(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体高分子バイオ凝集剤の製造方法であって、以下の工程：
炭素源、窒素源、および複数の無機質源を含む培養液を用意する工程；
該培養液に、真菌を、０．２〜１０体積％の範囲の接種量で接種する工程；
該培養液を、震盪速度０〜２５０ｒｐｍ、培養時間１２〜９６時間、温度１５〜４５℃で、インキュベートする工程；
該培養液を濾過することで、該真菌と該生体高分子を分離する工程；
該生体高分子を精製する工程；
を含み、以下の特徴：
該真菌は、アスペルギルス・フラーブスであり；
該炭素源は、スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトース、デンプン、およびグリセロールからなる群より選択され；
該窒素源は、ペプトン、酵母エキス、グルタミン酸、尿素、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、および硝酸ナトリウムからなる群より選択され；
該複数の無機質源は、マグネシウム、カリウム、鉄、塩化物、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され；
該炭素源対窒素源はモル比で５：１であり、該培養液のｐＨは５〜９であり、該温度は２５〜４０℃であり、接種量は０．２〜２体積％であり、震盪速度は５０〜２００ｒｐｍであり、かつ培養時間は１２〜６０時間である、
を有する、生体高分子バイオ凝集剤の製造方法であって、
前記バイオ凝集剤の分子量が２．４６６×１０４〜２．６８×１０４ダルトンの範囲である、生体高分子バイオ凝集剤の製造方法。
【請求項２】
前記培養液は、ロータリーシェーカーでインキュベートされる、請求項１に記載の生体高分子バイオ凝集剤の製造方法。
【請求項３】
前記炭素源は、スクロースである、請求項１に記載の生体高分子バイオ凝集剤の製造方法。
【請求項４】
前記窒素源は、ペプトンである、請求項１に記載の生体高分子バイオ凝集剤の製造方法。
【請求項５】
前記培養液は、ｐＨ７になっている、請求項１に記載の生体高分子バイオ凝集剤の製造方法。
【請求項６】
前記培養液は、４０℃になっている、請求項１に記載の生体高分子バイオ凝集剤の製造方法。
【請求項７】
前記接種量は、２体積％である、請求項１に記載の生体高分子バイオ凝集剤の製造方法。
【請求項８】
前記震盪速度は、２００ｒｐｍである、請求項１に記載の生体高分子バイオ凝集剤の製造方法。
【請求項９】
前記培養時間は６０時間である、請求項１に記載の生体高分子バイオ凝集剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体高分子の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、アスペルギルス・フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）を培養して生体高分子（バイオ凝集剤、バイオ凝固剤など）を産生させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水の汚染は、大量の有害物質（微生物、コロイド、および有毒物質など）が水に添加されたことが原因で水に大規模な悪影響が及んだ場合に生じる。有害な化学物質が下水に不適切に排出されると、有毒物質が生態系にもたらされることになり、巡り巡って、水性生物にとって有害な形で上水が汚染されることになる。凝固工程および凝集工程は、水および排水に見られるコロイドまたは懸濁物質を除去する最も一般的な方法である。周知のとおり、コロイドは負電荷（約−３０ｍＶ）を帯びていることがわかっており、したがって、一般に合成カチオン重合体を用いてコロイドを中和し、そうすることにより綿状塊の沈降を促進する。こうした重合体は高価なうえに環境を汚染するので、その取扱いにおいては安全注意事項に従わなくてはならない。これらの既存の問題を解決するための適切な代替手段としては、活性汚泥由来の細菌株が産生するバイオ凝固剤またはバイオ凝集剤の利用がある。
【０００３】
