(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５または配列番号１９に対して相補的である配列を含む第１のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび配列番号１４に対して相補的である配列を含む第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、病的な心臓肥大、心筋梗塞または心不全の治療が必要な対象において病的な心臓肥大、心筋梗塞または心不全を治療するための医薬の組み合わせ物であって、
前記第１および第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、８〜１８ヌクレオチド長であり、単一核酸分子内に含まれ、前記第１のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび前記第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドが１以上のスペーサーヌクレオチドで分離され、
前記第１および第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与後、対象の心臓細胞におけるｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９の発現または活性が低下する、医薬の組み合わせ物。
【請求項２】
前記第１および第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドが１０〜５０のスペーサーヌクレオチドまたは５のスペーサーヌクレオチドで分離される、請求項１に記載の医薬の組み合わせ物。
【請求項３】
前記第１のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの糖修飾および／または骨格修飾を含む、請求項１または２に記載の医薬の組み合わせ物。
【請求項４】
前記少なくとも１つの糖修飾が、二環式糖ヌクレオシド修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、または２’−フルオロ修飾である、請求項３に記載の医薬の組み合わせ物。
【請求項５】
前記二環式糖ヌクレオシド修飾がロックト核酸である、請求項４に記載の医薬の組み合わせ物。
【請求項６】
前記少なくとも１つの骨格修飾が、ホスホロチオエート結合である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の医薬の組み合わせ物。
【請求項７】
前記第１のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、１２〜１６ヌクレオチド長である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬の組み合わせ物。
【請求項８】
前記第１のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび前記第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドが発現ベクターによってコードされる、請求項１に記載の医薬の組み合わせ物。
【請求項９】
８〜１４ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号５の５’末端の連続するアミノ酸配列と相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、病的な心臓肥大、心筋梗塞または心不全の治療が必要な対象において病的な心臓肥大、心筋梗塞または心不全を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物の投与後、対象の心臓細胞におけるｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９の発現または活性が低下する、医薬組成物。
【請求項１０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが発現ベクターによってコードされる、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの糖修飾および／または骨格修飾を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記糖修飾が、二環式糖ヌクレオシド修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、または２’−フルオロ修飾である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記二環式糖ヌクレオシド修飾がロックト核酸である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記骨格修飾が、ホスホロチオエート結合である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１２〜１４ヌクレオチド長である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂおよび前記ｍｉＲ−４９９の発現または活性が、投与後に前記対象の心臓細胞において６０パーセント超低下する、請求項１に記載の医薬の組み合わせ物または請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
投与の２週間以内に前記対象において心臓ストレス応答が低下する、請求項１に記載の医薬の組み合わせ物または請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記心臓ストレス応答が、心筋細胞肥大、心臓繊維症、心臓細胞におけるα−ＭＨＣ発現の低下、および／または前記対象の心臓細胞におけるβ−ＭＨＣ発現の増大を含む、請求項１７に記載の医薬の組み合わせ物または医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２００９年２月４日出願の米国仮出願第６１／１４９，９１５号の利益を主張する。
【０００２】
政府支援の陳述
本発明は、国立衛生研究所（the National Institutes of Health）により与えられた認可番号ＨＬ５３３５１−０６の下で政府支援によってなされたものである。政府は、本発明の特定の権利を有する。
【０００３】
電子提出されたテキストファイルの記述
本明細書と共に電子提出されたテキストファイルの内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む：配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名: MIRG_013_01WO_SeqList_ST25.txt、記録日: 2010年2月1日、ファイルサイズ５キロバイト）。
【０００４】
技術分野
本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の活性または発現を調節する薬剤を投与することによる、心臓障害および筋骨格系障害の治療に関する。特に、本発明は、ヒトを含む対象の心臓細胞における、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９の両方の発現または活性を阻害することによって、心臓障害を治療または予防するための方法を提供する。さらに、本発明は、対象の骨格筋細胞における、ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９の両方の発現または活性を増大させることによって筋骨格系障害を治療または予防するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００５】
冠動脈疾患や心筋梗塞、うっ血性心不全、心臓肥大などの心疾患およびその徴候は、今日の米国において主要な健康上のリスクであることを明らかに示している。これらの疾患に罹っている患者の診断、治療、および支援にかかるコストは、何十億ドルにもなる。心疾患の、２つの特に重篤な徴候は、心筋梗塞および心臓肥大である。
【０００６】
心臓発作として一般的に知られている心筋梗塞は、心臓組織への血流量の突然の持続的な不足によって引き起こされ、これは、通常、冠状動脈の狭小化または閉塞の結果である。十分な血液供給がなければ、組織は、虚血性になり、心筋細胞（例えば心臓の筋肉細胞）および血管構造物の死に至る。心筋細胞の死に起因する壊死組織は、一般に、瘢痕組織によって置き換えられ、瘢痕組織は収縮を起こさず、心臓機能に寄与することができず、心収縮中に拡張することによってまたは心室のサイズおよび有効半径を増大させることによって、例えば肥大性になることによって、心臓機能にしばしば有害な役割を演じる。
【０００７】
心臓肥大は、高血圧、機械的負荷、心筋梗塞、心不整脈、内分泌障害、および心収縮タンパク質遺伝子の遺伝変異を生じるものを含めた事実上全ての形の心疾患に対する心臓の適応反応である。肥大応答は、最初は心拍出量を増大させる補償的機構であるが、持続的肥大によって拡張型心筋症（DCM）、心不全、および突然死をもたらす可能性がある。米国では、約５０万人が毎年心不全と診断されており、その死亡率は５０％に達する。
【０００８】
非常に数多くのシグナル伝達経路、特に、異常なカルシウムシグナル伝達が行われる経路は、心臓肥大および病理学的再構築を促進させる（Heineke & Molkentin、2006）。ストレスに応答する肥大成長では、運動に応答して引き起こされる生理的肥大とは異なるシグナル伝達経路および遺伝子発現パターンが行われる。ストレス媒介性心筋肥大は、非常に数多くの有害な結果に関連した複雑な現象であり、異なる分子および組織学的特性によって心臓が線維化し、拡張し、代償不全になり、心筋細胞の変性および死を通してしばしば心不全になる。したがって、基本的な分子機構の解明と、有害な心臓成長および究極的には心不全を抑制する新規な治療標的の発見に、強い関心が持たれている。これらの機構の理解は、心臓肥大および心不全を治療するための新たな治療の設計に対して必須である。
【０００９】
マイクロＲＮＡは、最近、とりわけ発生（developmental）タイミング、アポトーシス、脂肪代謝、および造血性細胞分化の調節を含めたいくつかの生物学的プロセスに関係している。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、個々のｍｉＲＮＡ遺伝子から、またはタンパク質コーディング遺伝子のイントロンから、または多数の緊密に関連したｍｉＲＮＡをしばしばコードするポリシストロン転写物から得られる長さ約１８〜約２５ヌクレオチドの小さな非タンパク質コーディングＲＮＡである。Carringtonらの概説（Science, Vol. 301(5631):336-338, 2003）を参照されたい。ｍｉＲＮＡは、その配列が完全に相補的である場合はその分解を促進させることによって、またはその配列がミスマッチを含有する場合は翻訳を阻害することによって、標的ｍＲＮＡのリプレッサーとして働く。
【００１０】
ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（pol II）またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（pol III; Qiら、（2006）Cellular & Molecular Immunology Vol.3: 411-419参照）によって転写され、初期転写物から発生し、一般に数千塩基の長さである１次ｍｉＲＮＡ転写物（プリ−ｍｉＲＮＡ）で終わる。プリ−ｍｉＲＮＡは、ＲＮアーゼＤｒｏsｈａによって、核内で、約７０〜約１００ヌクレオチドヘアピン形前駆体（プレ−ｍｉＲＮＡ）に処理される。細胞質に輸送後、ヘアピンプレ−ｍｉＲＮＡをさらにＤｉｃｅｒで処理して、二本鎖ｍｉＲＮＡを生成する。次いで成熟ｍｉＲＮＡ鎖をＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込み、その標的ｍＲＮＡに、塩基対相補性によって結合させる。ｍｉＲＮＡ塩基がｍＲＮＡ標的と完全に対になる比較的まれなケースでは、ｍＲＮＡ分解が促進される。より一般的には、ｍｉＲＮＡは、不完全なヘテロ二本鎖を標的ｍＲＮＡと形成し、ｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼしまたはｍＲＮＡの翻訳を阻害する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
最近、本発明者らは、α−ミオシン重鎖（MHC）遺伝子のイントロンによってコードされ、かつ心臓ストレスに応答したβ−ＭＨＣ発現の上方制御および心臓における速骨格筋（fast skeletal muscle）遺伝子の抑制に必要とされる、心臓特異的マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−２０８ａについて報告した（van Rooijら、(2007) Science, Vol. 316: 575-579）。本発明は、この発見をさらに拡大し、心臓障害および筋骨格系障害の治療に対する新規な治療上の手法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、心臓細胞における、ｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−４９９の両方の組織的な下方制御は、ストレスに応答した心臓肥大、高い収縮性、および病的心臓のリモデリングの発達に対して相乗効果をもたらすという発見に部分的に基づく。本発明者らは、驚くべきことに、β−ＭＨＣなどのストレス関連遺伝子の発現を制御するための期間が、ｍｉＲ−２０８ａ阻害剤およびｍｉＲ−４９９阻害剤の同時または連続した投与によってｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−４９９の両方を下方制御することによって劇的に減少することを見出した。そのような二重ターゲティングは、ｍｉＲ−２０８ａのみの下方制御で同様の効果を観察するのに必要とされる数か月の遅延と比較して、ストレス関連遺伝子発現に対する即時の効果をもたらす。したがって、本発明は、ヒトを含む、病的な心臓肥大、心不全、および心筋梗塞の治療の必要がある対象において病的な心臓肥大、心不全、および心筋梗塞を治療するための新規な治療上の手法を提供する。
【００１３】
