(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Chroomonas diplococca、Chroomonas mesostigmatica及びChroomonas nordstedtiiから選ばれるChroomonas属藻類の一種以上を培地中で培養し、培養物から脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上である油脂を採取し、所望により採取された油脂中のラウリン酸をエステル化した後、ラウリン酸又はそのエステルを分離取得することを特徴とする、ラウリン酸又はそのエステルの製造方法。
【請求項２】
Chroomonas属藻類が、Chroomonas diplococca UTEXLB2422株、Chroomonas mesostigmatica NIES1370株、Chroomonas nordstedtii NIES707株、Chroomonas nordstedtii NIES710株、又はこれらの藻類株と同一の菌学的性質を有する藻類株である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
照度３００〜１００００ルクスの光照射下で、７〜１２０日間培養する請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ラウリン酸エステルがラウリン酸メチルである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
Chroomonas diplococca、Chroomonas mesostigmatica及びChroomonas nordstedtiiから選ばれるChroomonas属藻類の一種以上を培地中で培養し、培養物から脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上である油脂を採取することを含む、ラウリン酸を構成脂肪酸として含有する油脂の製造方法。
【請求項６】
Chroomonas属藻類が、Chroomonas diplococca UTEXLB2422株、Chroomonas mesostigmatica NIES1370株、Chroomonas nordstedtii NIES707株、Chroomonas nordstedtii NIES710株、又はこれらの藻類株と同一の菌学的性質を有する藻類株である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
照度３００〜１００００ルクスの光照射下で、７〜１２０日間培養する請求項５又は６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類を用いた、ラウリン酸を構成脂肪酸として含有する油脂（以下、単に「ラウリン酸含有油脂」とも称する）、及びそれを用いたラウリン酸又はそのエステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラウリン酸は、ヤシ油やパーム核油に多く含まれる主な脂肪酸で、各種界面活性剤の原料や食品などに使用される。
ラウリン酸は、その供給源がヤシやパーム核に限定されており、そのため栽培地域が限定される。さらに、ラウリン酸の原料として耕地を利用することは、今後バイオディーゼルや、食料用途と競合することも懸念される。また、熱帯雨林の破壊という問題も付随する。
従って、ヤシやパーム核に頼らない、ラウリン酸供給技術の開発が望まれていた。
【０００３】
一方、藻類は面積あたりの油脂生産性が、植物などに比べ１０倍ほど高く、高効率であることが知られており（非特許文献１）、ラウリン酸供給生物として、光合成を行わず従属栄養で増殖する渦鞭毛藻であるCrypthecodinium choniiがラウリン酸を高含有（１５．７％／総脂質中）することが報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
炭素源コストなどの観点より、光合成（独立栄養）により増殖でき、且つラウリン酸をより多く含有する藻類が望まれるが、斯かる藻類では、ラウリン酸を１〜２％程度含有するNeochloris oleoabundansが知られているだけで（非特許文献３）、ラウリン酸をそれ以上含有する藻類はこれまでに知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Biotechnology Advances,(2007) 25, 294-306
【非特許文献２】Phytochemistry,(1988)27,1679-1683
【非特許文献３】J Ind Microbiol Biotechnol (2009) 36:821-826
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、クロララクニオン藻綱の藻類、並びにChroomonas diplococca、Chroomonas mesostigmatica、Chroomonas nordstedtii及びChroomonas placoideaから選ばれるChroomonas属藻類、及びRhodomonas属藻類からなるクリプト藻綱の藻類よりなる群から選ばれる一種以上を培地中で培養し、培養物から脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上である油脂を採取し、所望により採取された油脂中のラウリン酸をエステル化した後、ラウリン酸又はそのエステルを分離、取得することを特徴とする、ラウリン酸又はそのエステルの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、Chroomonas diplococca、Chroomonas mesostigmatica、Chroomonas nordstedtii及びChroomonas placoideaから選ばれるChroomonas属藻類の一種以上を培地中で培養し、培養物から脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上である油脂を採取することを含む、ラウリン酸を構成脂肪酸として含有する油脂の製造方法を提供するものである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、藻類を用いた、ラウリン酸を構成脂肪酸として含有する油脂の供給方法、及び当該油脂を用いたラウリン酸又はそのエステルの供給方法を提供することに関する。
