(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養対象微生物を糸状菌とし、前記糸状菌が耐性を有し且つ酸化型と還元型の両形態をとり得る電子メディエータを含む培地にて、前記電子メディエータを電気化学的に酸化させながら前記糸状菌の培養を行い、前記糸状菌の分化を誘導することを特徴とする糸状菌の形態変化制御方法。
【請求項２】
培養対象微生物を糸状菌とし、前記糸状菌が耐性を有し且つ酸化型と還元型の両形態をとり得る電子メディエータを含む培地にて、前記電子メディエータを電気化学的に還元させながら前記糸状菌の培養を行い、前記糸状菌の分化と伸長を抑制することを特徴とする糸状菌の形態変化制御方法。
【請求項３】
培養対象微生物を糸状菌とし、前記糸状菌が耐性を有し且つ酸化型と還元型の両形態をとり得る電子メディエータを含む固体培地にて、前記電子メディエータを前記酸化型の電子メディエータとして培養を行い、前記糸状菌の分化を誘導することを特徴とする糸状菌の形態変化制御方法。
【請求項４】
培養対象微生物を糸状菌とし、前記糸状菌が耐性を有し且つ酸化型と還元型の両形態をとり得る電子メディエータを含む固体培地にて、前記電子メディエータを前記還元型の電子メディエータとして培養を行い、前記糸状菌の分化と伸長を抑制することを特徴とする糸状菌の形態変化制御方法。
【請求項５】
請求項１または請求項３に記載の方法により糸状菌の分化を誘導した後、前記糸状菌の胞子を培地から回収することを特徴とする糸状菌胞子の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌の形態変化制御方法と、この方法を利用した胞子の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌は、多様な酵素・物質を細胞外に分泌する機能を有し、産業上の利用価値が極めて高い微生物である。真菌は、例えば、抗生物質等の医薬品の生産分野、発酵食品（例えば、醤油、アルコール類及びアミノ酸等）の生産分野において広く利用されている。
【０００３】
また、最近では、バイオ燃料の生産分野において真菌を利用することが提案されている。例えば、特許文献１では、セルロースをバイオエタノールに変換する際に必要となるセルロースの分解による糖化（グルコース化）のプロセスにおいて、糸状菌であるトリコデルマ・リーゼイＱＭ９４１４により産生されるセルラーゼを利用することが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−８１８２６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、バイオ燃料生産等のバイオプロセスにおいて糸状菌を利用する際には、長期保存性や遺伝子均一性の観点から、糸状菌を胞子（分生子）の形態で供することが望ましいと考えられる。
【０００６】
また、糸状菌の胞子は、菌糸と比較するとハンドリング性が圧倒的に優れている。したがって、胞子を植菌源とすれば、植菌操作自体を容易なものとできる。また、培地の単位容積当たりの細胞数を早期に増加させ易い。このように、ハンドリング性や植菌源としての有利性の観点からも、バイオプロセスにおいて糸状菌を利用する際には、糸状菌を胞子の形態で供することが望ましいと考えられる。
【０００７】
さらに、糸状菌の胞子の細胞表面には多様な酵素が常発現しているのに対し、菌糸の細胞表面における酵素の発現は、菌糸に基質が接近することによって誘導される（Enzyme Microb. Technol, vol15, 90-99, 1993）。したがって、菌糸を植菌源とした培地よりも、胞子を植菌源とした培地の方が、基質の分解処理開始時間をより早くできる。このように、基質の分解処理開始時間の早期化の観点からも、バイオプロセスにおいて糸状菌を利用する際には、糸状菌を胞子の形態で供することが望ましいと考えられる。
【０００８】
しかしながら、糸状菌の中には、胞子形成能が低いものも存在している。このような糸状菌の胞子をバイオプロセスに供するに際し、糸状菌に胞子を効率よく形成させることのできる技術を確立することが望ましいと考えられる。
【０００９】
また、糸状菌が胞子を形成する場合には、菌糸の分化過程（気中菌糸の形成過程）を経ることが一般的である。したがって、糸状菌に胞子を形成させるためには、糸状菌の分化を誘導することが必要となる。
【００１０】
また、糸状菌については、分化（気中菌糸の形成）を抑制することで、胞子形成を抑制することが可能となる。
【００１２】
本発明は、糸状菌の分化を制御する方法を提供することを目的とする。
【００１３】
さらに、本発明は、糸状菌の胞子を効率よく生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
かかる目的を達成するため、本願発明者等は、セルロースをバイオエタノールに変換する際に必要となるセルロースの分解による糖化（グルコース化）のプロセスに利用して極めて有用な、高いセルロース分解能を有する糸状菌であるTrichoderma longibrachiatum KFA-2（以下、単にＫＦＡ−２株と呼ぶこともある）を対象として各種培養試験を重ねた。その結果、以下の新たな知見を得るに至った。
【００１５】
即ち、ＫＦＡ−２株が耐性を有し且つ酸化型と還元型の両形態をとり得る物質であるチオニンを電子メディエータとして培地に含ませ、培地中の電子メディエータを電気化学的に酸化させながら培養を行うことで、ＫＦＡ−２株の分化（気中菌糸の形成）を誘導（促進）して、胞子形成を促進できることを知見するに至った。逆に、培地中の電子メディエータを電気化学的に還元させながら培養を行うことで、ＫＦＡ−２株の分化（気中菌糸の形成）を抑制して、胞子形成を抑制できることを知見するに至った。
【００１６】
また、ＫＦＡ−２株が耐性を有し且つ酸化型と還元型の両形態をとり得る物質であるチオニンを電子メディエータとして固体培地に含ませ、この培地にてＫＦＡ−２株を培養することで、ＫＦＡ−２株の分化（気中菌糸の形成）を誘導（促進）して、胞子形成を促進できることを知見するに至った。
【００１８】
本願発明者等は、これらの知見に基づき、さらに種々検討を重ね、本発明を完成するに至った。
【００１９】
即ち、本発明の糸状菌の形態変化制御方法は、培養対象微生物を糸状菌とし、糸状菌が耐性を有し且つ酸化型と還元型の両形態をとり得る電子メディエータを含む培地にて、電子メディエータを電気化学的に酸化または還元させながら糸状菌の培養を行うようにしている。