１つの実施態様において、前記方法は、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤とｍｉＲ−４９９の阻害剤を対象に投与する工程を含み、投与後、対象の心臓細胞におけるｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂとｍｉＲ−４９９の発現または活性が低下する。いくつかの実施態様において、阻害剤の投与後、対象の心臓細胞におけるｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９の発現または活性は、６０％超低下する。ｍｉＲ−２０８阻害剤およびｍｉＲ−４９９阻害剤は、アンタゴｍｉｒ（antagomir）またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。１つの実施態様において、ｍｉＲＮＡ阻害剤は発現ベクター上にコードされる。
【００１４】
別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤およびｍｉＲ−４９９の阻害剤の投与後、対象において心臓ストレス応答が低下する。心臓ストレス応答は、前記対象の、心筋細胞肥大、心臓の線維症、心臓細胞におけるα−ＭＨＣの発現低下、および／または心臓細胞におけるβ−ＭＨＣの発現増大を包含する。特定の実施態様において、心臓ストレス応答の低下は、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤およびｍｉＲ−４９９の阻害剤の投与後２ヶ月未満で起こる。好ましい実施態様において、心臓ストレス応答の低下は、阻害剤の投与後１週間未満で起こる。
【００１５】
いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤とｍｉＲ−４９９阻害剤は連続して投与される。２つの阻害剤の投与は、分単位から週単位の間隔で分離することができる。１つの実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤とｍｉＲ−４９９阻害剤は、少なくとも２４時間離れて投与される。別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤とｍｉＲ−４９９阻害剤は、同時投与される。２つの阻害剤は、それぞれ約１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。
【００１６】
本発明はまた、筋骨格系障害の治療または予防を必要とする対象において筋骨格系障害を治療または予防する方法であって、ｍｉＲ−２０８のアゴニストおよびｍｉＲ−４９９のアゴニストを対象に投与する工程を含み、投与後、対象の骨格筋細胞におけるｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９の発現または活性が増大する方法を提供する。１つの実施態様において、前記方法は、ｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストおよびｍｉＲ−４９９のアゴニストを対象に投与する工程を含む。ｍｉＲＮＡアゴニストは、成熟ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂまたはｍｉＲ−４９９配列をコードするポリヌクレオチドであることができる。いくつかの実施態様において、そのようなポリヌクレオチドはプロモーター配列に作動的に連結しており、発現ベクターにおいて対象の細胞に提供される。
【００１７】
ｍｉＲＮＡアゴニストは、同時投与されてもよいまたは特定の時間的間隔によって分離して、連続して投与されてもよい。いくつかの実施態様では、対象の骨格筋細胞における１または複数の速骨格筋遺伝子の発現は、対象へのｍｉＲ−４９９アゴニストおよびｍｉＲ−２０８ａアゴニストまたはｍｉＲ−２０８ｂアゴニストの投与後に低下する。１または複数の速骨格筋遺伝子は、トロポニンＩ２、トロポニンＴ３、速骨格ミオシン軽鎖、およびα骨格アクチンを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＭｉＲ−２０８ノックアウト動物は、胸部大動脈瘤絞扼術に応答した心臓肥大および線維症をそれほど示さない。Ａ．胸部大動脈瘤絞扼術（ＴＡＢ）処置を示す概略図（左）。野生型およびｍｉＲ−２０８−／−マウスの心臓の組織切片をＴＡＢ処置またはシャム処置の後にマッソントリクロームで染色した（右）。ｍｉＲ−２０８の不在により、ＴＡＢに２１日間供された野生型マウスに見られた肥大および線維症が減少する。Ｂ．シャム処置またはＴＡＢ処置の後の、野生型およびｍｉＲ−２０８−／−動物の心臓におけるβ−ミオシン重鎖（β−ＭＨＣ）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、および脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）についての相対発現レベル。Ｃ．シャム処置またはＴＡＢ処置の後の野生型およびｍｉＲ−２０８−／−動物の心臓におけるα−ＭＨＣおよびβ−ＭＨＣタンパク質レベルのウェスタン分析。ＧＡＰＤＨを、ローディングコントロールとして検出した。
【図２】ｍｉＲ−２０８の長期ノックダウンは、ｍｉＲ−２０８ノックアウト動物におけるストレス応答の阻害を表現型模写する。Ａ．成熟ｍｉＲ−２０８配列（配列番号１６）を標的とする合成オリゴヌクレオチドの配列。ミスマッチコントロール配列は、抗ｍｉＲ−２０８配列（配列番号１７）と比較して、４つの塩基ミスマッチを含有する。Ｂ．リアルタイムＰＣＲ分析は、抗ｍｉＲ−２０８オリゴヌクレオチドを用いて治療された動物の心臓におけるｍｉＲ−２０８の効率的なノックダウンを示す。Ｃ．シャム処置または胸部大動脈瘤絞扼術（ＴＡＢ）処置の後に抗ｍｉＲ−２０８オリゴヌクレオチド（抗２０８）またはミスマッチコントロール（ｍｍ）を受けた動物の心臓におけるβ−ミオシン重鎖（β−ＭＨＣ）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、および脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）についての相対発現レベル。ストレスマーカーＡＮＦおよびＢＮＰは、ＴＡＢに応答して誘発されるが、抗ｍｉＲ−２０８を受けた動物は、βＭＨＣ発現の誘発の減少を示した。
【図３】Ｍｙｈ７ｂおよびｍｉＲ−４９９は、ｍｉＲ−２０８によって調節される。野生型（＋／＋）、ｍｉＲ−２０８ヘテロ接合体（＋／−）、およびｍｉＲ−２０８ノックアウト（−／−）マウスの心臓におけるｍｉＲ−４９９の発現を示すノーザンブロット。野生型および突然変異マウスにおける、ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９ならびにＭｙｈ７ｂの発現の間には直接相関がある。ＧＡＰＤＨの発現は、コントロールとして測定した。
【図４】Ｍｙｈ７ｂおよびｍｉＲ−４９９は、心筋および遅骨格筋（slow skeletal muscle）において発現する。Ａ．ノーザン分析は、ｍｉＲ−４９９が心臓および遅骨格筋（例えばヒラメ筋）において発現することを示す。Ｍｙｈ７ｂについてのＲＴ−ＰＣＲは、ｍｉＲ−４９９がその宿主遺伝子と共発現することを示す。Ｂ．心臓および４種の骨格筋型（腓腹筋／足底（ＧＰ）、前脛骨筋（ＴＡ）、長趾伸筋（ＥＤＬ）、およびヒラメ筋）についてのｍｉＲ−４９９に関するリアルタイムＰＣＲ分析により、ｍｉＲ−４９９が心臓およびヒラメ筋において優勢に発現することが確認される。ＴＡおよびＥＤＬにおいては、ｍｉＲ−４９９のわずかなレベルの発現のみが検出できた。Ｃ．ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、胚形成期間中、Ｍｙｈ７ｂが心臓および体節において特異的に発現することを示す。
【図５】ｍｉＲ−４９９は、ミオシン発現に影響しない。Ａ．Ｍｙｈ７ｂについてのＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｍｉＲ−４９９の遺伝欠失がその宿主遺伝子、Ｍｙｈ７ｂの発現に影響しないことを示す。ＧＰ−腓腹筋／足底筋；ＴＡ−前脛骨筋；ＥＤＬ−長指伸筋。ＧＡＰＤＨの発現は、コントロールとして測定した。Ｂ．α−およびβ−ＭＨＣの両方についての野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合体（＋／−）、およびｍｉＲ−４９９ノックアウト（ＫＯ）動物からの心臓のウェスタンブロット分析は、ｍｉＲ−４９９の欠失がタンパク質レベルでいずれの遺伝子の発現にも影響しないことを示す。Ｃ．甲状腺ホルモン生合成を遮断し、β−ＭＨＣの強い誘発物質であるプロピルチオウラシル（ＰＴＵ）は、野生型（ＷＴ）およびｍｉＲ−４９９ノックアウト（ＫＯ）動物の両方において、α−ＭＨＣの減少およびβ−ＭＨＣの増加をもたらす。
【図６Ａ−Ｂ】ｍｉＲ−２０８のｉｎ  ｖｉｖｏノックダウンによるｍｉＲ−４９９の制御。Ａ．示す量の抗ｍｉＲ−２０８オリゴヌクレオチドまたは生理食塩液（Ｓａｌ）の尾部静脈注射の３日後のｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９の発現のノーザン分析。Ｂ．治療の２か月後の、単一８０ｍｇ／ｋｇ用量の抗ｍｉＲ−２０８、２日連続の２×８０ｍｇ／ｋｇ用量の抗ｍｉＲ−２０８、またはミスマッチコントロールオリゴヌクレオチド（ｍｍ）のいずれかを注射した動物の心臓組織のｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９の発現についてのノーザン分析。
【図６Ｃ−Ｄ】Ｃ．単一用量の抗ｍｉＲ−２０８の、２日連続の２用量の抗ｍｉＲ−２０８、または２日連続の２用量のミスマッチオリゴヌクレオチドを用いる治療の２か月後の心臓組織におけるｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８ｂ、α−ＭＨＣ、Ｍｙｈ７ｂ、およびβ−ＭＨＣの発現についてのリアルタイムＰＣＲ分析。Ｄ．抗ｍｉＲ−２０８（単一８０ｍｇ／ｋｇ用量もしくは２連続の８０ｍｇ／ｋｇ用量）またはミスマッチ（ｍｍ）コントロール治療の２か月後の心臓組織におけるβ−ＭＨＣ発現のウェスタンブロット分析。
【図７Ａ】ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９の二重ターゲティング。Ａ．野生型およびｍｉＲ−４９９ノックアウト動物の心臓組織におけるｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２０８ｂ、およびｍｉＲ−４９９についてのノーザン分析は、ＰＴＵに応答した、ｍｉＲ−２０８ｂの強い誘発を示す。ｍｉＲ−２０８ｂは、β−ＭＨＣと共発現し、その発現を表す。ｍｉＲ−４９９ノックアウト動物では、ｍｉＲ−２０８ｂの誘発は、野生型と同等である。しかしながら、ｍｉＲ−４９９ノックアウト動物におけるｍｉＲ−２０８のノックダウンは、ＰＴＵによるｍｉＲ−２０８ｂ発現の誘発を抑制する。
【図７Ｂ】Ｂ．ＰＴＵの存在下および不在下での、野生型動物、ｍｉＲ−２０８ノックアウト動物、ｍｉＲ−４９９ノックアウト動物、および抗ｍｉＲ−２０８を用いて治療したｍｉＲ−４９９ノックアウト動物の心臓組織におけるｍｉＲ−２０８、α−ＭＨＣ、およびβ−ＭＨＣについてのリアルタイムＰＣＲ分析。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
心筋および骨格筋は、収縮の効率を規制する、ミオシンアイソフォームの発現を調節することによって、仕事負荷、甲状腺ホルモンシグナル伝達、および損傷などの様々な病態生理学的刺激に応答する。
【００２０】
成人の心臓におけるα−およびβ−ＭＨＣアイソフォームの比は、心収縮性の主要な決定因子である。β−ＭＨＣ、即ち成人の心臓の主なミオシンアイソフォームは、比較的低いＡＴＰアーゼ活性を示すのに対し、α−ＭＨＣは、高いＡＴＰアーゼ活性を有する。心筋梗塞や高血圧、その他の障害など、様々な病理学的刺激に応答して、β−ＭＨＣ発現は増大し、一方、α−ＭＨＣ発現は、結果として起こる筋原線維ＡＴＰアーゼ活性の低下および心筋線維の短縮速度の低下と共に減少し、最終的には収縮不全に至る。注目すべきことに、心臓のα−ＭＨＣ含量の少しの変化は、心仕事量に対して深い影響力を及ぼす可能性がある。
【００２１】
最近、本発明者らは、α−ミオシン重鎖遺伝子のイントロンによってコードされ、かつ心臓ストレスに応答したβ−ＭＨＣ発現の上方制御および心臓の速骨格筋遺伝子の抑制に必要とされる、心臓特異的ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−２０８ａについて報告した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれている同時係属出願ＷＯ２００８／０１６９２４参照）。
【００２２】
本発明者らはまた、ｍｉＲ−２０８ａが、密接に関係するｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−４９９（Ｍｙｈ７ｂ遺伝子のイントロンによってコードされている）の心臓発現にも必要とされていることを最近発見した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれている同時係属出願ＰＣＴ／ＵＳ０８／７１８３７参照）。心臓、ならびに遅骨格筋でのＭｙｈ７ｂおよびｍｉＲ−４９９の発現は、ＭＥＦ２転写因子、横紋筋遺伝子発現のシグナル依存性レギュレーターによって制御される。ｍｉＲ−４９９またはｍｉＲ−２０８の強制発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの速遅筋線維変換を媒介するのに十分である。ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９は、Ｔｈｒａｐ１、甲状腺ホルモン受容体コレギュレーター、および転写因子のＰＵＲファミリーのメンバーの発現を、負に調節することができ、即ち、心筋および骨格筋でのβ−ＭＨＣ発現を負に調節する。Ｓｏｘ６は、遅筋線維型特異的遺伝子のリプレッサーとして機能する。野生型筋管でのＳｏｘ６発現のノックダウンは、β−ＭＨＣ発現に著しい増加をもたらす。β−ＭＨＣプロモーターの分析は、胎児骨格筋の線維型分化および心臓のβ−ＭＨＣ調節においてＳｏｘ６が極めて重要な役割を演ずることを示唆する、Ｓｏｘコンセンサス配列を明らかにした。これらの知見は、収縮性およびシグナル応答性を管理する調節ｍｉＲＮＡをコードすることによって、横紋筋のＭｙｈ遺伝子が遺伝子発現パターンを調節するという、一般的な調節機構を明らかにする（van Roojiら、(2009) Developmental Cell, Vol. 17: 662-673）。
【００２３】
