(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患を治療するための医薬組成物であって、配列番号１で表される塩基配列からなるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異を有するフクチン遺伝子の転写段階において、配列番号１の第１１１１７７位のグアニンの３’側のスプライシング供与部位および第１１５９４３位のチミンの５’側のスプライシング受容部位を用いる異常スプライシングを抑制し、正常フクチンタンパク質の生成を回復させるアンチセンス核酸を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
アンチセンス核酸が、配列番号１で表される塩基配列の第１１５９２２位〜第１１６３３１位の範囲を標的配列とし１４〜５０塩基からなる１種または２種以上の核酸であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
アンチセンス核酸が、配列番号１で表される塩基配列の第１１１１５８位〜第１１１６００位の範囲を標的配列とし１４〜５０塩基からなる１種または２種以上の核酸であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
アンチセンス核酸が、配列番号１で表される塩基配列の第１１５９２２位〜第１１６３３１位の範囲を標的配列とし１４〜５０塩基からなる１種または２種以上の核酸、および第１１１１５８位〜第１１１６００位の範囲を標的配列とし１４〜５０塩基からなる１種または２種以上の核酸であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
標的配列が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２で表される塩基配列から選択される１種または２種以上の塩基配列であることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
標的配列が、配列番号８および／または配列番号１１で表される塩基配列であることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
標的配列が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７で表される塩基配列から選択される１種または２種以上の塩基配列であることを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
標的配列が、配列番号８、配列番号１１および配列番号１７で表される塩基配列であることを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項９】
フクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患が、福山型筋ジストロフィー、成人発症の拡張型心筋症、またはＷａｌｋｅｒ−Ｗａｒｂｕｒｇ症候群様の重症型先天性筋ジストロフィーである請求項１〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、福山型筋ジストロフィー等のフクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患を治療するための医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
福山型筋ジストロフィー（Fukuyama muscular dystrophy、以下「ＦＣＭＤ」と略記する場合がある。）は日本に特有の疾患であり、先天性筋ジストロフィー、ＩＩ型滑脳症、眼奇形の３症状を示す常染色体劣性の遺伝疾患である。わが国で２番目に多い小児の筋疾患で、１０代のうちに死に至る重篤な疾患であるが、未だ治療法がない。ＦＣＭＤの疾患責任遺伝子であるフクチン遺伝子は、１９９８年にポジショナルクローニング法により同定された（非特許文献１、２参照）。ほとんどのＦＣＭＤ患者はフクチン遺伝子の３’側非翻訳領域に動く遺伝子である約３ｋｂのＳＶＡ型レトロトランスポゾン（SVA：Sine-VNTR-Alu）の挿入変異を認める（非特許文献２参照）。この変異は約１００世代前に日本人祖先のひとりに生じたもので、日本人の８８人に１人が保因者であり、約３万の出生に１人の割合で発症することが報告されている（非特許文献３参照）。ＦＣＭＤ患者の骨格筋には細胞膜と基底膜をつなぐ糖タンパク質αジストログリカン（以下「α−ＤＧ」と記す。）のＯ−マンノース型糖鎖修飾に欠損があり、この糖鎖を介する細胞膜と基底膜とのあいだの結合が破綻するため重度の筋ジストロフィーが発症することが知られている（非特許文献４参照）。
【０００３】
フクチン遺伝子の産物であるフクチンタンパク質はゴルジ体に局在し、既知の糖転移酵素とのアミノ酸配列の相同性からα−ＤＧの糖鎖修飾に関与する糖転移酵素ではないかと考えられているが、その機能を含め未知な点が多い。ＦＣＭＤの発症機序については、ＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異が３’側非翻訳領域にあることでフクチンｍＲＮＡが不安定化し分解される、あるいは、ＳＶＡ型レトロトランスポゾンの持つ繰り返し配列の影響でフクチン遺伝子の周辺がＤＮＡメチル化やヒストン脱アセチル化などエピジェネティックな不活性化をうけ発現抑制や転写伸長障害が起こる、などと考えられてきたが、ＳＶＡ型レトロトランスポゾンの配列にはグアニンおよびシトシンが豊富なため解析が難しく、発症機序は未解明のままであった。
【０００４】
福山型筋ジストロフィー以外にも、フクチン遺伝子の変異に起因して様々な病態が引き起こされることが知られている（非特許文献５参照）。これらの中で、例えば、成人発症の拡張型心筋症（非特許文献６参照）およびＷａｌｋｅｒ−Ｗａｒｂｕｒｇ症候群様の重症型先天性筋ジストロフィー（非特許文献７参照）はフクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾン挿入変異が原因であることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Toda, T., Segawa, M., Nomura, Y. et al.: Localization of a gene for Fukuyama type congenital muscular dystrophy to chromosome 9q31-33. Nat. Genet., 5, 283-286 (1993)
【非特許文献２】Kobayashi, K., Nakahori, Y., Miyake, M. et al.: An ancient retrotransposal insertion causes Fukuyama-type congenital muscular dystrophy. Nature, 394, 388-392 (1998)
【非特許文献３】Watanabe, M., Kobayashi, K., Jin, F. et al.: Founder SVA retrotransposal insertion in Fukuyama-type congenital muscular dystrophy and its origin in Japanese and Northeast Asian populations. Am. J. Med. Genet. A, 138, 344-348 (2005)
【非特許文献４】Michele, D. E., Barresi, R., Kanagawa, M. et al.: Post-translational disruption of dystroglycan-ligand interactions in congenital muscular dystrophies. Nature, 418, 417-422 (2002)
【非特許文献５】OMIM No.607440, http://omim.org/entry/607440
【非特許文献６】Murakami, T., Hayashi, Y. K., Noguchi, S., et al.: Fukutin gene mutations cause dilated cardiomyopathy with minimal muscle weakness.Ann. Neurol., 60, 597-602 (2006)
