(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料デンプンを含む培地に、リゾープス属菌とアスペルギルス・オリーゼを加えて混合培養し、α−アミラーゼとグルコアミラーゼを生成するアミラーゼの生産方法であって、
前記リゾープス属菌と前記アスペルギルス・オリーゼとの割合を１対４４〜１対９４の範囲に制御して接種し、その培養時間を４８〜７２時間の範囲に制御して混合培養することで、前記α−アミラーゼの活性を前記培地に前記アスペルギルス・オリーゼを加えた純粋培養に比較して抑えて、前記グルコアミラーゼの活性を前記培地に前記リゾープス属菌を加えた純粋培養に比較して高めたアミラーゼを生産することを特徴とするアスペルギルス属菌及びリゾープス属菌の混合培養系を用いたアミラーゼの生産方法。
【請求項２】
請求項１記載のアスペルギルス属菌及びリゾープス属菌の混合培養系を用いたアミラーゼの生産方法において、前記リゾープス属菌としてリゾープス・コーニイを用いることを特徴とするアスペルギルス属菌及びリゾープス属菌の混合培養系を用いたアミラーゼの生産方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載のアスペルギルス属菌及びリゾープス属菌の混合培養系を用いたアミラーゼの生産方法において、前記培地は生デンプンを使用した液体培地であることを特徴とするアスペルギルス属菌及びリゾープス属菌の混合培養系を用いたアミラーゼの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌と、リゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属菌とを混合培養系を用いて、グルコアミラーゼ、場合によってはグルコアミラーゼとα−アミラーゼを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブドウ糖の糖化酵素として工業的に広く用いられているグルコアミラーゼは、従来リゾープス属菌やアスペルギルス属菌等を用いて、純粋培養（いずれか一方の属菌を使用する単一培養）により、小麦ふすまや米糠等の固体培地を用いて生産している。また、近年は、培養コントロールが容易なことと、再現性の高さから、炭素源、窒素源及び塩類等の微生物の生育に必要な物質を含む水溶液（培養液）で培養する液体培養が注目され、液化デンプンやマルトース等の低分子糖等を培養基質として、リゾープス属菌又はアスペルギルス属菌などによる純粋培養の研究が進んでいる。
【０００３】
具体的には、図９に示すように、原料デンプン１０を破砕処理１１した後、煮沸処理１２を行ってデンプンを変性し、耐熱性α−アミラーゼ酵素剤を添加してデンプンを低分子糖に分解する液化工程１３を経て、液化デンプンにリゾープス属菌等からなる糸状菌を接種培養してグルコアミラーゼを生産していた。
また、特許文献１には、酒類の製造にあって、アスペルギルス属菌を用いて、グルコアミラーゼ活性を高めること、麹菌の液体培養によって発酵原料によるカタボライトリプレッション（異化産物抑制）を制御し、麹菌の液体培養によって発現する糖質分解酵素の生産性を調整することが記載されている。
【０００４】
そして、特許文献２（糸状菌類による厨芥処理方法）には、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリーゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・サイトイ、アスペルギルス・アワモリを単独又は混合して、又はリゾープス・ニウベス、リゾープス・デレマーを単独又は混合して、厨芥を分解させることが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２９５８７１号公報
【特許文献２】特開平８−１０７４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記した従来方法では、これらの液体培養によるグルコアミラーゼ活性は高いものの、煮沸処理時に熱エネルギーが必要となり、培養基質として高価な低分子糖や液化デンプン調製時に酵素製剤を使うことから全体として製造コストが高騰するという問題があり、生デンプンあるいは液化デンプンなどから直接グルコアミラーゼを高生産する技術が求められている。
特許文献１記載の技術でも同様、８０℃前後の高温に加熱した原料に、耐熱性酵素剤が使用されており、加熱と耐熱性酵素剤にコストがかかるという問題が残っている。
特許文献２には、糸状菌として、アスペルギルス属菌及びリゾープス属菌を使用し、厨芥物を分解する酵素を製造することの記載はあるが、目的が厨芥物の分解であり、更には、特許文献２記載の技術は、アスペルギルス属菌及びリゾープス属菌を混ぜて混合培養するものではない。
