(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の流体が入っている第１の流体用チューブ；第２の流体が入っている第２の流体用チューブであって、前記第１の流体は、前記第２の流体とは異なり、前記第１の流体と前記第２の流体は、混和しない、第２の流体用チューブ；共有の流体用チューブ；前記第１の流体用チューブ、前記第２の流体用チューブおよび前記共有の流体用チューブに連結される接続器であって、流体は、前記第１の流体と前記第２の流体の交互の不連続な区画が前記共有の流体用チューブを通って流れるように、前記第１の流体用チューブおよび前記第２の流体用チューブから前記接続器を介して前記共有の流体用チューブ内に流れる、接続器；および前記共有の流体用チューブに連結され、各々の前記交互の不連続な区画を受け取って分析する物質検出器；を備える、流体中の物質を検出する多相流システムであって、
循環腫瘍細胞の光音響検出を行うために、前記物質検出器が内壁を有する流れ室を備え、前記内壁がアクリルアミド・ゲルから作られて、励起細胞から音響センサまでの音響経路を提供し、前記交互の不連続な区画が前記流れ室を通って流れ、前記物質検出器が光音響レーザーを備え、光学導波路を用いて、前記光音響レーザーが前記流れ室を横切る方向または前記流れ室の軸に沿う方向に向けられることで前記不連続な区画全体が照射されるようにしたことを特徴とする多相流システム。
【請求項２】
前記物質検出器は、パルセーターをさらに備えていることを特徴とする請求項１に記載の多相流システム。
【請求項３】
前記物質検出器は、前記光音響レーザーで生成される撮像を用いて、前記流れ室を通って流れる第１の流体と第２の流体の不連続な区画内の物質を検出するように構成されていることを特徴とする請求項１に記載の多相流システム。
【請求項４】
第３の流体が入っている第３の流体用チューブ；をさらに備え、該第３の流体用チューブは、前記接続器に連結され、前記第２および第３の流体用チューブから流れ出る流体が結合し、流体の混合物を形成し、流体の該混合物の交互の不連続な区画が前記共有の流体用チューブを通って流れている前記第１の流体の交互の不連続な区画とは別個の共有のチューブを通って流れていることを特徴とする請求項１に記載の多相流システム。
【請求項５】
流体の移動用の少なくとも１つの装置；第１の流体が入っている第１の流体用チューブ；第２の流体が入っている第２の流体用チューブであって、前記第１の流体と第２の流体は混和しない第２の流体用チューブ；共有の流体用チューブ；前記第１の流体用チューブ、前記第２の流体用チューブおよび前記共有の流体用チューブに連結される接続器であって、前記共有の流体用チューブは、該接続器を介して前記第１の流体用チューブからの第１の流体の流れおよび前記第２の流体用チューブからの第２の流体の流れを受け取るように構成され、前記接続器を介して前記第１の流体用チューブからの第１の流体および前記第２の流体用チューブからの前記第２の流体を受け取ることが、前記第１の流体および前記第２の流体の交互の不連続な区画を発生させることを備え、前記第１の流体および前記第２の流体の交互の不連続な区画が前記共有の流体用チューブを通って流れている接続器；および前記共有の流体用チューブに連結される物質検出器であって、前記交互の不連続な区画が、前記物質検出器により分析される物質検出器；を備えて流体中の物質を検出する多相流システムであって、
循環腫瘍細胞の光音響検出を行うために、前記物質検出器が光音響レーザーを備え、光学導波路を用いて、前記光音響レーザーが前記流れを横切る方向または前記流れの軸に沿う方向に向けられることで前記不連続な区画全体が照射されるようにされ、前記物質検出器が内壁を有する流れ室を備え、前記内壁がアクリルアミド・ゲルから作られて、励起細胞から音響センサまでの音響経路を提供する、ことを特徴とする多相流システム。
【請求項６】
前記第２の流体は、屈折率を有し、前記第２の流体の屈折率は、前記アクリルアミド・ゲルの屈折率より高い屈折率にまで増大されることを特徴とする請求項５に記載の多相流システム。
【請求項７】
前記物質検出器は、パルセーターをさらに備えていることを特徴とする請求項５に記載の多相流システム。
【請求項８】
前記物質検出器は、前記光音響レーザーで生成される撮像を用いて、前記流れ室を通って流れている流体中の物質を検出するように構成されていることを特徴とする請求項５に記載の多相流システム。
【請求項９】
第３の流体が入っている第３の流体用チューブ；をさらに備え、該第３の流体用チューブは、前記接続器に連結されることを特徴とする請求項５に記載の多相流システム。
【請求項１０】
前記第３の流体は、前記第２の流体と混合し、流体の混合物を形成し、該流体の混合物は、前記第１の流体とは混合せず、前記流体の混合物の交互の不連続な区画と前記第１の流体の交互の不連続な区画とは、前記共有の流体用チューブ内を単一の流路に沿って流れ、前記流体の混合物の交互の不連続な区画と前記第１の流体の交互の不連続な区画とは、前記物質検出器により分析されることを特徴とする請求項９に記載の多相流システム。
【請求項１１】
接続器を介して第１の流体用チューブから第１の流体を受け取るステップ、
前記接続器を介して第２の流体用チューブから第２の流体を受け取るステップであって、前記第１の流体と前記第２の流体は、混和せず、前記接続器を介して前記第１の流体および前記第２の流体を受け取るステップは、前記第１の流体および前記第２の流体の交互の不連続な区画を受け取るステップを備えるステップ、
