(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血球上の膜タンパク質に特異的に結合する少なくとも１つのドメインと結合している凝固因子を含む標的化凝固因子であって、該ドメインは、抗体フラグメント、抗体、ＲＧＤペプチド、受容体リガンド、またはエプチフィバチドであり、該凝固因子は機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドであり、前記血球が血小板であり、前期膜タンパク質がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａである、標的化凝固因子。
【請求項２】
ドメインが抗体フラグメント、ＲＧＤペプチドまたはエプチフィバチドである、請求項１に記載の標的化凝固因子。
【請求項３】
ドメインがＲＧＤペプチドまたは抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体の一本鎖フラグメントである、請求項２に記載の標的化凝固因子。
【請求項４】
ドメインがＦＶＩＩＩのＢドメインに結合している抗体フラグメント、ＲＧＤペプチドまたはエプチフィバチドである、請求項１に記載の標的化凝固因子。
【請求項５】
血球が血小板であり、ドメインがＲＧＤペプチドまたは抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体の一本鎖フラグメントである、請求項４に記載の標的化凝固因子。
【請求項６】
治療有効量の請求項１に記載の標的化凝固因子および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項７】
血液病を処置するため、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
凝固因子を血球上の膜タンパク質に結合する少なくとも１つのドメインと結合させることを含む、凝固因子を血球の表面に標的化するためのインビトロでの方法であって、該ドメインは、抗体フラグメント、抗体、ＲＧＤペプチド、受容体リガンド、またはエプチフィバチドであり、該凝固因子は機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドであり、前記血球が血小板であり、前期膜タンパク質がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａである、方法。
【請求項９】
ドメインが抗体フラグメント、ＲＧＤペプチドまたはエプチフィバチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ドメインがＲＧＤペプチドまたは抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体の一本鎖フラグメントである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ドメインがＦＶＩＩＩのＢドメインに結合している抗体フラグメント、ＲＧＤペプチドまたはエプチフィバチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
血球が血小板であり、ドメインがＲＧＤペプチドまたは抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体の一本鎖フラグメントである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
凝固因子がさらに血球の表面から放出される、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年５月１６日に出願された米国仮出願第６１／０５３，９３２号（これの内容は、その全体において出典明示により本明細書に包含させる）の利益を主張する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は増加した有効性を有する標的化凝固因子に関する。本発明はさらに、凝固因子を生物学的作用部位に選択的に標的化することにより、例えば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を赤血球および血小板に標的化することにより、凝固因子欠乏症に罹患している患者を処置する方法に関する。本発明の標的化凝固因子を含む医薬組成物も提供する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
生物学的薬物の有効性は、しばしば、特に疾患が薬物による持続的な調節を必要とするとき、患者における作用期間により限定される。結果として、薬物動態特性の増強は、しばしば、病院における治療剤の成功のために薬効の最適化よりも重要である。半減期を延長するようにクリアランスの種々のメカニズムから薬物を保護する１つの手段は、循環において長寿命のタンパク質、例えば、基質タンパク質への、または細胞、例えば、血球または内皮細胞の表面への薬物結合を促進する標的ドメインを加えることである。例えば、治療ペプチドまたはタンパク質の血球表面への局在化は、正常クリアランスメカニズムを防止することにより、それらの循環半減期を延長することが示されている（Chen, et al., Blood 105(10):3902-3909, 2005）。多種多様の分子が標的ドメインとして使用され得る。
【０００４】
別の例では、ダニ抗凝固性タンパク質のクニッツ(Kunitz)タイプのプロテアーゼインヒビター（ＫＰＩ）ドメインがアニオン性リン脂質、ホスファチジル−Ｌ−セリン（ＰＳ）結合タンパク質、アネキシンＶ（ＡＮＶ）と結合したとき、融合タンパク質（ＡＮＶ−ＫＰＩ）は非融合対照物よりも良い活性であり、高いインビボ抗血栓活性を有することを示した（Chen, et al., 2005）。ＡＮＶがＰＳおよびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）に対する強い親和力を有するため、融合タンパク質ＡＮＶ−ＫＰＩは血栓形成の部位に存在するＰＳ／ＰＥリッチアニオン性膜関連凝固酵素複合体を特異的に標的化することができると仮定される。同様に、Dong, et al., は、フィブリン選択的ナミチスイコウモリ唾液ＰＡα１（ｄｓＰＡα１）をウロキナーゼ（ｕＰＡ）／抗−Ｐ−セレクチン抗体（ＨｕＳＺ５１）に融合し、インビトロアッセイにおいて非融合対照物と同様の抗血栓活性で完全に機能性である融合タンパク質を生産したことを報告した。さらに、融合タンパク質ＨｕＳＺ５１−ｄｓＰＡα１は、トロンビン活性化ヒトおよびイヌ血小板に結合することが示された（Dong, et al., Thromb. Haemost. 92:956-965, 2004）。
【０００５】
他の試験によって、凝固を防止し、血栓症と関連する死亡率を減少させるための標的抗凝固剤が製造された（例えば、ＷＯ９４／０９０３４、参照）。因子Ｘａ（ＦＸａ）インヒビターであるダニ抗凝固性ペプチド（ＴＡＰ）は、血小板表面上に豊富に発現する糖タンパク質であるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ上のリガンド誘導結合部位（ＬＩＢＳ）に抗ＬＩＢＳ一本鎖抗体（ｓｃＦｖ抗−ＬＩＢＳ）を介して標的化させることが、最近の研究Stoll, et al., (Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27:1206-1212, 2007)により証明された。融合タンパク質ｓｃＦｖ抗−ＬＩＢＳ−ＴＡＰは、非標的化対照物が機能しない低い用量でさえ、有効な抗凝固活性を有することが示された。
【０００６】
前記標的化抗凝固剤は、特定の細胞を標的化するように設計された融合タンパク質であった。Stoll, et al., によると、標的化抗凝固剤は、抗体に融合されているが、非常に強い凝固阻害活性が維持されている小分子であるべきである。標的化部位における融合タンパク質からの抗凝固剤の放出は議論されていなかった。
【０００７】
