(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５個の塩基対の二重鎖領域を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、
前記ｄｓＲＮＡの前記第２の鎖は、その３’末端に１〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドかつ多くとも３５個のヌクレオチドに沿って、配列番号１６１、１６４および４９３８から成る群から選択される標的ＫＲＡＳ  ｃＤＮＡ配列と相補的であり、
前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる、単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最初のヌクレオチド（１位）から始めて、１、２、および／または３位が、修飾ヌクレオチドで置換される、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項３】
前記第１の鎖の前記３’末端および前記第２の鎖の前記５’末端は、平滑末端を形成する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
前記第１の鎖は、２５ヌクレオチド長であり、かつ前記第２の鎖は、２７ヌクレオチド長である、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
前記第２の鎖は、配列番号２６、２９および４４５２から成る群から選択される配列を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
前記第１の鎖は、配列番号１０５、１０８および４６９５から成る群から選択される配列を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
前記第１の鎖の前記３’末端の前記修飾ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、および蛍光分子から成る群から選択される、請求項２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
前記３’オーバーハングの前記ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
前記３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである、請求項８に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１０】
前記３’オーバーハングの全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１１】
前記３’オーバーハングは、１〜２ヌクレオチド長である、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１２】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の前記５’末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第２の鎖の前記ヌクレオチド残基から始めて、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１３】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、前記標的ＫＲＡＳ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１４】
デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）および２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）の一リン酸ヌクレオチド、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチド、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチド、ならびにロックされた核酸から成る群から選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項１５】
哺乳動物細胞において、標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるための方法であって、哺乳動物細胞を、前記細胞内の標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量の請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡと、インビトロで接触させることを含む、方法。
【請求項１６】
ヒトを除く哺乳動物において、標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるための方法であって、前記哺乳動物内の標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡを哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
前記投与ステップは、静脈注射、筋肉注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアロゾル、直腸、膣内、局所、経口、および吸入送達から成る群から選択される様式を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞の増殖を選択的に阻害するための方法（ヒトの生体内における態様を除く）であって、前記細胞の増殖を阻害するのに十分な量の請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡと、細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項１９】
前記細胞は、対象の腫瘍細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞は、インビトロの腫瘍細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｄｓＲＮＡは、前記ｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞にインビトロで導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％から成る群から選択される（％によって表現される）量、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルを減少させるのに有効な量で存在し、前記ｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルの減少において、前記標的ＫＲＡＳ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項２３】
請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む、哺乳動物細胞。
【請求項２４】
請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項２５】
請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡおよびその使用のための取扱説明書を含む、キット。
【請求項２６】
配列番号１０５／配列番号２６、配列番号１０８／配列番号２９および配列番号４６９５／配列番号４４５２から成る群から選択される１対の第１の鎖／第２の鎖の配列を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２７】
第１のおよび第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５個の塩基対の二重鎖領域を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的に成るＫＲＡＳ阻害活性を有する組成物であって、
前記ｄｓＲＮＡの前記第２の鎖は、その３’末端に１〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドかつ多くとも３５個のヌクレオチドに沿って、配列番号１６１、１６４および４９３８から成る群から選択される標的ＫＲＡＳ  ｃＤＮＡ配列と相補的であり、
前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００９年４月３日に出願された米国特許仮出願第６１／１６６，５５９号、２００９年４月３日に出願された米国特許仮出願第６１／１６６，５７８号、２００９年４月３０日に出願された米国特許仮出願第６１／１７４，２７９号、２００９年４月３０日に出願された米国特許仮出願第６１／１７４，３０６号、２００９年１１月３日に出願された米国特許仮出願第６１／２５７，８１０号、および２００９年１１月３日に出願された米国特許仮出願第６１／２５７，８２０号の優先権、および米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張するものである。また、本出願は、２０１０年２月１１日に出願された米国出願第１２／７０４，２５６号、２００９年１２月１８日に出願された米国出願第１２／６４２，３７１号、２００９年１２月１８日に出願された米国出願第１２／６４６，４０４号、２００９年１２月１８日に出願された米国出願第１２／６４２，２６４号、および２００９年９月１７日に出願された国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５２１４号の優先権を主張するものである。本出願は、２００９年６月３日に出願された米国特許仮出願第６１／１８３，８１５号、２００９年６月３日に出願された米国特許仮出願第６１／１８３，８１８号、２００９年６月５日に出願された米国特許仮出願第６１／１８４，７３５号、２００９年１２月１１日に出願された米国特許仮出願第６１／２８５，９２５号、および２０１０年３月１日に出願された米国特許仮出願第６１／３０９，２６６号の優先権、および米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張するものである。上記の出願の全ての教示は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ＫＲＡＳ遺伝子発現および／または活性の調節に応答する形質、疾患、および状態の研究、診断、および治療のための、化合物、組成物、および方法に関する。本発明はまた、ＫＲＡＳ遺伝子発現経路に関与する遺伝子の発現および／または活性の調節に応答する形質、疾患、および状態、またはこのような形質、疾患、および状態の維持もしくは発達を媒介する他の細胞プロセスに関する、化合物、組成物、および／または方法も対象とする。具体的には、本発明は、ＫＲＡＳ遺伝子発現に対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する能力を有するダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）等のダイサー酵素によって処理することが可能な小核酸分子に関する。このような抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡは、例えば、癌、および／または他の増殖性疾患、障害、もしくは状態等の、対象においてＫＲＡＳの調節に応答することができる形質、疾患、および状態の治療のための組成物を提供するのに有用である。
【背景技術】
【０００３】
Ｒａｓシグナル伝達の調節異常は、腫瘍増殖および転移をもたらし得る（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ  ＤＳ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ４：２６３−４）。全てのヒト腫瘍のうちの２０〜２５％は、Ｒａｓの活性化変異を含み、特定の腫瘍型において、この数は、９０％までも高くなる場合がある（Ｄｏｗｎｗａｒｄ  Ｊ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，３：１１−２２）。したがって、Ｒａｓ遺伝子ファミリーのメンバーは、癌治療設計にとって興味を引く分子標的である。
【０００４】
３つのヒトＲＡＳ遺伝子は、高度に関連した１８８〜１８９個のアミノ酸タンパク質をコードし、Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、ならびにＫ−Ｒａｓ４Ａ（ＫＲＡＳアイソフォームａ）およびＫ−Ｒａｓ４Ｂ（ＫＲＡＳアイソフォームｂ、これらの２つのＫＲａｓタンパク質は、代替スプライシングから生じる）と命名される。Ｒａｓタンパク質は、細胞内シグナル伝達ネットワークを制御する二元分子スイッチとして機能する。Ｒａｓ調節シグナル経路は、アクチン細胞骨格の完全性、増殖、分化、細胞粘着、アポトーシス、および細胞移動等のプロセスを制御する。ＲａｓおよびＲａｓ関連タンパク質は、しばしば、癌において脱制御され、浸潤および転移の増加、およびアポトーシスの低下をもたらす。Ｒａｓは、多くの経路を活性化するが、腫瘍形成に対して特に重要なものは、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼであると見られ、それら自体、他のタンパク質キナーゼおよび遺伝子調節タンパク質に対して下流にシグナルを伝える（Ｌｏｄｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（４ｔｈ  ｅｄ．）．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２５，「Ｃａｎｃｅｒ」）。
【０００５】
２５〜３５個のヌクレオチドの鎖長を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤は、哺乳動物細胞内の標的遺伝子発現の有効な阻害剤として記載されている（Ｒｏｓｓｉら、米国特許出願第２００５／０２４４８５８号および第２００５／０２７７６１０号）。このような長さのｄｓＲＮＡ剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路のダイサー酵素によって処理されると考えられ、このため、このような薬剤は「ダイサー基質ｓｉＲＮＡ」（「ＤｓｉＲＮＡ」）剤と称される。ＤｓｉＲＮＡ剤のさらなる修飾構造は、すでに説明されている（Ｒｏｓｓｉら、米国特許出願第２００７／０２６５２２０号）。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を含む組成物、およびそれらを調製するための方法を対象とする。本発明のｄｓＲＮＡは、インビトロ、あるいは哺乳動物対象のいずれかの細胞中の標的ＫＲａｓ遺伝子の発現を減少させる能力を有する。さらに具体的には、本発明は、有効かつ極めて強力なＫＲＡＳ阻害剤として機能を果たすように最適化された構造および修飾パターンを有する好ましいダイサー基質ｓｉＲＮＡ（「ＤｓｉＲＮＡ」）を対象とし、これは、任意に、長期の阻害作用を有する。このようなＤｓｉＲＮＡの大部分が、同じ標的ＲＮＡを対象とする２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡと比較して、驚くほどに強化された標的特異的な阻害効力および有効性を有する。理論に束縛されることを意図するものではないが、このような強化された活性は、より短いｓｉＲＮＡ剤が、ＲＮＡｉ経路に関与する地点の上流にある、この経路内の地点でＲＮＡｉ経路に関与するＤｓｉＲＮＡ剤に固有の利点を反映している可能性が高い。
【０００７】
一態様において、本発明は、第１のおよび第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５個の塩基対の二重鎖領域を含む単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、該ｄｓＲＮＡの該第２の鎖は、その３’末端で１〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含み、該第２のオリゴヌクレオチド鎖は、該第２のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドかつ多くとも３５個のヌクレオチドに沿って、配列番号１４１〜１８６から成る群から選択される標的ＫＲＡＳ  ｃＤＮＡ配列と十分に相補的であり、該二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる。
【０００８】
一実施形態において、該第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最初のヌクレオチド（１位）から始めて、１、２、および／または３位が、修飾ヌクレオチドで置換される。ある実施形態において、該第１の鎖の３’末端の修飾ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、または蛍光分子である。関連する実施形態において、該第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の１位は、デオキシリボヌクレオチドである。
【０００９】
追加の実施形態において、該第１の鎖の３’末端および該第２の鎖の５’末端は、平滑末端を形成する。
【００１０】
別の実施形態において、該第１の鎖は、２５ヌクレオチド長であり、該第２の鎖は、２７ヌクレオチド長である。
【００１１】
一実施形態において、該第２の鎖は、配列番号１１〜５０および１３５〜１４０の配列を含む。
【００１２】
別の実施形態において、該第１の鎖は、配列番号５、８、および９１〜１３４の配列を含む。
【００１３】
追加の実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、配列番号５／配列番号１４、配列番号８／配列番号４３、配列番号１３２／配列番号１３８、配列番号９１／配列番号１１、配列番号１２９／配列番号１３５、配列番号９２／配列番号１２、配列番号１３０／配列番号１３６、配列番号９３／配列番号１３、配列番号１３１／配列番号１３７、配列番号９４／配列番号１５、配列番号１３３／配列番号１３９、配列番号９５／配列番号１６、配列番号９６／配列番号１７、配列番号９７／配列番号１８、配列番号９８／配列番号１９、配列番号９９／配列番号２０、配列番号１００／配列番号２１、配列番号１０１／配列番号２２、配列番号１０２／配列番号２３、配列番号１０３／配列番号２４、配列番号１０４／配列番号２５、配列番号１０５／配列番号２６、配列番号１０６／配列番号２７、配列番号１０７／配列番号２８、配列番号１０８／配列番号２９、配列番号１０９／配列番号３０、配列番号１１０／配列番号３１、配列番号１１１／配列番号３２、配列番号１１２／配列番号３３、配列番号１１３／配列番号３４、配列番号１１４／配列番号３５、配列番号１１５／配列番号３６、配列番号１１６／配列番号３７、配列番号１１７／配列番号３８、配列番号１１８／配列番号３９、配列番号１１９／配列番号４０、配列番号１３４／配列番号１４０、配列番号１２０／配列番号４１、配列番号１２１／配列番号４２、配列番号１２２／配列番号４４、配列番号１２３／配列番号４５、配列番号１２４／配列番号４６、配列番号１２５／配列番号４７、配列番号１２６／配列番号４８、配列番号１２７／配列番号４９、および配列番号１２８／配列番号５０である１対の第１の鎖／第２の鎖の配列を含む。
【００１４】
一実施形態において、該第１の鎖および該第２の鎖のそれぞれは、少なくとも２６ヌクレオチドの長さを有する。
【００１５】
別の実施形態において、該３’オーバーハングの該ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。任意に、該３’オーバーハングの該修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。関連する実施形態において、３’オーバーハングの全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。
【００１６】
追加の実施形態において、該第１のオリゴヌクレオチド鎖および第２のオリゴヌクレオチド鎖のうちの一方または両方が、５’リン酸塩を含む。
【００１７】
別の実施形態において、該ｄｓＲＮＡの修飾ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２’−アミノ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）である。
【００１８】
一実施形態において、該ｄｓＲＮＡの３’オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド長である。任意に、該３’オーバーハングは、１〜２ヌクレオチド長である。関連する実施形態において、該３’オーバーハングは、２ヌクレオチド長であり、該３’オーバーハングの修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドである。
【００１９】
さらなる実施形態において、該第２のオリゴヌクレオチド鎖は、該第１のオリゴヌクレオチド鎖の該５’末端ヌクレオチド残基と相補的な該第２の鎖のヌクレオチド残基から始めて、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含む。別の実施形態において、該第２のオリゴヌクレオチド鎖は、該第１のオリゴヌクレオチド鎖の該５’末端ヌクレオチド残基と相補的な該第２の鎖のヌクレオチド残基から始めて、該第２のオリゴヌクレオチド鎖の１８位から５’末端までの全ての位置において、非修飾ヌクレオチド残基を含む。
【００２０】
別の実施形態において、該第１の鎖および該第２の鎖のそれぞれは、少なくとも２６かつ多くとも３０ヌクレオチド長を有する。
【００２１】
一実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、細胞においてダイサーによって内因的に切断される。
【００２２】
追加の実施形態において、該標的遺伝子の発現を減少させるのに十分である該単離された二本鎖核酸の量は、該細胞の環境において、１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下である。
【００２３】
さらなる実施形態において、該単離されたｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、該標的ＫＲＡＳ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する。
【００２４】
別の実施形態において、該単離されたｄｓＲＮＡは、該二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させるように、標的ＫＲＡＳ  ｃＤＮＡ配列と十分に相補的である。
【００２５】
さらなる実施形態において、該第１の鎖および第２の鎖は、化学的リンカーによって結合される。関連する実施形態において、該第１の鎖の３’末端および該第２の鎖の５’末端は、化学的リンカーによって結合される。
【００２６】
一実施形態において、該第２の鎖または第１の鎖のヌクレオチドは、ダイサー切断の配向を導く修飾ヌクレオチドで置換される。
【００２７】
別の実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）および２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）の一リン酸ヌクレオチド、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチド、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチド、ならびにロックされた核酸である修飾ヌクレオチドを有する。
【００２８】
追加の実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、ホスホネート、ホスホロチオアート、またはホスホトリエステルリン酸骨格修飾を有する。
【００２９】
一実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞内の標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるための方法を提供し、この方法には、哺乳動物細胞を、該細胞内の標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、単離されたｄｓＲＮＡと、インビトロで接触させることを有する。
【００３０】
一実施形態において、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現は、少なくとも１０％、少なくとも５０％、または少なくとも８０〜９０％減少する。別の実施形態において、標的ＫＲＡＳ  ｍＲＮＡレベルは、該細胞を該ｄｓＲＮＡと接触させてから少なくとも８日後、少なくとも９０％減少する。さらなる実施形態において、ＫＲＡＳ  ｍＲＮＡレベルは、該細胞を該ｄｓＲＮＡと接触させてから少なくとも１０日後、少なくとも７０％減少する。
【００３１】
さらなる実施形態において、本発明は、哺乳動物内の標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、記載の単離されたｄｓＲＮＡを哺乳動物に投与することによって、標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるための方法を提供する。
【００３２】
一実施形態において、該単離されたｄｓＲＮＡは、１日当たり該哺乳動物のキログラム当たり１マイクログラム〜５ミリグラム、キログラム当たり１００マイクログラム〜０．５ミリグラム、キログラム当たり０．００１〜０．２５ミリグラム、キログラム当たり０．０１〜２０マイクログラム、キログラム当たり０．０１〜１０マイクログラム、キログラム当たり０．１０〜５マイクログラム、またはキログラム当たり０．１〜２．５マイクログラムの用量で投与される。
【００３３】
別の実施形態において、該単離されたｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、該標的ＫＲＡＳ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する。
【００３４】
追加の実施形態において、該投与ステップには、静脈注射、筋肉注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアロゾル、直腸、膣内、局所、経口、または吸入送達が含まれる。
【００３５】
さらなる実施形態において、本発明は、該細胞を、細胞の増殖を阻害するのに十分な量の記載の単離されたｄｓＲＮＡと接触させることによって、細胞の増殖を選択的に阻害するための方法を提供する。
【００３６】
一実施形態において、該細胞は、対象の腫瘍細胞である。任意に、該細胞は、インビトロの腫瘍細胞である。関連する実施形態において、該細胞は、ヒト細胞である。
【００３７】
追加の実施形態において、本発明は、記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む製剤を提供し、該ｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞にインビトロで導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルを減少させるのに有効な量で存在し、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルの減少において、該標的ＫＲＡＳ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する。
【００３８】
一実施形態において、該有効量は、該細胞の環境において、１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下である。
【００３９】
別の実施形態において、記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む製剤を提供し、該ｄｓＲＮＡは、哺乳動物対象の細胞に導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルを減少させるのに有効な量で存在し、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルの減少において、該標的ＫＲＡＳ  ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する。
【００４０】
一実施形態において、該有効量は、１日当たり該対象のキログラム当たり１マイクログラム〜５ミリグラム、キログラム当たり１００マイクログラム〜０．５ミリグラム、キログラム当たり０．００１〜０．２５ミリグラム、キログラム当たり０．０１〜２０マイクログラム、キログラム当たり０．０１〜１０マイクログラム、キログラム当たり０．１０〜５マイクログラム、およびキログラム当たり０．１〜２．５マイクログラムの用量である。
【００４１】
追加の実施形態において、本発明は、記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む哺乳動物細胞を提供する。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、記載の単離されたｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。本発明のさらなる実施形態は、記載の単離されたｄｓＲＮＡおよびその使用のための取扱説明書を有するキットを提供する。
【００４３】
追加の態様において、本発明は、第１のおよび第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５個の塩基対の二重鎖領域を含む単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的に成るＫＲＡＳ阻害活性を有する組成物を提供し、該ｄｓＲＮＡの該第２の鎖は、その３’末端で１〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含み、該第２のオリゴヌクレオチド鎖は、該第２のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドかつ多くとも３５個のヌクレオチドに沿って、配列番号１４１〜１８６から成る群から選択される標的ＫＲＡＳ  ｃＤＮＡ配列と十分に相補的であり、該二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる。
【００４４】
別の態様において、本発明は、第１のおよび第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５個の塩基対の二重鎖領域を含む単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、該ｄｓＲＮＡの該第２の鎖は、その３’末端で１〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含み、該第２のオリゴヌクレオチド鎖は、該第２のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドかつ多くとも３５個のヌクレオチドに沿って、配列番号１５９５〜２２９７および３７０４〜４４０６から成る群から選択される標的ＫＲＡＳ  ｃＤＮＡ配列と十分に相補的であり、該二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる。
【００４５】
一実施形態において、該第２の鎖は、配列番号１８９〜８９１および２２９８〜３０００の配列を含む。
【００４６】
一実施形態において、該第１の鎖は、配列番号８９２〜１５９４および３００１〜３７０３の配列を含む。
【００４７】
追加の実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、表４〜５に示されるＤｓｉＲＮＡ剤から成る群から選択されるＤｓｉＲＮＡ剤を含む。
【００４８】
さらなる態様において、本発明は、第１のおよび第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５個の塩基対の二重鎖領域を含む単離二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的に成るＫＲＡＳ阻害活性を有する組成物を提供し、該ｄｓＲＮＡの該第２の鎖は、その３’末端で１〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含み、該第２のオリゴヌクレオチド鎖は、該第２のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドかつ多くとも３５個のヌクレオチドに沿って、配列番号１５９５〜２２９７、および３７０４〜４４０６から成る群から選択される標的ＫＲＡＳ  ｃＤＮＡ配列と十分に相補的であり、該二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本明細書において、「ＫＲＡＳ−３５５」標的部位と称されるＫＲＡＳ  ＲＮＡにおける部位を標的にする例示的なＤｓｉＲＮＡ剤の構造を示す。２５／２７ｍｅｒおよび２７／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ剤（任意に、平滑／ほつれ（ｆｒａｙ）設計を有する）を、示される２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡコンストラクトと比較して、ＫＲａｓ阻害有効性について試験した。大文字＝非修飾ＲＮＡ、小文字＝ＤＮＡ、太字＝ミスマッチ塩基対ヌクレオチド、矢印は、推定されるダイサー切断部位を示し、破線は、標的ＫＲａｓ配列内の推定されるアルゴノート２（Ａｇｏ２）切断部位に対応するセンス鎖（上の鎖）配列を示す。
【図２】１ナノモルの濃度で培養中の細胞に形質転換される際の、図１に示される薬剤の抗ＫＲＡＳ阻害有効性を示す。「最適化」＝図１の２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡおよび２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ、平滑／平滑および平滑／ほつれの剤は、図１に示される通りであり、「Ｖｅｈ」＝ビヒクル処理された対照、「Ｕｎ」＝未処理の対照。
【図３】１００ピコモルの濃度で培養中の細胞に形質転換される際の、図１に示される薬剤の抗ＫＲＡＳ阻害有効性を示す。「最適化」＝図１の２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡおよび２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ、平滑／平滑および平滑／ほつれの剤は、図１に示される通りであり、「Ｖｅｈ」＝ビヒクル処理された対照、「Ｕｎ」＝未処理の対照。
【図４】本明細書において、「ＫＲＡＳ−９４０」標的部位と称されるＫＲＡＳ  ＲＮＡにおける部位を標的にする例示的なＤｓｉＲＮＡ剤の構造を示す。２５／２７ｍｅｒおよび２７／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ剤（任意に、平滑／ほつれ（ｆｒａｙ）設計を有する）を、示される２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡコンストラクトと比較して、ＫＲＡＳ阻害有効性について試験した。大文字＝非修飾ＲＮＡ、小文字＝ＤＮＡ、太字＝ミスマッチ塩基対ヌクレオチド、矢印は、推定されるダイサー切断部位を示し、破線は、標的ＫＲＡＳ配列内の推定されるアルゴノート２（Ａｇｏ２）切断部位に対応するセンス鎖（上の鎖）配列を示す。
【図５】１ナノモルの濃度で培養中の細胞に形質転換される際の、図４に示される薬剤の抗ＫＲＡＳ阻害有効性を示す。「最適化」＝図４の２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡおよび２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ、平滑／平滑および平滑／ほつれの剤は、図４に示される通りであり、「Ｖｅｈ」＝ビヒクル処理された対照、「Ｕｎ」＝未処理の対照。
【図６】１００ピコモルの濃度で培養中の細胞に形質転換される際の、図４に示される薬剤の抗ＫＲＡＳ阻害有効性を示す。「最適化」＝図４の２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡおよび２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ、平滑／平滑および平滑／ほつれの剤は、図４に示される通りであり、「Ｖｅｈ」＝ビヒクル処理された対照、「Ｕｎ」＝未処理の対照。
【図７】全く同じＫＲＡＳ標的配列を対象とする同族２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡと比較した、試験されたＤｓｉＲＮＡおよびそれらのダイサープロセッシング産物の図式の比較を示す。２’−Ｏ−メチル修飾は、白抜き丸によって示され、黒塗り丸は、デオキシリボヌクレオチドを示し、黒塗り三角は、２５／２７ｍｅｒの薬剤内のダイサー酵素切断部位を示し、白抜き三角は、標的ＲＮＡ内のアルゴノート２（Ａｇｏ２）切断部位に対応するアンチセンス鎖上の位置を示す。このような部位は、これらの同族ｓｉＲＮＡ剤と比較した際、４０個の試験したＤｓｉＲＮＡ剤の間で同一である。
【図８】抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡ  ２５／２７ｍｅｒとこれらの同族２１ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡとの間の阻害有効性の比較プロットを示す。プロットは、２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ剤によるＫＲＡＳ標的遺伝子の阻害率の順によって配置される。矢印は、ＤｓｉＲＮＡ剤と対応するｓｉＲＮＡ剤との間に観察された有効性の差異を示す。四角は、ｓｉＲＮＡ阻害結果を示し、丸は、ＤｓｉＲＮＡ阻害結果を示す。
【図９】ＤｓｉＲＮＡ剤とこれらの同族ｓｉＲＮＡとの間の阻害効果の差異の量の順によって配置される阻害結果のグラフを示す。ＤｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは共に、５ｎＭ（黒塗り四角）および１ｎＭ（黒塗り三角）の両方を投与してから２４時間後、および５ｎＭ（白抜き丸）および１ｎＭ（白抜き三角）の両方を投与してから４８時間後に試験した。黒塗り領域は、統計的に有意な差異がＤｓｉＲＮＡと同族ｓｉＲＮＡとの間で観察された薬剤を示す。４０個の試験した抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡ剤のうち２６個については、ＤｓｉＲＮＡ剤より優れており、それと比較して、４０個のｓｉＲＮＡ剤のうち６個のみが、統計的に有意なＤｓｉＲＮＡの優位性が観察された。
【図１０】示されたヒトＫＲＡＳ標的ＤｓｉＲＮＡに対して観察されたＩＣ−５０曲線を示す。
【図１１】示されたヒトＫＲＡＳ標的ＤｓｉＲＮＡに対して観察されたＩＣ−５０曲線を示す。
【図１２】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたヒトＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のヒトＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。ヒトＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して正規化された。
【図１３】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたヒトＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のヒトＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。ヒトＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して正規化された。
【図１４】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたヒトＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のヒトＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。ヒトＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して正規化された。
【図１５】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたヒトＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のヒトＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。ヒトＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して正規化された。
【図１６】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたヒトＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のヒトＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。ヒトＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して正規化された。
【図１７】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたヒトＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のヒトＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。ヒトＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して正規化された。
【図１８】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたヒトＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のヒトＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。ヒトＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して正規化された。
【図１９】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたヒトＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のヒトＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。ヒトＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して正規化された。
【図２０】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたヒトＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のヒトＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。ヒトＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して正規化された。
【図２１】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたヒトＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のヒトＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。ヒトＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９レベルに対して正規化された。
【図２２】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のマウスＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。マウスＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＲｐ１２３レベルに対して正規化した。
【図２３】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のマウスＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。マウスＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＲｐ１２３レベルに対して正規化した。
【図２４】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のマウスＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。マウスＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＲｐ１２３レベルに対して正規化した。
【図２５】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のマウスＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。マウスＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＲｐ１２３レベルに対して正規化した。
【図２６】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のマウスＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。マウスＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＲｐ１２３レベルに対して正規化した。
【図２７】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のマウスＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。マウスＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＲｐ１２３レベルに対して正規化した。
【図２８】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のマウスＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。マウスＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＲｐ１２３レベルに対して正規化した。
【図２９】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のマウスＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。マウスＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＲｐ１２３レベルに対して正規化した。
【図３０】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のマウスＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。マウスＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＲｐ１２３レベルに対して正規化した。
【図３１】示されたＤｓｉＲＮＡに対して観察されたマウスＫＲＡＳ阻害有効性のヒストグラムを示す。「Ｐ１」は、１相を示し、一方、「Ｐ２」は、２相を示す。１相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭで試験された。２相において、ＤｓｉＲＮＡは、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭおよび０．１ｎＭで（０．１ｎＭで行う重複実験を伴う）試験された。個々の棒は、３重で観察された平均のマウスＫＲＡＳレベルを示し、標準誤差を共に示す。マウスＫＲＡＳレベルは、ＨＰＲＴおよびＲｐ１２３レベルに対して正規化した。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、インビボまたはインビトロでＫＲＡＳ遺伝子のレベルおよび／または発現を減少させることができる、ある二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を含む組成物、およびそれらを調製するための方法を対象とする。ｄｓＲＮＡの鎖の一方は、標的とされるＫＲＡＳ転写物の分解および／または翻訳阻害を導くことができる１９個から３５個のヌクレオチドの範囲に及ぶ長さを有するヌクレオチド配列の領域を含む。
【００５１】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本発明で使用される多くの用語の一般的定義を提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）、Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、別途特定されない限り、以下のそれらに属するものとみなす意味を有する。
【００５２】
本発明は、ＫＲＡＳ発現を調節する（例えば、阻害する）ことができる１つ以上のＤｓｉＲＮＡ分子を特徴とする。本発明のＤｓｉＲＮＡは、任意に、ＫＲＡＳの誤調節と関連する疾患または障害（例えば、腫瘍形成および／または成長等）の維持または発展と関連する他の遺伝子のモジュレータおよび／または遺伝子産物と組み合わせて使用することができる。本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号  ＮＭ＿０３３３６０およびＮＭ＿００４９８５によって付託されるｃＤＮＡ配列に対応するもの等のＫＲＡＳ  ＲＮＡを調節し、これは、以下に列挙され、本明細書において、通常、「ＫＲＡＳ」と称される。
