(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
白麹菌又は白麹菌抽出物を含有することを特徴とするセラミド産生促進剤。
【請求項２】
白麹菌又は白麹菌抽出物を含有することを特徴とするタイトジャンクション形成促進
剤。
【請求項３】
白麹菌又は白麹菌抽出物を含有することを特徴とする角層形成促進剤。
【請求項４】
白麹菌又は白麹菌抽出物を含有することを特徴とするセリンパルミトイルトランスフ
ェラーゼ２（ＳＰＴＬＣ２）、ＵＤＰ−グルコースセラミドグルコシルトランスフェラ
ーゼ（ＵＧＣＧ）及び／又はβ−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）発現促進剤。
【請求項５】
白麹菌又は白麹菌抽出物を含有することを特徴とするクローディン１（ＣＬＤＮ１）
及び／又はオクルディン（ＯＣＬＮ）発現促進剤。
【請求項６】
白麹菌又は白麹菌抽出物を含有することを特徴とするトランスグルタミナーゼ１
（ＴＧＭ１）及び／又はインボルクリン（ＩＶＬ）発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹菌又は麹菌抽出物を含有する美容組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚のバリア機能とは、肌の水分を保持したり、外部から生体内への異物の侵入を防いだりする機能であり、この皮膚バリア機能が十分に発揮されないと、乾燥肌、敏感肌、肌荒れ、皮膚炎等の問題が発生する恐れがある。よって、皮膚バリア機能を改善することは、美容的観点から見て、重要な課題の一つとなっている。
【０００３】
皮膚バリア機能を改善するためには、タイトジャンクション形成、表面角化、セラミド産生等の作用の促進が重要であると知られている。ここで、タイトジャンクションとは、上皮細胞において見られる細胞間結合の一つであり、この形成により、肌にある水分の蒸発や皮膚への異物の侵入を防ぐことができる。表面角化とは、皮膚の表面に位置する表皮の最外層にある角層を形成することであり、それにより、肌にある水分の蒸散や外界からのアレルゲン等の異物の進入を防ぐことができる。また、角層のバリア機能の障害により、様々な皮膚疾患が生じることも知られている。セラミドは、角質細胞間を埋める細胞間脂質の主成分であり、皮膚バリア機能に重要な役割を果たしていることが知られている。
【０００４】
例えば、特開２０１２−２０１６６５号公報においては、生体内における硫酸化反応の硫酸基供与体として知られている３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）が、タイトジャンクション形成及びセラミド産生を促進することを見出し、これを皮膚バリア機能改善剤に用いることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−２０１６６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況下、本発明の目的は、美容的効果を奏する新規の組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、麹菌抽出物が、タイトジャンクション形成の促進に関連する遺伝子ＣＬＤＮ１及びＯＣＬＮ、表皮角化の促進に関連する遺伝子ＴＧＭ１及びＩＶＬ、並びにセラミド産生の促進に関連する遺伝子ＳＰＴＬＣ２、ＵＧＣＧ及びＧＢＡの発現を促進できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
また、本発明者は、麹菌抽出物が、セラミド輸送に関連する遺伝子ＡＢＣＡ１２の発現をも促進できることを見出した。更に、本発明者は、麹菌抽出物がセラミド産生を促進することも見出した。更に、本発明者は、麹菌抽出物が保湿作用を有することも見出した。
【０００８】
なお、皮膚バリア機能関連遺伝子について以下に説明する。
・表皮タイトジャンクション関連遺伝子（ＣＬＤＮ１、ＯＣＬＮ）
タイトジャンクションは、角化細胞間を接着させる細胞間接着構造である。細胞と細胞をシールすることで物質の透過を制御し、皮膚のバリア機能の１つとして働く。ＣＬＤＮ１にコードされるクローディン１及びＯＣＬＮにコードされるオクルディンは、タイトジャンクションの構成タンパクである。
なお、ＣＬＤＮ１のアクセッションナンバーとして、NM_021101などが知られている。
また、ＯＣＬＮのアクセッションナンバーとして、XM_001128133, NM_001205254, NM_001205255, NM_002538, XM_003118540, XM_003118541, XM_003118543, XM_003118544, XM_003118545, XM_003118546, XM_003118548, XM_003118549などが知られている。
・角化関連遺伝子（ＴＧＭ１、ＩＶＬ）
