(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバシラス・プランタラムから生成された代謝産物および薬学的に許容される賦形剤を含み、がん細胞に対してアポトーシスを誘導し、乳がん、子宮頸がん、および肝臓がんからなる群から選択されるがんを処置するための、医薬組成物。
【請求項２】
代謝産物のｐＨを生理学的ｐＨ７．２〜７．４に調節し、代謝産物を処置の前に０．２２μｍ膜フィルターでろ過した、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
代謝産物が、バクテリオシンおよび／または有機酸を含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
医薬組成物が、さらに栄養分、ビタミン、有機酸塩またはこれらの組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ビタミンが、ビタミンＢである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
有機酸塩が、ギ酸、酢酸および乳酸のナトリウム塩を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
哺乳動物のがん細胞に対してアポトーシスを誘導するためのキットであって、キットが、請求項１〜６のいずれか一項に定義される医薬組成物を含む容器を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌などのグラム陽性菌から得られる代謝産物の抗腫瘍剤としての使用に関する。本発明は、実際にヒト細胞における腫瘍の増殖の治療および／または予防するための方法についてまた開示する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
自然界に広く存在する乳酸菌は、グルコースまたはラクトースなどの炭水化物を用いて有機酸を生成する微生物である(von Wright, 2005)。乳酸菌は、昔から、直接的または間接的に食物に用いられてきた。ヒトの腸管微生物相の研究の結果、健常な人の胃腸管における主な乳酸菌として、ラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）およびラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）等が報告されてきた。そのような乳酸菌は、胃酸および胆汁に対して耐性である（Balcazar, 2007）。
【０００３】
現在、乳酸菌は、広く世界中で微生物剤または発酵品に不可欠な細胞調製品等として用いられてきた。発酵乳または乳酸菌の腫瘍細胞に対する細胞毒性の効果について多くの報告がある。たとえば、ラクトバシラス・カゼイの投与は、生きたラクトバシラス・カゼイの毎日の取り込みによって、腫瘍を有さない、および少なくとも２つの結腸直腸腫瘍を除去した、３９８人の男性および女性に結腸直腸の異型を抑制することにより、結腸直腸がんの進行を予防することができる(Ishikawa et al., 2005)。乳酸菌は、炭水化物を代謝する細菌であり、それにより乳酸を生成する。これら細菌は、嫌気性条件下で良好に増殖する通性嫌気性菌または絶対嫌気性菌に属する。
【０００４】
乳酸菌の一般に知られている属の少数は、ストレプトコッカス（Streptococcus）、ラクトバシラス、リューコノストック（Leuconostoc）、ビフィドバクテリア（Bifidobacteria）およびペディオコッカス（Pediococcus）である。ストレプトコッカス属微生物は、腐敗細菌または病原菌を抑えるために乳を発酵することによって乳酸を生成するホモ発酵性の細菌である。ラクトバシラス属微生物は、桿状のホモまたはヘテロ発酵性の細菌であり、乳製品または野菜の発酵中に広く見られる。リューコノストック属微生物である双球菌は、ヘテロ発酵微生物であり、主に野菜の発酵に関与する。ビフィドバクテリア属微生物は、こどもの健康に有効なＬ(＋)乳酸を生成する絶対嫌気性菌であるが、好気状態では、生存することができない(Holzapfel et al., 2001)。
