(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式Ｉの構造単位を含むセルロース基材に生物学的試料を接触させることによって生物学的試料からの遺伝学的材料又は検体を保存する方法。
【化１】
0005997703.tif 000008
式中、
Ｘ及びＹは独立にＮ−Ｏ−Ｌ−Ａ又はＯであるが、ＹがＯである場合にはＸがＮ−Ｏ−Ｌ−Ａであり、ＸがＯである場合にはＹがＮ−Ｏ−Ｌ−Ａであることを条件とし、
Ｌは直接結合、脂肪族基、芳香族基、脂環式基又はこれらの組合せであり、
ＡはＣＯＯＨ又はＳＯ3Ｈである。
【請求項２】
Ｌが−（ＣＨ2）n−（式中、ｎは１〜２０の整数である。）であるか、Ｌが直接結合であってＡがＳＯ3Ｈであるか、或いはＬがヘテロ原子置換されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｌが−（ＣＨ2）n−Ｚ−（ＣＨ2）m−であり、
ｎが０〜２０の整数であり、
ｍが０〜２０の整数であり、
ＺがＯ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｎ（ＣＯ）Ｎ、Ｏ（ＣＯ）Ｏ、Ｎ（ＣＳ）Ｎ、Ｏ（ＣＳ）Ｏ又はこれらの組合せに等しい、請求項２記載の方法。
【請求項４】
生物学的試料が頬側試料、脳脊髄液、糞便、血漿、血液、リンパ液、尿、精液、膣液、腺分泌液、細胞又はウイルスの懸濁液、ウイルスプラーク、血清試料或いはこれらの組合せである、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
さらに、セルロース基材上で生物学的試料を乾燥する段階、及びセルロース基材を乾燥した生物学的試料と共に２４時間以上保存する段階を含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
さらに、遺伝学的材料又は１以上の検体をセルロース基材から抽出する段階を含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
生物学的試料からの遺伝学的材料又は検体を保存するための物品であって、次の式Ｉの構造単位を含むセルロース基材を含む物品。
【化２】
0005997703.tif 000009
式中、
Ｘ及びＹは独立にＮ−Ｏ−Ｌ−Ａ又はＯであるが、ＹがＯである場合にはＸがＮ−Ｏ−Ｌ−Ａであり、ＸがＯである場合にはＹがＮ−Ｏ−Ｌ−Ａであることを条件とし、
Ｌは直接結合、脂肪族基、芳香族基、脂環式基又はこれらの組合せであり、
ＡはＣＯＯＨ又はＳＯ3Ｈである。
【請求項８】
Ｌが−（ＣＨ2）n−（式中、ｎは１〜２０の整数である。）であるか、Ｌが直接結合であってＡがＳＯ3Ｈであるか、或いはＬがヘテロ原子置換されている、請求項７記載の物品。
【請求項９】
セルロース基材の製造方法であって、
酸化Ｃ2−Ｃ3開環セルロースを次の式ＩＩの置換アミノオキシに接触させ、式ＩＩをセルロース基材に結合させるのに有効な時間及び温度に保つ段階と、
酸化Ｃ2−Ｃ3開環セルロースを洗浄して未反応の式ＩＩの置換アミノオキシを除去する段階と
を含む方法。
【化３】
0005997703.tif 000010
式中、
Ｌは直接結合、脂肪族基、芳香族基、脂環式基又はこれらの組合せであり、
Ａは−ＣＯＯＨ又は−ＳＯ3Ｈである。
【請求項１０】
Ｌが（ＣＨ2）n−（式中、ｎは１〜２０の整数である。）であるか、Ｌが直接結合であってＡがＳＯ3Ｈであるか、或いはＬがヘテロ原子置換されている、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Ｌが−（ＣＨ2）n−Ｚ−（ＣＨ2）m−であり、
ｎが０〜２０の整数であり、
ｍが０〜２０の整数であり、
ＺがＯ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｎ（ＣＯ）Ｎ、Ｏ（ＣＯ）Ｏ、Ｎ（ＣＳ）Ｎ、Ｏ（ＣＳ）Ｏ又はこれらの組合せに等しい、請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的材料の保存及び分析のためのセルロース基材、組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＴＡ（登録商標）紙（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｃ．、ピスカタウェイ、米国ニュージャージー州）は、各種の生物学的試料からの遺伝学的材料（例えばＤＮＡ）を収集し、輸送し、保存し、保管するための信頼できる手段であることが判明している。ＦＴＡ上に保存された試料の精製及び増幅のための簡単な技術が開発され、広く使用されている。また、薬物代謝及び毒物動態（ＴＫ）試験を含む薬物動態（ＤＭＰＫ）分析のようなＦＴＡ分子技術を用いる一層新しい技術も開発されている。多くの場合、分析は固定化ＤＮＡ試料を含む紙上で直接に実施できる。他の場合には、ＤＮＡをまず紙から溶出することで、ＤＮＡを溶液（ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ（登録商標））中に遊離させる。溶出は、ＤＮＡを可溶化し得る溶液を用いる様々な洗浄サイクルによって行うことができ、またかかるプロセスに熱、真空又は遠心分離を適用することもできる。
る。
【０００３】
現行のＦＴＡ紙は魅力的な性質（例えば、興味ある成分の安定化及び低い安全性ガイドラインを可能にする抗菌特徴）を提供するものの、現行のＦＴＡ紙の欠点の１つは、ＤＭＰＫ及びＴＫタイプの試験に適用した場合に浸出し得る成分が紙上に存在することである。かかる成分は、薬物及び代謝産物或いは他の検体の下流分析を妨害することがある。
【０００４】
ＦＴＡ紙技術の使用を拡大するためには、妨害性の浸出分の問題なしに、かつ紙の抗菌性及び親水性／吸上げ性のような他の望ましい特徴を維持しながら、生物学的試料を紙上に保存する方法が必要である。
【０００５】
欧州特許出願公開第１５３４２６９号は、例えば多糖に対するオキシムコンジュゲートを記載しているが、生物学的材料の保存及び分析用の基材として有用ないかなる紙処方物も開示していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
欧州特許出願公開第０８１５８７９号明細書
【発明の概要】
【０００７】
一実施形態では、本発明は、次の式Ｉの構造単位を含むセルロース基材に生物学的試料を接触させることによって生物学的試料からの遺伝学的材料又は検体を保存する方法を提供する。
【０００８】
【化１】
0005997703.tif 000002
式中、Ｘ及びＹは独立にＮ−Ｏ−Ｌ−Ａ又はＯであるが、ＹがＯである場合にはＸがＮ−Ｏ−Ｌ−Ａであり、ＸがＯである場合にはＹがＮ−Ｏ−Ｌ−Ａであることを条件とし、Ｌは直接結合、脂肪族基、芳香族基、脂環式基又はこれらの組合せであり、ＡはＣＯＯＨ又はＳＯ3Ｈである。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、生物学的試料からの遺伝学的材料又は検体を保存するための物品であって、式Ｉの構造単位を含むセルロース基材を含む物品を提供する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、式Ｉの構造単位を含むセルロース基材及びその製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。添付の図面中では、図面全体を通じて類似の部分は同一の符号で示されている。
