(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５００ｎｍ未満の範囲の乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子と、
治療上有効量のテトラピロール系の疎水性光増感剤と、
ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）と、
を含み、
抗凍結剤の存在下で凍結乾燥される、
光力学的療法における使用のためのナノ粒子医薬製剤であって、
前記光増感剤は、
式Ａのクロリン又はバクテリオクロリン誘導体であって、
【化１】
0005868869.tif 000003
ここで、
Ｒ１は、ＨまたはＯＨであって、
Ｒ２からＲ５は、‐ＯＨ、‐ＣＯＯＨ、‐ＮＨ２、‐ＣＯＯＸ、‐ＮＨＸ、ＯＸ、‐ＮＨ‐Ｙ‐ＣＯＯＨまたは‐ＣＯ‐Ｙ‐ＮＨ２からなる置換基の群から互いに独立して選択され、フェニル環のメタ‐、パラ‐位のいずれかにおける置換基であって、
このとき、
Ｘは、ｎ＝１‐３０の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ３を有するポリエチレングリコール残基あるいは炭水化物基であって、
Ｙは、ｎ＝１‐３０のペプチドまたはオリゴペプチドであって、
環Ｄは、次の構造を有する、
【化２】
0005868869.tif 000004
光力学的療法における使用のためのナノ粒子医薬製剤。
【請求項２】
前記光増感剤の治療上有効な濃度は、
ナノ粒子ｍｇあたり１０から３２０μｇで極めて可変である、
ことを特徴とする請求項１に記載の光力学的療法における使用のためのナノ粒子医薬製剤。
【請求項３】
前記光増感剤は、
テモポルフィン（ｍＴＨＰＣ）、２，３‐ジヒドロキシ‐５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐クロリン（ｍＴＨＰＤ‐ＯＨ）および５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐ポルフィリン（ｍＴＨＰＰ）からなる群から選択される、
ことを特徴とする請求項１または２に記載の光力学的療法における使用のためのナノ粒子医薬製剤。
【請求項４】
前記抗凍結剤は、
グルコース、トレハロース、スクロース、ソルビトール、マンニトールおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、
ことを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載の光力学的療法における使用のためのナノ粒子医薬製剤。
【請求項５】
前記製剤が、標的の細胞および組織への光増感剤の高度な移行のために薬剤標的リガンドのナノ粒子表面への付着を可能とする、
ことを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の光力学的療法における使用のためのナノ粒子医薬製剤。
【請求項６】
前記製剤が、静脈注射を含む非経口手段によって投与される、
ことを特徴とする請求項１ないし５のいずれか一項に記載の光力学的療法における使用のためのナノ粒子医薬製剤。
【請求項７】
ａ．有機溶媒にＰＬＧＡを溶解するステップと、
ｂ．ろ過器を通して前記ＰＬＧＡ溶液をろ過し、水溶液を安定化するステップと、
ｃ．粒子表面への吸着結合、封入結合およびこれらの組み合わせによって光増感剤を加えるステップと、
ｄ．ＰＶＡを含む安定化水溶液を加え、水中油型ナノエマルションを形成するステップと、
ｅ．得られたナノ粒子を精製するステップと、
を含む、
請求項１ないし６のいずれか一項に記載のナノ粒子医薬製剤の調製方法。
【請求項８】
前記有機溶媒は、
酢酸エチルである、
ことを特徴とする請求項７に記載の調製方法。
【請求項９】
光力学的療法における使用のための請求項１ないし６のいずれか一項に記載のナノ粒子医薬製剤。
【請求項１０】
腫瘍およびその他の腫瘍性疾患に対する光力学的療法における使用のための請求項１ないし６のいずれか一項に記載のナノ粒子医薬製剤。
【請求項１１】
皮膚疾患、眼科疾患または泌尿器疾患に対する光力学的療法における使用のための請求項１ないし６のいずれか一項に記載のナノ粒子医薬製剤。
【請求項１２】
関節炎および類似する炎症疾患に対する光力学的療法における使用のための請求項１ないし６のいずれか一項に記載のナノ粒子医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疎水性の光増感剤を含有するナノ粒子製剤の調製および光力学的療法、特に、静脈投与を用いる腫瘍の光力学的療法でのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
光力学的療法（ＰＤＴ）は、最も有望な新しい技術の１つであり、様々な医療用途で使用されるために現在検討されている、具体的には腫瘍を破壊するための処置としてよく認識されている。光力学的療法は、所望する医学的効果を達成するよう光および光増感剤（染料）を使用する。多数の天然の染料および合成された染料が、光力学的療法のための見込みのある光増感剤として評価されてきた。特に、最も広く研究されている光増感剤の種類は、大環状テトラピロール化合物である。これらの中でも特にポルフィリンおよびクロリンは、ＰＤＴにおける効果について調べられた。
【０００３】
ポルフィリンは、ピロールと結合している１つの炭素原子の架橋を有する大環状化合物であって、特徴的なテトラピロール環構造を形成する。ポルフィリン誘導体には、多くの異なる種類があり、ポルフィリン誘導体は、１つのジヒドロピロール基を有するクロリンおよび２つのジヒドロピロール基を有するバクテリオクロリンを含む。ＰＤＴに関して見込みのある当該ポルフィリン誘導体はどちらも天然物と全合成のいずれからでも得ることが可能である。
