(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ブレビスＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株であるロイテリン蓄積ラクトバチルス・ブレビス株。
【請求項２】
ロイテリン産生への請求項１に記載のラクトバチルス・ブレビス株の使用。
【請求項３】
請求項１に記載のラクトバチルス株を含む組成物。
【請求項４】
乾燥重量１ｇ当たり少なくとも１０5ｃｆｕの前記ラクトバチルス・ブレビス株を含むことを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
乾燥重量１ｇ当たり少なくとも１０6ｃｆｕの前記ラクトバチルス・ブレビス株を含むことを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
栄養組成物であることを特徴とする、請求項３〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
乳製品であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
薬剤として使用される、請求項１に記載のラクトバチルス・ブレビス株又は請求項３〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記薬剤がＨ．ピロリ感染を治療又は予防することを特徴とする、請求項８に記載の薬剤として使用されるラクトバチルス・ブレビス株又は組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の株の突然変異誘発又は遺伝子形質転換の工程を含む、ラクトバチルス・ブレビスのロイテリン蓄積株を得る方法。
【請求項１１】
ロイテリンを産生する方法であって、
請求項１に記載のラクトバチルス・ブレビス株をグリセロールの存在下で培養する工程と、
培養によって産生されたロイテリンを回収する工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）（Ｌ．ブレビス）のロイテリン産生株、並びに特にヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）（Ｈ．ピロリ）感染及びそれによって生じる病態の治療又は予防のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロイテリン（３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド、３−ＨＰＡ）は、グリセロールの存在下の嫌気条件下で培養した場合に多数のラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）（Ｌ．ロイテリ）株によって産生されるものとして初めて同定された抗菌性化合物である（非特許文献１）。グリセロールのロイテリンへの変換は、３つのサブユニット（それぞれＣ、Ｄ及びＥ又はα、β及びγ）から構成されるコバラミン依存性グリセロールデヒドラターゼ（Ｇｌｄ；ＥＣ  ４．２．１．３０）によって触媒される。グリセロールデヒドラターゼ（ＧＤＡ）経路の存在は、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）、ラクトバチルス・ブレビス及びラクトバチルス・ヒルガルディー（Lactobacillus hilgardii）等の他のラクトバチルス種においても報告されている。全ての種について、この経路の存在はグリセロールデヒドラターゼ又はジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子の存在に応じて株によって異なるようである（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。ＧＤＡ経路を介してグリセロールを代謝する大半の細菌において、ロイテリンは通常、後に細胞内で１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）へと還元され、細胞外培地に排出される代謝中間体である。グリセロールデヒドラターゼ又はジオールデヒドラターゼを有する株の一部しかロイテリンを培養培地に蓄積することが可能でない。これらのロイテリン蓄積株の大半がＬ．ロイテリ種に属する。しかしながら、概してＬ．ロイテリよりも少ない程度でロイテリンを細胞外に蓄積することが可能な幾つかの株が、他のラクトバチルス種であるラクトバチルス・コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）（非特許文献５）、ラクトバチルス・コリノイデス（非特許文献６、非特許文献７）及びラクトバチルス・ヒルガルディー（非特許文献８）において報告されている。最近になって、ロイテリンを細胞外に（ただしＬ．ロイテリの１０分の１の濃度で）蓄積することが可能な１つのラクトバチルス・ブレビス株及び１つのラクトバチルス・ペントーサス（Lactobacillus pentosus）株が記載されている（非特許文献９）。
