(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん患者の生存指標を測定する方法であって、前記がん患者に由来する腫瘍サンプル中のＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３εの遺伝子の１つ又は複数における少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態に基づいて、腫瘍浸潤全Ｔリンパ球（ｏＴＬ）の数及び／又は量を分析することを含み、高いｏＴＬの数及び／又は量が、非乳がんのがん、気管支がん、結腸直腸がん若しくは卵巣がん患者におけるより良好な生存及び／又はより良好な無進行生存の指標となるとともに、高いｏＴＬの数及び／又は量が、乳がん患者における生存の不良及び／又は無進行生存の不良の指標となる、がん患者の生存指標を測定する方法。
【請求項２】
前記サンプルにおける少なくとも１つのＣｐＧ位置の少なくとも９０％の脱メチル化が、ＣＤ３＋Ｔリンパ球細胞、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球細胞及び／又はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球細胞の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルにおけるＴｒｅｇ対ｏＴＬ比を決定する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＣｐＧ位置が、ＣＤ３遺伝領域内の転写開始部位、プロモーター領域、イントロン及び／又はエクソン／イントロン境界より上流の５’領域に存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
メチル化状態の分析がメチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、ＣｐＧ島メチル化、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥから選択される分析、若しくは増幅ＤＮＡの検出に基づく他の方法、又はＣＤ３特異的ｑＰＣＲを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＧＡＰＤＨで代表されるハウスキーピング遺伝子における少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化分析を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８、ＣＤ８βの遺伝子、又はＦＯＸＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１０３、ＧＮＧＴ２、ＣＲＴＡＭ、ＩＬ２ＲＢ及びＺＢＴＢ３２、若しくはＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及びＴＮＦＡＩＰ８の遺伝子、又はＦＯＸＰ３遺伝子内のＴＳＤＲにおける少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化分析を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記がんが、結腸直腸がん、気管支がん、乳がん及び／又は卵巣がんから選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが、固形腫瘍サンプル、ヒト血液サンプルを含む哺乳動物の体液、又は組織、器官若しくは細胞型の血液サンプル、血中リンパ球のサンプル若しくはその画分から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物がマウス、ラット、サル又はヒトである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記がん患者に与える化学物質及び／又は生物学的物質に応じた前記ｏＴＬの数及び／又は量を測定及び／又はモニタリングすることを更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法を行うためのキットであって、がん患者におけるｏＴＬの数及び／又は量を、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法に従い、遺伝子ＣＤ３内のＣｐＧ位置のメチル化状態の分析に基づいて同定、測定及び／又はモニタリングするための材料を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法を行うためのキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでがん患者の生存指標を測定する方法であって、上記がん患者に由来する腫瘍サンプル中のＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３εの遺伝子の１つ又は複数における少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態に基づいて、腫瘍浸潤全Ｔリンパ球（ｏＴＬ）の数及び／又は量を分析することを含み、高いｏＴＬの数及び／又は量が、非乳がんにおける上記がん患者のより良好な生存の指標となり、乳がんにおいては、高いｏＴＬの数及び／又は量が上記患者の生存の不良の指標となる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでがん患者の生存指標を測定する方法に関する。本発明は、本発明の方法で使用されるそれぞれのキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍の確立は、腫瘍細胞の好ましい成長速度、及び免疫学的監視から逃れる腫瘍戦略に左右される。最近まで、治療的抗腫瘍戦略は悪性細胞の根絶に焦点を合わせていたが、ほとんどの場合、それだけでは後期疾患を治癒させることができない。免疫系は、一方で宿主保護を示し、他方で腫瘍成長を促進するその曖昧な役割のために、付加的な標的として認識されていた。
【０００３】
抗原特異的な宿主保護は、Ｂリンパ球及びＴリンパ球からなる適応免疫系によって達成される。Ｔリンパ球は、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の発現によって集合的に規定される。腫瘍細胞は特異的な抗原を発現し、それによりＴ細胞媒介性免疫応答の標的となる。マウス実験から、がんの免疫監視におけるＴ細胞の役割が確認され、腫瘍浸潤全Ｔリンパ球（ｏＴＬ）が結腸直腸がん及び卵巣がんにおける腫瘍成長を阻害する。また、腫瘍におけるＣＤ３  ｍＲＮＡ発現レベルの増大は、転帰の改善と相関し、結腸直腸がんにおいて腫瘍再発を防止する（非特許文献１）。
【０００４】
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能は、エフェクターＴリンパ球の役割とは逆である。ＴｒｅｇはエフェクターＴ細胞の応答を制御し、寛容を媒介する。免疫寛容とは、或る特定の抗原を免疫的攻撃から免れさせ、過剰な免疫反応に対抗する適応免疫系の能力を指す。Ｔｒｅｇは一般的にＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５及び転写因子ＦＯＸＰ３の発現によって同定される。特異性を増大させるために、ＣＤ１２７、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＣＤ４５ＲＡ又はＣＤ１０３を含む更なるマーカーのアレイがＴｒｅｇの単離及び特性化に用いられる。
【０００５】
高等生物は、個体のほとんどの細胞がＤＮＡコードの全く同じ相補体を含有するにもかかわらず、様々な組織型において異なるパターンの遺伝子発現を行い、維持する必要がある。大抵の遺伝子調節は細胞の現状に応じた一時的なものであり、外部刺激によって変化する。一方で、持続的な調節は、エピジェネティクス（ＤＮＡの基本的な遺伝コードを変更しない遺伝的な調節パターン）の基本的法則（role）である。ＤＮＡメチル化は後成的調節の典型的な形態であり、安定な細胞記憶として機能し、様々な細胞型の長期同一性を維持するうえで重要な役割を果たす。
【０００６】
メチル化の主要な標的は、２ヌクレオチド配列であるシトシン−グアニン（「ＣｐＧ部位」）であり、この状況でシトシン（Ｃ）は簡単な化学修飾を受けて５−メチル−シトシンとなる場合がある。ヒトゲノムにおいては、ＣＧ配列は或る特定の比較的密なクラスター（「ＣｐＧ島」と呼ばれる）以外については予想されるよりもはるかに稀である。ＣｐＧ島は遺伝子プロモーターと関連することが多く、半数を超えるヒト遺伝子がＣｐＧ島を有すると推定されている（非特許文献２）。
【０００７】
異常なＤＮＡメチル化は、しばしば健常細胞から癌性細胞への形質転換を伴う。観察される影響には、ゲノム規模での低メチル化、腫瘍抑制遺伝子のメチル化の増大及び多くの癌遺伝子の低メチル化がある（例えば非特許文３、非特許文献４、非特許文献５に概説される）。メチル化プロファイルは腫瘍特異的である（すなわち、特定の遺伝子又はさらには個々のＣｐＧのメチル化パターンの変化は、特定の腫瘍型の診断に用いられる）ことが認識されており、現在では、膀胱がん、乳がん、結腸がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、肺がん及び前立腺がんの大規模な診断マーカー群が存在する（例えば非特許文献５に要約される）。
【０００８】
Hamerman et al.（非特許文献６）は、ＣＤ４  Ｔリンパ球とＣＤ８  Ｔリンパ球とを区別している。
【０００９】
特許文献１には、細胞、組織又は核から単離したＤＮＡのメチル化パターンについての情報を収集することと、得られた情報を分析することとを含む、細胞、組織又は核を同定する方法が記載されている。
【００１０】
特許文献２は、Ｔ細胞の亜群を記載しており、それらを調節性Ｔ細胞として規定する特徴に関する。該出願には、かかるＴ細胞、それらを含む組成物及び免疫応答調節の際にそれらを動員するケモカインの使用も記載されている。
【００１１】