【０００８】
本発明者らは、ラウリン酸供給生物について検討したところ、光合成をするタイプの藻類のうち、単細胞藻類であるクロララクニオン藻綱（Chlorarachniophyceae）の藻類、並びにクリプト藻綱（Cryptophyceae）の藻類のうち、Chroomonas diplococca、Chroomonas mesostigmatica、Chroomonas nordstedtii及びChroomonas placoideaから選ばれるChroomonas属藻類、又はRhodomonas属藻類がラウリン酸を高濃度で含有し、これを用いることにより、構成脂肪酸としてラウリン酸を高含有する油脂、更にはラウリン酸又はそのエステルを効率良く製造できることを見出した。
【０００９】
本発明の方法によれば、容易に増殖可能な藻類を用いることから、ヤシやパーム核の如く栽培地域が限定されたり、食料用途等の競合が発生することなく、効率良くラウリン酸を構成脂肪酸として高含有する油脂を製造することができる。また、本発明の方法によれば、熱帯雨林の破壊も回避可能である。
【００１０】
本発明のラウリン酸含有油脂の製造方法は、Chroomonas diplococca、Chroomonas mesostigmatica、Chroomonas nordstedtii及びChroomonas placoideaから選ばれるChroomonas属藻類並びにRhodomonas属藻類よりなる群から選ばれるクリプト藻綱藻類の一種以上を培地中で培養し、培養物から脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上である油脂を採取するものである。
また、本発明のラウリン酸又はそのエステルの製造方法は、クロララクニオン藻綱（Chlorarachniophyceae）の藻類、並びにChroomonas diplococca、Chroomonas mesostigmatica、Chroomonas nordstedtii及びChroomonas placoideaから選ばれるChroomonas属藻類、及びRhodomonas属藻類からなるクリプト藻綱の藻類よりなる群から選ばれる一種以上を培地中で培養し、培養物から脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上である油脂を採取し、所望により採取された油脂中のラウリン酸をエステル化した後、ラウリン酸又はそのエステルを分離、取得するものである。
ここで、脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上である油脂としては、油脂中の全構成脂肪酸中のラウリン酸の含有割合が３質量％以上、好ましくは３〜６０質量％、より好ましくは５〜６０質量％、更に好ましくは６〜６０質量％、更に好ましくは７〜６０質量％、更に好ましくは８〜６０質量％、更に好ましくは９〜６０質量％、更に好ましくは１０〜６０質量％、更に好ましくは１１〜５０質量％、更に好ましくは１２〜４０質量％の油脂が挙げられる。
【００１１】
本発明において用いられるクロララクニオン藻綱（Chlorarachniophyceae）に属する藻類は、脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上の油脂生産能を有するものであれば何れの株でもよい。
本発明において用いられるクリプト藻綱藻類は、Chroomonas diplococca、Chroomonas mesostigmatica、Chroomonas nordstedtii及びChroomonas placoideaから選ばれるChroomonas属藻類又はRhodomonas属藻類であり、より好ましくはChroomonas diplococca、Chroomonas mesostigmatica、及びChroomonas nordstedtiiから選ばれるChroomonas属藻類であり、脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上の油脂生産能を有するものであれば何れの株でもよい。
【００１２】
本発明の藻類は、例えば、次のようなスクリーニング法に従って選択することができる。
ｉ）培養容器に滅菌した培地（淡水用としてＷＡ培地（表２参照）、海水用としてダイゴＩＭＫ培地（表３参照））を分注する。
ii）藻類株を培地に接種し、室温（２２℃〜２４℃）、照度約３０００ルクス、１２時間明暗条件下で静置培養する。
iii）藻体を回収し、油脂を抽出し、脂肪酸をメチルエステル化し、その組成を分析して、ラウリン酸含有油脂を産生している藻類株を選択する。
iv）油脂中に全脂肪酸あたり、ラウリン酸を３質量％以上含有する藻類株を選択する。
【００１３】
クロララクニオン藻綱に属する藻類としては、例えば、Chlorarachnion属、Lotharella属、Gymnochlora属、Cryptochlora属、Bigelowiella属の藻類が挙げられ、好ましくはLotharella属、Gymnochlora属、Bigelowiella属である。