本発明は、血液病、例えば、血友病の処置のための治療タンパク質の標的化に注目している。例えば、血友病Ａ患者のＦＶＩＩＩ濃縮物または組換えＦＶＩＩＩでの現在の処置は、これらの因子の高いコストおよび比較的短い作用期間により制限される。血友病Ａ患者は現在、要求に応じてＦＶＩＩＩの静脈内投与または１週間に数回の予防的治療投与により処置される。予防処置のために、ＦＶＩＩＩを１週間に３回投与する。残念ながら、この頻度は多数の患者に対して法外な費用がかかる。ヒトにおいて短い半減期であるため、ＦＶＩＩＩは頻繁に投与されなければならない。全長タンパク質に関して３００ｋＤ以上の大型サイズにもかかわらず、ＦＶＩＩＩはヒトにおいてわずか約１１−１８（平均１４）時間の半減期である（Gruppo, et al., Haemophila 9:251-260, 2003）。推奨される頻繁な投与をすることができる人でさえ、やはりタンパク質を頻繁に静脈内に注射することは非常に不便である。長い半減期を有し、投与頻度が少なくてよいＦＶＩＩＩ産物が開発されることが患者に対してより都合がよい。さらに、必要とされる投与量がより少なくなるため、半減期が増加すれば処置費用を減少させることができる。したがって、有効な用量を少なくするか、または長期作用期間を有し、血友病に対する処置の選択を大きく改善することができるＦＶＩＩＩのより有効な形態を得ることが望ましい。
【０００８】
また、標的化ＦＶＩＩＩの持続血漿濃度は、トラフ値をＦＶＩＩＩのピークレベルに低減し、したがって早期の時点にて超生理学的レベルのタンパク質を導入する必要性を除去することにより、副作用の程度を減少させ得る。したがって、現在市販されている形態よりも持続期間が維持され半減期の長いＦＶＩＩＩの形態を得ることが望ましい。
【０００９】
現在の治療のさらなる不利益は、約２５−３０％の患者がＦＶＩＩＩ活性を阻害する抗体を産生することである（Saenko, et al., Haemophilia 8:1-11, 2002）。抗体産生は補充療法としてのＦＶＩＩＩの使用を妨げるため、このグループの患者は、高用量の組換え第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）および免疫寛容療法でのさらに費用のかかる処置を探索することを強いられる。したがって、免疫原性の低いＦＶＩＩＩ代替品が望まれている。
【００１０】
血友病に対する処置の改善における１つの手段は遺伝子治療を含む。血小板におけるＦＶＩＩＩ発現を指向することによって血小板に異所的に標的化したＦＶＩＩＩは、血友病Ａの処置における治療効果を有することができる（Shi, et al., J. Clin. Invest. 116(7):1974-1982, 2006）。
【００１１】
本発明の目的は非標的化タンパク質と比較して作用期間の延長、より良い有効性、より少ない副作用およびより低い免疫原性を有する標的化凝固因子を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、所望の特定の作用部位に標的化されたタンパク質を有し、それにより望ましくない副作用をもたらし得る他の可能性のある生物学的に活性な部位へのタンパク質の暴露を減少させることにより、治療タンパク質の投与と関連する副作用を減少させることである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、治療タンパク質がインビボで作用部位のすぐ隣接にて標的ドメインから放出される標的化治療凝固因子を設計することにより、さらなる利点を得ることである。非融合の活性化タンパク質の高い局所濃度が達成され得る。したがって、タンパク質の治療有効性は増加する。
【発明の概要】
【００１４】
発明の概要
本発明の標的化凝固因子は、血球上の膜タンパク質に特異的に結合する少なくとも１つのドメインと結合した凝固因子を含む。新たに開示された標的化凝固因子を含む医薬組成物および標的化凝固因子を使用する血液病を処置するための方法も提供する。本発明はさらに、凝固因子にて血液病を処置する効率を増加させるために新たに開示された標的化凝固因子を使用することにより、凝固因子を血球の表面へ標的化するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１：全長ＦＶＩＩＩ（“全長ＦＶＩＩＩ）および標的ドメイン（“ＴＤ”）がＢドメインに挿入され、Ｂドメインの大部分が除去されているＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（“ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ−ＴＤ”）の概略図。
【図２】図２：Ｂドメインシステインを介してＦＶＩＩＩに結合するための、修飾された環状ペプチドインテグリリン“ＢＨＲＦ−１”（Ａ）および“ＢＨＲＦ−３”（Ｂ）の構造。
【図３】図３：固定化されたＧＰＩＩａ／ＩＩＩｂに対するＢＨＲＦ−１およびＢＦＲＨ−３の結合親和性。
【図４】図４：固定化されたＧＰＩＩａ／ＩＩＩｂに対するＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩ結合アッセイ。
【図５】図５：ＦＶＩＩＩと比較したＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩのインビトロ凝固活性。
【図６】図６：ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩのヒト血小板へのインビトロでの結合。
【図７】図７：ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩのマウス血小板へのインビトロでの結合。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の説明
本発明は、凝固因子をその作用部位、例えば、血球へ標的化することである。１つの態様において、因子が血球上の膜タンパク質に結合する少なくとも１つのドメインへ結合することを介して、血球へ特異的に標的化されている標的化凝固因子を提供する。凝固因子を血球へ標的化するためのドメインは、限定はしないが、血球の表面上の膜タンパク質に対する高親和性を有する抗体フラグメント、抗体、ペプチド、受容体リガンド、炭水化物または小分子であり得る。血球は、例えば、赤血球または血小板である。
【００１７】
本明細書において使用される“凝固因子”は、凝固カスケードに関与し、大部分が凝固促進活性を有するタンパク質を示す。凝固因子は当分野で既知であり、凝固因子Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩおよびＸＩＩＩならびにタンパク質Ｓを含むがこれらに限定されない。凝固因子は血漿から濃縮するか、または組換え的に生産され得る。組換え的に生産されるとき、凝固因子は、変異体が治療的に有効であるように十分な凝固促進活性が維持している限り、天然構造から変化しているアミノ酸構造を有し得る。１つの態様において、凝固因子は、機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド、例えば、限定はしないが、血漿由来のＦＶＩＩＩ濃縮物または組換え的に生産されたＦＶＩＩＩまたは因子ＩＸ（ＦＩＸ）である。
【００１８】
本明細書において使用される“機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド”は、インビボまたはインビトロにて、例えば、血友病Ａにより特徴付けられるヒトＦＶＩＩＩ欠乏を修正することが可能である機能性ポリペプチドまたはポリペプチドの組合せを示す。ＦＶＩＩＩは、天然状態における多数の分解物または加工された形態を有する。これらは前駆体の一本鎖タンパク質からタンパク質分解的に得られる。機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドは、このような一本鎖タンパク質を含み、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏を修正する生物学的活性を有するこれらの種々の分解産物も提供する。アレル変異体が恐らく存在する。機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドは、ヒトＦＶＩＩＩの機能性セグメントおよび必須の特徴的なヒトＦＶＩＩＩ機能活性を含む限り、ＦＶＩＩＩの誘導体となるすべてのこのようなアレル変異体、グリコシル化バージョン、修飾物およびフラグメントを含む。このような必要な機能活性を有するＦＶＩＩＩの誘導体は、本明細書に記載されている直接的インビトロ試験により容易に同定することができる。さらに、機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドは、因子ＩＸａ（ＦＩＸａ）、カルシウムおよびリン脂質の存在下でのＦＸａへの因子Ｘ（ＦＸ）の変換を触媒すること、ならびに血友病Ａ罹患個体由来の血漿における凝固障害を修正することが可能である。ヒトＦＶＩＩＩアミノ酸配列の公開配列およびその機能性領域の公開情報から、ＤＮＡの制限酵素切断またはヒトＦＶＩＩＩタンパク質のタンパク質分解もしくは他の分解を介して得ることができるフラグメントは、当業者に明らかである。限定はしないが、機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドに特に含まれるものは、全長ヒトＦＶＩＩＩ（例えば、配列番号：１および配列番号：２）およびＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（例えば、配列番号：３および配列番号：４）ならびにＷＯ２００６／０５３２９９に記載されているアミノ酸配列を有するものである。