【００２０】
電子メディエータを電気化学的に酸化させながら培養を行うことで、糸状菌の分化を誘導することができる。逆に、電子メディエータを電気化学的に還元させながら培養を行うことで、糸状菌の分化を抑制することができる。
【００２１】
次に、本発明の糸状菌の形態変化制御方法は、培養対象微生物を糸状菌とし、糸状菌が耐性を有し且つ酸化型と還元型の両形態をとり得る電子メディエータを含む固体培地にて糸状菌の培養を行うようにしている。
【００２２】
酸化型の電子メディエータを含む培地にて培養を行うことで、糸状菌の分化を誘導することができる。逆に、還元型の電子メディエータを含む培地にて培養を行うことで、糸状菌の分化を抑制することができる。
【００２３】
次に、本発明の糸状菌胞子の生産方法は、本発明の形態変化制御方法により、糸状菌の分化を誘導した後に、糸状菌の胞子を培地から回収するようにしている。したがって、糸状菌の分化を誘導して胞子形成能を高めた状態として、糸状菌の胞子を回収することができるので、糸状菌の胞子を効率よく生産することが可能となる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の糸状菌の形態変化制御方法によれば、糸状菌について、菌糸の分化を誘導して胞子形成を促進することや、菌糸の分化を抑制して胞子形成を抑制することが可能となる。
【００２６】
さらに、本発明の糸状菌胞子の生産方法によれば、糸状菌の分化を誘導して胞子形成能を高めた状態として、糸状菌の胞子を回収するようにしているので、糸状菌の胞子を効率よく生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】固体培地を用いたゲル型電気培養装置の一例を示す図である。
【図２】ゲル型電気培養装置の電位制御領域を示す斜視図である。
【図３】ゲル型電気培養装置の電位制御領域を示す断面図である。
【図４】糸状菌の分生子（胞子）形成過程を示す図である。
【図５】糸状菌を固体培地上で培養した場合の成長過程を示す図である。
【図６】液体培地を用いた電気培養装置の一例を示す図である。
【図７】ＫＦＡ−２株について、２種の培養条件による培養試験結果を示す図である。
【図８】電子メディエータ（ＣｕＳＯ４、メチレンブルー、ニュートラルレッド、フェリシアン化カリウム）の添加効果について検討した結果を示す図である。
【図９】電子メディエータ（ＰＭＳ、ＡＱＤＳ、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ、チオニン）の添加効果について検討した結果を示す図である。
【図１０】ＫＦＡ−２株と電極との間での電子メディエータを介した電子授受の概念を示す図である。
【図１１】実験に使用した培養装置（培地：ゲル）を示す図である。
【図１２】作用電極と対電極の間の培地表面に植菌した場合の通電培養試験結果を示す図である。
【図１３】作用電極上のゲル培地表面と対電極上のゲル培地表面の双方に植菌した場合の通電培養試験結果を示す図である。
【図１４】電子メディエータをＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡとして通電培養試験を実施した結果を示す図である。
【図１５】実験に使用した培養装置（培地：液体）を示す図である。（ａ）が上から見た図であり、（ｂ）が横から見た図である。
【図１６】培養液中で非通電条件下でＫＦＡ−２株を培養した場合の胞子（分生子）及び菌糸の顕微鏡写真である。
【図１７】培養液中で通電条件下でＫＦＡ−２株を培養した場合の胞子（分生子）及び菌糸の顕微鏡写真である。
【図１８】培養対象微生物をアスペルギルス属の糸状菌として通電培養試験を行った結果を示す図である。
【図１９】培養対象微生物を  Trichoderma reesei（トリコデルマ・リーゼイ）QM9414株として、電子メディエータの添加効果を検討した結果を示す図である。
【図２０】培養対象微生物を  Trichoderma reesei（トリコデルマ・リーゼイ）QM9414株とした場合の通電培養試験結果を示す図である。
【図２１】培養対象微生物をＫＦＡ−２株として、電位条件を変化させることによる生育への影響を検討した結果を示す図である。
【図２２】図２１の結果について、菌糸到達半径を測定した結果を示す図である。
【図２３】図２１の結果について、陽極上と陽極上以外の分生子数のカウント結果を示す図である。
【図２４】陽極の面積を大きくした実験装置を示す図である。
【図２５】図２４の実験装置を使用して培養試験を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２９】
本発明の真菌の形態変化制御方法は、培養対象微生物を真菌とし、真菌が耐性を有し且つ酸化型と還元型の両形態をとり得る電子メディエータを含む培地にて、電子メディエータを電気化学的に酸化または還元させながら真菌の培養を行うようにしている。
【００３０】
以下、本発明の実施形態について、固体培地を用いた例を第一実施形態として、液体培地を用いた例を第二実施形態として説明する。
【００３１】
＜第一実施形態＞
（１）装置
固体培地を用いた本発明の第一実施形態は、例えば特開２０１１−１８８８４５号に開示されているゲル型電気培養装置を用いて実施することができる。このゲル型電気培養装置を図１に示す。
【００３２】
図１に示すゲル型電気培養装置１は、微生物培養用のゲル培地２と、ゲル培地２の表面のうちの培養面２ａに対向する対向面２ｂに配置された作用電極９と、ゲル培地２の表面に配置された対電極１０と、ゲル培地２の表面であって作用電極９と対電極１０との間に電圧を印加したときに電気力線が形成され得る位置に配置された参照電極１１と、作用電極９と対電極１０と参照電極１１とを結線して作用電極９の電位を３電極方式で制御する定電位設定装置１２と、ゲル培地２の少なくとも参照電極１１の周囲に含ませた参照電極１１の構成元素に対応する陰イオンとを有している。ゲル培地には電子メディエータが含まれている。尚、図１において、符号９ａは作用電極９と定電位設定装置１２とを結ぶリード線であり、符号１０ａは対電極１０と定電位設定装置１２とを結ぶリード線であり、符号１１ａは参照電極１１と定電位設定装置１２とを結ぶリード線である。符号２０は作用電極９にリード線９ａを、対電極１０にリード線１０ａを、参照電極１１にリード線１１ａをそれぞれ固定するための導電性ペースト（例えば銀ペースト等）である。符号６はゲル培地２を支持する支持体（例えばシャーレ）である。以降の説明では、ゲル培地２の培養面２ａに対向する対向面２ｂを単にゲル培地２の対向面２ｂと呼ぶこともある。