【００５３】
本発明の様々な態様および実施形態の以下の説明は、本明細書において、通常、「ＫＲＡＳ」と称される、例示的なＫＲＡＳ  ＲＮＡに関して提供される。しかしながら、このような参照は、例示のみであることを意図し、本発明の様々な態様および実施形態はまた、変異ＫＲＡＳ  ＲＮＡまたはさらなるＫＲＡＳスプライスバリアント等の、代替のＫＲＡＳ  ＲＮＡを対象にする。ある態様および実施形態はまた、ＫＲＡＳ経路に関与する他の遺伝子を対象とし、これには、誤調節が、治療のために標的とされ得る表現型効果（例えば、腫瘍形成および／または成長等）を生じさせるように、ＫＲＡＳのものと関連して作用する（または、ＫＲＡＳ調節が影響を受ける、もしくはそれに影響を及ぼす）遺伝子が含まれる。このようなさらなる遺伝子は、ＤｓｉＲＮＡ、およびＫＲＡＳを標的とするＤｓｉＲＮＡの使用のために本明細書に記載される方法を用いて標的とすることができる。故に、他の遺伝子の阻害およびこのような阻害の効果を、本明細書に記載されるように行うことができる。
【００５４】
「ＫＲＡＳ」という用語は、ＫＲａｓタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド（例えば、ＫＲＡＳ  Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号  ＮＭ＿０３３３６０．２およびＮＭ＿００４９８５．３の配列等のＫＲＡＳ転写物）をコードする核酸配列を指す。ある実施形態において、「ＫＲＡＳ」という用語はまた、他のＫＲＡＳアイソフォーム、変異ＫＲＡＳ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子のスプライスバリアント、およびＫＲＡＳ遺伝子多型等の配列をコードする他のＫＲＡＳを含むことも意味する。「Ｋｒａｓ」という用語は、ＫＲＡＳ遺伝子／転写物のポリペプチド遺伝子産物、例えば、ＫＲＡＳ  Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号  ＮＭ＿０３３３６０．２およびＮＭ＿００４９８５．３によってコードされるもの等のＫｒａｓタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指すために使用する。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「ＫＲＡＳ関連の疾患または障害」とは、ＫＲＡＳ発現、レベル、および／または活性の変化と関連する当技術分野において公知の疾患または障害を指す。特に、「ＫＲＡＳ関連の疾患または障害」には、癌、および／または増殖性疾患、状態、もしくは障害が含まれる。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「増殖性疾患」または「癌」とは、当技術分野において公知のような、無秩序な細胞増殖または複製を特徴とする疾患、状態、形質、遺伝子型、または表現型を意味し、これには、白血病、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、および急性リンパ球性白血病、カポジ肉腫等のＡＩＤＳ関連癌；乳癌；骨癌、例えば、骨肉種、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、巨細胞腫、アダマンチノーマ、および脊索腫等；脳腫瘍、例えば、髄膜腫、膠芽細胞腫、軽度星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、下垂体部腫瘍、神経鞘腫、および転移性脳腫瘍等；マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫等の様々なリンパ腫を含む頭頸部癌、腺腫、扁平上皮癌、喉頭癌、胆嚢および胆管癌、網膜芽細胞腫等の網膜の癌、食道癌、胃癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、睾丸癌、子宮内膜癌、メラノーマ、結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、膵臓癌、肉腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、頭頸部癌、皮膚癌、鼻咽腔癌、脂肪肉腫、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺癌、子宮内膜肉腫、多剤耐性癌；ならびに、増殖性疾患および状態、例えば、腫瘍血管形成に関連する血管新生、黄斑変性（例えば浸潤性／萎縮性ＡＭＤ）、角膜血管新生、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、近視性変性、ならびに他の増殖性疾患および状態、例えば、再狭窄、および多発性嚢胞腎、ならびに、単独でもしくは他の治療薬と組み合わせて、細胞または組織における疾患関連遺伝子発現の調節に応答することができる他の癌または増殖性疾患、状態、形質、遺伝子型、または表現型が含まれる。
【００５７】
ある実施形態において、ＫＲＡＳ標的配列のＤｓｉＲＮＡ媒介阻害が評価される。このような実施形態において、ＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルは、当技術分野において認識される方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法、発現アレイ等）によって、任意に、このような抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡの不在と比較して、本発明の抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡの存在下で、ＫＲＡＳレベルの比較によって評価することができる。ある実施形態において、抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡの存在下で、ＫＲＡＳレベルは、ビヒクルのみの存在下で、非関連の標的ＲＮＡを対象とするＤｓｉＲＮＡの存在下で、またはいずれの治療の不在下で観察されたものと比較される。また、Ｋｒａｓタンパク質のレベルは、ＤｓｉＲＮＡがＫＲＡＳ発現を阻害するＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルおよび／または範囲を示すように、評価することができ、故に、ＫＲＡＳタンパク質レベルを評価するための当技術分野において認識されている方法（例えば、ウエスタンブロット、免疫沈降、他の抗体に基づいた方法等）を採用して、本発明のＤｓｉＲＮＡの阻害効果を分析することもできることが認識される。本発明の抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ  ＲＮＡまたはタンパク質レベルの統計的に有意な低下が、本発明の抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡを系（例えば、無細胞のインビトロ系）、細胞、組織、または生物に投与する際に、適切な対照と比較して見られる場合、「ＫＲＡＳ阻害活性」を有すると見なされる。実験値の分布および行われる反復アッセイの数が、ＫＲＡＳ  ＲＮＡまたはタンパク質の減少のどれだけのレベルが（％として、あるいは絶対的のいずれかで）、（当技術分野において公知の統計的優位性を決定するための標準的な方法によって評価して）統計的に有意であると見なされるかのパラメータを決定付ける傾向がある。しかしながら、ある実施形態において、「ＫＲＡＳ阻害活性」は、系、細胞、組織、または生物におけるＫＲＡＳのレベルの減少の％または絶対レベルに基づいて定義される。例えば、ある実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ  ＲＮＡの少なくとも５％減少、または少なくとも１０％減少が、好適な対照に対して見られるＫＲＡＳレベルと比較して、ＤｓｉＲＮＡの存在下で観察される場合、ＫＲＡＳ阻害活性を有すると見なされる。（例えば、組織および／または対象におけるインビボＫＲＡＳレベルが、ある実施形態において、例えば、ＫＲＡＳレベルの５％または１０％減少が、対照と比較して観察される場合、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤によって阻害されると見なされ得る。）ある他の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルが、適切な対照と比較して少なくとも１５％減少、適切な対照と比較して少なくとも２０％減少、適切な対照と比較して少なくとも２５％減少、適切な対照と比較して少なくとも３０％減少、適切な対照と比較して少なくとも３５％減少、適切な対照と比較して少なくとも４０％減少、適切な対照と比較して少なくとも４５％減少、適切な対照と比較して少なくとも５０％減少、適切な対照と比較して少なくとも５５％減少、適切な対照と比較して少なくとも６０％減少、適切な対照と比較して少なくとも６５％減少、適切な対照と比較し��少なくとも７０％減少、適切な対照と比較して少なくとも７５％減少、適切な対照と比較して少なくとも８０％減少、適切な対照と比較して少なくとも８５％減少、適切な対照と比較して少なくとも９０％減少、適切な対照と比較して少なくとも９５％減少、適切な対照と比較して少なくとも９６％減少、適切な対照と比較して少なくとも９７％減少、適切な対照と比較して少なくとも９８％減少、適切な対照と比較して少なくとも９９％減少すると観察される場合、ＫＲＡＳ阻害活性を有すると見なされる。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳの完全な阻害には、ＫＲＡＳ阻害活性を有すると見なされるＤｓｉＲＮＡが必要とされる。あるモデル（例えば、細胞培養）において、ＤｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳレベルの少なくとも５０％減少が、好適な対照と比較して観察される場合、ＫＲＡＳ阻害活性を有すると見なされる。ある他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳレベルの少なくとも８０％減少が、好適な対照と比較して観察される場合、ＫＲＡＳ阻害活性を有すると見なされる。
【００５８】
ＫＲＡＳ阻害活性はまた、時間経過（持続時間）および濃度範囲（効力）に伴って、評価することができ、投与される濃度および投与後の持続時間に従って調整されるＫＲＡＳ阻害活性を有するＤｓｉＲＮＡを構成するものを評価する。故に、ある実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、投与してから２時間、５時間、１０時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、またはそれ以上の持続時間で、ＫＲＡＳ活性の少なくとも５０％減少が、観察される／持続する場合、ＫＲＡＳ阻害活性を有すると見なされる。追加の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ阻害活性（例えば、ある実施形態において、ＫＲＡＳの少なくとも５０％阻害）が、細胞の環境において、１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、２ｐＭ以下、またはさらに１ｐＭ以下の濃度で観察される場合、強力なＫＲＡＳ阻害剤であると見なされる。
【００５９】
ある実施形態において、「〜から本質的に成る」という語句は、本発明の抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡに関連して使用される。いくつかのかかる実施形態において、「〜から本質的に成る」とは、ＫＲＡＳ阻害活性の少なくともあるレベル（例えば、少なくとも５０％  ＫＲＡＳ阻害活性）を有する本発明のＤｓｉＲＮＡを含み、ＤｓｉＲＮＡのＫＲＡＳ阻害活性に著しく影響を与えない１つ以上のさらなる構成要素および／または修飾も含む、組成物を指す。例えば、ある実施形態において、組成物は、単離において、本発明のＤｓｉＲＮＡと比較して、本発明のＤｓｉＲＮＡおよび／またはその組成物のＤｓｉＲＮＡ関連構成要素の修飾が、３％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超でＫＲＡＳ阻害活性（任意に、ＫＲＡＳ阻害活性の効力または持続時間を含む）を変化させない、本発明のＤｓｉＲＮＡ「から本質的に成る」。ある実施形態において、組成物は、ＫＲＡＳ阻害活性のより劇的な減少（例えば、有効性、持続時間、および／または効力において８０％減少、９０％減少）が、さらなる構成要素または修飾の存在下で生じるが、ＫＲＡＳ阻害活性は、さらなる構成要素または修飾の存在下で、著しく上昇しない（例えば、ＫＲＡＳ阻害活性の観察されたレベルは、本発明のＤｓｉＲＮＡで観察されたものの１０％以内である）場合、本発明のＤｓｉＲＮＡから本質的に成ると見なされる。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖形態でのデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド、およびそのポリマーを指す。この用語は、既知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基または結合を有する核酸を包含し、それは合成、天然、および非天然であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される。かかる類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」は、（標準の）天然塩基、および当技術分野において公知の修飾塩基を含むように、当技術分野において認識されるように使用される。かかる塩基は、一般に、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは、一般に、塩基、糖、およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖、リン酸、および／または塩基部分において無修飾でも、修飾され得る（ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチド等とも区別なく称される；例えば、Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、上記参照；Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際公開第ＷＯ９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎら、国際公開第ＷＯ９３／１５１８７；Ｕｈｌｍａｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎ、上記参照、全ては、本明細書に参照することにより組み込まれる）。Ｌｉｍｂａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３，１９９４で要約されるように、当技術分野において公知である修飾核酸塩基のいくつかの例がある。核酸分子に導入することができる塩基修飾の限定されない例のいくつかには、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、または６−アザピリミジン、または６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、およびその他（Ｂｕｒｇｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４０９０，１９９６、Ｕｈｌｍａｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎ、上記参照）が含まれる。本態様において、「修飾塩基」とは、１’位でのアデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル以外のヌクレオチド塩基またはその均等物を意味する。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環、またはリン酸基への１つ以上の修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸塩、グアノシン一リン酸塩、ウリジン一リン酸塩、およびシチジン一リン酸塩を含むリボヌクレオチド、ならびにデオキシアデノシン一リン酸塩、デオキシグアノシン一リン酸塩、デオキシミジン一リン酸塩、およびデオキシシチジン一リン酸塩を含むデオキシリボヌクレオチドを含まない。修飾には、メチルトランスフェラーゼ等のヌクレオチドを修飾する酵素による修飾に由来する天然のものが含まれる。修飾ヌクレオチドはまた、合成または非天然ヌクレオチドも含む。ヌクレオチド中の合成または非天然修飾には、２’修飾を有するもの、例えば、Ｔ−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）、または塩基類似体を含むものが含まれる。本開示に記載される、２’−修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」とは、２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２を意味し、これは修飾または非修飾であり得る。このような修飾基は、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、米国特許第５，６７２，６９５号およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃら、米国特許第６，２４８，８７８号に記載されている。
【００６３】
本開示の核酸分子に関連して、修飾は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の一方の鎖または両方の鎖上のパターンにおいてこれらの薬剤に存在し得る。本明細書で使用する場合、「交互位置」とは、ヌクレオチドが１つおきに、修飾ヌクレオチドであるか、またはｄｓＲＮＡの鎖の定義した長さにわたって全てのそれぞれの修飾ヌクレオチドの間に非修飾ヌクレオチド（例えば、非修飾リボヌクレオチド）がある（例えば、５’−ＭＮＭＮＭＮ−３’；３’−ＭＮＭＮＭＮ−５’；Ｍは修飾ヌクレオチドであり、Ｎは非修飾ヌクレオチドである）パターンを指す。この修飾パターンは、例えば、本明細書に記載されるように、位置の番号付けの慣習に従って、５’あるいは３’末端のいずれかの最初のヌクレオチド位置から始める（ある実施形態において、１位は、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の推定されるダイサー切断事象後に、鎖の末端残基に関連して示される；故に、１位は、必ずしも本発明の前処理薬剤の３’末端または５’末端残基を構成するとは限らない）。交互の位置での修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長に及び得るが、ある実施形態において、それぞれ、少なくとも２、３、４、５、６、または７個の修飾ヌクレオチドを含む少なくとも４、６、８、１０、１２、１４個のヌクレオチドを含む。本明細書で使用する場合、「交互位置対」とは、２つの連続した修飾ヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡの定義した長さにわたって２つの連続した非修飾ヌクレオチドによって分離される（例えば、５’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−３’；３’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−５’；Ｍは修飾ヌクレオチドであり、Ｎは非修飾ヌクレオチドである）パターンを指す。この修飾パターンは、本明細書に記載されるような、位置の番号付けの慣習に従って、５’あるいは３’末端のいずれかの最初のヌクレオチド位置から始める。交互位置での修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長に及び得るが、それぞれ、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４個の修飾ヌクレオチドを含む少なくとも８、１２、１６、２０、２４、２８個のヌクレオチドを含むことが好ましい。上記の修飾パターンは、例示であり、本発明の範囲における限定として意図するものではない。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「塩基類似体」とは、核酸二重鎖に導入することができる修飾ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部分の１’位（または核酸二重鎖に導入することができるヌクレオチド糖部分の等価位置）に位置する複素環式部分を指す。本発明のｄｓＲＮＡにおいて、塩基類似体は、一般に、一般的な塩基のグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）を含まない、プリンあるいはピリミジンのいずれかである。塩基類似体は、ｄｓＲＮＡ中の他の塩基または塩基類似体で二重鎖にすることができる。塩基類似体は、本発明の化合物および方法に有用なもの、例えば、Ｂｅｎｎｅｒの米国特許第５，４３２，２７２号および同第６，００１，９８３号およびＭａｎｏｈａｒａｎの米国特許第２００８０２１３８９１号に開示されるものを含み、これらは、参照することによって本明細書に組み込まれる。塩基の限定されない例には、ヒポキサンチン（Ｉ）、キサンチン（Ｘ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（２，６−ジアミノピリミジン）（Ｋ）、３−β−Ｄ−リボフラノシル−（１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）（Ｐ）、イソシトシン（イソＣ）、イソグアニン（イソＧ）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（５−ニトロインドール）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（３−ニトロピロール）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、４−チオ−ｄＴ、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）、およびピロール−２−カルバルデヒド（Ｐａ）、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（Ｓ）、２−オキソピリジン（Ｙ）、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンズイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、および３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ならびにこれらの構造的誘導体が含まれる（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）、Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（１５）：２９１１−２９１４（２０００）、Ｍｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１９：２０５６−２０５７（１９９７）、Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２１：２３２３−２３２４（１９９９）、Ｇｕｃｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１８：８１８２−８１８３（１９９６）、Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２（６）：１００１−１００７（２０００）、ＭｃＭｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２１：１１５��５−１１５８６（１９９９）、Ｇｕｃｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３：９６５２−９６５６（１９９８）、Ｍｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ，９４：１０５０６−１０５１１（１９９７）、Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：１９７−２０６（２００２）、Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：１６０５−１６１１（２００１）、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２（３２）：７６２１−７６３２（２０００）、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６７：５８６９−５８７５（２００２）、Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１７：１０４３４−１０４４２（１９９５）、および米国特許第６，２１８，１０８号）。塩基類似体はまた、ユニバーサル塩基であり得る。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「ユニバーサル塩基」とは、修飾ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部分の１’位、または核酸二重鎖に存在する場合、二重らせん構造（例えば、リン酸骨格の構造）を変化させることなく、１を超える種類の塩基の反対側に位置することができるヌクレオチド糖部分置換の等価位置に位置する複素環式部分を指す。さらに、ユニバーサル塩基は、それが存在して標的核酸に対して二重鎖を形成する一本鎖核酸の能力を損ねない。標的核酸を二重鎖にするユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸の能力は、当業者には明らかである方法（例えば、紫外吸光度、円偏光二色性、ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性等）によってアッセイすることができる。さらに、二重鎖形成が観察される条件、例えば温度（融解温度（Ｔｍ）は核酸二重鎖の安定性と相関するため）を、二重鎖の安定性または形成を判定するために変化させることができる。標的核酸に正確に相補的である参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的な核酸で形成される二重鎖よりも低いＴｍを有する標的核酸で二重鎖を形成する。しかしながら、ユニバーサル塩基が、単一のミスマッチを生成する塩基で置き換えられている参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチした塩基を有する核酸で形成される二重鎖よりも高いＴｍを有する標的核酸で二重鎖を形成する。
【００６６】
いくつかのユニバーサル塩基は、塩基対を形成する条件下で、ユニバーサル塩基と、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）の塩基の全てとの間に水素結合を形成することによって塩基対合することができる。ユニバーサル塩基は、１つの単一の相補的な塩基のみと塩基対を形成する塩基ではない。二重鎖において、ユニバーサル塩基は、二重鎖の反対側の鎖上のそれとは反対側のＧ、Ｃ、Ａ、Ｔ、およびＵのそれぞれと、水素結合しない、１つの水素結合、または１つを超える水素結合を形成し得る。好ましくは、ユニバーサル塩基は、二重鎖の反対側の鎖上のそれとは反対側の塩基と相互作用しない。二重鎖において、ユニバーサル塩基の間での塩基対合は、リン酸骨格の二重らせん構造を変化させることなく生じる。ユニバーサル塩基はまた、スタッキング相互作用によって同じ核酸鎖上の隣接したヌクレオチド中の塩基と相互作用し得る。かかるスタッキング相互作用は、特に、ユニバーサル塩基が、二重鎖の反対側の鎖上のそれとは反対側に位置したいずれの水素結合も形成しない状況において、二重鎖を安定させる。ユニバーサル結合ヌクレオチドの限定されない例には、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、および／または１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが含まれる（Ｑｕａｙらの米国特許出願公開第２００７０２５４３６２号、Ｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ａｃｙｃｌｉｃ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄａｚｏｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ａｓ  ａｍｂｉｇｕｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５  Ｎｏｖ  １１；２３（２１）：４３６３−７０、Ｌｏａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ  ａｎｄ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５  ＪｕＩ  １１；２３（１３）：２３６１−６、Ｌｏａｋｅｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，５−Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４  Ｏｃｔ  １１；２２（２０）：４０３９−４３）。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「ループ」とは、核酸の一本鎖によって形成される構造を指し、ここで、特定の一本鎖ヌクレオチド領域を側面に位置する相補領域が、相補領域間の一本鎖ヌクレオチド領域が、二重鎖形成またはワトソンクリック塩基対から除外される様式でハイブリダイズする。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例には、ヘアピン、ステムループ、または拡張したループ等の構造に存在する不対ヌクレオチドが含まれる。
【００６８】
本明細書で使用する場合、ｄｓＲＮＡとの関連で「拡張したループ」とは、一本鎖ループおよび、さらに、ループを側面に位置する１、２、３、４、５、６個もしくは最大２０個の塩基対、または二重鎖を指す。拡張したループにおいて、５’側上にループの側面に位置するヌクレオチドは、３’側上にループの側面に位置するヌクレオチドと二重鎖を形成する。拡張したループは、ヘアピンまたはステムループを形成し得る。
【００６９】
本明細書で使用する場合、ｄｓＲＮＡとの関連で「テトラループ」とは、隣接したワトソンクリック型のハイブリダイズしたヌクレオチドの安定性の一因となる安定した二次構造を形成する４個のヌクレオチドから成るループ（一本鎖領域）を指す。理論に限定されるものではないが、テトラループは、スタッキング相互作用によって隣接したワトソンクリック型の塩基対を安定させ得る。加えて、テトラループ中の４つのヌクレオチドの間の相互作用は、非ワトソンクリック型塩基対、スタッキング相互作用、水素結合、および接触相互作用（Ｃｈｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０  Ａｕｇ  １６；３４６（６２８５）：６８０−２、Ｈｅｕｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１  Ｊｕｌ  １２；２５３（５０１６）：１９１−４）が含まれるが、これらに限定されない。テトラループは、４個のランダム塩基から成る単純モデルのループ配列から予期されるよりも高い隣接した二重鎖の溶解温度（Ｔｍ）をもたらす。例えば、テトラループは、少なくとも２個の塩基対長の二重鎖を含むヘアピンに対して、１０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４中で少なくとも５５℃の溶解温度をもたらすことができる。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、およびこれらの組み合わせを含み得る。ＲＮＡテトラループの例には、ＵＮＣＧファミリーのテトラループ（例えば、ＵＵＣＧ）、ＧＮＲＡファミリーのテトラループ（例えば、ＧＡＡＡ）、およびＣＵＵＧテトラループが含まれる。（Ｗｏｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０  Ｎｏｖ；８７（２１）：８４６７−７１、Ａｎｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１  Ｎｏｖ  １１；１９（２１）：５９０１−５）。ＤＮＡテトラループの例には、ｄ（ＧＮＮＡ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、ｄ（ＧＮＲＡ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＧＮＡＢ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＣＮＮＧ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＴＮＣＧ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が含まれる（Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（４８），１４２８１−１４２９２，２００２．、ＳＨＩＮＪＩ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｉｐｐｏｎ  Ｋａｇａｋｋａｉ  Ｋｏｅｎ  Ｙｏｋｏｓｈｕ  ＶＯＬ．７８ｔｈ；ＮＯ．２；ＰＡＧＥ．７３１（２０００））。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、それぞれの鎖がＲＮＡ、ＲＮＡ類似体、またはＲＮＡおよびＤＮＡを含む二本鎖核酸を指す。ｓｉＲＮＡは、１９〜２３個のヌクレオチドを含むか、または２１個のヌクレオチドを含む。ｓｉＲＮＡは、一般的に、ｓｉＲＮＡ中の二重鎖領域が、１７〜２１個のヌクレオチド、または１９個のヌクレオチドを含むように、それぞれの鎖の３’端上に２ｂｐオーバーハングを有する。一般的に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＫＲＡＳ遺伝子／ＲＮＡの標的配列と十分に相補的である。
【００７１】
本発明の抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡは、少なくとも２５個のヌクレオチドの鎖長を有する。したがって、抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡは、少なくとも２５個のヌクレオチド長であり、３５個以内または最大５０個のヌクレオチド長である、１つのオリゴヌクレオチド配列の第１の配列を含む。ＲＮＡのこの配列は、２６〜３５、２６〜３４、２６〜３３、２６〜３２、２６〜３１、２６〜３０、および２６〜２９ヌクレオチド長であり得る。この配列は、２７もしくは２８ヌクレオチド長、または２７ヌクレオチド長であり得る。ＤｓｉＲＮＡ剤の第２の配列は、真核細胞の細胞質等の生物学的条件下で、第１の配列にアニールする配列であり得る。概して、第２のオリゴヌクレオチド配列は、第１のオリゴヌクレオチド配列と相補的な少なくとも１９個の塩基対を有し、さらに一般的には、第２のオリゴヌクレオチド配列は、第１のオリゴヌクレオチド配列と相補的な２１個またはそれ以上の相補的な塩基対、または２５個またはそれ以上の塩基対を有する。一実施形態において、第２の配列は、第１の配列と同じ長さであり、ＤｓｉＲＮＡ剤は、平滑末端である。別の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤の端部は、１つ以上のオーバーハングを有する。
【００７２】
ある実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤の第１および第２のオリゴヌクレオチド配列は、化学的に合成され得、一般的に化学的に合成される、別個のオリゴヌクレオチド鎖に存在する。いくつかの実施形態において、両方の鎖は、２６〜３５ヌクレオチド長である。他の実施形態において、両方の鎖は、２５〜３０または２６〜３０ヌクレオチド長である。一実施形態において、両方の鎖は、２７ヌクレオチド長であり、完全に相補的であり、平滑末端を有する。本発明のある実施形態において、抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡの第１および第２の配列は、別個のＲＮＡオリゴヌクレオチド（鎖）上に存在する。一実施形態において、一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖は、ダイサーに対する基質としての役目を果たすことができる。他の実施形態では、遺伝子発現の阻害における、二本鎖ＲＮＡ構造の有効性を最大限にする配向において、ダイサーが二本鎖ＲＮＡ構造に結合するように促進する少なくとも１つの修飾が存在する。本発明のある実施形態において、抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡ剤は、異なる長さの２個のオリゴヌクレオチド鎖から成り、抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡは、第１の鎖（センス鎖）の３’末端で平滑末端、および第２の鎖（アンチセンス鎖）の３’末端で３’オーバーハングを有する。ＤｓｉＲＮＡはまた、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基置換を含むこともできる。
【００７３】
２つの別のオリゴヌクレオチドを含有する適切なＤｓｉＲＮＡ組成物は、化学的連結基によって、それらのアニール領域の外部で化学的に連結することができる。多くの好適な化学基が、当技術分野において公知であり、用いることができる。適切な基は、ＤｓｉＲＮＡに対するダイサー活性を遮断せず、標的遺伝子から転写されるＲＮＡの導かれる破壊に干渉しない。代替的に、２個の別のオリゴヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡを成す２個のオリゴヌクレオチドのアニーリングにおいてヘアピン構造が産生されるように、第３のオリゴヌクレオチドによって連結することができる。ヘアピン構造は、ＤｓｉＲＮＡに対するダイサー活性を遮断せず、標的ＲＮＡの指定される破壊に干渉しないであろう。
【００７４】
本明細書で使用する場合、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列（例えば、ＫＲＡＳ  ｍＲＮＡ）に「十分に相補的な」配列を有する、ｄｓＲＮＡ、例えば、ＤｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉ機構（例えば、ＲＩＳＣ複合体）または過程によって、標的ＲＮＡ（ここで、ｃＤＮＡ配列について述べられる際、ＲＮＡ配列はｃＤＮＡ配列に対応する）の破壊を誘発するのに十分な配列を有することを意味する。ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の全ての残基が、標的分子中の残基に相補的であるように、設計することができる。代替的に、置換は、該分子の安定性を増加させる、および／またはその処理活性を亢進するために、分子内で行うことができる。置換は、鎖内で行うことができるか、または鎖の端の残基に行うことができる。ある実施形態において、置換および／または修飾は、ＤｓｉＲＮＡ剤内の特定の残基でなされる。かかる置換および／または修飾は、例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端位置から番号付けする場合の１、２、および３位の１個以上の残基でのデオキシ修飾、およびＤｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’末端残基での２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）修飾を含むことができ、かかる修飾はまた、アンチセンス鎖の３’部分のオーバーハング位置で、および活性ｓｉＲＮＡ剤を形成するために処理されるＤｓｉＲＮＡ剤の領域内に含まれるＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の交互の残基でも行われる。前述の修飾は、例示として提供され、いかなる様式においても限定することを意図しない。本発明の抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡ剤に行うことができる修飾および置換のさらなる記述を含む、好ましいＤｓｉＲＮＡ剤の構造のさらなる考慮を、以下に見出すことができる。
【００７５】
「二重鎖領域」という語句は、ワトソンクリック塩基対合、あるいは相補的もしくは実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド鎖間の二重鎖を可能にする、他の様式のいずれかによって、互いに塩基対を形成する、２つの相補的または実質的に相補的なオリゴヌクレオチド内の領域を指す。例えば、２１ヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチド鎖は、２１ヌクレオチド単位の別のオリゴヌクレオチドと塩基対合することができるが、それぞれの鎖上の１９個の塩基のみが、「二重鎖領域」が１９個の塩基対から成るように、相補的または実質的に相補的である。残りの塩基対は、例えば、５’および３’オーバーハングとして存在することができる。さらに、二重鎖領域内で、１００％の相補性は必要ではなく、実質的な相補性が二重鎖領域内で許容できる。実質的な相補性とは、生物学的条件下でアニーリングすることができるような鎖間の相補性を指す。２つの鎖が生物学的条件下でアニーリングすることができるかどうかを実験的に決定する技術は、当技術分野において公知である。代替的に、２つの鎖を合成し、生物学的条件下で共に添加し、それらが互いにアニーリングするかどうかを決定することができる。
【００７６】
多くの塩基にわたって塩基対合する一本鎖核酸は、「ハイブリダイズする」と言われる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、生理学的または生物学的に適した条件下（例えば、細胞内：ｐＨ７．２、１４０ｍＭ  カリウムイオン；細胞外  ｐＨ７．４、１４５ｍＭ  ナトリウムイオン）で、判定される。ハイブリダイゼーション条件は、概して、一価陽イオンおよび生物学的に許容される緩衝液を含み、二価陽イオン、錯陰イオン、例えば、グルコン酸カリウムからのグルコン酸塩、スクロース等の非荷電種、試料、例えば、ＰＥＧ等の水の活性を軽減させる不活性ポリマーを含み得るか、または含み得ない。かかる条件は、塩基対を形成することができる条件を含む。
【００７７】
ハイブリダイゼーションは、二重鎖を形成する一本鎖核酸を分離するために必要とされる温度、すなわち、（溶解温度、Ｔｍ）によって測定される。ハイブリダイゼーション条件はまた、塩基対を形成することができる条件も含む。様々なストリンジェンシーの条件を用いて、ハイブリダイゼーションを判定することができる（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９、Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照）。ストリンジェント温度条件は、通常、少なくとも約３０℃の、さらに好ましくは、少なくとも約３７℃、最も好ましくは、少なくとも約４２℃の温度を含む。５０塩基対長未満であることが予想されるハイブリッドに対するハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低く、Ｔｍは、以下の等式に従って決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８〜４９の塩基対長のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％  Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここで、Ｎは、ハイブリッドの塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１ｘＳＳＣに対して［Ｎａ＋］＝０．１６５  Ｍ）。例えば、ハイブリダイゼーション用の判定緩衝液を、表１に示す。
【００７８】
【表１】
0006010458.tif 000002
0006010458.tif 000003
【００７９】
ハイブリダイゼーション条件の有用な変形は、当業者には容易に明白であろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者には公知であり、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド鎖」は、一本鎖の核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド（例えば、２’修飾を有するヌクレオチド、合成塩基類似体等）、またはこれらの組み合わせを含み得る。かかる修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、改善された細胞取り込みおよびヌクレアーゼ存在下での増加した安定性のため、天然型よりも好適であり得る。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「リボヌクレオチド」という用語は、天然および合成、非修飾および修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾には、糖部分、塩基部分、および／またはオリゴヌクレオチドにおけるリボヌクレオチド間の連結に対する変化が含まれる。本明細書で使用する場合、「リボヌクレオチド」という用語は、特に、デオキシリボヌクレオチドを除外し、リボース環の２’位で単一の陽子基を有するヌクレオチドである。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、天然および合成、非修飾および修飾デオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾には、糖部分、塩基部分、および／またはオリゴヌクレオチドにおけるデオキシリボヌクレオチド間の連結に対する変化が含まれる。本明細書で使用する場合、「デオキシリボヌクレオチド」という用語はまた、ｄｓＲＮＡ剤、例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのダイサー切断を許容しない、修飾リボヌクレオチド、およびこのような残基の結合でダイサー切断を生じさせないホスホロチオエート修飾リボヌクレオチド残基等も含まれる。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「ＰＳ−ＮＡ」という用語は、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド残基を指す。したがって、「ＰＳ−ＮＡ」という用語は、ホスホロチオエート修飾リボヌクレオチド（「ＰＳ−ＲＮＡ」）およびホスホロチオエート修飾デオキシリボヌクレオチド（「ＰＳ−ＤＮＡ」）の両方を包含する。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「ダイサー」とは、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有の分子、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）もしくはプレミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を、通常、３’端上に２塩基オーバーハングを有する、２本鎖核酸フラグメント１９〜２５個のヌクレオチド長に切断する、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリーのエンドリボヌクレアーゼを指す。本発明のｄｓＲＮＡに関して、本発明の薬剤のｄｓＲＮＡ領域によって形成される二重鎖は、ダイサーによって認識され、二重鎖の少なくとも１本の鎖上のダイサー基質である。ダイサーは、標的ＲＮＡの分解を連続してもたらす、ＲＮＡ干渉経路における第１のステップを触媒する。ヒトダイサーのタンパク質配列は、受入番号ＮＰ＿０８５１２４下のＮＣＢＩデータベースで提供され、参照することによって組み込まれる。
【００８５】
