(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対して結合活性を有する化合物を有効成分として含有し、かつ該化合物が抗体である、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制するための組成物。
【請求項２】
配列番号：１及び４〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対して結合活性を有する化合物を有効成分として含有し、かつ該化合物が抗体である、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する疾患の予防又は治療のための組成物。
【請求項３】
ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制することにより、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有し、かつ配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対して結合活性を有する、ＮＳ３プロテアーゼに対する抗体。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法
（ａ）被検化合物の存在下で、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体とを接触させる工程、
（ｂ）ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を検出する工程、
（ｃ）前記結合を抑制する化合物を選択する工程。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法
（ａ）被検化合物の存在下で、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体とを接触させる工程、
（ｂ）ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を検出する工程、
（ｃ）前記活性化を抑制する化合物を選択する工程。
【請求項６】
ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制することを特徴とする、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する方法（但し、人間に対する医療行為を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有する化合物、並びにそのスクリーニング方法に関し、より詳しくは、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制することにより、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有する化合物、並びにそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝硬変は、日本における死亡原因として９番目に多く（厚生労働省「平成２１年  人口動態統計月報年計の概況」）、約３０万人の患者と約３５０万人の肝炎患者予備軍がいる。この疾患は細胞外マトリックス蛋白質の異常蓄積により肝組織が硬化していく難病であり、肝硬化（肝線維化）は肝障害と再生とが繰り返される過程で生じ、結果として肝細胞はアポトーシスに陥り、肝不全となる一連の病態を呈する。【０００３】
この肝線維化を引き起こす主な要因としてサイトカインの１種であるＴＧＦ−βの活性化が知られている（非特許文献１）。肝硬変の際には、肝類洞と肝実質細胞との間に存在する肝星細胞が活性化され、コラーゲンを始めとする細胞外マトリックスを過剰産生するようになる。このコラーゲン等の過剰産生を促進するのがＴＧＦ−βであり、ＴＧＦ−βの働きを遺伝子治療等で止めてやると肝硬変が防げることが動物モデルで示されている（非特許文献２）。さらに、肝硬変に陥った肝臓からは年率５〜７％の頻度で肝癌が発症し死に至る。ここでもＴＧＦ−βによるＥＭＴ（上皮間葉転換）の誘導や制御性Ｔ細胞誘導を介する癌免疫の低下が一因と言われている（非特許文献３）。【０００４】
また、日本における肝硬変の７６％はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を原因とするものであり、ＨＣＶ感染者は日本国内だけでも推定２００万人、世界では約２億人いると言われている。ＨＣＶに感染すると１０年〜３０年を経て肝硬変が発症し、さらに肝癌に移行するため、大きな社会問題となっている。かかる状況に対して、現在、ＰＥＧ修飾インターフェロンとリバビリンとの併用療法が主に適用されており、４０〜５０％の患者においてウイルス除去の効果が認められている。さらにウイルス粒子の成熟化に必須のセリンプロテアーゼＮＳ３のプロテアーゼ活性阻害剤が開発され、ＰｈａｓｅII〜III試験が行われている（非特許文献４〜５）。【０００５】
しかしながら、ＨＣＶが肝線維化や肝癌を引き起こす機序については未だ解明されていないため、かかるウィルス性疾患の根治治療を可能とするものは依然として開発がなされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＳＬ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、２００８年５月、１３４（６）、１６５５−６９ページ
【非特許文献２】Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＳＬ、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．、２００８年１月、８８巻、１号、１２５−１７２ページ
【非特許文献３】Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ、Ｃｅｌｌ、２００８年７月、１３４巻、２号、２１５−２３０ページ
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２００９年１月、８巻、１号、１１ページ
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２０１０年７月、９巻、７号、５０１−５０３ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ＨＣＶによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制することを可能とする化合物、そのスクリーニング方法、並びにＣ型肝炎ウィルスに起因する疾患の予防又は治療のための組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＨＣＶ由来のＮＳ３プロテアーゼはＩ型ＴＧＦ−β受容体に結合すること、並びに該結合によりＴＧＦ−β受容体が活性化されることを見出した。また、該活性化によって、肝線維化の要因となる肝星細胞及び肝細胞におけるコラーゲンの産生が促進されることも見出した。さらには、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合サイトを同定し、これら結合サイトを認識する抗体によって、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化が抑制されることも見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制することにより、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有する化合物。
（２）ＮＳ３プロテアーゼ又はＩ型ＴＧＦ−β受容体に対して結合活性を有する、（１）に記載の化合物。
（３）配列番号：１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対して結合活性を有する、（２）に記載の化合物。
（４）ＮＳ３プロテアーゼ又はＩ型ＴＧＦ−β受容体に対する抗体である、（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物を有効成分として含有する、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する疾患の予防又は治療のための組成物。
（６）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法
（ａ）被検化合物の存在下で、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体とを接触させる工程、
（ｂ）ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を検出する工程、
（ｃ）前記結合を抑制する化合物を選択する工程。
（７）以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法
（ａ）被検化合物の存在下で、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体とを接触させる工程、
（ｂ）ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を検出する工程、
（ｃ）前記活性化を抑制する化合物を選択する工程。
（８）ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制することを特徴とする、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する方法。
（９）ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制することを特徴とする、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する疾患の予防又は治療のための方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＨＣＶによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制することを可能とする化合物、並びにそのスクリーニング方法を提供することが可能となり、ひいてはＣ型肝炎ウィルスに起因する疾患の予防又は治療のための組成物を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＮＳ３プロテアーゼがＴＧＦ−β２様抗原活性を有することを示すグラフである。
【図２】ＮＳ３プロテアーゼにより、ＴＧＦ−βシグナルが活性化されることを示すグラフである。
【図３】ＮＳ３プロテアーゼにより、コラーゲンの産生が促進されることを示すグラフである。
【図４】ＮＳ３プロテアーゼの推定されるＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合部位を示す図である。
【図５】ＮＳ３プロテアーゼにおける、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体との予測結合サイト及び予測接触残基を示すアミノ酸配列の図である。
【図６】Ｉ型ＴＧＦ−β受容体における、ＮＳ３プロテアーゼとの予測結合サイト及び予測接触残基を示すアミノ酸配列の図である。
【図７】各抗体とＮＳ３プロテアーゼとを同時に×９ＣＡＧＡ／ＣＣＬ６４細胞に添加するという条件下において、各予測結合サイトに結合する、抗Ｉ型ＴＧＦ−β受容体抗体及び抗ＮＳ３抗体によって、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−βシグナルの活性化が抑制されることを示すグラフである。
【図８】各抗ＮＳ３抗体とＮＳ３プロテアーゼとをプレインキュベーションするという条件下において、抗ＮＳ３抗体によって、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−βシグナルの活性化が抑制されることを示すグラフである。
【図９】各抗ＮＳ３抗体とＮＳ３プロテアーゼとをプレインキュベーションするという条件下において、抗ＮＳ３抗体によって、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−βシグナルの活性化は抗体の用量依存的に抑制されることを示すグラフである。
【図１０】各抗Ｉ型ＴＧＦ−β受容体抗体と×９ＣＡＧＡ／ＣＣＬ６４細胞とをプレインキュベーションするという条件下において、抗Ｉ型ＴＧＦ−β受容体抗体によって、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−βシグナルの活性化が抑制されることを示すグラフである。
【図１１】各抗Ｉ型ＴＧＦ−β受容体抗体と×９ＣＡＧＡ／ＣＣＬ６４細胞とをプレインキュベーションするという条件下において、抗Ｉ型ＴＧＦ−β受容体抗体によって、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−βシグナルの活性化は抗体の用量依存的に抑制されることを示すグラフである。