【０００４】
ポルフィリンと比較して、クロリンには、より有益な吸収スペクトルを有するという利点がある。すなわち、それらは、電磁スペクトルの赤外および近赤外領域において、より強い吸収を示す。ＰＤＴが腫瘍療法に適用される場合、長波長の光は深い組織の中へ入り込むので、例えばかなり広がった腫瘍の治療が可能となる。
【０００５】
しかし、様々な疾患の治療のためのＰＤＴの適用は、光増感剤（ＰＳ）の固有の特性によって限定される。これらには、高い費用、ホスト生体内での広範囲の残留、皮膚におけるかなりの光毒性、生理溶液での低い溶解度（これは、血管内投与での実用性を低下させ、血栓塞栓性障害を惹起する）、および標的に対する有効性の低下が含まれる。これらの不利な点、特にこれまでの当該技術分野におけるＰＳに関しては、かなり高濃度の光増感剤の投与につながることであり、これは非損傷組織における光増感剤の蓄積の可能性、およびこれに伴う照射による非損傷部位への影響の危険性を大いに増加させる。
【０００６】
費用の減少および付随する毒性の減少について努力されてきたが、これらは本発明の開発には関連しない。生理溶液における溶解度、皮膚における光毒性の影響、ホスト生体内での残留、および標的に対する狭い範囲の有効性についての研究が本発明の領域であって、本発明は、様々な新生組織形成、過形成および関連する疾患を治療するためのＰＤＴの使用における、新規かつ自明でない改良されたものを提供する。
【０００７】
腫瘍の光力学的療法において好適に使用される物質のほとんどは、脂溶性物質であり、これは適切な方法で形成されるうえで特有の低い水溶性が必要とされるためである。このため、テトラピロール系光増感剤の新規な製剤には、体内におけるこれらの取り込みとバイオアベイラビリティの向上が特に求められている。
【０００８】
ナノ粒子は脂溶性の医薬物質のためのキャリアとして集中的に研究されている。実際に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をベースにした抗癌剤パクリタキセルのナノ粒子製剤は、欧州および米国において規制当局によって近年認可された。
【０００９】
一般に、ナノ粒子は１０ｎｍから１０００ｎｍの範囲のサイズの固形のコロイド状の粒子である。それらは、活性成分が溶解され、取り込まれるかカプセル封入される、および／または活性本体が吸収され、付着する高分子物質から構成される。多くの異なる種類のナノ粒子、例えば、量子ドット、シリカ系ナノ粒子、光結晶、リポソーム、天然物や合成物に由来する種々のポリマーをベースにしたナノ粒子および金属系ナノ粒子が研究されている。
【００１０】
光増感剤と組み合わされたナノ粒子がイメージング手法を含む多くの適用に関して研究されており、例えば、バイオイメージングで用いるために近赤外染料を封入した生物分解性ポリマー物質を含有するナノ粒子がＳａｄｏｑｉらによって特許文献１に開示された。さらに、蛍光イメージングおよび磁気共鳴イメージングと組み合わせた他のナノ粒子、特に金属（イオン）系ナノ粒子との組み合わせが当技術分野で知られているが（非特許文献１ないし３参照）、これらの研究は本発明に関連しない。また、当技術分野で既知のリポソーム、量子ドット、無機物質（金属を含む）をベースにした他のナノ粒子は、本発明と競合しない。
【００１１】
光増感剤のキャリアシステムとして最も興味深いのは、生体適合性物質から構成されるナノ粒子である。当該キャリアシステムは、光力学的療法の治療レジメンを顕著に改良できた。既知の高い生体適合性を有するキャリアシステムは、例えば、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）である。ＰＬＧＡ物質のナノ粒子としての製剤化が成功している。
【００１２】
当技術分野で既知の光増感剤のためのキャリアとしてのＰＬＧＡ系ナノ粒子の例がいくつかある（非特許文献４乃至１３参照）。
【００１３】
しかし、上記既知の技術の一部は、他の種類の光増感剤に集中しており、例えば、特許文献２に開示された発明は、本発明に関連しない光増感剤である亜鉛（II）フタロシアニンおよびインドシアニングリーンを含む。
【００１４】
この他、例えばＡｌｌｅｍａｎｎらによる特許文献３および４には、光増感剤のキャリアとして用いられるＰＬＧＡ系ナノ粒子は、薬剤の速い放出、好ましくはナノ粒子が血清タンパク質を含む環境に取り込まれた後、約６０秒以内を意図しており、このため、標的の細胞や組織に薬剤を移行させるのにはあまり適切ではない。光増感剤は血清タンパク質を含む環境に取り込まれてから数秒で放出されるので、ＰＬＧＡ系ナノ粒子の標的に対する有効性が欠けている。さらに、小型化され、単分散する当技術分野で既知のＰＬＡ‐またはＰＬＧＡ‐系ナノ粒子の調製では、溶液において約５‐２０％の範囲という高い濃度のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）安定剤が使用される。
【００１５】
臨床業務における非経口投与のためのナノ粒子製剤の適用では、薬局方の仕様が保証されるように無菌の製剤が求められる。ＰＬＧＡを含有するナノ粒子光増感剤製剤の殺菌の問題は、ナノ粒子マトリックスの不安定性に加え、光増感剤の不安定性のために難しいことである。従来の無菌化の方法（オートクレーブ、エチレンオキシドの使用、ガンマ線照射）は、本発明に係る光増感剤製剤と両立しない（非特許文献１４および１５を参照）。このように化学的および熱的に反応性のある物質に対して、１つの選択肢は、決められたサイズの膜フィルターを通す無菌化ろ過である。無菌化ろ過のための細孔のサイズは、通常０．２２μｍであって、一方、本発明のナノ粒子は、１００から５００ｎｍの間の範囲のサイズである。このため、無菌化ろ過は、その欠点を有し、一般には本発明の対象であるナノ粒子と両立しない。
【００１６】
