(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療のための組み合わせ製剤の製造における、ＤＮＡ発現構築体およびビンデシンの使用であって、
前記ＤＮＡ発現構築体は、２本鎖のステム及び前記ステムの両端に位置する１本鎖のループを有するダンベル型の直線状共有結合閉鎖ＤＮＡ発現構築体であって、環状ＤＮＡ鎖の相補的デオキシリボ核酸の前記ステムが、プロモーター配列、コード配列及び終結シグナルを含み、前記ＤＮＡ発現構築体はＴＮＦ−αをコードし、
前記ＤＮＡ発現構築体はジェット注射による投与に適したものである、使用。
【請求項２】
前記プロモーター配列が真核細胞及びヒトの体内で作用可能である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＤＮＡ発現構築体が薬学的に適用可能な組成物として提供される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記薬学的に適用可能な組成物がワクチンである、請求項３記載の使用。
【請求項５】
追加的に非コード免疫調節ＤＮＡ配列がジェット注射によって投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記ＤＮＡ配列が、少なくとも１つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４を含み、ここでＮ１Ｎ２はＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、ＡＴ又はＡＡの群から選択される要素であり、Ｎ３Ｎ４はＣＴ又はＴＴの群から選択される要素であり、Ｃはデソキシシトシンであり、Ｇはデソキシグアノシンであり、Ａはデソシキアデノシンであり、Ｔはデソキシチミジンである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記非コード免疫調節ＤＮＡ構築体がダンベル型であり、共有結合閉環状ＤＮＡ１本鎖を含み、２本鎖のステム及び前記ステムの両端の１本鎖ループを形成する部分的２本鎖である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ＤＮＡ発現構築体は、前記ビンデシンと同時に又は逐次的に投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記癌はメラノーマである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デオキシリボ核酸のダンベル型環状鎖を含むＤＮＡ発現構築体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ構築体又はベクターであって、タンパク質の発現に好適であり、かかるＤＮＡ構築体内で配列によってコードされるものがいくつか当該技術分野において既知である。これらは、発現構築体を導入すべき生物又は細胞の種類に応じて、真核性又は原核性発現構築体と呼ばれる。用語「プラスミド」は一般的に共有結合閉環状ＤＮＡ２本鎖を含む環状発現構築体に関する。プラスミドは通常、マーカー遺伝子のように特異的選択に対して発現する配列に加えて、さらなる配列を含有し、場合によっては標的細胞中でのエピソーム複製のための配列を含有する。
【０００３】
構造的に異なる発現構築体が特許文献１に記載されている。当該文献は、両端に部分的に１本鎖のループを有するダンベル型で直線状の共有結合閉鎖ＤＮＡ構築体を開示している。かかる構築体は、ＤＮＡ構築体を細胞に導入する方法に応じて、形質移入後にタンパク質発現レベルの大幅な増大を引き起こす。
【０００４】
特許文献１はさらに、かかるダンベル型ＤＮＡ構築体を弾道的導入によって適用することはタンパク質発現に有利に関連することを開示している。発現レベルは増大するが、吸収、共有結合又はイオン結合によってＤＮＡを弾丸的導入に使用される微粒子弾とリンクすることは困難である。
【０００５】