本発明は、心臓ストレス応答を抑制する際に、心臓細胞におけるｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９の両方の下方制御が相乗効果をもたらすという発見に部分的に基づく。心臓細胞におけるｍｉＲ−２０８ａ発現の阻害は、β−ＭＨＣのストレス誘発性発現の低下をもたらす。しかしながら、この効果は、ｍｉＲ−２０８阻害剤の投与の２か月後まで観察されない。発明者らは、驚くべきことに、ｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−４９９の両方の阻害が、投与のほぼ直後にストレス誘発性β−ＭＨＣ発現の抑制をもたらし、したがって、心臓ストレス応答に対する効果を加速させることを見出した。したがって、心疾患の治療および予防のために同時にまたは連続してｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９の発現を調節することによって骨格筋および心筋遺伝子発現を操作するための戦略を、これらの発見に照らして記述する。
【００２４】
ｍｉＲ−２０８ａは、α−ＭＨＣ遺伝子のイントロンに位置する。正確なイントロン位置は、特定の種および特定の転写に依存する。例えば、ヒトでは、ｍｉＲ−２０８ａはα−ＭＨＣ遺伝子の２８番目のイントロンにコードされ、一方、マウスでは、２９番目のイントロンにコードされる。ヒト、マウス、ラットおよびイヌにおける、ｍｉＲ−２０８ａのプレ−ｍｉＲＮＡコード配列を、以下にそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４として示す。成熟ｍｉＲ−２０８ａ配列を、配列番号５に記載する。α−ＭＨＣと同様、ｍｉＲ−２０８ａは心臓内で単独で発現する。
【００２５】
【化１】
0005943608.tif 000002
【００２６】
ｍｉＲ−４９９のゲノム位置の分析により、α−ＭＨＣ遺伝子のホモログであるＭｙｈ７ｂ遺伝子の２０番目のイントロンに含まれることが示された。マウス、ラット、ヒト、イヌ、オポッサム、ニワトリおよびＸ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのｍｉＲ−４９９のプレ−ｍｉＲＮＡコード配列を、それぞれ配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２として示す。配列番号１３は、マウス前駆配列のステムループ構造であり、配列番号１４は成熟ｍｉＲ−４９９配列である。Ｍｙｈ７ｂ遺伝子は脊椎動物間で保存され、心臓および遅骨格筋（例えばヒラメ筋）内で単独で発現する。
【００２７】
【化２】
0005943608.tif 000003
【化３】
0005943608.tif 000004
【００２８】
本発明者らは、β−ＭＨＣ遺伝子のイントロン３１に位置する、ｍｉＲ−２０８ｂと呼ばれるｍｉＲ−２０８ａの第２のバージョンを含むゲノムも発見し、β−ＭＨＣと同様、ｍｉＲＮＡ−２０８ｂが心臓および遅骨格筋（例えばヒラメ筋）内で単独で発現することを発見した。ｍｉＲ−２０８ｂで制御される遺伝子には、例えば、Ｓｐ３、ミオスタチン、ＰＵＲベータ、ＴＨＲＡＰ１および速骨格筋タンパク質遺伝子が含まれる。このｍｉＲＮＡの配列は、ｍｉＲ−２０８ａと大幅に重複し、特定のｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的を規定する「シード領域」における相同性は１００％である。したがって、ｍｉＲ−２０８ｂはヒトにおける心収縮性および骨格筋収縮性に対し、深い影響力を有することができる。プレｍｉＲ−２０８ｂ配列は複数の哺乳類種（例えば、ヒト、マウス、ラットおよびイヌ）間において保存されている。プレｍｉＲ−２０８ｂ配列ならびに成熟ｍｉＲ−２０８ｂ配列を以下に示す：
【化４】
0005943608.tif 000005
【００２９】
本明細書において開示されるＲＮＡ配列がデオキシリボヌクレオチドを必要とする実施態様において使用される場合、チミジン残基がウリジン残基の代わりに用いられることが理解される。同様に、リボヌクレオチドを必要とする実施態様では、ウリジン残基は、本明細書において開示されるＤＮＡ配列中のチミジン残基の代わりに用いられる。
【００３０】
１つの実施態様では、本発明は、対象の心臓細胞におけるｍｉＲ−２０８（例えばｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂあるいは言い換えればｍｉＲ２０８ａ／ｍｉＲ２０８ｂ）ならびにｍｉＲ−４９９のいずれかまたは両方の発現ならびに／または活性を標的とすることによって、ヒトを含む、病的な心臓肥大、心筋梗塞、または心不全の治療の必要がある対象において、病的な心臓肥大、心筋梗塞、または心不全を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様では、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤およびｍｉＲ−４９９の阻害剤は、対象の心臓細胞におけるｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９の発現または活性を低下させるために対象に投与される。
【００３１】
別の実施態様では、前記の必要がある対象は、病的な心臓肥大、心不全、または心筋梗塞を発症する危険性があり得る。そのような対象は、これらに限定されないが、長期にわたって管理されていない高血圧、矯正されていない弁膜症、慢性アンギナ、最近の心筋梗塞、心疾患に対する先天的素因、または病的な肥大を含めた、１または複数の危険因子を示す可能性がある。危険性のある対象は、心臓肥大に対して遺伝的素因を有すると診断され得るか、または心臓肥大の家族歴を有する可能性がある。
【００３２】
好ましくは、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤およびｍｉＲ−４９９の阻害剤の両方の対象への投与の結果、対象の心臓肥大、心不全、または心筋梗塞の１または複数の症状が改善され、または心臓肥大から心不全への移行が遅くなる。１または複数の改善される症状は、例えば、高い運動能力、高い心臓駆出容積、低い左心室拡張末期圧、低い肺毛細血管楔入圧、高い心拍出量、高い心係数、低い肺動脈圧、低い左心室収縮末期および拡張末期径、低下した心臓線維症、心筋での少ないコラーゲン沈着、低い左心室および右心室壁応力、低い壁張力、高い生活の質、および低い疾患関連罹患率または死亡率であってもよい。
【００３３】
本発明の１つの実施態様では、心臓ストレス応答は、ｍｉＲ−２０８（例えばｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ）ならびにｍｉＲ−４９９の阻害剤の投与後に対象において低下する。心臓ストレス応答は、とりわけ、心筋細胞肥大、心臓の線維症、心臓細胞におけるα−ＭＨＣの発現低下、および／または心臓細胞におけるβ−ＭＨＣの発現増大を含む。対象へのｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤およびｍｉＲ−４９９の阻害剤の両方の投与は、いずれかの阻害剤のみの投与と比較して、心臓ストレス応答に対するより迅速な効果をもたらす。例えば、心臓ストレス応答の低下は、阻害剤の投与後、８週間未満、６週間未満、４週間未満、３週間未満、２週間未満、１週間未満、５日未満、３日未満、または１日未満で生じる。他の実施態様では、心臓ストレス応答の低下は、阻害剤の投与後、１２時間未満で生じる。
【００３４】
いくつかの実施態様では、ｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂ）阻害剤およびｍｉＲ−４９９阻害剤は、成熟ｍｉＲ−４９９および／またはｍｉＲ−２０８ａもしくはｍｉＲ−２０８ｂ配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであってもよい。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を有する。例えば、適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１種または複数の「配座的に制限された」または二環式糖ヌクレオシド修飾、例えば「ロックト核酸」からなるものであってもよい。「ロックト核酸」（ＬＮＡ）は、リボース糖部分の２’および４’炭素の間に余分な橋を含有することによって、ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドに高い熱安定性を与える「ロックされた」構造をもたらす、修飾されたリボヌクレオチドである。ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡまたは他の修飾ヌクレオチドおよびリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの組合せを含有することができる。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖−リン酸主鎖ではなくペプチドをベースにした主鎖を含有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含んでいてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドが含有していてもよいその他の化学修飾には、限定するものではないが、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ、および４’チオ修飾などの糖修飾と、１種または複数のホスホロチオエート、モルホリノ、またはホスホノカルボキシレート結合などの主鎖修飾が含まれる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第６，６９３，１８７号および第７，０６７，６４１号参照）。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、長さがより短いもの（例えば１５未満のヌクレオチド）は、限定するものではないが、ＬＮＡ、２環式ヌクレオシド、ホスホノギ酸、２’Ｏアルキルなどの１または複数の、親和性を高める修飾を含むことができる。いくつかの実施態様では、適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’および３’末端の両方に２’−Ｏ−メトキシエチル−修飾リボヌクレオチドを含有し少なくとも１０デオキシリボヌクレオチドが中央にある、２’−Ｏ−メトキシエチル「ギャップマー」である。これらの「ギャップマー」は、ＲＮＡ標的のＲＮアーゼＨ依存性分解機構を引き起こすことが可能である。参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第６，８３８，２８３号に記載されるように、安定性を高め効力を改善するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドのその他の修飾は当技術分野で知られており、本発明の方法で使用するのに適している。ｍｉＲＮＡの活性を阻害するのに有用な好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約５〜約５０ヌクレオチド、長さが約１０〜約３０ヌクレオチド、または長さが約２０〜約２５ヌクレオチドである。ある実施態様では、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約８〜約１８のヌクレオチドであり、他の実施態様では、長さが約１２〜１６のヌクレオチドである。特に、ｍｉＲ２０８ａまたはｍｉＲ２０８ｂに相補的である任意の８塩基長またはそれ以上のもの、つまり、ｍｉＲの５’末端から開始して、成熟配列の３’末端に至る、ｍｉＲ２０８ａまたはｍｉＲ２０８ｂ中の任意の連続する配列に相補的な、任意の抗ｍｉｒ配列が、使用されてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、いくつかの場合、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも部分的に相補的な配列、例えば、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的な配列を含んでいてもよい。いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して実質的に相補的であってもよく、即ち、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的であってもよい。１つの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して１００％相補的な配列を含む。
【００３５】
他の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンタゴｍｉｒである。「アンタゴｍｉｒ」は、ｍｉＲＮＡ配列に少なくとも部分的に相補的な、一本鎖の、化学修飾されたリボヌクレオチドである。アンタゴｍｉｒは、２’−Ｏ−メチル−糖修飾など、１または複数の修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施態様では、アンタゴｍｉｒは、修飾ヌクレオチドのみ含む。アンタゴｍｉｒは、部分または完全ホスホロチオエート主鎖をもたらす１または複数のホスホロチオエート結合を含んでいてもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達および安定性を促進させるために、アンタゴｍｉｒは、コレステロールなどのステロイド、脂肪酸、ビタミン、炭水化物、ペプチド、または他の小分子リガンドにその３’末端で結合してもよい。ｍｉＲＮＡを阻害するのに適したアンタゴｍｉｒは、長さが約１５〜約５０ヌクレオチドであってもよく、より好ましくは長さが約１８〜約３０ヌクレオチド、最も好ましくは長さが約２０〜約２５ヌクレオチドである。「部分的に相補的」は、標的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的な配列を指す。アンタゴｍｉｒは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的であってもよい。いくつかの実施態様では、アンタゴｍｉｒは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して実質的に相補的であってもよく、即ち、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が標的ポリヌクレオチド配列に対して相補的である。その他の実施態様では、アンタゴｍｉｒは、成熟ｍｉＲＮＡ配列に対して１００％相補的である。
【００３６】
いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−４９９の阻害剤およびｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤は、成熟ｍｉＲ−４９９および成熟ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ配列と完全に相補的な配列を含むアンタゴｍｉｒである。１つの実施態様において、ｍｉＲ−４９９の阻害剤は、５’−ＵＵＡＡＧＡＣＵＵＧＣＡＧＵＧＡＵＧＵＵＵ−３’（配列番号１４）と、部分的または完全に相補的な配列を有するアンタゴｍｉｒである。別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａの阻害剤は、５’−ＡＵＡＡＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＣＵＵＧＵ−３’（配列番号５）と、部分的または完全に相補的な配列を有するアンタゴｍｉｒである。別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａの阻害剤は、配列５’−ＡＣＡＡＧＣＵＵＵＵＵＧＣＵＣＧＵＣＵＵＡＵ−３’（配列番号１５）を有するアンタゴｍｉｒである。さらに別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａの阻害剤は、配列番号１６の配列を有するアンタゴｍｉｒである。別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤は、５’−ＡＵＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＧＧＵＵＵＧＵ−３’（配列番号１９）と、部分的または完全に相補的な配列を有するアンタゴｍｉｒである。
【００３７】
いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−４９９の阻害剤およびｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤は、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。１つの実施態様において、ｍｉＲ−４９９の阻害剤は、５’−ＵＵＡＡＧＡＣＵＵＧＣＡＧＵＧＡＵＧＵＵＵ−３’（配列番号１４）と、実質的に相補的な配列を含む、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａの阻害剤は、５’−ＡＵＡＡＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＣＵＵＧＵ−３’（配列番号５）と、実質的に相補的な配列を含む、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤は、５’−ＡＵＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＧＧＵＵＵＧＵ−３’（配列番号１９）と、実質的に相補的な配列を含む、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書において、「実質的に相補的な」とは、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、成熟または前駆ｍｉＲＮＡ配列）と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相補的な配列を指す。
【００３８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−４９９またはｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂの前駆ｍｉＲＮＡ配列（プレ−ｍｉＲＮＡ）に実質的に相補的な配列を含み得る。いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、プレ−ｍｉＲ−４９９またはプレ−ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ配列のステムループ領域の外側に位置する配列と実質的に相補的な配列を含む。１つの実施態様において、ｍｉＲ−４９９機能の阻害剤は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるプレ−ｍｉＲ−４９９配列と実質的に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａ機能の阻害剤は、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるプレ−ｍｉＲ−２０８ａ配列と実質的に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８ｂ機能の阻害剤は、配列番号１８のプレ−ｍｉＲ−２０８ｂ配列と実質的に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３９】
本発明の別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９の両方を同時に阻害するために、単一核酸（single nucleic acid）分子を用い得る。例えば、単一核酸は、成熟ｍｉＲ−２０８ａ配列（例えば、配列番号５）に少なくとも部分的に相補的な配列および成熟ｍｉＲ−４９９配列（例えば、配列番号１４）に少なくとも部分的に相補的な配列を含み得る。別の実施態様において、単一核酸は、成熟ｍｉＲ−２０８ｂ配列（例えば、配列番号１９）に少なくとも部分的に相補的な配列および成熟ｍｉＲ−４９９配列（例えば、配列番号１４）に少なくとも部分的に相補的な配列を含み得る。さらに別の実施態様において、単一核酸は、プレ−ｍｉＲ−２０８ａ配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４）に少なくとも部分的に相補的な配列およびプレ−ｍｉＲ−４９９配列（例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２）に少なくとも部分的に相補的な配列を含み得る。別の実施態様において、単一核酸は、プレ−ｍｉＲ−２０８ｂ配列（例えば、配列番号１８）に少なくとも部分的に相補的な配列およびプレ−ｍｉＲ−４９９配列（例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２）に少なくとも部分的に相補的な配列を含み得る。単一核酸は、さらに、ｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）とｍｉＲ−４９９標的配列との間に、１または複数のスペーサーヌクレオチドを含み得る。例えば、単一核酸は、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂとｍｉＲ−４９９標的配列との間に、約１〜約２００のスペーサーヌクレオチド、より好ましくは約５〜約１００のスペーサーヌクレオチド、最も好ましくは約１０〜約５０のスペーサーヌクレオチドを含み得る。
【００４０】
本明細書に記載の、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９の任意の阻害剤は、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤およびｍｉＲ−４９９阻害剤をコードする発現ベクターを細胞に送達することにより、標的細胞（例えば心臓細胞、骨格筋細胞）に送達することができる。ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤およびｍｉＲ−４９９の阻害剤は、同一の発現ベクターによってコードされることができる。あるいは、ｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）の阻害剤およびｍｉＲ−４９９の阻害剤は、別々の発現ベクター上にコードされる。「ベクター」とは、対象核酸を細胞内部へと送達するのに用いることができる物質の組成物である。直鎖ポリヌクレオチド、イオン化合物または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスが含まれるがこれらに限定されない多数のベクターが当技術分野で知られている。したがって、「ベクター」という用語は、自己複製型のプラスミドまたはウイルスを包含する。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるがこれらに限定されない。発現コンストラクトは、生細胞内で複製することもでき、合成することもできる。本出願の目的において、「発現コンストラクト」、「発現ベクター」、および「ベクター」という用語は、互換的に用いられ、一般的で例示的な意味において本発明の適用を示すものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【００４１】
１つの実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂおよび／またはｍｉＲ−４９９の阻害剤を発現する発現ベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするオリヌクレオチドに「作動的に連結された（operably linked）」プロモーターを含み、ここで、発現したアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、ｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）および／またはｍｉＲ−４９９の成熟配列に、部分的または完全に相補的である。本明細書において、「作動的に連結された」または「転写制御下にある」という語句は、プロモーターが、ポリヌクレオチドに対して、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始および該ポリヌクレオチドの発現を制御するのに適正な位置および方向にあることを意味する。別の実施態様において、発現ベクターは、本明細書に記載のｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）およびｍｉＲ−４９９の両方を標的とする単一核酸をコードしてもよく、ここで、単一核酸はプロモーターに作動的に連結する。別の実施態様において、単一発現ベクターは、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤とｍｉＲ−４９９阻害剤の両方をコードしてもよく、ここで、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤は、ｍｉＲ−４９９阻害剤とは異なるプロモーターによって作動する。
【００４２】
本明細書において、「プロモーター」とは、細胞の合成機構または導入された合成機構により認識され、遺伝子に特異的な転写を開始するのに必要とされるＤＮＡ配列を指す。適切なプロモーターは、ＲＮＡ  ｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩ、ｐｏｌＩＩＩおよびウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス長末端反復）を含むがこれらに限定されない。１つの実施態様において、プロモーターは組織特異的プロモーターである。特に関与するのは筋特異的プロモーターであり、より特定すれば、心臓特異的プロモーターである。これらには、ミオシン軽鎖２プロモーター（Franzら、(1994) Cardioscience, Vol. 5(4):235-43; Kellyら(1995) J. Cell Biol., Vol. 129(2):383-396）、アルファアクチンプロモーター（Mossら (1996) Biol. Chem., Vol. 271(49):31688-31694）、トロポニン１プロモーター（Bhavsarら(1996) Genomics, Vol. 35(1):11-23）；Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換プロモーター（Barnesら(1997) J. Biol. Chem., Vol. 272(17):11510-11517）、ジストロフィンプロモーター(Kimuraら(1997) Dev. Growth Differ., Vol. 39(3):257-265)、アルファ７インテグリンプロモーター（ZioberおよびKramer (1996) J. Bio. Chem., Vol. 271(37):22915-22）、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーター(LaPointeら(1996) Hypertension, Vol. 27(3 Pt 2):715-22)およびアルファＢ−クリスタリン／低分子熱ショックタンパク質プロモーター（Gopal-Srivastava (1995) J. Mol. Cell. Biol., Vol. 15(12):7081-7090）、アルファミオシン重鎖プロモーター（Yamauchi-Takiharaら(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86(10):3504-3508）およびＡＮＦプロモーター（LaPointeら(1988) J. Biol. Chem., Vol. 263(19):9075-9078）が含まれる。
【００４３】