特許文献３には、遺伝子ｆｏｘｐ３、又はそのオーソロガス遺伝子若しくはパラロガス遺伝子中の少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含む、哺乳動物のＦｏｘＰ３陽性調節性Ｔ細胞、好ましくはＣＤ２５＋ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を同定する方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法と、調節性Ｔ細胞の検出及び品質保証及び制御のための、転写因子ＦｏｘＰ３の遺伝子のＤＮＡメチル化分析の使用とが記載されている。
【００１２】
最後に、特許文献４は、ＣＤ３δ／γ／ε遺伝子、特にそれらの「上流」調節領域、特にＣＤ３遺伝子のプロモーター領域及び他の保存領域における少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を分析することを含み、分析されたサンプルにおける少なくとも１つのＣｐＧの少なくとも９０％の脱メチル化が記憶ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球、並びに記憶ＣＤ８＋Ｔリンパ球及びナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球の指標となる、哺乳動物のＣＤ３ＣＤ４陽性Ｔリンパ球及び／又はＣＤ３ＣＤ８陽性Ｔリンパ球を同定する方法を記載している。
【００１３】
腫瘍浸潤全Ｔリンパ球（ｏＴＬ）等のＴリンパ球の臨床的役割のより詳細な理解の不足は、主に組織浸潤免疫細胞の分析におけるｍＲＮＡ分析、免疫組織化学（ＩＨＣ）又はフローサイトメトリーに伴う技術的困難に起因する。これら３つの技術全てが、固形組織において定量的に適用する場合に制限を受ける。ｍＲＮＡ発現の分析は、サンプル中の或る特定の転写産物の全量を決定するものであるため、細胞数と関連付けることはできない。フローサイトメトリー分析は、単一細胞懸濁液への解離が分析に必要とされるため固形組織に関して問題があり、ＩＨＣは良くても半定量的でしかない。
【００１４】
腫瘍成長がＣＤ４＋ＣＤ２５＋と推定されるＴｒｅｇ細胞のレベルの上昇によって促進されることが、肝細胞がん、胃がん及び食道がんにおいて、これらの細胞の数の増大が観察されたことから提唱されている。また、報告によると、より低い腫瘍内ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞のレベルが、卵巣がんにおけるより良好な転帰及びＩ期非小細胞肺がん患者におけるより低い再発リスクと関連付けられている。
【００１５】
腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの数が患者の予後と逆相関するという説得力のある考えが、マウス腫瘍モデルにおいてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を除去した際の免疫不応答の解消を示すデータによって支持されている。
【００１６】
しかしながら、他の研究では、予後的重要性は確認されないどころか、Ｔｒｅｇのレベルが増大した患者について好ましい予後が予示されている（非特許文献７）。既知のＴｒｅｇ発現マーカーは全て、活性化エフェクターＴ細胞のサブセットによっても提示されるため、Ｔｒｅｇの正確な定量化は不明確であり、腫瘍におけるＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞カウントの上昇が、ナチュラルＴｒｅｇではなく、一時的にＦＯＸＰ３を発現するＣＤ２５＋エフェクターＴ細胞を少なくとも部分的に反映するかどうかは不確かなままである。この曖昧さは、疾患の転帰におけるＴｒｅｇの影響に関して報告された矛盾する結果の理由となり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】欧州特許第１２１３３６０号
【特許文献２】国際公開第２００４／０５０７０６号
【特許文献３】欧州特許第１８２６２７９号
【特許文献４】欧州特許第２１９９４１１号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Galon, J., et al., Type, density, and location of immune cellswithin human colorectal tumors predict clinical outcome. Science, 2006.313(5795): p. 1960-4
【非特許文献２】Antequera and Bird, Proc Natl Acad Sci USA 90: 11995-9, 1993
【非特許文献３】Jones and Laird, Nature Genetics 21:163-167, 1999
【非特許文献４】Esteller, Oncogene 21:5427-5440, 2002
【非特許文献５】Laird, Nature Reviews/Cancer 3:253-266, 2003
【非特許文献６】Hamerman JA, Page ST, Pullen AM. Distinct methylation states of theCD8 beta gene in peripheral T cells and intraepithelial lymphocytes. J Immunol.1997 Aug 1;159(3):1240-6
【非特許文献７】Tzankov, A., et al., Correlation of high numbers of intratumoralFOXP3+ regulatory T cells with improved survival in germinal center-likediffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma and classical Hodgkin'slymphoma. Haematologica, 2008. 93(2): p. 193-200
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞の測定及び決定は概して容易であり、通常は細胞表面上の上記抗原の発現を分析することによって臨床的に達成されるが、一般的に使用されるＦＡＣＳ分析については、細胞の構成要素（entities）を無傷に維持するには細胞サンプルを新たに単離するか、又は即座に固定する必要があるため、これらの細胞型を決定するのは依然として困難である。したがって、Ｔリンパ球の検出は所望されているが、特に日常的適用にとって問題をはらんでいる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記を鑑みると、腫瘍浸潤Ｔリンパ球の検出に基づきがん患者の生存指標を測定するためのＤＮＡメチル化分析に基づく改善された、特に確実な方法を提供することが本発明の一目的である。別の目的は、腫瘍浸潤Ｔリンパ球の検出に基づいて、患者におけるがん治療の転帰を予測する改善された方法を提供することであり得る。
【００２１】
本発明の第１の態様において、本発明は、がん患者の生存指標を測定する方法であって、上記がん患者に由来する腫瘍サンプル中のＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３εの遺伝子の１つ又は複数における少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態に基づいて、腫瘍浸潤全Ｔリンパ球（ｏＴＬ）の数及び／又は量を分析することを含み、高いｏＴＬの数及び／又は量が、非乳がんにおける上記がん患者のより良好な生存及び／又はより良好な無進行生存の指標となる、がん患者の生存指標を測定する方法を提供することにより上記目的を解決する。
【００２２】
全てではないが多くの分析された他のがんサンプルにおける状況とは対照的に、（本明細書中に記載されるものと同一のアッセイによって）乳がんサンプルを用いて得られたデータは、腫瘍浸潤Ｔリンパ球の存在下での無進行生存の顕著な減少を示した。したがって、検査される腫瘍対象物（entity）に応じて（乳がん対他のがん）、腫瘍部位においてＴリンパ球が多数存在することは、このように無進行生存に有益である場合も、又は有害である場合もある。
【００２３】
固形腫瘍は、ＶＥＧＦ及びＦＧＦのような血管新生促進因子（proangiogenic factors）を時期依存的に高度に発現するようである。したがって、腫瘍がより進行すると、血流量及び血液細胞の蓄積が高くなり、転帰が不良となる。腫瘍が最初から高い血流量を有する場合（例えば結腸直腸がんの場合）、血管新生は正常組織に対して又は時期依存的に腫瘍における血流量を実質的に変化させず、予後がｏＴＬの数と正に相関することとなる。
【００２４】
本発明との関連で、「高いｏＴＬの数及び／又は量」とは、Ｔｒｅｇ対ｏＴＬ比の中央値を健常組織と腫瘍組織とで比較した場合に、増大したｏＴＬの数及び／又は量を意味するものとする。一例では健常組織の３％〜８％に対して腫瘍対象物で１８％〜２５％であり、すなわち少なくとも２倍〜１０倍、好ましくは少なくとも５倍〜１０倍に増大する。
【００２５】
本発明は、特異的な後成的マーカーとしてのＣＤ３遺伝子の同定が、上記の状況の分析の日常的臨床応用を著しく促進することができるという本発明者らの驚くべき発見に基づく。詳細には、全Ｔリンパ球（ｏＴＬ）に対する後成的イムノフェノタイピングの概念が本発明との関連で用いられる。この手段によって、少なくともＦＡＣＳ分析と同等の精度の免疫細胞定量化が可能となり、これは血液及び固形組織の分析に採用可能である。
【００２６】
本発明者らのデータから、遺伝子内のＣＤ３Ｇ領域及びＣＤ３Ｄ領域が、ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるバイサルファイト変換にしか利用可能でないことが更に実証される。この特有の性質に基づいて、Ｔリンパ球の高感度定量化のための特異的ｑＰＣＲアッセイを設計した。このアッセイは、任意でＦＯＸＰ３  ｑＰＣＲアッセイとともに、ｏＴＬ及びＴｒｅｇの定量化に好適な技術的アプローチとなる。
