(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者を、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）を有するまたはその素因があると分類する方法であって、
前記被験者からの血球を含んだ試料に由来するＬＮＫ遺伝子の配列を決定することであって、前記血球がＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ変異を持っていないこと；および
決定されたＬＮＫ配列が、Ｅ２０８Ｑおよび６０３＿６０７ｄｅｌＧＣＧＣＴ；６１３Ｃ＞Ｇから選択される少なくとも１つの変異を有する場合、前記被験者を、骨髄増殖性新生物を有するまたはその素因があると分類すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの変異が、野生型ＬＮＫと比較して細胞におけるサイトカインシグナル伝達の増大を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が血液試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被験者を分類することが、決定されたＬＮＫ配列を１またはそれ以上の参照ＬＮＫ配列と比較することを含み、前記１またはそれ以上の参照ＬＮＫ配列が、
骨髄増殖性新生物の素因があることが既知の被験者からのＬＮＫ配列；および
骨髄増殖性新生物の素因がないことが既知の被験者からのＬＮＫ配列
の一方または両方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記配列決定工程が、ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション、塩基配列解析および抗体結合アッセイの１またはそれ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
被験者において血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を治療するための候補治療薬を同定する方法であって、
プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインおよび／またはＳｒｃ相同２（ＳＨ２）ドメイン内に変異を含む、および／または、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインおよび／またはＳＨ２ドメインの全部または一部の欠失を生ずる変異を含む、変異ＬＮＫタンパク質であって、野生型ＬＮＫと比較してサイトカインシグナル伝達の増大を細胞に付与する、変異ＬＮＫタンパク質を持つ被験者から採取した細胞を薬剤と接触させること；および
前記薬剤が対照と比較して前記細胞におけるサイトカインシグナル伝達を低減する場合、前記薬剤を被験者において血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を治療するための候補治療薬として同定すること
を含む方法。
【請求項７】
前記変異がＥ２０８Ｑおよび６０３＿６０７ｄｅｌＧＣＧＣＴ；６１３Ｃ＞Ｇから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記変異体が血液リンパ系新生物または悪性腫瘍に関連する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記血液リンパ系新生物または悪性腫瘍がＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ陰性骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記接触工程が、細胞をサイトカインと接触させることをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記サイトカインがＴＰＯである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、米国立衛生研究所によって与えられた契約ＮＩＨ  Ｕ１９  ＡＩ０５７２２９、ＮＩＨ  ０１５８  Ｇ  ＫＢ０６５およびＮＩＨ  ２Ｐ０１  ＣＡ０３４２３３−２２Ａ１の下での政府援助を得て為された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【発明の概要】
【０００２】
本発明の態様は、ＬＮＫ遺伝子の配列を決定することにより、被験者を血液リンパ系新生物もしくは悪性腫瘍に関してスクリーニングする、または血液リンパ系新生物もしくは悪性腫瘍に罹患する素因もしくはより高い感受性を有するとして被験者をスクリーニングするための方法、組成物およびキットを含み、野生型配列と比較して配列変異が存在することは、被験者が血液リンパ系新生物もしくは悪性腫瘍を有する、または血液リンパ系新生物もしくは悪性腫瘍を発症する素因もしくはより高い感受性を有することを示す。本発明の態様はまた、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を治療するための候補薬剤を、ＬＮＫ変異体を含む細胞と接触させ、候補薬剤であるかどうかを決定することにより、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を治療するための候補薬剤をスクリーニングすることを含む。また、本発明の方法を実施する際に使用し得る組成物、システム、キットおよびコンピュータプログラム製品も提供される。本発明の方法および組成物は様々な適用において使用し得る。
【０００３】
本発明の態様は、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を特徴づけ、分類すること、ならびに存在するＬＮＫ変異のタイプに応じて治療法を決定する方法をさらに含む。
本発明の態様は、薬のスクリーニングと開発、遺伝子治療、および変異ＬＮＫ遺伝子の作用または変異ＬＮＫ遺伝子から生じる作用を予防するまたは改善する他の用途のための、変異ＬＮＫ遺伝子および変異タンパク質の発現をさらに含む。
【０００４】
定義
便宜上、本明細書、実施例および付属の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集める。
本明細書で使用される「ストリンジェントなアッセイ条件」という用語は、アッセイにおいて所望レベルの特異性を提供するのに十分な相補性を有する核酸、例えば表面結合核酸および溶液相核酸の結合対を生じさせるのに適合するが、所望の特異性を提供するのに十分な相補性を有さない結合成員の間での結合対の形成にはより適合性でない条件を指す。ストリンジェントなアッセイ条件は、ハイブリダイゼーションと洗浄条件の両方の総和または組合せ（全体）である。
【０００５】
核酸ハイブリダイゼーションに関連する（例えばアレイ、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブリダイゼーションにおけるような）「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、種々の実験パラメータ下で異なる。本発明の範囲内の核酸を同定するために使用できるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む緩衝液中４２℃でのハイブリダイゼーション、または５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む緩衝液中６５℃でのハイブリダイゼーションを含むことができ、どちらも０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中６５℃での洗浄を伴う。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件はまた、４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌおよび１％ＳＤＳの緩衝液中３７℃でのハイブリダイゼーション、ならびに１×ＳＳＣ中４５℃での洗浄を含み得る。あるいは、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中６５℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６８℃での洗浄が使用できる。さらなるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６０℃もしくはそれ以上および３×ＳＳＣ（４５０ｍＭ塩化ナトリウム／４５ｍＭクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、または３０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％サルコシンナトリウム、５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５を含む溶液中４２℃でのインキュベーションを含む。当業者は、選択的であるが匹敵するハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が同様のストリンジェンシーの条件を提供するために利用できることを容易に認識する。
【０００６】
ある実施形態では、洗浄条件のストリンジェンシーは、核酸が表面結合核酸に特異的にハイブリダイズするかどうかを判定する条件を示す。核酸を同定するために使用される洗浄条件は、例えば、ｐＨ７で約０．０２モルの塩濃度および少なくとも約５０℃もしくは約５５℃〜約６０℃の温度；または７２℃、約０．１５Ｍ  ＮａＣｌの塩濃度で約１５分間；または約０．２×ＳＳＣの塩濃度、少なくとも約５０℃もしくは約５５℃〜約６０℃の温度で約１５〜約２０分間；またはハイブリダイゼーション複合体を、０．１％ＳＤＳを含む約２×ＳＳＣの塩濃度の溶液で室温にて１５分間２回洗浄し、次に０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣによって６８℃で１５分間２回洗浄するか；または等価の条件を含み得る。洗浄のためのストリンジェントな条件はまた、例えば４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳであり得る。
【０００７】
ストリンジェントなアッセイ条件の特定例は、１．５Ｍの総一価カチオン濃度を有する塩ベースのハイブリダイゼーション緩衝液中６５℃での回転ハイブリダイゼーション（例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２０００年９月５日出願の米国特許出願第０９／６５５，４８２号に記載されているように）と、それに続く室温での０．５×ＳＳＣおよび０．１×ＳＳＣの洗浄である。
ストリンジェントなアッセイ条件は、少なくとも上記の代表的条件と同程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件であり、その場合、上記の特定条件と比較して、所与のセットの条件下で所望特異性を提供するのに十分な相補性を欠く付加的な結合複合体が実質的に生成されない場合、前記所与のセットの条件は少なくともストリンジェントであるとみなされ、その場合、「実質的に超えない」とは、約５倍未満、典型的には約３倍未満であることを意味する。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当分野において公知であり、適宜に使用され得る。
【０００８】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」または「組換え遺伝子」という用語は、エクソンおよび（場合により）イントロン配列を含む、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指す。「イントロン」という用語は、タンパク質に翻訳されず、一般にはＤＮＡ分子中のエクソンの間に認められる、所与の遺伝子中に存在するＤＮＡ配列を指す。加えて、遺伝子は、場合によりその天然プロモータ（すなわち遺伝子のエクソンとイントロンが非組換え細胞、すなわち天然に生じる細胞中で作動可能に連結されているプロモータ）、および関連調節配列を含んでもよく、ＡＵＧ開始部位の上流に配列を有してもよくまたは有さなくてもよく、非翻訳リーダー配列、シグナル配列、下流非翻訳配列、転写開始および終結配列、ポリアデニル化シグナル、翻訳開始および終結配列、リボソーム結合部位等を含んでもよくまたは含まなくてもよい。
