、関心のあるソースからのクローニングまたは既知のもしくは予測された配列情報から合成することを含む種々のソースから得ることができ、そして特別に所望されるパラメーターを有するようにデザインされた配列を含むことができる。
【００４６】
他の態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１〜４および１３〜１６に示されたヌクレオチド配列の相補体である核酸分子を含む。本明細書で使用された、用語「相補性」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成を指し、そして用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または関連したポリペプチドまたは化合物またはそれらの組み合わせ間の物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は直接または間接的であることができる。間接相互作用は、他のポリペプチドまたは化合物の効果を通じてまたは該効果によることができる。直接結合は、他のポリペプチドまたは化合物の効果を通じてまたは該効果により起こらないで、その代わりに他の実質的な化学的中間体なしの、相互作用を指す。本明細書で提供された「フラグメント」は、核酸の場合には特異的ハイブリダイゼーションを可能としまたはアミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識を可能とするのに十分な長さである、少なくとも６個の（連続した）核酸または少なくとも４個の（連続した）アミノ酸の配列として定義され、そして多くても完全長配列より少ない部分である。フラグメントは、選択される核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分に由来することができる。完全長クローンは、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびインフレーム停止コドン（in-frame stop codon）を含有するものとして同定される。従って、ＡＴＧ翻訳開始コドンを欠いている任意の開示されたＮＯＶＸヌクレオチド配列は、それぞれのポリペプチドのトランケーションされたＣ末端フラグメントをコードし、そして対応する完全長ｃＤＮＡは、開示された配列の５’方向に延びていることを必用とする。インフレーム停止コドンを欠いている任意の開示されたヌクレオチド配列は、同様にそれぞれのポリペプチドのトランケーションされたＮ末端フラグメントをコードし、そして対応する完全長ｃＤＮＡは開示された配列の３’方向に延びていることを必用とする。
【００４７】
用語「ホスト細胞」は、異種核酸を保有するのにまたは異種核酸によりコードされたペプチドまたはタンパク質を発現するのに使用されうる細胞を含む。ホスト細胞は、細胞のネイティブな（非リコンビナント）形態内で見出されない遺伝子、遺伝子が改変されそして人工的手段により細胞に再導入されるネイティブな形態の細胞において見出される遺伝子、または細胞から核酸を除去することなく人工的に改変された細胞に対して内因性の核酸を含有することができる。ホスト細胞は真核細胞または原核細胞であることができる。例えば、バクテリアテ細胞は、核酸配列を保有もしくはクローニングするのにまたはポリペプチドを発現するのに使用することができる。バクテリアテの培養のために必要な一般的成長条件は、BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, Vol.1,N.R.Krieg, ed., Williams and Wilkins,Baltimore/London(1984)に見出されうる。「ホスト細胞」は、内因性遺伝子もしくはプロモーターまたはその両方が本発明の複合体のポリペプチド成分の１種以上を産生するように改変されているホスト細胞であることもできる。
【００４８】
「誘導体」は、直接に、改変によりまたは部分的置換によりネイティブ化合物から形成された核酸配列またはアミノ酸配列である。「アナログ」は、ネイティブな化合物に類似した、しかしネイティブな化合物と同じではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列であり、例えばそれらはある成分または側鎖に関してそれとは異なる。アナログは、合成されてもよくまたは異なる発生起源に由来することができ、そして野生型と比較して類似したまたは反対の代謝活性を有することができる。相同体は、異なる種に由来する特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００４９】
誘導体およびアナログは、完全長であるかまたは完全長以外であることができる。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、種々の態様において、同じサイズの核酸またはアミノ酸配列に対してまたは当技術分野で知られているコンピューター相同性プログラムによりアライメントが行われるアライメントされた配列と比較するとき、少なくとも約３０％、４５％、７０％、８０％または９５％一致（好ましい同一性は８０〜９０％）するかまたはそのコード核酸がストリンジェントな、中程度にストリジェントな、または低ストリンジェントな条件下に本発明のタンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイゼーションすることができる、本発明の核酸またはタンパク質に対して実質的に相同性である領域を含む分子を含むが、それらに限定されない。例えば、Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR  BIOLOGY, John Wiley&Sons, New York, N.Y., 1993参照。核酸誘導体および改変は、遺伝子置換、部位特異的突然変異、欠失、挿入、組み換え、修復、シャフリング、エンドヌクレアーゼ消化、ＰＣＲ、サブクローニング、および関連した技術により得られた核酸誘導体および改変を含む。
【００５０】
「相同体」は、自然に生じることができるか、または関連した配列を有する１つ以上の核酸の人工的合成または関連した核酸を産生するための１つ以上の核酸の改変により創生されうる。核酸は、それらが天然にまたは人工的に共通の先祖配列に由来するとき相同性である（例えばオーソログまたはパラログ）。２つの核酸間の相同性が明白に述べられていなければ、相同性は２つ以上の配列間の核酸比較により推定することができる。配列がある程度の配列類似性、例えば、一次アミノ酸構造レベルで約３０％より高い配列類似性を示すならば、それらは共通の先祖を共有すると結論される。類似性の程度は変わるであろうし、そして重要な因子は、例えば、全体の類似性の程度、コード配列の特定の領域内の類似性の程度、非コード配列の類似性およびポリペプチドの活性を含む。本発明の目的で、遺伝子は、もしも核酸配列が組換えを可能とするのに十分に類似しているならば、相同性である。
【００５１】
２種以上の核酸またはポリペプチドに関して、用語「相同性」または「同一性」は、同じであるか類似している２つ以上の配列またはサブ配列であって、ＢＬＡＳＴ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、または当業者により入手可能な他のアルゴリズムなどの配列比較アルゴリズムの１つを使用してまたは目で見る検査により測定して、最大対応について比較およびアライメントされるとき、同じであるアミノ酸またはヌクレオチドの特定された百分率を有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。配列比較および相同性決定のために、典型的には、１つの配列は、試験配列を比較するための基準配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および基準配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定しそして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで配列比較アルゴリズムは、指示されたプログラムパラメーターに基づいて基準配列に対する試験配列（１つまたは複数）の百分率配列一致を計算する。相同性の他の決定は、ストリンジェントな条件下の核酸のハイブリダイゼーションを含む。
【００５２】
フレーズ「ハイブリダイゼーションする」は、その配列が複合体混合物（例えば全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ内に存在するときを含めて、ストリンジェントな条件下の特定のヌクレオチド配列にのみ分子が結合、二本鎖化（duplexing）またはハイブリダイゼーションすることを指す。
【００５３】
本明細書で使用された用語「プレカップリングされた」は、ターゲット部位、例えば免疫細胞における活性化または結合の前に個々のポリペプチド成分を組み合わせて活性な複合体を形成する状況を指す。これは、個々のポリペプチド複合体成分が合成されるかまたはリコンビナントに発現され、次いで単離されそして組み合わされて生物への投与の前にインビトロで複合体を形成する状況；キメラまたは融合ポリペプチド（即ち、複合体の各分離したタンパク質成分が単一ポリペプチド鎖に含有されている）がインタクトな複合体として合成されまたはリコンビナントに発現される状況；および／または個々のポリペプチド複合体成分が個体に同時に、例えば静脈内に投与されそしてin situまたはインビボで複合体を形成する状況を含む。
【００５４】
核酸配列の「保存的突然変異」は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸をコードするこれらのヌクレオチドを指すか、またはヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。これは、遺伝子コードは「縮重している」、即ち、多数の異なる核酸が同じアミノ酸をコードする、ということに基づいている。例えば、コドンＧＴＴ、ＧＴＡ、ＧＴＣおよびＧＴＧは、すべてアミノ酸バリンをコードする。従って、バリンがコドンにより特定されるすべての位置で、コドンはコードされたポリペプチドを変えることなく、上記した対応するコドンのいずれかに変えることができる。このような核酸変異は、「サイレント突然変異」であり、これは「保存的突然変異」の１つの種類である。特記しない限り、アミノ酸をコードする本明細書で記載されたすべてのヌクレオチド配列は、すべての可能なサイレント変異も含む。当業者は、核酸における各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＴＧを除いて）は、標準技術により機能的に同一の分子を生じるように改変されうることを認識するであろう。従って、突然変異誘発が使用される各場合に、アミノ酸をコードする核酸の各「サイレント突然変異」は、事実上含まれる。
【００５５】
更に、当業者は、「保存的突然変異」が、核酸変更が化学的に同様なアミノ酸の置換をもたらす、コード配列における単一アミノ酸または少数のアミノ酸を変更、付加または欠失させる核酸の置換、欠失または付加も含むことを認識するであろう。お互いに対する保存的置換として働くことができるアミノ酸は、下記のもの：塩基性：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；親水性：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；疎水性：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、を含む。更に、保存的変異により異なる配列は一般に相同性である。
【００５６】
「サブ配列」は、それぞれ核酸またはアミノ酸のより長い配列の一部（例えばポリペプチド）を含む核酸またはアミノ酸の配列を指す。
【００５７】
核酸「オペロン」は、他の核酸配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーションシグナル、または他の遺伝子であってそれがコード配列の転写を増加させる場合の他の遺伝子との機能的関係において位置している遺伝子を含む。
【００５８】
本明細書で使用される「突然変異誘発」は、ＰＣＲ突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ突然変異誘発、等および本明細書で記載された技術のいずれかによる反復遺伝子組換えなどの当技術分野で知られた技術を含む。
【００５９】
突然変異誘発、ＰＣＲ、クローニング等を含む本発明の実施に有用な分子生物学的技術の説明は、Berger and Kimmel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, METGODS IN ENZYMOLOGY, volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING-A LABORATORY MANUAL (2nd Ed), Vol. 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989, and CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F.M.Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associatres, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.; Berger, Sambrook, and Ausubel, as well as Mullis et al., U.S.Pat.No.4,683,202(1987); PCR PROTOCOLS A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS(Innis et al, eds), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.(1990)(Innis); Arnheim & Levinson(Oct. 1, 1990)C&EN 36-47; Leung, et al., A methods for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction.Technique: J Methods Cell Molec Biol 1(1): 11-15(1989)を含む。これらはすべての目的で参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。本発明の例示的方法は、配列突然変異誘発、組換えまたはその両方ならびに個々の遺伝子のスクリーニングまたは選択を含む。
【００６０】
本明細書で使用された用語「リンホカイン」、「インターロイキン」、「ＩＬ−１５」または「ＩＬ−２」は、例えば、完全長配列、セグメント、ドメインもしくは分離した部分、置換、挿入および欠失突然変異体、同じもしくは他のリンホカインとのキメラ、アイソフォーム、スプライス変異体およびその任意の組合わせを含む対応するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のすべての形態を集約的に指すために使用される。
【００６１】
本明細書で使用された、用語「ＩＬ−１５Ｒａ」または「ＩＬ−２Ｒａ」は、例えば、完全長配列、セグメント、ドメインもしくは分離した部分、置換、挿入および欠失突然変異体、同じもしくは他のリンホカインレセプターとのキメラ、アイソフォーム、スプライス変異体およびその任意の組合わせを含む対応するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のすべての形態を集約的に指すために使用される。
【００６２】
核酸分子
ある態様では、本発明は、リンホカインもしくはその一部をコードする核酸およびポリヌクレオチド分子ならびにリンホカインレセプターもしくはその一部をコードする核酸およびポリヌクレオチド分子を含む。核酸態様のいずれかにおいて、本発明は、完全長タンパク質、野生型もしくは突然変異体ポリペプチド；分離したセグメント、ドメイン、サブドメイン、フラグメント、欠失もしくは挿入突然変異；キメラ；およびアイソフォームおよびスプライス変異体を実質的にコードするポリヌクレオチドの使用を意図する。ある好ましい態様では、本発明は、単一オープンリーディグフレームまたはＯＲＦ（即ち、開始コドンから停止コドンまで）内で少なく共１つのリンホカインレセプターもしくはその一部をコードするポリヌクレオチドセグメントと連続した、少なくとも１つのリンホカインもしくはその一部をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む核酸を含む。ある態様では、本発明の核酸は、転写調節配列（例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、エンハンサー等）；融合タンパク質配列（例えば、Ｈｉｓ−タグ、ＧＳＴ、ＧＦＰ、抗体Ｆｃ部分、抗生物質耐性、シグナルペプチド等）；および／またはポリペプチドコード配列の５’末端、３’末端もしくはポリペプチドコード配列内の位置に配置されたリンカー配列；および／またはその組合わせを含む少なくとも１つの追加のポリヌクレオチドセグメントを含む。本明細書に記載の態様のいずれかにおいて、本発明のポリヌクレオチドは、真核細胞もしくは細胞抽出物、原核細胞もしくは細胞抽出物および／またはその組合わせにおけるクローニングおよび／または発現のために適当なウイルスベクター、バクテリアプラスミド、または人工的染色体内に配置されていてもよい。
【００６３】
リコンビナント核酸のプラスミドベクターもしくはホスト細胞またはその両方へのクローニング、サブクローニングおよび移入のための多くの技術およびライブラリースクリーニングおよび選択のための技術が当技術分野で知られており、そしてこれらのフォーマットおよび／または技術の各々は、本発明に一般に適用可能である。例えば、本発明で使用される核酸を操作するための一般的技術を開示するテキストは、"Current Protocols in Molecular Biology"(Ausubel et al., eds., 1994)); Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual"(2nd ed. 1989); and Kriegler,"Gene Transfer and Expression: A Laboratory Mannual"(1990),を含み、その内容および適切な教示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
本発明の他の局面は、配列番号５〜１２またはその誘導体、フラグメントもしくは相同体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で使用された用語「ベクター」は、他の核酸を輸送することができる核酸分子であって、該他の核酸に「作用可能に連結されている」核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは環状二本鎖ＤＮＡループであってそれに追加のＤＮＡセグメントをライゲーションさせることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。他のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、該ウイルスベクターに追加のＤＮＡ配列をライゲーションすることができる。あるベクターは、それらが導入されるホスト細胞において自律複製することができる（例えば、バクテリア複製起点を有するバクテリアベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、ホスト細胞に導入されるとホスト細胞のゲノムに組み込まれ、それによりホストゲノムと共に複製される。更に、あるベクターは、該ベクターが作用的に連結されている（operatively linked）遺伝子の発現を指向することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、リコンビナントＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態にある。本明細書では、「プラスミド」および「ベクターは、は相互に交換可能に使用され得る。何故ならば、プラスミドは最も普通に使用される形態のベクターであるからである。しかしながら、本発明は、同等な機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製に欠陥のあるレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターのこのような他の形態を含むことを意図する。
【００６５】
本発明のリコンビナント発現ベクターは、ホスト細胞における核酸の発現のための適当な形態にある本発明の核酸を含み、これは、リコンビナント発現ベクターが、発現のために使用されるべきホスト細胞に基づいて選ばれた１つ以上の調節配列であって、発現されるべき核酸配列に作用的に連結されている１つ以上の調節配列を含むことを意味する。リコンビナント発現ベクターの範囲内で、「作用可能に連結された（operably linked）」は、関心のあるヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の発現（例えばインビトロ転写／翻訳システムにおいてまたはベクターがホスト細胞に導入されるときはホスト細胞において）を可能とする方式で調節配列（１つまたは複数）に連結されていることを意味することを意図する。
【００６６】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現コントロールエレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)に記載されている。調節配列は、多くのタイプのホスト細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する調節配列およびあるホスト細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指向する調節配列（例えば組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターのデザインは、トランスフォーメーションされるべきホスト細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベル等の如きファクターに依存しうることは当業者により認識されるであろう。本発明の発現ベクターは、ホスト細胞に導入されることができ、それにより本明細書に記載の核酸によりコードされた融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生することができる。本発明のリコンビナント発現ベクターは、原核細胞または真核細胞におけるタンパク質の発現のためにデザインされうる。例えば、タンパク質は、Escherichia coliなどのバクテリア細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現されうる。適当なホスト細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)に更に検討されている。または、リコンビナント発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写および翻訳されうる。
【００６７】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有するベクターによりEscherichia coliにおいて最も頻繁に行われる。融合ベクターは、その中にコードされたタンパク質に、通常リコンビナントタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的には、３つの目的：（ｉ）リコンビナントタンパク質の発現を増加させるため；（ｉｉ）リコンビナントタンパク質の溶解度を増加させるためおよび（ｉｉｉ）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することによりリコンビナントタンパク質の精製を助けるために役立つ。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解開裂部位は、融合部分の接合部として導入されて、融合タンパク質の精製の後に融合部分からのリコンビナントタンパク質の分離を可能とする。このような酵素およびそれらのコグネイト認識配列は、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを、それぞれ、ターゲットリコンビナントタンパク質に融合するｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc; Smith and Jofnson,1988.Gene 67: 31-40）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, Mass）およびｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, N. J.）を含む。