【００２７】
好ましい実施の形態では、全ての細胞型においてバイサルファイトが反応可能な（accessible）ハウスキーピング遺伝子、好ましくはＧＡＰＤＨのＣｐＧ島内の領域を用いて総細胞カウントを決定することができる。等モルの定量標準としてＦＯＸＰ３、ＣＤ３及びＧＡＰＤＨの対応する標的領域を単一プラスミド（特許文献４を参照）にクローニングすることは、任意の所与のサンプルにおける指定の細胞型の完全に同等な分析を可能にする。凍結又はパラフィン包埋したサンプルに対して測定を行うことができ、結果が新たなサンプルを用いたＦＡＣＳ分析によって得られた細胞カウントと良好に相関するため（図２）、この技術は、サンプルの管理が未だ中核的な課題である臨床試験及び日常診断の用途に適している。
【００２８】
この方法に基づいて、本発明者らは、一部ドナーをマッチさせた６１６個のサンプルを用いて、卵巣、結腸直腸、乳房及び気管支の健常組織及び腫瘍組織の独立コホートにおいて、Ｔｒｅｇの頻度、ｏＴＬ及びそれらの比率を分析した。本発明者らは、Ｔｒｅｇ対ｏＴＬ比の中央値が、健常組織の３％〜８％から全ての腫瘍対象物の１８％〜２５％までシフトすることを見出した。重要なことには、後成的に決定されたｏＴＬカウントが、結腸直腸がん及び卵巣がんの転帰と相関していた。したがって、このデータは、腫瘍微小環境における免疫細胞の組成を後成的測定によって定量的に評価することができることを示している。この組成は固形腫瘍において乱され、腫瘍免疫回避の基本的機構が示される。免疫組織化学とは対照的に、Ｔリンパ球の後成的定量化は、転帰予測の独立した臨床的パラメータとなる。
【００２９】
本発明による方法の別の好ましい実施の形態では、上記サンプルにおける少なくとも１つのＣｐＧ位置の少なくとも９０％の脱メチル化が、ＣＤ３＋Ｔリンパ球細胞、特にＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔリンパ球細胞、及び／又はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球細胞の指標となる。好ましくは、上記サンプルにおける上記少なくとも１つのＣｐＧ位置は、９１％超、好ましくは９２％超、最も好ましくは９５％超脱メチル化されている。
【００３０】
好ましい１つの実施の形態では、非常に良好な領域の１つは、プロモーターであるか、又は例えばバイサルファイトシークエンシング方法を使用する場合、ＣＤ４＋細胞若しくはＣＤ８＋細胞のいずれかにおいてＣＤ３を発現する細胞を、ＣＤ３を発現しない他の全ての細胞と比較した際に、差次的（differential）メチル化状態を示す多くのＣｐＧモチーフを含有する、例えば特許文献４等に記載されるようなヌクレオチド配列を有するＴＬＳＤＲである。
【００３１】
本発明者らは、ＣＤ３＋細胞においてＣｐＧモチーフがほぼ完全に（すなわち７０％超、好ましくは８０％、好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超）脱メチル化されている一方で、全てのＣＤ３−細胞においては同じモチーフが完全にメチル化されていることを実証することができた。上述の領域内のＣｐＧモチーフの差次的メチル化は、ＣＤ３発現と相関する。したがって、ＣＤ３遺伝子座のメチル化状態の決定は、Ｔリンパ球を同定するうえで有益な手段となり得る、例えば記載のように、がんにおいてＴリンパ球を測定するのに必要とされるか、又は少なくとも幾らか有用であるとされる。このアッセイは、精製又は任意の染色手順なしにＴリンパ球の測定を可能にする。固形腫瘍又は他の固形組織において、上記領域で脱メチル化される細胞の数もさらに報告され、それによりＣＤ３陽性腫瘍浸潤Ｔリンパ球の総量が示される。
【００３２】
本発明者らは、Ｔリンパ球におけるＣＤ３の構成的発現が、後成的調節、すなわちＤＮＡメチル化に基づく調節と同時に起こる可能性を示した。ＤＮＡメチル化は生物学的かつ化学的に安定な後成的修飾であり、長期の遺伝子発現変化をもたらす。本発明者らは、全ての主要な末梢血細胞型について試験し、様々な腫瘍細胞株を含む非血液細胞を選択したところ、ヒトのＣＤ３遺伝子座での脱メチル化がＴリンパ球に限定されることを見出した。これらのデータによって、ＣＤ３遺伝子座における後成的修飾が、特異的なδ副鎖（sub-chains）又はγ副鎖の発現にかかわらず、Ｔリンパ球の表現型を有する細胞の同定に対する有益なマーカーとなることが示された。
【００３３】
上記サンプルにおけるＴｒｅｇ対ｏＴＬ比を、マーカー（それぞれＴｒｅｇ特異的対非Ｔｒｅｇ特異的）及び本明細書に記載の方法に基づいて決定することが、本発明による方法との関連で更に好ましい。
【００３４】
本発明による方法の別の好ましい実施の形態では、上記少なくとも１つのＣｐＧ位置は、ＣＤ３遺伝子又は遺伝領域内の転写開始部位、プロモーター領域、イントロン、及び／又はエクソン／イントロン境界より上流の５’領域に存在する。本発明はまた、ＣＤ３遺伝子の特に好ましい領域、いわゆる「ＴＬＳＤＲ」（特許文献４に記載のＴリンパ球特異的脱メチル化領域）においてＣｐＧモチーフがほぼ完全に（すなわち９０％超、好ましくは９１％、好ましくは９２％超、最も好ましくは９５％超）脱メチル化されている一方で、全ての非Ｔリンパ球においては同じモチーフが完全にメチル化されているという驚くべき発見を提示する。したがって、これらの領域及びその診断用途は、本発明による診断分析に対して有益かつ確実な手段を提供するものでもある。
【００３５】
ＣｐＧ位置のメチル化状態を分析するために、ＤＮＡメチル化を分析する任意の既知の方法を用いることができる。本発明による方法の別の好ましい態様では、メチル化状態の分析は、メチル化特異的酵素消化、バイサルファイトシークエンシングから選択される方法、プロモーターメチル化、ＣｐＧ島メチル化、ＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥから選択される分析、又は増幅ＤＮＡの検出に基づく他の方法、好ましくはＣＤ３特異的ｑＰＣＲを含む。これらの方法は当業者に既知であり、それぞれの文献中に見ることができる。
【００３６】
好ましくは、例えばＭＳＰ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ、ＭＳ−ＳＮＵＰＥ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、バイサルファイトシークエンシング、メチル特異的制限アッセイの状況における増幅には、ポリメラーゼ酵素、ＰＣＲ増幅反応若しくは化学的増幅反応、又は当業者に既知の他の増幅方法が含まれる。増幅によって、本発明による方法（複数可）を行うための特に好ましい「手段」である、ＣＤ３遺伝子又は例えば特許文献４に記載されるような任意のパラログ若しくはオーソログ中のＴＬＳＤＲ又は任意の他の領域のアンプリコンが生成される。
【００３７】
当業者であれば、分析すべき部位の量を最小限にするために、ＣｐＧ位置の特異的サブセット、例えば分析対象の任意のアンプリコン、例えば特許文献４に記載のアンプリコンのＣｐＧ位置１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０の少なくとも１つ、又はＣＤ３遺伝子座内の他の配列を更に選択することが可能である。これらの位置は、生成及び分析されるアンプリコンの５’末端から数値的に数えられる。位置４、５、６又は７の組合せが好ましく、これらは本発明との関連で情報を提供するのに十分な情報を生み出す。
【００３８】
本発明による方法の好ましい実施の形態では、上記方法は例えばＤＮＡチップ上での日常的適用に好適である。当業者であれば、上記の情報及びそれぞれの文献に基づいて上記の方法をかかる状況に適応させることができる。
【００３９】
本発明による方法の別の好ましい実施の形態では、ハウスキーピング遺伝子、例えばＧＡＰＤＨ内の少なくとも１つのＣｐＧ位置の更なるメチル化分析を、上記サンプル中のｏＴＬの量及び／又は数を正規化するために行うことができる。ハウスキーピング遺伝子は、典型的には基本的な細胞機能の維持に必要とされ、全てのヒト細胞に見られる構成遺伝子である。他の好適なハウスキーピング遺伝子は当業者にとって既知であり、例えばHuggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A. Real-time RT-PCRnormalization; strategies and considerations. Genes Immun. 2005 Jun;6(4):279-84、又はRomanowski T, Markiewicz A, Bednarz N, Bielawski KP. Housekeepinggenes as a reference in quantitative real-time RT-PCR Postepy Hig Med Dosw(Online). 2007 Sep 28;61:500-10に記載されている。
【００４０】
本発明による方法の別の好ましい態様では、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８、特にＣＤ８βの遺伝子、又はＦＯＸＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１０３、ＧＮＧＴ２、ＣＲＴＡＭ、ＩＬ２ＲＢ及びＺＢＴＢ３２、若しくはＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及びＴＮＦＡＩＰ８の遺伝子、好ましくはＦＯＸＰ３遺伝子内のＴＳＤＲにおける少なくとも１つのＣｐＧ位置のメチル化状態を、ＣＤ３についての本明細書中の記載と同様にして分析する。したがって、これらの遺伝子は全てのＣＤ３陽性Ｔリンパ球の明確な同定も可能にする。したがって、本発明による方法の好ましい実施の形態では、上記少なくとも１つのＣｐＧ位置は、ＣＤ３陽性Ｔリンパ球において遺伝子（複数の場合もあり）ＦＯＸＰ３、ＧＮＧＴ２、ＣＲＴＡＭ、ＩＬ２ＲＢ及びＺＢＴＢ３２内の転写開始部位、プロモーター領域、イントロン及び／又はエクソン／イントロン境界より上流の５’領域に存在する。これらのマーカーによって、ＣＤ８陽性細胞とＣＤ４陽性細胞とを分離することが可能である。この分析は、Ｔリンパ球のＣＤ３表現型についての分析と同時に、又はそれに続いて行うのが好ましい。