細胞へのＤＮＡ導入に適したジェット注射器は、例えばワクチン適用用のものが、当該技術分野で既知である。かかるジェット注射器は、通常は注射筒を有する医療用具であり、高圧の細いジェット流を用いて液体を注射する。通常使用される表皮に穿通する皮下注射針との違いは、ジェット注射器は注射に伴う痛みを軽減することである。一般的にジェット注射器は大型注射器から又は内蔵のガスカートリッジ又は小型注射器からの高圧ホースによる圧縮空気又はガスを動力とする。基本的に、ジェット注射器は針式注射器の代替法として使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＥＰ０９４１３１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、細胞への導入のためのダンベル型ＤＮＡ発現構築体の別の使用法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、２本鎖のステム及び該ステムの両端に位置する１本鎖のループを有するダンベル型の直鎖状共有結合閉鎖ＤＮＡ構築体の使用を提供し、ここで環状ＤＮＡ鎖の相補的デオキシリボ核酸のステムは癌治療のためにジェット注射によって投与されるべきプロモーター配列、コード配列及び終結シグナルを含む。
【０００９】
プロモーター配列は真核細胞およびヒトの体内で作用可能であることを意図する。使用プロモーターを組織又は各組織の起源に適応させることは、それぞれ細胞又は核への導入後の発現速度を最適化するために有利となる可能性がある。
【００１０】
ＤＮＡ構築体は免疫調節剤及び／又は細胞表面マーカーをコードするために使用できる。用語「免疫調節剤」は、免疫系の刺激剤及び抑制剤を含む。用語「免疫系の調節」は、免疫応答の強化又は抑制のいずれかの意味で「免疫系の活性化」と同意語として使用される。
【００１１】
免疫調節剤は、抗体、ホルモン、サイトカイン又はその他の生物学的に活性な物質を含む群から選択される。用語「生物学的に活性な」は、細胞又は組織へのその適用又は導入後に作用を引き起こすすべての物質を含み、その際各物質が合成品か生物由来かは問わず、これは遺伝子を利用した製造方法を包含する。
【００１２】
本開示による使用は、ＤＮＡ構築体をコードするサイトカインのような免疫系のトランスミッター又はメッセンジャーを含み、ＴＮＦ−α、インターロイキン−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４及びＢ７．１／ＣＤ８０を含む群より選択される。上記のトランスミッターに加えて、いかなる他の分子媒介免疫シグナルも本発明の範囲内に含まれる。
【００１３】
本開示による使用は、化学療法剤と同時に又は逐次的に投与されるＤＮＡ構築体も含み、その際同時投与は、１つの化合物が対応する処方又は適切な化合物へのカップリングにより時間遅延して放出されるという選択肢を包含する。
【００１４】
本開示による使用は、抗体、アルキル化剤、白金アナログ、挿入剤、抗生物質、有糸分裂抑制剤、タキサン、トポイソメラーゼ抑制剤、代謝拮抗物質及び／又はＬ−アスパラギナーゼ、ヒドロキシカルバミド、ミトタン及び/又はアマニチンを含む群より選択される化学療法剤に言及する。
【００１５】
有糸分裂抑制剤ビンデシンは、ＴＮＦ−αをコードするダンベル型ＤＮＡ発現構築体との組合せで非常に良い結果を示した。
【００１６】
本発明はさらに、ＤＮＡ構築体が薬学的に適用可能な組成物、特にワクチンとして提供されることを意図する。
【００１７】
本開示による使用はさらに、非コード免疫調節性ＤＮＡ配列のジェット注射による同時投与を意図する。ここでもこの追加化合物を同時に又は逐次的に投与することができ、同時投与の場合でも、時間遅延放出を意図することができる。
【００１８】
非コードＤＮＡ配列のＤＮＡ配列は、少なくとも１つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４を含み、ここでＮ１Ｎ２はＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、ＡＴ又はＡＡの群から選択される要素であり、Ｎ３Ｎ４はＣＴ又はＴＴの群から選択される要素であり、Ｃはデソキシシトシンであり、Ｇはデソキシグアノシンであり、Ａはデソシキアデノシンであり、Ｔはデソキシチミジンである。
【００１９】
非コードが開鎖オリゴデオキシヌクレオチドである場合、末端をヌクレアーゼから保護する好適な手段は、本発明の範囲内に含まれる。