【０００５】
多くの化学組成物が抗腫瘍剤として報告されているが、これらの組成物は、腫瘍細胞を破壊するだけでなく、正常細胞もまた破壊する。代わりに、腫瘍組織を取り除く外科治療も通常行われている。しかし、この方法は、腫瘍組織を完全に取り除かないために非常に難しい。いかなる治療も副作用をもたらし、完全に最善の結果が得られていないのが現状である。たとえば、化学療法が、ネオアジュバント、アジュバントおよびサルベージ療法としてうまく用いられている(Carlson et al., 2006)。化学療法は、急速に正常細胞を分裂させる有害な副作用を伴って、癌細胞を急速に分裂させる。これは、内皮細胞毒性、免疫抑制、粘膜炎および脱毛症などの最も一般的な化学療法の副作用をもたらす(Mitchell, 2004; Mailloux et al., 2005)。さらに、従来の化学療法医薬の使用は、癌細胞に化学耐性をもたらすことがわかってきた(Zhivotovsky and Orrenius, 2009)。放射線および生物学的作用物質の同時治療法もまた用いられている（American Cancer Society, 2009）。さらに外科および放射線治療への化学療法の大きな進歩にもかかわらず、癌の死亡率は、多くの国の死亡の原因の中では、上位を占めている(WHO, 2009a)。したがって、正常な細胞には、限られた毒性でありながら、大きな効果を有する新規な化学療法を開発することが必要である。
【０００６】
食品が長期の健康のもとになるという期待に結びつき、長期の化学療法剤よりもむしろ、健康維持のための自然な方法を用いることへの消費者の要望は、プロバイオティクス市場が急速に拡大するという推測を支持するものである。総合的な研究から得られる結果が、食品、補助食品または医薬品のいずれかとしてプロバイオティクス製剤を市場に出すために、おそらく必要となるであろう(Mercenier et al., 2002)。バクテリオシンが乳酸菌から単離され、抗生物質に類似の方法によって種々の病原菌に対し阻害作用を有する。しかし、バクテリオシンは、その合成および作用機序、毒性および耐性のメカニズムの点から抗生物質とは区別できる。
新しい抗腫瘍化合物は、ヒトの癌の治療のために絶えず需要があり、新しい抗腫瘍化合物の製造は、さらなる研究のための抗腫瘍剤の開発の重要なものである。これらの化合物を製造するための製造プロセスに用いられる新規な培養菌株が同様に重要である。さらに微生物によって生成される代謝産物が、抗ウィルス性および抗腫瘍作用を有するとともに、重要なヒトの病原菌および菌に対する抗菌作用を示すことが見出された(Zhao et al., 2006; Wachsman et al., 1999)。
【０００７】
本発明の目的は、優れた抗腫瘍活性を有し、低減された副作用を有する代謝産物に基づく新規な抗腫瘍剤であり、かつ食品製造に用いられる高度に安全な細菌から製造することができる新規な抗腫瘍剤を提供することにある。さらに本発明の他の目的は、乳酸菌の抗がん効果（がん細胞増殖の阻害およびアポトーシスの誘導）を測定する方法の提供およびさらには抗がん効果を有する乳酸菌のスクリーニング方法を提供することにある。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明は、腫瘍の予防または治療のための乳酸菌株の使用であって、かかる菌株は、ＢＩＯＴＥＣカルチャーコレクション（BIOTEC Culture Collection（ＢＣＣ））およびタイのＢＩＯＴＥＣ中央研究ユニット（BIOTEC Central Research Unit of Thailand）に寄託されたラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）Ｉ−ＵＬ４、ＴＬ１、ＲＳ５、ＲＧ１４、ＲＧ１１およびＲＩ１１（菌株は生きた形態または生きてはいないが無傷である）である使用に関する。