前記交互の不連続な区画の受け取りに基づき、物質検出器を用いて、１以上の前記受け取られた交互の不連続な区画中の少なくとも１つの物質を検出するステップであって、前記物質検出器が内壁を有する前記交互の不連続な区画のための流れ室を備え、前記内壁がアクリルアミド・ゲルから作られて、励起細胞から音響センサまでの音響経路を提供し、前記物質検出器が光音響レーザーを備え、光学導波路を用いて、前記光音響レーザーが前記流れ室を横切る方向または前記流れ室の軸に沿う方向に向けられることで前記不連続な区画全体が照射されるようにするステップ、
少なくとも１つの前記交互の不連続な区画を抽出するステップ、および
前記第２の流体の各々の別個の抽出量が単一の腫瘍細胞を含むまで、前記抽出された少なくとも１つの不連続な区画を希釈および再度通過させるステップ、
を備えることを特徴とする流体中の物質を検出する方法。
【請求項１２】
前記第１の流体および第２の流体の交互の不連続な区画を受け取るステップは、前記接続器に連結されている共有の流体用チューブを介して前記第１の流体および前記第２の流体の前記交互の不連続な区画を受け取るステップを備えていることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アクリルアミド・ゲルの屈折率より高い屈折率まで第２の流体の屈折率を増大させるステップをさらに備えていることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記物質検出器は、受け取られた交互の不連続な区画を分析する励起装置、およびパルセーターをさらに備えていることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記励起装置は、光音響レーザー源であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質、例えば、メラノーマを検出する多相流システムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラノーマ（melanoma）は、致死性の皮膚がんである。メラノーマは、該メラノーマが一般的に皮膚上に容易に認識することができ、簡単に取り除かれるので、その他のがんと比べて比較的低い死亡率を有するけれども、表在性腫瘍（the superficial tumor）が身体の他の部分に転移した場合、メラノーマは、急速に死に至る。転移すると、循環メラノーマ細胞（ＣＭＣ）、元の腫瘍部位から離脱し、血液系またはリンパ系を通って移動する細胞は、それ自身を他の場所に植え付け、その後に最終的なメラノーマの原因となる二次的な腫瘍を作り出すことができる。したがって、治療が成功する可能性がより高いので、早期診断ががんに対する治療法として好ましい。なぜならば、がんがそれ自身まだ完全に明らかにされていないからである。
【０００３】
さらに、２０１０年では、６８,０００人を超えるアメリカ人が病気であると診断され、８，０００人を超えるメラノーマ患者は、病気が原因で死亡するだろう。それにもかかわらず、メラノーサは、早期に検知され、皮膚から迅速に取り除かれるならば、容易に治療され得る。しかしながら、転移した場合、がんは、命取りになり得る。通常、直径が１ｍｍの腫瘍が１００万個の細胞からなることを考慮すると、より大きな目に見える腫瘍は、通常、１０億個の細胞からなり得る。そうは言っても、大きな腫瘍から診断される患者は、選択権が減少し、二次的な腫瘍が形成される前に診断される患者より物理的に要求の多い治療が必要となるだろう。残念ながら、患者は、現在、表在性メラノーマ腫瘍が広がっているかどうかを知るために数ヶ月待たなければならない。なぜならば、転移性のがんを診断する現在の方法は、目に見える転移性の腫瘍の存在を必要とする撮像技術によっているからである。結果として、多くの場合、患者は、診断するには遅すぎることになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
転移性のがんを診断する現在の方法は、リンパ節生検および撮像技術を含んでいる。しかしながら、リンパ節生検は、がんがリンパ系と相互に作用しない場合、検出漏れを作り出すこと恐れがあり、監視している病気に対して何度も実行されることができない。そうは言っても、循環腫瘍細胞は、循環腫瘍細胞がリンパ系または血液系で検知され得るならば、転移性のメラノーマやその他の病理学的疾患の診断および監視のための優れた情報源であり得る。したがって、診断や病気の監視の両方をするために、これらの細胞を検出し、分離するための多くの技術が研究されてきている。ＣＭＣｓを見つけ出すために、既にいくつかの研究が行われてきた。該研究は、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学、磁気セル選別、光ファイバー配列走査技術（fiber optical array scanning technology）およびマイクロフィルタ（microfilters）を含んでいる。しかしながら、研究は、高い検出漏れ率、標識化（labeling）および臨床実施の長い治療の限界の見込みを含んでいる。
【０００５】