【非特許文献７】Kondo-Iida, E., Kobayashi, K., Watanabe, M., et al.: Novel mutations and genotype-phenotype relationships in 107 families with Fukuyama-type congenital muscular dystrophy (FCMD). Hum. Mol. Genet., 8, 2303-2309 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、福山型筋ジストロフィー等のフクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患の発症機序を解明し、これらの疾患の治療に有効な医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］フクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患を治療するための医薬組成物であって、配列番号１で表される塩基配列からなるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異を有するフクチン遺伝子の転写段階において、配列番号１の第１１１１７７位のグアニンの３’側のスプライシング供与部位および第１１５９４３位のチミンの５’側のスプライシング受容部位を用いる異常スプライシングを抑制し、正常フクチンタンパク質の生成を回復させるアンチセンス核酸を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
［２］アンチセンス核酸が、配列番号１で表される塩基配列の第１１５９２２位〜第１１６３３１位の範囲を標的配列とし１４〜５０塩基からなる１種または２種以上の核酸であることを特徴とする前記［１］に記載の医薬組成物。
［３］アンチセンス核酸が、配列番号１で表される塩基配列の第１１１１５８位〜第１１１６００位の範囲を標的配列とし１４〜５０塩基からなる１種または２種以上のアンチセンス核酸であることを特徴とする前記［１］に記載の医薬組成物。
［４］アンチセンス核酸が、配列番号１で表される塩基配列の第１１５９２２位〜第１１６３３１位の範囲を標的配列とし１４〜５０塩基からなる１種または２種以上の核酸、および第１１１１５８位〜第１１１６００位の範囲を標的配列とし１４〜５０塩基からなる１種または２種以上の核酸であることを特徴とする前記［１］に記載の医薬組成物。
［５］標的配列が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２で表される塩基配列から選択される１種または２種以上の塩基配列であることを特徴とする前記［２］に記載の医薬組成物。
［６］標的配列が、配列番号８および／または配列番号１１で表される塩基配列であることを特徴とする前記［２］に記載の医薬組成物。
［７］標的配列が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７で表される塩基配列から選択される１種または２種以上の塩基配列であることを特徴とする前記［３］に記載の医薬組成物。
［８］標的配列が、配列番号８、配列番号１１および配列番号１７で表される塩基配列であることを特徴とする前記［４］に記載の医薬組成物。
［９］フクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患が、福山型筋ジストロフィー、成人発症の拡張型心筋症、またはＷａｌｋｅｒ−Ｗａｒｂｕｒｇ症候群様の重症型先天性筋ジストロフィーである前記［１］〜［８］のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、福山型筋ジストロフィー等のフクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患の治療に有効な医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＳＶＡ挿入フクチン遺伝子の異常スプライシングを引き起こす潜在的なスプライシング調節部位の塩基配列と、今回デザインしたアンチセンス核酸（Ｄ１〜５、Ａ１〜３、Ｅ１〜４）の標的配列を示す図である。
【図２】ＦＣＭＤ患者のフクチンｍＲＮＡを定量ＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す図であり、（Ａ）はフクチンｃＤＮＡの模式図、（Ｂ）はＦＣＭＤ患者の健常人に対する相対発現量を示す図である。
【図３】健常人およびＦＣＭＤ患者のフクチン遺伝子ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを鋳型として長距離ＰＣＲを行った結果を示す図である。
【図４】ＦＣＭＤ患者におけるフクチンゲノムおよびｃＤＮＡ、ならびに健常人におけるフクチンゲノムおよびｃＤＮＡを示す図である。
【図５】ＦＣＭＤ患者由来のリンパ芽球のフクチンｍＲＮＡをノーザンブロットで検出した結果を示す図である。
【図６】ＦＣＭＤモデルマウスの骨格筋および脳のフクチンｍＲＮＡをノーザンブロットで検出した結果を示す図である。
【図７】ＦＣＭＤ患者由来のリンパ芽球の異常フクチンタンパク質を免疫沈降およびウエスタンブロットの組み合わせにより検出した結果を示す図である。
【図８】ＦＣＭＤ患者の脳の異常フクチンタンパク質を免疫沈降およびウエスタンブロットの組み合わせにより検出した結果を示す図である。
【図９】ＦＣＭＤモデルマウスの骨格筋および脳の異常フクチンタンパク質を免疫沈降およびウエスタンブロットの組み合わせにより検出した結果を示す図である。
【図１０】フクチンタンパク質の局在を免疫蛍光染色により観察した結果を示す図である。
【図１１】フクチンコンストラクト（ｐＨｎ、ｐＨｐ、ｐＳｐｌおよびｐＡｃｃ）をトランスフェクションしたＨｅＬａＳ３細胞を用いて、ノーザンブロット分析を行った結果を示す図である。
【図１２】ＦＣＭＤモデルマウスＥＳ細胞にアンチセンス核酸を導入し、正常フクチンｍＲＮＡ回復を確認した結果を示す図である。
【図１３】ＦＣＭＤモデルマウスにアンチセンス核酸を筋肉内投与し、正常フクチンｍＲＮＡの回復を確認した結果を示す図である。
【図１４】ＦＣＭＤモデルマウスにアンチセンス核酸を筋肉内投与し、正常フクチンｍＲＮＡの回復を確認した結果を示す図である。
【図１５】ＦＣＭＤモデルマウス（Ｈｐ／Ｈｐ）にアンチセンス核酸を筋肉内投与し、正常フクチンタンパク質の回復を確認した結果を示す図である。
【図１６】ＦＣＭＤモデルマウスにアンチセンス核酸を筋肉内投与し、α−ＤＧのグリコシル化およびα−ＤＧによるラミニン結合の回復を確認した結果を示す図である。
【図１７】ＦＣＭＤモデルマウスにアンチセンス核酸を静脈内投与し、α−ＤＧのグリコシル化およびα−ＤＧによるラミニン結合の回復を確認した結果を示す図である。
【図１８】ＦＣＭＤ患者由来リンパ芽球にアンチセンス核酸を導入し、正常フクチンｍＲＮＡの回復を確認した結果を示す図である。
【図１９】ＦＣＭＤ患者由来初代筋管細胞にアンチセンス核酸を導入し、正常フクチンｍＲＮＡの回復を確認した結果を示す図である。
【図２０】ＦＣＭＤ患者由来リンパ芽球にアンチセンス核酸を導入し、正常フクチンタンパク質の回復を確認した結果を示す図である。
【図２１】ＦＣＭＤ患者由来初代筋管細胞にアンチセンス核酸を導入し、α−ＤＧのグリコシル化およびα−ＤＧによるラミニン結合の回復を確認した結果を示す図である。
【図２２】ＦＣＭＤ患者由来初代筋管細胞にアンチセンス核酸を導入し、ラミニンクラスタリング分析を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明者らは、福山型筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）がＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入により誘導されるスプライシング異常症であることを世界で初めて証明した。より詳細には、疾患責任遺伝子であるフクチン遺伝子の最終エクソン（エクソン１０）の３’側非翻訳領域に挿入されたＳＶＡ型レトロトランスポゾンの配列に存在する強力なスプ
ライシング受容部位がエクソン１０の翻訳領域にある潜在的なスプライシング供与部位を新たに活性化すること（エクソントラッピング）が原因であることを明らかにした（図４参照）。さらに、本発明者らは、この異常スプライシングを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、患者由来の細胞に導入し、ＦＣＭＤモデルマウスに対して局所投与ならびに全身投与を行った。その結果、患者由来の細胞およびＦＣＭＤモデルマウスのいずれにおいても正常フクチンｍＲＮＡと正常フクチンタンパク質の発現が回復し、α−ＤＧの糖鎖修飾とラミニン結合能の回復が確認された。
【００１１】
本発明の医薬組成物は、フクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患を治療するための医薬組成物であって、配列番号１で表される塩基配列からなるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異を有するフクチン遺伝子の転写段階において、配列番号１の第１１１１７７位のグアニンの３’側のスプライシング供与部位および第１１５９４３位のチミンの５’側のスプライシング受容部位を用いる異常スプライシングを抑制し、正常フクチンタンパク質の生成を回復させるアンチセンス核酸を有効成分として含有するものであればよい。
【００１２】
フクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患としては、例えば、福山型筋ジストロフィー、成人発症の拡張型心筋症（非特許文献６参照）Ｗａｌｋｅｒ−Ｗａｒｂｕｒｇ症候群様の重症型先天性筋ジストロフィー（非特許文献７参照）等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物の適用対象となる疾患には、将来、フクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異が原因であることが明らかとなる疾患も含まれる。好ましくは福山型筋ジストロフィーである。