米国特許出願公開番号第２００２／００７４２９５号（特許文献１）は、汚染された液体を処理するプロセスを開示しており、このプロセスでは、処理しようとする液体を、互いに反対の電荷を帯びた２種の重合体材料の組み合わせと接触させる。このプロセスにおいて、重合体材料のうち少なくとも１種は分岐状であり、かつこれらの重合体材料は、好ましくは、多様な天然の供給源に由来するものである（例えば、２〜３例をあげると、藻類、細菌など）。綿状塊を形成させて、その綿状塊を液体から分離する。第一の重合体材料および第二の重合体材料は、多糖類、タンパク質、脂質、およびポリヒドロキシアルコールからなる群より選択することができる。しかしながら、この引用特許文献の欠点として、汚染された液体を第一の重合体材料（藍藻類由来の分岐したアニオン重合体材料）でまず処理し、一定期間を置いた後、第二の重合体材料（キトサン由来の分岐していないカチオン重合体）と接触させて水から汚染物質を除去するという２工程の水処理が挙げられる。このような２工程により、このプロセスは煩雑さが増し、時間がかかるとともに、水中の汚染物質濃度を下げるために大量の重合体材料を使用しなければならない。
【０００４】
微生物により産生されたバイオ凝集剤は、生分解性かつ無毒であり、しかもそれらの分解中間体は二次汚染と無関係であることから、そのようなバイオ凝集剤に対して科学的にも工業的にも関心が高まっている。バイオ凝集剤を産生する微生物は複数知られており、そのような微生物として、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）菌種、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ）、およびバチルス・ムシラギノサス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓ）が挙げられる。例えば、米国特許第５，２５０，２０１号（特許文献２）は、シアノ細菌、特にＪ−１株を液体から分離する方法、およびシアノ細菌を培養して、炭化水素および油を含む水性乳濁液を形成させる乳化剤として有用な重合体を産生させる方法を開示している。この引用特許文献は、さらに、精製単離技術を用いて製造される重合体物質、ならびにシアノ細菌が排せつする物質の使用を通じた石油の二次回収に影響を及ぼす方法に関する。シアノ細菌由来乳化作用物質（ｅｍｕｌｃｙａｎ）の乳化活性は、温度依存性かつｐＨ依存性であり、温度が約２６℃かつｐＨが５〜９の範囲にあるときに、最大値の１００％を示す。しかしながら、この引用特許文献の欠点は、シアノ細菌産生乳化作用物質の乳化活性が、限られた温度範囲ならびに限られたｐＨ範囲でしか最適活性に維持されなかったことである。
【０００５】
他の例として、米国特許第４，９４８，７３３号（特許文献３）は、野生型ズーグレア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ）１１５に由来する、ズーグレア・ラミゲラ１１５ＳＬおよびズーグレア・ラミゲラ１１５ＳＬＲと命名された２種の新種細菌株を開示している。ズーグレア・ラミゲラの培養物は、トリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）培地（７％ＤＭＳＯおよび１５％グリセロール含有）中で−７０℃で貯蔵される。ズーグレア・ラミゲラ株は、ＴＳＢ培地、または蒸留水１リットル中にグルコースを２５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４を２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇ、ＮＨ４ＣＩを１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．２ｇ、酵母エキスを０．０１ｇ含有する限定培地（グルコース、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、酵母エキス、および塩類は個別にオートクレーブ処理される）のいずれかでルーチン的に培養される。ズーグレア・ラミゲラの培養物１００ｍｌを、ロータリーシェーカーまたは撹拌バイオリアクター（２００ｒｐｍ）にて３０℃で、長くても２週間までの期間、増殖させる。この２種の新種株は、新規菌体外多糖（ＥＰＳ）を産生し、しかも培養性の改善をはじめとして親株にはない望ましい特性を複数有している。望ましい理由は、この２種は、親である１１５株が産生するようなＥＰＳ莢膜層を産生しないからである。その代わりに、１１５ＳＬのＥＰＳは、細胞を取り囲む隣接区域内に限定されずに粘液層として排せつされる。