(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を検出する方法であって、
（ａ）標的粒子と、前記標的粒子と結合する発光プローブと、分離回収用粒子とを含む、又は前記発光プローブと結合した前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離回収用粒子とを含む溶液を調製し、当該溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離回収用粒子とからなる複合体を形成する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記溶液から、固液分離処理により前記分離回収用粒子を回収し、当該分離回収用粒子を含む試料溶液を調製する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）において調製された試料溶液中に存在する前記複合体の分子数を算出する工程と、
を有し、
前記分離回収用粒子は、前記標的粒子及び前記発光プローブとからなる結合体と結合し、前記工程（ｃ）における前記複合体の分子数の計数を、
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記複合体から放出される光を検出する工程と、
前記検出された光から、個々の複合体からの光信号を個別に検出して、複合体を個別に検出する工程と、
前記個別に検出された複合体の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の数を計数する工程と、
により行い、
前記光検出領域中の前記複合体から放出される光信号の検出及び前記複合体の検出を、検出された光の時系列の光強度データを生成し、生成された時系列光信号データに対してスムージング処理をした後に時間についての一次微分値を演算してピーク存在領域を特定し、前記特定されたピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して釣鐘型関数のフィッティングを行い、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの複合体に対応する光信号において想定される範囲内にあると判定された信号を、一つの複合体に対応する信号であると判定することによって、一つの複合体を検出することにより行うことを特徴とする標的粒子の検出方法。
【請求項２】
前記分離回収用粒子の前記試料溶液中における沈降速度が１×１０−６ｍ／ｓ以下である請求項１に記載の標的粒子の検出方法。
【請求項３】
前記光検出領域の位置を移動する工程において、第一の経路に沿って位置が移動する第二の経路に沿って前記光検出領域の位置が移動する請求項１又は２に記載の標的粒子の検出方法。
【請求項４】
前記第一及び第二の経路が循環経路であり、前記第二の経路に沿った前記光検出領域の位置の移動周期が前記第一の経路に沿った前記第二の経路の位置の移動周期よりも短い請求項３に記載の標的粒子の検出方法。
【請求項５】
前記光検出領域の位置の移動周期τ１と前記第二の経路の位置の移動速度ｖ２と前記光検出領域の直径ｄとが、 
ｖ２・τ１＞ｄ 
を満たす請求項３又は４に記載の標的粒子の検出方法。
【請求項６】
前記光学系の光路を変更することにより前記第二の経路に沿って前記光検出領域の位置が移動し、前記試料溶液の位置を移動することにより前記第一の経路に沿って前記試料溶液内における前記第二の経路の位置が移動する請求項３〜５のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
【請求項７】
前記第二の経路が円形又は楕円形であり、前記第一の経路が円形、楕円形又は直線である請求項３〜６のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
【請求項８】
前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光検出領域の位置が、前記複合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動する請求項１〜７のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
【請求項９】
前記検出された光から、個々の複合体からの光信号を個別に検出して、複合体を個別に検出する工程において、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの複合体が前記光検出領域に入ったことが検出される請求項１〜８のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
【請求項１０】
前記分離回収用粒子が磁性粒子である請求項１〜９のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、試料溶液中にて分散しランダムに運動しており、かつ固液分離処理による分離回収用粒子に結合させた粒子の濃度を求める方法に関する。
本願は、２０１１年８月３０日に、日本に出願された特願２０１１−１８７６００号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１〜３、非特許文献１〜３参照）においては、レーザ共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為される。そして、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内における蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が達成される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成される。そして、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。更に、特許文献６、７においては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータにおいて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光を、フォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。【０００３】
特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度かつ微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６号公報
【特許文献２】特開２００８−２９２３７１号公報
【特許文献３】特開２００９−２８１８３１号公報
【特許文献４】特許第４０２３５２３号公報
【特許文献５】国際公開第２００８／０８０４１７号
【特許文献６】特開２００７−２０５６５号公報
【特許文献７】特開２００８−１１６４４０号公報
【特許文献８】特開平４−３３７４４６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】金城政孝、蛋白質 核酸 酵素、１９９９年、第４４巻、第９号、第１４３１〜１４３８ページ。
【非特許文献２】メイヤー−アルムス（Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、第２０４〜２２４ページ。
【非特許文献３】加藤則子、他４名、遺伝子医学、２００２年、第６巻、第２号、第２７１〜２７７ページ。
【非特許文献４】カスク（P. Kask）、他３名（K. Palo, D. Ullmann, K. Gall）、米国科学アカデミー紀要（PNAS）、１９９９年、第９６巻、第１３７５６〜１３７６１ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術では、概して述べれば、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出され、そのゆらぎの大きさに基づいて試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術において有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態において、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい（典型的には、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、蛍光分子等の濃度は、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であることが好ましい。）。換言すれば、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るときには（例えば、１ｎＭを大幅に下回るときには）、観測対象物が微小領域内に計測時間のうちに稀にしか進入してこない状態が発生し、蛍光強度の計測結果において、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれると共に、有意な蛍光強度の観測量が少なくなるので、上記の如き蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果を望むことができなくなる。【０００７】
特許文献６、７に記載された共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記の如き蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行うことなく、数秒間に亘る計測時間における有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中における観測対象となる蛍光分子等の有無が特定でき、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数とに相関が得られることが開示されている。特に、特許文献７では、試料溶液中を攪拌するランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。しかしながら、これらの方法においても、拡散により又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出することに留まっており、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することができず、例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献８に記載された技術は、フローサイトメータにおけるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出するものであり、試料溶液中に通常の状態にて溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子、即ち、試料溶液中にてランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではないので、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。また、特許文献８の技術は、フローサイトメータにおける計測或いは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含むため、検査に必要な試料量は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合に比して大幅に多くなるとともに、実施者において複雑で高度な操作技術が要求されると考えられる。【０００８】
一方で、光分析技術を用いて標的粒子を検出する場合には、一般的に、標的粒子を発光プローブで標識し、当該標的粒子と結合した発光プローブから放出される光を指標として間接的に検出される。この場合に、試料溶液中に標的粒子と結合していない遊離の発光プローブが存在していると、標的粒子と発光プローブの結合体のみならず遊離の発光プローブからも光が検出される結果、標的粒子の検出精度が低下してしまうという問題がある。【０００９】
かくして、本発明は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術にて実行されている如き、統計的処理を含まず、従って、観測対象粒子の濃度又は数密度がそれらの光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の観測対象粒子の状態又は特性を検出することが可能な新規な光分析技術により、発光プローブで標識した標的粒子を、遊離の発光プローブによる影響を抑制しつつ、高精度に検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を、当該粒子と結合した発光プローブから放出される光を指標として間接的に検出する場合において、発光プローブと結合した粒子の検出を、走査分子計数法を用いて行うことにより、試料溶液中の観測対象の粒子の濃度が非常に低い場合であっても、感度よく発光プローブと結合した粒子を検出することができることを見出した。さらに、発光プローブで標識した標的粒子を分離回収用粒子に結合させた後に固液分離処理により回収された分離回収用粒子に対して、走査分子計数法による計測を行い、標的粒子と発光プローブと分離回収用粒子とからなる複合体の分子数を計数することにより、高精度に標的粒子を検出し得ることを見出し、本発明を完成させた。