【００３３】
図１に示すゲル型電気培養装置１では、作用電極９と対電極１０と参照電極１１とを定電位設定装置１２に結線して、作用電極９の電位を３電極方式で制御するようにしている。したがって、作用電極９の電位を厳密に設定電位に制御することができる。詳細には、定電位設定装置（ポテンシオスタット）１２により、作用電極９と参照電極１１との間の電位差を測定し、この電位差が設定電位に達するように作用電極９と対電極１０との間に電流を流し、基準となる参照電極１１には一切電流が流れないようにしている。尚、３電極方式による電位制御については、例えば、電気化学測定法（上）、技報動出版株式会社、第１版１５刷、２００４年６月発行の６〜９ページにその詳細が記載されている。
【００３４】
そして、図１に示すゲル型電気培養装置１では、作用電極９の電位を厳密に制御することで、図２及び図３に示すように、作用電極９からゲル培地２の培養面２ａの作用電極９と対向している部分２ｃ（電位制御表面２ｃと呼ぶこともある）までを電位制御領域Ｘとして電位制御可能としている。したがって、ゲル培地２に含ませた電子メディエータを酸化または還元させることができる。尚、図２と図３では、ゲル培地２と作用電極９以外の構成については省略している。また、電位制御領域Ｘには電位制御表面２ｃも含まれている。
【００３５】
ここで、図１に示すゲル型電気培養装置１では、作用電極９と対電極１０と参照電極１１の配置位置は、ゲル培地２の対向面２ｂとしているが、各電極の配置位置はこれには限定されない。例えば、作用電極９は、ゲル培地２の対向面２ｂではなく、ゲル培地２の内部に配置（内包）するようにしてもよい。対電極１０と参照電極１１についても、電位制御領域Ｘの電位制御性が完全に失われることのない位置、例えば電位制御表面２ｃを完全に覆ったり、作用電極９から電位制御表面２ｃまでの間を完全に遮って電位制御表面２ｃにおける電位制御を不可能とすることのない位置にゲル培地２の内部に配置（内包）するようにしてもよいし、ゲル培地２の表面に配置するようにしてもよい。また、図１に示すゲル型電気培養装置１では、参照電極１１が作用電極９と対電極１０との間に配置されているが、参照電極１１の配置位置はこれに限定されず、作用電極９と対電極１０の間に電圧を印加したときに電気力線が生じ得る位置に配置すればよい。
【００３６】
また、作用電極９と対電極１０としては、例えばステンレス鋼電極、白金電極、炭素電極、各種透明電極（ガラス電極やＩＴＯ電極等）等を用いることができるが、これらに限定されるものではない、参照電極１１としては、例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極（陰イオン：Ｃｌ−）、Ａｇ／ＡｇＢｒ電極（陰イオン：Ｂｒ−）、Ａｇ／ＡｇＩ電極（陰イオン：Ｉ−）、Ｈｇ／Ｈｇ２Ｃｌ２電極（陰イオン：Ｃｌ−）、Ｈｇ／ＨｇＯ電極（陰イオン：ＯＨ−）、Ｈｇ／Ｈｇ２ＳＯ２電極（陰イオン：ＳＯ４２−）等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
（２）培養対象微生物
本発明における培養対象微生物である真菌は、特に限定されるものではなく、形態変化の制御が望まれる、あるいは胞子（分生子）形成の促進や抑制が望まれる鞭毛菌類、接合菌類、子嚢菌類、担子菌類、不完全菌類等である。その中でも特に、糸状の菌糸を栄養体とする多細胞真菌を対象とすることが好適であり、さらには接合菌類、子嚢菌類、不完全菌類に属する糸状菌を対象とすることが好適である。
【００３８】
より具体的には、トリコデルマ（Trichoderma）属に属する糸状菌、例えば、セルロースをバイオエタノールに変換する際に必要となるセルロースの分解による糖化（グルコース化）のプロセスに利用して極めて有用な、高いセルロース分解能を有する糸状菌であるTrichoderma longibrachiatum. KFA-2やTrichoderma reesei. QM9414等が挙げられる。ＫＦＡ−２株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターにて、２０１１年１２月７日に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７４で受託されている。他にも、アスペルギルス（Aspergillus）属に属する糸状菌であるAspergillus orysae NBRC100959やAspergillus sojae NBRC4239等が挙げられる。
【００３９】
（３）電子メディエータ
本発明において、培地に含ませる電子メディエータは、培養対象微生物である真菌が耐性を有し、且つ酸化型と還元型の両形態をとり得る物質を、培養対象微生物である真菌の種類に応じて適宜選択される。例示すると、硫酸銅、メチレンブルー、ニュートラルレッド、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、アントラキノン−２，６−ジスルホン酸ナトリウム（ＡＱＤＳ）等のキノン化合物、鉄イオン、チオニン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。培養対象微生物を糸状菌とする場合には、電子メディエータとして、鉄イオン、チオニンを用いることが好ましい。
【００４０】
ここで、電子メディエータとして鉄イオンを用いる場合、鉄イオンを培地中で安定に存在させるためには、キレート剤に配位させて鉄イオン錯体とすることが好ましい。キレート剤としては、鉄イオンを配位しうる任意のキレート剤を用いることができるが、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができ、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を用いることが好適である。
【００４１】
ゲル培地２における電子メディエータ含有量は、培養対象微生物との電子の授受が良好に起こり得る限り特に限定されるものではないが、概ね０．０５ｍＭ〜１００ｍＭ、好適には０．２ｍＭ〜１０ｍＭ、より好適には０．５ｍＭ程度である。尚、電子メディエータは、ゲル培地２の電位制御領域Ｘにのみ含ませるようにしても構わない。この場合にも、培養対象微生物との電子の授受が良好に起こり得る。