【０００３】
ロイテリンは潜在的に有害な微生物に対して広範な抗菌活性を有する。ロイテリンは酵母、真菌、原生動物及び様々な有害な細菌の成長を乳酸菌の成長の阻害に必要とされる濃度の４分の１〜５分の１の濃度で阻害することができる。このロイテリンの選択的な抗菌活性のために、腸内細菌叢の有益な乳酸菌に悪影響を及ぼさずに様々な病原性微生物を破壊することが可能となり、様々な消化系障害の治療にロイテリンを使用することが提案されている。
【０００４】
幾つかのＬ．ロイテリ株が、特にサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）及びヘリコバクター・ピロリ等の病原体に対するその保護効果から候補プロバイオティクスとみなされている（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、特許文献１）。これらの効果は少なくとも部分的にロイテリンの産生に関連付けられている。
【０００５】
胃腸管の病原性微生物の中でも、ヘリコバクター・ピロリがこの数年でますます着目されている。ヘリコバクター・ピロリは、世界人口の５０％を超えるヒトの胃粘液層に定着するグラム陰性らせん状細菌である。Ｈ．ピロリに感染した個体の大部分は無症候であるが、その胃上皮は炎症の兆候を示し、Ｈ．ピロリ感染被験体の１５％〜２０％が疾患を発症する。Ｈ．ピロリは消化性潰瘍疾患、慢性活動性胃炎、萎縮、化生、異形成、胃がん及び胃粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫の主要な原因物質である（概説として非特許文献１３、非特許文献１４を参照されたい）。
【０００６】
Ｈ．ピロリに感染した患者の標準治療は２つの抗生物質＋ＰＰＩ（プロトンポンプ阻害薬）による治療、いわゆる３剤併用療法である。しかしながら、３剤併用療法後のＨ．ピロリ除菌率は抗生物質耐性又は低コンプライアンスのために低下している。さらに、数々のアッセイに関わらず、効果的なワクチンは未だ市販されていない。
【０００７】
プロバイオティクスの使用が、Ｈ．ピロリを治療又は予防する３剤併用療法の代替手段又は補足として提案されている。上記のように、これらのプロバイオティクスとしては特にＬ．ロイテリが特にその抗菌特性のために挙げられる。他のラクトバチルス種の一部の株も、Ｈ．ピロリ感染の管理に潜在的に有用であるとして提案されている。例えば、SIMOVA et al.（非特許文献１５）は、阻害性ペプチド（バクテリオシン）を産生し、Ｈ．ピロリを強く阻害するラクトバチルス・デルブルッキー（Lactobacillus delbrueckii）株（ＢＢ１８）を開示している。LINSALATA et al.（非特許文献１６）は、ヒト胃粘膜におけるＨ．ピロリの生存に対して高いアルギニンデイミナーゼ活性を有する特定のＬ．ブレビス株（ＣＤ２）の効果を研究している。LINSALATA et al.は胃内Ｈ．ピロリ負荷の低減を見出し、それがＨ．ピロリからアルギニンを枯渇させ、その成長及び増殖を阻害し得るアルギニンデイミナーゼ活性の上昇によるものであることを示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００４／０３１３６８号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】TALARICO & DOBROGOSZ, Antimicrob Agents Chemother, 33, 674-9, 1989
【非特許文献２】CADIEUX et al., Appl Environ Microbiol, 74, 4645-9, 2008
【非特許文献３】SAUVAGEOT et al., FEMS Microbiology Letters, 209, 69-74, , 2002
【非特許文献４】CLAISSE and LONVAUD-FUNEL, Journal of Food Protection, 64, 833-837, 2001
【非特許文献５】MARTIN et al., Int J Food Microbiol, 104, 267-77, 2005
【非特許文献６】GARAI-IBABE et al., International Journal of Food Microbiology 121, 253-261, 2008
【非特許文献７】SAUVAGEOT et al., International Journal of Food Microbiology, 55, 167-170, 2000
【非特許文献８】PASTERIS and STRASSER DE SAAD, J. Agric. Food Chem., 57 (9), 3853-3858, 2009
