(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  トラウストキトリアレス  エスピー（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）ファミリーに属する微細藻類を２５〜３５℃の温度で培養するステップと、
−  前記前培養培地または培養培地に、１リットルの培養培地当たり１〜１０００μｇのビタミンＢ１２を添加するステップと
を含むことを特徴とする前記トラウストキトリアレス  エスピー（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）ファミリーに属する微細藻類によりスクアレンを産生する方法。
【請求項２】
培養する温度が２８〜３２℃の間で選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養する温度が３０℃であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
以下：
・１リットルの培養培地当たり０．１ｍｇ〜２００ｍｇのビタミンＢ１、および／または・１リットルの培養培地当たり０．１ｍｇ〜２００ｍｇのビタミンＢ６
を添加することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記トラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）ファミリーの前記微細藻類が、シゾキトリウム  エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）、オーランチオキトリウム  エスピー（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）およびトラウストキトリウム  エスピー（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記トラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）ファミリーの前記微細藻類が、パスツール研究所の国立微生物培養コレクションに、Ｎｏ．ＣＮＣＭ  Ｉ−４４６９で寄託されたシゾキトリウム  エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  
ｓｐ．）、オーランチオキトリウム  エスピー（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ  ＰＲＡ  ２７６およびシゾキトリウム  エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ  ２０８８８、の菌株からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
得られる前記スクアレン含有量が、１００ｇの乾燥バイオマスに対して２ｇ以上であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
得られる前記スクアレン含有量が、１００ｇの乾燥バイオマスに対して２ｇ〜１２ｇであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記トラウストキトリアレス  エスピー（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）ファミリーに属する前記微細藻類の前記培養が、以下の一連のステップ：
−  エルレンマイヤーフラスコにおける、２８℃の温度での、寒天皿上の単離したコロニーからの２４〜３６時間の第１の前培養ステップと、
−  エルレンマイヤーフラスコにおける、２８℃の温度での、前記第１の前培養ステップからもたらされる１％（ｖ／ｖ）の接種での２４〜３６時間の第２の前培養ステップと、−  ３０℃での、最大で４５ｍｍｏｌ／ｌ／時間の酸素移動が観察されるようコンディショニングされた発酵槽における、前記第２の前培養ステップからもたらされる０．５％〜２％（ｖ／ｖ）の接種での６０〜１５０時間の培養ステップと
により実施されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビタミンＢ１２の添加が、ビタミンの総含有量が１〜１０μｇ／培養培地１ｌとなるよう前記２つの前培養ステップで行われることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ビタミンＢ１およびＢ６もまた、ビタミンの総含有量が１００〜２００μｇ／培養培地１ｌとなるよう前記２つの前培養ステップで添加されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ビタミンＢ１２の添加が：
−  ビタミンの総含有量が１〜１０μｇ／培養培地１ｌとなるよう前記２つの前培養ステップで、
−  ビタミンの総含有量が約１０００μｇ／培養培地１ｌとなるよう前記産生ステップで行われることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ビタミンＢ１およびＢ６もまた：
−  ビタミンの総含有量が１００〜２００μｇ／培養培地１ｌとなるよう前記２つの前培養ステップで、
−  ビタミンの総含有量が１５０〜２００ｍｇ／培養培地１ｌとなるよう前記産生ステップで
添加されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）の微細藻類からの発酵によるスクアレンの製造を最適化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の目的上、「トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）の微細藻類」という表現は、シゾキトリウム  エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）、オーランチオキトリウム  エスピー（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）およびトラウストキトリウム  エスピー（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）に属する微細藻類を意味することが意図されている。
【０００３】
スクアレンは、３０個の炭素原子および５０個の水素原子を含む、式：２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサ−ヘキセンのトリテルペン（イソプレノイド）である。
【０００４】
これは、ヒトを含むすべての高等生物において天然に生じる脂質である（皮脂において見出される）。スクアレンは、実際には、コレステロール、ステロイドホルモンおよびビタミンＤの生合成における重要な中間体である（コレステロール代謝経路の酵素（スクアレンモノオキシゲナーゼ）は、スクアレン分子の一端部を酸化することにより環化を誘引してラノステロールをもたらし、これがコレステロールおよび他のステロイドに変換されることとなる）。