【図１２】予測結合サイトを認識しない抗ＴＧＦ−β２抗体等では、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−βシグナルの活性化は抑制されないことを示すグラフである。
【図１３】各抗ＮＳ３抗体とＴＧＦ−β２とをプレインキュベーションするという条件下において、抗ＮＳ３抗体によって、ＴＧＦ−β２によるＴＧＦ−βシグナルの活性化は抑制されないことを示すグラフである。
【図１４】各抗Ｉ型ＴＧＦ−β受容体抗体と細胞（リポーターアッセイ系）とをプレインキュベーションするという条件下において、抗Ｉ型ＴＧＦ−β受容体抗体によって、ＴＧＦ−β２によるＴＧＦ−βシグナルの活性化が部分的に抑制されることを示すグラフである。
【図１５】ＮＳ３プロテアーゼにより促進されたコラーゲンの産生が、抗ＮＳ３モノクローナル抗体（ｅ１２１１、ｅ０４５８、ｓ０６４７、Ｐ３−ｇ０８９９、Ｐ３−ｇ１３９０）によって抑制されることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の化合物は、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制することにより、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有することを特徴とするものである。
【００１３】
ＮＳ３プロテアーゼは、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）由来の非構造タンパク質の１つであり、６３１アミノ酸からなる。Ｎ端にプロテアーゼドメイン、Ｃ端にヘリカーゼドメインを含む。プロテアーゼドメイン及びヘリカーゼドメインの典型的なものとしては、各々ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＡＡＢ２７１２７．１で特定される蛋白質の１０５６〜１２０４アミノ酸からなるペプチド及び１２２４〜１４５５アミノ酸からなるペプチドが挙げられる。
【００１４】
また、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体は、II型ＴＧＦ−β受容体、及びこれら受容体のリガンドであるＴＧＦ−βと結合して複合体を形成するものであり、ヒト由来の典型的なものとしてはＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＢＡＧ６３４４９．１で特定される蛋白質が挙げられる。
【００１５】
さらに、本発明において、ＴＧＦ−β受容体の活性化とは、ＴＧＦ−β受容体が複合体を形成することによって下流へのシグナル伝達を発生させうる状態になることを意味する。このシグナル伝達により、例えば、該複合体の形成後に生じるＩ型ＴＧＦ−β受容体のリン酸化、リン酸化されたＩ型ＴＧＦ−β受容体によるＳｍａｄ２／３のリン酸化、リン酸化されたＳｍａｄ２／３とＳｍａｄ４との複合体の形成、そのＳｍａｄ複合体の核内への移行、核内に移行したＳｍａｄ複合体による標的遺伝子の転写活性化が生じうる。
【００１６】
なお、本発明における「抑制」には、完全な抑制（阻害）及び部分的な抑制の双方が含まれる。
【００１７】
また、本発明の化合物としては、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制することにより、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制することが可能な物質であれば特に制限されることはないが、該結合を抑制するという観点から、ＮＳ３プロテアーゼ又はＩ型ＴＧＦ−β受容体に対して結合活性を有しているものが好ましく、下記配列番号：１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列、すなわちＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合サイトからなるペプチドに対して結合活性を有しているものがより好ましい。さらに、本発明の化合物としては、ＴＧＦ−β２による活性化に影響せず、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を特異的に抑制するという観点から、下記配列番号：１〜３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対して結合活性を有しているものが特に好ましい。
ＴＧＲＤＫＮＱＶＥＧＥＶＱＶＶＳＴＡＴＱＳ（配列番号：１）
ＴＮＶＤＱＤＬＶＧＷＰＡＰＰＧＡＲＳＬＴＰ（配列番号：２）
ＲＧＤＮＲＧＳＬＬＳＰＲＰＶＳＹＬＫＧＳＳ（配列番号：３）
ＦＶＳＶＴＥＴＴＤＫＶＩＨＮＳＭ（配列番号：４）
ＩＡＥＩＤＬＩＰＲＤＲＰＦＶ（配列番号：５）
ＣＡＰＳＳＫＴＧＳＶＴＴＴＹ（配列番号：６）
なお、配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列はＮＳ３プロテアーゼ側の結合サイトを示し、配列番号４〜６に記載のアミノ酸配列はＩ型ＴＧＦ−β受容体側の結合サイトを示すものである。
【００１８】
本発明の化合物の１つの態様は、抗体である。本発明における「抗体」は、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラスを含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれ、また、抗体の機能的断片の形態も含む意である。
【００１９】
また、本発明の抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および、これら抗体の機能的断片が含まれる。抗体の機能的断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、およびこれらの重合体などが挙げられる。
【００２０】
本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体が望ましい。
【００２１】
抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（前記炎症性サイトカインなど）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法等によって作製することができる。
【００２２】
キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免役し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平７−１９４３８４号公報、特許３２３８０４９号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。
【００２３】
ヒト化抗体は、例えば、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）することにより作製することができる（例えば、特許２９１２６１８号、特許２８２８３４０号公報、特許３０６８５０７号公報、欧州特許２３９４００号公報、欧州特許１２５０２３号公報、国際公開９０／０７８６１号公報、国際公開９６／０２５７６号公報参照）。
【００２４】
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用して作製することができる（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２：２５５−２５８（１９９２）、Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １３：６５−９３（１９９５）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  ２２２：５８１−５９７（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １５：１４６−１５６（１９９７）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９７：７２２−７２７（２０００）、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報）。
【００２５】
本発明において用いる抗体には、望ましい活性（ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制することにより、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。なお、修飾された抗体において、かかる望ましい活性が減少させていないことについては、後述のスクリーニング方法における活性の評価系を用いて確認することができる。
【００２６】
本発明の抗体のアミノ酸配列変異体は、本発明の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、本発明の抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加および／または挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域およびＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８））。
【００２７】
また、抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数、位置、種類を変化させるなどの抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ−結合またはＯ−結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入または欠失などの公知の方法で行うことができる（特開２００８−１１３６６３号公報、特許４３６８５３０号公報、特許４２９０４２３号公報、米国特許第５０４７３３５号公報、米国特許第５５１０２６１号公報、米国特許第５２７８２９９号公報、国際公開第９９／５４３４２号公報）。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明において用いる抗体は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
【００２８】
本発明において用いられる抗体としては、前述の通り、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制することにより、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有する抗体であればよいが、好ましくはＮＳ３プロテアーゼ又はＩ型ＴＧＦ−β受容体に対する抗体であり、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を特異的に抑制するという観点から、より好ましくは、配列番号１〜６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体である。さらにこれらの抗体の中では、ＴＧＦ−β２による活性化に影響せず、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を特異的に抑制するという観点から、配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体が特に好ましい。
【００２９】
また本発明の化合物の他の態様は、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合ならびにＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化において、ＮＳ３プロテアーゼ、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体等に対してドミナントネガティブの形質を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドとしては、例えば、配列番号：１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列の置換、欠失、付加および／または挿入が施されたポリペプチドやペプチドライブラリーから後述のスクリーニング方法によって選択されたポリペプチドが挙げられる。このようなドミナントネガティブ体は、組換えＤＮＡ法、化学合成等によって作製することができる。
【００３０】
さらに本発明の化合物の他の態様は、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有し、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制することが可能な低分子化合物が挙げられる。かかる低分子化合物は、例えば、ＮＳ３プロテアーゼ又はＩ型ＴＧＦ−β受容体における配列番号：１〜６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド部位の構造を基に設計して合成することにより、または合成低分子化合物ライブラリーから後述のスクリーニング方法によって選択することにより、得ることができる。