ここで、走査分子計数法は、特願２０１０−０４４７１４において、本願出願人により提案されている新規な光分析技術である。【００１１】
すなわち、本発明は、以下の標的粒子の検出方法を提供するものである。
（１）  溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を検出する方法であって、
（ａ）標的粒子と、前記標的粒子と結合する発光プローブと、分離回収用粒子とを含む、又は前記発光プローブと結合した前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離回収用粒子とを含む溶液を調製し、当該溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離回収用粒子とからなる複合体を形成する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記溶液から、固液分離処理により前記分離回収用粒子を回収し、当該分離回収用粒子を含む試料溶液を調製する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）において調製された試料溶液中に存在する前記複合体の分子数を算出する工程と、
を有し、
前記分離回収用粒子は、前記標的粒子及び前記発光プローブとからなる結合体と結合し、前記工程（ｃ）における前記複合体の分子数の計数を、
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記光学系の光検出領域の位置を移動する工程と、
前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の前記複合体から放出される光を検出する工程と、
前記検出された光から、個々の複合体からの光信号を個別に検出して、複合体を個別に検出する工程と、
前記個別に検出された複合体の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の数を計数する工程と、
により行い、
前記光検出領域中の前記複合体から放出される光信号の検出及び前記複合体の検出を、検出された光の時系列の光強度データを生成し、生成された時系列光信号データに対してスムージング処理をした後に時間についての一次微分値を演算してピーク存在領域を特定し、前記特定されたピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して釣鐘型関数のフィッティングを行い、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの複合体に対応する光信号において想定される範囲内にあると判定された信号を、一つの複合体に対応する信号であると判定することによって、一つの複合体を検出することにより行うことを特徴とする標的粒子の検出方法。
（２）  前記分離回収用粒子の前記試料溶液中における沈降速度が１×１０−６ｍ／ｓ以下である前記（１）に記載の標的粒子の検出方法。
（３）  前記光検出領域の位置を移動する工程において、第一の経路に沿って位置が移動する第二の経路に沿って前記光検出領域の位置が移動する前記（１）又は（２）に記載の標的粒子の検出方法。
（４）  前記第一及び第二の経路が循環経路であり、前記第二の経路に沿った前記光検出領域の位置の移動周期が前記第一の経路に沿った前記第二の経路の位置の移動周期よりも短い前記（３）に記載の標的粒子の検出方法。
（５）  前記光検出領域の位置の移動周期τ１と前記第二の経路の位置の移動速度ｖ２と前記光検出領域の直径ｄとが、
ｖ２・τ１＞ｄ
を満たす前記（３）又は（４）に記載の標的粒子の検出方法。
（６）  前記光学系の光路を変更することにより前記第二の経路に沿って前記光検出領域の位置が移動し、前記試料溶液の位置を移動することにより前記第一の経路に沿って前記試料溶液内における前記第二の経路の位置が移動する前記（３）〜（５）のいずれか一つに記載の標的粒子の検出方法。
（７）  前記第二の経路が円形又は楕円形であり、前記第一の経路が円形、楕円形又は直線である前記（３）〜（６）のいずれか一つに記載の標的粒子の検出方法。
（８）  前記光検出領域の位置を移動する工程において、前記光検出領域の位置が、前記複合体の拡散移動速度よりも速い速度にて移動する前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の標的粒子の検出方法。
（９）  前記検出された光から、個々の複合体からの光信号を個別に検出して、複合体を個別に検出する工程において、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、１つの複合体が前記光検出領域に入ったことが検出される前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載の標的粒子の検出方法。
（１０）  前記分離回収用粒子が磁性粒子である前記（１）〜（９）のいずれか一つに記載の標的粒子の検出方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の標的粒子の検出方法において用いられる走査分子計数法は、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されない。従って、本発明の標的粒子の検出方法により、解析対象である標的粒子が試料中に極微量にしか存在していない場合であっても、試料中の当該標的粒子を検出することができる。さらに、本発明の標的粒子の検出方法では、分離回収用粒子を用いて、標的粒子と結合した発光プローブから、標的粒子と結合していない遊離の発光プローブを分離除去した後に、走査分子計数法による計測を行う。このため、遊離の発光プローブからの光の検出が効果的に抑制され、標的粒子を高精度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、走査分子計数法のための光分析装置の内部構造の模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ミラー７の向きを変更して試料溶液内において光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液の位置を移動する機構の模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、走査分子計数法のための光分析技術による光検出の原理を説明する模式図である。
【図２Ｂ】図ＢＡは、走査分子計数法で計測される光強度の時間変化の模式図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本実施形態における光学系の光路を変更することによる走査軌道（第二の経路）に沿った光検出領域の位置の移動の態様を説明する図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、試料溶液の位置の移動（第二の経路の位置の、第一の経路に沿った移動）の態様を説明する図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、試料溶液の位置の移動と、走査軌道に沿った光検出領域の位置の移動との関係を説明する図である。
【図３Ａ】図３Ａは、観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のモデル図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａのモデル図におけるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のモデル図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａのモデル図におけるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。
【図５】図５は、走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順をフローチャートの形式で表した図である。
【図６Ａ】図６Ａは、走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図の一例である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。
【図７】図７は、走査分子計数法により計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、ピーク存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。
【図８】図８は、実施例１において、磁石を用いた精製処理を行った試料溶液を、測定時間を２４０秒間として走査分子計数法により計測されたピーク数の結果を示した図である。
【図９】図９は、実施例１において、磁石を用いた精製処理を行わなかった試料溶液を、測定時間を２秒間として走査分子計数法により計測されたピーク数の結果を示した図である。
【図１０】図１０は、実施例２において、磁石を用いた精製処理を行った試料溶液を、測定時間を２４０秒間として走査分子計数法により計測されたピーク数の結果を示した図である。
【図１１】図１１は、実施例２において、磁石を用いた精製処理を行わなかった試料溶液を、測定時間を２秒間として走査分子計数法により計測されたピーク数の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の標的粒子の検出方法に関する一実施形態を説明する。
まず、走査分子計数法について説明する。走査分子計数法は、微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）が微小領域内を横切るときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする技術である。走査分子計数法は、ＦＩＤＡ等のような光分析技術と同様に、測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能となる。
【００１５】
なお、発光粒子は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子を意味する。本実施形態の標的粒子の定量方法においては、標的粒子と発光プローブとが結合したものが、発光粒子である。
【００１６】
本実施形態及び本願明細書において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。かかる領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡において照明光は要しない。なお、本明細書において、発光粒子の「信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。 
【００１７】
試料溶液内において光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している粒子に結合又は会合した発光プローブを包含したときには、発光プローブからの光が検出され、これにより、一つの粒子の存在が検出されることとなる（実験の態様によっては、発光プローブは、一旦検出したい粒子（標的粒子）と結合した後、光の検出時には、粒子から解離している場合もあり得る。）。そして、逐次的に検出された光において発光プローブからの光信号を個別に検出して、これにより、（発光プローブと結合した）粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。具体的には、例えば、上記の構成において、個別に検出された粒子を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。かかる構成によれば、粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。
【００１８】
また、走査分子計数法においては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されている。この構成によれば、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液において機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しない。従って、検出対象となる粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である（試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。）。そして、走査分子計数法においては、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１〜数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。
