(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型メチルグリオキサールシンターゼ（ＭＧＳ）酵素であって、配列番号１、配列番号２および配列番号３で特定されるＭＧＳからなる群から選択されるタンパク質配列を含んでなる、変異型メチルグリオキサールシンターゼ（ＭＧＳ）酵素。
【請求項２】
請求項１に記載の変異型ＭＧＳをコードしている配列を含んでなる、ＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載の変異型メチルグリオキサールシンターゼ（ＭＧＳ）酵素を発現する、改変微生物。
【請求項４】
乳酸、アセトール、および１，２−プロパンジオールから選択される生化学物質の改良された生産のためにさらに改変された、請求項３に記載の改変微生物。
【請求項５】
変異型ＹｑｈＤをコードする遺伝子をさらに含んでなる、アセトールを生産するための、請求項３または４に記載の改変微生物。
【請求項６】
変異型ＹｑｈＤをコードする遺伝子および／または変異型グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をさらに含んでなる、１，２−プロパンジオールを生産するための、請求項３または４に記載の改変微生物。
【請求項７】
変異型ＹｑｈＤが、Ｇ１４９Ｅ、Ｇ１４９Ｓ、Ａ２８６Ｔ、およびその組合せからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含んでなる、請求項５または６に記載の微生物。
【請求項８】
変異型グリセロールデヒドロゲナーゼが、Ａ１６０Ｔ、Ｔ１２０Ｎ、およびその組合せからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含んでなる、請求項６に記載の微生物。
【請求項９】
微生物が、腸内細菌科、バシラス科、クロストリジウム科、ストレプトミセス科、コリネバクテリウム科、および酵母からなる群から選択される、請求項３〜８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１０】
大腸菌、肺炎桿菌、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム、クロストリジウム・スフェノイデス、またはサッカロミセス・セレビシエからなる群から選択される、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
乳酸、アセトール、および１，２−プロパンジオールから選択される生化学物質の生産方法であって、
請求項３〜１０のいずれか一項に記載の微生物を適当な培養培地で培養すること、および
所望の生化学物質を回収すること
を含んでなる、方法。
【請求項１２】
回収された生化学物質が精製される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
適当な培養培地が、グルコース、スクロース、単糖類または二糖類、デンプンおよびその誘導体、並びにそれらの混合物から選択される炭素源を含んでなる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
炭素源が、グルコースおよびスクロースから選択される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、乳酸、アセトール、および１，２−プロパンジオールから選択される生化学物質の生産方法であって、乳酸、アセトール、および１，２−プロパンジオールから選択される生化学物質の改良された生産のために改変された微生物を適当な培養培地で培養すること、および所望の生化学物質を回収することを含み、この生化学物質はさらに精製してもよく、該微生物がオルトホスフェート(orthophosphate)によりその活性が阻害されないメチルグリオキサールシンターゼ（ＭＧＳ）酵素を発現することを特徴とする方法に関する。
【０００２】
本発明はまた、親酵素のタンパク質配列中の同じ位置で別のアミノ酸残基により置換された少なくとも１つのアミノ酸残を含み、
−変異型酵素が親酵素のメチルグリオキサールシンターゼ活性の５０％を超える活性を保持し、かつ、
−変異型ＭＧＳのメチルグリオキサールシンターゼ活性が親酵素と比較してオルトホスフェートにより阻害されない、
変異型メチルグリオキサールシンターゼ（ＭＧＳ）に関する。
【発明の背景】
【０００３】
メチルグリオキサールシンターゼ（ＭＧＳ）は、大腸菌のメチルグリオキサールバイパスの最初の酵素として発見され、同定された。後にＭＧＳは、グラム陰性ならびにグラム陽性細菌および酵母などの様々な生物体において発見された(Cooper (1984))。メチルグリオキサールバイパスは、グルコース異化作用において、トリオースホスフェートのピルビン酸への変換のための代替経路として役割を果たすことができる(Cooper and Anderson (1970), Cooper (1984))。エムデン・マイヤーホフ・パルナス（ＥＭＰ）経路または解糖は、トリオースリン酸グリセルアルデヒド３リン酸（Ｇ３Ｐ）のピルビン酸への変換に関与し、一方、メチルグリオキサールバイパスは第２番目のトリオースホスフェート、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）から出発し、それは中間体であるメチルグリオキサール（ＭＧ）および乳酸を介してピルビン酸に変換される。
【０００４】
ＭＧＳは、大腸菌のものが最初に精製され、特性が評価されており(Hopper and Cooper (1971および1972))、１モルのＤＨＡＰから１モルのＭＧおよび１モルのオルトホスフェート（Ｐｉ）への変換を触媒する。ＭＧＳはＤＨＡＰに対して非常に特異的であり、ＤＨＡＰは該酵素により良好な親和性で受け入れられる唯一の基質であるように思われる（親和定数Ｋｍは、０．２から０．４７ｍＭと様々である）。ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、３−ホスホグリセリン酸、Ｐｉおよびピロホスフェート（ＰＰｉ）などのいくつかの酵素阻害剤が同定されている。
【０００５】
最近の、大腸菌のＭＧＳをコードする遺伝子の同定（ｙｃｃＧ、その後ｍｇｓＡと改称された）により、ｍｇｓＡ遺伝子のクローニングおよび過剰発現後の、組換え型ＭＧＳの生産および特性評価が容易になった(Totemeyer et al (1998))。該酵素の詳細な特性評価が提案され(Saadat and Harrison (1998))、最も強力な阻害剤であるＰｉによる阻害がさらに研究された：Ｐｉは該酵素のアロステリック阻害剤として作用し、このことは、ホスフェート(phosphate)の存在下では、酵素反応を進行させるためにはより大量のＤＨＡＰが必要であったことを意味している（実施例２に示した大腸菌由来の天然ＭＧＳの特性評価も参照）。該酵素の触媒反応速度を常に低下させるいくつかの変異型ＭＧＳ（Ｄ２０、Ｄ７１、Ｄ９１、Ｄ１０およびＨ９８の位置）の特性が評価され、触媒機構が提案された(Saadat and Harrison (1998), Marks et al (2004))。酵素の結晶化の後に大腸菌由来のＭＧＳの三次元構造が決定された(Saadat and Harrison (1999 and 2000))。ＭＧＳは、１７ｋＤａの６つの独立したユニットからなるホモ六量体である。ＭＧＳの活性部位にホスフェートが結合することが可能であり、明らかな証拠は示されてはいないが、モノマー間の塩橋を介するアロステリックな情報の伝達に関する仮説が提案されている。
【０００６】
乳酸、アセトールおよび１，２−プロパンジオールといったいくつかの関心のある産物の生産は、様々な炭素基質（グルコース、フルクトース、スクロース、グリセロール）の、メチルグリオキサールバイパスおよび特にＭＧＳを経る異化作用によりもたらされうる。
【０００７】
メチルグリオキサールの解毒を理解するだけではなく、１，２−プロパンジオールを生産する目的のために、この化合物の異化作用のルートが、細菌を用いて研究されている(Ferguson et al, 1998)。メチルグリオキサールから乳酸の生産につながりうる３つの経路が大腸菌で同定されている；
第１の系は、２段階を経てメチルグリオキサールをＤ−ラクテートへ変換するグルタチオン依存性グリオキサラーゼＩ−ＩＩ系（ｇｌｏＡおよびｇｌｏＢ遺伝子によりコードされている）(Cooper, 1984)。
第２の系は、１段階を経てメチルグリオキサールのＤ−ラクテートへの変換を触媒するグルタチオン非依存性グリオキサラーゼＩＩＩ酵素系(Misra et al, 1995)
第３の系は、メチルグリオキサールレダクターゼによるメチルグリオキサールの分解であり、アセトールまたはＤ−もしくはＬ−ラクトアルデヒドのいずれかをもたらす(Cameron et al, 1998, Bennett and San, 2001)。Ｌ−ラクトアルデヒドはさらにアルデヒドデヒドロゲナーゼ、例えばａｌｄＡまたはａｌｄＢ遺伝子によりコードされる酵素などの作用によりＬ−乳酸に変換されうる(Grabar et al, 2006)。
【０００８】
３つの系のうちの１つにより生成された乳酸は、Ｄ−またはＬ−乳酸デヒドロゲナーゼにより、さらにピルビン酸へと変換されうる。これらの酵素は、発酵性の乳酸デヒドロゲナーゼとは対照的に、フラビン依存性の膜結合タンパク質であり、好気性条件下においてのみ活性化される(Garvie, 1980)。Ｄ−およびＬ−乳酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌ではそれぞれｄｌｄおよびｌｌｄＤ（またはｌｃｔＤ）遺伝子によりコードされている(Rule et al, 1985, Dong et al, 1993)。
【０００９】
第３の系により生成されたアセトールまたはラクトアルデヒドは、いくつかの酵素活性、特に大腸菌のグリセロールデヒドロゲナーゼ（ｇｌｄＡ遺伝子によりコードされている）、または１，２−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｆｕｃＯ遺伝子によりコードされている）により１，２−プロパンジオールへと変換されうる(Altaras and Cameron, 2000)。
【００１０】
Ｃ３ジアルコールである１，２−プロパンジオールすなわちプロピレングリコールは、広く用いられている化学物質である。これは、不飽和ポリエステル樹脂、液体洗剤、冷却剤、不凍剤および航空機の除氷剤の成分である。プロピレングリコールは、プロピレン誘導体より毒性が強いと認識されているエチレン誘導体の代替として１９９３〜１９９４年以来、その使用が増加してきている。
【００１１】
１，２−プロパンジオールは現在、大量の水を消費するプロピレンオキシド水和法を用いる化学的手段により生産されている。プロピレンオキシドは、１つはエピクロロヒドリン(epichlorhydrin)を用い、他方はヒドロペルオキシドを用いる２つの方法のいずれかによって生産することができる。両経路とも、非常に毒性の強い物質を使用する。加えて、ヒドロペルオキシド経路はｔｅｒｔ−ブタノールおよび１−フェニルエタノールなどの副産物を生じる。プロピレンの生産の収益を高めるためには、これらの副産物の利用法を見出さなければならない。この化学的経路は一般にラセミ１，２−プロパンジオールを生成するが、２つの立体異性体（Ｒ）１，２−プロパンジオールおよび（Ｓ）１，２−プロパンジオールはそれぞれ、ある特定の適用に関して（例えば、特殊化学物質および医薬品のためのキラル出発材料）注目されるものである。
【００１２】
アセトールすなわちヒドロキシアセトン（１−ヒドロキシ−２−プロパノン）は、Ｃ３ケトアルコールである。この産物は繊維工業のバット染色法において還元剤として使用されている。これは有利にも、環境に有害な排水中の硫黄含量を低減するため、従来の硫黄含有還元剤にとって代わることができる。アセトールはまた、例えばポリオールまたは複素環式分子を生産するために使用される化学工業の出発材料でもある。これはまた、興味深いキレート特性および溶媒特性を有する。
【００１３】
アセトールは、現在、主として１，２−プロパンジオールの触媒的酸化または脱水により生産されている。現在、グリセロールのような再生可能な原料から出発する新しい方法が提案されている（ＤＥ４１２８６９２およびＷＯ２００５／０９５５３６参照）。現在、化学法によるアセトールの生産コストがその産業上の利用および市場を縮小させている。
【００１４】
これら１，２−プロパンジオールおよびアセトールの生産のための化学法の不利な点は、生物学的合成を代替法として魅力あるものにしている。ＭＧＳは、これらの２つの化合物の生産のための、中央代謝からの必須の第１段階である。様々な微生物、クロストリジウム・スフェノイデス(Clostridium sphenoides)（ＤＥ３３３６０５１）、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)（ＷＯ２００４／０８７９３６）、組換え酵母（ＷＯ９９／２８４８１）または組換え大腸菌（ＷＯ９８／３７２０４）を用いる１，２−プロパンジオールまたはアセトールの生産のための方法が開示されている。１，２−プロパンジオールまたはアセトールの生産のための代替アプローチもまた開示されている（ＷＯ２００５／０７３３６４、ＷＯ２００８／１１６８５２、ＷＯ２００８／１１６８４８、ＷＯ２００８／１１６８４９、ＷＯ２００８／１１６８５１））。
【００１５】
乳酸またはラクテートおよびその誘導体は食品、医薬品、皮革および繊維工業において幅広い適用を有する。最近では、ポリ乳酸（ＰＬＡ）が再生可能、分解可能、かつ環境に優しいプラスチックとして開発され、このために、乳酸に対する需要の拡大が期待される。乳酸は、化学的合成または生物学的方法のいずれかにより生産されうる。しかしながら、生物学的方法のみが、所望の立体異性体、Ｄ−またはＬ−ラクテートを高い光学純度で生産することができ、このことは、その最終用途の多くにとって重要な特性である。ＰＬＡの物理的性質および微生物分解速度は、キラル基質、Ｄ−およびＬ−ラクテートの比を操作することによりコントロールすることができる。従って、光学的に純粋なＤ−およびＬ−ラクテートの生産のための生物学的方法の可用性は、高品質なポリマー合成のためには必要な条件である。
【００１６】
乳酸菌は、ラクテートの天然の生産者であり、その一部はＤ−またはＬ−型に特異的であることが見て取れる。これらの細菌は、特殊化学品としてのラクテートの生産のために昔から使用されてきた（例えば、ＵＳ２００４／０００５６７７）。しかしながらＰＬＡ合成のための汎用化学品として乳酸が知られるようになるとともに、より効率的で費用効果的な方法が必要とされる。無機塩培地中で増殖可能で、様々な異なる糖基質を使用しうる代替生体触媒の研究が行われている。酵母および大腸菌が、これらの特性と代謝工学のための幅広い遺伝的手段の利用可能性とを兼ね備えている。乳酸生産のためのこれらの触媒の使用は、酵母菌株に関してはＷＯ０３１０２２０１、ＷＯ０３１０２１５２およびＵＳ２００５／０１１２７３７、大腸菌株に関してはＥＰ１７６０１５６およびＷＯ２００５／０３３３２４に記載されている。微生物におけるＤ−またはＬ−ラクテートのこれらの生産方法は、一般に好気性条件下でのＮＡＤＨ−依存性乳酸デヒドロゲナーゼによる糖の異化作用により生産されるピルビン酸の還元に依存している。前述のＭＧ分解のための３つの経路があるメチルグリオキサールバイパスは、ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３０９３に記載のとおり、乳酸生産のための代替非発酵経路の役割を果たしうる。
【００１７】
ＰｉによるＭＧＳのアロステリック阻害によれば、酵素の活性化に必要な条件は、その基質であるＤＨＡＰが高濃度であること、またはＰｉが低濃度であることである。環境においてＰｉが制限されている場合、Ｇ３Ｐデヒドロゲナーゼはその基質の１つが欠けても働き続けることができず、従ってＧ３Ｐおよびそれ故にＤＨＡＰが蓄積することになり、ＭＧＳが効率よく働くための２つの条件を満たす。これらの条件下で、メチルグリオキサールバイパスはトリオースホスフェートの異化作用のための解糖を代替することになる。Ｐｉが豊富に存在する場合は、ＭＧＳが活性化されるにはＰｉ濃度が高すぎ、ＤＨＡＰ濃度が低すぎるために、解糖系が働くことになるであろう(Cooper (1984), Fergusson et al (1998))。このメカニズムは、微生物がＰｉに関して様々な状況に対処できるようにしている。しかしながら、メチルグリオキサールバイパスの代謝産物の生成に関しては、これらの分子が代謝の最終産物である場合、２つの並行経路である解糖およびメチルグリオキサールバイパスが共に働く必要があり、解糖は前駆体の供給および増殖のためのエネルギーを、そしてメチルグリオキサールバイパスは所望の産物の合成を請け合う。この場合、リン酸により阻害されることのないＭＧＳ酵素が有利であるのは明らかである。
【００１８】
本発明者らは、実施例２に示したように、精製酵素の特性評価により、ＤＨＡＰのＭＧへの変換のためのそれらの特異的活性の大部分を維持しながらも、リン酸によるアロステリック阻害を受けない、新規な変異型ＭＧＳを同定した。これらの変異体の利用は、特にアセトール、１，２−プロパンジオールおよびラクテートといったメチルグリオキサールバイパスの産物の生産のためのより効率的な方法のデザインにおける重要な要素である。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、乳酸、アセトール、および１，２−プロパンジオールから選択される生化学物質の生産のための方法であって、乳酸、アセトール、および１，２−プロパンジオールから選択される生化学物質の改良された生産のために改変された微生物を適当な培養培地で培養すること、および所望の生化学物質を回収することを含み、この生化学物質はさらに精製してもよく、該微生物がオルトホスフェートによりその活性が阻害されないメチルグリオキサールシンターゼ（ＭＧＳ）酵素を発現することを特徴とする方法に関する。
【００２０】
本発明は、親酵素のタンパク質配列中の同じ位置で別のアミノ酸残基により置換された少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、
変異型酵素が親酵素のメチルグリオキサールシンターゼ活性の５０％を超える活性を保持し、かつ、
変異型ＭＧＳのメチルグリオキサールシンターゼ活性が、親酵素と比較してオルトホスフェートにより阻害されない、
変異型メチルグリオキサールシンターゼ（ＭＧＳ）に関する。
【００２１】
本発明はまた、本発明の変異型ＭＧＳをコードしている配列を含むＤＮＡ配列、およびその活性がオルトホスフェートにより阻害されない、このようなＭＧＳを発現する微生物、特に本発明の変異型ＭＧＳをコードしている遺伝子を含む微生物に関する。
【発明の具体的説明】
【００２２】
本願において、用語は特に断りのない限り通常の意味で用いられている。