【００３１】
また、本発明は、本発明の化合物を含有する組成物を提供するものであり、本発明の組成物の形態としては、医薬組成物、飲食品（動物用飼料を含む）、あるいは研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）に用いられる試薬であり得る。
【００３２】
本発明の組成物は、本発明の化合物を有効成分として含有することにより、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制し、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有するため、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する疾患、例えば、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝癌などの予防又は治療のために投与される医薬組成物として好適に用いることができる。
【００３３】
また本発明の組成物は、本発明の化合物を含有することにより、これら疾患の予防又は改善のために、日常的に摂取される飲食品として好適に用いることもできる。
【００３４】
さらに本発明の組成物は、本発明の化合物を含有することにより、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制し、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する試薬として好適に用いることもできる。
【００３５】
本発明における組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤などとして、経口的または非経口的に使用することができる。
【００３６】
これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
【００３７】
本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合には、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する疾患の予防又は治療に用いられる公知の医薬組成物と併用してもよい。公知の医薬品としては、例えば、ＰＥＧインターフェロンやリバビリンが挙げられる。更には、現在、臨床試験のフェーズIIIに入っているＮＳ３プロテアーゼの活性阻害剤（Ｖｅｒｔｅｘ社製のＴｅｌａｐｒｅｖｉｒ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇ社製のＢｏｃｅｐｒｅｖｉｒ等）との併用も考えられる。これら活性阻害剤はＮＳ３プロテアーゼを対象にしている点では、本発明の化合物と同じではあるが、標的はあくまでＨＣＶウィルスの粒子の成熟化に必要なプロテアーゼの活性であり、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する疾患の発症機構における作用点が本発明の化合物とは異なる。従って、本発明の化合物とＰＥＧインターフェロンとリバビリンとＮＳ３プロテアーゼの活性阻害剤とを併用することによって、使用する各医薬品の濃度を低くおさえながら、Ｃ型肝炎ウィルスによる病態の進行を抑え、ウィルスを排除し、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する肝疾患の根治治療を実現することが期待できる。
【００３８】
本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、食品添加物、あるいは動物用飼料であり得る。本発明の飲食品は、上記のような組成物として摂取することができる他、種々の飲食品として摂取することもできる。飲食品の具体例としては、食用油、ドレッシング、マヨネーズ、マーガリンなどの油分を含む製品；スープ類、乳飲料、清涼飲料水、茶飲料、アルコール飲料、ドリンク剤、ゼリー状飲料、機能性飲料等の液状食品；飯類、麺類、パン類等の炭水化物含有食品；ハム、ソーセージ等の畜産加工食品；かまぼこ、干物、塩辛等の水産加工食品；漬物等の野菜加工食品；ゼリー、ヨーグルト等の半固形状食品；みそ、発酵飲料等の発酵食品；洋菓子類、和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、冷菓、氷菓等の各種菓子類；カレー、あんかけ、中華スープ等のレトルト製品；インスタントスープ，インスタントみそ汁等のインスタント食品や電子レンジ対応食品等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。本発明の組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などを対象とすることができる。具体的には、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００３９】
本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。当該飲食品においては、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する疾患の予防又は改善のために有効な１種もしくは２種以上の成分を添加してもよい。また、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する疾患の予防又は改善以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。
【００４０】
本発明の組成物を投与または摂取する場合、その投与量または摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）などに応じて、適宜選択される。例えば、１回当たりの本発明の組成物の投与量または摂取量は、一般に、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００４１】
本発明の組成物の製品（医薬品、飲食品、試薬）またはその説明書は、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制するために用いられる旨の表示においては、本発明の組成物を投与もしくは摂取することによりＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制するする機序についての情報を含むことができる。機序としては、例えば、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制することにより、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制することに関する情報が挙げられる。また、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制するために用いられる旨の表示においては、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する疾患の予防又は治療のため等に用いられること、に関する情報を含むことができる。
【００４２】
また、本発明は、前述のように、本発明の化合物又は組成物を対象に投与もしくは摂取等させることにより、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制し、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制することができる。さらに、該活性化を抑制することにより、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する疾患を予防又は治療することもできる。従って、本発明は、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制することを特徴とする、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する方法、並びに、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制することを特徴とする、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する疾患の予防又は治療のための方法をも提供するものである。
【００４３】
さらに、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法をも提供するものである。
（ａ）被検化合物の存在下で、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体とを接触させる工程、
（ｂ）ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を検出する工程、
（ｃ）前記結合を抑制する化合物を選択する工程。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法において使用する被験化合物としては特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。なお、本方法によりスクリーニングされた化合物は、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制し、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有するものである。従って、かかる化合物は、前述の通り、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する疾患の予防又は治療薬の候補となり得る。
【００４５】
また、ここで用いるＮＳ３プロテアーゼ及びＩ型ＴＧＦ−β受容体は、例えば、ＮＳ３プロテアーゼとしては、前述のＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＡＡＢ２７１２７．１で特定される蛋白質の１０５６〜１２０４アミノ酸と１２２４〜１４５５アミノ酸とからなるペプチドが挙げられ、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体としては、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＢＡＧ６３４４９．１で特定される蛋白質が挙げられる。また、かかる天然型のタンパク質に加え、各々に対する結合活性を維持した断片、改変体、修飾体等を用いることができ、例えば、検出を容易にするためのマーカー蛋白質、アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ等の酵素、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等の蛍光蛋白質との融合蛋白質として発現させて得られるものを用いることができる。Ｉ型ＴＧＦ−β受容体は、細胞表面に発現している形態のものを用いても良い。また、ＮＳ３プロテアーゼに関しては、後述の実施例に記載のような、Ｎ末端側にＮＳ４Ａの一部配列を融合させたものを用いることもできる。なお、ＮＳ４ＡはＮＳ３プロテアーゼと同じくＨＣＶ由来のタンパク質であり、ＮＳ３プロテアーゼのＮ末端部位に結合し複合体を形成し、プロテアーゼ活性を亢進させる補因子として機能するタンパク質である。
【００４６】
（ａ）の工程において、互いに結合するＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体とを被験化合物存在下で接触させるが、かかる接触は、被験化合物の非存在下において、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合が抑制されない条件下で行われればよい。
【００４７】
また（ｂ）の工程において、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を検出するが、かかる結合の検出は特に制限されることはなく、公知の手法を適宜採用することができる。例えば、免疫共沈降法、酵母ツーハイブリッドシステム、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴現象を利用した検出装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（ＧＥヘルスケア社製））を用いた方法、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した方法を採用することができる。
【００４８】
さらに（ｃ）の工程において、前記結合を抑制する化合物を選択するが、例えば、免疫共沈降法を用いた場合においては、被験化合物存在下で、ＮＳ３プロテアーゼをその特異的な抗体によって沈降させた際に共沈してくるＩ型ＴＧＦ−β受容体の量と、被験化合物非存在下におけるＩ型ＴＧＦ−β受容体の量（対照値）とを比較することにより評価することができる。すなわち、被験化合物存在下におけるＩ型ＴＧＦ−β受容体の量が被験化合物非存在下の量と比較して低い場合（例えば、コントロールの値の８０％以下、５０％以下、３０％以下の場合）には、該被験化合物をＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有する化合物と評価することができる。前記結合の検出において免疫沈降法以外の方法を用いる場合も同様に、被験化合物非存在下における前記結合の程度を対照値として用いて評価することができる。