【００１９】
上記の粒子を個別に検出する工程において、逐次的に検出される光信号から、１つの粒子に結合した発光プローブ（１つの発光プローブが１つの粒子に結合している場合、複数の発光プローブが１つの粒子に結合している場合、及び、実験態様によって１つの粒子に結合した後粒子から解離した発光プローブである場合を含む。以下同様）が光検出領域に入ったか否かの判定は、時系列に検出される光信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態において、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出されたときに、１つの粒子に結合した発光プローブが光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。より具体的には、通常、発光粒子からの光を表す信号は、光検出部の時系列の検出値、即ち、光強度データにおいて、或る程度以上の強度を有する釣鐘型のパルス状の信号として現れる。ノイズは、釣鐘型のパルス状ではないか、強度の小さい信号として現れる。そこで、時系列光強度データ上において、所定閾値を超える強度を有するパルス状信号を単一の発光粒子からの光を表す信号として検出してもよい。「所定閾値」は、実験的に適当な値に設定することが可能である。 
【００２０】
また、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、粒子に結合した発光プローブの特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者において理解される如く、粒子に結合した発光プローブから検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの粒子に結合した発光プローブから得られる光量は低減することとなるので、１つの粒子に結合した発光プローブからの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。
【００２１】
更に、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる粒子に結合した発光プローブ（即ち、本実施形態の標的粒子の定量方法においては、標的粒子と結合した状態の発光プローブ）の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、走査分子計数法では、光検出領域が１つの粒子に結合した発光プローブの存在位置を通過したときにその発光プローブから発せられる光を検出して、発光プローブを個別に検出する。しかしながら、粒子に結合した発光プローブが溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光プローブから複数回、（検出したい粒子の存在を表す）光信号が検出されてしまい、検出された光信号と１つの検出したい粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度よりも高く設定し（具体的には、標的粒子と結合した状態の発光プローブの拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるように設定し）、これにより、１つの粒子に結合した発光プローブを、１つの（粒子の存在を表す）光信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、粒子に結合した発光プローブによって変わるので、上記の如く、粒子に結合した発光プローブの特性（特に、拡散定数）に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。
【００２２】
光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。
例えば、レーザ走査型光学顕微鏡において採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
【００２３】
走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないので、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。
【００２４】
また、走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出するようになっているため、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子を一つずつ検出するため、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能となり、従前に比して、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。実際に、標的粒子と結合した状態の発光プローブを個別に検出しその数を計数して粒子濃度を決定する本実施形態の標的粒子の定量方法によれば、試料溶液中の標的粒子と結合した発光プローブの濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度であっても、標的粒子を定量的に測定することが可能である。
【００２５】
更に、光学系の光路を変更して試料溶液中を光検出領域にて走査する態様によれば、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、試料溶液内を一様に或いは試料溶液が機械的に安定した状態で観測することになる。従って、例えば、試料に流れを発生させる場合（流れを与える場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子、発光プローブ若しくは結合体又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。）に比して、定量的な検出結果の信頼性が向上し、また、試料溶液中の検出対象となる粒子に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトの無い状態で計測が行えることとなる。
【００２６】
＜走査分子計数法のための光分析装置の構成＞
走査分子計数法は、基本的な構成において、図１Ａに模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこにおいて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザ光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端において固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、かかる粒子と結合する発光プローブ、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光プローブと結合又は会合した粒子（実験の態様によっては、粒子と一旦結合した後に粒子から解離した発光プローブ）が励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者において知られている如く、上記の構成において、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１Ｂに模式的に示されている如きレーザ光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１Ｂに例示されたレーザ光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置における光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２ となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、走査分子計数法では、１つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
【００２７】
更に、上記の光分析装置の光学系においては、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内において焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１Ｃに模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザ走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい（光検出領域の位置を移動する方式）。また、更に、図１Ｂに例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内における光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の位置を移動する方式）。上記の光路を変更して光検出領域の絶対的な位置を移動する方式によって光検出領域を走査軌道（第二の経路）に沿って周回移動させると同時に、試料溶液の位置を移動する方式により、試料溶液内における光検出領域の走査軌道の位置が所定の移動経路（第一の経路）に沿って移動される。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８におけるプログラムにおいて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。
【００２８】
粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブがりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１においては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブを励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、検出光の光路にダイクロイックミラー１４ａを挿入して、検出光を複数の波長帯域に分割して別々に複数個の光検出器１６により検出するようになっていてよい。かかる構成によれば、発光粒子の発光波長特性（発光スペクトル）に関する情報の検出や、複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらからの光をその波長によって別々に検出するといったことも可能となる。更にまた、光の検出に関して、励起光として所定の方向に偏光した光が用いられ、検出光の、励起光の偏光方向と垂直な方向の成分を別々に検出して発光粒子の光の偏光特性が検出できるようになっていてもよい。その場合、励起光の光路には、ポーラライザ（図示せず）が挿入され、検出光の光路に偏光ビームスプリッタ１４ａが挿入される。
【００２９】
＜走査分子計数法の光分析技術の原理＞
ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定される。従って、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、観測対象粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、有意な光強度（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算において、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。これに対して、本実施形態の走査分子計数法では、観測対象粒子の濃度がＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出が可能である。
【００３０】
走査分子計数法の光分析技術において、実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２Ａ〜２Ｅにて模式的に描かれているように、試料溶液内において光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。