特定の実施態様において、ｍｉＲ−４９９および／またはｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤をコードするポリヌクレオチドに作動的に連結したプロモーターは、誘導プロモーターであり得る。誘導プロモーターは技術分野で既知であり、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答因子、アデノウイルス後期プロモーターおよび誘導マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲが含まれるがこれらに限定されない。発現ベクターは、本明細書に記載のｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）およびｍｉＲ−４９９の両方を標的とする単一核酸をコードしてもよく、ここで、単一核酸は誘導プロモーターに作動的に連結する。あるいは、単一発現ベクターは、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤およびｍｉＲ−４９９阻害剤をコードしてもよく、ここで、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤は第１誘導プロモーターによって作動し、ｍｉＲ−４９９阻害剤は第２誘導プロモーターによって作動する。別の実施態様において、第１発現ベクターは、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤をコードしてもよく、ここで、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤は第１誘導プロモーターに作動的に連結し、そして、第２発現ベクターは、ｍｉＲ−４９９阻害剤をコードしてもよく、ここで、ｍｉＲ−４９９阻害剤は第２誘導プロモーターに作動的に連結する。ｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）阻害剤およびｍｉＲ−４９９阻害剤の発現を制御するための、誘導プロモーターと構成的プロモーターの他の組み合わせもまた企図される。例えば、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤は構成的プロモーターを用いたベクターから発現し得る一方、ｍｉＲ−４９９阻害剤は誘導プロモーターを用いたベクターから発現し得る。
【００４４】
本発明は、処理後にｍｉＲ−４９９阻害剤およびｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤を除去（scavenging）または取り除く（clearing）方法もまた含む。前記方法は、心臓組織中でｍｉＲ−４９９阻害剤およびｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤の結合部位を過剰発現する工程を含み得る。別の実施態様において、本発明は、処理後にｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）を除去または取り除く方法を提供する。１つの実施態様において、前記方法は、骨格筋および心筋特異的プロモーター（筋クレチンキナーゼ（ＭＣＫ））を用いた骨格筋中でのｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂの結合部位領域の過剰発現を含む。前記結合部位領域は、好ましくはｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂのためのシード領域の配列を含む。シード領域は、２〜８塩基にわたるｍｉＲＮＡの５’部分であり、標的認識に重要である。いくつかの実施態様において、結合部位は、例えばＴＨＲＡＰ１またはＰＵＲベータのような、ｍｉＲ−４９９またはｍｉＲ−２０８の１または複数の標的の３’ＵＴＲからの配列を含み得る。別の実施態様において、ｍｉＲＮＡの機能を弱めるか停止するために、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８の後、ｍｉＲ−４９９阻害剤およびｍｉＲ−２０８阻害剤を投与し得る。
【００４５】
本発明の別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）の阻害剤およびｍｉＲ−４９９の阻害剤は、同時投与される。ｍｉＲ−２０８阻害剤およびｍｉＲ−２０８は、単一製剤中で投与され得る。例えば、ｍｉＲ−２０８阻害剤およびｍｉＲ−４９９阻害剤を含む医薬組成物を、２つの阻害剤を同時投与するために用いることができる。あるいは、ｍｉＲ−２０８阻害剤およびｍｉＲ−４９９阻害剤は、本願明細書中に記載の発現ベクターのような単一核酸によってコードされ得る。長期間（たとえば、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年または５年）にわたって２つの阻害剤の同時投与を複数回行うことができる。
【００４６】
いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）の阻害剤およびｍｉＲ−４９９の阻害剤は、連続して投与される。１つの実施態様において、ｍｉＲ−２０８の阻害剤は、ｍｉＲ−４９９の阻害剤に先立って投与される。別の実施態様において、ｍｉＲ−４９９の阻害剤は、ｍｉＲ−２０８の阻害剤に先立って投与される。ｍｉＲ−２０８阻害剤およびｍｉＲ−４９９阻害剤の投与を分離する間隔は、数分〜数日の範囲であり得る。例えば、該間隔は、約１時間〜約７２時間、６時間〜約４８時間または約１２時間〜約２４時間であることができる。好ましい実施態様において、ｍｉＲ−２０８阻害剤とｍｉＲ−４９９阻害剤の投与の間の間隔は、少なくとも２４時間である。本発明者らは、ｍｉＲ−４９９阻害剤を、ｍｉＲ−２０８阻害剤の少なくとも２４時間前に投与すると、ｍｉＲ−２０８阻害剤投与の約３日後のストレス誘導性β−ＭＨＣ発現が少なくとも約５０％低下することを確認した。ｍｉＲ−４９９阻害剤を投与しない場合、ｍｉＲ−２０８阻害剤投与の少なくとも約２ヶ月後まで、ストレス誘導性β−ＭＨＣ発現における同等の効果は確認されなかった。
【００４７】
本発明の他の実施態様において、持続的効果を発揮するために、ｍｉＲ−２０８阻害剤およびｍｉＲ−４９９阻害剤の連続投与は１または複数回実施される。この点では、各種の組合せを用いることができる。例示を目的として述べると、ｍｉＲ−４９９の阻害剤が「Ａ」であり、ｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）の阻害剤が「Ｂ」である場合、合計投与回数３および４回に基づく以下の順列が例示的である：
【化５】
0005943608.tif 000006
【００４８】
他の組合せも同様に意図される。
【００４９】
好ましくは、対象の心臓細胞におけるｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）およびｍｉＲ−４９９の発現または活性は、ｍｉＲ−２０８阻害剤およびｍｉＲ−４９９阻害剤の投与後に低下する。特定の実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂおよび／またはｍｉＲ−４９９の発現または活性は、ｍｉＲ−２０８阻害剤およびｍｉＲ−４９９阻害剤の投与後、５０％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超または９５％超、５０％超低下する。１つの実施態様において、阻害剤の投与後、対象の心臓細胞におけるｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９の発現または活性は、６０％超低下する。別の実施態様において、阻害剤の投与後、対象の心臓細胞におけるｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９の発現または活性は、８０％超低下する。さらに別の実施態様において、阻害剤の投与後、対象の心臓細胞におけるｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９の発現または活性は、９０％超低下する。
【００５０】
本発明はまた、心筋および／または骨格筋の収縮性を制御する方法も含む。成人骨格筋繊維は、特異的収縮および代謝特性に基づき、速単収縮および遅単収縮サブタイプに分類される。これらの特性は、ミオシン軽鎖および重鎖、トロポミオシンおよびトロポニンならびにミオグロビンの、速収縮および遅収縮タンパク質アイソフォームの特定のセットの発現を反映する（Nayaら (2000) J Biol Chem, Vol. 275(7):4545-4548）。遅−単収縮筋は、主に、姿勢維持および持続した自発運動のような慢性的活動に用いられる。速−単収縮繊維は、主に、力強い爆発的運動に用いられる。成人骨格筋表現型は、不変ではなく、負荷耐性および収縮使用パターンのバリエーションを調節する能力を保持し、形態、表現型および収縮特性の適応をもたらす。
【００５１】
両方のｍｉＲ−２０８ａ対立遺伝子を欠くマウスの心臓において、複数の速骨格筋収縮タンパク質遺伝子の上方制御が観察された。この、ｍｉＲ−２０８ａノックアウトマウスの心臓における、速骨格筋収縮タンパク質遺伝子の上方制御は、ｍｉＲ−２０８が速骨格筋タンパク質遺伝子プログラムを抑制するように通常は機能することを示す。ｍｉＲ−２０８ａ変異マウスにおいて、ｍｉＲ−４９９発現の随伴的現象が観察され（実施例３参照）、ｍｉＲ−４９９も、速骨格筋収縮タンパク質遺伝子の発現の負の制御をすることが示唆された。上述したように、ｍｉＲ−２０８ｂも、遅骨格筋（例えば、ヒラメ筋）中で主に発現する。したがって、ｍｉＲ−２０８ｂは、ヒトにおける心筋および骨格筋収縮性に大規模な影響を有し得、また、速骨格筋遺伝子プログラムの制御および繊維特性の決定をし得る。本発明者らは、最近、ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９は、遅筋繊維遺伝子プログラムを活性化し、速筋繊維遺伝子プログラムを抑制することによって、筋繊維特性の特定において重要な役割を果たすことを示した。これらのｍｉＲＮＡの働きは、Ｓｏｘ６、ＰＵＲβ、Ｓｐ３およびＨＰ１βのような、遅筋繊維遺伝子の転写抑制因子の堆積（collection）により、一部介在される。骨格筋特異的ＭＣＫプロモーターｍｉＲ−４９９遺伝子組み換え動物を用いて、遅筋繊維タイプへの変換も明らかになった。さらに著しいことに、マウスに強制トレッドミルランニング計画を行うと、野生型同腹子と比較してｍｉＲ−４９９遺伝子組み換え動物は５０％超長く走り、速筋原繊維タイプからより遅い繊維タイプへの再プログラミングの結果として持久力が高まったことが示唆された。van Rooijら、(2009) Developmental Cell, Vol. 17:662-673)参照のこと。
【００５２】
１つの実施態様において、心筋および／または骨格筋収縮性の制御方法は、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）発現または活性のモジュレータを心筋および／または骨格筋細胞に投与する工程を含む。別の実施態様において、前記方法は、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ｂのモジュレータを投与する工程を含む。別の実施態様において、心臓収縮タンパク質遺伝子の発現を制御する方法であって、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）発現または活性のモジュレータを心臓細胞に投与する工程を含む方法が提供される。別の実施態様において、骨格筋収縮タンパク質遺伝子の発現を制御する方法であって、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）発現または活性のモジュレータを骨格筋細胞に投与する工程を含む方法が提供される。別の実施態様において、骨格筋収縮タンパク質遺伝子の発現を制御する方法であって、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ｂ発現または活性のモジュレータを骨格筋細胞に投与する工程を含む方法が提供される。さらに別の実施態様において、本発明は、骨格筋細胞の繊維タイプの交代を誘導する方法であって、骨格筋細胞に、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８発現または活性のモジュレータを骨格筋細胞に投与する工程を含む方法を提供する。別の実施態様において、骨格筋細胞の繊維タイプの交代を誘導する方法は、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ｂ発現または活性のモジュレータを骨格筋細胞に投与する工程を含む。モジュレータは、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８および／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現または活性のアゴニストまたは阻害剤であり得る。いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ａ（またはｍｉＲ−２０８ｂ）阻害剤を細胞に接触させることにより、細胞中のＴＨＲＡＰ１、ＰＵＲベータ、ミオスタチン、Ｓｐ３、ＨＰ１βおよびＳｏｘ６の発現が増大する。別の実施態様において、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ａ（またはｍｉＲ−２０８ｂ）のアゴニストを細胞に接触させることにより、細胞中のＴＨＲＡＰ１、ＰＵＲベータ、ミオスタチン、Ｓｐ３、ＨＰ１βおよびＳｏｘ６の発現が低下する。
【００５３】
本発明の特定の実施態様において、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）発現または活性の阻害剤を心臓細胞に投与する工程を含む、心臓細胞中のβ−ＭＨＣ発現を低下させる方法が提供される。１つの実施態様において、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ｂ発現または活性の阻害剤を骨格筋細胞に投与する工程を含む、骨格筋細胞中のβ−ＭＨＣ発現を低下させる方法が提供される。本発明の別の実施態様において、内因性ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ａ（またはｍｉＲ−２０８ｂ）発現または活性を増大させる工程あるいは心臓細胞および／または骨格筋細胞に外因性ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ａ（またはｍｉＲ−２０８ｂ）を投与する工程を含む、心臓細胞および／または骨格筋細胞中のβ−ＭＨＣ発現を上昇させる方法が提供される。
【００５４】
本発明の１つの実施態様において、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）発現または活性の阻害剤を心臓細胞に投与する工程を含む、心臓細胞中の速骨格筋収縮タンパク質遺伝子の発現を増大させる方法が提供される。別の実施態様において、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ｂ発現または活性の阻害剤を骨格筋細胞に投与する工程を含む、骨格筋細胞中の速骨格筋収縮タンパク質遺伝子の発現を増大させる方法が提供される。本発明の別の実施態様において、内因性ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ａ（またはｍｉＲ−２０８ｂ）発現または活性を増大させる工程あるいは心臓細胞および／または骨格筋細胞に外因性ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ａ（またはｍｉＲ−２０８ｂ）を投与する工程を含む、心臓細胞および／または骨格筋細胞中の骨格筋速筋収縮タンパク質遺伝子の発現を低下させる方法が提供される。本発明の方法によって増大または低下し得る速骨格筋収縮タンパク質遺伝子の例には、トロポニンＩ２；トロポニンＴ３、速骨格筋ミオシン軽鎖またはアルファ骨格筋アクチンが含まれるがこれらに限定されない。