【０００７】
本発明は、かかる事情に鑑みてなされたもので、アスペルギルス属菌とリゾープス属菌を適当比率で混合培養し、直接、生デンプン又は加工されたデンプンからグルコアミラーゼを含むアミラーゼを効率よく短時間で生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的に沿う本発明に係るアスペルギルス属菌及びリゾープス属菌の混合培養系を用いたアミラーゼの生産方法は、原料デンプンを含む培地に、リゾープス属菌とアスペルギルス・オリーゼを加えて混合培養し、α−アミラーゼとグルコアミラーゼを生成するアミラーゼの生産方法であって、
前記リゾープス属菌と前記アスペルギルス・オリーゼとの割合を１対４４〜１対９４の範囲に制御して接種し、その培養時間を４８〜７２時間の範囲に制御して混合培養することで、前記α−アミラーゼの活性を前記培地に前記アスペルギルス・オリーゼを加えた純粋培養に比較して抑えて、前記グルコアミラーゼの活性を前記培地に前記リゾープス属菌を加えた純粋培養に比較して高めたアミラーゼを生産する。
【０００９】
ここで、原料デンプンは、穀類（トウモロコシを含む）、豆類、芋類、その他植物でデンプンを含むものであれば適用可能であるし、前記培地と生米粉を使用した液体培地とすることもできる。
また、アスペルギルス属菌としては、１）ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、ショウユコウジカビ（Ａ．ｓｏｊａｅ）等で代表される黄麹菌、２）カワチコウジカビ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ）で代表される白麹菌、３）アワモリコウジカビ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）で代表される黒麹菌等がある。また、リゾープス属菌としては、例えば、リゾープス・ニベウス（Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ）、リゾープス・コーニイ（Ｒ．ｃｏｈｎｉｉ）等がある。
【００１０】
【００１１】
【００１２】
そして、本発明に係るアスペルギルス属菌及びリゾープス属菌の混合培養系を用いたアミラーゼの生産方法において、前記リゾープス属菌はリゾープス・コーニイを用いるのがよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るアスペルギルス属菌及びリゾープス属菌の混合培養系を用いたアミラーゼの生産方法では、アスペルギルス属菌がα−アミラーゼを生産して原料デンプンを分解し、低分子糖（例えば、デキストリン、オリゴ糖等）とすると共に、リゾープス属菌が低分子糖を食べてグルコアミラーゼを生産するので、従来の原料デンプンの煮沸処理及び液化処理を必要とすることなく、原料デンプンから直接グルコアミラーゼ、場合によってはα−アミラーゼも同時に生産できることになった。
【００１４】
また、アスペルギルス属菌及びリゾープス属菌の混合培養の比と混合培養の時間を制御することで、製造できるグルコアミラーゼとα−アミラーゼの量を制御できる。従って、用途に応じてグルコアミラーゼとα−アミラーゼとの量を調製した酵素を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】アスペルギルス属菌及びリゾープス属菌の混合培養を用いたα−アミラーゼ活性の推移を示すグラフである。
【図２】アスペルギルス属菌及びリゾープス属菌の混合培養を用いたグルコアミラーゼ活性の推移を示すグラフである。
【図３】各種菌株と生デンプン分解活性との関係を示すグラフである。
【図４】（Ａ）は各種菌株と生デンプンの生成糖量との関係、（Ｂ）は各種菌株のグルコース量とそれ以外の低分子糖量の割合を示すグラフである。
【図５】（Ａ）〜（Ｅ）はアスペルギルス菌及びリゾープス菌の各種混合培養における菌体量の推移を示すグラフ、（Ｆ）はこれらの純粋培養の場合の菌体量との関係を示すグラフである。
【図６】（Ａ）〜（Ｅ）はアスペルギルス菌及びリゾープス菌の各種混合培養におけるｐＨの推移、（Ｆ）はこれらの純粋培養の場合のｐＨの推移を示すグラフである。
【図７】（Ａ）〜（Ｅ）はアスペルギルス菌及びリゾープス菌の各種混合培養におけるα−アミラーゼ活性の推移、（Ｆ）はこれらの純粋培養の場合のα−アミラーゼ活性の推移を示すグラフである。
【図８】（Ａ）〜（Ｅ）はアスペルギルス菌及びリゾープス菌の各種混合培養におけるグルコアミラーゼ活性の推移、（Ｆ）はこれらの純粋培養の場合のグルコアミラーゼ活性の推移を示すグラフである。