【００４９】
さらに、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法をも提供するものでもある。
（ａ）被検化合物の存在下で、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体とを接触させる工程、
（ｂ）ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を検出する工程、
（ｃ）前記結合を抑制する化合物を選択する工程。
【００５０】
このスクリーニング方法において使用する被験化合物、ＮＳ３プロテアーゼ、及びＩ型ＴＧＦ−β受容体、並びに（ａ）の工程は、前記スクリーニング方法と同様である。
【００５１】
また（ｂ）の工程において、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を検出するが、かかる活性化の検出は特に制限されることはなく、公知の手法を適宜採用することができる。例えば、リン酸化サイト特異的な抗体を利用したＩ型ＴＧＦ−β受容体やＳｍａｄ２／３等のリン酸化の検出、蛍光蛋白質等で標識したＳｍａｄ複合体の核内への移行の検出、後述の実施例６〜８に記載のようなリポーターアッセイを採用することができる。
【００５２】
さらに（ｃ）の工程において前記活性化を抑制する化合物を選択するが、例えば、リポーターアッセイを用いた場合において、被験化合物存在下におけるルシフェラーゼ活性の値と被験化合物非存在下におけるルシフェラーゼ活性の値（対照値）とを比較することにより評価することができる。すなわち、被験化合物存在下におけるルシフェラーゼ活性の値が被験化合物非存在下の値と比較して低い場合（例えば、コントロールの値の８０％以下、５０％以下、３０％以下の場合）には、該被験化合物をＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制する活性を有する化合物と評価することができる。前記活性化の検出においてリポーターアッセイ以外の方法を用いる場合も同様に、被験化合物非存在下における前記活性化の程度を対照値として用いて、評価することができる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、本実施例で用いた「精製組換えＮＳ３タンパク」は下記の通りに調製した。【００５４】
＜精製組換えＮＳ３タンパク＞
先ず、ＨＣＶ由来のＮＳ３プロテアーゼドメイン領域（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＡＡＢ２７１２７．１で特定されるタンパク質中の１０２７〜１４４５アミノ酸）のＮ末端（当該タンパク質中の１０２７〜１２０６アミノ酸）にＨＣＶ由来のＮＳ４Ａの一部配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＡＡＢ２７１２７．１で特定されるタンパク質中の１６７８〜１６９０アミノ酸、ＧＳＶＶＩＶＧＲＩＩＬＳＧ）をリンカー（ＳＧＳ）を介して融合させたタンパク質、ｓｃＮＳ４Ａ−ＮＳ３  ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、１９９８年、７巻、１０号、２１４３〜２１４９ページ  参照、配列番号：７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターｐＥＴ３２ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）でトランスフォームした大腸菌ＫＲＸ株を培養した。そして、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）でｐＥＴ３２ａ（＋）ベクター由来のｔｒｘ−Ｈｉｓ−Ｓタグが付加している目的タンパク質の発現を誘導後、菌体を回収した。回収した菌体は、バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，４ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１％  ｎ−ｃｔｙｌ−β−ｏ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）に懸濁した後、超音波で破砕して遠心し、分離した上清を０.４５μｍポアサイズのフィルターで濾過した。濾過した上清をＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）でアフィニティ精製し、ＨｉＰｒｅｐ２６／６０Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥヘルスケア社製）でバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２，２ｍＭ  ＤＴＴ）に交換後、ＬＰＳを除くために、ＥｎｄｏＴｒａｐ  Ｂｌｕｅカラム（ＧＥヘルスケア社製）に通した後、回収したフロースルーを精製組換えＮＳ３タンパクとして本実施例に供した。【００５５】
（実施例１）  ＮＳ３プロテアーゼのＴＧＦ−β２様抗原活性の確認
先ず、ＨＣＶ由来のＮＳ３プロテアーゼとＴＧＦ−βシグナル伝達との関連の有無を調べるために、精製組換えＮＳ３タンパクのＴＧＦ−β２様抗原活性をＴＧＦ−β２  Ｅｍａｘ（Ｒ）  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＥＬＩＳＡ法により検討した。すなわち、キットに添付のＴＧＦ−βコート抗体を炭酸緩衝液（ｐＨ９．２）にて１／１０００に希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート（ＮＵＮＣ社製）に１００μｌ／穴ずつ加え、４℃で一晩静置してプレートをコートした。コートしたプレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳＴ」とも称する）にて洗浄した後、キットに添付のＴＧＦ−βブロッキング溶液を２７０μｌ／穴ずつ加え、３７℃で３５分間静置してブロッキングを行った。次にブロッキング処理したプレートをＰＢＳＴにて洗浄し、調製したＴＧＦ−β２スタンダード溶液及び前記精製組換えＮＳ３タンパク溶液を加え、４℃で一晩静置した。なお、精製組換えＮＳ３タンパクはキットに添付のＴＧＦ−βサンプル希釈溶液により終濃度２．５、５、１０、２０μｇ／ｍｌになるように希釈し、ＥＬＩＳＡの検体として、各々１００μｌ／穴ずつ添加した。検体を添加したプレートをＰＢＳＴにて洗浄した後、ＴＧＦ−βサンプル希釈溶液にて１／２０００に希釈した抗ＴＧＦ−β２ポリクローナル抗体を１００μｌ／穴ずつ加え、室温で２時間振盪した。そして、ポリクローナル抗体を添加したプレートをＰＢＳＴにて洗浄した後、ＴＧＦ−βサンプル希釈溶液にて１／１００に希釈したペルオキシダーゼ標識ＴＧＦ−βを１００μｌ／穴ずつ加え、室温で２時間静置した。さらにＴＧＦ−βを添加したプレートをＰＢＳＴにて洗浄後、ペルオキシダーゼ基質用発色基質としてＴＭＢ（テトラメチルベンチジン）溶液を１００μｌ／穴ずつ加え、室温で最大１５分間発色させ、十分な発色が得られた時点で１ｍｏｌ／ｌの塩酸を等量加えて反応を停止させた。その後、４５０ｎｍの波長でプレート内における各穴の吸光度を測定した。そして、ＴＧＦ−β２  Ｓｔａｎｄａｒｄを用いて検量線を描き、精製組換えＮＳ３タンパクのＴＧＦ−β２様抗原活性を活性型ＴＧＦ−β２量に換算して求めた。得られた結果を図１に示す。【００５６】
図１に示した結果から明らかなように、ＨＣＶ由来のＮＳ３プロテアーゼはＴＧＦ−β２様抗原活性を示すことが確認され、ＨＣＶ感染時における肝細胞内におけるＴＧＦ−βシグナル伝達に関与していることが示唆された。また、ＮＳ３プロテアーゼの抗原活性の強さはＴＧＦ−β２のそれの１／５００００〜１／１０００００程度のものであった。【００５７】
（実施例２）  ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−βシグナル活性化の検討
次に、ＨＣＶ由来のＮＳ３プロテアーゼが、細胞内においてＴＧＦ−βシグナルを活性化することが可能であるのかをリポーターアッセイにて調べた。すなわち、精製組換えＮＳ３タンパクのＴＧＦ−β２様活性を、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にＴＧＦ−β標的遺伝子の転写に重要な転写因子ＳｍａｄのＤＮＡ結合配列（ＣＡＧＡ）を９つ挿入したｐＧＬレポータープラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をミンク肺上皮細胞（ＣＣＬ６４細胞）に導入し樹立した細胞株（以下、「×９ＣＡＧＡ／ＣＣＬ６４細胞」とも称する）を用いて検討した。具体的には、１０％胎児ウシ血清（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ社製）と１％防腐剤（ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン溶液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（以下、「培養培地」とも称する）に×９ＣＡＧＡ／ＣＣＬ６４細胞を２×１０５個／ｍｌになるよう懸濁し、９６穴の細胞培養用プレート（ＴＰＰ社製）に１００μｌ／穴ずつ播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で一晩培養した。そして、プレートから培養上清を吸引除去し、カルシウム−マグネシウム含有リン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ（＋）」とも称する）にて細胞を洗浄した後、０．１％ウシ血清アルブミン（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ社製）と前記１％防腐剤を含むＤＭＥＭ（以下、「処理培地」とも称する）に終濃度が１２．５、２５、５０、１００μｇ／ｍｌになるように精製組換えＮＳ３タンパクを加えたものを１００μｌ加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で更に２０時間培養した。その翌日、プレート内の細胞中のルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、そのキットの添付文書に従って測定した。すなわち、培養上清を吸引除去後、細胞をＰＢＳ（＋）にて洗浄し、キットに添付のＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（５×）を１倍に希釈した液を各穴に２０μｌ加え、室温にて１５分間振盪して細胞を溶解した。その間に、予め１バイアルのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを１０ｍｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  II（以下、「ＬＡＲII溶液」とも称する）にて溶解し、９６穴のルシフェラーゼアッセイ用プレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）に１００μｌ／穴ずつ分注した。次に、細胞溶解液を１０μｌずつ予め分注したＬＡＲII溶液に加え、ピペッティングにより混和した後、ルミノメーター（製品名：ＡＲＶＯ（ＴＭ）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）にて発光強度を測定した。各処理につき例数は３とし、未処理の細胞のリポーター活性を１として、精製組換えＮＳ３タンパク処理細胞の活性量を相対値として求めた。得られた結果を図２に示す。【００５８】
図２に示した結果から明らかなように、精製組換えＮＳ３タンパクは濃度依存的にルシフェラーゼ活性を増加させた。このことから、ＮＳ３プロテアーゼはＴＧＦ−β受容体になんらかの様式で作用し、ＴＧＦ−βシグナルを動員することが示唆された。【００５９】
（実施例３）  肝星細胞のコラーゲン産生のＮＳ３プロテアーゼによる促進化の検討