【００２３】
微生物
「微生物」とは、細菌などの原核生物、および酵母などの真核生物を含む、様々な単細胞生物を意味する。優先的には該微生物は、細菌、酵母および真菌からなる群から選択され、より優先的には腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、バシラス科（Bacillaceae）、ストレプトミセス科（Streptomycetaceae）、クロストリジウム科（Clostridiaceae）およびコリネバクテリウム科（Corynebacteriaceae）からなる群から選択される。より優先的には、該微生物はエシェリキア属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、パンテア属（Pantoea）、サルモネラ属（Salmonella）、バシラス属（Bacillus）、ストレプトミセス属(streptomyces)、クロストリジウム属（Clostridium）、またはコリネバクテリウム属の種である。さらにより優先的には、該微生物は大腸菌(Escherichia coli)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム（Thermoanaerobacterium Thermosaccharolyticum）、クロストリジウム・スフェノイデス（Clostridium sphenoides）、またはサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)からなる群から選択される。
【００２４】
本明細書において、「改変微生物」または「改変された」または「組換え」とは、例えば生物体には天然に存在しない核酸を加えることにより、または宿主細胞中に天然に存在する核酸を改変することにより、そのゲノムが改変された宿主細胞を意味する。
【００２５】
「乳酸、アセトール、および１，２−プロパンジオールから選択される生化学物質の改良された生産のために改変された微生物」とは、単純炭素源の変換による所望の生化学物質の生成に有利に働くように経路が改変されている微生物を意味する。そのような改良された生産のために改変された微生物は、天然の、非改変微生物よりもいっそう多くの所望の生化学物質を生成する。
【００２６】
本発明の微生物を用いる乳酸、アセトールおよびプロパンジオールの生産のための好ましい生合成経路を、図２に示す。当業者ならば、促進される経路に関連する酵素活性、および減弱される他の酵素活性を同定することができる。
【００２７】
メチルグリオキサールの変換による乳酸、アセトールおよびプロパンジオールの改良された生産のために改変された微生物もまた、Cameron et al, 1998, Bennett and San, 2001, Ko et al, 2005およびＷＯ９９／２８４８１、ＷＯ９８／３７２０４、ＷＯ２００５／０７３３６４、ＷＯ２００８／１１６８５２、ＷＯ２００８／１１６８４８、ＷＯ２００８／１１６８４９、ＷＯ２００８／１１６８５１、ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３０９３において開示されており、その内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００２８】
酵母の場合、以下に示す宿主生物の改変が好ましい：
以下に示す遺伝子：ＴＰＩ１、ＮＤＥ１、ＮＤＥ２、ＧＵＴ２、ＧＰＤ１、ＧＰＤ２、ＰＤＣ１、ＰＤＣ２、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、ＧＬＯ１の少なくとも１つの発現の減弱
ＧＲＥ３遺伝子発現の増強。
【００２９】
本発明の微生物において、本発明の変異型ＭＧＳをコードしているＤＮＡ配列は、変異型ＭＧＳの発現および翻訳のためにベクターに導入してよい。それはまた、前記微生物の染色体中に組み込むこともできる。
【００３０】
ＤＮＡ配列の組込は、完全に、または単に、微生物の天然遺伝子中で、変異型タンパク質のアミノ酸をコードするヌクレオチドと交換されるアミノ酸をコードするヌクレオチドを置換し、コード配列中に突然変異を導入することにより、行うことができる。
【００３１】
微生物の遺伝子における、全体の、部分的な、または特異的なヌクレオチド置換は、Sambrook J et al., Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbour Press, New York (2001), Ausubel FM et al, Current protocols in molecular biology, John Wiley and sons, New York (1999), Adams A et al., Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbour Press, New York (1997)を含む、当技術分野で十分公知の遺伝子工学である。
【００３２】
本発明の微生物は、ＮＡＤＰＨに対する触媒効率が増加しているＹｑｈＤ酵素をコードする遺伝子をさらに含んでよい。
【００３３】
「ＮＡＤＰＨに対する触媒効率が増加している」ＹｑｈＤ酵素とは、微生物において発現されたＹｑｈＤ酵素のＮＡＤＰＨに対する触媒効率が、同じ微生物の天然のＹｑｈＤ酵素のＮＡＤＰＨに対する触媒効率よりも高いことを意味する。この触媒効率とは、触媒定数（Ｋｃａｔ）とミカエリス定数（Ｋｍ）の間の比として定義される。ＹｑｈＤ酵素の触媒効率の増加は、酵素のＫｃａｔが増加しているか、または酵素のＫｍが減少していることを意味する。好ましい実施形態では、ＹｑｈＤ酵素のＫｃａｔが増加し、ＹｑｈＤ酵素のＫｍは減少している。
【００３４】
好ましくは、ＹｑｈＤ酵素のＮＡＤＰＨに対する触媒効率は、大腸菌の天然ＹｑｈＤ酵素の効率よりも高い。
このような酵素は、好ましくは、大腸菌のＹｑｈＤの活性の少なくとも５０％、より好ましくは、大腸菌のＹｑｈＤの活性の少なくとも６０％の酵素活性を有する。
【００３５】
特に、該ＹｑｈＤ酵素は変異型ＹｑｈＤＳ酵素であって、
変異型酵素は親酵素のＹｑｈＤ活性の５０％を超える活性を保持し、
変異型ＹｑｈＤのＮＡＤＰＨに対する触媒効率が、親酵素のＮＡＤＰＨに対する触媒効率に比べて増加している。
【００３６】
好ましくは、変異型ＹｑｈＤは、Ｇ１４９Ｅ、Ｇ１４９ＳおよびＡ２８６Ｔ、およびその組合せからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。アミノ酸の位置は、大腸菌のＹｑｈＤ配列を参照して示される。当業者ならば、配列アライメントの標準的技術により他の生物体由来の配列中に対応するアミノ酸を見出すことができる。
【００３７】
本発明の微生物は、さらに、ＮＡＤ＋および／またはその基質および／またはその産物によるその活性の阻害が低減されている、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧｌｙＤＨ）酵素をコードする遺伝子を含んでよい。
【００３８】
「ＮＡＤ＋および／またはその基質および／またはその産物によるその活性の阻害が低減されている」とは、微生物において発現されたＧｌｙＤＨ酵素の活性の阻害が、同じ微生物の天然ＧｌｙＤＨ酵素の活性の阻害を下回ることを意味する。ＧｌｙＤＨ酵素の活性の阻害は、阻害濃度５０（ＩＣ５０）または阻害定数（Ｋｉ）または当業者に公知のその他の技術により定義することができる。ＧｌｙＤＨ酵素の活性の阻害が低減されるとは、本発明のＧｌｙＤＨ酵素のＩＣ５０またはＫｉが天然ＧｌｙＤＨ酵素のＩＣ５０またはＫｉよりも高いことを意味する。当業者は、ＩＣ５０およびＫｉの間の関係および有名なミカエリス・メンテンの反応速度論における酵素の活性に関するそれらの意味を理解している。
【００３９】
好ましくは、ＧｌｙＤＨ酵素の活性は大腸菌の天然ＧｌｙＤＨ酵素よりも阻害が低減される。好ましい実施形態では、酵素活性はＮＡＤ＋、酵素の基質および酵素の産物からなる群の少なくとも２つに関して阻害が低減される。より好ましくは、ＮＡＤ＋、その基質およびその産物の３つによる酵素活性の阻害が低減される。
【００４０】
酵素の「基質」とは、ジヒドロキシアセトン、ヒドロキシアセトン、メチルグリオキサール、ラクトアルデヒド、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒドおよびその誘導体である。
【００４１】
酵素の「産物」とは、カルボニル基の還元により、選択された基質から得られた分子である。
【００４２】
１，２−プロパンジオールの生成に関しては、基質はヒドロキシアセトンであり、産物は１，２−プロパンジオールである。
【００４３】
特に、ＧｌｙＤＨ酵素は変異型酵素であり、
変異型酵素は親酵素の活性の５０％を超える活性を保持し、かつ、
変異型ＧｌｙＤＨのグリセロールデヒドロゲナーゼ活性は、ＮＡＤ＋による、および／または親酵素と比較してその基質による、および／または親酵素と比較してその産物による阻害が低減されている。
【００４４】
好ましくは、変異型ＧｌｙＤＨは好ましくはＡ１６０ＴおよびＴ１２０Ｎおよびその組合せからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。アミノ酸の位置は、大腸菌のＧｌｄＡ配列を参照して示される。当業者ならば、配列アライメントの標準的技術により他の生物体由来の配列中に対応するアミノ酸を見出すことができる。
【００４５】
メチルグリオキサールシンターゼ（ＭＧＳ）酵素
本発明は、オルトホスフェートにより活性が阻害されないメチルグリオキサールシンターゼ（ＭＧＳ）、それを含む微生物、および単純炭素源を含む培養培地上での前記微生物の発酵による所望の生化学物質の生産方法に関する。
【００４６】
「オルトホスフェートに阻害されない」または「オルトホスフェートによる阻害がない」とは、オルトホスフェートの存在下で酵素活性を検討した場合、オルトホスフェートによる阻害が認められなかったことを意味する。このような活性アッセイは当技術分野で十分公知であり、実施例２において開示されたように実施することができる。
【００４７】
さらに、オルトホスフェートの存在または非存在にかかわらず、本発明のＭＧＳ酵素の反応速度はミカエリス・メンテンの反応速度論に従う。天然酵素の反応速度はオルトホスフェートの不在下でのみミカエリス・メンテンモデルに従う。オルトホスフェートの存在は、天然酵素の反応速度プロフィール（基質濃度に対する特異的活性）をＳ字状にし、このことは、オルトホスフェートによるアロステリック阻害を示す。
【００４８】
このような酵素は、好ましくは、大腸菌のメチルグリオキサールシンターゼ活性の少なくとも５０％のメチルグリオキサールシンターゼ活性を有する。
【００４９】
該酵素は当業者に公知の様々な方法により得ることができる。
【００５０】
第１のアプローチは、様々な生物体の天然酵素をオルトホスフェートによる阻害の欠如に関してスクリーニングすることである。
第２のアプローチは、既知の生物体の酵素において突然変異を誘発し、オルトホスフェートにより阻害されない酵素を選択することである。突然変異は、当技術分野で公知の方法、例えば、微生物を突然変異誘発物質に曝露させるなどの方法により誘発することができる。突然変異を誘発するもう１つの方法は、高濃度のオルトホスフェートを用いて微生物を選択圧下で増殖させ、そのような条件下で増殖する微生物を同定し、オルトホスフェートにより阻害されない酵素を選択するものである。
【００５１】
突然変異を誘発するための他の方法もまた当技術分野で公知であり、様々な起源のＤＮＡを混ぜ合わせ、混ぜ合わせたＤＮＡによりコードされるタンパク質を、メチルグリオキサールシンターゼ活性およびオルトホスフェートによる阻害の欠如に基づき選択する。
【００５２】
本発明の特定の実施形態では、本発明者らは、ＷＯ２００５／０７３３６４で開示され、実施例１にて示されるように選択圧下で培養され、乳酸、アセトールおよび／または１，２−プロパンジオールの改良された生産のために改変された菌株を選択することにより、それらのメチルグリオキサールシンターゼ活性を保持し、オルトホスフェートにより阻害されない、いくつかの変異型ＭＧＳを得た。
【００５３】
本発明は、特に、親酵素のタンパク質配列中の同じ位置で別のアミノ酸残基により置換された少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、
変異型酵素が親酵素の活性の５０％を超える活性を保持し、かつ、
親酵素と比較して変異型ＭＧＳのメチルグリオキサールシンターゼ活性がオルトホスフェートにより阻害されない、
変異型メチルグリオキサールシンターゼ(ＭＧＳ)に関する。
【００５４】
「変異型」とは、タンパク質配列に人為的に突然変異が誘導されたことを意味する。本発明によれば、変異型酵素とは、親酵素に対し少なくとも１つのアミノ酸相違を有する酵素である。本発明の変異型酵素において、特定部位の突然変異誘発またはランダム突然変異誘発のいずれによってもアミノ酸の任意の交換を導入してよく、親酵素の対応する部分を置換する第２の酵素の１部分を含むキメラ酵素を用いてもよい。
【００５５】
「親酵素」は、突然変異前の酵素である。親酵素は、任意の起源、天然物、別の生物体から単離されたもの、または合成物であってよい。
【００５６】
変異型ＭＧＳが「５０％を超える」活性を保持しているかどうかを判定する方法は、当技術分野で十分公知であり、実施例２に開示されている。
【００５７】
実際、当業者は変異ＭＧＳの最終用途によって所望の活性レベルを選択しなければならない。実際、高い活性が必要とされる場合は、変異していない親酵素と比較して８０％を超える活性、より好ましくは、９０％を超える活性を有する変異体を選択する。他の場合において、親酵素と比較して約５０％および５０％を超える活性を有する変異型ＭＧＳを選択することは、プロモーターを改変して酵素の発現レベルを低下させるなどのように、微生物におけるさらなる改変を妨げる可能性がある。
【００５８】
本発明者らは、最大で３ｍＭまでのオルトホスフェートを含む培地中では、対応する親酵素は阻害されるが、変異酵素の酵素活性はオルトホスフェートにより阻害されないことを見出した。オルトホスフェートの量は、微生物中で酵素反応が通常起こる条件を考慮して選択された。
【００５９】
本発明において、「親ＭＧＳと比較して、オルトホスフェートにより阻害されない」とは、微生物の増殖に適合する濃度のオルトホスフェートを含む培地上で増殖する微生物中のオルトホスフェート濃度に適合するオルトホスフェート濃度においてであると理解される。
【００６０】
好ましい実施形態では、本発明の変異ＭＧＳは、同じ位置で別のアミノ酸残基により置換された、天然親ＭＧＳ中の同定された領域の少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。
【００６１】
本発明者らは、天然親ＭＧＳ中の以下の保存領域（ＣＲ）のうちの１の少なくとも１つのアミノ酸残基が、同じ位置で別のアミノ酸残基により置換された変異体を同定した。同定された３つの保存領域ＣＲ１、ＣＲ２およびＣＲ３を以下に示す：
−Ｘａ１−Ｌｅｕ−Ｘａ２−Ｘａ３−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｘａ４−Ｘａ５−Ｌｙｓ−（ＣＲ１）
式中、
Ｘａ１はＡｌａおよびＶａｌ、好ましくはＡｌａを表し、
Ｘａ２はＶａｌおよびＩｌｅを表し、
Ｘａ３はＡｌａおよびＳｅｒ、好ましくはＡｌａを表し、
Ｘａ４はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、ＭｅｔおよびＳｅｒ、好ましくはＨｉｓおよびＬｙｓを表し、かつ、
Ｘａ５はＡｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＭｅｔおよびＴｙｒ、好ましくはＣｙｓおよびＬｙｓを表す。
−Ａｓｐ−Ｘａ６−Ｘａ７−Ｘａ８−Ｘａ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｈｉｓ−Ｘ１２−Ｘ１３−Ａｓｐ−Ｘ１４−（ＣＲ２）
式中、
Ｘａ６はＡｓｐおよびＰｒｏ、好ましくはＰｒｏを表し、
Ｘａ７はＬｅｕおよびＭｅｔ、好ましくはＬｅｕを表し、
Ｘａ８はＡｓｎ、Ｇｌｕ、ＳｅｒおよびＴｈｒ、好ましくはＡｓｎおよびＴｈｒを表し、
Ｘａ９はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、ＳｅｒおよびＶａｌ、好ましくはＡｌａを表し、
Ｘ１０はＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＭｅｔおよびＶａｌ、好ましくはＧｌｎおよびＶａｌを表し、
Ｘ１１はＡｌａおよびＰｒｏ、好ましくはＰｒｏを表し、
Ｘ１２はＡｓｐおよびＧｌｕを表し、
Ｘ１３はＡｌａ、ＰｒｏおよびＶａｌ、好ましくはＰｒｏを表し、かつ、
Ｘ１４はＩｌｅおよびＶａｌ、好ましくはＶａｌを表す。
−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｐｒｏ−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２２−（ＣＲ３）
式中、
Ｘ１５はＩｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌ、好ましくはＶａｌを表し、
Ｘ１６はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＴｒｐおよびＴｙｒ、好ましくはＴｒｐおよびＴｙｒを表し、
Ｘ１７はＡｌａ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＬｙｓおよびＳｅｒ、好ましくはＡｓｎを表し、
Ｘ１８はＩｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌ、好ましくはＩｌｅを表し、
Ｘ１９はＣｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＭｅｔおよびＶａｌ、好ましくはＬｅｕおよびＶａｌを表し、
Ｘ２０はＡｌａおよびＶａｌ、好ましくはＡｌａを表し、
Ｘ２１はＣｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＭｅｔおよびＴｈｒ、好ましくはＴｈｒを表し、かつ、
Ｘ２２はＡｓｎおよびＴｈｒ、好ましくは、Ａｓｎを表す。
【００６２】
これらの保存領域は、様々なＭＧＳ酵素において、標準配列アライメントツール、例えば総てウェブサイトhttp://www.ebi.ac.uk/.で入手可能なＣｌｕｓｔａｌＷ２、Ｋａｌｉｇｎ、ＭＡＦＦＴ、ＭＵＳＣＬＥまたはＴ−ｃｏｆｆｅｅなどを用いて単純な配列アライメントにより同定することができる。様々な種のいくつかのＭＧＳの配列アライメントを図１に示す。
【００６３】
本願におけるアミノ酸番号は、大腸菌のタンパク質を参照することにより示されている。
【００６４】