【図１】図１は、陽性対照（現行のＦＴＡ紙）及び陰性対照（非修飾紙）の両方を含め、様々な表面化学及び処方を用いて処理した紙からの抽出分のＬＣ−ＭＳトレースである。
【図２】図２は、様々な化学的方法及び分子ファミリーを用いて処理した各種の紙の吸上げ性能のグラフ表示である。アミノオキシ／アミンファミリーに関しては、標準の陽性及び陰性対照に加えて、対応する酸化紙が対照として含まれている。
【図３】図３は、様々な紙処方物に関するパーセント回収率で表される複数モデル薬物の検体回収率を示している。
【図４】図４は、様々な紙処方物に関して抽出物中で定量された平均ＬＰＣ（リソホスファチジルコリン）で表されるリン脂質保持性を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
特許請求される発明の主題を一層明確で簡潔に記載しかつ指摘するため、以下の説明及び添付の特許請求の範囲中で使用される特定の用語に関して以下に定義を示す。
【００１３】
脂肪族基は、１以上の炭素原子を有する原子価１以上の有機基であり、線状又は枝分れ原子配列であり得る。脂肪族基は、窒素、硫黄、ケイ素、セレン及び酸素のようなヘテロ原子を含んでいてもよく、或いは炭素及び水素のみから構成されていてもよい。脂肪族基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロアルキル基、共役ジエニル基、アルコール基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、カルボン酸基、アシル基（例えば、エステルやアミドのようなカルボン酸誘導体）、アミン基、ニトロ基などの広範囲の官能基を含み得る。例えば、４−メチルペント−１−イル基はメチル基を含むＣ6脂肪族基であり、メチル基がアルキル基である官能基である。同様に、４−ニトロブト−１−イル基はニトロ基を含むＣ4脂肪族基であり、ニトロ基が官能基である。脂肪族基は、同一のもの又は相異なるものであってよい１以上のハロゲン原子を含むハロアルキル基であり得る。ハロゲン原子には、例えば、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素がある。１以上のハロゲン原子を有する脂肪族基には、ハロゲン化アルキルであるトリフルオロメチル、ブロモジフルオロメチル、クロロジフルオロメチル、ヘキサフルオロイソプロピリデン、クロロメチル、ジフルオロビニリデン、トリクロロメチル、ブロモジクロロメチル、ブロモエチル、２−ブロモトリメチレン（例えば、−ＣＨ2ＣＨＢｒＣＨ2−）などがある。脂肪族基のさらに他の例には、アリル、アミノカルボニル（−ＣＯＮＨ2）、カルボニル、ジシアノイソプロピリデン（−ＣＨ2Ｃ（ＣＮ）2ＣＨ2−）、メチル（−ＣＨ3）、メチレン（−ＣＨ2−）、エチル、エチレン、ホルミル（−ＣＨＯ）、ヘキシル、ヘキサメチレン、ヒドロキシメチル（−ＣＨ2ＯＨ）、メルカプトメチル（−ＣＨ2ＳＨ）、メチルチオ（−ＳＣＨ3）、メチルチオメチル（−ＣＨ2ＳＣＨ3）、メトキシ、メトキシカルボニル（ＣＨ3ＯＣＯ−）、ニトロメチル（−ＣＨ2ＮＯ2）、チオカルボニル、トリメチルシリル（（ＣＨ3）3Ｓｉ−）、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリメトキシシリルプロピル（（ＣＨ3Ｏ）3ＳｉＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−）、ビニル、ビニリデンなどがある。さらに他の例としては、「Ｃ1〜Ｃ30脂肪族基」は炭素原子数１以上３０以下のものである。メチル基（ＣＨ3−）はＣ1脂肪族基の例である。デシル基（即ち、ＣＨ3（ＣＨ2）9−）はＣ10脂肪族基の例である。
【００１４】
脂環式基は、環状であるが芳香族でない原子配列を有する原子価１以上の基である。脂環式基は１以上の非環式成分を含んでいてもよい。例えば、シクロヘキシルメチル基（Ｃ6Ｈ11ＣＨ2−）は、シクロヘキシル環（環状であるが芳香族でない原子配列）及びメチレン基（非環式成分）を含む脂環式基である。脂環式基は、窒素、硫黄、セレン、ケイ素及び酸素のようなヘテロ原子を含んでいてもよく、或いは炭素及び水素のみから構成されていてもよい。脂環式基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロアルキル基、共役ジエニル基、アルコール基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、カルボン酸基、アシル基（例えば、エステルやアミドのようなカルボン酸誘導体）、アミン基、ニトロ基などの１以上の官能基を含み得る。例えば、４−メチルシクロペント−１−イル基はメチル基を含むＣ6脂環式基であり、メチル基がアルキル基である官能基である。同様に、２−ニトロシクロブト−１−イル基はニトロ基を含むＣ4脂環式基であり、ニトロ基が官能基である。脂環式基は、同一のもの又は相異なるものであってよい１以上のハロゲン原子を含み得る。ハロゲン原子には、例えば、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素がある。１以上のハロゲン原子を有する脂環式基には、２−トリフルオロメチルシクロヘキス−１−イル、４−ブロモジフルオロメチルシクロオクト−１−イル、２−クロロジフルオロメチルシクロヘキス−１−イル、ヘキサフルオロイソプロピリデン−２，２−ビス（シクロヘキス−４−イル）（−Ｃ6Ｈ10Ｃ（ＣＦ3）2Ｃ6Ｈ10−）、２−クロロメチルシクロヘキス−１−イル、３−ジフルオロメチレンシクロヘキス−１−イル、４−トリクロロメチルシクロヘキス−１−イルオキシ、４−ブロモジクロロメチルシクロヘキス−１−イルチオ、２−ブロモエチルシクロペント−１−イル、２−ブロモプロピルシクロヘキス−１−イルオキシ（例えば、ＣＨ3ＣＨＢｒＣＨ2Ｃ6Ｈ10Ｏ−）などがある。脂環式基のさらに他の例には、４−アリルオキシシクロヘキス−１−イル、４−アミノシクロヘキス−１−イル（Ｈ2ＮＣ6Ｈ10−）、４−アミノカルボニルシクロペント−１−イル（ＮＨ2ＣＯＣ5Ｈ8−）、４−アセチルオキシシクロヘキス−１−イル、２，２−ジシアノイソプロピリデンビス（シクロヘキス−４−イルオキシ）（−ＯＣ6Ｈ10Ｃ（ＣＮ）2Ｃ6Ｈ10Ｏ−）、３−メチルシクロヘキス−１−イル、メチレンビス（シクロヘキス−４−イルオキシ）（−ＯＣ6Ｈ10ＣＨ2Ｃ6Ｈ10Ｏ−）、１−エチルシクロブト−１−イル、シクロプロピルエテニル、３−ホルミル−２−テトラヒドロフラニル、２−ヘキシル−５−テトラヒドロフラニル、ヘキサメチレン−１，６−ビス（シクロヘキス−４−イルオキシ）（−ＯＣ6Ｈ10（ＣＨ2）6Ｃ6Ｈ10Ｏ−）、４−ヒドロキシメチルシクロヘキス−１−イル（４−ＨＯＣＨ2Ｃ6Ｈ10−）、４−メルカプトメチルシクロヘキス−１−イル（４−ＨＳＣＨ2Ｃ6Ｈ10−）、４−メチルチオシクロヘキス−１−イル（４−ＣＨ3ＳＣ6Ｈ10−）、４−メトキシシクロヘキス−１−イル、２−メトキシカルボニルシクロヘキス−１−イルオキシ（２−ＣＨ3ＯＣＯＣ6Ｈ10Ｏ−）、４−ニトロメチルシクロヘキス−１−イル（ＮＯ2ＣＨ2Ｃ6Ｈ10−）、３−トリメチルシリルシクロヘキス−１−イル、２−ｔ−ブチルジメチルシリルシクロペント−１−イル、４−トリメトキシシリルエチルシクロヘキス−１−イル（例えば、（ＣＨ3Ｏ）3ＳｉＣＨ2ＣＨ2Ｃ6Ｈ10−）、４−ビニルシクロヘキセン−１−イル、ビニリデンビス（シクロヘキシル）などがある。「Ｃ3〜Ｃ30脂環式基」という用語は、炭素原子数３以上３０以下の脂環式基を包含する。脂環式基２−テトラヒドロフラニル（Ｃ4Ｈ7Ｏ−）はＣ4脂環式基を代表する。シクロヘキシルメチル基（Ｃ6Ｈ11ＣＨ2−）はＣ7脂環式基を代表する。