【００６８】
適当な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Amarann et al., (1988)Gene69:301-315）およびｐＥＴ１１ｄ（Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)60-89）を含む。
【００６９】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるリコンビナントタンパク質発現を最大にするための１つのストラテジーは、リコンビナントタンパク質をタンパク質分解的に開裂する能力が損なわれたホストバクテリアにおいてタンパク質を発現することである。例えば、Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)119-128）参照。他のストラテジーは、各アミノ酸のための個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンであるように、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20:2111-2118参照）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準ＤＮＡ合成技術により行うことができる。他の態様では、発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Saccharomyces cerevisaeにおける発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ（Baldari, et al., 1987. EMBO J.6: 229-234）、ｐＭＦａ（Kurjan and Herskowitz, 1982. Cewll 30: 933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123）、ｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif）およびｐｉｃＺ（In Vitrogen Corp, San Diego, Calif.）を含む。または、ポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞において発現されうる。培養された昆虫細胞（例えばＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165）およびｐＶＬシリーズ（Lucklow and Summers, 1989. Virology 170:31-39）を含む。
【００７０】
更に他の態様では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８（Seed, 1987. Nature 329:840）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufmann, et al., 1987. SMBO J. 6: 187-195）を含む。哺乳動物細胞において使用されるとき、発現ベクターのコントロール機能は、しばしばウイルス調節エレメントにより与えられる。例えば、よく使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞および真核細胞の両方のための他の適当な発現システムについては、例えば、Sambrock, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nded., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 のChapter 16 and 17参照。
【００７１】
他の態様では、リコンビナント哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的な核酸の発現を指向することができる（例えば組織特異的調節エレメントが核酸を発現するのに使用される）。組織特異的調節エレメントは当技術分野で知られている。適当な組織特異的プロモーターの非限定的例は、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987.Genes Dev. 1:268-277）、リンパ腫特異的プロモーター（Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275）、特にＴ細胞レセプターのプロモーター（Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8:729-733）および免疫グロブリンのプロモーター（Banerki, et al., 1983. Cell 33:729-740; Queen and Baltimore, 1983.Cell 33:741-748）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477）、膵臓特異的プロモーター（Edlund, et al., 1985.Science 230: 912-916）および乳腺特異的プロモーター（例えば乳腺プロモーター；U.S.Pat.No.4,873,316 and Europeaqn Application Publication No. 264,166）を含む。発生的に調節されたプロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379）およびα−フェトプロテインプロモーター（Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3:537-546）も包含される。
【００７２】
本発明の１つの態様では、出発核酸セグメントを、まず最初に本明細書で参照されたフォーマットのいずれかにより組み替えて、リコンビナント核酸のライブラリーを発生させる。ライブラリーは、サイズを変えることができ、例えば、約１０〜約１０９のメンバーの範囲にある。一般に、最初の核酸セグメントおよび発生した核酸のリコンビナントライブラリーは、完全長コード配列（即ち、開始コドン、コード配列および停止コドンを含むオープンリーディグフレーム（ＯＲＦ））および任意の必須の調節配列、例えば、発現のために必用なプロモーターおよびポリアデニル化配列を含む。しかしながら、リコンビナント核酸がこれらのエレメントを含有していない場合には、ライブラリーのリコンビナント核酸は、リコンビナントクローンのスクリーニングおよび選択の前に欠損配列（missing sequences）を含むベクターに挿入されうる。
【００７３】
リコンビナント核酸配列は、発現することができるリコンビナントセグメントのライブラリーをもたらすインビボフォーマットにおいて組合わせることができる。または、組換えは、インビトロで行うことができそしてリコンビナントライブラリーは、スクリーニングおよび選択の工程の前に所望の細胞型に導入される。本発明のある態様では、リコンビナント核酸ライブラリーを第１ホスト中で増幅し、次いでそのホストから回収し、そして発現、選択、またはスクリーニングまたは任意の他の望ましいパラメーターの理由で第２ホストに導入する。リコンビナント核酸をホスト細胞に導入する方式は、細胞型の核酸取り込み特徴に依存する（例えば、ウイルスレセプターを有する、コンジュゲーションすることができる、自然にコンピテントである、および／またはＤＮＡガンまたは電気パルスを必要とする）。リコンビナントＤＮＡ遺伝子のライブラリーの導入後に、細胞を遺伝子の発現が起こることを可能とするように増殖させることができる。
【００７４】
態様のいずれかにおいて、リンホカインまたはリンホカインレセプターをコードする核酸は、１つ以上のネイキッドＤＮＡｓ；適切な発現ベクター内に配置されそしてエピソーム的に維持された（maintained episomally）１つ以上の核酸；ホスト細胞のゲノムに組み込まれた１つ以上の核酸；複合体の成分をコードする内因性遺伝子の改変されたバージョン；１つ以上の調節核酸配列と組み合わせた１つ以上の核酸；またはそれらの組み合わせとして存在することができる。１つの態様では、ホスト細胞の内因性インターロイキンおよび／またはインターロイキンレセプター遺伝子は、細胞がインターロイキンポリペプチド、可溶性インターロイキンレセプターポリペプチドおよびインターロイキン／インターロイキンレセプター複合体ポリペプチド（これらは標準技術を使用して単離および精製されうる）の組合せを産生するように、相同的組換え技術を使用して改変される。この態様のいずれかにおいて、リンホカイン成分をコードする核酸は、配列番号１、２、１４、１５、その一部および組み合わせからなる群より選ばれるメンバーを含む。更に、態様のいずれかにおいて、リンホカインレセプター成分をコードする核酸は、配列番号３、４、１３、１６、その一部および組み合わせからなる群より選ばれるメンバーを含む。リンホカイン、リンホカインレセプター部分および／またはリンホカイン／リンホカインレセプターキメラをコードする核酸は、場合により、ＯＲＦの５’末端、３’末端またはＯＲＦの範囲内の任意の位置に、リンカーペプチドまたは融合タンパク質成分、例えば、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、ＦＬＡＧ−Ｔａｇ、ＧＦＰ、ＧＳＴ、抗体部分、シグナルペプチド等を含むことができる。
【００７５】
好ましい態様において、本発明の核酸は、リンホカインレセプターの可溶性（即ち、細胞外）部分をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の好ましい態様では、本発明は、シグナルペプチド、リンホカイン、リンカーペプチドおよびリンホカインレセプターの可溶性部分および抗体のＦｃ部分をコードする連続した核酸を含む。本明細書に記載の態様のいずれも、当業者に周知の標準分子生物学的アプローチおよび遺伝子アプローチを使用して達成されうる。態様のいずれかにおいて、配列番号１〜４および１３〜１６のオープンリーディグフレームまたはその一部をコードするｃＤＮＡは、市販のバクテリア発現プラスミド、例えば、ｐＧＥＭ（Promega）またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene）ベクター、または真核生物発現ベクター、例えばバキュロウイルスシステム、ｐＣＥＰ、ｐｃＤＮＡベクターまたはそれらの誘導体の１つに組み込まれることができる。
【００７６】
ある態様では、本発明は、配列番号５〜１２のポリペプチドまたはその一部をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を含む。「単離された核酸配列」は、コード配列のいずれかとじかに連続していないポリヌクレオチドであって、その由来元の生物の天然に存在するゲノムにおいてはそれは該コード配列とじかに連続している（５’端部のそれおよび３’端部のそれ）ポリヌクレオチドを意味する。従って、この用語は、例えば、ベクターに組み込まれているか；自律的複製プラスミドもしくはウイルスに組み込まれているか；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれているかまたは他の配列とは独立した別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ）として存在する、リコンビナントＤＮＡを含む。このヌクレオチドは、改変された形態のＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。改変は、天然に存在する塩基の既知の置換、改変された塩基、例えば５−メチルシトシン、改変された糖、例えば２’−メトキシおよび２’−フルオロ糖および改変された主鎖、例えばホスホロチオエートおよびメチルホスホネートとの糖もしくはヌクレオチド間（主鎖）連結を含むが、それらに限定されない。
【００７７】
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡとしてのポリヌクレオチドは、Ｔ（チミジン）がＵ（ウラシル）であることもできる配列を含むことができる。ポリヌクレオチドは、配列番号１〜４および１３〜１６に対して相補性であることができ、ここで相補性は、２つのヌクレオチド間の正確な対形成する能力を指す。例えば、ポリヌクレオチドのある位置におけるヌクレオチドが逆平行ＤＮＡもしくはＲＮＡ鎖における同じ位置のヌクレオチドとワトソン−クリック対形成することができるならば、このポリヌクレオチドとＤＮＡもしくはＲＮＡ分子はその位置で互いに相補性である。ポリヌクレオチドとＤＮＡもしくはＲＮＡ分子は、各分子における十分な数の対応する位置が所望のプロセスを実施するためにお互いにハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチドにより占められるとき、お互いに実質的に相補性である。本明細書で使用された、ハイブリダイゼーションは、相補性ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック水素結合を意味する。
【００７８】
更に、配列番号１〜４および１３〜１６のすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチドが含まれる。このようなポリヌクレオチドは、天然に存在するＤＮＡ分子、合成ＤＮＡ分子および意図的に操作されたＤＮＡ分子を含む。例えば、ポリヌクレオチドは、分子生物学技術分野で知られている技術により部位特異的突然変異誘発に供されることができる。２０の天然に存在するアミノ酸があり、その大部分は、１つより多くのコドンにより特定される。従って、縮重ヌクレオチド配列が含まれる。ポリヌクレオチドは、１つ以上のアミノ酸残基の一致または位置に関して天然に存在する形態とは異なる（ポリペプチドについて特定された残基のすべてより少ない残基を含有する欠失アナログ、１つ以上の特定された残基が他の残基により置換されている置換アナログおよび１つ以上のアミノ酸残基がポリペプチドの末端または中間部分に付加されている付加アナログ）且つ天然に存在する形態の一部またはすべての性質を共有する、抗原性ポリペプチドのポリペプチドアナログ、フラグメントまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドも含む。これらの分子は、例えば、選ばれた非哺乳動物ホストによる発現のために適当なコドンの組み込み；制限エンドヌクレアーゼ酵素による開裂のための部位の提供；および容易に発現されるベクターの構築を促進する追加の最初の、末端のまたは中間のＤＮＡ配列の提供を含む。
【００７９】
ポリヌクレオチドは、タンパク質主鎖に置換、挿入または欠失を含有するポリペプチドまたは完全長タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。関連したポリペプチドは、種々の欠失、置換および他の改変に対する相同性の程度を割り当てることによりアライメントされる。相同性は、全体のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドに沿ってまたは連続した残基のサブセットに沿って決定されうる。百分率一致は、２つの配列を比較するとき同一であるアミノ酸またはヌクレオチドの百分率である。百分率類似性は、２つの配列を比較するとき、化学的に類似しているアミノ酸またはヌクレオチドの百分率である。相同性ポリペプチドは、好ましくは２５％以上同一であり、好ましくは３０％以上同一であり、更に好ましくは３５％以上同一でありまたは最も好ましくは、４０％以上同一である。
【００８０】
本明細書に開示されたプラスミドは、市販されているか、制限なしに公的に入手可能であるかまたは周知の公開された手順のルーチンな適用により入手可能なプラスミドから構築されうる。多くのプラスミドおよび他のクローニングおよび発現ベクターは周知でありそして容易に入手可能であるか、または当業者は使用のために適当な任意の数の他のプラスミドを容易に構築することができる。これらのベクターは、適当なホスト細胞にトランスフォーメーションされて、細胞運搬体の生物学的活性を有するポリペプチドの産生のためのホスト細胞ベクターシステムを形成することができる。適当なホストは、微生物、例えばバクテリア、酵母、昆虫または哺乳動物生物または細胞系を含む。適当なバクテリアの例は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓである。好ましい酵母ベクターは、ｐＲＳ４２６−Ｇａｌである。適当な酵母の例は、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａである。適当な両生類細胞はゼノプス細胞である。昆虫細胞系のための適当なベクターは、バキュロウイルスベクターを含む。ラットまたはヒト細胞は好ましい哺乳動物細胞である。
【００８１】
リコンビナントＤＮＡによるホスト細胞のトランスフォーメーションは、当業者に周知の慣用の技術により行うことができる。「トランスフォーメーション」は、新規なＤＮＡ（即ち、細胞に対して外因性のＤＮＡ）の組み込みの後に細胞において誘導された永久的または一過性の遺伝子変化を意味する。細胞が哺乳動物細胞である場合は、永久的遺伝子変化は、一般に、細胞のゲノムへのＤＮＡの導入により達成される。「トランスフォーメーションされた細胞」または「ホスト細胞」は、細胞（例えば原核細胞または真核細胞）であって、それに（またはその先祖に）リコンビナントＤＮＡ技術によって本発明のポリペプチド（即ち、ＩＮＤＹポリペプチド）をコードするＤＮＡ分子またはそのフラグメントが導入されている、細胞を意味する。
【００８２】
ホストが原核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉである場合は、ＤＮＡを取りこむことができるコンピテント細胞は、対数増殖期後に回収され次いで当技術分野で周知の手順によりＣａＣｌ２法により処理された細胞から、調製されうる。または、ＭｇＣｌ２もしくはＲｂＣｌを使用することができる。トランスフォーメーションは、ホスト細胞のプロトプラストを形成した後またはエレクトロポレーションにより行うこともできる。
【００８３】
ホストが真核生物であるときは、ＤＮＡによるトランスフェクションのこのような方法は、リン酸カルシウム共沈法、慣用の機械的方法、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームに包まれたプラスミドの挿入またはウイルスベクターならびに当技術分野で知られている他の方法を含む。真核細胞は、この開示のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列およびヘルペスシンプレックスチミジンキナーゼ遺伝子などの選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子により共トランスフェクションされることもできる。他の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルスなどの真核生物ウイルスベクターを使用して、真核細胞を一過性に感染またはトランスフォーメーションしそしてタンパク質を発現することである。（Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982）。好ましくは、真核生物ホストは、本明細書に記載されたホスト細胞として利用される。真核細胞は、酵母細胞（例えば、Sacchromyces cerevisiae）であることができまたはヒト細胞を含む哺乳動物細胞であることができる。
【００８４】
リコンビナントウイルスまたはウイルスエレメントを利用して発現を指向する哺乳動物細胞システムは、工学的に産生されうる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用するとき、外来タンパク質をコードする核酸配列は、アデノウイルス転写／翻訳コントロール複合体、例えば、後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列にライゲーションさせることができる。このキメラ遺伝子は、次いでインビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノム内に挿入されうる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、感染したホストにおいて生存可能でありそしてポリペプチドを発現することができるリコンビナントウイルスをもたらすであろう（例えば、Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.81:3655-3659, 1984）。
【００８５】
リコンビナントタンパク質の長期間の高収率産生のために、安定な発現が好ましい。ウイルス複製起点（viral origins of replication）を含有する発現ベクターを使用するよりはむしろ、適切な発現コントロールエレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）によりコントロールされたインターロイキン／インターロイキンレセプター融合タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび選択可能なマーカーでホスト細胞をトランスフォーメーションすることができる。リコンビナントプラスミドにおける選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与えそして細胞がプラスミドをその染色体に安定に組み込みそして成長して病巣（foci）を形成することを可能とし、病巣は細胞系にクローニングされそしてエキスパンションされうる。例えば、外来ＤＮＡの導入の後、工学的に産生された細胞は、濃縮された培地において１〜２日成長させることができ、次いで選択培地に切り替えられる。ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., Cell 11:233,1977）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48:2026, 1962）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowry et al., Cell 22: 817, 1980）遺伝子を含むがそれらに限定されない多数の選択システムを使用することができる。
【００８６】
他の態様では、本発明は、インターロイキンポリペプチド、インターロイキンレセプターポリペプチド、抗体ポリペプチドおよびキメラインターロイキン／インターロイキンレセプターポリペプチドまたは生物学的に活性なその一部をコードする単離された核酸分子に関する。ハイブリダイゼーションプローブとして使用してキメラインターロイキン／インターロイキンレセプターコード核酸を同定するために十分な核酸フラグメントおよびキメラインターロイキン／インターロイキンレセプター核酸分子の増幅および／または突然変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するためのフラグメントも本発明内に含まれる。本明細書で使用された用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して発生させたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログならびにその誘導体、フラグメントおよび相同体を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であることができるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡを含む。
【００８７】