残念ながら、転移性疾患を診断するのに使用される現在の方法は、一塊の転移性細胞に対して敏感ではない。患者は、二次的腫瘍が診断され、救命治療が始まり得る前に、二次的腫瘍が形成されるまで、待たなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の実施形態は、簡単であり、失敗の余地が低く、効果的である分離方法と組み合わせてチューブ内でメラノーマを検出する無標識の方法を対象にしている。転移性のメラノーマ細胞が検出され、次に、遠心分離血液サンプルのような患者のサンプルから分離される。メラノーマ細胞の分離は、患者の早期診断において助けとなるばかりでなく、血液中に存在する循環腫瘍細胞の数と患者の予後との間に正の相関関係がある。循環メラノーマ細胞、元の腫瘍部位から離脱し、血液系またはリンパ系を通って移動する細胞の検出は、がんに対する診断ツール（diagnostic tools）であり、監視ツールであり得る。メラノーマ細胞を分離し、これを数え上げることができることが、がん患者の治癒効果を監視するのに使用され得る。細胞の数が大きいと、予後が厳しいことを示しているのに対し、細胞の数が小さいと、治療が効果を挙げていることを示す。
【０００７】
血液中の転移性メラノーマの検出は、がん患者にとって待機戦術を排除するので、血液中の転移性メラノーマの検出は、絶対に必要である。本発明に実施形態を用いて、患者は、走査において腫瘍が目に見えるかどうかを確かめるために数ヶ月も待っていることに代えて、所望されるたびにがんに対して走査された簡単な血液サンプルを有することが可能となる。これらの数ヶ月は、がんが広がったかどうかを確かめるために、または、現在の治療が効果的であるかどうかを監視するために待つこととは対照的に救命治療を患者に提供することに費やされた。
【０００８】
本発明の実施形態は、正常な流れに係る潜在的な誤りを減少させ、患者のサンプルからの転移性のメタノーマの予備の分離を許容する。ある実施形態においては、検出器は、レーザー（a laser）、トランスデューサー（a transducer）およびオシロスコープ（an oscilloscope）を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の実施形態に従う、物質を分離する多相流システムの斜視図である。
【図２Ａ】本発明の実施形態に従う、導管および流体をさらすために取り除かれた多相流システムの本体の頂部部分との連結部の拡大図である。
【図２Ｂ】本発明の実施形態に従う、導管、流体および光導波路をさらすために取り除かれた多相流システムの本体の頂部部分との連結部の拡大図である。
【図３Ａ】本発明の実施形態に従う、交互の流体それぞれの量が変動する２つの流体が入っているチューブの拡大図である。
【図３Ｂ】本発明の実施形態に従う、交互の流体それぞれの量が変動する２つの流体が入っているチューブの拡大図である。
【図４】本発明の実施形態に従う、多相流システムのチューブ理室の拡大斜視図である。
【図５Ａ】本発明の実施形態に従う、たくさんのサンプルの光音響振幅のグラフ図である。
【図５Ｂ】本発明の実施形態に従う、たくさんのサンプルの光音響振幅のグラフ図である。
【図５Ｃ】本発明の実施形態に従う、たくさんのサンプルの光音響振幅のグラフ図である。
【図５Ｄ】本発明の実施形態に従う、たくさんのサンプルの光音響振幅のグラフ図である。
【図５Ｅ】本発明の実施形態に従う、たくさんのサンプルの光音響振幅のグラフ図である。
【図５Ｆ】本発明の実施形態に従う、たくさんのサンプルの光音響振幅のグラフ図である。
【図６】本発明の実施形態に従う、細胞懸濁液の分離された小滴が白血球を示している、照射線を照射した白血球のサンプルの光音響振幅のグラフ図である。
【図７】本発明の実施形態に従う、細胞懸濁液の分離された小滴が色素沈着したメラノーマ細胞の存在を示している、白血球の中の照射線を照射したメラノーマのサンプルの光音響振幅のグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、添付された図面を参照して、以下に詳細に説明される。
【００１１】
本発明の実施形態の概要を簡単に説明すると、本発明の実施形態を示す代表的な図面が本発明の種々の形態に対する一般的状況を提供するために記載されている。多相流システム１０は、一般的に、第１ポンプ１２、第２ポンプ１４、第１の流体用チューブ２４、第２の流体用チューブ２６、接続器２８、複数流体用チューブ３０および物質検出器３２を含んでいる。２つのポンプを有するように示されているけれども、多相流システム１０は、ポンプをいくつでも含み得ることが理解されるだろう。第１ポンプ１２および第２ポンプ１４は、注射器ポンプとして図１に示されている。しかしながら、流体の移動用に使用されるいかなるタイプの装置もポンプとして利用され得ることが理解されるだろう。多相流システム用流量は、０〜１０００[μＬ／ｓｅｃ]の範囲で使用された。別の実施形態では、多相流システムを通る流体の移動は、システムを通るそれぞれの流体の流れを駆動する圧力に基づいている。例えば、１以上の流体は、重力に基づいて多相流システムを通って流れ、結果的に、流体の位置水頭を招いている。
【００１２】
図２を参照すると、チューブ２４、２６および３０は、流体の通過用に使用される長くて中空の、通常、円筒状の物である。１つの実施形態においては、チューブ２４、２６および３０は、シリコーンチューブ（silicone tubing）である。