【０００９】
「タンパク質コード配列」または特別なポリペプチドもしくはペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、インビトロまたはインビボでポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、ウイルス、原核生物または真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルス、原核生物または真核生物ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列に対して３’側に位置し得る。
【００１０】
「参照」および「対照」という用語は、観察されたデータを比較し得る公知の値または公知の値のセットを指すために交換可能に使用される。本明細書で使用される場合、公知とは、その値が了解されているパラメータ、例えば遺伝子またはタンパク質の野生型配列であることを意味する。参照または対照値は、単一データ点からであり得るかまたは２以上の測定もしくはデータ点に基づいて計算される値（例えば野生型コンセンサス配列）であり得る。本発明の態様を実施する際には任意の好都合な参照または対照値を使用し得る。
【００１１】
「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ（二本鎖または一本鎖）、その類似体（例えばＰＮＡまたはＬＮＡ分子）およびそれらの誘導体を含む。本明細書で使用される「リボ核酸」および「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチドから成るポリマーを意味する。本明細書で使用される「デオキシリボ核酸」および「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボヌクレオチドから成るポリマーを意味する。「ｍＲＮＡ」という用語は、メッセンジャーＲＮＡを意味する。「オリゴヌクレオチド」は、一般に約１０〜１００ヌクレオチド長のヌクレオチド多量体を指すが、「ポリヌクレオチド」は、任意の数のヌクレオチドを有するヌクレオチド多量体を含む。
【００１２】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」等の用語は、アミノ酸のポリマー（アミノ酸配列）を指し、特定の長さの分子を意味しない。この用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等のような、ポリペプチドの任意の修飾（例えば翻訳後）を指すまたは含む。例えば、アミノ酸の１またはそれ以上の類似体を含むポリペプチド、置換された結合を有するポリペプチド、ならびに天然および非天然に生じる、当分野で公知の他の修飾が上記の定義に含まれる。
【００１３】
「評価する(assesing)」および「審査する(evaluating)」という用語は、任意の形態の測定を指すために交換可能に使用され、分析物（例えばその配列）の同一性を判定するおよび／またはそれが存在するか否かを判定することを含む。「判定する」、「測定する」、「評価する」および「検定する」という用語は交換可能に使用され、定量的測定と定性的測定の両方を含む。評価は相対的または絶対的であり得る。「の存在を評価する」は、試料中の分析物の量または同一性を判定すること、ならびにそれが存在するか否かを判定することを含む。
【００１４】
「プロフィール」および「シグナチャー」および「結果」および「データ」等の用語は、ペプチドレベルまたは遺伝子発現レベルのデータを表すために使用される場合、交換可能に使用される（例えばペプチドシグナチャー／プロフィール／結果／データ、遺伝子発現シグナチャー／プロフィール／結果／データ等）。
【００１５】
本明細書で使用される「変異」は、非機能性タンパク質または実質的に低いもしくは変化した機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を生じさせる変化した遺伝子配列を指す。一般に、有害な変異は病変または病変の潜在的可能性に結びつく。
【００１６】
ＬＮＫ遺伝子／タンパク質は、ＮＣＢＩウエブサイト上に以下の要約情報を有する：遺伝子ＩＤ：１００１９；公式記号：ＳＨ２Ｂ３；公式名称：ＳＨ２Ｂアダプタータンパク質３；主要ソース：ＨＧＮＣ：２９６０５；関連するＥｎｓｅｍｂｌ参照：ＥＮＳＧ０００００１１１２５２、ＨＰＲＤ：０５４８０、ＭＩＭ：６０５０９３；遺伝子型：タンパク質をコードする；参照配列の状態：有効；生物：ヒト；別称：ＬＮＫ；ＳＨ２Ｂ３。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＬＮＫの構造および変異の位置。パネルＡは、Ｎ末端のプロリンリッチ・二量体化ドメイン（Ｐｒｏ／ＤＤ）、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン、ＳＨ２ドメインおよびＣ末端の保存されたチロシン残基（Ｙ）を含む、ＬＮＫの構造を示す。パネルＢでは、野生型（ＷＴ；配列番号：１８）および変異型のＬＮＫのＤＮＡ配列を示す。変異を緑色の斜線で示す。ＤＥＬ（配列番号：１９）は、フレームシフトと中途終止コドン（赤色の箱）を導く５ｂｐの欠失およびミスセンス変異（６０３＿６０７ｄｅｌＧＣＧＣＴ；６１３Ｃ＞Ｇ）である。６２２Ｇ＞Ｃ（配列番号：２０）は、ＰＨドメイン内の点変異である。ＷＴのタンパク質配列（配列番号：２１）および変異型のＬＮＫのタンパク質配列をパネルＣに示す。アミノ酸変化を赤色の斜線で示す。ＤＥＬ変異は、コドン２０２におけるフレームシフト、次で６３個のナンセンスアミノ酸および中途終止コドンを導く（配列番号：２２）。これは、ＰＨおよびＳＨ２ドメインの欠如をもたらす。６２２Ｇ＞Ｃ変異は、ＰＨドメイン内のグルタミン酸のグルタミン置換（Ｅ２０８Ｑ）を導く（配列番号：２３）。パネルＤでは、ＷＴおよび変異型のＬＮＫを図式的に示す。Ｅ２０８Ｑ変異の位置を星印で表す。配列決定クロマトグラムをパネルＥに示しており、ＬＮＫ変異は血液中に存在する（ＤＥＬは配列番号：２４であり；Ｅ２０８Ｑは配列番号：２６である）が、生殖系組織、この場合は皮膚線維芽細胞には存在しない（ＤＥＬに対応する野生型配列は配列番号：２５であり；Ｅ２０８Ｑに対応する野生型配列は配列番号：２７である）ことを明らかにし、変異が体細胞性であることを示す。
【図２】ＬＮＫ変異はＴＰＯ依存性増殖およびＪＡＫ２−ＳＴＡＴ３／５活性化の調節不全を引き起こす。ＢａＦ３−ＭＰＬ細胞を、空のベクター（ＥＶ）、ＷＴ  ＬＮＫ（ＷＴ）または変異ＬＮＫ（ＤＥＬ、Ｅ２０８Ｑ、Ｒ３９２Ｅ）で形質導入した。パネルＡは、０〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲のＴＰＯの濃度での４日間にわたるＢａＦ３−ＭＰＬの増殖を示す。生細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色することによって毎日計数し、ＬＳＲＩＩフローサイトメータでＴｒｕＣｏｕｎｔビーズを用いて定量した。誤差バーは、各試料につき２回の反復の標準偏差を表す。パネルＢでは、ＢａＦ３−ＭＰＬ細胞を、示されている期間ＴＰＯ（１ｎｇ／ｍＬ）で刺激し、次いでリン酸特異的フローサイトメトリによってＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５の活性化を測定した。リン酸化型のＪＡＫ２（ｐＪＡＫ２）、ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）およびＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）についてのヒストグラムを提示しており、内部の色は、各々の細胞株についての刺激していない細胞（ｕｎｓｔｉｍ）と比較した平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍数変化を表す。赤線は、比較のためのＥＶ非刺激細胞のＭＦＩを表す。パネルＣでは、ＢａＦ３−ＭＰＬ細胞を、ＤＭＳＯ対照または０．２μＭ〜５μＭの範囲の濃度のＪＡＫ阻害剤Ｉの存在下で培養した。４日目の累積増殖（各細胞株についての最大増殖に基準化した）を示す。誤差バーは、各試料につき２回の反復の標準偏差を表す。
【図３】ＬＮＫ変異を有する患者からのＣＤ３４＋早期前駆細胞におけるサイトカイン応答性ｐＳＴＡＴ３＋／ｐＳＴＡＴ５＋集団の同定。ＬＮＫ  ＤＥＬおよびＥ２０８Ｑ変異を有する患者、ならびにＪＡＫ２  Ｖ６１７ＦおよびＭＰＬ  Ｗ５１５Ｌ変異を有するＰＭＦ患者からの末梢血試料を健常ドナーと比較した。ＣＤ３−／ＣＤ６６−／ＣＤ３３ｍｉｄ未熟骨髄性細胞をパネルＡ〜Ｃに示す。パネルＡでは、試料をＤＭＳＯまたはＪＡＫ阻害剤Ｉ（５μＭ）のいずれかと共に３０分間プレインキュベートし、次にＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍＬ）またはＧ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）のいずれかで１５分間刺激した後、リン酸特異的フローサイトメトリによってＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５の活性化を評価した。パネルＢは、ＤＥＬからのサイトカイン応答性ｐＳＴＡＴ３＋／５＋（「応答性」）細胞のＣＤ３４およびＣＤ３８表面染色を、非応答性細胞（ｐＳＴＡＴ３＋／５＋細胞以外のすべての細胞を含む）と比較して示す。サイトカイン応答性細胞を緑色（ＴＰＯ）および赤色（Ｇ−ＣＳＦ）で示す。パネルＡおよびＢに関して、各々の象限に示す数は、各象限ゲートに存在する総細胞のパーセンテージを表す。パネルＣでは、ＣＤ３４＋サイトカイン応答性細胞の頻度を定量し、健常ドナーに対する倍数変化として提示する。パネルＤでは、ＤＥＬからのＰＢＭＣをＧ−ＣＳＦで刺激し、６つのサブセットを、表に示す表面マーカーおよびリン酸化ＳＴＡＴタンパク質によって定義されるように、ＦＡＣＳによって選別した。不適（ｎ／ａ）は、その特定のサブセットを説明するのには使用されなかった表面マーカーを表す。ＤＮＡを各々のサブセットから単離し、ＤＥＬ変異に関する対立遺伝子特異的な定量的ＰＣＲを実施した。各サブセットについての対立遺伝子負荷を提示する。誤差バーは３回の反復の標準偏差を表す。
【図４】ＴＰＯで刺激したＢａＦ３−ＭＰＬ細胞におけるＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５活性化についての倍数変化。各時点のＭＦＩを各々の細胞株について非刺激細胞（０分）に基準化し、倍数変化として表した。このデータを図２Ｂにおいてヒストグラムとして視覚的に提示する。
【図５】ＷＴまたは変異ＬＮＫを発現するＢａＦ３−ＭＰＬ細胞におけるＪＡＫ２−ＳＴＡＴ３／５の活性化はＪＡＫ活性を必要とする。ＷＴまたは変異ＬＮＫを発現するＢａＦ３−ＭＰＬ細胞を、０．２μＭ〜５μＭの範囲の濃度のＤＭＳＯまたはＪＡＫ阻害剤Ｉと共に２時間プレインキュベートした後、ＴＰＯ（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。次に、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５の活性化をリン酸特異的フローサイトメトリによって測定した。線グラフは各々の細胞株についての最大活性化％を表す。
【図６】図３Ａ〜Ｃのための上流ゲーティング方法。一重項を前方および側方散乱に基づいてゲートした。次にＣＤ３およびＣＤ６６を使用して、それぞれＴ細胞および顆粒球を排除した。初期試験は、ＣＤ３３ｈｉ細胞がＣＤ１４＋（成熟単球）であり、ＴＰＯおよび／またはＧ−ＣＳＦに応答したＳＴＡＴ３／５リン酸化を示さないことを指示した。ＣＤ３３ｍｉｄ細胞はＣＤ１４−（未熟骨髄性細胞）であり、それゆえｐＳＴＡＴ３およびｐＳＴＡＴ５の分析のために使用した。