図１から、ＣＲ１は大腸菌ＭＧＳのアミノ酸１５〜２３、ＣＲ２は大腸菌ＭＧＳのアミノ酸９１〜１０２、ＣＲ３は大腸菌ＭＧＳのアミノ酸１１１〜１１９に対応することが見出せる。
【００６５】
本発明によれば、変異型ＭＧＳはＣＲ１、ＣＲ２またはＣＲ３のうちの１つにおいて少なくとも１つの突然変異を有しうる。それは、少なくともＣＲ１およびＣＲ２、ＣＲ１およびＣＲ３、またはＣＲ２およびＣＲ３において少なくとも２つの突然変異を有しうる。それはまた、ＣＲ１、ＣＲ２およびＣＲ３において少なくとも３つの突然変異を有しうる。
【００６６】
このような文脈において「少なくとも」とは、変異型酵素が他の突然変異をしていてもよいが、同定された保存領域ＣＲ１、ＣＲ２およびＣＲ３と関連があってはならないことを意味する。これらの他の同定されていない突然変異は、以下に示す条件下では本発明の変異型酵素に大きな影響を与えることはない：
−変異型酵素が親酵素のメチルグリオキサールシンターゼ活性の５０％を超える活性を保持しており、かつ、
−親酵素と比較して変異型ＭＧＳのメチルグリオキサールシンターゼ活性はオルトホスフェートにより阻害されない。
【００６７】
好ましい実施形態では、変異型ＭＧＳにおいて同じ位置で別のアミノ酸残基により置換された親ＭＧＳ中の保存領域ＣＲ１からＣＲ３のアミノ酸残基は、ＣＲ１のアミノ酸Ｘａ４、ＣＲ２のアミノ酸Ｘａ９、およびＣＲ３のアミノ酸Ｘ１９およびその組合せ（ＣＲ１とＣＲ２、ＣＲ１とＣＲ３、ＣＲ２とＣＲ３およびＣＲ１とＣＲ２とＣＲ３）からなる群から選択される。
【００６８】
Ｘａ４は、大腸菌のＭＧＳ配列においてアミノ酸２１に相当する。Ｘａ９は大腸菌のＭＧＳ配列においてアミノ酸９５に相当する。Ｘ１９は大腸菌の配列においてアミノ酸１１６に相当する。
特に、本発明の変異ＭＧＳはＨ２１Ｑ、Ａ９５Ｖ、Ｖ１１６Ｌ、およびその組合せからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含み、アミノの位置は大腸菌のＭＧＳ配列を参照して示される。
【００６９】
より好ましくは、本発明の変異ＭＧＳは、保存領域ＣＲ１〜ＣＲ３において以下に示す少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
【化１】
0005913099.tif 000002
太字および下線のアミノ酸残基は、親ＭＧＳのアミノ酸とは異なる変異型ＭＧＳのアミノ酸に相当する。
【００７０】
特に、本発明の変異ＭＧＳがＣＲ１および／またはＣＲ２中に少なくとも１つの以下に示す突然変異を含むと仮定した場合：
【化２】
0005913099.tif 000003
大腸菌のＭＧＳ配列と比較して少なくとも５０％の配列同一性を有する。
【００７１】
配列同一性は、ＥＢＩウェブサイト（上記参照）で利用可能な、デフォルトパラメーターを用いるＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ２により、比較されるタンパク質配列と大腸菌のＭＧＳ配列との配列アライメント後に明らかにされる。次に、配列同一性を、この配列アライメントを用い、参照配列（大腸菌）中のアミノ酸総数と、同じ位置の同一アミノ酸の数の比により計算する。
【００７２】
好ましくは、該変異ＭＧＳは少なくとも７０％の配列同一性を有する。
最も好ましい実施形態では、本発明の変異ＭＧＳは配列番号１、配列番号２および配列番号３で特定されるＭＧＳからなる群から選択される配列を含む。
【００７３】
ＤＮＡ、ベクター、遺伝子
本発明はまた、本発明の変異ＭＧＳをコードする配列を含むＤＮＡ配列にも関する。本発明の変異ＭＧＳをコードする配列は、それ自体は限定要因ではない。当業者ならば、微生物から天然ＭＧＳ配列を容易に得ることができ、１以上の適当なヌクレオチドを交換することによりタンパク質中に導入する突然変異をコード配列中に導入することができる。
【００７４】
当業者はまた、微生物の配列中に突然変異を誘発し、標準的な方法により変異ＤＮＡ配列を単離することもできる。
【００７５】
突然変異は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR, Sambrook J et al., Molecular cloning : a laboratory manual, Cold Spring Harbour Press, New York (2001), Ausubel FM et al., Current protocols in molecular biology, John Wiley and sons, New York (1999), Adams A et al., Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbour Press, New York (1997)参照)などの通常の方法による部位特異的突然変異誘発、またはランダム突然変異誘発技術、例えば突然変異誘発物質の使用（紫外線、またはニトロソグアニジン（ＮＴＧ）またはエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）などの化学物質）、またはＰＣＲ技術（ＤＮＡシャッフリングまたはエラープローンＰＣＲ）の使用などにより導入することができる。
【００７６】
当業者はまた、特定の生物体中での改良された発現のために選択された好ましいコドンを持つ合成遺伝子を調製することもできる。様々な生物体によるコドンの使用は、当技術分野で十分公知であり、いくつかの会社がコドンを最適化した合成遺伝子の製造を提案している。
【００７７】
本発明の配列は単離することが可能であり、上記で定義されたコード配列を構成するか、または上流に調節エレメントを、下流に特定の生物体中でのその発現のためのコード配列を含む遺伝子中にある。
【００７８】
該配列はまた、その複製のために（複製ベクター）、または微生物における本発明の変異タンパク質の発現および翻訳のために（発現ベクター）、ベクター中に存在することができる。このようなベクターは、当技術分野で公知であり、本発明の定義に関して制限要因ではない。
前記遺伝子およびベクターもまた、本発明の一部である。
【００７９】
好ましくは、本発明のＤＮＡ配列は調節エレメントと共に微生物中に存在し、本発明の変異ＭＧＳの発現および翻訳を可能にしている。
【００８０】
乳酸、アセトール、または１，２−プロパンジオールの生産
本発明はまた、乳酸、アセトールおよび／または１，２−プロパンジオールの改良された生産のために改変された本発明の微生物の培養、および生化学物質の回収を含む発酵による、乳酸、アセトール、および１，２‐プロパンジオールから選択される生化学物質の製造方法に関する。
【００８１】
特定の実施形態では、回収された乳酸および／またはアセトールおよび／または１，２−プロパンジオールが精製される。
【００８２】
乳酸、アセトールおよび１，２−プロパンジオールの精製のための方法は、当技術分野で公知であり、Datta and Henry, 2006, Wasewar, 2005、ＵＳ５０７６８９６およびＷＯ２００７／０７４０６６に記載されている。
【００８３】
有利には、この生産は、微生物発酵の当業者に公知の方法に従って、バッチ法、流加法または連続法による発酵により行われる。好ましくは、この製造は、流加法での発酵により行われる。
【００８４】
培養培地および炭素源
本発明の生産方法において、微生物は適当な培養培地上で培養される。
「適当な培養培地」とは、微生物の増殖に適した既知のモル構成の培地を表す。特に、前記培地は少なくとも１つのリン源および１つの窒素源を含有する。前記の適当な培地とは、例えば、使用された細菌に適した既知の定められた組成の無機培養培地であり、少なくとも１つの炭素源を含有する。前記の適当な培地はまた、窒素源および／またはリン源を含む任意の液体を指定してよく、前記液体はスクロース源に添加および／または混合される。特に、腸内細菌科のための無機増殖培地は、従ってＭ９培地(Anderson, 1946)、Ｍ６３培地(Miller, 1992)、またはSchaefer et al. (1999)により定義されたような培地と同じかまたは類似した組成でありうる。
【００８５】
炭素源である「グルコース」は、この培地において他の任意の炭素源、特にスクロースまたは任意のスクロース含有炭素源、例えばサトウキビ汁もしくはサトウダイコン汁などにより代替することができる。
【００８６】
「炭素源」または「炭素基質」とは、微生物により代謝されうる任意の炭素源を意味し、この場合、基質は少なくとも１つの炭素原子を含む。
【００８７】
好ましくは、該炭素源は、グルコース、スクロース、単糖類もしくはオリゴ糖、デンプンもしくはその誘導体、またはグリセロールおよびその混合物からなる群から選択される。
【００８８】
実際、本発明の方法で用いられる微生物は、特定の炭素源上で増殖できるよう改変することができるが、非改変微生物は同じ炭素源では増殖できないかまたは増殖率が低い。これらの改変は、炭素源がバイオマス分解の副産物である場合、例えばサトウキビの副産物：果汁および様々な種類の糖蜜の清澄化により生じた濾過ケーキをなどである場合に必要となりうる。
【実施例】
【００８９】
実施例１：ケモスタット培養における大腸菌ＭＧ１６５５の３つの改変株の進化および進化したクローンにおける３つの変異型ＭＧＳ酵素の同定
大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊  ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ｌｄｈＡ：：Ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ（株１）、大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊  ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：Ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ（株２）および大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊  ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ：：Ｋｍ（株３）の構築は、株１については特許出願ＷＯ２００５／０７３３６４に、株２および３については特許出願ＷＯ２００８／１１６８５２に従前に記載されている。
【００９０】
それらを１，２プロパンジオール生産の改良に向けて進化させるために、３株を嫌気性条件下または微好気性条件（１％酸素）下のいずれかで、０．４２または０．８４ｇ／ｌの硝酸ナトリウムを含む培養培地ＭＰＧ（特許出願ＷＯ２００８／１１６８５２に示されている）中、グルコースを追加して（最初は２０ｇ／ｌから、グルコースが消耗すれば追加する）、連続培養にて培養した。温度は３７℃に設定し、ｐＨは、塩基を添加することにより６．５に調整し、ケモスタットの希釈率は０．０４／時〜０．０８／時の間に設定した。ケモスタットでの株の進化は、バイオマス濃度の増加を、産物である１，２−プロパンジオールおよび副産物であるアセテートの濃度と合わせることで数週間追跡した。これはこれらの株の性能の改良を表した。培養物がこれらの条件下でさらなる濃度の増加のない定常状態に達した際に、進化はなされた。
【００９１】
進化の前後で株の特徴を評価した。個々のクローンに相当する単一のコロニーをペトリ皿に単離した。これらのクローンを、エルレンマイヤーフラスコアッセイにて最初の株を対照として用い、ケモスタット培養で用いたものと同じＭＰＧ培地であるが、ＭＯＰＳで緩衝させたものを用いて評価した。これらのクローンのうちいくつかが、対照に比べて良好な１，２−プロパンジオール特異的生産率を示した。各進化条件について最良のクローンで得られた結果を以下の表１〜３に示す。
【００９２】
表１：嫌気性条件下で進化８１日後に得られた最良の進化クローンの、最初の株との比較
【表１】
0005913099.tif 000004
【００９３】
表２：嫌気性条件下で進化６６日後に得られた最良の進化クローンの、最初の株との比較
【表２】
0005913099.tif 000005
【００９４】
表３：微好気性条件下で進化１３２日後に得られた最良の進化クローンの、最初の株との比較
【表３】
0005913099.tif 000006
【００９５】
株１、株２および株３の最良の進化クローンにおいて、１，２−プロパンジオール生合成経路の終点に関与する特異的遺伝子の配列決定を行った。各クローンに関して、変異型ＭＧＳタンパク質の発現をもたらす１つの変異型ｍｇｓＡ遺伝子を同定した：株１の進化クローンではＭｇｓＡ＊（Ａ９５Ｖ）（配列番号１）、株２の進化クローンではＭｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）（配列番号２）、そして株３の進化クローンではＭｇｓＡ＊（Ｖ１１６Ｌ）（配列番号３）。
【００９６】
実施例２：天然ＭＧＳおよび３つの変異型ＭＧＳ（Ｈ２１Ｑ、Ａ９５ＶおよびＶ１１６Ｌ）の生産、精製および特性決定
【００９７】
１．ＭＧＳタンパク質の生産のための株の構築
１．１．ｍｇｓＡの過剰発現のためのプラスミド：ｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＳＡの構築
天然タンパク質（Ｈｉｓタグ無し）の過剰発現を得るためにプラスミドを構築した。遺伝子ｍｇｓＡ（配列１０２５７８０−１０２６２３８）を大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡから、以下のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅した。
・ｐＥＴＴＯＰＯ  ｍｇｓＡ  Ｆ（２４ｐｂからなる）：
【化３】
0005913099.tif 000007
遺伝子ｍｇｓＡの配列（１０２６２３８−１０２６２２０）と相同な領域領域（下線の文字）
プラスミドｐＥＴ１０１における断片の定方向クローニングのための領域（太字の文字）
を含む。
・ｐＥＴＴＯＰＯ−ＮｍｇｓＡ  Ｒ（２３ｐｂからなる）
【化４】
0005913099.tif 000008
遺伝子ｍｇｓＡの配列（１０２５７８０−１０２５８０２）に相同な領域（下線の文字）
を含む。
増幅された断片をそのまま、「Champion pET Directional TOPO Expression Kits」(invitrogen（登録商標）)からのｐＥＴ１０１にクローニングした。構築されたプラスミドをｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡと呼称した。
【００９８】
１．２．ｍｇｓＡ＊の過剰発現のためのプラスミドの構築
３つの変異型ＭＧＳは突然変異Ｈ２１Ｑ、Ａ９５ＶまたはＶ１１６Ｌを有する。３つの変異型タンパク質の過剰発現のためのプラスミドを、stratagene（登録商標）からのＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キットを表４に示されるオリゴヌクレオチドとともに用い、プラスミドｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡにおける定方向突然変異誘発によって構築した。
【００９９】
表４：ｍｇｓＡの部位特異的突然変異誘発のために用いるオリゴヌクレオチド
【表４】
0005913099.tif 000009
得られた３つのプラスミドをｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ＊（Ａ９５Ｖ）、ｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ＊（Ｖ１１６Ｌ）およびｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）と呼称した。
【０１００】
１．３．ＢＬ２１スター（ＤＥ３）ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍの構築
プラスミドによって発現された変異型タンパク質と染色体によって発現された野生型タンパク質の間の混合を避けるために、過剰発現を実行するために用いた株はｍｇｓＡ遺伝子を欠損させた。
【０１０１】
１．３．１．ＭＧ１６５５ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ株の構築
大腸菌ＭＧ１６５５株において、プロトコール１に従い、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連する遺伝子の大部分を欠失させることによって遺伝子ｍｇｓＡを不活性化した。
プロトコール１：組換えおよび組換え体の選択（ＦＲＴ系）のためのＰＣＲ産物の導入
選択されオリゴヌクレオチド（遺伝子または遺伝子間領域の置換は表５に示されている）を用いて、プラスミドｐＫＤ３由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドｐＫＤ４由来のカナマイシン耐性カセットのいずれかを増幅した(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000))。次に、得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションにより、プラスミドｐＫＤ４６を有するレシピエント株に導入したところ、λ  Ｒｅｄ系（γ、β、ｅｘｏ）が極めて好適な相同組換えを示した。その後、抗生物質耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
それらがその株における他の改変である場合には、表６に示されるオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍと呼称した。
【０１０２】
表５：ＰＣＲ産物を用いた組換えによる染色体領域の置換に用いたオリゴヌクレオチド
【表５】
0005913099.tif 000010
【０１０３】
表６：耐性カセットの挿入または耐性カセットの欠損を確認するために用いたオリゴヌクレオチド
【表６】
0005913099.tif 000011
【０１０４】
１．３．２．ＢＬ２１スター（ＤＥ３）ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ株の構築
大腸菌ＢＬ２１スター（ＤＥ３）株におけるクロラムフェニコール耐性カセットによる遺伝子の置換による遺伝子ｍｇｓＡの欠失は、Ｐ１ファージを用いた形質導入技術によって行った。
プロトコール２：遺伝子欠失のためのＰ１ファージを用いた形質導入
レシピエント大腸菌株における、遺伝子を耐性カセット（カナマイシンまたはクロラムフェニコール）で置換することによる選択された遺伝子の欠失は、Ｐ１ファージを用いた形質導入技術によって行った。プロトコールは、ｉ）単一遺伝子欠失を有するＭＧ１６５５株におけるファージ溶解液の調製、および（ｉｉ）このファージ溶解液によるレシピエント株の形質導入の二段階とした。