細胞が綿状塊内に捕獲されると、栄養の欠乏により増殖速度が遅くなるか死に至るが、そうならないことから、これらの新種株は、より着実で再現性のある増殖サイクルおよび向上した増殖速度を有する。結果として、菌体外多糖産生がより着実になり、力価が向上する。細胞からＥＰＳを分離するのもより簡単になり経済性も良くなる。しかしながら、ズーグレア・ラミゲラ株は、高塩分培地で繁殖させなければならず、このためコストがかかる。また、莢膜層のないズーグレア・ラミゲラ株は、水処理中の金属結合能が低下する可能性がある。というのも、莢膜のない細胞の周囲では存在する電荷が小さくなるからである。
【０００６】
したがって、適切な培地および環境条件で微生物株を培養して最適な量の生体高分子物質を産生させる、簡潔で、便利で、費用効率の良い方法として、本発明が必要とされている。また、本生体高分子物質は、水の汚染を減少させ、ひいては水産養殖において有益な生物多様性を保存する助けとなり得るものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開番号第２００２／００７４２９５号
【特許文献２】米国特許第５，２５０，２０１号
【特許文献３】米国特許第４，９４８，７３３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
製造コストを大幅に削減するために、合成高分子を使用せずに生体高分子を産生させる方法を提供することが、本発明の目的である。
【０００９】
真菌を培養して液体浄化および水処理用の生体高分子を産生させる方法を提供することも、本発明の目的である。
【００１０】
真菌を培養して最適な量の生体高分子を産生させる方法を提供することも、本発明のさらに別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
つまり、これらの目的は、本発明の教示に従うことにより達成することができる。本発明は、生体高分子の製造方法に関するものであって、本方法は、以下の工程：炭素源、窒素源、および複数の無機質源を含む培養液を用意する工程；培養液に、アスペルギルス・フラーブスを、０．２〜１０体積％の範囲の接種量で接種する工程；培養液をインキュベートする工程；培養液を濾過することで、アスペルギルス・フラーブスと生体高分子を分離する工程；生体高分子を精製する工程；を含み、本方法において、炭素源対窒素源はモル比で５：１であり、培養液のｐＨは５〜９であり、温度は２５〜４０℃であり、接種量は０．２〜２体積％であり、震盪速度は５０〜２００ｒｐｍであり、培養時間は１２〜６０時間である。産生された生体高分子は、分子量が２．４６６×１０４〜２．６８×１０４ダルトンの範囲であり、複数の官能基、複数の化学元素、糖、タンパク質を有し、ｐＨ範囲３〜７かつ温度範囲１０〜１００℃において９０％の最小凝集効率を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明の特徴は、本発明の好適な実施形態についての添付の図面と合わせて以下の詳細な説明を読むことにより、容易に理解され受け入れられるだろう。以下の図において：
【図１ａ】図１ａは、複数の炭素源（スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトース、デンプン、およびグリセロール）を用いて７２時間培養した後の、カオリン懸濁液でのバイオ凝集剤の凝集効率を示す；
【図１ｂ】図１ｂは、複数の窒素源（ペプトン、酵母エキス、グルタミン酸、尿素、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、および硝酸ナトリウム）を用いて７２時間培養した後の、カオリン懸濁液でのバイオ凝集剤の凝集効率を示す；
【図１ｃ】図１ｃは、バイオ凝集剤の産生における、炭素源対窒素源のモル比の影響を示す；
【図２】図２は、バイオ凝集剤の産生における、培養液のｐＨの影響を示す；
【図３】図３は、バイオ凝集剤の産生における、培養液の温度の影響を示す；
【図４】図４は、バイオ凝集剤の産生における、培養液へのアスペルギルス・フラーブス接種量の影響を示す；
【図５】図５は、バイオ凝集剤の産生における、培養液の震盪速度の影響を示す；
【図６】図６は、バイオ凝集剤の産生における培養液に含まれる無機質源の影響を示す；