【図７】野生型および変異ＬＮＫのドメイン構造。（Ａ）野生型ＬＮＫは５７５アミノ酸であり、Ｎ末端のプロリンリッチドメインおよび二量体化ドメイン（Ｐｒｏ／ＤＤ）、形質膜へのターゲティングのために重要なプレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン、ＭＰＬおよびＪＡＫ２と相互作用するＳＨ２ドメイン、ならびにＣ末端の保存されたチロシン残基（Ｙ）から成る。（Ｂ）ＤＥＬ変異体は５ｂｐの欠失およびミスセンス変異を含み、中途終止コドンおよび２６４アミノ酸の切断型タンパク質を導く。Ｅ２０８Ｑ変異体は、ＰＨドメインの開始部に位置する、アミノ酸２０８におけるグルタミン酸のグルタミンへの変化を生じさせる点変異を含む。（Ｃ）Ｒ３９２Ｅ変異体は、ＳＨ２ドメインを破壊し、ＴＰＯ媒介性シグナル伝達および増殖を阻害するＬＮＫの能力を廃することが示されている（Ｇｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ２００７）。ｄｅｌ  ＰＨ／ＳＨ２変異体は、形質膜に局在する能力を喪失する（Ｇｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ２００７）。ｄＰＨ／Ｒ３６４Ｅ／ｄＣ変異体は、野生型Ｌｎｋにドミナントネガティブ作用を及ぼす（Ｔａｋｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ  ２００６）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明を詳細に説明する前に、本発明の実施形態は、言うまでもなく、異なり得るので、本発明は記述される特定の実施形態に限定されないことが了解されるべきである。また、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、限定を意図されないことも了解されるべきである。
【００１９】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の、文脈上明らかに異なる指示が為されない限り下限の単位の１０分の１までの、各々の介在値およびその指定される範囲内の任意の他の指定値または介在値は、本発明に含まれる。これらのより小さな範囲の上限および下限は、指定される範囲内の任意の明確に除外される制限に従って、独立してそのより小さな範囲に含まれてもよく、同時に本発明に含まれる。指定される範囲が上下限の一方または両方を含む場合、それらの含まれる上下限のいずれかまたは両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【００２０】
ある特定の範囲は、本明細書において数値の前に「約」という用語を付けて提示される。「約」という用語は、本明細書ではその後に続く正確な数、ならびにその用語の後に続く数に近い数または近似する数について明示の裏付けを与えるために使用される。ある数が明確に言及される数に近いまたは近似するかどうかを判定する際に、近いまたは近似する言及されていない数は、それが提示される文脈において、明確に言及される数の実質的等価物を提供する数であり得る。
【００２１】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で述べるものと類似または等価の任意の方法および材料も本発明の実施または試験において使用できるが、代表的な例示的方法および材料をここで説明する。
【００２２】
本明細書で引用されるすべての公表文献および特許は、各々個別の公表文献または特許が、参照により組み込まれることが明確かつ個別に指示されているかのごとくに参照により本明細書に組み込まれ、関連して公表文献が引用される方法および／または材料を開示し、説明するために参照により本明細書に組み込まれるものである。任意の公表文献の引用は、出願日に先立つその開示のためであり、本発明が、先行発明によるそのような公表文献に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。さらに、提供される公表日は実際の公表日とは異なることがあり得、実際の公表日は独立して確認される必要があり得る。
【００２３】
本明細書および付属の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに異なる指示が為されない限り、複数の指示対象を含むことが留意される。さらに、特許請求の範囲は任意の選択的要素を除外するように作成され得ることも留意される。そこで、この記述は、請求項の要素の言及に関連して「唯一」、「のみ」等の排他的用語を使用すること、または「否定的な」限定を使用することの先行詞となることが意図されている。
【００２４】
本開示を読了後に当業者に明らかになるように、本明細書で記述および例示される個々の実施形態の各々は別個の構成要素および特徴を有し、それらは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、その他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るまたは前記特徴と組み合わされ得る。任意の言及される方法は、言及される事象の順序でまたは論理的に可能な任意の他の順序で実施することができる。
【００２５】
血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を診断するまたは予測するための方法
本発明の態様は、被験者を、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を有するまたはその素因があると分類する方法であって、
被験者からの血球を含んだ試料に由来するＬＮＫ遺伝子の配列を決定すること；および
決定されたＬＮＫ配列が少なくとも１つの変異を有する場合、被験者を、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を有するまたはその素因があると分類すること
を含む方法を含む。
【００２６】
ある実施形態では、ＬＮＫ変異はプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインおよび／またはＳＨ２ドメイン内にある。ある実施形態では、ＬＮＫ変異は、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインおよび／またはＳＨ２ドメインの全部または一部の欠失である。ある実施形態では、ＬＮＫ変異は、野生型ＬＮＫと比較して細胞におけるサイトカインシグナル伝達の増大を生じさせる。ある実施形態では、ＬＮＫ変異はＥ２０８Ｑおよび６０３＿６０７ｄｅｌＧＣＧＣＴ；６１３Ｃ＞Ｇから選択される。
ある実施形態では、試料は血液試料である。
ある実施形態では、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍は、ＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ陰性骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）である。
【００２７】
ある実施形態では、分類工程は、決定されたＬＮＫ配列を１またはそれ以上の参照ＬＮＫ配列と比較することを含み、１またはそれ以上の参照ＬＮＫ配列は、
血液リンパ系新生物または悪性腫瘍の素因があることが既知の被験者からのＬＮＫ配列；および
血液リンパ系新生物または悪性腫瘍の素因がないことが既知の被験者からのＬＮＫ配列
の一方または両方を含む。
【００２８】
ＬＮＫ核酸またはタンパク質の配列を決定するために任意の好都合な方法を使用してよく、そのためこれに関する限定は意図されていない。ある実施形態では、配列決定工程は、ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーション、塩基配列解析および抗体結合アッセイの１またはそれ以上を含む。
【００２９】
本開示の方法は、本開示の方法から生じる結果または成績を提供する報告の作成に適する。本明細書で述べる「報告」は、診断または危険性評価およびその結果（例えばＬＮＫ変異の結果および新生物／悪性腫瘍を有するまたは発症する可能性）に関する関心対象の情報を提供する報告要素を含む電子文書または有形文書である。本発明の報告は、完全にまたは部分的に電子的に作成する、例えば電子表示（例えばコンピュータのモニター）上に提示することができる。報告はさらに、１）試験施設に関する情報；２）サービスプロバイダー情報；３）患者データ；４）試料データ；５）ａ）適応症；ｂ）遺伝子検査データを含む様々な情報を含み得る説明報告、および６）他の特徴の１またはそれ以上を含み得る。
【００３０】
本開示は、したがって、報告を作成する方法およびそれから生じる報告を提供する。報告は、電子形式または書類上で提示されてよく、患者または患者の医療サービス提供者に提供され得る。ある実施形態では、本明細書で開示される方法は、ユーザー、例えば患者または医療サービス提供者に対して本明細書で詳述される方法の結果の報告を作成するまたは出力する工程をさらに含み得る。報告を作成する人物または主体（「報告作成者」）はまた、その中でデータの評価を実施してもよい。報告作成者はまた、処理工程の任意の１またはそれ以上、例えば試料の収集、試料の処理およびデータ生成を実施してもよい。あるいは、報告作成者以外の主体が、試料の収集、試料の処理およびデータ生成の１またはそれ以上を実施することができる。
【００３１】
ある実施形態、例えば本発明の方法が完全に１台のコンピュータ上で実行される実施形態では、ユーザーまたは顧客がデータ入力およびデータ出力の検討を提供する。「ユーザー」は、医療従事者（例えば臨床医、検査技師、医師（例えば癌専門医、外科医、病理学者）等）であり得る。
【００３２】
ユーザーが方法の一部だけを実行する実施形態では、本発明の方法に従ってコンピュータ化されたデータ処理後、データ出力（例えば、公表の前に完全な報告を提供する、または「不完全な」報告を検討し、手作業で介入して説明報告を完成させる）を検討する個人を本明細書では「検討者」と称する。検討者はユーザーとは離れた場所に位置し得る（例えば、ユーザーが位置し得る医療施設とは別途に提供される施設）。
【００３３】
政府の規制または他の制限事項（例えば保健衛生、医療過誤または損害賠償保険による要求）が適用される場合、すべての結果は、全面的または部分的に電子的に生成されたか否かに関わらず、ユーザーへの公表の前に品質管理ルーチンに供され得る。
本開示によって提供される方法はまた、全体的または部分的に自動化され得る。
【００３４】
薬剤スクリーニング
本発明の態様は、被験者において血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を治療するための候補治療薬を同定する方法であって、
野生型ＬＮＫと比較してサイトカインシグナル伝達の増大を細胞に付与する、変異ＬＮＫタンパク質を含有する細胞を薬剤と接触させること；および
前記薬剤が対照と比較して細胞におけるサイトカインシグナル伝達を低減する場合、前記薬剤を被験者の血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を治療するための候補治療薬として同定すること
を含む方法を含む。
【００３５】
ある実施形態では、ＬＮＫ変異はプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインおよび／またはＳＨ２ドメイン内にある。ある実施形態では、ＬＮＫ変異は、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインおよび／またはＳＨ２ドメインの全部または一部の欠失である。ある実施形態では、ＬＮＫ変異はＥ２０８Ｑおよび６０３＿６０７ｄｅｌＧＣＧＣＴ；６１３Ｃ＞Ｇから選択される。ある実施形態では、ＬＮＫ変異体は血液リンパ系新生物または悪性腫瘍に関連する。ある実施形態では、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍は、ＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ陰性骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）である。
ある実施形態では、接触工程は、細胞をサイトカインと接触させることをさらに含む。ある実施形態では、サイトカインはＴＰＯである。
【００３６】
治療方法、治療薬およびその医薬組成物
本発明の態様は、ＬＮＫ変異体が媒介するサイトカインシグナル伝達（例えばＴＰＯシグナル伝達からの）の増大を阻害する薬剤の有効量を投与することを含む、血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を有する被験者を治療することを含む。ある実施形態では、前記薬剤は、ＬＮＫ変異体が媒介するＳＴＡＴ３および／またはＳＴＡＴ５の活性化をブロックする。
【００３７】
