(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ）水性培地中でイデユコゴメ細胞を培養する工程と、
Ｂ）イデユコゴメ細胞を破壊する工程と、適切な場合には、
Ｃ）抽出物を得るために、固体細胞成分を除去する工程と、
Ｄ）４−アミノ酪酸をさらに精製する工程と
を含む、４−アミノ酪酸の精製方法。
【請求項２】
工程Ｃにおける抽出物が水性抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程Ａ）におけるイデユコゴメ細胞が高温で培養されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程Ａ）における水性培地が、１．５〜６の２５℃でのｐＨを有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程Ｂ）における細胞破壊が水性培地中で実施されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程Ｂ）における細胞破壊が、酵素的細胞破壊と組み合わせた水破壊であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程Ｃ）における固体細胞成分の除去が、遠心分離、沈降または濾過により実施されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
イデユコゴメ細胞の抽出物であって４−アミノ酪酸を含む抽出物を含有する、敏感皮膚、乾燥皮膚、痒い皮膚および／またはかさかさした皮膚に対する化粧品製剤。
【請求項９】
イデユコゴメ細胞の抽出物であって４−アミノ酪酸を含む抽出物を含有する、皮膚の粗さの低減、皮膚の鱗屑の低減、しわの深さの低減、皮膚弾力性の増大、皮膚の張りの増大および皮膚の厚みの増大のための、化粧品製剤。
【請求項１０】
イデユコゴメ細胞の抽出物であって４−アミノ酪酸を含む抽出物を含有する、顎、胸部、臀部および腹部に対するシェーピング化粧用処置のための化粧品製剤。
【請求項１１】
イデユコゴメ細胞の抽出物であって４−アミノ酪酸を含む抽出物を含有する、毛髪の安定性、強度、色の強さ、および耐性を向上させるための化粧品製剤。
【請求項１２】
イデユコゴメ細胞の抽出物であって４−アミノ酪酸を含む抽出物を含有する、皮膚の幹細胞機能を維持するための化粧品製剤。
【請求項１３】
０．０１重量％〜１０重量％のイデユコゴメ細胞成分の乾燥物と、適切な場合、０．０１重量％〜７重量％の保存料とを含むことを特徴とする、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の化粧品製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガンマ−アミノ酪酸、略してＧＡＢＡとも呼ばれる４−アミノ酪酸の製造方法、４−アミノ酪酸を含む抽出物の製造方法、４−アミノ酪酸を含む化粧品製剤の調製方法、および化粧用の適用におけるイデユコゴメ（Cyanidium caldarium）細胞または細胞成分の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚に対するＧＡＢＡのプラスの効果は、ＧＡＤ６７の発現がヒト皮膚線維芽細胞において示されたときに、Ｉｔｏらにより最初に記載された（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  ２００７  Ｆｅｂ；１７７０（２）：２９１−６）（GAD67は、他では神経細胞に局在し、GABA合成を触媒するとのみ記載されていた）。
【０００３】
ＧＡＢＡは、線維芽細胞におけるヒアルロン酸合成を上方制御できること、およびＧＡＤ６７は、コラーゲン合成に対するプラスの効果を有することが示された。
【０００４】
ＧＡＢＡ（INCI：アミノ酪酸）を含む化粧品は、デコラティブ化粧品（decorative cosmetic）、脱臭剤、ウェットティッシュ、スキンケアおよびシャワー製品の分野で見出される。ここで、ＧＡＢＡは、筋弛緩活性、皮膚美白活性、保湿活性を有する皮膚と同一の物質、ならびにコラーゲンおよびマトリキン合成に対する刺激活性を有する物質と記載されている。適用の分野は、アンチエイジング、しわ取り（anti-wrinkle）、口唇線の引締めおよびスムージング、表情ジワの低減、小ジワ（thin line）および目尻のしわの低減などの使用である。使用されるＧＡＢＡの起源は、植物の微生物発酵である。ここで、例えば、米の胚芽が３７℃で数年間発酵される。
【０００５】
今日まで、ＧＡＢＡの合成は、ほぼ例外なく高等生物でのみ発生すると記載されてきた。
【０００６】
藻類では、例えば、アマノリ属（Porphyra）におけるＧＡＢＡ模倣物の発生のみが、Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ、１１６-１１７（１）：１５５−１５８においてＭｏｒｓｅおよびＭｏｒｓｅにより今日までに記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＧＡＢＡを含み、ＧＡＢＡ源が、容易に培養することができる急速に成長する微生物に基づく化粧品製剤を提供することが、本発明の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、藻類イデユコゴメは、大量のＧＡＢＡを含むこと、ならびにＧＡＢＡの製造、また化粧品の製造にも顕著に使用できることが見出された。
【０００９】
ＧＡＢＡを合成することができる藻類を見出すことは不可能であると以前は考えられていたため、これは特に驚きである。
【００１０】
本発明の主題は、したがって、イデユコゴメ細胞を用いたＧＡＢＡおよびＧＡＢＡ含有化粧品の製造方法である。
【００１１】
本発明のさらなる主題は、記載された方法により得ることができる化粧品、および化粧品製剤におけるイデユコゴメ細胞または細胞成分の使用である。
【００１２】
本発明の利点は、再生可能な原料の使用による持続可能性である。
【００１３】
さらなる利点は、イデユコゴメ細胞は容易に加工することができるという事実によるＧＡＢＡの簡単な提供である。
【００１４】
本発明のさらに別の利点は、イデユコゴメ細胞が化粧品の妨げになる任意の二次成分を含まないことである。
【００１５】
本発明のさらに別の利点は、イデユコゴメ細胞が、例えば栄養素、ミネラル、非必須および必須アミノ酸、オルニチンならびにポリフェノールなどの化粧品に有利なさらなる二次成分を含むことである。
【００１６】
本発明のさらに別の利点は、本発明による化粧品が、細胞外マトリックスのマーカー遺伝子を上方制御できることである。
【００１７】
特に、弾性線維の最も重要な構造成分、フィブリリンおよびエラスチンは、一様な方法で有利に上方制御される。
【００１８】
さらに別の利点は、本発明による化粧品が、皮膚に対する抗酸化活性および栄養効果を有することである。
【００１９】
さらに別の利点は、本発明による化粧品は、幅広い皮膚タイプ、特に老化皮膚に効果があることが判明し、抗炎症および皮膚沈静活性を有することである。
【００２０】
以下の図面は実施例の一部である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＧＡＰＤＨ遺伝子発現と比較した、１００ｐｐｍ（＝１００μｇ／ｍｌ）イデユコゴメ抽出物（抽出物乾燥物に基づく濃度）または純粋培地（ビヒクル）の適用２４時間後のヒト皮膚線維芽細胞におけるＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現を示すグラフである。
【図２】ＧＡＰＤＨ遺伝子発現と比較した、純粋培地（ビヒクル）、ＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ、陽性対照）、または１００ｐｐｍ（＝１００μｇ／ｍｌ）イデユコゴメ抽出物（抽出物乾燥物に基づく濃度）の適用２４時間後のヒト皮膚線維芽細胞におけるさまざまな遺伝子の発現を示すグラフである。
【図３】総細胞タンパク質含量と比較した、純粋培地（ビヒクル）、１００ｐｐｍ（＝１００μｇ／ｍｌ）イデユコゴメ抽出物（抽出物乾燥物に基づく濃度）、またはＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ、陽性対照）の適用２４時間後のヒト皮膚線維芽細胞におけるエラスチンタンパク質含量を示すグラフである。
【図４】総細胞タンパク質含量と比較した、純粋培地（ビヒクル）、１００ｐｐｍ（＝１００μｇ／ｍｌ）イデユコゴメ抽出物（抽出物乾燥物に基づく濃度）、またはＴＧＦ−β（１０ｎｇ／ｍｌ、陽性対照）の適用２４時間後のヒト皮膚線維芽細胞におけるルミカンタンパク質含量を示すグラフである。