【非特許文献９】BAUER et al., International Journal of Food Microbiology, 137, 28-31, 2010
【非特許文献１０】CLEUSIX et al., BMC Microbiol, 7, 101, 2007
【非特許文献１１】SPINLER et al., Anaerobe, 14, 166-71, 2008
【非特許文献１２】FRANCAVILLA et al., Helicobacter, 13, 127-34, 2008
【非特許文献１３】FOX & WANG, J Clin Invest, 117, 60-9, 2007
【非特許文献１４】POLK & PEEK, Nat Rev Cancer, 10, 403-14
【非特許文献１５】SIMOVA et al., J Appl Microbiol, 106, 692-701, 2009
【非特許文献１６】LINSALATA et al., Helicobacter, 9, 165-72, 2004
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは今回、ロイテリンを産生し、様々なＨ．ピロリ株に対して抗菌活性を有するのに十分な量でロイテリンを蓄積する能力を有するラクトバチルス・ブレビス株を単離した。
【００１１】
「ロイテリンを蓄積することが可能な」株又は「ロイテリン蓄積」株は、本明細書においてロイテリンを産生し、細胞外に分泌することが可能な株として定義される。
【００１２】
したがって、本発明の一目的は、ブダペスト条約に従って２０１１年２月３日にアクセッション番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１でＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，25 rue du Docteur Roux，Paris）に寄託されたこのＬ．ブレビス株である。
【００１３】
ロイテリンを産生し、かつ蓄積するその能力に加えて、この株は以下の特徴を有する：
形態：小鎖で集団化する均一な（homogen）着色を有する桿菌；
代謝：ヘテロ型発酵性（heterofermentative）；
以下の糖の発酵（ＡＰＩ  ＭＲＳ培地、３７℃、４８時間のＡｐｉ  ５０  ＣＨストリップ上で得られる結果）：Ｌ−アラビノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マルトース、Ｄ−メリビオース、グルコン酸カリウム、５−ケトグルコン酸（正：5-Ketogluconate）カリウム。
【００１４】
本発明はまた、ＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株の突然変異誘発又は遺伝子形質転換によって得られるロイテリン蓄積Ｌ．ブレビス株を、それがこの親株の抗菌特性及びロイテリン産生能を保持する場合に包含する。これらの株は、ＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株の１つ又は複数の内因性遺伝子が、例えばその代謝特性（例えばこの株の糖を代謝する能力、その腸管輸送に対する耐性、その耐酸性又はその後酸性化（post-acidification））の一部が変更されるように突然変異した株であり得る。これらの株は、例えば上記株に対して付加的な生理的特徴を与えるか、又は上記株を用いて投与することが望まれる対象の治療剤若しくはワクチンのタンパク質を発現することを可能にする、対象の１つ又は複数の遺伝子によるＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株の遺伝子形質転換によって生じる株であってもよい。
【００１５】
これらの株は、例えばGURY et al.（Arch Microbiol., 182, 337-45, 2004）若しくはVELEZ et al.（Appl Environ Microbiol., 73, 3595-3604, 2007）によって記載されるようなラクトバチルスのランダム突然変異誘発若しくは部位特異的突然変異誘発及び遺伝子形質転換の従来の技法、又は「ゲノムシャッフリング」として知られる技法（PATNAIK et al. Nat Biotechnol, 20, 707-12, 2002、WANG Y. et al., J Biotechnol., 129, 510-15, 2007）を用いてＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株から得ることができる。
【００１６】
本発明の主題は、ＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株の突然変異誘発又は遺伝子形質転換の工程を含む、ロイテリン蓄積ラクトバチルス・ブレビス株を得る方法でもある。