【００１５】
芳香族基は、１以上の芳香族原子団を有する原子価１以上の原子配列である。これは、窒素、硫黄、セレン、ケイ素及び酸素のようなヘテロ原子を含んでいてもよく、或いは炭素及び水素のみから構成されていてもよい。好適な芳香族基には、フェニル基、ピリジル基、フラニル基、チエニル基、ナフチル基、フェニレン基及びビフェニル基がある。芳香族原子団は４ｎ＋２（式中、「ｎ」は１以上の整数である。）の「非局在化」電子を有する環状構造であり、フェニル基（ｎ＝１）、チエニル基（ｎ＝１）、フラニル基（ｎ＝１）、ナフチル基（ｎ＝２）、アズレニル基（ｎ＝２）、アントラセニル基（ｎ＝３）などで例示される。芳香族基はまた、非芳香族成分を含んでいてもよい。例えば、ベンジル基はフェニル環（芳香族原子団）及びメチレン基（非芳香族成分）を含む芳香族基である。同様に、テトラヒドロナフチル基は芳香族原子団（Ｃ6Ｈ3）が非芳香族成分−（ＣＨ2）4−に縮合してなる芳香族基である。芳香族基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロアルキル基、ハロ芳香族基、共役ジエニル基、アルコール基、エーテル基、チオ基、アルデヒド基、ケトン基、カルボン酸基、アシル基（例えば、エステルやアミドのようなカルボン酸誘導体）、アミン基、ニトロ基などの１以上の官能基を含み得る。例えば、４−メチルフェニル基はメチル基を含むＣ7芳香族基であり、メチル基がアルキル基である官能基である。同様に、２−ニトロフェニル基はニトロ基を含むＣ6芳香族基であり、ニトロ基が官能基である。芳香族基は、トリフルオロメチルフェニル、ヘキサフルオロイソプロピリデンビス（４−フェン−１−イルオキシ）（−ＯＰｈＣ（ＣＦ3）2ＰｈＯ−）、クロロメチルフェニル、３−トリフルオロビニル−２−チエニル、３−トリクロロメチルフェン−１−イル（３−ＣＣｌ3Ｐｈ−）、４−（３−ブロモプロプ−１−イル）フェン−１−イル（ＢｒＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｐｈ−）などのハロゲン化芳香族基を包含する。芳香族基のさらに他の例には、４−アリルオキシフェン−１−オキシ、４−アミノフェン−１−イル（Ｈ2ＮＰｈ−）、３−アミノカルボニルフェン−１−イル（ＮＨ2ＣＯＰｈ−）、４−ベンゾイルフェン−１−イル、ジシアノイソプロピリデンビス（４−フェン−１−イルオキシ）（−ＯＰｈＣ（ＣＮ）2ＰｈＯ−）、３−メチルフェン−１−イル、メチレンビス（フェン−４−イルオキシ）（−ＯＰｈＣＨ2ＰｈＯ−）、２−エチルフェン−１−イル、フェニルエテニル、３−ホルミル−２−チエニル、２−ヘキシル−５−フラニル、ヘキサメチレン−１，６−ビス（フェン−４−イルオキシ）（−ＯＰｈ（ＣＨ2）6ＰｈＯ−）、４−ヒドロキシメチルフェン−１−イル（４−ＨＯＣＨ2Ｐｈ−）、４−メルカプトメチルフェン−１−イル（４−ＨＳＣＨ2Ｐｈ−）、４−チオフェニル（−Ｓ−Ｐｈ）、４−メチルチオフェン−１−イル（４−ＣＨ3ＳＰｈ−）、３−メトキシフェン−１−イル、２−メトキシカルボニルフェン−１−イルオキシ（例えば、メチルサリチル）、２−ニトロメチルフェン−１−イル（−ＰｈＣＨ2ＮＯ2）、３−トリメチルシリルフェン−１−イル、４−ｔ−ブチルジメチルシリルフェン−１−イル、４−ビニルフェン−１−イル、ビニリデンビス（フェ���ル）などがある。「Ｃ3〜Ｃ30芳香族基」という用語は、炭素原子数３以上３０以下の芳香族基を包含する。芳香族基１−イミダゾリル（Ｃ3Ｈ2Ｎ2−）はＣ3芳香族基を代表する。ベンジル基（Ｃ7Ｈ7−）はＣ7芳香族基を代表する。
【００１６】
本明細書中に記載される化合物の多くは、１以上の非対称中心を含むことがあり、したがって鏡像異性体、ジアステレオマー及び他の立体異性体を生じることがある。これらは絶対立体化学の観点から（Ｒ）−又は（Ｓ）−として定義できる。本発明は、すべてのかかる可能な異性体並びにこれらのラセミ体及び光学的に純粋な形態を包含するものとする。光学的に活性の（Ｒ）−及び（Ｓ）−異性体は、キラルシントン又はキラル試薬を用いて製造でき、或いは通常の技術を用いて分割できる。本明細書中に記載される化合物がオレフィン性二重結合又は他の幾何学的非対称中心を含む場合には、特記しない限り、かかる化合物はＥ及びＺ幾何異性体の両方を包含することが意図されている。同様に、すべての互変異性形態も包含されるものとする。
【００１７】
ＦＴＡ紙は、細胞を溶解して核酸を保存する化学物質を含浸させたセルロース系マトリックスである。かかる化学物質は、生物学的流体が表面に接触すると活性化される。化学処理の追加の特徴は、細菌及びウイルスの不活性化である。これは生体試料を微生物増殖汚染から保護し、またユーザーを生体試料中に存在するバイオハザードから保護することもできる。したがってＦＴＡ紙は、各種の生物学的試料から収集し、輸送し、保存し、保管するためのＤＮＡを保護しかつ安定化する好ましい媒体である。その後、生物学的試料を分析することができる。かかる分析は、特に限定されないが、遺伝学的分析或いは生物学的試料中に存在する検体の定性的又は定量的測定を含み得る。
【００１８】
生物学的試料（遺伝学的試料ともいう）は植物及び動物組織試料の両方を含むことができ、特に限定されないが、頬側試料、脳脊髄液、糞便、血漿、血液、リンパ液、尿、精液、膣液、腺分泌液、細胞又はウイルスの懸濁液、ウイルスプラーク、或いは核酸を含む血清試料が挙げられる。試料は精製状態のもの又は細胞抽出物や培養物のような粗調製物からのものであってもよいし、或いは表面スワッビング又はスポッティングのような試料トランスファーで直接に得られたものであってもよい。核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡ、リボソームＲＮＡ及びメッセンジャーＲＮＡ、並びに核酸プライマー及びアプタマーを包含し得る。ひとたび遺的試料をＦＴＡ紙又は同様なセルロース系材料上に保存すれば、いくつかのプロトコルを用いて分析に付すことができる。
【００１９】
検体とは、生物学的試料中で測定すべき１種以上の物質をいう。乾燥血液試料（ＤＢＳ）中の検体の測定は、循環する化学物質、薬物又は代謝産物の定量的又は定性的測定を含み得る。これには、特に限定されないが、各種の代謝性疾患の検出に関係する代謝産物スクリーニング、例えば薬物スクリーニング候補についての薬物動態（ＤＭＰＫ）分析に関係する薬物代謝産物、或いは毒物動態（ＴＫ）試験における化学物質及び毒物暴露が含まれる。
【００２０】
遺伝学的材料の増幅又は制限酵素消化を含む分析は、抽出操作の必要なしに、ＦＴＡ紙又は同様なセルロース系材料上で直接に実施することができる。他の場合には、分析に先立ち、紙からの遺伝学的材料の抽出及び精製を行うことができる。これは、紙の一部（例えば、打抜き試料）を抽出試薬で洗浄することで行うことができる。
【００２１】
しかし、かかる分析とは関係なく、紙上には浸出性成分が存在し、これらが生物学的試料からの標的検体の下流分析（例えば、特に限定されないが、組成試験、薬物発見及び代謝産物）を妨害することがある。
【００２２】