【０００５】
工業的には、スクアレンは、食品分野、化粧品分野および薬学分野において特に用いられる。
【０００６】
栄養補助食品としては、スクアレンは通常カプセルまたは油として配合される。
【０００７】
化粧品分野においては、この分子は、脂肪の跡または脂っぽさを残すことなく直ぐに皮膚に浸透し、他の油およびビタミンと良好に混合される保湿クリームにおいて、抗酸化剤、帯電防止および皮膚軟化剤として用いられることが可能である。
【０００８】
この分野においては、スクアレン（６つの不飽和性）のきわめて低い安定性のために、スクアレンは飽和されてスクアレンよりも良好な抗酸化剤であるスクアラン（水素化によって得られる）を形成し、これは、一般にきわめて高い純度レベル（９９％）で市場において見出されることに留意すべきである。
【０００９】
毒性に関する研究では、化粧品において用いられている濃度では、スクアレンおよびスクアランは全く毒性を示さず、ヒトの皮膚に対する刺激物でも感作物質でもないことが示されている。
【００１０】
薬学分野においては、スクアレンはワクチンの補助剤として用いられる。
【００１１】
これらの補助剤は、免疫系を刺激し、ワクチンに対する応答を高める物質である。
【００１２】
スクアレンは、ワクチンを免疫原性とするために、１９９７年から、インフルエンザワクチン（季節性インフルエンザに対するＣｈｉｒｏｎ社製のＦｌｕａｄ）において、一投与量当たりおよそ１０ｍｇのスクアレンで、ワクチン投与物質に添加されるエマルジョンの形態で用いられている。
【００１３】
スクアレンを含有するすべてのワクチンと同様、これらのエマルジョンは乳白色の外観を有する。
【００１４】
スクアレンはまた：
−  Ｇｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ社によって、２００９年におけるインフルエンザの流行に対するＰａｎｄｅｍｒｉｘおよびＡｒｅｐａｎｒｉｘワクチンにおいて用いられたＡＳ０３アジュバント系の特許取得された構成成分として、
−  Ｎｏｖａｒｔｉｓ社によって用いられたＭＦ５９アジュバント系の特許取得された構成成分として、
新興のウイルスＨ５Ｎ１、次いで、２００９  Ｈ１Ｎ１を標的とする特に実験用ワクチン、抗マラリア剤またはインフルエンザワクチンのワクチンアジュバントとして用いられる。
【００１５】
スクアレンはまた、メモリーＣＤ４細胞の産生を介してヒトの身体の免疫応答を刺激するためにインフルエンザワクチンに添加されている。
【００１６】
これは、季節性インフルエンザウイルス抗原と組み合わされて市場に出されたインフルエンザワクチン用の最初の水中油型アジュバントである。
【００１７】
この応用分野においてスクアレンの純度レベルは重要である。
【００１８】
実際に、経口摂取される場合、スクアレンは完全に安全であると考えられるが；しかしながら、注射経路は議論の対象となる。
【００１９】
実際に、医学分野においては、このアジュバントは当然のようにその不純物に対しても強い免疫応答を誘起してしまうことが可能であるために、スクアレンが不純物により汚染されている場合に、ヒトレシピエントに対する有害性リスクが高まってしまう場合がある。
【００２０】
従って、スクアレンは不純物（微量の金属、特に水銀、および他の毒素）を含有しない高品質のものであることが重要である。
【００２１】
一定数のスクアレンの製造経路が文献において提案されている。
【００２２】
これは、深海鮫などの軟骨魚類の肝臓に蓄えられていることが見出されることの多い化合物である（よってこの名とされている）。
【００２３】
従って、これが乱獲される１つの理由であるが、鮫は鰭を採るために既に漁の対象とされている。鮫の肝臓は、現在、「健康によい」と表現されるゲルカプセルの製造用に販売されている。
【００２４】
しかしながら、それ故、市販されているスクアレンは主に鮫の肝臓から抽出されているが、健康上の問題が存在している。
【００２５】
これは、鮫は、ヒトに有害な物質を産する可能性がある病原菌に感染している可能性があるためである。加えて、生体の解毒および精製器官である鮫の肝臓は、ヒトに有害であるカーチャトキシン（ｃａｒｃｈａｔｏｘｉｎ）などの毒素を含有している場合がある。
【００２６】
これらの環境問題（鮫の生息数の大幅な減少）および健康上の問題（魚の肝臓もまた健康に関する懸念材料である毒素を有する）により、これを植物から抽出することが促されている。
【００２７】
それ故、オリーブ油およびヤシ油、ならびに、穀類からの他の油またはアマランス、種子、米ぬかまたはコムギ麦芽に由来する他の油からこれを単離することが可能である。
【００２８】
しかしながら、この場合における主な欠点は、スクアレンは、約０．１％〜０．７重量％ときわめて少量でしか抽出されないことである。
【００２９】
鮫の肝臓または植物からのこれらの抽出方法の最初の代替として、微生物：天然酵母または組み換え型酵母、特にサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）タイプからスクアレンを生成するための最初の方法が提案されているが、相当量の濃縮および精製方法が行われるために経済的ではなくなってしまう場合が多い。
【００３０】
そして、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がスクアレンを産生することが可能であることが知られているが、しかしながら、その量は、約０．０４１ｍｇ／バイオマス１ｇときわめて少量である（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ、Ｐ．ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７、ｐｐ．８１１−８１６）。
【００３１】
従って、遺伝子組み換えによってこれらの産生能を最適化するための研究が行われている。
【００３２】
スクアレンを産出する組み換え型酵母は、それ故、以下の利点を有する。
−  宿主細胞と同一のＧＲＡＳ（一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ））ステータスによる利点を有する、
−  宿主細胞と同様に病原菌、プリオンまたは毒素を含まない、および
−  ワクチン分野において既に使用実績がある（Ｂ型肝炎抗原を含有するベクターを発現するこれらの酵母など）。
【００３３】
しかしながら、医学分野について国際公開第２０１０／０２３５５１号パンフレットによって提示されているとおり（ワクチンアジュバントとしての９７％を超える純度を有するスクアレンの生産）、この最初の代替は、組み換え型酵母によりスクアレンを過剰産出させる（乾燥細胞の１５重量％超）ことが可能である場合にのみ工業化が可能である。
【００３４】