【００４１】
同様に、ＦＬＪ０００６０、ＦＬＪ３８３７９、ＰＰＰ６Ｃ、ＣＤ２２６、ＺＢＴＢ７Ｂ及びＴＮＦＡＩＰ８によって、全血においてＣＤ４発現細胞を確実に同定し、ＣＤ４陽性ＣＤ３陽性細胞とＣＤ８陽性ＣＤ３陽性細胞とを分離することが可能である。
【００４２】
本発明による方法は、好ましくは原発性又は続発性（転移）の固形腫瘍に由来する材料に対して行われる。更に好ましいのは、前記がんが、結腸直腸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、食道がん、前立腺がん、気管支がん、乳がん及び／又は卵巣がん、及び／又は黒色腫及び／又は非小細胞気管支癌から選択される、本発明による方法である。
【００４３】
本発明による方法の別の好ましい態様は、前記決定に基づく予後診断を更に含み、（任意で健常組織又は非悪性組織と比較して）高い腫瘍浸潤ｏＴＬの数及び／又は量が、上記非乳がん患者に対するより良好な予後の指標となる。より良好な予後は、がん患者についてのより長期の全生存、無再発期間、無進行期間及び転移がないことの少なくとも１つを含むものとする。乳がんにおいては、（任意で健常組織又は非悪性組織と比較して）高い腫瘍浸潤ｏＴＬの数及び／又は量が、上記乳がん患者についての予後不良の指標となる。
【００４４】
本発明による方法の更に別の好ましい態様では、より良好な予後が、例えば７％という健常組織の中央値よりも高いｏＴＬカウントと関連する。
【００４５】
本発明による方法の更に別の好ましい実施の形態では、サンプルは、固形腫瘍サンプル、ヒト血液サンプルを含む哺乳動物の体液、又は組織、器官若しくは細胞型の血液サンプル、血中リンパ球のサンプル若しくはその画分から選択される。好ましくは、上記がん患者はマウス、ラット、サル又はヒトである。サンプルは必要に応じて好適にプールすることができる。
【００４６】
次に、本発明による方法の別の好ましい態様は、例えば抗がん治療、例えば結腸直腸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、食道がん、前立腺がん、気管支がん、乳がん及び／又は卵巣がん、及び／又は黒色腫及び／又は非小細胞気管支癌、好ましくは結腸がん又は卵巣がんに対する化学療法として、上記がん患者に与える化学物質及び／又は生物学的物質に応じた上記ｏＴＬの数及び／又は量を測定及び／又はモニタリングすることを更に含む上記の方法に関する。
【００４７】
次に、本発明の更に別の好ましい態様は、抗がん治療、例えば結腸がん又は卵巣がんに対する化学療法として、本明細書の記載の本発明の方法を用いて与えられる化学物質及び／又は生物学的物質に応じた上記ｏＴＬの数及び／又は量を測定及び／又はモニタリングすることを含む、がん、例えば結腸直腸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、食道がん、前立腺がん、気管支がん、乳がん及び／又は卵巣がん、及び／又は黒色腫及び／又は非小細胞気管支癌、特に結腸がん、乳がん、気管支がん又は卵巣がんを治療する方法に関し、この場合、任意で未治療のがん患者と比較して高いｏＴＬの数及び／又は量が、上記非乳がんの治療の指標となる。
【００４８】
次に、本発明の更に別の好ましい態様は、例えば抗がん治療、例えば結腸直腸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、食道がん、前立腺がん、気管支がん、乳がん及び／又は卵巣がん、及び／又は黒色腫及び／又は非小細胞気管支癌、特に（inparticular）結腸がん、乳がん、気管支がん又は卵巣がんに対する化学療法として、上記がん患者に与える化学物質及び／又は生物学的物質に応じた上記ｏＴＬの数及び／又は量を測定及び／又はモニタリングすることと、上記がん患者に与えられる化学物質及び／又は生物学的物質に応じた上記ｏＴＬの数及び／又は量の変化に基づいて、上記抗がん治療、例えば結腸直腸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、食道がん、前立腺がん、気管支がん、乳がん及び／又は卵巣がん、及び／又は黒色腫及び／又は非小細胞気管支癌、特に結腸がん又は乳がん、気管支がん又は卵巣がんに対する上記化学療法の変更、継続又は中止を決定することとを含む、がん、例えば結腸直腸がん、子宮内膜がん、膵臓がん、食道がん、前立腺がん、気管支がん、乳がん及び／又は卵巣がん、及び／又は黒色腫及び／又は非小細胞気管支癌、特に結腸がん、乳がん、気管支がん又は卵巣がんを治療する改善された方法に関する。
【００４９】
次に、本発明の更に別の好ましい態様は、上記に記載の本発明による方法に従って、遺伝子ＣＤ３内のＣｐＧ位置のメチル化状態の分析に基づいて、がん患者におけるｏＴＬの数及び／又は量を同定、測定及び／又はモニタリングするための材料を含む、上記に記載の本発明による方法を行うためのキットに関する。好ましくは、上記キットは、ａ）バイサルファイト試薬と、ｂ）上記に記載の本発明による方法に従う遺伝子ＣＤ３内のＣｐＧ位置のメチル化分析のための材料とを含む。
【００５０】
最後に、本発明は、がん患者におけるｏＴＬを同定及び／又はモニタリングするための本発明によるキットの使用も包含する。
【００５１】
本発明のデータから、遺伝子内のＣＤ３Ｇ領域及びＣＤ３Ｄ領域が、ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるバイサルファイト変換にしか利用可能でないことがことが実証される。この特有の性質に基づいて、Ｔリンパ球の高感度定量化のための特異的ｑＰＣＲアッセイを設計した。このアッセイは、ＦＯＸＰ３  ｑＰＣＲアッセイとともに、ｏＴＬ及びＴｒｅｇの定量化に好適な技術的アプローチとなる。全ての細胞型においてバイサルファイトが反応可能なハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのＣｐＧ島内の領域を用いて総細胞カウントを決定することができる。等モルの定量標準としてＦＯＸＰ３、ＣＤ３及びＧＡＰＤＨの対応する標的領域を単一プラスミドにクローニングすることは、任意の所与のサンプルにおける指定の細胞型の完全に同等な分析を可能にする。凍結又はパラフィン包埋したサンプルに対して測定を行うことができ、結果が新たなサンプルを用いたＦＡＣＳ分析によって得られた細胞カウントと良好に相関するため（図２）、この技術は、サンプルの管理が未だ中核的な課題である臨床試験及び日常診断の用途に適している。
【００５２】
本発明では、固形の卵巣腫瘍、気管支腫瘍及び結腸直腸腫瘍を有する患者の罹患組織における免疫細胞の役割を解明するためにこの技術を適用した。データから、分析した他の組織と比較して、顕著に低いＴｒｅｇ浸潤及びｏＴＬが健常卵巣組織において示された。本発明者らは、この観察結果を組織特異的なレベルの潅流によるものと考える。ただし、Ｔｒｅｇ対ｏＴＬ比の平均は、全ての健常組織において安定して３．５％〜７％の範囲であり（図３Ｃ）、これは末梢血において測定される比率に相当し（図２）、ＦＡＣＳ分析を用いて別項に報告した。このことは、Ｔリンパ球の１０分の１までが抑制表現型を示す場合に健常な免疫バランスが得られることを示している。本発明者らは、試験した全ての腫瘍対象物において、より高頻度のＴｒｅｇを観察した（図３Ａ）。ｏＴＬカウントは肺腫瘍及び結腸直腸腫瘍のサンプルでは低減したが、卵巣腫瘍サンプルでは増大した（図３Ｂ）。健常卵巣組織におけるＴリンパ球カウントが、他の組織よりも低い値を示したことから（より低い組織潅流に起因する可能性が高い）、本発明者らは、Ｔｒｅｇレベルの著しい上昇及びｏＴＬレベルの顕著な増大が、腫瘍によって媒介される潅流の増大のためであると仮定する。他の健常組織では、腫瘍組織及び健常組織における潅流の差があまり明白でないことから、この影響は顕著には観察されない。
【００５３】
潅流関連因子を除く免疫状態を利用するために、Ｔｒｅｇ対ｏＴＬ比を決定した。本発明者らは、腫瘍中の組織浸潤免疫Ｔ細胞の総サブセットにおいて少なくとも抑制性Ｔ細胞の中央値レベルの倍増を観察した。とりわけ、このシフトは全ての腫瘍対象物にわたって観察された。この研究の信頼性を、２つの独立したＣＲＣコホートによるデータを比較する際の仮想結果の合同（congruence）によって更に高くした（図３）。
【００５４】
さらに、本発明によるマッチドペア（matched-pair）分析から、１７７人のうち１５３人（８６％）の患者においてＴｒｅｇの相対的な富化が示された。この傾向の例外は主に結腸直腸サンプルにおいて観察された。組織学的な組織割り当てがこれらのサンプルにいて特に要求されるため、本発明者らは組織選択の技術的課題を外れ値の適切な解釈であると考える。
【００５５】
ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞は、腫瘍組織において上方調節を示す。ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋細胞の数の低さ及びＣＤ３  ｍＲＮＡの数の高さは、より良好ながん患者の生存と関連していた。しかしながら、ヒト研究には、ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞が活性化エフェクターＴ細胞を含み、ｍＲＮＡ、ＩＨＣ又はＦＡＣＳ分析のいずれかを用いた組織分析が、限られた精度の絶対的定量及び相対的定量しかもたらさないという問題がある。ここで、本発明者らは、異なる技術的アプローチを用いて、不均衡な（dysbalanced）Ｔｒｅｇ対ｏＴＬ浸潤比が、固形腫瘍において高頻度で顕著に観察されるということを示した。ＦＯＸＰ３及びＣＤ３の後成的分析はＴｒｅｇ及びｏＴＬのみに関連したものであり、正確かつ完全に定量的なデータを提供する。様々な腫瘍対象物にわたって一様な不均衡が、以前の報告とともに（joint with）、この影響が固形腫瘍に関連する免疫状態の恒常的欠如であることを示唆している。本発明者らは、この不均衡が腫瘍確立に対抗する身体の病理学的な不能に寄与し、永続的な腫瘍確立の必須条件であり得ると仮定する。しかしながら、後成的分析は、その記述的な（descriptive）性質のために、かかる仮説を正式に証明するには不十分である。