セルロースの構造は、平行なＤ−グルコース鎖からなっている。かかる構造は、それに繊維性を与える水素結合によって安定化される。セルロース基材は、紙シート、パルプ形態、タブレット、或いはα−セルロース、軟質又は硬質木材パルプ、精製木材パルプ、コットンリンターシート、コットンパルプなどの機械的又は化学的砕解によって製造されるセルロース粉末であり得る。他のセルロース源には、低結晶化度セルロース並びにミクロフィブリル化セルロース、粉末セルロース、再生セルロース及び微晶質セルロースのような市販のセルロース賦形剤がある。セルロース基材は、遺伝学的材料の固定化、保存、溶出及び以後の分析を容易にするために多孔質であることが好ましい。
【００２３】
一実施形態に従えば、セルロース基材が開環酸化を受けてＣ2−Ｃ3位置にアルデヒド基を形成する方法が記載されている。若干の実施形態では、Ｃ2−Ｃ3位置での開環酸化に加えて、セルロースの表面に存在する１以上のヒドロキシル基の酸化も起こることがある。
【００２４】
若干の実施形態では、セルロース基材の開環酸化は、特に限定されないが、ガス状塩素、過ヨウ素酸と水酸化ナトリウムの水溶液、過硫酸塩及び過マンガン酸塩のような酸化剤に基材を接触させることによって起こり得る。他の実施形態では、酸化は過ヨウ素酸ナトリウム及び亜塩素酸ナトリウムによる連続酸化からなっている。他の実施形態では、酸化は酵素が関与し得る。酸化セルロースは、未処理基材のヒドロキシル基に加えて、カルボン酸基、アルデヒド基、ケトン基又はこれらの組合せを含むことがある。酸化の量は、酸化剤の性質及び反応条件に依存する。
【００２５】
セルロース基材は、それに続くアミノオキシ試薬との反応の直前に酸化することができる。他の実施形態では、ある程度の酸化を有するセルロース基材を以前の酸化処理又は商業的供給源から入手して保存しておき。それを使用することもできる。
【００２６】
若干の実施形態では、酸化セルロース基材は続いて、末端スルフェート基（−ＯＳＯ3Ｈ）、スルホネート基（−ＳＯ3Ｈ）又はカルボン酸基（−ＣＯＯＨ）を有するアミノオキシ試薬で処理される。１以上のアルデヒド基のアミノオキシル化が起こって、セルロース表面にペンダントα−オキシモカルボキサミド基を生じる。アミノオキシル化は、Ｃ2位置、Ｃ3位置又はその両方で起こる。若干の実施形態では、アミノオキシル化はまた、セルロース表面のペンダントヒドロキシル基の酸化から生じた表面のアルデヒド基でも起こり得る。
【００２７】
次のスキーム１は、Ｃ2及びＣ3の両位置におけるアミノオキシル化を示している。
【００２８】
【化２】
0005997703.tif 000003
これは、次の式Ｉの構造単位を含む修飾セルロース基材を生じる。
【００２９】
【化３】
0005997703.tif 000004
式中、Ｘ及びＹは独立にＮ−Ｏ−Ｌ−Ａ又はＯであるが、ＹがＯである場合にはＸがＮ−Ｏ−Ｌ−Ａであり、ＸがＯである場合にはＹがＮ−Ｏ−Ｌ−Ａであることを条件とし、Ｌは直接結合、脂肪族基、芳香族基、脂環式基又はこれらの組合せであり、ＡはＣＯＯＨ又はＳＯ3Ｈである。
【００３０】
若干の実施形態では、アミノオキシ試薬は次の式ＩＩの置換アミノオキシを含み得る。
【００３１】
【化４】
0005997703.tif 000005
式中、
Ｌは直接結合、脂肪族基、芳香族基、脂環式基又はこれらの組合せであり、
ＡはＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈ又はこれらの組合せである。
【００３２】
若干の実施形態では、Ｌは二置換（ＣＨ2）n脂肪族基（式中、ｎは１〜２０の整数である。）であり得る。脂肪族基は線状又は枝分れ原子配列であり得る。
【００３３】
若干の実施形態では、Ｌはヘテロ原子置換されていてもよい。若干の実施形態では、Ｌは−（ＣＨ2）n−Ｚ−（ＣＨ2）m−に等しくあり得る。この場合、ｎは０〜２０の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、Ｘがヘテロ原子含有部分である。若干の実施形態では、Ｚは特に限定されないがＯ、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｎ（ＣＯ）Ｎ、Ｏ（ＣＯ）Ｏ、Ｎ（ＣＳ）Ｎ、Ｏ（ＣＳ）Ｏ又はこれらの組合せに等しくある得る。各実施形態において、Ｌは、スルホネート基（−ＳＯ3Ｈ）、カルボン酸基（−ＣＯＯＨ）又は（Ｌが直接結合である場合には）末端スルフェート基をオキシモカルボキサミド基に連結する。例えば、ＺはＯであり、ｎは０であり、ｍは１であり、ＡはＣＯＯＨである。
【００３４】
アミノオキシ試薬は、その塩の水溶液として使用できる。塩には、特に限定されないが、硫酸塩、硝酸塩、ハロゲン化水素酸塩及びリン酸塩がある。若干の実施形態では、水溶液は０．０５〜０．５ｍｏｌ％アミノオキシの範囲内にある。若干の実施形態では、アルコール補助溶媒が使用できる。別の実施形態では、水溶液は緩衝液を含むこともできる。他の実施形態では、水溶液は安定剤を含むこともできる。
【００３５】
アミノオキシ試薬の適用方法は、酸化セルロースへのアミノオキシ試薬の結合を伴う化学反応が起こるようにして、アミノオキシ試薬を酸化セルロースに接触させることを含み得る。一実施形態では、酸化セルロース基材をアミノオキシ試薬の溶液中に浸漬することで、アミノオキシ試薬を酸化セルロース基材に接触させることができる。別の実施形態では、表面上への噴霧、湿潤又はプリントにより、アミノオキシ試薬を酸化セルロースに適用することができる。アミノオキシ試薬の溶液を使用する場合、それは溶媒を蒸発させるのに十分な揮発性を有する溶媒を含み得る。
【００３６】
一実施形態では、酸化セルロース基材は粉末形態のものであり得る。接触及び結合を可能にするため、アミノオキシ試薬及び酸化セルロースの両方を含むスラリーが使用できる。スラリーのデカント、圧縮及び乾燥を行うことで、酸化粉末を得ることができる。
一実施形態では、結合は室温で開始させることができる。別の実施形態では、結合は加熱によって開始させることができる。若干の実施形態では、温度は約４０〜約９０℃の範囲内にある。
【００３７】
試薬の結合は、式Ｉのアミノオキシ化合物を酸化セルロース基材上のアルデヒド基と反応させるのに十分な時間にわたって実施される。一実施形態では、反応は約１分から約３０分までの範囲内の時間にわたって実施される。別の実施形態では、時間は約１分から約１０分までの範囲内にある。
【００３８】
本明細書中で上記に記載された組成物及び方法を用いて物品を作製することができる。一実施形態では、物品が提供される。物品は、結合部位を有する酸化セルロースとアミノオキシ試薬との反応生成物を含んでいる。一実施形態では、本明細書中に開示された組成物及び方法を用いて作製される物品は、約０．１ミリメートルより大きく、約０．５ミリメートルより大きく、約１ミリメートルより大きく、又は約０．５センチメートルより大きい厚さを有し得る。一実施形態では、物品は粉末形態であって、適当なサイズの試料バイアル内に収容することができる。さらに別の実施形態では、物品はタブレットの形状を有し得る。さらに他の実施形態では、物品はゲル又は溶液中に存在し得る。
【００３９】