ＴＧＦ−βは、肝臓の星細胞に働きかけて、星細胞からのコラーゲンの異常産生を促すことで、肝線維化を引き起こすことが知られている。そこで、次にＮＳ３プロテアーゼとコラーゲン産生促進との関連性について調べた。すなわち、Ｗｉｓｔａｒ系ラット（ＳＰＦ下で飼育、雄性、１５週齢）をペントバルビタール麻酔下にて開腹後、門脈にカテーテルを挿入し、脱血用洗浄液、０．０６％プロナーゼ溶液（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ社製）、０．０３％コラゲナーゼ（和光純薬社製）溶液の順に潅流を行った。その後、肝臓を摘出し、０．０５７％プロナーゼ、０．０５７％コラゲナーゼを含む肝星細胞分離用緩衝液に２ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を１ｍｌ加えた溶液中にて、３０分間、３６℃の温浴中でインキュベーションした。なお、その間、１Ｎ  ＮａＯＨにて溶解液中のｐＨは７．２〜７．４に保った。次に、この肝組織溶解液をメッシュを通してろ過し、肝星細胞分離用緩衝液を加えて全量を１５０ｍｌとして５０ｍｌポリプロピレンチューブ３本に分注し、４℃で２０００ｒｐｍ、８分間遠心した。さらにポリプロピレンチューブ中の上清を吸引除去し、各チューブにＤＮａｓｅＩ溶液を０．２ｍｌずつ加え、ゲイ平衝塩類溶液を加えてピペッティングにより混和し、全量を１００ｍｌとして５０ｍｌポリプロピレンチューブ２本に再度分注し、４℃で２０００ｒｐｍ、８分間遠心した。ポリプロピレンチューブ中の上清を吸引除去後、各チューブに０．２ｍｌのＤＮａｓｅＩ溶液を加え、ゲイ平衝塩類溶液を加えてピペッティングにより混和した後、全量を６７．５ｍｌとしてビーカーに移し、０．２２μｍフィルターを通して滅菌したＮｙｃｏｄｅｎｚ（ＳＩＧＭＡ社製）溶液（終濃度７．７５％）を２７ｍｌ加えて混和した。この細胞溶液を１５ｍｌチューブ８本に分注し、１ｍｌのゲイ平衝塩類溶液を重層し、４℃で３２００ｒｐｍ、１５分間遠心して肝星細胞を分離した。分離した肝星細胞を１０％胎児ウシ血清（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ社製）と１％防腐剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ培地中に１×１０５個／ｍｌの濃度になるよう懸濁し、直径６ｃｍの細胞培養用ディッシュ（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に３ｍｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて一晩培養した。翌日、培地を交換すると同時に精製組換えＮＳ３タンパクを終濃度２０μｇ／ｍｌになるように処理を開始し、隔日で培地を交換して７日間培養した。また、コントロールとして精製組換えＮＳ３タンパク等で処理していない細胞（未処置細胞）も用意し、隔日で培地を交換して７日間培養した。７日後、これらの細胞からＲＮＡ精製キットＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｍＲＮＡを抽出し、分光光度計（Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、濃度を求めた。次いでこのｍＲＮＡをテンプレートとして、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＭ）  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用い、添付文書に従ってＲＴ反応を行った。さらにＳＹＢＲ（Ｒ）  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  Ｔａｑ（ＴＭ）II（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用い、添付文書に従って反応液を調製し、コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ１  α１）、α��滑筋アクチン（αＳＭＡ）、ＴＧＦ−β１、及び内部標準であるＧＡＰＤＨの各プライマー（インビトロジェン社製）を用いてＰＣＲ反応を行い、ｍＲＮＡ発現量を未処置細胞のそれらと比較した。得られた結果を図３に示す。【００６０】
図３に示した結果から明らかなように、精製組換えＮＳ３タンパクを処理した培養ラット初代肝星細胞ではＣｏｌｌａｇｅｎ  α１遺伝子の発現が未処置細胞と比較して約６倍増加し、ＮＳ３プロテアーゼは肝星細胞のコラーゲン産生を顕著に促進することが確認された。【００６１】
なお、ＴＧＦ−βの活性化によって、星細胞の活性化のマーカーであるαＳＭＡ遺伝子の発現量やＴＧＦ−β１遺伝子の発現量は変化しないことは既に知られているが、図３に示した結果から明らかなように、ＮＳ３プロテアーゼで星細胞を処理しても、これら遺伝子の発現量は変化しないことも明らかになった。【００６２】
したがって、実施例１〜３に示した結果から、ＮＳ３プロテアーゼがＴＧＦ−βのように、ＴＧＦ−β受容体におそらく結合することにより作用し、これを活性化してＴＧＦ−βシグナルを伝え、コラーゲンの産生を促進することで、肝線維化を引き起こすことが示唆された。【００６３】
（実施例４）ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体とのドッキングシミュレーション
ＴＧＦ−βは、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体及びII型ＴＧＦ−β受容体と複合体を形成してシグナルを伝えることが知られている（「Ｊｏａｎ  Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、２００８年２月１日、２９巻、２号、１４９−１５０ページ」参照）。従って、ＮＳ３プロテアーゼはＴＧＦ−β様活性を有するということから、分子生物学的に、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との間において分子間相互作用が働き、これらの複合体が形成されていることが示唆される。そこで、タンパク質間ドッキングシミュレーションを実施し、これらのタンパク質間相互作用の有無を検討した。また、ＮＳ３プロテアーゼ内及びＴＧＦ−β受容体内のどのアミノ酸残基がかかる相互作用に関与しているのかも予測した。【００６４】
なお、現時点において、完全なタンパク質間相互作用予測装置は存在しないが、既存のタンパク質間相互作用データベースから学習する方法、経験的物理関数に基づく方法等が提案されている。今回実施した方法は、タンパク質の幾何的相補性（言い換えるならばタンパク質のおうとつ）具合を網羅的に評価する方法であり、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｆｉｔ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｉ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、１９９３年３月、８９巻、２１９５−２１９９ページ」の記載に基づき実装した。すなわち、タンパク質座標を等間隔に分かれた三次元グリッドに射影し、各グリッドに、表面スコア、分子内部スコアを割り振った。この操作を受容体及びリガンドに対して行った。そして、得られたグリッド間の畳み込み計算を行い、網羅的に表面を探索し、スコアから結合状態の相補性を算出した。つまり、スコア（相補性スコア）が高いほど相補性がよいとして評価した。なお、この方法の利点の一つは、タンパク質座標を三次元グリッド座標に変換し、高速フーリエ変換を適用する事によりスコアを算出できることから、実行速度が高速であるので、受容体の一部分ではなく、すべての受容体表面とリガンド表面の相補性を考慮することができる点にある。また、この方法の利点のもう一つは、外部からの結合部位指定が存在しない状態でも、結合部位を予測することができる点にある。【００６５】
本実施例においては、具体的にＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼはＰＤＢ  ｃｏｄｅ：１ＮＳ３、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体はＰＤＢ  ｃｏｄｅ  ２ＰＪＹのＢ鎖（ｔｙｐｅ−II），Ｃ鎖（ｔｙｐｅ−I）をタンパク質の座標として各々用いた。得られた結果を図４に示す。なお、予測構造としては１２．０度刻みのオイラー角の組み合わせにより、３６０×３６０×１８０／１２＝１８０００の構造を発生させた。図４に示した予測構造は、相補性スコア上位の２０構造であり、この２０構造のスコアの分布は７６０  ７４０  ７３１  ７２０  ７０８  ６９０  ６８７  ６８６  ６８４  ６８４  ６８２  ６７７  ６６９  ６６６  ６６３  ６６２  ６６２  ６６１  ６６０  ６５９であり、平均値は４３５．５、中央値は４２８．０、標準偏差は５４．６であった。【００６６】
また、相補性スコア上位の結合状態に多く出現するアミノ酸残基は、実際の受容体との相互作用に出現しやすい残基と推測することができるため、予測結合状態において、原子間で３．８Å以内の距離にあるアミノ酸残基を接触残基と定義し、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体の予測接触残基とした。得られた結果を図５及び図６に示す。なお、図５中に記載のアミノ酸配列はＮＳ３プロテアーゼのプロテアーゼドメインのアミノ酸配列（配列番号：８に記載のアミノ酸配列）を示し、図６中に記載のアミノ酸配列はＩ型ＴＧＦ−β受容体の細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号：９に記載のアミノ酸配列）を示す。また、図５及び６中、下線が付されているアミノ酸残基は、予測結合状態において、原子間で３．８Å以内の距離にあるアミノ酸残基（予測接触残基）であることを示し、影が付されている部位は、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合に関与している部位（予測結合サイト）であることを示す。【００６７】
図４に示した結果から明らかなように、前記手法を適用した結果、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体とは３ヶ所で結合していることが予測された。また、図５及び図６に示したように、かかる結合に関与している部位（予測結合サイト）又はアミノ酸残基（予測接触残基）も推定された。【００６８】
（実施例５）  抗体の作製方法
前記予測結合サイト（配列番号１〜６に記載のアミノ酸配列）を介して、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体とが結合し、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化が生じていることを実証するため、以下の通り、前記予測結合サイトのアミノ酸配列に基づいて合成ペプチド等を調製し、かかる合成ペプチド等を抗原とするポリクローナル抗体を作製した。【００６９】
＜合成ペプチドの調製＞
ＮＳ３プロテアーゼ又はＩ型ＴＧＦ−β受容体における予測結合サイト（配列番号１〜６に記載のアミノ酸配列）をターゲットとしたポリクローナル抗体作製に用いた合成ペプチドの配列の一覧を表１に示す。なお、表１中、「ＮＨ２」及び「ＣＯＯＨ」は各合成ペプチドのＮ末端側及びＣ末端側を各々示す。またＮ末端側の「Ｃ」は後述のｍｃＫＬＨを各合成ペプチドに結合させるために必要なシステイン残基を示す。さらに「ｍｉｎｉＰＥＧ」はスペーサー分子として挿入し、抗原ペプチドとキャリアータンパクとの立体障害を改善する目的で付与する平均分子量６，０００のポリエチレングリコールを示す。【００７０】
【表１】
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【００７１】
表１に示したペプチド（株式会社バイオマトリックス研究所）をＦｍｏｃ固相合成法にて合成した。最終ペプチドは９５％ＴＦＡを含むクリベージカクテルにて脱保護およびレジンからの切り出しを行い調製し、合成したペプチドはＨＰＬＣにて精製した。そして、得られた合成ペプチドに対し、抗原性を付与するためにキャリアタンパク質としてｍｃＫＬＨ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を結合させた。【００７２】
＜精製組換えＮＳ３タンパクに対する抗血清の作製＞
精製組換えＮＳ３タンパクを用いて２把のウサギ（メス、日本白色種（ヘルシー））を免疫した。すなわち、初回は一匹あたりフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジュバント中の１５０μｇの精製組換えＮＳ３タンパクを皮内投与し、以降はアジュバント中の３００μｇの精製組換えＮＳ３タンパクを皮内に、または食塩加リン酸バッファー（ＰＢＳ）中の５０μｇの精製組換えＮＳ３タンパクを耳介静脈に投与した。免疫はフロイントの完全アジュバントを用いた場合は２週間隔、ＰＢＳを用いた場合では１週間間隔とした。そして、最終免疫の７日後に心臓より全採血を行った。回収した血液は４℃にて一晩静置後、遠心分離にて血清成分を分離回収し、抗血清とした。得られた抗血清はアジ化ナトリウムを０．１％濃度で添加し、４℃にて保管した。また、血清中の抗体価の決定はＥＬＩＳＡ法を用いて行った。この検定において、マイクロタイタープレートを先ずＰＢＳで希釈したリコンビナント蛋白質でコートした。次いで０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄及びブロッキングしたウェルに連続希釈した血清を添加しインキュベートして、免疫原に対する抗体をウサギ免疫グロブリンに対するパーオキシターゼ結合抗体で検出した。【００７３】
＜合成ペプチドに対する抗血清の作製＞