治療薬の医薬組成物は、標的部位における保持および安定化のために最適化され得る。安定化技術は、分子量の増大を達成するために架橋する、多量体化するまたはポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、中性タンパク質担体等のような基に連結することにより、ポリペプチドのサイズを増大させることを含む。保持を増大させるために他の方法は、ポリペプチドを生分解性または生腐食性インプラントに封入することを含む。治療有効成分の放出速度は、ポリマーマトリックスを通過する輸送の速度およびインプラントの生体内分解によって制御される。ポリマー障壁を通過するポリペプチドの輸送はまた、化合物の溶解度、ポリマーの親水性、ポリマーの架橋の程度、ポリマー障壁を薬剤に対してより透過性にするための水吸収後のポリマーの膨張、インプラントの形状等によっても影響される。インプラントは、移植の部位として選択される領域の大きさと形状に相応した寸法である。インプラントは、粒子、シート、パッチ、プラーク、繊維、マイクロカプセル等であり得、選択される挿入部位と適合性の任意の大きさまたは形状であり得る。
【００３８】
医薬組成物は、所望する製剤に応じて、動物またはヒトへの投与用の医薬組成物を製剤するために一般的に使用されるビヒクルと定義される、医薬的に許容される非毒性の担体または希釈剤を含み得る。希釈剤は、配合剤の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンガー液、デキストロース溶液およびハンクス液である。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバントまたは非毒性、非治療性、非免疫原性安定剤、賦形剤等を含み得る。組成物はまた、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤および界面活性剤などの、生理的条件に近づけるための付加的な薬剤も含み得る。
【００３９】
組成物はまた、様々な安定剤のいずれか、例えば抗酸化剤なども含み得る。ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボでの安定性を高める、またはさもなければその薬理的特性を増強する（例えばポリペプチドの半減期を延長させる、その毒性を低減する、溶解度または取り込みを増強する）様々な周知の化合物と複合体を形成し得る。そのような修飾または複合体化剤の例は、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩を含む。組成物のポリペプチドはまた、それらのインビボでの特性を増強する分子と複合体形成することもできる。そのような分子は、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）および脂質を含む。
様々なタイプの投与に適した製剤に関するさらなる指針は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）に認められ得る。薬物送達のための方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）参照。
【００４０】
医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。有効成分の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を測定することを含む、細胞培養物および／または実験動物における標準的な医薬的手順に従って決定できる。毒性作用と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。
【００４１】
細胞培養および／または動物実験から得られたデータを、ヒトについての投与量の範囲を策定する際に使用することができる。有効成分の投与量は、典型的には、低い毒性でＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。
本明細書で述べる医薬組成物は、様々な異なる方法で投与することができる。例としては、経口、鼻内、経直腸、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、経皮、髄腔内および頭蓋内方法によって医薬的に許容される担体を含有する組成物を投与することを含む。
【００４２】
例えば静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路等による非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および製剤を意図される受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る、水性および非水性等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および防腐剤を含有し得る水性および非水性滅菌懸濁液を含む。
【００４３】
医薬組成物を製剤するために使用される成分は、好ましくは高純度であり、潜在的に有害な夾雑物を実質的に含まない（例えば、少なくともナショナルフード（ＮＦ）等級、一般には少なくとも分析等級、より典型的には少なくとも医薬品等級）。さらに、インビボでの使用を意図される組成物は、通常は無菌である。所与の化合物を使用前に合成しなければならない限り、生じる生成物は、典型的には合成または精製工程の間に存在し得るいかなる潜在的毒性物質、特にいかなる内毒素も実質的に含まない。非経口投与用の組成物もまた無菌で、実質的に等張であり、ＧＭＰ条件下で製造される。
【００４４】
表現型決定遺伝子の発現プロフィールのデータベース
ＬＮＫ遺伝子配列および血液リンパ系新生物または悪性腫瘍とそれらの関連性についてのデータベースも提供される。配列および対応する関連性は、それらの使用を容易にする様々な媒体で（例えばユーザーがアクセス可能／読み取り可能な形式で）提供され得る。「媒体」は、本発明の発現プロフィール情報を含む製造物を指す。本発明のデータベースは、コンピュータ読み取り可能媒体、例えばコンピュータを使用するユーザーが直接読み取り、アクセスすることができる任意の媒体上に記録され得る。そのような媒体は、フレキシブルディスク、ハードディスク記憶媒体および磁気テープなどの磁気記憶媒体；ＣＤ−ＲＯＭなどの光記憶媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭなどの電気記憶媒体；ならびに磁気／光記憶媒体などのこれらのカテゴリーのハイブリッドを含むが、これらに限定されない。当業者は、現在公知のコンピュータ読み取り可能媒体のいずれかを使用して、どのようにして本発明のデータベース情報の記録を含む製造物を作製できるかを容易に認識し得る。「記録される」とは、当分野で公知の任意の方法を使用して、コンピュータ読み取り可能媒体に情報を保存するためのプロセスを指す。保存した情報にアクセスするために使用される手段に基づき、任意の好都合なデータ記憶構造を選択し得る。様々なデータ処理プログラムおよびフォーマット、例えばワードプロセシングテキストファイル、データベースフォーマット等が保存のために使用できる。したがって、本発明の発現プロフィールデータベースはユーザーによってアクセス可能である、すなわちデータベースファイルはユーザーの読み取り可能なフォーマット（例えばユーザーがコンピュータを制御する場は、コンピュータが読み取り可能なフォーマット）で保存される。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「コンピュータベースシステム」は、本発明の情報を解析するために使用されるハードウエア手段、ソフトウエア手段およびデータ記憶手段を指す。本発明のコンピュータベースシステムの最小限のハードウエアは、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段およびデータ記憶手段を含む。当業者は、現在利用可能なコンピュータベースシステムの任意の１つが本発明における使用に適することを容易に認識し得る。データ記憶手段は、上述した本発明の記録を含む任意の製造物、またはそのような製造物にアクセスできる記憶アクセス手段を含み得る。
【００４６】
そこで、本発明は、被験者が血液リンパ系新生物または悪性腫瘍を有するまたはその素因があるかどうかを判定するためのコンピュータプログラム製品をさらに含む。コンピュータプログラム製品は、コンピュータに搭載される場合、血球含有試料からのＬＮＫ遺伝子またはタンパク質配列を使用して、被験者についての血液リンパ系新生物または悪性腫瘍カテゴリーを決定するように構成される。決定されると、臨床的な血液リンパ系新生物または悪性腫瘍カテゴリーがユーザーに読み取り可能なフォーマットでユーザーに提供される。加えて、コンピュータプログラム製品は、患者の臨床移植カテゴリーを決定するために用いられる１またはそれ以上の参照または対照ＬＮＫ配列を含み得る。
【００４７】
試薬、システムおよびキット
また、上記で述べた方法の１またはそれ以上を実施するための試薬、システムおよびそれらのキットも提供される。本発明の試薬、システムおよびそれらのキットは大きく異なり得る。関心対象の試薬は、ＬＮＫ核酸および／またはタンパク質配列を決定する際に使用するために特に設計された試薬を含む。システムという用語は試薬の収集物を指すが、例えば、同じまたは異なる供給源からの試薬の収集物を購入することにより、蓄積されたものを指す。キットという用語は、一緒に提供される、例えば販売される、試薬の収集物を指す。
【００４８】
ＬＮＫ遺伝子またはタンパク質の配列を決定するために特にオーダーメードされた試薬は、そのうちの少なくとも１つがＬＮＫ変異遺伝子／ｃＤＮＡ（等）を選択的に検出するおよび／または増幅する（例えばハイブリダイゼーションアッセイ、ＰＣＲに基づく技術、線形増幅等を用いて）ように設計された、ＬＮＫ特異的プライマーまたはプローブの収集物を含む。本発明のシステムおよびキットは、変異アミノ酸配列（例えばポジティブスクリーニングアッセイに関して）またはＬＮＫ変異体において欠失していることが公知の配列（例えばネガティブスクリーニングアッセイにおいて）に特異的な抗体を含み得る。システムおよびキットは、様々な方法において用いられる１またはそれ以上の付加的な試薬、例えば標的核酸を作製するためのプライマー、あらかじめ混合されるかまたは別々であってよいｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ、１またはそれ以上の独自に標識されたｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ、例えばビオチニル化またはＣｙ３もしくはＣｙ５標識ｄＮＴＰ、種々の散乱スペクトルを有する金または銀粒子、または他の合成後標識試薬、例えば蛍光染料の化学的に活性な誘導体、一次および二次抗体（標識抗体を含む）、酵素、例えば逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ等、様々な緩衝媒質、例えばハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液、作製済みのプローブアレイ／基質、スピンカラム等のような標識プローブ精製試薬および成分、シグナル生成および検出試薬、例えばストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体、化学蛍光または発光基質等をさらに含み得る。
【００４９】
本発明のシステムおよびキットは、ペプチドまたはタンパク質レベルの測定のための試薬、例えばＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、ＭＳアッセイ（例えばＬＣ−ＭＳ）、ＨＰＬＣアッセイ、フローサイトメトリアッセイ等において使用されるものをさらに含み得る。
【００５０】
本発明のシステムおよびキットはまた、表現型決定要素も含んでもよく、表現型決定要素は、多くの実施形態において、「入力された」ＬＮＫ核酸またはタンパク質配列に基づき被験者に関して血液リンパ系新生物または悪性腫瘍カテゴリーを決定するために、例えば適切なコンピュータ手段によって、使用できる参照または対照配列である。
【００５１】