ダイサー「切断」は、以下の通りに判定される（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：１８７−２００（２００８）を参照）。ダイサー切断アッセイにおいて、ＲＮＡ二重鎖（１００ｐｍｏｌ）を、１ユニットの組み換えヒトダイサー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、または用いないで、２０μＬの２０ｍＭ  ＴｒｉｓｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で、３７℃で１８〜２４時間、インキュベートする。試料は、Ｐｅｒｆｏｒｍａ  ＳＲ  ９６ウェルプレート（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて脱塩する。ダイサー処理前および処理後に、二重鎖ＲＮＡのエレクトロスプレイイオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＴＳＱ７０００、Ｘｃａｌｉｂｕｒデータシステム、ＰｒｏＭａｓｓデータプロセシングソフトウェア、およびＰａｒａｄｉｇｍ  ＭＳ４  ＨＰＬＣ（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）から成る、Ｏｌｉｇｏ  ＨＴＣＳシステム（Ｎｏｖａｔｉａ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ、Ｈａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）を使用して行う。このアッセイにおいて、ダイサー切断は、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ（すなわち、２５〜３０ｂｐのｄｓＲＮＡ、好ましくは２６〜３０ｂｐ  ｄｓＲＮＡ）の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらに１００％が、より短いｄｓＲＮＡ（例えば、１９〜２３ｂｐ  ｄｓＲＮＡ、好ましくは、２１〜２３ｂｐ  ｄｓＲＮＡ）に切断される場合、生じる。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「ダイサー切断部位」とは、ダイサーがｄｓＲＮＡを切断する部位（例えば、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤のｄｓＲＮＡ領域）を指す。ダイサーは、一般的に、ｄｓＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の両方を切断する２つのＲＮａｓｅ  ＩＩＩドメインを含む。ＲＮａｓｅ  ＩＩＩドメインとＰＡＺドメインとの間の平均距離は、それが産生する短い二本鎖核酸フラグメントの長さを決定し、この距離は異なり得る（Ｍａｃｒａｅ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓｆｏｒ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｙ  Ｄｉｃｅｒ」．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１（５７５８）：１９５−８．）。図１および４に示されるように、ダイサーは、アンチセンス鎖の３’末端から取り除かれる２１番目と２２番目のヌクレオチドとの間の部位で、およびセンス鎖の５’末端から取り除かれる２１番目と２２番目のヌクレオチドとの間の対応する部位で、２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを有するアンチセンス鎖を有する本発明のある二本鎖リボ核酸を切断するように突出する。図１および４に示されるものとは異なるｄｓＲＮＡ分子に対して推定される、および／または一般的な切断部位は、同様に、Ｍａｃｒａｅらに記載されるものを含む、当技術分野に認識される方法によって特定され得る。図１および４に示されるダイサー切断の事象は、２１個のヌクレオチドのｓｉＲＮＡを生成するが、ｄｓＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）のダイサー切断は、１９〜２３ヌクレオチド長のダイサー処理されたｓｉＲＮＡ長の生成をもたらすことができる。実際には、ある実施形態において、二本鎖ＤＮＡ領域は、２１ｍｅｒではなく、一般的に、好ましくない１９ｍｅｒまたは２０ｍｅｒのｓｉＲＮＡの一般的なダイサーによる切除を導くために、ｄｓＲＮＡ内に含まれ得る。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「オーバーハング」とは、ｄｓＲＮＡの５’末端または３’末端で、１つ以上の遊離末端を有する二重鎖の状況における、不対ヌクレオチドを指す。ある実施形態において、該オーバーハングは、アンチセンス鎖またはセンス鎖における３’または５’オーバーハングである。いくつかの実施形態において、該オーバーハングは、１〜６個のヌクレオチド、任意に、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６個のヌクレオチド、または１個、２個、３個、４個、５個、もしくは６個のヌクレオチドの長さを有する３’オーバーハングである。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡプロセシング」という用語はｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＲＮａｓｅ  Ｈ経路（例えば、ドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）、ダイサー、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２、または他のＲＩＳＣエンドリボヌクレアーゼ、およびＲＮａｓｅＨ）の構成要素によって行われる処理活性を指し、これらは、以下のさらに詳細に記載されている（以下の項の「ＲＮＡプロセシング」を参照）。この用語は、ＲＮＡの５’キャッピングの転写後のプロセス、および非ＲＩＳＣ−または非ＲＮａｓｅ  Ｈ媒介プロセスによるＲＮＡの分解と、明確に区別される。ＲＮＡのかかる「分解」は、例えば、脱アデニル化（３’ポリ（Ａ）尾部の除去）、および／またはいくつかのエンドまたはエクソヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ｐ、ＲＮａｓｅ  Ｔ１、ＲＮａｓｅ  Ａ（１、２、３、４／５）、オリゴヌクレオチダーゼ等）のうちの１つ以上によるＲＮＡ本体の一部または全ての部分のヌクレアーゼ消化等のいくつかの形態を取り得る。
【００８９】
「相同配列」とは、遺伝子、遺伝子転写物、および／または非コードポリヌクレオチド等の１個以上のポリヌクレオチド配列によって共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば、相同配列は、サイトカインとその対応する受容体等の、遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォーム、または完全に相違する遺伝子等の関連するが異なるタンパク質をコードする２個以上の遺伝子によって共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、非コードＤＮＡまたはＲＮＡ、制御配列、イントロン、および転写制御または調節部位等の２個以上の非コードポリヌクレオチドによって共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、１個を超えるポリヌクレオチド配列によって共有される保存配列領域も含み得る。相同性は、完全な相同性（例えば、１００％）である必要はなく、部分的相同配列も本発明によって企図される（例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％等）。実際に、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の設計および使用は、今説明しているＤｓｉＲＮＡ剤との完全な相同性を有するＫＲＡＳの標的ＲＮＡだけでなく、該ＤｓｉＲＮＡ剤に、例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％等のみ相補的である配列を有する標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡに対して、かかるＤｓｉＲＮＡ剤を用いる可能性を企図する。同様に、本発明の今説明しているＤｓｉＲＮＡ剤は、例えば、ＫＲＡＳの特異的対立遺伝子バリアント（例えば、強化された治療目的の対立遺伝子）の、該ＤｓｉＲＮＡ剤と標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡとの間の相補性の程度を強化するために、当業者によって容易に変更され得ることが企図される。実際に、標的ＫＲＡＳ配列と比較して、挿入、欠失、および単一変異を有するＤｓｉＲＮＡ剤配列もまた、阻害のために有効であり得る。代替的に、ヌクレオチド類似体置換または挿入を有するＤｓｉＲＮＡ剤配列は、阻害のために有効であり得る。
【００９０】
配列同一性は、当技術分野において公知の配列比較およびアライメントアルゴリズムによって決定され得る。２つの核酸配列（または２つのアミノ酸配列）の同一性パーセントを決定するためには、配列は、最適の比較する目的で整列される（例えば、ギャップを、最適アライメントのために第１の配列または第２の配列に導入することができる）。次いで、対応するヌクレオチド（またはアミノ酸）位置でのヌクレオチド（またはアミノ酸残基）を比較する。第１の配列内のある位置が、第２の配列の対応する位置と同じ残基によって占められている場合は、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、任意に、導入されたギャップの数および／または導入されたギャップの長さに対してスコアにペナルティを科して、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち、相同性率（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）である。
【００９１】
２つの配列間の配列比較および同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。一実施形態において、アラインメントは、十分な同一性を有する整列された配列の特定の部分にわたっては生じたが、低い同一性を有する部分にわたっては生じなかった（すなわち、局所的アライメント）。配列比較のために利用される局所的アライメントアルゴリズムの好ましい非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７において改訂されたＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれる。
【００９２】
別の実施形態において、アラインメントは、適切なギャップを導入することによって最適化し、同一性パーセントは、整列された配列の長さにわたって決定される（すなわち、ギャップ付きアラインメント）。比較目的のためにギャップ付きアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。別の実施形態において、アラインメントは、適切なギャップを導入することによって最適化し、同一性パーセントは、整列された配列の長さにわたって決定される（すなわち、グローバルアラインメント）。配列のグローバル比較のために利用される数学アルゴリズムの好ましい非限定的例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，  ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合は、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用することができる。
【００９３】
ＤｓｉＲＮＡアンチセンス鎖とＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列の一部との間に、８０％を超える配列同一性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらに１００％の配列同一性が、好ましい。代替的に、ＤｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ  ＲＮＡの一部とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義され得る（例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で、１２〜１６時間のハイブリダイゼーション、続いて、洗浄）。さらなる好ましいハイブリダイゼーション条件には、７０℃で１×ＳＳＣ中もしくは５０℃で１×ＳＳＣ、５０％  ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション、続いて、７０℃で０．３×ＳＳＣ中での洗浄、または７０℃で４×ＳＳＣ中もしくは５０℃で４×ＳＳＣ、５０％  ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション、続いて、６７℃で１×ＳＳＣ中での洗浄が含まれる。５０塩基対長未満であることが予想されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低い温度であることが予期され、ここで、Ｔｍは、以下の等式に従って決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８〜４９の塩基対長のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％  Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここで、Ｎは、ハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件のさらなる例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．１０  ａｎｄ  ６．３−６．４に提供される。同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７、または３０個の塩基であり得る。
【００９４】
「保存配列領域」とは、ポリヌクレオチド中の１個以上の領域のヌクレオチド配列が、世代間で、または生物系、対象、もしくは生物体によって、さほど変化しないことを意味する。ポリヌクレオチドは、コードおよび非コードのＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むことができる。
【００９５】
「センス領域」とは、ＤｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域に対して相補性を有する、ＤｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。加えて、ＤｓｉＲＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含み得る。
【００９６】
「アンチセンス領域」とは、標的核酸配列に対して相補性を有する、ＤｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。加えて、ＤｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス領域は、ＤｓｉＲＮＡ分子のセンス領域に対して相補性を有する、核酸配列を含む。
【００９７】
本明細書で使用する場合、「アンチセンス鎖」とは、標的ＲＮＡの配列に対して相補的な配列を有する一本鎖核酸分子を指す。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する修飾ヌクレオチドを含む場合、その全長にわたって相補的である必要はないが、標的ＲＮＡで少なくともハイブリダイズしなければならない。
【００９８】
本明細書で使用する場合、「センス鎖」とは、アンチセンス鎖の配列に対して相補的な配列を有する一本鎖核酸分子を指す。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する修飾ヌクレオチドを含む場合、センス鎖は、アンチセンス鎖の全長にわたって相補的である必要はないが、アンチセンス鎖と少なくとも二重鎖を形成しなければならない。
【００９９】
本明細書で使用する場合、「ガイド鎖」とは、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有の分子の一本鎖核酸分子を指し、これは、ＲＮＡ干渉をもたらすために標的ＲＮＡの配列に十分に相補的な配列を有する。ダイサーによってｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有の分子を切断した後、ガイド鎖のフラグメントは、ＲＩＳＣに付随した状態であり、ＲＩＳＣ複合体の構成要素として標的ＲＮＡに結合し、ＲＩＳＣによる標的ＲＮＡの切断を促進する。本明細書で使用する場合、ガイド鎖は、連続的な一本鎖核酸を指す必要はなく、好ましくは、ダイサーによって切断される部位で、不連続性を含み得る。ガイド鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１００】
本明細書で使用する場合、「パッセンジャー鎖」とは、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有の分子のオリゴヌクレオチド鎖を指し、これは、ガイド鎖の配列に相補的である配列を有する。本明細書で使用する場合、パッセンジャー鎖は、連続的な一本鎖核酸を指す必要はなく、好ましくは、ダイサーによって切断される部位で、不連続性を含み得る。パッセンジャー鎖は、センス鎖である。
【０１０１】
「標的核酸」とは、発現、レベル、または活性が調節される核酸配列を意味する。この標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＫＲＡＳを標的とする薬剤については、ある実施形態において、標的核酸は、ＫＲＡＳ  ＲＮＡである。ＫＲＡＳ  ＲＮＡの標的部位はまた、対応するｃＤＮＡ配列によって区別なく引用することもできる。ＫＲＡＳのレベルはまた、ＫＲＡＳの上流エフェクターを標的とすることによって標的とされ得るか、または調節される、もしくは誤調節されるＫＲＡＳのエフェクターはまた、Ｒａｓシグナル伝達経路におけるＫＲＡＳの分子下流を標的とすることによっても調節され得る。
【０１０２】
「相補性」とは、核酸が、伝統的なワトソンクリックあるいは他の非伝統的なタイプのいずれかによって別の核酸配列と水素結合を形成し得ることを意味する。本発明の核酸分子に関連して、その相補的な配列との核酸分子の結合自由エネルギーは、核酸の関連機能、例えば、ＲＮＡｉ活性を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの判定は、当技術分野において公知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ  ｐｐ．１２３−１３３、Ｆｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照）。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソンクリック塩基対）を形成し得る、核酸分子中の隣接残基の百分率を示す（例えば、１０個のヌクレオチドを有する第２の核酸配列と塩基対した、第１のオリゴヌクレオチド中の合計１０個のヌクレオチドのうち５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドは、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性を示す）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての隣接する残基が、第２の核酸配列中の同数の隣接する残基と水素結合することを意味する。一実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、１個以上の標的核酸分子またはその一部に相補的である、１９〜３０個（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個もしくはそれ以上）のヌクレオチドを含む。
【０１０３】
一実施形態において、ＫＲＡＳ遺伝子発現を下方調節する、または減少させる本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、対象または生物体におけるＫＲＡＳ関連の疾患または障害（例えば、癌）を治療する、予防する、または減少させるために使用される。
【０１０４】
本発明の一実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの配列は独立して、２５〜３５ヌクレオチド長であり、特定の実施形態において、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオチド長である。別の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ二重鎖は独立して、２５〜３０個（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個）の塩基対を含む。別の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の１個以上の鎖は独立して、標的（ＫＲＡＳ）核酸分子に対して相補的である１９〜３５個（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個）のヌクレオチドを含む。ある実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、２５〜３４ヌクレオチド長（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４ヌクレオチド長、任意に、全てのかかるヌクレオチドは、反対側の鎖の同族ヌクレオチドと塩基対合する）の二重鎖ヌクレオチドの長さを有する。（本発明の例示的なＤｓｉＲＮＡ分子を、下の図１および４に示す。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、「細胞」は、その通常の生物学的意味で使用され、多細胞生物体全体を指すのではなく、例えば、特にヒトを指すのではない。細胞は、生物体、例えば、トリ、植物、ならびにヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、ネコ等の哺乳動物中に存在し得る。細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）あるいは真核細胞（例えば、哺乳動物または植物細胞）であり得る。細胞は、体細胞または生殖系列起源、全能性または多能性、分裂または非分裂からのものであり得る。細胞はまた、配偶子もしくは胚、幹細胞、または完全に分化した細胞に由来することもできる、またはこれらを含むことができる。ある態様において、「細胞」という用語は、特定的に、本開示の１個以上の単離されたｄｓＲＮＡ分子を含む、ヒト細胞等の哺乳動物細胞を指す。特定の態様において、細胞は、標的核酸のＲＮＡ干渉をもたらすｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有の分子を有し、例えば、ダイサーおよびＲＩＳＣ等のＲＮＡｉに必要とされるタンパク質およびタンパク質複合物を含む。
【０１０６】
本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、直接添加されるか、またはカチオン性脂質と複合体を形成することができ、リポソーム内に封入することができるか、または他の様式で標的細胞もしくは組織に送達することができる。核酸または核酸複合体は、関連組織にエクスビボでまたはインビボで、直接皮膚適用、経皮適用、または注射を通して、生体高分子にそれらの取り込みを有する、または取り込みを有さずに、局所投与することができる。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、図１および４、ならびに以下の例示的な構造に示される配列を含む。かかる核酸分子の例は、これらの図および例示的な構造に定義される配列から本質的に成る。さらに、かかる薬剤が、ＤｓｉＲＮＡ剤の修飾パターンの以下の説明に従って修飾される場合、図１および４に記載されるコンストラクトの化学修飾した形態、ならびに以下の例示的な構造は、図１および４のＤｓｉＲＮＡ剤、ならびに以下の例示的な構造に対して記載される全ての使用において使用することができる。
【０１０７】
別の態様において、本発明は、本発明の１個以上のＤｓｉＲＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供する。１個以上のＤｓｉＲＮＡ分子は独立して、同じまたは異なる部位を標的とすることができる。
【０１０８】
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡ等の単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換え生成ＲＮＡ、ならびに１個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または変化によって天然ＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含む。かかる変化は、ＤｓｉＲＮＡの端部もしくは内部、例えば、ＲＮＡの１個以上のヌクレオチドに、非ヌクレオチド材料の付加を含むことができる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、非天然ヌクレオチド、または化学合成ヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド等の非標準ヌクレオチドを含むこともできる。これらの改変ＲＮＡは、類似体、または天然に存在するＲＮＡの類似体と称することができる。
【０１０９】
「対象」とは、外植された細胞のドナーもしくはレシピエント、または細胞自体である、生物体を意味する。「対象」は、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤を投与することができる生物体も指す。対象は、ヒトまたはヒト細胞を含む、哺乳動物または哺乳動物細胞であり得る。
【０１１０】
「薬学的に許容される担体」という語句は、治療剤の投与のための担体を指す。例示的な担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが含まれる。経口投与される薬物では、薬学的に許容される担体としては、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤、および防腐剤等の薬学的に許容される賦形剤が含まれるが、これらに限定されない。好適な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびにラクトースが含まれるが、コーンスターチおよびアルギン酸は、好適な崩壊剤である。結合剤には、デンプンおよびゼラチンが含まれ得、滑剤は、存在する場合、概して、ステアリン酸マグネシウム，ステアリン酸、またはタルクである。必要に応じて、錠剤は、消化管での吸収を遅らさせるために、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリル等の材料によりコーティングしてもよい。開示されるｄｓＲＮＡ組成物の薬学的に許容される担体は、リポソーム、カプシド、カプソイド、ポリマーナノカプセル、またはポリマーマイクロカプセル等のミセル構造であってよい。
【０１１１】
ポリマーナノカプセルまたはマイクロカプセルは、カプセルに包まれた、あるいは、結合したｄｓＲＮＡの細胞への運搬および放出を促進する。それらは、特に、ポリブチルシアノアクリレートを含む、ポリマーおよびモノマー材料を含む。材料および製造方法の概要は公開されている（Ｋｒｅｕｔｅｒ，１９９１を参照）。重合／ナノ粒子生成ステップにおいて、モノマーおよび／またはオリゴマー前駆体から形成されるポリマー材料は、それ自体が先行技術より既知であり、ナノ粒子を製造する分野の技術者が、通常の技術に従って適切に選択することができる、ポリマー材料の分子量および分子量分布も同様に知られている。
【０１１２】
本発明の様々な方法論は、本明細書で「適切な対照」として区別なく称される、「好適な対照」と、値、レベル、特性、特徴、性質等との比較が関与するステップを含む。「好適な対照」または「適切な対照」は、比較の目的で有用な当業者が精通している対象または標準である。一実施形態において、「好適な対照」または「適切な対照」は、本明細書に記載される、ＲＮＡｉの方法を実行する前に決定される、値、レベル、特性、特徴、性質等である。例えば、転写速度、ｍＲＮＡレベル、翻訳速度、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞の特徴または性質、遺伝子型、表現型等を、細胞または生物体に、本発明のＲＮＡサイレンシング剤（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）を導入する前に決定することができる。別の実施形態において、「好適な対照」または「適切な対照」は、例えば、正常な形質を示す、例えば、対照もしくは正常な細胞または生物体等の細胞または生物体において決定される値、レベル、特性、特徴、性質等である。さらに別の実施形態において、「好適な対照」または「適切な対照」は、予め決定された値、レベル、特性、特徴、性質等である。
【０１１３】
「インビトロ」という用語は、例えば、精製試薬または抽出物、例えば、細胞抽出物に関与する、その当技術分野において認識される意味を有する。「インビボ」という用語もまた、例えば、生細胞、例えば、不死化細胞、一次細胞、細胞株、および／または生物体中の細胞に関与する、その当技術分野において認識される意味を有する。
【０１１４】
本明細書で使用する「治療」または「治療する」とは、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を治癒する、癒す、軽減する、緩和する、変化させる、修復する、寛解する、改善する、または影響を及ぼすことを目的とする、障害がある患者への治療剤（例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤または同じコードのベクターまたは導入遺伝子）の適用もしくは投与、または患者由来の単離された組織または細胞株への治療剤の適用もしくは投与として定義される。また、「治療」または「治療する」という用語は、予防的に薬剤を投与するという状況で、本明細書に使用される。「有効な量」または「有効な投薬量」という用語は、所望の効果を得る、または少なくとも部分的に得るのに十分な量として定義される。「治療上有効な量」という用語は、疾患に既に罹患している患者において、疾患およびその合併症を治癒するか、または少なくとも部分的に阻止するために十分な量として定義される。「患者」という用語は、予防あるいは治療処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
【０１１５】
ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡ剤の構造
ある実施形態において、本発明の抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡ剤は、以下の構造を有し得る。
【０１１６】
かかる一実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基であり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインである。関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基であり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替として、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖である。
【０１１７】
追加の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１１８】
別のかかる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１１９】
別のかかる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１２０】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１２１】
追加の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１２２】
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１２３】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１２４】
追加の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１２５】
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１２６】
追加の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１２７】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１２８】
追加の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１２９】
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１３０】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１３１】
追加の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１３２】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１３３】
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１３４】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１３５】
追加の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１３６】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１３７】
追加の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１３８】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１３９】
追加の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１４０】
さらなる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。１つの関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４ＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインであり、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。別の関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、および「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。さらに関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、
５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、および「Ｄ」＝ＤＮＡである。上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である
【０１４１】
上記の修飾パターンはまた、例えば、拡張したＤｓｉＲＮＡ構造、以下に記載のミスマッチおよび／またはほつれたＤｓｉＲＮＡ構造に組み込むこともできる。
【０１４２】
別の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、ダイサー切断を導く働きをする１〜３個のミスマッチ残基を有する同じ長さを有する鎖を含む（特に、３’末端残基から番号付ける場合のＤｓｉＲＮＡの第１の鎖上の１、２、または３位の１つ以上が、第１および第２の鎖が互いにアニールする場合の第２の鎖上の５’末端領域の対応する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を有する例示的な２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ剤を以下に示す：
【化１】
0006010458.tif 000004
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｍ」＝鎖がアニールされる場合、他の相補的な鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対（水素結合）しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡ、または非天然もしくは修飾核酸）である。このような薬剤の残基のいずれかも、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、下の（第２の）鎖の３’末端残基から開始する２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置はまた、上記の非対称な薬剤に示されるように、上記の「平滑／ほつれ」のＤｓｉＲＮＡ剤に使用することもできる。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖は、センス鎖であり、上の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１４３】
ある追加の実施形態において、本発明は、３’の推定されるセンス鎖ダイサー接続部位および対応する５’の推定されるアンチセンス鎖ダイサー接続部位に位置する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の領域内に１個以上の塩基対のデオキシリボヌクレオチドを有するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のための組成物を提供する。本発明の組成物は、前駆体分子であるｄｓＲＮＡを含み、すなわち、本発明のｄｓＲＮＡは、インビボでプロセッシングされて、活性低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）を産生する。ｄｓＲＮＡは、ダイサーによってプロセッシングされ、ＲＩＳＣに組み込まれる活性ｓｉＲＮＡとなる。
【０１４４】
ある実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、以下の例示的な構造を有することができる（以下の例示的な構造のいずれかは、例えば、上記の構造の下の鎖の修飾パターンと組み合わせることができ、１つの特定の例において、上記の構造のいずれかに示される下の鎖の修飾パターンは、以下の構造のいずれかの下の鎖の２７個ほとんどの３’残基に適用され、別の特定の例において、下の鎖の２３個ほとんどの３’残基に対して上記の構造のいずれかに示される下の鎖の修飾パターンは、以下の構造のいずれかの下の鎖の２３個ほとんどの３’残基に適用されることに留意されたい）。
【０１４５】
かかる一実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下のもの（例示的な「右に拡張した」、「ＤＮＡ拡張した」ＤｓｉＲＮＡ）を含み：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＮＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＮＸＸ−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーから成る任意のオーバーハングドメインである。ある実施形態において、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、ならびに「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０から成るオーバーハングドメインである。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖である。
【０１４６】
関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＮＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＮＤＤ−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーから成る任意のオーバーハングドメインである。ある実施形態において、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、ならびに「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０から成るオーバーハングドメインである。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖である。
【０１４７】
追加の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＮＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＮＺＺ−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーから成る任意のオーバーハングドメインである。ある実施形態において、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ならびに「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０から成るオーバーハングドメインである。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上の図式で今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿って交互の残基に位置する。
【０１４８】
別のかかる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＮＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＮＺＺ−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーから成る任意のオーバーハングドメインである。ある実施形態において、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ならびに「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０から成るオーバーハングドメインである。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上の図式で今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿って交互の残基に位置する。
【０１４９】
別のかかる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＮＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＮＺＺ−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーから成る任意のオーバーハングドメインである。ある実施形態において、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ならびに「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０から成るオーバーハングドメインである。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上の図式で今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿って交互の残基に位置する。
【０１５０】
別の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下を含み：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊［Ｘ１／Ｄ１］ＮＤＤ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊［Ｘ２／Ｄ２］ＮＺＺ−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーから成る任意のオーバーハングドメインである。ある実施形態において、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ならびに「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０から成るオーバーハングドメインであり、少なくとも１つのＤ１Ｎは、上の鎖中に存在し、下の鎖中の対応するＤ２Ｎを有する塩基対である。任意に、Ｄ１ＮおよびＤ１Ｎ＋１は、対応するＤ２ＮおよびＤ２Ｎ＋１を有する塩基対であり、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、およびＤ１Ｎ＋２は、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、およびＤ１Ｎ＋２等を有する塩基対である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上の図式で今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿って交互の残基に位置する。
【０１５１】
本明細書に示される構造において、センス鎖あるいはアンチセンス鎖のいずれかの５’末端は、任意に、リン酸基を含むことができる。
【０１５２】
別の実施形態において、ＤＮＡ：ＤＮＡ拡張したＤｓｉＲＮＡは、ダイサー切断を導く働きをする１〜３個のミスマッチ残基を有する同じ長さを有する鎖を含む（特に、３’末端残基から番号付けする場合のＤｓｉＲＮＡの第１の鎖上の１、２、または３位の１つ以上が、第１および第２の鎖が互いにアニールする場合の第２の鎖上の５’末端領域の対応する残基とミスマッチする）。２つの末端のミスマッチ残基を有する例示的なＤＮＡ：ＤＮＡ拡張したＤｓｉＲＮＡ剤を以下に示し：
【化２】
0006010458.tif 000005
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールされる場合、他の相補的な鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対（水素結合）しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡ、または非天然もしくは修飾核酸）、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。このような薬剤の残基のいずれかは、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、下の（第２の）鎖の３’末端残基から開始する２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置はまた、上記の非対称な薬剤に示されるように、上記の「平滑／ほつれ」のＤｓｉＲＮＡ剤に使用することもできる。一実施形態において、上の鎖（第１の鎖）は、センス鎖であり、下の鎖（第２の鎖）は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖である。非対称な／オーバーハング剤に対して上に示されるものと同等である修飾およびＤＮＡ：ＤＮＡ拡張パターンはまた、このような「平滑／ほつれ」の剤に組み込むこともできる。
【０１５３】
一実施形態において、ダイサー切断の特定の方向によって機能するためにモデル化した部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含む、長さを拡張したＤｓｉＲＮＡ剤が提供されるが、ｄｓＲＮＡ構造において、塩基対のデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない。このような分子に対する例示的な構造を以下に示し：
５’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤＸＸ−３’
３’−ＹＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤＸＸＸＸ−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーから成る任意のオーバーハングドメインである。ある実施形態において、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡから成るオーバーハングドメインである。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖である。上の構造は、その主な処理後形態として、ダイサーに最低２１ｍｅｒの二重鎖を切断させるようにモデル化される。上の構造の下の鎖がアンチセンス鎖である実施形態において、アンチセンス鎖の５’端の最後および最後から２番目の残基での２つのデオキシリボヌクレオチド残基の位置決めは、オフターゲット効果を低減する可能性がある（先行の研究が、オフターゲット効果を低減するために、アンチセンス鎖の５’末端から少なくとも最後から２番目の位置の２’−Ｏ−メチル修飾を示している場合、例えば、米国特許第２００７／０２２３４２７号を参照）。
【０１５４】
一実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、以下のもの（例示的な「左に拡張した」、「ＤＮＡ拡張した」ＤｓｉＲＮＡ）を含み：
５’−ＤＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊Ｙ−３’
３’−ＤＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡであり、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーから成る任意のオーバーハングドメインである。ある実施形態において、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、ならびに「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０から成るオーバーハングドメインである。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖である。
【０１５５】
関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは以下を含み：
５’−ＤＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
３’−ＤＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＸＸ−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、ならびに「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖である。
【０１５６】
追加の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは以下を含み：
