(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
計測単位時間毎に前記光検出領域から到来する光量を検出する光検出部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて前記計測単位時間毎に検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて、前記光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を一つの発光粒子の信号として個別に検出することにより、前記発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
前記計測単位時間が、前記光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて、前記光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の概算通過時間の半分未満となるように決定されていることを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１の装置であって、前記計測単位時間が前記光検出領域の大きさが大きいほど長く設定され、前記移動速度が高いほど短く設定されることを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１又は２の装置であって、前記光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくとも三つの前記計測単位時間と重複するよう前記計測単位時間が設定されることを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数することを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかの装置であって、前記信号処理部が、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とする装置。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記時系列光強度データを平滑化し、前記平滑化された時系列光強度データに於いて前記所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号を単一の前記発光粒子からの光を表す信号として検出することを特徴とする装置。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする装置。
【請求項１０】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置を移動させながら計測単位時間毎に前記光検出領域から到来する光量を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、
前記時系列光強度データに於いて前記光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を一つの発光粒子の信号として個別に検出することにより、前記発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する過程と
を含み、
前記計測単位時間が、前記光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて、前記光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の概算通過時間の半分未満となるように決定されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法であって、前記計測単位時間が前記光検出領域の大きさが大きいほど長く設定され、前記移動速度が高いほど短く設定されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０乃至１１のいずれかの方法であって、前記光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくとも三つの前記計測単位時間と重複するよう前記計測単位時間が設定されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０乃至１２のいずれかの方法であって、更に、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１０乃至１３のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１０乃至１４のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１０乃至１５のいずれかの方法であって、前記個々の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１０乃至１６のいずれかの方法であって、前記個々の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記時系列光強度データが平滑化され、前記平滑化された時系列光強度データに於いて前記所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の前記発光粒子からの光を表す信号として検出されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１０乃至１７のいずれかの方法であって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置の移動中に前記光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて前記光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の概算通過時間の半分未満となるように決定された計測単位時間毎に前記光検出領域から到来する光量を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
前記時系列光強度データに於いて前記光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を一つの発光粒子の信号として個別に検出することにより、前記発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する手順と
をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項２０】
請求項１９のコンピュータプログラムであって、前記計測単位時間が前記光検出領域の大きさが大きいほど長く設定され、前記移動速度が高いほど短く設定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項２１】
請求項１９乃至２０のコンピュータプログラムであって、前記光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくとも三つの前記計測単位時間と重複するよう前記計測単位時間が設定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項２２】
請求項１９乃至２１のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記個別に検出された発光粒子からの光を表す信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項２３】