ファージ溶解液の調製
単一遺伝子欠失を有するＭＧ１６５５株の一晩培養物１００μｌを１０ｍｌのＬＢ＋Ｃｍ３０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２  ５ｍＭに播種する。
振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
野生型ＭＧ１６５５株で調製したＰ１ファージ溶解液１００μｌ（およそ１×１０９ファージ／ｍｌ）を加える。
３７℃で３時間、総ての細胞が溶解するまで振盪する。
２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
４５００ｇで１０分間遠心分離して細胞残渣を除去する。
上清を無菌試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを加える。
溶解液を４℃で保存する。
形質導入
ＬＢ培地中、大腸菌レシピエント株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
細胞ペレットを２．５ｍｌのＭｇＳＯ４  １０ｍＭ、ＣａＣｌ２  ５ｍＭに懸濁させる。
対照試験管：細胞１００μｌ
単一遺伝子欠失を有するＭＧ１６５５株のＰ１ファージ１００μｌ
被験試験管：細胞１００μｌ＋単一遺伝子欠失を有するＭＧ１６５５株のＰ１ファージ１００μｌ
振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートする。
各試験管に１Ｍクエン酸ナトリウム１００μｌを加え、ボルテックスにかける。
１ｍｌのＬＢを加える。
振盪しながら、３７℃で１時間インキュベートする。
試験管を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、ＬＢ＋Ｃｍ３０μｇ／ｍｌのディッシュにプレーティングする。
３７℃で一晩インキュベートする。
次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により、欠失の挿入を確認した。
得られた株を大腸菌ＢＬ２１スター（ＤＥ３）ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍと呼称した。
【０１０５】
１．４．ＢＬ２１スター（ＤＥ３）ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ株におけるプラスミドの導入
プラスミドｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ、ｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ＊（Ａ９５Ｖ）、ｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ＊（Ｖ１１６Ｌ）、ｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）を、エレクトロポレーションにより、大腸菌ＢＬ２１スター（ＤＥ３）ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ株に形質転換し、得られた株をそれぞれ
ＢＬ２１スター（ＤＥ３）ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ  ｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ
ＢＬ２１スター（ＤＥ３）ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ  ｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ＊（Ａ９５Ｖ）
ＢＬ２１スター（ＤＥ３）ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ  ｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ＊（Ｖ１１６Ｌ）
ＢＬ２１スター（ＤＥ３）ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ  ｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）
と呼称した。
【０１０６】
２．ＭＧＳタンパク質の生産
ＢＬ２１スター（ＤＥ３）ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ  ｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ、ＢＬ２１スター（ＤＥ３）ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ  ｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ＊（Ａ９５Ｖ）、ＢＬ２１スター（ＤＥ３）ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ  ｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ＊（Ｖ１１６Ｌ）およびＢＬ２１スター（ＤＥ３）ΔｍｇｓＡ：：Ｃｍ  ｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）の４株を３７℃、好気性条件下、２．５ｇ／ｌのグルコースを含むＬＢ培地５００ｍｌの入った２  Ｌのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコで培養した。これらのフラスコをオービタルシェーカーにて２００ｒｐｍで撹拌した。５５０ｎｍで測定した光学密度が０．５単位に達した際に、フラスコを２５℃でインキュベートした。光学密度が１．２単位に達した際に、培養物に５００μＭのＩＰＴＧを加えることにより、ＭＧＳタンパク質の生産を誘導した。培養物が３．５単位を超える光学密度に達した際に、遠心分離によってバイオマスを採取した。上清を廃棄し、ペレットを使用するまで−２０℃で保存した。
【０１０７】
３．ＭＧＳの活性アッセイ
Hopper and Cooper (1972)から適合させた複合活性アッセイを用いて酵素活性を測定した。ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）はＭＧＳによってメチルグリオキサール（ＭＧ）に変換される。このＭＧの形成は、グルタチオンとの非酵素的チオヘミアセタールの形成、その後のグリオキサラーゼＩによるその複合体の異性化により、Ｓ−Ｄ−ラクトイルグルタチオンの形成に結びつけられる。Ｓ−Ｄ−ラクトイルグルタチオンの形成、従ってＭＧの形成に相当する２４０ｎｍにおける吸光度の増加率を分光光度計にて３０℃で測定した。標準アッセイ混合物は、総量１０００μｌにおいて、１．５ｍＭ  ＤＨＡＰ、１．５ｍＭグルタチオン、５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．０）、２単位の酵母グリオキサラーゼＩおよび３０μｌのＭＧＳサンプルからなった。ＭＧまたはＳ−Ｄ−ラクトイルグルタチオンの非特異的形成を考慮するために、ＭＧＳサンプルを欠く対照アッセイを並行して行い、対照に関して測定された値をアッセイに対して差し引いた。初速度は、ＭＧＳサンプルの添加後、２４０ｎｍにおける吸光度の増加を経時的に追跡することによって測定した。ＭＧＳ活性１単位は、そのアッセイ条件下で１分当たり１μｍｏｌのＭＧの形成と定義した。酵素の比活性をタンパク質１ｍｇ当たりの単位数として表した。
【０１０８】
４．ＭＧＳ酵素の精製
ｍｇｓＡ、ｍｇｓＡ＊（Ｖ１１６Ｌ）、ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）、ｍｇｓＡ＊（Ａ９５Ｖ）の４つのタンパク質を、同じプロトコールを用いて精製した。このプロトコールはHooper and Cooper (1972)から適合させた。
総てのクロマトグラフィーカラムは室温で作動させた。精製工程間は、画分を４℃で保存した。
【０１０９】
４．１．工程１：無細胞抽出液の調製
３５０〜４００ｍｇの大腸菌バイオマスを５０ｍＭイミダゾール、１ｍＭリン酸カリウムｐＨ７およびプロテアーゼ阻害剤カクテルの．７０ｍｌ中に再懸濁させた。細胞をＲｏｓｅｔｔ  ｃｅｌｌ  ＲＺ３にて氷上で、３０秒間隔で３０秒６回、音波処理した(Branson sonifier, 70W)。１２０００ｇにて４℃で３０分間遠心分離することによって細胞残渣を除去した。上清を粗抽出液として維持した。
【０１１０】
４．２．工程２：硫酸アンモニウム沈殿
氷上で粗抽出液に固体硫酸アンモニウム（２０９ｇ／ｌ）を際得た。４℃で１５分インキュベートした後、１２０００ｇにて４℃で１５分間遠心分離することによって沈殿を取り出し、廃棄した。この上清溶液に０℃で硫酸アンモニウム（１１１ｇ／ｌ）を追加した。４℃で１５分インキュベートした後、この混合物を１２０００ｇにて４℃で１５分間遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿を２００ｍｌの５０ｍＭイミダゾール、１ｍＭリン酸カリウムｐＨ７に溶解させた。
【０１１１】
４．３．工程３：陰イオンクロマトグラフィーｐＨ７
Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ(GE Healthcare)を用い、硫酸アンモニウムペレットの半量を５０ｍＭイミダゾール、１ｍＭリン酸カリウムｐＨ７（１００ｍｌ）に再懸濁させ、同じバッファーで平衡化した６ｍｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム(GE Healthcare)にロードした。２回実施した。実施ごとに、カラムを１０カラム容量の同じバッファーで洗浄した。０Ｍから０．５Ｍの塩化ナトリウム２０カラム容量の勾配でタンパク質を溶出した。溶出後、カラムを１カラム容量の０．５Ｍから１Ｍ塩化ナトリウム勾配、および５カラム容量の１Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した。カラムの流速は２ｍｌ／分とし、５ｍｌ画分を回収した。ＭＧＳタンパク質を１５０ｍＭ塩化ナトリウムで溶出した。
ＭＧＳタンパク質を含む画分をプールし、５０ｍＭイミダゾール、１ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８に対して一晩透析した。
【０１１２】
４．４．工程４：陰イオンクロマトグラフィーｐＨ８
透析したプールを、５０ｍイミダゾール、１ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８で平衡化した１．７ｍｌ  Ｍｏｎｏ  Ｑカラム(GE Healthcare)に適用した。カラムのオーバーロードを避けるため、４回実施した。実施ごとに、カラムを１０カラム容量の５０ｍＭイミダゾール、１ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８で洗浄した。０．１Ｍから０．５Ｍの塩化ナトリウム２０カラム容量の勾配でタンパク質を溶出した。溶出後、カラムを１カラム容量の０．５Ｍから１Ｍ塩化ナトリウム勾配、および５カラム容量の１Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した。カラムの流速は１．５ｍｌ／分とし、２ｍｌ画分を回収した。
ＭＧＳタンパク質を約２００ｍＭ塩化ナトリウムで溶出した。ＭＧＳタンパク質を含む画分をプールし、ゲル濾過カラムにロードされるように濃縮した。
【０１１３】
４．５．工程５：ゲル濾過
Ｍｏｎｏ  Ｑカラムからの濃縮画分を、５０ｍＭイミダゾール、１ｍＭリン酸カリウム、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム(GE Healthcare)にロードした。４回の実施した。カラムの流速は０．５ｍｌ／分とし、０．５ｍｌ画分を回収した。ＭＧＳタンパク質を約１３．５ｍｌのバッファーで溶出した。変異型ＭＧＳの発現および精製は野生型酵素の場合と同じであった。天然ｍｇｓＡと変異型ｍｇｓＡ＊の間でオリゴマー化状態に違いはなかった。
タンパク質は総て、タンパク質を安定化させるために０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡの存在下、４℃で保存した。
各精製工程のプールをＳＤＳ４〜１５％勾配のポリアクリルアミドゲルで分析した（図３）。このゲルは、精製工程ともに純度が高まることを示す。ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムの後には、タンパク質はほぼ９０％の純度であった。最終的なプールは、タンパク質ｍｇｓＡに相当する約１７ｋＤａと酵素の安定化に用いたＢＳＡに相当する約７０ｋＤａに２本の主要なバンドを示した。
【０１１４】
５．オルトホスフェートの不在下でのＭＧＳ酵素の特性決定
４つの精製酵素（ＭｇｓＡ、ＭｇｓＡ＊（Ｖ１１６Ｌ）、ＭｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）およびＭｇｓＡ＊（Ａ９５Ｖ））の反応速度定数（Ｋｍ、ｋｃａｔおよびｋｃａｔ／Ｒｍ）を、従前に記載されている活性アッセイを用いて測定した。各酵素に対して、０．０８ｍＭ〜１．５ｍＭの間の少なくとも６種類のＤＨＡＰ濃度を分析した。総ての反応速度に関して、全ＤＨＡＰ濃度について初速度を３反復で測定した。
【０１１５】
活性アッセイの前に、４℃、５０ｍＭイミダゾール、１ｍＭリン酸カリウム、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ  ｐＨ７中で保存されていた精製タンパク質を５０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ  ｐＨ７で希釈した。
各タンパク質の反応速度定数は、ソフトウエアＳｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ(Systat Software Inc, San Jose CA)の酵素反応速度モジュールを用いて計算した。ミカエリス・メンテンを示すデータセットをミカエリス・メンテン方程式に当てはめた。４つのＭＧＳの様々な反応速度パラメーターを表にまとめた。
【０１１６】
表７：Ｐｉ不在下でのＭＧＳ酵素の反応速度パラメーター
【表７】
0005913099.tif 000012
【０１１７】
オルトホスフェートの不在下における、天然ＭＧＳと３つの変異型ＭＧＳの、４つの酵素の反応速度パラメーターは極めて類似していた。Ｋｍの値は、これまでに天然酵素で報告されている値０．２０±０．０３ｍＭ(Saadat and Harrison, 1998)とよく一致している。
各ＭＧＳの比活性はｋｃａｔ値から直接計算した。ＭｇｓＡおよびＭｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）の比活性は類似していた。ＭｇｓＡ＊（Ａ９５Ｖ）の比活性は、ＭｇｓＡの比活性の７５％に相当した。ＭｇｓＡ＊（Ｖ１１６Ｌ）の比活性は、ＭｇｓＡの比活性の５０％に相当した。これらの突然変異はこの酵素の活性に有害ではなかった。
【０１１８】
６．オルトホスフェートの存在下でのＭＧＳ酵素の特性決定
４℃、５０ｍＭイミダゾール、１ｍＭリン酸カリウム、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ  ｐＨ７中で保存されていた４つの精製酵素（ＭｇｓＡ、ＭｇｓＡ＊（Ｖ１１６Ｌ）、ＭｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）およびＭｇｓＡ＊（Ａ９５Ｖ））の反応速度パラメーター（Ｋｍ、ｋｃａｔおよびｋｃａｔ／Ｒｍ）を、活性アッセイ（０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭオルトホスフェート（Ｐｉ））において、種々の濃度のリン酸カリウムの存在下で測定した。活性アッセイの前に、タンパク質を５０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ  ｐＨ７に希釈した。これらの反応速度パラメーターを正確に決定するために、初速度の総ての測定を、０．０８ｍＭ〜１．５ｍＭの間の少なくとも６種類の基質（ＤＨＡＰ）濃度で、３反復で行った。
各タンパク質の、各リン酸カリウム濃度（０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ  Ｐｉ）での反応速度定数は、ソフトウエアＳｉｇｍａ  Ｐｌｏｔの酵素反応速度モジュールを用いて求めた。ＭＧＳ酵素の様々な反応速度パラメーターを表８にまとめた。
【０１１９】
表８：種々の濃度のＰｉの存在下でのＭＧＳ酵素の反応速度パラメーター
【表８】
0005913099.tif 000013
【０１２０】
天然ＭｇｓＡでは、ホスフェートの不在下、種々の濃度のＤＨＡＰで活性を測定した場合、標準的なミカエリス・メンテン速度論を示した。しかしながら、０．２〜０．３ｍＭ濃度のＰｉが存在すると、ＤＨＡＰに対する応答はＳ字状となり、Ｐｉ濃度が上昇すると、ますます顕著なＳ字応答となる。結果として、酵素のＫｍは急激に増大した。これは、すでに文献に記載されているように(Saadat and Harrison, 1998)、オルトホスフェートによるＭＧＳ酵素のアロステリック阻害を意味した。
【０１２１】
３つの変異型ＭｇｓＡ＊（Ｖ１１６Ｌ）、ＭｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）およびＭｇｓＡ＊（Ａ９５Ｖ）では、総てのＰｉ濃度で、反応速度論はミカエリス・メンテン方程式に当てはまり、Ｐｉによるアロステリック阻害は見られなかった。ミカエリス・メンテン曲線は、オルトホスフェートの不在下でも存在下でも極めて類似していた。
【０１２２】
まとめると、３つの変異型ＭＧＳの特性は極めて類似しており、変異型ＭＧＳは、天然ＭＧＳ酵素が示すオルトホスフェートによるアロステリック阻害を消失していた。
【０１２３】
実施例３：野生型または改変型ＭＧＳを発現する２つの大腸菌１，２−プロパンジオール生産株の構築および１，２−プロパンジオール生産の評価
【０１２４】
１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５，ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（１６０Ｔ）の構築