更に好適なクロララクニオン藻綱藻類としては、例えば、Lotharella属では、Lotharella globosa、Lotharella amoeboformis、Lotharella vacuolata等が挙げられ、Gymnochlora属では、Gymnochlora stellata等が挙げられる。Bigelowiella属では、Bigelowiella natans等が挙げられる。このうち、Lotharella globosaとしては、より好ましくはLotharella globosa CCMP1729株、Lotharella amoebiformisとしては、より好ましくはLotharella amoebiformis CCMP2058株、Lotharella vacuolataとしては、より好ましくはLotharella vacuolata CCMP240株、Gymnochlora stellataとしては、より好ましくはGymnochlora stellata CCMP2057株、Bigelowiella natansとしては、より好ましくはBigelowiella natans CCMP621株、CCMP2757株（これらは、The Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton(CCMP)等より入手可能）、又は当該藻類株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株を挙げることができる。例えば、Lotharella amoebiformisは、近年Amorphochlora amoebiformisという新属に属することが提唱されているが、これらは同一の藻類学的性質を有する株とみなすことができる。これらのうち、Lotharella globosa がより好ましく、Lotharella globosa CCMP1729株又は当該藻類株と実質的に同一の菌学的性質を有する藻類株が更に好ましい。
【００１４】
Lotharella amoebiformis CCMP2058株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株としては、例えば、Lotharella amoebiformis Ryukyu株等が挙げられ、Lotharella vacuolata CCMP240株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株としては、例えば、Lotharella vacuolata FK18G株等が挙げられ、Gymnochlora stellata CCMP2057株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株としては、例えば、Gymnochlora stellata Guam-1株等が挙げられ、Bigelowiella natans CCMP621株、CCMP2757株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株としては、例えばBigelowiella natans A11株、490株、VA3株などが挙げられる。
【００１５】
斯かる藻類株の藻類学的性質は、以下のとおりである。これらの各藻類株と同一の種に属する菌株、各藻類株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株は、斯かる性質に基づいて同定することができる。
＜クロララクニオン藻綱に属する藻類の藻類学的性質＞
ｉ）クロロフィルa、bを有する
ii）葉緑体包膜は4枚である
iii）ヌクレオモルフを有する
iv）デンプンを蓄積しない
v）アメーバ相と細胞壁を持つ相が存在する
vi) 眼点を持たない
＜Chlorarachnion属に属する藻類の藻類学的性質＞
ｉ）栄養細胞はアメーバ様細胞である
ii）ヌクレオモルフはピレノイド内部に位置する
＜Cryptochlora属に属する藻類の藻類学的性質＞
ｉ）栄養細胞は球状細胞である
ii) ピレノイド構造は不明
＜Lotharella属に属する藻類の藻類学的性質＞
ｉ）深裂型のピレノイドを有する
ii）ヌクレオモルフはピレノイド基部近くにある葉緑体周縁区画内に位置する
＜Gymnochlora属に属する藻類の藻類学的性質＞
ｉ）葉緑体包膜の最内膜が管状にピレノイドマトリックス内に陥入している
ii）ヌクレオモルフはピレノイド基部近くにある葉緑体周縁区画内に位置する
＜Bigelowiella属に属する藻類の藻類学的性質＞
ｉ）遊泳細胞が無性的に増殖できる
ii) ピレノイドは浅裂型である
iii) ヌクレオモルフはピレノイドの基部にある
＜Lotharella globosa CCMP1729株の藻類学的性質＞
i）栄養細胞は球状であり、増殖時にアメーバ様細胞は出現しない
＜Lotharella amoebiformis CCMP2058株の藻類学的性質＞
i）栄養細胞はアメーバ様細胞である
＜Lotharella vacuolata CCMP240株の藻類学的性質＞
i) 生活環の主要ステージは球状であるが、培養令初期から中期にかけて糸状仮足を有するアメーバ状細胞が認められる
ii）他のLotharella属の藻類より、大きな液胞を有する
iii）栄養増殖はアメーバ様細胞の二分裂によって行われる
＜Gymnochlora stellata CCMP2057株の藻類学的性質＞
i）星型アメーバ状生物であり、多数の糸状仮足を有するが網状ネットワークを形成しない
ii) 生活環を通じて細胞壁を持つ細胞や遊泳細胞を生じない
＜Bigelowiella natans CCMP621株、CCMP2757株の藻類学的性質＞
i) 栄養ステージが遊泳細胞であり、アメーバ様細胞ではない
ii）長いものと短いものの2本の鞭毛を有する
iii）線条体を持たない
【００１６】
本発明のChroomonas属藻類のうち、Chroomonas diplococcaとしては、好ましくは例えばChroomonas diplococca UTEXLB2422株、Chroomonas mesostigmaticaとしては、好ましくは例えばChroomonas mesostigmatica NIES1370株、Chroomonas nordstedtiiとしては、好ましくは例えばChroomonas nordstedtii NIES707株、NIES710株、Chroomonas placoideaとしては、好ましくは例えばChroomonas placoidea NIES705株（これらは、The culture collection of algae at University of Texas at Austin (UTEX)、国立環境研究所(NIES)等より入手可能）、又は当該藻類株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株を挙げることができる。