請求項１９乃至２２のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項２４】
請求項１９乃至２３のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動することを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項２５】
請求項１９乃至２４のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記個々の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する前記手順に於いて、所定の閾値より大きい強度を有する光を表す信号が検出されたときに１つの発光粒子が前記光検出領域に入ったことを検出することを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項２６】
請求項１９乃至２５のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記個々の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する前記手順に於いて、前記時系列光強度データが平滑化され、前記平滑化された時系列光強度データに於いて前記所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の前記発光粒子からの光を表す信号として検出されることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項２７】
請求項１９乃至２６のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラムに係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３、非特許文献１−３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity  Distribution  Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon  Counting  Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。【０００３】
特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６
【特許文献２】特開２００８−２９２３７１
【特許文献３】特開２００９−２８１８３１
【特許文献４】特許第４０２３５２３号
【特許文献５】国際公開２００８−０８０４１７
【特許文献６】特開２００７−２０５６５
【特許文献７】特開２００８−１１６４４０
【特許文献８】特開平４−３３７４４６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】金城政孝、蛋白質  核酸  酵素  Vol.４４、No.９、１４３１−１４３８頁  １９９９年
【非特許文献２】エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４−２２４頁
【非特許文献３】加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１−２７７頁
【非特許文献４】カスク他３名、米国科学アカデミー紀要  １９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P.  Kask,  K.  Palo,  D.  Ullmann,  K.  Gall  PNAS  96,  13756-13761  (1999)）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６〜８に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が１ｎＭ未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。【０００７】
そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。【０００８】
上記の走査分子計数法では、より具体的には、試料溶液内に於ける光検出領域の位置の移動と共に、逐次的に計測された光強度値（若しくはフォトンカウント値）が時系列の光強度データとして記録され、そのデータ上に於いて、発光粒子から発せられる光を表す光強度値の増大（発光粒子の光を表す信号）が検出される。この点に関し、一般に、走査分子計数法を実施する光分析装置に於いて、単一の発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度は、光検出領域に於ける発光粒子の位置によって異なっており、典型的には、発光粒子の位置が光検出領域の略中心領域に在るときに光強度は最大となり（以下、光検出領域内に於ける発光粒子の光強度が最大となる位置を「最大強度点」と称する。）、発光粒子の位置が光検出領域の周縁へ近づくほど、光強度は徐々に低減する。即ち、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布（以下、単に「光検出領域内の光強度分布」と称する。）は、最大強度点から周縁に向かって強度が低減する略釣鐘状のプロファイルを有している。従って、発光粒子が略直線状に光検出領域内を通過するとすれば、時系列光強度データ上の発光粒子から発せられる光を表す光強度値の増大のプロファイルは、光検出領域内の光強度分布に対応した略釣鐘状のプロファイルとなるので、発光粒子から発せられる光を表す光強度値の増大、即ち、発光粒子の信号は、或る光強度値の増大のプロファイルが発光粒子の光検出領域内の通過時に想定される略釣鐘状のプロファイルとなっているか否かを判定することにより検出可能となる。【０００９】
一方、時系列光強度データ上に現れる発光粒子の信号のプロファイルは、時系列光強度データ生成時の時間分解能にも影響される。典型的には、走査分子計数法を実施する光分析装置に於いて、光強度は、所定の計測単位時間当たりに光検出器にて受光された光量により計測される。例えば、光の計測がフォトンカウンティングによる場合には、光強度は、通常、サブマイクロ秒〜ミリ秒のオーダーにて任意設定される計測単位時間（ビンタイム）毎に、光検出器に到達し検知された光子の数にて表される。従って、かかる計測単位時間当たりの光量にて光強度値の測定を逐次的に行い、時系列光強度データを生成する場合、計測単位時間が短いほど、即ち、時間分解能を高くするほど、高精度にて略釣鐘状の光強度値の増大のプロファイルを取得することが可能となり、計測単位時間が長過ぎると、即ち、時間分解能を低く過ぎると、略釣鐘状のプロファイルが得られなくなってしまう。つまり、発光粒子の信号を高精度にて検出するためには、計測単位時間が短い方が好ましいところ、計測単位時間が短いほど、時系列光強度データのデータ量が増大し、コストが増大することとなる。また、時系列光強度データ上で得られる発光粒子の信号のプロファイルは、光検出領域の移動速度にも依存する。即ち、光検出領域の移動速度が高いほど、発光粒子の光検出領域内に包含される時間が短くなり、単一の発光粒子の信号の出現する時間は短くなる。【００１０】