【図７】図７は、アスペルギルス・フラーブスの増殖曲線に対するバイオ凝集剤産生の変化を示す；
【図８】図８は、バイオ凝集剤のｐＨ安定性および温度安定性を示す；
【図９ａ】図９ａは、バイオ凝集剤の表面を示す；
【図９ｂ】図９ｂは、カオリン懸濁液の表面を示す；および
【図９ｃ】図９ｃは、バイオ凝集剤による綿状塊形成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
法が定めるとおり、本発明の詳細な実施形態を本明細書中に開示する。しかしながら、当然のことながら、開示される実施形態は本発明の例示に過ぎず、様々な形で具体化可能である。したがって、本明細書中に開示される具体的な構造および機能の詳細は、制限するものとしては見なされず、特許請求の範囲の根拠にすぎないと見なされるものとする。当然のことながら、図面およびそれらに対する詳細な説明は、開示される特定の形態に本発明を制限することを意図せず、それとは逆に、本発明は、付随する特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の範囲内に含まれる全ての修飾物、等価物、および代替物を包含するものとする。本出願全体を通じて使用されるとおり、「可能である（ｍａｙ）」という用語は、必須の意味（すなわち、「ねばならぬ（ｍｕｓｔ）」の意味）ではなく、許容の意味（すなわち、「する可能性を有する（ｈａｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ）」を意味する）で用いられる。同様に、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、およびｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は、主語が目的語を含むことを意味するが、主語に含まれるものが目的語に限定されないことを意味する。さらに、特に記載がないかぎり、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味し、「複数の（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」という用語は、１つ以上を意味する。専門用語の略語が用いられる場合、そうした略語は、当該技術分野で既知のとおりの一般的に理解される意味を示す。参照しやすくするため、図面間で共通する同一または類似の特徴を指し示す場合に、全図面にわたり共通参照番号を用いるものとする。ここで、本発明を図１ａ〜図９ｃを参照して説明する。
【００１４】
本発明は、生体高分子の製造方法に関するものであり、本方法は、以下の工程：
炭素源、窒素源、および複数の無機質源を含む培養液を用意する工程；
培養液に、真菌を０．２〜１０体積％の範囲の接種量で接種する工程、この真菌は、傾斜培地で培養される；
培養液を、震盪速度０〜２５０ｒｐｍ、培養時間１２〜９６時間、温度１５〜４５℃で、インキュベートする工程；
培養液を濾過することで、真菌と生体高分子を分離する工程；
生体高分子を精製する工程；
を含み、以下の特徴：
上記真菌は、アスペルギルス・フラーブスであり；
炭素源は、スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトース、デンプン、およびグリセロールからなる群より選択され；
窒素源は、ペプトン、酵母エキス、グルタミン酸、尿素、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、および硝酸ナトリウムからなる群より選択され；
複数の無機質源は、マグネシウム、カリウム、鉄、塩化物、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され；
炭素源対窒素源はモル比で５：１であり、培養液のｐＨは５〜９であり、温度は２５〜４０℃であり、接種量は０．２〜２体積％であり、震盪速度は５０〜２００ｒｐｍであり、かつ培養時間は１２〜６０時間である
を有する。
【００１５】
生体高分子の製造方法の好適な実施形態において、培養液は、ロータリーシェーカーまたは撹拌式バイオリアクターでインキュベートされる。
【００１６】
生体高分子の製造方法の好適な実施形態において、炭素源はスクロースである。
【００１７】
生体高分子の製造方法の好適な実施形態において、窒素源はペプトンである。
【００１８】