５’−ＤＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
３’−ＤＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＺＺ−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、ならびに「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。「Ｚ」＝ＤＮＡもしくはＲＮＡである。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上の図式で今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿って交互の残基に位置する。
【０１５７】
別のかかる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは以下を含み：
５’−ＤＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
３’−ＤＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＺＺ−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、ならびに「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。「Ｚ」＝ＤＮＡもしくはＲＮＡである。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上の図式で今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿って交互の残基に位置する。
【０１５８】
別のかかる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは以下を含み：
５’−ＤＮＺＺＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
３’−ＤＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＺＺ−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ならびに「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上の図式で今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿って交互の残基に位置する。
【０１５９】
別のかかる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは以下を含み：
５’−ＤＮＺＺＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊Ｙ−３’
３’−ＤＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ならびに「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーから成る任意のオーバーハングドメインである。ある実施形態において、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマーから成るオーバーハングドメインである。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上の図式で今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿って交互の残基に位置する。
【０１６０】
別の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは以下を含み：
５’−［Ｘ１／Ｄ１］ＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＤＤ−３’
３’−［Ｘ２／Ｄ２］ＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊ＺＺ−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ならびに「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０であり、少なくとも１つのＤ１Ｎは、上の鎖中に存在し、下の鎖中の対応するＤ２Ｎを有する塩基対である。任意に、Ｄ１ＮおよびＤ１Ｎ＋１は、対応するＤ２ＮおよびＤ２Ｎ＋１を有する塩基対であり、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、およびＤ１Ｎ＋２は、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、およびＤ１Ｎ＋２等を有する塩基対である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上の図式で今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿って交互の残基に位置する。
【０１６１】
関連する実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは以下を含み：
５’−［Ｘ１／Ｄ１］ＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊Ｙ−３’
３’−［Ｘ２／Ｄ２］ＮＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーから成る任意のオーバーハングドメインである。ある実施形態において、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマー、および「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０から成るオーバーハングドメインであり、少なくとも１つのＤ１Ｎは、上の鎖中に存在し、下の鎖中の対応するＤ２Ｎを有する塩基対である。任意に、Ｄ１ＮおよびＤ１Ｎ＋１は、対応するＤ２ＮおよびＤ２Ｎ＋１を有する塩基対であり、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、およびＤ１Ｎ＋２は、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、およびＤ１Ｎ＋２等を有する塩基対である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上の図式で今示した下の鎖ではなく、上の鎖に沿って交互の残基に位置する。
【０１６２】
別の実施形態において、ＤＮＡ：ＤＮＡ拡張したＤｓｉＲＮＡは、ダイサー切断を導く働きをする１〜３個のミスマッチ残基を有する同じ長さを有する鎖を含む（特に、３’末端残基から番号付けする場合のＤｓｉＲＮＡの第１の鎖上の１、２、または３位の１つ以上が、第１および第２の鎖が互いにアニールする場合の第２の鎖上の５’末端領域の対応する残基とミスマッチする）。２つの末端のミスマッチ残基を有する例示的なＤＮＡ：ＤＮＡ拡張したＤｓｉＲＮＡ剤を、以下に示し：
【化３】
0006010458.tif 000006
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールされる場合、他の相補的な鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対（水素結合）しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡ、または非天然もしくは修飾核酸）、「Ｄ」＝ＤＮＡであり、「Ｎ」＝１〜５０またはそれ以上であるが、任意に１〜８もしくは１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。このような薬剤の残基のいずれかは、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、下の（第２の）鎖の３’末端残基から開始する２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置はまた、上記の非対称な薬剤に示されるように、上記の「平滑／ほつれ」のＤｓｉＲＮＡ剤に使用することもできる。一実施形態において、上の鎖（第１の鎖）は、センス鎖であり、下の鎖（第２の鎖）は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖である。非対称な／オーバーハング剤に対して上に示されるものと同等である修飾およびＤＮＡ：ＤＮＡ拡張パターンはまた、このような「平滑／ほつれ」の剤に組み込むこともできる。
【０１６３】
別の実施形態において、ダイサー切断の特定の方向によって機能するためにモデル化した部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むが、ｄｓＲＮＡ構造において、塩基対のデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、長さを拡張したＤｓｉＲＮＡ剤が提供される。このような分子に対して例示的な構造を以下に示し：
５’−ＸＸＤＤＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊Ｙ−３’
３’−ＤＤＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＮ＊−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０個のＲＮＡモノマーから成る任意のオーバーハングドメインである。ある実施形態において、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである１〜４個のＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡから成るオーバーハングドメインである。「Ｎ＊」＝０〜１５またはそれ以上であるが、任意に０、１、２、３、４、５、もしくは６である。一実施形態において、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。代替的に、下の鎖が、センス鎖であり、上の鎖が、アンチセンス鎖である。上の構造は、その主な後処理形態として、ダイサーに最小限の２１ｍｅｒの二重鎖を切断させるようにモデル化される。上の構造の下の鎖がアンチセンス鎖である実施形態において、アンチセンス鎖の５’端の最後および最後から２番目の残基での２つのデオキシリボヌクレオチド残基の位置決めは、オフターゲット効果を低減する可能性がある（先行の研究が、オフターゲット効果を低減するために、アンチセンス鎖の５’末端から少なくとも最後から２番目の位置の２’−Ｏ−メチル修飾を示している場合、例えば、米国特許第２００７／０２２３４２７号を参照）。
【０１６４】
ある実施形態において、上の構造の「Ｄ」残基は、少なくとも１つのＰＳ−ＤＮＡまたはＰＳ−ＲＮＡを含む。任意に、上の構造の「Ｄ」残基は、ダイサー切断を阻害する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
【０１６５】
上記の「ＤＮＡ拡張した」ＤｓｉＲＮＡ剤は、「左に拡張した」あるいは「右に拡張した」のいずれかに分類することができるが、単一の薬剤内の左および右に拡張したＤＮＡ含有の配列の両方を含むＤｓｉＲＮＡ剤（例えば、コアｄｓＲＮＡ構造を取り囲む両側は、ｄｓＤＮＡ拡張である）もまた、生成され、「右に拡張した」および「左に拡張した」薬剤に対して、本明細書に記載の様式と同様の様式で使用することもできる。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、さらに、ＤＮＡ：ＤＮＡ拡張したＤｓｉＲＮＡ剤のセンスおよびアンチセンス鎖に接合するリンク部分またはドメインを含む。任意に、このようなリンク部分のドメインは、センス鎖の３’端およびアンチセンス鎖の５’端を接合する。該リンク部分は、オリゴメチレンジオールリンカー、オリゴエチレングリコールリンカー、または他の当該技術分野において認識されるリンカー部分等の化学的（非ヌクレオチド）リンカーであり得る。代替的に、該リンカーは、ヌクレオチドリンカーであり得、これには、任意に、拡張したループおよび／またはテトラループが含まれる。
【０１６７】
一実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤は、２５塩基対長を有するセンス鎖と、１〜４個の塩基の３’−オーバーハング（例えば、１塩基の３’−オーバーハング、２塩基の３’−オーバーハング、３塩基の３’−オーバーハング、または４塩基の３’−オーバーハング）を有する２７塩基対長を有するアンチセンス鎖と、を持つ、非対称構造を有する。別の実施形態において、このＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖の３’端で２個のデオキシヌクレオチドをさらに含む非対称構造を有する。
【０１６８】
別の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤は、２５塩基対長を有するアンチセンス鎖と、１〜４個の塩基の３’−オーバーハング（例えば、１塩基の３’−オーバーハング、２塩基の３’−オーバーハング、３塩基の３’−オーバーハング、または４塩基の３’−オーバーハング）を有する２７塩基対長を有するセンス鎖と、を持つ、非対称構造を有する。別の実施形態において、このＤｓｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’端で２個のデオキシヌクレオチドをさらに含む非対称構造を有する。
【０１６９】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤を標的とする例示的なＫＲＡＳには、以下のが含まれる：
【化４】
0006010458.tif 000007
【０１７０】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤を標的とする他の例示的なＫＲＡＳには、以下のものが含まれる。
【０１７１】
【表２】
0006010458.tif 000008
【０１７２】
【表３】
0006010458.tif 000009
【表４】
0006010458.tif 000010
【表５】
0006010458.tif 000011
【表６】
0006010458.tif 000012
【表７】
0006010458.tif 000013
【０１７３】
【表８】
0006010458.tif 000014
【表９】
0006010458.tif 000015
【表１０】
0006010458.tif 000016
【表１１】
0006010458.tif 000017
【表１２】
0006010458.tif 000018
【表１３】
0006010458.tif 000019
【表１４】
0006010458.tif 000020
【表１５】
0006010458.tif 000021
【表１６】
0006010458.tif 000022
【表１７】
0006010458.tif 000023
【表１８】
0006010458.tif 000024
【表１９】
0006010458.tif 000025
【表２０】
0006010458.tif 000026
【表２１】
0006010458.tif 000027
【表２２】
0006010458.tif 000028
【表２３】
0006010458.tif 000029
【表２４】
0006010458.tif 000030
【表２５】
0006010458.tif 000031
【表２６】
0006010458.tif 000032
【表２７】
0006010458.tif 000033
【表２８】
0006010458.tif 000034
【表２９】
0006010458.tif 000035
【表３０】
0006010458.tif 000036
【表３１】
0006010458.tif 000037
【表３２】
0006010458.tif 000038
【表３３】
0006010458.tif 000039
【表３４】
0006010458.tif 000040
【表３５】
0006010458.tif 000041
【表３６】
0006010458.tif 000042
【表３７】
0006010458.tif 000043
【表３８】
0006010458.tif 000044
【表３９】
0006010458.tif 000045
【表４０】
0006010458.tif 000046
【表４１】
0006010458.tif 000047
【表４２】
0006010458.tif 000048
【表４３】
0006010458.tif 000049
【表４４】
0006010458.tif 000050
【表４５】
0006010458.tif 000051
【表４６】
0006010458.tif 000052
【表４７】
0006010458.tif 000053
【表４８】
0006010458.tif 000054
【表４９】
0006010458.tif 000055
【表５０】
0006010458.tif 000056
【表５１】
0006010458.tif 000057
【表５２】
0006010458.tif 000058
【表５３】
0006010458.tif 000059
【表５４】
0006010458.tif 000060
【表５５】
0006010458.tif 000061
【表５６】
0006010458.tif 000062
【表５７】
0006010458.tif 000063
【表５８】
0006010458.tif 000064
【表５９】
0006010458.tif 000065
【表６０】
0006010458.tif 000066
【表６１】
0006010458.tif 000067
【表６２】
0006010458.tif 000068
【表６３】
0006010458.tif 000069
【表６４】
0006010458.tif 000070
【表６５】
0006010458.tif 000071
【表６６】
0006010458.tif 000072
【表６７】
0006010458.tif 000073
【表６８】
0006010458.tif 000074
【表６９】
0006010458.tif 000075
【表７０】
0006010458.tif 000076
【表７１】
0006010458.tif 000077
【表７２】
0006010458.tif 000078
【表７３】
0006010458.tif 000079
【表７４】
0006010458.tif 000080
【表７５】
0006010458.tif 000081
【表７６】
0006010458.tif 000082
【表７７】
0006010458.tif 000083
【表７８】
0006010458.tif 000084
【表７９】
0006010458.tif 000085
【表８０】
0006010458.tif 000086
【表８１】
0006010458.tif 000087
【表８２】
0006010458.tif 000088
【表８３】
0006010458.tif 000089
【表８４】
0006010458.tif 000090
【表８５】
0006010458.tif 000091
【表８６】
0006010458.tif 000092
【表８７】
0006010458.tif 000093
【表８８】
0006010458.tif 000094
【表８９】
0006010458.tif 000095
【表９０】
0006010458.tif 000096
【表９１】
0006010458.tif 000097
【表９２】
0006010458.tif 000098
【表９３】
0006010458.tif 000099
【表９４】
0006010458.tif 000100
【表９５】
0006010458.tif 000101
【表９６】
0006010458.tif 000102
【表９７】
0006010458.tif 000103
【表９８】
0006010458.tif 000104
【表９９】
0006010458.tif 000105
【表１００】
0006010458.tif 000106
【表１０１】
0006010458.tif 000107
【表１０２】
0006010458.tif 000108
【表１０３】
0006010458.tif 000109
【表１０４】
0006010458.tif 000110
【表１０５】
0006010458.tif 000111
【表１０６】
0006010458.tif 000112
【表１０７】
0006010458.tif 000113
【表１０８】
0006010458.tif 000114
【表１０９】
0006010458.tif 000115
【表１１０】
0006010458.tif 000116
【表１１１】
0006010458.tif 000117
【表１１２】
0006010458.tif 000118
【表１１３】
0006010458.tif 000119
【表１１４】
0006010458.tif 000120
【表１１５】
0006010458.tif 000121
【表１１６】
0006010458.tif 000122
【表１１７】
0006010458.tif 000123
【表１１８】
0006010458.tif 000124
【表１１９】
0006010458.tif 000125
【表１２０】
0006010458.tif 000126
【表１２１】
0006010458.tif 000127
【表１２２】
0006010458.tif 000128
【表１２３】
0006010458.tif 000129
【表１２４】
0006010458.tif 000130
【表１２５】
0006010458.tif 000131
【表１２６】
0006010458.tif 000132
【表１２７】
0006010458.tif 000133
【表１２８】
0006010458.tif 000134
【表１２９】
0006010458.tif 000135
【表１３０】
0006010458.tif 000136
【表１３１】
0006010458.tif 000137
【表１３２】
0006010458.tif 000138
【表１３３】
0006010458.tif 000139
【表１３４】
0006010458.tif 000140
【表１３５】
0006010458.tif 000141
【表１３６】
0006010458.tif 000142
【表１３７】
0006010458.tif 000143
【表１３８】
0006010458.tif 000144
【表１３９】
0006010458.tif 000145
【表１４０】
0006010458.tif 000146
【表１４１】
0006010458.tif 000147
【表１４２】
0006010458.tif 000148
【表１４３】
0006010458.tif 000149
【表１４４】
0006010458.tif 000150
【表１４５】
0006010458.tif 000151
【表１４６】
0006010458.tif 000152
【表１４７】
0006010458.tif 000153
【表１４８】
0006010458.tif 000154
【表１４９】
0006010458.tif 000155
【表１５０】
0006010458.tif 000156
【表１５１】
0006010458.tif 000157
【表１５２】
0006010458.tif 000158
【表１５３】
0006010458.tif 000159
【表１５４】
0006010458.tif 000160
【表１５５】
0006010458.tif 000161
【表１５６】
0006010458.tif 000162
【表１５７】
0006010458.tif 000163
【表１５８】
0006010458.tif 000164
【表１５９】
0006010458.tif 000165
【表１６０】
0006010458.tif 000166
【表１６１】
0006010458.tif 000167
【表１６２】
0006010458.tif 000168
【表１６３】
0006010458.tif 000169
【表１６４】
0006010458.tif 000170
【表１６５】
0006010458.tif 000171
【表１６６】
0006010458.tif 000172
【表１６７】
0006010458.tif 000173
【表１６８】
0006010458.tif 000174
【表１６９】
0006010458.tif 000175
【表１７０】
0006010458.tif 000176
【表１７１】
0006010458.tif 000177
【表１７２】
0006010458.tif 000178
【表１７３】
0006010458.tif 000179
【表１７４】
0006010458.tif 000180
【表１７５】
0006010458.tif 000181
【表１７６】
0006010458.tif 000182
【表１７７】
0006010458.tif 000183
【表１７８】
0006010458.tif 000184
【表１７９】
0006010458.tif 000185
【表１８０】
0006010458.tif 000186
【表１８１】
0006010458.tif 000187
【表１８２】
0006010458.tif 000188
【表１８３】
0006010458.tif 000189
【表１８４】
0006010458.tif 000190
【表１８５】
0006010458.tif 000191
【表１８６】
0006010458.tif 000192
【表１８７】
0006010458.tif 000193
【表１８８】
0006010458.tif 000194
【表１８９】
0006010458.tif 000195
【表１９０】
0006010458.tif 000196
【表１９１】
0006010458.tif 000197
【表１９２】
0006010458.tif 000198
【表１９３】
0006010458.tif 000199
【表１９４】
0006010458.tif 000200
【表１９５】
0006010458.tif 000201
【表１９６】
0006010458.tif 000202
【表１９７】
0006010458.tif 000203
【表１９８】
0006010458.tif 000204
【表１９９】
0006010458.tif 000205
【表２００】
0006010458.tif 000206
【表２０１】
0006010458.tif 000207
【表２０２】
0006010458.tif 000208
【表２０３】
0006010458.tif 000209
【表２０４】
0006010458.tif 000210
【表２０５】
0006010458.tif 000211
【表２０６】
0006010458.tif 000212
【表２０７】
0006010458.tif 000213
【表２０８】
0006010458.tif 000214
【表２０９】
0006010458.tif 000215
【表２１０】
0006010458.tif 000216
【表２１１】
0006010458.tif 000217
【表２１２】
0006010458.tif 000218
【表２１３】
0006010458.tif 000219
【表２１４】
0006010458.tif 000220
【表２１５】
0006010458.tif 000221
【表２１６】
0006010458.tif 000222
【表２１７】
0006010458.tif 000223
【表２１８】
0006010458.tif 000224
【表２１９】
0006010458.tif 000225
【表２２０】
0006010458.tif 000226
【表２２１】
0006010458.tif 000227
【表２２２】
0006010458.tif 000228
【表２２３】
0006010458.tif 000229
【表２２４】
0006010458.tif 000230
【表２２５】
0006010458.tif 000231
【表２２６】
0006010458.tif 000232
【表２２７】
0006010458.tif 000233
【表２２８】
0006010458.tif 000234
【表２２９】
0006010458.tif 000235
【表２３０】
0006010458.tif 000236
【表２３１】
0006010458.tif 000237
【表２３２】
0006010458.tif 000238
【表２３３】
0006010458.tif 000239
【表２３４】
0006010458.tif 000240
【表２３５】
0006010458.tif 000241
【表２３６】
0006010458.tif 000242
【表２３７】
0006010458.tif 000243
【表２３８】
0006010458.tif 000244
【表２３９】
0006010458.tif 000245
【表２４０】
0006010458.tif 000246
【表２４１】
0006010458.tif 000247
【表２４２】
0006010458.tif 000248
【表２４３】
0006010458.tif 000249
【表２４４】
0006010458.tif 000250
【表２４５】
0006010458.tif 000251
【表２４６】
0006010458.tif 000252
【表２４７】
0006010458.tif 000253
【表２４８】
0006010458.tif 000254
【表２４９】
0006010458.tif 000255
【表２５０】
0006010458.tif 000256
【表２５１】
0006010458.tif 000257
【表２５２】
0006010458.tif 000258
【表２５３】
0006010458.tif 000259
【表２５４】
0006010458.tif 000260
【表２５５】
0006010458.tif 000261
【表２５６】
0006010458.tif 000262
【表２５７】
0006010458.tif 000263
【表２５８】
0006010458.tif 000264
【表２５９】
0006010458.tif 000265
【表２６０】
0006010458.tif 000266
【表２６１】
0006010458.tif 000267
【表２６２】
0006010458.tif 000268
【表２６３】
0006010458.tif 000269
【表２６４】
0006010458.tif 000270
【表２６５】
0006010458.tif 000271
【表２６６】
0006010458.tif 000272
【表２６７】
0006010458.tif 000273
【表２６８】
0006010458.tif 000274
【表２６９】
0006010458.tif 000275
【表２７０】
0006010458.tif 000276
【表２７１】
0006010458.tif 000277
【表２７２】
0006010458.tif 000278
【表２７３】
0006010458.tif 000279
【表２７４】
0006010458.tif 000280
【表２７５】
0006010458.tif 000281
【表２７６】
0006010458.tif 000282
【表２７７】
0006010458.tif 000283
【表２７８】
0006010458.tif 000284
【表２７９】
0006010458.tif 000285
【表２８０】
0006010458.tif 000286
【表２８１】
0006010458.tif 000287
【表２８２】
0006010458.tif 000288
【表２８３】
0006010458.tif 000289
【表２８４】
0006010458.tif 000290
【表２８５】
0006010458.tif 000291
【表２８６】
0006010458.tif 000292
【表２８７】
0006010458.tif 000293
【表２８８】
0006010458.tif 000294
【表２８９】
0006010458.tif 000295
【表２９０】
0006010458.tif 000296
【表２９１】
0006010458.tif 000297
【表２９２】
0006010458.tif 000298
【表２９３】
0006010458.tif 000299
【表２９４】
0006010458.tif 000300
【表２９５】
0006010458.tif 000301
【表２９６】
0006010458.tif 000302
【表２９７】
0006010458.tif 000303
【表２９８】
0006010458.tif 000304
【表２９９】
0006010458.tif 000305
【表３００】
0006010458.tif 000306
【表３０１】
0006010458.tif 000307
【表３０２】
0006010458.tif 000308
【表３０３】
0006010458.tif 000309
【表３０４】
0006010458.tif 000310
【表３０５】
0006010458.tif 000311
【表３０６】
0006010458.tif 000312
【表３０７】
0006010458.tif 000313
【表３０８】
0006010458.tif 000314
【表３０９】
0006010458.tif 000315
【表３１０】
0006010458.tif 000316
【表３１１】
0006010458.tif 000317
【表３１２】
0006010458.tif 000318
【表３１３】
0006010458.tif 000319
【表３１４】
0006010458.tif 000320
【表３１５】
0006010458.tif 000321
【表３１６】
0006010458.tif 000322
【表３１７】
0006010458.tif 000323
【表３１８】
0006010458.tif 000324
【表３１９】
0006010458.tif 000325
【表３２０】
0006010458.tif 000326
【表３２１】
0006010458.tif 000327
【表３２２】
0006010458.tif 000328
【表３２３】
0006010458.tif 000329
【表３２４】
0006010458.tif 000330
【表３２５】
0006010458.tif 000331
【表３２６】
0006010458.tif 000332
【表３２７】
0006010458.tif 000333
【０１７４】
それぞれのＤｓｉＲＮＡに対する推定される２１ｍｅｒの標的配列を表７に示す。
【表３２８】
0006010458.tif 000334
【表３２９】
0006010458.tif 000335
【表３３０】
0006010458.tif 000336
【表３３１】
0006010458.tif 000337
【表３３２】
0006010458.tif 000338
【表３３３】
0006010458.tif 000339
【表３３４】
0006010458.tif 000340
【表３３５】
0006010458.tif 000341
【表３３６】
0006010458.tif 000342
【表３３７】
0006010458.tif 000343
【表３３８】
0006010458.tif 000344
【表３３９】
0006010458.tif 000345
【表３４０】
0006010458.tif 000346
【表３４１】
0006010458.tif 000347
【表３４２】
0006010458.tif 000348
【表３４３】
0006010458.tif 000349
【表３４４】
0006010458.tif 000350
【表３４５】
0006010458.tif 000351
【表３４６】
0006010458.tif 000352
【表３４７】
0006010458.tif 000353
【表３４８】
0006010458.tif 000354
【表３４９】
0006010458.tif 000355
【表３５０】
0006010458.tif 000356
【表３５１】
0006010458.tif 000357
【表３５２】
0006010458.tif 000358
【表３５３】
0006010458.tif 000359
【表３５４】
0006010458.tif 000360
【表３５５】
0006010458.tif 000361
【表３５６】
0006010458.tif 000362
【表３５７】
0006010458.tif 000363
【表３５８】
0006010458.tif 000364
【表３５９】
0006010458.tif 000365
【表３６０】
0006010458.tif 000366
【表３６１】
0006010458.tif 000367
【表３６２】
0006010458.tif 000368
【表３６３】
0006010458.tif 000369
【表３６４】
0006010458.tif 000370
【表３６５】
0006010458.tif 000371
【表３６６】
0006010458.tif 000372
【表３６７】
0006010458.tif 000373
【表３６８】
0006010458.tif 000374
【表３６９】
0006010458.tif 000375
【表３７０】
0006010458.tif 000376
【表３７１】
0006010458.tif 000377
【表３７２】
0006010458.tif 000378
【表３７３】
0006010458.tif 000379
【表３７４】
0006010458.tif 000380
【表３７５】
0006010458.tif 000381
【表３７６】
0006010458.tif 000382
【表３７７】
0006010458.tif 000383
【表３７８】
0006010458.tif 000384
【表３７９】
0006010458.tif 000385
【表３８０】
0006010458.tif 000386
【表３８１】
0006010458.tif 000387
【表３８２】
0006010458.tif 000388
【表３８３】
0006010458.tif 000389
【表３８４】
0006010458.tif 000390
【表３８５】
0006010458.tif 000391
【表３８６】
0006010458.tif 000392
【表３８７】
0006010458.tif 000393
【表３８８】
0006010458.tif 000394
【表３８９】
0006010458.tif 000395
【表３９０】
0006010458.tif 000396
【表３９１】
0006010458.tif 000397
【表３９２】
0006010458.tif 000398
【表３９３】
0006010458.tif 000399
【表３９４】
0006010458.tif 000400
【表３９５】
0006010458.tif 000401
【表３９６】
0006010458.tif 000402
【表３９７】
0006010458.tif 000403
【０１７５】
上の表２〜７内で、下線を引いた残基は、２’−Ｏ−メチル残基を示し、大文字は、リボヌクレオチドを示し、小文字は、デオキシリボヌクレオチドを示し、表２中の「Ｐ−」は、５’末端リン酸基を示す。表３〜６の上記のＤｓｉＲＮＡ剤は、平滑末端を有する２５／２７ｍｅｒの薬剤である。表３〜６の薬剤の構造および／または修飾パターンは、上記の一般的配列構造に容易に適応させることができ、例えば、第２の鎖の３’オーバーハングは、拡張または収縮させることができ、第２の鎖の２’−Ｏ−メチル化は、第２の鎖の５’端に向かって、任意に、交互の部位で、拡張させることができる。このようなさらなる修飾は、任意であるので、このような修飾を有する２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡはまた、上記のＤｓｉＲＮＡ剤から容易に設計することもでき、ＫＲＡＳ発現の機能的な阻害剤であることも期待される。
【０１７６】
ある実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、例えば、第２の鎖の対応する残基に相補的である第１の鎖の、少なくとも１９個の、少なくとも２０個の、少なくとも２１個の、少なくとも２２個の、少なくとも２３個の、少なくとも２４個の、少なくとも２５個の、または少なくとも２６個の残基を必要とする。ある関連する実施形態において、第２の鎖の対応する残基に相補的であるこれらの第１の鎖の残基は、任意に、連続する残基である。
【０１７７】
本明細書で使用する場合、「ＤｓｉＲＮＡｍｍ」とは、ＤｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖によって形成される二重鎖の１個、２個、３個、または４個のミスマッチ塩基対を含む「ミスマッチ耐性領域」を有するＤｉｓＲＮＡを指し、このようなミスマッチは、ＤｓｉＲＮＡのいずれかの端の２つの末端塩基対間（ひいては、含まない）に位置する位置のＤｓｉＲＮＡ内に位置する。ミスマッチ塩基対は、対応する標的核酸の推定されるＡｇｏ２切断部位の位置に対して本明細書に定義される「ミスマッチ耐性領域」内に位置する。このミスマッチ耐性領域は、標的鎖の推定されるＡｇｏ２切断部位の「上流」に位置する。この文脈において、「上流」は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ二重鎖の５’の大部分として理解され、ここで、５’は、ＤｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖の配向を指す。したがって、ミスマッチ耐性領域は、標的核酸の推定されるＡｇｏ２切断部位に対応するセンス（パッセンジャー）鎖における塩基の上流であり（図１を参照）、代替的に、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス（ガイド）鎖を指す場合には、ミスマッチ耐性領域はまた、標的核酸の推定されるＡｇｏ２切断部位に相補的である塩基の位置決められた下流、つまり、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の３’の大部分として記載することができる（アンチセンス鎖の１位は、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドである、図１を参照）。
【０１７８】
一実施形態において、例えば、図１に示されるように番号付けされて、ミスマッチ耐性領域は、二重鎖のセンス鎖の５’端から始まるヌクレオチドから番号付けされる場合には、塩基対３〜９の間で（かつ塩基対３と９を含む）位置決めされる。したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、右側に拡張したＤｓｉＲＮＡのセンス鎖の３、４、５、６、７、８、または９位のいずれか１つに単一のミスマッチ塩基対を有する（１位は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、９位は、センス鎖配列に対応する標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列の推定されるＡｇｏ２切断部位のすぐ５’であるセンス鎖のヌクレオチド残基である）。ある実施形態において、センス鎖の３、４、５、６、７、８、または９位のいずれかにミスマッチ塩基対のヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、アンチセンス鎖の対応するミスマッチ塩基対のヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列でミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列を有するミスマッチ塩基対を形成する（故に、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で妨害され、相補性は、同様に、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列との間で妨害される）。代替的な実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対のヌクレオチドのみが、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドでミスマッチ塩基対を形成し、さらに、その対応する標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列ヌクレオチドで塩基対を形成する（故に、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で妨害され、さらに、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列との間で維持される）。
【０１７９】
上述のように、ミスマッチ耐性領域（ミスマッチ領域）内で単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、センス鎖の３、４、５、６、７、８、または９位のいずれか１つにミスマッチヌクレオチド残基を含むＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、さらに、１つ、２つ、またはさらに３つの追加のミスマッチ塩基対を含むことができる。好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１つ、２つ、または３つの追加のミスマッチ塩基対は、センス鎖の３、４、５、６、７、８、または９位で（およびアンチセンス鎖の対応する残基で）生じる。１つの追加のミスマッチ塩基対がＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する一実施形態において、センス鎖の２つのミスマッチ塩基対は、例えば、センス鎖の４位と６位の両方のヌクレオチドで生じることができる（ミスマッチは、アンチセンス鎖の対応するヌクレオチド残基でも生じる）。
【０１８０】
２つのミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤において、ミスマッチは、連続して（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続した位置で）生じさせることができる。代替的に、アンチセンス鎖配列でミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドは、アンチセンス鎖配列で塩基対するヌクレオチドで散在させることができる（例えば、４位および５位ではなく、３位および６位でミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、３位および６位でのセンス鎖のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基でマッチ塩基対を形成する２つのヌクレオチドで散在させる）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列でミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の２つの残基（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対の間に位置する０、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのマッチ塩基対によって生じさせることができる。
【０１８１】
３つのミスマッチ塩基対を有するあるＤｓｉＲＮＡｍｍ剤については、ミスマッチは、連続して（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿ったトリプレットにおいて）生じさせることができる。代替的に、アンチセンス鎖配列でミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドは、アンチセンス鎖配列でマッチ塩基対を形成するヌクレオチドで散在させることができる（例えば、５位、６位、および７位ではなく、３位、４位、および８位でミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、３位および４位でのセンス鎖のミスマッチ残基は、互いに隣接するが、４位および８位でのセンス鎖のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基でマッチ塩基対を形成する３つのヌクレオチドで散在させる）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列でミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の３つの残基（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のうちのいずれか２つの間に位置する０、１つ、２つ、３つ、または４つのマッチ塩基対を用いて生じさせることができる。
【０１８２】
４つのミスマッチ塩基対を有するあるＤｓｉＲＮＡｍｍ剤については、ミスマッチは、連続して（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿ったクアドラプレットにおいて）生じさせることができる。代替的に、アンチセンス鎖配列でミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドは、アンチセンス鎖配列でマッチ塩基対を形成するヌクレオチドで散在させることができる（例えば、５位および６位ではなく、３位、５位、７位、および８位でミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、７位および８位でのセンス鎖のミスマッチ残基は、互いに隣接するが、３位および５位でのセンス鎖のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基でマッチ塩基対を形成する１つのヌクレオチドで散在させ、同様に、５位および７位でのセンス鎖のミスマッチ残基はまた、アンチセンス鎖の対応する残基でマッチ塩基対を形成する１つのヌクレオチドで散在させる）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列でミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の４つの残基（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のうちのいずれか２つの間に位置する０、１つ、２つ、または３つのマッチ塩基対を用いて生じさせることができる。