【００１３】
一時的に図４を参照すると、検出器室３８内の流れ室３３は、針金またはその他のチューブを取り囲んで形作られたアクリルアミド・ゲルから作られる。アクリルアミド・ゲルは、硬化または固体化することが可能であり、針金が取り除かれ、それが検出室３８内にあるとき流体が通過する、内壁によって画定される流れ室３３のような導管を作り出す。当然のことながら、さまざまなその他の方法や材料が使用され、流体が通過する流れ室３３を作り出し得る。実施形態においては、流れ室３３は、水の音響インピーダンス（an acoustic impedance）に近い音響インピーダンスを有する材料から作られる。多相流システム１０は、直径で約０−１０ｍｍの流れ室３３の流れ内径（an inner flow diameter）を有する。アクリルアミド・ゲルは、励起細胞から音響センサまでの音響経路として用いられる。
【００１４】
図１および２を参照すると、第１の流体２０と第２の流体２２が、接続器２８を用いて、それぞれのチューブ２４および２６から共有の流体用チューブ３０内に供給される。流体は、比較的容易に流れることができる物質の状態にあり、その容器の形となる傾向にあり、液体、気体またはプラズマ（plasma）を含み得る。この実施形態においては、第１の流体２０は、第２の流体２２とは異なり、第２の流体と混和しない、および／または第２の流体と気泡を作り出す。例えば、第１の流体２０は、空気であるのに対し、第２の流体２２は、水又は第２の流体２２内で第１の流体２０の気泡が作り出されるその他の流体であり得る。別の実施形態においては、第１の流体２０は、油であるのに対して、第２の流体２２は、水または親水性液体である。図１および２は、第１および第２の流体を有するように描かれているが、本発明の実施形態においては多くの異なる流体が利用され得ることが理解されるであろう。例えば、第３の流体が接続器２８を経由して共有の流体用チューブ３０内に流れ込み得る。
【００１５】
第１の流体２０および第２の流体２２は、接続器２８を用いて、共有の流体用チューブ３０内に供給される。共有の流体用チューブ３０は、流体が通過する共有の導管である。図１および２に示される接続器２８は、Ｙ字形接続器である。接続器は、第１の流体２０と第２の流体２２がともに混合されることなく単一の流路内に強制的に流れ込むことを可能にするＹ字形接続器またはＴ字形接続器を含むどのような形状であってもよいことが理解されるであろう。ある実施形態においては、多相流システムは、そのうちの２つは共有の流体用チューブ３０内で混合するが、３番目の流体とは分離したままである３つの流体を使用し得る。例えば、３つの流体が水、アルギン酸塩および空気である場合、水とアルギン酸塩は、混合し、ゲル状の不連続な区画を形成し得る。また、ゲル状の不連続の区画は。空気の不連続な区画とは分離したままである。別の実施形態においては、共有のチューブで交わる２つのチューブの代わりに、多相流が共有の流体用チューブ３０で交わる多数のチューブに基づいて作り出されてもよい。
【００１６】
第１の流体２０および第２の流体２２は、本質的に、２つの流体の非混和性（例えば、水と油）および／または気泡の発生（例えば、空気と水）に起因して、共有の流体用チューブ３０に交互に入る。ある実施形態においては、非混和性は、（油のような）第１の流体の疎水性および（水溶性の流体のような）第２の流体の親水性に起因している。第１の流体２０が共有の流体用チューブ３０に入ると、第２の流体２２は、第１の流体２０が流れを停止し、第２の流体２２が流れる順番が来るまで、圧力を高める。このことは、第１の流体２０および第２の流体２２それぞれの交互の不連続な区画を作り出す。Ｔ字形連結具のような接続器を通って単一の流路内に２つの流体を導入することで、物質は、区切られる。このことは、検出される物質が配置されている第１の流体または第２の流体の正確な不連続な区画は、識別され、容易に引き出され得るので、理想である。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、第１の流体２０および第２の流体２２の不連続な区画は、共有の流体用チューブ３０の直径によって大きさに違いがある。また、流体の流量（flow rate）は、大きさで０．１［ｍｌ／ｓ］からであり得る。さらに、２以上の流体が利用され、多数の患者からの生体液がまた使用され、交互の不連続な区画に分離され得る。
【００１７】
実施形態において、第１の流体２０は、第２の流体２２の不連続な区画を作り出す空気、気体および／または油のような分離流体である。第２の流体２２は、検出される物質を含んでいるどのようなタイプの流体をも含み得る。ある実施形態においては、第２の流体２２は、がん細胞（乳がん、メラノーマ、前立腺がんなど）、組織、細胞、病原菌、（マラリアのような）微生物、感染症、色素、色誘因を有する非光学的吸収物質（例えば、色のついていないがん細胞に加えられた染料または細胞に加えられた金ナノ粒子）、化合物、非生物学的物質および／または血液、唾液、尿、糞便物質、血清、血漿、組織および髄液を含むがこれに限定されるものではない個体の生物学的サンプルからの異物のような生物学的材料または物質が入っているどのような流体であってもよい。別の実施形態においては、第２の流体２２は、水（第２の流体）中にある検出リード（detecting lead）（物質）のような生物学的または非生物学的物質が入っている非生物学的流体である。以下に詳細に説明されるように、ある実施形態においては、第２の流体２２は、メラノーマ細胞が入っているかもしれないし、入っていないかもしれない個体の白血球溶液を遠心分離機にかけられる。ある実施形態においては、全血液サンプルがメラノーマ患者から採取され、遠心分離され、白血球懸濁液中にメラノーマを残す。