１．１．改変大腸菌株ΔｇｌｏＡ：：Ｃｍの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５において、表５に示されるオリゴヌクレオチドとともにプロトコール１に記載の技術を用い、クロラムフェニコール抗生物質カセットを挿入し、関連する遺伝子の大部分を欠失させることによって遺伝子ｇｌｏＡを不活性化した。この欠失を、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ΔｇｌｏＡ：：Ｃｍと呼称した。
【０１２５】
１．２．改変大腸菌株ΔｇｌｏＡ：：Ｃｍ  Δｅｄｄ−ｅｄａ：：Ｋｍの構築
１．２．１．改変大腸菌株Δｅｄｄ−ｅｄａ：：Ｋｍの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５において、表５に示されるオリゴヌクレオチドとともにプロトコール１に記載の技術を用い、カナマイシン抗生物質カセットを挿入し、関連する遺伝子の大部分を欠失させることによって遺伝子ｅｄｄ−ｅｄａを不活性化した。この欠失を、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ：：Ｋｍと呼称した。
１．２．２．改変大腸菌株ΔｇｌｏＡ：：Ｃｍ，Δｅｄｄ−ｅｄａ：：Ｋｍの構築
大腸菌株ΔｇｌｏＡ：：Ｃｍにおける、遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換することによる遺伝子ｅｄｄ−ｅｄａの欠失は、プロトコール２に従い、Ｐ１ファージを用いた形質導入技術によって行った。
【０１２６】
プロトコール２：遺伝子欠失のためのＰ１ファージを用いた形質導入
レシピエント大腸菌株における、遺伝子を耐性カセット（カナマイシンまたはクロラムフェニコール）で置換することによる選択された遺伝子の欠失は、Ｐ１ファージを用いた形質導入技術によって行った。プロトコールは、ｉ）単一遺伝子欠失を有するＭＧ１６５５株におけるファージ溶解液の調製、および（ｉｉ）このファージ溶解液によるレシピエント株の形質導入の二段階とした。
【０１２７】
ファージ溶解液の調製
単一遺伝子欠失を有するＭＧ１６５５株の一晩培養物１００μｌを１０ｍｌのＬＢ＋Ｃｍ３０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２  ５ｍＭに播種する。
振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
野生型ＭＧ１６５５株で調製したＰ１ファージ溶解液１００μｌ（およそ１×１０９ファージ／ｍｌ）を加える。
３７℃で３時間、総ての細胞が溶解するまで振盪する。
２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
４５００ｇで１０分間遠心分離して細胞残渣を除去する。
上清を無菌試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを加える。
溶解液を４℃で保存する。
【０１２８】
形質導入
ＬＢ培地中、大腸菌レシピエント株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
細胞ペレットを２．５ｍｌのＭｇＳＯ４  １０ｍＭ、ＣａＣｌ２  ５ｍＭに懸濁させる。
対照試験管：細胞１００μｌ
単一遺伝子欠失を有するＭＧ１６５５株のＰ１ファージ１００μｌ
被験試験管：細胞１００μｌ＋単一遺伝子欠失を有するＭＧ１６５５株のＰ１ファージ１００μｌ
振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートする。
各試験管に１Ｍクエン酸ナトリウム１００μｌを加え、ボルテックスにかける。
１ｍｌのＬＢを加える。
振盪しながら、３７℃で１時間インキュベートする。
試験管を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、ＬＢ＋Ｃｍ３０μｇ／ｍｌのディッシュにプレーティングする。
３７℃で一晩インキュベートする。
次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により、欠失の挿入を確認した。
この欠失を、その株にすでに存在していた欠失とともに、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
得られた株を大腸菌ΔｇｌｏＡ：：Ｃｍ，Δｅｄｄ−ｅｄａ：：Ｋｍと呼称した。
【０１２９】
１．３．改変大腸菌株ＭＧ１６５５ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａの構築
大腸菌株ΔｇｌｏＡ：：Ｃｍ  Δｅｄｄ−ｅｄａ：：Ｋｍにおける抗生物質耐性カセットを、プロトコール３に従って除去した。
プロトコール３：耐性カセットの除去（ＦＲＴ系）
クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットを以下の技術に従って除去した。クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを担持するプラスミドｐＣＰ２０を、エレクトロポレーションにより株に導入した。４２℃で連続培養を行った後、抗生物質耐性カセットの欠損を、表５に示されるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
この株にすでに構築されている改変の存在は、表６に示されるオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ΔｇｌｏＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａと呼称した。
【０１３０】
１．４．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ：：Ｃｍの構築
１．４．１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ΔａｌｄＡ：：Ｃｍの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５において、表５に示されるオリゴヌクレオチドとともにプロトコール１に記載の技術を用い、クロラムフェニコール抗生物質カセットを挿入し、関連する遺伝子の大部分を欠失させることによって遺伝子ａｌｄＡを不活性化した。この欠失を、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ΔａｌｄＡ：：Ｃｍと呼称した。
【０１３１】
１．４．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ：：Ｃｍの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡにおける、遺伝子をクロラムフェニコール耐性カセットで置換することによる遺伝子ａｌｄＡの欠失は、Ｐ１ファージを用いた形質導入技術（プロトコール２）によって行った。
この欠失ΔａｌｄＡ：：Ｃｍおよび他の改変を、表６に記載のオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ：：Ｃｍと呼称した。
【０１３２】
１．５．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ：：Ｃｍ，ＡａｌｄＢ：：Ｋｍの構築
１．５．１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ΔａｌｄＢ：：Ｋｍの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５において、表５に示されるオリゴヌクレオチドとともにプロトコール１に記載の技術を用い、カナマイシン抗生物質カセットを挿入し、関連する遺伝子の大部分を欠失させることによって遺伝子ａｌｄＢを不活性化した。この欠失を、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ΔａｌｄＢ：：Ｋｍと呼称した。
【０１３３】
１．５．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ：：Ｃｍ，ΔａｌｄＢ：：Ｋｍの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ  ΔａｌｄＡ：：Ｃｍにおける、遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換することによる遺伝子ａｌｄＡの欠失は、Ｐ１ファージを用いた形質導入技術（プロトコール２）によって行った。
この欠失ΔａｌｄＢ：：Ｋｍおよび他の改変を、表６に記載のオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ：：Ｃｍ，ΔａｌｄＢ：：Ｋｍと呼称した。
【０１３４】
１．６．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ：：Ｃｍ，ΔａｌｄＢ：：Ｋｍにおける抗生物質耐性カセットを、プロトコール３に従って除去した。
この抗生物質耐性カセットの欠損を、表６に示されるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。その株において従前に構築されていた改変の存在も、表６に示されるオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢと呼称した。
【０１３５】
１．７．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ：：Ｋｍの構築
１．７．１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ΔａｒｃＡ：：Ｋｍの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５において、表５に示されるオリゴヌクレオチドとともにプロトコール１に記載の技術を用い、カナマイシン抗生物質カセットを挿入し、関連する遺伝子の大部分を欠失させることによって遺伝子ａｒｃＡを不活性化した。この欠失を、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ΔａｒｃＡ：：Ｋｍと呼称した。
【０１３６】
１．７．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ：：Ｋｍの構築
大腸菌株Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ：：Ｋｍにおいて、遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換することによる遺伝子ａｒｃＡの欠失は、Ｐ１ファージを用いた形質導入技術（プロトコール２）によって行った。
この欠失ΔａｒｃＡ：：Ｋｍおよび他の改変を、表６に記載のオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，Δａｌｄ，ΔａｒｃＡ：：Ｋｍと呼称した。
【０１３７】
１．８．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ：：Ｋｍ，Δｎｄｈ：：Ｃｍの構築
１．８．１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｎｄｈ：：Ｃｍの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５において、表５に示されるオリゴヌクレオチドとともにプロトコール１に記載の技術を用い、クロラムフェニコール耐性カセットを挿入し、関連する遺伝子の大部分を欠失させることによって遺伝子ｎｄｈを不活性化した。この欠失を、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Δｎｄｈ：：Ｃｍと呼称した。
【０１３８】
１．８．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ：：Ｋｍ，Δｎｄｈ：：Ｃｍの構築
大腸菌株Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ：：Ｋｍにおける、遺伝子をクロラムフェニコール耐性カセットで置換することによる遺伝子ｎｄｈの欠失は、Ｐ１ファージを用いた形質導入技術（プロトコール２）によって行った。
この欠失Δｎｄｈ：：Ｃｍおよび他の改変を、表６に記載のオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，Δａｌｄ，ΔａｒｃＡ：：Ｋｍ，Δｎｄｈ：：Ｃｍと呼称した。
【０１３９】
１．９．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ：：Ｋｍ，Δｎｄｈ：：Ｃｍにおける抗生物質耐性カセットを、プロトコール３に従って除去した。
この抗生物質耐性カセットの欠損を、表６に示されるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。この株において従前に構築されていた改変の存在も、表６に示されるオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈと呼称した。
【０１４０】
１．１０．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ））の構築
１．１０．１．プラスミドｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）の構築
１．１０．１．１．プラスミドｐＭＥ１０１−ＶＢ０１の構築
プラスミドｐＭＥ１０１ＶＢ０１はプラスミドｐＭＥ１０１に由来し、まれな制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＰａｃＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＳａｃＩＩおよびＡｇｅＩに特異的な認識部位配列を含む多重クローニング部位とその後にクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)ＡＴＣＣ８２４のａｄｃ転写ターミネーターを担持する。
低コピーベクターからの発現のために、プラスミドｐＭＥ１０１を次のように構築した。プラスミドｐＣＬ１９２０(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631 - GenBank AX085428)を、オリゴヌクレオチドＰＭＥ１０１ＦおよびＰＭＥ１０１Ｒを用いてＰＣＲ増幅し、この増幅ベクターに、ｌａｃＩ遺伝子とｔｒｃプロモーターを担持するベクターＴｒｃ９９Ａ(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)由来のＢｓｔＺ１７Ｉ−ＸｍｎＩ断片を挿入した。
ＰＭＥ１０１Ｆ（配列番号１２）：
【化５】
0005913099.tif 000014
ＰＭＥ１０１Ｒ（配列番号１３）：
【化６】
0005913099.tif 000015
多重クローニング部位とａｄｃ転写ターミネーターを含んでなる合成二本鎖核酸リンカーを用いてｐＭＥ１０１ＶＢ０１を作出した。ＮｃｏＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ消化制限部位に挟まれた、相補的な２つの１００塩基オリゴヌクレオチドをアニーリングした。この１００塩基対の産物を、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化消化プラスミドｐＭＥ１０１にサブクローニングしてｐＭＥ１０１ＶＢ０１を作出した。
１００塩基からなるｐＭＥ１０１ＶＢ０１  １（配列番号１４）：
【化７】
0005913099.tif 000016
１００塩基からなるｐＭＥ１０１ＶＢ０１  ２（配列番号１５）：
【化８】
0005913099.tif 000017
多重クローニング部位に相当する領域（下線の小文字）
クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４  ｐＳＯＬ１（ＮＣ＿００１９８８）のａｄｃ転写ターミネーター（配列１７９８４７〜１７９８１４）に相当する領域（大文字）
を含む。
【０１４１】
１．１０．１．２．プラスミドｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）の構築
１．１０．１．２．１．プラスミドｐＳＣＢ−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）の構築
遺伝子ｙｑｈＤを、大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡから、以下のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅した。
４３ｐｂからなるｙｑｈＤ  Ｆ（配列番号１６）
【化９】
0005913099.tif 000018
遺伝子ｙｑｈＤの配列（３１５３３７７〜３１５３４０８）と相同な領域（下線の文字）
制限部位ＢｓｐＨＩ（太字の文字）
を含む。
２９ｐｂからなるｙｑｈＤ  Ｒ（配列番号１７）
【化１０】
0005913099.tif 000019
遺伝子ｙｑｈＤの配列（３１５４５４０〜３１５４５２１）と相同な領域（下線の文字）
制限部位ＮｈｅＩ（太字の文字）
を含む。
ＰＣＲ増幅した断片をｐＳＣＢ(strataclone（登録商標）)にクローニングした。得られたプラスミドをｐＳＣＢ−ｙｑｈＤと呼称した。このプラスミドに対して、以下のオリゴヌクレオチド：ｙｑｈＤ＊Ｇ１４９ＥｍｕｔＤｉｒＦ（４５ｐｂからなる、
【化１１】
0005913099.tif 000020
（配列番号１８）およびｙｑｈＤ＊Ｇ１４９ＥｍｕｔＤｉｒＲ（４５ｐｂからなる、
【化１２】
0005913099.tif 000021
（配列番号１９）を用いて定方向突然変異誘発を行った。この２つのオリゴヌクレオチドは、領域３１５３８０３〜３１５３８５０と相同であった。太字の文字は突然変異Ｇ１４９Ｅを作出するために変化させた塩基であり、大文字はＥｃｏＲＶ制限部位を作出するために変化させた塩基である。得られたプラスミドをｐＳＣＢ−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）と呼称した。
【０１４２】
１．１０．１．２．２．プラスミドｐＳＣＢ−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）の構築
大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡから、オリゴヌクレオチドｇｌｄＡ  ＦおよびｇｌｄＡ  Ｒを用いてＰＣＲ増幅した遺伝子ｇｌｄＡをｐＳＣＢ(Strataclone（登録商標）)にクローニングした。得られたプラスミドをｐＳＣＢ−ｇｌｄＡと呼称した。