【図５】総細胞タンパク質含量と比較した、純粋培地（ビヒクル）または１００ｐｐｍ（＝１００μｇ／ｍｌ）イデユコゴメ抽出物（抽出物乾燥物に基づく濃度）の適用２４時間後のヒト皮膚線維芽細胞におけるプロコラーゲンタンパク質含量を示すグラフである。
【図６】ＧＡＰＤＨ遺伝子発現と比較した、ＵＶＡ照射および７５０ｐｐｍ（＝７５０μｇ／ｍｌ）イデユコゴメ抽出物（抽出物乾燥物に基づく濃度）または水（ビヒクル）の適用２４時間後のＳｋｉｎＥｔｈｉｃ皮膚モデルにおけるＩＬ１−αの遺伝子発現を示すグラフである。
【図７】ＧＡＰＤＨ遺伝子発現と比較した、ＵＶＡ照射および７５０ｐｐｍ（＝７５０μｇ／ｍｌ）イデユコゴメ抽出物（抽出物乾燥物に基づく濃度）または水（ビヒクル）の適用２４時間後のＳｋｉｎＥｔｈｉｃ皮膚モデルにおけるＴＮＦ−αの遺伝子発現を示すグラフである。
【図８】ＧＡＰＤＨ遺伝子発現と比較した、ＵＶＡ照射および７５０ｐｐｍ（＝７５０μｇ／ｍｌ）イデユコゴメ抽出物（抽出物乾燥物に基づく濃度）または水（ビヒクル）の適用２４時間後のＳｋｉｎＥｔｈｉｃ皮膚モデルにおけるＮＦκ−Ｂの遺伝子発現を示すグラフである。
【図９】総細胞タンパク質含量と比較した、ＵＶＡ照射および７５０ｐｐｍ（＝７５０μｇ／ｍｌ）イデユコゴメ抽出物（抽出物乾燥物に基づく濃度）または水（ビヒクル）の適用２４時間後のＳｋｉｎＥｔｈｉｃ皮膚モデルにおけるインターロイキン１−アルファタンパク質含量を示すグラフである。
【図１０】表皮前駆細胞のコロニー形成に対するイデユコゴメ抽出物の効果を示すグラフである。１００ｐｐｍ（＝１００μｇ／ｍｌ）イデユコゴメ抽出物（抽出物乾燥物に基づく濃度）または純粋培地（ビヒクル）の適用後のＣＦＥ。
【図１１】Ｂ２Ｍ遺伝子発現と比較した、１００ｐｐｍ（＝１００μｇ／ｍｌ）イデユコゴメ抽出物（抽出物乾燥物に基づく濃度）または純粋培地（ビヒクル）の適用後の表皮前駆細胞におけるさまざまな遺伝子の遺伝子発現を示すグラフである。
【図１２】リーブオンヘアコンディショナーによる毛髪試料の処理前および処理後のパラメーターＥモジュールの平均を示すグラフである。
【図１３】皮膚弾力性パラメーターＲ１を示す図である。１％および５％イデユコゴメ抽出物による８週間の処理後の、ビヒクル製剤を基準とした相対的変化。
【図１４】皮膚弾力性パラメーターＲ４を示す図である。１％および５％イデユコゴメ抽出物による８週間の処理後のビヒクル製剤を基準とした相対的変化。
【図１５】皮膚のきめパラメーターを示すグラフである。１％および５％イデユコゴメ抽出物による８週間の処理後のビヒクル製剤を基準とした相対的変化。
【図１６】皮膚表面および容積パラメーターを示す図である。１％および５％イデユコゴメ抽出物による８週間の処理後のビヒクル製剤を基準とした相対的変化。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の主題は、したがって、
Ａ）水性培地中でイデユコゴメ細胞を培養する工程と、
Ｂ）イデユコゴメ細胞を破壊する工程と、適切な場合には、
Ｃ）抽出物を得るために、固体細胞成分を除去する工程と、適切な場合には、
Ｄ）４−アミノ酪酸をさらに精製する工程と
を含む、４−アミノ酪酸の製造方法である。
【００２３】
本発明の文脈において、表現「イデユコゴメ」は、イデユコゴメ（Cyanidiaceae）科からのイデユコゴメ（Cyanidium caldarium（Tilden）Geitler）として分類される藻類を意味すると理解される。
【００２４】
表現「水性」は、「水性」が指す全組成（本ケースでは詳細には培地）に基づいて少なくとも５０重量％の含水量を意味すると理解される。
【００２５】
表現「細胞を破壊する」は、細胞膜、特に外部細胞膜の破壊を意味すると理解される。
【００２６】
表現「抽出物」は、さまざまな成分の液体混合組成物を意味し、これらの混合組成物がイデユコゴメ細胞から単離され得ると理解される。
【００２７】
表現「細胞成分」は、イデユコゴメ細胞から単離され得るさまざまな成分の混合組成物を意味すると理解される。
【００２８】
（％）で示されるパーセンテージは全て、別段の指定がない限り重量パーセントである。
【００２９】
本発明による好ましいイデユコゴメ細胞は、株ＳＡＧ  １６．９１の細胞である。
【００３０】
工程Ａ）においてイデユコゴメ細胞は、高温で、したがって２０℃〜６０℃、特に３５℃〜４５℃の好ましい温度範囲で培養されることが、本発明によれば好ましい。高温での培養は、７日〜１９２日、特に２８日〜５６日の期間にわたって行われることが好ましい。これは、ＧＡＢＡ以外に、例えばスペルミン、スペルミジンおよびノルスペルミンなどのポリアミンを含む抽出物または化粧品の提供を可能にする。
【００３１】
工程Ａ）において水性培地は、１．５〜６、好ましくは２〜３の２５℃でのｐＨを好ましくは有する。
【００３２】
工程Ｂ）において細胞の破壊は、藻類培養物の懸濁液を超音波処理して、浸透圧ショックを適用して、高圧均質化（例えばフレンチプレス、マントンゴーリンホモジナイザー）により、熱水抽出により、高剪断力（例えばウルトラタラックス、ポッターエルベージェム（Potter-Elvehjem）法）を使用して、撹拌ボールミルにおける湿式破砕により、圧力を降下して、酵素を用いて（例えば、グルカナーゼなどのポリサッカリダーゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、もしくはＳＰ−３１１（ノボ）などの他の市販の酵素など）、またはこれらの上述された方法の任意の望ましい組み合わせにより行うことができる。
【００３３】
工程Ｂ）において細胞は、水性抽出物を好ましくは得るように水性培地中で好ましくは破壊される。特に好ましくは、工程Ｂ）の水性培地は、工程Ａ）の培地に対応し、特に同じ培地の形態をとる。
【００３４】
工程Ｂ）において特に好ましいのは、酵素的細胞破壊と組み合わせた熱水による破壊である。
【００３５】
工程Ｃ）における固体細胞成分の除去は、例えば遠心分離、沈降または濾過により行うことができる。
【００３６】
ＧＡＢＡのさらなる精製は、例えばＣａｒｍｏｎａら、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ（Ｃｏｐｅｎｈ）．  １９８０  Ｍａｒ；４６（３）：２３５−４０に記載されているように行うことができる。
【００３７】
本発明のさらなる主題は、
Ａ）水性培地中でイデユコゴメ細胞を培養する工程と、
Ｂ）イデユコゴメ細胞を破壊する工程と、適切な場合、
Ｃ）抽出物を得るために、固体細胞成分を除去する工程と
を含み、工程Ａ）〜Ｃ）が、本発明の最初に述べられた方法に対応し、かつ対応する好ましい実施形態が同様に好ましい、４−アミノ酪酸を含む抽出物の製造方法でもある。
【００３８】
好ましくは、抽出物を製造するための本発明による方法は、工程Ａ）、Ｂ）およびＣ）から構成される。
【００３９】
したがって、上述された方法により得ることができる抽出物も、本発明の一部である。
【００４０】
抽出物は、好ましくは水性抽出物である。
【００４１】
本発明による好ましい抽出物は、追加の成分として、例えば、スペルミン、スペルミジンおよびノルスペルミンなどのポリアミンを含むことを特徴とする。
【００４２】
抽出物は、有利には化粧品製剤の調製に使用され得るため、保存料を含む抽出物を提供することが好ましい。この文脈において、好ましい保存料は、安息香酸塩およびソルビン酸塩のなかから選択される。
【００４３】
本発明による好ましい抽出物は、０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．５重量％〜５重量％、特に好ましくは１重量％〜３重量％のイデユコゴメ細胞成分の乾燥物を含み、ここで重量パーセンテージは総抽出物に基づくことを特徴とする。
【００４４】
本発明による好ましい抽出物は、０．０１重量％〜７重量％、好ましくは０．２５重量％〜３重量％、特に好ましくは０．５重量％〜１．５重量％の保存料を含み、ここで重量パーセンテージは総抽出物に基づくことを特徴とする。
【００４５】
本発明のさらなる主題は、
Ａ）水性培地中でイデユコゴメ細胞を培養する工程と、
Ｂ）イデユコゴメ細胞を破壊する工程と、適切な場合には、
Ｃ）抽出物を得るために、固体細胞成分を除去する工程と、
Ｅ）工程Ｂ）からの破壊されたイデユコゴメ細胞および／または工程Ｃ）からの抽出物を化粧品製剤に組み込む工程と
を含み、工程Ａ）〜Ｃ）が、本発明の最初に述べられた方法に対応し、かつ対応する好ましい実施形態が同様に好ましい、４−アミノ酪酸を含む化粧品製剤の調製方法でもある。好ましくは、化粧品製剤を調製するための本発明による方法は、工程Ａ）、Ｂ）、Ｃ）およびＥ）から構成される。