【００１７】
本発明のＬ．ブレビス株はロイテリン産生に使用することができる。したがって、本発明の別の主題は、ロイテリンを産生する方法であって、
上で定義した本発明のＬ．ブレビス株、好ましくはＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株をグリセロールの存在下で培養する工程と、
培養によって産生されたロイテリンを回収する工程と、
を含む、方法である。
【００１８】
本発明の主題は本発明のＬ．ブレビス株、好ましくはＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株を含む組成物でもある。
【００１９】
本発明の組成物において、上記株は全細菌、好ましくは生細菌の形態で使用することができる。
【００２０】
本発明の組成物は投与、特に経口投与に好適な任意の形態であり得る。この形態としては、例えば固体、半固体、液体及び粉末が挙げられる。概して、液体組成物が例えば飲料としてのより容易な投与に好ましい。
【００２１】
組成物は、乾燥重量１ｇ当たり少なくとも１０5コロニー形成単位（Colony Forming Units：ｃｆｕ）、好ましくは少なくとも１０6ｃｆｕの本発明のＬ．ブレビス株を含み得る。
【００２２】
組成物は他の細菌株、特にプロバイオティクス株（複数の場合もあり）、例えばラクトバチルス株、ビフィドバクテリウム株、ストレプトコッカス株又はラクトコッカス株（複数の場合もあり）を更に含み得る。
【００２３】
組成物は、典型的には組成物の乾燥重量１ｇ当たり１０5コロニー形成単位（ｃｆｕ）〜１０13ｃｆｕ、好ましくは少なくとも１０6ｃｆｕ、より好ましくは少なくとも１０7ｃｆｕ、更により好ましくは少なくとも１０8ｃｆｕ、最も好ましくは少なくとも１０9ｃｆｕの本発明のＬ．ブレビス株を含み得る。液体組成物の場合、これは概して１ｍｌ当たり１０4コロニー形成単位（ｃｆｕ）〜１０1２ｃｆｕ、好ましくは少なくとも１０5ｃｆｕ、より好ましくは少なくとも１０6ｃｆｕ、更により好ましくは少なくとも１０7ｃｆｕ、最も好ましくは少なくとも１０9ｃｆｕに相当する。
【００２４】
組成物は、食品、保健食品及び機能性食品を含む栄養組成物であってもよい。「保健食品」は、通常食料品に使用される化合物から作製されるが、錠剤、粉末、カプセル、頓服水剤の形態又は通常は栄養物（aliments）と関連しない任意の他の形態であり、ヒトの健康に有益な効果を有する製品を指す。「機能性食品」は、同様にヒトの健康に有益な効果を有する栄養物である。特に、保健食品及び機能性食品は疾患、例えば慢性疾患に対して予防的又は治癒的な生理的効果を有し得る。
【００２５】
本発明による栄養組成物には、離乳食、乳児用調製乳又は乳児用調製食品（infant follow-on formula）も含まれる。本組成物が栄養補給食品若しくは医薬品、栄養剤又はメディカルフードであるのが好ましい。
【００２６】
組成物は乳製品、好ましくは発酵乳製品であってもよい。発酵製品は液体の形態又は発酵液を乾燥させることによって得られる乾燥粉末の形態で存在し得る。乳製品の例としては凝固、撹拌又は飲用形態の発酵乳及び／又は発酵ホエー、チーズ及びヨーグルトが挙げられる。
【００２７】
発酵製品は凝固、撹拌又は飲用形態の発酵させた大豆、穀物及び／又は果物等の発酵野菜であってもよい。
【００２８】
好ましい実施の形態では、発酵製品は生鮮製品である。厳しい熱処理工程を受けていない生鮮製品は、存在する細菌株が生きた状態であるという利点を有する。
【００２９】
本発明の主題は、薬剤として使用される本発明のＬ．ブレビス株、好ましくはＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株、又は本発明の組成物でもある。本発明のＬ．ブレビス株及び組成物は、Ｈ．ピロリ感染の治療又は予防に特に有用である。
【００３０】
本発明の主題は薬剤としての、又は薬剤、好ましくはＨ．ピロリ感染を治療若しくは予防する薬剤の製造への本発明のＬ．ブレビス株、好ましくはＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株、又は本発明の組成物の使用でもある。
【００３１】
本発明の主題は、それを必要とする被験体におけるＨ．ピロリ感染を治療又は予防する方法であって、上記被験体に治療的に有効な量の本発明のＬ．ブレビス株、好ましくはＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株、又は本発明の組成物を投与することを含む、方法でもある。
【００３２】
本発明は、薬剤、好ましくはＨ．ピロリ感染を治療又は予防する薬剤を製造する方法であって、上で定義したＬ．ブレビス株、好ましくはＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株を少なくとも１つの薬学的に許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤に組み込むことを含む、方法も包含する。