このプラスミドに対して、以下のオリゴヌクレオチド：ｇｌｄＡ＊  Ａ１６０ＴｍｕｔＤｉｒＦ（４５ｐｂからなる、
【化１３】
0005913099.tif 000022
配列番号２０）およびｇｌｄＡ＊Ａ１６０ＴｍｕｔＤｉｒＲ（４５ｐｂからなる、
【化１４】
0005913099.tif 000023
配列番号２１）を用いて定方向突然変異誘発を行った。この２つのオリゴヌクレオチドは領域４１３６６０２〜４１３６５５８と相同である。太字の文字は突然変異Ａ１６０Ｔを作出するために変化させた塩基であり、下線の文字はＥｃｏＲＶ制限部位を作出するために変化させた塩基である。得られたプラスミドをｐＳＣＢ−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）と呼称した。
【０１４３】
１．１０．１．３．ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）の構築
ｐＳＣＢ−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）を制限酵素ＢｓｐＨＩおよびＮｈｅＩで切断し、ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）を含む断片を、ベクターｐＭＥ１０１ＶＢ０１のＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）と呼称した。ｐＳＣＢ−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）を制限酵素ａｖｒＩＩおよびＳａｃＩで切断し、ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）を含む断片を、ベクターｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）のａｖｒＩＩ／ＳａｃＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｓ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）と呼称した。
【０１４４】
１．１０．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ））の構築
プラスミドｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）を、エレクトロポレーションにより、大腸菌株ＭＧ１６５５  ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈに導入した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）と呼称した。
【０１４５】
１．１１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍ  Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ））の構築
１．１１．１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍの構築
１．１１．１．１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）の構築
変異型タンパク質ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）を得るために、ｍｇｓＡ遺伝子に突然変異を導入した。この改変を構築するために用いた技術は、Heermann et al. (2008), Microbial Cell Factories.7(14):1-8によって記載されている。
以下のオリゴヌクレオチドを用いてｒｐｓＬ−Ｎｅｏカセットを増幅した。
１．１０５ｐｂからなるｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：ｒｐｓＬ−Ｎｅｏ  Ｆ（配列番号２２）
【化１５】
0005913099.tif 000024
遺伝子ｍｇｓＡの配列と相同な領域（下線の文字）
ｒｐｓＬ−Ｎｅｏカセットを増幅するための領域（太字の文字）
を含む。
２．ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：ｒｐｓＬ−Ｎｅｏ  Ｒ（配列番号２３）
【化１６】
0005913099.tif 000025
２つの突然変異（一方（赤色）は突然変異Ｈ２１Ｑを作出するものであり、もう一方（黄色）は制限部位ＡｌｗＮ１を作出ものである）を有する遺伝子ｍｇｓＡの配列と相同な領域（下線の文字）
ｒｐｓＬ−Ｎｅｏカセットを増幅するための領域（太字の文字）
を含む。
得られた断片を、プロトコール１に従い、ＭＧ１６５５  ｒｐｓＬ＊株（Heermann et alに記載されているように構築）に導入した。得られた株をＰＣＲおよび配列分析によって確認した。得られた株を大腸菌ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：ｒｐｓＬ−Ｎｅｏと呼称した。
カセットｒｐｓＬ−Ｎｅｏの欠失は、プロトコール１に従って行った。形質転換断片を、プラスミドｐＥＴＴＯＰＯ−ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）のＮｃｏＩおよびＳａｃＩでの制限酵素処理によって得た。
この改変を、表６に記載のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって確認した。
得られた株を大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）と呼称した。
【０１４６】
１．１１．１．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍの構築
カナマイシン耐性カセットを、以下のプライマーを用い、ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’に導入した。
１００ｂｐからなるｍｇｓＡ：：Ｋｍ  Ｆ：（配列番号２４）
【化１７】
0005913099.tif 000026
ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）ＯＲＦの末端と相同な領域領域（下線の文字）
カナマイシンカセットを増幅するための領域（太字の文字）
を含む。
１００ｂｐからなるｍｇｓＡ：：Ｋｍ  Ｒ（配列番号２５）
【化１８】
0005913099.tif 000027
ｈｅｌＤ  ＯＲＦの末端と相同な領域（下線の文字）
カナマイシンカセットを増幅するための領域（太字の文字）
を含む。
得られた断片を、プロトコール１に従い、ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）株に導入した。得られた株をＰＣＲによって確認した。得られた株を大腸菌ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍと呼称した。
【０１４７】
１．１１．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍ  ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ））の構築
大腸菌株ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ））における、ｍｇｓＡの、ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍでの置換は、Ｐ１ファージを用いた形質導入技術によって行った。プラスミドに保持された遺伝子の発現を促進するために、培養物にＩＰＴＧを加えた。
この改変ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍおよび他の欠失を、表６に記載のオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１４８】
２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ：：Ｋｍ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（１６０Ｔ）の構築
２．１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ））の構築
この株の構築については上記されている。
【０１４９】
２．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ：：Ｋｍ  Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ））の構築
２．２．１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ：：Ｋｍの構築
カナマイシン耐性カセットを、配列番号２４および配列番号２５で示されるプライマーを用い、ｍｇｓＡオープンリーディングフレームの３’に導入した。
得られた断片を、プロトコール１に従い、ＭＧ１６５５株に導入した。得られた株をＰＣＲによって確認した。得られた株を大腸菌ｍｇｓＡ：：Ｋｍと呼称した。
【０１５０】
２．２．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ：：Ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ））の構築
大腸菌株Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ））における、ｍｇｓＡの、ｍｇｓＡ：：Ｋｍでの置換は、Ｐ１ファージを用いた形質導入技術によって行った。
この改変ｍｇｓＡ：：Ｋｍおよび他の欠失を、表６に記載のオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ：：Ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ））と呼称した。
【０１５１】
３．ｍｇｓＡ対立遺伝子だけが異なる２つの大腸菌同質遺伝子型株における１，２−プロパンジオール生産の評価
上記の２株を、好気性条件下、単一炭素源として２０ｇ／ｌのグルコースを含む最小培地ＭＭＬ１１ＰＧ１＿１００（表９の組成を参照）を用いたエルレンマイヤーフラスコアッセイ（培地５０ｍｌが入った５００ｍｌフラスコ）にて培養した。スペクチノマイシンを５０ｍｇ／ｌの濃度で加えた。
【０１５２】
表９：最小培地ＭＭＬ１１ＰＧ１＿１００の組成
【表９】
0005913099.tif 000028
【０１５３】
培地のｐＨは水酸化ナトリウムで６．８に調整した。
培養は３７℃で行い、ｐＨは培養培地をＭＯＰＳで緩衝させることによって維持した。
培養の終了時に、発酵液中の１，２−プロパンジオールおよび残留グルコースを、分離にＢｉｏｒａｄ  ＨＰＸ  ９７Ｈカラム、検出に屈折計を用いるＨＰＬＣによって分析した。その後、グルコースに対する１，２−プロパンジオールの収率を計算した。
【０１５４】
表１０：炭素源としてグルコースを含む最小培地での１，２−プロパンジオールの生産
【表１０】
0005913099.tif 000029
【０１５５】
野生型ＭＧＳを有する株は、無機リン酸による阻害のために１，２−プロパンジオールを生産しない。
変異型ＭＧＳを有する大腸菌株は明らかに１，２−プロパンジオールを生産し、上記の所見と合わせて、無機リン酸による阻害に対して感受性のない変異型ＭＧＳは無機リン酸の存在下で１，２−プロパンジオールを生産できることが確認される。
【０１５６】
実施例４：グルコースおよびスクロースでの、変異型ＭＧＳ、変異型ＹｑｈＤおよび変異型ＧｌｙＤＨを有する大腸菌による１，２−プロパンジオールの生産
【０１５７】
１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍ  ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ））の構築
この株の構築は従前に記載した。
【０１５８】
２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）  ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ））（ｐＢＢＲ１ＭＣＳＳ−ｃｓｃＢＫＡＲ）の構築
２．１．プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−ｃｓｃＢＫＡＲの構築
プラスミドｐＫＪＬ１０１．１(Jahreis et al. (2002), J. Bacteriol. 184:5307-5316)をＥｃｏＲＩによって消化した。ｃｓｃＢＫＡＲ遺伝子を含む断片を、これもまたＥｃｏＲＩで消化したｐＢＢＲ１ＭＣＳ５(Kovach et al. (1995), Gene, 166 175-176)にクローニングした。
得られたプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−ｃｓｃＢＫＡＲと呼称した。
【０１５９】
２．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ））（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−ｃｓｃＢＫＡＲ）の構築
プラスミドｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−ｃｓｃＢＫＡＲを、エレクトロポレーションにより、大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ），Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈに導入した。
得られた株を大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔａｒｃＡ，Δｎｄｈ（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ））（ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−ｃｓｃＢＫＡＲ）と呼称した。
【０１６０】
３．グルコースおよびスクロースでの、変異型ＭＧＳ、変異型ＹｑｈＤおよび変異型ＧｌｙＤＨを有する２つの大腸菌における１，２−プロパンジオール生産の評価
上記の２株を、エルレンマイヤーフラスコアッセイ（培地５０ｍｌが入った５００ｍｌフラスコ）にて、好気性条件下、単一炭素源として２０ｇ／ｌグルコースまたはスクロースを含む最小培地ＭＭＬ１１ＰＧ１＿１００（表９の組成を参照）中で培養した。スペクチノマイシンを５０ｍｇ／ｌの濃度で加えた。
培養は３７℃で行い、ｐＨは培養培地をＭＯＰＳで緩衝させることによって維持した。
培養の終了時に、発酵液中の１，２−プロパンジオールおよび残留するグルコースまたはスクロースを、分離にＢｉｏｒａｄ  ＨＰＸ  ９７Ｈカラム、検出に屈折計を用いるＨＰＬＣによって分析した。その後、グルコースまたはスクロースに対する１，２−プロパンジオールの収率を計算した。
【０１６１】
表１１：炭素源としてグルコースまたはスクロースを含む最小培地での１，２−プロパンジオールの生産
【表１１】
0005913099.tif 000030
【０１６２】
変異型ＭＧＳを有する大腸菌株における１，２−プロパンジオールの生産は、単一炭素源としてスクロースにおいて、グルコースに比べて改善された。
【０１６３】
実施例５：野生型または改変型ＭＧＳを発現する２つの大腸菌アセトール生産株の構築およびアセトール生産の評価
【０１６４】
１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍ  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ，（ｐＭＥ１０１−Ｖ０１−ｙｑｈＤ）の構築
１．１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡの構築
１．１．１．改変株ΔｇｌｄＡ：：Ｋｍの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５において、表５に示されるオリゴヌクレオチドとともにプロトコール１に記載の技術を用い、カナマイシン抗生物質カセットを挿入し、関連する遺伝子の大部分を欠失させることによって遺伝子ｇｌｄＡを不活性化した。この欠失を、表５に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ΔｇｌｄＡ：：Ｋｍと呼称した。
【０１６５】
１．１．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ：：Ｋｍの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢにおける、遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換することによる遺伝子ｇｌｄＡの欠失は、Ｐ１ファージを用いた形質導入技術（プロトコール２）によって行った。
この欠失を、その株にすでに存在していた他の欠失とともに、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ：：Ｋｍと呼称した。
【０１６６】
１．１．３．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ：：Ｋｍにおける抗生物質耐性カセットを、プロトコール３に従って除去した。
この抗生物質耐性カセットの欠損を、表６に示されるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。その株において従前に構築されていた改変の存在も、表６に示されるオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡと呼称した。
【０１６７】
１．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ  ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡの構築
１．２．１．改変株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：Ｃｍの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５における天然ｇａｐＡプロモーターの、合成短鎖Ｐｔｒｃ０１プロモーター（配列番号２６：gagctgttgactattaatcatccggctcgaataatgtgtgg）での置換は、表５に示されるオリゴヌクレオチドとともにプロトコール２に記載の技術を用い、２２５ｐｂの上流ｇａｐＡ配列をＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴおよび操作型プロモーターで置換することによって行った。