【００４６】
好ましくは、工程Ｃ）からの抽出物のみが、工程Ｅ）に組み込まれる。
【００４７】
本発明のさらなる主題は、本発明による方法により得ることができるＧＡＢＡを含む化粧品製剤、ならびにＧＡＢＡおよびイデユコゴメ細胞および／または細胞成分を含む化粧品製剤、ならびに本発明による抽出物を含む化粧品製剤である。
【００４８】
本発明による製剤は、任意の化粧品製剤、特に皮膚製剤、ネイル製剤および毛髪製剤の形態をとることができ、皮膚製剤が特に好ましい。
【００４９】
例えば、皮膚および／または毛髪において残留物を形成する穏やかな傾向などの、イデユコゴメ細胞および／または細胞成分の特徴的特性は、皮膚および／または毛髪の構造に対する促進効果を有し、故に特には毛髪の安定性、耐性、色の強さ、および強度、特に引張強度を向上させる。
【００５０】
本発明による毛髪製剤は、リーブオン（leave-on）適用（ヘアコンディショナー、ヘアトリートメント）に限定されない。本発明による毛髪製剤は、有利にはリンスオフ製品（例えばシャンプー、皮膚クレンジング製品）の形態でも提示される。
【００５１】
皮膚での使用に適しており、本発明による好ましい製剤は、特に、アフターシェーブローション、男性用フェイスケア製品、日焼け止め、日焼け後製品、リップケア製品、しわ取りケア製品、皮膚バリアを強化する製品、アンチエイジング製品、デコルテ製品、抗セルライト製品、輪郭形成（contouring）製品、保湿製品、有害な環境の影響から保護する製品、皮膚沈静製品および皮膚刺激低減製品を含む。
【００５２】
本発明による製剤は、例えば、乳液、懸濁液、溶液、クリーム、軟膏、ペースト、ゲル、オイル、粉末、エアロゾル、スティック、スプレーまたは発泡体の形態で使用されてもよい。
【００５３】
本発明による化粧品製剤は、
皮膚軟化剤、
乳化剤、
増粘剤／粘度調節剤／安定剤、
抗酸化剤、
ヒドロトロープ（またはポリオール）、
固体および充填剤、
真珠光沢添加物（pearl lustre additive）、
脱臭剤および制汗活性物質、
防虫剤、
セルフタンニング剤、
保存料、
コンディショナー、
香料、
着色剤、
化粧品活性物質、
ケア添加物（care additive）、
過脂肪剤、
溶剤、
ＵＶフィルター
の群から選択される、例えば少なくとも１つの追加の成分を含んでもよい。
【００５４】
個々の群の代表の例として使用され得る物質は、当業者に公知であり、例えばドイツ出願ＤＥ  １０２００８００１７８８．４号に見出すことができる。この特許出願は、参照により本明細書に組み込まれており、したがって本開示の一部を形成する。
【００５５】
さらなる任意選択の成分およびこれらの成分が使用される量に関しては、熟練技能者に公知の専門家ハンドブック、例えばＫ．Ｓｃｈｒａｄｅｒ、「Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎ  ｕｎｄ  Ｒｅｚｅｐｔｕｒｅｎ  ｄｅｒ  Ｋｏｓｍｅｔｉｋａ」、第２版、３２９〜３４１頁、Ｈｕｔｈｉｇ  Ｂｕｃｈ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇを参照されたい。
【００５６】
それぞれの添加物の量は、使用目的に依存する。
【００５７】
それぞれの使用に対する典型的なフレームワーク処方は、公知の従来技術であり、それぞれの賦形剤および活性物質の製造業者の例えばパンフレットにおいて見出すことができる。原則として、これらの既存の製剤は、変更を行わずに使用することができる。しかし、必要とされる場合、製剤を適合させおよび最適化するための簡単な実験により、望ましい改変が問題のない方法で行われ得る。
【００５８】
本発明による好ましい化粧品製剤は、追加の成分として、例えば、スペルミン、スペルミジンおよびノルスペルミンなどのポリアミン、ならびに／あるいは保存料を含むことを特徴とする。この文脈において、好ましい保存料は、安息香酸塩およびソルビン酸塩のなかから選択される。
【００５９】
本発明による好ましい化粧品製剤は、０．００１２５〜１．５重量パーセント、好ましくは０．００２５〜０．６２５重量パーセント、特に好ましくは０．０１２５〜０．０６２５重量パーセントのイデユコゴメ細胞および／または細胞成分の乾燥物を含み、ここで重量パーセンテージは総製剤を参照することを特徴とする。
【００６０】
本発明による化粧品製剤は、高い抗炎症活性を有し、したがって、本発明のさらなる主題は、炎症、特に、例えばにきびなどの皮膚の炎症に対抗する本発明による化粧品製剤である。
【００６１】
本発明のさらなる主題は、化粧品製剤におけるイデユコゴメ細胞または細胞成分および本発明による抽出物の使用である。
【００６２】
本発明による化粧品製剤は、極めて幅広い皮膚タイプ、特に老化皮膚（年代的老化皮膚、光老化皮膚、たるんだ皮膚、弛緩した皮膚）に効果があることが判明している。
【００６３】
本発明による化粧品製剤の使用は、一般に皮膚構造の改善をもたらし、これにより本発明による化粧品製剤は、万能のアンチエイジング活性物質として有用になる。特に、本発明による化粧品製剤は、例えば、顎、胸部、臀部および腹部などに対するシェーピング化粧用処置（shaping cosmetic treatment）に使用することができる。
【００６４】
本発明による化粧品製剤のさらなるプラスの効果は、とりわけ、皮膚の粗さの低減、皮膚の鱗屑の低減、しわの深さの低減、ならびに皮膚弾力性、皮膚の張りおよび皮膚の厚みの増大を含む。
【００６５】
本発明による化粧品製剤の皮膚への局所適用は、ストレスを受けた、刺激を受けた、発赤した、および炎症を起こした皮膚の徴候の低減をもたらす。これは、本発明による化粧品製剤を、刺激を受けた皮膚、敏感皮膚を沈静するための化粧品に特に適するようにする。本発明による化粧品製剤の抗炎症および皮膚沈静活性は、皮膚沈静アフターシェーブローションのための使用にも有利である。
【００６６】
本発明による化粧品製剤は、有害な内因的および外因的要因（環境の有害な影響）からの保護活性を有し、これにより細胞巨大分子および表皮脂質バリアへの損傷が予防され得る。
【００６７】
本発明による化粧品製剤の皮膚沈静活性は、太陽の放射による日焼け症状または紅斑症状を示す発赤した皮膚においても観察され得る。この点において、本発明による化粧品製剤は、日焼け防止製品および日焼け後製品のための活性物質として使用することもできる。
【００６８】
その上、本発明による化粧品製剤は、皮膚、特に、特定の皮膚疾患の結果、表皮バリア機能が低下し、結果として経表皮水分喪失が増加し、および／または皮膚水和が低下した、皮膚のケアおよび保護に適する。このような皮膚疾患は、とりわけ、乾燥、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、乾癬、魚鱗癬、表皮肥厚、フケ、光線皮膚炎、紅斑、および角化損傷および／または障害を含む。本発明による化粧品製剤は、例えば自己免疫疾患（例えば乾癬）の結果生じる乾燥皮膚、痒い皮膚およびかさかさした皮膚などの特定の影響を緩和するための皮膚に対する使用にも適する。
【００６９】
後述の実施例において、本発明は、例として記載されるが、本発明を限定することは意図されず、その範囲は、説明および特許請求の範囲の全てから、例において述べられた実施形態まで見ることができる。
【実施例】
【００７０】
実施例１：イデユコゴメの培養
抽出物を得るための準備的イデユコゴメバイオマス生成は、ＤＥ４４１１４８６、ＤＥ２９６０７２８５、ＷＯ９１０５８４９、ＷＯ２０１０／１４９１５４またはＤＥ１０２００９０２８４７４Ａ１（ＷＯ２０１１／０１８０８２Ａ２）に詳細に記載されている密閉光バイオリアクターにおいて行われる。培養方法は、紅藻イデユコゴメ（SAG 16.91）の固有の成長条件に適合させた。適切なポンプ構成の選択による剪断応力の最小化、５０〜２０００μＥ＊ｍ−２ｓ−１の培養中の光の体制の可変設計による継続的な光適応、およびｐＨを＜３に調整することが、高い成長速度および再現可能なバイオマス品質の両方を達成できるようにする。
【００７１】