【００１９】
ＦＶＩＩＩの“凝固促進活性”は、凝固カスケードにおけるＦＶＩＩＩの活性を示す。ＦＶＩＩＩそれ自体は凝固を引き起こさないが、凝固カスケードにおいて重要な役割を果たす。凝固におけるＦＶＩＩＩの役割は、内因性ＦＸ活性化のための触媒補因子であるＦＶＩＩＩａへ活性化されることである（Thompson, Semin. Thromb. Hemost. 29 :11-22, 2003）。ＦＶＩＩＩは、トロンビンまたはＦＸａによりタンパク質分解的に活性化され、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）から分離し、カスケードにおけるその凝固促進機能を活性化する。その活性形態において、ＦＶＩＩＩａは血液凝固の内因性経路においてＦＸ活性化酵素複合体に対する補因子として機能し、それは血友病Ａを有する患者において減少しているか、または非機能性である。
【００２０】
“ＦＩＸ”は、ヒト凝固因子ＩＸとしても知られている凝固因子ＩＸまたは血漿トロンボプラスチン成分を意味する。
【００２１】
本明細書において使用される“標的化凝固因子”なる用語は、血球上の膜タンパク質に特異的に結合する少なくとも１つのドメインと結合する凝固因子を示す。標的化凝固因子は、例えば、結合最大半量＜１０ｎＭにて、血球に強く結合する。結合は、例えば、標的化細胞上で選択的に発現される膜タンパク質への結合を介して、標的化血球に特異的である。本明細書において使用される“ドメイン”または“標的ドメイン”は、標的細胞上の膜タンパク質に対して高親和性を有する部分を示す。本発明のために適当なドメインは、限定はしないが、血球の表面上の膜タンパク質に対して高い親和性を有する抗体、抗体フラグメント、例えば、一本鎖抗体（ｓｖＦｖ）またはＦＡＢフラグメント、抗体模擬物およびペプチドまたは小分子を含む。１つの局面において、一本鎖抗体フラグメントまたはペプチドのコード配列をＦＶＩＩＩコード配列と結合させて、組換え技術を使用して融合タンパク質を生産することができるため、一本鎖抗体フラグメントまたはペプチドが使用される。
【００２２】
凝固因子は、化学的に、または融合タンパク質の組換え発現によりドメインと結合させることができる。化学結合は、凝固因子および標的ドメイン上に存在する化学部分に互いに結合することにより達成することができ、アミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシル基および炭水化物基のような部分を使用する化学結合を含む。種々のホモおよびヘテロ−二重機能性リンカーは、これらの部分に結合するために連結されるように活性化されるか、または活性化され得る基を有するものを使用することができる。リンカー分子におけるいくつかの有用な反応基は、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシ−スクシン酸エステルおよびヒドラジドを含む。異なる化学組成物および長さの多数の異なるスペーサーがこれらの反応基を分離するために使用することができ、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、脂肪族基、アルキレン基、シクロアルキレン基、融合もしくは結合アリール基、長さで１から２０アミノ酸もしくはアミノ酸アナログのペプチドおよび／またはペプチジル模擬物を含む。例えば、ドメインは、インビボにて凝固因子の機能性形態が標的化ドメインから放出されるか、または放出が体内における凝固因子の生物学的活性部位にて、または付近にて起こるように、凝固因子と結合され得る。
【００２３】
したがって、本発明の１つの態様において、凝固因子を血球へ標的化するためのドメインと凝固因子の結合が、開裂または分解され、それにより凝固因子を複合体から放出することができる標的化凝固因子を提供する。
【００２４】
複合体形態から（すなわち、標的化凝固因子から）の凝固因子の放出は、活性化プロセス中に除去される凝固因子上の部位に標的ドメインを結合することにより、または血液中の酵素による制御様式において分解するリンカーを使用することにより達成することができる。例えば、一般的な血液プロテアーゼまたはヒドラーゼに感受性である糖ポリマーまたはペプチドを使用することができる。種々のこのような技術は当分野で既知であり、プロドラッグを製造するために使用されている。リンカーは、凝固因子が非常に必要とされる部位、例えば、炎症または外傷により誘導される血液凝固の部位にて特異的に開裂されるようにさらに加工することができる。例えば、リンカーは、所望の作用部位のみで生産される特定のプロテアーゼ、例えば、炎症プロセスにより放出されるか、または血液凝固カスケードにより生産されるプロテアーゼに感受性であってよい。治療タンパク質のこの選択的放出は、副作用の可能性を低下させ、作用部位でのタンパク質の効率を増加させ得る。
【００２５】
血球上の種々の膜タンパク質を本発明の標的とすることができる。凝固因子が血球に特異的かつ効率的に標的化するが、しかしながら、標的化膜タンパク質が血球表面上に豊富に存在することが好ましい。例えば、糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは、血小板表面上で非常に豊富に発現される分子の１つであることが見出される。
【００２６】
したがって、１つの態様において、凝固因子は、血小板膜タンパク質、例えば、糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに特異的に結合するドメインを介して血小板へ標的化される。凝固因子をＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへ標的化するためのこのようなドメインの例は、限定はしないが、ＲＧＤ含有ペプチドおよび模擬物（直鎖ペプチド、ヘビの毒のペプチドおよび環状ペプチド）、例えば、ＲＧＤ模擬物配列、ホモアルギニン、グリシンアスパラギン酸を含むインテグリリン９）、非ペプチドＲＧＤ模擬物および抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体を含む。抗体が標的ドメインとして使用されるとき、抗体の一本鎖フラグメント、例えば、ｓｖＦｖまたはＦＡＢフラグメントを使用することができる。
【００２７】
ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの標的化
ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの血球、例えば、血小板または赤血球の表面への標的化は、これらの凝固因子のクリアランスを遅くするために役立ち得る。ＦＶＩＩＩの血小板の表面への標的化は特に興味深い。ＦＶＩＩＩはＦＸのＦＩＸ介在活性化における重要な補因子であり、これは凝固部位にて蓄積する活性化血小板の表面上で大部分が起こる。血小板の活性化は、その表面へのこれらの凝固因子の結合を引き起こし、ＦＸａ産生を促進する複合体を形成する。血小板は約９日間の平均循環寿命を有する。対照的に、血漿中のＦＶＩＩＩ（大部分はフォン・ヴィレブランド因子に結合している）は約１４時間の半減期を示す。したがって、ＦＶＩＩＩの血小板への結合は、分子の循環時間を大きく延長させる可能性を有する。ＦＶＩＩＩの本発明の標的ドメインを介する血小板の表面への標的化は、ＦＶＩＩＩ作用の効率を増加させ、ＦＶＩＩＩの半減期を延長すると予測される。