【図９】従来例に係るグルコアミラーゼを生産する構成を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
続いて、本発明の一実施の形態に係るアスペルギルス属菌及びリゾープス属菌の混合培養系を用いたアミラーゼの生産方法について、その作用効果を確認した実施例と共に説明する。
図１、図２には、リゾープス属菌の一例であるリゾープス・コーニイ（Ｒ．ｃｏｈｎｉｉ Ｐ５）、アスペルギルス属菌の一例であるアスペルギルス・オリーゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ５２３８）、及びこれらを１対４４で同時接種して混合培養した場合のα−アミラーゼと、グルコアミラーゼの活性の推移を示すものである。
【００１７】
これらの培地（以下、「培地Ａ」という）の組成は、水１００ｍＬに対して、生米粉（生デンプン、原料デンプンの一例）：１ｇ、ＣＨ3ＣＯＯＮＨ4：０．４３ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．１ｇ、ＫＣｌ：０．１ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．０５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．００１ｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．０００３ｇ、ＣａＣｌ2：０．０２１ｇ、クエン酸：０．３３ｇを含むものである。なお、本発明はこの培地に限定されるものではなく、糸状菌の培養に一般的に用いられる窒素源、無機塩類を含む他の培地であってもよい。
【００１８】
リゾープス・コーニイとアスペルギルス・オリーゼの混合培養にあっては、両者の菌密度（又は胞子密度）を合わせる必要があるので、リゾープス・コーニイとアスペルギルス・オリーゼをＰＤＡ（Ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ）スラントで７日間３０℃でそれぞれ培養し発生する胞子の数を合わせて、１０ｍＬの滅菌水を添加し、胞子（即ち、菌株）数が同一となった胞子懸濁液を作成した。胞子懸濁液の全量を２ｍＬとし、リゾープス・コーニイとアスペルギルス・オリーゼの（胞子の状態で）菌株割合が１対４４となるように、培地に接種した。なお、培養に当たっては振とう処理により酸素を供給しながら行った。
【００１９】
図１に示すように、α−アミラーゼ活性は、アスペルギルス・オリーゼを単独で使用した場合が一番大きく、リゾープス・コーニイを用いた場合が最小であった。この理由は、アスペルギルス・オリーゼは、栄養源として利用できる大きさの低分子糖類を得るために生デンプンをランダムに分断するα−アミラーゼを造る、すなわち、生デンプンをランダムに分断して低分子糖類を作り、その過程でα−アミラーゼを造るが、リゾープス・コーニイは生デンプンをグルコース単位で分解しようとするからであると解される。
【００２０】
一方、リゾープス・コーニイとアスペルギルス・オリーゼが１対４４の混合培養では、アスペルギルス・オリーゼ単独培養の場合よりα−アミラーゼの活性が減少する。これはリゾープス・コーニイの存在によって、アスペルギルス・オリーゼのα−アミラーゼ生産が抑制される。また、この抑制度合いは、リゾープス・コーニイとアスペルギルス・オリーゼの混合比によって異なるので、この混合比を制御することによって、α−アミラーゼの活性を制御できることになる。
【００２１】
次に、図２には、リゾープス・コーニイと、アスペルギルス・オリーゼと、これらを１対４４で混合培養した菌を、前記した培地に投入し、それぞれのグルコアミラーゼ活性を示す。図２に示すように、アスペルギルス・オリーゼでは殆どグルコアミラーゼの活性は見られないが、両者混合培養では、短時間のうちにグルコアミラーゼの活性が増加し、リゾープス・コーニイの場合、時間をかけてグルコアミラーゼの活性が増加する。
【００２２】
図２から、リゾープス・コーニイとアスペルギルス・オリーゼとを混合培養することによって、生デンプンからグルコアミラーゼ活性を短時間に高めることができる。一方、アスペルギルス・オリーゼを用いることで、α−アミラーゼが生産されるので、両者を混合培養すると共に時間制御を行って、任意の割合のα−アミラーゼとグルコアミラーゼを含む酵素剤を造ることができ、酒類の醸造に応用することによって、新規な酒類を製造できる。
【００２３】
続いて、本発明の一実施の形態に係るアスペルギルス属菌及びリゾープス属菌の混合培養系を用いたアミラーゼの生産方法の作用、効果を確認するために行った実施例について説明する。