Rhodomonas属藻類としては、例えばRhodomonas salinaが好ましく、Rhodomonas salina UTEX1375、Rhodomonas salina CCMP272又は当該藻類株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株がより好ましく、Rhodomonas salina UTEX1375株又は当該藻類株と実質的に同一の菌学的性質を有する藻類株が更に好ましい。これらはUTEX、The Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton（CCMP）より入手可能である。
【００１７】
Chroomonas mesostigmatica NIES1370株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株としては、例えば、Chroomonas mesostigmatica TKB-112株等が挙げられ、Chroomonas nordstedtii NIES707株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株としては、例えば、Chroomonas nordstedtii  #00173株等が挙げられ、Chroomonas nordstedtii NIES710株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株としては、例えば、Chroomonas nordstedtii #00331株等が挙げられ、Chroomonas placoidea NIES705株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株としては、例えば、Chroomonas placoidea CCAP 978/8株等が挙げられる。
Rhodomonas salina CCMP272と実質的に同一の藻類学的性質を有する株としては、例えば、Rhodomonas salina Mel-023株等が挙げられる。
【００１８】
斯かる藻類株の藻類学的性質は、以下のとおりである。これらの各藻類株と同一の種に属する菌株、各藻類株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株は、斯かる性質に基づいて同定することができる。
＜クリプト藻網の藻類学的性質＞
ｉ）フィコビリン、クロロフィルｃを有する
ii）葉緑体包膜は4枚である
iii）ヌクレオモルフを有する
iv）管状羽型と管状片羽型の鞭毛を有する
v）α-1,4デンプンを蓄積する
＜Chroomonas属の藻類学的性質＞
i) 細胞は樽状で、側溝が認められない
ii) 2つの連なった射出装置を有する
iii) 葉緑体の色は青から緑である
iv) 通常、細胞中心に眼点が認められる
＜Rhodomonas属の藻類学的性質＞
i) 細胞は卵形で、短い側溝を有する
ii) 葉緑体の色は赤から赤褐色であり、目立つピレノイドを有する
iv) 通常、細胞中心に眼点が認められる
＜Chroomonas mesostigmatica NIES1370株の藻類学的性質＞
ｉ）クロロプラスト内に多量のラメラ構造を有する
ii) 葉緑体に付随して大きなピレノイドを一つ有する
＜Chroomonas nordstedtii NIES707、NIES710株の藻類学的性質＞
ｉ）眼点を持たない
ii) ４５０nmから６５０nmの波長の光に対し、走光性を有する
＜Chroomonas placoidea NIES705株の藻類学的性質＞
ｉ）鞭毛軸受け部位に葉舌を有する
＜Rhodomonas salina UTEX1375、Rhodomonas salina CCMP272の藻類学的性質＞
ｉ）細胞亜頂端から細胞長より短い鞭毛が２本生じている。
ii) 縦溝は短く、咽頭部は2列ほどの射出装置が付随して細胞中程まで達する。
iii)赤褐色〜黄橙色の葉緑体を１個もち、背側に明瞭なデンプン鞘で囲まれたピレノイドが１個存在する。
【００１９】
また、上述した藻類株又は当該藻類株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株の変異株も本発明の藻類に包含される。
例えば、ラウリン酸を野性株より高含量で含む油脂を産生するように設計された変異株が包含される。
さらに本発明のクロララクニオン藻綱藻類由来の遺伝子及びクリプト藻綱藻類由来の遺伝子は、ラウリン酸高含有油脂を産生するために利用することができる。
【００２０】
本発明のクロララクニオン藻綱藻類及びクリプト藻綱藻類の培養は、天然海水又は人工海水で調製した適当な培地中で、光照射下、微細藻類に用いられる一般的培養手段を用いることにより行うことができる。
【００２１】
培地としては、天然海水又は人工海水をベースに、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類等を添加した公知のものを使用できる。
ここで、例えば、窒素源としてＮａＮＯ3、ＫＮＯ3、Ｃａ（ＮＯ3）2、ＮＨ4ＮＯ3、（ＮＨ4）2ＳＯ4等、リン源としてＫ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、グリセロリン酸ナトリウム等、金属塩としてＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、Ｎａ2ＳＯ4、Ｋ2ＳＯ4、ＭｇＳＯ4、Ｎａ2ＣＯ3、ＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＳｉＯ3、Ｈ3ＢＯ3、ＭｎＣｌ2、ＭｎＳＯ4、ＦｅＣｌ3、ＦｅＳＯ4、ＣｏＣｌ2、ＺｎＳＯ4、ＣｕＳＯ4、Ｎａ2ＭｏＯ4等、ビタミン類としてＢｉｏｔｉｎ、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２、Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ、ニコチン酸、イノシトール、葉酸、チミン等を挙げることができる。
また、上記培地にはラウリン酸含有油脂の産生を促進するため、炭素源、微量金属等を適宜添加することができる。