また、臨床の用途では、製剤が凍結乾燥でき、後から水媒体で再構成できる製剤が特に望ましい。特に、本発明に係るクロリンあるいはバクテリオクロリン類（すなわち、１個または２個のジヒドロピロール基を有するテトラピロール）である光増感剤の場合、無菌のナノ粒子製剤および凍結乾燥に適したナノ粒子製剤を開発するのが難しいのは、上記システムは、ナノ粒子の調製でよく用いられる操作条件で誘導される酸化及び光化学修飾に特に影響を受けやすいからである（非特許文献１６ないし１８参照）。１個または２個のジヒドロピロール基を有するクロリンあるいはバクテリオクロリン類のこれらの光増感剤は、それぞれポルフィリンに応じてそれらの化学的および物理的な挙動に大きな違いがある（非特許文献１９および２０参照）。第２のポイントとして、無菌化と凍結乾燥の課題は、これまでに複数のテトラピロール系光増感剤に関してのみ化学的に解決されてきたが、特にＡｌｌｅｍａｎｎらによって記載された緑色ポルフィリン、あるいはＫｏｎａｎらによって研究された光増感剤に関しては残されている。
【００１７】
当技術分野で既知の光増感剤のためのキャリアとして用いられるＰＬＧＡ系ナノ粒子は、無菌化および凍結乾燥といった上記課題はいずれも解決されておらず、あるいはそうだとしたら、上記の研究された光増感剤は、より安定な化学構造のために、この点ではほとんど問題にならない。
【００１８】
これは、ナノ粒子の中核を形成する光増感剤と、生物分解性ポリマー殻と、標的アプタマー（ＥｒｂＢ３受容体特異的なアプタマー）を含有する光増感剤ナノ粒子アプタマー複合体を開示する特許文献５の場合であるが、安定なナノ粒子光増感剤製剤を得るのに必要なナノ粒子光増感剤製剤の無菌化および凍結乾燥工程のどちらの課題も解決していない。
【００１９】
上記した欠点にも関わらず、本発明はＰＬＧＡ系ナノ粒子製剤と、非経口用途に適した光増感剤に関する調製方法とを提供し、クロリンおよびバクテリオクロリンのような反応性のある化合物の調製が可能となる。
【００２０】
当技術分野には上記課題が残されており、本発明はこれに対処し解決する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７／０１４８０７４号明細書
【特許文献２】国際公開第９７／０１０８１１号
【特許文献３】国際公開第０３／０９７０９６号
【特許文献４】米国特許第７４５５８５８号明細書
【特許文献５】国際公開第０６／１３３２７１号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Mulder et. al, Nanomed., 2007, 2, 307-324
【非特許文献２】Kim et.al, NanotechnoL, 2002, 13, 610-614
【非特許文献３】Primo et al, J. Magnetism Magn. Maten, 2007, 311, 354-357
【非特許文献４】Gomes et al., Photomed Laser Surg., 2007, 25, 428-435
【非特許文献５】Ricci-Junior et al., J. Mic vencapsuL, 2006, 23, 523-538
【非特許文献６】Ricci-Junior et al., Int, J. Pharm., 2006, 310, 187-195
【非特許文献７】Saxena et al., Int. J. Pharm., 2006, 308, 200-204
【非特許文献８】McCarthy et al., Abstracts of Papers, 229th ACS Meeting, 2005
【非特許文献９】Vargas et al., Int. J. Pharm., 2004, 286, 131-145
【非特許文献１０】Konan et al., Eur. J. Pharm. Sci., 2003, 18, 241-249
【非特許文献１１】Konan et al., Eur. J. Pharm. Biopharm., 2003, 55, 115-124
【非特許文献１２】Vargas et al., Eur. J. Pharm. Biopharm., 2008, 69, 43-53
【非特許文献１３】Pegaz et at., J. Photochem. Photobiol. B: Biology, 2005, 80, 19-27
【非特許文献１４】K. A. Athanasiou, et al., Biomaterials, 1996, 17, 93-102
【非特許文献１５】C. Volland, et al., J. Contr. Rel., 1994, 31,293-305
【非特許文献１６】Y. Hongying, et al., Dyes Pigm., 1999, 43, 109-117
【非特許文献１７】C. Hadjur, et al., J. Photochem. Photobiol. B: Biology, 1998, 45, 170-178
【非特許文献１８】R. Bonnett, et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans., 2, 1999, 325-328
【非特許文献１９】R. Bonnett, et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans., 2, 1999, 325-328
【非特許文献２０】R. Bonnett, et al., J. Porphyrins Phthatocyanines, 2001, 5, 652-661
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の目的は、光力学的療法のための疎水性の光増感剤に係る、生体適合性ＰＬＧＡ物質をベースにしたナノ粒子製剤を提供する。