使用した培養培地は、４．５ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．６ｇ  ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ、０．６ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０３ｇ  ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ  ＦｅＳＯ４、０．０１８ｇエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物、０．００５ｇ  Ｈ３ＢＯ３、０．００４  ＭｎＣｌ２、０．０００６８ｇ  ＺｎＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ、０．０００５２ｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ、０．００００８ｇ  ＣｕＳＯ４×５  Ｈ２Ｏ、０．００００８ｇ  ＮａＶＯ３×４  Ｈ２Ｏ、０．０００６４ｇ  ＣｏＣｌ２×６  Ｈ２Ｏから成った（蒸留水１リットル当たり）。培地のｐＨは、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の添加および／またはＣＯ２濃度の調節により２〜３にした。
【００７２】
前培養のため、５ｌ三角フラスコを培地１ｌで満たし、イデユコゴメ（SAG 16.91）保存培養物を播種した。培養物を穏やかに振盪しながら、１４０μＥ＊ｍ−２ｓ−１を有する蛍光管の下、３０℃でインキュベートした。藻類培養物の成長は、５５０ｎｍの吸光度によりモニターした。成長が指数期（ＯＤ１．０）に達するとすぐ、細胞を５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により回収し、ペレットを蒸留水で洗浄した。湿性バイオマスは、さらなる使用まで−２０℃で保存した。
【００７３】
実施例２：イデユコゴメの水性抽出
光バイオリアクターからの回収は、例えばＤＥ１０１３６６４５（ＥＰ１２７７８３１）またはＷＯ９１０５８４９に記載されているように行う。
【００７４】
微細藻類細胞を破壊するための超音波の使用は、これまでに記載されており、とりわけＵＳ２００９０６９２１３、実施例３およびＵＳ２００８２９９１４７、実施例３を参照して再現することができる。不溶成分は、２００μｍバグフィルターを用いた濾過により分離した。１．０％のＲｏｋｏｎｓａｌ  ＢＳを、保存目的で水性抽出物に添加する。Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＭＡ３０  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒにより判定した水性イデユコゴメ抽出物の乾燥物（１０５℃）は、２．５％の値を示した。
【００７５】
実施例３：イデユコゴメにおけるＧＡＢＡの検出
ＧＡＢＡは、オルトフタル酸ジアルデヒド（OPA）による誘導体化後、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により検出した。ＨＰＬＣ装置は、Ｊａｓｃｏ  ＰＵ  ２０８０Ｐｌｕｓポンプ、Ｊａｓｃｏ  ＡＳ  ２０５５Ｐｌｕｓオートサンプラー、Ｊａｓｃｏ  ＦＰ-２０２０Ｐｌｕｓ蛍光検出器、およびＪａｓｃｏ  ＣｈｒｏｍＰａｓｓ  １．８．６．１積分器（Jasco Germany GmbH、グロス−ウムシュタット、ドイツ）から構成された。使用した固定相は、４０℃の温度でのＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ-Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍカラム（Agilent Technologies, Inc.）であった。以下の勾配を移動相として使用した（A:２％アセトニトリル、２％テトラヒドロフラン、９６％  ５０ｍＭリン酸、ＮａＯＨでｐＨ７．５にした）;B:６５％アセトニトリル、３５％水）：０〜２分、２０％Ｂ、一定；２〜８分、２０〜４０％Ｂ、直線；８〜１１分、４０〜１００％Ｂ、直線；１１〜３８分、１００％Ｂ、一定。流速は１．５ｍｌ／分であった。ＯＰＡ試薬（フタル酸ジアルデヒド試薬１ｍＬ、Solution Complete、Sigma-Aldrich P0532、およびメルカプトエタノール０．５μＬ）１５μＬと一緒に分析物５μＬを注入した。吸光波長は３４０ｎｍであり、発光波長は４５５ｎｍであった。使用した内部標準は、１，６−ジアミノヘキサンであった。分析物は、水性イデユコゴメ抽出物１ｍｌを水で１００ｍｌに希釈して調製した。
【００７６】
イデユコゴメ抽出物中のＧＡＢＡの典型値は０．０９０％であった。この値は、イデユコゴメ乾燥物に基づいて３．３％のＧＡＢＡに対応した。
【００７７】
実施例４：遺伝子チップ試験によるヒト皮膚線維芽細胞でのイデユコゴメ抽出物の遺伝子発現分析
方法：
本実施例では、線維芽細胞（正常なヒト皮膚線維芽細胞、NHDF）における遺伝子発現に対するイデユコゴメ抽出物の効果を試験した。
【００７８】
この目的に対し、初代ヒト皮膚線維芽細胞（CellSystems（登録商標）Biotechnologie Vertrieb GmbH、セントカタリーネン、ドイツから入手した、冷凍保存の新生児の皮膚（Lifeline Cell Technology）に由来するヒト皮膚線維芽細胞（HDF））を、１０％ウシ胎仔血清（FBS-ウシ胎仔血清、（Invitrogen Ltd、UK）、１％非必須アミノ酸（NEAA（１００×）−非必須アミノ酸、PAA、パッシング、オーストリア）、１％Ｌ−グルタミン（１００×）（Invitrogen Ltd、UK）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（５０００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、Invitrogen Ltd、UK）を３７℃、５％ＣＯ２で添加した、アール塩（EMEM）（PAA Laboratories GmbH、パッシング、オーストリア）を補充した最小必須培地（MEM）中で最初に増殖させた。遺伝子発現試験のため、細胞を６ウェルプレートに播き、サブコンフルエンス（最大６０％）まで増殖させた。
【００７９】
この後、培地を細胞から取り除き、イデユコゴメ抽出物を含む新鮮培地に置き換えた。培地中のイデユコゴメ抽出物の最終濃度は、１００ｐｐｍ（＝１００μｇ／ｍｌ、イデユコゴメ抽出物乾燥物に基づく）であった。対照として、培養物を培地（ビヒクル）のみを用いて活性物質なしで増殖させた。全ての培養は、３重（3つの生物学的複製）で行った。
【００８０】
細胞を２４時間培養した後、培地を取り除き、細胞をＲＮｅａｓｙ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）の添加により溶解させた。全ＲＮＡは製造業者の使用説明書に従って単離した。要約すると、全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いて単離した。ＲＮＡの質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔ（Agilent Technologies, Inc.、サンタクララ、CA、USA）により判定した。３つの生物学的複製をプールし、プール試料の濃度は、２６０／２８０ｎｍでの光度測定により判定した。
【００８１】
遺伝子発現は、標準的なデータ評価を含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現分析により、製造業者の使用説明書に従って分析した（Human Gene 1.0 ST Array、Expression Console Software、AFFYMETRIX, INC.、サンタクララ、CA、USA）。
【００８２】
【表１】
0005997275.tif 000002
【００８３】
ヒト皮膚線維芽細胞における遺伝子チップ試験は、イデユコゴメ抽出物の添加により、弾性線維の最も重要な構造成分、エラスチン（ELN）およびフィブリリン（FBN2）の均一な刺激を示した。さらに、結合組織の重要な構造タンパク質、コラーゲンＩＩＩおよびＸＩ（COL3A1、COL11A1）の遺伝子発現が増加した。アグレカン（ACAN）、シンデカン（SDC2）およびルミカン（LUM）などの他のタンパク質は、構造付与機能を有し、またはさまざまな細胞外マトリックス（ECM）成分と線維芽細胞との間の相互作用を組織するのを助ける。これらのタンパク質（LUM、ACAN、SDC2）の遺伝子も、イデユコゴメ抽出物により上方制御された。細胞外マトリックス成分の分解は、マトリックスメタロプロテアーゼ１（MMP-1）およびマトリックスメタロプロテアーゼ３（MMP-3）の下方制御により効率的に妨げられた。さらに、イデユコゴメ抽出物は、結合組織増殖因子（CTGF）の潜在的メディエーターである。
【００８４】
要約すると、記載された遺伝子調節は、本発明による化粧品が、単なる個々のＥＣＭ成分の構造ではなくＥＣＭの全体構造を強化することを示している。