かくして、本発明の主な課題は、発光粒子の信号の略釣鐘状のプロファイルが確実に検出され、且つ、時系列光強度データのデータ量の過剰な増大を回避できるように、走査分子計数法に於ける光測定の際の計測単位時間を適正な値に設定する手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、計測単位時間毎に光検出領域から到来する光量を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて計測単位時間毎に検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する信号処理部とを含み、計測単位時間が光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて決定されることを特徴とする装置によって達成される。【００１２】
かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。また、典型的には、光検出部は、所定の計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。なお、本明細書に於いて、「発光粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。【００１３】
上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、試料溶液内にて移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることが期待される。従って、逐次的に検出された光に於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。かかる構成に於いて、既に述べた如く、光の検出に際しては、光検出部が計測単位時間毎に光検出領域から到来する光量を検出し、計測単位時間当たりに検出された光量の大きさ又は光強度が電気信号に変換されて信号処理部へ送られ、時系列光強度データを構成する。その場合に、計測単位時間が長過ぎると、発光粒子の信号の特徴的なプロファイルが消失し、計測単位時間が短過ぎると、データ量が膨大となる。この点に関し、発光粒子の信号のプロファイルの特徴が時系列光強度データ上で消失するか否かは、時系列光強度データ上に出現する発光粒子の信号の長さと計測単位時間の長さとの関係によって決定され、発光粒子の信号の長さは、光検出領域の大きさと位置の移動速度とに依存する。そこで、本発明に於いては、発光粒子の信号の特徴的なプロファイルが捉えられ、且つデータ量が抑制できるように、計測単位時間の長さが、光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて設定される。【００１４】
上記の計測単位時間の設定に関して、より詳細には、計測単位時間の長さは、発光粒子の信号の特徴的なプロファイルを捉えるために、時系列光強度データ上に於ける発光粒子の信号の長さに対して相対的に短く設定すべきである。発光粒子の信号の長さは、光検出領域の大きさが大きいほど長くなり、移動速度が高いほど短くなるので、結局、計測単位時間は、光検出領域の大きさが大きいほど長く設定され、移動速度が高いほど短く設定されてよい。また、発光粒子の信号の長さは、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間に相当し、かかる通過時間は、［光検出領域の大きさ］／［光検出領域の移動速度］にて与えられる（ここで、［光検出領域の大きさ］とは、光検出領域の進行方向に平行な方向の寸法又は径である。）。従って、計測単位時間は、発光粒子の通過時間が長いほど長く設定されてよいこととなる。【００１５】
また、計測単位時間の設定について、更に詳細には、時系列光強度データ上に於ける発光粒子の信号からその信号のプロファイルの特徴を捉えるためには、時間方向に於いて少なくとも２つのデータ点が必要である（もしデータ点が一つであれば、信号の存在の有無のみが判別されるだけで、信号のプロファイルの情報は完全に消滅する。）。従って、計測単位時間は、好適には、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間の半分未満に設定される。この点に関し、発光粒子の通過時間としては、理論的な概算値が用いられてよい。上記の如く、発光粒子の通過時間は、［光検出領域の大きさ］／［光検出領域の移動速度］にて与えられる。ここで、光検出領域の移動速度は、後に詳細に述べる如く、光学系内のミラーの向きの変更又は試料容器の移動の速度により決定され、その値は、比較的精度良く見積もられる。しかしながら、光検出領域の大きさについては、光検出領域に於ける励起光の強度がその中心の強度の１／ｅ２となる球面体又は楕円球体の外径として光の波長と対物レンズの開口数を用いて概算されるが、正確に励起光の強度が実質的に０となる面領域を画定することは困難である。そこで、［光検出領域の大きさ］の概算値として、励起光の強度がその中心の強度の１／ｅ２となる球面体又は楕円球体の光検出領域の進行方向に平行な方向の最大寸法又は最大径（光検出領域の概算径）が用いられ、発光粒子の通過時間として、［光検出領域の概算径］／［光検出領域の移動速度］により与えられる値（概算通過時間）が採用されてよい。【００１６】
更に、後に示す実施例の実験の結果によれば、一つの発光粒子が光検出領域を通過する間に少なくとも３つのデータ点、より好適には、４つ以上のデータ点が含まれていると、時系列光強度データ上に於いて、発光粒子の信号をより精度良く検出できることが示された。ここで、一つの計測単位時間に於いて、一つのデータ点が与えられる。従って、上記の装置に於いては、好適には、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくとも三つの計測単位時間と重複するよう計測単位時間が設定されてよい。なお、一つの発光粒子が通過する際の通過時間は、上記の概算通過時間であってもよく、予め実験的に得られた時間値であってもよい。（概算通過時間は、通常、実験的に得られた通過時間よりも短い。）。【００１７】
上記の本発明の装置の信号処理部の処理に於いて、逐次的な光検出部からの検出値の信号から１つの発光粒子が光検出領域に入ったか否かの判定は、既に述べた如く、光検出部にて検出された時系列の光を表す信号のプロファイルに基づいて為されてよい。この点に関し、実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。より具体的には、後の実施形態の欄にて説明される如く、通常、発光粒子からの光を表す信号のプロファイルは、光検出部の時系列の検出値、即ち、光強度データに於いて、或る程度以上の強度を有する釣鐘型のパルス状となり、ノイズのプロファイルは、釣鐘型のパルス状ではないか、その強度が小さくなる。そこで、本発明の装置の信号処理部は、時系列光強度データ上に於いて、所定閾値を超える強度を有するパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号として検出するよう構成されていてよい。「所定閾値」は、実験的に適当な値に設定することが可能である。【００１８】
更に、本発明の装置の検出対象は、単一の発光粒子からの光であるため、光強度は、非常に微弱であり、一つの発光粒子が、蛍光一分子又は数分子などである場合、発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いて信号の値の欠落が生じる可能性がある。そして、そのような欠落が生ずると、一つの発光粒子の存在に対応する信号の特定が困難となる。そこで、信号処理部は、時系列の光強度データを平滑化し、微小な時間に於ける信号値の欠落を無視できるようにデータを加工した後、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号として検出するよう構成されていてよい。【００１９】