実際のところ、これらの組み換え型細胞を得るためには、分子生物学的ツールを用い、スクアレン生合成経路の刺激およびスクアレン異化反応経路の阻害をもたらす数多くの面倒で、時間がかかり、複雑な代謝工学ステップを実施する必要がある。
【００３５】
実際に、前記国際公開第２０１０／０２３５５１号パンフレットを再度引用すると、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ピロホスホメバロン酸デルカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、ＨＭＧＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ）およびスクアレンシンセターゼを含む多くの遺伝子がスクアレン生合成に関与している。
【００３６】
異化反応経路については、遺伝子が、スクアレンエポキシダーゼ（ＥＲＧ１）、ラノステロールシンセターゼ、Ｃ１４−ジメチラーゼ、ｄ１４−レダクターゼ、Ｃ４−メチルオキシダーゼ、Ｃ４−デルカルボキシラーゼ（ＥＲＧ２６）、３−ケトレダクターゼ、Ｃ２４−メチルトランスフェラーゼ、Ｃ８−イソメラーゼ、Ｃ５−デサチュラーゼ、ｄ２２−デサチュラーゼおよびｄ２４−レダクターゼを含む、スクアレンのエルゴステロールへの変換に関与する数多くの酵素をコードする。
【００３７】
しかも、ＬＥＵ２（β−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素）、オキシドスクアレンシクラーゼ、ジモステロール−２４−メチルトランスフェラーゼおよびエルゴスタ−５，７，２４（２８）−トリエノール−２２−脱水素酵素といった他の分解酵素もまた考慮されなければならない。
【００３８】
鮫の肝臓または植物からの抽出方法の第２の代替として、トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）（トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属を含む）、特にシゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）またはシゾキトリウムリマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）の微細藻類からスクアレンを生産する有望な方法が提案されている。
【００３９】
これらの微細藻類は、従属栄養的条件下（暗中；炭素源としてのグルコースの供給）でスクアレンを産生し、従って、微生物発酵分野における当業者により容易に操作され得る。
【００４０】
従って、これらの方法は、制御された発酵条件によって、食品、化粧品および医学的な要求を満たすための精製を容易に行うことが可能であるスクアレンの品質を提供する。
【００４１】
しかしながら、これらのトラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）の微細藻類において、スクアレンは、ω３族の多価不飽和脂肪酸である、ドコサヘキサエン酸（またはＤＨＡ）などの対象である他の脂質化合物の副産物である。
【００４２】
それ故、スクアレンは、市販のＤＨＡ油の不鹸化性画分の成分の一種として特に記載される（カロチノイドおよびステロールと共に）と考えられる。
【００４３】
比較として、シゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ１菌株は、０．０１７％のスクアレンに対して、細胞の乾燥重量基準で６．２％の割合でＤＨＡを産生する。
【００４４】
その結果、スクアレンを自然に産生するこれらの微生物は、その量は以下のように少量である。
−  トラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）ＡＣＥＭ  ６０６３（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００１、４３９−４４７を参照のこと）については約０．１ｍｇ／バイオマス１ｇ、
−  シゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ１（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、２００４、５２、ｐｐ．１１９６−１２００を参照のこと）については約０．１６２ｍｇ／バイオマス１ｇ。
【００４５】
産生を増加させるためには、従って、発酵条件を最適化することが重要であることが見受けられる。
【００４６】
Ｑｉａｎ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、２００９、５７、４２６７−４２７２による論文においては、スクアレンはステロール生合成の重要な中間体であり、スクアレンのステロールへの変換の第１のステップは酸素−依存スクアレンエポキシダーゼによって触媒されることが明記されている。
【００４７】
従って、溶存酸素に富む条件は、反対に、細胞内スクアレンを蓄積するために必要に応じて回避されるべきである。
【００４８】
それ故、低溶存酸素レベル（０〜５％飽和度）でのトラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）ＡＣＥＭ  ６０６３の培養により、１ｍｇ／ｇを上回るスクアレンを蓄積することが可能となり、一方で、より高い溶存酸素レベル（４０％〜６０％）での増殖では、０．０１ｍｇ／ｇのスクアレンの達成しか可能ではない。
【００４９】
同様に、１５℃の温度での培養は、トラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）ＡＣＥＭ  ６０６３によるスクアレンの産生は１．２ｍｇ／ｇであり、一方で、２０℃ではわずかに０．７ｍｇ／ｇである（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００１、３、４３９−４４７を参照のこと）。
【００５０】
Ｇ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１０、２７−４、ｐｐ．３８２−３８９による論文においては、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）はポリケチドシンターゼ（頭字語：ＰＫＳ）経路によってＤＨＡを主に産生するが、一方で、スクアレンは代わりにコレステロール生合成経路によって合成され、これは、これらの２種の化合物に対するトラウストキトリド（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）の栄養上の要求は異なっていることを意味することが想起される。
【００５１】
彼らの研究の目的は、従って、スクアレンの産生における種々の窒素源の効果を系統的に調べることであった。
【００５２】