さらに、ラクトバシラス・プランタラムＩ−ＵＬ４、ＴＬ１、ＲＳ５、ＲＧ１４、ＲＧ１１およびＲＴ１１が、哺乳動物（好ましくはヒト）における腫瘍の予防または治療のためにがんの増殖の阻害およびアポトーシスを誘導することができるバクテリオシンなどの代謝産物を生成するものである。とくに代謝産物が、抗腫瘍剤であって、代謝産物は、栄養分、ビタミン（好ましくは、ビタミンＢ）、有機酸塩（好ましくは、ギ酸、酢酸および乳酸のナトリウム塩）またはこれらの組み合わせで補助される。実際に特定の本発明に用いられる代謝産物の量は、完全増殖培地全体の１％（ｖ／ｖ）および５０％（ｖ／ｖ）の濃度である。
【０００９】
これに続き、抗腫瘍剤は、完全増殖培地全体の０％（ｖ／ｖ）および５０％（ｖ／ｖ）の濃度を有することにより、種々の型のヒトがん性細胞（たとえば、ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７、ヒト結腸直腸がん細胞株ＨＴ−２９、ヒト子宮頸がん細胞株ＨｅＬａ、ヒト肝臓がん細胞株ＨｅｐＧ２、ヒト白血病細胞株ＨＬ−６０およびＫ−５６２）の生存度を低下する手段を提供するものである。さらに、抗腫瘍剤が、１％（ｖ／ｖ）〜５０％（ｖ／ｖ）の濃度を有することにより、種々の型のヒトがん性細胞の増殖を阻害する手段を有する。また、本発明は、がん細胞のアポトーシスの誘導を促進しなければならない乳酸菌株について記載し、かかる菌株はＢＩＯＴＥＣカルチャーコレクション（ＢＣＣ）およびタイのＢＩＯＴＥＣ中央研究ユニットに寄託されたラクトバシラス・プランタラムＩ−ＵＬ４、ＴＬ１、ＲＳ５、ＲＧ１４、ＲＧ１１およびＲＩ１１である。したがって、本発明は、がん細胞の治療または予防の医薬の製造について記載し、かかる医薬は、ラクトバシラス・プランタラムＩ−ＵＬ４、ＴＬ１、ＲＳ５、ＲＧ１４、ＲＧ１１およびＲＩ１１株を用いて製造される。実際に抗腫瘍剤が、ＢＩＯＴＥＣカルチャーコレクション（ＢＣＣ）およびタイのＢＩＯＴＥＣ中央研究ユニットに寄託されたラクトバシラス・プランタラムＩ−ＵＬ４、ＴＬ１、ＲＳ５、ＲＧ１４、ＲＧ１１およびＲＩ１１由来の６種の代謝産物の組み合わせもまた提供する。
【００１０】
しかし、本発明の他の側面では、がんの治療または予防のための組成物に関し、有効量の少なくとも１種の乳酸菌株および薬学的に許容される賦形剤を含み、該菌株が、ＢＩＯＴＥＣカルチャーコレクション（ＢＣＣ）およびタイのＢＩＯＴＥＣ中央研究ユニットに寄託されたラクトバシラス・プランタラムＩ−ＵＬ４、ＴＬ１、ＲＳ５、ＲＧ１４、ＲＧ１１およびＲＩ１１である。組成物が、バクテリオシンなどの代謝産物および有機酸（ギ酸、酢酸および乳酸のナトリウム塩を含む）を含む抗腫瘍剤を含み、さらに栄養分、ビタミン（好ましくは、ビタミンＢ）、有機酸塩またはこれらの組み合わせを含む。また、組成物は、さらにＢＩＯＴＥＣカルチャーコレクション（ＢＣＣ）およびタイのＢＩＯＴＥＣ中央研究ユニットに寄託されたラクトバシラス・プランタラムＩ−ＵＬ４、ＴＬ１、ＲＳ５、ＲＧ１４、ＲＧ１１およびＲＩ１１由来の６種の代謝産物の組み合わせを含む。
【００１１】
さらに本発明は、哺乳動物（ヒト）のがん細胞のアポトーシスを促進するための方法および方法が、上記組成物の投与を含む方法にもまた関する。とくに、本発明は好ましくは、哺乳動物のがんの予防または治療のためのキットを提供し、キットが、上記組成物を含む容器を含むものである。また、本発明は、ＢＩＯＴＥＣカルチャーコレクション（ＢＣＣ）およびタイのＢＩＯＴＥＣ中央研究ユニットに寄託されたラクトバシラス・プランタラムＩ−ＵＬ４、ＴＬ１、ＲＳ５、ＲＧ１４、ＲＧ１１およびＲＩ１１を含む抗腫瘍のための食品について記載する。また、食品は、ラクトバシラス・プランタラムＩ−ＵＬ４、ＴＬ１、ＲＳ５、ＲＧ１４、ＲＧ１１およびＲＩ１１株由来の６代謝産物の組み合わせを含む。
本発明は、以下の詳細な記載および単に実例であり、本発明を限定するものではない、添付の図面により完全に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、乳酸菌の６菌株に由来する代謝産物のＭＣＦ-７細胞に対する抗増殖効果のグラフである。同じ列および実験のうち、アスタリスクを付した値は、処理しないコントロールに対し有意差がある、Ｐ＜０．０５。
