(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドを検出するための検出用剤であって、
固相担体と、
複数の前記標的ポリヌクレオチドに予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブであって、パターン情報を含むプローブ識別情報を伴って、前記固相担体上に固定される複数のオリゴヌクレオチドプローブと、
を備え、
前記固相担体上には、前記パターン情報の方向性を示す方向性情報を備えるとともに、複数の前記オリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ固定するための１２個以上のフィーチャーエリアが画定されており、
前記パターン情報は、前記フィーチャーエリアのそれぞれにおいて、複数の前記オリゴヌクレオチドプローブの固定領域又はそれらの非固定領域によって目視による識別可能な大きさを備えている、検出用剤。
【請求項２】
前記フィーチャーエリアは、前記固相担体の表面をグリッド状に区画した方形状である、請求項１に記載の検出用剤。
【請求項３】
前記固相担体は、アスペクト比が１．５以上である、請求項１又は２に記載の検出用剤。
【請求項４】
前記パターン情報は、前記フィーチャーエリアの輪郭に沿う前記固定領域によって実質的に囲繞される前記非固定領域によって特徴付けられる、請求項１〜３のいずれかに記載の検出用剤。
【請求項５】
前記パターン情報は、前記固定領域又は前記非固定領域の形状に関する情報を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の検出用剤。
【請求項６】
前記パターン情報は、前記固定領域又は前記非固定領域の大きさに関する情報を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の検出用剤。
【請求項７】
前記パターン情報は、前記固定領域又は前記非固定領域の模様に関する情報を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の検出用剤。
【請求項８】
前記パターン情報は、文字、数字、記号及び図形並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されるシンボルを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の検出用剤。
【請求項９】
前記シンボルはバーコードを含む、請求項８に記載の検出用剤。
【請求項１０】
前記固相担体上には、１又は２以上の前記オリゴヌクレオチドプローブを固定するための１又は２以上のフィーチャーエリアが画定されており、
１つの前記フィーチャーエリア内において、２以上の前記オリゴヌクレオチドプローブの前記パターン情報が配置されている、請求項１〜９のいずれかに記載の検出用剤。
【請求項１１】
１つの前記フィーチャーエリア内において、２以上の前記オリゴヌクレオチドプローブの前記パターン情報が少なくとも部分的に重複する、請求項１０に記載の検出用剤。
【請求項１２】
１つの前記フィーチャーエリア内において、２以上の前記オリゴヌクレオチドの前記パターン情報が相補的である、請求項１１に記載の検出用剤。
【請求項１３】
複数個の前記オリゴヌクレオチドプローブを、これらの前記オリゴヌクレオチドプローブ毎の前記プローブ識別情報を伴って前記固相担体上に備える、請求項１〜１２のいずれかに記載の検出用剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の検出用剤と、
前記ハイブリダイズ産物に前記プローブ識別情報を肉眼で視認可能な検出シグナルを付与可能な薬剤と、
を備える、キット。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれかに記載の検出用剤の製造方法であって、
前記固相担体上に、前記オリゴヌクレオチドプローブを、前記プローブ識別情報を伴って供給する工程、
を備える、製造方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドの供給工程は、前記オリゴヌクレオチドプローブを含有する液体を、ピエゾ素子を用いて吐出して前記固相担体上に供給する工程である、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
標的ポリヌクレオチドの検出方法であって、
請求項１〜１３のいずれかに記載の検出用剤上の前記オリゴヌクレオチドプローブと、被験試料とについてハイブリダイゼーションを実施する工程と、
前記ハイブリダイゼーションで得られたハイブリダイズ産物が呈示する前記プローブ識別情報に基づいて前記標的ポリヌクレオチドを検出する工程と、
を備える、検出方法。
【請求項１８】
前記ハイブリダイゼーション工程後、前記検出工程に先立って、前記ハイブリダイズ産物に前記プローブ識別情報を肉眼で視認可能な検出シグナルを付与する工程を、備える、請求項１７に記載の検出方法。
【請求項１９】
前記標的ポリヌクレオチドは一塩基多型を含む、請求項１７又は１８に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ポリヌクレオチドを検出するためのアレイなどの検出用剤、その製造方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生物における遺伝子解析が進み、遺伝子多型、遺伝子変異など検査など、結核菌の型別及び感染症における原因菌若しくはウイルスの同定、分類等が、遺伝子情報を利用して行われている。また、遺伝子配列の決定も行われている。
【０００３】
こうした遺伝子に関する検査にあたっては、通常、特定のオリゴヌクレオチドプローブを固相担体に固定したアレイなどの検出用剤を用いて行われている。より具体的には、固相担体に固定化された、予め配列を取得している標的オリゴヌクレオチドに関連付けたオリゴヌクレオチドプローブと、分析対象から取得した遺伝子試料とをハイブリダイズさせて、ハイブリダイズ産物をプローブ又は遺伝子試料に付与されたシグナル等に基づき検出することにより、標的ポリヌクレオチドを検出している。
【０００４】
従来この種の方法としては、例えば、複数の検出しようとする菌の型別に必要な特異的プローブ数十種類を準備し、メンブレン上にこれらのプローブを平行線状に固定化しておき、ブロッターを用いてプローブのラインパターンと垂直になるように試料から調製したＰＣＲ産物を供給しハイブリダイズさせる方法がある。この方法では、ＰＣＲ産物がビオチン標識されているため、ハイブリダイゼーション後のメンブレンをペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンでインキュベートする。これにより、ハイブリダイズしたＰＣＲ産物をペルオキシダーゼで標識し、ＥＣＬ試薬による化学発光シグナルをＸ線フィルムへ感光させる。生体試料に含まれている菌の型に応じて表出される特異的プローブの配列パターンに基づき型判別が可能となる（非特許文献１）。
【０００５】
さらに、標的ポリヌクレオチドの検出を容易にするため、試験紙などに、関連する２種類以上の互いに異なる生理活性物質（特異的プローブ等）を隣接して固定しておいて、これらの全部の生理活性物質においてシグナルを検出するかあるいはその一部においてシグナルを欠損するかによって、変異の有無を検出することも検討されている（特許文献１）。また、複数列×複数行のマトリックス状に複数のプローブが固定化されているときにおいて、プローブの位置を特定可能なマーカー物質も固定化しておくことも試みられている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−６４９２７号公報