【００１３】
配列番号１で表される塩基配列は、フクチン遺伝子のゲノム配列（GenBank ACSESSION: AB038490）にＳＶＡ型レトロトランスポゾン配列（GenBank ACSESSION: AB185332）が挿入された挿入変異型フクチン遺伝子のゲノム配列であり、第１１５６６９位〜第１１８７３０位がＳＶＡ型レトロトランスポゾン配列である。上記エクソントラッピングにより、配列番号１の第１１１１７７位のグアニンの３’側、つまり第１１１１７７位のグアニンと第１１１１７８位のグアニンの間が新たなスプライシング供与部位となり、第１１５９４３位のチミンの５’側、つまり第１１５９４２位のグアニンと第１１５９４３位のチミンの間が新たなスプライシング受容部位となる。それゆえ、第１１１１７７位のグアニンの３’側のスプライシング供与部位および第１１５９４３位のチミンの５’側のスプライシング受容部位を用いる異常スプライシングを抑制し、正常フクチンタンパク質の生成を回復させることによりＦＣＭＤ等のフクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患を治療することが可能となる。
【００１４】
なお、「配列番号１で表される塩基配列からなるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異を有するフクチン遺伝子の転写段階において、配列番号１の第１１１１７７位のグアニンの３’側のスプライシング供与部位および第１１５９４３位のチミンの５’側のスプライシング受容部位を用いる異常スプライシング」は、「配列番号１で表される塩基配列からなるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異を有するフクチン遺伝子の転写段階において、配列番号１の第１１１１７８位のグアニンから第１１５９４２位のグアニンをイントロンと認識し、第１１５９４３位のチミンから第１２０１９１位のグアニンをエクソンと認識する異常スプライシング」と換言することができる。
【００１５】
本発明の医薬組成物の有効成分となるアンチセンス核酸は、ＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異を有するフクチン遺伝子の転写段階において、一次転写産物であるプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制し、正常フクチンタンパク質の生成を回復させるものであればよい。このような効果を奏するアンチセンス核酸の標的配列としては、配列番号１で表される塩基配列の第１１５９２２位〜第１１６３３１位の範囲（以下「標的範囲１」と記す。）を標的とするアンチセンス核酸が好ましい。より好ましくは第１１５９２２位〜１１６０８４位の範囲を標的とするアンチセンス核酸である。標的範囲１には、異常スプライシングに用いられるスプライシング受容部位、第１のエクソン内スプライシング促進配列（第１１６００７位〜第１１６０１１位）および第２のエクソン内スプライシング促進配列（第１１６０５５位〜第１１６０５９位）が含まれる。なお、エクソン内スプライシング促進配列は、例えばＥＳＥｆｉｎｄｅｒ３．０（http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi）を用いて予測することができる。
【００１６】
また、アンチセンス核酸の他の標的配列としては、配列番号１で表される塩基配列の第１１１１５８位〜第１１１６００位の範囲（以下「標的範囲２」と記す。）を標的とするアンチセンス核酸が好ましい。より好ましくは第１１１１５８位〜第１１１２９０位の範囲を標的とするアンチセンス核酸である。標的範囲２には、異常スプライシングに用いられるスプライシング供与部位、第１のイントロン内スプライシング促進配列（第１１１２２５位〜第１１１２３０位）および第２のイントロン内スプライシング促進配列（第１１１２６１位〜第１１１２７３位）が含まれる。なお、イントロン内スプライシング促進配列は、例えばＡＣＥＳＣＡＮ２（http://genes.mit.edu/acescan2/index.html）を用いて予測することができる。
【００１７】
異常スプライシングを抑制するとは、ＦＣＭＤ患者等のフクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患患者において、異常スプライシングにより生成される異常フクチンｍＲＮＡの発現量が抑制されていることを意味する。異常フクチンｍＲＮＡの発現量が、本発明の医薬組成物投与前の同一患者の発現量と比較して約２０％以上抑制されていることが好ましく、約３０％以上抑制されていることがより好ましく、約４０％以上抑制されていることがさらに好ましく、約５０％以上抑制されていることが特に好ましい。異常フクチンｍＲＮＡの発現量が抑制されていることは、例えば定量ＲＴ−ＰＣＲ等の公知のｍＲＮＡ測定方法を用いることにより確認することができる。なお、異常フクチンｍＲＮＡの塩基配列を配列番号２に、異常フクチンタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００１８】
正常フクチンタンパク質の生成を回復させるとは、ＦＣＭＤ患者等のフクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患患者において、正常フクチンタンパク質の発現量が増加して健常人のレベルに近づくことを意味する。本発明の医薬組成物を投与した患者における正常フクチタンパク質の発現量が、健常人（正常フクチン遺伝子のホモ接合体）における正常フクチンタンパク質の発現量の約２０％以上のレベルに回復することが好ましく、約３０％以上のレベルに回復することがより好ましく、約４０％以上のレベルに回復していることがさらに好ましく、約５０％以上のレベルに回復していることが特に好ましい。正常フクチン遺伝子と挿入変異フクチン遺伝子とのヘテロ接合体（ＦＣＭＤ保因者）は、全フクチンタンパク質発現量の５０％が正常フクチンタンパク質であってもＦＣＭＤを発症しないので、正常フクチンタンパク質発現量が健常人（正常フクチン遺伝子のホモ接合体）の５０％程度のレベルに回復すれば、十分な治療効果が期待できる。正常フクチンタンパク質の生成が回復していることは、例えばＥＬＩＳＡやウエスタンブロッティング等の公知のタンパク質測定法を用いることにより確認することができる。正常フクチンタンパク質（配列番号５）は、正常なスプライシングによる転写産物に基づいて生成される。フクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患患者において正常なスプライシングにより生成されるｍＲＮＡの塩基配列は、正常フクチンｍＲＮＡの塩基配列（配列番号４）にＳＶＡ型レトロトランスポゾン配列（GenBank ACSESSION: AB185332）が挿入されたものである。正常フクチンタンパク質の発現量は正常なスプライシングにより生成されるｍＲＮＡに相関するので、正常なスプライシングにより生成されるｍＲＮＡの発現量を測定することにより、間接的に正常フクチンタンパク質の生成が回復していることを評価できる。
【００１９】
標的範囲１を標的とするアンチセンス核酸としては、異常スプライシングに用いられるスプライシング受容部位を含む塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸、第１のエクソン内スプライシング促進配列を含む塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸、第２のエクソン内スプライシング促進配列を含む塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸、上記スプライシング受容部位と第１のエクソン内スプライシング促進配列に挟まれる塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸、第１および第２のエクソン内スプライシング促進配列に挟まれる塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸、第２のエクソン内スプライシング促進配列より下流（３’側）の塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸が挙げられる。好ましくは、上記スプライシング受容部位を含む塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸、または第１および第２のエクソン内スプライシング促進配列に挟まれる塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸である。より好ましくは、上記スプライシング受容部位を含む塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸と上記標的範囲１を標的とする他のアンチセンス核酸との組み合わせ、または第１および第２のエクソン内スプライシング促進配列に挟まれる塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸と上記標的範囲１を標的とする他のアンチセンス核酸との組み合わせであり、特に好ましくは上記スプライシング受容部位を含む塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸と第１および第２のエクソン内スプライシング促進配列に挟まれる塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸との組み合わせである。