ＴＧＭ１にコードされるトランスグルタミナーゼ１は、周辺帯前駆物質の重合を行う酵素である。ＴＧＭ１の欠損により周辺帯が欠如し、皮膚バリア機能に障害をもたらす。ＩＶＬにコードされるインボルクリンは、周辺帯の主な構成要素であり、角化の際にトランスグルタミナーゼ等の酵素により架橋される。
なお、ＴＧＭ１のアクセッションナンバーとして、NM_000359などが知られている。
また、ＩＶＬのアクセッションナンバーとして、NM_005547, XM_001130659などが知られている。
・セラミド合成関連遺伝子（ＳＰＴＬＣ２、ＵＧＣＧ、ＧＢＡ）
ＳＰＴＬＣ２にコードされるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ２は、セラミドのｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路で働き、パルミトイルＣｏＡとＬ−セリンの縮合反応を触媒し、スフィンゴイド塩基を形成する。また、この反応はセラミド合成の律速反応である。ＵＧＣＧにコードされるUDP-グルコースセラミドグルコシルトランスフェラーゼは、セラミドの前駆体となるグルコシルセラミドを合成する。層板顆粒内に貯蓄されたグルコシルセラミドは、ＧＢＡにコードされるβ-グルコセレブロシダーゼの作用により、セラミドへと分解され角層へと分泌される。
【化１】
0005997719.tif 000002
なお、ＳＰＴＬＣ２のアクセッションナンバーとして、NM_004863などが知られている。
また、ＵＧＣＧのアクセッションナンバーとして、NM_003358などが知られている。
さらに、ＧＢＡのアクセッションナンバーとして、NM_000157, NM_001005741, NM_001005742, NM_001005749, NM_001005750, NM_001171811などが知られている。
・その他（ＡＣＢＡ１２）
ＡＢＣＡ１２にコードされるＡＴＰ結合カセット輸送体１２（ATP-binding cassette transporter 12）は、顆粒層の層板顆粒の表面に局在し、層板顆粒内への脂質の輸送に関与するトランスポーターであり、細胞間脂質の形成に寄与する。ＡＢＣＡ１２の欠損により角層細胞間脂質の低形成及びバリア機能障害を来し、ＡＢＣＡ１２は道化師様魚鱗癬の原因遺伝子とされている。
なお、ＡＢＣＡ１２のアクセッションナンバーとして、NM_015657, NM_173076などが知られている。
上記アクセッションナンバーは、NCBI RefSeqに基づくものである。
【０００９】
参考文献
Laura L. Mitic, Christina M. Van Itallie and James M. Anderson, Molecular Physiology and Pathophysiology of Tight Junctions I. Tight junction structure and function: lessons from mutant animals and proteins, 2000, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 279, 250-254
【００１０】
本発明の美容組成物は、麹菌又は麹菌抽出物を含有することを特徴とする。
【００１１】
本発明の美容組成物の好適例においては、麹菌が白麹菌であり、麹菌抽出物が白麹菌から得られる。
【００１２】
また、本発明の美容組成物は、保湿剤として好適である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、麹菌又は麹菌抽出物を含有させることによって、美容的効果を奏する新規の組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】標準品（Ｓｔａｎｄａｒｄ）のＴＬＣ展開図、並びにコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及び白麹菌抽出物（濃度１０、２０、５０μｇ／ｍｌ）を用いて得られた脂質サンプルのＴＬＣ展開図を示す。
【図２】標準品（Ｓｔａｎｄａｒｄ）のＴＬＣ展開図、並びにコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及び白麹菌抽出物（濃度１００、２００、５００μｇ／ｍｌ）を用いて得られた脂質サンプルのＴＬＣ展開図を示す。
【図３】白麹菌抽出物によるセラミド産生の評価を示す図である。
【図４】角層水分量の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明の美容組成物は、麹菌又は麹菌抽出物を含有することを特徴とし、美容的効果を奏することができ、より具体的には、皮膚バリア機能を改善することができる。
【００１６】