それ故、Ｇ．Ｃｈｅｎらは、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）は、グルタミン酸ナトリウム、イースト菌抽出物およびトリプトンからなる窒素源の混合物を含有する培養培地中では、急速に増殖して「大」量のスクアレンを蓄積することが可能であることを見出した。
【００５３】
これに関わらず、このスクアレンの「大量」の産生は完全に相対的である。
【００５４】
これらの著者らは、基準となる培養培地の値と比して、スクアレン含有量および収率をそれぞれ２６．３％および１０．１％で顕著に増加させることに成功しているが、これらの最適化された条件は、実際には０．７２ｍｇ／ｇのスクアレン含有量および５．９０ｍｇｌ／ｌの滴定量をもたらす。
【００５５】
スクアレンの産生を最適化するという同一の目的で、Ｋ．Ｗ．Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１０、２６−３、ｐｐ．１３０３−１３０９では、スクアレンモノオキシゲナーゼ（ステロール生合成における重要な酵素）の抑制剤であるテルビナフィンヒドロキシクロリドが用いられている。
【００５６】
スクアレン含有量および収率は、微生物培養の熟成度に関連していることは公知である。
【００５７】
細胞培養の熟成度が高いほどスクアレンの蓄積は少なくなり；実際には、ステロール生合成経路における前記スクアレンの消費が増えてしまう。
【００５８】
従って、テルビナフィンは、ステロール経路に向かうこのスクアレンの消費を防止するよう作用し、従って、細胞内における対照に比して３６％〜４０％以下までのスクアレンの蓄積を促進させることが可能である。
【００５９】
しかしながら、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）について記載のもの（０．０４１ｍｇ／バイオマス１ｇ）よりもかなり高く、または、トルラスポラデルブリュッキイについて記載のもの（０．２４ｍｇ／バイオマス１ｇ）よりも高いが、この研究において用いられたオーランチオキトリウムマングローヴァイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ３菌株で達成された最も高いスクアレンの産生は、わずかに０．５３ｍｇ／バイオマス１ｇである。
【００６０】
しかも、この代謝経路の転換ではスクアレンが比較的多量にもたらされるが、これらの同一の細胞の脂質メンブランの産生に必須であるステロールの産生がこれにより限定されて、細胞が弱化するというリスクが伴う。
【００６１】
文献において報告されている微細藻類を用いる最高のスクアレン産生結果のうち、Ｃ−Ｊ  ＹｕｅおよびＹ．Ｊｉａｎｇ、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９、４４、９２３−９２７による論文には、代謝経路の重要な酵素であるスクアレンシンセターゼに直接的に作用することにより、スクアレン合成の前記代謝経路の変調にジャスモン酸メチルを用いる、１．１７±０．６ｍｇ／シゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）のバイオマス１ｇの最大スクアレン含有量が記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００６２】
それ故、成されたすべての試みに関わらず、これらの値は、オリーブ油に係る基準値（約４．２４ｍｇ／ｇ）よりもかなり低く、工業規模において要求される値に遠く及ばない。
【００６３】
従来技術において記載されているものよりもかなり効果的であると共にかなり経済的な産生方法の開発に関して、本出願人は、トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）の微細藻類に係る発酵条件の最適化に対して独自のリサーチを行った。
【課題を解決するための手段】
【００６４】
本発明は、従って、１００グラムの乾燥バイオマスに対して１グラムの規模、すなわちこの分野における文献において通常記載されているものの最大で１０００倍でスクアレンを得るための方法に関する。
【００６５】
本発明はまた、得られる発酵培養培地からのスクアレンを抽出および精製するための方法に関する。
【００６６】
シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の発酵によるスクアレンの産生
先ず、本出願人の功績は、発酵を制御するためのすべてのパラメータのうちの２種が、それら自体によって、これらの微細藻類におけるスクアレン産生レベルを顕著に増加させることが可能であることを見出したことである。
【００６７】
これらの２種の重要なパラメータは、培養培地の温度、ならびに、ビタミン、より正確にはビタミンＢ１およびＢ６、特にビタミンＢ１２の添加である。
【００６８】
従って、本発明は、以下のステップ：
−  トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）に属する微細藻類を２５〜３５℃、好ましくは２８〜３２℃、より好ましくは約３０℃の温度で培養するステップと、
−  培養培地に、１リットルの培養培地当たり１〜１０００μｇのビタミンＢ１２を添加するステップと
を含むことを特徴とするトラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）に属する微細藻類によりスクアレンを産生する方法に関する。
【００６９】
好ましくは、本明細書中以下に記載するとおり、本出願人は：
・１リットルの培養培地当たり０．１ｍｇ〜２００ｍｇのビタミンＢ１、および／または
・１リットルの培養培地当たり０．１ｍｇ〜２００ｍｇのビタミンＢ６
を添加することを推奨する。
【００７０】
当然のように、この方法は、スクアレン富化バイオマスを回収するステップおよび／またはスクアレンを回収もしくは抽出するステップを含んでいることが好ましい。
【００７１】
より具体的には、以下の市販されている菌株をテストした：
−  ＡＴＣＣ  ２０８８８と称されるシゾキトリウム  エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）、
−  ＡＴＣＣ  ＰＲＡ  ２７６と称されるオーランチオキトリウム  エスピー（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）。
【００７２】
しかも、本出願人はまた、自身の産生菌株である、２０１１年４月１４日に、フランスにおいて、パスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ）のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］にＮｏ．ＣＮＣＭ  Ｉ−４４６９で寄託し、および、中国においても、武漢大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｕｈａｎ）、Ｗｕｈａｎ  ４３００７２、Ｐ．Ｒ．ＣｈｉｎａのＣＨＩＮＡ  ＣＥＮＴＥＲ  ＦＯＲ  ＴＹＰＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮに、Ｎｏ．Ｍ  ２０９１１８で寄託したシゾキトリウム  エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）を有する。
