(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の微生物感染を治療または予防するための医薬組成物であって、有効量の下記構造
【化１】
0006010548.tif 000044
のＲＮａｓｅ阻害剤、またはその薬学的に許容可能な塩を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記微生物感染が細菌感染である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記細菌感染がグラム陽性細菌感染である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記細菌感染がブドウ球菌感染である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記細菌感染が黄色ブドウ球菌感染である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記黄色ブドウ球菌感染が薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記黄色ブドウ球菌感染がバイオフィルム関連黄色ブドウ球菌感染である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
抗菌化合物である第２の化合物をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張出願への相互参照
本出願は、２０１１年１月２６日出願の米国特許仮出願第６１／４３６，３４２号の優先権を主張する。この特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本明細書で開示される内容は、一般的には、細菌リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の小分子阻害剤およびそれらの調製方法に関する。また、本明細書記載の内容は、一般的には、微生物感染を治療および予防するための本明細書記載の小分子阻害剤の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）感染は、高い罹患率および死亡率を伴う場合が多い（Ｓｈｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、３４：２５８８−２５９５（２００６）（非特許文献1）、を参照）。実際、報告によれば、米国では、２００５年、その生物体がＨＩＶ／ＡＩＤＳより多くの死亡の原因であったと推定されている（Ｂａｎｃｒｏｆｔ、Ｅ．Ａ．、Ｊａｍａ、２９８：１８０３−１８０４（２００７）（非特許文献2）；Ｋｌｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊａｍａ、２９８：１７６３−１７７１（２００７）（非特許文献3）、参照）。バンコマイシン耐性、メチシリン耐性、多剤耐性、および強毒性株の出現が、新規抗生物質の必要性をさらに高めた（Ａｐｐｅｌｂａｕｍ、Ｐ．Ｃ．、Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ、３０：３９８−４０８（２００７）（非特許文献4）；Ｚｅｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、５：２７５−２８６（２００５）（非特許文献5）を参照）。細菌ＲＮＡの処理および分解は、抗菌剤発見に活用可能な必須細胞プロセスである。
【０００４】
細菌ＲＮＡ分解に関する理解の多くは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の調査から得られており、バルクｍＲＮＡの崩壊は、ホロ酵素複合体（ＲＮＡデグラドソーム）により触媒されると考えられている。この複合体は、少なくとも４つのサブユニット：ＲＮａｓｅ  Ｅ（ｒｎｅ）、ＲＮＡヘリカーゼ（ｒｈｌＢ）、エノラーゼ（ｅｎｏ）、およびＰＮＰａｓｅ（ｐｎｐＡ）から構成される（Ｃａｒｐｏｕｓｉｓ、Ａ．Ｊ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６１：７１−８７（２００７）（非特許文献6）、を参照）。ＲＮａｓｅ  Ｅは、必要不可欠なリボヌクレアーゼであり、デグラドソーム複合体の主要成分である。それは、ＲＮＡデグラドソームの他のメンバーの構築のための足場として機能し、初期の基質分解の間のエンドリボヌクレアーゼを使ったイベントを触媒する（Ｍａｃｋｉｅ、Ｇ．Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９５：７２０−７２３（１９９８）（非特許文献7）；Ｖａｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１２：２７７０−２７８１（１９９８）（非特許文献8）を参照）。その本性に基づいて、ＲＮａｓｅ  Ｅは、抗生物質薬剤発見の適切な標的であると考えられる。しかし、黄色ブドウ球菌、等の多くのグラム陽性菌は、ＲＮａｓｅ  Ｅアミノ酸オーソログを欠いている（Ｃｏｎｄｏｎ、Ｃ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ、６７：１５７−１７４（２００３）（非特許文献9）、を参照）。結果として、それらの分解成分およびｍＲＮＡ崩壊機序の理解はあまり進んでいない。
【０００５】
最近の調査では、少なくとも２つのリボヌクレアーゼ：ＲＮａｓｅ  Ｊ１およびＲＮａｓｅ  Ｙが、枯草菌、およびおそらく他のグラム陽性菌内のバルクｍＲＮＡ分解に関与するであろうことが示唆されている。枯草菌リボヌクレアーゼ、Ｊ１は、５'エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性を有する二官能性リボヌクレアーゼであり、ｍＲＮＡ分解をインビトロで媒介する（Ｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３３：２１４１−２１５２（２００５）（非特許文献10）；Ｍａｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、１２９：６８１−６９２（２００７）（非特許文献11）、を参照）。この酵素はまた、エノラーゼ（大腸菌ＲＮＡデグラドソームの成分）と相互作用することも見出されており、ＲＮａｓｅ  Ｊ１枯渇枯草菌株は、ｍＲＮＡ崩壊の中等度の減少を示し、これが大腸菌ＲＮａｓｅ  Ｅと機能的に等価である可能性があることを示唆している（非特許文献１０；Ｃｏｍｍｉｃｈａｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、８：１３５０−１３６０（２００９）（非特許文献12）；Ｍａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７０：１８３−１９６（２００８）（非特許文献13）、を参照）。しかし、ｍＲＮＡ代謝回転は、ＲＮａｓｅ  Ｊ１減少細胞中でも起こり、５'強力ヘアピン構造を含むＲＮＡ種が、酵素により効率的に分解されず、別の因子が枯草菌細胞のＲＮＡ分解に関与している可能性があることを示唆している（Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｎａ、１５：２３３１−２３３９（２００９）（非特許文献14）、を参照）。リボヌクレアーゼＹは、最近特定されたエンドヌクレアーゼであり、表面上は、ＲＮａｓｅ  Ｊ１に呼応して働き、バルクＲＮＡ崩壊を媒介できる。ＲＮａｓｅ  Ｙは、高次二次構造を有するｍＲＮＡ分子を切断でき、細胞内メッセンジャーＲＮＡ代謝回転に全体的影響を与える（Ｓｈａｈｂａｂｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＥｍｂｏＪ、２８：３５２３−３５３３（２００９）（非特許文献15）、を参照）。ＲＮａｓｅ  Ｊ１およびＲＮａｓｅＹの両方とも、不可欠な酵素であり、その観点から、抗菌剤発見のための標的と見なすことができる（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１００：４６７８−４６８３（２００３）（非特許文献16）、を参照）。しかし、ＲＮａｓｅ  Ｊ１、ＲＮａｓｅ  Ｙ、および／または以前に特徴付けられていないリボヌクレアーゼが、どのようにして、黄色ブドウ球菌内のｍＲＮＡ崩壊を調節するかは、まだ明らかになっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｈｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、３４：２５８８−２５９５（２００６）
【非特許文献２】Ｂａｎｃｒｏｆｔ、Ｅ．Ａ．、Ｊａｍａ、２９８：１８０３−１８０４（２００７）
【非特許文献３】Ｋｌｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊａｍａ、２９８：１７６３−１７７１（２００７）
【非特許文献４】Ａｐｐｅｌｂａｕｍ、Ｐ．Ｃ．、Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ、３０：３９８−４０８（２００７）
【非特許文献５】Ｚｅｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、５：２７５−２８６（２００５）
【非特許文献６】Ｃａｒｐｏｕｓｉｓ、Ａ．Ｊ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６１：７１−８７（２００７）
【非特許文献７】Ｍａｃｋｉｅ、Ｇ．Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９５：７２０−７２３（１９９８）
【非特許文献８】Ｖａｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１２：２７７０−２７８１（１９９８）
【非特許文献９】Ｃｏｎｄｏｎ、Ｃ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ、６７：１５７−１７４（２００３）
【非特許文献１０】Ｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３３：２１４１−２１５２（２００５）
【非特許文献１１】Ｍａｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、１２９：６８１−６９２（２００７）
【非特許文献１２】Ｃｏｍｍｉｃｈａｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、８：１３５０−１３６０（２００９）
【非特許文献１３】Ｍａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７０：１８３−１９６（２００８）
【非特許文献１４】Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｎａ、１５：２３３１−２３３９（２００９）
【非特許文献１５】Ｓｈａｈｂａｂｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＥｍｂｏＪ、２８：３５２３−３５３３（２００９）
【非特許文献１６】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１００：４６７８−４６８３（２００３）
【発明の概要】
【０００７】
例示され、幅広く記載されている開示材料、化合物、組成物、キット、および方法の目的の通りに、開示内容は、主組成物、前記組成物を製造する方法、および前記組成物を使う方法に関する。さらに具体的には、細菌リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の阻害剤として使用される化合物および組成物が本明細書で提供される。ＲＮａｓｅ阻害剤の１つの種類には、下記式：
【化１】
0006010548.tif 000002
の化合物、ならびにその薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグが含まれる。これらの化合物において、
Ａｒは置換もしくは未置換アリールまたは置換もしくは未置換ヘテロアリールであり、
Ｌは、
【化２】
0006010548.tif 000003
であり、
式中、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立してＯまたはＳであり、かつＸ３は、ＣＨ２またはＮＨであり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルからなる群からそれぞれ独立に選択される。この種類の化合物で、Ｒ１およびＲ２が、メチルであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素であり、かつＡｒが未置換フランである場合、Ｌは、
【化３】
0006010548.tif 000004
ではない。
【０００８】
ＲＮａｓｅ阻害剤の１つの種類には、下記構造
【化４】
0006010548.tif 000005
の化合物、ならびに、その薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグが含まれる。これらの化合物において、
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、およびＡ５は、ＮおよびＣＲ１からそれぞれ独立に選択され；Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、 置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルからそれぞれ独立に選択され；かつＲ４およびＲ５は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、または置換もしくは未置換ヘテロアルキルからそれぞれ独立に選択され、かつＹはＯ、ＳまたはＮＲ５である。この種類の化合物で、Ａ１、Ａ２、Ａ４およびＡ５がＣＨであり、Ｒ２およびＲ３が、水素であり、Ａ３が、ＣＣｌであり、かつＹがＳである場合、Ｒ４は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈではない。
【０００９】
また、本明細書で提供されるのは、上述の化合物の１つまたは複数および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物である。
【００１０】
さらに、本明細書で提供されるのは、対象の微生物感染を治療または予防する方法である。一部の実施形態では、方法は、有効量の下記構造
【化５】
0006010548.tif 000006
のＲＮａｓｅ阻害剤、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグを対象に投与する段階を含む。これらの化合物において、Ａｒは、置換もしくは未置換アリールまたは置換もしくは未置換ヘテロアリールであり、Ｌは、
【化６】
0006010548.tif 000007
であり、
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立にＯまたはＳであり、Ｘ３はＣＨ２またはＮＨであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルからそれぞれ独立に選択される。任意選択で、Ａｒは、置換もしくは未置換フラン、置換もしくは未置換チオフェン、または置換もしくは未置換フェニルから選択されることができる。いくつかの例において、ＲＮａｓｅ阻害剤は、
【化７】
0006010548.tif 000008
である。
【００１１】
他の実施形態において、対象の微生物感染を治療および予防する方法は、有効量の下記構造
【化８】
0006010548.tif 000009
のＲＮａｓｅ阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグを対象に投与する段階を含む。これらの化合物において、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、およびＡ５は、ＮおよびＣＲ１からそれぞれ独立に選択され；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルからそれぞれ独立に選択され、Ｒ４およびＲ５は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、または置換もしくは未置換ヘテロアルキニルからそれぞれ独立に選択され、かつＹはＯ、ＳまたはＮＲ５である。一部の例では、ＲＮａｓｅ阻害剤は、
【化９】
0006010548.tif 000010
である。
【００１２】
一部の実施形態では、微生物感染は、細菌感染である。細菌感染は、例えば、グラム陽性細菌感染であってもよい。任意選択で、細菌感染は、例えば、黄色ブドウ球菌感染、等のブドウ球菌感染である。黄色ブドウ球菌感染は、薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染またはバイオフィルム関連黄色ブドウ球菌感染であってもよい。一部の例では、ＲＮａｓｅ阻害剤は、ＲｎｐＡ阻害剤である。任意選択で、方法は、第２の化合物を対象に投与する段階をさらに含み、この場合、第２の化合物は、抗菌化合物である。
【００１３】