【０１８３】
別の実施形態において、例えば、やはり図１に示されるように番号付けされて、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３位のいずれか１つに単一のミスマッチ塩基対のヌクレオチドを有するミスマッチ耐性領域を含む（ここで、１位は、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、１７位は、アンチセンス鎖配列に十分に相補的な標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列の推定されるＡｇｏ２切断部位のアンチセンス鎖中のすぐ３’（下流）であるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である）。ある実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖に対して、アンチセンス鎖の１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３位のいずれか１つにミスマッチ塩基対のヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対のヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列でミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ  標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列でミスマッチ塩基対を形成する（故に、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で妨害され、相補性は、同様に、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列との間で妨害される）。代替的な実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対のヌクレオチドのみが、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドでミスマッチ塩基対を形成し、さらに、その対応する標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列ヌクレオチドで塩基対を形成する（故に、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対で妨害され、さらに相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列との間で維持される）。
【０１８４】
上述のように、ミスマッチ耐性領域内で単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、アンチセンス鎖の１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３位のいずれか１つにミスマッチヌクレオチド残基を含むＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、さらに、１つ、２つ、またはさらに３つの追加のミスマッチ塩基対を含むことができる。好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのこれらの１つ、２つ、または３つの追加のミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖の１７、１８、１９、２０、２１、２２、および／または２３位で（およびセンス鎖の対応する残基で）生じる。１つの追加のミスマッチ塩基対がＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する一実施形態において、アンチセンス鎖の２つのミスマッチ塩基対は、例えば、アンチセンス鎖の１８位と２０位の両方のヌクレオチドで生じることができる（センス鎖の対応するヌクレオチド残基でも生じるミスマッチで）。
【０１８５】
２つのミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤において、ミスマッチは、連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続した位置で）生じさせることができる。代替的に、センス鎖配列でミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列で塩基対するヌクレオチドで散在させることができる（例えば、１８位および１９位ではなく、１７位および２０位でミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、１７位および２０位でのアンチセンス鎖のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基でマッチ塩基対を形成する２つのヌクレオチドで散在させる）。例えば、対応するセンス鎖配列でミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖の２つの残基（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対の間に位置する０、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのマッチ塩基対を用いて生じさせることができる。
【０１８６】
３つのミスマッチ塩基対を有するあるＤｓｉＲＮＡｍｍ剤については、ミスマッチは、連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿ったトリプレットにおいて）生じさせることができる。代替的に、センス鎖配列でミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列でマッチ塩基対を形成するヌクレオチドで散在させることができる（例えば、１９位、２０位、および２１位ではなく、１７位、１８位、および２２位でミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、１７位および１８位でのアンチセンス鎖のミスマッチ残基は、互いに隣接するが、１８位および１２２位でのセンス鎖のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基でマッチ塩基対を形成する３つのヌクレオチドで散在させる）。例えば、対応するセンス鎖配列でミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の３つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のうちのいずれか２つの間に位置する０、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのマッチ塩基対を用いて生じさせることができる。
【０１８７】
４つのミスマッチ塩基対を有するあるＤｓｉＲＮＡｍｍ剤については、ミスマッチは、連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿ったクアドラプレットにおいて）生じさせることができる。代替的に、センス鎖配列でミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列でマッチ塩基対を形成するヌクレオチドで散在させることができる（例えば、１９位および２１位ではなく、１８位、２０位、２２位、および２３位でミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍについては、２２位および２３位でのアンチセンス鎖のミスマッチ残基は、互いに隣接するが、１８位および２０位でのアンチセンス鎖のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基でマッチ塩基対を形成する１つのヌクレオチドで散在させ、同様に、２０位および２２位でのアンチセンス鎖のミスマッチ残基はまた、センス鎖の対応する残基でマッチ塩基対を形成する１つのヌクレオチドで散在させる）。例えば、対応するセンス鎖配列でミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の４つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）は、これらのミスマッチ塩基対のうちのいずれか２つの間に位置する０、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのマッチ塩基対を用いて生じさせることができる。
【０１８８】
明確さのために、上記のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤内のミスマッチヌクレオチド残基の位置は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖あるいはアンチセンス鎖のいずれかの５’末端残基に関して番号付けされる。アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域（ミスマッチ領域）内に位置する位置の番号付けは、推定されるＡｇｏ２切断部位に対して、センスまたはアンチセンス鎖の５’末端の付近に変形を伴って変えることができる。故に、アンチセンス鎖あるいはセンス鎖内のいずれかで好ましいミスマッチ部位の配置はまた、推定されるＡｇｏ２切断部位に対するこのようなミスマッチの許容される近接として特定することもできる。したがって、好ましい一実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドの位置は、対応する標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列の推定されるＡｇｏ２切断部位のすぐ５’（上流）に位置するセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施形態において、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、推定されるＡｇｏ２切断部位の２つのヌクレオチド５’（上流）、推定されるＡｇｏ２切断部位の３つのヌクレオチド５’（上流）、推定されるＡｇｏ２切断部位の４つのヌクレオチド５’（上流）、推定されるＡｇｏ２切断部位の５つのヌクレオチド５’（上流）、推定されるＡｇｏ２切断部位の６つのヌクレオチド５’（上流）、推定されるＡｇｏ２切断部位の７つのヌクレオチド５’（上流）、推定されるＡｇｏ２切断部位の８つのヌクレオチド５’（上流）、または推定されるＡｇｏ２切断部位の９つのヌクレオチド５’（上流）に位置するセンス鎖のヌクレオチド残基に位置決めされる。
【０１８９】
例示的なミスマッチ含有の２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡｍｍ）は、以下の構造を含む（このようなミスマッチ含有の構造はまた、本明細書に示される他の例示的なＤｓｉＲＮＡ構造にも組み込まれ得る）。
【化５】
0006010458.tif 000404
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｍ」＝鎖がアニールされる場合、他の相補的な鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対合（水素結合）しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡ、または非天然もしくは修飾核酸）である。このような薬剤の残基のいずれかは、任意に、下の（第２の）鎖の３’末端残基から開始する２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置であり得、上記のように、上記のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤に使用することもできる。上記のミスマッチ構造については、上の鎖は、センス鎖であり、下の鎖は、アンチセンス鎖である。
【０１９０】
ある実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡの２つの鎖内のミスマッチ塩基対として未だ、必ずしも存在するわけではない、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列に関して存在するミスマッチを含むことができる。故に、ＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡの第１の鎖と第２の鎖の間で完全な相補性を有することができるが、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡに関して未だミスマッチ残基を有する（ある実施形態において、有効性および／または効力および／または効果の持続性を促進する際の利点であり得る）。ある実施形態において、ミスマッチが、アンチセンス鎖と標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列との間に生じる場合、ミスマッチの位置は、標的領域の推定されるＡｇｏ２切断部位の５’に配置したセンス鎖の配列に対応する位置でアンチセンス鎖内に配置され、例えば、アンチセンス鎖残基は、標的配列の推定されるＡｇｏ２切断部位に相補的であるアンチセンス残基の３’へのアンチセンス鎖内で位置決めされる。
【０１９１】
標的配列に関して単一のミスマッチ残基を有する例示的な２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡは、以下の好ましい構造を含む。
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ｐＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ｐＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ｐＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ  ．  ．  ．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ｐＸＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ｐＸＸＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＸＸＸＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖：５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡｍｍアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸｐ−５’
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｅ」＝鎖がアニールされる場合、他の相補的な（標的）鎖の対応する「Ａ」ＲＮＡ残基と塩基対（水素結合）しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡ、または非天然もしくは修飾核酸）であり、さらに任意に、対応する「Ｂ」残基と塩基対する（「Ｂ」残基はまた、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または非天然もしくは修飾核酸でもある）。このような薬剤の残基のいずれも、任意に、下の（第２の）鎖の３’末端残基から開始する２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置であり得、上記のように、上記のＤｓｉＲＮＡ剤に使用することもできる。
【０１９２】
上記の例示された構造に加えて、本発明のＤｓｉＲＮＡはまた、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列でさらにミスマッチを形成する１つ、２つ、または３つの追加の残基を有することもできる。このようなミスマッチは、連続的であり得るか、または標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列でマッチ塩基対を形成するヌクレオチドで散在させることができる。マッチ塩基対を形成するヌクレオチドで散在させる場合、ミスマッチ残基は、このようなミスマッチを形成する残基の間で１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはさらに８つの塩基対ヌクレオチドの間隔で一本鎖内で互いに離れて間隙をあけることができる。
【０１９３】
上述のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤に関しては、（さらに、対応するセンス鎖ヌクレオチドでミスマッチを形成し得るか、あるいは形成し得ない）標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列でミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖ヌクレオチドに対してＤｓｉＲＮＡ内の好ましい配置は、ＤｓｉＲＮＡの推定されるＡｇｏ２切断部位に相補的であるアンチセンス鎖配列の３’（下流）に位置するアンチセンス鎖領域内である（例えば、図１において、推定されるＡｇｏ２切断部位の３’であるアンチセンス鎖の領域は、ミスマッチを形成する残基に対して好ましく、図１に示される２５／２７ｍｅｒの薬剤に対してアンチセンス鎖の１７〜２３位に位置する場合がある）。故に、好ましい一実施形態において、（標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列に関連して）ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチヌクレオチドの位置は、対応する標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列の推定されるＡｇｏ２切断部位のアンチセンス鎖配列内のすぐ３’（下流）に位置するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施形態において、（標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列に関連して）ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、対応する推定されるＡｇｏ２切断部位の２つのヌクレオチド３’（下流）、対応する推定されるＡｇｏ２切断部位の３つのヌクレオチド３’（下流）、対応する推定されるＡｇｏ２切断部位の４つのヌクレオチド３’（下流）、対応する推定されるＡｇｏ２切断部位の５つのヌクレオチド３’（下流）、対応する推定されるＡｇｏ２切断部位の６つのヌクレオチド３’（下流）、推定されるＡｇｏ２切断部位の７つのヌクレオチド３’（下流）、推定されるＡｇｏ２切断部位の８つのヌクレオチド３’（下流）、または推定されるＡｇｏ２切断部位の９つのヌクレオチド３’（下流）に位置するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基に位置決めされる。
【０１９４】
（ミスマッチを形成するヌクレオチドは、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列に関連してミスマッチを形成する）アンチセンス鎖の２つのミスマッチを形成するヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡ剤において、ミスマッチは、連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続した位置で）生じさせることができる。代替的に、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列でミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列と塩基対するヌクレオチドで散在させることができる（例えば、１８位および１９位ではなく、（図１に示される２５／２７ｍｅｒの薬剤のアンチセンス鎖の５’末端（１位）から始めて）１７位および２０位でミスマッチを形成するヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡに対して、１７位および２０位でのセンス鎖のミスマッチ残基は、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列の対応する残基でマッチ塩基対を形成する２つのヌクレオチドで散在させる）。例えば、対応する標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列でミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の２つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）は、これらのミスマッチを形成する塩基対の間に位置する（標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列に対して）０、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのマッチ塩基対を用いて生じさせることができる。
【０１９５】
３つのミスマッチを形成する（標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列に対してミスマッチを形成する）塩基対を有するあるＤｓｉＲＮＡについては、ミスマッチを形成するヌクレオチドは、連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿ったトリプレットにおいて）生じさせることができる。代替的に、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列でミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列でマッチ塩基対を形成するヌクレオチドで散在させることができる（例えば、１９位、２０位、および２１位ではなく、１７位、１８位、および２２位でミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡについては、１７位および１８位でのアンチセンス鎖のミスマッチを形成する残基は、互いに隣接するが、１８位および２２位でのアンチセンス鎖のミスマッチを形成する残基は、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡの対応する残基でマッチ塩基対を形成する３つのヌクレオチドで散在させる）。例えば、対応する標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列でミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の３つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）は、これらのミスマッチを形成する塩基対のうちのいずれか２つの間に位置する０、１つ、２つ、３つ、または４つのマッチ塩基対を用いて生じさせることができる。
【０１９６】
４つのミスマッチを形成する（標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列に対してミスマッチを形成する）塩基対を有するあるＤｓｉＲＮＡについては、ミスマッチを形成するヌクレオチドは、連続して（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿ったクアドラプレットにおいて）生じさせることができる。代替的に、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列でミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列でマッチ塩基対を形成するヌクレオチドで散在させることができる（例えば、１８位および２０位ではなく、１７位、１９位、２１位、および２２位でミスマッチを形成するヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡについては、２１位および２２位でのアンチセンス鎖のミスマッチを形成する残基は、互いに隣接するが、１７位および１９位でのアンチセンス鎖のミスマッチを形成する残基は、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列の対応する残基でマッチ塩基対を形成する１つのヌクレオチドで散在させ、同様に、１９位および２１位でのアンチセンス鎖のミスマッチを形成する残基はまた、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列の対応する残基でマッチ塩基対を形成する１つのヌクレオチドで散在させる）。例えば、対応する標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列でミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖の４つの残基（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）は、これらのミスマッチを形成する塩基対のうちのいずれか２つの間に位置する０、１つ、２つ、または３つのマッチ塩基対を用いて生じさせることができる。
【０１９７】
上記のＤｓｉＲＮＡｍｍおよび他のＤｓｉＲＮＡ構造は、ＤｓｉＲＮＡｍｍおよびＤｓｉＲＮＡ剤のある構造を例示するために記載されている。上記ＤｓｉＲＮＡｍｍおよびＤｓｉＲＮＡ構造の設計を適応して、例えば、以下に示される他のＤｓｉＲＮＡ構造のＤｓｉＲＮＡｍｍ形態を生成することができる。上に例示されるように、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間に単一のミスマッチ（または２つ、３つ、または４つのミスマッチ）を有するＤｓｉＲＮＡはまた、設計することができ、さらに、任意に、ＤｓｉＲＮＡのセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列との間に完全に相補性を保持することができる。
【０１９８】
以下に例示されるＤｓｉＲＮＡ剤はまた、それらの二本鎖および／または標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡに整列する構造内の挿入／欠失（ｉｎ／ｄｅｌ）構造を有することもできることをさらに留意されたい。したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡは、例えば、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列と比較したアンチセンス鎖配列および／またはセンス鎖配列と比較したアンチセンス鎖配列において、挿入／欠失変形を有し、ミスマッチ塩基対の位置決めおよび／またはミスマッチを形成する塩基対に対して上述のこれらの位置に対応するこのような挿入／欠失ヌクレオチドの配置に対して好ましい位置を有するように設計することができる。
【０１９９】
本発明のＤｓｉＲＮＡは、センス鎖の３’末端領域／アンチセンス鎖の５’末端領域内が、ダイサーによって処理され、ＲＩＳＣに取り込まれるガイド鎖配列から解放されるようにモデル化されるため、この領域内にミスマッチを許容することも留意されたい。このようなミスマッチを有する本発明の例示的なＤｓｉＲＮＡ構造は、以下を含み、
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＨＸＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡセンス鎖：５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＩＸＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＪＸＸＸｐ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＨＸＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡセンス鎖：５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＩＤＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＪＸＸｐ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＨＸ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡセンス鎖：５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＩＤ−３’
ＤｓｉＲＮＡアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＪＸｐ−５’
標的ＲＮＡ配列：５’−．．．ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＨ．．．−３’
ＤｓｉＲＮＡセンス鎖：５’−ｐＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＩ−３’
ＤｓｉＲＮＡアンチセンス鎖：３’−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＪｐ−５’、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「ｐ」＝リン酸基、「Ｉ」および「Ｊ」＝互いに塩基対（水素結合）しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡ、または非天然もしくは修飾核酸）であり、さらに、任意に、「Ｊ」は、標的ＲＮＡ配列ヌクレオチド「Ｈ」に相補的である。このような薬剤の残基のいずれも、任意に、下の（第２の）鎖の３’末端残基から開始する２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置であり得、上記の、または上記のメチル化パターンのいずれかのように、上記のＤｓｉＲＮＡ剤に使用することもできる。上記のミスマッチはまた、本発明のＤｓｉＲＮＡ内で組み合わせることもできる。
【０２００】
以下の構造において、このようなミスマッチは、非対称なＫＲＡＳ−４２０  ＤｓｉＲＮＡ内に導入される（新たに導入されたミスマッチ残基は、イタリック体で表示される）：
ＫＲＡＳ−４２０２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝（５’末端からの）センス鎖の２２
【化６】
0006010458.tif 000405
任意に、センス鎖の２２位のミスマッチ「Ｃ」残基は、代替的に、「Ｇ」または「Ｕ」である。
ＫＲＡＳ−４２０２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３
【化７】
0006010458.tif 000406
任意に、センス鎖の２３位のミスマッチ「Ｃ」残基は、代替的に、「Ｇ」または「Ｕ」である。
ＫＲＡＳ−４２０２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４
【化８】
0006010458.tif 000407
任意に、センス鎖の２４位のミスマッチ「ｃ」残基は、代替的に、「ｇ」または「ｔ」である。
ＫＲＡＳ−４２０２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５
【化９】
0006010458.tif 000408
任意に、センス鎖の２５位のミスマッチ「ｇ」残基は、代替的に、「ｃ」または「ａ」である。
ＫＲＡＳ−４２０２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１
【化１０】
0006010458.tif 000409
任意に、アンチセンス鎖の１位のミスマッチ「Ｃ」残基は、代替的に、「Ｇ」または「Ｕ」である。
ＫＲＡＳ−４２０２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２
【化１１】
0006010458.tif 000410
任意に、アンチセンス鎖の２位のミスマッチ「Ｃ」残基は、代替的に、「Ｇ」または「Ａ」である。
ＫＲＡＳ−４２０２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３
【化１２】
0006010458.tif 000411
任意に、アンチセンス鎖の３位のミスマッチ「Ｇ」残基は、代替的に、「Ａ」または「Ｃ」である。
ＫＲＡＳ−４２０２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４
【化１３】
0006010458.tif 000412
任意に、アンチセンス鎖の４位のミスマッチ「Ｇ」残基は、代替的に、「Ａ」または「Ｃ」である。
【０２０１】
上で述べたように、このようなミスマッチの導入は、本明細書に記載のＤｓｉＲＮＡのいずれかにおいて行うことができる。
【０２０２】
このようなＤｓｉＲＮＡ構造のミスマッチを組み合わせて、ＤｓｉＲＮＡプロセシング、例えば、センス鎖の３’末端の４つのヌクレオチド／アンチセンス鎖の５’末端の４つのヌクレオチド内で２つ、３つ、またはさらに４つのミスマッチを生成することができる。
【０２０３】
実際に、センス鎖の３’末端残基／アンチセンス鎖の５’末端残基で、ＤｓｉＲＮＡに組み込むことができる配列の柔軟性を考慮して、ある実施形態において、本発明の非対称ＤｓｉＲＮＡの配列要求性は、（例示的なＫＲＡＳ−４２０  ＤｓｉＲＮＡ配列に示される）以下の（最小限の）構造として表すことができる。
５’−ＧＵＡＵＵＵＧＣＣＡＵＡＡＡＵＡＡＵＡＣＵＸＸＸ［Ｘ］ｎ−３’（配列番号６８３９）
３’−ＣＡＣＡＵＡＡＡＣＧＧＵＡＵＵＵＡＵＵＡＵＸＸＸＸＸ［Ｘ］ｎ−Ｓ’（配列番号６８４０）
式中、ｎ＝１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜５０、または１〜８０もしくはそれ以上である。
ＫＲＡＳ−４２０標的：５’−ＧＴＧＴＡＴＴＴＧＣＣＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号６８４１）
【０２０４】
また、ＫＲＡＳ標的部位は、相補的な標的部位が、規定された標的部位とオーバーラップするいくつかのオリゴヌクレオチドのうちの１個以上によって標的とされる部位であり得る。例えば、例示的なＫＲＡＳ−４２０  ＤｓｉＲＮＡについては、オーバーラップおよびわずかにオフセットのＫＲＡＳ配列を標的とする特定のＤｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ−４２０のＤｓｉＲＮＡと同様の活性レベルを示すことができることに留意する（具体的には、図１０のＫＲＡＳ−４１５、ＫＲＡＳ−４１７、およびＫＲＡＳ−４１８  ＤｓｉＲＮＡ、ならびに表９、図１２、および１３のＫＲＡＳ−４２２、ＫＲＡＳ−４２３、ＫＲＡＳ−４２４、ＫＲＡＳ−４２５、およびＫＲＡＳ−４２６  ＤｓｉＲＮＡを参照）。故に、ある実施形態において、指定された標的配列領域は、大部分はオーバーラップする配列を有する一連のＤｓｉＲＮＡによって有効に標的とすることができる。（例えば、ＫＲＡＳ−４２０部位を取り囲むＤｓｉＲＮＡを考慮する場合、さらに包含するＫＲＡＳ標的配列は、例えば、５’−ＴＣＴＴＴＧＴＧＴＡＴＴＴＧＣＣＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＣＴＡＡＡＴＣＡ−３’（配列番号６８４２）として列挙され得、ここで、任意の所与のＤｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳ−４１５、ＫＲＡＳ−４１７、ＫＲＡＳ−４１８、ＫＲＡＳ−４２０、ＫＲＡＳ−４２２、ＫＲＡＳ−４２３、ＫＲＡＳ−４２４、ＫＲＡＳ−４２５、およびＫＲＡＳ−４２６から選択されるＤｓｉＲＮＡ）のみが、このような配列領域内での配列を標的とするが、全配列は、このような一連のＤｓｉＲＮＡに対して実行可能な標的と見なされ得る）。
【０２０５】
さらに、および／または代替的に、センス鎖の３’末端の４個のヌクレオチド／アンチセンス鎖の５’末端の４個のヌクレオチド内でのミスマッチは、上述のように他のミスマッチ耐性位置に位置付けされたミスマッチと組み合わせることができる。
【０２０６】
特定のＫＲＡＳ配列の標的によるＫＲＡＳレベルの阻害剤として上記のダイサー基質剤（ＤｓｉＲＮＡ）の本同一性を考慮して、配列番号１もしくは配列番号３内、またはそのバリアント内の他の配列（例えば、配列番号１および／もしくは配列番号３の配列に対して８０％同一性、９０％同一性、９５％同一性、９６％同一性、９７％同一性、９８％同一性、９９％もしくはそれ以上の同一性を有する標的配列）を標的とする、本明細書に記載のものと同様の構造を有するＤｓｉＲＮＡを合成することができることも認識されたい。
【０２０７】
ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡの設計／合成
２５〜３５個のヌクレオチド、特に、２５〜３０個のヌクレオチドのより長いｄｓＲＮＡ種（ＤｓｉＲＮＡ）が、１９〜２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡ剤と比較して、効力および作用の持続時間の観点から予想外に有効な結果を得ることが実験的に見出されている。ｄｓＲＮＡプロセシング機構の根本的な理論に束縛されることは望ましくないが、より長いｄｓＲＮＡ種は、細胞の細胞質中のダイサー酵素の基質としての役割を果たすと考えられる。本発明のｄｓＲＮＡをより短いセグメントに切断することに加えて、ダイサーは、切断されたｄｓＲＮＡ由来の一本鎖切断産物の、標的遺伝子のＫＲＡＳ（または、ＫＲＡＳ関連疾患または障害と関連する他の遺伝子）由来の細胞質ＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳ  ＲＮＡ）の分解に関与するＲＩＳＣ複合体への取り込みを促進すると考えられる。従来技術の研究（Ｒｏｓｓｉらの米国特許出願第２００７／０２６５２２０号）は、ダイサーによるｄｓＲＮＡ種（特に、ＤｓｉＲＮＡ剤）の切断能が、ｄｓＲＮＡ種の効力および作用の持続時間の増加と対応することを示している。
【０２０８】
ある好ましい抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡ剤が、予めスクリーニングされた集団から選択された。ＤｓｉＲＮＡの設計は、任意に、配列の領域にわたる多くの可能なＤｓｉＲＮＡ剤の予測される活性／有効性のコンピュータ内での評価を行う予測的スコアリングアルゴリズムの使用を含むことができる。かかるスコアリングアルゴリズムの設計に関する情報は、例えば、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００６，７：５１６）に見出すことができるが、さらに最近の「ｖ３」アルゴリズムは、当技術分野において既に利用可能なｓｉＲＮＡスコアリングアルゴリズムと比較して理論上は改善されたアルゴリズムを示す（「ｖ３」アルゴリズムは、ヒト配列における任意のバイアスに依存しない機械学習のアルゴリズムである。加えて、「ｖ３」アルゴリズムは、Ｇｏｎｇらに記載されるもの等のより古い「ｖ２」アルゴリズムから由来されるよりも約３倍大きいデータセットに由来する。）
【０２０９】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の第１および第２のオリゴヌクレオチドは、完全に相補的である必要はない。実際に、一実施形態において、センス鎖の３’末端は、１つ以上のミスマッチを含む。一態様において、２つのミスマッチが、センス鎖の３’末端に組み込まれる。別の実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、これらのそれぞれは、２７ヌクレオチド長である２個のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ分子で、互いにアニーリングされる場合、平滑末端、およびセンス鎖の３’末端（アンチセンス鎖の５’末端）に２つのヌクレオチドミスマッチを有する。恐らく、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの進入に伴って生じる、いくつかの律速巻き戻しステップに作用することにより、アンチセンス鎖のＲＩＳＣへの進入を促進するか、または有利にするため、ミスマッチ、または、熱力学的安定性の減少の使用（特に、３’センス／５’アンチセンス位置において）が提唱されている（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８、Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：２０９−２１６）。故に、末端の塩基組成物は、活性２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ二重鎖の選択における設計アルゴリズムに含まれている（Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：９３６−９４８、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：３２６−３３０）。本実施形態のｄｓＲＮＡのダイサー切断によって、ミスマッチを含む小さな末端の配列は、アンチセンス鎖と対にならずに残される（３’オーバーハングの一部になる）か、または最終の２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡから完全に切り落とされるであろう。したがって、これらの「ミスマッチ」は、ＲＩＳＣの最終ＲＮＡ構成要素のミスマッチとして存続しない。恐らく、ダイサーによるプロセシングを促進することにより、ダイサー基質のセンス鎖３’端での塩基のミスマッチ、またはセグメント不安定化が、ＲＮＡｉにおける合成二重鎖の効力を改善したという所見は、ことに、２５〜３０ｍｅｒ  のｄｓＲＮＡ（本明細書において、「ＤｓｉＲＮＡ」とも称される；Ｒｏｓｓｉらの米国特許出願第２００５／０２７７６１０号、第２００５／０２４４８５８号、および第２００７／０２６５２２０号）の設計および使用を記載する過去の研究の驚くべき所見であった。
【０２１０】
ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡの修飾
二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）の効果を阻害する１つの主要な因子は、ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ）の分解である。３’−エキソヌクレアーゼは、血清中に存在する主要なヌクレアーゼ活性であり、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端の修飾は、分解を防ぐために重要である（Ｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ，１：１４１−１５１）。ＥＲＩ−Ｉと呼ばれる、ｓｉＲＮＡの調節および分解に関与する、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性を有するＲＮａｓｅ−Ｔファミリーヌクレアーゼが、特定されている（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４２７：６４５−６４９、Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３９０：６７５−６７９）。この遺伝子は、マウスのＴｈｅｘ１（ＮＭ＿０２０６７）、あるいはヒトのＴＨＥＸ１（ＮＭ＿１５３３３２）としても公知であり、ヒストンｍＲＮＡの分解に関与する；ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングの分解も媒介するが、二重鎖ＲＮＡは分解しない（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８１：３０４４７−３０４５４）。したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡを含む３’端の安定性が、安定性を改善するであろうと推測することが妥当である。
【０２１１】
ＸＲＮ１（ＮＭ＿０１９００１）は、Ｐ本体に存在する５’から３’エキソヌクレアーゼであり、ｍｉＲＮＡによって標的とされるｍＲＮＡの分解に関連付けられており（Ｒｅｈｗｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，ＲＮＡ  １１：１６４０−１６４７）、また、ｓｉＲＮＡによって行われるように内部切断によって開始される分解の完了にも関与する可能性がある。ＸＲＮ２（ＮＭ＿０１２２５５）は、核ＲＮＡプロセシングに関与するはっきりと区別できる５’から３’エキソヌクレアーゼである。
【０２１２】
ＲＮａｓｅ  Ａは、哺乳動物においてＲＮＡを分解する主要なエンドヌクレアーゼである。それは、ｓｓＲＮＡに特異的であり、ピリミジン塩基の３’端で切断する。ＲＮａｓｅ  Ａ切断と一致するＳｉＲＮＡ分解産物は、血清中でインキュベーションした後、質量分析によって検出することができる（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ  ３：４３−５０）。３’オーバーハングは、ＲＮａｓｅ分解へのｓｉＲＮＡの感受性を亢進させる。血清からのＲＮａｓｅ  Ａの除去は、ｓｉＲＮＡの分解を減少させる；この分解は、いくつかの配列選択性を示し、末端にポリＡ／Ｕ配列を有する配列において、より悪い（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７１：７０２−７１０）。このことは、二重鎖のより安定性の低い領域が、「呼吸する（ｂｒｅａｔｈｅ）」可能性があり、ＲＮａｓｅ  Ａによる分解に使用可能である、一時的な一本鎖種を提供する可能性を示唆している。ＲＮａｓｅ  Ａ阻害剤を血清に加えて、それによってｓｉＲＮＡの寿命および効力を改善することができる（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２１：２０６−２１０）。
【０２１３】
２１ｍｅｒでは、ホスホロチオエートまたはボラノリン酸修飾が、ヌクレオシド間リン酸結合を直接的に安定化する。ボラノリン酸修飾ＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性が高く、サイレンシング剤として有効であり、比較的無毒である。ボラノリン酸修飾ＲＮＡは、標準的な化学合成方法を用いて製造することはできず、その代わり、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって作製される（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：５９９１−６０００、Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：２７７３−２７８１）。ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾は、ＲＮＡ二重鎖において、いかなる所望の位置にも容易に配置することができ、標準的な化学合成方法を用いて作製することができる。ＰＳ修飾は、用量依存的な毒性を示すため、ほとんどの研究者らは、ｓｉＲＮＡへの制限された組み込みを推奨しており、ヌクレアーゼからの保護が最も重要な３’端が好まれる（Ｈａｒｂｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １３：８３−１０５、Ｃｈｉｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ，２００３，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０：５４９−５６１、Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：７９６７−７９７５、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：５８９−５９５）。より広範囲のＰＳ修飾は、強力なＲＮＡｉ活性に適合することができるが、糖修飾（２’−Ｏ−メチルＲＮＡ等）の使用が優れている可能性がある（Ｃｈｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３４２：９１９−９２７）。
【０２１４】
多様な置換基を、リボースの２’位に配置することが可能であり、一般的に、二重鎖の安定性（Ｔｍ）を高め、ヌクレアーゼ耐性を顕著に改善することができる。２’−Ｏ−メチルＲＮＡは、哺乳動物のリボソームＲＮＡおよびトランスファーＲＮＡにおいて見出された、天然に生じる修飾である。ｓｉＲＮＡにおける２’−Ｏ−メチル修飾は既知であるが、二重鎖内の修飾塩基の正しい位置が、効力の維持には重要であり、ＲＮＡから２’−Ｏ−メチルＲＮＡへの完全な置換は、ｓｉＲＮＡを不活性化する。例えば、交互に２’−Ｏ−メチル塩基を用いるパターンは、非修飾ＲＮＡと等しい効力を有することができ、かつ、血清中で非常に安定である（Ｃｈｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３４２：９１９−９２７、Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：２７０５−２７１６）。
【０２１５】