生体高分子の製造方法の好適な実施形態において、無機質源はカリウムである。
【００１９】
生体高分子の製造方法の好適な実施形態において、培養液はｐＨ７になっている。
【００２０】
生体高分子の製造方法の好適な実施形態において、培養液は４０℃になっている。
【００２１】
生体高分子の製造方法の好適な実施形態において、接種量は２体積％である。
【００２２】
生体高分子の製造方法の好適な実施形態において、震盪速度は２００ｒｐｍである。
【００２３】
生体高分子の製造方法の好適な実施形態において、培養時間は６０時間である。
【００２４】
本発明はさらに、本方法により産生された生体高分子に関するものであり、本生体高分子は、分子量が２．４６６×１０４〜２．６８×１０４ダルトンの範囲であり、複数の官能基、複数の化学元素、糖、タンパク質を有し、ｐＨ範囲３〜７かつ温度範囲１０〜１００℃において９０％の最小凝集効率を有する。
【００２５】
産生された生体高分子の好適な実施形態において、複数の官能基は、ヒドロキシル基、炭化水素、アミド基、カルボキシル基、アミン、メトキシル基、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００２６】
産生された生体高分子の好適な実施形態において、複数の化学元素は、炭素、水素、酸素、窒素、および硫黄を含む。
【００２７】
以下は、生体高分子を産生する方法の例であり、これにより本発明の利点がより容易に理解できるだろう。当然のことながら、以下の実施例は例示のみを目的とし、いかなる方法においても本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００２８】
真菌の１種、アスペルギルス・フラーブス株４４−１は、（マレーシア・プトラ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｕｔｒａ  Ｍａｌａｙｓｉａ（ＫｕａｌａＬｕｍｐｕｒ、Ｍａｌａｙｓｉａ））のバイオテクノロジー学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により単離され、同大学生命工学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）工業バイオテクノロジー研究室（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））微生物資源保存部署（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ（ＵＮｉＣＣ））において保存されていたものである。アスペルギルス・フラーブス保存培養物は、寒天傾斜培地で４℃にて維持し、３０日〜４０日ごとに継代培養した。使用した寒天傾斜培地は、ジャガイモエキス４ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌを含有し、初期ｐＨが５．６±０．２であった。
【００２９】
炭素源、窒素源、および複数の無機質源を含む培養液を用意した。このとき、炭素源は、スクロース、グルコース、フルクトース、ラクトース、デンプン、およびグリセロールからなる群より選択され；窒素源は、ペプトン、酵母エキス、グルタミン酸、尿素、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、および硝酸ナトリウムからなる群より選択され；複数の無機質源は、マグネシウム、カリウム、鉄、塩化物、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。好適な実施形態において、培養液は、炭素源としてのスクロース３０ｇ／Ｌ、窒素源としてのペプトン３．０ｇ／Ｌ、水和した硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．５ｇ／Ｌ、塩化カリウム（ＫＣＩ）０．５ｇ／Ｌ、硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ４）０．０１ｇ／Ｌ、硫酸二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）１．０ｇ／Ｌを含有し、初期ｐＨは６．０に調整されていた。他の好適な実施形態において、上記の塩化カリウムの代わりに、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン（ＩＩ）および塩化鉄（ＩＩＩ）を供給することが可能である。好適な実施形態において、炭素源対窒素源のモル比を、０：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、および５０：１にして試験する。