ＫＬＨと結合した各合成ペプチドを用いて、各々２把のウサギ（メス、日本白色種（ヘルシー））を皮内投与により免疫した。すなわち、初回は一匹あたりＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント中の３００ｕｇのＫＬＨ結合合成ペプチドを投与し、以降はアジュバント中の３００ｕｇのＫＬＨ結合合成ペプチドを投与した。免疫はそれぞれ２週間隔で行った。最終免疫の７日後に心臓より全採血を行った。回収した血液は４℃にて一晩静置後、遠心分離にて血清成分を分離回収し、抗血清とした。得られた抗血清はアジ化ナトリウムを０．１％濃度で添加し、４℃にて保管した。血清中の抗体価の決定はＥＬＩＳＡ法を用いて行った。この検定において、マイクロタイタープレートを先ずＰＢＳで希釈した合成ペプチドでコートした。次いで０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄してブロッキングしたウェルに連続希釈した血清を添加しインキュベートした。合成ペプチドに対する抗体をウサギ免疫グロブリンに対するパーオキシターゼ結合抗体で検出した。【００７４】
＜抗血清からポリクローナル抗体の精製＞
前記の通りに作製した精製組換えＮＳ３タンパクに対する抗血清を等量の結合バッファーで希釈したのち、フィルターでろ過して不溶物を除去した。常法に従ってＰｒｏｔｅｉｎＡ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに通して抗体成分を吸着させたのち、非特異吸着分を除去してから酸性条件におくことで遊離した成分を回収し、精製ポリクローナル抗体とした。得られた精製抗体は１００倍量のＰＢＳ緩衝液に透析し置換した後、終濃度０．１％となるようにアジ化ナトリウムを添加した。【００７５】
また、前記の通りに作製した合成ペプチドに対する抗血清は、各々に対する抗原カラムを用いてアフィニティ精製を行った。すなわち、各合成ペプチドを常法に従ってＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＧＥヘルスケア社製）に結合させ抗原カラムとした。等量の結合バッファーで希釈した抗血清をフィルターでろ過して不溶物を除去したのち、抗原カラムに通して特異抗体を吸着させた。非特異吸着成分を除去してから酸性条件におくことで遊離した成分を回収、精製ポリクローナル抗体とした。得られた精製抗体は１００倍量のＰＢＳ緩衝液に透析し置換した後、終濃度０．１％となるようにアジ化ナトリウムを添加した。【００７６】
（実施例６）  ＮＳ３プロテアーゼとＴＧＦ−β受容体との結合部位に対する抗体による、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β様活性抑制の検討
実施例２と同様にして、培養培地に×９ＣＡＧＡ／ＣＣＬ６４細胞を２×１０５個／ｍｌの濃度で懸濁し、９６穴細胞培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で一晩培養した。培養後プレート内の培養上清を吸引除去し、ＰＢＳ（＋）にて細胞を洗浄した後、「ＮＳ３プロテアーゼと抗体との混合溶液」又はＮＳ３プロテアーゼのみ含有する溶液を１００μｌ／穴ずつ添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で更に２０時間培養した後、実施例２と同様にして、各抗体存在下におけるリポーター活性を求めた。得られた結果は図７に示す。なお、図７〜１４中、「コントロール」は、タンパク質（精製組換えＮＳ３タンパク及び組換えヒトＴＧＦ−β２）及び抗体を培地中に添加せず、接触させない条件下で培養した細胞のリポーター活性の値を示し、「兎１」及び「兎２」という表記は、同一抗原によって免疫されているが、異なるウサギ個体から抽出されたポリクローナル抗体であることを示す。【００７７】
また、前記「ＮＳ３プロテアーゼと抗体との混合溶液」は、処理培地に精製組換えＮＳ３タンパクを終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように加え、更に、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体側の予測結合サイトに対して作製した抗体（以下、「抗Ｉ型受容体抗体」とも称する）６種、ＮＳ３プロテアーゼ側のＮＳ３側の予測結合サイトに対して作製した抗体（以下、「抗ＮＳ３抗体」とも称する）６種、又は、精製組換えＮＳ３タンパクに対して作製した抗体（以下、「抗組換えＮＳ３抗体」とも称する）２種を各々終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加えて調製した。【００７８】
さらに、「ＮＳ３プロテアーゼと抗体との混合溶液」として、処理培地に精製組換えＮＳ３タンパクを終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように加え、終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように抗ＮＳ３抗体６種、抗組換えＮＳ３抗体、又は、陰性コントロールとして無免疫のマウス抗体を更に各々加えた後、４℃で１時間プレインキュベーションして調製したものを用いた以外は、前記と同様にして、各抗体存在下におけるリポーター活性を求めた。得られた結果は図８に示す。【００７９】
さらに、「ＮＳ３プロテアーゼと抗体との混合溶液」として、処理培地に精製組換えＮＳ３タンパクを終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように加え、終濃度が１．２５、２．５、５、１０μｇ／ｍｌになるように抗ＮＳ３抗体２種、終濃度３．１、６．３、１２．５、２５、５０、１００μｇ／ｍｌになるように抗組換えＮＳ３抗体、又は、終濃度が１．２５、２．５、５、１０μｇ／ｍｌになるように無免疫マウス抗体を更に各々加えた後、４℃で１時間プレインキュベーションして調製したものを用いた以外は、前記と同様にして、各抗体存在下におけるリポーター活性を求めた。得られた結果は図９に示す。【００８０】
また、前記と同様にして、×９ＣＡＧＡ／ＣＣＬ６４細胞を９６穴細胞培養用プレートに播種して一晩培養した後、プレート内の培養上清を吸引除去し、ＰＢＳ（＋）にて細胞を洗浄した。そして、洗浄後の細胞に、２０μｇ／ｍｌになるように抗Ｉ型受容体抗体６種又は無免疫のマウス抗体（陰性コントロール）を添加した処理培地を５０μｌ／穴ずつ加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１時間処理した。その後、２００μｇ／ｍｌになるように精製組換えＮＳ３タンパクを添加した処理培地を更に５０μｌ／穴ずつ加え、各抗体の終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように、精製組換えＮＳ３タンパクの終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにし、５％ＣＯ２存在下、３７℃で更に２０時間培養した。培養後、実施例２と同様にして、各抗体存在下におけるリポーター活性を求めた。得られた結果は図１０に示す。【００８１】
さらに、前記と同様にして、×９ＣＡＧＡ／ＣＣＬ６４細胞を９６穴細胞培養用プレートに播種して一晩培養した後、プレート内の培養上清を吸引除去し、ＰＢＳ（＋）にて細胞を洗浄した。そして、洗浄後の細胞に、２．５、５、１０、２０μｇ／ｍｌになるように抗Ｉ型受容体抗体２種又は無免疫のマウス抗体（陰性コントロール）を添加した処理培地を５０μｌ／穴ずつ加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１時間処理した。その後、２００μｇ／ｍｌになるように精製組換えＮＳ３タンパクを添加した処理培地を更に５０μｌ／穴ずつ加え、各抗体の終濃度が１．２５、２．５、５、１０μｇ／ｍｌになるように、精製組換えＮＳ３タンパクの終濃度が１００μｇ／ｍｌになるようにし、５％ＣＯ２存在下、３７℃で更に２０時間培養した。培養後、実施例２と同様にして、各抗体存在下におけるリポーター活性を求めた。得られた結果は図１１に示す。【００８２】
図７に示した結果から明らかなように、６種類の抗Ｉ型受容体抗体、６種類の抗ＮＳ３抗体、又は２種類の抗組換えＮＳ３抗体とＮＳ３プロテアーゼとを同時に細胞に添加することにより、ＮＳ３プロテアーゼによるルシフェラーゼ活性の増加が３０〜５０％抑制されることが確認された。【００８３】
また、図８及び図１０に示した結果から明らかなように、各抗体によって各抗原を前処理することによって、ＮＳ３プロテアーゼによるルシフェラーゼ活性の増加はほぼ１００％抑制されることが確認された。【００８４】
さらに、抑制効果の強かった抗体について濃度依存性を検討したところ、図９及び図１１に示した結果から明らかなように、濃度依存的にＮＳ３プロテアーゼによるルシフェラーゼ活性の増加を抑制することが確認された。【００８５】
また、図７〜１１に示した結果から明らかなように、陰性コントロールとして用いた無免疫マウス抗体ではかかる抑制作用は確認されず、以上のことから、ＮＳ３プロテアーゼは、実施例４において予測された部位にてＩ型ＴＧＦ−β受容体と結合し、ＴＧＦ−βシグナルを動員することが明らかになった。【００８６】
さらに、かかる抗体を用いた実験結果から、前記予測結合サイトを介して、実際にＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体とが結合し、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化が生じていることを実証された。また、ＮＳ３プロテアーゼ又はＩ型ＴＧＦ−β受容体における予測結合サイトを認識する抗体は、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制することも示され、前述の実施例３に記載の結果と併せて、本発明の抗体は、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する肝疾患の予防又は治療に有効であることが明らかになった。【００８７】
（実施例７）  ＮＳ３プロテアーゼとＴＧＦ−β受容体との結合サイトに対する抗体による、ルシフェラーゼ活性抑制効果に対する特異性の検討
実施例２と同様に×９ＣＡＧＡ／ＣＣＬ６４細胞を９６穴細胞培養用プレートに播種し、一晩培養した。終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように精製組換えＮＳ３タンパクを加えた処理培地に、抗ＮＳ３抗体１種、ＴＧＦ−β２  Ｅｍａｘ（Ｒ）  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に添付されている抗ＴＧＦ−β２ポリクローナル抗体、又は、２種類の無免疫ウサギ抗体を各々終濃度がおよそ１０μｇ／ｍｌなるように加えたものを調製し、４℃で１時間プレインキュベーションした。そして、一晩培養後のプレートから培養上清を吸引除去し、ＰＢＳ（＋）にて洗浄した後、プレインキュベーションした処理培地を各々１００μｌ／穴ずつ加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で更に２０時間培養した。その後、実施例２と同様にして、各抗体存在下におけるリポーター活性を求めた。得られた結果は図１２に示す。【００８８】
図１２に示した結果から明らかなように、抗ＮＳ３抗体はＮＳ３プロテアーゼによるルシフェラーゼ活性増加をほぼ１００％抑制したのに対し、ＮＳ３プロテアーゼに親和性のある前記抗ＴＧＦ−β２ポリクローナル抗体や無免疫ウサギ抗体ではかかる抑制効果は得られなかった。したがって、このような結果から、ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−βシグナル伝達を抑制するためには、実施例４において予測された部位に結合することが有効であるということが明らかになった
（実施例８）  ＮＳ３プロテアーゼとＴＧＦ−β受容体との結合部位に対する抗体による、ＴＧＦ−β２の活性に及ぼす影響の検討
実施例２と同様にして、×９ＣＡＧＡ／ＣＣＬ６４細胞を９６穴細胞培養用プレートに播種し、一晩培養した。終濃度５００μｇ／ｍｌになるように組換えヒトＴＧＦ−β２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を加えた処理培地に、抗ＮＳ３抗体、抗組換えＮＳ３抗体、陽性コントロールとして抗ＴＧＦ−β２抗体、又は、陰性コントロールとして抗ＴＧＦ−β２−ＬＡＰ抗体を各々終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように加えたものを調製し、４℃で１時間プレインキュベーションした。そして、前記一晩培養後のプレートから培養上清を吸引除去し、細胞をＰＢＳ（＋）にて洗浄した後、プレインキュベーションした処理培地を各々１００μｌ／穴ずつ加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で更に２０時間培養した。その後、実施例２と同様にして、各抗体存在下におけるリポーター活性を求めた。得られた結果は図１３に示す。【００８９】