【００７３】
また、本明細書中以下において例示するとおり、シゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）の菌株を対照としてテストした。
【００７４】
特に、本発明による方法では、１００ｇの乾燥バイオマスに対して２ｇ以上、好ましくは１００ｇの乾燥バイオマスに対して２〜１２ｇのスクアレン含有量を達成することが可能である。特に、産生されたスクアレンの定量化は、実験の段落において詳述されている方法に従って実施され得る。
【００７５】
本発明による方法において、従って、第１の重要な特徴は、微細藻類の培養およびそのスクアレン産生の両方を行う温度の選択である。
【００７６】
それ故、温度は２５〜３５℃、好ましくは２８〜３２℃、より好ましくは約３０℃で選択される。
【００７７】
従って、本出願人は、これらの微細藻類は２５℃以下で培養すべきことが必要であるとする第１の技術的な予想を打開した。
【００７８】
実際に、トラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）におけるスクアレンの産生に関する上記に言及した論文のほとんどにおいて、産生温度は、研究対象の微細藻類の増殖温度に基づいて設定されており、すなわち１５℃、２２℃または２５℃に設定されていた。
【００７９】
本発明の方法によれば、本出願人は、対照的に：
−  細胞バイオマスによって産生されるスクアレン濃度が３３℃以下の温度で増加する一方で、３０℃を超えると、バイオマスの量が顕著に低減し、それ故、スクアレン滴定量が限定され、
−  ２５℃の温度では、スクアレン濃度は検出不可能であるかきわめて低い
という点に留意することができたため、これらの微細藻類を２８および３２℃で培養することを推奨する。
【００８０】
この温度範囲は、従って、微細藻類の最適な培養のための温度と、効果的なスクアレンの産生のための温度との間の中間である。
【００８１】
従って、２５℃以下の温度は、従来技術において通例用いられるものとは対照的に、スクアレン産生を最良に促進させる温度ではない。
【００８２】
本発明による方法において、第２の重要な特徴は、スクアレンの産生のためにシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）培養培地に供給されるビタミンＢ１２の量であって、すなわち、１リットルの培養培地当たり１〜１０００μｇのビタミンＢ１２の割合である。
【００８３】
好ましくは、このビタミンＢ１２の添加を：
・１リットルの培養培地当たり０．１ｍｇ〜２００ｍｇのビタミンＢ１、および／または
・１リットルの培養培地当たり０．１ｍｇ〜２００ｍｇのビタミンＢ６
で補うことが可能である。
【００８４】
上記の微細藻類によるスクアレンの産生に関する文献において、ビタミンの役割は考慮されていない。ビタミンの供給は、イースト菌抽出物を添加することにより簡便に行われる。
【００８５】
実際には、当業者には、これらのビタミンはイースト菌抽出物中に：
−  ５０〜１２０ｍｇ／ｋｇのビタミンＢ１（チアミン）、
−  ４０〜８０ｍｇ／ｋｇのビタミンＢ６（ピリドキシン）、
−  １〜５．５μｇ／ｋｇのビタミンＢ１２（シアノコバラミン）
（これらの３種のビタミンＢは単なる例である）
の割合で自然に存在していることは周知である。
【００８６】
しかしながら、培養培養培地に導入されるイースト菌抽出物の供給はわずかに１００ｍｌの培養培地に対して１〜２ｇであり（上記に列挙した科学論文を参照のこと）、これは、きわめて少ないビタミン投与量である（例えば、ビタミンＢ１２に関しては、このイースト菌抽出物によるビタミンＢ１２の供給は０．０７μｇ／ｌに相当する）。
【００８７】
それはさておき、本書面は、微細藻類におけるスクアレンの産生のためのビタミンＢ１、Ｂ６またはＢ１２の含有量の制御を記載するものでも示唆するものでもない。
【００８８】
いかなる理論によっても束縛されることはないが、本出願人は、スクアレンの産生におけるビタミンＢ１２の主な役割は（本明細書中以下において例示するとおり）、スクアレン生合成に関与する重要な酵素のいくつかの補助因子としての関与が示唆されることを見出した。
【００８９】
ビタミンＢ１に関して、これはロイシン分解経路を刺激し、これが細胞内のスクアレン前駆体の量を増加させ、および、ビタミンＢ６は、シトクロムの作用を改変することにより、スクアレン分解を防止するであろう。
【００９０】
本出願人は、従って、ビタミンＢ１２の供給は、２８℃および３０℃とした温度と共に、スクアレンの産生を顕著に増加させる（１ｇ／１００ｇの乾燥バイオマスの規模で）ために重要であり、ならびに、ビタミンＢ１およびＢ６の供給により、実際には、本明細書中以下において実証するとおり、スクアレン産生能を特に増加させることが可能となることを見出した。
【００９１】
本発明による方法の他の特徴は、ビタミンの添加は、産生フェーズにおいてのみならず、発酵プロセスを通して、または、そのステップのいくつかの最中において行われることが可能であることである。
【００９２】
しかしながら、発酵プロセス全体を通して１〜１０００μｇ／ｌのビタミンＢ１２の供給が維持されなければならない。
【００９３】
従来において、実験で実施される微細藻類によるスクアレン産生条件を最適化するための研究に関連する文献においては、発酵は従来の微生物の接種および産生連鎖に基づいて実施されており、これは、最も一般的に作業が行われてきた産生条件である。
【００９４】
トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）からのスクアレンの産生は、実際には：寒天皿上の単離したコロニーから開始され、菌株を活性化するために前培養し、最後に、それ自体の培養（＝産生）といった３つの連続したステップを必要とする。
【００９５】
例えば、上記のＧ．Ｃｈｅｎによる論文には、以下の連続的なステップを含む方法が記載されている。
−  グルコース、グルタミン酸ナトリウム、イースト菌抽出物および種々の微量元素を含む寒天栄養培養培地上で維持した菌株から開始し、
−  活性化されたバイオマスを得るために、オービタルシェーカ上のエルレンマイヤーフラスコ中において、ｐＨ６、２５℃の温度で、前培養培地を調製し、
−  前培養において用いられたものと同一の培養培地を有する他の系列の産生エルレンマイヤーフラスコに、約０．５％（ｖ／ｖ）の前段のステップにおいて得られたバイオマスを接種し、温度を２５℃に維持する。
【００９６】
実際のところ、前記論文において読み取ることが可能であるとおり（これは、この分野における他の論文においても当てはまることが判明している）、専門家は、発酵条件を最適化するために、後述の培養ステップで作業する。
【００９７】