本発明の美容組成物において、麹菌又は麹菌抽出物は、タイトジャンクション形成の促進に関連する遺伝子ＣＬＤＮ１及びＯＣＬＮ、表皮角化の促進に関連する遺伝子ＴＧＭ１及びＩＶＬ、セラミド産生の促進に関連する遺伝子ＳＰＴＬＣ２、ＵＧＣＧ及びＧＢＡ、並びにセラミド輸送に関連する遺伝子ＡＢＣＡ１２よりなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を促進することができる。また、皮膚バリア機能の改善は、表皮タイトジャンクション形成、表皮角化、及びセラミド産生よりなる群から選択される少なくとも１つの作用を促進させることによって起こることが知られている。よって、上述した遺伝子のいずれかの発現を促進できれば、表皮タイトジャンクション形成、表皮角化、及びセラミド産生よりなる群から選択される少なくとも１つの作用の促進が起こり、皮膚バリア機能を改善することができる。
また、セラミド輸送に関連する遺伝子ＡＢＣＡ１２も、皮膚バリア機能において重要な遺伝子であり、皮膚バリア機能の改善作用が期待できる。
更に、本発明の美容組成物に用いる麹菌又は麹菌抽出物は、保湿作用を有することが確認されており、本発明の美容組成物を保湿剤として使用できる。
【００１７】
具体的には、遺伝子ＣＬＤＮ１及びＯＣＬＮの内の少なくとも一方の遺伝子の発現を促進することによって、表皮タイトジャンクション形成の促進が起こり、皮膚バリア機能を改善することができる。また、遺伝子ＴＧＭ１及びＩＶＬの内の少なくとも一方の遺伝子の発現を促進することによって、表皮角化の促進が起こり、皮膚バリア機能を改善することができる。更に、ＳＰＴＬＣ２、ＵＧＣＧ及びＧＢＡの内の少なくとも一つの遺伝子の発現を促進することによって、セラミド産生の促進が起こり、皮膚バリア機能を改善することができる。
【００１８】
なお、麹菌又は麹菌抽出物を含有する組成物は、その作用から、表皮タイトジャンクション形成を促進するための組成物、表皮角化を促進するための組成物、セラミド産生を促進するための組成物、又は保湿のための組成物として使用することも可能である。
【００１９】
本発明において、麹菌は、特に限定されるものではなく、白麹菌、黒麹菌、黄麹菌、紅麹菌等が挙げられるが、これらの中でも白麹菌が好ましい。なお、麹菌としては、市販品を好適に使用することができる。
【００２０】
麹菌の具体例としては、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）（白麹菌）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（黄麹菌）、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ）（黒麹菌）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）（黒麹菌）、アスペルギルス・ナカザワイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎａｋａｚａｗａｉ）(黒麹菌)、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓａｍｉｉ）（黒麹菌）、アスペルギルス・ルーチェンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｌｕｃｈｅｎｓｉｓ）（黒麹菌）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（黒麹菌）等のアスペルギルス属に属する微生物が挙げられるが、本発明において使用できる麹菌はこれに限定されず、例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属に属する微生物、Ｍｏｎｕｓｃｕｓ属に属する微生物、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属に属する微生物等の他の属に属する微生物も含まれる。
【００２１】
リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する微生物としては、リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）、リゾプス・ニヴェウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｎｉｖｅｕｓ）、リゾプス・ミクロスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅｓ）、リゾプス・ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）等が挙げられる。
【００２２】