【００２０】
標的範囲１の異常スプライシングに用いられるスプライシング受容部位を含む標的配列としては、例えば表１に示されるａ１（配列番号６）、ａ２（配列番号７）、ａ３（配列番号８）などが挙げられる。上記スプライシング受容部位と第１のエクソン内スプライシング促進配列に挟まれる標的配列としては、例えば表１に示されるｅ１（配列番号９）などが挙げられ、第１のエクソン内スプライシング促進配列を含む標的配列としては、例えば表１に示されるｅ２（配列番号１０）などが挙げられ、第１および第２のエクソン内スプライシング促進配列に挟まれる標的配列としては、例えば表１に示されるｅ３（配列番号１１）などが挙げられ、第２のエクソン内スプライシング促進配列を含む標的配列としては、例えば表１に示されるｅ４（配列番号１２）などが挙げられる。標的範囲１を標的とするアンチセンス核酸として好ましくは、ａ３またはｅ３を標的配列とするアンチセンス核酸が挙げられる。より好ましくは、ａ３を標的配列とするアンチセンス核酸とｅ３を標的配列とするアンチセンス核酸との組み合わせである。
【００２１】
標的範囲２を標的とするアンチセンス核酸としては、異常スプライシングに用いられるスプライシング供与部位を含む塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸、第１のイントロン内スプライシング促進配列を含む塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸、第２のイントロン内スプライシング促進配列を含む塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸、上記スプライシング供与部位と第１のイントロン内スプライシング促進配列に挟まれる塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸、第１および第２のイントロン内スプライシング促進配列に挟まれる塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸、第２のイントロン内スプライシング促進配列より下流（３’側）の塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸が挙げられる。好ましくは、第１のイントロン内スプライシング促進配列を含む配列を標的とするアンチセンス核酸、または第２のイントロン内スプライシング促進配列を含む配列を標的とするアンチセンス核酸である。
【００２２】
標的範囲２の異常スプライシングに用いられるスプライシング供与部位を含む標的配列としては、例えば表１に示されるｄ１（配列番号１３）、ｄ２（配列番号１４）などが挙げられ、上記スプライシング受容部位と第１のイントロン内スプライシング促進配列に挟まれる標的配列としては、例えば表１に示されるｄ３（配列番号１５）などが挙げられ、第１のイントロン内スプライシング促進配列を含む標的配列としては、例えば表１に示されるｄ４（配列番号１６）などが挙げられ、第２のイントロン内スプライシング促進配列を含む標的配列としては、例えば表１に示されるｄ５（配列番号１７）などが挙げられる。標的範囲２を標的とするアンチセンス核酸として好ましくは、ｄ４またはｄ５を標的配列とするアンチセンス核酸が挙げられる。
【００２３】
【表１】
0005943466.tif 000002
【００２４】
本発明の医薬組成物の有効成分は、標的範囲１に含まれる塩基配列を標的配列とする１種または２種以上のアンチセンス核酸と、標的範囲２に含まれる塩基配列を標的配列とする１種または２種以上のアンチセンス核酸を組み合わせた、２種以上のアンチセンス核酸を含有することが好ましい。好ましい組み合わせとしては、例えば、ａ３を標的配列とするアンチセンス核酸とｄ４を標的配列とするアンチセンス核酸との組み合わせ、ａ３を標的配列とするアンチセンス核酸とｄ５を標的配列とするアンチセンス核酸との組み合わせ、ｅ３を標的配列とするアンチセンス核酸とｄ４を標的配列とするアンチセンス核酸との組み合わせ、ｅ３を標的配列とするアンチセンス核酸とｄ５を標的配列とするアンチセンス核酸との組み合わせ、ａ３を標的配列とするアンチセンス核酸とｅ３を標的配列とするアンチセンス核酸とｄ４を標的配列とするアンチセンス核酸との組み合わせ、ａ３を標的配列とするアンチセンス核酸とｅ３を標的配列とするアンチセンス核酸とｄ５を標的配列とするアンチセンス核酸との組み合わせなどが挙げられる。特に好ましくは、ａ３を標的配列とするアンチセンス核酸とｅ３を標的配列とするアンチセンス核酸とｄ５を標的配列とするアンチセンス核酸との組み合わせである。
【００２５】
アンチセンス核酸の長さは特に限定されない。好ましくは約１４〜約５０塩基、より好ましくは約１４〜約４０塩基、さらに好ましくは約１４〜約３０塩基である。本発明に用いられるアンチセンス核酸は、ＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異を有するフクチン遺伝子のプレｍＲＮＡに相補的な配列を含むものであるが、完全に相補的であることを要するものではなく、当該プレｍＲＮＡとハイブリッドを形成できる限りにおいてミスマッチを含むものであってもよい。相補的な配列部分はアンチセンス核酸の長さ（塩基数）の５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である。
【００２６】
表１に示した標的配列と１００％相補的なアンチセンス核酸の塩基配列を表２に示す。本発明の医薬組成物の有効成分となるアンチセンス核酸は、表２に示した配列番号１８〜２９のいずれかで表される塩基配列において、いくつかの塩基が欠失、置換または付加された配列からなるアンチセンス核酸であってもよい。欠失、置換または付加される塩基数は、１〜１０個が好ましく、より好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１または２個である。
【００２７】
【表２】
0005943466.tif 000003
【００２８】
本発明の医薬組成物の有効成分となるアンチセンス核酸は、ＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖、ＤＮＡとＲＮＡの混合鎖のいずれからなるものでもよい。また、ヌクレオチド類似体を含むものであってもよい。アンチセンス核酸は、ヌクレアーゼ耐性を増加させ、および／または標的配列に対する親和性を増加させるように修飾されることが好ましい。好ましいヌクレオチド類似体は、例えば、モルホリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格、スルホン骨格、ホルムアセチル骨格、チオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルホメート骨格、スルホネート骨格、スルホンアミド骨格、メチレンイミノ骨格、メチレンヒドラジノ骨格、アミド骨格などの修飾骨格を含む。モルホリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が六員環に置き換えられ、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合に置き換えられた無電荷の骨格を有する。モルホリノオリゴヌクレオチドは酵素分解に耐性を有する。
【００２９】
さらに好ましい骨格は、モルホリノヌクレオチド類似体を含み、リボースまたはデオキシリボース糖が六員環モルホリノに置き換えられる。さらに好ましいヌクレオチド類似体は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含み、リボースまたはデオキシリボース糖が、六員環モルホリノに置き換えられ、隣接モルホリノ環の間の陰イオン性ホスホジエステル結合が、非イオン性ホスホロジアミデート結合に置き換えられる。
【００３０】
さらに、ヌクレオチド類似体は、ホスホジエステル結合中の非架橋酸素の１つの置換を含むことが好ましい。この修飾により、ヌクレアーゼ分解に対する重要な耐性が加えられる。好ましいヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｈ−ホスホネート、例えば３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラルなホスホネートを含むエチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、例えば３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートまたはボラノホスフェートを含む。
【００３１】