更に他の好ましい態様では、本発明は、（ａ）少なくとも２つのリンホカインまたはリンホカインレセプターからの核酸を組み換えて核酸のまライブラリーを創生すること；（ｂ）リコンビナント遺伝子をコンピテント細胞にトランスフォーメーションすること；（ｃ）細胞をスクリーニングすること；（ｄ）他の核酸との組換えのための更なるサイクルのために所望の核酸を単離することの１つ以上を含む本発明の核酸を単離するための方法を含む。本発明の方法は、リコンビナント核酸、プラスミドベクターまたはその両方の構築およびトランスフォーメーションされたホスト細胞における遺伝子の発現を含むこともできる。これらの目標を達成するために必用な分子クローニング技術は、当技術分野で周知である。
【００８８】
インターロイキンコード核酸は、成熟インターロイキンポリペプチドをコードすることができる。本明細書で使用された、本発明において開示された「成熟した」形態のポリペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するポリペプチド、前駆体形態、プレプロプロテインまたはプロプロテインの産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロプロテインは、非限定的例として、対応する遺伝子によりコードされた完全長遺伝子産物を含む。または、それは、本明細書に記載されたＯＲＦによりコードされたポリペプチド、前駆体またはプロプロテインとして定義されうる。産物「成熟」形態は、非限定的例として、遺伝子産物を生じさせる細胞（ホスト細胞）内で行われうる１つ以上の天然に存在するプロセッシング工程の結果として生じる。「成熟」形態のポリペプチドまたはタンパク質をもたらすこのようなプロセッシング工程の例は、ＯＲＦの開始コドンによりコードされたＮ末端メチオニン（Ｍｅｔ）残基の開裂またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質分解開裂を含む。かくして、残基１〜ｎ（式中、残基１はＮ末端メチオニンである）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後に残っている残基２〜ｎを有するであろう。または、残基１から残基ＭｅｔまでのＮ末端シグナル配列が開裂されている、残基１〜ｎを有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、残っている残基Ｍｅｔ＋１から残基ｎまでの残基を有するであろう。更に本明細書で使用された「成熟」形態のポリペプチドまたはタンパク質は、タンパク質分解開裂事象以外の翻訳後の改変から生じることができる。このような追加のプロセスは、非限定的例として、グリコシル化、ミリストイル化、オリゴマー化またはリン酸化を含む。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスの１つのみの操作またはそれらのいずれかの組合わせから生じることができる。
【００８９】
本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡを使用して、または別法として、標準ＰＣＲ増幅技術に従う適切なオリゴヌクレオチドプライマーと共にテンプレートとしてゲノムＤＮＡを使用して、増幅することができる。更に、配列番号１〜４および１３〜１６に対応するオリゴヌクレオチドおよびその一部および組み合わせは、例えば自動化ＤＮＡ合成機を使用して、標準合成技術により調製することができる。
【００９０】
ポリペプチド
本発明は、インターロイキンの治療有効性は、インターロイキンをインターロイキンレセプターまたはその可溶性部分にプレカップリングまたは複合体化することにより増強させることができるという驚くべき且つ予想外の発見に基づいている。ある態様では、本発明は、本発明の治療ポリペプチド複合体を形成するための方法を含む。１つの態様では、この方法は、適当な量の少なくとも１つのリンホカインポリペプチドまたはその一部を提供し、適当な量の少なくとも１つのリンホカインレセプターポリペプチドまたはその一部を提供し、適当なｐＨおよびイオン条件化下に、複合体形成を可能とするのに十分な期間、リンホカインおよびリンホカインレセプターポリペプチドを混合し、そして場合により複合体を濃縮または精製することを含む。複合体のポリペプチドは、例えば、標準方法に従うペプチド合成機を使用し；細胞または細胞抽出物において別々に各成分ポリペプチドを発現させ、次いでポリペプチドを単離しそして精製することにより、形成されうる。場合により、本発明の治療ポリペプチド複合体は、同じ細胞または細胞抽出物において本発明の複合体の両ポリペプチド成分を発現させ、次いで例えば、クロマトグラフィー技術、例えば、リンホカイン部分に対する抗体、リンホカインレセプター部分に対する抗体または複合体に対する抗体によるアフィニティークロマトグラフィーを使用して、複合体を単離および精製することにより、形成されうる。更に、本発明は、フレーム内の（in-frame）且つインターロイキンレセプターまたはその一部と連続した、インターロイキンを含むキメラまたは融合タンパク質の発現を含む。
【００９１】
図１２は、本発明の複合体が、ＩＬ−１５単独の投与に対してインビボでのより長い半減時間を示す治療組成物をもたらす、ことを示す。従って、好ましい態様では、本発明の治療ポリペプチド複合体は、少なくとも１つのリンホカインレセプターとプレカップリングまたは複合体化された少なくとも１つのリンホカインポリペプチドまたはその一部を含み、その際該複合体はＩＬ−１５単独より長いインビボ半減時間および高い有効性を示す。他の態様では、複合体は、約１時間より長いインビボ半減時間を示す。この態様の１つの局面では、本発明の治療複合体は、バクテリア細胞または真核細胞において発現されたリコンビナントポリペプチドから形成されるかまたは化学的に合成されたペプチドの使用により形成される。ある態様では、リンホカインポリペプチドまたはその一部は、配列番号５、６、１０、１２およびその組合わせからなる群より選ばれるメンバーである。ある態様では、リンホカインレセプターポリペプチドまたはその一部は、配列番号７、８、９、１１およびその組合わせからなる群より選ばれるメンバーである。他の態様では、本発明の治療複合体は、それを必要としている生物に投与されるとき、リンホカイン、例えばＩＬ−１５またはＩＬ−２単独の送達に比較して、増加した有効性を示す。
【００９２】
他の好ましい態様では、本発明は、インターロイキンポリペプチドを可溶性インターロイキンレセプタードメインと共にインキュベーションすることによりまたはリンホカインポリヌクレオチドセグメントおよびリンホカインレセプターポリヌクレオチドセグメントを含む新規なキメラ核酸分子を発現させることにより発生させた、少なくとも１つのインターロイキンレセプター、例えば、ＩＬ−１５Ｒａ、ＩＬ−２Ｒａ、その一部または組み合わせとプレカップリングされまたは複合体化された少なくとも１つのインターロイキン、例えば、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、その一部または組み合わせを含む、プレカップリングされた治療ポリペプチド複合体を創生する方法に関する。好ましい態様では、本発明は、リンホカイン部分およびリンホカインレセプター部分を提供し、そして複合体形成を可能とするための、イオンおよびｐＨ緩衝化条件下に適当な長さの時間結合させることを含む、リンホカインおよびリンホカインレセプターをプレカップリングさせる方法を提供する。特に好ましい態様では、リンホカインポリペプチドは、配列番号５、６、その一部または組み合わせからなる群より選ばれ、そしてリンホカインレセプターポリペプチドは、配列番号７、８、その一部または組み合わせからなる群より選ばれる。１つの態様では、本発明は、バッファー、例えばＰＢＳ中に再懸濁させた単離されたポリペプチド成分を提供し、ポリペプチドを混合し、そして約２６〜約４０℃で約１〜約６０分間インキュベーションすることを含む、複合体を形成するための方法を含む。更なる態様では、リンホカインレセプターポリペプチドは、リンホカイン結合部分および抗体Ｆｃ部分のキメラを含む。好ましい態様では、配列番号６またはその一部、および配列番号８−Ｆｃキメラ分子を両方ともＰＢＳ中に懸濁させ、混合しそして約３５〜約３９℃で約２０分〜約４０分間インキュベーションする。
【００９３】
他の態様では、配列番号５〜１２に対して相同性の実質的に純粋なポリペプチドが提供される。「実質的に純粋なポリペプチド」は、天然にインターロイキンもしくはインターロイキンレセプターポリペプチドまたはその一部を伴っている成分から分離された、インターロイキンもしくはインターロイキンレセプターまたはその一部である。典型的には、ポリペプチドは、それが少なくとも６０重量％であり、それが自然に結合しているタンパク質および自然に存在する有機分子を含まないとき、実質的に純粋である。好ましくは調製物は、少なくとも７５重量％、更に好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％インターロイキンおよび／またはインターロイキンレセプターポリペプチドである。実質的に純粋なポリペプチドは、例えば、天然のソース（例えば、真核細胞）からの抽出により；ポリペプチドをコードするリコンビナント核酸の発現により；またはタンパク質を化学的に合成することにより得られうる。純度は、任意の適当な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりまたはＨＰＬＣ分析により測定されうる。
【００９４】
インターロイキンおよびインターロイキンレセプターポリペプチドの機能のために必須のアミノ酸は、当技術分野で知られた技法、例えば部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発に従って同定されうる（Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085, 1989; Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-4502, 1991）。後者の技術において、単一のアラニン突然変異を分子中の種々の異なる残基において導入し、そして得られる突然変異体分子を生物学的活性について試験して（例えば、リガンド結合およびシグナル伝達）、分子の活性に決定的に重要なアミノ酸残基を同定する。リガンドタンパク質相互作用の部位は、核磁気共鳴、結晶学またはフォトアフィニティー標識化などの技術により決定される結晶構造の解析により決定することもできる（例えば、de Vos et al., Science 255: 306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992参照）。必須アミノ酸の一致は、関連したタンパク質との相同性の解析から推測することもできる。
【００９５】
多重アミノ酸置換は、突然変異誘発およびスクリーニングの既知の方法、例えばReidhaar-Olson and Sauer（Science 241: 53-57, 1988; またはSauer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156,1989）により開示された方法を使用して行われそして試験されうる。簡単に言えば、これらの著者は、ポリペプチドにおける２つ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次いで突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定して各位置における許容できる置換のスペクトルを決定するための方法を開示している。使用することができる他の方法は、ファージディスプレー（例えば、Lowman et al., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner et al., U.S.Pat.No.5,223,409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204）および領域特異的突然変異誘発（region-directed mutagenesis)(Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988）を含む。上記に開示された突然変異誘発方法は、高スループットスクリーニング法と組み合わせて、ホスト細胞においてクローニングされた、突然変異誘発されたタンパク質の活性を検出することができる。活性なタンパク質またはその一部（例えばリガンド結合フラグメント）をコードする突然変異誘発されたＤＮＡ分子は、ホスト細胞から回収することができそして現代の装置を使用して迅速に配列決定することができる。これらの方法は、関心のあるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能としそして未知の構造のポリペプチドに適用することができる。
【００９６】
上記した方法を使用して、当業者は、配列番号５〜１２またはそのアレル変異体に対して実質的に相同性でありそして野生型ポリペプチドの性質を保持する種々のポリペプチドを調製することができる。本明細書で表現されそして特許請求の範囲に請求された、用語「配列番号５〜１２により規定されたポリペプチド」は、ポリペプチドのすべてのアレル変異体および種オーソログ（species orthologs）を含む。本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、改変された配列、例えば、糖タンパク質を含み、そして特に、天然に存在するポリペプチドまたはタンパク質ならびに、少なくとも２つの異なるコンフォメーションにおいて存在し、両コンフォメーションは同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有するが異なる三次元構造を有する、リコンビナントにまたは合成により合成されるポリペプチドまたはタンパク質を包含することを意図する。「フラグメント」は、天然に存在するタンパク質の一部である。フラグメントは、天然に存在するタンパク質と同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有することができる。
【００９７】
この開示は、多数の基準のいずれかにより判定して、インターロイキンおよびインターロイキンレセプター遺伝子産物に機能的に同等なタンパク質も包含し、該基準は、得られる生物学的効果、例えば免疫細胞の増殖などの表現型の変化、遺伝子発現の変化、例えばＩＬ−１５および／またはＩＬ−２シグナリング経路の活性化を確認する特異的バイオマーカーの変化、を含むがそれらに限定されない。このような機能的に同等なタンパク質は、記載されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列の範囲内のアミノ酸残基の付加または置換を含むが、サイレント変化または「保存的突然変異」をもたらし、従って機能的に同等な遺伝子産物を産生する。基準配列に対して１００％未満同一であるポリペプチド配列の場合に、非同一の位置は好ましくはしかし必ずしもそうではないが、基準配列に対する保存的置換である。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つ以上の予言された非必須アミノ酸残基でなされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野内で定義された。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷のない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。従って、タンパク質における予言された非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファリーからの他のアミノ酸残基で置換される。または、他の態様では、飽和突然変異誘発によるなどの突然変異が、コード配列のすべてまたは一部に沿ってランダムに導入され得、そして得られる突然変異体は、生物学的活性についてスクリーニングされて活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発の後、コードされたタンパク質を、当技術分野で知られた任意のリコンビナント技術により発現することができそしてタンパク質の活性を決定することができる。
【００９８】
ポリヌクレオチドは、例えば、カラムでの捕捉または抗体の使用により精製を促進する付加されたＣ末端またはＮ末端アミノ酸のためのコード配列の付加などの追加の配列を与えるようにデザインすることもできる。このようなタグは、例えば、ニッケルカラムでのポリペプチドの精製を可能とするヒスチジンに富んだタグを含む。このような遺伝子改変技術および適当な追加の配列は、分子生物学の分野で周知である。
【００９９】
他の態様では、本発明は、配列番号５、６、１０、１２、その一部および組み合わせからなる群より選ばれるメンバーに対する少なくとも３０％の相同性を有するポリペプチドを、配列番号７、８、９、１１、その一部および組み合わせからなる群より選ばれるメンバーに対する少なくとも３０％の相同性を有するポリペプチドと共に含むペプチド複合体に関する。他の態様では、本発明は、配列番号５、６、１０、１２、その一部および組み合わせからなる群より選ばれるメンバーに対する少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドを、配列番号７、８、９、１１、その一部および組み合わせからなる群より選ばれるメンバーに対する少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドと共に含むペプチド複合体に関する。他の態様では、本発明は、配列番号７、８、９、１１、その一部および組み合わせからなる群より選ばれるメンバーとカップリングさせたまたは複合体化させた、配列番号５、６、１０、１２、その一部および組み合わせからなる群より選ばれるメンバーを含む。
【０１００】
細胞増殖、例えば、免疫細胞増殖、腫瘍量もしくは形成の減少または腫瘍耐性の増加は、本発明の複合体の有効性を評価するのに使用することができるパラメーターである。本発明の方法に使用するために適当な細胞の増殖能力を評価するための多くの方法があることは、当業者により理解されるであろう。例えば、上記Li et al.(1997)に記載されたとおり、細胞を、ＢｒｄＵでインビトロで（またはインビボで）標識して分裂している細胞の百分率を決定することができまたはコロニー形成アッセイを使用して評価することができる。増殖能力の解析のために適当な細胞は、組織培養で成長させた細胞、試験化合物で処理された動物から単離された細胞、生きている動物の一部である細胞、または動物から得られた組織切片の一部である細胞を含む。
【０１０１】
本発明の上記アッセイ法の１つより多くの態様では、インターロイキン、インターロイキンレセプターまたはインターロイキン／インターロイキンレセプター複合体を固定化して、複合体化されていない形態のタンパク質からの複合体化されたタンパク質の分離を促進することは望ましくありうる。１つの態様では、タンパク質の１つまたは両方がマトリックスに結合することを可能とするドメインを付加するインターロイキンまたはインターロイキンレセプター融合タンパク質が提供されうる。例えば、ＧＳＴ−融合タンパク質またはＧＳＴ−ターゲット融合タンパク質はグルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, Mo）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、そしてインターロイキンとインターロイキンレセプターの混合物を複合体形成を促す条件下に（例えば、塩およびｐＨについて生理学的条件で）インキュベーションさせる。インキュベーションの後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウエルを洗浄して任意の結合していない成分を除去し、ビーズの場合には固定化されたマトリックスおよび複合体の量を直接または間接に決定する。または、複合体をマトリックスから解離させることができ、そして量または活性を標準技術を使用して決定することができる。
【０１０２】
マトリックス上のタンパク質を固定化するための他の技術を本発明で使用することもできる。例えば、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用してタンパク質を固定化することができる。当技術分野で周知の技術（例えばビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）からビオチニル化タンパク質分子を調製することができ、そしてストレプトアビジンでコーティングされた９６ウエルプレート（Pierce Chemical）のウエルにおいて固定化することができる。または、インターロイキンまたはインターロイキンレセプターと反応性であるが結合を妨害しない抗体を、プレートのウエルに誘導体化することができ、そしてタンパク質複合体を抗体コンジュゲーションによりウエル内に捕捉することができる。ＧＳＴ−固定化複合体について上記した方法の外に、このような複合体を検出するための方法は、インターロイキンまたはインターロイキンレセプターポリペプチドと反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出および、インターロイキンまたはインターロイキンレセプターポリペプチドと会合した酵素活性を検出することに頼る酵素結合アッセイを含む。
【０１０３】
他の好ましい態様は、有効量の本発明の治療ポリペプチド複合体を個体に投与することを含む、免疫応答をモデュレーション、抑制または増大させるための方法に関する。この方法の他の局面は、少なくとも１種の薬学的に許容され得る賦形剤、佐剤、生物学的に活性な作用物質またはそれらの組み合わせと組み合わせて有効量の治療ポリペプチド複合体を投与することを含む。
【０１０４】
他の態様では、本発明は、リンホカイン単独よりも、実質的により長いインビボ半減時間および実質的により高い有効性を示すリンホカインおよびリンホカインレセプターのプレカップリングされた複合体の投与により、免疫の増強を必用としている生物の免疫を増強するための方法を提供する。更に、この態様は、リンホカイン応答性免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等のホメオスタティック増殖を推進する方法も含む。好ましい態様のあるものでは、本発明の態様が、ヒト免疫グロブリンＦｃフラグメントを含有するリンホカインレセプター分子の使用を含む。例えば、ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ構築物は、R&D Systems（Minneapolis, MN）から市販されている。更に、本発明の複合体のリンホカインレセプタードメインは場合により免疫グロブリンＦｃフラグメントを除去されてもよいことは、当業者により認識されるであろう。
【０１０５】
他の態様では、本発明は、癌、感染に対する免疫応答を増加させるためまたは任意の種類の予防接種を増強させるためのアジュバントとして複合体を適用するための方法を含む。この態様の１つの局面では、本発明の複合体は、骨髄移植、幹細胞移植の後またはＡＩＤＳ等の免疫不全の場合に免疫系再構成を増強させるために使用される。本発明は、本発明の複合体を使用して、後に養子免疫治療のために使用されうるインビトロでのリンパ球の成長を助ける方法であって、患者を提供し；患者からある容積の血液を取り出し；そして患者のリンパ球を単離し；リンパ球を有効量の本発明の複合体で処理し；そして処理されたリンパ球を患者に戻し投与することを含む、方法も含む。
【０１０６】
好ましい態様の更に他のものでは、本発明は、リンホカイン活性、例えばＩＬ−１５のアンタゴニストとして使用されるように改変された複合体を使用する方法を含む。例えば、リンホカインまたはリンホカインレセプター、例えばＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒａの配列改変により、組み合わされた複合体は、インビトロでのリンホカイン活性の阻害剤とされうる。このような分子は、自己免疫、移植片拒絶または移植片対ホスト病における潜在的治療効果を有することができる。
【０１０７】
好ましい態様のいずれかにおいて、リンホカイン／リンホカインレセプター複合体分子の可能なリコンビナント形態のいずれかが意図される。例えば、リンホカインレセプター遺伝子、例えば、ＩＬ−２Ｒａ、ＩＬ−１５Ｒａ、その一部または組み合わせおよび場合により抗体のＦｃ部分、に融合されたリンホカイン遺伝子、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１５、その一部または組み合わせを含有する遺伝子構築物から産生された単一鎖ポリペプチド分子。ある態様では、遺伝子構築物は、リンカーポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を更に含むことができる。複合体における立体的拘束またはコンフォメーション拘束を緩和するのに役立つことに加えて、リンカー配列は、他の性質、例えば、ヌクレアーゼ認識配列、プロテアーゼ認識配列、光反応性ドメイン、疎水性ドメイン、親水性ドメイン、活性ドメイン、酵素機能、化学的改変もしくはコンジュゲーションのための部位、精製のための部位、等を付与することができると考えられる。更なる態様では、本発明は、複合体のマルチマー形態、例えば、ダイマー、トリマー等の発現を可能とするようにタンデムでライゲーションされた少なくとも１つのリンホカイン遺伝子および少なくとも１つのリンホカインレセプター遺伝子からなるキメラ分子を提供する。これらのタンパク質は、真核細胞または原核細胞において産生することもできる。