また、本明細書で提供されるのは、細菌リボヌクレアーゼを阻害する方法であり、細菌リボヌクレアーゼに、有効量のＲＮａｓｅ阻害剤を接触させる段階を含む。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤は、下記構造
【化１０】
0006010548.tif 000011
の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグである。これらの化合物において、Ａｒは、置換もしくは未置換アリールまたは置換もしくは未置換ヘテロアリールであり、Ｌは、
【化１１】
0006010548.tif 000012
であり、
式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立にＯまたはＳであり、Ｘ３は、ＣＨ２またはＮＨであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルからそれぞれ独立に選択される。
【００１４】
他の実施形態において、このＲＮａｓｅ阻害剤は、下記構造
【化１２】
0006010548.tif 000013
の化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグである。これらの化合物において、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、およびＡ５は、ＮおよびＣＲ１からそれぞれ独立に選択され；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルからそれぞれ独立に選択され；かつＲ４およびＲ５は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、または置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立に選択され、かつＹはＯ、Ｓ、またはＮＲ５である。
【００１５】
任意選択で、黄色ブドウ球菌ＲＮａｓｅ  Ｐ（例えば、ＲｎｐＡ）の細菌リボヌクレアーゼは、タンパク質成分であってもよい。接触させる段階は、例えば、インビボまたはインビトロで行われてもよい。
【００１６】
[本発明1001]
対象の微生物感染を治療または予防する方法であって、有効量の下記構造
[化1]
0006010548.tif 000014
のＲＮａｓｅ阻害剤、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグを対象に投与する段階を含む、方法：
式中、
Ａｒは、置換もしくは未置換アリールまたは置換もしくは未置換ヘテロアリールであり；
Ｌは、
[化2]
0006010548.tif 000015
であって、Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立にＯまたはＳであり、かつＸ3は、ＣＨ2またはＮＨであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルからそれぞれ独立に選択される。
[本発明1002]
Ａｒが、置換もしくは未置換フラン、置換もしくは未置換チオフェン、または置換もしくは未置換フェニルからなる群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、
[化3]
0006010548.tif 000016
である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
対象の微生物感染を治療または予防する方法であって、
有効量の下記構造
[化4]
0006010548.tif 000017
のＲＮａｓｅ阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグを対象に投与する段階を含む、方法：
式中、
Ａ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4、およびＡ5は、ＮおよびＣＲ1からそれぞれ独立に選択され；
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素、ハロゲン、ヒドロオキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルからなる群からそれぞれ独立に選択され；
Ｒ4およびＲ5は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、または置換もしくは未置換ヘテロアルキルからそれぞれ独立に選択され；
ＹはＯ、Ｓ、またはＮＲ5である。
[本発明1005]
前記ＲＮａｓｅ阻害剤が、
[化5]
0006010548.tif 000018
である、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記微生物感染が細菌感染である、本発明1001から1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記細菌感染がグラム陽性細菌感染である、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記細菌感染がブドウ球菌感染である、本発明1006の方法。
[本発明1009]
前記細菌感染が黄色ブドウ球菌感染である、本発明1006の方法。
[本発明1010]
前記黄色ブドウ球菌感染が薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染である、本発明1009の方法。
[本発明1011] 
前記黄色ブドウ球菌感染がバイオフィルム関連黄色ブドウ球菌感染である、本発明1009の方法。
[本発明1012]
前記ＲＮａｓｅ阻害剤がＲｎｐＡ阻害剤である、本発明1001から1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
抗菌化合物である第2の化合物を投与する段階をさらに含む、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1014]
細菌リボヌクレアーゼを阻害する方法であって、細菌リボヌクレアーゼを有効量の下記構造
[化6]
0006010548.tif 000019
のＲＮａｓｅ阻害剤、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグと接触させる段階を含む、方法：
式中、
Ａｒは、置換もしくは未置換アリール、または置換もしくは未置換ヘテロアリールであり；
Ｌは、
[化7]
0006010548.tif 000020
であり、Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立してＯまたはＳであり、かつ、Ｘ3は、ＣＨ2またはＮＨであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルからそれぞれ独立に選択される。
[本発明1015]
細菌リボヌクレアーゼを阻害する方法であって、細菌リボヌクレアーゼを有効量の下記構造
[化8]
0006010548.tif 000021
のＲＮａｓｅ阻害剤、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグと接触させる段階を含む、方法：
式中、
Ａ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4、およびＡ5は、ＮおよびＣＲ1からそれぞれ独立に選択され；
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルからそれぞれ独立に選択され；
Ｒ4およびＲ5は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、または置換もしくは未置換ヘテロアルキルからそれぞれ独立に選択され；かつ
Ｙは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ5である。
[本発明1016]
前記細菌リボヌクレアーゼが黄色ブドウ球菌ＲＮａｓｅ  Ｐである、本発明1014または1015の方法。
[本発明1017]
前記細菌リボヌクレアーゼがＲｎｐＡである、本発明1014または1015の方法。
[本発明1018]
前記接触させる段階がインビボで行われる、本発明1001から1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記接触させる段階がインビトロで行われる、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1020]
下記構造
[化9]
0006010548.tif 000022
の化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグ：
式中、
Ａｒは、置換もしくは未置換アリール、または置換もしくは未置換ヘテロアリールであり、
Ｌは、
[化10]
0006010548.tif 000023
であり、Ｘ1およびＸ2は、それぞれ独立にＯまたはＳであり、かつＸ3は、ＣＨ2またはＮＨであり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルからそれぞれ独立に選択され；
Ｒ1およびＲ2がメチルであり、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6が水素であり、かつＡｒが未置換フランである場合、Ｌは、
[化11]
0006010548.tif 000024
ではない。
[本発明1021]
下記構造
[化12]
0006010548.tif 000025
の化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグ：
式中、
Ａ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4、およびＡ5は、ＮおよびＣＲ1からそれぞれ独立に選択され；
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルからそれぞれ独立に選択され；
Ｒ4およびＲ5は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、または置換もしくは未置換ヘテロアルキルからそれぞれ独立に選択され；
Ｙは、Ｏ、ＳまたはＮＲ5であり；
Ａ1、Ａ2、Ａ4、およびＡ5が、ＣＨであり、Ｒ2およびＲ3が水素であり、Ａ3がＣＣｌであり、かつＹがＳである場合、Ｒ4は、ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈではない。
[本発明1022]
本発明1020または1021の化合物の1つまたは複数および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物。
追加の利点は、以下で説明され、その記載により明らかとなろう。あるいは、以下に記載の態様の実施により理解されよう。下記の利点は、特に、添付の特許請求の範囲で示される要素および組み合わせの手段により実現され、達成されるであろう。前出の一般的説明および以下の詳細説明の両方は、代表としての例示のみの目的であり、限定するものではないことは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】対数期および／または定常期増殖（Ｘ−軸）の間の、２．５、５、１５、３０分以下、または３０分を超える半減期を有する検出可能なｍＲＮＡ種の割合（Ｙ−軸）を示すグラフである。
【図２Ａ】黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡがｒＲＮＡおよびｍＲＮＡ消化を触媒することを示す。精製された組換え黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥであり；示されているのは、分子マーカー（レーンＭ）、２．５μｇおよび２５μｇ溶出産物（それぞれレーン１および２）である。
【図２Ｂ】黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡがｒＲＮＡおよびｍＲＮＡ消化を触媒することを示す。１Ｘ反応緩衝液（２ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．０）中の５０ｐｍｏｌの各推定上のリボヌクレアーゼ（示されている）の非存在（−）または存在（＋）下における６０分インキュベーション後の１μｇの全黄色ブドウ球菌ＲＮＡのゲル移動を示す。
【図２Ｃ】黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡがｒＲＮＡおよびｍＲＮＡ消化を触媒することを示す。１Ｘ反応緩衝液中の示した量のＲｎｐＡタンパク質の非存在（０ｐｍｏｌ）または存在下で６０分のインキュベーション後に、インビトロで転写された０．５ｐｍｏｌ  ｓｐａ  ｍＲＮＡの移動を示す。分子量マーカー（Ｍ）が示されている。
【図２Ｄ】黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡがｒＲＮＡおよびｍＲＮＡ消化を触媒することを示す。５０ｐｍｏｌ  ＲｎｐＡまたはＲＮａｓｅ  Ｊ１の非存在（−）もしくは存在（＋）下で、および非存在（血清単独）または１、２．５、５、１０、もしくは２０μｇ  ＲｎｐＡポリクローナル抗体の存在下の、２μｇのインビトロ転写ｓｐａ  ｍＲＮＡの逆転写媒介ＰＣＲ産物を示す。
【図２Ｅ】黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡがｒＲＮＡおよびｍＲＮＡ消化を触媒することを示す。転写後０分（Ｘ−軸）および１０分（Ｙ−軸）停止時のＧｅｎｅＣｈｉｐ上で測定された全ｍＲＮＡ種に対する測定値のプロットを示す。灰色点線は、各試料に対する感度の下限値を示す。
【図３】パネルＡは、１０μＭのＣｄＣｌ２の存在下で増殖させた場合の、ベクター（ｐＣＮ５１；菱形）、ｒｎｐＡセンスＲＮＡ（ｐＲＮＰＡ−Ｓ；三角形）およびｒｎｐＡアンチセンスＲＮＡ（ｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓ．；正方形）含有黄色ブドウ球菌株ＲＮ４２２０の増殖特性（光学密度；Ｙ−軸）のプロットを示す。パネルＢは、２．５μＭのＣｄＣｌ２の存在下で増殖させた黄色ブドウ球菌株ＲＮ４２２０  ｐＣＮ５１（ベクター）、ＲＮ４２２０ｐＲＮＰＡ（過剰発現体）、およびＲＮ４２２０  ｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓ．（ＲｎｐＡ枯渇）細胞のウェスタンブロッティング結果を示す。
【図４Ａ】ＲｎｐＡ阻害に関して試験された化合物の構造、見かけのＩＣ５０測定値、およびすべての米国メチシリン耐性黄色ブドウ球菌系統および他の生物体の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）中央値を示す。
【図４Ｂ】ＲｎｐＡ阻害に関して試験された化合物の構造、見かけのＩＣ５０測定値、およびすべての米国メチシリン耐性黄色ブドウ球菌系統および他の生物体の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）中央値を示す。
【図５】示された化合物のＭＩＣ値の１、２、または４倍に暴露されたＨｅｐＧ２細胞から得られた細胞傷害性アッセイを示す。ＤＭＳＡで処理されたＨｅｐＧ２細胞（ＨｅｐＧ２）を陰性対照とし、マイトマイシンＣ（５または１０μｇ／ｍｌ）で処理された細胞を陽性対照とした。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本明細書で提供されるのは、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）活性関連細菌性ＲｎｐＡの小分子阻害剤、それらの調製方法、および微生物感染の治療および予防における使用方法である。小分子阻害剤は、ｒＲＮＡおよびｍＲＮＡの消化を触媒する不可欠のタンパク質、ＲｎｐＡ、を含む黄色ブドウ球菌、等の微生物感染治療の新規機序を開拓する。この機序は、今まで、既知でなく、または開発されていなかった。この活性の開拓にあたり、高スループットで二次的な選別アッセイを採用し、ＲｎｐＡ媒介ＲＮＡ分解の小分子阻害剤の特定を行った。これらの薬剤は、細胞性ｍＲＮＡ分解を制限し、いくつかの微生物に対する抗菌活性を示した。これらの微生物には、米国中に出回っている主なメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）系統、バンコマイシン中程度感受性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）および高ＲｎｐＡアミノ酸保存の他のグラム陽性細菌病原体が含まれる（ＭｃＤｏｕｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４１：５１１３−５１２０（２００３）、を参照）。本明細書で提供されるように、ＲｎｐＡ阻害剤は、全身性マウス感染モデルでの疾患を制限し、バイオフィルム関連黄色ブドウ球菌に対し抗菌活性がある。まとめると、これらの知見は、ＲｎｐＡが黄色ブドウ球菌のＲＮＡ分解で重要な役割を果たすことを示し、高スループット選別を使ってｍＲＮＡ代謝回転阻害剤を特定できることを立証し、ＲＮＡ異化反応に基づく抗菌療法の原理に対する証明を与える。
【００１９】
本明細書記載の材料、化合物、組成物、製品、および方法は、開示内容およびその中の実施例の下記の特定の態様の詳細説明を参照することにより、容易に理解されよう。
【００２０】