【００８５】
実施例５：ｑＲＴ−ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡによるヒト皮膚線維芽細胞でのイデユコゴメ抽出物の遺伝子およびタンパク質発現分析
方法：
本実施例では、線維芽細胞（正常なヒト皮膚線維芽細胞、NHDF）における遺伝子およびタンパク質発現に対するイデユコゴメ抽出物の効果を試験した。
【００８６】
この目的に対し、初代ヒト皮膚線維芽細胞（CellSystems（登録商標）Biotechnologie Vertrieb GmbH、セントカタリーネン、ドイツから入手した、冷凍保存の新生児皮膚（Lifeline Cell Technology）に由来するヒト皮膚線維芽細胞（HDF））を、１０％ウシ胎仔血清（FBS-ウシ胎仔血清、Invitrogen Ltd、UK）、１％非必須アミノ酸（NEAA（１００×）-非必須アミノ酸、PAA、パッシング、オーストリア）、１％Ｌ−グルタミン（１００×）（Invitrogen Ltd、UK）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（５０００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン／ｍｌ、Invitrogen Ltd、UK）を３７℃および５％ＣＯ２で添加した、アール塩（EMEM）（PAA Laboratories GmbH、パッシング、オーストリア）を補充した最小必須培地（MEM）中で、適切な細胞数が得られるまで最初に増殖させた。遺伝子発現試験のため、細胞を６ウェルプレートに播き、サブコンフルエンス（最大６０％）まで増殖させた。
【００８７】
この後、培地を細胞から取り除き、イデユコゴメ抽出物を含む新鮮培地に置き換えた。培地中のイデユコゴメ抽出物の最終濃度は、１００ｐｐｍ（＝１００μｇ／ｍｌ、抽出物乾燥物に基づく）であった。対照として、培養物を培地（ビヒクル）のみを用いて活性物質なしで、または陽性対照として１０ｎｇ／ｍｌトランスフォーミング増殖因子ベータ３（TGFβ-3）で増殖させた。全ての培養は、３重（3つの生物学的複製）で行った。
【００８８】
遺伝子発現を試験するために、２４時間の培養後に培地を取り除き、細胞をＲＮｅａｓｙ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）の添加により溶解させた。全ＲＮＡは製造業者の使用説明書に従って単離した。要約すると、全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いて単離した。ＲＮＡの質および量は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔ（Agilent Technologies, Inc.、サンタクララ、CA、USA）を用いて判定した。
【００８９】
各試料は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を用いて、コラーゲン（COL1A1）、エラスチン（ELN）、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（MMP-1）、フィブリリン−２（FBN2）、結合組織増殖因子（CTGF）、シンデカン−２（SDC2）およびルミカン（LUM）の遺伝子発現について分析した。この目的に対し、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｉｘ（Invitrogen Ltd、UK）を製造業者の使用説明書に従って使用して、各ケースで全ＲＮＡ  １００ｎｇをｃＤＮＡ合成に使用した。Ｑｕａｎｔｉ  Ｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）は、製造業者の使用説明書に従ってＰＣＲ反応に使用した。標的遺伝子の発現以外に、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子の発現も、参照として定量的に判定した。以下のプライマー対を、標的遺伝子の各ケースで使用した。
ＣＯＬ１Ａ１：６０℃
５’−ＧＣＣＴＣＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＧ−３’配列番号０１
５’−ＧＡＣＣＣＡＴＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧ−３’配列番号０２
ＥＬＮ：５６℃
５’−ＧＣＣＣＡＧＴＴＴＧＧＣＣＴＡＧＴＧ−３’配列番号０３
５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＴＡＴＴＴＡＧ−３’配列番号０４
ＭＭＰ−１：６０℃
５’−ＴＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＧＡ−３’配列番号０５
５’−ＡＴＣＡＣＴＴＣＴＣＣＣＣＧＡＡＴＣＧＴ−３’配列番号０６
ＦＢＮ２：６０℃
５’−ＴＣＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＡＧ−３’配列番号０７
５’−ＴＣＡＣＡＣＣＧＣＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＴ−３’配列番号０８
ＣＴＧＦ：６０℃
５’−ＣＡＧＧＣＴＡＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＣ−３’配列番号０９
５’−ＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧ−３’配列番号１０
ＳＤＣ２：６０℃
５’−ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＣＡＣＣＴ−３’配列番号１１
５’−ＣＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＴＣＡＡＧＧ−３’配列番号１２
ＬＵＭ：５６℃
５’−ＧＧＴＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＴＧＴＣＣＴ−３’配列番号１３
５’−ＡＧＴＡＧＧＡＴＡＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＧ−３’配列番号１４
ＧＡＰＤＨ：６０℃
５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’配列番号１５
５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’配列番号１６
【００９０】
ＰＣＲ反応は、Ｏｐｔｉｃｏｎ１（MJ Research、ウォルサム、MA、USA）を用いて行った。全てのＰＣＲにおいて、生物学的３つ組の二重の判定を実施し、全ての測定の平均を評価のために計算した。ＰＣＲプロトコルは以下のプロファイルを有した：工程１）、９５℃でホットスタートポリメラーゼの１５分活性化；工程２）、９４℃で１５秒変性；工程３）、プライマー対に応じて、５６℃または６０℃で３０秒プライマーアニーリング；工程４）、７２℃で３０秒伸長。工程２）〜４）のサイクル数は４４であった。２（−デルタデルタC（T））法（Livak KJおよびSchmittgen TD: Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2（-delta delta C（T））method. Methods 2001、25: 402-408）を遺伝子発現の相対比較に使用した。
【００９１】
タンパク質発現を試験するために、培地を培養の２４時間後に取り除き、細胞を超音波処理（３４〜４０ｋＨｚで１０秒）により溶解させた。
【００９２】
超音波処理物の総タンパク質含量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄテスト（Bio-Rad Protein Assay、Bio-Rad Laboratories, Inc.、ハーキュリーズ、CA、USA）により製造業者の使用説明書に従って判定した。ＥＬＩＳＡ技術を用いて、各試料を、細胞抽出物中のエラスチン（ヒトElastin ELISA Kit、ABO Swiss Co., Ltd、福建、CN）、および培養物上清中のルミカン（ヒトLumican ELISA Kit、ABO Swiss Co., Ltd、福建、CN）またはプロコラーゲン（Procollagen Type I C-Peptide（PIP）EIA Kit、TAKARA BIO INC.、JP）のタンパク質含量について、当該製造業者の使用説明書に従って分析した。絶対タンパク質量は、全タンパク質との関連で判定した。