【図２】図２は、乳酸菌の６菌株に由来する代謝産物のＨＴ−２９細胞における抗増殖効果のグラフである。同じ列および実験のうち、アスタリスクを付した値は、処理しないコントロールに対し有意差がある、Ｐ＜０．０５。
【図３】図３は、ＭＣＦ−７細胞における乳酸菌代謝産物のアポトーシス誘導のグラフである。注：「初期アポトーシス」は、初期のアポトーシス性細胞を示し、「後期アポトーシス」は、後期のアポトーシス性細胞および壊死性細胞を示す。Ｔ１：処理していないコントロール、Ｔ２：処理したコントロールである（±は、標準誤差を示す）。処理グループを処理していないコントロールと比較する。同じ列および実験のうち、共通の文字を有する値は、有意差がない、Ｐ＞０．０５。
【００１３】
【図４】図４は、ＵＬ４代謝産物で処理したＭＣＦ−７細胞の蛍光顕微鏡写真である。パネルＡ：２４時間、パネルＢ：４８時間、Ｃは、７２時間である。乳酸菌代謝産物に曝したときの以下の形態学的変化は、アポトーシスの典型であり、は↑ａは、細胞の収縮、↑ｂは、膜ブレブ形成（membrane blebbing）、↑ｃは、アポトーシス小体形成、↑ｄは、壊死性細胞である（倍率：４０００×）。
【図５】図５は、ＴＵＮＥＬアッセイによる、アポトーシス性細胞におけるＤＮＡ鎖切断の検出を表す２つのパラメーターの散布図（左図）および一つのパラメーターのヒストグラム（右図）のグラフである。パネルＡ：７２時間の処理なしコントロール；Ｂ：７２時間ＵＬ４代謝産物処理。アポトーシスを起こした細胞（Ｒ４）は、散布図におけるＤＮＡ鎖切断の非常に高い発現（Ｙ座標の指数関目盛に注意）およびヒストグラムのＭ２ゲートに特徴付けられる。
【図６】図６は、ＢＩＯＴＥＣカルチャーコレクション（ＢＣＣ）およびタイのＢＩＯＴＥＣ中央研究ユニットに寄託されたラクトバシラス・プランタラムＩ−ＵＬ４、ＴＬ１、ＲＳ５、ＲＧ１４、ＲＧ１１およびＲＩ１１株の配列表である。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、とくにマレーシアの食品、ラクトバシラス菌種から単離された、正常細胞の細胞毒性効果を有さないがん性細胞における、乳酸菌株の代謝産物の細胞毒性効果について記載する。本発明は、またヒトがん性細胞における細胞死の誘導にも関する。とくに、本発明は、結腸および乳がん細胞の増殖の阻害に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒト乳がん細胞におけるアポトーシス誘導に関する。
本発明は、乳酸菌の抗腫瘍効果について容易に測定する方法、かかる方法を用いて抗腫瘍効果を有する乳酸菌をスクリーニングする方法、乳酸菌の抗炎症サイトカイン効果を容易に測定する方法およびかかる方法を用いて炎症性サイトカイン阻害作用を有する乳酸菌のスクリーニング方法について記載する。
【００１５】
本発明の解決方法は、新規なラクトバシラス属微生物、さらには、食品源から単離したＩ−ＵＬ４、ＴＬ１、ＲＳ５、ＲＧ１４、ＲＧ１１およびＲＩ１１菌株を含むラクトバシラス・プランタラムに関する。とくにこれらの菌株が、免疫促進、抗がん活性およびこれらへの利用を有すると考えられる。がん細胞生存度の減少、がん細胞の増殖阻害およびヒトがん細胞のアポトーシス誘導によるこの優れた抗がん活性によって、本発明のＩ−ＵＬ４、ＴＬ１、ＲＳ５、ＲＧ１４、ＲＧ１１およびＲＩ１１菌株を含むラクトバシラス・プランタラムは、抗がん剤、食品添加剤、飼料添加剤、健康補助食品または栄養補助食品産における機能性食品、および医薬品などの種々の製品の製造に効果的に用いることができる。
【００１６】