【００２２】
好ましい培地としては、例えば、ダイゴＩＭＫ培地、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地等が挙げられる。
【００２３】
上記の培地は、調製後、適当な酸又は塩基を加えることによりｐＨを７．０〜８．０の範囲内に調整した後、オートクレーブにより殺菌して使用することが好ましい。
【００２４】
培養は、培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、好ましくは培養培地当り１．０〜１０．０％（vol/vol）が好ましく、１．０〜５．０％（vol/vol）がより好ましい。
【００２５】
培養温度は、本発明藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、一般的には１０〜３０℃で行うのが好ましく、１５〜２５℃がより好ましい。
【００２６】
光照射は、光合成が可能な条件であれば良く、人工光又は太陽光の何れでもよい。
照度は、１００〜５００００ルクスの範囲が好ましく、３００〜１００００ルクスがより好ましい。
【００２７】
培養時のｐＨは、一般的には６．５〜８．５であり、好ましくはｐＨ７．０〜８．０  である。
【００２８】
培養期間は、ラウリン酸含有油脂を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖するよう行えばよく、例えば７〜１２０日間、好ましくは７〜３０日間、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養すればよい。
【００２９】
培養終了後、遠心分離法や濾過などの常法により、藻体を分離し、分離藻体をそのままもしくは超音波やダイノミル等によって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール、メタノール、酢酸エチル等の有機溶剤による溶剤抽出を行うことにより、ラウリン酸含有油脂を採取することができる。
【００３０】
Gymnochlora stellata CCMP2057株、乾燥藻体１００ｇ当たりのラウリン酸含有油脂の含有量は、５〜１０ｇ程度であり、培地１リットル当たりのラウリン酸含有油脂の生産量は、０．０２〜０．０５ｇ程度に達する。
またこの場合、油脂の脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合は、４．０〜８．５質量％と高濃度である。従って、培地１リットル当たりのラウリン酸の生産量としては、０．０００８〜０．００４３ｇ程度と高い。
【００３１】
Chroomonas diplococca UTEXLB2422株を用いた場合、乾燥藻体１００ｇ当たりのラウリン酸含有油脂の含有量は、3〜4ｇ程度であり、培地１リットル当たりのラウリン酸含有油脂の生産量は、０．００７〜０．０１６ｇ程度に達する。
またこの場合、油脂の脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合は、５．０〜１７．０質量％と高濃度である。従って、培地１リットル当たりのラウリン酸の生産量としては、０．０００４〜０．００２７ｇ程度と高い。
【００３２】
ラウリン酸含有油脂からラウリン酸の分離及び取得は、常法により混合脂肪酸あるいは脂肪酸エステルの状態とした後、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法あるいは超臨界クロマトグラフィー法などにより濃縮採取することにより行うことができる。
また、ラウリン酸含有油脂について、当該油脂中のラウリン酸をエステル化することにより、ラウリン酸エステルを分離、取得することができる。
例えば、ラウリン酸含有油脂とメタノール等のアルコールとをアルカリ触媒の存在下で反応させ、反応生成物よりラウリン酸エステルを分離、取得することができる。
ここで、ラウリン酸エステルとしては、メチルエステル、エチルエステル等の低級アルキルエステルが挙げられ、メチルエステルが好ましい。
また、ラウリン酸含有油脂について、当該油脂中のラウリン酸を還元することにより、ラウリルアルコールを分離、取得することもできる。
例えば、ラウリン酸含有油脂を水素化触媒の存在下で水素化し、反応生成物よりラウリルアルコールを分離、取得することができる。
【００３３】
上述した実施形態に応じ、本発明は、下記［１］のラウリン酸又はそのエステルの製造方法、及び下記[１２]のラウリン酸を構成脂肪酸として含有する油脂の製造方法を開示するものであり、更に好適には、［２］〜［１１］のラウリン酸又はそのエステルの製造方法、及び[１２]〜［１４］のラウリン酸を構成脂肪酸として含有する油脂の製造方法を開示するものである。
[１]クロララクニオン藻綱の藻類、並びにChroomonas diplococca、Chroomonas mesostigmatica、Chroomonas nordstedtii及びChroomonas placoideaから選ばれるChroomonas属藻類、及びRhodomonas属藻類からなるクリプト藻綱の藻類よりなる群から選ばれる一種以上を培地中で培養し、培養物から脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上である油脂を採取し、所望により採取された油脂中のラウリン酸をエステル化した後、ラウリン酸又はそのエステルを分離、取得することを特徴とする、ラウリン酸又はそのエステルの製造方法。
[２]クロララクニオン藻綱（Chlorarachniophyceae）の藻類が、Lotharella属、Gymnochlora属又はBigelowiella属の藻類である、[１]の方法。
[３]Lotharella属藻類が、Lotharella globosa、Lotharella amoebiformis又はLotharella vacuolataであり、Gymnochlora属藻類が、Gymnochlora stellataであり、Bigelowiella属藻類が、Bigelowiella natansである、[１]又は[２]の方法。