上記の本発明の装置に於ける試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよい。発光粒子から検出される光の態様は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、一つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、一つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更可能となっていることが好ましい。【００２０】
また、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、光検出領域が発光粒子の存在位置を通過したときにその発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（発光粒子の存在を表す）信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を一つの（発光粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。【００２１】
試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよく、或いは、試料溶液の位置を（例えば、顕微鏡のステージを移動するなどして）動かして、光検出領域の試料溶液内に於ける位置を移動するようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。特に、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更される場合、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である点で有利である。【００２２】
上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、信号の数を計数して光検出領域に包含された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、検出された発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。【００２３】
上記の本発明の装置に於いて試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら光検出を行い、個々の発光粒子からの信号を個別に検出する光分析技術であって、光検出領域の大きさ及び位置の移動速度を考慮して光検出の計測単位時間が設定される光分析技術の処理は、汎用のコンピュータによっても実現可能である。従って、本発明のもう一つの態様によれば、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置の移動中に光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて決定された計測単位時間毎に光検出領域から到来する光量を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、時系列光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する手順とをコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラムが提供される。なお、典型的には、光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順に於いて、計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光が検出され、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータである。【００２４】
かかる構成に於いても、より詳細には、計測単位時間は光検出領域の大きさが大きいほど長く設定され、移動速度が高いほど短く設定され、或いは、発光粒子の通過時間が長いほど長く設定されてよい。また、好適には、計測単位時間は、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の概算通過時間の半分未満であり、より好適には、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくともの三つの計測単位時間と重複するよう計測単位時間が設定されてよい。【００２５】
また、上記のコンピュータプログラムに於いても、発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出は、時系列の信号のプロファイルに基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。具体的には、光強度データ上に於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよく、好適には、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよい。【００２６】
更に、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。【００２７】
更に、上記のコンピュータプログラムに於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する手順及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順が含まれていてよい。【００２８】
上記の本発明の装置又はコンピュータプログラムによれば、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら、個々の発光粒子の光の検出を行う光分析方法であって、光検出領域の大きさ及び位置の移動速度を考慮して光検出の計測単位時間が設定される新規な方法が実現される。かくして、本発明によれば、更に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、試料溶液内に於ける顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動させながら計測単位時間毎に光検出領域から到来する光量を検出して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列光強度データに於ける個々の発光粒子の各々からの光を表す信号を個別に検出する過程とを含み、計測単位時間が光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて決定されることを特徴とする方法が提供される。【００２９】
かかる方法に於いても、典型的には、光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する過程に於いて、計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光が検出され、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータである。そして、より詳細には、計測単位時間は光検出領域の大きさが大きいほど長く設定され、移動速度が高いほど短く設定され、或いは、発光粒子の通過時間が長いほど長く設定されてよい。また、好適には、計測単位時間は、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の概算通過時間の半分未満であり、より好適には、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくともの三つの計測単位時間と重複するよう計測単位時間が設定されてよい。【００３０】