換言すると、従来技術における最適化研究は、スクアレンの産生に対する産生培養培地の１種以上の成分を変更した場合の影響を研究するために、この成分を変更することを含む。
【００９８】
しかしながら、本明細書中以下において展開されるとおり、本出願人は、対照的に、工業規模における実施がより複雑であることが判明していても、第１のステップから発酵条件を制御することを推奨する。
【００９９】
この規模では、実際には、接種連鎖は、実際の産生ステップに先だつ一連の数回の前培養ステップから構成されていることが可能である。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
本発明による方法の好ましい一実施形態は、従って、以下の一連のステップ：
−  エルレンマイヤーフラスコにおける、２８℃の温度での、寒天皿上の単離したコロニーからの２４〜３６時間のトラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）の微細藻類の第１の前培養ステップと、
−  エルレンマイヤーフラスコにおける、２８℃の温度での、第１の前培養ステップからもたらされる１％（ｖ／ｖ）の接種での２４〜３６時間の第２の前培養ステップと、
−  ３０℃での、最大で４５ｍｍｏｌ／ｌ／時間の酸素移動容量が観察されるようコンディショニングされた発酵槽における、第２の前培養ステップからもたらされる０．５％〜２％（ｖ／ｖ）の接種での６０〜１５０時間の培養ステップと
から構成され得る。
【０１０１】
この連鎖においては、操作条件に応じて、本明細書中以下において例示するとおり、ビタミンの添加は、単一の前培養ステップで、２つの前培養ステップで、または、培養連鎖を通じて実施され得る。
【０１０２】
本明細書中以下において実証されるとおり、単一の前培養ステップにおけるビタミンの添加によってすでに顕著な結果を得ることが可能となっており、最適なモードでは、すべてのステップにおける添加を実施することが必要とされる。
【０１０３】
微細藻類の増殖に要求される炭素源はグルコースであることが好ましい。
【０１０４】
従って、本出願人は、供給されるグルコースの総量が１５％〜２２．５重量％となるよう、グルコースの添加を制御することを推奨する。
【０１０５】
それはさておき、選択されるシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）菌株について本明細書中以下において例示するとおり、８重量％以下のゼロではないグルコース残存含有量で作業することが好ましい。
【０１０６】
窒素源の性質に関して、本出願人は、イースト菌抽出物、尿素、グルタミン酸ナトリウムおよび硫酸アンモニウムからなる群から単独で、または、組み合わせで選択することが可能であることを見出した。
【０１０７】
従来技術における方法において慣習的に用いられているイースト菌抽出物、５ｍｌ／ｌで用いられるＳｉｇｍａ社により販売されているＢＭＥ反応混液などのビタミン反応混液が加えられた尿素を選択することが可能である。
【０１０８】
同様に、尿素を、グルタミン酸ナトリウムで完全にもしくは部分的に置き換えること、または、グルタミン酸ナトリウムと硫酸アンモニウムとの混合物を用いることが可能である。
【０１０９】
本出願人は、硝酸形態の窒素源を用いないことを特に推奨する。
【０１１０】
培養培地のｐＨに関して、本明細書中以下において例示するとおり、これは、５．５〜６．５、好ましくは６の固定値で維持されることとなる。
【０１１１】
ｐＨは、例えば２Ｎ硫酸、次いで、８Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによる、当業者に公知であるいずれかの手段により調節され得る。
【０１１２】
最後に、溶存酸素含有量は、２０％〜０％の値で調節され、０％で放置される前に、好ましくは、２４または４８時間、好ましくは３６時間の最初の期間の間５％で維持され得る。
【０１１３】
酸素移動容量に関して、これは、さらに、４５ｍｍｏｌ／ｌ／時間を超えることがないよう、当業者に公知のいずれかの手段によって調節されることとなる。
【０１１４】
本明細書中以下において例示するとおり、発酵の終了時にこれらの操作条件下で得られるバイオマスは、５０ｇ／ｌ超であり、好ましくは５０〜１００ｇ／ｌ、約８０ｇ／ｌである。
【０１１５】
スクアレン含有量に関しては、１００ｇの乾燥バイオマスに対して１ｇ超、好ましくは１００ｇの乾燥バイオマスに対して２〜１５ｇ、さらに好ましくは１００ｇの乾燥バイオマスに対して５〜１０ｇである。
【０１１６】
発酵培養培地からのスクアレンの抽出および精製
バイオマスは、それ自体が当業者に公知であるいずれかの方法によって発酵培養培地から回収され、例えばバイオマスは、発酵槽から取り出され、精密ろ過もしくは遠心分離によって単に濃縮されるか、または、水溶液による一連の濃縮−希釈を介して洗浄され得る。
【０１１７】
脂質内容物を抽出するための細胞の破壊は、機械的、化学的または酵素的経路といった種々の経路で実施され得る。
【０１１８】
数回にわたる順次の抽出において、ヘキサン／エタノールで細胞ライセートから油が抽出される。
【０１１９】
ヘキサン画分が分離され、次いで、原油が単離されるようヘキサンが蒸発される。
【０１２０】
最後に、本発明は、医学分野、化粧品分野および食品分野向けの組成物の調製における、本発明の方法のいずれか１つにより産生されたスクアレンの使用に関する。それ故、本発明は、本発明の方法のいずれか１つによるスクアレンの産生、次いで、医学分野、化粧品分野および食品分野向けの組成物の調製を含む医学分野、化粧品分野および食品分野向けの組成物の調製方法に関する。
【０１２１】
本発明は、例示であると共に非限定的であることが意図される以下の実施例によってより明白に理解されるであろう。
【実施例】
【０１２２】
実施例１：スクアレン産生に対する、ビタミンＢ１、Ｂ６およびＢ１２の添加の研究、ならびに、温度の影響の研究
前培養および培養培養培地
ここでは、実際の培養／産生フェーズに先だつ２回の事前の連続した前培養フェーズで微細藻類の発酵を行った。
【０１２３】
この実験に関して、ビタミンは第１の前培養培地に添加したが、第２の前培養培地および産生への添加は任意とした。
【０１２４】
従って、前培養培養培地は、以下の表ＩおよびＩＩに記載の組成を有していた。
【０１２５】
【表１】
0005959628.tif 000002
【０１２６】
【表２】
0005959628.tif 000003
【０１２７】
一般に、Ｃｌｅｒｏｌ  ＦＢＡ３１０７消泡剤を１ｍｌ／ｌで用いた。
【０１２８】
任意により、５０ｍｇ／ｌのペニシリンＧナトリウム塩を用いて汚染細菌の増殖を防止した。
【０１２９】
ＫＨ２ＰＯ４で、グルコースを残りの培養培地とは別に滅菌し、これにより、沈殿物（マグネシウム−アンモニウム−リン酸）の形成を防止した。
【０１３０】
ビタミン混合物および微量元素を滅菌ろ過の後に添加した。
【０１３１】
培養／産生培養培地の組成が以下の表ＩＩＩにより記載されている。
【０１３２】
【表３】