【００１８】
第１の流体２０および第２の流体２２の交互の不連続な区画は、共有のチューブ３０を通って検出器３２の検出室３８内の流れ室３３に流れ込む。図１および４を参照すると、発電器３４が光音響レーザー源である。検出室３８は、検出室３８の内側の開口を画定する内壁３６を含んでいる。レーザー源３４は、レーザー４０およびパルセーター（a pulsator）４２を含んでいる。レーザー源３４は、ある実施形態においては、光音響検出器であるように示されているけれども、発電器３４は、エネルギを、照射、レーザー、化学的、電気的半導体、蛍光、電波、磁気的、トモグラフィー（tomography）、サーモグラフィー（thermography）および超音波検出を含む情報を獲得するためにさらに処理され得る何かに変換する種々の励起装置および／または励起機構を含み得る。
【００１９】
ある実施形態においては、光音響検出器は、メラニン、小色素粒を本質的に含む転移性メラノーマのような色素を有する物質が流体に入っているか否かを検出または決定することができる。流体の個別の不連続な区画が流れ室３３を通過すると、光音響レーザー源３４が速脈の光を照射する。レーザー光は、図２Ｂに対して説明されているように光学導波チューブを用いて、流れを横切る方向にまたは流れの軸に沿う方向に向けられ得ることが理解されるであろう。メラノーマが速脈の強烈なレーザー光で照射されると、メラニンが熱弾性膨張を受ける。したがって、室３３を通過する不連続な区画にメラノーマが入っているならば、メラノーマ内のメラニンは、熱弾性膨張を受け、最終的に光音響波を作り出す。照射を受けたメラノーマ細胞は、圧電変換器で検出される光音響波を作り出し、他方、血液細胞は、該血液細胞が光学的には透明であるので、なんら信号を作り出さない。検出器は、多相流システム内の検出器を通過する流体に特定の物質が入っているか否かを決定するのに用いられることが理解されるであろう。
【００２０】
この実施形態においては、図５Ａ−５Ｆに示され、以下に詳細に説明されるように、強烈なレーザー光で照射された不連続な区画それぞれに対する照射量は、流れ室３３内の音響センサ（又は、その他のタイプのセンサ）から連結部５０を介してコンピュータ表示装置５２またはその他の出力装置へ伝送され得る。不連続な区画に対する照射量は、表示装置５２に表示され、図５Ａ−５Ｆに示され、以下に詳細に説明される。照射量の図式的表示は、求められる媒体を確保するための照射ポイントが信号を作り出す前のスペクトロメータ（a spectrometer）を含んでいる。照射量の使用は、メラノーマ細胞が検出されるとき、流体メラノーマ細胞の不連続な区画が存在することが視覚的に確かめられ得るので、単一のメラノーマ細胞の分離を可能にする。
【００２１】
メラノーマ細胞のような検査を受けている物質が入っていることが検出される特定の不連続な区画が抽出され得る。図１を参照すると、収集容器４８がチューブ出口４６から不連続な区画を収集するために使用され得る。検査を受けている物質が入っているとして識別される流体の不連続な区画の収集が図１の収集容器４８に手作業でなされているものとして示されているのに対して、自動的または手作業による種々の収集機構が不連続な区画を収集するのに用いられ得ることが理解されるであろう。さらに、別の独立した容器（不図示）は、検査を受けている物質に対する陽性反応が出なかったその他の不連続な区画を収集するのに用いられ得る。メラノーマ細胞のような物質が入っている流体量は、気泡により隔離され、少量の流体の分離を可能にし得る。実は、気泡のない連続した流れを利用しながら、収集する液体の量を決定することは難しい。収集された流体の不連続な区画は、種々の検査のために送られるかまたはさらに希釈され得る。
【００２２】
抽出された不連続な区画は、次に、希釈され、システム１０を再度通過し、第２の流体２２の各々の別個の抽出量が単一のメラノーマ細胞を含み、白血球を全く含まなくなるまでこれが繰り返される。それで、サンプルの分析は、所望の物質の所望の濃度が検出され、および／または分離されるまで、繰り返して行われ得る。ある実施形態においては、繰り返される分離の各繰り返しが、希釈の特定な要因により、（白血球のような）好ましくない粒子の濃度を減少させる。例えば、光音響効果を例証する（したがって、不連続な区画がメラノーマ細胞を含むことを示す）不連続な区画は、所望のメラノーマ細胞が別の好ましくない粒子から分離されるまで、繰り返し、希釈され、システム１０を再通過する。次に、分離されたメラノーマ細胞（または、その他の所望の細胞）は、遺伝子発現検査、ＰＣＲなどのような特定の検査のために分析される。
【００２３】
実施形態において、吸収体が光の速脈にぶつかると光音響熱弾性膨張による色素沈着が検出され、無色の粒子は、多数の細胞が同時に検出ビームを横切ることを可能にするように、音響的に透明のままである。したがって、体外でＣＭＣを検出し、捕獲する光音響検出に関して補助的な多相流測定技術が提供される。検出されたメラノーマ細胞の捕獲は、メラノーマが本当に検出されていることを立証するばかりではなく、研究のためにがん生物学者に初期段階のＣＭＣを提供し得る。