【特許文献２】特開２０００−２７０８９６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ocimum BiosolutionsのＨＰ（FIGGENhttp://www3.ocimumbio.com/wp-content/uploads/docs/OBS_SPK_WP.pdf）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
通常、プローブは、いずれも、固相担体上の予め決定された特定の位置に固定されている。したがって、どのプローブにおいてハイブリダイズ産物を検出したか否かを判定するには、予め決定されている固相担体上におけるプローブの位置情報と照らし合わせる必要がある。このような照合操作は、目視で行われうる場合もあるが、一般的には、ハイブリダイゼーション反応後のアレイから画像情報を取得し、その後、専用の解析ソフトでどのプローブにおいてハイブリダイズ産物が検出されたかが判定される。
【０００９】
しかしながら、上記した従来の方法では、いずれも、どの位置のプローブにおいてハイブリダイズ産物を検出したかを特定するのは困難であった。上記非特許文献１及び特許文献１では、標的ポリヌクレオチドに関連する一群のプローブの固定化領域の検出パターン認識を前提とするものであった。したがって、これらの先行技術では、個々の一つのプローブについての検出を容易することはできず、依然として面倒な照合操作を要していた。
【００１０】
また、上記特許文献２に開示される方法では、個別のプローブの特定ならびに検出及び定量を容易にし信頼性を向上させるものとして有効であった。しかしながら、依然として照合操作は必要であった。
【００１１】
そこで、本発明では、より簡便で実用的にハイブリダイズ産物の有無を検出できる標的ポリヌクレオチドの検出用剤を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、より実用的で簡便な標的ポリヌクレオチドの検出のために、既知のプローブ個別の位置情報との照合操作を簡素化ないし省略するべく検討した。その結果、本発明者らは、個々のプローブを固定化するパターンにそのプローブの識別情報を付与することで、ハイブリダイゼーション反応後のハイブリダイズ産物を生成したプローブの位置の照合操作を省略できるという知見を得た。こうした知見によれば、以下の手段が提供される。
【００１３】
（１）標的ポリヌクレオチドを検出するための検出用剤であって、
固相担体と、
前記標的ポリヌクレオチドに予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブであって、パターン情報を含むプローブ識別情報を伴って、前記固相担体上に固定されるオリゴヌクレオチドプローブと、
を備える、検出用剤。
（２）前記固相担体上には、１又は２以上の前記オリゴヌクレオチドプローブを固定するための１又は２以上のフィーチャーエリアが画定されており、
前記パターン情報は、前記フィーチャーエリアのそれぞれにおいて、１又は２以上の前記オリゴヌクレオチドプローブの固定領域又はそれらの非固定領域によって特徴付けられる、（１）に記載の検出用剤。
（３）前記パターン情報は、前記フィーチャーエリアの輪郭に沿う前記固定領域によって実質的に囲繞される前記非固定領域によって特徴付けられる、（２）に記載の検出用剤。
（４）前記パターン情報は、前記固定領域又は前記非固定領域の形状に関する情報を含む、（２）又は（３）に記載の検出用剤。
（５）前記パターン情報は、前記固定領域又は前記非固定領域の大きさに関する情報を含む、（２）〜（４）のいずれかに記載の検出用剤。
（６）前記パターン情報は、前記固定領域又は前記非固定領域の模様に関する情報を含む、（２）〜（５）のいずれかに記載の検出用剤。
（７）前記パターン情報は、文字、数字、記号及び図形並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されるシンボルを含む、（２）〜（６）のいずれかに記載の検出用剤。
（８）前記シンボルはバーコードを含む、（７）に記載の検出用剤。
（９）前記パターン情報は、目視によって識別可能な大きさを備える、（１）〜（８）のいずれかに記載の検出用剤。
（１０）前記固相担体上には、１又は２以上の前記オリゴヌクレオチドプローブを固定するための１又は２以上のフィーチャーエリアが画定されており、
１つの前記フィーチャーエリア内において、２以上の前記オリゴヌクレオチドプローブの前記パターン情報が配置されている、（１）〜（９）のいずれかに記載の検出用剤。
（１１）１つの前記フィーチャーエリア内において、２以上の前記オリゴヌクレオチドプローブの前記パターン情報が少なくとも部分的に重複する、（１０）に記載の検出用剤。
（１２）１つの前記フィーチャーエリア内において、２以上の前記オリゴヌクレオチドの前記パターン情報が相補的である、（１０）に記載の検出用剤。
（１３）  前記固相担体上の前記パターン情報の方向性を示す方向性情報を前記固相担体上に備える、（１）〜（１２）のいずれかに記載の検出用剤。
（１４）  複数個の前記オリゴヌクレオチドプローブを、これらの前記オリゴヌクレオチドプローブ毎の前記プローブ識別情報を伴って前記固相担体上に備える、（１）〜（１３）のいずれかに記載の検出用剤。
（１５）（１）〜（１４）のいずれかに記載の検出用剤と、
前記ハイブリダイズ産物に前記プローブ識別情報を肉眼で視認可能な検出シグナルを付与可能な薬剤と、
を備える、キット。
（１６）（１）〜（１４）のいずれかに記載の検出用剤の製造方法であって、
前記固相担体上に、前記オリゴヌクレオチドプローブを、前記プローブ識別情報を伴って供給する工程、
を備える、製造方法。
（１７）前記オリゴヌクレオチドの供給工程は、前記オリゴヌクレオチドプローブを含有する液体を、ピエゾ素子を用いて吐出して前記固相担体上に供給する工程である、（１６）に記載の製造方法。
（１８）標的ポリヌクレオチドの検出方法であって、
（１）〜（１４）のいずれかに記載の検出用剤上の前記オリゴヌクレオチドプローブと、被験試料とについてハイブリダイゼーションを実施する工程と、
前記ハイブリダイゼーションで得られたハイブリダイズ産物が呈示する前記プローブ識別情報に基づいて前記標的ポリヌクレオチドを検出する工程と、
を備える、検出方法。
（１９）前記ハイブリダイゼーション工程後、前記検出工程に先立って、前記ハイブリダイズ産物に前記プローブ識別情報を肉眼で視認可能な検出シグナルを付与する工程を、備える、（１８）に記載の検出方法。
（２０）前記標的ポリヌクレオチドは一塩基多型を含む、（１８）は（１９）に記載の検出方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の検出用剤の一例を示す図である。
【図２】２種以上のプローブを一つのフィーチャーエリアに固定した一例を示す図である。
【図３】一つのフィーチャーエリア内に第１〜第１０までの１０種のプローブを必要に応じて複数選択して固定するためのデザインの一例を示す図である。
【図４】デジタル表現された１〜０の数字の各数字からなるパターンを、８個のバー領域ａ〜ｇを用いて１０種のプローブを用いて形成する場合のプローブ供給領域を示す図であり、左図は、バー領域ａ〜ｇを示し、右図は、数字とプローブを付与するバー領域を示す図である。