さらに、ヌクレオチド類似体は、−ＯＨ；−Ｆ；１つまたは複数のヘテロ原子によって妨げることができる、置換または非置換の、直鎖状または分岐状の低級（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリルまたはアラルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アリル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、−メトキシ、−アミノプロポキシ；−メトキシエトキシ；−ジメチルアミノオキシエトキシ；−ジメチルアミノエトキシエトキシなどの、２’、３’および／または５’位で一または二置換される、１つまたは複数の糖部分を含むことが好ましい。糖部分は、ピラノースもしくはその誘導体、またはデオキシピラノースもしくはその誘導体、好ましくはリボースもしくはその誘導体、またはデオキシリボースもしくはその誘導体であってよい。好ましい誘導体化された糖部分は、ロックト核酸（ＬＮＡ）を含み、２’炭素原子が、糖環の３’または４’炭素原子に連結し、それによって二環式糖部分を形成する。好ましいＬＮＡは、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン架橋核酸を含む（Morita et al., 2001, Nucleic Acid Res Supplement No.1:241−242）。これらの置換により、ヌクレオチド類似体または同等物に、ＲＮａｓｅＨおよびヌクレアーゼ耐性が与えられ、標的ＲＮＡに対する親和性が増加する。
【００３２】
本発明の医薬組成物の有効成分となるアンチセンス核酸は、公知の核酸合成方法を用いて製造することができる。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、上述のアンチセンス核酸を有効成分とし、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。好ましくは、非経口剤である。注射剤は凍結乾燥製剤としてもよい。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００３４】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。さらに、凍結乾燥製剤としてもよい。
【００３５】
本発明の組成物中に含まれるアンチセンス核酸の濃度は、製剤形態や担体または添加剤の種類によって異なるが、通常０．１ｎＭ〜１００μＭの範囲であり、好ましくは１ｎＭ〜１０μＭ、より好ましくは１０ｎＭ〜４μＭの範囲である。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、フクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患を発症しているヒトに対して投与することができる。投与経路は特に限定されないが、非経口投与が好ましい。非経口投与は、静脈内投与等の全身性投与、筋肉内投与、経皮投与、経粘膜投与等の局所投与のいずれであってもよい。また、本発明の医薬組成物の有効成分であるアンチセンス核酸は、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。さらに、リポソームを用いてアンチセンス核酸を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともにアンチセンス核酸を細胞に移入する方法、超音波導入法等を併用して投与する方法などを利用することができる。
【００３７】
本発明の医薬組成物の用量は、含有するアンチセンス核酸の種類、剤形、投与経路、患者の年齢や体重によって異なるが、注射剤の形で投与する場合、１日当たり約０．０１ｍｇ〜６０ｇ程度、好ましくは約０．１ｍｇ〜２４ｇ程度、より好ましくは約０．１ｍｇ〜６ｇ程度を投与することができる。投与間隔は１日１回〜数回、または１日〜２週間の間隔を設定することができる。
【００３８】
さらに本発明には以下の発明が含まれる。
（ｉ）フクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患の治療方法であって、当該疾患患者に対して、配列番号１で表される塩基配列からなるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異を有するフクチン遺伝子の転写段階において、配列番号１の第１１１１７７位のグアニンの３’側のスプライシング供与部位および第１１５９４３位のチミンの５’側のスプライシング受容部位を用いる異常スプライシングを抑制し、正常フクチンタンパク質の生成を回復させるアンチセンス核酸の有効量を投与することを特徴とする治療方法。
（ｉｉ）フクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患の治療薬を製造するための、配列番号１で表される塩基配列からなるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異を有するフクチン遺伝子の転写段階において、配列番号１の第１１１１７７位のグアニンの３’側のスプライシング供与部位および第１１５９４３位のチミンの５’側のスプライシング受容部位を用いる異常スプライシングを抑制し、正常フクチンタンパク質の生成を回復させるアンチセンス核酸の使用。
（ｉｉｉ）フクチン遺伝子におけるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異に起因する疾患の治療に使用するための、配列番号１で表される塩基配列からなるＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入変異を有するフクチン遺伝子の転写段階において、配列番号１の第１１１１７７位のグアニンの３’側のスプライシング供与部位および第１１５９４３位のチミンの５’側のスプライシング受容部位を用いる異常スプライシングを抑制し、正常フクチンタンパク質の生成を回復させるアンチセンス核酸。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４０】
［Ｉ］実験方法
（１）アンチセンス核酸
図１に示したように、ＳＶＡ挿入フクチン遺伝子の異常スプライシングを引き起こす潜在的なスプライシング調節配列（スプライシング供与部位、スプライシング受容部位、エクソン内スプライシング促進配列およびイントロン内スプライシング促進配列を含む）を標的とするように１２種類のアンチセンス核酸をデザインした（塩基配列は表２を参照のこと）。エクソン内スプライシング促進配列はＥＳＥｆｉｎｄｅｒ３．０（http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi）を用いて予測し、イントロン内スプライシング促進配列はＡＣＥＳＣＡＮ２（http://genes.mit.edu/acescan2/index.html）を用いて予測した。Ｄ１〜５はエクソン１０内のスプライシング供与部位および予想されるイントロン内スプライシング促進配列の近傍を標的とするように設計した。Ａ１〜３はＳＶＡ挿入配列中のスプライシング受容部位を含む配列を標的とするように設計した。Ｅ１〜４は予想されるエクソン内スプライシング促進配列の近傍を標的とするように設計した。
ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ遺伝子のエクソン２３をスキップさせるために用いられるアンチセンス核酸（Ｄｙｓ、GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT（配列番号３０）、Yokota, T. et al. Ann. Neurol. 65, 667-676 (2009)）を陰性対照とした。
表２に記載の１２種類の２’ＯＭｅＰＳ ＲＮＡを作製した（表２の塩基配列のチミン（Ｔ）に代えてウラシル（Ｕ）を使用）。これらはＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎに合成を依頼した。Ａ３、Ｅ３、Ｄ５およびＤｙｓについては、ＶＭＯ（octa-guanidine morpholino oligonucleotide、Wu, B. et al. Mol. Ther. 17, 864-871 (2009)）を作製した。これらはＧｅｎｅ−Ｔｏｏｌｓに合成を依頼した。アンチセンス核酸は滅菌水に溶解して用いた。
【００４１】
（２）動物および細胞
すべての動物実験は、大阪大学大学院医学系研究科および神戸大学大学院医学研究科の実験動物倫理審査委員会の承認を受けた。ＦＣＭＤノックインモデルマウスおよびその命名については文献（Kanagawa, M. et al. Residual laminin-binding activity and enhanced dystroglycan glycosylation by LARGE in novel model mice to dystroglycanopathy. Hum. Mol. Genet. 18, 621-631 (2009).）に記載されている。フクチン遺伝子の正常ヒトエクソン１０およびＳＶＡ挿入ヒトエクソン１０を有するトランスジェニックアレルをそれぞれＨｎおよびＨｐと命名した。つまり、Ｈｐ／ＨｐはＳＶＡ挿入ヒトエクソン１０アレルのホモ接合体であり、Ｈｎ／Ｈｎは正常ヒトエクソン１０アレルのホモ接合体であり、Ｈｐ／＋はＳＶＡ挿入ヒトエクソン１０アレルと正常マウスフクチン遺伝子の複合ヘテロ接合体であり、Ｈｐ／−はＳＶＡ挿入ヒトエクソン１０アレルとマウスフクチン遺伝子ノックアウトアレルの複合ヘテロ接合体である。実験に用いたマウスの月齢は２〜６か月の範囲である。