【００２４】
図２Ｂを参照すると、光学的導波チューブ５４は、周囲材料より高い光の屈折率を有する流体により生成される。細胞が入っている流体は、糖またはポリエチレン・グリコールを加えることにより、１．３９の屈折率を有し、周囲のアクリルアミド流れ室は、１．３５の屈折率を有する。この不一致は、全反射により光ファイバーに似ている光学的導波チューブが作られることを可能にする。このことは、代わりの構成要素が光学的導波チューブになることを可能にし、それで、レーザー光は、チューブ全体を満たし、不連続な区画全体がレーザー光で満たされる。レーザー光は、全反射により、サンプル全体を照射することができる。全反射は、光が現在通過している材料より低い屈折率を有する材料に該光が衝突するときに発生する。このことは、屈折率パラメータが満たされているかぎりにおいて、レーザー光が選択媒体の内側にとどまることを可能にする。したがって、流路は、レーザー・エネルギを浪費することなしに不連続な区画全体が照射されることを確保する光学的導波チューブである。このことは、ある実施形態においては、糖、ポリエチレンまたはその他の物質を加え、第２の流体に対し屈折率を増大させ、アクリルアミドの屈折率より高い屈折率に増大させることによりなされる。
【００２５】
多相流システム１０は、興味のあるサンプルが、特定の検体および／または物質が該サンプル中に存在するかどうかを識別する検出器を通って流れることを可能にする。白血球の光音響的透過性により、何百万もの細胞が検出器を同時に通過することができる。このことは、非常に多くの量が循環するメラノーマ細胞に対し非常に迅速に走査されることを可能にする。
【００２６】
実施例１：多相流の設計
実施例１に利用された多相流システムは、円筒状のシリコーンチューブを備えている。しかしながら、正方形や長方形のような別の形状が使用され得ることが理解されるであろう。多相流システムは、直径で約１．６［ｍｍ］の流路内径（an inner flow diameter of the channel）を有する。多相流システムは、２００〜３００［μＬ／ｍｉｎ］の範囲以内で使用された。しかしながら、形成されたスラグ（slugs）は、わずかに２〜３マイクロリットルであり、キャピラリー数およびレイノルズ数は、マイクロ流体の状態内にとどまった。さらに、高流速が使用され、それで、多くの血液量が迅速に検査されることができた。
【００２７】
システムは、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）製「クリップ（clip）」変換器を利用した。センサは、圧電性物質であればどのようなものでもよく、またはその他の非圧電性の音波センサであってもよい。それが電流を通すかぎりどのような材料も使用され得ることが理解されるであろう。２枚の真鍮製薄板が中央に孔を有して切断され、ＢＮＣ同軸ケーブル接続器に半田付けされた。真鍮製薄板とＰＶＤＦを隔てるテープが孔を覆う真鍮の間に設置された。変換器は、変換器と安定した流れ室の両方を保持するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製筐体内に設置された。変換器は、スリット内に嵌合され、ＰＤＭＳ製リングは、変換器の上方に設置した。ＰＶＤＦをさらしているが真鍮を覆っている。ＰＤＭＳは、真鍮がメラノーマ検出に干渉することを音響反射が防止するのに使用された。
【００２８】
次に、流れ室は、該室がＰＶＤＦ製構成要素と一直線上に並べられるように、ＰＤＭＳ製リングの上に設置された。周波数が３倍の、Ｑスイッチ・ネオジウム：ＹＡＧレーザー（連続体）が、変換器から直角に流れ室の側部で発射した。レーザーは、５３２[ｎｍ]、２０[Ｈｚ]  および５[ｎｓ]のパルス持続時間の間に５〜８[ｍＪ]  の範囲で振動した。
【００２９】
流れ室は、２つの注射器ポンプに接続された。一方の注射器には、細胞のサンプルが入っており、他方の注射器には、空気が入っている。空気は、０．２[ｍＬ／ｍｉｎ]  で送り込まれ、細胞のサンプルは、０．１[ｍＬ／ｍｉｎ]  で送り込まれる。細胞を収容する注射器ポンプは、細胞が底に沈まないことを確保するように垂直にセットされ、したがって、空気は、増大した圧力を相殺するために高流速を必要とされた。
【００３０】
実施例２：サンプルの準備
２つの独立した相を１つの流路内に組み合わせるとともに、相を異なったままに保つＴ字形連結具を用いて、２相流が作り出された。実施例２において使用のために選択された相は、水と油の２相および空気と水の２相の両方であった。水のスラグを作り出す空気と水は、サンプルを隣接する相で汚すことなく容易に抽出された。しかしながら、空気と水を用いる場合、液体が圧力を高め、システムを浄化する。トゥイーン２０（Tween 20）が空気／水の２相流システムで使用され、相間の界面張力を減少させた。ＰＢＳ緩衝液中に２％のトゥイーン２０が水の相として用いられた。２％のトゥイーン８０のような別の界面活性剤が用いられ、相間の張力を減少させ得ることが理解されるであろう。
【００３１】
実施例３：サンプルの準備
生物学的サンプルが使用され、多相システムが臨床環境に適用できることを示した。メラノーマ細胞は、ミズーリ州の大学で培養され、全ての白血球が研究室員から提供された健康な血液から取得された。細胞の培養および濃縮技術が以下に説明される。メラノーマ細胞は、ＰＢＳ内で懸濁した。