【００４２】
（４）電子メディエータの電気化学的な酸化または還元
電子メディエータの電気化学的な酸化または還元は、作用電極９の電位を制御して、ゲル培地２の電位制御表面２ｃを含めた電位制御領域Ｘにおける電位を制御することにより行われる。電位の値は、電子メディエータが還元型から酸化型に酸化される酸化電位または電子メディエータの酸化体が還元体に還元される還元電位に制御される。酸化電位及び還元電位に関する情報は、公知文献等から入手することができる。あるいは、培養の際に使用する電子メディエータを例えばサイクリックボルタンメトリー測定等に供することで、入手することができる。
【００４３】
鉄−ＥＤＴＡ錯体を例に挙げて説明すると、鉄−ＥＤＴＡ錯体は、サイクリックボルタンメトリー測定において、−０．２Ｖに還元ピークを有し、＋０．１Ｖ付近に酸化ピークを有している。したがって、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ（鉄−ＥＤＴＡ錯体の還元体）は−０．２Ｖよりもプラス側に高い電位、好適には＋０．１Ｖ以上で酸化することが可能である。逆に、Ｆｅ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ（鉄−ＥＤＴＡ錯体の酸化体）は、−０．２Ｖよりもマイナス側に高い電位で還元することが可能である。チオニンはサイクリックボルタンメトリー測定において、２つの還元ピーク（−０．３Ｖ及び−０．１Ｖ）を有し、２つの酸化ピーク（−０．２Ｖ及び−０．５Ｖ）を有している。したがって、チオニンの還元体は、−０．１Ｖよりもプラス側に高い電圧、好適には０Ｖ以上で酸化することが可能である。逆にチオニンの還元体は、−０．５Ｖよりもマイナス側に高い電位で還元することが可能である。
【００４４】
（５）培地及び培養環境
ゲル培地２は、培養対象微生物の培養に用いられる一般的なものを使用することができる。例えば、糸状菌については、ＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天）培地等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４５】
また、培養環境（温度、湿度、ｐＨ及び光照射条件等）は、培養対象微生物に応じて、適宜制御される。
【００４６】
（６）培養
培養対象微生物をゲル培地２に植菌し、培養を行う。植菌は、培養対象微生物自体、例えば菌糸を植菌するようにしてもよいし、胞子を植菌するようにしてもよい。あるいは、菌糸と胞子の混合物を植菌するようにしてもよい。また、植菌する位置は、作用電極９上のゲル培地２の表面、即ち電位制御表面２ｃ上とすることが好適である。但し、電位制御表面２ｃ上に植菌することには限定されず、この位置から外れた箇所に植菌し、伸長して電位制御表面２ｃ上に到達した菌糸の分化を誘導するようにしても構わない。
【００４７】
培養対象微生物を糸状菌とした場合を例に挙げて説明する。図４に糸状菌による分生子（胞子）の形成過程を示す。尚、図４は、文献（Microbiology (2010), 156, 2887-2900, 蛋白質 核酸 酵素 (2008), 53,(6), 753-759）から引用したものである。糸状菌の菌糸の分化は、光や栄養飢餓等といったストレスによって誘導される。菌糸が分化することで、気中菌糸が形成される。そして気中菌糸の成長に伴って、分生子柄が発達し、分生子が形成される。しかし一方で、光や栄養飢餓等といったストレスは、糸状菌の菌糸の成長（ゲル培地表面に沿った伸長）を阻害する要因となる。したがって、光や栄養飢餓等といったストレスを与えることにより菌糸を分化させて分生子形成を誘導することでは、糸状菌の菌糸の成長と菌糸の分化の両立を図ることができず、分生子を効率的に形成させることができない。これに対し、電子メディエータを電気化学的に酸化させながら（電子メディエータが還元型から酸化型に酸化される酸化電位に作用電極９の電位を制御しながら）糸状菌を培養することで、糸状菌の菌糸の成長と菌糸の分化の両立を図ることができ、分生子を効率よく形成させることが可能となる。逆に、電子メディエータを電気化学的に還元させながら（電子メディエータが酸化型から還元型に還元される還元電位に作用電極９の電位を制御しながら）糸状菌を培養することで、糸状菌の菌糸の成長と菌糸の分化の双方を抑制することができ、分生子の形成を阻害することも可能となる。
【００４８】
尚、電子メディエータを電気化学的に酸化させながら（電子メディエータが還元型から酸化型に酸化される酸化電位に作用電極９の電位を制御しながら）糸状菌を培養することで、さらなる有利な効果が得られる。即ち、糸状菌をゲル培地２の中心部に植菌すると、ゲル培地２の表面に沿って菌糸が放射上に成長（伸長）しつつ、植菌位置である中央部及びその周辺の古い細胞は死滅していく現象が見られる。これは、成長方向の先端部の細胞の生育を優先させるために、先端部に向けて栄養を送る糸状菌の生存戦略として観察される現象である（図５を参照）。そして、菌糸が伸長してシャーレ壁面まで到達すると、菌糸の伸長が阻害され、そのことがストレスとなって菌糸の分化が誘導され、分生子が形成される場合がある。したがって、仮に一般的な培養方法で分生子を形成できたとしても、分生子が得られるのは、菌糸の先端部が衝突する壁面の近傍付近のみとなってしまう。これは、分生子が得られるまでに要する時間や分生子が得られる培地面積を考慮すると、効率的とは到底言い難い。これに対し、電子メディエータを電気化学的に酸化させながら（電子メディエータが還元型から酸化型に酸化される酸化電位に作用電極９の電位を制御しながら）糸状菌を培養することで、植菌位置及びその周辺における細胞の死滅を大幅に抑えながらも、菌糸の成長（伸長）と菌糸の分化の両立を図ることができ、糸状菌に分生子を早期に形成させることが可能となる。加えて、作用電極９の電極面積を大きくすれば、電位制御表面２ｃを大面積とでき、分生子を形成させるために有効な面積を拡大して、糸状菌による分生子形成をさらに効率よく行うことが可能となる。
【００４９】
そして、ゲル培地２から胞子を回収することによって、分生子を効率よく製造することが可能になる。ゲル培地２からの胞子の回収は、例えば、Tween80を0.01%含有する水溶液をゲル培地上に添加し、スプレッダーで胞子をかきとること等により行うことができるが、この方法に限定されるものではない。