[４]Lotharella属藻類が、Lotharella globosa CCMP1729株、Lotharella amoebiformis CCMP2058株、Lotharella vacuolata CCMP240株又は当該藻類株と実質的に同一の菌学的性質を有する藻類株である、[３]の方法。
[５]Gymnochlora属藻類が、Gymnochlora stellata CCMP2057株又は当該藻類株と実質的に同一の菌学的性質を有する藻類株である、[３]の方法。
[６]Bigelowiella 属藻類が、Bigelowiella natans CCMP621株、CCMP2757株又は当該藻類株と実質的に同一の菌学的性質を有する藻類株である、[３]の方法。
[７]Chroomonas属藻類が、Chroomonas diplococca UTEXLB2422株、Chroomonas mesostigmatica NIES1370株、Chroomonas nordstedtii NIES707株、Chroomonas nordstedtii NIES710株、Chroomonas placoidea NIES705株、又はこれらの藻類株と実質的に同一の菌学的性質を有する藻類株である、[１]の方法。
[８]Rhodomonas属藻類がRhodomonas salinaである、[１]の方法。
[９]Rhodomonas salina がRhodomonas salina UTEX1375、Rhodomonas salina CCMP272又はこれらの藻類株と実質的に同一の菌学的性質を有する藻類株である、[８]の方法。
[１０]照度３００〜１００００ルクスの光照射下で、７〜１２０日間培養する[１]〜[９]の方法。
[１１]ラウリン酸エステルがラウリン酸メチルである、[１]〜[１０]の方法。
[１２]Chroomonas diplococca、Chroomonas mesostigmatica、Chroomonas nordstedtii及びChroomonas placoideaから選ばれるChroomonas属藻類の一種以上を培地中で培養し、培養物から脂肪酸組成におけるラウリン酸の含有割合が３質量％以上である油脂を採取することを含む、ラウリン酸を構成脂肪酸として含有する油脂の製造方法。
[１３]Chroomonas属藻類が、Chroomonas diplococca UTEXLB2422株、Chroomonas mesostigmatica NIES1370株、Chroomonas nordstedtii NIES707株、Chroomonas nordstedtii NIES710株、Chroomonas placoidea NIES705株、又はこれらの藻類株と実質的に同一の菌学的性質を有する藻類株である、[１２]の方法。
[１４]照度３００〜１００００ルクスの光照射下で、７〜１２０日間培養する[１２]又は[１３]の方法。
【実施例】
【００３４】
実施例１  クロララクニオン藻綱藻類の培養と脂肪酸組成分析
実験に用いた藻類株として、The Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton(CCMP)より以下の6株を入手した。
【００３５】
【表１】
0005927199.tif 000002
【００３６】
藻類の培養は、以下のように行った。海水用として、市販培地であるダイゴＩＭＫ培地（日本製薬製、組成は表２参照）を用いた。
【００３７】
【表２】
0005927199.tif 000003
【００３８】
培養容器として滅菌した１６ｍｍ×１５０ｍｍのカルチャーチューブ（ＶＷＲ製）とスポンジ栓（６０８８２−１６７：ＶＷＲ製）を使用し、滅菌した培地を１０ｍＬ分注した。藻類株は液体培地からは１００μＬ、固体培地からは１白金耳相当新しい培地に接種し、室温（２２℃〜２４℃）、蛍光灯下、照度約３０００  ｌｕｘ、１２時間明暗条件下で静置培養した。
藻類の培養液から３０００ｒｐｍ、３０分にて遠心分離した沈殿画分を得た。沈殿画分を８０℃にて約３時間から１６時間乾燥させ、乾燥藻体とした。乾燥藻体の重量を測定後、０．５ｍＬの１％食塩水にて懸濁し、内部標準として５ｍｇ／ｍＬの７−ペンタデカノンを１０μＬ添加後、０．５ｍＬのクロロホルムおよび１ｍＬのメタノールを培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置し、その後さらに０．５ｍＬのクロロホルムおよび０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３０００ｒｐｍ、１５分遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
【００３９】
調製した脂質画分約５００μＬを窒素にて乾固後、０．５Ｎ  水酸化カリウム／メタノール溶液７００μＬを添加し、８０℃で３０分恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（ＳＩＧＭＡ製）を添加し８０℃にて２０分恒温し、その後ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し室温にて３０分放置後、上層であるヘキサン層を回収した後、ＧＣにて分析した。
【００４０】
装置はＨＰ  ７８９０Ａ  ＧＣ−ＦＩＤ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）、カラムはＤＢ−１  ｍｓ  ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（Ｊ＆Ｗ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）、移動相に高純度ヘリウムを用い、流量１ｍＬ／分、昇温プログラムは、１００℃（１分）、５℃／分、２８０℃（２０分）で行った。飽和脂肪酸のコントロールとして、ラウリン酸メチル（Ｃ１２）、ミリスチン酸メチル（Ｃ１４）、パルミチン酸メチル（Ｃ１６）、ステアリン酸メチル（Ｃ１８）を、不飽和脂肪酸はパルミトレイン酸メチル（Ｃ１６：１）、オレイン酸メチル（Ｃ１８：１）、リノール酸メチル（Ｃ１８：２）、リノレン酸メチル（Ｃ１８：３）、エイコサペンタエン酸メチル（Ｃ２０：５）、ドコサヘキサエン酸メチル（Ｃ２２：６）を購入し（全てＳＩＧＭＡ製）、分析した。