【図５】一つのフィーチャーエリア内で、２種のプローブをそれぞれ同時検出可能にパターン情報を形成する一例を示す図である。
【図６】本発明の検出方法の一例を示す図である。
【図７】実施例１で作製したアレイを示す図である。
【図８】実施例１で作製したアレイを用いた検出結果の一例を示す図である。
【図９】実施例１で作製したアレイを用いた検出結果の他の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、標的ポリヌクレオチドの検出用剤及びその利用、詳しくは、標的ポリヌクレオチドの検出用剤、その製造方法及び標的ポリヌクレオチドの検出方法に関する。本発明の検出用剤では、この種の検出用剤に必要とされていたオリゴヌクレオチドプローブの位置の照合操作に替えてオリゴヌクレオチドプローブを識別するためのパターン情報を含むプローブ識別情報を取得する。プローブ識別情報は、それ自体オリゴヌクレオチドプローブを識別できるパターン情報を含んでいるため、位置照合することなく、どのオリゴヌクレオチドプローブにおいてハイブリダイズ産物が生成されたか、すなわち、どの標的オリゴヌクレオチドが検出できたかを直ちに知ることができる。この結果、前記照合操作を省略して標的オリゴヌクレオチドの検出が可能となる。
【００１６】
本発明の検出用剤によれば、プローブの位置の照合操作を簡素化ないし省略できるため、画像情報の取得装置やプローブ位置照合のための専用の解析ソフトなどを簡素化ないし省略することができる。また、プローブ識別情報を目視で視認可能な大きさを有する場合には、簡易に標的ポリヌクレオチドの検出が可能となる。さらに、プローブ識別情報を、可視光等を用いて目視で視認可能である場合には、装置を備えていない検査現場において遺伝子検査等を容易に実施できるようになる。可視光による検出は、装置コストを低減できるほか、リアルタイムに発色を観察できる点が検査の迅速性に寄与している。
【００１７】
本明細書において、標的ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの重合体を意味しており、その重合数は特に限定しない。したがって、標的ポリヌクレオチドには、数個から数十程度のヌクレオチドが連結したオリゴヌクレオチドが包含される。標的ポリヌクレオチドは、例えば、体質、遺伝病、癌などの特定疾患についての発症、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択などのヒト、非ヒト動物などの生物における遺伝子上の指標となる塩基あるいは塩基配列を標的部位として含むことができる。標的ポリヌクレオチドとしては、典型的には、ＳＮＰなどの多型や先天的又は後天的変異を標的部位として含むポリヌクレオチドが挙げられる。また、病原菌やウイルスなどの微生物由来の塩基配列も標的部位として含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１８】
以下、本発明の実施形態について、適宜図面を参照しながら説明する。図１には、本発明の検出用剤の一例を示す。
【００１９】
（標的ポリヌクレオチドの検出用剤）
本発明の標的ポリヌクレオチドの検出用剤（以下、本検出用剤という。）１０は、固相担体２と、
標的ポリヌクレオチドに予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブであって、パターン情報を含むプローブ識別情報を伴って、固相担体２上に固定されるオリゴヌクレオチドプローブ４と、を備えている。
【００２０】
（固相担体）
固相担体２は、その材料を特に限定しないで、セラミックス、ガラス、金属、合成樹脂等を用いることができる。オリゴヌクレオチドプローブ４を固定化するための層を別途備えることもできる。固相担体２は、ダウンサイジング性、小スケールでの取り扱い性、反応性、プローブ識別情報の視認性等を考慮すると、液体の浸透性又は透過性を有することが好ましい。こうした材料としては、例えば、合成樹脂が挙げられ、典型的には、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデンなどのポリマーを主体としたいわゆる多孔性のメンブランフィルターのほか、セルロースなどのろ紙を好ましく用いることができる。
【００２１】
固相担体２の形状は、問わないで、各種形状のビーズ、シート状とすることができる。シート状であると、ハンドリング性が良く、検査データとしての保存にも有利である。さらに、シート状であると、一定の可撓性も付与しやすく、ハイブリダイゼーションの容器への充填性、収納性及び反応性に有利に寄与することができる。固相担体２の厚みとしては、０．０１ｍｍ以上０．３ｍｍ以下であることが好ましい。
【００２２】
より具体的には、固相担体２の形態は、平面積が１５０ｍｍ2以下であることが好ましい。この平面積以下であると、十分に１ｍｌ以下の液中においても固定化領域においてハイブリダイゼーションが可能である。より好ましくは、１００ｍｍ2以下であり、さらに好ましくは５０ｍｍ2以下である。５０ｍｍ2以下であると、０．３ｍｌ以下の液中でのハイブリダイゼーションにも有効である。
【００２３】
また、好ましくは、アスペクト比が１．５以上の方形状である。こうした方形状であると、チューブ状容器に収まりやすく、ハンドリングも容易である。また、チューブ状容器内で反転したりせずに、容器内において投入時の形態が保持され、予め定めた一定の方向性が確保される。さらに、方形状であると、本検出用剤１０の方向性を目視で簡易に判別することができ、後述するハイブリダイゼーション工程ほか、シグナル付与工程及び検出工程に都合がよい。より好ましくはアスペクト比は２０以下である。アスペクト比が２０を超えるとプローブ識別情報を把握しにくくなるからであり、２０以下であると複数個のプローブ識別情報を目視で識別しやすいため、検出精度を維持ないし向上させることができる。アスペクト比は好ましくは１５以下であり、より好ましくは１０以下であり、さらに好ましくは５以下であり、一層好ましくは３以下である。
【００２４】
（オリゴヌクレオチドプローブ）
オリゴヌクレオチドプローブ（以下、単にプローブという。）４は、特に限定しないで、従来公知の手法で固相担体２上に固定されている。すなわち、共有結合他、非共有結合で固定されていてもよい。また、プローブ４は、固相担体２上に少なくとも１つ備えられる。好ましくは複数個備えられ、より好ましくは十数個以上備えられ、さらに好ましくは数十個以上備えられる。
【００２５】
プローブ４は、検出する標的ポリヌクレオチドや、標的ポリヌクレオチドの検出システムに応じて適宜選択される。例えば、感染症等の感染原因菌の菌種（型）判定には、複数のプローブ４に対するハイブリダイゼーションによって検出する。変異の検出にあたっては、一つの変異に対して１又は複数のプローブ４を対応させてもよい。
【００２６】
プローブ４は、標的ポリヌクレオチドに予め関連付けられている。ここで、「標的ポリヌクレオチドに予め関連付けられている」とは、標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする塩基配列を有しているプローブのほか、標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする塩基配列を有してはいないが、標的オリゴヌクレオチドを検出するための予め決定された塩基配列を有しているプローブ（ユニバーサルプローブ）ことを意味している。
【００２７】