従って、Ｉ−ＵＬ４、ＴＬ１、ＲＳ５、ＲＧ１４、ＲＧ１１およびＲＩ１１菌株は、プトラマレーシア大学バイオプロセステクノロジー学科（Department of Bioprocess Technology, Universiti Putra Malaysia）より得られた。実際に菌株は、代謝産物を生成することができる。これらの菌株からの代謝産物を得る際、代謝産物は、未使用の万能容器に移し、代謝産物のｐＨを、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて生理学的ｐＨに調整した。さらに代謝産物をがん細胞に処理する前に０．２２μｍ膜シリンジフィルターを用いてろ過し、代謝産物は、使用するまで、４℃で保った。
理論に制限されることなく、プロビオティクス乳酸菌由来の代謝産物は、有意に、がん細胞の生存率を減少することができ、がん細胞の増殖を阻害し、ヒトがん細胞のアポトーシスを誘導することができると考えられる。さらなる詳細についてここでの実施例を参照する。
【００１７】
発明の実施のための最良の形態
本発明を詳述する前に、本発明は、記載の特定の態様には限定されず、当然に異なってもよいものとして理解される。本願発明の範囲が、添付のクレームによってのみ限定されるものであるため、ここで用いられる専門用語は、特定の態様についてのみ記載する目的であって、限定するものではないものとまた理解される。値の範囲が与えられているときは、かかる範囲の上限値および下限値の間に介在する各値、およびかかる記載範囲における他の記載された値または介在する値は、他に明らかな指示がなければ、下限値の１０分の１まで、本発明に包含される。記載の範囲において、特に除外される境界となりやすい、上限値および下限値のこれらより小さな範囲が、独立してこれらより小さな範囲に含まれてもよく、本発明の範囲にも含まれる。記載の範囲が、境界の一方または両方を含むとき、これら含まれる境界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
【００１８】
他に定義されていない限り、ここで用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に共通して理解されているものと同様の意味を有する。ここで記載されたものと同様またはそれと同等のいずれの方法および材料は、本発明の実務または試験にもまた用いることができるが、好ましい方法および材料をここでは記載する。ここで記載のすべての刊行物は、ここでは開示の参照として組み込まれ、刊行物が引用するものに関連する方法および／または材料を記載する。ここでおよび添付のクレームで用いられる単数「a」、「an」および「the」は、明確に別の指示がない限り、複数の指示対象を含むものであることに注意すべきである。
【００１９】
実施例
以下の例は、本発明の使用の範囲を例示するものであり、その範囲を限定するものではない。本発明の精神および範囲のいずれから逸脱することなく改良および変更を行うことができる。本発明を試験および実行するために以下に見出されるものと等価な他の方法または製品をたとえ用いてもよいにしても、材料および好ましい方法を述べる。本発明の背景において、乳酸菌ががんのアポトーシスをどのように助けるかを決定するために、ヒト乳がん細胞株 MCF-7、ヒト結腸直腸がん細胞株 HT-29, ヒト子宮頸がん細胞株 HeLa、ヒト肝臓がん細胞株 Hep G2、ヒト白血病細胞株 HL-60およびK-562がんに対して試験された。用いられた乳酸菌株は、Ｉ−ＵＬ４、ＴＬ１、ＲＳ５、ＲＧ１４、ＲＧ１１およびＲＩ１１菌株を含むラクトバシラス・プランタラムからなる。さらにこれらの菌株は、抗腫瘍剤または細胞毒性剤として働く代謝産物（単数／複数）を生成する。しかし本発明において抗腫瘍剤または細胞毒性剤は、バクテリオシン、栄養分、ビタミン、有機酸塩で補助される。
【００２０】
代謝産物の生成
ｉ）ラクトバシラス種の代謝産物を未使用の万能容器に移し、代謝産物のｐＨをＮａＯＨを用いて生理学的ｐＨ（７．２から７．４の間）に調節した。代謝産物をがん性細胞株および正常細胞の両方に処理する前に、０．２２μｍ膜シリンジフィルター（Milipore、ＵＳＡ）でろ過した。
【００２１】
細胞株の入手