本材料、化合物、組成物、キット、および方法が開示および記載される前に、以下に記載の態様は、当然変わってもよいので、特定の合成方法または特定の試薬に限定されないことは理解されよう。また、本明細書で使用される用語は、特定の態様のみの説明の目的のためであり、限定する意図はないことも理解されよう。
【００２１】
また、この明細書の全体を通して、種々の出版物が引用される。これらの出版物の開示は、その全体が、開示内容が関係する最先端技術をより完全に説明するために、参照によって本出願に組み込まれる。開示された文献は、また、文中で考察されるその文献の内容のために、個別に、具体的に参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２２】
一般的定義
本明細書および添付の特許請求の範囲では、多くの用語に言及されるが、これらは、下記の意味を持つものとする：
【００２３】
本明細書の記載および添付の特許請求の範囲の全体にわたり、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および単語の他の形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、限定されないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味し、例えば、他の添加物、成分、整数、または工程、を排除する意図はない。
【００２４】
本説明および添付の特許請求の範囲で使われるように、単数形「１つの」、「ある」、および「その」は、文意が明確に別義を示さない限り、複数の対象を含む。従って、例えば、「組成物（ａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」への言及は、２つ以上のこのような組成物の混合物を含み、「化合物（ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は、２つ以上のこのような組成物の混合物を含む、等。
【００２５】
「任意選択の（Ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「任意選択で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、その後に続くイベントまたは状況が起こっても起こらなくてもよく、また、その説明がイベントまたは状況が起こる場合、および起こらない場合を含むことを意味する。
【００２６】
本明細書では、範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までのように表現できる。このような範囲が表される場合、別の態様は、１つの特定の値から、および／またはもう一つの特定の値まで含む。同様に、値が近似値として、先行詞「約」によって表される場合は、特定の値は、別の態様を形成すると理解されるであろう。それぞれの範囲の終点は、他方の終点に関連して、および、他方の終点とは無関係に、意味があることもさらに理解されよう。本明細書でいくつかの値が開示され、それぞれの値は、また、本明細書では、値それ自体に加えて、「約」その特定の値としても開示されることも理解されよう。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。値が開示されると、「以下の（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ｏｒ  ｅｑｕａｌ  ｔｏ）」値、「以上の値（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ  ｏｒ  ｅｑｕａｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｖａｌｕｅ）」、および値の間の可能な範囲もまた、当業者には適切に理解されるように、開示されることも理解されよう。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」ならびに「１０以上」もまた、開示される。出願全体を通し、データがいくつかの異なるフォーマットで提供され、このデータが終点および始点ならびにデータポイントの任意の組み合わせの範囲を表すことも理解されよう。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント「１５」が開示される場合、１０と１５より大きい、以上、未満、以下およびこれらに等しい、ならびに１０および１５の間、が開示されていると見なされることが理解されよう。また、２つの特定のユニットの間のそれぞれのユニットも開示されていると理解されよう。例えば、１０と１５が開示される場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。
【００２７】
本明細書で使われる「対象」は、個体を意味する。従って、「対象」は、家畜化動物（例えば、ネコ、イヌ、等）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、等）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、等）、および鳥類、を含むことができる。対象は、また、哺乳動物、例えば、霊長類またはヒトを含むことができる。
【００２８】
「減らす（ｒｅｄｕｃｅ）」またはこの語の他の形、例えば、「減少（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」または「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」は、イベントまたは特性（例えば、細菌感染）を低下させることを意味する。典型的な例では、いくつかの標準的または予測値に対するものであり、換言すれば、相対的であるが、必ずしもいつも参照される標準的な値または比較する値が必要ではないことは理解されよう。例えば、「細菌感染を減らす」は、標準または対照に比べて細菌感染の蔓延を減らすことを意味する。
【００２９】
「防ぐ（ｐｒｅｖｅｎｔ）」またはこの語の他の形、例えば、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、特定のイベントまたは特性を停止させ、特定のイベントまたは特性の発生または進行を固定または遅らせること、または特定のイベントまたは特性が発生する機会を最小化することを意味する。例えば、減らす（ｒｅｄｕｃｅ）より絶対的であるので、典型的な例では、防ぐ（ｐｒｅｖｅｎｔ）は、対照に対する比較を必要としない。本明細書で使用されるように、減らすことはできるが防止できないものもあれば、減らすことができ、さらに防止も可能なものもある。同様に、あるものは防止できるが減らすことができないが、あるものは防止され、さらに減らすことも可能である。減らすまたは防ぐが使用される場合は、特に別義が指定されない限り、もう一方の語の使用も明示的に開示されることは理解されよう。
【００３０】
「治療（ｔｒｅａｔ）」またはこの語の他の形、例えば、「治療された（ｔｒｅａｔｅｄ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、特定の特性またはイベント（例えば、腫瘍成長または生存）を減らす、防ぐ、抑制する、または取り除くために、組成物を投与すること、またはある方法を実行することを意味する。用語「制御する（ｃｏｎｔｒｏｌ）」は、用語「治療（ｔｒｅａｔ）」と同義に使用される。
【００３１】
「抗菌」は、任意の濃度で微生物の増殖を治療または制御する（例えば、減らす、防ぐ、抑制する、または除く）能力を意味する。同様に、用語「抗菌性」は、任意の濃度で細胞性細菌増殖を治療または制御する能力を意味する。
【００３２】
本明細書の全体を通して、識別子「第１の」および「第２の」は、開示内容の種々の要素および工程を区別するのを助けるためのみの目的で使用されることは理解されよう。識別子「第１の」および「第２の」が、これらの用語で修飾される要素または工程に対し、特定の順番、量、優先度、または重要性を意味することは、まったく意図されていない。
【００３３】
化学上の定義
本明細書で使用される用語「置換」は、全ての許容される有機化合物の置換基を含むことが意図されている。広範な態様では、許容可能な置換基には、非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環式およびヘテロ環式、ならびに芳香族および非芳香族有機化合物置換基が含まれる。置換基の例には、例えば、下記に記載のものが含まれる。許容可能な置換基は、適切な有機化合物の、１つまたは複数の置換基であっても、同じでまたは異なる置換基であってもよい。本開示の目的のためには、窒素、等のヘテロ原子は、水素置換基および／または本明細書記載のヘテロ原子の原子価に適合するいずれかの許容可能な有機化合物置換基を持つことができる。本開示は、どのような形であれ、許容可能な有機化合物置換基を制限する意図はない。また、用語「置換」または「で置換」は、このような置換は、置換原子および置換基の許容された原子価に一致し、また、置換は、安定な化合物を生じ、例えば、化合物は、例えば、転移、環化、離脱、等により自然に変換を受けないという暗黙の条件を含む。
【００３４】
「Ｚ１」、「Ｚ２」、「Ｚ３」、および「Ｚ４」は、本明細書で一般的記号として種々の特定の置換基を表すために使用される。これらの記号は、任意の置換基でよく、本明細書で開示のものに限定されない。また、それらが、１つの例で特定の置換基であると定義される場合は、それらは、別の例では、いくつかの他の置換基として定義できる。
【００３５】
本明細書で使われる用語「脂肪族」は、非芳香族炭化水素基を意味し、分岐および非分岐、アルキル、アルケニル、またはアルキニル基を含む。
【００３６】
本明細書で使われる用語「アルキル」は、１〜２４炭素原子の分岐または非分岐飽和炭化水素基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシル、等である。アルキル基は、また、置換されていても未置換であってもよい。アルキル基は、限定されないが、下記に記載されるように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルフォオキソ、スルホニル、スルホン、スルフォキシド、またはチオール、を含む１つまたは複数の基で置換できる。
【００３７】
明細書全体を通して、「アルキル」は、一般的に、未置換アルキル基および置換アルキル基の両方を指すのに使われるが、本明細書では、置換アルキル基は、また、具体的に、アルキル基上の特定の置換基を特定することを意味する。例えば、用語「ハロゲン化アルキル」は、１つまたは複数のハロゲン化物、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素で置換されるアルキル基を具体的に指す。用語「アルコキシアルキル」は、以降で記載する１つまたは複数のアルコキシ基で置換されるアルキル基を具体的に指す。用語「アルキルアミノ」は、以降で記載する１つまたは複数のアミノ基で置換されるアルキル基を具体的に指す、等。「アルキル」が、１つの例で使われ、特定の用語、例えば、「アルキルアルコール」が別の例で使われる場合、用語「アルキル」が、特定の用語、例えば、「アルキルアルコール」、等もまた指さないことを暗示するようには意図されていない。
【００３８】
この手法は、本明細書記載の他の基にも使用される。すなわち、「シクロアルキル」等の用語は、未置換および置換シクロアルキル成分の両方を意味するが、置換成分は、さらに、本明細書で具体的に特定でき、例えば、特定の置換シクロアルキルは、例えば、「アルキルシクロアルキル」と呼ぶことができる。同様に、置換アルコキシは、具体的に、例えば、「ハロゲン化アルコキシ」と、また、特定の置換アルケニルは、例えば、「アルケニルアルコール」、と呼ぶことができる、等。繰り返すが、一般用語、例えば、「シクロアルキル」および特定の用語、例えば、「アルキルシクロアルキル」を使う手法は、一般用語が、特定の用語もまた含まないことを暗示するようには意図されていない。
【００３９】
本明細書で使われる用語「アルコキシ」は、単一の、末端エーテル結合を介して結合したアルキル基であり、すなわち、「アルコキシ」基は、−ＯＺ１として定義できる。ここでＺ１は、上で定義のアルキルである。
【００４０】
本明細書で使われる用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む構造式を有する２〜２４炭素原子の炭化水素基である。非対称の構造、例えば、（Ｚ１Ｚ２）Ｃ＝Ｃ（Ｚ３Ｚ４）は、ＥおよびＺ異性体の両方を含むことが意図されている。これは、非対称のアルケンが存在する本明細書の構造式で推定できるか、または明示的に結合記号Ｃ＝Ｃにより示されうる。アルケニル基は、限定されないが、以降で記載のように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルフォオキソ、スルホニル、スルホン、スルフォキシド、またはチオール、を含む１つまたは複数の基で置換できる。
【００４１】
本明細書で使われる用語「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む構造式を有する２〜２４炭素原子の炭化水素基である。アルキニル基は、以降で記載のように、限定されないが、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルフォオキソ、スルホニル、スルホン、スルフォキシド、またはチオール、を含む１つまたは複数の基で置換できる。
【００４２】
本明細書で使われる用語「アリール」は、限定されないが、ベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、フェノキシベンゼン、等のいずれかの炭素ベース芳香族基を含む基である。用語「ヘテロアリール」は、芳香族基の環中に組み込まれた少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基を含む基として定義される。ヘテロ原子の例には限定されないが、窒素、酸素、硫黄、およびリンが含まれる。用語「アリール」に包含される用語「非ヘテロアリール」は、ヘテロ原子を含まない芳香族基を含む基であると定義される。アリールまたはヘテロアリール基は、置換されていても未置換であってもよい。アリールまたはヘテロアリール基は、限定されないが、本明細書記載の、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルフォオキソ、スルホニル、スルホン、スルフォキシド、またはチオール、を含む１つまたは複数の基で置換できる。用語「ビアリール」は、アリール基の特定のタイプで、アリール定義に含まれる。ビアリールは、ナフタレンの場合のように、縮合環構造を介して一緒に結合された、またはビフェニルの場合のように、１つまたは複数の炭素−炭素結合を介して結合された２つのアリール基を意味する。
【００４３】
本明細書で使われる用語「シクロアルキル」は、少なくとも３つの炭素原子からなる非芳香族炭素ベース環である。シクロアルキル基の例には、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、等が含まれる。用語「ヘテロシクロアルキル」は、環の少なくとも１つの炭素原子が、ヘテロ原子、例えば、限定されないが、窒素、酸素、硫黄、またはリンで置換されている上記で定義のシクロアルキル基である。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、置換されていても未置換でもよい。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、限定されないが、本明細書記載のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルフォオキソ、スルホニル、スルホン、スルフォキシド、またはチオールを含む１つまたは複数の基で置換できる。
【００４４】
本明細書で使われる用語「シクロアルケニル」は、少なくとも３つの炭素原子からなる非芳香族炭素ベース環であり、少なくとも１つの二重結合、すなわち、Ｃ＝Ｃを含む。シクロアルケニル基の例には、限定されないが、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、等が含まれる。用語「ヘテロシクロアルケニル」は、上記で定義のシクロアルケニル基の１つのタイプであり、環の少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子、例えば、限定されないが、窒素、酸素、硫黄、またはリンで置換される場合の、用語「シクロアルケニル」の意味に包含される。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、置換されていても未置換であってもよい。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、限定されないが、本明細書記載のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルフォオキソ、スルホニル、スルホン、スルフォキシド、またはチオール、を含む１つまたは複数の基で置換できる。
【００４５】
用語「環式基」は、本明細書では、アリール基、非アリール基（すなわち、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニル基）、または両方を指すために使用される。環式基は、置換されていても未置換でもよい１つまたは複数の環系を有する。環式基は、１つまたは複数のアリール基、１つまたは複数の非アリール基、または１つまたは複数のアリール基と１つまたは複数の非アリール基を含むことができる。