図３には、各種の糸状菌の生デンプン分解活性との関係について調べた結果を示す。この実施例においては、１）２％米粉懸濁液（ｐＨ４．５）に、各種菌を含む酵素液を添加し、４０℃で６０分保持した。そして、各処理液を遠心分離により得た上澄み溶液中の糖量をフェノール硫酸法で測定した。なお、生デンプン分解活性（Ｒａｗ Ｓｔａｒｃｈ ｄｉｇｅｓｔｉｖｉｔｙ）は、（上澄み溶液中の糖量／初発糖量）×１００（％）で表される。
【００２４】
図３から、生デンプン分解活性に大きく寄与するのは、アスペルギルス・オリーゼＩＦＯ５２３８である。なお、２）〜８）の菌は全てアスペルギルス属菌であり、リゾープス・コーニイＰ５はリゾープス属菌を代表するグルコアミラーゼ生産菌である。
【００２５】
図４には、以上の８種の菌を用いて、生デンプンからの生成糖量とグルコースとの割合を調べた結果を示す。グルコース量はＧＯＤ法（過酸化水素電極法）によって測定した。測定にあっては、酵素を失活させた同量の培養液中の糖量を引いて算出した。
図４（Ａ）はサンプル中の総糖量を示し、（Ｂ）は糖中のグルコース量とそれ以外の低分子糖量との比を示す。これによると、アスペルギルス・オリーゼは生デンプンの分解能が高いが、グルコースが少ないので、グルコアミラーゼ活性が低い、即ち、α−アミラーゼ活性が高くて、生デンプンからグルコース以外の低分子糖を高生産することが判る。
【００２６】
一方、リゾープス属菌は低分子糖類を基質として、グルコアミラーゼ生産を活性化する作用があるので、リゾープス属菌とアスペルギルス属菌の両方を共同培養した生デンプンの性状を調査した。なお、前記した「培地Ａ」を用いて、リゾープス・コーニイとアスペルギルス・オリーゼを用いた共同培養を行った。図５（Ａ）〜（Ｅ）は、リゾープス・コーニイ対アスペルギルス・オリーゼの混合比をａ）１：４４、ｂ）１：９４、ｃ）１：１６２、ｄ）１：２５１、ｅ）１：３７７とした場合で、図５（Ｆ）は、これらを純粋培養した場合の、菌体量（ＤＭＷ）の時間的変化を測定した結果を示す。この実験から、リゾープス・コーニイとアスペルギルス・オリーゼは、共同培養した場合でも総菌体量が維持されており、共存できることが判る。なお、４８時間を経過すると菌体量が下がるのは、基質となる生米粉を消費したものと考えられる。
【００２７】
図６（Ａ）〜（Ｅ）はリゾープス・コーニイとアスペルギルス・オリーゼの混合比を変えて培養した場合、図６（Ｆ）は純粋培養した場合の培養液のｐＨの推移を調べたものであり、いずれも、酸性から中性又はアルカリ性に変わるという同じ推移を示している。
図７（Ａ）〜（Ｅ）はリゾープス・コーニイとアスペルギルス・オリーゼの混合比を変えて培養した場合、図７（Ｆ）は純粋培養した場合の、α−アミラーゼ活性の推移を調べたものである。混合培養にすることによって、アスペルギルス・オリーゼの純粋培養の場合よりも、α−アミラーゼの活性が下がっている。これによって、リゾープス・コーニイを適当量入れることによって、α−アミラーゼの活性を抑えることができる。
【００２８】
図８（Ａ）〜（Ｅ）はリゾープス・コーニイとアスペルギルス・オリーゼの混合比を変えて培養した場合、図８（Ｆ）は純粋培養した場合の、グルコアミラーゼ活性の推移を調べたものである。
このグラフからも明らかなように、リゾープス・コーニイの純粋培養に比較して、リゾープス・コーニイとアスペルギルス・オリーゼの混合培養の方が４８時間経過後の又は７２時間経過後のグルコアミラーゼ活性が高いことが判る。
【００２９】
なお、リゾープス・コーニイとアスペルギルス・オリーゼの混合比率を変えて更なる実験をした結果、リゾープス・コーニイとアスペルギルス・オリーゼの割合は胞子量比で１対３７７〜１対１（１対２５１〜１対１がより好ましく、最適には１対４４となる）の範囲において短い培養時間（例えば、４８時間又は７２時間）でグルコアミラーゼが生産可能となる。なお、アスペルギルス・オリーゼのみでは、殆どグルコアミラーゼ活性はないことになる。
従って、生デンプンを用いてグルコアミラーゼを造る場合、リゾープス属菌とアスペルギルス属菌の混合培養をすれば、短時間でグルコアミラーゼを造ることができる。
【００３０】
また、前記実施の形態においては、原料デンプンとして生デンプンを用いたが、当然のことながら、加工デンプンであっても本発明は適用される。
【符号の説明】
【００３１】
１０：原料デンプン、１１：破砕処理、１２：煮沸処理、１３：液化工程
【図１】
0005900871.tif 000002
【図２】
0005900871.tif 000003
【図３】
0005900871.tif 000004
【図４】
0005900871.tif 000005
【図５】
0005900871.tif 000006
【図６】
0005900871.tif 000007
【図７】
0005900871.tif 000008
【図８】
0005900871.tif 000009
【図９】
0005900871.tif 000010