ｉ）ユニバーシティプトラマレーシアの動物組織カルチャーラボラトリーが、ヒト乳がん細胞株MCF-7、ヒト結腸直腸がん細胞株HT-29、ヒト子宮頸がん細胞株 HeLa、ヒト肝臓がん細胞株 Hep G2、ヒト白血病細胞株 HL-60 およびK-562を提供した。正常腺上皮細胞モデルとしての良性正常腺上皮細胞 MCF-10A は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection (ATCC)）から入手した。すべてのがんおよび正常細胞株は、ＡＴＣＣが推奨する１０％（ｖ／ｖ）熱不活性ウシ胎仔血清および１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンを有する培地に維持され、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。
【００２２】
ｉｉ）すべての動物実験は、ユニバーシティプトラマレーシア、獣医および動物科学学部（Faculty of Veterinary and Animal Sciences, Universiti Putra Malaysia.）のガイドラインに基づいて行われた。７〜８週のメスＩＣＲマウスを頸椎脱臼によって屠殺した。解剖後に得られた脾臓および胸腺を氷冷ＰＢＳで２〜３回洗い流し、続いてＰＢＳに浸漬した金網で細分化した。細胞凝集を取り除くため、細胞縣濁液を金網を用いてろ過した。得られたすべての細胞は、遠心分離（３００×ｇ、５分）によって氷冷ＰＢＳで２〜３回洗浄した。
【００２３】
ｉｉ）ユニバーシティプトラマレーシア、獣医および動物科学学部から得られたガイドラインおよび承認では、健常なヒト提供者（２５〜３０歳）から約１０ｍｌの血液を無菌で取り出し（静脈穿刺）、防腐剤を有さないヘパリンチューブに移した。抗凝固処理血液を等量のｐＨ７．５のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈し、ゆっくりFicoll-Paque Plus上に層状にした。混合物をスウィング型ローターで４００×ｇ、４０分、１８〜２０℃で遠心分離した。末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）をFicoll−血漿の界面から回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。マウス脾臓、胸腺およびヒトＰＭＢＣの細胞のペレットを完全増殖培地に５×１０５セル／ｍｌの密度で再縣濁した。
【００２４】
がん細胞生存度、増殖およびアポトーシス誘導の測定
Mosmann (1983)によるＭＴＴアッセイを用いて局所的に単離したラクトバシラス菌種の６つの菌株由来の代謝産物の細胞生存度に対する効果を評価した。細胞を平底９６ウェルプレート上に１×１０４セル／ウェルの密度で２４時間プレートし、［コントロールセル、０％（ｖ／ｖ）の代謝産物］または代謝産物の２倍希釈濃度［５０％（ｖ／ｖ）から０．５％（ｖ／ｖ）］の存在下で処理した。２４時間、４８時間および７２時間の培養後、それぞれＭＴＴ溶液（ＰＢＳ５ｍｇ／ｍｌ）２０μｌをそれぞれのウェルに添加し、暗い中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で４時間培養した。得られたホルマザンの結晶を１００μｌＤＭＳＯに溶解した。参照波長、６３０ｎｍでの５７０ｎｍの吸収（Ａ）をμ Quant ELIZAリーダー(Biotek EL340, USA)を用いて計測した。細胞生存度の比率は、（Ａサンプル−Ａブランク）／（Ａコントロール−Ａブランク）×１００％として計算した。すべての実験は、それぞれの実験に対しを３つの試料を用いて独立した３回の実験を行い、５０％阻害の濃度（ＩＣ５０）値を測定した。
【００２５】
【表１】
0005913353.tif 000002
【００２６】