更に、上記の方法に於いても、発光粒子の各々からの光を表す信号の個別の検出は、時系列の信号のプロファイルに基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。具体的には、光強度データ上に於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよく、好適には、時系列光強度データが平滑化され、平滑化された時系列光強度データに於いて所定閾値を超える強度を有する釣鐘型のパルス状信号が単一の発光粒子からの光を表す信号として検出されてよい。【００３１】
また、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性、試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよく、好適には、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定される。試料溶液内での光検出領域の位置の移動は、任意の方式で為されてよく、好適には、顕微鏡の光学系の光路を変更して或いは試料溶液の位置を動かして光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。【００３２】
更に、上記の方法に於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。【００３３】
上記の本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
【発明の効果】
【００３４】
かくして、本発明によれば、光強度データ上の発光粒子の信号の特徴的なプロファイルが捉えられ、且つデータ量が抑制できるように、光検出の際の計測単位時間が、光検出領域の大きさ及び位置の移動速度に基づいて設定されることとなる。かかる構成によれば、発光粒子の信号の検出する上で、無駄にデータの時間分解能を高くしてデータ量を増やしてしまうといったことが回避され、コストの節約となる。また、データ量の節約を試みる際にも、発光粒子の信号のプロファイルの特徴をより確実に捉えられる限界を把握しながら計測単位時間の設定が可能となり、発光粒子の信号とノイズとの分離の精度の維持が可能となる。更に、発光粒子の信号とノイズとの分離の精度の維持しながら、データ量の節約が可能となるので、発光粒子の信号の検出処理に於ける信号処理の負荷が低減される。【００３５】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１（Ａ）は、本発明による走査分子計数法を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。
【図２】図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、発光粒子からの光の強度変化と、計測単位時間との関係を説明する図である。図２（Ｄ）は、光検出領域の模式図であり、発光粒子の通過時間が、通過位置によって異なることを模式的に示している。
【図３】図３は、本発明に従って実行される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。
【図４】図４（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図４（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。
【図５】図５は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。
【図６】図６は、発光粒子信号として検出されたパルス信号が包含するデータ点の数の分布を示している。（Ａ）は、ＢＩＮＴＩＭＥが２０μ秒に設定された場合あり、（Ｂ）は、ＢＩＮＴＩＭＥが３０μ秒に設定された場合である。
【図７】図７は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な計測精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。
【符号の説明】
【００３７】
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００３９】
光分析装置の構成
本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が中心光強度の１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、計測単位時間（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）毎に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェ��１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
【００４０】
更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。
【００４１】
観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。更にまた、光の検出に関して、励起光として所定の方向に偏光した光が用いられ、検出光として励起光の偏光方向と垂直な方向の成分が選択されてよい。その場合、励起光光路には、ポーラライザ（図示せず）が挿入され、検出光光路に偏光ビームスプリッタ１４ａが挿入される。かかる構成によれば、検出光に於ける背景光を大幅に低減することが可能となる。
【００４２】
本発明の光分析技術の原理
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、時系列光強度データ上にて発光粒子の信号の略釣鐘状のプロファイルの特徴が消失せず、発光粒子の信号を精度よく検出でき、且つ、データ量を過大にしないようにすべく、光検出処理の計測単位時間（フォトンカウンティングのビンタイム）が設定される。以下、本発明の走査分子計数法及びの計測単位時間の設定の原理について説明する。
【００４３】
１.走査分子計数法の原理
ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図１１（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図１１（Ｂ）に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
【００４４】
そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。
【００４５】
走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
【００４６】
２．計測単位時間設定の原理
上記の走査分子計数法により光検出器１６により経時的に取得された光強度のデータ（時系列光強度データ）に於いては、発光粒子からの光によるパルス状の信号の他に、光検出器の熱ノイズや背景光等に起因にするノイズが混入する。そこで、時系列光強度データから発光粒子の信号を検出する際には、典型的には、時系列光強度データに於いて見出されるパルス状の信号の形状的特徴、例えば、ピーク強度、幅、ガウス関数等の釣鐘型関数の形状に対する近似の程度（ガウス関数フィッティングに於ける相関係数）が参照される。そして、発光粒子によるパルス信号に於いて想定される範囲の形状的特徴を有するパルス信号を発光粒子の信号として判別し、それ以外のパルス信号は、ノイズ信号として判別する。