【０１０８】
キメラおよび融合タンパク質
前記したとおり、本発明は、キメラタンパク質または融合タンパク質も提供する。本明細書で使用された、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、他のポリペプチド、例えば、配列番号５〜１２またはその一部から選ばれた１つ以上のポリペプチド、に作用的に連結されたポリペプチドを含む。これに対して、配列番号５〜１２から選ばれたポリペプチドは少なくとも３０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。融合タンパク質内では、ポリペプチドは、配列番号５〜１２から選ばれたポリペプチドのすべてまたは一部に相当することができる。１つの態様では、融合タンパク質は、タンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。他の態様では、融合タンパク質は、配列番号５〜１２から選ばれた少なくとも１つのタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。更に他の態様では、融合タンパク質は、配列番号５〜１２から選ばれた少なくとも１つのタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質の範囲内で、用語「作用的に連結された」は、別個のポリペプチドがＮ末端またはＣ末端でお互いにフレーム内で融合されていることを示すことを意図する。
【０１０９】
上記アッセイ法の１つより多くの態様で、本発明のキメラポリペプチドを固定化してタンパク質の分離を促進することが望ましくありうる。１つの態様では、タンパク質がマトリックスに結合することを可能とするドメインを付加する融合タンパク質が提供されうる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質またはビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲーション。
【０１１０】
１つの態様では、融合タンパク質は、ポリペプチド配列がＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＮ末端またはＣ末端に融合されているＧＳＴ−融合タンパク質である。他の態様では、融合タンパク質はそのＮ末端に異種シグナル配列を含有する。あるホスト細胞（例えば哺乳動物ホスト細胞）では、発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用により増加させることができる。更に他の態様では、融合タンパクは、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド複合体が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合されている免疫グロブリン融合タンパク質である。１つの態様では、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物に配合することができ、そして被験体に投与してリガンドと細胞の表面のタンパク質との相互作用をモデュレーションすることができる。免疫グロブリン融合タンパク質は、コグネートリガンドのバイオアベイラビリティーに影響を及ぼすのに使用することができる。リガンド相互作用の抑制は、増殖および分化障害の処置の両方ならびに細胞生存をモデュレーションすること（例えば促進または抑制すること）のために治療的に有用でありうる。更に、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、免疫原として使用して、被験体において抗体を産生させ、リガンドを精製しそしてスクリーニングアッセイにおいて相互作用を抑制する分子を同定することができる。
【０１１１】
本発明のキメラまたは融合タンパク質は、標準リコンビナントＤＮＡ技術により産生することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、慣用の技術に従って、例えば、ライゲーションのための平滑末端または付着末端、適切な末端を与えるための制限酵素消化、必要に応じて付着末端の充填（filling-in）、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理および酵素ライゲーションにより、インフレームで互いにライゲーションされる。他の態様では、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む慣用の技術により合成されうる。または、後にアニーリングされそして再増幅されてキメラ遺伝子配列を発生することができる２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補性オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができる（例えば、Ausbel, et al.(eds) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley&Sons, 1992参照）。更に、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードする多くの発現ベクターが市販されている。配列番号１〜４および１３〜１６の１つ以上を、融合部分が所望のポリペプチドにフレーム内で連結されるように、このような発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１１２】
抗体
本明細書で使用された用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、即ち、少なくとも１つの、好ましくは２つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記される）および少なくとも１つの、好ましくは２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記される）を含む、抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。このような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーを含むが、それらに限定されない。ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域（ＦＲ）」と呼ばれる、より保存された領域に散在した（interspersed）「相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる、超化変性の領域に更に小分けされうる。フレームワーク領域およびＣＤＲ’ｓの長さは、正確に定義されている（Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of  Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242, and Chthia, C. et al. (1987) J.Mol.Biol.196:901-917、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。各ＶＨおよびＶＬは、下記の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４、にアミノ末端からカルボキシ末端まで配列された３つのＣＤＲ’ｓおよび４つのＦＲｓからなる。一般に、ヒトから得られた抗体分子は、クラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関し、これらは分子中に存在する重鎖の性質により互いに異なる。あるクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびその他などのサブクラスも有する。更に、ヒトでは、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であることができる。本明細書での抗体に関する言及は、すべてのこのようなクラス、サブクラスおよびヒト抗体種のタイプに対する言及を含む。
【０１１３】
抗体は、免疫感作剤として関心のあるペプチドを含有するインタクトなポリペプチドまたはフラグメントから調製されうる。好ましい抗原性ポリペプチドフラグメントは、配列番号５〜１２の１５〜１００の連続したアミノ酸である。１つの態様では、ペプチドは、ポリペプチドの非膜貫通ドメイン、例えば細胞外ドメインまたは細胞内ドメインに位置している。例示的抗体または抗体フラグメントは、細胞外環境からアクセス可能なそしてタンパク質の機能性を変化させるエピトープに結合する。ある態様では、本発明は、配列番号５〜１２、その変異体、一部および／または組み合わせのいずれかの１つ以上のエピトープを認識する且つ該エピトープに対して特異的な抗体を含む。他の態様では、本発明の抗体は、インターロイキン／インターロイキンレセプター複合体それ自体に対して特異的であることができる。更に他の態様では、インターロイキンに対して特異的な抗体は、「インターロイキンレセプター」として機能することができ、即ち、インターロイキンレセプターポリペプチド、即ち、ＩＬ−１５Ｒａおよび／またはＩＬ−２Ｒａの可溶性部分を含む複合体で観察された機構と同様なトランス提示機構において機能することができる。別の態様では、本発明の抗体は、インターロイキン／インターロイキンレセプター相互作用をターゲティングしそしてそれを妨害してインターロイキンシグナリングを抑制することができる。
【０１１４】
ポリクローナル抗体の調製は、分子生物学技術分野において周知であり、例えば、Production of Polyclonal Antisera in Immunochemical Processes(Manson, ed), pages1-5(Humana Press 1992) and Coligan et al., Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters in Current Protocols in Immunology, section2.4.1(1992)参照。モノクローナル抗体の調製も当技術分野で周知である；例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, npage 726(Cold Spring Harbor Pub. 1988)。
【０１１５】
モノクローナル抗体は、マウスまたはウサギに抗原を含む組成物を注射し、血清サンプルを取り出すことにより抗体産生の存在を証明し、脾臓を取り出してＢリンパ球を得、リンパ球をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを産生し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生するポジティブクローンを選択しそしてハイブリドーマ培養物から抗体を単離することにより得ることができる。モノクローナル抗体は、当技術分野で周知の技術によりハイブリドーマ培養物から単離および精製することができる。
【０１１６】
他の態様では、抗体は、リコンビナントに産生することができ、例えば、ファージディスプレーによりまたはコンビナトリアル法により産生されうる。ファージディスプレーおよびコンビナトリアル法を使用して、配列番号５〜１２またはそのフラグメントに結合する抗体を単離することができる（例えば、Ladner et al. International Publication No. WO91/17271; Winter et al. International Publication WO92/20791; Markland et al. International Publication No. WO92/15679; Breiting et al. International Publication WO93/01288; McCafferty et al. International Publication No.WO92/01047; Garrard et al. International Publication No. WO92/09690; Ladner et al. International Publication No. WO90/02809; Fuchs et al.(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hay et al.(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al.(1989)Science246:1275-1281; Griffths et al.(1993)EMBO J.12:725-734; Hawkins et al.(1992)K Mol Biol 226:889-896; Clackson et al.(1991)Nature 352:624-628; Gram et al.(1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al.(1991)Bio/ Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137; and Barbas et al.(1991)PNAS 88:7978-7982に記載されているとおり）。
【０１１７】
ヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりはむしろヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを使用して発生させることもできる。関心のある抗原で免疫感作されたこれらのトランスジェニックマウスからの脾細胞を使用して、ヒトタンパク質からのエピトープに対する特異的アフィニティーを有するヒトｍＡｂｓを分泌するハイブリドーマを産生する（例えば、Wood et al. Intenational Application WO91/00906, Kucherlapati et al. PCT publication WO91/10741; Lonberg et al. Intenational Application WO92/03918; Kay et al. Intenational Application92/03917; Lonberg, N. et al/ 1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al. 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S.L. et al.1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al.1993 Year Immunol 7:33-40; Tuailon et al. 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al.1991 Eur J Immunol 21:1323-1326参照）。
【０１１８】
本発明の複合体の成分または複合体それ自体に対する治療的に有用な抗体は、「ヒト化」モノクローナル抗体に由来することができる。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖からのマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに移し、次いでヒト残基をマウス対応物のフレームワーク領域に置換することにより産生される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、マウス定常領域の免疫原性と関連した潜在的問題を予防する。ヒト化モノクローナル抗体を産生するための技術は、Iones et al., Nature 321: 522, 1986 and Singer et al., J. Immunol. 150:2844,1993において見出されうる。抗体は、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーから単離されたヒト抗体フラグメントに由来することもでき；例えばBarbas et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2, 119, 1991参照。
【０１１９】
更に、キメラ抗体は、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的特異性のヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングすることにより得ることができ；例えば、Takeda et al., Nature 314: 544-546,1985参照。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物に由来するキメラ抗体である。
【０１２０】
抗イディオタイプ技術を使用して、エピトープを模擬するモノクローナル抗体を産生することができる。第１モノクローナル抗体に対して作られた抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第１モノクローナル抗体により結合されたエピトープの「イメージ」である超可変領域において結合ドメインを有するであろう。または、単一鎖抗体を産生するのに使用された技術は、単一鎖抗体を産生するのに使用することができる。単一鎖抗体は、アミノ酸ブリッジを介してＦｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントを連結して単一鎖ポリペプチドをもたらすことにより形成される。特異的エピトープ、例えば細胞外エピトープを認識する抗体フラグメントは、当技術分野で周知の技術により発生させることができる。このようなフラグメントは、タンパク質分解消化により産生されたＦａｂフラグメント、およびジスルフィドブリッジを還元することにより発生されたＦａｂフラグメントを含む。免疫治療様に使用されるとき、モノクローナル抗体、そのフラグメント、またはその両方は、治療剤で標識されていなくても標識されていてもよい。これらの作用物質は、当技術分野で周知の技術によりモノクローナル抗体に直接または間接にカップリングされ得、そして薬物、放射性同位元素、レクチンおよび毒素などの作用物質を含む。
【０１２１】
モノクローナル抗体の投与のための投薬量範囲は、所望の効果を生じるのに十分大きく、そして年齢、状態、重量、性、年齢および処置されるべき状態の程度と共に変わり、そして当業者により容易に決定することができる。投薬量は、約０．１mg／kg〜約２０００mg／kgであることができる。モノクローナル抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内および／または皮下に投与することができる。
【０１２２】
本発明のある態様では、抗原性ペプチドにより含まれる少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の表面に位置する配列番号５〜１２の領域、例えば親水性領域である。タンパク質配列の疎水性解析は、ポリペプチドのその領域が特に親水性であり、従って抗体産生をターゲティングするために有用な表面残基をコードしていそうであることを示すであろう。抗体産生をターゲティングするための手段として、親水性および疎水性の領域を示すヒドロパシープロットは、例えば、the Kyte Doolittle or the Hopp Woods法を含む当技術分野で周知の任意の方法により、フーリエ変換を伴いまたは伴わないで、発生させることができる。例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824-3828; Kyte and Doolittle 1982,J. Mol. Biol. 157:105-142参照。これらはそのまま参照により本明細書に組み込まれる。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくは相同体内の１つ以上のドメインに対して特異的な抗体も本発明で提供される。本発明のタンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログ、相同体またはオーソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の発生において免疫原として利用することができる。
【０１２３】
ヒト抗体
完全ヒト抗体は、本質的に、ＣＤＲｓを含む軽鎖および重鎖の両方の全体の配列がヒト遺伝子から生じる抗体分子に関する。このような抗体は、本明細書では「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 7:72）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（例えば、Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）により調製されうる。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用することができ、そしてヒトハイブリドーマを使用することにより（Cote, et al., 1983.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030）またはヒトＢ細胞をエプスタインバールウイルスでインビトロでトランスフォーメーションすることにより（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96参照）調製されうる。
【０１２４】
更に、ヒト抗体は、ファージディスプレーライブラリーを含む追加の技術を使用して産生することもできる（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381(1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581(1991)。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンローカスをトランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されているマウスに導入することにより作ることができる。チャレンジされると、ヒト抗体産生が観察され、これは遺伝子再編成（gene rearrangement）、アセンブリーおよび抗体レパートリーを含む、すべての点でヒトで見られることに密接に類似している。このアプローチは、例えば、U.S.Pat.Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, およびMarks et al. (Bio/Technology 10, 779-783(1992)); Lonberg et al.(Nature 368 856-859(1996)); Morrison(Nature Biotechnology 14, 845-51(1996)); Neuberger(Nature Biotechnology 14, 826(1996)); およびLonberg and Huszar(Intern. Rev. Immunol. 13 65-93(1995)）に記載されている。
【０１２５】