【００２４】
本発明の他の目的は、疎水性のテトラピロール類の光増感剤、すなわちクロリンおよびバクテリオクロリンに係る乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）および安定化剤をベースにしたナノ粒子を提供し、好ましくは、該安定化剤は、ポリ（ビニルアルコール）、ポリソルベート、ポロキサマーおよびヒト血清アルブミン等で構成される群から選択される。
【００２５】
本発明のさらに他の目的は、粒子システムが薬剤の薬物動態を変更できるように、光増感剤の含有率を変化させる（ｍｇのナノ粒子あたり２から３２０μｇの光増感剤）ことを可能にする疎水性の光増感剤に係るナノ粒子製剤を提供する。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、細胞内への蓄積後の薬剤放出と組み合わされる標的の細胞および組織への効果的な薬剤移行を可能にする疎水性の光増感剤に係るナノ粒子製剤を提供する。
【００２７】
本発明のさらに他の目的は、平均粒子サイズが５００ｎｍ未満のＰＬＧＡ系の、光増感剤を含有する無菌のナノ粒子の製造方法を提供し、当該光増感剤は、クロリンおよびバクテリオクロリンである。本発明の当該ナノ粒子は、凍結乾燥および水媒体内での再構成を可能にするほどに十分安定である。
【００２８】
本発明のさらに他の目的は、これらに限定されないが、腫瘍、腫瘍性疾患、皮膚疾患、眼科疾患、泌尿器疾患、関節炎および類似する炎症疾患に対する光力学療法においてＰＬＧＡをベースにしたナノ粒子光増感剤製剤の使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
簡潔に述べると、本発明は保存において安定な組成物と、疎水性の光増感剤、乳酸・グリコール酸共重合体および安定化剤を含む、光力学的療法における臨床での使用のための薬剤系ナノ粒子製剤の製造方法とを提供する。これらのナノ粒子製剤は、非経口投与において光増感剤の治療上の有効量を提供する。特にテトラピロール誘導体は光増感剤として用いられ、その有効性と安全性とが上記ナノ粒子製剤によって高められる。また、無菌条件下でのＰＬＧＡ系ナノ粒子の調製方法が提供される。本発明に係る好ましい１つの実施の形態では、ＰＬＧＡ系ナノ粒子は、５００ｎｍ未満の平均粒子サイズを有し、光増感剤はテモポルフィン、５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐クロリン（ｍＴＨＰＣ）である。他の実施の形態では、光増感剤２，３‐ジヒドロキシ‐５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐クロリン（ｍＴＨＰＤ‐ＯＨ）が非経口投与のためのナノ粒子として製剤化される。さらに、他の実施の形態では、好ましい光増感剤は５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐ポルフィリン（ｍＴＨＰＰ）である。当該製剤は、過形成や腫瘍性疾患、炎症性疾患を治療するため、さらに具体的には、腫瘍細胞を標的とするために用いられる。
【００３０】
添付する図面とともに以下の説明を読むことで、上記および他の目的、本発明の特徴と利点が明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明で用いられるクロリンおよびバクテリオクロリンの好ましい構造を示す。
【図２】本発明におけるナノ粒子で製剤化される特に好ましいクロリンの構造を示す。
【図３】ＰＬＧＡに対する薬剤の比に応じて、ミリグラムＰＬＧＡに対してｍＴＨＰＰが２から３２０μｇの間である薬剤含有効率を示す分布曲線である。
【図４】Ａ及びＢは、光増感剤５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐ポルフィリン（ｍＴＨＰＰ）を含有するＰＬＧＡ系ナノ粒子の細胞取り込みと細胞内分布に関する共焦点レーザー走査顕微鏡画像である。
【図５】Ａ及びＢは、光増感剤５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐クロリン（ｍＴＨＰＣ）を含有するＰＬＧＡ系ナノ粒子の細胞取り込みと細胞内分布に関する共焦点レーザー走査顕微鏡画像である。
【図６】３μＭのｍＴＨＰＣ、および各インキュベーション時間後のＪｕｒｋａｔ細胞による異なる濃度のｍＴＨＰＣを含有するＰＬＧＡナノ粒子の光毒性の結果である。
【図７】３μＭのｍＴＨＰＣ、および各インキュベーション時間後のＪｕｒｋａｔ細胞による異なる濃度のｍＴＨＰＣを含有するＰＬＧＡナノ粒子の細胞内取り込みの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の記載されたナノ粒子システムの調製方法は、血清タンパク質が存在しても数時間を超えて薬剤を放出でき、かつ標的の細胞および組織への薬剤の移行に適したシステムを提供する。これは、ＰＬＧＡナノ粒子システムを使用する先行技術における粒子の速い分解や光増感剤の放出と対照的である。さらに、賦形剤が粒子調製において使用される場合の状態に依存して、高い可変性の薬剤放出の動力学が得られる。
【００３３】
上記で概説したように、無菌化および凍結乾燥のような課題が光増感剤のナノ粒子製剤の開発に極めて重大である。臨床用途に適した上記ＰＬＧＡ系ナノ粒子光増感剤製剤は、無菌製造工程で調製できることがわかった。このため、本発明は、無菌の、平均粒子サイズが５００ｎｍ未満のＰＬＧＡ系の光増感剤含有ナノ粒子を製造するための方法を提供し、該光増感剤は、クロリンかバクテリオクロリンである。さらに、本発明のナノ粒子医薬製剤は、凍結乾燥および水媒体における再構成を可能にするほど安定である。このため、本発明は、臨床業務での非経口投与における必要性を満たす、光力学的療法のための疎水性の光増感剤に適切なナノ粒子製剤の問題を解決する。