２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾も、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ）機能に適合する；最も一般的には、（試薬の費用および入手し易さのため）ピリミジン部位に配置され、プリン位置において、２’−Ｏ−メチル修飾と組み合わせることができる；２’−Ｆプリンは、入手可能であり、使用することもできる。この種の大量に修飾された二重鎖は、インビトロにおいてＲＮＡｉを強力に誘発することができ（Ａｌｌｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８：９０１−９０４、Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８：４２４７−４２５３、Ｋｒａｙｎａｃｋ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，２００６，ＲＮＡ  １２：１６３−１７６）、インビトロで使用される場合、性能を高め、作用の持続時間を延長することができる（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４１：１３４９−１３５６、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１００２−１００７）。２’−Ｆおよび２’−Ｏ−Ｍｅ塩基を交互に含む、極めて強力な、ヌクレアーゼ安定の、平滑１９ｍｅｒの二重鎖は、Ａｌｌｅｒｓｏｎにより教授される。本設計において、交互の２’−Ｏ−Ｍｅ残基は、Ｃｚａｕｄｅｒｎａによって使用されるものと同一のパターンで位置付けられるが、残りのＲＮＡ残基は、２’−Ｆ修飾塩基に変換される。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙにより使用される、極めて強力な、ヌクレアーゼ耐性ｓｉＲＮＡは、インビボで、極めて強力な、ヌクレアーゼ耐性ｓｉＲＮＡを使用した。２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡおよび２’−Ｆ  ＲＮＡに加えて、本二重鎖には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、反転した脱塩基残基、および３’末端のＰＳヌクレオシド間結合が含まれる。広範囲の修飾は、いくらかの利点を有するが、より制限された二重鎖の修飾もまた、インビボにおける性能を改善することができ、さらに、製造するのが、より単純で、かつ、より安価である。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら（２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８）は、インビボで二重鎖を使用し、ほとんどが２つの２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡ塩基および限定された３’末端のＰＳヌクレオシド間結合を有するＲＮＡであった。
【０２１６】
ロックされた核酸（ＬＮＡ）は、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡおよびＤｓｉＲＮＡ）を安定化するために使用することができる、異なる分類の２’修飾である。効力を維持するＬＮＡ組み込みのパターンは、限定された修飾が好ましいため、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｆ塩基よりも、より限られている（Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：７９６７−７９７５、Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：３１８５−３１９３、Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：４３９−４４７）。限定された組み込みであっても、ＬＮＡ修飾の使用は、ｄｓＲＮＡ性能をインビボにおいて改善することができ、さらに、オフターゲット効果プロファイルを変更または改善することも可能である（Ｍｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ６：８３３−８４３）。
【０２１７】
細胞または生きた動物中に導入される合成核酸は、「異物（ｆｏｒｅｉｇｎ）」として認識され、免疫応答を誘発する可能性がある。免疫刺激は、オフターゲット効果の主要な分類を構成し、実験結果を大幅に変化させ、細胞死さえ導く可能性がある。先天性免疫系には、これらの応答を媒介するＤＮＡおよびＲＮＡと特異的に相互作用する、受容体分子の集積が含まれ、それらのいくつかは、細胞質に位置し、これらのいくつかはエンドソームに存在する（Ｍａｒｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１３９９−１４０５、Ｓｃｈｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １４：４６３−４７０）。カチオン性脂質またはリポソームによるｓｉＲＮＡの運搬は、ｓｉＲＮＡを細胞質およびエンドソームコンパートメントの両方に曝露し、１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答をインビトロおよびインビボの両方において誘発するリスクを最大にする（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１００２−１００７、Ｓｉｏｕｄ  ａｎｄ  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３１２：１２２０−１２２５、Ｓｉｏｕｄ，２００５，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４８：１０７９−１０９０、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３３０：７５５−７５９）。細胞内で転写されるＲＮＡは、免疫原性がより低く（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４：５６６−５７１）、脂質に基づく方法を用いて運搬される場合に免疫原性のある合成ＲＮＡは、機械的手法によって細胞に導入される場合には、インビボにおいても、免疫刺激を避けることができる（Ｈｅｉｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：１５７９−１５８２）。しかしながら、脂質に基づく運搬方法は、簡便で、有効で、かつ広く使用される。免疫応答を防ぐいくつかの一般的な戦略が、全ての細胞型が存在し、免疫応答を生み出すリスクが最も高い場合に、特に、インビボにおける応用において必要とされる。化学修飾ＲＮＡの使用は、これらの問題のほとんど、あるいは全てをも解決する可能性がある。
【０２１８】
ある実施形態において、修飾は、ＤｓｉＲＮＡ剤がＫＲＡＳ阻害活性を有さないようにする限り、この修飾は、本発明の抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡ剤に含むことができる。一実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤のダイサー処理を亢進する、１つ以上の修飾が、行われる（ＤｓｉＲＮＡのダイサー処理を判定するためのアッセイは、上に記載される）。第２の実施形態において、さらに有効なＫＲＡＳ阻害をもたらす、１つ以上の修飾が、行われる（本明細書に記載されるように、ＤｓｉＲＮＡのＫＲＡＳ阻害／ＫＲＡＳ阻害活性は、万一ＲＮＡレベルまたはＫｒａｓポリペプチドレベルが、例えば、ＫＲＡＳ  ｍＲＮＡレベルの評価の代わりに、またはそれに加えて評価される場合には、かかるレベルを判定するために、当技術分野において認識される方法によってアッセイすることができる）。第３の実施形態において、より高いＫＲＡＳ阻害活性を支持する、１つ以上の修飾が行われる（ＫＲＡＳ阻害活性を判定する手段は、上に記載される）。第４の実施形態において、細胞に運搬される、それぞれのＤｓｉＲＮＡ剤分子当たりのＫＲＡＳ阻害活性のより高い効力をもたらす、１つ以上の修飾が行われる（ＫＲＡＳ阻害活性の効力は上に記載される）。修飾は、３’末端領域、５’末端領域、３’末端および５’末端領域の両方、またはいくつかの例においては、配列内の様々な位置において、組み込むことができる。上述の制限を考慮した上で、あらゆる数および組み合わせの修飾を、ＤｓｉＲＮＡ剤に組み込むことができる。多数の修飾が存在する場合、それらは同じか、あるいは異なってもよい。塩基、糖部分、リン酸骨格、およびこれらの組み合わせへの修飾が企図される。５’末端のどちらかを、リン酸化することができる。
【０２１９】
リン酸骨格に企図される修飾の例には、メチルホスホネートを含むホスホネート、ホスホロチオエート、およびアルキルホスホトリエステル等のホスホトリエステル修飾等が含まれる。糖部分に企図される修飾の例には、２’−Ｏ−メチル等の２’−アルキルピリミジン、２’−フルオロ、アミノ、およびデオキシ修飾等が含まれる（例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：５８９−５９５を参照）。塩基基に企図される修飾の例には、脱塩基糖、２−Ｏ−アルキル修飾ピリミジン、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、および５−（３−アミノアリル）−ウラシル等が含まれる。ロックされた核酸、またはＬＮＡもまた、組み込むことができる。多くの他の修飾が既知であり、上記の基準が満たされる限り、使用することができる。修飾の例は、米国特許第５，６８４，１４３号、第５，８５８，９８８号、および第６，２９１，４３８号、ならびに米国公開特許出願第２００４／０２０３１４５  Ａ１号にも開示される。他の修飾は、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄＤｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：２９７−３１０）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄＤｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：１１７−２１）、Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：３３３−３４５）、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇ  Ｄｅｖ  １１：３１７−２５）、Ｖｏｒｏｂｊｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １１：７７−８５）に開示される。
【０２２０】
企図される１つ以上の修飾は、いずれの鎖にも組み込むことができる。ＤｓｉＲＮＡ剤における修飾の設置は、より大きな効力および安定性を与える、毒性を軽減する、ダイサー処理を亢進する、および免疫応答を最小限に抑えることを含む、ＤｓｉＲＮＡ剤の特徴に大きな影響を及ぼすことができる。一実施形態において、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖、または両方の鎖は、１個以上の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有する。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含有する。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドから成る３’オーバーハングを含有する。アンチセンス鎖はまた、さらなる２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドも含み得る。
【０２２１】
本発明のある実施形態において、抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡ剤は、以下の特性のうちの１つ以上を有する：（ｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は、非対称であり、例えば、アンチセンス鎖上に３’オーバーハングを有する、ならびに（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサーの結合および活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡのプロセシングの配向を導くために、センス鎖上に修飾された３’端を有する。本実施形態により、ｄｓＲＮＡの最も長い鎖は、２５〜３５個のヌクレオチド（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個のヌクレオチド）を含む。あるかかる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖が、２５〜３４個のヌクレオチドを含み、センス鎖の３’端が、アンチセンス鎖の５’端と平滑末端を形成する一方、アンチセンス鎖は、２６〜３５個のヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖の３’端上にオーバーハングを形成するように、非対称である。一実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖が２５〜２８個のヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は２５〜３０個のヌクレオチドを含むように、非対称である。故に、結果として生じるｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’端上にオーバーハングを有する。オーバーハングは、１〜４個のヌクレオチド、例えば、２個のヌクレオチドである。センス鎖はまた、５’リン酸を有し得る。
【０２２２】
他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、センス鎖の３’端に位置する好適な修飾因子によって、ダイサー処理のために修飾される、すなわち、ＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサーの結合およびプロセシングの配向を導くように設計される。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド等のヌクレオチド、および蛍光分子等の立体障害の分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖が２−ヒドロキシエトキシメチル基に置換されている。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドが含まれ得る。一実施形態において、デオキシヌクレオチドは、修飾因子として使用される。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、１〜３個のヌクレオチド修飾因子または２個のヌクレオチド修飾因子は、センス鎖の３’端上のリボヌクレオチドと置換される。立体障害の分子が使用される場合、それらをアンチセンス鎖の３’端のリボヌクレオチドに結合させる。故に、修飾因子の組み込みによって鎖の長さは、変化しない。別の実施形態において、本発明は、アンチセンス鎖のダイサー処理の配向を導くためにＤｓｉＲＮＡ剤内の２つのＤＮＡ塩基を置換することを企図する。本発明のさらなる実施形態において、２つの末端のＤＮＡ塩基が、センス鎖の３’端およびアンチセンス鎖の５’端上で二重鎖の平滑末端を形成するセンス鎖の３’端上の２つのリボヌクレオチドで置換され、２ヌクレオチドのＲＮＡオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’端に位置する。これは、平滑末端にＤＮＡ、およびオーバーハング端にＲＮＡ塩基を持つ、非対称の組成物である。
【０２２３】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤のセンスおよびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中に見出される条件等の生物学的条件下でアニーリングする。加えて、ＤｓｉＲＮＡ剤の、配列の一方、特に、アンチセンス鎖の領域は、少なくとも１９個のヌクレオチドの配列長を有し、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’端に隣接する２１ヌクレオチド領域中にあり、標的遺伝子から産生されるＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補的である。
【０２２４】
ＤｓｉＲＮＡ剤はまた、以下のさらなる特性のうちの１つ以上を有することができる：  （ａ）アンチセンス鎖が、典型的な２１ｍｅｒから右方シフトを有する（例えば、ＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡ内に推定されるダイサー切断部位の５’に伸長するアンチセンス鎖ヌクレオチドの長さを含み、かかるアンチセンス鎖ヌクレオチドは、センス鎖中の推定されるダイサー切断部位の３’を伸長するセンス鎖の対応するヌクレオチドで塩基対合する）、（ｂ）鎖は、完全に相補的でない可能性がある、すなわち、鎖は、単純ミスマッチ塩基対を含み得る（ある実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡのＫＲＡＳ阻害活性が、十分なレベルで保持される（例えば、ミスマッチ塩基対を有さない対応するＤｓｉＲＮＡと比較して、少なくとも５０％以上のＫＲＡＳ阻害活性、少なくとも６０％以上のＫＲＡＳ阻害活性、少なくとも７０％以上のＫＲＡＳ阻害活性、少なくとも８０％以上のＫＲＡＳ阻害活性、少なくとも９０％以上のＫＲＡＳ阻害活性、または少なくとも９５％以上のＫＲＡＳ阻害活性を保持する）という条件で、１、２、３、４、またはさらに５つもしくはそれ以上のミスマッチ塩基対を有する。ある実施形態において、ミスマッチ塩基対は、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とセンス鎖との間に存在する。いくつかの実施形態において、ミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖と標的ＲＮＡとの間に存在する（または存在することが予測される）。ある実施形態において、推定されるＡｇｏ２切断部位の標的ＲＮＡ配列において３’に位置する標的ＲＮＡ内のアンチセンス鎖残基と対応する残基との間のミスマッチ塩基対の存在が保持され、本発明のＤｓｉＲＮＡのＫＲＡＳ阻害活性を亢進し得る）、ならびに（ｃ）ロックされた核酸等の塩基修飾は、センス鎖の５’端に含まれ得る。「典型的な」２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡは、従来技術を用いて設計される。１つの技術において、一般的には様々な部位を、並行して試験するか、あるいは、同じ標的に特異的ないくつかの別のｓｉＲＮＡ二重鎖を含むプールにおいて、試薬のうちの１つが効果的であろうことを期待して試験する（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５５２：２４７−２５２）。他の技術は、活性ＲＮＡｉエフェクタ分子を得る可能性を増加させるために、設計規則およびアルゴリズムを使用する（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８、Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：２０９−２１６、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：９３６−９４８、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：３２６−３３０、Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：４２２３０−４２２３９、Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＮｕｃｌＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２（Ｗｅｂｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１３０−１３４、Ｂｏｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３９２：７３−９６）。ｓｉＲＮＡのハイスループット選択もまた、開発されている（米国公開特許出願第２００５／００４２６��１  Ａ１号）。可能性のある標的部位を、二次構造予測によって分析することもできる（Ｈｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３（３）：ｅ３０）。次いで、この２１ｍｅｒを使用して、２１ｍｅｒの５’端上に３〜９個の付加ヌクレオチドを含む右方シフトを設計する。これらの付加ヌクレオチドの配列は、制限されない。一実施形態において、不可リボヌクレオチドは、標的遺伝子の配列に基づく。本実施形態においても、標的配列とアンチセンスｓｉＲＮＡとの間に完全な相補性は、必要とされない。
【０２２５】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の第１および第２のオリゴヌクレオチドは、完全に相補的である必要はない。それらは、生物学的条件下でアニーリングし、標的配列に十分に相補的なｓｉＲＮＡを産生する、ダイサーの基質を提供するために、実質的に相補的であることのみを必要とする。ロックされた核酸、またはＬＮＡの核酸は、当業者には公知である（Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：４３９−４４７、Ｋｕｒｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１９１１−１９１８、Ｃｒｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：２４３５−２４４３、Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，２００１，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ８：１−７、Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６：２６８７−２６９５、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：５６３３−５６３８）。一実施形態において、ＬＮＡは、センス鎖の５’末端で組み込まれる。別の実施形態において、ＬＮＡは、アンチセンス鎖上に３’オーバーハングを含むように設計された二重鎖中のセンス鎖の５’末端に組み込まれる。
【０２２６】
ある実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、２５塩基対長を有するセンス鎖、および２塩基の３’オーバーハングを有する２７塩基対長を有するアンチセンス鎖を有する、非対称構造を有する。他の実施形態において、非対称構造を有する本ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖の３’端で、２個のリボヌクレオチドの代わりに２個のデオキシヌクレオチドをさらに含む。
【０２２７】
２つの別のオリゴヌクレオチドを含むあるＤｓｉＲＮＡ剤の組成物は、第３の構造によって連結することができる。第３の構造は、ＤｓｉＲＮＡ剤上でのダイサー活性を遮断せず、標的遺伝子から転写されるＲＮＡの誘導される分解を妨げない。一実施形態において、第３の構造は、化学的連結基であり得る。多くの好適な化学的連結基は、当技術分野において既知であり、使用することができる。代替的に、第３の構造は、２個のオリゴヌクレオチドをアニーリングして、ｄｓＲＮＡ組成物を作製する際に、ヘアピン構造が形成されるような様式で、ＤｓｉＲＮＡ剤の２個のオリゴヌクレオチドを連結するオリゴヌクレオチドであり得る。ヘアピン構造は、ＤｓｉＲＮＡ剤上のダイサー活性を遮断せず、ＫＲＡＳ  ＲＮＡの誘発される分解を妨げない。
【０２２８】
ある実施形態において、本発明の抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサーによるそのプロセシングを亢進する特性がいくつかある。かかる実施形態により、ＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサーによりプロセシングされて、ｓｉＲＮＡを産生するのに十分な長さ、および以下の特性のうちの少なくとも１つを有する：（ｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は、非対称であり、例えば、センス鎖上に３’オーバーハングを有する、ならびに（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサーの結合および活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡのプロセシングの配向を導くために、アンチセンス鎖上に修飾された３’端を有する。これらの実施形態により、ＤｓｉＲＮＡ剤中の最も長い鎖は、２５〜３０個のヌクレオチドを含む。一実施形態において、センス鎖は、２５〜３０個のヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、２５〜２８個のヌクレオチドを含む。故に、結果として生じるｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’端上にオーバーハングを有する。オーバーハングは、１〜４個のヌクレオチド、例えば、２個のヌクレオチド等である。アンチセンス鎖はまた、５’リン酸を有し得る。
【０２２９】
ある実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、センス鎖の３’端に位置する好適な修飾因子によって、ダイサー処理のために修飾される、すなわち、ＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサーの結合およびプロセシングの配向を導くように設計される。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド等のヌクレオチド、および蛍光分子等の立体障害の分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖が２−ヒドロキシエトキシメチル基に置換されている。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドが含まれ得る。一実施形態において、デオキシヌクレオチドは、修飾因子として使用される。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、１〜３個のヌクレオチド修飾因子または２個のヌクレオチド修飾因子は、センス鎖の３’端上のリボヌクレオチドと置換される。立体障害の分子が使用される場合、それらをアンチセンス鎖の３’端のリボヌクレオチドに結合させる。故に、修飾因子の組み込みによって鎖の長さは、変化しない。別の実施形態において、本発明は、ダイサー処理の配向を導くためにＤｓｉＲＮＡ剤内の２個のＤＮＡ塩基を置換することを企図する。さらなる発明において、アンチセンス鎖の５’端およびセンス鎖の３’端上で二重鎖の平滑末端を形成する２個のリボヌクレオチドの代わりに、２つの末端のＤＮＡ塩基が、センス鎖の３’端に配置され、２個のヌクレオチドのＲＮＡオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’端上に位置する。これは、平滑末端にＤＮＡ、およびオーバーハング端にＲＮＡ塩基を持つ、非対称の組成物である。
【０２３０】
ある他の実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’端に位置する好適な修飾因子によって、ダイサー処理のために修飾される、すなわち、ＤｓｉＲＮＡ剤は、ダイサーの結合およびプロセシングの配向を導くように設計される。好適な修飾因子には、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド等のヌクレオチド、および蛍光分子等の立体障害の分子が含まれる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖が２−ヒドロキシエトキシメチル基に置換されている。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）、ならびに、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドが含まれ得る。一実施形態において、デオキシヌクレオチドは、修飾因子として使用される。ヌクレオチド修飾因子が使用される場合、１〜３個のヌクレオチド修飾因子または２個のヌクレオチド修飾因子は、アンチセンス鎖の３’端上のリボヌクレオチドと置換される。立体障害の分子が使用される場合、それらをアンチセンス鎖の３’端のリボヌクレオチドに結合させる。故に、修飾因子の組み込みによって鎖の長さは、変化しない。別の実施形態において、本発明は、ダイサー処理の配向を導くためにＤｓｉＲＮＡ剤内の２個のＤＮＡ塩基を置換することを企図する。さらなる発明において、センス鎖の５’端およびアンチセンス鎖の３’端上で二重鎖の平滑末端を形成する２個のリボヌクレオチドの代わりに、２つの末端のＤＮＡ塩基が、アンチセンス鎖の３’端に配置され、２個のヌクレオチドのＲＮＡオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’端上に位置する。これはまた、平滑末端にＤＮＡ、およびオーバーハング端にＲＮＡ塩基を持つ、非対称の組成物である。
【０２３１】
センスおよびアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中に見出される条件等の生物学的条件下でアニーリングする。加えて、ＤｓｉＲＮＡ剤の、配列の一方、特に、アンチセンス鎖の領域は、少なくとも１９個のヌクレオチドの配列長を有し、これらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’端に隣接し、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補的である。
【０２３２】
さらに、ＤｓｉＲＮＡ剤構造は、ダイサーの切断から生じたオリゴヌクレオチドセグメントが、遺伝子発現を阻害するのに最も有効であるオリゴヌクレオチドの部分であることを確認するために、最適化することができる。例えば、本発明の一実施形態において、ＤｓｉＲＮＡ剤構造の２７−ｂｐオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を阻害すると予想される２１から２２−ｂｐセグメントを、アンチセンス鎖の３’端上に配置して、合成される。アンチセンス鎖の５’端上に位置する残りの塩基は、ダイサーによって切断され、廃棄される。この切断される部分は、相同（すなわち、標的配列の配列に基づいている）または非相同であり得、核酸鎖を伸長するために付加することができる。
【０２３３】
米国特許第２００７／０２６５２２０号は、２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡが、化学修飾が不在していても、同等の２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ組成物を上回って血清中の改善された安定性を示すことを開示している。上に詳述されるようなパターンにおいて、アンチセンス鎖の２’−Ｏ−メチルＲＮＡを含めること等のＤｓｉＲＮＡ剤の修飾は、５’リン酸の付加で結合される場合、ＤｓｉＲＮＡ剤の安定性を改善することができる。合成ＲＮＡ二重鎖の全ての鎖への５’リン酸の付加は、ある限定された程度のヌクレアーゼ安定性を与える、安価かつ生理学的方法である可能性がある。
【０２３４】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の化学修飾パターンは、かかる薬剤の有効性を亢進するように設計される。したがって、かかる修飾は、ＤｓｉＲＮＡ剤の効力を低下させるのを避ける、ＤｓｉＲＮＡ剤のダイサー処理を妨げるのを避ける、ＤｓｉＲＮＡ剤の生体液中における安定性を改善する（ヌクレアーゼ感受性を減少する）、または固有の免疫系による検出を遮断もしくは回避するように設計される。かかる修飾はまた、毒性がないように、本発明の本ＤｓｉＲＮＡ剤を製造する費用を増加させない、もしくは製造の容易さに影響を与えるように設計される。
【０２３５】
ＲＡＳ生物学および生物化学
変換は、それにより、細胞成長および分化の正常な制御が、通常、細胞成長および分化を調節する遺伝子の発現に影響を与える変異の蓄積を通して、妨害される。
【０２３６】
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）系は、受容体チロシンキナーゼの基質を特定するためのプロトタイプとしての役目を果たす。ある酵素は、ホスホリパーゼＣおよびホスファチジルイノシトール３’キナーゼ、Ｒａｓグアノシン三リン酸（ＧＴＰａｓｅ）活性化タンパク質（ＧＡＰ）、およびｓｒｃ様チオシンキナーゼを含むＰＤＧＦ受容体キナーゼによって活性化される。ＧＡＰは、２１ｋＤ  Ｒａｓタンパク質のＧＴＰａｓｅ活性を刺激することによってタンパク質の機能を調節する。Ｂａｒｂａｃｉｄ，５６  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７７９，１９８７。
ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞への腫瘍形成的に活性化されたＲａｓのマイクロインジェクションは、ＤＮＡ合成を誘発することが示されている。Ｒａｓの発癌性活性化を生じる変異は、分子の活性型のＧＴＰに結合させるＲａｓの累積をもたらす。これらの変異は、Ｒａｓを不活性型に変換するＧＡＰの能力を遮断する。ＲａｓのＧＡＰとの相互作用を損なう変異はまた、Ｒａｓの生物学的機能を遮断する。
【０２３７】
発癌に関与している多くのＲａｓ対立遺伝子（Ｎ−Ｒａｓ、ＫＲＡＳ、Ｈ−Ｒａｓ）が存在するが、ほとんどの場合、結腸および膵臓癌と関連しているタイプは、ＫＲＡＳである。ＫＲＡＳ対立遺伝子ｍＲＮＡのある領域を標的とする核酸分子はまた、Ｎ−ＲａｓおよびＨ−Ｒａｓ遺伝子の他の対立遺伝子ｍＲＮＡの機能への阻害を立証し得る。
【０２３８】
したがって、ＫＲＡＳを標的とするＤｓｉＲＮＡ剤の使用は、癌および／または増殖性疾患、状態、もしくは障害の治療、緩和、または予防を単独で、または他の治療薬と組み合わせて使用することができる新規の種類の治療剤を提供する。
【０２３９】
既知のヒトＫＲＡＳ遺伝子およびポリペプチド配列には、以下のものが含まれる：
野生型ＫＲＡＳ配列（配列番号１、Ｋ−Ｒａｓ４Ａ−転写物バリアントａ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０３３３６０．２）：
【化１４】
0006010458.tif 000413
【化１５】
0006010458.tif 000414
【化１６】
0006010458.tif 000415
【化１７】
0006010458.tif 000416
【０２４０】
上の下線を引いた配列は、本発明の例示的なＫＲＡＳ−３５５およびＫＲＡＳ−９４０  ＤｓｉＲＮＡ剤によって標的とされるＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列に対応する。上記のｃＤＮＡ配列内の周知のＳＮＰには、米国第２００５／０１７６０４５号に前述されるように、３６４位のＡ／Ｔ多型（ｄｂＳＮＰ受入番号ｒｓ１７８５１０４５）、８２４位のＴ／Ｃ多型（ｄｂＳＮＰ受入番号ｒｓ１１３７２８２）、および２１６位のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異Ｇ／Ｔ多型が含まれる。これらの３つの多型部位は、太字イタリック体で示される。
【０２４１】
生型ＫＲＡＳアミノ酸配列ＮＰ＿２０３５２４．１（配列番号２、ＮＭ＿０３３３６０の翻訳）：
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＲＶＥＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ
【０２４２】
生型ＫＲＡＳ配列（配列番号３、Ｋ−Ｒａｓ４−転写物バリアントｂ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００４９８５．３）：
【化１８】
0006010458.tif 000417
【化１９】
0006010458.tif 000418
【化２０】
0006010458.tif 000419
【化２１】
0006010458.tif 000420
【０２４３】
上の下線を引いた配列は、本発明の例示的なＫＲＡＳ−３５５およびＫＲＡＳ−９４０ＤｓｉＲＮＡ剤によって標的とされるＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列に対応する。上記のｃＤＮＡ配列内の周知のＳＮＰには、米国第２００５／０１７６０４５号に前述されるように、３６４位のＡ／Ｔ多型（ｄｂＳＮＰ受入番号ｒｓ１７８５１０４５）、７００位のＴ／Ｃ多型（ｄｂＳＮＰ受入番号ｒｓ１１３７２８２）、および２１６位のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異Ｇ／Ｔ多型が含まれる。これらの３つの多型部位は、太字イタリック体で示される。
【０２４４】
生型ＫＲＡＳアミノ酸配列ＮＰ＿００４９７６．２（配列番号４、ＮＭ＿００４９８５の翻訳）：
ＭＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮＨＦＶＤＥＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＶＩＤＧＥＴＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴＫＳＦＥＤＩＨＨＹＲＥＱＩＫＲＶＫＤＳＥＤＶＰＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬＰＳＲＴＶＤＴＫＱＡＱＤＬＡＲＳＹＧＩＰＦＩＥＴＳＡＫＴＲＱＧＶＤＤＡＦＹＴＬＶＲＥＩＲＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
【０２４５】
ｓｉＲＮＡ  ＫＲＡＳ阻害活性を評価するためのインビトロアッセイ
無細胞系のＲＮＡｉを反復するインビトロアッセイを用いて、ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列を標的とするＤｓｉＲＮＡコンストラクトを評価し、ひいては、ＤｓｉＲＮＡのＫＲＡＳに特異的な遺伝子阻害活性（本明細書において、ＫＲＡＳ阻害活性とも称する）を評価することができる。このアッセイは、ＫＲＡＳ  ＲＮＡを対象とするＤｓｉＲＮＡ剤と共に使用するために適している、Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７およびＺａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３によって記載される系を含む。シンシチウム胚盤葉に由来するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ抽出物を用いて、インビトロでＲＮＡｉ活性を再構築する。標的ＲＮＡは、適切なＫＲＡＳ発現プラスミドからＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写することにより、または化学合成によって作製する。センスおよびアンチセンスＤｓｉＲＮＡ鎖（例えば、それぞれ、２０ｕＭ）は、緩衝液（１００ｍＭ  酢酸カリウム、３０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ  酢酸マグネシウム等）中で、９０℃で１分間、次いで、３７℃で１時間インキュベートすることによりアニーリングさせ、次いで、緩衝液（例えば、１００ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  酢酸マグネシウム）で希釈する。アニーリングは、ＴＢＥ緩衝液中でアガロースゲル上でゲル電気泳動し、臭化エチジウムで染色することによりモニターすることができる。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ溶解物は、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｒハエからの０〜２時間齢の胚を用いて調製し、酵母糖蜜寒天上に回収し、絨毛膜を除去し、溶解する。溶解物を遠心分離し、上清を単離する。アッセイは、５０％  溶解物［ｖｏｌ／ｖｏｌ］、ＲＮＡ（１０〜５０ｐＭ  最終濃度）、およびＤｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ  最終濃度）を不空１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解緩衝液を含有する反応混合物を含む。反応混合物はまた、１０ｍＭ  クレアチンリン酸、１０ｕｇ／ｍＬ  クレアチンホスホキナーゼ、１００μＭのＧＴＰ、１００μＭのＵＴＰ、１００μＭのＣＴＰ、５００μＭのＡＴＰ、５ｍＭのＤＴＴ、０．１Ｕ／ｕＬのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１００μＭのそれぞれのアミノ酸を含む。酢酸カリウムの最終濃度は、１００ｍＭに調節する。反応は、氷上で予め組立て、ＲＮＡを添加する前に、２５℃で１０分間インキュベートし、２５℃でさらに６０分間インキュベートする。４倍容量の１．２５×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、反応を停止させる。標的ＲＮＡの切断は、ＲＴ−ＰＣＲ分析または当技術分野において公知の他の方法によりアッセイし、反応からＤｓｉＲＮＡが省略されている対照反応と比較する。
【０２４６】
代替的に、アッセイ用の内部標識した標的ＲＮＡを、［アルファ−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写により調製し、スピンクロマトグラフィーによりＧ５０Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムを通し、さらに精製することなく、標的ＲＮＡとして用いる。任意に、標的ＲＮＡは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて、５’−３２Ｐ端標識される。アッセイは、上述のように行い、標的ＲＮＡおよびＲＮＡｉにより生成する特異的ＲＮＡ切断産物を、ゲルのオートラジオグラフィーで可視化する。切断のパーセントは、無傷の対照ＲＮＡまたはＤｓｉＲＮＡなしの対照反応からのＲＮＡ、およびアッセイにより生成する切断産物を表すバンドをＰＨＯＳＰＨＯＲ  ＩＭＡＧＥＲ（登録商標）（オートラジオグラフィー）で定量することにより決定される。
【０２４７】
一実施形態において、このアッセイを用いて、ＤｓｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡｉ切断のためのＫＲＡＳ  ＲＮＡ標的の標的部位を決定し、標識した標的ＲＮＡの電気泳動によりアッセイ反応を分析することにより、またはノーザンブロット法により、ならびに当技術分野において公知の他の方法により、複数のＤｓｉＲＮＡコンストラクトを、ＫＲＡＳ  ＲＮＡ標的のＲＮＡｉ媒介性切断についてスクリーニングする。
【０２４８】
ある実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、例えば、好適な対照と比較して、ＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルの５０％減少が、系、細胞、組織、または生物体において観察される場合、ＫＲＡＳ阻害活性を有すると見なされる。本発明のＤｓｉＲＮＡのＫＲＡＳ阻害活性の決定のためのさらなる計量および結合は、上述される。
【０２４９】
ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡ剤の複合化および送達
ある実施形態において、本発明は、ＫＲＡＳ関連の疾患もしくは障害を患っている、またはＫＲＡＳ関連の疾患もしくは障害を発症する危険性がある対象を治療するための方法に関する。かかる実施形態において、ＤｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ関連疾患もしくは障害を制御するために新規の治療剤として機能し得る。該方法は、ＫＲＡＳ  ＲＮＡの発現、レベル、および／または活性を減少させるように、本発明の薬学的組成物を、患者（例えば、ヒト）を投与することを含む。ＫＲＡＳ  ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現、レベル、および／または活性はまた、該ＤｓｉＲＮＡが、ＫＲＡＳ転写物の非コード領域（例えば、標的５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ配列）を対象とする場合でさえも、本発明のＤｓｉＲＮＡによって減少され得る。それらの高特異性のために、本発明のＤｓｉＲＮＡは、任意に、多型対立遺伝子が、個人および／または集団内に存在する対立遺伝子特異的な様式で、細胞および組織のＫＲＡＳ配列を特異的に標的とすることができる。
【０２５０】
ＫＲＡＳ関連疾患もしくは障害の治療において、ＤｓｉＲＮＡを、対象の細胞もしくは組織、例えば、ＫＲＡＳの調節異常を示す、および／またはそうでなければ、ＫＲＡＳレベルの減少を標的とする、対象の細胞もしくは組織と接触させることができる。例えば、ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列の全てまたはその一部に実質的に同一のＤｓｉＲＮＡを、インビボまたはインビトロのいずれかで、このような細胞と接触させる、または導入され得る。同様に、ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列の全てまたはその一部に実質的に同一のＤｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ関連疾患もしくは障害を患っている、または発症する危険性がある対象に、直接投与され得る。
【０２５１】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の治療上の使用は、複数の異なるＤｓｉＲＮＡ剤配列を含むＤｓｉＲＮＡ剤の製剤の使用を含むことができる。例えば、今説明した薬剤のうちの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上を組み合わせて、例えば、ＫＲＡＳ  ＲＮＡの複数の異なる領域を標的とする、またはＫＲＡＳ  ＲＮＡを標的とするだけでなく、例えば、ＫＲＡＳ関連疾患もしくは障害と関連する細胞標的遺伝子を標的とする、製剤を製造することができる。本発明のＤｓｉＲＮＡ剤はまた、ＤｓｉＲＮＡ剤のどちらかの鎖が独立して、ＫＲＡＳ  ＲＮＡの２つ以上の領域を標的とするか、あるいは、ＤｓｉＲＮＡ剤の鎖の一方が、当技術分野において公知のＫＲＡＳの細胞標的遺伝子を標的とするように、構成され得る。
【０２５２】
標的核酸分子の１を超える領域を標的とする多官能性のＤｓｉＲＮＡ分子の使用はまた、ＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルおよび発現の強力な阻害を提供することもできる。例えば、本発明の単一の多官能性のＤｓｉＲＮＡコンストラクトは、同時に、ＫＲＡＳ−３５５およびＫＲＡＳ−９４０部位の両方を標的とすることができ、さらに、および／または代替的に、本発明の単一もしくは多官能性の薬剤は、別のスプライスバリアントを上回るＫＲＡＳの１つのスプライスバリアントを選択的に標的とするように設計することができる。
【０２５３】
故に、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、単独で、または他の薬物と組み合わせて、またはそれらと併せて、ＫＲＡＳ関連疾患もしくは障害を治療する、阻害する、減少させる、または予防するために使用することができる。例えば、ＤｓｉＲＮＡ分子は、対象に投与することができるか、または当業者には明らかな他の適切な細胞に、治療に対して好適な条件下で、単独で、または１つ以上の薬物と組み合わせて投与することができる。
【０２５４】
ＤｓｉＲＮＡ分子はまた、対象または生物体において、ＫＲＡＳ関連疾患もしくは障害を治療する、阻害する、減少させる、または予防するために、他の公知の治療と組み合わせて使用することができる。例えば、記載の分子は、当技術分野において公知のように、対象または生物体において、ＫＲＡＳ関連疾患もしくは障害を治療する、阻害する、減少させる、または予防するために、１つ以上の公知の化合物、治療、または手順と組み合わせて使用することができる。
【０２５５】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、（例えば、そのセンスまたはアンチセンス鎖のその５’または３’末端で）共役され得るか、または別の部分（例えば、ペプチド等の非核酸部分）、有機化合物（例えば、染色、コレステロール等）に非共役され得る。このように、ＤｓｉＲＮＡ剤の修飾は、細胞取り込みを改善するか、または対応する非共役ＤｓｉＲＮＡ剤と比較して、結果として生じるＤｓｉＲＮＡ剤誘導体の細胞の標的活性を亢進するか、細胞中のＤｓｉＲＮＡ剤誘導体を追跡するのに有用であるか、または対応する非共役ＤｓｉＲＮＡ剤と比較したＤｓｉＲＮＡ剤誘導体を改善する可能性がある。
【０２５６】
酸、ベクター、および宿主細胞を導入する方法
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、細胞中へ直接導入する（すなわち、細胞内）；または空洞、間質腔へと、有機体の循環へと、細胞外的に導入する、口腔的に導入することができるか、または細胞または有機体を核酸を含有する溶液に浸すことにより導入することができる。血管系またはリンパ系、および能脊髄液等の、脈管または脈管外の循環は、核酸を導入することができる部位である。
【０２５７】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、核酸を含有する溶液の注入、核酸により被覆される粒子による衝突、核酸の溶液中に細胞または有機体を浸すこと、または核酸の存在下での細胞質の電気穿孔法を含む、当技術分野において公知の核酸送達方法を用いて導入することができる。核酸を細胞に導入するための当技術分野において公知の他の方法が、例えば、脂質媒介担体輸送、化学的媒介搬送、およびリン酸カルシウム等のカチオン性リポソームトランスフェクション等が使用され得る。核酸は、以下の活性のうちの１つ以上を行う他の構成要素と共に導入され得る：細胞による核酸取り込みを増強する、またはそうでなければ、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡの阻害を増加させる。
【０２５８】