上記成分に加えて、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための説明書をさらに含む。これらの説明書は、様々な形態で本発明のキットに存在してよく、そのうちの１またはそれ以上はキット中に存在し得る。これらの説明書が存在し得る１つの形態は、適切な媒体または被印刷物、例えば情報が印刷された１または複数の紙片上、キットの包装中、添付文書中等に印刷された情報としてである。さらに別の手段は、情報が記録されているコンピュータ読み取り可能媒体、例えばディスケット、ＣＤ等である。存在し得るさらに別の手段は、離れた場所で情報にアクセスするためにインターネットを介して使用し得るウエブサイトアドレスである。任意の好都合な手段がキット中に存在し得る。
【００５２】
以下の実施例は説明として提供されるものであり、限定としてではない。
実験
概要
ＬＮＫは、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびＪＡＫ２を阻害するアダプタータンパク質である。ここで本発明者らは、ＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ陰性骨髄増殖性新生物を有する２名の患者における新規ＬＮＫ変異を報告する。１名の患者は、中途終止コドンおよびプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインおよびＳＨ２ドメインの喪失をもたらす５塩基対の欠失およびミスセンス変異を示した。２番目の患者は、ＰＨドメイン内にミスセンス変異（Ｅ２０８Ｑ）を有していた。これらのＬＮＫ変異体で形質導入したＢａＦ３−ＭＰＬ細胞は、ＴＰＯ依存性増殖およびシグナル伝達の調節不全を示した。サイトカイン応答性ＣＤ３４＋細胞が両方の患者において異常に豊富であった。したがって、ＬＮＫの負のフィードバック調節の喪失はＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達の異常を推進し、ＭＰＮの病因の新規機構を構成する。
【００５３】
緒言
チロシンキナーゼの活性化変異によるシグナル伝達異常は、慢性骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）の顕著な特徴である。ＪＡＫ２のエクソン１４におけるＶ６１７Ｆ変異は、真性赤血球増加症（ＰＶ）を有する患者の＞９５％、ならびに本態性血小板血症（ＥＴ）および原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）を有する患者の約５０％において記述されている（参考文献１〜４）。ＪＡＫ２遺伝子のエクソン１２における機能獲得型変異が、Ｖ６１７Ｆ変異を有さないＰＶ患者のごく少数で認められており（参考文献５）、またトロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体ＭＰＬにおける活性化変異（Ｗ５１５Ｋ／Ｌ）が、ＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ陰性ＰＭＦおよびＥＴを有する患者の約５％で同定されている（参考文献６、７）。したがって、ＥＴおよびＰＭＦ患者の約４０〜５０％は明確な遺伝的異常を有さない。ＪＡＫ２またはＭＰＬに変異が存在しない場合でも、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達の活性化を一部のＭＰＮ患者で明らかにすることができ（参考文献８〜１０）、この経路における他の調節要素の変化がＭＰＮの病因に寄与し得ることを示唆する。
【００５４】
ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達の１つの調節因子はＬＮＫ（ＳＨ２Ｂ３）であり、ＬＮＫは、プロリンに富むＮ末端の二量体化ドメイン、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン、ＳＨ２ドメインおよびＣ末端近くの保存されたチロシン残基を含む、いくつかの構造モチーフを共有するアダプタータンパク質のファミリーの成員である（参考文献１１）（図１Ａ）。ＬＮＫは、そのＳＨ２ドメインを介してＭＰＬに構成的に結合し、そのＰＨドメインを介して形質膜に共局在する（参考文献１２、１３）。ＴＰＯでのサイトカインの刺激後、ＬＮＫはＪＡＫ２に強く結合し、下流のＳＴＡＴ活性化を抑制するまたは終結させる（参考文献１２）。  ＬＮＫ−／−マウスは、造血幹細胞（ＨＳＣ）画分の拡大、巨核球過形成、巨脾腫、白血球増加および血小板増加を含む、ＭＰＮ表現型と一致する特徴を示す（参考文献１４〜１６）。ＴＰＯ−／−マウスと交配したＬＮＫ−／−マウスはこれらの特徴を示さないので、この表現型はＴＰＯ依存性である（参考文献１７）。加えて、ＬＮＫ−／−ＨＳＣは、ＴＰＯ刺激に応答して増強されたＪＡＫ２の活性化を示す（参考文献１２）。これらの試験は、ＬＮＫが造血の調節において中心的な役割を果たすこと、およびＬＮＫ活性の消失がＭＰＮの重要な病因特徴であり得ることの説得力のある証拠を提供する。本発明者らはそれゆえ、ＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ陰性ＭＰＮのコホートにおいてＬＮＫを塩基配列決定し、ここで、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達および増殖の調節不全を導く新規ＬＮＫ変異の同定を報告する。
【００５５】
結果
ＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ陰性ＭＰＮにおける体細胞性ＬＮＫ変異の同定
ＰＨおよびＳＨ２ドメインを含むＬＮＫの領域（部分的エクソン２〜エクソン７）（図１Ａ）の直接塩基配列決定を、ＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ陰性ＭＰＮ（世界保健機構によって定義される）を有する３３名の患者からの試料に関して実施し（表１）、ＬＮＫのエクソン２において２つの新規変異を同定した。図１Ｂに示すように、中途終止コドンを導く、５ｂｐの欠失およびミスセンス変異（ＮＭ＿００５４７５．２：ｃ．［６０３＿６０７ｄｅｌＧＣＧＣＴ；６１３Ｃ＞Ｇ］、以下ＤＥＬと称する）が、ＰＭＦを有する患者０１において同定された。この変異は、ＰＨドメインおよびＳＨ２ドメインの両方の不在を生じさせる（図１ＣおよびＤ）。
【００５６】
ＥＴを有する患者０２（図４の症例経過記録）では、ＰＨドメインに局在するグルタミン酸のグルタミン置換（Ｅ２０８Ｑ）を導くミスセンス変異（ＮＭ＿００５４７５．２：ｃ．６２２Ｇ＞Ｃ）が同定された。どちらの症例もＭＰＬ  Ｗ５１５変異に関しては陰性であった（データは示していない）。これらの患者の培養皮膚線維芽細胞からの生殖系ＤＮＡの塩基配列決定は野生型ＬＮＫ配列を明らかにし（図１Ｅ）、これらの変異が体細胞性であることを確認した。これらの変異のいずれもが、公的に利用可能なＳＮＮＰデータベースでは報告されていない。全体として、本発明者らのＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ陰性ＭＰＮ患者のコホートにおいて同定されたＬＮＫ変異の頻度は２／３３（６％）であった。
【００５７】
ＬＮＫ変異はＴＰＯ依存性増殖およびＳＴＡＴ３／５活性化の調節不全を引き起こす
ＭＰＮの病因におけるＬＮＫ変異の機能的影響を検討するため、野生型（ＷＴ）または変異型ＬＮＫをレトロウイルスによってＴＰＯ依存性ＢａＦ３−ＭＰＬ細胞株で発現させた。ＢａＦ３−ＭＰＬ細胞はＴＰＯ用量依存性増殖を示し、この増殖はＷＴ  ＬＮＫの発現によって阻害された（図２Ａ）。先の試験（参考文献１３）と一致して、ＳＨ２ドメインを破壊する合成点変異（Ｒ３９２Ｅ）は、ＬＮＫが媒介するＴＰＯ依存性増殖の阻害を排除した。同様に、ＤＥＬ変異体は、ＬＮＫの負のフィードバック機能の喪失と一致して、ＴＰＯ媒介性増殖を阻害する能力を欠如していた。これに対し、Ｅ２０８Ｑ変異体は部分的な阻害活性を保持しており、ＬＮＫ変異が様々な表現型を付与し得ることを示唆した。この区別的な作用は、下記の、これらの変異を担持するＭＰＮ患者からの一次試料におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達の分析においてさらに強調された。
【００５８】
ＬＮＫは、ＭＰＬおよびＪＡＫ２に結合し、下流のＳＴＡＴ３／５活性化をブロックすることによってＴＰＯ媒介性増殖を阻害する（参考文献１２、１３）。それゆえ、本発明者らは、ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ３／５経路のＴＰＯ媒介性活性化へのＬＮＫ変異の影響を検討した。ＷＴおよび変異ＬＮＫを発現するＢａＦ３−ＭＰＬ細胞をＴＰＯで刺激し、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５のリン酸化（活性化）をリン酸特異的フローサイトメトリによって測定した（図２Ｂおよび図４）。空のベクター（ＥＶ）で形質導入したＢａＦ３−ＭＰＬ細胞において、ＴＰＯ（１ｎｇ／ｍＬ）での刺激はＪＡＫ２−ＳＴＡＴ３／５経路の堅固な活性化を生じさせ、前記活性化は約３０分でピークに達し、６０分まで維持された。これに対し、ＷＴ  ＬＮＫを発現する細胞はＪＡＫ２−ＳＴＡＴ３／５の低い活性化を示し、３０分で一過性にピークに達し、直ちに低下した。ＳＨ２ドメイン変異体Ｒ３９２Ｅを発現するＢａＦ３−ＭＰＬ細胞はＬＮＫの阻害能力を喪失しており、ＥＶの２倍長い３０〜１２０分間、ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ３／５活性化の最大値を達成し、維持した。ＤＥＬ変異体を発現する細胞はＥＶに類似した成績であり、３０〜６０分間、ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ３／５活性化の維持を示した。Ｅ２０８Ｑ変異体はこの系においてほぼ完全な阻害能力を保持し、増殖アッセイで見られた部分的阻害と一致して、機能のわずかな喪失をもたらし得ることを示唆した。これらの所見は、ＬＮＫが、サイトカイン刺激後にＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達を終結させる上で重要な役割を果たし（参考文献１２）、機能喪失変異がＭＰＮにおいて一般的に認められる減衰しないＪＡＫ−ＳＴＡＴ活性化および細胞増殖の増大を可能にし得ることを示した以前の試験と一致する。
【００５９】
ＴＰＯ依存性ＳＴＡＴ３／５活性化および増殖のＬＮＫ媒介性阻害におけるＪＡＫ２の役割をさらに評価するため、ＢａＦ３−ＭＰＬ細胞を汎ＪＡＫ阻害剤（ＪＡＫ阻害剤Ｉ）の存在下で培養した。ＷＴまたは変異ＬＮＫを発現するＢａＦ３−ＭＰＬ細胞はＪＡＫ阻害に対して感受性のままであり、各々の細胞株について類似のＩＣ５０であった（図２Ｃ）。同様に、ＪＡＫ２−ＳＴＡＴ３／５活性化は、すべての細胞株においてＪＡＫ阻害剤Ｉによって有効に阻害された（図５）。これらの所見は、ＷＴまたは変異ＬＮＫの存在下で、ＴＰＯ媒介性増殖およびＳＴＡＴ活性化がＪＡＫ阻害によって排除され得ることを確認する。
【００６０】
ＬＮＫ変異はＣＤ３４＋早期前駆細胞画分におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴの異常活性化に関連する。
本発明者らは、健常ドナーならびにＬＮＫ、ＪＡＫ２  Ｖ６１７ＦまたはＭＰＬ  Ｗ５１５Ｌ変異を担持するＭＰＮ患者からの循環未熟骨髄性細胞におけるＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達を検討した（図６）。図３Ａ（左側）に示すように、ＴＰＯまたはＧ−ＣＳＦでの刺激は、健常ドナーの試料と比較してＤＥＬにおいて著明に増大している独特のリン酸化ＳＴＡＴ３／５（ｐＳＴＡＴ３＋／５＋）亜集団を明らかにした。同様のサイトカイン応答性ｐＳＴＡＴ３＋／５＋亜集団がＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ陽性およびＭＰＬ  Ｗ５１５Ｌ陽性ＰＭＦ試料に関して認められ、これがＰＭＦ患者の間で共有される表現型であり得ることを示唆した。興味深いことに、Ｅ２０８Ｑ変異を担持する患者からの細胞は、ＴＰＯに応答してＳＴＡＴ３／５リン酸化の増大を示したが、ＧＣＳＦでは増大を示さず、ＬＮＫ機能の部分的喪失が特定のサイトカインに応答して区別的なＳＴＡＴ活性化プロフィールをもたらし得ることを示唆した。ＳＴＡＴ３／５活性化をＪＡＫ阻害剤Ｉの存在下でも測定した（図３Ａ、右側）。各々の場合に、ｐＳＴＡＴ３＋／５＋亜集団はＪＡＫ阻害によって完全に根絶され、ＳＴＡＴ３／５活性化がＪＡＫ活性に依存することを確認した。
【００６１】