【００４６】
本明細書で使われる用語「アルデヒド」は、式：−Ｃ（Ｏ）Ｈで表される。この明細書全体を通して、「Ｃ（Ｏ）」または「ＣＯ」は、Ｃ＝Ｏの略式表記である。
【００４７】
本明細書で使われる用語「アミン」または「アミノ」は、式：−ＮＺ１Ｚ２で表され、Ｚ１およびＺ２は、それぞれ、本明細書記載の置換基、例えば、上述の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい。
【００４８】
本明細書で使われる用語「カルボン酸」は、式：−Ｃ（Ｏ）ＯＨで表される。本明細書で使われる「カルボキシラート」または「カルボキシル」基は、式：−Ｃ（Ｏ）Ｏ−で表される。
【００４９】
本明細書で使われる用語「エステル」は、式：−ＯＣ（Ｏ）Ｚ１または−Ｃ（Ｏ）ＯＺ１で表され、Ｚ１は、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい。
【００５０】
本明細書で使われる用語「エーテル」は、式：Ｚ１ＯＺ２で表され、Ｚ１およびＺ２は、独立に、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい。
【００５１】
本明細書で使われる用語「ケトン」は、式：Ｚ１Ｃ（Ｏ）Ｚ２で表され、Ｚ１およびＺ２は、独立に、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい。
【００５２】
本明細書で使われる用語「ハロゲン化物」または「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を意味する。
【００５３】
本明細書で使われる用語「ヒドロキシル」は、式：−ＯＨで表される。
【００５４】
本明細書で使われる用語「ニトロ」は、式：−ＮＯ２で表される。
【００５５】
本明細書で使われる用語「シリル」は、式：−ＳｉＺ１Ｚ２Ｚ３で表され、Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３は、独立に、上述の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい。
【００５６】
用語「スルホニル」は、本明細書では、式：−Ｓ（Ｏ）２Ｚ１で表されるスルフォオキソ基を意味し、Ｚ１は、上述の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい。
【００５７】
本明細書で使われる用語「スルホニルアミノ」または「スルホンアミド」は、式：−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−で表される。
【００５８】
本明細書で使われる用語「チオール」は、式：−ＳＨで表される。
【００５９】
本明細書で使われる用語「チオ」は、式：−Ｓ−で表される。
【００６０】
本明細書で使われる「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」、「Ｒｎ」、等（ｎはある整数）は、独立に、上に挙げた１つまたは複数の基を持つことができる。例えば、Ｒ１が直鎖アルキル基の場合、アルキル基の１つの水素原子は、任意選択で、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アミン基、アルキル基、ハロゲン化物、等で置換できる。選択された基に応じて、第１の基は、第２の基中に組み込むことができ、または、代わりに、第１の基は、第２の基にぶら下げても（すなわち、結合しても）よい。例えば、語句「アミノ基を含むアルキル基」で、アミノ基は、アルキル基の骨格内に組み込むことができる。あるいは、アミノ基は、アルキル基の骨格に結合できる。選択された基の性質が、第１の基が第２の基に埋め込まれるか、または結合するかを決定するであろう。
【００６１】
そうでないとの記述がない限り、化学結合が楔または点線としてではなく、実線のみとして示された式は、それぞれ、可能な異性体、例えば、それぞれ、鏡像異性体、ジアステレオマー、およびメソ化合物、ならびに異性体の混合物、例えば、ラセミまたはスケールミック混合物が意図されている。
【００６２】
以降で、開示物質、化合物、組成物、製品、および方法の特定の態様に対し詳細な言及がなされ、それらの例が、付随する実施例中で説明される。
【００６３】
化合物
本明細書記載の細菌リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の小分子阻害剤は、本明細書に記載される。阻害剤の第１の基は、式Ｉ：
【化１３】
0006010548.tif 000026
で表される化合物、ならびにその薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグを含む。
【００６４】
式Ｉで、Ａｒは置換もしくは未置換アリール、または置換もしくは未置換ヘテロアリールである。いくつかの例では、Ａｒは、置換もしくは未置換フラン、置換もしくは未置換チオフェン、または置換もしくは未置換フェニルである。
【００６５】
また、式Ｉで、Ｌは、  
【化１４】
0006010548.tif 000027
である。
【００６６】
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立にＯまたはＳとすることができる。いくつかの例では、Ｘ１はＯであり、かつＸ２はＳである。Ｘ３はＣＨ２またはＮＨである。Ｌで、
【化１５】
0006010548.tif 000028
は、式ＩにおけるＡｒまたは−ＣＨ２Ｏ−に対する炭素原子の付着を意味する。たとえば、式Ｉによる化合物を、Ｌに基づく下記構造；
【化１６】
0006010548.tif 000029
により表すことができる。いくつかの構造Ｉ−Ａの例では、Ｘ１およびＸ２はＯとすることができ、かつＸ３はＮＨとすることができる。
【００６７】
さらに、式Ｉで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルからそれぞれ独立に選択される。いくつかの例では、Ｒ１およびＲ２は、メチルである。いくつかの例では、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、水素である。
【００６８】
式Ｉで、隣接Ｒ基、例えば、Ｒ１およびＲ２、Ｒ３およびＲ４、ならびにＲ５およびＲ６を結合させて、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換シクロアルキル、置換もしくは未置換シクロアルケニル、置換もしくは未置換シクロアルキニル、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルケニル、または置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキニルを形成できる。たとえば、Ｒ５は置換または未置換エチレン基であってよく、Ｒ６は置換または未置換プロピレン基であってよく、これらが結合して置換または未置換フェニルを形成する。他の隣接Ｒ基は、Ｒ１およびＲ２、ならびにＲ３およびＲ４を含む。
【００６９】
上述のように、式ＩのＡｒはフランとすることができる。これらの式Ｉの実施形態は、下記構造Ｉ−Ｄ
【化１７】
0006010548.tif 000030
を含むことができる。
【００７０】
式Ｉのいくつかの例において、Ｒ１およびＲ２がメチルであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が水素であり、かつＡｒが未置換フランである場合、Ｌは、
【化１８】
0006010548.tif 000031
ではない。
【００７１】
式Ｉの特定の例は、化合物ＲＮＰＡ−２０００
【化１９】
0006010548.tif 000032
である。
【００７２】
阻害剤の第２の基は、式ＩＩ
【化２０】
0006010548.tif 000033
により表される化合物ならびにその薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグを含む。
【００７３】
式ＩＩで、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、およびＡ５は、ＮおよびＣＲ１からそれぞれ独立に選択される。Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシル、から独立に選択できる。いくつかの例では、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、およびＡ５はそれぞれＣＲ１である。いくつかの例では、Ａ３は、−ＣＣｌである。
【００７４】
また、式ＩＩで、Ｒ２およびＲ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシル、からそれぞれ独立に選択できる。いくつかの例で、Ｒ２およびＲ３は両方ともが水素である。
【００７５】
さらに、式ＩＩで、Ｒ４は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルから選択される。いくつかの例では、Ｒ４は、カルボン酸を含む。たとえば、Ｒ４は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈとすることができる。いくつかの例では、Ｒ４は、置換もしくは未置換アリールまたは置換もしくは未置換ヘテロアリールとすることができる。これらの例は、構造ＩＩ−Ａ
【化２１】
0006010548.tif 000034
により表すことができる。構造ＩＩ−Ａにおいて、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９およびＡ１０は、ＮおよびＣＲ６からそれぞれ独立に選択される。Ｒ６は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルからそれぞれ独立に選択される。
【００７６】
さらに、式ＩＩでは、ＹはＯ、Ｓ、またはＮＲ５である。Ｒ５は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、または置換もしくは未置換ヘテロアルキルから選択される。いくつかの例では、ＹはＳである。これらの例は、構造ＩＩ−Ｂ
【化２２】
0006010548.tif 000035
により表すことができる。
【００７７】
任意選択で、ＹはＮＲ５とすることができる。これらの例は、構造ＩＩ−Ｃ
【化２３】
0006010548.tif 000036
により表すことができる。
【００７８】
式ＩＩで、隣接Ｒ基、たとえば、２つの隣接Ｒ１基またはＲ２およびＲ３基を結合させて、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換シクロアルキル、置換もしくは未置換シクロアルケニル、置換もしくは未置換シクロアルキニル、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルケニル、または置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキニルを形成できる。たとえば、Ｒ２は置換または未置換エチレン基であってよく、Ｒ３は置換または未置換プロピレン基であってよく、これらが結合して置換または未置換フェニルを形成する。
【００７９】
式ＩＩの一部の例では、Ａ１、Ａ２、Ａ４およびＡ５が、ＣＨであり、Ｒ２およびＲ３が水素であり、Ａ３がＣＣｌであり、かつＹがＳである場合、Ｒ４は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈではない。
【００８０】
式ＩＩの特定の例は、化合物ＲＮＰＡ−３０００
【化２４】
0006010548.tif 000037
である。
【００８１】
医薬組成物
本明細書記載の化合物またはその誘導体は、医薬組成物として提供できる。目的とする投与モードに応じて、医薬組成物は、好ましくは、正確な投与量の一回投与に適する単位剤形の固体、半固形または液体剤形、例えば、錠剤、坐剤、ピル、カプセル剤、粉剤、液剤、または懸濁剤の形態であってよい。組成物は、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて、治療有効量の本明細書記載の化合物またはその誘導体を含み、さらに、他の薬剤、医薬品、キャリア、または希釈剤を含んでもよい。薬学的に許容可能とは、生物学的でもなく、その他の理由で望ましくないものでもない材料を意味し、これは、容認できない生物学的影響、または医薬組成物中に含まれるほかの成分との有害な相互作用を生じることなく、選択化合物と一緒に個体に投与できる。
【００８２】
本明細書で使用される用語のキャリアは、賦形剤、希釈剤、フィラー、塩、緩衝液、安定剤、溶解剤、脂質、安定剤、または当技術分野で製剤での使用によく知られた他の物質のいずれかを包含する。組成物中での使用のためのキャリアの選択は、組成物のための目的の投与経路に依存する。これらの物質を含む薬学的に許容可能なキャリアおよび製剤の調製は、例えば、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｅｄ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｐａ．、２００５、に記載されている。生理学的に受容可能なキャリアの例には、下記が含まれる：緩衝液、例えば、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、および他の有機酸を含む緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性高分子、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン；単糖類、二糖類、およびブドウ糖、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ＩＣＩ、Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）（ＢＡＳＦ；Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）。
【００８３】
非経口の注射用に適する本明細書記載の化合物またはその誘導体を含む組成物は、生理学的に受容可能な無菌の水性または非水性溶液、分散液、懸濁液または乳剤、および無菌の注射可能溶液または分散液中への再構成用の無菌粉末を含むことができる。適切な水性および非水性キャリア、希釈剤、溶剤またはビークルの例には、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、等）、それらの適切な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）および注射可能有機エステル、例えば、エチルオレアート、が含まれる。適切な流動度は、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合には必要粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持できる。
【００８４】
これらの組成物は、また、アジュバント、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤を含むことができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、等により推進できる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム、等もまた、含めることができる。注射可能剤型の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の使用により実現できる。
【００８５】
本明細書記載の化合物またはその誘導体の経口投与用固形剤形には、カプセル剤、錠剤、ピル、粉剤、粒剤が含まれる。固形剤形では、本明細書記載の化合物またはその誘導体が、不活性の通常の賦形剤（またはキャリア）、例えば、ナトリウムクエン酸塩もしくはジリン酸カルシウムまたは（ａ）充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール、およびケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、およびアラビアゴム、（ｃ）軟釈剤、例えば、グリセリン、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定の複合ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、４級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、およびグリセリンモノステアラート、（ｈ）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、ならびに（ｉ）潤滑剤、例えば、滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはこれらの混合物、の内の少なくとも１つと混合される。カプセル剤、錠剤、およびピルの場合には、剤形は、また、緩衝剤を含むことができる。
【００８６】
類似のタイプの固形組成物は、また、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール、等の賦形剤を使って、軟および硬ゼラチンカプセル剤中のフィラーとして使用可能である。