【００５０】
＜第二実施形態＞
（１）装置
液体培地（培養液）を用いた本発明の第二実施形態は、例えば特開２００８−０５４６４６号に開示されている電気培養装置等を用いて実施することができる。
【００５１】
図６に液体培地を用いた電気培養装置の一例を示す。電解槽５はイオン交換膜１６によって培養槽７と対極槽８に仕切られている。培養槽７には培養液４ａが収容され、対極槽８には電解液４ｂが収容される。培養槽７に収容された培養液４ａには作用電極９及び参照電極１１が浸漬される。対極槽８に収容された電解液４ｂには対電極１０が浸漬される。作用電極９と対電極１０と参照電極１１は定電位設定装置１２に結線され、作用電極９の電位を３電極方式で制御するようにしている。
【００５２】
作用電極９と対電極１０は、第一実施形態で挙げたものと同様の材質の電極を用いることができる。参照電極１１は、例えば銀・塩化銀電極（例えば、ＢＡＳ社製、ＲＥ−１Ｂ等）を用いることができるが、これに限定されるものではない。イオン交換膜１６は、例えばプロトン交換膜（例えば、デュポン社製、ナフィオンＮ１１７等）を用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００５３】
（２）培養対象微生物
第一実施形態と同様である。
【００５４】
（３）電子メディエータ
第一実施形態と同様である。
【００５５】
（４）培地に印加される電圧
第一実施形態と同様である。尚、第二の実施形態では、培養液４ａ全体の電位が制御されるので、培養液４ａ全体を培養対象微生物の培養に利用できる利点がある。
【００５６】
（５）培地及び培養環境
培養液４ａは、培養対象微生物の培養に用いられる一般的なものを使用することができる。例えば、糸状菌については、ＰＤＡ培地（ポテトデキストロース寒天）から寒天を除いたＰＤＢ培地等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５７】
また、培養環境（温度、湿度、ｐＨ及び光照射条件等）は、培養対象微生物に応じて、適宜制御される。
【００５８】
（６）培養
培養対象微生物を培養液４ａに植菌し、電子メディエータを電気化学的に酸化させながら（電子メディエータが還元型から酸化型に酸化される酸化電位に作用電極９の電位を制御しながら）培養を行うことにより、培養対象微生物の形態変化が誘導される。ここで、作用電極９への通電は、培養対象微生物を植菌して一定期間が経過した後に行うことが好ましい。例えば、培養対象微生物を糸状菌とした場合、電子メディエータを電気化学的に酸化させながら（電子メディエータが還元型から酸化型に酸化される酸化電位に作用電極９の電位を制御しながら）培養を行うと、菌糸の成長（伸長）と分生子（胞子）の発芽が抑制されることがある。したがって、培養液４ａへの植菌から一定期間が経過するまでは、作用電極９に通電することなく培養を行って、菌糸の成長（伸長）と分生子の発芽を十分なものとした後、電子メディエータを電気化学的に酸化させながら（電子メディエータが還元型から酸化型に酸化される酸化電位に作用電極９の電位を制御しながら）培養を行い、十分に成長（伸長）した菌糸に対して分化を誘導することで、分生子を効率よく形成させることが可能となる。逆に、電子メディエータを電気化学的に還元させながら（電子メディエータが酸化型から還元型に還元される還元電位に作用電極９の電位を制御しながら）糸状菌を培養することで、糸状菌の菌糸の成長と菌糸の分化の双方を抑制することができ、分生子の形成を阻害することも可能となる。
【００５９】
培養液からの胞子の回収は、例えば、胞子が通過する程度の目の粗いメッシュに培養液を通し、濾液側に胞子を回収して、菌糸をメッシュ上にトラップする。さらに、濾液を遠心分離することにより培養液と胞子を分離、回収する。但し、胞子の回収方法は、この方法に限定されるものではない。
【００６０】
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【００６１】
例えば、上述の実施形態では、参照電極１１を用いるようにしていたが、作用電極９と対電極１０との間の極間電圧の制御のみで、電子メディエータの酸化または還元を行うようにして、参照電極１１を省略するようにしてもよい。換言すれば、電子メディエータの電気化学的な酸化または還元を、陽極と陰極のみで制御するようにしても構わない。
【００６２】
また、上述の実施形態では、培地中の電子メディエータを電気化学的に酸化または還元しながら培養を行うようにしていたが、固体培地を用いた場合には、電子メディエータを電気化学的に制御することなく、初期に添加する電子メディエータを主に酸化型として（酸化型を好ましくは５０％超、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上）、最も好ましくは全てを酸化型として培養を行うようにしてもよい。この場合にも糸状菌の菌糸の分化を誘導して、胞子の形成を促進することができる。逆に、初期に添加する電子メディエータを主に還元型として（還元型を好ましくは５０％超、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上）、最も好ましくは全てを還元型として培養を行うようにしてもよい。この場合には糸状菌の菌糸の分化と伸長を抑制して、胞子の形成を抑制することができる。但し、還元型の電子メディエータを固体培地に含ませる場合には、大気中の酸素によって還元型の電子メディエータが酸化されないように、不活性ガス雰囲気等の嫌気雰囲気下にて培地の作製及び培養を実行することが望ましい。
【００６３】
また、上述の実施形態では、主に糸状菌による分生子形成を例に挙げて説明したが、糸状菌以外の真菌による胞子形成、さらには難培養性真菌の培養を可能とするための起点としての形態変化誘導に用いることもできる。例えば、難培養性の一部のキノコ類に対して、本発明の形態変化制御方法を適用することで、該キノコ類の形態を培養しやすい形態へと変化させ得る。
【実施例】
【００６４】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【００６５】
＜参考例１＞
ＫＦＡ−２株について、培地成分、湿度及び光照射等のパラメータの変動による胞子形成能の変化について、以下の２条件について検討した。
【００６６】
［条件１］