ＳＶＡが挿入されたヒトゲノムフクチンエクソン１０を有するマウスＥＳ細胞系統は、Ｈｐ／Ｈｐマウスから樹立した。フクチンノックアウトアレルを有するマウスＥＳ細胞系統は、文献（Takeda, S. et al. Fukutin is required for maintenance of muscle integrity, cortical histiogenesis and normal eye development. Hum. Mol. Genet. 12, 1449-1459 (2003).）に記載されている。
ヒトリンパ芽球は、ＦＣＭＤ患者（ＳＶＡ挿入フクチン遺伝子のホモ接合体）およびＦＣＭＤを発症してない個体から得た。ヒト初代筋芽細胞は、ＦＣＭＤ患者およびＦＣＭＤを発症してない個体からの筋生検により得た。ヒト剖検脳試料は、ＦＣＭＤ患者（胎児および３４歳）およびデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者（３４歳）から得た。すべての臨床試料は、大阪大学大学院医学系研究科および神戸大学大学院医学研究科の医学倫理審査委員会の承認を受けて用いた。
【００４２】
（３）筋芽細胞の分化
筋芽細胞は３７℃、５％ＣＯ２条件で維持した。培地には２０％ウシ胎児血清、２．５ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（Sigma）、０．５％ペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシンＢ混合液（Wako）。２％ウシ胎児血清を含む培地に置き換え、血清を欠乏させて１０〜１４日培養した後のコンフルエント筋芽細胞から、筋管細胞を取得した。
【００４３】
（４）ＲＮＡ分離、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲおよびシークエンス
ナンセンス変異依存のｍＲＮＡ分解を抑制するために、ＲＮＡ分離の２４時間前にシクロヘキシミド（100μg/ml、Sigma）を培地に添加した。ＲＴ−ＰＣＲおよび定量ＲＴ−ＰＣに用いるトータルＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Qiagen）を用いて抽出し、ｃＤＮＡはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ-ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）およびランダムプライマーを用いて取得した。定量ＲＴ−ＰＣＲには、ＳＹＢＲ Ｐｒｅ−ｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Takara）を用い、発現量はｍＲＮＡ量の内部標準であるグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ｇａｐｄｈ）遺伝子に対して標準化した。トリプリケートの実験からデータを得た。
ＦＣＭＤ患者から異常スプライシングによるＲＴ−ＰＣＲ産物を検出するために長距離ＰＣＲを行った。長距離ＰＣＲには、ＬＡ−ＴａｑとＬＡ−Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Takara）を用い、ＤＭＳＯおよび７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ（Roche）を添加した。このＲＴ−ＰＣＲ産物を直接シークエンスに供した。
【００４４】
（５）ノーザンブロット分析
今回の実験では、ＲＮＡ試料から大量のリボゾーマルＲＮＡを除去し、フクチン転写産物のもつれを解くために強力変性を行った後にノーザンブロット分析を実施した。ＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen）を用いて、ヒトリンパ芽球、マウスＥＳ細胞、マウス脳およびマウス骨格筋からトータルＲＮＡ（1mg）をそれぞれ抽出した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（Takara）を用いて３μｇ以上のポリＡ−ＲＮＡを抽出した。Ｒｉｂｏ−Ｍｉｎｕｓ（Invitrogen）を用いてリボゾーマルＲＮＡを除去した。０．８Ｍグリオキサールと５０％ＤＭＳＯ（10mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0））を併用して、ポリＡ−ＲＮＡを５５℃で６０分間インキュベーションすることにより、ＲＮＡを強力に変性させた。３μｇのポリＡ−ＲＮＡをアガロースゲルにロードした。フクチンをコードする配列をカバーするフクチンｃＤＮＡクローンを３２Ｐでラベルし、プローブとして用いた。
【００４５】
（６）ｃＤＮＡ発現用コンストラクト
ノーマルフクチンコンストラクトは全長フクチンタンパク質をコードする。スプライスドフクチンコンストラクトは異常フクチンタンパク質をコードする。トランケーテッドフクチンコンストラクトは正常フクチンタンパク質のＣ末端の３８アミノ酸を欠失したタンパク質をコードする。すべてのコンストラクトは発現タンパク質のＣ末端にＦＬＡＧエピトープタグを融合した。
【００４６】
（７）細胞のトランスフェクション
ＨｅＬａＳ３細胞およびＣ２Ｃ１２細胞に、ノーマルフクチンコンストラクト、スプライスドフクチンコンストラクトおよびトランケーテッドフクチンコンストラクトを、ＦｕＧＥＮＥ６（Roche）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後に、フクチンの局在を免疫細胞化学的に検出した。アンチセンス核酸（２’ＯＭｅＰＳ ＲＮＡ）をマウスＥＳ細胞、ヒト筋芽細胞、ヒトリンパ芽球を含む種々の細胞株に導入する際には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Invitrogen）を用いた。
【００４７】
（８）内在性フクチンタンパク質の検出
抗フクチンウサギポリクローナル抗体ＲＹ２１３は、ペプチドＣＬＫＩＥＳＫＤＰＲＬＤＧＩＤＳ（配列番号３１）を認識し、抗フクチンヤギポリクローナル抗体１０６Ｇ２はＮ末端の疎水性ドメインを欠失している全長フクチンを認識する。内在性のフクチンは、細胞または組織溶解液（溶解バッファー（1% Nonidet P-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 20mM Tris-Cl, pH 7.5 および150mM NaCl）中に合計５〜１０ｍｇのタンパク質を含むように調製したもの）から１０６Ｇ２を用いた免疫沈降法により検出し、続いてアフィニティー精製したＲＹ２１３を用いるウエスタンブロット分析に供した。
【００４８】
（９）免疫蛍光およびウエスタンブロット分析
細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（in PBS）で固定した。一次抗体として、抗ＧＭ１３０（monoclonal, BD Bioscience）、抗ＫＤＥＬ（monoclonal, Stressgen）、抗ＦＬＡＧ（rabbit polyclonal, MBL）、抗α−ＤＧ（monoclonal, IIH6C4およびVIA4-1, Millipore) および抗ラミニン（rabbit polyclonal, Sigma）を使用した。核を染色するために、４’６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（DAPI, Sigma）を最終濃度１ｎｇ／ｍｌで二次抗体溶液に添加した。蛍光共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）を用いて細胞を観察した。ウエスタンブロット分析およびラミニンオーバーレイ分析は、文献（Kanagawa, M. et al. Residual laminin-binding activity and enhanced dystroglycan glycosylation by LARGE in novel model mice to dystroglycanopathy. Hum. Mol. Genet. 18, 621-631 (2009).）の記載に従って実施した。
【００４９】
（１０）変異分析
以下の４種類のフクチンコンストラクトを作製した。
ｐＨｎ：ヒト正常フクチンコンストラクト（ｃＤＮＡのエクソン２〜９およびゲノムの正常エクソン１０からなる）
ｐＨｐ：患者フクチンコンストラクト（ｃＤＮＡのエクソン２〜９およびＦＣＭＤ患者ゲノムのＳＶＡが挿入されたエクソン１０からなる）
ｐＳｐｌ：患者フクチンコンストラクトｐＨｐにおいて異常スプライシング領域（新たなイントロン１０）を欠失したコンストラクト
ｐＡｃｃ：患者フクチンコンストラクトｐＨｐにおいてＳＶＡ配列中のスプライシング受容部位直前のＡＧがＧＧに置換されたコンストラクト