【００８７】
錠剤、糖衣錠、カプセル剤、ピル、および粒剤、等の固形剤形は、腸溶コーティングおよび当技術分野で既知のもの、等のコーティングおよびシェルを使って調製できる。これらは、乳白剤を含んでもよく、また、腸管の特定の部位で、遅延方式で、活性化合物または複数活性化合物を放出する組成物であってもよい。使用できる包埋組成物の例は、高分子物質および蝋である。活性化合物は、また、適切であれば１つまたは複数の上記賦形剤と一緒に、マイクロカプセル剤形に入れてもよい。
【００８８】
本明細書記載の化合物またはその誘導体の経口投与用液体剤形には、薬学的に許容可能な乳剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。活性化合物の他に、液体剤形は、当技術分野で通常使われる不活性希釈剤、例えば、水または他の溶剤、可溶化剤、および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチル炭酸塩、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル、特に、綿実油、ピーナッツオイル、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの混合物、等を含んでもよい。
【００８９】
また、このような不活性希釈剤に加えて、組成物は、追加の薬剤、例えば、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、調味料、または賦香剤を含んでもよい。
【００９０】
活性化合物の他に、懸濁剤は、追加の薬剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガント、またはこれらの物質の混合物、等を含んでもよい。
【００９１】
本明細書記載の化合物またはその誘導体の直腸投与用組成物は、任意選択の坐剤で、これは、化合物を、適切な非刺激性賦形剤またはキャリア、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ろうと混合することにより調製できる。これらの賦形剤またはキャリアは、常温で固体であるが、体温では液体であり、従って、直腸または腟腔中で溶解し、活性成分を放出する。
【００９２】
本明細書記載の化合物またはその誘導体の局所投与用剤形には、軟膏、粉剤、噴霧剤、および吸入剤が含まれる。本明細書記載の化合物またはその誘導体は無菌条件下で、生理学的に受容可能なキャリアおよび、必要に応じ、いずれかの防腐剤、緩衝剤、または噴霧剤と混合される。眼製剤、軟膏、粉剤、および溶液剤は、また、組成物の範囲内にあることが意図されている。
【００９３】
組成物は、１つまたは複数の本明細書記載の化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含むことができる。本明細書で使われる用語の薬学的に許容可能な塩は、本明細書記載の化合物またはその誘導体の、健全な医学判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等なしに、対象の組織と接触させる使用に適し、合理的な便益／リスク比に見合った、目的の使用に有効な塩、ならびに、可能であれば、本明細書記載の化合物の双性イオン型、を意味する。用語の塩は、本明細書記載の化合物の相対的に非毒性の、無機および有機酸付加塩を意味する。これらの塩は、化合物の単離および精製の間にインサイチューで、または遊離塩基型の精製化合物を適切な有機または無機酸と別々に反応させ、それにより生成した塩を単離することにより、調製することができる。代表的塩には、下記が含まれる：臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレアート、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、ベンゾアート、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸エステル、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチラートメシラート、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、メタンスルホン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩、等。これらは、アルカリおよびアルカリ土類金属に属するカチオン、例えば、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、等、ならびに限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン、等を含む非毒性アンモニウム、４級アンモニウム、およびアミンカチオン、を含むことができる（Ｓ．Ｍ．Ｂａｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９７７）６６、１、を参照。この文献は、参照により少なくとも本明細書で教示された組成物に関して、その全体が、本明細書に組み込まれる）。
【００９４】
本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩の対象への投与は、本明細書記載のように、治療有効量の本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩を使って、障害を治療するのに効果的な期間、実施できる。
【００９５】
本明細書記載の化合物および組成物または本明細書記載のその薬学的に許容可能な塩の有効量は、当業者によって決定でき、たとえば哺乳動物に対する例示的投与量が１日当たり約０．５〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物であり、これは、単回用量または個別分割量の形で、例えば、１〜４回／日投与できる。あるいは、投与量は、１日当たり約０．５〜約１５０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約０．５〜約７５ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約０．５〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約２０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約１０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、または１日当たり約５ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、であってもよい。方法中で化合物の量の記載に使われる場合、有効量の表現は、所望の薬理学的効果または他の効果を達成する化合物の量、例えば、細菌酵素抑制をもたらす量を意味する。
【００９６】
当業者なら、特定の用量レベルおよびいずれかの特定の対象に対する投与頻度は、変化してもよく、これらは、採用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、種、年齢、体重、総体的な健康、性別および対象の食事、投与モードおよび時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、および特定の状態の重症度、等の種々の因子に依存することは理解できよう。
【００９７】
化合物の作製方法
本明細書記載の化合物は、有機合成の当業者に既知の種々の方法、または当業者により認められているそれの変形法を使って調製できる。本明細書記載の化合物は、容易に入手可能な出発物質から調製できる。最適反応条件は、特定の反応物または使用される溶剤により変化してもよいが、この条件は、当業者により決定されうる。
【００９８】
式Ｉおよび式ＩＩの変形には、追加、除去、または各化合物で記載されるような種々の成分の移動が含まれる。同様に、分子中に１つまたは複数のキラル中心が存在する場合、分子のキラリティーを変えることができる。さらに、化合物合成では、種々の化学基の保護および脱保護を含むことができる。保護および脱保護の使用、および適切な保護基の選択は、当業者により決定できる。保護基の化学については、例えば、Ｗｕｔｓ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ、有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、４ｔｈ  Ｅｄ．、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、２００６、で見つけることができる。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９９】
開示化合物および組成物の調製に使用される出発物質および試薬は、市販品供給業者、例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ、ＮＪ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｐｆｉｚｅｒ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）、Ｍｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）、Ａｖｅｎｔｉｓ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｗｙｅｔｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ（ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ）、Ｒｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｌｉｌｌｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、Ａｂｂｏｔｔ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）、もしくはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能であるか、または、文献、例えば、フィーザー・アンド・フィーザーの有機合成試薬（Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ'ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９１）；Ｒｏｄｄの炭素化合物の科学（Ｒｏｄｄ'ｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−５  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９８９）；有機反応（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４０（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９１）；Ｍａｒｃｈの最新有機化学（Ｍａｒｃｈ'ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；およびＬａｒｏｃｋの総合有機変換（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．、１９８９）、で説明されている方法に従って当業者に既知の方法により調製される。他の物質、例えば、本明細書で開示の医薬品キャリアは、市販品供給業者から入手可能である。
【０１００】
本明細書記載の化合物を生成する反応は、溶剤中で行うことができ、これらの溶剤は、有機合成の当業者により選択されうる。溶剤は、反応が行われる条件、すなわち、温度および圧力下で、出発物質（反応物）、中間体、または生成物と実質的に非反応性である。反応は、１つの溶媒中、または２つ以上の溶媒の混合物中で行うことができる。生成物または中間体形成は、当技術分野で既知のいずれかの適切な方法に従ってモニタリングできる。例えば、生成物形成は、分光学的手段、例えば、核磁気共鳴分光法（例えば、１Ｈまたは１３Ｃ）、赤外分光法、分光光度法（例えば、ＵＶ−可視）、もしくは質量分析法により、またはクロマトグラフィー、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または薄層クロマトグラフィーによりモニタリングできる。
【０１０１】
スキーム１に概説するパラレル合成に適した方法を使用して、式Ｉの化合物を、ＢＯＣにより保護されたヘキサヒドロピリダジンまたはピラゾリジン開始物質（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）から調製することができる。多様性は、この順序の第１または第４工程で導入されることができる。
【化２５】
0006010548.tif 000038
【０１０２】
式Ｉのヒドロキシイミド化合物を、スキーム２に示される方法を使用して調製することができる。クネーフェナーゲル縮合は、必須のジエステル中間体（Ｃｈｉｋａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）を提供するものであり、これは、中間体である無水マレイン酸（Ｓｎｋａｗａ  ａｎｄ  Ｓｈｉｂａｔａ，  １９６９）を介して、必須のＮ−ヒドロキシ‐マレインイミドに変換され得る。さらなる多様性が、鈴木化学（Ｓｕｚｕｋｉ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ｓｅｌｌｅｓ，  ２００４）を使用する代替的な合成方法により達成できる。
【化２６】
0006010548.tif 000039
【０１０３】
式Ｉのさらなる例は、スキーム３に示される方法により調製することができる。チオシアン酸アンモニウム、続いて適切なヒドラジドによる酸塩化物の処理により、望ましい標的分子を得る。パラレル合成技術を用いて、この試薬の添加の順序を逆転させることによりこの骨格の多様性を急速に拡大させることができる（スキーム３参照）。その後のヨウ素カリウムによる処理により、類似のジアセチルヒドラジドを提供する。効力を高める任意の構造的修正は、可能性を示す代替的なキレート基との組み合わせにおいて試験される。
【化２７】
0006010548.tif 000040
【０１０４】
式ＩＩの化合物を、パラレル合成に適した、文献において利用可能な一般的手順を使用して調製することができる（スキーム４参照）。フルフルアルデヒドは、購入することができ、または市販の試薬フルフルアルデヒド−５−ボロン酸を使用して鈴木条件（Ｓｕｚｕｋｉ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下にて調製することができる。保護されたロダニンによる得られた中間体の縮合と引き続く脱保護によって、最後から２番目の中間体が提供され、これを多様な求電子試薬で処理してＲＮＰＡ３０００類似体を得ることができる。
【化２８】
0006010548.tif 000041
【０１０５】
チオキソチアゾリジン環のバイオイソスター（ｂｉｏｉｓｏｓｔｅｒｅ）およびフラン部分の複素環のバイオイソスターを有する式ＩＩの化合物を生成するために、同様の手順を使用することができる（たとえば、オキサゾリジンジオンは類似の縮合を受ける（Ｓｉｍｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓｅｉｇｌ，  １９９２））。Ｃｈｅｒｂｕｌｉｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９６４）の一般的な合成手順をこれらの化合物を調製するために使用することができる（スキーム５参照）。メルカプト酢酸でフェニルチオイソシアナートを縮合することによりＮ−アリールロダニン（ａｒｙｌｒｏｄａｎｉｎｅ）中間体を調製することができる。スキーム４において上述した置換されたフルフルアルデヒドによる処理により、望ましい標的分子を得る。
【化２９】
0006010548.tif 000042
【０１０６】
同様の順序（Ｓａｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）により、スキーム６に示した式ＩＩの化合物を提供する。イソチオシアナートおよびクロロ酢酸によるアミンの縮合により、最後から２番目の必須の中間体を提供し、これを、置換されたフルフルアルデヒドで処理することにより、所望の最終の標的化合物に変換することができる。
【化３０】
0006010548.tif 000043
【０１０７】
活性アッセイ