【００４７】
ところで、上記の如き走査分子計数法に於ける逐次的に実行される光測定では、光強度値は、所定の計測単位時間当たりに光検出器にて受光された光量である。光の計測がフォトンカウンティングによる場合には、光強度は、サブマイクロ秒〜ミリ秒のオーダーにて任意設定される計測単位時間（ビンタイム）毎に、光検出器に到達し検知された光子の数にて表される。従って、時系列光強度データは、実際には、計測単位時間毎の光量又は光子数を表すデータ点を時系列に並べたものとなるので、そこに出現する発光粒子の信号のプロファイルは、計測単位時間又はビンタイムの長さによって変化することとなる。即ち、計測単位時間又はビンタイムの長さが長くなるほど、発光粒子によるパルス信号の形状的特徴が消失し、発光粒子の信号とノイズ信号との間の判別を精度よく実行することが困難となる。かくして、精度の良い発光粒子の信号とノイズ信号との間の判別のためには、発光粒子の信号の形状的特徴が捉えられるように、計測単位時間又はビンタイムの長さを発光粒子の信号の長さよりも十分に短くすればよいこととなる。しかしながら、計測単位時間又はビンタイムの長さが短くなるほど、データ点数が増大し、データ量が膨大となって、データ処理負荷やコストの増大に繋がり得る。
【００４８】
そこで、本発明に於いては、光測定の際の計測単位時間又はビンタイムの長さが、発光粒子の信号の形状的特徴によって発光粒子の信号とノイズ信号との間の判別が実行可能であり、且つ、データ点数を無用に増大させないように設定される。図２（Ｃ）は、発光粒子のパルス信号のプロファイルＩＲ及び長さＴｐと、計測単位時間Δτとの関係を示している。同図を参照して、まず、発光粒子のパルス信号の長さＴｐよりも計測単位時間が長い場合、即ち、
［ｉ］Ｔｐ＜Δτ１
の場合、発光粒子のパルス信号のプロファイルＩＲに対して、データ点Ｄｐは、一点のみとなる。この場合、発光粒子のパルス信号のプロファイルの略釣鐘状の特徴が消失し、情報が強度値の大きさのみとなるので、発光粒子のパルス信号の形状的特徴に基づいて、発光粒子のパルス信号を検出することは極めて困難である。また、計測単位時間が、
［ii］Ｔｐ＞Δτ２≧１／２Ｔｐ
であるとき、発光粒子のパルス信号のプロファイルＩＲに対して、データ点Ｄｐは、２点となるが、この場合も、データ点Ｄｐの値には、略釣鐘状の特徴、即ち、時間方向に沿って、小、大、小の順に値が変化する特徴が消失しているので、発光粒子のパルス信号の形状的特徴に基づいて、発光粒子のパルス信号を検出することは困難である。一方、計測単位時間が、発光粒子のパルス信号の長さＴｐの１／２よりも短い場合、即ち、
［iii］1/2Ｔｐ＞Δτ３≧1/3Ｔｐ、
［iv］1/3Ｔｐ＞Δτ４≧1/4Ｔｐ、
［ｖ］1/4Ｔｐ＞Δτ５≧1/5Ｔｐ、
…以下、同様。
であるときには、データ点Ｄｐが少なくとも３点となり、時間方向に沿って、小、大、小の順に値が変化する略釣鐘状の特徴が保存され、発光粒子のパルス信号の形状的特徴に基づいて、発光粒子のパルス信号を検出することが可能となる。
【００４９】
実際、後に説明される実施例１に於ける実験結果によれば、発光粒子の信号として検出されたパルス信号に於いては、各信号の発生期間内にデータ点Ｄｐが少なくとも３点以上含まれていた。かくして、上記の考察及び実施例１の実験結果から、計測単位時間の長さは、発光粒子のパルス信号の発生時間内にデータ点Ｄｐが３点以上包含するよう設定されればよいこととなる。ここで、発光粒子のパルス信号の発生時間は、発光粒子が光検出領域内を通過している時間に相当する。また、１つのデータ点は、１つの計測単位時間に対応する。従って、結局、計測単位時間の長さは、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくとも三つの計測単位時間と重複するように設定されればよいこととなる。なお、かかる条件は、発光粒子の通過時間が三つの計測単位時間の和以上でなくてもよいことは理解されるべきである。上記の条件に於いて、重要なことは、発光粒子の通過時間に於いて、データ点が３以上存在していることであるので、この条件が満たされる限り、三つの計測単位時間の和が発光粒子の通過時間を上回っていてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属する。更に、後に説明される実施例１に於ける実験結果によれば、発光粒子のパルス信号は、その発生時間内にデータ点Ｄｐが４点以上包含される場合に、より精度良く検出することが可能であった。従って、計測単位時間の長さは、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間内に４点以上のデータ点Ｄｐが包含されるよう設定されてよい。（即ち、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくとも４つの計測単位時間と重複するように計測単位時間の長さが設定されてよい。）。
【００５０】
計測単位時間又はビンタイムの具体的な設定は、光検出領域の大きさと光検出領域の移動速度とに基づいて為されてよい。「発明の概要」の欄に於いて記載されている如く、適切な計測単位時間又はビンタイムの基準となる発光粒子の信号の長さ、即ち、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間は、理論的には、
［光検出領域の大きさ］／［光検出領域の移動速度］    …（１）
により与えられるので、計測単位時間又はビンタイムは、かかる理論値を参照して適宜決定されてよい。上記の式（１）から理解される如く、発光粒子の通過時間は、光検出領域の大きさが大きいほど、長くなり、光検出領域の移動速度が高いほど短くなるので、これに追従して、計測単位時間又はビンタイムが増減されてよい。
【００５１】
なお、上記の式（１）に関して、光検出領域の移動速度は、光検出領域の軌跡及び周期から精度よく一義的に算定可能であるが、光検出領域の大きさは、要すれば、発光粒子の光検出領域内に於ける軌跡の距離、即ち、光検出領域の移動方向（走査方向）に平行な方向に於ける長さであり、光検出領域内の発光粒子の通過位置によって異なることとなる。図２（Ｄ）に示されている如く、光検出領域は、球体又は楕円体であるので、球体又は楕円体を横切る距離に相当する式（１）に於ける［光検出領域の大きさ］は、光検出領域の走査方向と垂直な方向に於ける位置によって異なることとなる。例えば、図２（Ｄ）中、発光粒子α、β、γの通過距離は、順に短くなる。また、光検出領域の境界を厳密に定義することも困難である。即ち、光検出領域は、励起光の集光状態（及びピンホールの径）で画定されるところ、理論的に励起光強度（又は検出光強度）が実質的に０になる境界を精度良く定めることは容易ではない。そこで、光検出領域の境界として、光検出領域内の光強度が中心強度の１／ｅ２となる球面又は楕円面ＣＶｎが採用されてよい。そして、光検出領域の光強度が中心強度の１／ｅ２となる球面又は楕円面の直径２Ｗｏは、概ね
２Ｗｏ＝１．２２・λ／（Ｄ／２ｆ）    …（２）