【００９３】
結果は図１〜５に示されており、イデユコゴメ抽出物によるケラチノサイトの処理が、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＬＮ、ＦＢＮ２、ＳＤＣ２およびＬＵＭの遺伝子発現を著しく刺激することを示している。ＭＭＰ−１遺伝子の発現は、著しく下方制御された。さらに、イデユコゴメ抽出物による２４時間の細胞の処理は、エラスチンだけでなく、ルミカンおよびプロコラーゲンに対しても、タンパク質レベルでプラスの効果を有した。
【００９４】
要約すると、記載された遺伝子調節は、遺伝子チップ分析の結果を裏付けている。本発明による化粧品は、単なるＥＣＭの個々の成分ではなくＥＣＭの全体構造を強化する。
【００９５】
実施例６：ＵＶＡストレスヒト表皮モデルに対するイデユコゴメ抽出物の効果
方法：
本実施例では、表皮皮膚モデル（再構成ヒト表皮）における遺伝子およびタンパク質発現に対するイデユコゴメ抽出物の効果を試験した。
【００９６】
この目的に対し、皮膚モデル（正常なヒトケラチノサイトの再構築表皮、RHE/S/17、SkinEthic laboratories、ニース、F）を、維持培地（SkinEthic laboratories、ニース、F）中、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間培養した。遺伝子およびタンパク質発現試験のため、皮膚モデルはこの後、各ケースでイデユコゴメ抽出物５０μｌまたはそれぞれの対照により局所的に処理した。１時間後、過剰試料をブロットして除去した。培地中のイデユコゴメ抽出物の最終濃度は、７５０ｐｐｍ（＝７５０μｇ／ｍｌ、抽出物乾燥物に基づく）であった。培養は、対照として活性物質なしまたは水（ビヒクル）のみで行った。全ての培養は、３重（3つの生物学的複製）で行った。培養の２４時間後、皮膚モデルを９．５ｍＷ／ｃｍ２  ＵＶＡで４０Ｊ／ｃｍ２の線量により照射した。この後、培地を交換し、テスト物質または対照を再適用した。２回目の適用２４時間後、皮膚モデルをＲＮＡｌａｔｅｒ（RNA Stabilization Reagent、Qiagen、ヒルデン、ドイツ）に移した。皮膚モデルの上清（培地）は、タンパク質発現のさらなる分析のため、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｔａｂｌｅｔ（F. Hoffmann-La Roche Ltd、バーゼル、CH）を添加して凍結させた（−８０℃）。
【００９７】
皮膚モデル由来の全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いて製造業者の使用説明書に従って単離した。ＲＮＡの質および量は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔ（Agilent Technologies, Inc.、サンタクララ、CA、USA）を用いて判定した。
【００９８】
各試料のインターロイキン１−アルファ（IL1-α）、腫瘍壊死因子−アルファ（TNF-α）、および活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー（NFκ-B）の遺伝子発現は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を用いて試験した。この目的に対し、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｉｘ（Invitrogen Ltd、UK）を製造業者の使用説明書に従って使用して、各ケースで全ＲＮＡ  １００ｎｇをｃＤＮＡ合成に使用した。Ｑｕａｎｔｉ  Ｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）は、製造業者の使用説明書に従ってＰＣＲ反応に使用した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の発現も、参照遺伝子として定量的に判定した。以下のプライマー対を各ケースで使用した。
ＮＦκ−Ｂ：
５’−ＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡ−３’配列番号１７
５’−ＴＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＣ−３’配列番号１８
ＴＮＦ−α：
５’−ＣＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡ−３’配列番号１９
５’−ＧＧＣＧＴＴＴＧＧＧＡＡＧＧＴＴＧＧＡＴ−３’配列番号２０
ＩＬ１-α：
５’−ＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＡＧＧＣＴＧＣＡＴＧＧ−３’配列番号２１
５’−ＡＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣＴＴＧＣＴＴＴＧＴＧＧ−３’配列番号２２
ＧＡＰＤＨ：
５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’配列番号２３
５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’配列番号２４
【００９９】
ＰＣＲ反応は、Ｏｐｔｉｃｏｎ１（MJ Research、ウォルサム、MA、USA）を用いて行った。全てのＰＣＲにおいて、生物学的３つ組の二重の判定を実施し、全ての測定の平均を評価のために計算した。ＰＣＲプロトコルは以下のプロファイルを有した：工程１）、９５℃でホットスタートポリメラーゼの１５分活性化；工程２）、９４℃で１５秒変性；工程３）、６０℃で３０秒プライマーアニーリング；工程４）、７２℃で３０秒伸長。工程２）〜４）のサイクル数は４４であった。２（−デルタデルタＣ（Ｔ））法（Livak KJ、およびSchmittgen TD: Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2（-delta delta C（T））method. Methods 2001、25: 402-408）を遺伝子発現の相対比較に使用した。
【０１００】
タンパク質発現を試験するために、皮膚モデルの上清を取り除き、皮膚モデル由来の全タンパク質を、ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いて、ＲＮＡに加えて複合プロトコルの形態で単離した。詳細には、残留水相をＲＮＡ単離試料から除去した。１００％エタノール０．３ｍｌを添加し、試料を反転させ、室温（IT）で２〜３分間インキュベートした。この後、試料を４℃、２分間、２０００×ｇで遠心分離した。タンパク質を含む上清を新鮮な管（２ｍｌ）に入れた。タンパク質はイソプロパノール１．５ｍｌの添加により沈殿させ、ＩＴで１０分間インキュベートした。この後、試料を４℃、１０分間、１２０００×ｇで遠心分離した。ペレットをグアニジン／エタノール溶液２ｍｌに溶解し、ＩＴで２０分間インキュベートした。この後、試料をＩＴ、２０分間、７５００×ｇで遠心分離した。この洗浄工程を２回繰り返した。エタノール（１００％）２ｍｌの添加後、試料をＩＴで２０分間インキュベートした。この後、試料をＩＴ、５分間、７５００×ｇで遠心分離した。ペレットは空気中で５〜１０分間乾燥させ、尿素／ＤＴＴ溶液５００μｌに溶解し、ＩＴで１時間インキュベートした。タンパク質を溶解するために、試料を９５℃で３分間加熱した。
【０１０１】
総タンパク質含量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄテスト（Bio-Rad Protein Assay、Bio-Rad Laboratories, Inc.、ハーキュリーズ、CA、USA）により製造業者の使用説明書に従って判定した。ＥＬＩＳＡ法を用いて、各試料を、培養物上清中のインターロイキン１−アルファ（IL1-α）（ヒトIL-1α ELISA Kit、（Invitrogen Ltd、UK）のタンパク質含量について、それぞれの製造業者の使用説明書に従って分析した。絶対タンパク質量は、全タンパク質との関連で判定した。
【０１０２】
この試験の結果は図６〜９に示されており、イデユコゴメ抽出物が、炎症誘発性マーカーのＵＶＡ誘導発現を分子レベルで低減できることを示している。故に、イデユコゴメ抽出物はＵＶＡストレス皮膚モデルにおいて、ＮＦκＢならびにまたＴＮＦ−αおよびＩＬ−１αにより主に調節される表皮の恒常性を再建した。
【０１０３】