【００３４】
ＰＤＴにおけるＰＬＧＡをベースにしたナノ粒子光増感剤製剤の治療上の使用は、これらに限定されないが、皮膚疾患、眼科疾患、泌尿器疾患、関節炎および類似する炎症疾患を含む。より好ましくは、ＰＤＴにおけるＰＬＧＡをベースにしたナノ粒子光増感剤製剤の治療上の使用は、腫瘍組織、新生組織形成、過形成および関連疾患の治療を含む。
【００３５】
非経口投与のための、クロリンおよびバクテリオクロリンに関するＰＬＧＡ系ナノ粒子製剤に係る記載されたナノ粒子システムは、安定剤を減らして調製できる（すなわち１．０％ＰＶＡ）。当該システムは、血清タンパク質が存在しても数時間を超えて薬剤を放出することができ、このため、薬剤を標的の細胞および組織に移行させるのに好適である。延長された薬剤の放出は、薬剤標的リガンドの粒子表面（例えば抗体）への付着を可能にし、標的の細胞および組織への光増感剤の高度な移行を可能とする。
【００３６】
本発明は、粒子の調製において、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）のような賦形剤が用いられた状況での驚くべき発見に、一部、基づく。それは、１）光増感剤が粒子マトリックスに封入されることで付着し、２）粒子マトリックスに吸着することで付着し、３）あるいは粒子マトリックスに封入され、および吸着した結果、薬剤放出の動力学に高い可変性がもたらされたことである。
【００３７】
本発明に係る特に好ましい実施の形態では、ＰＬＧＡ系ナノ粒子は、５００ｎｍ未満の平均粒子サイズであって、光増感剤はテモポルフィン、５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐クロリン（ｍＴＨＰＣ）である。
【００３８】
本発明に係る他の実施の形態では、ＰＬＧＡ系ナノ粒子は、５００ｎｍ未満の平均粒径であって、光増感剤は２，３‐ジヒドロキシ‐５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐クロリン（ｍＴＨＰＤ‐ＯＨ）である。
【００３９】
さらに他の実施の形態では、ＰＬＧＡ系ナノ粒子は、５００ｎｍ未満の平均粒径であって、光増感剤は５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐ポルフィリン（ｍＴＨＰＰ）である。
【００４０】
本発明は、好ましくはクロリンおよびバクテリオクロリン類の光増感剤を用いた光増感剤含有ナノ粒子の製剤の調製方法を提供する。以下で開示される方法によって調製されたナノ粒子は、予測可能なサイズと均一性（サイズのぱらつきにおいて）を有する。ナノ粒子は、無菌製造工程で調製される。好ましくはＰＬＧＡ系ナノ粒子は、直径５００ｎｍ未満の平均サイズを有する。用語「直径」は、ナノ粒子が必ず球形状であることを意味するのではない。当該用語は、ナノ粒子のだいたいの平均幅を意味する。
【００４１】
本発明の好ましい実施の形態では、ＰＬＧＡ系ナノ粒子は、光増感剤の含有量が幅広い濃度範囲（ｍｇのナノ粒子に対して２から３２０μｇ）で変更できるように調製される。
【００４２】
本発明の特に好ましい実施の形態では、ＰＬＧＡ系ナノ粒子は、光増感剤が粒子マトリックスに封入されることで付着し、粒子マトリックスに吸着することで付着し、あるいは粒子マトリックスに封入され、および吸着した結果、薬剤放出の動力学に高い可変性がもたらされるように調製される。
【００４３】
当該ナノ粒子システムにおける薬剤の標的に対する有効性がＰＬＧＡナノ粒子に結合した１個または複数個のリガンドで向上し、当該ナノ粒子システムは光増感剤分子に結合せずに光増感剤化学物質を保持する。
【００４４】
本発明のナノ粒子は、保存上の安定性を改良するために脱水されてもよい。脱水の好ましい方法は、凍結乾燥か凍結真空乾燥である。凍結乾燥の間および水媒体での再構成の間の安定性を改良するために、添加剤として凍結乾燥保護剤が任意に用いられてもよい。
【００４５】
他の実施の形態では、本発明は、光力学的療法におけるＰＬＧＡをベースにしたナノ粒子光増感剤製剤の使用方法を提供し、その使用方法は、ナノ粒子の投与と、標的組織における蓄積と、特有の波長の光による光増感剤の活性化とを含む。投与は、好ましくは非経口手段、例えば、これに限定されないが静脈注射による。
【００４６】
光増感剤を含有するナノ粒子調製のために使用される材料
ポリマー
本発明で用いられるポリマーの限定しない例は、乳酸・グリコール酸共重合体ＰＬＧＡであって、好ましくは５０：５０または７５：２５の共重合体比であることを特徴とする。本発明の基本的な調製に用いられるＰＬＧＡは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社から取得された（Ｒｅｓｏｍｅｒ  ＲＧ５０２ＨおよびＲｅｓｏｍｅｒ  ＲＧ５０４Ｈ）。
【００４７】
光増感剤
本発明で用いられる光増感剤は、好ましくは、これらに限定されないがクロリンおよびバクテリオクロリン類のテトラピロールである。当該光増感剤は、天然物由来でも全合成によるものであってもよい。クロリンおよびバクテリオクロリンの全合成は、はじめにポルフィリンの合成、続いてそれをクロリンおよびバクテリオクロリン系に変換することによって行われる（例えば、R. Bonnet-t, R. D. White, U.-J. Winfield, M. C. Berenbaum, Hydroporphyrins of the meso-tetra(hydroxyphenyl)porphyrin series as tumor photosensitizers, Bioehem. J. 1989, 261,277-280）。
【００４８】
本発明で用いられるクロリンおよびバクテリオクロリンは、好ましくは図１の構造を有する。
【００４９】