そうすると、例えば、図２Ａの如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図２Ａ中、時間ｔ０〜ｔ２）において１つの粒子（図中、発光プローブとして蛍光色素が結合している。）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、図２Ｂに描かれている如く有意な光強度（Ｅｍ）が検出されることとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２Ｂに例示されている如き有意な光強度を一つずつ検出することによって、発光プローブの結合した粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の光分析技術の原理においては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、粒子が一つずつ検出されるので、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能であることは理解されるべきである。
【００３１】
また、走査分子計数法のように、試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測される蛍光強度から蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合よりも、より低い濃度まで測定することが可能である。蛍光分光光度計やプレートリーダーによって或る蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合、通常、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例すると仮定される。しかしながら、その場合、蛍光標識された粒子の濃度が十分に低くなると、蛍光標識された粒子から発せられた光による信号の量に対するノイズ信号の量が大きくなり（Ｓ／Ｎ比の悪化）、蛍光標識された粒子の濃度と光信号量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化することとなる。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、検出結果からノイズ信号が排除され、個々の粒子に対応する信号のみを計数して濃度を算出するので、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも低い濃度まで検出できることとなる。
【００３２】
更にまた、観測対象粒子の１つに複数の発光プローブが結合する場合には、走査分子計数法のように試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定の下に濃度を決定する従前の方法よりも、粒子濃度の高い側での粒子濃度の測定精度も向上する。観測対象粒子の一つに複数の発光プローブが結合する場合で或る量の発光プローブが試料溶液に添加されているとき、観測対象粒子の濃度が高くなると、相対的に粒子に結合する発光プローブの数が低減する。その場合、一つの観測対象粒子当たりの蛍光強度が低減するために、蛍光標識された粒子の濃度と光量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化することとなる。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、一つの粒子当たりの蛍光強度の低減の影響は少なく、粒子数から濃度を算出するので、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも高い濃度まで検出できることとなる。
【００３３】
＜走査分子計数法による試料溶液の光強度の測定＞
走査分子計数法の光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにおける光強度の測定工程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内において光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７は、ミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内において光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
【００３４】
光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された観測対象粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
【００３５】
ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの観測対象粒子の個別の検出、或いは、観測対象粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ、本実施形態においては、発光プローブと結合した標的粒子）のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。走査分子計数法の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図３Ａに模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度が図３Ｂの如くランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の観測対象粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図４Ａに描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データにおいて、図４Ｂに例示の如く、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の観測対象粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
【００３６】
具体的には、拡散係数Ｄを有する観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２ ＝６Ｄ・Δｔ     …（１）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）２ ／６Ｄ     …（２）
となるので、観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ    …（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０−１０ｍ２ ／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０−３ ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
【００３７】
発光粒子その他の物質の安定性のために、試料溶液内の流れや振動等の擾乱は最小にすべきである。従って、光検出領域の位置の移動は、原則としては、顕微鏡の光学系の光路の変更による方が好ましい。上記に説明されている如く、ミラー偏向器１７による光路の変更によれば、光検出領域の位置の移動を比較的容易に高速にて実行可能だからである。
この点に関し、対物レンズの視野の周縁は、一般に収差が大きくなり、光検出領域の寸法や形状が場所によって異なる可能性があるため、光路の変更による光検出領域の位置の移動範囲は、対物レンズの収差の少ない視野の中心付近の領域内にて実行されることが好ましい。
【００３８】
一方で、光検出領域の位置の移動範囲が対物レンズの視野の中心付近の領域内に限られると、光検出領域の通過する領域、即ち、走査領域が小さくなり、検出され得る発光粒子の数も少なくなる。また、小さい領域を繰り返し通過する場合には、特に、拡散の遅い粒子については、その存在領域を光検出領域が繰り返し通過することとなり、同一の粒子を複数回検出することとなる。もっとも、意図的に同一の粒子からの光を繰り返し検出することにより、その光の特性を精度よく見積もることも有用であるが、発光粒子の数のカウンティングや濃度又は数密度の検出など、できるだけ発光粒子の検出数を多くしたいときには、同一の粒子を複数回検出することをせずに、より広範囲の領域又はより長い距離を走査できることが好ましい。また、その際、発光粒子の濃度についての情報を得たいときには、光検出領域の寸法や形状に変化が殆どなく、走査領域（光検出領域の通過領域）の長さ又は体積の見積が容易であることが好ましい。
【００３９】
光検出領域の位置の移動を、光検出領域の位置を所定の走査軌道上にて移動させると共に、その走査軌道を移動させて、光検出領域の位置が短時間のうちにできるだけ（経路の交差点を除き）同一の領域を通過しないようにすることによって、より広範囲の領域又はより長い距離を安定的に走査できるようになる。光検出領域の位置の移動経路は、三次元的であってもよく、また二次元的であってもよい。
【００４０】
すなわち、光検出領域の位置が、試料溶液内において、第一の経路に沿って位置が移動する第二の経路に沿って移動される。かかる構成によれば、光検出領域の位置が沿って移動する第二の経路の位置が移動されることによって、少なくとも第一の経路に沿った第二の経路の位置の移動が完了するまでは、試料溶液内における光検出領域の位置の移動経路は、（瞬間的に経路が交差する場合を除き、）同一の領域を通過しないこととなり、同一の発光粒子を二回以上検出する可能性が大幅に低減されることとなる。また、光検出領域の位置が試料溶液内で移動されることにより、光検出領域の位置の形状や寸法の変化が最小限に抑えられることとなる。
【００４１】
光検出領域の形状や寸法の変化をできるだけ最小限に抑えるためには、光検出領域の位置は、対物レンズの視野内であって、収差の小さい範囲に制限されるべきである。一方、観測対象物は、ランダムに運動している発光粒子であるので、一旦検出された発光粒子が拡散して別の場所に移動するのに十分な時間の経過後であれば、光検出領域の位置は、同一の位置を通過してもよいと考えられる。そこで、光検出領域の位置の軌道である第二の経路と、第二の経路の位置の軌道である第一の経路とは、それぞれ、循環経路であってよい。例えば、第二の経路は、具体的には、円形又は楕円形であってよい。一方、第一の経路の形状は、円形、楕円形又は直線であってよい。その場合、試料溶液を基準にした光検出領域の位置の軌道が容易に把握して、光検出領域の位置が短時間の内に同一の領域を連続的通過しないことを確認しやすくするために、第二の経路に沿った光検出領域の位置の移動周期が第一の経路に沿った第二の経路の位置の移動周期よりも短く設定されてよい。
【００４２】
具体的には、まず、図１Ａのミラー偏向器１７を駆動して光路を変更して、対物レンズの視野内において、図２Ｃの如く、光検出領域を走査軌道（第二の経路）に沿って周回移動させる。そして、この運動と同時に、図２Ｄの如く、ステージ位置変更装置１７ａを連続的に駆動して、試料溶液の位置を移動し、これにより、試料溶液を基準にして光検出領域の走査軌道の位置を移動して、光検出領域が短時間のうちにできるだけ同一の領域を走査することが回避される。［図２Ｄの如く、試料溶液の位置の移動を循環経路とすると、その循環経路を光検出領域の走査軌道の位置が一巡すると、光検出領域が再び同じ領域を走査することとなるが、光検出領域の走査軌道の位置の一巡の間に、通常、発光粒子は、拡散により別の場所に移動されると想定されるので、同一の発光粒子が再び検出される可能性は極めて低いと考えてよい。］
【００４３】
なお、試料溶液を基準にした光検出領域の速度は、発光粒子の光の信号のパルス状形状が常に一定となるように、略一定であることが望ましいところ、試料溶液の位置の移動速度が光検出領域の走査軌道上での移動速度と匹敵する程度に高いと、試料溶液を基準にした光検出領域の速度が変動することとなる。そこで、好適には、試料溶液の位置の移動速度は、光検出領域の走査軌道上での移動速度に比して十分低いこと（例えば、２０％以下）が好ましい。また、図２Ｅに示されている如く、光検出領域が走査軌道を一巡したときに、前回（ｉ）の周回の際に通過した領域と今回（ii）の周回の際に通過する領域との重複を避けるために、試料溶液の位置の移動速度（走査軌道の位置の移動速度）ｖ２と光検出領域の走査軌道上の移動周期τ１は、光検出領域の直径ｄとにおいて、
ｖ２・τ１＞ｄ   …（４）
の関係が成立するよう設定される。これにより、光検出領域の位置が第二の経路を一周する間に第二の経路が少なくとも光検出領域の直径に相当する距離を移動することとなるので、光検出領域の位置の連続する周回において光検出領域が前回の周回で通過した領域に重複することが回避されることとなる。具体的には、光検出領域の直径ｄは、０．４〜３０μｍであり、光検出領域の走査軌道上の移動周期τ１が０．６〜６００ｍ秒であるとすると、試料溶液の位置の移動速度ｖ２は、０．６７μｍ以上となる。実際には、通常、光検出領域の走査軌道上の移動周期τ１は、６〜６０ｍ秒と設定されるので、その場合には、試料溶液の位置の移動速度ｖ２は、１７μｍ以上となる。光検出領域の走査軌道上での移動速度は、典型的には、１０〜９０ｍｍ／秒に設定されるので、試料溶液の位置の移動速度ｖ２は、殆ど無視できるほど小さい。
【００４４】