他の実施形態では、特に限定されないが、タンパク質変性剤及びフリーラジカル捕捉剤のような化学コーティング溶液の適用を含め、酸化セルロース基材の追加の処理を行うことができる。変性剤は、遺伝学的試料中のタンパク質及び病原性生物を変性させる界面活性剤又は陰イオン洗浄剤であり得る。変性剤はまた、遺伝学的材料を溶解するために働くと共に、遺伝学的材料を固定化して保存することを可能にする。若干の実施形態では、変性剤は、遺伝学的材料を含む細胞を溶解して興味ある検体を遊離させるために働く。化学溶液は、弱塩基、キレート化剤、及び陰イオン界面活性剤又は洗浄剤を含み得る。尿酸及び尿酸塩も使用できる。弱塩基は遊離塩基又は炭酸塩としてのＴｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルメタン）であり得る一方、キレート化剤はＥＤＴＡであり得る。同様な機能を有する他のコーティングも使用できる。例えば、若干の実施形態では、細胞を溶解し得るがタンパク質を変性させないコーティングが使用できる。他の実施形態では、コーティングは、例えば酵素機能のための補助因子として作用する金属をキレート化することで、変性させずに酵素を失活させるために働き得る。
【００４０】
若干の実施形態では、コーティング溶液は、コーティングが酸化セルロースに対して配設され、収着され、又はその他のやり方で結合されるようにして基材に適用できる。若干の実施形態では、コーティングは化学結合によって基材に付着し得る一方、他の実施形態では、付着は（例えば、含浸によるような）物理的なものであり得る。
【００４１】
若干の実施形態では、アミノオキシ試薬は他の化学処理に先立って適用される。他の実施形態では、アミノオキシ試薬は他の化学処理に続いて適用される。さらに他の実施形態では、アミノオキシ試薬は中間段階として適用される。
【００４２】
修飾された酸化セルロース基材は、基材に接触した遺伝学的材料を保存するための方法として使用できる。若干の実施形態では、かかる方法は、遺伝学的材料を基材に接触させることを含んでいる。遺伝学的材料は植物及び動物組織試料の両方を含むことができ、特に限定されないが、頬側試料、脳脊髄液、糞便、血漿、血液、リンパ液、尿、細胞又はウイルスの懸濁液、ウイルスプラーク、或いは核酸を含む血清試料が挙げられる。
【００４３】
修飾セルロース基材はまた、特に限定されないが、ＤＭＰＫのような用途に組み込むことができる小薬物及び代謝産物の保存方法で使用することもできる。前臨床状況では、例えば乾燥血液スポット（ＤＢＳ）アプローチを用いて生物学的媒体中に含まれる検体試料を保存できることは、実験ワークフローを簡略化し得る。これは必要な生物学的試料の量を減少さることで達成でき、結果として使用する動物被験体の数及びサイズが最小化されると同時に、検体は後の分析のために保存される。実験ワークフローの簡略化はまた、ヒューマンエラーの可能性を低下させることもできる。
【００４４】
若干の実施形態では、保存方法はまた、セルロース基材上で生物学的試料を乾燥する段階、及びセルロース基材を乾燥した生物学的試料と共に２４時間以上（例えば、１週間以上）保存する段階も含んでいる。乾燥は、例えば、乾燥空気流を基材に当てたり、或いは基材を適度の高温（例えば、２５〜４０℃）に暴露することによる能動的なものであり得る。乾燥はまた、受動的なものであってもよい。その場合には、試料を有する基材を例えばベンチ表面上に放置して乾燥させる。保存は乾燥条件下で（例えば、乾燥剤の存在下で）実施でき、室温（例えば、２０〜３５℃）、冷蔵下（例えば、０〜１０℃）又は凍結条件下であってよい。
【００４５】
若干の実施形態では、保存方法はさらに、遺伝学的材料又は１以上の検体をセルロース基材から抽出する段階を含んでいる。抽出は、水性液体（例えば、緩衝液）又は非水性液体（例えば、溶媒）、さらには超臨界ガス（例えば、二酸化炭素）を用いて行うことができる。生成した抽出物は、さらなる分離段階（例えば、クロマトグラフィー）に付すことができる。
【００４６】
若干の実施形態では、保存方法はまた、例えば質量分析法によって１以上の検体を分析する段階を含んでいる。
【００４７】
検体は、薬物又は薬物候補或いは薬物又は薬物候補の代謝産物であり得る。特に本方法は、例えば小さい血液試料を基材に適用してその上に保存し、薬物／薬物候補及び／又は薬物／薬物候補の代謝産物の濃度に関して分析するＤＭＰＫ試験において使用できる。
【００４８】
遺伝学的試料は精製状態のもの又は細胞抽出物や培養物のような粗調製物からのものであってもよいし、或いは表面スワッビング又はスポッティングのような試料トランスファーで直接に得られたものであってもよい。核酸は、特に限定されないが、ＤＮＡ及びＲＮＡ、リボソームＲＮＡ及びメッセンジャーＲＮＡ、並びに核酸プライマー及びアプタマーを包含し得る。
【００４９】
若干の実施形態では、修飾酸化セルロース基材は、遺伝学的材料の保存を容易にする物品に成形される。物品は紙、タブレット又は粉末の形態を有し得る。若干の実施形態では、カードストックのような紙形態が使用できる。この形態に接触させた試料は、以後に例えばカードストックの打抜きによって取り出すことができる。他の形態では、物品は試料管又はバイアル内に収容された粉末の形態を有し得る。試料管又はバイアルのサイズは、遺伝学的試料又は検体のサイズに整合すると共に、以後に試薬又は抽出技術を物品に直接作用させて遺伝学的インキュベーション、増幅又は他の試験を行い得るように決定すればよい。別の実施形態では、物品はタブレットの形態を有し得る。かかるタブレットは、相異なる成形圧力に基づき、相異なる物理的性質（例えば、孔径分布及び表面積）を有し得る。
【００５０】
物品としては、生物学的試料を収集し、保存し、保存するために有用なセルロース基材の望ましい性質には、低い浸出性成分、抗菌性、抗ウイルス性及び効率的な吸上げ性がある。
【００５１】
若干の実施形態では、修飾酸化セルロース基材は、他の同様に形成されたセルロース物品に比べて低レベルの浸出性を有し得る。浸出分とは、セルロース基材上又はその中に存在し得る残留化学物質であって、遺伝学的試料の以後の処理中に基材から浸出又は抽出され得る結果、単離された遺伝学的試料中に存在して下流の分析を妨害し得るものとして定義される。浸出分のレベルは、セルロース基材から物質を溶解又は抽出する溶剤による溶剤洗浄を用いてセルロース基材からの抽出分として測定できる。若干の実施形態では、浸出分のない基材は、洗浄液中の抽出分が２００ｐｐｍ未満、好ましくは１００ｐｐｍ未満、さらに好ましくは２５ｐｐｍ未満のものとして定義できる。したがって、浸出分のない組成物又は浸出分のない組成物から形成された物品とは、組成物が残留物をほとんど含まない結果、残留物が遺伝学的試料を汚染する可能性がないことを意味する。ＤＭＰＫ用途の場合、興味ある代謝産物又は検体の分析を妨害し得る浸出分及び抽出分は望ましくない。
【００５２】
セルロース基材を修飾するために使用した様々な化学的方法及び処方を下記の表１に示す。Ｗｈａｔｍａｎ ３１ＥＴＦは処理されていない平滑なセルロース紙であり、［Ｏ］ＥＴＦはＮａＩＯ4でＣ２及びＣ３開環表面酸化を受けた３１ＥＴＦである。ＦＴＡ（登録商標）は遺伝学的試料収集のために使用される市販の紙であって、ＴＲＩＳ、ＥＤＴＡ、尿酸及びドデシル硫酸ナトリウムで処理されている。
【００５３】
【表１】
0005997703.tif 000006