この改変を、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：Ｃｍと呼称した。
【０１６８】
１．２．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡにおける、天然ｇａｐＡプロモーターの、合成短鎖Ｐｔｒｃ０１プロモーターでの置換は、Ｐ１ファージを用いた形質導入技術によって行った。
この改変Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍおよび他の欠失を、表６に記載のオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡと呼称した。
【０１６９】
１．３．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ  ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）の構築
プラスミドｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）を、エレクトロポレーションにより、大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡに導入した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）と呼称した。
【０１７０】
１．４．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍ  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ  ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）の構築
大腸菌株Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔｇｌｄＡ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ））における、ｍｇｓＡの、ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍでの置換は、Ｐ１ファージを用いた形質導入技術によって行った。プラスミドに保持された遺伝子の発現を促進するために、培養物にＩＰＴＧを加えた。
この改変ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍおよび他の欠失を、表６に記載のオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍ  Ｐｔｖｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ  ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）と呼称した。
【０１７１】
２．改変大腸菌株ＭＧＩＧ５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ，ｍｇｓＡ：：Ｋｍ  Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ，（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ））の構築
２．１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｇＡ：：ｃｍ，ｍｇｓＡ：：Ｋｍ  Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ））の構築
大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ，ｍｇｓＡ：：Ｋｍ  Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇｌ４９Ｅ））において、従前に記載されているように、ｍｇｓＡ：：Ｋｍを構築した。
得られた株を大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａρＡ：：ｃｍ，ｍｇｓＡ：：Ｋｍ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ））と呼称した。
【０１７２】
３．ｍｇｓＡ対立遺伝子だけが異なる２つの大腸菌同質遺伝子型株におけるアセトール生産の評価
上記の２株を、エルレンマイヤーフラスコアッセイ（培地５０ｍｌが入った５００ｍｌフラスコ）にて、好気性条件下、単一炭素源として２０ｇ／ｌのグルコースを含む最小培地ＭＭＬ１１ＰＧ１＿１００（表９の組成を参照）中で培養した。スペクチノマイシンを５０ｍｇ／ｌの濃度で加えた。
培養は３７℃で行い、ｐＨは培養培地をＭＯＰＳで緩衝させることによって維持した。
培養の終了時に、発酵液中のアセトールおよび残留グルコースを、分離にＢｉｏｒａｄ  ＨＰＸ  ９７Ｈカラム、検出に屈折計を用いるＨＰＬＣによって分析した。その後、グルコースまたはスクロースに対するアセトールの収率を計算した。
【０１７３】
表１２：炭素源としてグルコースを含む最小培地でのアセトールの生産
【表１２】
0005913099.tif 000031
【０１７４】
変異型ＭＧＳを有する大腸菌株におけるアセトールの生産は、天然ＭＧＳと同質遺伝子型の株に比べて劇的に改善された。
【０１７５】
実施例６：グルコースおよびスクロースでの、変異型ＭＧＳおよび変異型ＹｑｈＤを有する大腸菌によるアセトールの生産
【０１７６】
１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ，ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ：：Ｋｍ），Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ，ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）の構築
この株の構築は従前に記載した。
【０１７７】
２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ，ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ），Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ  ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−ｃｓｃＢＫＡＲの構築
プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−ｃｓｃＢＫＡを、エレクトロポレーションにより、大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ，ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ：：Ｋｍ），Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ  ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）に導入した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ，ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）：：Ｋｍ，Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，ΔｇｌｄＡ  ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−ｃｓｃＢＫＡＲと呼称した。
【０１７８】
実施例７：野生型または改変型ＭＧＳを発現する２つの乳酸生産株の構築および乳酸生産の評価
【０１７９】
１−改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤ（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｅｄＵ）の構築
１．１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡΔｅｄｄ−ｅｄａの構築
１．１．１．大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ，Δｅｄｄ−ｅｄａ：：Ｋｍの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｇＡ：：ｃｍにおいて、遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換することによる遺伝子ｅｄｄ−ｅｄａの欠失（実施例３参照）は、Ｐ１ファージを用いた形質導入技術（プロトコール２）によって行う。
この欠失を、その株に存在する他の欠失とともに、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認する。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ，Δｅｄｄ−ｅｄａ：：Ｋｍと呼称する。
【０１８０】
１．１．２．大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５  ΔＰｔｒｃ０１−ｇａｐＡ：：ｃｍ，Δｅｄｄ−ｅｄａ：：Ｋｍにおける抗生物質耐性カセットは、プロトコール３に従って除去する。
この抗生物質耐性カセットの欠損を、表６に示されるオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認する。その株において従前に構築されていた改変の存在も、表６に示されるオリゴヌクレオチドを用いて確認する。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａと呼称する。
【０１８１】
１．２．大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤの構築
１．２．１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍの構築
表５に示されるオリゴヌクレオチドとともにプロトコール１に記載の技術を用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連する遺伝子の大部分を欠失させることによって遺伝子ｙｑｈＤを不活性化する。この欠失を、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認する。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍと呼称する。
【０１８２】
１．２．２．改変大腸菌株Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａにおける、遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換することによる遺伝子ｙｑｈＤの欠失は、プロトコール２に記載のＰ１ファージを用いた形質導入技術を用いて行う。この欠失を表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認する。
得られた株を大腸菌Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍと呼称する。
【０１８３】
１．３．改変大腸菌株Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄの構築
１．３．１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Δｄｌｄ：：Ｃｍの構築
表５に示されるオリゴヌクレオチドとともにプロトコール２に記載の技術を用い、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連する遺伝子の大部分を欠失させることによって遺伝子ｄｌｄを不活性化する。この欠失を、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認する。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Δｄｌｄ：：Ｃｍと呼称する。
【０１８４】
１．３．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍにおける遺伝子ｄｌｄの欠失は、プロトコール２に記載のＰ１ファージを用いた形質導入技術を用いて行う。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍ，Δｄｌｄ：：Ｃｍと呼称する。
次に、クロラムフェニコールおよびカナマイシン耐性カセットをプロトコール３に従って除去する。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄと呼称する。
【０１８５】
１．４．改変大腸菌株Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤの構築
１．４．１．大腸菌ＭＧ１６５５ΔｌｌｄＤ：：Ｃｍ
表５に示されるオリゴヌクレオチドとともにプロトコール２に記載の技術を用い、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入し、関連する遺伝子の大部分を欠失させることによって遺伝子ｌｌｄＤを不活性化する。この欠失を、表６に示される適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によって確認する。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ΔｌｌｄＤ：：Ｃｍと呼称する。
【０１８６】
１．４．２．大腸菌ＭＧ１６５５  ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤ
大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄにおける遺伝子ｌｌｄＤの欠失は、プロトコール３に記載のＰ１ファージを用いた形質導入技術を用いて行う。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤ：：Ｃｍと呼称する。
次に、クロラムフェニコール耐性カセットをプロトコール３に従って除去する。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤと呼称する。
【０１８７】
１．５．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤ（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｅｄＵ）の構築
プラスミドｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡおよびｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｅｄＵ（特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３０９３に記載）を、エレクトロポレーションにより、大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤに導入した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤ（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｅｄＵ）と呼称する。
【０１８８】
２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ），Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤ（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｅｄＵ）の構築
２．１．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ），Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤにおいて、従前に実施例３で記載したように、突然変異ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）を構築する。
得られた株を大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ），Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤと呼称する。
【０１８９】
２．２．改変大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ），Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤ（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）（ｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｅｄＵ）の構築
プラスミドｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡおよびｐＭＥ１０１−ＶＢ０１−ｙｅｄＵを、エレクトロポレーションにより、大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ），Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤに導入した。
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１−ｇａｐＡ，ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ），Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｙｑｈＤ，Δｄｌｄ，ΔｌｌｄＤ（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）（ｐＭＥ１０１−ＹＢ０１−ｙｅｄＵ）と呼称する。