共焦点光学顕微鏡の光学系における試料溶液内における光検出領域の位置の移動は、具体的には、顕微鏡の光学系の光路の変更か、試料溶液を含む容器の移動のいずれかにより実行可能である。そこで、光検出領域の位置の第二の経路に沿った移動は、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより実行され、第二の経路の位置の第一の経路に沿った移動は、試料溶液の位置を移動することにより実行されてもよい。換言すれば、この態様によれば、光学系の光路を変更することによる光検出領域の周回運動と試料溶液の周回運動とを組み合わせることにより、より広く或いはより長い距離にて試料溶液内を走査できることとなる。ここで、顕微鏡の光学系の光路を変更することによる試料溶液内での光検出領域の位置の第二の経路に沿った移動は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡において採用されているガルバノミラーを用いるなどして、顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。顕微鏡の光学系の光路を変更して光検出領域の位置を変更する態様によれば、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液において機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である点でも有利である。第二の経路は、具体的には、円形又は楕円形であってよい。一方、第一の経路の形状は、円形、楕円形又は直線であってよい。なお、試料溶液の移動は、好適には、既に触れたように、顕微鏡のステージを移動するなどして試料溶液の容器ごと移動するようになっていてよい。その場合、溶液内に流れが発生しないので、試料溶液の発光粒子への影響が低減されると考えられる。
【００４５】
＜走査分子計数法による光強度の分析＞
上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理（検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順）により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。
【００４６】
（ｉ）一つの観測対象粒子の検出
時系列の光強度データにおいて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４Ａに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図６Ａに模式的に描かれている如く、（光学系により決定される）光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル（通常、略釣鐘状）を有する。そこで、観測対象粒子の検出の一つの手法において、光強度に対して閾値Ｉｏが設定され、その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されるようになっていてよい。光強度に対する閾値Ｉｏ及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められる。具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）の特性によって選択的に決定されてよい。
【００４７】
また、観測対象粒子の検出の別の手法として、光検出領域の光強度分布が、
ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ２ ／ａ２ ）     …（５）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（５）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析において無視されてよい。）
【００４８】
（ii）観測対象粒子のカウンティング
観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数することにより為されてよい。しかしながら、粒子の数が大きい場合には、例えば、図５及び図６Ｂに例示された処理により為されてよい。
【００４９】
図５及び図６Ｂを参照して、時系列の光強度（フォトンカウント）データから粒子のカウンティングを行う手法の一つの例においては、上記に説明された光強度の測定、即ち、光検出領域による試料溶液内の走査及びフォトンカウンティングを行って時系列光信号データ（フォトンカウントデータ）が取得された後（ステップ１００）、かかる時系列光信号データ（図６Ｂ、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（ステップ１１０、図６Ｂ中上段「スムージング」）。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブの発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間においてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法において一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光信号データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
【００５０】
次いで、スムージング処理後の時系列光信号データにおいて、有意な信号が存在する時間領域（ピーク存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光信号データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光信号データの時間微分値は、図６Ｂ中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点における値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号（ピーク信号）の始点と終点を有利に決定することができる。
【００５１】
しかる後、時系列光信号データ上において、逐次的に、有意な信号（ピーク信号）を検出し、検出されたピーク信号が観測対象粒子に対応する信号であるか否かが判定される。
具体的には、まず、時系列光信号データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのピーク信号の始点と終点とが探索され決定され、ピーク存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのピーク存在領域が特定されると、そのピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図６Ｂ下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のピーク強度Ｉｍａｘ、ピーク幅（半値全幅）ｗ、フィッティングにおける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが光検出領域を通過したときに検出される光信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、ピーク強度、ピーク幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図７左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブに対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの観測対象粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの観測対象粒子が検出されたこととなり、一つの粒子としてカウントされる（粒子数がカウントアップされる。ステップ１６０）。一方、図７右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったピーク信号は、ノイズとして無視される。
【００５２】
上記のステップ１３０〜１６０の処理におけるピーク信号の探索及び判定は、時系列光信号データの全域に渡って繰り返し実行され、一つの観測対象粒子が検出される毎に、粒子としてカウントされる。そして、時系列光信号データの全域のピーク信号の探索が完了すると（ステップ１７０）、それまで得られた粒子のカウント値が時系列光信号データにおいて検出された観測対象粒子の数とされる。
【００５３】
（iii）観測対象粒子の数密度又は濃度の決定
観測対象粒子のカウンティングが為されると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難であり、従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液（参照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。
参照溶液の粒子としては、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体（又は観測対象粒子に結合後遊離した発光プローブ）と同様の発光特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの参照溶液について、その粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ     …（６）
により与えられる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子の数密度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ     …（７）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（６））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
【００５４】
＜標的粒子の検出方法＞
本実施形態の標的粒子の検出方法は、溶液中にて分散しランダムに運動する標的粒子を検出する方法であって、分離回収用粒子を用いて、標的粒子と結合した発光プローブから、標的粒子と結合していない遊離の発光プローブを分離除去した後に、走査分子計数法によって発光プローブと結合した標的粒子を検出することを特徴とする。走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、発光粒子を一粒子毎に測定することができる測定方法であることから、ｐＭオーダー以下の比較的低濃度の発光粒子に対しても測定が可能である。このため、本実施形態の標的粒子の検出方法により、試料溶液中の解析対象の標的粒子の濃度が非常に低い場合であっても、発光プローブと結合した標的粒子を高感度に計数することができる。さらに、本実施形態の標的粒子の検出方法は、発光プローブで標識された標的粒子を分離回収用粒子に結合させた後に、固液分離処理により分離回収用粒子を回収し、この回収された分離回収用粒子に対して走査分子計数法による計測を行う。発光プローブで標識された標的粒子は分離回収用粒子と結合しているため、固液分離処理により分離回収用粒子とともに回収されるが、標的粒子と結合していない遊離の発光プローブは、分離回収用粒子から分離して除去される。すなわち、遊離の発光プローブを除去した後に走査分子計数法による計測を行うため、遊離の発光プローブからの光の検出が効果的に抑制され、標的粒子を高精度に検出することができる。
【００５５】
具体的には、本実施形態の標的粒子の検出方法は、下記工程（ａ）〜（ｃ）を有する。
（ａ）標的粒子と、前記標的粒子と結合する発光プローブと、分離回収用粒子とを含む、又は前記発光プローブと結合した前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離回収用粒子とを含む溶液を調製し、当該溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離回収用粒子とからなる複合体を形成する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記溶液から、固液分離処理により前記分離回収用粒子を回収し、当該分離回収用粒子を含む試料溶液を調製する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）において調製された試料溶液中に存在する前記複合体の分子数を算出する工程。
以下、工程ごとに説明する。
【００５６】
まず、工程（ａ）として、標的粒子と、前記標的粒子と結合する発光プローブと、分離回収用粒子とを含む、又は前記発光プローブと結合した前記標的粒子と前記分離回収用粒子とを含む溶液を調製し、当該溶液中で、前記標的粒子と前記発光プローブと前記分離回収用粒子とからなる複合体を形成する。
【００５７】
本実施形態及び本願明細書において、「溶液中に分散しランダムに運動する粒子」とは、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの粒子（発光するもの又は発光しないもののいずれであってもよい。）であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子を意味する。