セルロース紙又は酸化セルロースについて試験した、様々な化学的方法及び処方に関する浸出性の程度は、各種の紙を７０％水性テトラヒドロフランで抽出することによって求めた。抽出物は、ＬＣ−ＭＳ方法を用いて同定しかつ定量化した。抽出分の分析結果は、他の化学的方法とは対照的に、アミノオキシ化学によって誘導体化されたセルロースがセルロース紙からの抽出分をほとんど示さないことを示した。この結果は、液体クロマトグラフィートレースとして図１に示した陰性対照（３１ＥＴＦ）と同等である。図示の通り、表面に含浸させた分子混合物を含み、代謝産物分析を妨害し得る抽出分を示す陽性対照（ＦＴＡ紙）とは対照的に、３１ＥＴＦは抽出分を示さない。アミノオキシ「Ｓ」とアミン分子「Ｄ」との組合せ（Ｓ−Ｄ）の使用を含む処方物は、酸化セルロース紙とオキシム結合を形成するアミノオキシ分子が抽出分を有しない（非浸出性）一方、第四級アミン塩から酸化セルロース紙とシッフ塩基を形成するアミン分子は抽出分を有することを示した。さらに、処方物中に存在するアミノオキシ分子（Ｓ、Ｃ、Ｔ）のみを有する試料は抽出分を示さない。
【００５４】
これらの結果は、部分的には、シッフ塩基の可逆性に比べてオキシム結合が不可逆性であることによって説明できる。第四級アミンを含む処方物では、抽出分は使用するモノマー単位及び加水分解生成物の両方に対応していた。したがって、これらの結果は、オキシム修飾化学が非浸出性を与えるための好ましい方法であり得ることを示唆している。
【００５５】
若干の実施形態では、修飾酸化セルロースは、市販のＦＴＡ紙と同等以上の抗菌性及び抗ウイルス性を有し得る。これらの性質は、生物学的試料の取扱いを含む手続きにおける高度に規制された安全性分類及びガイドラインの必要性を最小化する。これは、生物学的試料の使用、保存及び輸送を含み得る低コストで簡略化されたプロセスと言い換えることができる。加えて、紙の抗菌性は、保存後に生物学的試料を損なうことがある細菌増殖の可能性を最小化し得る。
【００５６】
各種の修飾酸化セルロース処方物の抗菌性を、グラム陽性及びグラム陰性菌株並びに多剤耐性菌株を代表する３種の菌株に対して評価した。表２はレプリカプレーティングアッセイからの結果を要約したものであり、アミノオキシ／アミン部分で修飾した酸化紙は、非修飾セルロース基材並びにポリマー系又は第四級アミン系処方物を固定化するためのラジカル化学アプローチを用いて製造した処方物の代表例に比べて最高の抗菌活性を有することを示している。したがって、抗菌性は修飾段階の結果であって、先行する酸化段階によるものではない。ポリマー分子は抗菌性を全く示さなかった一方、第四級アミンファミリーは菌株依存性の結果を示したが、それも軽度であった。表２に示す通り、抗菌活性なしは（−）、細菌増殖のわずかな阻止は（＋）、細菌増殖の部分的な阻止は（＋＋）、細菌増殖の完全な阻止は（＋＋＋）で表わされている。
【００５７】
【表２】
0005997703.tif 000007
生物学的試料の収集を含む用途では、紙が生物学的試料を迅速かつ均一に吸い上げ、又は湿潤タイプの作用で生物学的試料を紙中に流す能力は、信頼可能かつ再現可能な試料読取りを保証するために重要である。若干の実施形態では、修飾酸化セルロースは市販のＦＴＡ紙と同等な所望の吸上げ性を有している。
【００５８】
図２は、修飾紙の様々な例が１０μＬの全血をいかに速く吸収し得るかを示すグラフ表示である。対照セルロース紙（３１ＥＴＦ、ＦＴＡ及び［Ｏ］３１ＥＴＦ）は、１０μＬの全血を３〜４秒の範囲内で吸収することが示されている。３１ＥＴＦ及び［Ｏ］３１ＥＴＦ紙は、先に表１に示したように、異なる分子ファミリー及び処方を用いて修飾された。ポリマー（ＳＤＳ様）分子の使用を含む処方物は、ラジカル化学を含むアプローチを用いてセルロース紙上に固定化される前の分子が親水性及び水溶性を有するにもかかわらず、むしろ疎水性の表面を与えた。それでも、アミノオキシ及びアミン分子と反応させた酸化セルロース紙、並びに非酸化セルロース紙（３１ＥＴＦ）に対するラジカル化学を含む第四級アミン処方物は、対照と同等の結果を示した。
【００５９】
実証されたように、アミノオキシ化学は、生物学的材料の保存及び分析の分野における使用の改善に役立つ吸上げ性、抗菌性及び非浸出性を有する基材を与えた。それは、現在市場で入手できる製品（例えば、ＦＴＡ）における若干の望ましい性質を保持しながら、下流の分析を妨げることがある浸出分の源を最小化又は排除する。
【００６０】
内部での試験によれば、極度のｐＨ及び温度に暴露された場合、セルロース基材は褐色化及び脆化を生じ得ることが証明された。これは、大規模製造用途のためには実用的でなかろう。アミノオキシスルホン酸（Ｓ及びＴ）は、同等の濃度でアミノオキシ酢酸より５ｐＨ単位以上低い溶液を生成すると予想される。非浸出性かつ抗菌性の処方物Ｓ及びＴに関するこの問題は処方及びプロセス条件の最適化によって回避されるが、ＤＭＰＫ用途と一層密接に関連する性能試験に対して試験するためには処方物Ｃを使用した。
【００６１】
ＤＭＰＫ用途では、非常に低い濃度で存在する小薬物分子及びその代謝産物を保存しかつ分析する能力は決定的に重要である。体液（例えば、ＤＢＳ用途での血液）中に存在するリン脂質を吸着する能力もまた、重要である。それは、これらの分子も界面活性剤と同様にして分析を妨害し、低い感度及び高い変動性をもたらすことがあるからである。これらの性質を実験的に試験したところ、処方物Ｃは市販のＤＭＰＫ標準紙に比べて約４０〜５０％多くのリン脂質を紙上に保持しながら約２５〜４０％だけ低い量のモデル薬物を抽出する能力を有することが示された。このように妨害分子を顕著に保持することは、興味うる検体を一層再現可能であるばかりでなく一層低い濃度で良好に検出する能力を顕著に向上させることができる。これらの結果は、先に記載した他の性質に加えて、処方物Ｃが特にＤＭＰＫ用途或いは同等な組合せの性能特性を要求し得る他の用途にとって好適な処方物であることを示唆している。
【００６２】
本発明は、一般的には、分析、診断又は予後判定用途に適用し得る方法に関する実施形態を含んでいる。かかる用途には、特に限定されないが、法医学、トランスジェニック同定、トランスフュージョン医薬／ＨＬＡタイピング、プラスミドスクリーニング、食品及び農業試験、薬物発見、ゲノム学、ＳＴＲ分析、動物識別、全ゲノム増幅及び分子生物学がある。若干の実施形態では、本明細書中に開示された方法は特にＤＭＰＫ分析に適用し得る。異なる実施形態の特徴を組み合わせてそらに別の実施形態を形成し得ることに注意すべきである。
【実施例】
【００６３】
セルロースを酸化するための一般手順
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から供給されたＷｈａｔｍａｎグレード３１ＥＴＦセルロースをＮａＩＯ4の水溶液中に浸漬し、所定の温度で所定の時間にわたり反応させた。温度は様々に変化したが、通例は５０〜９０℃で１〜５分間であった。次いで、完全に湿潤した膜を、水性洗液の導電率が３μＳ未満になるまで脱イオン水で洗浄した。次いで、試料を室温で一晩乾燥した。
【００６４】
アミノオキシ化合物（ＡＯ）を酸化セルロースと反応させるための一般手順
酸化３１ＥＴＦセルロース試料を予め秤量し、次いで室温でアミノオキシ化合物の水溶液中に浸漬した。完全な湿潤後、試料をピンセットで溶液から取り出し、過剰の溶液を十分に濡れた膜から排出させた。次いで、試料をヒートガンで部分的に乾燥し、結晶化皿内に配置して所定の温度及び時間で乾燥した。通例、試料は室温で又は５０〜７０℃の温風循環オーブン内で１２〜２４時間乾燥した。乾燥後に試料を秤量し、脱イオン水で洗浄し、溶液導電率を記録した。試料を同じ所定のオーブン温度で約１時間再乾燥し、脱イオン水で再洗浄した。このプロセスを、イオン導電率が３μＳ未満になるまで繰り返した。試料を同じ所定の温度で再乾燥し、最終重量を記録した。次の式によってパーセント重量増加を求めた。