【００５６】
主要なヒト組織では、機能的重要性の評価の近似として生存分析が使用される。したがって、本発明者らは患者の生存に対する腫瘍におけるＴリンパ球浸潤の役割を試験した。本発明者らのデータは、状況が逆である乳がんを除いて、腫瘍内ｏＴＬの数の増大がより良好な予後につながることを示す以前の報告を裏付けるものである。この傾向は、無進行生存（ＰＦＳ）分析及び関連の全生存（ＯＳ）分析についての３回の独立研究の全てにおいて観察される。ＰＦＳ及びＯＳの両方についての全てのコホートにわたるデータの定性的同等性は、この観察結果の高い関連性を示している。したがって、日常的適用のための後成的予測手段の開発が可能である。ｏＴＬのプラスの影響は、腫瘍浸潤Ｔリンパ球の即応性、したがってＴｒｅｇ対ｏＴＬ比が腫瘍の展開に直接影響するという仮説と一致する。これは全Ｔリンパ球が主にエフェクターＴ細胞に相当するためである。
【００５７】
要約すると、本発明者らは、免疫細胞の後成的分析が血液、場合によっては、更に重要なことには固形組織におけるイムノフェノタイピングを容易にする新規の方法であるという証拠を示す。示したデータは、腫瘍確立におけるＴｒｅｇ対ｏＴＬ比の重要な役割を強く確立するものである。正式に証明されてないにもかかわらず、このデータは、抑制性ＴｒｅｇとエフェクターＴリンパ球との不均衡が腫瘍免疫回避と同時に起こり、腫瘍確立の固有の特徴であり得るという見解を確かに広めるものである。したがって、寛容原性免疫系対エフェクター免疫系の細胞の比率の変化が抗腫瘍戦略の強い標的となり得る。患者の予後に対する腫瘍内Ｔリンパ球カウントのプラスの影響は、免疫細胞の存在及び均衡が、抗腫瘍応答が機能していない身体の重要な要素であるという見解を更に支持する。
【００５８】
本発明をここで、以下の実施例に基づき、添付の図面及びシークエンシングプロトコルを参照して（これらに限定されない）更に説明する。本発明の目的上、本明細書中に引用される全ての参考文献は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ＣＤ３遺伝子座及びＧＡＰＤＨ遺伝子座の後成的プロファイリングを示す図である。Ａ）遺伝子のゲノム局在性及び構成。転写産物は、それらの配向に応じて染色体バーの上又は下に示す。後成的分析に使用されるアンプリコンを赤色のボックスとして示す。Ｂ）Ａに示すアンプリコンのバイサルファイトシークエンシングによって得られた後成的プロファイリングのマトリックス。各々のラインは、左側に示す精製細胞型に対して試験したアンプリコン中に存在するＣｐＧのバイサルファイト変換状態を表す。個々の四角は各々、単一のゲノムＣｐＧ位置を表す。青色の四角は、バイサルファイト変換に利用不可能であり、ＣｐＧとして検出されるゲノムＣｐＧに対応する（ＣｐＧ変異体）。黄色の四角は、バイサルファイト変換に利用可能であり、ＴｐＧとしてシークエンシングされるＣｐＧに対応する（ＴｐＧ変異体）。灰色の陰影によるコードを右側に示す。Ｃ）バイサルファイト変換に特異的なｑＰＣＲアッセイの増幅プロファイル。上パネルは、ＴｐＧ変異体に特異的なＰＣＲシステムを、ＴｐＧ鋳型変異体（薄い灰色）及びＣｐＧ鋳型変異体（濃い灰色）を示す１２５００個、２５００個、５００個、１００個及び２０個というプラスミドコピーの段階希釈物に対して試験したものである。下パネルは、同じ実験をＣｐＧ変異体に特異的なＰＣＲシステムを用いて行ったものである。各々のグラフにおいて、使用した鋳型のｌｏｇ濃度に対して測定されたＣＰ値をプロットすることによって、全てのＰＣＲシステムの直線性が示される。
【図２】後成的ｑＰＣＲ及びＦＡＣＳを用いたＣＤ３＋細胞及びＦＯＸＰ３＋細胞の計数を示す図である。末梢血を１７人のドナーから採取し、細胞数を４時間〜８時間以内にＦＡＣＳによって（Ｘ軸）、また１年以内にｑＰＣＲ分析によって（Ｙ軸）測定した。Ａ）ＦＡＣＳによって計数した細胞数は、全ての有核細胞に対するＣＤ３＋細胞のパーセンテージを表す。ＣＤ３特異的ｑＰＣＲシステムを適用してｑＰＣＲ分析を行った。Ｂ）ＦＡＣＳによって計数した細胞数は、全ての有核細胞に対するＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−細胞のパーセンテージを表す。ＦＯＸＰ３特異的ｑＰＣＲシステムを用いてｑＰＣＲ分析を行った。Ｃ）ＦＡＣＳによって計数した細胞数は、ＣＤ３＋細胞中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−細胞のパーセンテージを表す。Ｒは、後成的測定と比較した各々のＦＡＣＳ分析についてのスピアマンの順位相関係数を示す。統計的有意性は以下のように示される：２つのアスタリスク（＊＊）ｐ＜０．０１及び３つのアスタリスク（＊＊＊）ｐ＜０．００１。
【図３】健常組織及びがん性組織における組織浸潤リンパ球の頻度を示す図である。ボックスプロットは、健常組織及びがん性組織におけるＡ）Ｔｒｅｇ、Ｂ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、Ｃ）ＣＤ３＋Ｔ細胞中のＴｒｅｇのパーセンテージを示す。ＯＴ、ＢＴ及びＣＴは、それぞれ健常な卵巣、気管支及び結腸直腸の組織を示す。ＯｖＣａ、ＢＣａ及びＣＲＣは、がん性の卵巣、気管支及び結腸直腸の組織を示す。Ｎは各々のプロットに含まれる患者の数を示す。ボックスは分布の中央５０％を表す。ボックス内のラインは分布の中央値を表し、ひげは全ての測定データの９５％をカバーするように伸びる。この分布からの外れ値は丸によって示される。統計的有意性は以下のように示される：１つのアスタリスク（＊）はｐ＜０．０５、２つのアスタリスク（＊＊）はｐ＜０．０１、３つのアスタリスク（＊＊＊）はｐ＜０．００１を表す。
【図４】結腸直腸がん及び卵巣がんを有する患者の累積生存率を示す図である。各々の腫瘍対象物に由来するサンプルを、ＣＤ３特異的ｑＰＣＲによって測定されるそれらの腫瘍浸潤全Ｔリンパ球（ｏＴＬ）の中央値で２つのグループに分けた。中央値を超えるレベル（高いｏＴＬ数）は薄い灰色によって表され（上ライン）、中央値未満のレベル（低いｏＴＬ数）はより濃い灰色のライン（下ライン）によって表される。Ａ）無進行生存（ＰＦＳ）。左パネル（ＣＲＣ−Ｉ；中央値＝２６．１％；Ｎｈｉｇｈ＝７；Ｎｌｏｗ＝１２）及び中央パネル（ＣＲＣ−ＩＩ；中央値＝２３．９％；Ｎｈｉｇｈ＝１７；Ｎｌｏｗ＝２２）には結腸直腸がんサンプルを示す。右パネルは卵巣がんサンプルを示す（ＯｖＣａ；中央値＝７．７６％；Ｎｈｉｇｈ＝２３；Ｎｌｏｗ＝２３）。Ｂ）全生存（ＯＳ）。左パネルはＣＲＣ−Ｉコホートを示し（Ｎｈｉｇｈ＝３；Ｎｌｏｗ＝７）、中央パネルはＣＲＣ−ＩＩコホートを示し（Ｎｈｉｇｈ＝１１；Ｎｌｏｗ＝１９）、右パネルはＯｖＣａコホートを示す（Ｎｈｉｇｈ＝１４；Ｎｌｏｗ＝１８）。
【図５】実施例２によるＡ）卵巣組織におけるＴｒｅｇ、Ｂ）卵巣組織における全Ｔリンパ球、及びＣ）卵巣組織におけるＣＤ３中のＴｒｅｇの比率を示す図である。
【図６】乳がん患者の累積生存率を示す図である。サンプルを、ＣＤ３特異的ｑＰＣＲによって測定される腫瘍浸潤全Ｔリンパ球（ｏＴＬ）の中央値（１５．７％）で２つのグループに分けた。中央値を超えるレベル（高いｏＴＬ頻度）は緑色で示す。中央値未満のレベル（低いｏＴＬ頻度）は青色である。左側には無進行生存（Ｎｈｉｇｈ＝１４；Ｎｌｏｗ＝４）、右側には全生存（Ｎｈｉｇｈ＝８；Ｎｌｏｗ＝７）を示す。サンプルの数は、Ｎ＿ｏｖｅｒａｌｌ（ＰＦＳ）＝１２４、Ｎ＿ｏｖｅｒａｌｌ（ＯＳ）＝１３５であった。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６０】
実施例１
本発明者らは、ｏＴＬの同定のための特異的マーカーとして遺伝子間ＣＤ３Ｇ／ＣＤ３Ｄ領域の後成的パターンを決定した。本発明者らは、高感度の定量的リアルタイムＰＣＲベースアッセイを開発した。また、グリセルアルデヒド（glyceraldehyde）−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の調節領域内のＣｐＧ島に基づいた同様の後成的アッセイを確立することによって、総細胞計数のための全般的な基準系を提供する。これらの後成的アッセイ系を適用することによって、本発明者らは、気管支、結腸直腸及び卵巣起源の健常組織及び腫瘍組織における組織浸潤Ｔｒｅｇ及びｏＴＬを分析した。
【００６１】
データは、腫瘍におけるｏＴＬ浸潤の頻度が患者の予後と相関すること、及びＴｒｅｇ対ｏＴＬ比が腫瘍では不均衡であり、そのことが腫瘍確立に不可欠であり得ることを明らかに示している。
【００６２】
細胞及び組織
ＦＦＰＥサンプルについては、ベルリン大学附属シャリテ病院のベンジャミンフランクリンキャンパス（ChariteBerlin, Campus Benjamin Franklin）の病理学研究所のアーカイブから検索した。対応する正常実質を含む結腸直腸癌又は気管支癌の標本の組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を、直径１ｍｍのコアを用いて構築した。新鮮な卵巣組織及び血液については、ベルリン大学附属シャリテ病院のウィルヒョーキャンパス（Campus Virchow）の卵巣がん腫瘍バンクから検索した。
【００６３】
ゲノムＤＮＡの単離及びバイサルファイト変換
ゲノムＤＮＡの精製のために、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Qiagen）を使用した。ＦＦＰＥサンプルからのゲノムＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐＤＮＡ  ＦＦＰＥ  ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（Qiagen）を用いて単離した。パラフィンブロックをトリミングして余分なパラフィンを除去し、組織切片の厚さを１０μｍに調整した。各々の反応は１０個の組織切片を用いて行った。バイサルファイト変換は、ＥｐｉＴｅｃｔ  ＢｉｓｕｌｆｉｔｅＫｉｔ（Qiagen）を用いて行った。０．５μｇ〜１μｇのゲノムＤＮＡを用いて反応を行った。
【００６４】
オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチド（フォワードプライマー（ｆｐ）及びリバースプライマー（ｒｐ）、並びにプローブ（ｐ））は、ヒトゲノムＧＲＣｈ３７（e!Ensemble release 56；２００９年９月）のアセンブリに対するそれらの染色体位置によって表される。
バイサルファイトシークエンシング用オリゴヌクレオチド：
ａ）遺伝子間ＣＤ３Ｇ（ＥＮＳＧ０００００１６０６５４）／ＣＤ３Ｄ（ＥＮＳＧ０００００１６７２８６）領域：
アンプリコン番号１、ｆｐ：１１：１１８２１３２００−２１：１、ｒｐ：１１：１１８２１３６１６−３７：１；
アンプリコン番号２、ｆｐ：１１：１１８２１４２７１−９２：１、ｒｐ：１１：１１８２１４６８５−７０５：１；
アンプリコン番号３、ｆｐ：１１：１１８２１４７０２−２３：１、ｒｐ：１１：１１８２１５１５１−７３：１；
ｂ）ＧＡＰＤＨ（ＥＮＳＧ０００００１１１６４０）
ＣｐＧ島：アンプリコン番号３、ｆｐ：１２：６６４４１１９−３５：１、ｒｐ：１２：６６４４６３５−５６：１；
アンプリコン番号４、ｆｐ：１２：６６４３５８６−６０４：１、ｒｐ：１２：６６４３９９０−４０１１：１。
ＲＴ−ＰＣＲ用オリゴヌクレオチド：
ａ）ＦＯＸＰ３（ＥＮＳＧ００００００４９７６８）ＴＳＤＲ：ＣｐＧ特異的：ｆｐ：Ｘ：４９１１７２１９−４６：１、ｒｐ：Ｘ：４９１１７２８３−３０７：１、ｐ：Ｘ：４９１１７２５６−７３：１；ＴｐＧ特異的：７  ｆｐ：Ｘ：４９１１７２１９−４６：１、ｒｐ：Ｘ：４９１１７２８３−３０７：１、ｐ：Ｘ：４９１１７２５６−７８：１。
ｂ）ＣＤ３：ＣｐＧ特異的：ｆｐ：１１：１１８２１３６３３−５３：１、ｒｐ：１１：１１８２１３６８６−７０７：１、ｐ：１１：１１８２１３６７０−８７：１；ＴｐＧ特異的：ｆｐ：１１：１１８２１３６３２−５３：１、ｒｐ：１１：１１８２１３６８６−７０９：１、ｐ：１１：１１８２１３６６４−９０：１。
ｃ）ＧＡＰＤＨ：ＴｐＧ特異的：ｆｐ：１２：６６４４３７８−９９：１、ｒｐ：１２：６６４４４５６−７６：１、ｐ：１２：６６４４４２９−５７：１。
【００６５】
バイサルファイトシークエンシング
ＰＣＲを７ｎｇのＤＮＡ、１×ＰＣＲバッファー、１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Qiagen）、２００ｕＭ  ｄＮＴＰ、１２．５ｐｍｏｌのプライマーを含有する２５ｕｌ中で行った（熱サイクリング条件：１×９５℃、１５分；４０×（９５℃、１分；５５℃、４５秒；７２℃、１分）；１×７２℃、１０分）。ＰＣＲ産物をＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（USB Corp.）を用いて精製し、増幅プライマー及びＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。産物をエタノール沈殿し、１Ｍベタイン（betaine）に溶解させ、ＡＢＩ  ３１００遺伝子分析装置でキャピラリー電気泳動を行った。ＥＳＭＥを用いてＡＢＩファイルを解釈した（Lewin, J., et al., Quantitative DNA methylation analysis based onfour-dye trace data from direct sequencing of PCR amplificates. Bioinformatics,2004. 20(17): p. 3005-12.）。
【００６６】
リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ｑＰＣＲは、３０ｐｍｏｌの各プライマー、５ｐｍｏｌのプローブ、５０ｎｇのλファージＤＮＡ（New England Biolabs）、及び６０ｎｇのＤＮＡ鋳型又は対応量のプラスミド標準を含有する２０μｌ中で、RocheのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ又はＥｐｉｔｅｃｔ−ＭＳＰ（Qiagen）を用いて行った。各々のサンプルを三連で分析した。全てのアッセイについて、サイクリング条件は１×９５℃、１０分；５０×（９５℃、１５秒；６１℃、１分）であった。ＣＰ（「クロッシングポイント（crossing point）」）を、二次導関数最大値（secondderivative maximum）法（ＬＣ４８０ソフトウェア）によってコンピュータで計算した。コピー数を線形回帰による（プラスミドベース標準の段階希釈を用いた）検量線から算出した。
【００６７】
プラスミド標準
様々なリアルタイムＰＣＲベースアッセイのためのバイサルファイト変換されたメチル化標的領域及びバイサルファイト変換された脱メチル化標的領域をコンピュータ内で設計し、合成し（Genscript Inc.）、断片をプラスミドｐＵＣ５７に挿入した。組み換えプラスミドを線状化し、１０ｎｇ／μｌのλ−ファージＤＮＡ（New England Biolabs）中で段階希釈して、リアルタイムＰＣＲベースアッセイのための標準を、１回の反応当たりの鋳型コピー数が１２５００、２５００、５００、１００及び２０という最終濃度で得た。
【００６８】
主要末梢血白血球集団の細胞選別
末梢血サンプルを、地方倫理委員会の承認に従って健常ドナーから得た。顆粒球（ＣＤ１５＋）、単球（ＣＤ１４＋）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ４５ＲＡ−）、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ５６＋、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ、ＣＤ５６ｄｉｍ）、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ１２７＋）、及び記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１２７＋／−）等の異なる白血球集団への血液サンプルの分画を、以前に記載されるように行った（Baron, U., et al., DNA demethylation in the human FOXP3 locusdiscriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells.Eur J Immunol, 2007. 37(9): p. 2378-89）。選別した細胞の純度はフローサイトメトリーによって求められるように９７％超であり、生存度は常に９９％超であった。
【００６９】
統計分析
鋳型コピー数を、二次導関数最大値法によるクロッシングポイントでの線形回帰による検量線から推定した（Rasmussen, R., Quantification on the LightCycler, in Rapid cyclereal-time PCR, methods and applications. W.t.C. Meuer S, Nakagawar a K, Editor.2001, Springer Press: Heidelberg. p. 21-34）。中央値を使用して試験サンプルの三連の測定値を統合した。遺伝子特異的ＤＮＡの割合を、遺伝子特異的（specific）ＴｐＧ変異体ＤＮＡと、この遺伝子のＴｐＧ変異体とＣｐＧ変異体との合計、又はＧＡＰＤＨ  ＴｐＧ変異体コピーの数との比率としてコンピュータで計算した。累積生存率はカプランマイヤー法によって算出した（Kaplan, E.G., Civic Hospital; a report of its first year ofoperation. J Am Podiatry Assoc, 1958. 48(3): p. 112-3）。単変量比較については、統計的有意性をコックス・マンテル検定を用いて評価した（Mantel, N., Evaluation of survival data and two new rank orderstatistics arising in its consideration. Cancer Chemother Rep, 1966. 50(3): p.163-70）。相関分析については、スピアマンの順位相関統計を使用した。差の中央値は、サンプリング方法に応じて、ウイルコクスンの順位和検定（ＯＴコホート及びＯｖＣａコホートに対する）又はウイルコクソンの符号付き順位検定（ＢＴコホート、ＢＣａコホート、並びにＣＴコホート及びＣＲＣコホートの両方に対する）を用いて試験した。全てのＰ値は両側とした。分析については、統計ソフトウェアＳＡＳ  ９．２（ＴＳ２Ｍ２）（SAS Institute Inc.，Cary NC，USA）を使用した。
【００７０】
完全バイサルファイト変換の影響を受けやすい細胞型特異的遺伝子領域
本発明者らは、ＣＤ３Ｄ遺伝子及びＣＤ３Ｇ遺伝子の遺伝子間制御領域内のＣｐＧジヌクレオチド、並びにＧＡＰＤＨ遺伝子内のＣｐＧ島のバイサルファイト変換性を、バイサルファイトシークエンシングを用いて試験した（図１Ａ）。本発明者らは、分析したＣＤ３領域の全てのシトシンがナイーブＣＤ４＋（ナチュラルＴｒｅｇを含む）において完全に変換され、ＣＤ８＋Ｔリンパ球がＴｐＧ変異体のみを生じることを見出した（図１Ｂ）。顆粒球、単球、Ｂリンパ球及びＮＫ細胞を含む他の細胞型におけるバイサルファイト変換は、この遺伝子領域においてＣｐＧ変異体を生じた。本発明者らは、全ての試験した細胞型においてＧＡＰＤＨのＴｐＧ変異体のみを見出し（図１Ｂ）、様々な複合組織においてこれを確認した。これらのデータに基づいて、本発明者らは、ＣＤ３及びＧＡＰＤＨの分析される遺伝子座に対する定量的リアルタイムＰＣＲアッセイ（ｑＰＣＲ）を設計した。各々の領域について、本発明者らは、各々のアッセイに対する変異体特異的な蛍光標識検出プローブを含む、ＴｐＧ鋳型のみを認識する１つのｑＰＣＲシステム、及びＣｐＧ鋳型に特異的な１つのｑＰＣＲシステムを開発した（図１Ｃ）。コピー数の定量標準を提供するために、本発明者らは、ＴｐＧ変異体及びＣｐＧ変異体に相当する両方の遺伝子座に対するプラスミド系を構築した。本発明者らは、３桁にわたる増幅の直線性を示し（増幅効率は１．９５〜２の範囲であった）、本発明者らは、互いに対の鋳型変異体を用いた、ＴｐＧ変異体及びＣｐＧ変異体の各々に特異的なＰＣＲシステムの交差反応性を検出しなかった（図１Ｃ）。
【００７１】