【０１９０】
実施例８：２つのサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)１，２−プロパンジオール生産株の構築および１，２−プロパンジオール生産の評価
１−２つのＳ．セレビシエ株ＣＥＮＰＫ  Δｇｐｄ２，Δｔｐｉ１，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ，ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）およびＣＥＮＰＫ  Δｇｐｄ２，Δｔｐｉ１，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ），ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）の構築
１−１．Ｓ．セレビシエ株ＣＥＮＰＫ  Δｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）の構築
用いたＳ．セレビシエ株は、EuroscarfからのＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃ（ＭＡＴａ；ｕｒａ３−５２；ｔｒｐ１−２８９；ｌｅｕ２−３，１１２；ｈｉｓ３Δ１；ＭＡＬ２−８Ｃ；ＳＵＣ２）であった。
ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃ株を、Guldener et al. (1996)に記載の「ショート・フランキング・ホモロジー(short flanking homology)」（ＳＦＨ）法を用いて構築した、ｐＴＤＨ３−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）−ＣＹＣｔ−ｐＴＥＦ１−ｂｌｅ−ＴＥＦ１ｔカセットに相当するＰＣＲ断片で形質転換することによって、遺伝子ＧＰＤ２を不活性化した。
【０１９１】
このｐＴＤＨ３−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）−ＣＹＣｔ−ｐＴＥＦ１−ｂｌｅ−ＴＥＦ１ｔカセットは、Shevchuk et al. (2004)により記載されているように、いくつかの断片のロングＰＣＲ融合(long PCR-based fusion)を用いて構築した。
ｐＴＤＨ３およびＣＹＣｔは、それぞれｐＴＤＨ３／ＧＰＤ２  ＦとｐＴＤＦＢ  Ｒプライマー、およびＣＹＣｔ／ｇｌｄＡ  ＦとＣＹＣｔ／Ｚｅｏ  Ｒプライマーを用い、プラスミドｐ４０６ＴＤＨ３(Addgene)から増幅した。
ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）は、プライマーｇｌｄＡ／ＴＤＨ３ＦとｇｌｄＡ／ＣＹＣｔＲを用いて、ｐＳＣＢ  ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）から増幅した。
ｐＴＥＦ１−ｂｌｅ−ＴＥＦ１ｔは、Ｚｅｏ／ＣＹＣｔ  ＦとＺＥＯ／ＧＰＤ２  Ｒをプライマーとして用いて、Euroscarfから入手したプラスミドｐＵＧ６６から増幅した。
総ての断片を、表１３に記載されるオーバーラッピング末端を有するプライマーを用いて増幅した。その後、各断片を精製した。
プライマーを用いず、それらの同時融合を可能とする低アニーリング条件を用いるＰＣＲにおいて、各断片１００ｎｇを用いた。
【０１９２】
この工程において得られた未精製産物を、ＧＰＤ２遺伝子座の最初の４０ｂｐと最後の４０ｂｐに相同な４０ｂｐの延長部を有するｐＴＤＦＢ／ＧＰＤ２  ＦおよびＺＥＯ／ＧＰＤ２  Ｒプライマー（表１３）を用いる高温のＰＣＲ実験において、マトリックスとして用いた。
この断片をＧＰＤ２遺伝子座に組み込み、ＧＰＤ２オープンリーディングフレームを置換した。
用いた形質転換法は、Schiestl and Gietz (1989)により記載されている酢酸リチウム法であった。ＣＥＮＰＫ，Δｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）株を、７５μｇ／ｍｌのフレオマイシン(Cayla, France)を添加したＹＥＰＤ富化培地（１％バクト酵母抽出液、２％バクトペプトン、２％グルコース）上で選択した。ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）の組込みおよびＧＰＤ２遺伝子の欠失を、抽出されたゲノムＤＮＡに対して、ＧＰＤ２  ｖｅｒ  ＦおよびＧＰＤ２  ｖｅｒ  Ｒプライマーを（表１３）用いるＰＣＲによって確認した。
これにより、ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）の異種発現とＧＰＤ２の欠失が認められた。得られた株をＣＥＮＰＫ  Δｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）と呼称した。
【０１９３】
表１３
【表１３】
0005913099.tif 000032
0005913099.tif 000033
【０１９４】
１−２．２つのＳ．セレビシエ株ＣＥＮＰＫ  Δｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤおよびＣＥＮＰＫ  Δｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）の構築
用いた株は、従前に構築したＣＥＮＰＫ，Δｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）であった。ｙｑｈＤまたはｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）の発現は、「ショート・フランキング・ホモロジー」（ＳＦＨ）法を用い、これらの株を、ｐＴＥＦ１−ｙｑｈＤ−ＣＹＣｔ−ｐＴＥＦ１−ｎａｔ１−ＴＥＦ１ｔカセットまたはｐＴＥＦ１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ＣＹＣｔ−ｐＴＥＦ１−ｎａｔ１−ＴＥＦ１ｔカセットに相当するＰＣＲ断片で形質転換することによって実現した。
このｐＴＥＦ１−ｙｑｈＤ−ＣＹＣｔ−ｐＴＥＦ１−ｎａｔ１−ＴＥＦ１ｔカセットまたはｐＴＥＦ１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ＣＹＣｔ−ｐＴＥＦ１−ｎａｔ１−ＴＥＦ１ｔカセットは、いくつかの断片のロングＰＣＲ融合を用いて構築した。
ｐＴＥＦ１およびＣＹＣｔは、それぞれｐＴＥＦ１／ＵＲＡ３  ＦとｐＴＥＦ  Ｒプライマー、およびＣＹＣｔ／ｙｑｈＤ  ＦとＣＹＣｔ／Ｎａｔ１Ｒプライマーを用い、プラスミドｐ４０５ＴＥＦ１(Addgene)から増幅した。
【０１９５】
ｙｑｈＤおよびｙｑｈＤ＊は、それぞれプライマーｙｑｈＤ／ＴＥＦ−ＦおよびｙｑｈＤ／ＣＹＣｔＲを用い、ｐＳＣＢ−ｙｑｈＤおよびｐＳＣＢ  ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）から増幅した。
ｐＴＥＦ１−ｎａｔ１−ＴＥＦ１ｔは、プライマーとしてＮａｔ１／ＣＹＣｔ  ＦとＮａｔｌ／Ｌｅｕ２を用い、Euroscarfから入手したプラスミドｐＡＧ３５から増幅した。
総ての断片を、表１４に記載されるオーバーラッピング末端を有するプライマーを用いて増幅した。その後、各断片を精製した。
プライマーを用いず、それらの同時融合を可能とする低アニーリング条件を用いるＰＣＲにおいて、各断片１００ｎｇを用いた。
この工程において得られた未精製産物を、ＬＥＵ２遺伝子座の最初の４０ｂｐと最後の４０ｂｐに相同な４０ｂｐの延長部を有するｐＴＥＦ１／ＬＥＵ２  ＦおよびＮａｔ１／Ｌｅｕ２プライマーを用いる高温のＰＣＲ実験において、マトリックスとして用いた（表１４）。
これらの断片をＬＥＵ２遺伝子座に組み込み、ＧＰＤ２オープンリーディングフレームを置換した。
【０１９６】
用いた形質転換法は酢酸リチウム法であった。ＣＥＮＰＫ，Δｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）株を、ｐＴＥＦ１−ｙｑｈＤ−ＣＹＣｔ−ｐＴＥＦ１−ｎａｔ１−ＴＥＦ１ｔカセットまたはｐＴＥＦ１−ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）−ＣＹＣｔ−ｐＴＥＦ１−ｎａｔ１−ＴＥＦ１ｔのいずれかによって形質転換し、ＣＥＮＰＫ，Δｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤおよびＣＥＮＰＫ，Δｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）を得た。形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのノーセオスリシン(Weber bioagents, Germany)を添加したＹＥＰＤ富化培地（１％バクト酵母抽出液、２％バクトペプトン、２％グルコース）上で選択した。ｙｑｈＤまたはｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）の組込みを、抽出されたゲノムＤＮＡに対して、ＹＱＨＤ  ｖｅｒ  ＦおよびＹＱＨＤ  ｖｅｒ  Ｒプライマー（表１４）を用いるＰＣＲによって確認した。
これにより、ｙｑｈＤおよびｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）の異種発現が認められた。得られた株をＣＥＮＰＫ  Δｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤおよびＣＥＮＰＫ  Ａｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）と呼称した。
【０１９７】
表１４
【表１４】
0005913099.tif 000034
0005913099.tif 000035
【０１９８】
１−３．２つのＳ．セレビシエ株ＣＥＮＰＫ  Δｇｐｄ２，Δｔｐｉ１，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ，ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）およびＣＥＮＰＫ  Δｇｐｄ２，Δｔｐｉ１，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ），ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）の構築
用いた２つの株は、従前に構築したＣＥＮＰＫ，Δｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤまたはＣＥＮＰＫ，Δｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ＊であった。
これらの株を、「ショート・フランキング・ホモロジー」（ＳＦＨ）法を用いて、ｐＴＥＦ１−ｈｐｈ−ＴＥＦ１ｔ−ｐＰＧＫ１−ｍｓｇＡ＊（Ｈ２１Ｑ）カセットで形質転換することによって遺伝子ＴＰＩｌを不活性化した。
【０１９９】
このｐＴＥＦ１−ｈｐｈ−ＴＥＦ１ｔ−ｐＰＧＫ１−ｍｓｇＡ＊（Ｈ２１Ｑ）カセットは、ロングＰＣＲ融合を用いて構築した。
ｐＴＥＦ１−ｈｐｈ−ＴＥＦ１ｔ−ｐＰＧＫ１は、ＰＧＫ１／ＴＰＩ１ＦおよびＰＧＫ１／ｍｇｓＡＲを用い、ｐＡＧ３５(Euroscarf)から構築したプラスミドｐＡＧ３５ｐＰＧＫ１から増幅した。
ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）は、〆プライマーとしてｍｇｓＡ／ＰＧＫ１ＦおよｂｍｇｓＡ／ＴＰＩ  Ｒを用い、ｐＥＴＴＯＰＯ  ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）から増幅した。
総ての断片を、表１５に記載されるオーバーラッピング末端を有するプライマーを用いて増幅した。その後、各断片を精製した。
プライマーを用いず、それらの同時融合を可能とする低アニーリング条件を用いるＰＣＲにおいて、各断片１００ｎｇを用いた。
【０２００】
この工程において得られた未精製産物を、ＬＥＵ２遺伝子座の最初の４０ｂｐと最後の４０ｂｐに相同な４０ｂｐの延長部を有するｐＴＥＦ１／ＬＥＵ２  ＦおよびＮａｔ１／Ｌｅｕ２プライマーを用いる高温のＰＣＲ実験において、マトリックスとして用いた（表１４）。
この断片をＴＰＩ１遺伝子座に組み込み、ＴＰＩ１オープンリーディングフレームを置換した。
用いた形質転換法は酢酸リチウム法であった。ＣＥＮＰＫ，Δｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ株およびＣＥＮＰＫ，Δｇｐｄ２，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）株を、ｐＴＥＦ１−ｈｐｈ−ＴＥＦ１ｔ−ｐＰＧＫ１−ｍｓｇＡ＊（Ｈ２１Ｑ）カセットによって形質転換し、ＣＥＮＰＫ，Δｇｐｄ２，Δｔｐｉ１，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ＊（Ｇ４１９Ｅ），ｍｓｇＡ＊（Ｈ２１Ｑ），ＣＥＮＰＫ，Δｇｐｄ２，Δｔｐｉ１，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６を得た。形質転換体は、２５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン(Sigma-Aldrich)を添加したＹＥＰＤ富化培地（１％バクト酵母抽出液、２％バクトペプトン、２％グルコース）上で選択した。
【０２０１】
ｍｓｇＡ＊（Ｈ２１Ｑ）の組込みを、抽出されたゲノムＤＮＡに対して、ｍｇｓＡ  ｖｅｒ  ＦおよびｍｇｓＡ  ｖｅｒ  Ｒプライマー（表１５）を用いるＰＣＲによって確認した。
これにより、ｍｓｇＡ＊（Ｈ２１Ｑ）の異種発現とＴＰＩ１の欠失が認められた。得られた株をＣＥＮＰＫ  Δｇｐｄ２，Δｔｐｉ１，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ，ｍｓｇＡ＊（Ｈ２１Ｑ）およびＣＥＮＰＫ  Ａｇｐｄ２，Δｔｐｉ１，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ），ｍｓｇＡ＊（Ｈ２１Ｑ）と呼称した。
【０２０２】
表１５
【表１５】
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【０２０３】
２−Ｓ．セレビシエＣＥＮＰＫ  Δｇｐｄ２，Δｔｐｉ１，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ，ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）における１，２−プロパンジオール生産の評価
上記のＣＥＮＰＫ，Δｇｐｄ２，Δｔｐｉ１，ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ），ｙｑｈＤ，ｍｓｇＡ＊（Ｈ２１Ｑ）株および対照株ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃを、嫌気性または好気性条件下、単一炭素源として５％グルコースまたは５％スクロースのいずれかを含有する最小培地（ＳＤ培地  アミノ酸不含の０．６７％酵母窒素基体（ＤＩＦＣＯ））中、バッチ培養で培養した。最小培地に５０ｍｇ／ｌのウラシル、２５０ｍｇ／ｌのロイシン、５０ｍｇ／Ｌのヒスチジンおよび５０ｍｇ／Ｌのトリプトファンを添加した。培養物を２８℃で２２５ｒｐｍにて撹拌しながら増殖させた。
好気性培養は、５０ｍｌの培地を含む２５０ｍｌの振盪フラスコで行った。嫌気性培養は、９０ｍｌの培地を含む１００ｍｌのペニシリンフラスコで行った。
培養の終了時に、発酵液中の１，２−プロパンジオールを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ５９７５Ｃシリーズ質量選択検出器（ＥＩ）およびＨＰ  ＩＮＮＯＷａｘカラムにつないだＡｇｉｌｅｎｔ  ７８９０Ａシリーズガスクロマトグラフを用いたガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）によって分析した。生成した１，２−プロパンジオールの保持時間および質量スペクトルを標品１，２−プロパンジオールのそれらと比較した。発酵液中の残留グルコースまたはスクロースは、分離にＢｉｏｒａｄ  ＨＰＸ  ９７Ｈカラム、検出に屈折計を用いるＨＰＬＣによって分析した。その後、炭素源としてのグルコースまたはスクロースに対する１，２−プロパンジオールの収率を計算した。
【０２０４】
表１６：炭素源としてグルコースまたはスクロースを用いる、好気性または嫌気性条件下、最小培地中での１，２−プロパンジオールの生産
【表１６】
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【０２０５】
変異型ＭＧＳを有するＳ．セレビシエ株における、グルコースまたはスクロースを用いた嫌気性または好気性条件下での１，２−プロパンジオールの生産は、非改変対照株に比べて改善された。
【参照文献】
【０２０６】
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【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１】様々な起源の３６のＭＧＳタンパク質配列のアライメントを示す。配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅ(The UniProt consortium (2008))から入手し、デフォルトパラメーターを用いたＭＵＳＣＬＥによりアライメントを作製した。
【図２】本発明の微生物における乳酸、アセトールおよび１，２−プロパンジオールの生産のための代謝経路を示す。
【図３】タンパク質ｍｇｓＡ＊  Ｖ１１６Ｌの様々な精製段階におけるＳＤＳ４〜１５％勾配ポリアクリルアミドゲルの分析を示す。レーン１：分子量マーカー、レーン２：粗抽出液、レーン３、１回目の硫酸アンモニウム沈澱の上清、レーン４、２回目の硫酸アンモニウム沈澱のペレット、レーン５、ＲｅｓｏｕｒｃｅＱプール、レーン６、ＭｏｎｏＱプール、レーン７、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００プール、レーン８、ＢＳＡを含む最終プール。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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