・光照射  ：蛍光灯による照射（２８μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）
・湿度    ：高湿度（１００％）
・培地    ：ＰＤＡ培地、パラフィルム有
【００６７】
［条件２］
・光照射  ：自然光（１１μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）
・湿度    ：低湿度（５０％）
・培地    ：ＰＤＡ培地、パラフィルム無
【００６８】
ＰＤＡ培地の組成は以下の通りとした。また、培養温度は２８℃とした。
【００６９】
［ＰＤＡ培地組成］
・ポテトエキス  ４ｇ／Ｌ
・ブドウ糖      ２０ｇ／Ｌ
・寒天          １５ｇ／Ｌ
・ｐＨ          ５．６
【００７０】
シャーレに収容した培地の中央にＫＦＡ−２株の胞子を含む菌糸を植菌し、培養温度２８℃で５日間培養を行った。結果を図７に示す。図７（ａ）及び図７（ｂ）が条件１の培養結果であり、図７（ｃ）が条件２の培養結果である。
【００７１】
いずれの結果においても、中心部（植菌箇所）及びその周辺の細胞が死滅して同心円状に菌糸が成長していく傾向が見られた。この結果は、成長方向の先端部の細胞の生育を優先させるために、中央部及びその周辺部の古い細胞は死滅して先端部に向けて栄養を送る糸状菌の生存戦略と整合するものであった。
【００７２】
また、条件１による培養においては、気中菌糸の発達は見られたものの、分生子の形成は殆ど見られなかった。これに対し、条件２による培養においては、気中菌糸の発達と共にその表面が胞子の存在を示す緑色を呈し、分生子数は５．０×１０８／ｐｌａｔｅであることも確認された。尚、分生子数のカウントは、スプレッダーで分生子を回収し、顕微鏡(Eclipse E400,  Nicon)を用いて分生子数を計測することにより行った。しかしながら、同心円状に菌糸が成長していく傾向は、特に条件２による培養において顕著であり、培地の中央部及びその周辺の広い範囲において分生子が全く形成されなかった。
【００７３】
ここで、分生子形成量及び分生子形成速度を向上させるためには、今回の実験においては分生子の形成が見られなかった培地の中央部及びその周辺に分生子を形成させることが望ましいと考えられた。
【００７４】
＜実施例１＞
各種電子メディエータの添加によるＫＦＡ−２株の生育傾向について検討した。
【００７５】
以下の８種類の電子メディエータについて検討した。尚、電子メディエータを添加しない条件を対照試験として実施した。尚、電子メディエータは酸化体の形態で添加した。
（１）ＣｕＳＯ４    ４９９ｍｇ／Ｌ
（２）メチレンブルー    ７４７ｍｇ／Ｌ
（３）ニュートラルレッド    ５７７ｍｇ／Ｌ
（４）フェリシアン化カリウム    ６５８ｍｇ／Ｌ
（５）ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）  ６１２ｍｇ／Ｌ
（６）ＡＱＤＳ（アントラキノン−２，６−ジスルホン酸ナトリウム）  ８２４ｍｇ／Ｌ
（７）Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ    ８４２ｍｇ／Ｌ
（８）チオニン      １４３ｍｇ／Ｌ
【００７６】
培養条件は、＜参考例１＞の［条件１］と同様とした。培養温度２８℃で５日間培養を行った。
【００７７】
（１）〜（４）の電子メディエータに関する結果を図８に示し、（５）〜（８）の電子メディエータに関する結果を図９に示す。
【００７８】
（１）〜（４）の電子メディエータを用いた場合には、電子メディエータ添加無しの場合よりも気中菌糸の発達が抑制される傾向が見られた。また、ニュートラルレッドについては、還元（ＫＦＡ−２株からニュートラルレッドへの電子移動）に伴った赤色の消失が見られた。
【００７９】
このことから、ＫＦＡ−２株は、ＣｕＳＯ４、メチレンブルー、ニュートラルレッド、フェリシアン化カリウムに対して耐性が無く、電子メディエータとして適していないことが判明した。また、この結果から、ＫＦＡ−２株、さらにはそれ以外の一部の糸状菌の防除を行うという課題を解決できる発明を提供できることが明らかとなった。即ち、ＫＦＡ−２株、さらにはそれ以外の一部の糸状菌について、ＣｕＳＯ４、メチレンブルー、ニュートラルレッド及びフェリシアン化カリウムからなる群から選択される１種または２種以上を用いることで、分化と伸長を抑制する防除方法を提供できると考えられた。さらには、ＣｕＳＯ４、メチレンブルー、ニュートラルレッド及びフェリシアン化カリウムからなる群から選択される１種または２種以上を含むＫＦＡ−２株用の防除剤を提供できることも明らかとなった。さらには、一部の糸状菌用の防除剤を提供し得るものと考えられた。
【００８０】
これに対し、（５）〜（８）の電子メディエータを用いた場合には、電子メディエータ添加無しの場合よりも気中菌糸が発達する傾向が見られると共に、電子メディエータの違いによって気中菌糸の形成に差異が見られ、特にＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡを用いた場合と、チオニンを用いた場合とにおいて、気中菌糸の発達傾向が顕著であった。また、チオニンは培養過程において青色から無色に脱色したことから、ＫＦＡ−２株からチオニンへの電子移動によって、チオニンが還元されたものと考えられた。
【００８１】
このことから、ＫＦＡ−２株は、ＰＭＳ、ＡＱＤＳ、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ（鉄イオン）、チオニンに対して耐性が有り、電子メディエータとして適していることが判明し、特に、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ（鉄イオン）、チオニンが、ＫＦＡ−２株の培養に際しての電子メディエータとして好適であることが判明した。
【００８２】
尚、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡを用いた場合と、チオニンを用いた場合には、さらに培養を継続することで、分生子の形成が見られた。このことから、培養対象微生物が耐性を有する酸化型の電子メディエータを固体培地に含ませることのみで、培養対象微生物の分化を誘導（促進）できるものと考えられた。
【００８３】
＜実施例２＞