【００２０】
非コード免疫調節性ＤＮＡは、ダンベル型で、共有結合閉環状ＤＮＡ１本鎖を含むことができ、２本鎖のステム及び該ステムの両端に１本鎖のループを形成する部分的２本鎖である。
【００２１】
本開示は、ＤＮＡ構築体の新規及び発明的使用を提供し、前記ＤＮＡ構築体はジェット注射器によって細胞内に投与される。一方で前記ＤＮＡは腫瘍、筋肉又は結合組織のような組織内に直接注射されてもよい。他方で、本開示による使用は細胞培養と共に実施されてもよい。したがって、その使用は生体内及び生体外使用に適する。
【００２２】
本開示の範囲は、ダンベル型発現構築体だけでなく、環状２本鎖ＤＮＡ発現構築体も包含する。かかる発現構築体はＴＮＦ−αをコードする場合があり、ビンデシンのような化学療法剤と共に適用されるべきである。
【００２３】
用語「癌」は、乳癌、メラノーマ、皮膚新生物、胃腸腫瘍（結腸癌腫、胃癌腫、膵臓癌腫、結腸癌、小腸癌を含む）、卵巣癌腫、子宮頸癌腫、肺癌、前立腺癌、腎細胞癌腫及び／又は肝転移を含む群より選択される、治療又は予防されている癌性疾患又は腫瘍を含む。
【００２４】
当該医薬品は注射、特にジェット注射に適していなければならず、無菌水性溶液又は分散液及び無菌の注射可能な溶液又は分散液を即時調製するための無菌粉末を包含する。すべての場合で、該医薬品は容易な注射性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）又はジェット注射が可能な程度で無菌流体として提供されなければならない。また、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、溶媒又は分散媒体であることができ、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び／又は植物油を含有する。適切な流動性が、例えば、レシチンのような被覆剤の使用によって、分散液の場合には必要粒径の維持によって及び界面活性剤の使用によって維持されてもよい。微生物の作用の阻害は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって助長できる。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによって引き起こすことができる。
【００２５】
無菌の注射可能な溶液は、必要量の活性化合物を、適切な溶媒に、必要に応じて上記で列挙したいくつかの他の成分と共に組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散剤は、様々な無菌活性成分を、塩基性分散媒体及び上記で列挙したものから必要とされる他の成分を含有する無菌賦形剤に組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥の手法であり、該手法は事前に滅菌濾過した溶液から活性成分に任意の追加の所望成分を加えた粉末を与える。
【００２６】
本明細書に開示される組成物は中性又は塩の形態で処方されてもよい。薬学的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）を包含し、例えば塩酸若しくはリン酸のような無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される。フリーラジカル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄のような無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基からも誘導できる。処方と同時に、溶液はその投与製剤に適合するやり方で及び治療的に有効な量で投与される。処方は、注射可能な溶液、薬剤放出カプセルなどのような種々の投与形態で容易に投与される。
【００２７】
本明細書で使用するとき、「担体」は任意の及びすべての溶媒、分散媒体、賦形剤、被覆剤、希釈剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを包含する。医薬活性物質のためのそのような媒体及び作用剤の使用は、当該技術分野において周知である。従来の媒体又は作用剤が活性成分に適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が予想される。補助的活性成分も、組成物中に組み込むことができる。