本明細書で提供されるのは、微生物感染の治療または予防のための化合物を特定する方法である。方法は、本明細書記載の化合物または組成物を調製し、ＲＮａｓｅ  Ｐ等の細菌リボヌクレアーゼに対する化合物または組成物の阻害活性をアッセイする段階を含む。ＲＮａｓｅ  Ｐは、ｔＲＮＡ前駆体の５'末端の成熟を触媒する広範に分布する酵素である（Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、６７：１５３−１８０（１９９８）；Ｋａｚａｎｔｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４：７２９−７４０（２００６）；Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、４１：７７−１０２（２００６）、を参照）。この酵素は、単一のリボザイムＲＮＡ分子および少なくとも１つのタンパク質成分を含むリボ核タンパク質複合体であるという事実により、ユニークである。細菌内で、リボザイム（ｒｎｐＢ）およびタンパク質（ＲｎｐＡ）成分の両方が細胞生存にとって必須である；ｒｎｐＢは、ｔＲＮＡのインビトロ処理を媒介するが、一方、ＲｎｐＡの機能は、明確に確立されていない（Ｇｏｓｓｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：６８１６−６８２３（２００６）；Ｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、７０：２０９１−２０９５（１９７３）；Ｗａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７２：６３１６−６３２２（１９９０）、を参照）。ドメイン探索（Ｌｅｔｕｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３４：Ｄ２５７−２６０（２００６）；Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９５：５８５７−５８６４（１９９８）、を参照）により、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡ残基４０〜１１１は、リボヌクレアーゼ様モチーフに最もよく一致することが明らかになった。さらに、いくつかのＲＮＡ結合部位は、この領域内に包埋されている（Ｓｐｉｔｚｆａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２９５：１０５−１１５（２０００）、を参照）。大腸菌および枯草菌ＲＮａｓｅ  Ｐは、特定の二重鎖ＲＮＡテンプレート、例えば、ガイドＲＮＡおよび４．５ｓ  ＲＮＡを消化することが明らかになっている（Ｌｕｎｄｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０５：２３５４−２３５７（２００８）、を参照）。これらのテンプレートの切断は、必ずＲｎｐＡを必要とする（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、７７：１０９３−１１００（１９９４）；Ｍａｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０８：１２４４−１２５１（２００９）、を参照）。本明細書で提供されるように、ＲＮａｓｅ  Ｐ媒介ＲＮＡ消化は、ｒｎｐＢ、ＲｎｐＡ、または両方に依存する可能性がある。従って、ＲｎｐＡは、黄色ブドウ球菌ＲＮＡ分解を調節する。
【０１０８】
ＲＮＡ分解は、細菌リボヌクレアーゼの阻害に適した、従って、微生物感染の治療または予防に適した化合物を特定するために使用できる。一部の実施形態では、蛍光ベースアッセイを使用して、化合物を特定できる。この方法は、ＲＮＡ、ＲｎｐＡ、および蛍光染料を混合して混合物を形成する工程、該混合物を化合物と接触させる工程、ならびに、蛍光を使って、細胞におけるＲｎｐＡ媒介全細菌ＲＮＡ分解をモニタリングする工程を含むことができる。対照に比べて減少した蛍光は、ＲＮＡ分解を示す。本明細書で使われる蛍光の減少とは、対照に比べて、少なくとも約１％の蛍光の減少を意味する。例えば、蛍光の減少は、対照に比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の蛍光の減少であってもよい。対照に比べて、ＲｎｐＡ媒介全細菌ＲＮＡ分解を減らす化合物は、微生物感染の治療または予防のための化合物として特定できる。本明細書記載の方法で使用するための適切な蛍光染料には、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が含まれる。
【０１０９】
一部の例では、化合物は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭＩＣ微量液体希釈法（ｂｒｏｔｈ  ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ）プロトコル（Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ、以前のＮＣＣＬＳ）、７ｔｈ  ｅｄ．、Ｊａｎｕａｒｙ  ２００６、２６（２）、Ｍ７−Ａ７中の、好気的成長細菌用の希釈抗菌感受性試験法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｔｈａｔ  Ｇｒｏｗ  Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ）；承認標準、を参照されたい；また、Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ、以前のＮＣＣＬＳ）、Ｊａｎｕａｒｙ  ２００８、２８（１）、Ｍ１００−Ｓ１８中の、抗菌感受性試験実施基準（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）；Ｅｉｇｈｔｅｅｎｔｈ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、も参照されたい）により指定されているＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨ）ブロス抗菌アッセイを使ってさらにアッセイできる。
【０１１０】
本明細書で提供される化合物および組成物の細菌ＲＮａｓｅの阻害剤としての活性は、標準的アッセイ、例えば、ＨＰＬＣアッセイで測定できる。化合物は、細菌ＲＮａｓｅ酵素アッセイを使って細菌ＲＮａｓｅの阻害剤として試験できる。細菌ＲＮａｓｅ阻害剤として特定される化合物は、微生物感染の治療または予防に有用である。このアッセイを使って決定された化合物および組成物の活性は、ＩＣ５０として報告できる。本明細書で使われるＩＣ５０は、このような応答を測定するアッセイにおける最大応答の５０％抑制を実現する特定の試験化合物の量、濃度、または投与量を意味する。
【０１１１】
特定の態様では、開示化合物および組成物は、実際に合成する必要はなく、その代わりに、いずれかの分子モデリング技術に対する標的として使って、細菌ＲＮａｓｅとの相互作用を予測し、特徴付けることができる。これは、構造的情報およびコンピュータモデリングにより実現される。コンピュータモデリング技術は、選択分子の３次元原子構造の可視化および酵素と相互作用する新規化合物の合理的な設計を可能とする。典型的な例では、酵素の３次元構築は、選択分子のＸ線結晶学分析またはＮＭＲ画像処理由来のデータに依存する。このデータは、細菌ＲＮａｓｅ用に入手可能である。分子動力学には、力場データ（例えば、Ｍｅｒｃｋ分子力場）が必要である。コンピュータグラフィックスシステムは、新規化合物がどのように酵素に連結するかの予測を可能とし、化合物の構造の実験操作により結合特異性を完成させる。一方または両方で小さな変化が生ずる場合に起こる相互作用を予測するには、分子力学ソフトウェアおよび、通常、分子設計プログラムとユーザーの間のユーザーフレンドリーな、メニュー形式のインターフェースを備えた計算能力の高いコンピュータが必要である。
【０１１２】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子動力学関数を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび解析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子の相互挙動のインタラクティブな構築、修正、可視化、および解析を可能とする。コンピュータ上で、所望の方法で細菌ＲＮａｓｅと相互作用する化合物が特定されるとすぐ、本明細書で開示のように、実際の化合物を合成し、アッセイできる。
【０１１３】
使用方法
本明細書で提供されるのは、対象の微生物感染を治療する、予防する、または制限する方法である。この方法は、有効量の１つまたは複数の本明細書記載の化合物または組成物、またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与する段階を含む。本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩は、ヒト、例えば、小児および高齢者集団、および動物、例えば、獣医学分野での微生物感染および癌の治療に有用である。微生物感染には、例えば、細菌および真菌感染が含まれる。細菌感染には、桿菌、球菌、スピロヘータ、およびビブリオ属細菌が原因の感染が含まれる。一部の例では、微生物感染は、細菌感染（例えば、グラム陽性細菌感染）である。一部の例では、細菌感染は、例えば、黄色ブドウ球菌等のブドウ球菌感染である。本明細書記載の化合物および組成物は、薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染およびバイオフィルム関連黄色ブドウ球菌感染を含む種々の黄色ブドウ球菌感染の治療に有用である。一部の実施形態では、黄色ブドウ球菌感染は、メトシリン耐性黄色ブドウ球菌（黄色ブドウ球菌ＭＲＳＡ）感染である。他の実施形態では、黄色ブドウ球菌感染は、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌である。任意選択で、黄色ブドウ球菌感染は、多剤耐性である。一部の例では、本明細書記載の化合物および組成物を使って、バチルス感染（例えば、炭疽菌およびセレウス菌感染）、連鎖球菌感染（例えば、肺炎球菌および化膿性連鎖球菌感染）、および腸球菌感染（例えば、フェカリス菌およびバンコマイシン耐性腸球菌感染）を治療できる。
【０１１４】
本明細書記載の治療または予防の方法は、１つまたは複数の追加の薬剤（例えば、抗菌剤）を使った治療をさらに含むことができる。１つまたは複数の追加の薬剤ならびに本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩は、同時投与、ならびに数日間の間隔までの時間的に間をおいた順番を含む、どのような順番でも投与できる。方法は、また、１つまたは複数の追加の薬剤、および／または化合物および本明細書記載の組成物またはその薬学的に許容可能な塩の単回よりも多い投与を含んでもよい。１つまたは複数の追加の薬剤および本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩の投与は、同じ経路でも、異なる経路でもよい。１つまたは複数の追加の薬剤を共に使って治療する場合は、本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩は、１つまたは複数の追加の薬剤を含む医薬組成物として組み合わせてもよい。例えば、本明細書記載の化合物または組成物またはその薬学的に許容可能な塩を、例えば、下記の追加の抗菌剤と組み合わせて、医薬組成物とすることができる：アセダプソン；アセトスルホンナトリウム；アラメシン；アレキシジン；アムジノシリン；アムジノシリンピボキシル；アミシクリン；アミフロキサシン；アミフロキサシンメシレート；アミカシン；アミカシン硫酸塩；アミノサリチル酸；アミノサリチル酸ナトリウム；アモキシシリン；アンホマイシン；アンピシリン；アンピシリンナトリウム；アパルシリンナトリウム；アプラマイシン；アスパルトシン；アストロマイシン硫酸塩；アビラマイシン；アボパルシン；アジスロマイシン；アズロシリン；アズロシリンナトリウム；バカンピシリン塩酸塩；バシトラシン；バシトラシンメチレンジサリチル酸；バシトラシン亜鉛；バンベルマイシン；ベンゾイルパスカルシウム；ベリスロマイシン；ベタマイシン硫酸塩；ビアペネム；ビニラマイシン；ビフェナミン塩酸塩；ビスピリチオンマグスルフェクス；ブチカシン；ブチロシン硫酸塩；カプレオマイシン硫酸塩；カルバドクス；カルベニシリン二ナトリウム；カルベニシリンインダニルナトリウム；カルベニシリンフェニルナトリウム；カルベニシリンカリウム；カルモナムナトリウム；セファクロル；セファドロキシル；セファマンドール；セファマンドールナファート；セファマンドールナトリウム；セファパロール；セファトリジン；セファザフルナトリウム；セファゾリン；セファゾリンナトリウム；セフブペラゾン；セフジニル；セフェピム；セフェピム塩酸塩；セフェテコール；セフィキシム；セフメノキシム塩酸塩；セフメタゾール；セフメタゾールナトリウム；セフォニシド一ナトリウム；セフォニシドナトリウム；セフォペラゾンナトリウム；セフォラニド；セフォタキシムナトリウム；セフォテタン；セフォテタン二ナトリウム；セフォチアム塩酸塩；セフォキシチン；セフォキシチンナトリウム；セフピミゾール；セフピミゾールナトリウム；セフピラミド；セフピラミドナトリウム；セフピロム硫酸塩；セフポドキシムプロキセチル；セフプロジル；セフロキサジン；セフスロジンナトリウム；セフタジジム；セフチブテン；セフチゾキシムナトリウム；セフトリアキソンナトリウム；セフロキシム；セフロキシムアキセチル；セセフロキシムピボキセチル；セフロキシムナトリウム；セファセトリルナトリウム；セファレキシン；セファレキシン塩酸塩；セファログリシン；セファロリジン；セファロチンナトリウム；セファピリンナトリウム；セフラジン；セトサイクリン塩酸塩；セトフェニコール；クロラムフェニコール；クロラムフェニコールパルミチン酸塩；クロラムフェニコールパントテナート複合体；クロラムフェニコールナトリウムスクシナート；クロルヘキシジンホスファニル酸塩；クロロキシレノール；クロルテトラサイクリン重硫酸塩；塩酸クロルテトラサイクリン；シノキサシン；シプロフロキサシン；塩酸シプロフロキサシン；シロレマイシン；クラリスロマイシン；クリナフロキサシン塩酸塩；クリンダマイシン；クリンダマイシン塩酸塩；塩酸パルミチン酸クリンダマイシン；クリンダマイシンリン酸塩；クロファジミン；クロキサシリンベンザチン；クロキサシリンナトリウム；クロキシキン；メタンスルホン酸コリスチンナトリウム；コリスチン硫酸塩；クーママイシン；クーママイシンナトリウム；シクラシリン；サイクロセリン；ダルホプリスチン；ダプソン；ダプトマイシン；デメクロサイクリン；デメクロサイクリン塩酸塩；デメサイクリン；デノフンギン；ジアベリジン；ジクロキサシリン；ジクロキサシリンナトリウム；ジヒドロストレプトマイシン硫酸塩；ジピリチオン；ジリスロマイシン；ドキシサイクリン；ドキシサイクリンカルシウム；ドキシサイクリンフォスファテックス；ドキシサイクリン塩酸塩；ドロキサシンナトリウム；エノキサシン；エピシリン；エピテトラサイクリン塩酸塩；エリスロマイシン；エリスロマイシンアシストラート；エリスロマイシンエストラート；エリスロマイシンエチルコハク酸塩；エリスロマイシングルセプタート；エリスロマイシンラクトビオン酸塩；エリスロマイシンプロピオン酸塩；エリスロマイシンステアリン酸塩；エタンブトール塩酸塩；エチオナミド；フレロキサシン；フロキサシリン；フルダラニン；フルメキン；ホスホマイシン；ホスホマイシントロメタミン；フモキシシリン；塩化フラゾリウム；フラゾリウム酒石酸塩；フシジン酸ナトリウム；フシジン酸；ゲンタマイシン硫酸塩；グロキシモナム；グラミシジン；ハロプロジン；ヘタシリン；ヘタシリンカリウム；ヘキセジン；イバフロキサシン；イミペネム；イソコナゾール；イセパマイシン；イソニアジド；ジョサマイシン；カナマイシン硫酸塩；キタサマイシン；レボフラルタドン；レボプロピルシリンカリウム；レキシスロマイシン；リンコマイシン；リンコマイシン塩酸塩；ロメフロキサシン；塩酸ロメフロキサシン；ロメフロキサシンメシレート；ロラカルベフ；マフェニド；メクロサイクリン；メクロサイクリンスルホサリチル酸塩；メガロマイシンカリウムリン酸塩；メキドクス；メロペネム；メタサイクリン；塩酸メタサイクリン；メテナミン；ヒプル酸メテナミン；メテナミンマンデル酸塩；メチシリンナトリウム；メチオプリム；メトロニダゾール塩酸塩；メトロニダゾールリン酸塩；メズロシリン；メズロシリンナトリウム；ミノサイクリン；ミノサイクリン塩酸塩；ミリンカマイシン塩酸塩；モネンシン；モネンシンナトリウム；ナフシリンナトリウム；ナリジキシ酸ナトリウム；ナリジクス酸；ナタマイシン；ネブラマイシン；ネオマイシンパルミチン酸塩；ネオマイシン硫酸塩；ネオマイシンウンデシレン酸塩；ネチルマイシン硫酸塩；ニュートラマイシン；ニフイラデン（ｎｉｆｕｉｒａｄｅｎｅ）；ニフラルデゾン；ニフラテル；ニフラトロン；ニフルダジル；ニフリミド；ニフィウピリノール（ｎｉｆｉｕｐｉｒｉｎｏｌ）；ニフラキナゾール；ニフルチアゾール；ニトロサイクリン；ニトロフラントイン；ニトロミド；ノルフロキサシン；ノボビオシンナトリウム；オフロキサシン；オネトプリム（ｏｎｎｅｔｏｐｒｉｍ）；オキサシリン；オキサシリンナトリウム；オキシモナム；オキシモナムナトリウム；オキソリン酸；オキシテトラサイクリン；オキシテトラサイクリンカルシウム；オキシテトラサイクリン塩酸塩；パルジマイシン；パラクロロフェノール；パウロマイシン；ペフロキサシン；ペフロキサシンメシレート；ペナメシリン；ペニシリンＧベンザチン；ペニシリンＧカリウム；ペニシリンＧプロカイン；ペニシリンＧナトリウム；ペニシリンＶ；ペニシリンＶベンザチン；ペニシリンＶヒドラバミン；ペニシリンＶカリウム；ペンチジドンナトリウム；フェニルアミノサリチル酸塩；ピペラシリンナトリウム；ピルベニシリンナトリウム；ピリジシリンナトリウム；ピルリマイシン塩酸塩；ピバンピシリン塩酸塩；ピバンピシリンパモエート；ピバンピシリンプロベナート；ポリミキシンＢ硫酸塩；ポルフィロマイシン；プロピカシン；ピラジナミド；ピリチオン亜鉛；キンデカミン酢酸塩；キヌプリスチン；ラセフェニコール；ラモプラニン；レイニーマイシン；レロマイシン（ｒｅｌｏｍｙｃｉｎ）；レプロマイシン；リファブチン；リファメタン；リファメキシル；リファミド；リファンピン；リファペンチン；リファキシミン；ロリテトラサイクリン；硝酸ロリテトラサイクリン；ロサラマイシン；ロサラマイシン酪酸塩；ロサラマイシンプロピオン酸塩；ロサラマイシンナトリウムリン酸塩；ロサラマイシンステアリン酸塩；ロソキサシン；ロキサルソン；ロキシスロマイシン；サンサイクリン；サンフェトリネムナトリウム；サルモキシシリン；サルピシリン；スコパフンギン；シソマイシン；シソマイシン硫酸塩；スパルフロキサシン；スペクチノマイシン塩酸塩；スピラマイシン；スタリマイシン（ｓｔａｌｌｉｍｙｃｉｎ）塩酸塩；ステフィマイシン；ストレプトマイシン硫酸塩；ストレプトニコジド（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｃｏｚｉｄ）；スルファベンズ；スルファベンズアミド；スルファセタミド；スルファセタミドナトリウム；スルファシチン；スルファジアジン；スルファジアジンナトリウム；スルファドキシン；スルファレン；スルファメラジン；スルファメーテル；スルファメタジン；スルファメチゾール；スルファメトキサゾール；スルファモノメトキシン；スルファモキソール；スルファニル酸亜鉛；スルファニトラン；スルファサラジン；スルファソミゾール；スルファチアゾール；スルファザメト；スルフイソキサゾール；スルフイソキサゾールアセチル；スルフイソキサゾールジオラミン；スルホミキシン；スロペネム；スルタミシリン；サンシリンナトリウム；タランピシリン塩酸塩；テイコプラニン；テマフロキサシン塩酸塩；テモシリン；テトラサイクリン；テトラサイクリン塩酸塩；テトラサイクリンリン酸塩複合体；テトロキソプリム；チアンフェニコール；チフェンシリンカリウム；チカルシリンクレシルナトリウム；チカルシリン二ナトリウム；チカルシリン一ナトリウム；チクラトン；塩化チオドニウム；トブラマイシン；トブラマイシン硫酸塩；トスフロキサシン；トリメトプリム；トリメトプリム硫酸塩；トリスルファピリミジン；トロレアンドマイシン；トロスペクトマイシン硫酸塩；チロスリシン；バンコマイシン；バンコマイシン塩酸塩；ヴァージニアマイシン；またはゾルバマイシン。