サイトカイン応答性ｐＳＴＡＴ３＋／５＋（「応答性」）集団をさらに特徴づけるため、このサブセットに関する広範な表面マーカー分析を実施した。図３Ｂに示すように、ＤＥＬからの応答性細胞は主としてＣＤ３４＋であり（ＴＰＯ応答性の８１％およびＧＣＳＦ応答性の８９％）、応答性細胞が主として早期前駆細胞および／またはＨＳＣから成ることを示唆した。加えて、サイトカイン応答性細胞と非応答性細胞集団を比較した場合、ＣＤ３４＋発現は応答性細胞において著明に増大しており、サイトカイン応答性が早期前駆細胞画分の顕著な特徴であり得ることを指示した。ＣＤ３４＋応答性細胞の全体的な頻度を計算し（図３Ｃ）、この亜集団が健常ドナーと比較してＤＥＬにおいて著明に増加していることを認めた。同様の結果がＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ陽性およびＭＰＬ  Ｗ５１５Ｌ陽性ＰＭＦ試料に関して認められた。ＴＰＯ応答性であるがＧ−ＣＳＦ応答性ではないＥ２０８Ｑでは、ＣＤ３４＋細胞が増加していた。これらの所見は、ＣＤ３４＋早期前駆細胞画分におけるＴＰＯおよび／またはＧ−ＣＳＦを介したＳＴＡＴ３／５の活性化はＭＰＮにおいて頻発する特徴であるが、様々な表現型が存在し得ることを示唆する。
【００６２】
ＤＥＬにおけるサイトカイン応答性ＣＤ３４＋細胞の異常な存在率を考慮して、ＬＮＫ変異がこれらの細胞に存在するかどうかを検討した。図３Ｄに示すように、対立遺伝子特異的な定量的ＰＣＲは、サイトカイン応答性細胞におけるＤＥＬ変異の存在を確認した。加えて、Ｔ細胞中にＤＥＬ変異が存在しないことは、変異が骨髄系列に限定されていたことを示唆する。最後に、変異対立遺伝子負荷は、異型接合変異と一致して、検討したすべての骨髄性細胞において〜５０％であった。これらの所見は、ＬＮＫ変異がＣＤ３４＋早期前駆細胞画分において起こり、ＭＰＮの病因における早期遺伝的事象であることを示唆する。
【００６３】
考察
初めてヒト疾患に関係づけられた、本発明者らのＭＰＮ患者のサブセットにおけるＬＮＫ遺伝子の変異の同定は、阻害性アダプタータンパク質の破壊が、典型的にはチロシンキナーゼ（すなわちＪＡＫ２、ＭＰＬ）の活性化変異によって駆動される疾患を表現型模写できることを明らかにする。本発明者らは、３３名のうち２名（６％）のＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ陰性ＭＰＮ患者においてＬＮＫ変異を検出した。この頻度は、ＥＴおよびＰＭＦにおけるＭＰＬ  Ｗ５１５変異の発生率に類似するが、ＬＮＫ変異の正確な頻度ならびにＭＰＮの臨床病理学的特徴および予後とのそれらの関連性を決定するには、より大きなコホートのスクリーニングが必要である。以前のインビトロ試験は、ＬＮＫがＭＰＬ  Ｗ５１５ＬおよびＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆの両方の活性を阻害できることを明らかにしているので（参考文献１３、１８）、ＬＮＫ機能の喪失もまた、これらのＭＰＮの病因における協力的な事象として起こり得ることが考えられる。
【００６４】
本明細書で述べるＬＮＫ変異の両方がＰＨドメインに影響を及ぼし、また他のタンパク質（例えばＡＫＴ１）のＰＨドメインにおける変異が固形腫瘍において報告されており（参考文献１９、２０）、これが次第に認識されつつある腫瘍形成の機構であり得ることを示唆する。ＬＮＫのＰＨドメインは形質膜局在化のために重要であるので、ＤＥＬおよびＥ２０８Ｑ変異は、ＬＮＫの誤った局在化ならびにＭＰＬおよびＪＡＫ２に結合する能力の変化を生じさせ、下流のＳＴＡＴ活性化を阻害し得る。実際に、ＰＨドメインが欠失した合成ＬＮＫ変異体はもはや形質膜に局在することができなかった（参考文献１３）。ＤＥＬ変異体はまたＳＨ２ドメインも欠如しており、これは、そのより完全な機能の喪失を説明し得る。このことは以前の試験によって裏付けられ、その試験では、ＰＨドメインに影響を及ぼす合成点変異はＬＮＫ機能の部分的喪失をもたらしたが（Ｅ２０８Ｑと同様に）、ＳＨ２ドメインに影響を及ぼす変異はＭＰＬおよびＪＡＫ２への結合を排除し、より深刻な表現型を生じさせた（参考文献１２、１３、１６、２１）。
【００６５】
本発明者らの対立遺伝子特異的な定量的ＰＣＲの結果は、ＤＥＬ変異が異型接合であることを示唆し、一方の機能性ＬＮＫ対立遺伝子の喪失（すなわちハプロ不全）はこれらの症例においてＭＰＮ病因を開始させるのに十分であり得るという概念を想起させる。マウス試験では、ＬＮＫ機能の不在（ＬＮＫ−／−）はＭＰＮ表現型を導いたが、異型接合性（ＬＮＫ＋／−）は、ハプロ不全モデルと一致して、中間的な表現型を付与した（参考文献１５）。あるいは、Ｎ末端のプロリンリッチ二量体化ドメインはＤＥＬおよびＥ２０８Ｑ変異の両方に関して保持されるので、変異ＬＮＫの誤った局在化はＷＴ  ＬＮＫの分離を導き、それによって両方のＬＮＫ対立遺伝子の機能喪失をもたらし得る（すなわちトランス優性）。この仮説は、ＰＨドメインとＳＨ２ドメインの両方を破壊する合成変異体がドミナントネガティブ作用を及ぼした以前の試験によって裏付けられる（参考文献２２）。
【００６６】
ＬＮＫは負のフィードバックループの重要な成分であるので、ＴＰＯでのサイトカイン刺激はＬＮＫがＪＡＫ２に強く結合し、下流のＳＴＡＴ活性化を抑制するまたは終結させるように誘導する（参考文献１２）。この負の調節は、正常な造血およびＨＳＣの増殖と成長の調節に不可欠である。本発明者らの所見は、ＬＮＫの変異がこのフィードバック軸を分断し、それによってサイトカイン刺激に応答したＳＴＡＴ３／５活性化の増強と維持を可能にし、ＢａＦ３−ＭＰＬ増殖アッセイによって明らかにされたように、増殖の増大を生じさせることを指示する。これらの作用は、ＬＮＫ変異を担持するＭＰＮ患者におけるサイトカイン応答性ＣＤ３４＋早期前駆細胞の過剰として生理的に発現された。さらに、ＣＤ３４＋画分におけるＤＥＬ変異の存在は、ＬＮＫの破壊がこれらの細胞に増殖上の利点を与え、ＰＶにおけるＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆに関する以前の所見と同様に（参考文献２３）、ＭＰＮの病因における早期遺伝的事象であり得ることを示唆する。ＬＮＫ変異を担持する患者からの一次試料におけるｐＳＴＡＴ３＋／５＋応答は、ＪＡＫ２  Ｖ６１７ＦまたはＭＰＬ  Ｗ５１５Ｌ変異を担持するＰＭＦ患者においても認められた。明らかに、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ活性化はＭＰＮ生物学の主要な特徴である；ＪＡＫ２またはＭＰＬ変異の不在下で、ＬＮＫ変異はこの異常な応答を駆動し得る。さらに、ｐＳＴＡＴ３＋／５＋応答の異常は、急性骨髄性白血病において認められる亜集団を想起させ（参考文献２４）、このシグナル伝達表現型が様々な骨髄性新生物において認められる頻発特徴であることを示唆する。ＬＮＫ変異を担持する細胞株および一次試料のＴＰＯ媒介性シグナル伝達および増殖はＪＡＫ阻害剤によって有効に阻害されたので、ＪＡＫ２阻害剤による治療はＬＮＫ変異を有する患者のために実施可能であり得る。実際に、ＪＡＫ２阻害剤に関する早期治験において、ＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ陽性および陰性の両方のＭＰＮ患者で応答が認められており（参考文献２５）、それゆえこれらの後者の個人をＬＮＫ変異に関してスクリーニングすることは興味深い。
【００６７】
方法
臨床試料
すべての臨床試料は、インフォームドコンセントおよびスタンフォード大学医学部の治験審査委員会による承認を得て入手した。末梢血試料をヘパリンナトリウム中で得て、直ちにサイトカインで刺激するか、または標準的な手順に従ったフィコール密度勾配分離による末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離後にサイトカインで刺激した（参考文献２４、２６）。皮膚線維芽細胞を皮膚パンチ生検の機械的解離によって単離し、標準的な方法を用いて短期単層培養において樹立した。
【００６８】
塩基配列決定
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  ＭｉｎｉまたはＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）のいずれかを製造者の説明書に従って使用して末梢血試料または培養した皮膚線維芽細胞から抽出した。ｇＤＮＡの品質と量を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いて評価した。ＰＨドメインおよびＳＨ２ドメインを含む、ＬＮＫエクソン２〜７についてのＰＣＲおよび配列決定プライマーを以下のように設計した：
（配列番号：１）ＬＮＫ＿ＰＡＲＴ＿ＥＸ２＿Ｆ：ＣＧＧＡＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＣ
（配列番号：２）ＬＮＫ＿ＰＡＲＴ＿ＥＸ２＿Ｒ：ＴＴＧＣＡＣＴＣＧＧＣＣＴＡＡＡＡＧＴＴ
（配列番号：３）ＬＮＫ＿ＰＡＲＴ＿ＥＸ２＿Ｆ＿ｎｅｓｔ：ＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＧ
（配列番号：４）ＬＮＫ＿ＰＡＲＴ＿ＥＸ２＿Ｒ＿ｎｅｓｔ：ＣＴＧＧＡＡＡＧＣＣＡＴＣＡＣＡＣＣＴＣ
（配列番号：５）ＬＮＫ  ＥＸ  ３−５＿Ｆ：ＡＡＣＴＣＡＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧ
（配列番号：６）ＬＮＫ  ＥＸ  ３−５＿Ｒ：ＧＧＧＣＴＡＣＣＴＴＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧ
（配列番号：７）ＬＮＫ  Ｅｘ  ３−５＿Ｆ＿ＩＮＴＳＥＱ：ＧＧＴＧＧＧＡＧＡＣＧＡＧＣＡＧ
（配列番号：８）ＬＮＫ  Ｅｘ  ３−５＿Ｒ＿ＩＮＴＳＥＱ：ＣＴＧＴＧＣＡＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣ
（配列番号：９）ＬＮＫ＿Ｅｘ６−７＿Ｆ：ＧＴＡＣＧＣＴＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣ
（配列番号：１０）ＬＮＫ＿Ｅｘ６−７＿Ｒ：ＧＴＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＴＣＴＡＣＣ
（配列番号：１１）ＬＮＫ＿Ｅｘ６−７＿Ｎｅｓｔ＿Ｆ：ＡＣＴＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＡＡＧＧ
（配列番号：１２）ＬＮＫ＿Ｅｘ６−７＿Ｎｅｓｔ＿Ｒ：ＧＣＣＴＣＴＡＣＣＣＴＣＴＡＣＣＣＡＧＴＧ
（配列番号：１３）ＬＮＫ＿ＥＸ６＿ＮＥＳＴ＿ＳＥＱＦ：ＧＣＴＣＡＴＧＧＡＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴ
（配列番号：１４）ＬＮＫ＿ＥＸ６＿ＮＥＳＴ＿ＳＥＱＲ：ＡＧＧＴＧＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧ
【００６９】
タッチダウンＰＣＲを標準的なプロトコールに従って実施し、次いで配列分析の前に適切な増幅を確認するためにアガロースゲル電気泳動を行った。ＢｉｇＤｙｅ  ｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１００または３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、製造者のプロトコールに従って両方向塩基配列決定を実施した。
【００７０】
細胞培養
ＢａＦ３−ＭＰＬ細胞はＪ．Ｔｙｎｅｒ／Ｂ．Ｄｒｕｋｅｒ（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）の好意によって提供され、これらを１０％ＦＢＳおよびＩＬ−３（１ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を含有するＲＰＭＩ培地に維持した。増殖アッセイのために、ＢａＦ３−ＭＰＬ細胞をサイトカイン不含培地で２回洗浄し、１０％ＦＢＳおよびＴＰＯ（０〜１０ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，  ＮＪ）を含むＲＰＭＩに再塗布した。ＪＡＫ阻害剤増殖アッセイのために、ＢａＦ３−ＭＰＬ細胞を様々な濃度のＤＭＳＯ対照またはＪＡＫ阻害剤Ｉ（ＥＭＤ／Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の存在下でＴＰＯ（１０ｎｇ／ｍＬ）と共に増殖させた。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色することによって生細胞を毎日計数し、ＬＳＲＩＩフローサイトメータでＴｒｕＣｏｕｎｔビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて定量した。Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏレトロウイルスパッケージング細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地に維持した。