脂肪酸の同定は、これら標準物質とのリテンションタイムと同一かどうかにより判断した。また、ラウリン酸に関してはＧＣ−ＭＳによる同定も行った。鎖長数１６の多価不飽和脂肪酸に関しては、ＧＣ−ＭＳによる解析結果から推定した。表記はC16:x(x=2または3)とし、xは不飽和結合数を示した。装置はＨＰ  ７８９０Ａ  ＧＣ及び５９７５Ｃ  ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）、カラムはＤＢ−１  ｍｓ  ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（Ｊ＆Ｗ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）、移動相に高純度ヘリウムを用い、流量１ｍＬ／分、昇温プログラムは、１００℃（１分）、５℃／分、２８０℃（２０分）で行った。ＧＣ分析にて検出した脂肪酸エステル量を、内部標準を基準に算出し、その総量を総脂肪酸量とした。また総脂肪酸量を乾燥藻体量で除し１００を乗じた値を脂肪酸含量（％）とした。
各種藻類の脂肪酸組成データを表３に示した。
【００４１】
【表３】
0005927199.tif 000004
【００４２】
Lotharella globosa CCMP1729株、Lotharella amoebiformis CCMP2058株、Lotharella vacuolata CCMP240株、Gymnochlora stellata CCMP2057株、Bigelowiella natans CCMP621株、CCMP2757株において、総脂肪酸中３％以上のラウリン酸の蓄積が認められた。特にGymnochlora stellata CCMP2057において、高い脂肪酸生産性、及び総脂肪酸中約８．５％と高いラウリン酸の蓄積が認められた。
【００４３】
実施例２  クロララクニオン藻綱藻類を用いたラウリン酸の生産
Gymnochlora stellata CCMP2057を、１６ｍｍ×１５０ｍｍのカルチャーチューブ（ＩＭＫ培地１０ｍＬ仕込み）にて室温（２２℃〜２４℃）、照度約３０００  ｌｕｘ、１２時間明暗条件下で４週間静置培養した種培養液を、２００ｍＬ容三角フラスコ（ＩＭＫ培地１００ｍＬ仕込み）に２％（ｖ／ｖ）植菌し、室温（２２〜２４℃）、照度約３０００  ｌｕｘ、１２時間明暗条件下で３１日間静置培養した。培養液を３０００ｒｐｍで３０分間遠心して集菌し、１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液で１回洗菌を行った。
【００４４】
１００ｍＬの培養液から回収した藻体を、８０℃にて約１６時間乾燥させた。乾燥藻体に２ｍＬのクロロホルムおよび４ｍＬのメタノールを培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置し、その後さらに２ｍＬのクロロホルムおよび２ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３０００ｒｐｍ、１５分遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。回収したクロロホルム層より１００μＬを窒素ガス噴霧により乾固させ１０μＬのクロロホルムに溶解させた後、うち１μＬをイアトロスキャン（三菱化学ヤトロン社製）に供し中性脂質量を測定したところ、培養液１００ｍＬから１．２ｍｇの中性脂質を得た。
【００４５】
先に回収したクロロホルム層のうち５００μＬを実施例１記載と同様にメチルエステル化し分析したところ、培養液１００ｍＬから得た総脂肪酸は６．２ｍｇ、総脂肪酸中のラウリン酸の割合は４．９％であった。これにより１００ｍＬの培養液より、ラウリン酸０．３ｍｇを得た。
【００４６】
実施例３  Chromonas属藻類の培養と脂肪酸組成分析
実験に用いたChromonas属の藻類株として、The culture collection of algae at University of Texas at Austin (UTEX)、及び国立環境研究所(NIES)より以下の９株を入手した。
【００４７】
【表４】
0005927199.tif 000005
【００４８】
藻類の培養は、以下のように行った。淡水用としてＣ（組成は表５参照）、またはＷＡ培地（組成は表６参照）を、海水用として、f/2（組成は表７参照）または市販培地であるダイゴＩＭＫ培地（日本製薬製、組成は表８参照）を用いた。
【００４９】
【表５】
0005927199.tif 000006
【００５０】
【表６】
0005927199.tif 000007
【００５１】
【表７】
0005927199.tif 000008
【００５２】
【表８】
0005927199.tif 000009
【００５３】
培養容器として滅菌した１６ｍｍ×１５０ｍｍのカルチャーチューブ（ＶＷＲ製）とスポンジ栓（６０８８２−１６７：ＶＷＲ製）を使用し、滅菌した培地を１０ｍＬ分注した。藻類株は液体培地からは１００μＬ、固体培地からは１白金耳相当新しい培地に接種し、室温（２２℃〜２４℃）、蛍光灯下、照度約３０００  ｌｕｘ、１２時間明暗条件下で静置培養した。
藻類の培養液から３０００ｒｐｍ、３０分にて遠心分離した沈殿画分を得た。沈殿画分を８０℃にて約３時間から１６時間乾燥させ、乾燥藻体とした。乾燥藻体の重量を測定後、０．５ｍＬの１％食塩水にて懸濁し、内部標準として５ｍｇ／ｍＬの７−ペンタデカノンを１０μＬ添加後、０．５ｍＬのクロロホルムおよび１ｍＬのメタノールを培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置し、その後さらに０．５ｍＬのクロロホルムおよび０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３０００ｒｐｍ、１５分遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
【００５４】