【０１１５】
本明細書でさらに提供されるのは、細菌リボヌクレアーゼ、例えば、黄色ブドウ球菌ＲＮａｓｅ  Ｐのタンパク質成分を阻害する方法である。一部の実施形態では、細菌リボヌクレアーゼは、ＲｎｐＡである。方法は、細菌リボヌクレアーゼを有効量の本明細書記載の１つまたは複数の化合物または組成物と接触させる段階を含む。このような量は、インビボまたはインビトロで、組成物の化合物または活性成分の治療に有効な濃度を実現するのに十分な量である。
【０１１６】
本明細書記載の方法および化合物は、予防および治療処理の両方に有用である。本明細書で使われる用語の治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）または治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、予防；発症の開始の遅延；発症後の徴候または症状の悪化の減少、根絶、または遅延；および再発の防止を含む。予防のための使用では、治療有効量の本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩が、発症の前に（例えば、細菌感染の明らかな徴候の前に）、早期発症の間に（例えば、細菌感染の初期徴候および症状時に）、または細菌感染の炎症反応または発生が確定した後で、対象に投与される。予防投与は、感染症状の顕在化の前の数日から数年の間、行うことができる。予防投与は、例えば、黄色ブドウ球菌に曝された対象の予防処置に使用できる。治療処置は、細菌感染が診断された後で、治療有効量の本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与する段階を含む。
【０１１７】
キット
また、本明細書で提供されるのは、対象の炎症または癌を治療または予防するためのキットである。キットには、いずれかの明細書記載の化合物または組成物を含むことができる。例えば、キットは、式Ｉの化合物または式ＩＩの化合物を含むことができる。キットは、１つまたは複数の抗菌剤（例えば、オキサシリン）をさらに含むことができる。キットは、本明細書記載のいずれかの化合物または組成物の経口製剤を含むことができる。さらに、キットは、キットを使用するための使用法（例えば、対象を治療するための説明書）を含むことができる。
【０１１８】
以下の実施例は、本明細書記載の方法および化合物の特定の態様をさらに例示することを意図しており、添付の特許請求の範囲を限定する意図はない。
【実施例】
【０１１９】
黄色ブドウ球菌ＲＮＡ分解因子は、経験的に特定され、また、下記に示すように、有望な抗菌剤開発標的であることが明らかになった。これを行うために、黄色ブドウ球菌が感染を起こす能力は（その多くが研究室培養条件では細胞密度依存的に調節されている）広範なレパートリーの病原因子の一時的発現に部分的に起因しているという事実を利用した（Ｎｏｖｉｃｋ、Ｒ．Ｐ．、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４８：１４２９−１４４９（２００３）、を参照）。次いで、黄色ブドウ球菌病原因子発現における増殖期調節による変化が、ｍＲＮＡ分解のレベルで発生するか否か、およびこのプロセスに関与するタンパク質が生物体のＲＮＡ分解機構のメンバーを含みうるか否かを判定する調査を行った。そのために、ＧｅｎｅＣｈｉｐｓを使って、明確に特徴付けられた黄色ブドウ球菌病原因子の、対数期および定常期増殖の間の、ｍＲＮＡ崩壊速度を比較した。
【０１２０】
結果は、多くの黄色ブドウ球菌病原因子転写物のｍＲＮＡ代謝回転特性は、２つの増殖期の間で異なることを示した。さらに、対数期および定常期細胞の全体的ｍＲＮＡ崩壊特性が、劇的に異なることが明らかになった；８８４種の黄色ブドウ球菌ｍＲＮＡは、定常期増殖の間、安定化された。発現がｍＲＮＡ崩壊と相関する遺伝子の中にリボヌクレアーゼＰのタンパク質成分であるＲｎｐＡが含まれており、これが、バルクｍＲＮＡ代謝回転における何らかの役割を果たしている可能性があることが示唆される。その可能性と一致して、組換え黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡがインビトロでリボヌクレアーゼ活性を示し、ＲｎｐＡ枯渇細胞がｍＲＮＡ分解の減少を示すことが実証された。ＲｎｐＡは、哺乳類タンパク質とのアミノ酸保存性が低い必須黄色ブドウ球菌酵素であるため、それは、抗菌剤発見のための適切な標的である。このため、高スループットおよび二次選別アッセイを使って、ＲｎｐＡ媒介ＲＮＡ分解の小分子阻害剤を特定した。これらの薬剤の１つは、黄色ブドウ球菌ｍＲＮＡ代謝回転を阻害することを示し、高いＲｎｐＡ保存を伴って、ＭＲＳＡ、ＶＩＳＡ、およびＶＲＳＡ、ならびに他のグラム陽性病原体に対する抗菌活性を示し、かつ、マウス感染急性致死モデルにおける病原性は僅かであった。まとめると、これらの結果は、ＲｎｐＡが、今まで特性が明らかにされていない黄色ブドウ球菌ＲＮＡ分解機構のメンバーであることを示し、抗菌剤発見の標的としてのその有用性を確実なものとする。
【０１２１】
実施例１：黄色ブドウ球菌代謝回転の増殖期依存変化
半減期の測定のために、黄色ブドウ球菌株ＵＡＭＳ−１、ＲＮ４２２０（ｐＣＮ５１；ＣｄＣｌ２誘導性プロモーターを含むプラスミド）、ＲＮ４２２０（ｐＲＮＰＡ；完全長ｒｎｐＡ  ｍＲＮＡを産生できるｐＣＮ５１）、またはＲＮ４２２０（ｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓ．；ｒｎｐＡアンチセンスＲＮＡを産生できるｐＣＮ５１）を中間対数期または定常期まで増殖させ、リファンピン（２００μｇ／ｍｌ）の添加により転写を停止させた。株ＵＡＭＳ−１に対し、転写停止後０、２．５、５、１５および３０分で一定量を回収した。試薬を保存するため、ＲＮ４２２０誘導体に対しては、転写停止後０および１０分に、一定量を回収した。平板培養の徹底により培養物は、リファンピン耐性を発生しなかった。４回評価したＲＮ４２２０ｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓ．細胞以外は、各株および／または増殖期を２回評価した。ＲＮＡを各一定分量から単離し、標識し、黄色ブドウ球菌ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ；Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）にハイブリダイズし、２回測定値を平均して、以前記載のように、全ｍＲＮＡ種のｍＲＮＡ半減期を測定した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：６７３９−６７５６（２００６）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：２５９３−２６０３（２００６）、を参照）。阻害剤暴露細胞のｍＲＮＡ代謝回転特性を測定するために、対数期黄色ブドウ球菌を、０．５Ｘ  ＭＩＣのＲｎｐＡ阻害剤または等容量の化合物溶媒（ＤＭＳＯ）で３０分間処理した。次に、転写物合成を停止し、転写停止後０および５分にｍＲＮＡ種の転写物力価を測定した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：６７３９−６７５６（２００６）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：２５９３−２６０３（２００６）、を参照）。
【０１２２】
結果は、多くの（４１％）病原因子転写物のｍＲＮＡ代謝回転特性は、２つの増殖期の間で異なることを示し、ｍＲＮＡ代謝回転の調節された変化がそれらの発現に影響を与えることができることを示唆した。さらに、該生物体が、定常期特異的な少なくとも５つの小さな安定ＲＮＡ（ＳＳＲ）、すなわち仮定クラスの調節性ノンコーディングＲＮＡ分子を産生したことが観察された（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：６７３９−６７５６（２００６）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：２５９３−２６０３（２００６）、を参照）。さらに、対数期および定常期細胞の全体ｍＲＮＡ代謝回転特性は、かなり異なっていた。以前の測定値と一致して、大部分（９０％）の対数期転写物は、急速に分解し（５分以下の半減期）、９％は、中間的安定性を示し（５分を超え、３０分以下の半減期）、また１％は、安定である（３０分以上の半減期）ことが明らかになった（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：６７３９−６７５６（２００６）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：２５９３−２６０３（２００６）、を参照）。しかし、定常期増殖の間に、７６％、２１％、および３％のｍＲＮＡ種が、それぞれ、短期、中間的、および安定な半減期を示す（図１）。ＲＮａｓｅ  Ｊ１もＲＮａｓｅ  Ｙも、増殖期依存形式での異なった発現は認められなかった。定常期増殖の間に抑制された３６７遺伝子中に、リボヌクレアーゼＰ（ＲＮａｓｅ  Ｐ）のタンパク質成分をコードするｒｎｐＡが含まれていた。
【０１２３】
実施例２：黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡは、リボヌクレアーゼ活性を示し、細胞性ｍＲＮＡ分解に影響する
タンパク質精製
それぞれの推定上の黄色ブドウ球菌リボヌクレアーゼの予測読み枠を、ＰＣＲ増幅し、プラスミドｐＥＴ−３０Ｅｋ／ＬＩＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）の連結反応非依存性クローニング部位に挿入した。シーケンシングにより、これは、プラスミドのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下で、ヘキサヒスチジンタグを各タンパク質のＮ末端に融合したことが確認された。形質転換の後で、各タンパク質は、ＩＰＴＧの存在下で増殖（４時間）させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞から、Ｎｉ＋２親和性クロマトグラフィーにより精製された。さらに具体的には、１０ｇの細胞ペレットを、コンプリート、ミニ、ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ；Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）および２０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍｌの緩衝液Ａ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）中に懸濁した。１５，０００ｐｓｉでＥｍｕｌｓｉｆｅｘ−Ｃ３マイクロフルイダイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ  Ｉｎｃ．；Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）を７回通すことにより細胞を破砕した。１２，０００ｘｇで３０分間の遠心分離により細胞壊死組織片を取り除き、上清液をＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ高速液体クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）の５ｍＬ  Ｎｉ−ＮＴＡ  ＦＦ−粗製アフィニティカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に装填した。タンパク質は、緩衝液Ａ中の線形イミダゾール勾配（８０ｍＭ〜５００ｍＭ）で単一ピークとして溶出した。各タンパク質の存在を、Ｃｏｏｍａｓｉｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）分析分光法（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）により評価した。
【０１２４】
プラスミド
プラスミドｐＲＮＰＡ−ＳおよびｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓ．は、黄色ブドウ球菌シャトルベクターｐＣＮ５１の誘導性ＣｄＣｌ２の制御下の、それぞれセンスおよびアンチセンス配向の予測Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列を含む推定上のｒｎｐＡ転写ユニットを含む（Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７０：６０７６−６０８５（２００４）、を参照）。簡単に説明すると、それぞれ、５'末端ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ制限酵素部位（下線部）を含むプライマー５'ＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＧＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＧＴＴＡ（順方向）配列番号１）および５'ＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＡＡＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡ（逆方向）（配列番号２）、または制限酵素配列が逆転されたプライマーを使って、ｒｎｐＡ読み枠および３４ｎｔ上流配列を黄色ブドウ球菌株ＵＡＭＳ−１からＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターに連結し、増殖用に大腸菌ＩＮＶαＦ'細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に形質転換した。その後、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使って精製した後、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、プラスミド挿入断片を遊離させ、これを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってゲル精製して、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ消化ｐＣＮ５１に連結した。ＤＮＡシーケンシングにより、プラスミドｐＲＮＰＡ−ＳおよびｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓの健全性を確認した。
【０１２５】
ウェスタンブロッティング