また、実施例２と同様にして、×９ＣＡＧＡ／ＣＣＬ６４細胞を９６穴細胞培養用プレートに播種し、一晩培養した。一晩培養後のプレートから培養上清を吸引除去し、ＰＢＳ（＋）にて細胞を洗浄した後、２０μｇ／ｍｌの濃度にて、抗Ｉ型受容体抗体、抗ＴＧＦ−β２抗体（陽性コントロール）、又は抗ＴＧＦ−β２−ＬＡＰ抗体（陰性コントロール）を含有する処理培地を各々５０μｌ／穴ずつ加えて、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて１時間処理した。その後、１０００ｐｇ／ｍｌ  組換えヒトＴＧＦ−β２を含有する処理培地を５０μｌ／穴ずつ足し、組換えヒトＴＧＦ−β２の終濃度は５００ｐｇ／ｍｌ、各抗体の終濃度は１０μｇ／ｍｌとなるように調製し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて更に２０時間培養した。その後、実施例２と同様にして、各抗体存在下におけるリポーター活性を求めた。得られた結果は図１４に示す。【００９０】
図１３に示した結果から明らかなように、陽性コントロールである抗ＴＧＦ−β２抗体ではＴＧＦ−β２の活性がほぼ１００％抑制されたのに対して、ＮＳ３プロテアーゼに対する抗体ではＴＧＦ−β２の活性に対する影響は確認されなかった。一方、図１４に示した結果から明らかなように、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体に対する抗体によりＴＧＦ−β２の活性は最大で２７％抑制された。したがって、このような結果から、ＮＳ３プロテアーゼとＴＧＦ−β受容体との結合部位は、ＴＧＦ−β２とＴＧＦ−β受容体との結合部位と同一ではないものの、一部共有する部位があることが示唆された。【００９１】
（実施例９）  ＮＳ３プロテアーゼとＴＧＦ−β受容体との結合部位に対するモノクローナル抗体の作製
＜モノクローナル抗体作製用ＮＳ３タンパクの精製＞
先ず、ｓｃＮＳ４Ａ−ＮＳ３  ｐｒｏｔｅａｓｅをコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターｐＥＴ３２ａ（＋）をｐＭＩＮＯＲプラスミドを導入した大腸菌ＫＲＸ株に組み込み、培養した。なお、ｓｃＮＳ４Ａ−ＮＳ３  ｐｒｏｔｅａｓｅについては、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、１９９８年、７巻、１０号、２１４３〜２１４９ページ  参照のこと。またｐＭＩＮＯＲプラスミドについては、Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃ．Ｇｅｎｏｍ．、２００６年、７巻、３１〜３６ページ  参照のこと。【００９２】
そして、ラムノースで目的タンパク質の発現を誘導した後、当該タンパク質の発現を誘導した大腸菌の培養液を遠心分離することにより、菌体を回収した。回収した菌体は、バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，４ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２０μＭ  ＺｎＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１％  ｎ−ｃｔｙｌ−β−ｏ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製））に懸濁して、超音波で菌体を破砕した後、１４，０００×ｇにて２０分間遠心して、上清を回収した。回収した上清をＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）に通して、カラムに充填されているレジンに目的タンパク質を一旦吸着させた後、溶出バッファー（５００ｍＭ  イミダゾール，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，２０μＭ  ＺｎＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ）にてレジンから目的タンパク質を溶出させた。【００９３】
このようにして得られた溶出液をＨｉＰｒｅｐ２６／６０Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ＧＥヘルスケア社製）に通して、脱塩操作を行い、目的タンパク質を含むバッファー(２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２０μＭ  ＺｎＣｌ２，１０ｍＭ  ＤＴＴ，１００ｍＭ  ＣａＣｌ２)に置換した。これをエンドトキシン除去を目的としてＥｎｄｏＴｒａｐ  Ｂｌｕｅカラム（Ｈｙｇｌｏｓ  ＧｍｂＨ社製）に通して濾過された液を回収し、モノクローナル抗体作製用ＮＳ３タンパク（以下、「リコンビナントＮＳ３」とも称する）として以下の実験に供した。【００９４】
＜免疫及び細胞融合＞
次に、リコンビナントＮＳ３をメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔注射して免疫を行った。初回免疫には一匹あたりＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント中の５０μｇのリコンビナントＮＳ３を投与し、以降の免疫には水中油型エマルジョンアジュバント中の５０μｇのリコンビナントＮＳ３を投与した。免疫はそれぞれ３週間隔で行った。最終免疫は５０μｇのリコンビナントＮＳ３を含む食塩加リン酸バッファー（ＰＢＳ）を投与して行った。最終免疫の３日後、血清中の抗体価が高い個体の脾臓細胞についてポリエチレングリコール４０００を用いてＰ３．Ｘ６３−Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞との細胞融合処理を行った。ハイブリドーマ細胞は公知のＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの技術を用いてＨＡＴ培地中で選択した。【００９５】
なお、血清中の抗体価はＥＬＩＳＡ法を用いて検定した。この検定において、先ず９６ウェルマイクロプレートをリコンビナントＮＳ３又は後述のＩｍｊｅｃｔ  ＯＶＡが結合している抗原（以下、「ＯＶＡ結合合成ペプチド」とも称する）でコートした。次いで１％  スキムミルク／食塩加リン酸バッファーでブロッキングした後、連続希釈した血清を加えてインキュベートした。プレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、１％  スキムミルク／食塩加リン酸バッファーで希釈したマウス免疫グロブリンに対するパーオキシターゼ結合抗体をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、基質溶液（０．０５％  ｏ−フェニレンジアミン／クエン酸バッファー（ｐＨ５）／０．０３％  Ｈ２Ｏ２）をウェルに加え、発色反応を行った。基質溶液を添加してから１０分後に、２Ｎ  硫酸を添加することにより反応を停止させ、分光光度計で４９０ｎｍの吸光度を測定した。【００９６】
＜ＯＶＡ結合合成ペプチドの調製＞
先ず、表１に示したペプチド  ＮＳ−１〜ＮＳ−３（株式会社バイオマトリックス研究所）をＦｍｏｃ固相合成法にて合成した。ペプチド最終産物は９５％ＴＦＡを含むクリベージカクテルにて脱保護及びレジンからの切り出しを行い調製した。また、合成ペプチドをスクリーニングに用いるために、Ｉｍｊｅｃｔ  ＯＶＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）をキャリアタンパク質として合成ペプチドに結合させた。【００９７】
＜スクリーニング＞
ＥＬＩＳＡ法及び免疫沈降を利用した免疫沈降ＥＬＩＳＡ法を用いて、リコンビナントＮＳ３に反応するハイブリドーマを選別した。すなわち、先ずリコンビナントＮＳ３（終濃度１μｇ／ｍＬ、５０ｍＭ  炭酸バッファーにて調製）を疎／親水性分子吸着性９６ウェルマイクロプレートに室温で１時間固定した。次いでプレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、ウェル表面のフリーの吸着部分を１％  スキムミルク／食塩加リン酸バッファーを用いて室温で１時間ブロックし、再びＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。ハイブリドーマ培養上清をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いで１％  スキムミルク／食塩加リン酸バッファーで希釈したパーオキシターゼ結合マウス抗ＩｇＧ抗体をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、基質溶液（０．０５％  ｏ−フェニレンジアミン／クエン酸バッファー（ｐＨ５）／０．０３％  Ｈ２Ｏ２）をウェルに加え、発色反応を行った。基質溶液添加の１０分後、２Ｎ  硫酸で反応を停止し、分光光度計で４９０ｎｍの吸光度を測定した。また、比較対象として、抗ＮＳ１ペプチドポリクローナル抗体（実施例５において調製した、表１に記載のＮＳ−１に結合するポリクローナル抗体）、抗ＮＳ３ペプチドポリクローナル抗体（実施例５において調製した、表１に記載のＮＳ−３に結合するポリクローナル抗体）、抗ｒｉｋｅｎＮＳ３ペプチドポリクローナル抗体（実施例５において調製した、精製組換えＮＳ３タンパクを抗原とするポリクローナル抗体）についても同様に評価した（以下、同様）。得られた結果を表２及び３のＣ欄に示す。【００９８】
また、免疫沈降ＥＬＩＳＡ法においては、リコンビナントＮＳ３と抗体吸着ビーズとハイブリドーマ培養上清の各溶液とを混合した反応液を１時間撹拌した後、５分間放置して得られた上清を試料としてＥＬＩＳＡ法により検定を行った。得られた結果を表２及び３のＢ欄に示す。なお、表２及び３のＢ欄に記載の「ＩＰ％」は、抗原が抗体によって完全に除去された前記上清についてのＥＬＩＳＡ法による測定値を１００％とし、抗原が全く除去されていない前記上清についてのＥＬＩＳＡ法による測定値を０％として各々算出した値である。【００９９】
【表２】
0005975399.tif 000003
【０１００】
【表３】
0005975399.tif 000004
【０１０１】
次に、リコンビナントＮＳ３に含まれるタグタンパク質（ｔｒｘ−Ｈｉｓ−Ｓタグ）に反応するハイブリドーマを除外するため、遺伝子組換え大腸菌から調製したリコンビナントｔｒｘ−Ｈｉｓ−Ｓタグタンパク質に対する反応性を指標に、ＥＬＩＳＡ法及び免疫沈降を利用した免疫沈降ＥＬＩＳＡ法を用いて選別した。すなわち、先ずｔｒｘ−Ｈｉｓ−Ｓタグタンパク質（終濃度１μｇ／ｍＬ、５０ｍＭ  炭酸バッファーにて調製）を疎／親水性分子吸着性９６ウェルマイクロプレートに室温で１時間固定した。次いでプレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、ウェル表面のフリーの吸着部分を１％  スキムミルク／食塩加リン酸バッファーを用いて室温で１時間ブロックし、再びＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。ハイブリドーマ培養上清をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いで１％  スキムミルク／食塩加リン酸バッファーで希釈したパーオキシターゼ結合マウス抗ＩｇＧ抗体をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、基質溶液（０．０５％  ｏ−フェニレンジアミン／クエン酸バッファー（ｐＨ５）／０．０３％  Ｈ２Ｏ２）をウェルに加え、発色反応を行った。基質溶液添加の１０分後、２Ｎ  硫酸で反応を停止し、分光光度計で４９０ｎｍの吸光度を測定した。【０１０２】
また、免疫沈降ＥＬＩＳＡ法においては、ｔｒｘ−Ｈｉｓ−Ｓタグタンパク質と抗体吸着ビーズとハイブリドーマ培養上清の各溶液とを混合した反応液を１時間撹拌した後、得られた上清を試料としてＥＬＩＳＡ法により検定を行った。【０１０３】
そして、かかるｔｒｘ−Ｈｉｓ−Ｓタグタンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法及び免疫沈降ＥＬＩＳＡ法において、Ｔｒｘ−Ｈｉｓ−Ｓタグタンパク質に反応性を示すものと認められたハイブリドーマは、抗ｔｒｘ−Ｈｉｓ−Ｓタグタンパク質抗体産生クローンと予想されたため、検討対象から排除した。【０１０４】
＜エピト―プについての検討＞
上記の方法にて選抜されたリコンビナントＮＳ３に陽性を示すハイブリドーマについては、それらが産生する抗ＮＳ３モノクローナル抗体の前記合成ペプチド（ＮＳ−１〜ＮＳ−３）に対する反応性をＥＬＩＳＡ法により調べ、これら抗体が認識するエピトープについて検討した。すなわち、先ずＯＶＡを結合したＮＳ−１、ＮＳ−２、ＮＳ−３の合成ペプチド（終濃度０．５μｇ／ｍＬ、５０ｍＭ  炭酸バッファーにて調製）それぞれを疎／親水性分子吸着性９６ウェルマイクロプレートに室温で１時間固定した。次いでプレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、ウェル表面のフリーの吸着部分を１％  スキムミルク／食塩加リン酸バッファーを用いて室温で１時間ブロックし、再びＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。そして、ハイブリドーマ培養上清をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いで１％  スキムミルク／食塩加リン酸バッファーで希釈したパーオキシターゼ結合マウス抗ＩｇＧ抗体をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、基質溶液（０．０５％  ｏ−フェニレンジアミン／クエン酸バッファー（ｐＨ５）／０．０３％  Ｈ２Ｏ２）をウェルに加え、発色反応を行った。基質溶液を添加してから１０〜１５分後に、２Ｎ  硫酸を添加することにより反応を停止させ、分光光度計で４９０ｎｍの吸光度を測定した。得られた結果を表４及び５のＥ〜Ｇ欄に示す。【０１０５】