【００５８】
標的粒子は、溶液中にて分散しランダムに運動する粒子であって、検出する目的の粒子である。標的粒子としては、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸類似物質、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物又は非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）等が挙げられる。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。
【００５９】
また、本実施形態において用いられる発光プローブは、標的粒子と、特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質であって、標的粒子に結合した状態で光を放出する物質であれば、特に限定されるものではない。また、発光プローブと標的粒子との結合は、可逆的な結合であってもよく、共有結合等の不可逆的な結合であってもよい。例えば、発光プローブは、発光物質自体であってもよく、標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質に、発光物質を結合させたものであってもよい。発光物質としては、典型的には、蛍光物質であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する物質であってもよい。蛍光物質としては、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されるものではなく、ＦＣＳやＦＩＤＡ等で使用されている蛍光色素の中から適宜選択して用いることができる。
【００６０】
例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、発光プローブは、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに蛍光物質等の発光物質を結合させたもの、蛍光物質等の発光物質を結合させた核酸結合性タンパク質、核酸に結合する色素分子等が挙げられる。当該オリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。また、標的粒子がタンパク質又は低分子化合物等である場合には、発光プローブとしては、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプター、又はビオチンとアビジンのように標的粒子と特異的に結合する物質を、蛍光物質等の発光物質で標識したものを用いることができる。なお、核酸やタンパク質等の標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質への発光物質の結合は、常法により行うことができる。
【００６１】
また、本実施形態において用いられる発光プローブは、合成反応等によって標的粒子と結合可能な発光物質自体であってもよい。例えば、蛍光色素等の発光物質中の官能基と、標的粒子中の官能基とを、各種合成反応により結合させてもよい。当該合成反応としては、例えば、水溶性カルボジイミドでカルボン酸とアミノ基を結合させるＥＤＡＣ（１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル) −カルボジイミド塩酸塩）反応、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを予め混合してカルボン酸とアミノ基とを結合させる反応、活性化したアルデヒド基やトシル基と標的粒子中の官能基を結合する反応等が挙げられる。また、双極性を有するリンカーを用いて、標的物質中のアミノ基と発光物質中のアミノ基を架橋する反応であってもよい。
【００６２】
本実施形態において用いられる発光プローブは、標的粒子と非特異的に結合等するものであってもよいが、標的粒子の検出・定量の精度の点からは、特異的に結合等するものであることが好ましい。なお、標的粒子と特異的に結合する発光プローブとしては、物理的又は化学的性質が標的粒子と類似した他の物質に対する結合よりも、標的粒子と優先的に結合するものであればよく、標的粒子以外の物質と全く結合しないものである必要はない。例えば、標的粒子が核酸である場合には、発光プローブとして用いる発光物質で標識したオリゴヌクレオチドは、当該標的粒子の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、当該標的粒子の塩基配列とミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。
【００６３】
本実施形態においては、走査分子計数法による計測に供される試料溶液中から、標的粒子に結合していない遊離の発光プローブ（単独で存在している発光プローブ）の大部分は除去される。このため、標的粒子に結合した状態の発光プローブと、単独で存在している状態の発光プローブとが、同じ発光特性であっても、標的粒子を高精度に検出することができる。
【００６４】
本実施形態においては、標的粒子に結合した状態と、単独で存在している状態とにおいて、放出される光の発光特性が異なる発光プローブを用いてもよい。発光プローブが単独で存在している状態と、標的粒子と結合した状態とで、特定の波長の光の強度を異ならせる（例えば、蛍光強度を異ならせる）ことにより、標的粒子をより高精度に検出することができる。なお、標的粒子に結合した状態と単独で存在している状態とにおいて、発光プローブの発光特性が異なるとは、標的粒子に結合した状態と単独で存在している状態とで、特定の波長の光の強度が異なることを意味する。
【００６５】
例えば、標的粒子がタンパク質である場合には、タンパク質と結合して周囲環境が変化することにより蛍光強度や蛍光波長が変化する色素（例えば、疎水性プローブＡＮＳ、ＭＡＮＳ、ＴＮＳといった蛍光色素）を、発光プローブとして用いることができる。また、発光プローブは、それ自体が発光していなくてもよい。例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、発光プローブを当該標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとし、標的粒子と発光プローブとからなる会合体に、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を結合させることによっても、発光プローブが単独で存在している状態と、標的粒子と結合した状態とで、発光特性を異ならせることができる。２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質としては、蛍光性インターカレーターや、蛍光物質を結合させたグルーブバインダー等が挙げられる。
【００６６】
その他にも、例えば、発光プローブとして、少なくとも二つの構成要素から成る物質であって、標的粒子に結合することにより、前記の少なくとも二つの構成要素の互いの位置が変化して蛍光を発する物質が採用されてもよい。そのような物質の例としては、或る粒子に結合すると、構造変化して強い蛍光を放出するようになる蛍光性タンパク質や、或る粒子に結合すると、集合して蛍光性金属錯体を形成する分子（錯体の配位子）が挙げられる。かかる構成によれば、いずれの場合も、発光プローブ単体若しくは標的粒子に結合していない発光プローブは、殆ど発光しないか、発光しても、標的粒子及び発光プローブの結合体と波長が異なるため、標的粒子及び発光プローブの結合体からの光を選択的に検出することが可能となる。
【００６７】
また、蛍光エネルギー移動現象（ＦＲＥＴ）を利用することにより、単独で存在している発光プローブと、標的粒子に結合した状態である発光プローブとの発光特性を異ならせることができる。例えば、標的粒子と結合する物質に、ＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質及びエネルギー・アクセプターと成る物質（蛍光物質や消光物質）を、発光プローブが単独で存在している状態ではＦＲＥＴが生じ、標的粒子と結合した状態ではＦＲＥＴが生じなくなるように結合させたものを、発光プローブとして用いることができる。標的粒子と結合した発光プローブからは、ＦＲＥＴが起こらないため、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から蛍光が放出される。一方で、単独で存在している発光プローブからは、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光は検出されないか、もしくは減弱している。そこで、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光を検出することにより、発光プローブと結合した標的粒子を、単独で存在している発光プローブと区別して検出することができる。
【００６８】
例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、１本鎖核酸分子の状態の際に分子内構造体を形成するオリゴヌクレオチドに、ＦＲＥＴにおいてエネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質とを、１本鎖核酸分子の状態ではＦＲＥＴが起こり、他の１本鎖核酸分子とハイブリダイズして形成された会合体の状態ではＦＲＥＴが起こらないように結合させた分子ビーコンプローブを、発光プローブとして好ましく用いることができる。例えば、３’末端側にエネルギー・ドナーと成る蛍光物質又はエネルギー・アクセプターと成る物質が結合されており、５’末端側に残る一方が結合されており、かつ３’末端側の領域と５’末端側とに互いに相補的な塩基配列を有し、これらの塩基配列において塩基対を形成することによって、分子内構造体（いわゆるステム−ループ構造）を形成するものが挙げられる。なお、分子ビーコンプローブの分子内塩基対を形成する互いに相補的な領域は、標的粒子とハイブリダイズする領域を挟むようにして存在していればよく、３’末端側の領域及び５’末端側の領域は、それぞれ、３’末端又は５’末端を含んでいる領域であってもよく、含まない領域であってもよい。また、塩基対を形成する領域の塩基数や塩基配列は、形成された塩基対の安定性が、標的粒子との会合体の安定性よりも低く、且つ測定条件下で塩基対を形成し得る程度であればよい。
【００６９】
また、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を用い、当該蛍光性２本鎖核酸結合物質と発光プローブを標識した蛍光物質との間にＦＲＥＴを起こすことによっても、単独で存在している発光プローブと、標的粒子と結合している発光プローブとを区別することができる。すなわち、蛍光性２本鎖核酸結合物質と発光プローブを標識する蛍光物質のいずれか一方がＦＲＥＴのエネルギー・ドナーと成り、他方が当該ＦＲＥＴのエネルギー・アクセプターと成る。単独で存在している発光プローブからは、当該発光プローブを標識する蛍光物質から放出される蛍光が検出される。これに対して、標的粒子と結合している発光プローブには蛍光性２本鎖核酸結合物質が結合するため、ＦＲＥＴにより放出される蛍光が検出される結果、単独で存在している発光プローブとは区別して検出することができる。
【００７０】
なお、発光プローブと標的粒子との会合体の塩基対の間に入り込む蛍光性インターカレーターの量が多すぎる場合には、ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出する際のバックグラウンドが高くなりすぎ、検出精度に影響を及ぼすおそれがある。このため、発光プローブと標的粒子との会合体中の２本鎖を形成している領域が、４００ｂｐ以下となるように、発光プローブを設計することが好ましい。
【００７１】
その他、本実施形態においては、発光プローブを２種類使用してもよい。例えば、２種類の発光プローブを、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合に、標的粒子に対して互いに隣接してハイブリダイズするように設計し、一方の発光プローブをＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質で標識し、他方の発光プローブを当該ＦＲＥＴにおけるエネルギー・アクセプターと成る物質で標識させる。この場合、単独で存在している発光プローブではＦＲＥＴは起こらないが、標的粒子に結合することにより、当該２種類の発光プローブは互いに近接し、ＦＲＥＴが起こる。このため、当該ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出することにより、発光プローブと結合した標的粒子を検出することができる。
【００７２】
標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、２種類の発光プローブを用い、Ｑｕｅｎｃｈｅｄ  Ａｕｔｏｌｉｇａｔｉｏｎ（ＱＵＡＬ）反応を利用して、標的粒子と結合した発光プローブから光を放出させてもよい（J. AM. CHEM. SOC., 2002,(10),p2096）。