ユニバーサルプローブは、たとえば乱数から得られた所定塩基長のＤＮＡ配列に対して連続一致長、Nearest-Neighbor法による融解温度予測、ハミング距離、二次構造予測の計算を行うことにより設計される塩基配列である正規直交配列を有することができる。正規直交配列は、核酸の塩基配列であって、その融解温度が均一であるもの、即ち融解温度が一定範囲内に揃うように設計された配列であって、核酸自身が分子内（intramolecular）で構造化して、相補的な配列とのハイブリッド形成を阻害することのない配列であり、尚且つこれに相補的な塩基配列以外とは安定したハイブリッドを形成しない塩基配列を意味することができる。１つの正規直交配列群に含まれる配列は、所望の組み合わせ以外の配列間および自己配列内において反応が生じ難いか、または反応が生じない。また、正規直交配列は、ＰＣＲ等において増幅させると、たとえば上述のクロスハイブリダイズのような問題に影響されずに、当該正規直交配列を有する核酸の初期量に応じた量の核酸が定量的に増幅される性質を有しうる。上記のような正規直交配列は、H.Yoshida and A.Suyama,“Solution to 3-SAT by breadth first search”,DIMACS Vl.54, 9-20(2000)に詳細が記載されている。こうした文献に基づいて正規直交配列を設計することができる。
【００２８】
こうしたユニバーサルプローブを用いた場合、予め標的ポリヌクレオチドに対して特定のユニバーサルプローブを関連付けておく。このためには、ユニバーサルプローブと同一又は相補的な塩基配列を有し、かつ標的ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するプライマーやプローブを用いる。すなわち、標的ポリヌクレオチドに対して、このプライマー等とのハイブリダイゼーション反応とリガーゼ反応とを実施して、関連付けられたユニバーサルプローブの塩基配列と同一又は相補的な塩基配列を有するとともに標的ポリヌクレオチドに特異的なリガーゼ産物を取得し、このリガーゼ産物ないしこのＰＣＲ増幅産物と、固相担体２上のユニバーサルプローブとのハイブリダイゼーションを実施することとなる。リガーゼ産物等は、予め関連付けられたプローブとハイブリダイズし二重鎖ハイブリダイズ産物を生成する。なお、ＳＮＰなど変異の検出には、一つの標的ポリヌクレオチドに対して、複数のユニバーサルプローブが割り付けられることもある。この種の方法は、特開２００８−３０６９４１号公報、Analytical Biochemistry, 364, 1, 2007, 78-85の他、特開２００９−２３２７７８号公報、特開２００９−２４号公報等を参照して実施することができる。
【００２９】
固相担体２上には、１又は２以上のプローブ４を固定するための１又は２以上のフィーチャーエリア６が画定されている。一つのフィーチャーエリア６は、固相担体２上において、１又は複数のプローブ４に割り当てられる領域である。すなわち、一つのフィーチャーエリア６には、１種のプローブ４が固定されていてもよいし、２種以上のプローブ４が固定されていてもよい。固相担体２上において、フィーチャーエリア６は、同一の面積及び形状となっている。フィーチャーエリア６は、例えば、平面的な固相担体２の場合、固相担体２の平坦な表面をグリッド状に区画した方形状の各区画が挙げられる。なお、フィーチャーエリア６は、方形状に限定するものではなく、円形状であってもよく、特に限定されないが、グリッドの区画内で収まる形状とすることで、同一面積及び形状のフィーチャーエリア６を形成しやすい。こうしたグリッドによって区画された領域内にあるフィーチャーエリア６に、プローブ４を固定することでプローブ４を行×列のマトリックス状に備えることとなる。フィーチャーエリア６を多数個設けるために、グリッドによって区画された内部をさらに二分割等してもよい。二分割する形態としては、方形状の区画に対角線でさらに区画してもよい。
【００３０】
フィーチャーエリア６の大きさは、０．２ｍｍ2以上１５０ｍｍ2以下であることが好ましい。０．２ｍｍ2未満であると目視による視認性が低下しすぎ、１５０ｍｍ2を超えてはアレイのサイズ上問題がある。例えば、長辺が１ｍｍ〜１０ｍｍで、短辺が０．８ｍｍ〜５ｍｍ程度に設定することができる。なお、フィーチャーエリア６間には適当な間隔を置くことができる。
【００３１】
フィーチャーエリア６の個数は、検出意図や検出方法の用途に応じて適宜設定される。固相担体２のサイズ等を考慮すると、特に限定しないが、２個以上２００個以下であることが好ましい。２００個を超えると、固相担体２のサイズ上の観点及び目視による検出判定が困難になる可能性があるからである。１又は複数のフィーチャーエリア６における目視によるシグナル検出を考慮すると、好ましくは１５０個以下であり、より好ましくは１００個以下である。また、フィーチャーエリア６の個数は、好ましくは２０個以上であり、より好ましくは４０個以上である。２０個以上であると、例えば、各種診断等において汎用性が高い。
【００３２】
オリゴヌクレオチドプローブ４は、フィーチャーエリア６内において固定領域を少なくとも有しており、多くの場合、同時にプローブ４が固定されていない非固定領域を伴っている。
【００３３】
（プローブ識別情報）
プローブ４は、それぞれそのプローブ４を識別するためのプローブ識別情報を伴って固相担体２上に固定されている。プローブ識別情報は、固相担体２上のプローブ４ごとに特徴的であって、固相担体２上の他のプローブ４のプローブ識別情報と区別可能であることが好ましい。
【００３４】
（パターン情報）
プローブ識別情報は、パターン情報を含んでいる。プローブ識別情報がパターン情報を含むことで、他種多様な組み合わせを設定することができ、同一の固相担体２上に多数のプローブを配置してもそれぞれを識別することができる。例えば、プローブ識別情報が色情報のみの場合、色の多様性は低く、また多様な色を提供することも困難であり、さらに色の識別も困難である。このため、同一の固相担体２上において多数個のプローブを配置することができない。さらに、異なる発色操作や化合物を用いて異なる色を付与しなければならず、操作も煩雑でコストがかかってしまうことになる。さらに、安定した発色を確保することも困難である。なお、プローブ識別情報がパターン情報を含んでいれば、さらに色情報を含むことを排除するものではない。
【００３５】
本明細書において、「プローブ４がプローブ識別情報を伴って固定されている」とは、パターン情報がフィーチャーエリア６内におけるプローブ４の固定領域、あるいは同エリア６内におけるプローブ４の非固定領域によって特徴付けられていることを意味している。
【００３６】
プローブ４のプローブ識別情報がプローブ４の固定領域によって特徴付けられる場合とは、例えば、図１の左上に示すように、プローブ４の固定領域自体が、ある種の明示的なパターン情報（シンボル）（図１では数字の「１」）を形成している場合である。
【００３７】
また、プローブ４のプローブ識別情報が非固定領域によって特徴付けられる場合とは、例えば、図１の右上に示すように、プローブ４の固定領域と非固定領域があるとき、非固定領域自体がある種の明示的なパターン情報（シンボル）（図１では、数字の「１」）を形成している場合（いわゆる白抜きの状態）である。このように、フィーチャーエリア６の輪郭（ここでは方形状）に沿ってフィーチャーエリア６の外周をほぼ充填するように形成された固定領域によって実質的に囲繞される非固定領域によって特徴付けられる場合、以下のメリットを奏することができる。
（１）複数のプローブ４の複数のフィーチャーエリア６の各固定領域を、フィーチャーエリア６の輪郭に一致させることができる。プローブ４間で、その固定領域の輪郭が一致しているため、プローブ４を識別するパターン情報の識別力のバラツキを低減することができる。