パーセント重量増加＝（最終重量−初期重量）／初期重量×１００％
試料はまた、元素分析によっても特性決定した。元素状硫黄又は窒素含有量を求めることで、アミノオキシ（ＡＯ）官能化の程度を推定した。
【００６５】
ＡＯ−ＣＯ2Ｈ ＤＯＥにおける試料４ａに関する手順
１４ｃｍ×１４ｃｍの３１ＥＴＦセルロースシートを８０℃でＮａＩＯ4の１．０Ｍ水溶液中に浸漬し、５分間反応させた。次いで、完全に湿潤した膜を、水性洗液の導電率が３μＳ未満になるまで脱イオン水で洗浄した。次いで、酸化３１ＥＴＦセルロースを室温で一晩乾燥した。次いで、続くアミノオキシ試薬での処理のため、１４ｃｍ×１４ｃｍのシートを複数の６ｃｍ×４ｃｍシートに切断した。６ｃｍ×４ｃｍのシートを室温でアミノオキシ試薬の０．２Ｍ水溶液中に浸漬した。完全な湿潤後、試料をピンセットで溶液から取り出し、過剰の溶液を十分に濡れた膜から排出させた。次いで、試料をヒートガンで部分的に乾燥し、結晶化皿内に配置して６０℃で一晩乾燥した。一晩加熱した後、試料は褐色になった。乾燥した試料を秤量し、脱イオン水で洗浄し、溶液導電率を記録した。試料を６０℃で１時間再乾燥し、脱イオン水で再洗浄した。このプロセスを、イオン導電率が３μＳ未満になるまで繰り返した。試料を窒素元素分析に付すことで、共有結合したアミノオキシ部分の量を求めた。窒素元素分析の結果は、分析した試料中のＮ％±９５％信頼区間（ＣＩ）として表される。
【００６６】
試料作製
各試料タイプについて、試料は約３／４インチ平方の２つの正方形として分析した。ＩＰＡで予め清浄にしたカミソリの刃で、試料を小さな正方形に切断した。マイクロ天秤を用いて、各々の反復試験試料を風袋測定済みの５×９ｍｍスズカプセル中に秤取し、次いでそれを押しつぶしてカプセルで包囲された小さい球体とし、再び秤量した。各試料タイプの重量は概略窒素濃度に応じて変化した。２個のスズカプセルブランクについても分析を行った。
【００６７】
標準
ＥＡ１１０８元素分析装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、米国マサチューセッツ州）について、ＴＨＡＢ（１．４０７％Ｎ）を標準物質として用いてＣＨＮ較正を実施した。８点較正（０．０６８ｍｇ、０．１８７ｍｇ、０．４１６ｍｇ、０．８２６ｍｇ、１．５５２ｍｇ、２．４０４ｍｇ、３．４５０ｍｇ、６．３２３ｍｇ）により、Ｒ２＝９９．９８％の窒素曲線を作成した。ＴＨＡＢに加えて、第２の標準物質（アトロピン、４．８４％Ｎ）を未知物質として分析することで、較正曲線の正確さを確認した。ＴＨＡＢ窒素回収率：９７％〜１０９％。アトロピン窒素回収率：９６％〜１０６％。
【００６８】
実験技術
試料をＣａｒｌｏ Ｅｒｂａ ＥＡ１１０８分析装置上でＮについて４回分析した。その技術は、酸素富化雰囲気中において１０００℃で試料を定量的フラッシュ燃焼させることで、窒素、炭素、水素及び硫黄からそれぞれＣＯ2、Ｈ2Ｏ及びＮＯｘを生成させることに基づいている。燃焼ガスを加熱した元素銅中に通すことで、あらゆる形態のＮＯｘをＮ2に還元した。次いで、これらをキャリヤーガスでクロマトグラフィーカラムに通し、そこでこれらは分離され、熱伝導率検出器で検出されて定量化される。検体濃度は、一連の既知標準との比較によって算出される。較正曲線は検体の総ｍｇ数として作成されるが、これは分析する試料の重量に基づいて％に換算される。計器パラメーター：ヘリウム流量は１５０ｍＬ／分に設定、酸素流量は６０ｍＬ／分に設定、試料当たり５４０秒。元素状硫黄分析の結果は、９５％信頼区間（ＣＩ）でセルロース紙中のｗｔ％金属を測定して表面修飾を確認することで判定した。
【００６９】
試料作製
マイクロ波容器は、１マイクロ波サイクルを用いて１０ｍＬのＨＮＯ3酸で予め１回清浄にした。１組の０．０６〜０．０９ｇ反復試験試料（１回の反復試験については分析する試料全体を使用した。）を差によって秤量し、テフロン（登録商標）ＸＰ１５００マイクロ波ライナー中に配置した。１０ｍｌのＨＮＯ3酸を添加してライナーの壁を洗浄した。ライナーにキャップを付け、マイクロ波中に配置し、「紙」プログラム（１０分で１００℃に昇温、１００℃で１０分間保持、圧力を１００ｐｓｉに調節、１０分で１５０℃に昇温、１５０℃で１０分間保持、圧力を２００ｐｓｉに調節、分で１８０℃に昇温、１８０℃で１０分間保持、圧力を３００ｐｓｉに調節、分で２０００℃に昇温、２００℃で１０分間保持、圧力を４００ｐｓｉに調節、１０分で２２００℃に昇温、２２０℃で１０分間保持、圧力を６００ｐｓｉに調節）を用いて運転した。加熱サイクル後、試料を室温まで完全に放冷した後に開放した。容器内容物をオレンジキャップ管に移し、５ｍＬの１０ｐｐｍ Ｓｃを添加し、溶液を脱イオン水（ＤＩＷ）で５０ｍＬに希釈した。ブランク及び試料スパイクについて、すべての手順を実施した。酸スパイク回収率：Ｓ：１１０％。Ｓｐｅｘ ＱＣ回収率：Ｓ：１０２％。標準：Ｓ：１ ｐｐｍ Ｓｃを加えた２０％ＨＮＯ3を含むオレンジキャッププラスチック管中で０．０５ｐｐｍ〜１０ｐｐｍ。ＱＣ１：１ｐｐｍ Ｓｐｅｘ４。すすぎ液：２０％ＨＮＯ3。
【００７０】
技術：Ｓｐｅｃｔｒｏ Ａｒｃｏｓ ＩＣＰ−ＡＥＳ
アルゴンガス流中に高周波電力を誘導結合することで高温プラズマを発生させる。噴霧器により、試料をプラズマ中に溶液エーロゾルとして導入すると、それぞれの元素はその固有放射を放出する。光学系では、１３０〜７７０ｎｍの波長を同時記録するため、Ａｒｃｏｓは最適化Ｐａｓｃｈｅｎ−ＲｕｎｇｅマウントＯＲＣＡ（最適化ローランド円整列）で３２の線形ＣＣＤ検出器を使用している（ＳＰＥＣＴＲＯ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）。信号の大きさは試料中の元素の濃度に正比例する。試料信号強度を較正標準から生じるものと比較することで、定量的な結果が生み出される。
【００７１】
レプリカプレーティングアッセイ（抗菌アッセイ）実験
グラム陰性細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（感染単離物０９−０１０、Ｂｒｏｏｋｅ Ａｒｍｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂ及びＵＳ Ａｒｍｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、グラム陽性細菌ＭＲＳＡ ＵＳＡ３００（メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ感染単離物ＮＲＳ３８４、Ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）及び実験菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＨＢ１０１）を用いて抗菌性を評価した。その際、培養密度は０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準を用いて推定した。グラフト３１−ＥＴＦ紙並びに陽性（ＦＴＡ）及び陰性（３１−ＥＴＦ）対照紙の７ｍｍ打抜き片に約１〜２×１０7個の細胞（１４〜２０μＬの培養物）を適用し、試料を１０分間（臨床単離物）又は６０〜９０分間（実験菌株Ｅ．ｃｏｌｉ）風乾した。無菌鉗子を用いて、試料を新鮮なトリプチカーゼダイズ寒天（ＴＳＡ）にレプリカプレーティングした。その際には、各打抜き片を寒天表面上に裏返して置き、静かに押し付けた。打抜き片試料を取り除いた後、プレートを３７℃で一晩インキュベートし、１２〜２４時間後に細菌増殖を評価した。