ＣＤ３及びＧＡＰＤＨに特異的な後成的ｑＰＣＲアッセイの特性化
ＣＤ３及びＧＡＰＤＨのｑＰＣＲを、文献（Baron,U., et al., DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatoryT cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur J Immunol, 2007.37(9): p. 2378-89）に従って精製した分離血液細胞画分について分析した。標準と同等のバイサルファイト変換されたＴｐＧ  ＤＮＡ又はＣｐＧ  ＤＮＡの標的領域を含有するプラスミドの段階希釈物を用いて、本発明者らはＤＮＡコピー数を決定した。ＴｐＧ／（ＴｐＧ＋ＣｐＧ）のコピーの比率を、各々の遺伝子領域について算出した（表１）。結果から、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ３遺伝子座について９９％を超えるＴｐＧ変異体を含有する一方で、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ１５＋顆粒球、ＣＤ１４＋単球及びＣＤ３−ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞が実質的に（９９％超）ＣｐＧ変異体のみからなることが示される。ＧＡＰＤＨ遺伝子座の標的化によって、ＣｐＧ変異体の増幅は起こらなかったが、ＴｐＧ変異体が全ての細胞型において効率的に増幅されることが示された（表１）。したがって、ＧＡＰＤＨ脱メチル化の定量的分析は、所与のサンプル中の全ての細胞の総ＤＮＡコピー数を検出する細胞型独立マーカーをもたらす。両方のｑＰＣＲアッセイの技術的精度を更に実証するために、ＤＮＡスパイク（spiking）実験を行った。そこで本発明者らは、ＣＤ３遺伝子座及びＦＯＸＰ３遺伝子座の両方においてバイサルファイト変換されたＤＮＡが９９．５％超のＴｐＧ変異体からなるＦＡＣＳ精製した調節性Ｔ細胞及び顆粒球（９９．７％超のＣｐＧ変異体からなる）を選択した。
【００７２】
ＣＤ３内の領域のＴｐＧ変異体及びＣｐＧ変異体と同一の配列を含有するプラスミド、並びに陽性対照としてＦＯＸＰ３のＴＳＤＲ、並びに正規化のためにＧＡＰＤＨのＴｐＧ変異体を用いて、本発明者らは全細胞カウントと比較したＣＤ３及びＦＯＸＰ３のＴｐＧ変異体の相対量を定量した。そこで、本発明者らは４０％、２０％、１０％、５％、３％、２％及び１％のＴｒｅｇ  ＤＮＡを、顆粒球ＤＮＡのバックグラウンドに人工的にスパイクした。ＧＡＰＤＨ及び相対的定量のためのＤＮＡ系の特異的ＴｐＧ変異体を用いて、本発明者らは、スパイクしたサンプルについて理論的に推定された値と、ＣＤ３及びＦＯＸＰ３  ｑＰＣＲの測定値との間に厳密な相関を見出した（ＦＯＸＰ３及びＣＤ３の両方についてピアソンＲ＝０．９９８）。
【００７３】
全血サンプル中のＴｒｅｇ及び全Ｔリンパ球の分析
Ｔｒｅｇ及び全Ｔリンパ球（ｏＴＬ）に対する後成的マーカーを、１７個の全血サンプルについて試験し、その結果を、Ｔｒｅｇについては系統特異的表面分子ＣＤ４及びＣＤ２５、ｏＴＬについてはＣＤ３を用いて、同じ１７個のサンプルについて測定された、フローサイトメトリー分析によって得られたデータと比較した。ＦＡＣＳ分析によって決定されたＣＤ３＋細胞の割合は、ＣＤ３  ｑＰＣＲによって決定されたＴｐＧ変異体の割合と厳密に相関する（スピアマンＲ＝０．７８；ｐ＝２．０Ｅ−４）（図２Ａ）。同様に、ＦＡＣＳ測定によって得られたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７細胞の割合と、ＦＯＸＰ３のＴＳＤＲ遺伝子座に対して見られたＴｐＧ  ＤＮＡとの比較は、強い相関を示した（スピアマンＲ＝０．７４、ｐ＝７．０Ｅ−４）。ＦＡＣＳ又は後成的分析によるＦＯＸＰ３対ＣＤ３比の測定値も、強く相関していた（スピアマンＲ＝０．７、ｐ＝１．８Ｅ−３）。コルモゴロフ（Kolmogolov）・スミルノフによる適合度検定から、ＦＡＣＳ分析の正規分布からの有意な偏差が明らかとなり、一方で後成的測定の正規分布が認められたため、スピアマンの順位相関を比較のために使用した。この発見からＦＡＣＳ分析についての外れ値のより高い頻度が示唆される。ＴｒｅｇはｏＴＬの部分群であるため、これら２つの細胞集団の相互依存性についても調査した。本発明者らは、全血において、ｏＴＬカウント及びＴｒｅｇカウントが顕著なスピアマンの相関係数（Ｒ＝０．４７、ｐ＝３．８Ｅ−８）で互いに相関することを観察した。
【００７４】
固形健常組織及び腫瘍組織におけるＦＯＸＰ３のＴＳＤＲ及びＣＤ３のｑＰＣＲ分析
固形組織における組織浸潤ＦＯＸＰ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び全ＣＤ３＋Ｔリンパ球（ｏＴＬ）の完全に定量的な評価を提供するために、本発明者らは、卵巣、気管支及び結腸直腸起源の健常組織及び腫瘍組織から単離したＤＮＡを比較した（図３Ａ〜図３Ｃ）。健常卵巣組織（ＯＴ）における浸潤免疫細胞の量の中央値は、Ｔｒｅｇ及びｏＴＬのそれぞれについて０．１２％及び４．２７％である。病理学的に確認された卵巣がんのサンプル（ＯｖＣａ）については、本発明者らは１．２８％のＴｒｅｇ及び７．７６％のｏＴＬという中央値を観察した。独立したサンプルに対するノンパラメトリックなウイルコクスンの順位和検定によると、健常組織（ＯＴ）と比較して腫瘍における両方のパラメータの上昇が統計的に極めて有意である（ｐＴｒｅｇ＝２．３４Ｅ−１１；ｐｏＴＬ＝０．００６６；図３Ａ及び図３Ｂ）。健常気管支組織（ＢＴ）では、２．０％のＴｒｅｇ及び２９．６％のｏＴＬが観察された。隣接する腫瘍病変（ＢＣａ）を試験したところ、本発明者らは４．２％のＴｒｅｇ及び２２．３％のｏＴＬを観察した。腫瘍における、健常組織と比較してより高いＴｒｅｇカウント及びより低いｏＴＬカウントの両方が、対応のある（paired）サンプルについてのウイルコクソンの符号付き検定によって統計的に有意である（ｐ＝０．００２４及びｐ＝０．００１５；図３Ａ及び図３Ｂ）。２つの独立した結腸直腸がんコホートを用いて同じ分析を行い、健常な腫瘍に隣接する組織（ＣＴ）と腫瘍組織（ＣＲＣ）とを比較した。第１のコホートでは、本発明者らは、健常サンプル（ＣＴ−Ｉ）において、それぞれ１．９％及び３３．５％というＴｒｅｇカウント及びｏＴＬカウントの中央値、腫瘍組織（ＣＲＣ−Ｉ）において、それぞれ３．８％のＴｒｅｇ及び２６．１％のｏＴＬを観察した（図３Ａ及び図３Ｂ）。ウイルコクソンの符号付き検定から、腫瘍におけるより高い割合のＴｒｅｇ（ｐ＝３．８０Ｅ−４；図３Ａ）及び低下した割合のｏＴＬ（ｐ＝１．０Ｅ−４；図３Ｂ）が統計的に有意であることが示される。全ての統計分析が多重検定のための補正後も有意なままである。第２のＣＲＣコホートからのデータによって、腫瘍サンプル（ＣＲＣ−ＩＩ）における４．３％のＴｒｅｇ及び２３．９％のｏＴＬとは対照的に、健常組織（ＣＴ−ＩＩ）における１．８％のＴｒｅｇ及び３２．３％のＣＤ３細胞を示すこの観察結果を確認した（Ｔｒｅｇ及びｏＴＬについて、それぞれｐ＝１．０Ｅ−４及びｐ＝０．０２９６））。
【００７５】
ＣＲＣ−ＩＩコホートにおける健常な及び腫瘍性のＴｒｅｇ及びｏＴＬの間の差異を多重検定について補正すると、ｏＴＬ値は正式に統計的有意性を下回るが（ｐ＝０．１）、本発明者らの見解では傾向の関連性が明らかなままである。
【００７６】
４つ全てのコホートについて、本発明者らはＴｒｅｇ対ｏＴＬ比を分析した（図３Ｃ）。健常組織では、ｏＴＬにおける相対Ｔｒｅｇ量の中央値は３％〜８％の範囲であった（ＯＴの中央値：３．４％、ＢＴの中央値：７．６％、ＣＴ−Ｉの中央値：５．９％、ＣＴ−ＩＩの中央値：７．８％）。腫瘍対象物では、この比率はＴｒｅｇの割合の増大へとシフトする（ＯｖＣａの中央値：１９．７％、ＢＣａの中央値：１８．３％、ＣＲＣＩの中央値：１７．５％、ＣＲＣ−ＩＩの中央値：２１．６％）。全ての変化は統計的に極めて有意である（ｐＯｖＣａ対ＯＴ  ｐ＝８．０６Ｅ−０７、ｐＢＣａ対ＢＴ  ｐ＝１．５９Ｅ−１４、ｐＣＲＣ−Ｉ対ＣＴ  ｐ＝３．０５Ｅ−１３、ｐＣＲＣ−ＩＩ対ＣＴ−ＩＩ  ｐ＝５．１０Ｅ−７）。気管支がん患者及び結腸直腸がん患者のコホートについては、腫瘍及び隣接する健常組織のドナーをマッチさせたペアを使用したため、本発明者らは、ドナー間変動による影響を受けずに、ドナーをマッチさせた分析においてＴｒｅｇ対ｏＴＬカウントを直接比較した。本発明者らは、９３．５％（４６個のうち４３個）のペアが、健常隣接組織（ＢＴ）と比較して気管支腫瘍（ＢＣａ）におけるＴｒｅｇ対ｏＴＬ比の増大を示すことを見出した。ＣＲＣ−Ｉコホートでは、本発明者らは８１％（４８個のうち３９個）の症例において同等の増大を見出し、ＣＲＣ−ＩＩコホートではこの増大が８６％（８３個のうち７１個）のペアにおいて観察される。
【００７７】
本発明者らはまた、Ｔｒｅｇ及びｏＴＬの相互依存性を調査した。全血サンプルで見られる相関と同様に、本発明者らは健常気管支組織（スピアマンＲ＝０．６８、ｐ＝８．６Ｅ−０８）及び結腸組織（ＲＣＴ−Ｉ＝０．５５、ｐ＝４．４Ｅ−５、ＲＣＴ−ＩＩ＝０．５４、ｐ＝２．１Ｅ−８）において、Ｔｒｅｇ浸潤とｏＴＬ浸潤との間に顕著な相関を観察した。限定数の卵巣組織サンプル（Ｎ＝１３）を用いた同じ分析は、有意な相関を示さなかった（Ｒ＝０．１５、ｐ＝０．６）。病変組織におけるこの相互依存性を試験したところ、本発明者らは卵巣がん組織における強い相関（ＲＯｖＣａ＝０．７７、ｐ＝３．５Ｅ−２１）、並びにＢＣａ及びＣＲＣにおける顕著な相関（ＲＢＣａ＝０．４８、ｐ＝３．２５Ｅ−８；ＲＣＲＣ−Ｉ＝０．３７、ｐ＝０．０２；ＲＣＲＣ−ＩＩ＝０．５８、ｐ＝１．２Ｅ−１０）を観察した。
【００７８】
患者の生存と腫瘍内免疫細胞カウントとの関連付け