0005959628.tif 000004
【０１３３】
ビタミン混合物および微量元素の組成が以下の表ＩＶおよびＶに記載されている：
【０１３４】
【表４】
0005959628.tif 000005
【０１３５】
【表５−１】
0005959628.tif 000006
【０１３６】
発酵の実施
第１の前培養は、Ｃｏｇｎｉｓ  ＧｍｂＨ  Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ社製のＣｌｅｒｏｌ  ＦＢＡ  ３１０７消泡剤を滴下した５００ｍｌバッフル付エルレンマイヤーフラスコで実施した。
【０１３７】
その構成成分を完全に溶解させた後に培養培地をろ過し、任意により、ペニシリンＧナトリウム塩を０．２５ｍｇ／ｌの割合で追加した。
【０１３８】
ペトリ皿中で培養した微細藻類のコロニーと採ることにより接種を行った（１つの１０μｌループの割合で）。
【０１３９】
インキュベーションを、２８℃の温度で、１００ｒｐｍで振盪しながら（オービタルシェーカで）２４〜３６時間行った。
【０１４０】
バイオマスは沈殿する（または、壁に付着する）ため、エルレンマイヤーフラスコをよく振盪した後に３〜５ｍｌのサンプルを採取するよう注意した。
【０１４１】
第２の前培養に対しては、管を取り付けた２リットルのバッフル付エルレンマイヤーフラスコを用いた。
【０１４２】
１滴の消泡剤およびイースト菌抽出物を１００ｍｌの水に添加した。
【０１４３】
培養培地の構成成分のすべてを３００ｍｌの脱イオン水中に溶解させた後にろ過した。任意により、ペニシリンＧナトリウム塩を添加すること、および、その滅菌に先だって、事前にエルレンマイヤーフラスコに１滴の消泡剤を添加することが可能であった。
【０１４４】
次いで、接種を３〜５ｍｌの第１の前培養培地で行った。
【０１４５】
インキュベーションを、２８℃で、さらに２４〜３６時間、１００ｒｐｍで振盪しながら行った。
【０１４６】
実際の培養は、２０ｌ反応器中で以下の方法により行った：
−  反応器中の培養培地の一部、および、沈殿物の形成が防止されるよう別個に他の部分を滅菌し
−  第２の前培養の終了時に産生されたバイオマスを、培養培地の０．５％ｖ／ｖの割合で用いて接種を行い、
−  培養を３０℃で維持し、
−  酸素移動速度を３５〜４０ｍｍｏｌ／ｌ／ｈで固定し、
−  ０．２〜０．３ＶＶＭでエアレーションし、
−  初期ｐＨ＞５．５とし、
−  １５〜７０ｇ／ｌのグルコース濃度が維持されるよう、濃度が＞２０％となったらすぐにグルコースを供給した。
【０１４７】
以下の表に、本出願人のシゾキトリウム  エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）で得られた結果が記載されている。
【０１４８】
この表には：
−  スクアレンの産生に対する温度の効果（２つの前培養操作：テスト「Ｂ」および「Ｃ」においてのみビタミンは添加）、ならびに
−  ビタミンの添加を伴わない標準（テスト「Ａ」）と比した、前培養ステップおよび産生ステップ（テスト「Ｄ」および「Ｅ」）におけるビタミンＢ１、Ｂ６およびＢ１２の添加の効果
が記載されている。
【０１４９】
２５℃での追加的なビタミンの添加を行わなかった対照もまた実施した。
【０１５０】
【表５−２】
0005959628.tif 000007
【０１５１】
文献の従来の条件下での対照「Ａ」では、テストした微細藻類菌株について、検出可能な量のスクアレンが産生されなかったことに留意すべきである。
【０１５２】
テスト「Ｂ」および「Ｃ」：
前培養操作における２８℃の前培養温度、ならびに、ビタミンＢ１、Ｂ６およびＢ１２の存在では、１００ｇのバイオマスに対して約１ｇのスクアレン産生（テスト「Ｂ」）、（すなわち、文献において記載されているもののおよそ１０００倍超（例えば、トラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）ＡＣＥＭ  ６０６３またはＳ．マングローヴァイ（Ｓ．ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ１によるスクアレンの産生について））をもたらすことが既に可能であった。
【０１５３】
テスト「Ｄ」および「Ｅ」：
すべての培養ステップ（２つの前培養操作および産生）におけるビタミンの添加と組み合わせた温度の効果は顕著である。テスト「Ｄ」では、温度を２５℃のままとした場合、１００ｇのバイオマスに対して３．３ｇのスクアレンの産生が可能であり、これは、温度を３０℃にしたテスト「Ｅ」では、８．２ｇ／ｌに増加した。
【０１５４】
相当量のビタミンＢ１、Ｂ６およびＢ１２の添加を組み合わせた２５℃超の温度での発酵条件の実施では、従って、最高のスクアレン収率および産生能を達成することが可能となる。
【０１５５】
シゾキトリウム  エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）バイオマスにおけるスクアレンの定量化方法
バイオマスのビーズによる破壊およびクロロホルム／メタノールでの冷抽出後に、分析を２５℃でプロトンＮＭＲにより実施した。定量化は、以下に記載のとおり内標準により実施した。
【０１５６】
スペクトルを、４００ＭＨｚで操作されるＡｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ４００分光計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｐｉｎ）で得た。
【０１５７】
バイオマスの破壊：およそ２００ｍｇの新鮮なバイオマスを正確に計量する。およそ１〜１．５ｃｍのガラスビーズおよび０．１ｍｌのメタノールを加える。チューブを気密封止し、ボルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ）ミキサにより少なくとも５分間撹拌する。
【０１５８】
冷抽出：およそ２ｍｇのトリフェニルリン酸（ＴＰＰ）、０．９ｍｌのメタノールおよび２ｍｌのクロロホルムを添加する。チューブを気密封止し、ボルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ）ミキサにより１分間撹拌する。冷蔵庫に入れる。沈殿による分離の後（最低で１時間）、透明な上方相を注意深く回収し、これをガラスジャーに移し、周囲温度で、窒素流下に乾燥するまで蒸発させる。乾燥した抽出物を０．５ｍｌのＣＤＣｌ３および０．１ｍｌのＣＤ３ＯＤに溶解させ、これをＮＭＲ管に移す。
【０１５９】
スペクトルの記録：機器を適切に設定した後、溶剤抑制を行わず、回転させず、少なくとも１５秒間の緩和時間で取得を行う。スペクトル窓は、７．２５ｐｐｍのクロロホルムピークで較正されたスペクトルで少なくとも−１〜９ｐｐｍの間でなければならない。マニュアルモードにおけるフーリエ変換、位相補正およびベースラインの減算（指数関数的増幅を伴わない、ＬＢ＝ＧＢ＝０）後にスペクトルを用いる。
【０１６０】