【００３２】
ＨＳ９３６メラノーマ細胞株が、光音響実験において使用するために培養された。細胞は、エタノールに固定され、ＰＢＳ内で再懸濁された。実験の前約１５分、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋２％のトゥイーン２０の溶液で所望の細胞濃度まで希釈された。細胞は、次に、血球計を用いて手作業で計算された。
【００３３】
ＰＢＳで懸濁された白血球およびメラノーマ
ＰＢＳ内で懸濁された白血球は、研究室員から提供されたがんが含まれていない健康な血液を最初に取得することにより準備された。血液は、密度値が白血球のそれと赤血球のそれとの間にある材料であるヒストパク１０７７（Histopaque 1077）が入っている遠心分離チューブに注がれ、次に、遠心分離された。白血球の層とそれに隣接する内容物が取り除かれ、次に、小さな直径の遠心分離チューブに加えられる。このチューブは、再度遠心分離され、白血球の層は、取り除かれ、ＰＢＳで希釈される。
【００３４】
ＰＢＳ内で懸濁されたメラノーマが混入された白血球のサンプルが、最初に研究室員から提供された健康な血液を取得することにより。準備された。血液は、ヒストパク１０７７が入っている遠心分離チューブ内に再度注がれた。ＨＳ９３６株から培養されたメラノーマ細胞は、同じ遠心分離チューブ内に加えられた。遠心分離工程および分離処理は、上述の白血球の準備と同じままである。メラノーマ細胞および白血球は、同じような密度に起因して、遠心分離後、同じ層に沈殿する。この層は、分離され、ＰＢＳで希釈された。
【００３５】
実施例４：流れ室の設計
光音響多相流システムは、ＰＶＤＦ製の圧電変換器を利用し、レーザーは、変換器構成要素から９０°で衝突した。代替手段は、システムの光学的導波チューブの特質を利用して、レーザー光を流れ軸に沿って案内することにある。単一の細胞は、光学的点光源とみなされ、したがって、全ての方向に等しく、放射状に光音響波を放射するであろう。流れ室は、互いに９０°であけられている３つの孔を有するアクリル製リング（an acrylic ring）で結び付けられた。マスターフレックス・チューブ（masterflex tubing）が孔を通して供給され、チューブの内径と同じ外径を有する針金が、２つの対向する孔を通して吊り下げられ、第２の針金が第３の孔を通して供給され、アクリルアミドがチューブの孔に入ることを妨げた。
【００３６】
アクリル製リングが準備されると、パラフィルム（parafilm）がリングの底部に広げられ、透明なアクリルアミドがリングに注がれ、チューブと針金を取り囲んでゲル化した。アクリルアミドは、１０[ｍＬ]の２０％アクリルアミド溶液（シグマ・アルドリッシュ）、０．０４[ｇ]の過硫酸アンモニウム（シグマ・アルドリッシュ）および２０[μＬ]のＴＥＭＥＤ（フィッシャー・サイエンティフィック）から作られた。ＴＥＭＥＤを加えて後、混合物は、早すぎるゲル化を防ぐために直接注がれた。
【００３７】
ゲル化した後、針金は、取り除かれ、光ファイバーを保持するのに用いられるチューブが約４[ｍｍ]が引き出された。それで、流れ室は、システムに用いられる状態にある。
【００３８】
実施例５：盲検試験（Blind Study）
臨床医がこのシステムをうまく操作することができることを証明するために、盲検試験が実行され、メラノーマが入っていないサンプルが、メラノーマが入っているサンプルと容易に区別され得るかどうかを測定した。
【００３９】
２０の無作為のブール値（Boolean values）が、マトラブ（MATLAB）で作られたショートプログラム（a short program）を用いて取得された。「０」は、ＰＢＳ＋２％（ｗ／ｖ）のトゥイーン２０溶液を表し、「１」は、ＰＢＳ＋２％（ｗ／ｖ）のトゥイーン２０内で懸濁された１０メラノーマ細胞［数／μＬ］を表した。
【００４０】
最初は、２人の臨床医が、サンプルにはメラノーマが入っていることおよび入っていないことを漏らすことなしに、サンプルを準備した。次に、別の２人の臨床医がサンプルをフローシステム（the flow system）を通り抜けさせ、サンプルがメラノーマ細胞を有していることおよびオシロスコープ（the oscilloscope）で認識される光音響波に基づいていないことを測定することを求められた。
【００４１】
臨床医は、表１に見られるように、２０のサンプル全てを正確に識別した。基準と検出された細胞のサンプルの光音響信号は、図６および７に示されている。大きな振幅に加えて、メラノーマ細胞は、過度信号を生成し、基準のピーク（baseline peaks）は、流れ全体にわたって一定のままである。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
実施例６：光音響検出およびＷＢＣ中のメラノーマの捕獲
フローシステムは、３つの別個の注入口、１つは、空気が入っている注射器ポンプ、１つは、ＰＢＳ＋トゥイーン２０内にＷＢＣが入っている注射器ポンプ、１つは、ＰＢＳ内に培養されたメラノーマ細胞が入っている注射器ポンプ、を用いて準備された。ＷＢＣ＋ＰＢＳおよび空気は、システム全体にわたってスラグを形成し、いかなる光音響信号も空気またはＷＢＣの気泡からは生成されないことを示すのに用いられた。白血球が入っている注射器ポンプが停止され、メラノーマが入っている注射器ポンプは、期待して、メラノーマの気泡をフローシステム内に手作業で案内し、光音響波を作り出し、次に、システムから分離されるのに用いられた。