ヒト抗体は、更に抗原によるチャレンジに応答して動物の内因性抗体よりはむしろ完全ヒト抗体を産生するように改変されているトランスジェニック非ヒト動物を使用して産生されうる。（PCT publication WO94/02602参照）。非ヒトホストにおける重および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子を無能力化し、そしてヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性なローカスをホストの遺伝子に挿入する。ヒト遺伝子を、例えば、必用なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母人工染色体を使用して組み込む。次いで、すべての所望の改変を与える動物は、改変の完全相補体（full complement）より少なく含有する中間トランスジェニック動物を交雑することにより先祖として得られる。このような非ヒト動物の好ましい態様はマウスであり、そしてPCT publications WO96/33735およびWO96/34096に開示されたＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）と呼ばれる。この動物は、完全にヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体の調製のように、関心のある免疫原による免疫感作後に動物から直接得ることができ、またはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマなどの動物に由来する不死化されたＢ細胞から得ることができる。更に、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収しそして発現させて直接抗体を得ることができるか、またはさらに改変して例えば単一鎖Ｆｖ分子などの抗体のアナログを得ることができる。
【０１２６】
Ｆａｂフラグメントおよび単一鎖抗体
本発明に従えは、本発明の抗原性タンパク質に対して特異的な単一鎖抗体の産生に技術を適合させることができる（例えば、U.S.Pat.No.4,946,778参照）。更に、方法をＦａｂ発現ライブラリーの構築のために適合させて（（例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281）、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログまたは相同体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速な且つ有効な同定を可能とすることができる。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、（ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生されたＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィドブリッジを還元することにより発生させたＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）ハパインおよび還元剤による抗体分子の処理により発生させたＦａｂフラグメントおよび（ｉｖ）Ｆｖフラグメントを含むがそれらに限定されない当技術分野で知られた技術による産生させることができる。
【０１２７】
二重特異的抗体
二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。この場合に、結合特異性の１つは、本発明の抗原性タンパク質に対してである。第２結合ターゲットは任意の他の抗原であり、そして有利には細胞表面タンパク質またはレセプターまたはレセプターサブユニットである。
【０１２８】
二重特異的抗体を作るための方法は当技術分野で知られている。従来は、二重特異的抗体のリコンビナント産生は、２つの重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づいている（Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539(1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな種別の故に、これらのハイブリドーマ（クアドロマ（quadromas）は、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、その１つのみが正しい二重特異的構造を有する。正しい分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程により達成される。同様な手順は、１９９３年５月１３日に公表されたWO93/08829およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０１２９】
所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合されうる。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとである。融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖結合のために必要な部位を含有する第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体および所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、そして適当なホスト生物に共トランスフェクションする。二重特異的抗体を発生させる更なる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210(1986)参照。
【０１３０】
ＷＯ９６／２７０１１に記載の他のアプローチに従えば、抗体分子の対間の界面は、リコンビナント細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの百分率を最大にするように工学的に作成される。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きい側鎖（１つまたは複数）に同じまたは類似したサイズの補償「キャビティー」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えばアラニンまたはトレオニン）で置換することにより第２抗体分子の表面に創生される。これは、ホモダイマーなどの他の望まれない最終産物に対するヘテロダイマーの収率を増化させるための機構を与える。
【０１３１】
二重特異的抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的抗体）として調製されうる。抗体フラグメントから二重特異的抗体を発生するための技術は、文献に記載されている。例えば、二重特異的抗体は、化学的連結を使用して調製されうる。Brennan et al., Science 229:81(1985)は、インタクトな抗体をタンパク質分解により開裂させてＦ（ａｂ’）２フラグメントを発生させる技法を記載する。これらのフラグメントは、ジチオール複合化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下に還元されて近接ジチオールを安定化しそして分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで発生したＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に転換させる。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つを、次いでメルカプトエチルアミンによる還元によりＦａｂ’−チオールに再転換しそして等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異的抗体を形成する。産生された二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための作用物質として使用することができる。
【０１３２】
更に、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収することができ、そして化学的にカップリングさせて二重特異的抗体を形成することができる。Shalaby et al., J.Exp. Med.175:217-225(1992)は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ‘）２分子の産生を説明する。各Ｆａｂ’フラグメントをＥ．ｃｏｌｉから別々に分泌させそしてインビトロで指向された化学的カップリングに供して二重特異的抗体を形成した。かくして形成された二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターおよび正常なヒトＴ細胞を過発現する細胞に結合することができ、そしてヒト乳癌ターゲットに対してヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性をトリガーすることができた。
【０１３３】
二重特異的抗体フラグメントをリコンビナント細胞培養物から直接作成しそして単離するための種々の技術も記載されている。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生された。Kostelny et al., J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させた。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、次いで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法は、抗体ホモダイマーの産生のために利用することもできる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)により記載された「ダイアボディー」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作るための別の機構を与えた。このフラグメントは、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能とするのにはあまりにも短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインを、他のフラグメントの相補性ＶＬおよびＶＨドメインと対形成するように強制され、それにより２つの抗原結合部位を形成する。単一鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二重特異的抗体フラグメントを作るための他のストラテジーも報告された。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368(1994)参照。２より多くの結合価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異的抗体を調製することができる。Tutt et al., J. Immunol. 147:60(1991)。
【０１３４】
例示的二重特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合することができ、その少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に起源する。または、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームを、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７）またはＩｇＧのためのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などの白血球上のトリガリング分子に結合するアームと組み合わせて、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞防御機構に焦点を合わせることができる。二重特異的抗体は、特定の抗原を発現する細胞に細胞傷害剤（cytotoxic agent）指向させるのに使用することもできる。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞傷害剤または放射性核種キレーター、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡに結合するアームを有する。
【０１３５】
ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内にある。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合により結合された抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を望まれない細胞にターゲティングするため（U.S.Pat.No.4,676,980）およびＨＩＶ感染の処置のため（WO91/00360; WO92/200373; EP03089）に提供された。該抗体は、架橋剤を含む合成タンパク質化学を含む、合成タンパク質化学における既知の方法を使用してインビトロで調製されうることを意図する。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することにより構築することができる。この目的に適当な試薬の例は、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートおよび例えばU.S.Pat.No.4,676,980に開示された試薬を含む。
【０１３６】
イムノコンジュゲート
本発明は、化学療法剤、毒素（例えば、バクテリア、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）または放射性同位元素（即ち、放射性コンジュゲート）などの細胞傷害剤にコンジュゲーションされた抗体を含むイムノコンジュゲートにも関する。抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トリレン２，６−ジイソシアナート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作られる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science, 238:1098(1987)に記載の如く調製されうる。炭素１４標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示的キレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６参照。
【０１３７】
他の態様では、抗体を腫瘍プレターゲティングにおける利用のための「レセプター」にコンジュゲーションさせることができ、その際抗体−レセプターコンジュゲートは、患者に投与され、次いで清浄剤を使用して結合していないコンジュゲートを循環から除去し、次いで細胞傷害剤にコンジュゲーションされる「リガンド」を投与する。
【０１３８】
イムノリポソーム
本明細書に開示された抗体をイムノリポソームとして処方することもできる。抗体を含有するリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688(1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030(1980);およびU.S.Pat.Nos.4,485,045および4,544,545に記載の如き当技術分野で知られている方法により調製される。増強された循環時間を有するリポソームは、U.S.Pat.No.5,013,556に開示されている。
【０１３９】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物による逆相蒸発法により発生させることができる。リポソームを、ジスルフィド交換反応を介してChem. 257:286-288(1982)のフィルターを通して押し出す。化学療法剤（ドクソルビシンなどの）は場合によりリポソーム内に含有される。例えば、Gabizon et al., K. National Cancer Inst., 81(19):1484(1989)参照。
【０１４０】
本発明の抗体の治療的に有効な量は、一般に治療目的を達成するのに必用な量に関する。上記したとおり、これは、ある場合にはターゲットの機能を妨害しそしてある場合には生理学的応答を促進する、抗体とそのターゲット抗原との結合相互作用であることができる。投与されるのに必要な量は、更にその特異的抗原に対する抗体の結合アフィニティーに依存し、そして投与された抗体が、抗体を投与される他の被験体の遊離量から枯渇する速度にも依存するであろう。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的に有効な用量の普通の範囲は、非限定的例として、約０．１mg／kg体重〜約５０mg／kg体重であることができる。普通の投与頻度は、例えば２回／日〜１回／週の範囲にあることができる。
【０１４１】
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体および本明細書に開示されたスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、医薬組成物の形態で種々の障害の処置のために投与することができる。このような組成物の調製に関係する原理及び考慮事項ならびに成分の選択の指針は、例えば、Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19thed.(Alfonso R. Gennaro, et al., editors)Mack Pub.Co., Faston, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorme,Pa., 1994; and Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Pareteral Sciences, Vol.4), 1991, M.Dekker, New Yorkにおいて提供される。
【０１４２】
有効成分は、例えばコアセルベーション技術によりまたは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルに閉じ込められる（entrapped）こともでき、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルション内に閉じ込められてもよい。インビボ投与のために使用されるべき処方は無菌でなければならない。これは、無菌ろ過膜を通すろ過により容易に達成される。
【０１４３】
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適当な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、成形品、例えばフイルムまたはマイクロカプセルの形態にある半透過性マトリックスを含む。徐放性マトリックスの適当な例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ−（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）またはポリラクチド（U.S.Pat.No.3,773,919）、Ｌ−グルタミンとγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセタートからなる注射可能なマイクロスフェア）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。オチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日以上の間分子の放出を可能とするが、あるヒドロゲルは、より短い時間の期間タンパク質を放出する。
【０１４４】
ＥＬＩＳＡアッセイ
アナライトタンパク質を決定するための作用物質は、アナライトタンパク質に結合することができる抗体、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル、または更に好ましくはモノクローナル抗体であることができる。インタクトな抗体、そのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２）を使用することができる。プローブまたは抗体に関して、用語「標識された」は、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリングさせる（即ち、物理的に連結すること）ことによるプローブまたは抗体の直接標識ならびに直接標識される他の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含することを意図する。間接標識の例は、蛍光的に標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出およびＤＮＡプローブを蛍光的に標識されたストレプトアビジンで検出することができるような、ビオチンによるＤＮＡプローブの端部標識を含む。用語「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体内に存在する組織、細胞および流体を含むことを意図する。従って、血液ならびに、血清、血漿またはリンパを含む血液の画分または成分は、用語「生物学的サンプル」の使用の範囲内に含まれる。即ち、本発明の検出方法を使用して、インビトロおよびインビボで生物学的サンプル中のアナライトｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを検出することができる。例えば、アナライトｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術は、ノーザンハイブリダイゼーションおよびin situハイブリダイゼーションを含む。アナライトタンパク質の検出のためのインビトロ技術は、酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を含む。アナライトゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術は、サザーンハイブリダイゼーションを含む。イムノアッセイを行うための技法は、例えば、“ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther(Ed.)Human Press, Totowa, N.J., 1995; “Immunoassay”, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1996; and “Practice and Thory of Enzyme Immunoassays”, P.Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amstersam, 1985.に記載されている。更に、アナライトタンパク質の検出のためのインビボ技術は、標識された抗アナライトタンパク質抗体を被験体に導入することを含む。例えば、抗体を放射能マーカーで標識することができ、被験体においてそれが存在および位置することは、標準イメージング技術により腔内または経皮的に単独でまたはエフェクター細胞と共に検出されうる。
【０１４５】
治療的使用及び処方
本発明の核酸およびタンパク質は、代謝障害、糖尿病、肥満、感染疾患、食欲不振、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害および種々の異常脂血症（dyslipidemias）、肥満と関連した代謝障害、慢性疾患および種々の癌と関連した代謝症候群Ｘおよび廃棄障害、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心臓欠陥、大動脈弁狭窄症、心房中隔欠損（atrial septal defect）（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管（ductus arteriosus）、肺狭窄症、サブ大動脈狭窄症、心室中隔欠損（ＶＳＤ）、弁疾患、結節状硬化症、強皮症、エリテマトーデス（lupus erythematosus）、肥満、移植、副腎白質異栄養症、先天性副腎過形成（congenital adrenal hyperplasia）、前立腺癌、新生物（neoplasm）、腺癌、リンパ腫、子宮癌、受精能、白血病、血友病、凝固亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全、移植片対ホスト病、ＡＩＤＳ、気管支喘息、リウマチ様疾患および骨関節症、クローン病、多発性硬化症、オーブライト遺伝性骨ジストロフィーおよび他の疾患、障害および状態などを含むが、それらに限定されない種々の疾患に関係する潜在力のある予防および治療用途において有用である。