実施例１における実験結果から、図１０に示すように、ＫＦＡ−２株によって還元されたチオニンを電気的に酸化することによって菌糸の分化をさらに促進でき、分生子形成を誘導できる可能性があると考え、以下の条件により実験を行った。
【００８４】
実験装置を図１１に示す。図１１には、シャーレ６、ゲル培地２、作用電極９及び対電極１０のみを表示しており、その他の構成は図１と同様とした。但し、参照電極１１は用いずに実験を実施したことから、以降の説明では作用電極９を陽極９と呼び、対電極１０は陰極１０と呼ぶこととする。
【００８５】
角形シャーレ６（東京硝子器械製、型番：角２号、AW2000）の底面に陽極９及び陰極１０としての２枚の炭素板（縦７．５ｃｍ、横３．５ｃｍを並べた後、角形シャーレ６にＰＤＡ培地２を流し込んで静置して固めた。２枚の炭素板間の極間電位が１．０Ｖとなるように炭素板に電圧を印加し、陽極９において電子メディエータの酸化が生じる正の電位がかかり、陰極１０において電子メディエータの還元が生じる負の電位がかかるようにした。培地２にはチオニンを１４３ｍｇ／Ｌ添加した。
【００８６】
培養温度は２５℃〜２８℃とし、光照射は蛍光灯にて強度２８μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で実施した。湿度は約５０％とした。陽極９と陰極１０との間のＰＤＡ培地表面に植菌し、培養試験を実施した。
【００８７】
培養試験結果を図１２に示す。非通電の場合には、電極の位置に関係なく、同心円状に菌糸が生育し、シャーレの周縁部にて気中菌糸の形成が見られた。これに対し、通電した場合には、陽極９（図中右側の電極）上のＰＤＡ培地表面に到達した菌糸において気中菌糸の発達が見られると共に分生子の形成が見られた。但し、陰極１０（図中左側の電極）上のＰＤＡ培地表面では菌糸の生育（伸長及び分化）が抑制される傾向が見られた。
【００８８】
＜実施例３＞
植菌位置を陽極９上のＰＤＡ培地表面及び陰極１０上のＰＤＡ培地表面とした以外は、実施例２と同様の培養試験を実施して、気中菌糸及び分生子形成の状況について検討した。結果を図１３に示す。
【００８９】
非通電の場合には、陽極９上のＰＤＡ培地表面及び陰極１０上のＰＤＡ培地表面のいずれにおいても、同心円状に菌糸が生育した。これに対し、通電を行った場合には、陰極１０（図中左側の電極）上のＰＤＡ培地表面では菌糸の生育（伸長及び分化）が抑制される傾向が見られ、陽極９（図中右側の電極）上のＰＤＡ培地表面では気中菌糸の発達が見られると共に分生子の形成が見られた。しかも、陽極９上のＰＤＡ培地表面では、中央部（植菌箇所）およびその周辺における抜けが非常に少ない状態で気中菌糸の発達及び胞子形成が行われることも明らかとなった。
【００９０】
＜実施例４＞
電子メディエータをＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡとした以外は、実施例２と同様の培養試験を実施した。Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡは培地２に０．８４２ｇ／Ｌ添加した。結果を図１４に示す。電子メディエータをＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡとしたにも、チオニンを用いた場合と同様の試験結果が得られることが確認された。
【００９１】
＜実施例５＞
液体培地（ＰＤＢ培地）を用いて、実施例２〜４と同様、通電試験を実施し、ＫＦＡ−２株の形態変化について検討した。
【００９２】
実験装置を図１５に示す。電解槽５は角形シャーレ（東京硝子器械製、型番：角２号、AW2000）とし、プロトン交換膜１６（デュポン社製、ナフィオンＮ１１７）により培養槽（陽極槽）７と陰極槽８の二槽に区画した。陽極９及び陰極１０は炭素板（縦７．５ｃｍ、横３．５ｃｍ）とし、陽極９を培養槽７の底面に、陰極１０を陰極槽８の底面に寝かせて収容した。培養槽７には培養液４ａとして以下に示す組成のＰＤＢ培地を収容し、陰極槽８には電解液４ｂとして５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液を収容した。また、ＰＤＢ培地にチオニンを１４３ｍｇ／Ｌ添加した。参照電極１１は用いなかった。
【００９３】
［ＰＤＢ培地組成］
・ポテトエキス  ４ｇ／Ｌ
・ブドウ糖      ２０ｇ／Ｌ
・ｐＨ          ５．６
【００９４】
分生子濃縮液（５×１０６個／ｍＬ）を陽極９の表面に接触するように接種し、２枚の炭素板間の極間電位が１．０Ｖとなるように炭素板に電圧を印加し、陽極９において電子メディエータの酸化が生じる正の電位がかかり、陰極１０において電子メディエータの還元が生じる負の電位がかかるようにした。
【００９５】
また、対照実験として、分生子濃縮液（５×１０６個／ｍＬ）をＰＤＢ培地中で通電することなく培養する試験と、分生子濃縮液（５×１０６個／ｍＬ）をチオニン（１４３ｍｇ／Ｌ）を含むＰＤＢ培地中で通電することなく培養する試験とを実施した。
【００９６】
培養試験終了後、光学顕微鏡で×２００倍で観察した結果を図１６及び図１７に示す。
図１６が非通電における結果を示し、図１７が通電における結果を示している。非通電条件下においては、チオニンの有無で分生子の発芽及び発芽した菌糸の形態に大きな違いは見られなかった。これに対し、通電条件下では、非通電条件下よりも分生子の発芽率が低く、さらに発芽した菌糸が太く、分枝が多く、成長が遅い等といった傾向が見られ、非通電条件と比較して明らかに形態が異なっていた。また、菌糸の分化が起こっていたことから、通電によって分生子形成に有利な形態を誘導し得ることが明らかとなった。
【００９７】
以上の結果から、通電によって菌糸の分化を誘導して、胞子形成を誘導及び促進できるものと考えられた。
【００９８】
＜実施例６＞
アスペルギルス（Aspergillus）属に属する糸状菌であるAspergillus orysae NBRC100959やAspergillus sojae NBRC4239について、実施例３と同様の培養試験（電子メディエータ：チオニン）を実施した。但し、培養温度は２５℃〜２８℃とし、光照射は蛍光灯にて強度２８μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で実施した。湿度は約５０％とした。培養日数は４日間とした。
【００９９】
結果を図１８に示す。いずれの糸状菌とも通常の培養条件下においても分生子の形成が盛んに起こることから、陽極９側（図中右側の電極）のＰＤＡ培地表面における糸状菌の分化の促進は見られなかった。一方、陰極１０側（図中左側の電極）では糸状菌の分化と伸長が抑制される現象が見られた。