（２）フィーチャーエリア６内の固定領域におけるハイブリダイゼーション反応性にバラツキが生じた場合であっても、非固定領域による特徴付けが維持されやすく、パターン情報の識別力が高い（特に、パターン情報が数字の場合などが該当する。）
（３）隣り合うフィーチャーエリア６間で非固定領域で特徴付けられるパターン情報が同種であったとしても（例えば、いずれも数字であり、一方が一桁の数字で他方が二桁の数字である場合などが該当する。）、各フィーチャーエリア６における非固定領域は、それぞれの固定領域で区画化されているので、各フィーチャーエリア６のパターンをそれぞれ確実に識別できる。
【００３８】
こうしたパターン情報としては、固定領域又は非固定領域の形状に関する情報のほか、これらの領域の大きさに関する情報であってもよく、これらの領域の模様に関する情報であってもよい。パターン情報が形状に関する情報の場合には、文字、数字、記号及び図形並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されるシンボルが、フィーチャーエリア６内の固定領域又は非固定領域で特徴付けられる形態が挙げられる。シンボルとしては、シンボルは平行線状あるいはドット状等の各種のバーコードを含むことができる。
【００３９】
パターン情報が大きさに関する情報の場合には、同一形状での相似体のシンボルがフィーチャーエリア６の固定領域又は非固定領域によって特徴付けられている形態が挙げられる。
【００４０】
パターン情報が模様に関する情報の場合には、例えば、フィーチャーエリア６を多数個の各種形状のドット状、縦ストライプ状、横ストライプ状、斜めストライプ状、網目状等あるいはこれらの組み合わせが固定領域又は非固定領域によって特徴付けられている形態が挙げられる。
【００４１】
パターン情報は、目視によって識別可能な大きさを備えることが好ましい。こうした形態であると、ハイブリダイズ産物が検出シグナルを有しているかあるいはハイブリダイズ産物に検出シグナルを付与することで、顕微鏡観察によらずにプローブ識別情報を確認できる。
【００４２】
１種のプローブ４のみがフィーチャーエリア６内に固定されている場合には、当該プローブ４の固定領域及び非固定領域でパターン情報が形成される。また、２種以上のプローブ４が、それぞれ独立したパターン情報を形成して一つのフィーチャーエリア６内に固定されていてもよい。この場合、２種以上のプローブ４のパターン情報はフィーチャーエリア６内において部分的に重複していてもよいし、場合によっては完全一致していてもよい。こうすることで、一つのフィーチャーエリア６を２種以上のプローブ４を独立して使用することができ、一つのフィーチャーエリア６を異種のプローブ４のために独立して多重に有効活用できる。
【００４３】
例えば、図２に示すように、一つのフィーチャーエリア６内に、第１のプローブ４を数字の「１」というパターン情報を形成して固定するとともに、他の第２のプローブ４を、数字の「２」というパターン情報を形成して固定する。この結果、一つのフィーチャーエリア６は、第１のプローブ４に対応するポリヌクレオチドが存在する被験試料と接したとき、数字の「１」を呈示し、他の第２のプローブ４に対応するポリヌクレオチドが存在する被験試料と接したとき、数字の「２」を呈示する。こうした形態によれば、例えば、２種のポリヌクレオチドのうちいずれか一方が存在するような被験試料の場合において、一つのフィーチャーエリア６で効率的に当該一方のポリヌクレオチドを検出できる。また、異種のプローブ４が異なる用途や場面を意図している場合には、一つのフィーチャーエリア６を多用途（多場面）に使用できる。この場合、一つのフィーチャーエリア６における２種以上のプローブ４のパターン情報は少なくとも部分的に重複することができる。すなわち、完全に一致するパターンであってもよいし、全く異なるパターンであってもよい。検出用剤１０が異なる場面や用途に用いられるため、一つのフィーチャーエリア内において二つ以上のプローブ４に基づいて二つ以上のプローブ識別情報が提示されることがないからである。
【００４４】
さらに、例えば、一つの固相担体２上に複数個のフィーチャーエリア６を備えており、これらのフィーチャーエリア６に対して、ある種の臨床検査を意図した複数個のプローブ４をそれぞれパターン情報を形成して固定する。さらに、同じ複数個のフィーチャーエリア６に対して、全く異なる種の臨床検査を意図した複数個のプローブ４をそれぞれパターン情報を形成して固定する。こうすることで、一つの本検出用剤１０を、異なる用途や場面に用いることができる。
【００４５】
図３に、一つのフィーチャーエリア内に第１〜第１０までの１０種のプローブを必要に応じて複数選択して固定するためのデザインの一例を示す。図３には、１０種のプローブがそれぞれ伴うプローブ識別情報、すなわち、１〜０までの数字からなるパターン情報を示す。こうした１０種のプローブがそれぞれ個別のパターン情報を形成するためには、例えば、図４の左図に示すように、これらの数字をデジタル表現可能な７個のバー領域（ａ〜ｇ）で構成するものとする。そして、第１のプローブで数字の「１」を形成するとき、図４の右図に示すように、バー領域ｅ、ｇに第１のプローブを固定する。同様に、第２のプローブで数字の「２」を形成するとき、前記右図に示すように、バー領域ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｇに第２のプローブを固定する。同様に、第３のプローブ〜第１０のプローブを用いて、対応する数字を形成するように対応するバー領域に各プローブを固定する。数字をパターン情報として用いることで、一つのフィーチャーエリア６を効率的に活用して複数のプローブ４、すなわち、複数のプローブ情報を内在させることができる。また、数字をパターン情報として用いることで複数のパターン情報が内在されていても、誤認なく各パターン情報を含むプローブ識別情報を識別できる。さらに、デジタル表現された数字とすることで、高い識別性を有している。さらにまた、こうした一つのフィーチャーエリア６内で複数のプローブ４を異なるパターン情報を形成して固定するには、ピエゾ素子を用いたプローブ供給手法を用いることで明瞭なパターン情報を形成できる。
【００４６】
また、２種以上のプローブ４が、一つのフィーチャーエリア６内に固定されている場合として、一つのフィーチャーエリア６で同時に２種以上のプローブ４を用いた判別を実現することもできる。例えば、複数のプローブ４のうち、一部のプローブ４のみからなるパターン情報と、全てのプローブ４によって構成されるパターン情報とが、異なる形状、大きさ、模様等となって、同時にパターン情報が提示されても互いに区別可能に異なって形成される場合が挙げられる。典型的には、図５に示すように、一つのフィーチャーエリア６内に、２種のプローブ４を固定するとき、２種のプローブ４のパターン情報を相補的に形成することができる。すなわち、一つのフィーチャーエリア６内の中心部に各プローブ４につき合同の形状の直角三角形の固定領域をその斜辺が近接して対向するように形成する。この結果、第１及び第２のプローブ４のみからなるパターン情報は、斜辺が対向するように配置されたそれぞれ直角三角形のパターンであるが、二つのプローブ４のパターン情報が合体すると方形状のパターン形成することとなる。なお、個々のプローブ４のパターン情報や合体して形成するパターンについては特に限定されず、各種形態を採ることができる。
【００４７】
（方向性情報）