実施例７：表皮幹細胞に対するイデユコゴメ抽出物の効果
方法：
本実施例では、表皮幹細胞（表皮ケラチノサイト前駆細胞、HPEK）におけるイデユコゴメ抽出物の活性を試験した。
【０１０４】
この目的に対し、ＣｎＴ−５７  ＮＨＥＫ前駆細胞（新生児包皮に由来し、P2で冷凍保存した正常なヒト表皮ケラチノサイト前駆細胞（HPEKp05））、CELLnTEC Advanced Cell Systems AG、ベルン、スイス）を、補足ＣｎＴ-５７培地（低濃度ウシ下垂体抽出物（BPE）に基づく前駆細胞標的化表皮ケラチノサイト培地、CELLnTEC Advanced Cell Systems AG、ベルン、スイス）＋２％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（５０００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン／ｍｌ、Invitrogen Ltd、UK）中で、適切な細胞密度に達するまで３７℃、５％ＣＯ２で最初に培養した。
【０１０５】
コロニー形成効率（CFE）を判定するために、細胞をこの後、イデユコゴメ抽出物の存在下、低播種密度（８００細胞／２５ｃｍ２）で８日間増殖させた。
【０１０６】
培地中のイデユコゴメ抽出物の最終濃度は、１００ｐｐｍ（＝１００μｇ／ｍｌ、藻類乾燥物に基づく）であった。対照として、培養は培地（ビヒクル）のみを用いて活性物質なしで行った。全ての培養は、３重（3つの生物学的複製）で行った。
【０１０７】
細胞培養培地を取り除いた後、細胞コロニーを、ヘマトキシリン／エオシン（CnT-ST-100Stain Kit、CELLnTEC Advanced Cell Systems AG、ベルン、スイス）で製造業者の使用説明書に従って染色した。コロニー形成単位は顕微鏡下でカウントした。
【０１０８】
遺伝子発現試験のため、細胞を、イデユコゴメ抽出物の存在下、サブコンフルエンス（７５％）に達するまで３０００細胞／２５ｃｍ２の播種密度で７日間さらに増殖させた。
【０１０９】
培地中のイデユコゴメ抽出物の最終濃度は、１００ｐｐｍ（＝１００μｇ／ｍｌ、抽出物乾燥物に基づく）であった。対照として、培養物を培地（ビヒクル）のみを用いて活性物質なしで増殖させた。全ての培養は、３重（3つの生物学的複製）で行った。
【０１１０】
遺伝子発現を試験するために、培地を取り除き、細胞をＲＮｅａｓｙ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）の添加により溶解させた。全ＲＮＡは製造業者の使用説明書に従って単離した。要約すると、全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いて単離した。ＲＮＡの質および量は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔ（Agilent Technologies, Inc.、サンタクララ、CA、USA）により判定した。
【０１１１】
各試料は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を用いて、ＣＤ３４（造血前駆細胞抗原）、ＣＴＮＮＢ１（β-カテニン（catenine））、ＩＴＧＢ１（インテグリンベータ-1）、ＩＴＧＡ６（インテグリンアルファ-6）、ＬＲＩＧ１（ロイシンリッチリピートおよび免疫グロブリン様ドメインタンパク質1）、ＤＳＧ３（デスモグレイン-3）、ＭＫＩ６７（抗原KI-67）およびＫＲＴ１４（ケラチン-14）の遺伝子発現について分析した。この目的に対し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Invitrogen Ltd、UK）を製造業者の使用説明書に従って使用して、全ＲＮＡ  １００ｎｇを各ケースでｃＤＮＡ合成に使用した。ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）は、製造業者の使用説明書に従ってＰＣＲ反応に使用した。標的遺伝子の発現以外に、Ｂ２Ｍ（β2-ミクログロブリン）遺伝子の発現も、参照として定量的に判定した。以下のプライマー対を、遺伝子の各ケースで使用した。
ＣＤ３４：
５’−ＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＡＡＧ−３’配列番号２５
５’−ＧＣＧＧＣＧＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＡＡＡＴ−３’配列番号２６
ＣＴＮＮＢ１：
５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＴＡＴＡＧＡ−３’配列番号２７
５’−ＴＣＡＧＡＴＧＡＣＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡ−３’配列番号２８
ＩＴＧＢ１：
５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＧＣＣＡＡＡＧＣＧＡＡＧ−３’配列番号２９
５’−ＣＴＡＣＣＡＡＣＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＴＴ−３’配列番号３０
ＩＴＧＡ６：
５’−ＣＴＣＴＴＣＧＧＣＴＴＣＴＣＧＣＴＧ−３’配列番号３１
５’−ＣＣＣＧＴＴＣＴＧＴＴＧＧＣＴＣＴＣＴ−３’配列番号３２
ＬＲＩＧ１：
５’−ＧＡＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣ−３’配列番号３３
５’−ＧＴＡＧＧＴＴＣＧＧＣＡＡＧＴＣＣＴＣＡ−３’配列番号３４
ＤＳＧ３：
５’−ＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＧＧＴＣ−３’配列番号３５
５’−ＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＡＴ−３’配列番号３６
ＫＩ-６７：
５’−ＡＴＣＧＴＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴ−３’配列番号３７
５’−ＡＴＡＧＴＡＡＣＣＡＧＧＣＧＴＣＴＣＧＴＧＧ−３’配列番号３８
ＫＲＴ１４：
５’−ＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＡＣ−３’配列番号３９
５’−ＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＴＴＧＧＣ−３’配列番号４０
Ｂ２Ｍ：
５’−ＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’配列番号４１
５’−ＴＴＣＡＡＴＧＴＣＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＡ−３’配列番号４２
【０１１２】
ＰＣＲ反応は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Life Technologies Corporation、CA、USA）を用いて行った。全てのＰＣＲに対し、生物学的３つ組の二重の判定を実施し、全ての測定の平均を評価のために計算した。ＰＣＲプロトコルは、以下のプロファイルを有した：工程１）、９５℃でホットスタートポリメラーゼの５分活性化；工程２）、９５℃で１０秒変性；工程３）、６０℃で３０秒プライマーアニーリング。工程２）＋３）のサイクル数は４０であった。２（−デルタデルタC（T））法（Livak KJ、およびSchmittgen TD: Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2（-delta delta C（T））method. Methods 2001、25: 402-408）を遺伝子発現の相対比較に使用した。
【０１１３】
この試験の結果は図１０および１１に示されており、イデユコゴメ抽出物が、培養中の表皮前駆細胞のコロニー形成効率を著しく向上できることを示している。これは、イデユコゴメ抽出物がケラチノサイトの幹細胞特性を維持すること、および該細胞が分化状態に入らないことを意味する。記載された幹細胞マーカー遺伝子は、前駆細胞ケラチノサイトにおいて上方制御されることが遺伝子発現レベルで観察され、これは同様に、ケラチノサイトの幹細胞特性が、イデユコゴメ抽出物の添加により培養中に刺激され得ることを示している。
【０１１４】