本発明におけるナノ粒子で製剤化されるのに特に好ましいクロリンは、図２の構造を有する。
【００５０】
本発明に係るＰＬＧＡ系ナノ粒子は、Ｕｌｔｒａ‐Ｔｕｒｒａｘ拡散装置を用いた乳化‐拡散‐蒸発工程によって調製される。粒子マトリックスへの光増感剤の吸着結合、粒子マトリックスへの封入結合および粒子マトリックスへの吸着および封入結合の組み合わせが形成される。薬物含有ナノ粒子は、グルコース、トレハロース、スクロース、ソルビトールおよびマンニトール等を含む抗凍結剤の存在下で凍結乾燥される。
【００５１】
本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、これらに限定されない。
【００５２】
実施例１ａ：
光増感剤５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐ポルフィリン（ｍＴＨＰＰ）を含有するＰＬＧＡ系ナノ粒子の調製と特徴付け；粒子マトリックスへの吸着および封入結合の組み合わせ
【００５３】
本発明に係るＰＬＧＡ系ナノ粒子がＵｌｔｒａ‐Ｔｕｒｒａｘ拡散装置（Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５デジタル、ＩＫＡ、シュタウフェン、ドイツ）を用いた乳化‐拡散‐蒸発工程によって調製された。
【００５４】
５００ｍｇのＰＬＧＡ（Ｒｅｓｏｍｅｒ  ＲＧ５０２Ｈまたは５０４Ｈ）が５ｍＬの酢酸エチル（Ｆｌｕｋａ社、シュタインハイム、ドイツ）に溶解された。この溶液に異なる量のｍＴＨＰＰが添加された。１から２００ｍｇの範囲の量が評価された。一般に、５０ｍｇのｍＴＨＰＰが用いられた。
【００５５】
この有機溶液が安定化された１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液１０ｍＬに添加された。Ｕｌｔｒａ‐Ｔｕｒｒａｘ拡散装置（１７，０００ｒｐｍ、５分）で水中油型ナノエマルションが形成された。この調製工程の後、外部水相に有機溶媒が完全に拡散した後のナノ粒子の形成を誘導するために、エマルションが４０ｍＬのＰＶＡ安定化水溶液に添加された。継続される機械的な撹拌（５５０ｒｐｍ）が１８時間維持され、酢酸エチルが完全に蒸発できた。
【００５６】
粒子は５回の遠心分離（１６，１００Ｇ；８分）で精製され、超音波浴（５分）で１．０ｍＬの水に再拡散された。
【００５７】
粒子調製に用いられる全ての水溶液は、殺菌され、細孔サイズが０．２２μｍの膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ社、ダッセル、ドイツ）を通して事前にろ過された。用いられた全ての器具が２０分間以上、１２１℃でオートクレーブされた。粒子調製の全ての操作工程が層流キャビネット内で行われた。
【００５８】
粒子の平均サイズと多分散性がＺｅｔａｓｉｚｅｒ  ３００ＨＳＡ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、マルバーン、英国）を用いた光子相関分光法によって測定された。ナノ粒子の量は、微小重力で決定された。
【００５９】
直接的な定量方法：ＰＬＧＡナノ粒子がアセトンに溶解され、光増感剤の含有量を決定するために該溶液が光度的にｍＴＨＰＰに関して５１２ｎｍで測定された。ＰＬＧＡに対する薬剤の比に応じて、ミリグラムＰＬＧＡに対してｍＴＨＰＰが２から３２０μｇの間である薬剤含有効率が得られた（図３）。
【００６０】
次のプロトコールに従って、ナノ粒子の凍結乾燥が実行される。
凍結乾燥工程において、トレハロースが３％（ｍ／Ｖ）の濃度でナノ粒子試料に添加された。試料は、凍結乾燥機に移され、装置内温度が１℃／分の速度で５℃から−４０℃に下げられた。圧力は、０．０８ｍｂａｒに設定された。これらのパラメータは、６時間維持された。０．５℃／分で−４０℃から−２５℃まで温度が上昇することによって、一次乾燥が終了した。圧力は変化させずに維持された。一次乾燥の熱傾斜の終了時点で、圧力上昇試験（ＰＲＴ）が実行された。一次乾燥の終了に続いて、０．２℃／分で２５℃まで温度を上昇させることで二次乾燥が行われた。この温度は、圧力６０ｍＴ（＝０．０８ｍｂａｒ）で６時間維持された。
【００６１】
実施例１ｂ
光増感剤５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐クロリン、ｍＴＨＰＣを含有するＰＬＧＡ系ナノ粒子の調製と特徴付け；粒子マトリックスへの吸着および封入結合の組み合わせ
【００６２】
ｍＴＨＰＰの代わりにｍＴＨＰＣを用いたことを除いてナノ粒子が実施例１ａに従って調製された。ｍＴＨＰＣが５１７ｎｍで光度的に定量された。ＰＬＧＡに対する薬剤の比に応じて、ミリグラムＰＬＧＡに対してｍＴＨＰＣが２から３２０μｇの間である薬剤含有効率得られた。
【００６３】
ｍＴＨＰＣを含有するナノ粒子が実施例１ａに記載されたように特徴付けされた。
【００６４】
実施例１ｃ
光増感剤５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐ポルフィリン（ｍＴＨＰＰ）を含有するＰＬＧＡ系ナノ粒子の調製と特徴付け；粒子マトリックスへの吸着のみによる結合
【００６５】
上記の標準的な方法（実施例１ａ）が空のＰＬＧＡナノ粒子を調製するために用いられた。光増感剤ｍＴＨＰＰの添加を除いて調製工程が実施例１ａに記載されたように行われた。
【００６６】
次のステップで、ＰＶＡで安定化されたｍＴＨＰＰ溶液が調製された。このため、２５ｍｇのｍＴＨＰＰが５ｍＬの酢酸エチルに溶解され、その後１％ＰＶＡ水溶液１０ｍＬが添加された。Ｕｌｔｒａ‐Ｔｕｒｒａｘ拡散装置で、エマルションが調製された。当該エマルションは、４０ｍＬのＰＶＡ溶液（１％）に添加された。継続される機械的な撹拌（５５０ｒｐｍ）が１８時間維持され、酢酸エチルが完全に蒸発できた。