【００２８】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに加えて、血小板上の他のタンパク質、例えば、ＧＰ１ａおよびアネキシンＶは標的化ＦＶＩＩＩに対する受容体として役立つ。血小板表面上で非常に豊富に発現される分子の１つであるため、糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが好ましい。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの血中濃度は、血小板上の表面密度に基づいて約７５ｎＭであると概算される。これは、ＦＶＩＩＩの治療適用後に達成されるＦＶＩＩＩの最大濃度（Ｃｍａｘ約０．７ｎＭ）の１００倍を越えることを示す。したがって、ＦＶＩＩＩの血小板への標的化は、血小板上の利用できるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ部位の約１％以下を占有する。ブロックするためにはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ分子の大部分（すなわち、＞５０−６０％）を必要とするため、この低い占有レベルは血小板機能を変化させることは予期されない。また、高い濃度のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは、標的化ＦＶＩＩＩと血小板表面との平衡的結合をもたらす。
【００２９】
決して本発明を限定することなく、ＦＶＩＩＩのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの標的化は、また、凝固因子の一部がエンドサイトーシスを介して取り込まれ、血小板の開放小管系を介してＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが再利用され得るという利点を有し得ると考えられる。このＦＶＩＩＩは、アルファ顆粒になり、血小板活性化時に再放出され、凝固のために必要なときＦＶＩＩＩの源を提供することができる。血小板へ標的化された結合または内在化ＦＶＩＩＩは、多数の患者において存在するインヒビター（例えば、ＦＶＩＩＩ抗体）から保護され得る。したがって、標的化ＦＶＩＩＩはこの重要な群の患者に対する処置の選択肢を提供し得る。
【００３０】
凝固を促進するための標的化ＦＶＩＩＩに関して、分子は機能性形態（ＦＶＩＩＩａ）に処理され得て、そのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合部位から放出されるはずである。１つの態様において、これはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ標的ドメインをＦＶＩＩＩのＢドメインへ結合することにより達成される。Ｂドメインは、凝血促進環境下でトロンビンまたはＦＸａ介在タンパク質分解により除去され、成熟ＦＶＩＩＩａ分子を生産する。したがって、活性化時に、ＦＶＩＩＩａはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａから放出され、ＦＸ活性化複合体の形成に使用可能である。
【００３１】
ＦＶＩＩＩおよび標的ドメインの結合は、本明細書に記載されている架橋様式を使用して、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシル基およびカルボニル基を含むＦＶＩＩＩ上の反応基に標的ドメインを共有結合することにより達成することができる。標的ドメインは、また、ＦＶＩＩＩ分子のＢドメイン上に大抵は存在する炭水化物に結合することができる。例えば、過ヨウ素酸塩でのＦＶＩＩＩの穏やかな酸化によって炭水化物鎖上にアルデヒドを生じさせ、次にこれをアミンまたはヒドラジドと反応することができ、後に所望により還元することによって、より安定な結合を形成させることができる。
【００３２】
遊離システインは、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）での穏やかな還元を介して組換えＦＶＩＩＩのＢドメイン上に選択的に生産され、遊離システインと反応する標的ドメイン、例えば、チオール、トリフラート、トレシラート、アジリジン、オキシラン、Ｓ−ピリジルまたはマレイミド部分を含むドメインとＢドメインの特異的結合を可能にすることができる。さらに、ＦＶＩＩＩは、標的ドメインへの結合のための特定の位置を提供するために、アミノ酸残基をシステインで置き換える修飾をすることができる。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩが使用されるとき、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩの種々のシステイン変異タンパク質、例えば、ＷＯ２００６／０５３２９９に記載されているものは、表面システイン残基での化学結合を介してＦＶＩＩＩを標的ドメインと結合するために使用することができる。アミノ酸残基をシステインで置換して修飾され得るアミノ酸残基の例は、８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４番を含むが、これらに限定されない（このアミノ酸残基は全長ＦＶＩＩＩの配列における位置により示している）。
【００３３】
凝固因子は、また、組換え技術を使用して標的ドメインに結合させてもよい。宿主細胞はＦＶＩＩＩおよび標的ドメインの融合タンパク質を含むベクターをトランスフェクトされ得る。１つの態様において、標的ドメインはＦＶＩＩＩのＢドメインに挿入されていてよく、全長分子からＢドメインを欠失させるＢドメインの生物学的プロセシングを可能とするように、Ｂドメインのほんの一部をカルボキシおよびアミノ末端で残して、Ｂドメインの大部分は欠失させる。図１において説明されているとおり、生理学的条件下でＢドメインの生物学的プロセシングおよび除去が可能であるＢドメインの残す部分は特定されている。
【００３４】
宿主細胞系は、凝固因子を生産するために有用な当業者に既知のあらゆる細胞、例えば、限定はしないが、ＦＶＩＩＩ  ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞およびＨＫＢ１１細胞（ヒト胎児腎臓細胞系、ＨＥＫ２９３およびヒトＢｕｒｋｉｔｔ  Ｂ細胞リンパ腫系、２Ｂ８のハイブリッド）であり得る。
【００３５】
多くのドメインは、化学的にＦＶＩＩＩに結合するか、または組換え的にＦＶＩＩＩと共に発現し、ＦＶＩＩＩが血小板の表面上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに標的化することができる。このようなドメインの例は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体、ＲＧＤペプチド、ペプチド模擬物またはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを標的とする小分子模擬物を含むが、これらに限定されない。抗体、例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを標的とする一本鎖抗体（ｓｖＦｖ）またはＦＡＢフラグメントが標的ドメインとして特に有用である。
【００３６】
ＦＶＩＩＩ機能の喪失無しにＦＶＩＩＩのＢドメインを除去することができることが示されている。さらに、また、他のタンパク質ドメインを有する種々のＢドメイン切断型のＦＶＩＩＩおよびＢドメイン融合によって機能的に活性なＦＶＩＩＩを得ることができることが示されている。１つの局面において、本発明は、活性なＦＶＩＩＩを得るための分子の通常のプロセシングをブロックすることなく、ＦＶＩＩＩのＢドメインに挿入、置換または部分的に置換されるように加工され得る標的ドメインを含む。例えば、組換えＤＮＡ技術を使用して、ＦＶＩＩＩ分子は一本鎖抗体フラグメントをＦＶＩＩＩのＢドメインのＣ−末端に融合させることにより生産することができる。また、ｓｖＦｖフラグメントが、ＦＶＩＩＩの全てのまたは一部のＢドメインを置き換えるために使用することができる。これは、インフレームにおいてｓｖＦｖフラグメントをコードするＤＮＡ配列をＢドメインコード配列の後へ挿入すること、またはＢドメインコード配列の一部または全部を置換することを介して達成することができる。この戦略は、ＦＶＩＩＩの通常のタンパク質分解活性化のために必要とされるトロンビン切断部位を保存する。血小板へ効率的に局在するＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する種々の抗体は知られている（例えば、Schwarz, et al., Circ. Res. 99(1):25-33, 2006; Jacobin, et al., Clin. Immunol. 108(3):199-210, 2003; Christopoulos, et al., Blood Coagul. Fibrinolysis 4(5):729-37, 1993;およびChung, et al., FASEB J. 18(2):361-363, 2004、参照）。