【００３３】
Ｈ．ピロリ感染を診断する方法は当該技術分野で既知である。例としては、Ｈ．ピロリ感染の診断は血液抗体試験、便抗原試験又は炭素尿素呼気試験により確認することによって行うことができる。診断は内視鏡検査下の生検に続くウレアーゼ試験、組織学的検査又は微生物培養によっても行うことができる。
【００３４】
Ｈ．ピロリ感染と関連する症状又は疾患は、特に胃痛、胸焼け、胃酸の逆流、腹痛、食物の逆流（regurgitation）、嘔吐、おくび、鼓腸、嘔気、食道炎、慢性活動性胃炎等の胃炎、消化性潰瘍疾患、萎縮、化生、異形成、胃がん及び胃粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫である。
【００３５】
本発明は、ＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株の抗菌免疫調節特性及び抗感染特性を説明する実施例並びに添付の図面に言及する以下の更なる記載からより明確に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ラクトバチルス・ブレビス株のｇｌｄＣ配列についてのＰＣＲ反応の結果を示す図である。上の７２８ｂｐのバンドは、ｇｌｄＣ遺伝子特異的プライマーを用いた期待される産物を表す。下の２０１ｂｐのバンドは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子特異的プライマーを用いた期待される産物（陽性ＰＣＲ対照）を表す。Ｓｍａｒｔ：ＤＮＡ  ＳＭＡＲＴ  Ｌａｄｄｅｒ（Eurogentec）；Ｃ＋：ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ５５７３０のｇｌｄＣ陽性株に由来するＤＮＡ対照によって得られるＰＣＲ結果；Ｉ−４４３１：Ｌ．ブレビスＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株に由来するＤＮＡによって得られるＰＣＲ結果；Ｌ．ブレビス８０：Ｌ．ブレビス８０に由来するＤＮＡによって得られるＰＣＲ結果；Ｃ−：ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）のｇｌｄＣ陰性株に由来するＤＮＡ対照によって得られるＰＣＲ結果；Ｈ２Ｏ：滅菌水によって得られるＰＣＲ結果。
【図２】Ｈ．ピロリ単独（黒色バー）、Ｈ．ピロリ＋ＭＲＳ中で成長させたＬ．ブレビスＩ−４４３１株（濃灰色バー）、Ｈ．ピロリ＋グリセロールを含むＭＲＳ中で成長させたＬ．ブレビスＩ−４４３１株（白色バー）又はＨ．ピロリ＋グリセロールを含むＭＲＳの摂取後のＣ．エレガンスにおけるＨ．ピロリ（ＮＴＣＴＣ１１６３７株）の定量化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３７】
実施例１：Ｌ．ブレビスＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株によるＨ．ピロリ株の成長のｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害
材料及び方法
ラクトバチルス・ブレビス株：
Ｌ．ブレビスＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１
Ｌ．ブレビス８０：従来のＬ．ブレビス株
【００３８】
ヘリコバクター・ピロリ株：
３つのＨ．ピロリ参照株及び５つの臨床分離株を使用した。
【００３９】
参照株：
２６６９５：TOMBS et al. (Nature 388, 539-547, 1997)に記載；
ＨＰＡＧ１：OH et al. (Proc Natl Acad Sci U S A., 103, 9999-10004, 2006)に記載；
ＴＮ２ＧＦ４：日本で胃潰瘍患者から単離され、スナネズミに適合させた株（WATANABE, et al. Gastroenterol 1998; vol 115, pp642-648に記載の株）
【００４０】
臨床分離株：
ＣＲ１１３及びＣＲ１１４：ヒト前がん胃病変生検材料から単離された株；
Ａｘｃａｎ  ３４２及びＡｘｃａｎ  ３７４：それぞれ、Ｈ．ピロリの除菌のための４剤併用療法を試験する臨床研究に参加した胃炎患者及び食道炎患者から単離された株（MALFERTHEINER et al., Lancet, 377, 905-913, 2011）。
ＧＣ３Ｃ：胃がん患者から単離された株。
【００４１】
方法：
Ｌ．ブレビス株（正：strains）を、ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ（ｐＨ６．２）中で１７時間成長させた。細菌懸濁液をＫＯＨ溶液でｐＨ６．８に中和した。