これらのコンストラクトをＨｅＬａＳ３細胞にＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Qiagen）を用いてトランスフェクションした。Ｏｌｉｇｏｔｅｘを用いてポリＡ−ＲＮＡを抽出した後、上述の強力変性させた各試料の２μｇのポリＡ−ＲＮＡを用いてノーザンブロット分析を実施した。
【００５０】
（１１）ＦＣＭＤモデルマウスに対するアンチセンス核酸処理
筋肉内投与の場合、Ｈｐ／＋、Ｈｐ／−、Ｈｐ／ＨｐおよびＨｎ／Ｈｎの各マウスにカルジオトキシン（10 mM、Latoxan）を経皮的に前脛骨筋内（0.3nmol）および腓腹筋内（0.7nmol）に投与した。各遺伝子型毎に３匹のマウスを用い、カルジオトキシン投与日を０日目とした。１、４および７日目に、滅菌水に溶解したＶＭＯ（400mg/kg）を投与した。具体的にはＡＥＤ（Ａ３、Ｅ３およびＤ５の組み合わせ）およびＤｙｓ（陰性対照）をそれぞれ左足および右足に投与した。全身投与の場合、ｂｕｔｏｒｐｈａｎｏｌ ｔａｒｔｒａｔｅ（5mg/kg、Bristol-Myers Squibb）を０日目に腹腔内投与した。５％グルコース溶液に溶解したＶＭＯ（20mg/kg）を１および７日目に尾静脈から静脈内投与した（Hp/- (n=4), Hp/+ (n=2)）。
２１日目にマウスを安楽死させ、フクチンｍＲＮＡ発現、フクチンタンパク質翻訳、α−ＤＧグリコシル化のさらなる分析のために、各組織からトータルＲＮＡまたはタンパク質溶解液を分離した。
【００５１】
（１２）ヒトＦＣＭＤ患者由来細胞株に対するアンチセンス核酸処理
ＦＣＭＤ患者由来のリンパ芽球（n=2）または正常リンパ芽球（n=2）へのＶＭＯアンチセンス核酸（ＡＥＤまたはＤｙｓ）の導入は、培地にＶＭＯカクテルを最終濃度が２．５μＭとなるように添加し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩエレクトロポレーター（0.25-kV, 960-mF, 0.4-cm gene pulser cuvettes, time-constant 40ms、Bio-Rad）を用いることにより行い、タンパク質分析に供した。
ＦＣＭＤ患者由来の筋芽細胞（n=2）または正常筋芽細胞（n=2）へのＶＭＯアンチセンス核酸（ＡＥＤまたはＤｙｓ）の導入は、培地に直接ＶＭＯカクテルを最終濃度が４μＭとなるように添加することにより行い、グリコシル化分析に供した。
【００５２】
（１３）ラミニンクラスタリング分析
筋管細胞へのアンチセンス核酸の導入は、２日目の培地交換後、培地に直接ＶＭＯカクテル（ＡＥＤおよびＤｙｓ）を最終濃度が４μＭとなるように添加することにより行った。１０〜１４日目にマウスＥＨＳラミニン−１（Sigma）を新鮮な培地に１．０ｎＭとなるように添加し、３０分間インキュベートして免疫細胞化学に供した。
【００５３】
［ＩＩ］実験結果
（１）フクチンｍＲＮＡの定量ＲＴ−ＰＣＲ
フクチン遺伝子は１０個のエクソンと長い３’側非翻訳領域を持つ。過去のデータでは、ノーザンハイブリダイゼーション法ではＳＶＡ挿入を有するＦＣＭＤ患者からフクチン ｍＲＮＡは検出されなかった（非特許文献２）。そこで、ＦＣＭＤの病態を解析するため、フクチン遺伝子のそれぞれのエクソン、ＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入の周辺領域、および３’側非翻訳領域の全域にわたり患者のリンパ芽球におけるフクチン遺伝子の発現について定量ＲＴ−ＰＣＲ法による解析を行い健常人と比較した。
結果を図２（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）はフクチンｃＤＮＡの模式図であり、（Ｂ）は定量ＲＴ−ＰＣＲの結果である。（Ｂ）の縦軸は、健常人の発現量に対するＦＣＭＤ患者の発現量の比率であり、横軸の数字はフォワードプライマーおよびリバースプライマーの各５’末端の位置を表す。図２（Ａ）、（Ｂ）から明らかなように、フクチン遺伝子の５’側翻訳領域および３’側非翻訳領域のうちＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入より３’側領域の遺伝子発現は健常人とＦＣＭＤ患者との間でほとんど違いがなかった。一方、その配列に挟まれる領域における遺伝子発現がＦＣＭＤ患者において激減していた。よって、ＦＣＭＤ患者のｍＲＮＡでは翻訳領域およびＳＶＡ型レトロトランスポゾンの挿入の間のどこかで異常スプライシングが起こっている可能性が示唆された。
【００５４】
（２）長距離ＰＣＲ
次に、遺伝子発現の激減している配列を挟む領域にＰＣＲプライマーを設計し、健常人およびＦＣＭＤ患者のフクチン遺伝子ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを鋳型として長距離ＰＣＲを行った。結果を図３に示した。図３中ＦはＦＣＭＤ患者を、Ｎは健常人を表す。図３から明らかなように、ｃＤＮＡを鋳型とした場合、ＦＣＭＤ患者から約３ｋｂの単一ＰＣＲ産物（矢印参照）が検出され、これは健常人から検出された約５ｋｂのＰＣＲ産物より短いものであった。示していないが、ＦＣＭＤ患者の他の組織（筋芽細胞、脳、骨格筋等）からも同様のＰＣＲ産物が検出された。一方、ゲノムＤＮＡを鋳型とした場合、ＦＣＭＤ患者からは約８ｋｂのＰＣＲ産物（矢印参照）が検出され、これは健常人から検出された約５ｋｂのＰＣＲ産物より長いものであった。
【００５５】
（３）異常スプライシング
ＦＣＭＤ患者の転写産物の塩基配列を直接シークエンス法により確認したところ、ＦＣＭＤ患者において特異的にフクチンｍＲＮＡが異常なスプライシングを受けていることが明らかとなった。この異常スプライシングはＳＶＡ型レトロトランスポゾンの配列に存在する強力なスプライシング受容部位が翻訳領域の最終エクソン（エクソン１０）にある潜在的なスプライシング供与部位を新たに活性化すること（エクソントラッピング）が原因であると考えられた。
ＦＣＭＤ患者におけるフクチンゲノムおよびｃＤＮＡ、ならびに健常人におけるフクチンゲノムおよびｃＤＮＡを図４に示した。図４に示したように、ＦＣＭＤ患者において、新たなスプライシング供与部位はエクソン１０の真のストップコドンから１１６ｂｐ上流に位置する。スプライシング受容部位はＳＶＡ型レトロトランスポゾンの配列中（挿入配列の先頭から２７４ｂｐ下流）に存在し、このスプライシング受容部位がエクソン１０中の潜在的なスプライシング供与部位をトラップすることにより異常エクソン１１が付加されると考えられた。
【００５６】
（４）ＦＣＭＤ患者の異常フクチンｍＲＮＡ
健常人およびＦＣＭＤ患者由来のリンパ芽球からポリＡ−ＲＮＡを調製し、ノーザンブロット分析を行った。ＦＣＭＤ患者において異常スプライシングにより生成するフクチンｍＲＮＡは５．６ｋｂおよび４．６ｋｂと予想され、健常人における正常フクチンｍＲＮＡは７．４ｋｂおよび６．４ｋｂと予想される。
結果を図５に示した。図５中ＦはＦＣＭＤ患者を、Ｎは健常人を表す。図５から明らかなように、ＦＣＭＤ患者由来のリンパ芽球からは５．６ｋｂおよび４．６ｋｂのバンドが検出され、健常人由来のリンパ芽球からは７．４ｋｂおよび６．４ｋｂのバンドが検出された。
【００５７】
また、野生型マウス、Ｈｐ／Ｈｐマウス（ＦＣＭＤモデル、ＳＶＡ挿入ヒトエクソン１０を有する）およびＨｎ／Ｈｎマウス（正常ヒトエクソン１０を有する）の骨格筋および脳からポリＡ−ＲＮＡを調製し、ノーザンブロット分析を行った。結果を図６に示した。図６中、ＷＴは野生型マウスを、ＨｎはＨｎ／Ｈｎマウスを、ＨｐはＨｐ／Ｈｐマウスをそれぞれ表す。図６から明らかなように、骨格筋および脳のいずれからも、ＦＣＭＤモデルマウスからは、Ｈｎ／Ｈｎより短い異常フクチン ｍＲＮＡのバンドが検出された。
このようにヒトおよびＦＣＭＤモデルマウスにおいて同様の結果が得られたことから、ＦＣＭＤの発症機序はスプライシング異常に基づくものであると結論付けられた。
【００５８】
（５）ＦＣＭＤ患者の異常フクチンタンパク質
異常スプライシングは真のストップコドンを削除し、新たなエクソン１１の５’末端から３８８ｂｐの位置にもう１つのストップコドンを生じる（図４参照）。予想されるタンパク質は、フクチンタンパク質のＣ末端の３８アミノ酸を欠失し、その代わりにＳＶＡ配列由来の１２９アミノ酸を含む（配列番号３）。そこで、ヒトリンパ芽球、ヒト脳、マウス骨格筋およびマウス脳の各試料について、免疫沈降とウエスタンブロット分析を組み合わせてフクチンタンパク質の検出を試みた。
【００５９】
ヒトリンパ芽球の結果を図７に、ヒト脳の結果を図８にそれぞれ示した。図７および８中、ＦはＦＣＭＤ患者を、Ｎは健常人を、Ｄはデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者を表す。図７および８において、ＦＣＭＤ患者の異常フクチンタンパク質は予想した位置に検出された（矢印参照）。
マウスの結果を図９に示した。図９中ＨｎはＨｎ／Ｈｎマウスを、ＨｐはＨｐ／Ｈｐマウスを、ＰＩは免疫前の血清を、ＷＴは野生型マウスをそれぞれ表す。ＦＣＭＤモデルであるＨｐ／Ｈｐマウスの骨格筋および脳において異常フクチンタンパク質は予想した位置に検出された（矢印参照）。
【００６０】
（６）異常フクチンタンパク質の局在