【００６７】
１０ｍｇのナノ粒子に相当する体積のＰＬＧＡナノ粒子懸濁液が遠心分離され（１６，１００Ｇ、８分）、上清が除去された。超音波浴（５分）を用いて、ナノ粒子がＰＶＡで安定化されたｍＴＨＰＰ溶液に再拡散された。
【００６８】
粒子表面へのｍＴＨＰＰの吸着平衡を得るために、混合物が１８時間撹拌（５００ｒｐｍ、２０℃）された（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  ｃｏｍｆｏｒｔ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社、ハンブルグ、ドイツ）。当該ナノ粒子は、上記のように精製された。
【００６９】
ＰＬＧＡに対する薬剤の比に応じて、ミリグラムＰＬＧＡに対してｍＴＨＰＰが２から８０μｇの間である薬剤含有効率（具体的には標準プロトコールで２０μｇ）が得られた。
【００７０】
ｍＴＨＰＰ含有（吸着）ナノ粒子は、実施例１ａに記載されたように特徴付けされ、凍結乾燥された。
【００７１】
実施例１ｄ
光増感剤５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐クロリン、ｍＴＨＰＣを含有するＰＬＧＡ系ナノ粒子の調製と特徴付け；粒子マトリックスへの吸着のみによる結合
【００７２】
ナノ粒子は、ｍＴＨＰＰの代わりにｍＴＨＰＣを用いたことを除いて実施例１ｃに従って調製された。ｍＴＨＰＣは５１７ｎｍで光度的に定量された。
【００７３】
ＰＬＧＡに対する薬剤の比に応じて、ミリグラムＰＬＧＡに対してｍＴＨＰＣが２から８０μｇの間である薬剤含有率（具体的には標準プロトコールで２０μｇ）が得られた。
【００７４】
ｍＴＨＰＣ含有（吸着）ナノ粒子は、実施例１ａに記載されたように特徴付けされ、凍結乾燥された。
【００７５】
実施例１ｅ
光増感剤５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐ポルフィリン（ｍＴＨＰＰ）を含有するＰＬＧＡ系ナノ粒子の調製と特徴付け；粒子マトリックスへの封入のみによる結合
【００７６】
ＰＬＧＡナノ粒子は、実施例１ａに従って調製された。得られたナノ粒子は、ナノ粒子表面から吸着的に結合したｍＴＨＰＰを置換するために、精製水の代わりに５％（ｍ／Ｖ）ＰＶＡ水溶液で洗浄された。ＰＶＡ溶液での洗浄を３回繰り返した後、ナノ粒子は遠心分離および精製水での再拡散を繰り返すことでさらに精製された。
【００７７】
ＰＬＧＡに対する薬剤の比に応じて、ミリグラムＰＬＧＡに対してｍＴＨＰＰが１５から８０μｇの間である薬剤含有効率（具体的には標準プロトコールで５０μｇ）が得られた。
【００７８】
ｍＴＨＰＰ含有（封入）ナノ粒子は、実施例１ａに記載されたように特徴付けされ、凍結乾燥された。
【００７９】
実施例１ｆ
光増感剤５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐クロリン（ｍＴＨＰＣ）を含有するＰＬＧＡ系ナノ粒子の調製と特徴付け；粒子マトリックスへの封入のみによる結合
【００８０】
ナノ粒子は、ｍＴＨＰＰの代わりにｍＴＨＰＣを用いたことを除いて実施例１ｅに従って調製された。ｍＴＨＰＣは５１７ｎｍで光度的に定量された。
【００８１】
ＰＬＧＡに対する薬剤の比に応じて、ミリグラムＰＬＧＡに対してｍＴＨＰＣが１５から８０μｇの間である薬剤含有効率（具体的には標準プロトコールで５０μｇ）が得られた。
【００８２】
ｍＴＨＰＣ含有（封入）ナノ粒子は、実施例１ａに記載されたように特徴付けされ、凍結乾燥された。
【００８３】
実施例２ａ
光増感剤５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐ポルフィリン（ｍＴＨＰＰ）を含有するＰＬＧＡ系ナノ粒子の細胞取り込みおよび細胞粘着
【００８４】
ＰＬＧＡ系ナノ粒子の細胞内取り込みと粘着、および細胞内分布を解析するために、共焦点レーザー走査顕微鏡法が用いられた。ＨＴ２９細胞がガラススライド（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｅｓ  ＧｍｂＨ社、ハイデンベルグ）上で培養され、３７℃で４時間、ナノ粒子製剤とインキュベーションされた。続いて、細胞がＰＢＳで２回洗浄され、コンカナバリンＡ  ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ３５０（５０μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カルルスルーエ）によって膜が２分間染色された。細胞は、０．４％パラホルムアルデヒドで６分間固定された。固定後、細胞は２回洗浄され、次にＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ＨａｒｄＳｅｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ培地（Ａｘｘｏｒａ社、グルンベルグ）に組み込まれた。顕微鏡解析は、５１０  ＮＬＯ  Ｍｅｔａ装置（Ｚｅｉｓｓ社、イェナ）、カメレオンフェムト秒あるいはアルゴンイオンレーザーおよびＬＳＭ  Ｉｍａｇｅ  Ｅｘａｍｉｎｅｒソフトウェアを備えるＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡で行われた。封入されたＬｕｍｏｇｅｎ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）（ＢＡＳＦ社；ルートヴィヒスハーフェン）由来のＰＬＧＡ系ナノ粒子の緑色蛍光と光増感剤５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐ポルフィリン（ｍＴＨＰＰ）の赤色自己蛍光が分布の決定に利用された。
【００８５】