【００４２】
Ｈ．ピロリ株を、マクファーランド（Mac Farland）４標準に等しい濁度が得られるまでＢｒｕｃｅｌｌａ  Ｂｒｏｔｈ中で４８時間成長させた。細菌懸濁液を、最終濃度１００ｍＭまでグリセロールを含む同じ培地中、１％（ｖ／ｖ）のＰｏｌｙｖｉｔｅｘ添加剤（Biomerieux）で強化した１０％（ｖ／ｖ）ヒツジ血液を添加したミューラーヒントン寒天プレートの表面に塗布し、ロイテリンを産生させた。
【００４３】
滅菌ペーパーディスクをプレートの表面に貼り付けた。次いで、５μＬの中和したＬ．ブレビス懸濁液を各ペーパーディスクに適用した。プレートを３７℃、微好気的雰囲気（５％Ｏ２、１０％ＣＯ２及び８５％Ｎ２をもたらすRuskinの微好気ガスソーター）下で７２時間〜９６時間インキュベートした。
【００４４】
Ｈ．ピロリ株の成長に対するＬ．ブレビス懸濁液の効果を評価するために、ペーパーディスク周辺の成長阻害リングの幅を測定した。
【００４５】
結果
結果を下記表１に示す。
【００４６】
【表１】
0005868519.tif 000002
【００４７】
これらの結果から、Ｌ．ブレビス８０が試験した２つのＨ．ピロリ株にしか阻害特性を有さない一方で、Ｌ．ブレビスＩ−４４３１は試験した８つのＨ．ピロリ株のうち８つの成長を阻害することが示される。これらの阻害特性は、グリセロールの存在下で成長させたＬ．ブレビス培養物でしか観察されないことから、ロイテリンの蓄積と関連するようである。
【００４８】
実施例２：ｇｌｄＣ遺伝子のＰＣＲスクリーニング
材料及び方法
ロイテリン産生に関与する酵素であるグリセロールデヒドラターゼの大サブユニット（ＧｌｄＣ）をコードする遺伝子のＬ．ブレビスＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１における存在を、非特許文献２（上掲）に記載の方法に従って試験した。
【００４９】
簡潔に述べると、全ＤＮＡを、試験した各々の細菌株から単離した。
【００５０】
陽性対照（Ｃ＋）として、ロイテリン産生Ｌ．ロイテリ（正：L. reuteri）ＡＴＣＣ  ５５７３０株を使用した。陰性対照（Ｃ−）として、非ロイテリン産生種（ストレプトコッカス・サーモフィルス）の株を使用した。
【００５１】
Ｇｌｄの大サブユニットをコードする遺伝子（ｇｌｄＣ）のフラグメントの増幅を、以下の縮重プライマーを用いて行った：
ＧＤＣＲｅｖ：ＧＣＲＧＣＹＴＴＳＡＴＡＴＣＴＫＳＡＡＣＣＡＴ（配列番号１）及び
ＧＤＣＦｏｒ：ＧＣＭＴＡＹＧＣＷＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＣＡＧＴＴＴＡ（配列番号２）
（どちらも非特許文献２に記載されている）。増幅されたｇｌｄＣフラグメントの期待サイズは７２８ｂｐである。
【００５２】
陽性ＰＣＲ反応対照として、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のフラグメントも、以下の真正細菌プライマーを用いて全サンプルから増幅した：
１６ＳＦｏｒ：ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号３）及び
１６ＳＲｅｖ：ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣ（配列番号４）
（どちらも非特許文献２に記載されている）。
【００５３】
増幅された１６Ｓ  ｒＲＮＡフラグメントの期待サイズは２０１ｂｐである。
【００５４】
結果
ＰＣＲ反応の結果を図１に示す。Ｌ．ブレビスＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株、Ｌ．ブレビス８０株及び（Ｃ＋）ロイテリン産生Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ５５７３０株は期待される７２８ｂｐ産物について陽性であった。したがって、Ｌ．ブレビスＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株は、ロイテリン産生を可能にするｇｌｄＣ遺伝子を有する。
【００５５】
実施例３：Ｃ．エレガンスモデルにおけるＨ．ピロリ感染に対するＬ．ブレビスＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１の効果
Ｌ．ブレビス及びＨ．ピロリの培養
Ｌ．ブレビスＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株を実施例１に開示のようにＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ中で成長させた。
【００５６】
Ｈ．ピロリのＮＣＴＣ１１６３７（ＡＴＣＣ  ４３５０４Ｔ）株を、５％（ｖ／ｖ）ウマ血液（Oxoid）を含有するＢＨＩ培地（Oxoid）中で成長させた。