ｉｉｉ）９６ウェルプレートに５×１０３セル／ウェルの密度で細胞を播種する。培地を２４時間後に吸引し、それぞれ２４時間、４８時間および７２時間の試験を行う、被験抽出物を含む新しい培地で置換した。さらなる手順は、メーカーからの手順に従い行った。放射性[3H]チミジン取り込みアッセイに代わる方法としてBrdU ELISAシステムを用いるため、１０μＭ濃度の最終濃度にした後、BrdUによって２〜２４時間、再培養した。培地をそれぞれのウェルから吸引した。固定／変性溶液を、細胞が固定、透過およびＤＮＡが変性される、組み込まれたBrdUへの抗体が結合を抗体が結合することができるように添加した。抗−BrdU抗体をすべてのウェルに添加し、１時間、組み込まれたBrdUに結合するために１時間培養した。その後、結合していない抗体を洗い流し、検出器に結合しない、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウス抗体を添加した。停止液をそれぞれのウェルに添加し、分光光度計(Biotek EL340, USA)を用いて４５０ｎｍ（参照波長５４０ｎｍ）でのそれぞれのウェルの吸収を測定することで、着色反応生成物を定量する。
【００２７】
ｉｖ）アポトーシスを起こした細胞の特質の一つは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の外面化である。原理的には、ＰＩは傷害が起きた細胞膜を有する細胞の細胞ＤＮＡをＰＩが染色する一方で、アネキシンＶが細胞表面ホスファチジルセリンを検出する。これによって、初期にアポトーシスを起こした細胞(アネキシン V+/PI-)および後期にアポトーシスを起こした細胞および壊死性細胞(アネキシン V+/PI+)から生存能力のある細胞(アネキシン V-/PI-)の識別が可能となる。本研究では、細胞死の状態は、ＢＤバイオサイエンスアネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（BD Biosciences Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit.）を用いて試験した。MCF-7細胞を６−ウェル組織培養プレートへ２．５×１０５セル／ウェルの密度で播種し、一晩付着させ、２４、４８および７２時間処理した。処理の終わりに、分離し、トリプシン処理した細胞を沈殿させ、結合バッファー中で再縣濁した。その後、細胞をアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩで暗い中で１５分、染色し、最終容量が５００μｌの結合バッファーで希釈し、フローサイトメトリー分析を行った。１試料につき、計１０，０００の事象が得られた（Vermes et al., 1995）。データの取得および分析は、FACS-Calibur フローサイトメーター (BD Biosciences, USA)で行った。結果は、少なくとも３つの別々の実験の平均±標準誤差で表される。
【００２８】
ｖ）MCF-7細胞を６ウェルプレートでＵＬ４代謝産物で処理し、５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃、２４、４８および７２時間培養した。２４、４８時間のそれぞれの培養後、培地中に分離した細胞を回収し、トリプシン処理した付着細胞へ戻した。細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、細胞１ｍＬ中に１：１の比のＡＯ(100 μg/mL)およびＰＩ(100 μg/mL) 、１０μｌで培養し、２００×ｇで５分再び遠心分離した。上澄みを吸引し、残留上澄み５０μｌとした。ペレットを再縣濁し、細胞縣濁液１０μｌをスライドガラスに滴下し、カバーガラスで覆った。３０分以内にスライドを蛍光顕微鏡(Nikon FC-35DX, Japan)で励起フィルターおよび４５０−４９０のバリアフィルターおよび５２０ｎｍのロングパスフィルターの組み合わせで観察した。生存能力のある細胞（緑の無傷細胞）、アポトーシス性細胞（凝縮または断片化した核を有する緑の収縮細胞）、および後期アポトーシス性細胞および壊死性細胞（赤い細胞）の割合が、統計的に有意なデータで＞２００細胞から測定された。