シグナルの使用：７．０５〜７．１５ｐｐｍのクロロホルムシグナルを含有しないＴＰＰ未解像ピークを値１００とする（９つのＴＰＰプロトンとして計数）。１．５５ｐｐｍでのスクアレンシグナルの面積を積分する（６つのプロトンとして一重項の計数）。計算および結果の表記：結果は、粗重量割合として表記した。
【数１】
0005959628.tif 000008
ここで、
Ａｓ：１．５５ｐｐｍでのスクアレンシグナルの面積。
ＰＴＰＰ：積分したＴＰＰ未解像ピークのプロトンの数：９
ＷＴＰＰ：計量したＴＰＰの重量（グラム）
ＭＴＰＰ：モル質量（グラム／ＴＰＰ１モル）（ＭＴＰＰ＝３２６ｇ／ｍｏｌ）
ＭＳ：モル質量（グラム／スクアレン１モル）（ＭＳ＝４１０ｇ／ｍｏｌ）
ＰＥ：新鮮なバイオマスの重量（グラム）
【０１６１】
実施例２：ビタミンＢ１、Ｂ６およびＢ１２の影響の研究
ここで行った実験の目的は、スクアレン収率および産生能におけるビタミンの相対的な重要性を考慮することであった。
【０１６２】
前培養培養培地の温度は２８℃で実施例１と同様に定義し、培養／産生培養培地の温度は３０℃で維持した。
【０１６３】
２つの実験系列を実施した：
−  種々の前培養ステップおよび産生ステップでのビタミンＢ１、Ｂ２およびＢ６の添加、
−  単独での、または、ビタミンＢ１およびＢ６と組み合わせたビタミンＢ１２の役割。全体的な培養条件は実施例１に記載のものであったが、しかしながら、培養の２％ｖ／ｖとした第２の前培養培地での接種に関して変更を行った。
【０１６４】
以下の表ＶＩには、本出願人のシゾキトリウム  エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ）の菌株で得られた結果が一緒に示されている。
【０１６５】
【表６】
0005959628.tif 000009
【０１６６】
テスト「Ｇ」、「Ｈ」および「Ｉ」：
−  テスト「Ｇ」については、スクアレンの産生が１００ｇの乾燥バイオマスに対して０．４ｇ（すなわち、４ｍｇ／バイオマス１ｇ）に達していることが示されており、これはＣ−Ｊ  ＹｕｅおよびＹ．Ｊｉａｎｇ、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９、４４、９２３−９２７による論文において得られている結果の３倍であり、すなわち、ジャスモン酸メチルの存在下で１．１７±０．６ｍｇ／ｇのシゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）バイオマスの最大スクアレン含有量である。
【０１６７】
−  この結果は、第２の前培養ステップの最中にもビタミンの供給を維持した場合にさらに顕著な値に達し（１００ｇの乾燥バイオマスに対して７．７ｇ）、および、このビタミンの添加を産生において再度実施した場合には１００ｇの乾燥バイオマスに対して９ｇに近い値に達した。
【０１６８】
テスト「Ｊ」および「Ｋ」に関して、これらは、ビタミンＢ１２の添加が、１００ｇのバイオマスに対して９ｇの値に達するために必要であり十分であることを特に実証する。
【０１６９】
この値は、ビタミンＢ６およびＢ１を第２の前培養培地に添加した場合には、さらに１００ｇの乾燥バイオマスに対して１０ｇに達する。
【０１７０】
テスト「Ｉ」とテスト「Ｊ」との間の差はスクアレン滴定量に関するものであることに留意すべきである：１００ｇの乾燥バイオマスに対して産生された９ｇのスクアレンについて、滴定量は「Ｉ」と比してテスト「Ｊ」において低く：ビタミンＢ１およびＢ６は、従って、この系の産生能を明らかに増加させることが可能であった（バイオマスを増加することにより）。
【０１７１】
比較例３：比較テスト
この実験の目的は、実施例１および２においてテストした操作条件は本出願人が保持する他のタイプの微細藻類にも適用可能であることを実証することである。
−  ＡＴＣＣ  ２０８８８と称されるシゾキトリウム  エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）
−  ＡＴＣＣ  ＰＲＡ  ２７６と称されるオーランチオキトリウム  エスピー（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）
【０１７２】
操作条件は、実施例２のテスト「Ｉ」と同等であった。
【０１７３】
対照：スクアレンの産生能に係る文献において従来用いられていた菌株：シゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）。
【０１７４】
以下の表ＶＩＩに得られた結果が記載されている。
【０１７５】
【表７】
0005959628.tif 000010
【０１７６】
テストした亜科種のすべてのトラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）について、スクアレン産生は１００ｇのバイオマス当たり２ｇ超であった。Ｓ．マングローヴァイ（Ｓ．ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）のものは、文献に記載のものに適合している（得られた最良の結果について）：２ｍｇのスクアレン／乾燥バイオマス１ｇ。
【０１７７】
実施例４：発酵により産生されたスクアレンに富む原油の入手
実施例１（テスト「Ｅ」）の終了時に得たバイオマスは、発酵の終了時に５４ｇ／ｌの濃度であった。
【０１７８】
発酵の終了時に得たスクアレン滴定量は４．４ｇ／ｌであった。
【０１７９】
バイオマスを発酵槽から取り出し、次いで、遠心分離により１２０ｇ／ｌに濃縮した。
【０１８０】
バイオマスを５０ｌタンクの中で１５０ｒｐｍで攪拌し続け、６０℃に加熱した。
【０１８１】
次いで、ｐＨを４５％水酸化カリウムで１０に調節した。
【０１８２】
アルカリ溶解を完了するために、これらの条件を６時間維持した。
【０１８３】
溶解の質を、光学顕微鏡で、および、サンプルの遠心分離（２分間、１００００ｇ）により監視した。
【０１８４】
溶解の終了時に、１０リットルのエタノール（１体積のエタノール／ライセートの体積）を４５℃に維持したタンクに添加し、１０分間撹拌した。
【０１８５】
次いで、１０リットルのヘキサンをタンクに添加して３０分間攪拌し続けた。
【０１８６】
次いで、軽質画分（ヘキサン＋油）を分離するために混合物を遠心分離し、これを１ｍ３タンクに保管した。
【０１８７】
重質（水性）相を再度１０リットルのヘキサンと一緒にし、抽出収率を高めるために、既述のものと同一のスキームに従って２回目の抽出を行った。
【０１８８】
ロータリーエバポレータにおいてヘキサンの蒸発を行うために２つの有機画分を組み合わせた。
【０１８９】
抽出した油のヘキサン残渣をワイパー付き薄膜式エバポレータにおける蒸発（８０℃；１ｍｂａｒ）により除去した。
【０１９０】
これにより原油を７０％の収率で回収した。
【０１９１】
【表８】
0005959628.tif 000011
【０１９２】
【表９】
0005959628.tif 000012
【０１９３】
【表１０】
0005959628.tif 000013