要約すると、実施例４〜７は、イデユコゴメ抽出物が、エラスチンならびにルミカンおよびコラーゲンなどの周囲の細胞外皮膚構造の合成により皮膚弾力性を強化するための強力な化粧品であることを示している。さらに、イデユコゴメ抽出物は、ＵＶストレス皮膚に適用された場合、この抗炎症活性によって皮膚の表皮恒常性の回復をもたらす。さらに、イデユコゴメ抽出物は、表皮における幹細胞機能を維持し、したがって、皮膚老化に対する保護として最も重要な機能の３つを維持するのに役立つ。
【０１１５】
実施例８：イデユコゴメ抽出物による処理による毛髪の機械的特性の改善
一房の天然のヨーロッパ人毛（レミー（remis）、ダブルドローン（double-drawn）、長さ２３ｃｍ（自由毛髪２１ｃｍ）、幅２．０ｃｍ、重さ２．０ｇ、焦げ茶色）を、蛇口から水を流しながら１０秒以内で濡らした。この後、３０％強度水性過酸化水素溶液８ｇを、Ｂａｓｌｅｒ  Ｂｌｏｎｄ  Ｃｌａｉｒｅさらし粉４ｇと混合し、２５％強度水性アンモニア溶液２ｍｌを添加し、全てを再混合し、得られたペースト８ｇを、保護してあった髪の房に櫛および手を用いて揉み込んだ。室温で３０分の曝露時間後、約３５℃の温度を有する水道水を流しながら、髪の房を２分間洗浄し、次いで、同時に梳きながら電子ヘアドライヤーで３分間乾燥させた。髪の房を濡らすことから始まる手順全体を１回繰り返した。
【０１１６】
この後、毛髪４０本を髪の房から取り出し、各ケースで長さ３ｃｍの１本の毛髪の真ん中の部分を、内部にプラスチック被覆を備える２個の真鍮スリーブの間でカールさせた。個々の毛髪の平均面積は、Ｄｉａ-ｓｔｒｏｎ  ＦＤＡＳ７６０繊維次元解析システムおよびＵｖＷｉｎ  ＰＣアプリケーションソフトウェアを用いて測定した。この後すぐに、毛髪試料をＤｉａ−ｓｔｒｏｎ  Ｔｅｎｓｉｌ  Ｔｅｓｔｅｒ  ＭＴＴ  ６７０の試料カートリッジに移し、各ケースでクエン酸によりｐＨ７にしてあった完全脱塩水で処理した。「単一繊維法（single fibre method）」（伸長２０％、速度２０ｍｍ／分、ゲージ力２、最大荷重２００、破壊閾値５、試料サイズ３０ｍｍ）による個々の毛髪の房の測定を開始した。この後、毛髪試料を試料カートリッジから小さいプラスチック皿に取り出し、完全脱塩水で覆った。３０分後、水を除去し、毛髪試料をリーブオンヘアコンディショナーで覆った（表２）。
【０１１７】
【表２】
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【０１１８】
３０分の曝露時間後、各個々の毛髪試料を、約３５℃の温度を有する流水噴射下で６秒間洗浄した。毛髪試料を２２℃、５０％相対大気湿度で一晩乾燥させた。この後、Ｄｉａ−ｓｔｒｏｎ  Ｔｅｎｓｉｌｅ  Ｔｅｓｔｅｒ  ＭＴＴ  ６７０の試料カートリッジに移すことから始まる、個々の毛髪試料の測定を繰り返した。
【０１１９】
データは、弾力性のパラメーターモジュール（Eモジュール；図１２）を用いてスプレッドシートにより評価する。Ｅモジュールは、線形弾性挙動（「フックの範囲」）での固体の変形時の応力と伸長との間の関係を表す。故に、パラメーターＥモジュールは毛髪繊維引張強度を表し、単位Ｎ／ｍｍ２を有する。
【０１２０】
引張応力−伸長測定の結果により示されるように、リーブオンヘアコンディショナーへの２．５％イデユコゴメ抽出物の添加は、２５Ｎ／ｍｍ２のパラメーターＥモジュールの増加をもたらした。これは、損傷した毛髪の引張強度がイデユコゴメ抽出物により増加することを示すものであった。
【０１２１】
実施例９：イデユコゴメ抽出物による皮膚弾力性の増大および皮膚構造の改善
イデユコゴメ抽出物の局所適用による皮膚弾力性の増大および皮膚構造の改善を示すために、ヒト無作為化ビヒクル対照盲検適用モニタリングを８週間の期間にわたって行った。
【０１２２】
パネルは、３３〜５９歳（平均４７±８歳）の被験者を含んだ。被験者２０人はビヒクル製剤、被験者１９人は１％イデユコゴメ抽出物を含むビヒクル製剤、被験者２１人は５％イデユコゴメ抽出物を含むビヒクル製剤を受け取った。製剤は、前腕の内側に１日２回適用した（朝および晩）。スクイズボトルから２絞り（０．２５〜０．３０ｇ）を揉み込んで適用した。製剤の組成を表３に示す。
【０１２３】
【表３】
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【０１２４】
適用期は８週間に及んだ。測定したパラメーターは、適用期前のＴ０および８週間後のＴ８時点の前腕の内側におけるＣｕｔｏｍｅｔｅｒ  ＭＰＡ  ５８０（Courage+Khazaka electronic GmbH）を用いた皮膚弾力性、およびＶｉｓｉｏｓｃａｎ  ＶＣ  ９８（Courage+Khazaka electronic GmbH）を用いた皮膚表面の密度（consistency）であった。登録したデータは、数回の反復測定の個々の値に基づき計算される平均であった。それぞれの測定前の晩には、製剤は適用されなかった。
【０１２５】
ヒトインビボ試験により示されたように、皮膚弾力性パラメーターＲ１の低下が８週間の期間にわたって観察された。Ｒ１は、最初の伸長サイクル後の皮膚の残っている変形であり、元の状態に戻る皮膚の能力を表す。パラメーターＲ１は、年齢とともに大いに上昇する。Ｒ１の低下は、１％イデユコゴメ抽出物を適用した人の群で約５ｍｍであったが、５％イデユコゴメ抽出物を適用した人の群における低下は３倍顕著であった（図１３）。
【０１２６】
類似の傾向は、皮膚弾力性パラメーターＲ４に関して見出された。再変形能力は伸長が追加するごとに低下することから、Ｒ４は、皮膚の３伸長サイクルの最後のサイクルの最小振幅であり、皮膚の「疲労症状」を可視化する（図１４）。
【０１２７】
皮膚のきめパラメーターｔｅｘの増加もまた見出された。パラメーターｔｅｘは、皮膚の色合いの均一性を表す。改善されたｔｅｘ値は、改善された皮膚の見た目と関連する。３０および２４単位のｔｅｘパラメーター値の顕著な増加が、それぞれ１％イデユコゴメおよび５％イデユコゴメ群両方で８週間後に見出された（図１５）。
【０１２８】
最後に、皮膚表面パラメーターおよび容積パラメーターの低下が見出された。皮膚表面パラメーターは測定された皮膚の全表面を表し、一方、容積パラメーターは、皮膚のしわを埋めるのに必要とされる容積を表す。しわの深さおよび数の低減の場合、皮膚表面パラメーターおよび容積パラメーターは、１％イデユコゴメ群で７単位の減少が見出されたのに対し、５％イデユコゴメ群は、この値の１５単位のより大きい低下を示した（図１６）。
【０１２９】
ヒトインビボ試験の結果は、本発明による化粧品製剤の使用が、皮膚弾力性および皮膚の張りの増大、皮膚構造の改善、ならびにしわの深さおよび数の低減をもたらすことを示している。
【０１３０】
製剤の例
【０１３１】
【表４】
0005997275.tif 000005
【０１３２】
【表５】
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【０１３３】
【表６】
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【０１３４】
【表７】
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【０１３５】
【表８】
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【０１３６】
【表９】
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【０１３７】
【表１０】
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【０１３８】
【表１１】
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【０１３９】
【表１２】
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【０１４０】
【表１３】
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【０１４１】
【表１４】
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【０１４２】
【表１５】
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【０１４３】
【表１６】
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【０１４４】
【表１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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