固相担体２上には、固相担体２上のパターン情報の方向性を示す方向性情報８を備えることができる。こうした方向性情報を固相担体２上に備えることで、プローブ識別情報の識別力を高めることができる。方向性情報は、例えば、顔料インク又は染料インク等で固相担体２上に付与して形成することができる。方向性情報８の形態は特に限定しないで、バー状、ドット状等とすることができ、固相担体２における位置は、固相担体２を視認する場合の方向を特定できる形態であれば特に限定されない。方向性情報８は、例えば、固相担体２の一部（例えば、方形状のとき、上辺及び／又は下辺、角部等）に設けることができる。
【００４８】
（本検出用剤の製造方法）
本検出用剤の製造方法は、固相担体２上に、プローブ４を、プローブ識別情報を伴って供給する工程を備えることができる。こうすることで、プローブ４の固定位置の照合操作を省略できる検出用剤を製造できる。
【００４９】
プローブ４は、既に説明したプローブ識別情報を構成できるように固相担体２上に供給される。こうしたプローブ４の固相担体２への供給やプローブ４の固相担体２への固定化は、従来公知の手法に従い行うことができる。本検出用剤の製造方法においては、プローブ４をプローブ識別情報を伴って供給して固定するものであるため、プローブ４を含有する液体を、ピエゾ素子を用いて吐出して固相担体２に供給することが好ましい。ピエゾ素子を用いることで、微細なパターン情報であっても精度よく供給できて識別力の高いパターン情報を形成できる。
【００５０】
（標的ポリヌクレオチドの検出用のキット）
本発明のキットは、本検出用剤と、本検出用剤において得られる被験試料中のＤＮＡ等とのハイブリダイズ産物にプローブ識別情報を肉眼で視認可能な検出シグナルを付与可能な薬剤と、を備えることができる。肉眼で視認可能な検出シグナルをハイブリダイズ産物に付与できれば、蛍光を検知する装置なくして簡易にプローブ識別情報を確認できる。
【００５１】
こうした薬剤としては、特に限定しないが、例えば、被験試料を、蛍光色素などの標識物質あるいは標識物質と標識用化合物が結合したポリメラーゼ増幅反応の産物として調製できるプライマー又は当該プライマーを含むポリメラーゼ増幅反応キットが挙げられる。例えば、標識物質又は標識結合性物質が結合したプライマーであってもよいし、こうした結合物を持たないプライマーと、ＤＮＡ鎖の伸長に伴って標識物質あるいは標識結合性物質を連結できるように構成されたヌクレオチド３リン酸セットの組み合わせであってもよいし、増幅産物に対して標識物質又は標識結合性物質を導入できる修飾用の薬剤とこのためのプライマーとの組み合わせであってもよい。最終的にハイブリダイズ産物に肉眼で視認可能な検出シグナルを付与するための手法や薬剤は、当業者において周知であり、当業者であれば、必要に応じて公知の手法や薬剤から適宜選択して用いることができる。
【００５２】
（標的ポリヌクレオチドの検出方法）
本発明の標的ポリヌクレオチドの検出方法は、本検出用剤１０上のプローブ４と、被験試料とについてハイブリダイゼーションを実施する工程と、ハイブリダイゼーションで得られたハイブリダイズ産物が呈示するプローブ識別情報に基づいて標的ポリヌクレオチドを検出する工程と、を備えることができる。この検出方法によれば、プローブ識別情報を用いて標的ポリヌクレオチドを検出できるため、従来のプローブ位置の照合操作を省略することができる。
【００５３】
（被験試料の準備）
ハイブリダイゼーション工程に供する被験試料は、特に限定しないで、ハイブリダイゼーションの対象となる可能性のある標的ポリヌクレオチドを含んでいればよい。被験試料としては、プローブハイブリダイゼーションが適用される公知の遺伝子情報、ＤＮＡを用いた検出、検査、診断方法における被験試料を本方法に用いることができる。
【００５４】
被験試料には、各種の生体由来の試料（血液、尿、痰、組織、細胞（各種の動物由来の培養動物細胞、培養植物細胞、培養微生物細胞を含む））あるいは、こうした生体試料からＤＮＡなどのポリヌクレオチドを抽出した抽出試料、こうした生体試料の有するＤＮＡやＲＮＡから各種の遺伝子増幅手法による増幅試料等が含まれる。また、後述するシグナル付与工程を考慮すると、被験試料中のオリゴヌクレオチドが予め標識ないし標識可能に構成されていることが好ましい。当業者であれば、こうした被験試料を周知の技術に基づいて容易に調製することができる。
【００５５】
遺伝子増幅反応としては、公知の各種の反応が利用でき、例えば、各種手法によるＰＣＲのほか、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＩＣＡＮ等が挙げられる。また、被験試料中のポリヌクレオチドを標識するのにあたっては、所定の標識結合性物質が連結されたｄＮＴＰを取り込ませる方法によることができる。標識結合性物質とは、ジゴキニゲニン（ＤＩＧ）などのハプテンやビオチンなどが挙げられる。例えば、当該ハプテン特異的認識抗体を用い、さらに当該認識抗体に付与した例えば、ペルオキシダーゼ等の発色性物質を検出シグナルとして用いることができる。例えば、図６に例示する以下の被験試料調製工程を実施してもよい。
【００５６】
被験試料調製工程の一例は、ハイブリダイゼーション工程に用いる容器と同一容器を用いて、遺伝子増幅反応によって被験試料を調製する工程が挙げられる。同一容器を用いることで、増幅に用いた容器に対して検出用剤１０を投入することでそのままハイブリダイゼーション工程を実施できる。また、こうすることで、用いる容器数を減少させ、操作を簡略化することができる。なお、遺伝子増幅反応実施後、同一容器内の遺伝子増幅反応液又はハイブリダイゼーション用の液を供給することが好ましい。そして、さらに、ハイブリダイゼーションに先立つ高温による変性工程も同一容器内でそのまま実施することがより好ましい。こうすることで、操作を簡略化し、さらに操作の迅速化、温度制御の迅速化及び高精度化も実現できる。
【００５７】
（ハイブリダイゼーション工程）
ハイブリダイゼーション工程では、本検出用剤１０のプローブ４と被験試料とにつきハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーションは、プローブ４と被験試料中の可能性ある標的ポリヌクレオチドが特異的に結合するような条件で行う。こうした温度、塩濃度及び時間等は、用いるプローブ４等の種類にもよるが、当業者であれば適宜設定することができる。
【００５８】
ハイブリダイゼーション工程の実施形態は特に限定しないが、たとえば、上記した被験試料調製工程の一例の後段として、図２に例示するように、本検出用剤１０毎に１ｍｌ以下の液中で実施することができる。
【００５９】
ハイブリダイゼーション工程の一例では、本検出用剤１０を用いて１ｍｌ以下の液中ハイブリダイゼーションを可能とする形態は、ハイブリダイゼーション容器の大きさによっても異なるが、例えば、当該容器として、先細りのあるいは寸胴状のチューブ状容器が意図されることが好ましい。すなわち、こうした容器を用いて本検出方法を実施することが好ましい。先細り状の容器の例としては、典型的には、エッペンドルフチューブ（商品名）が挙げられ、寸胴状の容器の例としては、典型的には一般的な試験管等が挙げられる。チューブ状容器は、例えば、１ｍｌ以下、０．５ｍｌ以下、０．３ｍｌ以下のハイブリダイゼーション液を充填できる容積を有することが好ましい。こうしたチューブ状容器としては、それぞれ、内径７〜９ｍｍ、典型的には８ｍｍ、深さ３７〜３９ｍｍ、典型的には３８ｍｍ、内径５〜７ｍｍ、典型的には６ｍｍ、深さ２９〜３１ｍｍ、典型的には３０ｍｍ及び内径４〜６ｍｍ、典型的には５ｍｍ、深さ１９〜２１ｍｍ、典型的には２０ｍｍのサイズを有するものが挙げられる。