【００７２】
ＨＰＬＣ−エレクトロスプレーＴｏＦＭＳによる３１−ＥＴＦ酸化基材からの抽出性試薬の分析
１分間の渦動を用いて、紙円形打抜き片（直径７ｍｍ）を５００μＬの水中７０ＴＨＦで抽出した。抽出分のクロマトグラフィー分析は、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｐｒａｙイオン化アクセサリを備えたＡＢ Ｓｃｉｅｘ Ｑ Ｓｔａｒ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）Ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒと直列に配置された、１２００ Ｓｅｒｉｅｓ Ｐｈｏｔｏ−Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣシステムを用いて達成した。分離は、３μｍ粒子媒体からなるＣａｄｅｎｚａ ＣＬ Ｃ１８ １×５０ｍｍ逆相カラムを用いて実施した。エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルを正イオン化モードで取得した。定量分析結果は、それぞれの基準材料の既知質量の抽出質量クロマトグラムの積分ピークから求めた。方法パラメーターは次の通りであった。移動相：溶媒Ａ，２ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ＝４）、溶媒Ｂ，０．１％ギ酸を含む１００％アセトニトリル、流量：０．２ｍｌ／分、ホトダイオードアレイ検出器取得：２００〜８００ｎｍ、カラム：Ｃａｄｅｎｚａ ＣＬ Ｃ１８ ３μｍ（１×５０ｍｍ）、注入量：５０μｌ、ＥＳＩ条件：噴霧ガス：４０，乾燥ガス：４０，印加ニードル電圧：３０００Ｖ、温度：４００℃。
【００７３】
本発明は、その技術思想又は本質的特徴から逸脱することなしに他の特定の形態で実施できる。したがって、前述の実施形態はすべての点で、本明細書中に記載した本発明を限定するものではなく例示的なものと見なすべきである。かくして、本発明の技術的範囲は前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲によって表され、したがって特許請求の範囲と同等の意味及び範囲に含まれる変更はすべて本発明に包含されるものとする。
【００７４】
検体回収率及びリン脂質保持性
モデル薬物分子の原液をメタノール中に調製した。モデル分子は、異なる化学物質群、即ち塩基、第四級アミン、中性物質及び酸を代表していた。これらは、それぞれプログアニル、ハイアミン、シムバスチン及び２，４，６−トリイソプロピル安息香酸であった。最初の３者は１００μｇ／ｍＬの濃度に調製し、最後のものは２００μｇ／ｍＬに調製した。最終薬物濃度が元の濃度の１／１０になり、かつ血液中に１０％以下のメタノールしか存在しないようにして、ヒト全血をこれらの薬物溶液でスパイクした。各処方紙に各々の薬物−血液混合物１０μＬをスポットした。紙を乾燥室内で一晩乾燥した。７ｍｍホールパンチャーを用いて全血スポットを打ち抜いて集め、５００μｌの７０％メタノールでスポットを抽出した。理論上の１００％最終回収量は、最初の３種の薬物に関しては２００ｎｇ／ｍＬであり、最後のものに関しては４００ｎｇ／ｍＬであった。検体回収率を得るためには、ＬＣ−ＭＳを用いて各成分を定量し、同じ成分の較正標準と比較した。試験全体を通じて一定の信号を確保するため、ジノニルアミン（陽イオン）及びトリイソプロピル安息香酸（陰イオン）の内標準を使用した。クロマトグラフィー分析のために使用したシステム及び条件は、次のようにして使用した逆相ＨＰＬＣ−ＴｏＦＭＳを用いて実行された。使用した計測器は、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｐｒａｙイオン化アクセサリを備えたＡＢ Ｓｃｉｅｘ Ｑ Ｓｔａｒ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）Ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒであった。分離は、３μｍ粒子媒体からなるＣａｄｅｎｚａ ＣＬ Ｃ１８ １×５０ｍｍ逆相カラムを用いて実施した。エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルを正イオン化モードで取得した。定量分析結果は、それぞれの基準材料の既知質量の抽出質量クロマトグラムの積分ピークから求めた。方法パラメーターは次の通りであった。移動相：溶媒Ａ，２ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ＝４）、溶媒Ｂ，０．１％ギ酸を含む１００％アセトニトリル、流量：０．２ｍｌ／分、勾配プロファイル：１０分で９５〜０％Ａ，１００％Ｂに２分間保持，初期条件で１０分間再平衡化、ホトダイオードアレイ検出器取得：２００〜８００ｎｍ、カラム：Ｃａｄｅｎｚａ ＣＬ Ｃ１８ ３μｍ（１×５０ｍｍ）、注入量：５μｌ、ＥＳＩ条件：Ｇ１ ４０，Ｇ２ ３０，ＣＧ ２５、印加ニードル電圧：３０００Ｖ、温度：４００℃。
【００７５】
リン脂質集団のクロマトグラフィー分析のために使用したシステム及び条件は逆相ＨＰＬＣ−ＴｏＦＭＳを用いて実行され、方法条件は次の通りであった。使用した計測器は、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｐｒａｙイオン化アクセサリを備えたＡＢ Ｓｃｉｅｘ Ｑ Ｓｔａｒ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）Ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒであった。分離は、３μｍ粒子媒体からなるＣａｄｅｎｚａ ＣＷ Ｃ１８ １×５０ｍｍ逆相カラムを用いて実施した。エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルを正イオン化モードで取得した。定量分析結果は、それぞれの基準材料（アセトニトリル及びイソプロピルアルコール（５０：５０）に溶解したリソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミン）の既知質量の抽出質量クロマトグラムの積分ピークから求めた。方法パラメーターは次の通りであった。移動相：溶媒Ａ，２ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ＝４）＋１０％イソプロピルアルコール、溶媒Ｂ，０．１％ギ酸及び１０％イソプロピルアルコールを含む１００％アセトニトリル、流量：０．２５ｍｌ／分、勾配プロファイル：１０分で９５〜０％Ａ，１００％Ｂに１０分間保持，初期条件で１０分間再平衡化、ホトダイオードアレイ検出器取得：２００〜８００ｎｍ、カラム：Ｃａｄｅｎｚａ ＣＷ Ｃ１８ ３μｍ（１×５０ｍｍ）、注入量：５μｌ、ＥＳＩ条件：Ｇ１ ４０，Ｇ２ ３０，ＣＧ ２５、印加ニードル電圧：３０００Ｖ、温度：４５０℃。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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