【００３０】
次いで、培養液にアスペルギルス・フラーブスを接種して、接種量が０．２〜１０体積％の範囲のアスペルギルス・フラーブス接種菌液を製造した。好適な実施形態において、アスペルギルス・フラーブスは寒天傾斜培地で培養した。アスペルギルス・フラーブスを保有する寒天傾斜培地を複数個に切り分け、蒸留水１００ｍＬに浸漬した。アスペルギルス・フラーブスを蒸留水に懸濁させ、ついでロータリーシェーカーまたは撹拌式バイオリアクターを用いて３０℃で２４時間インキュベートした。ついで、懸濁したアスペルギルス・フラーブスを濾過して、アスペルギルス・フラーブス接種菌液を得た。
【００３１】
複数の培養パラメーター（炭素源、窒素源、炭素源対窒素源のモル比、ｐＨ、温度、震盪速度、および生体高分子（バイオ凝集剤、バイオ凝固剤など）を得るための培養時間など）を変更することで、培養プロセスを最適化した。好適な実施形態において、バイオ凝集剤は、細菌、真菌、藻類、および酵母菌により分泌される細胞外または細胞内の生体高分子物質である。バイオ凝集剤の組成および性質は、バイオ凝集剤産生微生物（ＢＰＭ）、培養液組成、および環境条件に依存する。
【００３２】
他の好適な実施形態では、ロータリーシェーカーまたは撹拌式バイオリアクターにおいて、震盪速度を０〜２５０ｒｐｍの範囲、培養時間を１２〜９６時間、温度を１５〜４５℃として、培養液をインキュベートした。ついで、培養液を濾過することにより、アスペルギルス・フラーブスを残渣として得るとともに、バイオ凝集剤はろ液として分離した。アスペルギルス・フラーブスバイオマスをオーブンにて８０℃で時間乾燥させた。
【００３３】
バイオ凝集剤の精製
沈殿物を得る目的で、バイオ凝集剤含有ろ液１リットルに９５％冷エタノール（４℃にしたもの）２リットルを加えた。得られた沈殿物を脱イオン水１００ｍＬに再溶解させ、溶液を撹拌しながら、そこに２％塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）溶液５０ｍＬを加えた。３時間後、沈殿物を回収し、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液１００ｍＬに溶解させた。ついで、９５％冷エタノール２リットルを加えて、沈殿物を得た。沈殿物をエタノールで洗い、脱イオン水５ｍＬに溶解させ、真空乾燥させた。バイオ凝集剤含有ろ液１リットルから、純粋なバイオ凝集剤が約０．４０２ｇ得られた。
【００３４】
凝集効率の決定
カオリン懸濁液を用いて、バイオ凝集剤含有ろ液の凝集効率を測定した。２グラム量のカオリン粘土（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を脱イオン水１リットルに懸濁させた。４００ｍｌビーカー中、カオリン懸濁液９９ｍｌにバイオ凝集剤含有ろ液１ｍＬを加え、１Ｍ水酸化ナトリウムまたは塩酸を用いてｐＨ値を７．０に調整した。６列撹拌試験機（６−ｂｒｅａｋｅｒ  ｊａｒ  ｔｅｓｔｅｒ  ＪＬＴ６、ＶＥＬＰ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣＡ、Ｉｔａｌｙ）を用いて、混合液を２００ｒｐｍで１分間激しく撹拌してから８０ｒｐｍで５分間ゆっくりと撹拌し、ついで５分間放置した。清澄化溶液（得られた上清）の吸光度（ＯＤ）を、分光光度計（ＧＥＮＥＳＹＳ  １０ＵＶ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いて５５０ｎｍで測定した。対照実験は、同様の手順においてバイオ凝集剤含有ろ液を新鮮な培養液（ブランクとして）に置き換えることで実施した。凝集活性を、以下の式に従って計算した：
凝集効率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００％
式中、ＡおよびＢは、それぞれ、対照および試料の上清のＯＤ５５０（５５０ｎｍでの吸光度）である。
【００３５】