【０１４６】
本発明の治療複合体の投与用の製剤は、無菌の水性または非水性溶液剤、懸濁剤、および乳剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、水、アルコール性／水性溶液、乳液または懸濁液を含み、これらは食塩および緩衝化媒体を含む。ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、流体および栄養補充剤、電解質補充剤を含む乳酸化リンゲル静脈内ビヒクルなどを含む。例えば、抗微生物剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性ガスなどの如き保存剤および他の添加剤を加えることができる。
【０１４７】
本発明の核酸分子、ポリペプチドおよび抗体（本明細書では「有効化合物」と呼ばれる）ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログおよび相同体は、投与のために適当な医薬組成物中に配合することができる。このような組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質または抗体および薬学的に許容され得る担体を含む。本明細書で使用された「薬学的に許容され得る担体」は、薬学的投与に適合性の、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗バクテリア剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は、当技術分野の標準参照テキストであるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最近版に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。このような担体または希釈剤の例は、水、生理的食塩水、リンゲル液、デキストロース液および５％ヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。リポソームまたは非水性ビヒクル、例えば脂肪油も使用することができる。薬学的に有効な物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野で周知である。任意の慣用の媒体または作用物質が有効化合物と非適合性である場合を除いて、組成物におけるその使用が意図される。補充の有効化合物も組成物に配合することができる。
【０１４８】
本発明の医薬組成物は、その意図する投与経路に適合性であるように処方される。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（即ち、局所）、経粘膜、腹腔内および直腸投与を含む。非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液剤または懸濁剤は、下記の成分：無菌の希釈剤、例えば注射用の水、食塩水、脂肪油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗バクテリア剤、例えばベンジルアルコールもしくはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウム；キレート化剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩ならびに張力調節剤、例えば塩化ナトリウムもしくはデキストロースを含むことができる。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸もしくは水酸化ナトリウムで調節することができる。非経口用製剤は、ガラスもしくはプラスチックから作られたアンプル、使い捨て可能な注射器または多用量バイアル（multiple dose vials）に封入されうる。
【０１４９】
注射可能な使用に適当な医薬組成物は、無菌水性溶液剤（水溶性である場合）または分散剤（dispersions）および無菌の注射剤もしくは分散剤のその場での調製用の無菌散剤を含む。静脈内投与のために、適当な担体は、生理学的食塩水、静菌水（bacteriostatic water）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標）（BASF, Parsippany, N.J.）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。すべての場合に、組成物は、無菌でなければならずそして容易に注射可能な程度に流動性であるべきである。それは、製造および保存の条件下に安定でなければならず、そしてバクテリア及び真菌類などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）およびそれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合には必用な粒径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の阻止は、種々の抗バクテリア剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成することができる。多くの場合に、組成物中に等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことは好ましいであろう。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含ませることにより引き起こすことができる。
【０１５０】
無菌の注射剤は、適切な溶媒中に、必用な量の有効化合物（例えば、本発明の治療複合体）を、必用に応じて上記した成分の１つまたは組み合わせと共に混合し、次いで、ろ過滅菌を行うことにより調製されうる。一般に、分散剤は、基礎分散媒（basic dispersion medium）および上記した成分からの必要な他の成分を含有する無菌のビヒクル中に有効化合物を配合することにより調製される。無菌の注射剤の調製用の無菌の散剤の場合には、調製方法は、有効成分＋先に無菌ろ過されたその溶液からの任意の追加の所望の成分の散剤を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１５１】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用になる担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に包まれるかまたは錠剤中に圧縮されうる。経口治療投与の目的で、有効化合物を賦形剤と共に配合し、そして錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物は、流体担体中の前記化合物を経口的に適用し、うがいをし（swished）、吐き出すかまたは飲みこむ、うがい剤として使用するための流体担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合性の結合剤および／または佐剤物質は、組成物の一都部として含まれうる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、下記の成分いずれかまたは類似した性質の化合物：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル（Primogel）またはトウモロコシデンプン；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Sterotes）；流動促進剤（glidant）、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリン；または矯味・矯臭剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバーを含有することができる。
【０１５２】
経口投与のために、医薬組成物は、例えば、薬学的に許容され得る賦形剤、例えば、結合剤（例えば、プレゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）を使用して、慣用の手段により調製された錠剤もしくはカプセル剤の形態をとることができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によりコーティングすることができる。経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態をとることができ、またはそれらは、使用の前に水または他のビヒクルと共に構成するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液体製剤は、薬学的に許容され得る添加剤、例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別化植物油）；および保存剤（たとえば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を使用して慣用の手段により調製されうる。製剤は、適当ならば、緩衝剤塩、矯味・矯臭剤、着色剤および甘味剤を含有することもできる。
【０１５３】
経口投与用の製剤は、有効化合物のコントロールされた放出を与えるように適当に処方されうる。口腔内投与のために、組成物は、慣用の方法で処方された錠剤またはトローチ剤の形態をとることができる。吸入による投与のために、本発明に従って使用するための化合物は、適当な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスの使用により、加圧されたパックまたはネブライザーからエアゾルスプレー組成（aerosol spray presentation）の形態で都合よく送達される。加圧されたエアゾルの場合に、投薬単位（dosage unit）は、計量された量を送達するための弁を設けることにより決定されうる。化合物とラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤の粉末混合物を含有する、吸入器または通気器で使用するための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方することができる。化合物は、注射により、例えば、濃縮塊注射（bolus injection）または連続注入により非経口投与用に処方することができる。注射用の処方は、加えられた保存剤と共に、単位剤形において、例えばアンプルまたは多用量容器において提供されうる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液剤または乳剤のような形態をとることができ、そして懸濁化剤、安定剤および／または分散化剤などのような処方剤（formulatory agents）を含有することができる。または、有効成分は、使用前に、適当なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質を含まない水との構成のための散剤形態にあることができる。化合物は、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの慣用の坐剤基剤を含有する坐剤または保持浣腸剤などの直腸組成物において処方することもできる。これまでに述べた処方に加えて、化合物は、デポ製剤として処方することもできる。このような長く作用する処方は、移植により（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、化合物は、適当なポリマーまたは疎水性物質と共に（例えば、許容され得る油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂と共にまたは僅かに可溶性誘導体として、例えば僅かに可溶性の塩として処方することができる。
【０１５４】
吸入による投与のために、化合物は、適当な推進剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧された容器もしくは分配器または噴霧器からエアゾルスプレーの形態で送達される。
【０１５５】
全身性投与は、経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮投与のために、透過されるべきバリアーに対して適切な浸透剤を処方中に使用する。このような浸透剤は、当技術分野で公知でありそして、例えば、経粘膜投与用の洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用により達成されうる。経皮投与のために、有効化合物は、当技術分野で公知の軟膏剤（ointments）、膏薬剤（salves）、ゲル剤またはクリーム剤に処方される。
【０１５６】
１つの態様では、有効化合物は、移植片およびマイクロカプセル化送達システムを含む、コントロールされた放出処方などの身体からの迅速な除去に対して化合物を保護する担体と共に調製される。生物分解性、生物適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。このような処方を調製するための方法は、当業者には明らかであろう。これらの物質は、Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を感染細胞にターゲティングしたリポソームを含む）を、薬学的に許容され得る担体として使用することもできる。これらは、例えば、U.S.Pat.No.4,522,811に記載された、当業者に知られている方法に従って調製されうる。
【０１５７】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために単位剤形（dosage unit form）において経口または非経口組成物を処方することは特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、  処置されるべき被験体のための一単位投薬量（unitary dosage）として適合した物理的に分離した単位を指し；各単位は、必要な薬学的担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の有効化合物を含有する。本発明の単位剤形のための明細は、有効化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果および個体の処置のためのこのような有効化合物を配合することの当技術分野における固有の限界、により指令されそしてこれらに直接依存する。
【０１５８】
本発明の核酸分子を、ベクターに挿入することができそして遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（例えば、U.S.Pat.No.5,328,470）によりまたは立体空間的注射（例えば、Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057）により被験体に送達されうる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容され得る希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている徐放性マトリックスを含むことができる。または、完全な遺伝子送達ベクターが、リコンビナント細胞、例えばレトロウイルスベクターからインタクトに産生されうる場合には、医薬製剤は、遺伝子送達システムを産生する１種以上の細胞を含むことができる。医薬組成物は、投与のための指示と共に、容器、パックまたは分配器内に含まれうる。
【０１５９】
治療有効用量は、症侯の軽減または遅延をもたらすのに十分な治療複合体のその量を指す。このような化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための細胞培養物または実験動物における標準薬学的手順により決定されうる。毒性効果と治療効果との用量比は、治療インデツクスでありそしてそれは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現されうる。大きな治療インデツクスを示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することはできるが、感染していない細胞への潜在的損傷を最小にし、それにより副作用を減少させるために、このような化合物を罹患した組織の部位にターゲティングする送達システムをデザインするように注意を払うべきである。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための投薬量の範囲を処方する際に使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性を殆ど伴わないかまたは全然伴わないでＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される剤形および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変わることができる。本発明の方法で使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから評価されうる。用量は、細胞培養物において決定されたＩＣ５０（即ち、症候の最大の半分の抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するのに使用することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１６０】
医薬組成物は、１種以上の生理学的に許容され得る担体または賦形剤を使用して慣用の方式で処方することができる。かくして、化合物およびその生理学的に許容され得る塩および溶媒を、吸入または通気（insufflation）（口または鼻を通して）または経口、口腔内、静脈内、腹腔内、非経口または直腸投与による投与用に処方することができる。
【０１６１】
本明細書に記載された方法、選択ストラテジー、物質または成分の任意の１つを利用するキットまたはシステムも本発明に従って開示される。本発明の開示に従う例示的キットは、場合により、追加的に、方法もしくはアッセイを行うためのインストラクション、パッケージング物質、アッセイ、装置またはシステム成分等を含有する１つ以上の容器を含むであろう。
【０１６２】
更なる局面では、本発明は、本明細書に開示された複合体および使用方法を具体化するキットを提供する。本発明のキットは、場合により、下記：（１）本明細書に開示されたポリペプチドまたは核酸成分；（２）本明細書に開示された方法を実施するためおよび／または本明細書の選択手順を操作するためのインストラクション；（３）１つ以上の検出アッセイ成分；（４）核酸もしくはポリペプチド、他の核酸、トランスジェニック植物、動物、細胞等を保持するための容器および（５）パッケージング物質、の１つ以上を含む。
【０１６３】
トランスジェニック生物
本発明の方法で使用されるトランスジェニック細胞または動物は、例えば、インターロイキンとインターロイキンレセプターを含むキメラポリペプチドのコピーをコードするトランスジーンを含むことができる。トランスジーンは、ヒトタンパク質を含む、トランスジェニック細胞または動物に対して普通外因性であるタンパク質をコードすることができる。トランスジーンは、異種またはネイティブプロモーターに連結されうる。
【０１６４】
この開示は、更にトランスジェニック動物を産生する方法に関する。当技術分野で知られている技術を使用して、動物にトランスジーンを導入して動物の始祖系統を産生することができる。このような技術は、前核マイクロインジェクション；生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Van der Putten et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152, 1985;胚幹細胞における遺伝子ターゲティング（Thompson et al., Cell 56: 313-321,1989）；胚のエレクトロポレーション（Lo, Mol, Cell Biol. 3:1803-1814, 1983;および精子媒介遺伝子移入（(Lavitrano, et al., Cell 57:717-229,1989)を含むが、それらに限定されない。このような技術の概説については、Gorden, Intl.Rev.Cytol.115:171-229,1989参照。従って、本発明は、キメラインターロイキン／インターロイキンレセプターポリペプチドをコードするトランスジーンを含有するトランスジェニック生物を特徴とする。トランスジェニック生物は、真核細胞、例えば、酵母細胞、昆虫、例えば、虫またはハエ、魚、爬虫類、鳥または哺乳動物、例えばげっ歯動物であることができる。トランスジェニック生物は、更に、内因性遺伝子における遺伝子変更、例えば点突然変異、挿入または欠失を含むことができる。
【０１６５】
本発明のホスト細胞、例えば培養物中の原核または真核ホスト細胞を使用して、本発明のポリペプチド成分または複合体を産生する（即ち、発現する）ことができる。従って、本発明は、タンパク質が産生されるような適当な培地中で本発明のホスト細胞（それにタンパク質をコードするリコンビナント発現ベクターが導入されている）を培養することを含む。他の態様では、この方法は、更に培地またはホスト細胞からタンパク質を単離することを含む。
【０１６６】
本発明の他の局面は、本発明のリコンビナント発現ベクターが導入されているホスト細胞に関する。用語「ホスト細胞」および「リコンビナントホスト細胞」は本明細書では交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験体細胞を指すのみならずこのような細胞の先祖または潜在的先祖も指すことは理解される。ある改変は突然変異または環境的影響により後の世代において起こりうるので、このような先祖は、実際には、親細胞と同じでなくてよいが、依然として本明細書で使用された用語の範囲内に含まれる。ホスト細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であることができる。例えば、タンパク質は、バクテリア細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現されうる。他の適当なホスト細胞は当業者に知られている。
【０１６７】
ベクターＤＮＡは、慣用のトランスフォーメーションまたはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞に導入されうる。本明細書で使用された、用語「トランスフォーメーションおよび「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む、外来核酸（例えばＤＮＡ）をホスト細胞に導入するための種々の当技術分野で認識された技術を指すことを意図する。ホスト細胞をトランスフォーメーションまたはトランスフェクションするための適当な方法は、Sambrock, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nded., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cols Spring Harbor, N. Y., 1989)および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
【０１６８】
哺乳動物の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の少さなフラクションのみが外来ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込むことができることが知られている。これらの組み込み体（integrants）を同定および選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗体に対する抵抗）をコードする遺伝子を、一般に関心のある遺伝子と共にホスト細胞に導入する。種々の選択可能なマーカーは、薬物、例えば、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートに対する耐性を与えるマーカーを含む。選択可能なマーカーをコードする核酸は、タンパク質をコードするベクターと同じベクター上でホスト細胞に導入されることができ、または別々のベクター上で導入されうる。導入された核酸で安定にトランスフェクションされた細胞は、薬物選択（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込まれた細胞は生存するが、他の細胞は死ぬ）により同定することができる。