【００３７】
同様に、多くのペプチドがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する高い結合親和性を有することが述べられているため、ＲＧＤまたはＲＧＤ模擬物含有ペプチドもＦＶＩＩＩを標的化するために有用なリガンドである。これらは直鎖ペプチド、ヘビの毒のペプチドおよび環状ペプチドを含む。非ペプチドＲＧＤ模擬物も使用することができる。抗体フラグメントと同様に、ＲＧＤペプチドはＦＶＩＩＩと化学的に結合することができる。あるいは、ＲＧＤ配列は、Ｂドメインコード配列に挿入するか、または、全体または部分的に、ＦＶＩＩＩのＢドメインコード配列を置き換えるために使用して、組換えＤＮＡ技術を使用して発現させることができる。
【００３８】
標的化ＦＩＸは同様の方法を使用して製造することができる。例えば、標的ドメインは、ＦＩＸａへのＦＩＸの活性化においてタンパク質分解的に除去されるＦＩＸ分子の活性化ドメイン（選択の好みに依存してアミノ酸残基１９１−２２６または１４５−１８０、すなわち、＋／−シグナル配列）に結合させることができる。ドメインは、架橋剤を使用してアミノ酸側鎖基、例えば、活性化ドメインにおけるスルフヒドリル、アミンおよびカルボキシル基と反応させて化学的に結合させるか、またはＦＶＩＩＩに対して上記されているとおりに炭水化物鎖を介して結合させることができる。また、融合分子は、標的ドメインのアミノ酸配列をＦＩＸ活性化ペプチドに挿入する組換え技術を使用するか、または活性化ペプチド配列の一部を置き換えて製造することができる。挿入される標的ドメイン配列は、一本鎖抗体または他の血小板結合ペプチド配列、例えば、ＲＧＤ結合ペプチドをコードする。
【００３９】
医薬組成物および使用
本発明は、また、治療有効量の本発明の標的化凝固因子および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物に関する。“薬学的に許容される賦形剤または担体”は、製剤化を助けるか、または製造物を安定化させるために活性成分に加えられ得、患者に有意な毒性有害事象を引き起こさない物質である。このような賦形剤または担体の例は、当業者に知られており、水、糖、例えば、マルトースまたはスクロース、アルブミン、塩などを含む。他の賦形剤または担体は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20th edition, 2000)に記載されている。このような組成物は、必要とする患者への有効な投与のために適当な薬学的に許容される組成物を製造するために、有効量の標的化凝固因子を適当な量の賦形剤または担体と共に含む。
【００４０】
例えば、複合体は出血症状の重症度で変化し得る用量で血友病Ａに罹患している対象に非経腸的に投与され得る。静脈内に投与される平均用量は、術前の適応に対してキログラムあたり４０単位、軽度の出血に対してキログラムあたり１５から２０単位、および８時間にわたる持続投与に対してキログラムあたり２０から４０単位の範囲である。
【００４１】
１つの態様において、本発明は、治療有効量の前記標的化凝固因子を必要とする患者に投与することを含む血液病を処置するための方法に関する。
【００４２】
本明細書において使用される“治療有効量”は、血流または標的組織における所望のレベルの標的化因子（または標的化形態から放出される対応する非結合因子）を提供するために必要とされる標的化凝固因子の量を意味する。正確な量は、限定はしないが、治療組成物の成分および物理的特性、意図される患者集団、個々の患者の判断などを含む多数の因子に依存し、当業者により容易に決定することができる。
【００４３】
本明細書において使用される、“患者”は医療および／または処置を受けるヒトまたは動物個体を示す。
【００４４】
本明細書に記載されているポリペプチド、原料、組成物および方法は本発明の代表的な例であることを意図し、本発明の範囲が実施例の範囲に限定されないと理解する。本発明が記載されているポリペプチド、原料、組成物および方法を変化させて実施され得ることが当業者は理解でき、このような変化させたものは本発明の範囲内と見なされる。
【００４５】
以下の実施例は本明細書に記載されている本発明を説明するために存在するが、多少なりとも本発明の範囲を限定するように解釈してはならない。
【実施例】
【００４６】
実施例
本発明をより理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は説明の目的のみであり、どのような形であれ本発明の範囲を限定すると解釈すべきでない。本明細書に記載されているすべての文献は出典明示によりそれら全体を包含させる。
【００４７】
実施例１：ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合に対する高親和性を有する修飾されたＲＧＤペプチド
環状ペプチドは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに強力にかつ選択的に結合することが述べられている。インテグリリンがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへ選択的に結合することができることが示されているため、このようなペプチドの１つであるインテグリリンをＦＶＩＩＩと結合するための標的ドメインとして使用した。インテグリリンは、短いＰＥＧリンカーを加えることにより修飾され、タンパク質中の遊離システイン残基へ選択的に結合することができるマレイミド部分となった。修飾されたインテグリリンは、リンカーのみを有するものをＢＨＲＦ−１（図２Ａ）ならびにリンカーおよびフルオレセイン（ＦＩＴＣ）を有するものをＢＨＲＦ−３（図２Ｂ）と称する。図３に示されるとおり、固定化されたＧＰＩＩａ／ＩＩＩｂへのフィブリノーゲン（Ｆｂｎ）結合を強くブロックしたため、修飾されたインテグリリンは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する親和性を維持している。
【００４８】
ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａへのペプチド結合を、試験化合物によるフィブリノーゲン結合の競合を測定する固相結合アッセイを使用して測定した。該アッセイは以下のように行った。精製されたＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ（Innovative Research, Novi, MI）で、バッファーＡ（２０ｍＭのトリス  ｐＨ７．５、０．１５ＭのＮａＣｌならびにそれぞれ１ｍＭのＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２）で希釈された０．ｍＬ／ウェル×２μｇ／ｍＬにて、９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ−Ｂプレートを被覆した。４℃で一晩インキュベーション後、プレートを、バッファーＢ（５０ｍＭのトリス  ｐＨ７．５、０．１ＭのＮａＣｌならびにそれぞれ１ｍＭのＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２）中３．５％のＢＳＡにて１時間３０℃でブロックした。バッファーＢで３回洗浄後、希釈されたペプチドまたはタンパク質溶液を０．１％のＢＳＡ／バッファーＢ中の３．５ｎＭのビオチン化フィブリノーゲンと混合し、ウェルに加え、３０℃で２時間インキュベートした。洗浄（３回、バッファーＢ）後、１：４０００のストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を１時間３０℃で加えた（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）。最後の洗浄工程（３回、バッファーＢ）後、プレートをＵｌｔｒａ  ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）で５分展開し、同量の２Ｍの硫酸で停止した。プレート吸光度を４５０ｎｍで読み、ＩＣ５０値を４−パラメーターロジスティックフィットを使用して決定した。
【００４９】
次に、修飾されたインテグリリンペプチド（ＢＨＲＦ１）をＦＶＩＩＩのＢドメインに位置するシステイン（Ｃｙｓ）残基を介してＦＶＩＩＩと結合させる。
【００５０】
実施例２：ＦＶＩＩＩへのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合ペプチドの結合
全長ＦＶＩＩＩのポリペプチド配列は当分野で知られている（例えば、配列番号：１、配列番号：２およびＷＯ２００６／０５３２９９に記載されているもの、参照）。
【００５１】
ＦＶＩＩＩの濃縮および遊離スルフヒドリル基の脱離
組換えＦＶＩＩＩのＢドメインに位置するＣｙｓ残基は、タンパク質発現中の培地において存在するシステインにより覆われているが、以下のとおり還元剤、例えば、ＴＣＥＰでの処理により容易に除去することができる。ＦＶＩＩＩ（２０ｍＬ）を解凍し、２つのＡｍｉｃｏｎ（登録商標）−１５カートリッジ（Millipore, Billerica, MA）で濃縮し、低温下で２５分２０００×ｇ（約３１５３ｒｐｍ）で回転させた。２．８ｍＬの副産物の濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）分光光度計（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）を使用してＡ２８０により約０．８−０．９ｍｇ／ｍＬである。次にバッファーを１０ｍＬのＺｅｂａ  ｄｅｓａｌｔｉｎｇカートリッジを使用して交換し、５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２および１００ｐｐｍのＴｗｅｅｎ（登録商標）−８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）であらかじめ平衡にした。０．８８ｍｇ／ｍＬの濃度で２．８ｍＬのタンパク質溶液を得た。次にＴＣＥＰを最終濃度０．６８ｍＭに加え、混合物を４℃で約３時間穏やかに回転させた。ＴＣＥＰを２連続Ｚｅｂａカートリッジスピンにより除去し、ＦＶＩＩＩを再酸化のために少なくとも３０分放置し、ペプチドを加えた。ＴＣＥＰの除去後、ＦＶＩＩＩ濃度は０．７６８ｍｇ／ｍＬと測定された（“ＫＧ−Ｒ”）。
【００５２】
ＲＧＤ標的ペプチドの結合
修飾されたインテグリリンペプチドＢＨＲＦ−１をＦＶＩＩＩへ結合させるために、０．２９４ｍｇのペプチド（Ｍ．Ｗ．１２２５）を４８μＬの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に加え、５ｍＭの貯蔵溶液を製造した。次にこの貯蔵溶液（３４．４μＬ）を２．８ｍＬのＫＧ−Ｒに加えた。８０分後に反応を等モル量のシステインの添加によりクエンチした。次に反応混合物を開始Ｔｒｉｓバッファー（２リットル）に対して大規模に透析した。ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩの最終濃度は０．７４ｍｇ／ｍＬであり、そして収量は２ｍｇであった。同様の方法をＢＨＲＦ−３−ＦＶＩＩＩを製造するために使用した。
【００５３】
図３に示されるとおり、修飾されたインテグリリンペプチドＢＨＲＦ−１およびＢＨＲＦ−３は、固定化されたＧＰＩＩａ／ＩＩＩｂへのフィブリノーゲン（Ｆｂｎ）結合を強力にブロックするため、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する親和性を維持している。ＢＨＲＦ−１へ結合したＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ−ＢＨＲＦ−１）は、固定されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへのフィブリノーゲン結合の阻害に対して高力価を示した（ＩＣ５０＝０．０４３＋／−０．０５ｎＭ（Ｎ＝３））。これは親ＢＨＲＦ−１ペプチドよりもさらに強力であった。結果を表１に示す。
表１
【表１】
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【００５４】
Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩへのＲＧＤ標的ペプチドの結合
Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（“ＢＤＤ”）を結合するために使用するとき、ＷＯ２００６／０５３２９９に記載されているＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩの種々のＣｙｓ変異タンパク質を、標的ドメイン、例えば、本明細書に記載されている修飾されたＲＧＤペプチドへＢＤＤを結合するために使用することができる。
【００５５】
実施例３：ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩは固定化されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合する
ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合活性を試験するために、ビオチン化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａをストレプトアビジンプレート上に固定し、結合バッファー（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２および１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中でＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩまたは非修飾ＦＶＩＩＩのいずれかと処理した。非結合タンパク質を結合バッファーで３回洗浄することにより除去した。アッセイバッファー（２５μＬ）をプレートに加え、ＦＶＩＩＩ活性を発色アッセイキット（Coatest(登録商標) SP4, Chromogenix, Lexington, MA）を使用して測定した。図４に示されるとおり、ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩの結合が存在するが、ほんの少しの非修飾ＦＶＩＩＩの結合が検出された。ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩの結合の増加は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへのＢＨＲＦ−１結合に対して競合する環状ＲＧＤペプチド（ＧｐｅｎＧＲＧＤＳＰＣＡ；配列番号：５）の添加により完全に除去された。さらに、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａがプレート上に固定化されていないとき、非常に低いバックグラウンドレベルのタンパク質が結合した。これらのデータは、ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩがペプチド標的ドメインを介してＧＰＩＩＩ／ＩＩＩＩａへ標的化され得ることを示す。
【００５６】
非結合ＦＶＩＩＩをＢＨＲＦ１−ＦＶＩＩＩの製造物から除去しなかったため、試験を行い、存在する非結合ＦＶＩＩＩの量を測定した。ＢＨＲＦ１−ＦＶＩＩＩ活性を過剰レベルの固定化されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを含むビーズを使用して枯渇させた。約８０％のＢＨＦＲ１−ＦＶＩＩＩの活性を枯渇させることができ、製造物における約２０％のＦＶＩＩＩ活性は非結合ＦＶＩＩＩ由来であることを示す。
【００５７】
実施例４：ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩでのインビトロ全血凝固活性アッセイ
止血活性におけるＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩの血小板結合の効果を評価するため、その活性をLandskroner, et al., (Haemophilia 11:346-352, 2005)に記載されている全血凝固線溶分析装置（ＲＯＴＥＭ(登録商標)、Pentapharm GmbH）システムを使用して非結合ＦＶＩＩＩの活性と比較した。凝固活性の測定、例えば、Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）発色アッセイまたは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイとは異なって、ＲＯＴＥＭ（登録商標）アッセイは血小板の機能に依存し、したがって、血小板へのＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩ結合の効果を示すことができる。アッセイを行うために、血友病Ａマウスのクエン酸全血を室温で等量のＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩ（１ｍＩＵ）または非結合ＦＶＩＩＩ（Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）発色アッセイに基づく）と混合した。自動ピペットにて３００μＬの処理血液を２０μＬのＣａＣｌ２（２００ｍｍｏｌ）を有し、外因性アクチベーター（ＮＡＴＥＭ）を有さないＲＯＴＥＭ（登録商標）カップへ分配することにより、サンプルを再石灰化した。測定を最後のピペッティング後即座に開始し、血液凝固形成を３７℃で２時間（７２００秒）連続的にモニタリングした。