【００２８】
用語「薬学的に許容可能な」は、ヒトに投与された場合にアレルギー性の又は類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含有する水性組成物の製剤は、当該技術分野において十分に理解される。一般的に、かかる組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射可能として調製され；注射前に溶液又は懸濁液にして液体とするのに適した固体形態も調製できる。製剤は乳化することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本開示を、図及び実施例によって、これらに限定することなく例証する。
【図１Ａ】メラノーマにジェット注射されたダンベル型ＤＮＡの用量依存性。
【図１Ｂ】メラノーマにジェット注射されたダンベル型ＤＮＡの用量依存性。
【図１Ｃ】メラノーマにジェット注射されたダンベル型ＤＮＡの用量依存性。
【図２Ａ】ダンベル型ＤＮＡと環状２本鎖プラスミドの腫瘍における生体内発現効率の比較。
【図２Ｂ】ダンベル型ＤＮＡと環状２本鎖プラスミドの腫瘍における生体内発現効率の比較。
【図３Ａ】ダンベル型ＤＮＡのみ又はビンデシンとの組合せを用いた遺伝子導入。
【図３Ｂ】ダンベル型ＤＮＡのみ又はビンデシンとの組合せを用いた遺伝子導入。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
図１は、タンパク質発現の用量依存性及び腫瘍に適用された各用量からの導入ＤＮＡの存在を示す。導入されたダンベル型ＤＮＡ構築体はＴＮＦ−αをコードする。メラノサイトの悪性腫瘍であるメラノーマにおけるＴＮＦ−αの発現又は導入ＤＮＡの存在を実証するために３種類の方法を用いた。
【００３１】
図１Ａは、ＴＮＦ−ＥＬＩＳＡの結果を、ｘ軸にＤＮＡ用量（μｇ）、ｙ軸に総タンパク質（ｍｇ）当たりのＴＮＦ−α（ｐｇ）を用いて、ＤＮＡのジェット注射後１、３、７及び１４日目について示す。
【００３２】
ジェット注射後のタンパク質発現レベルは腫瘍当たりのＤＮＡ用量に依存することが明らかである。ジェット注射後の各時点で、タンパク質発現レベルが最も高いのは１５０μｇＤＮＡである。１５０μｇＤＮＡのジェット注射後１日目に最も強いＤＮＡ発現を観察することができ、その後の測定時点ごとに低下している。図１Ａの右側に、陰性対照としてＤＮＡを含まないＰＢＳを示す。
【００３３】
図１Ｂは、異なるＤＮＡ用量について、ＤＮＡジェット注射後３、７及び１４日目の腫瘍部分当たりの形質移入されたＤＮＡ構築体の量（ｎｇ）をｙ軸に示す。形質移入されたダンベル型ＤＮＡ構築体のＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、さらに陰性対照としてＰＢＳを使用した結果をｘ軸の右側に示す。
【００３４】
ＤＮＡ増幅の結果は図１Ａにおけるタンパク質測定結果と一致する。最高レベルのＤＮＡはジェット注射後３日目に増幅され、最小量のＤＮＡはジェット注射後７日目に測定された。
【００３５】
腫瘍当たりのＤＮＡ用量が５０μｇの場合、１５μｇＤＮＡの場合よりもＤＮＡ発現は少ないが、エラーバーは５０μｇＤＮＡの平均ＤＮＡ発現が１５μｇの場合よりも高いことを示す。合計では、腫瘍当たりのＤＮＡ用量が最も高い１５０μｇは、導入ＤＮＡの量が最も多く、これがＰＣＲにより増幅された。
【００３６】
図１Ｃは、腫瘍におけるＴＮＦ−α発現を測定する免疫蛍光を示す。図中の矢印は、ＴＮＦ−αを発現する細胞を表す。１５μｇ及び１５０μｇの導入により、ジェット注射後１日目にはっきりと検出できるＴＮＦ−α発現が得られる。一番上の図は陰性対照を示す。
【００３７】
図２は、ダンベル型ＤＮＡと環状閉鎖２本鎖ＤＮＡの腫瘍における生体内発現の比較を示す。いずれのＤＮＡ発現構築体もＴＮＦ−αをコードする。図２Ａ及びＢにおいて、プラスミドＤＮＡ−２本鎖環状ＤＮＡ−の結果を左側（白棒）に、右側（黒棒）のダンベル型ＤＮＡ構築体の結果と比較して示す。各ＤＮＡ構築体は等モル量を適用した。
【００３８】