モナスカス（Ｍｏｎｕｓｃｕｓ）属に属する微生物としては、モナスカス・アンカ（Ｍｏｎｕｓｃｕｓ  ａｎｋａ）、モナスカス・パープレウス（Ｍｏｎｕｓｃｕｓ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）、モナスカス・ルーバー（Ｍｏｎｕｓｃｕｓｒｕｂｅｒ）、モナスカス・ピロサス（Ｍｏｎｕｓｃｕｓ  ｐｉｌｏｓｕｓ）、モナスカス・オーランチアクス（Ｍｏｎｕｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、モナスカス・カオリアン（Ｍｏｎｕｓｃｕｓ  ｋａｏｌｉａｎｇ）等が挙げられる。
【００２３】
ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物としては、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリウム・グラウカム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、ペニシリウム・カゼイコラム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｓｅｉｃｏｌｕｍ）等が挙げられる。
【００２４】
本発明において、麹菌抽出物は、麹菌から得られる抽出物であり、上述した麹菌を１種単独で、又は複数種を組み合わせて使用することができるが、白麹菌（アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ））から得られた抽出物が好ましい。
【００２５】
本発明の美容組成物に用いる麹菌抽出物の製造方法は、麹菌を溶媒で抽出して抽出液を得る工程を含む。抽出に用いる溶媒（抽出溶媒）としては、例えば、クロロホルム、メタノール、エタノール等が挙げられる。これら抽出溶媒は、単独で用いてもよいし、混合溶媒として用いてもよい。クロロホルムとメタノールの混合溶媒を用いる場合、クロロホルム（Ａ）とメタノール（Ｂ）の体積比（Ａ／Ｂ）は、１０００／１〜１／１０が好ましい。また、メタノール、エタノールを抽出溶媒として用いる場合には、水との混合溶媒とすることができる。水との混合溶媒を使用する場合には、水１０質量部に対してメタノールまたはエタノールを１〜９０質量部添加することが好ましい。
【００２６】
上記抽出工程においては、麹菌として、市販品をそのまま使用することもできるが、麹菌をオートクレーブ等によって滅菌処理したもの（麹菌の滅菌処理物）を用いることが好ましい。なお、市販の麹菌や麹菌の滅菌処理物には、水等の液体が含まれている恐れがあるため、抽出工程の前に、これらを凍結乾燥等により乾燥させることが好ましい。
【００２７】
また、麹菌は、抽出工程の前に、固体培養法、液体培養法等の公知の方法によって増殖させてもよい。固体培養の場合、例えば、培地として蒸米や蒸麦などを用いることができる。一方、液体培養の場合、例えば、培地としてｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ  ｍｅｄｉｕｍ（３％ｓｏｌｕｂｌｅ  ｓｔａｒｃｈ  ｏｒ  ｇｌｕｃｏｓｅ,０．１％ＮａＮＯ３,０．０５％ＫＣｌ,０．１％ＫＨ２ＰＯ４,０．０５％ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ,０．００１％ＦｅＳＯ４,ｐＨ６．０）やポリデキストロース培地などを用いることができる。固体培養、液体培養のいずれの場合でも、培養温度は２０〜５０℃が好ましく、２５℃〜４５℃がより好ましい。また、培養期間は、１〜２０日が好ましい。
【００２８】
また、上記抽出工程では、麹菌を抽出溶媒に浸漬させる手段等を利用することができるが、麹菌と抽出溶媒の混合物を超音波処理する手段や、麹菌と抽出溶媒の混合物を振盪しながら加熱処理する手段を利用することが好ましく、超音波処理及び振盪・加熱処理の両方の手段を利用することが更に好ましい。
【００２９】
上記麹菌抽出物の製造方法においては、上記抽出工程により得られる抽出液に対して分離操作を行ってもよい。例えば、上記抽出液に水を加えて、遠心分離を行い、抽出溶媒に溶けない成分を除去する。
【００３０】
上記麹菌抽出物の製造方法においては、凍結乾燥、減圧濃縮乾固等の乾燥処理によって、上記抽出液から溶媒を除去し、麹菌抽出物を得る工程を含む。
【００３１】
本発明の美容組成物には、麹菌又は麹菌抽出物の他、食品、化粧品又は医薬品業界で通常使用される配合剤、例えば、賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料、美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を目的に応じて適宜配合することができる。これら配合剤としては、市販品を好適に使用することができる。本発明の美容組成物は、麹菌又は麹菌抽出物と、必要に応じて適宜選択した各種配合剤とを混合することにより調製できる。
【００３２】