【００５８】
止血に関するＲＯＴＥＭ（登録商標）分析パラメーターは、凝固時間（ＣＴ）、測定の開始後に２ｍｍの凝固堅固を得るために必要である時間、凝固形成時間（ＣＦＴ）、２ｍｍの凝固堅固から２０ｍｍの凝固強度までの時間、およびα角度、凝固形成の速度を含む。
【００５９】
図５に示されるとおり、ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩは、ＲＯＴＥＭ（登録商標）アッセイにおいて等量（発色アッセイに基づいて）の非結合ＦＶＩＩＩよりも凝固に必要な時間が少なく、凝固の効率が高いことを示した。ＣＴの違いは約４００秒であり、これはＦＶＩＩＩ標準曲線に基づいて約２−３倍のＦＶＩＩＩ活性に相当する。
【００６０】
標的化凝固因子の止血活性および薬物動態パラメーターは、血友病Ａマウスモデルを使用してインビボで評価することができる。標的化凝固因子は尾静脈内注射により投与することができる。処置後複数の時点で、血液を％のクエン酸ナトリウム中に回収し、マウスにおけるＦＶＩＩＩの＞６の半減期（ｔ１／２）に相当する注入後４８時間にわたって、止血活性をＲＯＴＥＭを使用して測定する。
【００６１】
実施例５：ヒトおよびマウス血小板へのインビトロ結合アッセイ
ＦＶＩＩＩ−ＢＨＲＦ−１のヒト血小板への結合
ヒト血小板は、５×１０９の血小板／チューブで１４ｍＬの血漿でＡｌｌｃｅｌｌｓ（Emeryville, CA）から得た。血小板およびすべての洗浄液、バッファー、試薬および遠心機を室温に温め、実験工程中、室温で維持した。血小板のための洗浄バッファー（ＷＢ）は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５％のＢＳＡおよび５０ｎｇ／ｍＬのＰＧＥ１および２．５Ｕ／ｍＬのアピラーゼ、ｐＨ７．４を補ったＴｙｒｏｄｅのバッファーである。
【００６２】
細胞を７００×ｇで１５分２５℃で遠心し、次に上清を注意深く除去し、１４ｍＬのＷＢを加えた。細胞を穏やかにＷＢに再懸濁し、記載のとおりに遠心した。
【００６３】
第２の遠心分離後、上清を除去し、血小板を１５ｍＬのＷＢに再懸濁した。その時に、細胞をそれぞれ５ｍＬの３つの等量のアリコートに分けた。３つのアリコートを前記のように遠心し、次に３つの血小板ペレットを下記のいずれかで再懸濁した：
Ａ．５ｍＬの結合バッファー＋５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ＢＢＢ、５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、それぞれ１ｍＭのＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２）
Ｂ．ＦＶＩＩＩを欠いているがｖＷＦは存在する５ｍＬのＨｅｍＡ血漿
Ｃ．ＦＶＩＩＩおよびｖＷＦの両方を欠いている５ｍＬの免疫喪失血漿。
【００６４】
バッファー（Ａ）または血漿（ＢまたはＣ）に関して、以下の条件を使用した：
１．バッファー／血漿のみ＋２．５ｎＭのＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩ（約２０％の非結合ＦＶＩＩＩ（実施例３、参照）を含む）
２．バッファー／血漿＋血小板＋２．５ｎＭのＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩ（約２０％の非結合ＦＶＩＩＩを含む）
３．バッファー／血漿のみ＋２．５ｎＭの組換えＦＶＩＩＩ
４．バッファー／血漿＋血小板＋２．５ｎＭの組換えＦＶＩＩＩ。
【００６５】
それぞれの条件１−４に関して、１００μＬのＡ、ＢまたはＣを室温でマイクロチューブにピペットで移し、次にＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩまたは非結合ＦＶＩＩＩをチューブに加えた。チューブを３７℃で１．５時間（振とうなしで）インキュベートした。インキュベーション後、チューブを最高速度（１６，０００ｒｐｍ）で５分遠心し、血小板をペレット化した。上清を回収し、ＦＶＩＩＩ活性をアッセイした。上清中の活性量は非結合ＦＶＩＩＩまたはＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩの量を反映する。データはすべての状態におけるＢＨＲＦ１−ＦＶＩＩＩのヒト血小板への結合を証明する（図６に示されている）。ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩが条件ＡおよびＣにおいて約２０％の非結合ＦＶＩＩＩを含むため、データは、高い割合の複合体が結合していることを示す。ＦＶＩＩＩの結合は条件ＡおよびＢにおいて観察されなかったが、３５％のＦＶＩＩＩ活性が条件Ｃにおいて結合した。図は、また、３５％のＦＶＩＩＩの非特異的結合に関して補正された条件Ｃに対して維持しているＦＶＩＩＩ活性のレベルが、この条件において観察されたことを示す（すなわち、出発ＦＶＩＩＩ活性を、結合パーセントを計算するために３５％引いた）。
【００６６】
ＦＶＩＩＩ−ＢＨＲＦ−１のマウス血小板への結合
ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩは、また、図７に示されるとおりマウス血小板へ結合した。同様の結合アッセイを、血小板リッチ血漿（ＰＲＰ）を回収するためにマウスクエン酸血を２００×ｇで１５分遠心することを除いて、ヒト血小板に記載されたとおりに実施した。ＰＲＰをクエン酸洗浄バッファー（１１ｍＭのグルコース、１２８ｍＭのＮａＣｌ、４．３ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、７．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、４．８ｍＭのクエン酸Ｎａ、２．４ｍＭのクエン酸、０．３５％のＢＳＡ、ｐＨ６．５）＋５０ｎｇ／ｍＬのＰＧＥ１で希釈し、クエン酸洗浄バッファー＋５０ｎｇ／ｍＬのＰＧＥ１で２回洗浄した（１２００×ｇで１０分遠心することにより）。最後に血小板を結合バッファー（５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、それぞれ１ｍＭのＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２）＋５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡに再懸濁した。非結合ＦＶＩＩＩおよびＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩを血小板に加え、３７℃で２時間後、血小板を遠心分離により回収し、上清における非結合ＦＶＩＩＩ活性を測定した。
【００６７】
図７に示されるとおり、５９％の非結合ＦＶＩＩＩの活性にて血小板に結合した。ＢＨＲＦ−１ペプチドを介する血小板への添加ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩ活性結合のパーセントを計算するために、ＦＶＩＩＩの非特異的結合（ペプチドを介して起こらない）のレベルを反映するために、出発ＦＶＩＩＩ活性の量を５９％によって補正した。ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩに関する補正値は３１％非結合であった（６９％結合）。１００ｕＭのインテグリリンをペプチド結合を完了するために加えたとき、非結合活性は８２％非結合に上がった（１８％結合）（非特異的ＦＶＩＩＩ結合に関しても補正した）。これらのデータは、ＢＨＲＦ−１−ＦＶＩＩＩがＢＨＲＦ−１標的ドメインを介してマウス血小板に結合し得ることを証明する。