標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡを有する細胞は、生殖細胞系もしくは体性、分化全能性もしくは多能性、分裂もしくは非分裂、柔組織もしくは上皮、不死化もしくは形質転換等からのものであり得る。細胞は、幹細胞または分化細胞であり得る。分化した細胞型には、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、神経膠、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、および内分泌腺または外分泌腺の細胞が含まれる。
【０２５９】
特定の標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列および送達されるＤｓｉＲＮＡ剤の材料の用量に依存して、このプロセスは、ＫＲＡＳ  ＲＮＡの部分的なまたは完全な喪失を提供し得る。標的細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％もしくはそれ以上でのＲＮＡレベルまたは発現（ＫＲＡＳ  ＲＮＡ発現あるいは、コードされたポリペプチド発現のいずれか）の減少または喪失が、例示される。ＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルまたは発現の阻害とは、ＫＲＡＳ  ＲＮＡ、またはＫＲＡＳ  ＲＮＡコードされたタンパク質のレベルにおける不在（または観察可能な低下）を指す。特異性とは、細胞の他の遺伝子への明白な影響のない、ＫＲＡＳ  ＲＮＡを阻害する能力を示す。阻害の結果は、細胞または有機体の表面的特性の試験により、またはＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、遺伝子発現、マイクロアレイでのモニタリング、抗体結合、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、他の免疫アッセイ、および蛍光活性化細胞アッセイ（ＦＡＣＳ）等の生化学的技術により、確認することができる。本発明のＤｓｉＲＮＡ剤による標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列の阻害はまた、インビボあるいはインビトロのいずれかで、ＫＲＡＳ関連疾患もしくは障害、例えば、腫瘍形成、成長、転移等の発症／進行時、このようなＤｓｉＲＮＡ剤の投与効果に基づいて測定することもできる。治療および／または腫瘍または癌細胞レベルの減少は、腫瘍の成長もしくは癌細胞レベルの下落もしくは減少、または例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％もしくはそれ以上の減少を含むことができ、対数項において測定することもできる、例えば、癌細胞レベルの１０倍、１００倍、１０００倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍の減少が、細胞、組織、または対象への本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の投与によって達成され得る。
【０２６０】
細胞株または全生物におけるＲＮＡ媒介性阻害については、タンパク質産物が容易にアッセイされるレポーターまたは薬物耐性遺伝子の発現により測定することができる。かかるレポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、およびそれらの誘導体が含まれる。複数の選択可能なマーカーは、アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノスリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに対する耐性を付与することにより得られる。アッセイに依存して、遺伝子発現量の定量により、本発明に従って処理していない細胞と比較して、１０％、３３％、５０％、９０％、９５％、または９９％より大きな程度の阻害を判定することが可能である。
【０２６１】
注入した材料の用量が低いほど、およびＲＮＡサイレンシング剤の投与後の時間が長いほど、小さな割合の細胞において阻害が得られ得る（例えば、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％、または９５％）。細胞における遺伝子発現の定量は、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡの蓄積のレベル、または標的タンパク質の翻訳で同様の阻害量を示し得る。例として、阻害の有効性は、細胞内の遺伝子産物の量を評価することによって判定することができ、ＲＮＡは、阻害ＤｓｉＲＮＡに対して使われた領域外のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブを用いて検出することができるか、あるいは翻訳されたポリペプチドは、その領域のポリペプチド配列に対して生じた抗体で検出され得る。
【０２６２】
ＤｓｉＲＮＡ剤は、１細胞当たり少なくとも１つのコピーの送達を可能にする量で導入され得る。物質が高用量（例えば、細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００、または１０００コピー）であるほど、より効果的な阻害をもたらし得、低用量は、特異的適用に有用であり得る。
【０２６３】
学的組成物
ある実施形態において、本発明は、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤を含む薬学的組成物を提供する。ＤｓｉＲＮＡ剤試料を適切に配合し、十分な量の試料を細胞内に入れ、遺伝子サイレンシングをもし起こす場合には誘導することができる、いかなる手段によっても細胞の環境に導入することができる。ｄｓＲＮＡの多数の配合法が、当技術分野において公知であり、ｄｓＲＮＡが機能できるように標的細胞に進入させることができる限り、使用することができる。例えば、米国公開特許出願第２００４／０２０３１４５  Ａ１号および第２００５／００５４５９８  Ａ１号を参照されたい。例えば、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液、リポソーム、ミセル構造、および、カプシド中に配合することができる。カチオン性脂質を用いるＤｓｉＲＮＡ剤の配合は、ＤｓｉＲＮＡ剤の細胞へのトランスフェクションを促進するために使用されることができる。例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体等のカチオン性脂質、および、ポリリジン（本公開ＰＣＴ国際出願題ＷＯ９７／３０７３１号）等のポリカチオン性分子を使用することができる。好適な脂質には、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、またはＦｕＧｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ）が含まれ、これらの全ては、製造業者の指示に従って使用することができる。
【０２６４】
かかる組成物は、典型的には、核酸分子および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という語句は、薬学的投与に適合する、生理食塩水、溶媒体、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性剤および吸収遅延剤等が含まれる。補助的に活性な化合物もまた、組成物に組み込むこともできる。
【０２６５】
薬学的組成物は、その意図される投与経路に適合するように配合される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与等が含まれる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液には、以下の構成成分が含まれる：注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩等の緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロース等の張度調節用の薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調節され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、ガラスまたはプラスチック製の複数用量バイアルに入れることができる。
【０２６６】
注入用に好適な薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性）または懸濁液、および滅菌注射溶液または懸濁液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。静脈内投与について、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合おいて、組成物は、滅菌されていなければならず、注射しやすさが存在する程度まで流体であるべきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、溶媒、または例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）を含む分散媒、ならびにそれらの好適な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用、分散物の場合において必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、および塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射可能組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【０２６７】
滅菌注射溶液は、上に列挙した成分の１つまたはその組み合わせを有する適切な溶媒中に、必要な量の活性化合物を組み入れ、必要に応じて、滅菌濾過することによって調製することができる。概して、分散物は、活性化合物を、塩基性分散媒および上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と、予め滅菌濾過したその溶液からの任意のさらなる所望の成分との粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２６８】
経口組成物は、概して、不活性希釈剤または食用に適する担体を含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物を、賦形剤と共に組み込むことができ、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態で使用することができる。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして使用される液体担体を用いて調製することもできる。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は、いかなる以下の成分も、または同様の性質の化合物をも含むことができる：微結晶性セルロース、ゴムトラガカント、またはゼラチン等の結合剤；デンプンまたは乳糖等の賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）等の潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；蔗糖またはサッカリン等の甘味剤；またはペパーミント、メチルサリチル酸、またはオレンジ香料等の香料剤。
【０２６９】
吸入による投与においては、化合物は、例えば、二酸化炭素等の適切なスプレー用高圧ガスを含有する圧力容器またはディスペンサー、または噴霧器からのエアゾールスプレーの形態で送達される。かかる方法には、米国特許第６，４６８，７９８号に記載されるものが含まれる。
【０２７０】
全身投与もまた、経粘膜手段または経皮手段によってなされ得る。経粘膜または経皮投与においては、バリアを透過するのに適した浸透剤が製剤中に使用される。このような浸透剤は、当技術分野において一般的に公知であり、例えば、経粘膜投与においては、浄化剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体等を含む。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまた座薬の使用により達成することができる。経皮投与においては、活性化合物は、当技術分野において一般的に公知であるように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに配合される。
【０２７１】
化合物はまた、直腸送達のために、（例えば、ココアバターおよび他のグリセリド等の従来の坐薬基剤を有する）坐薬、または保持浣腸の形態で調製することもできる。
【０２７２】
化合物はまた、当技術分野において公知の方法を用いてトランスフェクションまたは感染させることによって投与することもでき、これには、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１８（６８９３），３８−９（流体力学的トランスフェクション）、Ｘｉａら（２００２），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（１０），１００６−１０（ウイルス媒介送達）、またはＰｕｔｎａｍ（１９９６），Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３（２），１５１−１６０，誤字  Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３（３），３２５（１９９６）に記載される方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７３】
化合物はまた、ＤＮＡワクチン等の核酸剤の投与に好適な方法によって投与することもできる。これらの方法には、遺伝子銃、バイオ注射器、および皮膚用添付剤、ならびに米国特許第６，１９４，３８９号に開示される微粒子ＤＮＡワクチン技術等の無針法、米国特許第６，１６８，５８７号に開示されるような、パウダー状ワクチンを有する哺乳動物経皮無針ワクチン投与が含まれる。さらに、とりわけ、Ｈａｍａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，８８（２），２０５−１０に記載されるような、経鼻送達も可能である。リポソーム（例えば、米国特許第６，４７２，３７５号に記載されるような）およびマイクロカプセル封入も使用することができる。生分解性標的化可能微粒子送達システムも使用することができる（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号に記載されるような）。
【０２７４】
一実施形態において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル封入送達システムを含む、制御放出製剤等の、体外への急速な排出から該化合物を保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。このような製剤は、標準的な技術を用いて調製することができる。該材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に得ることもできる。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞を標的としたリポソームを含む）を薬学的に許容される担体として用いることもできる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０２７５】
かかる化合物の毒性および治療上の有効性は、例えば、ＬＤ５０（個体群の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（個体群の５０％に治療上有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果の投与量の比は、治療指数であって、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を用いる可能性がある場合、感染していない細胞に与える可能性のある損傷を最小にし、それによって副作用を減少するように、罹患組織の部位へのこのような化合物を標的とする送達システムを設計するように、注意が払われなければならない。
【０２７６】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトで用いる投薬量範囲を処方する際に用いることができる。かかる化合物の投薬量は、毒性がほとんどないか、あるいは全くなく、かつＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあるのが好ましい。投薬量は、用いる投薬形態および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明の方法で使用される化合物に対しても、治療上有効な用量は、最初は、細胞培養アッセイから見積もることができる。用量は、細胞培養において判定されるように、ＩＣ５０（すなわち、症状の阻害が最大値の半分に達するときの試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲に達するように動物モデルにおいて処方され得る。かかる情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に判定することができる。血漿中濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０２７７】
本明細書で定義する場合、核酸分子の治療上有効な量（すなわち、有効投薬量）は、選択された核酸によって異なる。例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤をコードするプラスミドを選択する場合、約１ｐｇ〜１０００ｍｇの範囲の単一用量が投与され得る；いくつかの実施形態において、１０、３０、１００、もしくは１０００ｐｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００ｎｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００μｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００ｍｇが投与され得る。いくつかの実施形態において、１〜５ｇの組成物を投与することができる。組成物は、１日に１回〜１回以上、１週間に１回以上投与することができ、これには、２日に１回が含まれる。当業者は、いくつかの要因が、疾患もしくは障害の重症度、治療歴、対象の全般的な健康状態および／もしくは年齢、および罹患する他の疾患が含まれるが、これらに限定されない、対象を有効に治療するのに必要とされる用量および時間に影響を与え得ることを認識されよう。さらに、治療上有効な量のタンパク質、ポリペプチド、または抗体による対象の治療は、単回の治療を含むことができるか、または、好ましくは、一連の治療を含むことができる。
【０２７８】
本発明の核酸分子は、例えば、Ｘｉａら（２００２）、上記を参照に記載されるものが含まれるが、これに限定されない、当技術分野において公知の方法を用いて、発現コンストラクト、例えば、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセット、またはプラスミドウイルスベクターに挿入することができる。発現コンストラクトは、例えば、吸入、経口、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，３０５４−３０５７）によって、対象に送達することができる。送達ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤に含まれ得るか、または送達ビヒクルが包埋される徐放性マトリックスを含み得る。代替的に、完全な送達ベクターは、組み換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターからそのまま生産し得る場合に、薬学的調製物は、遺伝子送達システムを生産する１個以上の細胞を含み得る。
【０２７９】
発現コンストラクトは、適切な発現システムで用いるのに好適なコンストラクトであり得、当技術分野において公知であるように、レトロウイルスベクター、線形発現カセット、プラスミドおよびウイルス、またはウイルス由来のベクターが含まれるが、これらに限定されない。かかる発現コンストラクトは、１つ以上の誘導プロモーター、Ｕ６  ｓｎＲＮＡプロモーターもしくはＨ１  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター等のＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター系、または当技術分野において公知の他のプロモーターが含まれ得る。かかるコンストラクトは、ｓｉＲＮＡの１つまたは両方の鎖を含むことができる。両方の鎖を発現する発現コンストラクトはまた、両方の鎖に連結するループ構造を含むことができるか、またはそれぞれの鎖を同じコンストラクト内の分離プロモーターから別々に転写することもできる。それぞれの鎖はまた、別々の発現コンストラクト、例えば、Ｔｕｓｃｈｌ（２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：５００−５０５）から転写することもできる。
【０２８０】
ＤｓｉＲＮＡ剤を細胞の環境に導入する方法は、細胞の種類およびその環境の作製によって異なることを認識され得る。例えば、細胞が液体内に見出される場合、１つの好ましい製剤は、リポフェクタミン等の液体製剤を伴い、ＤｓｉＲＮＡ剤は、細胞の液体環境に直接付加することができる。脂質製剤はまた、静脈内、筋肉、または腹腔内注射によるか、あるいは経口または吸入または当技術分野において公知の他の方法によって動物に投与することもできる。この製剤が、哺乳動物、およびさらに具体的には、ヒト等の動物への投与に好適である場合、製剤はまた薬学的に許容される。オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容される製剤は公知であり、使用することができる。場合によっては、ＤｓｉＲＮＡ剤を緩衝液または食塩溶液中に配合し、配合されたＤｓｉＲＮＡ剤を細胞内に、卵母細胞を用いる研究と同様に、直接注入することが好ましい場合がある。ＤｓｉＲＮＡ剤二重鎖の直接注入も、行われ得る。ｄｓＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤）を導入する好適な方法については、米国公開特許出願第２００４／０２０３１４５  Ａ１号を参照されたい。
【０２８１】
ＤｓｉＲＮＡ剤の好適な量を、導入しなければならず、これらの量は、標準的な方法を用いて実験的に判定することができる。典型的には、細胞の環境中の個々のＤｓｉＲＮＡ剤種の有効濃度は、５０ナノモル以下、１０ナノモル以下であり、１ナノモル以下の濃度の組成物を使用することができる。別の実施形態において、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下の濃度、およびさらに１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、または１ピコモル以下の濃度を利用する方法を、多くの状況において使用することができる。
【０２８２】
十分な量のＤｓｉＲＮＡ剤が細胞に侵入して、その効果を発揮することができるように、ＤｓｉＲＮＡ剤組成物を配合するという条件で、細胞が生存可能な細胞外マトリックスにＤｓｉＲＮＡ剤組成物を付加することによって、該方法を行うことができる。例えば、該方法は、液体培地または細胞増殖培地等の液体に存在する細胞、組織外植片、または哺乳動物および特にヒト等の動物を含む全生物で使用するのに適している。
【０２８３】
ＫＲＡＳ  ＲＮＡのレベルまたは活性は、現在当技術分野において公知の、または後に開発される好適な方法によって判定することができる。標的ＲＮＡおよび／または標的ＲＮＡの発現を測定するのに使用される方法は、標的ＲＮＡの性質に依存し得ることが認識できる。例えば、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ配列が、タンパク質をコードする場合、「発現」という用語は、（ゲノムあるいは外因性起源のいずれかの）ＫＲＡＳ遺伝子に由来するタンパク質またはＫＲＡＳ  ＲＮＡ／転写物を指す。このような場合には、ＫＲＡＳ  ＲＮＡ／転写物の量を直接測定することによって、またはＫＲａｓタンパク質の量を測定することによって、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡの発現を、測定することができる。タンパク質は、例えば、染色またはイムノブロッティングによって、あるいはタンパク質が測定可能な反応を触媒する場合、反応速度を測定するによって、タンパク質アッセイで測定することができる。全てのこのような方法は、当技術分野において公知であり、使用することができる。標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルが測定される場合には、ＲＮＡレベルを検出するための当技術分野において認識される方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット法等）を使用することができる。本発明のＤｓｉＲＮＡ剤を用いたＫＲＡＳ  ＲＮＡの標的化において、ＤｓｉＲＮＡ剤の有効性の測定を用いて、対象、組織、細胞内、インビトロあるいはインビボのいずれか、または細胞抽出物において、ＫＲＡＳ  ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを減少させる際、ＫＲＡＳ関連の表現型（例えば、疾患もしくは障害、例えば、癌、または腫瘍の、形成、成長、転移、もしくは広がり等）の減少の程度を判定することもできる。上記の測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物、または他の好適な供給源物質に対して行うことができる。
【０２８４】
ＫＲＡＳ  ＲＮＡの発現が減少しているかどうかの判定は、信頼性がありＲＮＡレベルの変化を検出することができる好適な方法によるものであり得る。典型的には、この判定は、ＤｓｉＲＮＡ剤の少なくとも一部が細胞質に侵入するように、細胞環境内に、未消化ＤｓｉＲＮＡを導入し、次いで、標的ＲＮＡのレベルを測定することによって行われる。同じ測定を、同一の未処理細胞に対して行い、それぞれの測定から得られた結果を比較する。
【０２８５】
ＤｓｉＲＮＡ剤は、薬理学的に有効な量のＤｓｉＲＮＡ剤および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物として配合することができる。薬理学的または治療上有効な量とは、意図する薬理学的、治療的、または予防的結果を得るのに有効なＤｓｉＲＮＡ剤の量を指す。「薬理学的に有効な量」および「治療上有効な量」という語句は、意図する薬理学的、治療的、または予防的結果を得るのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、所与の臨床的治療が、疾患または障害と関連する測定可能なパラメータの少なくとも２０％減少すると有効であると見なされる場合、疾患または障害の治療のための薬物の治療上有効な量は、そのパラメータを少なくとも２０％減少をもたらすのに必要な量である。
【０２８６】
本発明の好適に配合された薬学的組成物は、静脈内、筋内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、直腸、膣、および局所（頬側および舌下を含む）投与を含む非経口経路等の当技術分野において公知の手段によって、投与することができる。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、静脈内または腹腔内注入または注射によって投与される。
【０２８７】
一般に、ｄｓＲＮＡの好適な投薬量単位は、１日当たり、受容者のキログラム体重当たり０．００１〜０．２５ミリグラムの範囲内、または１日当たり、キログラム体重当たり０．０１〜２０マイクログラムの範囲内、または１日当たり、キログラム体重当たり０．０１〜１０マイクログラムの範囲内、または１日当たり、キログラム体重当たり０．１０〜５マイクログラムの範囲内、または１日当たり、キログラム体重当たり０．１〜２．５マイクログラムの範囲内である。ｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物は、毎日１回投与することができる。しかしながら、治療剤は、１日の間に適切な間隔で投与される、２、３、４、５、６またはそれ以上の副用量を含有する投薬量単位で投薬され得る。その場合、それぞれの副用量に含有するｄｓＲＮＡは、総１日投薬量単位に達するため、それに応じて、より低量でなければならない。投薬量単位はまた、例えば、数日の期間にわたってｄｓＲＮＡを、持続し、一貫して放出するような従来の徐放製剤を用いて、数日間にわたって単一用量用に調合され得る。徐放製剤は、当技術分野において公知である。本実施形態において、投薬量単位は、対応する複数の１日用量を含有する。この製剤にかかわらず、薬学的組成物は、治療すべき動物またはヒトにおいて、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量でｄｓＲＮＡを含有しなければならない。組成物は、複数単位のｄｓＲＮＡを伴う合計が十分な用量を含む、このような方法で、調合することができる。
【０２８８】
データを、細胞培養アッセイおよび動物研究から得て、ヒトに対する好適な投薬量範囲を処方することができる。本発明の組成物の投薬量は、毒性がほとんどないか、あるいは全くない、（公知の方法によって判定されるように）ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、用いる投薬形態および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明の方法で使用される化合物に対しても、治療上有効な用量は、最初は、細胞培養アッセイから見積もることができる。用量は、細胞培養において判定されるように、ＩＣ５０（すなわち、症状の阻害が最大値の半分に達するときの試験化合物の濃度）を含む化合物の循環血漿濃度の範囲に達するように動物モデルにおいて処方され得る。かかる情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に判定することができる。血漿中のｄｓＲＮＡ濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィー等の標準的な方法によって測定され得る。
【０２８９】
薬学的組成物は、投与のための取扱説明書と共に、キット、容器、パック、またはディスペンサーに含むことができる。
【０２９０】
療方法
本発明は、ＫＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ転写物および／もしくはＫＲａｓタンパク質レベルの誤調節および／もしくは上昇）によって、全体または一部において、引き起こされる疾患または障害の危険性がある（またはそれに対する感受性がある）対象を治療する、またはＫＲＡＳの選択的標的化によって治療可能な、予防的および治療的方法の両方を提供する。
【０２９１】
本明細書で使用する「治療」または「治療する」とは、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を治癒する、癒す、軽減する、緩和する、変化させる、修復する、寛解する、改善する、または影響を及ぼすことを目的とする、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害になりやすい傾向を有する患者への治療剤（例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤または同じコードのベクターまたは導入遺伝子）の適用もしくは投与、または患者由来の単離された組織または細胞株への治療剤の適用もしくは投与として定義される。
【０２９２】
一態様において、本発明は、対象における、対象に治療剤（例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤または同じコードのベクターまたは導入遺伝子）を投与することによって、上述のような疾患もしくは障害を予防するための方法（例えば、ＫＲＡＳ発現の阻害によって対象内での事象を形質転換する開始の予防を含む）を提供する。疾患の危険性がある対象は、例えば、本明細書に記載されるような、診断的または予後判定的アッセイの１つ、またはその組み合わせによって確定することができる。予防薬の投与は、疾患もしくは障害が予防される、または代替的に、その進行を遅延させるように、例えば、対象における癌、または疾患もしくは障害を特徴とする症状の兆候を検出する前に行うことができる。
【０２９３】
本発明の別の態様は、治療的に、対象を治療する、すなわち、疾患もしくは障害の症状の発症を変化させる方法に関する。これらの方法は、（例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤を用いて細胞を培養することによって）インビトロで、または代替的に、（例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤を対象に投与することによって）インビボで行うことができる。
【０２９４】
治療の予防的および治療的方法の両方に関して、このような治療を、薬理ゲノム学の分野から得られた知識に基づいて特別に個別化すること、または修正することができる。本明細書で使用する場合、「薬理ゲノム学」とは、臨床開発中および上市されている薬物への、遺伝子シークエンシング、統計遺伝的および遺伝子発現解析等のゲノム学の技術の適用を指す。より具体的には、この用語は、患者の遺伝子がいかにして、その人の薬物に対する反応性を判定するか（例えば、患者の「薬物反応性表現型」または「薬物反応性遺伝子型」）の研究を指す。故に、本発明の別の態様は、本発明の標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡ分子あるいは標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡモジュレータのいずれかによる個体の予防的または治療的処置を、その個体の薬物反応性遺伝子型に従って個別化するための方法を提供する。薬理ゲノム学により、臨床医または医師が、治療によって最大の利益を得ると考えられる患者に予防的または治療的処置を標的化し、有害な薬物関連副作用を生じると考えられる患者への治療を避けることが可能になる。
【０２９５】
治療剤は、適切な動物モデルにおいて試験することができる。例えば、本明細書に記載されるＤｓｉＲＮＡ剤（または同じコードの発現ベクターまたは導入遺伝子）を、動物モデルに使用して、該薬剤による治療の、有効性、毒性、または副作用を判定することができる。代替的に、薬剤（例えば、治療剤）を動物モデルに使用して、このような薬剤の作用機構を判定することができる。
【０２９６】
ＲＡＳ  ｍＲＮＡレベルおよび発現の下方調節を評価するのに有用なモデル
細胞培養
Ｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０，５５３−５５８は、変異したＫＲＡＳ遺伝子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによってヒト膵臓癌細胞株の成長阻害を記載している。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポソームを用いて形質変換細胞にトランスフェクトされた。細胞増殖、ＫＲＡＳ  ｍＲＮＡ発現、およびＫＲａｓタンパク質合成は全て、エンドポイントとして評価された。Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，１５５，１５３−１６１は、高血管形成活性および転移能を特徴とする別のヒト膵臓癌細胞株、ＨＯＲ−Ｐ１を記載している。この細胞株の遺伝および分子解析は共に、テロメラーゼ活性の増加およびＫＲＡＳ癌遺伝子の変異を示した。
【０２９７】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、例えば、以下の手順を用いて、インビボでの切断活性について試験することができる。本発明のＤｓｉＲＮＡ剤によって標的とされるＫＲＡＳ  ｃＤＮＡ内のヌクレオチド配列を、上のＫＲＡＳ配列に示す。
【０２９８】
本発明のＤｓｉＲＮＡ試薬は、ＨｅＬａまたは他の哺乳動物細胞を用いて細胞培養中で試験して、ＫＲＡＳ  ＲＮＡおよびＫＲａｓタンパク質阻害の程度を決定することができる。ＤｓｉＲＮＡ試薬（例えば、図１および４、ならびに上記の構造を参照）は、本明細書に記載されるように、ＫＲＡＳ標的に対して選択される。ＫＲＡＳ  ＲＮＡ阻害は、例えば、培養中で培養したＨｅＬａ細胞または他の形質転換したもしくは形質転換しない哺乳動物細胞に、好適なトランスフェクション剤によるこれらの試薬の送達後、測定される。標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡの相対量は、増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング（例えば、ＡＢＩ  ７７００  ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））を用いて、アクチンまたは他の適切な対照と比べて測定される。比較は、同じ全長および化学反応を有するが、それぞれの位置でランダムに置換された非関連標的またはランダム化ＤｓｉＲＮＡ対照、または単に適切なビヒクル処理されたもしくは処置されない対照に作製されたオリゴヌクレオチド配列の混合物に対して行われる。一次および二次リード試薬は、標的に対して選択され、最適化が行われる。最適なトランスフェクション剤濃度を選択した後、阻害のＲＮＡ経時変化が、リードＤｓｉＲＮＡ分子を用いて行われる。
【０２９９】
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）およびｍＲＮＡのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
総ＲＮＡを、例えば、大規模な抽出用にＡｍｂｉｏｎ  Ｒｎａｑｕｅｏｕｓ  ４−ＰＣＲ精製キット、または９６ウェルアッセイ用Ａｍｂｉｏｎ  Ｒｎａｑｕｅｏｕｓ−９６精製キットを用いて、ＤｓｉＲＮＡの送達後、細胞から調製する。Ｔａｑｍａｎ分析については、例えば、５’端で共有結合したレポータ色素ＦＡＭまたはＶＩＣ、および３’端に共役したクエンチャー色素ＴＡＭＡＲＡを用いて、二重標識したプローブを合成する。１段階ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、例えば、１０ｕＬ  総ＲＮＡ、１００ｎＭ  順方向プライマー、１００ｍＭ  逆方向プライマー、１００ｎＭ  プローブ、１×ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応緩衝液（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｕＭ  各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、０．２Ｕ  ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．０２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ならびに０．２Ｕ  Ｍ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から成る５０ｕＬの反応物を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ検出器上で実施される。サーマルサイクリング条件は、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間、続いて、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サイクルから成り得る。標的ＫＲＡＳ  ｍＲＮＡレベルの定量は、段階希釈された全細胞ＲＮＡ（３００、１００、３０、１０ｎｇ／反応）から作製した標準と比較して判定され、例えば、並行あるいは同じ管のＴａｑＭａｎ反応のいずれかで、３６Ｂ４  ｍＲＮＡに対して正規化される。
【０３００】
ウエスタンブロット法
核抽出物は、標準マイクロ調製技術（例えば、Ａｎｄｒｅｗｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｌｅｒ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，２４９９）を用いて調製することができる。上清からのタンパク質抽出物を、例えば、ＴＣＡ沈殿を用いて調製する。等体積の２０％ＴＣＡを細胞上清に添加し、氷上で１時間インキュベートし、５分間遠心分離してペレット化する。ペレットをアセトン中で洗浄し、乾燥させ、水に再懸濁させる。細胞タンパク質抽出物は、１０％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰａｇｅ（核抽出物）または４〜１２％  Ｔｒｉｓ−グリシン（上清抽出物）ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、ニトロセルロース膜に移す。非特異的結合は、例えば、５％脱脂乳と一緒に１時間、続いて、一次抗体と一緒に４℃で１６時間インキュベートすることによって、遮断することができる。洗浄後、二次抗体を例えば、（１：１０，０００希釈）室温で１時間適用し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてシグナルを検出する。
【０３０１】
いくつかの細胞培養系において、カチオン性脂質は、培養中の細胞へのオリゴヌクレオチドの生物学的利用能を高めることが示されている（Ｂｅｎｎｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４１，１０２３−１０３３）。一実施形態において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、細胞培養実験のためのカチオン性脂質と複合体を形成する。ＤｓｉＲＮＡとカチオン性脂質の混合物が、細胞に添加する直前に、無血清ＤＭＥＭ中で調製される。添加物に加えてＤＭＥＭを室温（約２０〜２５℃）まで温め、カチオン性脂質を最終の所望濃度に添加し、溶液を簡単にボルテックス撹拌する。ＤｓｉＲＮＡ分子を、最終の所望の濃度に添加し、溶液を再度、簡単にボルテックス撹拌し、室温で１０分間インキュベートする。用量反応性実験において、ＲＮＡ／脂質複合体は、ＤＭＥＭで段階希釈し、続いて、１０分間のインキュベートを行う。
【０３０２】
物モデル
動物モデルにおいて、抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡ剤の有効性を評価することは、ヒト臨床試験に対する重要な必要条件である。当技術分野において公知の、癌、および／または増殖性疾患、状態、もしくは障害の様々な動物モデルは、治療上の使用のためにＫＲＡＳ遺伝子発現を調節する際に、本発明のＤｓｉＲＮＡ組成物の有効性を予め臨床的な評価するための使用に適し得る。
【０３０３】
細胞培養モデル等と同様に、ほとんどのＲａｓ感受性のマウス腫瘍異種移植片は、変異Ｒａｓタンパク質を発現する癌細胞に由来するものである。Ｈ−Ｒａｓを形質転換した膀胱癌細胞異種移植片を担持するヌードマウスは、抗Ｒａｓアンチセンス核酸に対して感受性があり、３１日間の治療期間後、腫瘍成長の８０％阻害をもたらす（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，２００１，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，３５−３５）。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７，２０４１は、ＫＲＡＳ変異（ＫＲＡＳ  コドン１２  ＧＧＴからＧＴＴ；それぞれ、Ｈ４４１細胞およびＨ１７２５細胞）を標的とする抗ＫＲＡＳリボザイムアデノウイルスベクター（ＫＲｂｚ−ＡＤＶ）を記載する。変異ＫＲａｓタンパク質を発現する非小細胞癌細胞（ＮＳＣＬＣ  Ｈ４４１およびＨ１７２５細胞）が、関連変異を欠くＮＳＣＬＣ  Ｈ１６５０細胞と比較して、ヌードマウス異種移植片に使用された。ＫＲｂｚ−ＡＤＶによる前処理により、Ｈ４４１およびＨ１７２５細胞の両方の移植を完全に廃棄し、未処理腫瘍細胞または対照ベクターを受容した動物における１００％  移植および腫瘍成長と比較した。ＫＲＡＳ誤調節／変異のさらなるマウスモデルも記載されている（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １２１：８２３−８３５において、これは、肺腺癌を亢進する際に、ＫＲＡＳの役割を特定する）。上記の研究は、抗Ｒａｓ剤によるＲａｓ発現（例えば、ＫＲＡＳ発現）の発現は、動物における腫瘍成長の阻害を生じる証拠を提供する。
【０３０４】
このようにして、これらのモデルは、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の有効性を評価する際に、他のＫＲＡＳ関連表現型、疾患もしくは障害等の、ＫＲＡＳレベル、発現、腫瘍／癌の形成、成長、広がり、発展を阻害する際に使用することができる。これらのモデルおよび他のものは、同様に、予め薬が使用される状況において、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の安全性／毒性、および有効性を評価するために使用することができる。
【０３０５】
ＫＲＡＳを標的とする本発明のＤｓｉＲＮＡを評価するのに有用な動物モデル系の特定の例には、野生型マウス、同所ＨＣＣ異種移植片腫瘍モデルマウス（例えば、Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２）、および播種性メラノーマモデルマウスが含まれる。例示的なインビボ実験において、本発明のＤｓｉＲＮＡは、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量でこのようなマウスモデルに尾静脈注入されるか、または代替的に、反復投与が、単回投与のＩＣ５０レベルで投与され、臓器（例えば、肝臓、腎臓、肺、膵臓、結腸、皮膚、脾臓、骨髄、リンパ節、乳房脂肪体等）を、最終用量を投与してから２４時間後に採取する。次いで、かかる臓器を、使用したモデルに依存して、マウスおよび／またはヒトＫＲＡＳレベルについて評価する。作用の持続時間はまた、例えば、最終ＤｓｉＲＮＡ投与の１、４、７、１４、２１日後またはそれ以降に、検査することもできる。
【０３０６】
本発明の実施には、別途指示がない限りは、化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養、および遺伝子組み換え生物学の通常の技術を使用し、これは、当技術分野の技術内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，定期的な更新を含む）、Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）、Ａｎａｎｄ，１９９２、Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，１９９１、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、Ｊａｋｏｂｙ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，１９７９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＯｆＡｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＶｏＩｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）、Ｒｉｏｔｔ，���ｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）、Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．，Ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｏｏｋ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ），（４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２０００）を参照されたい。
【０３０７】
別途定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価の方法および材料を、本発明の実施形態の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料について以下に説明する。本明細書において言及されるあらゆる刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照することによって組み込まれる。矛盾が生じる場合には、定義を含み、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、単に説明的なものであり、限定を意図したものではない。
【０３０８】
実施例
本発明は、以下の実施例を参照することにより記載され、これは、例示のために提供され、本発明のいかなる様式においても限定することを意図しない。当技術分野において公知の標準的な技術、または以下に具体的に記載される技術を使用した。
【０３０９】
実施例１：抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡ設計
好ましい抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡ剤は、ＤｓｉＲＮＡの予めスクリーニングされた集団から選択された。ＤｓｉＲＮＡの設計は、任意に、配列の領域にわたる多くの可能なＤｓｉＲＮＡの予測される活性／有効性のコンピュータ内での評価を行う予測的スコアリングアルゴリズムの使用を含むことができる。
【０３１０】
実施例２：二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチド合成および精製
ＤｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡメッセージ中の種々の部位、例えば、本明細書に記載されるＲＮＡ配列内の標的配列と相互作用するよう設計することができる。今例示した薬剤において、２つの標的ＫＲＡＳ配列が選択された。ＤｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖の配列は、上述した標的ＫＲＡＳ部位配列に相補的であった。ＤｓｉＲＮＡ分子は、本明細書に記載される方法を用いて化学的に合成された。概して、ＤｓｉＲＮＡコンストラクトは、１９〜２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡについて記載されるように、固相オリゴヌクレオチド合成方法を用いて合成された（例えば、Ｕｓｍａｎらの米国特許第５，８０４，６８３号、第５，８３１，０７１号、第５，９９８，２０３号、第６，１１７，６５７号、第６，３５３，０９８号、第６，３６２，３２３号、第６，４３７，１１７号、第６，４６９，１５８号、Ｓｃａｒｉｎｇｅらの米国特許第６，１１１，０８６号、第６，００８，４００号、第６，１１１，０８６号を参照）。