図１は、同一濃度にて、スクロースに代えて様々な炭素源（グルコース、フルクトース、ラクトース、デンプン、およびグリセロール）を用いて７２時間培養した後のカオリン懸濁液での凝集効率を示す。スクロース、デンプン、およびグルコースは、バイオ凝集剤産生に好適な炭素源であったが、一方、フルクトースおよびグリセロールを炭素源として培養液に加えた場合、バイオ凝集剤の産生は相対的に少なかった。しかしながら、図１ａに示すバイオ凝集剤産生が最も高かったことからスクロースを単独炭素源として選択した。
【００３６】
同一の培養液でアスペルギルス・フラーブスを培養するが、ただし窒素源は図１ｂに示すとおりに変更することで、窒素源の影響を調べた。全体的に、有機窒素源（ペプトン、酵母エキス、および尿素）を用いると効果的にアスペルギルス・フラーブスによりバイオ凝集剤が産生されたが、一方、無機窒素源である硫酸アンモニウムおよび硝酸ナトリウムでは、バイオ凝集剤産生は少なかった。例外的に、硝酸アンモニウムはデンプン培地でのバイオ凝集剤産生に影響を受けた。図１ｂに示すとおり、ペプトンが、バイオ凝集剤産生に最も好適な窒素源であった。
【００３７】
図１ｃに示すとおり、炭素源対窒素源（Ｃ：Ｎ）のモル比を５：１まで上昇させると、バイオ凝集剤産生の劇的な増加が観測された。Ｃ：Ｎモル比をさらに上昇させてもバイオ凝集剤産生に寄与せず、むしろその低下を招いた。このことは、Ｃ：Ｎがモル比で５：１であることがバイオ凝集剤産生に好適であることを示す。
【００３８】
培養液のｐＨは、バイオ凝集剤産生微生物の栄養吸収および酵素反応に影響する可能性がある。ｐＨ２〜９の範囲にわたって、凝集効率が最低であったのは、２〜４の酸性ｐＨ範囲においてであり、一方、５〜９の範囲のｐＨはバイオ凝集剤産生に好適であった。とはいえ、図２に示すとおり、ｐＨ７がバイオ凝集剤産生に最適であった。
【００３９】
図３は、バイオ凝集剤の産生における培養液温度の影響を示す。培養温度が２５℃を超えると凝集効率は劇的に上昇し、４０℃で８６．２％にまで達した。最大酵素活性は、最適温度においてのみ達成可能である。それより低い培養温度では、アスペルギルス・フラーブスを一部冬眠させる可能性があり、アスペルギルス・フラーブスのバイオ凝集剤産生用の酵素系が完全には活性化されない可能性もあり得る。したがって、図３に示すとおり、バイオ凝集剤産生の最適温度は、４０℃であった。
【００４０】
図４は、バイオ凝集剤産生におけるアスペルギルス・フラーブス接種量の影響を示す。アスペルギルス・フラーブスの接種量は、０．２体積％から２体積％に向かって徐々に増加する。この菌株の接種量が２体積％になると、バイオ凝集剤の凝集効率は８６．６％に達した。しかしながら、そこからいくら接種量を増やしても凝集効率はまったく上がらなかった。接種量２体積％は、アスペルギルス・フラーブスを培養液に対して気候馴化させてバイオ凝集剤の産生を促進させることが可能な、アスペルギルス・フラーブスの最適接種量であることが判明した。
【００４１】
図５は、震盪速度が５０〜２００ｒｐｍであるときにバイオ凝集剤の産生が多かったことを示す。混合速度を２５０ｒｐｍに上げるとバイオ凝集剤の産生が減少した。震盪速度は、培養液に溶解している酸素のレベルを左右するとともに、アスペルギルス・フラーブスの栄養吸収および酵素反応にも影響を及ぼす可能性がある。２００ｒｐｍの震盪速度が、バイオ凝集剤の産生に最適な速度であった。
【００４２】
図６は、バイオ凝集剤の産生における培養液に含まれる無機質源の影響を示す。図６に示すとおり、アスペルギルス・フラーブスのバイオ凝集剤産生は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびマンガン、またはそれらの任意の組み合わせの存在下では刺激されたが、鉄により阻害された。図６を参照すると、カリウムが最適な無機質源であったので、バイオ凝集剤の産生に用いることにした。
【００４３】
図７は、アスペルギルス・フラーブスの増殖曲線にわたるバイオ凝集剤産生の変化を示す。全体的に、バイオ凝集剤の産生は、バイオマスの成長と並行しており、時間とともに増加した。バイオ凝集剤の凝集効率は、６０時間後の定常期初期においてその最大（８７．２％）に到達した。このことは、アスペルギルス・フラーブスの増殖中の生合成によりバイオ凝集剤が産生されていたことを示す。凝集効率は、解膠酵素の活動のため、定常期後期中に低下し始めた。７２時間後、アスペルギルス・フラーブスの死亡率が出生率を上回り始めたことで、この菌株は死滅期に入り、バイオ凝集剤の凝集効率も徐々に低下した。凝集効率曲線に対応して、ｐＨ曲線も、始めから４８時間までに７．０から５．３まで低下、続いてわずかな落ち込みおよび９６時間後の時点で５．６まで上昇という変化を示した。したがって、６０時間が、バイオ凝集剤の産生にとって最適な培養時間であった。