ノーマルフクチンコンストラクト、スプライスドフクチンコンストラクトおよびトランケーテッドフクチンコンストラクトをトランスフェクションしたＨｅＬａＳ３細胞を用いて、免疫蛍光染色によりフクチンタンパク質の局在を調べた。結果を図１０に示した。図１０の上段は正常フクチンタンパク質発現細胞、中段は異常スプライシングによる異常フクチンタンパク質発現細胞、下段は正常フクチンタンパク質のＣ末端３８アミノ酸が欠失したタンパク質発現細胞の結果である。抗ＦＬＡＧ抗体（左側、緑色）はフクチンを染色し、抗ＧＭ１３０抗体（上段中央、赤色）はゴルジ体を染色し、抗ＫＤＥＬ抗体（中下段中央、赤色）は小胞体を染色する。右側は左側と中央の染色像を統合した上にＤＡＰＩ染色（核染色、青色）を施したものである。図１０から明らかなように、正常フクチンタンパク質はゴルジ体に局在するが、異常スプライシングによる異常フクチンタンパク質はゴルジ体から小胞体に移動していた。また、Ｃ末端３８アミノ酸が欠失したフクチンタンパク質も小胞体に局在していた。これらの結果から、フクチンタンパク質のＣ末端ドメインが、ゴルジ体への局在に重要であることが示唆された。それゆえ、このドメインの機能障害がＦＣＭＤにおけるフクチンタンパク質の機能不全を導いていると考えられた。
【００６１】
（７）変異導入による異常スプライシング消失の確認
４種類のフクチンコンストラクト（ｐＨｎ、ｐＨｐ、ｐＳｐｌおよびｐＡｃｃ）をトランスフェクションしたＨｅＬａＳ３細胞を用いて、ノーザンブロット分析を行った。結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、ｐＨｐ導入細胞およびｐＳｐｌ導入細胞で検出された異常フクチンｍＲＮＡのバンド（矢印）が、ｐＡｃｃ導入細胞では消失した。つまり、挿入されたＳＶＡ配列中のスプライシング受容部位直前のＡＧがＧＧに変異することにより異常スプライシングが生じなくなったことが示された。この結果は、挿入されたＳＶＡ配列中のスプライシング受容部位で生じる異常スプライシングにより異常フクチンｍＲＮＡが生成されることを確認すると共に、スプライシング受容部位におけるスプライシング調節を阻害することにより、異常スプライシングを止めることができることを示すものである。
【００６２】
（８）アンチセンス核酸による正常フクチンｍＲＮＡ回復試験
Ｈｐ／ＨｐマウスＥＳ細胞に１２種類のアンチセンス核酸（２’ＯＭｅＰＳ ＲＮＡ、図１および表１参照）をそれぞれ単独で、または組み合わせて導入し、異常スプライシングによるｍＲＮＡおよび正常ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより検出した。
図１２に各ｍＲＮＡを検出するためのプライマーの位置、およびＲＴ−ＰＣＲの結果を示した。図１２中Ｆはアンチセンス核酸を導入していないＨｐ／ＨｐマウスＥＳ細胞を、Ｎはアンチセンス核酸を導入していない正常コントロールを表す。図１２から明らかなように、いずれのアンチセンス核酸を導入した場合も正常ｍＲＮＡが検出され、アンチセンス核酸の導入により異常スプライシングが抑制され、正常スプライシングが回復していることを確認した。特にＡ３およびＥ３は、ＳＶＡ挿入による異常スプライシングを強力に抑制した。Ａ３、Ｅ３およびＤ５を組み合わせて導入した場合の回復レベルが最も高く、正常コントロール（図中Ｎ）の４０％を超えるレベルまで正常ｍＲＮＡが回復した。
【００６３】
（９）ＦＣＭＤモデルマウスに対するアンチセンス核酸の効果
この実験には、Ａ３、Ｅ３およびＤ５の３種類のＶＭＯ（octa-guanidine morpholino oligonucleotide）アンチセンス核酸を組み合わせたＡＥＤカクテルを使用した。陰性対照としてＶＭＯアンチセンス核酸Ｄｙｓを使用した。
【００６４】
（９−１）正常フクチンｍＲＮＡおよび正常フクチンタンパク質の回復
正常ｍＲＮＡの回復を確認した結果を図１３および１４に示した。図１３はＨｐ／Ｈｐマウスの結果、図１４はＨｐ／＋およびＨｐ／−マウスの結果である。図１３および１４から明らかなように、いずれのマウスもＤｙｓ（陰性対照）を投与した場合よりＡＥＤカクテルを投与した場合のほうが、正常フクチンｍＲＮＡ量が有意に増加した。
【００６５】
正常フクチンタンパク質の回復を確認した結果を図１５に示した。左の２レーンがＨｐ／Ｈｐマウス、右の２レーンがＨｎ／Ｈｎマウスの結果である。ＡＥＤカクテルを投与したＨｐ／Ｈｐマウスから正常フクチンタンパク質のバンド（矢印）が検出されたことから、正常フクチンｍＲＮＡの回復と共に正常フクチンタンパク質も回復していることが明らかとなった。
【００６６】
（９−２）α−ＤＧのグリコシル化およびα−ＤＧによるラミニン結合の回復
ＶＭＯアンチセンス核酸（ＡＥＤまたはＤｙｓ）を筋肉内投与したＨｐ／−およびＨｐ／＋マウスにおいてα−ＤＧのグリコシル化およびα−ＤＧによるラミニン結合の回復を確認した結果を図１６に示した。ＶＭＯアンチセンス核酸（ＡＥＤまたはＤｙｓ）を静脈内投与したＨｐ／−およびＨｐ／＋マウスにおいてα−ＤＧのグリコシル化およびα−ＤＧによるラミニン結合の回復を確認した結果を図１７に示した。図１６および１７中、１段目はα−ＤＧのコアタンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロットであり、２段目はグリコシル化α−ＤＧに対する抗体を用いたウエスタンブロットであり、３段目はラミニンオーバーレイアッセイの結果であり、下段は内部標準としてのβ−ＤＧのウエスタンブロットである。
図１６および１７から明らかなように、Ｄｙｓを投与したＨｐ／−マウスでは、グリコシル化が不十分であるため正常サイズより小さいα−ＤＧのバンドが検出されているが、ＡＥＤを投与したマウスでは、正常サイズのα−ＤＧの回復が検出された（１段目）。また、グリコシル化α−ＤＧの回復（２段目）およびラミニン結合能の回復（３段目）が検出された。これらの結果は、局所投与（筋肉内投与）および全身性投与（静脈内投与）のいずれの投与経路でも同じであった。
【００６７】
（１０）ＦＣＭＤ患者由来細胞に対するアンチセンス核酸の効果
この実験には、Ａ３、Ｅ３およびＤ５の３種類のＶＭＯ（octa-guanidine morpholino oligonucleotide）アンチセンス核酸を組み合わせたＡＥＤカクテルを使用した。陰性対照としてＶＭＯアンチセンス核酸Ｄｙｓを使用した。
（１０−１）正常フクチンｍＲＮＡおよび正常フクチンタンパク質の回復
正常ｍＲＮＡの回復を確認した結果を図１８および１９に示した。図１８はＦＣＭＤ患者由来リンパ芽球の結果、図１９はＦＣＭＤ患者由来初代筋管細胞の結果である。図１８および１９から明らかなように、いずれの細胞もＤｙｓ（陰性対照）を導入した場合よりＡＥＤカクテルを導入した場合のほうが、正常フクチンｍＲＮＡ量が有意に増加した。正常フクチンｍＲＮＡは、正常コントロール（図中Ｃｏｎｔｒｏｌ）の５０％を超えるレベルまで回復した。発病しないＦＣＭＤ保因者は、正常フクチンｍＲＮＡを５０％しか持っていないことから、この結果はＦＣＭＤの治療に十分な回復を示したものであると確信した。
【００６８】
ＦＣＭＤ患者由来リンパ芽球における正常フクチンタンパク質の回復を確認した結果を図２０に示した。図２０から明らかなように、ＦＣＭＤ患者由来リンパ芽球にＡＥＤカクテルを導入した場合、正常フクチンタンパク質のバンド（矢印）が検出され、正常フクチンタンパク質の発現が顕著に回復したことが示された。
【００６９】
（１０−２）α−ＤＧのグリコシル化およびα−ＤＧによるラミニン結合の回復
ＦＣＭＤ患者由来初代筋管細胞におけるα−ＤＧのグリコシル化およびα−ＤＧによるラミニン結合の回復を確認した結果を図２１に示した。図２１中、１段目はα−ＤＧのコアタンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロットであり、２段目はグリコシル化α−ＤＧに対する抗体を用いたウエスタンブロットであり、３段目はラミニンオーバーレイアッセイの結果であり、下段は内部標準としてのβ−ＤＧのウエスタンブロットである。図２１から明らかなように、ＦＣＭＤ患者由来初代筋管細胞にＡＥＤカクテルを導入した場合、α−ＤＧサイズの正常サイズへのシフト（１段目）、グリコシル化α−ＤＧの回復（２段目）およびラミニン結合能の回復（３段目）が検出された。
【００７０】
（１１）ラミニンクラスタリング分析
ラミニンクラスタリング分析の結果を図２２に示した。図２２の上段はＤｙｓを導入した健常人由来の初代筋管細胞、中段はＤｙｓを導入したＦＣＭＤ患者由来の初代筋管細胞、下段はＡＥＤカクテルを導入したＦＣＭＤ患者由来の初代筋管細胞の結果である。抗ラミニン抗体はラミニンを染色し（左側、緑色）、抗グリコシル化α−ＤＧ抗体（中央、赤色）はグリコシル化されたα−ＤＧを染色する。右側は左側と中央の染色像を統合した画像である。図２２から明らかなように、ＦＣＭＤ患者由来初代筋管細胞にＡＥＤカクテルを導入することにより、健常人由来初代筋管細胞と同程度のα−ＤＧの糖鎖が検出され、健常人由来初代筋管細胞と同程度に回復した典型的なラミニンクラスタリングが観察された。この結果から、アンチセンス核酸投与によるα−ＤＧの糖鎖の回復およびラミニン結合能の回復が確認された。
【００７１】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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