により与えられる（ここで、λは、励起波長、Ｄは、入射光ビーム径、ｆは、対物レンズの焦点距離である。）。従って、式（２）により算出される値を光検出領域の大きさの概算値として用いて式（１）から算出される値が、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間（即ち、発光粒子のパルス信号の長さＴｐ）の概算値（概算通過時間）として参照され、計測単位時間又はビンタイムが決定されてよい。概算通過時間から計測単位時間又はビンタイムを決定する際には、既に述べた如く、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間が少なくとも３つのデータ点を包含すべきであるで、計測単位時間又はビンタイムは、例えば、概算通過時間の半分未満、好適には、１／３程度に設定されてよい。或いは、概算通過時間内に少なくとも３つのデータ点を包含するよう計測単位時間又はビンタイムが決定されてもよい。また、発光粒子の通過位置が光検出領域の周縁に近づくほど、通過時間が短くなることを考慮して、計測単位時間又はビンタイムは、光検出領域の周縁を通過する発光粒子の信号をより確実に検出すべく、少なくとも３つのデータ点が光検出領域の周縁を通過する発光粒子の通過時間内に包含されるように、概算通過時間を参考にして、その１／３よりも十分に短い時間、例えば、その１／６程度の時間などに設定されてよい。もちろん、光検出領域を一つの発光粒子が通過する際の通過時間は、予め実験によっても決定可能であるので、実験的に得られた発光粒子の通過時間内に少なくとも３つのデータ点が包含されるように、計測単位時間又はビンタイムが決定されてもよい。
【００５２】
走査分子計数法の処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明に従った走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定処理、及び（３）測定された光強度の分析処理が実行される。図３は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。
【００５３】
（１）試料溶液の調製
本発明の光分析技術の観測対象物となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。観測対象物となる粒子が光を発する粒子でない場合には、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が観測対象物となる粒子に任意の態様にて付加されたものが用いられる。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。
【００５４】
（２）試料溶液の光強度の測定（図３−ステップ１００）
本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。フォトンカウンティングに於けるビンタイムは、上記の如く、概算通過時間又は実験的に得られた粒子の通過時間内に少なくとも３つのデータ点が包含されるよう適宜設定される。
【００５５】
光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
【００５６】
ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本発明の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図４（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図４（Ｃ）の最上段に例示の如く、個々の発光粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（発光粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
【００５７】
具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ      …（３）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ      …（４）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ      …（５）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０−１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
【００５８】
（３）光強度の分析
上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、発光粒子の信号の検出、発光粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。
【００５９】
（ｉ）発光粒子の信号の個別検出（ステップ１１０〜１６０）
時系列光強度データが生成されると、かかる光強度データ上にて、発光粒子の信号を個別に検出する処理が実行される。既に触れた如く、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度データ上での光強度の変化は、光学系により決定される光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、走査分子計数法では、基本的には、光強度データ上で、適宜設定される閾値Ｉｔｈを超える光強度値が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、光強度が閾値Ｉｔｈを超えないか、時間幅Δτが所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ２／ａ２）      …（６）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（６）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
【００６０】
光強度データ上の信号の検出の処理の一つの例に於いては、まず、光強度データ（図４（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図３−ステップ１１０、図４（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ  ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
【００６１】
次いで、スムージング処理後の光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。光強度データの時間微分値は、図４（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
【００６２】
しかる後、光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号が検出される（ステップ１３０〜１６０）。具体的には、まず、光強度データの時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図４（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図５左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図５右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。なお、発光粒子の信号の検出と同時に信号数のカウンティング、即ち、発光粒子のカウンティングが実行されてよい。
【００６３】
上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。なお、光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