【００５５】
骨格筋において、遅繊維遺伝子の抑制および速繊維遺伝子の活性は、非活動性萎縮、反重力への応答における筋肉消耗および脱神経を含むがこれらに限定されない多数の筋骨格系障害に関与する。したがって、骨格筋細胞における、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂと組み合わせたｍｉＲ−４９９の発現は、速繊維遺伝子を抑制することによって遅繊維遺伝子の相互発現を活性化することに有用であり得る。よって、本発明はまた、筋骨格系障害の治療または予防を必要とする対象において、筋骨格系障害を治療または予防する方法も包含する。１つの実施態様において、前記方法は、ｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）のアゴニストおよびｍｉＲ−４９９のアゴニストを対象に投与する工程を含み、ここで、投与後、対象の骨格細胞におけるｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９の発現または活性が増大する。別の実施態様において、前記方法は、ｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストおよびｍｉＲ−４９９のアゴニストを対象に投与する工程を含み、ここで、投与後、対象の骨格細胞におけるｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９の発現または活性が増大する。好ましくは、ｍｉＲ−４９９アゴニストおよびｍｉＲ−２０８ａ（またはｍｉＲ−２０８ｂ）アゴニストの投与後、対象の骨格筋細胞における１または複数の速骨格筋遺伝子の発現が低下する。１または複数の速骨格筋遺伝子は、トロポニンＩ２；トロポニンＴ３、速骨格筋ミオシン軽鎖およびアルファ骨格筋アクチンを含むことができるがこれらに限定されない。
【００５６】
別の実施態様において、本発明は、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）のアゴニストを骨格筋に投与する工程を含む、低下した重力環境への応答における筋肉消耗の治療または予防方法を提供する。別の実施態様において、低下した重力環境への応答における筋肉消耗の治療または予防方法は、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストを骨格筋に投与する工程を含む。さらに別の実施態様において、本発明は、ｍｉＲ−４９９のアゴニストおよびｍｉＲ−２０８（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）のアゴニストを骨格筋に投与する工程を含む、筋萎縮の治療または予防方法を提供する。別の実施態様において、筋萎縮の治療または予防方法は、ｍｉＲ−４９９のアゴニストおよびｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストを骨格筋に投与する工程を含む。
【００５７】
いくつかの実施態様において、ｍｉＲ−２０８（ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）のアゴニストおよびｍｉＲ−４９９のアゴニストは、成熟ｍｉＲ−２０８（ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）および／またはｍｉＲ−４９９配列をコードするポリヌクレオチドである。１つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、成熟ｍｉＲ−２０８ａ配列（配列番号５）および成熟ｍｉＲ−４９９配列（配列番号１４）を含む。別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、成熟ｍｉＲ−２０８ｂ配列（配列番号１９）および成熟ｍｉＲ−４９９配列（配列番号１４）を含む。別の実施態様において、ｍｉＲ−４９９のアゴニストおよびｍｉＲ−２０８（ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）のアゴニストは、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８（ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）のプリ−ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドであり得る。あるいは、ｍｉＲ−２０８（ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）のアゴニストおよびｍｉＲ−４９９のアゴニストは、それぞれｍｉＲＮＡの成熟配列またはプレ−ｍｉＲＮＡ配列を含む、別々のポリヌクレオチドであり得る。成熟ｍｉＲ−４９９および／またはｍｉＲ−２０８（ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）配列を含むポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドは、ロックト核酸、ペプチド核酸、糖修飾、例えば、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロおよび４’チオ修飾、ならびにバックボーン修飾、例えば、１または複数のホスホロチオエート、モルホリノまたはホスホノカルボキシレート連結などの、１または複数の化学修飾を含み得る。１つの実施態様において、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８および／またはｍｉＲ−２０８ｂ配列を含むポリヌクレオチドは、コレステロールに共有結合している。
【００５８】
別の実施態様において、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８（ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）のアゴニストは、発現ベクター上にコードされ得る。ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８（ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）発現のための発現ベクターは、ｍｉＲ−４９９および／またはｍｉＲ−２０８（ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ）をコードするポリヌクレオチドに作動的に連結した少なくとも１つのプロモーターを含む。ｍｉＲ−４９９をコードするポリヌクレオチドは、一次ｍｉＲＮＡ−４９９配列（プリ−ｍｉＲ−４９９）、前駆体ｍｉＲＮＡ−４９９配列（プレ−ｍｉＲ−４９９）または成熟ｍｉＲ−４９９配列をコードし得る。ｍｉＲ−２０８ａ／ｍｉＲ−２０８ｂをコードするポリヌクレオチドは、一次ｍｉＲＮＡ−２０８ａ／２０８ｂ配列（プリｍｉＲ−２０８／プリｍｉＲ−２０８ｂ）、前駆体ｍｉＲＮＡ−２０８／２０８ｂ配列（プレｍｉＲ−２０８ａ／プレｍｉＲ−２０８ｂ）または成熟ｍｉＲ−２０８ａ／２０８ｂ配列をコードし得る。いくつかの実施態様において、発現ベクターは、プロモーターに作動的に連結したポリヌクレオチドを含み、ここで、前記ポリヌクレオチドは、配列番号５および配列番号１４の配列を含む。別の実施態様において、発現ベクターは、プロモーターに作動的に連結したポリヌクレオチドを含み、ここで、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１９および配列番号１４の配列を含む。このようなポリヌクレオチドは、約１８〜約２０００ヌクレオチド長、約７０〜約２００ヌクレオチド長、約２０〜約５０ヌクレオチド長または約１８〜２５ヌクレオチド長であり得る。別の実施態様において、発現ベクターは、ｍｉＲ−４９９アゴニスト（例えば、ｍｉＲ−４９９配列を含むポリヌクレオチド）およびｍｉＲ−２０８アゴニスト（例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ配列を含むポリヌクレオチド）を、異なるプロモーターから発現し得る。ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂをコードするポリヌクレオチドは、イントロンをコードする核酸またはｍＲＮＡの非翻訳領域をコードする核酸または非コードＲＮＡ中に位置し得る。１つの実施態様において、発現ベクターは、Ｍｙｈ７ｂ遺伝子の２０番目のイントロンからの配列またはＭｙｈ７（β−ＭＨＣ）遺伝子の３１番目のイントロンからの配列を含み得る。
【００５９】
対象に対し、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストは、ｍｉＲ−４９９のアゴニストと同時投与し得る。２つのアゴニストは、単一製剤、例えば、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂアゴニストとｍｉＲ−４９９アゴニストを含む医薬組成物で投与し得る。あるいは、２つのアゴニスト（例えば、ｍｉＲ−２０８ａとｍｉＲ−４９９またはｍｉＲ−２０８ｂとｍｉＲ−４９９）は、２つのｍｉＲＮＡの成熟またはプレ−ｍｉＲＮＡ配列をコードする単一のポリヌクレオチドであり得る。２つのアゴニストの複数回の同時投与は、長期間（たとえば、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、３年、４年または５年）にわたって行うことができる。
【００６０】
特定の実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストとｍｉＲ−４９９のアゴニストは連続して投与される。１つの実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストは、ｍｉＲ−４９９のアゴニストに先立って投与される。別の実施態様において、ｍｉＲ−４９９のアゴニストは、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストに先立って投与される。アゴニストの投与を分離する間隔は、数分〜数週の範囲、例えば、約１時間〜約７２時間、６時間〜約４８時間または約１２時間〜約２４時間であることができる。好ましい実施態様において、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂアゴニストとｍｉＲ−４９９アゴニストの投与の間の間隔は、少なくとも２４時間である。
【００６１】
本発明はまた、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤またはアゴニストを含む医薬組成物を包含する。臨床適用が企図される場合、医薬組成物は意図する適用に適切な形態に調製されるであろう。一般的に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物に有害であり得る他の不純物を実質的に含まない組成物の調製を伴うであろう。
【００６２】
１つの実施態様において、医薬組成物は、有効用量のｍｉＲ−４９９阻害剤および／または有効用量のｍｉＲ−２０８ａもしくはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤を含む。別の実施態様において、医薬組成物は、有効用量のｍｉＲ−４９９アゴニストおよび／または有効用量のｍｉＲ−２０８ａもしくはｍｉＲ−２０８ｂアゴニストを含む。「有効用量」は、有利または所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。本発明のｍｉＲＮＡ阻害剤またはｍｉＲＮＡアゴニストの有効用量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約１６０ｍｇ／ｋｇまたは約４０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇであり得る。１つの実施態様において、ｍｉＲ−２０８またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤とｍｉＲ−４９９の阻害剤は、それぞれ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８またはｍｉＲ−２０８ｂの阻害剤とｍｉＲ−４９９の阻害剤は、それぞれ、約８０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８またはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストとｍｉＲ−４９９のアゴニストは、それぞれ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約２００  ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。さらに別の実施態様において、ｍｉＲ−２０８またはｍｉＲ−２０８ｂのアゴニストとｍｉＲ−４９９のアゴニストは、それぞれ、約８０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。何を有効用量と考えるかの正確な決定は、サイズ、年齢、障害のタイプ（例えば、心筋梗塞、心不全、心臓肥大、または筋骨格系）を含む、各患者の個別の要素および阻害剤またはアゴニストの本質（例えば、アンタゴｍｉｒ、発現コンストラクト、アンチセンスオリゴヌクレオチド、等）に基づくことができる。したがって、当業者であれば、本開示および技術常識から、用量を容易に確定することができる。
【００６３】