調製した脂質画分約５００μＬを窒素にて乾固後、０．５Ｎ  水酸化カリウム／メタノール溶液７００μＬを添加し、８０℃で３０分恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（ＳＩＧＭＡ製）を添加し８０℃にて２０分恒温し、その後ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し室温にて３０分放置後、上層であるヘキサン層を回収した後、ＧＣにて分析した。
【００５５】
装置はＨＰ  ７８９０Ａ  ＧＣ−ＦＩＤ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）、カラムはＤＢ−１  ｍｓ  ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（Ｊ＆Ｗ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）、移動相に高純度ヘリウムを用い、流量１ｍＬ／分、昇温プログラムは、１００℃（１分）、５℃／分、２８０℃（２０分）で行った。飽和脂肪酸のコントロールとして、ラウリン酸メチル（Ｃ１２）、ミリスチン酸メチル（Ｃ１４）、パルミチン酸メチル（Ｃ１６）、ステアリン酸メチル（Ｃ１８）を、不飽和脂肪酸はパルミトレイン酸メチル（Ｃ１６：１）、オレイン酸メチル（Ｃ１８：１）、リノール酸メチル（Ｃ１８：２）、リノレン酸メチル（Ｃ１８：３）、エイコサペンタエン酸メチル（Ｃ２０：５）、ドコサヘキサエン酸メチル（Ｃ２２：６）を購入し（全てＳＩＧＭＡ製）、分析した。脂肪酸の同定は、これら標準物質とのリテンションタイムと同一かどうかにより判断した。また、ラウリン酸に関してはＧＣ−ＭＳによる同定も行った。鎖長数１６の多価不飽和脂肪酸に関しては、ＧＣ−ＭＳによる解析結果から推定した。表記はC16:x(x=2または3)とし、xは不飽和結合数を示した。装置はＨＰ  ７８９０Ａ  ＧＣ及び５９７５Ｃ  ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）、カラムはＤＢ−１  ｍｓ  ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（Ｊ＆Ｗ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）、移動相に高純度ヘリウムを用い、流量１ｍＬ／分、昇温プログラムは、１００℃（１分）、５℃／分、２８０℃（２０分）で行った。ＧＣ分析にて検出した脂肪酸エステル量を、内部標準を基準に算出し、その総量を総脂肪酸量（ｇ）とした。総脂肪酸量を培養液量（Ｌ）で除した値を生産性(ｇ/Ｌ，又はｍｇ/Ｌ)とした。また各脂肪酸量を総脂肪酸量で除し１００を乗じた値を脂肪酸含量（％）とした。
各種藻類の脂肪酸組成データを表９に示した。
【００５６】
【表９】
0005927199.tif 000010
【００５７】
Chroomonas diplococca UTEXLB2422株、Chroomonas mesostigmatica NIES1370株、Chroomonas nordstedtii NIES707株、Chroomonas nordstedtii NIES 710株、Chroomonas placoidea NIES705株において、総脂肪酸中５％以上のラウリン酸の蓄積が認められた。特にChroomonas diplococca LB2422株において、総脂肪酸中約１７％と非常に高いラウリン酸の蓄積が認められた。
【００５８】
実施例４  Chromonas属藻類を用いたラウリン酸の生産
Chroomonas diplococca(LB2422株)を、１６ｍｍ×１５０ｍｍのカルチャーチューブ（ＩＭＫ培地１０ｍＬ仕込み）にて、室温（２２℃〜２４℃）、照度約３０００  ｌｕｘ、１２時間明暗条件下で４週間静置培養した種培養液を、２００ｍＬ容三角フラスコ（ＩＭＫ培地１００ｍＬ仕込み）に２％（ｖ／ｖ）植菌し、室温（２２〜２４℃）、照度約３０００  ｌｕｘ、１２時間明暗条件下で３１日間静置培養した。培養液を３０００ｒｐｍで３０分間遠心して集菌し、１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液で１回洗菌を行った。
【００５９】
１００ｍＬの培養液から回収した藻体を、８０℃にて約１６時間乾燥させた。乾燥藻体に２ｍＬのクロロホルムおよび４ｍＬのメタノールを培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置し、その後さらに２ｍＬのクロロホルムおよび２ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３０００ｒｐｍ、１５分遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。回収したクロロホルム層より１００μＬを窒素ガス噴霧により乾固させ１０μＬのクロロホルムに溶解させた後、うち１μＬをイアトロスキャン（三菱化学ヤトロン社製）に供し中性脂質量を測定したところ、培養液１００ｍＬから０．６４ｍｇの中性脂質を得た。
【００６０】
先に回収したクロロホルム層のうち５００μＬを実施例３記載と同様にメチルエステル化し分析したところ、培養液１００ｍＬから得た総脂肪酸は３．５ｍｇ、総脂肪酸中のラウリン酸の割合は５．７％であった。これにより１００ｍＬの培養液より、ラウリン酸０．２ｍｇを得た。
【００６１】
実施例５  Rhodomonas属藻類の培養と脂肪酸組成分析
Rhodomonas属の藻類として、The culture collection of algae at University of Texas at Austin (UTEX)、及びThe Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton（CCMP）より、Rhodomonas salina UTEX1375、Rhodomonas salina CCMP272を購入し、IMK培地にて実施例３と同様の試験を行った。表９記載の培養時間にて、培養時間以外は実施例３と同じ条件で試験を行い、総脂肪酸の生産性及び各脂肪酸の割合を測定した。その結果、両藻類とも３％以上のラウリン酸の割合を示し、それぞれ９．４％及び８．８％であった。
【００６２】
【表１０】
0005927199.tif 000011