【００６４】
（iii）発光粒子濃度の決定
検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されている場合、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度が決定される（ステップ１７０）。
【００６５】
光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ      …（７）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ      …（８）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（７））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
【００６６】
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
【実施例１】
【００６７】
走査分子計数法に於いて、光検出処理に於ける計測単位時間を種々変更して発光粒子信号の検出に対する計測単位時間の影響を検証した。【００６８】
試料溶液として、リン酸緩衝液（０．１％  Pluronic  F-127を含む）に発光粒子として蛍光色素ＡＴＴＯ６３３(ATTO-TEC)を１０ｐＭにて含む溶液を調製した。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、６３３ｎｍのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、６６０−７１０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列フォトンカウントデータを生成した。励起光のレーザーパワーは、２００μＷとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ  ＴＩＭＥを１μ秒とし、１秒間の測定を行った。【００６９】
光計測後のデータ処理に於いては、まず、取得された時系列フォトンカウントデータについて、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが、それぞれ、１０、２０、３０、５０、１００μ秒となるように、時系列フォトンカウントデータを再構成した（例えば、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが１０μ秒の再構成データは、ＢＩＮ  ＴＩＭＥ１μ秒のデータ点に於いて１０点の光子数を加算して１点のデータ点を生成した。）。次いで、再構成された時系列フォトンカウントデータの各々に於いて、発光粒子の信号の個別検出と信号数のカウンティングを行った。発光粒子の信号の検出は、「（ｉ）発光粒子の信号の個別検出」及び図３のステップ１１０〜１６０に記載された要領に従って、時系列フォトンカウントデータにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小自乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。そして、下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１［ｐｃ／１０μｓ］        …（Ａ）
相関係数＞０．９０
を満たすパルス信号のみを発光粒子の信号として抽出し、その信号数を計数した。【００７０】
表１は、再構成された時系列フォトンカウントデータの各々に於いて、発光粒子信号として検出された信号数と、再構成データのデータ量とを示している。
【表１】
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上記の結果を参照して、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが１０μ秒〜２０μ秒の場合には、検出信号数に大幅な変化はないところ、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが３０μ秒の場合には、検出信号数が大きく減少し、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが５０μ秒以上になると、信号が検出できなかった。光検出領域の直径は、約１μｍに調整されており、光検出領域の移動速度が１５ｍｍ／秒であることから、発光粒子が光検出領域を通過する概算通過時間は約６７μ秒となる。上記の結果は、ＢＩＮ  ＴＩＭＥは、好適には、概算通過時間の半分未満、より好適には、１／３程度に設定されることにより、発光粒子信号の略釣鐘状のプロファイルの特徴が維持され、精度良く発光粒子の検出が可能となることを示唆している。また、ＢＩＮ  ＴＩＭＥを必要以上に短くしないことで、データ量を抑制することも可能となった。【００７１】
更に、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが２０μ秒の場合と、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが３０μ秒の場合とについて発光粒子の信号として検出された各信号に於いて包含されたデータ点の数を確認した。図６（Ａ）は、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが２０μ秒の場合の検出パルス信号内に包含されたデータ点の数に対する検出パルス信号数を示し、図６（Ｂ）は、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが３０μ秒の場合の検出パルス信号内に包含されたデータ点の数に対する検出パルス信号数を示している。同図を参照して理解される如く、発光粒子の信号として検出された信号に於いては、少なくとも３つのデータ点が包含されていた。また、４つ乃至５つのデータ点が包含されているパルス信号の検出数が特に多かった。このことは、検出パルス信号内に包含されたデータ点が４つ以上の場合には、発光粒子信号の釣鐘状のプロファイルの特徴がより良く維持されたためであると考えられる。更に、図６（Ａ）、（Ｂ）を比較して、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが３０μ秒の場合の検出パルス信号数が、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが２０μ秒の場合に比して低減した理由は、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが３０μ秒の場合には、ＢＩＮ  ＴＩＭＥが長くなったために、各発光粒子の信号内に包含されるデータ点が減少し、これにより、光検出領域の周縁に近い位置を通過した通過時間の短い発光粒子の信号の釣鐘状のプロファイルの特徴が消失したためであると考えられる。【００７２】
かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明の教示に従って、走査分子計数法に於ける計測単位時間を設定することにより、発光粒子の信号がその略釣鐘状のプロファイルに基づいて精度良く検出され、且つ、時系列光強度データのデータ量の過剰な増大を回避できることとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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