【０１６９】
本発明のホスト細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を産生するのに使用することもできる。例えば、１つの態様では、本発明のホスト細胞は、受精した卵母細胞またはタンパク質コード配列が導入されている胚性幹細胞である。このようなホスト細胞は、次いで非ヒトトランスジェニック動物であって、そのゲノムに外因性ポリペプチド配列が導入されている非ヒトトランスジェニック動物、または内因性ポリペプチド配列が変更されている相同性リコンビナント動物（homologous recombinant animals）を創生するのに使用することができる。このような動物は、タンパク質の機能および／または活性を研究するためおよび／またはタンパク質活性のモデュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書で使用された「トランスジェニック動物」は、動物の細胞の１つ以上がトランスジーンを含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、更に好ましくは、ラットまたはマウスなどのゲッ歯類である。トランスジェニック動物の他の例は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類等を含む。トランスジーンは、トランスジェニック動物を発生させる細胞のゲノムに組み込まれそして成熟動物のゲノムに残っていて、それによりトランスジェニック動物の１種以上の細胞型または組織におけるコードされた遺伝子産物の発現を指向する、外因性ＤＮＡである。本明細書で使用された、「相同性リコンビナント動物」は、動物の発生の前に、内因性遺伝子と、動物の細胞、例えば動物の胚細胞に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同的組換えにより内因性遺伝子が変更されている非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、更に好ましくはマウスである。
【０１７０】
本発明の好ましい態様の例は下記に示される。当業者により理解されるとおり、本発明に記載され、それにより本発明に組み込まれた技術が一般に適用されそして本発明の一般的範囲から逸脱することなく任意の数の方法において変わることができる。可記の実施例は、好ましい態様の例として与えられそして本発明を限定するものではない。例えば、成分の相対的量を変えて異なる所望の効果を達成することができ、追加の成分を加えることができ、および／または同様な成分が、記載された成分の１つ以上を類似した成分で置換することができる。
【０１７１】
実施例１
ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒａの共投与は、インビボでのＣＤ８メモリーＴ細胞およびＮＫ細胞増殖を駆動する。
ＩＬ−１５およびリコンビナントマウスＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（ｒｍＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ）の共投与がインビボでＩＬ−１５活性を媒介することができるかどうかを決定するために、我々は、養子移入モデルを利用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に対するＩＬ−１５の効果を測定した。ＣＤ４５．１ＣＦＳＥ標識され濃縮された脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞（CD45.1 CFSE labeled enriched splenic CD8+T cells）を正常なＣＤ４５．２マウスおよびｒｍＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約１５μg）に移入した。ＩＬ−１５単独による処理の４日後、ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞集団の約１１％は我々の以前の結果と合致して分裂した（図１ａ、上部パネル）。極めて対照的に、ｒｍＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃに結合したＩＬ−１５の同じ量の共投与は、ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞の約６０％の増殖をもたらした（図１）。更に、ＩＬ−１５単独に対応するＣＤ８Ｔ細胞の大多数は一度分裂したが、組み合わせ処理に対応する細胞は５〜７回の分裂を受け、細胞数の実質的な増化をもたらした（データは示されていない）。分裂している細胞の大部分は、高いレベルのＣＤ４４を発現し、対応する細胞が主としてメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞であるかまたは、ＣＤ４４がアップレギュレーションされた（図１ａ、下部パネル）ことを示唆する。重要なことであるが、ｒｍＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ単独の投与は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導しなかった（データは示されていない）。注目すべきことに、可溶性形態のｒｍＩＬ−１５ＲａのＩＬ−１５との共投与も、ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞の増強された増殖をもたらしたが、ＩＬ−１５単独およびｒｍＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃと組み合わされたＩＬ−１５に対して中間のレベルをもたらした（データは示されていない）。真正のメモリーＣＤ８Ｔ細胞に対する組み合わせた治療の作用を試験するために、我々は、ＯＶＡを発現するリコンビナント水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−ＯＶＡ）による感染により発生させた、ＣＦＳＥ標識されたオブアルブミン（ＯＶＡ）特異的ＣＤ８＋メモリーＴ細胞を養子移入した。上記結果と同様に、組み合わせたＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ処理に対応する抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１５単独で得られた程度よりはるかに高い程度に増殖した（図１ｂ）。
【０１７２】
過去の研究は、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞増殖のインデューサーとしてＩＬ−１５を関係付けたがＣＤ４＋Ｔ細胞増殖のインデューサーを関係付けなかった。従って、我々は、養子移入システムを使用してこれらの細胞型の増殖を誘導するためのＩＬ−１５およびレセプターと複合体化されたＩＬ−１５の能力を検査した。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞は約２．５μgのＩＬ−１５に応答して増殖しなかったが、ＮＫ細胞は非常に僅かに増殖した（図２）。対照的に、ｒｍＩＬ−１５Ｒａ−ＦｃのＩＬ−１５との共投与は、ＮＫ細胞の甚だしい増殖を誘導したが、Ｂ細胞は応答しなかった。ＮＫ−Ｔ細胞の応答は、ＮＫ細胞の応答に類似していた（デ―タは示されていない）。興味深いことに、ＩＬ−１５はマウスＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を媒介すると考えられないけれども、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、投与された複合体に対する中間的応答を示した。
【０１７３】
実施例２
複合体化されたＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａはインビボでＩＬ−１５活性を大いに増強する
我々は、次いでｒｍＩＬ−１５Ｒａ−ＦｃのＩＬ−１５との共投与に対する増殖応答の早期速度論を検討した。ＣＦＳＥ希釈は処理の１日後では無視できるものであったが、２日までにドナーＣＤ８＋Ｔ細胞集団の約３６％が分裂し、第３および第４回の分裂においで認識できる数の細胞があった（図３）。３日までにドナーＣＤ８＋Ｔ細胞の約５９％が分裂し、多くの細胞は５〜６回の分裂にあり、４日までに約７３％が分裂し、いくらかの細胞は第７回の分裂にあった。これらの結果および他の結果は、単一用量のＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃの最大効果は処理の約４日後に達成され、続いてドナーＣＤ８＋Ｔ細胞がメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の特徴的な長引く増殖率（protracted rate of proliferation）に入ったことを示した（データは示されていない）。
ＩＬ−１５Ｒａ−ＦｃのＩＬ−１５との共投与は、ＩＬ−１５効能を顕著に増強する。−１日目に、マウスは、約１．５×１０６のコンジェニックな、ＣＦＳＥ標識された、ＣＤ８濃縮されたリンパ球を静脈内に受け取り、そして０日目にＰＢＳ（示されていない）、ＩＬ−１５（約５μg）または変化する用量のＩＬ−１５＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約２．５μg＋１５μg、約０．５μg＋３μg、約０．１μg＋０．６μg、または約０．０２μg＋０．１２μg）を腹腔内に受け取った。−１日目に、各マウスは、約４．５×１０６の、コンジェニックな、ＣＦＳＥ標識された、ＣＤ８濃縮されたリンパ球を静脈内に受け取り、そして０日目にＰＢＳ（示されていない）、ＩＬ−１５（約０．５μg）＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約３μg）または変化する用量のＩＬ−１５（約１２．５μg、２５μg、または３７．５μg）を腹腔内に受け取った。ＣＤ８＋脾細胞をフローサイトメトリーによりＣＦＳＥ希釈について４日目に解析した。
【０１７４】
ＩＬ−１５単独の処理に対する組み合わされた処理により得られた活性の増強の近似を得るために、我々は、養子移入モデルを使用してＩＬ−１５およびＩＬ−１５／ｒｍＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃのタイトレーションを行った。比較は、ＣＦＳＥ希釈により評価されたドナーＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の程度に基づいていた。約０．６μgのＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃと組み合わせた約０．１μgのＩＬ−１５の用量は、約５μgのＩＬ−１５の増殖のレベルに類似した増殖のレベルを誘導した。かくして、このタイプの実験では、ＩＬ−１５活性は、ｒｍＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃとの共投与により〜５０倍増強された。この実質的な増強を考慮して、我々は、ＩＬ−１５単独でこのレベルの活性を達成することができるかどうかを調べた。約３７．５μgのＩＬ−１５の投与によってさえ、レセプターで複合体化されたＩＬ−１５約０．５μgで得られた増殖のレベルは達成できなかった（図４ｂ）。これらの結果は、ＩＬ−１５Ｒａアベイラビリティーがインビボで限定されているかも知れないことを示唆している。何故ならば、ＩＬ−１５レベルを増化させても、活性の更なる増大は得られなかったからである。
【０１７５】
実施例３
複合体化されたＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａは、ＩＬ−１５Ｒｂを必用とするトランス提示を介して作用を及ぼす。
複合体化されたＩＬ−１５＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃの活性はＩＬ−２Ｒａを必用とするが、応答する細胞によるＩＬ−１５Ｒａ発現を必要としない。−１日目に、マウスは、コンジェニックな、ＣＦＳＥ標識された、ＣＤ８濃縮されたＩＬ−１５Ｒａ−／−リンパ球を静脈内に受け取り、そして０日目にＰＢＳ、ＩＬ−１５（約２．５μg）またＩＬ−１５（約２．５μg）＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約１５μg）で腹腔内で処理された。４日目にＣＤ８＋ドナー脾細胞を、ＣＦＳＥ蛍光およびＣＤ１２２発現について解析した。−１日目に、正常なマウスは、コンジェニックな、ＣＦＳＥ標識された野生型またはＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒａ−／−脾細胞を静脈内に受け取り、そして０日目に、ＰＢＳまたはＩＬ−１５（約２．５μg）＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約１５μg）で腹腔内で処理された。ＣＤ８＋ドナー脾細胞を、フローサイトメトリーにより４日目にＣＦＳＥ希釈について解析した。
複合体化されたＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａの効果は、対応する細胞型に対する直接または間接の効果により媒介されうる。もし直接ならば、その場合にはターゲット細胞はＩＬ−１５Ｒ成分（１つまたは複数）を発現することか必要であろうということが予想されうる。これを試験するために、我々は、ＣＦＳＥ標識されたＩＬ−１５Ｒａ−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ−１５Ｒａ−／−ホストに移入しそしてマウスをＩＬ−１５または複合体化されたＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａで処理した。ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５Ｒａの不存在下ではトランスプレゼンテーションされることができず、そして増殖を誘導しなかった（図５ａ）。他方、ＩＬ−１５／ｒｍＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ処理されたマウスからのドナーＣＤ８＋Ｔ細胞は甚だしく増殖した。更に、主としてナイーブ表現型ＣＤ８＋Ｔ細胞からなるＩＬ−１５Ｒａ−／−ドナー細胞は、分裂と共にＣＤ４４およびＣＤ１２２のそれらの発現を漸次に増加させた。応答するＴ細胞は、複合体化されたＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａに応答するためにＩＬ−１５Ｒａを必用としなかったので、我々はこの効果の媒介におけるＩＬ−１５Ｒｂ（ＣＤ１２２）の役割を調べた。このために、我々は、ＣＦＳＥ標識されたＣＤ１２２＋／＋またはＣＤ１２２−／−ＣＤ８＋Ｔ細胞を正常なマウスに移入しそして処理の４日後にＣＦＳＥ希釈についてドナー細胞を解析した。コントロール細胞は、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ処理に応答して活発に増殖したが、ＣＤ１２２−／−ドナーＣＤ８＋Ｔ細胞は共投与に応答して増殖しなかった（図５ｂ）。これらの結果は、一緒になって、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃは、多分γＣとの共同においてＩＬ−１５Ｒｂとの相互作用を通じて直接トランスプレゼンテーションを介して作用を及ぼすことを示した。
【０１７６】
実施例４
強制されたＩＬ−１５トランスプレゼンテーションにより誘導された増殖は、ＭＨＣクラスＩを必用とするが、ＩＬ−７または樹状細胞を必要としない
ＣＤ８＋Ｔ細胞のプレカップリングされたＩＬ−１５＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃで推進された増殖は、ＭＨＣクラスＩ発現を必要とするが、ＩＬ−７またはＤＣを必要としない。−１日目に、Ｂ６およびβ２ｍ−／−マウスは、正常なＢ６およびナイーブＯＴ−Ｉ−ＲＡＧ−／−ＣＦＳＥ標識されたＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を受け取り、そして０日目に、ＰＢＳまたはＩＬ−１５（約２．５μg）＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約１５μg）で処理された。−１日目に、ＩＬ−７＋／−またはＩＬ−７−／−マウスは、コンジェニックな、ＣＦＳＥ標識されたＣＤ８濃縮されたリンパ球を受け取った。０日目に、マウスは、ＩＬ−１５（約２．５μg）＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約１５μg）を腹腔内に受け取った。−１日目にＢ６またはＣＤ１１ｃ−ＤＴＲ骨髄で産生されたキメラは、碑細胞を静脈内に受け取り、そして０日目に、ＰＢＳまたはＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約１５μg）＋ＩＬ−１５（約２．５μg）で腹腔内処理された。すべてのマウスを、０、１および３日目にＤＴで処理した。すべての場合に、ドナーＣＤ＋脾細胞を４日目にＣＦＳＥ希釈について解析した。
ナイーブＴ細胞はＭＨＣクラスＩおよびそれらの生存のための内因性ペプチドを必要とするが、メモリーＣＤ８Ｔ細胞生存および増殖は、ＭＨＣクラスＩ非依存性であると考えられる。空のホスト（empty hosts）におけるこれらのサブセットのホメオスタティック増殖は、同様なＭＨＣ要求を示す。これらの結果を考えると、ｒｍＩＬ−１５Ｒａ−ＦｃのＩＬ−１５との共投与により誘導される増殖のためのＭＨＣ要求を決定することは重要であった。かくして、我々は、ナイーブＴＣＲトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞（ＯＴ−Ｉ）および濃縮されたＢ６ＣＤ８＋Ｔ細胞（メモリ細胞を含有する）を、正常なマウスまたはＭＨＣクラスＩ欠失（ｂ２−ミクログロブリン−／−）マウスに共移入した。興味深いことに、ナイーブＯＴ−ＩＲＡＧ−／−ＣＤ８Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩが十分なホストにおいて複合体による処理に応答して活発に増殖した。対照的に、ＭＨＣクラスＩ−／−ホストでは、ナイーブＴ細胞増殖は起らなかった。同様に、Ｂ６ＣＤ８Ｔ細胞は正常なホスト中で増殖したが、驚くべきことに、ＭＨＣクラスＩ−／−ホストでは増殖は実質的になかった。これらのデータは、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａによる増殖の誘導は、ナイーブおよびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の両方についてＭＨＣクラスＩ依存性であることを示した。ｒｍＩＬ−１５Ｒａ−ＦｃのＩＬ−１５との共投与により誘導された増殖応答はＭＨＣクラスＩのホスト発現に依存していたので、我々は、役割を演じているかもしれない他の基準を調べることを望んだ。我々は、ＩＬ−７の関与を調べた。何故ならば、このサイトカインは、免疫不全ホストにおいてＣＤ８Ｔ細胞のホメオスタティック増殖に必須であるからである。ＣＦＳＥ標識されたＣＤ８＋Ｔ細胞をコントロールマウスまたはＩＬ−７−／−マウスに移入しそして組み合わせたＩＬ−１５／ｒｍＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃを投与した。ＩＬ−７の存在下または不存在下に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１５Ｒａ−ＦｃとのＩＬ−１５に十分同等に応答して増殖し、これは、ＩＬ−７が我々のシステムではＩＬ−１５媒介増殖に関与していないことを示す。以前の研究は、ＩＬ−１５活性を媒介することにおいて樹状細胞（ＤＣ）の潜在力を強調しており、そしてＤＣによるＭＨＣ発現がＴ細胞ホメオスタシスにおいて重要でありうる。ＤＣがＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ共投与により誘導される増殖応答において何の役割を演じるかを試験するために、我々は、ＤＣが条件的に枯渇されうるシステムを利用した。ＣＤ１１ｃ−ＤＴＲマウスは、ＣＤ１１ｃプロモーターのコントロール下にサルジフテリア毒素レセプターを発現し、ＣＤ１１ｃ＋細胞をＤＴに感受性にし、これはＤＣの＞９５％を除去する。非造血細胞に対する効果の結果として、インタクトなＣＤ１１ｃ−ＤＴＲマウスに対するＤＴの毒性により、我々は、ＣＤ１１ｃ−ＤＴＲ骨髄および正常なＢ６ホストを使用してキメラを発生させた。ＣＦＳＥ標識されたＣＤ８＋Ｔ細胞を次いでＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ複合体の投与の前にＤＴで処理されたキメラに移入した。興味深いことに、我々は、ＤＴ処理されたコントロールまたはＣＤ１１ｃ−ＤＴＲキメラ間にＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の差を見いださなかった。従って、Ｍ���ＣクラスＩはＩＬ−１５媒介増殖に対して必須であったけれども、ＤＣは必用ではなかった。
【０１７７】
実施例５
ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ免疫治療は、ナイーブＴ細胞活性化およびエフェクター機能を誘導する
ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は、プレカップリングされたＩＬ−１５＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ処理に応答してエフェクター表現型および機能を獲得する。−１日目にマウスは、ナイーブおよびメモリーＯＴ−Ｉ−ＲＡＧ−／−細胞の混合物またはナイーブＯＴ−Ｉ−ＲＡＧ−／−細胞のみを受け取り、そして０日目にＰＢＳまたはＩＬ−１５（約２．５μg）を伴うｒｍＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約１５μg）で処理された。４日後、碑細胞をＣＦＳＥ強度、ドナーＯＴ−Ｉの百分率およびＣＤ４４発現について検査した。−１日目に、マウスは、約７×１０５ナイーブＯＴ−Ｉ−ＲＡＧ−／−細胞を受け取り、そして０日目にＰＢＳ、ＩＬ−１５（約２．５μg）、ＩＬ−１５（約２．５μg）＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約１５μg）または約１×１０５ｐｆｕ  ＶＳＶ−ＯＶＡで処理された。４日目に、碑細胞をインビトロでＳＩＩＮＦＥＫＬと共にまたはＳＩＩＮＦＥＫＬを伴わないで約５時間インキュベーションし、そしてＩＦＮ−ａの産生を細胞内染色により解析した。−１日目に、マウスは、約２×１０６ナイーブＯＴ−Ｉ−ＲＡＧ−／−細胞を受け取り、そしてＰＢＳまたはＩＬ−１５（約２．５μg）＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約１５μg）で腹腔内処理され、または約１×１０５ｐｆｕのＶＳＶ−ＯＶＡで静脈内処理された。処理後４日目に、各マウスは、ＣＦＳＥ標識された（約０．２５μＭ）非ペプチドパルスド碑細胞およびＣＦＳＥ標識された（約２．５μＭ）ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドパルスド碑細胞の混合物を受け取った。４時間後、碑細胞をＣＦＳＥ標識されたターゲット集団の存在について解析した。