具体的には、標的粒子とハイブリダイズし、かつ特殊な３’末端修飾塩基を有する核酸プローブ（Ｎプローブ）と、当該Ｎプローブの３’末端側に隣接して標的粒子とハイブリダイズし、かつ５’末端側に消光色素及び蛍光色素が修飾された核酸プローブ（Ｅプローブ）とを設計し、作製する。２つのプローブが標的粒子とハイブリダイズすると、非酵素的なライゲーション（Ａｕｔｏｌｉｇａｔｉｏｎ）反応が起こり、このときにＥプローブから消光色素が脱離する。つまり、２つのプローブが標的粒子とハイブリダイズしたときのみ蛍光を発する。
【００７３】
本実施形態において用いられる分離回収用粒子は、標的粒子と発光プローブとの結合体と特異的又は非特異的に結合又は吸着し、かつ水に懸濁可能であり、一般的な固液分離処理によって液体と分離可能である。分離回収用粒子としては、例えば、水に懸濁可能であり、かつ一般的な固液分離処理によって液体と分離可能な粒子に、標的粒子と、特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質を結合させた粒子を用いることができる。その他にも、標的粒子と結合していない発光プローブとは結合せず、標的粒子と結合した状態の発光プローブとは結合可能な部位を表面に有し、水に懸濁可能であり、かつ一般的な固液分離処理によって液体と分離可能な粒子を、分離回収用粒子として用いてもよい。
【００７４】
分離回収用粒子は、走査分子計数法による測定中に試料溶液において懸濁状態を維持している必要がある。測定中に試料溶液において沈殿する粒子は、走査分子計数法によっては正確な検出が困難であるためである。このため、本実施形態において用いられる分離回収用粒子の試料溶液中における沈降速度は、１×１０−６ｍ／ｓ以下であることが好ましく、１×１０−７ｍ／ｓ以下であることがより好ましい。
【００７５】
なお、粒子の沈降速度は、一般的にはストークスの式により求められる。下記式（８）中、ｒはビーズ半径であり、ρPはビーズ密度であり、ρｆは溶液密度であり、ｇは重力加速度であり、ηは溶液の粘度である。
【００７６】
【数１】
0006010034.tif 000002
【００７７】
分離回収用粒子に用いられる粒子は、水に懸濁可能であり、かつ一般的な固液分離処理によって液体と分離可能な粒子であればよく、当該技術分野において、物質の精製・分離等の処理のために一般的に用いられている粒子の中から適宜選択して用いることができる。本実施形態において用いられる分離回収用粒子は、磁性粒子であってもよく、非磁性粒子であってもよい。その他、分離回収用粒子は、ウイルス、細菌、細胞などの生体材料であってもよい。本実施形態に用いる分離回収用粒子は、１種類の材質からなる粒子であってもよく、２種類以上の材質からなる粒子であってもよい。さらに、１種類の分離回収用粒子を用いてもよく、２種類以上の分離回収用粒子を混合して用いてもよい。
【００７８】
磁性粒子として、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロム等の金属からなる粒子や、あるいはコバルト、ニッケル、マンガン等を含む合金からなる粒子等が挙げられる。また、該磁性粒子は、磁性体のみからなる粒子であってもよく、非磁性体粒子の内部に磁性体の微粒子を含有させた粒子であってもよい。該非磁性体粒子として、例えば、疎水性重合体からなるラテックス粒子や、架橋した親水性重合体からなるラテックス粒子等がある。２〜４種類程度のモノマーの共重合体からなるラテックス粒子であってもよい。該疎水性重合体として、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレート等がある。
【００７９】
また、該架橋した親水性重合体として、例えば、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメタクリレート、デキストラン等がある。その他、ラテックス粒子等の非磁性体粒子の表面に磁性体の微粒子を固定させた粒子であってもよい。
【００８０】
非磁性粒子として、例えば、ガラス、セラミックス、プラスチック、ラテックス等からなる粒子がある。その他、アルミニウム、ニッケル、アルミナ、チタニア、ジルコニア等の磁性を帯びていない金属粒子であってもよい。
【００８１】
本実施形態において用いられる分離回収用粒子としては、磁性粒子、ガラス粒子、又はラテックス粒子に標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質を結合させた粒子であることが好ましい。また、磁場を用いることにより、固液分離処理を簡便に行えるため、磁性粒子であることがより好ましい。例えば、磁性粒子の懸濁液の入っている容器に磁石を接近させ、該容器の該磁石に最も近接する面に磁性粒子を収束させた後、上清を除去することにより、磁性粒子のみを該容器内に回収することができる。
【００８２】
分離回収用粒子は、走査分子計数法による測定中に試料溶液において懸濁状態を維持し得るものであれば、特に限定されるものではなく、その平均粒子径、密度等は、用いる分離回収用粒子の素材や試料溶液の粘度等を考慮して適宜調整することができる。例えば、分離回収用粒子の平均粒子径は、１ｎｍ〜１００μｍとしてもよく、好ましくは０．０１〜５０μｍとしてもよい。
【００８３】
本実施形態において用いられる分離回収用粒子を製造するために、水に懸濁可能であり、かつ一般的な固液分離処理によって液体と分離可能な粒子と結合させる標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質としては、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプター、又はビオチンとアビジンのように標的粒子と特異的に結合する物質等、発光プローブと同様のものを用いることができる。なお、分離回収用粒子は、標的粒子と非特異的に結合等するものであってもよいが、標的粒子の検出・定量の精度の点からは、特異的に結合等するものであることが好ましい。
【００８４】
水に懸濁可能であり、かつ一般的な固液分離処理によって液体と分離可能な粒子と、標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質とを結合させる方法は、特に限定されるものではなく、物理的に吸着させてもよく、粒子表面の官能基に化学的に結合させてもよい。化学的に結合させる場合には、各官能基に適した方法により結合させることができる。例えば、ＥＤＡＣ反応、ＥＤＣとＮＨＳとを予め混合してカルボン酸とアミノ基とを結合させる反応、双極性を有するリンカーを用いてアミノ基同士を架橋する反応、活性化したアルデヒド基やトシル基と、標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質中の官能基を結合する反応等が挙げられる。粒子表面に官能基を有さない磁性粒子の場合には、粒子表面を官能基で被覆してもよい。
【００８５】
具体的には、工程（ａ）は、まず、標的粒子と発光プローブと分離回収用粒子とを含む、又は発光プローブと結合した標的粒子と発光プローブと分離回収用粒子とを含む溶液を調製する。当該溶液を調製するために標的粒子等が添加される溶媒は、標的粒子と発光プローブと分離回収用粒子とからなる複合体（以下、３者複合体ということがある。）の形成を阻害しないものであれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているバッファの中から、適宜選択して用いることができる。該バッファとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファやトリスバッファ等がある。
【００８６】
当該溶液は、例えば、適当な溶媒に、標的粒子と発光プローブと分離回収用粒子とをそれぞれ添加することによって調製することができる。添加する順番は、最終的に３者複合体が形成できれば特に限定されるものではない。具体的には、標的粒子と発光プローブと分離回収用粒子とを実質的にほぼ同時に添加した後、調製された溶液中で３者複合体を形成させてもよい。また、標的粒子と発光プローブとを添加して標的粒子と発光プローブからなる結合体を形成した後、分離回収用粒子を添加して３者複合体を形成させてもよく、標的粒子と分離回収用粒子とを添加して標的粒子と分離回収用粒子からなる結合体を形成した後、発光プローブを添加して３者複合体を形成させてもよい。
【００８７】
標的粒子と発光プローブを同じ溶液中に共存させるだけで、両者を結合させることができる場合には、標的粒子と発光プローブを含む溶液を調製した後、必要に応じて所定時間当該試料溶液をインキュベートするだけで、当該溶液中で、標的粒子と発光プローブとを結合させることができる。
【００８８】
一方で、標的粒子や発光プローブが二本鎖構造の核酸又は核酸類似物質である場合には、標的粒子及び発光プローブを含む溶液中の核酸等を変性させた後、両者を会合させることが好ましい。なお、「核酸又は核酸類似物質を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、分子ビーコンプローブ中の互いに相補的な塩基配列によって形成された塩基対を解離させ、分子内構造を解いて１本鎖構造にすることや、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。なお、発光プローブがＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、標的粒子が二本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、当該発光プローブと標的粒子とからなる会合体を形成することができる場合がある。
【００８９】
変性処理としては、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性等が挙げられる。中でも、蛍光物質等の発光物質への影響が比較的小さく、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、当該溶液を、高温処理をすることにより、当該溶液中の核酸等を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、標的粒子の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、この温度に限定するものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、当該溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
【００９０】
必要に応じて変性させた後、前記溶液中の標的粒子と発光プローブを会合させる。熱変性を行った場合には、高温処理後、当該溶液の温度を、標的粒子と発光プローブとが特異的にハイブリダイズできる温度にまで低下させることにより、当該溶液中の両者を適宜会合させることができる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、当該溶液の塩濃度を、標的粒子と発光プローブとが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、当該溶液中の両者を適宜会合させることができる。
【００９１】
なお、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、両者からなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、両者のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、当該溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した２本の１本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、両者が特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。
【００９２】
２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、発光プローブの塩基配列情報から、標的粒子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。
【００９３】
また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、会合体形成させる際に、溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、当該溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。
【００９４】
また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。
これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。