結腸直腸がん患者及び卵巣がん患者について、追跡調査データが利用可能であった。したがって、本発明者らは腫瘍浸潤ｏＴＬの数が患者の予後と相関するか否かについて試験した（図４）。ｏＴＬ数によって示される影響を検出するために、本発明者らはｏＴＬカウントの中央値で患者を２つのグループに分けた。このグループ分けは任意であるが、バランスの取れたサンプリングサイズを提供する。ＣＲＣコホート−Ｉでは、２０例の再発（無進行生存（ＰＦＳ）の終点が報告される）及び１０例の死亡（全生存（ＯＳ）の終点）が、それぞれ７７個及び９０個の打ち切りデータ点によって報告された。これらの事象数は、統計的に有意な生存分析に十分ではないが、高いｏＴＬの数を有する患者についてＰＦＳ及びＯＳの改善傾向が観察された。高いｏＴＬカウントを有する患者の１０％未満及び低いｏＴＬカウントを有する患者のおよそ２５％で、２０ヶ月後に再発が起こった。高いｏＴＬの数を有する患者の５％及び低いｏＴＬの数を有する患者の１５％が、診断から４０ヶ月後に死亡した（図４）。次いで、本発明者らは、Ｉ期疾患患者を除く独立した結腸直腸がんコホート（ＣＲＣ−ＩＩ）を用いて、観察された傾向を確認した。このコホートでは、８０人の患者が十分な追跡調査を受け、３９例の再発及び３０例の死亡が報告された。このコホートにおけるｏＴＬカウントの中央値は２３．９％であった（４．９％〜７２．１％の範囲）。ＰＦＳについての単変量カプラン・マイヤー（Meier）分析では、高いｏＴＬカウントを有する患者のより良好な生存の明白な傾向（４０ヶ月に対して８２ヶ月という中央値）が見出された。高いｏＴＬを有する患者についてはＯＳの中央値に到達せず、低いｏＴＬカウントで８０ヶ月であり、統計的に有意な生存率の改善（survival advantage）が示された（ｐ＝０．０３９）。このコホートでは、本発明者らはＩＨＣを用いることによってもｏＴＬ数を決定した。これらのデータは、より良好な予後又は後成的分析において見られるデータとは相関しなかった。ＯｖＣａコホートでは、６７人の患者からのデータがＰＦＳ分析に含まれ、４５例の再発が報告された。ＯＳ分析については、７９人の患者が含まれ、３０例の再発事象が報告された。ＯｖＣａコホートにおける単変量分析から、（この場合）７．７６％という中央値よりも高いｏＴＬカウントを有する患者について、より良好な予後が示唆される（図４）。ＰＦＳの中央値は、高いｏＴＬの数を有する患者については４０ヶ月、低いｏＴＬの数を有する患者については２５ヶ月であった。同様に、ＯＳの中央値は、低いｏＴＬカウントを有する患者（５２ヶ月）と比較して、高いｏＴＬカウントを有する患者でより良好であった（７０ヶ月）。
【００７９】
３つ全てのコホートのＰＦＳ及びＯＳについて、本発明者らはコックス回帰モデルを算出した。連続的に増加するｏＴＬの影響は全ての分析にわたって、年齢、悪性度（grading）、病期及び他のコホート特異的パラメータについて調節した後も保護的であった。ＰＦＳに関するハザード率はＯｖＣａ及びＣＲＣ−ＩＩのそれぞれについて０．９６６及び０．９９８、ＯＳに関してはＯｖＣａ及びＣＲＣ−ＩＩのそれぞれについて０．９８及び０．９８７であった。ＣＲＣ−Ｉについては、小数の事象によって確実なモデリングが無効となるが、暫定的なハザード率はＰＦＳ及びＯＳのそれぞれについて０．９９５及び０．９７２であり、Ｔリンパ球数の上昇によって媒介される腫瘍応答の改善傾向が更に確認される。まとめると、コックス回帰分析から、腫瘍環境におけるｏＴＬ含量の１％の増加毎に、再発又は死亡のリスクがおよそ０．２％〜３．４％減少することが示される。
【００８０】
実施例２
本実施例は、腫瘍発生における免疫系の悪化の理解に寄与することを目的とする。そこで、本発明者らは以下のコホートを使用した：
ａ）良性卵巣組織成長を表す卵巣嚢胞、
ｂ）卵巣の全ての悪性疾患の同等に最良の転帰を有する（半）悪性腫瘍を表す非浸潤性境界型腫瘍、
ｃ）幾らかより危険であるが、依然として半悪性の形態の卵巣腫瘍を表す浸潤性境界型腫瘍、並びに、
ｄ）異なる進行の病期で見られる最も悪性の形態の卵巣腫瘍を表す早期及び後期の卵巣がん。
【００８１】
本発明による後成的試験を用いて、これらの種々の卵巣疾患における調節性Ｔ細胞及び全Ｔ細胞の頻度及び比率を決定した。１５人のドナーのコホートでは、健常（良性）卵巣組織において０．１２％という調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の中央値が、０．０１％の最小値及び０．７１％の最大値で見られた。非浸潤性境界型腫瘍（ｎ＝２３）では、０．３５％（最小値＝０．０６％、最大値＝１．４８％）という平均が見られた。浸潤性境界型腫瘍の患者（ｎ＝２４）では、この平均値は更に０．５７％まで増大した（最小値＝０．０６％、最大値＝３．９６％）。早期卵巣がん患者では、０．８％というＴｒｅｇレベルの中央値（最小値＝０．１１％、最大値＝８．１６％）が観察され、後期卵巣がんでは、Ｔｒｅｇレベルの中央値は更に１．３２％まで増大した（最小値＝０．０５％、最大値＝１１．９５％）。
【００８２】
早期卵巣がん対後期卵巣がんの比較を除く全ての比較が、ノンパラメトリック両側ｔ検定において試験した場合に統計的に有意であった。次に、本発明者らは全Ｔリンパ球（ｏＴＬ）の数を分析した。これらの細胞の頻度は所与の組織における免疫系の「活性」を示すものとする。健常卵巣組織（４．２７％、ｎ＝１５）、非浸潤性境界型腫瘍（２．９３％、ｎ＝２５）、及び早期卵巣がん（３．４７％、ｎ＝４０）の間で比較的安定なｏＴＬカウントが観察された。同等により良好な転帰を有する形態の疾患（すなわち、非浸潤性境界型腫瘍、卵巣組織及び早期卵巣がん）と比較して、浸潤性境界型腫瘍（５．７１％、ｎ＝２５）及び後期卵巣がん（７．９４％、ｎ＝７７）の増大が観察された。
【００８３】
最後に、種々の腫瘍対象物におけるＴｒｅｇとｏＴＬとの間の比率を、上記に記載の実験において得られたデータに基づいて決定した。調節性Ｔ細胞の活性がエフェクターＴ細胞を標的とし、エフェクターＴ細胞の活性がそれらの存在度だけでなく、腫瘍を攻撃するそれらの能力によっても決定されるため、これは全てのアプローチの中で最も重要である。この能力は、抑制性Ｔｒｅｇの存在によって大きく損なわれる。本発明者らは、非悪性卵巣組織ではこの比率はおよそ３．５％であることを観察した。この値は血液及び他の健常組織における比率と一致する。この比率は、半悪性非浸潤性腫瘍（９．５８％）及び浸潤性境界型腫瘍（１０．５１％）ではおよそ１０％にまで増大する。同じ傾向が更に悪性腫瘍にも当てはまり、ｏＴＬ集団におけるＴｒｅｇの保有率（prevalence）が更に早期腫瘍において１７．２２％、後期腫瘍において２０．２２％にまで増大する。
【００８４】
要約すると、悪性度の増大及びＴｒｅｇカウントの増大、並びにｏＴＬ、すなわち腫瘍微小環境におけるエフェクターＴ細胞コンパートメントの占有率の減少は密接に関連している。本発明者らはここで、Ｔｒｅｇ及びｏＴＬの保有率が、身体の応答に打ち勝ち、回避する腫瘍の能力の重要な決定因子であるという更なる証拠を提供する。免疫細胞濃度に影響を与える腫瘍細胞の能力が、腫瘍の悪性度プロファイルの極めて重要な特徴であることが推測され得る。
【００８５】
表１  実施例２によるデータ：ＯＴ＝卵巣組織；ｎｏｎ−ｉｎｖ  ＢＯＴ＝非浸潤性境界型腫瘍、ｉｎｖ  ＢＯＴ＝浸潤性境界型腫瘍、ＯｖＣａ＝卵巣がん、  ｅａｒｌｙ ＯｖＣａ＝早期卵巣がん、ｌａｔｅ ＯｖＣａ＝後期卵巣がん、Ｌｅｖｅｌ＝レベル、ｍｅｄｉａｎ＝中央値、ｍｅａｎ＝平均、ｍｉｎ＝最小値、ｍａｘ＝最大値、Ｓ．Ｄ．＝標準偏差、Ｔ−Ｔｅｓｔ（ｐ−Ｖａｌｕｅ）；２−ｓｉｄｅｄ＝ｔ検定（ｐ値）；両側、ｖｓ＝対
【表１】
0006010037.tif 000002
【符号の説明】
【００８６】
図１
forwardstrand  フォワード鎖
reversestrand  リバース鎖
CpG Island  ＣｐＧ島
Granulocytes  顆粒球
Monocytes  単球
NK cells  ＮＫ細胞
Th cells  Ｔｈ細胞
CytotoxicT-cells  細胞傷害性Ｔ細胞
B-Lymphocytes  Ｂリンパ球
Amplicon  アンプリコン
Methylationrate  メチル化率
Genomic CpGamplified to TpG  ＴｐＧに増幅されたゲノムＣｐＧ
Genomic CpGamplified to CpG  ＣｐＧに増幅されたゲノムＣｐＧ
CD3 PCRSystem  ＣＤ３  ＰＣＲシステム
GAPDH PCRSystem  ＧＡＰＤＨ  ＰＣＲシステム
Fluorescence  蛍光
Cycle No  サイクル数
CP value  ＣＰ値
log conc.  ｌｏｇ濃度
図２
% TpG contentof CD3 locus  ＣＤ３遺伝子座のＴｐＧ含量（％）
% CD3+ T cellsper total cell count  総細胞カウントに対するＣＤ３＋Ｔ細胞の％
Spearman R  スピアマンＲ
% TpG contentof TSDR locus  ＴＳＤＲ遺伝子座のＴｐＧ含量（％）
% Treg pertotal cell count  総細胞カウントに対するＴｒｅｇの％
% TpG cont. ofTSDR / TpG cont. of CD3 locus  ＴＳＤＲのＴｐＧ含量／ＣＤ３遺伝子座のＴｐＧ含量（％）
% Treg perCD3+ cell count  ＣＤ３＋細胞カウントに対するＴｒｅｇの％
図３
% Treg  Ｔｒｅｇの％
% Overall Tlmphocytes  全Ｔリンパ球の％
% Treg per overallT lmphocytes  全Ｔリンパ球に対するＴｒｅｇの％
図４
Survivalprobability  生存確率
Progessionfree survival (months)  無進行（Progression free）生存（月数）
Overallsurvival (months)  全生存（月数）
図５
Tregs in CD3  ＣＤ３におけるＴｒｅｇ
Tissue  組織
early OvCa  早期ＯｖＣａ
late OvCa  後期ＯｖＣａ
図６
Survivalprobability  生存確率
Progressionfree survival (month)  無進行生存（月数）
Overallsurvival (month)  全生存（月数）
【図２】
0006010037.tif 000003
【図３】
0006010037.tif 000004
【図４】
0006010037.tif 000005
【図５】
0006010037.tif 000006
【図１】
0006010037.tif 000007
【図６】
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