本発明の美容組成物は、例えば、経口投与または摂取用の組成物や、皮膚外用組成物として使用することができる。本発明の美容組成物中の麹菌又は麹菌抽出物の配合量は、配合される製品の種類、投与または摂取の対象の年齢、性別、体重、状態、投与時間、剤形、投与または摂取の方法、時期などに応じて適宜設定され得る。本発明の美容組成物が経口投与または摂取用の組成物や皮膚外用組成物である場合、美容組成物中における麹菌又は麹菌抽出物の含有量は、麹菌又は麹菌抽出物の乾燥質量換算で好ましくは０．０００１〜１００質量％、より好ましくは０．００１〜５０質量％、更に好ましくは０．０１〜２０質量％、特に好ましくは０．１〜２０質量％である。
【００３３】
経口投与または摂取用の組成物は、需要者の嗜好に合わせて、ハードカプセル、ソフトカプセルのようなカプセル剤、錠剤、丸剤などの剤形、または粉末状、顆粒状、飴状などの形状に成形され得る。また、溶液、懸濁液、または乳液のような液状の剤形または形状にも調製され得る。経口投与または摂取用の組成物は、医薬品、医薬部外品、特定保健用食品、栄養補助食品、その他の飲食品などとして用いる、あるいはこれらに配合して用いることができる。経口投与または摂取用の組成物は、剤形もしくは形状または好みに応じて、そのまま食されても良いし、水、湯、牛乳、豆乳、茶、ジュースなどに溶かして飲んでも良い。
【００３４】
皮膚外用組成物は、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤などの種々の形態に加工され得る。皮膚外用剤組成物は、化粧品、医薬品、医薬部外品などとして利用される。具体的には、本発明の美容組成物は、化粧水、化粧クリーム、乳液、クリーム、パック、ヘアトニック、ヘアクリーム、シャンプー、ヘアリンス、トリートメント、ボディシャンプー、洗顔剤、石鹸、ファンデーション、育毛剤、水性軟膏、スプレーに含有させて利用することができる。
【実施例】
【００３５】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００３６】
＜＜白麹菌抽出物が皮膚バリア機能関連遺伝子に及ぼす影響＞＞
１．白麹菌抽出物の調製例
以下の手順ｉ）〜ｘ）に従い、白麹菌抽出物を調製した。
ｉ）ポリデキストロース培地にて、白麹菌（Aspergillus Kawachii，NITE Biological Resoucce Center 製）を２日間液体培養する。
ｉｉ）菌体を回収するため、回収物から培地を除去し、その後、菌体を純水で２〜３回洗浄する。
ｉｉｉ）菌体をオートクレーブにより滅菌処理を行い、その後、凍結乾燥し、乾燥菌体を得る。
ｉｖ）スクリューキャップ付き試験管に、乾燥菌体０．６ｇを入れる。
ｖ）上記試験管に、クロロホルムとメタノールの混合溶媒（体積比１：１）８．０ｍＬを加える
ｖｉ）上記試験管の内容物に対して、５分間の超音波処理を行う。
ｖｉｉ）上記試験管の内容物に対して、振盪しながら４２℃で３０分間加熱処理を行う。
ｖｉｉｉ）上記試験管に、クロロホルム１０．０ｍＬとの蒸留水４．５ｍＬとを加えて混合し、上記試験管の内容物に対して、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行う。
ｉｘ）下層（有機層）を回収し、濃縮乾固し、白麹菌抽出物を得る。
【００３７】
２．角化細胞における皮膚バリア機能関連遺伝子への影響
２−１．試験方法
以下の手順ｉ）〜ｖｉ）に従い、遺伝子発現量を測定した。
ｉ）Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，ａｄｕｌｔ  ｐｏｏｌｅｄ（継代数Ｐ４）（以下、角化細胞と称する）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ製）をＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２  Ｋｉｔ（以下、ＫＢＭと略す)（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ製）で培養する。
ｉｉ）７５ｃｍ２フラスコ中で培養された角化細胞をトリプシン処理により浮遊させ、これを、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように、２４ウェルプレートに播種した。
ｉｉｉ）２４ウェルプレートに播種された角化細胞を、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間前培養する。
ｉｖ）前培養後、培地を除去し、所定濃度（１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ）に調整された白麹菌抽出物を含有するＫＢＭ培地５００μＬを２４ウェルプレート中の角化細胞に添加し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で４８時間培養する。また、比較のため、白麹菌抽出物を含有しないＫＢＭ培地５００μＬを用い、同様の条件で培養する（コントロール）。