アフィニティー精製したＰｏｌｙＱｕｉｋウサギ黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡポリクローナル抗体を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において生成した。２．５μＭ  ＣｄＣｌ２（ＲＮＡ発現誘導用）および１０μｇ／ｍｌエリスロマイシン（プラスミド維持用）を補充したＴＳＢ培地中で３０分間増殖後、全細菌タンパク質を、プラスミドベクター（ｐＣＮ５１）、ＲｎｐＡ過剰発現プラスミド（ｐＲＮＰＡ−Ｓ）またはＲｎｐＡアンチセンスＲＮＡプラスミド（ｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓ．）を含むＲＮ４２２０細胞から単離した。生成タンパク質濃度を、従来のＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより測定し、２．０μｇの各タンパク質試料または精製された黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡを１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ポリビニリデンフッ化物膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に移した。膜を１０％ミルクでブロッキングし、洗浄後、ウサギＲｎｐＡ抗体（１：１０００希釈）と共にインキュベートし、洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギ抗体（１：１０００希釈；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共にインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬウェスタンブロッティングシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使って、メーカーの推奨に従い、処理した。
【０１２６】
結果
組換え黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡは、ｒＲＮＡおよびブドウ球菌性タンパク質Ａ（ｓｐａ）ｍＲＮＡ、ならびに試験した３つの他のｍＲＮＡ種の消化を触媒することが明らかになった（図２Ｂおよび２Ｃ）。他の推定上のＲＮａｓｅ  ＩＩＩを含む黄色ブドウ球菌リボヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ｙ、ＲＮａｓｅ  Ｊ１、およびＢＮは、これらのアッセイ条件の間、等価のＲＮＡ分解活性を示さなかった（図２Ｂ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）分析により、観察されたリボヌクレアーゼ活性は、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡの存在に関連していることが確認された（図２Ａ）。図２Ａで、約１７．２ｋＤａのバンド（実線矢印；バンド２）は、タンデム型質量分析（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）により、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡであると確認され、一方、少量の混入物の上位データ（点線矢印）は、大腸菌５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３（バンド１）またはアミノ酸１１〜１０７（バンド３および４）または１２〜１０７（バンド５）に対応する黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡポリペプチド断片であると判定された。にもかかわらず、上述のリボヌクレアーゼアッセイで使用された約１０００倍過剰（２５μｇ）なＲｎｐＡ精製産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価は、タンパク質調製物内の微量の４つの追加のポリペプチドを示し、ＲｎｐＡ産物と一緒に大腸菌リボヌクレアーゼの混入が存在する可能性が提起された。ＭＡＬＤＩ分析は、これらのタンパク質の素性が、大腸菌リボソームタンパク質Ｌ３、および３つの黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡ断片（これは、成熟選択的翻訳産物とは対照的に、タンパク質調製の間の完全長ＲｎｐＡのタンパク質分解を反映していると思われる）であることを示した。大腸菌リボヌクレアーゼは検出されず、タンパク質調製物のリボ核酸分解活性の原因は、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡである可能性があることを示唆している。さらに、逆転写酵素媒介ＰＣＲは、大腸菌ｒｎｐＢが、調製物中に検出できなかったことを示し、ＲｎｐＡリボヌクレアーゼ活性は、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡおよび大腸菌ｒｎｐＢ  ＲＮＡを含むキメラＲＮａｓｅ  Ｐ分子の形成に起因するものではないことを確証した。実際、インビトロ合成大腸菌ｒｎｐＢは、標準的および高Ｍｇ＋２反応条件の両方下で、黄色ブドウ球菌ＲＮＡ分解（単独）を触媒もせず、ＲｎｐＡ媒介ＲＮＡ消化活性に影響もしなかった。
【０１２７】
黄色ブドウ球菌ＲＮａｓｅ  Ｊ１は、ここで使用した反応条件下で低リボ核酸分解活性を示したが、その後の調査で、それは異なる条件下では強力なリボヌクレアーゼであることが示され（Ｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３３：２１４１−２１５２（２００５）、を参照）、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡの推定上のインビトロリボヌクレアーゼ活性をさらに評価するための対照としての使用が可能であった。さらに具体的には、ＲｎｐＡ媒介ｓｐａ  ｍＲＮＡ分解が、アフィニティー精製ウサギポリクローナル黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡ抗体の添加により阻害できるか否かを評価した。最初の調査では、抗体は、ＲｎｐＡのおよびＲＮａｓｅ  Ｊ１のリボ核酸分解活性を制限することは示されなかった。しかし、免疫グロブリン混合物内の抗体のサブセットのみが、酵素の活性に影響を与えるＲｎｐＡエピトープを認識できるということを予測して、該抗体がＲｎｐＡ媒介転写物分解に対しどのような効果を及ぼすか（もしあれば）をモニタリングするためのより感度の高い手段としてｓｐａ消化産物の逆転写ＰＣＲ増幅を使った。結果から、抗体添加は、実際に、完全長ｓｐａｍ  ＲＮＡのＲｎｐＡ媒介分解を弱く阻害するが、ＲＮａｓｅ  Ｊ１活性に対しては効果を示さないことがわかった（図２Ｄ）。等量の免疫前の血清は、ＲｎｐＡ活性に効果を与えなかった。まとめると、これらのデータは、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡの今まで認識されていなかった機能とはＲＮＡ消化の機能であることを示唆している。
【０１２８】
必須の細菌ＲＮＡ代謝回転タンパク質の小分子阻害剤は、細菌増殖を妨害し、新規クラスの抗菌剤であることが期待される。この点について、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡは、必須酵素であることが報告され（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１０：２９１（２００９）；Ｊｉｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：２２６６−２２６９（２００１）、参照）、従って、化学療法開発の標的と見なすことができる。実際、−３４〜＋３５３ｒｎｐＡ  ｍＲＮＡ翻訳開始部位に相補的であると予測されるアンチセンスＲＮＡ分子の誘導が（プラスミドｐＣＮ５１の塩化カドミウム誘導性プロモーターの制御下で（Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７０：６０７６−６０８５（２００４）、参照）、１０μＭ誘導因子の存在下の黄色ブドウ球菌増殖を制限した。逆に、対応するセンス鎖ＲＮＡ分子、または誘導因子の非存在下で、アンチセンスプラスミド株を発現している細胞では、増殖欠陥は観察されなかった（図３）。これらの結果は、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡが、必須タンパク質であることを示す。さらに、このｒｎｐＡアンチセンスＲＮＡ系を使って、ＲｎｐＡが黄色ブドウ球菌の細胞性ｍＲＮＡ代謝回転に影響を与えるか否かを評価した。このため、ＲＮＡ分解特性を、２．５μＭ  ＣｄＣｌ２の存在下で増殖の間に、プラスミドベクターのみを保有する細胞、または、ｒｎｐＡ  ｍＲＮＡもしくはｒｎｐＡアンチセンスＲＮＡプラスミド由来コピーを含む細胞について測定した。図３に示すように、それぞれｒｎｐＡ  ｍＲＮＡまたはｒｎｐＡアンチセンス発現株内で増加したまたは減少したＲｎｐＡ産生を可能とするがアンチセンスＲＮＡ産生株の細菌増殖を制限しない最適濃度を、経験的に、２．５μＭの塩化カドミウム濃度に決定した。結果的に、ＲＮＡ代謝回転分析は、低減したＲｎｐＡレベルが、多くのｍＲＮＡ種の安定化に相関することを示し、酵素が、バルク細胞性ＲＮＡ分解に寄与することを示唆した。さらに具体的には、ＲｎｐＡ高発現およびベクター含有細胞中で産生された全対数期転写物のそれぞれ、８８％および８７％が、１０分未満の半減期を示すことが明らかになった。ＲｎｐＡ過剰発現が細胞性ＲＮＡ分解を加速しなかったという知見は、そのタンパク質のＲＮＡ分解活性が、野性型レベルのまま残っているコファクターに依存するか、またはタンパク質が、ＲＮＡ代謝回転を有効に増加させる濃度に達しなかったことを示す可能性がある。
【０１２９】
実施例３：ＲｎｐＡ媒介ＲＮＡ分解の小分子阻害剤の特定
上記結果は、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡが、インビトロでリボヌクレアーゼ活性を示し、細胞性ＲＮＡ分解に寄与する必須酵素であることを示す。さらに、このタンパク質は、グラム陽性細菌全体にわたりよく保存されているが、哺乳類タンパク質に対するアミノ酸保存性に欠け、このことにより新規抗生物質薬剤開発のための魅力的な標的となっている。そのために、蛍光ベース高スループットアッセイを使って、２９，０６６市販化合物（ＡｃｔｉＰｒｏｂｅ−２５Ｋおよび天然物ライブラリー；Ｔｉｍｔｅｃ；Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）に対し、ＲｎｐＡ媒介ＲＮＡ分解の小分子阻害剤の選別を行った。
【０１３０】
具体的には、ＡｃｔｉＰｒｏｂｅ−２５Ｋおよび天然物ライブラリー（合計２９，９４０化合物；ＴｉｍＴｅｃ  Ｉｎｃ．；Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）のメンバーに対し、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡ媒介全細菌ＲＮＡ分解の小分子阻害剤を選別した。全ての反応（５０μｌ）を９６ウエル形式で行い、１Ｘ反応緩衝液（２ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．０）中の２０ｐｍｏｌ  ＲｎｐＡ、２００ｎｇ黄色ブドウ球菌全ＲＮＡ、および約５μＭの各化合物を含めた。混合物を３７℃で２０分間インキュベートし、この時点で、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（１００μｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて、残っているＲＮＡ基質の量を定量した。パーセント酵素抑制を残余基質／開始基質＊１００として計算した。阻害用量設定アッセイのため、２０ｐｍｏｌ  ＲｎｐＡ単独（陽性対照）と共に、または、４つの化合物の内の１つが存在する中で、３７℃で１時間、１ｐｍｏｌのｓｐａ  ｍＲＮＡをインキュベートした。この化合物は、漸増量（０、２．５、５、１０、１２．５、１５、１７．５および２０μＭ）の（ＳＴ００３５３１として図４に表示される）ＲＮＰＡ−２０００、漸増量（０、２．５、５、１０、１２．５、１５、２０および２５μｍ）の（ＳＴ０００６６３０として図４に表示される）ＲＮＰＡ−３０００、漸増量（０、２５、１００、２００、４００、８００および１０００μＭ）のＳＴ０４０２２５ならびにＳＴ０２５２０１（０、１、２．５、５、１０、２５および５０μＭ）を含むものであった。この後、２０μｌの各反応混合物を、１．２％ホルムアルデヒド含有アガロースゲルの電気泳動に供し、臭化エチジウム染色により可視化した。
【０１３１】
化合物ＲＮＰＡ−２０００、ＲＮＰＡ−３０００およびＳＴ０２５２０１は、１０種の主なＵ．Ｓ．  ＭＲＳＡ系統に対するＲｎｐＡ媒介ＲＮＡ分解を阻害することが示された（図４参照）。このＲＮＰＡ−２０００、ＲＮＰＡ−３０００およびＳＴ０２５２０１の化合物の見かけのＩＣ５０値は、それぞれ、１５から２０μＭ、１２．５から２０μＭ、および５から１０μＭであった。
【０１３２】
実施例４：抗菌感受性試験
（ＳＴ００３５３１として図４に示した）ＲＮＰＡ−２０００、（ＳＴ０００６６３０として図４に示した）ＲＮＰＡ−３０００、ＳＴ０４０２２５およびＳＴ０２５２０１の細菌に対するインビトロ活性を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）ガイドラインに従い、陽イオン調節Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロスまたは５％溶解ウマ血液を補充したＭＨブロス（連鎖球菌属の試験用）を使って、ブロス微量希釈法により測定した。これらの化合物の系列希釈１０００（０、４、８、１６、３２、６４、および１２８μｇ／ｍｌ）を含むマイクロタイタープレートに、１０５コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）／ｍｌを播種し、３７℃で１８時間、インキュベートした。各単離物に対するＭＩＣを、裸眼で検出される生物体の増殖の完全阻害を示すそれぞれの化合物の最小濃度として定義した。図４に示すように、ＲＮＰＡ−２０００、ＲＮＰＡ−３０００およびＳＴ０４０２２５は、ＭＲＳＡに対する適切な抗菌活性を示す。
【０１３３】
実施例５：細胞傷害性アッセイ
次に、効果的細菌ＭＩＣ値（１０〜５０μｇ／ｍｌ）に対応するＲｎｐＡ阻害剤濃度が、ヒトの細胞傷害を誘導するか否かを評価した。ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞（１０５細胞）を、マイクロタイタープレートの個別ウエルに播種し、１０％胎仔ウシ血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地中で、５％二酸化炭素下、３７℃で１６時間、インキュベートした。細胞をマイトマイシンＣに（５または１０μｇ／ｍｌ；陽性対照）、または、ＭＩＣ値１、２、または４倍（１Ｘ、２Ｘ、４Ｘ）の示されたＲｎｐＡ阻害化合物に４８時間、暴露した。メーカーの推奨（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に従い、代謝的に活性な細胞内でのテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）の添加、および続けて還元後に、分光測定（５７０ｎｍ）により細胞生存率を測定した。
【０１３４】
ＭＴＴ細胞増殖アッセイ測定は、ＳＴ０２５２０１がヒト毒性効果を示すことを明らかにした（図５参照）。したがって、この薬剤は、ＲｎｐＡを阻害しかつ抗菌性効果を示すが、さらなる発展のための適切なリード分子ではない。反対に、ＳＴ０４０２２５、ＳＴ００６６３０（すなわち、ＲＮＰＡ−３０００）、およびＳＴ００３５３１（すなわち、ＲＮＰＡ−２０００）は、ヒト細胞の生存に影響しなかった（図５参照）。まとめると、ＲＮＰＡ−２０００およびＲＮＰＡ−３０００は、優れたＲｎｐＡ阻害活性、良好な抗ブドウ球菌活性を示し、ならびにヒト細胞毒性を引き起こさない。
【０１３５】
添付の特許請求の範囲の化合物および方法は、本明細書記載の特定の化合物および方法により範囲を限定されることはなく、これらは、添付の特許請求の範囲の少数の態様の例示として意図されており、また、機能的に等価ないずれの化合物および方法も、本開示の範囲内にある。示されたおよび本明細書記載のものに加えて、化合物および方法の種々の改変も、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図されている。さらに、特定の代表的な化合物、方法、およびこれらの化合物の態様および方法のみが、具体的に記載されているが、他の化合物および方法ならびに化合物および方法の種々の特徴の組み合わせも、たとえ、具体的に説明されていなくても、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図されている。従って、工程、要素、成分、または構成部分の組み合わせは、本明細書で明示的に述べることができるが、たとえ明示的に述べられていなくても、他の全ての工程、要素、成分、または構成部分の組み合わせも、含まれる。
【図１】
0006010548.tif 000045
【図２Ａ】
0006010548.tif 000046
【図２Ｂ】
0006010548.tif 000047
【図２Ｃ】
0006010548.tif 000048
【図２Ｄ】
0006010548.tif 000049
【図２Ｅ】
0006010548.tif 000050
【図３】
0006010548.tif 000051
【図４Ａ】
0006010548.tif 000052
【図４Ｂ】
0006010548.tif 000053
【図５】
0006010548.tif 000054
【配列表】
0006010548000001.app