プラスミド導入に５種類の動物、ダンベル型ＤＮＡ用に４種類の動物を実験に使用した。腫瘍の重量を腫瘍質量（ｇ）当たりのＴＮＦ質量（ｐｇ）と共に下表に示す。
【００３９】
【表１】
0005935223.tif 000002
【００４０】
図２Ａは、総タンパク質の質量（ｍｇ）当たりのＴＮＦ−α（ｐｇ）を示す。プラスミドＤＮＡを使用した場合は測定可能な量の発現ＴＮＦ−α（左側）は得られず、ダンベル型ＤＮＡ構築体を使用した場合ははっきりと検出可能な量の発現ＴＮＦ−α（右側）が得られることは明らかである。
【００４１】
図２Ｂからわかるように、総タンパク質質量当たりのＴＮＦ−αの平均量は、プラスミドＤＮＡの代わりにダンベル型ＤＮＡ構築体を使用すると約２００倍になる。プラスミドＤＮＡとダンベル型ＤＮＡの発現効率の違いは全く意外であり、ジェット注射がＤＮＡ構築体の導入を向上することを考慮しても予想できなかった。プラスミドＤＮＡはジェット注射によって導入されるが、ＴＮＦ−α発現はほとんど検出不可能であるのに対し、ダンベル型ＤＮＡはかなりの量の発現ＴＮＦ−αを引き起こした。
【００４２】
さらなる実験で、ＴＮＦ−α発現が細胞生存率及び腫瘍容積に与える影響を調査した。図３は、ＴＮＦ−αをコードするダンベル型ＤＮＡ構築体を化学療法剤ビンデシンと共に使用した遺伝子導入の結果（黒棒）を、ビンデシンのみ使用の場合（白棒）と比較して示す。
【００４３】
図３Ａは、ビンデシンを単独で及びＴＮＦ−αをコードするダンベル型ＤＮＡ構築体との併用で導入した後のＡ３７５メラノーマ細胞の化学増感アッセイの結果を示す。ビンデシン単独の使用で細胞生存率が低下することがはっきりわかる。この効果は、ビンデシンをＴＮＦ−αをコードするダンベル型ＤＮＡ構築体と併用することによって増幅できる。ビンデシンのみを１２．８μｇ／ｍｌの濃度で使用した場合の相対的細胞生存率は０．６であるのに対し、ＴＮＦ−αをコードするダンベル型ＤＮＡ構築体を同時に使用した場合は０．２である。この効果の増幅度合いは意外であり、図３Ｂからわかるように、ＴＮＦ−αをコードするダンベル型ＤＮＡ構築体及びビンデシンのそれぞれの効果を加算することで明らかにすることはできなかった。
【００４４】
図３Ｂは、ＴＮＦ−αをコードするダンベル型ＤＮＡ構築体（ＭＩＤＧＥ−ＴＮＦ）、ビンデシン及びＭＩＤＧＥ−ＴＮＦとビンデシンの組合せの遺伝子導入によるＡ３７５メラノーマ異種移植腫瘍の化学増感を示す。腫瘍内ジェット注射を１５０μｇのダンベル型ＤＮＡ構築体を２回用いて実施し、指示された場合にはさらに０．５ｍｇ／ｋｇ腫瘍のビンデシンを２回実施した。
【００４５】
ｙ軸は、導入後の日数（ｘ軸）に対する相対的腫瘍容量の中央値を示す。ビンデシン及びＭＩＤＧＥ−ＴＮＦのそれぞれの導入は平均腫瘍容量を低減するが、ビンデシン及びＭＩＤＧＥ−ＴＮＦの組合せは明らかな相乗効果があり、前記化合物を単独で使用した場合の効果を単純に加算した結果を超える。この結果は予想外であり、ビンデシンをＴＮＦ−αをコードするダンベル型構築体と組み合わせてジェット注射によって適用した場合に相乗効果により細胞生存率（図３Ａ）も低下するという仮説を強固にする。
【００４６】
図は、ジェット注射によって適用されたダンベル型ＤＮＡ構築体が、ジェット注射されたプラスミドＤＮＡと比較して、コードされたタンパク質の発現を数倍にすることを示す。ダンベル型ＤＮＡ構築体のビンデシンのような化学療法剤との併用は、腫瘍細胞生存率及び腫瘍容量に対して相乗効果がある。いずれの効果も、化合物単独の効果を単純に加算した場合よりもはるかに強力であるため、予想できなかった。
【００４７】
全体として、これらの結果は免疫調節剤、すなわち免疫刺激剤又は免疫抑制剤をコードするダンベル型ＤＮＡ構築体を化学療法剤と併用すること及び前記ＤＮＡをジェット注射により適用することは、制御されてない細胞増殖に関連する癌又はその他の疾患の治療に有利である。
【図１Ａ】
0005935223.tif 000003
【図１Ｂ】
0005935223.tif 000004
【図１Ｃ】
0005935223.tif 000005
【図２Ａ】
0005935223.tif 000006
【図２Ｂ】
0005935223.tif 000007
【図３Ａ】
0005935223.tif 000008
【図３Ｂ】
0005935223.tif 000009