ｖ）培養後、培養上清を除去し、ＲＮｅaｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて、角化細胞からＲＮＡを回収し、次いで、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて、回収したＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。
ｖｉ）得られたｃＤＮＡを用いて、各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定する。なお、内部標準として、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量も測定する。
【００３８】
２−２．結果
結果を表１に示す。表１は、角化細胞における遺伝子ＣＬＤＮ１、ＯＣＬＮ、ＴＧＭ１、ＩＶＬ、ＳＰＴＬＣ２、ＵＧＣＧ及びＡＢＣＡ１２の相対的発現量を示す。なお、表中の値は、白麹菌抽出物を含まない培地を用いた場合（コントロール）の遺伝子の発現量を１としたときの相対的発現量である。
【００３９】
【表１】
0005997719.tif 000003
【００４０】
表１から分かるように、白麹菌抽出物を含む培地を用いた場合の遺伝子ＣＬＤＮ１、ＯＣＬＮ、ＴＧＭ１、ＩＶＬ、ＳＰＴＬＣ２、ＵＧＣＧ及びＡＢＣＡ１２の相対的発現量は、白麹菌抽出物を含まない培地を用いた場合（コントロール）に比べて、増加している。
【００４１】
２−３．考察
表皮角化細胞への白麹菌抽出物の添加により、タイトジャンクションタンパク遺伝子であるＣＬＤＮ１及びＯＣＬＮ、角層形成に関連する遺伝子ＩＶＬ及びＴＧＭ１、セラミド産生に関連する遺伝子ＳＰＴＬＣ２及びＵＧＣＧ、並びにセラミド輸送に関連する遺伝子ＡＢＣＡ１２の有意な発現増加が認められた。これらの発現増加が認められた遺伝子は、表皮細胞の分化と共に発現が上昇し、皮膚バリア機能において重要な遺伝子であるため、白麹菌抽出物による皮膚バリア機能の改善作用が期待される。
【００４２】
３．ヒト３次元培養皮膚モデルにおける皮膚バリア機能関連遺伝子への影響
３−１．試験方法
ヒト３次元培養皮膚モデルＬａｂＣｙｔｅ  ＥＰＩＭＯＤＥＬ１２（６日培養品）（Ｊ−ＴＥＣ製）を、アッセイ培地（Ｊ−ＴＥＣ製）中、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間前培養した。各ウェルより培地を除去した後、所定濃度（１００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ）に調整された白麹菌抽出物を含有するアッセイ培地を１ｍｌ培養カップの外側に添加し、ＣＯ２インキュベーター内で７日間培養した。被験物質含有培地を一日おきに交換した。
７日間培養の後、皮膚モデルをＰＢＳで３回洗浄し、ＲＮｅaｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、皮膚モデルからＲＮＡを回収し、次いで、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、回収したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを用いて、各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。なお、内部標準として、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量も測定した。
【００４３】
３−２．結果
結果を表２に示す。表２は、ヒト３次元培養皮膚モデルにおける遺伝子ＳＰＴＬＣ２、ＧＢＡ、ＣＬＤＮ１、ＯＣＬＮ、ＴＧＭ１、ＩＶＬ、ＡＢＣＡ１２及びＵＧＣＧの相対的発現量を示す。なお、表中の値は、白麹菌抽出物を含まない培地を用いた場合（コントロール）の遺伝子の発現量を１としたときの相対的発現量である。
【００４４】
【表２】
0005997719.tif 000004
【００４５】
表２から分かるように、白麹菌抽出物を含む培地を用いた場合の遺伝子ＳＰＴＬＣ２、ＵＧＣＧ及びＧＢＡの相対的発現量は、白麹菌抽出物を含まない培地を用いた場合（コントロール）に比べて、増加している。
【００４６】
＜＜白麹菌抽出物がセラミド産生に及ぼす影響＞＞
１．白麹菌抽出物の調製例
上述した「白麹菌抽出物が皮膚バリア機能関連遺伝子に及ぼす影響」における「１．白麹菌抽出物の調製例」に従って、白麹菌抽出物を調製した。
【００４７】
２．角化細胞におけるセラミド産生への影響
２−１．細胞からの脂質の抽出
以下の手順ｉ）〜ｖ）に従い、脂質サンプルの調製を行った。
ｉ）上述した「白麹菌抽出物が皮膚バリア機能関連遺伝子に及ぼす影響」における「２−１．試験方法」の手順ｉ）〜ｉｖ）に従い、角化細胞の培養を行う。
ｉｉ）Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（以下ＰＢＳと略す）で３倍希釈したトリプシン５００μＬを添加し、細胞を浮遊させた。