【００６０】
容器は、また、透明性であることが好ましい。内部の本検出用剤１０のプローブ識別情報を肉眼で視認するのに都合がよいからである。また、容器は、その開口部（通常は上部）を開閉するために脱着可能な蓋を備えていてもよい。こうした蓋を備えることで、少ない液量の蒸発等を防ぐとともに、温度制御を迅速かつ容易化できる。
【００６１】
ハイブリダイゼーション工程の一例では、図６に示すように、本検出用剤１０を用いて、一つの本検出用剤１０につき１ｍｌ以下、好ましくは、０．５ｍｌ以下、より好ましくは０．３ｍｌ以下の液中でハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーション工程において、被験試料中に、プローブと塩基対を形成する標的ポリヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含んでいるとき、二重鎖ハイブリダイズ産物が形成される。
【００６２】
ハイブリダイゼーション工程の一例では、本検出用剤１０を所定の方向でチューブ状容器に投入し、その状態を維持して実施することが好ましい。具体的には、チューブ状容器の内部形態に合わせて、本検出用剤１０の長辺が容器の深さ方向に沿う状態を維持して実施することが好ましい。上記したアスペクト比の方形状シートの本検出用剤１０を用いることで、市販で入手できる１〜０．３ｍｌ程度の各種形態のチューブ状容器内に安定して保持される。
【００６３】
ハイブリダイゼーション工程の一例では、チューブ状容器を用いる場合、既存のＰＣＲのための温度制御装置に適用することができる。こうした温度制御を実施することで、精度よくかつ迅速に温度制御が可能となる。ハイブリダイゼーション工程の条件は特に限定しない。通常のハイブリダイズ媒体を用いることができる。また、適度な温度に設定することができる。
【００６４】
なお、後段の検出工程に先立って、過剰の被験試料を洗浄除去する洗浄工程を実施することが好ましい。洗浄工程は、ハイブリダイゼーション工程を実施した容器からハイブリダイゼーション液を除去して本検出用剤１０のみを残留させた状態で、所定の温度条件で洗浄に適した液を供給して適当な時間接触させることを適数回繰り返すことによって実施できる。こうした洗浄工程を同一容器で実施することで、操作を簡略化し容器数を減らしてしかも、温度制御を迅速かつ精度よく行うことができる。
【００６５】
（シグナル付与工程）
ハイブリダイゼーション工程後、前記検出工程に先立って、前記ハイブリダイズ産物に前記プローブ識別情報を検出可能な検出シグナルを付与する工程を、備えることができる。ハイブリダイズ産物が、被験試料において付与された標識物質によって既に標識されている場合においては、ハイブリダイゼーション工程後に検出工程を実施してプローブ識別情報を確認できるが、そうでない場合には、ハイブリダイズ産物からプローブ識別情報をなんらかの手段で確認できる検出シグナルを付与することが好ましい。
【００６６】
シグナル付与工程は、ハイブリダイズ産物に対して各種の標識物質を付与する、又は既に標識結合性物質を備えている場合には当該標識結合物質に特異的に結合する標識物質を付与する工程である。こうした標識物質及び標識結合性物質については、既に説明したとおりである。特に、肉眼で視認可能な標識物質を付与することで、特別な検出装置を要することなく、しかもリアルタイムに発色を肉眼で観察し判定することができる。二重鎖ハイブリダイズ産物に検出シグナル付与するには、例えば、既に記載のとおり、予め被験試料中のポリヌクレオチドに対してハプテンなどのほか、ビオチンなどの標識結合性物質を付与しておくことが挙げられる。そして、本工程において、当該標識結合性物質に特異的な標識物質を付与することで、当該二次シグナルを利用して肉眼で視認可能な検出シグナルを付与することができる。すなわち、検出系としては、抗原抗体反応やビオチン−アビジン反応を利用できる。あるいは、ハイブリダイズ産物の被験試料部位に標識結合性物質に付与し、その後標識物質を付与してもよいし、ハイブリダイズ産物の被験試料部位に直接標識物質を付与するようにしてもよい。
【００６７】
標識物質は、発色性の生成物を生成する酵素であることが好ましい。こうすることで、酵素反応を利用して発色性生成物を速やかにかつリアルタイムに検出することができる。この場合、標識物質は、ハプテンに特異的に結合する抗体とこうした酵素とを備えた複合体とすることができる。
【００６８】
なお、抗原抗体反応やビオチン−アビジン結合のための２以上の化合物を介して最終的に標識物質をハイブリダイズ産物に結合させてもよい。
【００６９】
シグナル付与工程は、図６に示すように、上記した被験試料調製工程及びハイブリダイゼーション工程の各一例の後段として行うときには、前段の工程で用いたのと同一容器内で実施することが好ましい。こうすることで、操作を簡略化して迅速性を向上させることができる。また、本検出用剤１０を、同一容器に残しておくことで、本検出用剤１０の容器への投入時（ハイブリダイゼーション工程時）の一定の方向性を容易に維持できる。例えば、過剰試料除去後の本検出用剤１０が残留した同一容器に、標識物質を含む溶液を投入して標識反応を実施することができる。過剰の標識物質を除去洗浄後、標識物質による検出シグナルをそのまま肉眼で視認できる場合以外は、さらに、標識物質を発色させる発色反応を実施する。例えば、標識物質としてペルオキシダーゼなどの酵素を用いた場合には、過剰なペルオキシダーゼ除去後に、その基質を供給して酵素反応を生じさせる。さらに重ねて標識物質を要する場合には、洗浄及び反応工程をさらに実施する。
【００７０】
（検出工程）
検出工程は、ハイブリダイゼーションで得られたハイブリダイズ産物が呈示するプローブ識別情報に基づいて標的ポリヌクレオチドを検出する工程である。この検出工程によれば、予めプローブ毎に付与されているプローブ識別情報を識別することで直ちに標的ポリヌクレオチドを特定できるため、従来のようなプローブの位置照合操作を省略することができる。上記のとおり、ハイブリダイズ産物は、被験試料調製時からあるいはハイブリダイゼーション工程後の修飾により検出シグナルが付与されているので、プローブ識別情報を呈示することができる。プローブ識別情報は、標識物質の種類に応じて、特定波長域の光を照射して検出したり、発色反応を行って検出したりすることができる。標識物質等の種類により、プローブ識別情報を肉眼にて視認できる場合には、特別な、標的ポリヌクレオチドの有無を検出する。
【００７１】
検出にあたっては、既に説明した被験試料調製工程、ハイブリダイゼーション工程及びシグナル付与工程を同一容器内で行う形態においては、図６に示すように、本検出用剤１０が充填されたままの容器内で行ってもよいし、本検出用剤１０を容器から取り出して容器外で行ってもよい。また、シグナル付与のための液が投入されたままの状態で行っても良い。シグナル付与工程において、ハイブリダイゼーション工程に用いたのと同一容器で本検出用剤１０の方向性が維持された状態とすることで、本検出用剤１０における検出シグナルの検出の際に、投入時と同様である、所定の方向性でシグナルを検出できるため、標的ポリヌクレオチドの検出が容易であり確度も高いものとなる。
【００７２】
検出工程は、標的ポリヌクレオチドや用途に応じて、被験試料中の複数の標的ポリヌクレオチドの組み合わせを検出する工程であってもよい。例えば、肺炎の原因菌の型判別のように、複数の遺伝子の複数の配列を検出する場合には、複数の標的ポリヌクレオチドに対応する複数のプローブ４の組み合わせが検出される。この場合、こうした組み合わせを、本検出用剤１０上において得られたプローブ識別情報とから、最終的な検出対象を特定することもできる。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００７４】