【００９５】
一般的に、標的粒子を効率よく標識するためには、標的粒子よりも過剰量の発光プローブを要する。このため、予め標的粒子と発光プローブとを添加して標的粒子と発光プローブからなる結合体を形成させる場合、形成反応後の溶液中には、発光プローブと結合した標的粒子と発光プローブとが含まれている。したがって、標的粒子と発光プローブとの結合反応後の反応溶液に分離回収用粒子を添加することによっても、工程（ａ）における溶液を調製することができる。
【００９６】
例えば、ＥＤＡＣ反応等の合成反応によって蛍光色素を標的粒子に結合させた後の反応溶液に、分離回収用粒子を添加し、必要に応じてインキュベートを行い、３者複合体を形成させてもよい。また、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、蛍光物質で標識されたプライマー又は蛍光物質で標識されたｄＮＴＰと、分離回収用粒子と結合可能な物質で標識されたプライマーとを用いて標的粒子を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ＰＣＲ産物として、蛍光物質と分離回収用粒子と結合可能な物質の両方で標識された標的粒子が得られる。このＰＣＲの反応溶液に分離回収用粒子を添加し、必要に応じてインキュベートを行い、３者複合体を形成させることもできる。
【００９７】
次いで工程（ｂ）として、工程（ａ）において調製された３者複合体を含有する溶液から、固液分離処理により分離回収用粒子を回収し、当該分離回収用粒子を含む試料溶液を調製する。
【００９８】
固液分離処理としては、溶液中に懸濁している分離回収用粒子を液体成分とは分離して回収可能な方法であれば、特に限定されるものではなく、固液分離処理に用いられる公知の処理の中から適宜選択して用いることができる。例えば、３者複合体を含有する溶液に対して遠心分離処理を行い、分離回収用粒子を沈殿させ、上清を除去してもよく、当該溶液を濾紙又は濾過フィルターを用いて濾過し、濾紙等の表面に残留した分離回収用粒子を回収してもよい。また、分離回収用粒子が磁性粒子である場合には、当該溶液が入れられている容器に磁石を接近させ、該容器の該磁石に最も近接する面に分離回収用粒子を収束させた後、上清を除去してもよい。
【００９９】
回収された分離回収用粒子を適当な溶媒中で懸濁させることにより、試料溶液が調製される。該溶媒は、標的粒子と結合した発光プローブから放出される光の検出、及び、走査分子計数法による標的粒子と結合した発光プローブの検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているバッファの中から、適宜選択して用いることができる。該バッファとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファやトリスバッファ等がある。
【０１００】
回収された分離回収用粒子は、試料溶液を調製する前に、適当なバッファにより洗浄してもよい。洗浄により、遊離の発光プローブをより厳密に、分離回収用粒子から分離して除去することができる。
【０１０１】
その後、工程（ｃ）として、調製された試料溶液中の３者複合体（発光プローブと結合した標的粒子）の分子数を、走査分子計数法により計数する。具体的には、試料溶液を前記の走査分子計数法のための光分析装置に設置し、前記の手法により、３者複合体中の発光プローブから放出される光を検出し解析することにより、３者複合体の分子数を算出する。算出された３者複合体の分子数が、試料溶液中の標的粒子の分子数である。
【０１０２】
分離回収用粒子を含む３者複合体は大きな粒子であり、溶液中における拡散運度が比較的遅い。このため、工程（ｃ）における試料溶液を走査分子計数法による測定では、光検出領域の位置の移動は、試料溶液内における光検出領域の位置を所定の走査軌道上にて移動させると共に、その走査軌道を移動させて、光検出領域の位置が短時間のうちにできるだけ（経路の交差点を除き）同一の領域を通過しないようにすることが好ましい。すなわち、光検出領域の位置を、試料溶液内において、第一の経路に沿って位置が移動する第二の経路に沿って移動させる。光検出領域は、その位置の移動の間、経路の交差点を除き、試料溶液内の異なる領域を走査することとなるので、同一の３者複合体を別の粒子として検出する可能性が大幅に低減され、３者複合体の検出数のばらつきが縮小され、或いは、３者複合体中の発光プローブの退色による影響を最小限に抑えられることとなる。
【実施例】
【０１０３】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１０４】
［実施例１］
発光プローブをＡＴＴＯ（登録商標）４８８とし、発光プローブで標識された標的粒子をＡＴＴＯ（登録商標）４８８−ビオチンとし、分離回収用粒子として磁性粒子を用いて、本実施形態の標的粒子の検出方法により、溶液中のＡＴＴＯ（登録商標）４８８−ビオチンを検出した。
具体的には、１Ｍ  ＮａＣｌ及び０．０５体積％濃度（Ｖ／Ｖ）  ｐｌｕｏｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を含むＴＥバッファ（本実施例において、以下、バッファという。）を用いて、ＡＴＴＯ（登録商標）４８８−ビオチン（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びＡＴＴＯ（登録商標）４８８（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社）をそれぞれ０．２μＭとなるように溶解させた。ＡＴＴＯ（登録商標）４８８−ビオチン及びとＡＴＴＯ（登録商標）４８８を体積比で０：１０００、１：９９９、５：９９５、又は１０：９９０となるように混合した溶液を、それぞれ０％（ｍｏｌ）、０．１％（ｍｏｌ）、０．５％（ｍｏｌ）、又は１％（ｍｏｌ）色素修飾ビオチン溶液とした。次いで、２５μＬの１０ｍｇ／ｍＬ（≒１０ｐＭ）ストレプトアビジン修飾磁性ビーズ（製品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１、ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製）と２５μＬの色素修飾ビオチン溶液を混合して懸濁液を調製した。各懸濁液を３０分間インキュベートすることにより、磁性ビーズ上のストレプトアビジンに対してＡＴＴＯ（登録商標）４８８−ビオチン中のビオチンを結合させた。【０１０５】
磁石を用いて、各懸濁液中の磁性ビーズを沈殿させ、上澄みを全て取り除いた。残った磁性ビーズに対し、１ｍＬのバッファを加えることで磁性ビーズを再懸濁後、磁石を用いて磁性ビーズを沈殿させた後、上澄み液を取り除いた。同様の操作を計６回繰り返し、磁性ビーズの洗浄を行った。洗浄後の磁性ビーズを２５μＬのバッファに懸濁し、懸濁液（精製済み）を調製した。【０１０６】
得られた各懸濁液（精製済み）中の、ストレプトアビジン修飾磁性ビーズと結合した状態のＡＴＴＯ（登録商標）４８８−ビオチンを、走査分子計数法により計数した。対照として、磁石を用いた精製処理を行わなかった各懸濁液（精製無し）に対しても、同様に走査分子計数法により計数した。
具体的には、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ−２０（オリンパス株式会社製）を用い、上記の各懸濁液を１０００倍希釈した溶液を試料溶液とし、各試料溶液の時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、２００μＷの４８８ｎｍのレーザ光を用い、バンドパスフィルターを用いて、５１０〜５６０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中における光検出領域は、１５ｍｍ／秒（６０００ｒｐｍ）の移動速度にて回転させ、ＢＩＮ  ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は２秒間又は２４０秒間とした。測定によって得られた時系列光強度データをスムージング後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似でき、強度が５以上となるもののピーク強度を抽出した。【０１０７】
走査分子計数法による計数結果を図８及び９に示す。図８は磁石を用いた精製処理を行った試料溶液を、測定時間を２４０秒間として計測した結果であり、図９は磁石を用いた精製処理を行わなかった試料溶液を、測定時間を２秒間として計測した結果である。この結果、精製処理を行った場合には、０体積％色素修飾ビオチン溶液ではピークがほとんど検出されなかったのに対して、ＡＴＴＯ（登録商標）４８８−ビオチンの添加量に依存してピーク数が増大することが観察された（図８参照。）。これに対して、精製処理を行わなかった場合には、ＡＴＴＯ（登録商標）４８８−ビオチンの添加量にかかわらず、検出されたピーク数に差は確認できなかった（図９参照。）。これらの結果から、磁性粒子を用いて発光プローブと結合した標的粒子を精製し、標的粒子と結合していない過剰量の発光プローブを取り除くことにより、標的粒子の検出精度を向上させられることが示された。【０１０８】
［実施例２］
実施例１において調製された試料溶液を、試料溶液の位置を移動する方式により、光検出領域の位置を、試料溶液内の平面内において、第一の経路に沿って位置が移動する第二の経路に沿って移動させて、走査分子計数法による計測を行った。
具体的には、実施例１で走査分子計数法による計測に用いた各試料溶液に対して、実施例１で用いた１分子蛍光測定装置ＭＦ−２０を用いて、以下の条件で走査分子計数法による計測を行った。励起光は、２００μＷの４８８ｎｍのレーザ光を用い、バンドパスフィルターを用いて、５１０〜５６０ｎｍの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中における光検出領域は、１５ｍｍ／秒（６０００ｒｐｍ）の移動速度にて回転させた。さらに測定容器を１ｍｍ／秒で円形（ＯＤ：１ｍｍ）に駆動させた。また、ＢＩＮ  ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は２秒間又は２４０秒間とした。測定によって得られた時系列光強度データをスムージング後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似でき、強度が５以上となるもののピーク強度を抽出した。【０１０９】
走査分子計数法による計数結果を図１０及び１１に示す。図１０は磁石を用いた精製処理を行った試料溶液を、測定時間を２４０秒間として計測した結果であり、図１１は磁石を用いた精製処理を行わなかった試料溶液を、測定時間を２秒間として計測した結果である。この結果、実施例１の場合と同様に、精製処理を行った場合には、ＡＴＴＯ（登録商標）４８８−ビオチンの添加量に依存してピーク数が増大することが観察された（図１０参照。）。これに対して、精製処理を行わなかった場合には、ＡＴＴＯ（登録商標）４８８−ビオチンの添加量にかかわらず、検出されたピーク数に差は確認できなかった（図１１参照。）。また、精製処理を行った場合には、実施例１の場合に比べて標準偏差が小さく、ステージを駆動させることで、測定のばらつきを低減できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明の標的粒子の検出方法により、溶液中に非常に低濃度にしか存在していない場合であっても、走査分子計数法により、発光プローブで標識した標的粒子を、遊離の発光プローブによる影響を抑制しつつ高精度に検出することができるため、臨床検体等の、解析対象物質の濃度が微量である試料の解析・検査等の分野で利用が可能である。
【符号の説明】
【０１１１】
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
【図１Ａ】
0006010034.tif 000003
【図１Ｂ】
0006010034.tif 000004
【図１Ｃ】
0006010034.tif 000005
【図１Ｄ】
0006010034.tif 000006
【図２Ａ】
0006010034.tif 000007
【図２Ｂ】
0006010034.tif 000008
【図２Ｃ】
0006010034.tif 000009
【図２Ｄ】
0006010034.tif 000010
【図２Ｅ】
0006010034.tif 000011
【図３Ａ】
0006010034.tif 000012
【図３Ｂ】
0006010034.tif 000013
【図４Ａ】
0006010034.tif 000014
【図４Ｂ】
0006010034.tif 000015
【図５】
0006010034.tif 000016
【図６Ａ】
0006010034.tif 000017
【図６Ｂ】
0006010034.tif 000018
【図７】
0006010034.tif 000019
【図８】
0006010034.tif 000020
【図９】
0006010034.tif 000021
【図１０】
0006010034.tif 000022
【図１１】
0006010034.tif 000023