【０１００】
ここで、実施例２、３、４及び６においては、陽極９上にて電子メディエータの酸化反応が起こっている一方で、陰極１０ではその補完反応である電子メディエータの還元反応が生じている。したがって、実施例２、３、４及び６における結果から、電子メディエータを還元させながら糸状菌を培養することで、糸状菌の分化と伸長を抑制できるものと考えられた。また、この現象は液体培地中でも起こり得ると考えられた。さらには、固体培地中に還元型の電子メディエータを含ませておくことで、電気化学的な制御を行うことなく、糸状菌の分化と伸長を抑制できるものと考えられた。
【０１０１】
＜実施例７＞
Trichoderma reesei（トリコデルマ・リーゼイ）QM9414株（以下、ＱＭ９４１４株と呼ぶ）について、実施例１〜３と同様の実験を実施した。ＱＭ９４１４株は、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）から入手した。
【０１０２】
実施例１と同様の８種の電子メディエータ０．２ｍＭをＰＤＡ培地に添加し、培養試験を実施した結果を図１９に示す。培養温度は２５℃〜２８℃とし、光照射は蛍光灯にて強度２８μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で実施した。湿度は約５０％とした。培養日数は４日間とした。
【０１０３】
培養試験結果を図１９に示す。図１９には、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ、メチレンブルー、ＡＱＤＳのみの結果を示したが、他の電子メディエータを用いた場合にも、菌糸生長や胞子形成に関して目立った効果は得られなかった。尚、ＱＭ９４１４株は、電子メディエータを添加しない場合においても菌糸生長や分生子形成が十分に起こっていたことから、電子メディエータの添加による菌糸生長や胞子形成の促進効果が得られにくかったものと考えられた。
【０１０４】
次に、実施例２及び３と同様の実験を実施した。但し、電子メディエータはＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ（０．２ｍＭ）とし、培養温度は２５℃〜２８℃とし、光照射は蛍光灯にて強度２８μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１で実施した。湿度は約５０％とした。培養日数は４日間とした。
【０１０５】
培養試験結果を図２０に示す。ＱＭ９４１４株は、上記の通り、通常の培養条件下においても菌糸生長や分生子形成が十分に起こっていたことから、陽極９側（図中右側の電極）のＰＤＡ培地表面における菌糸の分化の促進や分生子形成の促進は見られなかった。一方、陰極１０側（図中左側の電極）では菌糸の分化と伸長が抑制される現象が見られた。
【０１０６】
この培養試験結果からも、電子メディエータを還元させながら糸状菌を培養することで、糸状菌の分化と伸長を抑制できることが示された。
【０１０７】
また、この培養試験では、ＱＭ９４１４株が成長過程において通常分泌する黄色色素が、陽極上で見られなかった。このことから、通電によって、ＱＭ９４１４株による黄色色素生産が抑制されるか、あるいは生産された黄色色素が陽極上で酸化されて無色になっている可能性が示唆された。
【０１０８】
＜実施例８＞
ＫＦＡ−２株について、実施例２と同様の培養試験を、複数の電位条件で４日間実施し、電位の変化による生育への影響を検討した。極間電位を、１．２Ｖ、１．０Ｖ、０．８Ｖ、０．６Ｖ、０．４Ｖとした。
【０１０９】
培養試験の結果を図２１に示す。通電を行うことで、非通電の場合と比較して、陽極９側で分生子の形成が促進され、陰極１０側で分生子の形成が抑制される傾向が見られた。また、図２２に示す菌糸到達半径（植菌位置から菌糸成長先端部までの距離）の測定結果からも明らかなように、陰極１０側における菌糸の伸長の抑制は、１．０Ｖと１．２Ｖにおいて顕著であった。極間電位を０．８Ｖ、０．６Ｖ、０．４Ｖとした場合に陰極１０側で菌糸の伸長の抑制があまり見られなかった理由は、この電位範囲においては、陰極１０側でチオニンの酸化体が還元体に十分に還元されなかったことによるものと考えられた。
【０１１０】
次に、ゲル培地２の陽極９上とそれ以外の部分における分生子数のカウント結果を図２３に示す。分生子数のカウントは、陽極９上とそれ以外の部分についてそれぞれ別にスプレッダーで分生子を回収し、顕微鏡(Eclipse E400, Nicon)を用いて分生子数を計測することにより行った。この結果から、極間電位を０．８Ｖ〜１．２Ｖとすることで、陽極９上の分生子形成量を顕著に高めることができ、特に極間電位を１．０Ｖとすることで、陽極９上の分生子形成量を極めて顕著に高めることができることが明らかとなった。
【０１１１】
＜実施例９＞
陽極９の面積を大きくすることで、より効率的な分生子の生産が可能か検討した。
【０１１２】
実施例９において使用した実験装置を図２４に示す。基本構成は実施例２で使用した実験装置と同じであるが、陽極９の面積を大きくするために、陽極９を３枚並べて（縦７．５ｃｍ、横１０．５ｃｍ）角形シャーレ６内のゲル培地２の中央に配置し、陰極１０の横幅を実施例２で使用した陰極よりも小さくして（横幅：1.0ｃｍ）、これを角形シャーレの左隅に配置した。この実験装置を用いて、実施例２と同条件でＫＦＡ−２株の培養試験を６日間実施した。その結果、図２５に示すように、角形シャーレ６内のゲル培地２の表面全体に分生子を形成させることに成功した。分生子数は７．７×１０９／ｐｌａｔｅと大量であった。分生子数のカウントは、スプレッダーで分生子を回収し、顕微鏡(Eclipse E400,  Nicon)を用いて分生子数を計測することにより行った。
【０１１３】
即ち、本発明により、参考例１のように菌糸を同心円状に生長させることなく、培地の中央部及びその周辺の広い範囲において分生子を形成させ、分生子を効率よく生産できることが明らかとなった。
【符号の説明】
【０１１４】
２、４ａ    培地（ゲル培地、培養液）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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