高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを包含する脂質ベース系などの、コロイド分散系を、ｍｉＲＮＡ機能の阻害剤、ｍｉＲＮＡアゴニストをコードするポリヌクレオチドまたは特定のｍｉＲＮＡ阻害剤もしくはアゴニストを発現するコンストラクトのための送達担体として用い得る。心筋組織および骨格筋組織に対して本発明の核酸を送達するのに適する市販の脂質エマルジョンには、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、および他の類似の脂質エマルジョンが含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける送達担体として用いるのに好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞体）である。このような系の調製および使用は、当技術分野でよく知られている。例示的な製剤はまた、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＵＳ５，９８１，５０５；ＵＳ６，２１７，９００；ＵＳ６，３８３，５１２；ＵＳ５，７８３，５６５；ＵＳ７，２０２，２２７；ＵＳ６，３７９，９６５；ＵＳ６，１２７，１７０；ＵＳ５，８３７，５３３；ＵＳ６，７４７，０１４；およびＷＯ０３／０９３４４９においても開示されている。
【００６４】
一般に、送達担体を安定させ、標的細胞による取込みを可能とするのに適する塩および緩衝液を用いることが所望される。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散した、有効量の送達担体を含み、前記送達担体は、阻害剤ポリヌクレオチドまたはｍｉＲＮＡポリヌクレオチド配列（例えば、リポソームまたは他の複合体または発現ベクター）を含む。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトに投与した場合に、有害反応、アレルギー性反応、または他の都合の悪い反応をもたらさない分子的実体および組成物を指す。本明細書において「薬学的に許容される担体」には、ヒトに対する投与に適する医薬などの医薬の製剤化に用いるのに許容される、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質のためのこのような媒体および剤の使用は、当技術分野でよく知られている。任意の従来の媒体または剤は、本発明の有効成分に適合しない場合を除いて、治療組成物における使用が意図される。補完的な有効成分もまた、それらが組成物のベクターまたはポリヌクレオチドを不活化しない場合に、組成物中に組み込むことができる。
【００６５】
本発明の活性組成物は、従来の医薬調製物を包含する。本発明によるこれらの組成物の投与は、その経路を介して標的組織に達し得る限りにおいて、任意の一般的な経路を介し得る。これには、経口経路、鼻腔内経路、または口腔内経路が含まれる。あるいは、投与は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または静脈内注射によるものであり得、あるいは心臓組織内への直接的な注射によるものでもあり得る。ｍｉＲＮＡ阻害剤、ｍｉＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドまたはｍｉＲＮＡ配列を含む発現コンストラクトを含む、医薬組成物はまた、カテーテルシステムを介して投与することもでき、心臓への治療剤の送達のために冠動脈循環を分離するシステムを介して投与することもできる。当技術分野では、心臓および冠動脈血管系へと治療剤を送達するための各種のカテーテルシステムが知られている。本発明において用いるのに適する、カテーテルベースの送達方法または冠動脈分離方法の一部の非限定的な例は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４１６，５１０号；米国特許第６，７１６，１９６号；米国特許第６，９５３，４６６号；ＷＯ２００５／０８２４４０；ＷＯ  ２００６／０８９３４０；米国特許公開第２００７／０２０３４４５号；米国特許公開第２００６／０１４８７４２号；および米国特許公開第２００７／００６０９０７号において開示されている。このような組成物ならば通常、本明細書に記載の薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。
【００６６】
活性化合物はまた、非経口投与も腹腔内投与も可能である。例示を目的として述べると、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中において調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中、ならびに油中おいても調製することができる。保管および使用の通常の条件下において、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を防止する防腐剤を含有する。
【００６７】
注射用の使用またはカテーテル送達に適する医薬形態には、例えば、無菌の水溶液または分散液、および無菌の注射用溶液または分散液を即時調製するための無菌粉末が含まれる。一般に、これらの調製物は無菌であり、容易な注射可能性が存在する程度において流体である。調製物は、製造条件および保管条件の下において安定であり、細菌および真菌など、微生物の汚染作用に対して保護されるべきである。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および植物油を含有しうる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持により、また界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、各種の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを組み入れることが好ましいであろう。注射用組成物の長時間吸収は、組成物中における吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。
【００６８】
無菌の注射用溶液は、所望の他の任意の成分（例えば、上記で列挙された）と共に、活性化合物を適切な量で溶媒内へと組み込んだ後で、濾過による滅菌を行うことにより調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒、また例えば、上記で列挙した通りの他の所望の成分を含有する無菌の担体内へと、各種の無菌の有効成分を組み込むことにより調製することができる。無菌の注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法には、（１または複数の）有効成分に、任意のさらなる所望の成分を添加した粉末をもたらす、あらかじめ無菌で濾過されたそれらの溶液からの、真空乾燥法および凍結乾燥法が含まれる。
【００６９】
本発明の組成物は一般に、中性または塩の形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、例えば、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデリン酸など）に由来する酸添加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が含まれる。タンパク質の遊離カルボキシル基と形成される塩も、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄）あるいは、有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）に由来することができる。
【００７０】
製剤化されたら、溶液は、投与製剤に適合する形で、かつ治療的に有効であるような量で投与することが好ましい。製剤は、注射用溶液、薬剤放出カプセルなど、各種の形態において容易に投与することができる。水溶液中の非経口投与の場合、例えば一般には、溶液を適する形で緩衝し、例えば、まず十分な生理食塩水またはグルコースにより希釈液を等張とする。このような水溶液は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に用いることができる。特に、本開示に照らせば、当業者に知られる通り、無菌の水性媒体を用いることが好ましい。例示を目的として述べると、１回の用量は、等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解させてから、皮下注入液１０００ｍｌに添加することも、提起される注入部位に注射することもできる（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第15版、1035〜1038および1570〜1580頁を参照されたい）。治療される対象の状態に応じて、用量には何らかの変化が必然的に生じる。投与責任者は、いずれにせよ、個々の対象に適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与の場合、調製物は、ＦＤＡの生物学的製剤事務局基準により要請される無菌性、発熱物質性、一般的な安全性、および純度の基準を満たすものとする。
【００７１】
本明細書に記載の任意の組成物は、キット内に含まれ得る。１つの実施態様において、キットは、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤を含む第１医薬組成物およびｍｉＲ−４９９阻害剤を含む第２医薬組成物を包含する。別の実施態様において、キットは、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤とｍｉＲ−４９９阻害剤を含む単一医薬組成物を包含する。別の実施態様において、キットは、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂアゴニストを含む第１医薬組成物およびｍｉＲ−４９９アゴニストを含む第２医薬組成物を包含する。さらに別の実施態様において、キットは、ｍｉＲ−２０８ａまたはｍｉＲ−２０８ｂアゴニストとｍｉＲ−４９９アゴニストを含む単一医薬組成物を包含する。いくつかの実施態様において、キットは、細胞へのｍｉＲＮＡアゴニストまたは阻害剤の送達を促進する１または複数のトランスフェクション試薬も包含しうる。
【００７２】
キットの成分は、水性媒体中または凍結乾燥形態のいずれかにパッケージングし得る。キットの容器手段には一般に、その中に成分を入れ、好ましくは、適切に分注される、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段が含まれる。キット内に複数の成分が存在する場合、キットはまた一般に、その中にさらなる成分を個別に入れることが可能な第２、第３、または他のさらなる容器も含有する（例えば、無菌の薬学的に許容される緩衝液および／または他の希釈剤）。しかし、成分の各種の組合せをバイアル内に含めることができる。本発明のキットはまた、販売用に、核酸および他の任意の試薬を含有するための手段を気密容器で包含することが典型的である。このような容器には、その中に所望のバイアルが保持される、射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器が含まれうる。
【００７３】
キットの成分が１および／または複数の溶液中において提供される場合、該溶液は水溶液であり、無菌の水溶液が特に好ましい。
【００７４】
しかし、キットの成分は、（１または複数の）乾燥粉末として提供することができる。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合、該粉末は、適切な溶媒の添加により再構成することができる。溶媒はまた、別の容器手段内において提供し得ることが想定される。
【００７５】
このようなキットはまた、ｍｉＲＮＡアゴニストもしくはｍｉＲＮＡ阻害剤を保存または維持するか、あるいはそれらの分解に対して保護的である成分も包含する。このような成分は、ＤＮＡｓｅフリー、ＲＮＡｓｅフリーまたはヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡｓｅおよびＤＮＡｓｅ）に対して保護的であり得る。このようなキットは一般に、適切な手段で、各個別の試薬または溶液ごとに異なる容器を含む。
【００７６】
キットはまた、キット成分を用いる他、該キット内に包含されない他の任意の試薬を用いるための指示書も包含する。指示書は、実装の可能性がある変更も包含しうる。キットはまた、非経口投与もしくはカテーテルによる投与など、各種の投与経路によりｍｉＲＮＡのアゴニストまたは阻害剤を投与するための器具またはデバイスも包含する。
【００７７】
そのような試薬は、本発明のキットの実施態様であることが企図される。そのようなキットは、しかしながら、上記に特定された特定の品目に限定されず、ｍｉＲＮＡの操作および特徴付けのために用いられる任意の試薬を包含し得る。
【００７８】
以下の実施例は、本発明の多様な側面を例示する目的でのみ包含される。実施例および図面におけるｍｉＲ２０８への言及は、マウスのｍｉＲ２０８ａを指す。しかし、当業者は、本開示に照らして、任意のヒトまたは他の動物に対して本発明を同様に適用可能であり、ｍｉＲ２０８ａおよび／またはｍｉＲ２０８ｂのいずれかの変更を包含することを理解されたい。
【実施例】
【００７９】
（実施例１）
ｍｉＲ−２０８ノックアウトマウスは、圧負荷に応答して低減された心臓肥大および線維症を示す
ｍｉＲ−２０８を、α−ＭＨＣ遺伝子のイントロン内にコードする。α−ＭＨＣと同様に、ｍｉＲ−２０８を、心臓において特異的に発現し、肺においてわずかに発現する。ｍｉＲ−２０８を、別個の転写産物として転写するのではなく、α−ＭＨＣのプレ−ｍＲＮＡの外側に処理する。しかし、興味深いことに、ｍｉＲ−２０８は、少なくとも１４日の著しく長い半減期を示し、その結果α−ＭＨＣのｍＲＮＡの発現が下方制御された場合でも、機能を発揮できる。
【００８０】
ｍｉＲ−２０８ノックアウトマウスは、ｍｉＲ−２０８コード領域の上流に伸長した０．４ｋｂの断片（５’アーム）を、ＳｃａＩＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、ｌｏｘＰ部位およびＦｒｔ−隣接ネオマイシンカセットの上流のｐＧＫｎｅｏＦ２Ｌ２ｄｔａ標的プラスミドに連結することにより、ｍｉＲ−２０８標的ベクターを作製することによって作製される。３．３ｋｂの断片（３’アーム）を、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、ネオマイシン耐性およびＤｔａ陰性選択カセットの間のベクターに連結した。破壊された対立遺伝子を担持する標的ＥＳ細胞を、５’および３’のプローブを用いてサザンブロット分析により特定した。３種のｍｉＲ−２０８標的ＥＳクローンを特定し、胚盤胞注入に使用した。得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６に交配させ、突然変異対立遺伝子の生殖細胞系列伝達を得た。
【００８１】
マウスにおけるｍｉＲ−２０８の遺伝的欠失では、明白な表現型の誘導に失敗したが、２月齢の野生型およびｍｉＲ−２０８−／−動物由来の心臓についてのマイクロアレイ分析により、ｍｉＲ−２０８の除去が多数の速骨格筋収縮性タンパク質遺伝子（通常は心臓において発現しない）の顕著な発現をもたらすことを明らかにした。したがって、これらの結果は、通常の状態下でｍｉＲ−２０８は、単独の心臓特異的ＭＨＣ遺伝子と共発現し、心臓における骨格筋遺伝子の発現を抑制することにより、心筋細胞の同一性を維持することを示唆する。