【００７１】
発現ベクター
野生型ＬＮＫおよびＤＥＬ配列をＧａｔｅｗａｙ適合性ドナーベクター中のＤＮＡ  ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）によって合成した。ｐＳＲαレトロウイルス発現ベクターはＪ．Ｔｙｎｅｒ／Ｂ．Ｄｒｕｋｅｒの好意によって提供され、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者の説明書に従って使用してＧａｔｅｗａｙ適合性デスティネーションベクター（ｐＳＲα−ＧＷ）に転換した。ＷＴおよびＤＥＬ配列を、ＬＲクロナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてｐＳＲα−ＧＷに移入した。Ｅ２０８ＱおよびＲ３９２Ｅ変異体を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてＷＴ  ＬＮＫから作製し、直接塩基配列決定によって確認した。
【００７２】
レトロウイルス形質導入
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してレトロウイルス発現ベクターをＰｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後にレトロウイルス上清を収集し、レトロネクチン被覆プレート上でポリブレン（４ｍｇ／ｍＬ）と共にＢａＦ３−ＭＰＬ細胞に添加して、１５００×ｇで９０分間遠心分離した。形質導入の２日後、形質導入された細胞が安定に増殖し続けるまで、細胞を少なくとも１週間Ｇ４１８（７５０ｎｇ／ｍＬ）中で選択した。
【００７３】
サイトカイン刺激およびリン酸特異的フローサイトメトリ
ＢａＦ３−ＭＰＬ細胞をサイトカイン不含培地中で一晩飢餓させ、１５分〜１６時間にわたる時点で３７℃にてＴＰＯ（１または１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。末梢血試料をＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍＬ）またはＧ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）のいずれかで３７℃にて１５分間刺激した。ＰＢＭＣを、サイトカイン刺激の前に１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中で３７℃にて１時間休ませた。ＪＡＫ阻害剤実験のために、ＰＢＭＣをＪＡＫ阻害剤Ｉ（ＥＭＤ／Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）５μＭと共に最後の３０分間インキュベートした後、サイトカインで刺激した。サイトカイン刺激後、細胞をパラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）に固定した。末梢血試料のために、赤血球を低張条件下で溶解した。次に、固定した細胞を氷冷メタノール中で透過処理し、標準的な手順に従って細胞表面マーカーおよび／または細胞内リン酸特異的エピトープを染色した（参考文献２４、２６）。以下の抗体を使用した（特に断りのない限り、すべての抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡから得た）：ｐＳＴＡＴ３（ｐＹ７０５、クローン４／Ｐ）、ｐＳＴＡＴ５（ｐＹ６９４、クローン４７）、ｐＪＡＫ２（ｐＹ１００７／１００８、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ＣＤ３４（クローン８Ｇ１２）、ＣＤ３８（クローンＨＩＴ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＣＤ１４（クローンＭ５Ｅ２）、ＣＤ６６（クローンＢ１．１）、ＣＤ３３（クローンＰ６７．６）、ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）。細胞をＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメータで測定した。選別実験のために、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩセルソータを用いて細胞を直接ＰＢＳ中に選別した。フローサイトメトリのデータをＦＡＣＳＤｉｖａソフトウエアで入手し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）またはＣｙｔｏｂａｎｋを用いて標準的な手順に従って解析した（参考文献２４、２６）。
【００７４】
対立遺伝子特異的な定量的ＰＣＲ
選別した細胞からのＤＮＡを、ＲｅｃｏｖｅｒＡＬＬ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を製造者の説明書に従って使用して抽出した。Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ／Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で、５％ＤＭＳＯの存在下に３組の複製と共に増幅を実施した。ＬＮＫの両方の対立遺伝子に区別なくハイブリダイズするプライマー［（配列番号：１５）ＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴおよび（配列番号：１６）ＧＣＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＴＣＧＴ）］ならびに変異体（ＤＥＬ）対立遺伝子に特異的なプライマー［（配列番号：１７）ＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＴＡＧＣＧＴおよび（配列番号：１６）ＧＣＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＴＣＧＴ）］を使用して全ＬＮＫまたは変異ＬＮＫのいずれかを増幅した。ＷＴまたは変異ＬＮＫ  ＤＮＡプラスミドの段階希釈を使用して別々の標準曲線を構築した。変異ＬＮＫ対立遺伝子の相対的存在率を、分析した細胞サブセット内の変異ＬＮＫ対全ＬＮＫの絶対濃度の比として推定した。
【００７５】
【表１】
0005959439.tif 000002
【００７６】
ＬＮＫ変異を有する２名の患者の臨床症例報告
患者０１は、２００７年に疲労を呈した７５歳の男性であった。理学的検査は、肋骨縁の下の２０ｃｍ以上の巨脾腫が顕著であった。白血球数は１２，１００／ｍｍ３、ヘモグロビンは６．３ｇ／ｄＬ、血小板数は３２３，０００／ｍｍ３であった。末梢血スメアは、涙滴赤血球および有核赤血球形態ならびに未熟骨髄性細胞を含む白赤芽球症を示した。骨髄穿刺液は針骨状（ａｓｐｉｃｕｌａｔｅ）であり、細胞遺伝学分析は実施しなかった。骨髄生検は、巨核球の過形成およびクラスタリングを伴うびまん性の著明な線維症を明らかにした。フローサイトメトリは、末梢血中で６％および骨髄で８％の芽細胞を示した。ＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ変異分析は陰性であった。原発性骨髄線維症の診断が与えられた。患者は赤血球輸血依存性であり、プレドニゾン、ダナゾール、エリスロポエチンおよびヒドロキシ尿素を含むいくつかの療法に対して不応答性であった。患者は現在、ＪＡＫ２阻害剤臨床試験のために考慮されている。
【００７７】
患者０２は５９歳の男性で、２００２年に１，２００，０００／ｍｍ３の血小板数を示し、そのほかの血球算定は正常であった。検査で臓器巨大症は存在しなかった。血小板増加症の反応性原因は除外された。末梢血スメアは、他の有意の形態学異常を伴わない巨大血小板形態を明らかにし、骨髄生検は、本態性血小板血症と一致して、巨核球増加を伴う正常細胞性であった。細胞遺伝学は正常であり、ＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ変異分析は陰性であった。患者は、アスピリンならびにアナグレリドおよびヒドロキシ尿素を含む細胞減少薬の間欠的使用で治療されており、血栓出血性合併症は有していなかった。
【００７８】
さらなる研究
ＬＮＫ変異体の細胞内局在の検査：これまでの試験は、ＬＮＫがＰＨドメインを介して形質膜に局在し、形質膜においてＭＰＬおよびＪＡＫ２と直接相互作用することを示した（Ｂｅｒｓｅｎｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ２００８，１１８：２８３２−２８４４；およびＧｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００７，１１０：３３６０−３３６４）。ＬＮＫ  ＳＨ２変異体Ｒ３９２ＥおよびＳＨ２ドメインを欠く欠失変異体は、どちらも形質膜に局在する能力を保持する。しかし、ＳＨ２ドメインとＰＨドメインの両方を欠く欠失変異体（ｄｅｌ  ＰＨ／ＳＨ２）はこの能力を喪失する（Ｇｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００７，１１０：３３６０−３３６４）。ＬＮＫのＮ末端（二量体化ドメインを含む）、次いでＰＨドメインの直前の中途終止コドンを保持するこの変異体は、本発明者らが同定したＬＮＫ  ＤＥＬ変異体に著しく類似する（図７）。それゆえ、本発明者らは、ＬＮＫ  ＤＥＬ変異体もまた、もはや形質膜に局在しないと予測する。この仮説を調べるため、野生型ＬＮＫならびにＬＮＫ  ＤＥＬおよびＥ２０８Ｑ変異体を発現する細胞をＬＮＫ特異的抗体で染色し、共焦点顕微鏡で検査する免疫蛍光実験を実施する予定である。ＬＮＫに特異的な市販の抗体が利用可能であるが、本発明者らは、これらの実験を容易にするためにＬＮＫのＮ末端にエピトープタグ（例えばＨＡタグ）を導入するつもりである。
【００７９】
潜在的ドミナントネガティブとしてのＬＮＫ変異体の評価：新たに記述されたＬＮＫ  ＤＥＬおよびＥ２０８Ｑ変異体は、野生型ＬＮＫ機能の一部または全部を欠如し得る。加えて、野生型ＬＮＫタンパク質の存在下で発現された場合（これらの変異を担持する患者について述べたように異型接合状態であるので）、それらはドミナントネガティブとして作用し得る。これは、おそらくＰＨドメインの欠如のために形質膜に局在する能力を喪失している、ＬＮＫ  ＤＥＬ変異体に関して特に当てはまる。しかし、この変異体は二量体化ドメインを保持するので、本発明者らは、この変異体が野生型ＬＮＫと二量体化して、野生型タンパク質の誤った局在化も引き起こし得ると推測する。この概念は、同様に構造化された変異体（ＰＨドメインの欠失およびＳＨ２ドメインを破壊する点変異を含む）（図７）がドミナントネガティブ作用を及ぼす能力を有することが示された以前の試験（Ｔａｋｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００６，１０７：２９６８−２９７５）によってさらに裏付けられる。
【００８０】
参考文献
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６．Ｐｉｋｍａｎ  Ｙ，Ｌｅｅ  ＢＨ，Ｍｅｒｃｈｅｒ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．ＭＰＬＷ５１５Ｌ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｏｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ．ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ２００６；３：ｅ２７０．