【０３１１】
個々のＲＮＡ鎖を合成し、標準的な方法に従って、ＨＰＬＣ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）で精製した。例えば、標準的な技術を用いて、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、固相ホスホラミダイト化学を用いて合成し、脱保護し、ＮＡＰ−５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ．）上で脱塩した（Ｄａｍｈａ  ａｎｄ  Ｏｌｇｉｖｉｅ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２０：８１−１１４、Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：２６７７−８４）。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑカラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ．）上で、１５分間の過程、線形勾配を用いたイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥ−ＨＰＬＣ）を用いて、オリゴマーを精製した。勾配は、９０：１０の緩衝液Ａ：Ｂから５２：４８の緩衝液Ａ：Ｂに変化させ、ここで、緩衝液Ａは、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５であり、緩衝液Ｂは、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、１Ｍ  ＮａＣｌであった。試料を、２６０ｎｍでモニターし、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークを回収し、プールし、ＮＡＰ−５カラム上で脱塩し、凍結乾燥した。
【０３１２】
それぞれのオリゴマーの純度を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＰＡＣＥ５０００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆ．）上でのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定した。ＣＥキャピラリーは、１００μｍの内径を有し、ｓｓＤＮＡ  ＩＯＯＲ  Ｇｅｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含有した。典型的には、約０．６ナノモルのオリゴヌクレオチドをキャピラリー中に注入し、４４４Ｖ／ｃｍの電場中で泳動させて、２６０ｎｍでの紫外線吸光度によって検出した。変性Ｔｒｉｓ−ホウ酸−７Ｍ−尿素泳動緩衝液を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒより購入した。以下に記載される実験において使用するため、ＣＥによって評価される場合に、少なくとも９０％の純度のオリゴリボヌクレオチドを得た。製造業者推奨のプロトコルに従って、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ（商標）Ｂｉｏｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって、化合物の同一性を検証した。全てのオリゴマーの相対的分子量は、多くの場合、期待される分子量の０．２％以内で得られた。
【０３１３】
二重鎖の調製
一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）オリゴマーを、例えば、１００ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５から成る二重鎖緩衝液中、１００μＭの濃度で再懸濁した。相補的なセンスおよびアンチセンス鎖を、等モル量で混合し、例えば、５０μＭ  二重鎖の最終溶液を得た。試料を、ＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中で、１００℃で５分間加熱し、使用前に室温まで冷却させた。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）オリゴマーを−２０℃で保存した。一本鎖ＲＮＡオリゴマーを凍結乾燥して保存するか、またはヌクレアーゼを含まない水中、−８０℃で保存した。
【０３１４】
命名法
一貫性のため、以下の命名法を、本明細書において使用する。二重鎖に与えられる名前は、オリゴマーの長さおよびオーバーハングの存在または不在を示す。「２５／２７」は、２塩基の３’オーバーハングを持つ、２５塩基センス鎖および２７塩基アンチセンス鎖を有する非対称二重鎖である。「２７／２５」は、２７塩基センス鎖および２５塩基アンチセンス鎖を有する非対称二重鎖である。
【０３１５】
細胞培養およびＲＮＡトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞をＡＴＣＣから得、１０％  ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）中に、３７℃、５％  ＣＯ２下で、維持した。ＲＮＡトランスフェクションのために、ＨｅＬａ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者の指示に従って、１ｎＭまたは０．１ｎＭの最終濃度で示されるように、ＤｓｉＲＮＡとトランスフェクトした。簡潔には、２．５μＬの０．２μＭまたは０．０２μＭのそれぞれのＤｓｉＲＮＡのストック溶液を、４６．５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸと混合した。結果として生じる５０μＬの混合物を、１２ウェルプレートの個々のウェルに加え、室温で２０分間インキュベートし、ＤｓｉＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸの複合体を形成させた。一方で、ＨｅＬａ細胞をトリプシン化し、３６７細胞／μＬの最終濃度で、培地中に再懸濁した。最後に、４５０μＬの細胞懸濁液を、それぞれのウェル（最終容積５００μＬ）に加え、プレートを、２４時間インキュベーターに静置した。
【０３１６】
ＫＲＡＳ阻害の評価
ＫＲＡＳ標的遺伝子ノックダウンを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸのみ（ビヒクル対照）または未処理のものを含む、ＨＰＲＴ発現対照の処理に対して値を正規化して、ｑＲＴ−ＰＣＲによって判定した。
【０３１７】
ＲＮＡ単離および分析
細胞を、２ｍＬのＰＢＳで１回洗浄し、総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、３０μＬの最終容積で溶出した。１μｇの総ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  １ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）およびランダム六量体を用いて逆転写した。結果として生じるｃＤＮＡのうちの１／３０（０．６６μＬ）を、３．３３μＬのＨ２Ｏおよび１μＬの３μＭ  ヒト遺伝子ＨＰＲＴ−１（受入番号ＮＭ＿０００１９４）およびＫＲＡＳ標的配列に対して特異的なプライマーおよびプローブを含む混合物と共に、５μＬのＩＱ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｏｗｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と混合した。
【０３１８】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
Ｃ１０００  Ｔｈｅｒｍａｌサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を搭載する、ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍを、増幅反応のために使用した。ＰＣＲ条件は、９５℃で３分間、次いで、９５℃で１０秒間でのサイクリング、５５℃で１分間の４０サイクルのあった。それぞれの試料は三重で試験された。相対的なＨＰＲＴ  ｍＲＮＡレベルは、ＫＲＡＳ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化され、トランスフェクション試薬のみで処理された対照試料、または未処理されたもので得たｍＲＮＡレベルと比較した。データは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒバージョン１．０ソフトウェアを用いて分析した。
【０３１９】
実施例３：ＫＲＡＳ−３５５を標的としたＫＲＡＳのＤｓｉＲＮＡ阻害
上述のように、ＫＲＡＳを標的とするＤｓｉＲＮＡ分子を設計し、合成し、阻害有効性についてＨｅＬａ細胞を試験した。ＫＲＡＳ発現を阻害するために、端構造の変化を有するが、一般に、同じＫＲＡＳ  ｃＤＮＡ標的配列（５’−ＡＧＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＴＧＣＡＡＴ−３’（配列番号１４７））を対象とするＤｓｉＲＮＡ剤の能力は、対応するＫＲＡＳ標的配列を対象とする２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡと比較して評価された（試験した抗ＫＲＡＳ剤の構造については、図１を参照）。このような実験を行うために、トランスフェクション時に、細胞が７０〜９０％コンフルエントとなるように、ＨｅＬａ細胞を、５，０００〜７，５００細胞／ウェル、１００μＬ／ウェルで、９６ウェルプレート中にトランスフェクションする約２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、アニーリングしたＤｓｉＲＮＡを、５０μＬ／ウェルの容積のトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温で２０分間インキュベートした。ＤｓｉＲＮＡのトランスフェクション混合物を細胞に添加し、１５０μＬの容積の、１ｎＭ（図２）または１００ｐＭ（図３）の最終ＤｓｉＲＮＡ濃度を得た。それぞれのＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合物を、３重のＤｓｉＲＮＡ処理のために３つのウェルに添加した。細胞を、ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合物の連続的存在下で、３７℃で、２４時間インキュベートした。２４時間において、処理した細胞のそれぞれのウェルからＲＮＡを調製した。まず、トランスフェクション混合物を有する上清を、除去して廃棄し、次いで、細胞を溶解し、それぞれのウェルからＲＮＡを調製した。処理後の標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルを、ビヒクル処理した対照のために得られたものに対して値を正規化して、ＫＲＡＳ標的遺伝子に対してｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。３重のデータを平均化し、それぞれの処理についての標準偏差を判定した。正規化データをグラフに表し、ｓｉＲＮＡおよびビヒクルまたは未処理の対照と比較して、活性なＤｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少倍率を判定した。
【０３２０】
図２に示されるように、試験した２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ剤（ＤＰ１１４８Ｐ／ＤＰ１１５１Ｇ）は、１ｎＭ  濃度で、試験された図１の全ての他の薬剤と同じＫＲＡＳ標的配列を対象とし、標的ＫＲＡＳ転写配列内で同じ推定されるＡｇｏ２切断部位を共有する、最適化された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ（ＤＰ１１５８Ｐ／ＤＰ１１５９Ｇ  ｓｉＲＮＡ）よりも、有意にＫＲＡＳ阻害有効性を高めることを示した（かかるＡｇｏ２切断部位のアラインメントは、ＲＩＳＣ活性のレベルを変化させるのに起因し得る変動に対して正規化される）。とりわけ、試験した２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡのダイサー酵素切断は、試験した「最適化された」２１ｍｅｒと全く同じ「最適化された」２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡを生成することが推定され、得られた結果は、ＤｓｉＲＮＡ剤が、対応するｓｉＲＮＡ剤を超える特別な有効性／効力の利点を有することを強調している。同様に、１ｎＭ  濃度での劇的な結果が、同様に、ＫＲＡＳ−３５５配列を対象とする平滑／平滑および平滑／ほつれの端構造を有する２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡと比較して、ＫＲＡＳ−３５５配列を対象とする２７ｍｅｒの平滑／平滑と２７ｍｅｒの平滑／ほつれのＤｓｉＲＮＡ剤の両方で観察された。故に、再現性良く試験された２５／２７ｍｅｒおよび２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡは、同時に試験した対応する２１ｍｅｒ薬剤と比較して、標的ＫＲＡＳ転写物に対して増加した阻害有効性を呈した。実際には、１ｎＭ  濃度で試験した全ての２５／２７ｍｅｒおよび２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡは、驚くほどに、同じ濃度で試験した全ての２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも優れていた。
【０３２１】
堅固な阻害有効性はまた、１００ｐＭ  濃度での抗ＫＲＡＳ−３５５ＤｓｉＲＮＡ剤に対して観察された（図３）。試験した２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ剤（ＤＰ１１４８Ｐ／ＤＰ１１５１Ｇ）は、１００ｐＭ  濃度で、ＫＲＡＳ同じＫＲＡＳ−３５５標的配列を対象とする最適化された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ（ＤＰ１１５８Ｐ／ＤＰ１１５９Ｇ  ｓｉＲＮＡ）よりも、阻害有効性が有意に高いことを示した。同様に、１００ｐＭ  濃度での劇的な結果が、平滑／ほつれの端構造を有する対応する２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡと比較して、ＫＲＡＳ−３５５配列を対象とする２７ｍｅｒの平滑／ほつれのＤｓｉＲＮＡ剤で観察された。２７ｍｅｒの平滑／平滑剤は、２１ｍｅｒの平滑／平滑剤の有効性と比較して、２７ｍｅｒの平滑／平滑剤の有効性の明らかな強化が１００ｐＭ  濃度で統計的に有意ではなかったとしても、試験した対応する２１ｍｅｒの平滑／平滑剤と少なくとも同等には有効であった。故に、再現性良く試験された２５／２７ｍｅｒおよび２７ｍｅｒの平滑／ほつれのＤｓｉＲＮＡは、１００ｐＭで同時に試験した対応する２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ剤と比較して、標的ＫＲＡＳ転写物に対して増加した阻害有効性を呈した。
【０３２２】
実施例４：  ＫＲＡＳ−９４０を標的としたＫＲＡＳのＤｓｉＲＮＡ阻害
上述のように、ＫＲＡＳを標的とするＤｓｉＲＮＡ分子を設計し、合成し、実施例３の記載されるように、阻害有効性についてＨｅＬａ細胞を試験した。ＫＲＡＳ発現を阻害するために、端構造の変化を有するが、一般に、同じＫＲＡＳ  ｃＤＮＡ標的配列（５’−ＴＡＴＴＡＧＣＡＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＡＣＣＴＡ−３’（配列番号１７９））を対象とするＤｓｉＲＮＡ剤の能力は、対応するＫＲＡＳ標的配列を対象とする２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡと比較して評価された（試験した抗ＫＲＡＳ剤の構造については、図４を参照）。図５に示されるように、試験した２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ剤（ＤＰ１１３６Ｐ／ＤＰ１１３９Ｇ）は、１ｎＭ  濃度で、試験された図４の全ての他の薬剤と同じＫＲＡＳ標的配列を対象とし、標的ＫＲＡＳ転写配列内で同じ推定されるＡｇｏ２切断部位を共有する、最適化された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ（ＤＰ１１４６Ｐ／ＤＰ１１４７Ｇ  ｓｉＲＮＡ）よりも、有意にＫＲＡＳ阻害有効性を高めることを示した（かかるＡｇｏ２切断部位のアラインメントは、ＲＩＳＣ活性のレベルを変化させるのに起因し得る変動に対して正規化される）。とりわけ、試験した２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡのダイサー酵素切断は、試験した「最適化された」２１ｍｅｒと全く同じ「最適化された」２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡを生成することが推定され、得られた結果は、ＤｓｉＲＮＡ剤が、対応するｓｉＲＮＡ剤を超える特別な有効性／効力の利点を有することを強調している。同様に、１ｎＭ  濃度での劇的な結果が、同様に、ＫＲＡＳ−９４０配列を対象とする平滑／平滑および平滑／ほつれの端構造を有する２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡと比較して、ＫＲＡＳ−９４０配列を対象とする２７ｍｅｒの平滑／平滑と２７ｍｅｒの平滑／ほつれのＤｓｉＲＮＡ剤の両方で観察された。故に、再現性良く試験された２５／２７ｍｅｒおよび２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡは、同時に試験した対応する２１ｍｅｒ薬剤と比較して、標的ＫＲＡＳ転写物に対して強化された阻害有効性を呈した。実際には、１ｎＭ  濃度で試験した全ての２５／２７ｍｅｒおよび２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡは、予想外に、同じ濃度で試験した全ての２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも優れていた。
【０３２３】
堅固な阻害有効性はまた、１００ｐＭ  濃度で、抗ＫＲＡＳ−９４０  ＤｓｉＲＮＡ剤に対して観察された（図６）。試験した２５／２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡ剤（ＤＰ１１３６Ｐ／ＤＰ１１３９Ｇ）は、１００ｐＭ  濃度で、同じＫＲＡＳ−９４０標的配列を対象とする最適化された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ（ＤＰ１１４６Ｐ／ＤＰ１１４７Ｇ  ｓｉＲＮＡ）よりも、ＫＲＡＳ阻害有効性が有意に高いことを示した。同様に、１００ｐＭ  濃度での劇的な結果が、平滑／平滑および平滑／ほつれの端構造を有する対応する２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡと比較して、ＫＲＡＳ−９４０配列を対象とする２７ｍｅｒの平滑／平滑および平滑／ほつれのＤｓｉＲＮＡ剤で観察された。故に、再現性良く試験された２５／２７ｍｅｒおよび２７ｍｅｒの平滑／平滑および平滑／ほつれのＤｓｉＲＮＡは、１００ｐＭで同時に試験した対応する２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ剤と比較して、標的ＫＲＡＳ転写物に対して増加した阻害有効性を呈した。実際には、１００ｐＭ  濃度で試験した全ての抗ＫＲＡＳ−９４０  ２５／２７ｍｅｒおよび２７ｍｅｒのＤｓｉＲＮＡは、予想外に、同じ濃度で試験した全ての２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも優れていた。
【０３２４】
実施例５：ＫＲＡＳのさらなるＤｓｉＲＮＡ阻害
アンチセンス鎖配列番号１１〜５０を有し、ＫＲＡＳ野生型配列を標的とする表３に示される４０個のＤｓｉＲＮＡ分子（代替／多型配列を標的とする表３のＤｓｉＲＮＡは、試験されなかった）を、上述のように設計し、合成し、上の実施例３に記載されるように、阻害有効性についてＨｅＬａ細胞において試験した。ＫＲＡＳ発現を阻害するこれらのＤｓｉＲＮＡ剤の能力は、対応するＫＲＡＳ標的配列を対象とする２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡと比較して評価した（試験した対応する抗ＫＲＡＳ２１ｍｅｒ剤のアンチセンス鎖については、表２を参照し、実験の略図については、図７を参照）。全てのＤｓｉＲＮＡ剤は、ＫＲＡＳ阻害剤として有効性を示し、４０個の試験したＤｓｉＲＮＡ剤のうちの３５個が、ＫＲＡＳ標的の５０％減少を超えることを示した。図８に示されるように、試験した５個のうち４個のＤｓｉＲＮＡ同族ｓｉＲＮＡ対については、ＤｓｉＲＮＡ剤が、同族ｓｉＲＮＡ剤よりもＫＲＡＳ標的のレベルの減少において有意に優れた有効性を呈した。このような阻害有効性の持続はまた、１ｎＭおよび５ｎＭの濃度で試験して、投与してから２４時間および４８時間後の両方で検査された。４０個のＤｓｉＲＮＡ同族ｓｉＲＮＡ対のうちの２６個については、ＤｓｉＲＮＡ剤は、試験した全ての濃度および期間で、対応する同族ｓｉＲＮＡ剤よりも統計的に有意なＫＲＡＳ標的阻害の強化レベルを示した（図９）。この結果は、同族ｓｉＲＮＡ剤が、ＤｓｉＲＮＡ剤よりも優れており、４０例のうちわずか６例と好対照であった（図９）。故に、統計的に有意な差異が、ＫＲＡＳ標的ＲＮＡにわたって、ＤｓｉＲＮＡと、一致した同族ｓｉＲＮＡ（整列した推定されるＡｇｏ２切断部位を有する）の間で観察された。このＤｓｉＲＮＡは、大差で、同族ｓｉＲＮＡよりも劇的かつ予想外に優れていた。重要なことに、これらの結果は、ＤｓｉＲＮＡ活性がｓｉＲＮＡ活性と直接相関せず、その逆もなかったことを示した。したがって、上の結果は、ＤｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡが、ＲＮＡ干渉機構に異なって関与し、ＤｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡがともに二本鎖ＲＮＡを含むにもかかわらず、異なる薬物であることを示した。
【０３２５】
図１０および１１に示されるように、これらの４０個のＫＲＡＳを標的とする非対称ＤｓｉＲＮＡのうちの２９個について、ＩＣ５０値を決定した。著しいことに、これらの２９個の非対称ＤｓｉＲＮＡのうちの１５個は、１０ｐＭを下回るＩＣ５０値呈し、これらのＤｓｉＲＮＡの著しい効力をさらに立証した。
【０３２６】
実施例６：  ＫＲＡＳ阻害のために２４３個の選択されたＫＲＡＳを標的とするＤｓｉＲＮＡのアッセイ
本実施例において、２４３個の非対称ＤｓｉＲＮＡ（ここで、上記のように、試験したＤｓｉＲＮＡは、２５／２７ｍｅｒ構造を有した）を構成し、１ｎＭの濃度で、このようなＤｓｉＲＮＡの存在下でインキュベートしたヒトＨｅＬａおよびマウスＨｅｐａ  １−６細胞におけるＫＲＡＳ阻害有効性について試験した。試験した２４３個の非対称ＤｓｉＲＮＡは、上の表２〜５から選択されるＤｓｉＲＮＡのサブセットを含み、ヒトＫＲＡＳ、マウスＫＲＡＳ、または両方の特異的な配列を標的とするように設計される非対称ＤｓｉＲＮＡの追加のセットも含んだ。これらの追加の２４３個の非対称ＤｓｉＲＮＡの配列および構造を表８に示す。
【０３２７】
表８：  ヒトＨｅＬａおよびマウスＨｅｐａ１−６細胞において試験された追加の抗ＫＲＡＳ非対称（２５／２７ｍｅｒ）のＤｓｉＲＮＡ剤の構造
【表３９８】
0006010458.tif 000421
【表３９９】
0006010458.tif 000422
【表４００】
0006010458.tif 000423
【表４０１】
0006010458.tif 000424
【表４０２】
0006010458.tif 000425
【表４０３】
0006010458.tif 000426
【表４０４】
0006010458.tif 000427
【表４０５】
0006010458.tif 000428
【表４０６】
0006010458.tif 000429
【表４０７】
0006010458.tif 000430
【表４０８】
0006010458.tif 000431
【表４０９】
0006010458.tif 000432
【表４１０】
0006010458.tif 000433
【表４１１】
0006010458.tif 000434
【表４１２】
0006010458.tif 000435
【表４１３】
0006010458.tif 000436
【表４１４】
0006010458.tif 000437
【表４１５】
0006010458.tif 000438
【表４１６】
0006010458.tif 000439
【表４１７】
0006010458.tif 000440
【表４１８】
0006010458.tif 000441
【表４１９】
0006010458.tif 000442
【表４２０】
0006010458.tif 000443
【表４２１】
0006010458.tif 000444
【表４２２】
0006010458.tif 000445
【表４２３】
0006010458.tif 000446
【表４２４】
0006010458.tif 000447
【０３２８】
上の表２〜５と同様に、上表８の下線を引いたヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル修飾残基を示し、リボヌクレオチド残基を大文字として示し、一方デオキシリボヌクレオチド残基を小文字として示す。
【０３２９】
１ｎＭでのヒトＨｅＬａおよびマウスＨｅｐａ１−６細胞の上の２４３個のＫＲＡＳを標的とするＤｓｉＲＮＡのアッセイは、表９に示される、以下のＫＲＡＳ阻害効力を示した。ＫＲＡＳレベルは、ＫＲＡＳ転写物内の異なる位置に位置付けられた対のｑＰＣＲアッセイを用いて、決定した（ＨｅＬａ細胞実験については、ｑＰＣＲアッセイは、「Ｈｓ  ＫＲＡＳ２６８−３８５（ＭＡＸ）」および「Ｈｓ  ＫＲＡＳ３３９３−３５１６（ＦＡＭ）」として示され、Ｈｅｐａ１−６細胞実験については、かかるアッセイは、「Ｍｍ  ＫＲＡＳ２７９−３９０（ＭＡＸ）」および「Ｍｍ  ＫＲＡＳ１０６４−１１６１（ＦＡＭ）」として示される）。
【０３３０】
【表４２５】
0006010458.tif 000448
【表４２６】
0006010458.tif 000449
【表４２７】
0006010458.tif 000450
【表４２８】
0006010458.tif 000451
【表４２９】
0006010458.tif 000452
【表４３０】
0006010458.tif 000453
【表４３１】
0006010458.tif 000454
【表４３２】
0006010458.tif 000455
【０３３１】
表９に示されるように、検査した２４３個の非対称ＤｓｉＲＮＡのうちの１０３個は、ヒトＫＲＡＳレベルを判定するために用いられるｑＰＣＲアッセイの両方において、１ｎＭでＨｅＬａ細胞中のヒトＫＲＡＳレベルの７０％を超える減少を示した。これらの１０３個のＤｓｉＲＮＡのうち３７個は、ヒトＫＲＡＳレベルを判定するために用いられるｑＰＣＲアッセイの両方において、１ｎＭでＨｅＬａ細胞中のヒトＫＲＡＳレベルの８０％を超える減少を呈した。細胞の環境において、１ｎＭでマウスＨｅｐａ１−６細胞中のマウスＫＲＡＳレベルを阻害することも可能な多くの非対称ＤｓｉＲＮＡはまた、かかるアッセイにおいても特定された。
【０３３２】
次いで、上記の実験の１２０個の非対称ＤｓｉＲＮＡは、二次アッセイ（「２相」）において検査され、かかるアッセイの結果を、図１２〜３１のヒストグラム形態で示した。具体的には、上述の試験した２４３個から選択される１２０個の非対称ＤｓｉＲＮＡは、ヒトＨｅＬａ細胞の環境において、１ｎＭ、０．１ｎＭ、および０．１ｎＭ（０．１ｎＭは、各ＫＲＡＳ標的非対称ＤｓｉＲＮＡのための重複する独立したアッセイにおいて実施された）でのヒトＫＲＡＳの阻害に対して評価された（図１２〜２１）。これらの１２０個の非対称ＤｓｉＲＮＡはまた、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において、１ｎＭ、０．１ｎＭ、および０．１ｎＭ（再度、０．１ｎＭは、各ＫＲＡＳ標的非対称ＤｓｉＲＮＡのための重複する独立したアッセイにおいて実施された）でのマウスＫＲＡＳの阻害に対して評価された。図１２〜２１に示されるように、著しい数の非対称ＤｓｉＲＮＡが、ＨｅＬａ細胞の環境においてアッセイされる場合、１００ｐＭで堅固なヒトＫＲＡＳ阻害有効性を呈した。加えて、図２２〜３１に示されるように、多くのこれらの非対称ＤｓｉＲＮＡはまた、マウスＨｅｐａ１−６細胞の環境において評価されたとき、１ｎＭで堅固なマウスＫＲＡＳ阻害有効性を示した。（一方、ヒトＫＲＡＳ特異的阻害非対称ＤｓｉＲＮＡもまた、特定された。）
【０３３３】
実施例７：付加的な好ましいＤｓｉＲＮＡによるＫＲＡＳの阻害
示されるように、センスおよびアンチセンス鎖配列を有し、ＫＲＡＳ野生型配列（および、適用可能な場合、バリアント配列）を標的とする、表４〜５に示される、残りのＤｓｉＲＮＡ分子は、上述のように設計および合成され、上記の実施例３および６に記載されるように、阻害有効性に対してＨｅＬａ細胞において（および、任意に、マウスＨｅｐａ１−６細胞において）試験される。これらのＤｓｉＲＮＡ剤のＫＲＡＳ発現を阻害する能力は、任意に、対応するＫＲＡＳ標的配列を対象とする２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡと比較して評価される（表２のｓｉＲＮＡ配列を密集させるために使用される方法と同一の２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡの特定方法は、表４〜６のＤｓｉＲＮＡに適用することができる）。表４〜６の残りの選択されたＤｓｉＲＮＡ剤は、ＫＲＡＳ阻害剤としての有効性を示すことが期待され、有意な数の試験したＤｓｉＲＮＡ剤は、１ｎＭおよび１００ｐＭでＫＲＡＳ標的の５０％を超える減少を呈することが予想された。表２〜３のＤｓｉＲＮＡ剤で見られるように、ＤｓｉＲＮＡの相当の大部分は、同族ｓｉＲＮＡ剤に対するＫＲＡＳ標的レベルを減少する有効性の測定によって決定して、同族ｓｉＲＮＡ対よりも優れていることが期待される。かかる阻害有効性の持続時間はまた、試験した０．１ｎＭ、１ｎＭ、および５ｎＭの濃度で、投与してから２４時間後、および４８時間後に検査される。上述のように、有意なＤｓｉＲＮＡの大部分は、効力および効果の持続時間の測定によって判定されるように、そのｓｉＲＮＡ対よりも優れていることが期待される。
【０３３４】
実施例８：適応症
ＫＲＡＳ研究における本知識体系は、研究的、診断的、および治療的使用のために、ＫＲＡＳ活性をアッセイするための方法、およびＫＲＡＳ発現を調節することができる化合物に対する必要性を示す。本明細書に説明されるように、本発明の核酸分子をアッセイに用いて、ＫＲＡＳレベルに関連する疾患状態を診断することができる。加えて、核酸分子を用いて、ＫＲＡＳの誤調節、およびレベル等に関連する疾患状態を治療することができる。
【０３３５】
ＫＲＡＳ発現の調節と関連することができる特定の障害および疾患状態としては、癌および／または増殖疾患、状態、または障害、ならびに、単独で、もしくは他の治療薬と組み合わせて、細胞または組織におけるＫＲＡＳのレベルと関連するか、または応答する他の疾患、状態、または障害が挙げられるが、これらに限定されない。ＫＲＡＳ発現の調節に関連する特定の変性状態および疾患状態としては、例えば、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、膵臓癌、乳癌、および前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３６】
ゲムシタビンおよびシクロホスファミドは、本発明の核酸分子（例えば、ＤｓｉＲＮＡ分子）と組み合わせるか、または併せて用いることができる、化学療法剤の制限されない例である。当業者は、抗癌化合物等の他の薬物および治療薬が、同様に、本発明の核酸分子（例えば、ＤｓｉＲＮＡ分子）と容易に組み合わせることができ、かつ、したがって、本発明の範囲内であることを認識するであろう。かかる化合物および治療薬は、当該技術分野において、周知であり（例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，ｅｄｓ  Ｄｅｖｉｔａ，Ｖ．Ｔ．，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳＡを参照）、抗葉酸剤、フロロピリミジン、シタラビン、プリン類似体、アデノシン類似体、アムサクリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、アントラピラゾール、レチノイド、抗生物質（ブレオマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン、およびミトラマイシン等）、ヘキサメチルメラミン、ダカルバジン、１−アスパラギナーゼ、白金類似体、アルキル化剤（ナイトロジェン・マスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、イホスファミド、４−ヒドロペルオキシシクロホスファミド、ニトロソウレア、チオテパ等）、植物由来化合物（ビンカ・アルカロイド、  エピポドフィロトキシン、タクソール等）、タモキシフェン、放射線療法、手術、栄養補助食品、遺伝子療法、放射線治療（３Ｄ−ＣＲＴ等）、抗毒素療法（リシン、単クローン抗体ハーセプチン等）等が挙げられるが、これらに限定されない。組み合わせ療法では、本発明の核酸は、２つの方法のうちの１つで調製される。第１に、薬剤は、静脈内投与のための溶液中のリポソームおよびイホスファミドに封入される本発明の核酸の混合物等の核酸および化学療法剤の調製の際に物理的に組み合わされ、両方の薬剤は、治療上有効な濃度（例えば、１０００〜１２５０ｍｇ／ｍ２／日を送達するための溶液中のイホスファミド、および０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日を送達するための同一の溶液中のリポソーム関連核酸）で存在する。代替的には、薬剤は、別個であるが、それらの相対する有効量（例えば、本発明の１０００〜１２５０ｍｇ／ｍ２／日のイホスファミド、および０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の核酸）で同時に投与される。
【０３３７】
当業者は、本明細書に説明される疾患および状態を治療するために用いられる他の化合物および治療薬が、同様に、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）と組み合わせることができ、かつ、したがって、本発明の範囲内であることを認識するであろう。
【０３３８】
実施例９：ＤｓｉＲＮＡの血清安定性
ＤｓｉＲＮＡ剤の血清安定性は、３７℃で、種々の期間（最大２４時間）の間、５０％のウシ胎仔血清中のＤｓｉＲＮＡ剤の培養を介して評価される。血清は、抽出され、核酸は、２０％の非変性ＰＡＧＥ上で分離され、Ｇｅｌｓｔａｒ染色で可視化される。ヌクレアーゼ分解からの相対的保護レベルは、ＤｓｉＲＮＡに対して評価される（任意に、調節を有する、または有さない）。
【０３３９】
実施例１０：ＫＲＡＳ遺伝子発現の下方調節を評価するためのさらなる細胞培養モデルの使用
種々のエンドポイントは、抗Ｒａｓ剤による治療後のＲａｓ媒介効果を確認するために、細胞培養モデルにおいて使用されている。表現型エンドポイントは、細胞増殖の阻害、ＲＮＡ発現、およびＲａｓタンパク質発現の減少を含む。ＫＲＡＳ癌遺伝子変異が、ある腫瘍細胞の増殖の増加と直接関連するため、細胞培養アッセイの増殖エンドポイントは、好ましくは、一次スクリーンとして用いられる。このエンドポイントを測定することができる種々の方法が存在する。ＤｓｉＲＮＡによる細胞の処理後、細胞は、細胞生存、細胞ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジンの組み込み、および／または細胞密度を測定した後に、成長させられる（典型的には、５日間）。細胞密度のアッセイは、市販の蛍光核酸染色（Ｓｙｔｏ（登録商標）またはＣｙＱｕａｎｔ（登録商標）等）を使用して、９６ウェルフォーマットで行うことができる。二次確証的エンドポイントとして、ＤｓｉＲＮＡの媒介による、ＫＲａｓタンパク質発現の減少は、ＫＲａｓ特異的ＥＬＩＳＡを用いて評価することができる。
【０３４０】
実施例１１：ＫＲＡＳ誤調整のマウスモデルにおける抗ＫＲＡＳＤｓｉＲＮＡ有効性の評価
インビトロアッセイから選択した抗ＫＲＡＳ  ＤｓｉＲＮＡはさらに、例えば、異種移植片を含むマウスモデル、および上記に列挙する他の動物モデルにおいて試験することができる。一例において、誤調節された（例えば、上昇した）ＫＲＡＳレベルを有するマウスは、流体力学的尾静脈注射を介して本発明のＤｓｉＲＮＡ剤が投与される。群当たり３〜４匹のマウス（試験した特異的ＤｓｉＲＮＡ剤に基づき分割）は、５０μｇまたは２００μｇのＤｓｉＲＮＡが注入される。ＫＲＡＳ  ＲＮＡのレベルは、ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて評価される。さらに、または代替的に、ＫＲａｓのレベル（例えば、ＫＲａｓタンパク質レベルおよび／または癌細胞／腫瘍形成、成長または広がり）は、当技術分野において認識される方法を用いて評価することができるか、またはＫＲＡＳの誤調節と関連する表現型（例えば、腫瘍形成、成長、転移等）は、（任意に、ＫＲＡＳ転写またはＫＲａｓタンパク質レベルの測定のための代用として）モニターされる。かかる動物モデルにおける活性ＤｓｉＲＮＡはまた、その後、標準的化学療法と組み合わせて試験することもできる。
【０３４１】
実施例１２：診断的使用
本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、種々の用途において、例えば、臨床的な、産業、環境、農業、および／または研究設定での、分子標的（例えば、ＲＮＡ）の特定等の種々の診断的用途におけて使用することができる。ＤｓｉＲＮＡ分子のかかる診断的使用は、再構成されたＲＮＡｉ系を使用すること、例えば、細胞溶解物、または部分的に精製された細胞溶解物を用いることを伴う。本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、罹患した細胞内の遺伝子浮動および変異を検査するための診断ツールとして用いることができる。ＤｓｉＲＮＡ活性と標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡの構造との間の緊密な関係は、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡの塩基対および三次元構造を変化させるＫＲＡＳ分子の領域内の変異の検出を可能にする。本発明に記載の複数のＤｓｉＲＮＡ分子を用いることにより、インビトロ、ならびに細胞および組織内のＲＮＡ構造および機能にとって重要である、ヌクレオチド変化をマッピングすることができる。ＤｓｉＲＮＡ分子を有する標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡの切断を用いて、遺伝子発現を阻害し、ＫＲＡＳ関連疾患または障害の進行における特定の遺伝子産物の役割を定義することができる。このようにして、他の遺伝子標的を疾患の重要な媒介物質として定義することができる。これらの実験は、組み合わせ療法（例えば、異なる遺伝子を標的とした複数のＤｓｉＲＮＡ分子、公知の小分子阻害剤に連結したＤｓｉＲＮＡ分子、またはＤｓｉＲＮＡ分子および／または他の化学的もしくは生物学的分子の組み合わせを用いる断続的治療）の可能性を与えることにより、疾患進行のより優れた治療につながる。本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の他のインビトロでの使用は、当技術分野において周知であり、疾患または関連状態と関連するＲＮＡの存在の検出を含む。かかるＲＮＡは、標準的な方法論、例えば、蛍光共鳴発光移動（ＦＲＥＴ）を用いて、ＤｓｉＲＮＡでの処理後の切断産物の存在を判定することにより検出される。
【０３４２】
特定の例では、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡの野生型、または変異型、または多形型形態のみを切断するＤｓｉＲＮＡ分子は、アッセイのために使用される。第１のＤｓｉＲＮＡ分子（すなわち、標的ＫＲＡＳ  ＲＮＡの野生型形態のみを切断するもの）を用いて、試料中に存在する野生型ＫＲＡＳ  ＲＮＡを特定し、第２の分子（すなわち、標的ＲＮＡの変異型または多形型形態のみを切断するもの）を用いて、試料内の変異型または多形型ＫＲＡＳ  ＲＮＡを特定する。反応対照として、野生型および変異型もしくは多形型ＫＲＡＳ  ＲＮＡの両方の合成基質が、ＤｓｉＲＮＡ分子の両方により切断され、反応物中の相対的ＤｓｉＲＮＡの効率および「非標的」ＫＲＡＳ  ＲＮＡ種の切断の不在を表す。合成基質からの切断産物はまた、試料集団中の野生型および変異型ＫＲＡＳ  ＲＮＡの分析のためのサイズマーカを生成するように機能する。したがって、各分析は、２個のＤｓｉＲＮＡ分子、２個の基質、および６個の反応物に組み合わされる１個の未知の試料を必要とする。切断産物の存在は、各ＫＲＡＳ  ＲＮＡの全長および切断断片が、ポリアクリルアミドゲルの１つの列において分析することができるように、ＲＮａｓｅ保護分析を用いて判定される。変異型または多形型ＫＲＡＳ  ＲＮＡの発現、および標的細胞内のＫＲＡＳに関連する表現型変化の推定的リスクについての洞察を得るように結果を定量するためには必要とは限らない。そのタンパク質産物が表現型の発達（すなわち、関連（ｒｅｌａｔｅｄ）／関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）疾患）に関与する、ＫＲＡＳ  ＲＮＡの発現は、リスクを確立するのに十分である。同程度の特異的活性のプローブが、転写物の両方に用いられるなら、ＫＲＡＳ  ＲＮＡの定性的比較は、十分であり、初期診断の費用を低減する。より高い変異型または多形型形態対野生型比は、ＫＲＡＳ  ＲＮＡレベルが定性的または定量的に比較されるかどうかにかかわらず、より高いリスクに相関する。
【０３４３】
本明細書に記載した全ての特許および刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示す。本開示で引用された全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照することにより個々にその全体において組み込まれるのと同じ程度、参照することにより組み込まれる。
【０３４４】
当業者は、本発明が、目的を実行し、記載した最終結果および利点、ならびにそれに固有のものを得るように十分に適合されることを容易に理解するであろう。現在好ましい実施形態の代表として本明細書に説明する方法および組成物は、例示であり、本発明の範囲を制限することを意図しない。その中の変更および他の使用が、当業者には思い浮かび、それは、本発明の精神内に含有され、請求項の範囲により定義される。
【０３４５】
本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示する発明に異なる置換および修正を行うことができることは、当業者には容易に明らかとなるあろう。したがって、かかるさらなる実施形態は、本発明および以下の請求項の範囲内である。本発明は、ＲＮＡｉ活性を媒介するために改善された活性を有する核酸構造の生成に向けて、本明細書に説明する化学的修正の種々の組み合わせ、および／または置換を試験することを当業者に教示する。かかる改善された活性は、ＲＮＡｉを媒介する細胞反応の改善された安定性、改善された生物学的利用能、および／または改善された活性を含むことができる。したがって、本明細書に説明する特別の実施形態は、制限するものではなく、当業者は、本明細書に説明された修正の具体的な組み合わせが、改善されたＲＮＡｉ活性を有するＤｓｉＲＮＡ分子の特定に向けて、過度に実験することなく試験可能であることを、容易に理解することができる。
【０３４６】
本明細書で例証的に好適であるとして説明された本発明は、本明細書で具体的に開示されない任意の１つもしくは複数の要素、１つもしくは複数の制限なく、実践することができる。したがって、例えば、本明細書における各例では、「含む」、「〜から本質的に成る」、および「〜から成る」という用語のうちのいずれも、他の２つの用語のうちのいずれかと置き換えることができる。採用されている用語および語句は、説明の用語として用いられ、制限するものではなく、かかる用語および語句の使用において、示され、説明される特性またはその部分の任意の均等物を除外することは意図されず、特許請求される本発明の範囲内で種々の修正が可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態により具体的に開示されたが、本明細書に開示される任意の特性、概要の修正および変化が当業者により用いられ得、かかる修正および変化が、説明および付属の特許請求の範囲により定義されるように、本発明の範囲内であるとみなされることを理解されたい。
【０３４７】
加えて、本発明の特性または態様が、マーカッシュ群または他の代替物の群化の観点から記載されている場合には、当業者は、本発明が、それにより、マーカッシュ群または他の群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群の観点からも記載されることも認識するであろう。
【０３４８】
本発明を説明する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の文脈）における「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに同様の指示対象の使用は、本明細書において特に指示がないか、または内容と明確に矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を網羅するように解釈されるものとする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｇｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する」という用語は、特に注記されない限り、無制限の用語（すなわち、「〜を含むが、〜に限定されない」を意味する）として解釈されるものとする。本明細書の値の範囲の記述は、本明細書で別途指示されない限り、範囲内に含まれる各別個の値を個々に参照するための簡潔な方法として機能することが意図されるに過ぎず、各別個の値は、それが本明細書に別個に記述されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書で説明された全ての方法は、本明細書において別途指示がないか、または別様に、内容と明らかに矛盾しない限り、いずれの好適な順序でも実行することができる。本明細書に提供されるあらゆる例または例示的言語（例えば、「等」）の使用は、単に、本発明をより明らかにすることが意図され、別途特許請求されない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書内の表現も、特許請求されていないいかなる要素も、本発明の実践に必須であるとして示すものと解釈されてはならない。
【０３４９】
本発明を実行するために、本発明者に知られる最良の様態を含む、本発明の実施形態が、本明細書に説明される。これらの実施形態の変形例は、先述の説明を読むことから、当業者に明らかになり得る。
【０３５０】
本発明者は、当業者がかかる変形例を必要に応じて採用することを予期し、本発明者は、本発明が、本明細書に具体的に説明されるものと別様に実践されることを意図する。故に、本発明は、適用可能な法律により許可される、本明細書に付属する特許請求の範囲において記述される主題の全ての修正および均等物を含む。さらに、その全ての考えられる変形例における上述の要素の任意の組み合わせが、本明細書で別途示されない限り、または内容と明確に矛盾しない限り、本発明により包含される。当業者は、日常的なものを超える実験を用いずに、本明細書に説明する本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を理解するか、または確認することが可能であろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることを意図する。
【図１】
0006010458.tif 000456
【図２】
0006010458.tif 000457
【図３】
0006010458.tif 000458
【図４】
0006010458.tif 000459
【図５】
0006010458.tif 000460
【図６】
0006010458.tif 000461
【図７】
0006010458.tif 000462
【図８】
0006010458.tif 000463
【図９】
0006010458.tif 000464
【図１２】
0006010458.tif 000465
【図１３】
0006010458.tif 000466
【図１４】
0006010458.tif 000467
【図１５】
0006010458.tif 000468
【図１６】
0006010458.tif 000469
【図１７】
0006010458.tif 000470
【図１８】
0006010458.tif 000471
【図１９】
0006010458.tif 000472
【図２０】
0006010458.tif 000473
【図２１】
0006010458.tif 000474
【図２２】
0006010458.tif 000475
【図２３】
0006010458.tif 000476
【図２４】
0006010458.tif 000477
【図２５】
0006010458.tif 000478
【図２６】
0006010458.tif 000479
【図２７】
0006010458.tif 000480
【図２８】
0006010458.tif 000481
【図２９】
0006010458.tif 000482
【図３０】
0006010458.tif 000483
【図３１】
0006010458.tif 000484
【図１０】
0006010458.tif 000485
【図１１】
0006010458.tif 000486