【００４４】
結果
２相流：水と油
水と空気を用いる２相流は、フローシステムの未処理分を残すことなしに、均質な、安定した気泡を生成することが観察された。
【００４５】
水と空気
水と空気を用いる２相流は、一貫性のない流れを生成し、圧力上昇は、時々、フローシステムを浄化した。
【００４６】
２％トゥイーン２０が水に加えられた後、安定且つ均質な気泡がいかなる未処理分を受けることなく生成された。
【００４７】
実施例７：濃度による光音響メラノーマ信号
システムは、メラノーマの気泡から光音響信号を生成し、図５Ａ−５Ｆに認められるように、ＷＢＣと空気の気泡に関しては基準のままであった。検出されたメラノーマの気泡は、次に、該気泡がシステムから滴り落ちるときに分離され、気泡は、制御ＷＢＣの気泡とともに表現された。
【００４８】
図５Ａ−５Ｅは、上述された多相流システムを利用して検出された不連続な区画のメラノーマ細胞の密度の違いからの光音響信号のグラフ表示である。図５Ａ−５Ｅは、光音響振幅［ｍＶ］対時間［μｓ］としてプロット（plot）されている。図５Ａは、メラノーマ細胞が含まれていないサンプルからの光音響信号のグラフ表示である。図５Ｂは、メラノーマ細胞が１０［細胞数／μＬ］含まれているサンプルからの光音響信号のグラフ表示である。図５Ｃは、メラノーマ細胞が２５［細胞数／μＬ］含まれているサンプルからの光音響信号のグラフ表示である。図５Ｄは、メラノーマ細胞が１００［細胞数／μＬ］含まれているサンプルからの光音響信号のグラフ表示である。図５Ｅは、メラノーマ細胞が８００［細胞数／μＬ］含まれているサンプルからの光音響信号のグラフ表示である。
【００４９】
図５Ｆは、電圧応答対細胞密度のプロットのグラフ表示である。光音響信号の振幅は、図５Ｆに示されるように、１０［細胞数／μＬ］の濃度まで濃度に直線的に追随する。
【００５０】
盛大な気泡の形成は、油／水と空気／水＋界面活性剤の両方を用いて達成されたけれども、メラノーマ細胞がフローシステムから抽出されことの容易さにより、界面活性剤を添加した水と空気は、さらなる研究のために最高の流体であるであろう。トゥイーン２０の添加は、圧力が上昇したとき、水が空気の前方を横切ることを可能にする２つの相の間の界面張力を減少させる能力により効果的であった。
【００５１】
濃度の研究は、非常に低い濃度が調査されるまで、電圧の振幅と濃度との間の線形相関を示した。このことは、細胞が一様に広まらないので、期待され、それは、外見上低濃度で作られる。また、予想通りに、ＰＢＳ＋トゥイーン２０の制御は、いかなる光音響信号をも生成しなかった。
【００５２】
盲検試験は、このような方法が臨床の場で用いられ、メラノーマを検出し得ることを立証した。メラノーマ細胞の捕獲は、システムが検出されたメラノーマ細胞を該システムから効果的に分離できることをさらに証明した。さらに、このことは、能率的な病気監視技術に向けての重要なステップであり、がん患者やその他の病気を持つ患者のためのよりよい治療法が発見されるように、科学者たちが、細胞が血液系やリンパ系において、転移し、生き続け、また、別の組織内に住み着くメカニズムを発見することを願って、これらの転移性の細胞を研究することを可能にするであろう。
【００５３】
実施例８：メラノーマの捕獲と分離
システムは、ＰＢＳ基準に対しはなんの信号も生成しなかった。また、それぞれ異なる濃度のメラノーマ・スラグから光音響信号を生成した。図６および７は、ＰＢＳ基準に比較して１メラノーマ［細胞数／μＬ］の光音響応答を示している。光音響信号を生成したスラグは、分離され、次に、フォンタナ・マッソン染色（Fontana Masson stain）を用いて染色された。しかし、最高の結果は、スライド（the slides）を何度も洗う必要があり、細胞核は赤に染められ、メラニンは黒に染められる粗っぽい染色方法による可能性が最も高い１００［細胞数／μＬ］のサンプルから得られた。図６に示されるように、細胞懸濁液の分離された液滴は、白血球６１０を示しているとともに、放射線を照射した白血球のサンプルの光音響振幅のグラフ図６００は、光音響効果を何等生じない。図７において、白血球中で放射線が照射されたメラノーマ細胞のサンプルの光音響振幅のグラフ図７００は、光音響波を生じている。光音響波を示す細胞懸濁液の分離された液滴は、着色されたメラノーマ細胞７１０の存在を示している。
【００５４】
上述のことから、本発明は、自明であり、構造物に本来備わっているその他の利点を含めて、先に述べた全ての目標を十分に達成するように構成されていることが認識されるであろう。
【００５５】
特定の特徴およびサブコンビネーション（subcombinations）は、有用性を有し、その他の特徴やサブコンビネーションに言及されることなく採用され得ることが理解されるであろう。
【００５６】
多くの可能性のある実施形態が本発明の範囲から逸脱することなくなされ得るので、上述したまたは添付された図面に示される全ての事項が例示として解釈され、限定するものではないことが理解されるであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７】
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