【００４４】
バイオ凝集剤の特性決定
バイオ凝集剤の組成分析
精製したバイオ凝集剤の化学分析から、全糖および全タンパク質の割合はそれぞれ、２８．３％および５．７％であることがわかった。この結果は、バイオ凝集剤が主に多糖類バイオ凝集剤であったことを示していたので、精製したバイオ凝集剤をトリフルオロ酢酸で加水分解して、他の糖類（中性糖、ウロン酸、およびアミノ糖など）について調べた。精製したバイオ凝集剤の元素分析から、炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、および硫黄（Ｓ）の質量割合が、それぞれ、２９．９重量％、４．８重量％、３４．７重量％、３．３重量％、および２．０重量％であることが明らかになった。ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）システムにより、バイオ凝集剤の分子量は２．４６６×１０４〜２．６８×１０４ダルトンであると求められた。
【００４５】
バイオ凝集剤の官能基分析
精製したバイオ凝集剤の赤外スペクトルは、ヒドロキシル基の特徴である約３２８５ｃｍ−１の広い伸縮ピーク、および２９２７ｃｍ−１の弱いＣ−Ｈ伸縮バンドを示した。１３３３ｃｍ−１および１６３３ｃｍ−１のピークは両方ともＣＯＯ−結合非対称振動の結果である。１５３８ｃｍ−１のピークは、ＮＨ変角振動に帰属され、１００７ｃｍ−１に現れた強い吸収のピークは、Ｃ−Ｏ伸縮振動およびメトキシル基の存在を示し、これらは一般に全ての糖誘導体の典型的な特性として既知であるものだった。
【００４６】
バイオ凝集剤のｐＨ安定性
図８は、バイオ凝集剤のｐＨ安定性および熱安定性を示し、ｐＨ３．０〜７．０の範囲で凝集効率の９０％超が達成された。ｐＨが７．０より高くなると、凝集効率は劇的に低下した。
【００４７】
バイオ凝集剤の熱安定性
バイオ凝集剤の熱安定性の調査から、バイオ凝集剤は非常に安定であることがわかった（図８）。このバイオ凝集剤の主成分は多糖であったため、バイオ凝集剤のｐＨが３．０〜７．０の範囲にあれば、幅広い温度（１０〜１００℃）で凝集効率の９０％超が維持された。
【００４８】
液体を清澄させるバイオ凝集剤の機構
水中のコロイドまたは粒子のいずれかの不純物は、負電荷を帯びており、したがってカチオン性バイオ凝集剤を用いると最も効果的に凝集できるだろう。バイオ凝集剤の表面（図９ａ）とコロイドとの間の静電相互作用は、誘引力およびコロイド表面の電荷の中和をもたらし、綿状塊を形成させ（図９ｃ）および表面間の電気的反発力の減少を導くだろう。表１は、バイオ凝集剤およびカオリン懸濁液（合成した濁り水）のゼータ電位を示す。表中、ゼータ電位が−９．３ｍＶの処理されたカオリン懸濁液は、凝集してより清澄な液体を与える傾向にある。カオリン懸濁液の表面は、図９ｂに見ることができる。好適な実施形態において、形成された綿状塊は、液体の上に向かって浮かんでいくことも、液体の底に沈んでいくことも可能である、すなわち液体からすぐに濾別または除去することが可能である。他の好適な実施形態において、ゼータ電位は、分散液中の隣接した、同様な電荷を帯びた粒子（ビタミン類）間の反発力の度合いを示す。ゼータ電位が０ｍＶであることは、液体浄化のプロセスにおいて凝集性能が最適であることを示す。
【００４９】
表１：バイオ凝集剤、カオリン懸濁液、および処理したカオリン懸濁液のゼータ電位
【００５０】
【表１】
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【００５１】
具体的な実施形態を参照し、添付の図面にも示して、本発明を説明してきたものの、明細書中記載されるとおりの、および以下の特許請求の範囲に定義されるとおりの本発明の範囲内において、多くの改変および修飾をなし得ることが、当業者には明らかであるだろう。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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