【００８２】
ｍｉＲ−２０８の最も注目に値する機能が、心臓ストレスに対するｍｉＲ−２０８ヌルマウスの異常応答によって明らかになった（van Rooijら、(2007) Science, Vol. 316: 575-579）。心臓の病理的リモデリングを起動する胸部大動脈絞扼（ＴＡＢ）による圧負荷に応答して、ｍｉＲ−２０８ノックアウトマウスからの心臓の組織切片は、野生型マウスからの切片と比較して実質的には心筋細胞の肥大または線維症がなかった（図１Ａ）。さらに、ｍｉＲ−２０８ノックアウトマウスは、圧負荷に応答してβ−ＭＨＣの発現を上方制御できなかった（図１ＢおよびＣ）。対照的に、ＡＮＦおよびＢＮＰをコードするストレス応答遺伝子などの他のストレス応答遺伝子は、ｍｉＲ−２０８突然変異動物において強く誘導され（図１Ｂ）、ｍｉＲ−２０８が、心臓ストレス応答の他のファセットから切り離すことができる、β−ＭＨＣの発現の調節に特異的に関与することを実証した。
【００８３】
（実施例２）
ｍｉＲ−２０８のノックダウンは、ストレスへの応答において、ｍｉＲ−２０８ノックアウト動物を表現型模写する
心臓ストレス応答に対するｍｉＲ−２０８の不在の効果の特異性を調べるために、動物に、成熟ｍｉＲ−２０８配列に相補的な配列（抗２０８；配列番号１６）またはミスマッチ配列（ｍｍ；配列番号１７）を有するアンタゴｍｉｒを毎日、静脈内注射した。ヌクレオシドはすべて、２’−ＯＭｅ修飾されており、５’末端の２塩基および３’末端の４塩基は、ヌクレオシド間にホスホロチオエートを含有した。コレステロールは、ヒドロキシプロリノールリンカーを通してパッセンジャー鎖の３’末端に結合させた（図２Ａ）。ｍｉＲ−２０８アンタゴｍｉｒを注射した動物の心臓のリアルタイムＰＣＲ分析は、処置の２か月後に、ｍｉＲ−２０８の効率的なノックダウンを示した（図２Ｂ）。
【００８４】
心臓ストレス応答に対するｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｉＲ−２０８下方制御の効果を試験するために、抗ｍｉＲ−２０８アンタゴｍｉｒまたはミスマッチコントロールを受けている動物に、圧負荷を誘発するために、シャム処置または胸部大動脈瘤絞扼術処置に供した。ミスマッチコントロールを用いて処置した動物は、β−ＭＨＣならびに他のストレス遺伝子（ＡＮＦおよびＢＮＰ）の上方制御と共に、典型的なストレス応答を示した。対照的に、抗ｍｉＲ−２０８アンタゴｍｉｒを用いて処置した動物は、ストレス刺激に応答したβ−ＭＨＣの上方制御を示さなかった。しかしながら、他のストレス遺伝子（ＡＮＦおよびＢＮＰ）の発現の増加が観察された（図２Ｃ）。抗ｍｉＲ−２０８アンタゴｍｉｒを用いて処置した動物のストレス応答は、ｍｉＲ−２０８ノックアウト動物に著しく類似し、ｍｉＲ−２０８が、ストレスに応答したβ−ＭＨＣ発現の制御において重大な役割を果たすことを示唆した。
【００８５】
（実施例３）
ｍｉＲ−２０８は、ｍｉＲ−４９９の発現に必要とされる
心臓におけるｍｉＲ−２０８の作用機構をさらに探求するために、本発明者らは、野生型およびｍｉＲ−２０８ノックアウトマウス由来の心臓におけるｍｉＲＮＡの発現パターンを、マイクロアレイ分析により明確にした。ｍｉＲ−２０８ノックアウト心臓において上方制御および下方制御されるいくつかのｍｉＲＮＡの中で、本発明者らは、ｍｉＲ−４９９が、正常な心臓において非常に豊富であるが、ｍｉＲ−２０８ノックアウト動物においてバックグラウンドレベルを超えて発現しなかったことを発見した。これらの知見は、ノーザンブロットにより確認した（図３）。ｍｉＲ−４９９遺伝子のゲノムの位置の分析は、ｍｉＲ−４９９遺伝子のゲノムが、α−ＭＨＣ遺伝子の相同体であるＭｙｈ７ｂ遺伝子の２０番目のイントロン内に含まれることを示した。Ｍｙｈ７ｂに関するＲＴ−ＰＣＲが、宿主遺伝子のｍＲＮＡが、ｍｉＲ−２０８の不在下で用量依存的に無効になることを示すので、ｍｉＲ−２０８は、Ｍｙｈ７ｂを制御し、その結果ｍｉＲ−４９９の転写レベルの発現を制御すると思われる（図３）。
【００８６】
Ｍｙｈ７ｂ遺伝子は、脊椎動物において保存され、心筋および遅骨格筋（例えば、ヒラメ筋）だけにおいて発現する（図４Ａ）。同様に、ｍｉＲ−４９９は、リアルタイムＰＣＲ分析によって確認されるようにその宿主遺伝子と同じ発現パターンを有する（図４Ａ＆Ｂ）。Ｍｙｈ７ｂ遺伝子の３’末端を対象とするプローブを使用したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、このミオシン（およびｍｉＲ−４９９）が心臓においてＥ１０．５と同様に早く発現したことを示した（図４Ｃ）。その後、胚形成期間中、Ｍｙｈ７ｂ／ｍｉＲ−４９９はまた、体節においても発現する。これらのデータは、ｍｉＲ−２０８がさらなるミオシンのＭｙｈ７ｂの起動に必要であり、Ｍｙｈ７ｂは関連ｍｉＲ−４９９を生み出す。さらに、ｍｉＲ−４９９は心臓肥大期間に下方制御される。
【００８７】
病的な心臓肥大および筋肉収縮性の制御におけるｍｉＲ−４９９の役割をさらに探求するために、ｍｉＲ−４９９ノックアウト動物を作製した。ｍｉＲ−４９９の遺伝欠失は、その宿主遺伝子、Ｍｙｈ７ｂの発現に対して影響を有していなかった（図５Ａ）。α−およびβ−ＭＨＣの両方についてのｍｉＲ−４９９突然変異体および野生型の動物からの心臓のウェスタンブロット分析は、ｍｉＲ−４９９の欠失がタンパク質レベルでいずれの遺伝子の発現にも影響しないことを示した（図５Ｂ）。ｍｉＲ−４９９がβ−ＭＨＣ制御に対する効果を有するかどうかを調べるために、野生型およびｍｉＲ−４９９ノックアウト動物に、甲状腺機能低下を誘発し、β−ＭＨＣを上方制御するプロピルチオウラシル（ＰＴＵ）を受けさせた。野生型およびｍｉＲ−４９９ノックアウト動物の両方は、ＰＴＵに応答したα−ＭＨＣの減少およびβ−ＭＨＣの増加を示した（図５Ｃ）。驚くべきことに、ｍｉＲ−２０８と異なり、ｍｉＲ−４９９は、α−ＭＨＣまたはβ−ＭＨＣのいずれの発現の制御にも必要とされない。
【００８８】
（実施例４）
ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９の二重ターゲティング
ｍｉＲ−２０８は、ｍｉＲ−２０８ヘテロ接合体およびｍｉＲ−２０８ノックアウト動物におけるｍｉＲ−４９９発現の用量依存的減少によって示されるようにｍｉＲ−４９９の発現を調節する（図３および実施例３）。ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９の間の相互作用をさらに明らかにするために、野生型動物に、生理食塩液または成熟ｍｉＲ−２０８配列に相補的な配列を有する合成オリゴヌクレオチド（例えばアンタゴｍｉｒ）（抗ｍｉＲ−２０８；配列番号１６）の４用量（２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、および１６０ｍｇ／ｋｇ）のうちの１つを静脈内注射した。尾部静脈注射の３日後の心臓組織のノーザン分析は、成熟ｍｉＲ−２０８の発現の用量依存的減少を明らかにしたが、プレ−ｍｉＲ−２０８の発現は完全なままであった（図６Ａ）。しかしながら、遺伝欠失モデルと異なり、ｍｉＲ−４９９の発現は、変わらなかった。さらに、β−ＭＨＣの発現レベルもまた、抗ｍｉＲ−２０８アンタゴｍｉｒの注射の３日後に影響を受けなかった（データ示さず）。
【００８９】
実験の第２のシリーズでは、野生型動物に、単一用量の抗ｍｉＲ−２０８（８０ｍｇ／ｋｇ）、２日連続の２回の連続的な用量（８０ｍｇ／ｋｇ）の抗ｍｉＲ−２０８、または２日連続の２回の連続的な用量（８０ｍｇ／ｋｇ）のミスマッチコントロールオリゴヌクレオチド（配列番号１７）を静脈内注射した。処置の２か月後の心臓組織のノーザン分析は、ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９の両方の発現が、抗ｍｉＲ−２０８を用いて処置した動物において低下したことを示した（図６Ｂ）。リアルタイムＰＣＲ分析により、これらの結果を確認した（図６Ｃ）。さらに、β−ＭＨＣのイントロン内にコードされ、β−ＭＨＣと共発現するｍｉＲ−２０８ｂの発現の減少もまた、観察された。対応する宿主ミオシン遺伝子についてのリアルタイムＰＣＲ分析は、ｍｉＲ−２０８のノックダウンが、α−ＭＨＣの発現に影響しないが、β−ＭＨＣおよびＭｙｈ７ｂの発現の減少を誘発することを明らかにした（図６Ｃ）。β−ＭＨＣタンパク質の減少もまた、抗ｍｉＲ−２０８を用いる処置の２か月後に観察された（図６Ｄ）。これらの結果は、ｍｉＲ−４９９およびβ−ＭＨＣの発現のｍｉＲ−２０８制御が遅れて生じることを示し、ｍｉＲ−２０８がｍｉＲ−４９９の上流にあり、同様にβ−ＭＨＣの上流にあることを示唆する。したがって、β−ＭＨＣ発現の低下の促進を達成するためにｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９の両方を下方制御する必要がある。ｍｉＲ−２０８下方制御のみで、ｍｉＲ−４９９発現の最終的な減少が起こり、これは、次にβ−ＭＨＣ発現の減少を誘発する。β−ＭＨＣ発現に対するより即時の効果を得るために、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８の両方は、下方制御のために標的とすることができる。
【００９０】
ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９の両方を下方制御することの複合効果を調べるために、ｍｉＲ−４９９ノックアウト動物は、プロピルチオウラシル（ＰＴＵ）、β−ＭＨＣ発現の誘発物質を受ける前に、抗ｍｉＲ−２０８オリゴヌクレオチドを投与した。先の結果と同様に、ＰＴＵは、抗ｍｉＲ−２０８オリゴヌクレオチドを用いる処置がない状態で、野生型およびｍｉＲ−４９９ノックアウト動物の両方において、α−ＭＨＣ発現の減少およびβ−ＭＨＣ／ｍｉＲ−２０８ｂ発現（ｍｉＲ−２０８ｂはβ−ＭＨＣと共発現する）の増加を誘発した（図７Ａ、Ｂ）。そのような効果は、心臓ストレス応答の特性である。対照的に、処置の２週間後の、抗ｍｉＲ−２０８オリゴヌクレオチドを用いて処置したｍｉＲ−４９９ノックアウト動物からの心臓組織のノーザン分析およびリアルタイムＰＣＲ分析は、ＰＴＵに応答したβ−ＭＨＣ／ｍｉＲ−２０８ｂ発現の増加が観察されなかったことを示した（図７Ａ、Ｂ）。抗ｍｉＲ−２０８を用いて処置したｍｉＲ−４９９ノックアウト動物の応答は、ｍｉＲ−２０８ノックアウト動物の応答に似ていた（図７Ｂ）。これらの結果は、β−ＭＨＣの効率的で迅速な下方制御が、ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９の両方を標的とすることによって達成することができることを示唆する。動物に投与した抗ｍｉＲ−２０８オリゴヌクレオチドの用量は、ｍｉＲ−２０８発現の６０％の低下をもたらした。この減少のパーセンテージは、ｍｉＲ−４９９の不在下、ＰＴＵによるβ−ＭＨＣの誘発を抑制するのに十分であった（図７Ｂ）。これらの知見は、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８の両方の低下が、病的な心臓肥大および心不全などの心臓障害の治療のための効率的な治療上の戦略であるかもしれないことを示す。
【００９１】
（実施例５）
ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９のノックダウンは、心臓ストレス応答を阻害する
心臓障害を治療するためにｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９を標的とする治療価値をさらに評価するために、マウスに、成熟ｍｉＲ−２０８ａ配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（抗２０８）、成熟ｍｉＲ−４９９配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（抗４９９）、または抗２０８および抗４９９オリゴヌクレオチド配列の両方を静脈内注射する。抗２０８および抗４９９の両方は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって結合したロックト核酸（ＬＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の組合せを含有する。処置の３週間〜２か月後の、アンチセンスオリゴヌクレオチドを注射した動物の心臓のリアルタイムＰＣＲ分析を、ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９のノックダウンを評価するために使用する。
【００９２】
心臓ストレス応答に対するｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｉＲ−２０８およびｍｉＲ−４９９下方制御の効果を試験するために、抗２０８、抗４９９、または抗２０８および抗４９９オリゴの両方を受けている動物に、圧負荷を誘発するためにシャム処置または胸部大動脈瘤絞扼術処置に供した。未処置の動物は、β−ＭＨＣならびに他のストレス遺伝子（ＡＮＦおよびＢＮＰ）の上方制御と共に、典型的なストレス応答を示すことが予想される。対照的に、抗２０８および抗４９９の両方を用いて処置する動物は、いずれかのアンチセンスオリゴのみを受けている動物よりも明白に、ストレス刺激に応答した、β−ＭＨＣの上方制御の低下を示すことが予想される。
【００９３】
本明細書に論じられ引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。開示された本発明は、これらが変更可能なように、記載される特定の方法論、プロトコール、および材料に限定されないことが理解される。本明細書において使用される用語は、特定の実施態様のみについて記載する目的のためのものであり、添付の請求項によってのみ限定される本発明の範囲を限定するようには意図されないこともまた理解される。
【００９４】
当業者らは、本明細書において記載される本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物をルーチン的な実験のみを使用して認識するまたは確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の請求項によって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ−Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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