【表４】
0005975399.tif 000005
【０１０６】
【表５】
0005975399.tif 000006
【０１０７】
＜抗ＮＳ３モノクローナル抗体の反応性についての評価＞
また、リコンビナントＮＳ３に陽性を示すハイブリドーマについては、それらが産生する抗ＮＳ３モノクローナル抗体のＮＳ３ペプチド（市販品）に対する反応性をもＥＬＩＳＡ法により調べた。すなわち、先ずＮＳ３−ＮＳ４Ａ（ＨＣＶ），（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）（Ｈｉｓ−ｔａｇ）（ＡＬＥＸＩＳ社製）（終濃度０．５μｇ／ｍＬ、５０ｍＭ  炭酸バッファーにて調製）を疎／親水性分子吸着性９６ウェルマイクロプレートに室温で１時間固定した。次いでプレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、ウェル表面のフリーの吸着部分を１％  スキムミルク／食塩加リン酸バッファーを用いて室温で１時間ブロックし、再びＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。ハイブリドーマ培養上清をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。その後、プレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次いで１％  スキムミルク／食塩加リン酸バッファーで希釈したパーオキシターゼ結合マウス抗ＩｇＧ抗体をウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、基質溶液（０．０５％  ｏ−フェニレンジアミン／クエン酸バッファー（ｐＨ５）／０．０３％  Ｈ２Ｏ２）をウェルに加え、発色反応を行った。基質溶液を添加してから１０〜１５分後に、２Ｎ  硫酸を添加することにより反応を停止させ、分光光度計で４９０ｎｍの吸光度を測定した。得られた結果を表２及び３のＤ欄に示す。【０１０８】
＜モノクローナル抗体の精製＞
公知の方法に則り、前記ハイブリドーマの培養上清を０．２２μｍフィルターで濾過して培養上清から不溶物を除去した。次いで常法に則り、ＰｒｏｔｅｉｎＧ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅｌｔｈｅｃａｒｅ社製）を充填したカラムに培養上清を通して抗体成分を吸着させた後、カラム洗浄により非特異吸着成分を除去してから、酸性条件下で吸着したＩｇＧを遊離させた。遊離したＩｇＧ（モノクローナル抗体）を回収し、精製抗体とした。また、得られた精製抗体は１００倍量のＰＢＳで透析し、バッファーを置換した。【０１０９】
なお、表２〜５に記載の３５種の抗ＮＳ３モノクローナル抗体のアイソタイプは、アイソタイプ同定用キット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って同定した。【０１１０】
（実施例９）  抗ＮＳ３モノクローナル抗体を用いたリポーターアッセイ
リコンビナントＮＳ３に陽性を示すハイブリドーマについては、それらが産生する抗ＮＳ３モノクローナル抗体による、ＮＳ３プロテアーゼとI型ＴＧＦ−β受容体との結合（ＮＳ３プロテアーゼによるＴＧＦ−β様活性）の抑制について検討した。すなわち、先ずII型ＴＧＦβ受容体からのシグナル増強によりルシフェラーゼ遺伝子の発現が亢進するようにデザインされたリポーター細胞（×９ＣＡＧＡ／ＣＣＬ６４細胞）を９６ウェルマイクロプレートにコンフルエントになるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。細胞は培養上清除去後にＰＢＳで洗浄し、終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにリコンビナントＮＳ３を加えた無血清培地に置換した。その際、リコンビナントＮＳ３を添加した無血清培地には濃度既知の抗ＮＳ３モノクローナル抗体を含むハイブリドーマ培養上清（血清不含）を終濃度が１μｇ／ｍＬ又は０．１μｇ／ｍＬとなるように加えた。また、リコンビナントＮＳ３を添加した無血清培地に抗ＮＳ３モノクローナル抗体を添加しないものも用意した。そして、このように調製した細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した後、培養上清の除去とＰＢＳによる洗浄とを行った。次いで、洗浄後の細胞にＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を３０μＬ添加し、室温で１５分間激しく撹拌して細胞を溶解させた。標準的なプロトコールに従って調製したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ用９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ分注し、さらに、これらに細胞溶解液１５μＬを添加した。そして、細胞溶解液を添加したマイクロプレートは直ちに蛍光プレートリーダーにてｌｕｃｉｆｅｒｉｎ蛍光シグナルを測定した。また、得られた各測定値をリコンビナントＮＳ３のみを添加した無血清培地（抗ＮＳ３モノクローナル抗体を添加しない培地）における測定値を１００として換算することにより、各抗ＮＳ３モノクローナル抗体によるＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合の抑制の程度（結合抑制％）を算出した。得られた結果を表２及び３のＡ欄に示す。なお、表２〜５に示した３５種のクローンは、今回作製した抗ＮＳ３モノクローナル抗体のうち、このリポーターアッセイにて活性（結合抑制）を示したクローン又は前記免疫沈降ＥＬＩＳＡ法にて抗原に対する反応性（ＩＰが１０％以上）を示したクローンである。【０１１１】
（実施例１０）  ＮＳ３プロテアーゼとＴＧＦ−β受容体との結合部位に対する抗体によるＮＳ３プロテアーゼのコラーゲン産生促進能の抑制
ＮＳ３プロテアーゼとＴＧＦ−β受容体との結合部位に対するモノクローナル抗体（抗ＮＳ３モノクローナル抗体）５種（表２〜５に記載のクローン：ｅ１２１１、ｅ０４５８、ｓ０６４７、Ｐ３−ｇ０９４８、Ｐ３−ｇ１３９０）が、ＮＳ３プロテアーゼによるコラーゲン産生促進能を抑制するかどうかをヒト正常肝細胞由来細胞株Ｈｃ細胞を用いて検討した。１０％胎児ウシ血清（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ社製）と１％防腐剤（ペニシリンーストレプトマイシンーグルタミン溶液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にＨｃ細胞を４×１０５個／ｍｌになるよう懸濁し、２４穴の細胞培養用プレート（ＴＰＰ社製）に５００μｌ／穴ずつ播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で一晩培養した。そして、プレートから培養上清を吸引除去し、カルシウム−マグネシウム含有リン酸緩衝液にて細胞を洗浄した後、終濃度が０．０２、０．２、２、２０μｇ／ｍｌになるように抗ＮＳ３モノクローナル抗体ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．ｅ１２１１、又は他のクローンについては２０μｇ／ｍｌになるように抗ＮＳ３モノクローナル抗体を添加した０．１％ウシ血清アルブミン（ＥＱＵＩＴＥＣＨ−ＢＩＯ社製）と前記１％防腐剤とを含むＤＭＥＭ（以下、「処理培地」とも称する）を２５０μｌ／穴ずつ加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１時間培養した。その後、１００μｇ／ｍｌになるようにリコンビナントＮＳ３を添加した処理培地を更に２５０μｌ／穴ずつ加え、ｅ１２１１抗体の終濃度が０．０１、０．１、１、１０μｇ／ｍｌ、他のクローンについては終濃度１０μｇ／ｍｌになるように、かつリコンビナントＮＳ３の終濃度が５０μｇ／ｍｌになるようにし、５％ＣＯ２存在下、３７℃で更に２０時間培養した。また、抗ＮＳ３モノクローナル抗体及び精製組換えＮＳ３プロテアーゼを含まない処理培地にて培養した細胞（無処理細胞）も陰性対照として調製した。さらに、抗ＮＳ３モノクローナル抗体を含まず、精製組換えＮＳ３プロテアーゼを終濃度が５０μｇ／ｍｌになるように添加した処理培地にて培養した細胞も陽性対照として調製した。【０１１２】
その後、これら細胞からＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＲＮＡを抽出し、分光光度計（Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、濃度を求めた。次いでこのＲＮＡをテンプレートとして、ｐｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＭ）ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用い、添付文書に従ってＲＴ反応を行った。さらにＳＹＢＲ（Ｒ）Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＭ）II（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用い、添付文書に従って反応液を調製し、コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）１α１及び内部標準であるＧＡＰＤＨの各プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＰＣＲ反応を行い、Ｃｏｌｌａｇｅｎ１α１  ｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨ発現量で補正したのち、無処理細胞（陰性対照）のそれと比較した。得られた結果を図１５に示す。【０１１３】
図１５に示す通り、ＮＳ３プロテアーゼによってＨｃ細胞のコラーゲン発現量は約２倍に亢進されたが（陰性対照及び陽性対照  参照）、かかるＮＳ３プロテアーゼのコラーゲン産生促進能は抗ＮＳ３モノクローナル抗体により抑制されることが明らかになった。特に調べた５種の抗ＮＳ３モノクローナル抗体のうち、ｅ１２１１は一番低い低濃度から抑制活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
以上説明したように、本発明によれば、ＨＣＶによるＴＧＦ−β受容体の活性化を抑制することを可能とする化合物、並びにそのスクリーニング方法を提供することが可能となり、ひいてはＣ型肝炎ウィルスに起因する疾患の予防又は治療のための組成物を提供することが可能となる。【０１１５】
また、本発明の化合物及びそれを有効成分として含有する医薬組成物は、ＮＳ３プロテアーゼとＩ型ＴＧＦ−β受容体との結合を抑制するという作用機構に基づく効果を有しているため、ＰＥＧインターフェロン、リバビリン、ＮＳ３プロテアーゼの活性阻害剤等といった現行又は開発中のＣ型肝炎ウィルスに起因する疾患の治療薬とは、肝線維化等の発症機構における作用点が異なる。従って、本発明の医薬組成物とこれら現行又は開発中の治療薬とを併用することによって、使用する各医薬品の濃度を低くおさえながら、Ｃ型肝炎ウィルスによる病態の進行を抑え、ウィルスを排除し、Ｃ型肝炎ウィルスに起因する肝疾患を根治することも可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１６】
配列番号７
＜２２３＞  組換えタンパク質の配列
【図１】
0005975399.tif 000007
【図２】
0005975399.tif 000008
【図３】
0005975399.tif 000009
【図４】
0005975399.tif 000010
【図５】
0005975399.tif 000011
【図６】
0005975399.tif 000012
【図７】
0005975399.tif 000013
【図８】
0005975399.tif 000014
【図９】
0005975399.tif 000015
【図１０】
0005975399.tif 000016
【図１１】
0005975399.tif 000017
【図１２】
0005975399.tif 000018
【図１３】
0005975399.tif 000019
【図１４】
0005975399.tif 000020
【図１５】
0005975399.tif 000021
【配列表】
0005975399000001.app