【００２９】
ｖｉ）UL4代謝産物で処理した細胞は、２４、４８および７２時間の培養後、採取した。分離しトリプシン処理した細胞を沈殿させ、氷冷８０％エタノール液滴で一滴ずつ固着し、分析まで（最小で２時間）４℃で培養した。その後、細胞を再沈殿し、PBS-BSA-Az-EDTA緩衝液で２回洗浄した。細胞をＤＮＡ断片を溶出するためにパルスボルテックス（pulse-vortexed）した。ＤＮＡ分析のために細胞を０．１％（ｖ／ｖ）Triton X-100、１０ｍＭEDTA、５０μｇ／ｍＬRNase A および２μｇ／ｍＬPIからなるＰＢＳ緩衝液で染色した。ＰＩが、光感受性のためこの工程は、暗所で行った。その後、細胞を４℃で３０分培養し、動物組織カルチャーラボラトリー、分子生物学科、バイオテクノロジーおよび生体分子学部、ユニバーシティプトラマレーシア（Animal Tissue Culture Laboratory, Department of Molecular Biology, Faculty of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University Putra Malaysia）のFACS-Caliburフローサイトメーター(BD Biosciences, USA)で２４時間以内に読み込んだ。試料ごとに１万の事象が取得された。算出前にダブレット（Doublets）および細胞破片は、ＤＮＡドットプロットビューでゲートオフ（gated off）した。細胞サイクル分布をCELLQuest Pro ソフトウェア(BD Biosciences, USA)を用いて算出した。実験は、各々の実験で３つの試料で少なくとも３回繰り返した。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
（ｖｉ）ＤＮＡラベリングは、BD バイオサイエンスAPO-DIRECT キットを用いて行った。細胞を６−ウェル組織培養プレートへ２×１０５セル／ウェルで播種した。２４時間後、培地を所望の濃度で、試験する被験抽出物を含む新しい培地で置き換えた。さらなる手順は、メーカーの指示に従って行った。培養後分離し、トリプシン処理した細胞を沈殿させ、１−２×１０６セル／ｍＬの濃度で、1% (w/v) パラホルムアルデヒドのＰＢＳ（pH 7.4）で再縣濁した。細胞縣濁液を３０−６０分氷上に置いた。その後、固着した細胞を５分間３００×ｇで遠心分離で回収し、上澄みを取り除いた。細胞ペレットを５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、緩やかに渦を巻く管内で残留ＰＢＳで再縣濁した。続いて細胞をエタノールで７０％（ｖ／ｖ）の氷冷エタノールで再縣濁し、氷上に最低３０分放置し、−２０℃で保存した。適切な保存期間（１−７日）後、細胞縣濁液を３００×ｇで５分遠心分離し、７０％ｖ／ｖエタノールを吸引した。細胞を１ｍＬの洗浄緩衝液で２回洗浄し、細胞ペレットを５０μｌのＤＮＡラベリング溶液で再縣濁した。
【００３２】
６０分の培養後、細胞を１ｍＬのリンス緩衝液で洗い流し、３００×ｇで、５分遠心分離することで沈殿させた。細胞ペレットは、０．５ｍＬのPI/RNase染色緩衝液で染色した。細胞を室温で３０分、暗い中で培養し、３時間以内に、CELLQuest Proソフトウェアを用いたFACS-Caliburフローサイトメトリ−によって分析した。試料ごとに１万の事象が取得され、ダブレットおよび細胞破片は、ＤＮＡドットプロットビューで算出前にゲートオフした。
結果は、平均±標準誤差で表され、一般線形モデル（General Linear Model）によって分析した。統計的分析をMinitab統計的ソフトウェア（Minitab Statistical Software）を用いてＰ＜０．０５の相違で行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【配列表】
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