（本検出用剤（アレイ）の作製）
ポリエーテルスルホン製であって、サイズが２８５ｍｍ×５０ｍｍ、孔径が０．５μｍ、厚さが０．１５ｍのシートに、以下の表に示す塩基配列からなるＤＮＡプローブ溶液を、特開２００３−７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（ピエゾ素子を用いた吐出ユニット）を用いた日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、スポットし、以下の手順で固定化した。
【００７５】
（ＤＮＡプローブ溶液）
ＤＮＡプローブ１５種類を以下の表に示す塩基配列に従って合成し、Tris-EDTA bufferで溶解した水溶液を、ＳＳＣ緩衝液、ブロモフェノールブルーと混合してＤＮＡプローブ濃度が２μＭ〜６０μＭのＤＮＡプローブ溶液を調製した。
【表１】
0005918981.tif 000002
【００７６】
（手順１）
吐出ユニット内に配置した液体注入部に、ＤＮＡプローブ溶液を注入し、シートにスポットする前に、シート上に検査スポットを行った。品質の検査は、検査スポットに対し、スポットが形成されないことはないか、スポットがいびつな形状ではないか、スポット径が設計値から１０％ 以上ずれていないか、サテライトと呼ばれる本スポット以外の不要なスポットが発生していないか、スポット位置がスポット径の３分の１以上ずれていないかという項目を実施した。シートの色は白色で、ＤＮＡプローブ溶液はブロモフェノールブルーによって青色に着色されているため、目視で検査を実施した。ブロモフェノールブルーは、ハイブリダイゼーション〜酵素付抗体免疫反応〜酵素発色色素沈着において、溶出し、除去される。
【００７７】
（手順２）
検査スポットで不良が検出されたときは、吐出ユニット内に配置された圧電/電歪素子の駆動信号を調整して検査スポットを再度行う。駆動信号の調整は電圧値、所定電圧までの上昇時間、所定電圧値のキープ時間、電圧立ち下げ時間の変更で行った。それでも不良が検出されるときは、真空吸引することで吐出ユニットからＤＮＡプローブ溶液を抜き取り、液体注入部にＤＮＡプローブ溶液を再度注入して、検査スポットを行う。不良スポットが検出されなくなるまで、この操作を繰り返した。
【００７８】
（手順３）
不良スポットが検出されなくなったことを確認したのち、以下の方法でＤＮＡプローブ溶液をシートにスポットした。すなわち、１種類のＤＮＡプローブ溶液につき、スポットのピッチを横方向（Ｘ方向）、縦方向（Ｙ方向）ともに０．０５ｍｍで、横方向、縦方向ともにスポットを行い、横方向０．９ｍｍ、縦方向１．３ｍｍのスクエア形状の一つのフィーチャーを形成した。固定領域のコーナーはＲ＝０．０５ｍｍとなった。シート上を吐出ユニットが、シート長手方向（Ｘ方向）に移動しながら、シートがシート短手方向（Ｙ方向）に移動して、非接触でスポットを行う。フィーチャーのピッチを縦方向１．５ｍｍ、横方向１ｍｍで３列×５行の格子エリア内に１５種類のＤＮＡプローブの固定化領域を形成・配置して、複数のフィーチャーからなる１つの区画（７．３ｍｍ×２．９ｍｍ）を形成した。さらにこの区画を、縦方向１３．５ｍｍピッチ、横方向６．８ｍｍピッチで、１シートに８４個形成した。
【００７９】
フィーチャー内に、ＤＮＡプローブを個別に識別できるように、プローブ識別情報として、ＤＮＡプローブ溶液を“１、２、・・・・・、Ａ、Ｂ、・・・”の英数字と、英数字が白抜けとなるように２種類のデザインで、スポットを行った。
【００８０】
（手順４）
１区画の上部に、１区画の上下を判別できるように顔料系マゼンダインクのマーカー（方向性情報）のスポットを行った。
【００８１】
（手順５）
ＤＮＡプローブ溶液、マーカーのスポットが完了したのち、風乾することで、ＤＮＡプローブの固定、マーカーの固着を行った。
（手順６）
（手順１）で行う検査と同様の項目で検査を行った。
（手順７）
不良が検出されなかったシートについて、１アレイを４ｍｍ×９ｍｍサイズに、ローラーカッターで切断することで、１シートから８４個のアレイを得た。２種類のアレイを図７に示す。
【実施例２】
【００８２】
本実施例では、本アレイを評価した。
【００８３】
（遺伝子増幅工程）
ＤＮＡプローブに対して相補的な配列を有するように人工的に合成したＤＮＡを、ＤＩＧラベルにより標識することで、サンプルＤＮＡを得た。
【００８４】
（変性工程）
各チューブに、ハイブリダイゼーション液として、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液２００μｌを加えて、良く混合し、９５℃に加熱したヒートブロックに５分配置後、氷水中に移して急冷した。
【００８５】
（ハイブリダイゼーション工程）
各チューブに、実施例１で作製したアレイを一個ずつ、投入して、６０℃に制御したヒートブロックに挿入して１５分ハイブリダイゼーションを実施した。
【００８６】
（洗浄工程）
ハイブリダイゼーション工程に用いた溶液を一旦除去し、チューブ内のアレイに対して新たにハイブリダイゼーション溶液２００μｌを添加し、６０℃のヒートブロックで１分間静置状態で加熱してハイブリダイゼーション液を除去した後、さらに同様にしてハイブリダイゼーション液を交換してそれぞれ１０分及び１分の洗浄を繰り返した。
【００８７】
（シグナル付与工程）
抗ＤＩＧ抗体酵素（ペルオキシダーゼ）含有試薬（ＤＩＧ−ＰＯＤ、ロッシュ製）の１０００倍希釈液２００μｌを各チューブ内のアレイに供給して、抗原抗体反応により酵素を結合させた。
【００８８】
（洗浄工程）
シグナル付与工程に用いた溶液を除去し、チューブ内のアレイに対して新たにハイブリダイゼーション溶液２５０μｌを添加し、６０℃のヒートブロックで１分間静置状態で加熱してハイブリダイゼーション液を除去した後、さらに同様にしてハイブリダイゼーション液を交換してそれぞれ１０分及び１分の洗浄を繰り返した。
【００８９】
（基質反応工程）
洗浄後のチューブに対してペルオキシダーゼの基質溶液（Ｖｅｃ．Ｌａｂ製、ＴＭＢキット）２００μｌを供給して、室温で酵素反応を行い、青色の反応生成物を生成させた。
【００９０】
（検出工程）
ＤＮＡプローブ名”１”は発色パターンの数字の”１”と対応している。他にもＤＮＡプローブ名”２”、”Ａ”、”Ｂ”は、それぞれ発色パターンの数字の”２”並びにアルファベットの”Ａ”及び”Ｂ”に対応している。各チューブ内で反応後、固定化領域の発色パターンを確認したところ、図８のように、それぞれの発色パターン、“１”、“２”、“Ａ”、“Ｂ”が発色するのを確認することができた。白抜けのデザインについても、図９のように、プローブ名を白抜けの英数字で確認することができた。こうして、発色したＤＮＡプローブの位置情報とプローブ配置図を照合することなく、ＤＮＡプローブを認識することができた。図８のように文字の部分が発色したことで、迅速かつ容易にＤＮＡプローブを認識することができた。図９のように、文字部を白抜けとすることで、さらに認識が容易となった。
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列番号１〜１５：プローブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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