先の実験で、我々は、ＣＤ４４低ポリクローナルＣＤ８Ｔ細胞およびナイープＴＣＲトランスジェニックＴ細胞が、ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃと共投与されるときのＩＬ−１５に対して応答することに留意した。ホメオスタティックな条件下に、ＣＤ８メモリーＴ細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞よりもはるかに高いＩＬ−１５に対する応答を示すことを考慮して、我々は、複合体化されたＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃに対するこれらの２つのサブセットの応答を直接比較することを望んだ。そうするために、ＣＦＳＥ標識されたメモリーＯＴ−ＩおよびナイーブＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞を同じコンジェニックＣ５７ＢＬ／６ホストに養子移入しそして増殖をＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃによる処理の４日後に解析した。驚くべきことに、ナイーブＯＴ−ＩＣＤ８Ｔ細胞は、メモリーＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞と殆ど同じく増殖した。ナイーブＯＴ−Ｉ細胞も、コントロール複合体に応答して〜１０倍エキスパンションしそしてＣＤ４４をアップレギュレーションした。ナイーブＴ細胞において誘導された活発な増殖に照らして、エフェクター機能が付随的に誘導されたかどうかを確立することは興味深いことであった。この問題を試験するために、我々は、ナイーブＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞をコンジェニックＣ５７ＢＬ／６ホストに養子移入し、そしてインビトロキリングアッセイを使用して、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃによる処理の４日後または比較のためにオブアルブミンを発現するリコンビナント水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−ＯＶＡ）による感染の後に抗原特異的溶解活性を測定した。興味深いことに、ＩＬ−１５／ｒｍＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ処理は、ウイルス感染により得られたレベルに類似した、活発な抗原特異的溶解活性の誘導をもたらした。溶解活性に加えて、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ−ＦｃまたはＶＳＶ−ＯＶＡ感染により活性化されたナイーブＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞の大多数は、ペプチドによるインビトロ再刺激に続いて、高いレベルのＩＦＮｇを産生した。この結果は、コントロール（ＰＢＳ）およびＩＬ−１５処理したマウスからＩＦＮｇを産生するＯＴ−Ｉ細胞の無視できる頻度と対照的であった。従って、ＩＬ−１５Ｒａ−ＦｃのＩＬ−１５との共投与によるナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞におけるエフェクター機能の誘導は、感染により得られた活性化と同様であった。
【０１７８】
実施例６
複合体化されたＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ−ＦＣによるナイーブＴ細胞の処理は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を発生する。
プレカップリングされたＩＬ−１５＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ処理は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞からメモリー細胞を発生させる。１日目に、Ｂ６マウスは、約６×１０６ＣＦＳＥ標識されたナイーブＯＴ−Ｉ−ＲＡＧ−／−細胞を受け取りそして０日目に、ＰＢＳまたはＩＬ−１５（約２．５μg）＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ（約１５μg）で腹腔内処理された。４４日後、碑細胞をドナーＯＴ−ＩＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（上部パネル）およびＣＤ４４およびＣＤ１２２のＯＴ−Ｉ発現（中部および下部パネル）について解析した。
ナイーブＴ細胞はトランスプレゼンテーションされたＩＬ−１５に応答してエフェクター細胞に成長したけれども、これが一過性の効果であるかまたはメモリーＴ細胞発達（memory T cell development）をもたらしたかどうかは、まだ確められていない。従って、我々は、ナイーブＯＴ−ＩＴ細胞移入およびＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ処理の４４日後ＯＴ−ＩＴ細胞の数および表現型を解析した。この時点で、非処理マウスに比較してＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ投与の後〜５倍高い百分率のＯＴ−Ｉ細胞が存在していた。更にこれらの細胞の殆どすべてが高いレベルのＣＤ４４およびＣＤ１２２を発現した。従って、抗原の不存在下ですら、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ処理は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の発達を誘導することができた。
【０１７９】
最近の発見は、予防接種、腫瘍免疫治療および免疫不全における免疫系再構築のためのアジュパントとしてのＩＬ−１５の使用を支持する。癌処置の場合に、リンパ球減少症の誘導が養子移入されたリンパ球の機能的活性を増強するのに現在使用されている。この療法は、リンパ球減少症で駆動されたホメオスタティック増殖を受けるＣＤ８＋Ｔ細胞は溶解およびサイトカイン産生活性を有するエフェクター細胞に分化するという発見に基づいている。ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクターおよびメモリー表現型細胞への分化もまたＭＨＣクラスＩ発現を必要とする。従って、インタクトなホストにおけるＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ−ｆＣ複合体により誘導された増殖および機能的活性は、リンパ球減少症によりトリガーされたホメオスタティック増殖に模擬していた。更に、複合体による処理により得られた増殖のレベルは、高い用量のＩＬ−１５単独によっては達成できなかった。ＩＬ−１５を産生する同じ細胞、サイトカインをトランスプレゼンテーションすることもできるので、遊離ＩＬ−１５Ｒａのアベイラビリティーは限定されている可能性がある。更に、ＩＬ−１５の短い半減時間は、レセプターに複合体化されるとき延長されうる。従って、ＩＬ−１５単独による処理は、このサイトカインの完全治療潜在力を達成しそうもない。ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａの組み合わせた投与は、これらの問題を回避することができそして改良された有効性を与える。
【０１８０】
複合体化されたＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａの作用の機構は、ナイーブおよびメモリーＴ細胞ホメオスタティック生存および増殖に対する要求に関する最近の状態を考えれば、特に興味深いことであった。普通の条件下に、ナイーブおよびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の生存はＩＬ−７を必用とするが、ＩＬ−１５は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のホメオスタティック増殖のために必須である。リンパ球減少症環境において、ＩＬ−７は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞のホメオスタティック増殖のために必用であり、そしてＣＤ８＋メモリーＴ細胞ホメオスタティック増殖を媒介することにおいてＩＬ−１５と共に役割を演じる。従って、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ複合体に強く応答することは予想外であった。しかしながら、ＩＬ−１５−／−マウスでは、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞プールは約５０％減少し、これはナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞発達および／または生存は、ＩＬ−５を必要とすることを示唆していることに留意されるべきである。いずれにせよ、レセプターが結合したＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａにより推進されるナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、ＩＬ−７非依存性でありそしてＩＬ−１５Ｒａ発現を必要とした。この結果は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞はＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａに応答するのに十分なレベルのＩＬ−１５Ｒａを発現するが、可溶性ＩＬ−１５単独に対してはそうではないことを示した。更に、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は、エフェクター機能を獲得し、次いで高いレベルのＣＤ４４およびＣＤ１２２を発現する長く生きるメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞に発達した。興味深いことに、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａでトリガーされたナイーブまたはメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、ＭＨＣクラスＩ発現を必用とした。ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の生存はＭＨＣに依存するが、ＣＤ８メモリーＴ細胞の生存はＭＨＣ非依存性であると考えられる。従って、レセプター複合体化されたＩＬ−１５により誘導されたメモリー細胞増殖におけるＭＨＣクラスＩの必要性は幾分予想外であったが、以前に示されたとおり、メモリー細胞の機能の面でＭＨＣについての役割を支持する。我々の発見は、インタクトなホストにおける活発なＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞エキスパンションおよびエフェクター分化を推進することにおいてＩＬ−１５の潜在力を例示する。いずれのアジュバントに関しても、このような活性化が自己免疫も増強させうるかどうかを決定することは必用であろう。にもかかわらず、このシステムは、免疫不全におけるまたは骨髄もしくは幹細胞移植後の免疫再構築を支援するための手段を与えることができる。更に、癌の処置における養子免疫治療も、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａの投与により増大されうるが、複合体単独による処理は、内因性抗原特異的Ｔ細胞およびＮＫ／ＮＫＴ細胞の十分なエキスパンションを推進して、あるレベルの保護を与えうることも可能である。免疫治療におけるこの新規な複合体の潜在力を決定するのに、更なる研究が必要である。
【０１８１】
【表１】
0005918817.tif 000003
【０１８２】
例示的方法
マウス。Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１マウスは、The Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)から購入された。Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．２マウスは、Charls Riverから購入された。ＯＴ−Ｉマウス系は、寛大にもDr.W.R.Heath(WEHI,Parkville,Australia)およびDr.F.Carbone(Monash Medical School,Prahan,Victoria,Austrakia)により提供されそしてＲＡＧ−／−バックグラウンド上のＣ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．２系として維持された。
【０１８３】
ＩＬ−１５Ｒａ−／−マウス２２は、寛大にもDr.Averil Ma(UCSF)により提供された。ＩＬ−２Ｒｂ−／−マウスからの脾細胞は、寛大にもDr.Michael Farrar(UMINN)により提供された。ＤＴＲトランスジェニックマウスは、Dr.D.Littman(Skirball Institute,NY,NY)からの贈答であった。マウスは、UCONN Health Center施設でＣ５７ＢＬ／６に１０回戻し交雑された。ＤＴＲ  Ｔｇ＋マウスは、前記したとおりテイルＤＮＡのＰＣＲによりスクリーニングされた。ＩＬ−７−／−マウスは、起源としてDNAX Research Institute of Molecular and Cellular Biology(palo Alt,CA)から得られ、そしてＣ５７ＢＬ／６ｘ／Ｏｌａハイブリッドバックグラウンド上に維持された。
本発明のＩＬ−１５＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ融合タンパク質−融合タンパク質のマウスバージョンの例。この実施例では、一般的構築物は、増強された発現及びプロセッシングのためのＩＬ−２シグナルペプチド、ＩＬ−１５遺伝子またはその一部、立体的自由度およびタンパク質折りたたみを促進するための可変リンカー領域、（任意の所望の長さまたは配列であってもよい）、ＩＬ−１５Ｒａ遺伝子の可溶性もしくは細胞外部分およびヒトＩｇＧのＦｃ部分を含む。ヒト相同体の遺伝子またはその一部は、同様な方式で置換されることができる。同様に、ＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒａ遺伝子またはその一部は、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒａ遺伝子またはその一部との組み合わせも含むキメラ構築物において置換されることができる。
ＩＬ−１５＋ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を誘発する。ＣＦＳＥ標識されたリンパ球を正常なマウスに移入し、次いでそれを〜１０μgのＩＬ−１５＋ＩＬ−１５Ｒａ融合タンパク質で処理した。４日後、碑細胞を単離しそしてフローサイトメトリーにより解析した。
マウスにおけるＩＬ−１５＋ＩＬ−１５Ｒａタンパク質複合体により減少した肝臓癌量。約１×１０５Ｂ６−Ｆ１メラノーマ細胞を脾臓内に注射した（肝臓に腫瘍を指向する）。１および７日後に、マウスをＰＢＳ（コントロール）、２．５μgＩＬ−１５または２．５μgＩＬ−１５＋ＩＬ−１５Ｒａ複合体で処理した。接種の１４日後、腫瘍を肝臓において計数し、そして脾臓の重量を計った。
ＩＬ−１５をＩＬ−１５Ｒａに複合体化させることは、インビボでの半減時間およびバイオアベイラビリティーを顕著に増強させる。２．５μgのヒトＩＬ−１５単独またはＩＬ−１５Ｒａにプレ複合体化されたＩＬ−１５を腹腔内注射によりマウスに投与した。指示された時間に、血清を得、そしてＩＬ−１５の存在についてＥＬＩＳＡにより試験した。存在する全ＩＬ−１５を、標準濃度曲線から計算した。半減時間をＡにおける減衰曲線の線形部分から計算した。
【０１８４】
ＩＬ−１５処理。リコンビナントマウスＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃキメラ分子をR&D Systems,Inc.(Minneapolis, MN)から購入した。両方共ｈＰＢＳに懸濁させたｈＩＬ−１５およびｒｍＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃを混合しそして約３７℃で約３０分間インキュベーションした。各マウスは、特記しない限り、２００ｕｌ  ＰＢＳ中の２．５μgＩＬ−１５および１５μgｒｍＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃを受け取った。
【０１８５】
ヒト。エキソン３を欠いているヒトＩＬ−１５Ｒａ−Ｅ３の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列（Anderson, D. et al., 1995, J.Biol.Chem.270:29862-29869）を６Ｘヒスチジンタグ付きのヒトＩｇＧ１のＦｃにポリペプチドリンカーを介して融合させた。キメラタンパク質をバキュロウイルス発現システムを使用してＳｆ２１細胞において発現させた。分子質量。リコンビナント成熟ヒトＩＬ−１５Ｒａ／Ｆｃはジスルフィド連結されたホモダイマータンパク質である。Ｎ末端配列決定に基づいて、リコンビナントヒトＩＬ−１５Ｒａタンパク質は、アミノ末端にＩＬｅ３１を有する。還元されたヒトＩＬ−１５Ｒａ／Ｆｃモノマーは、約４２．６ｋＤａの計算分子質量を有する。グリコシル化の結果として、リコンビナントモノマーは、還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約６０〜７０ｋＤａタンパク質として移動する。
【０１８６】
マウス。マウスＩＬ−１５Ｒａの細胞外ドメインのアミノ酸残基３３〜２０５と連結されたヒトＣＤ３３からの単一ペプチドをコードするＤＮＡ配列（Giri, J.G. et al., 1995, EMBO. 14:3654-3663）を、ポリペプチドリンカーを介してヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合させた。キメラタンパク質をマウスミエローマ細胞系、ＮＳ０において発現させた。分子質量。リコンビナント成熟マウスＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃは、ジスルフィド連結されたホモダイマータンパク質である。Ｎ末端配列決定に基づいて、リコンビナントマウスＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃタンパク質は、アミノ末端にＧｌｙ３３を有する。還元されたマウスＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃモノマーは、４４．９ｋＤａの計算分子質量を有する。グリコシル化の結果として、リコンビナントタンパク質は、還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約８０〜９０ｋＤａタンパク質として移動する。完全長ＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃのほかに、この調製物はタンパク質分解開裂により発生した少量の（１０％）遊離ＩＬ−１５ＲａおよびＦｃも含有する。遊離ＩＬ−１５ＲａおよびＦｃは、還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてそれぞれ約４２ｋＤａおよび３５ｋＤａタンパク質として移動する。
【０１８７】
細胞のＣＦＳＥ標識および養子移入。リンパ球を脾臓および／または末梢リンパ節から（リンパ球集団の単離で述べられたとおり）単離し、そして１０×１０６細胞／mlでＨＢＳＳ（約１％ＨＧＰＧ）中に再懸濁させ、次いで３７℃で加温した。細胞をＣＦＳＥ（０．０１mM；Molecular Probes,Eugene,OR）と約１０分間インキュベーションしそして反応を約１％ＨＧＰＧおよび約５％ＦＣＳを有するＨＢＳＳで抑えた。細胞をＨＢＳＳ（約１％ＨＧＰＧ）で２回洗浄した。ＣＦＳＥ標識された細胞をＰＢＳ中に再懸濁させ（１〜２０×１０６細胞）そしてコンジェニックマウスに静脈内注射した。細胞を指示された時間に単離し、そしてＣＤ４５アレル状態および表面マーカーのそれらの発現およびＣＦＳＥ強度を使用してドナー細胞の存在について解析した。
【０１８８】
リンパ球集団の単離及び免疫蛍光分析。つや消しのガラススライドを使用して脾臓をホモジナイジングすることによりＨＢＳＳ（約１％ＨＧＰＧを伴う）中の単一細胞懸濁液を創り出した。赤血球を溶解しそして碑細胞をＮｉｔｅｘを通してろ化した。指示された時点で、リンパ球を単離しそしてドナーＣＦＳＥ標識された細胞を、それらのＣＤ−４５アレル状態を使用して検出するか、またはＯＶＡ特異的ドナー細胞を、先に述べたとおりに産生されたＯＶＡ由来のペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬを含有するＨ２Ｋｂテトラマーを使用して検出した。染色のために、リンパ球をＰＢＳ／約０．２％ＢＳＡ／約０．１％ＮａＮ３（ＦＡＣＳバッファー）中に約３〜１５×１０６／２００μｌの濃度で懸濁させた。テトラマーについて染色するときは、細胞をＯＶＡ−テトラマーＡＰＣ＋適当な希釈率の抗ＣＤ８ＰｅｒＣｐと約１時間室温でインキュベーションした。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、そして抗ＣＤ４４ＰＥで約４℃にて約２０分間染色し、洗浄し、次いでＰＢＳ中に約３％パラホルムアルデヒドで固定した。相対的蛍光強度をFACScalibur（BD Biosciences,San Jose,CA）て測定した。FlowJo Software（Tree Star,San Carlos,CA）を使用してデータを解析した。
【０１８９】
インビボ細胞傷害アッセイ。このアッセイは、本質的に前記したとおりに行った。正常な碑細胞を低い（約０．２５ｕｍ）または高い（約２．５ｕｍ）ＣＦＳＥレベルに標識し、そしてＣＦＳＥ高細胞を、約１μg／ml  ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと約３７℃で約４５分間インキュベーションした。同数の（１０×１０６）の各集団を混合しそして、そして処理されていないまたはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａで処理されたまたは４日前にニワトリオブアルブミンを発現する水泡性口内炎ウイルス１×１０５ｐｆｕで感染された、ＯＴ−Ｉ移入されたマウスに静脈内に注射した。４時間後に、脾細胞をＣＦＳＥ高およびＣＦＳＥ低集団の存在について解析した。百分率溶解＝［１−（プライミングされなかった割合（ratio unprimed）／プライミングされた割合（ratio primed））］×１００。割合＝百分率ＣＦＳＥ低／百分率ＣＦＳＥ高。
【０１９０】
ＩＦＮ−ｇの細胞内検出．リンパ球を脾臓から単離し、そして約１μg／ml  Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（BD PharMingen）と共に、約１μg／mlのＯＶＡ由来のペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬを伴ってまたは伴って、約５時間培養した。培養後に、細胞を表面分子について染色し、次いで固定し、そして細胞膜をサイトフィックス（cytofix）／サイトペルム（cytoperm）溶液（BD PharMingen）中で透過性化し、そして抗ＩＦＮ−ｇＰＥまたはコントロールラットＩｇＧ１ＰＥで染色した。細胞を洗浄しそして蛍光強度をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで測定した。
【０１９１】
骨髄キメラ。大腿骨および：けい骨（tibias）を、ＣＤ１１ｃ−ＤＴＲＴｇ＋マウスまたは非Ｔｇ同腹仔から採取した。骨髄（ＢＭ）を注射器でフラッシュアウトし、そして７０ｕｍナイロンメッシュを通して単一細胞懸濁液を発生した。赤血球（ＲＢＣ）を溶解し、そして細胞を、ＨＥＰＥＳＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンサルフェートを補充したＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ−ＨＧＰＧ）に再懸濁した。ＢＭから成熟Ｔ細胞を除去するために、細胞を抗Ｔｈｙｌ腹水（Ｔ２４）とインキュベーションし、ＨＢＳＳ−ＨＧＰＧ中で１回洗浄し、次いでＬｏｗ−Ｔｏｘ−Ｍウサギ補体（Low-Tox-M rabbit complement）（Cedarlane Laboratories, Ontario, Canada）と共に約３７℃で約４５分間インキュベーションした。ＣＤ４５．１レシピエントＢ６マウスを照射し（約１，０００ラド）、次いで約２〜５×１０６骨髄細胞を静脈内に移入した。マウスは、使用の前に８週間休養させた。ＰＢＳ中のジフテリア毒素（Sigma, St Louis, MO）を、約４ｎｇ／ｇ体重でマウスに腹腔内に投与した。キメラは、サイトカイン処置の１日前にＤＴ、サイトカイン処理のすぐ前の用量、およびサイトカイン処理の３日後の最終用量を受け取った。
【０１９２】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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