ｉｉｉ）３ウェル分（Ｎ＝３）の細胞浮遊液を１本の５ｍｌチューブに回収し、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離を行う。
ｉｖ）上清を除去後、ＰＢＳ  １ｍＬ／ｗｅｌｌで２回洗浄する。
ｖ）Ｂｒｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法に従って脂質の抽出を行う。
・まず、回収した細胞にＰＢＳ  ５００μｌを添加し、超音波処理を行う。
・次いで、メタノール１２５０μＬ、クロロホルム６２５μＬを加え、４２℃、１２５ｒｐｍにて２０分間振とうする。
・振とう後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行う。
・上清を回収し、回収した上清にクロロホルム６２５μＬを加え攪拌する。
・攪拌後、ＰＢＳ  ６２５μＬを加えよく攪拌する。
・上層中の白い沈殿物が中間層に沈むまで３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行う。
・下層を回収し、窒素ガスを吹きつけ乾固した後、得られた固形物をクロロホルム：メタノール（体積比２：１）溶液１００μＬに溶解し、これを脂質サンプルとする。
【００４８】
２−２．セラミドの展開及び定量
ｉ）ＴＬＣ展開槽の壁面にろ紙を張り、ＨＰＴＬＣプレートのスポット位置に触れない程度の展開液（クロロホルム：メタノール：酢酸（体積比１９０：９：１）溶液）を加えた。
ｉｉ）ＨＰＴＬＣプレートのガラス下から１．５ｃｍ部分にマイクロシリンジを用いて各脂質サンプルを１０μＬずつスポットした。また、標準品としてＣｅｒａｍｉｄｅｓ  ｎｏｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ（以下、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ＩＩと表記）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ製）、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ＩＩＩ（製造元：ＥＶＯＮＩＫ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ）、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ＶＩ（製造元：ＥＶＯＮＩＫ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ）を０．８、４、２０、１００、５００μｇ／ｍＬの濃度となるようにクロロホルム：メタノール（体積比２：１）溶液に溶解し、これらを５μＬずつスポットした。
ｉｉｉ）ＨＰＴＬＣプレートを静かに展開槽に入れ、上端まで（スポットから８．５ｃｍ）展開した。展開後、ＨＰＴＬＣプレートを乾燥させた。乾燥後、再び展開層に入れ、もう一度展開を行った。
ｉｖ）展開溶媒を乾燥後、１０質量％ＣｕＳＯ４−８体積％Ｈ３ＰＯ４溶液をＨＰＴＬＣプレートに満遍なく噴霧し、１８０℃で１０分間加熱した。
ｖ）ＨＰＴＬＣプレートを常温まで冷却した後、Ｃｈｅｍｉ  Ｄｏｃ  ＸＲＳ＋  ｗｉｔｈ  Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＩＯ  ＲＡＤ製）を用いてＨＰＴＬＣプレートをスキャンした。
ｖｉ）得られた画像データからＩｍａｇｅ  Ｌａｂ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、各バンドのシグナル強度を算出した。標準品のシグナル強度を元に、セラミド量とシグナル強度に関する検量線を作成し、各バンドにおけるセラミド量を算出した。サンプルの定量値は、３ウェル分（ｎ＝３）から調製されたサンプル１０μＬであるため、脂質サンプルの全量１００μＬ分のセラミド量を求め、更に１ウェル当りのセラミド量に換算した。
【００４９】
２−３．結果及び考察
ＴＬＣ展開図について説明する。標準品（Ｓｔａｎｄａｒｄ）のＴＬＣ展開図、並びにコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及び白麹菌抽出物（濃度１０、２０、５０μｇ／ｍｌ）を用いて得られた脂質サンプルのＴＬＣ展開図を図１に示す。
図１から分かるように、疎水性側に位置するＣｅｒａｍｉｄｅ  ＩＩと親水性側に位置するＣｅｒａｍｉｄｅ  ＶＩの間（傍線範囲内）に３つのバンド（１〜３）が存在し、これらをサンプル中のｃｅｒａｍｉｄｅとして定量した。また、バンド１とバンド３は標準品と同位置にあることからＣｅｒａｍｉｄｅ  ＩＩとＣｅｒａｍｉｄｅＶであると推測される。また、他文献よりバンド１の上部に位置する濃いバンドはコレステロールであり、バンド３の下部に位置するバンドはグルコシルセラミドであると推測される。
Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂによってバンド１〜３を定量し、１ウェル当りのセラミド量に換算した（表３）。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
表３に示されるように、バンド１〜３の総セラミド量を比較すると、いずれの濃度においても、１割程度のセラミド量の増加が認められた。
【００５２】
３．ヒト３次元培養皮膚モデルにおけるセラミド産生への影響
３−１．細胞からの脂質の抽出
ｉ）上述した「白麹菌抽出物が皮膚バリア機能関連遺伝子に及ぼす影響」における「３−１．試験方法」に従い、ヒト３次元培養皮膚モデルの培養を行った。
ｉｉ）ヒト３次元培養皮膚モデルをＰＢＳ中に懸濁させた。
ｉｉｉ）上述した「２．角化細胞におけるセラミド産生への影響」における「２−１．細胞からの脂質の抽出」の手順ｖ）に従い、Ｂｒｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法による脂質の抽出を行った。なお、得られる固形物は、クロロホルム：メタノール（体積比２：１）溶液２００μＬに溶解した。
【００５３】
３−２．セラミドの展開及び定量
上述した「２．角化細胞におけるセラミド産生への影響」における「２−２．セラミドの展開及び定量」の手順ｉ）〜ｖｉ）に従い、各バンドのシグナル強度を算出した。次いで、標準品のシグナル強度を元に、セラミド量とシグナル強度に関する検量線を作成し、各バンドにおけるセラミド量を算出した。サンプルの定量値は、スポットしたサンプルは１０μｌであるため、全量２００μｌ分のセラミド量を求め、ｔｉｓｓｕｅ当りのセラミド量として解析した。
【００５４】
３−３．結果及び考察
標準品（Ｓｔａｎｄａｒｄ）のＴＬＣ展開図、並びにコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及び白麹菌抽出物（濃度１００、２００、５００μｇ／ｍｌ）を用いて得られた脂質サンプルのＴＬＣ展開図を図２に示す。文献より、点線枠内に位置するバンドがセラミドであることが知られている（図２）。
なお、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂによって、点線枠内に位置するバンドを定量し、総セラミド量を算出した（表４及び図３）。その結果、白麹菌抽出物の用量に依存して、セラミド量の増加傾向が認められ、特に、白麹菌抽出物の濃度が５００μｇ／ｍＬである場合に有意な産生増加が認められた。これらの結果から、白麹菌抽出物の添加により、細胞内の脂質産生が亢進しているのではないかと考えられる。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
＜＜白麹菌抽出物の臨床での有効性確認試験＞＞
１．試験方法
２０〜３０代の健常成人女性を被験者として、試験品を皮膚に適用した前後の角層水分量の比較を行った。
被験者に腕を洗浄させ、測定室にて１５分間馴化させた後、腕の角層水分量の測定を行った。測定後、以下に記載する試験品２０μｌを腕に塗布し、塗布後５、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０分経過時点の角層水分量の測定を行った。角層水分量の測定には、ＳＫＩＣＯＮ−２００ＥＸ（（株）ヤヨイ）を用いた。
試験は、単盲検クロスオーバーにて実施した。
【００５７】
２．試験品の調製例
２−１．白麹菌抽出物の調製例
上述した「白麹菌抽出物が皮膚バリア機能関連遺伝子に及ぼす影響」における「１．白麹菌抽出物の調製例」に従って、白麹菌抽出物を調製した。
２−２．化粧水の調製例
表５に従う配合処方に従い、化粧水を調製した。
【００５８】
【表５】
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【００５９】
２−３．試験品の調製
・化粧品のみを試験品（コントロール群）として用いた。
・試験品中の白麹菌抽出物の濃度が０．１質量％となるように白麹菌抽出物を化粧品と混合し、試験品（０．１％群）を調製した。
・試験品中の白麹菌抽出物の濃度が１質量％となるように白麹菌抽出物を化粧品と混合し、試験品（１％群）を調製した。
【００６０】
３．結果
角層水分量の測定結果を図４に示す。０．１％群及び１％群は、コントロール群と比較して、高い値を示した。
【００６１】
４．考察
本試験では、白麹菌抽出物が優れた保湿効果を有することを検証するため、白麹菌抽出物の塗布前後で角層水分量を比較した。その結果、白麹菌抽出物を塗布した群は、コントロール群と比較して、高い値を示した。よって、白麹菌抽出物は保湿作用を有することが示された。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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