【００５７】
上清を遠心分離によって細胞から分離し、ＮａＯＨ（１Ｍ）で中和した。次いで、上清を濾過し（０．２２μｍ）、細胞ペレットに添加した。
【００５８】
Ｈ．ピロリ培養の場合、ウマ血液を含有するＢＨＩ培地（Oxoid）を遠心分離によって除去し、細胞を生理食塩溶液で洗浄した。
【００５９】
Ｃ．エレガンス感染アッセイに使用するＮＧ寒天プレートは、Ｏ．Ｄ．＝２．２２の各ＬＡＢ培養物（細胞及び上清を含む）を対応するＨ．ピロリ株の細胞（Ｏ．Ｄ．＝０．０２２）とともに含有する１００μＬの混合物を添加することによって調製した。線虫にＬＡＢを供給しない参照条件においては、Ｈ．ピロリ細胞を生理食塩溶液に再懸濁し、プレートに添加した。
【００６０】
Ｃ．エレガンス感染アッセイ
野生型Ｃ．エレガンス株（Ｎ２）を用いて感染アッセイを行った。Ｈ．ピロリのＮＣＴＣ１１６３７株を線虫感染に使用した。実験は、同調幼若成虫（３日齢の線虫）を以下の異なる培養条件に移すことによって開始した：
ＮＧ培地＋Ｅ．コリＯＰ５０（対照）
ＮＧ培地＋Ｅ．コリＯＰ５０＋１００μＬのＬＡＢ培養培地（対照培養培地）
ＮＧ培地＋Ｅ．コリＯＰ５０＋１００μＬの（Ｈ．ピロリＮＣＴＣ  １１６３７Ｔ＋ＬＡＢ）。
【００６１】
虫を２日毎に新たなプレートに移しながら８日間２５℃でインキュベートした。線虫集団の生存を各々の培養条件でスコアリングした。インキュベーション期間の後、１つの条件につき１５匹の虫のサンプルを取り、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＭ９バッファーで洗浄した。虫を０．４ｇの炭化ケイ素ビーズ及びボルテックスを用いて破壊した。
【００６２】
感染した虫のＤＮＡを、市販のキット「Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Roche）を用いて単離し、続いて無水エタノール及び５Ｍ酢酸カリウムによる沈殿及び洗浄プロセスを行った。ＤＮＡサンプルの希釈物を使用して、サンプル中のＨ．ピロリの存在をＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。
【００６３】
ＲＴ−ＰＣＲ
本研究に使用するプライマーはｖａｃＡ遺伝子を対象とする（NAYAK & ROSE、J Appl Microbiol, 103, 1931-41, 2007）。プライマーはＨｐｙｌＦ（５’  ＣＡＡ  ＴＡＧ  ＣＡＡ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  Ｇ  ３’、配列番号５）及びＨｐｙｌＲ（５’  ＧＣＧ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＡＴＴ  ＡＧＣ  ３’、配列番号６）と名付けられている。特異性は既にＢＬＡＳＴオンラインツールによってコンピューターで、更にはＨ．ピロリ種の株、種々のプロバイオティクス株及びＣ．エレガンスの採餌に使用するＥ．コリＯＰ５０を用いてＱ−ＰＣＲによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで確認されている（以前の最適化の報告を参照されたい）。「ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」（Applied Biosystem）及びＳｔｅｐＯｎｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅサーモサイクラー（Applied Biosystem）を使用した。下記表２にＨ．ピロリのＱ−ＰＣＲ反応の最適化条件をまとめる。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
ＤＮＡの標準曲線を、分光光度法（Ａ２６０）によるＨ．ピロリＤＮＡの定量化によって作成した。対応するゲノムの数を以下のようにして算出した：
ゲノム数＝ＤＮＡ（ｇ）×ＮＡ／Ｍｍ
Ｈ．ピロリのゲノムサイズ＝１．６Ｍｐｂ
ＮＡ＝６．０２３×１０２３
ゲノム数＝ＤＮＡ（ｇ）×６．０２３×１０２３／１．６×１０６×２×３０９
【００６６】
標準曲線を４つのＤＮＡの１０倍希釈物を用いて作成した。
【００６７】
ＭＲＳ中又はＭＲＳ＋グリセロール中で成長させたＩ−４４３１株によって得られた結果を図２に示す。これらの結果から、ＣＮＣＭ  Ｉ−４４３１株がＣ．エレガンスにおけるＨ．ピロリＮＣＴＣ  １１６３７Ｔの負荷を低減することが示される。Ｉ−４４３１株をＭＲＳ＋グリセロール中で成長させた場合に感染の低減がより顕著であり、この株の抗感染効果の少なくとも一部がロイテリン産生に起因することが示される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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