【００６８】
実施例６：薬物動態学的試験
血漿中の細胞（例えば、血小板）への結合におけるＦＶＩＩＩ活性を反映する血友病Ａマウスへの注射後の種々の時間での血液中のＦＶＩＩＩのレベルを、全血凝固アッセイ、例えば、上記のＲＯＴＥＭ（登録商標）を使用して測定する。
【００６９】
実施例７：ＦＶＩＩＩ活性の評価のための発色アッセイ
精製されたタンパク質および複合体のＦＶＩＩＩ活性をＣｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰアッセイキット（Chromogenix, Lexington, MA）を使用して評価した。アッセイを、９６−ウェルプレートフォーマットにおいて製造業者の指示にしたがって行った。簡潔には、ＦＶＩＩＩまたは複合体を含む希釈されたサンプルを、活性化ＦＩＸ／ＦＸ／リン脂質の混合物、次に２５ｍＭのＣａＣｌ２、発色基質Ｓ−２７６５／Ｉ−２５８１の順に混合した。それぞれの試薬添加中、サンプルを３７℃で５分インキュベートした。最後の発色基質の添加後、反応を５分後に２０％の酢酸を停止させ、プレート吸光度を４０５ｎｍで読み、４９０ｎｍバックグラウンドに対して標準化した。サンプル吸光度を、０．３−４０ｍＩＵ／ｍＬの動作範囲でＷＨＯ／ＮＩＢＳＣの血漿由来ＦＶＩＩＩ標準曲線に対して調節した。
【００７０】
実施例８：血友病マウスにおけるインビボ有効性アッセイ
血液凝固の促進における標的化ＦＶＩＩＩ分子の有効性を示すため、およびこれらの作用期間を評価するために、血友病（ＨｅｍＡ）マウスの尾クリップ損傷または尾静脈切断モデルを下記のとおりに使用することができる。
【００７１】
尾クリップ損傷モデル
試験サンプルを尾静脈注射を介したマウスに投与する。投与後、マウスをケタミン／キシラジン（１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）にて腹腔内（ＩＰ）で麻酔する。動物を完全に麻酔後、尾を個々に１３ｍＬの３７℃にあらかじめ温められた塩水中に約１０分置く。尾カットを鋭利なメスにて行い、尾を９ｍＬの３７℃の温塩水を有する新しいチューブに即座に入れる。血液を３０分間連続的に回収する。出血量を血液回収チューブの重量により、または血液回収チューブ中の血液／塩水混合物の光学濃度により測定する。
【００７２】
尾静脈切断
ＨｅｍＡオスマウスを、それらの体重によって異なる処置グループにランダム化する。尾静脈の取り扱いの２４時間前に、マウスに尾静脈注射によって投与する。尾静脈切断の前に、マウスを５０μｇ／ｋｇのケタミンおよび１ｍｇ／ｋｇのメデトミジンを含む混合物にて麻酔する（ＩＰ）。尾にフレンチカテーテルを使用して直径２．７ｍＭで印を付ける。メデトミジンの麻酔効果はＩＰ注射による１ｍｇ／ｋｇのアチパメゾールにて逆転される。尾静脈をメスの刃で切断する。次に尾を３７℃の塩水チューブに入れ、血液を傷口から洗い流すためにチューブを回転させる。塩水が視覚化するためにあまりにも不透明になったとき、尾の出血が停止するまで新しいチューブと置き換える。出血が停止するためにかかる時間を急性凝固時間として記録する。次にマウスを４×８インチの湿布上に置かれた白色の紙寝具を備えた個々の透明なケージに戻す。再出血および瀕死の時間を、後の９−１１時間を１時間毎に過剰血液喪失に関してモニタリングする。
【００７３】
実施例９：標的化ＦＶＩＩＩの組換え発現
１つの態様において、ＨＫＢ１１細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃でタンパク質フリー培地中でオービタルシェーカー（１００−１２５ｒｐｍ）上で懸濁液培地中にて培養し、０．２５から１．５×１０６細胞／ｍＬ密度で維持する。トランスフェクションのためのＨＫＢ１１細胞を遠心分離により回収し、次に発現培地、例えば、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）中で１．１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞を６−ウェルプレート（４．６ｍＬ／ウェル）に播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中でオービタルローター（１２５ｒｐｍ）上でインキュベートする。それぞれのウェルにおいて、５μｇのプラスミドＤＮＡを０．２ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）と混合する。それぞれのウェルにおいて、７μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）を０．２ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地と穏やかに混合し、室温で５分インキュベートする。希釈した２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭを希釈したＤＮＡ溶液に加え、穏やかに混合し、室温で２０−３０分インキュベートし、次に５×１０６（４．６ｍＬ）のＨＫＢ１１細胞で播種されたそれぞれのウェルに加える。次に細胞をＣＯ２インキュベーター中で３７℃で３日間オービタルローター（１２５ｒｐｍ）上でインキュベートし、その後に細胞を１０００ｒｐｍで５分遠心分離によりペレット状にし、上清を回収する。
【００７４】
ＨＫＢ１１細胞の安定なトランスフェクションを以下の方法を使用して得る。ＨＫＢ１１細胞に一過性トランスフェクションに記載されている２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ試薬を使用してプラスミドＤＮＡをトランスフェクトする。トランスフェクト細胞を種々の希釈（１：１００、１：１０００、１；１０，０００）で１００ｍｍの培養皿に分配し、５％のＦＢＳおよび２００ｕｇ／ｍＬのハイグロマイシン（Invitrogen, Carlsbad, CA）を補ったＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で約２週間維持する。個々の単一コロニーを採取し、滅菌クローニングディスク（Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ（登録商標）、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を使用して６ウェルプレートへ移した。クローンを確立し、預ける。これらのクローンを、ＦＶＩＩＩ活性アッセイ（例えば、Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）およびａＰＴＴアッセイ）により、ならびにＦＶＩＩＩ  ＥＬＩＳＡにより、高い発現の融合タンパク質をスクリーニングする。
【００７５】
培養上清および精製画分における第ＶＩＩＩ因子の活性レベルは、上記９６ウェルフォーマットにおいて市販の発色アッセイキット（Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）  ＳＰ４  ＦＶＩＩＩ、Chromogenix, Lexington, MA）を使用して測定され得る。第ＶＩＩＩ因子の凝固活性は、また、Ｅｌｅｃｔｒａ（登録商標）１８００Ｃ自動凝固分析器（Beckman Coulter, Fullerton, CA）によるＦＶＩＩＩ欠失ヒト血漿におけるａＰＴＴアッセイを使用して測定され得る。簡潔には、凝固希釈液中の上清サンプルの３つの希釈物を器具により製造し、次に１００μＬを１００μＬのＦＶＩＩＩ欠失血漿および１００μＬの自動ａＰＴＴ試薬（ウサギ脳のリン脂質および微粉化シリカ、Biomerieux, Durham, NC）と混合する。１００μＬの２５ｍＭのＣａＣｌ２溶液の添加後、凝固形成の時間を記録する。標準曲線を同じ精製ＦＶＩＩＩの連続希釈物を使用してそれぞれの時間に対して作成し、ＥＬＩＳＡアッセイにおける標準として使用する。
【００７６】
本発明が特定の態様および実施例と関連して記載されているが、種々の修飾および変化が作成され得て、均等は本発明の精神および範囲から逸脱することなく置き換えられ得ると理解すべきである。したがって、明細書および実施例は、限定的意味というよりはむしろ説明と考えるべきである。さらに、本明細書に挙げられている全ての文献、特許出願および特許はそれら全体を出典明示により本明細書に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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