図４ＡおよびＢは、共焦点レーザー走査顕微鏡法によって調べられた光増感剤５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐ポルフィリン（ｍＴＨＰＰ）を含有するＰＬＧＡ系ナノ粒子の細胞取り込み／細胞粘着および細胞内分布を示す。ＨＴ２９細胞は、ガラススライド上で培養され、ナノ粒子と３７℃で４時間インキュベートされた。光増感剤ｍＴＨＰＰの赤色自己蛍光が用いられた。ナノ粒子は、封入されたＬｕｍｏｇｅｎ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）（緑色）を含む。
【００８６】
図４Ａは、緑色ナノ粒子のチャネルを示し、図４Ｂは、赤色光増感剤のチャネルを示す。スケールバーは２０μｍである。
【００８７】
実施例２ｂ
光増感剤５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐クロリン（ｍＴＨＰＣ）を含有するＰＬＧＡ系ナノ粒子の細胞取り込みおよび細胞粘着
図５ＡおよびＢは、共焦点レーザー走査顕微鏡法によって調べられた光増感剤５，１０，１５，２０‐テトラキス（３‐ヒドロキシフェニル）‐クロリン（ｍＴＨＰＣ）を含有するＰＬＧＡ系ナノ粒子の細胞取り込み／細胞粘着および細胞内分布を示す。ＨＴ２９細胞は、ガラススライド上で培養され、ナノ粒子と３７℃で４時間インキュベートされた。光増感剤ｍＴＨＰＣの赤色自己蛍光が用いられた。ナノ粒子は、封入されたＬｕｍｏｇｅｎ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）（緑色）を含む。
【００８８】
図５Ａは、緑色ナノ粒子のチャネルを示し、図５Ｂは、赤色光増感剤のチャネルを示す。スケールバーは２０μｍである。
【００８９】
実施例３
ｍＴＨＰＣ光増感剤を含有するＰＬＧＡナノ粒子の細胞取り込みおよび光力学活性
表１に挙げた試料がｍＴＨＰＣ‐ＰＬＧＡ‐ナノ粒子の細胞取り込みおよび光毒性に関して調べられた。
【表１】
0005868869.tif 000002
【００９０】
全ての細胞試料は、培地（ＲＰＭＩ１６４０）において染料濃度３μＭのｍＴＨＰＣで、Ｊｕｒｋａｔ細胞懸濁液に対して１時間、３時間、５時間、２４時間インキュベートされた。
【００９１】
異なるインキュベーション時間後のＪｕｒｋａｔ細胞に対する各ｍＴＨＰＣを含有するＰＬＧＡナノ粒子の光毒性がトリパンブルー試験と細胞形状のアポトーシス変化で評価された。実験は、６６０ｎｍのＬＥＤ光源で暴露時間１２０秒、２９０ｍＪ／ｃｍ２の光量で実行された。
【００９２】
図６は、各インキュベーション時間後のＪｕｒｋａｔ細胞に対する３μＭのｍＴＨＰＣの光毒性、および各ｍＴＨＰＣ含有ＰＬＧＡナノ粒子の光毒性の結果を示す。左がアポトーシスの割合で、右がネクローシスの割合である（対照の細胞は光増感剤なしでインキュベートされ、照射された）。光源はＬＥＤで、λｅｘｃ＝６６０ｎｍである。暴露時間は１２０秒である。光量は２９０ｍＪ／ｃｍ２である。この実験は、２回繰り返され、各測定で細胞数は、光暴露後２時間で平均を得るために３回計数された。エラーバーは、６回の測定（ｎ＝６）の標準偏差を示す。
【００９３】
各ｍＴＨＰＣを含有するＰＬＧＡナノ粒子の細胞取り込みを定量する実験が行われた。
【００９４】
図７は、各インキュベーション時間後のＪｕｒｋａｔ細胞による３μＭのｍＴＨＰＣ、および各ｍＴＨＰＣを含有するＰＬＧＡナノ粒子の細胞内取り込みの結果を示す。この実験は、２回繰り返され、各測定で細胞数は、平均を得るために３回計数された。エラーバーは、６回の測定（ｎ＝６）の標準偏差を示す。
【００９５】
インキュベーション後、細胞は血球計を用いて計数され、洗浄され（ＰＢＳ、４００×ｇ、３分、２回）、細胞沈殿物が細胞膜を破壊するために−２０℃で一晩、凍結保存された。
【００９６】
超音波を用いて、これらの細胞からｍＴＨＰＣがエタノールに抽出された。
【００９７】
エタノール抽出におけるｍＴＨＰＣの濃度は、標準的な蛍光系を用いて蛍光強度を介して決定された。細胞内濃度の計算のために、細胞の直径が１０μｍであると想定された（３回測定）。
【００９８】
３つ全てのＰＬＧＡナノ粒子が細胞内にｍＴＨＰＣを移行させる。移行は速い様式で起こり、それはｍＴＨＰＣがナノ粒子に封入されるときである。
【００９９】
インキュベーションの５時間後、全てのナノ粒子が高い光毒性を起こす。
【０１００】
本発明に係る好ましい実施の形態が添付された図面を参照することで説明され、本発明は上記実施の形態のみに限定されず、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲から逸脱することなく、当業者が改変および改良できることが理解される。
【０１０１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００９年１２月１１日にＫｌａｕｓ  Ｌａｎｇｅｒらによって出願された「光力学的療法のための乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）をベースにしたナノ粒子キャリアシステム」というタイトルの米国仮出願番号第６１／２８５，８９５号の利益と優先権とを主張し、本願で参照することにより組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
0005868869.tif 000009
【図５Ａ】
0005868869.tif 000010
【図５Ｂ】
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【図６】
0005868869.tif 000012
【図７】
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