７．Ｐａｒｄａｎａｎｉ  Ａ，Ｌｅｖｉｎｅ  Ｒ，Ｌａｓｈｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．ＭＰＬ５１５  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  １１８２  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２００６；１０８：３４７２−６．
８．Ｔｅｏｆｉｌｉ  Ｌ，Ｍａｒｔｉｎｉ  Ｍ，Ｃｅｎｃｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＳＴＡＴ−３  ａｎｄ  ＳＴＡＴ−５  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅｓ  ａｍｏｎｇ  Ｐｈ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖ６１７Ｆ  ＪＡＫ−２  ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  ２００７；１１０：３５４−９．
９．Ｈｅｌｌｅｒ  Ｐ，Ｌｅｖ  Ｐ，Ｓａｌｉｍ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｆｒｏｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｈｅｍｉａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＳＴＡＴ５  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２００６；７７：２１０−６．
１０．Ｍｅｓａ  Ｒ，Ｔｅｆｆｅｒｉ  Ａ，Ｌａｓｈｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅ  ２（Ｖ６１７Ｆ）  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ，ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−３  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００６；２０：１８００−８．
１１．Ｒｕｄｄ  ＣＥ．Ｌｎｋ  ａｄａｐｔｏｒ：ｎｏｖｅｌ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００１；２００１：ＰＥ１．
１２．Ｂｅｒｓｅｎｅｖ  Ａ，Ｗｕ  Ｃ，Ｂａｌｃｅｒｅｋ  Ｊ，Ｔｏｎｇ  Ｗ．Ｌｎｋ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｏｕｓｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆｒｅｎｅｗａｌ  ａｎｄ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＪＡＫ２．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００８．
１３．Ｇｅｒｙ  Ｓ，Ｇｕｅｌｌｅｒ  Ｓ，Ｃｈｕｍａｋｏｖａ  Ｋ，Ｋａｗａｍａｔａ  Ｎ，Ｌｉｕ  Ｌ，Ｋｏｅｆｆｌｅｒ  ＨＰ．Ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｎｋ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｔ  ＭＰＬ，ＭＰＬＷ５１５Ｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２００７；１１０：３３６０−４．
１４．Ｔａｋａｋｉ  Ｓ，Ｍｏｒｉｔａ  Ｈ，Ｔｅｚｕｋａ  Ｙ，Ｔａｋａｔｓｕ  Ｋ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｂｙ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｎｋ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００２；１９５：１５１−６０．
１５．Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ  Ｌ，Ｃｈｅｎｇ  ＡＭ，Ｆｌｅｍｉｎｇ  ＨＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｒｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  ｉｎ  Ｌｎｋ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００２；１９５：１５９９−６１１．
１６．Ｔｏｎｇ  Ｗ，Ｌｏｄｉｓｈ  ＨＦ．Ｌｎｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔｐｏ−ｍｐｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｐｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００４；２００：５６９−８０．
１７．Ｂｕｚａ−Ｖｉｄａｓ  Ｎ，Ａｎｔｏｎｃｈｕｋ  Ｊ，Ｑｉａｎ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ：ｏｐｐｏｓｉｎｇ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｎｄ  ＬＮＫ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２００６；２０：２０１８−２３．
１８．Ｇｅｒｙ  Ｓ，Ｃａｏ  Ｑ，Ｇｕｅｌｌｅｒ  Ｓ，Ｘｉｎｇ  Ｈ，Ｔｅｆｆｅｒｉ  Ａ，Ｋｏｅｆｆｌｅｒ  ＨＰ．Ｌｎｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＪＡＫ２  ｍｕｔａｎｔ，ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ２００９；８５：９５７−６５．
１９．Ｃａｒｐｔｅｎ  ＪＤ，Ｆａｂｅｒ  ＡＬ，Ｈｏｒｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＡＫＴ１  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００７；４４８：４３９−４４．
２０．Ｓｈｏｊｉ  Ｋ，Ｏｄａ  Ｋ，Ｎａｋａｇａｗａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＡＫＴ１  ｉｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９；１０１：１４５−８．
２１．Ｔｏｎｇ  Ｗ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｌｏｄｉｓｈ  ＨＦ．Ｌｎｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｐｏ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＪＡＫ２  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２００５；１０５：４６０４−１２．
２２．Ｔａｋｉｚａｗａ  Ｈ，Ｋｕｂｏ−Ａｋａｓｈｉ  Ｃ，Ｎｏｂｕｈｉｓａ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｎｋ．Ｂｌｏｏｄ  ２００６；１０７：２９６８−７５．
２３．Ｊａｍｉｅｓｏｎ  ＣＨ，Ｇｏｔｌｉｂ  Ｊ，Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＪＡＫ２  Ｖ６１７Ｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｃｃｕｒｓ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ  ｖｅｒａ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００６；１０３：６２２４−９．
２４．Ｉｒｉｓｈ  ＪＭ，Ｈｏｖｌａｎｄ  Ｒ，Ｋｒｕｔｚｉｋ  ＰＯ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  ２００４；１１８：２１７−２８．
２５．Ｖｅｒｓｔｏｖｓｅｋ  Ｓ，Ｋａｎｔａｒｊｉａｎ  ＨＭ，Ｐａｒｄａｎａｎｉ  ＡＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＪＡＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＩＮＣＢ０１８４２４，ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｄｕｒａｂｌｅ  ａｎｄ  ｍａｒｋｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ（ＰＭＦ）  ａｎｄ  ｐｏｓｔｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ／ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｈｅｍｉａ  ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ（ｐｏｓｔ  ＰＶ／ＥＴＭＦ）．ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ２００８；１１２：１７６２．
２６．Ｋｏｔｅｃｈａ  Ｎ，Ｆｌｏｒｅｓ  Ｎ，Ｉｒｉｓｈ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ＳＴＡＴ５  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００８；１４：３３５−４３．
【００８１】
前述の本発明を、理解を明瞭にするために図面および実施例によってある程度詳細に説明したが、本発明の教示に照らして、付属の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく特定の変更および修正を行い得ることは当業者に容易に明白である。
【００８２】
したがって、前記説明は単に本発明の原理を例示するものである。当業者は、本明細書において明白に説明または示されてはいないが、本発明の原理を具現化し、その精神および範囲に含まれる様々な仕組みを考案できることが認識される。さらに、本明細書で言及されるすべての例および条件付き言語は、主として、本発明の原理および当分野の技術を推進するために発明人によって寄与される概念を理解する閲覧者の助けとなることが意図されており、そのような特定して言及される例および条件に限定されないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様および実施形態を列挙する本明細書のすべての記述ならびにその特定例は、その構造的および機能的等価物の両方を含むことが意図されている。加えて、そのような等価物は、現在公知の等価物および将来開発される等価物、すなわち、構造にかかわりなく同じ機能を実施する開発された任意の要素の両方を含むことが意図されている。本発明の範囲は、それゆえ、本明細書で示され、説明される例示的な実施形態に限定されることを意図されない。むしろ、本発明の範囲および精神は付属の特許請求の範囲によって具現化される。
【図１−１】
0005959439.tif 000003
【図１−２】
0005959439.tif 000004
【図２Ａ】
0005959439.tif 000005
【図２Ｂ】
0005959439.tif 000006
【図２Ｃ】
0005959439.tif 000007
【図３−１】
0005959439.tif 000008
【図３−２】
0005959439.tif 000009
【図３−３】
0005959439.tif 000010
【図４】
0005959439.tif 000011
【図５】
0005959439.tif 000012
【図６】
0005959439.tif 000013
【図７】
0005959439.tif 000014
【配列表】
0005959439000001.app